PL171920B1

PL171920B1 - Sposób wytwarzania nowego, hamujacego PDGF-R polipeptydy immunoglobulinowego PL

Info

Publication number: PL171920B1
Application number: PL92304026A
Authority: PL
Inventors: Vanitha Ramakrishnan; Maria A Escobedo; Larry J Fretto
Original assignee: Cor Therapeutics Inc
Priority date: 1991-12-02
Filing date: 1992-12-01
Publication date: 1997-06-30
Also published as: JP2000355548A; DE69233125D1; RU94031472A; AU3232893A; NZ246242A; EP0619738A1; DE69233125T2; EP0619738A4; EP0619738B1; SG72635A1; ATE244571T1; EP1350799A2; CA2124958A1; JP3455743B2; AU672377B2; RU2194760C2; CA2124958C; JP2000355600A; JP3732385B2; JPH07501806A

Abstract

Sposób wytwarzania nowego, hamujacego PDGF-R polipeptydu imm unoglobuli- now ego lub jego fragmentu wiazacego, który specyficznie wiaze sie z domena ludzkiego receptora PDGF typu beta ( ßPDGF-R), przy czym wiazanie polipeptydu imm unoglobuli- nowego z ßPDGF-R wywiera jeden z wplywów wybranych z nastepujacej grupy: hamowanie wiazania PDGF BB lub AB z receptorem; hamowanie inkubowanej PDGF fosforylacji ßPDGF-R; hamowanie inkubowanej PDGF dimeryzacji ßPDGF-R; hamowanie inkubowanej PDGF m itogenezy komórek posiadajacych ludzki ßPDGF-R; i hamowanie indukowanej PDGF chemotaksji i migracji komórek posiadajacych ludzki ßPDGF-R, polegajacy na hodow aniu lin ii kom órkow ej zawierajacej kw as nukleidow y kodujacy polipeptyd immunoglobulinowy i zbieraniu otrzymanego polipeptydu imm unoglobulinowego, zna- m ienny tym , ze jako linie komórkowa stosuje sie hybrydome ATCC numer H B 10938. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania hamującego PDGF-R polipeptydu immunoglobulinowego, użytecznego w leczeniu chorób zależnych od PDGF-R, zwłaszcza nawrotu zwężenia. Polipeptyd ten hamuje proliferację komórek posiadających ludzki receptor czynnika wzrostowego z płytek krwi typu beta, w której zaangażowany jest PDGF.

Czynnik wzrostowy z płytek krwi (PDGF) jest silnym czynnikiem proliferacyjnym w komórkach pochodzenia mezenchymalnego (Antoniades, H.N. i in. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76; 1809-1813; Bowen-Pope, D.F. i Ross, R. (1982) J.Biol. Chem. 257: 5161 -5171; Heldin, C-H. i in., (1983) J. Biol. Chem. 258: 10054-10059). PDGF (m.cz. 30 Kda) jest połączonym wiązaniem dwusiarczkowym dimerem składającym się z dwóch homologicznych łańcuchów, nazywanych A lub B (Johnsson, A. i in., (1982) Biochem. Biophys. Res. Commun. 104: 66-74). Łańcuchy mogą się łączyć z łańcuchami tego samego lub innego typu, tworząc 3 izoformy AA, BB, lub AB (Heldin, C-H. i in. (1986) Nature 319:511-514). Mitogen PDGF najpierw zidentyfikowano (Antoniades, H.N. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1809-1813; Raines, E.W. i Ross, R. (1982) J. Biol. Chem. 257: 5154-5160 i oczyszczono z ludzkich płytek krwi (Raines, op. cit.), jednak dalsze badania wykazały, że kilka typów komórek, włącznie z naczyniowymi komórkami nabłonkowymi, naczyniowymi komórkami mięśni gładkich, makrofagami, a nawet fibroblastami syntetyzują PDGF (Ross, R. i in. (1986) Cell 46: 155-169).

W proliferacji komórkowej indukowanej przez wszystkie izoformy PDGF zaangażowane jest wiązanie liganda z receptorem PDGF (Heldin, C-H. (1983) op. cit., Ek, B. i in. (1982) Nature 295:419-420; Gleen, K. i in. (1982) J. Biol. Chem. 257: 5172-5176;Frackelton, A.R. i in. (1984) J. Biol. Chem. 259: 5287-5294, Williams, L.T. i in. (1984) J. Biol. Chem. 259: 5287-5294). Receptor PDGF (m.cz. 180 KDa) należy do rodziny kinaz tyrozynowych i składa się z dwóch podtypów receptora, nazwanych typem A (lub typem alfa) (Matsui, T. i in. (1989) Science 243: 800-804 oraz Claesson-Wels, L. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4917-4921) i typem B (lub typem beta) (Yarden, Y i in. (1986) Nature 323: 226-232 oraz Escobedo, J.A. i in. (1988) Science 240: 1532-1534).

Po wiązaniu, z wysokim powinowactwem, PDGF z receptorem następuje dimeryzacja receptora (Bishayee, S. i in. (1989) J. Biol. Chem. 264: 11699-11705 oraz Heldin, C-H. i in. (1989) J. Biol. Chem. 264: 8905-8912) i autofosforylacja (Frackelton, i in. op. cit.), w wyniku czego, zachodzą serie skomplikowanych sygnałów wewnątrzkomórkowych prowadzących do syntezy DNA. Sklonowano geny mysiego i ludzkiego receptora beta PDGF i receptora alfa

171 920

PDGF (Matsui i in. op. cit., Claesson-Welsh i in. op. cit., Yarden i in. op. cit i Escobedo i in. op. cit.) W niniejszym opisie, w odniesieniu do receptorów PDGF, wymiennie stosuje się nazwy typ A i typ alfa, tak jak typ B i typ beta.

Dwie izoformy receptora można rozróżnić poprzez ich znacznie różniące się specyficzności wiązania liganda. Receptor beta PDGF wiąże tylko łańcuch beta (izoformy BB i AB), podczas gdy receptor alfa PDGF może wiązać wszystkie formy PDGF (izoformy zawierające łańcuch A i/lub B (Matsui i in. op. cit., Claesson-Welsh i in. op. cit. oraz Seifert, R.A. i in. (1989) J. Biol. Chem. 264: 8771-8778). Receptor PDGF wykazuje wysoki stopień homologii strukturalnej z receptorem makrofagowego czynnika stymulującego kolonizację (Coussens, L. i in. (1986) Nature 320: 277-280) i produktem protoonkogenu c-kit (Yarden i in., op. cit.).

Dla receptorów charakterystyczna jest domena pozakomórkowa, w której można rozgraniczyć pięć domen podobnych do Ig (domeny 1 -5) w oparciu o ich wysoką zawartość struktury β. Te powtórzenia Ig, o długości około 100 aminokwasów każde, posiadają w regularnych odstępach reszty cysteiny (z wyjątkiem powtórzenia czwartego). Receptor posiada pojedynczą domenę transblonkową i cytoplazmatyczną domenę kinazy tyrozynowej (Williams, L.T. (1989) Science 243: 1564-1570).

PDGF odgrywa ważną rolę podczas normalnych procesów fizjologicznych, takich jak regeneracja uszkodzonej tkanki i embriogeneza (Ross, R. i in. op. cit.). Jednakże, badania wskazują obecnie, że ten silny mitogen jest zaangażowany w chorobach związanych z patologiczną proliferacją i w rozwoju pewnych raków (Ross, R. i in. op. cit.). Ekspresję łańcucha A PDGF i receptora beta PDGF wykryto w ludzkich blaszkach miażdżycowych przez hybrydyzację in situ (Wilcox, J.N. i in. (1988) J. Clin. Invest. 82: 1134-1143). Ostatnio Ferns i in. ((1991) Science 253: 1129-1132) stwierdzili, że poliklonalne przeciwciało skierowane przeciwciało skierowane przeciw PDGF znacząco obniża tworzenie uszkodzeń błony wewnętrznej w pozbawionych śródbłonka tętnicach szyjnych pozbawionych grasicy nagich szczurów. PDGF jest zaangażowany w chorobach związanych z patologiczną proliferacją w komórkach pochodzenia mezenchymalnego (Nister, M. i in. (1984). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 926-930 oraz Nister, M. i in. (1987) Cancer Res. 47: 4953-4961). Golden i in. podali, ze poziom mRNA łańcucha A PDGF był podwyższony w obszarach rozrostu błony wewnętrznej naczynia w przeszczepach naczyniowych u pawiana ((1990) J. Vasc. Surg. 11: 580-585). PDGF jest także chemotaktyczny dla mięśni gładkich (Westermark, B. i in. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 128-132) i PDGF płytek krwi może być czynnikiem przyczynowym migracji i proliferacji komórek mięśni gładkich w wypełnionej powietrzem tętnicy szyjnej szczura, czego wynikiem jest znaczne zwężenie.

Wynalezienie przeciwciał skierowanych przeciw receptorom wspomogłoby badania innych czynników wzrostowych i ich receptorów. Na przykład, udowodniono, że przeciwciała rozpoznające receptor epidermalnego czynnika wzrostowego są skutecznym narzędziem w ocenie mechanizmu aktywacji receptora (Spaargaren, M. i in. (1991) J. Biol. Chem. 266: 1733-1739). Przeciwciała skierowane przeciw receptorom interleukiny-2 (IL-2) hamują internalizację IL-2 i w ten sposób hamują dalszą indukcję proliferacji wrażliwych komórek (Duprez, V i in. (1991) J. Biol. Chem. 1497-1501). Podobnie, monoklonalne przeciwciało skierowane przeciw receptorowi epidermalnego czynnika wzrostowego (EGF) hamuje stymulowany estrogenami wzrost ludzkiej linii komórkowej MCF-7 gruczolakoraka sutka (Eppstein, D.A. (1989) J. Cell. Physiol. 141: 420-430). Takie przeciwciała mogą mieć wielką wartość terapeutyczną w leczeniu chorób, w których zaangażowane są czynniki wzrostowe.

Kilka grup wyizolowało przeciwciała skierowane przeciw receptorom PDGF, ale te przeciwciała mają ograniczoną użyteczność (patrz, na przykład, Kawahara, R.S. i in. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 147: 839-845). Otrzymano dodatkowe przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw pozakomórkowej domenie wiążącej PDGF receptora PDGF z macicy świni (Ronnestrand, L. i Terracio, L. (1988) J. Biol. Chem. 263: 10429-10435), ale te przeciwciała nie hamowały wiązania znakowanego ^l25J PDGF z fibroblastami człowieka. O licznych przeciwciałach skierowanych przeciw receptorowi PDGF, które nie hamowały aktywności PDGF, informowali również Kanakaraj, P.S. i in. (1991) Biochemistry 30: 1761 -1767; Claesson-Welsh, L. i in. (1989) J. Biol. Chem. 264: 1742-1747; Seifert, R.A. i in. (1989)

J. Biol. Chem. 264: 8771-8778; Kumjian, D.A. i in. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8232-8236; Bishayee, S. i in. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 3696-3702; Hart, C.E. i in. (1987)

J. Biol. Chem. 262: 10780-10785; Escobedo. J.A. i in. (1988) J. Biol. Chem. 263: 1482-1487; Daniel, T.O. i in. J. Biol. Chem. 262' 9778-9784; Keating, M.T. i L.T. Williams (1987) J. Biol. Chem. 262: 7932-7937; Kazlauskas, A. i J. A. Cooper (1990) EMBO J. 9: 3279-3286).

A zatem, istnieje zapotrzebowanie na immunoglobulinę i inne czynniki zdolne do specyficznego hamowania aktywacji ludzkiego receptora i/lub proliferacji komórek posiadających ludzki receptor PDGF typu beta. Czynniki takie byłyby użyteczne w mapowaniu różnych domen funkcjonalnych receptora oraz w drobiazgowej analizie roli PDGF i jego receptora w procesach normalnych i chorobowych. Ponadto, czynniki takie będą miały wartość terapeutyczną w leczeniu chorób związanych z patologiczną proliferacją, w której zaangażowany jest PDGF, a także chorobach obejmujących chemotaksję i migrację, w których zaangażowany jest PDGF.

Choroby takie obejmują:

a) nawrót zwężenia, włącznie z nawrotem zwężenia tętnicy wieńcowej po zabiegach plastycznych naczynia, aterotomii lub innych inwazyjnych metodach usuwania blaszki oraz nawrót zwężenia tętnic nerkowej lub obwodowych po tych samych procedurach;

b) zjawiska proliferacji w naczyniach krwionośnych i zwłóknienia związane z innymi formami poważnych uszkodzeń, takimi jak: zwłóknienie płuc związane z zespołem ostrego wyczerpania oddechowego dorosłych, zwłóknienie nerek związane z zapaleniem nerek, zwężenie tętnicy wieńcowej związane z chorobą Kawasaki oraz zwężenie naczyń związane z innymi stanami zapalnymi tętnic, takimi jak choroba Takaysau;

c) zapobieganie zwężeniom w przeszczepach żylnych;

d) zapobieganie zwężeniom spowodowanym przyspieszoną migracją i proliferacją komórek mięśni gładkich w przeszczepionych organach;

e) inne procesy zwłókniania, takie jak twardzina skóry, zwyrodnienie włókniste mięśni; i

f) hamowanie proliferacji komórek nowotworowych, w której zaangażowany jest PDGF. W publikacji Rodney S. Kasakawa i wsp. pt.: Monoclonal C3.1 is a platelet derived growth factor (PDGF) antagonist, Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 147, Nr 2, 1987, str. 839-845 opisano przeciwciało monoklonalne (C3.1) skierowane przeciw linii komórkowej NR 6 która jest wariantem linii komórkowej 3Tc szwajcarskiej myszy pozbawionej receptorów epidermalnego endogenicznego czynnika wzrostu i częściowo oczyszczonego receptora PDGF. Autorzy tej publikacji informują, ze przeciwciało to blokuje stymulowaną PDGF inkorporację [³H]-tymidyny. Autorzy stwierdzają, że 50% stężenie hamujące (IC50) wynosi 2 pM . Ponadto zauważono, że immunoprecypitaty przeciwciał z pochodzącą z komórek NR 6 fosfoproteiną 180 kDa, które po związaniu ze złożem powinowactwa C3.1 - sferoza, mogłyby być eluowane z PDGF.

