ES2236605T3 - Tecnologia de anticuerpos dirigida. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la identificación de secuencias experimentales de por lo menos la zona CDR3 de los anticuerpos específicos contra al menos un antígeno producido por un microorganismo durante una infección o contra una vacuna, que comprende las etapas siguientes: (i) secuenciar por lo menos la zona CDR3 de las zonas de codificación VH y/o VL de dichos linfocitos B con linfocitos B aislados por lo menos de un paciente que ha sido infectado por dicho microorganismo o al que se le ha administrado dicha vacuna; y (ii) correlacionar por lo menos dichas zonas CDR3 secuenciadas de las zonas de codificación VH y VL de dichos linfocitos B para identificar una serie de secuencias experimentales por lo menos para una zona CDR3 de los anticuerpos específicos contra al menos dicho antígeno producido por dicho microorganismo o contra dicha vacuna, sucediendo cada uno de dichos conjuntos de secuencias CDR3 experimentales o una secuencia que presenta por lo menos el 60% de homología con éstas en total con una frecuencia de al menos 1 por ciento en la serie de secuencias determinadas en la etapa (i).
Description
Tecnología de anticuerpos dirigida.
La presente invención se refiere a los
procedimientos de identificación de anticuerpos específicos para
microorganismos tales como bacterias, virus y levaduras y que
confieren inmunidad contra la infección por los mismos. Asimismo se
proporcionan procedimientos para la preparación de medicamentos,
procedimientos para el tratamiento de pacientes que producen bases
de datos, bases de datos producidas por los mismos, procedimientos
para la preparación de informes respecto a los mismos,
procedimientos para la determinación de la eficacia de vacunas,
bases de datos producidas por las mismas y procedimientos para la
preparación de informes respecto a las mismas.
Durante el transcurso de la infección microbiana
se emplean varias estrategias adaptativas por el sistema
inmunitario. Una de dichas estrategias, y que podría considerarse
la más importante, es la producción de una respuesta del anticuerpo.
Los anticuerpos capaces de unirse a los antígenos presentados por
el agente infeccioso se producen y se unen a los microorganismos y
permiten su destrucción mediante la activación del complemento, el
restablecimiento del macrófago y mediante la interacción directa
con el propio microbio. La eficacia terapéutica de los anticuerpos
capaces de unirse a un antígeno dado varía y esto se refleja en el
hecho de que la producción de anticuerpos por el sistema
inmunitario madura durante el transcurso de una infección y llega a
ser el centro de atención en el caso de un paciente que lucha con
éxito contra una infección.
La respuesta del anticuerpo se produce por el
repertorio de linfocitos B cuando los linfocitos B individuales
producen moléculas de anticuerpos estructuralmente diversas. El
tamaño real de este repertorio de linfocitos B y anticuerpos es
desconocido, pero se estima que la frecuencia aleatoria clonal de
la reactividad de un antígeno dado puede ser tan elevada como 1 en
100.000 en los linfocitos B cultivados (Nobrega A. et al., Eur.
J. Immunol. 1998 resumen; 28(4):1204-15;
PMID: 9565360). Durante el transcurso de la infección, los
anticuerpos capaces de unirse al patógeno se seleccionan por
cambios en la población de linfocitos B resultantes en los
anticuerpos clave que se producen en grandes cantidades. Los
mecanismos de estos cambios incluyen la expansión clonal, la
clasificación de isotipos y la mutación somática de las zonas
variables de la inmunoglobulina. Los linfocitos B responsables de
la generación de anticuerpos que son capaces de unirse a patógenos
se multiplican, sesgando de este modo el repertorio de linfocitos B
y cambiando las proporciones de linfocito B. Por ejemplo, en un
estudio de linfocitos B aislados de la sangre de individuos con
inmunidad y anticuerpos contra Plasmodium falciparum (el
agente causante del paludismo) la frecuencia de los linfocitos B
circulantes que producen anticuerpos reactivos contra el patógeno
fue tan alta como 1 en 1.403 (no se pudo observar reactividad del
patógeno en los individuos no infectados; Migot F. et al., Clin.
Exp. Immunol. diciembre de 1995;
102(3):529-34; PMID:8536368). En la
infección por VIH, se ha observado una distorsión similar en el
repertorio de linfocitos B circulantes cuando la frecuencia de
linfocitos B que producen anticuerpos específicos contra VIH se
observó que era nueve veces mayor en los individuos VIH+ en
comparación con los pacientes VIH- (Zubler RH et al., Clin. Exp.
Immunol. enero de 1992; 87(1):31-6;
PMID: 1733635).
Obviamente es deseable que se pueda efectuar el
tratamiento de la infección en pacientes. Esto se puede realizar,
por ejemplo, por vacunación o por inmunoterapia pasiva, así como
mediante la utilización de otros productos químicos terapéuticamente
eficaces. Normalmente, la vacunación se consigue por aislamiento y
purificación de un inmunógeno del patógeno infeccioso y
utilizándola como base, ya sea en forma modificada o no modificada,
para una vacuna que se administra a pacientes para estimular la
producción de anticuerpos.
La inmunoterapia pasiva se puede conseguir
mediante la administración del anticuerpo a un paciente y es
particularmente eficaz en el tratamiento de pacientes
inmunoinsuficientes que son incapaces de responder a la vacunación y
a pacientes que necesitan la terapia inmediata y no pueden esperar
que haga efecto la vacunación. La inmunoterapia pasiva se consigue
normalmente administrando a un paciente un anticuerpo monoclonal
específico contra un inmunógeno producido por un patógeno. Por
tanto, para efectuar el tratamiento del paciente, en primer lugar
se debe aislar y purificar un inmunógeno, administrar a los
animales de la prueba y clonar las células que producen anticuerpo
específico contra el inmunógeno. La gama de anticuerpos producida
por los clones puede a continuación probar su eficacia terapéutica
y un solo anticuerpo monoclonal seleccionado que se administra a
continuación a los pacientes efectuar la inmunoterapia pasiva.
Obviamente todas estas técnicas resultan algo
complejas, inconvenientes, costosas y prolongadas. En general
requieren que se aísle un inmunógeno del patógeno infeccioso y se
utilice para generar anticuerpos. Simplemente el aislamiento del
inmunogen puede ser extremadamente difícil y prolongado. En
particular, los antígenos con carbohidratos plantean grandes
problemas (son presentados por similares a Meningitidis del grupo B
p. ej., Neisseria meningitidis y Streptococcus
agalactiae. Existen también epítopos complejos no lineales (es
decir con características estructurales secundarias, terciarias y
cuaternarias) que no se pueden sintetizar in vitro. Como tal
es simplemente imposible aislar y producir el antígeno para su
utilización p. ej., como vacuna. Además, algunos epítopos son
producidos solamente por patógenos in vivo y no se sintetizan
in vitro. Varios sistemas de expresión específicos del
anfitrión son bien conocidos, por ejemplo en la gonorrea (organismo
causante Neisseria gonorrhoeae) los antígenos específicos se
expresan en la infección de un anfitrión, dichos antígenos están
comprendidos en la clase general de criptantígenos. Además, los
antígenos muy lábiles plantean también problemas a los sistemas de
la técnica anterior ya que durante la utilización simplemente se
degradan y se pierde el epítopo que presentan. Con esta amplia gama
de epítopos/antígenos cuya identificación y/o utilización in
vitro es de gran dificultad o imposible la presente invención
proporciona una solución y permite la producción y el aislamiento de
anticuerpos específicos contra ellos.
Además, la técnica anterior normalmente ha de
intentar conseguir un equivalente de maduración por afinidad de los
anticuerpos sintetizando en primer lugar una serie de anticuerpos
experimentales específicos para un antígeno, probando sus
características de unión y a continuación modificando las secuencias
de los candidatos con el fin de optimizar la unión. Un intento
completo en maduración por afinidad (es decir optimizando la unión
del anticuerpo) puede requerir la síntesis de miles de anticuerpos
diferentes, que puede ser costosa y prolongada. Debido a que los
anticuerpos de la presente invención se obtienen de pacientes que
han sido infectados por un patógeno que presenta un antígeno o que
han sido vacunados con un antígeno, ellos han experimentado ya por
su naturaleza y definición la maduración por afinidad, como está
demostrado muy claramente por las secuencias de sus zonas CDR3.
La presente invención intenta superar las
desventajas de la técnica anterior.
Según la presente invención, se proporciona un
procedimiento para la identificación de secuencias experimentales
por lo menos de la zona CDR3 de los anticuerpos específicos contra
al menos un antígeno producido por un microorganismo durante una
infección o contra una vacuna, que comprende las etapas
siguientes:
- (i)
- secuenciar por lo menos la zona CDR3 de las zonas de codificación VH y/o VL de dichos linfocitos B con linfocitos B aislados por lo menos de un paciente que ha sido infectado por dicho microorganismo o se le ha administrado dicha vacuna; y
- (ii)
- correlacionar por lo menos dichas zonas CDR3 secuenciadas de las zonas de codificación VH y VL de dichos linfocitos B para identificar una serie de secuencias experimentales por lo menos para una zona CDR3 de los anticuerpos específicos contra al menos dicho antígeno producido por dicho microorganismo o contra dicha vacuna, cada uno de dichas series de secuencias CDR3 experimentales o una secuencia que presenta por lo menos el 60% de homología con éstas que sucede en total con una frecuencia de al menos 1 por ciento en la serie de secuencias determinadas en la etapa (i).
Ejemplos de pacientes utilizados como fuente de
linfocitos B en dicho procedimiento son los seres humanos y otros
mamíferos tales como ratones, conejos, ratas, mandriles, monos y
antropoides.
En determinadas formas de realización de la
invención, la etapa (i) puede comprender las etapas siguientes:
- (i)(a)
- aislamiento de linfocitos B de por lo menos un paciente que ha sido infectado por dicho microorganismo o se le ha administrado dicha vacuna; y
- (i)(b)
- secuenciado de por lo menos la zona CDR3 de las zonas de codificación VH y/o VL de dichos linfocitos B;
Las secuencias que se producen en total a una
frecuencia de por lo menos 1 por ciento en la serie de secuencias
determinadas en la etapa (i) pueden ser las secuencias CDR3
experimentales o una secuencia que presenta por lo menos el 80% de
homología, por ejemplo 85, 90, 95, 96, 97, 98 ó 99% de homología
con ésta. La homología de secuencia es como se determina utilizando
el programa BLAST2 (Tatusova TA et al., FEMS Microbiol.
Lett. 15 de mayo de 1999; 174(2):247-50;
PMID: 10339815) en el National Center for Biotechnology
Information, USA (www.ncbi.nim.nlh.gov) con falta de parámetros.
Por ejemplo, las secuencias que se producen en
total a una frecuencia de por lo menos 1 por ciento en la serie de
secuencias determinadas en la etapa (i) pueden ser las secuencias
CDR3 experimentales o una secuencia que presenta 1 ó 2 cambios de
aminoácido en ellas. Por ejemplo, una primera secuencia puede tener
lugar a una frecuencia de 0,7 por ciento, y la primera, segunda,
tercera y cuarta secuencias que tienen cada una un solo cambio de
aminoácido en ellas cada una tiene lugar a una frecuencia de 0,1%,
la frecuencia total es por consiguiente 1,1% y la secuencia del
anticuerpo dominante (que tiene lugar a una frecuencia de 0,5%) es
por consiguiente una secuencia CDR3 experimen-
tal.
tal.
