JP2017515811A - 抗d因子抗体変異体及びその使用法 - Google Patents
抗d因子抗体変異体及びその使用法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017515811A JP2017515811A JP2016564582A JP2016564582A JP2017515811A JP 2017515811 A JP2017515811 A JP 2017515811A JP 2016564582 A JP2016564582 A JP 2016564582A JP 2016564582 A JP2016564582 A JP 2016564582A JP 2017515811 A JP2017515811 A JP 2017515811A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- factor
- seq
- sequence
- hvr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/10—Ophthalmic agents for accommodation disorders, e.g. myopia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/14—Decongestants or antiallergics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21046—Complement factor D (3.4.21.46)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本発明は抗D因子抗体変異体、それらの変異体の作製、及び過剰補体活性化または無制御補体活性化に関連する疾患及び障害の治療用の組成物及び医薬の調製におけるそれらの変異体の使用に関する。【選択図】図1B
Description
関連出願の相互参照
本願はそれぞれ全体の参照により援用される2014年5月1日に出願された米国仮特許出願番号第61/987298号及び2014年11月6日に出願された米国仮特許出願番号第62/076372号の利益を主張する。
本願はそれぞれ全体の参照により援用される2014年5月1日に出願された米国仮特許出願番号第61/987298号及び2014年11月6日に出願された米国仮特許出願番号第62/076372号の利益を主張する。
配列表
本願は、ASCII形式で電子的に提出されており、且つ、ここにその全体の参照により援用される配列表を含有する。2015年4月27日に作製された当該ASCIIコピーはP05826−WO_SL.txtという名称であり、31,825バイトのサイズである。
本願は、ASCII形式で電子的に提出されており、且つ、ここにその全体の参照により援用される配列表を含有する。2015年4月27日に作製された当該ASCIIコピーはP05826−WO_SL.txtという名称であり、31,825バイトのサイズである。
治療抗体の開発はヒト医療の長い歴史の中の革命的な時代を表す。30種類を超える抗体がヒト治療用に認可されており、癌、自己免疫、炎症、心血管疾患、感染症、及び眼疾患をはじめとする広範囲の主要な疾患に対して250種類を超える抗体が世界中で臨床開発中である。モノクローナル抗体製品市場は過去十年にわたってトラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、インフリキシマブ及びアダリムマブのようなブロックバスター薬の成功によって押し上げられて指数関数的に成長している。これらの第1世代抗体治療薬は多数の患者の役に立ってきたが、抗体技術の進歩と作用機序の理解の深化によってさらに効力が高く、且つ、副作用がより少ない改良型の抗体への道筋がつけられている。
抗体治療薬の開発成功と実行可能な使用により、小有機分子及び無機分子である伝統的な医薬と比較して多数のユニークな課題が突きつけられている。全てのタンパク質のように抗体の物理的特性はそれらの挙動の重要な決定因子であり、発現、精製、製剤、貯蔵、送達、薬物動態学、免疫原性及び投与計画に関して治療薬の開発に重大な影響を有する。それら多数の特性のうち、タンパク質安定性が候補抗体の特質と有望な治療薬としてのその好ましさを規定する主要な特性である。
タンパク質療法は所望の効力を達成するために高用量のそのタンパク質を患者に送達することを多くの場合に必要とする。一方である特定の投与経路は送達時間、体積、及び物理的な力などの前記高用量のタンパク質が高濃度製剤(例えば、少なくとも100mg/ml)の状態であることを必要とする制約と関連している。しかしながら、高濃縮タンパク質製剤は安定性、溶解性、粘性及び他のタンパク質特性に関する特定の課題を突きつける。
タンパク質は不安定であり得、複数の物理的及び化学的分解経路を介して分解し得る。物理的不安定性は主に2つの経路、すなわち、変性と凝集を介して生じ、一方で化学的不安定性は脱アミド化、異性化、架橋、酸化、及び断片化などの多数の経路を介して生じ得る。抗体不安定性は活性型薬品量の減少とインビボ効力の低下、治療薬のバッチ間の変動性の上昇、及びおそらくは最も重要なことに患者における凝集物と分解物に対する免疫原性につながり得るので抗体不安定性は薬品開発にとって望ましくない。Wang et al (2007) J. Pharm. Sci. 96:1−26、Moore et al (1980) J Clin Endocrinology & Metabolism 51: 691−697、Rosenberg et al (2006) AAPSJ 8:E501−7、Joubert et al (2011) J Biol Chem 286: 25118−25133、Joubert et al (2012) J Biol Chem(2012) 286:25266−79)。
抗体は大きなマルチドメインタンパク質であり、抗体の安定性及び凝集性向に寄与する因子は複合的であり、温度、pH、濃度、イオン強度及び物理的ストレスなどの多数の外因性条件を含む。そのタンパク質自体の一次配列が同様に重要である。本来Fc領域は特定のアイソタイプの抗体の間では大部分で同一であるが、Fab領域は非常に異なる。したがって、大部分はFab配列の差異と抗体の特定の抗原特異性に起因して抗体間で安定性と凝集性向に重大な違いがある。Lowe et al. (2011) Adv. Protein Chem. Struct Biol. 84:41−61。
補体系は免疫複合体除去ならびに感染性因子、外来性抗原、ウイルス感染細胞、及び腫瘍細胞に対する免疫応答において中心的な役割を果たす。しかしながら、補体は病的炎症及び自己免疫疾患にも関係する。したがって、補体カスケードの過剰活性化または無制御活性化の抑制によってそのような疾患及び症状を有する患者に臨床的利益を与える可能性がある。
補体系は古典的経路と副経路と呼ばれる2つの別個の活性化経路を包含する(V.M. Holers、Clinical Immunology内、Principles and Practice、R.R. Rich編、Mosby Press、1996、363−391)。古典的経路は通常は抗原抗体複合体の形成によって活性化されるカルシウム/マグネシウム依存的カスケードである。副経路はある特定の感受性表面上(例えば酵母及び細菌の細胞壁多糖類、及びある特定の生体高分子物質)でのC3の沈着と活性化によって活性化されるマグネシウム依存的カスケードである。補体経路の活性化によって補体タンパク質の生物活性断片、例えばC3a、C4a及びC5aアナフィラトキシン及びC5b−9膜侵襲複合体(MAC)が作製され、それらは白血球走化性、マクロファージ、好中球、血小板、肥満細胞及び内皮細胞の活性化、血管透過性、細胞溶解、ならびに組織傷害を含む炎症活性を媒介する。
D因子は副補体経路の活性化に必須である非常に特異的なセリンプロテアーゼである。それはC3bに結合したB因子を切断し、副経路C3/C5コンバターゼの活性要素であるC3b/Bb酵素を作製する。D因子は、ヒトにおけるその血漿濃度は非常に低い(1.8μg/ml)ので、適切な阻害標的であり得、それは副補体経路の活性化の限定化酵素であることが示されている(P.H. Lesavre and H.J. Muller−Eberhard. (1978) J. Exp. Med. 148: 1498−1510、J.E. Volanakis et al. (1985) New Eng. J. Med. 312: 395−401)。
補体活性化の下方制御が動物モデル及び生体外試験で幾つかの疾患適応症、例えば全身性エリテマトーデスと糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、心肺バイパスと血液透析、臓器移植の超急性拒絶反応、心筋梗塞、再灌流損傷、及び成人呼吸促迫症候群の治療に有効であることが示されている。加えて、熱傷、重症喘息、アナフィラキシーショック、腸炎、じん麻疹、血管浮腫、脈管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、膜性増殖性糸球体腎炎、及びシェーグレン症候群をはじめとする他の炎症性症状及び自己免疫/免疫複合体疾患も補体活性化と密接に関連する。
加齢黄斑変性(AMD)は視力に対する重大な結果を有する中心網膜の進行性慢性疾患である。Lim et al. (2012) Lancet 379:1728。後期型のその疾患は工業化諸国における視力喪失の主因である。40歳以上の白人集団について、初期AMDの有病率は6.8%と推計され、進行期AMDは1.5%と推計される。de Jong (2006) N. Engl. J. Med. 355: 1474。後期AMDの有病率は80歳以降では加齢と共に11.8%まで劇的に上昇する。非滲出(乾燥)型AMDと滲出(湿潤)型AMDの2種類のAMDが存在する。より一般的な乾燥型AMDは中心網膜の下にある網膜色素上皮(RPE)における萎縮性及び肥大性の変化(黄斑)ならびにRPE上の沈着(ドルーゼン)を伴う。進行期乾燥型AMDは地図状萎縮(GA)をはじめとする重大な網膜損傷を引き起こすことがあり得、不可逆的な視力喪失を伴う。また、乾燥型AMDの患者は湿潤型に進行することがあり得、湿潤型では脈絡膜新生血管膜(CNVM)と呼ばれる異常血管が網膜の下に発生し、体液と血液を漏出し、且つ、究極的には失明を引き起こす円板上瘢痕組織を網膜の中及び下に生じさせる。
新血管形成(血管新生)を標的とする薬品が湿潤型AMD治療の中核となっている。ラニビズマブは抗VEGFA抗体断片であり、湿潤型AMDに悩む患者の視力改善に非常に有効であることが示されている。最近の研究によってAMDと補体カスケードにおける重要なタンパク質との間に関係があるとされており、乾燥型AMDを治療するために特定の補体要素を標的とする多数の治療法が開発されているところである。D因子上の非活性部位への結合を介してD因子と副補体経路を強力に阻害するヒト化抗D因子Fab断片(aFD、ランパリズマブ、FCFD4514S)が乾燥型AMD関連性GAの治療のために現在臨床開発されている。Katschke et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:12886。ランパリズマブの毎月の硝子体内注射が進行期乾燥型AMDの患者におけるGA病変の進行を効果的に遅らせたことが最近の第II相治験によって示されている。
眼は眼球薬品送達をより困難だがやりがいのあるものにする多数のユニークな生物物理的特徴及び解剖的特徴を有する。例えば、血液眼球関門は眼を感染から守るための防御機構であるが、それは同時に薬品が、特に後眼部の疾患向けの薬品が透過することを困難にする。その結果、効力を改善するために薬品のその場での生物学的利用能(例えば、眼球滞留時間)を達成及び維持する高用量投与が望ましいことが多い。一方、眼球後部の空間が限られていることが送達される薬品の体積を抑制し、そのことが今度は薬品が高濃度製剤で送達されることを要求する。
眼疾患を有する患者は治療薬の長期作用性/徐放性送達から利益を得ることもあり得る。低い投与頻度は改善された利便性を患者にもたらし、感染率の低下と臨床効力の増加という潜在的な利益を有することになる。高用量薬品の制御放出は薬品の副作用を最小限にする可能性もある。長期作用性送達向けの2つの有望な系はPLGA系固体移植物と移植可能ポート送達系(PDS)である。両方の系が長期間にわたってほぼゼロ次放出カイネティクスを提供する潜在力を有する。PLGA移植物について、タンパク質薬品が疎水性高分子マトリックスにカプセル化され、その高分子のゆっくりとした加水分解を介して薬品放出が達成される。その放出速度は薬品負荷量、高分子疎水性、または高分子分子量を変えることで制御され得る。PDSは硝子体への放出がチタンフリットを含む多孔性金属膜によって制御される再充填可能器具である。その貯蔵器は低容量であるので高タンパク質濃度がそのPDSを用いる効果的な送達に必要である。
高濃度及び長期作用性送達に加えて、またはそれらの代わりに薬品の生物学的利用能(例えば、眼球滞留時間)の上昇が、そのタンパク質薬品が天然または合成高分子と共有結合で複合体化されるポリシアル酸化、HES化(ヒドロキシエチルデンプンとの複合体化)及びPEG化などの翻訳後修飾によって達成または促進され得る。Chen et al (2011) Expert. Opin. Drug Deliv. 8:1221−36、Kontermann (2009) BioDrugs 23:93−109。PEG化は高分子ポリエチレングリコール(PEG)のタンパク質への共有結合であり、抗体断片治療薬の半減期の延長に特に有用な充分に確立された技術である。Jevsevar et al. (2010) Biotech. J. 5:113−128。
薬品が曝露される条件は使用される送達系に応じて変化する。固体PLGA移植物へ組み込むために凍結乾燥薬品またはスプレー乾燥薬品が使用される。薬品が90℃に近づいている温度に曝露される時間がわずかであるように移植物はホットメルト射出成形を用いて作製される。その薬品は放出期間にわたって固体状態のままであるが、その薬品はPLGAの分解によって低pH環境に曝露され得る。対照的に、PDSで送達される薬品は液体状態で高濃度に維持され、生理学的イオン強度及びpHにおいて還元的環境として特徴づけられる硝子体に曝露される。
したがって、安定性が改善しており、好ましくは高濃度製剤及び/または長期作用性送達に適切である抗D因子抗体の大きな必要性が存在する。
本発明は、抗体中の特定されたホットスポットの標的アミノ酸置換によりその抗体の安定性と治療薬としての全体的な効力が効果的に改善され得るという発見に部分的に基づく。
1つの態様では本発明は安定性が改善された抗D因子抗体変異体に関する。本発明には基準抗D因子抗体の超可変領域(HVR)内の少なくとも1個の標的アスパラギン酸(DまたはAsp)残基の置換を含む抗D因子抗体変異体であって、標的Asp残基が異性化しやすいものと特定されており、且つ、置換がAspからグルタミン酸(EまたはGlu)への置換であり、基準抗D因子抗体と比較するとD因子結合親和性をあまり失わずに改善された安定性を示す抗D因子抗体変異体が含まれる。幾つかの態様では置換の対象である標的Asp残基はXaaがAsp、Gly、His、SerまたはThrであるAsp−Xaaモチーフ内に存在する。1つの態様では標的Asp残基はAsp−Asp(DD)モチーフの1番目のAspである。1つの態様では抗D因子抗体変異体は、抗体の全体的な電荷を減少させることでその抗体の溶解性を改善するためにAspからセリン(SまたはSer)への置換である1か所以上の置換を基準抗D因子抗体のHVR内の追加Asp部位に含む。1つの態様では抗D因子抗体変異体は、抗体の脱アミド化を減少させる、または無くすためにAsnからSerへの置換である1か所以上の置換を脱アミド化しやすいと特定されたアスパラギン(NまたはAsn)部位に含む。
1つの態様では本発明の抗体変異体を作製するために使用される基準抗D因子抗体は配列番号3の軽鎖可変ドメイン配列、配列番号4の重鎖可変ドメイン配列、またはそれらの両方を含む。その後、その結果生じる抗体変異体は配列番号11の軽鎖HVR1(HVR−L1)配列と配列番号12の重鎖HVR2(HVR−H2)配列を含み得るか、または配列番号13の軽鎖HVR3(HVR−L3)配列を含み得るか、または配列番号14の軽鎖HVR1(HVR−L1)配列と配列番号12の重鎖HVR2(HVR−H2)配列を含み得るか、または配列番号15の重鎖HVR3(HVR−H3)配列を含み得る。
1つの態様では本発明の抗D因子抗体変異体は配列番号1の軽鎖配列と配列番号2の重鎖配列を含む基準抗D因子抗体の変異体であって、基準抗D因子抗体に対して次の配列改変、すなわち、配列番号11の軽鎖HVR1(HVR−L1)配列と配列番号12の重鎖HVR2(HVR−H2)配列を含む変異体である。そのような変異体は本明細書において下の実施例で「TM」変異体(AFD.v6)と呼ばれる(例えば表1を参照されたい)。
1つの態様では本発明の抗D因子抗体変異体は配列番号1の軽鎖配列と配列番号2の重鎖配列を含む基準抗D因子抗体の変異体であって、基準抗D因子抗体に対して次の配列改変、すなわち、配列番号11の軽鎖HVR1(HVR−L1)配列、配列番号12の重鎖HVR2(HVR−H2)配列及び配列番号13の軽鎖HVR3(HVR−L3)配列を含む変異体である。そのような変異体は本明細書において下の実施例で「TM.D92E」変異体(AFD.v7)と呼ばれる(例えば表1を参照されたい)。
1つの態様では本発明の抗D因子抗体変異体は配列番号1の軽鎖配列と配列番号2の重鎖配列を含む基準抗D因子抗体の変異体であって、基準抗D因子抗体に対して次の配列改変、すなわち、配列番号14の軽鎖HVR1(HVR−L1)配列と配列番号12の重鎖HVR2(HVR−H2)配列を含む変異体である。そのような変異体は本明細書において下の実施例で「SIESD」変異体(AFD.v8)と呼ばれる(例えば表1を参照されたい)。1つの実施形態では「SIESD」変異体(AFD.v8)は配列番号26の軽鎖配列と配列番号27の重鎖配列を含む。1つの実施形態ではCys修飾型の「SIESD」変異体は配列番号30の重鎖配列を含む。1つの実施形態ではCys−Pro−Pro−Cys修飾型の「SIESD」変異体は配列番号31の重鎖配列を含む。
1つの態様では本発明の抗D因子抗体変異体は配列番号1の軽鎖配列と配列番号2の重鎖配列を含む基準抗D因子抗体の変異体であって、基準抗D因子抗体に対して次の配列改変、すなわち、配列番号14の軽鎖HVR1(HVR−L1)配列、配列番号12の重鎖HVR2(HVR−H2)配列及び配列番号15の重鎖HVR3(HVR−H3)配列を含む変異体である。そのような変異体は本明細書において下の実施例で「SIESD.N103S」変異体(AFD.v14)と呼ばれる(例えば表1を参照されたい)。1つの実施形態では「SIESD.N103S」変異体(AFD.v14)は配列番号28の軽鎖配列と配列番号29の重鎖配列を含む。1つの実施形態ではCys修飾型の「SIESD.N103S」変異体は配列番号32の重鎖配列を含む。1つの実施形態ではCys−Pro−Pro−Cys修飾型の「SIESD」変異体は配列番号33の重鎖配列を含む。
1つの態様では本発明は基準抗D因子抗体のHVR内に1か所以上の置換を含む抗D因子抗体変異体に関する。1つの態様では基準抗D因子抗体は次のHVR配列を含む:
HVR−L1:ITSTDIDDDMN(配列番号5)、
HVR−L2:GGNTLRP(配列番号6)、
HVR−L3:LQSDSLPYT(配列番号7)、
HVR−H1:GYTFTNYGMN(配列番号8)、
HVR−H2:WINTYTGETTYADDFKG(配列番号9)、及び
HVR−H3:EGGVNN(配列番号10)。
そしてそれらの対応する変異体は次の置換、すなわち、
(a)配列番号5におけるD5S、
(b)配列番号5におけるD7E、
(c)配列番号5におけるD8S(配列番号22において開示されるa、b、及びc)、
(d)配列番号9におけるD13E(配列番号23)、
(e)配列番号7におけるD4E(配列番号24)、または
(f)配列番号10におけるN5S(配列番号25)
のうちの1つ以上を含む。
HVR−L1:ITSTDIDDDMN(配列番号5)、
HVR−L2:GGNTLRP(配列番号6)、
HVR−L3:LQSDSLPYT(配列番号7)、
HVR−H1:GYTFTNYGMN(配列番号8)、
HVR−H2:WINTYTGETTYADDFKG(配列番号9)、及び
HVR−H3:EGGVNN(配列番号10)。
そしてそれらの対応する変異体は次の置換、すなわち、
(a)配列番号5におけるD5S、
(b)配列番号5におけるD7E、
(c)配列番号5におけるD8S(配列番号22において開示されるa、b、及びc)、
(d)配列番号9におけるD13E(配列番号23)、
(e)配列番号7におけるD4E(配列番号24)、または
(f)配列番号10におけるN5S(配列番号25)
のうちの1つ以上を含む。
1つの態様では本発明の変異体は上記の置換(b)〜(d)を含む。別の態様では変異体は上記の置換(b)〜(e)を含む。別の態様では変異体は上記の置換(a)〜(d)を含む。別の態様では変異体は上記の置換(a)〜(d)及び(f)を含む。
1つの態様では本発明は配列番号16、18または19の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗D因子抗体に関する。別の態様では本発明は配列番号17または20の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗D因子抗体に関する。別の態様では抗D因子抗体は配列番号16、18または19の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と配列番号17または20の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。例えば、抗D因子抗体は配列番号16の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と配列番号17の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む「TM」変異体(AFD.v6)、配列番号18の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と配列番号17の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む「TM.D92E」変異体(AFD.v7)、配列番号19の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と配列番号17の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む「SIESD」変異体(AFD.v8)、または配列番号19の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と配列番号20の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む「SIESD.N103S」変異体(AFD.v14)であり得る。
1つの態様では本発明は配列番号11または14の配列を有するHVR−L1、配列番号6の配列を有するHVR−L2、及び配列番号7または13の配列を有するHVR−L3を含む可変軽鎖、及び配列番号8の配列を有するHVR−H1、配列番号9または12の配列を有するHVR−H2、及び配列番号10または15の配列を有するHVR−H3を含む可変重鎖を有する抗D因子抗体に関する。例えば、抗D因子抗体は次の6つのHVR配列、すなわち、HVR−L1(配列番号14)、HVR−L2(配列番号6)、HVR−L3(配列番号7)、HVR−H1(配列番号8)、HVR−H2(配列番号12)、及びHVR−H3(配列番号10)を含む「SIESD」変異体(AFD.v8)、または次の6つのHVR配列、すなわち、HVR−L1(配列番号14)、HVR−L2(配列番号6)、HVR−L3(配列番号7)、HVR−H1(配列番号8)、HVR−H2(配列番号12)、及びHVR−H3(配列番号15)を含む「SIESD.N103S」変異体(AFD.v14)であり得る。
1つの態様では本発明は、異性化を無くす、または減少させるための方法であって、(a)基準抗D因子抗体のHVR内にあるAsp異性化しやすい1個以上のAsp残基の特定、(b)ステップ(a)で特定されたAsp残基のGluによる置換、(c)その結果生じた候補変異体のAsp異性化についてのスクリーニング、及び(d)検出可能なAsp異性化を有しない変異体の選択を含む方法によって作製される検出可能なAsp異性化を有しない抗D因子抗体変異体に関する。1つの態様では上記の方法は、脱アミド化を無くす、または減少させるための方法であって、(a)基準抗D因子抗体のHVR内にある脱アミド化しやすい1個以上のAsn残基の特定、(b)ステップ(a)で特定されたAsn残基のSerによる置換、(c)その結果生じた候補変異体の脱アミド化についてのスクリーニング、及び(d)脱アミド化が減少した、または無くなった変異体の選択を含む方法と組み合わせられる。別の態様では異性化を無くす、または減少させるための方法は、(a)基準抗D因子抗体のHVR内にある1個以上の負に帯電したアミノ酸残基DまたはEを選択し、(b)ステップ(a)で選択された残基をSerによって置換し、(c)その結果生じた候補変異体を溶解性についてスクリーニングし、且つ、(d)基準抗D因子抗体と比較すると改善された溶解性を有する変異体を選択することによって抗体の全体的な電荷を減少させるための方法と組み合わせられる。
1つの態様では本発明の抗D因子抗体変異体は基準抗D因子抗体と比較するとD因子結合親和性を維持しつつ改善された安定性を有する。1つの態様では本発明の抗体は少なくとも約10−9から10−12Mの結合親和性でD因子に結合する。1つの態様では本発明の抗体にはヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体が含まれる。
1つの態様では本発明の抗体は抗体断片(例えば抗原結合断片)である。本発明の抗体断片は、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、(scFv)2、dAb、相補性決定領域(CDR)断片、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ディアボディ、または抗体断片から形成される多重特異性抗体であり得る。
本発明の他の態様では本発明には本発明の抗体を含む組成物が含まれる。別の態様では本発明は本明細書に記載されるように担体と組み合わせて本発明の抗体を含む組成物に関する。担体は薬学的に許容可能な担体でもよい。
1つの態様では本発明には上記の抗体または抗体変異体を治療有効濃度で含む医薬製剤が含まれる。幾つかの態様では医薬製剤は抗体または抗体変異体を少なくとも100mg/mlの濃度、100〜150mg/mlの間の濃度、100〜200mg/mlの間の濃度、100〜300mg/mlの間の濃度、100〜400mg/mlの間の濃度、100〜500mg/mlの間の濃度、少なくとも200mg/mlの濃度、少なくとも300mg/mlの濃度、少なくとも400mg/mlの濃度、または少なくとも500mg/mlの濃度で含む。幾つかの態様では製剤中の抗体または抗体変異体の濃度は約200、250、300、350、400、450または500mg/mlである。1つの態様では製剤中の抗体または抗体変異体の濃度は450mg/ml未満である。
本発明の別の態様は過剰補体活性化または無制御補体活性化と関連する疾患の治療用に本発明の抗体を使用することである。それらの疾患には心肺バイパス手術時の補体活性化、急性心筋梗塞、動脈瘤、脳卒中、出血性ショック、挫傷、多臓器不全、血液量減少性(hypobolemic)ショック、腸管虚血または虚血の原因になる他の事象の後の虚血再灌流に起因する補体活性化が含まれる。補体活性化は重症の火傷、内毒素血症、敗血症性ショック、成人呼吸促迫症候群、血液透析などの炎症症状;アナフィラキシーショック、重症喘息、血管浮腫、クローン病、鎌状赤血球貧血、溶連菌感染後糸球体腎炎及び膵臓炎と関連することも示されている。疾患は有害薬物反応、薬品アレルギー、IL−2誘導性血管漏出症候群またはX線撮影造影剤アレルギーの結果であり得る。その疾患には全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、リウマチ性関節炎、アルツハイマー病及び多発性硬化症などの自己免疫疾患も含まれる。別の実施形態では補体活性化は移植拒絶反応とも関連する。別の実施形態では補体活性化は眼疾患(補体の古典的経路及び副経路を含む、補体が病理に関与する全ての眼症状及び眼疾患)、例えば、限定されないが、乾燥型及び湿潤型(非滲出型及び滲出型)を含む全てのステージの加齢黄斑変性(AMD)などの黄斑変性症、糖尿病性網膜症及び他の虚血性網膜症、脈絡膜血管新生(CNV)、ぶどう膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、及び網膜血管新生などとも関連する。一例では補体関連眼疾患には非滲出型AMD(例えば中期乾燥型AMDまたは地図状萎縮(GA))及び滲出型AMD(例えば湿潤型AMD(脈絡膜血管新生(CNV))を含む加齢黄斑変性(AMD)、糖尿病性網膜症(DR)、眼内炎及びぶどう膜炎が含まれる。追加の例では非滲出型AMDは硬性ドルーゼン、軟性ドルーゼン、地図状萎縮及び/またはピグメント・クランピングの存在を含み得る。別の例では補体関連眼疾患には初期AMD(例えば、複数の小さなサイズのドルーゼンから1つ以上の大きくない中程度のサイズのドルーゼンを含む)、中期AMD(例えば、大きな中程度のドルーゼンから1つ以上の大きなドルーゼンを含む)及び進行期AMD(例えば、地図状萎縮または進行湿潤型AMD(CNV)を含む)をはじめとする加齢黄斑変性(AMD)が含まれる。追加の例では中期乾燥型AMDは大きな集密的ドルーゼンを含み得る。追加の例では地図状萎縮は光受容体及び/または網膜色素上皮(RPE)の喪失を含み得る。追加の例では地図状萎縮領域は小さくても大きくてもよく、及び/または黄斑領域の中にあっても周辺部網膜の中にあってもよい。一例では補体関連眼疾患は中期乾燥型AMDである。一例では補体関連眼疾患は地図状萎縮である。一例では補体関連眼疾患は湿潤型AMD(脈絡膜血管新生(CNV))である。
別の態様では本発明は本発明の抗体を含むキットを提供する。1つの実施形態では本発明は本発明の抗体と取扱説明書を含むキットを提供する。1つの実施形態では本発明は補体関連疾患を治療するための本発明の抗体と抗体の投与指示書を含むキットに関する。1つの実施形態では本発明は本発明の1つ以上の1つ以上の抗体を含む組成物を含む第1容器と緩衝液を含む第2容器を含むキットを提供する。1つの実施形態では緩衝液は薬学的に許容可能である。1つの実施形態では本発明の抗体を含む組成物は担体をさらに含み、幾つかの実施形態ではその担体は薬学的に許容可能である。1つの実施形態ではキットは対象に組成物(例えば抗体またはその抗体断片(例えば抗原結合断片))を投与するための指示書をさらに含む。1つの実施形態ではキットはそのキットの取扱説明書をさらに含む。
1つの態様では本発明は補体関連疾患の治療、予防、及び/または診断に有用な物質を含有する製品に関する。1つの実施形態では本発明は、(a)容器、(b)その容器上のラベル、及び(c)容器に入っている本発明の抗体を含む組成物を備える製品であって、補体関連疾患の治療、予防、及び/または診断に組成物を使用することができると容器上のラベルが示している製品に関する。
1つの態様では本発明は補体関連眼疾患などの疾患の治療処置及び/または予防処置のための医薬の調製における本発明の抗D因子抗体の使用法を提供する。1つの実施形態では補体関連眼疾患は非滲出型AMD(例えば中期乾燥型AMDまたは地図状萎縮(GA))及び滲出型AMD(例えば湿潤型AMD(脈絡膜血管新生(CNV))を含む加齢黄斑変性(AMD)、糖尿病性網膜症(DR)、眼内炎及びぶどう膜炎から選択される。一例では補体関連眼疾患は中期乾燥型AMDである。一例では補体関連眼疾患は地図状萎縮である。一例では補体関連眼疾患は湿潤型AMD(脈絡膜血管新生(CNV))である。
1つの態様では本発明は補体関連眼疾患などの疾患の治療処置及び/または予防処置のための医薬の調製における本発明の製品の使用法を提供する。1つの実施形態では補体関連眼疾患は非滲出型AMD(例えば中期乾燥型AMDまたは地図状萎縮(GA))及び滲出型AMD(例えば湿潤型AMD(脈絡膜血管新生(CNV))を含む加齢黄斑変性(AMD)、糖尿病性網膜症(DR)、眼内炎及びぶどう膜炎から選択される。一例では補体関連眼疾患は中期乾燥型AMDである。一例では補体関連眼疾患は地図状萎縮である。一例では補体関連眼疾患は湿潤型AMD(脈絡膜血管新生(CNV))である。
