JP2008545438A - 染色体10q26上の加齢性黄斑変性症(ARM)に対する感受性遺伝子 - Google Patents
染色体10q26上の加齢性黄斑変性症(ARM)に対する感受性遺伝子 Download PDFInfo
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Abstract
Description
加齢性黄斑変性症(Age-Related Maculopathy)(age-related macular degenerationとしても知られている)は、高齢者個体群における中枢性失明(central blindness)の主要な原因であり、そして多数の研究が、この複雑な症状に対する強力な原因となる遺伝子成分が存在することを示唆している。多人数の家系、罹患同胞ペア(affected sib pairs)、およびより最近では不一致同胞ペア(discordant sib pairs)を使用したゲノム規模での連鎖スキャニングにより、多数の潜在的な感受性遺伝子座が特定された(Klein et al. 1998 Age-related macular degeneration. Clinical features in a large family and linkage to Chromosome 1q. Archives of Ophthalmology 116:1082-1088;Weeks et al. 2000 A full genome scan for age-related maculopathy. Human Molecular Genetics 9:1329-1349;Majewski et al. 2003 Age-related macular degeneration--a genome scan in extended families. Am J Hum Genet 73:540-550;Schick et al. 2003 A whole-genome screen of a quantitative trait of age-related maculopathy in sibships from the Beaver Dam Eye Study. Am J Hum Genet 72:1412-1424;Seddon et al. 2003 A genomewide scan for age-related macular degeneration provides evidence for linkage to several chromosomal regions. Am J Hum Genet 73:780-790;Abecasis et al. 2004 - Age-related macular degeneration: a high-resolution genome scan for susceptibility Loci in a population enriched for late-stage disease. Am J Hum Genet 74:482-494;Iyengar et al. 2004 Dissection of genomewide-scan data in extended families reveals a major locus and oligogenic susceptibility for age-related macular degeneration. Am J Hum Genet 74:20-39;Kenealy et al. 2004 Linkage analysis for age-related macular degeneration supports a gene on Chromosome 10q26. Mol Vis 10:57-61;Schmidt et al. 2004 Ordered subset linkage analysis supports a susceptibility locus for age-related macular degeneration on Chromosome 16p12. BMC Genet 5:18;Weeks et al. 2004 Age-related maculopathy: a genomewide scan with continued evidence of susceptibility loci within the 1q31, 10q26, and 17q25 regions. Am J Hum Genet 75:174-189;Santangelo et al. 2005 A Discordant Sib-Pair Linkage Analysis of Age-Related Macular Degeneration. Ophthalmic Genetics 26:61-68)。ゲノム規模での連鎖スクリーニングは、加齢性黄斑変性症(age-related macular degeneration;AMD)遺伝子を含有する可能性があるものとして、10q26領域を強力に関係づけた(Weeks et al. 2004);この領域は、多数のその他の研究によっても示唆され、そして最近のメタ解析において上位にランキングされる領域である(Fisher et al. 2005 Meta-analysis of genome scans of age-related macular degeneration. Hum Mol Genet. 2005 Aug 1;14(15):2257-64)。最近、3つの論文(Science(Edwards et al. 2005 Complement Factor H Polymorphism and Age-Related Macular Degeneration. Science 308, 421-424;Haines et al. 2005 Complement Factor H Variant Increases the Risk of Age-Related Macular Degeneration. Science 308, 419-421. Klein et al. 2005 Complement Factor H Polymorphism in Age-Related Macular Degeneration. Science 308, 385-389))が、補体因子H(CFH)におけるアリル変異を染色体1上に見られる連鎖シグナルの原因であるとして特定するようであり、そして家族性の事例および散発的な事例の両方において、ARMの顕著な起因するリスクの原因であるとされるようである。これらの知見が、以下の文献において確認された(Conley et al. 2005 Candidate gene analysis suggests a role for fatty acid biosynthesis and regulation of the complement system in the etiology of age-related maculopathy. Hum Mol Genet 14: 1991-2002. ;Hageman et al. (2005a) From The Cover: A common haplotype in the complement regulatory gene factor H (HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A 102:7227-7232;およびZareparsi et al. 2005a Strong Association of the Y402H Variant in complement factor H at 1q32 with Susceptibility to Age-Related Macular Degeneration. Am J Hum Genet 77:149-53)。