DE69535690T2

DE69535690T2 - Kostimulatorisches T-Zell-Oberflächen-Antigen SLAM

Info

Publication number: DE69535690T2
Application number: DE69535690T
Authority: DE
Inventors: Gregorio Palo Alto AVERSA; Chia-Chun J. San Jose CHANG; Benjamin G. Mountain View COCKS; Jan E. Los Altos DE VRIES
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 1994-12-02
Filing date: 1995-11-29
Publication date: 2009-01-15
Anticipated expiration: 2015-11-30
Also published as: ATE384127T1; EP1867720A3; DE69535690D1; AU4365196A; ES2301164T3; EP1867720A2; JPH10510707A; WO1996017060A1; AR002004A1; JP2007008958A; EP0795014A1; EP0795014B1; CA2206610A1; MX9703956A; US6399065B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Aktivierung von ruhenden T-Zellen ist für die meisten Immunantworten entscheidend und erlaubt diesen Zellen, ihre regulatorischen Fähigkeiten oder ihre Effektorfähigkeiten auszuüben. Siehe Paul (Hrsg.; 1993) Fundamental Immunology 3. Auflage, Raven Press, N.Y. Die verstärkte Adhäsion zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen (antigen presenting cells; APC) oder andere Formen von primären Stimuli, z. B. immobilisierte monoklonale Antikörper (mAb) können die T-Zell-Rezeptorsignale potenzieren. Die T-Zellaktivierung und die T-Zellexpansion hängen von der Beteiligung des T-Zellrezeptors (TCR) und von co-stimulatorischen Signalen ab, die von Hilfszellen bereitgestellt werden. Siehe beispielsweise Jenkins und Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol. 5: 361–367; Bierer und Hahn (1993) Semin. Immunol. 5: 249–261; June et al. (1990) Immunol. Today 11: 211–216 und Jenkins (1994) Immunity 1: 443–446. Eine wesentliche und hinreichend untersuchte co-stimulatorische Interaktion für T-Zellen betrifft entweder CD28 oder CTLA-4 auf T-Zellen entweder mit B7 oder B70 (Jenkins (1994) Immunity 1: 443–446.). Kürzlich durchgeführte Untersuchungen an CD28-defizienten Mäusen (Shahinian, et al. (1993) Science 261: 609–612; Green, et al. (1994) Immunity 1: 501–508) und an transgenen Mäusen, die das Immunglobulin CTLA-4 exprimierten (Ronchese, et al. (1994) J. Exp. Med. 179: 809–817), haben Defizite in Bezug auf einige der T-Zell-Antworten gezeigt, obwohl diese Mäuse normale primäre Immunantworten und normale CTL-Antworten auf das lymphozytäre Choriomeningitisvirus und das vesikuläre Stomatitisvirus zeigten. Als Ergebnis wurde in beiden Untersuchungen gefolgert, dass andere co-stimulatorischen Moleküle die T-Zellfunktion unterstützen müssen. Die Identifizierung dieser Moleküle, die verschiedene co-stimulatorische Signale vermitteln, war jedoch schwierig.
Die Unfähigkeit, Aktivierungssignale zu modulieren, verhindert die Kontrolle von ungünstigen Entwicklungsantworten oder physiologischen Antworten des Immunsystems. Die vorliegende Erfindung stellt mindestens ein alternatives co-stimulatorisches Molekül bereit, das bei der Modulierung einer Vielzahl von Immunantworten nützlich ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung eines Antigens, das als Co-Stimulator der T-Zellaktivierung wirkt. Die Erfindung stellt insbesondere ein Gen bereit, das für ein glykosyliertes Protein von 70 kD kodiert, das als SLAM bezeichnet wird und auf CD4⁺, CD8⁺ Thymozyten und auf CD45RO^h Memory-T-Zellen des peripheren Bluts exprimiert wird, und das nach einer Aktivierung schnell auf naiven T-Zellen induziert wird. Die Bindung von SLAM stimuliert direkt die Proliferation von CD4⁺ T-Zellklonen und verstärkt die Antigen-spezifische Proliferation und Zytokinproduktion durch CD4⁺ T-Zellen. Insbesondere die Produktion von IFN-γ ist stark hochreguliert, sogar in T-Helfer Typ 2 (Th2)-CD4⁺ T-Zellklonen, wohingegen keine Induktion der IL-4- oder IL-5-Produktion in Th1-Klonen beobachtet wurde. Diese Daten zeigen, dass SLAM ein neues, für T-Zellen co-stimulatorisches Molekül ist, das bei einer Bindung die T-Zellexpansion verstärkt und ein Th0/Th1-Zytokinproduktionsprofil induziert. Ausführungsformen sind sowohl für den Menschen als auch für die Maus beschrieben, wodurch Gene, Proteine und Antikörper von Säugetieren sowie deren Verwendungen verfügbar sind. Funktionelle Äquivalente, die eine signifikante Sequenzhomologie aufweisen, sind aus Nicht-Säugetierarten verfügbar. Des Weiteren kann SLAM als sein Bindungspartner wirken, um andere Zellen zu stimulieren, das Antigen in einer homophilen Interaktion zu exprimieren.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein aufgereinigtes oder rekombinantes SLAM-Protein bereit, umfassend:

(a) eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 oder 12.

Das Protein schließt solche ein, die ein post-translationales Modifikationsmuster aufweisen, das sich von natürlichem SLAM unterscheidet, wobei das Protein ein Co-Stimulator einer T-Zelle ist.
Das Protein kann ein Fusionsprotein sein. Eine andere Ausführungsform ist eine Zusammensetzung, die ein SLAM-Protein und einen pharmazeutisch geeigneten Träger umfasst.
Die Erfindung umfasst ferner einen Antikörper, der spezifisch an ein SLAM-Protein bindet, z. B. wenn das SLAM-Protein ein Säugetierprotein ist, einschließlich ein humanes oder murines Protein; der Antikörper wird gegen eine aufgereinigte SLAM-Peptidsequenz nach SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 erzeugt; der Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper; oder der Antikörper ist markiert. Die Antikörper machen darüber hinaus ein Verfahren zur Aufreinigung eines SLAM-Proteins oder eines SLAM-Peptids aus anderem Material in einer Mischung verfügbar, bei dem die Mischung mit einem Anti-SLAM-Antikörper in Kontakt gebracht wird, und das gebundene SLAM von anderen Materialien getrennt wird.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist eine isolierte oder rekombinante Nukleinsäure, die in der Lage ist, für ein SLAM-Protein zu kodieren, einschließlich einer Nukleinsäure, die für eine Sequenz nach SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, oder 12 kodiert; die eine Sequenz nach SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 umfasst. Solche Ausführungsformen mit Nukleinsäuren umfassen ferner einen Expressionsvektor oder einen Replikationsvektor.
Die Erfindung stellt ferner ein Kit bereit, das ein aufgereinigtes SLAM enthält; einen Antikörper, der spezifisch an ein SLAM bindet; oder eine Nukleinsäure, die für ein SLAM kodiert. Dieses Kit stellt darüber hinaus Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins einer Nukleinsäure, eines Proteins oder eines Antikörpers in einer Probe bereit, bei dem die Probe mit einem solchen Kit untersucht wird.
Die Erfindung stellt ferner in vitro-Verfahren zur Modulierung der Physiologie einer T-Zelle bereit, bei denen man die Zelle mit einem aufgereinigten SLAM; mit einem Antikörper, der spezifisch an SLAM bindet; oder mit einer Nukleinsäure, die für ein SLAM kodiert, in Kontakt bringt. Bestimmte bevorzugte Ausführungsformen umfassen ein Verfahren, bei dem die Zelle eine T-Zelle ist und die Modulierung der Physiologie die Aktivierung der T-Zelle ist; oder bei dem die Zelle in einem Gewebe und/oder in einem Organismus vorkommt.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Expression eines SLAM-Peptids durch Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein SLAM-Polypeptid kodiert. Die Erfindung stellt ferner eine Zelle oder ein Gewebe bereit, die/das eine Nukleinsäure umfasst, welche für ein SLAM-Peptid kodiert.
Die Erfindung stellt ferner eine rekombinante Nukleinsäure bereit, die eine Sequenz mit mindestens 85% Identität zu einer Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO: 1, 5, 7, 9 oder 11 umfasst, wobei die Nukleinsäure für ein Protein kodiert, das ein Co-Stimulator einer T-Zelle ist. Die Erfindung stellt ferner eine rekombinante Nukleinsäure bereit, die eine Nukleotidsequenz mit mindestens 70% Identität zu einer Nukleotidsequenz nach SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 umfasst, wobei die Nu kleinsäure in funktionsfähiger Weise mit einem Promotor verknüpft ist, und wobei die Nukleinsäure für ein Protein kodiert, das ein Co-Stimulator einer T-Zelle ist. Eine weitere Ausführungsform kodiert für ein Polypeptid, das mindestens etwa 60% Identität zu einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 umfasst, wobei das Protein ein Co-Stimulator einer T-Zelle ist.
Die Erfindung stellt ferner ein aufgereinigtes SLAM-Protein oder einen Antikörper, der spezifisch an ein Protein bindet, welches eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 und 12 umfasst; oder eine Nukleinsäure, die für ein Protein kodiert, welches eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 und 12 umfasst, für die Verwendung als Medikament bereit. Ein aufgereinigtes Protein oder ein Antikörper der Erfindung kann für die Verwendung zur Behandlung eines medizinischen Zustands ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Autoimmunerkrankung, rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus erythematodes, Hashimoto-Autoimmunthyreoiditis, akuter Entzündung und chronischer Entzündung verwendet werden, oder für die Verwendung zur Behandlung eines medizinischen Zustands ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HIV-Infektion, Herpesvirusinfektion, Zytomegalievirusinfektion, Nahrungsmittelallergie, Medikamentenallergie, Rhinitis, atopische Dermatitis, Asthma, Hyper-IgE-Syndrom, Hypereosinophilie, Infektionserkrankung, lepromatöse Leprainfektion, Leishmaniose, Chagas-Erkrankung, Schistosomiase, Glomerulonephritis und juvenile Arthritis verwendet werden.
Ebenfalls bereitgestellt wird die Verwendung eines antagonistischen Antikörpers, der spezifisch an ein Protein bindet, welches eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 10 und 12 umfasst, für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines medizinischen Zustandes ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Au toimmunerkrankung, rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus erythematodes, Hashimoto-Autoimmunthyreoiditis, akuter Entzündung und chronischer Entzündung. Ebenfalls bereitgestellt wird die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins, Anti-SLAM (Fab')₂ oder eines Antikörpers, der von einer Hybridomzelllinie mit der Zugangsnummer HB11760 produziert wird, zur Behandlung eines medizinischen Zustands ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HIV-Infektion, Herpesvirusinfektion, Zytomegalievirusinfektion, Nahrungsmittelallergie, Medikamentenallergie, Rhinitis, atopische Dermatitis, Asthma, Hyper-IgE-Syndrom, Hypereosinophilie, Infektionserkrankung, lepromatöse Leprainfektion, Leishmaniose, Chagas-Erkrankung, Schistosomiase, Glomerulonephritis und juvenile Arthritis.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
1. Allgemeines
Die vorliegende Erfindung stellt Aminosäuresequenzen und DNA-Sequenzen bereit, die für verschiedene Säugetierproteine kodieren, wobei es sich um Antigene handelt, die in den frühen Phasen der T-Zellaktivierung gefunden werden, z. B. um solche, die eine T-Zelle aktivieren können. Unter diesen Proteinen sind Antigene, die neben anderen physiologischen Effekten die Proliferation von T-Zellen induzieren. Die Antigene vollständiger Länge sowie Fragmente werden bei der physiologischen Modulierung von Zellen, die das Antigen exprimieren, nützlich sein. Die Proteine werden ferner als Antigene, z. B. als Immunogene zum Erzeugen von Antikörpern gegen verschiedene Epitope auf dem Protein (sowohl lineare Epitope als auch Konformationsepitope) nützlich sein.
Es wurden monoklonale Antikörper (mAb) gegen Moleküle erzeugt, die in der frühen Phase der T-Zellaktivierung exprimiert wer den. Ein Antikörper, der als A12 bezeichnet wurde, wies einzigartige agonistische Wirkungen auf T-Zellklone auf und erkannte ein zuvor nicht identifiziertes, frühes Aktivierungsmolekül, das als SLAM bezeichnet wurde. A12 induzierte direkt die Proliferation von CD4⁺ T-Zellklonen, die zu den Th0-, Th1- und Th2-ähnlichen Untergruppen gehörten. In Abwesenheit eines anderen Stimulus induzierte A12 oder sein F(Ab')₂ die Proliferation der T-Zellklone B21, ChT38, HY06 und TA23, wohingegen die Bindung von CD28 nicht wirksam war, was mit vorherigen Untersuchungen übereinstimmte, siehe June et al. (1990) Immunol. Today 11: 211–216. Diese Daten zeigen, dass SLAM unabhängig von CD28 wirkt und eine neue wichtige Rolle bei der T-Zellaktivierung spielt.
Eine cDNA, die für ein SLAM kodiert, wurde durch Expressionsklonierung unter Verwendung von A12 für die Selektion aus einer T-Zell-cDNA-Bibliothek isoliert. Die SLAM-cDNA war 1860 bp lang und enthielt einen großen offenen Leserahmen, der für ein Transmembranprotein vom Typ I mit einer N-terminalen hydrophoben Leadersequenz aus 27 Aminosäuren, einer extrazellulären Region aus 202 Aminosäuren, welche acht potentielle Stellen für eine N-Glykosylierung umfasst, einem hydrophoben die Membran durchspannenden Teil aus 22 Aminosäuren und einer zytoplasmatische Domäne aus 77 Aminosäuren kodiert. Siehe SEQ ID NO: 1. Drei der vier potentiellen Tyr-Phosphorylierungsstellen in der zytoplasmatischen Domäne von SLAM entsprechen der Konsensus-Sequenz Phosphotyrosin-hydrophob-X-hydrophob, die für die Bindung an eine Klasse von SH2-Domänen bestimmt wurde. Siehe Zhou, et al. (1993) Cell 72: 767–778. Antiseren, die gegen rekombinantes SLAM erzeugt wurden, präzipitierten ein Glykoprotein von 70 kD aus einem aktivierten CD4⁺ T-Zellklon. Eine N-Glycanasebehandlung des immunpräzipitierten SLAM ergab einen Proteinkern von 40 kD, der mit der vorhergesagten molekularen Größe in Einklang steht. SLAM die zeigt Eigenschaften eines Mitglieds der Immunglobulin-(Ig)-Supergen familie, mit einer variablen und einer konstanten Domäne, und es zeigt einen gewissen Grad an Homologie zu CD48 (26% Homologie; siehe Staunton und Thorley-Lawson (1987) EMBO J. 6: 3695–3701), LFA-3/CD58 (17% Homologie; siehe Seed (1987) Nature 329: 840–842) und zu einem kürzlich klonierten Signalmolekül, das auf murinen NK-Zellen und zytotoxischen T-Zellen exprimiert wird und als 254 bezeichnet wird (28% Homologie; siehe Mathew, et al. (1993) J. Immunol. 151: 5328–5337).
Die Verwendung einer PCR zur Detektion von Transkripten in verschiedenen Geweben und Zelltypen zeigt, dass SLAM vornehmlich in lymphoiden Zellen exprimiert wird. Aktivierte mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC) enthalten ein Transkript von 1,9 kb, das der Größe der klonierten SLAM-cDNA entspricht, sowie ferner ein 4 kb-Transkript. Die mRNA von 4 kb ist aus mindestens zwei verschiedenen Transkripten zusammengesetzt, einschließlich einem solchen, das für eine sekretierte Form von SLAM kodiert, der 30 Aminosäuren fehlen, einschließlich der gesamten Transmembranregion aus 22 Aminosäuren, und einem weiteren, das für ein Transmembran-SLAM kodiert. Ein alternativ gespleißter 2 kb-cDNA-Klon wurde ebenfalls identifiziert, der für eine Form von SLAM mit trunkierter zytoplasmatischer Domäne kodiert.
Die SLAM-mRNA wird innerhalb von 2 Stunden nach Aktivierung induziert, was mit ihrem schnellen Auftauchen auf der T-Zelloberfläche korreliert. SLAM wird nicht auf naiven CD45RA⁺ T-Zellen exprimiert, sondern kann in Abwesenheit einer in vitro-Aktivierung in geringen Mengen auf CD45RO^high Memory-T-Zellen nachgewiesen werden. Die SLAM-Expression wird auf naiven CD45RA⁺ T-Zellen schnell induziert (innerhalb von 3 Stunden) und auf CD45RO^high T-Zellen nach der Aktivierung verstärkt, und die maximale Expression tritt nach 6 bis 8 Stunden auf. Unreife, fötale CD3^low, CD4⁺, CD8⁺ Thymozyten exprimieren SLAM, wohingegen die reiferen CD3^high, einzeln CD4⁺ oder CD8⁺ Thymozyten meist negativ sind. SLAM wird in sehr geringen Mengen auf peripheren B-Zellen exprimiert und bei der Aktivierung hochreguliert, ist aber auf Monozyten nicht vorhanden.
Das Vorhandensein von SLAM auf B-Zellen und CD45RO^high Memory-T-Zellen und das natürliche Vorkommen einer löslichen Form von SLAM verweisen auf eine breite Funktion dieses Moleküls. Die Erkenntnisse, dass eine Co-Stimulierung über SLAM Ag-pezifische proliferative Antworten verstärkt und Th0/Th1-Zytokinproduktionsprofile in T-Zellklonen (einschließlich in Th2-Klonen) induziert, verweist darauf, dass die Interaktion zwischen SLAM und seinen Liganden zur T-Zellexpansion und zur Erzeugung von Th0- oder Th1-Antworten beitragen wird.
Zusätzlich zu seinen direkten stimulatorischen Effekten auf T-Zellklone, wirkt SLAM als ein co-stimulatorisches Molekül für die T-Zellaktivierung. Die optimalen Antigen-spezifischen proliferativen Antworten von T-Zellen des peripheren Bluts aus Spendern, die mit Tetanus-Toxoid (TT) oder mit aufgereinigtem Proteinderivat (PPD) immunisiert wurden, wurden in Dosisabhängiger Weise durch den Zusatz von A12 F(ab')₂ weiter verstärkt, was zeigt, dass die spezifische Beteiligung von SLAM für die verstärkten T-Zellantworten verantwortlich ist. Im Allgemeinen wurde eine 2-3-fache Steigerung der Proliferation beobachtet. In ähnlicher Weise wurde die optimale Antigenspezifische Proliferation von CD4⁺ T-Zellklonen in Gegenwart von A12 oder A12 F(ab')₂ in Dosis-abhängiger Weise verstärkt. Diese Verstärkung wurde mit CD4⁺ T-Zellklonen beobachtet, die zur Th2-, Th0- und Th1-Untergruppe gehören. Die co-stimulatorischen Effekte, die durch SLAM an T-Zellen vermittelt wurden, waren nicht auf eine Ag-spezifische Stimulation beschränkt, da die durch einen Anti-CD3 mAb induzierte T-Zellproliferation ebenfalls durch A12 verstärkt wurde. Selbst bei optimalen Anti-CD3-Konzentrationen wurde eine weitere 2-3- fache Steigerung der Proliferation durch A12 bei Einsatz von SLAM beobachtet.
In einer Gruppe von CD4⁺ T-Zellklonen, die zu verschiedenen Untergruppen gehörten, wurde die Zytokinproduktion, welche durch ihre entsprechenden Antigene stimuliert wurde, nach SLAM-Bindung durch A12 hochreguliert. Insbesondere wurde die IFN-γ-Produktion durch A12 und A12 F(Ab')₂ stark gesteigert.
Die Co-Stimulation von Th2-Klonen mit A12 oder seinem F(Ab')2 führt zu einer starken Hochregulierung der IFN-γ-Produktion (5-17-fach), wohingegen bei den vier getesteten Klone nur geringe (weniger als 2-fach) oder keine verstärkende Effekte auf die Interleukin-4-Produktion vorhanden waren. Das Ausmaß der IFN-γ-Produktion, die in Gegenwart von A12 durch Th2-Klone induziert wurde, war vergleichbar mit dem Ausmaß, das durch Antigen in Th1- und Th0-Klonen induziert wurde. Die A12-Co-Stimulation verstärkte darüber hinaus vorzugsweise die IFN-γ-Produktion durch Th0- und Th1-Klone. Im Gegensatz zu seiner starken IFN-γ-induzierenden Wirkung auf Th2-Klone induzierte die Co-Stimulation über SLAM die Produktion von IL-4 oder IL-5 durch Th1-Klone nicht.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die T-Zell-Co-Stimulation über SLAM vorzugsweise zu einer Induktion der IFN-γ-Produktion führt, selbst in Allergen-spezifischen CD4⁺ T-Zellklonen der Th2-Untergruppe; dabei wird der Phänotyp dieser Zellen in ein klares Th0-Zytokinproduktionsprofil zurück verwandelt. Das Muster der Zytokinproduktion, das etablierte Th1-Klone definiert, wird jedoch durch die Co-Stimulation über SLAM nicht verändert.
T-Zellen des peripheren Bluts, die 5 Tage lang durch PHA aktiviert wurden (PHA-Blasts), zeigen eine direkte Proliferation als Antwort auf die Stimulation mit Anti-SLAM mAbs, was darauf verweist, dass die direkte Ligation von SLAM zu einer T-Zellexpansion führt, sobald die T-Zellen über den T-Zellrezeptor aktiviert sind. Darüber hinaus führt die Aktivierung dieser PHA-Glasts durch Anti-SLAM F(Ab')₂-Fragmente für 24 Stunden zu einer starken IFN-γ-Produktion, wohingegen IL-4 nicht nachweisbar war, was darauf hinweist, dass die Ligation von SLAM zu einem Th1-Zytokinproduktionsprofil führt.
Ein Anti-SLAM mAb ist in Anwesenheit von PHA in der Lage, eine langfristige Expansion von stark gereinigten CD4⁺ T-Zellen des peripheren Bluts zu induzieren. Die T-Zellen zeigen eine über 9 Wochen (die maximal analysierte Zeitspanne) anhaltende Proliferation mit einer geschätzten Verdopplungszeit von 16 Stunden in Reaktion auf eine wöchentliche wiederholte Stimulation mit PHA (1 μg/ml) und Anti-SLAM Ab (10 μg/ml). Diese Ergebnisse sowie die Beobachtung, dass die Bindung von SLAM durch Anti-SLAM F(Ab')₂ die IFN-γ-Produktion (und somit ein Th0-, Th1-ähnliches Zytokinproduktionsprofil) in humanen Th2-Klonen stark induziert, verweist darauf, dass die Behandlung mit F(Ab')₂ Anti-SLAM mAbs, oder mit humanisierten Anti-SLAM F(Ab')₂-Fragmenten bei verschiedenen Krankheitssituationen klinisch nützlich sein kann.
Anti-SLAM F(Ab')₂ oder ähnliche bindende Zusammensetzung, wären nützlich, um z. B. angeborene T-Zell-Immundefizienzen zu behandeln, die durch eine fehlerhafte Antigen-spezifische T-Zellproliferation gekennzeichnet sind, wie sie bei Infektionen mit einem Herpesvirus, wie bei einer Zytomegalievirus-Infektion, beobachtet werden. Die Beschleunigung der Wiederherstellung der T-Zellgruppe nach einer Chemotherapie und/oder einer Bestrahlungstherapie bei Krebspatienten oder nach einer Therapie mit Immunsuppressiva vor einer Knochenmarkstransplantation wäre ein weiterer Zustand, der von der oben genannten Therapie profitieren würde.
Der SLAM-Antikörper oder bindende Zusammensetzungen können z. B. als Adjuvanzien für die Impfung verwendet werden, oder um die HIV-bedingte Entreicherung von T-Zellen bei AIDS-Patienten zu kompensieren. Diese Therapie kann ferner krankheitsverursachende Th2-Antworten (charakterisiert durch eine starke Produktion von IL-4 und IL-5) in heilende Th0- oder Th1-Antworten umwandeln, die durch eine IFN-γ-Produktion gekennzeichnet sind, z. B. Nahrungsmittel- und Medikamentenallergie; Rhinitis; atopische Dermatitis; Asthma; Hyper-IgE-Syndrom und Hypereosinophilie, und Infektionserkrankungen, wie beispielsweise lepromatöse Lepra, siehe Yamamura, et al. (1991) Science 254: 277–279; Leishmaniose; Chagas-Erkrankung; Schistosomiase; und Trypanosomiase, siehe De Vries, et al. (Hrsg.) (1995) Interleukin-10 R.G. Landes Company, Austin, Texas, Seiten 70 und 91.
Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, dass ein verändertes Muster der T-Zell-Zytokinproduktion mit dem Fortschreiten der Entwicklung von AIDS assoziiert sind. Mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC), die aus HIV-1-infizierten Individuen in einer frühen Phase der Infektion erhalten wurden, sind bezüglich ihrer Zytokinproduktionsprofile in Reaktion auf Recall-Antigene relativ normal. In dieser asymptotischen Phase produzieren diese aktivierten PBMC überwiegend IL-2 und nur sehr geringe Mengen IL-4 und IL-10. Zu einem späteren Zeitpunkt der HIV-Abstoßung verändern sich die Profile dahingehend, dass es zu einem geringeren Ausmaß an IL-2-Produktion und zu einem stärkeren Ausmaß an IL-4- und IL-10-Produktion kommt. Siehe Clerici et al. (1993) J. Clin. Invest. 91: 759–765; und Clerici et al. (1994) J. Clin. Invest. 93: 768–775. Darüber hinaus scheinen Th2-Zellen empfindlicher in Bezug auf eine HIV-Infektion zu sein. SLAM-Antikörper oder eine bindende Zusammensetzung könnten für die Umwandlung von Th2-Antworten (welche die Antikörperproduktion begünstigen) in Th1-Antworten (welche die Zell-vermittelten Antworten steuern) nützlich sein. Diese Therapie könnte auch bei Krankheiten vorteilhaft sein, die durch Immunkomplexe verursacht werden, wie beispielsweise Glomerulonephritis und juvenile Arthritis.
Um den natürlichen Liganden für SLAM zu identifizieren, wurde ein SLAM-Immunoglobulin-Fusionsprotein (SLAM-Ig) erzeugt. Der SLAM-Teil von SLAM-Ig band spezifisch an L-Zellen, die stabil mit SLAM transfiziert waren. Darüber hinaus interagierte SLAM-Ig in homophiler Weise in Lösung, was zeigt, dass SLAM als Selbst-Ligand dienen kann. Die Bindung von SLAM-Ig an verschiedene Zelltypen korrelierte ebenfalls mit ihrer SLAM-Expression. Im Gegensatz zu anderen beschriebenen Liganden für T-Zellen stellte SLAM, das auf L-Zellen exprimiert wurde, ein direktes proliferatives Signal für humane T-Zellklone in Abwesenheit von anderen Stimuli bereit. Diese neue durch die homophile Interaktion von SLAM bereitgestellte stimulatorische Aktivität war resistent gegen Cyclosporin.
Humane SLAM-Sequenzen.
Die Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz von humanem SLAM1 (pSURslam1) sind in SEQ ID NO: 1 und 2 gezeigt. Die vorhergesagte Leadersequenz und die Transmembransequenz sind die Aminosäuren 1–27 und 237–258, obwohl die natürlichen Grenzen abweichen können (auch abhängig vom Zelltyp). Ein Exon, das für die Transmembrandomäne kodiert, welche in humanem SLAM3 (pSECslam) nicht vorhanden ist, umfasst die Nukleotide 761–780. Cysteine werden an den Aminosäuren mit den Nummern 53, 57, 102, 125, 150, 155, 189 und 217 gefunden. Fragmente zwischen Cysteinen und/oder N-gekoppelten Glykosylierungsstellen sind insbesondere bei der Herstellung von Antikörpern nützlich.
Die Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz von humanem SLAM2 (pSURslam2) sind in SEQ ID NO: 3 und 4 dargestellt. Das humane SLAM2 unterscheidet sich offensichtlich vom humanen SLAM1 durch ein differentielles Spleiß-Ereignis, das zu einer unterschiedlichen C-terminalen Sequenz führt, welche bei Nukleotid 924 beginnt.
Die Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz von humanem SLAM3 (pSECslam) sind in SEQ ID NO: 5 und 6 dargestellt. Die Spleißverknüpfungsstelle, an der die Sequenz der Transmembrandomäne von SLAM1 deletiert wurde, ist bei Nukleotid 768. SLAM3 wird von COS-Zellen, die mit pSECslam transfiziert wurden, sekretiert, wodurch bestätigt wird, dass SLAM3 für eine lösliche Form von SLAM kodiert. Durch Verwendung von RT-PCR-Primern, die spezifisch für diese lösliche Form von SLAM sind, ist das SLAM3-Transkript in verschiedenen Zelltypen nachgewiesen worden, wodurch bestätigt wird, dass es eine echte mRNA ist. SEQ ID NO: 5 und 6.
Die Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz von humanem SLAM4 (pCYTslam) sind in SEQ ID NOS: 7 und 8 gezeigt. Der Punkt, vor dem sich die Sequenz von SLAM4 von der von SLAM1 unterscheidet, ist bei Nukleotid 145. Das Vorhandensein dieses abweichenden Exons am 5'-Ende läßt darauf schließen, dass SLAM4 keine Leadersequenz aufweist. Das SLAM4-Molekül wird bei Expression in COS-Zellen nicht effektiv zur Zelloberfläche gebracht und ist wahrscheinlich zytoplasmatisch. Dieses Transkript wurde in verschiedenen Zelltypen durch RT-PCR unter Verwendung eines 5'-Primers, der spezifisch für das untranslatierte 5'-Exon von SLAM4 ist, und eines 3'-Primers, der spezifisch für die SLAM-kodierende Region ist, nachgewiesen, wodurch bestätigt wird, dass es eine echte mRNA ist.
Die Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Maus-SLAM ist in SEQ ID NO: 9, 10, 11 und 12 gezeigt. Eine Version des Maus-SLAM ist ein Transmembranprotein vom Typ I, das 9 potentielle N-gekoppelte Glykosylierungsstellen umfasst.
Das vorhergesagte unglykosylierte Molekulargewicht ist 40 000. Die gezeigte Sequenz ist die von Maus-SLAM1 (in dem Plasmid pMSLAM1), welche die häufigste SLAM-cDNA mit 1,8 kB ist. Es wurde jedoch eine weitere cDNA-SLAM2 (in pMSLAM2) mit 1,8 kB isoliert, die etwa 25 der cDNAs repräsentiert. SLAM2 teilt etwa die ersten 1 kB der Sequenz mit der SLAM1-Sequenz, weist jedoch eine unterschiedliche Sequenz an seinem 3'-Ende auf. Diese SLAM2-cDNA in pMSLAM2 kodiert für ein SLAM-Protein mit einer unterschiedlichen zytoplasmatischen Domäne. Tabelle 1 zeigt ein Alignment ausgewählter humaner und muriner SLAM-Proteinsequenzen. Wie es für humanes SLAM der Fall ist, weist Maus-SLAM üblicherweise eine V- und eine C-Immunglobulindomäne und zeigt eine ausgedehnte Aminosäurehomologie zu humanem SLAM über das gesamte Molekül (88 zählende konservative Substitutionen). Die Homologie auf der Nukleotidebene beträgt etwa 70 Dieses Mausprotein umfasst im Vergleich zum humanen SLAM acht separate Aminosäureinsertionen. Die Cysteine in der extrazellulären Domäne sind alle konserviert, und der Kontext von drei Tyrosinen in der zytoplasmatischen Domäne ist perfekt erhalten. Die zwei distalen Tyrosine in der zytoplasmatischen Domäne sind in dem alternativ gespleißten Maus-SLAM2-Molekül, das von pSLAM2 (SEQ ID NO: 11 und 12) kodiert wird, nicht vorhanden, und der einzigartige Teil dieser zytoplasmatischen Domäne zeigt keine hohe Homologie zu humanem SLAM. Es gibt eine alternative gespleißte Form von humanem SLAM mit einem unterschiedlichen zytoplasmatischen Ende. Die abweichende Sequenz in pMSLAM2 ist nicht homolog zu der einzigartigen Sequenz des humanen SLAM2 (pSURslam2); jedoch ist die Position in der Nukleotidsequenz, an der das alternative Exon gespleißt wird, in beiden Sequenzen identisch.
Maus-SLAM-Sequenzen.
Die Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Maus-SLAM1 (pMSLAM1) sind in SEQ ID NO: 9 und 10 darge stellt. Die vohergesagte Leadersequenz und die Transmenbransequenz sind die Aminosäuren 1–28 und 242–267, obwohl die natürliche Grenzen abweichen können (auch abhängig vom Zelltyp). Cysteine werden an den Aminosäureresten mit den Nummern 32, 133, 161, 167, 212, 232, 276 und 310 gefunden. Potentielle N-gekoppelte Glykosylierungsstellen werden an den Resten mit den Nummern 54, 58, 103, 126, 151, 158, 192, 210 und 226 gefunden. Fragmente zwischen Cysteinen und/oder N-gekoppelten Glykosylierungsstellen sind insbesondere für die Herstellung von Antikörpern nützlich.
Die Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Maus-SLAM2 (pMSLAM2 sind in SEQ ID NO: 11 und 12 gezeigt. Der Punkt, an dem sich die Sequenz von Maus-SLAM2 von Maus-SLAM1 unterscheidet, beginnt bei Nukleotid 944.
Tabelle 1: Alignment von Maus-SLAM1 mit humanem SLAM1. • verweist auf ein konserviertes Cystein; * verweist auf identische Aminosäuren; . verweist auf eine konservierte Aminosäuresequenz; konservierte Cysteine in der zytoplasmatischen Domäne sind unterstrichen.
Ein gewisses Maß an Homologie von humanem SLAM mit den Proteinsequenzen von Maus-2B4, humanem CD48 und humanem LFA-3 (CD58) ist in den extrazellulären Domänen offensichtlich. Ein Alignment der Sequenzen ergibt Abschnitte mit gemeinsamer Homologie, ungleicher Homologie, gemeinsamen Motiven und zum Teil gemeinsamen Merkmalen.
Die natürlichen Antigene sind in der Lage, verschiedene biochemische Antworten zu vermitteln, die zu biologischen oder physiologischen Antworten in Zielzellen führen. Die am besten charakterisierte Ausführungsform wurde ursprünglich im Menschen beschrieben, wobei allerdings humane Varianten und Maus-Varianten vorliegend ebenfalls beschrieben werden. Zusätzliche Sequenzen für Proteine aus anderen Säugetierarten, z. B. aus Primaten und Nagern, sollten ebenfalls verfügbar sein. Siehe unten. Die unten aufgeführten Beschreibungen sind beispielhaft auf humanes SLAM gerichtet, sind aber ebenso auf verwandte Ausführungsformen mit anderen Arten anwendbar.

