KR101354876B1 - 염색체 10ｑ26상의 연령-관련 황반병증(ＡＲＭ)에 대한감수성 유전자 - Google Patents
염색체 10ｑ26상의 연령-관련 황반병증(ＡＲＭ)에 대한감수성 유전자 Download PDFInfo
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Abstract
유전자 PLEKHA1 및 LOC387715내 대립형질 변이가 연령-관련 황반병증(ARM)에 대한 위험 인자로서 동정되었다. 따라서, PLEKHA1 및/또는 LOC387715내 대립형질 변이를 동정하는 것을 포함하는, 개체에서 ARM이 발병될 위험도를 확인하는 방법을 제공한다. 관련 장치, 예로서, 어레이가 상기 방법을 이행하는데 유용하다고 확인되었다.
Description
발명자
마이클 B. 고린(Michael B. Gorin)
요한나 야콥스도티르(Johanna Jakobsdottir)
이베트 P. 콘레이(Yvette P. Conley)
다니엘 E. 윅스(Daniel E. Weeks)
타미 S. 마하-프레지저(Tammy S. Mah-Fraser)
로버트 E. 페렐(Robert E. Ferrell)
연령-관련 황반병증(연령-관련 황반 변성으로도 공지되어 있음)은 노인의 중추 시각소실증에 대한 주요 원인이며, 수많은 연구를 통해서는 상기 복합 장애에 대한 강력한 근본적인 유전적 요소가 입증되었다. 대 가계도, 질병을 나타내는(affected) 형제쌍, 및 더욱 최근에서는, 불일치 형제쌍을 사용하는 전체-게놈 연관 스캔을 통해 잠재적인 감수성 유전자좌를 다수 동정하게 되었다([Klein et al 1998 Age-related macular degeneration. Clinical features in a large family and linkage to chromosome 1q. Archives of Ophthalmology 116:1082-1088.]; [Weeks et al. 2000 A full genome scan for age-related maculopathy. Human Molecular Genetics 9:1329-1349]; [Majewski et al. 2003 Age-related macular degeneration-a genome scan in extended families. Am J Hum Genet 73:540-550]; [Schick et al. 2003 A whole-genome screen of a quantitative trait of age-related maculopathy in sibships from the Beaver Dam Eye Study. Am J Hum Genet 72:1412-1424]; [Seddon et al 2003 A genomewide scan for age-related macular degeneration provides evidence for linkage to several chromosomal regions. Am J Hum Genet 73:780-790]; [Abecasis et al 2004 - Age-related macular degeneration: a high-resolution genome scan for susceptibility Loci in a population enriched for late-stage disease. Am J Hum Genet 74:482-494]; [Iyengar et al 2004 Dissection of genomewide-scan data in extended families reveals a major locus and oligogenic susceptibility for age-related macular degeneration. Am J Hum Genet 74:20-39]; [Kenealy et al. 2004 Linkage analysis for age-related macular degeneration supports a gene on chromosome 10q26. Mol Vis 10:57-61]; [Schmidt et al. 2004 Ordered subset linkage analysis supports a susceptibility locus for age-related macular degeneration on chromosome 16pl2. BMC Genet 5:18]; [Weeks et al 2004 Age-related maculopathy: a genomewide scan with continued evidence of susceptibility loci within the 1q31, 10q26, and 17q25 regions. Am J Hum Genet 75:174-189]; [Santangelo et al. 2005 A Discordant Sib-Pair Linkage Analysis of Age-Related Macular Degeneration. Ophthalmic Genetics 26:61-68]). 전체-게놈 연관 스크린은 연령-관련 황반 변성(AMD: age-related macular degeneration) 유전자를 함유할 가능성이 있는 것으로서 10q26 부위를 강력하게 관련시켰고[Weeks et al. 2004]; 상기 부위는 또한 다수의 다른 연구에 의해 입증되었으며, 최근의 메타-분석에서 정상-등급화된 부위이다[Fisher et al. 2005 Meta-analysis of genome scans of age-related macular degeneration. Hum Mol Genet. 2005 Aug 1;14(15):2257-64]. 1번 염색체상에서 볼 수 있는 연관 신호를 초래하는 것으로서 보체 인자 H(CFH: complement factor H)의 대립형질 변이체를 동정하고, 가족성 및 산발성 사례, 양자 모두에서 ARM의 유의적인 기여 위험도를 설명하는 논문 3개가 최근 Science에 실렸다([Edwards et al. 2005 Complement Factor H Polymorphism and Age-Related Macular Degeneration. Science 308, 421-424]; [Haines et al. 2005 Complement Factor H Variant Increases the Risk of Age-Related Macular Degeneration. Science 308, 419-421]; [Klein et al 2005 Complement Factor H Polymorphism in Age-Related Macular Degeneration. Science 308, 385-389]). 이들 발견이 확인되었다([Conley et al. 2005 Candidate gene analysis suggests a role for fatty acid biosynthesis and regulation of the complement system in the etiology of age-related maculopathy. Hum Mol Genet 14: 1991-2002.]; [Hageman et al. (2005a) From The Cover: A common haplotype in the complement regulatory gene factor H (HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A 102:7227-7232]; 및 [Zareparsi et al. 2005a Strong Association of the Y402H Variant in Complement Factor H at 1q32 with Susceptibility to Age-Related Macular Degeneration. Am J Hum Genet 77: 149-53]). CFH는 앞서, 다수의 ARM 환자에서 관찰되는 망막하 침착물(드루젠)이 보체 인자를 함유한다고 제시한 하게만(Hageman) 및 앤더슨(Anderson)의 연구에 기인하여 ARM에 중요한 역할을 하는 것으로 의심받은 바 있다([Hageman and Mullins 1999 Molecular composition of drusen as related to substructural phenotype. Molecular Vision 5:28]; [Johnson et al. 2000 A potential role for immune complex pathogenesis in drusen formation. Experimental Eye Research 70:441-449 Complement activation and inflammatory processes in Drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research 73:887-896]; [Mullins et al. 2000 Drusen associated with aging and age-related macular degeneration contain proteins common to extracellular deposits associated with atherosclerosis, elastosis, amyloidosis, and dense deposit disease. FASEB Journal 14:835-846]; [Hageman et al. 2001 An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age- related macular degeneration. Progress in Retinal & Eye Research 20:705-732.]; [Johnson et al. 2001]). 그러나, ARM에 기여하는 다른 유전자들이 동정될 때까지 CFH는 어려운 문제로서 고립된 채 남아 있었고, 이는 대체 경로와 ARM 발병기전의 일부분인 염증과 관련되었지만, 눈에서 관찰되는 유일한 병증을 설명하지는 못했다.
요약
하기 기술하는 바와 같이, 이러한 목적에서 단일 염기 다형태를 비롯한 대립형질 변이체는 염색체 10q26상에서 동정되었다. 본원에서 이들 단일 염기 다형태는 연령-관련 황반병증이 발생될 위험이 높은 것과 관련이 있는 것으로 나타났다. 대립형질 변이체는 염색체 10q26상의 LOC387715 및/또는 PLEKHA1 유전자내 위치한다. 하나의 실시태양에서, 대립형질 변이는 LOC387715내 존재한다.
본 발명중 하나의 비제한적인 실시태양에서, 연령-관련 황반병증이 발생될 위험이 높은 인간 대상을 동정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상으로부터 유래된 핵산 샘플중 연령-관련 황반병증이 발생될 위험과 관련된, 염색체 10q26에 위치하는 대립형질 변이체의 존재를 동정하는 것을 포함한다. 하나의 비제한적인 실시태양에서, 대립형질 변이체는 염색체 10q26의 PLEKHA1/LOC387715/PRSS11 유전자좌에 존재한다. 예를 들면, 제한없이, 대립형질 변이체는 PLEKHA1 및 LOC387715중 하나 또는 상기 양자 모두의 대립형질 변이체이며, 예로서, LOC387715중 Ser69Ala 변이체가 있되, 이로써 제한하는 것은 아니다.
또다른 비제한적인 일례로, 변이체는 rs4146894, rs10490924, rs1O45216, rs1882907, rs760336, rs763720, rs800292, rs1483883 및 rs1853886으로서 동정된, 하나 이상의 변이체에 상응하는 다형태이다. 대립형질 변이체는 비-작용성 유전자 산물 및 발현이 변경된 유전자 산물을 생산하는 돌연변이, 예로서, 프레임쉬프트 돌연변이, 프로모터 돌연변이 및 스플라이싱 돌연변이중 하나일 수 있되, 이로써 제한하는 것은 아니다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 대상으로부터 유래된 핵산 샘플중 보체 인자 H의 대립형질 변이체, 예로서, 제한없이, rs1853883로서 동정된 단일 염기 다형태에 상응하는 변이체의 존재를 동정하는 것을 추가로 포함한다.
본 방법은 임의의 유용한 기술, 예로서, 핵산 증폭 검정법, 예로서, PCR중 하나, 역전사효소 PCR(RT-PCR: reverse transcriptase PCR), 등온 증폭, 핵산 서열 기반 증폭(NASBA: nucleic acid sequence based amplification), 5' 형광 뉴클레아제 검정법(예를 들면, 택맨(TAQMAN) 검정법), 분자 비콘 검정법 및 회전환 증폭을 사용할 수 있지만, 이로써 제한하는 것은 아니다. 대립형질 변이는 전형적으로 대상으로부터 유래된 핵산 샘플중 rs4146894, rs1O45216, rs10490924, rs1882907, rs760336, rs763720, rs800292, rs1483883 및 rs1853886으로서 동정된 단일 염기 다형태중 2개 이상에 상응하는 대립형질 변이의 존재를 동정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 어레이를 사용하여 동정할 수 있다.
또다른 비제한적인 실시태양에서, 대상으로부터의 핵산 샘플중 연령-관련 황반병증이 발생될 위험과 관련된, 염색체 10q26에 위치하는 대립형질 변이체의 존재를 동정하기 위한, 하나 이상의 시약 서열을 포함하는 어레이를 제공한다. 대립형질 변이는 10q26의 PLEKHA1/LOC387715/PRSS11 유전자좌에 존재할 수 있되, 이로써 제한하는 것은 아니며, 예를 들면, rs4146894, rs1O45216, rs10490924, rs1882907, rs760336, rs763720, rs800292, rs1483883 및 rs1853886으로서 동정된 단일 염기 다형태중 하나 이상에 상응할 수 있다.
도 1: 후보 유전자와 관련하여 CIDR 및 국부적으로 유전자형이 분석된 SNPs의 위치화. 10번 염색체를 따른 위치, 거리 및 뉴클레오티드 위치는 NCBI Entrez-유전자 및 SNP 데이타베이스로부터 유도된 것이다.
도 2: 10번 염색체상에서의 단일점 및 다중점 연관 결과. 좌측 패널은 모든 SNPs를 사용하였을 때의 결과를 요약한다. 우측 패널은 오직 H-클러스트 SNPs만을 분석을 위해 사용하였을 때의 결과를 요약한다. "F"로 표시된 피크는 높은 SNP-SNP LD를 원인으로 하는 가능한 오류 피크를 나타내는 반면, "G" 및 "P"로 표시된 피크는 각각 GRK5 및 PLEKHA1를 포함하는 유전자좌에 상응하는 것이다. 가로선은 다중점 S모두(최대 S모두-1)의 1-단위 지원 간격을 표시한다.
도 3A-3D: 196개의 CIDR SNPs 및 179명의 혈연이 아닌(unrelated) 대조군에 기초한 10번 염색체상의 연관 비평형 패턴. 도 3A: 135 cM에서의 오류 피크(도 2를 참조할 수 있다), 도 3B: 142 cM에서의 오류 피크(도 2를 참조할 수 있다), 도 3C: 연관 피크. 도 3D-1 및 3D-1은 선 A-A'로 분할된, 도 3C의 확장 버전이다. 오류 피크에서 가장 큰 S모두를 갖는 SNP는 회색으로 나타내고, CCREL로부터 5개의 유전자(GRK5/RGS10/PLEKHA1/LOC387715/PRSS11)가 중복 점유하는 유의적 SNPs는(표 5)는 진정 연관 피크에서 회색으로 나타내었다. 그림자형 회색은 SNP 쌍간의 유의적 LD를 나타내고(번호가 기재되지 않은 짙은 회색 사각형은 쌍별로 D'=1인 것을 나타낸다), 흰색 사각형은 유의적 LD의 증거가 없음을 나타내고, 번호가 기재되지 않은 회색 사각형은 통계학적 유의성없이 쌍별로 D'가 1인 것을 나타낸다. LD는 D'를 사용하여 측정되었고, 사각형내 기재된 번호는 D'* 100로, 쌍별 LD를 제공한다.
도 4: 1번 염색체상의 다중점 연관 결과. 좌측 패널은 모든 SNPs를 사용하였을 때의 결과를 요약하고, 우측 패널은 오직 H-클러스트 SNPs만을 분석을 위해 사용하였을 때의 결과를 요약한다. "F"로 표시된 피크는 높은 SNP-SNP LD를 원인으로 하는 가능한 오류 피크를 나타내는 반면, "C"로 표시된 피크는 CFH 유전자에 상응하는 것이다. 가로선은 다중점 S모두(최대 S모두-1)의 1-단위 지원 간격을 표시한다.
도 5A-5C는 679개의 CIDR SNPs 및 179명의 혈연이 아닌 대조군에 기초한 1번 염색체상의 연관 비평형 패턴을 제공한다. 도 5A: 188 cM에서의 오류 피크(도 4를 참조할 수 있다), 도 5B: 202 cM에서의 오류 피크(도 4를 참조할 수 있다), 도 5C: CFH 유전자좌와 중복 점유하는 연관 피크. 오류 피크에서 가장 큰 S모두를 갖는 SNP는 회색으로 나타내고, CCREL로부터 CFH가 중복 점유하고 있는 유의적인 SNPs는(표 5)는 진정 연관 피크에서 회색으로 나타내었다. 그림자형 회색은 SNP 쌍간의 유의적 LD를 나타내고(번호가 기재되지 않은 짙은 회색 사각형은 쌍별로 D'=1인 것을 나타낸다), 흰색 사각형은 유의적 LD의 증거가 없음을 나타내고, 번호가 기재되지 않은 회색 사각형은 통계학적 유의성없이 쌍별로 D'가 1인 것을 나타낸다. LD는 D'를 사용하여 측정되었고, 사각형내 기재된 번호는 D'* 100로, 쌍별 LD를 제공한다.
도 6A 및 6B: 도 6A: GRK5(블록 1), RGS10(SNP 6), PLEKHA1(블록 2), LOC387715(블록 3), PRSS11(블록 4)에서 연관 비평형 패턴. 도 6B: CFH(블록 1)에 서 연관 비평형 패턴. 그림자형 회색은 SNP 쌍간의 유의적 LD를 나타내고(번호가 기재되지 않은 짙은 회색 사각형은 쌍별로 D'=1인 것을 나타낸다), 흰색 사각형은 유의적 LD의 증거가 없음을 나타내고, 번호가 기재되지 않은 회색 사각형은 통계학적 유의성없이 쌍별로 D'가 1인 것을 나타낸다. LD는 D'를 사용하여 측정되었고, 사각형내 기재된 번호는 D'* 100로, 쌍별 LD를 제공한다. CCREL 대립형질 검정으로부터의 유의적인 SNPs는 회색으로 가장 밝게 나타내었다(표 6을 참조할 수 있다). 3개의 SNP(rs6428352, rs12258692 및 rs11538141)는 이형접합성이 극도로 낮았기 때문에 포함시키지 않았고, 하나의 SNP, rs2736911은 정보 가치가 없기 때문에 포함시키지 않았다. 블록은 유전자의 위치를 명확하게 나타내기 위하여 그린 것이며, 일배체형 블록을 나타내는 것은 아니라는 것에 주의한다.
도 7은 CFH, ELOVL4, PLKEHA1, 및 LOC387715 유전자에 대하여 추정된 조 ORs 및 95% CIs를 나타낸다. 1개 또는 2개의 위험 대립형질(RR+RN)을 갖는 보유자를 비-위험 대립형질에 대하여 동형접합성(NN)인 보유자를 비교하였다. 실선은 OR(흰색 원)에 상응하는 95% CI를 표시한다. 수직 점선은 1의 OR에 대한 0값을 표시한다. AREDS 및 CHS 코호트에서 평가된 대조는 세로축에 제시하였다.
도 8은 CFH에 대하여 추정된 조 ORs 및 95% CIs를 나타낸다. A: 우성 효과 평가에 대한 OR우성(CT+CC 대 TT). B: 이형접합체의 위험도 평가에 대한 OR이형(CT 대 TT). C: 열성 효과 평가에 대한 OR열성(CC 대 CT+TT). D: 동형접합체의 위험도 평가에 대한 OR동형(CC 대 TT). 수직 점선은 1의 OR에 대한 0값을 표시한다.
도 9는 ELOVL4에 대하여 추정된 조 ORs 및 95% CIs를 나타낸다. A: 우성 효과 평가에 대한 OR우성(AG+GG 대 AA). B: 이형접합체의 위험도 평가에 대한 OR이형(AG 대 AA). C: 열성 효과 평가에 대한 OR열성(GG 대 AG+AA). D: 동형접합체의 위험도 평가에 대한 OR동형(GG 대 AA). 수직 점선은 1의 OR에 대한 0값을 표시한다.
도 10은 LOC387715에 대하여 추정된 조 ORs 및 95% CIs를 나타낸다. A: 우성 효과 평가에 대한 OR우성(GT+TT 대 GG). B: 이형접합체의 위험도 평가에 대한 OR이형(GT 대 GG). C: 열성 효과 평가에 대한 OR열성(TT 대 GT+GG). D: 동형접합체의 위험도 평가에 대한 OR동형(TT 대 GG). 수직 점선은 1의 OR에 대한 0값을 표시한다.
도 11은 PLKEHA1에 대하여 추정된 조 ORs 및 95% CIs를 나타낸다. A: 우성 효과 평가에 대한 OR우성(AG+AA 대 GG). B: 이형접합체의 위험도 평가에 대한 OR이형(AG 대 GG). C: 열성 효과 평가에 대한 OR열성(AA 대 AG+GG). D: 동형접합체의 위험도 평가에 대한 OR동형(AA 대 GG). 수직 점선은 1의 OR에 대한 0값을 표시한다.
도 12는 CFH내 Y402H의 메타-분석에 포함된 데이타 세트로부터 유도된, 추정된 ORs 및 95% CIs, 및 고정 및 무작위 효과 모델로부터의 병합 추정치를 제공한다. 상단의 도면은 OR이형(TT와 비교되는 CT 이형접합체에 대한 OR)을 나타내고, 하단의 도면은 OR동형(TT와 비교되는 CC 동형접합체에 대한 OR)을 나타낸다. 'Hage-C' 및 'Hage-I'은 각각 (Hageman et al.)[Hageman, G.S., et a(2005) A common haplotype in the complement regulatory gene factor H(HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 May 17;102(20):7227-32. Epub 2005 May 3]의 콜롬비아 및 아이오와 코호트로부터 유도된 추정치를 표시하고, 'Jakobs'은 (Jakobsdottir et al.)[(Jakobsdottir, J., et al(2005) Susceptibility genes for age-related macular degeneration on chromosome 10q26. Am J Hum Genet. 77, 389-407)]의 논문으로부터의 추정치를 표시한다. "고정"은 연구간의 변동은 우연 때문이라는 가정하에서 모든 연구로부터 유도된 병합 추정치를 표시한다. '무작위'는 연구 전체에서 이질성을 허용하는 모든 연구로부터 유도된 병합 추정치를 표시한다. 'nAMD'는 추정에 포함된 ARM 환자군의 총수이고, 'n대조군'은 추정에 포함되되, ARM은 없는 대조군의 총수이다. 수직 점선은 동질성하의('고정') 병합 OR의 점 추정치를 표시한다.
도 13은 A: CFH내 Y402H의 메타-분석에 포함된 코호트 전체에서 혈연이 아닌 ARM 환자군의 유전자형 빈도(%), B: CFH내 Y402H의 메타-분석에 포함된 연구 전체에서 ARM이 없는, 혈연이 아닌 대조군의 유전자형 빈도(%)를 제공한다. "Hage-C" 및 "Hage-I"은 각각 (Hageman et al)의 콜롬비아 및 아이오와 코호트로부터 유도된 추정치를 표시하고, 'Jakobs'은 (Jakobsdottir et al.)의 논문으로부터의 추정치를 표시한다.
도 14는 LOC387715내 S69A의 메타-분석에 포함된 데이타 세트로부터 유도된, 추정된 ORs 및 95% CIs, 및 고정 및 무작위 효과 모델로부터의 병합 추정치를 제공한다. 상단의 도면은 OR이형(GG와 비교되는 GT 이형접합체에 대한 OR)을 나타내고, 하단의 도면은 OR동형(GG와 비교되는 TT 동형접합체에 대한 OR)을 나타낸다. 'Jakobs'은 (Jakobsdottir et al.)[(Jakobsdottir, J., et al(2005) Susceptibility genes for age-related macular degeneration on chromosome 10q26. Am J Hum Genet. 77, 389-407))]의 논문으로부터의 추정치를 표시한다. "고정"은 연구간의 변동은 우연 때문이라는 가정하에서 모든 연구로부터 유도된 병합 추정치를 표시한다. '무작위'는 연구 전체에서 이질성을 허용하는 모든 연구로부터 유도된 병합 추정치를 표시한다. 'nAMD'는 추정에 포함된 ARM 환자군의 총수이고, 'n대조군'은 추정에 포함되되, ARM은 없는 대조군의 총수이다. 수직 점선은 동질성하의('고정') 병합 OR의 점 추정치를 표시한다.
도 15는 A: LOC387715내 S69A의 메타-분석에 포함된 코호트 전체에서 혈연이 아닌 ARM 환자군의 유전자형 빈도(%), B: LOC387715내 S69A의 메타-분석에 포함된 연구 전체에서 ARM이 없는, 혈연이 아닌 대조군의 유전자형 빈도(%)를 제공한다. 'Jakobs'은 (Jakobsdottir et al.)의 논문으로부터의 추정치를 표시한다.
도 16은 LOC387715에 대한 아미노산(서열 번호: 19) 및 뉴클레오티드 서열(서열 번호: 20)을 제공한다.
상세한 설명
하기 기술하는 바와 같이, 단일 염기 다형태를 비롯한 대립형질 변이체가 염 색체 10q26상에서 동정되었다. 본원에서 이들 대립형질 변이체는 연령-관련 황반병증이 발생될 위험이 높은 것과 관련이 있는 것으로 나타낸다. 실시예 1에서는 ARM과 관련된 대립형질 변이체의 유전자좌로서 PLEKHA1 및/또는 LOC387715를 동정하였다. 실시예 2에 나타낸 바와 같이 추가의 연구에서는 ARM에 대한 마커로서 LOC387715중 동정된 변이의 관련성이 동정되고 입증되었다. ARM에 대한 마커로서 PLEKHA1의 변이의 관련성이 제외되지는 않았지만, 가장 최근의 유전적 연구로부터 입증된 바에 따르면 LOC387715 유전자내의 변이체와 더욱 강력한 관련성을 갖고 있다.
