DE69334064T2

DE69334064T2 - Antagonistische monoklonale Antikörper gegen menschliches CD40

Info

Publication number: DE69334064T2
Application number: DE69334064T
Authority: DE
Inventors: Mark De Boer; Leah B Pacifica Conroy
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1992-07-09
Filing date: 1993-07-08
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2013-07-09
Also published as: ATE258595T1; EP0945465A1; ATE339451T1; DE69333403D1; EP0651797B1; EP1834671A2; EP0945465B1; ES2273452T3; DE69334064D1; EP1834671A3; EP0651797A1; DK0945465T3; DE69333403T2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper, die gegen membrangebundene Antigenmoleküle gerichtet sind. Die vorliegende Erfindung beschreibt spezielle Verfahren der Verwendung dieser membrangebundenen Antigene zur Immunisierung eines Wirtstiers und zum Durchmustern der von diesem Wirtstier isolierten Antikörper. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner neue Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung von Antikörper-vermittelten Erkrankungen wie IgE-vermittelten Erkrankungen (Allergien) und Autoimmunerkrankungen, einschließlich systemischem Lupus erythematodes (SLE), der primären biliären Zirrhose (PBC) und der idiopathischen thrombocytopenischen Purpura (ITP).
Hintergrund der Erfindung
I. Herstellung monoklonaler Antikörper
Monoklonale Antikörper haben sich in der immunologischen Forschung als sehr wirksame Werkzeuge erwiesen. Allgemein können monoklonale Antikörper unter Verwendung unreiner Antigene als Immunogene hergestellt werden, sofern ein Durchmusterungs-Assay verfügbar ist, das Antikörper, die gegen das interessierende Antigen gerichtet sind, von Antikörpern unterscheidet, die gegen andere Antigene gerichtet sind, die in der immunogenen Zusammensetzung vorliegen. Wenn das interessierende Antigen ein Zelloberflächenmolekül ist, ist es wünschenswert, Zellen oder Membranfraktionen, die das interessierende Molekül enthalten, als Immunogene zu verwenden, um die Konformationsbedingungen beizubehalten, die eine Membranumgebung bietet.
Die Immunisierung von Mäusen mit vollständigen Zellen führt gewöhnlich zu einer starken Immunantwort, aufgrund deren Antikörper gegen eine große Anzahl unterschiedlicher Moleküle erzeugt werden. Diese breite Immunantwort schließt die Verwendung der immunogenen Zellen beim nachfolgenden Durchmustern im Hinblick auf spezifische Antikörperproduktion durch Hybridomklone, die von Milzzellen oder Lymphocytenzellen der Maus abgeleitet sind, aus.
Wenn das interessierende Antigen mit geringer Dichte exprimiert wird, ist es ferner wahrscheinlich, dass die Häufigkeit von Maus-B-Zellen, die für das Antigen spezifisch sind, relativ gering sein wird. Diese geringe Häufigkeit erfordert ein Durchmustern einer großen Anzahl von Hybridomklonen, um einen Klon zu identifizieren, der Antikörper erzeugt, die gegen das interessierende Antigen gerichtet sind.
Syngenische murine Fibroblasten, die humane Zelloberflächen-Antigene exprimieren, wurden zur Immunisierung von Mäusen für eine spezifische Antikörperproduktion verwendet (DiSanto et al., 1991). Wenn sie in den geeigneten Mausstamm injiziert werden, sollten die Hintergrund-Antigenproteine, die auf den Fibroblasten vorliegen, nicht immunogen sein, so dass die Immunantwort auf das xenogene rekombinante Protein gerichtet sein sollte. Dieser Ansatz erfordert jedoch die Konstruktion spezifischer rekombinanter Zellen für jede Species oder jeden Stamm, bei denen eine Antikörperproduktion erwünscht ist.
II. B-Zell-Aktivierung und das CD40-Antigen-Ligand-System
B-Zellen spielen eine wichtige Rolle während der normalen Immunantwort in vivo. Ein fremdes Antigen bindet an Oberflächen-Immunglobulinen an spezifischen B-Zellen und triggert eine Kette von Ereignissen, zu denen die Endocytose, die Verarbeitung, die Präsentation der verarbeiteten Peptide an MHC-Klasse-II-Molekülen sowie die Aufwärtsregulation des B7-Antigens auf der Oberfläche der B-Zelle gehören. Eine spezifische T-Zelle bindet dann über T-Zellen-Rezeptor(TCR)-Erkennung des am MHC-Klasse-II-Molekül präsentierten verarbeiteten Antigens an die B-Zelle. Die Stimulation durch den TCR ist der Beginn der Aktivierung der T-Zelle und initiiert die Cytokin-Produktion der T-Zelle. Die Wechselwirkung zwischen dem CD28-Antigen auf T-Zellen und dem B7-Antigen auf B-Zellen kann ein zweites Signal liefern, das zu einer weiteren Aktivierung der T-Zelle führt, was zu einer Cytokin-Sekretion auf hohem Niveau führt. Zusätzlich wird der CD40-Ligand, der auf ruhenden humanen T-Zellen nicht exprimiert wird, auf der Oberfläche der T-Zelle aufwärtsreguliert, wenn die oben erwähnten Signale empfangen werden. Die B-Zelle wird dann durch den CD40-Liganden über das CD40-Antigen auf der Oberfläche der B-Zelle stimuliert, und ferner auch durch lösliche Cytokine, was die Reifung der B-Zelle zu einer Plasmazelle hervorruft, die lösliches Immunglobulin auf hohen Niveaus sezerniert.
Vor einigen Jahren wurde von Zubler et al., J. Immunol. (1985) 134:3662, festgestellt, dass ein Mutanten-Subklon der Mäuse-Thyom-Zelllinie EL-4, der als EL4B5 bekannt ist, B-Zellen sowohl murinen als auch humanen Ursprungs in vitro stark zur Proliferation und zur Differenzierung zu Immunglobulin-sezernierenden Plasmazellen stimuliert werden konnte. Es wurde festgestellt, dass diese Aktivierung Antigen-unabhängig und nicht auf MHC beschränkt ist. Für eine optimale Stimulation humaner B-Zellen war das Vorliegen des Überstands von aktivierten humanen T-Zellen erforderlich, jedoch trat ein Ansprechen der B-Zellen auch auf, wenn die EL4B5-Zellen mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) oder IL-1 voraktiviert wurden, Zubler et al., Immunological Reviews (1987) 99:281, sowie Zhang et al., J. Immunol. (1990) 144:2955. Die B-Zellen-Aktivierung in diesem Kultursystem ist effizient – Versuche mit serieller Verdünnung zeigten, dass die Mehrzahl der humanen B-Zellen zur Proliferation und zur Differenzierung in Antikörpersezernierende Zellen aktiviert werden können, Wen et al., Eur. J. Immunol. (1987) 17:887.
Der Mechanismus, durch den diese mutierten EL-4-Zellen sowohl murine als auch humane B-Zellen aktivieren, wurde früher nicht aufgeklärt. Es ist allerdings klar, dass ein Zell-Zell-Kontakt für eine durch EL4B5-Zellen-induzierte B-Zell-Aktivierung erforderlich ist. Zunächst tritt keine Proliferation der B-Zellen in Gegenwart des Überstands von PMA-stimulierten EL4B5-Zellen auf, Zubler et al., (1985), supra. Zweitens tritt keine Proliferation der B-Zellen auf, wenn sie von mit PMA behandelten EL4B5-Zellen durch eine semipermeable Filtermembran getrennt sind, Zhang et al., supra. Antikörper gegen Maus-LFA-1, humanes LFA-1 oder humanes LFA-3 und Antikörper gegen murine oder humane MHC-Moleküle der Klasse II inhibieren die EL4B5-induzierte Proliferation von humanen oder murinen B-Zellen nicht, Zubler et al., (1987) und Zhang et al., supra.
Das CD40-Antigen ist ein Glycoprotein, das auf der Zelloberfläche von B-Zellen exprimiert wird. Während der Differenzierung der B-Zellen wird das Molekül zunächst auf Prä-B-Zellen exprimiert und verschwindet dann von der Zelloberfläche, wenn die B-Zelle eine Plasmazelle wird. Die Vernetzung von CD40-Molekülen mit Anti-CD40-Antikörpern vermittelt eine Reihe von Effekten an B-Zellen. Von dem CD40-Antigen ist bekannt, dass es mit dem Rezeptor für den humanen Nervenwachstumsfaktor (NGF) und dem Rezeptor des Tumornekrosefaktors α (TNF-α) in Verbindung steht, was nahelegt, dass CD40 ein Rezeptor für einen Liganden mit wichtigen Funktionen bei der B-Zell-Aktivierung darstellt.
Ein Ligand für CD40 wurde auf der Zelloberfläche aktivierter T-Zellen identifiziert, Fenslow et al., J. Immunol. (1992) 149:655, Lane et al., Eur. J. Immunol. (1992) 22:2573, Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:6550. Die cDNA-Klonierung des CD40-Liganden ergab ein Molekül mit Eigenschaften eines Transmembran-Glycoproteins vom Typ II mit Homologie zu TNF-α, Armitage et al., Nature (1992) 357:80, und Spriggs et al., J. Exp. Med. (1992) 176:1543. Die extracelluläre Domäne des CD40-Liganden enthält zwei Argininreste proximal zur Transmembranregion, was eine potentielle proteolytische Spaltungsstelle ergibt, die zu einer löslichen Form des Liganden führen könnte. Die Expression des rekombinanten CD40-Liganden demonstrierte, dass dieses Molekül die Proliferation von gereinigten B-Zellen stimulieren und, in Kombination mit IL-4, die Sekretion von IgE vermitteln kann, Armitage et al., und Spriggs et al., supra. Es wurde berichtet, dass Anomalien im Gen für den CD40-Liganden, die zum Fehlen eines funktionellen Moleküls auf aktivierten T-Zellen führen, für das Auftreten des X-chromosomal vererbten Hyper-IgM-Syndroms verantwortlich sind, eine seltene Erkrankung, die durch die Unfähigkeit dieser Patienten gekennzeichnet ist, normale Niveaus von Antikörper-Isotypen, die von IgM verschieden sind, zu produzieren, Allen et al., Science (1993) 259:990, sowie Korthäuer et al., Nature (1993) 361:539.
Sämtliche im Stand der Technik bekannten Anti-CD40-Antikörper besitzen eine stimulierende Wirkung auf humane B-Zellen. Die Vernetzung des CD40-Moleküls auf der B-Zell-Oberfläche unter Verwendung bekannter Anti-CD40-Antikörper vermittelt eine Reihe von Effekten an B-Zellen. Monoklonale Anti-CD40-Antikörper (mAbs) können die intercelluläre Adhäsion, die Proliferation sowie, in Kombination mit bestimmten Cytokinen, die Reifung zu Antikörpersezernierenden Zellen induzieren. So wurde zum Beispiel nachgewiesen, dass bekannte Anti-CD40-mAbs die Wirkung von T-Helferzellen bei der B-Zell-Aktivierung nachbilden. Wenn sie auf adhärenten Zellen vorliegen, die FcγRII exprimieren, induzieren diese Antikörper die B-Zell-Proliferation, J. Bancherau et al., Science (1989) 251:70. Darüber hinaus können die bekannten Anti-CD40-mAbs das T-Helfer-Signal zur Sekretion von IgM, IgG und IgE in Gegenwart von IL-4 ersetzen, H. Gascan et al., J. Immunol. (1991) 147:8. Darüber hinaus können bekannte Anti-CD40-mAbs den programmierten Zelltod (Apoptose) von B-Zellen, die aus Lymphknoten isoliert sind, verhindern.
Die vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren zur Herstellung von Zellen, die monoklonale Antikörper produzieren, an, wobei die Antikörper eine Bindungsspezifität für ein spezielles Zelloberflächenmolekül besitzen; dieses Verfahren überwindet die Einschränkungen der oben beschriebenen Verfahren. Die Erfindung gibt ferner Verfahren zur Verwendung von Anti-CD40-Antikörpern an, die (1) befähigt sind, die B-Zellantwort zu inhibieren, und (2) dazu verwendet werden können, Antikörper-vermittelte Erkrankungen zu verhindern oder zu behandeln.
Zusammenfassung der Erfindung:
Die Erfindung beruht auf der Auffindung von Anti-CD40-Antikörpern, die das Wachstum und die Differenzierung von humanen B-Zellen nicht stimulieren. Im Gegensatz dazu können diese Antikörper die Zellantwort von humanen B-Zellen bei relativ niedrigen Konzentrationen inhibieren. Dementsprechend können diese Antikörper zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen Verwendung finden, die durch Antikörper vermittelt werden, die durch die Zellantwort von humanen B-Zellen erzeugt werden. Diese Antikörper erkennen auch neue Epitope auf dem CD40-Antigen, was sich zur Modulierung der Zellantwort von B-Zellen eignet.
Dementsprechend gibt die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper an, der zur Bindung an ein humanes CD40-Antigen befähigt ist, das sich auf der Oberfläche einer humanen B-Zelle befindet, wobei die Bindung des Antikörpers an das CD40-Antigen das Wachstum oder die Differenzierung der B-Zelle verhindert.
Die Antikörper können zusätzlich bei einem Verfahren zur Vorbeugung und Behandlung Antikörper-vermittelter Erkrankungen bei Patienten verwendet werden, wobei das Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines monoklonalen Antikörpers in einem pharmazeutisch akzeptablen Excipiens an einen behandlungsbedürftigen Patienten umfasst und der Antikörper zur Bindung an ein humanes CD40-Antigen befähigt ist, das sich auf der Oberfläche einer humanen B-Zelle befindet, wobei die Bindung des Antikörpers an das CD40-Antigen das Wachstum oder die Differenzierung der B-Zelle verhindert.
Die Antikörper können ferner auch bei einem Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung IgE-vermittelter Erkrankungen wie Allergien bei Patienten verwendet werden, wobei das Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines monoklonalen Antikörpers in einem pharmazeutisch akzeptablen Excipiens an einen behandlungsbedürftigen Patienten umfasst und der Antikörper zur Bindung an ein humanes CD40-Antigen befähigt ist, das sich auf der Oberfläche einer humanen B-Zelle befindet, wobei die Bindung des Antikörpers an das CD40-Antigen das Wachstum oder die Differenzierung der B-Zelle verhindert.
Die Antikörper können darüber hinaus auch bei einem Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung von Antikörper-vermittelten Autoimmunerkrankungen bei Patienten verwendet werden, wobei das Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines monoklonalen Antikörpers in einem pharmazeutisch akzeptablen Excipiens an einen behandlungsbedürftigen Patienten umfasst und der Antikörper zur Bindung an ein humanes CD40- Antigen befähigt ist, das sich auf der Oberfläche einer humanen B-Zelle befindet, wobei die Bindung des Antikörpers an das CD40-Antigen das Wachstum oder die Differenzierung der B-Zelle verhindert. Spezielle Autoimmunerkrankungen, deren Behandlung nach diesem Verfahren in Betracht gezogen wird, umfassen systemischen Lupus erythematodes (SLE), die primäre biliäre Zirrhose (PBC) sowie die idiopathische thrombocytpenische Purpura (ITP).
Bei bevorzugteren Ausführungsformen der obigen Gegenstände wird der monoklonale Anti-CD40-Antikörper nach den oben beschriebenen Verfahren hergestellt und ist entweder 5D12 (ATCC HB 11339) oder 3C6 (ATCC HB 11340).
Kurze Beschreibung der Figuren
1A zeigt eine schematische Darstellung des Baculovirus-Transfervektors pAcC8 und die Sequenz der multiplen Klonierungsstelle. 1B zeigt eine schematische Darstellung der Erzeugung von Sf9-Zellen, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung humanes CD40-Antigen exprimieren.
2 zeigt die Sequenzen von Primern für die Polymerase-Kettenreaktion, die bei der Herstellung von codierenden Bereichen für humane CD40-Antigene verwendet wurden. Diese Primer wurden auf der Grundlage der veröffentlichten vollständigen codierenden DNA-Sequenzen für CD40 konstruiert (Stamenkovic et al., 1989).
3 zeigt die Ergebnisse von ELISA-Assays, bei denen die Reaktion des monoklonalen Anti-CD40-Antikörpers S2C6 mit Sf9-Zellen, die CD40 exprimieren, und Sf9-Zellen, die B7 exprimieren, untersucht wurde.
Die 5A–5C zeigen die Ergebnisse der Zell-Fluoreszenzfärbung anhand von ARC-Zellen der EBV-transformierten B-Zelllinie, die CD40 oder B7 exprimieren.
Die 6A–6F zeigen die Ergebnisse von kompetitiven Assays unter Anwendung der Zell-Fluoreszenzfärbung von ARC-Zellen der EBV-transformierten B-Zelllinie, die CD40 und B7 exprimieren, sowie unter Verwendung der löslichen Antigene CD40 und B7.