Esto resulta fundamentalmente diferente respecto
a los procedimientos de la técnica anterior de preparación de un
banco de anticuerpos en un vector tal como un banco de fagos en el
que los anticuerpos se aíslan por apelmazamiento y que requieren la
unión con un antígeno (conocido) específico en un estado
estructuralmente específico y con carga. Una analogía mediante la
cual se pueden comparar los dos sería como decir que la técnica
anterior es la formación de una biblioteca y el posterior
apelmazamiento es como entrar en una biblioteca, escoger un libro y
esperar que sea el correcto. En comparación, la presente invención
es como entrar en una biblioteca, leer todos los libros en la
biblioteca y encontrar uno que es el libro dominante (que existen
muchas copias de él) y que es adecuado para la enfermedad que se
debe tratar.
Además, la utilización en la técnica anterior de
los sistemas de banco presenta numerosos problemas significativos,
en particular, algunos anticuerpos producidos por un banco pueden
producir la muerte del organismo que los expresa y por consiguiente
ellos simplemente no se pueden detectar. Este no es un problema
particular cuando por ejemplo buscando anticuerpos específicos de
cánceres, sino cuando se está buscando anticuerpos específicos
contra un antígeno a partir de un patógeno que puede ser homólogo a
uno producido por el sistema de expresión en el anfitrión (p. ej.
E. coli), entonces los anticuerpos importantes no se pueden
expresar. La utilización p. ej. de E. coli para expresar
banco p. ej., de anticuerpos humanos también adolecen del problema
de la utilización del codón, los codones utilizados por el hombre
para aminoácidos específicos con frecuencia pueden no ser los
óptimos para el mismo aminoácido en E. coli u otros sistemas
del anfitrión. Esto significa que un anticuerpo importante puede no
expresarse (o al menos no en suficientes cantidades) ya que los
codones en su secuencia son muy ineficaces en E. coli, dando
como resultado en el E. coli que no pueda leer completamente
y lo exprese en total. La optimización del codón de los bancos de
anticuerpo no es obviamente una opción ya que los bancos en primer
lugar deberían de ser secuenciados, lo cual frustra las principales
ventajas de la utilización de bancos. Como la presente invención
secuencia anticuerpos directamente en un paciente, ello evita este
problema.
La etapa (ii) de correlación también puede
correlacionar la aparición de las secuencias experimentales contra
su aparición en pacientes que no han sido infectados con el
microorganismo o se le ha administrado la vacuna, determinándose
solamente las secuencias que son las secuencias experimentales si
ellas o una secuencia con uno o dos cambios de aminoácidos en ellas
tienen lugar en total con una frecuencia menor del 1 por ciento en
los pacientes no infectados/vacunados.
Por lo menos un antígeno producido por el
microorganismo puede desde luego ser un inmunógeno.
La presente invención proporciona oportunidades
únicas para comprender las respuestas del anticuerpo a la infección
que no estaban disponibles anteriormente, y proporciona nuevas
oportunidades de diagnóstico y terapéuticas.
En particular, los procedimientos de la presente
invención evitan la necesidad de aislar un antígeno procedente de
microorganismo, y en su lugar determinan la identidad de
anticuerpos específicos contra uno o más antígenos producidos por el
microorganismo. Como se explica a continuación los procedimientos
de la presente invención permiten la identificación de anticuerpos
terapéuticamente eficaces y pueden permitir la identificación de
las partes más importantes de las secuencias del anticuerpo. Esto es
particularmente evidente cuando los linfocitos B de un paciente
dado se muestrean en diferentes puntos de tiempo durante el
transcurso de una infección por un microorganismo, a medida que el
sistema inmunitario del paciente se centra en la producción de
anticuerpos terapéuticamente eficaces contra el microorganismo
infeccioso, se observa un enfoque de las secuencias del anticuerpo,
y se observa el desarrollo de zonas variables y no variables dentro
de las partes de la CDR de las secuencias VH y VL. Además, los
procedimientos de la presente invención pueden permitir la
identificación de los anticuerpos más adecuados para el tratamiento
de la infección en determinados grupos de pacientes, tales como la
edad, el sexo y los grupos raciales. Asimismo comparando las
secuencias del anticuerpo de pacientes que se han recuperado de la
infección con las de los que no se han recuperado de la infección,
se pueden identificar las secuencias de anticuerpo ineficaces (que
podrían estar producidas por ambos conjuntos de pacientes).
Los linfocitos B aislados al menos de un paciente
pueden ser linfocitos B periféricos (PBL) y se pueden aislar de una
muestra de sangre por lo menos de un paciente. Los linfocitos B
también se pueden aislar de otras fuentes y la presente invención
incluye su utilización. Por ejemplo, los linfocitos B se pueden
aislar del bazo.
Las secuencias CDR de anticuerpo se determinan
tal como se detalla en el apartado "Experimentos" utilizando
técnicas normalizadas y definiciones de su inicio y fin.
Tal como se detalla a continuación, las
secuencias de anticuerpo se determinan en pacientes con infecciones
especificadas. Estas secuencias pueden proceder de ARNm de
inmunoglobulina de linfocitos B y por consiguiente reflejar los
anticuerpos expresados y los repertorios en éstos. Las secuencias
determinadas según la presente invención no necesitan ser las
secuencias de todas las moléculas de anticuerpos, comprenden por lo
menos las secuencias VH y VL que especifican las zonas responsables
de la unión del antígeno.
En las secuencias de nucleótidos determinadas
mediante el secuenciado inicial, se pueden determinar las supuestas
secuencias de aminoácidos para las zonas VH y VL utilizando
algoritmos patrones y paquetes de programas informáticos (p. ej.
véase www.mrc-lmb.cam.ac.uk/pubseq/, el paquete
Staden y los programas Gap4). Estas pueden ser más caracterizadas
para determinar las partes de la CDR (zona determinante de
complementariedad) de las secuencias VH y VL, particularmente CDR1,
CDR2 y CDR3. Los procedimientos para la determinación de las
supuestas secuencias de aminoácidos y la identificación de las
zonas CDR son bien conocidos y se detallan a continuación.
Además de las secuencias de aminoácidos VH y/o
VL, se pueden utilizar en la etapa de correlación diversos
elementos de información adicional:
- (i)
- el microorganismo que produce la infección al paciente;
- (ii)
- el punto de infección;
- (iii)
- el punto de tiempo durante el proceso de infección en el que se toman muestras de las secuencias de anticuerpo;
- (iv)
- detalles del paciente, ninguno o más de: sexo, raza y edad; y
- (v)
- el intervalo de las zonas determinantes de complementariedad (CDR) es decir las zonas variables del anticuerpo que experimentan unión/contacto directo con el antígeno.
Por tanto en un procedimiento según la presente
invención, se pueden utilizar linfocitos B que han sido aislados
por lo menos de un paciente en diversos puntos de tiempo durante la
infección (o después de la vacunación) por el microorganismo por lo
menos de un paciente, correlacionando la etapa (ii) de correlación
el punto de tiempo durante la infección por lo menos de un paciente
por el microorganismo en el que se aíslan los linfocitos B.
Asimismo, en un procedimiento según la presente
invención, se pueden utilizar linfocitos B que han sido aislados
por lo menos de dos pacientes, uno de los cuales al menos se ha
recuperado de la infección por el microorganismo, y al menos uno de
los cuales no se ha recuperado de la infección por el
microorganismo, correlacionando la etapa (ii) de correlación la
recuperación por lo menos de dos pacientes de la infección por el
microorganismo.
Asimismo, en un procedimiento según la presente
invención, se pueden utilizar linfocitos B que han sido aislados
por lo menos de dos pacientes, siendo infectados los pacientes por
diferentes microorganismos que producen por lo menos un antígeno,
correlacionando la etapa (ii) de correlación por lo menos las zonas
de codificación VH y VL secuenciadas de los linfocitos B para
identificar una serie de secuencias experimentales para los
anticuerpos, cada una de las cuales es específica contra por lo
menos un antígeno compartido producido por los diferentes
microorganismos o es específica contra diferentes antígenos
producidos por los diferentes microorganismos.
El secuenciado de las zonas VH y VL también se
puede utilizar para identificar la estructura del anticuerpo
circundante y de este modo se puede utilizar para determinar el
isotipo del anticuerpo. Éste se puede utilizar a continuación en la
etapa de correlación para determinar si los isotipos específicos
del anticuerpo son particularmente útiles.
Se han realizado experimentos para secuenciar las
zonas VH y VL de los PBL aislados de pacientes con
Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA),
Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa (agente
causante de la fibrosis quística), Streptococcus oralis e
infecciones por enterococos resistentes a la vancomicina (VRE) y
para identificar secuencias de anticuerpo que están relacionadas con
la resistencia a las infecciones y que por lo tanto se pueden
utilizar para efectuar la terapia contra estas infecciones. Estas
secuencias han constituido la base de los documentos GB 0127983 y WO
01/76627.
Para todas estas, las secuencias VH o VL aisladas
demuestran el sesgo del repertorio del anticuerpo en todo el
transcurso de la infección, poniendo de manifiesto de este modo la
identidad de las secuencias VH y VL maduradas, que confieren
inmunidad. Esto que se ha realizado normalmente utilizando 5.000 a
15.000 secuencias para cada uno de los repertorios VH o VL, VH y VL
de individuos sanos se puede utilizar también con fines de
comparación.
El término "terapia" significa cualquier
tratamiento que se diseñe para curar, aliviar, eliminar o reducir
los síntomas, o prevenir o reducir la posibilidad de contraer
cualquier trastorno o disfunción del cuerpo humano o animal.
La invención es adecuada para la identificación
de secuencias de anticuerpos útiles en el tratamiento de las
infecciones anteriores, así como en otras infecciones tales como
las infecciones víricas en las que el anticuerpo ha demostrado que
es importante (incluyendo pero sin limitarse al VIH, virus de la
gripe, virus de la hepatitis A, B, C y D, virus hemorrágicos tales
como los virus Ébola, así como el Dengue y de la fiebre amarilla)
así como las infecciones parasitarias tales como el paludismo (P.
falciparum).
Utilizando los campos de información adicional
mencionados anteriormente en la etapa (ii) de correlación, es fácil
realizar la correlación utilizando, p. ej., solamente las
secuencias de las CDR, las CDR de un paciente dado o una infección
dada o ambos, las CDR de un punto dado o de un grupo de pacientes,
o las CDR de diferentes tiempos de muestreo durante el transcurso
de la infección.
Estas correlaciones son específicas de CDR porque
son las zonas hipervariables responsables de la unión del antígeno
y de la diversidad de secuencias del repertorio de anticuerpos
(aunque se pueden utilizar zonas de la estructura en la etapa de
correlación también para poner de manifiesto el isotipo del
anticuerpo).
