JP3455743B2 - ヒトｐｄｇｆベータ・レセプタに対する阻害性免疫グロブリン・ポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、一般に、ヒト型ベータ血小板由来成長因子
レセプタ提示細胞のPDGF−仲介増殖を阻害する免疫グロ
ブリン・ポリペプチドの製造及び使用に関する。

発明の背景 血小板由来成長因子（platelet derived growth fact
or（PDGF））は、間充織（mesenchymal）起源の細胞に
おける有効な増殖剤である（Antoniades,H.N.et al.（1
979）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:1809−1813;Bowen−P
ope,D.F.and Ross.R.（1982）J.Biol.Chem.257:5167−5
171;Heldin,C−H.et al.（1983）J.Biol.Chem.258:1005
4−10059（これを、引用により本明細書中に取り込
む。））。PDGF（分子量30kDa）は、Ａ又はＢという２
つの相同鎖から成るジスルフィド結合ダイマーである
（Johnsson,A.et al.（1982）Biochim.Biophys.Res.Com
mun.104:66−74（これを、引用により本明細書中に取り
込む。））。この鎖は、同一又は異なる型の鎖と組み合
わされ、相同形態（isoforms）AA、BB又はABをもたらす
（Heldin,C−H.et al.（1986）Nature 319:511−514
（これを、引用により本明細書に取り込む。））。この
有糸分裂促進物質（mitogen）PDGFは、最初に同定され
（Antoniades,H.N.et al.（1979）Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 76:1809−1813;Raines,E.W.and Ross,（1982）J.Bi
ol.Chem.257:5154−5160（これらの両方を、引用により
本明細書中に取り込む。）、そしてヒト血小板から精製
された（Raines,前掲書中）、但し、その後の研究は、
血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、マクロファージ及び繊
維芽細胞さえも含む幾つかの細胞がPDGFを合成すること
を、示した（Ross,R.et al.（1986）Cell 46:155−169
（これを、引用により本明細書中に取り込む。））。

PDGFの相同形態のすべてにより誘導される細胞増殖
は、PDGFレセプタへのリガンド結合により仲介される
（Heldin,C−H.（1983）前掲書中.,EK,B.et al.（198
2）Nature 295:419−420;Glenn,K.et al.（1982）J.Bio
l.Chem.257:5172−5176;Frackelton,A.R.et al.（198
4）J.Biol.Chem.259:7909−7915;Williams,L.T.et al.
（1984）J.Biol.Chem.259:5287−5294（これを、引用に
より本明細書中に取り込む。））。PDGFレセプタ（分子
量180kDa）は、チロシン・キナーゼ・ファミリーに属
し、そしてＡ型（又はα型）（Matsui,T.et al.（198
9）Science 243:800−804,及びClaesson−Welsh,L.（19
89）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:4917−4921（これらの
両方を、引用により本明細書中に取り込む。））及びＢ
型（又はベータ型）（Yarden,Y.et al.（1986）Nature
323:226−232,及びEscobedo,J.A.et al.（1988）Scienc
e 240:1532−1534（これを、引用により本明細書中に取
り込む。））という２つのレセプタ・サブタイプから成
る。

PDGFのレセプタへの高いアフィニティー結合が、レセ
プタ・ダイマー化（Bishayee,S.et al.（1989）J.Biol.
Chem.264:11699−11705,及びHeldin,C−H.et al.（198
9）J.Biol.Chem.264:8905−8912）及び自動リン酸化（F
rackelton,et al.前掲書中）の後に起こり、そしてDNA
合成における最高点に達する一連の複雑な細胞間シグナ
ル事件（signalling events）をもたらす。マウス及び
ヒトPDGFベータ・レセプタ並びにPDGFアルファ・レセプ
タ遺伝子が、クローン化されている（Matsui et al.前
掲書中,Claesson−Welsh et al.前掲書中,Yarden et a
l.前掲書中，及びEscobedo et al.前掲書中）。本明細
書中でPDGFレセプタについていうとき、Ａ型とアルファ
型とを、同様に、Ｂ型とベータ型とを、交換できるもの
として使用する。

２つのタイプの相同形態は、それらの顕著に異なるリ
ガンド結合の特性により、区別されることができる。PD
GFベータ・レセプタは、Ｂ−鎖（相同形態BB及びAB）の
みに結合し、一方、PDGFアルファ・レセプタは、PDGFの
すべての形態（Ａ及び／又はＢ鎖を含む形態（Matsui e
t al.前掲書中,Claesson−Welsh et al.前掲書中，及び
Seifert,R.A.et al.（1989）J.Biol.Chem.264:8771−87
78））に結合することができる。PDGFレセプタは、マク
ロファージ−コロニー刺激因子レセプタ（Coussens,L.e
t al.（1986）Nature 320:277−280）及びｃ−kitプロ
トオンコジーン（protooncogene）生成物（Yarden,et a
l.,前掲書中）に対する高い程度の構造相同性を示す。

PDGFレセプタは、それらのβ−シート豊富構造に基づ
く５つのIg−様ドメイン（ドメイン１−５）中にはっき
り分けられることができる細胞外ドメインを特徴とす
る。約100アミノ酸のこれらのIg反復は、（第４反復を
除き）それぞれ、規則的に間隔をあけて配置されたシス
テイン残基をもつ。このレセプタは、単一のトランスメ
ンブラン・ドメイン及び細胞質チロシン・キナーゼ・ド
メインをもつ（Williams,L.T.（1989）Science 243:156
4−1570（これを、引用により本明細書中に取り込
む。））。

PDGFは、正常な生理学的過程、例えば、組織修復及び
胚形成（embryogenesis）において重要な役割を演じて
いる（Ross,R.et al.前掲書中）。しかしながら、目
下、研究は、病因学的増殖失調における及び特定の肉腫
の発達におけるこの有効な有糸分裂促進物質（mitoge
n）に係わっている（Ross,R.et al.前掲書中）。PDGF A
鎖及びPDGFベータ・レセプタの発現は、その場のハイブ
リダイゼーションによるヒト・アテローム性動脈硬化症
プラークにおいて検出された（Wilcox,J.N.et al.（198
8）J.Clin.Invest.82:1134−1143）。最近、Ferns et a
l.（1991）Science 253:1129−1132）は、PDGFに対する
ポリクローナル抗体が無胸線の（athymic）ヌード・ラ
ットにおける脱内皮化頸動脈（deendothelialised caro
tid arteries）における脈管内膜の（intimal）病変の
形成を有意に減少させることを、報告した。PDGFは、間
充織起源の細胞における増殖疾患の病因論において掛か
り合っている（Nister,M.et al.（1984）Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 81:926−930,及びNister,M.et al.（1987）C
ancer Res.47:4953−4961（これらの両方を、引用によ
り本明細書中に取り込む。））。Golden et al.は、PDG
F A鎖メッセージが、血管移植のためのヒヒ・モデルに
おける脈管内膜の過形成（hyperplasia）の領域内にお
いて増加されたことを報告した（（1990）J.Vasc.Surg.
11:580−585）。また、PDGFは、平滑筋のために化学走
性（chemotactic）であり（Westermark,B.et al.（199
0）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:128−132）、及び血小
板PDGFは、ヒヒ化ラット頸動脈における平滑筋細胞の転
移及び増殖であって重症な狭窄症（stenosis）をもたら
すもの、のための原因となる剤となることができる。

他の増殖因子及びそれらのレセプタの研究は、レセプ
タに対する抗体の発明により、援助された。例えば、表
皮成長因子レセプタを認識する抗体は、レセプタ活性化
の機構の評価における強力な道具であることが証明され
ている（Spaargaren,M.et al.（1991）J.Biol.Chem.26
6:1733−1739,（これを、引用により本明細書中に取り
込む。））。インターロイキン−２（IL−２）のための
レセプタに対する抗体は、IL−２の内面化（internalis
ation）を阻害し、そしてこれ故、応答性細胞の増殖の
その後の導入を阻害する（Duprez,V.et al.（1991）J.B
iol.Chem.1497−1501（これを、引用により本明細書中
に取り込む。））。同様に、表皮成長因子（EGF）レセ
プタに対するモノクローナル抗体は、ヒト哺乳動物腺癌
（adenocarcinoma）細胞系MCF−７のエストロゲン−刺
激成長を阻害する（Eppstein,D.A.（1989）J.Cell.Phys
iol.141:420−430（これを、引用により本明細書中に取
り込む。））。このような抗体は、成長因子−仲介疾患
の治療において非常に治療的な価値を有することができ
る。

幾つかのグループは、PDGFレセプタに対する抗体を単
離したが、これらの抗体は、用途を限定されていた（例
えば、Kawahara,R.S.et al.（1987）Biochem.Biophys.R
es.Commun.147:839−845（これを、引用により本明細書
中に取り込む。）を参照のこと。）。追加のモノクロー
ナル抗体が、ブタの子宮（porcine uterus）からのPDGF
の細胞外PDGF−結合ドメインに対して作られたが（Ronn
estrand,L.and terracio,L.（1988）J.Biol.Chem.263:1
0429−10435（これを、引用により本明細書中に取り込
む。））、これらの抗体は、¹²⁵I−標識PDGFの、ヒト繊
維芽細胞への結合を阻害しなかった。また、PDGF活性を
阻害しないPDGFレセプタに対する多数の抗体が、Kanaka
raj,P.S.et al.（1991）Biochemistry 30:1761−1767;C
laesson−Welsh,L.et al.（1989）J.Biol.Chem.264:174
2−1747;Seifert,R.A.et al.（1989）J.Biol.Chem.264:
8771−8778;Kumjian,D.A.et al.（1989）Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 86:8232−8236;Bishayee,S.et al.（1988）M
ol.Cell.Biol.8:3696−3702;Hart,C.E.et al.（1987）
J.Biol.Chem.262:10780−10785;Escobedo,J.A.et al.
（1988）J.Biol.Chem.263:1482−2487;Daniel,T.O.et a
l.（1987）J.Biol.Chem.262:9778−9784;Keating,M.T.a
nd L.T.Williams（1987）J.Biol.Chem.262:7932−7937;
Kazlauskas,A.and J.A.Copper（1990）EMBO J.9:3279−
3286;（これらの全てを、引用により本明細書中に取り
込む。）により、報告されている。

このように、ヒト・レセプタの活性化を特異的に阻
害、及び／又はヒト・ベータ型PDGFレセプタを提示する
細胞の増殖を、可能にする免疫グロブリン及び他の剤の
必要性が在る。このような剤は、そのレセプタの異なる
機能的ドメインのマッピングにおいて、そして正常及び
疾患状態におけるPDGF及びそのレセプタの役割を吟味す
ることにおいて、有用であろう。さらに、このような剤
は、PDGF−仲介増殖性疾患、そしてまた、PDGF−仲介化
学走性及び転移の治療における治療的価値をもつであろ
う。このような疾患は： ａ）再狭窄（restenosis）であって、血管形成（angiop
lasty）、atherectomy、又はプラーク（plaque）除去の
他の侵入方法後の冠状動脈再狭窄（coronary restenosi
s）、並びに同一手順の後の腎臓（renal）又は末梢（pe
ripheral）の動脈再狭窄を含むもの； ｂ）血管増殖現象及び繊維症（fibrosis）であって急性
損傷の他の形態と関連のあるもの、例えば：成人呼吸困
難症候群関連肺繊維症、腎炎（nephritis）関連腎臓繊
維症、カワサキ病関連冠状狭窄、及び他の動脈炎（arte
ritis）、例えば、タカヤス病関連血管狭窄（vascular
narrowing）； ｃ）静脈移植における狭窄の防止； ｄ）移植臓器における加速された平滑筋細胞の転移及び
増殖を原因とする狭窄の防止； ｅ）他の繊維症の（fibrotic）過程、例えば、他の硬皮
症（acleroderma）、筋繊維症（myofibrosis）；及び、 ｆ）PDGFにより仲介される腫瘍細胞増殖の阻害、 を含む。