1つの態様では本発明は補体関連眼疾患などの疾患の治療処置及び/または予防処置のための医薬の調製における本発明のキットの使用法を提供する。1つの実施形態では補体関連眼疾患は非滲出型AMD(例えば中期乾燥型AMDまたは地図状萎縮(GA))及び滲出型AMD(例えば湿潤型AMD(脈絡膜血管新生(CNV))を含む加齢黄斑変性(AMD)、糖尿病性網膜症(DR)、眼内炎及びぶどう膜炎から選択される。一例では補体関連眼疾患は中期乾燥型AMDである。一例では補体関連眼疾患は地図状萎縮である。一例では補体関連眼疾患は湿潤型AMD(脈絡膜血管新生(CNV))である。
1つの態様では本発明はD因子アンタゴニストとHTRA1アンタゴニストを提供する。1つの実施形態ではD因子アンタゴニストは抗D因子抗体である。追加の実施形態では抗D因子抗体は本明細書に記載される抗D因子抗体変異体である。1つの実施形態ではHTRA1アンタゴニストは抗HTRA1抗体である。
1つの態様では過剰補体活性化または無制御補体活性化と関連する疾患を有するヒト対象における過剰補体活性化または無制御補体活性化と関連する疾患の治療はD因子アンタゴニストなどの治療化合物の有効量を対象に投与することを含み、HTRA1アンタゴニストなどの第2治療化合物の有効量を対象に投与することをさらに含む。1つの実施形態ではD因子アンタゴニストは抗D因子抗体である。1つの実施形態では抗D因子抗体は本明細書に記載される抗D因子抗体変異体である。1つの実施形態ではHTRA1アンタゴニストは抗HTRA1抗体である。1つの実施形態ではD因子アンタゴニストは抗D因子抗体であり、HTRA1アンタゴニストは抗HTRA1抗体である。
1つの態様ではD因子アンタゴニストといずれかの第2治療化合物の投与は、例えば、単一の組成物として、または2つ以上の別個の組成物として同じ投与経路または異なる投与経路を用いて同時に行われ得る。あるいは、または加えて、投与は任意の順序で順次行われ得る。
定義
本願を通して使用される用語は当業者にとって一般的で普通の意味によって解釈されるものとする。しかしながら、出願人は以下の用語に下で定義される特定の定義が与えられることを望む。
本願を通して使用される用語は当業者にとって一般的で普通の意味によって解釈されるものとする。しかしながら、出願人は以下の用語に下で定義される特定の定義が与えられることを望む。
「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、抗原結合活性などの所望の生物活性を示す限り具体的には全長型モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二特異性抗体)及び抗体断片を範囲とする。抗体(Ab)及び免疫グロブリン(Ig)は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体が特定の標的への結合特異性を示す一方で免疫グロブリンには抗体と標的特異性を失っている他の抗体様分子の両方が含まれる。天然の抗体及び免疫グロブリンは通常は2本の同一の軽(L)鎖と2本の同一の重(H)鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。それぞれの重鎖は一端に可変ドメイン(VH)を有し、続いてある数の定常ドメインを有する。それぞれの軽鎖は一端に可変ドメイン(VL)を有し、その他方の末端に定常ドメインを有する。本明細書において使用される「抗体」という用語は抗原結合活性を保持する抗体断片を明示的に包含する。
「抗体断片」は完全抗体の一部を含む完全抗体以外の分子であって、その完全抗体が結合する抗原に結合するその分子を指す。抗体断片の例にはFv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、ディアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子(例えばscFv)、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「抗D因子抗体」は補体活性化を抑制するように、または実質的に低下させるようにD因子に特異的に結合する抗体を意味する。
「D因子」という用語は天然配列及び変異体のD因子ポリペプチドを指すために本明細書において使用される。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は抗体の抗原への結合に関与するその抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン(それぞれVH及びVL)は一般的に同様の構造を有しており、それぞれのドメインが4つの保存されたフレームワーク領域(FR)と3つの超可変領域(HVR)を備える(例えば、Kindt et al. Kuby Immunology、第6版、W.H. Freeman and Co.、91頁(2007)を参照されたい)。抗原結合特異性を付与するには単一のVHドメインまたはVLドメインで充分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体のVHドメインまたはVLドメインを使用してそれぞれ相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングして単離され得る。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880−887 (1993)、 Clarkson et al., Nature 352:624−628 (1991)を参照されたい。
「可変」という用語は可変ドメインのある特定の部分が配列に関して抗体間で非常に異なっており、且つ、それぞれ特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性にそれらの部分が使用されるという事実を指す。しかしながら、その可変性は抗体可変ドメインを通して均一に分布されているのではない。その可変性は軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方の中にある超可変領域と呼ばれる3つの区域に集中している。可変ドメインの保存性がより高い部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ4つのFRを含み、それらのFRは大部分がβシート構成を採り、3つの超可変領域によって接続されており、それらの超可変領域はそのβシート構造を接続するループを形成し、幾つかの事例ではそのβシート構造の一部を形成する。それぞれの鎖の超可変領域はFRによって近接した状態で一緒に保持されており、他の鎖の超可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、公衆衛生局、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州(1991)を参照されたい)。定常ドメインは抗体の抗原への結合には直接的に関与していないが、抗体依存性細胞傷害(ADCC)への抗体の関与など、様々なエフェクター機能を示す。
抗体のパパイン消化によって「Fab」断片と呼ばれるそれぞれ単一の抗原結合部位を有する2つの同一の抗原結合断片、及び容易に結晶化する能力を反映する名前を有する残りの「Fc」断片が作製される。ペプシン消化によって2つの抗原結合部位を有し、且つ、依然として抗原の架橋が可能であるF(ab’)2が産生される。
Fab断片は軽鎖の定常ドメインと重鎖の第1定常ドメイン(CH1)も含む。Fab’断片は抗体ヒンジ領域に由来する1個以上のシステインを含む数個の残基を重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に付加していることでFab断片と異なる。Fab’−SHは定常ドメインのシステイン残基が少なくとも1つの遊離チオール基を担持しているFab’に対しての本明細書における名称である。F(ab’)2抗体断片はヒンジシステインを間に有しているFab’断片対としてもともと作製された。抗体断片の他の化学的連結体も知られている。
「Fv」は完全抗原認識抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域はしっかりと非共有結合で結合した1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この構成で各可変ドメインの3つの超可変領域が相互作用してそのVH−VL二量体の表面上に抗原結合部位を規定する。まとめると、それら6つの超可変領域がその抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン(抗原に特異的な3つの超可変領域だけを含む半分のFv)であっても完全な結合部位よりも低い親和性ではあるが抗原を認識し、結合する能力を有する。
「超可変領域」または「HVR」という用語は本明細書において使用される場合に配列において超可変的であり、且つ/または構造的に規定されたループ(「超可変ループ」)を形成する抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般的に天然四本鎖抗体は6つのHVR、すなわち、VH中の3つ(H1、H2、H3)とVL中の3つ(L1、L2、L3)を含む。HVRは一般的に超可変ループ及び/または「相補性決定領域」(CDR)に由来するアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性を有し、且つ/または抗原認識に関与する。HVR−H3は抗体への精密な特異性の付与に固有の役割を果たすと考えられている。例えば、Xu et al. (2000) Immunity 13:37−45、Methods in Molecular Biology、第248巻内のJohnson and Wu (2003)、1−25頁(Lo編、Human Press、トトワ、ニュージャージー州)を参照されたい。「フレームワーク領域」残基または「FR」残基は本明細書において定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。本明細書において使用されるHVR領域は位置24〜36(L1について)、位置46〜56(L2について)、位置89〜97(L3について)、位置26〜35B(H1について)、位置47〜65(H2について)、及び位置93〜102(H3について)内に位置する任意の数の残基を含む。したがって、HVRはこれまでに述べた位置、すなわち、
A)24〜34(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、及び96〜101(H3)(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901−917 (1987)、
B)L1の24〜34、L2の50〜56、L3の89〜97、H1の31〜35B、H2の50〜65、及びH3の95〜102(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、公衆衛生局、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州(1991)、
C)30〜36(L1)、46〜55(L2)、89〜96(L3)、30〜35(H1)、47〜58(H2)、93〜100a〜j(H3)(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732−745 (1996)
内の残基を含む。
A)24〜34(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、及び96〜101(H3)(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901−917 (1987)、
B)L1の24〜34、L2の50〜56、L3の89〜97、H1の31〜35B、H2の50〜65、及びH3の95〜102(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、公衆衛生局、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州(1991)、
C)30〜36(L1)、46〜55(L2)、89〜96(L3)、30〜35(H1)、47〜58(H2)、93〜100a〜j(H3)(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732−745 (1996)
内の残基を含む。
超可変領域は次のもの、すなわち、VL内の24〜36または24〜34(L1)、46〜56または50〜56(L2)及び89〜97(L3)ならびにVH内の26〜35B(H1)、50〜65、47−65または49〜65(H2)及び93〜102、94〜102または95〜102(H3)のような「拡張超可変領域」を含み得る。それらの可変ドメイン残基にはこれらの定義の各々についての上掲のKabatらの著作に従って番号が付けられている。
VH中のCDR1を例外としてCDRは超可変ループを形成するアミノ酸残基を含むことが一般的である。CDRは抗原と接触する残基である「特異性決定残基」、すなわち「SDR」も含む。SDRは短縮型CDR、すなわちa−CDRと呼ばれるCDR領域内に含まれる。例となるa−CDR(a−CDR−L1、a−CDR−L2、a−CDR−L3、a−CDR−H1、a−CDR−H2、及びa−CDR−H3)はL1のアミノ酸残基31〜34、L2のアミノ酸残基50〜55、L3のアミノ酸残基89〜96、H1のアミノ酸残基31〜35B、H2のアミノ酸残基50〜58、及びH3のアミノ酸残基95〜102に見出される(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619−1633 (2008)を参照されたい)。
基準抗体(「出発抗体」または「親抗体」とも呼ばれる)の「抗体変異体」または「改変抗体」はその基準/出発抗体のものとは異なるアミノ酸配列を含む抗体であって、基準抗体のアミノ酸残基のうちの1個以上が改変されているものである。抗体変異体は基準抗体と少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性、及び最も好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有することが一般的である。パーセンテージ配列同一性は最大相同性を提供するように基準抗体配列と候補抗体変異体配列を整列させた後に、例えば、Fitch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 1382−1386 (1983)、Needleman et al., J. Mol. Biol., 48: 443−453 (1970)によって記載される版のアルゴリズムによって決定される。同一性または類似性は、最大パーセント配列同一性を達成するように配列を整列させ、必要であればギャップを導入した後で親抗体残基と同一である(すなわち同じ残基である)または類似している(すなわち下で参照される共通の側鎖特性に基づく同じグループのアミノ酸残基である)候補変異体配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書において定義される。抗体のアミノ酸配列変異体はその抗体をコードするDNAに適切なヌクレオチド変化を導入することにより、またはペプチド合成により調製され得る。そのような変異体は、例えば、目的の抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び/またはそれらの残基への挿入、及び/またはそれらの残基の置換を含む。最終構成物が所望の特徴を有することを条件としてその最終構成物に到達するために欠失、挿入、及び置換の任意の組合せが行われる。それらのアミノ酸変化はグリコシル化部位の数または位置の変化のように抗体の翻訳後処理を変更し得る。抗体の抗体配列変異体の作製方法は、例えば、参照により本明細書に明白に援用される米国特許番号第5,534,615号明細書に記載されるポリペプチドのアミノ酸配列変異体の作製方法と同様である。
抗体をはじめとするタンパク質が未変化の高次構造及び生物活性を基本的に保持する場合にそのタンパク質は「安定である」と言われる。タンパク質安定性を測定するための様々な分析技術が当技術分野において利用可能であり、例えばPeptide and Protein Drug Delivery、247〜301頁、Vincent Lee編、Marcel Dekker社、ニューヨーク、ニューヨーク州(1991)及びJones (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29−90において論評されている。「改善された安定性」を有する抗体変異体は出発基準抗体と比較してより安定的な抗体変異体を指す。改善された安定性を有する抗体変異体は物理的安定性及び/または化学的安定性及び/または生物活性の改善、及び/または天然抗体の免疫原性の低減を目的として特定のアミノ酸残基が変更されている天然(野生型)抗体の変異体であることが好ましい。Walsh (2000) Nat. Biotech. 18:831−3。
「異性化」という用語は、化学化合物がその異性体型、すなわち、同じ化学的組成を有しているが異なる構造または構成を有しており、したがって一般的に異なる物理的及び化学的特性を有している型のうちのいずれかに変換される化学的過程を一般的に指す。ポリペプチドの1個以上のアスパラギン酸(DまたはAsp)残基がイソアスパラギン酸残基に変換されている過程であるアスパラギン酸異性化が本明細書において特に使用される。Geiger and Clarke (1987) J. Biol. Chem. 262:785−94。
「脱アミド化」という用語は有機化合物からアミド官能基が除去される化学反応を一般的に指す。ポリペプチドの1個以上のアスパラギン(NまたはAsn)残基がアスパラギン酸(DまたはAsp)に転換されている過程、すなわち中性アミド側鎖が全体的に酸性の特性を有する残基に転換されている過程であるアスパラギン脱アミド化が本明細書において特に使用される。Xie and Schowen (1999) J. Pharm. Sci. 88:8−13。
ある特定の特定された物理的または化学的過程(例えば、異性化または脱アミド化)を「起こす傾向がある」アミノ酸残基は、特定のタンパク質分子内の異性化または脱アミド化などのそれら特定の過程を経る性向を有すると特定されている残基を指す。それらの残基の傾向はそのタンパク質の一次構造及び/または高次構造内のそれらの残基の相対的位置によって決定されることが多い。例えば、Asp−XXXモチーフ(XXXはAsp、Gly、His、SerまたはThrであり得る)内の1番目のAspはその隣接する残基の関与に起因してAsp異性化しやすいことが示されており、その場合に同じタンパク質内の他の幾つかのAspはそのような性向を有しないことがあり得る。特定のタンパク質分子内のある特定の過程に至る残基を特定するためのアッセイが当技術分野において知られている。例えば、Cacia et al (1996) Biochem. 35:1897−1903を参照されたい。
本発明の抗D因子抗体の文脈での「活性の」または「活性」または「生物活性」はD因子の生物活性に拮抗する(部分的または完全に抑制する)能力である。D因子アンタゴニストの生物活性の一例はD因子関連疾患または症状、例えば、補体関連眼疾患などの状態、例えば病状のある程度の改善を達成する能力である。その活性は適切な動物モデルを使用する結合アッセイ、副経路溶血アッセイ(例えば副経路補体活性の阻害または活性化を測定するアッセイ)をはじめとするインビトロ検査またはインビボ検査、またはヒト治験において決定され得る。
「補体関連疾患」という用語は最も広い意味で使用され、過剰補体活性化または無制御補体活性化と関連する疾患を含む。それらの疾患には心肺バイパス手術時の補体活性化、急性心筋梗塞、動脈瘤、脳卒中、出血性ショック、挫傷、多臓器不全、血液量減少性(hypobolemic)ショック、腸管虚血または虚血の原因になる他の事象の後の虚血再灌流に起因する補体活性化が含まれる。補体活性化は重症の火傷、内毒素血症、敗血症性ショック、成人呼吸促迫症候群、血液透析などの炎症症状;アナフィラキシーショック、重症喘息、血管浮腫、クローン病、鎌状赤血球貧血、溶連菌感染後糸球体腎炎及び膵臓炎と関連することも示されている。当該疾患は有害薬物反応、薬品アレルギー、IL−2誘導性血管漏出症候群またはX線撮影造影剤アレルギーの結果であり得る。その疾患には全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、リウマチ性関節炎、アルツハイマー病及び多発性硬化症などの自己免疫疾患も含まれる。補体活性化は移植拒絶反応とも関連する。補体活性化は加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症及び他の虚血性網膜症、脈絡膜血管新生(CNV)、ぶどう膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、及び網膜血管新生などの眼疾患とも関連する。
「補体関連眼疾患」という用語は最も広い意味で使用され、補体の古典的経路及び副経路、特に補体の副経路を含む、補体が病理に関与する全ての眼症状を含む。補体関連眼疾患には、限定されないが、乾燥型及び湿潤型(非滲出型及び滲出型)を含む全てのステージの加齢黄斑変性(AMD)などの黄斑変性症、脈絡膜血管新生(CNV)、ぶどう膜炎、糖尿病性及び他の虚血性網膜症、ならびに糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、及び網膜血管新生などの他の眼内血管新生病が含まれる。一例では補体関連眼疾患には非滲出型AMD(例えば中期乾燥型AMDまたは地図状萎縮(GA))及び滲出型AMD(例えば湿潤型AMD(脈絡膜血管新生(CNV))を含む加齢黄斑変性(AMD)、糖尿病性網膜症(DR)、眼内炎及びぶどう膜炎が含まれる。追加の例では非滲出型AMDは硬性ドルーゼン、軟性ドルーゼン、地図状萎縮及び/またはピグメント・クランピングの存在を含み得る。一例では補体関連眼疾患には初期AMD(例えば、複数の小さなサイズのドルーゼンから1つ以上の大きくない中程度のサイズのドルーゼンを含む)、中期AMD(例えば、大きな中程度のドルーゼンから1つ以上の大きなドルーゼンを含む)及び進行期AMD(例えば、地図状萎縮または進行湿潤型AMD(CNV)を含む)をはじめとする加齢黄斑変性(AMD)が含まれる。(Ferris et al., AREDS Report No. 18、Sallo et al., Eye Res., 34(3): 238−40 (2009)、 Jager et al., New Engl. J. Med., 359(1): 1735 (2008))。追加の例では中期乾燥型AMDは大きな集密的ドルーゼンを含み得る。追加の例では地図状萎縮は光受容体及び/または網膜色素上皮(RPE)の喪失を含み得る。追加の例では地図状萎縮領域は小さくても大きくてもよく、且つ/または黄斑領域の中にあっても周辺部網膜の中にあってもよい。一例では補体関連眼疾患は中期乾燥型AMDである。一例では補体関連眼疾患は地図状萎縮である。一例では補体関連眼疾患は湿潤型AMD(脈絡膜血管新生(CNV))である。
「治療」はある疾患の病状の発生の防止またはその病状の変化を意図して実行される介入である。したがって、「治療」は治療処置と予防または防止手段の両方を指す。治療を必要とする者には既に疾患を有する者、ならびに疾患が予防されるべき者が含まれる。免疫関連疾患の治療では治療薬は免疫応答要素の応答の程度を直接的に変更し、その疾患を他の治療薬、例えば、抗生物質、抗真菌薬、抗炎症薬、化学療法薬等による治療に対してより敏感にすることができる。
補体関連眼疾患などのある疾患の「病状」にはその患者の健康状態を損なう全ての現象が含まれる。この現象には、限定されないが、異常または無制御の細胞増殖(好中球、好酸球、単球、リンパ球)、抗体生産、自己抗体生産、補体生産、隣接する細胞の正常な機能の妨害、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌性産物の放出、任意の炎症応答または免疫応答の抑制または悪化、炎症細胞(好中球、好酸球、単球、リンパ球)の細胞空間への浸潤等が含まれる。
本明細書において使用される「哺乳類動物」という用語は、限定されないが、ヒト、高等霊長類、家畜、ならびにウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、及びフェレットのような動物園動物、スポーツ用動物または愛玩動物をはじめとする哺乳類動物として分類されるあらゆる動物を指す。本発明の1つの実施形態ではその哺乳類動物はヒトである。
1種類以上の追加治療薬との「併用」投与には同時(並行)投与及び任意の順序の順次投与が含まれる。
「治療有効量」は標的疾患または症状、例えば、補体関連眼疾患などの状態、例えば病状の測定できるの改善を達成するために必要とされる「D因子アンタゴニスト」の量である。
「アミノ酸置換」は所定のアミノ酸配列内の少なくとも1個の既存のアミノ酸残基の別の異なる「置換」アミノ酸残基による置換を指す。その置換残基またはそれらの置換残基は「天然アミノ酸残基」(すなわち、遺伝コードによってコードされるアミノ酸残基)であり得、アラニン(ala)、アルギニン(Arg)、アスパラギン(Asn)、アスパラギン酸(Asp)、システイン(Cys)、グルタミン(Gln)、グルタミン酸(Glu)、グリシン(Gly)、ヒスチジン(His)、イソロイシン(Ile)、ロイシン(Leu)、リシン(Lys)、メチオニン(Met)、フェニルアラニン(Phe)、プロリン(Pro)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)、及びバリン(Val)からなる群より選択され得る。1つ以上の非天然アミノ酸残基による置換も本明細書におけるアミノ酸置換の定義に包含される。「非天然アミノ酸残基」は上記の天然アミノ酸残基以外の残基であって、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基と共有結合可能である残基を指す。非天然アミノ酸残基の例にはノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及びEllman et al., Meth. Enzym, 202: 301−336 (1991)に記載されるアミノ酸残基類似体のような他のアミノ酸残基類似体が含まれる。そのような非天然アミノ酸残基を作製するため、Noren et al., Science, 244: 182 (1989)及び上掲のEllmanらの手法を使用することができる。簡単に説明すると、これらの手法は非天然アミノ酸残基とのサプレッサーtRNAの化学的活性化とそれに続くRNAのインビトロ転写とインビトロ翻訳を含む。
「アミノ酸挿入」は少なくとも1個のアミノ酸の所定のアミノ酸配列への組込みを指す。その挿入は1個または2個のアミノ酸残基の挿入からなることが通常であるが、本願はより大きな「ペプチド挿入」、例えば、約3個から約5個、または最大で約10個ものアミノ酸残基の挿入を企図する。挿入残基は上で開示されたような天然残基または非天然残基であり得る。
「アミノ酸欠失」は所定のアミノ酸配列からの少なくとも1個のアミノ酸残基の除去を指す。
「長期作用性送達」、「持続放出」及び「制御放出」という用語は治療薬品の長期または持続性の放出または生物学的利用能を達成するために製剤、剤形、装置または他の種類の技術を使用する送達機構を説明するために一般的に使用される。その用語は全身循環または対象に対して、または(限定されないが)細胞、組織、器官、関節、領域等を含む対象中の局所的作用部位に対して薬品の長期または持続性の放出または生物学的利用能を提供する技術を指す。さらに、これらの用語は製剤または剤形からの薬品の放出を長期化または延長するために使用される技術を指してよく、またはそれらの用語は対象に対する薬品の生物学的利用能または薬物動態または作用期間を延長または長期化するために使用される技術を指してよく、またはそれらの用語は製剤によって引き出される薬力学効果を延長または長期化するために使用される技術を指してよい。「長期作用性製剤」、「持続放出性製剤」、または「制御放出製剤」は長期作用性送達をもたらすために使用される医薬製剤、剤形、または他の技術である。1つの態様では制御放出は薬品の局所的生物学的利用能、眼球送達の文脈においては具体的に眼球滞留時間を改善するために用いられる。「眼球滞留時間の増加」は送達された眼内薬品が質の点(活性であり続ける)でも量の点(有効量)でも有効であり続ける送達後の期間を指す。高用量制御放出に加えて、またはその代わりにインビボ半減期の増加を達成するためにPEG化などを介して翻訳後に薬品を修飾することができる。
抗D因子抗体及びそれらの変異体
本明細書において本発明には抗D因子抗体及びそれらの変異体の作製及び使用が含まれる。1つの態様では本発明の変異体を作製するための基を形作る親基準抗D因子抗体はヒト化抗D因子抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法が当技術分野においてよく知られている。ヒト化抗体はヒトではない起源に由来する抗体に導入された1個以上のアミノ酸残基を有することが一般的である。これらの非ヒトアミノ酸残基は「輸入」残基と呼ばれることが多く、それらの輸入残基は「輸入」可変ドメインから取られることが典型的である。ヒト化は基本的にはWinter及び共同研究者の方法(Jones et al. (1986) Nature 321:522−525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323−327、Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534−1536)に従い、げっ歯類のCDRまたはCDR配列によりヒト抗体の対応する配列を置換することによって実行され得る。したがって、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体(米国特許番号第4,816,567号明細書)であり、実質的には完全ではないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際にはヒト化抗体は幾つかのCDR残基及び可能であれば幾つかのFR残基がげっ歯類抗体中の類似部位の残基によって置換されているヒト抗体であることが典型的である。
本明細書において本発明には抗D因子抗体及びそれらの変異体の作製及び使用が含まれる。1つの態様では本発明の変異体を作製するための基を形作る親基準抗D因子抗体はヒト化抗D因子抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法が当技術分野においてよく知られている。ヒト化抗体はヒトではない起源に由来する抗体に導入された1個以上のアミノ酸残基を有することが一般的である。これらの非ヒトアミノ酸残基は「輸入」残基と呼ばれることが多く、それらの輸入残基は「輸入」可変ドメインから取られることが典型的である。ヒト化は基本的にはWinter及び共同研究者の方法(Jones et al. (1986) Nature 321:522−525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323−327、Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534−1536)に従い、げっ歯類のCDRまたはCDR配列によりヒト抗体の対応する配列を置換することによって実行され得る。したがって、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体(米国特許番号第4,816,567号明細書)であり、実質的には完全ではないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際にはヒト化抗体は幾つかのCDR残基及び可能であれば幾つかのFR残基がげっ歯類抗体中の類似部位の残基によって置換されているヒト抗体であることが典型的である。
