DE69709632T2 - Humanisierte monoklonale anti-cd40 antikörper und fragmente zur hemmung der b-zellaktivierung - Google Patents

Humanisierte monoklonale anti-cd40 antikörper und fragmente zur hemmung der b-zellaktivierung

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Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft humanisierte Antikörper gegen CD40 (bzw. Anti- CD40-Antikörper) und Antikörperfragmente. Die Antikörper können zur Prävention oder Behandlung Antikörper-vermittelter Krankheiten, wie z. B. IgE-vermittelte Krankheit (Allergien) und Autoimmunkrankheiten einschließlich systemischem Lupus erythematodes (SL), primär biliäre Zirrhose (PC), idiopathische thrombozytopenische Purpura (ITP) und rheumatoide Arthritis (RA), verwendet werden.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG I. Aktivierung von B-Zellen
  • B-Zellen spielen während der normalen in vivo-Immunantwort eine wichtige Rolle. Ein fremdes Antigen wird an spezifischen B-Zellen an Oberflächen Immunglobuline binden, wobei eine Kette von Ereignissen ausgelöst wird, die Endozytose, Verarbeitung, Präsentation von verarbeiteten Peptiden an MHC-Klasse-II-Molekülen und eine Regulierung des B7-Antigen an der B-Zelloberfläche einschließen. Eine spezifische T-Zelle bindet dann über eine T-Zellenrezeptor(TCR)-Erkennung von bearbeitetem Antigen, das sich an dem MHC-Klasse-II-Molekül darstellt, an die B-Zelle. Eine Stimulation durch den TCR beginnt, die T-Zelle zu aktivieren, und initiiert die T-Zellcytokinproduktion. Eine Wechselwirkung zwischen dem CD28-Antigen an T- Zellen und dem B7-Antigen an B-Zellen kann ein zweites Signal hervorrufen, das die T-Zelle weiter aktiviert, was in einem höheren Level der Cytokinsekretion resultiert. Außerdem wird der CD40-Ligand, der bei ruhenden humanen T-Zellen nicht exprimiert wird, an der T- Zelloberfläche aktiviert, wenn die oben genannten Signale erhalten werden. Die B-Zelle wird dann durch den CD40-Liganden über das CD40-Antigen an der B-Zelloberfläche und auch durch lösliche Cytokine stimuliert, was die B-Zelle zu einer Plasmazelle reifen lässt, die hohe Level an. löslichem Immunglobulin sekretiert.
    • II. Die EL4B5-Zelllinie
  • Vor einigen Jahren beobachteten Zubler et al., J. Immunol. (1985) 134 : 3662, dass ein mutanter Subclon der Maus-Thymom-EL-4-Linie, als EL4B5 bekannt, B-Zellen sowohl murinen wie auch humanen Ursprungs stark stimulieren konnte, wobei eine in vitro-Proliferation und -Differenzierung zu Immunglobulin-sekretierenden Plasmazellen erfolgte. Es wurde festgestellt, dLass die Aktivierung Antigen-unabhängig und nicht MHC-beschränkt ist. Für eine optimale Stimulation von humanen B-Zellen war das Vorhandensein eines Überstands aus aktivierten humanen T-Zellen erforderlich, allerdings trat auch eine B-Zellantwort auf, wenn EL4B5- Zellen mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) oder IL-1 voraktiviert wurden. Zubler et al. (Immunological Reviews (1987) 99 : 281; und Zhang et al., J. Immunol. (1990) 144 : 2955. Eine B-Zellaktivierung in diesem Kultursystem ist effizient -- limitierende Verdünnungsexperimente haben gezeigt, dass die Mehrheit der humanen B-Zellen zur Proliferation und Differenzierung zu Antikörper-sekretierenden Zellen aktiviert werden kann. Wen et al., Eur. J. Immunol (1987) 17 : 887.
  • Der Mechanismus, durch den diese Mutanten-EL4-Zellen sowohl murine wie auch humane B-Zellen aktivieren, wurde bisher noch nicht geklärt. Es ist allerdings klar, dass für eine EL4B5-induzierte B-Zellaktivierung ein Zell-Zell-Kontakt erforderlich ist. Erstens, B-Zellen vermehren sich nicht in Gegenwart eines Überstandes aus PMA-stimulierten EL4B5-Zellen. Zubler et al. (1985), supra. Zweitens, B-Zellen vermehren sich nicht, wenn sie durch eine semipermeable Filtermembran von PMA-behandelten EL4B5-Zellen getrennt sind. Zhang et al., supra. Antikörper gegen Maus-LFA-1, humanes LFA-1 oder humanes LFA-3 und Antikörper gegen Maus- oder humane MHC-Klasse-II-Moleküle hemmen eine EL4B5-induzierte Proliferation von humanen oder murinen B-Zellen nicht. Zubler et al. (1987) und Zhang et al.,sura.
    • III. Das CD40-Antigen, der CD40-Antigen-Ligand und Antikörper gegen CD40 (bzw. Anti-CD40-Antikörper)
  • Das CD40-Antigen ist ein Glykoprotein, das an der Zelloberfläche von B-Zellen exptimiert wird. Während der B-Zell-Differenzierung wird das Molekül zuerst an Prä-B-Zellen exprimiert und verschwindet von der Zelloberfläche, wenn die B-Zelle eine Plasmazelle wird. Eine Vernetzung der CD40-Moleküle mit Antikörpern gegen CD40 vermittelt eine Vielzahl von Wirkungen auf B-Zellen. Von dem CD40-Antigen ist bekannt, dass es mit dem humanen Nervenwachstumsfaktor(NGF)-Rezeptor und dem Tumornekrosefaktor-alpha(TNF-α)-Rezeptor in Verbindung steht, was nahelegt, dass CD40 ein Rezeptor für einen Liganden mit wichtigen Funktionen bei der B-Zellaktivierung ist.
  • Ein Ligand für CD40 wurde an der Zelloberfläche aktivierter T-Zellen identifiziert. Fenslow et al., J. Immunol. (1992) 149 : 655; Lane et al., Eur. J. Immunol. (1992) 22 : 2573; Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1992) 89 : 6550. Eine cDNA-Clonierung des CD40-Liganden zeigte ein Molekül mit Charakteristika eines Transmembran-Glykoproteins Typ II mit Homologie zu TNF-α. Armitage et al., Nature (1992) 357 : 80 und Spriggs et al., J. Exp. Med. (1992) 176 : 1543. Die extracelluläre Domäne des CD40-Liganden enthält zwei Argininreste, die der Transmembranregion benachbart sind, die eine potentielle proteolytische Spaltungsstelle bereitstellt, die zu einem Anstieg der löslichen Form des Liganden führen könnte. Eine Expression von rekombinantem CD40-Liganden hat demonstriert, dass dieses Molekül die Proliferation von gereinigten B-Zeilen stimulieren kann und in Kombination mit IL-4 die IgE-Sekretion vermitteln kann. Armitage et al. und Spriggs et al., supra. Es wurde beschrieben, dass Abnormalitäten im Gen für den CD40-Liganden, die zum Fehlen eines funktionellen Moleküls an aktivierten T-Zellen führen, für das Auftreten des X-gebundenen Hyper-IgM-Syndroms, eine seltene Krankheit, die durch die Unfähigkeit dieser Patienten, normale Level an anderen Antikörper- Isotypen als IgM zu produzieren, gekennzeichnet ist, verantwortlich sind. Allen et al., Science (1993) 259 : 990 und Korthäuer et al., Nature (1993) 361 : 539.
  • Antikörper gegen CD40 haben eine stimulatorische Wirkung auf humane B-Zellen. Eine Vernetzung der CD40-Moleküle an der B-Zelloberfläche unter Verwendung bekannter Antikörper gegen CD40 vermittelt eine Vielzahl von Wirkungen auf B-Zellen. Monoclonale Antikörper gegen CD40 (mAbs) können eine intercelluläre Adhäsion, Proliferation und in Kombination mit bestimmten Cytokinen Reifung zu Antikörper-sekretierenden Zellen induzieren. Es wurde gezeigt, dass z. B. Anti-CD40-rnAbs die Wirkung von T-Helferzellen bei der B-Zellaktivierung nachahmen. Wenn sie an anhaftenden Zellen, die FcγRII exprimieren, vorliegen, induzieren diese Antikörper eine B-Zellproliferation. J. Bancereau et al., Science (1989) 251 : 70. Darüber hinaus können die bekannten Anti-CD40-mAbs das T-Helfer-Signal zur Sekretion von IgM, IgG und IgE in Gegenwart von IL-4 ersetzen. H. Gascan et al., J. Immunol. (1991) 147 : 8. Darüber hinaus können bekannte Anti-CD40-mAbs einen programmierten Zelltod (Apoptosis) von B-Zellen, die aus Lymphknoten isoliert wurden, verhindern.
  • Die Anti-CD40-Antikörper auf dem obigen Gebiet stimulieren B-Zellen, sind aber unfähig, die B-Zellantwort zu inhibieren.
  • WO 94/01547 offenbart ein Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern gegen Zelloberflächenmoleküle, einschließlich Antikörper gegen CD40, die eine B-Zellproliferation hemmen. Solche Antikörper werden auch von Kwekkeboom et al., Immunology, 79 : 439-440 (1993) offenbart, welche beschreibt, dass solche Antikörper eine Aktivierung von humanen B-Zellen durch murine EL4B5-Zellen hemmen kann.
  • WO 93/11794 beschreibt Verfahren und Materialien zur Herstellung von modifzierten Antikörper-variablen Domänen und therapeutische Verwendungen davon. Padlan, Molecular Immunology, 28 : 489-498 (1991) beschreibt ein Verfahren zur Reduzierung der Immunogenität von Antikörper-variablen Domänen, während die Ligandenbindungseigenschaften konserviert werden.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • lDie vorliegende Erfindung basiert auf der Feststellung, dass Anti-CD40-Antikörper das Wachstum und die Differenzierung von humanen B-Zellen nicht stimulieren. Im Gegenteil, diese Antikörper können die humane B-Zellantwort in relativ geringen Konzentrationen hemmen. Dementsprechend können diese Antikörper zur Prävention oder Behandlung von Krankheiten oder Zuständen verwendet werden, welche durch Antikörper vermittelt werden, die durch die humane B-Zellantwort produziert werden. Diese Antikörper erkennen auch neue Epitope am CD40-Antigen, die zur Modulierung der B-Zellantwort verwendbar sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen humanisierten monoclonalen Antikörper 5D12 bereit, der aus der hinterlegten Hybridom-Zelllinie mit der Bezeichnung ATCC HB 11339 erhältlich ist, wobei der Antikörper an ein humanes CD40-Antigen bindet, das an der Oberfläche einer humanen B-Zelle lokalisiert ist, wobei die Bindung des Antikörpers an das CD40-Antigen das Wachstum oder die Differenzierung der B-Zelle verhindert, wobei der humanisierte monoclonale Antikörper 5D12, der die VHx und VLx-Aminosäuresequenzen umfasst, welche durch die cDNA-Sequenzen codiert werden, die in den Fig. 12 und 13 dargestellt sind.
  • Die Erfindung stellt ferner ein Antigen-bindendes Fragment des monoclonalen Antikörpers 5D12 bereit, wobei der Antikörper aus der hinterlegten Hybridomzelllinie mit der Bezeichnung ATCC HB 11339 erhältlich ist, wobei der humanisierte monoclonale Antikörper 5D12, der die VHx und VLx-Aminosäuresequenzen umfasst, die durch die cDNA-Sequenzen codiert werden, welche in den Fig. 12 und 13 dargestellt sind. Solche Fragmente können das Fragment Fab, F(ab')&sub2; oder Fv sein.
  • Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die einen humanisierten monoclonalen Antikörper oder ein humanisiertes Antigen = bindendes Fragment der Erfindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Fig. 1A zeigt eine schematische Darstellung des baculoviralen Transfervektors pAcC8 und der Sequenz der mehrfachen Clonierungsstelle. Fig. 1B zeigt eine schematische Darstellung der Bildung von Sf9-Zellen, die humanes CD40- oder B7-Antigen exprimieren.
  • Fig. 2 zeigt die Sequenzen von Polymerasekettenreaktions-Primern, die bei der Herstellung der codierenden Regionen für humanes CD40- und humanes B7-Antigen verwendet werden. Diese Primer wurden auf der Basis der veröffentlichten vollständigen DNAcodierenden Sequenzen für die Antigene B7 und CD40 veröffentlicht.
  • Fig. 3 zeigt die Resultate von ELISA-Assays, die die Reaktion des monoclonalen Antikörpers S2C6 gegen CD40 mit Sf9-Zellen, die CD40 exprimieren, und mit Sf9-Zellen, die B7 exprimieren, untersucht.
  • Fig. 4 zeigt die Resultate der Fluoreszenszellfärbung der EBV-transformierten B- Zelllinien-ARC-Zellen, die CD40 exprimieren.