그러므로, 연령-관련 황반병증(ARM)이 발생될 위험이 높은 인간 대상을 동정하는 방법을 제공한다. 본 방법은 대상으로부터 유래된 핵산 샘플중 PLEKHA1 및/또는 LOC387715 , 및 하나의 비제한적인 실시태양에서, LOC387715의 대립형질 변이체 또는 특이 일배체형(수개의 대립형질 변이체로 구성됨)의 존재를 동정하는 것을 포함한다. 특이 단일 염기 다형태(SNPs: single nucleotide polymorphisms)가 이들 유전자좌에서 동정되었고, rs4146894, rs1O45216, rs10490924, rs1882907, rs760336 및 rs763720으로서 동정된 것과 같은 SNPs를 포함하되, 이로써 제한하는것은 아니다. 본 방법은 추가로 보체 인자 H(CFH)에서 대립형질 변이, 예로서, 제한없이, rs1853883으로서 동정된 대립형질 변이체를 동정하는 것을 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "대립형질 변이"는 대상, 예로서, 인간 환자의 하나 이상의 대립형질에서 유전자의 핵산 및 전형적으로 1차 아미노산 서열내 변이를 언 급한다. 대립 변이는 제한하는 것은 아니지만, 전사를 조절하는 프로모터 활성, 프레임쉬프트, 조기 단백질 종결, 단백질 미스폴딩, 단백질 프로세싱 변경, 단백질의 활성 부위 또는 결합 부위의 파괴(증진), mRNA의 미스-스플라이싱 또는 최종 유전자 산물의 발현 및/또는 작용에 영향을 주는 핵산 또는 단백질의 임의의 다른 성질을 비롯한, 단백질 발현에 다수의 영향을 미치는 단일 또는 다중 핵산 및 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 아미노산 및 핵산 서열 변이는 침묵일 수 있거나, 침묵이 아닐 수 있고, 즉, 표현형상의 효과, 예로서, 질환의 위험도가 상기 서열 변이와 관련될 수 있다. 한편, 대립형질 변이는, 예로서 ARM과 같은 질환 상태의 위험에 대한 원인이 될 수 있거나, 그와 관련될 수 있거나, 다르게는 그와 연관될 수 있는, 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, 통계학적 방법에 의해 본원에 기술된 공통 "야생형" 핵산 또는 아미노산 서열에서의 변이이다. 따라서, rs10490924(Ser69Ala)로서 동정된 LOC387715 단일 염기 다형태가 대립형질 변이이다.
SNPs 및/또는 다른 대립형질 변이의 검출을 위해 고효율 방법(high throughput method)을 비롯한 다수의 방법들이 이용가능하고, 예를 들면, 하기 실시예에 기술되는 PCR 및 제한 단편 길이 다형태가 있되, 이로써 제한하는 것은 아니다. 하나의 실시태양에서, 샘플로부터의 DNA는 SNP 또는 작은 대립형질 변이를 동정하는 임의의 방법에 의해 서열화(재서열화)된다. 고효율 방법을 비롯한, 매우 다양한 재서열화 방법이 당업계에 공지되어 있다. 대립형질 변이, 예로서 SNPs를 동정하는 증폭-기반 방법 또한 이용가능하고, PCR, 역전사 효소 PCR(RT-PCR), 등온 증폭, 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 5' 형광 뉴클레아제 검정법(예를 들면, 택맨 검정법), 분자 비콘 검정법 및 회전환 증폭을 포함하되, 이로써 제한하는 것은 아니다. 변이체 대립형질(들)을 동정하는데 적절하고 효과적이면, 다른 방법들, 예로서, 제한 단편 길이 다형태 RFLP도 사용될 수 있다. 검정법은 다중화된 반응의 반응 산물이 구별될 수 있는 한, 다중화될 수 있는데, 이는 2개 이상의 반응이 물리적으로 동일한 위치, 예로서, 어레이상의 동일한 튜브 또는 위치에서 동시에 수행되는 것을 의미한다. 예를 들면, 2개의 상이한 서열-특이 프로브에 상응하는 2개의 상이한 2개의 상이한 형광 색소의 사용 또는 상기 형광 색소의 누적 또는 소실을 모니터함으로써 택맨 또는 분자 비콘 검정법이 다중화될 수 있되, 이로써 제한하는 것은 아니다. 대부분의 경우, 적절한 방법은 개인별 선택과 경험, 보유하고 있는 장비와 시약, 고효율 방법 및/또는 다중화된 방법에 대한 필요성, 방법의 정확성, 및 검정법을 실시하는 기술자의 기술적 수준에 의해 지정된다. 그러한 기법의 디자인과 이행은 광범위하게 공지되어 있고, 이는 당업자의 능력 안에 있다.
본원에서 제공되는 방법을 이행할 때, 어레이가 사용될 수 있다. 어레이는 특히 고효율 검정법 이행시에 유용하다. 어레이는 전형적으로, 인간 대상으로부터의 핵산 샘플중 LOC387775 및/또는 PLEKHA1에서 동정된 하나 이상의 단일 염기 다형태, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, rs4146894, rs1O45216, rs10490924, rs1882907, rs760336, rs763720, rs800292, rs1483883, rs1853883 및 rs1853886으로서 동정된 SNPs에 상응하는 대립형질 변이의 존재를 동정하기 위한 하나 이상의 시약, 예를 들면, 핵산 프라이머 및/또는 프로브를 포함하되, 이로써 제한하는 것 은 아니다. 어레이를 통해 LOC387775 및/또는 PLEKHA1에서의 하나 이상의 대립형질 변이, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, rs4146894, rs1O45216, rs10490924, rs1882907, rs760336, rs763720, rs800292, rs1483883, rs1853883 및 rs1853886으로서 동정된 SNPs를 동시에 검정하고 동정할 수 있을 뿐만 아니라, CFH, 다른 유전자/유전자좌 및 조절 유전자/유전자좌/핵산내 대립형질 변이를 동시에 동정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "어레이"는 2개 이상의 동정가능한 위치에 위치하는 유전자내 대립형질 변이를 용이하게 동정할 수 있도록 해주는 시약을 언급한다. 하나의 실시태양에서, 어레이는 2개 이상의 분리식의, 동정가능한 반응 챔버, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 96-웰 디쉬를 갖는 장치로서, 동정되는 구성 요소들을 포함하는 반응은 상기 챔버에서 실시되는 것이다. 예시적인 실시태양에서, 2개 이상의 핵산 프라이머 또는 프로브를 공간적으로 지정가능한(spatially addressable) 방식으로 기판상에 고정시킴으로써 각각의 개별적인 프라이머 또는 프로브가 기판상의 상이하고 (지정가능한) 동정가능한 위치에 위치하도록 한다. 기판으로는 다중-웰 플레이트, 실리콘 칩 및 비드를 포함하되, 이로써 제한하는 것은 아니다. 하나의 실시태양에서, 어레이는 2개 이상의 비드 세트를 포함하는데, 각 비드 세트는 예로서 양자점 또는 형광 태그와 같은 확인가능한 마커를 갖는 바, 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, 유동 세포 측정기를 사용함으로써 개별적으로 확인가능하다. 하나의 실시태양에서, 본 개시물과 관련하여, 어레이는 SNPs을 동정하기 위하여 DNA를 증폭시키기 위한 프라이머, 또는 특이 서열 결합을 위한 프로브 를 갖는 웰 반응 챔버를 2개 이상 함유하는 다중-웰 플레이트일 수 있다. 그 자체로서, 시약, 예로서 프로브 및 프라이머는 어레이상의 특정 위치상에 또는 그 특정 위치로 결합하거나, 다르게는 침착될 수 있다. 시약은 임의의 적절한 형태일 수 있으며, 액형, 건조형, 동결건조형 또는 유리화된 형태일 수 있지만, 이로써 제한하는 것은 아니다.
유용한 어레이 기술로는 예를 들면, 애피메트릭스 진칩(Affymetrix GeneChip)® 어레이, 예를 들면, 진칩® 커스텀시크® 리시퀀싱(GeneChip® CustomSeq® 재서열화) 어레이(캘리포니아주 산타클라라에 소재하는 Affymetrix Inc.로부터 상업적으로 구입가능) 등의 기술을 포함하나, 이로써 제한하는 것은 아니다. 어레이 데이타를 분석하고/거나, 환자 샘플로부터 수득한 데이타로부터 유전적 위험 요소를 동정하기 위한 정보학 및/또는 통계 소프트웨어 또는 다른 컴퓨터-구현 프로세스는 당업계에 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 바, 특이적으로 동정되거나, 유전자 또는 유전자좌와 관련하여 동정되는, "대상으로부터의 핵산중 대립형질 변이의 존재를 동정하기 위한 시약"은 임의의 적합한 방법, 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, PCR, 재서열화 5' 엑소뉴클레아제(택맨) 검정법 및/또는 어레이 또는 고효율 검정법에 의해 상기의 특이 대립형질 변이를 동정하여 줄 수 있는 시약을 언급한다. 그러한 시약의 일례로서 임의의 유용한 검정법 시스템에 유용한 서열-특이 프라이머, 프라이머 세트 및 프로브를 포함하지만, 이로써 제한하는 것은 아니다. 프라이머 및 프로브는 임의의 유용한 형태를 취할 수 있지만, 전형적으로는 핵산이되, 예로서, 제한하는 것 은 아니지만, 포스포로티에이트와 같은 핵산 유사체도 가능하다.
실시예 1에서는 고밀도 SNP 패널을 사용하여 1q31 및 10q26상의 2개 부위 연관에 대한 가계-기반 연관 연구 및 환자군-대조군 연합 연구를 착수하였다. 염색체 1q31에 대한 SNP 연관과 연합 결과를 통해 ARM과의 최대 연관 및 가장 강력한 연합이 CFH 유전자상에 위치함으로 동정하게 되었다. 염색체 10q26상에서 가계 데이타 및 환자군-대조군 데이타, 양자 모두를 분석하여 다음으로 중요한 ARM 감수성-관련 유전자를 동정하였다.
실시예 2에 기술하는 바, 추적 조사 연구에서는 원래 심혈관 건강 연구(CHS: Cardiovascular Health Study)를 통해 모집된 대상인, 연령-관련 황반병증(ARM) 상태가 확정에 대한 요인이 아닌 모집단-기반 코호트, 및 연령-관련 안과 질환 연구(AREDS: Age-Related Eye Disease Study)를 통해 모집된 대상인, ARM 상태가 확정에 대한 요인이 아닌 모집단-기반 코호트를 포함하는 네스티드(nested) 환자군-대조군 디자인을 사용하였다. 상이한 확장 방식을 사용하여 2개의 코호트에서 ARM 감수성에 대한 CFH, PLEKHA1, LOC387715 및 ELOVL4 유전자를 조사하기 위하여 상기의 코호트들을 사용하였다. 추가로, 각각 CFH 및 LOC387715에 대한 메타-분석에 이들 2개의 코호트와, 11개 및 4개의 추가의 환자군-대조군 연구를 포함하였다. 2개의 코호트, 양자 모두에서 CFH가 ARM과 유의적으로 연합되어 있었고(p < 0.00001), 메타-분석을 통해서는 이형접합체 또는 동형접합체 상태에서의 위험 대립형질(OR, 2.4 및 6.2; 95% CI(신뢰 구간: Confidence Interval), 각각 2.2-2.7 및 5.4-7.2)이 이러한 감수성을 부여한다는 것을 확인하였다. 2개의 코호트, 양자 모두에서 LOC387715는 ARM 상태와 유의적으로 연합되어 있었고(p < 0.00001), 메타-분석을 통해서는 이형접합체 또는 동형접합체 상태에서의 위험 대립형질(OR, 2.5 및 7.3; 95% CI, 각각 2.2-2.9 및 5.7-9.4)이 이러한 감수성을 부여한다는 것을 확인하였다. LOC387715와 밀접하게 연계되어 있는 PLEKHA1은 CHS 코호트를 제외한 AREDS 코호트에서 ARM 상태와 유의적으로 연합되어 있었고, ELOVL4는 어떤 코호트와도 유의적으로 연합되어 있지 않았다. 본 연구는 메타-분석을 통한 추가적인 증거 뿐만 아니라, ARM 상태와 관련하여 상이한 확정 방식을 갖는 코호트 추정을 통해 ARM 감수성에서의 CFH 및 LOC387715 유전자에 대한 추가적인 증거를 제공한다.
실시예
1
재료 및 방법
가계 및 환자군-대조군
코호트
유전자형 분석을 위해 총 612개의 AMD 가계와 184명의 혈연이 아닌 대조군을 유전병 연구 센터(CIDR: Center for Inherited Disease Research)에 보냈다. 가능한 모집단 하위구조에 기인하여 분석은 본 발명의 데이타중 백인 아집단으로 제한하였다. 백인 아집단은 594개의 AMD 가계를 가졌으며, 이는 1443명의 유전자형이 분석된 개체와 179명의 혈연이 아닌 대조군을 포함하였다. 백인 가계는 430개의 유전자형이 분석된, 질병을 나타내는 형제쌍, 38개의 유전자형이 분석된, 질병을 나타내는 숙부(avuncular)쌍, 및 52개의 유전자형이 분석된, 질병을 나타내는 제1 사촌(cousin)쌍을 포함한다.
추가의 SNPs에 대해 총 323개의 백인 가계, 117명의 혈연이 아닌 대조군, 및 196명의 혈연이 아닌 환자군도 국부적으로 유전자형을 분석하였다. 국부 아집단은 824명의 유전자형이 분석된 개체, 298개의 유전자형이 분석된, 질병을 나타내는 형제쌍, 23개의 유전자형이 분석된, 질병을 나타내는 숙부쌍 및 38개의 유전자형이 분석된, 질병을 나타내는 제1 사촌쌍을 포함하였다. 멀린(Merlin) 패키지로부터의 PedStats[Abecasis et al. 2000]를 사용하여 가계 데이타에 대한 약식 계수를 용이하게 얻었다.
질병(affection) 상태 모델
ARM 상태의 중증도에 대하여 모델을 3개 부류(A, B, 및 C)로 정의하였다[Weeks et al. 2004]. 단순화를 위해 가장 엄격하고 보존적인 진단으로 "A형"의 질병을 나타내는 것으로 제한하였다. 모든 진단학적 모델을 사용할 경우, 혈연이 아닌 대조군만이 질병을 나타내지 않았다. 그에 대한 눈 관리 기록 및/또는 기저부 사진에는 임의의 어떤 RPE 변화없이, 어떤 황반 변화(드루젠 포함) 또는 소수(10개 미만)의 경성 드루젠(그의 직경은 50 미크론 이하)에 대한 증거가 표시되어 있지 않은 개체가 질병을 나타내지 않는 개체이다. 상기 정보를 이용할 수 있을 때, 다수의 황반외 드루젠을 갖는 개체는 질병을 나타내지 않는 개체로서 코딩하지 않았다.
특이 ARM 하위-표현형을 조사하기 위한 노력으로, 말기 질환을 갖는 것, 어느쪽 눈이든 맥락막 신생혈관막(CNV: choroidal neovascular membrane)의 증거를 갖는 것, 어느 쪽 눈이든 지도형 위축(GA: geographic atrophic)을 갖는 것을 선택 하고 조사하였다. 이들 환자군에서 지도형 위축은 CNV로부터의 손상에 대하여 속발성인지, 또는 CNV 성장을 제한하기 위하여 제공되는 치료법(즉, 레이저, 외과적 수술, 또는 광선역학 요법)으로부터의 손상에 대하여 속발성인지를 말한다는 것은 종종 어렵기 때문에 상기는 문제가 될 수 있지만, 지도형 위축 및 CNV, 양자 모두를 갖는 것으로 보고된 개체는 상당수가 존재한다. 사진 또는 기록으로부터 사람이 CNV 발생 이전에 눈에 GA를 갖는지를 구별하는 것은 종종 어려울 수 있기 때문에, CNV 군내에 상기 병증, 양자 모두를 갖는 환자들이 포함되었다. 그러나, 이러한 중복되는 군의 아집단만을 지도형 위축 군내 포함시켰고, 특히, CNV의 증거를 갖지 않는, 한쪽 눈에 지도형 위축이 보고된 경우에 그러하였다. 표 1은 3개의 환자군 집단중 각각에 대한 개체의 수를 나타낸다. 이 접근법에서는 같은쪽 눈에 CNV가 발생되기 이전에 비대칭 지도형 위축을 갖거나, 양측성 지도형 위축을 가질 수는 있되, 양쪽 눈 모두에서 CNV가 발생한 지도형 위축군으로부터 소수의 개체를 제외시킬 수 있다.
표 1 진행성 ARM을 갖는 환자중 하위-표현형의 분포. 괄호안의 숫자는 교차비 및 기여 위험도 추정 및 연합 검정을 위한, CNV 및 GA, 양자 모두를 갖고, GA 군에도 포함되는 개체의 수를 나타낸다(선택 기준에 대한 텍스트를 참조할 수 있다).
| CIDR 가계로부터의 환자군 |
국부 가계로부터의 환자군 |
국부의 혈연이 아닌 환자군 |
||||
| GA | GA 없음 | GA | GA 없음 | GA | GA 없음 | |
| CNV | 220(76) | 187 | 130(45) | 106 | 71(17) | 59 |
| CNV 없음 | 108 | 62 | 57 | 28 | 40 | 26 |
가계도 및 유전자형 분석 오차 및
데이타
처리
프로그램 PedCheck[O'Connell and Weeks1998 PedCheck; program for identifying genotype incompatibilities in linkage analysis. Am J Hum Genet 63:259-266]를 사용하여 멘델 법칙의 모순을 체크하였다. 소가족 내에서 유전자형이 오류인지를 결정한다는 것은 극도로 어려울 수 있기 때문에[Mukhopadhyay et al. 2004 Comparative study of multipoint methods for genotype error detection. Hum-Hered 58:175-189], 모든 유전자형은 멘델의 법칙의 불일치를 포함하는 각 가계내의 결측에 대하여 각각의 문제시되는 마커로 설정하였다. Mega2(Mukhopadhyay et al., http://watson.hgen.pitt.edu/register)를 사용하여 유전자-계수에 의한 대립형질 빈도 추정에 대한 파일 뿐만 아니라 연관 분석에 대한 파일을 셋업하였다.
대립형질
빈도 및 하디
바인베르크
(
Hardy
Weinberg
) 평형
혈연이 아니고 질병을 나타내지 않는 대조군으로부터 직접 계수하여 연관 분석에 사용되는 대립형질 빈도를 추정하였다. 대조군 모두는 모든, 3개의 질병 상태 모델하에서 영향을 받지 않았다. 아이가 없는 유전자형 배우자 또는 아직 본 연구의 요소가 된 바 없는 어린이들을 본 연구에 대한 대조군과 조합시켰다. Mega2[Mukhopadhyay et al. 2005 Mega2: data-handling for facilitating genetic linkage and association analyses. Bioinformatics]에 의해 이행되는 하디 바인베르크 평형의 정확한 검정을 본 발명의 SNPs에 대하여 실시하였다.
멘델이 대립형질 빈도를 추정하면서 대상의 관계성을 적절히 설명한 바와 같이, 멘덴 버전 5[Lange et al. 2001 MENDEL Version 4.0: A complete package for the exact genetic analysis of discrete traits in pedigree and population data sets. Am J of Hum Genet 69 (Supplement):A1886]도 사용하여 가계 데이타로부터 직접 대립형질 빈도를 추정하였다. 유전자형이 분석된 가계 일원들 대다수는 질병을 나타내기 때문에 이러한 추정은 혈연이 아니면서 질병을 나타내는 환자군을 사용하여 수득한 추정치와 매우 흡사하다.
유전자 지도
루거스(Rutgers) 조합 연관-물리적 지도(버전 2.0)[Kong et al. 2004 A combined linkage-physical map of the human genome. Am J Hum Genet 75:1143-1148]를 사용하여 기존에는 루거스 지도에 존재하지 않았던, SNPs의 유전자 위치를 예측하였다. 본 발명의 SNPs의 분포는 관심의 대상이 되는 부위에 매우 밀집되어 있기 때문에 수개의 SNPs 사이의 추정된 재조합은 0이었고; 이 경우 상기 재조합을 0.000001로 설정하였다. NCBI dbSNP 데이타베이스(휴먼 빌드 35)로부터 본 발명의 SNPs 모두에 대한 물리적 위치를 얻었다.
연관 비평형 구조
연관 분석을 실시할 때 SNPs 사이의 높은 연관 비평형(LD: linkage disequilibrium)을 무시함으로써 오류 양성 발견을 얻을 수 있다([Schaid et al. 2002 Caution on pedigree haplotype inference with software that assumes linkage equilibrium. Am J Hum Genet 71:992-995]; [Huang et al. 2004 Ignoring linkage disequilibrium among tightly linked markers induces false-positive evidence of linkage for affected sib pair analysis. Am J Hum Genet 75:1106-1112]). 높은 SNP-SNP LD를 고려하기 위한 노력으로서 하기를 포함하였다:
1. 혈연이 아닌 대조군에서의 LD 구조는 H-클러스터 방법[Rinaldo et al. 2005 Characterization of multilocus linkage disequilibrium. Genetic Epidemiology 28:193-206]을 사용하여 연구되었는데, 이는 R에서 이행되었다(R Development Core Team 2004 R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, R statistical software website, http://www.r-proi ect . org /). 상기 목적은 연관 분석을 위해 일배체형-태깅 SNP(htSNPs: haplotype-tagging SNPs)를 결정하는 것이었다. 본 방법은 고도로 상관된 SNPs를 클러스터링하기 위하여 계통 클러스터화를 사용한다. 클러스터화한 후, H-클러스트는 각 클러스터에 대한 htSNP를 선택하는데; htSNP는 클러스터내의 모든 다른 SNPs와 대부분 상관되는 SNP이다. 각 SNP는 적어도 하나의 htSNP와 0.5 초과의 상관 계수(r2)를 갖도록 SNPs를 선택하였다;
2. 프로그램 HaploView[Barrett et al. 2005 Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics 21 :263-265.]를 사용하여 1번 염색체 및 10번 염색체에 따른 SNP-SNP LD의 그래픽 영상을 얻고;
3. 2 내지 3개의 SNP 이동식 윈도우를 사용하여 일배체형-기반 연합 분석을 실시하였다(하기 참조).
연관 분석
1. 단일점 분석. 본 발명자의 이전 연구에서와 같이[Weeks et al. 2004], 단일의 단순 우성 모델을 사용하여 LOD 점수를 전산 처리하였다(질환 대립형질 빈도 = 0.0001 및 침투 벡터 = [0.01 0.90 0.90]). 복잡성 및 ARM 표현형의 후기-발병에 기인하여 오직 2개의 질환 표현형만을 사용하였다: "모델 A하에서 질병을 나타내는 것" 및 "미상." 이질성하에서 지표 LOD 점수를 전산 처리하고(HLOD), 모델이 없는 LOD 점수는 선형 S모두 통계치를 사용하여 전산 처리하였다. 두 점수 모두는 Allegro[Gudbjartsson et al. 2000 Allegro, a new computer program for multipoint linkage analysis. Nat Genet 25:12-13.]를 사용하여 전산 처리하였다.