抗体がヒト治療用途のために意図されているとき、幾つかの事例ではヒト化抗体の作製において使用される軽鎖と重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択が抗原性及び/またはHAMA(ヒト抗マウス抗体)反応を低下させるために重要であり得る。HAMA反応の低下または除去は適切な治療薬の臨床開発の重要な要素であることが一般的である。例えば、Khaxzaeli et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst 80:937、Jaffers et al. (1986) Transplantation 41:572、Shawler et al. (1985) J. Immunol. 135:1530、Sears et al. (1984) J. Biol. Response Mod. 3:138、Miller et al. (1983) Blood 62:988、Hakimi et al. (1991) J. Immunol. 147:1352、Reichmann et al. (1988) Nature 332:323、Junghans et al. (1990) Cancer Res. 50:1495を参照されたい。本明細書に記載されるように、本発明はHAMA反応の低下または除去が起こるようにヒト化されている抗体を提供する。当技術分野において知られている日常的方法を用いてさらにこれらの抗体の変異体を得ることができ、それらの方法のうちの幾つかが下でさらに説明される。いわゆる「ベストフィット」法に従い、げっ歯類抗体の可変ドメイン配列が既知のヒト可変ドメイン配列の完全ライブラリーに対してスクリーニングされる。そのげっ歯類のVドメイン配列に最も近いヒトVドメイン配列が特定され、且つ、その配列内のヒトフレームワーク領域(FR)がヒト化抗体用に受容される(Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296、Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol.196:901)。別の方法は軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用してよい(Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285、Presta et al. (1993) J. Immunol. 151:2623)。
例えば、本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列がフレームワーク配列及び/または超可変配列の多様化のための出発(親)配列として働き得る。出発超可変配列が連結される選択されたフレームワーク配列は本明細書において受容側ヒトフレームワークと呼ばれる。受容側ヒトフレームワークはヒト免疫グロブリン(そのVL領域及び/またはVH領域)に由来してよい、またはヒト免疫グロブリンから得られてよいが、ヒトコンセンサスフレームワークはヒト患者において免疫原性が最小であるか、または無いことが示されているのでその受容側ヒトフレームワークはヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来してよい、またはその配列から得られてよい。本明細書における目的に適した「受容側ヒトフレームワーク」はヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来するVLフレームワークまたはVHフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来」する受容側ヒトフレームワークはそれの同アミノ酸配列を含んでよく、または前から存在するアミノ酸配列変化を含んでよい。アミノ酸変化が前から存在する場合、好ましくは5か所を超えない、及び好ましくは4か所を超えないまたは3か所を超えないアミノ酸変化が前から存在する。1つの実施形態ではVH受容側ヒトフレームワークは配列に関してVHヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。1つの実施形態ではVL受容側ヒトフレームワークは配列に関してVLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。「ヒトコンセンサスフレームワーク」は選択されたヒト免疫グロブリンVLフレームワーク配列またはVHフレームワーク配列の中で最も共通して現れるアミノ酸残基に当たるフレームワークである。一般的に、その選択されたヒト免疫グロブリンVL配列またはVH配列は可変ドメイン配列のサブグループに由来する。一般的に、その配列サブグループはKabatらの著作に見られるようなサブグループである。VLについての1つの実施形態ではそのサブグループはKabatらの著作に見られるようなサブグループ・カッパIである。VHについての1つの実施形態ではそのサブグループはKabatらの著作に見られるようなサブグループIIIである。
その受容側がヒト免疫グロブリンに由来する場合、ヒトフレームワーク配列のコレクションの中の様々なヒトフレームワーク配列と供給側フレームワーク配列を整列させることによってその供給側フレームワーク配列に対する相同性に基づいて選択されるヒトフレームワーク配列を選択してもよく、最も相同的なフレームワーク配列を受容側として選択してもよい。受容側ヒトフレームワークは公開データベースで入手可能であるヒト抗体生殖系列配列に由来してよい、またはその配列から得られてよい。
1つの実施形態では本明細書におけるヒトコンセンサスフレームワークはVHサブグループVIIコンセンサスフレームワーク配列及び/またはVLカッパサブグループIコンセンサスフレームワーク配列に由来する、またはそれらのコンセンサスフレームワーク配列から得られる。
1つの実施形態では抗D因子抗体の作製に使用されるヒトフレームワークテンプレートはVH鎖用のVI−4.1b+(VH7ファミリー)とJH4dの組合せ及び/またはVL鎖用のDPK4(VκIファミリー)及びJK2の組合せを含むテンプレートに由来するフレームワーク配列を含み得る。
受容側は配列に関してヒト免疫グロブリンに由来するものであれ、ヒトコンセンサスフレームワークに由来するものであれ選択されたヒトフレームワーク配列と同一であり得るが、本発明は受容側配列がそのヒト免疫グロブリン配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と比較して前から存在するアミノ酸置換を含み得ることを企図する。これらの前から存在する置換は最小限であることが好ましく、通常はヒト免疫グロブリン配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と比較してわずかに4か所、3か所、2か所、または1か所のアミノ酸差異である。
非ヒト抗体の超可変領域残基がVL受容側ヒトフレームワーク及び/またはVH受容側ヒトフレームワークに組み込まれる。例えば、Kabat CDR残基、Chothia超可変ループ残基、Abm残基、及び/または接触残基に相当する残基を組み込むことができる。任意選択で次のような拡張超可変領域残基が組み込まれる:24〜36または24〜34(L1)、46〜56または50〜56(L2)及び89〜97(L3)、26〜35B(H1)、50〜65、47−65または49〜65(H2)及び93〜102、94〜102、または95〜102(H3)。
1つの態様では本発明の抗D因子抗体または抗体変異体は軽鎖ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む。1つの態様では本発明の基準抗D因子抗体は配列番号3の軽鎖可変ドメインを含む。1つの態様では本発明の基準抗D因子抗体は配列番号4の重鎖可変ドメインを含む。
さらに、抗D因子抗体はその抗体がD因子結合能を保持することを条件としてあらゆる適切な定常ドメイン配列を含み得る。例えば、幾つかの実施形態では本発明の抗D因子抗体は重鎖定常ドメインの少なくとも一部を含む。1つの実施形態では本発明の抗D因子抗体はα重鎖、δ重鎖、ε重鎖、γ重鎖、またはμ重鎖のうちの1つまたはそれらの組合せのどちらかの重鎖定常ドメインを含む。免疫グロブリンはそれらの重鎖の定常ドメイン(CH)のアミノ酸配列に応じて異なるクラスまたはアイソタイプに指定され得る。それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる重鎖を有する5クラスの免疫グロブリンIgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMが存在する。γクラスとαクラスはCH配列と機能の比較的にわずかな差異に基づいてさらにサブクラスに分割され、例えば、ヒトは次のサブクラスIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2を発現する。1つの実施形態では本発明の抗D因子抗体はエフェクター機能(例えば、結合親和性)に対して所望の効果を生じるアミノ酸位置に置換を含む重鎖定常ドメインを含む。1つの実施形態では本発明の抗D因子抗体はエフェクター機能(例えば、結合親和性)に対して効果を生じないアミノ酸位置に置換を含む重鎖定常ドメインを含む。1つの実施形態では本発明の抗D因子抗体はIgGタイプ(例えばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4)の重鎖定常ドメインを含み、且つ、位置114(Kabat番号付け;EU番号付けにおける118と同等)、位置168(Kabat番号付け;EU番号付けにおける172と同等)、位置172(Kabat番号付け;EU番号付けにおける176と同等)及び/または位置228(EU番号付け)に置換をさらに含む。1つの実施形態では本発明の抗D因子抗体はIgG(例えばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4)タイプの重鎖定常ドメインを含み、位置114に置換をさらに含んで位置114がシステイン(C)またはアラニン(A)であり、位置168がシステイン(C)またはアラニン(A)であり、位置172がシステイン(C)またはアラニン(A)であり、且つ/または位置228がプロリン(P)、アルギニン(R)またはセリン(S)である。
さらに、例えば幾つかの実施形態では本発明の抗D因子抗体は軽鎖定常ドメインの少なくとも一部を含む。1つの実施形態では、任意の脊椎動物種の軽鎖はそれらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ及びラムダと呼ばれる2つの明確に異なるタイプのうちの一方に指定され得るので本発明の抗D因子抗体はカッパ軽鎖またはラムダ軽鎖の一方またはそれらの組合せのどちらかの軽鎖定常ドメインを含む。1つの実施形態では本発明の抗D因子抗体はエフェクター機能(例えば、結合親和性)に対して所望の効果を生じるアミノ酸位置に置換を含む軽鎖定常ドメインを含む。1つの実施形態では本発明の抗D因子抗体はエフェクター機能(例えば、結合親和性)に対して効果を生じないアミノ酸位置に置換を含む軽鎖定常ドメインを含む。1つの実施形態では本発明の抗D因子抗体はカッパタイプの軽鎖定常ドメインを含み、位置110、位置144、位置146及び/または位置168(Kabat番号付け)に置換をさらに含む。1つの実施形態では本発明の抗D因子抗体はカッパタイプの軽鎖定常ドメインを含み、位置110に置換をさらに含んで位置110がシステイン(C)またはバリン(V)であり、位置144に置換をさらに含んで位置144がシステイン(C)またはアラニン(A)であり、位置146に置換をさらに含んで位置146がイソロイシン(I)またはバリン(V)であり、及び/または位置168に置換をさらに含んで位置168がシステイン(C)またはセリン(S)である。
ヒト化抗D因子抗体をはじめとする親抗D因子抗体または基準抗D因子抗体が改変されて改変抗D因子抗体または抗D因子抗体変異体が作製され得る。1つの実施形態ではそれらの改変抗D因子抗体及びそれらの変異体は親抗体に対して改善された物理的特性、化学的特性、生物学的特性、または同質特性を有し得る。
1つの実施形態では本発明の抗体は1か所以上のアミノ酸変化(例えば、置換)を親抗体の超可変領域のうちの1つ以上の領域に含む。あるいは、または加えて、フレームワーク領域残基の1か所以上の変化(例えば、置換)が親抗体に導入され得る。改変されるフレームワーク領域残基の例には抗原に直接的に非共有結合する残基(Amit et al., (1986) Science, 233: 747−753)、CDRの立体構造と相互作用する/その立体構造をもたらす残基(Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol., 196: 901−917)、及び/またはVL−VH接触面(欧州特許第239400(B1)号明細書)に関わる残基が含まれる。ある特定の実施形態ではそのようなフレームワーク領域残基のうちの1つ以上の残基の改変によって抗体の抗原に対する結合親和性の増強が生じる。例えば、約1個から約5個までのフレームワーク残基が本発明のこの実施形態において変更され得る。改変されるフレームワーク領域残基またはHVR領域残基の例には改変によって脱アミド化変異体の形成が起こる部位(例えば、アスパラギン酸(DまたはAsp)に改変されるアスパラギン(NまたはAsn)残基)、酸化変異体の形成が起こる部位(例えば、スルホンまたはスルフオキシドに改変されるメチオニン(MまたはMet)残基及び/またはトリプトファン(WまたはTrp)残基)、またはピログルタミン酸変異体の形成が起こる部位(例えば、ピログルタミン酸に改変されるグルタミン(QまたはGln)残基)が含まれる。改変されるフレームワーク領域残基またはHVR領域残基の例には可能性がある脱アミド化部位(すなわちアスパラギン(NまたはAsn))、酸化部位(すなわちメチオニン(MまたはMet)またはトリプトファン(WまたはTrp))またはピログルタミン酸変換部位(すなわちグルタミン(QまたはGln))が含まれ、そのような部位での改変はそれぞれ脱アミド化及び/または酸化及び/またはピログルタミン酸変換を防止する。
脱アミド化変異体の形成を防止するためにはアスパラギン(NまたはAsn)をアラニン(AまたはAla)、グルタミン(QまたはGln)またはセリン(SまたはSer)に変異させてよい。酸化変異体の形成を防止するためにはメチオニン(Met)またはトリプトファン(WまたはTrp)をロイシン(L)またはイソロイシン(I)に変異させてよい。ピログルタミン酸変異体の形成を防止するためにはグルタミン(QまたはGln)をグルタミン酸(EまたはGlu)に変異させてよい。(Amphlett, G. et al., Pharm. Biotechnol., 9:1−140 (1996))。あるいは、または加えて、フレームワーク領域残基の1か所以上の変化(例えば、置換)が親抗体のFc領域中に存在し得る。
そのような改変抗体の作製の1つの有用な方法は「アラニンスキャニング突然変異形成」と呼ばれる(Cunningham and Wells (1989) Science 244:1081−1085)。この方法では超可変領域残基のうちの1つ以上をアラニン残基またはポリアラニン残基によって置換してそれらのアミノ酸の抗原との相互作用に影響を与える。次にそれらの置換に対して機能感受性を示す超可変領域残基は、それらの置換部位に追加の突然変異または他の突然変異を導入することにより精選される。したがって、アミノ酸配列変化を導入するための部位が予め決められているが、その突然変異それ自体の性質は必ずしも予め決められていない。この方法で作製されたala突然変異体が本明細書に記載されるようなそれらの突然変異体の生物活性(すなわち、結合親和性または溶血アッセイ)についてスクリーニングされる。
抗体またはそれらの断片(例えば抗原結合断片)の生物学的特性のずっとより実質的な改変は、(a)置換領域の、例えば、シート状またはらせん状立体構造としてのポリペプチド骨格の構造、(b)標的部位におけるその分子の電荷または疎水性、または(c)側鎖の大きさの維持に対する効果に関して著しくことなる置換を選択することで達成される。天然残基は共通の側鎖特性に基づいて次のグループに分類される:
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile、
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、
(3)酸性:Asp、Glu、
(4)塩基性:His、Lys、Arg、
(5)鎖の方向に影響する残基:Gly、Pro、及び
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile、
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、
(3)酸性:Asp、Glu、
(4)塩基性:His、Lys、Arg、
(5)鎖の方向に影響する残基:Gly、Pro、及び
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
非保存的置換はこれらのクラスのうちの1つのクラスのメンバーを別のクラスのものに変更することを必要とする。
別の実施形態では改変に選ばれた部位が改変され、改善された結合親和性を有する改変体がファージディスプレイによって選択される。
アミノ酸配列突然変異体または改変アミノ酸配列をコードする核酸分子が当技術分野において知られている様々な方法によって調製される。これらの方法には以前に調製された親抗体の変異体版または非変異体版のオリゴヌクレオチド介在性(または部位特異的)突然変異形成、PCR突然変異形成、及びカセット突然変異形成が含まれるがこれらに限定されない。突然変異体または変異体または改変アミノ酸配列を作製するための1つの方法は部位特異的突然変異形成である(例えば、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488を参照されたい)。
ある特定の実施形態では改変抗体は単一の超可変領域残基が置換されているだけである。他の実施形態では親抗体の超可変領域残基のうちの2つ以上の残基が置換されており、例えば約2か所から約10か所の超可変領域置換がある。通常、改変抗体は親抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのどちらかのアミノ酸配列と少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、及び最も好ましくは少なくとも95%の(定義節において上で定義された)アミノ酸配列の同一性または類似性を有しているアミノ酸配列を有する。
改変抗体の作製に続いて親抗体と比較したその分子の生物活性が決定される。上に記したように、この生物活性の決定は抗体変異体またはその断片(例えば抗原結合断片)の結合親和性及び/または他の生物学的活性の決定を含み得る。本発明の1つの実施形態では一団の改変抗体が調製され、D因子またはその断片のような抗原に対する結合親和性についてスクリーニングされる。この最初のスクリーニングから選択された抗体突然変異体または改変抗体のうちの1つ以上は、その抗体変異体またはその断片(例えば抗原結合断片)が例えば前臨床研究に実に有用であることを確認するための1種類以上の追加生物活性アッセイの対象とされてもよい。
本明細書に記載される改変抗D因子抗体はしばしばその改変抗体の使用目的に応じて追加改変の対象とされ得る。そのような改変はアミノ酸配列の追加変更、異種性ポリペプチドへの融合、及び/または下で説明されるような共有結合性修飾を含み得る。アミノ酸配列変化に関しては例となる改変は上で説明されている。例えば、改変抗体の適正な立体構造の維持に関与していない任意のシステイン残基もその分子の酸化安定性を改善し、異常架橋を防止するために一般的にはセリンで置換され得る。逆に、抗体の安定性(特に抗体がFv断片などの抗体断片である場合)を改善するためにシステイン結合がその抗体に加えられ得る。
別のタイプのアミノ酸突然変異体は変更されたグリコシル化パターンを有する。これは抗体に見出される1か所以上の炭水化物部分を欠失すること、及び/または抗体には存在しない1か所以上のグリコシル化部位を付加することによって達成され得る。抗体または抗体断片(例えば抗原結合断片)のグリコシル化はN結合型かO結合型のどちらかであることが典型的である。N結合はアスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。Xがプロリンを除く任意のアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン−X−セリン及びアスパラギン−X−トレオニンはアスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のうちのどちらかの存在が潜在的なグリコシル化部位を形成する。O結合グリコシル化はヒドロキシアミノ酸、5−ヒドロキシプロリンまたは5−ヒドロキシリシンも使用され得るが最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの糖N−アセチルグルコサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの1つの結合を指す。抗体へのグリコシル化部位の付加はそのアミノ酸配列が上記の(N結合グリコシル化部位の)トリペプチド配列のうちの1つ以上を含むようにそのアミノ酸配列を変更することによって都合よく達成される。その変更は元の抗体の(O結合グリコシル化部位の)配列への1個以上のセリン残基またはトレオニン残基の付加、または1個以上のセリン残基またはトレオニン残基による置換によっても行われ得る。
本発明の抗体及び抗体変異体は様々な非タンパク質性高分子のうちの1つに抗体を結合させることによっても共有結合的に改変され得る。それらの抗体高分子複合体は高分子を用いて抗体を誘導体化する任意の適切な技術を用いて作製され得る。本発明は抗体または抗体断片と高分子との間のいかなる特定のタイプの結合を利用する複合体にも限定されないことが理解される。
1つの態様では本発明の複合体には親抗体上の特定の部位または複数の特定の部位に高分子が共有結合している種、すなわち、高分子結合が親抗体または抗体断片中の特定の領域または特定のアミノ酸残基または複数の特定の残基を標的としている種が含まれる。高分子の部位特異的結合は最も一般的には親抗体または抗体断片中のシステイン残基への結合によって達成される。そのような実施形態ではその結合化学は、例えば、親抗体においてジスルフィド架橋の中にないシステイン残基の遊離スルフヒドリル基を利用することができる。その高分子は親抗体上の遊離スルフヒドリル基または遊離チオール基と特異的に反応することが可能であるマレイミド官能基、スルフヒドリル官能基、チオール官能基、トリフラート官能基、テシラート官能基、アジリジン官能基、エキシラン官能基、及び5−ピリジル官能基などの任意の官能基に関して活性化され得る。高分子は、米国特許番号第4,179,337号明細書、第7,122,636号明細書、及びJevsevar et al. (2010) Biotech. J. 5:113−128に記載されるプロトコル及び系のような選択された結合系の化学に適切なあらゆるプロトコルを用いて親抗体に結合され得る。
1つの実施形態では親抗体中にもともと存在する1個以上のシステイン残基が高分子複合体化用の結合部位として使用される。別の実施形態では高分子の特定の結合部位または複数の特定の結合部位を提供することを目的に1個以上のシステイン残基が親抗体中の選択部位または複数の選択部位に加えられる。
1つの態様では本発明は抗体断片高分子複合体であって、その抗体断片がFabであり、且つ、その高分子がそのFab断片の軽鎖または重鎖の中の通常であれば軽鎖と重鎖を連結する鎖間ジスルフィド架橋を形成する1個以上のシステイン残基に結合している抗体断片高分子複合体を包含する。
別の態様では本発明は抗体断片高分子複合体であって、その抗体断片がFab’であり、その高分子がそのFab’断片のヒンジ領域に向けらてる抗体断片高分子複合体を包含する。1つの実施形態では抗体断片のヒンジ領域中にもともと存在する1個以上のシステイン残基がその高分子の結合のために使用される。別の実施形態では高分子の特定の結合部位または複数の特定の結合部位を提供することを目的に1個以上のシステイン残基がFab’断片のヒンジ領域に加えられる。1つの実施形態では本発明の抗D因子抗体変異体Fab断片は高分子複合体化用の1つの結合部位を提供することを目的にC’末端に1個のシステインを付加することによって改変される。別の実施形態では本発明の抗D因子抗体変異体Fab断片は高分子複合体化用の2つの結合部位を提供することを目的にC’末端に4個の追加の残基Cys−Pro−Pro−Cys(配列番号21)を付加することによって改変される。
1つの一般的に用いられる抗体複合体化はPEG化であり、1つ以上のポリエチレングリコール(PEG)高分子が抗体の定常領域に共有結合する。米国特許番号第4,179,337号明細書、第7,122,636号明細書を参照されたい。様々なサイズ(例えば、約500Dから約300,000Dまで)及び形状(例えば、直鎖状または分岐状)のPEG高分子が知られており、当分野において広く使用されている。本発明に有用なそれらの高分子は(例えば、日本油脂、Nektar Therapeutics、Creative PEGWorksから)商業的に入手可能であり、または従来の化学的手法を用いて市販の出発物質から調製可能である。PEG化は抗体薬品の物理的及び化学的特性を変え、改善された安定性、低下した免疫原性、延長した循環寿命、ならびに増加した滞留時間などの改善された薬物動態挙動を生じ得る。
親和性及び生物活性
抗D因子抗体に関して望ましいと本明細書において特定される特徴を有する抗体はD因子結合親和性及びD因子阻害活性などの望ましい特性についてインビトロまたはインビボでスクリーニングされ得る。
抗D因子抗体に関して望ましいと本明細書において特定される特徴を有する抗体はD因子結合親和性及びD因子阻害活性などの望ましい特性についてインビトロまたはインビボでスクリーニングされ得る。
a.親和性
1つの態様では本発明は、抗D因子抗体変異体を作製する元である親抗D因子抗体と競合するそれら抗D因子抗体変異体を提供する。親抗D因子抗体と同じエピトープに結合する抗D因子抗体変異体も提供される。
1つの態様では本発明は、抗D因子抗体変異体を作製する元である親抗D因子抗体と競合するそれら抗D因子抗体変異体を提供する。親抗D因子抗体と同じエピトープに結合する抗D因子抗体変異体も提供される。
抗D因子抗体変異体が基準抗D因子抗体によって結合されるヒトD因子上の同じエピトープに結合するか決定するためにクロスブロッキングアッセイを行うことができる(Antibodies, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Ed Harlow and David Lane (1988))。あるいは、抗D因子抗体が目的のエピトープに結合するか決定するためにエピトープマッピングを行うことができる(Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 1388−1394)。抗体親和性、例えば、ヒトD因子に対する抗体親和性は実施例においてより詳しく説明される表面プラズモン共鳴(SPR)アッセイをはじめとする標準的方法を用いて決定され得る。
1つの態様では本発明の抗D因子抗体変異体のD因子結合親和性はその抗D因子抗体変異体が作製される元である親抗D因子抗体のD因子結合親和性と同等である。幾つかの態様では本発明の抗D因子抗体変異体のD因子結合親和性は親抗D因子抗体のD因子結合親和性の10倍以内、7倍以内、5倍以内、2倍以内、または1倍以内である。
1つの実施形態では本発明はD因子に対する一価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)が20nM(20×10−9M)であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する一価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)が10nM(10×10−9M)であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する一価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)が1.0nM(1.0×10−9M)であるか、またはそれより世良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する一価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)が0.5nM(0.5×10−9M)であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する一価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)が1.0pM(1.0×10−12M)であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する一価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)が0.5pM(0.5×10−12M)であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。
別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が10.0nM(10.0×10−9M)であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が5.0nM(5.0×10−9M)であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が1.0nM(1.0×10−9M)であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が0.5nM(0.5×10−9M)であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が5.0pM(5.0×10−12M)であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が2.0pM(2.0×10−12M)であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が1.0pM(1.0×10−12M)であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が0.5pM(0.5×10−12M)であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。
別の実施形態では本発明はD因子に対する一価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)が0.5mM(0.5×10−6M)と0.5pM(0.5×10−12M)との間である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する一価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)が15nM(15×10−9M)と0.1nM(0.1×10−9M)との間である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する一価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)が5.5nM(5.5×10−9M)と1nM(1×10−9M)との間である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する一価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)が0.5pM(0.5×10−12M)と50pM(5×10−11M)との間である抗体を提供する。
別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が0.5mM(0.5×10−6M)と0.5pM(0.5×10−12M)との間である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体またはその抗体変異体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が10nM(10×10−9M)と0.05nM(0.05×10−9M)との間である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が5.5nM(5.5×10−9M)と1nM(1×10−9M)との間である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が0.5pM(0.5×10−12M)と50pM(5×10−11M)との間である抗体を提供する。