Isoliertes humanes SLAM-Protein ist ein Protein, das strukturelle Merkmale zeigt, die charakteristisch für ein Zelloberflächenantigen sind. Das Protein wird leicht auf bestimmten Zelltypen nachgewiesen, wohingegen andere sehr viel geringere Mengen exprimieren. Siehe Tabelle 2. Das SLAM vermittelt eine biochemische Antwort auf die Bindung eines Antikörpers oder eines anderen, bislang nicht identifizierten Liganden, was zu einer Signaltransduktion und zu zellulären Antworten führt. Das SLAM-Antigen ist insbesondere durch Expressionsklonierung unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers isoliert worden. Das SLAM-Antigen wurde isoliert und als ein Protein charakterisiert, das in einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit einer Mobilität wandert, die charakteristisch für ein Protein von etwa 70 kD ist. Das Kernprotein weist nach der Behandlung mit N-Glycanase eine Mobilität eines Proteins von etwa 40 kD auf.

Zelltyp	Expression
JY EBV transformierte B-Zellen	+
aufgereinigte B-Zellen CD20⁺	+
CD4+ T-Zellklon S11	+
CD4+ T-Zellklone S40	+
CD4⁺ T-Zellklone B21	+
CD4⁺ T-Zellklone B21, aktiviert	+
aufgereinigte NK-Zellen	+
aufgereinigte NK-Zellen	+
fötale Leber	-
fötales Knochenmark	-
fötaler Thymus	+
Dünndarm	-
Gehirn	-
Niere	-
Herz	-
FL508 prä-T-Zelllinie	+
TN92 prä-T-Zelllinie	+

Tabelle 2: Zelluläre Expression von SLAM. RNA von verschiedenen Zellen und Geweben wurde einer reversen Transkription und einer PCR unter Verwendung von SLAM-spezifischen Primern unterzogen. Grobe qualitative Bestimmungen werden bereitgestellt, obwohl ein Minuszeichen lediglich unterhalb des Schwellenwerts der Nachweisgrenze bedeutet. Thymus exprimiert die Botschaft ebenfalls.

