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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induktion der Immunreaktion
eines Individuums gegen B-lymphoproliferative Störungen, wobei das Verfahren
auf einer DNA-Impfung mit dem kurzen Peptid, das die hypervariable
CDR3-Region der schweren Immunoglobulinkette (VH-CDR3) allein oder
in Kombination mit mindestens einer weiteren immunomodulierenden
Sequenz umfasst.
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Hintergrund der Erfindung
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B-Zelllymphome
sind Neoplasmen von reifen Lymphozyten, die im allgemeinen Immunoglobulin
(Ig) auf der Zelloberfläche
exprimieren. Die Igs sind klonspezifisch und die variablen Regionen
enthalten Determinanten, die selbst als Antigene oder Idiotope erkannt
werden können.
Das idiotypische Ig stellt daher ein einziges tumorspezifisches
Antigen dar (Y. J. Wen et al., Eur. J. Immunol., Bd. 27 (1997),
S. 1043–1047).
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Herkömmliche
Behandlungen, wie eine Chemotherapie und Strahlungstherapie, können jeweils
eine Remission bei Patienten mit Nicht-Hodgkin-Lymphom (NHL) von geringer Intensität herbeiführen. Jedoch kommt
es trotz dieser Reaktion auf die Behandlung bei einem Großteil der
Patienten letztlich zu Rückfällen, so dass
diese Patienten mit diesen üblichen
Therapien nicht behandelt werden können und ihre Langzeitperspektive
schlecht bleibt.
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Es
ist wahrscheinlich, dass die Krankheit im wesentlichen unheilbar
ist, ausgenommen möglicherweise
durch eine allogene Knochenmarktransplantation. Da die Anzahl von
Patienten, die für
eine derartige therapeutische Möglichkeit
geeignet sind, äußerst gering
ist, benötigt
man alternative Behandlungsverfahren. Ein attraktiver Weg bestünde darin,
die Fähigkeit
des Immunsystems zur Erkennung und Beseitigung von neoplastischen
Zellen unter Aussparung von normalen Zellen hervorzurufen.
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B-Zelllymphome
stellen ideale Modelle für
eine experimentelle Tumor-Immunotherapie dar. Tatsächlich stellen
die Ig-Idiotypen, die sich auf ihrer Zelloberfläche zeigen, attraktive tumorale
Antigene dar, da sie tumorspezifisch sind, zu einer bekannten Familie
von Molekülen
gehören
und gezeigt worden ist, dass auch für eigene Igs eine für den Ideotyp
spezifische Immunreaktion erhalten werden kann. Jedoch ist die Wirksamkeit
der antiidiotypischen Impfung vermutlich bei einigen Histotypen
größer als
bei anderen. Es ist zu erwarten, dass B-Zelllymphome von geringer Intensität sowie
solche mit einem geringfügig
lymphozytischen oder follikulären
Histotyp ideale Ziele darstellen, da sie i) im allgemeinen ein träges Verhalten
zeigen und schwer zu beseitigen sind; ii) einen sehr geringen Grad
der klonalen Entwicklung aufweisen; iii) Oberflächen-Igs in hohen Konzentrationen
exprimieren; und iiii) keine Oberflächen-Immunoglobuline sezernieren.
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Auf
der anderen Seite wird erwartet, dass eine antiidiotypische Impfung
gegen Lymphoblastoide und andere hochgradige Lymphome, die keine
Immunoglobuline an der Oberfläche
exprimieren, weniger wirksam ist. Außerdem sind diese Typen sehr
aggressiv und zeigen einen hohen Grad an klonaler Entwicklung (30–40%).
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Obgleich
der herkömmliche
Weg zur Immunisierung, d. h. eine subkutane Immunisierung mit dem
vollständigen
Immunoglobulin durch B-Zelllymphom
im Gemisch mit einem Adjuvans, sich als wirksam sowohl bei experimentellen
Modellen (George et al., J. Immunol., Bd. 138 (1988), S. 2168–2174) als
auch bei kontrollierten klinischen Studien (Kwak et al., N. Engl.
J. Med., Bd. 327 (1992), S. 1209–1215) erwiesen hat, wurde
dieser Weg durch die Notwendigkeit an großen Mengen an gereinigtem Protein,
die sich nicht in jedem Fall herstellen und zertifizieren lassen,
behindert.
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Mehrere
Berichte haben gezeigt, dass sich die immunodominanten Epitope des
für Ig
spezifischen Klons innerhalb der hypervariablen Regionen und hauptsächlich innerhalb
der dritten komplementaritätsbestimmenden
Region der schweren Immunoglobulinkette (VH-CDR3) befinden (Campbell
et al., J. Immunol., Bd. 139 (1987), S. 2825–2833; Watanabe et al., J.
Immunol., Bd. 151 (1993), S. 2871–2876). Ferner lassen zahlreiche
Beobachtungen darauf schließen,
dass eine Immunisierung mit dem vollständigen Protein in einigen Fällen eine
Antikörperreaktion
hervorrufen kann, die auf kurze lineare Epitope beschränkt und
daher ungeeignet ist, da die dreidimensionale Struktur des Proteins
selbst nicht erkannt wird (Kawaguchi et al., J. Biol. Chem., Bd.
264 (1989), S. 5762–5767).
Umgekehrt kann eine Immunisierung mit kurzen Peptiden (8–20 Aminosäurereste
lang) zur Bildung von Antikörpern
führen,
die das entsprechende lineare Epitop an einem Protein erkennen,
ohne dass eine Konjugation mit Trägern erforderlich ist, vorausgesetzt,
dass sich das kurze Peptid wie ein vollständiges Antigen verhält (d. h.
Sequenzen enthält,
die zur Bindung an Klasse II-MHC-Moleküle und zum Eingreifen in den
T-Zellrezeptor befähigt
sind).
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Tatsächlich wurde
nachgewiesen, dass ein kurzes Peptid, das die VH-CDR3-Region eines
humanen, lymphomspezifischen IgM umfasste, zur Förderung der in vitro-Proliferation
von spezifischen CD4+- und CD8+-Zellen fähig war, die die autologen
Lymphomzellen lysieren können
(Wen et al., Eur. J. Immunol., Bd. 27 (1997), S. 1043–1047).
Die klinische Bedeutung dieser in vitro- Ergebnisse wurde durch die spezifische
Immunreaktion bestätigt,
die bei einem Patienten im Anschluss an eine Impfung mit dem Peptid
erreicht wurde (Wen et al., Br. J. Haematol., Bd. 103 (1998), S.
663–668).
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Die
Entwicklung des Impfverfahrens mittels direkter Injektion von bloßer DNA
auf intramuskulärem oder
subkutanem Wege hat in Kombination mit der Fähigkeit zur leichten Identifizierung
und Klonierung individueller, tumorspezifischer Idiotypen die Chancen,
diese Tumorantigene auszunützen,
verbessert. Dieser Weg hat sich bereits beim Induzieren von Immunreaktionen
gegen mehrere Antigene, hauptsächlich
viralen Ursprungs, als wirksam erwiesen und er wurde auf die Therapie
von experimentellen, murinen Lymphomen angewandt, wo das Ig, das
das Lymphom charakterisiert, für
die Immunotherapie des parentalen Tumors über eine DNA-basierte Impfung
herangezogen wurde (Hawkins et al., Blood, Bd. 83 (1994), S. 3279–3288; V.