In 7A sind drei neue Anti-CD40-mAbs mit einem alten Anti-CD40-mAb hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Co-Stimulation der Anti-IgM-induzierten Proliferation von humanen B-Zellen verglichen. In 7B ist der Versuch von 5A in Gegenwart von rekombinantem Interleukin-2 (rIL-2) wiederholt.
8 zeigt die Fähigkeit von drei neuen Anti-CD40-mAbs zur Inhibierung der durch Co-Stimulation mit immobilisiertem Anti-IgM und Anti-CD40-mAb 52C6 induzierten Proliferation von humanen B-Zellen.
9 zeigt die Wirkung von drei neuen Anti-CD40-mAbs auf die durch EL4B5 induzierte Proliferation humaner B-Zellen.
10 zeigt die Wirkung von löslichem CD40 (hCD40.μ) auf die durch EL4B5 induzierte Proliferation humaner B-Zellen.
Die 4A und 4B zeigen die Wirkung des neuen Anti-CD40-mAbs 5D12 auf die durch humane T-Zellen induzierte Immunglobulinproduktion durch humane B-Zellen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die hier beschriebene Erfindung geht von vorveröffentlichten Arbeiten und anhängigen Patentanmeldungen aus. Solche Arbeiten bestehen zum Beispiel aus wissenschaftlichen Publikationen, Patenten oder anhängigen Patentanmeldungen.
I. Definitionen:
Im hier verwendeten Sinne beziehen sich die Ausdrücke "membrangebundenes Antigen", "Zelloberflächenmolekül" und "Zelloberflächenantigen" sämtlich auf ein Protein, ein Polypeptid oder ein Peptid, bei denen zumindest ein antigener Bereich des Proteins, Polypeptids oder Peptids auf einer Oberfläche einer biologischen Membran exponiert ist und bei denen einer oder mehrere der folgenden Reste kovalent gebunden sein kann: Ein oder mehrere einfache oder komplexe Zuckerreste (wie in einem Glycoprotein), Lipidreste (wie einem Lipoprotein), eine Kombination von Lipid- und Zuckerresten oder andere post-translationelle Modifizierungen.
"Proteine" sind typischerweise langkettige Polymere auf der Basis von Aminosäuren ("Polypeptide"). Proteine können aus einer, zwei oder mehr Polypeptidketten aufgebaut sein und ferner auch andere Arten von Substanzen in Verbund mit der Polypeptidkette bzw. den Polypeptidketten enthalten, wie etwa Kohlenhydrate. Die Größe der Proteine erstreckt sich über einen ziemlich weiten Bereich von (willkürlich angenommene Zahl) 5000 bis mehrere hunderttausend g/mol. Die Zahl 5000 entspricht dem Vorliegen von grob geschätzt 40–45 Aminosäuren. Proteine, die kleiner sind als etwa 5000 g/mol, werden typischerweise als Polypeptide oder einfach als Peptide bezeichnet (Bohinski).
Der Ausdruck "Antikörper", wie er hier verwendet ist, bezieht sich auf polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, humanisierte Antikörper, Einkettenantikörper sowie Fragmente davon, wie F_ab, F_(ab')2, F_v, sowie andere Fragmente, in denen die Antigenbindungsfunktion des zugrundeliegenden Antikörpers erhalten ist.
Der Ausdruck "monoklonaler Antikörper", wie er hier verwendet ist, bezieht sich auf eine Antikörperzusammensetzung mit einer homogenen Antikörperpopulation. Der Ausdruck unterliegt hinsichtlich der Species oder Quelle des Antikörpers keiner Einschränkung und soll auch nicht durch die Art seiner Herstellung eingeschränkt sein. Der Ausdruck umfasst ganze Immunglobuline und Fragmente, wie F_ab, F_(ab')2, F_v, sowie andere Fragmente, bei denen die Antigenbindungsfunktion des Antikörpers erhalten ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können monoklonale Antikörper beliebiger Säugerspecies verwendet werden. In der Praxis stammen allerdings die Antikörper wegen der Verfügbarkeit von Rattenzelllinien oder Mauszelllinien zur Verwendung bei der Herstellung der erforderlichen Hybridzelllinien oder Hybridomen zur Erzeugung monoklonaler Antikörper typischerweise von der Ratte oder der Maus.
Der Ausdruck "humanisierte Antikörper", wie er hier verwendet ist, bedeutet, dass zumindest ein Teil der Gerüstregionen eines Immunglobulins von humanen Immunglobinsequenzen abgeleitet ist.
Der Ausdruck "Einkettenantikörper", wie er hier verwendet ist, bezieht sich auf Antikörper, die hergestellt sind durch Bestimmen der Bindungsdomänen (sowohl der schweren Kette als auch der leichten Kette) eines bindenden Antikörpers und Hinzufügen eines verbindenden Restes, der eine Beibehaltung der Bindungsfunktion ermöglicht. Hierdurch entsteht im Wesentlichen ein radikal verkürzter Antikörper, der lediglich den Teil der variablen Domäne aufweist, der zur Bindung an das Antigen erforderlich ist. Die Festlegung und Konstruktion von Einkettenantikörpern ist in dem Patent US 4 946 778 von Ladner et al. beschrieben.
Der Ausdruck "Molekül, das am B7-Antigen bindet", wie er hier verwendet ist, bedeutet ein Molekül, das befähigt ist, in einer Umgebung, in der andere Substanzen in der gleichen Umgebung keinen Komplex mit dem B7-Antigen bilden, einen Komplex mit dem B7-Antigen zu bilden. Der Komplex wird so gebildet, dass der Signalweg der normalen Signalweiterleitung von B7 durch das Antigen CD28 oder CTLA4 blockiert wird. Moleküle, die an das Antigen B7 binden, sind zum Beispiel die Antikörper CD28, CTLA4, CTLA4Ig und Anti-B7.
Der Ausdruck "Epitop des CD40-Antigens", wie er hier verwendet ist, bezieht sich auf ein Molekül, das zur Immunreaktivität mit den monoklonalen Anti-CD40-Antikörpern der vorliegenden Erfindung befähigt ist, mit Ausnahme des CD40-Antigens selbst. Epitope des CD40-Antigens können Proteine, Proteinfragmente, Peptide, Kohlenhydrate, Lipide und andere Moleküle umfassen, jedoch handelt es sich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung am üblichsten um Proteine, kurze Oligopeptide, Oligopeptid-Mimics (d.h., organische Verbindungen, welche die Antikörperbindungseigenschaften des CD40-Antigens nachbilden) oder um Kombinationen davon. Geeignete Oligopeptid-Mimics sind, inter alia, in der PCT-Anmeldung US91/04282 beschrieben.
II. Erzeugung von Antikörpern gegen membrangebundene Antigenmoleküle
Dieser Abschnitt beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung und Selektion von Antikörpern gegen ein Zelloberflächenmolekül, wobei transfizierte Insektenzellen als Immunogen verwendet werden. Die transfizierten Insektenzellen der vorliegenden Erfindung können auch in Durchmusterungs-Assays verwendet werden.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen ein Zelloberflächenantigen. Das Verfahren umfasst folgende Schritte: den Immunisierungsschritt, der umfasst: (i) Selektieren und Isolieren einer codierenden Sequenz einer Nucleinsäure, die das interessierende Antigen codiert, (ii) Einfügen der codierenden Sequenz in einen Baculovirus-Expressionsvektor, um so eine wirksame Expression der codierenden Sequenz zu erzielen, (iii) Transfizieren des Expressionsvektors in eine Insektenzelllinie zum Erhalt rekombinanter Insektenzellen, die das selektierte Antigen exprimieren, und (iv) Immunisieren eines Wirtstiers mit den Insektenzellen, die das membrangebundene Antigen exprimieren.
Nach der Immunisierung wird das Serum des Wirtstiers einem Durchmustern auf Zellen unterzogen, die nicht die Insektenzellen sind und das interessierende Antigen exprimieren. Alternativ können Membranfraktionen, die das interessierende Antigen enthalten, oder in einigen Fällen gereinigte, durch Rekombinationsverfahren erzeugte Antigene selbst zum Durchmustern des Serums herangezogen werden. Typischerweise werden einem Durchmustern unterzogen: (a) Serum vor der Immunisierung, (b) das Serum eines mit Insektenzellen, die das interessierende Antigen nicht exprimieren, immunisierten Wirtstiers und (c) das Serum des mit den rekombinanten Insektenzellen immunisierten Wirtstiers. Das Vorliegen von Antikörpern, die spezifisch gegen das interessierende Antigen gerichtet sind, wird durch negative Reaktionen mit den Seren (a) und (b) und positive Reaktionen mit dem Serum (c) angezeigt.
Nach einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von Hybridomen, die monoklonale Antikörper gegen ein Zelloberflächenprotein erzeugen. Das Verfahren umfasst die oben beschriebenen Schritte (i) bis (iv). Nach der Immunisierung des Wirtstiers mit den rekombinanten Insektenzellen werden Antikörper-produzierende Zellen aus dem Tier isoliert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden solche Antikörper-produzierenden Zellen zur Erzeugung von Hybridomzellen verwendet, die kloniert und zur Produktion von monoklonalen Antikörpern verwendet werden. Überstände von solchen Hybridomzellen werden auf eine spezifische Antikörperproduktion durchgemustert, zum Beispiel unter Verwendung eines zellbezogenen Durchmusterungs-Assays, wie es unten beschrieben ist.
A. Isolierung von Membranmoleküle codierenden Sequenzen
Die codierende Nucleinsäuresequenz für ein ausgewähltes membrangebundenes Antigen kann auf der Basis der bekannten Aminosäuresequenz und/oder der bekannten codierenden DNA-Sequenz für die Proteinkomponente des Antigens isoliert werden. Die codierende Sequenz kann aus biologischen Quellen nach Standardverfahren isoliert werden (Asubel et al.; Maniatis et al.; Sambrook et al.) (zum Beispiel Hybridisierung, differentielle Hybridisierung, Klonierung und Plaque-Durchmusterung, etc.). Alternativ können synthetische Oligonucleotidsequenzen, die das interessierende Antigen codieren, unter Verwendung im Handel erhältlicher automatischer Oligonucleotid-Synthesizer herstellt oder gekauft werden, zum Beispiel von Synthetic Genetics (San Diego, CA). Im Fall großer codierender Sequenzen kann die codierende Oligonucleotidsequenz durch eine Reihe von Klonierungsschritten einschließlich eines Tandem-Arrays mehrerer Oligonucleotidfragmente, die der codierenden Sequenz entsprechen, synthetisiert werden (Crea; Yoshio et al.; Eaton et al.). Codierende Oligonucleotidsequenzen können nach Standard-Rekombinationsverfahren (Maniatis et al.; Ausubel et al.) oder durch die Polymerase-Kettenreaktion (Mullis; Mullis, et al.) amplifiziert und isoliert werden.
Wenn die Sequenz des membrangebundenen Antigens bekannt oder partiell bekannt ist, kann eine spezifische Antigen-codierende Sequenz isoliert werden. Typischerweise wird die das Antigen codierende Sequenz aus einer cDNA-Bibliothek isoliert, die durch Insertion von DNA-Fragmenten aus einer ausgewählten Quelle in einen Vektor erzeugt wurde. Die cDNA-Bibliothek, die DNA-Fragmente von einer ein Membranantigen enthaltenden Quelle enthält, kann unter Verwendung von Zufallsfragmenten von cDNA-Molekülen aufgebaut werden, die aus Ziel-RNA-Molekülen erzeugt wurden. Eine solche cDNA-Bibliothek wird allgemein unter Verwendung eines bakteriellen Systems (wie etwa lambda gt10 (Promega, Madison, WI)) aufgebaut, kann jedoch auch in einem Hefe-Expressionssystem oder einem eukaryotischen Expressionssystem unter Anwendung herkömmlicher Techniken aufgebaut werden (Ausubel).
Die Bibliothek wird einem Durchmustern auf das Vorliegen der DNA-Sequenz des membrangebundenen Antigens unterzogen (üblicherweise durch Hybridisierung; Ausubel et al.; Maniatis et al.), typischerweise unter Verwendung eines Oligonucleotids mit einer bekannten Sequenz oder einer Konsensus-Sequenz als Sonde, die mit der das Antigen codierenden Region hybridisierbar ist. Die Sonde kann eine Reihe von Detektionsresten tragen, wozu Radioisotope, Biotin und die Digoxigenin gehören. Alternativ, wenn eine Nucleinsäure-Sondensequenz nicht verfügbar ist, kann das Durchmustern auf Klone, welche die interessierende codierende Region tragen, beispielsweise unter Anwendung der Immundurchmusterung durchgeführt werden (unter Verwendung des "PROTOCLONE"-lambda gt11-Systems, Promega; Young et al.; Huynh et al.).
Codierende Regionen werden aus rekombinanten Isolaten, die positive Signale ergeben, isoliert (entweder durch Hybridisierung oder durch immunologisches Durchmustern). DNA-Fragmente, welche die codierenden Regionen enthalten, werden typischerweise durch Restriktionsverdau und anschließende Fraktionierung nach Größe und Reinigung der Fragmente isoliert. Solche codierenden Nucleinsäureregionen können dann zur Insertion in einen baculoviralen Transfervektor, wie etwa den Vektor pAcC8 (1A) verarbeitet werden, wie unten in Teil B beschrieben ist. Alternative Baculovirus-Vektoren sind verfügbar, wozu die Vektoren pVL1393 (Luckow et al.) und pAC3T3 (Summers et al.) gehören.
Alternativ können codierende Sequenzen auch unter Anwendung der Amplifizierung durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Mullis; Mullis et al.) isoliert werden. Für die PCR geeignete Primer können aus irgendeiner bekannten Nucleinsäuresequenz abgeleitet werden. Wenn die genaue Sequenz nicht bekannt ist, können degenerative Primer verwendet werden (Mullis; Mullis et al.). Diese Primer sind typischerweise zwei Nucleinsäuresequenzen, die aus acht oder mehr colinearen Nucleotiden bestehen, wobei die beiden Sequenzen durch einen gewissen, definierten Abstand voneinander getrennt sind, um eine Zielsequenz zu erzeugen (Beispiel 1), und sie sind zu gegenüberliegenden Strängen komplementär.
Ein typischer PCR-Zyklus umfasste folgende Schritte: Schmelzen bei erhöhter Temperatur, anschließende Reassozüerung und Verlängerung. Die Reaktionen werden über 25–30 Zyklen wiederholt. Die PCR-Produkte können mit Restriktionsenzymen abgebaut und unter Verwendung eines präparativen, 1,5%igen Agarosegels elektrophoretisch aufgelöst werden. Klonspezifische amplifizierte Fragmente werden typischerweise durch elektrophoretische Gelfraktionierung nach Größe identifiziert. Die klonspezifischen DNA-Fragmente werden dann aus dem Gel gewonnen, zum Beispiel unter Verwendung des „GENE CLEAN"-Systems (BIO 101, La Jolla, CA). Erforderlichenfalls kann die DNA mit Phenol und/oder Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert werden. Die isolierte DNA wird mit Ethanol gefällt. Nach der Fällung wird die DNA zur Insertion in Baculovirus-Expressionsvektoren herangezogen.
Die Erzeugung von Sf9-Zellen, die humanes CD40 exprimieren, ist in 1B schematisch dargestellt. Wie daraus ersichtlich ist, wird die RNA aus einer Population von mit Epstein-Barr-Virus (EBV) transformierten humanen Milzzellen nach Standardverfahren isoliert (Chirgwin et al.). Die gesamte RNA wird unter Anwendung von Hexamer-Primern mit Zufallssequenz nach etablierten Verfahren in die cDNA umgewandelt, wie im Detail in Beispiel 1 dargestellt ist. Das die interessierenden Moleküle des membrangebundenen Antigens codierende DNA-Molekül wird durch PCR-Amplifizierung erzeugt, wobei ein Vorwärts-Primer und ein Rückwärts-Primer mit Restriktionsschnittstellen zur Klonierung an ihren 5'-Termini verwendet werden. Solche cDNA-Primer, die bei der Herstellung der humanes CD40 codierenden Regionen verwendet werden, sind in 2 dargestellt. Diese Primer wurden auf der Basis der publizierten vollständigen codierenden DNA-Sequenzen für CD40 konstruiert (Stamenkovic et al., 1989).
Es wird weiterhin auf 1B Bezug genommen; die cDNA wird mit einem Vorwärts-Primer und einem Rückwärts-Primer in Gegenwart einer thermostabilen Polymerase, wie der aus Thermus aquaticus erhaltenen Polymerase, eines äquimolaren Gemisches von Desoxynucleotiden und eines Puffersystems gemischt (Beispiel 1). Das Gemisch wird in einem Thermocycler der Amplifizierung unterworfen, und die erhaltenen PCR-Produkte werden in den Polylinker eines Baculovirus-Transfervektors subkloniert. Ein solcher Vektor, pAcC8, ist in 1A schematisch dargestellt. Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung können eine Reihe solcher baculoviraler Transfervektoren, die eine einzige Endonuclease-Restriktionsschnittstelle stromabwärts von dem Polyhedrin-Promotor (Miller) enthalten, verwendet werden: Zum Beispiel Polyhedrin-mRNA von Nuclear-Polyhedrosis-Virus von Autographa californica (AcNPV) (Wu et al.; Matsuura et al.; Takehara et al.) oder Nuclear-Polyhedrosis-Virus von Bombyx mori (pBmNPV) (Nyunoya et al.; Sekine et al.).