2. 연관 비평형을 무시하는 다중점 분석. 종종 마커간의 거리는 매우 작기 때문에 SNPs 사이의 LD은 높을 수 있고, 이로써 대부분의 연관 분석 프로그램에 의한 LD가 없다는 가정에 위배되는 것이다. LD를 무시하는 다중점 분석은 Allegro[Gudbjartsson et al. 2000]를 사용하여 실시하였다. HLODs 및 S모두 통계치를 전산 처리하였다.
3. htSNPs 를 사용한 다중점 분석. LOD 점수 계산을 위해 오직 htSNPs만을 사용할 때, SNPs의 갯수는 1번 염색체에서는 533개로 감소하고, 10번 염색체에서는 159개로 감소한다. 다중점 LOD 분석을 이전과 같이 수행하였다[Weeks et al. 2004]. 생략된 SNPs를 HaploView로 추정된 SNP-SNP LD 구조에 잘 적합화시켰 다[Barrett et al. 2005].
연합 분석
가계로부터의 모든 환자군을 사용하기 위하여, 혈연이 아닌 대조군과 동시에친족(related)의 환자군을 사용하여 연합에 대하여 검정할 수 있도록 하는 신규의 CCREL 프로그램[Browning et al. 2005 Case-Control single-marker and haplotypic association analysis of pedigree data. Genet Epidomiol 28:110-122.]을 사용하였다. 연합에 대하여 검정하기 위하여 CCREL을 사용하여 1번 염색체 및 10번 염색체상의 연관 피크하 SNPs를 분석하였다. CCREL 검정은 환자군과 대조군의 유효수를 계산하여 생물학적으로 관련이 있는 대상을 밝혀낸다. 이들 분석을 위해 혈연이 아닌 대조군은 "정상" 표현형으로서 지정된 반면, 'A형' ARM에 질병을 나타내지 않는 가계 일원들은 "미상" 표현형으로서 지정되었다(CCREL 접근법은 동시에 친족의 환자군 및 친족의 대조군, 양자 모두를 사용할 수 있도록 확장되지는 않았다). 그러므로, 연합 검정을 위해 사용되는 각 SNP에 대한 대조군의 유효수는 상기 SNP에 대하여 유전자형이 분석되는 대조군의 수이다. 대립형질 검정, 2개의 SNP 슬라이딩 윈도우(sliding window)를 사용하는 일배체형 검정, 3개의 SNP 슬라이딩 윈도우를 사용하는 일배체형 검정, 및 유전자형 검정을 실시하였다. [Browning et al. 2005]의 저자에 의해 제공되는 바와 같이 분석을 위해 CCREL R 패키지를 사용하였다.
GIST
분석
연관 신호에 대하여 어떤 대립형질/SNP가 가장 최대로 기여하는지를 조사하기 위하여, 1번 염색체 및 10번 염색체, 양자 모두의 연관 피크 주변의, CCREL 검 정으로부터의 국부적으로 유전자형이 분석된 SNPs 및 유의적인 SNPs를 사용하여 유전자형-IBD 공유 검정(GIST: genotype-IBD sharing test)을 실시하였다. GIST 검정을 통해 대립형질 또는 그와 함께 LD의 대립형질이 관찰되는 연관 신호를 부분적으로 밝혀내는지 여부를 결정한다[Li et al. 2004]. 가중치는, 3개의 상이한 질환 모델(열성, 우성, 부가)하에서 각각의, 질병을 나타내는 형제관계에 대하여 전산 처리하는데-이들 가중치는 무질환-마커 연합의 귀무가설하에 편향되지 않는다. 가계 가중치 변수와 비지표 연관(NPL: nonparametric linkage) 점수 사이의 상관관계는 검정 통계치의 기초가 된다. GIST 검정만이 오직 질병을 나타내는 형제쌍 가계에 대하여 적용될 수 있기 때문에 NPL 점수를 전산 처리하기 이전에 가계를 그들의 요소인 핵가족으로 분할하였다. 기초 질환 모델은 미상이기 때문에 본 발명자는 3개의 상이한 질환 모델(열성, 우성, 부가)하에서 검정한 후, 3개의 모델에 대한 다중 검정을 위해 조절된 p-값을 사용하여 최대치를 취하였다.
3부 분석
3개의 순차적인 단계로 분석을 수행하였다. 먼저, CIDR에서 유전자형이 분석된 데이타 세트를 분석하였다. 이어서, 10번 염색체상의 PLEKHA1/LOC387715/PRSS11 부위에서 8개의 추가의 SNPs를 국부적으로 유전자형 분석을 한 후, 국부적으로-유전자형이 분석된 데이타 세트를 분석하였다. PLEKHA1부터 PRSS11까지의 공지된 비동의 SNPs 모두에 대하여 조사하였음에 주목한다. 이들 2개의 데이타 세트는 크기와 조성에 있어 상이하기 때문에 그를 따로따로 분석하는 것이 가장 간단하다(표 2). 상기 기술한 바와 같이, 이들(중복) 데이타 세트, 양자 모두에 대하여 대립형 질 빈도 추정, CCREL 연합 검정, GIST 검정을 수행하였다. 세번째로, 본 발명자들은 1번 염색체와 10번 염색체 부위 사이의 상호 작용에 대하여 검정하였을 뿐만 아니라, 지도형 위축 또는 맥락막 신생혈관막의 존재에 따른 함수로서 위험도가 달라지는지 여부를 조사하였다.
표 2 각 파트에서의 통계학적 분석 및 샘플 크기 요약
| 파트 | 분석 | 사용된 SNPs 세트 및 샘플 | 결과 |
| I | htSNP 선택 | 179명의 대조군상의 CIDR SNPs | |
| SNP-SNP LD | 179명의 대조군상의 CIDR SNPs | 도 3A-3D 및 5A-5C |
|
| 연관 | 594개의 ARM 가계상의 CIDR SNPs 및 htSNPs | 도 2, 3 | |
| 대립형질 빈도 | 594개의 ARM 가계상의 멘델 5 179명의 대조군상에서의 계수 |
표 5 | |
| CCREL | 594개의 ARM 가계상의 CIDR SNPs 및 179명의 대조군 |
표 5 | |
| GIST | 594개의 ARM 가계를 734개의 분석된 핵가족으로 분할 |
표 5 | |
| II | 대립형질 빈도 | 모든 SNPs(CIDR 및 국부) 323개의 ARM 가계상의 멘델 5 117명의 대조군 계수 |
표 6 |
| CCREL | 유전자내 CIDR SNPs 및 국부 SNPs 323개의 가계 및 117명의 대조군 |
표 6 | |
| GIST | 323개의 ARM 가계를 407개의 분석된 핵가족으로 분할 |
표 6 | |
| SNP-SNP LD | 117명의 혈연이 아닌 대조군상에서의 유전자내 CIDR 및 국부 SNPs |
표 6 | |
| III | GIST와의 상호 작용 |
상기 I 및 II의 GIST 참조 | 표 5, 6 |
| 지수형 회귀 | CIDR SNPs, 577명의 환자군 및 179명의 대조군 | 표 7 | |
| OR 및 AR | CIDR SNPs, 577명의 환자군 및 179명의 대조군 | 표 8 | |
| 국부 SNPs, 517명의 환자군(가계로부터 321, 196명 산발성) 및 117명의 대조군 |
|||
| 하위-유형의 OR 및 AR |
표 9 | ||
| CIDR SNPs |
CNV: 407명의 환자군 및 179명의 대조군 | ||
| GA: 184명의 환자군 및 179명의 대조군 | |||
| 국부 SNPs |
CNV: 366명의 환자군 및 117명의 대조군 | ||
| GA: 159 및 117명의 대조군 |
파트 I: CIDR SNPs의 분석
CIDR SNP 유전자형 분석
염색체 10q26 상의 관여 유전자를 동정하기 위하여 유전병 연구 센터(CIDR)는 관심의 대상이 되는 부위를 신장시켜, 13.4 Mbp(26.7 cM)에 걸쳐 있는 199개의 SNPs를 사용하여 612개의 AMD 가계 및 184명의 혈연이 아닌 대조군의 고도로 조밀한 맞춤형 SNP 유전자형 분석을 수행하였다. 분석을 위해 196개의 SNPs를 사용하였 는데: 대조군내 다형태가 부족하기 때문에 3개는 생략하였다(가계 데이타내 체크시, 결측 대립형질은 극도로 드물고, 오직 이형접합체에만 존재한다). 염색체 1q31상의 45.7 Mbp(47.1 cM)에 걸쳐 있는 684개의 SNPs 또한 유전자형을 분석하였다: 대조군내 다형태가 부족하기 때문에 5개는 생략하였다 - 결측 대립형질은 가계 데이타에서 존재하지 않거나 극히 드물었고, 오직 이형접합체에만 존재하였다. 본원에서 제공되는 대립형질 표지와 실제 대립형질 사이의 일치성, 및 비동의 SNPs에 대한 아미노산 변화에 대하여 표 3을 참조한다.
표 3 대립형질 표지화. 조사된 각 마커에 대한 대립형질 표지, 비동의 SNPs에 대한 아미노산 변화, CIDR 대조군(179)에서의 대립형질 빈도 및 국부 대조군(117개가 CIDR 대조군과 중복된다)에서의 대립형질 빈도 및 정확한 검정의 HWE p-값을 조사하였다.
파트
II
: 국부적으로 유전자형이 분석된
SNPs
의 분석
국부적인 SNP 유전자형 분석 - 3개의 감수성 유전자를 중복 점유하는 10번 염색체 상의 추가적인 SNPs 8개, PLEKHA1(rs12258692, rs4405249 및 rs1O45216), LOC387715(rs10490923, rs2736911, rs10490924) 및 PRSS11(rs11538141, rs1803403)에 대하여 유전자형 분석을 하였다. 이러한 유전자형 분석에 대한 노력으로 NCBI 데이타베이스에서 상기 유전자들에 대하여 보고된 바 있는 모든 비동의 SNPs를 포함하였다(도 1 참조). 또다른 연구의 일부분으로서[Conley et al. 2005 Candidate gene analysis suggests a role for fatty acid biosynthesis and regulation of the complement system in the etiology of age-related maculopathy], 2개의 CFH 변이체(rs10922093 및 rs1061170)에 대하여 유전자형 분석하였고, 이는 본원에서도 잘 이용된다. GRK5/RGS10 유전자좌하의 추가적인 SNPs의 유전자형 분석은 진행중이다. 서열화하고(워싱턴주 시애틀에 소재하는 Rexagen Corporation), 시퀀서(Sequencher) 소프트웨어(미시간주 앤아버에 소재하는 Gene Codes Corporation)를 사용하여 분석함으로써 rs12258692, rs1803403, 및 rs12258692의 3'에 대하여 하나의 염기를 특징으로 하는 새로 SNP로서 rs4405249를 수집하였다. rs11538141, rs2736911, rs10490923 및 rs10490924에 대한 유전자형 데이타를 RFLP를 사용하여 수집하였다. 적절한 프라이머, 증폭 조건, 및 제한 엔도뉴클레아제는 서열화 또는 RFLP에 의해 유전자형이 분석되는 SNPs에 대한 표 4에서 찾아볼 수 있다.
표 4 서열화 또는 RFLP에 의해 유전자형이 분석되는 SNPs의 유전자형 데이타 수집을 위해 사용되는 프라이머, 어닐링 조건 및 제한 엔도뉴클레아제. NA = 미적용
rs1045216에 대한 유전자형 데이타는 5' 엑소뉴클레아제 어쎄이-온-디맨드(Assay-on-Demand) 택맨 검정법(캘리포니아주 라호야에 소재하는 Applied Biosystems Incorporated)을 사용하여 수집하였다. ABI7000 및 SDS 2.0 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하여 증폭시키고 유전자형을 할당하였다. 2명의 혈연이 아닌 CEPH 샘플은 각 변이체에 대하여 유전자형을 분석하고, 각각의 겔상 및 각각의 택맨 트레이에 포함시켜 유전자형 요청시 내적 일치도를 확인시켜 준다. 추가로, 각 변이체에 대하여 이중-차폐된 유전자형을 할당하고, 비교하고, 원 데이타 또는 재-유전자형 분석을 사용하여 각각의 차폐된 불일치점을 지정하였다. 본원에서 제공된 대립형질 표지와 실제 대립형질 사이의 일치, 및 비동의 SNPs의 아미노산 변화에 대해서는 표 3을 참조한다.
파트
III
: 상호 작용 및 교차비(
OR
:
odds
ratio
) 분석
혈연이 아닌 환자군 - 혈연이 아닌 환자군에 대해 CIDR은 유전자형 분석을 하지 않았지만, 196명의 혈연이 아닌 환자군은 추가의 SNPs에 대하여 국부적으로 유전자형 분석을 하였다. 교차비의 계산 및 상호 작용 분석을 위해(하기 참조), 각 가계로부터 "A형"의 질병을 나타내는 사람을 한사람씩 뽑아 한 세트의 혈연이 아닌 환자군을 생성하였다. 321개의 국부적으로-유전자형 분석된 가계에는 적어도 1명의 "A형"의 질병을 나타내는 사람이 포함되어 있었다. 가계에 1명 이상의 "A형"의 질병을 나타내는 사람이 포함되어 있는 경우, 대부분이 rs800292(CFH), rs1O61170(CFH), rs1537576(GRK5) 및 rs4146894(PLEKHA1)로 유전자형이 분석된 사 람을 선택하였고; 유전자형이 분석된 SNPs의 수에 있어 두 사람 사이에 차이가 없었다면, 질환이 발생한 사람중 보다 어린 사람을 선택하였고, 다르게는, 대부분이 유전자형이 분석되었고, 가장 이른 시기에 발병된 사람들중 무작위적으로 "A형"의 질병을 나타내는 환자군을 뽑았다. 577개의 CIDR 가계에는 적어도 1명의 "A형"의 질병을 나타내는 사람이 포함되어 있었고, 이들 가계들중 321개는 또한 국부적으로 유전자형 분석이 이루어졌으며, 국부 세트에 대한 것과 동일하게 "A형"의 질병을 나타내는 사람을 선택하였다. 남은 256개의 가계에 대해서, 상기와 동일한 기준으로 선택하되, 단, 오직 rs800292(CFH), rs1537576(GRK5), 및 rs4146894(PLEKHA1)을 사용하여 가장 완벽하게 유전자형이 분석된 사람을 찾았다.
CFH와의 상호 작용 분석
CFH내 SNPs가 10번 염색체상의 연관 신호에 관여하는지, 및 10번 염색체상의 SNPs가 1번 염색체상의 연관 신호에 관여하는지는 GIST를 사용하여 검정함으로써 1번 염색체상의 CFH와 10번 염색체의 유전자 사이에 가능한 상호 작용을 조사하였다. 하나의 염색체상의 SNPs로부터의 가중치와 다른 하나로부터의 가계-기반 NPLs를 사용하여 수행하였다.
[North et al (2005) Application of logistic regression to case-control association studies involving two causative loci. Hum Hered 59:79-87]에 기재된 접근법에 따라 지수형 회귀 또한 사용하여 상이한 상호 작용 모델에 대하여 추정하고, 상호 작용에 대하여 검정하였다. 이 접근법에서, 2개의 유전자좌 모두에서 부가 및 우성 효과에 대하여 동시에 허용하는, 다수의 상이한 상호 작용 가능 모델 이 적합하고, 가장 가능성이 있고 경제적(parsimonious)인 모델에 대하여 단정하기 위하여 상이한 모델에 대한 상대적인 가능성을 비교한다. 앞서 [North et al. 2005]에 기재된 바와 같이, 적합한 모델은 오직 매개 개념만이 추정되는 MEAN 모델, 2개의 유전자좌중 하나 또는 다른 것 또는 양자 모두에서 부가 효과를 나타내는 ADD1, ADD2 및 ADD 모델, 추가로 우성 효과를 구현하는 DOM1 , DOM2 및 DOM 모델 및 상호 작용 효과(보다 상세한 설명을 위해서는 [North et al.(2005)]를 참조할 수 있다)를 허용하는, 추가의 모델 2개, ADDINT 및 DOMINT를 포함하였다. 이들 모델중 몇몇 쌍은 내포형이 아니기 때문에, 아카이케의 정보량 기준(AIC: Akaike information criteria)을 사용하여 비교하였고; 이 접근법에서는 가장 낮은 AIC를 갖는 모델이 최고로 적합하고 가장 경제적인 것으로 간주한다. 이들 분석을 위해 노쓰(North)와 그의 동료들로부터 제공받은 프로그램을 사용하였다. 본 발명자가 발견한 몇몇 오류를 정정한 후; 결과는 본 발명자 자체의 R 프로그램을 사용하여 이중으로 체크하였다. 샘플의 크기를 최대화시키기 위하여 각 유전자내 고도로 유의적인 비동의 SNP를 포함하는, 높은 LD내의 CIDR SNPs를 선택하였다. rs10611710(CFH의 Y402H 변이체)를 대표하여 CIDR SNP rs800292가 선택되었고, PLEKHA1에서는 CIDR SNP rs4146894가 rs1O45216을 대표한다. 유사하게, GRK5, RGS10, 및 PRSS11에서 대표적인 CIDR SNP를 선택하였다.
연합 크기
조 교차비를 계산하고, 각 유전자에서의 SNPs에 대한 기여 위험도를 추정하였다. 대조군에서 빈도가 가장 작은 대립형질을 위험 대립형질로 간주하였다. 기여 위험도는 대조군으로부터 추정하는 바와 같이, 식 AF = 100*P*(OR - 1)/(1 + P*(OR-1)(여기에서, OR은 교차비이고, P는 모집단내 위험 대립형질의 빈도이다)을 사용하여 추정하였다. 대조군과 비교되는 "A형"의 질병을 나타내는 대상, 대조군과 비교되는, CNV를 갖는 대상, 및 대조군과 비교되는, GA를 갖는 대상을 사용하여 수행하였다. 중복되되, 크기가 상이한, 최대의 가능한 샘플을 사용하기 위하여, CIDR 및 국부적으로 분석된 SNPs에 대한 샘플을 사용하였다. 가계로부터 뽑힌 577명의 환자군과 179명의 혈연이 아닌 환자군을 CIDR SNPs의 OR 및 AR을 계산하는데 사용하였지만, 517명의 환자군(그중 321명은 577명의 환자군에 포함된다) 및 117명의 대조군(이들 모두는 179명의 CIDR SNP 대조군에 포함된다)은 국부적으로 유전자형이 분석된 SNPs의 OR 및 AR 계산에 사용하였다.
다중 검정 문제
염색체 10q26 부위에 ARM-감수성 유전자좌가 존재한다는 이전 연구로부터의 매우 강력한 증거를 고려해 볼 때, 본원에서 실시된 분석은 가설 검정이라기 보다는 감수성 유전자의 위치를 추정하는 것을 목적으로 한다. 가설 검정과 관련하여 다중 검정 문제가 가장 중요하고 관련되는 것이다. 추정시 본 연구에서는 간단하게 신호가 가장 강한 곳에 촛점을 맞춘다. 어느 경우에든, 다중 검정에 대한 임의의 상관 관계가 결과의 등급 순위를 변경시키지는 않을 것이다. LD에 기인하여 검정들 사이의 어떤 상관 관계도 설명하지 못하는, 본페로니(Bonferroni) 수정을 통해 196개의 검정에 대하여 0.05 수준으로 0.05/196 = 0.00026의 유의적인 임계치를 얻을 수 있고; LD에 기인한 상관 관계를 통해서는 보다 큰 임계치를 얻을 수 있다.
결과
3개의 순차적인 단계로 분석을 수행하였다. 먼저, CIDR에서 유전자형이 분석된 데이타 세트를 분석하였다. 이어서, 10번 염색체상의 PLEKHA1/LOC387715/PRSS11 부위에서 8개의 추가의 SNPs를 국부적으로 유전자형 분석을 한 후, 국부적으로-유전자형 분석된 데이타 세트를 분석하였다. 상기 기술한 바와 같이, 이들(중복) 데이타 세트, 양자 모두에 대하여 대립형질 빈도 추정, 하디-바인베르크 평형에 대한 검정(표 3), CCREL 연합 검정, 및 GIST 검정을 수행하였다. 세번째로, 1번 염색체와 10번 염색체 부위 사이의 상호 작용에 대하여 분석하고, 지도형 위축 또는 맥락막 신생혈관막의 존재에 따른 함수로서 위험도가 달라지는지 여부를 조사하였다.
파트
I:
CIDR
SNPs
의 분석
CIDR
연관 결과
CIDR SNPs를 사용하고, 본 발명자의 이전 연구[Weeks et al. 2004)]에서의 것과 동일한 연관 분석을 적용시켜, 10번 염색체상의 S모두 다중점 곡선의 피크는 GRK5 부위(도 2에서 'G'; GRK5에서 rs1537576은 1.87의 단일점 S모두를 갖는 반면, 3.86의 최대 단일점 S모두는 rs555938에 존재하였고, GRK5의 동원체는 206 kb)와, PLEKHA1/LOC387715/PRSS11 부위(도 2에서 "P")에 주의를 끄는 수개의 상승된 2-지점의 비지표 S모두 LOD 점수 및 본 발명에서 가장 높은 이질성 LDO 점수(HLOD)를 관련시킨다. 상기 부위에서 PLEKHA1중 SNP rs4146894는 3.34의 2-지점 S모두와, 2.66의 2-지점 HLOD를 가진 반면, PRSS11중 SNPs rs760336 및 rs763720은 각각 2.69 및 2.23의 2-지점 S모두를 가졌다. 그러나, 지원 간격은 크고(10.06 cM, 도 2), 따라서, 연관 분석만으로 위치화하는 것은 상당히 부정확하다.
SNPs 모두를 사용한 다중점 점수(도 2, 좌측 패널)를 htSNPs로만 전산 처리된 것(도 2, 우측 패널)과 비교하여 SNP-SNP LD를 고려하지 않는 것에 대한 효과를 조사하였다. H-클러스트 SNPs를 사용할 경우에만 2개의 피크가 거의 소멸하였고(도 2, 좌측 패널에서 오류 피크, "F"로서 언급함); 흥미롭게도, 이들 2개의 피크는 일배체형 블록(도 3A 및 3B)내 존재하는 반면, 최고의 다중점 및 2-지점 LDO 점수 주변의 LD는 낮고, 이는 연관 분석을 실시할 때 LD를 고려하는 것이 중요하다는 것을 시사한다.
1번 염색체상의 연관 결과는 2 초과의 S모두를 갖는 3개의 피크를 제공하였고, 분석을 htSNPs로 제한하였을 때에는 상기 피크들중 오직 1개가 관찰되었다(도 4). 이중 나머지 피크는 보체 인자 H(CFH) 유전자와 중복 점유하고, 매우 높은 2-지점 S모두 및 HLOD 점수를 갖는 2개의 SNPs를 포함하였고; CFH중 비동의 SNP인 rs800292는 1.53의 S모두 및 2.11의 HLOD를 가진 반면, CFH의 텔로미어 165 kb인 SNP rs1853883은 4.06의 S모두 및 3.49의 HLOD를 가졌다. 이러한 결과는 ARM에 CFHs가 관여한다는 초기의 발견을 강력하게 입증하는 것이다([Conley et al 2005]; [Edwards et al. 2005]; [Hageman et al. 2005b A common haplotype in the complement regulatory gene factor H (HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci USA.]; [Haines et al. 2005]; [Klein et al 2005]; [Zareparsi et al. 2005a]). 연관 분석에서 본 발명의 SNPs 모두를 사용하였을 때 본 발명자가 관찰한 소멸한 피크(도 4, 좌측 패널에서 'F')는 진한 일배체형 블록(도 5 A 및 5B)내 위치한 반면, CFH 피크하의 LD는 상대적으로 낮았다(도 5C).
