KR100506118B1

KR100506118B1 - 수막염균증 백신 조성물

Info

Publication number: KR100506118B1
Application number: KR10-2003-0024950A
Authority: KR
Inventors: 신전수; 박인호; 최인홍; 남문희
Original assignee: 학교법인연세대학교
Priority date: 2002-04-19
Filing date: 2003-04-19
Publication date: 2005-08-04
Also published as: AU2003235185A1; CA2482747A1; CA2482747C; US7250164B2; US20060073139A1; WO2003089473A1; KR20030083617A

Abstract

본 발명은 나이세리아 메닝자이티디스 혈청 그룹 B(Neisseria meningitidis serogroup B) (NMGB)의 항체인 HmenB3에 대한 항-이디오타입 항체 및 이 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)에 관한 것이다. 또한 본 발명은 NMGB 항체 HmenB3에 대한 항-이디오타입 항체 및 약제학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 혈청 그룹 B 수막염균증(meningococci)을 예방 또는 치료할 수 있는 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

수막염균증 백신 조성물{Vaccine composition for preventing meningococcal disease}

본 발명은 나이세리아 메닝자이티디스(Neisseria meningitidis)에 대한 항-이디오타입 항체에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 나이세리아 메닝자이티디스 혈청 그룹 B(Neisseria meningitidis serogroup B, 이후 NMGB로 인용됨)의 항체인 HmenB3에 대한 항-이디오타입 항체 및 이 항체를 생성하는 하이브리도마(hybridoma)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 NMGB 항체 HmenB3에 대한 항-이디오타입 항체 및 약제학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 혈청 그룹 B 수막염균증 (meningococci)을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

세균성 뇌막염(bacterial meningitis)은 강력한 항생제의 개발에도 불구하고 아직도 어린 아이와 청소년기의 생명을 위협하는 질병이며, 임상적으로 볼 때 세균성 뇌막염은 감염 시 임상경과가 빠르기 때문에, 사망률이 약 20%정도로 매우 높고 치료 후에도 신경계의 후유증을 남기는 질병이다. 인종과 지역에 따라 차이는 있지만 나이세리아 메닝자이티디스(Neisseria meningitidis) (N. meningitidis)에 의한 뇌막염은 우리나라, 미국과 유럽뿐만 아니라 전 세계적으로 여전히 질병 발생이 줄지 않고 있으며(Rosenstein NE et al., Meningococcal disease, New Engl J Med 344:1378-88. (2001)), 이에 따라 미국과 유럽은 NMGB에 대한 백신(vaccine) 개발을 현재 우선적 백신 개발 항목에 두고 있다. 엔. 메닝자이티디스(N. meningitidis) 혈청 그룹 A 및 B 균의 전체 염기서열이 2000년도에 각각 밝혀졌다(Tettelin H, et al., Complete genome sequence of Neisseria meningitidis serogroup B strain MC58. Science 287:1809-1815, (2000) and Parkhill J, et al, Complete DNA sequence of a serogroup A strain of Neisseria meningitidis Z2491, Nature 404:502-6, (2000)).

엔. 메닝자이티디스(N. meningitidis)는 세균성 뇌막염의 가장 흔한 원인균 중 하나로 캡슐 다당류(capsular polysaccharide, 이후 PS로 인용됨)의 구조를 기준으로 13가지의 혈청형으로 분류되며 그 중 A, B, C, Y, W135가 사람에게 질병을 일으킨다. 그 중 혈청 그룹 B가 뇌수막균성 뇌막염 (meningococcal meningitis) 중 50% 정도를 차지하며(Rosenstein NE, et al., Meningococcal disease. New Engl J Med 344:1378-88. (2001), Al'Aldeen, et al., Neisseria meningitidis: vaccines and vaccine candidates. J Infection 33:153, (1996) and Riedo FX et al., Epidemiology and prevention of meningococcal disease. Pediatr Infect Dis J 14:642, (1995)), 유럽과 북미의 경우에는 이유를 알 수 없지만 다른 혈청형에 비해 보다 더 많은 혈청 그룹 B형이 발생되고 있어 보건학적 문제로 대두되고 있다.

NMGB의 캡슐(capsular) PS는 항원성이 아주 낮아 다른 세균처럼 콘쥬케이트 (conjugate) PS 백신(vaccine)을 만들 수 없고, 또한 NMGB의 캡슐 (capsular) PS 구조가 α(2-8) N-아세틸 뉴라민산(N-acetyl neuraminic acid)의 선형 폴리머(linear polymer)로 구성되어, 사람 신경세포 등에서 표현되는 신경세포 부착 분자(neural cell adhesion molecule) (NCAM)의 폴리시알산(polysialic acid)과 구조적으로 유사하여 자가 면역반응을 일으킬 가능성이 있어서 백신 개발이 어렵다(Finne J, et al., Occurrence of α2-8 linked poly- sialosyl units in a neuronal cell adhesion molecule. Biochem Biophys Res Commun 112:482, (1983); Finne J, et al., An IgG monoclonal antibody to group B meningococci cross-reacts with developmentally regulated polysialic aicd of glycoprotiens in neuronal and extraneural tissues. J Immunol 138:4402, (1987); Nedelec J, et al., Evidence for autoimmune antibodies directed against embryonic neural cell adhesion molecules (NCAM) in patients with group B meningitis. J Neuroimunol 29:45-46, (1990)).

이 단점을 보완하기 위하여 최근에 NMGB의 PS의 α(2-8) N-아세틸 뉴라민산(N-acetyl neuraminic acid)의 측쇄(side chain)인 N-아세틸(N-acetyl)을 N-프로피오닐(N-propionyl)로 치환하여 항원성을 높이면서 NCAM과 교차 항원성을 없애려는 시도가 제닝(Jenning)에 의해 제시되었다(Jennings HJ, et al., N-propionylated group B meningococcal polysaccharide mimics a unique epitope on group B Neisseria meningitidis. J Exp Med 165:1207-11, (1987)). 그러나, N-프로피오닐(N-propionyl)로 치환된 뉴라민산의 폴리머(polymer)로 동물 실험 결과, 항체를 유도하고 생체 외(in vitro)에서 세균 살상능(bactericidal activity)를 나타내는데는 성공하였으나 이 항체가 사람의 NCAM과도 결합하여 N-프로피오닐 뉴라민산(N-propionyl neuraminic acid)를 이용한 백신 개발도 안정성에 문제가 있는 것으로 밝혀졌다(Pon RA, et al., N-propionylated group B meningococcal polysaccharide mimics a unique bactericidal capsular epitope on group B Neisseria meningitidis. J Exp Med 185:1929-1938, (1997) and Granoff DM, A Bartoloni, S Ricci, E Gallo, et al, Bacterial monoclonal antibodies that define unique meningococcal B polysaccharide epitopes that do not cross-react with human polysialic acid. J Immunol 160:5028-36, (1998)).

결국, 엔. 메닝자이티디스(N. meningitidis) 혈청 그룹 B의 백신 개발을 위해서는 높은 항원성을 가지면서도 NCAM과의 교차성이 없는 NMGB의 에피토프(epitope)를 찾아야 한다. 본 발명자들은 이미 NMGB의 캡슐 PS에 반응하는 단클론 항체를 제조하여 NCAM과 교차반응이 없으며 세균 살상능(bactericidal activity)이 있는 단클론 항체인 HmenB3을 제조하여 보고한 바 있다(Shin JS, Lin JS, Anderson PW, Insel RA, Nahm MH: Monoclonal antibodies specific for Neisseria meningitidis group B polysaccharide and their peptide mimotopes. Infect Immun 69(5):3335-3342, (2001)).

