DE102005019845A1

DE102005019845A1 - Neue aus humanen Keimbahnsequenzen gewonnene Antikörperstrukturen

Info

Publication number: DE102005019845A1
Application number: DE200510019845
Authority: DE
Inventors: Li-Te Chin; Shu-Ching Hsu; Chishih Chu
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-04-28
Filing date: 2005-04-28
Publication date: 2006-11-02

Abstract

In der vorliegenden Erfindung wurden die Primärsequenzen der schweren und der leichten Kette von Antikörpern aufgeklärt, um die Information bereitzustellen, die für die Herstellung vollständig humaner Antikörper notwendig ist, die in der Lage sind, menschliches CD152 (CTLA-4) zu binden. Die neuen Antikörpersequenzen der identifizierten schweren und leichten Kette sind von den humanen Keimbahngenen VH3 bzw. Vlambda abgeleitet. Antikörper, die derartige neue Strukturen umfassen, binden an lösliches rekombinantes humanes CD152 sowie an aktivierte humane periphere T-Zellen, wenn die Expression von CD152 erhöht worden ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Primärsequenzen vollständiger humaner Antikörper, insbesondere Sequenzen, die höchstwahrscheinlich aus humanen Keimbahngenen stammen und die Fähigkeit solcher Sequenzen, spezifisch an humanes CD152 (CTLA-4) zu binden, sowohl in Lösung als auch an einer Zelloberfläche. Auf Grund ihres humanen Ursprungs könnten diese Strukturen eine Reaktion des Wirts auf die Verabreichung von Antikörpern, wie sie üblicherweise in der Antikörpertherapie auftritt, verbessern oder sogar beseitigen.

Immunglobuline (Igs, Antikörper) sind als Proteine von Y-förmiger Struktur z.B. auf der Oberfläche von B-Zellen bekannt, die als Antwort auf einen Antigenstimulus wie ein Bakterium, Virus, Parasit oder ein transplantiertes Organ, ins Blut, die Lymphe und andere Körperflüssigkeiten abgegeben werden. Sie neutralisieren das entsprechende Antigen, indem sie spezifisch daran binden. 1 zeigt, wie nach heutigem Erkenntnisstand ein Antikörper strukturell aus variablen (1a) und konstanten (1b) Regionen aufgebaut ist. Innerhalb jeder variablen Region gibt es drei hypervariable Bereiche (1f). In diesen hypervariablen Bereichen liegen Aminosäuren, die zur Antigenbindung beitragen, so dass sie auch als komplementaritätsbestimmende Regionen (complementary determining region, CDR) bezeichnet werden.

Um eine ausreichende Menge an Antikörper zu gewinnen, werden üblicherweise Mäuse durch eine Injektion des entsprechenden Antigens immunisiert, um spezifische B-Zellen zu erhalten. B-Zellen eingeschläferter Mäuse werden dann mit Myelom-Zellen fusioniert, um eine Hybridom-Zellinie zu generieren, die in der Lage ist, für eine unbegrenzte Zeitspanne monoklonale Antikörper zu sezernieren. Die so gewonnenen Antikörper haben jedoch murine Sequenzen, die eine nachteilige humane Anti-Maus-Immunantwort im Organismus von Patienten auslösen. Der therapeutische Nutzen von monoklonalen Mausantikörpern ist somit begrenzt. Um dieses Problem zu lösen, werden so genannte humanisierte Antikörper hergestellt, indem man Regionen der Mausantikörper, die für die Antigenspezifität unwesentlich sind, durch ein humanes Gegenstück ersetzt. Humanisierungsprotokolle zum Erreichen dieses Ziels wurden in jüngster Zeit publiziert. Das US Patent 5,585,089 offenbart zum Beispiel, wie eine Übertragung der Bindungsstelle (CDRs) eines Mausantikörpers auf einen humanen Antikörper erfolgen kann sowie, wie Aminosäuresubstitutionen in die Gerüstregionen des Mausantikörpers zur Bildung des humanisierten Antikörpers eingeführt werden. Im klinischen Einsatz zeigten diese humanisierten Antikörper durchweg eine minimale humane Anti-Maus-Reaktion und wurden erfolgreich als therapeutische Wirkstoffe gegen verschiedene Krankheiten eingesetzt. Traditionell sind diese Krankheiten Infektionskrankheiten, wie zum Beispiel Infektionen durch das Respiratory Syncytial Virus (RSV). Neuerdings werden Antikörper vermehrt in der Therapie zahlreicher anderer Erkrankungen eingesetzt, einschließlich Autoimmunerkrankungen und bösartiger Krebsformen wie metastasenbildender Brustkrebs, nicht-Hodgkins Lymphom, chronische Lymphozytenleukämie und akute Myeloidleukämie. Auch ein prophylaktischer Einsatz gegen Organabstoßung oder Blutgerinnung während einer Angioplastie war möglich. Trotz der Fülle an positiven Daten über humanisierte Antikörper sind verbliebene murine Sequenzen und nachteilige Wirkungen nach wie vor vorhanden. Daher ist es wünschenswert, vollständig humane Antikörper herzustellen, die keinerlei nicht-humane Sequenzen enthalten.