M. Fazio, Res. Virol., Bd. 148 (1997), S. 101–108; Stevenson et al., Immunol.
Rev., Bd. 145 (1995), S. 211–228). Ein
derartiges Verfahren hat sich bei der Herbeiführung von antiidiotypischen,
spezifischen Immunreaktionen als wirksam erwiesen, wenn vollständiges Ig
oder dessen variable Regionen, die gentechnisch so bearbeitet worden
waren, dass sie fremdes Ig (Syringelas et al., Nature Med., Bd.
2 (1996), S. 1038–1041),
keimartige leichte Ketten (Watanabe et al., J. Immunol., Bd. 151
(1993), S. 2871–2876)
oder Toxin-Fusionsprotein (King et al., Nature Med., Bd. 11 (1998),
S. 1281–1286)
exprimierten, als kodiertes Antigen verwendet wurden.
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Dennoch
wäre bei Übertragung
dieser Technik auf die klinische Praxis eine so zeitaufwändige Bearbeitung
für jeden
einzelnen Patienten erforderlich, dass dieser Weg zur Durchführung auf
einer regelmäßigen klinischen
Basis zu teuer käme.
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Ein
wirksames und billiges, auf DNA basierendes Verfahren zur Herbeiführung einer
Immunreaktion gegen B-lymphoproliferative Störungen wäre erstrebenswert, insbesondere
wenn man berücksichtigt,
dass gereinigte, doppelsträngige
DNA selbst nicht immunogen ist (S. E. Parker, F. Borellini et al.,
Hum. Gene Ther., Bd. 10 (5) (1999), S. 741–758). Außerdem würde bei Berücksichtigung der Tatsache,
dass die berechnete Mutationsrate 3000-fach kleiner als die spontane
Mutationsrate für
Säugetiergenome
ist, der Grad der Integration, wenn diese erfolgen sollte, kein
ernsthaftes Sicherheitsproblem darstellen (T. Martin, S. E. Parker
et al., Hum. Gene Ther., Bd. 10 (5), S. 759–768).
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Beschreibung der Erfindung
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Es
wurde nunmehr überraschenderweise
festgestellt, dass sich eine wirksame, sichere und leicht reproduzierbare
Immunreaktion auf DNA-Basis gegen B-lymphoproliferative pathologische
Zustände
erreichen lässt,
indem man dem Patienten ein Plasmid verabreicht, das eine DNA-Sequenz
enthält,
das im wesentlichen für
ein kurzes Peptid kodiert, das die hypervariable Region der idiotypischen,
schweren Immunoglobulinkette (VH-CDR3) umfasst.
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Ferner
wurde festgestellt, dass ein Multigen-Expressionsvektor, dessen
Haupteigenschaft im gemeinsamen Vorliegen von zwei verschiedenen,
vollständigen
und differenziell regulierten Transkriptionseinheiten besteht, was
die Coexpression eines immunoregulatorischen Moleküls, vorzugsweise
von humanem Interleukin-2 (IL2), und der hypervariablen CDR3-Region
der idiotypischen schweren Imnunoglobulinkette ermöglicht, in
erheblichem Maße
die vorerwähnte
Immunreaktion verstärkt.
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Das
hauptsächliche
Ziel der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Verwendung
der DNA-Sequenz, die für
die hypervariable Region (VH-CDR3) der an B-Zellen von chronischen,
B-lymphoproliferativen Störungen
exprimierten, idiotypischen Immunoglobulins kodiert, als Impfstoff
(oder zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung), wobei der
Impfstoff gegen chronische, B-lymphoproliferative
Störungen,
die das idiotypische Oberflächenimmunoglobulin
bei Säugern
exprimieren, wirksam ist.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung kodiert diese DNA-Sequenz für Peptide mit einer Länge von
0–45 Aminosäuren und
vorzugsweise von 7–45
Aminosäuren.
Diese DNA-Sequenz befindet sich zwischen eFW3- und eJH-Sequenzen
und entspricht der VH-CDR3-Sequenz.
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Ein
zweites Ziel der Erfindung besteht in einem rekombinanten Plasmid-Expressionsvektor,
der sich für
die Expression einer DNA-Sequenz in einem Säuger eignet und eine damit
funktionell verknüpfte
DNA-Sequenz enthält,
wobei der Vektor dadurch gekennzeichnet ist, dass diese DNA-Sequenz
im wesentlichen aus der hypervariablen Region (VH-CDR3) des an B-Zellen
von chronischen, B-lymphoproliferativen Störungen bei einem Säuger exprimierten,
idiotypischen Immunoglobulins besteht. Wie vorstehend angegeben,
weist eine derartige Sequenz üblicherweise
7–45 Aminosäuren auf.
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Das
Plasmid, das für
die erfindungsgemäßen Zwecke
verwendet werden kann, kann aus multigenen Vektoren ausgewählt werden,
die zwei verschiedene Transkriptionskassetten, die von zwei unabhängigen Promotoren,
vorzugsweise CMV- und RSV-Promotoren/Enhancern, gesteuert werden,
beinhalten und die Coexpression eines Cytokins oder eines Immunotoxins,
wie humanes IL-2, GM-CSF oder IL-6, zusammen mit einem spezifischen
Antigen, nämlich
dem individuellen VH-CDR3-Peptid, ermöglichen.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung kodiert dieser rekombinante Plasmid-Expressionsvektor auch
für ein
immunomodulatorisches Molekül,
das beispielsweise aus IL-2, GM-CSF, IL-12 oder IL-6 ausgewählt sein
kann, oder für
ein Fragment aus bakteriellen Immunotoxinen, wie Tetanus-Toxin.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung besteht diese DNA-Sequenz aus (a) dem Gen, das für die hypervariable
Region (VH-CDR3) des idiotypischen Immunoglobulins kodiert, das
an B-Zellen von chronischen, B-lymphoproliferativen
Störungen
exprimiert wird, und (b) strangaufwärtigen und strangabwärtigen PCR-Primern,
wobei es sich vorzugsweise beim strangaufwärtigen PCR-Primer um eFW3 und
beim strangabwärtigen
PCR-Primer um eJH handelt.
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Ein
drittes Ziel der Erfindung besteht in einer Impfstoffzusammensetzung,
die einen derartigen rekombinanten Plasmid-Expressionsvektor enthält, wobei
die Impfstoffzusammensetzung vorzugsweise in einer Form vorliegt,
die sich für
die parenterale Verabreichung und insbesondere für die intramuskuläre Verabreichung
eignet, z. B. in Form einer Lösung
in Wasser.