Jak podano na wstępie opisu PDGF istnieje w dwóch izoformach, które można rozróżniać przez ich znacznie różniące się specyficzności w wiązaniu ligandów. Receptor βΡΟΟΙ· wiąże tylko łańcuch B (izoformy BB i AB), podczas gdy receptor aPDGF-R może wiązać wszystkie izoformy PDGF (izoformy zawierające łańcuch A i B). Niniejszy wynalazek zapewnia specyficzne ciało monoklonalne dla receptora βPDGF. W publikacji Rodney’a nie wskazano ani nie zasugerowano istnienia dwóch różnych izoform receptora βPDGF, nie mówiąc juz o opracowaniu sposobu wytwarzania przeciwciała monoklonalnego, które byłoby specyficzne dla jednej z izoform.

Stosowane w sposobie według wynalazku przeciwciało monoklonalne wykazuje inne właściwości niż przeciwciało monoklonalne C3.1. Przeciwciało monoklonalne C3.1 może hamować inkorporację [³H]-tymidyny przy stężeniu 500 pg, a IC50 wynosi 2 pM. Natomiast stosowane w sposobie według wynalazku przeciwciało monoklonalne jest zdolne do hamowania inkorporacji [³H]-tymidyny juz przy stężeniu 1nM. Ponadto, stosowane w sposobie według wynalazku przeciwciało monoklonalne 2A1E2 rozpoznaje niezredukowany ludzki βPDGF-R i immunoprecypitaty pozakomórkowego receptora o pełnej długości. Przeciwciało C3.1 immunoprecypituje fosfoproteinę 180 kDa, a rozpoznawanie tego przeciwciała mogłoby być zmniejszane przez PDGF. Nie zauważono, żeby βPDGF było zidentyfikowane jako mające główny składnik o ciężarze cząsteczkowym w przybliżeniu 180 kDa.

171 920

Sposoby immunizacj i stosowane do otrzymywania przeciwciała C3.1 nie zostały określone w taki sposób, że przeciętny specjalista mógłby przewidzieć, ze przeciwciało to skierowane jest przeciw PDGF-R, tym bardziej, ze przeciwciało to jest specyficzne dla (PDGF-R, ogólnie, lub ludzkiego (PDGF-R w szczególności. Ponadto, dane przedstawione w tej publikacji, które wydają się polegać na założeniu, że przeciwciało C3.1 było specyficzne dla (PDGF-R, nie doprowadziłoby przeciętnego specjalisty do przekonania, że przeciwciało to jest specyficzne dla (PDGF-R, a faktycznie mogłoby pouczać o czymś przeciwnym.

W szczególności, przeciwciało C3.1 wykazywało tylko hamowanie indukowanej PDGF mitogenezy przy 1000 razy większych stężeniach przeciwciała niż poziom przy którym można by się spodziewać takiego hamowania i poziomy przy których możnaby oczekiwać niespecyficznego hamowania. Autorzy omawianej publikacji zapewniają również dane, które prawdopodobnie stanowią podstawę twierdzenia, że przeciwciało C3.1 immunoprecypitowało C3.1. Jednakże, przedstawione dane nie mogą potwierdzić tego twierdzenia, a w rzeczywistości wnioski przebiegają w przeciwnym kierunku. W szczególności autorzy publikacji usiłowali wykazać, że przeciwciało C3.1 immunoprecypituje białko o ciężarze cząsteczkowym 180 kDa (ciężar cząsteczkowy w przybliżeniu równy z PDGF-R) z wytworzoną proteiną stosowaną do immunizacji. Jednakże fosforylację białka 180 kDa prowadzono wobec nieobecności PDGF. Bez wiązania PDGF, autofosforylacja jest wysoce nieprawdopodobna. Tak więc, przeciwciało C3.1 immunoprecypitowało białko, które miało odmienne charakterystyki niż PDGF-R i najprawdopodobniej nie było PDGF-R.

Dodatkowe dane o immunoprecypitacji przedstawiono jako przypuszczalnie wskazujące, ze przeciwciało C3.1 i PDGF wiąze się z nakładającymi się epitopami na PDGF-R. W szczególności w publikacji tej zapewniono żele SDS-PAGE, które wykazują zmniejszanie precypitującego białka 180 kDa przy wytwarzaniu białka gdy preinkubuje się PDGF. Dane te nie wskazują na specyficzną interakcję między przeciwciałem C3.1 i PDGF-R, która była przestrzennie hamowana w obecności PDGF. W szczególności, ilość PDGF wymagana do zaobserwowania jakiegokolwiek zmniejszania poziomu immunoprecypitującego białka 180 kDa była daleka od poziomu, przy którym można by się spodziewać zaobserwowania wiązania PDGF-R przez PDGF w opisanych warunkach. Ponadto, preinkubowanie z takim samym stężeniem FGF wykazało podobne zmniejszenie ilości białka 180 kDa, które immunoprecypitowano. Ostatecznie, białko o ciężarze cząsteczkowym w zakresie 60-90 kDa, które nie mogło być PDGF-R, wykazują daleko większe zmniejszanie przy preinkubowaniu przy pomocy PDGF.

Opierając się na uwagach autorów omawianej publikacji należy uznać, że nie ujawniono w niej sposobu wytwarzania przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla PPDGF-R.

W publikacji Lewis T. Williams’apt.: Signal Transduction by the Platelet-derived Growth Factor Receptor:, Science, Vol.243, str. 1564-1570 przedstawiono ogólną dyskusję metody transdukcji towarzyszącej wiązaniu PDGF do jego receptora. Ponadto w publikacji tej usiłowano wyjaśnić, które części receptora PDGF zaangażowane są w procesie transdukcji. Przedstawiono strukturę całości receptora PDGF wiążącą domenę PDGF. Zasugerowano, że szereg części, zwłaszcza ważnych dla działania receptora obejmuje region transmembrany i domenę włączającą kinazę. Skomentowano również ważną zdolność receptora do ulegania zmianom strukturalnym i jego oddziaływanie na inicjowanie ścieżki transdukcji, a więc funkcji receptora. Nie zasugerowano jednak, że przeciwciało skierowane na region epitopów leży w obrębie domeny podobnej do Ig, domeny pozakomórkowej, hamowałoby funkcję receptora PDGF. Na podstawie powyższej publikacji nie można było przewidzieć, ze konkretna domena (PDGF-R mogłaby zwiększyć przeciwciała lub, że przeciwciała te mogłyby wiązać receptor i hamować funkcję PDGF. W publikacji tej nie przedstawiono wytwarzania pożądanego przeciwciała zdolnego do wiązania z domeną beta receptora ani, że takie przeciwciało mogłoby hamować funkcje (PDGF-R.

W europejskim zgłoszeniu patentowym nrEP-0327369A2 przedstawiono sekwencjęDNA ekspresję wektorów receptora ludzkiego PDGF. W zgłoszeniu tym nie wskazano ani nie zasugerowano sposobu wytwarzania lub stosowania monoklonalnego przeciwciała, które do domeny podobnej do Ig wiąże receptor β, a więc hamuje funkcję receptora.

W publikacji Cary Queen i wsp., pt.: 'A humanized antibody that binds to the interleukin receptor, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol. 86, str. 10029-10033 przedstawiono sposób hurna6

171 920 nizacji przeciwciał w celu zmniejszenia ich immunogeniczności, przy utrzymaniu wysokiego powinowactwa wiązania dla celów terapeutycznych. Nie wskazano w niej ani nie zasugerowano sposobu wytwarzania polipeptydu immunoglobulinowego hamującego PDGF-R.

Niniejszy wynalazek zapewnia polipeptydy immunoglobulinowe, które specyficznie wiążą się z ludzkim receptorem czynnika wzrostowego z płytek krwi typu beta ((3PDGF-R), przy czym wiązanie polipeptydu immunoglobulinowego z ludzkim β-PDGF-R wywiera jeden lub więcej z następujących wpływów: i) hamowanie wiązania PDGF BB z receptorem; ii) hamowanie indukowanej PDGF fosforylacji ePDGF-R; iii) hamowanie indukowanej PDGF dimeryzacji β-PDGF-R; iv) hamowanie indukowanej PDGF mitogenezy komórek posiadających ludzki ePDGF-R; i v) indukowanej PDGF chemotaksji i migracji komórek posiadających ePDGF-R. Korzystnym rozwiązaniem wynalazku jest przeciwciało monoklonalne, takie jak przeciwciało monoklonalne 2A1E2, które należy do izotopu IgGi.

Sposób wytwarzania nowego, hamującego PDGF-R polipeptydu immunoglobulinowego lub jego fragmentu wiążącego, który specyficznie wiąże się z domeną ludzkiego receptora PDGf typu beta (ePDGF-R), przy czym wiązanie polipeptydu immunoglobulinowego z ePDGF-R wywiera jeden z wpływów wybranych z następującej grupy: hamowanie wiązania PDGF BB lub AB z receptorem; hamowanie inkubowanej PDGF fosforylacji ePDGF-R; hamowanie inkubowanej PDGF dimeryzacji ePDGF-R; hamowanie inkubowanej PDGF mitogenezy komórek posiadających ludzki ePDGF-R; i hamowanie indukowanej PDGF chemotaksji i migracji komórek posiadających ludzki ePDGF-R, polegający na hodowaniu linii komórkowej zawierającej polipeptyd immunoglobulinowy i zbieraniu otrzymanego polipeptydu immunoglobulinowego polega według wynalazku na tym, że jako linię komórkową stosuje się linię ATCC numer HB 10938.

Polipeptydy immunoglobulinowe wytworzone sposobem według wynalazku mają zastosowanie diagnostyczne, jak również terapeutyczne. Na przykład, znajdują zastosowanie w metodach leczenia ludzi cierpiących na chorobę, w której zaangażowany jest PDGF, obejmującą proliferację komórek mięśni gładkich, które to metody obejmują podawanie pacjentowi terapeutycznie skutecznej dawki polipeptydu immunoglobulinowego wytworzonego sposobem według wynalazku.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia konstrukcje zrekombinowanej domeny zewnątrzkomórkowej ludzkiego receptora beta. Delecyjną mutagenezę receptora beta PDGF przeprowadzono jak opisano w przykładach wykonania. PA 1 oznacza 5 domenę zewnątrzkomórkową receptora beta PDGF (aminokwasy 1-499), którą wykonano przez wydeletowanie z cDNA receptora PDGF typu beta kodonów reszt aminokwasowych 500-1074 z zastosowaniem oligonukleotydu GTG TGA GGA ACG GGA AAT TCA TCG AAG GAC ATC CCC CGAC (sekwencja o numerze identyfikacyjnymi: 1). PA2 oznacza 4 domenę zewnątrzkomórkową receptora PDGF (aminokwasy 1-384), którą wykonano przez wydeletowanie kodonów reszt aminokwasowych 385-1074 z cDNA z zastosowaniem oligonuklotydu GGA AGG TCG ATG TCT AGT TAA TCG AAG GAC ATC CCC CGAC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2). Przypuszczalne domeny Ig oznaczono następująco: Dl ('aminokwasy 1-91), D2 (aminokwasy 92-181), D3 (aminokwasy 182-282), D4 (aminokwasy 283384) i D5 (aminokwasy 385-499). Determinantą peptydową antysurowic poliklonalnych 1-3-5 jest wskazana powyżej D1.

