DE60202877T2

DE60202877T2 - Gezieltes antikörper-verfahren

Info

Publication number: DE60202877T2
Application number: DE60202877T
Authority: DE
Inventors: Peter James Alderley Edge BURNIE; Christine Ruth Alderley Edge MATTHEWS; Patrick Gordon Glossop RIGG; Peter Manchester WILLIAMSON
Original assignee: Neutec Pharma Ltd
Current assignee: Neutec Pharma Ltd
Priority date: 2001-12-19
Filing date: 2002-12-16
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2022-12-17
Also published as: EP1415002A2; ES2236605T3; ATE288502T1; PT1415002E; EP1415002B1; WO2003052416A2; CA2471570A1; AU2002352394A1; DE60202877D1; WO2003052416A3; GB0130267D0; US20060233812A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Antikörpern, die spezifisch für eine Infektion durch Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien, Viren und Hefen, sind und gegen diese Immunität verleihen. Ebenso werden Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln, Verfahren zur Behandlung von Patienten unter Aufbau von Datenbanken, durch diese aufgestellten Datenbanken, Verfahren zur Herstellung von Berichten unter deren Berücksichtigung, Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit von Impfstoffen, Datenbanken, die hierdurch hergestellt wurden und Verfahren zur Erstellung von Berichten, die dies berücksichtigen.
Während des Verlaufs einer mikrobiellen Infektion werden verschiedene adaptive Strategien durch das Im munsystem eingesetzt. Eine solche Strategie, die wohl die größte Bedeutung besitzt, ist die Erzeugung einer Antikörperantwort. Antikörper, die zur Bindung von durch das infektiöse Mittel freigesetzten Antigenen in der Lage sind, werden hergestellt, binden an diese und ermöglichen die Tötung der Mikroorganismen durch Komplementaktivierung, Vermehrung von Makrophagen und durch direkte Interaktion mit den Mikroben selbst. Die therapeutische Wirksamkeit von Antikörpern, die zur Bindung der gegebenen Antigene in der Lage ist, variiert, was sich in der Tatsache widerspiegelt, dass die Antikörperproduktion durch das Immunsystem während des Verlaufs der Infektion ausläuft und im Fall eines Patienten, der sich erfolgreich einer Infektion entledigt hat, fokussiert wird.
Die Antikörperantwort wird durch das Repertoire der B-Zellen ausgelöst, wobei die individuellen B-Zellen jeweils strukturell unterschiedliche Antikörpermoleküle erzeugen. Die aktuelle Größe dieses Repertoires an B-Zellen/Antikörpern ist unbekannt, aber es wird geschätzt, dass die zufällige klonale Frequenz der Reaktivität für ein gegebenes Antigen etwa so hoch wie 1:100.000 in gezüchteten B-Zellen ist (Nobrega A et al., Eur J. Immunol. 1998 Apr; 28(4): 1204–15; PMID: 9565360). Während des Verlaufs der Infektion werden Antikörper, die zur Bindung des Erregers in der Lage sind, durch Wechsel in der Population der B-Zellen ausgewählt, was zu Schlüssel-Antikörpern führt, die in großer Anzahl erzeugt werden. Die Mechanismen für diese Wechsel schließen klonale Expansion, Isotypen-Wechsel und somatische Mutation der variablen Regionen des Immunoglobulins. B-Zellen, die für die Herstellung von Antikörpern verantwortlich sind, die zum Binden von multiplen Erregern in der Lage sind, verdrehen somit das Repertoire der B- Zellen und ändern die Verhältnisse der B-Zellen. Zum Beispiel war in einer Studie von B-Zellen, die aus Blut von Individuen mit Immunität und Antikörpern gegen Plasmodium falciparum (der ursächliche Erreger von Malaria), die Frequenz der Kreislauf-B-Zellen, die gegenüber dem Erreger reaktive Antikörper bilden, so hoch wie 1 in 1403 (in nicht-infizierten Individuen konnte keine Erregerreaktivität gefunden werden; Migot F. et al., Clin Exp Immunol. 1995 Dec; 102(3): 529–34; PMID: 8536368). Bei HIV-Infektionen konnte eine ähnliche Verzerrung des Kreislaufs des B-Zellen-Repertoires beobachtet werden, wobei die Frequenz der HIV-spezifischen Antikörper produzierenden B-Zellen neunmal höher in HIV + Individuen verglichen zu HIV-Subjekten (Zubler RH et al., Clin Exp Immunol. 1992 Jan; 87(1): 31–6; PMID: 1733635).
Es ist offensichtlich, dass es erwünscht ist, dazu in der Lage zu sein, die Behandlung von Infektionen im Patienten zu bewirken. Dies kann z.B. durch Impfung oder durch passive Immunotherapie genauso wie durch die Verwendung anderer therapeutisch wirksamer Chemikalien erfolgen. Typischerweise wird die Impfung dadurch erreicht, dass das Immunogen von dem infizierenden Erreger isoliert und gereinigt wird und als Basis, entweder in einer modifizierten oder in einer unmodifizierten Form, für einen Impfstoff verwendet wird, der dem Patienten zur Stimulierung der Antikörperproduktion verabreicht wird.
Die passive Immunotherapie kann durch Verabreichung eines Antikörpers bei einem Patienten erreicht werden und ist insbesondere bei der Behandlung von immunsupprimierten Patienten wirksam, die zu einer Antwort auf die Immunisierung nicht in der Lage sind, und bei Patienten, die eine sofortige Therapie benötigen und nicht auf das Wirksamwerden der Impfung warten können. Die passive Immunotherapie wird typischerweise durch Verabreichung eines monoklonalen Antikörpers, der gegenüber einem von einem Erreger erzeugten Immunogen spezifisch ist, bei einem Patienten erreicht. Somit muss ein Immunogen zuerst isoliert und gereinigt, Versuchstieren verabreicht, und es müssen Zellen hergestellt werden, die gegenüber dem geklonten Immunogen spezifisch sind, um die Behandlung des Patienten zu bewirken. Der Bereich der durch die Klone hergestellten Antikörper kann dann auf deren therapeutische Wirksamkeit getestet werden und ein einzelner monoklonaler Antikörper wird ausgewählt, der dann dem Patienten verabreicht wird, um eine passive Immunotherapie zu bewirken.
Offensichtlich sind all diese Techniken etwas kompliziert, unbequem, teuer und zeitaufwendig. Im Allgemeinen erfordern sie, dass ein Immunogen von dem infizierenden Erreger isoliert und zur Herstellung des Antikörpers verwendet wird. Das Immunogen einfach zu isolieren kann sehr schwierig und zeitaufwendig sein. Insbesondere stellen Carbohydrat-Antigene große Probleme dar – sie werden durch die Vertreter der Gruppe B Meningetidis, z.B. Neisseria meningitidis und Streptococcus agalactiae entwickelt. Es gibt auch komplexe nicht-lineare Epitope (d.h. mit sekundären, tertiären und quarternären Strukturmerkmalen), die nicht in-vitro synthetisiert werden können. Als solches ist es schlicht unmöglich, das Antigen für die Verwendung, z.B. als Impfstoff, zu isolieren und herzustellen. Zusätzlich werden einige Epitope nur durch Erreger in-vivo erzeugt und nicht in-vitro synthetisiert. Verschiedene gegenüber dem Wirt spezifische Expressionssysteme sind bekannt, z.B. werden in Gonorrhea (ursächlicher Organismus Neisseria gonor rhoeae) die spezifischen Antigene durch Infektion eines Wirts exprimiert, wobei solche Antigene in die allgemeine Klasse der Cryptantigene fallen. Weiterhin stellen hochlabile Antigene auch Probleme für Systeme des Standes der Technik dar, weil sie sich während der Verwendung einfach zersetzen und das Epitop, das sie entwickeln, verloren ist. Mit diesem großen Bereich von Epitopen/Antigenen, deren Identifizierung und/oder in-vitro-Verwendung von großer Schwierigkeit oder unmöglich ist, stellt die vorliegende Erfindung eine Lösung bereit und erlaubt die Herstellung und Isolierung von Antikörpern, die gegen diese spezifisch sind.
Zusätzlich muss der Stand der Technik typischerweise versuchen, ein Gleichgewicht der Affinitäts-Maturation von Antikörpern dadurch zu erreichen, dass zuerst ein Satz von Kandidaten-Antikörpern, die gegenüber einem Antigen spezifisch sind, synthetisiert, ihre Bindungscharakteristiken untersucht und dann die Sequenzen der Kandidaten modifiziert werden, um die Bindung zu optimieren. Ein sorgfältiger Versuch bei der Affinitäts-Maturation (d.h. die Optimierung der Antikörper-Bindung) kann die Synthese von tausend verschiedenen Antikörpern erfordern, was kostspielig und zeitaufwendig sein kann. Da die Antikörper der vorliegenden Erfindung von Patienten erlangt wurden, die entweder durch einen das Antigen entwickelnden Erreger infiziert oder die mit einem Antigen geimpft wurden, haben sie aufgrund ihrer wirklichen Natur und Definition bereits eine Affinitäts-Maturation unterlaufen, wie es ganz offensichtlich durch die Sequenzen ihrer CDR3-Bereiche gezeigt wird.
Die vorliegende Erfindung versucht die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung von Kandidaten-Sequenzen zumindest des CDR3-Bereiches von Antikörpern, die gegenüber mindestens einem Antigen, das durch einen Mikroorganismus während einer Infektion erzeugt wird, oder gegenüber einem Impfstoff spezifisch sind, mit den folgenden Schritten:

(i) Isolierung von B-Zellen mindestens eines Patienten, der durch den Mikroorganismus infiziert wurde oder dem der Impfstoff verabreicht wurde und Sequenzierung zumindest des CDR3-Bereiches der VH und/oder VL codierenden Bereiche der B-Zellen und
(ii) Korrelation der zumindest die CDR3-Bereiche der VH und VL codierenden Bereiche der B-Zellen sequenzierten Zellen, um eine Gruppe von Kandidatensequenzen für wenigstens einen CDR3-Bereich der Antikörper, die gegenüber wenigstens einem Antigen, das durch den Mikroorganismus erzeugt wurde oder gegenüber dem Impfstoff spezifisch ist, zu bestimmen, wobei jede aus der Gruppe von CDR3-Kandidatensequenzen oder einer Sequenz mit wenigstens 60% Homologie hiermit insgesamt bei einer Frequenz mit mindestens 1% in der Gruppe der in Schritt (i) bestimmten Sequenzen auftritt.

Beispiele für Patienten, die als Quelle von B-Zellen in solch einem Verfahren eingesetzt wurden, sind Menschen oder andere Säugetiere, wie z.B. Mäuse, Hasen, Ratten, Paviane, Affen und Menschenaffen.
In gewissen Ausführungsformen der Erfindung kann Schritt (i) die Schritte umfassen:

(i)(a) Isolierung der B-Zellen von mindestens einem Patienten, der durch den besagten Mikroorganismus infiziert wurde oder dem der besagte Impfstoff verabreicht wurde und
(i)(b) Sequenzierung zumindest des CDR3-Bereiches von den VH- und/oder VL-codierenden Bereichen der besagten B-Zellen.