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Die
Untersuchung, die die vorliegende Erfindung ermöglichte, beschäftigte sich
mit der Frage, ob verschiedene kurze Peptide, die die hypervariable
VH-CDR3-Region des Lymphom/Leukämie-Oberflächen-Immunoglobulins mit üblicherweise
(ohne Beschränkung
hierauf) 7–45
Aminosäuren,
die durch direkte intramuskuläre
Injektion der entsprechenden Minigene exprimiert werden, in wirksamer
Weise dem Immunsystem einer verschiedenen "Outbred"-Maus (outbred = aus der Kreuzung entfernt
verwandter oder nicht zuchtverwandter Individuen hervorgegangen)
präsentiert
werden kann, um Antikörper
zu erzeugen, die zur Reaktion mit Tumorzellen des Patienten, bei
denen das spezifische idiotypische Protein exponiert ist, befähigt sind.
Es wurde festgestellt, dass das xenogene "Outbred"-Mäusemodell
die MHC-1-Variabilität
nachahmt, die in einem klinischen Ansatz vorliegt, ohne humane Subjekte
zu immunisieren.
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Die
Beschränkung
auf die individuelle CDR3-Region schloss xenogene oder allogene
Epitope, die in der variablen sowie in der konstanten Region des
idiotypischen Immunoglobulins enthalten waren, aus, was den Sicherheitsrahmen
stark erhöht,
wenn dieser Weg in einem syngenen Kontext übertragen wird.
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Ein
Doppelgen-Plasmidvektor für
die Coexpression der spezifischen, individuellen CDR3-Sequenzen und
eines immunomodulierenden Cytokins, d. h. IL-2, wurde als Träger für die intramuskuläre Injektion
verwendet.
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Es
wurde angenommen, dass ein derartiger Vektor die Sicherheit verbessert,
indem die Expression des Cytokins mit der Expression des fremden Antigens
in den gleichen Zellen verknüpft
wird. Diese Strategie gewährleistet
tatsächlich
die Erzeugung des immunomodulierenden Moleküls nur bei Bedarf, d. h. sofern
das fremde Antigen selbst erzeugt wird. Es wurde als unwahrscheinlich
angenommen, dass es unwahrscheinlich ist, dass T-Zellen, die auf
ein Protein (IL2) reagieren, das an sämtlichen Immunreaktionen beteiligt
ist und jedes Mal, wenn T-Zellen aktiviert werden, in hoher Konzentration
vorhanden ist, die Toleranzinduktion überleben könnten.
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Tatsächlich gab
es nach unserer Kenntnis nur einen einzigen Bericht, der die Möglichkeit
zur Induktion von anti-IL-2-Antikörpern in Mäusen zeigt, wobei aber das
Verfahren die Immunisierung mit einer Form des IL-2 erforderlich
macht, die verkürzt
war und eine Aminosäuresubstitution
enthielt (Matesanz et al., Autoimmunity, Bd. 12 (1999), S. 221–227).
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Es
wurde somit festgestellt, dass bis zu 60% von Outbred-Tieren, denen
jeweils VH-CDR3/IL2-coexprimierende Plasmidvektoren injiziert worden
waren, eine signifikante, rasche Immunreaktion entwickelten, die mindestens
19 Wochen nach der ersten DNA-Injektion anhielt. Die Anzahl der
reagierenden Tiere nahm in Abwesenheit der IL2-Costimulation auf
bis zu 20% ab. Noch wichtiger ist, dass sämtliche VH-CDR3-immunen Tiere
eine Antikörperreaktion
entwickelten, die zur Erkennung des gesamten idiotypischen Immunoglobulins, das
an den Lymphom/Leukämie-Zellen
von Patienten exponiert ist, befähigt
waren, wie durch FACS-Analyse nachgewiesen wurde.
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Es
wurde keine Kreuzreaktivität
festgestellt, wenn Immunseren von jedem VH-CDR3 mit Tumorzellen anderer
Patienten behandelt wurden. Eine mögliche Erklärung für diese Ergebnisse besteht
darin, dass die DNA-Impfung durch lineare, kurze VH-CDR3-Peptide
die Erzeugung von Antikörpern
induzieren kann, die spezifische lineare Epitope am gefalteten idiotypischen
Immunoglobulin identifizieren.
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Der
derzeit angenommene Mechanismus der DNA-Impfung durch intramuskuläre Plasmidinjektion geht
davon aus, dass das Priming von vom Knochenmark abgeleiteten, ein
Antigen präsentierenden
Zellen (APC) vorgenommen wird, die bei der Bereitstellung sämtlicher
für das
Priming der T-Zellen
notwendigen Signale wirksam sind. Die Muskelzellen nehmen am Immunisierungsmechanismus
als ein Reservoir für
das Antigen und ein anhaltender Immunstimulus teil, und zwar aufgrund
der Langzeitstabilität
von Muskelfasern und der Transgenexpression. Das Verfahren der DNA-Impfung
und die Form des DNA-exprimierten Antigens lenken möglicherweise
die T-Zell-Hilfe vorwiegend auf den Typ 1 oder Typ 2.
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Das
vorgeschlagene experimentelle Modell umfasst die intramuskuläre Injektion
und nicht-sezernierte Peptide, die die Reaktion zum Thl-Weg dirigieren können. Außerdem kann
die IL2-Expression durch Verstärkung
der T-zellvermittelten Immunreaktion und durch Verbesserung der
antigenspezifischen T-Zellproliferation wirken sowie durch Differenzierung
und Ig-Sekretion von antigenaktivierten B-Zellen.
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In
diesem Zusammenhang kann die Antikörperreaktion durch B-Zellstimulation erzeugt
werden, die durch Peptide erreicht wird, die aus Muskelzellen während einer
immunvermittelten Zerstörung
von transfizierten Muskelfasern freigesetzt werden.
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Mehrere
Berichte stellten die Theorie auf, dass der Schutzmechanismus gegen
ein Lymphom von geringer Intensität durch Antikörper vermittelt
seijn kann (Dyke et al., Cell. Immunol., Bd. 132 (1991), S. 70–83), möglicherweise
aufgrund der direkten Induktion der Apoptose (Vitetta et al., Blood,
Bd. 89 (1997), S. 4425–4436).
Ganz neue experimentelle Daten bestätigten, dass Tumorschutzwirkungen
einer DNA-Impfung hauptsächlich
einer idiotypspezifischen humoralen Immunität zuzuschreiben sind (Syrengelas
et al., J. Immunol., Bd. 1162 (1999), S. 4790–4795), und in noch überzeugenderer
Weise wurde eine verlängerte Überlebenszeit
bei einer klinischen Untersuchung mit der Induktion von antiidiotypischen
Antikörperreaktionen
in Zusammenhang gebracht.
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Jedoch
wird die Natur einer schützenden
Immunreaktion bei bereits manifesten B-Zelllymphomen von geringer
Intensität
noch diskutiert, und andere Studien sprechen für eine Korrelation zwischen
der zellvermittelten Zytotoxizität
und der therapeutischen Reaktion (Nelson et al., Blood, Bd. 88 (1996),
S. 580–589).
Bei diesem experimentellen "outbred"-Modell werden die
idiotypischen Peptide weder sezerniert noch intravenös injiziert,
sondern direkt ohne spezifische Signale (d. h. eine Leadersequenz
für die
Sekretion) in in vivo-transfizierten Zellen in Kombination mit rekombinanter
IL2-Expression erzeugt.