本発明は、これらの及び他の必要性を実現する。

発明の要約 本発明は、ヒト型ベータ血小板由来成長因子レセプタ
（βPDGF−Ｒ）に特異的に結合する免疫グロブリン・ポ
リペプチドであって、その免疫グロブリン・ポリペプチ
ドの、ヒトβPDGF−Ｒの第5Ig−様ドメインへの結合
が、以下の効果の１以上をもつものを提供する:i）レセ
プタへのPDGF BB結合の阻害;ii）PDGF−誘導βPDGF−Ｒ
リン酸化の阻害;iii）PDGF−誘導βPDGF−Ｒダイマー化
の阻害;iv）ヒトβPDGF−Ｒ提示細胞のPDGF−誘導有糸
分裂誘発の阻害；及びｖ）βPDGF−Ｒ提示細胞のPDGF−
誘導化学走性及び転移。本発明の好ましい態様は、モノ
クローナル抗体、例えば、モノクローナル抗体2A1E2で
あってIgG₁イソタイプを有するものである。

上記の性質をもつ免疫グロブリン・ポリペプチドの全
部又は部分をコードしているものに実質的に同じ配列を
もつ単離核酸も、本発明に包含される。これらの核酸に
よりトランスフェクト、形質転換、又は感染された細胞
系は、請求の核酸を含む細胞系を培養しそしてその免疫
グロブリン・ポリペプチド又は断片を収穫することによ
りその免疫グロブリン・ポリペプチド又はそれらの断片
を製造する方法と同様に、本発明の他の態様である。

本発明の免疫グロブリン・ポリペプチドは、診断及び
治療の用途をもつ。例えば、本発明のさらなる態様は、
平滑筋細胞の増殖に関連するPDGF−仲介疾患をもつヒト
を治療する方法であって、患者に、本発明の免疫グロブ
リン・ポリペプチドの治療的有効投与量を投与すること
を含んで成る方法を含む。

図面の簡単な説明 図1. 組換えヒト・ベータ・レセプタ細胞外ドメイン構
築物。完全長のPDGFベータ・レセプタの欠失突然変異誘
発を、方法中に記載するように行った。ＰΔ１は、第５
ドメイン細胞外PDGFベータ・レセプタ（アミノ酸１−49
9）であって、PDGFベータ型レセプタcDNAからアミノ酸
残基500−1074のコドンをオリゴヌクレオチドGTG TGA G
GA ACG GGA AAT TCA TCG AAG GAC ATC CCC CGAC（配列
番号１）を使用して欠失させることにより作られたもの
をいう。ＰΔ２は、第４ドメイン細胞PDGFレセプタ（aa
1−384）であって、上記cDNAからアミノ酸残基385−107
4のコドンをオリゴヌクレオチドGGA AGG TCG ATG TCT A
GT TAA TCG AAG GAC ATC CCC CGAC（配列番号２）を使
用して欠失させることにより作られたものをいう。仮定
のIgドメインを、以下のように示す:D1（aa 1−91）、D
2（aa 92−181）、D3（aa182−282）、D4（aa283−38
4）及びD5（aa385−499）。ポリクローナル抗血清１−
３−５のペプチド決定基は、先に示したD1である。

図2. A.分泌された第５ドメイン細胞外PDGFベータ・レ
セプタｐΔ１−５のウェスタン・ブロット。還元された
（レーン１−３）及び非還元（レーン４−６）のPDGFベ
ータ・レセプタの分泌細胞外ドメイン（ｐΔ１−５、５
μg/レーン）を、７％ Laemmliゲル上で電気泳動にか
け、その後、方法中に記載するようにウェスタン転移を
おこなった。ニトロセルロースを、２％ミルクを含むリ
ン酸塩−バッファー生理食塩水（PBS）中でブロック
し、ストリップに切断し、そしてMAb 2A1E2（レーン１
及び４）、他のPDGFベータ・レセプタ・モノクローナル
抗体（1C7D5）（レーン２及び５）、又は非特異的モノ
クローナル抗体（レーン３及び６）のいずれかの60μg/
mlと共に、４℃において一夜インキュベートした。この
ニトロセルロース・ストリップを、0.5％ミルク及び0.1
％ Tween 20を含むPBSにより洗浄し、室温において２時
間¹²⁵I−標識プロテインＡと共にインキュベートし、そ
してＸ−線フィルムに露出させた。矢印は、ｐΔ１−５
の位置を示している。

B. 分泌された第４ドメイン細胞外PDGFベータ・レセプ
タｐΔ２−７の免疫沈降。分泌された第４ドメイン細胞
外PDGFベータ・レセプタｐΔ２−７（2.6μｇ）を、MAb
2A1E2（レーン２、５μｇ）、1C7D5（レーン３、５μ
ｇ）又は非特異的MAb（レーン４、５μｇ）のいずれか
と共にI.P.バッファー中の最終容量500μｌ中で４℃に
おいて３時間インキュベートした。プロテインＡセファ
ロースCL4B:プロテインＧセファロースCL4B（1:1）を、
それぞれのチューブに添加し（60μｌの50％スラリ
ー）、そしてインキュベーションを、４℃において２時
間続けた。ビーズを、分離し、I.P.バッファー中で５回
洗浄し、そして10％ Laemmliゲル上で電気泳動にかけ
た。このゲルを、ニトロセルロースに移し、そして５％
ミルクを含むPBS中でブロックした。このブロットを、
0.5％ミルクを含むPBS中のウサギ・ポリクローナル抗−
PDGFベータ・レセプタAb（１−３−５）の1:100希釈物
と共にインキュベートした。一夜のインキュベーション
後、このブロットを、洗浄し、¹²⁵I−プロテインＡと共
にインキュベートし、洗浄し、そしてＸ−線フィルムに
露出させた。レーン１は、免疫沈降をもたないｐΔ２−
７の標準を示している。矢印は、ｐΔ２−７の位置を示
している。

C. MAb 2A1E2による分泌細胞外PDGFベータ・レセプタ
の免疫沈降。細胞外ヒトPDGFベータ・レセプタ（ｐΔ１
−５、５μｇ）を、非特異的MAb（レーン２）、MAb 2A1
E2（レーン３）、又は1C7D5（レーン４）のいずれかの
５μｇと共に、パネルＡについて記載したように、免疫
沈降させた。このサンプルを、加工し、そしてそのブロ
ットを、ウサギ・ポリクローナル抗−PDGFベータ・レセ
プタ１−３−５（1:100希釈物）及び¹²⁵I−プロテイン
Ａと共に、パネルＢについての凡例中に記載したよう
に、インキュベートした。

図3. HR5細胞への¹²⁵I−PDGF BB結合の阻害。Ａ）HR5
細胞を、方法中に記載したように、様々な濃度のMAb 2A
1E2又は対照MAbs（200nM抗−II b/III a又は200nM 4C5C
8）と共にインキュベートした。次に、この細胞を、¹²⁵
I−PDGF BBとインキュベートし、そして結合された放射
能を先に記載したように測定した。非特異的結合は、10
0倍過剰の非標識PDGF BBの存在中で結合した¹²⁵I−PDGF
BBの量といして決定する。Ｂ）HR5細胞を、様々な濃度
の完全長MAb 2A1E2、MAb 2A1E2−Ｆ（ab'）２、又はMAb
2A1E2−Fab、及び方法中に記載するような100nM完全長
抗−II b/III aと共にインキュベートした。MAbs及びそ
れらの誘導体の存在及び非存在中の細胞への¹²⁵I−PDGF
BBの全結合を測定した。100倍過剰の非標識PDGF BBの
存在中で結合した¹²⁵I−PDGF BBの量は、非特異的結合
を表している。

図4. MAb 2A1E2によるHR5細胞のリン酸化の阻害。６−
well皿中のHR5細胞の集密単層を、様々なMAbsと２で前
インキュベートし、その後、方法中に記載するようにリ
ガンドPDGF BBとインキュベートした。細胞を、可溶化
し、そして１つの６−well皿の当量を、７％ Laemmliゲ
ル上で電気泳動し、そしてニトロセルロースに移した。
ウェスタン・ブロットをブロックし、そして次に¹²⁵I−
プロテインＡと共にインキュベートし、そしてオートラ
ジオグラフを行った。レーン３−７は、0.13nM MAb 2A1
E2（レーン３）、1.3nM MAb 2A1E2（レーン４）、13.3n
M MAb 2A1E2（レーン５）、0.13μM Mab 2A1E2（レーン
６）又は0.53μM 2A1E2（レーン７）のいずれかと前イ
ンキュベートされ、その後100ng/ml PDGF BBとインキュ
ベートされたwellsを表している。レーン２は、その細
胞が0.53μＭの非特異的MAbと第一前インキュベートさ
れたときの100ng/ml PDGF BBの存在中のリン酸化の程度
を示しており、そしてレーン８は、その細胞が0.53μＭ
のPDGFベータ・レセプタMAb 4C5C8と前インキュベート
されたときのPDGF BB−誘導体リン酸化を示している。
矢印は、完全長のヒトPDGFベータ・レセプタの位置を示
している。

図5. MAb 2A1E2によるPDGFレセプタのPDGF BB−仲介ダ
イマー化の阻害。HR5細胞を、0.13nM MAb 2A1E2（レー
ン３）、0.13μM MAb 2A1E2（レーン４）、又は1.3μM
MAb 2A1E2（レーン５）のいずれかと、その後、100ng/m
l PDGF BBとインキュベートし、そして架橋を、方法中
に記載するように行った。レーン６は、ダイマー化に対
する0.1μＭの抗−II b/III a MAbの効果を表してい
る。レーン１は、添加された架橋剤の非存在中のダイマ
ーの相対量を示しており、そしてレーン２は、抗体の非
存在中のダイマー化PDGFレセプタの量を示している。

図6. MAb 2A1E2によるAG01523B細胞における有糸分裂
誘発の阻害。細胞を、集密まで増殖させ、そして方法中
に記載したように、様々な濃度の、MAb 2A1E2（白丸）
又は非阻害的対照PDGFベータ・レセプタMAb 4C5C8（黒
四角）のいずれかと共に、50ng/mlのPDGF BBの存在中で
インキュベートした。³H−チミジンの取り込みを、記載
するように測定した。

図7. ヒト平滑筋細胞におけるMAb 2A1E2によるリン酸
化の阻害。ヒト平滑筋細胞を、PDGF BB無し（レーン
１）、又は100ng/ml PDGF BBと共に、MAbの非存在中
（レーン２）、又は2nM MAb 2A1E2（レーン３）、200nM
MAb 2A1E2（レーン４）又は20nM MAb 2A1E2（レーン
５）の存在中、インキュベートした。リガンド誘導リン
酸化を、方法中に記載したようにウェスタン分析により
測定した。

図8. MAb 2A1E2によるヒヒ平滑筋細胞における有糸分
裂誘発の阻害。集密ヒヒ平滑筋細胞を、様々な濃度のPD
GF BBの存在で、1nM、5nM、25nM、250nM、又は１μM MA
b 2A1E2とインキュベートした。³H−チミジン取り込み
を、方法中に記載したように測定した。データは、MAb
の非存在中の飽和リガンド濃度（10ng/ml）における最
大³H−チミジン取り込み（約30−50000cpm）のパーセン
トとして、表されている。PDGF BBの非存在中の³H−チ
ミジン取り込みは、５−8000cpmである。このグラフ
は、４つの別々の実験の平均を表している。

好ましい態様の説明 本発明は、ヒト型ベータPDGFレセプタに特異的に結合
する免疫グロブリン・ポリペプチドを提供する。この抗
体は、その細胞表面上にヒト・ベータ型PDGFレセプタを
提示する細胞のPDGF−誘導有糸分裂誘発を阻害すること
ができる。本発明は、診断用途において、並びに、ヒト
・ベータ型PDGFレセプタを提示する細胞の、PDGF−仲介
増殖、転移及び化学走性に関連する疾患の治療のために
も、有用であろう。

