DE60124313T2 - Dns-vakzine von hypervariablen vh-cdr3 idiotypischen determinanten - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induktion der Immunreaktion eines Individuums gegen B-lymphoproliferative Störungen, wobei das Verfahren auf einer DNA-Impfung mit dem kurzen Peptid, das die hypervariable CDR3-Region der schweren Immunoglobulinkette (VH-CDR3) allein oder in Kombination mit mindestens einer weiteren immunomodulierenden Sequenz umfasst.
  • Hintergrund der Erfindung
  • B-Zelllymphome sind Neoplasmen von reifen Lymphozyten, die im allgemeinen Immunoglobulin (Ig) auf der Zelloberfläche exprimieren. Die Igs sind klonspezifisch und die variablen Regionen enthalten Determinanten, die selbst als Antigene oder Idiotope erkannt werden können. Das idiotypische Ig stellt daher ein einziges tumorspezifisches Antigen dar (Y. J. Wen et al., Eur. J. Immunol., Bd. 27 (1997), S. 1043–1047).
  • Herkömmliche Behandlungen, wie eine Chemotherapie und Strahlungstherapie, können jeweils eine Remission bei Patienten mit Nicht-Hodgkin-Lymphom (NHL) von geringer Intensität herbeiführen. Jedoch kommt es trotz dieser Reaktion auf die Behandlung bei einem Großteil der Patienten letztlich zu Rückfällen, so dass diese Patienten mit diesen üblichen Therapien nicht behandelt werden können und ihre Langzeitperspektive schlecht bleibt.
  • Es ist wahrscheinlich, dass die Krankheit im wesentlichen unheilbar ist, ausgenommen möglicherweise durch eine allogene Knochenmarktransplantation. Da die Anzahl von Patienten, die für eine derartige therapeutische Möglichkeit geeignet sind, äußerst gering ist, benötigt man alternative Behandlungsverfahren. Ein attraktiver Weg bestünde darin, die Fähigkeit des Immunsystems zur Erkennung und Beseitigung von neoplastischen Zellen unter Aussparung von normalen Zellen hervorzurufen.
  • B-Zelllymphome stellen ideale Modelle für eine experimentelle Tumor-Immunotherapie dar. Tatsächlich stellen die Ig-Idiotypen, die sich auf ihrer Zelloberfläche zeigen, attraktive tumorale Antigene dar, da sie tumorspezifisch sind, zu einer bekannten Familie von Molekülen gehören und gezeigt worden ist, dass auch für eigene Igs eine für den Ideotyp spezifische Immunreaktion erhalten werden kann. Jedoch ist die Wirksamkeit der antiidiotypischen Impfung vermutlich bei einigen Histotypen größer als bei anderen. Es ist zu erwarten, dass B-Zelllymphome von geringer Intensität sowie solche mit einem geringfügig lymphozytischen oder follikulären Histotyp ideale Ziele darstellen, da sie i) im allgemeinen ein träges Verhalten zeigen und schwer zu beseitigen sind; ii) einen sehr geringen Grad der klonalen Entwicklung aufweisen; iii) Oberflächen-Igs in hohen Konzentrationen exprimieren; und iiii) keine Oberflächen-Immunoglobuline sezernieren.
  • Auf der anderen Seite wird erwartet, dass eine antiidiotypische Impfung gegen Lymphoblastoide und andere hochgradige Lymphome, die keine Immunoglobuline an der Oberfläche exprimieren, weniger wirksam ist. Außerdem sind diese Typen sehr aggressiv und zeigen einen hohen Grad an klonaler Entwicklung (30–40%).
  • Obgleich der herkömmliche Weg zur Immunisierung, d. h. eine subkutane Immunisierung mit dem vollständigen Immunoglobulin durch B-Zelllymphom im Gemisch mit einem Adjuvans, sich als wirksam sowohl bei experimentellen Modellen (George et al., J. Immunol., Bd. 138 (1988), S. 2168–2174) als auch bei kontrollierten klinischen Studien (Kwak et al., N. Engl. J. Med., Bd. 327 (1992), S. 1209–1215) erwiesen hat, wurde dieser Weg durch die Notwendigkeit an großen Mengen an gereinigtem Protein, die sich nicht in jedem Fall herstellen und zertifizieren lassen, behindert.
  • Mehrere Berichte haben gezeigt, dass sich die immunodominanten Epitope des für Ig spezifischen Klons innerhalb der hypervariablen Regionen und hauptsächlich innerhalb der dritten komplementaritätsbestimmenden Region der schweren Immunoglobulinkette (VH-CDR3) befinden (Campbell et al., J. Immunol., Bd. 139 (1987), S. 2825–2833; Watanabe et al., J. Immunol., Bd. 151 (1993), S. 2871–2876). Ferner lassen zahlreiche Beobachtungen darauf schließen, dass eine Immunisierung mit dem vollständigen Protein in einigen Fällen eine Antikörperreaktion hervorrufen kann, die auf kurze lineare Epitope beschränkt und daher ungeeignet ist, da die dreidimensionale Struktur des Proteins selbst nicht erkannt wird (Kawaguchi et al., J. Biol. Chem., Bd. 264 (1989), S. 5762–5767). Umgekehrt kann eine Immunisierung mit kurzen Peptiden (8–20 Aminosäurereste lang) zur Bildung von Antikörpern führen, die das entsprechende lineare Epitop an einem Protein erkennen, ohne dass eine Konjugation mit Trägern erforderlich ist, vorausgesetzt, dass sich das kurze Peptid wie ein vollständiges Antigen verhält (d. h. Sequenzen enthält, die zur Bindung an Klasse II-MHC-Moleküle und zum Eingreifen in den T-Zellrezeptor befähigt sind).
  • Tatsächlich wurde nachgewiesen, dass ein kurzes Peptid, das die VH-CDR3-Region eines humanen, lymphomspezifischen IgM umfasste, zur Förderung der in vitro-Proliferation von spezifischen CD4+- und CD8+-Zellen fähig war, die die autologen Lymphomzellen lysieren können (Wen et al., Eur. J. Immunol., Bd. 27 (1997), S. 1043–1047). Die klinische Bedeutung dieser in vitro- Ergebnisse wurde durch die spezifische Immunreaktion bestätigt, die bei einem Patienten im Anschluss an eine Impfung mit dem Peptid erreicht wurde (Wen et al., Br. J. Haematol., Bd. 103 (1998), S. 663–668).
  • Die Entwicklung des Impfverfahrens mittels direkter Injektion von bloßer DNA auf intramuskulärem oder subkutanem Wege hat in Kombination mit der Fähigkeit zur leichten Identifizierung und Klonierung individueller, tumorspezifischer Idiotypen die Chancen, diese Tumorantigene auszunützen, verbessert. Dieser Weg hat sich bereits beim Induzieren von Immunreaktionen gegen mehrere Antigene, hauptsächlich viralen Ursprungs, als wirksam erwiesen und er wurde auf die Therapie von experimentellen, murinen Lymphomen angewandt, wo das Ig, das das Lymphom charakterisiert, für die Immunotherapie des parentalen Tumors über eine DNA-basierte Impfung herangezogen wurde (Hawkins et al., Blood, Bd. 83 (1994), S. 3279–3288; V. M. Fazio, Res. Virol., Bd. 148 (1997), S. 101–108; Stevenson et al., Immunol. Rev., Bd. 145 (1995), S. 211–228). Ein derartiges Verfahren hat sich bei der Herbeiführung von antiidiotypischen, spezifischen Immunreaktionen als wirksam erwiesen, wenn vollständiges Ig oder dessen variable Regionen, die gentechnisch so bearbeitet worden waren, dass sie fremdes Ig (Syringelas et al., Nature Med., Bd. 2 (1996), S. 1038–1041), keimartige leichte Ketten (Watanabe et al., J. Immunol., Bd. 151 (1993), S. 2871–2876) oder Toxin-Fusionsprotein (King et al., Nature Med., Bd. 11 (1998), S. 1281–1286) exprimierten, als kodiertes Antigen verwendet wurden.