CFHは、Hageman and Andersonの研究のために、ARMにおいて何らかの役割を果たしていると以前は考えられていた(Hageman and Mullins 1999 Molecular composition of drusen as related to substructural phenotype. Molecular Vision 5:28;Johnson et al. 2000 A potential role for immune complex pathogenesis in drusen formation. Experimental Eye Research 70:441-449 Complement activation and inflammatory processes in Drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research 73:887-896;Mullins et al. 2000 Drusen associated with aging and age-related macular degeneration contain proteins common to extracellular deposits associated with atherosclerosis, elastosis, amyloidosis, and dense deposit disease. FASEB Journal 14:835-846;Hageman et al. 2001 An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration. Progress in Retinal & Eye Research 20:705-732;Johnson et al. 2001)。Hageman and Andersonは、多数のARM患者において観察された網膜下の沈着(ドルーゼ、drusen)が、補体因子を含有することを示した。しかしながら、ARMに寄与する別の遺伝子が特定されるまで、CFHは、パズルの特定された一つのピースであり続けており、これはARMの発症機序の一部として別の経路や炎症を関係づけているが、眼において観察される独特の病理学の原因となることはできない。
以下に記載する様に、この目的を達成するために、一塩基多型を含むアリル変異を、染色体10q26上で特定した。これらのアリル変異が、加齢性黄斑変性症を発症するリスクの増加と関連することが、本明細書中で示される。アリル変異は、染色体10q26上のLOC387715および/またはPLEKHA1遺伝子中に位置づけられる。一態様において、アリル変異は、LOC387715中にある。
以下に記載する様に、一塩基多型を含むアリル変異が、染色体10q26上に特定された。これらのアリル変異は、加齢性黄斑変性症を発祥するリスクの増加と関連することが、本明細書において示される。実施例1は、ARMに関連するアリル変異の遺伝子座として、PLEKHA1および/またはLOC387715を特定した。実施例2に示されるさらなる研究により、ARMに対するマーカーとして、LOC387715における変異の特定された関連性について、確認され、そしてさらなるサポートが追加される。ARMに対するマーカーとして、PLEKHA1における変異の関連性が除かれたが、しかしもっとも最近の遺伝子的研究から得られた証拠は、LOC387715遺伝子内部の変異体に、より強力に関連する。
材料と方法
家族性およびケースコントロール集団
全部で612例のAMD家族および184例の血縁関係のない対照を、遺伝子型決定のためにCenter for Inherited Disease Research(CIDR)に送った。個体群の潜在的な基礎構造があるため、解析を、本発明者らのデータのコーカソイドサブセット(Caucasian subset)に限定した。コーカソイドサブセットには、594例のAMD家族が含まれ、それには1443例の遺伝子型決定された個体、および179例の血縁関係のない対照が含有される。コーカソイド家族には、430例の遺伝子型決定された罹患同胞ペア(sib pairs)、38例の遺伝子型決定された罹患おじペア(avuncular pairs)、および52例の遺伝子型決定された罹患いとこペア(first cousin pairs)が含まれた。
3種類の分類モデル(A、BおよびC)を、ARM状況の重症度に関して定義した(Weeks et al. 2004)。単純化のため、注目点を“Type A”の罹患個体に限定し、最も厳密で慎重な診断を行った。血縁関係のない対照のみが、3種の診断モデルすべてを使用した場合に、非罹患者であった。非罹患者は、眼の治療記録および/または眼底の写真から、その他のRPE変化は伴わず、黄斑変化のいずれか(ドルーゼを含む)または少数(10未満)の硬性ドルーゼ(50ミクロンまたはそれ未満の直径)の証拠のいずれも何も示されない個体であった。多数の黄斑外ドルーゼ(extramacular drusen)を伴う個体は、この情報が利用できたため、非罹患者としてコードされなかった。
プログラムPedCheck(O'Connell and Weeks 1998 PedCheck: A program for identifying genotype incompatibilities in linkage analysis. Am J Hum Genet 63:259-266)を使用して、メンデルの法則の矛盾点をチェックした。小さな家族内のどの遺伝子型が間違ったものであるかを決定することは非常に困難である可能性があるため(Mukhopadhyay et al. 2004 Comparative study of multipoint methods for genotype error detection. Hum-Hered 58:175-189)、それぞれの問題のあるマーカーにて、メンデルの法則の矛盾点を含むそれぞれの家族内での欠落に対して、すべての遺伝子型を設定した。Mega2(Mukhopadhyay et al., http://watson.hgen.pitt.edu/register)を使用して、連鎖解析のためのファイル並びに遺伝子カウントによるアリル頻度推定のためのファイルを設定した。
連鎖解析において使用されたアリル頻度を、直接的カウントにより、血縁関係のない対照および非罹患者対照から推定した。すべての対照は、3種の罹患状況モデルのすべての下での非罹患者であった。子供無しの遺伝子型決定された配偶者または未だ研究の一部を構成していない子供を有する遺伝子型決定された配偶者を、この研究のために対照と組み合わせた。Mega2において行われたハーディ・ワインベルグ平衡の実際の試験(Mukhopadhyay et al. 2005 Mega2: data-handling for facilitating genetic linkage and association analyses. Bioinformatics)は、本発明者らのSNPsについて行われた。
Rutgersの複合連鎖(combined linkage)-物理的マッピング(バージョン2.0)(Kong et al. 2004 A combined linkage-physical map of the human genome. Am J Hum Genet 75:1143-1148)を使用して、Rutgersのマッピングにおいてこれまでに示されていなかったSNPsの遺伝子的位置を予測した。本発明者らのSNPsの分布は、目的とする領域中で非常に密度が高いため、いくつかのSNPs間での推定される組換えはゼロであった;これらの事例において、組換えは、0.000001と設定された。NCBI dbSNPデータベース(ヒト構築物35)から得た、本発明者らのSNPsのすべてについて、物理的位置を得た。