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Dieser
Mechanismus garantiert möglicherweise
eine Antikörpererzeugung
und eine zytotoxische Reaktion ohne die Behinderung, die mit der
Bindung antiidiotypischer VH-CDR3-Antikörper an das sezernierte Peptid
oder den injizierten Peptid-Impfstoff verbunden ist.
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Selbst
wenn die VH-CDR3-Region des idiotypischen Immunoglobulins äußerst variabel
und daher höchstwahrscheinlich
für dieses
Protein einzigartig ist, sind die meisten somatischen Mutationen,
die sich unter dem Immundruck entwickeln können, in CDR1-, CDR2- und Gerüst 3 (FR3)-Regionen des idiotypischen
Proteins zusammengeballt (C. Berek, C. Milstein, Immunol. Rev.,
Bd. 96 (1987), S. 23–41).
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Aufgrund
der einfachen Identifizierung neuer idiotypischer VH-CDR3-Varianten sowie aufgrund
der raschen Klonierung und Herstellung von DNA-Impfstoffpräparaten von klinischer Qualität kann das
vorgeschlagene Verfahren jedenfalls bei der Nachsorge des behandelten
Patienten wieder angewandt werden.
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Infolgedessen
können
die durch bloße
DNA-Immunisierung in einem Outbred-Tiermodell erzeugten Immunreaktionen
die potentielle Immunogenizität
und einen großen
Sicherheitsrahmen der VH-CDR3-Minigen-kodierten Peptide beweisen
und die Grundlage für
die Impfung humaner Patienten, die von einer B-lymphoproliferativen Krankheit betroffen
sind, darstellen. Dieser Weg vermeidet in der Tat die xenogenen
oder allogenen Epitope, die in der variablen sowie in der konstanten
Region des idiotypischen Immunoglobulins enthalten sind, was den
Sicherheitsrahmen dieser molekularen Vorgehensweise erhöht.
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Außerdem kann
das xenogene experimentelle "outbred"-Modell in engerer
Weise die Lage beim Patienten und die Variabilität der Immunreaktion reproduzieren,
da es die MHC-1-Variabilität
imitiert, die bei einem klinischen Zustand ohne direkte Immunisierung
von humanen Subjekten gegeben ist,
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Erfindungsgemäß ist es
nunmehr möglich,
Menschen, die von B-lymphoproliferativen
Störungen
betroffen sind, zu impfen, indem man (i) die DNA-Sequenz des Patienten, die für die hypervariable
Region (VH-CDR3) des an B-Zellen
exprimierten idiotypischen Immunoglobulins kodiert, isoliert; (ii)
diese Sequenz in das vorerwähnte
Expressionsplasmid kloniert; und (iii) das auf diese Weise erhaltene
rekombinante Expressionsplasmid dem Patienten vorzugsweise durch
intramuskuläre
Injektion verabreicht.
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Diese
und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung gehen klarer aus
dem folgenden experimentellen Teil hervor, dessen Zweck es ist,
die Erfindung zu erläutern,
ohne deren Anwendungsgebiet zu beschränken.
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Legende
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Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen
verwendet: CDR3, komplementaritätsbestimmende
Region 3; Ig, Immunoglobulin; VH, variable schwere Immunoglobulinkette; mIL2,
Mäuse-Interleukin-2; FRW,
Gerüst;
GM-CSF, Granulozyten-Makrophagen-Kolonienbildungsfaktor; WBC,
weiße
Blutkörperchen.
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1: Überblick über die
experimentelle Strategie. Die molekulare Gewinnung von VH-CDR3-Sequenzen
wurde aus Tumor B-Zellen von Patienten mit unterschiedlichen chronischen
lymphoproliferativen Störungen
vorgenommen. Amplifizierte Sequenzen wurden in einen multigenen
Säugetiervektor
(pRC111) kloniert, der in unabhängiger
Weise Interleukin-2 und tumorspezifische VH-CDR3- Sequenzen koexprimiert. pRC111-Vektoren
mit einem Gehalt an klonierten VH-CDR3-Sequenzen wurden in "Outbred"-Mäuse injiziert. Seren,
die zu verschiedenen Zeitpunkten nach der DNA-Injektion erhalten
worden waren, wurden mit den ursprünglichen Tumor B-Zellen der
Patienten behandelt und durch FACS-Analyse getestet.
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2:
Nucleotidsequenz (untere Reihe) und abgeleitete Aminosäuresequenz
(obere Reihe) von cDNA, die für
humane, schwere Ketten-CDR3-variablen
Regionen von 3 verschiedenen Patienten kodieren. Fettdruck: Teil
der Primersequenzen; graues Kästchen:
abgeleitete CDR3-Sequenz.
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3:
Halbquantitative RT-PCR-Analyse der mIL2-Transkription in Muskeln
von Mäusen
mit pRC111-PA-Injektion. Die Ergebnisse werden unter Verwendung
von 500, 50 und 5 ng der gesamten RNA, die aus vier Tieren (mit
den Bezeichnungen 1, 2, 3 und 4) 1 Woche nach der Injektion erhalten
worden war. Mäuse-beta-Actin
(βAct)-
und Mäuse-IL2-Sequenzen
wurde gemäß den Angaben
im Text amplifiziert. Positive Proben zeigen ein mIL2-spezifisches
158 bp-amplifiziertes Fragment. C2 und C4 (PA 2- bzw. PA 4-kontralaterale Muskeln)
erhielten eine Injektion mit leerem pRC100-Plasmidvektor (negative
Kontrolle). Erste Linie: Molekulargewichtsmarker (162 und 79 bp). β-act: Mäuse-beta-Actin-spezifisches
154 bp-amplifiziertes Fragment.
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4:
Reaktivität
von Antikörpern,
induziert durch einen DNA-Impfstoff
mit einem Gehalt an der VH-CDR3-Region von Patient PA mit Patienten-Tumorzellen, bestimmt
durch Fluoreszenzaktivator-Zellsortierung (FACS). Das Serum (1:50
verdünnt)
von Mäusen,
die mit pRC111-PA immunisiert worden waren, wurde mit deren Zieltumorzellen
(PA682) (A, B) oder mit Tumorzellen von Patient BA (C) inkubiert.
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Das
Kontrollserum stammte von den gleichen Mäusen mit vorheriger Injektion.
Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen und gebundene Antikörper wurden
durch FITC-konjugiertes Ziegen-anti-Mäuse-Serum unter Anwendung einer
FACS-Abtastung nachgewiesen. Die Ergebnisse einer repräsentativen
Probe (PA) sind als Peak-Präsentationen
dargestellt, die mit (A) Präimmunserum
und (B) Immunserum (6 Wochen nach pRC111-PA-Injektion) erhalten
worden sind. Der interne Kontrollpeak (B) zeigt die Basislinienreaktivität beim Nachweis
von Ziegen-Fluoreszenz-anti-Maus-Antikörper allein. C: FACS-Analyse von pRC111-PA-Antiserum
bei Behandlung mit BA-Tumorzellen.