  • Dennoch wäre bei Übertragung dieser Technik auf die klinische Praxis eine so zeitaufwändige Bearbeitung für jeden einzelnen Patienten erforderlich, dass dieser Weg zur Durchführung auf einer regelmäßigen klinischen Basis zu teuer käme.
  • Ein wirksames und billiges, auf DNA basierendes Verfahren zur Herbeiführung einer Immunreaktion gegen B-lymphoproliferative Störungen wäre erstrebenswert, insbesondere wenn man berücksichtigt, dass gereinigte, doppelsträngige DNA selbst nicht immunogen ist (S. E. Parker, F. Borellini et al., Hum. Gene Ther., Bd. 10 (5) (1999), S. 741–758). Außerdem würde bei Berücksichtigung der Tatsache, dass die berechnete Mutationsrate 3000-fach kleiner als die spontane Mutationsrate für Säugetiergenome ist, der Grad der Integration, wenn diese erfolgen sollte, kein ernsthaftes Sicherheitsproblem darstellen (T. Martin, S. E. Parker et al., Hum. Gene Ther., Bd. 10 (5), S. 759–768).
  • Beschreibung der Erfindung
  • Es wurde nunmehr überraschenderweise festgestellt, dass sich eine wirksame, sichere und leicht reproduzierbare Immunreaktion auf DNA-Basis gegen B-lymphoproliferative pathologische Zustände erreichen lässt, indem man dem Patienten ein Plasmid verabreicht, das eine DNA-Sequenz enthält, das im wesentlichen für ein kurzes Peptid kodiert, das die hypervariable Region der idiotypischen, schweren Immunoglobulinkette (VH-CDR3) umfasst.
  • Ferner wurde festgestellt, dass ein Multigen-Expressionsvektor, dessen Haupteigenschaft im gemeinsamen Vorliegen von zwei verschiedenen, vollständigen und differenziell regulierten Transkriptionseinheiten besteht, was die Coexpression eines immunoregulatorischen Moleküls, vorzugsweise von humanem Interleukin-2 (IL2), und der hypervariablen CDR3-Region der idiotypischen schweren Imnunoglobulinkette ermöglicht, in erheblichem Maße die vorerwähnte Immunreaktion verstärkt.
  • Das hauptsächliche Ziel der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Verwendung der DNA-Sequenz, die für die hypervariable Region (VH-CDR3) der an B-Zellen von chronischen, B-lymphoproliferativen Störungen exprimierten, idiotypischen Immunoglobulins kodiert, als Impfstoff (oder zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung), wobei der Impfstoff gegen chronische, B-lymphoproliferative Störungen, die das idiotypische Oberflächenimmunoglobulin bei Säugern exprimieren, wirksam ist.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kodiert diese DNA-Sequenz für Peptide mit einer Länge von 0–45 Aminosäuren und vorzugsweise von 7–45 Aminosäuren. Diese DNA-Sequenz befindet sich zwischen eFW3- und eJH-Sequenzen und entspricht der VH-CDR3-Sequenz.
  • Ein zweites Ziel der Erfindung besteht in einem rekombinanten Plasmid-Expressionsvektor, der sich für die Expression einer DNA-Sequenz in einem Säuger eignet und eine damit funktionell verknüpfte DNA-Sequenz enthält, wobei der Vektor dadurch gekennzeichnet ist, dass diese DNA-Sequenz im wesentlichen aus der hypervariablen Region (VH-CDR3) des an B-Zellen von chronischen, B-lymphoproliferativen Störungen bei einem Säuger exprimierten, idiotypischen Immunoglobulins besteht. Wie vorstehend angegeben, weist eine derartige Sequenz üblicherweise 7–45 Aminosäuren auf.
  • Das Plasmid, das für die erfindungsgemäßen Zwecke verwendet werden kann, kann aus multigenen Vektoren ausgewählt werden, die zwei verschiedene Transkriptionskassetten, die von zwei unabhängigen Promotoren, vorzugsweise CMV- und RSV-Promotoren/Enhancern, gesteuert werden, beinhalten und die Coexpression eines Cytokins oder eines Immunotoxins, wie humanes IL-2, GM-CSF oder IL-6, zusammen mit einem spezifischen Antigen, nämlich dem individuellen VH-CDR3-Peptid, ermöglichen.
  • Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kodiert dieser rekombinante Plasmid-Expressionsvektor auch für ein immunomodulatorisches Molekül, das beispielsweise aus IL-2, GM-CSF, IL-12 oder IL-6 ausgewählt sein kann, oder für ein Fragment aus bakteriellen Immunotoxinen, wie Tetanus-Toxin.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung besteht diese DNA-Sequenz aus (a) dem Gen, das für die hypervariable Region (VH-CDR3) des idiotypischen Immunoglobulins kodiert, das an B-Zellen von chronischen, B-lymphoproliferativen Störungen exprimiert wird, und (b) strangaufwärtigen und strangabwärtigen PCR-Primern, wobei es sich vorzugsweise beim strangaufwärtigen PCR-Primer um eFW3 und beim strangabwärtigen PCR-Primer um eJH handelt.
  • Ein drittes Ziel der Erfindung besteht in einer Impfstoffzusammensetzung, die einen derartigen rekombinanten Plasmid-Expressionsvektor enthält, wobei die Impfstoffzusammensetzung vorzugsweise in einer Form vorliegt, die sich für die parenterale Verabreichung und insbesondere für die intramuskuläre Verabreichung eignet, z. B. in Form einer Lösung in Wasser.
  • Die Untersuchung, die die vorliegende Erfindung ermöglichte, beschäftigte sich mit der Frage, ob verschiedene kurze Peptide, die die hypervariable VH-CDR3-Region des Lymphom/Leukämie-Oberflächen-Immunoglobulins mit üblicherweise (ohne Beschränkung hierauf) 7–45 Aminosäuren, die durch direkte intramuskuläre Injektion der entsprechenden Minigene exprimiert werden, in wirksamer Weise dem Immunsystem einer verschiedenen "Outbred"-Maus (outbred = aus der Kreuzung entfernt verwandter oder nicht zuchtverwandter Individuen hervorgegangen) präsentiert werden kann, um Antikörper zu erzeugen, die zur Reaktion mit Tumorzellen des Patienten, bei denen das spezifische idiotypische Protein exponiert ist, befähigt sind. Es wurde festgestellt, dass das xenogene "Outbred"-Mäusemodell die MHC-1-Variabilität nachahmt, die in einem klinischen Ansatz vorliegt, ohne humane Subjekte zu immunisieren.
  • Die Beschränkung auf die individuelle CDR3-Region schloss xenogene oder allogene Epitope, die in der variablen sowie in der konstanten Region des idiotypischen Immunoglobulins enthalten waren, aus, was den Sicherheitsrahmen stark erhöht, wenn dieser Weg in einem syngenen Kontext übertragen wird.
