DE60038304T2

DE60038304T2 - Interleukin-12 p40 und interleukin-b30. kombinationen davon. antikörper. verwendungen in pharmazeutische zusammensetzungen

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Publication number: DE60038304T2
Application number: DE60038304T
Authority: DE
Inventors: Birgit Oppmann; Rene Sunnyvale DE WAAL MALEFYT; Donna M. Los Altos RENNICK; Robert A. Redwood City KASTELEIN; Maria T. Wayne WIEKOWSKI; Sergio A. Chatham LIRA; Satwant K. West Caldwell NARULA
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 1999-09-09
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2009-03-19
Anticipated expiration: 2020-09-09
Also published as: IL148300A0; KR20020034185A; HK1044170A1; EP1210434B2; DE60038304D1; JP4969610B2; CN100529076C; MXPA02002684A; HU230679B1; DE60038304T3; AU2008240348B2; WO2001018051A2; JP2015051005A; EP1210434A2; JP2007045830A; HUP0301102A2; HK1044170B; HUP0301102A3; AR035560A1; JP2013128489A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren, die Proteine betreffen, welche in der Kontrolle der Biologie und Physiologie von Säugetierzellen aktiv sind, z. B. Zellen eines Säugerimmunsystems. Insbesondere werden gereinigte Gene, Proteine, Antikörper, verwandte Reagenzien und Verfahren zur Verfügung gestellt, die dazu verwendet werden können, z. B. die Aktivierung, Entwicklung, Differenzierung und Funktion verschiedener Zelltypen, darunter hämatopoetischer Zellen zu regulieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Verfahren rekombinanter DNA Technologie sind allgemein Verfahren zur Integration genetischer Informationen von einer Quelle zur nachfolgenden Prozessierung in einen Vektor, wie zur Einführung in einen Wirt, wodurch die übertragene genetische Information kopiert und/oder in der neuen Umgebung exprimiert wird. Im Allgemeinen besteht die genetische Information in Form einer komplementären DNA (cDNA), die von einer messenger RNA (mRNA) abgeleitet wurde, welche für ein gewünschtes Protein kodiert. Der Träger ist häufig ein Plasmid, welches die Kapazität hat, cDNA für spätere Replikation in einem Wirt aufzunehmen und in einigen Fällen tatsächlich die Expression der cDNA zu kontrollieren und somit die Synthese des kodierten Produkts in dem Wirt zu veranlassen.
Es ist bereits seit einiger Zeit bekannt, daß Säugetier Immun reaktionen auf einer Reihe komplexer Zellulärer Interaktionen beruhen, die als das „immune network" bezeichnet werden. Siehe z. B. Paul, (1998) Fundamental Immunology (4^th edition) Raven Press, NY. Neuere Forschungsergebnisse ermöglichten neue Einsichten in die inneren Zusammenhänge dieses Netzwerks. Obwohl dabei klar wird, daß ein wesentlicher Anteil der Reaktion tat sächlich durch Netzwerk-ähnliche Interaktionen von Lymphozyten, Makrophagen, Granulozyten und anderen Zellen erzeugt wird, sind Immunologen jetzt allgemein der Auffassung, daß lösliche Proteine, die als Lymphokine, Zytokine oder Monokine bekannt sind, eine kritische Rolle bei der Kontrolle dieser Zellulären Interaktionen einnehmen. Es besteht daher wesentliches Interesse an der Isolierung, Charakterisierung und der Aufklärung des Wirkungsmechanismus der zellmodulierenden Faktoren, da diese Verständnis wesentliche Fortschritte bei der Diagnose und Therapie von einer Vielzahl medizinischen Befunde führen wird, z. B. bei Störungen des Immunsystems. Einige dieser Faktoren sind hämatopoetische Wachstumsfaktoren, z. B. Granulozyten Kolonie stimulierender Faktor (G-CSF). Siehe z. B. Thomson, (herausgegeben 1998) The Cytokine Handbook (3. Auflage) Academic Press, Dan Diego; Mire-Sluis und Thorpe (herausgegeben 1998) Cytokines Academic Press, San Diego; Metcalf und Nicola, (1995) The Hematopoietic Colony Stimulating Factors Cambridge University Press; und Aggarwal und Gutterman (1991) Human Cytokines Blackwell Pub. Die Expression der Zytokine durch Zellen des Immunsystems spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Immunreaktion. Die meisten Zytokine sind pleiotrop und weisen eine Vielzahl biologischer Aktivitäten auf, darunter Antigen-Präsentation; Aktivierung; Proliferation und Differenzierung der CD4+ T Zell Teilpopulationen; Antikörperreaktionen durch B Zellen; und Manifestationen der Hypersensitivität. Die Zytokine können ferner für die Diagnose und Therapie eines breiten Bereichs von degenerativen oder nicht-normalen Zuständen verwendet werden, welche unmittelbar oder mittelbar das Immunsystem und/oder hämatopoetische Zellen treffen.
Lymphokine vermitteln offenbar zelluläre Aktivitäten in einer Vielzahl von Arten. Es konnte gezeigt werden, daß sie die Proliferation, das Wachstum und/oder die Differenzierung der pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen in eine Vielzahl von Nachfolgezellen vermitteln, was verschiedene Zelluläre Linien umfaßt, die das komplexe Immunsystem bilden. Richtige und ausgeglichene Interaktionen zwischen den Zellulären Bestandteilen sind für eine gesunde Immunreaktion notwendig. Die verschiedenen Zellinien reagieren häufig in einer verschiedenen Art, wenn Lymphokine zusammen mit anderen Agenzien verabreicht werden. Die für die Immunreaktion besonders wichtigen Zellinien umfassen zwei Klassen von Lymphozyten: B-Zellen, die Immunoglobuline erzeugen und sekretieren (Proteine mit der Fähigkeit fremde Stoffe zu erkennen und zu binden, um deren Entfernung zu bewirken), und T-Zellen verschiedener Unterpopulationen, die Lymphokine sekretieren und B-Zellen und verschiedene andere Zellen induzieren oder unterdrücken (darunter weiter T-Zellen), welche das Immunnetzwerk bilden. Diese Lymphozyten interagieren mit vielen anderen Zelltypen.