Das SLAM-Antigen sollte in den identifizierten Gewebetypen vorhanden sein, und die Interaktion des Antigens mit seinem Bindungspartner sollte für die Vermittlung verschiedener Aspekte der zellulären Physiologie oder Entwicklung wichtig sein.
II. Aufgereinigtes SLAM
Humane und murine SLAM-Aminosäuresequenzen sind in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 und 12 gezeigt. Diese Aminosäuresequenzen, die vom Amino-Ende zum Carboxy-Ende gezeigt werden, sind wichtig bei der Bereitstellung von Sequenzinformation des Antigens, was die Unterscheidung des Proteins von anderen Proteinen erlaubt und eine Vielzahl von Varianten veranschaulicht. Des Weiteren ermöglichen Peptidsequenzen die Herstellung von Peptiden für die Herstellung von Antikörpern zur Erkennung solcher Segmente, und sie ermöglichen die Herstellung von Oligonukleotidsonden, wobei beides Strategien zum Nachweis oder zur Isolierung (z. B. Klonierung) von Genen sind, die für solche Sequenzen kodieren.
Wie vorliegend verwendet, soll der Ausdruck "humanes SLAM" bei Verwendung im Zusammenhang mit Proteinen ein Protein umfassen, das die in den SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweist, oder ein signifikantes Fragment eines solchen Proteins, oder ein anderes im hohen Maße homologes Protein, das aus dem Menschen abgeleitet ist. Selbstverständlich gibt es mRNA-Arten, die Spleißvarianten darstellen. Der Ausdruck bezieht sich ferner auf ein vom Menschen abgeleitetes Polypeptid, das eine ähnliche biologische Funktion zeigt, oder mit SLAM-spezifischen Bindungskomponenten wechselwirkt. Diese Bindungskomponenten, z. B. Antikörper, binden typischerweise mit hoher Affinität an ein SLAM, z. B. mit mindestens 100 nM, normalerweise besser als etwa 30 nM, vorzugsweise besser als etwa 10 nM und stärker bevorzugt besser als etwa 3 nM. Homologe Proteine würden in nicht-humanen Säugetierarten gefunden werden, z. B. in Primaten oder Nagern. Nicht-Säugetierarten sollten ebenfalls strukturelle oder funktionell verwandte Gene und Proteine aufweisen, z. B. Vögel oder Amphibien.
Der Ausdruck "Polypeptid" umfasst wie vorliegend verwendet ein signifikantes Fragment oder Segment, und er umfasst einen Abschnitt aus Aminosäureresten mit mindestens etwa 8 Aminosäuren, im Allgemeinen mit mindestens etwa 12 Aminosäuren, typischerweise mit mindestens etwa 16 Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens etwa 20 Aminosäuren und in besonders bevorzugten Ausführungsformen mit mindestens etwa 30 oder mehr Aminosäuren.
Der Ausdruck "bindende Zusammensetzung" bezieht sich auf Moleküle, die mit einer Spezifität an SLAM binden, z. B. nach Art einer Zelladhäsionspaarung oder einer Antikörper-Antigen-Wechselwirkung. Er schließt ferner Verbindungen ein, z. B. Proteine, die spezifisch mit SLAM assoziiert sind, einschließlich einer natürlichen, physiologisch relevanten Protein-Protein-Wechselwirkung (kovalent oder nicht-kovalent). Das Molekül kann ein Polymer oder ein chemisches Reagenz sein. Ein funktionelles Analog kann ein Antigen mit strukturellen Modifikationen sein, oder es kann ein Molekül sein, das eine molekulare Form hat, die mit den geeigneten Bindungsdeterminanten interagiert. Die Verbindungen können als Agonisten oder Antagonisten der Bindungsinteraktion dienen, siehe z. B. Goodman, et al. (Hrsg.) (1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Gases of Therapeutics (8. Auflage), Pergamon Press.
Im wesentlichen rein bedeutet üblicherweise, dass das Protein frei von anderen kontaminierenden Proteinen, Nukleinsäuren oder anderen biologischen Stoffen ist, die von dem ursprünglichen Organismus stammen. Die Reinheit kann durch Standardverfahren beurteilt werden, typischerweise durch Gewicht, und sie wird normalerweise mindestens etwa 40% rein, üblicherweise mindestens etwa 50% rein, häufig mindestens etwa 60% rein, typischerweise mindestens etwa 80% rein, vorzugsweise mindestens etwa 90% rein und in den am meisten bevorzugten Ausfüh rungsformen mindestens etwa 95% rein sein. Träger oder Hilfsstoffe werden häufig zugegeben werden.
Die Löslichkeit eines Polypeptids oder Fragments hängt von der Umgebung und dem Polypeptid ab. Zahlreiche Parameter beeinflussen die Polypeptidlöslichkeit, einschließlich Temperatur, Elektrolytumgebung, Größe und molekulare Eigenschaften des Polypeptids sowie die Art des Lösungsmittels. Typischerweise reicht die Temperatur, bei der das Polypeptid verwendet wird, von etwa 4°C bis etwa 65°C. Normalerweise ist die Temperatur bei der Verwendung größer als etwa 18°C. Für diagnostische Zwecke wird die Temperatur normalerweise etwa Raumtemperatur oder wärmer betragen, jedoch niedriger als die Denaturierungstemperatur der Komponenten im Assay. Für therapeutische Zwecke wird die Temperatur normalerweise Körpertemperatur betragen, typischerweise etwa 37°C für Menschen und Mäuse, obwohl in bestimmten Situationen die Temperatur in situ oder in vitro erhöht oder erniedrigt werden kann.
Die Größe und Struktur des Polypeptids sollte im Allgemeinen in einem im Wesentlichen stabilen Zustand sein und üblicherweise nicht in einem denaturierten Zustand. Das Polypeptid kann mit anderen Polypeptiden in einer Quartärstruktur assoziiert sein, z. B. um Löslichkeit zu verleihen, oder es kann mit Lipiden oder Detergenzien in einer Art assoziiert sein, die den natürlichen Wechselwirkungen in der Lipiddoppelschicht ähneln.
Das Lösungsmittel und die Elektrolyte werden normalerweise ein biologisch kompatibler Puffer des Typs sein, der für die Erhaltung von biologischen Aktivitäten verwendet wird; sie werden normalerweise einem physiologischen wässrigen Lösungsmittel ähneln. Üblicherweise wird das Lösungsmittel einen neutralen pH aufweisen, typischerweise zwischen etwa 5 und 10, und vorzugsweise etwa 7,5. Bei einigen Gelegenheiten werden ein oder mehrere Detergenzien zugegeben, typischerweise ein mildes nicht-denaturierendes Detergens, z. B. CHS (Cholesterylhemisuccinat) oder CHAPS (3-[3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat) oder eine Konzentration, die niedrig genug ist, um signifikante Störungen der strukturellen oder physiologischen Eigenschaften des Proteins zu vermeiden.
III. Physikalische Varianten
Diese Erfindung umfasst ebenfalls Proteine oder Peptide, die eine Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von SLAM aufweisen, wie es in den anhängigen Ansprüchen definiert ist. Die Varianten umfassen Speziesvarianten oder allelische Varianten.
Die Aminosäuresequenzhomologie oder Sequenzidentität wird durch Optimieren der Übereinstimmungen der Reste bestimmt, falls notwendig durch Einfügung von Lücken, wo diese angebracht sind. Siehe auch Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453; Sankoff, et al. (1983) Kapitel 1 in Time Warps. String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA; und die Softwarepakete von IntelliGenetics, Mountain View, CA; und von der Genetics Computer Group der Universität von Wisconsin; Madison, WI. Die Sequenzidentität verändert sich, wenn konservative Substitutionen als Übereinstimmungen gewertet werden. Konservative Substitutionen umfassen typischerweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin. Homologe Aminosäuresequenzen sollen üblicherweise natürliche allelische Variationen und Inter-Spezies-Variationen jeder entsprechenden Proteinsequenz umfassen. Typische homologe Proteine oder Peptide werden von 25 bis 100% Identität aufweisen (wenn Lücken eingefügt werden können) bis zu 50 bis 100% Identität (wenn konservative Substitutionen eingeschlossen sind) zu der Aminosäuresequenz von SLAM aufweisen. Identitätsmaße werden mindestens etwa 35%, im Allgemeinen mindestens etwa 40%, häufig mindestens etwa 50%, typischerweise mindestens etwa 60%, üblicherweise mindestens etwa 70%, vorzugsweise mindestens etwa 80% und stärker bevorzugt mindestens etwa 90% sein.
Die isolierte SLAM-DNA kann leicht durch Nukleotidsubstitutionen, Nukleotiddeletionen, Nukleotidinsertionen und Inversionen von Nukleotidsträngen modifiziert werden. Diese Modifikationen führen zu neuen DNA-Sequenzen, welche für diese Antigene, ihre Derivate oder für Proteine mit ähnlichen physiologischen, immunogenen, antigenischen oder einer anderen funktionellen Aktivität kodieren. Diese modifizierten Sequenzen können verwendet werden, um mutierte Antigene zu produzieren, oder die Expression zu steigern. Eine gesteigerte Expression kann Genamplifikation, gesteigerte Transkription, gesteigerte Translation und andere Mechanismen beinhalten. "Mutiertes SLAM" umfasst ein Polypeptid, das im übrigen in die Definition der oben angegebenen Sequenzidentität fällt, das jedoch eine Aminosäuresequenz aufweist, die von der von SLAM, wie es normalerweise in der Natur gefunden wird, abweicht, entweder durch Deletion, Substitution oder Insertion. Dies schließt im Allgemeinen Proteine ein, die eine signifikante Identität mit einem Protein mit den Sequenzen nach SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 aufweisen, und die verschiedene biologische Aktivitäten mit diesen Sequenzen gemein haben, z. B. antigenische oder immunogene; in bevorzugten Ausführungsformen enthalten sie den größten Teil der offenbarten Sequenzen vollständiger Länge. Sequenzen vollständiger Länge werden typischerweise bevorzugt sein, obwohl verkürzte Versionen ebenfalls nützlich sein werden. Ähnliche Konzepte gelten für verschiedene SLAM-Proteine, insbesondere für solche, die in verschiedenen warmblütigen Tieren, z. B. in Säugetieren und Vögeln, gefunden werden. Diese Be schreibungen sind im Allgemeinen so zu verstehen, dass sie alle SLAM-Proteine umfassen und nicht auf bestimmte, spezifisch diskutierte humane oder murine Ausführungsformen beschränkt sind.
Eine SLAM-Mutagenese kann ebenfalls durch die Erzeugung von Aminosäureinsertionen oder -deletionen durchgeführt werden. Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder beliebige Kombinationen können erzeugt werden, um ein finales Konstrukt zu erzeugen. Insertionen umfassen aminoterminale oder carboxyterminale Fusionen. Eine Zufallsmutagenese kann an einem Zielkodon durchgeführt werden, und die exprimierten Mutanten können dann in einem Screening auf die gewünschte Aktivität untersucht werden. Verfahren zur Durchführung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in einer DNA mit bekannter Sequenz sind im Stand der Technik hinreichend bekannt, z. B. durch M13-Primermutagenese oder Polymerasekettenreaktions (PCR)-Verfahren. Siehe z. B. Sambrook, et al. (1989); Ausubel, et al. (1987 und Ergänzungsbände); und Kunkel, et al. (1987) Methods in Enzymol. 154: 367–382.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner rekombinante Proteine bereit, z. B. heterologe Fusionsproteine, die Segmente dieser Proteine verwenden. Ein heterologes Fusionsprotein ist eine Fusion von Proteinen oder Segmenten, die in der Natur normalerweise nicht in derselben Weise fusioniert sind. Ein ähnliches Konzept gilt für heterologe Nukleinsäuresequenzen.
Zusätzlich können neue Konstrukte durch Kombinieren ähnlicher funktioneller Domänen von anderen Proteinen erzeugt werden. Zum Beispiel können ein Ziel bindende oder andere Segmente zwischen verschiedenen neuen Fusionspolypeptiden oder Fragmenten "vertauscht" werden. Siehe z. B. Cunningham, et al. (1989) Science 243: 1330–1336; und O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985–15992.
Das Phosphoramiditverfahren, das von Beaucage und Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859–1862, beschrieben wurde, wird geeignete synthetische DNA-Fragmente herstellen. Ein doppelsträngiges Fragment wird häufig entweder durch Synthetisierung des komplementären Stranges und Zusammenanlagerung der Stränge unter geeigneten Bedingungen oder durch Hinzufügen des komplementären Stranges unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit einer geeigneten Primersequenz, z. B. PCR-Methoden, erhalten werden.
IV. Funktionelle Varianten
Die Blockierung der physiologischen Antwort auf SLAMs könnte die Folge der Inhibierung der Bindung des Antigens an seinen Bindungspartner sein (z. B. ein anderer oder es selbst), wahrscheinlich durch kompetitive Inhibierung. Somit werden in vitro-Assays der vorliegenden Erfindung häufig isoliertes Protein, Membranen aus Zellen, die ein Membran-assoziiertes rekombinantes SLAM exprimieren, lösliche Fragmente, die Antigenbindende Segmente dieser Proteine umfassen oder Fragmente, die an Festphasensubstrate gebunden sind, verwendet. Diese Assays werden auch die diagnostische Bestimmung der Wirkungen von Mutationen und Modifikationen im Bindungssegment oder von Mutationen und Modifikationen des Antigens, z. B. SLAM-Analoge, ermöglichen.
Diese Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung kompetitiver Wirkstoffscreeningassays, bei denen z. B. neutralisierende Antikörper gegen ein Antigen oder bindende Fragmente mit einer Testverbindung um die Bindung an das Protein konkurrieren.
"Derivate" von SLAM-Antigenen umfassen Aminosäuresequenzmutanten, Glykosylierungsvarianten und kovalente oder aggregierte Konjugate mit anderen chemischen Gruppen. Kovalente Derivate können durch Verknüpfen von Funktionalitäten an Gruppen erzeugt werden, die in SLAM-Aminosäureseitenketten oder am N- oder C-Terminus vorgefunden werden, z. B. durch Standardverfahren. Siehe z. B. Lundblad und Noyes (1988) Chemical Reagents for Protein Modification, Bände 1–2, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL; Hugli (Hrsg.) (1989) Techniques in Protein Chemistry, Academic Press, San Diego, CA; und Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Press, Boca Raton, FL.
Insbesondere sind Glykosylierungsveränderungen eingeschlossen, z. B. solche, die durch Modifizierung der Glykosylierungsmuster eines. Polypeptids während seiner Synthese und seiner Prozessierung oder in weiteren Verarbeitungsschritten erzeugt werden. Siehe z.B. Elbein (1987) Ann. Rev. Biochem. 56: 497–534. Ebenfalls umfasst sind Versionen der Peptide mit derselben primären Aminosäuresequenz, die andere kleinere Modifikationen aufweisen, einschließlich phosphorylierte Aminosäurereste, z. B. Phosphotyrosin, Phosphoserin oder Phosphothreonin.
Fusionspolypeptide zwischen SLAMs und anderen homologen oder heterologen Proteinen werden ebenfalls bereitgestellt. Viele Zytokinrezeptoren oder andere Oberflächenproteine sind multimer (z. B. homodimere Einheiten) und ein Wiederholungskonstrukt kann verschiedene Vorteile aufweisen, einschließlich eine verringerte Empfindlichkeit für eine proteolytische Spaltung. Typischer Beispiele sind Fusionen eines Reporterpolypeptids, z. B. Luciferase, mit einem Segment oder mit einer Domäne eines Proteins, z. B. ein Rezeptorbindungssegment, sodass das Vorhandensein oder die Lokalisierung des fusionierten Liganden leicht bestimmt werden kann. Siehe z. B. Dull, et al., US-Patent Nr. 4,859,609 . Andere Genfusionspartner umfassen bakterielle β-Galaktosidase, trpE, Protein A, β-Lactamase, alpha-Amylase, Alkoholdehydrogenase, alpha-Matingfaktor der Hefe und Anhänge für den Nachweis oder die Aufreinigung, wie bei spielsweise eine FLAG-Sequenz oder eine His6-Sequenz ein. Siehe z. B. Godowski, et al. (1988) Science 241: 812–816.
Fusionspeptide werden typischerweise entweder durch rekombinante Nukleinsäureverfahren oder durch synthetische Polypeptidverfahren hergestellt. Methoden für die Manipulation und Expression von Nukleinsäuren sind allgemein, z. B. in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage), Bände 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory; und Ausubel, et al. (Hrsg.) (1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene und Wiley, NY, beschrieben. Methoden für die Synthese von Polypeptiden sind, z. B. in Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149–2156; Merrifield (1986) Science 232: 341–347; Atherton, et al. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; und Grant (1992) Synthetic Peptides: A User's cuide, W.H. Freeman, NY, beschrieben.
Diese Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Derivaten von SLAMs, bei denen es sich nicht um Variationen der Aminosäuresequenz oder der Glykosylierung handelt. Solche Derivate können eine kovalente oder aggregierte Assoziation mit chemischen Gruppen umfassen. Kovalente oder aggregierte Derivate werden als Immunogene, als Reagenzien in Immunoassays oder in Aufreinigungsverfahren, wie beispielsweise bei der Affinitätsaufreinigung von Bindungspartnern, z. B. anderen Antigenen, nützlich sein. Ein SLAM kann durch kovalente Bindung an einen festen Träger, wie beispielsweise Cyanogenbromid-aktivierte SEPHAROSE immobilisiert werden, wobei Verfahrenverwendet werden, die im Stand der Technik hinreichend bekannt sind, oder es kann auf Polyolefinoberflächen mit oder ohne Glutaraldehyd-Quervernetzung adsorbiert werden, um in dem Assay oder bei der Aufreinigung von Anti-SLAM-Antikörpern oder einer alternativen bindenden Zusammensetzung verwendet zu werden. Die SLAMs können ferner mit einer nachweisbaren Gruppe markiert sein, z. B. zur Verwendung in diagnostischen Assays. Die Aufreinigung von SLAM kann durch einen immobilisierten Antikörper oder einen komplementären Bindungspartner durchgeführt werden.
Ein gelöstes SLAM oder Fragment dieser Erfindung kann als Immunogen für die Herstellung von Antiseren oder Antikörpern, die spezifisch für die Bindung an das Antigen oder Fragmente davon sind, verwendet werden. Aufgereinigtes Antigen kann verwendet werden, um monoklonale Antikörper oder Antigen-bindende Fragmente, einschließlich Antigen-bindender Fragmente natürlicher Antikörper, mittels Screening zu untersuchen. Aufgereinigte SLAMs können ferner als Reagenz verwendet werden, um Antikörper nachzuweisen, die in Reaktion auf das Vorhandensein von erhöhten Mengen des Antigens oder von Zellfragmenten, die das Antigen enthalten, erzeugt wurden, wobei beides diagnostisch für einen abnormalen Zustand oder für einen spezifisch physiologischen Zustand oder für einen Krankheitszustand sein kann. Die Erfindung betrifft Antikörper, die gegen Aminosäuresequenzen erzeugt wurden, welche von den Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 gezeigt sind, kodiert werden, oder gegen Fragmente von Proteinen, die diese enthalten. Insbesondere betrifft die Erfindung Antikörper, die eine Bindungsaffinität für spezifische Fragmente aufweisen oder gegen diese erzeugt wurden, wobei von den Fragmenten vorhergesagt wurde, dass sie außerhalb der Lipiddoppelschicht liegen, sowohl extrazellulär als auch intrazellulär.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung von zusätzlichen, nah verwandten Spezies-Varianten. Southern- und Nothern-Blot-Analysen sollten belegen, dass ähnliche genetische Einheiten in anderen Säugetieren vorkommen. Es ist wahrscheinlich, das SLAM in Spezies-Varianten, z. B. in Nagern, Lagomorphen, Carnivoren, Paarhufer, Perissodaktylen und Primaten, verbreitet sind.
Die Erfindung stellt ferner Mittel bereit, um eine Gruppe von verwandten Antigenen zu isolieren, die sowohl eine Verschiedenartigkeit als auch eine Ähnlichkeit hinsichtlich der Struktur, Expression und Funktion aufweisen. Die Aufklärung von zahlreichen der physiologischen Wirkungen der Moleküle wird die Isolierung und Charakterisierung weiterer anderer Spezies-Varianten stark beschleunigt. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung nützliche Sonden zur Identifizierung zusätzlicher homologer genetischer Einheiten in unterschiedlichen Spezies bereit.
Die isolierten Gene werden die Transformation von Zellen ermöglichen, denen die Expression eines entsprechenden SLAM fehlt, z. B. entweder Spezies-Typen oder Zellen, denen entsprechende Antigene fehlen, und die eine negative Hintergrundaktivität zeigen. Dies sollte die Analyse der Funktion von SLAM im Vergleich zu nicht-transformierten Kontrollzellen ermöglichen.
Die Analyse wichtiger Strukturelemente, die die verschiedenen Aktivierungs- oder Differenzierungsfunktionen beeinflussen, welche durch diese Antigene ermittelt werden, ist unter Verwendung von Standardmethoden der modernen Molekularbiologie möglich, insbesondere beim Vergleich von Mitgliedern aus verwandten Klassen. Siehe z. B. die Homologie-Scanningmutagenesemethode, die in Cunningham, et al. (1989) Science 243: 1339–1336 beschrieben wird; and die Verfahren, die in O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985–15992; und in Lechleiter, et al. (1990) EMBO J. 9:4381–4390 verwendet werden.
Intrazelluläre Funktionen werden wahrscheinlich Segmente des Antigens betreffen, die normalerweise für das Zytosol zugänglich sind. Unter bestimmten Umständen kann jedoch eine Internalisierung des Protein erfolgen, und eine Wechselwirkung zwischen intrazellulären Komponenten und "extrazellulären" Segmenten kann auftreten. Die spezifischen Segmente der Wechsel- Wirkung von SLAM mit anderen intrazellulären Komponenten können durch Mutagenese oder durch direkte biochemische Mittel, z. B. Quervernetzungs- oder Affinitätsverfahren, identifiziert werden. Eine strukturelle Analyse mittels kristallogaphischer oder anderer physikalischer Verfahren wird ebenfalls anwendbar sein. Die weitere Untersuchung des Mechanismus der Signaltransduktion wird die Untersuchung von assoziierten Komponenten einschließen, die durch Affinitätsverfahren oder durch genetische Mittel, z. B. durch Komplementierungs-Analyse von Mutanten, isolierbar sein könnten.
Eine weitere Untersuchung der Expression und Kontrolle von SLAM wird durchgeführt werden. Die kontrollierenden Elemente, die mit den Antigenen assoziiert sind, sollten differentielle physiologische, die Entwicklung betreffende, Gewebe-spezifische oder andere Expressionsmuster zeigen. Stromaufwärts oder stromabwärts gelegene genetische Regionen, z. B. Kontrollelemente, sind von Interesse. Insbesondere sind physiologische Varianten oder Entwicklungsvarianten gefunden worden, z. B. mehrere alternativ prozessierte Formen des Antigens. Siehe z. B. SEQ ID NO: 1 und 3. Somit kann ein differentielles Spleißing von Boten-RNA zu einer Mischung von membrangebundenen Formen, löslichen Formen und modifizierten Versionen des Antigens führen.
Strukturelle Untersuchungen der Antigene werden zur Erstellung von neuen Antigenen führen, insbesondere von Analoge, die Agonisten- oder Antagonisteneigenschaften auf dem Molekül zeigen. Dies kann mit zuvor beschriebenen Screeningverfahren kombiniert werden, um Antigene zu isolieren, die das gewünschte Spektrum von Aktivitäten zeigen.
V. Antikörper
Antikörper können gegen verschiedene SLAMs (einschließlich Spezies-Varianten oder allelische Varianten) und Fragmente davon erzeugt werden, wobei diese sowohl in ihren natürlich vorkommenden Formen als auch in ihren rekombinanten Formen vorliegen können. Zusätzlich können Antikörper gegen SLAMs erzeugte werden, die entweder in ihren aktiven Formen oder in ihren inaktiven Formen vorliegen, einschließlich nativer oder denaturierte Versionen. Anti-idiotypische Antikörper werden ebenfalls vorgeschlagen.
Antikörper (einschließlich bindende Fragmente und Einzelkettenversionen) gegen vorbestimmte Fragmente der Antigene können durch Immunisierung von Tieren mit Konjugaten der Fragmente mit immunogenen Proteinen erzeugt werden. Monoklonale Antikörper werden aus Zellen hergestellt, die den gewünschten Antikörper sekretieren. Diese Antikörper können mittels Screening auf eine Bindung an normale oder fehlerhafte SLAMs untersucht werden, oder auf eine agonistische oder antagonistische Aktivität, welche z. B. durch das Antigen oder seinen Bindungspartner vermittelt wird. Diese monoklonalen Antikörper werden normalerweise mit einer KD von mindestens etwa 1 mM, gewöhnlicherweise mindestens etwa 300 μM, typischerweise mindestens etwa 100 μM, noch typischer mindestens etwa 30 μM, vorzugsweise mindestens etwa 10 μM und mehr bevorzugt mindestens etwa 3 μM oder besser binden.