定義 ａ）蛋白 用語“ペプチド”、“ポリペプチド”又は“蛋白”
は、本明細書中で互換可能に使用される。用語“実質的
同一性”は、ポリペプチドについていうとき、問題のポ
リペプチド又は蛋白が天然蛋白の全体又はそれらの部分
に少なくとも約30％同じであり、普通には少なくとも約
70％同じであり、そして好ましくは少なくとも約95％同
じであることを示している。

本明細書中で使用するとき、用語“単離された”、
“実質的に純粋な”及び“実質的に均一な”は、互換可
能に使用され、そして蛋白質に天然に同伴する成分から
分離された蛋白について記載している。典型的には、モ
ノマー蛋白が、サンプルの少なくとも約60〜75％が１本
鎖ポリペプチド骨格を示すとき、実質的に純粋である。
僅かな変異体又は化学修飾は、典型的には、同じポリペ
プチド配列を占めている。実質的に純粋な蛋白は、典型
的には、蛋白サンプルの約85〜90％超えるもの、より普
通には約95％を含んで成るであろうし、そして好ましく
は約99％を超えるものであろう。蛋白の純度又は同質性
（homogeneity）は、本分野においてよく知られた多数
の手段、例えば、蛋白サンプルのポリアクリルアミド・
ゲル電気泳動、その後の、染色の間のポリアクリルアミ
ド・ゲル上の単一ポリペプチド・バンドの可視化によ
り、示されることができる。特定の目的のためには、高
分解能が必要であろうし、そしてHPLC又は精製用途のた
めの類似の手段が必要であろう。

ポリペプチドは、それがその天然の状態においてそれ
を同伴する生来の汚染物から分離されるとき、天然関連
成分を実質的に含まない。したがって、化学的に合成さ
れる又はそれが天然に生じる細胞と異なる細胞系内で合
成されるポリペプチドは、その天然関連成分を実質的に
含まないであろう。

蛋白は、硫酸アンモニウムのような物質による選択的
沈降、カラム・クロマトグラフィー、免疫精製法、及び
その他を含む本分野においてよく知られた標準的な技術
により、実質的な同質性まで精製されることができる。
例えば、R.Scopes,Protein Purification:Principles a
nd Practice,Springer−Verlag:New York（1982）（こ
れを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこ
と。

ｂ）核酸 本明細書中で使用するとき、核酸は、DNA又はRNAであ
ることができる。核酸についていいうとき、用語“実質
的同一性”は、２つの核酸配列、又はそれらの設計され
た部分が、場合により並べられそして比較されたとき、
適当なヌクレオチドの挿入又は欠失を伴って、そのヌク
レオチドの少なくとも約80％において、そのヌクレオチ
ドの、普通には少なくとも約90％〜95％、そしてより好
ましくは少なくとも約98〜99.5％において、同一である
ことを、示している。

あるいは、実質的な核酸配列の同一性は、核酸セグメ
ントが選択的ハイブリダイゼーション条件下、他の核酸
ストランドとハイブリダイズするであろうときに、存在
する。

“実質的に相補的な”は、同様に、ある核酸が他の核
酸と同一であり、又はそれに選択的にハイブリダイズす
るということを、意味している。典型的には、選択的ハ
イブリダイゼーションは、少なくとも14−25ヌクレオチ
ドのストレッチにわたり少なくとも約55％の同一性が、
好ましくは少なくとも約65％の同一性が、より好ましく
は少なくとも約75％の、そして最も好ましくは少なくと
も約90％の同一性が、在るときに、起こる。M.Kanehisa
Nucleic Acids Res.12:203（1984）（これを、引用に
より本明細書中に取り込む。）を参照のこと。

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、
典型的には、約1M未満の、より普通には約500mM未満
の、そして好ましくは約200mM未満の塩濃度を含むであ
ろう。温度条件は、典型的には、22℃よりも高く、より
典型的には約30℃よりも高く、そして好ましくは約37℃
を超えるであろう。その相補的ストランドの塩基組成及
びサイズ、有機溶媒の存在及び塩基非適合の程度を含む
他の要素が、劇的にハイブリダイゼーションのストリン
ジェンシーに影響を与えることができるので、パラメー
ターの組み合わせが、いずれか１つの単独の絶対的な測
定よりも、より重要である。

“単離された”又は“実質的に純粋な”は、核酸につ
いていうとき、アルカリ/SDS処理、CsCl結合、カラム・
クロマトグラフィー。そして本分野においてよく知られ
ているその他を含む標準的な技術により、他の細胞成分
又は他の汚染物、例えば、他の細胞核酸又は蛋白から精
製されているものをいう。F.Ausubel,et al.,ed.Curren
t Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing
and Wiley−Interscience,New York（1987）（これ
を、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこ
と。

核酸は、それが他の核酸配列との機能的関係に中に置
かれてるとき、“作用可能な状態で結合されて（operab
ly linked）”いる。例えば、プロモーター又はエンハ
ンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合に、コ
ーディング配列に作用可能な状態で結合されている。一
般的には、作用可能な結合は、結合されている核酸配列
が連続しており、２つの蛋白コーティング領域を連結さ
せる必要がある場合には、連続しており、そして読み取
り枠内にある。

核酸操作のための技術、例えば、ポリペプチドをエン
コードしている核酸配列の、発現ベクターへのサブクロ
ーニング、プローブの標識付け、DNAハイブリダイゼー
ション、等は、一般的に、例えば、Sambrook et al.（1
989）Molecular Cloning:A Laboretory Manual（2nd e
d.）,Vols.1−3,Cold Spring Harbor Laboratory,又はA
usbel et al.,ed.（1987）前掲書中，（これらの両方
を、引用により本明細書中に取り込む。）の中に記載さ
れている。

“発現ベクター”、“クローニング・ベクター”又は
“ベクター”は、しばしば、プラスミド又は他の核酸分
子であって選ばれた宿主内で複製することができるもの
である。発現ベクターは、自己複製可能であり、又はそ
れらは、本分野においてよく知られた方法により、宿主
細胞のゲノム内に挿入されることにより、複製すること
ができる。自己複製したベクターは、選ばれた宿主細胞
内において機能的な複製起点又は自律複製配列（autono
mous replicating sequence（ARS））をもつであろう。
しばしば、ベクターが、１以上の宿主細胞内において、
例えば、クローニング及び構築のための大腸菌（E.col
i）内において、並びに発現のための哺乳類細胞内にお
いて、使用可能であることが必要である。

哺乳類細胞系は、しばしば、真核生物から得られるポ
リペプチドの発現のための宿主細胞として使用される。
培養における哺乳類細胞の増殖（Propagation）は、そ
れ自体よく知られている。Tissue Culture,Academic Pr
ess,Kruse and Patterson,ed.（1973）（これを、引用
により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。また、
宿主細胞系は、数ある中で、バクテリア（例えば、大腸
菌（E.coli）又はバチルス・サブチリス（B.subtili
s）））、酵母、糸状菌、植物細胞、又は昆虫細胞、の
ような生物を含む。

“形質転換”は、よく知られた方法により、問題の核
酸を含むベクターを直接に宿主に導入することをいう。
宿主のタイプに依存する形質転換の方法は、エレクトロ
ポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン
酸カルシウム、DEAE−デキストラン、又は他の物質を使
用するトランスフェクション；マイクロプロジェクタイ
ル・ボンバードメント（microprojectile bombardmen
t）；リポフェクション；感染（ベクターが感染性剤の
場合）；及び他の方法を含む。一般的には、Sambrook e
t al.,（1989）前掲書中．及びAusbel et al.（ed.），
（1987）前掲書中．を参照のこと、また、先に記載した
核酸が導入されている細胞への言及は、そのような細胞
の子孫を含むことを意味している。

ｃ）抗体 本明細書中で使用するとき、“免疫グロブリン・ポリ
ペプチド”は、特異的な免疫反応活性をもつ分子をい
う。抗体は、典型的には、免疫グロブリン・ポリペプチ
ドのテトラマーである。本明細書中で使用するとき、用
語“抗体”は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコ
ードされている１以上のポリペプチドから成る蛋白をい
う。免疫グロブリン遺伝子は、カッパ又はラムダ型を有
することができる軽鎖をコードしているもの、及び重鎖
をコードしているものを含み、重鎖の型は、アルファ、
ガンマ、デルタ、エプシロン及びミューである。免疫グ
ロブリン重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端部分は、定常領
域であり、一方、そのアミノ末端部分は、無数の免疫グ
ロブリン可変領域遺伝子によりコードされている。免疫
グロブリンの可変領域は、抗原認識特異性を提供する部
分である。特に、その特異性は、その免疫グロブリン
の、相補性決定領域（complementerity determing regi
ons（CDRs））であって超可変領域としても知られてい
るものの内に在る。免疫グロブリンは、例えば、Fv、Fa
b、及びＦ（ab）_２、を含む様々な形態において、並び
に１本鎖において、存在することができる（例えば、Hu
ston,et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,85:5879−5883
（1988）及びBird,et al.,Science 242:423−426（198
8）（これを、引用により本明細書中に取り込
む。））。（一般的には、Hood,et al.,“Immunology",
Benjamin,N.Y.,2nd ed.（1984），（これを、引用によ
り本明細書中に取り込む。）を参照のこと。）。重鎖及
び軽鎖のための遺伝子が１本鎖コーティング配列内で組
み合わされているところの１本鎖抗体を、使用すること
もできる。

“モノクローナル抗体”は、当業者に馴染みのある様
々な技術により得られることができる。簡単に言えば、
所望の抗原により免疫化された動物からの脾臓細胞を、
一般的には骨髄腫細胞との融合により、不死化する（Ko
hner and Milstein,Eur.J.Immunol.6:511−519（197
6））。不死化の他の方法は、Epstein Barrウイルス、
オンコジーン、又はレトロウイルスによる形質転換、あ
るいは、本分野においてよく知られた他の方法を含む。
単一の不死化細胞から生じたコロニーは、所望の特異性
及び抗原についてのアフィニティーを有する抗体を作り
出すためにスクリーニングされ、そしてこのような細胞
により作られたモノクローナル抗体の収率は、脊椎動物
宿主の腹膜腔（pertoneal cavity）中への注射を含む様
々な技術により、増強されることができる。

また、モノ特異的免疫グロブリンが、原核生物又は真
核生物宿主細胞における組換え技術により、作られるこ
とができる。

“キメラ”抗体は、その軽鎖及び重鎖の遺伝子が異な
る種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから成る
ように遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子によりコ
ードされている。例えば、マウス・モノクローナル抗体
からの遺伝子の可変（Ｖ）セグメントを、ヒト定常
（Ｃ）セグメントに結合することができる。このような
キメラ抗体は、マウス定常領域並びにマウス可変領域を
もつ抗体よりもヒトに対してより少ない抗原性をもつよ
うである。

本明細書中で使用するとき、また、用語キメラ抗体
は、ヒト−様の枠組み（framework）をもち、そしてそ
の中で、存在するいずれかの定常領域がヒト免疫グロブ
リン定常領域に少なくとも約85−90％、そして好ましく
は約95％同じポリペプチド配列をもつような免疫グロブ
リン、所謂“ヒト化”免疫グロブリンをいう（例えば、
PCT国際公開WO 90/07861、（これを、引用により本明細
書中に取り込む。）を参照のこと。）。これ故に、この
ような“ヒト化”免疫グロブリンの全ての部分は、ひょ
っとしたら相補性決定領域（COR's）を除いて、１以上
の生来のヒト免疫グロブリン配列の対応部分に実質的に
同一である。