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Beispiel 1
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Molekulare Gewinnung von
VH-CDR3-Sequenzen von Patienten-Tumor
B-Zellen von chronischen lymphoproliferativen Störungen
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Das
Ziel dieser Studie bestand darin, den Nachweis der Wirksamkeit der
kurzen hypervariablen Region (VH-CDR3) des idiotypischen Immunoglobulins,
das an B-Zellen von chronischen B-lymphoproliferativen Störungen exprimiert
wird, zu erbringen, was eine rasche Klonierung und spezifische Reaktion
durch bloße DNA-Immunisierung
erlaubt.
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Zwei
EBV-transformierte Zelllinien (AS283A und PA682), die sich von Zellen
von zwei Nicht-Hodgkin-B-Lymphom-Patienten ableiteten, und eine
eingefrorene periphere Blutprobe eines Patienten mit Haarzellen-Leukämie (BA)
wurden als Quellen für
CDR3-Sequenzen verwendet.
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Der
WBC-Wert bei Bestimmung im peripheren Blut des HCL-V-Patienten war sehr
hoch (130000/mm3) und der prozentuale Anteil
der Leukämiezellen
war größer als
95%. Bei den Zelllinien, die als Quellenmaterial für die CDR3-Sequenzen
verwendet wurden, handelte es sich um klonale Zellen, deren Herkunft
von primären Lymphomen
der Patienten früher
festgestellt worden war (Gaidano et al., "In vitro establishment of AIDS-related
lymphoma cell lines: phenotypic characterization, oncogene and tumor
suppressor gene lesions and heterogeneity in Epstein-Barr virus
infection", Leukemia,
Bd. 7 (1993), S. 1621–1629).
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Die
Identität
ihrer CDR3-Regionen mit den für
die DNA-Impfung verwendeten Sequenzen wurde festgestellt, indem
man die Sequenz der amplifizierten Fragmente, die aus den Tumorzellen
erhalten worden waren, mit der Sequenz der Plasmide, die für die Impfung
verwendet wurden, verglich (vergl. die nachstehenden Ausführungen).
Die gleichen Zellen wurden auch zur Bestimmung der Anwesenheit von
Antikörpern,
die mit den Idiotypen in behandelten Mäusen reaktiv waren, verwendet
(vergl. die nachstehenden Ausführungen).
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Die
gesamte RNA wurde aus Patientenzellen gereinigt und cDNA wurde unter
Verwendung von willkürlichen
Hexameren präpariert.
Die Amplifikation wurde in zwei Stufen gemäß den Angaben in Beispiel 2 durchgeführt. Die
Verwendung von RNA und ein zweistufiges PCR-Verfahren ermöglichten
eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität der erhaltenen Produkte.
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Amplifizierte
variable Regionen und CDR3s wurden an einem 2%-SeaKem-Agarosegel (FMC, Rockland, ME)
analysiert. Banden wurden mit einem QIAEX-Gelextraktionskit (Qiagen
Inc., GmbH) gemäß den Anweisungen
des Herstellers gereinigt. Die gereinigten VHCDR3-cDNAs wurden direkt
in die NheI/NotI-Stellen einer transkriptionalen Kassette von pRC100-bezogenen
Plasmidvektoren kloniert, und zwar mit (pRC111) oder ohne (pRC101)
Mäuse-IL2 (mIL2)-cDNA in
der zweiten transkriptionalen Kassette (Tabelle 1) (Ciafrè et al.,
Plasmid, Bd. 40 (1998), S. 84–89).
cDNA-Fragmente wurden anschließend durch
das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren unter Verwendung von T7-DNA-Polymerase (Sequenase,
Version 2.0, USB) sequenziert.
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Plasmid-DNA
wurde durch das Qiagen Plasmid Mega Kit (Kat. Nr. 12181) gemäß den Angaben
des Herstellers gereinigt, um die Verwendung eines Mutagens (Ethidiumbromid)
oder eines CsCl-Gradienten zu vermeiden, die beide im üblichen
Verfahren für
die Plasmidreinigung eingesetzt werden. Das DNA-Plasmid wurde in einer Menge von 1,2 μg/μl in steriler
225 mM NaCl-Lösung
(1,5 × normale
Kochsalzlösung)
resuspendiert.
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Diese
multigenen Vektoren beinhalten zwei verschiedene Transkriptionskassetten,
die durch zwei unabhängige
Promotoren (CMV- und RSV-Promotoren/Enhancer) gesteuert werden und
ermöglichen
die Coexpression von einem Cytokin, humanem IL2 oder GM-CSF oder
einem Toxin zusammen mit einem spezifischen Antigen, dem individuellen
VH-CDR3-Peptid (pRC111) (1).
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Tabelle
1 DNA-Immunisierungskonstrukte,
kodierte antigene Proteine und Immunmodulator
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Abkürzungen:
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- RSV = Rous-Sarcomavirus-LTR-Promotor/Enhancer; VH-CDR3 =
komplementaritätsbestimmende
Region 3 der variablen schweren Immunoglobulinkette; HCL = Haarzellen-Leukämie; NHL
= Nicht-Hodgkin-B-Zelllymphom;
BA/PA/AS = Patienten-CDR3-Quellen; CMV = Zytomegalovirus-Promotor/Enhancer;
mIL2 = murines Interleukin 2; N = keines; HCV = Hepatitis C-Virus; NS3 = HCV-nicht-strukturelles
Protein 3, 4403–4829-Fragment
-
Beispiel 2
-
VH-CDR3-Amplifikation
-
Die
Amplifikation wurde in zwei Stufen durchgeführt, wobei die folgenden familienspezifischen PCR-Primer
für die
humane schwere Ketten-CDR3-variable
Region verwendet wurden:
- A) Erste Stufe: Strangaufwärts: VH1-3-5-7. 5'-(C,G)AG GTG CAG CTG GTG (C,G)AG TCT-3'; VH2-5'-CAG (G,A)TC ACC
TTG AAG GAG TCT-3';
VH4 5'-CAG
GTG CAG CTG CAG GAG TCG-3';
VH6 5'-CAG
GTA CAG CTG CAG CAG TCA-3'.
Strangabwärts:
RHmu 5'-CAC GCT GCT CGT ATC
CGA CGG-3'. Strangaufwärtige Primer
wurden abgeleitet gemäß Deane
et al., Brit. J. Haematol., Bd. 77 (1991), S. 274–281. Der strangabwärtige Primer
RHmu wurde so konzipiert, dass er sich an den 5'-Terminus
der konstanten Region mu der humanen schweren Kette anlagert.
- B) Zweite Stufe: Strangaufwärts:
(eFR3-abgeleitetes) eFW3 5'-TTT G/CTAGC ATG CAC ACG GC(C,T) (G,C)TG
TAT TAC TGT-3'.
Strangabwärts:
(eLJH-abgeleitetes) eJH 5'-TAT GC/GGCCGC TTA TTA TGA GGA
GAC GGT GAC C-3'.
Strangaufwärtige
und strangabwärtige
Primer für
die PCR der zweiten Stufe wurden gemäß Ramasamy et al., "Improved PCR method
for detecting monoclonal immunoglobulin heavy-chain rearrangement
in B-cell neoplasm".