Die Sequenzen, die insgesamt mit einer Frequenz von mindestens 1 Prozent in dem Satz der in Schritt (i) bestimmten Sequenzen auftreten, können die CDR3-Kandidatensequenzen oder eine Sequenz mit mindestens 80% Homologie, z.B. 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99% Homologie hiermit aufweisen. Die Sequenzhomologie wurde unter Verwendung des BLAST2-Programms (Tatusova TA et al., FEMS Microbiol Lett. 1999 May 15, 174(2): 247–50; PMID: 10339815) am „National Centre for Biotechnology Information USA (www.ncbi.nlm.nih.gov) mit vorgegebenen Parametern bestimmt.
Beispielsweise können die Sequenzen, die insgesamt mit einer Frequenz von mindestens 1% in dem Satz der in Schritt (i) bestimmten Sequenzen auftreten, CDR3-Kanndidatensequenzen oder eine Sequenz mit einem oder zwei Aminosäurenwechseln hiervon sein. Beispielsweise kann eine erste Sequenz bei einer Frequenz von 0,7% und erste, zweite, dritte und vierte Sequenzen jeweils mit einem einzelnen Aminosäurenwechsel hiervon bei einer Frequenz von 0,1% auftreten – die gesamte Menge ist daher 1,1% und die dominante Antikörper-Sequenz (die bei einer Frequenz von 0,5% auftritt) ist daher eine CDR3-Kandidatensequenz.
Dies unterscheidet sich fundamental von den Methoden nach dem Stand der Technik, bei dem eine Bibliothek von Antikörpern in einem Vektor, wie z.B. eine Phagen-Bibliothek, wobei die Antikörper durch Panning isoliert wurden und die die Bindung mit einem spezifischen (bekannten) Antigen in einem struktur- und ladungsspezifischen Zustand erfordern. Eine Analogie, bei der die beiden miteinander verglichen werden können, wäre zu sagen, dass die aus dem Stand der Technik bekannte Herstellung einer Bibliothek und das nachfolgende Panning vergleichbar damit sind, in eine Bibliothek zu gehen, ein Buch zu nehmen und zu hoffen, dass es das richtige ist. Im Vergleich hierzu ist die vorliegende Erfindung, wie in eine Bibliothek zu gehen, alle Bücher in der Bibliothek zu lesen und herauszufinden, dass ein Buch dominant ist – dass dort viele Kopien hiervon sind – und dass es für die zu behandelnde Krankheit relevant ist.
Zusätzlich weist die aus dem Stand der Technik bekannte Verwendung von Bibliothek-Systemen eine Vielzahl von signifikanten Problemen auf – insbesondere können einige Antikörper, die durch eine Bibliothek erzeugt wurden, den Tod von diesen exprimierenden Organismen verursachen und daher können sie nicht einfach bestimmt werden. Dies ist kein besonderes Problem, wenn z.B. nach gegen Krebs spezifischen Antikörpern gesucht wird, aber wenn man nach Antikörpern sucht, die gegenüber einem Antigen von einem Erreger spezifisch sind, der homolog zu einem durch das Expressionssystem des Wirtes (z.B. E. coli) produzierten Antigen sein könnte, können wichtige Antikörper nicht exprimiert werden. Die Verwendung von z.B. E. coli um Bibliotheken von z.B. menschlichen Antikörpern zu exprimieren leidet auch unter dem Problem der Verwendung von Kodon. Kodone, die von Menschen für spezifische Aminosäuren verwendet werden, können oft nicht die optimalen Kodone für die gleiche Aminosäure in E. coli oder anderen Wirtsystemen sein. Dies bedeutet, dass ein wichtiger Antikörper nicht exprimiert werden könnte (oder zumindest nicht in ausreichenden Mengen), weil die Kodone in ihrer Sequenz in E. coli sehr ineffizient sind, was dazu führt, dass E. coli nicht zum durchlesen und vollständigen exprimieren geeignet ist. Die Optimierung von Kodon von Antikörper-Bibliotheken ist offensichtlich keine Option, da die Bibliotheken zuerst sequenziert werden müssten, was die hauptsächlichen Vorteile der Verwendung der Bibliotheken zunichte macht. Da die vorliegende Erfindung Antikörper direkt vom Patienten sequenziert, wird dieses Problem vermieden.
Der Korrelationsschritt (i) kann auch das Auftreten von Kandidatensequenzen gegen das Auftreten in Patienten, die nicht mit den Mikroorganismen infiziert wurden oder denen der Impfstoff verabreicht wurde, korrelieren, wobei Sequenzen nur dann als Kandidatensequenzen bestimmt werden, wenn sie oder eine Sequenz mit einem oder zwei Aminosäurenaustauschen insgesamt in einer Frequenz von weniger 1% in dem nichtinfizierten/geimpften Patienten auftritt.
Das mindestens eine durch den Mikroorganismus produzierte Antigen kann natürlich ein Immunogen sein.
Die vorliegende Erfindung stellt einzelne Möglichkeiten für das Verständnis von Antikörperantworten auf Infektionen bereit, die zuvor nicht zur Verfügung standen und stellt neue diagnostische und therapeutische Möglichkeiten vor.
Insbesondere umgehen die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung das Erfordernis, ein Antigen von dem Mikroorganismus zu isolieren und stattdessen die I dentität der Antikörper, die gegen einen oder mehrere durch den Mikroorganismus erzeugte Antigene spezifisch sind, zu bestimmen. Wie im Folgenden erklärt, erlauben die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die Identifizierung von therapeutisch wirksamen Antikörpern und erlauben die Identifizierung der wichtigsten Bereiche von Antikörper-Sequenzen. Dies ist insbesondere erwiesen, wenn die B-Zellen eines Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten während des Verlaufs einer Infektion mit einem Mikroorganismus gesammelt werden, weil das Immunsystem des Patienten auf die Herstellung therapeutisch wirksamer Antikörper gegen den infizierenden Mikroorganismus fokussiert wird, wobei eine Fokussierung von Antikörper-Sequenzen und die Entwicklung von variablen und nicht-variablen Bereichen innerhalb der CDR-Bereiche der VH- und VL-Sequenzen beobachtet wird. Zusätzlich erlauben die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die Identifizierung von Antikörpern, die für die Behandlung der Infektion bestimmter Patientengruppen, z.B. Alter, Geschlecht und Rasse, am Besten geeignet sind. Gleichzeitig können durch den Vergleich von Antikörper-Sequenzen von Patienten, die sich von der Infektion erholt haben, mit Patienten, die sich von der Infektion nicht erholt haben, ineffiziente Antikörper-Sequenzen (die durch beide Gruppen von Patienten erzeugt werden können) identifiziert werden.
Die von dem mindestens einen Patienten isolierten B-Zellen können periphere B-Zellen-Lymphozyten (PBLs) sein und können aus einer Blutprobe von dem mindestens einen Patienten isoliert werden. B-Zellen können auch aus anderen Quellen isoliert werden und die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf deren Verwendung, z.B. können B-Zellen aus der Milz isoliert werden.
CDR-Sequenzen der Antikörper können, wie im Abschnitt „Versuche" detailliert beschrieben, unter Verwendung von Standardtechniken und Definitionen von deren Beginn und Ende bestimmt werden.
Wie weiter unten detailliert aufgeführt, werden die Antikörper-Sequenzen von Patienten mit spezifizierten Infektionen bestimmt. Diese Sequenzen können von B-Zellen-Immunoglobulin-mNRA erhalten werden und spiegeln somit die exprimierten Antikörper und deren Repertoire wider. Die gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmten Sequenzen müssen keine Sequenzen eines ganzen Antikörpermoleküls sein – sie umfassen wenigstens die VH- und VL-Sequenzen, die die für die Antigen-Bindung verantwortlichen Bereiche spezifizieren.
Von den Nukleotid-Sequenzen, die durch die anfängliche Sequenzierung bestimmt wurden, können vermeintliche Aminosäure-Sequenzen für die VH- und VL-Bereiche unter Verwendung von Standard-Algorithmen und Software-Packeten bestimmt werden (z.B. siehe www.mrclmb.cam.ac.uk/pubseq/, das Staden-Package und Gap4-Programm). Diese können weiter charakterisiert werden, um die CDR-Bereiche (engl. Complementarity Determining Region) der VH- und VL-Sequenzen, insbesondere CDR1, CDR2 und CDR3, zu bestimmen. Methoden zur Bestimmung der vermeintlichen Aminosäure-Sequenzen und die Identifizierung der CDR-Bereiche sind bekannt und werden weiter unten detailliert beschrieben.
Genauso wie die VH- und/oder VL-Aminosäure-Sequenzen können verschiedene Stücke zusätzlicher Informationen im Korrelationsschritt verwendet werden:

(i) der die Infektion des Patienten verursa chende Mikroorganismus;
(ii) der Ort der Infektion;
(iii) der Zeitpunkt während des Infektionsprozesses, zu dem Antikörper-Sequenzen gesammelt werden;
(iv) Details der Patienten – keines oder mehr von: Geschlecht, Rasse und Alter; und
(v) der Bereich der komplementären Bestimmungsbereiche (CDR), d.h. die variablen Regionen der Antikörper, die eine direkte Bindung/Kontakt des Antigens durchlaufen.

Somit können in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung B-Zellen verwendet werden, die von mindestens einem Patienten zu einer Vielzahl von Zeitpunkten während der Infektion des mindestens einen Patienten durch den Mikroorganismus (oder nach Impfung) isoliert wurden, wobei der Korrelationsschritt den Zeitpunkt während der Infektion des mindestens einen Patienten durch den Mikroorganismus, an dem die B-Zellen isoliert werden, korreliert.
Gleichzeitig können in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung B-Zellen verwendet werden, die von mindestens zwei Patienten isoliert wurden, wobei mindestens einer der Patienten sich von der Infektion durch den Mikroorganismus erholt hat und mindestens ein Patient sich von der Infektion durch den Mikroorganismus nicht erholt hat, wobei der Korrelationsschritt (ii) die Wiederherstellung der mindestens zwei Patienten von der Infektion durch den Mikroorganismus korreliert.
Gleichzeitig können in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung B-Zellen verwendet werden, die von mindestens zwei Patienten isoliert wurden, wobei die Patienten durch verschiedene Mikroorganismen, die mindestens ein Antigen produzieren, infiziert wurden, sodass der Korrelationsschritt (ii) die sequenzierten mindestens VH- und VL-Kodierungsbereiche der B-Zellen zur Identifizierung eines Satzes von Kandidatensequenzen für Antikörper korreliert, wobei von diesem jeder spezifisch gegen mindestens ein geteiltes Antigen ist, das durch verschiedene Mikroorganismen produziert wird oder spezifisch gegen verschiedene Antigene ist, die durch verschiedene Mikroorganismen produziert werden.
Die Sequenzierung der VH- und VL-Bereiche kann auch verwendet werden, um das umgebende Antikörper-System zu identifizieren und dies kann verwendet werden, um den Antikörper-Isotyp zu bestimmten. Dies kann dann im Korrelationsschritt verwendet werden, um zu bestimmen, ob spezifische Antikörper-Isotypen besonders nützlich sind.
Es wurden Experimente durchgeführt, um die VH- und VL-Bereiche von PBLs zu sequenzieren, die von Patienten mit Methicillin-resistenten Stahylococcus aureus (MRSA), Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa (der ursächliche Erreger von Mukoviszidosi), Streptococcus oralis und Vancomycin-resistenten Enterococci(VRE)-Infektionen isoliert wurden, und um Antikörper-Sequenzen zu identifizieren, die mit der Resistenz zu den Infektionen verbunden sind und die daher verwendet werden können, um die Therapie gegen solche Infektionen zu bewirken. Diese Sequenzen bilden die Basis der GB 0127983 und der WO 01/76627.
Von all diesen zeigen die isolierten VH- oder VL-Sequenzen ein Verdrehen des Antikörper-Repertoires während des Verlaufs der Infektion, wodurch die Identi tät der maturierten, Immunität verleihenden VH- und VL-Sequenzen offenbart wird. Dies wurde typischerweise unter Verwendung von 5000 bis 15000 Sequenzen für jedes VH oder VL erreicht. Die Repertoires von VH und VL von gesunden Individuen können auch zu Vergleichszwecken verwendet werden.
Unter dem Begriff „Therapie" ist jede Behandlung zu verstehen, die dafür entworfen wurde, deren Symptome zu kurieren, zu lindern, zu entfernen oder abzuschwächen, oder die Möglichkeit zu verhindern oder reduzieren, an einer Funktionsstörung oder Fehlfunktion des menschlichen oder tierischen Körpers zu erkranken.
Die Erfindung ist geeignet für die Identifizierung einer Antikörper-Sequenz, die für die Behandlung der obigen, genauso wie aller anderen Infektionen, nützlich sind, wie z.B. Virus-Infektionen, bei denen sich Antikörper als wichtig gezeigt haben (einschließlich, aber nicht beschränkt auf HIV, Influenza-Virus, Hepatitis-Viren A, B, C und D, hämorrhagische Viren wie Ebola, sowie Denguefiber- und Gelbfiber-Viren) ebenso wie parasitäre Infektionen wie Malaria (P. falciparum).
Unter Verwendung der zuvor genannten zusätzlichen Informationsfelder im Korrelationsschritt (ii) ist es einfach, die Korrelation durchzuführen, indem z.B. nur CDR-Sequenzen, CDRs von entweder einem bestehenden Patienten oder einer bestehenden Infektion oder beiden, CDRs von einer bestehenden Stelle oder Patientengruppe oder CDRs von verschiedenen Probenahmezeiten während des Verlaufs der Infektion verwendet werden.
Diese Korrelationen sind CDR-spezifisch, da diese die hypervariablen Bereiche sind, die für die Antigen-Bindung und für die Sequenzen-Vielfalt des Antikörper-Repertoires verantwortlich sind (obwohl die Systembereiche in dem Korrelationsschritt genauso verwendet werden können, wie zur Preisgabe des Antikörper-Isotyps).
Die vorliegende Erfindung ist in einem weiten Bereich von Anwendungen nützlich, z.B. der Antikörper-Therapie und Impfungsstudien.
Antikörper-Therapie:
Dies erfordert den passiven Transfer des Antikörpers zu nicht-immunen Individuen (z.B. Patienten, die sich einer Chemo- oder Radio-Therapie unterziehen, Immunosuppression für organische Transplantationen mit geschwächtem Immunsystem aufgrund zugrunde liegender Bedingungen, wie Diabetes, Trauma, etc, ebenso die sehr jungen oder sehr alten).
Die vorliegende Erfindung kann zur Bestimmung der Sequenzen von Immunität übertragenden Antikörpern durch die Suche nach überrepresentierten VH- und VL-Sequenzen in Patienten, die die Infektion überstanden haben, bestimmt werden. Diese schützenden Antikörper können auf dem genetischen Niveau wiederhergestellt, in E. coli (oder anderen Expressionssystemen) über-exprimiert und gereinigt werden. Der resultierende gereinigte rekombinante Antikörper kann dann Patienten als eine passive Immunotherapie verabreicht werden. Antikörper können ebenso von kommerziellen Anbietern, wie Operon Technologies Inc., USA (www.operon.com) durch deren einfache Versorgung mit der Sequenz des herzustellenden Antikörpers erhalten werden.
Therapeutisch nützliche Sequenzen können in einer Vielzahl von Wegen identifiziert werden, die im Korrelationsschritt (ii) verwendet werden können:

1) Durch die Suche nach einer Überrepresentation der Antikörper-Sequenz im Patienten, die sich von der Infektion erholt haben – B-Zellen, die zur Bindung des Erregers fähige Antikörper produzieren, durchlaufen eine klonale Expansion, daher sind Antikörper-Sequenzen hoher Frequenz wahrscheinlicher, dass sie die Erreger binden und Immunität übertragen.
2) Durch nachfolgende Änderungen im Antikörper-Repertoire während des Verlaufs der Infektion. Während der Infektion durchlaufen Antikörper einen Maturationsprozess um die Bindung des Erregers zu verbessern, und dies ist durch Sequenz-Änderungen gekennzeichnet. Ebenso ist die klonale Expansion von B-Zellen in den Endstadien der Infektion, in denen die Infektion beseitigt wird, vorherrschender. Die häufigsten Antikörper im Repertoire werden als Kandidaten für eine Immunotherapie ausgewählt. Im Anschluss an den Maturationsprozess zeigt der Kandidaten-Antikörper, welche Änderungen der Schlüssel-Aminosäurenreste die Bindung des Antigens verbessern und diese Information kann zur Verbesserung der Antikörper-Synthese genutzt werden.
3) Die Analyse der Repertoires von verschiedenen Patienten mit der gleichen Infektion kann geteilte und identische schützende Antikörper identifizieren. Diese Antikörper sind eine bevorzugte Auswahl für die Immunotherapie, da ihre Anwesenheit in verschiedenen Patienten eine stark positive Auswahl in deren Eignung vorschlägt, daher spielen diese eine wichtige Rolle in der Antikörper-basierten Immunität.
4) Analyse der Repertoires von Patienten mit unterschiedlichen Infektionen. In dieser Situation kann der Antikörper, wenn eine gemeinsame Antikörper-Sequenz in den Repertoires für beide Erreger gefunden wurde, nützlich für die Behandlung beider Infektionstypen sein, d.h. ein breites Spektrum offenbaren.
5) Analyse der Repertoires für Affinitäts-Maturation der Sequenzen.

Impfstudien:
Eine Impfung schützt gegen Infektionen durch Vorbereitung des Immunsystems mit einem Antigen bzw. Antigenen, die vom Erreger stammen. Die Impfung wird dadurch bewirkt, dass ein einzelnes oder wiederholtes Aussetzen gegenüber dem Antigen bzw. den Antigenen, die vom Erreger stammen, erfolgt, und erlaubt die Maturation der Antikörper und die klonale Expansion der B-Zellen ohne die schädlichen Effekte des kompletten infektiösen Prozesses. Die Einbindung von T-Zellen ist ebenso von großer Bedeutung, um eine Impfung von Patienten zu erreichen. Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um den Immunisierungsprozess mit experimentellen Impfstoffen zu beobachten. Der experimentelle Impfstoff wird einem Subjekt verabreicht und die VH- und VL-Sequenzen werden vom Patienten amplifiziert und das Antikörper-Repertoire, wie zuvor beschrieben, analysiert. Es ist eine qualitative und quantitative Beurteilung des Impfprozesses möglich:

1) Das VH/VL-Repertoire einer Gruppe von Patienten, denen ein experimenteller Impfstoff verabreicht wurde, wurde untersucht. Es kann eine präzise molekulare Zerlegung der resultierenden Antikörperantwort auf den Impfstoff durchgeführt werden, um (a) eine klonale Expansion der schützenden Antikörper, (b) schützende Antikörper-Herstellung in verschiedenen Populationen (z.B. verschiedene ethnische Gruppen mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund genauso wie z.B. Alter und Geschlechtsgruppen) und (c) den Langzeiteffekt des Impfstoffs, d.h. die Antikörperantwort über den langen Zeitraum, Langzeit-Antikörper-Erinnerung in dem Immunsystem genauso wie jeder Autoimmundeffekt, zu bestimmen.
2) Wenn die Impfung zu einer erhöhten Frequenz eines verabreichten Antikörpers führt, kann die Antikörper-Sequenz einfach kloniert und exprimiert und in Versuchstieren der Infektion verwendet werden. Wenn der Antikörper schützend ist, kann er für sich nützlich in der Immunotherapie sein, aber dies zeigt, dass der Impfstoff wahrscheinlich schützend sein kann, ohne dass das menschliche Subjekt einer experimentellen Infizierung unterworfen werden muss. Alternativ, in Abwesenheit eines geeigneten Versuchstieres, kann der geklonte schützende Antikörper in Zellkulturen bewertet werden (insbesondere nützlich für menschliche Studien mit HIV und anderen Viren). Dies ist ein einzigartiger Ansatz für die Untersuchung der Wirksamkeit von Impfstoffen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ebenso ein Ver fahren zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Infektion durch einen Mikroorganismus, der mindestens ein Antigen produziert, bereitgestellt, das folgende Schritte umfasst:

(i) Durchführung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung eines Satzes von Kandidatensequenzen für Antikörper, die gegen das mindestens eine durch den Mikroorganismus produzierte Antigen spezifisch sind und
(ii) Synthese wenigstens eines Antikörpers, der eine Kandidatensequenz aufweist, die spezifisch gegen das mindestens eine durch den Mikroorganismus produzierte Antigen ist.

Solch ein Arzneimittel kann natürlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Vehikel einschließen (Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia, 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA; United States Pharmacopoeia, ISBN: 1889788031).
Erfindungsgemäß wird ebenso ein Verfahren zur Behandlung einer Infektion eines Patienten durch einen Mikroorganismus, der mindestens ein Antigen produziert, bereitgestellt, mit folgenden Schritten:

(i) Durchführung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, um einen Satz von Kandidatensequenzen für Antikörper, die gegen das mindestens eine durch den Mikroorganismus produzierte Antigen spezifisch sind, zu identifizieren;
(ii) Synthese mindestens eines Antikörpers, der eine Kandidatensequenz aufweist, die gegenüber dem mindestens einen Antigen, das durch den Mikroorganismus produziert wurde, spezifisch ist und
(iii) Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des mindestens einen synthetisierten Antikörpers beim Patienten.

Erfindungsgemäß wird ebenso ein Verfahren bereitgestellt zur Erstellung einer Datenbank zur Identifizierung von Kandidatensequenzen für Antikörper, die gegen mindestens ein durch einen Mikroorganismus produziertes Antigen spezifisch sind, mit folgenden Schritten:

(i) Durchführung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung eines Satzes von Kandidatensequenzen für Antikörper, die gegen mindestens ein durch einen Mikroorganismus produziertes Antigen spezifisch sind, und
(ii) Speichern der durch das besagte Verfahren erstellten Daten in der Datenbank.

Es wird auch ein Verfahren zur Erstellung eines Reports zur Identifizierung von Kandidatensequenzen für Antikörper, die gegen mindestens ein durch einen Mikroorganismus produziertes Antigen spezifisch sind, bereitgestellt, mit folgenden Schritten:

(i) Durchführung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung eines Satzes von Kandidatensequenzen für Antikörper, die gegen mindestens ein durch den Mikroorganismus produziertes Antigen spezifisch sind, und
(ii) Erstellung eines Reports, der die durch das Verfahren nach Schritt (i) erstellten Daten umfasst.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Impfstoffs mit folgenden Schritten bereitgestellt:

(i) Sequenzierung zumindest des CDR3-Bereiches von den VH- und/oder VL-Kodierungsbereichen mit B-Zellen, wobei die B-Zellen von mindestens einem Patienten, dem der besagte Impfstoff verabreicht wurde, isoliert wurden, und
(ii) Korrelation des sequenzierten zumindest CDR3-Bereiches der VH- und/oder VL-Kodierungsbereiche besagter B-Zellen zur Identifizierung eines Satzes von Kandidatensequenzen zumindest für den CDR3-Bereich von Antikörpern, die gegen den besagten Impfstoff spezifisch sind, wobei jede des besagten Satzes von CDR3-Kandidatensequenzen oder einer Sequenz mit mindestens 60% Homologie hiermit insgesamt mit einer Frequenz von mindestens 1% in dem in Schritt (i) bestimmten Satz von Sequenzen auftritt.

In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann der obige Schritt (i) folgende Schritte umfassen:

(i)(a) Verabreichung des besagten Impfstoffs bei mindestens einem Patienten;
(i)(b) Isolierung von B-Zellen des mindestens einen Patienten und
(i)(c) Sequenzierung zumindest des CDR3-Bereiches der VH- oder VL-Kodierungsbereiche der besagten B-Zellen.

Der Korrelationsschritt (ii) kann die Korrelation des besagten sequenzierten zumindest CDR3-Bereiches der VH- und VL-Kodierungsbereiche der besagten B-Zellen mit sequenzierten zumindest CDR3-Bereichen der VH- und VL-Kodierungsbereiche von B-Zellen, die von mindestens einem Patienten stammen, der durch einen Mikroorganismus infiziert ist, gegen den die Impfung mit dem besagten Impfstoff die Stimulierung einer schützenden Immunantwort beabsichtigt, umfassen.
Wie zuvor beschrieben, können zusätzliche Informationen in der Korrelation von Schritt (ii) eingesetzt werden, einschließlich:

(i) die Zeit seit Verabreichung des Impfstoffs;
(ii) Patientendetails – keines oder mehr von: Geschlecht, Rasse, und Alter; und
(iii) der Bereich der komplementären Bestimmungsregion (CDR), d.h. die variablen Regionen des Antikörpers, die eine direkte Bindung/Kontakt des Antigens durchlaufen.