Tatsächlich wurde beschrieben, dass durch die Immunisierung transgener Mäuse, die humane Immunglobulin-Gene besaßen, vollständig humane Antikörper zu erhalten sind. Bedauerlicherweise bildet der relativ begrenzte genetische Spielraum, den eine transgene Maus bietet, ein erhebliches Hindernis, allen humanen Immunglobulin-Keimzellgene zu erfassen. Wie bereits von Jakobovits (Curr Opin Biotechnol 6:561, 1995) diskutiert, ist der Austausch in der leichten Kette auf humane κ Keimzellgene beschränkt und ein gesamtes humanes Repertoire schwerer zu erreichen. Trotz bestehender Grenzen stellt dieses besondere, wenn auch beschränkte Werkzeug eine attraktive Lösung für die Herstellung kompletter humaner monoklonaler Antikörper dar. So offenbart z.B. WO 01/14424 einen CD152-spezifischen Antikörper, der mit Hilfe eines humanen κ-Keimzellgens gewonnen wurde.

Die vorliegende Erfindung ist eine Substantiierung und Fortsetzung der US Patentanmeldung Nr. 10/866 120, die am 22. Juni 2004 eingereicht wurde, welche eine Verbesserung der Technologie der „ortsgerichteten in vitro Immunisierung" („sitedirected in vitro immunization", Chin et al. Immunol. 81:428, 1994; Eur. J. Immunol. 25:657, 1995) darstellt, die der Erfinder ersann und entwickelte. Techniken der ortsgerichteten in vitro Immunisierung sind in vitro Verfahren zur Stimulation humaner Lymphozyten, um eine Antikörperreaktion auf ein Protein-Antigen durch die Verwendung eines Bruchstückes eines interessierenden Proteins auszulösen und dem Fachmann bekannt. Beispielsweise gelang es Zafiropoulos et al. (J Immunol Methods. 200:181, 1997), die Präparation, Charakterisierung und Verwendung der Technologie zu wiederholen, die der Erfinder beschrieb. Durch die Verwendung einer eher unbegrenzten genetischen Kombination und somit einer Diversität, die humanen Lymphozyten aus verschiedenen Individuen inhärent ist, konnten neue Strukturen identifiziert werden. Die Neuheit lässt sich beispielsweise durch den Umstand veranschaulichen, dass ein bedeutendes λ-Keimzelllinien-Gen identifiziert werden konnte, was ein extrem schwieriges, wenn nicht im Grunde unmögliches Unterfangen wäre, wenn ein wie oben beschriebenes transgenes Tier verwendet würde.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine wirkungsvolle, Strukturinformation humanen Ursprungs zur Herstellung humaner Antikörper gegen CD152 bereitzustellen, die nicht mit unerwünschten Reaktionen, wie einer humanen Anti-Maus-Reaktion oder allergischen Reaktionen einhergeht.

Um diese Aufgabe zu lösen, umfaßt das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung humaner Antikörper folgende Schritte: (a) Stimulieren humaner Lymphozyten mit CD152 Immunogenen in vitro; (b) Identifizieren von und optional Screenen (Durchmustern) auf humane(n) Lymphozyten, die Antikörper produzieren, welche CD152 erkennen können, und (c) Bestimmung der Sequenzdaten klonierter Lymphozyten.