J. Clin. Pathol., Bd. 45 (1992), S. 770–775, mit einigen Modifikationen
abgeleitet. Im Vergleich zur veröffentlichten
Sequenz ist die eJH-Annealing-Sequenz um 2 Nucleotide am 3'-Ende von eLJH länger und
die eFW3-Annealing-Sequenz ist um 1 Nucleotid am 5'-Ende von eFR3 länger, um
die Spezifität
und die PCR-Bedingungen
zu verbessern. Außerdem
umfassten beide Primer für
die zweite Stufe der PCR-Amplifikation Sequenzen für Restriktionsstellen
(eFW3: NheI; eJH: NotI) (unterstrichen), vorausgehend eine kurze
Sequenz (kursiv) zur Verstärkung
des enzymatischen Spaltungswirkungsgrads (Ausubel et al., Current
Protocols In Molecular Biology. New York, J. Wiley and Sons Inc., 1992).
Die Insertion der NheI- und NotI-Restriktionsstellen als 5'-"flushing"-Enden der Primer ermöglichte das
gerichtete Klonieren der amplifizierten cDNAs in einer transkriptionalen
Kassette des pRC110-Vektors (vergl. die nachstehenden Ausführungen).
-
RNA
wurde zunächst
aus Zelllinien und gefrorenen klinischen Proben gemäß den Angaben
von Chomczynski et al., Anal. Biochem., Bd. 162, (1987), S. 156–159, isoliert.
Die Synthese von cDNA wurde unter Verwendung eines Erststrang-cDNA-Synthesekits
(Perkin Elmer), von MuLV-reverser Transkriptase (Perkin Elmer) und
von willkürlichen
Hexameren in 20 μl
Endvolumen durchgeführt.
Folgende Reaktionsbedingungen wurden eingehalten: 23°C, 10 Minuten;
42°C, 45
Minuten und 99°C,
5 Minuten. RT-PCR wurde in einem Endvolumen von 100 μl mit 15
pmol eines jeden Primers, 50 μmol
Desoxynucleotidtriphosphat und 1 U AmpliTAQ (Perkin Elmer) durchgeführt. Erste
Amplifikationsstufe: 2 Minuten bei 96°C, gefolgt von 5 Zyklen bei
93°C für 1 Minute,
65°C für 30 Sekunden,
72°C für 30 Sekunden;
und 30 Zyklen bei 93°C
für 30
Sekunden, 65°C
für 30 Sekunden,
72°C für 30 Sekunden.
Die zweite Stufe sämtlicher
PCRs (verschachtelte PCR) wurde mit dem Warmstartverfahren durchgeführt. Folgende
Reaktionsbedingungen wurden eingehalten: 2 Minuten bei 96°C, gefolgt
von 10 Zyklen bei 93°C
für 30
Sekunden, 65°C
für 30
Sekunden, 72°C
für 15
Sekunden und 20 Zyklen von 15 Sekunden für jeden Denaturierungs-, Annealing-
und Polymerisationsvorgang.
-
Die
amplifizierten Fragmente wurden durch das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren
unter Verwendung von T7-DNA-Polymerase (Sequenase Version 2.0, USB)
sequenziert. Die CDR3-Regionen, die Anzahl der vorhandenen somatischen
Mutationen sowie die Keimliniensequenzen der Patienten, von denen
die Leukämie/Lymphom-Zellen
abgeleitet worden waren, wurden durch Vergleich der Sequenz der
amplifizierten Fragmente mit den am stärksten homologen Keimliniensequenzen
der IgV-Gene, die in den Genebank-Datenbanken der NCBI und im V-BASE-Sequenz-Verzeichnis
des MRC-Center for Protein Engineering (Cambridge, UK) vorhanden
sind, festgestellt. Folgende Softwarepakete wurden verwendet: das
BLAST-Programm und die Mac Vector 6.0.1-Software (Oxford Molecular
Group PLC, Oxford, UK).
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Beispiel 3
-
Tiere und Immunisierungsverfahren
-
Weibliche
Swiss-Mäuse
im Alter von etwa 8 Wochen wurden für die Immunisierung herangezogen. Blutproben
wurden durch Entnahme am Schwanz erhalten. Serum wurde für den anschließenden Test
bei –80°C aufbewahrt.
Die DNA-Injektion wurde in den Quadriceps-Muskel (intramuskuläre Injektion,
i. m.) unter Verwendung einer Einmal-Insulin-Spritze aus Kunststoff
und einer 29G × 1/2''-Nadel (Becton Dickinson, Ref. Nr. 324804.
mikrofein) durchgeführt.
Die experimentellen Gruppen erhielten i. m.-Injektionen von 80 μg pRC100-abgeleiteten Vektoren,
die entweder nur für
die CDR3-Region (pRC101) oder nur für mIL2 (pRC110) oder für beide
(pRCI111) kodierten (1 und Tabelle
1).
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Als
Kontrolle erhielten zwei weitere Gruppen von Mäusen bei gleicher experimenteller
Vorgehensweise Injektionen mit leerem Plasmid (pRC100) oder mit
pRC100-abgeleitetem Vektor, der für mIL2 und für ein nicht-strukturelles HCV-Antigen
(NS-3) (pRC112) kodierte. Zwei Injektionen wurden zu Beginn des
Experiments (T0) und drei Wochen nach der ersten Injektion (T3)
durchgeführt.
Die dritte Injektion erfolgte 6 oder 16 Wochen nach Beginn der Experimente
(T6 oder T16). Den Mäusen
wurde Blut am Tag vor jeder Injektion und zu folgenden Zeitpunkten
entnommen: T6, T9 und T19 (6, 9 bzw. 19 Wochen nach der ersten Injektion.
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Beispiel 4
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Anti-VH-CDR3-Antikörper-Nachweis
-
Die
Erzeugung von Antikörpern
durch behandelte Mäuse
wurde durch FACS-Analyse festgestellt, wobei die Seren auf die EBV-transformierten
B-Zelllinien (von
den Patienten PA und AS) oder auf die aufgetauten, peripheren, mononuklearen
Blutzellen (von Patient BA) abgestimmt waren, wonach sich eine Inkubation
mit Fluoreszein-konjugiertem (FITC) Ziegen-anti-Maus-Antiserum (Coulter
Clone, GAM-FITC) und ein Nachweis durch fluoreszenzaktivierte Fließzytometrie
(FACS) (Profile II FACS, Coulter) anschlossen. Sämtliche Färbungsstufen wurden in PBS,
das mit 5% FCS, 1% NHS und 0,1% NaN3 ergänzt war
(Färbemedium),
durchgeführt.
2 × 105 Zellen wurden 40 Minuten im Färbemedium
zur Verringerung von nicht-spezifischer Bindung inkubiert, wonach
eine erste Färbestufe
mit behandeltem Mäuseserum
in 1:50- oder 1:20-Verdünnung in
Färbemedium
mit einem Endvolumen von 100 μl
(30 Minuten auf Eis) folgte. Nach drei Waschvorgängen in Färbemedium wurden 105 Zellen
als eine interne Kontrolle (nur für PA und AS) zugesetzt und
die Zellen wurden einer zweiten Färbestufe mit 1:500-FITC-Ziegen-anti-Maus-Serum
in einem Endvolumen von 100 μl
unterworfen. Nach weiteren 30 Minuten wurden die Zellen gründlich gewaschen,
in Färbemedium
resuspendiert und einer Fluoreszenzablesung unter Anwendung einer
Profile II-FACS unterzogen.