항-이디오타입(anti-idiotype) 항체를 이용한 연구는 항원성이 낮아서 면역반응을 잘 일으키지 못하는 암 특이항원(tumor specific antigen)의 면역성을 높이기 위하여 많이 활용되고 있으며, 최근에 세균 백신 제조에 이용하기 위하여 개발되고 있다. 그 중 엔. 메닝자이티디스(N. meningitidis) 혈청 그룹 C와 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)에서 캡슐 PS에 대한 단클론 항체에 대한 항-이디오타입 항체를 제조하여, 그 중 항-이디오타입 펩타이드(anti-idiotope peptide)(Westerink MAJ, P Giardina, M Apicella, and T Kieber-Emmons, Peptide mimicry of the meningococcal group C capsular polysaccharide. Proc Natl Acad Sci USA 92:4021, (1995)) 혹은 항-이디오타입 항체 중, 단일 사슬 가변 단편(single chain variable fragment) (scFv)를 포함하는 파아지(phage)를 마우스에 면역할 경우(Magliani W, et al., Neonatal mouse immunity against group B streptococcal infection by maternal vaccination with recombinant anti-idiotypes. Nature Med 4:705-709, (1998)) 각각의 세균 감염을 억제할 수 있었다.

본 발명자들은 위의 근거를 바탕으로 NMGB의 캡슐 PS에 대한 단클론 항체인 HmenB3의 특성을 이용하여 항-이디오타입 항체를 개발하여, 이 항체의 생물학적 특성을 밝혀 NMGB의 수막염균증을 예방 또는 치료할 수 있는 백신을 제공하고자 한다.

본 발명은 NMGB의 항체인 HmenB3에 대한 항-이디오타입 항체 또는 이의 활성 단편에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 이러한 항-이디오타입 항체를 생성하는 하이브리도마 (hybridoma)에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 NMGB 항체 HmenB3에 대한 항-이디오타입 항체 또는 이의 활성 단편 및 약제학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 혈청 그룹 B 수막염균증(meningococci)을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서는 다수의 정의들이 사용되며, 이들의 의미는 다음과 같다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 항체 Ab1은 특정 항원 또는 감염원에 결합하는 항체이며, 본원의 경우에 있어서 Ab1은 NMGB의 캡슐 PS를 인식하지만 NCAM과 교차반응성이 없는 HmenB3 항체에 해당한다.

또한, Ab2 항체는 통상적인 항체(Ab1)의 가변부위에 대해 지시되는 항체이다. 따라서, Ab2 및 면역원(또는 항원)은 Ab1-결합 부위의 동일한 영역에 결합할 수 있기 때문에, 이중에서 특정 Ab2("내부 이미지(internal image)" 항체 또는 "Ab2β" 항체로도 표현됨)는 면역원의 3차원 구조를 흉내낼 수 있으며, 이러한 Ab2 항체는 항-이디오타입 항체라고 한다. 상기 Ab2 항체로 면역화된 개체는 항-항-항체(anti-anti-antibody, Ab3으로도 표현됨)를 생산하며, 이중에는 상기 면역원에 결합할 수 있는 항체(Ab1')가 존재할 것이다.

항-이디오타입 항체의 이러한 항원 모방 특성(antigen mimicry property)은, 면역원을 용이하게 이용할 수 없거나 숙주가 면역원에 대해서 내성을 갖는 경우에 Ab2β 항체를 대용 항원(또는 이디오타입 백신)으로서 사용할 수 있게 한다.

본 발명의 경우, 항-이디오타입 항체 Ab2는 HmenB3에 결합하는 항체이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 Ab2는 HmenB3의 가변부위와 결합하며, 따라서 NMGB의 PS의 에피토프를 모방할 수 있는 Naid60 항체이다.

본 발명의 경우, Ab1' 항체는 항-Naid60 항체인 2-7-34 항체이며, 이는 자가면역의 우려없이 NMGB에 대한 살상능을 갖는 항체이다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 항체 단편은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab 등과 같은 항체의 일부분이다. 구조와 관계없이, 항체 단편은 전체 항체에 의해 인식되는 바와 같은 동일한 항원과 결합한다. 본원의 경우, Naid60 항체의 활성 단편들은 HmenB3 항체의 동일한 가변부위를 인식하고, NMGB의 캡슐 PS의 에피토프를 모방하는 단편들이다.

또한, 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 항체 단편은 특정 항원에 결합하여 복합체를 형성함으로써 항체로서 작용하는 모든 합성 단백질 또는 유전자 조작된 단백질을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 항체 단편은 L 사슬 가변부위로 이루어진 분리된 단편, H 및 L 사슬의 가변부위로 이루어진 Fv 단편, 및 L 및 H 사슬 가변부위가 펩타이드 링커로 연결된 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 사람화된 항체는 예를 들면, 쥐의 단클론 항체의 상보성 결정 영역이 쥐의 면역글로불린의 H 및 L 사슬 가변부위로부터 사람 가변부위로 전환된 재조합 항체 단백질을 의미한다.

일반적으로, 항체 단편은 통상적인 방법으로 전체 항체의 펩신(pepsin) 또는 파파인(papain) 절단으로 얻을 수 있다. 예를 들면, 항체를 펩신으로 절단하여 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다. 이러한 단편은 티올 환원제(thiol reducing agent)로 추가로 절단하여 Fab' 일가 단편을 얻을 수 있다. 또한, 펩신을 사용한 효소적 절단으로 두 개의 Fab 단편 및 Fc 단편을 직접적으로 얻을 수도 있다.

또한, Fv 단편은 H 및 L 사슬 가변부위가 결합된 단편이다. 이러한 결합은 비공유적이거나 공유적일 수 있으며, 바람직하게는 펩타이드 링커를 통해 공유 결합된다. 이러한 단일 사슬 가변 단편(scFv)은 각각 H 및 L 사슬 가변부위를 암호화하는 DNA 서열을 올리고뉴클레오타이드로 연결시킨 구조 유전자를 작제함으로써 제조할 수 있다. 이러한 구조 유전자를 발현 벡터에 도입하여 숙주 세포, 예를 들면, E. coli에 형질전환시켜 상기 두개의 가변부위를 연결하는 링커를 갖는 단일 폴리펩타이드 사슬을 합성하게 함으로써 scFv 단편을 얻을 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 하이브리도마는 당해 분야에 공지되어져 있으며, 항체 생산 세포와 불멸 세포, 예를 들면 골수종 세포와의 융합에 의해서 형성된 세포를 의미한다. 상기 하이브리드 세포는 항체를 지속적으로 공급할 수 있다.

단클론 항체(monoclonal antibody)를 만드는 기술은 당해 기술 분야에 알려져 있다. 일반적으로, 특정의 항원으로 면역화된 동물로부터의 림프구(전형적으로는 비장 세포(splenocyte))를 불멸(immortal) 세포주(cell line)(전형적으로는 골수세포)와 융합시키고, 목적하는 항원에 대한 항체를 확인하기 위해 수득되는 하이브리도마 세포의 배양 상층액을 스크리닝한는 것이다(Kholer, G. and C. Milstein. Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity. Nature 256:495-7 (1975)).

본 발명의 단클론 항-이디오타입 항체를 생산하기 위해서는, 면역원으로 NMGB의 PS에 대한 어떤 항체(Ab1) 또는 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 사용할 수 있다. 본 발명에서는 항-이디오타입 단클론 항체(Ab2)를 생산하기 위해 면역원(Ab1)으로 HmenB3를 사용하였다. HmenB3는 NMGB의 PS와 결합하고 NMGB에 대한 세균 살상능이 이미 밝혀진 HmenB3 단클론 항체 생성 세포를 이미 프리스탄(pristane)이 처리된 마우스 복강 내에 넣어 복수를 얻어, 세파크릴(Sephacryl) S-300HR를 이용한 크기 배제법(size exclusion)을 이용하여 정제하여 얻었다.

면역화는 일반적인 과정을 사용하여 수행될 수 있다. 면역화에 필요한 용량 및 투여계획(regimen)은 면역화되는 동물의 종, 이들의 면역 상태 및 동물의 체중을 포함하는 변수들에 의해 달라진다. 일반적으로 면역화된 동물에서 채혈하여 각 혈액 샘플로부터의 혈청은 적당한 스크리닝 분석법(screening assay)을 사용하여 특정 항체에 대하여 분석된다.