連鎖解析を行う際のSNPs間の高い連鎖不均衡(LD)を無視することにより、結果として偽陽性の知見が得られる可能性がある(Schaid et al. 2002 Caution on pedigree haplotype inference with software that assumes linkage equilibrium. Am J Hum Genet 71:992-995; Huang et al. 2004 Ignoring linkage disequilibrium among tightly linked markers induces false-positive evidence of linkage for affected sib pair analysis. Am J Hum Genet 75:1106-1112)。高いSNP-SNP LDを考慮する努力には、以下のものが含まれた:
1. 血縁関係のない対照におけるLD構造を、H-クラスター法を使用して研究し(Rinaldo et al. 2005 Characterization of multilocus linkage disequilibrium. Genetic Epidemiology 28:193-206)、これがR中で実行される(R Development Core Team 2004 R:A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, R statistical software website, http://www.r-project.org/)。目的は、連鎖解析のためにハプロタイプ-タグ化SNPs(htSNPs)を決定することであった。この方法は、階層的クラスタ形成(hierarchical clustering)を使用して、非常に相関したSNPsをクラスター化する。クラスター化の後、H-クラスター法は、各クラスターについてhtSNPを選択する;htSNPは、そのクラスター中のすべてのその他のSNPsと最も相関するSNPである。各SNPが少なくとも1種のhtSNPと0.5より大きい相関係数(r2)を有する様に、SNPsを選択した;
2. プログラムHaploView(Barrett et al. 2005 Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics 21:263-265.)を使用して、染色体1および染色体10にわたるSNP-SNP LDの画像(graphical view)を得た;そして
3. ハプロタイプ-ベースの関連性解析を、2種および3種の-SNP移動ウィンドウを使用して行った(以下を参照)。
1. 一点解析。本発明者らの以前の研究において(Weeks et al. 2004)、LODスコアを、一点単純優性遺伝子モデル(single simple dominant model)のもとでコンピュータで算出した(疾患アリル頻度= 0.0001および浸透用ベクター= [0.01 0.90 0.90])。ARM表現型の複雑性および晩発性のため、2種の疾患表現型のみを使用した:“モデルAでの罹患者”および“未知”。パラメトリックLODスコアを、不均一性のもとでコンピュータで算出し(HLOD)、一方モデルフリーのLODスコアを、直線Sall統計値を使用してコンピュータで算出した。これらのスコアは両方とも、Allegroを使用してコンピュータで算出した(Gudbjartsson et al. 2000 Allegro, a new computer program for multipoint linkage analysis. Nat Genet 25:12-13)。
家族に由来する事例のすべてを使用するために、新規のCCRELプログラム(Browning et al. 2005 Case-Control single-marker and haplotypic association analysis of pedigree data. Genet Epidomiol 28:110-122.)を使用した。このプログラムは、血縁関係のある事例を血縁関係のない対照と同時に使用して、関連性について試験することを可能にする。CCRELを使用して、染色体1および染色体10上の連鎖ピークのもとSNPsを解析し、関連性について試験した。CCREL試験は、有効事例数および有効対照数を計算することにより、生物学的に血縁関係のある被検体を明らかにする。これらの解析について、血縁関係のない対照には“正常”表現型と割り当てられ、一方、‘A型’ARMに罹患していない家族の構成員には“未知の”表現型と割り当てられた(CCRELのアプローチは、血縁関係のある事例および血縁関係のある対照の両方を同時に使用することを可能にするまでにはまだ拡張されていない)。従って、関連性試験のために使用された各SNP用の有効対照数は、そのSNPについて遺伝子型決定された対照の数である。アリル試験、2種のSNPスライドウィンドウを使用するハプロタイプ試験、3つのSNPスライドウィンドウを使用するハプロタイプ試験、および遺伝子型決定試験を行った。著者らにより提供されたCCREL Rパッケージを解析用に使用した(Browning et al. 2005)。
アリル/SNPが連鎖シグナルに対して最も寄与することを調べるため、遺伝子型-IBD共有試験(GIST)を、局所的に遺伝子型決定されたSNPsおよびCCREL試験由来の大型のSNPsを使用して、染色体1および染色体10両方に対する連鎖ピーク周辺で行った。GIST試験は、アリルまたはアリルを伴うLD中のアリルが、部分的に、観察される連鎖シグナルの原因となるかどうかを決定する(Li et al. 2004)。3種の異なる疾患モデル(劣性モデル、優性モデル、付加モデル)のもと、各罹患者の親類関係についての重み付けをコンピュータで算出した - これらの重み付けは、疾患-マーカーの関連性なしとのヌル仮説のもとでは、バイアスがかかっていない。家族の重み付け変数と非パラメータ連鎖(NPL)スコアの間の相関性は、試験統計値の基礎である。GIST試験は、現在では罹患者血縁者ペアファミリーに対して適用されるだけであるため、NPLスコアをコンピュータで計算する前に、家族は、構成成分である核家族に分解された。根拠となる疾患モデルは未知であったため、本発明者らは、3種の異なる疾患モデル(劣性モデル、優性モデル、付加モデル)のもとで試験し、その後3種のモデルに対する多重試験にあわせて調節したp-値を使用して、最大値を取った。
解析は、3つの連続した工程で行われた。第一に、CIDRにて遺伝子型決定されたデータセットを解析した。第二に、染色体10上のPLEKHA1/LOC387715/PRSS11領域における8つの追加のSNPsを局所的に遺伝子型決定した後、次に、局所的に遺伝子型決定されたデータセットを解析した。PLEKHA1からPRSS11領域における既知の非-同義のSNPsのすべてを調べた点に注目すべきである。これらの2種類のデータセットは、サイズおよび組成の点で異なっているため、それらを別々に解析することはもっとも直接的なことである(表2)。アリル頻度推定、CCREL関連性試験、およびGIST試験を、上述したこれらの(重複する)データセット両方に対して行った。第三に、本発明者らは、染色体1領域と染色体10領域との相関関係について試験し、並びにリスクが、地図状萎縮または脈絡膜新生血管膜のいずれかの存在の関数として異なっているかどうかを調べた。
CIDR SNP遺伝子型決定
染色体10q26上の原因となる遺伝子を特定するため、Center for Inherited Disease Research(CIDR)は、本発明者らの目的とする領域を含む13.4 Mbp(26.7 cM)をカバーする199種のSNPsを用いて、612例のAMD家族および184例の血縁関係のない対照の高密度カスタムSNP遺伝子型決定を行った。解析のために、196種のSNPsを使用した:3例は対照中に多型が存在しないため使用しなかった(この点について家族のデータ内をチェックした際、失われたアリルは非常にまれなものであり、そしてヘテロ接合体中にのみ存在した)。染色体1q31上の45.7 Mbp(47.1 cM)をカバーする684種のSNPsもまた、遺伝子型決定された;5種のSNPsは対照中に多型が存在しないため使用しなかった - 失われたアリルは、存在しないかまたは非常にまれなものであり、そして家族のデータ中のヘテロ接合体中にのみ存在した。本明細書中で提供されるアリル標識と実際のアリルとの間の対応関係について、そして同義性のないSNPsのアミノ酸変化については、表3を参照。