-
Bei
Durchführung
unter Verwendung von Serumproben, die vor der ersten Immunisierung
(T0) erhalten worden waren, ergab die FACS-Analyse üblicherweise
nur einen einzigen Peak, bei dem sich die interne Kontrolle und
die doppelt gefärbten
Zellen überlappten.
Die Proben wurden als positiv in Bezug auf anti-CDR3-Antikörper ausgewählt, wenn
zwei Peaks beobachtet wurden: der erste Peak überlappte mit dem mit der T0-Probe
erhaltenen Peak und entsprach der internen Kontrolle (d. h. die
Zellen, die nach der Färbung
mit dem Immunserum zugesetzt wurden, üblicherweise 1/3 der gesamten
Zellen), während
der zweite Peak mit starker Fluoreszenz auf die Zellen zurückzuführen war,
die der Färbung
mit "Immun"-Serum unterzogen
worden waren (2/3 der gesamten Zellen). Ein durchschnittlich 5-fach
höherer
Fluoreszenz-Mittelwert für
den "Peak mit starker
Fluoreszenz" in
Bezug zur internen Kontrolle wurde als Schwellenwert einer positiven
Beschaffenheit in Bezug auf den antiidiotypischen Antikörper gewählt. Für jede individuelle
Maus wurden sämtliche
Proben (T0–T19)
gleichzeitig gemessen.
-
Die
Spezifität
der Immunreaktion, die sich gegen jede individuelle VH-CDR3-Sequenz
entwickelt hatte, wurde bewertet, indem Seren von jeder Gruppe von
Tieren mit Zellen der anderen Patienten abgestimmt und durch FACS mit
der gleichen technischen Vorgehensweise analysiert wurden (z. B.
Seren von pRCI11-PA-injizierten Mäusen wurden auf BA und AS-Zellen
abgestimmt).
-
Beispiel 5
-
IL2 wird an der Stelle
von Injektion von bloßer
DNA erzeugt.
-
In
einem Vorversuch erhielten 8 Swiss-Mäuse im Alter von 2 Monaten
eine intramuskuläre
(i. m.) Injektion sowohl von pRC111-PA-Vektor, der für Mäuse-IL2
und VH-CDR3 von Patient PA kodiert als auch von leerem pRC100-Plasmid in die kontralateralen
Muskeln gemäß den Angaben
in Beispiel 3. Die Transkription wurde an der Injektionsstelle durch
halbquantitative RT-PCR-Analyse
nach 2 Tagen und 1 Woche bewertet.
-
Gesamte
zelluläre
RNA wurde aus herausgeschnittenen Muskeln gemäß den Angaben von P. Chomezynski
et al., "Single
step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanato-phenol-chloroform
extraction", Anal.
Biochem., Bd. 162 (1987), S. 156–159) extrahiert. 500, 50 und
5 ng gesamte RNA wurden unter Verwendung von 500 ng oligo-(dT)-Primern
(GIBCO-BRL), 1 mM [dNTPs] (Promega), 10 U AMV-RT (Promega) und 20
U RNAsin (Promega) in einem Endvolumen von 20 μl revers transkribiert.
-
Folgende
Inkubationsbedingungen wurden eingehalten: 42°C für 45 Minuten und 99°C für 5 Minuten. Mäuse-β-Actin- und
Mäuse-IL2-Sequenzen
wurden unter Verwendung von jeweils 5 μl cDNA-Präparat, 1 U Taq-Polymerase (Promega),
2 mM MgCl2 (Promega), 200 μM [dNTPs],
20 pmol eines jeden Primers in 50 μl Endvolumen amplifiziert. Mäuse-β-Actin-Primer:
FW: TgAgg CTCTT TTCCA gCCT; RV: CTAgA AgCAC TTgCg gTgCA.
-
Mäuse-IL2-Primer:
FW: CACTT CAAgC TCTAC AgCgg A; RV: AAAAT TTgAA ggTgA gCATC C. Die Amplifikation
wurde in 38 Zyklen bei 94°C
für 1 Minute,
56°C für 1 Minute
und 72°C
für 1 Minute
durchgeführt.
-
3 zeigt
die mit 4 Tieren (mit den Bezeichnungen 1, 2, 3 und 4) erhaltenen
Ergebnisse 1 Woche nach Injektion von pRC111-PA in den linken Quadriceps-Muskel
bzw. von pRC100 in den kontralateralen Muskel (als C2 und C4 bezeichnet).
Eine IL2-Transkription wurde in sämtlichen Muskeln mit Injektion
von pRC111-PA, wenngleich auch in unterschiedlichem Ausmaß, nachgewiesen,
während
keine endogene IL2-Expression in den kontralateralen Muskeln mit
pRC100-Injektion nachgewiesen wurde. Die gleichen Ergebnisse wurden
2 Tage nach der Injektion (4 Tiere) erhalten.
-
Beispiel 6
-
Eine bloße DNA-Injektion
von pRC111-Vektoren, die für
das individuelle VH-CDR3 kodieren, führt zu einer Immunreaktion
gegen das an den Tumorzellen des Patienten exprimierte idiotypische
Ig.
-
Da
humane Subjekte, die möglicherweise
von diesem therapeutischen Weg profitieren, ein breites Spektrum
von MHC-Haplotypen aufweisen, wurden Swiss-Mäuse als Teststamm ausgewählt, aufgrund
der Tatsache, dass sie fremdeingekreuzt (outbred) sind und daher
eine Vielzahl von MHC-Haplotypen aufweisen.
-
Somit
erhielten Swiss-Mäuse
im Alter von 8 Wochen eine intramuskuläre Injektion von pRC101-PA (mIL2–)-
oder pRC111-PA (mIL2+)-Vektoren, in die VH-CDR3 des Patienten
PA kloniert war. Als Kontrollen erhielten drei Gruppen von Mäusen eine
Injektion entweder von pRC100 (CDR3–,
mIL2–-Vektor) oder pRC110 (CDR3–,
mIL2+-Vektor) (Ciafrè et al., "A plasmid family containing two different
expression cassettes suitable for immune modulation and genetic
vaccination", Plasmid,
Bd. 40 (1998), S. 84–89)
oder von pRC112 (kodierend für
nicht-strukturelles HCV-Antigen NS-3, mIL2+ (Papa
et al., "Development
of a multigenic plasmid vector for HCV DNA immunization", Res. Virol., Bd.
149 (1998), S. 315–319)
gemäß dem gleichen
experimentellen Schema, wie es in Beispiel 3 beschrieben wurde.
-
Zu
verschiedenen Zeitpunkten nach der DNA-Injektion wurden den Mäusen Blut
entnommen und die Anwesenheit von antiidiotypischen Antikörpern wurde
mittels zytofluorimetrischer Analyse getestet. Für jede individuelle Maus wurden
sämtliche
Proben gleichzeitig vermessen.