CIDR
연합 결과
연관에 의해 수득할 수 있는 것보다 더욱 치밀한 위치화를 위해 연합 분석을 사용하였다(이는 1번 염색체상의 CFH를 발견하는데 매우 성공적이었다). 여기에서는 CCREL 접근법을 사용하여 연합 분석을 실시함으로써 환자군의 관계성에 대하여 적절하게 조절하여 본 발명의 혈연이 아닌 대조군, 및 본 발명의 친족의 가족 환자군 모두를 동시에 사용할 수 있도록 하였다. 10번 염색체상의 CIDR 샘플중, 본 발명의 연관 피크내에서 본 발명자들은 매우 작은 p-값을 갖는 것으로, 3개의 유전자: PLEKHA1 , LOC387715 및 PRSSl1와 중복 점유하는 4개의 인접한 SNPs 클러스터(rs4146894, rs1882907, rs760336 및 rs763720)를 동정하게 되었다. 10번 염색체상에서 가장 강력한 CCREL 결과는 SNP rs4146894를 갖는 PLEKHA1에 존재하였다(표 5). 동시에 3개("haplo3")의 SNPs를 사용하여 이동식 윈도우 일배체형 분석을 수행한 결과 전체 PLEKHA1부터 PRSSl1 부위까지 매우 작은 p-값을 얻었다(표 5). 연합 검정 또한 GRK5 부위에서 일부의 적당히 작은 p-값을 생성하였는데, 이는 연관이 존재한다는 것에 대한 강력한 증거가 된다.
1번 염색체상의 연관 피크에 걸쳐 있는 56개의 SNPs에 대하여 CCREL을 실시하고, CFH와 중복 점유하는, 2개의 고도로 유의적인 SNP(rs800292 및 rs1853883)를 발견하게 되었다. 동시에 2개("haplo2") 및 3개("haplo3")의 SNPs를 사용하여 이동식 윈도우 일배체형 분석을 수행한 결과, 전체 CFH 유전자(표 5)에 걸쳐 극도로 낮은 p-값을 수득하였고, CFH와 ARM의 강력한 관련성에 대한 조기 발현을 다시 입증하게 되었다.
CIDR
GIST
결과
CIDR 데이타 세트에서 GIST 검정을 수행할 때, 염색체 10q26의 2개의 가장 작은 p-값(0.006, 0.004)은 GRK5/RGS10 부위에 존재한 반면, 세번째로 작은 p-값(0.008)은 PLEKHA1에 존재하였다(표 5). GRK5 유전자의 SNPs 4개 모두 작은 GIST p-값을 가졌다. GIST 결과는, GRK5 및 PLEKHA1, 양자 모두가 10번 염색체상의 연관 신호에 유의적으로 기여하고, CFH는 1번 염색체상의 연관 신호에 유의적으로 기여한다는 것을 제안한다. PRSS11의 SNPs 2개는 어느 것도 10번 염색체상의 연관 신호에 유의적으로 기여하지는 않았다. 10번 염색체상의 이들 유전자 2개가 1번 염색체상에서 관찰되는 연관 신호와 관련된다는 증거는 없었다.
파트
II
: 국부적으로 유전자형이 분석된
SNPs
의 분석
국부 연합 결과
추가의 SNPs를 국부적으로 분석한 후, 대립형질 및 유전자형 검정을 통해 3개의 유전자 PLEKHA1/LOC387715/PRSS11 각각에서 극도로 작은 p-값을 생성하였다(표 6). 동시에 3개("haplo3")의 SNPs를 사용하여 이동식 윈도우 일배체형 분석을 수행한 결과 PLEKHA1/LOC387715/PRSS11 부위 전역에 걸쳐 매우 작은 p-값을 얻었다(표 6). 따라서, 연합은 PLEKHA1/LOC387715/PRSS11 부위를 관련시키지만, 이들 유전자를 구별하지는 못했다.
표 5 CIDR에서 분석된 가계(594) 및 대조군(179)에서의 CCREL, GIST, 및 대립형질 빈도 추정. 대조군에서의 소수의 대립형질 빈도를 대조군(계수에 의해 추정됨) 및 가계(멘델 버전 5에 의해 추정됨), 양자 모두에 대하여 기록하고, 대조군과 가계 사이의 대립형질 빈도가 0.1 초과로 차이가 날 경우에는 대립형질 빈도를 볼드체로 나타내었다. 대립형질 검정, 일배체형 2 SNP 이동식 윈도우 검정, 일배체형 3 SNP 이동식 윈도우 검정 및 CCREL로부터의 유전자형 검정에 대한 P-값이 ≤0.05일 경우, 볼드체로 나타내고, ≤0.001일 경우에는 밑줄체로 나타내었다. 1번 및 10번 염색체로부터의 NPL 점수를 사용한 GIST P-값을 기록하고, 0.05 미만일 경우, 볼드체로 나타내고, ≤0.001일 경우, 볼드체의 밑줄체로 나타내었다.
표 6 국부적으로-분석된 가계(323) 및 대조군(117)에서의 CCREL, GIST, 및 대립형질 빈도 추정. 대조군에서의 소수의 대립형질 빈도를 대조군(계수에 의해 추정됨) 및 가계(멘델 버전 5에 의해 추정됨) 양자 모두에 대하여 기록하고, 대조군과 가계 사이의 대립형질 빈도가 0.1 초과로 차이가 날 경우에는 대립형질 빈도를 볼드체로 나타내었다. 대립형질 검정, 일배체형 2 SNP 이동식 윈도우 검정, 일배체형 3 SNP 이동식 윈도우 검정 및 CCREL로부터의 유전자형 검정에 대한 P-값이 ≤0.05일 경우, 볼드체로 나타내고, ≤0.001일 경우에는 볼드체의 밑줄체로로 나타내었다. 1번 및 10번 염색체로부터의 NPL 점수를 사용한 GIST P-값을 기록하고, 0.05 미만일 경우, 볼드체로 나타내었다. 이탤릭체로 표기된 SNPs는 국부적으로 분석된 SNPs이다.
국부 GIST 결과
GIST는 3개의 유전자 PLEKHA1/LOC387715/PRSS11중 PLEKHA1을 가장 강력하게 관련시킨다(표 6). LOC387715(rs10490924)에서도 작은 p-값이 생성되었지만, 이 SNP는 PLEKHA1 SNPs와 함께 높은 LD에 존재하였다(도 6A 참조). 국부적으로-분석된 데이타 세트를 사용할 때, GIST는 PRSS11에서는 어떤 유의적인 결과도 생성하지 않 았는데, 이는 보다 큰 CIDR 샘플에서 상기 관찰된 바와 같은 비-유의적인 결과와 유사하였다. 이는 PLEKHA1(또는 그와 함께 강력한 LD의 유전자좌)이 AMD에 관여할 가능성이 가장 크고, 따라서, LOC387715에는 가능성이 남아있다.
부위에서 어떤 SNP가 연관 신호의 원인이 되는지에 대한 공정한 평가를 위해 오직 국부적으로-유전자형이 분석된 가계를 사용하여 NPLs를 전산 처리하였다. 표 6의 PLEKHA1/LOC387715/PRSS11 결과를 GRK5/RGS10 결과와 직접 비교할 수 있었다. 국부적으로-분석된 데이타 세트상에서 GRK5 GIST 결과 또한 관심의 대상이 되었는데, CFH에 GIST를 적용시킨 것으로부터 얻은 p-값과 동일한 크기의, 적당히 좀 작은 p-값을 얻었다(표 6). 그러나, CIDR 데이타 세트를 분석하였을 때 관찰되었던 것만큼 p-값이 작지는 않았다는 것에 주목한다. GRK5 부위의 SNPs 모두 CIDR SNPs이기 때문에 국부적으로-분석된 데이타 세트는 CIDR 데이타 세트보다는 작은 바, 이러한 차이는 단지 샘플 크기에 따른 함수이다(표 2를 참조).
파트
III
: 상호 작용 및 교차비(
OR
) 분석
GIST 결과
GIST 검정으로는 1번 염색체와 10번 염색체 부위 사이에 상호 작용이 있다는 강력한 증거는 관찰되지 않았다. 10번 염색체상의 SNPs가 1번 염색체상의 연관 신호에 기여하는지 여부를 검정하기 위하여(표 5 'GIST(NPL 1)') CIDR 데이타 세트를 사용할 때, PRSS11의 rs763720만이 0.05 미만의 p-값을 제공하였지만, rs763720은 10번 염색체상의 연관 신호에는 유의적으로 기여하지 않았으며, 이 p-값의 신뢰도는 감소되었다. 국부적인 데이타 세트만을 사용할 때, 보다 큰 CIDR 데이타 세트에 서는 유의적이지 않았던 하나의 GRK5 변이체(rs1537576)는 0.05 미만의 p-값을 제공하였다. 유사하게, CFH내 SNPs가 10번 염색체상의 연관 신호에 기여한다는 어떤 증거도 관찰되지 않았고, 오직 SNP(rs955927)만이 0.05 미만의 p-값을 제공하였지만, 상기 SNP는 CFH에 존재하지 않고, CFH 유전자내의 어느 SNPs와도 강력한 LD에 있지 않았다(도 6B 참조)
지수형 회귀 결과
지수형 회귀는 CFH부터 PLEKHA1까지의 변이체, 양자 모두를 포함하는 부가 모델은 환자군-대조군 상태에 대한 최적의 모델임을 제안하고; 이는 상기 유전자, 양자 모두가 ARM 표현형에 중요하다는 것을 시사한다. AIC 기준은 또한 부가 상호 작용 개념을 포함하는 부가 모델이 차선의 모델이지만(표 7), 상호 작용 개념은 유의적이지 못하다(p-값 = 0.71)는 것을 제공한다. CFH와 PRSS11 사이의 상호 작용에 대하여 유사한 결과를 수득하였는데, 여기에서, 두 변이체, 양자 모두를 포함하는 부가 모델이 최적의 모델인 것으로 나타났다. GRK5/RGS10 부위 내, CFH SNP만을 갖는 모델이 최고로 적합한 모델이고, 이는 GRK5 또는 RGS1O 변이체를 상기 모델에 첨가해서는 CFH 유전자형을 갖는 환자군-대조군 상태를 예측하는 것이 개선되지 못한다는 것을 시사한다.
표 7 지수형 회귀에 의한 2-유전자좌 모델을 적합화한 결과. 각 모델의 AIC, 및 AIC와 최고의 적합한 모델과의 차이. 모델에 대한 정의는 문서상에 있다.
오차비
및 기여 위험도
연합 크기는 교차비(OR)와 기여 위험도(AR)를 계산하여 추정하였다: 관찰된 유의적인 연합(표 8)은 파트 I 및 II의 CCREL로부터 얻은 결과와 일치하였다. PLEKHA1/LOC387715 부위의 가장 유의적인 SNP 2개는 SNPs rs4146894(PLEKHA1) 및 rs10490924(LOC387715)에 존재하였고; 이들 SNPs 사이의 LD은 매우 높은 바(D'=0.93)(도 6A 참조), 상기 2개의 검정은 고도로 상관적이었다. 10번 염색체 부위에서 세번째로 가장 유의적인 SNP(rs1O45216)는 PLEKHA1에서 비동의 SNP이고, rs4146894(D'=97) 및 rs10490924(D'=0.91), 양자 모두와 높은 LD에 있다.
표 8 교차비(OR), 기여 위험도(AR) 및 10000회 반복을 사용한 카이-제곱 검정으로부터의 모의 p-값. "A형"의 질병을 나타내는 대상을 대조군과 비교하였다. 상응하는 p-값이 0.001 미만일 경우, OR 및 AR 값은 볼드체의 밑줄체로 나타내고, 0.05 미만이 경우에는 볼드체로 나타내었다. SNP.대립형질은 측정된 SNP 및 위험 대립형질(대조군내 소수 대립형질)을 표시한다. RR은 위험 대립형질에 대한 동형접합체를 표시하고, RN은 위험 대립형질에 대한 이형접합체를 표시하며, NN은 정상 대립형질에 대한 동형접합체를 표시한다. 이탤릭체로 표기된 SNPs는 국부적으로 분석된 SNPs이다.
본 발명자들은 CFH 유전자에 대하여 보고된 것과 유사한 결과 및 유사한 OR 및 AR 값(표 8)을 수득하였다. 3개의 가장 유의적인 SNPs는 rs1O61170(Y402H 변이체), rs800292(CFH중) 및 rs1853883(rs1O61170과 강력한 LO에 있음, D'=91)이었다.
PLEKHA1/LOC387715내에서 관찰된 연합 크기는 CFH와 ARM 사이에서 관찰되는 연합 수준과 매우 유사하였고; 2개의 유전자좌, 양자 모두에서 극도로 낮은 p-값(p-값 < 0.0001)을 얻었다. OR 및 AR 값 또한 유사하였고, CFH내 우성 OR은 5.29(95% CI 3.35-8.35)이고, PLEKHA1/LOC387715내의 것은 5.03(95% CI 3.2-7.91)이었으며, CFH 및 PLEKHA1/LOC387715에 대한 우성 AR은 각각 68% 및 57%였다.
하위-표현형 분석
본 발명자는 삼출성 질환을 갖는 환자군 대 대조군, 및 지도형 위축을 갖는 환자군 대 대조군에서 교차비 및 기여 위험도를 추정하였다(표 9). 교차비 및 상응하는 p-값은 CCREL의 대립형질 검정과 유사한 발견에 이르게 하였다(표 5 및 6). 지도형 위축 또는 맥락막 신생혈관막의 존재에 따른 교차비 사이에 중요한 차이는 본 발명자는 없다는 것을 발견하게 되었다.
표 9 ARM 하위-유형 분석으로부터의 OR 및 AR. 상응하는 p-값(카이-제곱 검정, 10000회 반복을 사용한 모의 p-값)이 0.001 미만일 경우, OR 및 AR 값은 볼드체의 밑줄체로 나타내고, 0.05 미만이 경우에는 볼드체로 나타내었다. SNP.대립형질은 측정된 SNP 및 위험 대립형질(대조군내 소수 대립형질)을 표시한다. RR은 위험 대립형질에 대한 동형접합체를 표시하고, RN은 위험 대립형질에 대한 이형접합체를 표시하며, NN은 정상 대립형질에 대한 동형접합체를 표시한다. 이탤릭체로 표기된 SNPs는 국부적으로 분석된 SNPs이다.
본 발명의, ARM 가계 연관 연구를 통해 수개의 다른 유전자좌 이외에도 일관되게 염색체 1q31 및 염색체 10q26 유전자좌도 동정하였다. 다중 연관 연구는 이러한 발견을 모사함으로써, 혈연이 아닌, 질병을 나타내는 개체 및 대조군도 ARM 가계와 함께 사용하여 관심이 집중된 SNP 분석에 착수하게 되었다. 염색체 1q31 상에서 본 발명자들은 다른 발명자에 의해 보고된([Conley et al.(2005)] 또한 참조할 수 있다) CFH와의 강력한 연합을 확인하게 되었고, 최초로 CFH내 SNPs가 유의적으로 연관 신호에 대한 원인이 된다는 것을 나타내었다. 흥미롭게도, rs1853883은 가장 작은 GIST p-값(O.001)을 갖고, Y402H 변이체와 0.91의 높은 D'를 갖되, 추정의 "질환-연합" Y402H 변이체 그 자체와는 그렇지 않았다. 이는 CFH 유전자내에 다른 가능한 ARM-관련 변이체가 유전히 고려되어야 하고, 이들은 Y402H와 높은 LD에 있을 수 있다는 가능성을 증가시킨다.
염색체 10q26에 대한 본 발명의 연구에서는 2개의 잠재적 유전자좌를 관련시켰는데, 이는 밀착 연결된 3개의 유전자 PLEKHA1, LOC387715, 및 PRSS11을 포함한 매우 강력한 관련성을 갖는 유전자와, 2개의 유전자, GRK5 및 RGS1O를 포함하는, 그보다는 덜 강력한 관련성을 갖는 유전자였다(도 1). GIST 분석을 통해 PRSS11이 ARM-관련 유전자로서는 입증되지 못했지만, 잠재적인 후보 물질로서 그를 완전히 제외시키지는 않았다. PLEHKA1은 가장 낮은 GIST-유도 p-값을 가진 반면, LOC387715는 가장 강력한 연합 신호와 가장 높은 교차비를 갖는 SNP를 포함하였다. LOC387715 및 PLEKHA1내 SNPs 사이의 높은 연관 비평형을 이용하여, 통계학적 분석만으로는 이들 유전자들을 명확하게 구별할 수는 없다. 그러나, PLEKHA1/LOC387715 유전자좌가 ARM에 미치는 효과의 크기는 CFH 유전자좌에 대하여 관찰된 것과 유사하다는 것은 분명하다. Science([Edwards et al, 2005; Haines et al. 2005]; [Klein et al, 2005])에서의 최근 연구와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 환자군-대조군 모집단에서 CFH 대립형질(이형접합성 또는 동형접합성)이 5.3 OR(CI: 3.4-8.4)의 교차비와 68%의 유의적인 모집단 기여 위험도의 원인이 된다는 것을 밝혀냈다. 동일한 방식으로, 이형접합성 및 동형접합성 개체, 양자 모두를 고려할 때, PLEKHA1/LOC387715 유전자좌내 고-위험도의 대립형질이 5.0의 교차비(CI: 3.2-7.9)와 57%의 모집단 기여 위험도의 원인이 되었다. [Klein et al(2005)]에서 논의된 바와 같이, 환자군 대조군 연구로부터 측정된 교차비는 보통, 평행 위험도를 측정하는데 필요한, 등가 상대 위험을 과대 추정할 것이다.
1번 염색체상의 보체 인자 H(CFH)의 경우, CFH가 관련 유전자 부위내 존재할지라도 연합 데이타는 단일 유전자에 대하여 극도로 관심의 대상이었다. 다중의 독립군에 의해 관측된 연합 데이타 이외에도, ARM 환자의 드루젠 침착물내 단백질의 위치화를 비롯한, CFH를 관련시키는 추가의 생물학적 데이타가 존재한다. 따라서, 본 발명자는 또한 염색체 10q26에 대한 본 발명의 연구를 통해 동정된 잠재적인 ARM-감수성 유전자의 생물학적 관련성을 고려하여야 한다.
상기 논의된 바와 같이, GIST 분석은 특히 본 발명자가 유전자형 분석에 추가된, 추가의 비동의 SNPs를 포함할 때, 가장 강력하게 PLEKHA1을 관련시켰다. PLEKHA1(GenBank NM_001001974, NM_021622, NP_001001974 및 NP_067635; MIM 607772; UniGene Hs.287830)은 추정의 포스파티딜이노시톨 3,4,5-삼인산염-결합 모 티프(PPBM: phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-binding motif) 뿐만 아니라, 2개의 플렉스트린 상동성(PH: plectstrin homology) 도메인을 포함하는 404개의 아미노산으로 이루어진 단백질인, TAPP1을 코딩한다. 마지막 3개의 C-말단 아미노산이 MUPP1중 하나 이상의 13 PDZ 도메인(PRSS11내 PDZ 도메인과 유사)과 상호 작용하는 것으로 예측되었다. 드웰러(Dowler)와 동료들은 전장의 TAPP1 단백질 뿐만 아니라, C-말단 PH 도메인이 포스파티딜이노시톨 3,4-비스인산염(PtdIn(3,4)P2)과는 특이적으로 상호 작용하지만, 임의의 다른 포스포이노시티드와는 상호 작용하지 않음을 제시하였다[Dowler et al. 2000 Identification of pleckstrin-homology-domain-containing proteins with novel phosphoinositide-binding specificities. Biochem J 351:19-31.]. TAPP2의 처음 300개의 아미노산과 58%의 일치도를 갖는 TAPP1은 PtdIn(3,4)P2에 대하여 TAPP2보다 5배 높은 친화성을 나타내고, 이러한 결합은 PPBM 부위(이는 두번째 PH 도메인의 일부분이다)내의 보존되는 arg212를 류신으로 돌연변이화시킴으로써 거의 소멸한다. TAPP1(및 그의 관계물, Bam32 및 TAPP2)의 가장 잘 정의된 역할은 림프구의 활성자였다. 지질 인산분해효소(SHIP: lipid phosphatase)가 PI3K(포스파티딜 이노시톨 3-키나제: phosphatidyl inositol 3-kinase)와 함께 활성화될 때, PtdIn(3,4)P2는 우선적으로 세포막으로 동원된다. SHIP는 PIP3이 PtdIn(3,4)P2로 탈인산화하는데 관여하다. SHIP는 림프구 활성화의 음성 조절자이고, 이로써, TAPP1(및 TAPP2)은 분열촉진 신호화, 및 PI3K 신호화 경로의 중요한 음성 조절자일 수 있다. 따라서, ARM은 염증 과정과 연계한다는 가설과 일치하게, 국소 림프구 활성화를 변형시킴으로써 눈에서 PLEKHA1 및 그의 단백질 TAPP1의 역할을 구현시킬 수 있다.
그러나, 본 발명자가 이러한 유전자좌내의 다른 2개의 후보 유전자, LOC387715 및 PRSS11의 생물학적 개연성에 대하여 고려해야할 필요성은 여전히 남아있다. LOC387715(Genbank XM 373477 및 XP 373477; UniGene Hs.120359)의 생물 현상과 관련해서는 거의 알려져 있지 않지만, 단, 예외적으로, 그의 발현은 태반에 한정되는 것으로 나타났다. 인간 망막 RNA를 사용한 본 발명자 스스로의 역전사 실험을 통해 LOC387715 및 PRSS11의 발현을 확인하였지만, 본 발명자들은 태반 RNA를 사용하여 그의 발현을 확인하였음에도(데이타는 나타내지 않음), 표준 조건하의 망막에서는 LOC387715 전사체를 검출하지 못했다. 그러나, 본 발명자들은 LOC387715가 망막 또는 망막 색소 상피에서 매우 낮은 수준으로 발현될 수 있거나, 눈을 제외한 조직, 예로서, 수상돌기 세포 또는 유주 대식세포에서 그의 발현은 ARM 발병기전에 대한 인자가 될 수 있다는 가능성을 제외시킬 수는 없었다.