Das Diagramm in 1 zeigt die Primärstruktur eines IgG-Antikörpers, wobei dieser aus zwei schweren und zwei leichten Polypeptidketten besteht. Ungewöhnliche Diversitätseigenschaften sind teilweise auf das Vorhandensein von variablen und konstanten Regionen auf der gleichen individuellen Polypeptidkette zurückzuführen. Des Weiteren ist die Antigenbindungsstelle, welche an ein Epitop bindet und das Charakteristikum eines Antikörpers ausmacht, eine Tasche, die von gefalteten variablen Regionen der schweren (VH) und leichten (VL) Ketten gebildet wird. Eine Sequenzanalyse der konstanten Regionen zeigte, dass alle Antikörper eine von zwei Formen der L-Kette besitzen, nämlich κ oder λ. Jeder Antikörper hat zwei identische κ-Ketten oder zwei identische λ-Ketten. Demgegenüber wurden fünf verschieden H-Ketten beschrieben: μ, δ, γ, β und ε.

Auf der anderen Seite sind Ig-Gene in einzelne Abschnitte segmentiert und können zufällig zusammengespleißt werden. Beispielsweise werden bei humanen Igs Genabschnitte, die für Ig kodieren, H-, κ- und λ-Ketten auf den Chromosomen 14, 2 bzw. 22 gefunden. Ig-Genabschnitte sind jedoch im Säugetiergenom nicht zufällig gestreut sondern in Gruppen von variablen (V), mannigfaltigen (diversity, D), angrenzenden (joining, J) und konstanten (constant, C) Exons angeordnet (2). Die variablen Regionen eines Antikörperproteins, die zur Antigenbindung beitragen, werden von den Spleißprodukten der Keimbahngenabschnitte V, (D) und J kodiert, wobei V die wichtigste Rolle spielt. Es ist weitgehend akzeptiert, dass die Keimbahngene der schweren Ketten als VH1 bis VH7 klassifiziert werden, während die Keimbahngene der leichten Ketten als κ bis λ klassifiziert werden.

Unter physiologischen Bedingungen treten Mutationen vor allem in den so genannten hypervariablen CDR-Regionen auf, die im Wesentlichen vom V-Keimbahngenabschnitt kodiert werden. Mutationen treten auch in den Gerüstregionen (framework regions, FRs) auf, die einzelne CDR-Regionen flankieren, wenn auch weniger häufig. Während des Fortschreitens der Immunantwort stellt diese „somatische Hypermutation" sicher, dass die durchschnittliche Affinität der gebildeten Antikörper zum Antigen zunimmt (Affinitätsreifung). Die Idee der vorliegenden Erfindung ist es, die Beschaffenheit der humanen Ig-Keimbahnstrukturen für anti-CD152 Antikörper zu verwerten, indem die gerichteten in vitro Immunisierungstechniken eingesetzt werden.

Nach der Sequenzierung von VH_neu und VL_neu wurde eine Homologiesuche durchgeführt, um VH_neu und VL_neu mit allen verschiedenen Säuger-V-Genen in einer großen GenBank Datenbank (National Center for Biotechnology Information; NCBI, Washington, D.C., USA) zu vergleichen, und um andere homologe Proteine zu finden, deren Datenbank-Sequenzen die beste Entsprechung oder höchste Homologie besaßen. Eine Homologiesuche wurde im Internet mit dem Programm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) des NCBI durchgeführt.

Die resultierenden neuen Antikörpersequenzen, die von humanen Keimbahngenen abgeleitet sind, sind Aminosäuresequenzen von VH (VH_neu, SEQ ID NO: 1) und VL (VL_neu SEQ ID NO: 2). Wie 3 und 4 zeigen, sind VH und VL höchstwahrscheinlich von den humanen Keimbahngenen VH3 bzw. Vλ abgeleitet und besitzen die höchste Homologie zu diesen. Beim Vergleich der VH_neu-Daten mit den verfügbaren Ig-Sequenzen kommen wir zu dem Schluss, dass VH_neu (SEQ ID NO: 1) mit einer Allelform des humanen VH3 Keimbahnabschnitts assoziiert sein könnte. Die Identität mit den Genen der Hinterlegungsnummer (accession number) AB019439, VH3-30 und VH33 beträgt 89,8% (88/98, 3). Alignments zeigten auch eine Homologie von VL_neu (SEQ ID NO: 2) zu bestehenden humanen Vλ-Keimbahngenen. Dabei wurde ein Wert einer 92,13%igen Ähnlichkeit zu Genen der Hinterlegungsnummer BAC01778, 578058 und CAA38313 ermittelt (4). Eine hohe Ähnlichkeit zu zugänglichen V-Keimbahngenen humanen, jedoch nicht anderen Ursprungs ist zugleich ein Nachweis für einen vollständig humanen Antikörper.