La presente invención es útil en una amplia gama
de aplicaciones, p. ej. terapia con anticuerpos y estudios de
vacunas.
Ésta implica la transferencia pasiva de
anticuerpos a individuos no inmunizados (p. ej., pacientes que
reciben quimio/radioterapia, inmunosupresión para el trasplante de
órganos, inmunodeficiencia debida a las enfermedades subyacentes
tales como diabetes, traumatismo, etc., también los muy jóvenes o
muy viejos).
La presente invención se puede utilizar para
determinar las secuencias de anticuerpos que confieren inmunidad
buscando las secuencias VH y VL sobre-representadas
en pacientes que han superado la infección. Estos anticuerpos
protectores se pueden volver a sintetizar en el nivel genético,
sobreexpresar en E. coli (u otros sistemas de expresión) y
purificar. El anticuerpo recombinante purificado resultante se puede
administrar a continuación a pacientes como inmunoterapia pasiva.
Los anticuerpos se pueden también encargar en proveedores
comerciales tal como Operon Technologies Inc. USA (www.operon.com)
simplemente suministrándoles la secuencia del anticuerpo que se
debe preparar.
Las secuencias terapéuticamente útiles se pueden
identificar en numerosas formas que se pueden utilizar en la etapa
(ii) de correlación:
- 1)
- Buscando la sobre-representación de la secuencia del anticuerpo en pacientes que se han recuperado de la infección por linfocitos B que producen anticuerpos capaces de unirse al patógeno que experimenta expansión clonal, por consiguiente secuencias de anticuerpo de alta frecuencia es más probable que se unan al patógeno y confieran inmunidad.
- 2)
- Siguiendo las alteraciones en el repertorio del anticuerpo durante el transcurso de la infección. Durante la infección los anticuerpos experimentan un proceso de maduración para mejorar la unión al patógeno y éste se caracteriza por alteraciones en la secuencia. También, la expansión clonal de los linfocitos B es más frecuente en las etapas finales de la infección en las que se cura la infección. Los anticuerpos más frecuentes en el repertorio se seleccionan como candidatos para la inmunoterapia. Tras el proceso de maduración el anticuerpo experimental demostrará qué alteraciones clave de los restos de aminoácidos mejoran la unión al antígeno y esta información se puede utilizar para mejorar el diseño del anticuerpo.
- 3)
- Análisis de los repertorios de diferentes pacientes con la misma infección pueden identificar anticuerpos protectores compartidos e idénticos. Estos anticuerpos son selecciones atractivas para la inmunoterapia ya que su aparición en diferentes pacientes sugiere una fuerte selección positiva en su favor, por consiguiente una importante función en la inmunidad basada en anticuerpos.
- 4)
- Análisis de los repertorios de pacientes con diferentes infecciones. En esta situación, si se observa una secuencia de anticuerpos común en los repertorios para ambos patógenos, el anticuerpo puede servir para el tratamiento de ambos tipos de infecciones, es decir que presenta un amplio espectro.
- 5)
- Análisis de los repertorios para la maduración por afinidad de las secuencias.
La vacunación protege contra la infección
preparando el sistema inmunitario con antígeno(s)
derivado(s) del patógeno. La vacunación se efectúa mediante
una única o repetidas exposiciones al antígeno(s)
derivado(s) del patógeno y permite la maduración del
anticuerpo y la expansión clonal de linfocito B sin los efectos
perjudiciales del proceso infeccioso hecho y derecho. La
implicación de los linfocitos T es también de gran importancia al
efectuar la vacunación de los pacientes. La presente invención se
puede utilizar para controlar el proceso de inmunización con vacunas
experimentales. Se administra la vacuna experimental a los
pacientes y se amplifican las secuencias VH y VL en el paciente y
se analiza el repertorio del anticuerpo como se describió
anteriormente. La evaluación cualitativa y cuantitativa del proceso
de vacunación es posible:
- 1)
- Se evalúa el repertorio VH/VL de un grupo de pacientes al que se ha administrado una vacuna experimental. Se puede realizar una disección molecular precisa de la respuesta del anticuerpo resultante a la vacuna para determinar (a) la expansión clonal de los anticuerpos protectores, (b) la producción de anticuerpos protectores en diferentes poblaciones (por ejemplo diferenciando grupos étnicos con antecedentes genéticos, así como p. ej., grupos de edad y sexo diferentes), y (c) el efecto a largo plazo de la vacuna, es decir, la respuesta al anticuerpo durante el largo plazo, la memoria del anticuerpo a largo plazo en el sistema inmunitario así como cualquier defecto autoinmunitario;
- 2)
- Cuando la vacuna produce una aumento de frecuencia de un anticuerpo dado, la secuencia de anticuerpos puede fácilmente clonarse y expresarse y utilizarse en modelos de infección animales. Si el anticuerpo es protector, puede ser útil en sí mismo como una inmunoterapia, pero esto demuestra también que la vacuna probablemente es protectora sin someter al paciente humano a la infección experimental. Por otra parte, en ausencia de un modelo animal adecuado, el anticuerpo protector clonado se puede evaluar en cultivos celulares (particularmente útil en estudios en el hombre con VIH y otros virus). Esto es un método único para el estudio de la eficacia de la vacuna.
También se proporciona en la presente invención
un procedimiento para la preparación de un medicamento destinado al
tratamiento de una infección por un microorganismo que produce por
lo menos un antígeno, que comprende las etapas siguientes:
- (i)
- realización de un procedimiento según la presente invención para identificar una serie de secuencias experimentales para anticuerpos específicos contra por lo menos un antígeno producido por el microorganismo; y
- (ii)
- síntesis de por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia experimental específica contra por lo menos un antígeno producido por el microorganismo.
Dicho medicamento puede desde luego incorporar un
portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable
(Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia, 1984,
Mack Publishing Company, Easton, PA, USA; United States
Pharmacopoeia, ISBN: 1889788031).
También se proporciona en la presente invención
un procedimiento para el tratamiento de una infección de un
paciente por un microorganismo que produce por lo menos un
antígeno, que comprende las etapas siguientes:
- (i)
- realización de un procedimiento según la presente invención para identificar una serie de secuencias experimentales para anticuerpos específicos contra por lo menos un antígeno producido por el microorganismo;
- (ii)
- síntesis de por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia experimental específica contra por lo menos un antígeno producido por el microorganismo; y
- (iii)
- administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos un anticuerpo sintetizado para el paciente.
También se proporciona según la presente
invención un procedimiento para la producción de una base de datos
que identifica las secuencias experimentales para anticuerpos
específicos contra por lo menos un antígeno producido por un
microorganismo, que comprende las etapas siguientes:
- (i)
- realización de un procedimiento según la presente invención para identificar una serie de secuencias experimentales para anticuerpos específicos contra por lo menos un antígeno producido por el microorganismo; y
- (ii)
- almacenamiento de los datos producidos por dicho procedimiento en la base de datos.
Asimismo se proporciona un procedimiento para la
generación de un informe que identifica las secuencias
experimentales para anticuerpos específicos contra por lo menos un
antígeno producido por un microorganismo, que comprende las etapas
siguientes:
- (i)
- realización de un procedimiento según la presente invención para identificar una serie de secuencias experimentales para anticuerpos específicos contra por lo menos un antígeno producido por el microorganismo; y
- (ii)
- producción de un informe que comprende los datos producidos por el procedimiento de la etapa (i).
Asimismo se proporciona según la presente
invención un procedimiento para determinar la eficacia de una
vacuna, que comprende las etapas siguientes:
- (i)
- secuenciado de por lo menos la zona CDR3 de las zonas de codificación VH y/o VL de dichos linfocitos B con linfocitos B aislados de por lo menos un paciente al que se ha administrado dicha vacuna; y
- (ii)
- correlación por lo menos de dicha zona CDR3 secuenciada de las zonas de codificación VH y/o VL de dichos linfocitos B, para identificar una serie de secuencias experimentales por lo menos para la región CDR3 de los anticuerpos específicos contra dicha vacuna, teniendo cada una de dichas series de secuencias experimentales de CDR3 o produciéndose una secuencia por lo menos el 60% de homología con éstas en total a una frecuencia de por lo menos el 1 por ciento en la serie de secuencias determinadas en la etapa (i).
En determinadas formas de realización de la
invención, la etapa (i) anterior puede comprender las etapas
de:
- (i)(a)
- administración de dicha vacuna por lo menos a un paciente;
- (i)(b)
- aislamiento de los linfocitos B por lo menos de dicho paciente; y
- (i)(c)
- secuenciado por lo menos de la zona CDR3 de las zonas de codificación VH y/o VL de dichos linfocitos B.
La etapa (ii) de correlación puede comprender la
correlación de dicho secuenciado por lo menos en una zona CDR3 de
las zonas de codificación VH y VL de dichos linfocitos B con el
secuenciado por lo menos de una zona CDR3 de las zonas de
codificación VH y VL de los linfocitos B aislados por lo menos de
un paciente que ha sido infectado con un microorganismo contra el
que la vacunación que dicha vacuna se pretende que estimule una
respuesta inmunitaria protectora.
Como se describió anteriormente, se puede
utilizar información adicional en la etapa de correlación (ii), que
incluye:
- (i)
- el tiempo desde la administración de la vacuna al paciente;
- (ii)
- detalles del paciente, ninguno o más de: sexo, raza y edad; y
- (iii)
- la gama de zonas determinantes de complementariedad (CDR) es las zonas variables del anticuerpo que experimentan unión/contacto directo con el antígeno.
Las secuencias del anticuerpo determinadas en
pacientes a los que se ha administrado la vacuna se pueden comparar
con las secuencias del anticuerpo aisladas de pacientes que han
sido infectados con el microorganismo contra el que la vacuna
pretende estimular una respuesta inmunitaria protectora en los
pacientes. Por tanto es posible determinar si la vacuna produce la
generación de anticuerpos que también son producidos por el propio
microorganismo en respuesta a la infección. En particular, se puede
realizar la comparación utilizando secuencias de anticuerpo
determinadas en los pacientes que se han recuperado de la infección
por el microorganismo.
En particular, el procedimiento puede determinar
la eficacia de la vacuna estimulando una respuesta inmunitaria
protectora contra el microorganismo contra el que la vacunación con
la vacuna pretende estimular una respuesta inmunitaria
protectora.
Asimismo se proporciona según la presente
invención un procedimiento para la vacunación de un paciente contra
la infección por un microorganismo, que comprende las etapas
siguientes:
- (i)
- realización por lo menos con una vacuna de un procedimiento según la presente invención para determinar la eficacia por lo menos de una vacuna en la estimulación de una respuesta inmunitaria protectora contra el microorganismo contra el que la vacunación al menos con una vacuna pretende estimular una respuesta inmunitaria protectora;
- (ii)
- correlación de los resultados de la etapa (i) para determinar la más adecuada por lo menos de una vacuna para el paciente; y
- (iii)
- la vacunación del paciente con la más adecuada por lo menos de una vacuna.