  • Fig. 5A vergleicht die Fähigkeit von drei neuen (5D12, 3C6 und 3A8)-Anti-CD40- mAbs und einem alten (S2C6)-Anti-CD40-mAb zur Co-Stimulation einer Anti-IgM-induzierten humanen B-Zellproliferation. Fig. 5B wiederholt das Experiment von Fig. 5A in Gegenwart von rekombiniertem Interleukin-2 (rIL-2).
  • Fig. 6 zeigt die Fähigkeit von drei neuen Anti-CD40-mAbs zur Hemmung der humanen B-Zellproliferation, die durch Co-Stimulation mit immobilisiertem Anti-IgM und Anti- CD40-mAb S2C6 induziert wird.
  • Fig. 7 zeigt den Effekt von drei neuen Anti-CD40-mAbs auf die EL4B5-induzierte humane B-Zellproliferation.
  • Fig. 8 zeigt den Effekt von löslichem CD40 (hCD40.hu) auf die EL4B5-induzierte humane B-Zellproliferation.
  • Fig. 9A und 9B zeigen den Effekt eines neuen Anti-CD40-mAb SD 12 auf die humane T-Zell-induzierte Immunglobulinherstellung von humanen B-Zellen.
  • Fig. 10 zeigt die DNA-Sequenz für die murine variable Region der schweren Kette (VHM) des monoclonalen Antikörpers 5D12 und die dadurch codierte Aminosäuresequenz unter Verwendung herkömmlicher Einbuchstaben-Bezeichnungen. Fig. 10 markiert in VHM die erste Aminosäure jeder der vier Gerüstregionen (FR1, FR2, FR3 und FR4) und die drei Komplementarität-bestimmenden Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3), die in abwechselnder Weise dazwischen positioniert sind.
  • Fig. 11 zeigt die DNA-Sequenz für die murine variable Region der leichten Ketten (VLM) des monoclonalen Antikörpers 5D12 und die dadurch codierte Aminosäuresequenz unter Verwendung herkömmlicher Einbuchstaben-Bezeichnungen. Fig. 11 markiert in VLM die erste Aminosäure jeder der vier Gerüstregionen (FR1, FR2, FR3 und FR4) und die drei Komplementarität-bestimmenden Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3), die in abwechselnder Weise dazwischen positioniert sind.
  • Fig. 12 zeigt die DNA-Sequenz für die humanisierte variable Region der schweren Kette (VHx) des monoclonalen Antikörpers 5D12 und die dadurch codierte Aminosäuresequenz unter Anwendung herkömmlicher Einbuchstaben-Bezeichnungen. Fig. 12 markiert in VHx die erste Aminosäure jeder der vier Gerüstregionen (FR1, FR2, FR3 und FR4) und die Komplementarität-bestimmenden Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3), die in abwechselnder Weise dazwischen positioniert sind.
  • Fig. 13 zeigt die DNA-Sequenz für die humanisierte variable Region der leichten Kette (VLx) des monoclonalen Antikörpers 5D 12 und die dadurch codierte Aminosäuresequenz unter Verwendung der herkömmlichen Einbuchstaben-Bezeichnungen. Fig. 13 markiert auch VLx am ersten Aminosäurerest jeder der vier Gerüstregionen (FR1, FR2, FR3 und FR4) und der drei Komplementarität-bestimmenden Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3), die in abwechselnder Weise dazwischen positioniert sind.
  • Fig. 14 vergleicht die Bindung von murinem monoclonalem Antikörper 5D12, chimärem 5D12 Fab, chimärer VL, chimärer VH, humanisierter VL, humanisierter VH und humanisiertem 5D12 Fab an CD40-exprimierende Zellen durch FACScan flow-Cytometer-Kurven untereinander und mit FITC-Konjugat als Kontrolle. Fig. 14 zeigt, dass chimäres 5D12 Fab und humanisiertes 5D12 Fab dieselbe Bindung an CD40-exprimierende Zellen aufweisen, wie dies beim monoclonalen Antikörper 5D12 der Fall ist.
  • Fig. 15 ist eine graphische Vergleichsdarstellung der mittleren Fluoreszensintensität (MFI) gegen Fab-Verdünnungen (1 = 16, 1 = 8, 1 4, 1 = 2 und 1 = 1) von chimärem 5D12 Fab (ausgefüllte Rechtecke) und humanisiertem 5D12 Fab (offene Ovale). Um die Kurvenpunkte zu erhalten, wurden CD40-exprimierende B-Zellen (Zelllinie JY) mit 50 ng intaktem monoclonalem Antikörper 5D12 zusammen mit den verdünnten Mengen des exprimierten chimären oder humanisierten 5D12 Fab in 100 ul für dreißig Minuten bei 4ºC inkubiert, dann wurde die MFI gemessen. Die Verdünnung 1 = 1, die 70 ng chimäres 5D12 Fab oder 80 ng humanisiertes 5D12 Fab enthielt, war fähig, 50% des intakten murineri monoclonalen Antikörpers 5D12 zu inhibieren.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Definitionen:
  • Der Ausdruck "Antikörper", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf polyclonale Antikörper, monoclonale Antikörper, humanisierte Antikörper, Einzelketten-Antikörper und Fragmente davon, z. B. Fab, F(ab')2, Fv, und andere Fragmente, z. B. CDR-Fragmente, die die Antigenbindungsfunktion des Elternantikörpers beibehalten.
  • Der Ausdruck "monoclonaler Antikörper", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Antikörperzusammensetzung mit homogener Antikörperpopulation. Der Ausdruck ist bezüglich der Spezies oder der Quelle des Antikörpers nicht beschränkt, noch soll er durch die Art, in der er hergestellt wird, in irgendeiner Weise beschränkt werden. Der Ausdruck umfasst ganze Immunglobuline, wie auch Fragmente, z. B. Fab, F(ab')2, Fv und andere, z. B. CDR- Fragmente, die die Antigenbindungsfunktion des Antikörpers beibehalten. In der vorliegenden Erfindung können monoclonale Antikörper einer beliebigen Säugerspezies eingesetzt werden. In der Praxis werden die Antikörper wegen der Verfügbarkeit von Ratten- oder murinen Zelllinien bei der Verwendung der Herstellung der erforderlichen Hybridzelllinien oder Hybridome zur Herstellung monoclonaler Antikörper typischerweise von Ratten oder Mäusen stammen.
  • Der Ausdruck "humanisierte monoclonale Antikörper", wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass mindestens ein Teil der freigelegten Aminosäuren in den Gerüstregionen des Antikörpers (oder Fragments), die nicht mit den entsprechenden Aminosäuren in den meisten homologen humanen Gegenstücken übereinstimmen, ausgetauscht werden, z. B. durch eine sequenzspezifische Mutagenese der DNA, die für den Antikörper codiert. Da diese freiliegenden Aminosäuren sich an der Oberfläche des Moleküls befinden, wird diese Technik "resurfacing" genannt. Da darüber hinaus die Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls die sind, die am wahrscheinlichsten eine Immunantwort hervorrufen, verringert dieses Resurfacing die Immunogenität des monoclonalen Antikörpers, wenn er einer Spezies verabreicht wird, deren Zelllinie nicht zur Erzeugung des Antikörpers verwendet wurde, z. B. einem Menschen. Der Ausdruck "humanisierter monoclonaler Antikörper" umfasst auch einen chimären Antikörper, bei dem die leichten und schweren variablen Regionen eines monoclonalen Antikörpers, der durch ein Hybridom aus einer nicht humanen Zelllinie erzeugt wird, jeweils über Rekombinationstechnik an eine konstante Region der humanen leichten Kette bzw. mindestens eine konstante Region einer schweren Kette gebunden werden. Die Herstellung von solchen chimären (d. h. humanisierten) Antikörpern ist in Referenzen offenbart, die hier als solche aufgenommen sind.
  • Der Ausdruck "einkettige Antikörper" bezieht sich auf Antikörper, die durch Bestimmung der Bindungsdomänen (sowohl schwere wie leichte Ketten) eines Bindungsantikörpers und Zuführen einer Bindungsgruppierung, die eine Konservierung der Bindungsfunktion erlaubt, hergestellt werden. Dies bildet im Wesentlichen ein radikal gekürzter Antikörper, der nur den Teil der variablen Domäne hat, der zur Bindung an das Antigen notwendig ist. Bestimmung und Aufbau einkettiger Antikörper werden im U. S. Patent Nr. 4 946 779 von Ladner et al. beschrieben.
  • Der Ausdruck "CD40-Antigenepitop", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das zur Immunreaktivität mit den monoclonalen Antikörpern gegen CD40 der Erfindung fähig ist, ausgeschlossen das Antigen CD40 selbst. CD40-Antigen-Epitope können Proteine, Proteinfragmente, Peptide, Kohlenhyrate, Lipide und andere Moleküle umfassen; zum Zweck der vorliegenden Erfindung sind sie am gängigsten Proteine, kurze Oligopeptide, Oligopeptidmimiks (d. h. organische Verbindungen, die die Antikörper-Bindungseigenschaften des CD40-Antigens nachahmen) oder Kombinationen davon. Geeignete Oligopeptidmimiks werden inter alia in WO 91/19735 beschrieben.
    • I. Antikörperherstellung
  • Monoclonale Antikörper gegen CD40 5D12, 3A8 und 3C6 wurden wie in Beispiel 1 in dieser Beschreibung beschrieben hergestellt. Humanisierte monoclonale Antikörperfragmente gegen CD40 wurden wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt.
    • a) Polyclonale Seren
  • Polyclonale Seren können nach konventionellen Verfahren hergestellt werden. Im Allgemeinen wird zuerst eine Lösung, die das CD40-Antigen enthält, zur Immunisierung eines geeigneten Tiers, vorzugsweise einer Maus, einer Ratte, eines Kaninchens oder einer Ziege, verwendet. Kaninchen und Ziegen sind infolge des erhältlichen Serumvolumens und der Verfügbarkeit markierter Anti-Kaninchen- und Anti-Ziege-Antikörper zur Herstellung polyclonaler Seren bevorzugt. Eine Immunisierung wird im Allgemeinen durch Vermischen oder Emulgieren der Antigen-enthaltenden Lösung in Salzlösung, vorzugsweise in einem Adjuvans, z. B. Freunds vollständigem-Adjuvans und Injizieren des Gemisches oder der Emulsion parenteral (im Allgemeinen subkutan oder intramuskulär) durchgeführt. Im Allgemeinen ist eine Dosis von 50 bis 200 ug/Injektion typischerweise ausreichend. Die Immunisierung wird im Allgemeinen 2 bis 6 Wochen später durch eine oder mehrere Injektionen des Proteins in Salzlösung, vorzugsweise in Freund's-unvollständigem-Adjuvans, verstärkt. Man kann alternativ Antikörper durch eine in-vitro-Immunisierung unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren erzeugen, was zu Zwecken der vorliegenden Erfindung als Äquivalent zu einer in-vitro- Immunisierung angesehen wird.
  • Polyclonale Antiseren werden erhalten, indem das immunisierte Tier in einen Glas- oder Kunststoff-Behälter ausbluten gelassen wird, das Blut eine Stunde lang bei 25ºC inkubiert wird, worauf sich eine Inkubation bei 4ºC für 2 bis 18 Stunden anschließt. Das Serum wird durch Zentrifugation (z. B. 1000 · g für 10 Minuten) gewonnen. Aus Kaninchen können etwa 20 bis 50 ml pro Bluten erhalten werden.
    • b) Monoclonale Antikörper
  • Monoclonale Antikörper werden unter Verwendung des Verfahrens von Kohler und Milstein, Nature (1975) 254 : 495-96 oder einer Modifikation desselben, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist, hergestellt. Typischerweise wird eine Maus oder eine Ratte wie oben beschrieben immunisiert. Allerdings werden die Milz (und fakultativ verschiedene große Lymphknoten) entfernt und zu einzelnen Zellen dissoziiert, bevor das Tier zum Extrahieren des Serums ausbluten gelassen wird. Wenn gewünscht, können die Milzzellen durch Auftragen einer Zellsuspension auf eine Platte oder eine Vertiefung, die mit dem Proteinantigen überzogen ist, durchgemustert werden (nach Entfernung nicht spezifisch anhaftender Zellen). B-Zellen, die membrangebundenes Immunoglobulin exprimieren, das für das Antigen spezifisch ist, binden an die Platte und werden mit dem Rest der Suspension nicht weggespült. Resultierende B-Zellen oder alle dissozüerten Milzzellen werden dann induziert, um mit Myelomzellen unter Bildung von Hybridomen zu verschmelzen und werden in einem selektiven Medium (z. B. Hypoxanthin-, Aminopterin-, Thymidin-Medium, "HAT") kultiviert. Die resultierenden Hybridome werden durch limitierende Verdünnung plattiert und werden auf die Produktion von Antikörpern, die spezifisch an das gewünschte immunisierende Zelloberflächenantigen binden (und die nicht an nichtverwandte Antigene binden), untersucht. Die selektierten mAb-sekretierenden Hybridome werden dann entweder invitro (z. B. in Gewebekulturflaschen oder Hohlfaserreaktoren) oder in vivo (als Ascites in Mäusen) kultiviert.