PRSS11(GenBankNM 002775 및 NP 002766; MIM 602194 및 UniGene Hs.501280)은 포유동물 HtrA(고온 요건 A: high temperature requirement A) 세린 단백질분해효소 계열의 유전자중 하나로서, 고도로 보존되는 C-말단 PDZ 도메인을 갖는다[Oka et al. 2004 HtrAl serine protease inhibits signaling mediated by TGFfbeta family proteins. Development 131:1041-1053]. 고온에서의 생존을 위해 필요한 세균 형태와의 그들의 상동성 및 저온에서의 분자 샤페론 활성 때문에 이들 분비 단백질분해효소는 초기에 동정되었다. ATP-비의존성 세린 단백질분해효소 활성은 고온에서 미스폴딩된 단백질을 분해한다고 판단된다. 포유동물 형태인, HtrA1은 HtrA2와는 대조적으로, III형 콜라겐 알파 1C 프로펩티드에 의해 선택적으로 자극을 받는 것으로 나타났다[Murwantoko et al. 2004 Binding of proteins to the PDZ domain regulates proteolytic activity of HtrAl serine protease. Biochem J 381:895-904]. III형 콜라겐은 브르크 막(Bruch membrane)의 주요 성분(전체 콜라겐중 35-39%)이고, 망막 미세혈관 기저막에도 소량 존재한다. 발생학 연구를 통해 HtrA1이 편재하여 발현되되, 단, 시간 및 공간적 특이성을 갖고 발현되며, 이는 TGF-베타 단백질이 중요한 역할을 하는 부위와 일치한다고 보고되었다[De Luca et al. 2004 Pattern of expression of HtrAl during mouse development. J Histocnem Cytochem 5Z:1609-1617.]. 오카(Oka) 및 동료들은, 아마도 HtrA1 분자의 단백질분해효소 활성에 대한 요건을 사용하여 수용체 활성화를 방해함으로써 HtrA1이 Bmp4, Bmp2 및 TGF-베타1을 비롯한 다수의 TGF-베타 계열 단백질의 신호화를 저해할 수 있다는 것을 제시하였다[Oka et al 2004 HtrAl serine protease inhibits signaling mediated by Tgfbeta family proteins. Development 131:1041-1053.]. ARM에 대한 이러한 관계의 잠재적인 중요성에 관한 단서는 문헌 [Hollbom et al (2004) Contrary effects of cytokines on niRNAs of cell cycle- and ECM-related proteins in hRPE cells in vitro. Curr Eye Res 28:215-223]의 연구로부터 유래한 것으로서, 상기 문헌의 저자는 검정관내에서 TGF-베타1 및 TGF-베타2의 존재하에 인간 RPE 세포의 증식은 감소하고, III형 콜라겐 및 IV형 콜라겐 전사체의 수준은 증가한다는 것을 밝혀냈다. 보통 III형 콜라겐의 증가는 HtrA1을 활성화시켜 TGF-베타1 효과의 2차 저해를 일으킨다. 그러나, 세린 단백질분해효소가 덜 효과적인 경우(합성 감소 또는 비작용성 돌연변이에 기인함), 이 조절 경로는 파괴되어 RPE 세포의 증식능은 전체적으로 감소하게 되며, 이는 아마도 RPE 위축 또는 ARM 발생을 일으킬 수 있는 추가의 변화에 대한 원인이 된다. 노화됨에 따라 관찰되는, 브루크 막내 III형 콜라겐 용해도의 점진적인 감소가 또한 부분적으로는, 개체 연령에 따른 HtrAl 활성의 일반적인 감소의 원인이 된다.
PRSS11 및 PLEKHA1, 양자 모두 망막에서 발현되고, 망막 중심 및 주변 망막의 SAGE 분석(GEO 발현 데이타)은 황반 중심에 보다 고수준의 유전자 2개 모두의 전사체가 존재함을 나타낸다(PRSS11보다 PLEKHA1이 더욱 많다). 다중 연구(GEO 프로파일에서 보고됨)는 PLEKHA1 발현이 특이 염증성 사이토카인에 대한 노출의 반응으로서 다양한 세포 종류에서 현저하게 유도된다는 것을 나타내었다. PRSS11은 또한 정상인과 ARM 환자 사이의 비교에서 산화적으로 손상된 진피 섬유모세포의 마이크로어레이 발현 분석의 요소로서도 조사되었다. 상기 연구에서, ARM 샘플의 ½(9/18)이 임의의 정상 샘플보다 낮은 Htra1 발현을 가졌다. ARM 환자의, 눈을 제외한 조직에서의, 보다 낮은 Htra1 수준은 정상 개체와의 비교에서 이들 환자들의 생물 현상의 고유의 차이이지, 눈의 퇴행성 변화에 따른 결과는 아님을 제안한다.
GRK5/RGS10 유전자좌는 수개의 일련의 증거에 의해 입증된다. 본 발명의 S모두 다중점 곡선의 피크는 직접적으로 GRK5에 대한 것이고, 본 발명의 가장 큰 단일점 S모두 = 3.86(rs555938)는 GRK5의 동원체는 단지 206 kb였다. GRK5/RGS10 CIDR 데이타의 GIST 분석에 대한 p-값은 0.004 및 0.006으로서, 이는 PLEKHA1내의 SNP에 대한 p-값(0.008)보다 훨씬 작은 값이다. 본 발명의 국소적으로 유전자형이 분석된 샘플을 사용하였을 때, GRK5 유전자좌에 대한 GIST p-값은 0.01이었고, 이는 CFH내 의 Y402H 변이체에 대하여 본 발명자가 발견한 p-값(p=0.011)에 상당하는 것이었다. 그러나, CCREL 분석은 GRK5 SNPs에 대항 매우 유의적이지 못했고, 교차비는 대개 비-유의적이었다.
생물학적 증거에 기초하여, GRK5(GenBank NM 005308 및 NP 005299; UniGene Hs.524625; MIM 600870; 및 PharmGKB PAl 80)는, 화학유인물질에 대한 중성구 주화반응 및 그의 톨(Toll) 4 수용체와의 상호 작용을 조절하는 역할을 하고([Haribabu and Snyderman 1993 Identification of additional members of human G-protein-coupled receptor kinase multigene family. Proc Natl Acad Sci U S A 90:9398-9402]; [Fan and Malik 2003 Toll-like receptor-4 (TLR4) signaling augments chemokine-induced neutrophil migration by modulating cell surface expression of chemokine receptors. Nat Med 9:315-321.]), 이것이 또한 ARM과 관련이 있다[Zareparsi et al. 2005b Toll-like receptor 4 variant D299G is associated with susceptibility to age-related macular degeneration. Hum Mol Genet 12:1449-55]고 가정할 때, 적합한 ARM 후보 유전자이다. GRK5의 발현과, 림프구 및 대식 세포를 유주시키는 GRK5의 작용이 ARM을 발병시킬 수 있는 면역/염증 경로에서 그의 역할에 중요하기 때문에 망막 또는 RPE에서 GRK5가 발현되는 것이 인과 관계를 증강시키는 것과 특별한 관련성을 갖는 것은 아니다. 가장 강력한 GIST 결과는 rs2039488에 존재하는데, 이는 실제로는 GRK5와 RGS10 사이의, 양 유전자 말단 에 대하여 3'측에 위치한다. GRK5 유전자내의 여러 다른 SNPs 또한 작은 GIST p-값을 갖지만, RGS1O SNP는 비유의적인 GIST p-값을 갖는다. 그러나, 본 발명자는 rs2039488과 강력한 연관 비평형에 있는, RGS10내 SNP가 존재할 수 있다는 가능성을 완전히 제외시키지는 못했다.
RGS10(GenBank NM 001005339, NM 002925, NP 001005339 및 NP 002916; UniGene Hs.501200; 및 MIM 602856)은 케모카인-유도성의 림프구 유주에 관여하고[Moratz et al. 2004 Regulation of chemokine-induced lymphocyte migration by RGS proteins. Methods Enzymol 389:15-32.], 가지세포에서의 그의 발현(ARM-관련 드루젠 침착물에서 동정된다)은 톨-양 신호 전달 경로에 의해 변경되는[Shi et al. 2004 Toll-like receptor signaling alters the expression of regulator of G protein signaling proteins in dendritic cells: implications for G protein-coupled receptor signaling. J Immunol 172:5175-5184], G 단백질 커플링된 수용체 계열중 하나이다. AMD 및 대조군 대상에서 이루어진 산화적-스트레스성 진피 섬유모세포에 대한 동일 마이크로어레이 연구에서 RGS10 및 GRK5 발현은 샘플간에 최소의 변동을 나타내었지만, 대조군과 질병을 나타내는 환자군 사이에 뚜렷한 차이는 없었다. RGS10- 및/또는 GRK5-관련 단백질이 조절될 것으로 예측되는 세포 모집단에는 진피 섬유모세포가 부족하기 때문에 ARM에 관여하는 이들 유전자에 대한 잠재성을 반드시 감소시키는 것은 아니다.
본 발명자는 1번 염색체상의 CFH와 관련하여 PLEKHA1/LOC387715 및 GRK5/RGS10 유전자좌내 고-위험 대립형질들 사이의 잠재적인 상호 작용에 대하여 조사하고자 하였다. 이는 아마도 이들 상호 작용을 조사하기 위하여 GIST를 사용하였다는 것에 관한 최초 보고이며, 본 발명자는 1번 염색체상의 NPL 데이타가 10번 염색체상의 SNP 데이타에 의해 설명될 수 있다는 증거는 찾지 못했다. 반대로, 10번 염색체상의 NPL 데이타와 CFH 대립형질로부터의 SNP 데이타 사이의 그와 같은 연합도 찾지 못했다. 지수형 회귀 분석을 통해서도 상호 작용은 확인하지 못했고, 단순한 부가 위험 모델이 가장 경제적이라고 나타났다. 본 발명자는 흡연에 대한 노출을 포함하는, 몇몇의 초기 지수형 분석을 실시하였다. 보체 인자 H의 생물 현상과 흡연 사이의 상호 작용이 앞서 제안된 바 있고[Esparza-Gordillo et al. 2004 Genetic and environmental factors influencing the human factor H plasma levels. Immunogenetics 56:77-82.], 본 발명자는 본 발명자의 이전 연구에서 염색체 10q26상의 유전자좌와 흡연 사이의 상호 작용을 발견하였는 바[Weeks et al. 2004], 이러한 분석들을 개시하게 되었다. 현재까지 본 발명자는 흡연이 CFH 또는 PLEKHA1/LOC387715 유전자좌, 어느 것과도 강력한 상호 작용이 있다는 것을 발견하지 못했지만, 본 발명자는 GRK5/RGS10 유전자좌 및 상이한 모델링 전략법을 사용하여 가능한 상호 작용을 계속하여 연구하고 있다. 본 발명자는 또한 1번 염색체 및 10번 염색체상의 SNPs와 ARM 하위-표현형의 연합을 조사하였다(표 9). 본 발명자는 지도형 위축 또는 맥락막 신생혈관막, 어느 것이 존재하든 교차비에는 중요한 차이가 없다는 것을 발견하게 되었고, 이는 ARM 유전자좌가 말기의 질환 형태를 유발할 수 있다는 공통 병적 경로의 원인이 된다는 것을 제안하는 것이다. 비록 기술하지는 않았지만, 따로따로 지도형 위축 또는 CNV 발생에 대한 특이 위험을 부여할 수 있는 다른 유전적 유전자좌가 존재할 수 있다는 가능성은 제외시키지 못했다.
요약컨대, 이러한 SNP-기반 연관 및 연합 연구는 ARM 감수성의 기초가 되는 원인성 대립형질 및 및 유전자를 동정하는 방법의 검정력과 한계를 설명한다. 이들 유전적 접근법을 통해 본 발명자들은, 조직-특이 발현의 존재 여부와는 상관없이 질환의 원인이 될 수 있는 유전자 및 그의 변이체를 고려할 수 있다. 고밀도의 SNP 유전자형 분석을 통해, 본 발명자들은 100여개로부터 주로는 GRK5 및 PLEKHA1까지 염색체 10q26상에서 발견된 연관 피크내의 후보 유전자 목록을 제한하였지만, RGS10 및/또는 PRSS11 및 LOC387715의 가능한 역할을 완전하게 제외시킬 수는 없었다. GRK5 유전자내 비동의 3' SNPs의 추가적인 유전자형 분석을 통해 GRK5와 RGS10을 추가로 차별화하는데 도움을 줄 수는 있지만, 인과 관계를 명확하게 지정할 수는 없다. 다른 연구에 의한 복제(예로서, CFH의 경우)를 통해 단일 유전자에 관심을 둘 수 있지만, 본 발명자는 연합 연구로는 추가의 해결 답안을 얻을 수 없거나, 염색체 10q26상의 ARM 감수성에 원인이 되는 2 초과의 유전자가 존재하는지 여부를 명확하게 확립시킬 수 없을 것이라는 가능성도 뚜렷이 존재한다. 그러나, 분자 생물학자들은 현재 ARM 마우스 모델에서 이들 후보 유전자중 각각의 잠재적인 역할에 대하여 조사하고 있고, 질환 발병기전에서 원인적 역할에 관한 문제를 제기할 수 있다.
실시예
2 -
실시예
1에 이은 추적 조사
본 실시예는, PLEKHA1에서의 대립형질 변이 및 가상의 LOC387715 유전자가 연령-관련 황반병증에 대한 위험 인자로서 동정된 실시예 1의 결론 및 발견을 입증 하고 확인시켜 주는 추가의 데이타를 제공한다.
ARM의 병인은 복잡하고, 환경적인 것 뿐만 아니라 유전적 감수성도 중요한 역할을 한다. 연합-기반 분석이 연관-기반 분석보다 작은 유전적 효과에 대해서는 더욱 민감하고, 질환-관련 유전자를 치밀하게 지도화하기 위해서는 연합-기반 분석이 매우 가치가 있다[Cordell et al(2005) Genetic association studies Lancet. 366, 1121-1131]. 특히 다중유전자좌 유전자 모델이 예기될 때에는 혈연이 아닌 개체들을 사용한 환자군-대조군 연합 연구가 가계-기반 연구보다 유리할 수 있지만([Howson et al. (2005) Comparison of population- and family-based methods for genetic association analysis in the presense of interacting loci. Genet Epidemiol. 29, 51-67]; [Risen et al. (2001) Implications of multilocus inheritance for gene-disease association studies. Theor Popul Biol. 60, 215-220.]), 그러한 연구는 환자군 및 대조군 코호트에 대한 확정 방식에 잠재적으로 민감하다. 이러한 이유에서, 상이한 확정 방식을 사용하여 모집단내 후보 유전자를 평가하는 것이 가치가 있다. 본 실시예에서는 2개의 상이한 코호트에서 보체 인자 H(CFH) 유전자, 매우 긴 장쇄 지방산-양 4의 신장(ELOVL4: elongation of very long chain fatty acid-like 4) 유전자, PLEKHA1 유전자, 및 가상의 LOC387715 유전자를 조사하였다.
ARM 감수성을 갖는 CFH 유전자의 연합은 구미 세대의 샘플([Edwards et al.(2005)], [Haines et al.(2005)], [Klein et al.(2005)], [Hageman et al.(2005)], [Conley et al.(2005)], [Zareparsi et al(2005)]), 영국으로부터의 샘플[Sepp, T. et al (2006) Complement factor H variant Y402H is a major risk detriment for geographic atrophy and choroidal neovascularization in smokers and nonsmokers. Invest Ophthalmol Vis Sd. 47, 536-540], 독일로부터의 샘플[Rivera et al (2005) Hypothetical LOC387715 is a second major susceptibility gene for age-related macular degeneration, contributing independently of complement factor H to disease risk. Hum Mol Genet. 14, 3227-3236], 프랑스로부터의 샘플[Souied et al (2005) Y402H complement factor H polymorphism associated with exudative age-related macular degeneration in the French population. Mol Vis. 11, 1135-1140], 아이슬란드로부터의 샘플[Magnusson et al (2006) CFH Y402H confers similar risk of soft drusen and both forms of advanced AMD. PLoS Med. 3, e5]. 및 일본으로부터의 샘플[Okamoto et al (2006) Complement factor H polymorphisms in Japanese population with age-related macular degeneration. Mo Vis. 12, 156-158]에서 확립시켰다.
3개의 연구가 염색체 10q26상의 PLEKHA1/LOC387715 유전자좌를 입증한다([Rivera et al(2005)], [Jakobsdottir Jr. et al(2005)] 및 [Schmidt et al(2006) Cigarette smoking strongly modifies the association of LOC387715 and age-related macular degeneration Am J Hum Genet. 78, 852-864]). [Jakobsdottir et al. (2005) Susceptibility genes for age-related maculopathy on chromosome 10q26. Am J Hum Genet. 77, 389-407]의 연구에서는 PLEKHA1/LOC387715 유전자좌가 ARM 상태와 유의적으로 연합하고 있지만, 본 연구에 사용된 독립적인 가계-기반 및 환자군-대조군 모집단에서 PLEKHA1과 LOC387715 사이의 강력한 연관 비평형은 하나의 역할을 다른 하나에 대하여 측정할 수 없다는 것을 의미하였다[Jakobsdottir, et al. (2005)]. (Jakobsdottir et al)이 공개한 이래로, 가상의 LOC387715 유전자가 보다 더욱 ARM에 대한 감수성의 원인이 되는 유전자일 수 있다는 증거는 2개의 독립적인 환자군-대조군 샘플을 사용한 (Rivera et al.)의 연구[Rivera et al. (2005)] 및 가계 기반 연구 및 환자군-대조군 연구, 양자 모두를 사용한 (Schmidt et al.)의 연구에서 공개되었다. 3개의 연구 모두가, 염색체 10q26상의 상기 부위와 ARM 상태와의 연합은 앞서 3개 모집단 모두에서 보고된([Haines et al.(2005)], [Conley et al.(2005)], [Rivera et al.(2005)]), CFH와의 연합과는 무관하다는 것을 시사하였다. 추가로, (Schmidt et al.)의 연구에 기초하여 LOC387715 유전자좌의 효과는 흡연 경력에 의해 변형될 수 있는 것으로 나타났다(Schmidt et al.(2006)).
2개의 연구에서는 인간 ARM에서 ELOVL4에 대한 잠재적인 역할에 대하여 평가하였다. 상기 유전자를 평가하고, 그들의 산발성 환자군-대조군 분석에서 ARM 상태와 유의적인 연합은 없다는 것을 발견하게 되었다[Ayyagari et al. (2001) Evaluation of the ELOVL4 gene in patients with age-related macular degeneration. Opthalmic Genet. 22, 233-239]. 그러나, (Conley et al.)이 본 발명자의 가계 및 산발성 환자군-대조군 분석에서 ELOVL4와 ARM 상태에는 유의적인 연합이 있음을 발견하게 되었다[Conley et al.(2005)]. (Conley et al.)에 의해 ELOVL4는 특히 삼출성의 하위-표현형과 관련이 있다고 밝혀진 바, 양 연구에서 발 견이 차이가 나는 것은 각 모집단내 삼출성 ARM을 갖는 환자의 비율과 관련성을 가질 수 있다. 이러한 결과는 ELOVL4와 ARM 사이의 관계를 확립하거나, 그의 잘못을 밝히기 위해서는 추가 연구가 필요함을 시사한다.
본 연구를 위해 사용된 2개의 코호트는, 심혈관 건강 연구(CHS)의, 기준선에서 ARM 상태가 확정에 대한 요인이 아닌 65세 이상의 개체들의 모집단-기반 코호트[Fried et al. (1991) The Cardiovascular Health Study: design and rationale. Ann Epidemiol. 1, 263-276], 및 연령-관련 안과 질환 연구(AREDS)의, ARM 상태가 확정에 대한 요인인, 항-산화제 및 아연 중재의 무작위 조절 임상 시험에 참여한 55세부터 80세까지의 개체의 코호트였다[Age-Related Eye Disease Study Research Group (1999) the Age-Related Eye Disease Study (AREDS): design implications. ARJEDS report no. 1. ControlClin Trials. 20, 573-600]. 이들 코호트는 앞서 기술한 바 있다([Klein, R., et al. (2003) Early age-related maculopathy in the cardiovascular health study. Ophthalmology. 110, 25-33] 및 [Age-Related Eye Disease Study Research Group (2000) Risk factors associated with age-related macular degeneration. A case-control study in the age-related eye disease study: Age-Related Eye Disease Study Report Number 3. Ophthalmology. 107, 2224-2232]).
ARM 상태와 관련하여 매우 상이한 확정 방식을 사용하여 2개의 독립적인 코호트에서 CFH, ELOVL4 , PLEKHA1, 및 LOC387715 유전자를 평가한 후, 본 발견을 메타-분석으로 통합하기 위하여 본 연구를 디자인하였다. 확정 방식과는 상관없이, ARM에 대한 감수성을 갖는 유전자의 연합은 추가로 본 연합이 사실이라는 증거를 증가시킬 것이고, 유전자(들)의 평가가 위험 상태에 있는 개체를 정확하게 확인시켜 줄 수 있다는 가능성을 증진시킬 것이다.
약어: ARM = 연령-관련 황반병증; GA = 지도형 위축; CNV = 맥락막 신생혈관막; OR = 교차비; PAR = 모집단 기여 위험도; OR우성 = 우성 효과에 대한 교차비; OR열성 = 열성 효과에 대한 교차비; OR이종 = 위험 대립형질에 대하여 이형접합체인 대상의 교차비; 및 OR동형 = 위험 대립형질에 대하여 동형접합체인 대상의 교차비
재료 및 방법.
심혈관 건강 연구(
CHS
) 참가자 - 샘플링 및 유전자형 분석
CHS는 본래 65세 이상인 대상에서 심혈관 질환과 관련된 인자들을 동정하기 위하여 디자인된, 모집단-기반의, 종적 연구이다. 망막 평가는 8년간의 추적 조사방문시 실시되었고, 본 코호트의 생존한 일원들은 18년간의 추적 조사 평가를 이제 막 마쳤다. 노스캐롤라이나주의 포시스 컨츄리; 캘리포니아주의 새크라멘토 컨츄리; 메릴랜드주의 워싱턴 컨츄리; 및 펜실베이니아주의 피츠버그에서 지역 사회-기반으로 모집되었다. 보건재정국(Health Care Financing Administration)의 국민 의료 보장 자격 목록을 사용하여 65세 이상의 개체들을 동정하였다. 목록에 있는 일원의 가족중 65세 이상인 개체 또한 자격이 있었다. 포함 기준은 최소이고, 이는 공공 단체로 만들어진 바 없고, 적어도 3년간 상기 지역에 체류할 것으로 기대되며, 사전 동의할 수 있고, 휠체어에 의지하지 않고, 병원 관리를 받지 않고, 암에 대한 방사선 조사 또는 화학요법을 받지 않는 것을 포함한다[Fried et al.(1991)]. CHS로부터의 DNA 샘플을 본 연구에 사용하였다.