別の実施形態では本発明はD因子に対する一価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)が約1.4pM(1.4×10−12M)である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が約1.1pM(1.1×10−12M)である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する一価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)が約0.19nM(0.19×10−9M)である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が約0.08nM(0.08×10−9M)である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する一価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)が約12.3nM(12.3×10−9M)である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が約9.0nM(9.0×10−9M)である抗体を提供する。
別の実施形態では本発明はD因子に対する一価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)が約1.4pM(1.4×10−12M)±0.5である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が約1.1pM(1.1×10−12M)±0.6抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する一価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)が約0.19nM(0.19×10−9M)±.01である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が約0.08nM(0.08×10−9M)±0.01である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する一価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)が約12.3nM(12.3×10−9M)±2である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はD因子に対する二価型の抗D因子抗体の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)が約9.0nM(9.0×10−9M)±1である抗体を提供する。
別の実施形態では抗D因子抗体はその一価型でD因子に対して約1.4pM(1.4×10−12M)±2の親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)を有し得る。別の実施形態では抗D因子抗体はその二価型でD因子に対して約1.1pM(1.1×10−12M)±2の親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)を有し得る。別の実施形態では抗D因子抗体はその一価型でD因子に対して約0.19nM(0.19×10−9M)±2である親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)を有し得る。別の実施形態では抗D因子抗体またはその抗体変異体はその二価型でD因子に対して約0.08nM(0.08×10−9M)±2である親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)を有し得る。別の実施形態では抗D因子抗体はその一価型でD因子に対して約12.3nM(12.3×10−9M)±2である親和性(例えば、D因子に対するFab断片としての抗体の親和性)を有し得る。別の実施形態では抗D因子抗体はその二価型でD因子に対して約9.0nM(9.0×10−9M)±2である親和性(例えば、D因子に対するIgGとしての抗体の親和性)を有し得る。
当技術分野においてよく確立されているように、リガンドの受容体に対するそのリガンドの結合親和性を様々なアッセイのうちのいずれかを用いて決定することができ、様々な定量値で表すことができる。したがって、1つの実施形態ではその結合親和性はKD値として表され、(例えば、アビディティー効果の最小化による)固有の結合親和性を反映する。結合親和性は無細胞環境であれ、細胞結合型環境であれ、インビトロで測定されることが一般的であり、好ましい。本明細書においてさらに詳しく説明されるように、結合親和性の差異倍率は、同様のアッセイ条件下で決定される(例えば、Fab型の)ヒト化抗体の一価結合親和性値と(例えば、Fab型の)基準/対照抗体(例えば、供給側超可変領域配列を有するマウス抗体)の一価結合親和性値の比率として定量され得る。したがって、1つの実施形態では結合親和性の差異倍率はFab型のヒト化抗体と基準/対照Fab抗体のKD値の比率として決定される。例えば、1つの実施形態では本発明の抗体(A)が基準抗体(M)の親和性よりも「3倍低い」親和性を有している場合、AのKD値が3倍であればMのKD値が1倍であり、MのKDに対するAのKDの比率は3:1である。逆に、1つの実施形態において本発明の抗体(C)が基準抗体(R)の親和性よりも「3倍高い」親和性を有する場合、CのKD値が1倍である場合にRのKD値が3倍であり、RのKDに対するCのKDの比率が1:3である。例えばBiacore、放射免疫アッセイ(RIA)及びELISAをはじめとする本明細書に記載されるアッセイを含む当技術分野において知られている多数のアッセイのうちのいずれかを用いて結合親和性測定結果を得ることができる。
さらに、本発明の抗体のKD値は用いられる特定のアッセイの条件に応じて変化し得る。例えば、1つの実施形態では結合親和性測定結果はFabまたは抗体が固定化され、そしてリガンド、すなわち、D因子の結合が測定されるアッセイ、あるいはFabまたは抗体のリガンド、すなわちD因子が固定化され、そしてFabまたは抗体の結合が測定されるアッセイにおいて取得され得る。1つの実施形態では結合親和性測定結果は再生条件が(1)pH1.5の10mMのグリシンまたは4MのMgCl2、及び(2)pH1.5、pH5.0、pH6.0、及びpH7.2を含むpH1.0とpH7.5の間のpHを含み得るアッセイにおいて取得され得る。1つの実施形態では結合親和性測定結果は結合条件が(1)PBSまたはHEPES緩衝生理食塩水及び(2)ツイーン−20、すなわち0.1%のツイーン−20を含み得るアッセイにおいて取得され得る。1つの実施形態では結合親和性測定結果はリガンド、すなわちD因子の起源が市販の起源の物であり得るアッセイにおいて取得され得る。1つの実施形態では結合親和性測定結果は(1)Fabまたは抗体が固定化され、そしてリガンド、すなわちD因子の結合が測定され、(2)再生条件がpH7.2で4MのMgCl2を含み、且つ、(3)結合条件が0.1%のツイーン−20を含有するpH7.2のHEPES緩衝生理食塩水を含むアッセイにおいて取得され得る。1つの実施形態では結合親和性測定結果は(1)リガンド、すなわちD因子が固定化され、そしてFabまたは抗体の結合が測定され、(2)再生条件がpH1.5で10mMのグリシンを含み、(3)結合条件がPBS緩衝液を含むアッセイにおいて取得され得る。
b.生物活性
抗D因子抗体またはその変異体もしくは断片(例えば抗原結合断片)がD因子に結合し、且つ、生物学的効果、例えば、副経路溶血の抑制を発揮することができるか決定するために実施例2に記載されるアッセイを含むウサギRBCを使用する溶血抑制アッセイを用いることができる。そのような溶血抑制は標準的アッセイ(Kostavasili et al. (1997) J of Immunology 158:1763−72; Wiesmann et al. (2006) Nature 444:159−60)を用いて決定され得る。そのようなアッセイでは血清または血漿を用いて補体活性化を開始することができる。血清または血漿中のD因子の適切な濃度(Pascual et al. (1998) Kidney International 34:529−536; Complement Facts Book, Bernard J. Morley and Mark J. Walport, editors, Academic Press (2000)、 Barnum et al. (1984) J. Immunol. Methods, 67: 303−309)はPascual et al. (1998) Kidney International 34:529−536及びBarnum et al. (1984) J. Immunol. Methods 67:303−309などの参照文献に記載されている方法を含む当技術分野において知られている方法に従って日常的に決定され得る。本発明は概してD因子と関連する生物学的活性を阻害することができる抗体に関する。例えば、18μg/ml(血中のヒトD因子のモル濃度の約1.5倍と等しくD因子に対する抗D因子抗体の比率が約1.5:1)の濃度で抗体による副経路補体活性の著しい阻害を観察することができる(例えば、米国特許番号第号明細書6,956,107を参照されたい)。
抗D因子抗体またはその変異体もしくは断片(例えば抗原結合断片)がD因子に結合し、且つ、生物学的効果、例えば、副経路溶血の抑制を発揮することができるか決定するために実施例2に記載されるアッセイを含むウサギRBCを使用する溶血抑制アッセイを用いることができる。そのような溶血抑制は標準的アッセイ(Kostavasili et al. (1997) J of Immunology 158:1763−72; Wiesmann et al. (2006) Nature 444:159−60)を用いて決定され得る。そのようなアッセイでは血清または血漿を用いて補体活性化を開始することができる。血清または血漿中のD因子の適切な濃度(Pascual et al. (1998) Kidney International 34:529−536; Complement Facts Book, Bernard J. Morley and Mark J. Walport, editors, Academic Press (2000)、 Barnum et al. (1984) J. Immunol. Methods, 67: 303−309)はPascual et al. (1998) Kidney International 34:529−536及びBarnum et al. (1984) J. Immunol. Methods 67:303−309などの参照文献に記載されている方法を含む当技術分野において知られている方法に従って日常的に決定され得る。本発明は概してD因子と関連する生物学的活性を阻害することができる抗体に関する。例えば、18μg/ml(血中のヒトD因子のモル濃度の約1.5倍と等しくD因子に対する抗D因子抗体の比率が約1.5:1)の濃度で抗体による副経路補体活性の著しい阻害を観察することができる(例えば、米国特許番号第号明細書6,956,107を参照されたい)。
1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が30nM未満のIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を含む。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が15nM未満のIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を含む。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が10nM未満のIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が5nM未満のIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。
1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が30nMと2nMの間のIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が25nMと7nMの間のIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が20nMと12nMの間のIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が30nMと15nMの間のIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が12nMと8nMの間のIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が7nMと2nMの間のIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が6nMと3nMの間のIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が8nMと5nMの間のIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が5nMと2nMの間のIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が10nMと5nMの間のIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が8nMと2nMの間のIC550値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が7nMと3nMの間のIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が6nMと4nMの間のIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Fab断片が約4.7nM±0.6nMのIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Fab断片が約6.4nM±0.6nMのIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Fab断片が約3.5nM±0.5nMのIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Fab断片が約4.4nM±1.5nMのIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Fab断片が約10.2nM±0.8nMのIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Fab断片が約23.9nM±5.0nMのIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。
1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が80nM未満のIC90値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が50nM未満のIC90値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が40nM未満のIC90値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が20nM未満のIC90値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が15nM未満のIC50値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。
1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が80nMと10nMの間のIC90値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が75nMと15nMの間のIC90値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が70nMと20nMの間のIC90値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が65nMと25nMの間のIC90値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が60nMと30nMの間のIC90値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が55nMと35nMの間のIC90値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が50nMと40nMの間のIC90値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が80nMと70nMの間のIC90値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が55nMと25nMの間のIC90値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が16nMと12nMの間のIC90値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Fab断片が約14.0nM±1.0nMのIC90値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Fab断片が約38.0nM±11.0nMのIC90値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Fab断片が約72.6nM±4.8nMのIC90値で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体を提供する。
1つの実施形態では本発明は抗体Fab断片が約0.05:1(0.05)から約10:1(10)、または約0.09:1(0.09)から約8:1(8)、または約0.1:1(0.1)から約6:1(6)、または約0.15:1(0.15)から約5:1(5)、または約0.19:1(0.19)から約4:1(4)、または約0.2:1(0.2)から約3:1(3)、または約0.3:1(0.3)から約2:1(2)、または約0.4:1(0.4)から約1:1(1)、または約0.5:1(0.5)から約1:2(0.5)、または約0.6:1(0.6)から約1:3(0.33)、または約0.7:1(0.7)から約1:4(0.25)、または約0.8:1(0.8)から約1:5(0.2)または約0.9:1(0.9)から約1:6(0.17)のD因子に対する抗体のモル比で副経路溶血を抑制するような抗D因子抗体に関する。
1つの実施形態では本発明にはヒト化抗D因子抗体の断片(例えば抗原結合断片)が含まれる。本発明の抗体断片は、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、(scFv)2、dAb、相補性決定領域(CDR)断片、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ディアボディ、または抗体断片から形成される多重特異性抗体であり得る。追加の実施形態では本発明は網膜の実質的に全体に浸透することが可能であるヒト化抗D因子抗体断片(例えば抗原結合断片)を提供する。さらに追加の実施形態では本発明は網膜全層に浸透することが可能であるヒト化抗D因子抗体断片(例えば抗原結合断片)を提供する。
1つの実施形態では本発明には抗体Fab断片が単回硝子体内注射による哺乳類(例えばヒト)の眼への投与後に少なくとも3日、5日、7日、10日、または12日の半減期を有するような抗D因子抗体が含まれる。別の実施形態では本発明には抗体Fab断片が単回硝子体内注射による哺乳類(例えばヒト)の眼への投与後に少なくとも40日間、45日間、50日間、55日間、60日間、65日間、70日間、75日間、80日間、85日間、90日間、95日間、100日間、105日間、110日間、または115日間にわたって副経路(AP)補体活性化を阻害するようなヒト化抗D因子抗体が含まれる。別の実施形態では本発明には副経路(AP)補体活性化を阻害する抗体Fab断片の濃度が単回硝子体内注射による哺乳類(例えばヒト)の眼への投与後に少なくとも40日間、45日間、50日間、55日間、60日間、65日間、70日間、75日間、80日間、または85日間にわたって網膜組織内で維持されるようなヒト化抗D因子抗体が含まれる。別の実施形態では本発明には副経路(AP)補体活性化を阻害する抗体Fab断片の濃度が単回硝子体内注射による哺乳類(例えばヒト)の眼への投与後に少なくとも80日間、85日間、90日間、95日間、100日間、105日間、110日間、または115日間にわたって硝子体液中で維持されるようなヒト化抗D因子抗体が含まれる。
D因子アンタゴニストは単独で、または少なくとも第2治療化合物と併用して投与され得る。D因子アンタゴニストと任意の第2治療化合物の投与は、例えば、単一の組成物として、または2つ以上の別個の組成物として同じ投与経路または異なる投与経路を用いて同時に行われ得る。あるいは、または加えて、投与は任意の順序で順次行われ得る。ある特定の実施形態ではそれら2つ以上の組成物の投与間に数分から数日まで、数週間まで、数か月までの間隔が存在し得る。例えば、D因子アンタゴニストが最初に投与され、続いて第2治療化合物が投与されてよい。しかしながら、第2治療化合物の同時投与またはD因子アンタゴニストの前の投与も企図される。一例ではD因子アンタゴニストは抗D因子抗体である。追加の例では抗D因子抗体は本明細書に記載される抗D因子抗体変異体である。一例では第2治療化合物はHTRA1アンタゴニストである。追加の例ではHTRA1アンタゴニストは抗HTRA1抗体である。
1つの実施形態では補体介在性疾患を有するヒト対象における補体介在性疾患の本発明の治療はD因子アンタゴニストなどの治療化合物の有効量をその対象に投与することを含み、第2治療化合物、すなわち、HTRA1アンタゴニストの有効量をその対象に投与することをさらに含む。一例ではD因子アンタゴニストは抗D因子抗体である。追加の例では抗D因子抗体は本明細書に記載される抗D因子抗体変異体である。一例ではHTRAアンタゴニストは抗HTRA1抗体である。一例では補体介在性疾患は補体関連眼疾患である。一例では眼疾患は非滲出型AMD(例えば中期乾燥型AMDまたは地図状萎縮(GA))及び滲出型AMD(例えば湿潤型AMD(脈絡膜血管新生(CNV))を含む加齢黄斑変性(AMD)、糖尿病性網膜症(DR)、眼内炎及びぶどう膜炎である。一例では補体関連眼疾患は中期乾燥型AMDである。一例では補体関連眼疾患は地図状萎縮である。一例では補体関連眼疾患は湿潤型AMD(脈絡膜血管新生(CNV))である。
本明細書における併用投与は別々の製剤または単一の医薬製剤を用いる共投与、及びどちらかの順序での順次投与を含み、両方の(または全ての)活性剤がそれらの生物学的活性を同時に働かせる間に一定期間があることが一般的である。
医薬製剤
抗体またはその抗体変異体の治療製剤は所望の程度の純度を有するポリペプチドを当技術分野において通常使用される任意選択の「薬学的に許容可能な」担体、賦形剤または安定化剤(それらの全てが「賦形剤」と呼ばれる)と混合することにより凍結乾燥製剤または水溶液として調製され得る。例えば、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤、非イオン性洗剤、抗酸化剤及び他の種々雑多な添加物である。(Remington’s Pharmaceutical Sciences、第16版、A. Osol編(1980)を参照されたい)。そのような添加物は用いられる投与量及び濃度において受容者にとって無毒でなくてはならない。
抗体またはその抗体変異体の治療製剤は所望の程度の純度を有するポリペプチドを当技術分野において通常使用される任意選択の「薬学的に許容可能な」担体、賦形剤または安定化剤(それらの全てが「賦形剤」と呼ばれる)と混合することにより凍結乾燥製剤または水溶液として調製され得る。例えば、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤、非イオン性洗剤、抗酸化剤及び他の種々雑多な添加物である。(Remington’s Pharmaceutical Sciences、第16版、A. Osol編(1980)を参照されたい)。そのような添加物は用いられる投与量及び濃度において受容者にとって無毒でなくてはならない。
緩衝剤は生理的条件に近似する範囲にpHを維持するのに役立つ。それらは約2mMから約50mMまでの範囲の濃度で存在することが好ましい。本発明に関する使用に適切な緩衝剤にはクエン酸緩衝剤(例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物、等)、コハク酸緩衝剤(例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物、等)、酒石酸緩衝剤(例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物、等)、フマル酸緩衝剤(例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、等)、フマル酸緩衝剤(例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物、等)、グルコン酸緩衝剤(例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物、等)、シュウ酸緩衝液(例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物、等)、乳酸緩衝剤(例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物、等)及び酢酸緩衝剤(例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物、等)などの有機酸及び無機酸とそれらの塩の両方が含まれる。加えてリン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤及びトリスなどのトリメチルアミン塩も挙げられる。
保存剤は微生物の増殖を遅らせるために、0.2%から1%(重量/体積)までの範囲の量で添加され得る。本発明に関する使用に適切な保存剤にはフェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウムハライド(例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物)、塩化ヘキサメトニウム、メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び3−ペンタノールが含まれる。
時には「安定化剤」として知られる等張剤が本発明の液体組成物の等張性を確保するために添加されてよく、等張剤には多価糖アルコール、好ましくはグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールなどの3価以上の糖アルコールが含まれる。
安定化剤は充填剤から治療薬を溶解する添加剤または変性もしくは容器壁への付着の防止に役立つ添加剤まで様々な機能を範囲とし得る広いカテゴリーの賦形剤を指す。典型的な安定化剤は(上で列挙された)多価糖アルコール;アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、L−ロイシン、2−フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン等のようなアミノ酸;ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロール等のような有機糖または糖アルコールであってイノシトールのようなシクリトールを含む有機糖または糖アルコール;ポリエチレングリコール、アミノ酸重合体;尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウムなどの含硫還元剤;低分子量ポリペプチド(すなわち10残基未満);ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体;キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなどの単糖類;ラクトース、マルトース、ショ糖などの二糖類及びラフィノースなどの三糖類;デキストランなどの多糖類であり得る。安定化剤は活性タンパク質重量部当たり0.1重量部から10,000重量部までの範囲で存在し得る。
非イオン性界面活性剤または洗剤(「湿潤剤」としても知られる)は治療薬の溶解を補助するためにも撹拌誘導性凝集から治療タンパク質を守るためにも添加されてよく、それによって製剤がタンパク質の変性を引き起こすことなく加えられたせん断面に曝されることも可能になる。適切な非イオン性洗剤にはポリソルベート(20、80等)、ポリオキサマー(184、188等)、プルロニック(登録商標)ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル(ツイーン(登録商標)−20、ツイーン(登録商標)−80等)が含まれる。非イオン性洗剤は約0.05mg/mlから約1.0mg/ml、好ましくは約0.07mg/mlから約0.2mg/mlの範囲で存在し得る。
その他の種々雑多な賦形剤には充填剤(例えばデンプン)、キレート剤(例えばEDTA)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンE)、及び共溶媒が含まれる。本明細書における製剤は、治療を受けている特定の適応症の必要に応じて1種類より多くの活性化合物、好ましくは相互に悪影響を与えない相補的活性を有する活性化合物を含んでもよい。例えば、免疫抑制剤をさらに加えることが望ましいことがあり得る。そのような分子は意図する目的にとって有効である量で組み合わさって適切に存在する。それらの有効成分は、例えばそれぞれコアセルベーション技法または界面重合によって調製されたミクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースミクロカプセルまたはゼラチンミクロカプセル及びポリ−(メチルメタクリレート)ミクロカプセルの中に、コロイド状薬品送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノパーティクル及びナノカプセル)の中に、またはマクロエマルジョンの中に封入されてもよい。そのような技法はRemington’s Pharmaceutical Sciences、第16版、A. Osal編(1980)において開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌性でなくてはならない。これは例えば無菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。持続放出性調製物を調製してよい。持続放出性調製物の適切な例には抗体またはその抗体変異体もしくは断片(例えば抗原結合断片)を含有する固形疎水性重合体の半透過性マトリックスが含まれ、それらのマトリックスは成形物品、例えばフィルムまたはミクロカプセルの形態である。持続放出性マトリックスの例にはポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許番号第3,773,919号明細書)、L−グルタミン酸とエチル−L−グルタミン酸の共重合体、非分解性エチレンビニルアセテート、リュープロン(LUPRON)デポー(商標)(乳酸グリコール酸共重合体とロイプロリド酢酸から構成される注射可能ミクロスフィア)などの分解性乳酸グリコール酸共重合体、及びポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレンビニルアセテート及び乳酸グリコール酸のような重合体が100日間を超える期間にわたる分子の放出を可能にする一方である特定のヒドロゲルはより短い期間にわたってタンパク質を放出する。カプセル封入された抗体が長期間にわたって体内に留まっているとき、それらの抗体は37℃の水分への曝露の結果として変性または凝集し、結果として生物活性を失い、可能性がある免疫原性の変化を生じ得る。関わる機序に応じて合理的な戦略が安定化のために工夫され得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド相互交換を介した分子間S−S結合形成であることが分かった場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量の制御、適切な添加剤の使用、及び特定の高分子マトリックス組成物の開発によって安定化が達成され得る。