También se proporciona un procedimiento para la
producción de una base de datos que identifica la eficacia de una
vacuna, que comprende las etapas siguientes:
- (i)
- realización de un procedimiento según la presente invención para determinar la eficacia de la vacuna; y
- (ii)
- almacenamiento de los datos producidos por el procedimiento en la base de datos.
Asimismo se proporciona según la presente
invención un procedimiento para la generación de un informe que
identifica la eficacia de una vacuna, que comprende las etapas
siguientes:
- (i)
- realización de un procedimiento según la presente invención para determinar la eficacia de la vacuna; y
- (ii)
- producción de un informe que comprende los datos producidos por el procedimiento.
Con respecto a los anticuerpos que se pueden
utilizar en la presente invención, particularmente los anticuerpos
sintéticos (el término "anticuerpo" se considera también que
incorpora fragmentos de anticuerpos que se unen al antígeno a menos
que el contexto lo requiera de otro modo), el anticuerpo puede ser
un anticuerpo completo o un fragmento de unión al antígeno del
mismo y en general puede pertenecer a cualquier clase de
inmunoglobulina. Por tanto, por ejemplo, puede ser un anticuerpo de
IgM o IgG. El anticuerpo o fragmento puede ser de animal, por
ejemplo, de origen mamífero y puede ser por ejemplo de origen
murino, de rata, oveja o humano. Puede ser un anticuerpo natural o
un fragmento del mismo, o, si se desea, un fragmento de anticuerpo
recombinante, es decir un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que
se ha producido utilizando técnicas de ADN recombinante.
Determinados anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos recombinantes incluyen, (1) los que tienen un punto de
unión al antígeno por lo menos partes del que procede de un
anticuerpo diferente, por ejemplo aquellos en los que las zonas
determinantes hipervariables de complementariedad de un anticuerpo
se han injertado en las zonas de estructura variable de un segundo
anticuerpo diferente (como se describe, por ejemplo, en la patente
EP 239400); (2) anticuerpos o fragmentos recombinantes en los que
las secuencias no-Fv se han sustituido por
secuencias no-Fv de otros anticuerpos diferentes
(como se describe, por ejemplo, en las patentes EP 171496, EP 173494
y EP 194276); o (3) anticuerpos o fragmentos recombinantes que
poseen sustancialmente la estructura de una inmunoglobulina natural
pero en los que la zona bisagra tiene un número diferente de restos
de cisteína del que se observa en la inmunoglobulina natural pero en
el que uno o más restos de cisteína en una calidad superficial del
anticuerpo o fragmento recombinante está en lugar de otro resto de
aminoácido presente en la inmunoglobulina natural (como se
describe, por ejemplo, en las patentes WO 89/01782 y WO
89/01974).
Las enseñanzas de textos tal como Harlow, E. y
Lane, D. ("Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1998) da más detalles de
anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, su preparación y
utilización.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser
de origen policlonal o monoclonal. Puede ser específico por lo
menos para un epítopo.
Los fragmentos de anticuerpo de unión al antígeno
incluyen, por ejemplo, fragmentos derivados por escisión
proteolitica de un anticuerpo completo, tales como los fragmentos
F(ab')2, Fab' o Fab, o los fragmentos obtenidos por técnicas
de ADN recombinante, por ejemplo los fragmentos Fv (como se
describe, por ejemplo, en la patente WO 89/02465).
Se pueden preparar anticuerpos según la invención
utilizando técnicas inmunológicas muy conocidas. Por tanto, se
puede inyectar, por ejemplo, cualquier anfitrión adecuado con la
proteína y extraer sangre para dar el anticuerpo policlonal deseado
tras purificación y/o concentración apropiadas (por ejemplo por
cromatografía de afinidad utilizando la proteína inmovilizada como
medio de afinidad). Como alternativa se pueden recuperar
esplenocitos o linfocitos del anfitrión inyectado con proteínas e
inmortalizarlos utilizando por ejemplo el procedimiento de Kohler
et al. (1976, Eur. J. Immunol., 6:511),
segregándose las células resultantes para obtener una sola línea
genética que produce anticuerpos monoclonales. Se pueden producir
fragmentos de anticuerpos utilizando técnicas convencionales, por
ejemplo, por digestión enzimática con pepsina o papaína. Cuando se
desee producir anticuerpos recombinantes según la invención éstos
se pueden producir utilizando, por ejemplo, los procedimientos
descritos en las patentes EP 171469, EP 173494, EP 194276 y EP
239400.
Los anticuerpos según la invención se pueden
marcar con un marcador detectable o se pueden conjugar con una
molécula efectora, por ejemplo un fármaco, p. ej. un agente
antibacteriano o una toxina o una enzima, utilizando procedimientos
convencionales y la invención incluye dichos anticuerpos o
conjugados de anticuerpo marcados.
Los contenidos de cada una de las referencias
expuestas en la presente memoria, incluyendo las referencias
citadas en la presente memoria, se incorporan a la presente memoria
como referencia en su totalidad.
Cuando se dan números de referencia "PMID:"
para publicaciones, estos son los números de identificación PubMed
asignados a ellos por la US National Library of Medicine, cuya
información bibliográfica completa y resúmenes para cada
publicación está disponible en www.ncbl.nlm.nih.gov.
La invención se pone más de manifiesto en la
descripción siguiente, con referencia a varias figuras de los
dibujos adjuntos, que muestran, a título de ejemplo únicamente,
formas de identificación de secuencias experimentales para
anticuerpos específicos por lo menos contra un antígeno y de
determinación de la eficacia de una vacuna.
En las Figuras:
la Figura 1 presenta los principios generales
para el aislamiento y secuenciado de ADN de fragmentos del gen del
anticuerpo VH y VL de linfocitos B. La referencia numérica 10 indica
la PCR primaria, la referencia numérica 20 la clonación en un vector
de secuenciado de ADN utilizando el principio de ajuste de la
T-orientación al azar, y el número de referencia 30
la determinación de la secuencia de nucleótido de transcrita y
complementaria utilizando los cebadores M13 transcritos y
complementarios; y
la Figura 2 presenta una eliminación esquemática
de la casete resintetizada del gen del anticuerpo recombinante. Las
zonas VH y VL están ligadas con un enlazador de glicina rico en
serina. Cada dominio variable contiene tres zonas determinantes de
complementariedad (CDR) que participan en la unión del antígeno.
Los experimentos siguientes detallan los
procedimientos de identificación de las secuencias VH y VL del
anticuerpo que comunican inmunidad en pacientes con infección
vírica, bacteriana o parasitaria. Estas secuencias se utilizan
entonces para producir anticuerpos sintéticos y estos anticuerpos
sintéticos son adecuados para la administración a pacientes
destinados a su terapia.
También se detallan los procedimientos de
determinación de la eficacia de una vacuna en la generación de una
respuesta inmunitaria deseada en un paciente.
A menos que se indique de otro modo, todos los
procedimientos se realizan utilizando protocolos normalizados y
siguiendo las instrucciones del fabricante cuando sea aplicable.
Los protocolos normalizados para varias técnicas que incluyen la
PCR, clonación molecular, manipulación y secuenciado, preparación de
anticuerpos, cartografía del epítopo y diseño del mimótopo, cultivo
celular y presentación del fago, se describen en textos tales como
McPherson, M.J. et al. (1991, PCR: A practical
approach, Oxford University Press, Oxford), Sambrook, J. et
al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold
Spring Harbour Laboratory, Nueva York), Huynh y Davies (1985,
"DNA Cloning Vol I - A Practical Approach", IRL Press,
Oxford, Ed. D.M. Glover), Sanger, F. et al. (1977, PNAS
USA 74(12):5463-5467), Harlow, E. y Lane,
D. ("Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1998), Jung, G. y
Beck-Sickinger, A.G. (1992, Angew. Chem. Int. Ed.
Eng., 31: 367-486), Harris, M.A. y Rae, I.F.
("General Techniques of Cell Culture", 1997, Cambridge
University Press, ISBN 0521 573645), "Phage Display of
Peptides and Proteins: A Laboratory Manual" (Eds. Kay, B.K.,
Winter, J., y McCafferty, J., Academic Press Inc., 1996, ISBN
0-12-402380-0).
Los reactivos y el equipo útil, entre otros, en
los procedimientos detallados en la presente memoria están
disponibles en los similares a Amersham (www.amersham.co.uk),
Boehringer Mannheim (www.boehringer-ingeltheim.com),
Clontech (www.clontech.com), Genosys (www.genosys.com), Millipore
(www.millipore.com), Novagen (www.
novagen.com), Perkin Elmer (www.perkinelmer.com), Pharmacia (www.pharmacia.com), Promega (www.promega.
com), Qiagen (www.qiagen.com), Sigma (www.sigma-aldrich.com) y Stratagene (www.stratagene.com).
novagen.com), Perkin Elmer (www.perkinelmer.com), Pharmacia (www.pharmacia.com), Promega (www.promega.
com), Qiagen (www.qiagen.com), Sigma (www.sigma-aldrich.com) y Stratagene (www.stratagene.com).
El término "anticuerpo" en sus varias formas
gramaticales se utiliza en la presente memoria para referirse a
moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos
de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen
un punto de combinación del anticuerpo o parátopo. Dichas moléculas
se denominan también "fragmentos de unión del anticuerpo" o
moléculas de inmunoglobulina.
Las moléculas de anticuerpo ilustrativas son
moléculas de inmunoglobulina íntegras, sustancialmente moléculas
íntegras de inmunoglobulina y los fragmentos de una molécula de
inmunoglobulina que contienen el parátopo, incluyendo los fragmentos
conocidos en la técnica como Fab, Fab', F(ab')2, scFv y
F(v).
La expresión "punto de combinación del
anticuerpo" se refiere al fragmento estructural de una molécula
de anticuerpo comprendida por una cadena pesada y ligera variable y
zonas hipervariables que se unen específicamente (inmunorreaccionan
con) el antígeno.
La identificación y el secuenciado de linfocitos
B que producen anticuerpos y el análisis de los datos resultantes
comprende las siguientes etapas básicas:
- 1)
- Aislamiento de las zonas de codificación VH y VL de linfocitos B circulantes de pacientes humanos.
- 2)
- Determinación de la secuencia de nucleótidos de los repertorios VH y VL.
- 3)
- Determinación de las secuencias primarias de aminoácidos VH y VL.
- 4)
- Extracción de las zonas CDR in silico - incorporación en la base de datos.
- 5)
- Detección de las zonas CDR dominantes y de la estructura en el repertorio VH o VL.
- 6)
- Construcción y producción de anticuerpos recombinantes terapéuticos a partir de secuencias de anticuerpo dominantes.
Para este procedimiento, se seleccionaron
pacientes humanos con una(s) infección o infecciones
microbiana(s) como donantes de linfocitos B inmunizados. Los
criterios de selección fueron:
- (a)
- El paciente debe presentar una respuesta pronunciada al anticuerpo para el patógeno en cuestión, detectable por ejemplo por transferencia Western. Se recogieron muestras de anticuerpo de una muestra de sangre del paciente. Se diluyeron las muestras y se analizó su inmunorelatividad por transferencia Western utilizando antígeno(s) procedente(s) del patógeno microbiano. En dicho análisis, los pacientes que presentan respuestas fuertes al anticuerpo presentaban un reconocimiento/unión al anticuerpo pronunciado de antígenos microbianos según se detectó utilizando anticuerpos para detección policlonales anti-humanos.