Neben dem humanen Ursprung, der durch den Homologiealgorithmus bestätigt wurde, zeigen VH_neu und VL_neu eine spezifische Bindung an rekombinantes humanes CD152 (5). Darüber hinaus bewirken Antikörper, die derartige neue Strukturen umfassen, eine spezifische Bindung an aktivierte humane periphere T-Zellen, wenn die Expression von CD152 erhöht worden ist (6).

Die vorliegende Erfindung umfasst Antikörper mit Aminosäuresequenzen der schweren Kette, die in einigen Ausführungsformen eine Sequenzidentität von beispielsweise mehr als 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder 95% mit der Sequenz von SEQ ID NO: 1 aufweisen. Sie umfasst ferner Antikörper mit Aminosäuresequenzen der leichten Kette, die in einigen Ausführungsformen eine Sequenzidentität von beispielsweise mehr als 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder 95% mit der Sequenz von SEQ ID NO: 2 aufweisen. Die vorliegende Erfindung umfasst ferner alle Antikörperfragmente, die von den vollständigen erfindungsgemäßen Antikörpern gewonnen werden können, und die Bindungsaktivität gegen CTLA-4 zeigen. Beispiele solcher Fragmente sind Fab-Fragmente, (Fab^,)₂-Fragmente, Fv-Fragmente, die dem Fachmann wohlbekannt sind und beispielsweise proteolytisch aus den intakten Antikörpern gewonnen werden können. Derartige Antikörperfragmente können ebenfalls rekombinant z.B. in E. coli oder Hefezellen hergestellt werden. Beispiele für rekombinant hergestellte Antikörperfragmente, die dem Fachmann ebenfalls wohlbekannt sind, sind Fv-Fragmente, Fab-Fragmente, single chain Fv-Fragmente (scFv-Fragmente), oder Diabodies, um nur einige zu nennen.

Antikörper der vorliegenden Erfindung können in einer Ausführungsform als Antagonisten humaner CD 152 (CTLA4)-Rezeptoren verwendet werden. In dieser Ausführungsform blockieren sie die Signaltransduktion dieser Rezeptoren, wie bereits in US Patenten 6,051,277, 5,855,887 und 5,811,097 beschrieben wurde. CD152-Rezeptoren sind hemmend an der Regulation der Immunantwort durch periphere T-Zellen beteiligt. Die Signaltransduktion dieser CD152-Rezeptoren scheint unter anderem die klonale Ausstattung von T-Zellen mit hochaffinene T-Zellrezeptoren zu begrenzen. Es ist bekannt, dass ein Blockieren von CD152-Rezeptoren durch Antikörper die Abstoßung einer Reihe immunogener übertragbarer Tumorzelllinien auslöst, einschließlich kolorektaler Karzinom-, renaler Karzinom-, Lymphom- und Fibrosarkom-Zelllinien. Daher können die Antikörper der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Tumorerkrankungen eingesetzt werden. Beispiele für Tumorerkrankungen, die behandelt werden können, sind Lungenkrebs, Darmkrebs, Magenkrebs, Knochenkrebs, Hautkrebs, Gebärmutterkrebs, Eierstockkrebs, Knochenmarkkrebs, Speiseröhrenkrebs, Kehlkopfkrebs, Leberkrebs, Brustkrebs, Hodenkrebs oder Prostatakrebs. Die Behandlung vorstehend genannter Tumorerkrankungen mit Hilfe von Antikörpern, die an CD152 binden, ist beispielsweise in der internationalen Patentanmeldung WO 2005/003298 beschrieben.

In einer weiteren Ausführungsform können Antikörper der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten eingesetzt werden. Entsprechende Ausführungsformen sind z.B. in der US Patentanmeldung 2002/0086014 beschrieben. Beispiele für Autoimmunkrankheiten, die behandelt werden können, sind Multiple Sklerose, Myasthenia Gravis, Morbus Crohn, Morbus Basedow, Rheuma, Colitis ulcerosa, Myositis, Sarkoidose, Lupus erythematodes, Sjögren Syndrom, Cogan-Syndrom oder Guillain-Barré-Syndrom.