局所SNP遺伝子型決定 - 3種の感受性遺伝子、PLEKHA1、LOC387715およびPRSS11をカバーする、染色体10上の8種の追加のSNPs(すなわち、PLEKHA1(rs12258692、rs4405249およびrs1045216)、LOC387715(rs10490923、rs2736911、rs10490924)およびPRSS11(rs11538141、rs1803403))を遺伝子型決定した。この遺伝子型決定の作業には、NCBIデータベースにおいてはこれらの遺伝子について記録された同義性のないSNPsのすべてが含まれた(図1を参照)。別の研究(Conley et al. 2005 Candidate gene analysis suggests a role for fatty acid biosynthesis and regulation of the complement system in the etiology of age-related maculopathy)の一部として、2種のCFH変異体(rs10922093およびrs1061170)を遺伝子型決定し、これもここで使用した。GRK5/RGS10遺伝子座のもとでの追加のSNPsの遺伝子型決定は、現在進行中である。rs12258692、rs1803403、および新たに特性決定されたSNP、rs12258692の1塩基3’側であるrs4405249、についての遺伝子型データを、配列決定により回収し(Rexagen Corporation, Seattle, WA)、そしてSequencherソフトウェア(Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI)を使用して解析した。rs11538141、rs2736911、rs10490923およびrs10490924についての遺伝子型データを、RFLPを使用して回収した。プライマー、増幅条件、および制限エンドヌクレアーゼ(適切な場合)は、配列決定またはRFLPにより遺伝子型決定されたSNPsについては、表4において見いだすことができる。
血縁関係のない事例 - 血縁関係のない事例は、CIDRによっては何も遺伝子型決定されなかった。しかし、196例の血縁関係のない事例が、追加のSNPsについて局所的に遺伝子型決定された。オッズ比の計算のため、そして相互作用解析のため(以下を参照)、一組の血縁関係のない事例を、各家族から一人の“Type A”罹患者を採取することにより生成した。321例の局所的に遺伝子型決定された家族少なくとも一人の“Type A”罹患者を有した。家族が一人以上の“A”罹患者を有した場合、rs800292(CFH)、rs1061170(CFH)、rs1537576(GRK5)およびrs4146894(PLEKHA1)において最も遺伝子型決定されたヒトが選択された;遺伝子型決定されたSNPsの数が、2人のヒトの間で識別できない場合、疾患を発症したより若年のヒトが選択され、それ以外の場合は‘A’罹患者事例が最も遺伝子型決定されたヒトであって発症年齢の最も若かったヒトから無作為に選択された。577例のCIDR家族が少なくとも一人の“A”罹患者を有し、321例のこれらの家族もまた局所的に遺伝子型決定され、そして‘A’罹患者が局所セットに対する場合と同一のものとして選択された。残りの256家族について、選抜は、rs800292(CFH)、rs1537576(GRK5)、およびrs4146894(PLEKHA1)のみを使用して最も完全に遺伝子型決定したヒトを見いだした以外は、同一の分類に基づいていた。
CFH中のSNPsが染色体10上の連鎖シグナルに寄与し、そして染色体10上のSNPsが染色体1上の連鎖シグナルに寄与した場合、染色体1上のCFHおよび染色体10上の遺伝子との潜在的な相互作用は、GISTを用いた試験により調べられた。これは、一つの染色体上のSNPsからの重み付けおよび別のものから採取した家族ベースのNPLsからの重み付けを使用することにより行われた。
およそのオッズ比が計算され、そしてSNPsについての寄与リスクが各遺伝子において推定された。対照において最も頻度が低かったアリルが、リスクアリルであると考えられた。寄与リスクが、式
AF = 100×P×(OR - 1)/(1 + P×(OR - 1)
〔式中、ORはオッズ比であり、そしてPは対照から推定した場合の個体群中のリスクアリルの頻度である〕を使用して推定された。これは、対照と比較した‘Type A’罹患者、対照と比較したCNVを有する被験者、および対照と比較したGAを有する被験者、を使用して行われた。可能性ある最大のサンプルサイズを使用するため、異なるがしかし重複するサンプルを、CIDRについておよび局所的にタイピングされたSNPsについて使用した。家族から取り出した577例の事例および179例の血縁関係のない事例を、CIDR SNPsのORおよびARを計算するために使用したが、517例の事例(そのうち、321例が、577例のCIDR SNPの事例の中のものである)および117例の対照(すべてが179例のCIDR SNP対照の中のものである)を、局所的に遺伝子型決定されたSNPs上でのORおよびARを計算するために使用した。
染色体10q26領域にARM-感受性遺伝子座が存在するという以前の研究に由来する非常に強力な証拠を考慮して、ここで行われた解析は、仮説検定ではなく、感受性遺伝子の位置を推定することを目的としている。多重試験の問題は、最も重要なものであり、そして仮説検定の文脈において関連性のあるものである。推定の際、これらの研究の焦点は、単純に、シグナルが最強である場合である。いずれにしても、多重試験についてのいずれかの補正は、結果の序列を変えるものではなかった。LDよる試験間でのいずれかの補正の原因とはならないボンフェローニ補正(Bonferroni correction)(196例の試験のための0.05レベルでの補正)は、0.05/196 = 0.00026の有意な閾値を導いた;LDによる補正はより大きな閾値を導いた
解析を、3つの連続する工程において行った。第一に、CIDRで遺伝子型決定されたデータセットを解析した。第二に、染色体10上のPLEKHA1/LOC387715/PRSS11領域における8つの追加のSNPsを局所的に遺伝子型決定した後、次いで局所的に遺伝子型決定されたデータセットを解析した。アリル頻度推定、ハーディ・ワインベルグ平衡についての試験(表3)、CCREL関連性試験、およびGIST試験を、上述したこれらの(重複する)データセット両方について行った。第三に、染色体1領域と染色体10領域との間の相互作用を解析し、地図状萎縮または脈絡膜新生血管膜のいずれかの存在の関数としてリスクが異なるかどうかを調べた。
CIDR連鎖の結果
本発明者の以前の研究の場合と同様に(Weeks et al. 2004)、CIDR SNPsを使用して、そして同一の連鎖解析アプローチを適用して、染色体10上のSall多重点曲線のピークをGRK5領域と関連づけるが(図2における‘G’;GRK5におけるrs1537576は1.87の単一点Sallを有し、一方3.86の最大単一点Sallが、GRK5の206 kbセントロメア側のrs555938に生じた)、しかしいくつかの亢進された二点の非-パラメトリックSall LODスコアおよびPLEKHA1/LOC387715/PRSS11領域に注目を集める本発明者らの最高不均質LODスコア(HLOD)を関係づける(図2における“P”)。この領域において、PLEKHA1におけるSNP rs4146894は、3.34の二点Sallおよび2.66の最高の二点HLODを有し、一方、PRSS11におけるSNPs rs760336およびrs763720は、それぞれ2.69および2.23の二点Sallを有した。しかしながら、サポート間隔は大きく(10.06 cM、図2)、そして連鎖解析のみからの局在化はむしろ不正確である。