用語“フレームワーク領域”は、本明細書中で使用す
るとき、Kabat,et al.,（1987）:Sequences of Protein
s of Immunologic Interest,4th Ed.,US Dept.Health a
nd Human Services,（これを、引用により本明細書中に
取り込む。）により定められるような、免疫グロブリン
の軽鎖及び重鎖の可変領域の部分であって単一種内の異
なる免疫グロブリンの中の比較的保存されているような
（すなわち、CDR's以外の）ものをいう。本明細書中で
使用されるとき、“ヒト−様フレームワーク領域”は、
それぞれの現存鎖内に、ヒト免疫グロブリン内のものと
同じ、少なくとも約70％以上のアミノ酸残基、典型的に
は75〜85以上の残基を含んで成るフレームワーク領域で
ある。

ヒト定常領域DNA配列は、よく知られた手順に従っ
て、様々なヒト細胞から単離されることができるが、好
ましくは、不死化Ｂ−細胞から単離されることができ
る。本発明のキメラ免疫グロブリンを作るための可変領
域又はCDRsは、ヒト・ベータ型PDGFレセプタに結合する
ことができるモノクローナル抗体から、同様に得られる
であろうし、そしてマウス、ラット、ウサギ、又はよく
知られた方法により抗体を作ることができる他の脊椎動
物を含むいずれかの慣用の哺乳類源内で作られるであろ
う。

好適な、DNA配列のための源細胞及び免疫グロブリン
発現及び分泌のための宿主細胞は、多数の源、例えば、
American Type Culture Collection（“Catalogue of C
ell Lines and Hybridomas,"Fifth edtion（1985）Rock
ville,Maryland,U.S.A.,（これを、引用により本明細書
中に取り込む。）から得られることができる。

本明細書中に特に記載するキメラ及び“ヒト化”免疫
グロブリンに加えて、他の実質的に同一な修飾された免
疫グロブリンを、当業者によく知られた様々な組換えDN
A技術を使用して容易に設計及び製造することができ
る。一般的に、遺伝子の修飾は、様々なよく知られた技
術、例えば、部位特異的突然変異誘発により容易に行わ
れることができる（Gillman and Smith,Gene 8:81−97
（1979）及びRoberts et al.,Nature 328:731−734（19
87），（これらの両方を、引用により本明細書中に取り
込む。）を参照のこと。）。

あるいは、一次免疫グロブリン構造の一部のみを含ん
で成るポリペプチド断片を作ることができる。例えば、
抗原認識に加えて、又はそれ以外の、１以上の免疫グロ
ブリン活性（例えば、補体固定）を有する免疫グロブリ
ン・ポリペプチド断片を作ることが要求されることがで
きる。

また、免疫グロブリン遺伝子は、全体として又は部分
において、他の遺伝子からの機能的領域（例えば、酵
素）と、又は他の分子、例えば、新たな性質をもつ融合
蛋白（例えば、“免疫毒（immunotoxins）”）を作るた
めの毒素又は標識と、組み合わされることができる。遺
伝子融合のこれらの場合においては、２つの成分が、同
一ポリペプチド鎖内に存在する。あるいは、免疫グロブ
リン又はそれらの断片が、様々なよく知られた化学的手
順のいずれかにより、毒素又は標識に化学的に結合され
ることができる。例えば、標識又は細胞毒性剤が蛋白で
あり、そして第２成分が無傷の免疫グロブリンであると
き、その結合は、ヘテロ２官能価の架橋剤、例えば、SP
DP、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、等の方法に
よるものであることができる。

好適な標識は、例えば、放射性核種、酵素、基質、補
因子、阻害剤、蛍光剤、化学発光剤、磁気粒子を含む。
このような標識の使用を教示している特許の例は、以下
のものである：米国特許第3,817,837号；第3,850,752
号；第3,939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号；
第4,275,149号；及び第4,366,241号，（これらの全て
を、引用により本明細書中に取り込む。）。

また、１本鎖分子を含む免疫毒は、組換え手段によ
り、製造されることができる。様々な免疫毒の製造は、
本分野によく知られており、そして方法は、例えば、
“Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine,Acade
mic Press,pp.168−190（1982）;E.Vitetta,Science（1
987）237:1098−1104;及びG.Winter and C.Milstein,Na
ture（1991）349:293−299;（すべてを、引用により本
明細書中に取り込む。）中に見られることができる。

様々な細胞毒剤（cytotoxic agent）が、免疫毒にお
ける使用に好適である。細胞毒剤は、放射性核種、例え
ば、インジウム−131、イットリウム−90、レンニウム
−188、及びビスマス−212;多数の化学療法医薬、例え
ば、ビンデジン（vindesine）、メトトレキサート、ア
ドリアマイシン、及びシスプラチナム（cisplatinu
m）；及び細胞毒性蛋白、例えば、リボソーム阻害蛋白
様ヤマゴボウ（pokeweed）抗ウイルス蛋白、シュードモ
ナス外毒素Ａ（Pseudomonas exotoxin A）、リシン（ri
cin）、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖、等、又は細胞表
面において活性な剤、例えば、ホスホリパーゼ酵素（例
えば、ホスホリパーゼＣ）を、含むことができる（一般
的に、“Chimeric Toxins,"Olsnes and Phil,Pharmac.T
her.,15:355−381（1981）、及び“Monoclonal Antibod
ies for Cancer Detection and Therapy,"eds.Baldwin
and Byers,pp.159−179,224−266,Academic Press（198
5），（これらの両方を、引用により本明細書中に取り
込む。）を参照のこと。）。

発明の説明 本発明の免疫グロブリン・ポリペプチドは、治療にお
ける並びに診断及び他の用途における使用を見つけられ
るであろう。これらの分野において有用な様々な技術
は、例えば、Harlow and Lane,Antibodies:A Laborator
y Manual,Cold Spring Harbor,New York（1988）（すべ
ての目的のために、引用により本明細書中に取り込
む。）中に記載されており：免疫グロブリンを作るため
の動物の免疫化；モノクローナル抗体の生産；プローブ
としての使用のための免疫グロブリンの標識付け；免疫
アフィニティー精製；及び免疫検定を含む。

本発明の免疫グロブリン・ポリペプチドの例は、以下
に記載するようなモノクローナル抗体2A1E2であって、
ベータ型ヒトPDGFレセプタに特異的に結合するものであ
る。モノクローナル抗体2A1E2であってIgG₁イソタイプ
を有するものは、American Type Culture Collection,1
2301 Park Lawn Drive,Rockville,Maryland 20231（ATC
C no.HB10938）に、この出願の出願日に先立って、寄託
されている。

本発明の抗−PDGFレセプタ免疫グロブリン・ポリペプ
チドを、ヒト・ベータ型PDGFレセプタの精製された又は
部分的に精製された細胞外ドメインにより動物を免疫化
することにより、調製することができる。免疫化された
動物は、ヒト・ベータ型PDGFレセプタ細胞外ドメインに
特徴的なエピトープを免疫学的に認識することができる
様々な種、例えば、ネズミ、ウサギ（lagomorph）、ウ
マ（equine）等の中のいずれか１つである。

本発明のモノクローナル抗体は、ヒト・ベータ型PDGF
レセプタ細胞外ドメインに特徴的な抗原決定基に特異的
に結合する免疫グロブリン・ポリペプチド又はそれらの
部分をコードしている核酸配列を免疫化することによ
り、調製されることができる。不死化過程を、ハイブリ
ドーマ融合技術により、抗体−産生リンパ球のウイルス
形質転換、組換えDNA技術により、又は細胞融合、ウイ
ルス形質転換及び／又は組換えDNA方法論を組み合わせ
ることにより、行うことができる。

本発明の１つの態様に従って、ヒト抗−PDGFレセプタ
・モノクローナル抗体産生細胞を、例えば、Epstein−B
arrウイルス（EBV）形質転換技術を使用して、不死化す
る。例えば、患者の、末梢血液、骨髄、リンパ節、扁桃
（tonsils）等、好ましくは、PDGFレセプタ又はそれら
の部分により免疫化されたものを、米国特許第4,464,46
5号及びChan et al.,J.Immunol.136:106（1986）（これ
を、引用により本明細書中に取り込む。）に従ってEBV
を使用して、不死化する。

また、ヒト抗−PDGFレセプタ・モノクローナル抗体
を、様々な他の方法により、例えば、EBV又は他のウイ
ルス形質転換とハイブリドーマ融合技術との組み合わせ
を使用して、調製することができる。例えば、ハイブリ
ドーマを、PDGFレセプタ又はそれらの部分により免疫化
された個体から得られた刺激されたＢ細胞を、マウス／
ヒト・ヘテロハイブリッド融合パートナーと、融合する
ことにより、創出することができ、これらの様々なもの
が、記載されている。例えば、米国特許第4,624,921号
及びJames and Bell,J.Immunol.Meths.100:5−40（198
7）（これを、引用により本明細書中に取り込む。）
を、参照のこと。マウス／ヒト融合パートナーは、EBV
により刺激され又は形質転換されたヒト・リンパ球を、
容易に入手可能なマウス骨髄腫系、例えば、NS−１又は
P3NS−１と、例えば、ポリエチレン・グリコールの存在
中で、融合することにより、構築されることができる。
このハイブリッドは、好適に医薬−マークされるべきで
あり、これは、そのハイブリッドを、所望の医薬、例え
ば、６−チオグアニン、オウバイン（oubain）、又はネ
オマイシン（neomycin）の増加濃度において培養するこ
とにより、達成されることができる。

問題の抗体を分泌するマイブリドーマ又はリンパ芽球
様細胞（lymphoblastoid cells）は、ベータ型PDGFレセ
プタに結合する抗体について培養上澄液をスクリーニン
グすることにより同定されることができる。より好まし
くは、スクリーニング検定は、例えば、PDGF−仲介有糸
分裂誘発を阻害する抗体を検出するために使用されるこ
とができる。所望の活性を有する細胞を、慣用の技術に
従ってクローン化及びサブクローン化し、そして問題の
抗−PDGFレセプタ・モノクローナル抗体を産生する安定
な、不死化された系が同定されるまで、監視する。モノ
クローナル抗体は、異なる抗原結合特異性をもつ抗体を
産生する細胞から分離されたクローンの、不死化された
細胞系により作られた抗体を、意味する。したがって、
このような抗体は、他のモノクローナル抗体から単離さ
れて作られ、そして、従って、（他の抗体と比べて）実
質的に純粋な形態であり、そしてＢ細胞源として役立つ
動物種からの血清中に正常に生じるよりも一般的に高い
濃度にある。

あるいは、ある者は、Huse et al.,Science 246:1275
−1281（1989）（これを、引用により本明細書中に取り
込む。）により概説されるような一般的な手順に従って
ヒトＢ細胞からDNAライブラリーをスクリーニングし、
そして次に所望の特異性を有する抗−PDGFレセプタ抗体
（又は結合断片）をコードしている配列をクローニング
及び増幅することにより、PDGFレセプタの細胞外ドメイ
ンに特異的に結合するヒト抗PDGFレセプタ免疫・ポリペ
プチド又はそれらの部分をコードしているDNA配列を単
離することができる。

免疫グロブリンを、次に、適当な免疫グロブリン遺伝
子、又はそれらの部分を含む発現ベクターを、適当な宿
主細胞に導入することにいより、作ることができる。こ
の宿主細胞を、次に、免疫グロブリン・ヌクレオチド配
列の高レベル発現に好適な条件下で、維持し、そして必
要なときに、軽鎖、重鎖、軽／重鎖ダイマー又は無傷抗
体、結合断片、又は他の免疫グロブリン形態の回収及び
精製が、続くことができる。

好適な宿主細胞は、微生物を含むが、哺乳類又は昆虫
の組織細胞培養物が、本発明のモノクローナル抗体の生
産に好まれることができる（E.Winnacker,“From Genes
to Clones,"VCH Publishers,N.Y.,N.Y.（1987）（これ
を、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこ
と。）。無傷の免疫グロブリンを分泌することができる
多数の好適な宿主細胞系が、本分野において開発されて
おり、そしてこれは、チャイニーズ・ハムスター卵巣
（CHO）細胞系を含むが、好ましくは、形質転換された
Ｂ−細胞又はハイブリドーマが使用されるであろう。