眼疾患または眼症状の予防または治療のための本発明の化合物は眼球注射、眼内注射、及び/または硝子体内注射、及び/または強膜近傍注射、及び/またはテノン嚢下注射、及び/または脈絡膜上注射ならびに/または点眼液及び/もしくは軟膏の形態での局所投与によって投与されることが典型的である。本発明のそのような化合物はIntraocular Drug Delivery、Jaffe, Jaffe, Ashton,及びPearson編、Taylor & Francis(2006年3月)のような参照文献に記載される方法を含む様々な方法によって、例えば、硝子体内への化合物の徐放を可能にする装置及び/またはデポーとして硝子体内に送達され得る。一例では装置は長期間にわたって化合物を放出するminポンプ及び/またはマトリックス及び/または受動拡散系及び/またはカプセル封入セルの形態であり得る(Intraocular Drug Delivery、Jaffe, Jaffe, Ashton,及びPearson編、Taylor & Francis(2006年3月))。他の投与方法を用いてもよく、それらの方法には局所投与、非経口投与、皮下投与、腹膜内投与、肺内投与、鼻腔内投与、及び病変内投与が含まれるがこれらに限定されない。非経口注入には筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹膜内投与、または皮下投与が含まれる。
眼球投与、眼内投与、または硝子体内投与用の製剤は当技術分野において知られている方法により、当技術分野において知られている成分を使用して調製され得る。有効な治療の主な要件は眼への適切な浸透である。薬品を局所送達することができる眼の前部の疾患と異なり網膜疾患はより部位特異的なアプローチを必要とする。点眼液及び軟膏は眼球後部にほとんど浸透せず、血液眼球関門が全身投与された薬品の眼組織への透過を妨げる。したがって、AMD及びCNVなどの網膜疾患を治療するために選択される薬品送達方法は直接硝子体内注射であることが通常である。硝子体内注射は患者の症状及び送達される薬品の特性と半減期に応じる間隔で繰り返されることが通常である。眼内(例えば硝子体内)浸透にとってより小さいサイズの分子が好ましいことが通常である。
AMDまたはCNVなどの補体関連眼疾患の治療効力は眼内疾患の評価に一般的に用いられる様々なエンドポイントによって測定され得る。例えば、視力喪失が評価され得る。視力喪失は、限定されないが、例えば、所望の時点までの最高矯正視力(BCVA)のベースラインからの平均変化の測定(例えば、BCVAが糖尿病性網膜症の早期治療研究(ETDRS)視力表と4メートルの検査距離での評価に基づく場合)、所望の時点において視力で15文字よりも少ない文字をはずした対象のベースラインと比較した割合の測定、所望の時点において視力で15文字以上の文字を当てた対象のベースラインと比較した割合の測定、所望の時点において20/2000以下のスネレン等価視力を有する対象の割合の測定、NEI視覚機能質問票の評価、例えばフルオロセイン血管造影法による所望の時点におけるCNVのサイズ及びCNVの漏出量の測定等によって評価され得る。例えば検眼の実施、眼内圧の測定、視力評価、細隙灯圧力の測定、眼内炎症の評価等を、例えば、含むがこれらに限定されない眼球評価を行うことができる。
特定の疾患または症状の治療に有効である抗体またはその抗体変異体の量はその疾患または症状の性質に左右され、標準的臨床技術によって決定され得る。可能であれば用量応答曲線と本発明の医薬組成物を最初にインビトロで決定し、次にヒトで検査する前に有用な動物モデル系で決定することが望ましい。
幾つかの実施形態では製剤中の抗体は約50mg/mL超、約75mg/mL超、約100mg/mL超、約125mg/mL超、約150mg/mL超、約175mg/mL超、約200mg/mL超、約225mg/mL超、約250mg/mL超、約275mg/mL超、約300mg/mL超、約325mg/mL超、約350mg/mL超、約375mg/mL超、約400mg/mL超、約425mg/mL超、約450mg/mL超、約475mg/mL超、及び約500mg/mL超のうちのいずれかの量である。製剤中の抗体は約50mg/mLと約500mg/mLとの間、約50mg/mLと約300mg/mLとの間、約100mg/mLと約500mg/mLとの間、約100mg/mLと約300mg/mLとの間、約200mg/mLと約500mg/mLとの間、約200mg/mLと約400mg/mLとの間、または約250mg/mLと約375mg/mLとの間のいずれかの量であり得る。
1つの実施形態では治療ポリペプチド、抗体、またはその抗体変異体、またはその断片(例えば抗原結合断片)の水溶液は皮下注射により投与される。別の実施形態では治療ポリペプチド、抗体、またはその抗体変異体、またはその断片(例えば抗原結合断片)の水溶液は硝子体内注射により投与される。それぞれの用量は体重キログラム当たり約0.5μgから約50μgまで、またはより好ましくは体重キログラム当たり約3μgから約30μgまでの範囲であり得る。
皮下投与の投与スケジュールは疾患の種類、疾患の重症度、及び治療薬に対する対象の感受性をはじめとする多数の臨床因子に応じて月一回から毎日まで変わり得る。
製品及びキット
本発明の別の実施形態は本発明の抗体またはそれらの変異体またはそれらの断片(例えば抗原結合断片)によって標的とされる症状の治療、予防、及び/または診断に有用な物を含む製品である。例えば、本発明は補体関連疾患の治療、予防、及び/または診断に有用な物質を含有する製品に関する。その製品は容器とその容器上の、またはその容器に添えられたラベルまたは添付文書を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル瓶、注射器等が含まれる。それらの容器はガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。その容器は補体関連症状の治療、予防、及び/または診断に有効である組成物を保持し、その容器は無菌アクセスポートを有してよい(例えば、その容器は皮下注射針によって突き刺すことが可能であるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル瓶であり得る)。その組成物の中の少なくとも1種類の活性薬剤が本発明の抗D因子抗体である。そのラベルまたは添付文書はその組成物が特定の症状の治療、予防及び/または診断に有用であることを示す。
本発明の別の実施形態は本発明の抗体またはそれらの変異体またはそれらの断片(例えば抗原結合断片)によって標的とされる症状の治療、予防、及び/または診断に有用な物を含む製品である。例えば、本発明は補体関連疾患の治療、予防、及び/または診断に有用な物質を含有する製品に関する。その製品は容器とその容器上の、またはその容器に添えられたラベルまたは添付文書を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル瓶、注射器等が含まれる。それらの容器はガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。その容器は補体関連症状の治療、予防、及び/または診断に有効である組成物を保持し、その容器は無菌アクセスポートを有してよい(例えば、その容器は皮下注射針によって突き刺すことが可能であるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル瓶であり得る)。その組成物の中の少なくとも1種類の活性薬剤が本発明の抗D因子抗体である。そのラベルまたは添付文書はその組成物が特定の症状の治療、予防及び/または診断に有用であることを示す。
添付文書は市販の治療用製品パッケージに習慣的に含まれている指示書であって、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用法、服用量、投与、禁忌及び/または注意についての情報を含むものを指す。1つの実施形態ではそのラベルまたは添付文書は、例えば、眼疾患、例えば加齢黄斑変性(AMD)をはじめとするこれまでに記載されている症状のうちのいずれかなど、補体関連疾患の治療に組成物が使用されることを示す。そのラベルまたは添付文書は患者へ抗体組成物を投与するための指示をさらに含む。
加えて、その製品は静菌性注射用水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液及びブドウ糖溶液などの薬学的に許容可能な緩衝液を含む第2容器をさらに含んでよい。その製品は、他の緩衝液、希釈液、フィルター、針、及び注射器をはじめとする商業的立場及び使用者の立場から望ましい他の物をさらに含んでよい。
別の実施形態では様々な目的に、例えば、補体関連疾患の治療、予防、及び/または診断に、補体関連溶血アッセイに、細胞からのD因子ポリペプチドの精製に、または細胞からのD因子ポリペプチドの免疫沈殿に有用なキットも提供される。D因子ポリペプチドの単離及び精製のためにそのキットはビーズ(例えば、セファロースビーズ)に結合した抗D因子抗体を含み得る。例えばELISAまたはウエスタンブロットにおいてD因子ポリペプチドをインビトロで検出及び定量するために抗体を含むキットが提供され得る。製品と同様にキットは容器とその容器上の、またはその容器に添えられたラベルまたは添付文書を含む。その容器は少なくとも1つの本発明の抗因子抗体を含む組成物を保持する。例えば希釈剤及び緩衝液、対照抗体を含む追加の容器が含まれてよい。そのラベルまたは添付文書はその組成物の説明ならびに意図されているインビトロ用途または検出用途についての指示を提供してよい。そのラベルまたは添付文書は対象への投与(例えば抗体またはその抗体断片(例えば抗原結合断片)についての指示を提供してよい。
治療用途
本発明の抗体は哺乳類動物を治療するために使用され得る。1つの実施形態では抗体は例えば前臨床データを得ることを目的に非ヒト哺乳類動物に投与される。治療される例となる非ヒト哺乳類動物には前臨床研究が実施される非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類、及び他の哺乳類動物が含まれる。そのような哺乳類動物は抗体で治療される疾患の確立された動物モデルであり得、または目的の抗体の毒性を研究するために使用され得る。これらの実施形態の各々において用量増加試験を哺乳類動物に対して実施してよい。
本発明の抗体は哺乳類動物を治療するために使用され得る。1つの実施形態では抗体は例えば前臨床データを得ることを目的に非ヒト哺乳類動物に投与される。治療される例となる非ヒト哺乳類動物には前臨床研究が実施される非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類、及び他の哺乳類動物が含まれる。そのような哺乳類動物は抗体で治療される疾患の確立された動物モデルであり得、または目的の抗体の毒性を研究するために使用され得る。これらの実施形態の各々において用量増加試験を哺乳類動物に対して実施してよい。
抗体は非経口投与、皮下投与、腹膜内投与、肺内投与、及び鼻腔内投与、及び局所的免疫抑制治療に望ましい場合は病変内投与を含む任意の適切な手法によって投与される。非経口注入には筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹膜内投与、または皮下投与が含まれる。加えて、抗体はパルス注入、特に抗体またはその抗体変異体またはその断片(例えば抗原結合断片)の用量を減少させることを含むパルス注入によって適切に投与される。投与は注射によって行われることが好ましく、部分的にはその投与にかかる時間の長短に応じて静脈内注射または皮下注射によって行われることが最も好ましい。
疾患の予防または治療のため、抗体の適切な投与量は治療される疾患の種類、その疾患の重症度と経過、抗体が予防目的で投与されるのか、または治療目的で投与されるのか、それまでの治療法、患者の臨床歴と抗体への反応、及び主治医の判断に左右される。
疾患の種類及び重症度に応じて約0.1mg/kgから150mg/kg(例えば、0.1〜20mg/kg)の抗体が、例えば1回以上の個別投与か連続注入による、患者に投与される最初の候補投与量である。典型的な一日投与量は前述の因子に応じて約1mg/kgから100mg/kg以上までの範囲であってよい。数日間以上にわたる反復投与には疾患症状の所望の抑制が起こるまで症状に応じてその治療が持続される。しかしながら、他の投与計画も有用であり得る。この治療法の進捗は従来技術及びアッセイによって容易にモニターされる。例となる投与計画はWO94/04188に開示されている。
抗体組成物は良好な医療行為に合うように製剤され、投薬され、投与され得る。この状況で考慮する因子には治療されている特定の疾患、治療されている特定の哺乳類動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジューリング、及び医師に知られている他の因子が含まれる。投与される抗体またはその抗体変異体またはその断片(例えば抗原結合断片)の「治療有効量」はそのような考慮事項によって決定され、その治療有効量は疾患または障害を予防、改善、または治療するために必要な最少の量である。抗体またはその抗体変異体またはその断片(例えば抗原結合断片)は問題の疾患の予防または治療のために現在使用されている1種類以上の薬剤と共に製剤される必要は無いが、一緒に製剤されてもよい。そのような他の薬剤の有効量はその製剤中に存在する抗体またはその抗体変異体またはその断片(例えば抗原結合断片)の量、疾患または治療の種類、及び上で考察した他の因子によって左右される。これらは本明細書の上文で使用されたものと同じ投与量と投与経路で、またはこれまでに採用されていた投与量の約1〜99%までの投与量で使用されることが一般的である。
D因子を標的として認識する本発明の抗体は補体介在性疾患を治療するために使用され得る。これらの疾患は過剰補体活性化または無制御補体活性化と関係する。それらの補体活性化には心肺バイパス手術時の補体活性化、急性心筋梗塞、動脈瘤、脳卒中、出血性ショック、挫傷、多臓器不全、血液量減少性(hypobolemic)ショック及び腸管虚血の後の虚血再灌流に起因する補体活性化が含まれる。これらの疾患には重症の火傷、内毒素血症、敗血症性ショック、成人呼吸促迫症候群、血液透析などの炎症症状;アナフィラキシーショック、重症喘息、血管浮腫、クローン病、鎌状赤血球貧血、溶連菌感染後糸球体腎炎及び膵臓炎である疾患または症状も含まれ得る。疾患は有害薬物反応、薬品アレルギー、IL−2誘導性血管漏出症候群またはX線撮影造影剤アレルギーの結果であり得る。その疾患には全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、リウマチ性関節炎、アルツハイマー病及び多発性硬化症などの自己免疫疾患も含まれる。補体活性化は移植拒絶反応とも関連する。近年、補体活性化と加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症及び他の虚血性網膜症、脈絡膜血管新生(CNV)、ぶどう膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、及び網膜血管新生などの眼疾患との間に強い相関関係が示されている。
次の実施例は例示のために提供するものであり、限定のために提供するものではない。実施例中で言及される市販の試薬は別段の指示が無い限り製造業者の指示に従って使用された。次の実施例において、及び本明細書を通してATCC受託番号によって示される細胞の起源は20110−2209、バージニア州、マナサス、ユニバーシーティー・ブルバード10801にある米国培養細胞系統保存機関である。
実施例1:抗D因子抗体変異体の作製
D因子上の非活性部位への結合を介してD因子と副補体経路を強力に阻害するヒト化抗D因子Fab断片であるランパリズマブは進行型の乾燥型AMDである地図状萎縮(GA)の治療のために現在臨床開発されている。ランパリズマブ(FCFD4515S;以下「aFD」)は214残基の軽鎖(配列番号1)と223残基の重鎖(配列番号2)から構成される抗体Fab断片である。
D因子上の非活性部位への結合を介してD因子と副補体経路を強力に阻害するヒト化抗D因子Fab断片であるランパリズマブは進行型の乾燥型AMDである地図状萎縮(GA)の治療のために現在臨床開発されている。ランパリズマブ(FCFD4515S;以下「aFD」)は214残基の軽鎖(配列番号1)と223残基の重鎖(配列番号2)から構成される抗体Fab断片である。
GAにおける第II相ヒト治験の結果からaFDの毎月の硝子体内注射によって治療効果が得られることが示されているが、さらに良好な効力を達成するためにより高い薬品用量を使用する動機が存在する。一方、低い投与頻度は改善された利便性を患者にもたらし、感染率の低下と臨床効力の増加という潜在的な利益を有することになり、低進行型の乾燥型AMDの患者の治療を促進する可能性がある。
野生型aFD(WT)の物理的及び化学的安定性、特に低pH条件下での、及び/または中性pHにおける高濃度での物理的及び化学的安定性をさらに改善する取り組みがなされた。軽鎖上のアスパラギン酸残基Asp−30と重鎖上のアスパラギン残基Asp−62(図1A)が異性化しやすい残基と特定されている。Asp異性化は通常8未満のpHで長期にわたって存在し、且つ、イオン交換クロマトグラフィー(IEC)時に塩基性ピークとして検出される環状イミド中間産物(Asu)を形成するための脱水反応を含む。その環状中間産物の形成は低いpHになるほど促進される。出発物質と同じ荷電状態を生じ、したがってIECによって検出されないAspまたはイソ−Aspを形成するその環状中間産物の加水分解は高いpHになるほど速い。Asp−62(Kabat番号付けによるAsp−61)はFab:fD複合体の結晶構造の中でD因子と接触していないのでAsp−62の異性化は効力に影響しないようである。Katschke et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:12886。Asp−30は軽鎖残基Asp−32及びAsp−92と共にD因子上の塩基性残基と静電的接触を行う。Asp−30の異性化は極めて速く、抗体の効力の観察された減少の主要因であると仮定される。Asp残基32及び92の異性化もfD結合に対して効果を有する可能性があるが、速度が非常に遅いことが知られている。位置30におけるその環状イミドの形成、またはその後続のイソアスパラギン酸への加水分解は静電的相互作用の妨害を介して抗原結合に対して負の影響を与える可能性がある。単離された塩基性画分に対する抗原結合測定の結果が環状中間産物型は充分に活性であることを示唆しており、結合減少の原因としてのイソアスパラギン酸形成と合致する。
重鎖上のAsn−103(Kabat番号付けによるAsn−101)はやや酸性のpH(6〜7)と比較して中性のpHにおいてより高速で進行する反応である脱アミド化を受けやすい。脱アミド化はIEC時に酸性ピークの出現として検出され得る。Asn脱アミド化はAsp異性化と同様に環状Asu中間産物を介して進行する。しかしながら、AsnからのAsuの形成はAsuが加水分解されてAspまたはイソ−Aspを形成する高めのpHでしか起こらないので通常は酸性ピークだけが検出される。Asn−103の側鎖はD因子残基Arg−172と水素結合を形成する。この部位における脱アミド化または環状イミド中間産物Asu形成の抗原結合に対する効果は不明である。
aFD WTは典型的なヒト化Fab(pI8〜9)よりも低いpI(7.1)を有する。CDR−L1の組成(図1A)によりVLドメイン上に負の電荷クラスターが生じる。これらの特徴は特に低pH及び低イオン強度においてその分子の溶解性に影響し得る。加えて、中性pH及び生理的イオン強度であってもaFD WTの高濃度製剤は37℃においてより速い速度で非共有結合性二量体を形成する傾向を有し得る。
安定性を改善することを目的にaFD WTの幾つかの変異体を作製した。QuikChangeII(登録商標)(Agilent)突然変異形成キットをそのキットに添付されたプロトコルに従って使用して部位特異的突然変異形成により点突然変異を導入した。要求されるコドン変化を規定するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。設計された変化を有するプラスミドを特定し、DNAシーケンシングにより確認した。小規模の発現及び精製のためにDNAを大腸菌株64B4に形質転換した。50μg/mLのカルベネシリン(培地調製コードA3232)を含有する5mLのLB培地(培地調製コードA2008)の中にシングルコロニーを採取し、37℃のInnova恒温器において200RPMで振盪しながら14mLの培養チューブ中で一晩にわたって培養した。これらの培養物を使用して1Lのバッフル付き振盪フラスコ中の250mLの完全大豆クラップ培地(培地調製コードA4564)、50μg/mLカルベネシリンに接種した。培養物を200RPMで振盪しながら30℃で一晩にわたって培養し、その後で遠心分離により回収した。製造業者によって支給されたプロトコルに従ってPopCultureメディア(Invitrogen)を使用して細胞沈殿物を溶解し、GravitrapプロテインGカラム(GEヘルスケア)上でFabを精製した。より大規模のFab生産のために形質転換細胞の10Lの発酵に由来する細胞ペーストを抽出緩衝液中に懸濁し、マイクロフルイダイザーを使用してホモジナイズした。FabをプロテインG−セファロースまたはカッパ−セレクト上で免疫親和性クロマトグラフィーにより捕捉し、低pH緩衝液により溶出した。低pH溶離液をpH5に調節し、S−セファロースカラム上で陽イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。それらの精製タンパク質の正体を質量分析により確認し、貯蔵画分を約10mg/mLまで濃縮し、透析濾過によりPBS緩衝液(pH7.3)(本明細書において「PBS」とも呼ばれる;8mMのリン酸水素ナトリウム(Na2HPO4)、2mMのリン酸二水素カリウム(KH2PO4)、140mMのNaCl、2.7mMのKCl)中に入れ換えた。
実施例2:抗D因子抗体変異体の生物活性
有望な単一突然変異体及び混合突然変異体をD因子(fD)結合親和性及びD因子活性阻害能力について検査した。
有望な単一突然変異体及び混合突然変異体をD因子(fD)結合親和性及びD因子活性阻害能力について検査した。
a.表面プラズモン共鳴(SPR)測定結果によるD因子結合親和性
固定化されたaFD WT及びその変異体に対するD因子結合の動態及び結合定数KDをBiacore(登録商標)T200機器上での表面プラズモン共鳴(SPR)測定より決定した。抗huFab捕捉キット(GEヘルスケアカタログ番号28−9583−25)を製造業者により記載されたプロトコルに従って使用して抗体Fab断片をシリーズS CM5センサーチップ上に固定化した。濃度が0.39nMから25nMまで2倍毎に漸増するヒトD因子溶液の60μLアリコットの注入について記録されたセンサーグラムから結合動態を計算した。流速は30μL/分であり、ランニング緩衝液はHBS−P+であり、分析温度は25℃であり、リアルタイム基準セルサブトラクションを採用し、且つ、D因子注入後の解離を10分間にわたって追跡した。ランニング緩衝液の注入について観察されたセンサーグラムのサブトラクション後にBiaEvalソフトウェア第4.1版(GEヘルスケア)を使用して1:1モデルに従ってデータを分析して動態及び親和性定数を抽出した。
固定化されたaFD WT及びその変異体に対するD因子結合の動態及び結合定数KDをBiacore(登録商標)T200機器上での表面プラズモン共鳴(SPR)測定より決定した。抗huFab捕捉キット(GEヘルスケアカタログ番号28−9583−25)を製造業者により記載されたプロトコルに従って使用して抗体Fab断片をシリーズS CM5センサーチップ上に固定化した。濃度が0.39nMから25nMまで2倍毎に漸増するヒトD因子溶液の60μLアリコットの注入について記録されたセンサーグラムから結合動態を計算した。流速は30μL/分であり、ランニング緩衝液はHBS−P+であり、分析温度は25℃であり、リアルタイム基準セルサブトラクションを採用し、且つ、D因子注入後の解離を10分間にわたって追跡した。ランニング緩衝液の注入について観察されたセンサーグラムのサブトラクション後にBiaEvalソフトウェア第4.1版(GEヘルスケア)を使用して1:1モデルに従ってデータを分析して動態及び親和性定数を抽出した。
aFD WTの軽鎖可変ドメイン(VL;配列番号3)と重鎖可変ドメイン(VH;配列番号4)の中の位置に基づいて突然変異体に名前と番号を付けた。野生型残基の一文字コードの後に配列位置が続き、その後に置換アミノ酸の一文字コードが続く。同じドメイン上の複数の変化はコロンによって分けられている。
表1に示されているようにaFD WTはSPR技術で決定され得る限度(約10pM KD)のfDに対する高い親和性を有する。CDR−L1中のアスパラギン酸残基28、30、及び31はfDへの親和性に対して明確な効果を与えずにそれぞれSer、Glu、及びSerにより個々に置換され得た(表1)。対照的に、CDR−L1のAsp32のSerによる置換は個別(AFD.v4)に検査された場合でもD28S突然変異体及びD31S突然変異体(AFD.v5)と組み合わせて検査された場合でもfD結合の著しい減少を引き起こした。野生型分子と同等のfD親和性がVL−D30E、D31S及びVH−D62Eを組み合わせている三重突然変異体(「TM」(AFD.v6))とTM(AFD.v6)にVL−D92Eが付加されている四重突然変異体(TM.D92E(AFD.v7))について決定された。VH−D62EはfD結合に対して明確な効果を与えずに異性化を受ける部位における置換であり、VL−Asp92は異性化速度が遅い抗原接触残基である。VL−D28S、D30E、D31S及びVH−D62Eを組み合わせている四重突然変異体「SIESD」(AFD.v8)はfDへの親和性のわずかな(約2倍の)減少を示す。SIESD(AFD.v8)の背景ではVL−D92E置換によってfDへの親和性のさらなる減少が生じた(AFD.v10(表1内のSIESD.D92E)を参照されたい)。
潜在的な脱アミド化部位を他の残基との置換について検査した。VL−N34とVH−N52の両方が共結晶構造中でfDと接触しているが、これらの部位のどちらも中性pH条件下では顕著な脱アミド化速度を示さない。これらの部位におけるSer置換は親和性の減少を引き起こした(表1;AFD.v9及びAFD.v11)。VH残基Asn−103はfDと接触せず、PBS中で測定可能な脱アミド化速度を有しない。SIESD(AFD.v8)の背景におけるAsn−103のAspまたはSerによる置換はfDへの親和性のわずかで許容可能な減少を引き起こした(AFD.v12(SIESD.N103D)及びAFD.v14(SIESD.N103S)を参照されたい)(表1)。Asn−103のGln置換は結合親和性のより大きな減少を引き起こした(AFD.v13(SIESD.N103Q)を参照されたい(表1))。SIESD(AFD.v8)と同様に五重突然変異体SIESD.N103S(AFD.v14)にVL−D92Eを付加したSIESD.N103S.D92E(AFD.v15)はfDへの親和性のさらに4倍の減少を引き起こした。
b.D因子阻害アッセイ
副経路(AP)溶血アッセイを用いてD因子誘導性補体活性化を阻害する能力についてaFD WT及び変異体を検査した。ウサギ赤血球(Er)を使用するAP溶血アッセイがこれまでに記載されている。Pangburn (1998), Methods. Enzymol. 162:639、Katschke et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:10473。Er(コロラド・セラム)をベロナール緩衝液中の0.5%ウシ皮膚ゼラチン(GVB)で3回洗浄し、再懸濁した。aFDの希釈物を2倍濃度で調製し、96ウェルポリプロピレンプレートに添加した。Er懸濁液をGVB/0.1M EGTA/0.1M MgCl2と混合し、それらのプレートに添加した。古典的経路を介したあらゆる補体活性化を回避するためにC1q除去ヒト血清(Comp Tech;GVB中に1:3希釈)の添加により補体活性化を開始した。室温で30分間の培養後にGVB中の10mM EDTAの添加によりその反応を停止した。それらのプレートを遠心分離し、上清を移した。その上清の吸光度を412nmで読んだ。最大半抑制(IC50)を引き起こすaFD濃度を非線形回帰分析により決定した。
副経路(AP)溶血アッセイを用いてD因子誘導性補体活性化を阻害する能力についてaFD WT及び変異体を検査した。ウサギ赤血球(Er)を使用するAP溶血アッセイがこれまでに記載されている。Pangburn (1998), Methods. Enzymol. 162:639、Katschke et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:10473。Er(コロラド・セラム)をベロナール緩衝液中の0.5%ウシ皮膚ゼラチン(GVB)で3回洗浄し、再懸濁した。aFDの希釈物を2倍濃度で調製し、96ウェルポリプロピレンプレートに添加した。Er懸濁液をGVB/0.1M EGTA/0.1M MgCl2と混合し、それらのプレートに添加した。古典的経路を介したあらゆる補体活性化を回避するためにC1q除去ヒト血清(Comp Tech;GVB中に1:3希釈)の添加により補体活性化を開始した。室温で30分間の培養後にGVB中の10mM EDTAの添加によりその反応を停止した。それらのプレートを遠心分離し、上清を移した。その上清の吸光度を412nmで読んだ。最大半抑制(IC50)を引き起こすaFD濃度を非線形回帰分析により決定した。
表2において示されているように変異体SIESD(AFD.v8)、SIESD.N103S(AFD.v14)、及びTM.D92E(AFD.v7)は±30%というIC50測定の標準誤差を考慮するとaFD WTと同等のfD依存的補体活性化活性を抑制する効力を有する。
c.長期にわたる結合能
規定条件下での長期間にわたるfDへのaFD変異体の総合的結合を測定するためにもSPRを使用した。これらの測定結果における標準誤差は±10%である。図2AはpH5.5でaFD WTとaFD変異体D30E(AFD.v2)及びTM(AFD.v6)については結合の減少が1カ月に約40%であり、一方でSIESD(AFD.v8)及びSIESD.N103S(AFD.v14)については結合の減少は長期間(70日)にわたっても約15%とより少なかったことを示している。比較として、抗VEGF抗体Fab断片(aVEGF)は70日間にわたって結合の減少を示さなかった。そのpH7.4条件への塩の添加はaFD WT及びaVEGFの結合減少速度を上昇させるようであった(データを示さず)。図2Bにおいて示されるようにPBS(100mg/mlのFabタンパク質濃度を含む)の存在下でD30E(AFD.v2)及びTM(AFD.v6)はaFD WTについて観察された速度より遅い、同等の結合減少速度を有した。37℃で10週間後に結合減少はaFD WTについては約30%、及び抗D因子D30E(AFD.v2)変異体とTM(AFD.v6)変異体については20%であった。37℃で10週間後の結合減少はSIESD.N103Sについてはわずかに10%であり(AFD.14;図2B)、実験誤差よりも大きくなく、同じ条件下でaVEGFについて観察されたものと等しかった。70日間にわたってデータを収集するために100mg/mLのFab濃度でのPBS中温度ストレス実験をSIESD(AFD.v8)について繰り返した。図2Cに示されているように、70日目における結合減少はSIESD(AFD.v8)について10%未満であった。