Figura 2. A. przedstawia blot typu Western ulegającej sekrecji 5 domeny zewnątrzkomórkowej receptora beta PDGF pA1-5. Zredukowaną (ścieżki 1-3) i niezredukowaną (ścieżki 4-6) wydzieloną domenę zewnątrzkomórkową receptora beta PDGF (PA 1-5, 5 gg/ścieżkę) poddano elektroforezie w 7% żelu Laemmlego, a następnie przeniesiono według procedury Western, jak opisano w przykładach wykonania. Nitrocelulozę wyblokowano solą fizjologiczną zbuforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 2% mleko, pocięto na paski i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C z 60 gg/ml albo przeciwciała monoklonalnego 2A1E2 (ścieżki 1 i 4), innego przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciw receptorowi beta PDGF (1C7D5 ) (ścieżki 2 i 5) lub niespecyficznego przeciwciała monoklonalnego (ścieżki 3 i 6). Paski nitrocelulozy przemyto PBS zawierającym 0,5% mleko i 0,1% Tween 20, inkubowano w ciągu 2 godzin w

171 920 i 25 temperaturze pokojowej ze znakowanym J białkiem A i poddano ekspozycji błonę rentgenowską. Strzałka wskazuje pozycję p Δ1-5;

fig. 2 B. przedstawia immunoprecypitację ulegającej sekrecji 4 domeny zewnątrzkomórkowej receptora beta PDGF pA2-7. Wydzieloną 4 domenę zewnątrzkomórkową receptora beta PDGF pΔ2-7 (2,6 μg) inkubowano z przeciwciałem monoklonalnym 2A1E2 (ścieżka 2, 5 μg), 1C7D5 (ścieżka 3, 5 μg) lub niespecyficznym przeciwciałem monoklonalnym (ścieżka 4, 5 μg) w objętości końcowej 500 μl w buforze I.P. w ciągu 3 godzin w temperaturze 4°C. Do każdej probówki dodano Białko A-Sepharose CL4B: Białko G-Sepharose CL4B (1:1) (60 μl 50% zawiesiny) i inkubację kontynuowano w ciągu 2 godzin w temperaturze 4°C. Cząstki żelu odwirowano, przemyto 5X buforem I.P. i poddano elektroforezie w 10% żelu Laemmlego. Po przeniesieniu białek z żelu na nitrocelulozę blokowano ją w PBS zawierającej 5% mleko. Blot inkubowano z rozcieńczeniem 1:100 poliklonalnych przeciwciał królika anty-receptor beta PDGF (1-3-5) w PBS zawierającej 0,5% mleko. Po inkubacji przez noc blot przemyto, inkubowano z ¹²⁵J-białkiem A, przemyto i poddano ekspozycji błonę rentgenowską. Ścieżka 1 przedstawia standard P 2-7 bez immunoprecypitacji. Strzałka wskazuje pozycję pA2-7;

fig. 2. C. przedstawia immunoprecypitację wydzielonego zewnątrzkomórkowego receptora PDGF beta przeciwciałem monoklonalnym 2A1E2. Zewnątrzkomórkowy ludzki receptor PDGF beta φΔ1 -5, 5 μg) immunoprecypitowano 5 pg niespecyficznego przeciwciała monoklonalnego ścieżka 2), przeciwciała monoklonalnego 2A1E2 (ścieżka 3) lub 1C7D5 (ścieżka 4) jak opisano dla części A. Próbki poddano obróbce i blot inkubowano z poliklonalnym przeciwciałem królika antyreceptor beta PDGF, 1-3-5 (rozcieńczenie 1:100) i J-bialkiem A, jak opisano w legendzie do części B. Ścieżka 1 zawiera 5 pg standardu^1-5;

na fig. 3. przedstawiono hamowanie wiązania 1PDGF BB z komórkami HR5. A) Komórki HR5 inkubowano z różnymi stężeniami przeciwciała monoklonalnego 2A1E2 lub kontrolnych przeciwciał monoklonalnych (200 nM anty-IIb/IIIa lub 200 nM 4C5C8) jak opisano w przykładach wykonania. Komórki inkubowano następnie z ^J-PDGF BB i związaną radioaktywność oznaczano w opisany sposób. Wiązanie niespecyficzne określono jako ilość 125J-PDGF BB związanego w obecności 100-krotnego nadmiaru nieznakowanego PDGF BB. B) Komórki HR5 inkubowano z różnymi stężeniami przeciwciała monoklonalnego 2A1E2 o pełnej długości, F(ab’) 2 przeciwciała monoklonalnego 2A1E2 lub Fab przeciwciała monoklonalnego 2A1E2 i 100 n anty-IIb/IIIa, jak opisano w Metodach. Mierzono całkowite wiązanie ¹²5j-PDGF BB z komórkami w obecności i nieobecności przeciwciał monoklonalnych i ich pochodnych. Ilość ^J-PDGF BB związanego z komórkami w obecności 100-krotnego nadmiaru nieznakowanego PDGF BB odpowiada wiązaniu niespecyficznemu;

na fig. 4. przedstawiono hamowanie przez przeciwciało monoklonalne 2A1E2 fosforylacji w komórkach HR5. Spójne monowarstwy komórek HR5 w 6-studzienkowych płytkach preinkubowano w dwóch powtórzeniach z różnymi przeciwciałami monoklonalnymi, a następnie inkubowano z ligandem, PDGF BB, jak opisano w przykładach wykonania. Komórki solubilizowano i odpowiednik jednej 6-studzienkowej płytki poddawano elektroforezie w 7% żelu Laemmlego i przenoszono na nitrocelulozę. Blot typu Western blokowano, a następnie inkubowano z przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciw fosfotyrozynie. Blot inkubowano następnie z ^J-białkiem A i poddano autoradiografii. Ścieżki 3-7odpowiadają studzienkom, które preinkubowano z 0,13 nM przeciwciałem monoklonalnym 2A1E2 (ścieżka 3), 1,3 nM przeciwciałem monoklonalnym 2A1E2 (ścieżka 4), 13,3 nM przeciwciałem monoklonalnym 2A1E2 (ścieżka 5), 0,13 pM przeciwciałem monoklonalnym 2A1E2 (ścieżka 6) lub 0,53 pM przeciwciałem monoklonalnym 2A1E2 (ścieżka 7), a następnie z 100 ng/ml PDGF BB. Ścieżka 2 przedstawia stopień fosforylacji w obecności 100 ng/ml PDGF BB, gdy komórki najpierw preinkubowano z 0,53 pM niespecyficznym przeciwciałem monoklonalnym, a ścieżka 8 przedstawia fosforylację indukowaną PDGF BB, gdy komórki preinkubowano z 0,53 pM przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciw receptorowi betaPDGF, 4C5C8. Strzałka wskazuje pozycję ludzkiego receptora beta PDGF o pełnej długości;

171 920 na fig. 5. przedstawiono hamowanie przez przeciwciało monoklonalne 2A1E2 dimeryzacji receptora PDGF, w której zaangażowany jest PDGF. Komórki HR5 inkubowano z 13 nM przeciwciałem monoklonalnym 2A1E2 (ścieżka 3), 0,13 μΜ przeciwciałem monoklonalnym 2A1E2 (ścieżka 4) lub 1,3 μΜ przeciwciałem monoklonalnym 2A1E2 (ścieżka 5), a następnie 100 ng/ml PDGF BB i przeprowadzano sieciowanie, jak opisano w przykładach wykonania. Ścieżka 6 przedstawia wpływ 0,1 μΜ przeciwciała monoklonalnego antyllb/IIIa na dimeryzację. Ścieżka 1 przedstawia względną ilość dimeru w nieobecności dodanego czynnika sieciującego, a ścieżka 2 przedstawia ilość zdimeryzowanego receptora PDGF w nieobecności przeciwciała;

na fig. 6. przedstawiono hamowanie przez przeciwciało monoklonalne 2A1E2 mitogenezy komórek AG01523B. Komórki hodowano do uzyskania spójnej warstwy i inkubowano, jak opisano w przykładach wykonania, z różnymi stężeniami albo przeciwciała monoklonalnego 2A1E2 (puste kółka) lub niehamującego kontrolnego przeciwciała kontrolnego skierowanego przeciw receptorowi beta PDGF, 4C5C8, (pełne kwadraty) w obecności 50 ng/ml PDGF BB. Inkorporację Ή-tymidyny mierzono jak opisano;

na fig. 7. przedstawiono hamowanie przez przeciwciało monoklonalne 2A1E2 fosforylacji w komórkach mięśni gładkich pawiana. Komórki mięśni gładkich pawiana inkubowano bez PDGF (ścieżka 1) lub z 100 ng/mg PDGF BB w nieobecności przeciwciała monoklonalnego (ścieżka 2), bądź w obecności 2 nM przeciwciała monoklonalnego 2A1E2 (ścieżka 3), 200 nM przeciwciała monoklonalnego 2A1E2 (ścieżka 4) lub 20 nM przeciwciała monoklonalnego 2A1E2 (ścieżka 5). Indukowaną ligandem fosforylację określono przez analizę Western jak opisano w przykładach wykonania;

na fig. 8. przedstawiono hamowanie przez przeciwciało monoklonalne 2A1E2 mitogenezy w komórkach mięśni gładkich pawiana. Spójną warstwę komórek mięśni gładkich pawiana inkubowano z 1 nM, 5 nM, 25 nM, 250 nM lub 1 μM przeciwciałem monoklonalnym 2A1E2 w obecności różnych stężeń PDGF BB. Inkorporację ³H-tymidyny mierzono jak opisano w przykładach wykonania. Dane wyrażono jako procent maksymalnej inkorporacji ³H-tymidyny (około 30-50000 cpm) przy wysycającym stężeniu ligandu (10 ng/ml) w nieobecności przeciwciała monoklonalnego. Inkorporacja H-tymidyny w nieobecności PDGF BB wynosi 5 -8000 cpm. Wykres przedstawia średnią z czterech niezależnych doświadczeń.

Niniejszy wynalazek zapewnia polipeptyd immunoglobulinowy, który specyficznie wiąże się z ludzkim receptorem PDGF typu beta. Przeciwciało zdolne do hamowania indukowanej PDGF mitogenezy komórek, które posiadają na powierzchni ludzki receptor PDGF typu beta. Wynalazek użyteczny będzie w zastosowaniach diagnostycznych, a także leczeniu chorób obejmujących proliferację, migrację i chemotaksję komórek posiadających ludzki receptor PDGF typu beta, w których zaangażowany jest PDGF.

Określenia peptyd, polipeptyd. lub białko stosuje się tu zamiennie Określenie identyczne, gdy dotyczy polipeptydów; wskazuje na to, że polipeptyd lub białko będące przedmiotem zainteresowania jest co najmniej w 30% identyczne z białkiem występującym naturalnie lub jego częścią, zazwyczaj co najmniej w 70% identyczne, a korzystnie w co najmniej 95% identyczne.

W znaczeniu tu stosowanym, określenia wyizolowany, czysty i homogenny stosuje się wymiennie, i opisują one białko, które oddzielono od towarzyszących mu naturalnie składników. Zazwyczaj, monomeryczne białko jest czyste, jeśli co najmniej około 60 do 75% próbki wykazuje pojedynczy szkielet polipetydowy. Nieznaczne warianty lub modyfikacje chemiczne zazwyczaj wykazują tę samą sekwencję polipeptydową. Oczyszczone białko będzie zazwyczaj stanowić ponad około 85 do 90% próbki białka, lepiej około 95%, a korzystnie będzie w ponad około 99% czyste. Czystość lub homogenność białka można wykazać licznymi ze sposobów znanych w nauce, takich jak elektroforeza próbki białka w żelu poliakryloamidowym, a następnie uwidocznienie pojedynczego prążka polipeptydowego w żelu poliakryloamidowym po wybarwieniu. Dla pewnych celów potrzebna będzie wysoka rozdzielczość i stosować się będzie HPLC lub podobny sposób.

171 920

Polipeptyd jest wolny od składników naturalnie towarzyszących, gdy oddzielony jest od natywnych zanieczyszczeń towarzyszących mu w jego stanie naturalnym. A zatem, polipeptyd, który zsyntetyzowano chemicznie lub zsyntetyzowano w układzie komórkowym różnym od komórek, z których pochodzi on naturalnie, będzie wolny od składników naturalnie mu towarzyszących.

Białka można oczyszczać do stanu homogennego standardowymi technikami dobrze znanymi w nauce, obejmującymi selektywne wytrącanie takimi substancjami, jak siarczan amonu, chromatografia kolumnowa, metody oczyszczania immunologicznego i inne. Patrz, na przykład, R. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: Nowy Jork (1982).

Kwasami nukleinowymi w znaczeniu tu stosowanym mogą być DNA lub RNA. Określenie identyczne, gdy dotyczy kwasów nukleinowych, wskazuje na to, że porównywane sekwencje dwóch kwasów nukleinowych, lub wyznaczone ich części, przy optymalnym przyporządkowaniu są identyczne, z odpowiednimi insercjami lub delecjami nukleotydowymi, w co najmniej 80% nukleotydów, zazwyczaj w co najmniej 90% do 95%, a jeszcze korzystniej co najmniej 98 do 99,5% nukleotydów.

Alternatywnie, sekwencje kwasów nukleinowych są identyczne, gdy odcinek kwasu nukleinowego będzie hybrydyzował w selektywnych warunkach hybrydyzacji z komplementarną częścią innej nici kwasu nukleinowego.

Komplementarny podobnie oznacza, że jeden kwas nukleinowy jest identyczny, lub selektywnie hybrydyzuje, z innym kwasem nukleinowym. Zazwyczaj, selektywna hybrydyzacja będzie zachodzić, gdy występuje co najmniej około 55% identyczności na odcinku co najmniej 14-25 nukleotydów, korzystnie co najmniej około 65% identyczności, jeszcze korzystniej co najmniej około 75%, a najkorzystniej co najmniej około 90% identyczności. Patrz M. Kanehisa Nucleic Acids Res. 12: 203 (1984).

Surowe warunki hybrydyzacji będą zazwyczaj obejmować stężenia soli niższe niż około 1 M, lepiej niższe niż około 500 mM, a korzystnie niższe niż około 200 mM. Temperatura będzie zazwyczaj wyższa niż 22°C, lepiej wyższa niż około 30°C, a korzystnie wyższa niż około 37°C. Jako że inne czynniki, takie jak skład zasad i wielkość komplementarnych nici, obecność rozpuszczalników organicznych i zakres różnic w zasadach, mogą w dramatyczny sposób wpływać na surowość hybrydyzacji, ważniejsza od bezwzględnego pomiaru któregokolwiek samego parametru jest ich kombinacja.

Określenie wyizolowany lub czysty, gdy dotyczy kwasów nukleinowych, odnosi się do tych, które oczyszczono od innych składników komórkowych lub innych zanieczyszczeń, np. innych komórkowych kwasów nukleinowych lub białek, z wykorzystaniem technik standardowych, włącznie z traktowaniem zasadą/SDS, wirowaniem w gradiencie CsCl, chromatografia kolumnowa i innymi dobrze znanymi w nauce. Patrz F. Ausubel i in., red., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, Nowy Jork (1987).

Kwas nukleinowy jest połączony w sposób umożliwiający działanie gdy znajduje się w funkcjonalnej współzależności z sekwencją innego nukleinowgo. Na przykład, promotor lub sekwencja wzmacniająca są połączone w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kodującą, jeśli wpływają na transkrypcję sekwencji. Ogólnie, połączony w sposób umożliwiający działanie oznacza, że połączone sekwencje kwasów nukleinowych sąsiadują ze sobą i, gdy jest konieczne połączenie dwóch regionów kodujących białko, sąsiadują w jednej ramce odczytu.