  • Ein Doppelgen-Plasmidvektor für die Coexpression der spezifischen, individuellen CDR3-Sequenzen und eines immunomodulierenden Cytokins, d. h. IL-2, wurde als Träger für die intramuskuläre Injektion verwendet.
  • Es wurde angenommen, dass ein derartiger Vektor die Sicherheit verbessert, indem die Expression des Cytokins mit der Expression des fremden Antigens in den gleichen Zellen verknüpft wird. Diese Strategie gewährleistet tatsächlich die Erzeugung des immunomodulierenden Moleküls nur bei Bedarf, d. h. sofern das fremde Antigen selbst erzeugt wird. Es wurde als unwahrscheinlich angenommen, dass es unwahrscheinlich ist, dass T-Zellen, die auf ein Protein (IL2) reagieren, das an sämtlichen Immunreaktionen beteiligt ist und jedes Mal, wenn T-Zellen aktiviert werden, in hoher Konzentration vorhanden ist, die Toleranzinduktion überleben könnten.
  • Tatsächlich gab es nach unserer Kenntnis nur einen einzigen Bericht, der die Möglichkeit zur Induktion von anti-IL-2-Antikörpern in Mäusen zeigt, wobei aber das Verfahren die Immunisierung mit einer Form des IL-2 erforderlich macht, die verkürzt war und eine Aminosäuresubstitution enthielt (Matesanz et al., Autoimmunity, Bd. 12 (1999), S. 221–227).
  • Es wurde somit festgestellt, dass bis zu 60% von Outbred-Tieren, denen jeweils VH-CDR3/IL2-coexprimierende Plasmidvektoren injiziert worden waren, eine signifikante, rasche Immunreaktion entwickelten, die mindestens 19 Wochen nach der ersten DNA-Injektion anhielt. Die Anzahl der reagierenden Tiere nahm in Abwesenheit der IL2-Costimulation auf bis zu 20% ab. Noch wichtiger ist, dass sämtliche VH-CDR3-immunen Tiere eine Antikörperreaktion entwickelten, die zur Erkennung des gesamten idiotypischen Immunoglobulins, das an den Lymphom/Leukämie-Zellen von Patienten exponiert ist, befähigt waren, wie durch FACS-Analyse nachgewiesen wurde.
  • Es wurde keine Kreuzreaktivität festgestellt, wenn Immunseren von jedem VH-CDR3 mit Tumorzellen anderer Patienten behandelt wurden. Eine mögliche Erklärung für diese Ergebnisse besteht darin, dass die DNA-Impfung durch lineare, kurze VH-CDR3-Peptide die Erzeugung von Antikörpern induzieren kann, die spezifische lineare Epitope am gefalteten idiotypischen Immunoglobulin identifizieren.
  • Der derzeit angenommene Mechanismus der DNA-Impfung durch intramuskuläre Plasmidinjektion geht davon aus, dass das Priming von vom Knochenmark abgeleiteten, ein Antigen präsentierenden Zellen (APC) vorgenommen wird, die bei der Bereitstellung sämtlicher für das Priming der T-Zellen notwendigen Signale wirksam sind. Die Muskelzellen nehmen am Immunisierungsmechanismus als ein Reservoir für das Antigen und ein anhaltender Immunstimulus teil, und zwar aufgrund der Langzeitstabilität von Muskelfasern und der Transgenexpression. Das Verfahren der DNA-Impfung und die Form des DNA-exprimierten Antigens lenken möglicherweise die T-Zell-Hilfe vorwiegend auf den Typ 1 oder Typ 2.
  • Das vorgeschlagene experimentelle Modell umfasst die intramuskuläre Injektion und nicht-sezernierte Peptide, die die Reaktion zum Thl-Weg dirigieren können. Außerdem kann die IL2-Expression durch Verstärkung der T-zellvermittelten Immunreaktion und durch Verbesserung der antigenspezifischen T-Zellproliferation wirken sowie durch Differenzierung und Ig-Sekretion von antigenaktivierten B-Zellen.
  • In diesem Zusammenhang kann die Antikörperreaktion durch B-Zellstimulation erzeugt werden, die durch Peptide erreicht wird, die aus Muskelzellen während einer immunvermittelten Zerstörung von transfizierten Muskelfasern freigesetzt werden.
  • Mehrere Berichte stellten die Theorie auf, dass der Schutzmechanismus gegen ein Lymphom von geringer Intensität durch Antikörper vermittelt seijn kann (Dyke et al., Cell. Immunol., Bd. 132 (1991), S. 70–83), möglicherweise aufgrund der direkten Induktion der Apoptose (Vitetta et al., Blood, Bd. 89 (1997), S. 4425–4436). Ganz neue experimentelle Daten bestätigten, dass Tumorschutzwirkungen einer DNA-Impfung hauptsächlich einer idiotypspezifischen humoralen Immunität zuzuschreiben sind (Syrengelas et al., J. Immunol., Bd. 1162 (1999), S. 4790–4795), und in noch überzeugenderer Weise wurde eine verlängerte Überlebenszeit bei einer klinischen Untersuchung mit der Induktion von antiidiotypischen Antikörperreaktionen in Zusammenhang gebracht.
  • Jedoch wird die Natur einer schützenden Immunreaktion bei bereits manifesten B-Zelllymphomen von geringer Intensität noch diskutiert, und andere Studien sprechen für eine Korrelation zwischen der zellvermittelten Zytotoxizität und der therapeutischen Reaktion (Nelson et al., Blood, Bd. 88 (1996), S. 580–589). Bei diesem experimentellen "outbred"-Modell werden die idiotypischen Peptide weder sezerniert noch intravenös injiziert, sondern direkt ohne spezifische Signale (d. h. eine Leadersequenz für die Sekretion) in in vivo-transfizierten Zellen in Kombination mit rekombinanter IL2-Expression erzeugt.
  • Dieser Mechanismus garantiert möglicherweise eine Antikörpererzeugung und eine zytotoxische Reaktion ohne die Behinderung, die mit der Bindung antiidiotypischer VH-CDR3-Antikörper an das sezernierte Peptid oder den injizierten Peptid-Impfstoff verbunden ist.
  • Selbst wenn die VH-CDR3-Region des idiotypischen Immunoglobulins äußerst variabel und daher höchstwahrscheinlich für dieses Protein einzigartig ist, sind die meisten somatischen Mutationen, die sich unter dem Immundruck entwickeln können, in CDR1-, CDR2- und Gerüst 3 (FR3)-Regionen des idiotypischen Proteins zusammengeballt (C. Berek, C. Milstein, Immunol. Rev., Bd. 96 (1987), S. 23–41).
  • Aufgrund der einfachen Identifizierung neuer idiotypischer VH-CDR3-Varianten sowie aufgrund der raschen Klonierung und Herstellung von DNA-Impfstoffpräparaten von klinischer Qualität kann das vorgeschlagene Verfahren jedenfalls bei der Nachsorge des behandelten Patienten wieder angewandt werden.