CHS 대상은 보통 무작위적으로 선택된 한쪽 눈의 망막을 사진촬영하고, 사진은 이전 공개문헌[Weeks et al. (2004) Age-related maculopathy: a genomewide scan with continued evidence of susceptibility loci within the 1q31, 10q26, and 17q25 regions. Am J Jum Genet. 75, 174-189]에 기술되어 있는 동일한 분류 모델을 사용하여 고린(Gorin) 박사가 등급화하였다. ARM을 갖는 다른 군의 샘플 크기는 논리적인 결과를 위해서는 너무 작기 때문에 오직 백인 개체만이 분석에 포함되었다: 182명의 흑인 대조군, 다른 인종은 단지 3명인 환자군, 및 5명의 대조군이 있었다. 분석을 위해 사용되는 모든 CHS 환자군(n=126)은 "A형"으로서, 이는 임상 분류[Weeks et al.(2004)]에서 본 발명의 가장 엄격한 모델에 속하는 것이다. 본 카테고리에 있는 개체들은 확산성 및/또는 융합성 드루젠, 색소 변화(색소 상피 박리 포함), 및/또는 말기 질환(지도형 위축(GA) 및/또는 맥락막 신생혈관(CNV)막)의 존재에 기초하여 ARM에 대하여 확실히 영향을 받았다. 매우 극소수의 CHS 환자군은 말기의 ARM, GA 또는 CNV를 가졌고(표 10); 따라서, ARM의 특이적인 하위-유형에 대한 분석은 수행하지 않았다. 모든 CHS 대조군(n=1,051)은 AREDS 등급이 1이었다. 소수의 잠재성 대조군(n=22)은 불명확한 GA 또는 CNV 징후를 가졌고, 분석으로부터는 제외시켰다.
표 10 연구 모집단의 특징. AREDS 코호트에서의 평균 연령 및 표현형에 대한 분류는 마지막 기저부 촬영시의 연령에 기초한다. 괄호안의 숫자는 AREDS 등급 방 법에 따를 질환의 중증도를 표시한다. CHS 코호트에서의 평균 연령은 기준선에서의 방문시 연령에 기초하되, 망막 평가는 8년간의 추적 조사 방문으로 수행하였다.
연령-관련 안과 질환 연구(
AREDS
) 참가자 - 샘플링 및 유전자형 분석
본 연구에 포함된, 고용량의 비타민 및 무기물을 보충하는 것의 임상 시험과 함께, ARM의 병력(natural history)과 연령-관련 백내장에 대한 전향 다중센타 연구이다. AREDS 연구에 모집된 개체들은 등록시 55세부터 80세까지 남성 및 여성이었다; 이들 개체들은 장기간의 추적 조사를 방해할 수 있는 어떤 증상도 질환도 없어야 했다. 포함 기준은 최소이고, 기저부 촬영할 수 있을 만큼 안구매체는 투명하여야 하며, 어느 쪽 눈에도 ARM에 대한 증거는 없거나, 한쪽 눈은 ARM을 갖더라도 다른 한쪽의 시력은 좋아야 한다는 것(20/30 이상으로 우수함)을 포함하였다[The Age-Related Eye Disease Study Research Group 1999]. NEI-AREDS 제네틱 리포지토 리(Genetic RepositoryNEI-AREDS Genetic Repository)로부터의 DNA를 본 연구에 사용하였다.
AREDS 연령-관련 황반병증 등급화 시스템을 사용하고, 가장 최근의 추적 조사 방문시에 지정된 표현형에 기초하여 ARM 상태를 지정하였다. 다시, 다른 군의 샘플 크기는 논리적인 결과를 위해서는 너무 작기 때문에 오직 백인 개체만이 분석에 포함되었다: 단지 15명의 흑인, 2명의 히스패닉, 및 3명의 다른 인종. AREDS 환자군(n=701)은 3, 4, 및 5 등급으로 구성되었다. 3등급의 AREDS 대상(n=96)은 ARM은 갖되, 말기 ARM으로 고생하지는 않았고, 4등급의 대상(n=266)은 한쪽 눈에 말기 ARM을 갖고, 5등급의 대상(n=339)은 양쪽 눈 모두에 말기 ARM을 가졌다. AREDS 대조군(n=175)의 AREDS 등급은 1이었다(2등급의 개체는 분석 전에 제외시켰다).
유전자형 분석
ELOVL4에서의 M299V 변이체(rs3812153), CFH에서의 Y402H 변이체(rs1061 170) 및 LOC387715에서의 S69A 변이체(rs10490924)는 RFLP 기법을 사용하여 유전자형을 분석하였다. 각 검정법을 위한 프라이머, 어닐링 온도 및 제한 엔도뉴클레아제는: ELOVL4의 경우, 5'-AGATGCCGATGTTGTTAAAAG-3'(F, 서열 번호: 13), 5'-CATCTGGGTATGGTATTAAC-S'(R, 서열 번호: 14), 5O℃ 및 BspHI; CFH의 경우, 5'-TCTTTTTGTGCAAACCTTTGTTAG-S'(F, 서열 번호: 15), 5'-CCATTGGTAAAACAAGGTGACA-S'(R, 서열 번호: 16), 52℃ 및 NIaIII, LOC387715의 경우, 5'-GCACCTTTGTCACCACATTA-S '(F, 서열 번호: 17), 5'-GCCTGATCATCTGCATTTCT-S'(R, 서열 번호: 18), 54℃ 및 PvuII였다.
PLEKHA1에서의 A320T 변이체(rs1045216)는 5' 엑소뉴클레아제 어쎄이-온-디맨 택맨 검정법(Applied Biosystems Incorporated)을 사용하여 유전자형을 분석하였다. ABI7000 및 SDS 2.0 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하여 증폭시키고 유전자형을 할당하였다. 본 연구에서 수행된 모든 유전자형 분석을 위해, 각 변이체에 대하여 이중-차폐된 유전자형을 할당하고, 비교하고, 원 데이타 또는 재-유전자형 분석을 사용하여 각각의 차폐된 불일치점을 지정하였다.
연합 분석
SNP-질환 연합은 대립형질- 및 유전자형 카이-제곱 검정을 사용하여 측정하고, P-값은 100,000회 반복하여 모의하였다; 하나 이상의 예측되는 세포 갯수가 5개 미만인 환자군에서는 피셔의 정확 검정(Fisher's exact test)를 사용하였다. 연합 강도는 조 교차비(OR) 및 모집단 기여 위험도(PAR)에 의해 추정하였다. 하기 일반식을 사용하여 PAR을 계산하였다: PAR = Pr(OR-1)/(1+Pr(OR-1))(여기에서, P1은 일반 모집단내의 위험 효소의 유병율이다). Pr의 추정은 CHS 대조군으로부터 유도되었다; ARM 질환 상태에 기초하여 CHS 대상을 선택하지 않았고, 대조군의 수(n=1,051)는 크기 때문에 이는 이치에 맞는 것이다. 비교 목적으로, 연력 및 성별에 대하여 조절된 교차비(OR조절)를 추정하였다. 지수형 회귀 모델을 사용하여 R(38)을 이용함으로써 조 교차비 및 조절된 교차비, 양자 모두를 계산하였다. 대조군에서 빈도가 보다 낮은 대립형질은 위험 대립형질로서 간주하였고, OR 및 OR조절은 위험 대립형질에 대한 동형접합체 대상(RR)과 기준군(정상 대립형질에 대한 동형접 합체 대상[NN])을 비교하고, 위험 대립형질에 대한 이형접합체 대상(RN)과 기준군을 비교하여 계산하였다. 우성(RR 및 RN 대 NN) 및 열성(RR 대 RN 및 NN) 효과에 대한 대조도 평가하였다.
PLEKHA1 및 LOC387715 사이의 구별
본 발명자는 2개의 유전자, PLEKHA1중 A320T, 또는 LOC387715중 S69A중 어느 하나가 10q26 부위에서 실제 질환 소인성 변이체인지를 동정하기 위하여 일배체형 방법[Valdes, A.M. and Thomson, G. (1997) Detecting disease-predisposing variants: the haplotype method. Am J Hum Genet. 60, 703-716]을 사용하였다. 일배체형 방법의 기본 원리는 간단하고 명쾌하다(수학적 증명을 위해서는 [Valdes and Thomson(1997)]를 참조할 수 있다). 모든 소인성 변이체가 일배체형상에 포함되어 있는 경우, 실제 빈도는 상이할 수 있지만, 중립 변이는 환자군 및 대조군에서 동일한 비율로 특정 질환-소인성 일배체형상에 존재할 것으로 예측된다. 한편, 소인성 변이체 모두가 동정되지 않았다면 비-소인성 변이체의 일배체형 빈도 비율은 동일하다고는 예측되지 않는다.
변이체 하나는 ARM-소인성이고, 다른 하나는 중립 변이체라고 가정할 경우, A320T-S69A 일배체형에 대한 예측비는 하기와 같이 공식화된다. 본 발명자는 A320T 및 S69A, 모두가 염색체 10q26상의 PLEKHA1 - LOC387715 일배체형 블록에서 ARM-소인성 변이체라고 가정하였다. 가능한 A320T-S69A 일배체형 4개가 존재한다: G-G, A-G, G-T, 및 A-T. A320T가 원인적 유전자좌이고, S69A가 중립 유전자좌일 경우에, 본 발명자는
S69A가 원인적 유전자좌이고, A320T가 중립 유전자좌일 경우에는
로 예측된다
(여기에서, f는 대조군 또는 환자군에서의 특정 일배체형의 빈도를 표시한다)
관심의 대상이 되는 가설은:
HOp: PLEKHA1에서의 A329T 변이체가 PLEKHA1 - LOC387715 일배체형 블록의 ARM 소인의 원인이 된다.
H0: LOC387715에서의 S69A 변이체가 PLEKHA1 - LOC387715 일배체형 블록의 ARM 소인의 원인이 된다.
이러한 가설중 어느 것을 기각한다는 것은 검정된 변이체가 단지 PLEKHA1 -LOC387715 일배체형 블록만의 ARM 소인의 원인이 되기에는 충분히 않다는 것을 의미한다.
4개, 2x2의 분할표를 식 (1a), (1b), (2a), 및 (2b)로부터 유도할 수 있다:
HOp하에, 본 발명자는 분할표 (1a) 및 (1b)에서 동질성을 예측하고, HO하에, 본 발명자는 분할표 (2c) 및 (2c)에서 동질성을 예측하였다. 정칙 카이-제곱 통계치를 각 분할표로부터 계산하여 조합 통계치를 얻었다. HOp의 경우, 통계치는 식 (1a) 및 (1b)로부터의 최대 카이-제곱값이고, HO의 경우, 통계치는 식 (2a) 및 (2b)로부터의 최대 카이-제곱값이다.
그러나, 각 분할표 세트로부터 유도된 통계치는 의존적이기 때문에 조합 통계치의 분포는 분명한 것이 아니다. 독립성의 부족은 (1) 소인성 유전자좌의 다양한 대립형질에 상응하는 측정치를 조합하였는 것과 (2) 소인성 및 비-소인성 유전자좌 사이의 연관 비평형 때문이다. (1) 변이체는 1 초과의 대립형질을 갖고, (2) 변이체가 완전 연관 평형에 있을 때에는 그들의 독립적인 연합 신호를 서로 구별할 필요가 없기 때문에 상기 2개의 조건, 양자 모두는 당연한 것이다.
데이타가 의존적이기 때문에 소인성 유전자좌의 대립형질에 대하여 조건부로 순열 검정이 수행되어야 한다(귀무가설하에). 본 발명자는 소인성 유전자좌에서의 대립형질에 따라 일배체형(한사람당 2회)을 분류하기 시작하였다. 이어서, 각 군내 에서 환자군-대조군 표지를 순열로 배치하고 조합 통계치를 각 복제쌍에 대하여 계산하였다. 순열 방법은 (Li H.(2001))의 [A permutation procedure for the haplotype method for identification of disease-predisposing variants. Ann Hum Genet. 65:189-196)]에 제안되어 있는 방법과 유사하다. 단계적 유전자형 데이타는 이용불가능하였고, 일배체형은 비단계적 유전자형으로부터 귀속되어야 했다. 일배체형 빈도는 대조군과 환자군에서 따로따로 추정되었다. 프로그램 SNPHAP(39)를 사용하여 각 대상에서의 일배체형 빈도 및 단계적 일배체형을 추정하였다. 주어진 비단계적 유전자형 데이타하에서 일배체형 빈도의 최대 우도 추정치를 계산하기 위하여 SNPHAP는 EM 알고리즘을 사용한다. 개개의 일배체형 할당에 대한 경험적 확률은 A320T 및 S69A, 양자 모두에서 분석된 모든 개체에 대한 94%를 초과한다. 추정된 일배체형 빈도는 표 11에 제공한다.
표 11 PLEKHA1중 A320T의 빈도 및 LOC387715중 S69A의 일배체형 빈도(프로그램 SNPHAP를 사용하여 추정됨). AREDS 및 CHS 코호트, 양자 모두로부터 유도된 추정치를 제공한다.
상호 작용 분석
상호 작용 분석은 3부로 구성되었다: 먼저, 본 발명자는 CHS 및 AREDS 샘플 양자 모두에서 CFH중의 Y402H와 LOC387715중의 S69A의 유전적 효과의 상호 작용에 대하여 검정한 후, 본 발명자는 CHS 및 AREDS 샘플 양자 모두에서 Y402H 및 S69A, 양자 모두와 흡연 경력의 상호 작용에 대하여 검정하고, 마지막으로 3개의 위험 인자의 공동 ORs를 계산하였다.
본 발명자는 (North et al.)의 [North, B.V., Curtis, D. and Sham, P.C. (2005) Application of logistic regression to case-control association studies involving two causative loci. Hum Hered. 59, 79-87]에서 제안된 모델링 전략법을 따랐다. CFH 및 LOC387715의 공동 효과를 가장 잘 설명하는 모델을 찾아내기 위하여 일련의 지수형 회귀 모델을 AREDS 및 CHS 데이타 세트에 적합화시켰다. 각 유전자형에 대하여, 부가 효과를 허용하는 모델(ADD1, ADD2 및 ADD-BOTH), 및 우성 효과를 통합시키는 모델(DOM1, D0M2 및 DOM-BOTH)를 적합화시켰다. ADD1 모델은 Y402H에서 유전자형 TT에 대하여 -1로, 유전자형 CT에 대하여 0으로, 유전자형 CC에 대하여 1로 코딩되는, 유일한 항 x1만을 포함한다. ADD2는 S69A에서 유전자형 GG에 대하여 -1로, 유전자형 GT에 대하여 0으로, 유전자형 TT에 대하여 1로 코딩되는, LOC387715의 부가적인 효과에 대한 유일한 모델 항 x2만을 포함한다. ADD-BOTH는 CFH 및 LOC387715의 공동 부가 효과를 모델링한다. DOM1은 ADD1에 우성 효과를 통합시키고, Y402H에서 유전자형 CT에 대하여 0.5로, 유전자형 TT 및 CC에 대하여 -0.5로 코딩되는, X1 및 Z1을 포함한다. D0M2는 유사하게 ADD2에 우성 효과를 통합 시키고, S69A에서 유전자형 GT에 대하여 0.5로, 유전자형 GG 및 TT에 대하여 -0.5로 코딩되는, X2 및 Z2를 포함한다. DOM-BOTH는 CFH 및 LOC387715의 공동 우성 효과를 모델링한다. CFH 및 LOC387715 사이의 상호 작용을 모델링하는, 3개의 추가적인 모델을 적합화시켰다: ADD-INT는 곱 항 x1*x2를 포함하고, ADD-DOM은 x1*x2, x1*z2, 및 z1*x2를 포함하고, OM-INT는 x1*x2, x1*z2, z1*x2, 및 z1*z2를 포함한다.
상기 모델링 전략법을 변형시켜 CFH 및 흡연의 공동 효과, 및 LOC387715 및 흡연의 공동 효과를 조사하였다. 변형된 접근법은 LOC387715와 흡연의 상호 작용을 검정하기 위한 것으로서, [Schmidt et al.(2006)]에서 사용된 것과 동일한 것이다. 코딩 방식은 상기와 동일하되, 단 흡연의 경우, 한번도 흡연하지 않은 비흡연자는 0으로, 평생 흡연자는 1로 코딩하였다. CFH 및 흡연의 효과에 대하여 적합화된 모델은 ADD1 , SMOKE, ADD1-SMOKE, DOM1, ADD1-SMOICE-INT, 및 DOM1-SMOICE-INT이고, LOC387715 및 흡연의 효과에 대하여 적합화된 모델은 ADD2, SMOICE, ADD2-SMOICE, D0M2, ADD2-SMOICE-INT, 및 D0M2-SM0KE-INT였다.
모든 모델을 아카이케의 정보량 기준(AIC)데 의해 비교하였다. AIC가 < 2까지 차이가 나는 모델은 구별할 수 없는 것으로 간주하고[North, B.V., Curtis, D. and Sham, P.C. (2005) Application of logistic regression to case-control association studies involving two causative loci. Hum Hered. 59, 79-87], 가장 경제적인 모델로서 변수가 보다 적은 모델이 선택되었다. 연령과 성별을 조절해도 Y2402H 또는 S69A의 ORs 추정치 어느 것에도 영향을 주지 않았기 때문에(표 12 및 13), 변수의 갯수를 가능한 작게 유지시키기 위하여 상호 작용을 모델링할 때 이들 공변량을 조절하지 않았다. 상기 상호 작용 분석에 대한 결과에 기초하여 공동 ORs를 계산하였다.
표 12 추정된 조 ORs, 상응하는 95% CIs, 및 PARs(연령 및 성별에 대하여 조절된 것이 아니다)
표 13 추정된 조 ORs, 상응하는 95% CIs, 및 PARs(연령 및 성별에 대하여 조절된 것이 아니다.
APOE
분석
이전 연구에서는 ARM에서 아포지방단백 E(APOE: apolipoprotein E) 유전자의 가능한 보호 및 유해 효과를 보고한 바 있다. ε4 대립형질은 보호 효과를 가질 수 있는 반면([Klaver, CC, et al. (1998) Genetic association of apolipoprotein E with age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 63, 200-206]; [Schmidt, S., et al. (2000) Association of the apolipoprotein E gene with age-related macular degeneration: possible effect modification by family history, age, and gender. MoI Vis. 6, 287-293]; [Schmidt, S., et al. (2002) A pooled case-control study of the apolipoprotein E (APOE) gene in age- related maculopathy. Ophthalmic Genet. 23, 209-223]; [Baird, P.N., et al. (2004) The e[rho]silon2 and epsilon4 alleles of the apolipoprotein gene are associated with age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 1311-1315] 및 [Zareparsi, S., et al (2004) Association of apolipoprotein E alleles with susceptibility to age-related macular degeneration in a large cohort from a single center. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 1306-1310]), 빈도가 가장 작은 대립형질인 ε2는 ARM의 위험도를 증가시킬 수 있다([Klaver, CC, et al.(1998)] 및 [Zareparsi, S., et al.(2004)]). APOE 변이체는 CHS에 의해 유전자형이 분석되었고, 본 연구에서는 ARM과 그의 연합을 평가하였다. APOE 유전자형에 의해 개체를 APOE-ε3/ε3 유전자형, 및 APOE-ε2 및 APOE-z4 보유자를 갖는 개체(각각 APOE-ε2/* 및 APOE-ε4/*로 표시)로 분류하고; APOE-ε2/ε4 유전자형을 갖 는 개체는 APOE-ε2/* 군 및 APOE-ε4/* 군, 양자 모두에 포함되었다. 카이-제곱 검정을 사용하여 대조군 및 환자군에서의 APOE-ε3/ε3 및 APOE-ε2/*, 및 APOE-ε3/ε3 및 APOE-ε4/* 유전자형 분포의 차이에 대하여 검정하였다.
메타
-분석
본 발명자는 앞서 공개된 CHS 및 LOC387715에 대한 보고 및 본원에 제시한 2개의 보고로부터 추정된 OR을 병합시키기 위하여 본 발명자는 메타-분석 접근법에 착수하였다. 연구간의 변동은 우연 때문이라는 가정하에 먼저 데이타를 분석하고, 고정-효과 모델을 사용하였다. 고정-효과 모델하에서, 병합 OR의 최대 우도 추정량은 개개 추정치의 평균으로서, 분산의 역으로 가중치가 주어진 것이며, 병합 OR의 분산은 개개 가중치의 합의 역수에 의해 추정된다. R로 동질성하의 메타-분석을 실시하였다[RDevelopmentCoreTeam(2005) R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria]. 동질성에 대한 가정은 카이-제곱 검정을 통해 체크하였다. 그러나, 동질성 검정법은 검정력이 낮은 경향이 있기 때문에, 비교를 위해 본 발명자는 또한 무작위 효과 세팅으로 OR을 병합하였다. SAS Proc Mixed(SAS 소프트웨어 배포 8.2 [미국 노스캐롤라이나주 게리에 소재하는 SAS Institute Inc.])로 이행된 바와 같이, 제한적 최대 우도(REML: restricted maximum likelihood) 방법을 사용하여 이질성하의 메타-분석을 실시하였다. 병합 REML 추정량은 DerSimonian-Laird 추정량과 일치한다([DerSimonian, R. and Laird, N. (1986) Meta-analysis in clinical trials. Control Clin Trials. 7, 177-188] 및 [van Houwelingen, H.C., Arends, L.R. and Stijnen, T. (2002) Advanced methods in meta-analysis: multivariate approach and meta-regression. Stat Med. 21 , 589-624]). [van Houwelingen et al. 2002]의 SAS 코드를 변형시켜 이질성하의 분석을 실시하였다.
11개의 연구에서 CFH내 Y402H 변이체가 ARM과 강력하게 연합되어 있다는 것이 밝혀졌다([Edwards, A.O., et al. (2005) Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration. Science. 308, 421-424]; [Haines, J.L.,et al. (2005) Complement factor H variant increases the risk of age- related macular degeneration. Science. 308, 419-421]; [Klein, RJ., et al. (2005) Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389]; [Hageman, G.S., et al. (2005) A common haplotype in the complement regulatory gene factor H (HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A]; [Conley, Y.P., et al. (2005) Candicate gene analysis suggests a role for fatty acid biosynthesis and regulation of the complement system in the etiology of age-related maculopathy. Hum Mol Genet. 14, 1991-2002]; [Zareparsi, S., et al. (2005) Strong association of the Y402H variant in complement factor H at 1q32 with susceptibility to age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 77, 149-153]; [Sepp, T., et al. (2006) Complement factor H variant Y402H is a major risk determinant for geographic atrophy and choroidal neovascularization in smokers and nonsmokers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 536-540]; [Rivera, A., et al. (2005) Hypothetical LOC387715 is a second major susceptibility gene for age-related macular degeneration, contributing independently of complement factor H to disease risk. Hum Mol Genet. 14, 3227-3236]; [Souied, E.H., et al. (2005) Y402H complement factor H polymorphism associated with exudative age-related macular degeneration in the French population. MoI Vis. 11, 1135-1140]; [Magnusson, K.P., etal (2006) CFH Y402H confers similar risk of soft drusen and both forms of advanced AMD. PLoS Med. 3, e5] 및 [Jakobsdottir, J., et al. (2005) Susceptibility genes for age-related maculopathy on chromosome 10q26. Am J Hum Genet. 77, 389-407)]); 상기 11개의 연구중 2개는 본 발명자의 것이며, 모든 대조를 평가하는, 본 발명자의 [Jakobsdottir et al. (2005)]의 논문으로부터의 결과만을 메타-분석에 사용하였다. [Klein et al. (2005) Study]에서는 AREDS 샘플의 작은 아집단을 사용하였고, [Magnusson et al. (2006)] 논문에서는 단지 ORs 및 유전자형이 계수되지 않는 것에 기초하여 대립형질을 보고하였다. 따라서, 이들 2개의 연구는 포함하지 않았다. [Haines et al. (2005) Study]로부터의 결과는 이형접합체 및 동형접합체에 대한 ORs의 병합 추정치에 포함되어 있었고; 우성 및 열성 효과에 대한 대조를 평가하기 위해서는 유전자형 계수를 사용할 수 없었다. 3개의 연구는 가상의 LOC387715내의 고도로 연합된 변이체, S69A를 보고하였다(Rivera, A. et al. (2005)]; [Jakobsdottir, et al. (2005)]; [Schmidt et al. (2006) and Schmidt (2006) Cigarette smoking strongly modifies the association of LOC387715 and age- related macular degeneration. Am J Hum Genet, in press]). LOC387715에 대한 보고 3개 모두가 메타-분석에 포함되었다. CFH 및 LOC387715의 모든 연구에 참가한 연구 참가자들은 구미 세대의 히스패닉계가 아닌 백인이었다. 표 14 및 15에는 CFH 및 LOC387715의 메타-분석에 포함된 연구가 각각 요약되어 있다.