Die Antikörper dieser Erfindung können ferner bei diagnostischen Anwendungen nützlich sein. Als "Capture" oder nichtneutralisierende Antikörper können sie mittels Screening auf die Fähigkeit untersucht werden, an die Antigene zu binden, ohne die Bindung durch einen Partner zu inhibieren. Als neutralisierende Antikörper können sie in kompetitiven Bindungsassays nützlich sein. Sie werden ferner beim Nachweis oder bei der Quantifizierung von SLAM-Protein oder dessen Bindungspartnern nützlich sein. Siehe z. B. Chan (Hrsg.) (1987) Immunology: A Practical Guide, Academic Press, Orlando, FLA; Price und Newman (Hrsg.) (1991) Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press, N.Y.; und Ngo (Hrsg.) (1988) Nonisotopic Immunoassay, Plenum Press, N.Y. Kreuzabsorptionen oder andere Tests werden Antikörper identifizieren, die verschiedene Spektren von Spezifitäten zeigen, z. B. einzigartige oder gemeinsame Spezies-Spezifitäten.
Des Weiteren können die erfindungsgemäßen Antikörper (einschließlich Antigen-bindender Fragmente) wirksame Antagonisten sein, die an das Antigen binden und eine funktionelle Bindung inhibieren, oder die Fähigkeit des Bindungspartners inhibieren, eine biologische Antwort hervorzurufen. Sie können ferner als nicht-neutralisierende Antikörper nützlich sein, und sie können an Toxine oder Radionukleotide gekoppelt sein, sodass bei Bindung des Antikörpers an das Antigen eine Zelle, die dieses exprimiert, z. B. auf ihrer Oberfläche, abgetötet wird. Des Weiteren können diese Antikörper an Wirkstoffe oder andere therapeutische Mittel konjugiert sein, entweder direkt oder indirekt mittels eines Linkers, und sie können das Wirkstofftargeting beeinflussen.
Antigenfragmente können an andere Materialien gebunden werden, insbesondere an Polypeptide, in Form von fusionierten oder kovalent verbundenen Polypeptide, die als Immunogene verwendet werden. Ein Antigen und seine Fragmente können mit einer Vielzahl von Immunogenen, wie beispielsweise Keyhole-Limpet-Hemocyanin, bovines Serumalbumin, Tetanustoxoid, etc., fusioniert werden oder kovalent mit diesen verknüpft werden. Siehe Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper und Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York; Williams, et al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, Band 1, Academic Press, New York; und Harlow und Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Man ual, CSH Press, NY, für die Beschreibung von Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antisera.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, monoklonale Antikörper aus verschiedenen Säugetierwirten, wie beispielsweise Mäusen, Nagern, Primaten, Menschen, etc., herzustellen. Die Beschreibung der Methoden zur Herstellung solcher monoklonaler Antikörper kann z. B. in Stites, et al. (Hrsg.) Basic and Clinical Immunology (4. Auflage), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, und den darin zitierten Literaturstellen; Harlow und Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. Auflage), Academic Press, New York; und insbesondere in Köhler und Milstein (1975) in Nature 256: 495–497, welches ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper diskutiert, gefunden werden.
Andere geeignete Methoden umfassen ein in vitro-Inkontaktbringen von Lymphozyten mit den antigenischen Polypeptiden oder alternativ dazu mit einer Auswahl von Antikörper-Bibliotheken in Phagen oder ähnlichen Vektoren. Siehe Huse, et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246: 1275–1281; und Ward, et al. (1989) Nature 341: 544–546. Die Polypeptide und Antikörper der vorliegenden Erfindung können mit oder ohne Modifikation verwendet werden, einschließlich chimäre oder humanisierte Antikörper. Häufig werden die Polypeptide und Antikörper durch Anbinden (entweder kovalent oder nicht-kovalent) einer Substanz, die ein nachweisbares Signal bereitstellt, markiert sein. Eine große Vielfalt von Markierungen und Konjugationsmethoden sind bekannt und werden sowohl in der wissenschaftlichen als auch in der Patentliteratur ausführlich beschrieben. Geeignete Markierungen umfassen Radionuklide, Enzyme, Substrate, Co-Faktoren, Inhibitoren, fluoreszente Gruppen, chemilumineszente Gruppen, magnetische Partikel und Ähnliches. Patente, die die Verwendung solcher Markierungen offenbaren, umfassen US-Patent Nrn. 3,817,837 ; 3,850,752 ; 3,939,350 ; 3,996,345 ; 4,277,437 ; 4,275,149 und 4,366,241 . Ferner können auch rekombinante Immunglobuline hergestellt werden, siehe Cabilly, US-Patent Nr. 4,816,567 ; Moore, et al., US-Patent Nr. 4,642,334 ; und Queen, et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029–10033.
Die Antikörper dieser Erfindung können ferner für die Affinitätschromatographie bei der Isolierung des Proteins verwendet werden. Es können Säulen hergestellt werden, bei denen der Antikörper an einen festen Träger gebunden ist. Siehe z. B. Wilchek et al. (1984) Meth. Enzymol., 104: 3–55.
Antikörper, die gegen jedes SLAM erzeugt wurden, werden ferner nützlich sein, um anti-idiotypische Antikörper zu erzeugen. Dies wird beim Nachweis oder bei der Diagnose verschiedener immunologischer Zustände nützlich sein, die mit der Expression der entsprechenden Antigene zusammenhängen.
IV. Nukleinsäuren
Die beschriebenen Peptidsequenzen und die verwandten Reagenzien sind nützlich beim Nachweis, bei der Isolierung oder bei der Identifizierung eines DNA-Klons, der für SLAM kodiert, beispielsweise von einer natürlichen Quelle. Typischerweise wird es bei der Isolierung eines Gens aus einem Säugetier nützlich sein, und ähnliche Verfahren werden angewendet werden, um Gene aus anderen Arten zu isolieren, z. B. aus warmblütigen Tieren, wie z. B. aus Vögeln und Säugetieren. Eine Kreuzhybridisierung wird die Isolierung von SLAM aus anderen Spezies ermöglichen. Eine Anzahl von verschiedenen Ansätzen sollte verfügbar sein, um einen geeigneten Nukleinsäureklon erfolgreich zu isolieren.
Das aufgereinigte Protein oder das definierte Peptide sind für die Erzeugung von Antikörpern durch Standardverfahren nützlich, wie es oben beschrieben wurde. Synthetische Peptide oder aufgereinigtes Protein kann einem Immunsystem präsentiert werden, um monoklonale oder polyklonale Antikörper zu erzeugen. Siehe z. B. Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; und Harlow und Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. Alternativ dazu kann SLAM als ein spezifisches Bindungsreagenz verwendet werden, seine Bindungsspezifität kann genutzt werden, als ob ein Antikörper verwendet würde.
Beispielsweise kann die spezifisch bindende Zusammensetzung für das Screening einer Expressionsbibliothek, die aus einer Zelllinie erzeugt wurde, welche ein SLAM exprimiert, verwendet werden. Das Screening kann mittels Standardfärbung von Oberflächen-exprimiertem Antigen oder durch Panning durchgeführt werden. Das Screening in Bezug auf die intrazelluläre Expression kann ebenfalls durch verschiedene Färbungen oder durch Immunfluoreszenzverfahren durchgeführt werden. Die bindenden Zusammensetzung können verwendet werden, um Zellen, die das Protein exprimieren, über ihre Affinität aufzureinigen oder auszusortieren.
Die Peptidsegmente können ferner verwendet werden, um geeignete Oligonukleotide für das Screening einer Bibliothek vorherzusagen. Der genetische Kode kann verwendet werden, um geeignete Oligonukleotide auszuwählen, die als Sonden für das Screening nützlich sind. Siehe beispielsweise SEQ ID NO: 1 oder 3. Synthetische Oligonukleotide werden in Kombination mit Polymerasekettenreaktions (PCR)-Methoden beim Auswählen richtiger Klone aus einer Bibliothek nützlich sein. Komplementäre Sequenzen werden ebenfalls als Sonden, Primer oder Antisense-Stränge verwendet werden. Basierend auf der Identifizierung der mutmaßlichen extrazellulären Domäne sollten verschiedene Fragmente besonders nützlich sein, z. B. gekoppelt mit verankertem Vektor oder poly-A-komplementäre PCR-Methoden oder mit komplementärer DNA von anderen Peptiden.
Diese Erfindung betrifft die Verwendung von isolierter DNA oder von Fragmenten, um ein biologisch aktives, entsprechendes SLAM-Polypeptid zu kodieren. Darüber hinaus umfasst die Erfindung isolierte oder rekombinante DNA, die für ein biologisch aktives Protein oder Polypeptid kodiert, welches in der Lage ist, unter geeigneten Bedingungen mit den vorliegend beschriebenen DNA-Sequenzen zu hybridisieren. Das biologisch aktive Protein oder Polypeptid kann ein intaktes Antigen oder ein Fragment sein, und es kann eine Aminosäuresequenz aufweisen, die z. B. in SEQ ID NO: 1 oder 3 offenbart ist. Des Weiteren umfasst diese Erfindung die Verwendung von isolierter oder rekombinanter DNA oder von Fragmenten davon, die für Proteine kodiert, welche homolog zu einem SLAM sind, oder die unter Verwendung von cDNA, die für ein SLAM kodiert, als Sonde isoliert wurden. Die isolierte DNA kann die entsprechenden regulatorischen Sequenzen in der 5'- und 3'-flankierenden Region haben, z. B. Promotoren, Enhancer, poly-A-Additionssignale und andere.
Eine "isolierte" Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure (z. B. eine RNA, DNA oder ein gemischtes Polymer), die im Wesentlichen von anderen Komponenten, die natürlicherweise die native Sequenz begleiten (z. B. Ribosomen, Polymerasen, und/oder flankierende genomische Sequenzen aus der ursprünglichen Spezies), getrennt ist. Der Begriff umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die aus ihrer natürlich vorkommenden Umgebung entfernt wurde, und er umfasst rekombinante oder klonierte DNA-Isolate und chemisch synthetisierte Analoge oder Analoge, die durch heterologe Systeme biologisch synthetisiert wurden. Ein im Wesentlichen reines Molekül umfasst isolierte Formen des Moleküls. Im Allgemeinen wird die Nukleinsäure in einem Vektor oder in einem Fragment von weniger als etwa 50 kb, normalerweise weniger als etwa 30 kb, typischerweise weniger als etwa 10 kb und vorzugsweise weniger als etwa 6 kb.
Eine isolierte Nukleinsäure wird im Allgemeinen eine homogene Zusammensetzung von Molekülen sein; sie wird aber in einigen Ausführungsformen eine geringfügige Heterogenität umfassen. Diese Heterogenität wird typischerweise an den Enden des Polymers gefunden oder in Teilen, die für eine gewünschte biologische Funktion oder Aktivität nicht wichtig sind.
Ein "rekombinante" Nukleinsäure ist entweder durch das Verfahren ihrer Herstellung oder durch ihre Struktur definiert. In Bezug auf das Verfahren ihrer Herstellung (z. B. ein Produkt, das durch ein Verfahren hergestellt wird) ist das Verfahren die Verwendung rekombinanten Nukleinsäuremethoden, die z. B. den menschlichen Eingriff in die Nukleotidsequenz umfassen, typischerweise Selektion oder Herstellung. Alternativ dazu kann es eine Nukleinsäure sein, die durch Herstellung einer Sequenz erzeugt wurde, welche die Fusion von zwei Fragmenten umfasst, die natürlicherweise nicht zusammenhängend sind; sie soll aber natürliche Produkte, z. B. natürlich vorkommende Mutanten, ausschließen. Somit sind z. B. Produkte umfasst, die durch Transformation von Zellen mit einem beliebigen nicht natürlich vorkommenden Vektor erzeugt wurden, ebenso wie Nukleinsäuren, die Sequenzen umfassen, welche unter Verwendung eines beliebigen synthetischen Oligonukleotidverfahrens erhalten wurden. Dies wird häufig durchgeführt, um ein Kodon gegen ein redundantes Kodon auszutauschen, das dieselbe oder eine konservative Aminosäure kodiert, wobei üblicherweise eine Sequenzerkennungsstelle eingefügt oder entfernt wird.
Alternativ dazu wird dies durchgeführt, um Nukleinsäuresegmente mit gewünschten Funktionen zusammenzufügen, um eine einzelne genetische Einheit zu erzeugen, die eine gewünschte Kombi nation von Funktionen umfasst, die in den allgemein verfügbaren natürlichen Formen nicht vorgefunden wird. Restriktionsenzymerkennungsstellen sind häufig das Ziel solcher künstlichen Manipulationen, wobei jedoch andere ortsspezifische Ziele, z. B. Promotoren, DNA-Replikationsstellen, Regulationssequenzen, Kontrollsequenzen oder andere nützliche Merkmale, durch Design eingebaut werden können. Ein ähnliches Konzept ist für ein rekombinantes Polypeptid, z. B. ein Fusionspolypeptid, vorgesehen. Spezifisch eingeschlossen sind synthetische Nukleinsäuren, die, durch die Redundanz des genetischen Kodes, für Polypeptide kodieren, die ähnlich zu Fragmenten dieser Antigene sind und Fusionen von Sequenzen, von vielen verschiedenen Artvarianten.
Ein signifikantes "Fragment" im Zusammenhang mit Nukleinsäure ist ein zusammenhängendes Segment von mindestens etwa 17 Nukleotiden, im Allgemeinen mindestens etwa 22 Nukleotiden, gewöhnlicherweise mindestens etwa 29 Nukleotiden, häufiger mindestens etwa 35 Nukleotiden, typischerweise mindestens etwa 41 Nukleotide, normalerweise mindestens etwa 47 Nukleotide, vorzugsweise mindestens etwa 55 Nukleotide und in besonders bevorzugten Ausführungsformen mindestens etwa 60 Nukleotide oder mehr.
Eine DNA, die für ein SLAM-Protein kodiert, wird insbesondere nützlich zum Identifizieren von Genen, mRNA-Spezies und cDNA-Spezies sein, die für verwandte oder homologe Proteine kodieren, sowie auch von DNAs, die für homologe Proteine aus unterschiedlichen Spezies kodieren. Diese sind wahrscheinlich in anderen Spezies homolog, einschließlich in Primaten, Nagern und Vögeln. Verschiedene SLAM-Proteine sollten homolog sein, und diese sind vorliegend umfasst. Aber selbst Proteine, die eine größere Distanz hinsichtlich der evolutionären Verwandtschaft zu dem Antigen haben, können unter geeigneten Bedingungen problemlos durch Verwendung dieser Sequenzen isoliert wer den, wenn sie ausreichend homolog sind. SLAM-Proteine von Primaten sind von besonderem Interesse.
Rekombinante Klone, die von den genomischen Sequenzen abgeleitet sind, welche z. B. Introns enthalten, werden für transgene Untersuchungen nützlich sein (einschließlich z. B. transgene Zellen und Organismen) sowie für die Gentherapie. Siehe z. B. Goodnow (1992) "Transgenic Animals" in Roitt (Hrsg.) Encyclopedia of Immunology, Academic Press, San Diego, Seiten 1502–1504; Travis (1992) Science 256: 1392–1394; Kuhn, et al. (1991) Science 254: 707–710; Capecchi (1989) Science 244: 1288; Robertson (1987) (Hrsg.) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; und Rosenberg (1992) J. Clinical Oncology 10: 180–199.
Wesentliche Homologie im Zusammenhang mit einem Nukleinsäuresequenzvergleich bedeutet entweder, dass die Segmente oder ihre komplementären Stränge bei einem Vergleich in mindestens etwa 50% der Nukleotide, im Allgemeinen in mindestens etwa 58% gewöhnlicherweise in mindestens etwa 65% häufig in mindestens etwa 71% typischerweise in mindestens etwa 77%, normalerweise in mindestens etwa 85% vorzugsweise in mindestens etwa 95 bis 98% oder mehr und in besonderen Ausführungsformen in bis zu etwa 99% oder mehr der Nukleotide identisch sind, wenn sie einander optimal gegenübergestellt werden, mit geeigneten Nukleotidinsertionen oder -Deletionen. Alternativ dazu gibt es eine wesentliche Homologie, wenn die Segmente unter selektiven Hybridisierungsbedingungen an einen Strang (oder sein Komplement) hybridisieren, typischerweise unter Verwendung einer Sequenz von SLAM, z. B. in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 oder 11. Typischerweise wird eine selektive Hybridisierung auftreten, wenn mindestens etwa 55% Homologie über einen Abschnitt von mindestens etwa 30 Nukleotiden vorliegt, vorzugsweise mindestens etwa 75% über einen Abschnitt von etwa 25 Nukleotiden und am meisten bevorzugt mindestens etwa 90% über etwa 20 Nukleotide. Siehe Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12: 203–213. Die Länge des Homologievergleichs, wie er beschrieben wurde, kann über längere Abschnitte reichen, und in bestimmten Ausführungsformen wird er über einen Abschnitt von mindestens etwa 17 Nukleotide, gewöhnlicherweise mindestens etwa 28 Nukleotide, typischerweise mindestens etwa 40 Nukleotide und vorzugsweise mindestens etwa 75 bis 100 oder mehr Nukleotide erfolgen.
Stringente Bedingungen in Bezug auf Homologie im Zusammenhang mit einer Hybridisierung werden stringente, kombinierte Bedingungen von Salz, Temperatur, organischen Lösungsmitteln und anderen Parametern sein, typischerweise solchen, die bei Hybridisierungsreaktionen kontrolliert werden. Stringente Temperaturbedingungen werden normalerweise Temperaturen mehr als etwa 30°C einschließen, normalerweise mehr als etwa 37°C, typischerweise mehr als etwa 55°C, vorzugsweise mehr als etwa 70°C. Stringente Salzbedingungen werden gewöhnlicherweise weniger als etwa 1000 mM sein, normalerweise weniger als etwa 400 mM, typischerweise weniger als etwa 250 mM, vorzugsweise weniger als etwa 150 mM. Die Kombination der Parameter ist jedoch sehr viel wichtiger als der Wert eines einzelnen Parameters. Siehe z. B. Wetmur und Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31: 349–370.
SLAM aus anderen Sängertier-Spezies kann kloniert und durch Spezies-Kreuzhybridisierung von nahe verwandten Spezies isoliert werden. Die Homologie kann zwischen entfernt verwandten Arten relativ gering sein, und somit ist die Hybridisierung von relativ nah verwandten Arten empfehlenswert. Alternativ dazu kann die Herstellung einer Antikörperpräparation, die eine geringere Spezies-Spezifität zeigt, für Expressionsklonierungsansätze nützlich sein.
VI. Herstellung von SLAM; Mimetika
DNA, die für das SLAM oder für Fragmente davon kodiert, kann durch chemische Synthese, durch Screening von cDNA-Bibliotheken oder durch Screening genomischer Bibliotheken, die aus einer großen Vielzahl von Zelllinien oder Gewebeproben hergestellt wurden, erhalten werden. Siehe z. B. Okayama und Berg (1982) Mol. Cell. Biol. 2: 161–170; Gubler und Hoffman (1983) Gene 25: 263–269; und Glover (Hrsg.) (1984) DNA Cloning: A Practical Approach, IRL Press, Oxford. Alternativ dazu können die Sequenzen, die vorliegend bereitgestellt werden, nützliche PCR-Primer bereitstellen, oder sie ermöglichen die synthetische oder anderweitige Herstellung geeigneter Gene, die für SLAM kodieren.
Diese DNA kann in einer großen Vielfalt von Wirtszellen für die Synthese von SLAM vollständiger Länge oder von Fragmenten verwendet werden, die beispielsweise wiederum verwendet werden können, um polyklonale oder monoklonale Antikörper zu erzeugen; für Bindungsstudien; für die Konstruktion und Expression von modifizierten Molekülen; und für Struktur/Funktionsuntersuchungen.
Wie vorliegend verwendet umfassen Vektoren Plasmide, Viren, Bakteriophagen, integrierbare DNA-Fragmente und andere Vehikel, die die Integration von DNA-Fragmenten in das Genom des Wirts ermöglichen. Siehe z. B. Pouwels, et al. (1985 und Ergänzungen) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y.; und Rodriguez, et al. (1988)(Hrsg.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA.
Für die Zwecke dieser Erfindung sind DNA-Sequenzen in funktionsfähiger Weise miteinander verbunden, wenn sie funktionell miteinander in Verbindung stehen. Zum Beispiel ist die DNA für eine Prä-Sequenz oder einen sekretorischen Leader in funkti onsfähiger Weise mit einem Polypeptid verbunden, wenn sie als Prä-Protein exprimiert wird oder wenn sie an der Lenkung des Polypeptids zur Zellmembran oder an der Sekretion eines Polypeptids beteiligt ist. Ein Promotor ist in funktionsfähiger Weise mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn er die Transkription des Polypeptids kontrolliert; eine Ribosombindungsstelle ist in funktionsfähiger Weise mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Translation erlaubt. Üblicherweise bedeutet in funktionsfähiger Weise verbunden zusammenhängend und im Leserahmen; bestimmte genetische Elemente, wie beispielsweise Repressor-Gene, sind jedoch nicht zusammenhängend verknüpft, binden aber dennoch an Operatorsequenzen, die wiederum die Expression kontrollieren. Siehe z. B. Rodriguez, et al., Kapitel 10, Seiten 205–236; Balbas und Bolivar (1990) Methods in Enzymology 185: 14–37; und Ausubel, et al. (1993) Current Protocols in Molecular Biology. Greene und Wiley, NY.
Repräsentative Beispiele für geeignete Expressionsvektoren umfassen pCDNA1; pCD, siehe Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5: 1136–1142; pMClneo Poly-A, siehe Thomas, et al. (1987) Cell 51: 503–512; und einen Baculovirusvektor, wie beispielsweise pAC 373 oder pAC 610. Siehe z. B. Miller (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42: 177–199.
Es wird häufig gewünscht sein, ein SLAM-Polypeptid in einem System zu exprimieren, das ein spezifisches oder definiertes Glykosylierungsmuster bereitstellt. Siehe z. B. Luckow und Summers (1988) Bio/Technology 6: 47–55; und Kaufman (1990) Meth. Enzymol. 185: 487–511.
Das SLAM oder ein Fragment davon kann so konstruiert werden, dass es über Phosphatidylinositol (PI) an eine Zellmembran gebunden ist; es kann aber durch Behandlung mit einem Phosphatidylinositol-spaltenden Enzym, z. B. Phosphatidylinositol- Phospholipase-C von der Membran entfernt werden. Dies setzt das Antigen in einer biologisch aktiven Form frei und erlaubt die Aufreinigung durch Standardverfahren der Proteinchemie. Siehe z. B. Low (1989) Biochim. Biophys. Acta 988: 427–454; Tse, et al. (1985) Science 230: 1003–1008; und Brunner, et al. (1991) J. Cell Biol. 114: 1275–1283.
Da nunmehr das SLAM charakterisiert worden ist, können Fragmente oder Derivate davon durch herkömmliche Verfahren zur Synthetisierung von Peptiden hergestellt werden. Diese umfassen Verfahren, wie sie beispielsweise in Stewart und Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky und Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; und Villafranca (Hrsg.) (1991) Techniques in Protein Chemistry II, Academic Press, San Diego, Ca, beschrieben sind.
VII. Verwendungen
Die vorliegende Erfindung stellt Reagenzien bereit, die Verwendung bei diagnostischen Anwendungen finden werden, wie sie vorliegend an anderer Stelle beschrieben werden, z. B. bei der allgemeinen Beschreibung von T-Zell-vermittelten Zuständen oder nachstehend bei der Beschreibung von Kits zur Diagnose.
Diese Erfindung stellt ferner Reagenzien mit signifikantem therapeutischen Werten bereit. SLAM (natürlich vorkommend oder rekombinant), Fragmente davon und Antikörper dagegen, sollten zusammen mit Verbindungen, bei denen eine Bindungsaffinität gegenüber SLAM identifiziert wurde, bei der Behandlung von Zuständen nützlich sein, die mit einer abnormalen Physiologie oder Entwicklung assoziiert sind, einschließlich abnormaler Proliferation, z. B. krebsartiger Zustände oder degenerativer Zustände. Insbesondere wird eine Modulation der Entwicklung von lymphoiden Zellen durch geeignete therapeutische Behandlung unter Verwendung der Zusammensetzungen, die vorliegend bereitgestellt sind, erreicht werden. Zum Beispiel sollte eine Krankheit oder ein Zustand, die/der mit abnormaler Expression oder abnormaler Signalübertragung durch ein SLAM assoziiert ist, ein mutmaßliches Ziel für einen Agonisten oder einen Antagonisten des Antigens sein. Das Antigen spielt eine Rolle bei der Regulation oder Entwicklung von blutbildenden Zellen, z. B. lymphoiden Zellen, die immunologische Reaktionen beeinflussen, z. B. autoimmune Erkrankungen.
Insbesondere wurde gezeigt, dass das Antigen ein costimulatorisches Signal für die T-Zellaktivierung bereitstellt. Somit spielt das SLAM eine Rolle bei den Interaktionen von T-Zellen mit T-Zellen. Diese Interaktionen führen in besonderen Zusammenhängen zu einer Zellproliferation, zu einer gesteigerten Zytokinsynthese durch die Zellen und somit zur Amplifikation der T-Zellproliferation.