  • Wenn gewünscht, können die Antikörper (entweder polyclonale oder monoclonale) unter Verwendung herkömmlicher Techniken markiert werden. Geeignete Markierungen umfassen Fluorophore, Chromophore, radioaktive Atome (insbesondere ³²P und ¹²&sup5;I) Elektronendichtereagentien, Enzyme und Liganden mit spezifischen Bindungspartnern. Enzyme werden typischerweise durch ihre Aktivität nachgewiesen. So wird beispielsweise Meerrettichperoxidase durch ihre Fähigkeit, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) in ein blaues Pigment umzuwandeln, was mit einem Spektralphotometer quantitativ bestimmt werden kann, nachgewiesen. Der Ausdruck "spezifische Bindungspartner" bezieht sich auf ein Protein, das fähig ist, ein Ligandenmolekül mit hoher Spezifität zu binden, so z. B. im Fall eines Antigens und eines monoclonalen Antikörpers, der für dieses spezifisch ist. Andere spezifische Bindungspartner umfassen Biotin und Avidin oder Streptavidin, IgG und Protein A sowie die zahlreichen Rezeptor-Ligand-Paare, die auf diesem Gebiet bekannt sind. Es sollte selbstverständlich sein, dass die obige Beschreibung nicht bedeutet, dass die verschiedenen Markierungen in getrennte Klassen eingeteilt werden, da dieselbe Markierung nach verschiedenen unterschiedlichen Modi eingesetzt werden kann.
  • ¹²&sup5;I kann z. B. als radioaktive Markierung oder als elektronendichtes Reagens dienen. HRP kann als Enzym oder als Antigen für einen mAb dienen. Außerdem kann man für einen gewünschten Effekt verschiedene Markierungen kombinieren. Beispielsweise verlangen auch mABs und Avidin Markierungen in der Praxis der vorliegenden Erfindung; so könnte man einen mAb mit Biotin markieren und sein Vorliegen mit Avidin, das mit ¹²&sup5;I markiert ist, oder mit einem Anti-Biotin-mAb, der mit HRP markiert ist, nachweisen. Weitere Permutationen und Möglichkeiten werden dem Fachmann auf diesem Gebiet klar werden und werden als Äquivalente im Rahmen der vorliegenden Erfindung angesehen.
    • CD40-Antigen-Epitope
  • Die CD40-Antigen-Epitope sind Moleküle, die mit den Anti-CD40-monoclonalen Antikörpern, deren Bindung an ein humanes CD40-Antigen, die an der Oberfläche einer humanen B-Zelle lokalisiert ist, das Differenzierungswachstum der B-Zelle verhindert, immunreaktiv sind. D. h., solche Epitope konkurrieren mit der Bindung dieser Antikörper an das CD40- Antigen. Systematische Techniken zur Identifizierung dieser Epitope sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden von H. M. Geysen im U. S. Patent Nr. 4 708 871 beschrieben. Typischerweise sind diese Epitope kurze Aminosäuresequenzen. Diese Sequenzen können in die Sequenz längerer Peptide oder Proteine eingebettet sein, solange sie zugänglich sind.
  • Die Epitope können nach Standardpeptid-Synthesetechniken, z. B. Festphasensynthese, hergestellt werden. Alternativ können die Sequenzen durch Rekombinationsverfahren in größere Peptide oder Proteine eingearbeitet werden. Dies erfolgt am einfachsten, indem eine DNA- Kassette hergestellt wird, die für die interessierende Sequenz codiert, und die Kassette in DNA, die für das Protein codiert, ligasiert wird, um diese so an der geeigneten Stelle zu modifizieren. Die DNA-Sequenz kann nach Standardsynthesetechniken synthetisiert werden oder kann unter Verwendung der geeigneten Restriktionsenzyme aus dem Phage pIII-Gen ausgeschnitten werden.
  • Epitope, die hier identifiziert werden, können durch einfache Festphasentechniken hergestellt werden. Die minimale Bindungssequenz kann für jedes Epitop systematisch durch Standardmethoden, z. B. durch Verwendung des Verfahrens, das von H. M. Geysen, U. S. Patent Nr. 4 708 871 beschrieben wird, bestimmt werden. Kurz, man kann einen Satz überlappender Oligopeptide, die aus dem CD40-Antigen stammen und an eine Festphasen-Stiftanordnung gebunden sind, wobei an jedem Stift eineinziges Oligopeptid ist, synthetisieren. Die Stifte sind so angeordnet, dass sie mit dem Format einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen übereinstimmen, was es ermöglicht, alle Pins gleichzeitig z. B. auf Bindung an einen Anti-CD40- monoclonalen Antikörper zu untersuchen. Unter Anwendung dieses Verfahren kann leicht die Bindungsaffinität für jeden möglichen Untersatz aufeinanderfolgender Aminosäuren bestimmt werden. Zur Synthese von Epitopen können auch die Festphasenverfahren, die in WO 91/19785 beschrieben sind, verwendet werden.
    • Formulierungen und Verabreichungsverfahren
  • Die Antikörper der vorliegenden Erfindung werden in einer Konzentration verabreicht, die therapeutisch wirksam ist, um Antikörper-vermittelte Erkrankungen, wie z. B. Allergien, SLE, PBC, ITP und RA, zu behandeln oder diesen vorzubeugen. Um dieses Ziel zu erreichen, können die Antikörper unter Verwendung einer Vielzahl annehmbarer Träger, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, formuliert werden. Typischerweise werden die Antikörper durch Injektion, entweder intravenös oder intraperitoneal verabreicht. Verfahren zur Durchführung dieser Verabreichung sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Es kann auch möglich sein, Zusammensetzungen zu erhalten, die topisch oder oral verabreicht werden oder die geeignet sind, durch Schleimhautmembranen aufgenommen zu werden.
  • Vor Verabreichung an Patienten können Formulierungsmittel zu den Antikörpern gegeben werden. Eine flüssige Formulierung ist bevorzugt. Diese Formulierungsmittel können z. B. Öle, Polymere, Vitamine, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Salze, Puffer, Albumin, oberflächenaktive Mittel oder Volumenmittel enthalten. Kohlenhydrate umfassen vorzugsweise Zucker oder Zuckeralkohole, z. B. Mono-, Di- oder Polysaccharide, oder wasserlösliche Glucane. Das Saccharid oder die Glucane können Fructose, Dextrose, Lactose, Glucose, Mannose, Sorbose, Xylose, Maltose, Saccharose, Dextran, Pullulan, Dextrin, alpha- und beta-Cyclodextrin, lösliche Stärke, Hydroxyethylstärke und Carboxymethylcellulose oder Gemische davon umfassen. Saccharose ist am bevorzugtesten. "Zuckeralkohol" wird als C&sub4;-C&sub8;-Kohlenwasserstoff definiert, der eine OH-Gruppe hat, und umfasst Galacitol, Inositol, Mannit, Xylit, Sorbit, Glycerin und Arabitol. Mannit ist am bevorzugtesten. Diese oben genannten Zucker oder Zuckeralkohole können einzeln oder in Kombination eingesetzt werden. Es gibt keine festgelegte Grenze für die verwendete Menge, solange der Zucker oder der Zuckeralkohol in der wässrigen Zubereitung löslich sind. Vorzugsweise ist die Zucker- oder Zuckeralkoholkonzentration 1,0 Gew./Vol.-% bis 7,0 Gew./Vol.-%, bevorzugter 2,0 bis 6,0 Gew./Vol.-. Vorzugweise umfassen Aminosäuren linksdrehende Formen (L) von Carnitin, Arginin und Betain; es können aber auch andere Aminosäuren zugesetzt werden. Bevorzugte Polymere umfassen Polyvinylpyrrolidon (PVP) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 2000 und 3000 oder Polyethylenglykol (PEG) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 3000 und 5000. Es ist auch bevorzugt, in der Zusammensetzung einen Puffer zu verwenden, um pH-Änderungen in der Lösung vor Lyophilisierung oder nach Verdünnung zur ursprünglichen Konzentration auf ein Minimum zu beschränken. Meistens kann ein physiologischer Puffer eingesetzt werden, allerdings sind Citrat-, Phosphat-, Succinat- und Glutamat-Puffer oder Gemische derselben bevorzugt. Am stärksten bevorzugt ist ein Citratpuffer. Vorzugsweise ist die Konzentration 0,01 bis 0,3 molar. Oberflächenaktive Mittel, die der Formulierung zugesetzt werden können, sind in den EF Nrn. 270 799 und 268 110 gezeigt.
  • Außerdem können Antikörper durch covalente Konjugation an ein Polymer chemisch modifiziert werden, um z. B. ihre Zirkulations-Halbwertszeit zu erhöhen. Bevorzugte Polymere sind in den U. S. Patenten 4 179 337, 4 495 285 und 4 609 546 beschrieben. Bevorzugte Polymere sind polyoxyethylierte Polyole und Polyethylenglykol (PEG). PEG ist bei Raumtemperatur in Wasser löslich und hat die allgemeine Formel R(O-CH&sub2;-CH&sub2;)nO-R, worin R Wasserstoff, eine Schutzgruppe, z. B. eine Alkyl- oder Alkanol-Gruppe, sein kann. Die Schutzgruppe hat vorzugsweise 1 bis 8 Kohlenstoffatome und ist bevorzugter Methyl. Das Symbol n ist eine positive ganze Zahl, vorzugsweise zwischen 1 und 1000, bevorzugter zwischen 2 und 500. PEG hat ein bevorzugtes durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 1000 und 40.000, bevorzugter zwischen 2000 und 20.000, am bevorzugtesten zwischen 3000 und 12.000. PEG hat vorzugsweise mindestens eine Hydroxygruppe, wobei diese bevorzugter eine terminale Hydroxygruppe ist. Es ist diese Hydroxygruppe, die vorzugsweise aktiviert ist, um mit einer freien Aminogruppe am Inhibitor zu reagieren. Allerdings wird es selbstverständlich sein, dass jeder Typ und jede Menge der reaktiven Gruppen variiert werden kann, um einen covalent konjugierten PEG- Antikörper der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
  • In der vorliegenden Erfindung sind auch wasserlösliche polyoxyethylierte Polyole einsetzbar. Sie umfassen polyoxyethyliertes Sorbit, polyoxyethylierte Glycose, polyoxyethyliertes Glycerin (POG), usw. POG ist bevorzugt. Ein Grund dafür ist der, dass die Glycerinhauptkette von polyoxyethyliertem Glycerin dieselbe Hauptkette ist, die natürlicherweise z. B. bei Tieren und Menschen in Mono-, Di- und Triglyceriden auftritt. Daher wird diese Verzweigung nicht notwendigerweise als fremdes Agens im Körper angesehen. Das POG hat ein bevorzugtes Molekulargewicht in demselben Bereich wie PEG. Die Struktur für POG ist in Knauf et al., 1988 J. Bio. Chem. 263 : 15064-15070 dargestellt und eine Diskussion von POG/IL-2-Konjugaten wird im U. S. Patent Nr. 4 766 106 gefunden.
  • Ein weiteres Arzneimittel-Zuführungssystem zur Erhöhung der Zirkulations- Halbwertszeit ist das Liposom. Verfahren zur Herstellung von Liposom-Zuführungssystemen werden in Gabizon et al., Cancer Research (1982) 42 : 4734; Cafiso, Biochem. Biophys. Acta (1981) 649 : 129; und Szoka, Ann. Rev. Biophys. Eng. (1980) 9 : 467 diskutiert. Weitere Arzneimittel-Zuführungssysteme sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden z. B. in Poznansky et al., DRUG DELIVERY SYSTEMS (R. L. Juliano, Herausg., Oxford, N. Y. 1980), S. 253-315; M. L. Poznansky, Pharm. Revs. (1984) 36 : 277 beschrieben.
  • Nachdem die flüssige pharmazeutische Zusammensetzung hergestellt ist, wird sie vorzugsweise lyophilisiert, um einen Abbau zu verhindern und Sterilität zu bewahren. Verfahren zur Lyophilisierung flüssiger Zusammensetzungen sind dem Fachmann auf diesem Gebiet geläufig. Unmittelbar vor der Verwendung kann die Zusammensetzung mit einem sterilen Verdünnungsmittel (Ringer's-Lösung, destilliertes Wasser oder sterile Salzlösung beispielsweise), das zusätzliche Ingredientien enthalten kann, wieder auf die ursprüngliche Konzentration verdünnt werden. Bei Wiederverdünnung auf die ursprüngliche Konzentration wird die Zusammensetzung vorzugsweise an Personen verabreicht, wobei die Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, angewendet werden.