Vor der Expression in Baculovirus werden die DNA-Inserts typischerweise durch Sequenzierungsanalyse auf PCR-induzierte Mutationen geprüft.
B. Insertion einer Antigen-codierenden Sequenz in einen Baculovirus-Vektor
Die Insertion der das membrangebundenen Antigen codierenden Region in einen Baculovirus-Vektor wird nach etablierten Verfahren vorgenommen (Ausubel et al.; Maniatis et al.; Sambrook et al.). Volllängen-cDNAs, die humanes B7 und humanes CD40 codieren, wurden durch PCR unter Verwendung von Primern mit Restriktionsschnittstellen zur Klonierung erzeugt. Die Matrize für die PCR-Amplifizierung war cDNA, die aus RNA aus EBV-transformierten humanen Milz-B-Zellen erzeugt wurde. Kurz zusammengefasst wird eine codierende DNA-Region in den baculoviralen Transfervektor oder ein Plasmid, wie ein pAcC8-Plasmid, ligasiert, so dass sich die das membrangebundene Antigen codierende Region stromabwärts von dem Polyhedrin-Promotor befindet. Das Polyhedrin-Gen ATG wurde zu ATT mutiert (1A), um eine Initiierung der Translation in rekombinanten Klonen, die keine codierende Sequenz mit einem funktionellen ATG enthalten, zu verhindern. Die resultierende Plasmid-DNA wird mit Baculovirus-Wildtyp (AcNPV) durch Cotransfektion in Insektenzellen von Spodoptera frugiperda (Sf9-Zellen) eingebracht, um rekombinante Viruspartikel über eine Rekombination in vivo zwischen den Wildtyp-Virus und dem rekombinanten Vektor, der das Gen des membrangebundenen Antigens trägt, zu erzeugen.
Die Beispiele 1–2 beschreiben die Isolierung von rekombinanten Baculovirus-Vektoren, die heterologe DNA-Segmente enthalten: pAcCD40 (codiert ein Full-Length-CD40-Molekül), pAcCD40-ED/Glu (codiert die extracelluläre Domäne von CD40), pAcB7 (codiert ein Full-Length-B7-Molekül) und pCcB7-ED/Glu (codiert die celluläre Domäne des B7-Moleküls).
C. Infizierung von Insektenzellen mit Baculovirus-Vektoren
Die oben beschriebenen rekombinanten Viren wurden anschließend zur Coinfektion von Insektenzellen verwendet (Beispiel 2). Diese Zellen exprimierten dann die durch die heterologen DNA-Inserts codierten Antigene.
Sf9-Zellen (Spodoptera frugiperda; Summers et al.) mit einer Zelldichte von 10⁶ Zellen/ml wurden mit dem rekombinanten Virus infiziert. Die mit dem rekombinanten Baculovirus infizierten Sf9-Zellen wurden identifiziert und durch Klonieren gereinigt (Summers et al.).
Zellen, die das Oberflächenantigen exprimierten, wurden nach 48 Stunden gesammelt und zur Immunisierung von Wirtstieren verwendet. Zur Erzeugung von sezernierten, rekombinanten Proteinen wurden die Zellen nach 72 Stunden Kultivierung gewonnen.
Die Expression der rekombinanten Moleküle an der Zelloberfläche der Sf9-Zellen (Beispiel 3) wurde unter Verwendung eines ELISA-Systems getestet (Harlow et al.). 3 zeigt, dass der monoklonale Anti-(B7)-Antikörper BB-1 lediglich mit Sf9-Zellen reagierte, die mit AcB7-Virus infiziert waren, jedoch nicht mit Sf9-Zellen, die humanes CD26 exprimieren. Im Gegensatz dazu reagierte der monoklonale Anti-(CD26)-Antikörper Ta-1 lediglich mit den Sf9-Zellen, die CD40 exprimieren. 3 zeigt, dass der monoklonale Anti-(CD40)-Antikörper S2C6 lediglich mit Sf9-Zellen reagierte, die CD40 exprimieren, jedoch nicht mit Sf9-Zellen, die B7 exprimieren. Diese Ergebnisse zeigen die Spezifität des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von ausgewählten membrangebundenen Antigenen im Baculovirus-System. Diese Ergebnisse zeigen ferner, dass die membrangebundenen Antigene an der Oberfläche der Sf9-Zellen exponiert sind.
Diese Ergebnisse legen zudem nahe, dass Sf9-Zellen, die ausgewählte membrangebundene Antigene exprimieren, zum Durchmustern von Seren und Hybridom-Überständen auf das Vorliegen von Antikörpern, die gegenüber dem ausgewählten Antigen reaktiv sind, herangezogen werden können.
D. Injektion von Insektenzellen, die das membrangebundene Antigegn exprimieren, in ein Wirtstier
Geeignete Wirtstiere zur Erzeugung von polyklonalen Antikörpern sind zum Beispiel Kaninchen, Ziegen, Schafe, Meerschweinchen, Schimpansen und Hunde. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass generell keine Immunisierungsadjuvantien erforderlich sind.
Beispiele für geeignete Wirtstiere zur Verwendung bei der Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind üblicherweise Ratten, Hamster und Mäuse. Wenn es allerdings erwünscht ist, Antikörper zu erzeugen, die dem Menschen immunologisch näher stehen, können höhere Primaten, wie Schimpansen, Quellen für solche Antikörper darstellen. Die Fusion mit einem Heteromyelom-Fusionspartner kann zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern verwendet werden (Carroll; Perkins, 1991). Solche Fusionen können nach einer Reihe von Verfahren erzielt werden, die im Stand der Technik bekannt sind (Harlow et al.), wozu das Verfahren, bei dem gemischte Zellen Polyethylenglycol ausgesetzt werden, und das Verfahren, bei dem Zellen einem starken elektrischen Feld ausgesetzt werden (Elektrofusion), gehören. Hybridome werden durch Kultivierung in einem selektiven Medium selektiert und dann auf ihre Antigenspezifität getestet, wie unten beschrieben ist.
Zur Erzeugung monoklonaler Antikörper gegen CD40 und B7 wurden Mäuse mit den Sf9-Zellen immunisiert, die diese Moleküle auf der Zelloberfläche exprimieren (Beispiel 5). Eine Woche nach der zweiten Immunisierung wurden die Mäuse ausbluten gelassen, und die Seren wurden unter Anwendung der Zell-Fluoreszenzfärbung von EBV-transformierten B-Zellen auf das Vorliegen spezifischer Antikörper hin untersucht (Beispiel 3). 5 zeigt die Ergebnisse der Zellfärbung, die anzeigen, dass Mäuse, die mit Sf9-Zellen, die CD40 oder B7 exprimieren, immunisiert wurden, einen Serumtiter gegen die EBV-transformierte B-Zelllinie ARC (American Type Culture Collection (A.T.C.C.), 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852) hatten, der sowohl für CD40 als auch für B7 positiv war. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse, die mit Kontroll-Sf9-Zellen immunisiert wurden, keine Reaktivität mit den ARC-Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Wirtstiere mit Sf9-Zellen, die ein membrangebundenes Antigen der Wahl exprimieren, immunisiert werden können und die Immunisierung zu einer Immunantwort führt, die Antikörper gegen das rekombinante Antigen mit einschließt. Die Immunisierung führt nicht zu Antikörpern, die mit anderen humanen Proteinen als den in den Sf9-Insektenzellen klonierten rekombinanten humanen Proteinen kreuzreaktiv sind.
Einer Maus wurde eine letzte Boosterinjektion mit CD40 exprimierenden Sf9-Zellen verabreicht; eine andere Maus erhielt eine letzte Boosterinjektion mit B7 exprimierenden Sf9-Zellen. Drei Tage nach der Boosterinjektion wurden die Milzen entnommen, und die Splenocyten wurden mit SP2/0-Maus-Myelomzellen fusioniert.
E.Isolierung und Immortalisierung spezifische Antikörper produzierender Lymphocyten
Antikörper produzierende Lymphocyten zur Produktion von monoklonalen Antikörpern sind bevorzugt B-Lymphocyten, wie sie aus dem Knochenmark, der Milz oder den Lymphknoten eines immunen Wirtstiers isoliert werden können (Harlow et al.).
Alternativ dazu können B-Lymphocyten aus dem peripheren Kreislauf isoliert werden. In diesem Fall werden Blutproben zentrifugiert und Gradienten-Trennverfahren unterzogen, um ein rohes Gemisch von Lymphocyten aus peripherem Blut (PBL) zu erzeugen. Monocyten und T-Lymphocyten werden nach etablierten Verfahren (Mishell) aus diesem Zellgemisch selektiv abgereichert. Solche übrigen Zellen können einem Selektionsverfahren unterzogen werden, wie beispielsweise einem „Panning"-Verfahren, bei dem die Zellen, die Affinität für das Antigen besitzen, durch selektive Bindung an einer Affinitätsmatrix, die das Antigen enthält, aufkonzentriert werden. Im Kontext der vorliegenden Erfindung kann eine solche Matrix eine Zelle umfassen, die das membrangebundene Antigen exprimiert.
Wenn B-Lymphocyten aus dem Kreislauf isoliert werden, wie oben beschrieben wurde, kann die Transformation mit einem transformierenden Virus, wie Epstein-Barr-Virus, von Vorteil sein. Transformierte Zellen (Lymphoblastoide) werden in Subkultur-Vertiefungen verteilt und mehrere Wochen in Kultur gehalten, bevor sie auf die Produktion spezifischer Antikörper getestet werden. Kulturen, die ein solche Produktion spezifischer Antikörper zeigen, werden vermehrt und mit für diese Species geeigneten Myelom-Partnerzellen unter Anwendung von einem oder mehreren Standard-Fusionsprotokollen, einschließlich Polyethylenglycol oder Elektrofusion, wie oben beschrieben, fusioniert. Verfahren zur Isolierung und Immortalisierung von B-Lymphocyten aus verschiedenen Quellen sind im Stand der Technik bekannt.
In Experimenten, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wurden Splenocyten aus immunisierten Mäusen mit murinen SP2/0-Myelomzellen und mit Polyethylenglycol fusioniert, wie früher von de Boer et al. (1988) beschrieben wurde. Die Hybridom-Klone wurden wie in Beispiel 6 beschrieben, verarbeitet.
Tabelle 1 (Beispiel 6) gibt eine Zusammenfassung der Fusionsdaten wieder. Nach der CD40-Fusion wurden lediglich die Hälfte der Zellen in 480 Vertiefungen ausgesät. Dies führte zu 351 Vertiefungen mit Hybridomwachstum. Nach der B7-Fusion wurden die Zellen auf 960 Vertiefungen verteilt, und diese Fusion führte zu 312 Vertiefungen mit Hybridomwachstum. Vierzehn Tage nach den Fusionen wurden die Überstände von 12 Vertiefungen gepoolt, und die Pools wurden auf das Vorliegen von Antikörpern getestet, die mit ARC-Zellen reagierten. Die FACS-Analyse zeigte, dass 4 Pools aus der CD40-Fusion und ein Pool aus der B7-Fusion gegenüber ARC-Zellen reaktiv waren. Beim neuerlichen Testen individueller Überstände der positiven Pools wurden 4 Vertiefungen mit Reaktivität gegenüber CD40 und eine Vertiefung mit Reaktivität gegenüber B7 identifiziert. Die Zellen von diesen positiven Vertiefungen wurden durch definierte serielle Verdünnung kloniert, und nach drei Runden Zellwachstum wurden 4 stabile Anti-(CD40)-Hybridom-Klone (CD40-3A8, CD40-3C6, CD40-5D12 und CD40-5) und ein stabiler Anti-(B7)-Hybridom-Klon (B7-24) etabliert. Diese Ergebnisse zeigen, die Möglichkeit, dass stabile Hybridom-Klone erhalten werden können, die monoklonale Antikörper sezernieren, die gegen ein ausgewähltes membrangebundenes Antigen gerichtet sind.
Zum Durchmustern von Hybridom-Fusionen sind eine Reihe von Verfahren verfügbar (Harlow et al.); hierzu gehören:
Antikörperbindung, (i) unter Verwendung von markiertem Antigen, z. B. radioaktiv markiertem, teilweise gereinigtem oder gereinigtem Antigen, (ii) unter Verwendung von vollständigen oder permeabilisierten Zellen, z. B. Sf9-Zellen, die das rekombinante Antigen exprimieren, sowie die Antigenbindung mit (i) Antikörper/Antigen in Lösung, (ii) mit Antikörper/Antigen-Festphase.
F. Testen der Spezifität der monoklonalen Antikörper
Für das Durchmustern der primären Hybridom-Überstände und für das Durchmustern der daraus nachfolgenden Produkte der seriellen Verdünnungs-Klonierung wurden EBV-transformierte Zellen verwendet. Mehrere zum Nachweis dienende Linien, die unten aufgezeigt sind, deuten darauf hin, dass 4 monoklonale Anti(CD40)-Antikörper und ein monoklonaler Anti-(B7)-Antikörper erzeugt wurden.
Zum Ersten waren alle Überstände der 5 Hybridom-Klone mit ARC-Zellen und anderen EBV-transformierten B-Zelllinien reaktiv, aber nicht mit T-Zelllinien HSB (A.T.C.C.) und CEMM (A.T.C.C.).
Zum Zweiten wurden Versuche zur kompetitiven Bindung unter Verwendung der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung und löslicher Formen des Ziel-Antigens durchgeführt (Beispiel 7). Hybridom-Überstände wurden mit löslichen Formen von CD40 und B7 präinkubiert (Beispiel 7). Anschließend wurden die Gemische zur Zell-Fluoreszenzfärbung zu ARC-Zellen hinzugegeben. Die Ergebnisse des kompetitiven Versuchs sind in 6 gezeigt. Die Daten zeigen, dass lösliches B7, aber nicht lösliches CD40, die Bindung von monoklonalem Anti-(B7)-Antikörper B7-24 an ARC-Zellen blockieren kann. Umgekehrt kann lösliches CD40, aber nicht lösliches B7, die Bindung von monoklonalem Anti-(CD40)-Antikörper CD40-3A8 an ARC-Zellen blockieren.
Ähnliche Ergebnisse wurden mit den anderen 3 monoklonalen Anti-(CD40)-Antikörpern erhalten. Außerdem waren die Wirkungen von löslichem CD40 auf die monoklonalen Anti-(CD40)-Antikörper und die Wirkung von löslichem B7 auf den monoklonalen Anti-(B7)-Antikörper konzentrationsabhängig. Die Verringerung der Menge an löslichem Protein führte zu verminderter Blockierung der Bindung der Antikörper an ARC-Zellen.
Zur weiteren Untersuchung wurden die monoklonalen Anti-(CD40)-Antikörper und Anti-(B7)-Antikörper auf ihre Fähigkeit getestet, an Tonsillen-B-Zellen zu binden (Beispiel 8). Tabelle 2 zeigt, dass 89–95 Prozent frisch isolierter tonsillärer B-Zellen mit den vier monoklonalen Anti-(CD40)-Antikörpern positiv gefärbt wurden. Ungefähr der gleiche Prozentsatz von Zellen war mit dem monoklonalen Antikörper Anti-(CD40) G28.5 positiv (Clark et al.). Tabelle 3 zeigt, dass 12–17 Prozent frisch isolierter tonsillärer B-Zellen mit dem monoklonalen Anti-(B7)-Antikörper B7-24 positiv gefärbt wurden. Wenn jedoch tonsilläre B-Zellen 5 Tage in Anwesenheit von immobilisierten Anti-(IgM)-Antikörpern und IL-2 kultiviert wurden, erhöhte sich die Anzahl von für B7-24 positiven Zellen auf ungefähr 25 Prozent.
Wenn ferner tonsilläre B-Zellen mit Anti-(IgM)-Antikörpern und IL-2 stimuliert wurden, erhöhte sich nicht nur die Anzahl der B-Zellen, die für B7-24 positiv waren, sondern es gab auch einen signifikanten Anstieg der Menge an Fluoreszenzfärbung pro Zelle, was anzeigt, dass die Expression von B7 nach der Stimulierung erhöht war.
Die obigen Daten deuten darauf hin, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Weg eröffnet, monoklonale Antikörper zu isolieren, welche mit membrangebundenen Antigenen spezifisch reaktiv sind. Die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltenen monoklonalen Antikörper können, wie zuvor beschrieben, typisiert werden (Harlow et al.).