規定条件下での長期間にわたるfDへのaFD変異体の総合的結合を測定するためにもSPRを使用した。これらの測定結果における標準誤差は±10%である。図2AはpH5.5でaFD WTとaFD変異体D30E(AFD.v2)及びTM(AFD.v6)については結合の減少が1カ月に約40%であり、一方でSIESD(AFD.v8)及びSIESD.N103S(AFD.v14)については結合の減少は長期間(70日)にわたっても約15%とより少なかったことを示している。比較として、抗VEGF抗体Fab断片(aVEGF)は70日間にわたって結合の減少を示さなかった。そのpH7.4条件への塩の添加はaFD WT及びaVEGFの結合減少速度を上昇させるようであった(データを示さず)。図2Bにおいて示されるようにPBS(100mg/mlのFabタンパク質濃度を含む)の存在下でD30E(AFD.v2)及びTM(AFD.v6)はaFD WTについて観察された速度より遅い、同等の結合減少速度を有した。37℃で10週間後に結合減少はaFD WTについては約30%、及び抗D因子D30E(AFD.v2)変異体とTM(AFD.v6)変異体については20%であった。37℃で10週間後の結合減少はSIESD.N103Sについてはわずかに10%であり(AFD.14;図2B)、実験誤差よりも大きくなく、同じ条件下でaVEGFについて観察されたものと等しかった。70日間にわたってデータを収集するために100mg/mLのFab濃度でのPBS中温度ストレス実験をSIESD(AFD.v8)について繰り返した。図2Cに示されているように、70日目における結合減少はSIESD(AFD.v8)について10%未満であった。
実施例3.改善された安定性を有する抗D因子抗体変異体
上記の親和性アッセイに基づいて幾つかの単一抗D因子抗体変異体及び混合抗D因子抗体変異体を追加の安定性分析に選択した。
上記の親和性アッセイに基づいて幾つかの単一抗D因子抗体変異体及び混合抗D因子抗体変異体を追加の安定性分析に選択した。
a.溶解性
試料を低イオン強度及びpH6における溶解性について最初に検査した。アミコン・セントリプレップYM−10遠心フィルターユニットを使用して最初に試料を20mMヒスチジン塩酸のpH5緩衝液中に約100mg/mLの濃度に調製した。pH5及び低イオン強度のこれらの溶液は目視検査時には濁りを示さなかった。試料を14,000×gで10分間にわたって遠心分離してあらゆる不溶性物質を沈殿させた。沈殿物は観察されず、その溶液のタンパク質濃度をUV吸光度測定により決定した。試料(約1mL)を10K MWCOのSlide−A−Lyzerカセット(Pierce)中に入れ、1Lの20mMヒスチジン緩衝液pH6に対して4℃で一晩にわたって透析し、続いて濁りについて目視検査した。それらの溶液の写真が撮影され、図6において提供されている。pH6及び低イオン強度条件(pH6の20mMヒスチジン塩酸中に約100mg/ml)でaFD WT溶液及びD30E(AFD.v2)溶液は著しく濁っており、TM(AFD.v6)溶液は濁りが少なく、SIESD(AFD.v8)の溶液は透明であった(図6)。上記の遠心分離の後、それによって大きな沈殿物がaFD WT及びAFD.v2について目に見えて観察され、より小さい沈殿物がTM(AFD.v6)について観察され、SIESD(AFD.v8)については沈殿物が観察されず、それらの上清のタンパク質濃度をUV吸光度測定により決定した(表3)。aFD WT及びD30E(AFD.v2)は50mg/ml未満の溶解度を示し、TM(AFD.v6)は100mg/mLに近い溶解度を示し、SIESD(AFD.v8)はこれらの条件下で完全に溶けた。pH5での出発濃度と比較したpH6透析後のSIESD(AFD.v8)のタンパク質濃度のわずかな減少は遠心分離時に沈殿物が観察されなかったのでAFD.v8の沈殿よりはむしろ透析時の希釈効果を反映している。
試料を低イオン強度及びpH6における溶解性について最初に検査した。アミコン・セントリプレップYM−10遠心フィルターユニットを使用して最初に試料を20mMヒスチジン塩酸のpH5緩衝液中に約100mg/mLの濃度に調製した。pH5及び低イオン強度のこれらの溶液は目視検査時には濁りを示さなかった。試料を14,000×gで10分間にわたって遠心分離してあらゆる不溶性物質を沈殿させた。沈殿物は観察されず、その溶液のタンパク質濃度をUV吸光度測定により決定した。試料(約1mL)を10K MWCOのSlide−A−Lyzerカセット(Pierce)中に入れ、1Lの20mMヒスチジン緩衝液pH6に対して4℃で一晩にわたって透析し、続いて濁りについて目視検査した。それらの溶液の写真が撮影され、図6において提供されている。pH6及び低イオン強度条件(pH6の20mMヒスチジン塩酸中に約100mg/ml)でaFD WT溶液及びD30E(AFD.v2)溶液は著しく濁っており、TM(AFD.v6)溶液は濁りが少なく、SIESD(AFD.v8)の溶液は透明であった(図6)。上記の遠心分離の後、それによって大きな沈殿物がaFD WT及びAFD.v2について目に見えて観察され、より小さい沈殿物がTM(AFD.v6)について観察され、SIESD(AFD.v8)については沈殿物が観察されず、それらの上清のタンパク質濃度をUV吸光度測定により決定した(表3)。aFD WT及びD30E(AFD.v2)は50mg/ml未満の溶解度を示し、TM(AFD.v6)は100mg/mLに近い溶解度を示し、SIESD(AFD.v8)はこれらの条件下で完全に溶けた。pH5での出発濃度と比較したpH6透析後のSIESD(AFD.v8)のタンパク質濃度のわずかな減少は遠心分離時に沈殿物が観察されなかったのでAFD.v8の沈殿よりはむしろ透析時の希釈効果を反映している。
追加の変異体AFD.v3、AFD.v12、AFD.v13及びAFD.v14を無塩溶解性検査において検査した。4℃のpH6緩衝液への透析と37℃で一晩にわたる培養の後にaFD WTを除くタンパク質溶液の全てが透明であった(図7)。37℃の培養と遠心分離の後のタンパク質濃度の測定値(表4)は全ての変異体がaFD WTよりも溶けやすいことを示している。aFD WTの濁った溶液(図7上段)は後で塩(NaCl)含有緩衝液であるPBS(pH7.3)に対して透析されると透明になり、このことは塩の添加及び/またはpHの上昇によって沈殿が可逆的であったことを示唆している(図7下段)。AFD.v3についての溶解性データは1個の負に帯電した残基の除去である単一アミノ酸変化D31Sによって溶解度の上昇が引き起こされ得ることを示している。AFD.v8、AFD.v12、AFD.v13及びAFD.v14における追加のアミノ酸変化も溶解度の上昇を引き起こす。
aFD WT、SIESD(AFD.v8)及びSIESD.N103S(AFD.v14)ついても生理的なpH(pH7.3)の条件下での溶解性およびイオン強度を検査した。生理的なpHの下での溶解性検査とイオン強度についてPBSに対して一晩にわたって試料を透析し、その後でアミコン・セントリプレップYM−10遠心フィルターユニットを使用して227〜372mg/mLまで濃縮した。4℃で一晩にわたる培養の後に濁りについて試料を目視検査し、一部を遠心分離して沈殿したタンパク質を除去し、タンパク質濃度をUV吸光度測定により決定し、表5に報告した。遠心分離の前にaFD WT試料は濁っており、一方でSIESD(AFD.v8)及びSIESD.N103S(AFD.v14)の溶液は透明であった(図8に示されるaFD WT、AFD.v8及びAFD.v14)。AFD.v14の濃度は写真の溶液については344mg/mLであり(図8)、それはその後372mg/mLまでさらに濃縮された。AFD.v8の濃度は図8の溶液について269mg/mlであった。aFD WTの濃度は図8の溶液について227mg/mlであった。遠心分離後に沈殿物がaFD WT溶液について観察されたが、SIESD(AFD.v8)及びSIESD.N103S(AFD.v14)の溶液について観察された沈殿物は無かった。タンパク質濃度データ(表5)から、aFD WTは沈殿が観察される前にPBS中で227mg/mLまでにしか濃縮され得ないが、一方でSIESD(AFD.v8)(269mg/mL以上)及びSIESD.N103S(AFD.v14)(372mg/mL以上)については溶解性限度がより高いことが示された。269mg/mLのSIESD(AFD.v8)について沈殿物は観察されず、その溶液をさらに濃縮する試みが行われなかったので、これはPBS中のこの変異体の溶解度の下限である。同様に、PBS中のSIESD.N103S(AFD.v14)の溶解度の下限は372mg/mLである。PBS中のSIESD(AFD.v8)の269mg/mL溶液は2〜8℃で4週間の培養後に透明なままであった。同様に、2〜8℃で3週間の培養後のPBS中のSIESD.N103S(AFD.v14)の372mg/mL溶液については濁度のどのような明確な上昇もなかった。この濃度ではサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて測定すると凝集体の割合(%)の非常にわずかな変化があり(図9)、2〜8℃で3週間の内に0.9%から2.1%まで増加した(3週間の培養前のSECデータ(0.9%の凝集体)が図9に示されている;3週間の培養後のSECデータは示されないデータである)。
*pI値は画像化毛管等電点電気泳動(icIEF)によって決定された。
*pI値は画像化毛管等電点電気泳動(icIEF)によって決定された。
変異体SIESD(AFD.v8)及びSIESD.N103S(AFD.v14)の溶解性も硝子体内注射を介して投与される薬品に使用される製剤を代表し得るpH5.5(20mM HCl pH5.5)の緩衝液の中でNaCl濃度を変えて比較した。約100mg/mLタンパク質濃度の溶液を調製し、検査緩衝液に対して透析した。その後、アミコン・セントリプレップYM−10遠心フィルターユニットを使用してこれらの溶液を濃縮した。溶液が外界温度で目に見えて透明のままである、その濃縮によって得られた濃度が表6に報告されている。SIESD(AFD.v8)はpH5.5及び低NaCl濃度で314mg/mLまでの高い溶解度を有する。高濃度のSIESD.N103S(AFD.v14)も100mMのNaClの添加により278mg/mLまで達成可能である。
SIESD.N103S(AFD.v14)はaFD WTと比較して2個少ない負に帯電した残基を有するが、電荷のこれらの変化は画像化毛管等電点電気泳動(iCIEF)によって測定されると顕著なpI変化を引き起こさない(表5)(Salas−Solano et al, J. Sep Sci, 35(22): 3124 (2012))。タンパク質はpIに近いpH値で最小の溶解度を有すると予期される(Green, A.A., J. Biol. Chem., 93: 517−542 (1931))。SIESD.N103S(AFD.v14)についてPBS(pH7.3)中での上昇した溶解度はpIの変化と相関しない。むしろLC−CDR−L1におけるAspのSerへのアミノ酸変化(VL−D28S及びD31S)がその分子の表面上の電荷分布を変更するようである。
b.異性化及び脱アミド化
長期作用性送達系に見出され得る様々な条件への変異体の曝露をシミュレートするため、37℃で数週間にわたって変化したpH及び塩条件の下で抗体にストレスをかけた。具体的には次の5つの異なる製剤で抗体を評価した:
製剤1:10mg/mL、pH2.5の10mMリン酸緩衝液、
製剤2:10mg/mL、pH5.5の10mMヒスチジン塩酸、
製剤3:10mg/mL、pH7.4の10mMリン酸緩衝液(「低塩」)、
製剤4:10mg/mL、pH7.4PBS(「高塩」;10mMリン酸、137mM NaCl)、
製剤5:100mg/mL、pH7.4のPBS。
長期作用性送達系に見出され得る様々な条件への変異体の曝露をシミュレートするため、37℃で数週間にわたって変化したpH及び塩条件の下で抗体にストレスをかけた。具体的には次の5つの異なる製剤で抗体を評価した:
製剤1:10mg/mL、pH2.5の10mMリン酸緩衝液、
製剤2:10mg/mL、pH5.5の10mMヒスチジン塩酸、
製剤3:10mg/mL、pH7.4の10mMリン酸緩衝液(「低塩」)、
製剤4:10mg/mL、pH7.4PBS(「高塩」;10mMリン酸、137mM NaCl)、
製剤5:100mg/mL、pH7.4のPBS。
全ての溶液が0.02%PS20を有し、37℃で培養され、2週間ごとに試料採取された。低塩条件(pH2.5、5.5、及び7.4)は液体製剤における化学的分解の効果を評価するためのものであった。PBSをヒト硝子体のpH及びイオン強度の模倣物として使用した。加えて、10mMリン酸、pH7.4をPBS条件と比較することで化学的及び物理的安定性に対するイオン強度の効果が明らかになるはずである。PBS試料は硝子体の交換をシミュレートするために培養時に定期的に緩衝液交換された。野生型aFD(「WT」または「aFD WT」)及びaVEGFを5条件全てで評価した。4番を除く全ての製剤でD30E(AFD.v2)変異体及びTM(AFD.v6)変異体を検査した。SIESD(AFD.v8)及びSIESD.N103S(AFD.v14)は製剤2及び5で検査された。
定量されている化学的分解は、酸性ピークの形成を特徴とする脱アミド化、及び塩基性ピークとして検出される長期存在性スクシンイミド(Asu)中間産物の形成を特徴とする異性化脱水ステップであった。陰イオン交換クロマトグラフィー(Dionex ProPac SAX−10カラム)(IEC)を使用して異なる製剤中の抗体試料内のAsn脱アミド化種及びAsp脱水種の出現を定量した。
検査した全ての条件についてaFD WTは検査した抗体の中で主要ピークの最大の減少速度と塩基性ピークの最大の増加を示す。これはaVEGF、D30E(AFD.v2)、TM(AFD.v6)、SIESD(AFD.v8)、及びSIESD.N103S(AFD.v14)の全てがaFD WTよりも著しく低い主要ピーク減少速度を示すpH5.5において非常に顕著である。図3Aを参照されたい。SIESD.N103S(AFD.v14)はpH5.5においてaVEGFと同様であり(図3A)、且つ、PBS中のaVEGFよりもさらにゆっくりとした速度による最もゆっくりとした主要ピーク減少速度を示す(図3B)。図4B(PBS(pH7.3)中に100mg/mlのFab、D30E(AFD.v2))は、aFD WTの約半分の塩基性ピーク形成速度を示し、一方でTM(AFD.v6)、SIESD(AFD.v8)、及びSIESD.N103S(AFD.14)は無視できるほどの塩基性ピーク形成を示す。対照的に、図4B(PBS(pH7.3)中に100mg/mlのFab)に示されるようにaFD WT及びD30E(AFD.v2)の酸性ピーク形成速度はPBS条件について同等であり、TM(AFD.v6)及びSIESD(AFD.v8)について決定されたものよりも約2倍遅い。PBS中でのSIESD.N103S(AFD.v14)の酸性ピーク形成は基本的に無視できるほどである。
c.凝集
検査抗体の凝集体及び単量体の形成を定量するためにサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を活用した。使用したカラムはTSK−GEL Super SW2000(東ソーバイオサイエンス)であった。製造業者の指示(www.tskgel.com)に基づいて材料と条件を用いた。
検査抗体の凝集体及び単量体の形成を定量するためにサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を活用した。使用したカラムはTSK−GEL Super SW2000(東ソーバイオサイエンス)であった。製造業者の指示(www.tskgel.com)に基づいて材料と条件を用いた。
37℃でPBS中に製剤されたFabの100mg/mlでの検査抗体のSECデータに基づく経時的な単量体の割合(%)が図5に示されている。AFD WTは単量体ピーク画分の月当たり3〜4%の減少を示している。aFD WTと比較して負の電荷に変化を有しないAFD.v2(D30E)は同様の単量体減少速度を示す。AFD.v6、AFD.v8及びAFD.v14は低下した単量体減少速度を示す。0日目における単量体含量の差異は精製調製物の均一性のわずかな変化を反映している。D30E(AFD.v2)及びTM(AFD.v6)の凝集速度は10mg/mlのタンパク質濃度においてpH5.5及び7.4(無塩)で同等である。pH7.4での塩の添加はaFD変異体の凝集速度に影響しないが、aVEGFの凝集速度を二倍にする。PBS中での10mg/mLから100mg/mLまでの濃度の増加が検査された全ての試料の凝集速度を上昇させるので凝集はタンパク質濃度依存的である(表7)。10mMリン酸緩衝液pH7.4及び無NaCl中の10mg/mLの濃度、及びPBS中の10mg/mLの濃度における凝集が最小であった(表7)。PBS中に100mg/mLの濃度において単量体の減少は37℃のPBS中に100mg/mLのaVEGF、TM(AFD.v6)、SIESD(AFD.v8)、及びSIESD.N103S(AFD.v14)(40日間でそれぞれ1.8%、1.5%、0.7%、及び1.5%)よりもaFD WT及びD30E(AFD.v2)(40日間でそれぞれ5.8%及び7.3%)についてずっと大きい。これらのデータはAFD.v6、AFD.v8及びAFD.v14がaFD WT及びAFD.v2よりも少ない凝集を有し、それらはインビボで免疫原性になりにくい場合があり得るので治療薬としてより適切であり得ることを示唆している。
pHの関数として形成される断片化を検出するため、直径50μmの内径を有する非被覆溶融石英毛管(Polymicro Technologies社)とベックマンPA800システムを使用してドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動(CE−SDS)を実施した。Q12695と同等の自動化を有するベックマン・コールターNXpリキッド・ハンドリング・ロボットにより試料を調製した。5kVの電圧で15秒間にわたって毛管に試料を注入し、その後で15kVの電圧で30分間にわたって泳動した。全ての試料を外界温度で泳動した。全ての検査抗体の電気泳動図はaFD WTの電気泳動図と同様である。pH2.5でのみ著しい断片化が観察された。高分子量種が観察される条件は無く、形成されたあらゆる凝集体がSDS分離可能であり、共有結合で結合していないことを示している。
上記安定性結果は三重(TM(AFD.v6))及び四重(SIESD(AFD.v8))突然変異体抗D因子変異体がaFD WTまたはD30E(AFD.v2)に対して著しく改善されている化学的安定性を有することを示している。このシリーズではSIESD.N103S(AFD.14)はaVEGFの安定性と同様にpH5.5及びPBSにおいて最も高い化学的安定性を有する。異性化部位と脱アミド化部位の両方が除去されており、fD結合親和性を維持しつつ中性pHにおける溶解性が上昇している。上記発見に基づくと、本明細書に記載される選択された抗D因子変異体、特にSIESD(AFD.v8)変異体及びSIESD.N103S(AFD.v14)変異体は高濃度製剤と、例えば、ポート送達系(PDS)装置を介した長期作用性送達の両方に適切である。例えば、ポート送達系のような恒久的再充填可能装置を使用する長期作用性送達は高濃度製剤と生理的条件のpH(約7.3)及びイオン強度(約150mM NaCl)下での低い凝集傾向を必要とし得る。
HVR配列の表(変異体中の置換に下線を引いてある)
HVR配列の表(変異体中の置換に下線を引いてある)
実施例4.高分子複合体化用にさらに改変された抗D因子抗体変異体
上記実施例において説明されたaFD WT及び変異体はFab断片である。それらの軽鎖及び重鎖の可変ドメイン(VL及びVH)は図1Bに示されるように配列に関して変化しており、それらの定常ドメインCL及びCH1は同じままである。特に、重鎖のCH1ドメインは図1A(配列番号2)、図1C(配列番号27)及び図1D(配列番号29)に示されているようにトレオニン残基で終わる。PEG化などの高分子複合体化用にaFD変異体を調製するため、付加されたシステインがPEG高分子の結合部位として働くようにFab’対応物のヒンジ領域の最初のシステイン残基を付加することによりそのFab断片の重鎖をさらに改変した(例えばAFD.v8のCys修飾HC(配列番号30)及びAFD.v14のCys修飾HC(配列番号32))。したがって、それにより生じる断片は1つのPEG分子と複合体化され得る。Fab断片の重鎖は2つの付加されたCysの両方がPEGの結合部位として働き、2つのPEG分子に結合できる改変aFD Fab断片が生じるようにFab’対応物のヒンジ領域の最初の4残基、すなわち、Cys−Pro−Pro−Cys(配列番号21)を付加することによっても改変された(例えば、AFD.v8のCys−Pro−Pro−Cys修飾HC(配列番号31)及びAFD.v14のCys−Pro−Pro−Cys修飾HC(配列番号33))。
上記実施例において説明されたaFD WT及び変異体はFab断片である。それらの軽鎖及び重鎖の可変ドメイン(VL及びVH)は図1Bに示されるように配列に関して変化しており、それらの定常ドメインCL及びCH1は同じままである。特に、重鎖のCH1ドメインは図1A(配列番号2)、図1C(配列番号27)及び図1D(配列番号29)に示されているようにトレオニン残基で終わる。PEG化などの高分子複合体化用にaFD変異体を調製するため、付加されたシステインがPEG高分子の結合部位として働くようにFab’対応物のヒンジ領域の最初のシステイン残基を付加することによりそのFab断片の重鎖をさらに改変した(例えばAFD.v8のCys修飾HC(配列番号30)及びAFD.v14のCys修飾HC(配列番号32))。したがって、それにより生じる断片は1つのPEG分子と複合体化され得る。Fab断片の重鎖は2つの付加されたCysの両方がPEGの結合部位として働き、2つのPEG分子に結合できる改変aFD Fab断片が生じるようにFab’対応物のヒンジ領域の最初の4残基、すなわち、Cys−Pro−Pro−Cys(配列番号21)を付加することによっても改変された(例えば、AFD.v8のCys−Pro−Pro−Cys修飾HC(配列番号31)及びAFD.v14のCys−Pro−Pro−Cys修飾HC(配列番号33))。
実施例5:AFD.v8/v14についてのウサギpK
AFD.v8及びAFD.v14についてのインビボpK試験をウサギにおいて行った。ヒト化抗体は反復投与時に、または曝露が持続性送達製剤を介して増加するとウサギにおいて免疫原性となるので単回投与実験からpKパラメーターを決定した。
AFD.v8及びAFD.v14についてのインビボpK試験をウサギにおいて行った。ヒト化抗体は反復投与時に、または曝露が持続性送達製剤を介して増加するとウサギにおいて免疫原性となるので単回投与実験からpKパラメーターを決定した。
動物の世話はジェネンテック社動物実験委員会のガイドラインに従った。未感作ニュージーランド白(NZW)ウサギ(41匹のオス動物;投与時に3.1kgから4.1kg及び約4か月齢)を投与群に割り当て、チャールス・リバー・ラボラトリーズにおいてそれらのウサギに検査品目を投与した。
SIESD(AFD.v8)、SIESD.N103S(AFD.v14)またはラニビズマブを単回両側硝子体内注射によりウサギに投与し、最大で27日間にわたって観察した。1日目及び2日目に剖検に送られる動物を除いて両眼に局所用抗生物質(トブラマイシン眼軟膏)を治療前日、その注射直後に2回塗布し、及びその注射の翌日に2回塗布した。投与前に完全に瞳孔を拡張させるために散瞳目薬(1%トロピカミド)を両目にさした。処置前及び処置中にイソフルラン/酸素ガスを用いて動物を落ち着かせた。注射前にアルカイン(0.5%)も両目にさした。結膜を米国薬局方の滅菌水に1:10,000(体積/体積)で希釈した塩化ベンザルコニウム(ゼフィラン(商標))で洗った。
投与直前に注射器を層流フードの下で充填した。全ての動物においてFabを単回30μL硝子体内注射(0.3mg用量)により両眼に投与した。30ゲージ×1/2インチの針を着けた滅菌100μLハミルトン・ルアーロック注射器を使用して認定獣医眼科専門医によって用量が投与された。臨床投与を模倣するため、眼の耳下側、すなわち、(動物に対面したときの)左眼及び右眼のそれぞれ5時と7時の位置に投与した。治療直後にそれらの眼を細隙灯生体顕微鏡検査法及び/または間接検眼法により調査した。
全ての動物がペントバルビタールナトリウムの静脈内注射による麻酔後に腋下動脈または大腿動脈の切開により失血させられた。眼房水、硝子体液及び網膜組織を採取し、液体窒素中で瞬間凍結し、−80℃で貯蔵した。網膜中の抗体Fabを50mMトリス塩酸pH8.0、1M NaCl中でのホモジナイゼーションにより抽出した。検査物品の硝子体濃度及び網膜濃度の決定は下に記載されるGRIP ELISAによった。薬物動態分析、またはグラフ目的もしくは要約目的にLLOQ未満の値を使用しなかった。薬物動態パラメーターは名目上の時間及び用量を用いるノンコンパートメント解析(Phoenix WinNonlin、Pharsight社、マウンテン・ビュー、カリフォルニア州)により決定された。
次の例外を含む一般的免疫グロブリン薬物動態(GRIP)ELISAにおいてSIESD(AFD.v8)、SIESD.N103S(AFD.v14)及びラニビズマブの分析を行った。ヒツジ抗ヒトIgG(The Binding Site;サンディエゴ、カリフォルニア州)を0.5M炭酸/重炭酸、pH9.6中に1000ng/mLまで希釈し、4℃で一晩の培養中に384ウェルELISAプレート(Nunc;ネプチューン、ニュージャージー州)上に被覆した。プレートをPBSプラス0.05%ツイーン−20で洗浄し、1時間から2時間の培養中にPBSプラス0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)でブロックした。この培養及び後続の全ての培養は穏やかに撹拌しながら室温で実施した。AFD.v8、AFD.v14またはラニビズマブをアッセイ緩衝液(PBS、0.5%BSA、15ppmプロクリン、0.05%ツイーン20、0.25%CHAPS、5mM EDTA、0.35M NaCl、(pH7.4))中に40〜0.625ng/mLまで段階希釈することで検量線を作成した。ウサギ硝子体ホモジネート試料または網膜ホモジネート試料をアッセイ緩衝液中にそれぞれ最低1:100または1:50に希釈した。その後、それらの希釈標準品、対照、及び試料を洗浄したプレート上で1〜2時間にわたって培養した。洗浄ステップ後にプレートに結合したAFD.v8、AFD.v14またはラニビズマブをアッセイ希釈液(PBS+0.5%BSA+0.05%ツイーン20+10ppmプロクリン)中に83.3ng/mLまで希釈したHRP結合ヒツジ抗ヒトIgG mAb(Bethyl Laboratories社;モントゴメリー、テキサス州)との1.5時間の培養中に検出した。最後の洗浄後にテトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ基質(Moss社、パサデナ、メリーランド州)を添加し、10〜15分間にわたって発色させ、及び1Mリン酸により反応を停止した。マイクロプレートリーダー(Multiscan Ascent、サーモフィッシャー;ウォルサム、マサチューセッツ州)を使用してそれらのプレートを620nmの参照と共に450nmで読んだ。自作のExcelベースのソフトウェアを使用して各検量線の4パラメーターフィットからAFD.v8、AFD.v14またはラニビズマブの濃度を計算した。硝子体ホモジネートまたは網膜ホモジネートにおける最小希釈度を考慮に入れるとウサギ硝子体ホモジネートまたは網膜ホモジネート中のAFD.v8、AFD.v14またはラニビズマブの最小定量可能濃度はそれぞれ62.5ng/mLまたは31.25ng/mLであった。
0.3mgのSIESD(AFD.v8)の硝子体内注射、SIESD.N103S(AFD.v14)の硝子体内注射、またはラニビズマブ(抗VEGF)の対照投与について観察された時間依存濃度曲線が図10に示されている。
ノンコンパートメントモデルを使用する硝子体データの分析からSIESD(AFD.v8)とSIESD.N103S(AFD.v14)の両方がラニビズマブと非常に類似するクリアランス特性を有することが示された。3種類全てのタンパク質がAUCパラメーターに反映されているように硝子体液、眼房水、及び網膜の3種類の眼の区画において非常に類似する曝露を示した。ラニビズマブについて計算されたPKパラメーターはウサギにおける以前の研究(Gaudrealt et al, Retina, 27:1260−6 (2007))と一致した。SIESD(AFD.v8)とSIESD.N103S(AFD.v14)の両方がこれらの分子を開発にふさわしいものにする標的独立的眼クリアランス特性を示している。
実施例6:AFD.v8/v14の粘度
低い粘度が硝子体内投与に重要であるので、pH5.5の低塩緩衝液中の様々なタンパク質濃度でのSIESD(AFD.v8)及びSIESD.N103S(AFD.v14)の粘度を測定した。1000s−1のせん断速度を用いて粘度測定を25℃にサーモスタット制御されたTAインスツルメントのコーンプレートレオメーター上で実施した。
低い粘度が硝子体内投与に重要であるので、pH5.5の低塩緩衝液中の様々なタンパク質濃度でのSIESD(AFD.v8)及びSIESD.N103S(AFD.v14)の粘度を測定した。1000s−1のせん断速度を用いて粘度測定を25℃にサーモスタット制御されたTAインスツルメントのコーンプレートレオメーター上で実施した。
aFD WT、SIESD(AFD.v8)及びSIESD.N103S(AFD.v14)は200mg/mLを超える濃度であっても硝子体内注射にとって許容可能な粘度(30cP未満)を有する同様の粘度のタンパク質濃度依存性プロファイルを示した(図11)。
当業者は本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多数の同等の実施形態を理解し、または日常的実験にすぎない実験を用いてそれらの実施形態を確認することができる。そのような同等の実施形態は以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
前述の発明は明瞭な理解を目的として例示と実例により幾分詳しく説明されているが、それらの説明及び実例は本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書において引用される全ての特許文献及び科学文献の開示は参照により全体が明示的にに援用される。
上記の明細書は当業者による本発明の実施を可能にするのに充分であると考えられる。挿入された実施形態は本発明のある特定の態様の一つの例示を目的としており、また機能的に同等であるあらゆる構成体は本発明の範囲内であるので、本発明は挿入された構成体によって範囲を限定されるべきではない。実際、本明細書において示され、記載された改変に加えて様々な本発明の改変が前述の説明から当業者に明らかになり、添付されている特許請求の範囲の範囲内に入る。
Claims (58)
- 基準抗D因子抗体の超可変領域(HVR)内に少なくとも1個の標的アスパラギン酸(DまたはAsp)残基の置換を含む安定性改善型抗D因子抗体変異体であって、該標的Asp残基が異性化しやすいものと特定されており、且つ、該置換がAspからグルタミン酸(EまたはGlu)への置換であり、該基準抗D因子抗体と比較するとD因子結合親和性をあまり失わずに改善された安定性を示す、抗D因子抗体変異体。
- XaaがAsp、Gly、His、SerまたはThrであるAsp−Xaaモチーフ内にAsp残基が存在する、請求項1に記載の抗体変異体。
- 標的Asp残基がAsp−Aspモチーフの1番目のAspである、請求項2に記載の抗体変異体。
- 変異体が基準抗D因子抗体のHVR内にさらに少なくとも1個のAsp残基のセリン(SまたはSer)による置換をさらに含み、その結果生じる変異体が該基準抗D因子抗体と比較するとより少ない負電荷を有し、且つ、改善された溶解性を示す、請求項1に記載の抗体変異体。
- 変異体が基準抗D因子抗体のHVR内に脱アミド化易発性アスパラギン(NまたはAsn)残基の1か所以上のSer置換をさらに含む、請求項1に記載の抗体変異体。
- 基準抗D因子抗体が配列番号3の軽鎖可変ドメイン配列を含む、請求項1に記載の抗体変異体。
- 配列番号4の重鎖可変ドメイン配列をさらに含む、請求項6に記載の抗体変異体。
- 基準抗D因子抗体が配列番号1の軽鎖配列と配列番号2の重鎖配列を含む、請求項7に記載の抗体変異体。
- 変異体が配列番号11の軽鎖HVR1(HVR−L1)配列と配列番号12の重鎖HVR2(HVR−H2)配列を含む、請求項8に記載の抗体変異体。
- 配列番号13の軽鎖HVR3(HVR−L3)配列をさらに含む、請求項9に記載の抗体変異体。
- 変異体が配列番号14の軽鎖HVR1(HVR−L1)配列と配列番号12の重鎖HVR2(HVR−H2)配列を含む、請求項8に記載の抗体変異体。
- 配列番号15の重鎖HVR3(HVR−H3)配列をさらに含む、請求項11に記載の抗体変異体。
- 基準抗D因子抗体のHVR内に1か所以上の位置に置換を含む抗D因子抗体変異体であって、前記基準抗D因子抗体が配列ITSTDIDDDMN(配列番号5)を含む軽鎖HVR−1、配列GGNTLRP(配列番号6)を含む軽鎖HVR−2、配列LQSDSLPYT(配列番号7)を含む軽鎖HVR−3、配列GYTFTNYGMN(配列番号8)を含む重鎖HVR−1、配列WINTYTGETTYADDFKG(配列番号9)を含む重鎖HVR−2、及び配列EGGVNN(配列番号10)を含む重鎖HVR−3を含み、且つ、前記置換が次のもの、すなわち、(a)配列番号5の位置5のアミノ酸がS(配列番号22において開示されるa、b、及びc)、(b)配列番号5の位置7のアミノ酸がE、(c)配列番号5の位置8のアミノ酸がS、(d)配列番号9の位置13のアミノ酸がE(配列番号23)、(e)配列番号7の位置4のアミノ酸がE(配列番号24)、または(f)配列番号10の位置5のアミノ酸がS(配列番号25)のうちの1つ以上である、抗D因子抗体変異体。