  • Infolgedessen können die durch bloße DNA-Immunisierung in einem Outbred-Tiermodell erzeugten Immunreaktionen die potentielle Immunogenizität und einen großen Sicherheitsrahmen der VH-CDR3-Minigen-kodierten Peptide beweisen und die Grundlage für die Impfung humaner Patienten, die von einer B-lymphoproliferativen Krankheit betroffen sind, darstellen. Dieser Weg vermeidet in der Tat die xenogenen oder allogenen Epitope, die in der variablen sowie in der konstanten Region des idiotypischen Immunoglobulins enthalten sind, was den Sicherheitsrahmen dieser molekularen Vorgehensweise erhöht.
  • Außerdem kann das xenogene experimentelle "outbred"-Modell in engerer Weise die Lage beim Patienten und die Variabilität der Immunreaktion reproduzieren, da es die MHC-1-Variabilität imitiert, die bei einem klinischen Zustand ohne direkte Immunisierung von humanen Subjekten gegeben ist,
  • Erfindungsgemäß ist es nunmehr möglich, Menschen, die von B-lymphoproliferativen Störungen betroffen sind, zu impfen, indem man (i) die DNA-Sequenz des Patienten, die für die hypervariable Region (VH-CDR3) des an B-Zellen exprimierten idiotypischen Immunoglobulins kodiert, isoliert; (ii) diese Sequenz in das vorerwähnte Expressionsplasmid kloniert; und (iii) das auf diese Weise erhaltene rekombinante Expressionsplasmid dem Patienten vorzugsweise durch intramuskuläre Injektion verabreicht.
  • Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung gehen klarer aus dem folgenden experimentellen Teil hervor, dessen Zweck es ist, die Erfindung zu erläutern, ohne deren Anwendungsgebiet zu beschränken.
  • Legende
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen verwendet: CDR3, komplementaritätsbestimmende Region 3; Ig, Immunoglobulin; VH, variable schwere Immunoglobulinkette; mIL2, Mäuse-Interleukin-2; FRW, Gerüst; GM-CSF, Granulozyten-Makrophagen-Kolonienbildungsfaktor; WBC, weiße Blutkörperchen.
  • 1: Überblick über die experimentelle Strategie. Die molekulare Gewinnung von VH-CDR3-Sequenzen wurde aus Tumor B-Zellen von Patienten mit unterschiedlichen chronischen lymphoproliferativen Störungen vorgenommen. Amplifizierte Sequenzen wurden in einen multigenen Säugetiervektor (pRC111) kloniert, der in unabhängiger Weise Interleukin-2 und tumorspezifische VH-CDR3- Sequenzen koexprimiert. pRC111-Vektoren mit einem Gehalt an klonierten VH-CDR3-Sequenzen wurden in "Outbred"-Mäuse injiziert. Seren, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach der DNA-Injektion erhalten worden waren, wurden mit den ursprünglichen Tumor B-Zellen der Patienten behandelt und durch FACS-Analyse getestet.
  • 2: Nucleotidsequenz (untere Reihe) und abgeleitete Aminosäuresequenz (obere Reihe) von cDNA, die für humane, schwere Ketten-CDR3-variablen Regionen von 3 verschiedenen Patienten kodieren. Fettdruck: Teil der Primersequenzen; graues Kästchen: abgeleitete CDR3-Sequenz.
  • 3: Halbquantitative RT-PCR-Analyse der mIL2-Transkription in Muskeln von Mäusen mit pRC111-PA-Injektion. Die Ergebnisse werden unter Verwendung von 500, 50 und 5 ng der gesamten RNA, die aus vier Tieren (mit den Bezeichnungen 1, 2, 3 und 4) 1 Woche nach der Injektion erhalten worden war. Mäuse-beta-Actin (βAct)- und Mäuse-IL2-Sequenzen wurde gemäß den Angaben im Text amplifiziert. Positive Proben zeigen ein mIL2-spezifisches 158 bp-amplifiziertes Fragment. C2 und C4 (PA 2- bzw. PA 4-kontralaterale Muskeln) erhielten eine Injektion mit leerem pRC100-Plasmidvektor (negative Kontrolle). Erste Linie: Molekulargewichtsmarker (162 und 79 bp). β-act: Mäuse-beta-Actin-spezifisches 154 bp-amplifiziertes Fragment.
  • 4: Reaktivität von Antikörpern, induziert durch einen DNA-Impfstoff mit einem Gehalt an der VH-CDR3-Region von Patient PA mit Patienten-Tumorzellen, bestimmt durch Fluoreszenzaktivator-Zellsortierung (FACS). Das Serum (1:50 verdünnt) von Mäusen, die mit pRC111-PA immunisiert worden waren, wurde mit deren Zieltumorzellen (PA682) (A, B) oder mit Tumorzellen von Patient BA (C) inkubiert.
  • Das Kontrollserum stammte von den gleichen Mäusen mit vorheriger Injektion. Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen und gebundene Antikörper wurden durch FITC-konjugiertes Ziegen-anti-Mäuse-Serum unter Anwendung einer FACS-Abtastung nachgewiesen. Die Ergebnisse einer repräsentativen Probe (PA) sind als Peak-Präsentationen dargestellt, die mit (A) Präimmunserum und (B) Immunserum (6 Wochen nach pRC111-PA-Injektion) erhalten worden sind. Der interne Kontrollpeak (B) zeigt die Basislinienreaktivität beim Nachweis von Ziegen-Fluoreszenz-anti-Maus-Antikörper allein. C: FACS-Analyse von pRC111-PA-Antiserum bei Behandlung mit BA-Tumorzellen.
  • Beispiel 1
  • Molekulare Gewinnung von VH-CDR3-Sequenzen von Patienten-Tumor B-Zellen von chronischen lymphoproliferativen Störungen
  • Das Ziel dieser Studie bestand darin, den Nachweis der Wirksamkeit der kurzen hypervariablen Region (VH-CDR3) des idiotypischen Immunoglobulins, das an B-Zellen von chronischen B-lymphoproliferativen Störungen exprimiert wird, zu erbringen, was eine rasche Klonierung und spezifische Reaktion durch bloße DNA-Immunisierung erlaubt.
  • Zwei EBV-transformierte Zelllinien (AS283A und PA682), die sich von Zellen von zwei Nicht-Hodgkin-B-Lymphom-Patienten ableiteten, und eine eingefrorene periphere Blutprobe eines Patienten mit Haarzellen-Leukämie (BA) wurden als Quellen für CDR3-Sequenzen verwendet.
  • Der WBC-Wert bei Bestimmung im peripheren Blut des HCL-V-Patienten war sehr hoch (130000/mm3) und der prozentuale Anteil der Leukämiezellen war größer als 95%. Bei den Zelllinien, die als Quellenmaterial für die CDR3-Sequenzen verwendet wurden, handelte es sich um klonale Zellen, deren Herkunft von primären Lymphomen der Patienten früher festgestellt worden war (Gaidano et al., "In vitro establishment of AIDS-related lymphoma cell lines: phenotypic characterization, oncogene and tumor suppressor gene lesions and heterogeneity in Epstein-Barr virus infection", Leukemia, Bd. 7 (1993), S. 1621–1629).
  • Die Identität ihrer CDR3-Regionen mit den für die DNA-Impfung verwendeten Sequenzen wurde festgestellt, indem man die Sequenz der amplifizierten Fragmente, die aus den Tumorzellen erhalten worden waren, mit der Sequenz der Plasmide, die für die Impfung verwendet wurden, verglich (vergl. die nachstehenden Ausführungen). Die gleichen Zellen wurden auch zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern, die mit den Idiotypen in behandelten Mäusen reaktiv waren, verwendet (vergl. die nachstehenden Ausführungen).