G. Brauchbarkeit
Zur Herstellung monoklonaler Antikörper ist es optimal, Mäuse mit gereinigtem Material zu immunisieren. Die Reinigung von Membran-Antigenen erfordert allerdings spezialisierte und komplexe Techniken, und außerdem kann die Extraktion aus der Membran die Struktur des Moleküls verändern. Hinzu kommt, dass das Lösen von Proteinen oft ihre Immunogenität verringert. Daher wurden die meisten monoklonalen Antikörper gegen Zelloberflächen-Antigene nach einer Immunisierung mit Mäusen mit vollständigen Zellen oder Membranfraktionen erhalten. In vielen Fällen wurden spezielle Lymphocyten-Untergruppen in Mäuse injiziert, was zu ganzen Reihen von monoklonalen Antikörpern führte. Diese Antikörper wurden verwendet, um das Antigen, an das sie banden, zu isolieren und zu charakterisieren. Wenn Mäuse mit ganzen Zellen immunisiert werden, werden Antikörper gegen eine große Anzahl unterschiedlicher Moleküle erzeugt. Es ist daher schwierig, dieselben Zellen für das Durchmustern der spezifischen Antikörperproduktion durch die Hybridom-Klone zu verwenden.
Um das oben erwähnte Problem zu umgehen, wird bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung die Expression von membrangebundenen Antigenen in Insektenzellen verwendet, und diese Insektenzellen werden verwendet, um Wirtstiere zu immunisieren. Seit der Einführung der PCR-Technologie (Saiki et al., 1985; Saiki et al., 1988; Mullis; Mullis et al.) ist es relativ einfach geworden, cDNAs für Proteine zu klonieren, deren codierende Nucleinsäuresequenz veröffentlicht wurde. Man kann PCR-Primer verwenden, die nur die vollständige codierende Region überspannen, und man kann Restriktionsschnittstellen in diese Primer einführen, um die Klonierung in Expressionsvektoren zu erleichtern.
Es wurde gezeigt, dass humane intracelluläre, sezernierte Proteine und Transmembran-Proteine auf hohem Niveau in Insektenzellen exprimiert werden können, wenn sie in den Zellen unter der Regulation des nicht-essentiellen Baculovirus-Gens für das Polyhedrin-Protein exprimiert werden (Webb et al., 1989; Übersichtsartikel von Luckow, 1990). Experimente, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass nur zwei Injektionen mit 5 × 10⁶ Sf9-Zellen, die humanes CD40 oder humanes B7 exprimieren, gute Serumtiter gegen diese Antigene ergaben. Außerdem riefen die Insektenzellen selbst keine Immunantwort hervor, die mit humanen Zellen kreuzreaktiv war. Dies ermöglichte die Verwendung von EBV-transformierten B-Zellen für das Durchmustern einer spezifischen Antikörper-Produktion durch die Hybridom-Klone, und zwar mit einem minimalen Risiko, falschpositive Klone zu erhalten. Alle nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltenen positiven primären Vertiefungen waren tatsächlich für das Antigen spezifisch, das zur Immunisierung verwendet worden war.
Antikörper, die nach dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurden und die gegen membrangebundene Antigene gerichtet sind, sind zur Verwendung als diagnostische Agentien zur Erfassung des membrangebundenen Antigens vorteilhaft, beispielsweise Antikörper, die gegen Oberflächen-Markerproteine oder virale Proteine, die aus der Zelloberfläche herausragen, gerichtet sind.
Eine diagnostische Konfiguration umfasst die Verwendung von antiviralen Antikörpern, die befähigt sind, spezifische virale Antigene zu erfassen. Die Antigene können zum Beispiel unter Verwendung eines Capture-Assays erfasst werden, bei dem in zu prüfenden Serumproben vorliegende virale Antigene mit einem Antigenspezifischen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper zur Reaktion gebracht werden.
Die antiviralen Antikörper, die nach dem Verfahren der Erfindung erhalten werden, können als Mittel zur Verstärkung einer antiviralen Immunantwort verwendet werden, da Antikörper-Virus-Komplexe typischerweise von Makrophagen und anderen Effektorzellen erkannt werden. Die Antikörper können in Mengen verabreicht werden, die ähnlich den Mengen sind, die für andere therapeutische Verabreichungen von Antikörpern Verwendung finden. So wird zum Beispiel gepooltes Gammaglobulin in einer Menge von 0,02–0,1 ml/lb Körpergewicht (0,02–0,1 ml/454 g Körpergewicht) während der frühen Inkubationszeit viraler Erkrankungen wie Tollwut, Masern und Hepatitis B verabreicht, um das Eindringen der Viren in die Zellen zu behindern. Daher können Antikörper, die mit einem membrangebundenen viralen Antigen reaktiv sind, in einem "Cocktail" mit anderen viralen Antikörpern oder in Verbindung mit einem anderen antiviralen Mittel passiv allein verabreicht werden, um die Immunantwort und/oder die Wirksamkeit eines antiviralen Arzneimittels zu erhöhen.
III. Zusammensetzungen unter Verwendung von Antikörpern
Die vorliegende Erfindung schlägt die Verwendung von monoklonalen Antikörpern wie jenen vor, die nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurden. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung binden an einem humanen CD40-Antigen auf der Oberfläche einer humanen B-Zelle und stimulieren das Wachstum oder die Differenzierung der B-Zelle nicht. Diese monoklonalen Antikörper können humanisierte Antikörper, Einketten-Antikörper und deren Fragmente sein.
A. Antikörper-Präparation
Monoklonale Antikörper 5D12, 3A8 und 3C6 werden wie in Abschnitt II der detaillierten Beschreibung und in den vorliegenden Beispielen 1–7 hergestellt. Andere monoklonale Antikörper der Erfindung können ähnlich hergestellt werden oder wie folgt. Als Erstes werden polyklonale Antikörper gegen das CD40-Antigen erzeugt. Als Zweites werden monoklonale Antikörper, die für CD40 spezifisch sind, selektiert.
1. Polyklonale Seren
Polyklonale Seren können nach herkömmlichen Verfahren hergestellt werden. Im Allgemeinen wird zuerst eine Lösung, die das CD40-Antigen oder B7-Antigen enthält, verwendet, um ein geeignetes Tier zu immunisieren, bevorzugt eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen oder eine Ziege. Kaninchen und Ziegen sind für die Herstellung polyklonaler Seren aufgrund des verfügbaren Volumens an Serum und der Verfügbarkeit von markierten Anti-Kaninchen- und Anti- Ziege-Antikörpern bevorzugt. Die Immunisierung wird im Allgemeinen durch Mischen oder Emulgieren der Antigen enthaltenden Lösung in Kochsalzlösung, bevorzugt in einem Adjuvans, wie Freund'schem vollständigem Adjuvans, und durch parenterales Injizieren (im Allgemeinen subcutan oder intramuskulär) des Gemisches oder der Emulsion erzeugt. Eine Dosis von 50–200 μg/Injektion ist typischerweise ausreichend. Die Immunisierung wird im Allgemeinen 2–6 Wochen später mit einer oder mehr Injektionen des Proteins in Kochsalzlösung, bevorzugt unter Verwendung von Freund'schem unvollständigem Adjuvans, verstärkt. Man kann alternativ dazu Antikörper durch Immunisierung in vitro unter Anwendung von Verfahren erzeugen, die im Stand der Technik bekannt sind, was für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als zur Immunisierung in vivo äquivalent angesehen wird.
Polyklonale Antiseren erhält man durch Ausbluten des immunisierten Tiers in ein Glas- oder Kunststoffgefäß, Inkubieren des Blutes bei 25 °C für eine Stunde und anschließende Inkubation bei 4 °C für 2–18 Stunden. Das Serum wird durch Zentrifugieren (z. B. 1000 x g für 10 Minuten) gewonnen. Ungefähr 20–50 ml pro Ausblutung können von Kaninchen gewonnen werden.
2. Monoklonale Antikörper
Monoklonale Antikörper werden unter Anwendung des Verfahrens von Kohler und Milstein, Nature (1975) 256: 495–96, oder einer Modifizierung davon erzeugt. Typischerweise wird eine Maus oder eine Ratte wie oben beschrieben immunisiert. Jedoch anstatt das Tier auszubluten, um das Serum zu gewinnen, wird die Milz (und wahlweise mehrere große Lymphknoten) entfernt und zu Einzelzellen dissoziiert. Wenn es erwünscht ist, können die Milzzellen (nach Entfernen nicht-spezifischer adhärenter Zellen) durchgemustert werden, indem eine Zellsuspension auf eine Platte oder in eine Vertiefung eingebracht/aufgebracht wird, die mit dem Protein-Antigen beschichtet ist. B-Zellen, die membrangebundenes Immunglobulin exprimieren, das für das Antigen spezifisch ist, binden an die Platte und werden nicht mit dem Rest der Suspension weggespült. Die resultierenden B-Zellen, oder alle dissoziierten Milzzellen, werden dann induziert, um mit Myelomzellen unter Bildung von Hybridomen zu fusionieren, und sie werden in einem selektiven Medium (z. B. Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin-Medium, "HAT") kultiviert. Die daraus hervorgehenden Hybridome werden durch serielle Verdünnung ausplattiert und auf die Produktion von Antikörpern hin untersucht, die spezifisch an das gewünschte immunisierende Zelloberflächen-Antigen binden (und die nicht an nicht-verwandte Antigene binden). Die selektierten mAb-sezernierenden Hybridome werden dann entweder in vitro (z. B. in Gewebekulturflaschen oder Hohlfaserreaktoren) oder in vivo (als Ascites in Mäusen) kultiviert.
Wenn es erwünscht ist, können die Antikörper (ob sie polyklonal sind oder monoklonal) unter Verwendung von konventionellen Techniken markiert werden. Geeignete Markierungen umfassen Fluorophore, Chromophore, radioaktive Atome (insbesondere ³²P und ¹²⁵I), Elektronendichtereagentien, Enzyme und Liganden, die spezifische Bindungspartner haben. Enzyme werden typischerweise aufgrund ihrer Aktivität erfasst. Zum Beispiel wird Meerrettich-Peroxidase für gewöhnlich aufgrund ihrer Fähigkeit, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) in ein blaues Pigment umzuwandeln, erfasst, was mittels eines Spektrophotometers quantifizierbar ist.
"Spezifischer Bindungspartner" bezieht sich auf ein Protein, das in der Lage ist, ein Ligandenmolekül mit hoher Spezifität zu binden, wie z. B. im Falle eines Antigens und eines monoklonalen Antikörpers, der dafür spezifisch ist. Andere spezifische Bindungspartner umfassen Biotin und Avidin oder Streptavidin, IgG und Protein A, und die zahlreichen Rezeptor-Ligand-Paare, die im Stand der Technik bekannt sind. Es versteht sich, dass die obige Beschreibung die verschiedenen Markierungen nicht in verschiedene Klassen einteilen soll, da die gleiche Markierung auf mehrere unterschiedliche Weisen nützen kann. Zum Beispiel kann ¹²⁵I als radioaktive Markierung oder als elektronendichtes Reagens dienen. HRP kann als Enzym oder als Antigen für einen mAb dienen. Außerdem kann man verschiedene Markierungen für eine gewünschte Wirkung kombinieren. Beispielsweise benötigen mAbs und Avidin auch bei der Durchführung dieser Erfindung Markierungen: Daher könnte man einen mAb mit Biotin markieren und seine Anwesenheit mit Avidin, das mit ¹²⁵I markiert ist, oder mit einem Anti-Biotin-mAb, der mit HRP markiert ist, erfassen. Andere Abwandlungen und Möglichkeiten sind für den Fachmann leicht erkennbar und werden als Äquivalente innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung angesehen.
IV. CD40-Antigen-Epitope
Die CD40-Antigen-Epitope der vorliegenden Erfindung sind Moleküle, die mit monoklonalen Anti-CD40-Antikörpern immunreaktiv sind, deren Bindung an ein humanes CD40-Antigen, das sich auf der Oberfläche einer humanen B-Zelle befindet, das Wachstum oder die Differenzierung der B-Zelle verhindert. Dies bedeutet, dass solche Epitope mit der Bindung dieser Antikörper an das CD40-Antigen konkurrieren. Systematische Techniken zur Identifizierung dieser Epitope sind im Stand der Technik bekannt und beispielsweise beschrieben von H. M. Geysen in dem Patent US 4 708 871 . Diese Epitope stellen typischerweise kurze Aminosäuresequenzen dar. Diese Sequenzen können in der Sequenz längerer Peptide oder Proteine eingebettet sein, solange sie zugänglich sind.
Die Epitope der Erfindung können nach Standard-Peptidsynthesetechniken herstellt werden, zum Beispiel durch Festphasensynthese. Alternativ können die Sequenzen der Erfindung durch Rekombinationsverfahren in größere Peptide oder Proteine eingebracht werden. Dies wird am leichtesten durch Erzeugung einer DNA-Kassette erreicht, welche die interessierende Sequenz codiert, und Ligasierung dieser Kassette an der geeigneten Stelle in eine DNA, die das zu modifizierende Protein codiert. Die DNA-Sequenz kann nach Standard-Synthesetechniken synthetisiert werden oder aus dem Phagen-PIII-Gen unter Anwendung geeigneter Restriktionsenzyme herausgeschnitten werden.
Die hier identifizierten Epitope können durch einfache Festphasen-Techniken hergestellt werden. Die Mindest-Bindungssequenz kann für jedes Epitop systematisch nach Standardverfahren ermittelt werden, zum Beispiel durch Anwendung des Verfahrens, das von H. M Geysen in dem Patent US 4 708 871 beschrieben wurde. Kurz zusammengefasst kann ein Satz überlappender Oligopeptide, die von dem CD40-Antigen abgeleitet und an eine Festphasen-Anordnung von Stiften gebunden sind, synthetisiert werden, wobei ein einziges Oligopeptid an jedem Stift vorliegt. Die Stifte sind so angeordnet, dass sie mit dem Format einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen übereinstimmen, was es erlaubt, alle Stifte gleichzeitig zu testen, zum Beispiel auf Bindung an einen monoklonalen Anti-CD40-Antikörper. Durch Anwendung dieses Verfahrens kann die Bindungsaffinität für jede mögliche Untergruppe aufeinanderfolgender Aminosäuren leicht bestimmt werden.
Analoga der Erfindung werden ebenfalls durch Standard-Festphasenmethoden hergestellt, wobei solche Methoden in der PCT-Anmeldung US91/04282 beschrieben sind.
VI. Formulierungen und Verabreichungsmethoden
Die Antikörper und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden in einer Konzentration verabreicht, die therapeutisch wirksam ist, um Antikörper-vermittelte Erkrankungen wie Allergien, SLE, PBC und ITP zu verhindern oder zu behandeln. Um dieses Ziel zu erreichen, können die Antikörper oder Zusammensetzungen unter Verwendung einer Vielzahl von annehmbaren Excipientien, die im Stand der Technik bekannt sind, formuliert werden. Typischerweise werden die Antikörper oder Zusammensetzungen durch Injektion, entweder intravenös oder intraperitoneal, verabreicht. Verfahren, um diese Verabreichung zu erreichen, sind dem Fachmann bekannt. Es kann außerdem möglich sein, Zusammensetzungen zu erhalten, die topisch oder oral verabreicht werden können oder welche dazu fähig sein können, Schleimhäute zu durchdringen.
Vor der Verabreichung an Patienten können zu den Antikörpern Formulierungsmittel hinzugegeben werden. Eine flüssige Formulierung ist bevorzugt. Diese Formulierungsmittel können zum Beispiel Öle, Polymere, Vitamine, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Salze, Puffer, Albumin, grenzflächenaktive Mittel oder volumenerhöhende Mittel umfassen. Bevorzugt umfassen Kohlenhydrate Zucker oder Zuckeralkohole, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide oder wasserlösliche Glucane. Die Saccharide oder Glucane können Fructose, Dextrose, Lactose, Glucose, Mannose, Sorbose, Xylose, Maltose, Saccharose, Dextran, Pullulan, Dextrin, alpha- und beta-Cyclodextrin, lösliche Stärke, Hydroxyethylstärke und Carboxymethylcellulose, oder Gemische daraus, umfassen. Saccharose ist am meisten bevorzugt. "Zuckeralkohol" ist als ein C₄-C₈-Kohlenwasserstoff definiert, der eine -OH-Gruppe aufweist, und umfasst Galactit, Inosit, Mannit, Xylit, Sorbit, Glycerin und Arabit. Mannit ist am meisten bevorzugt. Diese Zucker oder Zuckeralkohole, die oben genannt sind, können einzeln verwendet werden oder in Kombination. Es gibt keine festgesetzte Grenze für die verwendete Menge, solange der Zucker oder Zuckeralkohol in der wässerigen Zusammensetzung löslich ist. Bevorzugt liegt die Zucker- oder Zuckeralkohol-Konzentration zwischen 1,0 % G/V und 7,0 % G/V und noch bevorzugter zwischen 2,0 und 6,0 % G/V. Bevorzugt umfassen Aminosäuren linksdrehende (L-) Formen von Carnitin, Arginin und Betain; jedoch können auch andere Aminosäuren zugesetzt werden. Bevorzugte Polymere umfassen Polyvinylpyrrolidon (PVP) mit einem mittleren Molekulargewicht von 2000 bis 3000 oder Polyethylenglycol (PEG) mit einem mittleren Molekulargewicht von 3000 bis 5000. Es ist ferner bevorzugt, einen Puffer in der Zusammensetzung zu verwenden, um pH-Änderungen in der Lösung vor der Lyophilisierung oder nach dem Wiederlösen zu minimieren. Fast jeder physiologische Puffer kann verwendet werden, jedoch sind Citrat-, Phosphat-, Succinat- und Glutamat- Puffer oder Gemische daraus bevorzugt. Am meisten bevorzugt ist ein Citratpuffer. Die Konzentration beträgt bevorzugt 0,01 bis 0,3 mol/l. Grenzflächenaktive Mittel, die zu der Formulierung hinzugegeben werden könnten, sind in den Patenten EP 270 799 und EP 268 110 angegeben.