Aus dem Vorgehenden wird deutlich, daß die Entdeckung und Entwicklung neuer Lymphokine, z. B. von solchen, die mit G-CSF und/oder IL-6 verwand sind, neue Therapien für eine Vielzahl von degenerativen oder nicht-normalen Zuständen bereitstellen, die unmittelbar oder mittelbar das Immunsystem und/oder hämatopoetische Zellen betreffen. Die Entdeckung und Entwicklung von Lymphokinen, welche die vorteilhaften Aktivitäten bekannter Lymphokine steigern oder verstärken wäre insbesondere sehr vorteilhaft. Das neue Gen IL-B30 wurde auf der Grundlage der vorhergesagten Struktur zunächst als ein mögliches Zytokin identifiziert und als ein langkettiges Zytokin mit Ähnlichkeit zu IL-6 und G-CSF klassifiziert (international Patentanmeldung PCT/US98/15423 ( WO 99/05280 ). IL-6 und verwandte Zytokine, wie Oncostatin M, leukemia inhibitory factor (LIF), ciliary neurothophic factor (CNTF) und Cardiothophin-1 wirken mit ihren biologischen Aktivitäten auf Hämatopoese, Thrombopoese, Induktion der Reaktion der akuten Phase, Osteoklasten-Bildung, Neuronendifferenzierung und Überleben und Hypertrophie des Herzen. Die transgene Expression des IL-B30 in Mäusen induzierte einen ähnlichen Phänotyp, wie der, welcher nach Überexpression der IL-6 in Mäusen beobachtet worden war, was Zwergwüchsigkeit, Systemische Entzündung, Unfruchtbarkeit und Tod umfaßte. IL-B30 scheint ein neues Zytokin darzustellen, daß an Entzündungen beteiligt ist.
WO 99/05280 offenbart IL-B30.
Presky et al., (Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, vol. 93, 26 November 1996, Seiten 14002–14007) offenbart IL-12, dessen Rezeptor und Antikörper dagegen.
EP-A-0 433 827 betrifft ein Zytokin, das als Cytotoxic Lymphocyte Maturation Factor (CLMF) bezeichnet wird und Lymphokin aktivierte Killer (LAK) Zellen in Gegenwart von IL-12 induziert.
US-A-5 851 523 betrifft die Zugabe von IL-12 und IL-6 an T-Zellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung der physiologischen Rolle des IL-B30, das in der vorliegenden Anmeldung als IL-B30 Protein bezeichnet wird und dessen Rolle in der Immunreaktion. Insbesondere wurde die Rolle von IL-B30 in Stoffwechselwegen aufgeklärt, welche an Entzündungsreaktionen, infektiösen Erkrankungen, hämatopoetischer Entwicklung und viraler Infektion beteiligt sind. Die Erfindung richtet sich insbesondere auf Zusammensetzungen, die einen Komplex aus der p40 Untereinheit des IL-12 und Interleukin-B30 (IL-B30) umfaßt und auf dessen biologischen Aktivitäten. Nukleinsäuren, welche für beide Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren und Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung sind umfaßt. Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung sind teilweise da durch gekennzeichnet, daß sie Homologie zu komplementären DNA (cDNA) Sequenzen aufweisen, wie hierin beschrieben und/oder durch funktionale Assays. Ferner werden Polypeptide, Antikörper und Verfahren zu deren Verwendung bereitgestellt, umfassend die Verwendung der Verfahren zur Expression von Nukleinsäuren. Verfahren zur Veränderung oder Intervention in die Kontrolle einer Wachstumsfaktor-abhängigen Physiologie oder einer Immunreaktion werden zur Verfügung gestellt.
Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der Feststellung, daß die p40 Untereinheit des IL-12 auch mit dem IL-B30 Zytokin assoziiert, das zuvor in einer natürlichen Form beschrieben wurde, z. B. in USSN 08/900,905 und 09/122,443. Die Koexpression der beiden Polypeptide gemeinsam führt daher zu einer funktionalen Rezeptorbindung und Signalgebung.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Verfügung, die einen Komplex umfaßt aus:

i) einem im wesentlichen reinen, reifen humanen IL-12 p40 Polypeptid; und
ii) einem im wesentlichen reinen, reifen Polypeptid der SEQ ID NO: 2.

Die Erfindung stellt ferner eine rekombinante Nukleinsäure zur Verfügung, welche für die erfindungsgemäße Zusammensetzung kodiert.
Die Erfindung stellt ferner Antikörper oder ein Bindungsfragment davon zur Verfügung, welche spezifisch an eine erfindungsgemäße Zusammensetzung binden, aber nicht an reifes menschliches IL-12 p40 Polypeptid oder an ein reifes Polypeptid der SEQ ID NO: 2 allein.
Die Erfindung stellt ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung für die Herstellung eine Medikaments zur Veränderung einer entzündlichen Reaktion zur Verfügung und die Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers oder Bindungsfragments für die Herstellung eines Medikaments zur Veränderung der Physiologie oder Entwicklung einer Zelle, worin die Veränderung zu einer Verbesserung von:

a) einer Autoimmun-Erkrankung; oder
b) einer chronisch entzündlichen Erkrankung führt.

Es werden ferner Zusammensetzungen beschrieben, die umfassen:
a) sowohl ein im Wesentlichen reines Polypeptid, daß eine Vielzahl von getrennten Abschnitten von mindestens 7 kontinuierlichen Aminosäuren des IL-12 p40 umfaßt und ein im Wesentlichen reines Polypeptid, daß eine Vielzahl von getrennten Abschnitten von mindestens 7 kontinuierlichen Aminosäuren des IL-B30 umfaßt; b) sowohl ein im Wesentlichen reines Polypeptid, das mindestens 11 kontinuierliche Aminosäuren des IL-12 p40 umfaßt, und einem im Wesentlichen reines Polypeptid, daß mindestens 11 kontinuierliche Aminosäuren des IL-B30 umfaßt; c) ein im Wesentlichen reines Polypeptid, das sowohl eine Mehrzahl von getrennten Abschnitten von mindestens 7 kontinuierlichen Aminosäuren des IL-12 p40 umfaßt, und eine Mehrzahl von getrennten Abschnitten von mindestens 7 kontinuierlichen Aminosäuren des IL-B30; oder d) ein im Wesentlichen reines Polypeptid, das sowohl einen Abschnitt von mindestens 11 Aminosäuren des IL-12 p40 umfaßt und eine Abschnitt von mindestens 11 kontinuierlichen Aminosäuren des IL-B30. verschieden Ausführungsformen der Offenbarung umfassen folgende Zusammensetzungen: a) in denen die beschriebene Mehrzahl von getrennten Abschnitten von mindestens 7 kontinuierlichen Aminosäuren einen Abschnitt von mindestens 12 kontinuierlichen Aminosäuren umfassen; b) in denen die beschriebene Mehrzahl von getrennten Abschnitten von mindestens 7 kontinuierlichen Aminosäuren beide mindestens 9 kontinuierliche Aminosäuren darstellen; c) in denen der beschriebene Abschnitt von mindestens 11 kontinuierlichen Aminosäuren des IL-12 p40 mindestens 15 kontinuierliche Aminosäuren beträgt; d) in denen der beschriebene Abschnitt von mindestens 11 kontinuierlichen Aminosäuren des IL-B30 mindestens 15 kontinuierliche Aminosäuren enthält. Die erfindungsgemäße Zusammensetzungen können ferner eine Träger umfassen, der aus einer wäßrigen Verbindung, umfassen Wasser, Kochsalzlösung und/oder Puffer umfassen; können für die oral, rektale, nasale, topische oder parenterale Verabreichung formuliert werden; oder steril sein. Weitere Ausführungsformen der Erfindung umfassen: a) solche in denen mindestens eines der beschriebenen Polypeptide i) nachweisbar markiert wurde; ii) rekombinant hergestellt wurde; iii) nicht glykosiliert ist; iv) denaturiert ist; v) an ein festes Substrat gebunden ist; oder vi) an eine andere chemische Gruppe gebunden wurde; b) die sowohl ein im Wesentlichen reines IL-12 p40 Polypeptid und ein im Wesentlichen reines IL-B30 Polypeptid umfassen; c) ein im Wesentlichen reines Polypeptid umfassen, daß IL-12 p40 mit IL-B30 in fusionierter Form umfaßt; oder d) mit IL-18, IL-12; Radio- oder Chemotherapie, einem Immunadjuvans oder einem Antivirusmittel kombiniert wird. Ausführungsformen, welche Kits betreffen, umfassen diese Zusammensetzung und: a) einen Teil, der ein beschriebenes Polypeptid umfaßt; oder b) Weisungen für die Verwendung oder Vernichtung der Reagenzien in den beschriebenen Kits.