  • Wie oben festgestellt wurde, werden die Antikörper und die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von menschlichen Patienten verwendet, um Antikörper-vermittelte Erkrankungen, z. B. Allergien, SLE, PBC, ITP und RA, zu verhindern oder diesen vorzubeugen. Der bevorzugte Verabreichungsweg ist parenteral. Bei der parenteralen Verabreichung werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in einer injizierbaren Form als Einheitsdosis, z. B. als Lösung, Suspension oder Emulsion, in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren parenteralen Träger formuliert. Solche Träger sind von sich aus nichttoxisch und nicht-therapeutisch. Beispiele für solche Träger sind Salzlösung, Ringers-Lösung, Dextroselösung und Hank's-Lösung. Nicht-wässrige Vehikel, wie z. B. fixierte Öle und Ethyloleat, können auch verwendet werden. Ein bevorzugtes Vehikel ist 5% Dextrose in Salzlösung. Das Vehikel kann geringere Mengen an Additiven enthalten, z. B. Substanzen, die die Isotonizität und chemische Stabilität erhöhen, einschließlich Puffer und Konservierungsstoffe.
  • Die Dosierung und die Art der Verabreichung wird vom Individuum abhängen. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen so verabreicht, dass die Antikörper in einer Dosis zwischen 1 ug/kg und 20 mg/kg, bevorzugter zwischen 20 ug/kg und 10 mg/kg, am günstigsten zwischen 1 und 7 mg/kg gegeben werden. Im Allgemeinen werden sie als Bolus-Dosis gegeben, um die Zirkulationslevel um das 10- bis 20-Fache und für 4 bis 6 Stunden nach der Bolus-Dosis zu erhöhen. Nach der Bolus-Dosis kann auch eine kontinuierliche Infusion angewendet werden. Dabei können die Antikörper mit einer Dosis zwischen 5 und 20 ug/kg/Minute, bevorzugter zwischen 7 und 15 ug/kg/Minute infusiert werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele, welche besonders vorteilhafte Ausführungsformen darstellen, mehr erläutert. Allerdings sollte betont werden, dass diese Ausführungsformen erläuternd sind und in keiner Weise zur Beschränkung der Erfindung gedacht sind.
    • BEISPIELE Materialien und Verfahren Zelllinien
  • Der mutante Maus-Thymoma-EL-4-Subclon EL4B5 war ein Geschenk von Dr. R. H. Zubler, Hôpital Cantonal Universitaire, Genf. Transfizierende Maus-3T6-Zellen, die Hybridmoleküle der allelen HR(high responder)-Form von humanem FγRIIa exprimieren, waren ein Geschenk von Dr. P. A. M. Warmerdam, Department of Experimental Immunology, University Hospital Utrecht, Utrecht, Niederlande. Warmerdam et al., J. Immunol. (1991) 147 : 1388. Beide Zelllinien wurden in Iscove's-modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM), ergänzt mit Gentamicin (80 ug/ml) und 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) (Hyclone, Logan, Utah) kultiviert. Um einen möglichen Verlust an B-Zellaktivierungsaktivität zu vermeiden, wurde alle 4 bis 8 Wochen eine neue Charge an EL4B5-Zellen aufgetaut. Die Zellen wurden periodisch durch Verwendung einer ³H-markierten DNA-Sonde für ribosomale Mykoplasma-RNA (GenProbe, San Diego, CA) auf Mykoplasmakontamination untersucht und waren im Verlauf der Experimente von Mykoplasma frei.
    • Antikörper und hCD40.hu-Fusionsprotein
  • Anti-CD40 mAB 5D 12, 3C6 und 3A8 wurden erzeugt, indem Mäuse mit Insektenzellen immunisiert wurden, die rekombinantes humanes CD40 exprimieren, was in Beispiel 1 gezeigt ist. Anti-(B7)mAb B7-24 wurde in ähnlicher Weise durch Immunisierung mit Insektenzellen, die rekombinante humane B exprimieren, erzeugt. Anti-CD40 mAb S2C6 war ein Geschenk von Dr. S. Pauli (Universität Stockholm, Schweden). Pauli et al., J. Immunol. (1989) 142 : 590, Anti-CD40 mAB G28.S wurde von Dr. J. A. Ledbetter (Oncogen Corporation, Seattle, WA, USA) erhalten. Clark et al., PNAS (USA) (1986) 83 : 4494. Kontroll-Antikörper waren. Anti-(β- glucocerebrosidase)mAB 8E4 (IgGl), Barneveld et al., Eur. J. Biochem. (1983) 134 : 585, und Myelom-Immunoglobuline MOPC-21 (IgG1) und MOPC-141 (IgG2b) (Sigma, St. Louis, MO). Alle mAb wurden als gereinigte Antikörper-Präparationen verwendet. hCD40.hu- Fusionsprotein war ein Geschenk von Dr. P. Lane (Institut für Immunologie Basel, Schweiz) und wurde als 5x konzentrierter Überstand von transfizierten J558L-Zellen eingesetzt. Lane et al., Eur. J. Immunol. (1992) 22 : 2573.
    • Humane B-Lymphozyten
  • B-Lymphozyten wurden aus Mandeln isoliert, die von Kindern erhalten wurden, welche eine Tonsillektomie durchmachten, und zwar im Wesentlichen so, wie es in De Groot et al., Lymphokine Research (1990) 9 : 321 beschrieben ist. Kurz, das Gewebe wurde mit Skalpellblättern dispergiert, phagozytische und NK-Zellen wurden durch Behandlung mit 5 mM L- Leucinmethylester erschöpft und T-Zellen wurden durch einen Rosettencyclus mit Schaferythrozyten (SRBC), die mit 2-Aminoethylisothiouroniumbromid behandelt waren, entfernt. Die Reinheit der resultierenden B-Lymphozytenpräparation wurde mit indirekter Immunofluoreszensmarkierung mit Anti-(CD20)mAb B 1 (Coulter Clone, Hialeah, FL) oder Anti- (CD3)mAB OKT3 (Ortho, Raritan, NJ) und einem FITC = konjugierten F(ab')&sub2;-Fragment von Kaninchen-Anti-(Maus Ig) (Zymed, San Francisco, CA) und FACS-Analyse untersucht. Die B- Zellpräparation enthielt (Mittelwert ± SD 6 Isolierungen): 95 ± 4% CD20-positive Zellen und 2 ± 4% CD20-positive Zellen und 2 ± 1% CD3-positive Zellen.
    • Assay auf B-Zellproliferation
  • B-Zellen (4 · 10&sup4; pro Vertiefung) wurden in 200 ul IMDM, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt war, in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen und flachem Boden kultiviert. B-Zellen wurden durch Zusatz von immobilisierten Anti-(IgM)-Antikörpern (Immunobeads (Registrierte Marke in einem oder mehreren der bezeichneten Staaten); 5 ug/ml; Bio-Rad (Registrierte Marke in einem oder mehreren der bezeichneten Staaten), Richmond, CA) stimuliert. Wenn angegeben, wurden 100 E/ml rekombinantes IL-2 zugesetzt. Variierende Konzentrationen an mAbs wurden zu Beginn zu den Mikrokulturen gegeben und am Tag 3 wurde die Proliferation durch Messung des Einbaus von [³H]-Thymidin nach achtzehn Stunden Pulsation untersucht.
    • Assay auf B-Zellproliferation nach Banchereau
  • Zur Untersuchung der Fähigkeit von Anti-CD40-mAbs, die B-Zellproliferation in einem Kultursystem, analog dem von Banchereau et al., Science (1991) 251 : 70 beschriebenen zu stimulieren, wurden transfizierende 3T3-Mauszellen verwendet, die die allele HR-Form von humanern FcγRII exprimieren. B-Zellen (2 · 10&sup4; pro Vertiefung) wurden in Mikrovertiefungen mit flachem Boden in Gegenwart von 1 · 10&sup4; transfizierenden Zellen (bestrahlt mit 5000 Rad) in 200 ul IMDM, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum und 200 E/ml rekombinantem IL-4, kultiviert. Vor Zugabe der B-Zellen wurden die 3T6-Zellen für mindestens fünf Stunden an den Kulturkunststoff haften gelassen. Anti-CD40-mAbs wurden in Konzentrationen, die zwischen 15 mg/ml und 2000 ng/ml variierten, zugesetzt, und die Proliferation der B-Zellen wurde durch Messung des Thymidineinbaus am Tag 7 bei 18 stündiger Pulsation mit [³H]-Thymidin bestimmt.
    • B-Zellaktivierungsassay mit EL4B5-Zellen
  • B-Zellen (1000 pro Vertiefung) wurden zusammen mit bestrahlten (5000 Rad) EL4B5- Zellen (5 · 10&sup4; pro Vertiefung) in Mikrotiterplatten mit flachem Boden in 200 ul IMDM, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum, 5 ng/ml Phorbol-12-myristat-13-acetat (Sigma) und 5% humanem T-Zellüberstand kultiviert. Zu Beginn der Kulturen wurden mAbs in unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt, und am Tag 6 wurde der Thymidineinbau nach 24 Stunden Pulsation mit [³H]-Thymidin bestimmt. Für die Herstellung des T-Zellüberstands wurden gereinigte T-Zellen in einer Dichte von 106/ml für 36 Stunden in Gegenart von 1 ug/ml PHA und 10 ng/ml PMA kultiviert. Wen et al., supra. Der T-Zellüberstand wurde durch Zentrifugieren der Zellen erhalten und bei -20ºC gelagert. Die Wirksamkeit der T-Zellüberstände bei Verstärkung der Proliferation von humanen B-Zellen in EL4B5-B-Zellkulturen wurde untersucht, und die wirksamsten Überstände wurden gesammelt und in den Experimenten verwendet.
    • Test mit humanen T-Helferzellen auf die Antikörperproduktion durch Zellen
  • Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit einer 1 : 500-Verdünnung von Ascitesflüssigkeit von Anti-CD3-mAB-CLB-T3/3 (CLB, Amsterdam, Niederlande) beschichtet. Wie angegeben, wurden costimulatorische mAbs zugesetzt: Anti-CD2-mAbs CLB-T11.1/1 und CLB-T11.2/1 (CLB, Amsterdam, Niederlande), Ascites 1 : 1000 und Anti-CD28-mAB CLB-28/1 (CLB, Amsterdam, Niederlande).
  • Anschließend wurden Mandel-T-Zellen (bestrahlt, 3000 Rad; 10&sup5; pro Vertiefung), Mandel-B-:Zellen (10&sup4; pro Vertiefung) und rIL-2 (20 E/ml) zugesetzt. Das Endvolumen jeder Zellkultur war 200 ul. Nach acht Tagen wurden die Zellen zentrifugiert, und der zellfreie Überstand geerntet. Die Konzentrationen an humanem IgM und IG in (verdünnten) Proben wurden wie unten beschrieben durch ELISA bestimmt.
    • ELISA-Assay auf Immunglobulin-Quantifizierung
  • Die Konzentrationen an humanem IgM und IgG wurden durch ELISA bestimmt. ELI- 5A-Platten mit 96 Vertiefungen wurden mit 4 ug/ml murinem Anti-humanes IgG-mAb-MH-16- 01 (CLB, Amsterdam, Niederlande) oder mit 1,2 ug/ml murinem Anti-humanes IgM-mAB- 4102 (Tago, Burlingame, CA) in 0,05 M Carbonatpuffer (pH = 9,6) durch Inkubation für 16 h bei 4ºC beschichtet. Die Platten wurden dreimal mit PBS-0,05% Tween-20 (PBS-Tween: eingetragene Marke in einem oder mehreren der bezeichneten Staaten) und mit BSA für eine Stunde gesättigt. Nach zweimaligem Waschen wurden die Platten für eine Stunde bei 37ºC mit unterschiedlichen Verdünnungen der Testproben inkubiert. Nach drei Waschgängen wurde gebundenes Ig durch Inkubation für 1 Stunde bei 37ºC mit 1 ug/ml Peroxidase-markiertem murinen Anti-humanes-IgG-mAb-MH-16-01 (CLB) oder murinen Anti-humanes-IgM-mAb-MH-15-01 (CLB) nachgewiesen. Die Platten wurden viermal gewaschen und gebundene Peroxidaseaktivität wurde durch Zusatz von o-Phenylendiamin als Substrat gezeigt. Humanes Standardserum (H00, CLB) wurde verwendet, um eine Standardkurve für jeden Assay zu erstellen.
    • Assay auf cytofluorometrische Strömung
  • ARC-Zellen (10&sup6; Zellen pro Probe) wurden in 100 ul primärem Antikörper (10 ug/ml in PBS-BSA oder Hank's-ausgeglichener-Salzlösung (HBSS), ergänzt mit 1% BSA und 0,05% Natriumazid) für zwanzig Minuten bei 4ºC inkubiert. Nach drei Waschgängen mit PBS-BSA oder HBSS-BSA wurden die Zellen in 100 ul FITC-markierten F(ab')&sub2;-Fragmenten von Ziege- Anti-(Maus IgG)-Antikörpern (Jackson, West Grove, PA) für zwanzig Minuten bei 4ºC inkubiert. Nach drei Waschgängen mit PBS-BSA oder HBSS-BSA und einem Waschgang mit PBS wurden die Zellen in 0,5 ml PBS resuspendiert. Die Analysen wurden mit einem FACSCAN V (Becton-Dickinson, San Jose, CA) durchgeführt.