In einer anderen Ausführungsform können Antikörper der vorliegenden Erfindung in der Therapie von Infektionskrankheiten verwendet werden. Diese Ausführungsform wird als besonders nützlich bei der Behandlung von Infektionskrankheiten angesehen, gegen die herkömmliche Impfstoffe zur Zeit keinen oder keinen vollständigen Schutz bieten. Hierzu zählen z.B. HIV, Hepatitis, Malaria, Influenza, Herpes, Leishmania oder Giardia. Die Behandlung der genannten und weiterer Infektionskrankheiten sind in oben genannter Patentanmeldung WO 2005/003298 beschrieben.

1 ist eine schematische Darstellung der wohlbekannten Ig-Struktur.

2 ist eine Genkarte der schweren Ketten humaner Igs.

3 zeigt ein Alignment von VH_neu (SEQ ID NO: 1) mit bekannten VH-Keimbahnsequenzen mit den höchsten Homologien.

4 zeigt ein Alignment von VL_neu (SEQ ID NO: 2) mit bekannten VL-Keimbahnsequenzen mit den höchsten Homologien.

5 repräsentiert ELISA-Reaktivitätsprofile eines Antikörpers, der die neuen Strukturen enthält. Die Probe wurde aufeinanderfolgend zehnfach verdünnt und für die Beurteilung der Spezifität verwendet.

6 ist eine bildliche Darstellung der Ergebnisse einer Durchflußzytometrieanalyse von CD3⁺-T-Zellen, die CD152 exprimieren.

In den Figuren verwendete Symbole

11: variabler Region
12: leichte Kette
13: konstanter Region
14: schwere Kette
15: hypervariabler Region
17: Disulfidbrücke
20: leichte Kette Kappa (κ)
22: leichte Kette Lambda (λ)
24: schwere Kette
30: FR1 von VH
31: CDR1 von VH
32: FR2 von VH
33: CDR2 von VH
34: FR3 von VH
1~98: Aminosäuresequenz von VH
*: Aminosäureübereinstimmung des neuen Gens
40: FR1 von VL
41: CDR1 von VL
42: FR2 von VL
43: CDR2 von VL
44: FR3 von VL
1~89: Aminosäuresequenz von VL
–: Aminosäuredeletion im neuen Gen
•: humanes CD 152
⧠: monoklonaler Maus-IgG2a
⟡: Rinderserumalbumin
Tetanustoxoid (Tetanusimpfstoff)
60: Markierung ruhender CD3⁺-T-Zellen mit Hilfe eines Isotyp-entsprechenden, aber irrelevanten IgG sowie eines FITC-markierten zweiten Antikörpes
62: Markierung ruhender CD3⁺-T-Zellen mit Hilfe eines Antikörpers, der aus den neuen Strukturen bestand, sowie eines FITC-markierten zweiten Antikörpers
64: Markierung aktivierter CD3⁺-T-Zellen mit Hilfe eines Isotyp- entsprechenden, aber irrelevanten IgG sowie eines FITC-markierten zweiten Antikörpers
66: Markierung aktivierter CD3⁺-T-Zellen mit Hilfe eines Antikörpers, der aus den neuen Strukturen bestand, sowie eines FITC-markierten zweiten Antikörpers

Die vorliegende Erfindung stellt Informationen zur Herstellung vollständig humaner Antikörper bereit, die CD152 als das spezifische Antigen erkennen. Zu diesem Zweck werden Lymphozyten aus nativen humanen Spendern in vitro mit dem CD152 Immunogen immunisiert. Zellen, die Antikörper gegen das Antigen bilden, werden identifiziert, selektiert und sequenziert.