一旦発現されれば、本発明の、抗体全体、それらのダ
イマー、個々の軽鎖及び重鎖、又は他の免疫グロブリン
形態を、硫酸アンモニア沈降、アフィニティー・カラ
ム、カラム・クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等を
含む、本分野の標準的技術に従って精製することができ
る（一般的には、R.Scopes,Protein Purification,Spri
nger−Verlag,N.Y.（1982）（引用により本明細書中に
取り込む。）を参照のこと。）。少なくとも約90〜98％
同質性（homogeneity）を有する実質的に純粋な免疫グ
ロブリンが好ましく、そして医薬用途のめには、98〜99
％以上の同質性を有するものが最も好ましい。一旦、部
分的に又は同質性まで精製されれば、そのポリペプチド
を、次に、（体外を含み）治療的に、又は検定手順、免
疫蛍光染色、等の開発及び実施において、使用すること
ができる。（一般的に、Immunological Methods,Vols.I
and II,Lefkovits and Pernis,eds.,Academic Press,N
ew York,N.Y.（1979 and 1981）（これを、引用により
本明細書中に取り込む。）を参照のこと。）。

本発明に従って作られた免疫グロブリン・ポリペプチ
ドは、IgG、IgM、IgA又はIgDイソタイプを有することが
でき、そしてさらに、それらの適当なサブクラス、例え
ば、IgG₁、IgG₂、IgG₃、又はIgG₄の中のいずれかである
ことができる。組換えDNA技術を使用して、単離された
免疫グロブリン・ポリペプチドの“クラス−スイッチン
グ（class−switching）”を、容易に行うことができ
る。この方法においては、問題の免疫グロブリン分子の
イソタイプを決定する定常領域をコードしている遺伝子
が、欧州特許出願第EP1 314,161号（引用により本明細
書中に取り込む。）中に一般的に記載されるように、所
望のイソタイプ又はサブクラスをコードしている遺伝子
により、置き換えられる。また、クラス−スイッチされ
た免疫グロブリンは、本分野において知られた選択方法
を使用して自発的スイッチングを経験した細胞を選択す
ることにより、単離されることもできる。

実質的に非−ヒトである免疫グロブリン・ポリペプチ
ドのヒトへの投与は、抗−抗体応答を顕現させることが
できる。したがって、実質的にヒトである本発明の抗−
PDGFレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチドを調製する
ことが必要であることができる。“実質的にヒト”と
は、特に、確立されたPDGF−仲介細胞増殖失調を治療す
るために必要であることができる長い期間にわたる反復
投与のための、起源において少なくとも約50％、より好
ましくは約70〜80％以上、そして最も好ましくは約95〜
99％以上であるアミノ酸配列から成る抗体又はそれらの
結合断片を、意味する。本明細書中で使用するとき、ヒ
ト抗体は、その文脈が特にことわらない限り、完全にヒ
ト起源の抗体並びに実質的にヒトであるものを含むこと
を、意味する。

ヒト抗−PDGFレセプタ・モノクローナル抗体の生産が
慣用の不死化技術によっては困難であることができるの
で、まず、非−ヒト抗体を作り、そして次に組換えDNA
技術を介して、非−ヒト抗体の抗原結合領域、例えば、
Fab、相補性決定領域（CDRs）又は超可変領域を、実質
的なヒト分子を作るために適用なヒト定常領域（Fc）又
はフレームワーク領域に、移すことが、必要であること
ができる。このような方法は、本分野において一般的に
知られており、そして、例えば、米国特許第4,816,397
号、PCT国際公開WO 90/07861、及び欧州特許出願第1734
94号及び239400号（これらのそれぞれを、引用により本
明細書中に取り込む。）中に記載されている。

ヒト・ベータ型PDGFレセプタに特異的に結合し、そし
てこれ故、そのレセプタへのPDGFの結合を阻害する、得
られたキメラ抗体及びキメラ免疫グロブリン・ポリペプ
チドも、本発明の範囲内にある。典型的な治療的キメラ
抗体は、ヒトPDGFベータ型レセプタ抗原決定基に特異的
なマウス免疫グロブリンからの可変（Ｖ）又は抗原結合
ドメイン、及びヒト免疫グロブリンからの定常（Ｃ）又
はエフェクター・ドメインから成るハイブリッド蛋白で
あるであろう。但し、他の哺乳類種からのドメインを、
可変及び定常ドメインの両方のために使用することがで
きる。本明細書中で使用するとき、また、用語“キメラ
抗体”は、相補性決定領域（CDR's）だけがその抗原決
定基を特異的に認識する免疫グロブリンから移されてお
り、その免疫グロブリン遺伝子の残りがヒト（又は所望
により他の哺乳類）の免疫グロブリン遺伝子から得られ
ているような、免疫グロブリン遺伝子により、コードさ
れている抗体をいう。このタイプのキメラ抗体は、“ヒ
ト化（humanized）”（ヒト免疫グロブリン遺伝子が使
用される場合）抗体といわれる。

抗−PDGFレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチドの可
変ドメインの超可変領域は、本発明の関連態様を含んで
成る。この超可変領域又はCDRsは、フレームワーク領域
（単一種内の異なる免疫グロブリンの中で比較的保存さ
れている免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の可変領域の部
分）と共に、抗−PDGFレセプタ免疫グロブリン・ポリペ
プチドがヒト・ベータ型PDGFレセプタを認識し且つそれ
故それに結合することを、可能にする。この超可変領域
を、クローン化し、そして配列決定することができる。
一旦、同定されれば、PDGFレセプタの特異的認識を与え
るこれらの領域は、次に、他の免疫グロブリン分子の一
部として又は融合蛋白、例えば、そのクローン化イディ
オタイプの免疫原性を強化する働きをもつ担体分子とし
て、宿主内での発現のために、ベクター内にクローン化
されることができる。

本発明の抗−PDGFレセプタ免疫グロブリン・ポリペプ
チドは、一般的に無傷で、又は免疫原性断片、例えば、
F_v、Fab、又はＦ（ab'）_２断片として、使用されるであ
ろう。この断片を、慣用の技術により、例えば、ペプシ
ン又はパパインのようなものを使用した抗体の蛋白分解
消化により、又は所望の断片をコードしている遺伝子又
はそれらの部分がクローン化又は合成され、そして様々
な宿主内で発現されてるような組換えDNA技術により、
抗体から得ることができる。

当業者は、“抗−イディオタイプ”抗体を標準的な方
法に従って免疫原として特異的免疫グロブリンを使用す
ることにより作ることができることを認めるであろう。
例えば、PDGFレセプタ・ポリペプチド、又はそれらの断
片による感染又は免疫化は、そのFab可変領域結合部位
の上に、その特定の免疫グロブリン、例えば、イディオ
タイプに対しユニークなPDGFレセプタ・ポリペプチドの
イメージをもつ中和免疫グロブリンを、誘導する。この
ような抗−PDGF−Ｒ免疫グロブリンによる免疫化は、抗
−イディオタイプ抗体であって元のPDGF−Ｒ抗原の構造
を真似たその結合部位において立体配置をもつものを、
誘導する。これらの抗−イディオタイプ抗体は、それ故
に、PDGF−仲介疾患を治療するためにPDGF−Ｒ抗原の代
わりに、使用されることができる（例えば、Nisonoff
（1991）J.Immunol.147:2429−2438（これを、引用によ
り本明細書中に取り込む。）を参照のこと。）。

本発明の抗−PDGFレセプタ免疫グロブリン・ポリペプ
チドは、治療及び診断方法並びに組成物における用途を
見いだしている。治療用途のためには、抗−PDGFレセプ
タ免疫グロブリン・ポリペプチドを、ヒト・ベータ型PD
GFレセプタのための可溶性リガンドとして使用され、そ
のレセプタをマスキングし又はその他にそのレセプタへ
の結合からPDGF分子を阻害し、そしてそれにより不所望
の細胞の転移及び増殖を阻害する。

医薬組成物のためには、本明細書中に記載するような
本発明の抗−PDGFレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチ
ドを、PDGF−仲介細胞増殖失調をもつ個体に投与する。
治療用途においては、組成物を、細胞レセプタを有効に
ブロックするのに充分な量で患者に投与し、そしてそれ
によりその細胞増殖及びその徴候及び／又は合併症を少
なくとも部分的に休止させる。これを達成するのに適当
な量は、“治療的有効投与量”として定められる。この
使用のために有効な量は、例えば、抗−PDGFレセプタ免
疫グロブリン・ポリペプチド組成物の性質、投与のやり
方、治療される疾患の段階及び重度、患者の体重及び健
康の総合状態、及び処方内科医の判断に依存するであろ
うが、一般的には、１日当たり約0.01mg/kgから約100.0
0mg/kg体重までの範囲にあるであろうし、１日当たり約
0.1mg/kgから約10.0mg/kg体重までの投与量が、より一
般的に使用される。抗−PDGFレセプタ免疫グロブリン・
ポリペプチド及びそれから得られたペプチド組成物が、
重症な疾患状態、すなわち、致死的又は潜在的に致死的
な状態において使用されることができるということに留
意しなければならない。このような場合には、実質的に
過剰のこれらの組成物を投与することが、可能であり、
そしてそその処方内科医により必要と思われることがで
きる。したがって、本発明の、ヒト抗−PDGFレセプタ・
モノクローナル抗体又は実質的ヒト抗−PDGFレセプタ・
モノクローナル抗体が、これらの情況の下では最も好ま
しい。

本組成物の単一又は複数の投与を、その処方内科医に
より選ばれた投与レベル及びパターンにより、行うこと
ができる。いずれの事件においても、医薬配合物は、患
者を有効に治療するのに充分な本発明の抗−PDGFレセプ
タ免疫グロブリン・ポリペプチドの量を提供すべきであ
る。投与は、不所望の細胞増殖の第一指標において又は
診断直後に開始され、そして徴候が実質的に軽減され、
そしてその後の期間にわたり、続けられるべきである。
よく確立された病気の場合においては、負荷投与量その
後の維持投与量が、必要であろう。

治療処置のための医薬組成物は、非経口的、局所的、
経口的又は居所投与について意図されている。好ましく
は、医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈中に、皮
下内に、皮膚内に、又は筋肉内に、投与される。したが
って、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体
中に溶解され又は懸濁される抗−PDGFレセプタ免疫グロ
ブリン・ポリペプチドの溶液を含んで成る非経口投与の
ための組成物を提供する。様々な水性担体、例えば、
水、バッファー水、0.4％生理食塩水、0.3％グリシン、
ヒアルロン酸、等を、使用することができる。これらの
組成物は、慣用の、よく知られた滅菌技術により、滅菌
され、又は滅菌濾過されることができる。得られた水溶
液を、それ自体としての使用のために包装し、又は凍結
乾燥することができる。投与に先立ちその凍結乾燥調製
物が無菌溶液と組み合わされる。この組成物は、生理学
的条件に近づけるために必要な、医薬として許容される
補助物質、例えば、pH調整及び緩衝化剤、浸透圧調整
剤、水和剤、等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリ
ウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウ
ム、ソルビタン・モノラウレート、トリエタノールアミ
ン・オレエート、等を含むことができる。

医薬配合品中の本発明の抗−PDGFレセプタ免疫グロブ
リン・ポリペプチドの濃度は、広く、すなわち、約１％
未満、普通には約10−15％において又は少なくとも約10
−15％においてから、50重量％以上と同じ程度まで、変
動することができ、そして選ばれた投与の特定の態様に
従って、主に、液体の容量、粘度等により、選ばれるこ
とができるであろう。