  • Alternativ wurden EL4B5-Zellen vor der Kultur und zu verschiedenen Zeitpunkten während der Kultur in einem Medium, das PMA (5 ng/ml) und humanen T-Zellüberstand (5%) enthielt, geerntet. Die Zellen wurden für dreißig Minuten mit 10 ul Überstand von transfiszierten Zellen, enthaltend hCD40.hu, verdünnt in 100 ul Hank's-ausgeglichener-Salzlösung, die mit 0,05% Natriumazid ergänzt war (4ºC), inkubiert. Es folgte eine Inkubation mit FITCkonjugierten F(ab')&sub2;-Fragmenten von Kaninchen-Anti-(humanes IgM) (Central Laboratory der Niederlande, Bluttransfusionsservice, Amsterdam, Niederlande). Als Kontrollen wurden Zellen nur mit dem FITC-Konjugat inkubiert. Zur Analyse wurde ein FACScan-4-Cytofluorometer (Beeton-Dickinson) verwendet. Nicht-lebende Zellen wurden durch die Verwendung von Propidiumiodid von der Analyse ausgeschlossen.
    • c) Humanisierte monoclonale Antikörper
  • Die oben beschriebenen monoclonalen Antikörper, die fähig sind, die CD40-CD40- Liganden-Wechselwirkung zu blockieren, sind ein nützliches therapeutisches Werkzeug bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen. Da allerdings viele der monoclonalen Antikörper aus einer nicht humanen (z. B. murinen) Zelllinie stammen, können die Antikörper im Lauf der Zeit vom humanen Rezipienten als fremd erkannt werden, und es kann eine Immunantwort aufgebaut werden, die nachfolgende Verabreichungen der monoclonalen Antikörper neutralisieren würde. Da die Immunogenität eines Fremdproteins in großem Umfang durch die Natur der Oberfläche bestimmt wird, wurde entschieden, dass die Immunogenität monoclonaler Antikörper, die von nicht humanen Zelllinien stammen, reduziert oder abgeschafft werden könnte, wenn eine wirksame Menge freiliegender(d. h. Oberflächen)-Aminosäuren in den Gerüstregionen des Antikörpers durch solche Aminosäuren ersetzt würden, die üblicherweise in humanen Antikörpern gefunden werden.
  • Techniken zur Humanisierung monoclonaler Antikörper sind auf dem Gebiet wohlbekannt. Techniken zur Humanisierung eines monoclonalen Antikörpers sind in den folgenden Publikationen beschrieben:
  • 1) Rodwell, "Engineering Monoclonal Antibodies", Nature, 342 : 99-100 (1989);
  • 2) Reichmann, et al., "Reshaping Human Antibodies For Therapy", Nature, 332 : 323-327 (1988);
  • 3) Waldman, Thomas, "Monoclonal Antibodies in Diagnosis and Therapy", Science, 252 : 1657-1662 (1991);
  • 4) Oi, et al., "Chimeric Antibodies", Bio Techniques, 4(3):214 : 221 (1986);
  • 5) Liu, et al., "Production Of A Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody To CD20 With Patent Fc-Dependent Biologie Activity", J. Immunol., 139 : 3521-3526 (1987);
  • 6) Beidler, et al., "Cloning and High Level Expression of A Chimeric Antibody With Specificity For Human Carcinoembryonic Antigen"; J. Immunol.,141 : 4053-4060 (1986);
  • 7) Jones, et al., "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse", Nature, 321 : 522-525 (1986);
  • 8) Wood, et al., "The Synthesis And In Vivo Assembly of Functional Antibodies In Yeast", Nature, 314 : 446-449 (1985);
  • 9) U. S. Patent 4 816 567 (Cabilly, et al.) "Recombinant Immunoglobulin Preparations";
  • 10) Morrison, "Transfectomas Provide Novel Chimeric Antibodies", Science 229 : 1202-1207 (1985);
  • 11) Better, et al., "Escherichia coli Secretion of an Active Chimeric Antibody Fragment", Science, 240 : 1041-1043 (1988);
  • 12) Boulianne, G. L., et al., "Production of Functional Chimeric Mouse/Human Antibody", Nature 312 : 643-646 (1984); und
  • 13) Heuberger, et al., "A Hapten-specific Chimeric IgE antibody With Human Physiological Effector Function", Nature 314 : 268-270 (März 1985).
  • Zur Humanisierung eines monoclonalen Antikörpers werden z. B. die variable schwere Kette (VH) und die variable leichte Kette (VL) des zu humanisierenden monoclonalen Antikörpers cloniert, sequenziert, mit einer Reihe der meisten homologen humanen Sequenzen verglichen und dann wird die DNA-Sequenz, die für den monoclonalen Antikörper codiert, durch Sequenz-spezifische Mutagenese modifiziert. Es wird insbesondere Messenger-RNA, die für den zu humanisierenden monoclonalen Antikörper codiert, aus dem Hybridom, das den Antikörper produziert, erhalten. Um mRNA zu erhalten, die den monoclonalen Antikörper codiert, werden die Hybridomzellen zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und mit Quanidiumthiocyanat in Gegenwart von 0,7M 2-Mercaptoethanol lysiert. Das Zelllysat wird auf einen diskontinuierlichen CsCl-Gradienten geschichtet und für etwa sechzehn Stunden bei 26.000 UpM in einer Beckman(in einem oder mehreren der bezeichneten Staaten eine eingetragene Marke)-Zentrifuge, die einen SW28-Rotor hat, zentriftigiert. Die RNA wird isoliert, indem das resultierende Pellet in Diethylpyrocarbonat-behandeltem H&sub2;O (DEPC-behandeltem H&sub2;O) gelöst wird. Die RNA wird mit Ethanol ausgefällt, noch einmal in DEPC-behandeltem H&sub2;O resuspendiert und bei -70ºC gelagert.
  • Eine Amplifikation der cDNA, die für die variablen Regionen der schweren und leichten Kette des mAb codiert, wird durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines Satzes degenerierter Primer mit Restriktionsstellen zur Clonierung durchgeführt. Das typische Primerset besteht aus acht 5'-Primern für die variable Region der schweren Kette (VH), die mit einem universellen 3'-Primer, der in der konstanten Region der schweren Kette (CH) lokalisiert ist, kombiniert sind, und fünf 5'-Primer für die variable Region der leichten Kette (VL), die mit einem universellen 3'-Primer, der in der konstanten Region der leichten Kette (CL) lokalisiert ist, kombiniert sind. Gegebenenfalls wird eine Bestimmung, welcher der Primersets für die Amplifikation der VH- und VL-Regionen am besten geeignet ist, durchgeführt. Danach werden mehrfache PCR-Durchläufe durchgeführt, wobei eine niedrige Zykluszahl angewendet wird, um die Einarbeitung von PCR-Fehlern zu vermeiden. Die PCR-Produkte, die nach etwa 24 Amplifikationszyklen erhalten werden, werden in den Polylinker eines Sequenzierungsvektors subcloniert. Verschiedene (z. B. sechs) unabhängige Clone werden sowohl auf VH wie auch auf VL analysiert. Dies führt zu einer Übereinstimmungssequenz für die cDNA und die abgeleitete Proteinsequenz der VH- bzw. VL-Region für den monoclonalen Antikörper. Die abgeleitete Proteinsequenz ist mit der Stelle der Gerüstregionen (FR) und der Komplementarität-bestimmenden Regionen (CDR), die die Antigen-Bindungsstelle des Antikörpers bilden, überlagert.
  • Um einen humanisierten Antikörper mit mindestens einer Wahrscheinlichkeit zur Erzeugung einer Immunantwort in einem Menschen zu bilden, werden die abgeleiteten Proteinsequenzen der VH- und VL-Regionen verwendet, um verschiedene Datenbasen für eine humane Antikörpersequenz mit der besten Homologie zu monoclonalem Antikörper (oder Fragment, wenn nur ein Fragment humanisiert werden soll) zu suchen. Die Resultate für die VH- und VL- Regionen werden tabellarisch geordnet. Mehrere (z. B. drei) der besten übereinstimmenden humanen Antikörpersequenzen werden verwendet, um festzustellen, welche der nicht humanen Aminosäuren in dem freigelegten Gerüst in eine humane Aminosäure geändert werden sollte, um eine humanisierte Version des monoclonalen Antikörpers zu erhalten.
  • Es werden PCR-Primer aufgebaut, um die ausgewählten freigelegten Reste aus nichthuman in human zu ändern. Dem Fachmann auf diesem Gebiet ist bekannt, dass die codierende Zahl rnutagener Primer, die aufgebaut werden, von der Zahl der mutagenen Stellen, die in die VH- und VL-Region eingeführt werden soll, abhängt. Um z. B. insgesamt sieben nichtbenachbarte mute mutagene Stellen sowohl in die VH- wie auch die VL-Region einzuführen, werden insgesamt acht Primer für die Mutagenese der VH-Region und in gleicher Weise acht Primer für die VL-Region aufgebaut. cDNA, die für die nicht-humane Sequenz codiert, wird als Matrize für die PCR-Reaktionen eingesetzt. Sowohl die humanisierte variable schwere Region (VHx) als auch die humanisierte variable leichte Region (VLx) werden in drei aufeinanderfolgenden PCR- Schritten aufgebaut. Nach dem End-PCR-Schritt wird das PCR-Konstrukt in den Polylinker eines Sequenzierungsvektors subcloniert.
  • Die VHx- und VLx Subclone werden unter Verwendung von Standardtechniken aus den Sequenzvektoren zu Expressionsvektoren transferiert, welche bereits einen Teil der humanen konstanten schweren (CHH)-Region und die vollständige humane konstante leichte (CLH)- Region codieren; dadurch werden Expressionsvektoren hergestellt, die für VHxCHH bzw. VLxCLH codieren. Die Expressionsvektoren, die für VHxCHH und VLxCLH codieren, werden in Sf9-Insektenzellen cotransfiziert, woraufhin die transfizierten Insektenzellen den Antikörper als humanisiertes monoclonales Antikörperfragment sekretieren.
  • Zur Herstellung eines chimären monoclonalen Antikörpers aus einem nicht humanen monoclonalen Antikörper werden alternativ die variablen Regionen der ursprünglichen nichthumanen(z. B. Maus-)-schweren und leichten Ketten (VHM und VLM) des monoclonalen Antikörpers, wie oben beschrieben, jeweils in die Expression oben transferiert, die bereits die CHH- und CLH-Regionen eines humanen Fab-Fragments codierte, wodurch Expressionsvektoren, die für VHMCHH und VLMCLH codieren, in Sf9-Insektenzellen produziert werden, wobei die transfizierten Insektenzellen den Antikörper als humanes/murines chimäres monoclonales Antikörperfragment sekretieren.
    • Beispiel 1 Herstellung der monoclonalen Antikörper gegen B7 und CD40 A. PCR-Clonierung von CD40 und B7
  • IRNA wurde aus einer Population EBV-transformierter humaner Milzzellen isoliert, und zwar im Wesentlichen, wie es von Chirgwin et al., Biochemistry (1979) 17 : 5294b : 5294 beschrieben ist. Kurz ausgedrückt, die Zellen wurden zweimal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und in 5 M Guanidiniumthiocyanat in Gegenwart von 0,7 M 2- Mercaptoethanol lysiert. Das Zelllysat wurde auf einen diskontinuierlichen CsCl-Gradienten (Chirgwin et al.) geschichtet und für 16 Stunden bei 26.000 UpM in einem Beckman-SW28- Rotor zentrifugiert. Die RNA wurde durch Auflösen des Pellets in DEPC-behandeltem H&sub2;O gewonnen. Die RNA wurde einmal mit Ethanol ausgefällt, in DEPC-behandeltem H&sub2;O resuspendiert und bei -70ºC gelagert.
  • Die gesamte RNA (10 ug/Reaktion) wurde unter Verwendung eines statistischen Hexamers als Primer in 50 ul Reaktionspuffer, enthaltend 500 Einheiten MLV-RT (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD), 5 uM statistisches Hexamer (Pharmacia, Piscataway, NJ), 1 mM MgCl&sub2; und 0,1 mg/ml BSA (Rinderserumalbumin), in cDNA umgewandelt. Nach Inkubation bei 37ºC für eine Stunde wurden die Proben für drei Minuten gekocht und bei -70ºC gelagert. Die DNA, die für die CD40- und B7-Moleküle codiert, wurde durch PCR unter Verwendung von Primern, die Sequenzen enthalten, die Homologie zu der bekannten CD40- und B7-Sequenz haben, erzeugt, wobei die Primer auch Restriktionsstellen codierten, die zum Clonieren verwendbar sind (Fig. 2). Diese Primer basierten auf den veröffentlichten cDNAcodierenden Sequenzen für B7 und CD40. Freeman et al., J: Immunol (1989) 143 : 1714 und Stamenkovic et al., EMBO J. (1989) 8 : 1403. Alle Primer beginnen mit einer C-G-Klemme am 5'-Ende, gefolgt von einer Restriktionsstelle zum Clonieren (in Fig. 2 fett dargestellt). Die unterstrichenen Sequenzen in den Rückwärtsprimern zur Clonierung der löslichen Formen von B7 und CD40 stellen ein Epitop dar, das von einem monoclonalen Antikörper erkannt wird, der zur Affinitätsreinigung verwendet wird. Die Nummern in den Klammern geben die Lage der Primer bezüglich der veröffentlichten cDNA für CD40 und B7 an.