- 抗体変異体がその中に前記置換(b)〜(d)を含む、請求項13に記載の抗体変異体。
- 抗体変異体がその中に前記置換(b)〜(e)を含む、請求項13に記載の抗体変異体。
- 抗体変異体がその中に前記置換(a)〜(d)を含む、請求項13に記載の抗体変異体。
- 抗体変異体がその中に前記置換(a)〜(d)及び(f)を含む、請求項13に記載の抗体変異体。
- 配列番号16、18または19の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗D因子抗体。
- 配列番号17または20の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗D因子抗体。
- 配列番号17または20の重鎖可変ドメインアミノ酸配列をさらに含む、請求項18に記載の抗D因子抗体。
- 軽鎖可変ドメインアミノ酸配列が配列番号19に記載のものであり、且つ、重鎖可変ドメインアミノ酸配列が配列番号17に記載のものである、請求項20に記載の抗D因子抗体。
- 軽鎖可変ドメインアミノ酸配列が配列番号19に記載のものであり、且つ、重鎖可変ドメインアミノ酸配列が配列番号20に記載のものである、請求項20に記載の抗D因子抗体。
- 配列番号11または14の配列を有するHVR−L1、配列番号6の配列を有するHVR−L2、及び配列番号7または13の配列を有するHVR−L3を含む可変軽鎖、及び配列番号8の配列を有するHVR−H1、配列番号9または12の配列を有するHVR−H2、及び配列番号10または15の配列を有するHVR−H3を含む可変重鎖を有する、抗D因子抗体。
- 配列番号14の配列を有するHVR−L1、配列番号6の配列を有するHVR−L2、及び配列番号7の配列を有するHVR−L3を含む可変軽鎖、及び配列番号8の配列を有するHVR−H1、配列番号12の配列を有するHVR−H2、及び配列番号10の配列を有するHVR−H3を含む可変重鎖を有する、請求項23に記載の抗D因子抗体。
- 配列番号14の配列を有する配列番号HVR−L1のHVR−L1配列、配列番号6の配列を有するHVR−L2、及び配列番号7の配列を有するHVR−L3を含む可変軽鎖、及び配列番号8の配列を有するHVR−H1、配列番号12の配列を有するHVR−H2、及び配列番号15の配列を有するHVR−H3を含む可変重鎖を有する、請求項23に記載の抗D因子抗体。
- 配列番号26のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号27のアミノ酸配列を有する重鎖を有する、抗D因子抗体。
- 配列番号28のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号29のアミノ酸配列を有する重鎖を有する、抗D因子抗体。
- 配列番号26のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号30のアミノ酸配列を有する重鎖を有する、抗D因子抗体。
- 配列番号26のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号31のアミノ酸配列を有する重鎖を有する、抗D因子抗体。
- 配列番号28のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号32のアミノ酸配列を有する重鎖を有する、抗D因子抗体。
- 配列番号28のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号33のアミノ酸配列を有する重鎖を有する、抗D因子抗体。
- (a)基準抗D因子抗体のHVR内にあるAsp異性化しやすい1個以上のAsp残基の特定、(b)ステップ(a)で特定された該Asp残基のGluによる置換、(c)その結果生じた候補変異体のAsp異性化についてのスクリーニング、及び(d)検出可能なAsp異性化を有しない変異体の選択、を含む方法によって作製される、検出可能なAsp異性化を有しない抗D因子抗体変異体。
- 方法が、(e)基準抗D因子抗体のHVR内における脱アミド化しやすい1個以上のAsn残基の特定、(f)ステップ(e)で特定されたAsn残基のSerによる置換、(g)その結果生じた候補変異体の脱アミド化についてのスクリーニング、及び(h)脱アミド化が減少した、または無くなった変異体の選択をさらに含む、請求項32に記載の抗体変異体。
- 方法が、(e)基準抗D因子抗体のHVR内にある1個以上の負に帯電したアミノ酸残基DまたはEの選択、(f)ステップ(e)で選択された残基のSerによる置換、(g)その結果生じた候補変異体の溶解性についてのスクリーニング、及び(h)該基準抗D因子抗体と比較すると改善された溶解性を有する変異体の選択をさらに含む、請求項32に記載の抗体変異体。
- 方法が、結合親和性を維持しつつ改善された安定性を有する変異体を生じさせる、基準抗体のHVR内での追加置換をさらに含む、請求項32に記載の抗体変異体。
- 請求項1〜35のいずれか1項に記載の抗体または抗体変異体を含む、医薬製剤。
- 抗体変異体が少なくとも100mg/mlの濃度で存在する、請求項36に記載の医薬製剤。
- 抗体変異体が少なくとも200mg/mlの濃度で存在する、請求項36に記載の医薬製剤。
- 抗体変異体が少なくとも300mg/mlの濃度で存在する、請求項36に記載の医薬製剤。
- 抗体変異体が少なくとも500mg/mlの濃度で存在する、請求項36に記載の医薬製剤。
- 請求項36に記載の医薬製剤及び該製剤を患者に硝子体内送達するための手段を含み、それにより該製剤が長期間にわたってその場で有効であり続ける、眼球送達用の長期作用性送達装置。
- 補体関連疾患の治療用医薬の製造における請求項36に記載の製剤または請求項41に記載の装置の使用。
- 前記補体関連疾患が眼疾患である、請求項42に記載の使用。
- 眼疾患が加齢黄斑変性(AMD)、糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生(CNV)、ぶどう膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、及び網膜血管新生からなる群より選択される、請求項43に記載の使用。
- 眼疾患が中期乾燥型AMDまたは地図状萎縮(GA)である、請求項44に記載の使用。
- D因子アンタゴニストとHTRA1アンタゴニストを含む、組成物。
- D因子アンタゴニストが抗D因子抗体である、請求項46に記載の組成物。
- HTRA1アンタゴニストが抗HTRA1抗体である、請求項46または47に記載の組成物。
- 抗D因子抗体が請求項1〜31のいずれか1項に記載の抗D因子抗体である、請求項46〜48のいずれか1項に記載の組成物。
- 補体関連疾患の治療用のD因子アンタゴニストとHTRA1アンタゴニストとを含む組成物の使用。
- 補体関連疾患が眼疾患である、請求項44に記載の使用。
- ヒト対象における補体関連疾患の治療方法であって、該対象に第1治療化合物の有効量と第2治療化合物の有効量を投与することを含む、方法。
- 第1及び第2治療化合物が同時に投与される、請求項46に記載の方法。
- 第1及び第2治療化合物が単一の組成物として投与される、請求項52に記載の方法。
- 第1及び第2治療化合物が別個の組成物として投与される、請求項52に記載の方法。
- 第1及び第2治療化合物が順次投与される、請求項52に記載の方法。
- 第1治療化合物がD因子アンタゴニストである、請求項52に記載の方法。
- 第2治療化合物がHTRA1アンタゴニストである、請求項52または57に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461987298P | 2014-05-01 | 2014-05-01 | |
US61/987,298 | 2014-05-01 | ||
US201462076372P | 2014-11-06 | 2014-11-06 | |
US62/076,372 | 2014-11-06 | ||
PCT/US2015/028641 WO2015168468A1 (en) | 2014-05-01 | 2015-04-30 | Anti-factor d antibody variants and uses thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017515811A true JP2017515811A (ja) | 2017-06-15 |
JP2017515811A5 JP2017515811A5 (ja) | 2018-06-14 |
Family
ID=53059539
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016564582A Pending JP2017515811A (ja) | 2014-05-01 | 2015-04-30 | 抗d因子抗体変異体及びその使用法 |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10179821B2 (ja) |
EP (1) | EP3137503A1 (ja) |
JP (1) | JP2017515811A (ja) |
KR (1) | KR20160147855A (ja) |
CN (1) | CN106536561A (ja) |
AU (1) | AU2015253042A1 (ja) |
BR (1) | BR112016025312A2 (ja) |
CA (1) | CA2944712A1 (ja) |
CL (1) | CL2016002738A1 (ja) |
CR (1) | CR20160561A (ja) |
EA (1) | EA201692109A1 (ja) |
IL (1) | IL248042A0 (ja) |
MA (1) | MA39934A (ja) |
MX (1) | MX2016014160A (ja) |
PE (1) | PE20161440A1 (ja) |
PH (1) | PH12016502015A1 (ja) |
SG (1) | SG11201608868PA (ja) |
TW (1) | TW201623337A (ja) |
WO (1) | WO2015168468A1 (ja) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2920666A1 (en) | 2013-08-12 | 2015-02-19 | Genentech, Inc. | Compositions and method for treating complement-associated conditions |
SG11201608868PA (en) | 2014-05-01 | 2016-11-29 | Genentech Inc | Anti-factor d antibody variants and uses thereof |
US9840553B2 (en) | 2014-06-28 | 2017-12-12 | Kodiak Sciences Inc. | Dual PDGF/VEGF antagonists |
EP3368090A1 (en) | 2015-10-30 | 2018-09-05 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Anti-factor d antibody variant conjugates and uses thereof |
CN108602881A (zh) * | 2015-10-30 | 2018-09-28 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 抗-因子d抗体制剂 |
CN108289951A (zh) | 2015-10-30 | 2018-07-17 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 抗-因子d抗体和缀合物 |
AU2016381964B2 (en) | 2015-12-30 | 2024-02-15 | Kodiak Sciences Inc. | Antibodies and conjugates thereof |
GB2553252B (en) * | 2016-01-20 | 2019-07-31 | Vitrisa Therapeutics Inc | Aptamers that block the catalytic cleft of complement Factor D |
CN107043422B (zh) * | 2016-01-28 | 2022-01-04 | 成都康弘生物科技有限公司 | 抗补体因子D的人源化Fab和人源化抗体及其用途 |
WO2018136827A1 (en) | 2017-01-20 | 2018-07-26 | Vitrisa Therapeutics, Inc. | Stem-loop compositions and methods for inhibiting factor d |
IL268601B1 (en) * | 2017-02-10 | 2024-03-01 | Univ Pennsylvania | Antibodies against factor D and their uses |
CN106905431B (zh) * | 2017-04-10 | 2020-01-17 | 旭华(上海)生物研发中心有限公司 | 抗人补体d因子的单克隆抗体及其用途 |
AU2018250695A1 (en) * | 2017-04-14 | 2019-11-07 | Kodiak Sciences Inc. | Complement factor D antagonist antibodies and conjugates thereof |
EP4041312A4 (en) | 2019-10-10 | 2023-12-20 | Kodiak Sciences Inc. | METHOD FOR TREATING AN EYE DISORDER |
AU2021270867A1 (en) | 2020-05-12 | 2022-12-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Use of complement factor D inhibitors alone or in combination with anti-C5 antibodies for treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria |
AU2021401052A1 (en) | 2020-12-18 | 2023-06-22 | Century Therapeutics, Inc. | Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity |
WO2022215054A1 (en) * | 2021-04-09 | 2022-10-13 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Antibodies targeting complement factor d and uses therof |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011521623A (ja) * | 2008-04-28 | 2011-07-28 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | ヒト化抗d因子抗体とその用途 |
WO2012138997A1 (en) * | 2011-04-07 | 2012-10-11 | Amgen Inc. | Novel egfr binding proteins |
WO2013100120A1 (ja) * | 2011-12-28 | 2013-07-04 | 中外製薬株式会社 | ヒト化抗Epiregulin抗体および当該抗体を有効成分として含む癌治療剤 |
JP2013544493A (ja) * | 2010-09-03 | 2013-12-19 | ステム セントリックス, インコーポレイテッド | 新規モジュレータ及びその使用法 |
Family Cites Families (146)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
US4741900A (en) | 1982-11-16 | 1988-05-03 | Cytogen Corporation | Antibody-metal ion complexes |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
GB8430252D0 (en) | 1984-11-30 | 1985-01-09 | Beecham Group Plc | Compounds |
US5206344A (en) | 1985-06-26 | 1993-04-27 | Cetus Oncology Corporation | Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
EP0245993B1 (en) | 1986-04-28 | 1993-05-26 | Cetus Oncology Corporation | Monoclonal antibodies against c5a and des-arg74-c5a, their production and use |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US5256642A (en) | 1988-04-01 | 1993-10-26 | The Johns Hopkins University | Compositions of soluble complement receptor 1 (CR1) and a thrombolytic agent, and the methods of use thereof |
NZ230747A (en) | 1988-09-30 | 1992-05-26 | Bror Morein | Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5166322A (en) | 1989-04-21 | 1992-11-24 | Genetics Institute | Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof |
US5244800A (en) | 1990-04-27 | 1993-09-14 | The Uab Research Foundation | Crystals of human complement factor d that are triclinic |
US5571894A (en) | 1991-02-05 | 1996-11-05 | Ciba-Geigy Corporation | Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor |
ATE255131T1 (de) | 1991-06-14 | 2003-12-15 | Genentech Inc | Humanisierter heregulin antikörper |
AU2147192A (en) | 1991-06-28 | 1993-01-25 | Genentech Inc. | Method of stimulating immune response using growth hormone |
US5587458A (en) | 1991-10-07 | 1996-12-24 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof |
DE69333807T2 (de) | 1992-02-06 | 2006-02-02 | Chiron Corp., Emeryville | Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür |
US5456909A (en) | 1992-08-07 | 1995-10-10 | T Cell Sciences, Inc. | Glycoform fractions of recombinant soluble complement receptor 1 (sCR1) having extended half-lives in vivo |
WO1994004188A1 (en) | 1992-08-21 | 1994-03-03 | Genentech, Inc. | Method for treating an lfa-1-mediated disorder |
AU6048294A (en) | 1992-11-25 | 1994-06-22 | Amgen Boulder Inc. | Modified insulin-like growth factors |
US5861156A (en) | 1993-01-08 | 1999-01-19 | Creative Biomolecules | Methods of delivering agents to target cells |
CA2160154A1 (en) | 1993-04-07 | 1994-10-13 | George N. Cox | Methods of using insulin-like growth factor binding proteins |
US5856300A (en) | 1994-05-12 | 1999-01-05 | T Cell Sciences, Inc. | Compositions comprising complement related proteins and carbohydrates, and methods for producing and using said compositions |
US5679546A (en) | 1993-09-24 | 1997-10-21 | Cytomed, Inc. | Chimeric proteins which block complement activation |
US5627264A (en) | 1994-03-03 | 1997-05-06 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric complement inhibitor proteins |
DE69533921T2 (de) | 1994-03-23 | 2005-12-01 | Alexion Pharmaceuticals, Inc., New Haven | Verfahren zur reduktion von fehlfunktionen des immunsystems und der hämostase während des extrakorporalen kreislaufs |
US5534615A (en) | 1994-04-25 | 1996-07-09 | Genentech, Inc. | Cardiac hypertrophy factor and uses therefor |
US5919623A (en) | 1994-04-27 | 1999-07-06 | St. James's And Seacroft University Hospitals Nhs Trust | Nucleic acid mutation assays |
US6074642A (en) | 1994-05-02 | 2000-06-13 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis |
US5679345A (en) | 1994-06-02 | 1997-10-21 | The Johns Hopkins University | Method for preventing complement-dependent rejection of organ or tissue transplants |
WO2000053758A2 (en) | 1999-03-08 | 2000-09-14 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immune related diseases |
WO2001004311A1 (en) | 1999-07-07 | 2001-01-18 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US5897475A (en) | 1994-10-05 | 1999-04-27 | Antex Biologics, Inc. | Vaccines comprising enhanced antigenic helicobacter spp. |
US5869046A (en) | 1995-04-14 | 1999-02-09 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
US6267958B1 (en) | 1995-07-27 | 2001-07-31 | Genentech, Inc. | Protein formulation |
WO1997011178A1 (en) | 1995-09-21 | 1997-03-27 | Genentech, Inc. | Human growth hormone variants |
US7122636B1 (en) | 1997-02-21 | 2006-10-17 | Genentech, Inc. | Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same |
US20050197285A1 (en) | 1997-03-07 | 2005-09-08 | Rosen Craig A. | Human secreted proteins |
US6472520B2 (en) | 1997-03-21 | 2002-10-29 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Rat PEG-3 promoter |
US6884879B1 (en) | 1997-04-07 | 2005-04-26 | Genentech, Inc. | Anti-VEGF antibodies |
WO1998045331A2 (en) | 1997-04-07 | 1998-10-15 | Genentech, Inc. | Anti-vegf antibodies |
US5994511A (en) | 1997-07-02 | 1999-11-30 | Genentech, Inc. | Anti-IgE antibodies and methods of improving polypeptides |
CA2296770A1 (en) | 1997-07-14 | 1999-01-28 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins |
US6410708B1 (en) | 1997-11-21 | 2002-06-25 | Genentech, Inc. | Nucleic acids encoding A-33 related antigen polypeptides |
ATE335511T1 (de) | 1997-08-26 | 2006-09-15 | Amgen Fremont Inc | Ein verfahren zur inhibierung der komplementaktivierung über einen alternativen weg |
US8088386B2 (en) | 1998-03-20 | 2012-01-03 | Genentech, Inc. | Treatment of complement-associated disorders |
US8007798B2 (en) | 1997-11-21 | 2011-08-30 | Genentech, Inc. | Treatment of complement-associated disorders |
PT1481990E (pt) | 1997-11-21 | 2007-09-17 | Genentech Inc | Antigénios relacionados com a-33 e suas utilizações farmacológicas |
US7192589B2 (en) | 1998-09-16 | 2007-03-20 | Genentech, Inc. | Treatment of inflammatory disorders with STIgMA immunoadhesins |
US7419663B2 (en) | 1998-03-20 | 2008-09-02 | Genentech, Inc. | Treatment of complement-associated disorders |
US7282565B2 (en) | 1998-03-20 | 2007-10-16 | Genentech, Inc. | PRO362 polypeptides |
US7005504B2 (en) | 1998-01-22 | 2006-02-28 | Genentech, Inc. | Antibody fragment-peg conjugates |
JP2002502589A (ja) | 1998-02-09 | 2002-01-29 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ, インコーポレイテッド | 45個のヒト分泌タンパク質 |
US6956107B2 (en) | 1998-02-20 | 2005-10-18 | Tanox, Inc. | Inhibitors of complement activation |
EP3260467A1 (en) | 1998-02-20 | 2017-12-27 | Genentech, Inc. | Inhibitors of complement activation |
US7112327B2 (en) | 1998-02-20 | 2006-09-26 | Tanox, Inc. | Inhibition of complement activation |
EP1490386B1 (en) | 1998-03-10 | 2008-08-13 | Genentech, Inc. | Novel polypeptide and nucleic acids encoding the same |
JP2002523089A (ja) | 1998-08-27 | 2002-07-30 | インサイト・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド | タンパク質輸送関連分子 |
US6376653B1 (en) | 1998-09-28 | 2002-04-23 | Smithkline Beecham Plc | Tie2 antagonist antibodies |
KR100468977B1 (ko) | 1998-12-16 | 2005-02-02 | 제넨테크, 인크. | 분비 및 막횡단 폴리펩티드, 및 이를 코딩하는 핵산 |
AU768230B2 (en) | 1998-12-22 | 2003-12-04 | Genentech Inc. | Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth |
PL220113B1 (pl) | 1999-01-15 | 2015-08-31 | Genentech Inc | Wariant macierzystego polipeptydu zawierającego region Fc, polipeptyd zawierający wariant regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania receptora Fc gamma (FcγR), polipeptyd zawierający wariant regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania noworodkowego receptora Fc (FcRn), kompozycja, wyizolowany kwas nukleinowy, wektor, komórka gospodarza, sposób otrzymywania wariantu polipeptydu, zastosowanie wariantu polipeptydu i sposób otrzymywania wariantu regionu Fc |
CN1637019A (zh) | 1999-03-11 | 2005-07-13 | Rmf迪克塔吉恩有限公司 | 血管粘着分子及其功能的调节 |
US6642353B1 (en) | 1999-03-17 | 2003-11-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Peptide ligands for the erythropoietin receptor |
JP2003514541A (ja) | 1999-11-19 | 2003-04-22 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ, インコーポレイテッド | 18個のヒト分泌タンパク質 |
CA2494705A1 (en) | 1999-12-01 | 2001-06-07 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
WO2001058526A2 (en) | 2000-02-10 | 2001-08-16 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Mixtures of caspase inhibitors and complement inhibitors and methods of use thereof |
US6821775B1 (en) | 2000-02-11 | 2004-11-23 | Genvec, Inc. | Viral vector encoding pigment epithelium-derived factor |
AU2001249410A1 (en) | 2000-03-23 | 2001-10-03 | Tanox, Inc. | Anti-c2/c2a inhibitors of complement activation |
EP2026073B1 (en) | 2000-04-29 | 2016-03-30 | University Of Iowa Research Foundation | Diagnostics and therapeutics for macular degeneration-related disorders |
JP2004506413A (ja) | 2000-06-23 | 2004-03-04 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 血管形成に関与する疾患の診断と治療のための組成物と方法 |
JP2004516013A (ja) | 2000-07-20 | 2004-06-03 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 血管形成に関連する障害を診断及び治療するための組成物と方法 |
ATE449791T1 (de) | 2000-10-10 | 2009-12-15 | Genentech Inc | Inhibierung von c5 komplement-aktivierung für die behandlung und vorbeugung von xeno-transplantat oder akute vaskuläre abstossung |
PT1324776E (pt) | 2000-10-12 | 2009-12-23 | Genentech Inc | Formulações de proteína concentradas de viscosidade reduzida |
AU1174702A (en) | 2000-10-13 | 2002-04-22 | Biogen Inc | Humanized anti-lt-beta-r antibodies |
NZ526720A (en) | 2000-12-28 | 2007-11-30 | Altus Pharmaceuticals Inc | Crystallisation of whole antibodies or fragments thereof, on a large scale and a process allowing an alternative route for delivery of therapeutic antibodies |
US20040077575A1 (en) | 2002-01-11 | 2004-04-22 | Giordano Giovan Giacomo | Inhibition of pathological angiogenesis in vivo |
US6867189B2 (en) | 2001-07-26 | 2005-03-15 | Genset S.A. | Use of adipsin/complement factor D in the treatment of metabolic related disorders |
US7432356B2 (en) | 2001-08-17 | 2008-10-07 | Genentech, Inc. | Complement pathway inhibitors binding to C5 and C5a without preventing formation of C5b |
US20040186051A1 (en) | 2001-10-02 | 2004-09-23 | Kelley Robert F | Apo-2 ligand variants and uses thereof |
US20060141561A1 (en) | 2002-06-24 | 2006-06-29 | Kelley Robert F | Apo-2 ligand/trail variants and uses thereof |
US20050180972A1 (en) | 2002-07-31 | 2005-08-18 | Wahl Alan F. | Anti-CD20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders |
TWI323265B (en) | 2002-08-06 | 2010-04-11 | Glaxo Group Ltd | Antibodies |
WO2004022594A2 (en) | 2002-09-06 | 2004-03-18 | Cytos Biotechnology Ag | Immune modulatory compounds and methods |
AU2003301813A1 (en) | 2002-10-30 | 2004-06-07 | University Of Kentucky Research Foundation | Methods and animal model for analyzing age-related macular degeneration |
US7816497B2 (en) | 2002-10-30 | 2010-10-19 | University Of Kentucky | Compositions and methods for inhibiting drusen complement components C3a and C5a for the treatment of age-related macular degeneration |
CN101897969B (zh) | 2003-02-21 | 2014-04-02 | 健泰科生物技术公司 | 补体抑制剂在制备用于预防或抑制组织损伤的药物中的用途 |
RU2232991C1 (ru) | 2003-04-09 | 2004-07-20 | Государственное учреждение "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" | Способ определения функциональной активности фактора d комплемента человека |
KR100512483B1 (ko) | 2003-05-07 | 2005-09-05 | 선바이오(주) | 신규한 폴리에틸렌글리콜-말레이미드 유도체의 합성방법 |
US7709610B2 (en) | 2003-05-08 | 2010-05-04 | Facet Biotech Corporation | Therapeutic use of anti-CS1 antibodies |
EP2267028A3 (en) | 2003-06-30 | 2011-07-27 | Domantis Limited | Dual specific single domain antibodies (dAb) conjugated to PEG |
WO2005014849A2 (en) | 2003-07-03 | 2005-02-17 | Euro-Celtique, S.A. | Genes associated with responses to neuropathic pain |
WO2005044853A2 (en) | 2003-11-01 | 2005-05-19 | Genentech, Inc. | Anti-vegf antibodies |
US20050106667A1 (en) | 2003-08-01 | 2005-05-19 | Genentech, Inc | Binding polypeptides with restricted diversity sequences |
WO2005025509A2 (en) | 2003-09-11 | 2005-03-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and materials for treating autoimmune diseases and conditions |
US20050169921A1 (en) | 2004-02-03 | 2005-08-04 | Leonard Bell | Method of treating hemolytic disease |
US7127355B2 (en) | 2004-03-05 | 2006-10-24 | Perlegen Sciences, Inc. | Methods for genetic analysis |
US20090087854A1 (en) | 2007-09-27 | 2009-04-02 | Perlegen Sciences, Inc. | Methods for genetic analysis |
US7794713B2 (en) | 2004-04-07 | 2010-09-14 | Lpath, Inc. | Compositions and methods for the treatment and prevention of hyperproliferative diseases |
BRPI0516284A (pt) | 2004-09-23 | 2008-09-02 | Genentech Inc | anticorpo construìdo com cisteìna, método de selecionar anticorpos, compostos conjugados de droga-anticorpo, composição farmacêutica, método para matar ou inibir a proliferação de células de tumor, métodos de inibir a proliferação celular e o crescimento de células de tumor, artigo manufaturado e método para produzir um composto |
CN102618644A (zh) | 2004-11-18 | 2012-08-01 | 耶鲁大学 | 治疗眼病的方法和组合物 |
WO2006071856A2 (en) | 2004-12-23 | 2006-07-06 | Glycofi, Inc. | Immunoglobulins comprising predominantly a man5glcnac2 glycoform |
EP2319940A1 (en) | 2005-01-04 | 2011-05-11 | Hitachi Chemical Company, Ltd. | Primer generation rolling circle amplification |
JP2008529536A (ja) | 2005-02-14 | 2008-08-07 | ユニバーシティー オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション | 加齢性黄斑変性を処置および診断するための方法および試薬 |
KR101354876B1 (ko) | 2005-06-08 | 2014-02-18 | 유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 | 염색체 10q26상의 연령-관련 황반병증(ARM)에 대한감수성 유전자 |
CN105582523B (zh) | 2005-10-08 | 2022-04-15 | 阿佩利斯制药公司 | 用于眼部病症的补体抑制素和其类似物 |
NZ594285A (en) | 2005-11-04 | 2013-02-22 | Genentech Inc | USE OF COMPLEMENT PATHWAY INHIBITOR ANTIBODY AGAINST C5a TO TREAT OCULAR DISEASES |
US20070190057A1 (en) | 2006-01-23 | 2007-08-16 | Jian Wu | Methods for modulating mannose content of recombinant proteins |
AR059066A1 (es) | 2006-01-27 | 2008-03-12 | Amgen Inc | Combinaciones del inhibidor de la angiopoyetina -2 (ang2) y el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf) |
US20080146501A1 (en) | 2006-02-13 | 2008-06-19 | University Of Iowa Research Foundation | Protective complement proteins and age-related macular degeneration |
JP2009531390A (ja) | 2006-03-31 | 2009-09-03 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | 有機化合物 |
HUE053612T2 (hu) | 2006-06-16 | 2021-07-28 | Regeneron Pharma | Intravitreális bevitelre alkalmas VEGF-antagonista készítmények |
CA2663892A1 (en) * | 2006-09-25 | 2008-04-03 | Medimmune, Llc | Stabilized antibody formulations and uses thereof |
CN101541345A (zh) * | 2006-09-25 | 2009-09-23 | 米迪缪尼有限公司 | 稳定化的抗体制剂和其应用 |
CA2667997C (en) | 2006-11-02 | 2016-10-11 | Genentech, Inc. | Humanized anti-factor d antibodies and uses thereof |
AU2008251801A1 (en) | 2007-05-11 | 2008-11-20 | The General Hospital Corporation | Polynucleotides associated with age-related macular degeneration and methods for evaluating patient risk |
AR066660A1 (es) | 2007-05-23 | 2009-09-02 | Genentech Inc | Prevencion y tratamiento de condiciones del ojo asociadas con su complemento |
NZ581097A (en) * | 2007-05-24 | 2012-03-30 | Ablynx Nv | Amino acid sequences directed against rank-l and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders |
US20090203001A1 (en) | 2007-08-24 | 2009-08-13 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for diagnosing and treating macular degeneration |
WO2009146204A1 (en) | 2008-04-18 | 2009-12-03 | Tufts Medical Center | Polymorphisms associated with age-related macular degeneration and methods for evaluating patient risk |
WO2009134709A2 (en) | 2008-04-28 | 2009-11-05 | Tufts Medical Center | Polynucleotides associated with age-related macular degeneration and methods for evaluating patient risk |
ES2629345T3 (es) | 2008-06-25 | 2017-08-08 | Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc | Optimización de la solubilidad de agentes de unión inmunológica |
CN101724144A (zh) | 2008-11-03 | 2010-06-09 | 北京键凯科技有限公司 | 新型的多臂聚乙二醇及其制备方法和应用 |
KR101719376B1 (ko) | 2008-11-05 | 2017-03-23 | 제넨테크, 인크. | 연령-관련 황반 변성에서 유전자 다형성 |
WO2010075519A2 (en) | 2008-12-23 | 2010-07-01 | Massachusetts Eye & Ear Infirmary | Allelic variants associated with advanced age-related macular degeneration |
AU2009333100B2 (en) | 2009-01-02 | 2014-08-14 | Alcon Research, Ltd. | In-situ refillable ophthalmic implant |
WO2010085542A2 (en) | 2009-01-23 | 2010-07-29 | Novartis Ag | Biomarkers related to age-related macular degeneration (amd) |
CN104887389B (zh) | 2009-01-29 | 2017-06-23 | 弗赛特影像4股份有限公司 | 后段给药 |
WO2010132459A2 (en) | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Cleveland Clinic Foundation | Biomarkers for assessment of age-related macular degeneration |
EP2449121B1 (en) | 2009-07-02 | 2020-09-02 | Lanzatech New Zealand Limited | Alcohol production process |
EP2451983B1 (en) | 2009-07-10 | 2015-05-06 | The Regents of the University of Michigan | Methods for diagnosing macular degeneration |
WO2011017229A2 (en) | 2009-08-06 | 2011-02-10 | Tufts - New England Medical Center | Plasma complement components as expression markers for age-related macular degeneration and related phenotypes |
US8221753B2 (en) * | 2009-09-30 | 2012-07-17 | Tracon Pharmaceuticals, Inc. | Endoglin antibodies |
US20110165648A1 (en) | 2009-11-04 | 2011-07-07 | Menno Van Lookeren Campagne | Co-crystal structure of factor D and anti-factor D antibody |
EP2512511B1 (en) * | 2009-11-19 | 2015-01-07 | Merck Serono S.A. | Humanized antibodies against human il-22ra |
CN102770456B (zh) | 2009-12-04 | 2018-04-06 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 多特异性抗体、抗体类似物、组合物和方法 |
CN103755949B (zh) | 2009-12-25 | 2016-04-13 | 天津键凯科技有限公司 | 多臂聚乙二醇衍生物及其与药物的结合物和凝胶 |
NZ610067A (en) | 2010-11-01 | 2015-05-29 | Genentech Inc | Predicting progression to advanced age-related macular degeneration using a polygenic score |
AU2012322618A1 (en) | 2011-10-14 | 2014-05-29 | Genentech, Inc. | Anti-HtrA1 antibodies and methods of use |
JP6051998B2 (ja) | 2012-03-30 | 2016-12-27 | 日油株式会社 | マルチアーム型ポリエチレングリコール誘導体、その中間体及び製造方法 |
CA2920666A1 (en) | 2013-08-12 | 2015-02-19 | Genentech, Inc. | Compositions and method for treating complement-associated conditions |
EP3042205B1 (en) | 2013-09-06 | 2019-12-25 | F. Hoffmann-La Roche AG | Method for improving antibody stability |
SG11201608868PA (en) | 2014-05-01 | 2016-11-29 | Genentech Inc | Anti-factor d antibody variants and uses thereof |
-
2015
- 2015-04-30 SG SG11201608868PA patent/SG11201608868PA/en unknown
- 2015-04-30 JP JP2016564582A patent/JP2017515811A/ja active Pending
- 2015-04-30 MA MA039934A patent/MA39934A/fr unknown
- 2015-04-30 WO PCT/US2015/028641 patent/WO2015168468A1/en active Application Filing
- 2015-04-30 AU AU2015253042A patent/AU2015253042A1/en not_active Abandoned
- 2015-04-30 CA CA2944712A patent/CA2944712A1/en not_active Abandoned
- 2015-04-30 US US14/700,853 patent/US10179821B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2015-04-30 EP EP15721516.1A patent/EP3137503A1/en not_active Withdrawn
- 2015-04-30 CN CN201580023643.0A patent/CN106536561A/zh active Pending
- 2015-04-30 CR CR20160561A patent/CR20160561A/es unknown
- 2015-04-30 TW TW104114014A patent/TW201623337A/zh unknown
- 2015-04-30 PE PE2016002153A patent/PE20161440A1/es not_active Application Discontinuation
- 2015-04-30 KR KR1020167032259A patent/KR20160147855A/ko unknown
- 2015-04-30 EA EA201692109A patent/EA201692109A1/ru unknown
- 2015-04-30 BR BR112016025312A patent/BR112016025312A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-04-30 MX MX2016014160A patent/MX2016014160A/es unknown
-
2016
- 2016-09-26 IL IL248042A patent/IL248042A0/en unknown
- 2016-10-10 PH PH12016502015A patent/PH12016502015A1/en unknown
- 2016-10-27 CL CL2016002738A patent/CL2016002738A1/es unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011521623A (ja) * | 2008-04-28 | 2011-07-28 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | ヒト化抗d因子抗体とその用途 |
JP2013544493A (ja) * | 2010-09-03 | 2013-12-19 | ステム セントリックス, インコーポレイテッド | 新規モジュレータ及びその使用法 |
WO2012138997A1 (en) * | 2011-04-07 | 2012-10-11 | Amgen Inc. | Novel egfr binding proteins |
WO2013100120A1 (ja) * | 2011-12-28 | 2013-07-04 | 中外製薬株式会社 | ヒト化抗Epiregulin抗体および当該抗体を有効成分として含む癌治療剤 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PH12016502015A1 (en) | 2017-01-16 |
US20160017052A1 (en) | 2016-01-21 |
US10179821B2 (en) | 2019-01-15 |
SG11201608868PA (en) | 2016-11-29 |
TW201623337A (zh) | 2016-07-01 |
EP3137503A1 (en) | 2017-03-08 |
AU2015253042A1 (en) | 2016-10-20 |
PE20161440A1 (es) | 2017-01-26 |
BR112016025312A2 (pt) | 2017-10-17 |
CA2944712A1 (en) | 2015-11-05 |
WO2015168468A1 (en) | 2015-11-05 |
MA39934A (fr) | 2017-03-08 |
IL248042A0 (en) | 2016-11-30 |
MX2016014160A (es) | 2017-02-16 |
CL2016002738A1 (es) | 2017-06-23 |
EA201692109A1 (ru) | 2017-03-31 |
CR20160561A (es) | 2017-05-03 |
CN106536561A (zh) | 2017-03-22 |
KR20160147855A (ko) | 2016-12-23 |
AU2015253042A2 (en) | 2016-10-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10179821B2 (en) | Anti-factor D antibodies | |
TWI616456B (zh) | 人類化之抗因子d抗體及其用途 | |
JP7003348B2 (ja) | 糖尿病黄斑浮腫の治療のための組成物および方法 | |
JP7153696B2 (ja) | ヒト化抗C1s抗体及びその使用方法 | |
KR101414847B1 (ko) | 페길화된 Aβ FAB | |
JP6454678B2 (ja) | pH範囲で結合性が異なる薬物動態改善のための抗TFPI抗体変異体 | |
US10407510B2 (en) | Anti-factor D antibodies and conjugates | |
EP3246339B1 (en) | Antibodies to bradykinin b1 receptor ligands | |
TW201211063A (en) | Humanized anti-factor D antibodies and uses thereof | |
US10961313B2 (en) | Anti-factor D antibody variant conjugates and uses thereof | |
JP2018531980A (ja) | 抗d因子抗体製剤 | |
TW202421661A (zh) | Igf1r抗體 | |
NZ626296B2 (en) | Compositions and methods for antibodies targeting factor p | |
OA17139A (en) | Antibodies to bradykinin B1 receptor ligands |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180427 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180427 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190423 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20191119 |