Die Antikörper-Sequenzen, die vom Patienten bestimmt wurden, denen der Impfstoff verabreicht wurde, können mit den Antikörper-Sequenzen verglichen werden, die von Patienten isoliert wurden, die durch den Mikroorganismus infiziert wurden, gegen den der Impfstoff zur Stimulation einer schützenden Immunantwort im Patienten beabsichtigt ist. Somit ist es möglich, festzustellen, ob der Impfstoff zu der Generation von Antikörpern führt, die auch in Antwort auf die Infekti on durch den Mikroorganismus selbst erzeugt werden. Insbesondere kann der Vergleich durchgeführt werden, indem Antikörper-Sequenzen verwendet werden, die von Patienten bestimmt wurden, die sich von der Infektion durch den Mikroorganismus erholt haben.
Insbesondere kann durch das Verfahren die Wirksamkeit des Impfstoffs bei der Stimulierung einer schützenden Immunantwort gegen den Mikroorganismus, gegen den die Impfung mit dem Impfstoff zur Stimulierung einer schützenden Immunantwort beabsichtigt ist, bestimmt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ebenso ein Verfahren zur Impfung eines Patienten gegen eine Infektion durch einen Mikroorganismus mit folgenden Schritten bereitgestellt:

(i) Durchführung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung mit mindestens einem Impfstoff zur Bestimmung der Wirksamkeit des mindestens einen Impfstoffs bei der Stimulation einer schützenden Immunantwort gegen den Mikroorganismus, gegen den die Impfung mit dem mindestens einen Impfstoff zur Stimulierung einer schützenden Immunantwort beabsichtigt ist;
(ii) Korrelation der Ergebnisse von (i) zur Bestimmung des am Besten geeigneten von dem mindestens einen Impfstoff für den Patienten und
(iii) Impfung des Patienten mit dem am Besten geeigneten von dem mindestens einen Impfstoff.

Bereitgestellt wird auch ein Verfahren zur Erstellung einer Datenbank, die die Wirksamkeit eines Impfstoffs identifiziert, mit folgenden Schritten:

(i) Durchführung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung der Wirksamkeit des Impfstoffs und
(ii) Speicherung der durch das Verfahren erstellten Daten in der Datenbank.

Ebenso wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Erstellung eines Reports, der die Wirksamkeit eines Impfstoffs identifiziert, mit folgenden Schritten bereitgestellt:

(i) Durchführung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung der Wirksamkeit des Impfstoffs und
(ii) Erstellung eines Reports, der die durch das Verfahren erstellten Daten umfasst.

Was die einsetzbaren Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft, können insbesondere synthetische Antikörper eingesetzt werden (der Begriff „Antikörper" wird auch so aufgefasst, dass er Antigen-bindende Fragmente von Antikörpern umfasst, sofern der Kontext nichts anderweitiges erfordert), wobei der Antikörper ein ganzer Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon sein und im Allgemeinen zu jeder Immunoglobulin-Klasse gehören kann. Somit kann er z.B. ein IgM- oder ein IgG-Antikörper sein. Der Antikörper oder das Fragment kann tierischen Ursprungs sein, z.B. von einem Säugetier, und kann z.B. von Mäusen, Ratten, Schafen oder Menschen stammen. Es kann ein natürlicher Antikörper oder ein Fragment hiervon sein oder, wenn gewünscht, ein rekombinantes Antikörper-Fragment, d.h. ein Antikörper oder ein Antikörper-Fragment, das unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt wurde.
Besondere rekombinante Antikörper oder Antikörper-Fragmente schließen ein: (1) solche mit einer Antigen-Bindungsstelle, die zumindest teilweise von einem unterschiedlichen Antikörper erhalten wurde, z.B. solche, in denen die hypervariablen oder komplementären Bestimmungsregionen eines Antikörpers in den variablen Netzwerkbereich eines zweiten unterschiedlichen Antikörpers (wie beschrieben, z.B. in EP 239 400 ) gepfropft wurde; (2) rekombinante Antikörper oder Fragmente, in denen von Fv verschiedene Sequenzen durch von Fv verschiedene Sequenzen von anderen, hiervon verschiedenen Antikörpern, substituiert sind (wie beschrieben in z.B. EP 171 496 , EP 173 494 und EP 194 276 ), oder (3) rekombinante Antikörper oder Fragmente, die im Wesentlichen die Struktur eines natürlichen Immunoglobulins aufweisen, aber in denen der Hinge-Bereich eine unterschiedliche Anzahl von Cystein-Resten im Vergleich zu den in natürlichem Immunoglobulin gefundenen besitzt, aber worin ein oder mehrere Cystein-Reste in der Oberflächentasche des rekombinanten Antikörpers oder Fragmentes anstelle eines Aminosäurerestes, der in natürlichem Immunoglobulin anwesend ist, vorliegt (wie z.B. beschrieben in WO 89/01782 und WO 89/01974).
Die Lehren aus Druckschriften, wie z.B. Harlow, E. and Lane, D. („Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998), beschreiben ausführlich Antikörper, Antikörper-Fragmente, deren Herstellung und Verwendung.
Der Antikörper oder das Antikörper-Fragment kann polyklonalen oder monoklonalen Ursprungs sein. Er kann spezifisch für mindestens ein Epitop sein.
Antigen-bindende Antikörper-Fragmente schließen z.B. Fragmente ein, die durch proteolytische Spaltung eines ganzen Antikörpers erhalten wurden, z.B. die Fragmente F(ab')2, Fab' oder Fab, oder Fragmente, die durch rekombinante DNA-Techniken erhalten wurden, z.B. Fv-Fragmente (wie z.B. in WO 89/02465 beschrieben).
Die Antikörper gemäß der Erfindung können unter Verwendung bekannter immunologischer Techniken hergestellt werden. Somit kann z.B. jedem geeigneten Wirt das Protein injiziert und dessen Blut gesammelt werden, um den gewünschten polyklonalen Antikörper nach angemessener Reinigung und/oder Konzentrierung zu erhalten (z.B. durch Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung des immobilisierten Proteins als dem Affinitäts-Medium). Alternativ können Splenozyten oder Lymphozyten vom mit dem Protein injizierten Wirt erhalten und unter Verwendung z.B. der Methode nach Kohler et al. (1976, Eur. J. Immunol,. 6: 511) immortalisiert werden, wobei die resultierenden Zellen isoliert werden, um eine einzelne genetische Linie zur Herstellung monoklonaler Antikörper zu erhalten. Die Antikörper-Fragmente können unter Verwendung konventioneller Techniken hergestellt werden, z.B. durch enzymatische Verdauung mit Pepsin oder Papain. Wo die Herstellung rekombinanter Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung erwünscht ist, können diese z.B. unter Verwendung der Verfahren hergestellt werden, wie sie in EP 171 469 , EP 173 494 , EP 194 276 und EP 239 400 beschrieben sind.
Erfindungsgemäße Antikörper können mit einem detektierbaren Marker markiert werden oder können mit ei nem Wirkungsmolekül, z.B. einem Arzneimittel, beispielsweise einem antibakteriellen Mittel oder einem Toxin oder einem Enzym, unter Verwendung konventioneller Verfahren konjugiert werden, sodass sich die Erfindung auf solche markierten Antikörper oder Antikörper-Konjugate erstreckt.
Die Inhalte von allen Referenzen, die hier diskutiert wurden, einschließlich der dort zitierten Referenzen, werden hiermit mittels Querverweis in ihrer Gesamtheit einbezogen.
Wo „PMID"-Referenznummern für Veröffentlichungen angegeben sind, beziehen sich diese auf die PubMed-Identifizierungsnummern, wie sie durch die US National Library of Medicine zugeordnet sind, von denen die vollständige bibliographische Information und Zusammenfassungen für jede Veröffentlichung auf www.ncbi.nlm.nhi.gov erhältlich sind.
Die Erfindung wird durch die folgende Beschreibung mit Bezug auf die verschiedenen Figuren der begleitenden Zeichnungen weiter ersichtlich, wobei die Zeichnungen, alleine anhand von Beispielen, Formen der Identifizierung von Kandidatensequenzen für Antikörper, die spezifisch gegen mindestens ein Antigen sind, und die Bestimmung der Wirksamkeit eines Impfstoffs zeigen.
Aus den Figuren:
1 zeigt die allgemeinen Prinzipien für die Isolierung und DNA-Sequenzierung von VH- und VL-Antikörper-Genfragmenten von B-Zellen. Bezugszeichen 10 zeigt die primäre PCR, Bezugszeichen 20 die Klonierung in einen DNA-Sequenzierungsvektor unter Verwendung der T-Tailing-Prinzips der zufälligen Orientierung und Bezugszeichen 30 die Bestimmung der Nukleotidsequenz von Vorwärts- und Rückwärts-Strängen unter Verwendung von M13-Primern, die vorwärts oder rückwärts gerichtet sind; und
2 zeigt eine schematische Darstellung einer resynthetisierten Gen-Kassette von rekombinanten Antikörpern. Die VH- und VL-Bereiche sind mit einem Linker verbunden, der reich an Glycinserin ist. Jede variable Domaine enthält drei komplementäre Bestimmungsregionen (CDRs), die an der Antigen-Bindung partizipieren.
Versuche
Die folgenden Experimente beschreiben im Detail Verfahren zur Identifizierung von VH- und VL-Antikörper-Sequenzen, die Patienten mit viralen, bakteriellen oder parasitären Infektionen Immunität verleihen. Diese Sequenzen werden dann zur Herstellung synthetischer Antikörper verwendet, wobei diese synthetischen Antikörper für die Verabreichung bei Patienten zu Therapiezwecken geeignet sind.
Ebenso werden im Detail Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Impfstoffs bei der Erzeugung einer gewünschten Immunantwort in einem Patienten beschrieben.
Sofern nichts anderes angegeben ist, wurden alle Verfahren unter Verwendung von Standard-Protokollen und dem Benutzerhandbuch folgend, sofern anwendbar, durchgeführt. Die Standard-Protokolle für verschiedene Techniken, einschließlich PCR, molekularer Klonierung, Manipulation und Sequenzierung, Herstellung der Antikörper, Epitop-Mapping und Mimitop-Design, Zellkulturierung und Phagen-Entwicklung werden in Druckschriften beschrieben, wie z.B. McPherson, M. J. et al. (1991, PCR: A practical approach, Oxford University Press, Oxford), Sambrook, J. et al. (1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), Huynh and Davies (1985, "DNA Cloning Vol I – A Practical Approach", IRL Press, Oxford, Ed. D. M. Glover), Sanger, F. et al. (1977, PNAS USA 74(12): 5463–5467), Harlow, E. Lane, D. ("Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998), Jung, G. and Beck-Sickinger, A. G. (1992, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 31: 367–486), Harris, M. A. and Rae, I. F. ("General Techniques of Cell Culture", 1997, Cambridge University Press, ISBN 0521 573645), "Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual" (Eds. Kay, B. K., Winter, J., and McCafferty, J., Academic Press Inc., 1996, ISBN 0-12-402380-0).
Reagenzien und Ausstattung, die u.a. in dem hier ausführlich beschriebenen Verfahren eingesetzt werden können, sind von Firmen wie Amersham (www.amersham.co.uk), Boehringer Mannheim (www.boehringer-ingeltheim.com) Clontech (www.clontech.com), Genosys (www.genosys.com), Millipore (www.millipore.com), Novagen (www.novagen.com), Perkin Elmer (www.perkinelmer.com), Pharamcia (www.pharmacia.com), Promega (www.promega.com), Qiagen (www.qiagen.com), Sigma (www.sigma-aldrich.com) und Stratagene (www.stratagene.com) erhältlich.
Der Begriff „Antikörper" in seinen vielfältigen gram matikalischen Formen wird im Folgenden benutzt, um Immunoglobulin-Moleküle und immunologisch aktive Bereiche von Immunoglobulin-Molekülen, d.h. Molekülen, die eine Antikörper-Kombinierungsstelle oder ein Paratop enthalten, zu bezeichnen. Solche Moleküle werden ebenso als „Antigen-bindende Fragmente" von Immunoglobulin-Molekülen bezeichnet.
Veranschaulichende Antikörper-Moleküle sind intakte Immunoglobulin-Moleküle, im Wesentlichen intakte Immunoglobulin-Moleküle und solche Bereiche eines Immunoglobulin-Moleküls, die das Paratop enthalten, einschließlich solcher aus dem Stand der Technik bekannten Bereiche, wie Fab, Fab', F(ab')2, scFv und F(v).
Der Begriff „Antikörper-Kombinierungsstelle" bezieht sich auf den strukturellen Bereich eines Antikörper-Moleküls, zusammengesetzt aus variablen und hypervariablen Bereichen von Schwer- und Leichtketten, die spezifisch ein Antigen binden (eine Immunreaktion mit diesem eingehen).
Die Identifizierung und Sequenzierung von B-Zellen, die Antikörper produzieren und die Analyse von den resultierenden Daten umfasst die folgenden grundlegenden Schritte:

1) Isolierung von VH- und VL-Kodierungsbereichen von zirkulatorischen B-Zellen menschlicher Patienten.
2) Bestimmung der Nukleotidsequenz von VH- und VL-Repertoires.
3) Bestimmung von VH und VL primären Aminosäurensequenzen.
4) Extraktion von CDR-Bereichen in silico – Einbau in die Datenbank.
5) Detektion der dominanten CDR- & Netzwerkbereiche im VH- oder VL-Repertoire.
6) Aufbau und Herstellung von therapeutisch rekombinanten Antikörpern von dominanten Antikörpersequenzen.

1. Isolierung von VH- und VL-Kodierungsbereichen von zirkulatorischen B-Zellen menschlicher Pati enten.
Für dieses Verfahren wurden menschliche Patienten mit einer gegebenen mikrobiellen Infektion(en) als Spender von immunisierten B-Zellen ausgewählt. Die Kriterien für die Auswahl waren:

a) Der Patient muss eine ausgeprägte Antikörperantwort auf den fraglichen Erreger zeigen, detektierbar z.B. durch einen Western-Blot. Es wurden Proben von Antikörpern aus einer Blutprobe eines Patienten gesammelt. Die Proben wurden verdünnt und mittels Western-Blot unter Verwendung von Antigenen, die von dem mikrobiellen Erreger erhalten wurden, auf Immunoreaktivität getestet. In solch einem Assay zeigten Patienten, die eine starke Antikörperantwort aufwiesen, eine ausgeprägte Erkennung/Antikörper-Bindung des mikrobiellen Antigens, was unter Verwendung von anti-humanen polyklonalen Detektions-Antikörpern detektiert wurde.
b) Der Patient hat den Verlauf der Infektion überlebt – dies verbessert die Chance der Erzeugung von B-Zellen-Antworten für Antikörper, die zur Neutralisierung des Erregers in der Lage sind.

Periphere B-Zellen-Lymphozyten (PBLs) wurden von Blutproben eines infizierten Patienten gesammelt. Hierfür wurde heparinisiertes Blut in PBS (20 ml insgesamt) verdünnt und ein 15 ml Kissen von Ficol Hypaque (Pharmacia; sofern nicht anders angegeben, wurden alle Chemikalien und Kulturmedien von Sigma, UK, bezogen) in einem 30 ml Zentrifugenröhrchen mit dem Blut überdeckt. Die PBLs wurden dann durch Zentrifugation (400 × g, 5 Minuten) in PBS gewaschen und durch Zentrifugation erneut gewonnen. RNA wurde unter Verwendung eines QuickPrep-mRNA-Reinigungskits (Pharmacia) aus PBLs genau gemäß dem Benutzerhandbuch hergestellt. Die isolierte mRNA wurde zur Herstellung von cDNA über eine entgegengesetzte Transkriptase-Reaktion hergestellt (Promega cDNA-Synthesekit). Hierfür wurden 2 μg von mRNA erneut in 16 μL Nuklease-freiem Wasser suspendiert und 3 Minuten lang bis 65°C erhitzt (zur Denaturierung der sekundären Struktur) und dann sofort 1 Minute lang auf Eis abgekühlt. Die mRNA wurde anschließend folgendem Cocktail zugesetzt: 8 μL 25 mM MgCl₂, 4 μL dNTP-Mix (10 mM im Hinblick auf jedes Ribonukleotid-Triphosphat), 1 μL RNAsin 40 uμL^–1 Stammlösung, 1,2 μL AMV entgegengesetzte Transkriptase (25 uμL^–1 Stammlösung), 6 μL cDNA 10 pmolμL^–1 Primer (siehe 1 – cDNA-Synthese). Die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 42°C inkubiert und anschließend 3 Minuten lang bei 100°C zum Beenden der Reaktion inkubiert.
Die DNA-Kodierung für die Antigen-bindenden Bereiche wurde dann mittels PCR unter Verwendung der cDNA, die aus PBLs von Patienten hergestellt wurde, verstärkt. Hierfür wurde die cDNA in der folgenden PCR-Reaktion verwendet, um entweder von schweren Ketten oder von leichten Ketten stammende variable Regionen von Anti körper-DNA herzustellen (siehe 1): 2,5 μL cDNA, 33 μL Wasser, 4 μL dNTP-Mix (25 mM im Hinblick auf jedes Deoxynukleotid-Triphosphat), 5 μL Taq-Reaktionspuffer (Perkin Elmer), 2,5 μL eines äquimolaren Primer-Gemisches (abschließende Konzentration von 20 pmol im Hinblick auf jeden Primer) und 0,5 μL Taq-DNA-Polymerase (1 uμL^–1, Perkin Elmer Corp.). Die Vorwärts- und Rückwärts-Primer, die in diesen Reaktionen verwendet wurden, sind in 1 dargestellt und ihre entsprechenden Nukleotidsequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Konditionen für die PCR-Reaktion betrugen 94°C für 1 Minute, 57°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten für eine Gesamtheit von 30 Zyklen mit einer erweiterten Denaturierung (94°C für 5 Minuten) vor dem Zyklus 1 und einem zusätzlichen Extensionsschritt nach dem Ende von Zyklus 30 (72°C für 10 Minuten). Die PCR wurde unter Verwendung eines Perkin Elmer 9700 GeneAmp PCR-Geräts durchgeführt. 5 μL der PCR-Reaktion lies man auf 1% Agarose-Gel laufen, um die Amplifizierung der erwarteten Produkte mit 393 Basenpaaren (bp) zu überprüfen. Das verbliebene Produkt lies man auf einem 0,8% Agarose-Gel mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) laufen und der 393 bp-Bereich wurde unter Verwendung einer sauberen Skalpellklinge herausgeschnitten. Die DNA wurde aus der Scheibe des Agarose-Gels unter Verwendung eines GeneClean II Kits (Anachem, Luton, UK) extrahiert.
Die PCR führte zu zwei Fragmenttypen – erhalten von VH- bzw. VL-Bereichen, in Abhängigkeit von den verwendeten PCR-Primer-Sets (für Details der Primer-Sets für die Antikörper-Gene und ein PCR-Schema, siehe Tabelle 1 bzw. 1).
VH- und VL-Genfragemente wurden in einem Klonierungs vektor pGEM-T easy (Promega Corporation) kloniert, um die DNA-Sequenzierung zu vereinfachen. Hierfür wurden 3 μg des PCR-Produktes für die Abgrenzung unter Verwendung von PCR-Reinigungs-Schleudersäulen QIAquick (Qiagen, UK) gemäß dem Benutzerhandbuch hergestellt. Die DNA wurde von der Schleudersäule in 40 μL Puffer EB eluiert. Das gereinigte PCR-Produkt (2 μL) wurde mit 1 μL pGEM-T easy Vektor, 6 μL Wasser und 1 μL DNA-Ligase gemischt und die Mischung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur ligiert. Die Ligationen wurden anschließend in elektrokompetente E. coli TG1-Zellen (Stratagene) durch Elektroporation transformiert und auf Agar-Platten mit Ampicillin 100 μgml^–1 IPTG (100 μM) und X-gal (0,006 Gew.-%) plattiert. Man lies die Kolonien über Nacht bei 37°C wachsen und bewahrte sie anschließend bei 4°C auf. Die rekombinanten Kolonien wurden als weiße Kolonien auf diesem Medium identifiziert.
2. Bestimmung der Nukleotidsequenz von VH- und VL-Repertoires
Die DNA wurde zuerst aus VH- und VL-rekombinanten E. coli-Klonen hergestellt. Hierfür wurden jeweils einzelne Kolonien in ein 1,2 ml LB-Medium überführt, ergänzt mit Ampicillin 100 μgml^–1 unter Verwendung eines Plattenformats mit 96 Wells. Man lies die Kulturen bei 37°C für 24 Stunden wachsen. Die bakteriellen Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4000 × g 30 Minuten lang gewonnen und die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Wizard SV 96 Plasmid-Reinigungskits (Promega Corporation) hergestellt, wobei im Wesentlichen dem Benutzerhandbuch gefolgt wurde. Die Ausbeuten der Plasmid-DNA lagen typischerweise in einer Größenordnung von 5 μg pro 1,2 ml Startkultur.
Die DNA-Sequenzierungsreaktionen wurden unter Verwendung des DYEnamic ET Farbstoffterminierungszyklus-Sequenzierungs-Kits (Amersham Pharmacia Biotech) durchgeführt. Gereinigte Plasmid-DNA (0,5 μg) wurde mit 8 μL DYEnamic ET Terminierungsreagenzvormischung und 1 μL M13 Vorwärts- oder Rückwärts-Primer (5 μM) in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 μL gemischt. Die thermische Zyklisierung wurde dann unter Verwendung eines GeneAmp PCR-Systems 9700 (Perkin Elmer) mit den folgenden Parametern durchgeführt: 95°C, 20 Sekunden; 50°C, 15 Sekunden; 60°C, 1 Minute; 30 Zyklen). Die Reaktionen wurden unter Verwendung von nicht eingefassten ELISA-Platten mit einem 96 Well-Format (AB-Gene) durchgeführt. Der Farbstoffterminator, der nicht eingebaut wurde, wurde durch Fällung entfernt. Hierfür wurden die Ethanol-Proben mit 2 μL 7,5 M Ammoniumacetat und 55 μL von 100%igem Ethanol gemischt und bei 3000 g 30 Minuten lang zentrifugiert. Die DNA-Pellets wurden mit 70%igem Ethanol gewaschen und in 20 μL Ladungslösung erneut suspendiert. Die Reaktionen wurden unter Verwendung eines MegaBACE 1000 DNA-Sequenzierers (Amersham Pharamcia Biotech) sequenziert, wobei dem Benutzerhandbuch gefolgt wurde (2 kV-Injektionsspannung für 30 Sekunden mit Elektrophorese bei kV für 200 Minuten). Die Chromatogramme werden unter Verwendung des .scf.-Dateiformats zur Beendigung und Archivierung exportiert.
3. Bestimmung von VH- und VL-primären Amminosäuresequenzen
DNA-Sequenzen von VH und VL wurden sowohl in Vorwärts- als auch Rückwärts-Strängen bestimmt (unter Verwendung von M13 Vorwärts- bzw. Rückwärts-Primern) und verglichen, um die Abweichungen hervorzuheben und einen hohen Grad an Präzision beizubehalten. Dies erfolgte unter Verwendung der Programme von Staden (Staden, R. (1996) The Staden Sequence Analysis Package. Molecular Biotechnology 5, 233–241). Zuerst wurden die Sequenz-Dateien (.scf) in das PREGAP-Programm eingegeben, wo die Vektorsequenz gestrippt wurde und die Qualität der Sequenzen festgestellt wurde. Sequenzen mit geringer Qualität, bei denen die DNA-Sequenz nicht eindeutig war, wurden verworfen und erneut sequenziert. Vorwärts- und Rückwärts-Stränge wurden unter Verwendung des GRP-Programms abgeglichen, um die Bereiche, die Sequenzierungsartefakte enthielten, zu kennzeichnen und aufzulösen. Die Orientierung der VH- oder VL-Sequenz wurde notiert, und, wenn erforderlich, revers ergänzt, um alleine vorwärts gerichtete Rahmenorientierungen des Readers für die Translation zu erzeugen. VH- und VL-Gensequenzen wurden dann in Amminosäuresequenzen umgewandelt. Jeder Sequenz wurde eine einzelne Identifizierung (Name) gegeben.
3. Extraktion der CDR-Bereiche in silico – Einbau in die Datenbank
Eine allgemeine Lehre für die Identifizierung von CDR-Bereichen ist www.bioinf.org.uk/abs/ zu entnehmen.