Zusätzlich können Antikörper chemisch durch kovalente Verknüpfung mit einem Polymer modifiziert werden, um z. B. ihre Halbwertszeit im Kreislauf zu erhöhen. Bevorzugte Polymere und Verfahren, um sie an Peptide anzuhängen, sind in den Patenten US 4 766 106 , US 4 179 337 , US 4 495 285 und US 4 609 546 angegeben. Bevorzugte Polymere sind polyoxyethylierte Polyole und Polyethylenglycol (PEG). PEG ist in Wasser bei Raumtemperatur löslich und hat die allgemeine Formel R(O-CH₂-CH₂)_nO-R, wobei R Wasserstoff oder eine Schutzgruppe, wie eine Alkyl- oder eine Alkanol-Gruppe, sein kann. Bevorzugt besitzt die Schutzgruppe 1 bis 8 Kohlenstoffatome, bevorzugter ist sie Methyl. Das Symbol n ist eine positive ganze Zahl, bevorzugt zwischen 1 und 1000 und bevorzugter zwischen 2 und 500. Das PEG hat ein bevorzugtes mittleres Molekulargewicht von 1000 bis 40000, bevorzugter von 2000 bis 20000 und am bevorzugtesten von 3000 bis 12000. Bevorzugt besitzt PEG mindestens eine Hydroxygruppe, noch bevorzugter ist eine endständige Hydroxygruppe. Es ist diese Hydroxygruppe, die bevorzugt aktiviert ist, um mit einer freien Aminogruppe am Inhibitor zu reagieren. Es versteht sich jedoch, dass die Art und die Menge der reaktiven Gruppen variiert werden kann, um einen kovalent verknüpften konjugierten PEG-Antikörper der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
Wasserlösliche polyoxyethylierte Polyole sind ebenfalls nützlich für die vorliegende Erfindung. Sie umfassen polyoxyethylierten Sorbit, polyoxyethylierte Glucose, polyoxyethyliertes Glycerin (POG), etc. POG ist bevorzugt. Ein Grund hierfür ist, dass das Glyceringerüst eines polyoxyethylierten Glycerins das gleiche Gerüst ist, das natürlich beispielsweise in Tieren oder Menschen in Mono-, Di- und Triglyceriden vorkommt. Daher würde diese Verzweigung nicht notwendigerweise als ein fremdes Mittel im Körper angesehen. Das POG hat ein bevorzugtes Molekulargewicht im gleichen Bereich wie PEG. Die Struktur von POG ist in Knauf et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 15064–15070, dargestellt, und eine Diskussion von POG/IL-2-Konjugaten findet sich in dem Patent US 4 766 106 .
Ein anderes Arzneimittel-Verabreichungssystem zur Erhöhung der Halbwertszeit im Kreislauf ist das Liposom. Verfahren zur Herstellung von Liposomen-Verabreichungssystemen sind diskutiert in Gabizon et al., Cancer Research (1982) 42: 4734; Cafiso, Biochem. Biophys. Acta (1981) 649:129, und Szoka, Ann. Rev. Biophys. Eng. (1980) 9: 467. Andere Arzneimittel-Verabreichungssysteme sind im Stand der Technik bekannt und z. B. in Poznansky et al., DRUG DELIVERY SYSTEMS (R. L. Juliano, Hrsg., Oxford, N.Y. 1980), S. 253–315 und M. L. Poznansky, Pharm. Revs. (1984) 36: 277, beschrieben.
Nachdem die flüssige pharmazeutische Zusammensetzung hergestellt wurde, wird sie bevorzugt lyophilisiert, um Abbau zu verhindern und die Sterilität aufrechtzuerhalten. Verfahren zur Lyophilisierung von flüssigen Zusammensetzungen sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Kurz vor der Verwendung kann die Zusammensetzung mit einem sterilen Verdünnungsmittel (z. B. Ringerlösung, destilliertem Wasser oder steriler Kochsalzlösung) wieder gelöst werden, das zusätzliche Inhaltsstoffe enthalten kann. Nach dem Wiederlösen wird die Zusammensetzung bevorzugt unter Anwendung von Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, an Patienten verabreicht.
Die Anti-CD40-Antikörper und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden verwendet, um bei menschlichen Patienten Antikörper-vermittelte Erkrankungen, wie Allergien, SLE, PBC und ITP, zu verhindern oder zu behandeln. Der bevorzugte Weg der Verabreichung für diese Antikörper ist parenteral. Bei der parenteralen Verabreichung werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in einer injizierbaren Einheitsdosierform, wie einer Lösung, einer Suspension oder einer Emulsion, formuliert, und zwar in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren parenteralen Träger. Solche Träger sind schon per se nicht-toxisch und nicht-therapeutisch. Beispiele für solche Träger sind Kochsalzlösung, Ringerlösung, Dextroselösung und Hanksche Lösung. Nichtwässerige Träger, wie fixierte Öle und Ethyloleat, können ebenfalls verwendet werden. Ein bevorzugter Träger ist 5 % Dextrose in Kochsalzlösung. Der Träger kann geringere Mengen an Zusätzen enthalten, wie beispielsweise Substanzen, welche die Isotonizität und die chemische Stabilität erhöhen, wozu Puffer und Konservierungsmittel gehören.
Die Dosierung und die Art der Verabreichung hängen vom Individuum ab. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen so verabreicht, dass die Antikörper in einer Dosis von 1 μg/kg bis 20 mg/kg, bevorzugter von 20 μg/kg bis 10 mg/kg und am meisten bevorzugt von 1 bis 7 mg/kg gegeben werden. Bevorzugt wird eine Bolus-Dosis gegeben, um die Kreislaufspiegel 10–20 fach und für 4–6 Stunden nach der Bolus-Dosis zu erhöhen. Es kann auch eine kontinuierliche Infusion nach der Bolus-Dosis angewandt werden. In diesem Fall können die Antikörper in einer Dosis von 5 bis 20 μg/kg·min und bevorzugter von 7 bis 15 μg/kg·min infundiert werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, sollen aber in keiner Weise einschränkend sein.
Materialien und Methoden
Die Iscove-Modifizierung von Dulbeccos Eagle-Medium (IMDM) und fötales Rinderserum wurden von JR Biosciences (Lenexa, KS) bezogen, Penicillin und Streptomycin wurden von Irvine (Santa Ana, CA) bezogen, und Polyethylenglycol (Mol.-Gew. 1500) stammte von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN).
Kulturmedien.
SP2/0-Maus-Myelomzellen, Hybridomzellen, gereinigte T-Zellen, EBV-transformierte B-Zellen und Zelllinien wurden in IMDM kultiviert, das mit Streptomycin (200 μg/ml), Penicillin (200 U/ml) und 10 % Hitze-inaktiviertem fötalen Rinderserum ergänzt war (vollständiges IMDM). Die Sf9-Insektenzellen wurden in geschüttelten Schüttelflaschen (125–150) in einem Medium kultiviert, das von Maiorella et al. (1989) beschrieben worden war, und zwar ergänzt mit 0, 5 % fötalem Rinderserum. 3T6-FcγRII-Zellen wurden in einem Medium kultiviert, das aus 50 % modifiziertem Dulbeccos Eagle-Medium und 50 % HAM-F10-Medium bestand, ergänzt mit Aminopterin (0,2 μg/ml), Thymidin (5 μg/ml), Xanthin (10 μg/ml), Hypoxanthin (15 μg/ml), Mycophenolsäure (20 μg/ml), Desoxycytidin (2,3 μg/ml) und 10 % Hitze-inaktiviertem fötalen Rinderserum (vollständiges DME/HAM-F10). 3T6-FcγRII/B7-Zellen wurden in vollständigem DME/HAM-F10-Medium kultiviert, das 400 μg/ml G418 (Gibco) enthielt.
Zellen und Zelllinien.
Periphere mononukleäre Blutzellen wurden aus heparinisiertem Blut (erhalten von gesunden Spendern) mittels Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten-Zentrifugierung isoliert. T-Zellen wurden durch Abreichern von Monocyten und B-Zellen unter Verwendung von Lymphokwik (Lambda, Californien) (1 λ) angereichert. Die EBV-transformierte B-Zelllinie ARC und die P815-Zelllinie, eine NK-resistente Maus-Mastocytom-Zelllinie, die FcγRII und FcγRIII exprimiert (Ra, C., et al., Nature (1989) 341: 752), waren von ATCC (Rockville, MD) erhalten. 3T6-FcγRII, die Maus-Fibroblasten-Zelllinie, die CD32 exprimiert, das humane stark reagierende FcγRII-Allel, wie beschrieben von Warmerdam, P. A. M., et al., J. Exp. Med. (1990) 172: 19, wurden freundlicherweise von Dr. J. van de Winkel (Universitätskrankenhaus, Utrecht, Niederlande) zur Verfügung gestellt. Der mutierte Maus-Thymom-EL-4-Subklon EL4B5 war von Dr. R. H. Zubler, Hȏpital Cantonal Universitaire, Genf, überlassen. Transfizierte Maus-3T6-Zellen, die Hybridmoleküle der stark reagierenden HR ("high responder")-Allelform von humanem FcγRIIa exprimierten, waren überlassen von Dr. P. A. M. Warmerdam, Abteilung für experimentelle Immunologie, Universitätskrankenhaus Utrecht, Utrecht, Niederlande, Warmerdam et al., J. Immunol. (1991) 147: 1338. Beide Zelllinien wurden in Iscove-modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM), ergänzt mit Gentamycin (80 μg/ml) und 10 % Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) (Hyclone, Logan, Utah), kultiviert. Um einen möglichen Verlust an B-Zell-Aktivierungskapazität zu vermeiden, wurde alle 4 bis 8 Wochen eine neue Charge EL4B5-Zellen aufgetaut. Diese Zelllinien wurden periodisch unter Verwendung einer ³H-markierten DNA-Sonde für Mykoplasma-Ribosomen-RNA (GenProbe, San Diego, CA) auf Mykoplasma-Kontamination getestet; sie waren während des Verlaufs der Experimente frei von Mykoplasma.
Humane B-Lymphocyten.
B-Lymphocyten wurden aus Tonsillen isoliert, die von Kindern erhalten waren, bei denen eine Tonsillektomie vorgenommen worden war, wie im Wesentlichen in De Groot et al., Lymphokine Research (1990) 9: 321, beschrieben ist. Kurz zusammengefasst wurde das Gewebe mit Skalpellklingen dispergiert, phagocytische und NK-Zellen wurden durch Behandlung mit 5 mM L-Leucin-methylester abgereichert, und T-Zellen wurden durch einen Lauf der Rosettierung mit Schaf-Erythrocyten (SRBC), die mit 2-Aminoethylisothiuroniumbromid behandelt waren, entfernt. Die Reinheit der daraus hervorgehenden B-Lymphocyten-Präparationen wurde durch indirekte Immunfluoreszenz-Markierung mit dem Anti-(CD20)-mAb B1 (Coulter Clone, Hialeah, FA) oder dem Anti-(CD3)-mAb OKT3 (Ortho, Raritan, NJ) und mit einem FITC-konjugierten F(ab')₂-Fragment eines Kaninchen-anti-(Maus-Ig) (Zymed, San Francisco, CA) und mit FACS-Analyse überprüft. Die B-Zell-Präparationen enthielten (Mittelwert ± Standardabweichung von 6 Isolaten): 95 ± 4 % CD20-positive Zellen und 2 ± 1 % CD3-positive Zellen.
Antikörper.
Monoklonaler Anti-(human B7)-Antikörper BB-1 (Yokochi et al., 1982) war von Dr. E. A. Clark (University of Washington, Seattle, WA) erhalten und wurde als gereinigter Antikörper verwendet. Monoklonaler Anti-(human CD40)-Antikörper G27.5 (Clark et al., 1986) wurde von Dr. J. A. Ledbetter (Oncogen Corporation, Seattle, WA) bezogen und wurde als gereinigter Antikörper verwendet. Monoklonaler Anti-(CD40)-Antikörper S2C6 (Paulie et al., 1985) wurde von Dr. S. Paulie (Universität Stockholm, Stockholm Schweden) bezogen und wurde als gereinigter Antikörper verwendet. Monoklonaler Anti-(human CD26)-Antikörper Ta-1 und monoklonaler Anti-(CD20)-Antikörper B1 wurden von Coulter (Hialeah, FL) bezogen. Monoklonaler Anti-(CD3)-Antikörper OKT3 wurde von Ortho (Raritan, NJ) bezogen, und der monoklonale Anti(LeuM3)-Antikörper wurde von Becton-Dickinson (San Jose, CA) bezogen. Anti-(IgM)-Antikörper, die an Kügelchen (Immunobeads) gekoppelt waren, wurden von Bio-Rad (Richmond, CA) bezogen.
Anti-B7-mAb B7-24 (IgG2a, x) und Anti-CD40-mAbs 5D12, 3C6 und 3A8 wurden, wie oben in Abschnitt II beschrieben, erhalten; sie wurden als gereinigte Antikörper verwendet. Anti-CD3-mAb CLB-T3/4.1 (IgG1, x) wurde als verdünnter Gewebekultur-Überstand verwendet und war freundlicherweise von Dr. L. Aarden (Zentrallabor des Bluttransfusions-Service des Roten Kreuzes, Amsterdam, Niederlande) zur Verfügung gestellt. Anti-CD3-mAb UCHT1 (IgG, x) wurde als gereinigter Antikörper verwendet und war eine Gabe von Dr. P. Beverley (Imperial Research Cancer Fund, London, UK). Anti-CD72-mAb WL225 (IgG2a, x) wurde als gereinigter Antikörper verwendet und war eine Gabe von Dr. K. Thielemans (Freie Universität Brüssel, Belgien). Der Anti-ICAM-1-mAb 84H10 wurde als verdünnte Ascitesflüssigkeit verwendet. Anti-CD40-mAb S2C6 war eine Gabe von Dr. S. Paulie (Universität Stockholm, Schweden), Paulie et al., J. Immunol. (1989) 142: 590. Anti-CD40-mAb G28.5 wurde von Dr. J. A. Ledbetter (Oncogen Corporation, Seattle, WA, USA) gestiftet, Clark et al., PNAS (USA) (1986) 83: 4494. Kontroll- Antikörper waren: Anti-(β-Glucocerebrosidase)-mAb 8E4 (1gG1), Barneveld et al., Eur. J. Biochem. (1983) 134: 585, und die Myelom-Immunglobuline MOPC-21 (IgG1) und MOPC-141 (IgG2b) (Sigma, St. Louis, MO). Alle mAb wurden als gereinigte Antikörper-Präparationen verwendet. hCD40.Hμ-Fusionsprotein war eine Gabe von Dr. P. Lane (Baseler Insitut für Immunologie, Basel, Schweiz) und wurde als 5-fach konzentrierter Überstand von transfizierten J558L-Zellen verwendet, Lane et al., Eur. J. Immunol. (1992) 22: 2573.
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung können nach Standardverfahren markiert werden, wobei eine ganze Reihe von Reportermolekülen verwendet werden können, einschließlich der folgenden: Fluoreszenzmarkierungen (Fluorescein (FITC), R-Phycoerythrin, Rhodamin (TMRITC), Rhodamin 600 (XRITC), "TEXAS RED", und ähnliche, üblicherweise Avidin-gebunden); radioaktive Reste (¹²⁵I und ähnliche); lichtemittierende Markierungen (Luciferase und ähnliche); enzymatische Markierungen (Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Glucoseoxidase, β-Galactosidase und ähnliche). Außerdem können bei Reporter-Antikörpern (Antikörper, die Bindungsspezifität für die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung besitzen, z. B. Ziege-anti-Maus-IgG) ebenfalls die oben aufgelisteten Markierungsgruppierungen verwenden werden.
Enzyme und Oligonucleotide.