Techniki manipulowania kwasami nukleinowymi, takie jak subklonowanie sekwencji kwasów nukleinowych kodujących polipeptydy w wektorach ekspresyjnych, znakowanie sond, hybrydyzowanie DNA i tak dalej, opisano ogólnie w, na przykład Sambrook i in. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (wyd. 2), tomy 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, lub Ausubel i in., red., (1987) op. cit.

Wektory ekspresyjne, wektory klonujące lub wektory są często plazmidami łub innymi cząsteczkami kwasów nukleinowych, które są zdolne do replikacji w wybranych komórkach gospodarza. Wektory ekspresyjne mogą replikować autonomicznie lub mogą ulegać replikacji dzięki wstawieniu do genomu komórki gospodarza metodami dobrze znanymi w nauce. Wektory, które replikują autonomicznie, będą miały miejsce początku replikacji lub

171 920 sekwencję replikującą autonomicznie (ARS), które funkcjonują w wybranej komórce(kach). Często pożądane jest, aby wektor był użyteczny w więcej niż jednej komórce gospodarza, np. w E. coli klonowania i konstruowania i w komórce ssaka do ekspresji.

Linie komórek ssaków często stosuje się jako komórki gospodarza do ekspresji polipeptydów pochodzące z Eukaryota. Rozmnażanie komórek ssaków w hodowli jest per se dobrze znane. Patrz Tissue Culture, Academic Press, Krause i Patterson, red. (1973). Linie komórek gospodarza mogą także obejmować takie organizmy, jak między innymi bakterie (np. E. coli lub

B. subtilis), drożdże, grzyby nitkowate, komórki roślinne lub komórki owadów.

Transformacja odnosi się wprowadzania wektorów zawierających kwasy nukleinowe będące przedmiotem zainteresowania bezpośrednio do komórek gospodarza dobrze znanymi metodami. Metody transformacji, które różnią się w zależności od komórki gospodarza, obejmują elektroporację; transfekcję wykorzystującą chlorek wapnia, chlorek rubidu, fosforan wapnia, DEAE-dekstran lub inne substancje; bombardowanie mikropociskami, lipofekcję; infekcję (gdy wektor jest czynnikiem infekcyjnym) i inne metody. Patrz Sambrook i in. (1989) op. cit. i Ausubel i in (red.), (1987) op. cit. W rozumieniu tego wynalazku, komórki do których wprowadzono opisane powyżej kwasy nukleinowe obejmują również potomstwo tych komórek.

W znaczeniu tu stosowanym, polipeptyd immunoglobulinowy odnosi się do cząsteczek, które mają specyficzną aktywność immunoreaktywną. Przeciwciała są zazwyczaj tetramerami polipeptydów immunoglobulinowych. W znaczeniu tu stosowanym, określenie przeciwciało odnosi się do białka składającego się z jednego lub więcej polipeptydów, zasadniczo kodowanych przez geny immunoglobulin. Geny immunoglobulin obejmują te kodujące lekkie łańcuchy, które mogą być typu kappa lub lambda, i te kodujące ciężkie łańcuchy. Ciężkie łańcuchy są typu alfa, gamma, delta, epsilon i mu. Karboksykońcowe części lekkich i ciężkich łańcuchów i immunoglobulin są regionami stałymi, podczas gdy części aminokońcowe kodowane są przez bardzo dużą liczbę genów regionu zmiennego immunoglobulin. Zmienne regiony immunoglobulin są częściami, które zapewniają specyficzność rozpoznawania, antygenów. W szczególności, specyficzność zależy od regionów determinujących komplementarność (CDR) immunoglobulin, znanych także jako regiony wysoce zmienne. Immunoglobuliny mogą istnieć w różnorodnych formach, obejmujących na przykład Fv, Fab i F(ab)₂, jak również w postaci jednołańcuchowej (np. Huston, i in., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 85: 5879-5883 (1988) oraz Bird, i in., Science 242: 423-426 (1988). (Patrz Hood i in., Iminunology, Benjamin, N.Y., wyd. 2 (1984) oraz Hunkapiller i Hodd, Nature, 323: 15-16 (1986). Można także stosować przeciwciała jednołańcuchowe, w których geny ciężkiego łańcucha i lekkiego łańcucha połączono w jedną sekwencję kodującą.

Przeciwciała monoklonalne można otrzymać różnymi technikami znanymi specjalistom w tej dziedzinie. Komórki śledziony ze zwierząt immunizowanych pożądanym antygenem unieśmiertelnia się, zazwyczaj przez fuzję z komórkami szpiczaka (patrz Kohler i Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976)). Alternatywne metody unieśmiertelniania obejmują transformację wirusem Epsteina-Barra, onkogenami lub retrowirusami, bądź inne metody znane w nauce. Kolonie powstające z pojedynczych unieśmiertelnionych komórek przeszukuje się pod kątem wytwarzania przeciwciał o pożądanej specyficzności i powinowactwie do antygenu, a wydajność wytwarzanych przez takie komórki przeciwciał monoklonalnych można zwiększyć różnymi technikami, włącznie z iniekcją do jamy otrzewnej gospodarza należącego do kręgowców.

Monospecyficzne immunoglobuliny można także wytwarzać technikami rekombinacji w komórkach gospodarzy prokariotycznych lub eukariotycznych.

Przeciwciała chimeryczne kodowane są przez geny immunoglobulin, które zmodyfikowano technikami inżynierii genetycznej, tak że geny lekkiego i ciężkiego łańcucha składają się z odcinków genów immunoglobulin należących do różnych gatunków. Na przykład, zmienne (V) odcinki genów mysiego przeciwciała monoklonalnego można połączyć z ludzkimi odcinkami stałymi (C). Takie chimeryczne przeciwciało prawdopodobnie będzie mniej antygenowe dla człowieka niż przeciwciała z mysimi regionami stałymi oraz mysimi regionami zmiennymi.

171 920

W znaczeniu tu stosowanym, określenie przeciwciało chimeryczne odnosi się również do przeciwciała, które ma zrąb typu ludzkiego, i w którym każdy obecny region stały posiada co najmniej około 85-90%, a korzystnie około 95% identyczności sekwencji polipetydu z regionem stałym immunoglobuliny ludzkiej, tak zwanej immunoglobuliny humanizowanej (patrz, na przykład, publikacja PCT światowego opisu patentowego numer WO 90/07861). Stąd, wszystkie części takiej humanizowanej immunoglobuliny, z wyjątkiem być może regionów determinujących komplementarność (CDR), są zasadniczo identyczne z odpowiadającymi częściami jednej lub więcej natywnych sekwencji immunoglobulin ludzkich.

Określenie region zrębu w znaczeniu tu stosowanym, odnosi się do tych części regionów zmiennych lekkiego i ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, które są stosunkowo konserwatywne (tj. inne niż CDR) wśród różnych immunoglobulin u jednego gatunku, jak zdefiniowali Kabat i in., (1987): Sequences of Proteins of Immunologic Interest, wyd. 4, US. Dept. Health and Human Services. W znaczeniu tu stosowanym, region zrębu typu ludzkiego jest regionem zrębu, który w każdym istniejącym łańcuchu zawiera co najmniej około 70 lub więcej reszt aminokwasowych, zazwyczaj 75 do 85 lub więcej reszt, identycznych z tymi immunoglobuliny ludzkiej.

Sekwencje DNA ludzkich regionów stałych można wyizolować zgodnie z dobrze znanymi procedurami z różnorodnych komórek ludzkich, ale korzystnie z unieśmiertelnionych komórek

B. Regiony zmienne, lub CDR, do wytwarzania immunoglobulin chimerycznych będzie się podobnie otrzymywać z przeciwciał monoklonalnych zdolnych do wiązania z ludzkim receptorem PDGF typu beta i będzie się wytwarzać w dowolnym dogodnym źródle ssaczym, włącznie z myszami, szczurami, królikami, lub innych kręgowcach zdolnych do wytwarzania przeciwciał dobrze znanymi metodami.

Odpowiednie komórki będące źródłami sekwencji DNA i komórki gospodarza do ekspresji i sekrecji immunoglobulin można otrzymać z licznych źródeł, takich jak American Type Culture Collection (Catalogue of Cell Lines and Hybriodomas, wydanie piąte (1985) Rockville, Maryland, Stany Zjednoczone Ameryki).

Poza specyficznie opisanymi tu immunoglobulinami chimerycznymi i humanizowanymi, łatwo można zaprojektować i wytworzyć inne identyczne zmodyfikowane immunoglobuliny, wykorzystując różne techniki rekombinacji DNA dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Ogólnie, modyfikacje genów można łatwo przeprowadzić stosując szereg dobrze znanych technik, takich jak ukierunkowana mutageneza (patrz Gillman i Smith, Gene 8: 81-97 (1979) oraz S. Roberts i in., Nature 328: 731-734 (1987).

Alternatywnie, można wytwarzać fragmenty polipeptydowe zawierające tylko część pierwszorzędowej struktury immunoglobulin. Na przykład, może być pożądane wytwarzanie fragmentów polipeptydów immunoglobulinowych, które posiadają jedną lub więcej aktywności immunoglobulin poza, lub innych niż rozpoznawanie antygenu (np. wiązanie dopełniacza).

Geny immunoglobulin, całe lub w części, można także łączyć z funkcjonalnymi regionami z innych genów (np. enzymów), lub z innymi cząsteczkami, takimi jak toksyny lub znaczniki tworząc białka fuzyjne (np. immunotoksyny) o nowych właściwościach. W tych przypadkach fuzji genów, w tym samym łańcuchu polipeptydowym obecne są dwa składniki.

Alternatywnie, immunoglobulinę lub jej fragment można chemicznie związać z toksyną lub znacznikiem wykorzystując którąkolwiek z szeregu dobrze znanych procedur chemicznych. Na przykład, gdy znacznik lub czynnik cytotoksyczny jest białkiem, a drugim składnikiem jest nietknięta immunoglobulina wiązanie może polegać na wykorzystaniu heterobifunkcjonalnych czynników sieciujących, np. SPDP, karbodiimidu, glutaraldehydu lub podobnych.

Odpowiednie znaczniki obejmują, na przykład, radionuklidy, enzymy, substraty, kofaktory, inhibitory, czynniki fluoroscencyjne, czynniki chemiluminescencyjne, cząstki magnetyczne. Dla przykładów stosowania takich znaczników patrz ujawnienia patentowe opisów patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 3 817 837, 3 850 752, 3 939 350, 3 996 345, 4 277 437, 4 275 149 i 4 366 241.

Immunotoksyny, włącznie z cząsteczkami jednołańcuchowymi, można także wytwarzać technikami rekombinacyjnymi. Wytwarzanie, różnych immunotoksyn jest dobrze znane w nauce, a metody można znaleźć na przykład w Monoclonal AntibodyToxin Conjugates: Aiming

171 920 the Magic Bullet, Thorpe i in., Monoclonal antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, str. 168-190 (1982); E. Vitetta, Science (1987) 238 1098-1104 oraz G. Winter i C. Milstein, Nature (1991) 349: 293-299.

Do stosowania w immunotoksynach odpowiednie są różnorodne czynniki cytotoksyczne. Czynniki cytotoksyczne mogą obejmować radionuklidy, takie jak jod-131, itr-90, ren-188 i bizmut-212; liczne leki chemioterapeutyczne, takie jak windezyna, metotreksat, adriamycyna i cysplatyna, oraz białka cytotoksyczne, takie jak rybosomalne białka hamujące jak białko antywirusowe szkarłatki, egzotoksyna A Pseudomonas, toksyna rącznika, toksyna błonicy, łańcuch A toksyny rącznika itp. lub czynniki aktywne na powierzchni komórki takie jak enzymy fosfolipazy (np. fosfolipaza C): (Patrz Chimeric Toxins, Olsnes i Pihl, Pharmac. Ther., 15: 355-381 (1981) oraz Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, red Baldwin i Byers, str. 159-179, 224-266, Academic Press (1985).

Polipeptydy immunoglobulinowe wytworzone sposobem według niniejszego wynalazku znajdą zastosowania w środkach leczniczych, diagnostycznych i innych zastosowaniach. Dyskutowano różne techniki użyteczne do tych celów, na przykład w Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nowy Jork (1988), które obejmują: immunizację zwierząt w celu otrzymania immunoglobulin; wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych; znakowanie immunoglobulin do stosowania jako sondy; oczyszczanie przez immunopowinowactwo i oznaczenia immunologiczne.

Przykładem polipeptydu immunoglobulinowego wytworzonego sposobem według wynalazku jest opisane poniżej przeciwciało monoklonalne 2A1E2, które wiąże się specyficznie z ludzkim receptorem PDGF typu beta. Przeciwciało monoklonalne, które należy do izotopu IgG1, zdeponowano w American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20231 (ATCC nr HB10938), przed datą złożenia tego zgłoszenia.

Polipeptydy immunoglobulinowe anty-receptor PDGF można przygotować przez immunizację zwierzęcia oczyszczoną, lub częściowo oczyszczoną, pozakomórkową domeną ludzkiego receptora PDGF typu beta. Immunizowane zwierzęta mogą należeć do jednego lub wielu gatunków, które zdolne są do immunologicznego rozpoznawania epitopów charakterystycznych dla zewnątrzkomórkowej domeny ludzkiego receptora PDGF typu beta, takich jak myszy, konie itp.

Przeciwciała monoklonalne można przygotowywać przez unieśmiertelnianie sekwencji kwasów nukleinowych kodujących polipeptydy immunoglobulinowe lub ich części, które wiążą się specyficznie z determinantami antygenowymi charakteiystycznymi dla pozakomórkowej domeny ludzkiego receptora PDGF typu beta. Proces unieśmiertelniania można przeprowadzać technikami fuzji komórek z otrzymaniem hybrydom, technikami rekombinacji DNA lub technikami łączącymi fuzję komórkową, transformację wirusową i/lub metodologie rekombinacji DNA.