- (b)
- El paciente ha sobrevivido al curso de la infección, esto aumenta la posibilidad de generar respuestas a los linfocitos B para los anticuerpos capaces de neutralizar al patógeno.
Se recogieron linfocitos B periféricos (PBL) de
muestras de sangre infectadas del paciente. Esta sangre tratada con
heparina se diluyó en PBS (20 ml totales) y se superpuso en una
almohadilla de 15 ml de Ficol Hypaque (Pharmacia; a menos que se
indique de otro modo, todos los productos químicos y medios de
cultivo se adquirieron en Sigma, Reino Unido) en un tubo de
centrifugadora de 30 ml. Los PBL se recogieron a continuación por
centrifugación (400 \times g, 5 minutos) y se lavaron en PBS y se
recogieron de nuevo por centrifugación. Se preparó ARN de los PBL
utilizando un kit de purificación de ARNm QuickPrep (Pharmacia)
exactamente según las instrucciones de los fabricantes. Se utilizó
ARNm aislado para preparar ADNc mediante una reacción con
transcriptasa inversa (kit de síntesis de ADNc de Promega). Estos 2
\mug de ARNm se volvieron a poner en suspensión en 16 \mul de
agua exenta de nucleasa y se calentó a 65ºC durante 3 minutos (para
desnaturalizar la estructura secundaria) y a continuación se
enfriaron inmediatamente en hielo durante 1 minuto. El ARNm se
añadió a continuación en la siguiente mezcla: 8 \mul de
MgCl_{2}25 mM, 4 \mul de mezcla de dNTP (10 mM con respecto a
cada trifosfato de ribonucleótido), 1 \mul de ARNsin 40 u de
\mul^{-1} de solución madre, 1,2 \mul de transcriptasa
inversa de AMV (25 u de \mul^{-1} de solución madre), 6 \mul
de ADNc 10 pmol \mul^{1} de cebador (véase Figura 1 - síntesis
del ADNc). La mezcla se incubó a 42ºC durante 1 hora y a
continuación se incubó a 100ºC durante 3 minutos para interrumpir la
reacción.
El ADN que codifica las zonas de unión al
antígeno se amplificó a continuación por PCR utilizando el ADNc
preparado de los PBL de pacientes. Para esto, se utilizó el ADNc en
la siguiente reacción de PCR para producir un ADN con zona variable
del anticuerpo procedente de la cadena pesada o de la cadena ligera
(véase Figura 1): 2,5 \mul de ADNc, 33 \mul de agua, 4 \mul
de mezcla de dNTP (25 mM con respecto a cada trifosfato de
desoxinucleótido), 5 \mul de tampón de reacción Taq (Perkin
Elmer), 2,5 \mul de una mezcla de cebador equimolar
(concentración final de 20 pmol con respecto a cada cebador) y 0,5
\mul de Taq ADN polimerasa (1 u \mul^{-1}, Perkin Elmer Corp).
Los cebadores transcrito y complementario utilizados en estas
reacciones se representan en la Figura 1, y sus secuencias de
nucleótidos respectivas se enumeran en la Tabla 1. Las condiciones
de reacción PCR fueron 94ºC durante 1 minuto, 57ºC durante 1 minuto
y 72ºC durante 2 minutos para un total de 30 ciclos, con una
desnaturalización prolongada (94ºC durante 5 minutos) antes del
ciclo 1 y una etapa de ampliación adicional tras el final del ciclo
30 (72ºC durante 10 minutos). Se realizó la PCR utilizando una
máquina para PCR 9700 GeneAmp de Perkin Elmer. Se introdujeron 5
\mul de la reacción PCR en un gel de agarosa al 1% para comprobar
la amplificación del producto de 393 pares de bases (bp) esperado.
El producto resultante se introdujo en un gel de agarosa de bajo
punto de fusión (LMP) al 0,8% y la banda de 393 bp se escindió
utilizando una hoja de bisturí limpia. Se extrajo ADN de la sección
del gel de agarosa utilizando un kit GeneClean II (Anachem, Luton,
Reino Unido).
La PCR produjo dos tipos de fragmento procedentes
de las zonas VH y VL respectivamente, dependiendo de las series de
cebador de PCR utilizadas (para detalles de series de cebadores
para genes de anticuerpo y un esquema de PCR véase la Tabla 1 y la
Figura 1, respectivamente).
Se clonaron los fragmentos del gen VH y VL en el
vector de clonación pGEM-T fácil (Promega
Corporation) para facilitar el secuenciado del ADN. Para esto se
preparó 3 \mug de producto de PCR para restricción utilizando las
columnas de spin de purificación de PCR QIAquick (Qiagen, Reino
Unido) según las instrucciones de los fabricantes. Se eluyó el ADN
de la columna de spin en 40 \mul de tampón EB. El producto de PCR
purificado (2 \mul) se mezcló con 1 \mul de vector
pGEM-T fácil, 6 \mul de agua y 1 \mul de ADN
ligasa y la mezcla se ligó durante 1 h a temperatura ambiente. Las
ligaduras se transformaron a continuación en células TG1
electrocompetentes de E. coli (Stratagene) por
electroporación, y se colocaron en placas de
agar-agar que contenían 100 \mug ml^{-1} de
ampicilina IPTG (100 \muM) y X-gal (0,006% p/v).
Se dejaron desarrollar las colonias durante la noche a 37ºC y a
continuación se almacenaron a 4ºC. Las colonias recombinantes se
identificaron como colonias blancas en este medio.
Se preparó en primer lugar ADN procedente de los
clones VH y VL recombinantes de E. coli. Para esto, se
transfirieron cada una de las colonias individuales a 1,2 ml de
caldo de cultivo LB enriquecido con 100 \mug ml^{-1} de
ampicilina utilizando un formato de placa de 96 pocillos. Se
cultivaron los cultivos a 37ºC durante 24 horas. Se recogieron las
células bacterianas por centrifugación a 4.000 \times g, 30
minutos y se descartaron los sobrenadantes. Se preparó ADN de
plásmido utilizando kits de purificación de plásmido SV 96 de
Wizard (Promega Corporation) siguiendo esencialmente las
instrucciones del fabricante. Los rendimientos de ADN del plásmido
fueron normalmente del orden de 5 \mug por 1,2 ml de cultivo
iniciador.
Las reacciones de secuenciado del ADN se
realizaron utilizando el kit de secuenciado del ciclo terminador
con colorante DYEnamic ET (Amersham Pharmacia Biotech). El ADN del
plásmido purificado (0,5 \mug) se mezcló con 8 \mul de reactivo
terminador DYEnamic ET premezclado y 1 \mul de cebador transcrito
o complementario M13 (5 \muM) en un volumen de reacción total de
20 \mul. Se realizó a continuación el ciclo térmico utilizando un
sistema 9700 (Perkin Elmer) para GeneAmp PCR con los siguientes
parámetros: 95ºC, 20 segundos; 50ºC, 15 segundos; 60ºC, 1 minuto; 30
ciclos). Las reacciones se llevaron a cabo utilizando placas ELISA
sin camisa de formato de 96 pocillos (AB Gene). El terminador del
colorante no incorporado se eliminó utilizando precipitación. Para
esto, las muestras de etanol se mezclaron con 2 \mul de acetato
de amonio 7,5 M y 55 \mul de etanol al 100% y se centrifugaron a
3.000 g durante 30 minutos. Se lavaron los sedimentos de ADN con
etanol al 70% y se volvieron a poner en suspensión en 20 \mul de
solución de carga. Se secuenciaron las reacciones utilizando un
secuenciador de ADN MegaBACE 1000 (Amersham Pharmacia Biotech)
siguiendo las instrucciones del fabricante (voltaje de inyección 2
kV durante 30 s con electroforesis a 6 kV durante 200 minutos). Se
exportaron los cromatogramas utilizando el formato de archivo .scf
para acabado y archivo.
Se determinaron las secuencias de ADN de VH y VL
tanto en la cadena transcrita como en la complementaria (utilizando
cebadores transcritos y complementarios M13 respectivamente) y se
compararon para las discrepancias destacadas y mantener un alto
grado de precisión. Esto se realizó utilizando la serie de programas
Staden (Staden, R. (1996) The Staden Sequence Analysis Package.
Molecular Biotechnology 5, 233-241). En primer
lugar, se introdujeron los archivos .scf de la secuencia en el
programa PREGAP donde se quitó la secuencia del vector y se evaluó
la calidad de la secuencia. Las secuencias de escasa calidad en las
que la secuencia de ADN era ambigua se rechazaron y se volvieron a
secuenciar. Se emparejaron las cadenas transcrita y complementaria
utilizando el programa GAP para destacar y resolver las áreas que
contienen artefactos de secuenciado. Se indicó la orientación de la
secuencia VH o VL y la inversa se complementó cuando fue necesario
para producir sólo orientaciones del marco de lectura transcrito
para la traducción. Las secuencias de los genes VH y VL se
tradujeron a continuación en secuencias de aminoácidos. Se dio a
cada secuencia un único identificador (denominación).
Las instrucciones generales de identificación de
las zonas CDR están en www.bioinf.org.uk/abs/
El siguiente conjunto de reglas permitirá la
definición de las CDR en una secuencia del anticuerpo. Existen
ejemplos raros en los que estas características prácticamente
constantes no suceden (por ejemplo la secuencia EU de la cadena
pesada humana no tiene Trp-Gly después de
CDR-H3). Los restos de Cys son la característica
mejor conservada.