DNA-Polymerase I von E. coli (Klenow-Fragment) wurde von Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB) (Indianapolis, IN) bezogen. T4-DNA-Ligase und T4-DNA-Polymerase wurden von New England Biolabs (Beverly, MA) bezogen; Nitrocellulosefilter waren von Schleicher und Schuell (Keene, NH) erhalten. Synthetische Oligonucleotid-Linker und Primer wurden unter Verwendung von kommerziell erhältlichen automatischen Oligonucleotid-Synthesemaschinen hergestellt. Alternativ dazu können von Kunden vorgegebene synthetische Oligonucleotide, zum Beispiel von Synthetic Genetics (San Diego, CA) bezogen werden. cDNA-Synthese-Kits und Zufalls-Primer-Markierungs-Kits sind von Boehringer Mannheim Biochemical (BMB, Indianapolis, IN) erhältlich. Oligonucleotidsequenzen, die Peptide codieren, können entweder wie oben beschrieben synthetisiert werden; alternativ dazu können Peptide direkt mittels Standard-Techniken in vitro synthetisiert werden (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Übliche Manipulationen, die mit der Arbeit mit polyklonalen und monoklonalen Antikörpern einhergehen, einschließlich der Antikörperreinigung, wurden nach Standardverfahren durchgeführt (Harlow et al.).
Zell-Fluoreszenzfärbungs-Assay (FACS).
Die Zellen (10⁶/Probe) wurden in 10 μl primärem Antikörper (10 μl/ml in PBS-BSA oder HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution, Gibco/BRL), ergänzt mit 1 % BSA und 0,05 % Natriumazid) 20 Minuten bei 4 °C inkubiert. Nach 3 Waschschritten mit PBS-BSA oder HBSS-BSA wurden die Zellen in 100 μl FITC-markierten Fab'₂-Fragmenten von Ziege-anti-(Maus IgG)-Antikörpern (Jackson, West Grove, PA) 20 Minuten bei 4 °C inkubiert. Nach 3 Waschschritten mit PBS-BSA oder HBSS-BSA und einem Waschschritt mit PBS wurden die Zellen in 0,5 ml PBS resuspendiert. Die Analysen wurden mit einem Gerät FACSSCAN V (Becton Dickinson, San Jose, CA) durchgeführt.
Assay der B7-vermittelten T-Zell-Proliferation.
Gereinigte T-Zellen wurden mit 3T6-Fibroblasten kultiviert, die mit dem hochreaktiven FcγRIIa-Allel und dem B7-Molekül transfiziert waren (De Boer, M. et al., Eur. J. Immunol. (1992) 22: 3071–3075). Die Proliferation wurde mittels ³H-Thymidin-Einbau gemessen. Kurz zusammengefasst wurden 4 × 10⁴ T-Zellen mit 10⁴ bestrahlten (2500 rd) 3T6-FcγRII/B7-Zellen in Flachboden-Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen mit je 200 μl/Vertiefung vollständigem IMDM mit oder ohne Anti-CD3 Mab CLB-T3/4.1 kultiviert. Während der letzten 16 Stunden einer Kulturdauer von 72 Stunden wurden die Zellen mit 1 μCi/Vertiefung ³H-Thymidin pulsmarkiert.
Die Proliferation von T-Zellen ist als mittlere Zählrate cpm von drei Vertiefungen ausgedrückt.
Cytotoxisches T-Zell-Assay.
Gereinigte T-Zellen wurden mit 3T6-Fibroblasten, die mit dem stark reagierenden FcγRIIa-Allel und dem B7-Molekül transfiziert waren, kultiviert. Kurz zusammengefasst wurden 10⁶ T-Zellen mit 0,2 × 10⁶ bestrahlten (2500 rd) 3T6-FcγRII/B7-Zellen in Flachboden-Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen mit je 1 ml/Vertiefung vollständigem IMDM in Gegenwart von Anti-CD3 Mab UCHT1 3–4 Tage kultiviert. Die cytotoxische Aktivität der Lymphocyten wurde in einem Anti-CD3-gerichteten Cytotoxizitäts-Assay, wie oben beschrieben, analysiert.
Assay gemischter Lymphocyten-Kultur (MLC).
Die Proliferation von gereinigten T-Zellen wurde in gemischten Lymphocyten-Kulturen (MLC) unter Verwendung der EBV-transformierten B-Zelllinie ARC als Stimulatorzellen gemessen.
5 × 10⁴ T-Zellen wurden mit 5 × 10⁴ bestrahlten (5000 rd) Stimulatorzellen in rundbödigen Gewebekulturplatten (Corning) mit 96 Vertiefungen mit 200 μl/Vertiefung vollständigem IMDM-Medium kultiviert. Während der letzten 16 Stunden einer Kulturdauer von 72 Stunden wurden die Zellen mit 1 μCi/Vertiefung ³H-Thymidin pulsmarkiert. Die Proliferation von T-Zellen ist als mittlere Zählrate cpm von drei Vertiefungen ausgedrückt. Für sekundäre MLCs wurden Zellen, wie oben für primäre MLC beschrieben, stimuliert. Die T-Zell-Blasten für sekundäre MLC wurden in 5- bis 7-tätigen primären MLCs erzeugt, mit einer anschließenden Kultur in Abwesenheit der Stimulatorzellen für 2–4 Tage. Die cytotoxische Aktivität von T-Zellen, die in primärer oder sekundärer MLC erzeugt wurden, wurde in einem Anti-CD3-gerichteten Cytotoxizitäts-Assay unter Verwendung der Maus-P815-Zellen, wie unten beschrieben, analysiert. Alternativ dazu dienten die EBV-transformierten B-Zellen, die verwendet wurden, um die CTL-Aktivität zu induzieren, als Zielzellen.
Cytotoxizitäts-Assay.
Die CTL-Aktivität wurde in einem 4-stündigen Zielzell-Lyse-Assay unter Verwendung von P815-Maus-Mastocytom-Zellen oder EBV-transformierten B-Zellen ARC als Zielzellen bestimmt. Im Falle der P815-Zielzellen wurden die CTLs nichtspezifisch mit den Zielzellen verbunden, und zwar unter Verwendung des Anti-CD3-mAb OKT3 bei 2 μg/ml. Wenn die ARC-Zellen als Zielzellen verwendet wurden, nahmen nur die Alloantigenspezifischen CTLs an dem Abtötungsprozess teil. 10⁶ Zielzellen wurden zusammen mit 200 μCi ⁵¹Cr-Natriumchromat (Amersham International) eine Stunde inkubiert und anschließend gewaschen. Die CTL-Assays wurden in V-bödigen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen unter Verwendung von 5000 ⁵¹Cr-markierten Zielzellen mit unterschiedlichen Mengen Effektorzellen in einem Gesamtvolumen von 200 μl/Vertiefung durchgeführt. Vier Vertiefungen wurden mit 5 × 10³ Zielzellen in 200 μl Medium allein gefüllt, und vier Vertiefungen wurden mit 5 × 10³ Zielzellen in 100 μl Medium und 100 μl Saponin (zur Ermittlung spontaner bzw. maximaler Freisetzung) gefüllt. Im Falle der P815-Zellen wurden drei Vertiefungen mit Effektorzellen und Zielzellen in Abwesenheit von Anti-CD3-mAb gefüllt (um den Untergrund der experimentellen Lyse zu bestimmen). Drei andere Vertiefungen enthielten ebenfalls den Anti-CD3-mAb mit 2 μg/ml, um die gesamte Lyse in Anwesenheit von Anti-CD3 zu bestimmen. Die Platten wurden 10 Minuten bei 200 x g zentrifugiert und 4 Stunden bei 37 °C inkubiert. Danach wurden 100 μl des Überstands von jeder Vertiefung in einem Gamma-Counter gezählt. Die Ergebnisse sind als prozentualer Anteil der Anti-CD3-abhängigen spezifischen Freisetzung bei den P815-Zielzellen oder als prozentualer Anteil Alloantigen-spezifischer Freisetzung bei den ARC-Zielzellen ausgedrückt.
B-Zell-Proliferations-Assay.
B-Zellen (4 × 10⁴ pro Vertiefung) wurden in flachbödigen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in 200 μl IMDM, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt war, kultiviert. Die B-Zellen wurden durch Zusatz von immobilisierten Anti-(IgM)-Antikörpern (Immunobeads; 5μg/ml; BioRad, Richmond, CA) immobilisiert. Wo es angegeben ist, wurden 100 U/ml rekombinantes IL-2 hinzugefügt. Variierende Konzentrationen von mAbs wurden bei Beginn der Mikrokulturen zugegeben, und die Proliferation wurde am Tag 3 durch Messung des Einbaus von [³H]-thymidin nach 18 Stunden Pulsmarkierung bestimmt.
Banchereau-artiges B-Zell-Proliferations-Assay.
Zum Testen der Fähigkeit von Anti-CD40-mAbs zur Stimulation der B-Zell-Proliferation in einem Kultursystem, das analog zu dem von Banchereau et al., Science (1989) 251:70, beschriebenen Kultursystem ist, wurden transfizierte Maus-3T6-Zellen verwendet, welche die HR-Allelform von humanem FcγII exprimieren. B-Zellen (2 × 10⁴ pro Vertiefung) wurden in flachbödigen Mikrovertiefungen in Gegenwart von 1 × 10⁴ transfizierten Zellen (bestrahlt mit 5000 rd) in 200 μl IMDM, das mit 10% fötalem Kälberserum und 100 U/ml rekombinantem IL-4 ergänzt war, kultiviert. Vor der Zugabe der B-Zellen wurden die 3T6-Zellen an dem Kunststoffmaterial der Kulturplatte mindestens 5 Stunden anhaften gelassen. Anti-CD40-mAbs wurden in Konzentrationen zugegeben, die von 15 ng/ml bis 2000 ng/ml variierten; die Proliferation der B-Zellen wurde durch Messung des Thymidin-Einbaus am Tag 7 nach 18 Stunden Pulsmarkierung mit [³H]-Thymidin getestet.
B-Zell-Aktivierungs-Assay mit EL4B5-Zellen.
B-Zellen (1000 pro Vertiefung) wurden zusammen mit bestrahlten (5000 rd) EL4B5-Zellen (5 × 10⁴ pro Vertiefung) in flachbödigen Mikrotiterplatten in 200 μl IMDM kultiviert, das mit 10% Hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 5 ng/ml Phorbol-12-myristat-13-acetat (Sigma) und 5% humanem T-Zell-Überstand ergänzt war. Beim Beginn der Kultivierung wurden mAbs in variierenden Konzentrationen zugegeben, und der Thymidin-Einbau wurde am Tag 6 nach 18 Stunden Pulsmarkierung mit [³H]-Thymidin getestet. Zur Erzeugung des T-Zell-Überstands wurden gereinigte T-Zellen bei einer Dichte von 10⁶/ml 36 Stunden in Gegenwart von 1 μg/ml PHA und 10 ng/ml PMA kultiviert, Wen et al., supra. Der T-Zell-Überstand wurde durch Zentrifugieren der Zellen erhalten und bei –20 °C aufbewahrt. Die Wirksamkeit der T-Zell-Überstände bei der Förderung der Proliferation humaner B-Zellen in EL4B5-B-Zellkulturen wurde getestet, und die wirksamsten Überstände wurden gepoolt und in den Versuchen verwendet.
Human-T-Zell-Helfer-Assay auf die Antikörperproduktion durch B-Zellen.
Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit 1:500 verdünnter Ascitesflüssigkeit von Anti-CD3-mAb CLB-T3/3 (CLB, Amsterdam, Niederlande) beschichtet. Es wurden die folgenden costimulierenden mAbs zugegeben:
Anti-CD2-mAbs CLB-T 11.1/1 and CLB-T 11.2/1 (CLB, Amsterdam, Niederlande), beide Ascites 1:1000, und Anti-CD28-mAb CLB-28/1 (CLB, Amsterdam, Niederlande). Anschließend wurden tonsilläre T-Zellen (bestrahlt, 3000 rd; 10⁵ pro Vertiefung), tonsilläre B-Zellen (10⁴ pro Vertiefung) und rIL-2 (20 U/ml) zugegeben.
Das Endvolumen jeder Zellkultur betrug 200 μl. Nach 8 Tagen wurden die Zellen abzentrifugiert, und der zellfreie Überstand wurde gewonnen. Die Konzentrationen an humanem IgM und IgG in (verdünnten) Proben wurden durch ELISA abgeschätzt, wie im Folgenden beschrieben ist.
ELISA-Assay zur Immunglobulin-Quantifizierung
Die Konzentrationen von humanem IgM und IgG wurden mittels ELISA abgeschätzt. ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen wurden mit 4 μg/ml Maus-anti-Mensch-IgG-mAb MH16-01 (CLB, Amsterdam, Niederlande) oder mit 1,2 μg/ml Maus-anti-Human-IgM-mAb 4102 (Tago, Burlingame, CA) in 0,05 M Carbonatpuffer (pH = 9,6) durch 16 Stunden Inkubation bei 4 °C beschichtet. Die Platten wurden dreimal mit PBS-0,05 % Tween-20 (PBS-Tween) gewaschen und 1 Stunde mit BSA abgesättigt. Nach 2 Waschschritten wurden die Platten 1 h bei 37°C mit unterschiedlichen Verdünnungen der Testproben inkubiert. Nach 3 Waschschritten wurde gebundenes Ig durch 1 h Inkubation bei 37°C mit 1 μg/ml Peroxidase-markiertem Maus-anti-Human-IgG-mAb MH 16-01 (CLB) oder Maus-anti-Human-IgM-mAb MH 15-01 (CLB) detektiert. Die Platten wurden viermal gewaschen, und gebundene Peroxidaseaktivität wurde durch Zugabe von o-Phenylendiamin als Substrat sichtbar gemacht. Humanes Standardserum (H00, CLB) wurde verwendet, um eine Eichkurve für jedes Assay aufzustellen.
Durchflusscytofluorometrisches Assay.
ARC-Zellen (10⁶ Zellen/Probe) wurden in 100 μl primärem Antikörper (10 μg/ml in PBS-BSA oder "Hank's balanced salt solution" (HBSS), ergänzt mit 1 % BSA und 0,05 % Natriumazid) 20 min bei 4 °C inkubiert. Nach 3 Waschschritten mit PBS-BSA oder HBSS-BSA wurden die Zellen in 100 μl FITC-markierten F(ab')₂-Fragmenten von Ziege-anti-(Maus-IgG)-Antikörpern (Jackson, West Grove, PA) 20 min bei 4 °C inkubiert. Nach 3 Waschschritten mit PBS-BSA oder HBSS-BSA und einem Waschschritt mit PBS wurden die Zellen in 0,5 ml PBS resuspendiert. Die Analysen wurden mit einem Gerät FACSCAN V (Becton Dickinson, San Jose, CA) durchgeführt.
Alternativ dazu wurden EL4B5-Zellen vor und zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der Kultur in einem Medium, das PMA (5 ng/ml) und humanen T-Zell-Überstand (5 %) enthielt, geerntet. Die Zellen wurden 30 Minuten mit 10 μl Überstand von transfizierten Zellen, der hCD40-Hμ, verdünnt in 100 μl "Hank's balanced salt solution", ergänzt mit 0,05 % Natriumazid, enthielt, inkubiert. Dann folgte eine Inkubation mit FITC-konjugierten F(ab')₂-Fragmenten von Kaninchen-anti-(Human IgM) (Zentrallabor des Bluttransfusionsservice, Amsterdam, Niederlande). Als Kontrolle wurden Zellen nur mit dem FITC-Konjugat inkubiert. Zur Analyse wurde ein FACScan-4-Cytofluorometer (Becton and Dickinson) verwendet. Nicht-lebensfähige Zellen wurden durch Verwendung von Propidiumiodid von der Analyse ausgeschlossen.
Beispiel 1
PCR-Klonierung von CD40
RNA wurde aus einer Population von EBV-transformierten humanen Milzzellen, im Wesentlichen wie von Chirgwin et al. (1979) beschrieben, isoliert. Kurz zusammengefasst wurden die Zellen zweimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und in 5 M Guanidiniumthiocyanat in Anwesenheit von 0,7 M 2-Mercaptoethanol lysiert. Das Zelllysat wurde auf einen diskontinuierlichen CsCl-Gradienten geschichtet (Chirgwin et al.) und 16 Stunden bei 26.000 U/min in einem Beckman-SW28-Rotor zentrifugiert. Die RNA wurde wiedergewonnen, indem das Pellet in DEPC-behandeltem H₂O gelöst wurde. Die RNA wurde einmal mit Ethanol gefällt, in DEPC-behandeltem H₂O resuspendiert und bei –70 °C gelagert.