전형적으로, 불멸 세포주(예를 들면, 골수 세포주)는 림프구와 같은 동물 종으로부터 유래된다. 바람직한 불멸 세포주는 하이포잔틴 (hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine) ("HAT 배지")를 포함하는 배양 배지에 민감한 마우스 골수 세포주이다. HAT-감수성 마우스 골수세포들은 폴리에틸렌 글리콜(예를 들면, PEG 3350)을 사용하여 마우스 비장 세포(splenocyte)에 융합된다(Lerner, R.A, How to make a hybridoma. Yale J. Biol. Med., 54:387-402 (1981)). 그 후, 융합으로부터 생긴 하이브리도마 세포들은 융합되지 않고 비생산적으로(unproductively) 융합된 골수 세포들(융합되지 않는 비장 세포들은 변형되지 않았기 때문에 수일 후에 죽게 됨)을 죽이는 HAT 배지를 사용하여 선택된다. 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마는 원하는 특이성을 가진 단클론 항체(MAb)를 찾는 분석법을 사용하여 하이브리도마 배양 상층액을 스크리닝함으로써 확인할 수 있다.

본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마의 제조를 위해서, HmenB3으로부터 이의 F(ab')_2μ를 얻어 마우스에 면역시킨 후 비장 세포를 적출하여 단세포로 만들어 마우스 골수세포인 P3-x63-Ag8.653 세포와 섞은 후 폴리에틸렌(polyethylene) 방법으로 세포 융합을 시행하였다. 세포 융합된 세포는 HAT 배지를 이용하여 선택적으로 배양하였고, HT 배지를 이용하여 계대 배양하였다. 이로써 HmenB3 항체의 F(ab')_2μ에 대한 항체 Naid60 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하였다. 이렇게 제조된 하이브리도마는 2002년 4월 16일, 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC10228BP로 기탁하였다.

본 발명에 따른 항-이디오타입 항체를 생산하기 위해, 하이브리도마 세포들은 이들이 배양 배지 내로 단클론 항체를 분비할 수 있는 충분한 시간 동안 그리고 조건 하의 영양 배지에서 배양된다. 하이브리도마 세포에 적당한 조직 배양 기술 및 배양 배지들은 공지되어 있다. 하이브리도마 배양 상층액이 수집될 수 있고, 항체들은 일반적인 방법으로 더 정제될 수 있다.

원하는 항체는 2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(PRISTANE, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.)으로 처리된 마우스의 복강 내로 하이브리도마 세포를 주입함으로써 생산될 수 있다. 하이브리도마 세포들은 복강 내에서 복수로 축적되는 분비 항체를 증식시킨다. 주사기로 복강 내로부터 복수를 뽑음으로써 항체가 회수될 수 있다.

본 발명의 재조합 항체는 일반적인 재조합 기술, 예를 들면 원하는 항체의 L 사슬(light chain) 및 H 사슬(heavy chain)을 암호화하는 DNA를 포함하는 적당한 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명 항체의 H 사슬(heavy chain)의 일부 또는 모든 힌지(hinge) 및 불변 영역(constant region) 및/또는 L 사슬(light chain)의 불변 영역이 다른 종(species)의 면역글로불린의 L 사슬 또는 H 사슬의 대응하는 영역으로 대치된 재조합 키메릭(chimeric) 항체, 그리고 항체의 항원성을 감소시키기 위해 항체의 상보성 결정 영역(CDR)의 거의가 사람 항체의 대응하는 부분과 대치된 CDR 이식(grafting)에 의해 제조된 재조합 "인간화된(humanized)"항체를 생산하는 것도 가능하다.

본 발명에 의하면, NMGB의 항체인 HmenB3에 대한 항-이디오타입 항체 또는 이의 활성 단편(예를 들면, 활성을 갖는 scFv 항체 단편 또는 F(ab')2 단편)은 NMGB를 포함하는 세균 또는 세포에 대한 특이적인 면역반응을 유도하기 위해 감염되지 않은 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 면역 반응은 NMGB에 노출될 환자의 감염을 방지할 수 있다는 점에서 면역예방이 될 수 있다.

본 발명에 의하면, NMGB로 이미 감염된 또는 임상증상을 나타내는 환자들은 면역원으로 본 발명의 항-이디오타입 항체 및 이의 활성 단편으로 치료함으로써 면역치료가 될 수 있다.

치료 및 예방제로의 사용의 경우, 본 발명의 항-이디오타입 항체 및 약제학적으로 수용 가능한 담체와 혼합된 항체의 면역치료에 또는 면역예방에 유효한 양을 포함하는 약제학적 조성물로 제형될 수 있다. 면역치료에 또는 면역예방에 유효한 양은 보체(complement)의 존재 시에 감염 세균을 죽이는데 충분하고, 또는 숙주 다형핵백혈구(polymorphonuclear leukocytes, PMN)에 의한 식세포 죽음(phagocytic killing)이 가능하도록 감염 세균을 옵소닌화(opsonize)하기에 효과적인 양을 말한다. 일반적으로 면역치료에 또는 면역예방에 유효한 양은 환자 체중 당 약 0.1~10 mg/kg, 바람직하게는 1 mg/kg의 범위가 될 것이다. 단위 용량(unit dose)은 최초 투여 후 약 2개월 간격으로 2회 이상 부스팅될 수 있다. 하지만 더 낮은 용량 또는 더 높은 용량 및 다른 투여 스케줄이 적용될 수 있다.

본 발명의 항체 및 이의 활성 단편들은 항체 또는 단편을 가용성 면역원성 담체 단백질에 접합시켜 백신으로서 사용할 수 있다. 백신에서 사용할 수 있는 적합한 담체 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 톡소이드(toxoid) 등을 포함한다. 본 발명의 항체 및 이의 단편은 당해 분야에 공지된 방법으로 담체 단백질에 접합시킬 수 있다.

바람직한 백신 조성물은 항체-담체 단백질 접합체 또는 항체 단편-담체 단백질 접합체 및 어주반트를 포함한다. 적합한 어주반트는 수산화알루미늄 및 지질 등을 포함한다. 백신 조성물의 제형화 방법은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 방법을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체 조성물은 공지된 방법들에 따라서 항체 또는 항체 단편을 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 약제학적 조성물을 제조할 수 있다. 어떤 조성물의 투여에 대해서 수용체 동물이 내성을 갖는 경우, 이러한 조성물에 대해서 "약제학적으로 허용되는 담체"라고 한다. 한가지 예로서 멸균 포스페이트-완충된 염수를 들 수 있다. 다른 적합한 담체들은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어져 있다. 일반적으로, 본 발명의 항체들은 치료 용도의 경우에 멸균된 염수(saline) 용액에 현탁(suspension)될 것이다. 약제학적 조성물은 활성 성분의 방출을 조절하기 위해 또는 환자의 전신에서의 잔류를 연장하기 위해 선택적으로 제형될 수 있다. 수많은 적당한 약물 전달 시스템이 공지되어 있다. 예를 들면, 이식할 수 있는 약물 전달 시스템, 하이드로겔, 하이드록시메틸셀룰로즈, 마이크로캡슐, 리포좀, 마이크로에멀젼, 마이크로스피어 등이 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 경비, 피하, 근육 내, 정맥 내, 동맥 내 또는 비경구적 수단과 같은 적당한 방법에 의해 투여될 수 있다. 정상적으로는 정맥 내 (i.v.) 또는 비경구적으로 투여되는 것이 바람직할 것이다.

본 발명의 항체 또는 항체의 단편의 면역치료에 또는 면역예방에 유효한 양은 특히 투여 스케줄, 투여될 항체 또는 항체 단편의 단위 용량, 항체 또는 이것의 단편이 다른 치료제와 혼합되어 투여되는지 여부, 환자의 면역 상태 및 건강상태, 투여될 항체 또는 항체 단편의 치료 활성 및 치료하는 의사의 판단에 따라 달라질 것이라는 것은 이 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.