Diese Erfindung schließt auch pharmazeutische Zusammensetzungen ein, die als aktiven Bestandteil einen oder mehrere Antikörper oder Fragmente davon enthalten, ggf. in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Hilfsstoffen. Bei der Herstellung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wird in der Regel der aktive Bestandteil/ Antikörper/ das Fragment davon mit einem Hilfsstoff gemischt oder in einem solchen Träger eingeschlossen. Der Träger kann die Form einer Kapsel, Portionspackung, Papier oder eines anderen Behältnisses haben. Wenn der pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoff als Streckmittel dient, kann er auch ein festes, halb-festes oder flüssiges Material sein, das als Vehikel, Träger oder Medium für den aktiven Bestandteil fungiert. Die Zusammensetzungen können somit die Form von Lösungen, (insbesondere sterilen Injektionslösungen), Tabletten, Pillen, Puder, Bonbons, Duftkissen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Emulsionen, Sirup, Aerosolen (in fester Form oder in einem flüssigen Medium), Salben oder Zäpfchen annehmen. Salben können zum Beispiel zu bis zu 10 Gewichtsprozent eines Antikörper enthalten, Kapseln Weich- oder Hartgelatinekapseln sein und beispielsweise Puder steril verpackt sein.

Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung. Sie sind nicht in der Weise zu verstehen, dass in irgend einer Form der Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschränkt werden soll.
Beispiel 1: Erzeugung von Anti-CD 152 Antikörpern
Buffy Coats (Leukozytenfihne) gesunder Blutspender, auf die Abwesenheit von HIV-1/2, HTLV-I/II, HCV, HbsAg geprüft und mit normalem Gehalt an Alanintransferase (ALT), wurden vom Hualien Blood Center, Chinese Blood Services Foundation (Hualien, Taiwan) bezogen. Periphere mononukleare Blutzellen (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) wurden durch Dichtegradientenzentrifugation (400 × g) mit Hilfe von Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala Sweden) gewonnen.
Die erhaltenen PBMC wurden mittels CD45RO MACS microbeads (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) magnetisch markiert. Anschließend wurden sie mit Hilfe eines VarioMACS-Instruments (Miltenyi Biotec) in Untergruppen getrennt. Die eluierten CD45RO⁺-Zellen wurden durch Zentrifugation bei 100 × g gewonnen und unmittelbar anschließend in Kultur genommen, bei einer Dichte von 2 × 106 Zellen/ml in RPMI-1640-Medium (HyQ^TM; HyClone, Logan, UT), ergänzt durch 1 × nichtessentielle Aminosäuren (Life Technologies, Grand Island, NY), 10% humanen Serums, 50 μg/ml Gentamycin/Kanamycin (China Chemical & Pharmaceutical, Taipeh, Taiwan), 50 μM (3-Mercaptoethanol und 10 μg/ml Kermesbeerenmitogen (pokeweed mitogen; PWM Sigma Chemicals, St. Louis, MO). Nach einer Inkubationszeit von 24 h wurden die Zellen durch eine Zentrifugation bei 400 × g pelletiert und entnommen. Schließlich wurde eine CD45RO⁺-T-Zell-Ersatzlösung in Form des Überstandes gewonnen. Dazu wurde der verbliebene Überstand aus der Zellkultur durch einen Filter mit Poren von 0,45 mm gegeben und in eingefrorener Form bei –20°C gelagert.
Eine magnetische Zellabreicherung der PBMC wurde vorgenommen, um cytotoxische Zellpopulationen zu entfernen, die eine in vitro-Immunisierung hemmen. Kolloidale super-paramagnetische Microbeads, die mit monoklonalen Anti-Maus-CD8- und Anti-CD56-Antikörpern (Miltenyi Biotec) konjugiert waren, wurden wie oben beschrieben verwendet. PBMC, die um cytotoxische Zellen abgereichert waren, wurden in vitro unter Verwendung eines Zwei-Schritt-Protokolls immunisiert. Eine anfängliche Immunisierung wurde durch eine 6-tägige Inkubation der Zellen in einem Medium erreicht, das CD152-Immunogene sowie 50 μM (3-Mercaptoethanol, 10% Hitze-inaktiviertes humanes Serum, 0,05 ng/ml rIL2 (Calbiochem, San Diego, CA) und 25% (v/v) CD45RO⁺-T-Zell-Ersatzlösung enthielt. Am siebten Tag wurden Zellen, die der anfängliche Immunisierung unterzogen worden waren, geerntet und durch 40% Ficoll-Paque sedimentiert. Für eine sekundäre Immunisierung wurden 3 × 10⁷ Zellen in einer Flasche mit CD152 Immunogenen kontaktiert, das über Nacht mit 5 μg/ml an CD40L (CD154; Vinci-Biochem, Vinci, Italien) immobilisiert worden war. Die Zellen wurden für 3 bis 5 Tage in einem Medium kultiviert, dem 5% humanen Serums, 50μM β-Mercaptoethanol und 10 nM Peptidantigen zugesetzt worden war.