Die folgenden Regelsätze erlauben die Definition der CDRs in einer Antikörper-Sequenz. Es gibt wenige Beispiele, wo diese virtuell konstanten Merkmale nicht auftreten (z.B. besitzt die menschliche Sequenz EU mit schwerer Kette kein Trp-Gly nach CDR-H3). Die Cys-Reste sind das am Besten erhaltene Merkmal. CDR-L1

Start	etwa Rest 24
Vorheriger Rest	immer ein Cys
Nachfolgender Rest	immer ein Trp. Typischerweise Trp-Tyr-Gln, aber ebenso Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, Trp-Tyr-Leu
Länge	10 bis 17 Reste;

CDR-L2

Start	immer 16 Reste nach dem Ende von CDR-L1
Vorherige Reste	im Allgemeinen Ile-Tyr, aber ebenso Val-Tyr, Ile-Lys, Ile-Phe
Länge	immer 7 Reste (außer NEW(7FAB), das eine Löschung in diesem Bereich aufweist);

CDR-L3

Start	immer 33 Reste nach dem Ende von CDR-L2 (außer NEW(7FAB), das eine Löschung am Ende von CDR-L2 aufweist)
Vorheriger Rest	immer Cys
Nachfolgende Reste	immer Phe-Gly-XXX-GLy (SEQ ID NO: 69)
Länge	7 bis 11 Reste;

CDR-H1

Start

etwa 26 Reste (immer 4 nach einem Cys)

Vorherige Reste	immer Cys-XXX-XXX-XXX (SEQ ID NO: 70)
Nachfolgende Reste	immer ein Trp, typischerweise Trp-Val aber ebenso Trp-Ile, Trp-Ala
Länge	10 bis 12 Reste;

CDR-H2

Start	immer 15 Reste nach dem Ende von CDR-H1
Vorherige Reste	typischerweise Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (SEQ ID NO: 71) aber eine Anzahl von Variationen
Nachfolgende Reste	Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala
Länge	16 bis 19 Reste;

CDR-H3

Start	immer 33 Reste nach dem Ende von CDR-H2 (immer 2 nach einem Cys)
Vorherigere Reste	immer Cys-XXX-XXX (typischerweise Cys-Ala-Arg)
Nachfolgende Reste	immer Trp-Gly-XXX-Gly (SEQ ID NO: 72)
Länge	3 bis 25 Reste

5. Detektion der dominanten CDR & Netzwerkregionen im VH- oder VL-Repertoire
Die Datenbank wurde unter Verwendung der SQL-Server-Database-Software (Microsoft) erstellt. Dies erlaubte die Abfrage der Datenbank unter Verwendung von SQL und ermöglichte die Extraktion der CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen von jedem Bereich der Datenbank VH- oder VL-Sequenzen in FASTA-Format. Die extrahierten CDRs unterlagen dann der mehrfachen Anordnung unter Verwendung von CLUSTAL X in einer Weise, sodass identische oder sehr ähnliche CDRs zusammen in Blöcken gruppiert wurden (Thompson, J. D. Higgins, D. G. and Gibson, T. J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: 4673–4680). Hiervon wurde die Frequenz sich wiederholender CDRs bestimmt und die CDR-Dominante in dem Immunogobulin-Repertoire wurde festgestellt. Alternativ wurde ein graphisches Interface unter Verwendung von ProBiosys (proBionic EMEA, Amsterdam) eingesetzt. ProBiosys erstellt Dendrogramme von CLUSTAL.phy-Dateien und erlaubt eine schnelle visuelle Interpretation der Verhältnisse zwischen einer großen Anzahl von angeordneten Sequenzen. Der gesamte Prozess wurde für CDRs von dem gleichen Patienten durchgeführt, wobei die Proben an verschiedenen Punkten während der Krankheit genommen wurden, und für CDRs von Patienten mit unterschiedlichen Infektionen oder von Patientengruppen, die sich hinsichtlich Geschlecht, Alter oder Rasse entsprachen, in Abhängigkeit von den Suchinformationen und den zusätzlichen Informationen, die den Datenbankeinträgen zugefügt wurden.
6. Aufbau & Herstellung von therapeutischen rekombinanten Antikörpern von dominanten Antikörper-Sequenzen
Sobald dominante Antikörper-Sequenzen in einem gegebenen Repertoire erkannt wurden, wurde die Information verwendet, um die Anwesenheit von CDRs und Netzwerken, die Immunität verleihen, abzuleiten. Ausge wählte VH- und VL-Sequenzen wurden identifiziert und deren Gensequenzen unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide resynthetisiert. Dies war wichtig, da es ermöglichte, die vom Menschen stammende Gensequenz hinsichtlich der Kodone für E. coli zu optimieren, um die Protein-Expression zu verbessern. Dominante VH- und VL-Sequenzen wurden unter Verwendung einer Spacer(Linker)-Sequenz miteinander verbunden (2). Diese Gen-Kassette, bezeichnet als scFv, wurde resynthetisiert, um terminale NdeI- und NotI-Restriktionsstellen für die Klonierung in den Expressionsvektor pET29b (Novagen) einzuschließen. ScFv-DNA wurde mit NdeI (Abschnitte in VH) oder NotI (Abschnitte in VL) unter Verwendung der folgenden Reaktionen abgeschnitten: 40 μL DNA (4 μg), 10 μL des Restriktionsenzym-Puffers D (Promega), 47 μL Wasser und 2 μL NdeI und NotI-Enzym (10 uμL^–1; Promega) mit Verdauung bei 37°C über 4 Stunden. Die DNA wurde dann auf 0,7% Agarose-TAE-Gele fraktioniert und die verdaute DNA wurde aus dem Gel herausgeschnitten und von der Agarose-Scheibe unter Verwendung des Geneclean-II-Kits (Bio 101) genau gemäß dem Benutzerhandbuch gereinigt. pET29b-Vektor-DNA wurde mit NdeI und NotI, wie zuvor beschrieben, abgeschnitten. 1 μg Vektor wurde mit 1 μg abgeschnittener VL-DNA, die in 8,5 μL Wasser erneut suspendiert wurde, gemischt und durch Addition von 1 μL 10 × Bindungspuffer (Boehringer Mannheim) und 0,5 μL DNA-Ligase (3 uμL^–1, Boehringer Mannheim) gefolgt von Ligation übernacht bei 14 C ligiert.
Die gesamte Ligation wurde in E. coli TG2-Zellen (Stratagene, UK) durch Elektroporation überführt. Die Überführungsprodukte wurden dann auf Agar-Platten enthaltend Tetracyclin (25 μgml^–1 – selektiv für recA:Tn10 auf dem Chromosom von TG2) und Kanamycin (50 μgml^–1 – selektiv für pET29) plattiert. Rekombinante Plasmid-DNA, die aus individuellen Klonen hergestellt wurde, wurde auf die scFv-Sequenz durch Verdauung mit NdeI und NotI, wie zuvor beschrieben, geprüft.
Rekombinante scFvs wurden im E. coli-Strang JM109(DE3) über-exprimiert und gereinigt, wodurch die biochemische und biologische Charakterisierung ermöglicht wurde. Die Rekombinate wurden auf LB-Platten mit 50 mg/ml Kanamycin und einer einzelnen Kolonie, die zur Impfung einer 10 Mikroliter Startkultur vom LB-Medium mit 50 Mikrogramm pro ml Kanamycin verwendet wurde, ausgebreitet. Hierfür wurde eine 1-Liter-Expressionskultur in Gegenwart von Kanamycin bei 37°C für 4 bis 5 Stunden unter Schütteln bei 300 rpm hergestellt. Bei OD₆₀₀ = 1 wurde die Induktion unter Verwendung von IPTG durchgeführt und man lies die Zellen mit kräftiger Sauerstoffanreicherung für weitere 3 bis 5 Stunden wachsen. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation (4000 × g, 15 Minuten, 4°C) gewonnen. Das Zellen-Pellet wurde in 10 ml frischem (4 C) Lyse-Puffer (s. unten) resuspendiert und bei –20°C übernacht vor dem Aufbruch der Zellen unter Verwendung von 25 ml X-Press-System (AB Biox) aufbewahrt.
Lyse-Puffer

50 mM Tris HCl pH 8,0
1 mM EDTA
100 mM KCl
0,1 mM AEBSF (Aminoethylbenzosulphonsäure)