連鎖により得ることができる場合よりもより精密な局在化のため、関連性解析を使用した(これは、染色体1上でCFHを発見する際に非常に有用であった)。ここでは、CCRELアプローチを使用して関連性解析を行った。それにより、事例の同系性(relatedness)について適切に調整することにより、本発明における血縁関係のない対照および本発明における血縁関係のある家族の事例のすべてを、同時に使用することが可能になる。染色体10上のCIDRサンプルにおいて、本発明の連鎖ピーク中において、本発明者らは、非常に小さなp-値を有する4つの隣接するSNPs(rs4146894、rs1882907、rs760336およびrs763720)のクラスタであって、3つの遺伝子:PLEKHA1、LOC387715およびPRSS11をカバーするもの、が特定されることを見いだした。染色体10上の最強のCCRELの結果は、SNP rs4146894を用いたPLEKHA1におけるものであった(表5)。3つのSNPsを同時に使用するMoving Windowハプロタイプ解析(“ハプロ3”)は、結果として、PRSS11領域に対してPLEKHA1の全体にわたり、非常に小さなp-値をもたらす(表5)。関連性試験はまた、連鎖の最高の証拠が生じる場所であるGRK5領域におけるいくつかの適度に小さなp-値を生成する。
GIST試験がCIDRデータセットについて行われる場合、染色体10q26における2つの最小のp-値(0.006、0.004)が、GRK5/RGS10領域において生じ、一方、3番目に小さいp-値(0.008)が、PLEKHA1において生じる(表5)。GRK5遺伝子中の4種のSNPsのすべてが、小さなGIST p-値を有する。GISTの結果は、GRK5およびPLEKHA1の両方が、染色体10上の連鎖シグナルに顕著に寄与し、そしてCFHが染色体1上の連鎖シグナルに顕著に寄与することを示唆する。PRSS11における2種のSNPsのいずれも、染色体10上の連鎖シグナルには特に寄与しない。染色体10上のこれら2つの遺伝子が、染色体1上で見られる連鎖シグナルに関連しているという証拠は、存在しなかった。
局所的関連性の結果
追加のSNPsを局所的にタイピングした後、アリル試験および遺伝子型試験は、3つの遺伝子PLEKHA1/LOC387715/PRSS11のそれぞれにおいて、きわめて小さなp-値を生成する(表6)。3つのSNPsを同時に使用するMoving Windowハプロタイプ解析(“ハプロ3”)は、結果として、PLEKHA1/LOC387715/PRSS11領域全体にわたり非常に小さなp-値をもたらす(表6)。従って、関連性がPLEKHA1/LOC387715/PRSS11領域に関連しているが、一方、それはこれらの遺伝子間で識別されない。
3種の遺伝子PLEKHA1/LOC387715/PRSS11のうち、GISTは、PLEKHA1と最も強力に関連している(表6)。それはまた、LOC387715(rs10490924)においては小さなp-値を生成し、しかしこのSNPは、PLEKHA1 SNPsにより高いLDである(図6Aを参照)。局所的にタイピングしたデータセットを使用する場合、GISTは、より大きなCIDRサンプルにおいて上述したように有意ではない結果が得られたのと同様に、PRSS11において何ら有意な結果を生成しない。このことは、PLEKHA1(またはそれを伴う強力なLDにおける遺伝子座)が、AMDに関与する可能性が最も高く、そして従ってLOC387715が依然として可能性を有することを意味している。
GISTの結果
染色体1領域と染色体10領域との間の相互作用についての強力な証拠は何も、GIST試験により見られなかった。CIDRデータセットを使用する場合、染色体10上のSNPsが染色体1上の連鎖シグナルに寄与するかどうかを試験するため(表5 ‘GIST(NPL 1)’)、PRSS11中のrs763720のみが0.05よりも低いp-値をもたらし、しかしながらrs763720は、染色体10上の連鎖シグナルには顕著に寄与せず、このために、このp-値はあまり説得力のあるものではなくなる。局所データセットのみを使用した場合、より大きなCIDRデータセットにおいては顕著ではなかった1つのGRK5変異(rs1537576)が、0.05未満のp-値をもたらす。同様に、CFH中のSNPsが染色体10上の連鎖シグナルに寄与するという証拠は見られなかった。わずか1つのSNP(rs955927)が0.05未満のp-値をもたらしたが、しかしながらこのSNPは、CFH中のものではなく、そしてCFH遺伝子中のいずれかのSNPsを伴う強力なLD中のものではない(図6Bを参照)。
ロジスティック回帰により、CFH由来の変異およびPLEKHA1由来の変異の両方を含む追加のモデルが、ケースコントロール状態を予測するための最良のモデルであることが、示唆される;このことは、両遺伝子が、ARM表現型にとって重要なものであることを示している。AIC基準により、追加の相互作用期間を含む追加のモデルが、次に最良のモデルであるが(表7)、しかし、相互作用期間は重要ではない(p-値 = 0.71)ことがもたらされる。同様の結果は、両方の変異を含む追加のモデルが最良のモデルであると思われる、CFHおよびPRSS11の間の相互作用について得られた。GRK5/RGS10領域内部では、CFH SNPのみを有するモデルが最良適合モデルであり、このことは、CFH遺伝子型を用いたケースコントロール状態の予測が、モデルに対してGRK5変異またはRGS10変異のいずれかを追加することにより改良されるのではないことを示唆している。
関連性の程度は、オッズ比(OR)および寄与リスク(AR)を計算することにより推定した;観察された顕著な関連性(表8)は、part Iおよびpart IIのCCREL試験から得られた結果と一致していた。PLEKHA1/LOC387715領域中の最も大型のSNPsのうちの2つは、SNPs rs4146894(PLEKHA1)およびrs10490924(LOC387715)で生じる;これら2つの試験は非常に相関している。というのも、それらのSNPsの間でのLDは非常に高いためである(D’=0.93)(図6Aを参照)。染色体10領域中で3番目に大型のSNP(rs1045216)は、PLEKHA1において、そしてrs4146894(D’=97)およびrs10490924(D’=0.91)の両方を伴う高いLDにおいて、同義性のないSNPである。
本発明者らは、滲出性疾患vs.対照を用いた事例、および地図状萎縮vs.対照を用いた事例、におけるオッズ比および寄与リスクを推定した(表9)。オッズ比および対応するp-値は、CCRELのアリル試験と同様の知見をもたらす(表5および表6)。本発明者らは、地図状萎縮または脈絡膜新生血管膜のいずれかが存在することについて、オッズ比間での大きな差異は存在しないことを見いだした。
ARM家族についての本発明者らの連鎖研究は、いくつかのそれ以外の遺伝子座に加えて、染色体1q31遺伝子座および染色体10q26遺伝子座を一貫して特定した。複合連鎖の研究がこの知見を再現し、そして従って、ARM家族並びに血縁関係のない罹患者個体および対照を使用して両方の領域の集中的なSNP解析を、行った。染色体1q31上に、他の研究グループにより報告された、CFHとの強力な関連性を本発明者らは確認し(同様に、Conley et al. (2005)を参照)、そしてCFH中のSNPsが、連鎖シグナルの顕著な原因となることが初めて示された。興味深いことに、本発明者らの最小のGIST p-値(<0.001)は、Y402H変異により0.91の高いD'を有するrs1853883によるものであり、そして“疾患関連”と予測されたY402H変異自体によるものではなかった。CFH遺伝子中の可能性のあるその他のARM-関連変異が依然として検討されなければならないかもしれず、そしてこれらのものがY402Hにより高いLDである可能性がある、という可能性が、このことにより生じる。
この実施例は、実施例1において提供された結論および発見をサポートしそして確認する、追加のデータを提供する。この中で、PLEKHA1におけるアリル変異および仮説上のLOC387715遺伝子が、加齢性黄斑変性症のリスク因子として特定された。