したがって、静脈中の注入のための典型的な医薬組成
物は、250mlの滅菌Ringer's溶液、及び100mgの抗−PDGF
レセプタ免疫グロブリン・ポリペプチドを含むように調
製されることができる。非経口的に投与することができ
る化合物を製造するための実際の方法は、当業者に知ら
れ又は明らかになるであろうし、そして例えば、Reming
ton's Pharmaceutical Science,17th ed.,Merk Publish
ing Company,Easton,PA（1985）（これを、引用により
本明細書中に取り込む。）中により詳細に記載されてい
る。

また、抗−PDGFレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチ
ド及びそれらの断片は、リポソームを介して投与される
こともできる。この抗−PDGFレセプタ免疫グロブリン・
ポリペプチドは、そのリポソームを、ヒト・ベータ型PD
GFレセプタを表示する特定の組織又は細胞に、標的化す
ることに役立つことができる。リポソームは、エマルジ
ョン、泡、ミセル、不溶性単層、脂質結晶、リン脂質分
散体、ラメラ層、等を含む。これらの調製物において
は、配達されるべき免疫グロブリン・ポリペプチド又は
断片は、リポソームの一部として、単独で又は例えば、
その標的細胞に対して毒性である分子と共に、取り込ま
れる。免疫グロブリン・ポリペプチドを含むリポソーム
懸濁液は、静脈内に、局部的に、局所的に、等に、とり
わけ、投与のやり方、配達されるペプチド、及び治療さ
れる疾患の段階に従って変動する投与量において、投与
されることができる。

本発明の抗−PDGFレセプタ免疫グロブリン・ポリペプ
チドの固体組成物のために、慣用の非毒性固体担体であ
って、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトー
ス、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナ
トリウム、タルク、セルロース、グルコース、シュクロ
ース、炭酸マグネシウム等を含むものを、使用すること
ができる。経口投与のためには、医薬として許容される
非毒性組成物を、正常に使用される賦形剤、例えば、先
に列記したような担体、一般的に10−95％の活性成分、
すなわち、１以上の抗−PDGFレセプタ免疫グロブリン・
ポリペプチドのいずれかを、そしてより好ましくは25％
−75％の濃度において、取り込むことにより配合する。

診断目的のためには、抗−PDGFレセプタ免疫グロブリ
ン・ポリペプチドを、標識又は非標識のいずれかを行う
ことができる。標識は、本分野においてよく知られ且つ
報告されている様々な技術の中のいずれかにより検出す
ることができるシグナルを提供する物質である。あるい
は、本発明内に含まれる非標識抗体を、標識され、そし
て本発明の抗−PDGFレセプタ免疫グロブリン・ポリペプ
チドを認識する他の抗体（第二抗体）と共に、使用する
ことができる。例えば、抗−PDGFレセプタ免疫グロブリ
ン・ポリペプチドの定常領域に特異的な標識抗体を、サ
ンプルに結合した免疫グロブリン・ポリペプチドを検出
するために使用することができる。

多種多様の標識、例えば、放射性核種、ホタル石（fl
uors）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、リ
ガンド（特にハプテン）、等を、使用することができ
る。多くのタイプの免疫検定が利用でき、そして当業者
によく知られている。

本発明の、抗−PDGFレセプタ免疫グロブリン・ポリペ
プチド、及びそれらの断片は、生理学的試料中のPDGFレ
セプタの検出のための様々な免疫検定において使用され
ることができる。このような免疫検定は、液相イムノア
ッセイ及びウェスタン・ブロット検定、競合的及び非競
合的蛋白結合検定、酵素−結合イムノソルベント検定
（ELISA）、一般的に使用され、そして科学的及び特許
の刊行物において広く記載されている他のもの、並びに
商業的に使用される多くのものを、含むことができる。

このような免疫グロブリン及びペプチドは、同様に、
本分野においてよく知られた方法により、免疫組織化学
的染色技術において、使用されることができる。

以下の例を、限定ではなく、例示により、提供する。

実施例 材料 PDGF BBをAmgenから購入した。抗−ホスホチロシン・
モノクローナル抗体（MAb）PY20を、ICIから購入した。
DMEM、RPMI 1640、F12、ウシ血清、ペニシリン−ストレ
プトマイシン溶液、G418−ネオマイシン、200mMグルタ
ミン、1M HEPES、ピルビン酸ナトリウム（11mg/ml）、
及びリン酸塩バッファー生理食塩水（PBS）を、GIBCOか
ら入手した。ウシ胎児血清（FCS）及びモノクローナル
抗体サブタイピング・キットは、Hycloneからのもので
あった。Tris、リン酸ナトリウム、硼酸ナトリウム、酢
酸、ピロリン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、ジチオ
トレオトール（DDT）、エチレン・ジアミン・テトラ酢
酸（EDTA）、EGTA、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、
ナトリウム・オルトバナデート、塩化ナトリウム（NaC
l）、クエン酸、フェニル・メチル・スルホニル・フル
オリド（PMSF）、ウシ血清アルブミン（BSA）、Triton
X100、Tween 20、2,2'アジノ−bis（３−エチルベンズ
チアゾリン）−６−スルホン酸（ABTS）、及び過酸化水
素は、Sigmaからのものであった。ヤギ抗−マウス・ペ
ルオキシダーゼ及びヒポキサンチン−チアミン（HT）
は、Boehringer Mannheimからのものであった。ゼラチ
ン、非染色蛋白分子量マーカー及びニトロセルロース
は、BioRadからのものであった。前染色高分子量蛋白マ
ーカーは、BRLからのものであった。プロテインＡセフ
ァロースCL4B、プロテインＧセファロースCL4B、Immuno
pure^TM結合バッファー、Ｆ（ab'）_２及びFab調製キット
は、Pierceからのものであった。前包装PD10カラムは、
Pharmaciaからのものであった。¹²⁵I−プロテインＡ及
び¹⁴C−分子量マーカーは、Amershamからのものであっ
た。¹²⁵I−ジヨード−Bolton−Hunter試薬は、New Engl
and Nuclearからのものであった。メタノールは、Burdi
ck−Jacksonからのものであった。組織培養供給物は、C
astarからのものであった。AG01523B細胞は、ATCCから
得た。HR5細胞は、J.A.Escobedo（UCSF）により好意的
に提供された。初期のヒト腕動脈平滑筋細胞は、J.Ande
rson及びS.Hanson（Emory Univ.）により、親切に提供
された。

方法 細胞培養。NIH 3T3細胞を、10％ウシ胎児血清、1Xペ
ニシリン−ストレプトマイシン、2mMグルタミン、及び
ピルビン酸ナトリウム（0.11mg/ml）を含むDMEM中で、
定例的に維持した。細胞外ドメイン（ＰΔ１−５）又は
完全長PDGFベータ・レセプタ（HR5）を表示するCHO細胞
を、10％ FCS、1Xペニシリン−ストレプトマイシン、2m
Mグルタミン、ピルビン酸ナトリウム（0.11mg/ml）及び
G418（200μg/ml）を含むRPMI中で培養した。ヒト包皮
繊維芽細胞（AG01523B）を、10％ FCS、1Xペニシリン−
ストレプトマイシン、2mMグルタミン、及びピルビン酸
ナトリウム（0.11mg/ml）を含むDMEM中で培養した。モ
ノクローナル・ハイブリドーマ細胞を、20％ FCS、1Xペ
ニシリン−ストレプトマイシン、2mMグルタミン、ピル
ビン酸ナトリウム（0.1mg/ml）、1X HT、及び10％マク
ロファージ−ならし培地を含む50:50 DME:RPMI中で維持
した。

切り詰められたヒトPDGFベータ・レセプタ−発現細胞
系の構築。ヒトPDGFベータ・レセプタcDNAの切り詰め
を、オリゴヌクレオチド−特異的欠失突然変異誘発（ol
igonucleotide−directed deletion mutagenesis）によ
り、行った。オリゴヌクレオチド−特異的インビトロ突
然変異誘発は、Kunkel et al.（1987）Meth.Enzymol.15
4:367−382（これを、引用により本明細書中に取り込
む。）の修飾された方法に従って行われた。最初に、ヒ
トPDGFベータ・レセプタのコーディング領域全体の3.9k
b EcoR I−Hind III cDNA断片（残基−32〜499）を、m1
3mp18産生ベクターmp18PRのEcoR IとHind IIIとの中に
サブクローン化した（Maniatis,T.et al.（1982）Molec
ular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbo
r Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,（これを、引用
により本明細書中に取り込む。））。

オリゴヌクレオチドを、アミノ酸499−1074（PRΔ1;G
TG TGA GGA ACG GGA AAT TCA TCG AAG GAC ATC CCC CGA
C）、又はアミノ酸384−1074（PRΔ2;GGA AGG TCG ATG
TCT AGT TAA TCG AAG GAC ATC CCC CGAC）をコードして
いるヒトPDGFベータ・レセプタcDNAの部分を欠失させる
ために設計した（図１）。終止コドンを、残基499（PR
Δ１）又は残基384（PRΔ２）の後に導入した。サブク
ローニングの正当化を、制限酵素消化分析及びジデオキ
シ連鎖終止配列決定により行った（Sanger,F.et al.（1
977）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463−5467,（これ
を、引用により本明細書中に取り込む。））。

修飾されたPDGFベータ・レセプタ・ポリペプチドを、
発現ベクターPBJ1（Lin,A.et al.（1990）Science 249:
677−679,（これを、引用により本明細書中に取り込
む。））のEcoR IとHind IIIとの中にサブクローン化
し、ベクターpSV2Neo（Southern,P.J.and Berg,P.（198
2）J.Mol.Appl.Gen.1:327−341（これを、引用により本
明細書中に取り込む。））と共に、1:10の比において、
CHO−K1細胞中に、リポフェクチン試薬取り込み（lipof
ectin reagent uptake）の方法（Felgner,P.L.et al.
（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413−7417（これ
を、引用により本明細書中に取り込む。））により、共
同トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞
を、G418−ネオマイシン耐性について選択し、そして個
々のクローンを、単離し、そして無血清培地中の細胞外
PDGFベータ・レセプタの高レベル発現のための等しい細
胞密度において、スクリーニングした。修飾された細胞
外PDGFベータ・レセプタ蛋白の発現を、ヒトPDGFレセプ
タ残基51−68に基づく合成ペプチド（SVLTLTNLTGLDTGEY
FC配列番号３）に対して作られたウサギ・ポリクローナ
ル血清（Ab 1−３−５、図１を参照のこと。）を使用し
て、ウェスタン・ブロット検定により、測定した。組換
えクローンｐΔ１−５（完全長細胞外PDGFレセプタを発
現するもの）及びｐΔ２−７（細胞外PDGFレセプタのド
メイン１−４を発現するもの）を、その後の蛋白製造の
ために使用した。

ヒトPDGFベータ・レセプタに対するMAbsの調製。抗体
を、Harlow and Lane（1988）,In Antibodies:A Labora
tory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spr
ing Harbor,NY,（これを、引用により本明細書中に取り
込む。）により記載されているように、開発した。マウ
スを、PDGFベータ・レセプタ（ｐΔ１−５）の部分的に
精製された細胞外ドメインにより、50−100μg/免疫注
射を使用して、免疫化した。免疫化マウス中の抗体の力
価を、以下のように、酵素−結合イムノソルベント検定
（ELISA）を使用して測定した。96−welll Immunolon I
Iマイクロタイター・プレートを、PDGFベータ・レセプ
タの部分精製（10−15％）細胞外ドメイン（200−300ng
/well）により、４度において一夜被覆した。残りの操
作を、室温において行った。このwellを、100mM NaCl及
び0.5％ゼラチンを含む0.05M Tris,pH7により、１時間
ブロックした。プレートを、各種希釈のマウス血清によ
り２時間インキュベートし、洗浄バッファー（0.05M Tr
is,pH7、100mM NaCl及び0.3％ゼラチン）により５回洗
浄し、ヤギ抗−マウス・ペルオキシダーゼ（洗浄バッフ
ァー中1:1000）と共に１時間インキュベートした。プレ
ートを、先に記載したように洗浄し、そして過酸化水素
（最終濃度0.003％）を含む、0.1Mクエン酸、0.1Mリン
酸ナトリウム２塩基、pH4中の2,2'−アジノ−bis（３エ
チルベンズチアゾリン）６−スルホン酸（ABTS、1mg/m
l）により、顕色させた。650nmにおける吸光度を測定
し、そしてその値を、pBJベクター単独によりトランス
フェクトされたCHO細胞からのならし培地から類似の程
度まで精製された蛋白により得られた値と比較した。