Die in vitro immunisierten Zellen wurden dann mit EBV infiziert. Kurz zusammengefaßt wurden 10⁷ Lymphozyten für zwei Stunden bei 37°C unter gelegentlichem Resuspendieren mit 1 ml eines Überstandes inkubiert, der EBV enthielt. Dieser Überstand war aus der Kultur der EBV-produzierenden Krallenaffenzellinie B95-8 (American Type Culture Collection, ATCC CRL 1612; freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. L.-F. Shu, Tri-Service General Hospital, Taipeh) erhalten worden. Die infizierten Zellen wurden mit einer Dichte von 105 Zellen/Vertiefung in einer Standard-Kulturplatte mit 96 Vertiefungen zusammen mit feeder-Zellen ausgesät. Als feeder-Zellen dienten PBMC (104 Zellen/ Vertiefung), die mit Mytomycin (Kyowa Hakko Kogyo, Tokyo, Japan) behandelt worden waren. Das Vorliegen einer Reaktionsfähigkeit auf CD 152 wurde mittels eines Antigen-spezifischen Enzymgekoppelten Immunosorbtions-Tests (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) überprüft.
Beispiel 2: Charakterisierung von humanen Anti-CD152 Antikörpern mittles ELISA
Zur Durchführung eines ELISA wurden in einem ersten Schritt Mikrotiterplatten über Nacht bei Raumtemperatur mit einem der folgenden Proteine abgesättigt: 1) ein rekombinantes humanes CD 152 (CTLA-4)-Maus-Ig-Fusionsprotein, das von BHK Zellen exprimiert worden war (Ancell Corporation, Bayport, MN), in einer Konzentration von 1 μg/ml; 2) ein monoklonaler muriner IgG2a (Ancell) in einer Konzentration von 1 μg/ml; 3) Rinderserumalbumin (Sigma) in einer Konzentration von 10 μg/Vertiefung; oder 4) Tetanustoxoid (Tetanusimpfstoff, TT, ADImmune Corporation, Taichung, Taiwan) in einer Konzentration von 10 μg/Vertiefung. Zellkultur-Überstände wurden auf das gewünschte Niveau in 10 mM Natriumphosphat, pH 8,0 verdünnt, das 0,5 M Natriumchlorid und 0,1% Tween-20 enthielt. Die abgesättigten Mikrotiterplatten wurden mit den verdünnten Zellkultur-Überständen inkubiert und gewaschen. Anschließend wurden sie mit Peroxidase-markierten Ziegen-Antikörpern inkubiert, die gegen humane IgG gerichtet waren (Zymed Laboratories, So. San Francisco, CA). Durch die Zugabe von 100 μl des chromogenen Substrates ortho- Phenyldiamin (OPD) wurde die Detektionsreaktion gestartet. Die Reaktion wurde nach 30 Min. durch Zugabe von 1 M Schwefelsäure beendet und die Absorbtion bei 490 nm gemessen. Es wurden EBV-infizierte Lymphoblastoide Zellen identifiziert, die vermutlich anti-CD152-Antikörper sezernierten, und durch begrenzte Verdünnung kloniert. Wie in 5 gezeigt, reagierte der identifizierte Antikörper spezifisch mit CD152, jedoch nicht Antigenen, die nicht damit verwandt sind, wie z.B. murines IgG2a, Rinderserumalbumin oder Tetanustoxoid.
Beispiel 3: Identifizierung neuer Strukturen