Die gesamte RNA (10 μg/Reaktion) wurde unter Anwendung des Random-Hexamer-Primings in 50 μl Reaktionspuffer, der 500 Einheiten LMV-RT (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD), 5 μM Random-Hexamere (Pharmacia, Piscataway, NJ), 1 mM DTT, dNTP-Mix (jeweils 0,5 mM), 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂ und 0,1 mg/ml BSA (Rinderserumalbumin) enthielt, in cDNA umgewandelt. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37°C wurden die Proben 3 min gekocht und bei –70°C aufbewahrt. Die DNA, die CD40 codiert, wurde mittels PCR unter Verwendung von Primern erzeugt, die Sequenzen enthielten, die Homologie zu der bekannten CD40-Sequenz aufwiesen, wobei die Primer auch Restriktionsschnittstellen, die zur Klonierung nützlich sind, codierten (2). Diese Primer basierten auf den publizierten codierenden cDNA-Sequenzen von CD40 (Stamenkovic et al., 1989). Alle Primer beginnen mit einer C-G-Klammer am 5'-Ende, gefolgt von einer Restriktionsschnittstelle zur Klonierung (fettgedruckt, 2). Die unterstrichene Sequenz in den Rückwärts-Primern zur Klonierung der löslichen Form von CD40 stellt ein Epitop dar, das von einem monoklonalen Antikörper erkannt wird, der zur Affinitätsreinigung benutzt wird. Die Zahlen in Klammern geben die Lage der Primer relativ zu der publizierten cDNA von CD40 an.
Zur PCR-Amplifizierung wurden 1 μl cDNA mit 1 μl (10 Picomol) eines Vorwärts-Primers, 1 μl (10 Picomol) eines Rückwärts-Primers und 47 μl PCR-Mix vermischt. Der PCR-Mix bestand aus 1,25 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin-Elmer/Cetus, Norwalk, CT), dNTP-Mix (jeweils 0,2 mM), 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂ und 0,1 mg/ml BSA. Die 50 μl des PCR-Gemisches wurden mit 70 μl Mineralöl überschichtet und in einem Perkin-Elmer/Cetus-Thermocycler 25 Zyklen der Amplifizierung unterzogen (Denaturierung bei 95 °C für 30 s, Primeranlagerung bei 55 °C für 30 s und Verlängerung bei 72 °C für 1,5 min). Die PCR-Produkte wurden nach 25 Amplifizierungszyklen erhalten.
Die Amplifizierungsprodukte wurden einem Verdau mit BglII und KpnI unterzogen (1B) und durch Größen-Fraktionierung isoliert. Vor der Expression in Baculovirus wurde die DNA-Sequenz jedes Fragments durch Sequenzanalyse bestätigt, um die Einführung von PCR-induzierten Mutationen zu verhindern. Der Baculovirus-Transfervektor pAcC8 wurde ebenfalls mit BglII und KpnI verdaut (1B).
Die amplifizierten Fragmente wurden in den linearen pAcC8-Vektor ligasiert (das Verhältnis von Insert zu Vektor betrug 3 : 1). Die Ligasierungsprodukte wurden in den bakteriellen Stamm DH5α transformiert (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD), und rekombinante pAcC8-Vektoren wurden auf der Basis der Ampicillin-Resistenz selektiert. Rekombinante Plasmide wurden von bakteriellen Klonen isoliert (Maniatis et al.; Ausubel et al.), und das Vorliegen des interessierenden Inserts wurde unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion verifiziert (siehe oben). Eine Plasmidpräparation in großem Maßstab wurde nach Standardverfahren durchgeführt (Ausubel et al.; Maniatis et al.; Sambrook et al.).
Beispiel 2
Baculovirus-Expression von humanem CD40
Sequenzen, die humanes CD40 codieren, wurden unter Verwendung der Transfervektoren pAcCD40 (der das Volllängen-CD40-Molekül codiert) und pAcCD40-ED/Glu (der die extracelluläre Domäne von CD40 codiert) durch Rekombination in den Baculovirus von Autographa californica (AcNPV) eingebracht.
Die Plasmide wurden mit Wildtyp-Baculovirus-DNA (2–10 pfu) (AcNPV; Summers et al.) in Sf9 (Spodoptera frugiperda)-Zellen bei einer Dichte von 10⁶ Zellen/ml (Sommers et al.) cotransfiziert. Rekombinante Baculovirus-infizierte Sf9-Zellen wurden identifiziert und klonal gereinigt (Sommers et al.).
Zur Expression von rekombinanten Proteinen auf der Zelloberfläche wurden die Zellen nach 48 Stunden Kultur geerntet; zur Produktion von sezernierten rekombinanten Proteinen wurden die Zellen nach 72 Stunden Kultur geerntet.
Beispiel 3
Sf9-Zellen-ELISA
Sf9-Insektenzellen, die mit rekombinantem Virus infiziert waren, wurden 48 Stunden in Platten mit 24 Vertiefungen kultiviert. Nach Entfernen des Gewebekulturmediums wurden die Platten 45 min bei Raumtemperatur (RT) mit 0,25 ml Antikörper in PBS mit 1 % BSA (PBS-BSA) inkubiert. Nach 3 Waschschritten mit PBS-BSA wurden die Platten bei RT 35 min mit 250 μl 1/250 verdünnten Ziege-anti(Maus-Gesamt-Ig)-Immunglobulinen, die mit Merrettich-Peroxidase konjugiert waren (Zymed, South San Francisco, CA), in PBS-BSA konjugiert. Nicht-gebundene Peroxidase-Aktivität wurde durch fünfmaliges Waschen mit PBS-BSA entfernt. Gebundene Peroxidase-Aktivität wurde durch Zugabe eines Assay-Gemisches, das durch Verdünnen von 0,5 ml einer Lösung von 2 mg/ml 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin in Ethanol mit 10 mM Na-Acetat, 10 mM EDTA-Puffer (pH 5,0) auf 10 ml und Zugabe von 0,03 % (V/V) H₂O₂ hergestellt wurde, nachgewiesen. Die Reaktion wurde nach 10 min durch Zugabe von 100 μl 1M H₂SO₄ gestoppt.
Die oben beschriebenen ELISA-Assays, die an lebenden Sf9-Zellen durchgeführt wurden, ergaben die folgenden Ergebnisse. 3 zeigt die Daten für lebende Sf9-Zellen, die mit pAcB7 und pAcCD40 infiziert und 48 Stunden in Platten mit 24 Vertiefungen kultiviert worden waren. Die in den ELISA-Assays verwendeten Antikörper waren: S2C6, Anti-(CD40) (nicht-gefüllte Balken) und ohne primären Antikörper (schraffierte Balken).
Beispiel 4
Zell-Fluoreszenzfärbung
A. Zell-Fluoreszenzfärbung
Zellen (10⁶/Probe) wurden in 10 μl primärem Antikörper (10 μg/ml in PBS-BSA oder HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution, Gibco/BRL), ergänzt mit 1 % BSA und 0,05 % Natriumazid) 20 min bei 4 °C inkubiert. Nach 3 Waschschritten mit PBS-BSA oder HBSS-BSA wurden die Zellen in 100 μl FITC-markierten Fab'2-Fragmenten von Ziege-anti-(Maus IgG)-Antikörpern (Jackson, West Grove, PA) 20 min bei 4 °C inkubiert. Nach 3 Waschschritten mit PBS-BSA oder HBSS-BSA und einem Waschschritt mit PBS wurden die Zellen in 0,5 ml PBS resuspendiert. Die Analysen wurden mit einem Gerät FACSSCAN V (Becton Dickinson, San Jose, CA) durchgeführt.
Allgemeine Protokolle zur durchflusscytometrischen Analyse und die Analyse klinischer Daten für Durchfluss-Cytometrie sind bei Keren et al. und Coon et al. detailliert dargestellt. Allgemeine Blutzellen-Zähltechniken und DNA-Quantifizierung sind von Powers, Keren et al. und Coon et al. beschrieben.
Die Daten zur Zell-Fluoreszenzfärbung von EBV-transformierten ARC-B-Zellen sind in 5 dargestellt. In 5A sind die Ergebnisse der Färbung mit einer 1 : 100-Verdünnung von Serum von einer Maus, die mit B7 exprimierenden Sf9-Zellen immunisiert wurde (durchgezogene Kurve), oder einer 1 : 100-Verdünnung von normalem Mausserum (punktierte Kurve) gezeigt.
In 5B sind die Ergebnisse der Färbung mit einer 1 : 100-Verdünnung von Serum von einer Maus, die mit CD40 exprimierenden Sf9-Zellen immunisiert wurde (durchgezogene Kurve), oder einer 1:100-Verdünnung von normalem Mausserum (punktierte Kurve) dargestellt.
In 5C sind die Ergebnisse einer Färbung mit einer 1 : 100-Verdünnung von Serum von einer Maus, die mit Kontroll-Sf9-Zellen immunisiert wurde (durchgezogene Kurve), oder einer 1 : 100-Verdünnung von normalem Mausserum (punktierte Kurve) dargestellt.
B. Kompetetive Assays mit löslichem Antigen
EBV-transformierte ARC-B-Zellen wurden mit monoklonalen Anti(B7)- und Anti-(CD40)-Antikörpern in Anwesenheit und Abwesenheit von löslichem B7 und löslichem CD40 gefärbt. Die Antikörper und das lösliche B7, lösliches CD40 oder Kontrollen wurden vor der Zugabe der ARC-Zellen 20 min bei RT präinkubiert.
6A zeigt die Ergebnisse der Färbung mit B7-24 (punktierte Kurve) oder nur sekundärem Antikörper (durchgezogene Kurve). 6B zeigt die Ergebnisse der Färbung mit B7-24 allein (punktierte Kurve) oder B7-24, das mit löslichem B7 präinkubiert wurde (durchgezogene Kurve). 6C zeigt die Ergebnisse der Färbung mit B7-24 allein (punktierte Kurve) oder B7-24, das mit löslichem CD40 präinkubiert wurde. 6D zeigt die Ergebnisse der Färbung mit CD40-3A8 (punktierte Kurve) oder nur sekundärem Antikörper (durchgezogene Kurve). 6E zeigt die Ergebnisse der Färbung mit CD407A8 allein (punktierte Kurve) oder CD403A8, das mit löslichem B7 präinkubiert wurde (durchgezogene Kurve). 6F zeigt die Ergebnisse der Färbung mit CD403A8 allein (punktierte Kurve) oder präinkubiert mit löslichem CD40 (durchgezogene Kurve).
Beispiel 5
Wirtstier-Immunisierung
Weiblichen BALB/c-Mäusen wurden intraperitoneal am Tag 0 und am Tag 14 5 × 10⁶ Sf9-Zellen, die mit AcCD40-Virus, AcB7-Virus oder AcCd3-Virus (Kontrollvirus) infiziert waren, injiziert. Am Tag 21 wurden 100 μl Serum zum Testen auf Anwesenheit von spezifischen Antikörpern entnommen. Nach einer Ruhephase von mindestens 2 Wochen erhielten die Mäuse eine letzte Injektion mit 5 × 10⁶ Zellen, die mit AcCD40- oder AcB7-Virus infiziert waren. Drei Tage nach dieser letzten Injektion wurden die Milzzellen zur Zellfusion verwendet.
Beispiel 6
Erzeugung von Hybridom-Klonen
Splenocyten von immunisierten BALB/c-Mäusen wurden mit murinen SP2/0-Myelomzellen bei einem Verhältnis von 10 : 1 unter Verwendung von 50 % Polyethylenglycol, wie zuvor von De Boer et al. beschrieben (1988), fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden in vollständigem IMDM-Medium, das mit Hypoxanthin (0,1 mM), Aminopterin (0,01 mM), Thymidin (0,016 mM) und 0,5 ng/ml hIL-6 (Genzyme, Cambridge, MA) ergänzt war, resuspendiert. Die fusionierten Zellen wurden dann auf die Vertiefungen von Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen so verteilt, dass im Mittel jede Vertiefung ein wachsendes Hybrid enthielt.
Nach 10–14 Tagen wurden die Überstände der Hybridom-Populationen im Hinblick auf spezifische Antikörperproduktion durchgemustert. Zur Durchmusterung im Hinblick auf die Produktion spezifischer Antikörper durch die Hybridom-Klone wurden die Überstände von 12 Vertiefungen gepoolt und zur Zell-Fluoreszenzfärbung von EBV-transformierten B-Zellen verwendet, wie in Beispiel 4 beschrieben. Anschließend wurden die Überstände der positiven Pools einzeln getestet. Positive Hybridomzellen wurden dreimal durch serielle Verdünnung in IMDM/FBS, das 0,5 ng/ml hIL-6 enthielt, kloniert. Die Ergebnisse der Untersuchung sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 Zusammenfassung von Fusionsdaten der Erzeugung von monoklonalen Antikörpern gegen humanes CD40 und humanes B7

^aNur die Hälfte der nach der Fusion erhaltenen Zellen wurde analysiert.
^bDurch FACS-Analyse, die in Beispiel 4 beschrieben ist, bestimmt.
^cDie Häufigkeit positiver Vertiefungen ist definiert als Anzahl positiver Vertiefungen, geteilt durch die Gesamtzahl von Vertiefungen mit Hybridom-Wachstum, multipliziert mit 100.

Beispiel 7
Testen tonsillärer B-Zellen
Tonsilläre B-Lymphocyten wurden aus Tonsillen isoliert, die von Kindern erhalten waren, die eine Mandeloperation durchgemacht hatten, wie von deGroot et al. (1990) beschrieben. Kurz zusammengefasst wurde das Gewebe mit Skalpellen dispergiert; phagocytische Zellen und NK-Zellen wurden durch Behandlung mit 5 mM L-Leucinmethylester abgereichert, und T-Zellen wurden durch einen Rosettierungszyklus mit Schaf-Erythrocyten, die mit 2-Aminoethylisothiuroniumbromid behandelt worden waren, entfernt.
Die monoklonalen Anti-(CD40)- und Anti-(B7)-Antikörper wurden unter Verwendung des Zell-Fluoreszenzfärbungs-Assays, das oben in Beispiel 4 beschrieben ist, auf ihre Fähigkeit hin getestet, an tonsilläre B-Zellen zu binden. Für die Fluoreszenzfärbungs-Analyse kultivierter tonsillärer B-Zellen wurde Propidiumiodid verwendet, um tote Zellen auszuschließen.
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der obigen Analyse für die Bindung von monoklonalen Anti-(CD40)-Antikörpern an hochangereicherte tonsilläre B-Zellen. Tabelle 2 Bindung von monoklonalen Anti-(CD40)-Antikörpern an hochangereicherte tonsilläre B-Zellen

^aDer prozentuale Anteil positiver tonsillärer Zellen wurde durch Zellfluoreszenzfärbung gemessen, wie in Beispiel 4 beschrieben ist.

Diese Daten zeigen, dass 89-95 % frisch isolierter tonsillärer B-Zellen mit den vier monoklonalen Anti-(CD40)-Antikörpern positiv gefärbt wurden.
Die Reaktion der tonsillären B-Zellen mit dem monoklonalen Antikörper G28.5 (Clark et al.) wurde im Wesentlichen auf die gleiche Weise getestet: Ungefähr der gleiche prozentuale Anteil der Zellen war positiv bei G28.5 wie bei den monoklonalen Anti(CD40)-Antikörpern der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 8
Costimulation der B-Zell-Proliferation mit Anti-CD40-mAbs
Es wurden 4 Hybridome, die monoklonale Antikörper gegen humanes CD40 produzieren, erzeugt, wie in den Beispielen 1 bis 7 beschrieben ist. Es wurde gezeigt, dass diese mAbs an einen ähnlichen Anteil tonsillärer B-Zellen binden, wie dies bei dem Anti-CD40-mAb G28.5 der Fall ist; de Boer et al. J. Immunol. Methods (1992) 152:15. Drei dieser monoklonalen Antikörper (5D12, 3A8 und 3C6), die der Unterklasse IgG2b angehörten, wurden in dem oben beschriebenen B-Zell-Proliferations-Assay auf ihre Fähigkeit getestet, Aktivierungssignale an humane B-Zellen abzugeben.
Humane tonsilläre B-Zellen (4 × 10⁴ pro Vertiefung) wurden in 200 μl in Mikrovertiefungen in Gegenwart von an Sepharosekügelchen (5 μg/ml) gekuppeltem Anti-IgM (7A) oder in Gegenwart von Anti-IgM plus rIL-2 (100 U/ml) (7B) kultiviert. Variierende Konzentrationen der Anti-CD40-mAbs S2C6, 5D12, 3C6 oder 3A8 wurden zugegeben, und der Einbau von [³H]-Thymidin wurde am Tag 3 nach 18 h Pulsmarkierung gemessen. Die in 7A dargestellten Daten sind Mittelwerte, die von Versuchen mit B-Zell-Präparationen von drei verschiedenen Spendern mit doppelter Inkubation abgeleitet sind. Die Daten von 7B sind Mittelwerte von einem von zwei Experimenten mit vergleichbaren Ergebnissen.
Keiner der neuen Anti-CD40-mAbs war befähigt, die Proliferation von humanen B-Zellen in Gegenwart von immobilisiertem Anti-IgM oder in Gegenwart von immobilisiertem Anti-IgM und IL-2 signifikant zu costimulieren. Im Gegensatz dazu costimulierte der Anti-CD40-mAB S2C6 die Proliferation von humanen B-Zellen in einer konzentrationsabhängigen Weise.