Cardiovascular Health Study(CHS)参加者 - サンプリングおよび表現型解析
CHSは、65歳以上の個体における心臓血管疾患に関連する因子を特定するために主として設計された、個体群ベースの、長期的な研究である。網膜の評価を8年間の追跡訪問で行い、そしてこの集団の生存メンバーは18年の追跡評価をまさに完了したところである。コミュニティベースの動員は、Forsyth County, NC;Sacramento County, CA;Washington County, MD;およびPittsburgh, PAで行った。Health Care Financing Administrationのメディケア的確性リストを使用して、65歳以上である個体を特定した。リストメンバーの家族の中で生活する65歳以上の個体もまた、適格であった。試験対象患者基準(Inclusion criteria)は最小限であり、そして慣行化されたものではなく、少なくとも3年間この領域に残ることが期待され、インフォームドコンセントを与えることができ、車いすに束縛されておらず、ホスピスケアを受けておらず、そして癌のために放射線治療または化学療法を受けていないこと、が含まれた(Fried et al. (1991))。CHS由来のDNAサンプルが、本研究において使用された
AREDSは、ARMの博物学および本研究の中に埋め込まれる高用量ビタミンおよびミネラル添加の臨床試験による加齢性白内障の博物学についての予測的な多施設共同研究である。AREDS研究に動員された個体は、在籍者名簿の55〜80歳の男性および女性であった;これらの個体は、長期の追跡を妨害しうるいずれの症状または病気もないことが必要とされた。試験対象患者基準(Inclusion criteria)は最小限であり、基底部の写真撮影を許容する程度に十分に透明な眼球中膜(ocular media)を有することそしていずれの眼にもARMの証拠がないこと、または一方の視力は良好に維持されているが、他方においてARMを有すること、が含まれた(20/30またはそれ以上)(The Age-Related Eye Disease Study Research Group 1999)。NEI-AREDS Genetic Repository由来のDNAサンプルが、本研究のために使用された。
ELOVL4中のM299V変異体(rs3812153)、CFH中のY402H変異体(rs1061170)、およびLOC387715中のS69A変異体(rs10490924)が、RFLP技術を使用して遺伝子型決定された。各アッセイについての、プライマー、アニーリング温度、および制限エンドヌクレアーゼは:
ELOVL4について、5’-AGATGCCGATGTTGTTAAAAG-3’(F, SEQ ID NO: 13)、5’-CATCTGGGTATGGTATTAAC-3’(R, SEQ ID NO: 14)、50℃およびBspHI;
CFHについて、5’-TCTTTTTGTGCAAACCTTTGTTAG-3’(F, SEQ ID NO: 15)、5’-CCATTGGTAAAACAAGGTGACA-3’(R, SEQ ID NO: 16)、52℃およびNlaIII;
LOC387715について、5’-GCACCTTTGTCACCACATTA-3’(F, SEQ ID NO: 17)、5’-GCCTGATCATCTGCATTTCT-3’(R, SEQ ID NO: 18)、54℃およびPvuII。
SNP-疾患関連性は、アリルカイ二乗検定および遺伝子型カイ二乗検定を用いて測定され、そしてP-値は、100,000個の複製物を使用してシミュレートした;1またはそれ以上の5個未満であると予想された細胞数を有する場合、Fisherの限定的試験を使用した。関連性の強度は、大まかなオッズ比(OR)および集団寄与リスク(PAR)により推定された。以下の一般式を使用して、PARを計算した:
PAR = Pr(OR-1)/(1+Pr(OR-1))
〔式中、Prは一般的集団におけるリスク因子の保持率である〕。Prの推定値は、CHS対照に由来した;このことは合理的である。というのも、CHS被検体は、ARM疾患状況に基づいては選択されず、そしてCHS対照の数は多数である(n=1,051)ためである。比較の目的で、年齢および性別に対して調整されたオッズ比(ORadj)を推定した。ロジスティック回帰モデルを使用して、R(38)を使用して、大まかなオッズ比および調整されたオッズ比の両方を計算した。対照群におけるより頻度が低いアリルを、リスクアリルと考え、そしてORおよびORadjを、リスクアリルについてのホモ接合体(RR)の個体を基準群(正常アリルについてのホモ接合体[NN])と比較することにより、そしてリスクアリルについてのヘテロ接合体(RN)の個体を基準群と比較することにより、計算した。優性効果(RRおよびRN vs NN)および劣性効果(RR vs RNおよびNN)についての差異もまた、評価した。
本発明者らは、ハプロタイプ法(Valdes, A.M. and Thomson, G. (1997) Detecting disease-predisposing variants: the haplotype method. Am J Hum Genet. 60, 703-716)を使用して、PLEKHA1中のA320TまたはLOC387715中のS69Aの2つの遺伝子座のうちのいずれが、10q26領域の変異という傾向をもたらす実際の疾患により似ているかを特定した。ハプロタイプ法の基礎は、単純で洗練されている(数学的な証明については、Valdes and Thomson (1997)を参照)。すべての素因性変異がハプロタイプ上に含まれるならば、特定の疾患-素因ハプロタイプに対する事例および対照の実際の比率は異なっている場合があるが、中立な変異は特定の疾患-素因ハプロタイプ上での事例および対照が同率であると予測される。一方、すべての素因性変異が特定されていない場合、非素因性変異のハプロタイプ頻度の比率の同等性は予想されない。
興味の対象となる仮説は:
H0P:PLEKHA1におけるA329T変異が、PLEKHA1-LOC387715ハプロタイプブロックに対するARM素因についての十分な原因である。
これらの仮説のいずれかを否定することは、試験された変異がPLEKHA1-LOC387715ハプロタイプブロックのみに対するARM素因についての十分な原因ではないことを意味する。4つの2×2の偶然性に関する表は、式1a、式1b、式2a、および式2bから導くことができる:
相互作用の解析は3つから構成された:はじめに、本発明者らは、CHSサンプルおよびAREDSサンプルの両方において、CFH中のY402HおよびLOC387715中のS69Aの遺伝的作用を相互作用させることについて試験し、ついで本発明者らはCHSサンプルおよびAREDSサンプルの両方において、Y402HおよびS69Aの両方の喫煙歴との相互作用を試験し、そして最後に3つのリスク因子の組合せORsを計算した。