CDR-L1
| Inicio | Aprox. resto 24 |
| Resto antes | siempre una Cys |
| Resto después | \begin{minipage}[t]{127mm} siempre una Trp. Normalmente Trp-Tyr-Gln, pero también, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, Trp-Tyr-Leu\end{minipage} |
| Longitud | 10 a 17 restos |
CDR-L2
| Inicio | siempre 16 restos después del final de CDR-L1 |
| Resto antes | generalmente Ile-Tyr, pero también, Val-Tyr, Ile-Lys, Ile-Phe |
| Longitud | siempre 7 restos (excepto NEW (7FAB) que presenta una deleción en esta zona) |
CDR-L3
| Inicio | \begin{minipage}[t]{127mm} siempre 33 restos después del final de CDR-L2 (excepto NEW (7FAB) que presenta la delación al final de CDR-L2)\end{minipage} |
| Resto antes | siempre Cys |
| Resto después | siempre Phe-Gly-XXX-Gly (SEC ID nº: 69) |
| Longitud | 7 a 11 restos |
CDR-H1
| Inicio | Aprox. resto 26 (siempre 4 después de una Cys) |
| Resto antes | siempre Cys-XXX-XXX-XXX (SEC ID nº: 70) |
| Resto después | siempre un Trp. Normalmente Trp-Val, pero también, Trp-Ile, Trp-Ala |
| Longitud | 10 a 12 restos |
CDR-H2
| Inicio | siempre 15 restos después del final de CDR-H1 |
| Resto antes | normalmente Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (SEC ID nº: 71), pero numerosas variaciones |
| Resto después | Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala |
| Longitud | 16 a 19 restos; |
CDR-H3
| Inicio | siempre 33 restos después del final de CDR-H2 (siempre 2 después de un Cys) |
| Resto antes | siempre Cys-XXX-XXX (normalmente Cys-Ala-Arg) |
| Resto después | siempre Trp-Gly-XXX-Gly (SEC ID nº: 72) |
| Longitud | 3 a 25 restos |
Se construyó la base de datos utilizando el
programa SQL Server Database (Microsoft). Esto permitió hacer
preguntas a la base de datos utilizando SQL y permitió extraer las
secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cualquier intervalo de las
secuencias VH o VL de la base de datos en formato FASTA. Las CDR
extraidas se sometieron a continuación a alineación múltiple
utilizando CLUSTAL X de tal modo que las CDR idénticas o muy
similares se agruparon en bloques (Thompson, J.D., Higgins, D.G. y
Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: Improving the sensitivity of
progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,
positions-specific gap penalties and weight matrix
choice. Nucleic Acids Research,
22:4673-4680). A partir de esto, se determinó la
frecuencia de repetición de las CDR y se determinó la predominancia
de CDR en el repertorio de inmunoglobulina. Como alternativa, se
empleó una interfase gráfica utilizando Probiosys (proBionic EMEA,
Amsterdam). ProBiosys prepara dendrogramas a partir de los archivos
CLUSTAL.phy y permite una interpretación rápida visual de las
relaciones entre un gran número de secuencias alineadas. Se realizó
el proceso completo para las CDR del mismo paciente muestreadas en
diferentes puntos durante la enfermedad, para las CDR de pacientes
con diferentes infecciones o de grupos de pacientes emparejados por
el sexo, emparejados por la edad o emparejados por la raza,
dependiendo de la búsqueda y de la información adicional añadida a
las entradas en la base de datos.
Una vez reconocidas las secuencias dominantes del
anticuerpo en un repertorio dado, se utilizó la información para
deducir la presencia de las CDR y las estructuras que comunican
inmunidad. Se identificaron las secuencias VH y VL seleccionadas y
sus secuencias génicas se volvieron a sintetizar utilizando
oligonucleótidos sintéticos. Esto era importante ya que ello
permitía además a la secuencia del gen procedente del hombre ser
optimizada en el codón por E. coli con el fin de mejorar la
expresión de la proteína. Las secuencias dominantes VH y VL se
cortaron y empalmaron conjuntamente utilizando una secuencia de
espaciador (enlazador) (Figura 2). Esta casete del gen, denominada
scFv, se volvió a sintetizar para incluir los puntos de restricción
terminales NdeI y NotI para la clonación en el vector
de expresión pET29b (Novagen). El ADN de ScFv se cortó con
NdeI (cortes en VH) o NotI (cortes en VL) utilizando
la siguiente reacción: 40 \mul de ADN (4 \mug), 10 \mul de
tampón D de enzima de restricción (Promega), 47 \mul de agua y 2
\mul de enzimas NdeI y NotI (10 u \mul^{-1};
Promega) con digestión durante 4 h a 37ºC. El ADN se fraccionó a
continuación en geles TAE de agarosa al 0,7% y el ADN digerido se
escindió en el gel y se purificó en sílice de agarosa utilizando el
kit Geneclean II (Bio 101) exactamente según las instrucciones de
los fabricantes. El ADN del vector pET29b se cortó con NdeI
y NotI como se describió anteriormente. Se mezcló 1 \mug
de vector con 1 \mug de ADN de VL restringido se volvió a poner en
suspensión en 8,5 \mul de agua y se ligó mediante la adición de 1
\mul 10 \times de tampón de ligadura (Boehringer Mannheim) y
0,5 \mul de ADN ligasa (3 u \mul^{-1}; Boehringer Mannheim),
seguido de ligadura durante la noche a 14ºC.
La ligadura completa se transformó en las células
TG2 de E. coli (Stratagene, Reino Unido) por
electroporación. Los transformantes se colocaron a continuación en
placas de agar-agar que contenían tetraciclina (25
\mug ml^{-1}, selectiva para recA::Tn10 en el cromosoma
de TG2) y kanamicina (50 \mug ml^{-1}, selectiva para
pET29). Se comprobó la secuencia scFv del ADN del plásmido
recombinante preparado a partir de clones individuales por digestión
con NdeI y NotI como se describió anteriormente.
Los scFv recombinantes se sobreexpresaron en la
cepa JM109(DE3) de E. coli y se purificaron
permitiendo de este modo la caracterización bioquímica y biológica.
Se extendieron los recombinantes en placas LB con 50 mg/ml de
kanamicina y se utilizó una sola colonia para inocular un cultivo
de iniciación de 10 microlitros de cultivo LB con 50 microgramos
por ml de kanamicina. Para esto, se preparó 1 litro de cultivo de
expresión en presencia de kanamicina durante 4 a 5 h a 37ºC con
agitación a 300 rpm. Se realizó la inducción a la DO_{600}=1
utilizando IPTG y se cultivaron las células con fuerte aireación
durante otras 3 a 5 h. Se recogieron a continuación las células por
centrifugación
(4000 \times g, 15 minutos, 4ºC). Se volvió a poner en suspensión el sedimento celular en 10 ml de tampón de lisis reciente (4ºC) (a continuación) y se almacenó a -20ºC durante la noche antes de la destrucción celular utilizando 25 ml de sistema X-Press (AB Biox).
(4000 \times g, 15 minutos, 4ºC). Se volvió a poner en suspensión el sedimento celular en 10 ml de tampón de lisis reciente (4ºC) (a continuación) y se almacenó a -20ºC durante la noche antes de la destrucción celular utilizando 25 ml de sistema X-Press (AB Biox).
Tris HCl 50 mM pH 8,0
EDTA 1 mM
KCl 100 mM
AEBSF (ácido aminoetilbencenosulfónico) 0,1
mM
Se centrifugó el lisado en un tubo Oakridge
(24.300 \times g, 4ºC, 30 minutos). Se volvió a poner en
suspensión el sedimento en 20 ml de tampón de lisis enfriado en
hielo utilizando un mezclador de laboratorio Silverson. El lisado se
dividió en 8 \times tubos Oakridge y cada alícuota se diluyó
hasta 30 ml (total 120 ml) en tampón de lisis enfriado en hielo. Se
sedimentaron los cuerpos de la inclusión (24.300 \times g, 4ºC,
30 minutos) y se descartó el sobrenadante. Se volvió a poner en
suspensión cada uno de los 8 sedimentos en 30 ml de tampón de lisis,
y los cuerpos de inclusión se recogieron de nuevo por
centrifugación (24.300 \times g, 4ºC, 30 minutos). Esta etapa de
lavado/centrifugación se realizó 5 \times veces en total para
limpiar la fracción del cuerpo de inclusión. Cada sedimento se
volvió a poner en suspensión en 15 ml de agua enfriada con hielo y
los cuerpos de inclusión se almacenaron a -20ºC.
Para el replegamiento, se prepararon 200 ml de
solución de N-laurilsarcosina (NLS) al 2% (p/v) en
Tris HCl 50 mM pH 9,0 de la forma siguiente. Se solubilizó 4 g de
NLS en 100 ml de agua con agitación, 10 ml de solución madre Tris 1
M pH 9,0 se añadió y se llevó hasta 195 ml con agua. Se añadió 5 ml
de lechada de cuerpo de inclusión y se agitó a fondo durante 30
minutos a temperatura ambiente.
Se añadió CuCl_{2} a una concentración de 100
\muM. Esto sirve como catalizador para la oxidación. La reacción
de replegamiento se transfirió a 4ºC y se agitó a fondo durante 2
días para favorecer la aireación. La reacción de replegamiento se
filtró al vacío a través de una unidad de filtración en la boca del
frasco vacucup de 0,44 \mum (90 mm de diámetro, Gellman Sciences)
y el filtrado se transfirió a un sistema Pellicon Labscale TFF
equipado con una unidad de membrana PLGC10 (Millipore). Se concentró
la reacción hasta 25 ml utilizando flujo tangencial, descartando el
perneado (el scFv se localiza en lo retenido). Se filtró por
diálisis la solución frente a 40 \times volúmenes de recambio (1
l) de acetato de amonio (AAT) 10 mM pH 9,0. Por último, se diluyó el
volumen del anticuerpo hasta 50 ml utilizando AAT 10 mM pH 9,0. El
anticuerpo intercambiado con el tampón se almacenó durante 2 h a
4ºC. El contenido típico en proteína fue de 1 a 2 mg ml^{-1} con
un rendimiento de hasta 50 mg por litro.
Para la purificación de scFv se preparó un
volumen de lecho de 10 ml de Ni NTA superflow agarosa de Qiagen
según las instrucciones de los fabricantes utilizando una columna
de vidrio de 10 ml (Sigma) sin adaptadores de flujo. Se equilibró la
columna con 50 ml de tampón B (urea 6M, NaH_{2}PO_{4} 0,1 M,
Tris HCl 10 mM, pH 8,0). El scFv replegado (descrito anteriormente)
se diluyó 1/5 en tampón B y se aplicó directamente a la columna en
ml min^{-1}. Se aplicaron 50 ml de tampón B a la columna (caudal 5
ml min^{-1}) seguido de 50 ml de tampón C (la misma composición
que el tampón B pero pH 6,3). Se eluyó el scFv purificado de la
columna aplicando lentamente tampón B enriquecido con imidazol 250
mM de alta calidad hasta la A_{280}<0,05.
La cadena pesada variable (VH) de los genes del
anticuerpo en los linfocitos de la sangre periférica han sido
clonados con TA y secuenciados. En cada caso se identificó la zona
determinante de complementariedad (CDR3). Esta zona es tanto la zona
más variable de la cadena VH como el área identificada como la más
importante en la determinación de la unión del antígeno, por esta
razón esta área se utiliza como la firma para cada cadena VH. Se
han desarrollado varios bancos de datos de secuencias. M1 es un
banco de secuencias VH para un paciente con septicemia producida
por un Staphylococcus aureus resistente a la meticilina
(MRSA). M2 es un banco de un paciente diferente con septicemia MRSA
de larga duración, esta muestra se extrajo muy al final del periodo
infeccioso. M3 es otro banco construido en el mismo paciente como
en M2 pero tomado diez días después de la muestra M2. P1 es un
banco de un paciente de fibrosis quística (CF) colonizado a largo
plazo con Pseudomonas aeruginosa. C1 es un banco de un
paciente infectado con una infección generalizada por Candida
albicans.