Nukleinsäurezusammensetzungen, die hierin beschrieben werden, umfassen z. B. eine isolierte oder rekombinante Nukleinsäure, die für folgendes kodiert: a) sowohl ein im Wesentlichen reines Polypeptid, das eine Mehrzahl von getrennten Abschnitten von mindestens 7 kontinuierlichen Aminosäuren des IL-12 p40 umfaßt und ein im Wesentlichen reines Polypeptid, das eine Mehrzahl von getrennten Abschnitten von mindestens 7 kontinuierlichen Aminosäuren von IL-B30 umfaßt; b) sowohl ein im Wesentlichen reines Polypeptid, das mindestens 11 kontinuierliche Aminosäuren des IL-12 p40 umfaßt, und ein im Wesentlichen reines Polypeptid, das mindestens 11 kontinuierliche Aminosäuren von IL-B30 umfaßt; c) ein im Wesentlichen reines Polypeptid, das sowohl eine Mehrzahl von getrennten Abschnitten von mindestens 7 kontinuierlichen Aminosäuren des IL-12 p40 umfaßt, und eine Mehrzahl von getrennten Abschnitten von mindestens 7 kontinuierlichen Aminosäuren des IL-B30; oder d) ein im Wesentlichen reines Polypeptid, das einen Abschnitt von mindestens 11 Aminosäuren des IL-12 p40 umfaßt, und einen Abschnitt von mindestens 11 kontinuierlichen Aminosäuren des IL-B30. verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung umfassen entsprechende Nukleinsäuren: a) in denen die beschriebene Mehrzahl von getrennten Abschnitten von mindestens 7 kontinuierlichen Aminosäuren einen Abschnitt von mindestens 9 kontinuierlichen Aminosäuren umfaßt; b) in denen die beschriebene Mehrzahl von getrennten Abschnitten von mindestens 7 kontinuierlichen Aminosäuren beide mindestens 9 kontinuierliche Aminosäuren sind; c) in denen die beschriebenen Abschnitte von mindestens 11 kontinuierlichen Aminosäuren des IL-12 p40 mindestens 15 kontinuierliche Aminosäuren lang ist; d) in denen die beschriebenen Abschnitte von mindestens 12 kontinuierlichen Aminosäuren des IL-B30 mindestens 15 kontinuierliche Aminosäuren lang ist; e) in denen das beschriebene IL-12 p40 von einem Primaten abstammt; f) in denen das beschriebene IL-B30 von einem Primaten abstammt. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können eine Expressionsvektor darstellen; sie können ferner eine Applikationsursprung umfassen; sie können eine nachweisbare Markierung umfassen; sie können synthetische Nukleinsäuresequenzen umfassen; können weniger als 6 kb, vorzugsweise 3 kb groß sein. Ferner werden Nukleinsäuren von Primaten beschrieben. Es wird zudem eine Zelle zur Verfügung gestellt, welche die rekombinanten Nukleinsäuren umfaßt, wobei die beschriebene Zelle umfaßt: Prokaryoten, Eukaryoten, Bakterien, Hefen, Insekten, Säuger, Mäuse, Primaten, oder menschliche Zellen. Die Kits betreffenden Ausführungsformen umfassen solche, in denen die beschriebene Nukleinsäure und folgendes umfaßt sind; a) einen Teil, welche die beschriebene Nukleinsäure umfaßt; b) einen Teil, welcher ferner Primaten IL-12 p40 Polypeptid umfaßt; c) einen Teil, welcher ferner einen Primaten IL-B30 Polypeptid umfaßt; oder d) Anweisungen zur Verwendung oder Beseitigung der in dem Kits beschriebenen Reagenzien.
Ferner wird eine Nukleinsäure offenbart, die mit folgendem hybridisiert: a) unter Waschbedingungen von 30 Minuten von 50°C und weniger als 1M Salz mit den natürlichen reifen kodierenden Teil des Primaten IL-12 p40; und b) unter Waschbedingungen von 30 Minuten bei 50°C und weniger als 1M Salz mit dem natürlichen reifen kodierenden Teil eine Primaten IL-B30. verschiedene Ausführungsformen der Offenbarung umfassen die beschriebenen Nukleinsäuren, in denen: a) die beschriebenen Waschbedingungen für IL-12 p40 60°C und weniger als 400 mM Salz betragen; b) die beschriebenen Waschbedingungen für IL-B30 60°C und weniger als 400 mM Salz betragen; c) die beschriebene Nukleinsäureidentität über einen Bereich von mindestens 50 Nukleotiden zur Sequenz aufweist, die für Primaten IL-12 p40 kodiert; und/oder d) die beschriebene Nukleinsäureidentität über einen Bereich von mindestens 50 Nukleotiden zur Sequenz aufweist, die für Primaten IL-B30 kodiert. Bevorzugte Ausführungsformen der Offenbarung umfassen eine Nukleinsäure, in der: a) die beschriebenen Waschbedingungen für IL-12 p40 65°C und weniger als 150 mM Salz betragen; b) die beschriebenen Waschbedingungen für IL-B30 65°C und weniger als 150 mM Salz betragen; c) die beschriebene Nukleinsäureidentität über einen Bereich von mindestens 90 Nukleotiden zur Sequenz aufweist, welche für Primaten IL-12 p40 kodiert; und/oder d) die beschriebene Nukleinsäureidentität über einen Bereich von mindestens 90 Nu kleotiden zur Sequenz aufweist, die für Primaten IL-B30 kodiert.
Antagonisten der IL-12 p40/IL-B30 Zusammensetzungen werden offenbart zusammen mit z. B. einem TNFα Antagonisten, einem IL-12 Antagonisten, einem IL-10 oder Steroiden.