  • Die gesamte RNA wurde aus Patientenzellen gereinigt und cDNA wurde unter Verwendung von willkürlichen Hexameren präpariert. Die Amplifikation wurde in zwei Stufen gemäß den Angaben in Beispiel 2 durchgeführt. Die Verwendung von RNA und ein zweistufiges PCR-Verfahren ermöglichten eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität der erhaltenen Produkte.
  • Amplifizierte variable Regionen und CDR3s wurden an einem 2%-SeaKem-Agarosegel (FMC, Rockland, ME) analysiert. Banden wurden mit einem QIAEX-Gelextraktionskit (Qiagen Inc., GmbH) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die gereinigten VHCDR3-cDNAs wurden direkt in die NheI/NotI-Stellen einer transkriptionalen Kassette von pRC100-bezogenen Plasmidvektoren kloniert, und zwar mit (pRC111) oder ohne (pRC101) Mäuse-IL2 (mIL2)-cDNA in der zweiten transkriptionalen Kassette (Tabelle 1) (Ciafrè et al., Plasmid, Bd. 40 (1998), S. 84–89). cDNA-Fragmente wurden anschließend durch das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren unter Verwendung von T7-DNA-Polymerase (Sequenase, Version 2.0, USB) sequenziert.
  • Plasmid-DNA wurde durch das Qiagen Plasmid Mega Kit (Kat. Nr. 12181) gemäß den Angaben des Herstellers gereinigt, um die Verwendung eines Mutagens (Ethidiumbromid) oder eines CsCl-Gradienten zu vermeiden, die beide im üblichen Verfahren für die Plasmidreinigung eingesetzt werden. Das DNA-Plasmid wurde in einer Menge von 1,2 μg/μl in steriler 225 mM NaCl-Lösung (1,5 × normale Kochsalzlösung) resuspendiert.
  • Diese multigenen Vektoren beinhalten zwei verschiedene Transkriptionskassetten, die durch zwei unabhängige Promotoren (CMV- und RSV-Promotoren/Enhancer) gesteuert werden und ermöglichen die Coexpression von einem Cytokin, humanem IL2 oder GM-CSF oder einem Toxin zusammen mit einem spezifischen Antigen, dem individuellen VH-CDR3-Peptid (pRC111) (1).
  • Tabelle 1 DNA-Immunisierungskonstrukte, kodierte antigene Proteine und Immunmodulator
    Figure 00110001
  • Abkürzungen:
    • RSV = Rous-Sarcomavirus-LTR-Promotor/Enhancer; VH-CDR3 = komplementaritätsbestimmende Region 3 der variablen schweren Immunoglobulinkette; HCL = Haarzellen-Leukämie; NHL = Nicht-Hodgkin-B-Zelllymphom; BA/PA/AS = Patienten-CDR3-Quellen; CMV = Zytomegalovirus-Promotor/Enhancer; mIL2 = murines Interleukin 2; N = keines; HCV = Hepatitis C-Virus; NS3 = HCV-nicht-strukturelles Protein 3, 4403–4829-Fragment
  • Beispiel 2
  • VH-CDR3-Amplifikation
  • Die Amplifikation wurde in zwei Stufen durchgeführt, wobei die folgenden familienspezifischen PCR-Primer für die humane schwere Ketten-CDR3-variable Region verwendet wurden:
    • A) Erste Stufe: Strangaufwärts: VH1-3-5-7. 5'-(C,G)AG GTG CAG CTG GTG (C,G)AG TCT-3'; VH2-5'-CAG (G,A)TC ACC TTG AAG GAG TCT-3'; VH4 5'-CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG-3'; VH6 5'-CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA-3'. Strangabwärts: RHmu 5'-CAC GCT GCT CGT ATC CGA CGG-3'. Strangaufwärtige Primer wurden abgeleitet gemäß Deane et al., Brit. J. Haematol., Bd. 77 (1991), S. 274–281. Der strangabwärtige Primer RHmu wurde so konzipiert, dass er sich an den 5'-Terminus der konstanten Region mu der humanen schweren Kette anlagert.
    • B) Zweite Stufe: Strangaufwärts: (eFR3-abgeleitetes) eFW3 5'-TTT G/CTAGC ATG CAC ACG GC(C,T) (G,C)TG TAT TAC TGT-3'. Strangabwärts: (eLJH-abgeleitetes) eJH 5'-TAT GC/GGCCGC TTA TTA TGA GGA GAC GGT GAC C-3'. Strangaufwärtige und strangabwärtige Primer für die PCR der zweiten Stufe wurden gemäß Ramasamy et al., "Improved PCR method for detecting monoclonal immunoglobulin heavy-chain rearrangement in B-cell neoplasm". J. Clin. Pathol., Bd. 45 (1992), S. 770–775, mit einigen Modifikationen abgeleitet. Im Vergleich zur veröffentlichten Sequenz ist die eJH-Annealing-Sequenz um 2 Nucleotide am 3'-Ende von eLJH länger und die eFW3-Annealing-Sequenz ist um 1 Nucleotid am 5'-Ende von eFR3 länger, um die Spezifität und die PCR-Bedingungen zu verbessern. Außerdem umfassten beide Primer für die zweite Stufe der PCR-Amplifikation Sequenzen für Restriktionsstellen (eFW3: NheI; eJH: NotI) (unterstrichen), vorausgehend eine kurze Sequenz (kursiv) zur Verstärkung des enzymatischen Spaltungswirkungsgrads (Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology. New York, J. Wiley and Sons Inc., 1992). Die Insertion der NheI- und NotI-Restriktionsstellen als 5'-"flushing"-Enden der Primer ermöglichte das gerichtete Klonieren der amplifizierten cDNAs in einer transkriptionalen Kassette des pRC110-Vektors (vergl. die nachstehenden Ausführungen).
  • RNA wurde zunächst aus Zelllinien und gefrorenen klinischen Proben gemäß den Angaben von Chomczynski et al., Anal. Biochem., Bd. 162, (1987), S. 156–159, isoliert. Die Synthese von cDNA wurde unter Verwendung eines Erststrang-cDNA-Synthesekits (Perkin Elmer), von MuLV-reverser Transkriptase (Perkin Elmer) und von willkürlichen Hexameren in 20 μl Endvolumen durchgeführt. Folgende Reaktionsbedingungen wurden eingehalten: 23°C, 10 Minuten; 42°C, 45 Minuten und 99°C, 5 Minuten. RT-PCR wurde in einem Endvolumen von 100 μl mit 15 pmol eines jeden Primers, 50 μmol Desoxynucleotidtriphosphat und 1 U AmpliTAQ (Perkin Elmer) durchgeführt. Erste Amplifikationsstufe: 2 Minuten bei 96°C, gefolgt von 5 Zyklen bei 93°C für 1 Minute, 65°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden; und 30 Zyklen bei 93°C für 30 Sekunden, 65°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden. Die zweite Stufe sämtlicher PCRs (verschachtelte PCR) wurde mit dem Warmstartverfahren durchgeführt. Folgende Reaktionsbedingungen wurden eingehalten: 2 Minuten bei 96°C, gefolgt von 10 Zyklen bei 93°C für 30 Sekunden, 65°C für 30 Sekunden, 72°C für 15 Sekunden und 20 Zyklen von 15 Sekunden für jeden Denaturierungs-, Annealing- und Polymerisationsvorgang.