Cada banco posee un pequeño número de anticuerpos
dominantes. El anticuerpo más frecuente en cada banco tiene una
frecuencia del 10% (SEC ID nº: 27) (RNNWPPT), 41% (SEC ID nº: 28)
(RSGSHYDAFNI), 32% (SEC ID nº: 29) (VTGCFDH), 7% (SEC ID nº: 30)
(LHGFGHGFRI) y 30% (SEC ID nº: 31) (GEIFDY) (M1, M2, M3, P1, C1
respectivamente). M1 tiene dos cadenas VH principales que responden
del 18% del banco. M2 posee cuatro cadenas VH dominantes que
responden del 80% del banco. M3 posee cuatro cadenas VH que componen
el 79% del banco. P1 posee 3 cadenas VH que responden del 18% del
banco. El banco C1 posee seis cadenas VH que juntas responden del
72% de los clones en el banco. Varias de estas cadenas VH han sido
probadas en modelos de ratón y se demuestra que poseen actividad
terapéutica contra el agente pertinente.
Los bancos M2 y M3 son comparaciones del
repertorio de VH durante un periodo de tiempo para un individuo con
una septicemia MRSA. La cadena VH más dominante (SEC ID nº: 28)
(RSGSHYDAFNI) está a una frecuencia del 41% al final del periodo
infeccioso (M2); ésta ha disminuido hasta el 22% tras 10 días (M3).
Otros anticuerpos frecuentes presentan descensos similares del 19%
al 7% (SEC ID nº: 32) (LLGGSSGRYMDV), del 10% al 2% (SEC ID nº: 33)
(HRGGPQCHNLNCYTLDF) y del 7% al 3% (SEC ID nº: 34) (EAESYAERIGFDY).
Otros anticuerpos presentan un aumento en las concentraciones
durante el mismo periodo de tiempo. El anticuerpo más dominante en
el banco M3 (SEC ID nº: 29) (VTGCFDH) con una frecuencia del 32% no
se ha detectado hasta ahora en el banco M2. En este caso las cadenas
VH que presentan una reducción en el periodo
post-infeccioso se deben considerar agentes
terapéuticos potenciales. Aquellos anticuerpos que presentan un
aumento excesivo después de la curación de la infección pueden ser
de menor importancia como terapéuticos. El análisis de la expresión
de la cadena VH durante el transcurso de una infección y más allá
es importante para ayudar a identificar los anticuerpos
neutralizantes.
Con los bancos secuenciados hasta ahora ha sido
posible comparar el repertorio de la cadena VH de los individuos
con infecciones similares y diferentes. M1 y M2/M3 son bancos de
dos pacientes diferentes con la misma infección. Hasta ahora ha sido
posible identificar seis secuencias de CDR3 diferentes que están
presentes en ambos pacientes de MRSA. Uno de dichos anticuerpos
(SEC ID nº: 33) (LLGGSSGRYMDV) compone el 4% del repertorio del
banco M1 y el 19% y el 7% de los bancos M2 y M3 respectivamente.
Este anticuerpo es idéntico a lo largo de toda la longitud de la
zona VH en ambos pacientes. Se han observado también cuatro cadenas
VH más diferentes que están presentes en ambos bancos de los
pacientes y poseen una secuencia idéntica a lo largo del resto de
la zona VH (SEC ID nº 35 a nº 38) (YDVVVTGKYAFDI, RRYHDLTTNNWFDP,
NVGSGSYYTGGHWFDP, HRGGPQCHNLNCYTLDF). La quinta CDR3 compartida por
ambos pacientes (SEC ID nº: 39) (ARRYGTSNYCFDH) se encuentra a una
frecuencia del 2% y 3% en los bancos M1 y M2 respectivamente. Las
cadenas VH con esta CDR3 son idénticas a lo largo de la mayor parte
de la cadena VH excepto para una zona importante, la segunda zona
determinante de complementariedad (CDR2). La CDR2 es otra zona del
anticuerpo maduro que entra en contacto con el antígeno y desempeña
una función importante en su actividad. La identificación de
anticuerpos con la misma CDR3 pero diferentes secuencias fuera de
esta zona dará anticuerpos con antígenos diana similares aunque
puedan variar otras propiedades.
Se han comparado también los bancos de pacientes
con diferentes infecciones. Estos bancos se ha demostrado también
que comparten las cadenas VH con idénticas secuencias CDR3 aunque
esto parece que es menos frecuente. Se ha observado hasta ahora una
CDR3 que se observa tanto en el banco P1 como en el M2 (SEC ID nº:
40) (DQS
HAAQGF). Los anticuerpos comunes a los pacientes con diferentes infecciones pueden ser una señal de que la cadena VH no es específica para la infección de interés. En este caso no es posible admitir que el paciente del banco P1 no entre en contacto con S. aureus ya que ésta es una bacteria frecuente en el medio.
HAAQGF). Los anticuerpos comunes a los pacientes con diferentes infecciones pueden ser una señal de que la cadena VH no es específica para la infección de interés. En este caso no es posible admitir que el paciente del banco P1 no entre en contacto con S. aureus ya que ésta es una bacteria frecuente en el medio.
- 1)
- Los individuos infectados con bacterias presentan un centro de atención muy fuerte de un pequeño número de secuencias de CDR.
- 2)
- La expresión de las concentraciones de anticuerpos con determinado tipo de CDR3 varía durante el transcurso de la infección y en el periodo tras la infección.
- 3)
- Los pacientes con la misma enfermedad se demuestra que expresan anticuerpos con las mismas secuencias de CDR3. En la mayoría de los casos existen los mismos para la longitud total de la cadena VH. En otros casos la variación se observa en otras partes de la cadena VH.
- 4)
- Los pacientes con diferentes infecciones pueden compartir anticuerpos con las mismas secuencias CDR3 y VH.
Se emprendieron más estudios para identificar las
zonas CDR3 en pacientes que estaban colonizados por VRE, positivos
al cultivo de sangre VRE, positivos al cultivo de sangre MRSA y con
un paciente de fibrosis quística infectado con P.
aeruginosa.
Las secuencias de las zonas CDR3 en varios bancos
se determinaron como se detalló anteriormente.
Los resultados de los experimentos de dan en la
Tabla 2 (a continuación) y muestran el centro de atención del
repertorio VH de los pacientes positivos al cultivo de sangre,
siendo muy frecuentes numerosas CDR3 de VH. En la Tabla 2, la
columna SEC es la SEC ID nº de la secuencia CDR3. Otras columnas dan
resultados para el porcentaje de clon en cada librería. Para V01,
n=75; V02, n=82; V03, n=110; V04, n=43; M01, n=103; M02, n=231;
M03, n=150; M04, n=136; M05, n=229; P01, n=131.
\vskip1.000000\baselineskip
M02, M03, M04 son tres muestras del mismo
paciente durante un periodo de tiempo.
1) Todos los pacientes positivos al cultivo de
sangre presentan el centro de atención del repertorio VH. Las
secuencias CDR3 de VH más frecuentes procedentes de cada uno de los
bancos positivos al cultivo de sangre son:
\vskip1.000000\baselineskip
Los bancos no positivos al cultivo de sangre, V01
y P01, permanecieron relativamente diversos. V01 no presenta centro
de atención notable y la CDR3 de VH más frecuente procedente de P01
(SEC ID nº: 56) es responsable solamente del 3% del banco.
2) En el conjunto de bancos de pacientes con la
misma infección comparten más las CDR3 de VH que los pacientes con
infecciones diferentes. La lista de anticuerpos frecuentes demuestra
que seis secuencias diferentes de CDR3 de VH (SEC ID nº: 59, nº 60,
nº 61, nº 66, nº 67 y nº 68) están compartidas por dos pacientes
diferentes positivos al cultivo de sangre VRE. Uno de estos seis
anticuerpos se observa a muy baja concentración (<1%) en el
banco P01 y otro a <1% en M04.
Las secuencias CDR3 de VH de los bancos MRSA
presentan un resultado similar. Una secuencia CDR3 de VH (SEC ID
nº: 46) se observa en los tres pacientes de MRSA. Otras tres
secuencias CDR3 de VH (SEC ID nº: 47, nº 48 y nº 50) aparecen en dos
bancos diferentes. Ninguna de estas secuencias CDR3 de VH aparecen
en bancos de pacientes con otras enfermedades.
Se secuenció la VH de tres pacientes positivos al
cultivo de sangre VRE (bancos V02, V03 y V04) y de un paciente
colonizado con VRE (V01). Se comparan las secuencias CDR3.
8,4% = SEC ID nº: 68
6,1% = SEC ID nº: 67
2,3% = SEC ID nº: 62
2% = SEC ID nº: 60
1,6% = SEC ID nº: 61
1,6% = SEC ID nº: 63
1,3% = SEC ID nº: 64
1,3% = SEC ID nº: 66
1,3% = SEC ID nº: 59
Todas estas secuencias CRD3 de VH se obtuvieron a
partir de los bancos V02, V03 y V04, ninguno de los clones
anteriores estuvo presente en el banco V01 (paciente colonizado). La
CDR3 (SEC ID nº: 68) estuvo también presente en <1% del banco
M04 y la SEC ID nº: 59 estuvo también presente en <1% del banco
P01. Seis secuencias CDR3 están presentes en \geq0,9% en más de un
banco.
Las secuencias CDR3 de VH de MRSA proceden de
tres pacientes. Un paciente posee tres bancos independientes (M02,
M03 y M04) que corresponden a tres muestras de sangre tomadas 1, 11
y 32 días después de la infección. Tres secuencias CDR3 presentan
una reducción durante el tiempo después de la infección. La SEC ID
nº: 45 disminuye desde el 38% al 12%, la SEC ID nº: 46 disminuye
desde el 23% al 8% y la SEC ID nº: 48 disminuye desde el 10% a menos
del 1%. Las cadenas VH con estas CDR3 es de esperar que estén muy
relacionadas con la infección por MRSA. Otra de las secuencias de
CDR3 frecuentes, la SEC ID nº: 47 se maximiza a los 11 días al 24% y
a continuación disminuye al 8%, este anticuerpo frecuente puede
también esperarse que se asocie con la infección por MRSA. En todos
los anticuerpos anteriores se está probando la reactividad a
antígenos MRSA.