Die Erfindung stellt ein Bindemittel zur Verfügung, insbesondere einen Antikörper oder Bindungsfragment davon, welche spezifisch an die erfindungsgemäße IL-12 p40/IL-B30 Zusammensetzung bindet; jedoch nicht an reifes menschliches IL-12 p40 oder reifes Polypeptid der SEQ ID NO: 2 alleine. Der Antikörper oder das Bindungsfragment davon können: a) in einem Behälter vorliegen; b) eine Fv, Fab oder Fab2 Fragment darstellen; c) mit einer anderen chemischen Gruppe konjugiert werden; oder d) die beschriebenen Antikörper können: i) gegen eine IL-12 p40/IL-B30 Zusammensetzung gebildet worden sein; ii) immunoselektiert worden sein; iii) ein polyklonaler Antikörper sein; iv) einen Kd gegenüber dem Antigen von mindestens 30 mM aufweisen; v) an eine festen Träger gebunden sein, darunter ein Kügelchen oder eine Plastikmembran; vi) in einer sterilen Zusammensetzung vorliegen; oder vii) nachweisbar markiert sein, darunter radioaktive oder fluoreszierende Markierungen. Bestimmte bevorzugte Ausführungsformen umfassen Zusammensetzungen, die folgendes umfassen: a) einen erfindungsgemäßen sterilen Antikörper oder ein Bindungsfragment davon; oder b) eine erfindungsgemäßen Antikörper oder Bindungsfragment davon und einen Träger, wobei der beschriebene Träger folgendes sein kann: i) eine wäßrige Verbindung, darunter Wasser, Kochsalzlösung und/oder Puffer; und/oder ii) zur oralen, rektalen, nasalen, topischen oder parenteralen Verabreichung formuliert sein. Ferner werden Ausführungsformen zur Verfügung gestellt, die einen Kit betreffen, der den beschriebenen Antikörper oder das Bindungsfragment davon umfaßt und: a) einen Teil, der das beschrieben Bindemittel umfaßt; oder b) Weisungen zur Verwen dung oder Entsorgung der in dem beschriebenen Kit enthaltenen Reagenzien.
Ferner werden Verfahren zur Erzeugung eines Antigen:Antikörper Komplexes offenbart, Schritte umfassend bei denen man eine Primaten IL-12 p40/IL-B30 Zusammensetzung unter geeigneten Bedingungen mit dem beschriebenen Bindungsmittel umsetzt, wodurch die Bildung des beschriebenen Komplexes ermöglicht wird. Verschiedene Verfahren umfassen solche, in denen: a) der beschriebene Komplex aus anderen Zytokinen gereinigt wird; b) der beschriebene Komplex von anderen Antikörpern gereinigt wird; c) die beschriebene Umsetzung in einer Probe erfolgt, die Zytokin umfaßt; d) die beschriebene Umsetzung einen quantitativen Nachweis beschriebene Antigens ermöglicht; e) die beschriebene Umsetzung mit einer Probe erfolgt, welche den beschriebenen Antikörper umfaßt; oder f) die beschriebene Umsetzung eine quantitativen Nachweis des beschriebenen Antikörpers ermöglicht.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Verämderung der Physiologie oder der Entwicklung einer Zelle oder eines Gewebes, Schritte umfassend, bei denen man die beschriebene Zelle mit einer IL-12 p40/IL-B30 Zusammensetzung oder Antagonisten dagegen umsetzt. In einem bevorzugten Verfahren wird die Veränderung der Physiologie oder Entwicklung einer Zelle Schritte umfassen, bei denen man die beschriebene Zelle mit einer IL-12 p40/IL-B30 Zusammensetzung umsetzt, wobei die beschriebene Umsetzung zu einer Steigerung der Erzeugung des IFNγ führt. Die beschriebenen Zellen befinden sich üblicherweise in einem Wirtsorganismus und der beschriebene Organismus weist eine gesteigerte Th1 Reaktion auf (z. B. eine ausgewählt aus: Anti-Tumor Wirkung; Adjuvanswirkung; anti-virale Wirkung; oder antagonistische allergische Wirkung. Die Umsetzung erfolgt häufig in Kombination mit: IL-18; IL-12; Strahlen- oder Chemothera pie; einem Immunadjuvans; oder einem anti-viralen Therapeutikum.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung ist der beschriebene Antagonist ein Antikörper gegen die β1 Untereinheit des IL-12 Rezeptors. Die Erfindung umfaßt daher auch ein beschriebenes Verfahren, in dem die beschrieben Umsetzung mit einem Antagonisten erfolgt und die beschriebene Umsetzung zu einer relativen Steigerung der Herstellung des IFNγ führt. Ferner werden Verfahren zur Veränderung der Physiologie oder Entwicklung einer Zelle in einem Wirtsorganismus zur Verfügung gestellt, Schritte umfassend, bei denen man die beschriebenen Antagonisten den beschriebenen Organismen verabreicht, wobei die beschriebene Umsetzung zu einer Verbesserung eines Autoimmunen Zustands oder einer chronischen entzündlichen Reaktion führt.
Wie ferner hierin beschriebenen, stellt die Identifizierung des Assoziierung der beiden Untereinheiten Verfahren zur Steigerung der Sekretion von folgendem zur Verfügung: a) einem Primaten IL-B30, wobei das Verfahren Schritte umfaßt, bei denen das gewünschte Polypeptid mit IL-12 p40 exprimiert wird; oder b) ein Primaten IL-12 p40, wobei das Verfahren Schritte umfaßt, bei denen das beschriebene IL-12 p40 mit IL-B30 exprimiert wird. Vorzugsweise wird entweder: a) die beschriebene Steigerung mindestens dreifach sein; oder b) die beschriebene Expression durch eine rekombinante Nukleinsäure erfolgen, die für IL-B30 und IL-12 p40 kodiert.
Verfahren zum Screening nach einem Rezeptor, welcher IL-12 p40/IL-B30 Zusammensetzung bindet, werden beschrieben, z. B. Schritte umfassend, bei denen der beschriebene Komplex mit einer Zelle, welche den beschriebenen Rezeptor exprimiert, unter Bedingungen umgesetzt wird, welche die Bindung des beschriebenen Komplexes an den beschriebenen Rezeptor ermöglichen, wo durch eine nachweisbare Interaktion gebildet wird. Die nachweisbare Interaktion führt vorzugsweise zu einer physiologischen Reaktion in der beschriebenen Zelle.
Ferner werden Verfahren zur Veränderung der Migration oder Aktivierung von Leukozyten in einem Tier beschrieben, wobei die Verfahren Schritte umfassen, bei denen man Zellen der Monozyten/Makrophagenlinie in einem Tier mit einer therapeutischen Menge eines Agonisten für das Säuger IL-530 Protein umsetzt; oder einem Antagonisten des menschlichen IL-530 Proteins. Bevorzugte Ausführungsformen der Offenbarung umfassen Schritte, in denen: das Säuger IL-B30 Protein ein von Primaten abstammendes Protein ist; und/oder der Antagonist ein Antikörper ist, welcher das Säuger IL-B30 bindet. Bestimmte Ausführungsformen betreffen verfahren, bei denen die Zellen der Monozyten/Makrophagen-Linien eine Mikroglialzelle oder eine dendritische Zelle umfassen, oder soweit das Tier Zeichen oder Symptome eine Entzündung, leukoproliferativen, neurodegenrativen oder posttraumatischen Erkrankung zeigt. Bevorzugte Ausführungsformen umfassen solche, bei denen das Zeichen oder Symptom in Lungengewebe; Lebergewebe; neuralem Gewebe; lymphoidem Gewebe; myeloidem Gewebe; Pankreas; gastrointestinalem Gewebe; thyroidem Gewebe, Muskelgewebe oder Haut oder Kollagenartigem Gewebe vorliegt.