以前の研究において、ARMにおけるアポリポタンパク質E(APOE)遺伝子の、可能性のある保護的な作用および有害作用が報告された。ε4アリルは、保護的作用を有する可能性がある(Klaver, C.C., et al. (1998) Genetic association of apolipoprotein E with age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 63, 200-206; Schmidt, S., et al. (2000) Association of the apolipoprotein E gene with age-related macular degeneration: possible effect modification by family history, age, and gender. Mol Vis. 6, 287-293; Schmidt, S., et al. (2002) A pooled case-control study of the apolipoprotein E (APOE) gene in age-related maculopathy. Ophthalmic Genet. 23, 209-223; Baird, P.N., et al. (2004) The epsilon2 and epsilon4 alleles of the apolipoprotein gene are associated with age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 1311-1315 and Zareparsi, S., et al. (2004) Association of apolipoprotein E alleles with susceptibility to age-related macular degeneration in a large cohort from a single center. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 1306-1310)が、一方、最低頻度のアリルであるε2は、ARMのリスクを増加させる可能性がある(Klaver, C.C., et al. (1998) and Zareparsi, S., et al. (2004)。APOE変異は、CHSにより遺伝子型決定され、そしてそのARMとの関連性を本研究において評価した。個体が、APOE-ε3/ε3遺伝子型を有する個体、およびAPOE-ε2キャリアおよびAPOE-ε4キャリア(それぞれ、APOE-ε2/*およびAPOE-ε4/*と示される)において、APOE遺伝子型により分類された;APOE-ε2/ε4遺伝子型を有する個体がAPOE-ε2/*群およびAPOE-ε4/*群の両方に含まれた。カイ二乗検定を使用して、APOE-ε3/ε3とAPOE-2ε/*、およびAPOE-3ε/3εとAPOE-4ε/*、対照および事例における遺伝子型の分布における差異について試験した。
本発明者らは、CFHおよびLOC387715について以前に刊行物に記載された報告から推定されたORを蓄積するためのメタ-解析アプローチを行い、そして2件の報告をここで提示した。最初に、研究間の偏差が偶発的なものであると仮定してデータを解析し、そして固定化作用モデルを使用した。固定化作用モデルの下、蓄積されたORの最尤推定量は、個体推定値の平均であり、それらの偏差の逆数により重み付けされ、そして蓄積されたORの偏差は、個体重量の合計の逆数により推定される。ホモ接合性の下でのメタ解析を、R中で行った(R DevelopmentCoreTeam (2005) R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria)。ホモ接合性の仮定をカイ二乗検定を使用して確認した。しかしながら、ホモ接合性の試験は、低出力しか有さないという傾向があり、そして従って、比較のため、本発明者らは、無作為化作用設定におけるORも蓄積した。ヘテロ接合性の下でのメタ解析を、制限付き最尤法(restricted maximum likelihood;REML)の方法を使用して、SAS Proc Mixed(SAS software release 8.2[SAS Institute Inc., Cary, NC, USA])において実行することにより行った。蓄積されたREML推定量は、ダーサイモニアン・レアード推定量(DerSimonian-Laird estimator)と同一である(DerSimonian, R. and Laird, N. (1986) Meta-analysis in clinical trials. Control Clin Trials. 7, 177-188 and van Houwelingen, H.C., Arends, L.R. and Stijnen, T. (2002) Advanced methods in meta-analysis: multivariate approach and meta-regression. Stat Med. 21, 589-624)。van Houwelingen et al. 2002によるSASコードは、ヘテロ接合性の下、解析を行うために改変された。
b 平均年齢および対応する標準偏差、または元の文献から利用可能なその他の概要統計。
c 遺伝子型カウントが利用可能な場合、限定的試験(R Geneticsのパッケージにおいて実施)由来のP-値がもたらされる。
d Edwardsらの文献の2種のデータセットを、メタ解析において組み合わせる。組み合わせた対照および事例についてのHWE P-値は、それぞれ0.53および0.36である。
e Hainesらの文献由来の結果が、ヘテロ接合体個体およびホモ接合体個体についてのORsのメタ解析に含まれる。サンプルサイズは、CHFにおけるY402Hでの失われた遺伝子型データの原因ではなく個体の全数に基づくものである。
f Hagemanらの文献の2種のデータセットは、元の文献に従って組み合わせない。
g Riveraらの文献の2種のデータセットは、メタ解析において組み合わせる。組み合わせた対照および事例についてのHWE P-値は、それぞれ0.03および0.09である。
b 平均年齢および対応する標準偏差、または元の文献から利用可能なその他の概要統計。
c 遺伝子型カウントが利用可能な場合、限定的試験(R Geneticsのパッケージにおいて実施)由来のP-値がもたらされる。
d Riveraらの文献の2種のデータセットは、メタ解析において組み合わせる。組み合わせた対照および事例についてのHWE P-値は、それぞれ0.03および0.01である。
e メタ解析においては、グレード1の被検体のみを対照として分類する(グレード2被検体は除く)。Schmidtらによる元々の研究は、グレード2の個体を対照として分類した。対照の平均年齢および%男性は、この文献から採用し、そしてグレード1および2の両方に基づいた。
ARMにおけるCFH、ELOVL4、PLEKHA1、およびLOC387715をさらに評価するため、本発明者らは、AREDS研究およびCHS研究に由来するサンプルにおいて、4種の遺伝子すべての内部で以前に報告されたSNPsを遺伝子型決定した。AREDS研究由来の合計701例の非ヒスパニック白人ARM患者および175例の対照、およびCHS研究由来の合計126例の非ヒスパニック白人ARM患者および1051例の対照を使用して、各データセットについて、別の解析を行った(データについてのサンプルサイズおよびその他の特徴については表10を参照、そして遺伝子型頻度については表16を参照)。最新の追跡訪問時の被検体の疾患の状況は、AREDS被検体に関して評価された主要な評価項目(endpoint)であった。AREDS被検体には、グレード1の対照および中程度のARMを有する事例、および片眼または両眼に進行型ARMを有する事例(グレード3〜5)が含まれる。CHS被検体のARM疾患の状況は、8年の追跡訪問時の撮影された単眼の非散瞳性の基底部写真を使用して、整合性(consistency)のために一人の専門家により評価された。CHS事例の大半は、色素上皮の変化を伴うかまたは伴わない複数のドルーゼを含む中程度のARM(AREDSグレード3と同等)を有し、少数の事例が地図状萎縮(GA)または脈絡膜新生血管膜(CNV)を有した。そしてCHS対照は、AREDSグレード1のものであり、有意な黄斑外ドルーゼ(斑外ドルーゼ)を有する事例を排除する。
CFH、ELOVL4、PLEKHA1、およびLOC387715の各遺伝子について、ARMとの関連性をカイ二乗統計値により評価した。各遺伝子の作用の程度を、オッズ比(ORs)および集団寄与リスク(PARs)により推定した。遺伝子が初期ARMおよび進行型ARMに対して同様に寄与するかどうかを評価するため、AREDSデータを使用して、各グレードおよびサブタイプ(GAおよびCNV)について、ORsを個別に計算した。