Die Primärstrukturen der neuen Antikörper wurden durch Sequnzierung von cDNA aus klonierten anti-CD152-spezifischen Zellen abgeleitet. Kurz zusammengefaßt wurde poly(A)⁺ RNA aus 2 × 10⁴ Zellen mit Hilfe des Dynabeads^® mRNA DIRECT^TM Micro Kit (Dynal Biotech, Oslo, Norwegen) isoliert. Die gereinigte mRNA wurde dann als Matrize für die Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktionen (reverse transkription polymerase chain reaction, RT-PCR) eingesetzt. Die RT-PCR wurde mit Hilfe des Titan One Tube RT-PCR-Systems (Roche Diagnostics Corporation, Indinapolis, IN durchgeführt. Verwendete PCR-Primer-Sätze (1 μM) waren: HuVH-JH (SEQ ID NO: 3 und 4) zur Amplifizierung von humanem VH und HuVλ (SEQ ID NO: 5 und 6) zur Amplifizierung von humanem VL. Die 37 Temperaturzyklen umfaßten: einen 2-minütigen Denaturierungszyklus bei 94°C, 35 Zyklen von 3-minütiger Denaturierung bei 94°C, 30 Sekunden Annealing bei 51°C und 1-minütige Verlängerung bei 68°C; sowie einen abschließenden 10-minütigen Verlängerungszyklus bei 68°C. Die PCR-Fragmente, die in der Agarose-Gelelktrophorese eine einzige Bande zeigten, wurden einer Nukleotidsequenzierung unterzogen. Die Sequenzen wurden verifiziert (Molecular Clinical Diagnostic Laboratory, DR: Chip Biotechnology, Inc., Taipei, Taiwan) und in Aminosäuren konvertiert.
Beispiel 4: Identifizierung neuer Strukturen
Zur Charakterisierung der Bindungsspezifität des humanen Anti-CD152-Antikörpers wurde seine Bindung an die Zelloberfläche humaner peripherer T-Lymphocyten untersucht, die in vitro stimuliert worden waren. Dazu wurden Kulturen von PBMC mit nachweislich erhöhter Oberflächenexpression von CD152 angelegt.
Kurz zusammengefaßt wurden Kulturen von 10 ml mit 2 × 106 Zellen/ml, die 10 μg/ml Phytohämagglutinin (PHA; GE Healthcare), 10 ng/ml Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA, Sigma), 10% autologes (d.h. vom vom selben Individuum stammendes) Plasma und RPMI-164 Medium enthielten, in einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO₂ in Luft bei 37°C für 72 h inkubiert. Die so erhaltenen Zellen wurden einer Zweifarben-Durchflußzytometrieanalyse unterzogen, um die Oberflächenexpression von CD152 zu bestimmen. Eingesetzt wurde ein FACSCalibur Zytometer (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, CA), das mit einem Macintosh Computer verbunden war. Die Datenauswertung erfolgte mittels des Programms Cell Quest (Becton Dickinson). Logarithmisch amplifizierte Fluoreszenzdaten wurden von 10.000 CD3-Zellen gewonnen. Alle Durchflußzytometrie-Färbeschritte erfolgten bei 4°C in Durchflußzytometriepuffer (13 PBS, 0,01% NaN₃, 12% Rinderserumalbumin; Sigma). Zur extrazellulären Detektion von CD 152 wurden aktivierte Zellen zunächst mit monoklonalen Anti-CD3-PE-Antikörpern und dem neuen humanen Anti-CD152-Antikörper oder einer Isotypen-Kontrolle behandelt. Die Oberflächenfärbung erfolgte mit FITC-konjugiertem Anti-human IgG. Die in 6 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die neuen humanen Anti-CD152-Antikörper bevorzugt mit aktivierten CD3⁺-T-Zellen reagieren (7,31% gegenüber 2,38%), die CD152 in größeren Mengen exprimieren. Das gezeigte Ergebnis ist repräsentativ für vier unabhängig durchgeführte Versuche.
Obwohl die vorliegende Erfindung anhand einer bevorzugten Ausführungsform erläutert worden ist, sollte selbstverständlich sein, dass viele andere mögliche Abwandlungen und Variationen vorgenommen werden können, ohne vom Geist und dem Umfang der Erfindung, wie nachfolgend beansprucht, abzuweichen.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Humaner Antikörper, der in der Lage ist, humanes CD152(CTLA-4) zu binden, oder ein Antikörperfragment davon, wobei die schwere Kette des Antikörpers vom humanen Keimbahngen VH3 und die leichte Kette vom humanen Keimbahngen Vλ abgeleitet sind.
Antikörper nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz der schweren Kette eine Sequenzidentität von mindestens 70% mit der Sequenz von SEQ ID NO: 1 hat.
Antikörper nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz der leichten Ketten eine Sequenzidentität von mindestens 70% mit der Sequenz von SEQ ID NO: 2 hat.
Verwendung eines Antikörpers gemäß Anspruch 1 zur Diagnose oder Behandlung menschlicher Krankheiten, die durch Über- oder Unterexpression von CD152 verursacht werden.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.