Weitere Verfahren umfassen die Veränderung durch Hemmung der Funktion der Leukozytenzellen; und/oder die Verabreichung des Agonisten, vorzugsweise ist der Agonist das Säuger IL-530.
Bestimmte Ausführungsformen umfassen die Beobachtung, daß das Tier Zeichen oder Symptome einer Autoimmunerkrankung; einer entzündlichen Erkrankung; einer gewebespezifischen Autoimmunerkrankung; einer degenerativen Autoimmunerkrankung; einer rheumatischen Arthritis; einer Osteoarthritis; eine Arteriosklerose; einer Multiplen Sklerose; einer Vaskulities; einer verzögerten Hypersensitivität; einer Hauttransplantation; einen Transplantat; einer Rückenmarksverletzung; einem Schlag; einer neurodegenerativen Erkrankung; einer infektiösen Erkrankung; einer Ischämie; einem Krebs; Tumoren; Multiplen Myelom; der Castleman's Erkrankung; post-menopausaler Osteoporose oder IL-6 assoziierten Erkrankungen erlebt. Die Verabreichung kann in Kombination mit einem der folgenden erfolgen: einem entzündungshemmenden Zytokin-Agonisten oder -antagonisten; einem Schmerzmittel; einem entzündungshemmenden Mittel oder. einem Steroid.
Verschiedene weitere Verfahren werden beschrieben, in denen die Veränderung eine Verstärkung der Funktion der Leukozytenzellen und/oder die Verabreichung des Antagonisten darstellen. Vorzugsweise ist der Antagonist ein Antikörper, welcher Säuger IL-B30 bindet; oder ein Mutein des Säuger IL-B30, das mit dem Säuger IL-B30 um die Bindung an den IL-B30 Rezeptor im Wettbewerb steht, jedoch im Wesentlichen kein Signal übertragen kann. In verschiedenen Ausführungsformen wird das Verfahren angewendet, in dem das Tier Zeichen oder Symptome von Wundheilung oder Klumpenbildung durchmacht.
Schließlich wird ein Verfahren zur Induktion der Proliferation von Gedächtnis T-Zellen zur Verabreichung von IL-B30 oder einem Agonisten davon offenbart.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BERVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Übersicht

I. Allgemeines
II. Gereinigter IL-12 p40/IL-B30 Komplex A. Physikalische Eigenschaften B. Biologische Eigenschaften
III. Physikalische Varianten A. Sequenzvarianten, Fragmente B. Post-translationale Varianten 1. Glykosilierung 2. Weitere
IV. Funktionale Varianten A. Analoga, Fragmente 1. Agonisten 2. Antagonisten B. Mimetika 1. Proteine 2. Chemikalien C. Artvarianten
V. Antikörper A. Polyklonal B. Monoklonal C. Fragmente, Bindemittel
VI. Nukleinsäuren A. Natürliche Isolate; Verfahren B. Synthetische Gene C. Verfahren zur Isolierung
VII. Herstellung des p40/IL-B30 Komplexes, Mimetika A. Rekombinante Verfahren B. Synthetische Verfahren C. Natürliche Reinigung
VIII. Verwendung A. Diagnostik B. Therapeutisch
IX. Kits A. Nukleinsäurereagenzien B. Proteinreagenzien C. Antikörperreagenzien
X. Isolierung des Rezeptors für den p40/IL-B30 Komplex

I. Allgemeines
Die vorliegende Erfindung stellt die Beschreibung und Lehre zur Verfügung, daß die Paarung von Säugerproteinen zur Bildung löslicher Zytokine erfolgt, z. B. ein sekretiertes Molekül, das ein Signal zwischen Immun- und anderen Zellen vermitteln kann. Siehe z. B. Paul (1998) Fundamental Immunology (4. Ausgabe) Raven Press, N. Y. Bestimmte lösliche Faktoren bestehen aus heterodimeren Polypeptiden, z. B. IL-6 und IL-12. Chimäre Formen, die wahrscheinlich die physiologischen Formen darstellen und Fragmente oder Antagonisten können nützlich sein, z. B. für die physiologische Veränderung der Zellen, welche in einem Rezeptor exprimieren. Es ist wahrscheinlich, daß der funktionale Zytokin-Komplex, welcher p40/IL-B30 umfaßt, entweder stimulierende oder hemmende Wirkungen auf hämatopoetische Zellen aufweist, darunter lymphoide Zellen, wie T-Zellen, B-Zellen, natürliche Killer (NK) Zellen, Makrophagen, dendritische Zellen, hämatopoetische Vorläuferzellen, etc. Diese Proteine können ferner als Antigene verwendet werden, z. B. Immunogene, zur Bildung von Antikörpern gegen verschiedene Epitope des Proteins, sowohl lineare als auch Konformationsepitope.
Die IL-12 p40 Untereinheit ist im Stand der Technik beschrieben. Siehe z. B. Seiler et al., US Pat. 5,547,852 ; Scott und Trinchieri, US Pat. 5,571,515 ; Gately et al., US Pat. 5,650,492 ; Liesehke und Mulligan, US Pat. 5,891,680 ; Warne et al., US Pat. 5,744 132 ; und Hinterlegungsnummern gbM86671, gbAF133197, gbU16674, gbU83184, embY07762, embY11129.1, gbM65272, gbAF007576, gbU19841, gbU11815, gbU57752, gbAF004024, gbU49100, gbU19834,und embX97019. Die Sequenz des IL-B30 wurde aus der menschlichen genomischen Sequenz identifiziert. Die Nukleotidsequenz wurde als huIL-B30 bezeichnet. Eine Nagersequenz, z. B. von der Maus, wurde ferner beschrieben. Siehe z. B. USSN 08/900,905 und 09/122,443. Die vorliegende Erfindung umfaßt Zusammensetzungen, die Komplexe dieser beiden Polypeptide umfassen, z. B. p40 und IL-B30, und Nukleinsäurekonstrukte, welche für beide Sequenzen kodieren. Antikör per, welche die Zusammensetzung erkennen, werden ferner zur Verfügung gestellt, sowie Verfahren zur Herstellung der beiden Messenger oder Polypeptide, z. B. in koordinierter Weise.
Das menschliche IL-330 Gen kodiert für ein kleines lösliches Zytokin-ähnliches Protein von etwa 198 Aminosäuren. Die mittels psort vorhergesagte Signalsequenz weist etwa 17 Reste auf und läuft von dem Met bis etwa Ala. Siehe Tabelle 1 und SEQ ID NO: 1 und 2. IL-B30 weist strukturelle Motive auf, welche für ein Mitglied der langkettigen Zytokine kennzeichnend sind. Vergleiche beispielsweise IL-B30, G-CSF und die IL-6 Sequenzen, die von GenBank erhältlich sind. Siehe auch USSN 08/900,905 und 09/122,443.