Das Lysat wurde in einem Oakridge-Röhrchen (24300 × g, 4°C, 30 Minuten) zentrifugiert. Das Pellet wurde erneut in 20 ml von eiskaltem Lyse-Puffer auf Eis un ter Verwendung eines Labormischers von Silverson suspendiert. Das Lysat wurde in 8 × Oakridge-Röhrchen aufgeteilt und jedes Aliquot wurde auf 30 ml in eiskaltem Lyse-Puffer verdünnt (insgesamt 120 ml). Die Inklusionskörper wurden pelletiert (24300 × g, 4°C, 30 Minuten) und die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Jede der 8 Pellets wurde in 30 ml Lyse-Puffer erneut suspendiert und die Inklusionskörper wurden durch erneute Zentrifugation (24300 × g, 4 C, 30 Minuten) gewonnen. Dieser Wasch-/Zentrifugations-Schritt wurde insgesamt 5 × durchgeführt, um die Fraktion des Inklusionskörpers zu reinigen. Jedes Pellet wurde erneut in 15 ml eiskaltem Wasser suspendiert und die Inklusionskörper wurden bei –20°C aufbewahrt.
Für die Neufaltung wurden 200 ml Lösung von 2 Gew.-% N-Lauryl-Sarcosine (NLS) in 50 mM Tris HCl pH 9,0 wie folgt hergestellt. 4 g NLS wurden in 100 ml Wasser unter Rühren aufgelöst. 10 ml von 1 M Tris pH 9,0 Stammlösung wurden zugesetzt und auf 195 ml mit Wasser aufgefüllt. 5 ml vom Slurry des Inklusionskörpers wurden zugesetzt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur kräftig gerührt.
CuCl₂ wurde bis zu einer Konzentration von 100 μM zugesetzt. Dies dient als ein Katalysator für die Oxidation. Die Neufaltungsreaktion wurde auf 4°C überführt und 2 Tage lang kräftig gerührt, um die Sauerstoffanreicherung zu fördern. Die Neufaltungsreaktion wurde im Vakuum durch eine 0,44 μm Vacucup-Flaschentopfiltereinheit (90 mm Durchmesser, Gellman Sciences) filtriert und das Filtrat in ein Pellicon Labscale TFF-System, ausgestattet mit einer PLGC10-Membraneinheit (Millipore), überführt. Die Reaktion wurde bis auf 25 ml unter Verwendung eines tangentialen Flusses auf konzentriert und das Permeat verworfen (das scFv wird im Rückstand lokalisiert). Die Lösung wurde gegen 40 × Umlaufvolumen (1 Liter) von 10 mM Ammoniumacetat (AAT) pH 9,0 diafiltriert. Schließlich wurde das Volumen des Antikörpers auf 50 ml unter Verwendung von 10 mM AAT pH 9,0 verdünnt. Der mit Puffer ausgetauschte Antikörper wurde zwei Stunden lang bei 4°C aufbewahrt. Der typische Proteingehalt betrug 1 bis 2 mgml^–1 mit einer Ausbeute von bis zu 50 mg pro Liter.
Für die Reinigung von scFv wurde ein 10 ml Bettvolumen von Ni NTA Superflow-Agarose (Qiagen) gemäß dem Benutzerhandbuch unter Verwendung einer 10 ml Glassäule (Sigma) ohne Flussadapter hergestellt. Die Säule wurde mit 50 ml Puffer B (6 M Harnstoff, 0,1 MNaH₂PO₄, 10 mM Tris HCl pH 8,0) äquilibriert. Das neu gefaltete scFv (wie zuvor beschrieben) wurde 1/5 in Puffer B verdünnt und direkt mit der Säule bei mlmin^–1 angewandt. 50 ml Puffer B wurden in der Säule verwendet (Flussrate 5 mlmin^–1) gefolgt von 50 ml Puffer C (gleiche Zusammensetzung wie Puffer B, aber pH 6,3). Das gereinigte scFv wurde von der Säule durch langsame Anwendung des Puffers B ergänzt mit 250 mM Imidazol hoher Reinheit bis A₂₈₀ < 0,05 eluiert.
Ergebnisse:
Die variable schwere Kette (VH) der Antikörper-Gene von periphären Blutlymphozyten wurde mit TA kloniert und sequenziert. In jedem Fall wurde der dritte komplementäre Bestimmungsbereich (CDR3) identifiziert. Dieser Bereich ist sowohl der am stärksten variable Bereich der VH-Kette und der identifizierte Bereich ist bei der Bestimmung der Antigen-Bindung am bedeut samsten und wird aus diesem Grund als Signatur für jede VH-Kette verwendet. Verschiedene Bibliotheken von Sequenz-Daten wurden entwickelt. M1 ist eine Bibliothek von VH-Sequenzen eines Patienten mit Septicaemia, verursacht durch ein Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA). M2 ist eine Bibliothek eines anderen Patienten, mit lange stehendem MRSA-Septicaemia, wobei diese Probe am äußersten Ende der Infektionsperiode genommen wurde. M3 ist eine weitere Bibliothek, aufgebaut von einem Patienten, wie in M2, wobei aber die Probe zehn Tage später als bei der M2-Probe genommen wurde. P1 ist eine Bibliothek von einem Patienten mit zystischer Fibrose (CF), der lange Zeit mit Pseudomonas aeruginosa kolonisiert wurde. C1 ist eine Bibliothek von einem Patienten, der mit systemischer Candida albicans infiziert war.
Jede Bibliothek hat eine kleine Anzahl von dominanten Antikörpern. Die gebräuchlichsten Antikörper in jeder Bibliothek haben eine Frequenz von 10% (SEQ ID NO: 27) (RNNWPPT), 41% (SEQ ID NO: 28) (RSGSHYDAFNI), 32% (SEQ ID NO: 29) (VTGCFDH), 7% (SEQ ID NO: 30) (LHGFGHGFRI) und 30% (SEQ ID NO: 31) (GEIFDY) (M1, M2, M3, P1 bzw. C1. M1 besitzt zwei hauptsächliche VH-Ketten, die 18% der Bibliothek ausmachen. M2 besitzt vier dominante VH-Ketten, die 80% der Bibliothek ausmachen. M3 besitzt vier VH-Ketten, die 79% der Bibliothek ausmachen. P1 besitzt drei VH-Ketten, die 18% der Bibliothek ausmachen. Die C1-Bibliothek hat sechs VH-Ketten, die zusammen 72% der Klone in der Bibliothek ausmachen. Verschiedene dieser VH-Ketten wurden in Mäusen getestet und zeigten eine therapeutische Aktivität gegen das relevante Mittel.
Die Bibliotheken M2 und M3 sind Vergleiche des VH-Repertoires über einen Zeitraum für ein Individuum mit einer MRSA-Septicaemia. Die dominanteste VH-Kette (SEQ ID NO: 28) (RSGSHYDAFNI) liegt bei einer Frequenz von 41% am Ende der Infektionsperiode (M2); diese fiel nach 10 Tagen auf 22% (M3). Andere gebräuchliche Antikörper zeigen ähnliche Abfälle von 19% bis 17% (SEQ ID NO: 32) (LLGGSSGRYMDV), 10% bis 2% (SEQ ID NO: 33) (HRGGPQCHNLNCYTLDF) und 7% bis 3% (SEQ ID NO: 34) (EAESYAERIGFDY). Andere Antikörper zeigen einen Anstieg des Niveaus über dem gleichen Zeitraum. Der dominanteste Antikörper in der M3-Bibliothek (SEQ ID NO: 29) (VTGCFDH) mit einer Frequenz von 32% wurde bislang in der M2-Bibliothek nicht detektiert. In diesem Fall werden VH-Ketten, die eine Reduktion in der Phase nach der Infektion zeigen, als potentielle therapeutische Mittel angesehen. Diejenigen Antikörper, die einen steilen Anstieg nach der Befreiung von der Infektion zeigen, haben wohl eine geringere Bedeutung als Therapeutika. Die Analyse der Expression der VH-Kette während des Verlaufs einer Infektion und danach ist wichtig, um die Identifizierung neutralisierender Antikörper zu unterstützen.
Mit den Bibliotheken, soweit sie sequenziert wurden, wurde es ermöglicht, das Repertoire der VH-Kette mit ähnlichen und unterschiedlichen Infektionen zu vergleichen. M1 und M2/M3 sind Bibliotheken von zwei verschiedenen Patienten mit der gleichen Infektion. Bislang ist es möglich gewesen, sechs verschiedene CDR-Sequenzen, die in beiden MRSA-Patienten anwesend sind, zu identifizieren. Ein solcher Antikörper (SEQ ID NO: 33) (LLGGSSGRYMDV) macht 4% des Repertoires von der M1-Bibliothek und 19% bzw. 7% der Bibliotheken M2 und M3 aus. Dieser Antikörper ist über die gesamte Länge des VH-Bereichs in beiden Patienten identisch. Vier weitere unterschiedliche VH-Ketten wurden ebenso in den Bibliotheken beider Patienten gefunden und haben eine identische Sequenz über den Rest des VH-Bereichs (SEQ ID NOs: 35–38) (YDVVVTGKYAFDI, RRYHDLTTNNWFDP, NVGSGSYYTGGHWFDP, HRGGPQCHNLNCYTLDF). Der fünfte CDR3, den beide Patienten teilen (SEQ ID NO: 39) (ARRYGTSNYCFDH) wurde bei einer Frequenz von 2% bzw. 3% in den Bibliotheken M1 und M2 gefunden. Die VH-Ketten mit diesem CDR3 sind über den größten Teil der VH-Kette identisch, außer für einen wichtigen Bereich, nämlich den zweiten komplementären Bestimmungsbereich (CDR2). Der CDR2 ist ein anderer Bereich des voll entwickelten Antikörpers, der mit dem Antigen in Kontakt kommt und eine wichtige Rolle bei dessen Aktivität spielt. Die Identifizierung von Antikörpern mit demselben CDR3, aber unterschiedlichen Sequenzen außerhalb dieses Bereichs, führt zu Antikörpern mit ähnlichen Ziel-Antigenen, obwohl andere Eigenschaften variieren können.
Die Bibliotheken von Patienten mit unterschiedlichen Infektionen wurden ebenso verglichen. Für diese Bibliotheken stellte es sich heraus, dass sie VH-Ketten mit identischen CDR3-Sequenzen teilen, obwohl dies weniger gebräuchlich erscheint. Bislang haben wir eine CDR3 gefunden, die sowohl in der P1- als auch der M2-Bibliothek gefunden wurde (SEQ ID NO: 40) (DQSHAAQGF). Antikörper, die für Patienten mit verschiedenen Infektionen gebräuchlich sind, können ein Zeichen sein, dass die VH-Kette nicht gegenüber den interessierenden Infektionen spezifisch ist. In diesem Fall ist es nicht möglich, auszuschließen, dass der Patient mit der P1-Bibliothek nicht mit S. aureus in Kontakt gekommen ist, da dies ein verbreitetes Bakterium in der Umgebung ist.
Zusammenfassung der Ergebnisse:

1) Individuen, die mit Bakterien infiziert sind, zeigen eine sehr starke Fokussierung einer kleinen Gruppe von CDR-Sequenzen.
2) Das Niveau der Expression von Antikörpern mit besonderem CDR3-Typ variiert über den Verlauf der Infektion und in der Zeit nach der Infektion.
3) Es hat sich gezeigt, dass Patienten mit der gleichen Krankheit, Antikörper mit den gleichen CDR3-Sequenzen exprimieren. In den meisten Fällen sind dies die gleichen für die gesamte Länge der VH-Kette. In anderen Fällen wird eine Variation in anderen Bereichen der VH-Kette beobachtet.
4) Patienten mit unterschiedlichen Infektionen können Antikörper mit den gleichen CDR3- und VH-Sequenzen teilen.

7. Zusätzliche Studien
Weitere Studien wurden unternommen, um CDR3-Bereiche in Patienten zu identifizieren, die VRE-kolonisiert, VRE-Blutkultur-positiv, MRSA-Blutkultur-positiv waren und mit einem Patienten mit zystischer Fibrose, der mit P. aeruginosa infiziert war.
Sequenzen der CDR3-Bereiche in den verschiedenen Bibliotheken wurden wie zuvor beschrieben bestimmt.

Ergebnisse der Versuche werden in Tabelle 2 (s. unten) dargestellt und zeigen die Fokussierung des VH-Repertoires von Blutkultur-positiven Patienten, von denen eine Anzahl von VH-CDR3-Sequenzen sehr gebräuchlich ist. In Tabelle 2 ist die SEQ-Spalte die SEQ ID NO der CDR3-Sequenz. Die anderen Spalten zeigen die Ergebnisse für die Prozentzahlen der Klone in jeder Bibliothek. Für V01, n = 75; V02, n = 82; V03, n = 110; V04, n = 43; M01, n = 103; M02, n = 231; M03, n = 150; M04, n = 136; M05, n = 229; P01, n = 131. Bibliotheksinformation

V01	VRE-kolonisierter Patient
V02	VRE-Blutkultur-positiv
V03	VRE-Blutkultur-positiv
V04	VRE-Blutkultur-positiv
M01	MRSA-Blutkultur-positiv
M02	MRSA-Blutkultur-positiv
M03	MRSA-Blutkultur-positiv
M04	MRSA-Blutkultur-positiv
M05	MRSA-Blutkultur-positiv
P01	P. aeruginosa CF-Patient

M02, M03, M04 sind drei Proben von demselben Patienten über einen Zeitraum.
Allgemeine Punkte

1) Alle Blutkultur-positiven Patienten zeigen eine Fokussierung des VH-Repertoires. Die gebräuchlichsten VH-CDR3-Sequenzen von jeder der Blutkultur-positiven Bibliotheken sind: V02 (SEQ ID NO: 62) 9% V03 (SEQ ID NO: 68) 19% V04 (SEQ ID NO: 67) 42% M01 (SEQ ID NO: 40) 13% M02 (SEQ ID NO: 45) 38% M03 (SEQ ID NO: 67) 24% M04 (SEQ ID NO: 45) 12% M05 (SEQ ID NO: 53) 4% Die nicht-Blutkultur-positiven Bibliotheken V01 und P01 blieben relativ unterschiedlich. V01 zeigt keine feststellbare Fokussierung und die gebräuchlichste VH-CDR3- von P01 (SEQ ID NO: 56) macht nur 3% der Bibliothek aus.
2) Im Großen und Ganzen teilen Bibliotheken von Patienten mit derselben Infektion mehr VH-CDR3's als Patienten mit unterschiedlichen Infektionen. Die Liste von gebräuchlichen Antikörpern zeigt, dass sechs verschiedene VH-CDR3-Sequenzen (SEQ ID NOs: 59, 60, 61, 66, 67 und 68) von zwei verschiedenen VRE-Blutkultur-positiven Patienten geteilt werden. Einer von diesen sechs Antikörpern wird bei einem sehr geringen Level (< 1%) in der P01-Bibliothek und ein anderer bei < 1% in M04 gefunden. VH-CDR3-Sequenzen von den MRSA-Bibliotheken zeigen ein ähnliches Resultat. Eine VH-CDR3-Sequenz (SEQ ID NO: 46) wurde in allen drei Bibliotheken der MRSA-Patienten gefunden. Drei andere VH-CDR3-Sequenzen (SEQ ID NOs: 47, 48 und 50) erscheinen in zwei verschiedenen Bibliotheken. Keine dieser VH-CDR3-Sequenzen erscheint in Bibliotheken von Patienten mit anderen Krankheiten.