高い反応性を示すマウスを、殺し、そしてその脾臓を
単離した。脾臓細胞を取り出し、そして先に記載したよ
うな骨髄腫細胞と融合した（harlow and Lane,前掲書
中）。ハイブリドーマを、同一ELISAを使用してスクリ
ーニングし、そして陽性ハイブリドーマを、クローン化
し、そして再スクリーニングした。陽性モノクローナル
抗体細胞を、培養し、そして腹水（ascites）を、記載
されたBalb/cマウス中で調製した（Harlow and Lane,前
掲書中）。組織培養基を、製造者による指示に従ってHy
Cloneからのサブタイピング・キットを使用してそのMAb
sをサブ−タイプ（sub−type）するために使用した。

抗体の精製。抗体を、以下のようにプロテインA CL4B
上で精製した。腹水液を、Immunopure^TM結合バッファー
（Pierce）中で1:5希釈し、そして同一バッファー中で
平衡にしたプロテインA CL4Bカラム上でクロマトグラフ
ィーにかけた。通過物を、回収し、そしてそのカラム
を、Immunopure結合バッファー（10カラム容量）により
洗浄した。この結合IgGsを、0.1Mグリシン、pH2.8によ
り溶出させ、そして中和剤として2M Tris,pH11（40μg/
ml）を入れたチューブ内に回収した。ピーク蛋白画分
を、280nmにおける吸光度を測定することにより検出
し、プールし、そしてPBS中で透析した（それぞれ4Lの
２回交換）。

MAb 2A1E2 F（ab'）_２及びFab蛋白分解断片の調製。M
Ab 2A1E2のＦ（ab'）_２断片を、製造者の指示に従ってI
mmunopure F（ab'）_２調製キット（Pierce）を使用して
無傷MAbから調製した。モノクローナル抗体2A1E2を、pH
4.2において37℃において４時間、固定化ペプシンと共
にインキュベートし、そして非解裂IgG及びFc断片を、
プロテインＡセファロースCL4Bを使用してＦ（ab'）_２
断片から分離した。Fab断片を、同様に、Pierce Immuno
pure Fab調製キットを使用して調製した。このIgGを、3
7℃においてpH7で５時間、固定化パパインと共にインキ
ュベートし、そして未消化IgG及びFc断片を、プロテイ
ンＡを使用して除去した。サンプルを、酵素消化後SDS
−PAGEにより分析し、そしてPDGFベータ・レセプタELIS
Aを、たとえあるにしても、抗原認識の損失について測
定するために使用した。

免疫沈降検定。免疫沈降検定を、Kessler,S.W.（198
1）,Meth.Enzymol.73:442−471（これを、引用により本
明細書中に取り込む。）の手順の修正により行った。精
製ｐΔ１−５又はｐΔ２−７を使用するとき、蛋白を、
室温において２時間か又は４℃において12時間かのいず
れかで、免疫沈降（IP）バッファー（40mM Tris,pH8,10
0mM NaCl,10mM EDTA,1mM EGTA及び１％ Triton X100）
中で、MAbとインキュベートした。完全長レセプタを免
疫沈降させる場合、その時、PDGFベータ・レセプタ表現
細胞は、１μＭナトリウム・オルトバナデート及び1mM
PMSFを含むIPバッファー中で可溶化され、そして４℃に
おいて８−12時間、MAbとインキュベートされた。次
に、サンプルを、プロテインＡ−セファロースCL4Bとプ
ロテインＧ−セファロースCL4Bとの1:1混合物の50％ス
ラリー（50−100μl/サンプル）と共にインキュベート
した。４℃において１−２時間後、樹脂を、３サイクル
の遠心分離により洗浄し、そしいてIPバッファー中に再
懸濁させ、そして最終的に、その樹脂を、Laemmliサン
プル可溶化バッー中で煮沸した（50−100μl/サンプ
ル）（1970,Nature 227:680−685（これを、引用により
本明細書中に取り込む。）。サンプルを、７％又は10％
Laemmliゲル上でSDS−PAGEに供し、そして次に、ニト
ロセルロースに移した。ウェスタン・ブロットを、ブロ
ッキング・バッファー（0.5％ NaCl及び４％ BSAを含む
0.05M Tris,pH8）中でブロックし、そして４℃において
12時間、一次抗体と共にインキュベートした。このニト
ロセルロースを、ブロッキング・バッファーにより洗浄
し、そして¹²⁵I−プロテインＡ（0.4mCi/ml）と、室温
において１−２時間インキュベートし、そしてＸ−線に
露出させた。

PDGF BBの放射ヨウ素化。PDGF BBを、Duan et al.（1
991,J.Biol.Chem.266:413−418（これを、引用により本
明細書中に取り込む。））により記載されているような
Bolton−Hunter手順の修正によりヨウ素化した。簡単に
言えば、¹²⁵I−ジヨードBolton−Hunter試薬（1mCi）
を、窒素下で乾燥させた。次に、PDGF BB（2.5μｇ）
を、10μｌの0.1Mホウ酸ナトリウム（pH8.5）中４℃に
おいて15分間、¹²⁵I−ジヨードBolton−Hunter試薬に添
加した。この試薬混合物を、500μｌの0.1Mホウ酸ナト
リウム、0.2Mグリシン、pH8.5により、４℃において10
分間、クエンチした。この材料を、1mg/mg BSAを含む0.
3M酢酸により前もって平衡としたPD10カラム上のゲル濾
過クロマトグラフィーに供した。ピーク放射標識蛋白画
分を、ガンマ・カウンターを使用して検出した。典型的
には、ヨウ素化PDGF BBの比活性は、50000カウント/ng
であった。

無傷HR5細胞への¹²⁵I−PDGF BBの結合。HR5細胞を、2
mM EDTAを含むPBSにより、37℃において20分間、収穫し
た。洗浄HR5細胞（1 x 10⁶細胞/100μｌ）を、0.5％ BS
Aを含むPBS中のMAb（又はＦ（ab'）_２又はFab断片）の
各種濃度をもつ懸濁液中で、３連で、30分間室温におい
てインキュベートした。HR5細胞を、100倍過剰の非標識
PDGF BB及び担体蛋白（血小板貧弱血漿、50μｌ）の非
存在中（全結合）又は存在中（非特異的結合）において
¹²⁵I−PDGF BB（約1ng/チューブ）と、室温において45
分間、インキュベートした。インキュベーションの最終
容量は、500μｌであった。このインキュベーション混
合物（400μｌ）を、Ficoll−paque（700μｌ）上に層
化し、そして遠心分離した。その上澄液を、除去し、そ
して細胞ペレット中の放射能を測定した。

リン酸化検定。HR5細胞を、６−well皿内で集密まで
増殖させ、そして一次細胞を、100mm皿内で培養した。
細胞を、冷無血清DMEMにより２回洗浄し、そして10分間
氷上でインキュベートした。細胞を、回転振とう機上で
氷上で30−45分間、MAb 2A1E2と２連で、前インキュベ
ートし、そして次に、リガンドPDGF BBを、そのwellに
添加し、そしてインキュベーションを、1.5−２時間続
けた。細胞を冷PBSにより２回洗浄し、そして溶菌バッ
ファー（100mM Tris,pH8、30mMピロリン酸ナトリウム、
50mM フッ化ナトリウム、5mM EDTA、5mM EGTA、１％ S
DS、100mM DTT）、又はIPバッファーであって両者が1mM
PMSF及び１μＭオルトバナデートを含むもののいずれ
かにおいて、可溶化した。次に、サンプルを、電気泳動
に先立ってさらに加工した。

ヒト包皮繊維芽AG01523B細胞及びヒヒ平滑筋細胞にお
ける有糸分裂誘発。ヒト包皮繊維芽AG01523B細胞及びヒ
ヒ平滑筋細胞を、96−well皿内で集密まで増殖させた。
ヒヒ平滑筋細胞を、0.5％ウシ血清を含むDMEMと一夜イ
ンキュベートすることにより、静止させた。次に、細胞
を、PDGF BBの存在中37℃において18時間、その後37℃
において５時間、２μCi/wellの³H−チミジンと共に、
様々な濃度のMAb 2A1E2と共に３連でインキュベートし
た。対照ヒヒ初期平滑筋細胞を、非特異的MAbと共に並
行してインキュベートし、そして対照AG01523B細胞を、
非阻害性抗−PDGFベータ・レセプタMAb（4C5C8）と共に
インキュベートした。次に、Wellを、氷冷５％ TCA（2
x 250μｌ）により洗浄し、そして0.25 N NaOH（2 x 10
0μｌ）により可溶化した。この可溶化サンプルを、シ
ンチレーション・バイアルに移し、そして放射能を測定
した。

ダイマー化検定。集密HR5細胞を、100mm皿内で先に記
載したように培養した。細胞を、冷PBS中で２回洗浄
し、そしてBSA（1.5mg/ml）及び25mM Hepesを含むPBS中
の各種濃度のMAb 2A1E2と共に４℃において１時間、イ
ンキュベートした。PDGF BBを、細胞に添加し、そして
インキュベーションを、４℃において２時間続けた。細
胞を、冷PBSで２回洗浄し、25mM Hepesを含むPBS中の架
橋剤BS³（0.75mg/プレート）と共に４℃において30分
間、インキュベートした。この反応を、クエンチ・バッ
ファー（150mM NaClを含む0.025M Tris,pH7.4;10ml/プ
レート）中の希釈により終了させた。細胞を、1mM PMSF
及び100μＭナトリウム・オルトバナデートを含むIPバ
ッファー（0.5ml/プレート）中で４℃において20分間、
抽出した。細胞溶解物を、ポリクローナル抗ヒト・ベー
タ・レセプタAb（AB88、1:500希釈）を使用して４℃に
おいて一夜免疫沈降させた。次に、プロテインA CL4B
（60μｌの50％スラリー）を、それぞれのサンプルに添
加した。４℃において１時間後、ビーズを、逐次、0.5
％ NP400を含むPBS、0.5％ NP40を含む0.5M塩化リチウ
ム、0.5M塩化リチウム、そして最後に、水により、洗浄
した。サンプルを、Laemmliサンプル可溶化バッファー
により可溶化し、そして３％−８％グラジエント・ゲル
上のSDS−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動、その後
の、ニトロセルロースへのウェスタン転移に供した。ウ
ェスタン・ブロットを、抗ホスホチロシンMAb（1:100
0）又はAb88（1:500希釈）のいずれかと、４℃において
一夜、その後、¹²⁵I−プロテインＡ（0.15μCi/ml）
と、室温において２時間、インキュベートした。次に、
ウェスタン・ブロットをＸ−線フィルムに露出させた。

結果 MAb 2A1E2の性質。MAb 2A1E2は、IgG₁モノクローナル
抗体である。ウェスタン分析は、MAb 2A1E2が、非−還
元ヒトPDGFベータ・レセプタ（図２、パネルＡ、レーン
４）を認識するが、還元蛋白（図２、パネルＡ、レーン
１）を認識しないことを示している。MAb 2A1E2は、溶
液から完全長の細胞外レセプタ（ｐΔ１−5;残基１−49
9）を免疫沈降させる（図２、パネルＣ、レーン３）。
しかしながら、精製Δ２−７（ドメイン５を除く；残基
１−384）が抗原であるとき、反応性は全くない（図
２、パネルＢ、レーン２）。このデータは、MAb 2A1E2
により認識されるエピトープが第5Ig−様ドメイン内
に、すなわち、ヒトPDGFベータ・レセプタの残基385−4
99間にあることを示している。