  • Die amplifizierten Fragmente wurden durch das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren unter Verwendung von T7-DNA-Polymerase (Sequenase Version 2.0, USB) sequenziert. Die CDR3-Regionen, die Anzahl der vorhandenen somatischen Mutationen sowie die Keimliniensequenzen der Patienten, von denen die Leukämie/Lymphom-Zellen abgeleitet worden waren, wurden durch Vergleich der Sequenz der amplifizierten Fragmente mit den am stärksten homologen Keimliniensequenzen der IgV-Gene, die in den Genebank-Datenbanken der NCBI und im V-BASE-Sequenz-Verzeichnis des MRC-Center for Protein Engineering (Cambridge, UK) vorhanden sind, festgestellt. Folgende Softwarepakete wurden verwendet: das BLAST-Programm und die Mac Vector 6.0.1-Software (Oxford Molecular Group PLC, Oxford, UK).
  • Beispiel 3
  • Tiere und Immunisierungsverfahren
  • Weibliche Swiss-Mäuse im Alter von etwa 8 Wochen wurden für die Immunisierung herangezogen. Blutproben wurden durch Entnahme am Schwanz erhalten. Serum wurde für den anschließenden Test bei –80°C aufbewahrt. Die DNA-Injektion wurde in den Quadriceps-Muskel (intramuskuläre Injektion, i. m.) unter Verwendung einer Einmal-Insulin-Spritze aus Kunststoff und einer 29G × 1/2''-Nadel (Becton Dickinson, Ref. Nr. 324804. mikrofein) durchgeführt. Die experimentellen Gruppen erhielten i. m.-Injektionen von 80 μg pRC100-abgeleiteten Vektoren, die entweder nur für die CDR3-Region (pRC101) oder nur für mIL2 (pRC110) oder für beide (pRCI111) kodierten (1 und Tabelle 1).
  • Als Kontrolle erhielten zwei weitere Gruppen von Mäusen bei gleicher experimenteller Vorgehensweise Injektionen mit leerem Plasmid (pRC100) oder mit pRC100-abgeleitetem Vektor, der für mIL2 und für ein nicht-strukturelles HCV-Antigen (NS-3) (pRC112) kodierte. Zwei Injektionen wurden zu Beginn des Experiments (T0) und drei Wochen nach der ersten Injektion (T3) durchgeführt. Die dritte Injektion erfolgte 6 oder 16 Wochen nach Beginn der Experimente (T6 oder T16). Den Mäusen wurde Blut am Tag vor jeder Injektion und zu folgenden Zeitpunkten entnommen: T6, T9 und T19 (6, 9 bzw. 19 Wochen nach der ersten Injektion.
  • Beispiel 4
  • Anti-VH-CDR3-Antikörper-Nachweis
  • Die Erzeugung von Antikörpern durch behandelte Mäuse wurde durch FACS-Analyse festgestellt, wobei die Seren auf die EBV-transformierten B-Zelllinien (von den Patienten PA und AS) oder auf die aufgetauten, peripheren, mononuklearen Blutzellen (von Patient BA) abgestimmt waren, wonach sich eine Inkubation mit Fluoreszein-konjugiertem (FITC) Ziegen-anti-Maus-Antiserum (Coulter Clone, GAM-FITC) und ein Nachweis durch fluoreszenzaktivierte Fließzytometrie (FACS) (Profile II FACS, Coulter) anschlossen. Sämtliche Färbungsstufen wurden in PBS, das mit 5% FCS, 1% NHS und 0,1% NaN3 ergänzt war (Färbemedium), durchgeführt. 2 × 105 Zellen wurden 40 Minuten im Färbemedium zur Verringerung von nicht-spezifischer Bindung inkubiert, wonach eine erste Färbestufe mit behandeltem Mäuseserum in 1:50- oder 1:20-Verdünnung in Färbemedium mit einem Endvolumen von 100 μl (30 Minuten auf Eis) folgte. Nach drei Waschvorgängen in Färbemedium wurden 105 Zellen als eine interne Kontrolle (nur für PA und AS) zugesetzt und die Zellen wurden einer zweiten Färbestufe mit 1:500-FITC-Ziegen-anti-Maus-Serum in einem Endvolumen von 100 μl unterworfen. Nach weiteren 30 Minuten wurden die Zellen gründlich gewaschen, in Färbemedium resuspendiert und einer Fluoreszenzablesung unter Anwendung einer Profile II-FACS unterzogen.
  • Bei Durchführung unter Verwendung von Serumproben, die vor der ersten Immunisierung (T0) erhalten worden waren, ergab die FACS-Analyse üblicherweise nur einen einzigen Peak, bei dem sich die interne Kontrolle und die doppelt gefärbten Zellen überlappten. Die Proben wurden als positiv in Bezug auf anti-CDR3-Antikörper ausgewählt, wenn zwei Peaks beobachtet wurden: der erste Peak überlappte mit dem mit der T0-Probe erhaltenen Peak und entsprach der internen Kontrolle (d. h. die Zellen, die nach der Färbung mit dem Immunserum zugesetzt wurden, üblicherweise 1/3 der gesamten Zellen), während der zweite Peak mit starker Fluoreszenz auf die Zellen zurückzuführen war, die der Färbung mit "Immun"-Serum unterzogen worden waren (2/3 der gesamten Zellen). Ein durchschnittlich 5-fach höherer Fluoreszenz-Mittelwert für den "Peak mit starker Fluoreszenz" in Bezug zur internen Kontrolle wurde als Schwellenwert einer positiven Beschaffenheit in Bezug auf den antiidiotypischen Antikörper gewählt. Für jede individuelle Maus wurden sämtliche Proben (T0–T19) gleichzeitig gemessen.
  • Die Spezifität der Immunreaktion, die sich gegen jede individuelle VH-CDR3-Sequenz entwickelt hatte, wurde bewertet, indem Seren von jeder Gruppe von Tieren mit Zellen der anderen Patienten abgestimmt und durch FACS mit der gleichen technischen Vorgehensweise analysiert wurden (z. B. Seren von pRCI11-PA-injizierten Mäusen wurden auf BA und AS-Zellen abgestimmt).
  • Beispiel 5
  • IL2 wird an der Stelle von Injektion von bloßer DNA erzeugt.
  • In einem Vorversuch erhielten 8 Swiss-Mäuse im Alter von 2 Monaten eine intramuskuläre (i. m.) Injektion sowohl von pRC111-PA-Vektor, der für Mäuse-IL2 und VH-CDR3 von Patient PA kodiert als auch von leerem pRC100-Plasmid in die kontralateralen Muskeln gemäß den Angaben in Beispiel 3. Die Transkription wurde an der Injektionsstelle durch halbquantitative RT-PCR-Analyse nach 2 Tagen und 1 Woche bewertet.
  • Gesamte zelluläre RNA wurde aus herausgeschnittenen Muskeln gemäß den Angaben von P. Chomezynski et al., "Single step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanato-phenol-chloroform extraction", Anal. Biochem., Bd. 162 (1987), S. 156–159) extrahiert. 500, 50 und 5 ng gesamte RNA wurden unter Verwendung von 500 ng oligo-(dT)-Primern (GIBCO-BRL), 1 mM [dNTPs] (Promega), 10 U AMV-RT (Promega) und 20 U RNAsin (Promega) in einem Endvolumen von 20 μl revers transkribiert.