Beispiel 9
Induktion der B-Zell-Proliferation mit Anti-CD40-mAbs
Die in Beispiel 8 getesteten mAbs wurden auf ihre Fähigkeit getestet, in dem oben beschriebenen Banchereau-artigen Assay, d.h., durch Präsentation des Anti-CD40-mAbs auf adhärenten Zellen, die FcγRII exprimieren, die Proliferation humaner B-Zellen zu induzieren. Als Antikörper präsentierende Zellen wurden mit 3T6 transfizierte Mäusezellen verwendet, welche die HR-Allelform von humanem FcγRII exprimieren. Es wurde festgestellt, dass der Anti-CD40-mAb S2C6 zusammen mit IL-4 in diesem System die Proliferation tonsillärer humaner B-Zellen in wesentlichem Umfang induzierte, wie durch Messung des [³H]-Thymidin-Einbaus geprüft wurde. Die Anti-CD40-mAbs 5D12, 3C6 oder 3A8 induzierten jedoch in diesem Kultursystem die Proliferation humaner B-Zellen nicht (Daten nicht angegeben).
Beispiel 10
Inhibierung der Proliferation mit S2C6 stimulierter B-Zellen mit Anti-CD40-mAbs
Die Anti-CD40-mAbs wurden ferner auf ihre Fähigkeit getestet, die Costimulation der Proliferation humaner B-Zellen durch den Anti-CD40-mAb S2C6 zu inhibieren, wobei das oben beschriebene B-Zell-Proliferations-Assay verwendet wurde. Humane tonsilläre B-Zellen (4 × 10⁴ pro Vertiefung) wurden in 200 μl in Mikrovertiefungen in Gegenwart von an Sepharosekügelchen (5 μg/ml) gekoppelten Anti-IgM und des Anti-CD40-mAbs S2C6 (1,25 μg/ml) kultiviert. Variierende Konzentrationen der Anti-CD40-mAbs 5D12, 3C6 oder 3A8 wurden zugegeben, und der Einbau von [³H]-Thymidin wurde nach drei Tagen getestet. Als Kontrolle wurde der Anti-(Glucocerebrosidase)-mAb 8E4 in ähnlichen Konzentrationen zugegeben, Barneveld et al., Eur. J. Biochem. (1983) 134:585. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung und stammen von Experimenten mit B-Zellen von zwei verschiedenen Spendern bei Doppelinkubation.
Es wurde festgestellt, dass jeder der Anti-CD40-mAbs 5D12, 3A8 und 3C6 die Costimulation der mit Anti-IgM induzierten Proliferation humaner B-Zellen durch den mAb S2C6 inhibieren konnte (8).
Im Gegensatz dazu wurde keine signifikante Inhibierung mit äquivalenten Mengen des nicht relevanten mAb 8E4, der gegen β-Glucocerebrosidase gerichtet ist, festgestellt, Barneveld et al., supra. Daher wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass diese Anti-CD40-mAbs keine stimulierenden Signale zur Proliferation humaner B-Zellen abgeben, sondern, im Gegensatz dazu, durch Triggern von Anti-CD40 mit einem anderen mAb erzeugte stimulierende Signale zu inhibieren imstande sind.
Daher wurden diese mAbs als ausgezeichnete Werkzeuge zur Untersuchung angesehen, ob die Signalisierung über CD40 eine Rolle bei der Stimulation der Proliferation humaner B-Zellen durch EL4B5-Zellen spielt.
Beispiel 11
Wirkung von Anti-CD40-mAbs auf die EL4B5-induzierte Proliferation humaner B-Zellen
Die Wirkung von Anti-CD40-mAbs auf die EL4B5-induzierte Proliferation humaner B-Zellen wurde unter Anwendung des oben beschriebenen B-Zell-Aktivierungs-Assays getestet. Humane tonsilläre B-Zellen (1000 pro Vertiefung) wurden zusammen mit bestrahlten EL4B5-Zellen (50000 pro Vertiefung) in Gegenwart von 5 % Überstand aktivierter humaner T-Zellen und 5 ng/ml PMA kultiviert. Die Anti-CD40-mAbs 5D12, 3C6 oder 3A8 wurden in variierenden Konzentrationen zugegeben. Als Kontrolle wurde der mAb MOPC-141 (IgG2b) zugegeben. Nach 6 Tagen Kultivierung wurde der Einbau von [³H]-Thyimidin ermittelt.
9 zeigt, dass der Zusatz der Anti-CD40-mAbs 5D12, 3C6 oder 3A8 zu einer konzentrationsabhängigen Inhibierung der Proliferation humaner B-Zellen führte.
Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung und stammen von Experimenten mit B-Zellen von vier verschiedenen Spendern mit Doppelinkubation. Die Werte für den Einbau von [³H]-Thymidin, die für Inkubationen ohne mAb gefunden wurden, waren (Mittelwerte ± Standardabweichung) 10460 ± 1843 cpm, 6982 ± 1729 cpm, 4362 ± 1020 cpm bzw. 1543 ± 3190 bei den vier verschiedenen Experimenten. Der Wert für den Einbau von [³H]-Thymidin in B-Zellen allein betrug 40 ± 5 cpm und bei bestrahlten EL4B5-Zellen allein 31 ± 15 cpm.
Es trat eine sehr starke Inhibierung auf. Bei niederen Konzentrationen von jeweils 10 ng/ml inhibierten die drei Anti-CD40-mAbs 5D12, 3C6 und 3A8 die Proliferation humaner B-Zellen vollständig. Die Hälfte der maximalen Inhibierung wurde bei etwa 1 ng/ml festgestellt. Im Gegensatz dazu hatte das Mäuse-Myelom-Protein MOPC-141 vom passenden Isotyp IgG2b keine signifikante Wirkung auf den Einbau von [³H]-Thymidin. Eine ähnliche Inhibierung wurde festgestellt, wenn der Einbau von [³H]-Thymidin am Tag 4 der Kultur anstelle am Tag 6 getestet wurde, wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen wurde, dass der beobachtete Effekt durch eine Änderung in der Kinetik der Proliferation unter dem Einfluss des Anti-CD40-mAb bedingt war (Daten nicht dargestellt).
Zu Vergleichszwecken wurde der Einfluss einiger mAb, die gegen andere Oberflächenstrukturen von B-Zellen gerichtet sind, untersucht. Weder der Anti-CD20-mAb B1 noch der Anti-B7-mAb B7-24 (der letztere mAb wurde nach einem ähnlichen Verfahren erzeugt, wie es zur Erzeugung des in 9 verwendeten Anti-CD40-mAb angewandt wurde) hatte in ähnlichen Konzentrationen, wie sie bei den Experimenten mit dem Anti-CD40-mAb angewandt wurden, irgendeine Wirkung auf die EL4B5-induzierte Proliferation humaner B-Zellen (Daten nicht angegeben). Daher kann die Schlussfolgerung gezogen werden, dass die inhibierende Wirkung des Anti-CD40-mAb auf die EL4B5-induzierte Proliferation von B-Zellen nicht durch eine Maskierung der B-Zell-Oberfläche bedingt ist.
Beispiel 12
Wirkungen von hCD40.Hμ auf die EL4B5-induzierte Proliferation humaner B-Zellen
Zur Untersuchung, ob EL4B5-Zellen eine Membranstruktur exprimierten, die CD40 bindet, wurde ein Fusionsprotein zur durchflusscytometrischen Analyse verwendet, das aus der extracellulären Domäne von CD40 und den konstanten Domänen CH₂, CH₃ und CH₄ von humanem IgM bestand (hCD40.Hμ), Lane et al., supra. Nicht-aktivierte EL4B5-Zellen zeigten keine Bindung an das Fusionsprotein. Nach der Kultivierung von EL4B5-Zellen zusammen mit PMA (5 ng/ml) und 5 % Überstand humaner T-Zellen, was den zur Aktivierung humaner B-Zellen erforderlichen Bedingungen entspricht, wurde allerdings eine geringe Bindung von hCD40.Hμ festgestellt (Daten nicht gezeigt). Diese kleine Verschiebung in der Fluoreszenz wurde in konsistenter Weise bei drei unabhängigen Experimenten gefunden. Die zur Induktion der CD40-Bindung erforderliche Mindest-Aktivierungsdauer betrug 24 Stunden. Zur Feststellung, ob eine Bindung von hCD40.Hμ an EL4B5-Zellen die EL4B5-induzierte Proliferation humaner B-Zellen inhibiert, wie dies bei dem Anti-CD40-mAb der Fall ist, wurde das Fusionsprotein in Cokulturen von EL4B5-Zellen mit humanen B-Zellen unter Anwendung des oben beschriebenen B-Zell-Aktivierungs-Assays hineintitriert. 10 zeigt, dass das Fusionsprotein tatsächlich den Einbau von [³H]-Thymidin in einer konzentrationsabhängigen Weise inhibierte und wie der bei den in 9 gezeigten Experimenten verwendete Anti-CD40-mAb befähigt war, die durch EL4B5-Zellen induzierte B-Zell-Proliferation vollständig zu inhibieren.
Beispiel 13
Wirkungen von Anti-CD40-mAbs auf die durch humane T-Zellen induzierte Antikörperproduktion von humanen B-Zellen
Die Antikörper wurden auch auf ihre Fähigkeit getestet, die Immunglobulinproduktion durch B-Zellen zu inhibieren, die in einer kontaktabhängigen Weise mit aktivierten T-Zellen stimuliert wurden, wobei das oben beschriebene T-Zell-Helfer-Assay angewandt wurde. Humane tonsilläre B-Zellen (10⁴/Vertiefung) wurden zusammen mit bestrahlten gereinigten T-Zellen (3000 rd, 10⁵/Vertiefung) in Platten mit 96 Vertiefungen kultiviert, die mit Anti-CD3-mAb und mit oder ohne verschiedene mAbs zur Costimulation der T-Zellen beschichtet waren. Nach 8 Tagen Kultivierung wurden die Überstände zur Bestimmung der Immunglobulinproduktion durch die B-Zellen gewonnen. Die Immunglobulinproduktion der B-Zellen wurde mit dem oben beschriebenen ELISA-Assay untersucht. Am Beginn der Kultivierungen wurde der Anti-CD40-mAb 5D12 in variierenden Konzentrationen zugegeben. Als Kontrolle wurde der mAb MOPC-141 zugegeben. 4A zeigt, dass dann, wenn die T-Zellen mit immobilisiertem Anti-CD3-mAb stimuliert und mit löslichem Anti-CD2-mAb und Anti-CD28-mAb costimuliert wurden, der Zusatz des Anti-CD40-mAb 5D12 zu einer konzentrationsabhängigen Inhibierung der IgG-Produktion von humanen B-Zellen führte. Die IgM-Produktion der B-Zellen wurde in gleichem Ausmaß inhibiert. Ähnliche Ergebnisse wurden mit den Anti-CD40-mAbs 3C6 und 3A8 sowie mit dem Fusionsprotein hCD40.Hμ erhalten.
Die Anti-CD40-mAbs der vorliegenden Erfindung zeigten eine sehr starke Inhibition. Bei niederen Konzentrationen von etwa 30 ng/ml ergab jeder der drei Anti-CD40-mAbs 50 % der maximalen Inhibition. Im Gegensatz dazu hatte das Mäuse-Myelom-Protein MOPC-141 vom passenden Isotyp IgG2b keine Wirkung auf die Immunglobulinproduktion.
Die inhibierende Wirkung der drei Anti-CD40-mAbs war nicht spezifisch hinsichtlich der Art der Aktivierung der T-Zellen, welche die CD40-Liganden-Helferaktivität ergeben. 4B zeigt, dass unter sämtlichen Bedingungen der T-Zell-Stimulation (Anti-CD3 allein; Anti-CD3 + Anti-CD2; Anti-CD3 + Anti-CD28 sowie Anti-CD3 + Anti-CD2 + Anti-CD28) der Zusatz des Anti-CD40-mAb 5D12 zu einer starken Inhibierung der Immunglobulinproduktion durch humane B-Zellen führt. Die Inhibition ist mit dem Ausmaß der Inhibition mit dem Fusionsprotein hCD40.Hμ vergleichbar, von dem bekannt ist, dass es die CD40-CD40-Ligandenwechselwirkung vollständig blockiert. Der Prozentsatz der Inhibierung variierte je nach den Bedingungen der T-Zell-Aktivierung von 40 bis 70 %. Im Gegensatz dazu hatte das Mäuse-Myelom-Protein MOPC-141 mit dem passenden Isotyp IgG2b oder humanes IgM (als Kontrolle für das Fusionsprotein hCD40.Hμ) keine Wirkung auf die Immunglobulinproduktion durch humane B-Zellen.
Hinterlegung von Kulturen
Die in den obigen Beispielen verwendeten Hybridome wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, gemäß den Maßgaben des Budapester Vertrags hinterlegt und angenommen. Diese Hinterlegung bedeutet nicht, dass diese Hybridome notwendig sind, um die oben beschriebene oder unten beanspruchte Erfindung auszuführen.
Die vorliegende Erfindung wurde mit Bezugnahme auf spezielle Ausführungsformen beschrieben. Diese Anmeldung soll jedoch auch die Abwandlungen und Austauschformen, die von einem Fachmann vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Umfang der beigefügten Ansprüche abzuweichen, abdecken.
Literaturnachweis

Ausubel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Media, PA.
Bohinski, R. C., Modern Concepts in Biochemistry, Zweite Auflage, Allyn and Bacon, Inc.
Carroll, W. P., Thielemans, K., Dilley, J., und Levy, R. (1986) J. Immunol. Methods 89: 61.
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Claims

Monoklonaler Antikörper oder Fragment davon mit der Fähigkeit der Bindung an ein humanes CD40-Antigen, das sich auf der Oberfläche einer humanen B-Zelle befindet, wobei die Bindung des Antikörpers oder des Fragments davon an das CD40-Antigen das Wachstum oder die Differenzierung der B-Zelle verhindert.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, der unter den Antikörpern 5D12, erzeugt von dem Hybridom ATCC HB 11339, und 3C6, erzeugt von dem Hybridom ATCC HB 11340, ausgewählt ist.
Monoklonaler Antikörper oder Fragment nach Anspruch 1 oder 2, der bzw. das humanisiert ist.
Monoklonaler Antikörper oder Fragment nach Anspruch 3, wobei das Fragment ein Fragment Fab', F(ab')₂ oder Fv ist.
Hybridom mit der Fähigkeit, einen monoklonalen Antikörper zu erzeugen, der Spezifität für das CD40-Antigen einer humanen B-Zelle besitzt, wobei die Bindung des monoklonalen Antikörpers an das humane CD40-Antigen, das auf der Oberfläche einer humanen B-Zelle exprimiert wird, das Wachstum oder die Differenzierung der B-Zelle inhibiert.
Hybridom nach Anspruch 5 mit der Hinterlegungsnummer ATCC HB 11339, das den monoklonalen Antikörper 5D12 erzeugt.
Hybridom nach Anspruch 5 mit der Hinterlegungsnummer ATCC HB 11340, das den monoklonalen Antikörper 3C6 erzeugt.
Verwendung eines monoklonalen Anti-CD40-Antikörpers oder eines Fragments davon mit der Fähigkeit der Bindung an ein humanes CD40-Antigen, das sich auf der Oberfläche einer humanen B-Zelle befindet, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung oder zur Behandlung einer Antikörpervermittelten Erkrankung bei einem Patienten, wobei die Bindung des Antikörpers oder des Fragments davon an das CD40-Antigen das Wachstum oder die Differenzierung der B-Zelle verhindert.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Antikörper-vermittelte Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus IgE-vermittelten Erkrankungen, systemischem Lupus erythematodes (SLE), der primären biliären Zirrhose (PBC) und der idiopathischen thrombocytopenischen Purpura (ITP).
Verwendung eines monoklonalen Anti-CD40-Antikörpers oder eines Fragments davon mit der Fähigkeit der Bindung an ein humanes CD40-Antigen, das sich auf der Oberfläche einer humanen B-Zelle befindet, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibierung der Proliferation von humanen B-Zellen, wobei die Proliferation der B-Zellen durch die Wechselwirkung eines CD40-Liganden mit einem CD40-Antigen, das auf der Oberfläche der B-Zellen exprimiert wird, erhöht wird und wobei die Bindung des monoklonalen Anti-CD40-Antikörpers an das CD40-Antigen das Wachstum oder die Differenzierung der B-Zelle verhindert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die umfasst: (a) einen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon mit der Fähigkeit der spezifischen Bindung an ein humanes CD40-Antigen, das auf der Oberfläche einer humanen B-Zelle exprimiert wird, wobei die Bindung des Antikörpers oder Fragments an das DC40-Antigen das Wachstum oder die Differenzierung der B-Zelle verhindert, und (b) ein pharmazeutisches Excipiens.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11, bei welcher der monoklonale Antikörper wie in Anspruch 2, 3 oder 4 definiert ist.