MAb 2A1E2によるHR5細胞への¹²⁵I−PDGF BB結合の投
与量−依存性阻害。HR5細胞（完全長ヒトPDGFベータ・
レセプタを発現するCHO−Ｋ細胞）が最初にMAb 2A1E2
と、その後¹²⁵I−PDGF BBとインキュベートされると
き、有意（48.1％）な阻害が、MAb 2A1E2により処理さ
れていない細胞と比べて、0.1nM MAbと同程度に低い濃
度にあることが観察される。1nM以上の濃度のMAb 2A1E2
を使用するとき、その細胞上の完全長PDGFベータ・レセ
プタへのリガンド結合の100％阻害が在る（図３、パネ
ルＡ）。PDGFベータ・レセプタに対する200nMの異な
る、非阻害性MAb（4C5C8）を前インキュベーションにお
いて使用するとき、阻害の量は、ほんの36.1％である。
これは、200nMの非関連MAb（抗−II b/III a）の効果に
匹敵する（19.18％阻害）。1nM MAb 2A1E2の存在中の
¹²⁵I−PDGF BB結合の量は、非標識PDGF BBの1500倍過剰
の存在中に見られるリガンド結合の量に（図３、パネル
Ａ）、又はヒトPDGFレセプタを発現しない非トランスフ
ェクトCHO細胞へのリガンドの結合量に（データを示さ
ず。）、等しい。

MAb 2A1E2により見られる阻害が立体障害によるもの
であるかどうかを決定するために、我々は、MAbのＦ（a
b'）_２及びFab断片を調製した。この抗体のこれらの蛋
白分解断片は、ELISAにおけるPDGFベータ・レセプタを
未だに認識する（データを示さず。）。但し、それらの
活性は、僅かに減少されていた。これを、放射標識リガ
ンド結合検定において使用するとき、我々は、その抗体
断片が、濃度に依存してHR5細胞上の完全長PDGFベータ
・レセプタへの¹²⁵I−PDGF BBの結合を未だ阻害するこ
とを見つけた（図３、パネルＢ）。しかしながら、完全
な阻害が、10nM MAb 2A1E2のＦ（ab'）_２又はFab断片に
より見られ、一方、1nM無傷抗体は、完全に、結合を阻
害した。1nM F（ab'）_２断片の存在中のリガンドの結合
は、64.5％程阻害され、1nM Fab断片の存在中の結合
は、50％程阻害された。

MAb 2A1E2によるリン酸化の阻害。図４中に示すよう
に、MAb 2A1E2は、濃度に依存して、HR5細胞におけるPD
GF誘導リン酸化を特異的に阻害し、約50％の阻害が1.3n
Mの濃度において生じ（レーン４）、そして100％の阻害
が13.3nM MAb 2A1E2において生じている（レーン５）。
対照の非関連MAb（抗−II b/III a）は、効果な無く
（レーン３）、そしてMAb 4C5C8であってこれもヒトPDG
Fベータ・レセプタに対して開発されたが異なるエピト
ープを認識するものは、リガンド−誘導リン酸化に対す
る効果を全くもっていなかった（レーン８）。

ヒトPDGFベータ・レセプタのPDGF BB誘導ダイマー化
に対するMAb 2A1E2の効果。PDGF BBによるHR5細胞の処
理は、PDGFベータ・レセプタの、リガンド−仲介リン酸
化（図５、レーン１−６中の180KDa）及びダイマー化
（図５、レーン２及び６中の390KDa）をもたらした。HR
5細胞を、MAb 2A1E2と最初の前インキュベートし、そし
て次に、PDGF BBとインキュベートするとき、ダイマー
化は、テスト濃度のすべてにおいて阻害された（図５、
レーン３、４及び５）。このデータは、レセプタ上のMA
b 2A1E2の結合がリガンド結合及びレセプタ・ダイマー
化を排除することを示している。

MAb 2A1E2による有糸分裂誘発の阻害。図６中に示す
ように、MAb 2A1E2は、濃度に依存して、ヒト包皮繊維
芽AG01523B細胞におけるPDGF BB−誘導有糸分裂誘発を
阻害し、最大阻害（69.55％）は、1.3μＭの濃度におい
て生じる。非−阻害性MAb、4C5C8を使用したとき、我々
は、有糸分裂誘発の有意な阻害を検出しなかった。MAb
2A1E2の濃度の増加は、阻害の程度を改善しなかった。
主な理由は、これらの細胞が、2A1E2により結合又は阻
害されないPDGFアルファ・レセプタ（データを示さ
ず。）をも発現するからである。

また、我々は、ヒヒ動脈からの初期平滑筋細胞に対す
る様々な濃度のMAb 2A1E2の効果について測定した。ヒ
ヒ平滑筋細胞におけるPDGF BB−仲介PDGFレセプタ・リ
ン酸化は、200nM及び20nM MAb 2A1E2により阻害された
（それぞれ、図７中、レーン４及び５）。

図８中に見られるように、1nM MAb 2A1E2は、１−2ng
/mlのPDGFの存在中の³H−チミジンの取り込みを、90％
程、阻害し、そして25nM MAbは、１−10ng/mlからのリ
ガンドの濃度範囲において、80％程、有糸分裂誘発を阻
害する。250nMを超える濃度のMAb 2A1E2は、リガンドの
すべてのテスト濃度において90％程、有糸分裂誘発を阻
害する。非関連MAbsを使用するとき、ヒヒ平滑筋細胞に
おける有糸分裂誘発の有意な効果は全くなかった。

要約すると、我々は、ヒトPDGFベータ・レセプタに高
く特異的であるモノクローナル抗体、MAb 2A1E2を開示
した。MAb 2A1E2は、ナノモル濃度においてヒト・ベー
タ型PDGFレセプタへのPDGFの結合を阻害し、そしてそれ
故、リガンド−仲介リン酸化及びダイマー化の阻害によ
り示されるようなレセプタの活性化を阻害する。この抗
体は、マイクロモルの濃度においてインビトロにおける
有糸分裂誘発を阻害する。本MAbの蛋白分解断片は、¹²⁵
I−PDGF BB結合の阻害により測定されるように、阻害作
用を保持している（図3A）。MAb 2A1E2は、PDGFベータ
・レセプタの第5Ig−様ドメイン内のエピトープを認識
するようであり（図２）、そしてこのドメインへの結合
は、このレセプタのダイマー化を防ぐようである（図
５）。1.3nM MAb 2A1E2と同程度に低い濃度において、P
DGFベータ・レセプタのリガンド−誘導自動リン酸化の
特異的且つ有意な阻害が在る（図４）。結果として、我
々は、0.1μM MAb 2A1E2においてHR5細胞におけるPDGF
誘導有糸分裂誘発の完全な阻害を見つけ（データを示さ
ず。）、そしてヒト包皮繊維芽細胞（AG01523B）におい
て、70％阻害が、１μM MAb 2A1E2濃度において達成さ
れる。

また、MAb 2A1E2を、ヒト腕動脈からの平滑筋細胞と
の交差反応についてテストした。PDGF BB−誘導リン酸
化（図７）及び有糸分裂誘発（図８）は、20−25nM MAb
2A1E2により80％まで阻害された。モノクロナール抗体
2A1E2は、イヌ、ウサギ、マウス、又はブタからあのPDG
Fレセプタと交差反応せず、そしてまた、ヒト・アルフ
ァ型PDGFレセプタと交差反応しない（データを示さ
ず。）。

特に興味のあるのは、我々が、MAb 2A1E2がPDGFベー
タ型レセプタの第5Ig−様ドメインに結合し、そしてそ
れ故、PDGF−仲介活性を阻害するといことを証明したと
同時に、PDGFが第3Ig−様ドメインに結合するというこ
とである。

これまでの記載は、例示的なものであって、限定的な
ものではないことを理解すべきである。先の記載をレビ
ューする間、多くの態様が当業者にとって明らかとなる
であろう。それ故、本発明の範囲は、先の記載を参照に
より決定されるべきではなく、代わりに、添付の請求の
範囲を参照して、このような請求の範囲が権利をもつ等
価な範囲の全体を伴って、決定されるべきである。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人:Ramakrishnan,Vanitha Escobedo,Maria A. Fretto,Larry J. （ii）発明の名称：ヒトPDGFベータ・レセプタに対す
る阻害性免疫グロブリン・ポリペプチド （iii）配列数:3 （iv）通信先： （Ａ）番地:Townsend and Townsend （Ｂ）ストリート:One Market Plaza,Steuart Towe
r,Suite2000 （Ｃ）市:San Francisco （Ｄ）州:California （Ｅ）国:USA （Ｆ）郵便番号（ZIP）:94105 （ｖ）コンピューター読込媒体： （Ａ）媒体形式：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換性 （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェアー:PatentIn Release ＃1.0,ve
rsion ＃1.25 （vi）現出願データ： （Ａ）出願番号:PCT （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）先行出願データ： （Ａ）出願番号:US 07/801,795 （Ｂ）出願日:02−DEC−1991 （viii）代理人／エージェント情報： （Ａ）氏名:Smith,William M. （Ｂ）登録番号:30,223 （Ｃ）参照／事件整理番号:12418−18 （ix）遠距離通信情報： （Ａ）電話番号:415−326−2400 （Ｂ）ファックス番号:415−326−2422 （２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:40塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:36塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:18アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子種類：ペプチド （xi）配列：配列番号3:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ａ (72)発明者 エスコベド，マリア エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94117，サンフランシスコ，＃３，アッ パーテラス 455 (72)発明者 フレット，ラリー ジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94002，ベルモント，エスコンディド ウェイ 1553 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕ．，147〔２〕, （1987）ｐｐ．839−845. Ｎａｔｕｒｅ，323，（1986）ｐｐ. 226−232. Ｓｃｉｅｎｃｅ，243，（1989）ｐｐ. 800−804. Ｓｃｉｅｎｃｅ，252，（1991−１) ｐｐ．1657−1662.

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト・ベータ型血小板由来成長因子レセプ
   タ（βPDGF−Ｒ）の細胞外ドメインに特異的に結合し、
   かつ、ヒトαPDGF−Ｒに特異的に結合しない、精製され
   た抗体又はその抗原結合性断片であって、前記抗体又は
   その抗原結合性断片のβPDGF−Ｒの細胞外ドメインへの
   特異的結合が、βPDGF−ＲへのPDGF−BB結合の阻害をも
   たらすものである、前記抗体又はその抗原結合性断片。
2. 【請求項２】前記抗体が２特異的である、請求項１の抗
   体。
3. 【請求項３】前記抗体がさらにイムノトキシンを含んで
   成る、請求項１の抗体又は断片。
4. 【請求項４】前記抗体がモノクローナルである、請求項
   １の抗体。
5. 【請求項５】前記抗体が細胞系ATCC HB−10938により
   生産されるものである、請求項１の抗体。
6. 【請求項６】次の工程を含んで成る請求項１に記載の抗
   体を生産する方法であって、 （ａ）前記抗体を生産する細胞系を増殖させ、そして （ｂ）前記細胞系から前記抗体を単離させる、前記方
   法。
7. 【請求項７】前記抗体がモノクローナルである、請求項
   ６の方法。
8. 【請求項８】前記細胞系がハイブリドーマ細胞系であ
   る、請求項７の方法。
9. 【請求項９】前記ハイブリドーマ細胞系がATCC HB1093
   8である、請求項８の方法。
10. 【請求項１０】前記抗体が2A1E2である、請求項６の方
    法。
11. 【請求項１１】請求項１に記載の抗体を生産することが
    できる、ATCC番号HB10938と命名された単離細胞系。