  • Folgende Inkubationsbedingungen wurden eingehalten: 42°C für 45 Minuten und 99°C für 5 Minuten. Mäuse-β-Actin- und Mäuse-IL2-Sequenzen wurden unter Verwendung von jeweils 5 μl cDNA-Präparat, 1 U Taq-Polymerase (Promega), 2 mM MgCl2 (Promega), 200 μM [dNTPs], 20 pmol eines jeden Primers in 50 μl Endvolumen amplifiziert. Mäuse-β-Actin-Primer: FW: TgAgg CTCTT TTCCA gCCT; RV: CTAgA AgCAC TTgCg gTgCA.
  • Mäuse-IL2-Primer: FW: CACTT CAAgC TCTAC AgCgg A; RV: AAAAT TTgAA ggTgA gCATC C. Die Amplifikation wurde in 38 Zyklen bei 94°C für 1 Minute, 56°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute durchgeführt.
  • 3 zeigt die mit 4 Tieren (mit den Bezeichnungen 1, 2, 3 und 4) erhaltenen Ergebnisse 1 Woche nach Injektion von pRC111-PA in den linken Quadriceps-Muskel bzw. von pRC100 in den kontralateralen Muskel (als C2 und C4 bezeichnet). Eine IL2-Transkription wurde in sämtlichen Muskeln mit Injektion von pRC111-PA, wenngleich auch in unterschiedlichem Ausmaß, nachgewiesen, während keine endogene IL2-Expression in den kontralateralen Muskeln mit pRC100-Injektion nachgewiesen wurde. Die gleichen Ergebnisse wurden 2 Tage nach der Injektion (4 Tiere) erhalten.
  • Beispiel 6
  • Eine bloße DNA-Injektion von pRC111-Vektoren, die für das individuelle VH-CDR3 kodieren, führt zu einer Immunreaktion gegen das an den Tumorzellen des Patienten exprimierte idiotypische Ig.
  • Da humane Subjekte, die möglicherweise von diesem therapeutischen Weg profitieren, ein breites Spektrum von MHC-Haplotypen aufweisen, wurden Swiss-Mäuse als Teststamm ausgewählt, aufgrund der Tatsache, dass sie fremdeingekreuzt (outbred) sind und daher eine Vielzahl von MHC-Haplotypen aufweisen.
  • Somit erhielten Swiss-Mäuse im Alter von 8 Wochen eine intramuskuläre Injektion von pRC101-PA (mIL2)- oder pRC111-PA (mIL2+)-Vektoren, in die VH-CDR3 des Patienten PA kloniert war. Als Kontrollen erhielten drei Gruppen von Mäusen eine Injektion entweder von pRC100 (CDR3, mIL2-Vektor) oder pRC110 (CDR3, mIL2+-Vektor) (Ciafrè et al., "A plasmid family containing two different expression cassettes suitable for immune modulation and genetic vaccination", Plasmid, Bd. 40 (1998), S. 84–89) oder von pRC112 (kodierend für nicht-strukturelles HCV-Antigen NS-3, mIL2+ (Papa et al., "Development of a multigenic plasmid vector for HCV DNA immunization", Res. Virol., Bd. 149 (1998), S. 315–319) gemäß dem gleichen experimentellen Schema, wie es in Beispiel 3 beschrieben wurde.
  • Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der DNA-Injektion wurden den Mäusen Blut entnommen und die Anwesenheit von antiidiotypischen Antikörpern wurde mittels zytofluorimetrischer Analyse getestet. Für jede individuelle Maus wurden sämtliche Proben gleichzeitig vermessen.
  • 4 zeigt die FACS-Analyse, die mit PA682-Zellen (Patient PA) nach Behandlung mit Präimmun-Serumproben (4A) und Immun-Serumproben (4B) einer mit dem pRC111-PA-Vektor geimpften Maus erhalten wurden.
  • Wir bewerteten ferner die Fähigkeit von bloßer DNA, die für die VH-CDR3-Region kodiert, zur Induktion von antiidiotypischen Antikörpern und beobachteten den Einfluss von mIL2 auf diese Reaktion. Nur 20% der Mäuse mit einer Injektion von pRC101-PA (IL2) erzeugten messbare Mengen an antiidiotypischen Antikörpern (Tabelle 2). Die Injektion des Vektors pRC111-PA (IL2+) führte bei 56% der Mäuse zur Erzeugung von Ig-spezifischen Antikörpern. Somit führt IL2, das mit dem Antigen coexprimiert wird, zu einer Steigerung der Wirksamkeit der Immunisierung. Keine spezifischen Antikörper wurden in Mäusen nach Injektion mit pRC100-, pRC110- oder pRC112-Kontrollvektoren nachgewiesen.
  • Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurde die Reaktion bereits 3 Wochen nach der ersten Immunisierung nachgewiesen, erreichte bald nach der zweiten Immunisierung das Maximum und hielt über eine beträchtliche Zeitspanne hinweg an, da sie noch nach etwa 5 Monaten nachgewiesen werden konnte. Ferner wurde kein Abfall des Titers von spezifischen Igs beobachtet. Wie bei der vorliegenden experimentellen Strategie wird häufig festgestellt, dass eine dritte Injektion von DNA nicht immer zu einem Anstieg des Titers oder der Anzahl von Tieren, die einen positiven Test ergaben, führte. Interessanterweise steigert die Coinjektion von IL2 die Anzahl an reagierenden Mäusen, modifiziert aber nicht die Kinetik der Antikörpererzeugung.
  • Tabelle 2
  • Bewertung der Immunreaktion gegen Nicht-Hodgkin-Lymphom-Zellen von Patient PA
  • Fremdeingekreuzte Swiss-Mäuse erhielten eine intramuskuläre Injektion von unterschiedlichen Plasmidkonstrukten zum Zeitpunkt T0 und 3 Wochen (T3) und 16 Wochen (T16) später. Seren wurden 3 (T3), 6 (T6), 9 (T9), 16 (T16) und 19 (T19) Wochen nach der ersten Injektion gewonnen. Lymphom-Zellen des Patienten PA wurden mit Mäuseseren behandelt und durch FAC-Scanning analysiert. Die Ergebnisse sind als prozentualer Anteil von positiven Tieren angegeben.
  • Figure 00170001
  • Bezüglich der Abkürzungen wird auf Tabelle 1 verwiesen.
  • Beispiel 7
  • Anti-CDR3-Reaktionen können mit verschiedenen CDR3s erhalten werden.
  • Zwei weitere Punkte waren zu klären, um diese Möglichkeit für die Immuntherapie vorzuschlagen. Der erste Punkt bestand in dem Nachweis, dass ein derartiger Weg für mehrere verschiedene VH-CDR3s erfolgreich sein kann. Der zweite Punkt bestand in dem Nachweis, dass die hervorgerufenen Antikörper tatsächlich ein "privates" Epitop des Ig erkennen, um die Möglichkeit zur Erzeugung einer systemischen, selbstreaktiven Krankheit auf ein Minimum zu beschränken.
  • Bezüglich dieser Punkte wurden in einer neuen Reihe von Experimenten die VH-CDR3s von 2 weiteren Patienten (AS und BA) kloniert. Swiss-Mäuse wurden mit den erhaltenen Vektoren pRC111-AS bzw. -BA unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 3 immunisiert. Wie in Tabelle 3A gezeigt, war die Rate an positiven Ergebnissen, die unter Verwendung von 3 verschiedenen CDR3s erhalten wurden, ähnlich. Diese Beobachtung bestätigte, dass eine Immunisierung mit bloßer DNA mit dem Vektor pRC111 zu einer anti-CDR3-Reaktion für mehrere verschiedene CDR3s führen kann.