Des Weiteren legt die SLAM-induzierte Produktion von Interferon-γ nahe, dass bestimmte Agonisten von SLAM T-Zellantworten auf einen Th0/Th1-Weg lenken und somit eine Antwort vom Th2-Typ unterdrücken könnten. Unter diesen Agonisten sollten verschiedene Antikörper sein, die die geeigneten Epitope erkennen, z. B. solche, die eine Bindung von SLAM an seine Liganden nachahmen.
Umgekehrt können Antagonisten von SLAM, wie die natürlich vorkommende sekretierte Formen von SLAM oder blockierende Antikörper, einen selektiven und wirksamen Weg zur Blockierung von Immunantworten in anormalen Situationen bereitstellen, z. B. bei Autoimmunerkrankungen, einschließlich rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus erythematodes (SLE), Hashimoto-Autoimmunthyreoiditis sowie akuter und chronischer entzündlicher Antworten, bei denen die T-Zellaktivierung, Expansion und/oder immunologische T-Zellerinnerung eine wichtige Rolle spielen. Siehe auch Samter, et al. (Hrsg.) Immunological Diseases Bände 1 und 2, Little, Brown and Co. Die Unterdrückung der T-Zellaktivierung, Expansion und/oder Zytokinfreisetzung durch die natürlich vorkommende sekretierte Form von SLAM, die in großen Mengen durch rekombinante Verfahren hergestellt werden kann, oder durch blockierende Antikörpern, sollte bei zahlreichen Erkrankungen, bei denen abnormale T-Zellantworten von Bedeutung sind, wirksam sein.
Das SLAM scheint mit CD45R0, das ein Marker für aktivierte (primed) T-Zellen oder für Memory-T-Zellen ist, co-exprimiert zu werden. SLAM ist ferner in CD45RA-Zellen abwesend, welche die naive T-Zell-Untergruppe darstellen. SLAM kann auch als solches als ein diagnostischer Marker für Memory-T-Zellen dienen.
Verschiedene abnormale Zustände sind für jeden der zwei Typen bekannt, von denen durch Northern-Blot-Analyse gezeigt wurde, dass sie SLAM-mRNA enthalten. Siehe Berkow (Hrsg.) The Merek Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; Thorn, et al. Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Rill, N.Y.; und Weatherall, et al. (Hrsg.) Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, Oxford. Viele andere medizinische Zustände und Erkrankungen umfassen T-Zellen oder sind von T-Zellen vermittelt, und viele von diesen werden auf eine Behandlung mit einem vorliegend bereitgestellten Agonisten oder Antagonisten ansprechen. Siehe z. B. Stites und Terr (Hrsg.; 1991) Basic and Clinical Immunology Appleton und Lange, Norwalk, Connecticut; und Samter, et al. (Hrsg.) Immunological Diseases Little, Brown and Co. Diese Probleme sollten unter Verwendung der vorliegend bereitgestellten Zusammensetzung der Vorbeugung oder Behandlung zugänglich sein.
SLAM-Antikörper können aufgereinigt und anschließend an einen Patienten (tierisch oder menschlich) verabreicht werden. Diese Reagenzien können für die therapeutische Verwendung mit zusätzlichen aktiven oder inerten Inhaltsstoffen kombiniert werden, z. B. in herkömmlichen, pharmazeutisch akzeptablen Trägern oder Verdünnungsmitteln, z. B. immunogenen Adjuvanzien, zusammen mit physiologisch harmlosen Stabilisatoren, Hilfsstoffen oder Konservierungsmitteln. Diese Kombinationen können sterilfiltriert und in Dosierungsformen eingebracht werden, wie beispielsweise durch Lyophilisierung in ein Dosierungsfläschchen oder durch Lagerung in stabilisierten wässrigen Präparationen. Diese Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Antikörpern oder bindenden Fragmenten davon, einschließlich Formen, die nicht Komplement-bindend sind.
Das Wirkstoff-Screening unter Verwendung von SLAM oder Fragmenten davon kann durchgeführt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die eine Bindungsaffinität für SLAM oder eine andere relevante biologische Wirkung auf SLAM-Funktionen aufweisen, einschließlich der Isolierung assoziierter Komponenten. Die nachfolgenden biologischen Assays können dann verwendet werden, um zu bestimmen, ob die Verbindung eine intrinsische, stimulierende Aktivität aufweist und daher ein Blocker oder Antagonist ist, indem sie die Aktivität des Antigens blockiert. Gleichermaßen kann eine Verbindung, die eine intrinsische stimulierende Aktivität aufweist, den Signal-Weg aktivieren, und sie ist somit ein Agonist, indem sie die Aktivität von SLAM stimuliert. Diese Erfindung umfasst des Weiteren die therapeutische Verwendung von blockierenden Antikörpern gegen SLAM als Antagonisten und von stimulatorischen Antikörpern, z. B. A12, als Agonisten. Dieser Ansatz sollte insbesondere mit anderen Spezies-Varianten von SLAM nützlich sein.
Die Mengen der Reagenzien, die für eine wirksame Therapie erforderlich sein werden, hängen von zahlreichen verschiedenen Faktoren ab, einschließlich Verabreichungsart, Zielstelle, physiologischer Zustand des Patienten und andere verabreichte Medikamente. Somit sollten die Behandlungsdosierungen titriert werden, um die Sicherheit und Wirksamkeit zu optimieren. Typischerweise werden Dosierungen, die in vitro verwendet werden, eine nützliche Leitlinie für die Mengen bieten, welche für die in situ-Verabreichung dieser Reagenzien nützlich sein werden. Tierversuche zur wirksamen Dosis für die Behandlung spezieller Erkrankungen werden einen weiteren prädiktiven Hinweis auf die menschliche Dosierung bereitstellen. Verschiedene Überlegungen sind z. B. in Gilman, et al. (Hrsg.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, B. Auflage, Pergamon Press; und Remington's Pharmaceutical Sciences. 17. Auflage. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn, beschrieben. Verfahren zur Verabreichung werden dort und nachstehend beschrieben, z. B. für die orale, intravenöse, intraperitoneale oder intramuskuläre Verabreichung, für die transdermale Infusion und andere. Pharmazeutisch geeignete Träger werden Wasser, Saline, Puffer und andere Verbindungen umfassen, die z. B. in Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey, beschrieben sind. Es wird erwartet, dass sich die Dosierungsbereichenormalerweise bei Mengen von weniger als 1 mM Konzentrationen, typischerweise weniger als etwa 10 μM Konzentrationen, normalerweise weniger als etwa 100 nM, vorzugsweise weniger als etwa 10 pM (pikomolar), und am meisten bevorzugt weniger als etwa 1 fM (femtomolar) bewegen, in einem geeigneten Träger. Formulierungen zur langsamen Freisetzung oder Geräte zur langsamen Freisetzungen werden häufig für eine kontinuierliche oder anhaltende Verabreichung verwendet werden. Siehe z. B. Langer (1990) Science 249: 1527–1533.
SLAM, Fragmente davon, und Antikörper dagegen oder seine Fragmente, Antagonisten und Agonisten können direkt an den Wirt, der behandelt werden soll, verabreicht werden; oder es kann abhängig von der Größe der Verbindung wünschenswert sein, sie vor der Verabreichung an Trägerproteine, wie beispielsweise Ovalbumin oder Serumalbumin, zu konjugieren. Therapeutische Formulierungen können in jeder herkömmlichen Dosisformulierung verabreicht werden. Während es möglich ist, den aktiven Bestandteil allein zu verabreichen, ist es bevorzugt, ihn als pharmazeutische Formulierung anzubieten. Formulierungen umfassen typischerweise mindestens einen wie oben definierten aktiven Bestandteil zusammen mit einem oder mit mehreren geeigneten Trägern davon. Jeder Träger sollte sowohl pharmazeutisch als auch physiologisch in dem Sinne geeignet sein, dass er kompatibel mit anderen Bestandteilen und nicht schädlich für den Patienten ist. Die Formulierungen umfassen solche, die für die orale, rektale, nasale, topische oder parenterale (einschließlich subkutane, intramuskuläre, intravenöse und intradermale) Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen können in geeigneter Weise in Einheitsdosierungsformen angeboten werden und können nach einem beliebigen Verfahren hergestellt werden, das im Stand der Technik auf dem Gebiet der Pharmazie bekannt ist. Siehe z. B. Gilman, et al. (Hrsg.) (1990) Goodman und Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, B. Auflage, Pergamon Press; und Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis, et al. (Hrsg.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, New York; Lieberman, et al. (Hrsg.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, New York; und Lieberman, et al. (Hrsg.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, New York. Die erfindungsgemäße Therapie kann mit anderen Mitteln kombiniert werden oder in Verbindung mit diesen verwendet werden.
Sowohl die natürlich vorkommende als auch die rekombinante Form der erfindungsgemäßen SLAMs sind insbesondere in Kits und Assayverfahren nützlich, die in der Lage sind, Verbindungen mittels Screening auf die Bindungsaktivität an die Proteine zu untersuchen. Verschiedene Verfahren der Assay-Automatisierung sind in den letzten Jahren entwickelt worden, um das Screening von Zehntausenden von Verbindungen in einer kurzen Zeitspanne zu ermöglichen. Siehe z. B. Fodor, et al. (1991) Science 251: 767–773, der Mittel zum Testen der Bindungsaffinität durch Synthese einer Vielzahl von definierten Polymeren auf einem festen Substrat beschreibt. Die Entwicklung geeigneter Assays kann erheblich durch die Verfügbarkeit großer Mengen an aufgereinigtem, löslichen SLAM, wie es von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, erleichtert werden.
Andere Verfahren können verwendet werden, um die wichtigen Reste bei den SLAM-SLAM-Interaktionen zu bestimmen. Mutationsanalysen können durchgeführt werden, siehe z. B. Somoza, et al. (1993) J. Exptl. Med. 178: 549–558, um spezifische Reste zu bestimmen, die bei der Interaktion und/oder Signalübertragung entscheidend sind. Sowohl extrazelluläre Domänen, die an der homophilen Interaktion beteiligt sind, oder die intrazelluläre Domäne, die Interaktionen bereitstellen, welche für die intrazelluläre Signalübertragung wichtig sind.
Zum Beispiel können Antagonisten normalerweise gefunden werden, sobald das Antigen strukturell definiert ist, z. B. anhand von Tertiärstrukturdaten. Das Testen von möglichen interagierenden Analoga ist nunmehr durch die Entwicklung der hochautomatisierten Assayverfahren unter Verwendung eines aufgereinigten SLAM möglich geworden. Insbesondere werden neue Agonisten und Antagonisten durch die Verwendung von Screening-Methoden, die vorliegend beschrieben werden, entdeckt werden. Von besondere Wichtigkeit sind Verbindungen, bei denen herausgefunden wurde, dass sie eine kombinierte Bindungsaffinität für ein Spektrum von SLAM-Molekülen aufweisen, z. B. Verbindungen, die als Antagonisten für Spezies-Varianten von SLAM dienen können.
Ein Verfahren des Wirkstoff-Screenings verwendet eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, die stabil mit rekombinanten DNA-Molekülen transformiert sind, welche ein SLAM exprimieren. Es können Zellen isoliert werden, die ein SLAM isoliert von anderen Molekülen exprimieren. Solche Zellen können entweder in lebensfähiger oder in fixierter Form für Standard-Bindungsassays für Bindungspartner verwendet werden. Siehe auch Parce, et al. (1989) Science 246: 243–247; und Owicki, et al. (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87: 4007–4011, die sensitive Verfahren beschreiben, um zelluläre Antworten nachzuweisen.
Eine andere Technik für das Wirkstoff-Screening umfasst einen Ansatz, der eine Hochdurchsatz-Screening für Verbindungen bereitstellt, die geeignete Bindungsaffinität für ein SLAM haben, und dieser ist im Detail in Geysen, Europäische Patentanmeldung 84/03564 beschrieben, die am 13. September 1984 veröffentlicht wurde. Zunächst wird eine große Anzahl verschiedener kleiner Peptidtestverbindungen auf einem festen Substrat synthetisiert, z. B. auf Kunststoffstiften oder auf einer anderen geeigneten Oberfläche, siehe Fodor, et al. (1991). Dann werden alle Stifte mit gelöstem, ungereinigtem oder mit gelöstem, aufgereinigtem SLAM umgesetzt und gewaschen. Der nächste Schritt umfasst das Nachweisen des gebundenen SLAM.
Eine rationale Wirkstoffentwicklung (rational drug design) kann ebenfalls auf strukturellen Untersuchungen der molekularen Formen von SLAM und anderen Effektoren oder Analoga basieren. Effektoren können andere Proteine sein, die andere Funktionen als Antwort auf eine Bindung vermitteln, oder andere Proteine, die normalerweise mit SLAM interagieren. Ein Mittel zur Bestimmung, welche Stellen mit spezifischen anderen Proteinen interagieren, ist eine physikalische Strukturbestimmung, z. B. Röntgenkristallographie oder zweidimensionale NMR-Methoden. Diese werden Leitlinien in Bezug auf die Aminosäure reste bereitstellen, die molekulare Kontaktregionen bilden. Für eine ausführliche Beschreibung der Proteinstrukturbestimmung, siehe z. B. Blundell und Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York.
VIII. Kits
Diese Erfindung betrifft ferner die Verwendung von SLAM-Proteinen, Fragmenten davon, Peptiden und ihrer Fusionsprodukte in einer Vielzahl von diagnostischen Kits und Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines anderen SLAM oder eines Bindungspartners. Typischerweise wird das Kit ein Fach haben, das entweder ein definiertes SLAM-Peptid oder ein Gensegment oder ein Reagenz, das eines von beiden erkennt, z. B. SLAM-Fragmente oder Antikörper, enthält.
Ein Kit zur Bestimmung der Bindungsaktivität einer Testverbindung an ein SLAM würde typischerweise eine Testverbindung umfassen; eine markierte Verbindung, z. B. einen Bindungspartner oder einen Antikörper, der eine bekannte Bindungsaffinität für SLAM aufweist; eine Quelle für SLAM (natürlich vorkommendes oder rekombinantes); und ein Mittel zur Trennung einer gebundenen von einer freien markierten Verbindung, wie beispielsweise eine Festphase zur Immobilisierung des Moleküls. Nach Screening der Verbindungen können solche, die geeignete Bindungsaffinität zu dem Antigen haben, in geeigneten biologischen Assays bewertet werden, wie es im Stand der Technik hinreichend bekannt ist, um zu bestimmen, ob sie als Agonisten oder Antagonisten auf den SLAM Signalübertragungsweg wirken. Die Verfügbarkeit rekombinanter SLAM-Polypeptide stellt ferner hinreichend definierte Standards zur Kalibrierung solcher Assays bereit.
Ein bevorzugtes Kit zur Bestimmung der Konzentration von z. B. einem SLAM in einer Probe würde typischerweise eine markierte Verbindung umfassen, z. B. einen Bindungspartner oder einen Antikörper mit bekannter Bindungsaffinität für das Antigen, eine Quelle für das Antigen (natürlich vorkommend oder rekombinant) und ein Mittel zur Trennung einer gebundenen von einer freien markierten Verbindung, z. B. ein Festphase zur Immobilisierung von SLAM. Fächer, die Reagenzien enthalten und Instruktionen werden normalerweise bereitgestellt werden.
Antikörper, einschließlich Antigen-bindender Fragmente, die spezifisch für das SLAM oder für Fragment sind, sind für diagnostische Anwendungen nützlich, um das Vorhandensein erhöhter Mengen von SLAM und/oder seiner Fragmente nachzuweisen. Solche diagnostischen Assays können Lysate, lebendige Zellen, fixierte Zellen, Immunfluoreszenz, Zellkulturen und Körperflüssigkeiten verwenden, und sie können des Weiteren den Nachweis von Antigenen, die verwandt zu dem Antigen im Serum sind, oder Ähnliches umfassen. Diagnostische Assays können homogen (ohne einen Trennungsschritt zwischen freiem Reagenz und Antigen-Bindungspartnerkomplex) oder heterogen (mit einem Trennungsschritt) sein. Es gibt verschiedene kommerzielle Assays, wie beispielsweise Radioimmunassay (RIA), Enzym-gekoppelter Immunosorbent-Assay (ELISA), Enzymimmunsassay (EIA), Enzymverstärkte Immunassaytechnik (EMIT), Substrat-markierter Fluoreszenz-Immunassay (SLFIA) und Ähnliches. Siehe z. B. Van Vunakis, et al. (1980) Meth Enzymol. 70: 1–525; Harlow und Lane (1980) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY; und Coligan, et al. (Hrsg.) (1993) Current Protocols in Immunology, Greene und Wiley, NY.
Anti-idiotypische Antikörper können eine ähnliche Verwendung haben, um das Vorhandensein von Antikörpern gegen ein SLAM zu diagnostizieren, da dieses diagnostisch für verschiedene abnormale Zustände sein kann. Zum Beispiel kann die Überproduktion von SLAM zur Erzeugung von verschiedenen immunologischen Reaktionen führen, die diagnostisch für abnormale physiologi sche Zustände sind, insbesondere für proliferative Zellzuständen, wie beispielsweise Krebs oder eine abnormale Aktivierung oder Differenzierung.
Häufig werden die Reagenzien für diagnostische Assays in Kits zur Verfügung gestellt, um die Sensitivität des Assays zu optimieren. Für die vorliegende Erfindung wird abhängig von der Art des Assays, dem Protokoll und der Markierung entweder markierter oder unmarkierter Antikörper oder Bindungspartner oder markiertes SLAM bereitgestellt. Dies erfolgt normalerweise in Verbindung mit anderen Additiven, wie beispielsweise Puffern, Stabilisatoren, Materialien, die für die Signalerzeugung notwendig sind, wie beispielsweise Substrate für Enzyme und Ähnliches. Vorzugsweise wird das Kit auch Instruktionen für die richtige Verwendung und die Entsorgung der Inhalte nach der Verwendung beinhalten. Typischerweise hat das Kit Fächer für jedes nützliche Reagenz. Praktischerweise werden die Reagenzien als trockenes lyophilisiertes Pulver bereitgestellt, wobei die Reagenzien in einem wässrigen Medium, das geeignete Konzentrationen der Reagenzien zur Durchführung des Assays bereitstellt, rekonstituiert werden können.
Jeder der zuvor genannten Bestandteile des Wirkstoff-Screenings und der diagnostischen Assays kann ohne Modifikation verwendet werden, oder er kann auf vielfältige Weise modifiziert werden. Beispielsweise kann die Markierung durch kovalente oder nicht-kovalente Anbindung einer Gruppe, die direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal bereitstellt, erreicht werden. In jedem dieser Assays kann der Bindungspartner, die Testverbindung, SLAM oder die Antikörper dagegen direkt oder indirekt markiert sein. Möglichkeiten für die direkte Markierung umfassen die folgenden Markierungsgruppen: Radiomarkierungen wie beispielsweise ¹²⁵I, Enzyme ( US-Patent Nr. 3,645,090 ), wie beispielsweise Peroxidase und alkalische Phosphatase, und fluoreszente Markierungen ( US-Patent Nr.3,940,475 ), die in der Lage sind, die Veränderungen in der Fluoreszenzintensität, die Wellenlängenverschiebungen oder die Fluoreszenzpolarisierung zu verfolgen. Möglichkeiten für die indirekte Markierung umfassen die Biotinylierung eines der Bestandteile gefolgt von einer Bindung an Avidin, das an eine der oben genannten Markierungsgruppen gekoppelt ist.
Es gibt ferner eine Vielzahl von Verfahren zur Trennung des gebundenen vom freien SLAM, oder alternativ dazu der gebunden von der freien Testverbindung. Das SLAM kann auf verschiedenen Matrices immobilisiert werden, gefolgt von einem Waschschritt. Geeignete Matrices umfassen Kunststoff, wie beispielsweise eine ELISA-Platte, Filter und Beads. Siehe z. B. Coligan, et al. (Hrsg.) (1993) Current Protocols in Immunology, Band 1, Kapitel 2, Greene und Wiley, NY. Andere geeignete Trennungstechniken umfassen ohne Einschränkung, das Verfahren mit Fluorescein-Antikörpern und magnetisierbaren Partikeln, das in Rattle, et al. (1984) Clin. Chem. 30: 1457–1461, beschrieben ist, und die Doppelantikörper-Magnetpartikeltrennung, wie sie in US-Paten Nr. 4,659,678 beschrieben ist.
Verfahren zur Verknüpfung von Proteinen oder ihren Fragmenten an verschiedenen Markierungen sind ausführlich in der Literatur beschrieben worden und erfordern vorliegend keine ausführliche Diskussion. Viele der Methoden umfassen die Verwendung von aktivierten Carboxylgruppen, entweder durch die Verwendung von Carbodiimiden oder aktiven Estern, um Peptidbindungen zu bilden, die Bildung von Thioethern durch Reaktion einer Mercaptogruppe mit einem aktivierten Halogen, wie beispielsweise Chloracetyl, oder ein aktiviertes Olefin, wie beispielsweise Maleimid, für die Verknüpfung, oder Ähnliches. Fusionsproteine werden ebenfalls Verwendung in diesen Anwendungen finden.
Ein anderer diagnostischer Aspekt dieser Erfindung umfasst die Verwendung von Oligonukleotid- oder Polynukleotidsequenzen, die aus der Sequenz eines SLAM stammen. Diese Sequenzen können als Sonden für den Nachweis der Mengen der SLAM-mRANS in Proben aus Patienten verwendet werden, die unter Verdacht stehen, einen abnormalen Zustand aufzuweisen, z. B. Krebs oder ein Entwicklungsproblem. Die Herstellung von sowohl RNA- als auch DNA-Nukleotidsequenzen, die Markierung der Sequenzen und die bevorzugte Größe der Sequenzen ist Gegenstand vielfältiger Beschreibungen und Diskussionen in der Literatur. Siehe z. B. Langer-Safer, et al. (1982) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 79: 4381–4385; Caskey (1987) Science 236: 962–967; und Wilchek et al. (1988) Anal. Biochem. 171: 1–32.
Diagnostische Kits, die ferner das qualitative oder quantitative Vorhandensein anderer Markierungen testen, sind ebenfalls umfasst. Die Diagnose oder Prognose kann von der Kombination von multiplen Indikationen, die als Marker verwendet werden, abhängen. Somit können Kits auf Kombinationen von Markern testen. Siehe z. B. Viallet, et al. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1: 89–97.
Die Bindung von SLAM-Ig an SLAM-transfizierte L-Zellen zeigt, dass SLAM mit sich selbst als Ligand interagieren kann. Eine native Gelelektrophorese mit aufgereinigtem SLAM-Ig zeigte, dass bei Vorliegen von Formen mit hohem Molekulargewicht SLAM-Ig-Moleküle ebenfalls zur homophilen Interaktion in Lösung in der Lage sind. Obwohl monomere und dimere Formen des SLAM-Ig auf dem nativen Gel vorherrschend waren, handelte es sich nicht um verschiedene Banden, was auf eine relativ schwache molekulare Interaktion hinweist, die empfindlich für eine Dissoziation während der Elektrophorese ist. Tatsächlich war das Ausmaß der SLAM-Ig-Bindung an SLAM-exprimierende L-Zellen geringer als das unter Verwendung einer äquiavalenten Konzentration eines monoklonalen Antikörpers beobachtete, was nahelegt, dass eine SLAM-SLAM-Interaktion schwächer ist als die Interaktion des mAb A12 mit SLAM. Interaktionen zwischen anderen Mit gliedern der Ig-Superfamilie sind wesentlich schwächer als Interaktion der Antikörper (van der Merwe und Barclay (1994) TIBS 19: 354–358). Übereinstimmend mit der Tatsache, dass SLAM ein Ligand für sich selbst ist, wurde eine SLAM-Ig-Bindung auf T-Zellklonen und EBV-transformierten B-Zellen beobachtet, wobei beide Zelltypen signifikante Mengen an SLAM exprimieren. Die Mengen von SLAM auf CD45RO⁺ T-Zellen von PBMC korrelierte mit dem Ausmaß der SLAM-Ig-Bindung nach der Aktivierung. Diese Daten schließen nicht aus, dass es einen anderen Liganden für SLAM gibt, aber es gibt keine Hinweise für einen anderen Liganden, da bislang kein getesteter SLAM-negativer Zelltyp eine SLAM-Ig-Bindung gezeigt hat; wenn eine SLAM-Ig-Bindung beobachtet wurde, war sie proportional zum Ausmaß der SLAM-Expression.
Übereinstimmend mit dem biochemischen Beweis, dass SLAM ein natürlicher Ligand für sich selbst ist, könnten L-Zellen, die mit SLAM transfiziert sind, ein direktes co-stimulatorisches Signal für CD4⁺ Zellklone bereitstellen. Die Bindung von SLAM mit mAb A12 stellt ein signifikantes co-stimulatorisches Signal für die T-Zellaktivierung bereit. Wie mit dem agonistischen mAb A12 beobachtet wurde, führt die Aktivierung von CD4⁺ T-Zellklonen über SLAM, das auf L-Zellen exprimiert wird, in Kombination mit Anti-CD3 zu einer starken Steigerung der Proliferation. Die Co-Stimulation der Proliferation mit suboptimalen Dosen von Anti-CD3 wurde bei SLAM-Transfektanten beobachtet. Die Stimulation, die durch SLAM-transfizierte L-Zellen bereitgestellt wurde, war wesentlich genug, um in Abwesenheit andere Stimuli direkt zu einer T-Zellproliferation zu führen. Diesbezüglich ist das direkte stimulatorische Signal, das durch auf L-Zellen exprimiertes SLAM bereitgestellt wird, einzigartig und wird selbst für die klassischen costimulatorischen Moleküle N7 (Jenkins und Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol. 5: 361–367 und B70 (Azuma, et al. (1993) Nature 366: 76–79) nicht beobachtet.