표 14 CFH내 Y402H의 메타-분석에 포함된 연구들의 특징
표 15 LOC387715내 S69A의 메타-분석에 포함된 연구들의 특징
결과
ARM에서 CFH, ELOVL4, PLEKHA1, 및 LOC387715를 추가로 평가하기 위하여 본 발명자들은 AREDS 및 CHS 연구로부터의 샘플중 4개의 모든 유전자내 앞서 보고된 SNPs에 대하여 유전자형을 분석하였다. REDS 연구로부터의, 총 701명의 히스패닉계 가 아닌 백인 ARM 환자 및 175명의 대조군과, CHS 연구로부터의 총 126명의 히스패닉계가 아닌 백인 ARM 환자 및 1051명의 대조군(샘플 크기와 데이타의 다른 특징들에 대해서는 표 10을 참조하고, 유전자형 빈도에 대해서는 표 16을 참조할 수 있다)을 사용하여 각 데이타 세트상에서 별도의 분석을 실시하였다. 그의 마지막 추적 조사 방문시 대상의 질환 상태가 AREDS 대상에 대하여 평가되는 1차 평가변수였다. AREDS 대상은 1등급의 대조군 및 한쪽 눈 또는 양쪽 눈 모두에 중등도의 ARM 및 진행성 ARM을 갖는 환자군(3-5등급)을 포함하였다. 일관성을 위해 1명의 전문가가 8년간의 추적 조사 방문시 촬영한, 산동제를 사용하지 않은 외눈의 기저부 사진을 사용하여 CHS 대상의 ARM 질환 상태를 평가하였다. CHS 환자군중 대부분은 색소 상피의 변화 및 미변화와 함께 다수의 드루젠을 포함하는 중등도의 ARM(AREDS 등급은 3등급인 것에 상당한다)을 가졌고, 소수의 환자군은 지도형 위축(GA) 또는 맥락막 신생혈관막(CNV)을 가졌으며, CHS 대조군은 AREDS 등급이 1등급이었고, 상당한 황반외 드루젠을 갖는 환자는 제외시켰다.
표 16 AREDS 및 CHS 코호트에서 ARM 상태에 의한 유전자형 분포. 비교를 위해, 국제 단일형 지도맵(International HapMap) 과제의 CEU 모집단(북유럽 및 서유럽으로부터 유래된 조상을 갖고, 유타에 거주)으로부터 유도된 추정치를 나타낸다. AREDS 환자군은 3-5등급이고, AREDS 대조군은 1등급이었다. 각 등급 및 표 17의 하위-표현형에 의해 유전자형 계수를 사용할 수 있다. 단일형 지도맵 CEU 모집단에 대한 설명을 본원에서 제공한다.
표 17 ARM 상태에 의한 AREDS 및 CHS 코호트에서의 유전자형 분포
연합 분석
각각의 유전자, CFH, ELOVL4, PLEKHA1, 및 LOC387715에 대하여, ARM과의 연합을 카이-제곱 통계치에 의해 평가하였다. 각 유전자의 효과 크기는 교차비(ORs) 및 모집단 기여 위험도(PARs)에 의해 추정하였다. 유전자가 조기 ARM 및 진행성 ARM에 유사하게 부여하는지 여부를 평가하기 위하여, AREDS 데이타를 사용하여 각 등급 및 하위-유형(GA 및 CNV)에 대하여 따로따로 ORs를 계산하였다.
CFH: AREDS 및 CHS 코호트 양자 모두에서 CFH내 Y402H 변이체와 ARM의 연합 은 유의적이었고(P < 0.00001), 이는 본 발명자[Conley et al.(2005) 및 Jakobsdottir et al.(2005)]와 그외 사람들([Edwards et al(2005)]; [Haines et al.(2006)]; [Klein et al(2005)] 및 [Rivera et al(2005)])에 의한 초기의 발견을 확인시켜 주었다. CFH내 Y402H 변이체에 대한 추정된 ORs는 변이체가 모든 단계의 ARM과 진행성 ARM의 양 형태, GA 및 CNV에 유사한 위험을 제공한다(도 7 및 표 12).
표 18 대립형질- 및 유전자형 연합 검정 결과. P-값 < 0.05일 때, 볼드체로 나타낸다. a 피셔의 정확 검정으로부터의 양측(2-sided) P-값. b ARM 환자군은 양쪽 눈 모두에 GA를 가졌다.
대립형질-분량에 따른 효과는 존재하는 것으로 나타났으며, 2개의 C 대립형질을 갖는 보유자가 하나의 C 대립형질을 갖는 보유자보다 더욱 높은 ARM의 위험를 가졌다(표 12 및 도 8). 2개의 C 대립형질을 갖는 보유자에서 위험도가 증가하였음 에도 불구하고, 모집단 기여 위험도(PAR)는 2개의 위험 유전자형이 유사하였는데,이는 일반 모집단에서의 CC 유전자형과 비교되는 CT 유전자형의 빈도가 상대적으로 높기 때문이다. CHS 데이타 세트로부터 유도된 PAR 추정치는 CT 및 CC 유전자형이 히스패닉계가 아닌 백인 모집단에서 각각 27% 및 25%의 ARM의 원인을 설명한다는 것을 시사한다. ELOVL4: ELOVL4내 M299V 변이체는 AREDS 샘플에서 삼출성 ARM과 유의적인 연합을 나타내고(P = 0.034)(표 18), 이는 본 발명자의 이전 발견[Conley, Y.P., et al.(2005)]과 일치하는 것이다. 그러나, 어떤 ORs도 95% 유의 수준에서는 통계학적으로 유의적이지 않다(도 7 및 9 및 표 12). 이러한 결과는 ARM에서 ELOVL4의 잠재적인 역할을 제외시키지는 않았지만, 그를 강력하게 입증하지는 못했다. 삼출성 ARM을 갖는 소수의 개체는 CHS 코호트에서의 하위-표현형 분석에 참작되지 못했다.
PLEKHA1 및 LOC387715: AREDS 및 CHS 데이타 세트, 양자 모두에서 LOC387715내 S69A 변이체와 ARM의 모든 발현과의 연합은 극도로 유의적이었고(P < 0.00001), 이는 본 발명자([Conley, Y.P., et al.(2005)] 및 [Jakobsdottir, J., et al.(2005)])와 그외 사람들([Edwards, A.O., et al(2005)]; [Haines, J.L., et al.(2005)]; [Klein, RJ., et al.(2005)]; [Rivera, A., et al.(2005)] 및 [Schmidt, S., et al.(2006)])에 의한 초기의 발견을 확인시켜 주었다. LOC387715와 동일한 일배체형 블록상에 위치하는 PLEKHA1내 A320T 변이체는 AREDS 샘플에서는 고도로 유의적이었지만(P = 0.00004), CHS 샘플에서는 단지 경계선상의 유의성(P = 0.08)을 나타내었다. A320T 및 S69A 사이의 연관 비평형도는 ARED(D' = 0.66) 및 CH(D' = 0.65) 대조군, 양자 모두에서 통계학적으로 유의적이었다. PLEKHA1 또는 LOC387715중 어떤 유전자가 진정 ARM-소인성 변이체를 수반할 가능성이 더욱 높은지를 확인하기 위하여, 본 발명자는 일배체형 방법[Valdes, A.M. and Thomson, G. (1997) Detecting disease-predisposing variants: the haplotype method. Am J Hum Genet. 60, 703-716]을 적용시켰다. 일배체형 방법에 따라 중립 변이체에서의 대립형질의 상대빈도는 모든 소인성 변이체를 함유하는 일배체형에 대하여 환자군과 대조군에서 동일하다고 예측되었다. 본 방법의 적용에 기초한 결과는 PLEKHA1내 A320T를 제외한, LOC387715내 S69A가 ARM-소인성 변이체임을 시사한다(본원의 "PLEKHA1 및 LOC387715 사이의 구별"을 참조할 수 있다). 추가로, 귀무가설의 순열 검정에 의해: H0: LOC387715에서의 S69A 변이체가 PLEKHA1 - LOC387715 일배체형 블록의 ARM 소인의 원인이 된다는 것을 채택한 반면(AREDS 데이타에서 P = 0.92, CHS 데이타에서 P = 0.45), A320T에 대한 유사한 가설은 기각되었다(AREDS 데이타에서 P < 0.0001, CHS 데이타에서 P = 0.0002).
LOC387715내 S69A 변이체는 CFH내 Y402H와 상이한 위험도 패턴을 나타낸다. 질환의 중증도가 분화되어 있는 AREDS 데이타에서 변이체는 경미한 ARM의 위험도보다 실질적으로 더욱 많이 중증 ARM의 위험도를 증가시키는 것으로 나타났다(도 7 및 10 [도 11은 PLEKHA1에 대한 완전한 결과를 제공한다] 및 표 12). 예를 들면, 1개 또는 2개의 T 대립형질을 보유하는, 3등급의 AREDS 환자군의 OR은 3.07(95% CI 1.82-5.17)인 반면, 1개 또는 2개의 T 대립형질을 보유하고, 양쪽 눈 모두에 CNV를 갖는, AREDS 환자군의 OR은 7.21(95% CI 4.24-12.27)이었다. CFH와 유사하게, S69A는 GT 및 TT 유전자형의 모집단 기여 위험도에 있어 극적인 차이없이 대립형질-분량 효과를 나타내었다(표 12 및 도 10). 단지 4개의 AREDS 대조군이 S69A에서 TT 동형접합성인 바, 정칙 지수형 회귀로부터 유도된, 열성 및 동형접합체에 대한 점 추정치 및 신뢰 구간을 비교하여 정확 회귀로부터 추정하였다(SAS 소프트웨어 배포 8.2 [미국 노스캐롤라이나주 게리에 소재하는 SAS Institute Inc.]로 적합화된 모델). 이러한 품질 체크를 통해 점 추정치(이는 PAR 추정치의 기초가 된다) 및 신뢰 하한(이는 ORs와의 비교에 기초가 된다)에는 큰 차이가 없었지만, 신뢰 상한은보다 높다는 것이 밝혀졌다(결과를 나타내지 않음).
상호 작용 분석
CFH 및 LOC387715, CFH 및 흡연, 및 LOC387715 및 흡연의 공동 기여에 대한 모델을 구축하기 위하여 본 발명자는 지수형 회귀 모델링을 사용하였다. 가장 가능성이 있고 경제적인 모델(들)에 대하여 단정하기 위하여 일련의 모델을 적합화시켰다. [North et al.(2005)]에 기재되어 있는 바와 같이, 아카이케의 정보량 기준을 사용하여 모델을 비교하였다. 가장 경제적인 모델을 확인하였을 때, 본 발명자는 위험 인자의 공동 ORs를 추정하였다. 각 코호트로부터 별도의 추정치를 계산하였다. AREDS 샘플 크기를 최대화하기 위하여, 하위 표현형 또는 하위 등급에 대한 어떤 분석도 실시하지 않았다; 3-5등급의 AREDS 환자군을 1등급의 AREDS 대조군과 비교하였다.
이전 논문 [Jakobsdottir (2005)]에서 본 발명자는 CFH 및 PLEKHA1 / LOC387715 유전자좌의 상호 작용 효과에 대한 어떤 증거도 발견하지 못했고; 2개의 유전자좌의 공동 작용은 독립적인 증배 효과(로그-규모에 대한 부가 효과)에 의해 최상으로 설명된다. [Rivera et al.(2005)]에서 LOC387715내 S69A가 CFH내 Y402H와는 독립적으로 작용한다는 것을 보고하였다. [Schmidt et al.(2006a)]에서는 또한 동일의, 가장 경제적인 모델을 얻었고, 본원에서 다시, 상기 모델은 AREDS 및 CHS 데이타 세트, 양자 모두에서 가장 경제적인 것이다(표 19). Y402H 및 S69A에서의 위험 유전자형의 조합에 대한 공동 ORs를 전산 처리함으로써 2개의 유전자좌의 공동 작용을 추가로 이해하였다(표 20). 중증도와는 상관없이 환자군 모두를 사용할 때, AREDS 데이타는 유전자좌중 하나가 위험 대립형질에 대하여 이형접합성이고, 다른 하나에서는 비-위험 대립형질에 대하여 동형접합성이 개체가 유전자 2개 모두에서 비-위험 대립형질을 갖는 개체보다 ARM에 대하여 더욱 감수성이라는 것을 시사한다(CT-GG 공동 유전자형의 경우, OR 2.8, 95% CI 1.6-5.0; TT-GT 공동 유전자형의 경우, OR 3.2, 95% CI 1.7-6.0). 유전자 2개 모두에서 이형접합성일 경우 ARM의 위험도는 2개로 높았고(CT-GT 공동 유전자형의 경우, OR 7.2, 95% CI 3.8-13.5), 유전자좌중 적어도 하나가 위험 대립형질에 대하여 동형접합성일 경우 위험도는 추가로 증가된다. CHS 데이타로부터 추정된 공동 ORs는 유사한 패턴을 나타내지만, 오직 위험 대립형질만을 갖는 경우에는 위험도를 증가시키기에는 충분치 않았다(CT-GG 공동 유전자형의 경우, OR 1.3, 95% CI 0.6-2.7; TT-GT 공동 유전자형의 경우, OR 1.2, 95% CI 0.5-2.8).
표 19 지수형 회귀에 의한 2-인자 모델을 적합화한 결과. 모델 정의에 대한 상세한 설명은 "물질 및 방법-상호 작용 분석" 섹션에 기재되어 있다. AIC 차이는 최고로 적합한 모델의 AIC와의 차이이다. 가장 경제적인 모델은 볼드체로 나타내었다. 최고로 적합한 모델(AIC가 가장 작은 것)은 AIC 차는 0이었다.
표 20 CFH내 Y402H 및 LOC387715내 S69A에서의 공동 ORs 및 95% CIs
최근 연구[Schmidt et al.(2006a)]는 2원적 규모(평생 흡연자 대 한번도 흡연하지 않은 비흡연자) 및 연속적인 규모(총 흡연량)로 S69A의 유전자형과 흡연 사이의 강력한 통계학적 상호 작용을 보고하였다. 본 발명자는 AREDS 및 CHS 데이타 세트, 양자 모두에서 상기 발견을 복제하는데 실패하였다(표 19). AREDS 샘플로부터의 결과를 통해, Y402H와 흡연의 공동 효과는, 유의적인 우성 효과 또는 상호 작용의 효과없이, 독립적인 증배 효과에 의해 최상으로 설명된다. 한편, CHS 데이타 를 최상으로 설명하는 모델은 Y402H의 부가적인 효과만을 포함한다. AREDS 데이타로부터의 결과는 S69A와 흡연의 공동 효과는, 유의적인 우성 효과 또는 상호 작용의 효과없이, 독립적인 증배 효과에 의해 최상으로 설명된다는 것을 시사한다. CHS 데이타는 오직 S69A만을 갖는 모델을 관련시켰다. 흡연 노출이 연속 변수이고(총 흡연량), S69A 유전자형은 부가 방식으로 코딩될 때, 상호 작용 개념은 CHS 데이타에서 유의적이지 않다(P=O.40). AREDS 연구에서는 참가자의 총 흡연량을 이용할 수 없었다. 유전자와 흡연의 조합 효과를 추가로 이해하기 위하여 각 유전자에서의 위험 유전자형과 흡연의 공동 ORs를 AREDS 데이타로부터 추정하였다(표 21). 위험 유전자형(Y402H 및 S69A에서)중 어느 것에 기인하는 ARM의 위험도는 흡연자에서 상승하지만, 2개의 유전자 모두는 흡연보다도 실질적으로 더욱 많이 ARM 위험도에 영향을 준다. 모델 적합화 접근법 및 단순 카이-제곱 검정(P=O.71), 양자 모두는 흡연의 주요 효과는 CHS 데이타에서 무의미함을 나타낸다(2원 규모).
표 21 CFH내 Y402H와 흡연, 및 LOC387715내 S69A와 흡연에 대한 공동 ORs 및 95% CIs
APOE 결과: ARM에서 APOE 유전자의 주요 효과를 CHS 데이타를 사용하여 검정하였다. APOE-ε3/3과 비교할 때, 환자군과 대조군 사이에는 APOE-ε4 보유자(P=0.41) 및 APOE-ε2 보유자(P=0.42)의 분포는 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
메타
-분석
CFH 의 메타 -분석: 11개의 독립적인 데이타 세트(본원에 기록된 CHS 및 AREDS 코호트 포함)로부터 Y402H에 대하여 추정된 ORs를 병합하기 위하여 메타-분석 접근법을 사용하였다(표 14). 유럽 또는 구미 세대 모두에서, 451명의 환자와 3,540명의 대조군을 분석하였다. 그 결과, 히스패닉계가 아닌 백인 모집단에서의 C 대립형질에 기인하여 ARM 위험도가 증가하였음을 확인하였다(도 12 및 표 22). 병합 추정치는 개별 연구에서보다 좁은 CI와, 이형접합성- 및 동형접합성 ORs에 대하여 중복되지 않는 CI를 가졌다: 본 연구에 있어 동질성을 가정할 때, OR이형=2.43(95% CI 2.17-2.72)이고, OR동형 = 6.22(95% CI 5.38-7.19)이다. 이질성하에서 분석을 실시할 때, 점 추정치는 본질적으로 동일하고, CIs는 약간 보다 넓다. 고정 효과 모델하에서 리브-원-아웃(Leave-one-out) 민감도 분석에서는 어떤 연구도 병합 추정치에 극정 영향을 주지 못하였음을 나타낸다(표 22).
[Rivera et al.(2005)]의 연구는 임의의 다른 연구보다 더 많이 추정치에 변화를 주었다; 본 연구를 제외시킬 경우, OR우성 및 OR이형은 대략 0.2까지 저하된 반 면, OR열성 및 OR동형은 대략 0.2 상승하였다. [Rivera et al.(2005)]의 연구는 대조군중의 유전자형 분포가 HWE로부터 이탈하는(P = 0.03), 유일한 연구였다. 환자군 및 대조군에서 대립형질 및 유전자형 분포는 연구 전체에 있어 상당히 유사하였다. 그러나, CHS 환자군에서의 유전자형 분포는 다른 연구에서와 상이하였고, TT 위험 유전자형의 빈도는 다른 코호트와의 비교시 더욱 낮았다(도 13).
표 22 CFH내 Y402H의 메타-분석 결과. 개별적인 연구 및 모든 연구의 병합으로부터 추정된 OR(95% CIs). 리브-원-아웃 민감도 분석 결과를 나타낸다.
LOC387715의 메타-분석: ARM에서 S69A와 연합된 위험도의 메타-분석은 5개의 독립적인 데이타 세트를 포함하였다(본원에 기록된 CHS 및 AREDS 코호트 포함(도 14 및 표 15)). 유럽 또는 구미 세대 모두에서, 3,193명의 환자와 2,405명의 대조군을 분석하였다. LOC387715 연구는 CFH 연구에서보다 더욱 이질성이었다; 연구 전체에서 OR우성 및 OR이형은 유의적으로 상이하였다(각각 P < 0.01 및 0.02). 본 결과는 T 대립형질과 ARM 위험도 증가와의 연합에 대한 조기 발현을 입증한다(표 23). 2개의 T 대립형질을 갖는 보유자가 하나의 T 대립형질을 갖는 보유자보다 더욱 높은 위험도를 갖고 있다; 연구간의 변동을 설명할 때, OR이형 및 OR동형은 각각 2.48(95% CI 1.67-3.70) 및 7.33(95% CI 4.33-12.42)이었다. 유전자형 분포는 모든 대조군 모집단과, 모든 ARM 모집단에 있어 유사하되, 단, CHS ARM 모집단은 제외된다(도 15).
표 23 LOC387715내 S69A의 메타-분석 결과. 개별적인 연구 및 모든 연구의 병합으로부터 추정된 OR(95% CIs). 리브-원-아웃 민감도 분석 결과를 나타낸다.
실시예 1의 발견 이후, CFH 및 PLEKHA1/LOC387715 유전자와 ARM 사이의 연합에 대한 주요 발견들이 공개되었다. 다수의 보고를 통해 CFH내 Y402H 코딩 변화와 ARM 사이에 강력한 연합이 있음이 확립되었고, 3개의 보고를 통해서는 LOC387715내 S69A 코딩 변화와 ARM 사이의 연합이 밝혀졌으며, 이는 Y402H의 연합과 크기가 유사하였다. 이들 유전자, 양자 모두는 1q31상의 CFH, 및 10q26상의 LOC387715로 염색체내 부위에 존재하는데, 이는 가계-기반 연관 연구에서 확인된 것과 일치하였다([Seddon, J.M., et al.(2003)]; [Majewski, J., et al.(2003)]; [Iyengar, S.K., et al.(2004)]; [Weeks, D.E., et al. (2001) Age-related maculopathy: an expanded genome-wide scan with evidence of susceptibility loci within the 1q31 and 17q25 regions. Am J Ophthalmol.132, 682-692]; [Weeks, D.E., et al.(2004)]; [Klein, M.L., et al.(1998)]; 및 [Kenealy, S. J., et al.(2004)]).
Y402H에 대한 다수의 연구 및 S69A에 대한 3개의 연구 모두는 ARM의 복합적인 병인에 관여하는 유전자를 탐색하기 위해(및 찾아내기 위해) 특별히 디자인되었기 때문에, Y402H 및 S69A에서의 위험 대립형질의 효과 크기를 과대 추정할 수 있다. 그러므로, 2개의 독리적인 환자군-대조군 코호트는 ARM 상태, AREDS 및 CHS 코호트에 기초하여 최소의 포함 및 제외 기준을 사용하여 분석되었다. AREDS 코호트에는 안과 질환 상태에 기초한 기준을 비롯한 건강-관련 포함 및 제외 기준이 없었지만; 질병을 나타내는 개체 및 질병을 나타내지 않는 개체, 양자 모두 등록하였다[Age-Related Eye Disease Study Research Group (1999) The Age-Related Eye Disease Study (AREDS): design implications. AREDS report no. 1. Control Clin Trials. 20, 573-600]. CHS 코호트는 최소의 포함 및 제외 기준으로 65세 이상의 개체들을 지역 사회-기반으로 모집한 모집단-기반 코호트이다(Fried et al.(1991)). 8년간의 추적 조사 방문 동안 망막 평가를 수행하였고, 망막 질환이 모집에 대한 인자는 아니였다. 2개의 연구에서 대상 확정에 차이가 있다고 가정할 때, 코호트 둘 모두에서 후보 유전자의 연합 복제가 ARM 발병기전에서 그의 원인적인 관여에 관한 확증을 더욱더 강화시켜 준다.