  • Bezüglich des zweiten Punkts wurden Immunseren ferner auf ihre Fähigkeit zur Erkennung von Zellen, die von den übrigen Patienten erhalten worden waren, getestet (beispielsweise wurden in Bezug auf anti-CDR3-PA-Reaktion positive Seren mit Zellen der Patienten AS und BA und umgekehrt abgestimmt). Dieses Experiment ermöglichte uns die Prüfung der Feinspezifität der Antikörper-Reaktion. Es wurde keine Kreuzreaktivität in Bezug auf die CDR3s, die von dem für die Immunisierung verwendeten CDR3 verschieden waren, unter Seren, die positiv getestet worden waren, festgestellt (4C und Tabelle 3). Dieses Ergebnis bestätigt, dass keine Reaktion gegen Gerüstregionen der CDR3s unter Anwendung dieses Verfahrens herbeigeführt wurde und daher das Risiko der Ausbreitung der Immunreaktion in Richtung auf eine systemische Selbstreaktivität möglicherweise gering ist.
  • Tabelle 3
  • Spezifität der anti-VH-CDR3-Immunreaktion gegen lymphoproliferative Zellen von drei verschiedenen Patienten (PA, AS, BA)
  • Fremdeingekreuzte Swiss-Mäuse erhielten zum Zeitpunkt T0 und 3 Wochen (T3) und 6 Wochen (T6) später eine intramuskuläre Injektion von verschiedenen Plasmidkonstrukten. Seren wurden 3 (T3), 6 (T6) und 9 (T9) Wochen nach der ersten Injektion gewonnen.
  • Die Ergebnisse sind als prozentualer Anteil von positivem Serum bei Bestimmung durch FACS-Analyse angegeben.
    Figure 00180001
  • A
    = Prozentualer Anteil von Seren aus Mäusen mit Injektion von pRC111-PA/AS/BA-Vektoren, die mit Patienten-Tumorzellen, die das gleiche VH-CDR3 (PA/AS/BA) exprimieren, reagieren.
    B
    = Spezifität der Immunreaktion gegen jedes VH-CDR3. Seren von Tieren, die eine Injektion mit dem Vektor, der für jeden Idiotyp kodierte, erhalten hatten, wurden mit Patienten-Zellen, die jedes der drei VH-CDR3s exprimierten, behandelt.
    C
    = Kontrollmäuse: Seren von 5 Mäusen, die eine Injektion von CDR3-freiem Vektor (pRC110) erhalten hatten, wurden mit Patienten-Zellen behandelt, die jedes der drei VH-CDR3s exprimierten.
    NT
    = nicht getestet.
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00190001
  • Figure 00200001

Claims (14)

  1. DNA-Sequenzen, bestehend aus: (a) dem Gen, das für die hypervariable Region VH-CDR3 des an B-Zellen von chronischen, B-lymphoproliferativen Störungen exprimierten, idiotypischen Immunoglobulins kodiert, und (b) den Sequenzen, die für die stromaufwärtige Aminosäuresequenz HisThrAlaValTyrTyrCys und die stromabwärtige Aminosäuresequenz ValThrValSerSer kodieren, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen zwischen den Sequenzen, die für die stromaufwärtige Aminosäuresequenz HisThrAlaValTyrTyrCys und die stromabwärtige Aminosäuresequenz ValThrValSerSer kodieren, enthalten ist und dass die DNA-Sequenzen, die für diese hypervariable Region VH-CDR3 kodieren, für Peptide mit einer Länge von 7–45 Aminosäuren kodieren, zur Verwendung als therapeutischer Impfstoff.
  2. DNA-Sequenzen nach Anspruch 1 zur Verwendung als therapeutischer Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, dass die Impfstoffe gegen chronische, B-lymphoproliferative Störungen, die das idiotypische Oberflächen-Immunoglobulin bei Säugern, vorzugsweise beim Menschen, exprimieren, wirksam sind.
  3. DNA-Sequenzen nach Anspruch 1 zur Verwendung als therapeutischer Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz von einem Säuger, vorzugsweise dem Menschen, stammt.
  4. Rekombinanter Plasmid-Expressionsvektor, der sich für die Expression einer DNA-Sequenz in einem Säuger eignet, enthaltend eine damit funktionell verknüpfte DNA-Sequenz, bestehend aus: (a) dem Gen, das für die hypervariable Region VH-CDR3 des an B-Zellen von chronischen, B-lymphoproliferativen Störungen exprimierten, idiotypischen Immunoglobulins kodiert, und (b) den Sequenzen, die für die stromaufwärtige Aminosäuresequenz HisThrAlaValTyrTyrCys und die stromabwärtige Aminosäuresequenz ValThrValSerSer kodieren, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen zwischen den Sequenzen, die für die stromaufwärtige Aminosäuresequenz HisThrAlaValTyrTyrCys und die stromabwärtige Aminosäuresequenz ValThrValSerSer kodieren, enthalten ist und dass die DNA-Sequenzen, die für diese hypervariable Region VH-CDR3 kodieren, für Peptide mit einer Länge von 7–45 Aminosäuren kodieren.
  5. Rekombinanter Plasmid-Expressionsvektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff gegen chronische, B-lymphoproliferative Störungen, die das idiotypische Oberflächen-Immunoglobulin bei Säugern, vorzugsweise beim Menschen, exprimieren, wirksam ist.
  6. Rekombinanter Plasmid-Expressionsvektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz von einem Säuger, vorzugsweise dem Menschen, stammt.
  7. Rekombinanter Plasmid-Expressionsvektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Plasmid-Expressionsvektor auch für ein immunomodulatorisches Molekül kodiert.
  8. Rekombinanter Plasmid-Expressionsvektor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das immunomodulatorische Molekül aus IL-2, GM-CSF, IL-12, IL-6 und Fragmenten von bakteriellen Immunotoxinen ausgewählt ist.
  9. Rekombinanter Plasmid-Expressionsvektor nach Anspruch 4 zur Verwendung als therapeutischer Impfstoff.
  10. Verwendung eines rekombinanten Plasmid-Expressionsvektors nach Anspruch 4 zur Herstellung eines Impfstoffes, der gegen chronische, B-lymphoproliferative Störungen, die das idiotypische Oberflächen-Immunoglobulin in Säugern, vorzugsweise in Menschen, exprimieren, wirksam ist.
  11. Impfstoffzusammensetzung, die gegen chronische, B-lymphoproliferative Störungen, die das idiotypische Oberflächen-Immunoglobulin in Säugern, vorzugsweise in Menschen, exprimieren, wirksam ist, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen rekombinanten Plasmid-Expressionsvektor nach Anspruch 4 enthält.
  12. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einer Form vorliegt, die sich zur parenteralen Verabreichung, vorzugsweise zur intramuskulären Verabreichung, eignet.
  13. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Wasserlösung handelt.
  14. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 12, ferner enthaltend übliche Exzipientien und Adjuvantien.
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GB0414886D0 (en) 2004-07-02 2004-08-04 Neutec Pharma Plc Treatment of bacterial infections
US20070134248A1 (en) * 2005-12-08 2007-06-14 Genitope Corporation Combination therapy and antibody panels

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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