-
4 zeigt
die FACS-Analyse, die mit PA682-Zellen (Patient PA) nach Behandlung
mit Präimmun-Serumproben
(4A) und Immun-Serumproben (4B) einer mit dem pRC111-PA-Vektor geimpften
Maus erhalten wurden.
-
Wir
bewerteten ferner die Fähigkeit
von bloßer
DNA, die für
die VH-CDR3-Region
kodiert, zur Induktion von antiidiotypischen Antikörpern und
beobachteten den Einfluss von mIL2 auf diese Reaktion. Nur 20% der
Mäuse mit
einer Injektion von pRC101-PA (IL2–)
erzeugten messbare Mengen an antiidiotypischen Antikörpern (Tabelle
2). Die Injektion des Vektors pRC111-PA (IL2+)
führte
bei 56% der Mäuse
zur Erzeugung von Ig-spezifischen Antikörpern. Somit führt IL2,
das mit dem Antigen coexprimiert wird, zu einer Steigerung der Wirksamkeit
der Immunisierung. Keine spezifischen Antikörper wurden in Mäusen nach
Injektion mit pRC100-, pRC110- oder pRC112-Kontrollvektoren nachgewiesen.
-
Wie
in Tabelle 2 gezeigt, wurde die Reaktion bereits 3 Wochen nach der
ersten Immunisierung nachgewiesen, erreichte bald nach der zweiten
Immunisierung das Maximum und hielt über eine beträchtliche
Zeitspanne hinweg an, da sie noch nach etwa 5 Monaten nachgewiesen
werden konnte. Ferner wurde kein Abfall des Titers von spezifischen
Igs beobachtet. Wie bei der vorliegenden experimentellen Strategie
wird häufig festgestellt,
dass eine dritte Injektion von DNA nicht immer zu einem Anstieg
des Titers oder der Anzahl von Tieren, die einen positiven Test
ergaben, führte.
Interessanterweise steigert die Coinjektion von IL2 die Anzahl an
reagierenden Mäusen,
modifiziert aber nicht die Kinetik der Antikörpererzeugung.
-
Tabelle 2
-
Bewertung der Immunreaktion
gegen Nicht-Hodgkin-Lymphom-Zellen von Patient PA
-
Fremdeingekreuzte
Swiss-Mäuse
erhielten eine intramuskuläre
Injektion von unterschiedlichen Plasmidkonstrukten zum Zeitpunkt
T0 und 3 Wochen (T3) und 16 Wochen (T16) später. Seren wurden 3 (T3), 6 (T6),
9 (T9), 16 (T16) und 19 (T19) Wochen nach der ersten Injektion gewonnen.
Lymphom-Zellen des
Patienten PA wurden mit Mäuseseren
behandelt und durch FAC-Scanning
analysiert. Die Ergebnisse sind als prozentualer Anteil von positiven
Tieren angegeben.
-
-
Bezüglich der
Abkürzungen
wird auf Tabelle 1 verwiesen.
-
Beispiel 7
-
Anti-CDR3-Reaktionen können mit
verschiedenen CDR3s erhalten werden.
-
Zwei
weitere Punkte waren zu klären,
um diese Möglichkeit
für die
Immuntherapie vorzuschlagen. Der erste Punkt bestand in dem Nachweis,
dass ein derartiger Weg für
mehrere verschiedene VH-CDR3s erfolgreich sein kann. Der zweite
Punkt bestand in dem Nachweis, dass die hervorgerufenen Antikörper tatsächlich ein "privates" Epitop des Ig erkennen,
um die Möglichkeit
zur Erzeugung einer systemischen, selbstreaktiven Krankheit auf
ein Minimum zu beschränken.
-
Bezüglich dieser
Punkte wurden in einer neuen Reihe von Experimenten die VH-CDR3s
von 2 weiteren Patienten (AS und BA) kloniert. Swiss-Mäuse wurden
mit den erhaltenen Vektoren pRC111-AS bzw. -BA unter Anwendung des
gleichen Verfahrens wie in Beispiel 3 immunisiert. Wie in Tabelle 3A
gezeigt, war die Rate an positiven Ergebnissen, die unter Verwendung
von 3 verschiedenen CDR3s erhalten wurden, ähnlich. Diese Beobachtung bestätigte, dass
eine Immunisierung mit bloßer
DNA mit dem Vektor pRC111 zu einer anti-CDR3-Reaktion für mehrere verschiedene CDR3s
führen
kann.
-
Bezüglich des
zweiten Punkts wurden Immunseren ferner auf ihre Fähigkeit
zur Erkennung von Zellen, die von den übrigen Patienten erhalten worden
waren, getestet (beispielsweise wurden in Bezug auf anti-CDR3-PA-Reaktion positive
Seren mit Zellen der Patienten AS und BA und umgekehrt abgestimmt).
Dieses Experiment ermöglichte
uns die Prüfung
der Feinspezifität
der Antikörper-Reaktion.
Es wurde keine Kreuzreaktivität
in Bezug auf die CDR3s, die von dem für die Immunisierung verwendeten
CDR3 verschieden waren, unter Seren, die positiv getestet worden
waren, festgestellt (4C und Tabelle
3). Dieses Ergebnis bestätigt, dass
keine Reaktion gegen Gerüstregionen
der CDR3s unter Anwendung dieses Verfahrens herbeigeführt wurde
und daher das Risiko der Ausbreitung der Immunreaktion in Richtung
auf eine systemische Selbstreaktivität möglicherweise gering ist.
-
Tabelle 3
-
Spezifität der anti-VH-CDR3-Immunreaktion
gegen lymphoproliferative Zellen von drei verschiedenen Patienten
(PA, AS, BA)
-
Fremdeingekreuzte
Swiss-Mäuse
erhielten zum Zeitpunkt T0 und 3 Wochen (T3) und 6 Wochen (T6) später eine
intramuskuläre
Injektion von verschiedenen Plasmidkonstrukten. Seren wurden 3 (T3),
6 (T6) und 9 (T9) Wochen nach der ersten Injektion gewonnen.
-
Die
Ergebnisse sind als prozentualer Anteil von positivem Serum bei
Bestimmung durch FACS-Analyse angegeben.
- A
- = Prozentualer Anteil
von Seren aus Mäusen
mit Injektion von pRC111-PA/AS/BA-Vektoren,
die mit Patienten-Tumorzellen, die das gleiche VH-CDR3 (PA/AS/BA)
exprimieren, reagieren.
- B
- = Spezifität der Immunreaktion
gegen jedes VH-CDR3. Seren von Tieren, die eine Injektion mit dem Vektor,
der für
jeden Idiotyp kodierte, erhalten hatten, wurden mit Patienten-Zellen,
die jedes der drei VH-CDR3s exprimierten, behandelt.
- C
- = Kontrollmäuse: Seren
von 5 Mäusen,
die eine Injektion von CDR3-freiem Vektor (pRC110) erhalten hatten,
wurden mit Patienten-Zellen behandelt, die jedes der drei VH-CDR3s
exprimierten.
- NT
- = nicht getestet.
-
-