  • Zur PCR-Amplifikation wurde 1 ul cDNA mit 1 ul (10 Picomol) eines Vorwärtsprimers, 1 ul (10 Picomol) eines Rückwärtsprimers und 47 ul PCR-Mischung vermischt. Die PCR- Mischung bestand aus 1,25 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin-Elmer/Cetus, Norwalk, CT), dNTP-Mischung (0,2 mM jeweils), 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl&sub2; und 0,1 mg/ml BSA. Das 50 ul-PCR-Gemisch wurde mit 70 ul Mineralöl beschichtet und 25 Amplifikationszyklen in einem Perkin-Elmer/Cetus-Thermozykler unterworfen (Denaturierung bei 95ºC für 30 Sekunden, Primer-Erhitzen bei 55ºC für 30 Sekunden und Extension bei 72ºC für 1,5 Minuten). Nach 25 Amplifikationszyklen wurden PCR-Produkte erhalten.
  • Die Amplifikationsprodukte wurden mit BgIII und KpnI (Fig. 1B) abgebaut und durch Größenfraktionierung isoliert. Vor der Expression in Baculovirus wurde die DNA-Sequenz jedes Fragments durch Sequenzierungsanalyse bestätigt, um die Einführung von PCR-induzierten Mutationen zu verhindern. Der Baculovirus-Transfervektor pAcCB wurde mit BgIII und KpnI abgebaut (Fig. 1B).
  • Die amplifizierten Fragmente wurden an den linearen pAcC8-Vektor (Verhältnis von Insert zu Vektor war 3 : 1) ligiert. Die Ligationsprodukte wurden in den Bakterienstamm DHSα (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) transformiert, und es wurden rekombinante pAcC8-Vektoren auf der Basis der Ampicillinresistenz selektiert. Aus bakteriellen Clonen wurden rekombinante Plasmide isoliert (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratories, 1982; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Media, PA: John Wiley and Sons)) und das Vorliegen des interessierenden Inserts durch Polymerasekettenreaktionen verwirklicht (siehe oben). Eine Plasmidherstellung in großem Maßstab wurde nach Standardverfahren durchgeführt (Ausubel et al.; Maniatis et al., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor, NY; Cold Spring : Harbor Laboratories), 1989).
    • B. Baculovirusexpression von humanem CD40 und B7
  • Sequenzen, die für humanes CD40 und humanes B7 codieren, wurden in den Autographa californica-Baculovirus (AcNPV) rekombiniert, wobei die Transfervektoren pAcCD40 (codiert für das CD40-Molekül voller Länge), pAcCD40-ED/Glu (codiert für die extracelluläre Domäne von CD40), pAcB7 (codiert für das B7-Molekül voller Länge) und pCcB7-ED/Glu (codiert für die celluläre Domäne des B7-Moleküls) verwendet wurden.
  • Die Plasmide wurden mit baculoviraler Wildtyp-DNA (2 bis 10 pfu) (AcNPV; Summer et al A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987)) in Sf9 (Spodoptera frugiperda)- Zellen bei einer Dichte von 10&sup6; Zellen/ml (Summers et al.) cotransfiziert. Rekombinante Baculovirus-infizierte Sf9-Zellen wurden identifiziert und clonal gereinigt (Summers et al.).
  • Zur Zelloberflächenexpression von rekombinanten Proteinen wurden die Zellen nach 4Bstündiger Kultur geerntet.
    • C. Sf9-Insektenzellen-ELISA
  • Sf9-Insektenzellen, die mit rekombinantem Virus infiziert waren, wurden für 48 Stunden in Platten mit 24 Vertiefungen kultiviert. Nach Entfernung des Gewebekulturmediums wurden die Platten für 45 Minuten mit 0,25 ml Antikörper in PBS mit 1% BSA (PBS-BSA) bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Nach drei Waschgängen mit PBS-BSA wurden die Platten für 35 Minuten mit 250 ul einer 1/250-Verdünnung von Ziege-Anti-(Maus Gesamt-Ig)- Immunglobulinen an Meerreitichperoxidase (Zymde, South San Francisco, CA) konjugiert in PBS-BSA inkubiert. Ungebundene Peroxidaseaktivität wurde durch fünfmaliges Waschen mit PBS-BSA entfernt. Gebundene Peroxidaseaktivität wurde durch Zusatz eines Assaygemisches, hergestellt durch Verdünnen von 0,5 ml 2 mg/ml 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin in Ethanol mit 10mM Natriumacetat, 10 mM EDTA-Puffer (pH 5,0) und Zusetzen von 0,03% (Vol./Vol.) H&sub2;O&sub2; auf 10 ml, gezeigt. Die Reaktion wurde nach 10 Minuten durch Zugabe von 100 ul 1 M H&sub2;SO&sub4; gestoppt.
  • Die oben beschriebenen ELISA-Assays, die an lebenden Sf9-Zellen durchgeführt worden waren, ergaben die folgenden Resultate. Fig. 3 stellt die Daten für lebende Sf9-Zellen dar, die mit pAcB7 und pAcCD40 infiziert waren und die für 48 Stunden in Platten mit 24 Vertiefungen kultiviert worden waren. Die Antikörper, die im ELISA zur Bildung von Fig. 3 verwendet wurden, waren: S2C6 (Anti-CD40, nicht ausgefüllte Balken) und kein primärer Antikörper (schraffierte Balken).
    • D. Wirtstier-Immunisierung
  • Weiblichen BALB/c-Mäusen wurden am Tag 0 und am Tag 14 5 · 10&sup6; Sf9-Zellen, die mit AcCD40-Virus, AcB7-Virus oder AcCD3-Virus (Kontrollvirus) infiziert waren, injiziert. Am Tag 21 wurden 100 ul Serum erhalten, um auf das Vorliegen spezifischer Antikörper zu testen. Nach einem Ruhezeitraum von mindestens 2 Wochen erhielten die Mäuse eine abschließende Injektion mit 5 · 106 Zellen, die mit AcCD40 oder AcB7-Virus infiziert waren. Drei Tage nach dieser letzten Injektion wurden die Milzzellen zu der Zellfusion verwendet.
    • E. Erzeugung von Hybridom-Clonen
  • Splenozyten aus immunisierten BALB/c-Mäusen wurden mit murinen SP2/0- Myelomzellen im Verhältnis 10 : 1 unter Verwendung von 50% Polyethylenglykol fusioniert, wie es bereits früher von Boer et al., J. Immunol. Meth. (1988) 113 : 143 beschrieben ist. Die fusionierten Zellen wurden in komplettem IMDM-Medium, ergänzt mit Hypoxanthin (0,1 mM), Thymidin (0,016 mM) und 0,05 ng/ml hIL-6 (Genzyme, Cambridge, MA) resuspendiert. Die fusionierten Zellen wurden dann zwischen den Vertiefungen von Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen verteilt, sodass jede Vertiefung im Schnitt ein wachsendes Hybridom enthielt.
  • Nach 10 bis 14 Tagen wurden die Überstände der Hybridompopulationen auf spezifische Antikörperproduktion durchgemustert. Zur Durchmusterung auf spezifische Antikörperproduktion der Hybridomclone wurden die Überstände von 12 Vertiefungen gesammelt und zur Fluoreszens-Zellfärbung von EBV-transformierten B-Zellen wie für den oben beschriebenen FACS- Assay verwendet. Anschließend wurden die Überstände der positiven Pools einzeln untersucht. Positive Hybridomzellen wurden dreimal durch limitierende Verdünnung in IMDM/FBS, enthaltend 0,5 ng/ml hIL-6, cloniert. Drei Hybridome-produzierende Anti-CD40-Antikörper werden markiert: 5D12, 3A8 und 3C6. Die Daten sind in Fig. 4 gezeigt, die zeigt, dass eine lösliche Form von CD40, aber keine von B7 die Bindung des Anti-CD40-mAb 5D 12 an CD40- exprimierende EBV-transformierte B-Zellen blockieren kann. Fig. 4 zeigt die Fluoreszenszellfärbung von ARC EBV-transformierten B-Zellen mit 5D12 in Gegenwart oder Abwesenheit von löslichem B7 und löslichem CD40. 5D12 und das lösliche B7, das lösliche CD40 oder Kontrollen wurden vor Zusatz zu den ARC-Zellen bei Raumtemperatur für 20 Minuten vorinkubiert. Fig. 4A zeigt eine Färbung mit 5D12 (unterbrochene Linie) oder nur mit sekundärem Antikörper (durchgezogene Linie). Fig. 4B zeigt eine Färbung nur mit 5D 12 (unterbrochene) Linie oder vorinkubiert mit löslichem B7 (durchgezogene Linie). Fig. 4C zeigt ein Färben mit 5D12 allein (unterbrochene Linie) oder vorinkubiert mit löslichem CD40.
    • Beispiel 2 Costimulierung der B-Zellproliferation unter Verwendung von Anti-CD40-mAbs
  • In Beispiel 1 wurden vier Hybridome, die monoclonale Antikörper gegen humanes CD40 produzieren, erzeugt. Es wurde gezeigt, dass diese mAbs im gleichen Verhältnis an Mandel-B-Zellen binden, wie dies Anti-CD40-mAB-G28.5 tut. de Boer et al., J. Immunol Methods (1992) 152 : 15. Drei dieser monoclonalen Antikörper (5D12, 3A8 und 3C6), die zur IgG2b- Unterklasse gehörten, wurden auf ihre Fähigkeit, im B-Zellproliferationsassay, der oben beschrieben wurde, Aktivierungssignale an humanen B-Zellen zu liefern, getestet.
  • Humane B-Zellen von Mandeln (4 · 10&sup4; pro Vertiefung) wurden in 200 ul in Mikrovertiefungen in Gegenwart von Anti-IgM, gebunden an Sepharoseperlen (5 u/ml) (Fig. 5A) oder in Gegenwart von Anti-IgM-plus-rIL-2 (100 E/ml) (Fig. 5B) kultiviert. Unterschiedliche Konzentrationen an Anti-CD40-mAbs S2C6, 5D12, 3C6 oder 3A8 wurden zugesetzt und der [³H]- Thymidineinbau wurde am Tag 3 nach 18stündiger Pulsation gemessen. Die in Fig. 5A dargestellten Daten sind Mittelwerte, die aus Experimenten mit B-Zellpräparationen von drei verschiedenen Donoren bei doppelten Inkubationen stammen. Die Daten von Fig. 5B sind Mittelwerte von doppelten Inkubationen aus einem Experiment mit zwei vergleichbaren Resultaten.
  • Keiner der neuen Anti-CD40-mABs war zu einer Costimulierung humaner B- Zellproliferation in Gegenwart von immobilisiertem Anti-IgM oder in Gegenwart von immobilisiertem Anti-IgM und IL-2 fähig. Dagegen trat mit Anti-CD40-mAB S2C6 eine Costimulierung der humanen B-Zellproliferation in Konzentrations-abhängiger Art auf.
    • Beispiel 3 Induktion einer B-Zellproliferation unter Verwendung von Anti-CD40-mAbs
  • Die in Beispiel 2 untersuchten mAbs wurden auf ihre Fähigkeit, eine Proliferation humaner B- Zellen in Banchereau-artigem Assay, der oben beschrieben ist, z. B. indem der Anti-CD40-mAb an anheftenden Zellen, die FcγRll exprimieren, dargeboten wird. Als Antikörper-bietende Zellen wurden transfizierte Maus-3T6-Zellen, die die allele HR-Form von humanem FcγRII exprimieren., verwendet. Es wurde beobachtet, dass Anti-CD40-mAb S2C6 zusammen mit IL-4 eine wesentliche Proliferation von humanen B-Zellen aus Mandeln in diesem System induzierte, was durch die Messung des [³H]-Thymidineinbaus festgestellt wurde. Anti-CD50-mAbs 5D12, 3C6 oder 3A8 induzierten allerdings keine Proliferation humaner B-Zellen in diesem Kultursystem (Daten nicht gezeigt).