Tabelle 1: Nukleinsäure (SEQ ID NO: 1), welche für IL-B30 von einem Säuger, z. B. einem Menschen, kodiert. Translatierte Aminosäuresequenz ist SEQ ID NO: 2.
Die strukturelle Homologie des IL-B30 mit verwandten Zytokin Proteinen legt nahe, daß das Molekül verwandte Funktionen aufweist. Die Erkennung der Assoziierung des IL-12 p40 Polypeptids mit dem IL-B30 Polypeptids ermöglicht jedoch den biologischen Nachweis des aktiven p40 IL-B30 Dimers. IL-12 p40/IL-330 Komplexe können entweder aus getrennten Polypeptiden gebildet werden, in denen jedes einzelne Polypeptid repräsentiert ist oder Fusionskonstrukten für IL-12 p40 und IL-B30. Beobachtungen zeigen, daß der Dimer in der Lage ist die Herstellung von Interferon-γ (IFNγ) in verschiedenen Zelltypen, z. B. PBMC, zu steigern, was auf biologische Funktionen verweist, für die der Dimer verwendet wird. Experimente konnten ferner zeigen, daß die β1 Untereinheit des IL-12 Rezeptors ein Bestandteil des Rezeptors für den p40 IL-B30 Dimer ist.
IFNγ aktiviert Makrophagen, stimuliert tumorizide und Mikrobizide Aktivitäten. Es verändert ferner Klasse I und II MHC Molekülexpression, darunter die Steigerung der Klasse II Moleküle auf Monozyten/Makrophagen und dendritischen Zellen und induziert die Expression auf epithelialen, endothelialen und anderen Zellen, wodurch diese in der Lage sind, Antigene zu präsentieren. Das Zytokin ist ein Th1-ähnliches Zytokin, welches die Entwicklung der Th1-ähnlichen CD4+ T-Zellen fördert, aber die der Th2-ähnlichen T-Zellen hemmt. Es stellt einen starken und relativ spezifischen Hemmstoff für die IL-4 induzierte IgE und IgG4 Synthese durch B-Lymphozyten dar, obwohl es bei höheren Konzentrationen nicht-spezifisch die Produktion aller Antikörper Isotypen hemmt. IFNγ fördert cytotoxische Immunreaktionen gegen Intrazelluläre Organismen und Tumore, welche über NK Zellen und CTLs vermittelt werden. Ähnlich wie IL-12 hat IFNγ die Neigung, die Zell-vermittelte cytotoxische Reaktionen zu steigern, während allergische Entzündungen und IgE Synthese gehemmt werden. Siehe z. B. Karupiah (herausgegeben 1997) Gamma Interferon in Antiviral Defense Chapmann & Hall; Jaffe (herausgegeben 1992) Anti-Infective Applications of Interferon-Gamma Marcel Dekker (ISBN: 0824786882); Sutterwala et al., (1999) J. Leukoc. Biol. 65:543–551; Billiau et al., (1998) Ann. NY Acad. Sci. 856:22–32; und Gessani et al., (1998) Zytokine Growth Factor Rev. 9:117–123.
IL-B30 Agonisten oder Antagonisten können auch als funktionale oder Rezeptorantagonisten wirken, z. B. solche, die IL-6 oder IL-12 Bindungen an die zugehörigen Rezeptoren blockieren oder die gegenteilige Wirkung vermitteln. IL-B30 oder seine Antagonisten können daher für die Behandlung von nicht-gesunden me dizinischen Zuständen verwendet werden, darunter Immunerkrankungen, z. B. T-Zell Immundefizienzen, Chronische Entzündungen oder Gewebeabstoßung oder für kardiovaskuläre oder Neurophysiologische Zustände. Agonisten können voraussichtlich in einem therapeutischen Kontext verwendet werden, welcher die Zell-vermittelte Immunität stärkt, z. B. als Anti-Tumor, Adjuvans und anti-viraler Wirkstoff oder zur Hemmung allergischer Reaktionen. Antagonisten können voraussichtlich im Zusammenhang mit der Blockade gesteigerter Immunität verwendet werden, z. B. bei Zellulären Beiträgen für Autoimmune Erkrankungen oder chronisch Entzündliche Erkrankungen.
Die natürlichen Antigene sind in der Lage, verschiedene biochemische Reaktionen zu erzeugen, welche zu biologischen oder physiologischen Zwischenreaktionen in den Zielzellen führen. Die bevorzugten Ausführungsformen wären aus Menschen oder anderen Primaten oder Arten, die in der Natur vorkommen. Weitere Sequenzen von Proteinen anderer Säugetierarten, z. B. Primate, Hunde, Katzen und Nager sollten auch verfügbar sein.
Insbesondere konnte die Assoziation der p40 Untereinheit des IL-12 mit IL-B30 bestätigt werden. IL-12 p40 und IL-B30 Moleküle sollten sich daher gemeinsam entwickelt haben. Wenn beide funktionell assoziieren, können sie gemeinsam wie IL-12 wirken. Siehe z. B. Trinchieri (1998) Adv. Immunol. 70:83–243; Gately et al., (1998) Ann. Rev. Immunol. 16:495–521; und Trinchieri (1998) Int. Rev. Immunol. 16:365–396.
Als Komplex ist jedoch davon auszugehen, daß der Komplex mit zwei großen Signalübertragungsrezeptoren der Zytokin-Rezeptorfamilie interagieren wird. Dies konnte für die β1 Untereinheit des IL-12 Rezeptors gezeigt werden. Weitere Verwandte Rezeptoren können für die Bindung an den löslichen Komplex untersucht werden. Eine Reihe von Zellen, z. B. BAF/3, die verschiedene dieser großen Rezeptoren exprimieren, welche die Fähigkeit haben Signale zu übertragen, wurden erzeugt.
Die Überstände der mit sowohl IL-12 p40 und IL-B30 (oder als ein einziges Kombinationskonstrukt) in derselben Zelle transfiziert wurden zur Untersuchung verschiedener Zellen verwendet, um festzustellen, ob eine proliferative und andere Signalreaktion festgestellt werden kann. Die meisten physiologischen Wirkungen der Zytokine erfolgen durch Bildung von Komplexen der Proteine. Die nachfolgenden Erläuterungen zur Biologie, welche durch die Zytokine verursacht werden, kann tatsächlich physiologisch durch den Komplex verursacht werden, welcher die Kombination der Untereinheiten umfaßt.
Die nachfolgenden Beschreibungen können auf den IL-12 p40/IL-330 Komplex übertragen werden. Eine Fusion der p40 Untereinheit des IL-12 mit dem IL-B30 wurde hergestellt, wie z. B. das Hyper IL-6. Siehe z. B. Fischer et al., (1997) Natur Biotechnol. 15:142–145; Rakemann et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:1257–1266; und Peters et al., (1998) J. Immunol. 161:3575–3581. Die Verknüpfung dieses Zytokin-Komplexes mit einem Rezeptor, der die β1 Untereinheit des IL-12 Rezeptors umfaßt, ermöglicht die Identifizierung von Antikörpern gegen diese Untereinheit, welche Rezeptorantagonisten des Zytokin-Komplexes sind.