Der Ligand für B7 ist CD28 und Anti-CD28 mAbs stimulieren nicht direkt die Proliferation von T-Zellklonen. Der Anti-SLAM mAb A12 oder seine F(ab)₂-Fragmente können jedoch die T-Zellproliferation direkt induzieren. Die Konsequenzen der Bindung von SLAM auf T-Zellklonen durch SLAM auf transfizierten L-Zellen oder durch mAb A12 oder seine F(ab)₂-Fragmente sind die gleichen. Somit ist die direkte Bindung von SLAM ohne die Beteiligung anderer Moleküle bei der Interaktion ausreichend, um die beobachteten funktionellen Wirkungen zu induzieren. Dies schließt die wahrscheinliche Interaktion von SLAM mit signaltransduzierenden Molekülen nicht aus, und es verringert nicht die Wichtigkeit anderer Interaktionen von Zelloberflächenmolekülen für das Erreichen der stärksten funktionellen Wirkungen der SLAM-Bindung, wie z. B. die enormen costimulatorischen Wirkungen über SLAM auf T-Zellen, die in einer Antigen-spezifischen Art stimuliert werden.
Das SLAM-Gen wurde an der Grenze der Banden q21.2 und q22 auf dem humanen Chromosom 1 lokalisiert. Diese Region des Chromosoms 1 scheint ein wichtiger Locus für Gene zu sein, die an Zell-Zell-Interaktionen beteiligt sind. Die Gene für Selektine (Watson et al. 1990) J. Exp. Med. 172: 263–272), Moleküle, die an der Leukozytenadhäsion und am Transport (trafficking) beteiligt sind, sind ebenfalls bei 1d22-23 lokalisiert. Ein anderes Gen an diesem Locus (1q21.3-23) ist das Gen für Myelin Po (Pham-Dinh, et al. (1993) Hum. Mol. Genet. 2: 2051–2054), das am stärksten vorhandene Protein in Myelin (Filbin, et al. (1990) Nature 344: 871–872). Wie SLAM ist Myelin Po ein Mitglied der Ig-Superfamilie (Williams und Barclay (1988) Annu. Rev. Immunol. 6: 381–405) und interagiert ebenfalls in homophiler Weise. Die normale Myelinstruktur beruht auf der Selbst-Interaktion von Myelin Po, und vererbte Mutationen im Myelin Po sind für die Charcot-Marie-Tooth-Neuropathie vom Typ 1b verantwortlich (Kulkens, et al. (1993) Nat. Genet. 5: 35–39; Hayasaka, et al. (1993) Nat. Genet. 5: 31–34). Viele Mitglieder der Ig-Superfamilie interagieren in heterophiler Weise mit verwandten Familienmitgliedern, wobei bekannte Beispiele die folgenden sind: CD2 mit LFA-3 (Selvaraj, et al. (1987) Nature 326: 400–403) oder CD48 (van der Merwe, et al. (1993( EMBO J. 12: 4945–4954); CD28 mit B7-1 (Linsley, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5031–5035) oder B7-2 (Freeman, et al. (1993) Science 262: 909–911; Azuma, et al. (1993) Nature 366: 76–9); und das TCR mit MHC Klasse II (Matsui, et al. (1991) Science 254: 1788–1791). Die Tatsache, dass derart viele Mitglieder der Ig-Superfamilie auf diese Weise interagieren können, könnte das Ergebnis der Evolution eines in homophiler Weise interagierenden Vorläufers nach Gen-Duplikation sein (Williams und Barclay (1988) Annu. Rev. Immunol. 6: 381–405). SLAM und Myelin Po haben möglicherweise eine ursprüngliche Funktion der Mitglieder der Ig-Superfamilie zur homophilen Interaktion beibehalten.
Das Gen für CD48 ist auf demselben Teil von Chromosom 1 lokalisiert wie SLAM bei 1q21-23 (Staunton et al. (1989) J. Exp. Med. 169: 1087–1099). CD48, von dem berichtet wird, dass es ein schwacher Ligand für CD2 ist (van der Merwe, et al. (1993) EM-BO J. 12: 4945–4954), und 2B4, ein Signalmolekül, das auf murinen NK-Zellen und zytotoxischen T-Zellen exprimiert wird (Mathew, et al. (1993) J. Immunol. 151: 5328–5337), und für das kein Ligand beschrieben wurde, sind die am stärksten verwandten Moleküls zu SLAM. Interessanterweise haben SLAM, CD48 und 2B4 jeweils eine V- und eine C-Domäne, und sie können von anderen Mitgliedern der Ig-Superfamilie durch die Konservierung der Sequenz CXLXLXC unterschieden werden, wobei das zweite Cystein das Rückgrat für die C-Domäne ist und das erste Cystein ein konservierter Rest ist, der wahrscheinlich zwischen der V- und der C-Domäne liegt. CD48 und 2B4 sind bislang nicht direkt auf ihre Fähigkeit zur homophilen Interaktion beurteilt worden; es ist jedoch berichtet worden, dass eine rekombinante lösliche Form von CD48 dazu neigt, in Lösung Aggregate zu bilden. Die Verwandtschaft und chromosomale Co-Lokalisierung von CD48 und SLAM ist ein Hinweis für eine evolutionäre Abweichung nach einer Gen-Duplikation.
Von anderen großen Mitgliedern der Ig-Superfamilie mit mehreren Domänen ist berichtet worden, dass sie in homophiler Weise interagieren, und diese umfassen das Blutplättchen-Endothelzelladhäsionsmolekül (CD31) (Watt, et al. (1993) Blood 82: 2649–2663), das Neuronen-Gliazelladhäsionsmolekül (Grumet und Edelman (1988) J. Cell Biol. 106: 487–503), Neuronen-Gliaverwandte Zelladhäsionsmolekül (Mauro, et al. (1992) J. 10 Cell Biol. 119: 191–202), das neurale Zelladhäsionsmolekül oder CD56 (Rao, et al. (1992) J. Cell Biol. 118: 937–949), und das karzinoembroynale Antigen (Zhou, et al. (1993) J. Cell Biol. 122: 951–960).
Eine alternativ gespleißte Form von SLAM, der ein 90 bp Exon fehlt, welches der Transmembranregion von SLAM entspricht und diese präzise umfasst, kodiert für eine sekretierte Form von SLAM. Dieses natürlich produzierte Molekül, das von aktivierten T-Zellen exprimiert wird, könnte die T-Zellfunktion unterdrücken und Teil einer negativen Rückkopplungsschleife sein, um die SLAM-vermittelte Aktivierung in Folge einer Zell-Zell-Interaktion abzuschwächen oder lokal zu begrenzen. Die SLAM-vermittelte T-Zellaktivierung ist resistent gegenüber Cyclosporin, was mit der Unfähigkeit von Anti-IL-2-Antikörpern übereinstimmt, die SLAM-induzierte T-Zellklonproliferation zu inhibieren. Angesichts der starken co-stimulatorischen Wirkungen einer SLAM-Bindung auf T-Zellproliferation und die Produktion von Th1-Zytokin kann die potentielle immunosuppressive Aktivität von löslichem SLAM eine effektive Ergänzung zur Inhibierung einer laufenden Immunantwort, wie sie beispielsweise bei einer Transplantatabstoßung zu sehen ist (Pereira, et al. (1990) J. Immunol. 144: 2109–2116; Zeevi, et al. (1988) Hum. Immunol. 21: 143–153), sein, die relativ resistent gegenüber Cyclosporin ist.
Eine SLAM-Bindung hat einzigartige Konsequenzen für die T-Zellaktivierung, da es Fähigkeit aufweist, die Zytokinproduktionsprofile in einen Th0/Th1-Subtypen zu ändern. und unter bestimmten Umständen die T-Zellproliferation direkt zu induzieren. Das neu beschriebene SLAM scheint neben TCR, CD28, CTLA-4, CD4 und CD2 ein Mitglied der Ig-Superfamilie zu sein, und seine Bindung reguliert T-Zellantworten. Das Vorhandensein von SLAM auf Lymphozyten verweist darauf, dass aktivierte Lymphozyten selbst einen signifikanten Co-Stimulus bereitstellen können. Dies ist nicht unerwartet, da die am meisten vorherrschenden Zelltypen in lymphoiden Organen Lymphozyten sind, die statistisch stets vorhandene Helfer sind, und die Hauptquelle für autokrine T-Zellwachstumsfaktoren wie beispielsweise IL-2. SLAM kann möglicherweise nicht nur starke co-stimulatorische Signale bereitstellen, sondern es könnte auch an der Beibehaltung der relativen Segregation und an der Lymphozytenakkumulation innerhalb der lymphoiden Organe beteiligt sein. Die überwiegende Arbeit im Bereich der T-Zell-Co-Stimulation war auf verschiedene Antigen-präsentierende Zellen und die Moleküle, die sie exprimieren, gerichtet, insbesondere auf B7 und 370, die Liganden für CD28 und CTLA-4 (Jenkins (1994) Immunity 1: 443–446). B-Zellen sind Antigen-präsentierende Zellen, die bei einer Aktivierung SLAM exprimieren, was eine B-T-Zellkollaboration unterstützen könnte, die zu einer Produktion von Ig führt. Übereinstimmend mit dem co-stimulatorischen Funktionen, die vorliegend für SLAM beschrieben sind, haben kürzliche Untersuchungen bei CD28-defizienten Mäusen eine Rolle für andere co-stimulatorische Moleküle bei der T-Zellaktivierung ergeben (Green, et al. (1994) Immunity 1: 501–508; Shahinian, et al. (1993) Science 261: 609–612); sie haben gezeigt, dass Co-Stimulierung, die von anderen T-Zellen bereitgestellt wird, zur T-Zellaktivierung beitragen kann (Green, et al. (1994) Immunity 1: 501–508; Jenkins (1994) Immunity 1: 443–446). Neben SLAM exprimieren aktivierte humane T-Zellen MHC Klasse II und B7, und es wurde gezeigt, dass sie in der Lage sind, Antigene zu präsentieren (Azuma, et al. (1993) J. Exp. Med. 177: 845–850), was die Möglichkeit von Interaktionen zwischen T-Zellen verdeutlicht, die das Erfordernis für das konstante Vorhandensein Antigen-präsentierender Zellen während der klonalen Expansion von T-Zelle abschwächen könnte. Natürlich hergestelltes, lösliches SLAM sollte einen nützlichen Antagonisten bereitstellen, um die Wichtigkeit der SLAM-SLAM-Interaktionen bei der Entwicklung von humanen Immunreaktionen weiter zu beurteilen.
Monoklonale Anti-SLAM-Antikörper inhibieren die durch IL-4 induzierte IgE-Synthese, was zeigt, dass die Signalübertragung durch SLAM entweder auf Ebene der T-Helferzellen oder auf Ebene der B-Zellen eine produktive Interaktion zwischen T-B-Zellen inhibiert, was zu einem von IL-4 gesteuerten IgE-Switching und zur IgE-Produktion führt. Dieser Effekt kann direkt sein, z. B. durch Interaktionen zwischen SLAM auf T-Zellen und SLAM auf B-Zellen, oder er kann indirekt sein, z. B. durch Induzierung der Zytokinproduktion durch die T-Helferzellen, welche die von IL-4 gesteuerte IgE-Synthese inhibiert. Interferon-γ ist das primäre Beispiel für ein solches Zytokin.
Diese Ergebnisse legen ferner nahe, dass lösliche Formen von SLAM mit Agonisten-Aktivitäten in der Lage sein könnten, die von IL-4 und/oder IL-13 gesteuerte Ig-Synthese in atopischen Patienten zu verhindern; somit könnten sie einen therapeutischen Nutzen bei der Herunterregulierung IgE-vermittelter allergischer Erkrankungen haben. Aufgrund der Tatsache, dass die Bindung von SLAM vorzugsweise eine Th1-Zytokinproduktion induziert, könnten SLAM-Agonisten darüber hinaus eine allgemeine klinische Verwendbarkeit bei der Umwandlung von Th2-Antworten in Th1-Antworten in Krankheiten haben, bei denen ein klares Th2-Profil vorliegt, wie beispielsweise Allergie, bestimmte Autoimmunerkrankungen oder bestimmte entzündliche Erkrankungen. Dies schließt Hashimoto-Thyreoiditis ein.
Auf der anderen Seite werden SLAM-Antagonisten eine entgegengesetzte Wirkung haben; d. h. Blockierung der Th1-Antworten in Krankheitssituationen, die durch Th1-Zellen und durch von Th1-Zellen abgeleitete Zytokine verursacht wird, wie beispielsweise Infektionskrankheiten, einschließlich z. B. Tuberkulose und Lepra, oder Autoimmunerkrankungen, z. B. rheumatoide Arthritis und Autoimmunuveitis.
Diese therapeutischen Reagenzien werden ferner bei der Modulierung solcher Antworten auf parasitäre Infektionen nützlich sein, um ein Impfreaktion zu modulieren.
BEISPIELE
ALLGEMEINE VERFAHREN
Einige der Standardverfahren sind z. B. in Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989), Molecular Clonino: A Labortory Manual (2. Auflage), Bände 1–3, CSH Press, NY; Ausubel, et al. Biology. Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; oder Ausubel, et al. (1987 und Ergänzungen) Current Protocols in Molecular Biology, Greene und Wiley, New York; Innis, et al. (Hrsg.) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, N.Y., beschrieben oder es wird darauf Bezug genommen. Verfahren zur Proteinaufreinigung umfassen Verfahren, wie beispielsweise Ammoniumsulfatpräzipitation, Säulenchromatographie, Elektrophorese, Zentrifugation, Kristallisation und andere. Siehe z. B. Ausubel, et al. (1987 und regelmäßig erschei nende Ergänzungen); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology, Band 182 und andere Ausgaben dieser Serie; und die Herstellerliteratur für die Verwendung von Proteinaufreinigungsprodukten, z. B., Pharmacia, Piscataway, N.J., oder Bio-Rad, Richmond, CA. Die Kombination mit rekombinanten Methoden ermöglicht die Fusion an geeignete Segmente, z. B. an eine FLAG-Sequenz oder an ein Äquivalent, das über eine Protease-entfernbare Sequenz fusioniert werden kann. Siehe z. B. Hochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69–70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow (Hrsg.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87–98, Plenum Press, N.Y.; und Crowe, et al. (1992) OIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUTAGEN, Inc., Chatsworth, CA. Zellkulturmethoden werden in Doyle, et al. (Hrsg.) (1994) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley und Sons, NY, beschrieben.
FACS-Analysen sind in Melamed, et al. (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY; und Robinson, et al. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY beschrieben. Die Fluoreszenzmarkierung von geeigneten Reagenzien wurde anhand von Standardverfahren durchgeführt.
BEISPIEL 1: Herstellung von mAb
Der monoklonale Anti-SLAM-Antikörper A12 (IgG1) wurde mittels Fusion von Splenozyten aus einer Balb/c-Maus erzeugt, die mit mononukleären Zellen aus peripherem Blut immunisiert worden waren, welche für 5 Stunden mit 12-O-Tetradecanoyl-13-Acetat (TPA) (1 ng/ml) und dem Ca² ⁺-Ionophor A23187 (500 ng/ml) (Calbiochem-Behring Corporation) aktiviert worden waren. Standardverfahren wurden verwendet, um ein Screening nach geeigneten produzierenden Klonen durchzuführen, und das A12-Hybridom wurde klonal isoliert und einer normalen Analyse unterzogen, z. B. Bestimmung der Produktionsfähigkeit und des Immunoglobulintyps. Die A12-Hybridomzelllinie wurde bei der ATCC am 10. November 1994 hinterlegt, und ihr wurde die ATCC-Zugangsnummer HB11760 zugewiesen.
BEISPIEL 2: Klonierung von humanem SLAM
COS-7-Zellen wurden durch Elektroporation wie in Cooks, et al. (1993) Int. Immunol. 5: 657–663 beschrieben transfiziert, mit einer A10 CD8⁺ T-Zellbibliothek-DNA, die hergestellt wurde, wie es in McKinney und Parkinson (1987) J. Immunol. Methods 96: 271–278 beschrieben ist.
Transfizierte Zellen wurden mit FITC-konjugiertem Anti-SLAM mAB A12 angefärbt und mit einem FACStar plus (Becton Dickinson) Zellsortiergerät sortiert. Plasmid-DNA wurde aus den sortierten Zellen unter Verwendung eines Wizard-Miniprep-Kits (Promega Corporation) isoliert. Plasmid-DNA wurde für die Amplifikation durch Elektroporation in Escherichia coli (ElectroMAX, BRL) transformiert und anschließend in COS-7-Zellen eingebracht. Nach 2 Runden Sortieren wurden SLAM-cDNA-Klone auf 45 der Gesamt-cDNA-Klone angereichert. Ein 1,8 kb-Insert in einem dieser Klone (pSURslam1) wurde auf beiden Strängen unter Verwendung des Didesoxykettenabbruchsverfahren sequenziert. Dieses Plasmid wurde bei der ATCC am 10. November 1994 hinterlegt, und ihm wurde die ATCC-Zugangsnummer 69713 zugewiesen. Andere cDNA-Klone, die für SLAM-Varianten kodieren, wurden unter Verwendung von Standardverfahren isoliert und charakterisiert. Insbesondere wurden Konstrukte, die für einen extrazellulären Teil von SLAM oder für einen intrazellulären Teil kodieren, durch Verwendung geeigneter PCR-Primer und von pSURslam1 als Matrize hergestellt.
BEISPIEL 3: Klonierung von Maus-SLAM
Die Maus-SLAM-cDNA wurde aus einer frühen Thymozyten-DNA-Bibliothek kloniert (d. h. αβ, CD4^–, CD8^– Thymozyten) wobei DNA verwendet wurde, die die extrazelluläre Domäne des humanen SLAM als Hybridisierungssonde repräsentierte.
Die Thymozyten wurden isoliert und mit primärem Antikörper für 30 Minuten bei 4°C angefärbt, zweimal gewaschen und anschließend mit FITC-konjugiertem sekundärem Antikörper für 30 Minuten bei 4°C inkubiert, bevor sie dreimal gewaschen wurde. Frisch isolierte Thymozyten wurden mit monoklonalem Anti-SLAM-Antkörper oder mit IgG angefärbt, gefolgt von einem FITC-konjugierten Schaf-Anti-Maus-Antikörper. Die Zellen wurden unter Verwendung eines FACScan (Becton-Dickinson)-Geräts hinsichtlich ihrer Färbung beurteilt.
BEISPIEL 4: Herstellung von Antikörpern gegen humanes SLAM
CH3-Mäuse wurden mit L-Zellen immunisiert, die stabil mit pSURslam1 transfiziert waren. Hybridome wurden durch Fusionierung von Splenozyten mit der NJ1-Myelomlinie hergestellt. Der Nachweis der Hybridomzellen, die geeignete monoklonale Antikörper gegen humanes SLAM produzierten, erfolgte durch indirekte Immunofluoreszenz und Durchflusszytometrie. Die Hybridomüberstände wurden in einem Screening auf eine Reaktivität mit sSURslam1-transfizierten L-Zellen im Vergleich zu nicht-transfizierten L-Zellen als Kontrolle untersucht.
BEISPIEL 5: Herstellung von Antikörpern gegen Maus-SLAM
Ratten wurden mit 10⁷ COS-Zellen, die mit pMSLAM1 transfiziert waren, immunisiert. Hybridome wurden durch Fusionierung von poplitealen Lymphknotenzellen aus Ratten mit Maus-Myelomzellen hergestellt. Polyklonales Serum wurde ebenfalls aus den Ratten isoliert.
BEISPIEL 6: Immunopräzipitation von humanem SLAM
Die Zelloberflächenproteine des Th0 T-Zellklons B21 wurden mit ¹²⁵I-Na (Amersham) unter Verwendung der Lactoperoxidasekatalysierten Reaktion radiomarkiert. SLAM wurde unter Verwendung von Pansorbin (Calbiochem), das mit Kaninchen-Anti-Maus-Ig beschichtet war, und dem Anti-SLAM-Antiserum immunopräzipitiert. Die Immunopräzipitate wurden auf einem 10% Acrylamid-Minigel (ISS) unter reduzierenden Bedingungen gefahren, und das getrocknete Gel wurde gescannt und mit einem Phosphorimager (Molecular Dynamics) analysiert.
Das natürliche SLAM wanderte mit einer Mobilitätseigenschaft von etwa 70 kD in einer diffusen Weise, die charakteristisch für Glykoproteine ist. Wenn das SLAM über Nacht mit 1,2 μl N-Glycanase (Genzyme) behandelt wurde, wanderte das Protein bei einer Mobilitätseigenschaft eines Proteins von 40 kD.
BEISPIEL 7: SLAM-Expression auf humanem PBMC
Die SLAM-Expression auf humanem PBMC induziert, indem man die Zellen für verschiedene Zeitspannen mit Anti-CD3-Antikörpern in Kontakt bringt. Die Lymphozyten des peripheren Bluts wurden mit Anti-CD3-Antikörpern (1 μg/ml) für 0, 1, 2, 4, 8 oder 24 Stunden inkubiert. Die RNA wurde extrahiert und einer Northern-Analyse unterzogen, wobei nacheinander eine SLAM-Sonde und eine Aktin-Sonde verwendet wurde. Für die PCR-Analyse wurden geeignete Primer für SLAM und für HPRT ausgewählt. 5 ng der cDNA-Primer wurden 30 Zyklen einer PCR unterzogen. Das Aktinsignal dient als ein Normalisierungsfaktor.
Eine Spezies von 4 kB ist an den Zeitpunkten nach 2 und 4 Stunden sichtbar, und ist im geringeren Maße an den Zeitpunkten nach 0, 1, 8 und 24 Stunden nachweisbar. Eine Spezies von 2 kB ist im geringeren Maße an den Zeitpunkten nach 0 und 1 Stunde nachweisbar, ist am Zeitpunkt nach 2 Stunden stark nachweisbar, und nimmt am Zeitpunkt nach 4 Stunden ab und stabilisiert sich nach 8 und 24 Stunden.
BEISPIEL 8: Oberflächenexpression von SLAM auf mononukleären Zellen und fötalen Thymozyten
Für die FACS-Analyse wurden mononukleäre Zellen aus peripherem Blut von einem gesunden Donor für 6 Stunden mit oder ohne TPA und dem A23187 Ca² ⁺-Ionophor inkubiert und mit Anti-CD3-Cychrom-konjugiertem (Pharmingen), PE-konjugiertem A12 mAb und mit FITC-markiertem CD45R0 (Pharmingen) gefärbt. Darüber hinaus wurden fötale Thymozyten für 30 Minuten mit PE-konjugiertem A12 und FITC-konjugiertem Anti-CD3 (Becton Dickinson) gefärbt und mit einem FACScan (Becton Dickinson) analysiert.
Nicht-stimulierte T-Zellen des peripheren Bluts und aktivierte T-Zellen (CD3⁺ Zellen) wurden mit mAbs gegen CD450 und A12 gefärbt. In ähnlicher Weise wurden fötale Thymozyten mit Anti-CD3 und A12 gefärbt.
Die nicht-stimulierten T-Zellen wiesen zwei signifikante Unterpopulationen auf: eine mit wenig oder keinem SLAM und keinem CD45R0 – diese umfasste etwa 49% der Zellen; und eine mit wenig SLAM und viel CD45R0 – diese Unterpopulation umfasste etwa 51% der Zellen. Das CD45R0 ist ein Marker für Memory-T-Zellen, und das SLAM scheint positiv mit seiner Expression zu korrelieren. Naiven T-Zellen, die CD45R0^– sind, fehlt SLAM ebenfalls. Das SLAM scheint ein nützlicher Marker für einen Memory-T-Zell-Phänotyp zu sein.
Die aktivierten T-Zellen hatten zwei Hauptunterpopulationen: Beide hatten viel SLAM, allerdings hatte eine wenig CD45R0 – diese machte etwa 46% der Zellen aus, und die zweite hatte viel CD45R0. Eine kleinere Unterpopulation, etwa 4% der Zellen, exprimierte weder CD45R0 noch SLAM.
Fötale Thymozyten hatten ein Muster, das ein Fortschreiten der Entwicklung nahezulegen scheint. Es gibt eine kleinere Unterpopulation von Zellen, etwa 2%, die weder SLAM noch CD3 aufweisen. Etwa 13% der Zellen, wahrscheinlich Zellen in früher Entwicklung, haben wenig CD3 und viel SLAM. Etwa 80% der Zellen, wahrscheinlich in einer mittleren Phase der Entwicklung, exprimieren sowohl CD3 als auch SLAM. Eine kleine Unterpopulation, etwa 5% der Zellen, sind reife Thymozyten, die wenig SLAM aber viel CD3 aufweisen. Dies spiegelt wahrscheinlich ein Fortschreiten der SLAM-Expression bei der Thymozytenreifung wieder. In den frühesten Reifungsphasen wird SLAM stark exprimiert, verschwindet jedoch schließlich.
BEISPIEL 9: Zelluläre Expression von humanem SLAM
RNA aus verschiedenen Zellen und Geweben wurde einer reversen Transkription und einer PCR unter Verwendung von SLAM-spezifischen Primern unterzogen. Siehe Tabelle 2 für die Gewebeverteilung von humanem SLAM.
BEISPIEL 10: Zelluläre Expression von Maus-SLAM1
Eine Sonde, die spezifisch für DNA ist, die einen Teil der extrazellulären Domäne von Maus-SLAM1 kodiert, wurde verwendet, um die Gewebeverteilung des Antigens zu bestimmen. Eine Sonden-DNA von 600 bp für murines SLAM wurde durch einen XhoI/PstI-begrenzten Verdau des Plasmids pMSLAM1 (das die Maus-SLAM-cDNA enthält) hergestellt und nach Gelelektrophorese unter Verwendung eines Promega (Madison, WI) DNA-Aufreinigungssystems aufgereinigt. Alle Sonden wurden durch zufälliges Priming markiert. Der multiple Gewebe-Northern-Blot wurde von Clontech bezogen und unter Verwendung von Quick Hyb (Stratagene, La Jolla, CA) untersucht.
Die Ergebnisse zeigten, dass SLAM in der Milz sehr viel stärker exprimiert wurde als in Herz, Gehirn, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere oder Hoden. Die Hoden schienen eine stärkere Expression aufzuweisen als die anderen Gewebe, allerdings nicht so stark wie im Thymus. Obwohl der Thymus keines der Gewebe auf dem Northern-Blot war, muss SLAM dort exprimiert werden. Die Maus-SLAM-cDNA wurde aus αβ, CD4 , CD8 Thymozyten kloniert, und darüber hinaus band ein monoklonaler Antikörper, der Maus-SLAM erkennt, spezifisch an 90% der frisch isolierten Thymozyten. Die Häufigkeit der SLAM-Klone in der Thymozyten-Bibliothek war etwa 1 von 5000.
BEISPIEL 11: Spezies-Verteilung von SLAM-Homologen
Es wurde DNA aus verschiedenen Spezies erhalten, mit EcoRI verdaut, einer Elektrophorese unterzogen, geblottet und transferiert und anschließend mit einer ³²2-markierten humanen SLAM-Sonde, welche die Nukleotide 291–901 umfasste, bei 68°C hybridisiert. Der Blot wurde zweimal in 0,2 × SSC bei 60°C gewaschen. Die Southern-Analyse der genomischen DNA aus verschiedenen Spezies ergab, dass das SLAM-Gen in Säugetieren, z. B. Mensch, Affe, Maus, Hund, Kuh, Kaninchen, gut konserviert war, allerdings in Hühnern oder Hefe nicht nachgewiesen wurde. Es wurde ebenfalls nicht in der Ratte nachgewiesen, wobei jedoch keine Positivkontrolle bereitgestellt wurde.
BEISPIEL 12:
Steigerung der Antigen-induzierten Zytokinproduktion durch T-Zellklone, die mit dem Anti-SLAM-Antikörper A1 co-stimuliert wurden.