    • Beispiel 4 Inhibierung der S2C6-stimulierten B-Zellproliferation unter Verwendung von Anti- CD40-mAEs
  • Die mAbs wurden auch auf ihre Fähigkeit getestet, die Costimulierung von humaner B- Zellproliferation durch Anti-CD40-mAb S2C6 zu inhibieren, wobei der oben beschriebene B- Zellproliferationsassay angewendet wurde. Humane B-Zellen aus Mandeln (4 · 10&sup4; pro Vertiefung) wurden in 200 ul in Mikrovertiefungen in Gegenwart von Anti-IgM, gebunden an Sepharose(in einem oder mehreren benannten Staaten eingetragene Marke)-Perlen (5 ug/ml) und Anti-CD40-mABs S2C6 (1,25 ug/ml) kultiviert. Es wurden variierende Konzentrationen an Anti- CD40-mAbs 5D12, 3C6 oder 3A8 zugesetzt und nach drei Tagen wurde der [³H]- Thymidineinbau bestimmt. Als Kontrolle wurde Anti-(glucocerebrosidase)mAb 8E4 in entsprechenden Konzentrationen zugesetzt. Barneveld et al., Eur. J. Biochem. (1983) 134 : 585. Die Daten sind Mittelwerte ± S. D., die aus Experimenten mit B-Zellen von zwei verschiedenen Spendern bei doppelten Inkubationen stammen.
  • Es wurde festgestellt, dass jeder Anti-CD40-mAbs 5D12, 3A8 und 3C6 die Costimulierung von Anti-IgM, induziert durch humane B-Zellproliferation durch mAb 52C6, hemmen konnte (Fig. 6). Im Gegensatz dazu wurde keine signifikante Inhibition mit äquivalenten Mengen an nicht-relevantem mAb 8E4, der auf β-Glucocerebrosidase gerichtet war, erkannt. Barneveld et al., supra. So wurde der Schluss gezogen, dass dieser Anti-CD40-mAbs keine stimulatorischen Signale zur Proliferation von humanen B-Zellen liefern sondern im Gegenteil die stimulatorischen Signale hemmen können, die durch Auslösen von Anti-CD40 mit einem anderen mAb ausgeübt werden. Daher wird angenommen, dass diese mAbs hervorragende Werkzeuge sind, um zu untersuchen, ob eine Signalgebung über CD40 eine Rolle bei der Stimulation der humanen B-Zellproliferation durch EL4B5-Zellen spielt.
    • Beispiel 5 Effekte von Anti-CD40-mAbs auf die EL4B5-induzierte humane B-Zellproliferation
  • Die Effekte von Anti-CD40-mAb auf die EL4B50-induzierte humane B- Zellproliferation wurde unter Verwendung des oben beschriebenen B-Zellaktivierungsassays untersucht. Humane B-Zellen von Mandeln (1000 pro Vertiefung) wurden zusammen mit bestrahlten EL4B5-Zellen (50.000 pro Vertiefung) in Gegenwart von 5% Überstand aktivierter humaner T-Zellen und 5 ng/ml PMA kultiviert. Anti-CD40-mAbs 5D12, 3C6 oder 3A8 wurden in variierenden Konzentrationen zugesetzt. Als Kontrolle wurde mAb MOPC-141 (IgG2b) zugesetzt. Nach 6tägiger Kultur wurde der [³H]-Thymidineinbau bestimmt.
  • Fig. 7 zeigt, dass ein Zusatz von Anti-CD40-mAbs 5D12, 3C6 oder 3A8 zu einer Konzentrations-abhängigen Inhibition der humanen B-Zellproliferation führt. Die Daten sind Mittelwerte ± S. D., die aus Experimenten mit B-Zellen von vier verschiedenen Spendern bei doppelter Inkubation stammen. [³H]-Thymidineinbau-Werte, die für Inkubationen ohne mAb gefunden wurden, waren (Mittelwerte ± S. D.) 10460 ± 1843 cpm, 6982 ± 1729 cpm, 4362 ± 1020 cpm bzw. 1543 ± 3190 in vier verschiedenen Experimenten. Der [³H]-Thymidineinbau in B- Zellen allein stieg auf 40 ± 5 cpm und in bestrahlten EL4B5-Zellen allein auf 31 ± 15 cpm.
  • Es trat eine wirksame Inhibition auf. Bei Konzentrationen, die mit 10 ng/ml jeweils niedrig waren, hemmten die drei Anti-CD40-mAbs 5D12, 3C und 3A8 die humane B- Zellproliferation vollständig. Eine halb-maximale Hemmung wurde bei etwa 1 ng/ml festgestellt. Dagegen hatte ein Isotop, das IgG2b-Mausmyelomprotein MOPC-141 entsprach, keinen deutlichen Effekt auf den [³H]-Thymidineinbau. Eine ähnliche Inhibition wurde beobachtet, wenn [3H]-Thymidineinbau am Tag 4 der Kultur anstatt an Tag 6 bestimmt wurde; auf diese Weise wurde die Möglichkeit, dass der beoachtete Effekt infolge einer Änderung in der Kinetik der Proliferation unter Einfluss des Anti-CD40-mAb erfolgte, ausgeschlossen (Daten nicht gezeigt).
  • Als Vergleich wurde der Einfluss eines geringen mAb, der gegen andere B- Zelloberflächenstrukturen gerichtet war, untersucht. Weder Anti-CD20-mAb B1 oder Anti-B7- mAB B7-24 (der letztgenannte mAb wurde durch ein Verfahren entsprechend dem, das zur Erzeugung des Anti-CD40-mAb in Fig. 7 verwendet wurde, erzeugt) hatten in Konzentrationen, die denen entsprachen, die in den Experimenten mit dem Anti-CD40-mAb verwendet wurde, irgendeinen Effekt auf die EL4B5-induzierte humane B-Zellproliferation (Daten nicht gezeigt). Daraus kann geschlossen werden, dass die Inhibitorwirkung von Anti-CD40-mAb auf die EL4B5-induzierte B-Zellproliferation nicht in einer Maskierung der B-Zelloberfläche begründet ist.
    • Beispiel 6 Effekte von hCD40.hu auf die EL4B5-induzierte humane B-Zellproliferation
  • Um zu untersuchen, ob EL4B5-Zellen eine Membran exprimiert haben, die CD40 bindet, wurde ein Fusionsprotein, das aus der extracellulären Domäne von CD40 und den konstanten IgM-Domänen CH&sub2;, CH&sub3; und CH&sub4; (hCD40.hu) besteht, zur fluorocytometrischen Strömungsanalyse verwendet. Lane et al., suura. Nicht-aktivierte EL4B5-Zellen binden das Fusionsprotein nicht. Bei Kultivieren von EL4B5-Zellen zusammen mit PMA (5 ng/ml) und 5% humanem T-Zellüberstand, was die Bedingungen zur Aktivierung von humanen B-Zellen sind, wurde eine geringe Bindung von hCD40.hu festgestellt (Daten nicht gezeigt). Diese geringe Fluoreszensverschiebung zeigte sich in drei unabhängigen Exprimenten konsistent. Der minimale Aktivierungszeitraum, der zur Induzierung der CD40-Bindung benötigt wurde, war 24 Stunden. Um zu bestimmen, ob eine Bindung von hCD40.hu an die EL4B5-Zellen eine EL4B5- induzierte humane B-Zellproliferation, wie es Anti-CD40-mAb tut, hemmen würde, wurde das Fusionsprotein in Cokulturen von EL4B5-Zellen mit humanen B-Zellen unter Verwendung des oben beschriebenen B-Zellaktivierungsassays titriert. Fig. 8 zeigt, dass das Fusionsprotein tatsächlich den [³H]-Thymidineinbau in Konzentrations-abhängiger Weise hemmte und ähnlich wie das in den in Fig. 7 gezeigten Experimenten verwendete Anti-CD40-mAb fähig war, eine B-Zellproliferation, die durch die EL4B5-Zellen induziert wurde, vollständig zu hemmen.
    • Beispiel 7 Effekte von Anti-CD40-mAbs auf eine humane T-Zell-induzierte Antikörperproduktion durch humane B-Zellen
  • Die Antikörper wurden auch auf ihre Kapazität getestet, die Immunglobulinproduktion durch B-Zellen zu hemmen, welche in Kontakt-abhängiger Weise mit aktivierten T-Zellen stimuliert worden waren, wobei der oben beschriebenen T-Helferzelleneffekt eingesetzt wurde. Humane B-Zellen von Mandeln (10&sup4;/Vertiefung) wurden zusammen mit bestrahlten gereinigten T-Zellen (3000 rad, 10&sup5;/Vertiefung) in Platten mit 96 Vertiefungen, die mit Anti-CD3-mAb und mit oder ohne verschiedene mAbs zur Costimulierung der T-Zellen überzogen waren, kultiviert. Nach 8tägiger Kultur wurden die Überstände zur Bestimmung der Immunglobulinproduktion durch die B-Zellen geerntet. Die Immunglobulinproduktion durch die B-Zellen wurde durch den oben beschriebenen ELISA-Assay beurteilt. Anti-CD40-mAb 5D12 wurde ab Beginn der Kulturen in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Als Kontrolle wurde mAb 5D 12 in verschiedenen Konzentrationen ab Beginn der Kulturen zugesetzt. Als Kontrolle wurde mAb MOPC- 141 zugesetzt. Fig. 9A zeigt, dass, wenn T-Zellen mit immobilisiertem Anti-CD3-mAB stimuliert und mit löslichem Anti-CD2- und Anti-CD28-mAs costimuliert wurden, der Zusatz von Anti-CL40-mAb 5D 12 zu einer Konzentrations-abhängigen Inhibierung der IgG-Produktion durch humane B-Zellen führte. Die IgM-Produktion durch die B-Zellen wurde in gleichem Ausmaß inhibiert. Ähnliche Resultate wurden mit den Anti-CD40-mAbs 3C6 und 3A8 und mit dem hCD40.hu-Fusionsprotein erhalten.
  • Die Anti-CD40-mAbs der Erfindung wiesen eine sehr kräftige Inhibierung auf. Bei Konzentrationen, die mit etwa 30 ng/ml niedrig waren, zeigte jeder der drei Anti-CD40-mAbs eine Inhibierung von 50% der maximalen Inhibierung. Im Gegensatz dazu hatte das Isotyp entsprechende IgG2b-Mausmyelomprotein MOPC-141 keine Wirkung auf die Immunglobulinproduktion.
  • Der Inhibitoreffekt der drei Anti-CD40-mAbs war für die Art der Aktivierung der T- Zellen, die die CD40-Ligandenhelferaktivität liefern, nicht spezifisch. Fig. 9B zeigt, dass unter allen T-Zellstimulationsbedingungen (Anti-CD3 allein; Anti-CD3 + Anti-CD2; Anti-CD3 + Anti-CD28; und Anti-CD3 + Anti-CD2 + Anti-CD28) der Zusatz von Anti-CD40-mAb 5D12 zu einer starken Inhibierung der Immunglobulinproduktion durch die humanen B-Zellen führt. Die Inhibierung ist dem Inhibierungsgrad mit dem hCD40.hu-Fusionsprotein vergleichbar, von dem bekannt ist, dass es die CD40-CD40-Ligandenwechselwirkung vollständig blockiert. Die prozentuale Inhibierung schwankte in Abhängigkeit von den T-Zellaktivierungsbedingungen zwischen 40 und 70%. Dagegen hatten das Isotop-gepaarte IgG2b-Mausmyelomprotein MOPC- 141 oder das humane IgM (äls Kontrolle für das hCD40.hu-Fusionsprotein) keinen Effekt auf die Immunglobulinproduktion durch die humanen B-Zellen.
    • Beispiel 8 Humanisierung von Anti-CD40-monoclonalen Antikörpern
  • Um das Fab-Fragment des monoclonalen Antikörpers 5D12 zu humanisieren, wurden zuerst die variable schwere Kette (VH) und die variable leichte Kette (VL) des monoclonalen Antikörpers 5D12 cloniert und dann sequenziert. Um Messenger-RNA zu erhalten, die für den monoclonalen Antikörper 5D12 codiert, wurden die Hybridomzellen, die den monoclonalen Antikörper 5D12 produzieren, mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen, in 5 M Guanidiniumthiocyanat in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol lysiert (siehe Beispiel 1 A). Das Lysat wurde dann mit oligo-dT-Perlen zur Bindung der mRNA inkubiert. Um die variablen Regionen (VH und VL) von 5D12 zu amplifizieren, wurden die mRNA in RT-PCR eingesetzt, die degenerierte Primer für die variable leichte (VL) Kette oder die variable schwere (VH) Kette des IgG verwendete. RT-PCR ist eine Modifikation der PCR-Technik, die die Amplifikation von Sequenzen, die in RNA-Zielpolynukleotiden gefunden werden, erlaubt, indem zuerst ein cDNA-Produkt gebildet wird, das dann durch PCR amplifiziert wird. Die RT-PCR-Technik ist auf dem Fachgebiet bekannt; siehe z. B. Myers et al., Biochemistry 30 : 7661-7666 (1991) und U. S. Patent Nrn. 5 310 652 und 5 407 800.
  • Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung einer TA-Clonierung in einem sequenzierenden Plasmid cloniert. Die DNA-Sequenz mehrerer unabhängiger Clone, die für VH und VL codieren, wurde bestimmt. Aus diesen DNA-Sequenzen wurde eine übereinstimmende Aminosäure sowohl für die VH- wie auch für die VL-Regionen des monoclonalen Antikörpers 5D12 abgeleitet. Die Fig. 10 und 11 zeigen die cDNA und die abgeleitete Proteinsequenz der VH- bzw. VL-Region des monoclonalen Antikörpers 5D12. In den Fig. 10 und 11 sind auch die Lagen der vier Gerüstregionen (wie FR1, FR2, FR3 und FR4) und die drei Komplementaritätbestimmenden Regionen (wie CDR1, CDR2 und CDR3), die dazwischen positioniert sind, angegeben.
  • Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen für die VH- und VL-Regionen wurden verwendet, um verschiedene Datenbasen für humane Antikörpersequenzen mit der besten Homologie zu 5D12 zu suchen. Die Resultate dieser Suche, die zehn homologe Sequenzen (H1 bis H10) mit den abgeleiteten Sequenzen für die VH- und VL-Region von 5D12 vergleichen, wurden verwendet, um zu entscheiden, welche Mausreste geändert werden.
  • Es wurde insbesondere entschieden, dass neun (9) in der VH-Region und vier (4) Reste in der VL-Region zu ändern sind.
  • Der nächste Schritt im Humanisierungsprozess von 5D12 bestand im Aufbau von Mutageneseprimern, um die angegebenen Reste von murinen Resten in humane Reste zu ändern. Aus den Plasmiden, die die variablen VH- oder VL-Mausregionen enthielten, wurde Einzelstrang- DNA durch Infektion mit R408-Helferphage, gefolgt von einer Verschmelzung mit den Mutageneseprimern, hergestellt. Doppelstrang-DNA wurde durch T4-DNA-Polymerase und T4- DNA-Ligase zusammen mit dNTP hergestellt. Es wurden mehrere Clone sequenziert, um einen Clon zu finden, der alle eingeführten Mutationen enthält. Die Fig. 12 und 13 zeigen die cDNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz der humanisierten VH- bzw. VL-Region, die jetzt als VHx bzw. VLx bezeichnet werden.
  • Um humanisierte Fab-Fragmente von 5D12 zu erhalten, wurden die zwei humanisierten variablen Regionen (VHx und VLx) jeweils in ein Baculovirus(AcNPV)-Expressionsplasmid (siehe Beispiel 1B) cloniert, welches einen Teil der konstanten Region des humanen IgG schwere Kette (CHH) bzw. die vollständige humane konstante leichte (CLH)-Region umfasste; dadurch wurden Expressionsvektoren hergestellt, die für VHxCHH bzw. VLxCLH codieren. Die zwei Expressionsvektoren von oben, die für VHxCHH und VLxCLH codieren, wurden mit Wildtyp-AcNPV-Baculovirus in Sf9-Insektenzellen (siehe Beispiel 1B) cotransfiziert, worauf sich wenige Amplifikationsrunden anschlossen, um rekombinante Virusstämme mit hohem Titer zu erhalten. Um das humanisierte 5D12-Fab-Fragment zu exprimieren, wurden die 8±9-Zellen für vier Tage mit den rekombinanten Virusstämmen mit humanisierter leichter und schwerer Kette infiziert. Die Überstände und Lysate wurden auf humanisierte 5D12-Fab-Expression unter Verwendung von Western blotting und FACS-Analyse untersucht (Fig. 14). Im resultierenden 5D12-Fab-Fragment hatte die leichte Kette 23 Aminosäurereste, die schwere Kette hatte 239 Aminosäurereste.
  • In ähnlicher Weise wurde ein chimäres humanes/murines SD12-Fab-Fragment hergestellt. Die cDNA, die die zwei variablen Mausregionen (VHM und VLM) von 5D12, wie oben erhalten, codiert, wurde jeweils in ein Baculovirus (AcNPV)-Expressionplasmid (siehe Beispiel 1B) cloniert, welches einen Teil der konstanten Region der humanen IgG-schweren Kette (CHH) bzw. die vollständige konstante leichte Region (CLH) umfasst, wodurch Expressionsvektoren hergestellt wurden, die für VHMCHH bzw. VLMCLH codieren. Die zwei Expressionsvektoren, die für VHMCHH und VLMCLH codieren, wurden mit Wildtyp-AcNPV-Baculovirus in Sf9- Insektenzellen (siehe Beispiel 1B) cotransfiziert, worauf einige Amplifikationsrunden folgten, um rekombinante Virusstämme mit hohem Titer zu erhalten. Um das chimäre humane/murine 5D12-Fab-Fragment zu exprimieren, wurden die Sf9-Zellen für vier Tage mit rekombinanten Virusstämmen mit chimärer schwerer und leichter Kette infiziert. Die Überstände und Lysate wurden unter Verwendung von Western blotting und FACS-Analyse auf chimärer 5D 12-Fab- Expression analysiert (Fig. 14).
    • Western Blot
  • Ein Western blot mit 10% SDS-PAGE-Gel, der unter nicht-reduzierenden Bedingungen durchgefiAirt worden war, wurde mit 4-Chlornaphthol gefärbt. Die Bahnen 1 und 5, die Proben für eine Kultur der Überstände aus Sf9-Zellen, die mit humanisiertem 5D12-Fab-Fragment und chimärem 5D12-Fab-Fragment infiziert waren, waren, zeigten vergleichbare Migration ab dem 44 kD-Marker. Die Bahnen 3 und 7, die Proben für eine Kultur von Überständen aus Sf9-Zellen waren, welche mit humanisierter leichter Kette (VLxCLH) und chimärer leichter Kette (VLMCLH) infiziert waren, zeigten auch eine vergleichbare Migration, die ein Molekulargewicht anzeigt, das deutlich unter dem 32 kD-Marker liegt.
    • FACS-Bindungsanalyse
  • Unter Verwendung der hier beschriebenen cytometrischen Assaytechnik wurde die Bindung des monoclonalen Antikörpers gegen humanes CD40 5D12 und verschiedener exprimierter Fab-Fragmente bezüglich der B-Zelllinie JY bestimmt, welche hohe Level an CD40 exprimiert. Zellen (500.000/Pellet) wurden mit 1 ug 5D12 in einem Volumen von 100 ul oder mit 100 ul Sf9-Kulturüberstand (der die VL-, VH- oder Fab-Fragmente enthielt) für 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Nach Waschen mit PBS wurden die Zellen mit FITC-markierten Antikörpern, die entweder gegen murines Ig oder gegen die Fab-Fragmente gerichtet waren, inkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und in 0,5% Paraformaldehyd in PBS fixiert. Die Zellen wurden an einem FACScan-Strömungscytometer (Becton-Dickinson) analysiert. Die Resultate, die in Fig. 14 dargestellt sind, zeigen, dass das "humanisierte" 5D12-Fab-Fragment und das "chimäre" 5D12-Fab-Fragment vergleichbar mit dem intakten murinen monoclonalen Antikörper 5D12 an das CD40-Antigen an den B-Zellen binden und dass die chimären VL- und HL- Fragmente und die humanisierten VL- und HL-Fragmente eine Bindung aufwiesen, die von der der nicht-bindenden Kontrolle (d. h. des FITC-Konjugats allein) unterscheidbar war.
    • FACS-Kompetitionsexperünent
  • JY-Zellen (250.000/Pellet), die CD40 exprimieren, wurden zusammen mit unterschiedlichen Mengen des exprimierten chimären oder humanisierten 5D12-Fab in 100 ul für dreißig Minuten bei 4ºC inkubiert. Die 1 = 1-Verdünnung enthielt 70 ng chimäres 5D12-Fab oder 80 ng humanisiertes 5D12-Fab (Fab-Konzentration wurde mit einem Sandwich-ELISA unter Verwendung von Ziege-Anti-humanes IgG als Beschichtung, humanes IgG-Fab von Jackson als Standard und Phosphatase-markiertem Ziege-Anti-humanes-IgG F(ab')&sub2; als Nachweis-Antikörper bestimmt).
  • Nach Waschen mit PBS wurden die Zellen mit FITC-markiertem Anti-Maus-Ig, das mit den exprimierten Fab-Fragmenten nicht kreuzreagiert, inkubiert, worauf sich eine Fixierung in 0,5% Paraformaldehyd anschloss. Zellen wurden an einem FACScan-Strömungscytometer analysiert (Becton-Dickinson). Die mittlere Fluoreszensintensität (MFI) wurde gegen die Menge an zugesetztem Fab-Fragment, ausgedrückt als Verdünnung, aufgetragen und ist in Fig. 15 dargestellt. Im obigen FACS-Kompetitionsexperiment zeigten das chimäre 5D12-Fragment und das humanisierte 5D12 Fab dieselben kompetitiven Bindungscharakteristika wie der murine monoclonale Eltern-Antikörper 5D12. Siehe Fig. 15. Es wurde festgestellt, dass etwa 70 bis 80 ng des Fab- Fragments (humanisiert oder chimär) die Bindung des ganzen murinen Antikörpers 5D12 (50 ng) um 50% hemmen. Siehe Fig. 15.
    • Hinterlegung von Kulturen
  • Die Hybridome, die in den obigen Beispielen verwendet wurden, um das erfindungsgemäße Verfahren zu erläutern, wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt und akzeptiert.
    • SEQUENZPROTOKOLL
  • (1) ALLGEMEINE ANGABEN:
  • (i) ANMELDER: CHIRON CORPORATION
  • (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Humanisierte monoclonale Antikörper gegen CD40 und Fragmente, die fähig sind, die B-Zellaktivierung zu blockieren
  • (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 8
  • (iv) KORRESPONDENZADRESSE:
  • (A) ADRESSAT: CHIRON CORPORATION Intellectual Property - R440
  • (B) STRASSE: P. O. Box 8097
  • (C) ORT: Emveryville
  • (D) BUNDESLAND: Kalifornien
  • (E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika
  • (F) POSTLEITZAHL:94662-8097
  • (v) COMPUTERLESBARE FORM:
  • (A) DATENTRÄGER: Floppy disk
  • (B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOSIMS-DOS
  • (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
  • (vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
  • (A) ANMELDENUMMER: nicht zugewiesen
  • (C) ANMELDETAG: gleiches Datum wie hier
  • (D) KLASSIFIKATION:
  • (vii) DATEN DER VORANMELDUNG:
  • (A) ANMELDENUMMER:
  • (B) ANMELDETAG:
  • (viii) ANGABEN ZUM ANWALT:
  • (A) NAME: Savereide, Paul B.
  • (B) REGISTRIERNUMMER: 36 914
  • (C) REFERENZ/GERICHTS-NUMMER: 0 925 300
  • (ix) ANGABEN ZUR TELEKOMMUNIKATION:
  • (A) TELEFON: (510) 923-2585
  • (B) TELEFAX: (510) 655-3542
  • (C) TELEX: n/a
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 1:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 339 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: CD5
  • (B) LAGE: 1..339 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 1:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 2:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 113 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 2
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 3:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 336 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: CD5
  • (B) LAGE: 1..336 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 3:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 4:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 112 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 4:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 5:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 339 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: CD5
  • (B) LAGE: 1..339 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:S.
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 6:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 113 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 6:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 7:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 336 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
  • (ix) MERKMAL
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: CD5
  • (B) LAGE: 1..336 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 7:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 8:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 112 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 8:

Claims (5)

1. Humanisierter monoklonaler Antikörper 5D12 erhältlich aus der hinterlegten Hybridoma-Zellinie mit der Bezeichnung ATCC HB 11339, der an ein menschliches CD40-Antigen, welches sich auf der Oberfläche einer humanen B-Zelle befindet, bindet, wobei die Bindung des Antikörpers an das CD40-Antigen das Wachstum oder die Differenzierung der B-Zelle verhindert, wobei der humanisierte monoklonale Antikörper 5D12 die VHx und VLx-Aminosäuresequenzen umfasst, welche durch die cDNA- Sequenzen codiert werden, die in den Fig. 12 und 13 beschrieben sind.
2. Humanisiertes Antigen-bindendes Fragment des monoklonalen Antikörpers 5D12, worin der Antikörper erhältlich ist aus der hinterlegten Hybridoma-Zellinie mit der Bezeichnung ATCC HB 11339, wobei der humanisierte monoklonale Antikörper 5D12 die VHx und VLx-Aminosäuresequenzen umfasst, die durch die cDNA- Sequenzen codiert werden, welche in den Fig. 12 und 13 beschrieben sind.
3. Fragment nach Anspruch 2, nämlich Fab, F(ab')&sub2; oder Fv.
4. Fragment nach Anspruch 3, nämlich Fab.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen humanisierten monoklonalen Antikörper oder ein humanisiertes Antigen-bindendes Fragment nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
DE69709632T 1996-02-23 1997-02-21 Humanisierte monoklonale anti-cd40 antikörper und fragmente zur hemmung der b-zellaktivierung Expired - Lifetime DE69709632T2 (de)

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