II. Gereinigter p40/IL-B30 Komplex
Die menschliche IL-330 Aminosäuresequenz wird gemäß einer Ausführungsform in SEQ ID NO: 2 gezeigt. Weitere natürlicherweise vorkommende Nukleinsäuren, welche für das Protein kodieren, können unter Verwendung von Standardverfahren isoliert werden, wobei die zur Verfügung gestellte Sequenz benutzt werden kann, z. B. PCR Verfahren oder durch Hybridisierung. Diese Aminosäuresequenzen, die in Amino- nach Carboxy-Richtung dargestellt werden, sind für die Bereitstellung der Sequenzinformation der Zytokinuntereinheit wichtig, da sie es ermöglichen, zwischen dem Proteinantigen und anderen Proteinen zu unterscheiden und eine Vielzahl an Varianten beispielhaft bereitzustellen. Die Peptidsequenzen ermöglichen ferner die Herstellung von Peptiden, zur Erzeugung von Antikörpern, die Abschnitte erkennen, und Nukleinsäuresequenzen ermöglichen die Herstellung von Oligonukleotid-Proben, was beides Strategien zum Nachweis oder zur Isolierung, z. B. Klonierung der für diese Sequenzen kodierenden Gene darstellt.
Der Begriff „Humanes lösliches IL-B30", wie hierin verwendet, soll ein Protein mit der Aminosäuresequenz umfassen, die einem löslichem Polypeptid mit SEQ ID NO: 2 entspricht. Signifikante Segmente davon werden häufig ähnliche Funktionen aufweisen, z. B. Antigenität. Es werden Ausführungsformen offenbart, welche eine Vielzahl von getrennten, z. B. nicht überlappenden, Abschnitten mit spezifischer Länge darstellen. Typischerweise wird diese Vielzahl mindestens zwei, noch üblicherweise mindestens drei und vorzugsweise mindestens fünf, sieben oder sogar mehr sein. Obwohl minimale Längen angegeben werden können, können auch größere Längen verschiedener Größe geeignet sein, z. B. eines mit Länge sieben und zwei mit Länge zwölf. Ähnliche Merkmale werden für das IL-12 p40 Polypeptid angewendet und auf die für beide kodierenden Nukleotide.
Bindemittel, z. B. Antikörper, binden typischerweise eine IL-12 p40/IL-B30 Komplex mit hoher Affinität, z. B. mit mindestens 100 nM, üblicherweise besser als mindestens 30 nM, vorzugsweise besser als 10 nM und besonders bevorzugt besser als etwa 3 nM. Entsprechende Proteinkomplexe werden in anderen Säugetierarten als Menschen, z. B. anderen Primaten, Paarhufern oder Nagern gefunden. Nicht-Säugetierarten, z. B. Vögel oder Amphibien sollen ebenfalls strukturelle oder funktional verwandte Gene und Proteine besitzen.
Ferner werden hierin signifikante Fragmente oder Abschnitte der Polypeptide offenbart, die einen Abschnitt von Aminosäureresten mit mindestens acht Aminosäuren umfassen, im Allgemeinen mindestens zwölf Aminosäuren, üblicherweise mindestens 16 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 20 Aminosäuren und in besonders bevorzugten Ausführungsformen der Offenbarung mindestens 30 oder mehr Aminosäuren, z. B. 35, 40, 45, 50, etc. Entsprechende Fragmente können Enden aufweisen, die tatsächlich in allen Positionen anfangen und/oder enden können, z. B. beginnend bei den Resten 1, 2, 3, etc. und endend bei z. B. 175, 174, 173, etc. für alle praktischen Kombinationen des IL-B30 oder der IL-12 p40 Untereinheit. Peptide von besonderem Interesse weisen Enden auf, die strukturellen Grenzen der Domänen entsprechen, z. B. Helices A, B, C, und/oder D des IL-B30 oder der Ig Domänen des IL-12 p40. Siehe nachfolgend.
Der Begriff „Bindemittel" bezeichnet Moleküle, die spezifisch an den IL-12 p40/IL-B30 Komplex, z. B. in einer Antikörper-Antigen Interaktion, jedoch nicht an die einzelnen Bestandteile alleine. Diese Spezifität kann mehr oder weniger inklusive sein, z. B. spezifisch für eine bestimmte Ausführungsform oder für Gruppen verwandter Ausführungsformen, z. B. Primaten, Nager, etc. Die gewünschte Selektivität kann durch Abreicherung oder Absorptionen erzielt werden, z. B. durch Abreicherung von Antikörpern, die an jedes Bestandteil des Polypeptids einzeln binden. Ferner werden Verbindungen offenbart, z. B. Proteine, die spezifisch mit IL-12 p40/IL-B30 Komplex assoziieren, darunter solche, die in einer natürlichen physiologisch relevanten Protein-Protein Interaktion kovalent oder nicht-kovalent assoziieren. Das Molekül kann ein Polymer oder ein chemisches Reagenz sein. Funktional Analoga können ein Protein mit strukturellen Veränderungen oder ein Molekül, welches eine molekulare Form aufweist, die mit geeigneten Bindungsdeterminanten interagiert. Die Verbindungen können als Agonisten oder Ant agonisten einer Rezeptorbindungsinteraktion wirken (siehe z. B. Goodman et al., (Herausgeber) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics (current edition) Pergamon Press.
Im Kontext des Proteins weist der Begriff im Wesentlichen rein üblicherweise darauf, daß das Protein frei von anderen kontaminierenden Proteinen, Nukleinsäuren und weiteren biologischen Materialien, die von dem Wirtsorganismus abgeleitet wurden, ist. Die Reinheit kann durch Standardverfahren bestimmt werden, typischerweise mittels Gewichtsbestimmung und beträgt üblicherweise mindestens etwa 40% Reinheit, im Allgemeinen mindestens etwa 50% Reinheit, häufig mindestens etwa 60% Reinheit, typischerweise mindestens etwa Reinheit 80%, vorzugsweise mindestens 90% Reinheit und in besonders bevorzugten Ausführungsformen mindestens 95% Reinheit. Träger oder Hilfsmittel werden häufig zugegeben. Eine Zusammensetzung, die im Wesentlichen reines IL-12 p40 und IL-B30 enthält, wird keine großen Mengen anderer Polypeptide enthalten, die nicht natürlicherweise mit dem Komplex der beiden Polypeptide assoziiert sind.