本発明者らは、ロジスティック回帰モデリングを使用して、CFHとLOC387715、CFHと喫煙、およびLOC387715と喫煙の組合せ寄与のモデルを構築した。一連のモデルは、最も有望でそして最も安上がりな(1または複数の)モデルについての推定を導くために、適合させた。North et al. (2005)により記載される様に、モデルは、Akaike情報基準(AIC)を使用して比較した。もっとも安上がりのモデルが特定されたら、本発明者らは、リスク因子の組合せORsを推定した。別々の推定値を、各集団から計算した。AREDSサンプルのサイズを最大にするため、部分表現型解析または部分グレード解析は行わなかった;グレード3〜5のAREDS事例を、グレード1のAREDS対照と比較した。
CFHのメタ-解析:本発明者らは、メタ-解析アプローチを使用して、Y402Hについて推定されたORsを、11種の非依存的データセット(ここで報告されたCHS集団およびAREDS集団を含む)から蓄積した(表14)。これは、結果として、5,451例の事例および3,540例の対照(これらのすべてはヨーロッパ人の家系またはヨーロッパ系アメリカ人の家系である)の解析をもたらした。この結果から、非ヒスパニック白人個体群におけるCアリルによるARMリスクの増加が確認される(図12および表22)。蓄積された推定値は、個体研究のどれよりも狭いCIを有し、そして研究全体にわたるホモ接合性を仮定した場合、ヘテロ接合体のORおよびホモ接合体ORについての非重複性CIを有する:ORhet=2.43(95%CI 2.17-2.72)およびORhom=6.22(95%CI 5.38-7.19)。解析をヘテロ接合性のもとで行う場合、点推定は本質的に同一であり、そしてCIsはわずかに幅広い。固定化作用モデルの下では、1例を除き、感受性解析により、蓄積された推定値に対する劇的な作用を有する研究は存在しないことが示される(表22)。
Claims (33)
- 加齢性黄斑変性症(Age-Related Maculopathy)を発症するリスクと関連する染色体10q26に位置するアリル変異の発生を、ヒト被検体由来の核酸サンプル中で特定することを含む、加齢性黄斑変性症を発症するリスクが増加したヒト被検体を特定する方法。
- アリル変異が、染色体10q26のPLEKHA1/LOC387715/PRSS11遺伝子座において生じる、請求項1に記載の方法。
- PLEKHA1およびLOC387715の一方または両方のアリル変異の発生を、被検体由来の核酸サンプル中で特定することを含む、請求項1に記載の方法。
- アリル変異が、一塩基多型rs4146894に対応する、請求項1に記載の方法。
- アリル変異が、LOC387715のSer69Alaに対応する、請求項1に記載の方法。
- アリル変異が、rs10490924として特定される一塩基多型に対応する、請求項1に記載の方法。
- アリル変異が、rs1045216として特定される一塩基多型に対応する、請求項1に記載の方法。
- アリル変異が、rs1882907として特定される1またはそれ以上の一塩基多型に対応する、請求項1に記載の方法。
- アリル変異が、rs760336として特定される1またはそれ以上の一塩基多型に対応する、請求項1に記載の方法。
- アリル変異が、rs763720として特定される1またはそれ以上の一塩基多型に対応する、請求項1に記載の方法。
- アリル変異が、rs800292として特定される1またはそれ以上の一塩基多型に対応する、請求項1に記載の方法。
- アリル変異が、rs1483883として特定される1またはそれ以上の一塩基多型に対応する、請求項1に記載の方法。
- アリル変異が、rs1853886として特定される1またはそれ以上の一塩基多型に対応する、請求項1に記載の方法。
- アリル変異が、PLEKHA1におけるアリル変異である、請求項1に記載の方法。
- アリル変異が、LOC387715におけるアリル変異である、請求項1に記載の方法。
- アリル変異が、非機能的な遺伝子生成物および遺伝子生成物の発現が変化されたもののいずれか一方を生成する変異である、請求項1に記載の方法。
- 変異が、フレームシフト変異、プロモータ変異およびスプライシング変異の1またはそれ以上である、請求項16に記載の方法。
- 被検体由来の核酸サンプル中で、補体因子Hのアリル変異の発生を特定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- アリル変異が、rs1853883として特定される一塩基多型に対応する、補体因子Hのものである、請求項11に記載の方法。
- アリル変異が、核酸増幅アッセイを使用して特定される、請求項1に記載の方法。
- 核酸増幅アッセイが、PCR、逆転写酵素PCR(RT-PCR)、等温増幅、核酸配列に基づく増幅(NASBA)、5’蛍光ヌクレアーゼアッセイ(例えば、TAQMANアッセイ)、モレキュラービーコンアッセイ、およびローリングサークル増幅のいずれか一つを含む、請求項20に記載の方法。
- アリル変異が、アレイを用いて特定される、請求項1に記載の方法。
- アレイが、被検体由来の核酸サンプル中で、rs4146894、rs1045216、rs10490924、rs1882907、rs760336、rs763720、rs800292、rs1483883、およびrs1853886として特定される一塩基多型の1またはそれ以上に対応するアリル変異の発生を特定するための、1またはそれ以上の試薬、配列を含む、請求項22に記載の方法。
- アレイが、被検体由来の核酸サンプル中で、rs4146894、rs1045216、rs10490924、rs1882907、rs760336、rs763720、rs800292、rs1483883、およびrs1853886として特定される一塩基多型の2またはそれ以上に対応するアリル変異の発生を特定するための、1またはそれ以上の試薬を含む、請求項22に記載の方法。
- アリル変異が、染色体10q26のPLEKHA1/LOC387715/PRSS11遺伝子座において生じる、請求項1に記載の方法。
- 被検体に由来する核酸サンプル中で、加齢性黄斑変性症の発症のリスクと関連する染色体10q26上に位置するアリル変異の発生を特定するための、1またはそれ以上の試薬を、特定可能な遺伝子座中に含む基質を含む、アレイ。
- アリル変異が、rs4146894、rs1045216、rs10490924、rs1882907、rs760336、rs763720、rs800292、rs1483883、およびrs1853886として特定される1またはそれ以上の一塩基多型に対応する、請求項26に記載の方法。
- アリル変異が、染色体10q26のPLEKHA1/LOC387715/PRSS11遺伝子座に発生する、請求項26に記載のアレイ。
- アリル変異が、rs4146894、rs1045216、rs10490924、rs1882907、rs760336、rs763720、rs800292、rs1483883、およびrs1853886として特定される1またはそれ以上の一塩基多型に対応する、請求項26に記載のアレイ。
- 被検体由来の核酸サンプル中で、rs4146894、rs1045216、rs10490924、rs1882907、rs760336、rs763720、rs800292、rs1483883、およびrs1853886として特定される2またはそれ以上の一塩基多型に対応するアリル変異の発生を特定するための試薬を含む、請求項29に記載のアレイ。
- 試薬が、PLEKHA1またはLOC387715におけるアリル変異を特異的に特定するためのプライマーまたはプローブを含む、請求項26に記載のアレイ。
- アレイが、PLEKHA1またはLOC387715におけるアリル変異を特異的に特定するための再配列決定用プライマーを含む、請求項26に記載のアレイ。
- 2またはそれ以上の反応ウェル、およびPLEKHA1またはLOC387715の一方または両方に対して特異的なPCRプライマーセットを含む、請求項26に記載のアレイ。
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