이하, 본 발명을 하기 실시 예에서 좀더 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

실시예

세균

본 실험에 사용한 NMGB는 ATCC 13090으로 초코레이트 아가 플레이트 (chocolate agar plate)에 도말한 후 37℃에서 6 시간동안 캔들 자르(candle jar)에 배양한 후 수확하였다. NMGB는 HBSS(Hank's balanced salt solution)으로 세척하고 20% 글리세롤(glycerol)에 분주하여 -70℃에 보관하여 사용하였다.

<실시예 1> F(ab')의 준비 및 면역

NMGB PS과 결합하고 NMGB에 대한 세균 살상능이 이미 밝혀진 HmenB3(IgM, κ) 단클론 항체 생성 세포를, 이미 프리스탄(pristane)이 처리된 마우스 복강 내에 넣어 복수를 얻었다. HmenB3의 순수 정제는 세파크릴 S-300HR(Pharmacia, Uppsala, Sweden)를 이용한 크기 배제법(size exclusion)을 이용하였다. F(ab')_2μ를 얻기 위하여 HmenB3를 4℃에서 펩신(pepsin)으로 단백질을 분해한 후 순수 정제하였다(Pascual DW and Clem LW: Low temperature pepsin proteolysis: An effective procedure for mouse IgM F(ab)2u fragment production. J Immunol Methods 146:249-255 (1992)). 정제된 F(ab')_2μ 2mg을 동량의 KLH (keyhole limplet hemocyanin)과 섞은 후 0.2% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 용액으로 15분간 섞으면서 서서히 반응시키고 30분간 계속적으로 반응시켰다. 이후 글리신(glycine)으로 200mM이 되도록 섞어서 반응시켜 잔류된 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde)를 블랏킹(blocking)시킨 후 PBS 용액으로 투석하여 F(ab')_2μ-KLH접합체(conjugate)를 얻었다. 마우스 면역은 접합된 항원 100 μg을 프로인트 완전 보조제(Freund complete adjuvant)와 섞어서 BALB/c 마우스 복강 내 접종하였고, 부스터(booster)는 2주 간격으로 프로인트 불완전 보조제(Freund incomplete adjuvant)와 섞어서 시행하였다. 세포융합 반응 실험 3일 전에 다시 F(ab')_2μ의 단백질 100μg을 꼬리정맥으로 주사한 후 마우스 비장세포를 얻어 세포융합반응을 시행하였다.

<실시예 2> 단클론 항체의 생성 및 분석

단클론 항체의 생성을 위하여 마우스 비장을 적출하여 단세포로 만든 후, 마우스 골수세포인 P3-x63-Ag8.653 세포와 섞은 후 폴리에틸렌(polyethylene) 법으로 세포 융합을 시행하였다. 세포 융합된 세포는 HAT 배지를 이용하여 선택적으로 배양하였고, HT 배지를 이용하여 계대 배양하였다. 이렇게 제조된 하이브리도마는 2002년 4월 16일, 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC10228BP로 기탁하였다. HmenB3 항체와 HmenB3의 F(ab')_2μ와 결합하는 단클론 항체를 효소결합 면역측정법 (ELISA)으로 선택하였다. 이 항체가 HmenB3의 이디오타입(idiotype) 부위에 결합하는지 여부를 확인하기 위하여 경쟁적 ELISA(competitive ELISA)를 이용하여 확인하였다. 이 단클론 항체의 아이소타입(isotype)은 하이브리도마 서브타이핑 키트(hybridoma subtyping kit) (Boehringer Mannheim GmbH, Germany)를 이용하였다.

<실시예 3> 효소결합 면역측정법(ELISA)

단클론 항체의 생성을 측정하기 위하여 ELISA 방법을 이용하였다. 즉, 항원을 10mg/L가 되도록 탄산-중탄산 완충액(carbonate-bicarbonate buffer) (pH 9.6)에 희석한 후, EIA 플레이트(Corning Inc., Corning, NY)에 웰(well) 당 100μl씩 넣고 4℃에서 하룻밤 부착시킨 후 0.05% (v/v) Tween 20이 함유된 인산완충용액 (PBST, pH 7.4)으로 세척하고, 5% (v/v) 정상 염소 혈청(normal goat serum) (Gibco)이 함유된 PBST (NGS-PBST)로 1시간 동안 블랏킹(blocking)을 시행하였다. 그 후, 각 웰에 단클론 항체 배양액을 100μl 씩 넣고 37^oC에서 90분간 반응시켰다. 다시 PBST로 4회 세척한 후 퍼옥시데이즈-접합체 항-마우스 Igγ(peroxidase-conjugated anti-mouse Igγ)(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo)로 90분간 반응시킨 후 PBST로 4회 세척하였다. 기질용액으로 O-페닐렌디아민(O-phenylene diamine)을 이용하여 발색반응을 시킨 후 2.5N 황산용액으로 반응을 정지시키고 490nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 제조된 단클론 항체의 아이소타입(isotype)은 퍼옥시데이즈(peroxidase)가 결합된 염소 항-마우스 아이소타입-특이성 항체 (goat anti-mouse isotype-specific antibodies)를 이용하였다.

위에서 얻어진 단클론 항체를 Naid60라 명명하고, 이 항체가 HmenB3의 이디오타입 부위에 대한 것인지를 확인하였다. 우선 NMGB를 열처리하여 감염성을 없앤 후 EIA 플레이트(plate)에 넣고 말려서 부착시켰다. 이후 플레이트를 위와 같이 세척 및 블랏킹을 시행한 후, 각 웰에 HmenB3와 Naid60 항체를 동량씩 섞어서 실온에서 진탕하며 3시간 반응시켰다. 이때 HmenB3의 농도는 고정하였고, Naid60 항체는 다양한 농도로 반응시켰다. 이후 PBST로 세척 후 퍼옥시데이즈-접합체 항-마우스 Igμ(peroxidase-conjugated anti-mouse Igμ)로 반응을 시켰고, 발색 기질 반응을 위와 같이 시행하여 단클론 항체의 농도에 따라 HmenB3가 NMGB에 결합되는 것이 억제되는 정도를 관찰하였다. Naid60에 대한 대조군 항체로 아이소타입이 동일한 단클론 항체를 이용하였고, 아울러 NMGB PS와 구조가 동일한 것으로 밝혀진 E. coli K1 PS를 양성 대조군으로 이용하였다.

<실시예 4> 세균 살상능 측정

Naid60 항체가 HmenB3의 세균 살상능을 실제로 억제하는지를 관찰하기 위하여 NMGB 세균을 HBSS(Hank's balanced salt solution)으로 세척한 후, 2,500 CFU를 포함하는 NMGB 30μl와 HmenB3 항체 25μl, Naid60 항체 25μl, 보체로 토끼 혈청 20μl을 96웰 플레이트에 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 진탕 배양하였다(Shin JS, et al., Monoclonal antibodies specific for Neisseria meningitidis group B polysaccharide and their peptide mimotopes. Infect Immun 69(5):3335-3342 (2001)). 배양 후 10μl를 초코레이트 아가 플레이트(chocolate agar plate)에 도말한 후 캔들 자르(candle jar)에서 하룻밤 배양한 후 균수를 측정하였다. 이때 HmenB3에 대한 음성 대조군 항체로 아이소타입이 같은 단클론 항체를 이용하였다. 각 실험은 3중으로(triplicate) 시행하여 평균값을 사용하였다. 세균 살상능은 다음 식을 이용하여 산출하였다.

세균 살상능 (%) = [(CFU_{no Naid60} - CFU_Naid60) / CFU_{no Naid60}] x 100.