Die bezeichneten T-Zellklone, einschließlich der CD4⁺ T-Zellklone MoT72 (Th2) und MoT81 (Th0), die spezifisch für Tetanus-Toxoid sind, wurden unter ähnlichen Bedingungen wie für die proliferativen Assays kultiviert, mit den folgenden Abweichungen: die Kulturen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen durchgeführt, wobei 10⁶ T-Zellen mit 10⁶ bestrahlten autologen EBV-transformierten T-Zellen, Antigen und mAbs in 1 ml Yssel-Medium kultiviert wurden, wie es für die proliferativen Assays beschrieben ist. Die Überstände wurden 24 Stunden später geerntet, und der Zytokingehalt wurde durch einen ELISA bestimmt, wie er von Chretien, et al. (1989) J. Immunol. Methods 117: 67–81; oder von Favre, et al. (1989) Mol. Immunol. 26: 17–25 beschrieben wurde. Die CD4⁺ T-Zellklone MoT72 (Th2) und MoT81 (Th0) sind spezifisch für Tetanus-Toxoid, und sie wurden wie beschrieben kultiviert. Siehe Tabelle 3. Die mAbs, die in dieser Studie und in den funktionellen Studien zur Co-Stimulation verwendet wurden, wurden aus Aszites durch Caprylsäurefraktionierung aufgereinigt, siehe McKinney und Parkinson (1987) J. Immunol. Methods 96: 271–278, gefolgt von einer Ammoniumsulfatpräzipitation. F(Ab')₂ wurden nach Standardverfahren durch Verdau der mAbs mit Pepsin hergestellt. Die verwendeten Kontroll-mAbs waren IgG1 aus MOPC-21 und IgG1-Kontroll-mAb (Pharmingen). Tabelle 3: Zytokinproduktion, IFN-γ oder IL-4. IFN-γ