<110> NeuTec Pharma PLC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Tecnología de anticuerpos
dirigida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> N01/0731/PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 0130267.8
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-12-19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtccaccttg gtgttgctgg gctt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de PCR
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<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagactctccc ctgttgaagc tctt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador de PCR
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<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptgaggagacg gtgaccaggg tgcc
\hfill24
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptgaagagacg gtgaccattg tccc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de PCR
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<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaggagacg gtgaccaggg ttcc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de PCR
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskiptgaggagacg gtgaccgtgg tccc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggtgcagc tggtgcagtc tgg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 23
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<212> ADN
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\sa{Arg Asn Asn Trp Pro Pro Thr}
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\sa{Arg Ser Gly Ser His Tyr Asp Ala Phe Asn
Ile}
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 10
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<400> 30
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\sa{Leu His Gly Phe Gly His Gly Phe Arg
Ile}
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
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\sa{Gly Glu Ile Phe Asp Tyr}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Leu Gly Gly Ser Ser Gly Arg Tyr Met Asp
Val}
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Arg Gly Gly Pro Gln Cys His Asn Leu Asn
Cys Tyr Thr}
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Ala Glu Ser Tyr Ala Glu Arg Ile Gly Phe
Asp Tyr}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Asp Val Val Val Thr Gly Lys Tyr Ala Phe
Asp Ile}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Tyr His Asp Leu Thr Thr Asn Asn Trp
Phe Asp Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Val Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Thr Gly Gly
His Trp Phe Asp}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Arg Gly Gly Pro Gln Cys His Asn Leu Asn
Cys Tyr Thr Leu}
\sac{Asp Phe}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Arg Arg Tyr Gly Thr Ser Asn Tyr Cys Phe
Asp His}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Gly Leu Asp Ser Ala Tyr Cys Gly Gly Asp
Cys Phe Gly Tyr}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Gln Asp Ala Ala Pro Tyr Asp His}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Leu Asp Glen Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
Asp Val}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Tyr Ser Ser Thr Trp Tyr Gly Ser Trp Phe
Asp Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Asp Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Phe
His Trp Phe Asp}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Arg Ser Gly Ser His Tyr Asp Ala Phe Asn
Ile}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Leu Gly Gly Ser Ser Gly Arg Tyr Met Asp
Val}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Asp Val Val Val Thr Gly Lys Tyr Ala Phe
Asp Ile}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Arg Gly Gly Pro Gln Cys His Asn Leu Asn
Cys Tyr Thr Leu}
\sac{Asp Phe}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Ala Glu Ser Tyr Ala Glu Arg Ile Gly Phe
Asp Tyr}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Val Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Thr Gly Gly
His Trp Phe Asp}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Ala Thr Thr Thr Glu Trp Phe Leu Asp
Phe}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Gly Gly Arg Asp Pro Gly Asp Thr Thr Arg
Val Ala Gly Ala}
\sac{Gln His Leu Tyr Tyr Tyr Leu Asp Val}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Trp His Glu Val Gly Ile Gly Tyr Pro Leu
Phe Gln Asn}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Asp Ser Ala Asp Gly Ser Met Asn Asp Tyr
Phe Asp Ala}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Cys Gly Gln Gly Gly Ser Arg Asp
Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Gln Ser His Ala Ala Gln Gly Phe}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Met Arg Arg Arg Gln Asp Gly Gly Val Leu
Val Gln Thr Gly}
\sac{Phe Asp Phe}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Glu Met Ala Gly Asp Phe Asp Ser Asp
Tyr}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Arg Asp Trp Arg Glu Gly Gly Leu Asp
Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Ala Leu Ala Gly Ile His Leu Tyr Asp
His}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Met Leu Arg Gly Leu Tyr Trp Phe Asp
Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Gly Tyr Ser Asp Tyr}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Pro Ala Thr Ala Ile Tyr Pro Leu
Asp}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Arg Gly Met Ile Arg Gly Val Leu Pro Asp
Ala Phe Asp Ile}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ser Asp Gly Asp Tyr Gly Asp Ser Arg Val
Asp Val}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Ser Glu Pro Ala Phe Asp Tyr}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Arg Tyr Asn Thr Gly Leu Gly His Ala Ala
Leu Asp}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Arg Tyr Phe Asp Trp Pro Arg Gly Asp Asn
Trp Phe Asp Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Utilizada para definir la zona
CDR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Gly Xaa Gly}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Utilizada para definir la zona
CDR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Xaa Xaa Xaa}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Utilizada para definir la zona
CDR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Glu Trp Ile Gly}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Utilizada para definir la zona
CDR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Gly Xaa Gly}
Claims (23)
1. Procedimiento para la identificación de
secuencias experimentales de por lo menos la zona CDR3 de los
anticuerpos específicos contra al menos un antígeno producido por un
microorganismo durante una infección o contra una vacuna, que
comprende las etapas siguientes:
- (i)
- secuenciar por lo menos la zona CDR3 de las zonas de codificación VH y/o VL de dichos linfocitos B con linfocitos B aislados por lo menos de un paciente que ha sido infectado por dicho microorganismo o al que se le ha administrado dicha vacuna; y
- (ii)
- correlacionar por lo menos dichas zonas CDR3 secuenciadas de las zonas de codificación VH y VL de dichos linfocitos B para identificar una serie de secuencias experimentales por lo menos para una zona CDR3 de los anticuerpos específicos contra al menos dicho antígeno producido por dicho microorganismo o contra dicha vacuna, sucediendo cada uno de dichos conjuntos de secuencias CDR3 experimentales o una secuencia que presenta por lo menos el 60% de homología con éstas en total con una frecuencia de al menos 1 por ciento en la serie de secuencias determinadas en la etapa (i).
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que dichas células se seleccionan de entre el grupo constituido por
linfocitos B periféricos y linfocitos B del bazo.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que dichos linfocitos B periféricos se aíslan de la sangre por lo
menos de dicho paciente.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que por lo menos dicho antígeno es un inmunógeno.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que por lo menos dicho paciente presenta una respuesta pronunciada
al anticuerpo en respuesta a la infección por dicho
microorganismo.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que por lo menos dicho paciente se ha recuperado de la infección
por dicho microorganismo.
7. Procedimiento según la reivindicación 1,
comprendiendo dicha etapa (ii) de correlación la determinación de
las supuestas secuencias de aminoácidos de dicho secuenciado por lo
menos las zonas de codificación VH y VL de CDR3 y la correlación de
dichas supuestas secuencias de aminoácidos.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
comprendiendo dicha etapa (ii) de correlación la identificación de
las zonas determinantes de complementariedad comprendidas por lo
menos en dichas zonas VH y VL y la correlación de dichas zonas
determinantes de complementariedad.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el
que las zonas determinantes de complementariedad se seleccionan de
entre el grupo constituido por CDR1, CDR2 y CDR3.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha etapa (ii) de correlación correlaciona además uno de
los grupos constituidos por: el microorganismo que infecta a dicho
por lo menos un paciente, el punto de infección de dicho por lo
menos un paciente por dicho microorganismo, el punto de tiempo en el
que dichos linfocitos B se aíslan durante la infección de dicho por
lo menos un paciente por dicho microorganismo, la edad de dicho por
lo menos un paciente, el sexo de dicho por lo menos un paciente y
la raza de dicho por lo menos un paciente.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dichos linfocitos B han sido aislados de dicho por lo menos
un paciente en múltiples puntos de tiempo durante la infección de
dicho por lo menos un paciente por dicho microorganismo,
correlacionando dicha etapa de correlación (ii) el punto de tiempo
durante la infección de dicho por lo menos un paciente por dicho
microorganismo en el que se aíslan dichos linfocitos B.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dichos linfocitos B han sido aislados por lo menos dos
pacientes, de los cuales por lo menos uno se ha recuperado de la
infección por dicho microorganismo, y por lo menos uno de los cuales
no se ha recuperado de la infección por dicho microorganismo,
correlacionando dicha etapa (ii) de correlación la recuperación de
dichos por lo menos dos pacientes de la infección por dicho
microorganismo.
13. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dichos linfocitos B han sido aislados de por lo menos dos
pacientes, siendo infectados dichos pacientes por diferentes
microorganismos que producen dicho por lo menos un antígeno,
correlacionando dicha etapa (ii) de correlación dicho secuenciado
por lo menos en las zonas de codificación VH y VL de dichos
linfocitos B para identificar una serie de secuencias
experimentales para anticuerpos, cada uno de los cuales es
específico contra por lo menos un antígeno compartido producido por
dichos microorganismos diferentes o es específico contra diferentes
antígenos producidos por dichos microorganismos diferentes.
14. Procedimiento para la preparación de un
medicamento destinado al tratamiento de una infección por un
microorganismo que produce por lo menos un antígeno, que comprende
las etapas siguientes:
- (i)
- realización de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores; y
- (ii)
- síntesis de por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia experimental específica contra dicho por lo menos un antígeno producido por dicho microorganismo.
15. Procedimiento para la preparación de un
medicamento según la reivindicación 14, que comprende la etapa de
mezclar dicho por lo menos un anticuerpo sintetizado con un
portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
16. Procedimiento para la producción de una base
de datos que identifica las secuencias experimentales para
anticuerpos específicos contra por lo menos un antígeno producido
por un microorganismo, que comprende las etapas siguientes:
- (i)
- realización de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13; y
- (ii)
- almacenamiento de los datos producidos por dicho procedimiento en dicha base de datos.
17. Procedimiento para generar un informe que
identifica las secuencias experimentales para anticuerpos
específicos contra por lo menos un antígeno producido por un
microorganismo, que comprende las etapas siguientes:
- (i)
- realización de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13; y
- (ii)
- preparación de un informe que comprende los datos producidos por dicho procedimiento.
18. Procedimiento para determinar la eficacia de
una vacuna, que comprende las etapas siguientes:
- (i)
- secuenciado por lo menos de la zona CDR3 de las zonas de codificación VH y/o VL de dichos linfocitos B con linfocitos B aislados de por lo menos un paciente al que se ha administrado dicha vacuna; y
- (ii)
- correlación por lo menos de dicha zona CDR3 secuenciada de las zonas de codificación VH y/o VL de dichos linfocitos B para identificar una serie de secuencias experimentales por lo menos para la región CDR3 de los anticuerpos específicos contra dicha vacuna, teniendo cada una de dichas series de secuencias experimentales de CDR3 o una secuencia por lo menos el 60% de homología con éstas que suceden en total a una frecuencia de por lo menos el 1 por ciento en la serie de secuencias determinadas en la etapa (i).
19. Procedimiento según la reivindicación 18,
comprendiendo la etapa (ii) de correlación de dicho secuenciado de
por lo menos una zona CDR3 de las zonas de codificación VH y/o VL de
dichos linfocitos B con el secuenciado de por lo menos una zona
CDR3 de las zonas de codificación VH y VL de los linfocitos B
aislados de por lo menos un paciente que ha sido infectado con un
microorganismo contra el que la vacunación con dicha vacuna pretende
estimular una respuesta inmunitaria protectora.
20. Procedimiento según la reivindicación 18, en
el que dicha etapa (ii) de correlación que correlaciona además por
lo menos uno de los grupos constituidos por: el tiempo desde la
administración de la vacuna, a dicho por lo menos un paciente, la
edad, de dicho por lo menos un paciente y las zonas determinantes de
complementariedad de dicho secuenciado por lo menos en las zonas de
codificación VH y VL.
21. Procedimiento según la reivindicación 18, en
el que dicho procedimientodetermina la eficacia de dicha vacuna en
la estimulación de una respuesta inmunitaria protectora contra el
microorganismo contra el que la vacunación con dicha vacuna pretende
estimular una respuesta inmunitaria protectora.
22. Procedimiento para la producción de una base
de datos que identifica la eficacia de una vacuna, que comprende
las etapas siguientes:
- (i)
- realización de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21; y
- (ii)
- almacenamiento de los datos producidos por dicho procedimiento en dicha base de datos.
23. Procedimiento para la generación de un
informe que identifica la eficacia de una vacuna, que comprende las
etapas siguientes:
- (i)
- realización de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21; y
- (ii)
- creación de un informe que comprende los datos producidos por dicho procedimiento.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| GB0130267 | 2001-12-19 | ||
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02788114T Expired - Lifetime ES2236605T3 (es) | 2001-12-19 | 2002-12-16 | Tecnologia de anticuerpos dirigida. |
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