<실시예 5> Naid60 항체의 가변부위 염기서열 분석

항체의 가변부위 염기서열을 밝히기 위해서 하이브리도마(hybridoma) 세포를 10% 소 태아 혈청(bovine fetal serum)이 함유된 RPMI1640 배지에 배양한 후, 전체 (total) RNA를 RNase 키트를 사용하여 분리하였다. 분리된 RNA를 MMLV 역전사 효소(reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA를 제조한 후 H 사슬과 L 사슬의 가변부위를 증폭하기 위한 RT-PCR을 시행하였다. PCR 반응은 1.5mM MgCl₂, 0.2mM dNTP, 2.5U Taq 폴리머라제(polymerase) (Takara, Japan)로 95℃ 1 분, 55℃ 1 분, 72℃ 1 분으로 35회 반응을 시켰고, 72℃에서 10분간 익스텐션(extension)시켰다. 반응을 위한 프라이머(primer)로 V_H는

5-CAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTAT-3(센스, 서열번호 1) 및

5-GTGCACACCGCTGGACAGGGATCC-3(안티센스, 서열번호 2)

를 이용하였고, V_L 프라이머로

5-GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA(센스, 서열번호 3) 및

5-TGGTGGGAAGATGG-3(안티센스, 서열번호 4)

를 이용하였다. PCR DNA 산물은 PCR 정제 키트(purification kit) (Qiagen)로 정제한 후, Big Dye Terminator Cycle sequencing kit(Applied Biosystems, Foster city, CA)를 이용한 디데옥시 종결 반응 (dideoxy termination reaction) 방법을 이용하였다. 염기서열은 DNA 시퀀서(sequencer) (Applied Biosystems)를 이용하여 분석하였다. H 사슬 및 L 사슬의 상보성 결정 부위(complementarity determining regions) (CDRs)은 웹 사이트(http://imgt.cnusc.fr)의 V-Quest 프로그램을 이용하여 분석하였다. Naid60 항체의 가변부위 염기서열은 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타내었다.

<실시예 6> 펩타이드 합성

Naid60 항체에서 항-이디오타입(anti-idiotype) 부위를 추정하기 위하여 H 사슬과 L 사슬의 CDR 부위를 추정하였다. Naid60의 H 사슬과 L 사슬의 아미노산 서열을 이미 아미노산 서열이 밝혀진 단클론 항체와 비교하기 위하여 가장 가까운 아미노산 서열을 갖는 단클론 항체를 웹 사이트(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST)에서 찾은 후 밝혀진 결정(crystal) 구조를 이용하여 Naid60 항체의 CDR 부위를 추정하였다. 항-이디오토프 (Anti-idiotope) 부위를 조사하기 위하여 H 사슬의 CDR3 부위를 포함하는 펩타이드CARHKGYYGYYYALD(pNaid60)를 합성하여 이 펩타이드가 항-이디오토프의 특징이 있는지를 조사하였다.

pNaid60를 먼저 BSA와 결합(pNaid60-BSA)시키고 HmenB3와 결합을 관찰하였다. 먼저, pNaid60-BSA를 다양한 농도로 마이크로웰 플레이트(microwell plate)에 부착한 후, HmenB3와 결합하는 것을 ELISA로 관찰하였다. 아울러 pNaid60-BSA가, HmenB3의 E. coli K1 PS에 대한 결합을 억제하는지 보기 위하여 E. coli K1 PS를 마이크로웰 플레이트에 부착시킨 후 HmenB3와 pNaid60-BSA를 함께 넣고 반응시키는 경쟁적 ELISA를 시행하였다. 대조 단백질로는 pNaid60이 결합되지 않은 BSA를 사용하였다.

<실시예 7> 마우스 면역

Naid60 및 pNaid60에 대한 마우스 면역으로 NMGB에 대한 항체 생성을 관찰하기 위하여 Naid60 및 pNaid60를 각각 KLH 혹은 BSA에 콘쥬게이션(conjugation)시켜 BALB/c 마우스에 2주 간격으로 100μg씩 5회 주사하였다. 대조군으로는 KLH 단독을 사용하였으며 한 군당 마우스 수는 5마리로 하였다. 첫 번째 주사의 경우 어쥬반트(adjuvant)로 프로인트 완전 보조제(Freund complete adjuvant)를 사용하였고, 두 번째 주사부터는 프로인트 불완전 보조제(Freund incomplete adjuvant)를 사용하여 마우스 복강 내 주사하였다. 마우스 혈청은 매 주사 7일 후에 얻어 -20℃에 보관하였다. 얻어진 마우스 혈청은 ELISA를 시행하여 항체의 역가를 분석하였다. ELISA는 위에 언급된 방법으로 시행하였으며 항원으로는 불활성화시킨 NMGB를 사용하였고, 마우스 혈청을 희석하여 NMGB와 결합을 측정하였다.

<실시예 8> Naid60 항체의 단일 사슬 가변 단편(single chain variable fragment, scFv)를 포함하는 파아지(phage) 및 단백질 합성

Naid60 항체가 HmenB3에 대한 항이디오타입 항체임을 다시 한번 확인하고 Naid60 항체의 사용의 수월성을 위하여 재조합 항체인 scFv를 제조하였다. Naid60의 총 RNA를 얻은 후 역전사효소로 중쇄와 경쇄의 가변부위의 DNA를 증폭하였다. 증폭할 때 사용한 프라이머는 링커(linker)와 제한효소로 처리하여 원하는 벡터에 넣을 수 있도록 제조하였다. 증폭된 중쇄와 경쇄의 가변 부위 DNA를 연결한 후 pCANTAB5E 벡터에 클로닝하여 E. coli TG1에 형질전환시키고 헬퍼(helper) 파아지인 M13KO7를 감염시켜 완전한 파아지를 얻었다. 얻은 파아지를 HmenB3와 반응하여 결합하는 파아지를 얻었다. 이 파아지의 중쇄와 경쇄 부위의 DNA를 얻어서 다시 pRSET Sfi I/Not I 벡터에 클로닝하고 E. coli BL21에 형질전환하여 scFv 재조합 단백질을 얻었다. 이 단백질을 순수분리하여 원래의 단백질 모양을 얻기위해 재폴딩(refolding)을 시행하였고, 이 단백질을 웨스턴 블랏(Western blot)하여 HmenB3와 반응하는 것을 확인하였다.

또한, Naid60의 scFv 단백질이 HmenB3의 NMGB에 결합하는 것을 억제하는 것을 관찰하고자 NMGB가 결합된 plate에 HmenB3와 다양한 농도의 scFv 단백질을 넣어 억제(inhibition) ELISA를 <실시예 2>에 준하여 시행하였다. 아울러 scFv 단백질이 Naid60의 가변부위를 포함하고 있음을 관찰하고자 Naid60 항체를 플레이트에 부착시킨 후 HmenB3와 다양한 농도의 scFv 단백질을 넣어 <실시예 2>에 준하여 억제(inhibition) ELISA를 시행하였다. 재조합 scFv 단백질이 HmenB3의 NMGB 살상능을 억제하여 기능적으로도 Naid60처럼 NMGB에 대한 펩타이드 에피토프를 가지고 있는지를 관찰하기 위하여 세균살상능 억제 실험을 <실시예 4>에 준하여 실시하였다.

<실시예 9> Naid60 항체에 대한 항-Naid60 항체의 생성

Naid60 항체를 면역하여 얻은 항-Naid60 항체가 실제로 NMGB를 제거할 수 있는 항체를 형성하는지를 밝히고자 하였다. Naid60를 정제하고 동량의 KLH와 섞은 후 0.2% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 용액으로 15분간 섞으면서 서서히 반응시키고 30분간 계속적으로 반응시켰다. 마우스 면역은 접합된 항원 100 μg을 프로인트 완전 보조제(Freund complete adjuvant)와 섞어서 BALB/c 마우스 복강 내에 접종하였고, 부스터(booster)는 2주 간격으로 프로인트 불완전 보조제(Freund incomplete adjuvant)와 섞어서 시행하였다. 세포융합 반응 실험 3일 전에 다시 Naid60의 단백질 100μg를 꼬리정맥으로 주사한 후 마우스 비장세포를 얻어 세포융합 반응을 시행하였다. <실시예 2>처럼 단클론 항체를 생성하고 <실시예 3>처럼 효소결합 면역측정법(ELISA)으로 Naid60과 결합하는 항체를 얻어 분석하였다. Naid60과 결합하는 항-Naid60 항체를 얻어서 <실시예 4>처럼 NMGB에 대한 세균 살상능 측정을 측정하였다.