Komórki wytwarzające ludzkie przeciwciała monoklonalne anty-receptor PDGF unieśmiertelnia się stosując np. technikę transformacji wirusem Epsteina-Barra (EB V). Na przykład, limfocyty B otrzymane z krwi obwodowej, szpiku kostnego, węzłów chłonnych, migdałków itp. pacjentów, korzystnie tych zaimmunizowanych receptorem PDGF lub jego częścią, unieśmiertelnia się stosując EBV zgodnie z takimi metodami, jak opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 464 465 oraz Chan i in., J. Immunol. 136: 106 (1986).

Ludzkie przeciwciała monoklonalne anty-receptor PDGF można również przyporządkowywać różnymi innymi sposobami, np. stosując połączenie transformacji EBV lub innym wirusem i techniki fuzji komórkowej z utworzeniem hybrydom. Na przykład, hybrydomy można tworzyć prowadząc fuzję stymulowanych komórek B, otrzymanych z osobnika zaimmunizowanego receptorem PDGF lub jego częścią, z mysim/ludzkim partnerem fuzyjnym heterohybrydy, których szereg zostało opisanych. Patrz np. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 624 921 i James i Bell, J. Immunol. Meths. 100: 5-40(1987). Fuzje mysie/ludzkie można skonstruować tworząc fuzję ludzkich leukocytów stymulowanych lub stransformowanych EBV z łatwo dostępnymi liniami szpiczaka myszy, takimi jak NS-1 lub P3NS-1, w obecności np. glikolu polietylenowego. Hybryda powinna charakteryzować się

171 920 odpowiednią opornością na lek, co można uzyskać przez hodowanie hybryd we wzrastających stężeniach pożądanego leku, takiego jak 6-tioguanina, uabaina lub neomycyna.

Hybrydomy lub komórki limfoblastoidalne, które wydzielają przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania można zidentyfikować przez poszukiwanie supernatantów hodowli pod kątem przeciwciała, które wiąże się z receptorem PDGF typu beta. Korzystnie, przeszukiwanie można wykorzystać do wykrywania tych przeciwciał, które hamują, na przykład, mitogenezę w której zaangażowany jest PDGF. Komórki, które posiadają pożądaną aktywność, klonuje się i subklonuje zgodnie z konwencjonalnymi technikami oraz monitoruje aż do zidentyfikowania stabilnych, unieśmiertelnionych linii wytwarzających pożądane przeciwciało monoklonalne antyreceptor PDGF. Przez przeciwciało monoklonalne rozumie się przeciwciało wytwarzane przez klonalną, unieśmiertelnioną linię komórkową, oddzieloną od komórek wytwarzających przeciwciało o odmiennej specyficzności wiązania antygenu. A zatem, takie przeciwciała monoklonalne są wytwarzane jako odizolowane od innych przeciwciał monoklonalnych, a zatem w postaci czystej (w porównaniu z innymi przeciwciałami) i w stężeniu na ogół wyższym niż normalnie występujące w surowicach z gatunków zwierząt, które służą jako źródło komórek B. Alternatywnie, można wyizolować sekwencje DNA, które kodują ludzki polipeptyd immunoglobulinowy antyreceptor PDGF lub jego część, która specyficznie wiąże zewnątrzkomórkową domenę receptora PDGF; przez przeszukanie biblioteki DNA ludzkich komórek B zgodnie z ogólnym protokołem, jak opisali Huse i in., w Sience 246: 1275-1281 (1989), a następnie sklonowanie i amplifikację sekwencji kodujących przeciwciała antyreceptor PDGF (lub fragmentu wiążącego) o pożądanej specyficzności.

Immunoglobuliny można następnie wytwarzać przez wprowadzenie wektora ekspresyjnego, zawierającego odpowiedni gen immunoglobuliny lub jego część, do odpowiedniej komórki gospodarza. Linię komórek gospodarza utrzymuje się następnie w warunkach odpowiednich dla uzyskania wysokiego poziomu ekspresji sekwencji nukleotydowych immunoglobulin i, jeśli jest to pożądane, można następnie zbierać i oczyszczać lekkie łańcuchy, ciężkie łańcuchy, dimery lekki/ciężki łańcuch lub nietknięte przeciwciała, fragmenty wiążące bądź inne formy immunoglobulin.

Odpowiednie komórki gospodarza obejmują mikroorganizmy, ale do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych mogą być korzystne hodowle komórek tkanek ssaków lub owadów (patrz E. Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y, N.Y. (1987). W tej dziedzinie opracowano liczne odpowiednie linie komórek gospodarza zdolne do wydzielania nietkniętych immunoglobulin, i obejmują one linię komórek jajników chomika chińskiego (CHO), ale korzystnie będzie się stosować stransformowane komórki B lub hybrydomy.

Po ekspresji pełne przeciwciała, ich dimery, pojedyncze lekkie i ciężkie łańcuchy lub inne formy immunologlobulin, można oczyszczać zgodnie ze standardowymi procedurami w tej dziedzinie, włącznie z wytrącaniem siarczanu amonu, kolumnami powinowactwa, chromatografię kolumnową, elektroforezą żelową i podobnymi (patrz R. Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, N.Y. (1982). Do zastosowań farmaceutycznych korzystne są czyste immunoglobuliny o co najmniej około 90 do 95% homogenności, a najkorzystniejsze te o homogenności 98 do 99% lub wyższej. Po oczyszczeniu, częściowo lub do pożądanej homogenności, polipeptydy można następnie stosować terapeutycznie (włącznie ze stosowaniem pozaustrojowym) lub w opracowywaniu i przeprowadzaniu procedur oznaczania, wybarwiania immunofluorescencyjnego i podobnych. (Patrz Immunological Methods, tomy I i II, Lefkovits i Pernis, red., Academic Press, Nowy Jork, N.Y. (1979 i 1981). Polipeptydy immunoglobulinowe wytworzone sposobem według wynalazku mogą należeć do izotopu IgG, IgM, IgA lub IgD i mogą dalej należeć do każdej jego odpowiedniej subklasy, takiej jak np. IgG1, IgG₂, IgG3 lub IgG4. Stosując techniki rekombinacji DNA można łatwo przeprowadzić zmianę klasy wyizolowanych polipeptydów immunoglobulinowych. W metodzie tej geny kodujące regiony stałe, które determinują izotop cząsteczki immunoglobuliny będącej przedmiotem zainteresowania, zastępuje się genami kodującymi pożądany izotyp lub subklasę, jak ogólnie opisano w publikacji europejskiego opisu patentowego numer EP 314 161. Immunoglobuliny o zmienionej klasie można także izolować selekcjonując komórki, w których zaszła zmiana spontaniczna, stosując znane w tej dziedzinie metody selekcji.

171 920

Podawanie ludziom polipeptydów immunoglobulinowych, które zasadniczo nie są ludzkie, może wywołać odpowiedź anty-przeciwciało. A zatem, może być pożądane przygotowanie polipeptydów immunoglobulinowych anty-receptor PDGF, które są polipeptydami człowieka. Przez określenie ludzkie rozumie się przeciwciało lub jego fragment wiążący złożony z sekwencji aminokwasowych, które są co najmniej w około 50% pochodzenia ludzkiego, korzystniej co najmniej w około 70 do 80%, a najkorzystniej w około 95-99% lub więcej, szczególnie do powtarzanych podawań w ciągu przedłużonego okresu, jak może być konieczne do leczenia ustalonych, zależnych od PDGF, chorób proliferacyjnych komórek. W znaczeniu tu stosowanym, przeciwciało ludzkie obejmuje przeciwciała o całkowicie ludzkim pochodzeniu, jak również te, które są zasadniczo ludzkie, o ile kontekst nie wskazuje inaczej.

Jako że tworzenie przeciwciał monoklonalnych anty-receptor PDGF może być trudne z zastosowaniem konwencjonalnych technik unieśmiertelniania, może być pożądane najpierw przygotowanie przeciwciała nie-ludzkiego, a następnie przeniesienie technikami rekombinacji DNA regionów wiążących antygen przeciwciał nie-ludzkich, np. Fab, regionów determinujących komplementarność (CDR) lub regionów wysoce zmiennych, do ludzkich regionów stałych (Fc) lub regionów zrębu, jak pożądane jest do wytworzenia cząsteczek ludzkich. Metody takie są ogólnie znane w tej dziedzinie i opisano je w, na przykład, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 816 397, publikacji PCT światowego opisu patentowego numer WO 90/07861 oraz publikacjach europejskich opisów patentowych o numerach 173494 i 239400.

Otrzymuje się chimeryczne przeciwciała lub chimeryczne polipeptydy immunoglobulinowe, które specyficznie wiążą się z ludzkim receptorem PDGF typu beta i w ten sposób hamują wiązanie PDGF z receptorem. Typowe terapeutyczne przeciwciało chimeryczne może być białkiem hybrydowym, składającym się z domeny zmiennej (V) lub wiążącej antygen) z mysiej immunoglobuliny specyficznej wobec determinanty antygenowej ludzkiego receptora PDGF typu beta oraz domeny stałej (C) lub efektorowej z immunoglobuliny ludzkiej, chociaż domeny innych gatunków ssaków można stosować dla obu domen zmiennych i stałych. W znaczeniu tu stosowanym, określenie przeciwciało chimeryczne odnosi się także do przeciwciał kodowanych przez geny immunoglobulin, w których tylko regiony determinujące komplementarność (CDR) przenosi się z immunoglobuliny, która specyficznie rozpoznaje determinanty antygenowe, a pozostała część genu immunoglobuliny pochodzi z ludzkiego (lub innego ssaczego, jak jest to pożądane) genu immunoglobuliny. Ten typ przeciwciała chimerycznego określa się jako przeciwciało humanizowane (w przypadku zastosowania ludzkiego genu immunoglobuliny).

Wysoce zmienne regiony domen zmiennych polipeptydów immunoglobulinowych antyreceptor PDGF stanowią zbliżony aspekt wynalazku. Regiony wysoce zmienne, lub CDR, łącznie z regionami zrębu (tymi częściami regionów zmiennych lekkiego i ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, które są stosunkowo konserwatywne wśród różnych immunoglobulin pojedynczego gatunku) umożliwiają polipeptydom immunoglobulinowym anty-receptor PDGf rozpoznawanie, a zatem wiązanie ludzkiego receptora PDGF typu beta. Wysoce zmienne regiony można sklonować i zsekwencjonować. Po zidentyfikowaniu, te regiony, które nadają specyficzne rozpoznawanie receptora PDGF, można następnie sklonować w wektorze do ekspresji w gospodarzu jako części innej cząsteczki immunoglobuliny lub białka fuzyjnego, np. cząsteczki nośnikowej, której działanie w celu wzmocnienia immunogenności sklonowanego idiotypu.

Polipeptydy immunoglobulinowe anty-receptor PDGF będzie się na ogół stosować nietknięte lub w postaci fragmentów immunogennych, takich jak fragmenty Fv, Fab lub F (ab’)2. Fragmenty można otrzymać z przeciwciał technikami konwencjonalnymi, takimi jak trawienie proteolityczne przeciwciała z zastosowaniem np. pepsyny lub papapiny, lub technikami rekombinacji dNa, w których gen lub jego część kodującą pożądany fragment klonuje się lub syntetyzuje i prowadzi jego ekspresję w szeregu gospodarzy.

Specjaliści w tej dziedzinie będą wiedzieć, że przeciwciała antyidiotypowe można wytwarzać, zgodnie ze standardowymi technikami, jako immunogen stosując specyficzną immunoglobulinę. Na przykład, infekcja lub immunizacja polipeptydem receptora PDGF lub jego fragmentem, indukuje przeciwciała neutralizujące, które posiadają w swoim miejscu

171 920 łączenia regionu zmiennego posiadają odwzorowanie polipeptydu receptora PDGF, które jest unikalne dla tej poszczególnej immunoglobuliny, tj. idiotyp. Immunizacja taką immunoglobuliną anty-PDGF-R indukuje przeciwciało antyidiotypowe, które w swoim miejscu łączenia ma konformację, która naśladuje strukturę oryginalnego antygenu PDGF-R. Te przeciwciała antyidiotypowe można dlatego stosować zamiast antygenu PDGF-R do leczenia chorób zależnych od PDGF (patrz, na przykład, Nisonoff (1991) J. Immunol. 147:2429-2438).

Polipeptydy immunoglobulinowe anty-receptor PDGF znalazły zastosowanie w metodach i kompozycjach terapeutycznych i diagnostycznych. Do zastosowań terapeutycznych, polipeptydy immunoglobulinowe anty-receptor PDGF stosuje się jako rozpuszczalny ligand ludzkiego receptora PDGF, maskując receptor lub w inny sposób hamując wiązanie cząsteczek PDGF z receptorem i w ten sposób hamując niepożądaną migrację i proliferacje komórek.