Th Typ/Zelllinie	kein Antikörper	Kontroll-Ab	A12 Ab
Th2/NP12	962	902	8303
Th2/NP44	1073	1319	7660
Th2/MoT72	496	170	8585
Th0/ChT38	5207	7463	20569
Th0/MoT81	5423	6596	18176
Th1/HY06	5982	5904	21946
Th1/TA20	8374	8070	15414

IL-4

Th Typ/Zelllinie	kein Antikörper	Kontroll-Ab	A12 Ab
Th2/NP12	6636	6486	11104
Th2/NP44	11617	11738	10373
Th2/MoT72	8805	8542	16548
Th0/ChT38	12907	10102	15039
Th0/MoT81	8455	8451	11070
Th1/HY06	48	40	90
Th1/TA20	62	69	97

BEISPIEL 13: Co-stimulatorische Aktivität für T-Zellaktivierung
Mononukleäre Zellen aus peripherem Blut (10⁵/Vertiefung) aus kürzlich aufgefrischten Spendern wurden mit 1 μg/ml des Tetanus-Toxoid oder mit aufgereinigtem Proteinderivat (PPD) in Platten mit 96 Vertiefungen und flachem Boden in 200 μl Yssel-Medium in dreifach parallelen Vertiefungen stimuliert. Die Kulturen wurden 5 Tage später geerntet. 1 μCi ³H-Tdr wurde während der letzten 16 Stunden der Kultur zu jeder Vertiefungen zugegeben, und die Proliferation wurde durch ³H-Tdr-Aufnahme unter Verwendung eines β-Zählers gemessen.
Die folgenden CD4⁺ T-Zellklone wurden verwendet: Th0: B21 (Bacchetta, et al. (1990) J. Immunol. 144: 902–908); MoT72, spezifisch für Tetanus-Toxoidfragment 947–960, und ChT38, spezifisch für Tetanus-Toxoidfragment 16–35 (hergestellt gemäß Carballido, et al. (1993) J. Immunol. 150: 3582–3591. Th1: HY-06 (Haanen, et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 583–592), spezifisch für Hitzeschockprotein; TA20 und TA23, spezifisch für aufgereinigtes Proteinderivat (PPD). Th2: NP12 und NP44 (Th2), spezifisch für Der-p1 (Yssel, et al. (1992) J. Immunol. 148: 738–745). Alle T-Zellklone wurden 5–7 Tage nach der Restimulierung mit PHA und bestrahlten PBMC als Futterzellen geerntet und wie angegeben in Yssel-Medium (5 × 10⁴/Vertiefung) in Anwesenheit oder Abwesenheit des spezifischen Antigens (1 μg/ml) oder von Tetanuspeptiden (100 ng/ml) und 2,5 × 10⁵ autologen bestrahlten (5000 Rad) EBV-transformierten B-Zellen und mAbs kultiviert. Die Proliferation wurde 3 Tage später gemessen.
Direkte Induktion der T-Zellklonproliferation durch den Anti-SLAM mAb A12: Die T-Zellklone B21 und ChT38 wurden in Yssel-Medium in Anwesenheit oder Abwesenheit von mAbs und deren F(Ab')₂ kultiviert. Die Proliferation wurde 3 Tage später gemessen. Eine Dosis-abhängige Proliferation der zwei Zelllinien wurde beobachtet.
Die Antigen-spezifische T-Zellproliferation der Lymphozyten des peripheren Bluts wird durch den Anti-SLAM-Antikörper A12 verstärkt: Fab-Fragmente von A12 induzierten eine Dosisabhängige Proliferation. PBMC aus immunisierten Donoren wurden mit Tetanus-Toxoid oder mit aufgereinigtem Proteinderivat, mit oder ohne mAb-Fragmente, stimuliert.
Co-Stimulierung der Antigen-induzierten T-Zellklonproliferation durch den A12-Antikörper: T-Zellklone NP12, AR142, ChT38 oder Hy06 wurden mit ihrem spezifischen Antigen mit oder ohne mAbs stimuliert. Alle Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit einer Interpretation, wonach entweder A12 oder Fab-Fragmente die Proliferation in einer Dosis-abhängigen Weise induzieren können.
Co-Stimulierung der Anti-CD3-induzierten T-Zellklonproliferation durch A12-Antikörper: Die T-Zellklone B21 oder TA20 wurden mit Anti-CD3-mAb in Anwesenheit oder in Abwesenheit von A12 mAb oder Kontroll-IgG1-mAb stimuliert. In jedem Fall trat eine Dosis-abhängige Proliferation mit dem A12 auf, allerdings nicht mit den Kontroll-Antikörpern. Die Proliferation war ferner von der Anti-CD3-Menge abhängig.
BEISPIEL 14: Herstellung einer SLAM-Ig-Fusion
Um einen potentiellen Liganden für das T-Zell-costimulatorische Molekül SLAM zu identifizieren, wurde ein rekombinantes Protein (SLAM-Ig) hergestellt, das die gesamte extrazelluläre Domäne von SLAM fusioniert an den Fc-Teil eines humanen IgG umfasste. SLAM-Ig wurde durch Fusionieren von DNA, die für SLAM kodiert, an DNA, die für den Fc-Teil von IgG kodiert, hergestellt. DNA, die für die extrazelluläre Domäne des SLAM kodiert, wurde durch PCR unter Verwendung des Plasmids pSURslam1 als Vorlage und geeigneten Primern erzeugt. Nach dem Verdau mit XhoI wurde das Fragment an cDNA fusioniert, die für den Fc-Teil der schweren Kette von IgG1 kodiert. Der SLAM-Ig-Expressionsvektor wurde in COS-Zellen transfiziert, und SLAM-Ig wurde aus den Überständen unter Verwendung von Protein G-Sepharose (Sigma) affinitätsgereinigt.
BEISPIEL 15: SLAM-Ig bindet an SLAM, das auf der Zelloberfläche exprimiert wird
Rekombinantes SLAM-Ig war bei der Neutralisierung des SLAM-spezifischen monoklonalen Antikörpers A12 wirksam, was darauf verweist, dass SLAM-Ig eine native Konformation ähnlich zum Transmembran-SLAM beibehalten hat. Fluorescein-konjugiertes SLAM-Ig wurde für die fluorozytometrische Analyse verschiedener Zelltypen verwendet und band nicht an viele der getesteten Zelltypen. SLAM-Ig bindet jedoch an Zelltypen, von denen gezeigt wurde, dass sie SLAM exprimieren.
BEISPIEL 16: Intramolekulare Interaktion von SLAM-Ig
Die T-Zellklone B21 (Bacchetta, et al. (1990) J. Immunol. 144: 902–908) und HY06 (Haanen, et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 583–592) sind beschrieben worden. Epitheliale Zelllinien aus dem Thymus wurden durch Kultur aus fötalem Thymus hergestellt, wie es von Galy und Spits (1991) J. Immunol. 147: 3823–3830 beschrieben wurde, und die Linien TEC, TEC, U937 wurden ebenfalls von Galy und Spits (1991) beschrieben. In RPMI geführte L-Zellen wurden stabil mit pSURslam1 transfiziert. Monozyten wurden durch negative Depletion aufgereinigt und CD32 L-Zellen wurden von Dr. K. Moore (DNAX, Palo Alto) zur Verfügung gestellt. PBMC wurden durch Zentrifugation über Ficoll (Histopaque-1077, Sigma) frisch aus peripherem Blut isoliert.
SLAM-Ig band an L-Zellen, die mit SLAM (SLAM/L-Zellen) transfiziert waren, und nicht an untransfizierte L-Zellen, was zeigt, dass SLAM in homophiler Weise interagiert. Die Bindung von SLAM-Ig an SLAM-Transfektanten ist spezifisch für den SLAM-Teil des Moleküls und nicht für den Ig-Teil, da die Färbung in Anwesenheit eines Überschusses von IgG in dem zugegeben 30%igen humanen Serum durchgeführt wurde. Des Weiteren wurden SLAM-Transfektanten nicht von anderen Fc-enthaltenen Molekülen, wie beispielsweise CD40-Ig, gefärbt. Die Bindung von SLAM-Ig war etwa 5-fach niedriger als die Bindung an SLAM/L-Zellen, die unter Verwendung einer äquivalenten Konzentration des mAb A12 beobachtet wurde. Die Interaktion von SLAM-Ig mit Zelloberflächen-SLAM konnte spezifisch durch einen Überschuss eines monoklonalen Antikörpers gegen SLAM inhibiert werden. Die SLAM-Ig-Bindung an transfizierte Zellen wurde durch EDTA nicht inhibiert.
Der Anti-SLAM-mAb A12 ist beschrieben worden. Phycoerythrinkonjugiertes CD45R0 und CD3 mAbs wurden von Becton-Dickinson bezogen. Zellen, die mit mAbs, SLAM-Ig oder CD40-Ig gefärbt wurden, wurden dreimal mit PBS, 2% FCS gewaschen und unter Verwendung eines FACScan (Becton-Dickinson) analysiert.
Fluorescein-konjugiertes SLAM-Ig wurde für die fluorozytometrische Analyse verschiedener Zelltypen verwendet, und es band nicht an viele der getesteten Zelltypen, einschließlich Monozyten oder epitheliale Zelllinien aus dem Thymus. SLAM-Ig band jedoch an EBV-transformierte B-Zelllinien und an CD4⁺ T-Zellklone, wobei für beide Zelltypen gezeigt wurde, dass sie SLAM exprimieren. In keinem der getesteten Zelltypen band SLAM-Ig an Zellen, die kein SLAM exprimierten. Darüber hinaus veränderte sich das Ausmaß der SLAM-Ig-Bindung gemeinsam mit der SLAM-Expression auf CD45R0⁺ T-Zellen nach Aktivierung mit Anti-CD3. Das Ausmaß der SLAM-Ig-Färbung relativ zur A12-Färbung auf verschiedenen Zelltypen stimmte mit demjenigen überein, das auf L-Zell-Transfektanten beobachtet wurde, und das 5-fach niedriger sowie unabhängig von Ca²⁺ war.
BEISPIEL 17: Intermolekulare Interaktion von SLAM-Ig
Es wurde eine Gelelektrophorese unter Verwendung von Gelen durchgeführt, die von Integrated Separation Systems bezogen wurden, und einer BioRad-Multigel-Apparatur. Die SDS-Elektrophorese wurde unter den beschriebenen Bedingungen unter Verwendung eines 10%igen Gels durchgeführt, und die native Gelelektrophese wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung eines 2–25%igen Gradientengels durchgeführt. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau gefärbt. Molekulargewichtsstandards wurden von Sigma bezogen.
Da eine lösliche Form von SLAM (SLAM-Ig) mit Zelloberflächen-SLAM interagieren kann, wurde getestet, ob SLAM-Ig in homophiler Weise in Lösung interagieren würde (z. B. durch Selbsterkennung). Aufgereinigtes SLAM-Ig wandert an eine Position, die mit seiner Größe unter SDS-Gelelektrophoresebedingungen ist und bildet unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen eine einzelne Bande. SLAM-Ig läuft jedoch als ungewöhnlich großes Molekül bei nativer Gelelektrophorese, was auf eine Aggregation der SLAM-Ig-Moleküle in Lösung verweist. CD40-Ig und andere Proteine bilden scharfe Banden gemäß ihrer Größe, wohingegen unter denselben Bedingungen SLAM-Ig einen Schmier bildet, der bei seiner vorhergesagten Größe von 160000 ohne Aggregation beginnt and bis zu mehr als 500000 reicht. Innerhalb dieses Bereiches von Molekulargewichten gibt es zwei stärker vorherrschende Banden, eine bei 160000 und die andere bei 300000, was einem bzw. zwei Molekülen des SLAM-Ig entspricht. Die Gelfiltration von SLAM-Ig bestätigte die Existenz von SLAM-Ig-Aggregaten. Unter diesen Bedingungen war auch ein Peak in dem Material mit höherem Molekulargewicht auffallend, der einem dimeren SLAM entspricht, obwohl die monomere Form vorherrschender war.
BEISPIEL 18: Eine homophile Interaktion von SLAM führt zur T-Zellaktivierung
Es wurde ferner gezeigt, dass SLAM, das auf aktivierten T-Zellen exprimiert wird, ein signifikant co-stimulatorisches Molekül ist. Die Bindung von SLAM durch mAb A12 führt zu einer Steigerung der T-Zellproliferation und Zytokinproduktion. Der natürliche Ligand für SLAM sollte also ein solches ein costimulatorisches Signal bereitstellen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der natürliche Ligand für SLAM SLAM selbst ist. Daher wurde die Fähigkeit von Oberflächen-SLAM getestet, stimulatorische Signale für T-Zellen bereitzustellen. Bei subopti malen Dosen von Anti-CD3, stellten L-Zellen, die SLAM exprimieren, für T-Zellen ein direktes co-stimulatorisches Signal zur Proliferation bereit, wohingegen untransfizierte L-Zellen unwirksam waren. SLAM/L-Zellen waren ebenfalls in der Lage, die T-Zellproliferation in Abwesenheit von Anti-CD3 oder anderen stimulatorischen Signalen direkt zu unterstützen. Diese Fähigkeit, T-Zellen in Abwesenheit anderer Stimuli direkt zu stimulieren, unterscheidet SLAM von anderen co-stimulatorischen Molekülen, einschließlich LFA-3 (Bierer und Hahn (1993) Semin. Immunol. 5: 249–261), B7 (Jenkins und Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol. 5: 361–367), und B70 (Azuma, et al. (1993) Nature 366: 76–79), von denen jedes zusätzliche Signale erfordert, um die T-Zellproliferation zu induzieren.
Da SLAM-SLAM-Interaktionen zwischen L-Zellen und T-Zellen eine klare funktionelle Wirkung haben, war es nicht überraschend, dass L-Zellen, die mit SLAM transfiziert waren, von nicht-transfizierten L-Zellen durch mindestens drei Kriterien unterschieden werden konnten. Erstens sind SLAM⁺ L-Zellen resistent gegenüber einer Ablösung mit EDTA, die über 30 Minuten bei 37°C erfordert, verglichen mit normalen L-Zellen und anderen L-Zell-Transfektanten, die innerhalb von 5 Minuten freigesetzt werden. Zweitens sind die SLAM-Transfektanten strikt kontaktinhibiert, wohingegen nicht-transfizierte L-Zellen nach Erreichen einer Konfluenz zu einem gewissen Grad weiter proliferieren, obwohl Sie kontaktinhibiert sind. Drittens haben SLAM-Transfektanten eine mehr längliche Morphologie, die in konfluenten Monolager-Kulturen, in denen die Zellen verflochten sind, offensichtlich wird, im Gegensatz zu normalen L-Zellen, die eine mehr pflastersteinartige Erscheinung haben. Abgelöste SLAM/L-Zellen scheinen in Suspension nicht mehr problemlos anzuhaften.
BEISPIEL 19: Die durch SLAM-SLAM-Interaktion induzierte T-Zellproliferation ist resistent gegenüber Cyclosporin
Die über TCR vermittelte T-Zellaktivierung wird durch Cyclosporin inhibiert. Um zu testen, ob die SLAM-vermittelte T-Zellaktivierung gegenüber Cyclosporin empfindlich ist, wurde der T-Zellklon B21 direkt mit SLAM/L-Zellen in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von Cyclosporin aktiviert. SLAM/L-Zellen waren selbst in Anwesenheit von 1 μg Cyclosporin in der Lage, die T-Zellproliferation direkt zu unterstützen. Interessanterweise förderte Cyclosporin sogar die T-Zellproliferation, die durch homophile Interaktion von SLAM bei Konzentrationen von mehr als 100 ng/ml induziert wurde. Bei 2 μg/ml, verstärkte Cyclosporin die T-Zellproliferation, die durch SLAM/L-Zellen induziert wurde, um das Zweifache.
BEISPIEL 20: Chromosomale Lokalisierung
Die Sonde (pSURslam1) wurde mit Biotin-14-dATP "Nicktranslatiert" und in situ bei einer Endkonzentration von 5 ng/μl mit Metaphasen von zwei normalen Männern hybridisiert. Das Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungsverfahren (FISH) wurde ausgehend von dem Verfahren, das von Callen, et al. (1990). Ann. Genet. 33: 219–221 beschrieben wurde, modifiziert, indem die Chromosomen vor der Analyse sowohl mit Propidiumiodid (als Gegenfärbung) und mit DAPI (für die Chromosomidentifizierung) gefärbt wurden. Bilder von Präparationen wurden von einer CCDq-Kamera aufgenommen und über einen Computer verstärkt.
Zwanzig Metaphasen aus dem ersten normalen Mann wurden auf Fluoreszenzsignale untersucht. 19 dieser Metaphasen zeigten ein Signal auf einem oder auf beiden Chromatiden von Chromosom 1 in der Region 1q21.2-1q23; 34% dieses Signals befand sich bei 1q21.3 und 59% befand sich bei 1q22. Dies zeigte ei ne wahrscheinliche Lokalisierung in der Nähe der Grenze zwischen diesen beiden Banden. Es gab insgesamt vier nichtspezifische Hintergrundpunkte, die in diesen 20 Metaphasen beobachtet wurden. Ein ähnliches Ergebnis wurde für die Hybridisierung der Sonde an 20 Metaphasen von dem zweiten normalen Mann erhalten.
Das Gen kartiert in derselben Region wie ein Gen, das mit einer Anfälligkeit für systemischen Lupus erythematodes im Zusammenhang steht. Die zwei Gene könnten dieselben sein, z. B. könnten SLAM-Reagenzien entweder als ein direktes Therapeutikum für die Erkrankung nützlich sein, oder das Gen könnte ein nützlicher genetischer Marker für die Kartierung eines solchen Gens sein.
BEISPIEL 21: Kd der SLAM-SLAM-Interaktion
Die Gleichgewichtskonstante für SLAM/SLAM-Interaktionen wurde durch Oberflächenplasmonresonanz unter Verwendung eines BIAcore^TM-Geräts (Pharmacia) analysiert. Ein Anti-SLAM Ab 7D4 wurde verwendet.
Die Bindungskinetik und die Affinität von Ab 7D4/SLAM-Ig und SLAM-Ig/SLAM-Ig wurden gemessen. Etwa 8000 Resonanzeinheiten (RU) von SLAM-Ig wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers (BIAcore^TM-Anleitung, Pharmacia Biosensor) über seine Lysine kovalent an die Dextranmatrix in dem Sensorchip angeheftet. Puffer (Phosphat-gepufferte Saline, PBS, pH 7,0) wurde, durch die Flusszelle geleitet, bis das gesamte dissoziierbare Protein entfernt war und die Grundlinie stabil blieb. Lösungen, die verschiedene Konzentrationen des Antikörpers 7D4 in PBS (von 10 nM bis 500 nM) enthielten, wurden anschließend durch die Flusszelle geleitet. Eine Steigerung der Masse des gebundenen Proteins wurde beobachtet, gefolgt von einer Verringerung, sobald die Proteinlösung durch Puffer ersetzt wurde. Ein nicht lineares Datenanalyseprotokoll, O'Shannessy, et al. (1993) Anal. Biochem. 212: 457–468 wurde verwendet, um die Daten zu analysieren, um die Konstanten für die Assoziationsrate (k_a) und die Dissoziationsrate (k_d) zu bestimmen. Siehe Tabelle 4.
Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante Kd wurde anschließend aus dem Verhältnis k_d/k_a berechnet.
Die Bindungskinetik von SLAM-Ig-SLAM-Ig wurde auf ähnliche Weise gemessen. Nach der Immobilisierung von SLAM-Ig auf dem Chip wurden Lösungen von SLAM-Ig mit Konzentrationen, die von 100 nM bis 1500 nM reichten, mit einer Flussrate von 5 μl/min durch die Flusszelle geleitet. Aus den Assoziations- und Dissoziationsphasen wurden die entsprechenden Ratenkonstanten und somit die Gleichgewichtbindungskonstante erhalten.

Sowohl die Rate k_on als auch die Rate k_off sind langsamer als bei anderen Zell-Zell-Adhäsionsinteraktionen. Die Kd ist etwa 10–100-mal höher als bei anderen Zell-Zell-Adhäsionsinteraktionen, z. B. bei Interaktionen von CD2 mit CD48 (etwa 60–80 μM).

Tabelle 4: Konstanten für die Assoziationsrate und die Dissoziationsrate¹ und die apparente Gleichgewichtskonstante K_d für SLAM/SLAM- und SLAM/Ab 7D4-Interaktionen
Immobilisiert Oberfläche	Ligand	k_on (× 10⁴ M^–1s^–1)	k_off (s^–1)	K_d
SLAM-Ig	Ab 7D4	1,32	5,5 × 10^–5	4,2 nM
SLAM-Ig	SLAM-Ig	1,2	0,011	0,92 nM

¹ Die Standardfehler bei den Parametern wurde wie folgt geschätzt: k_on, 20%; k_off, 10%; K_d, 24%.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gereinigtes oder rekombinantes Protein, das a) die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 umfasst.
Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein ein posttranslationales Modifikationsmuster aufweist, das sich von dem eines natürlich vorkommenden Proteins, welches die in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, unterscheidet, und wobei das Protein ein Co-Stimulator einer T-Zelle ist.
Gereinigtes oder rekombinantes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens zu 90% identisch mit einer Aminosäuresequenz ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 und 12, wobei das Protein ein Co-Stimulator einer T-Zelle ist.
Fusionsprotein, das ein Protein nach Anspruch 1 umfasst.
Zusammensetzung, die ein Protein nach Anspruch 1 sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Antikörper, der spezifisch ein Protein nach Anspruch 1 bindet.
Antikörper nach Anspruch 6, wobei a) der Antikörper gegen ein gereinigtes Peptid erzeugt ist, das aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 besteht; b) der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist; oder c) der Antikörper markiert ist.
Verfahren zur Reinigung eines Proteins, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 umfasst, von anderen Materialien in einer Mischung, bei dem man die Mischung mit einem Antikörper nach Anspruch 6 in Kontakt bringt und das gebundene Protein von den anderen Materialien abtrennt.
Isolierte oder rekombinante Nukleinsäure, die für ein Protein nach Anspruch 1 kodiert.
Nukleinsäure, welche die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 umfasst.
Expressionsvektor oder Replikationsvektor, der eine Nukleinsäure nach Anspruch 9 umfasst.
Kit, umfassend: a) ein gereinigtes Protein nach Anspruch 1; b) einen Antikörper, der spezifisch ein Protein bindet, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 umfasst; oder c) eine Nukleinsäure, die für ein Protein kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 umfasst.
Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins einer Nukleinsäure, eines Proteins oder eines Antikörpers in einer Probe, bei dem man die Probe mit einem Kit nach Anspruch 12 untersucht.
In vitro-Verfahren zum Modulieren der Physiologie einer T-Zelle, bei dem man die Zelle mit a) einem gereinigten Protein nach Anspruch 1; b) einem Antikörper, der spezifisch ein Protein bindet, welches eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 und 12 umfasst; oder c) einer Nukleinsäure, die für ein Protein kodiert, welches eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 und 12 umfasst; in Kontakt bringt.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Zelle eine T-Zelle ist und das Modulieren der Physiologie die Aktivierung der T-Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Zelle in einem Gewebe vorliegt.
Gereinigtes Protein nach Anspruch 1 oder ein Antikörper, der spezifisch ein Protein bindet, welches eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 und 12 umfasst, oder eine Nukleinsäure, die für ein Protein kodiert, welches eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 und 12 umfasst, zur Verwendung als Medikament.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das die Expression einer Nukleinsäure nach Anspruch 9 umfasst.
Isolierte Zelle, die einen Vektor nach Anspruch 11 umfasst.
Rekombinante Nukleinsäure, die: a) eine Nukleinsäuresequenz mit mindestens 85% Identität zu einer Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, 5, 7, 9 oder 11 umfasst; oder b) eine Nukleinsäuresequenz mit mindestens 70% Identität zu einer Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 umfasst, wobei die Nukleinsäuresequenz in funktionsfähiger Weise mit einem Promotor verbunden ist; wobei die Nukleinsäure für ein Protein kodiert, das ein Co-Stimulator einer T-Zelle ist; oder c) für ein Polypeptid kodiert, das mindestens 60% Identität zu einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 umfasst, wobei das Protein ein Co-Stimulator einer T-Zelle ist.
Verwendung eines antagonistischen Antikörpers, der spezifisch ein Protein bindet, welches eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 und 12 umfasst, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines medizinischen Zustands ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Autoimmunerkrankung, rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus erythematodes, Hashimoto-Autoimmunthyreoiditis, akuter Entzündung und chronischer Entzündung.
Verwendung eines Proteins nach Anspruch 1 oder von Anti-SLAM F(ab')₂ oder eines Antikörpers, der von einer Hybridomzelllinie mit der ATCC-Zugangsnummer HB11760 erzeugt wird, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines medizinischen Zustands, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HIV-Infektion, Herpesvirusinfektion, Zytomegalievirusinfektion, Nahrungsmittelallergie, Medikamentenallergie, Rhinitis, atopischer Dermatitis, Asthma, Hyper-IgE-Syndrom, Hypereosinophilie, Infektionserkrankung, lepromatöser Leprainfektion, Leishmaniose, Chagas-Erkrankung, Schistosomiase, Glomerulonephritis und juveniler Arthritis.
Antagonistischer Antikörper, der spezifisch ein Protein bindet, welches eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 und 12 umfasst, für die Verwendung zur Behandlung eines medizinischen Zustands ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Autoimmunerkrankung, rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus erythematodes, Hashimoto-Autoimmunthyreoiditis, akuter Entzündung und chronischer Entzündung.
Antikörper nach Anspruch 23, wobei der medizinische Zustand rheumatoide Arthritis ist.
Isolierter monoklonaler Antikörper, der spezifisch ein Protein bindet, welches eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 und 12 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen isolierten monoklonalen Antikörper umfasst, welcher spezifisch ein Protein bindet, das eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 und 12 umfasst, sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Isolierter monoklonaler Antikörper, der spezifisch ein Protein bindet, welches aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 und 12 besteht.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen isolierten monoklonalen Antikörper umfasst, welcher spezifisch ein Protein bindet, das eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 und 12 umfasst, sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Isolierter monoklonaler Antikörper nach Anspruch 27, der spezifisch ein Protein bindet, welches aus einer Aminosäuresequenz besteht, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist.
Isolierter monoklonaler Antikörper nach Anspruch 27, der spezifisch ein Protein bindet, welches aus einer Aminosäuresequenz besteht, die in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist.
Isolierter monoklonaler Antikörper nach Anspruch 27, der spezifisch ein Protein bindet, welches aus einer Aminosäuresequenz besteht, die in SEQ ID NO: 6 gezeigt ist.
Isolierter monoklonaler Antikörper nach Anspruch 27, der spezifisch ein Protein bindet, welches aus einer Aminosäuresequenz besteht, die in SEQ ID NO: 8 gezeigt ist.
Isolierter monoklonaler Antikörper nach Anspruch 27, der spezifisch ein Protein bindet, welches aus einer Aminosäuresequenz besteht, die in SEQ ID NO: 10 gezeigt ist.
Isolierter monoklonaler Antikörper nach Anspruch 27, der spezifisch ein Protein bindet, welches aus einer Aminosäuresequenz besteht, die in SEQ ID NO: 12 gezeigt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die den Antikörper nach Anspruch 29 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die den Antikörper nach Anspruch 30 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die den Antikörper nach Anspruch 31 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die den Antikörper nach Anspruch 32 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die den Antikörper nach Anspruch 33 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die den Antikörper nach Anspruch 34 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 8 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 12 umfasst.
Antikörper nach Anspruch 6, der von einer Hybridomzelllinie erzeugt wird, welche die ATCC-Zugangsnummer HB11760 aufweist.
Hybridomzelllinie, die einen Antikörper nach Anspruch 25 oder 27 erzeugt.
Hybridomzelllinie nach Anspruch 48, welche die ATCC-Zugangsnummer HB11760 aufweist.