<실시예 10> 항-Naid60 항체의 NCAM과 결합

<실시예 9>에서 얻어진 항-Naid60 항체중 세균 살상능이 있는 항체가 신경세포의 NCAM과 결합하여 자가면역질환을 유발할 가능성을 알아보기 위해 NCAM을 세포표면에 표현하는 사람 신경세포주인 CHP-134를 대상으로 유세포분석법(flow cytometry)을 시행하였다. 또한, 신생 마우스의 뇌조직으로 동결절편을 만들어 항-Naid60 항체가 일차 뇌신경 조직에 결합하는지를 면역화학염색으로 밝히고자 하였다. 이때, 대조군 항체로는 이미 NCAM과 잘 결합하는 것으로 알려진 항체로 항-CD56 항체나 HmenB1 항체(Shin JS, Lin JS, Anderson PW, Insel RA, Nahm MH: Monoclonal antibodies specific for Neisseria meningitidis group B polysaccharide and their peptide mimotopes. Infect Immun 69(5):3335-3342, (2001))를 사용하였다. HmenB1 항체는 NMGB의 캡슐 PS에 대한 항체로 CHP-134 세포주에 결합하는 항체이다.

실험 실시예

<실시예 1> 항-이디오타입 단클론 항체(Anti-idiotype MAb)의 특성분석

HmenB3에서 F(ab')_2μ를 얻어 마우스에 면역한 후, 비장세포를 얻어 세포융합을 시행하여 얻은 세포 배양액을 얻었다. ELISA 방법으로 HmenB3 및 F(ab')_2μ에 반응하는 Naid60 단클론 항체를 분리하여 NMGB의 캡슐 PS의 항원과 유사성을 조사하였다. HmenB3에 반응하는 단클론 항체 2가지(도 1A) 중 HmenB3가 NMGB에 부착하는 것을 억제하는 항체는 Naid60이었다(도 1B). Naid60 항체가 농도에 따라 HmenB3의 NMGB 결합을 억제하는지를 관찰하기 위하여 Naid60 항체를 순수 분리한 후 경쟁적 ELISA(competitive ELISA)를 시행한 관찰 결과 Naid60의 농도가 증가함에 따라 HmenB3의 NMGB에 대한 결합이 감소되었다(도 2). 이 현상은 NMGB의 캡슐 PS와 구조가 같은 E. coli K1 PS가 HmenB3의 NMGB에 결합을 억제하는 결과와 마찬가지였으며, 대조군 항체(Ab-CNTL)는 상기 세포융합에서 얻어진 항체를 이용하였고, HmenB3의 NMGB의 결합을 억제하지 않았다. 이로써 Naid60 항체는 HmenB3에 대하여 항-이디오타입의 특징을 갖는 항체임을 알 수 있었으며, 이 항체는 κ형의 L 사슬을 갖는 IgG1 아이소타입(isotype)을 나타내었다.

<실시예 2> NMGB 세균 살상능 (bactericidal activity)의 억제

Naid60 항체가 실제로 HmenB3의 이디오타입(idiotype) 부위에 붙어서 항체의 활성도를 억제하는지 관찰하기 위하여 NMGB에 대한 HmenB3의 세균 살상능을 억제하는 실험을 실시하였다. 세균은 살아있는 엔. 메닝자이티디스(N. meningitidis) 혈청 그룹 (ATCC 13090)를 이용하였다. HmenB3(4 mg/L)와 엔. 메닝자이티디스(N. meningitidis) 혈청 그룹 B 및 토끼 혈청을 넣고 반응시킨 후 배양할 때 세균 집락수를 관찰할 수 없었으며, 이 때 세균 살상능은 100%로 하였고, HmenB3(IgM, κ) 대신 아이소타입(isotype)이 동일한 다른 항체를 이용하여 반응을 시킨 후 배양된 세균수를 기준으로 세균 살상능 0%로 정의하였다. Naid60이 HmenB3의 세균 살상능에 미치는 영향을 보기 위하여 Naid60을 4 mg/L가 되도록 HmenB3와 함께 첨가한 경우 세균 살상능은 57.7%로 관찰되었고, Naid60를 40 mg/L 되도록 첨가하였을 경우 HmenB3의 세균 살상능은 전혀 관찰할 수 없었다. Naid60 항체 대신 E. coli K1 PS를 40 mg/L 되도록 첨가하여 HmenB3 항체와 함께 배양하였을 경우 HmenB3에 의한 NMGB의 세균 살상능은 56.2%로 관찰되었다(도 3).

<실시예 3> Naid60의 가변부위 염기서열 분석

Naid60로부터 cDNA를 제조하여 항체의 H 사슬과 L 사슬의 가변 부위를 PCR 법으로 증폭한 후 직접 DNA 서열화(direct DNA sequencing)를 두 차례 이상 시행하여 염기서열을 밝혔다. Naid60 H 사슬 가변부위의 아미노산 서열은 아미노산 서열이 가장 유사한 항체인 개 림프종(canine lymphoma)에 대한 단클론 항체인 Mab231 (Harris, L.J. et al., McPherson, A. Refined structure of an intact IgG2a monoclonal antibody. Biochemistry 36:1581-97, (1997))의 결정 구조(crystal structure)와 비교하여 CDR의 길이와 위치를 추정하였고, Naid60 L 사슬 가변부위의 아미노산 서열도 마찬가지로 염기서열이 가장 유사한 MAK33(Augustine,J.G. et al., The crystal structure of the fab fragment of the monoclonal antibody MAK33. Implications for folding and interaction with the chaperone bip. J Biol Chem 276:3287-94 (2001)) 및 HyHEL-63(Li Y, Li H, Smith-Gill SJ, Mariuzza RA: Three-dimensional structures of the free and antigen-bound Fab from monoclonal antilysozyme antibody HyHEL-63. Biochemistry 39:6296-6309 (2000))의 L 사슬의 결정 구조(crystal structure)와 비교하여 CDR 부위를 추정하였다 (도 4)

<실시예 4> Naid60 항체의 항체 단편 작제 및 이의 항원성 측정

Naid60 항체 부위 중 어떤 부위가 HmenB3와 결합하는지를 밝히는 것이 항-이디오타입(anti-idiotype)을 이용한 펩타이드 백신 개발에 중요하다. 따라서, 본 발명자들은 항체의 구조 중에서 항원 결합에 중요한 역할을 담당할 것으로 추정되는 H 사슬의 CDR3에 해당하는 부위를 펩타이드(pNaid60) 합성하여 BSA와 결합(pNaid60-BSA)시킨 후 HmenB3와 반응을 관찰하였다. 먼저 pNaid60-BSA에 대한 HmenB3의 결합을 관찰하기 위하여 다양한 농도의 pNaid60-BSA를 마이크로웰(microwell)에 부착시킨 후 ELISA를 시행하였다. HmenB3는 pNaid60-BSA의 농도가 증가함에 따라 결합이 증가하여 약 2.5 mg/L의 농도에서 최대의 결합을 보였다(도 5A). pNaid60-BSA의 HmenB3와의 결합이 특이적인 반응인지를 확인하기 위하여 경쟁적 ELISA를 시행하였다. 먼저 마이크로웰 플레이트에 E. coli K1 PS를 부착한 후 HmenB3와 pNaid60-BSA를 넣고 반응시켜 HmenB3의 E. coli K1 PS에 대한 부착을 pNaid60-BSA가 억제하는지를 관찰하였다. 대조군 단백질로 pNaid60이 결합되지 않은 BSA를 500 mg/L가 되도록 첨가한 경우 HmenB3의 E. coli K1 PS에 대한 결합을 거의 억제시키지 않았으나, pNaid60-BSA의 농도를 125, 250 mg/L로 첨가한 경우에는 HmenB3의 E. coli K1 PS에 대한 반응이 각각 53%, 64% 감소하였으며, 이로써 pNaid60-BSA가 HmenB3에 특이적임을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터, Naid60는 HmenB3의 항-이디오타입 항체이며, 상기 합성된 pNaid60 펩타이드가 HmenB3의 항-이디오토프(anti-idiotope)일 가능성을 제시하였다(도 5B).