VRE-Bibliotheken
Der VH von drei VRE-Blutkultur-positiven Patienten (Bibliotheken V02, V03 und V04) und von einem Patienten, der mit VRE (V01) kolonisiert war, wurden sequenziert. Die CDR3-Sequenzen wurden verglichen.
8,4% = SEQ ID NO: 68
6,1% = SEQ ID NO: 67
2,3% = SEQ ID NO: 62
2% = SEQ ID NO: 60
1,6% = SEQ ID NO: 61
1,6% = SEQ ID NO: 63
1,3% = SEQ ID NO: 64
1,3% = SEQ ID NO: 66
1,3% = SEQ ID NO: 59
All diese VH-CDR3-Sequenzen wurden von den Bibliotheken V02, V03 und V04 erhalten, keines der obigen Klone war in der Bibliothek V01 erhalten (kolonisierter Patient). Die CDR3 (SEQ ID NO: 68) war auch in < 1% der Bibliothek M04 enthalten und SEQ ID NO: 59 war auch in < 1% der Bibliothek P01 enthalten. Sechs CDR3-Sequenzen sind in mehr als einer Bibliothek in einer Menge von ≥ 0,9% enthalten.
MRSA-Bibliotheken
Die MRSA-VH-CDR3-Sequenzen wurden von drei Patienten erhalten. Ein Patient hat drei verschiedene Bibliotheken (M02, M03 und M04) entsprechend den drei Blutproben, die 1, 11 und 32 Tage nach der Infektion genommen wurden. Drei CDR3-Sequenzen zeigen eine Reduktion über die Zeit nach der Infektion. SEQ ID NO: 45 fällt von 38% bis 12%, SEQ ID NO: 46 fällt von 23% bis 8% und SEQ ID NO: 48 fällt von 10% bis weniger als 1%. Es wird erwartet, dass VH-Ketten mit diesem CDR3 mit der MRSA-Infektion stark zusammenhängen. Eine andere der gebräuchlichen CDR3-Sequenzen SEQ ID NO: 47 hat nach elf Tagen bei 24% eine Spitze und fällt dann auf 8%, wobei von diesem gebräuchlichen Antikörper ebenso erwartet wird, dass er in Zusammen hang mit der MRSA-Infektion steht. Alle der obigen Antikörper werden hinsichtlich der Reaktivität gegenüber MRSA-Antigenen getestet.
Tabelle 1: Primer, die zur Herstellung und Sequenzierung von VH- und VL-Genfragmenten verwendet wurden. Alle Sequenzen sind in der 5' bis 3'-Richtung angegeben. Die Verwendung der Primer ist oben und in Figur 1 beschrieben.
Tabelle 2
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Identifizierung von Kandidatensequenzen zumindest des CDR3-Bereiches von Antikörpern, die gegenüber mindestens einem Antigen, das durch einen Mikroorganismus während einer Infektion erzeugt wird, oder gegenüber einem Impfstoff spezifisch sind, mit den folgenden Schritten: (i) Isolierung von B-Zellen mindestens eines Patienten, der durch den Mikroorganismus infiziert wurde oder dem der Impfstoff verabreicht wurde und Sequenzierung zumindest des CDR3-Bereiches der VH und/oder VL codierenden Bereiche der B-Zellen und (ii) Korrelation der zumindest die CDR3-Bereiche der VH und VL codierenden Bereiche der B-Zellen sequenzierten Zellen, um eine Gruppe von Kandidatensequenzen für wenigstens einen CDR3-Bereich der Antikörper, die gegenüber wenigstens einem Antigen, das durch den Mikroorganismus erzeugt wurde oder gegenüber dem Impfstoff spezifisch sind, zu bestimmen, wobei jede aus der Gruppe von CDR3-Kandidatensequenzen oder einer Sequenz mit wenigstens 60% Homologie hiermit insgesamt bei einer Frequenz mit wenigstens 1% in der Gruppe von in Schritt (i) bestimmten Sequenzen auftritt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die B-Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus peripheren B-Zellen-Lymphozyten und B-Zellen der Milz.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die peripheren B-Zellen-Lymphozyten aus dem Blut von dem mindestens einen Patienten isoliert wurden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Antigen ein Immunogen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Patient eine ausgeprägte Antikörperreaktion in Reaktion auf eine Infektion durch den Mikroorganismus zeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Patient von einer Infektion durch den Mikroorganismus wiederhergestellt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Korrelationsschritt (ii) die Bestimmung vermeintlicher Aminosäuresequenzen der mindestens die VH und VL codierenden CDR3-Bereiche sequenzierten Zellen und die Korrelation der vermeintlichen Aminosäurensequenzen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Korrelationsschritt (ii) die Identifizierung der hypervariablen Bereiche, d.h. CDR-Bereiche, die mindestens in den VH- und VL-Bereichen enthalten sind und die Korrelation dieser hypervariablen Bereiche aufweist.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die hypervariablen Bereiche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus CDR1, CDR2 und CDR3.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Korrelationsschritt (ii) zusätzlich wenigstens eine der Gruppen bestehend aus dem den mindestens einen Patienten infizierenden Mikroorganismus, dem Infektionsort des Mikroorganismus bei dem mindestens einen Patienten, dem Zeitpunkt, zu dem die B-Zellen während der Infektion durch den Mikroorganismus des mindestens einen Patienten isoliert wurden, das Alter des mindestens einen Patienten, das Geschlecht des mindestens einen Patienten und die Rasse des mindestens einen Patienten korreliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die B-Zellen von mindestens einem Patienten während einer Vielzahl von Zeitpunkten während der Infektion durch den Mikroorganismus beim mindestens einen Patienten von diesem isoliert wurden, wobei der Korrelationsschritt (ii) den Zeitpunkt während der Infektion durch den Mikroorganismus bei dem mindestens einen Patienten, bei dem die B-Zellen isoliert wurden, korreliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die B-Zellen von mindestens zwei Patienten isoliert wurden, wobei mindestens einer von diesen sich von einer Infektion durch den Mikroorganismus erholt hat und mindestens einer von ihnen sich von der Infektion mit dem Mikroorganismus nicht erholt hat, wobei der Korrelationsschritt (ii) die Korrelation der Genesung der mindestens zwei Patienten von der Infektion durch den Mikroorganismus aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die B-Zellen von mindestens zwei Patienten isoliert wurden, wobei die Patienten durch verschiedene Mikroorganismen, die mindestens ein Antigen erzeugen, infiziert wurden, und der Korrelationsschritt (ii) die Korrelation der mindestens die VH und VL codierenden Bereiche der B-Zellen aufweist, um eine Gruppe von Kandidatensequenzen für Antikörper zu bestimmen, von denen jeder gegenüber mindestens einem geteilten Antigen, der durch verschiedene Mikroorganismen erzeugt wurde, oder gegenüber verschiedenen Antigenen, die durch verschiedene Mikroorganismen erzeugt wurden, spezifisch ist.
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Infektion durch einen Mikroorganismus, der mindestens ein Antigen erzeugt, mit folgenden Schritten: (i) Durchführung des Verfahrens nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche und (ii) Herstellung mindestens eines Antikörpers, der eine Kandidatensequenz enthält, die gegenüber mindestens einem durch den Mikroorganismus erzeugten Antigen spezifisch ist.
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich der Schritt der Vermischung des mindestens einen Antikörpers mit einem pharmazeutisch verträglichen Carrier, Verdünnungsmittel oder Arzneistoffträger enthalten ist.
Verfahren zur Erstellung einer Datenbank, die die Kandidatensequenzen für Antikörper, die gegenüber wenigstens einem durch einen Mikroorganismus erzeugten Antigen spezifisch sind, mit folgenden Schritten: (i) Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13, und (ii) Speicherung der durch das Verfahren erstellten Daten in der Datenbank.
Verfahren zur Erstellung eines Reports, der die Kandidatensequenzen für Antikörper, die gegenüber einem durch einen Mikroorganismus erzeugten Antigen spezifisch sind, mit folgenden Schritten: (i) Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13, und (ii) Erstellung eines Reports, der die durch das Verfahren erstellten Daten aufweist.
Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Impfstoffes mit folgenden Schritten: (i) Isolierung von B-Zellen von mindestens einem Patienten, dem der Impfstoff verabreicht wurde, wobei wenigstens der CDR3-Bereich der VH und/oder VL codierenden Bereiche der B-Zellen sequenziert werden, und (ii) Korrelation der mindestens den CDR3-Bereich, der VH und/oder VL codierenden Bereiche der B-Zellen sequenzierten Zellen, um eine Gruppe von Kandidatensequenzen für mindestens den CDR3-Bereich von gegenüber dem Impfstoff spezifischen Antikörpern zu identifizieren, wobei jede aus der Gruppe der CDR3-Kandidatensequenzen oder einer Sequenz mit einer Homologie von mindestens 60% hiervon insgesamt mit einer Frequenz von mindestens 1% der Gruppe in der in Schritt (i) bestimmten Sequenzen auftritt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Korrelationsschritt (ii) die Korrelation der mindestens einen CDR3-Bereich der VH und VL codierenden Bereiche der B-Zellen sequenzierten Zellen mit mindestens einem CDR3-Bereich der VH und VL codierenden Bereiche der B-Zellen sequenzierten Zellen, die von mindestens einem Patienten isoliert wurden, der mit einem Mikroorganismus, gegen den eine Impfung mit dem Impfstoff zur Stimulation einer schützenden Immunantwort beabsichtigt ist, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Korrelationsschritt (ii) zusätzlich die Korrelation von Daten aus der Gruppe bestehend aus der seit der dem mindestens einen Patienten erfolgten Verabreichung des Impfstoffs vergangenen Zeit, dem Alter des mindestens einen Patienten, dem Geschlecht des mindestens einen Patienten, der Rasse des mindestens einen Patienten und den hypervariablen Bereichen, d.h. CDR-Bereichen, der mindestens die VH und VL codierenden Bereiche sequenzierten Zellen.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die Wirksamkeit des Impfstoffs zur Stimulierung einer schützenden Immunantwort gegenüber dem Mikroorganismus, gegen den die Impfung mit dem Impfstoff zur Stimu lierung einer schützenden Immunantwort beabsichtigt ist, bestimmt wird.
Verfahren zur Erstellung einer Datenbank, die die Wirksamkeit eines Impfstoffs identifiziert, mit folgenden Schritten: (i) Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 18 bis 21, und (ii) Speicherung der durch das Verfahren erstellten Daten in der Datenbank.
Verfahren zur Erstellung eines Reports, der die Wirksamkeit eines Impfstoffes identifiziert mit folgenden Schritten: (i) Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 18 bis 21 und (ii) Erstellung eines Reports, der die durch das Verfahren erstellten Daten enthält.