W kompozycjach farmaceutycznych, polipeptydy immunoglobulinowe anty-receptor PDGF jak tu opisane, podaje się osobnikom cierpiącym na chorobę związaną z patologiczną proliferacją komórek, w której zaangażowany jest PDGF. W zastosowaniach terapeutycznych, pacjentowi podaje się kompozycje w ilości wystarczającej do skutecznego zablokowania receptorów komórkowych, i w ten sposób wyleczenia, lub przynajmniej częściowego zahamowania proliferacji komórkowej i jej objawów i/lub powikłań. Odpowiednią do realizacji tego ilość określa się jako dawkę skuteczną terapeutycznie. Ilości skuteczne dla tego zastosowania będą zależeć od np. natury kompozycji polipeptydu immunoglobulinowego anty-receptor PDGF, sposobu podawania, stadium i ciężkości przebiegu leczonej choroby, wagi i ogólnego stanu zdrowia pacjenta oraz zdania lekarza przepisującego, ale będą na ogół pozostawać w zakresie od około 0,01 mg/kg do około 100,0 mg/kg przeciwciała na dzień, z najczęściej stosowanym dawkowaniem od około 0,1 mg/kg do około 10,0 mg/kg przeciwciała na dzień. Trzeba pamiętać, że polipeptyd immunoglobulinowy anty-receptor PDGF i wywodzące się z niego kompozycje peptydowe można stosować w poważnych stanach chorobowych, tj. sytuacjach zagrażających życiu lub potencjonalnie zagrażających życiu. W takich przypadkach możliwe jest, i może być uznane za konieczne przez lekarza leczącego, podanie tych kompozycji w znacznym nadmiarze. A zatem, w tych okolicznościach, najkorzystniejsze są ludzkie przeciwciała monoklonalne anty-receptor PDGF lub zasadniczo ludzkie przeciwciała monoklonalne anty-receptor PDGF.

Wysokość dawek i schemat podawania przy pojedynczym lub wielokrotnym podawaniu kompozycji może wybierać lekarz prowadzący. W każdym przypadku, preparaty farmaceutyczne powinny dostarczać polipeptyd immunoglobulinowy anty-receptor PDGF w ilości dostatecznej do skutecznego leczenia pacjenta. Podawanie powinno się rozpocząć przy pierwszym wskazaniu niepożądanej proliferacji komórkowej lub wkrótce po diagnozie i kontynuować do chwili znacznego osłabnięcia objawów oraz w ciągu pewnego okresu później. W dobrze ustalonych przypadkach choroby wymagane będą dawki uderzeniowe, a następnie dawki podtrzymujące.

Kompozycje farmaceutyczne do stosowania terapeutycznego są przeznaczone do podawania pozajelitowego, miejscowego, doustnego lub lokalnego. Korzystnie, kompozycje farmaceutyczne podaje się pozajehtowo, np. dożylnie, podskórnie, śródskórnie lub domięśniowo. Kompozycje do podawania pozajelitowego, zawierają roztwór polipeptydu immunoglobulinowego anty-receptor PDGF rozpuszczonego lub zawieszonego w dopuszczalnym nośniku, korzystnie nośniku wodnym. Można stosować szereg nośników wodnych, np. wodę, zbuforowaną wodę, 0,4% sól, 0,3% glicynę, kwas hialuronowy i podobne. Kompozycje te można wyjaławiać konwencjonalnymi, dobrze znanymi technikami wyjaławiania, lub można wyjaławiać przez sączenie. Otrzymane roztwory wodne można pakować jako takie do stosowania lub liofilizować, przy czym przed podawaniem liofilizowany preparat należy połączyć z jałowym roztworem. Kompozycje mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze wymagane do przybliżenia warunków fizjologicznych, takie jak czynniki doprowadzające pH i buforujące, czynniki doprowadzające toniczność roztworu, czynniki zwilżające i podobne, na przykład octan sodu, mleczan sodu, chlorek sodu, chlorek potasu, chlorek wapnia, monolaurynian sorbitanu, oleinian trietanolaminy itp.

171 920

Stężenie polipeptydów immunoglobulinowych antyreceptor PDGF w preparatach farmaceutycznych może znacznie się różnić, tj. może wynosić od mniej niż około 1 %, zazwyczaj lub co najmniej około 10-15%, do tak wysokiego jak 50% lub więcej wagowo i będzie wybrane przede wszystkim zależnie od objętości płynu, lepkość itp., zgodnie z konkretnym wybranym sposobem podawania.

A zatem, typową kompozycją farmaceutyczną do infuzji dożylnej można sporządzić tak, aby zawierały 250 ml jałowego roztworu Ringera i 100 mg polipeptydu immunoglobulinowego anty-receptor PDGF. Aktualne metody przygotowywania związków do podawania pozajelitowego będą znane lub oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie i opisano je bardziej szczegółowo w na przykład Remington’s Pharmaceutical Science, wyd. 17, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985).

Polipeptydy immunoglobulinowe anty-receptor PDGF i ich fragmenty można także podawać poprzez liposomy. Polipeptydy immunoglobulinowe anty-receptor PDGF mogą służyć do kierowania liposomów do konkretnych tkanek lub komórek posiadających ludzki receptor PDGF typu beta. Liposomy obejmują emulsje, piany, micelle nierozpuszczalne monowarstwy, ciekłe kryształy, zdyspergowane fosfolipidy, warstwy lamellarne i podobne. W preparatach tych mający ulec dostarczeniu polipeptyd immunoglobuiinowy lub fragment włącza się jako część liposomu, sam lub łącznie z cząsteczką, która jest, na przykład, toksyczna wobec komórek docelowych. Zawiesinę liposomów zawierających polipeptyd immunoglobuiinowy można podawać dożylnie, lokalnie, miejscowo itp., w dawce która różni się w zależności od, między innymi, sposobu podawania, dostarczanego peptydu i stadium leczonej choroby.

Dla stałych kompozycji polipeptydów immunoglobulinowych można stosować nietoksyczne nośniki stałe, które obejmują, na przykład, farmaceutycznej czystości mannit, laktozę, skrobię, stearynian magnezu, sacharynę sodową, talk, celulozę, glukozę, sacharozę, węglan magnezu i podobne. Do podawania doustnego tworzy się kompozycje dopuszczalne farmaceutycznie przez włączenie jakichkolwiek z normalnie wykorzystywanych zarobek, takich jak nośniki wymienione uprzednio, i na ogół 10-95% składnika aktywnego, tj. jednego lub więcej polipeptydów immunoglobulinowych anty-receptor PDGF, a korzystniej 25-75%.

Do celów diagnostycznych polipeptydy immunoglobulinowe anty-receptor PDGF mogą być albo wyznakowane, albo niewyznakowane. Znacznikiem jest substancja, która zapewnia sygnał wykrywalny którąkolwiek z szeregu technik dobrze znanych i podawanych w nauce. Można bezpośrednio znakować same polipeptydy immunoglebullnowe. Alternatywnie, nieznakowane przeciwciało, można stosować łącznie z innymi przeciwciałami (drugimi przeciwciałami, które wyznakowano i które rozpoznają polipeptydy immunoglobulinowe anty-receptor PDGF. Na przykład, do wykrywania polipeptydu immunoglobulinowego związanego z próbką można stosować znakowane przeciwciała specyficzne wobec polipeptydów immunoglobulinowych anty-receptor PDGF.

Można wykorzystać szereg różnorodnych znaczników, takich jak radionuklidy związki fluoryzujące, enzymy, substraty enzymów, kofaktory enzymów, inhibitory enzymów, ligandy (szczególnie hapteny) itp. Dostępne są liczne typy oznaczeń immunologicznych dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie.

Polipeptydy immunoglobulinowe anty-receptor PDGF i ich fragmenty można stosować w różnych oznaczeniach immunologicznych do wykrywania receptora PDGF w próbkach biologicznych. Metody takich oznaczeń immunologicznych mogą obejmować oznaczenia immunologiczne w fazie wodnej i analizę biotów typu Western, oznaczenia współzawodniczego i niewspółzawodniczego wiązania białka, test ELISA i inne powszechnie stosowane i szeroko opisywane w literaturze naukowej i patentowej, a wiele wykorzystywanych komercjalnie.

Takie immunoglobuliny i peptydy można również wykorzystać w technikach wybarwiania immunohistochemicznego stosując metody dobrze znane w nauce.

Poniższy przykład podano w celu ilustracji, a nie ograniczania tego wynalazku.

PRZYKŁAD

a) Substancje wyjściowe

PDGF BB nabyto od firmy Amgen. Przeciwciało monoklonalne (MAb) anty-fosfotyrozyna PY20 nabyto od firmy ICI. DMEM, RPMI 1640, F12, surowica cielęca, roztwór penicyliny-streptamycyny, G418-neomycyna, 200 mM glutamina, 1 M HEPES, pirogronian sodowy (11 mg/ml) i sól fizjologiczna zbuforowana fosforanami (PBS) pochodziły z firmy GIBCO. Płodowa surowica cielęca (FCS) i zestaw do oznaczania podtypów przeciwciał monoklonalnych pochodziły z firmy Hyclone. Tris, fosforan sodu, boran sodu, kwas octowy, pirofosforan sodu, fluorek sodu, ditiotreitol (DTT), kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), EGTA, siarczan sodowy dodecylu (SDS), ortowanadan sodu, chlorek sodu (NaCl), kwas cytrynowy, fenylometylosulfonylofluorek (PMSF), albumina surowicy bydlęcej (BSA), Triton X100, Twen 20, kwas 2,2' azyno-bis(3-etylobenzotiazolino) 6-sulfonowy (ABTS), i nadtlenek wodoru pochodziły z firmy Sigma. Koniugat kozich przeciwciał skierowanych przeciw, immunoglobulinom myszy z peroksydazą i hipoksantyna-tiamina (HT) pochodziły z firmy Boehringer Mannheim. Żelatyna, niewybarwione białkowe markery masy cząsteczkowej i nitroceluloza pochodziły z firmy BioRad. Wstępnie barwione białkowe markery wysokiej masy cząsteczkowej pochodziły z firmy BRL. Białko A-Sepharose CL4B, białko G-Sepharose CL4B, bufor do wiązania Immunopure™, zestawy do przygotowywania F(ab’)2i Fab pochodziły z firmy Pierce. Upakowane kolumny PD 10 pochodziły z firmy Pharmacia. ²⁵J-białko A i ⁴C-markery masy cząsteczkowej pochodziły z firmy Amersham. ²J-dijodoodczynnikBoltona-Huntera pochodziły z New England Nuclear. Metanol pochodził w firmy Burdick-Jackson. Hodowle tkankowe nabyto w firmie Costar. Komórki AG01523B otrzymano z ATCC. Komórki HR5 otrzymano dzięki uprzejmości J. A. Escobedo (UCSF). Pierwsze pokolenie komórek mięśni gładkich tętnicy ramiennej pawiana dostarczyli J. Anderson i S. Hanson (Emory Univ.).

b) Hodowla komórek

Hodowla komórek. Komórki NIH 3T3 rutynowo utrzymywano w DMEM zawierającym 10% płodową surowicę cielęcą, 1X penicylinę-streptamycynę, 2 mM gluatminę i pirogronian sodu (0,11 mg/ml). Komórki CHO, w których zachodziła ekspresja domeny zewnątrzkomórkowej (p 1-5) lub receptora beta PDGF o pełnej długości (HR5) hodowano w RPMI zawierającym 10% FCS, 1X penicylinę-streptamycynę, 2mM glutaminę, pirogronian sodowy (0,11 mg/ml) i G418 (200 gg/ml). Ludzkie fibroblasty napletka (AGO1523B) hodowano w dMeM zawierającym 10% FCS, 1X penicylinę-streptamycynę, 2mM glutaminę i pirogronian sodowy (0,11 mg/ml). Monoklonalne komórki hybrydom utrzymywano w DME:RPMI (50:50) zawierających 20% FCS, 1X streptamycynę-penicylinę, 2 mM glutaminę, pirogronian sodowy (0,1 mg/ml, 1X HT i 10% podłoże kondycjonowane makrofagami.

Konstruowanie linii komórek, w których zachodzi ekspresja skróconego ludzkiego receptora PDGF beta. Skrócenie cDNA ludzkiego receptora PDGF beta przeprowadzono przez delecyjną mutagenezę ukierunkowaną. Ukierunkowaną mutagenezę in vitro przeprowadzono zgodnie ze zmodyfikowaną metodą Kunkela in. (1987) Meth. Enzymol. 154: 367-382. Początkowo fragment EcoRI - HindIII cDNA o długości 3,9 kb całego regionu kodującego ludzki receptor PDGF beta (reszty -32 do 499) zsubklonowano w miejscach EcoRI i HindIII ml3mpl 8, tworząc wektor mp18PR (Maniatis, T. i in. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

Zaprojektowano oligonukleotydy do wydeletowania części cDNA ludzkiego receptora PDGF beta, które kodują aminokwasy 499-1074 (PRA1; GTG TGA GGA ACG GGA AAT TCA TCG AAG GAC ATC CCC CGAG) lub aminokwasy 384-1074 (PRA2; GGA AGG TCG ATG TCT AGT TAA TCG AAG GAC ATC CCC CGAC) (fig. 1). Po reszcie 499 (PR Δ1) lub reszcie 384 (PRΔ2) wprowadzono kodon stop. Weryfikację subklonowania przeprowadzono przez analizę poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi i sekwencjonowanie metodą terminacji łańcucha dideoksynukleotydami (Sanger, F. i in. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467). ,

Zmodyfikowane polipeptydy receptora PDGF beta zsubklonowano w miejscach EcoRI i HindITI wektora ekspresyjnego PBJ1 (Lin, A. i in. (1990) Science 249: 677-679) i skotransfekowano z wektorem pSV2Neo (Southern, PJ. i Berg, P. (1982) J. Mol. Appel. Gen. 1: 327-341) w stosunku 1:10 komórki CHO-K1 metodą pobierania odczynnika lipofektynowego (Feigner, P.L. i in. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417. Stransfekowane komórki selekcjonowano pod kątem oporności na G418-neomycynę, wyizolowano pojedyncze klony i przeszukano przy równej gęstości komórek pod kątem wysokiego poziomu ekspresji

171 920 zewnątrzkomórkowego receptora PDGF beta w podłożu wolnym od surowicy. Ekspresję zmodyfikowanego białka zewnątrzkomórkowego receptora PDGF beta określono przez analizę biotów typu Western z zastosowaniem poliklonalnej surowicy królika (przeciwciało 1 -3-5, patrz fig. 1) skierowanej przeciw syntetycznemu peptydowi opartemu na resztach 51-68 ludzkiego receptora PDGF beta (SVLTLtNlTGLdTgEYFC, sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3). Zrekombinowane klony pΔ 1-5 (w których zachodziła ekspresja receptora PDGF o pełnej długości) i pA2-7 (w których zachodziła ekspresja domeny 1-4 zewnątrzkomórkowego receptora PDGF) zastosowano do późniejszego wytwarzania białka.

c) Przygotowanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw ludzkiemu receptorowi PDGF beta.