또한, Naid60-KLH (또는 BSA) 및 pNaid60-KLH (또는 BSA)의 면역으로 NMGB에 대한 항체 반응이 증가하는지를 관찰하기 위하여, BALB/c 마우스에 이를 면역시킨 후 NMGB에 대한 항체가를 측정하였다. 그 결과, Naid60-KLH (또는 BSA) 및 pNaid60-KLH (또는 BSA)의 주사 횟수가 증가함에 따라 NMGB에 대한 항체가가 증가하였으며(데이터 제시않됨), 이로부터, Naid60가 NMGB PS의 에피토프(epitope)를 모방하며 이에 대한 대용 항원성이 있음을 알 수 있었다.

추가로, Naid60 항체의 F(ab')2 항체 단편 또는 scFv 항체 단편을 작제하여 이들의 NMGB에 대한 항체 반응을 확인하였다. 본 발명의 항-이디오타입 항체 Naid60의 F(ab')2 단편은 공지된 방법에 따라 Naid60 항체를 단백질 분해효소 펩신으로 처리하여 수득할 수 있거나, Fab' 단편을 티오에테르 결합 또는 디설파이드 결합시켜 작제할 수 있었다. 또한, Fab' 단편은 상기한 F(ab')2 단편의 힌지 영역의 디설파이드 결합을 절단한 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 또한, scFv 단편은 상기 언급된 바와 같이 본 발명의 Naid60 항체의 H 사슬 및 L 사슬 가변부위 암호화 서열 및 이들 사이를 연결하는 링커를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 작제하여 이를 발현 벡터에 도입하여 숙주 세포에서 발현시켜 제조한 항체 단편이다. 상기의 F(ab')2 항체 단편 또는 scFv 항체 단편을 마우스 복강에 각각 6회 또는 5회 면역화시키고 NMGB에 대한 항체가를 면역 전 및 후에 대해서 비교한 결과, 주사 횟수가 증가함에 따라 상기 항체 단편들의 NMGB에 대한 항체가가 현저하게 증가되어 항원성이 있음을 알 수 있었다(도 6의 A 및 B).

<실시예 5> Naid60 항체의 단일 사슬 가변 단편(single chain variable fragment, scFv) 단백질 특성

Naid60 항체가 HmenB3에 대한 항이디오타입 항체임을 다시 한번 확인하고 Naid60 항체의 사용의 수월성을 위하여 재조합 항체인 scFv를 제조하였다. Naid60의 중쇄와 경쇄의 가변부위를 링커로 연결한 후 pCANTAB5E 벡터에 클로닝하여 E. coli TG1에 형질전환시키고 헬퍼 파아지인 M13KO7로 완전한 파아지를 얻었다. 얻은 파아지의 Naid60에 해당하는 중쇄와 경쇄 부위를 다시 pRSET Sfi I/Not I 벡터에 클로닝하여 E. coli BL21에 형질전환하여 scFv 재조합 단백질을 얻었다. 이 단백질을 순수분리하여 전기영동을 한 결과 예상 분자량인 30kDa를 얻을 수 있었다(도 7D). Naid60의 scFv 단백질은 HmenB3가 NMGB에 결합하는 것을 농도 의존적으로 억제하여(도 7A) NMGB의 에피토프와 유사한 에피토프를 가지고 있음을 알 수 있었다. 또한, HmenB3가 Naid60에 결합하는 것을 억제하여(도 7B) 이 scFv 단백질은 Naid60의 가변부위의 구조를 가지고 있음을 알 수 있었으며, 아울러 scFv 단백질은 농도 의존적으로 HmenB3의 NMGB 살상능을 억제함을 볼 때(도 7C), 기능적으로도 NMGB의 에피토프와 유사한 특징을 가지고 있음을 알 수 있었다. 이상의 결과로 볼 때 Naid60의 중쇄와 경쇄의 가변부위를 이용하여 재조합 단일 사슬 가변 단편 단백질과 이를 포함하는 파아지를 얻을 수 있었으며, 이러한 단백질은 NMGB에 대한 펩타이드 에피토프를 포함하고 있어 Naid60 항체와 마찬가지로 항-이디오타입 항체로 사용될 수 있음을 제시하였다.

<실시예 6> Naid60 항체에 대한 항-Naid60 항체의 세균 살상능

Naid60 항체가 NMGB에 대한 에피토프를 갖는 항체이며 이 항체를 면역시 NMGB를 죽일 수 있는 항체를 형성하는지를 관찰하기 위하여 Naid60를 마우스에 면역하여 항-Naid60 항체를 제조하여, 그 클론을 2-7-34로 명명하였다. 이 항체는 ELISA 검사결과 NMGB에 농도의존적으로 결합하여(도 8A) NMGB에 결합하는 항체임을 알 수 있었다. 2-7-34 항체가 기능적으로 NMGB에 대한 보체매개 세균살상능이 존재하는지를 확인하기 위하여 NMGB에 보체가 포함된 토끼 혈청 및 다양한 농도로 항체를 섞고 배양하여 세균 살상능을 관찰한 결과 대조군 항체에 비하여 현저하게 낮은 농도에서 세균을 죽이며 LD50의 농도가 8 ng/mL임을 알 수 있었다(도 8B). 2-7-34 항체의 세균 살상능은 위에서 나타난 ATCC13090 NMGB 뿐만 아니라 H44/76 NMGB에서도 동일하게 관찰되어(데이터 제시않됨), 2-7-34 항체는 NMGB의 에피토프에 결합하여 일어나는 현상임을 나타낸다. 2-7-34의 NMGB 세균 살상능은 Naid60 항체를 넣었을 때 억제되는 것으로 볼 때(도 8C), 2-7-34 항체는 Naid60의 항-이디오타입 항체임을 제시한다. 이 결과를 통하여 Naid60 항체는 NMGB의 캡슐 PS와 유사한 에피토프 부위를 가지고 있으며, 이 에피토프에 대한 항체는 NMGB의 에피토프와 결합하여 보체매개 세균 살상능을 나타냄을 알 수 있었다.

<실시예 7> 2-7-34 항체의 자가면역성

NMGB의 캡슐 PS에 대한 면역은 자가면역성이 있는 항체를 유발할 수 있으므로, 2-7-34 항체가 자가면역성이 있는지를 관찰하기 위하여 폴리시알산(polysialic acid)을 발현하고 있는 사람 신경아세포종(neuroblastoma) 세포주에 2-7-34 항체를 반응시켜 유세포 분석법(flow cytometry)을 시행하였다. 그 결과 100 μg/mL의 농도에서도 CHP-134 세포주에 결합하지 않아(도 9A), 2-7-34 항체는 폴리시알산과 결합하지 않음을 알 수 있었다. 이 항체가 실제로 3-4주 이하의 신생 마우스의 뇌 조직에 실제로 결합하는지를 관찰하기 위하여 뇌 조직을 동결절편으로 슬라이드를 만든 후 50 μg/mL의 2-7-34 항체와 반응시켜 보았다. 대조군 항체인 HmenB1이 0.1 μg/mL에도 마우스 뇌 조직에 강하게 결합하지만(도 9B의 C에서 가운데 황토색으로 표시된 부분), 2-7-34 항체는 500 배 이상의 농도에서도 관련성이 없는 항체 수준으로 신생 마우스 뇌 조직에 결합하지 않음을 알 수 있었다(도 9B: A - 50 μg/mL 2-7-34; B - 50 μg/mL 관련성이 없는 Ab; C - 0.1 μg/mL HmenB1; D - 헤마톡실린/에오신(hematoxylin/eosin) 염색). 상기된 바와 같이, HmenB1은 NMGB의 캡슐 PS에 대한 항체로 CHP-134 세포주에 결합하는 항체이다. 이상의 결과로 볼 때, 2-7-34는 폴리시알산에 결합하지 않는 항체이며 이로써 자가면역질환을 일으킬 가능성이 없음을 나타내었다.