본 발명자는 4개의 유전자, CFH(1q31), ELOVL4(6q14), PLEKAH1(10q26), 및 LOC387715(10q26)의 연합을 평가하였다. CFH/LOC387715 둘 모두 AREDS 및 CHS 코호트, 양자 모두에서 ARM과 극도로 유의적이게(P < 0.00001) 연합하고 있었다. 유전 자 둘 모두 ARM 위험도에 대하여 대립형질-분량 효과를 나타내고, 두 유전자의 독립적인 증배 기여에 관한 모델은 AREDS 및 CHS 코호트, 양자 모두에서 가장 경제적이었다. 10q26상의 LOC387715에 인접하고, 그와 연관 비평형에 있는, PLEKHA1 유전자에서의 A320T 코딩 변화는 AREDS 코호트에서는 ARM과 유의적으로 연합하지만(P=0.00004), CHS 코호트에서는 그렇지 않았다(P=0.08). AREDS 및 CHS 코호트, 양자 모두에 일배체형 방법을 적용시킨 것에 기초한 이들 결과는, 조건부 일배체형 분석을 사용하여, 최초로 망막에서 LOC387715의 약한 발현을 검출한 [Rivera et al.(2005)]의 발견과, PLEKHA1에서 오직 약한 연합 신호만을 검출하고, LOC387715내 S69A가 10q26상의 주된 ARM-소인성 변이체임을 강력하게 제안하는 [Schmidt et al.(2006)]의 발견을 조합하였다. 일배체형 방법의 결과에서 PLEKHA1은 ARM-소인의 원인이 되기에는 충분치 않을 수 있지만; PLEKHA1내 A320T은 S69A 및 다른 미상 변이체와 함께 원인적 일배체형으로서 제외될 수는 없었다.
상이한 확정 방식을 갖는 2개의 코호트인 AREDS 및 CHS 코호트에서 ARM과 CFH 및 LOC387715 유전자의 연합에 대하여 계속적으로 복제함으로써 그들이 ARM에 관여한다는 강력한 확증을 제공하였다. 그러나, AREDS 및 CHS 코호트에서 PLEKHA1에 대한 다양한 발견들은 두 코호트간의 차이와 관련하여 고려될 필요는 없다. 환자군 및 대조군 모집단의 확장에서의 차이 이외에도, 망막 변화에 대한 평가, 망막 발견에 대한 문서화, 및 진행성 ARM의 유병율도 두 코호트간에 차이가 있었다. CHS 연구에서, 기저부 촬영은 무작위적으로 선택된 한쪽 눈에 대하여 사용만이 가능하였고, 동공을 확장시키기 않고 촬영을 실시하였으며, 조기 망막 변화 검출에 영향 을 줄 수 있는 가능성은 더욱 클지라도, 이러한 제한이 질환 병증을 검출하기 위한 민감성에 영향을 줄 수 있다는 것은 확실하다. 8년간의 추적 평가에서 평가받은 전체 CHS 코호트중 진행성 ARM의 비율은, ARED에서의 대략적인 17%와 비교할 때(Age-Related Eye Disease Study Research Group(2000)), 대략 1.3%였고[Klein, R., Klein, B.E., Marino, E.K., Kuller, L.H., Furberg, C, Burke, G.L. and Hubbard, L.D. (2003) Early age-related maculopathy in the cardiovascular health study. Ophthalmology. 110, 25-33], 두 코호트간의 진행성 ARM의 비율의 변동은 발견상의 변동을 이끌 수 있고, 특히, 유전자가 질환의 진행에 영향을 줄 수 있는 가능성이 더욱 클 경우에 그러하다. 추가로, 두 코호트간의 중요한 차이는 망막 평가 시간이다. AREDS 참가자들은 기준선 뿐만 아니라 추적 조사 평가 동안에 망막 평가를 받았는데, CHS 참가자들은 등록 후 8년째, 그들이 적어도 73세가 되는 시점에 망막 평가를 받았다. CHS 참가자에 대한 망막 평가는 이러한 특정 유형의 연구에 사용될 수 있는 모집단을 편재시킬 수 있다. 또한, 비타민 및 무기물 보충물이 ARM 진행에 미치는 효과를 평가하기 위하여 비타민 및 무기물 보충물을 사용하여 AREDS 코호트에서 질병을 나타내지 않는 군과는 상이한 카테고리에 있는 대상을 임상 시험으로 무작위하였다. 이 효과는 명확하지 않았다.
앞서 언급한 바와 같이, ARM의 유전적 병인을 조사한 대부분의 연구들은 ARM 및 ARM 후보 유전자 검정을 위해 감수성 유전자를 포함하는 게놈 부위 확인을 최적화하기 위하여 디자인되었다. 기염 위험도를 추정하는 후향 연구를 사용하는 것은 과대 추정하게 할 수 있다. CFH내 Y402H 변이체에 대하여 공개된 기여 위험도 범위 는 43% 내지 68%이고([Edwards et al.(2005)]; [Haines et al.(2005)]; [Jakobsdottir(2005)]; 및 [Schmidt et al.(2006)]), LOC387715내 S69A 변이체의 경우는 36% 내지 57%였다([Jakobsdottir(2005)] 및 [Schmidt et al.(2006)]). 흥미롭게도, CHS 모집단에 대하여 조절된 모집단 기여 위험도(PARs)는 앞서 공개된 것보다 낮았는데; CFH내 Y402H 변이체의 경우 38%였고, LOC387715내 S69A 변이체의 경우 25%였다(표 13). CHS 환자군 대다수는 중등의 ARM을 갖기 때문에, CHS 데이타로부터 유도된 PAR 추정치는 진행성 ARM을 갖는 환자의 비율가 더 높은 이전 연구로부터의 추정치와는 완전히 유사한 것은 아니었다. 그러나, 3등급의 AREDS 환자군을 사용한 것으로부터 유도된 추정치와는 유사하였다. 이들 추정치는 앞서 공개된 PARs 범위내에 있었다: CFH내 Y402H의 경우 49% 및 LOC387715내 S69AH의 경우 46%. 이러한 발견은, CHS 코호트가 ARM 상태에 기초하여 확정된 것이 아니라는 가정하에서는 2개의 감수성 변이체가 원인이 되는 ARM의 위험도가 이전의 생각보다 낮을 수 있다는 것을 제시할 수 있다. 후향 환자군-대조군 디자인으로부터 추정되는 ORs, 및 상응하는 PARs에 의해 추정되는 상대 위험도를 보다 정확하게 추정하기 위해서는 전향 디자인이 필요하다.
본 발명자는 전체 ARM과 ELOVL4의 연합을 복제할 수 없었다[Conley et al.(2005)]. 삼출성 ARM을 갖는 개체의 수를 통해 본 발명자는 CHS 코호트가 아닌, AREDS 코호트에서 하위 표현형을 분석할 수 있었다. 본 발명자의 이전 발견은 삼출성 ARM에서의 ELOVL4에 대한 역할을 제시하는 바, 하위 표현형은 특히, ELOVL4와 관련하여 특히 중요하고; AREDS 코호트에서 (약하게) 입증된다. 두 코호트중 ARM 감수성에서 ELOVL4에 대한 유의적인 ORs와 강력한 연합이 결여되어 있고, [Ayyagari et al.]에 보고된 바와 같은 연합도 결여되어 있다고 가정할 때, ELOVL4가 ARM 감수성에 실질적인 역할을 할 가능성은 거의 없다. 전체 ARM에 대한 0.6의 OR을 검출하는 검출력이 적당한데, I형의 오류율은 5%이고, 최소 대립형질 빈도는 0.15이며, 모집단 유병율은 6%일 때, AREDS에서 검출력은 ~81%이고, CHS에서는 ~69%였다. 삼출성 ARM에서 동일한 효과를 검출하는 검출력은 동일 조건하의 AREDS 데이타에서는 단지 ~53%였다. 따라서, ELOVL4가 전체 ARM에서 역할을 할 수 있다는 가능성은 없지만, 삼출성 ARM에서의 경미한 효과에 대해서는 반박될 수는 없다. QUANTO[Gauderman, WJ. and Morrison, J.M. (2006) QUANTO 1.1: A computer program for power and sample size calculations for genetic-epidemiology studies, http://hydra.usc. edu / gxe]를 사용하여 이러한 검출력을 추정하였다.
AREDS 및 CHS 데이타는 ARM 감수성에 대한 CFH내 Y402H 및 LOC387715내 S69A의 독립적인 기여를 입증한다. AEEDS 및 CHS 코호트 평가에 기초할 때 상기 두 변이체에 대한 증배 위험 모델이 가장 경제적이다; 이 모델은 또한 본 발명자들의 이전 논문 [Jakobsdottir et al(2005)] 뿐만 아니라, ([Rivera et al(2005)] 및 [Schmidt et al(2006a)])에 의해 제시된 데이타에 의해서도 입증된다. ARM 위험도는 Y402H 및 S69A가 증가함에 따라 위험 대립형질의 총수고 증가하는 것으로 나타났다(표 20).
CFH 및 LOC387715의 발견에 앞서, 흡연이 보다 중요한 공지 ARM-관련 위험 인자들중 하나였다. 흡연은 일반적으로 ARM에 대하여 변경이 가능한 위험 인자로 용인되고; (van Leeuwen et al.)은 ARM의 역학에 대한 고찰을 제공하고, 흡연이 ARM 위험 인자라는 확증에 대하여 논의하였다[van Leeuwen, R., Klaver, CC, Vingerling, J.R., Hofhian, A. and de Jong, P.T. (2003) Epidemiology of age-related maculopathy: a review. Eur J Epidemiol. 18, 845-854]. 최근 [Schmidt et al.(2006)]에서 ARM에서 LOC387715와 흡연 사이의 통계학적으로 유의적인 상호 작용이 보고되었다. 그의 데이타는 LOC387715와 ARM과의 연합은 주로 애연가에서의 유전자 효과에 의해 발생하였다고 제안하였다. 상호 작용에 대한 본 발명자 스스로의 분석에서는 상기 발견을 입증하지 못했고, AREDS 데이타는 S69A 및 흡연의 공동 작용이 증배라는 것을 제안하였다.
ARM 감수성에서 CFH 및 LOC387715에 대한 역할은 추가로 본 발명자의 메타-분석 결과를 통해 입증된다. 상기 논문에서 보고된, CHS 및 AREDS 코호트를 포함하는 메타-분석은 CFH 또는 LOC387715에 위험 대립형질에 대한 1개 또는 2개의 카피를 갖는 것이 ARM의 위험도를 증가시키며, 2개의 카피를 갖는 대상의 위험도가 더욱 높다는 것을 시사한다. 모든 연구로부터의 조합된 결과 뿐만 아니라, 각각의 독립적인 연구로부터의 결과는 매우 치밀하였다(도 12 및 14). 공지된 메타-분석의 한계는 공개 편견(publication bias)에 대한 감수성이다. 일반적으로, 그러한 편견은 공개되지 않은 음성적 발견에 따른 결과이다[Normand, S.L. (1999) Meta-analysis: formulating, evaluating, combining, and reporting. Stat Med. 18, 321-359]. CFH 및 LOC387715의 환자군에서, 모든 공개된 연구에서는 히스티딘을 코딩하는 대립형질인 CFH에 대한 위험 대립형질과, 세린을 코딩하는 대립형질인 LOC387715에 대한 위험 대립형질과 같은 동일한 방향으로 ARM과 강력하게 연합함을 보고하였다.유의적인 연합이 오류-양성 결과일 경우, 통계학적으로 유의적인 연합의 우선적 공개는 무작위적 방향성을 나타낼 것으로 예측되었다[Lohmueller, K.E., Pearce, C.L., Pike, M., Lander, E.S. and Hirschhorn, J.N. (2003) Meta-analysis of genetic association studies supports a contribution of common variants to susceptibility to common disease. Nat Genet. 33, 177-182]. 따라서, ARM와 CFH 및 LOC387715의 연합이 일관되는 것은 공개 편견의 결과일 가능성은 없다.
본 발명의 통계학적 분석 결과는 LOC387715이 10q26상의 주요 ARM-관련 유전자라는 것과 일치하지만, 인과성을 입증하지는 못했다. ARM 발병기전에서 CFH의 가능한 원인적인 역할은 추가로 ARM 환자의 드루젠 침착물내 그의 단백질의 위치화, 및 보체 경로의 활성화에 관여하는 것에 의해 입증되었다. LOC387715와 관련하여 현재는 상기 유전자의 생물성에 대하여 거의 공지되어 있지 않고, 그의 단백질이 ARM 감수성에 어떻게 영향을 줄 수 있는지에 대한 것도 공지되어 있지 않다. 최근까지, LOC387715의 발현은 태반으로 제한되는 것으로 나타났지만, 최근에는 망막에서 약하게 발현된다고 보고되었고[Rivera et al.(2005)], 이는 유전자의 조직-특이 역할에 대한 가능성을 개시하는 것이다.
요약하면, 대상이 확정된 방법과는 상관없이 두 유전자 모두가 고도로 연합되어 있다는 가정하에서, 본 실시예에서 제시된 결과들은 ARM의 병인에 있어서의 CFH 및 LOC387715, 양자 모두의 역할을 계속적으로 입증하고 있다. AREDS 및 CHS 코호트에서 PLEKHA1 및 ELOVL4를 평가함으로써 이들 유전자는 ARM 감수성에서 중요한 역할을 할 가능성의 거의 없다는 것을 증명하였다. CFH 및 LOC387715 유전자는 ARM 발병기전에서 증배 방식으로 독립적으로 작용하는 것으로 나타났고, 어느 유전자좌에서든 위험 대립형질에 대하여 동형접합성인 개체가 가장 높은 위험도를 갖고 있다.
상기에서 본 발명을 기술한 바와 같이, 본 발명의 범주 또는 그의 임의의 실시태양에는 영향을 주지 않으면서, 광범위하고 등가인 범위의 조건, 포뮬레이션, 및 다른 변수내에서 동일하게 실시될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> University of Pittsburgh - of the Commonwealth System of
Higher Education
Gorin, Michael B
Johanna, Jakobsdottir
Yvette, Conley P.
Daniel, Weeks E
Tammy, Mah-Fraser S
Robert, Ferrell E
<120> SUSCEPTIBILITY GENES FOR AGE-RELATED MACULOPATHY (ARM) ON
CHROMOSOME 10q26
<130> 0002.0001
<150> 60/688,572
<151> 2005-06-08
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Forward PCR primer for rs11538141
<400> 1
cagagtcgcc atgcagatcc 20
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gcacctttgt caccacatta 20
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<223> Forward PCR primer for LOC387715
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Met Leu Arg Leu Tyr Pro Gly Pro Met Val Thr Glu Ala Glu Gly Lys
1 5 10 15
Gly Gly Pro Glu Met Ala Ser Leu Ser Ser Ser Val Val Pro Val Ser
20 25 30
Phe Ile Ser Thr Leu Arg Glu Ser Val Leu Asp Pro Gly Val Gly Gly
35 40 45
Glu Gly Ala Ser Asp Lys Gln Arg Ser Lys Leu Ser Leu Ser His Ser
50 55 60
Met Ile Pro Ala Ala Lys Ile His Thr Glu Leu Cys Leu Pro Ala Phe
65 70 75 80
Phe Ser Pro Ala Gly Thr Gln Arg Arg Phe Gln Gln Pro Gln His His
85 90 95
Leu Thr Leu Ser Ile Ile His Thr Ala Ala Arg
100 105
<210> 20
<211> 808
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
gagatggcag ctggcttggc aaggggacag cacctttgtc accacattat gtccctgtac 60
cctacatgct gcgcctatac ccaggaccga tggtaactga ggcggagggg aaaggagggc 120
ctgagatggc aagtctgtcc tcctcggtgg ttcctgtgtc cttcatttcc actctgcgag 180
agtctgtgct ggaccctgga gttggtggag aaggagccag tgacaagcag aggagcaaac 240
tgtctttatc acactccatg atcccagctg ctaaaatcca cactgagctc tgcttaccag 300
ccttcttctc tcctgctgga acccagagga ggttccagca gcctcagcac cacctgacac 360
tgtctatcat ccacactgca gcaaggtgat tctgccaaaa catatctcct taaaagccaa 420
ctggagcttc tcatcagcat caatgtgaag ccaaaaatcc ttaggaggac agagggagtc 480
cctcacaacc tagactggtc cccttccctc cagctgcctc aactgtccac aggactctct 540
tcccacctgc ggccacactg tgcaacctgg aatttcccca cctgggcgga ctcatcacgt 600
catcaccaat tggatgcatc ttctgctctg tgcagctggt gaaatctttc tcaacccttg 660
agatgcagcc caatcttctc ctaacatctg gattcctctc tgtcactgca ttccctcctg 720
tcatcctgcc tttgttttct tgccctcctt tctctcccgg gtgataggca ttaactaaaa 780
ttaaataaaa attcagatca tccttgca 808
Claims (33)
- 연령 관련 황반병증(Age-Related Maculopathy; ARM) 발병 감수성을 스크리닝하는 방법으로서, 대상으로부터 얻은 샘플 중에서 ARM 위험과 관련된 염색체 10(Chromosome 10) 상의 일배체형(haplotype)의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함하며, 위험 일배체형은 한쪽 또는 양쪽 대립유전자에서 서열 번호 20(rs10490924)의 염기 270에서 티민을 포함하고, 비위험 일배체형은 양쪽 대립유전자에서 서열 번호 20(rs10490924)의 염기 270에서 구아닌을 포함하는 것인 방법.
- 인간 대상으로부터 얻은 샘플 중에서 연령 관련 황반병증(Age-Related Maculopathy; ARM)과 관련된 다형태(polymorphism)를 검출하는 방법으로서, 서열 번호 20(rs10490924)의 염기 270에서의 티민 또는 구아닌의 존재를 확인하는 단계를 포함하며, 한쪽 또는 양쪽 대립유전자에서의 티민의 존재는 ARM 발병 위험 증가를 나타내고, 양쪽 대립유전자에서의 구아닌의 존재는 ARM 발병 위험 감소를 나타내는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, ARM이 중증 ARM인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 확인 단계는 대상으로부터 얻은 샘플에서 샘플 중의 PLEKHA1, PRSS11 및 LOC387715 중 하나 이상에서의 대립유전자 변이를 조사하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 20(rs10490924)의 염기 270에서 티민 또는 구아닌 염기를 검출하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, rs4146894로서 동정된 단일 염기 다형태(single nucleotide polymorphism)의 염기를 검출하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, rs1045216으로서 동정된 단일 염기 다형태의 염기를 검출하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, rs1882907로서 동정된 단일 염기 다형태의 염기를 검출하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, rs760336으로서 동정된 단일 염기 다형태의 염기를 검출하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, rs763720으로서 동정된 단일 염기 다형태의 염기를 검출하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, LOC387715에서의 대립유전자 변이를 조사하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 다형태가 비기능성 유전자 산물 및 유전자 산물의 발현 변경 중 하나를 생성하는 돌연변이의 결과인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 다형태가 프레임쉬프트 돌연변이, 프로모터 돌연변이 및 스플라이싱 돌연변이 중 하나 이상의 결과인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, ARM 발병의 위험 증가 또는 위험 감소를 나타내는 보체 인자 H(Complement Factor H)의 다형태를 샘플 중에서 확인하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, rs800292로서 동정된 단일 염기 다형태에 상응하는 보체 인자 H의 다형태를 샘플 중에서 검출하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, rs1853883으로서 동정된 단일 염기 다형태에 상응하는 보체 인자 H의 다형태를 샘플 중에서 검출하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, rs1061170으로서 동정된 단일 염기 다형태에 상응하는 보체 인자 H의 다형태를 샘플 중에서 검출하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산 증폭 검정법을 포함하는 방법을 이용하여 다형태를 검출하는 것을 포함하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 핵산 증폭 검정법이 PCR, 역전사 효소 PCR(RT-PCR), 등온 증폭, 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 5' 형광 뉴클레아제 검정법, 분자 비콘 검정법 및 회전환 증폭법(rolling circle amplification) 중 하나를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 어레이(array)를 사용하여 다형태를 검출하는 것을 포함하는 방법.
- 제20항에 있어서, 어레이가 대상으로부터 얻은 샘플 중에서 rs4146894, rs1045216, rs4405249, rs1882907, rs10490923, rs760336, rs763720 및 rs1803403으로서 동정된 단일 염기 다형태 중 하나 이상에 상응하는 대립유전자 변이의 발생을 동정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 대상이 ARM의 초기 증상을 갖는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 대상이 ARM의 하나 이상의 증상을 가지고, 한쪽 또는 양쪽 대립유전자에서의 티민의 존재는 말기 ARM의 발병 위험 증가를 나타내고, 양쪽 대립유전자에서의 구아닌의 존재는 말기 ARM의 발병 위험 감소를 나타내는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 대상이 ARM의 하나 이상의 증상을 가지고, 한쪽 또는 양쪽 대립유전자에서의 티민의 존재는 지도형 위축(geographic atrophy) 및 맥락막 신생혈관막(choroidal neovascular membrane) 중 하나 또는 둘 다의 발병 위험 증가를 나타내고, 양쪽 대립유전자에서의 구아닌의 존재는 지도형 위축 및 맥락막 신생혈관막 중 하나 또는 둘 다의 발병 위험 감소를 나타내는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 한쪽 또는 양쪽 대립유전자에서의 티민의 존재는 말기 ARM의 발병 위험 증가를 나타내고, 양쪽 대립유전자에서의 구아닌의 존재는 말기 ARM의 발병 위험 감소를 나타내는 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 한쪽 또는 양쪽 대립유전자에서의 티민의 존재는 지도형 위축 및 맥락막 신생혈관막 중 하나 또는 둘 다의 발병 위험 증가를 나타내고, 양쪽 대립유전자에서의 구아닌의 존재는 지도형 위축 및 맥락막 신생혈관막 중 하나 또는 둘 다의 발병 위험 감소를 나타내는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 19의 69번 위치의 Ala 또는 Ser을 검출함으로써 다형태를 확인하며, 여기서 서열 번호 19의 69번 위치의 Ser은 ARM의 발병 위험 증가를 나타내고, 서열 번호 19의 69번 위치의 Ala은 ARM의 발병 위험 감소를 나타내는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 대상에서 ARM의 중증도를 구별하기 위해서 대상으로부터 얻은 샘플로부터의 서열 번호 20(rs10490924)의 염기 270에서 티민 또는 구아닌의 존재를 검출하는 것을 포함하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, 샘플 중에서 PLEKHA1, PRSS11 및 LOC387715 중 하나 이상에서 대립유전자 변이를 조사하는 단계를 더 포함하는 방법.
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