Przeciwciała przygotowano jak opisali Harlow i Lane (1988, w: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Myszy zaimmunizowano częściowo oczyszczoną zewnątrzkomórkową domeną receptora PDGF beta φΔ 1-5), stosując 50 -100 μg/lmmunlzację). Miano przeciwciał immunizowanych myszy określono stosując test ELISA w następujący sposób. 96-studzienkowe płytki do mikromiareczkowania Immunolon II opłaszczano przez noc w temperaturze 4°C częściowo oczyszczoną (10-15%) zewnątrzkomórkową domeną receptora PDGF beta(200-300 ng/studzienkę). Pozostałych manipulacji dokonano w temperaturze pokojowej. Studzienki blokowano w ciągu 1 godziny 0,05 M Tris, pH 7, zawierającym 100 mM NaCl i 0,5% żelatynę. Płytki inkubowano w ciągu 2 godzin z różnymi rozcieńczeniami surowicy mysiej, przemyto pięć razy buforem do przemywania (0,05 M Tris, pH 7, 100 mM NaCl i 0,3% żelatyna) i w ciągu 1 godziny inkubowano z kozim przeciwciałem skierowanym przeciw immunoglobulinom myszy skoniugowanym z peroksydazą (1:1000 w buforze do przemywania). Płytki przemyto jak opisano uprzednio i wywołano kwasem 2,2’-azyno-bis(3-etylobenzotiazolino)-6-sulfonowym (ABTS, 1 mg/ml) w 0,1 M kwasie cytrynowym, 0,1 M dwuzasadowym fosforanie sodowym, pH 4, zawierającym nadtlenek wodoru (stężenie końcowe 0,003%). Oznaczano absorbancję przy długości fali 650 nmk i wartości porównano z wartościami otrzymanymi dla oczyszczonego w podobnym stopniu białka z kondycjonowanych podłóż z komórek CHO stransfekowanych samym wektorem pBJ.

Myszy wykazujące wysoką reaktywność zabito i wyizolowano śledziony. Pobrano limfocyty śledziony i poddano fuzji z komórkami szpiczaka P3X jak opisano (Harlow i Lane, op. cit). Hybrydomy przeszukano stosując taki sam test ELISA i ponownie sklonowano i przeszukano dodatnie hybrydomy. Hodowano dodatnie komórki monoklonalne i u myszy Balb/c doprowadzono do puchliny brzusznej jak opisano (Harlow i Lane, op. cit.). Podłoża hodowli komórkowych zastosowano do określenia podtypu przeciwciał monoklonalnych stosując zestaw do określania podtypu HyClone, zgodnie z instrukcjami producenta.

d) Oczyszczanie przeciwciał

Przeciwciała oczyszczano na białku A-Sepharose CL4B. Płyn puchlinowy rozcieńczano 1:5 w buforze do wiązania Immunopure™ (Pierce) i poddawano chromatografii na kolumnie białka A-Sepharose CL4B zrównoważonej tym samym buforem. Zbierano frakcję niezwiązaną, a kolumnę przemywano buforem do wiązania Immunopore (10 objętości kolumny). Związane IgG eluowano 0,1 M glicyną, pH 2,8, i zbierano w probówkach zawierających jako czynnik zobojętniający 2M Tris.pH 11 (40 μΐ/ml). Frakcje pików białek wykrywano mierząc absorbancję przy długości fali 280 nm, łączono i dializowano w PBS (2 zmiany po cztery litry każda).

Przygotowywanie fragmentów proteolitycznych F(ab’)₂ i Fab przeciwciała monoklonalnego 2A1E2. Fragmenty F(ab’ )₂ przeciwciała monoklonalnego 2A1 e2 przygotowano z nietkniętego przeciwciała monoklonalnego stosując zestaw do przygotowywania F(ab’)₂ Immunopure (Pierce) zgodnie z instrukcjami producenta. Przeciwciało monoklonalne 2A1E2 inkubowano w ciągu 4 godzin z immobilizowaną pepsyną w temperaturze 37°C w pH 4,2 i niestrawioną IgG fragmenty Fc oddzielono od fragmentów F(ab ’)2 stosując białko A-Sepharose CL4B. Fragmenty Fab przygotowano podobnie stosując zestaw do przygotowywania Fab Immunopure (Pierce). IgG inkubowano w ciągu 5 godzin z immobilizowaną papainą w temperaturze 37°C w pH 7, a niestrawione IgG i fragmenty Fc usunięto stosując białko A. Po trawieniu enzymatycznym próbki analizowano przez SDSPAGE, a do określenia utraty, jeśli wystąpiła, zdolności rozpoznawania antygenu zastosowano test ELISA receptora PDGF beta.

171 920

e) Oznaczenie immunoprecypitacji.

Immunoprecypitację przeprowadzono przez zmodyfikowaną procedurę Kesslera, S.W. (1981, Meth. Enzymol. 73: 442-471. Gdy stosowano oczyszczone p 1-5 lub p 2-7 białko, inkubowano z przeciwciałem monoklonalnym w ciągu albo dwóch godzin w temperaturze pokojowej, albo 12 godzin w temperaturze 4°C w buforze do immunoprecypitacji (IP) (40 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA i 1% Triton Χ-100). Jeśli immunoprecypitowano receptor o pełnej długości, to komórki, w których zachodziła ekspresja receptora PDGF beta solubilizowano w buforze IP zawierającym 1 pM ortowanadan sodowy i 1 mM PMSF i inkubowano w ciągu 8-12 godzin w temperaturze 4°C. Następnie próbki inkubowano z 50% zawiesiną mieszaniny białka A-Sepharose CL4B i białka G-Sepharose CL4B (50-100 pl/próbkę). Po 1-2 godzinach w temperaturze 4°C żywicę przemyto przez trzy cykle wirowania i ponownego zawieszania w buforze IP, a na koniec żywicę gotowano w solubilizującym buforze do próbek Laemmli’ego (50-100 pl/próbkę) (1970, Nature 227: 680-685). Próbki poddano SDS-PAGE w 10% żelu LaemmlFego, a następnie przeniesiono na nitrocelulozę. Bioty typu Western blokowano w buforze do blokowania (0,05 M Tris, pH 8, zawierający 0,5% NaCl i 4% BSA) i inkuuowaao z pierwszym przzeiwcialem w ciągu 12godzm w temperaturzz 4°C. Nitrocelulozę przemyto buforem do blokowania i inkubowano z ^l25J-białkiem A (0,4 mCi/ml) w ciągu 1-2 godzin w temperaturze pokojowej i poddano ekspozycji błonę rentgenowską.

Jodowanie radioaktywnym jodem PDGf BB. PDGF dD jodowano zgodnie ze zmodyfikowaną procedurą Boltona-Huntera, opisaną przez Duana i in. (1991, J. Biol. Chem. 266: 413-418. W skrócie, ’²⁵J-dijodo-odczynnik Boltona-Huntera (1 mCi) suszono w atmosferze azotu. Następnie do 1²5J-dijodo-odczynnika Boltona-Huntera w 10 pl 0,1 M boranie sodowym (pH 8,5) dodawano w ciągu 15 minut, w temperaturze 4°C, PDGF BB (2,5 pg). Reakcje zatrzymywano w ciągu 10 minut w temperaturze 4°C 500 pl 0,1 M boranu sodowego, 0,2 M glicyny, pH 8,5. Materiał ten poddawano sączeniu molekularnemu na kolumnie PD 10 uprzednio zrównoważonej 0,3 M kwasem octowym zawierającym 1 mg/ml BSA. Pik białka znakowanego izotopem promieniotwórczym wykrywano stosując licznik promieniowania gamma. Zazwyczaj, aktywność właściwa jodowanego PDGF BB wynosiła 50000 zliczeń/ng.

Wiązanie ^J-PDGF BB z nietkniętymi komórkami HR5. Komórki HR5 zebrano w PBS zawierającej 2 mM EDTAQ w ciągu 20 minut w temperaturze 37°C. Przemyte komórki HR5 (1 x 10⁶ UomóaeluΩ00 pl) inkubowano w trzech powtórzeniach w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej w zawiesinie z różnymi stężeniami przeciwciała monoklonalnego (bądź fragmentów F(ab ’)₂ lub Fab) w PBS zawierającej 0,5% BSA. Komórki HR5 inkubowano w ciągu 45 minut w temperaturze pokojowej z ²J-PDGF BB (około 1 ng/probówkę) w nieobecności (wiązanie całkowite) lub obecności (wiązanie niespecyficzne) 100-Uroenrgo nadmiaru nieznakowanego PDGF BB i białka nośnikowego (osocze ubogie w płytki krwi, 50 pl). Objętość końcowa mieszaniny inkubacyjnej wynosiła 500 pl. Mieszaninę inkubacyjną (400 pl) nawarstwiono na Flcoll-eague (700 pl) i wirowano. Supernatant usuwano, i określano radioaktywność komórek.

f) Oznaczenie josjoryla(:ji.

Komórki HR5 hodowano do uzyskania spójnej warstwy w 6-studzienkowych płytkach i pierwsze pokolenie komórek hodowano w płytkach o średnicy 100 mm. Komórki dwukrotnie przemywano zimnym DMEM wolnym od surowicy i inkubowano na lodzie w ciągu 10 minut. Komórki eaeinUubowano w ciągu 30-45 minut na lodzie na wytrząsarce obrotowej w dwóch powtórzeniach z przeciwciałem monoklonalnym 2A1E2, a następnie do studzienek dodawano ligand PDGF bB i inkubację kontynuowano w ciągu 1,5-2 godzin. Komórki dwukrotnie przemywano zimną PBS i solubilizowano albo w buforze do lizy (100 mH Tris, pH 8, 30 mM pirofosfc^ran sodowy, 50 mM fluorek sodowy, 5 mH EDTA, 1% SDS, 100 mM DTT) lub w buforze IP, z których oba zawierały 1 mM PMSF i 1 pM ortowanadan sodowy. Próbki następnie poddawano dalszej obróbce przed elektroforezą.

Mitogeneza w ludzkich fibroblastach napletka AG01523B i komórkach mięśni gładkich pawiana. Ludzkie fibroblasty napletka AG01523B i komórki mięśni gładkich pawiana hodowano do uzyskania spójnej warstwy w 96-studzlrnkowych płytkach. Komórki mięśni gładkich pawiana unieruchomiono przez inkubowanie przez noc z DMEM zawierającym 0,5% surowicę cielęcą. Następnie komórki inkubowano w trzech powtórzeniach z różnymi stężeniami przeciw20

171 920 ciała monoklonalnego 2A1B2 w obecności PDGF BB w ciągu 18 godzin w temperaturze 37°C, a następnie w ciągu 5 godzin w temperaturze 37°C z 2 gCi/studzienkę ³H-tymidyny. Równolegle kontrolne pierwsze pokolenie komórek mięśni gładkich pawiana inkubowano z niespecyficznym przeciwciałem monoklonalnym, a kontrolne komórki AG01523B inkubowano z niehamującym przeciwciałem monoklonalnym anty-receptor PDGF beta (4C5C8). Następnie studzienki przepłukiwano schłodzonym lodem 5% TCA (2x250 gl) i solubilizowano 0,25 N NaOH (2x100 gl). Zsolubilizowane próbki przenoszono do naczynek scentylacyjnych i określano radioaktywność.

g) Oznaczenie dimeryzacji.

Spójną warstwę komórek HR5 hodowano jak opisano powyżej w płytkach o średnicy 100 mm. Komórki dwukrotnie przemywano w zimnej PBS i inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze 4°C z różnymi stężeniami przeciwciała monoklonalnego 2A1E2 w PBS zawierającej BSA (1,5 mg/ml) i 25 mM Hepes. Do komórek dodawano PDGF BB i inkubację kontynuowano w ciągu 2 godzin w temperaturze 4°C. Komórki dwukrotnie przemywano zimną PBS i inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C z czynnikiem sieciującym BS³ (0,75 mg/płytkę) w PBS zawierającej 25 mM Hepes. Reakcję zatrzymywano przez rozcieńczenie buforem do zatrzymywania (0,025 M Tris, pH 7,4, zawierający 150 mM NaCl; 10 mL/płytkę). Komórki ekstrahowano w ciągu 20 minut w temperaturze 4°C w buforze IP zawierającym 1 mM PMSF i 100 gM ortowanadan sodowy (0,5 ml/płytkę). Lizaty komórkowe poddawano immunoprecypitacji przez noc w temperaturze 4°C stosując poliklonalne przeciwciało antyludzki receptor beta (AB88; rozcieńczenie 1:500). Następnie do każdej próbki dodawano białko ACL4B (60 gl 50% zawiesiny). Po jednej godzinie w temperaturze 4°C cząstki żelu przemywano kolejno PBS zawierającą 0,5% NP4O, 0,5 M chlorek litu, a ostatecznie wodą. Próbki solubilizowano solubilizującym buforem Laemmli’ego do próbek i poddawano elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z SDS w gradiencie żelu 3%-8%, a następnie przeniesieniu typu Western na nitrocelulozę. Bioty Western inkubowano przez noc w temperaturze 4°C albo z przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciw fosfotyrozynie (1:1000), albo z AB88 (rozcieńczenie 1:500), następnie z 1²⁵J-białkiem A 0,15 gCi/ml) w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie na bioty typu Western eksponowano błonę rentgenowską.

h) Właściwości przeciwciała monoklonalnego 2A1E2.