본 발명에 따라, 항원성이 아주 낮아 백신을 만들기에 곤란한 NMGB에 대한 항체에 대해 항-이디오타입 항체를 제공함으로써 NMGB에 대한 대용 항원성을 제공하여 NMGB에 대한 체내 면역능력을 효과적으로 향상시킬 수 있다. 또한, NMGB의 항체 HmenB3에 대한 항-이디오타입 항체 및 약제학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공함으로써 NMGB의 수막염균증을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 HmenB3에 반응하는 단클론 항체(monoclonal antibody) 2가지 중에서 HmenB3가 NMGB에 부착하는 것을 억제하는 항체를 보여주는 도이다. (A)는 HmenB3에 결합하는 항체가 2가지임을 보여주고, (B)는 이 중에서 HmenB3가 NMGB에 부착하는 것을 억제하는 것이 Naid60이라는 것을 보여준다.

도 2는 Naid60 항체 농도에 따라 HmenB3가 NMGB에 결합하는 것이 억제되는 정도를 나타낸 도이다. 관찰 결과 Naid60 항체의 농도가 증가함에 따라 HmenB3의 NMGB에 대한 결합이 감소됨을 보여준다.

도 3은 항-이디오타입 항체 Naid60가 HmenB3의 항체 활성도를 억제하는 것을 보여주는 도이다. Naid60의 다양한 농도에서 HmenB3의 NMGB에 대한 세균 살상능력을 보여준다.

도 4는 Naid60의 H 사슬 및 L 사슬 가변부위(VH 및 VL)의 뉴클레오타이드 및 추정 아미노산 염기서열을 나타낸 도이다.

도 5는 Naid60 항체 중 어떤 부위가 HmenB3와 결합하는지, 그리고 이 부위가 HmenB3와 결합에 특이적인 반응인지를 확인하는 도이다. (A)는 항체 구조 중 항원 결합에 중요한 역할을 담당할 것으로 추정되는 CDR3에 해당하는 부위를 펩타이드 및 BSA와 결합(pNaid60-BSA)한 후 HmenB3와의 반응을 나타내었는데 pNaid60-BSA의 농도가 증가함에 따라 결합이 증가함을 알 수 있다. (B)는 pNaid60-BSA가 HmenB3에 특이적으로 결합하는지를 보여주는 그래프인데, 첨가된 pNaid60-BSA의 농도가 증가함에 따라 HmenB3의 E.coli K1 PS에 대한 반응이 감소됨을 알 수 있다.

도 6는 Naid60 항체의 F(ab')2 항체 단편(A)과 scFv 항체 단편(B)을 사용한 마우스 면역화 후의 NMGB에 대한 항체 역가를 면역화 전의 항체 역가와 비교한 그래프이다.

도 7은 Naid60 항체의 scFv 단편의 활성 실험을 나타내는 도이다. (A)는 Naid60 항체의 scFv 단편이 HmenB3가 NMGB에 결합하는 것을 농도 의존적으로 억제한다는 것을 나타내는 그래프이고, (B)는 Naid60 항체의 scFv 단편이 HmenB3가 Naid60 항체에 결합하는 것을 농도 의존적으로 억제한다는 것을 나타내는 그래프이고, (C)는 Naid60 항체의 scFv 단편이 농도 의존적으로 HmenB3의 NMGB 살상능을 억제한다는 것을 나타내는 그래프이며, (D)는 Naid60 항체의 scFv 단편을 순수 분리한 결과를 나타내는 전기영동 결과의 방사선사진이다.

도 8은 Naid60 항체에 대한 항-Naid60 항체인 2-7-34 항체의 세균 살상능을 나타내는 도이다. (A)는 2-7-34 항체가 농도 의존적으로 NMGB에 결합한다는 것을 나타내는 ELISA 결과이고, (B)는 2-7-34 항체가 NMGB에 대한 보체매개 세균 살상능을 갖는다는 것을 나타내는 그래프이며, (C)는 2-7-34 항체의 NMGB 세균 살상능이 Naid60 항체 도입으로 억제된다는 것을 나타내는 그래프이다.

도 9은 2-7-34 항체가 NCAM에 결합하지 않아 자가면역성을 나타내지 않는다는 것을 보여주는 그래프(A) 및 형광사진(B)이다. (A)는 폴리시알산(polysialic acid)을 발현하는 사람 신경아세포종 세포주 CHP-134에 대한 2-7-34 항체의 결합 정도를 나타내는 유세포분석 결과이다. (B)는 마우스 뇌 조직에 대한 2-7-34 항체의 결합 정도를 나타내는 형광사진이다.

서열에 대한 간단한 설명

서열 번호 1 및 2는 Naid60 항체의 H 사슬의 가변부위를 증폭시키는데 사용된 센스 및 안티센스 프라이머이다.

서열 번호 3 및 4는 Naid60 항체의 L 사슬의 가변부위를 증폭시키는데 사용된 센스 및 안티센스 프라이머이다.

서열 번호 5 및 6은 Naid60 항체의 H 사슬 및 L 사슬 가변부위 각각의 염기 서열로부터 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 7 및 8은 Naid60 항체의 H 사슬 및 L 사슬 가변부위 각각의 염기 서열이다.

<110> Yonsei University <120> Vaccine composition for preventing meningococcal disease <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cagcttgatt ttccttgtcc tta 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gtgcacaccg ctggacaggg atcc 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gacattcagc tgacccagtc tcca 24 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tggtgggaag atgg 14 <210> 5 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of Naid60 VH <400> 5 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Leu Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Phe Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Lys Gly Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr 115 <210> 6 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of Naid60 VL <400> 6 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 100 <210> 7 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of Naid60 VH <400> 7 gaagtgaagt tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcaa cctctggatt ccttttcact gactattaca tgttttgggt tcgccagact 120 ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatac attagtaatg gtggtggtga cacctattat 180 ccagacactg taaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa cgccctgtac 240 ctgcaaatga gccgtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagacataag 300 ggctactatg gatattacta tgctttggac tactggggtc aaggaacc 348 <210> 8 <211> 309 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of Naid60 VL <400> 8 gacattcagc tgacccagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagcgtcagt 60 ctttcctgca gggccagcca aagtattagc aacaacctac actggtatca acaaaaatca 120 catgagtctc caaggcttct catcaagtat gcttcccagt ccatctctgg gatcccctcc 180 aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctca gtatcaacag tgtggagact 240 gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag agtaacaact ggcctctcac gttcggtgct 300 gggaccaag 309

Claims

삭제
서열번호 5로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 6으로 표시되는 경쇄 가변부위의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, NMGB(Neisseria meningitidis serogroup B)의 단클론 항체 HmenB3에 대한 항-이디오타입 항체.
삭제
기탁번호 KCTC10228BP인 것을 특징으로 하는, 제2항의 항-이디오타입 항체를 생산하는 하이브리도마.
삭제
서열번호 7로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 8로 표시되는 경쇄 가변부위의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 제2항의 항-이디오타입 항체를 암호화하는 DNA 서열.
제2항의 항-이디오타입 항체 및 약제학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 혈청 그룹 B 수막염균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물.