Przeciwciało monoklonalne 2A1E2 jest przeciwciałem monoklonalnym IgG1. Analiza typu Western wykazuje, że przeciwciało monoklonalne 2A1E2 rozpoznaje niezredukowany ludzki receptor PDGF beta (fig. 2. część A, ścieżka 4), ale nie rozpoznaje białka zredukowanego (fig. 2, część A, ścieżka 1). Przeciwciało monoklonalne 2A1E2 immunoprecypituje z roztworu zewnątrzkomórkowy receptor o pełnej długości (pA 1-5; reszty 1 -499) (fig. 2, część C, ścieżka 3). Jednakże, gdy antygenem jest oczyszczony p Δ2-7 (bez domeny 5; reszty 1 -384), reaktywność nie występuje (fig. 2, część B, ścieżka 2).

Zależne od dawki hamowanie wiązania ^J-PDGF BB z komórkami HR5 przez przeciwciało monoklonalne 2A1E2. Gdy komórki HR5 (komórki CHO-K, w których zachodzi ekspresja ludzkiego receptora PDGF beta o pełnej długości) inkubuje się najpierw z przeciwciałem monoklonalnym 2A1E2, a następnie z ^J-PDGF BB, znaczące hamowanie (48,1%), porównaniu z komórkami nietraktowanymi przeciwciałem monoklonalnym 2A1E2, obserwuje się przy stężeniu przeciwciała monoklonalnego tak niskim, jak 0,1 nM. Gdy stosuje się 1 nM lub wyższe stężenia przeciwciała monoklonalnego 2A1E2, występuje 100% inhibicja wiązania ligandu z receptorem PDGF o pełnej długości na komórkach (fig. 3, część A). Gdy podczas preinkubacji stosuje się 200 nM inne, niehamujące receptora PDGF beta, przeciwciało' monoklonalne (4C5C8), inhibicja wynosi tylko 36,1 %. Jest to porównywalne z wpływem 200 nM przeciwciała monoklonalnego o innej specyficzności (anty-IIb/IIIa) (19,18% hamowania). Wiązania PDGF BB w obecności 1 nM przeciwciała monoklonalnego 2A1E2 jest równoważne wiązaniu ligandu widocznego w obecności 1500-krotnego nieznakowanego PDGF BB (fig. 3, część A) lub wiązaniu ligandu z nietransfekowanymi komórkami CHO, w których nie zachodzi ekspresja ludzkiego receptora PDGF (dane nieprzedstawione).

W celu określenia, czy hamowanie widoczne dla przeciwciała monoklonalnego było spowodowane blokowaniem przestrzennym, przygotowaliśmy jego fragmenty F(ab ’)₂ i Fab. Te proteolityczne fragmenty przeciwciała nadal rozpoznają receptor PDGF beta w ELISA (dane

171 920 nieprzedstawione), chociaż ich aktywność była nieznacznie obniżona. Gdy stosowano je w oznaczeniu wiązania ligandu znakowanego izotopem promieniotwórczym, stwierdziliśmy, że fragmenty przeciwciała wciąż hamowały wiązanie 1²⁵J-PDGF BB z receptorem PDGF beta o pełnej długości na komórkach HR5 w sposób zależny od stężenia (fig. 3, część B). Jednakże pełna inhibicja była widoczna dla 10 nM fragmentów F(ab ’)2 lub Fab przeciwciała monoklonalnego, podczas gdy 1 nM nietknięte przeciwciało monoklonalne całkowicie hamowało wiązanie. Wiązanie ligandu w obecności 1 nM fragmentu F(ab ’)2 było hamowane o 64,5%, a wiązanie w obecności 1 nM fragmentu Fab było hamowane o 50%.

Hamowanie fosforylacji przez przeciwciało monoklonalne 2A1E2. Jak przedstawiono na fig. 4, przeciwciało monoklonalne 2A1E2 w komórkach HR5 specyficznie hamowało, w sposób zależny od stężenia, fosforylację indukowaną PDGF, z około 50% hamowaniem występującym przy stężeniu 1,3 nM (ścieżka 4) i 100% hamowaniem przy 13,3 nM przeciwciele monoklonalnym 2A1E2 (ścieżka 5). Kontrolne przeciwciało monoklonalne o innej specyficzności (antyIIb/IIIa) nie miało żadnego wpływu (ścieżka 3) i przeciwciało monoklonalne 4C5C8, które również wywołano wobec ludzkiemu receptorowi PDGF beta, ale które rozpoznaje inny epitop, nie miało żadnego wpływu na indukowaną ligandem fosforylację (ścieżka 8).

Wpływ przeciwciała monoklonalnego 2A1E2 na indukowaną PDGF BB dimeryzację ludzkiego receptora PDGF beta. Wynikiem traktowania komórek HR5 PDGF BB jest zależna od ligandu fosforylacja (fig. 5, białko o masie cząsteczkowej 180 kDa na ścieżkach 1-6) i dimeryzacja (fig. 5, białko o masie cząsteczkowej 390 kDa na ścieżkach 2 i 6) receptora PDGF beta. Gdy komórki HR5 najpierw preinkubowano z przeciwciałem monoklonalnym 2A1E2, a następnie z PDGF BB, dimeryzacja była zahamowana przy wszystkich testowanych stężeniach (fig. 5, ścieżki 3, 4 i 5). Dane te wskazują, że wiązanie przeciwciała monoklonalnego 2A1E2 z receptorem wyklucza wiązanie ligandu i dimeryzację receptora.

Hamowanie mitogenezy przez przeciwciało monoklonalne 2A1E2. Jak przedstawiono na fig. 6, przeciwciało monoklonalne 2A1E2 hamuje w sposób zależny od stężenia indukowaną PDGF BB mitogenezę w ludzkich fibroblastach napletka AG01523B, z maksimum inhibicji (69,55%) występującym przy stężeniu 1,3 μM. Gdy zastosowano nie hamujące przeciwciało monoklonalne, 4C5C8, nie wykryliśmy znaczącego hamowania mitogenezy. Podwyższanie stężenia monoklonalnego 2A1E2 nie poprawiało stopnia hamowania, przede wszystkim ponieważ w komórkach tych również zachodzi ekspresja receptora PDGF alfa (dane nieprzedstawione), który nie jest wiązany lub hamowany przez 2A1E2.

Określiliśmy także wpływ różnych stężeń przeciwciała monoklonalnego 2A1E2 na pierwsze pokolenie komórek mięśni gładkich z tętnicy pawiana. 200 nM i 20 nM przeciwciało monoklonalne hamowało zależną od PDGF BB fosforylację receptora PDGF w komórkach mięśni gładkich tętnicy pawiana (fig. 7, ścieżki odpowiednio 4 i 5).

Jak pokazano na fig. 8, 1 nM przeciwciało monoklonalne 2A1E2 hamuje inkorporację ³H-tymidyny w obecności 1 -2 ng/ml PDGF BB o 90%, a 25 nM przeciwciało hamuje mitogenezę o 80% przy stężeniu ligandu w zakresie 1-10 ng/ml. Wyższe niż 250 nM stężenia przeciwciała monoklonalnego 2A1E2 hamują mitogenezę o 90% przy wszystkich testowanych stężeniach ligandu. Gdy stosuje się przeciwciała monoklonalne o innych specyficznościach, nie występuje znaczący wpływ na mitogenezę w komórkach mięśni gładkich pawiana.

Podsumowując, ujawniono przeciwciało monoklonalne, 2A1E2, które jest wysoce specyficzne wobec ludzkiego receptora PDGF beta. Przeciwciało monoklonalne 2A1E2 nanomolowych stężeniach hamuje wiązanie PDGF z ludzkim receptorem PDGF typu beta, a zatem hamuje aktywację receptora, jak wykazano przez hamowanie fosforylacji i dimeryzacji, w których zaangażowany jest ligand. Przeciwciało hamuje mitogenezę in vitro w stężeniach mikromolowych. Proteolityczne fragmenty przeciwciała monoklonalnego zachowują funkcję hamującą, jak wykazano przez pomiar hamowania wiązania ^l25J-PDGF BB (fig. 3A). Występuje specyficzne i znaczące hamowanie indukowanej autofosforylacji receptora PDGF beta (fig. 4) przy stężeniach tak niskich, jak 1,3 nM przeciwciało monoklonalne 2A1E2. W konsekwencji, stwierdziliśmy całkowite hamowanie indukowanej PDGF mitogenezy w komórkach HR5 (dane nieprzedstawione) przy 0,1 μM przeciwciele monoklonalnym 2A1E2, a w ludzkich fibroblastach

171 920 napletka (AGO1523B) 70% hamowania uzyskuje się przy 1 pM stężeniu przeciwciała monoklonalnego 2A1E2.

Przeciwciało monoklonalne 2A1E2 testowano także pod względem reaktywności krzyżowej z komórkami mięśni gładkich z tętnicą ramieniową. 20-25 nM przeciwciało monoklonalne 2A1E2 hamowało aż do 80% indukowaną PDGF BB fosforylację (fig. 7) i mitogenezę (fig. 8). Przeciwciało monoklonalne 2A1E2 nie reaguje krzyżowo z receptorami PDGF psa, szczura, myszy lub świni i nie reaguje również krzyżowo z ludzkim receptorem typu alfa (dane nieprzedstawione).

171 920

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁADZAJĄCY: Ramakrishnan, Vanitha

Escobedo, Maria A.

Fretto, Larry J.

(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: HAMUJĄCE POLIPEPTYDY IMNUNOGLOBULINOWE SKIEROWANE PRZECIW LUDZKIEMU RECEPTOROWI PDGF BETA (iii) LICZBA SEKWENCJI: 3 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

A) ADRESAT: Townsend and Townsend

B) ULICA: One Market Plaza, Steuart Tower, Suitę 2000

C) MIEJSCOWOŚĆ: San Francisco

D) STAN: Kalifornia

E) KRAJ: Stany Zjednoczone Ameryki

F) KOD POCZTOWY: 94105 (v) FORMA ZAPISU KOMPUTEROWEGO (A.) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PS-DOS/MS/DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentin Release #1,0, wersja #1,25 (vi) DANIE DOTYCZĄCE AKTUALNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: PCT

171 920 (vii) (viii) (B) DATA ZŁOŻENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

DANE DOTYCZĄCE UPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 07/801 759 (B) DATA ZŁOŻENIA: 2 grudnia 1991 INFORMACJA O (A) NAZWISKO: Smith, William M.

(B) NUMER REJESTRACYJNY: 30 223 (C) NUMER., NA KTÓRY NALEŻY SIĘ POWOŁY WAĆ/NUMER w REJESTRZE: 12418-18

INFORMACJA TELEKOMUNIIKAYJJNA:

(A) TELEFON: 415-326-2400 (B) TELEFAX: 415-326-2422 (ix)

171 920

2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 1

(i)	OARAKCTERYSTYIA. SEKWENCJI: A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad B) TYP: kwas nukleinowy C) ILOŚĆ NICI: jedna D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii)	RODZAJJ CZĄSTECZKI: DNA (genomoyy)
(xi)	OPIS SERWENO: SEKWENCJA 0 NUMMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 1:
GTGTGAGGAA	CGGGAAATTC ATCGAAGGAC ATCCCCCGAC
40

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYMI: 2

(i)	CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad B) TYP: kwas nukleinowy C) ILOŚĆ NICI: jedna D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii)	RODZAJ CZĄSTECZKA DNA (genomowy)
(xi)	OPIS ΕΕΚλΈΝΟ : SEKWENCJA 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 2:

GGAAGGTCGA TGTCTAGTTA ATCGAAGGAC ATCCCC

171 920 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 3:

(i) ClARAKKTERYSTYiAY SEKWENJJI:

A)	DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów
B)	TYP: aminokwasowa
C)	ILOŚĆ NICI: jedna
D)	TOPOLOGIA: liniowa
RODZJJ	CZĄSTECZU i peptyd

(xi) OPIS S^IK^^1^(^«JI: SEIKiENCJA O INUTERZE

IDENTYFIKACYJNYM: 3:

Ser Val Leu Thr Leu Thr Asn Leu Thr Gly Leu Asp Thr Gly Glu 15 10 15

Tyr Phe Cys

171 920

fR 6?) 6?)

Ρδ2 (1-384) ,

171 920

2 3 4 5 6 7 8

FIG. 2C.

171 920

U

FIG. 3A

171 920

23456789

200 —

—180 kDa —

FG 4

2 3 4 5 6

*—180 kDa —390 kDa

97- ' I

FG. 5

171 920

STĘŻENIE PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNEGO (MM)

FIG. 6.

FIG. 8.

200 — —

—

180 kDa

45— «λ 9 w

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 6,00 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób wytwarzania nowego, hamującego PDGF-R polipeptydu immunoglobulinowego lub jego fragmentu wiążącego, który specyficznie wiąże się z domeną ludzkiego receptora PDGF typu beta ((PDGF-R), przy czym wiązanie polipeptydu immunoglobulinowego z (PDGF-R wywiera jeden z wpływów wybranych z następującej grupy: hamowanie wiązania PDGF BB lub AB z receptorem; hamowanie inkubowanej PDGF fosforylacji (PDGF-R; hamowanie inkubowanej PDGF dimeryzacji (PDGF-R; hamowanie inkubowanej PDGF mitogenezy komórek posiadających ludzki (PDGF-R; i hamowanie indukowanej PDGF chemotaksji i migracji komórek posiadających ludzki (PDGF-R, polegający na hodowaniu linii komórkowej zawierającej kwas nukleidowy kodujący polipeptyd immunoglobulinowy i zbieraniu otrzymanego polipeptydu immunoglobulinowego, znamienny tym, że jako linię komórkową stosuje się hybrydomę ATCC numer HB10938.

WWW