Die Löslichkeit eines Polypeptids oder eine Fragments davon hängt von der Umgebung und dem Polypeptid ab. Viele Parameter beeinflussen die Polypeptidlöslichkeit, darunter Temperatur, Elektrolyten in der Umgebung, Größe und Molekulareigenschaften des Polypeptids, und Natur des Lösungsmittels. Üblicherweise wird die Temperatur bei etwa 4°C bis etwa 65°C betragen. Übliche Temperaturen befinden sich im Bereich von größer als 18°C. Für Diagnoseverfahren wird üblicherweise die Temperatur auf Raumtemperatur oder warmer eingestellt, aber unter Denaturierungstemperatur für die Bestandteile des Assays. Für therapeutische Zwecke wird die Temperatur üblicherweise der Körpertemperatur entsprechen, typischerweise etwa 37°C für menschliche Wesen und Mäuse, obwohl die Temperatur bei bestimmten Bedingungen in sito oder in vitro erhöht oder gesengt werden kann.
Die Größe und Struktur der Polypeptide sollte so gewählt werden, daß ein im Wesentlichen stabiler Zustand im nicht-denaturierten Stadium erzielt wird. Das Polypeptid kann mit anderen Polypeptiden zu einer quaternären Struktur assoziiert sein, z. B. um die Stabilität zu erhalten oder mit Lipiden oder Detergentien assoziiert sein. Die Erfindung betrifft einen Komplex aus der Assoziation von IL-12 p40 und IL-B30 Polypeptiden, vorzugsweise als Fusionsprodukt.
Die Lösungsmittel und Elektrolyte werden üblicherweise in Form eine biologisch verträglichen Puffers vorliegen, wobei ein Typ verwendet wird, der für die Aufrechterhaltung der biologischen Aktivitäten geeignet ist und üblicherweise ein wäßriges Lösungsmittel mit physiologischen Bedingungen sein wird. Das Lösungsmittel wird üblicherweise einen neutralen pH Wert aufweisen, typischerweise zwischen etwa 5 und 10 und vorzugsweise etwa 7,5. In einigen Fällen können ein oder mehrere Detergentien zugegeben werden, typischerweise ein mildes nichtdenaturierendes, z. B. CHS (Cholesteryl Hemisuccinat) oder CHAPS (3-[3-Cholamidopropyl)Dimethylammonio]-1-Propansulfonat) oder in so geringer Konzentration, daß eine wesentliche Störung der Strukturellen oder Physiologischen Eigenschaften des Proteins ausgeschlossen ist. In anderen Fällen kann ein scharfes Detergenz gesetzt werden, um signifikante Denaturierung zu erzielen.
Ein IL-B30 Polypeptid, das spezifisch durch einen Antikörper gebunden wird oder spezifisch immunoreaktiv damit ist, z. B. ein polyklonaler Antikörper, der gegen ein definiertes Immunogen gebildet wurde, z. B. ein Immunogen bestehend aus der Sequenz der SEQ ID NO: 2 oder Fragmenten davon oder ein Polypep tid, das aus der Nukleinsäure der SEQ ID NO: 1 gebildet wurde, wird üblicherweise mittels eines Immunoassays bestimmt.
Ferner werden entsprechende Nukleinsäuresequenzen hierin offenbart, darunter funktionale Varianten, die Polypeptide kodieren, welche selektiv an polyklonale Antikörper binden, die. gegen das Prototyp IL-B30 Polypeptid, wie strukturell und funktional hierin beschrieben, erzeugt wurden. Der Immunoassay verwendet üblicherweise polyklonales Antiserum, das z. B. gegen einen Komplex, der die Sequenz des Proteins der SEQ ID NO: 2 umfaßt, gebildet wurde. Das Antiserum wird ausgewählt, abgereinigt, um geringe Kreuzaktivität gegen weitere, nahe verwandte Familienmitglieder zu erzielen, vorzugsweise von derselben Art und verbleibender Kreuzreaktivität wird mittels Immunoabsorption oder Abreicherung vor der Ausführung des Immunoassays entfernt. Antikörper welche die IL-12 p40 oder IL-530 Polypeptide allein oder gemeinsam kodieren sind Ziele für eine Immunodepletion. Geeignete selektive Serumpräparationen können isoliert und gekennzeichnet werden.
Um Antisera für ein Immunoassay zu erzeugen, kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung wie oben beschrieben daraus entfernt werden. Rekombinante Proteine können beispielsweise in Säugetierzellinien exprimiert werden. Eine geeigneter Wirt, z. B. ingezogener Stamm von Mäusen, wie Balb/c wird mit dem Komplex, der ein Protein der SEQ ID NO: 2 umfaßt unter Verwendung von Standard-Adjuvans, wie Freund's Adjuvans und Standard Maus Immunisierungsprotokoll (siehe Harlow and Lane) immunisiert. Alternativ dazu kann ein vollständig synthetisches Peptidkonstrukt erzeugt werden, welches von den Sequenzen abgeleitet wurde, die hierin als Immunogen benutzt werden. Polyklonale Seren werden gesammelt und gegen das Immunogen Protein in einem Immunoassay titriert, z. B. mittels Festphasen-Immunoassay oder Assays, bei denen das Immunogen auf einem festen Träger immobilisiert wurde, zusammen mit entsprechenden Abreinigungen oder Selektionsverfahren. Polyklonale Antiseren mit einem Titer von 10⁴ oder größer werden ausgewählt und auf Kreuzreaktivität gegen andere nahe Verwandte Familienmitglieder, z. B. LIF, CT-1, CNTF oder andere Mitglieder der IL-6 Familie unter Verwendung eines kompetitiven Bindungsimmunoassays getestet, wie der in Harlow and Lane beschriebene, supra, Seiten 570–573. Vorzugsweise werden mindestens zwei einzelne IL-6/IL-12 Familienmitglieder für die Untersuchung in Verbindung mit dem Ziel verwendet. Diese langkettigen Zytokin Familienmitglieder können als rekombinante Proteine erzeugt und unter Verwendung von molekularbiologischen und Proteinchemie Standardverfahren, wie hierin beschrieben, isoliert werden. Antikörperzusammensetzungen können daher identifiziert oder hergestellt werden, welche die gewünschte Selektivität oder Spezifität für Untergruppen der IL-12 p40/IL-B30 Familienmitglieder aufweisen. Alternativ dazu können Antikörper hergestellt werden, die an Fusionspolypeptid formen des Komplexes binden, der IL-12 p40 und IL-B30 umfaßt.
Immunoassays mit einem kompetitiven Bindungsformat können zur Bestimmung der Kreuzreaktivität benutzt werden. Das Fusionsprotein kann beispielsweise auf einem festen Träger immobilisiert werden. Die Proteine werden zu dem Assay gegeben und konkurrieren im Hinblick auf die Bindung der selektiven Antiseren mit dem immobilisierten Antigen. Die Fähigkeit der obigen Proteine im Hinblick auf die Bindung der selektiven Antigene mit dem immobilisierten Protein zu konkurrieren wird mit dem Fusionsprotein verglichen. Die Prozentuale Kreuzreaktivität des obigen Proteins wird errechnet, wobei Standardrechnungen benutzt werden. Die Antiseren mit weniger als 10% Kreureaktivität wird jedem der oben genannten Proteine werden ausgewählt und vereinigt. Kreuzreaktive, selektive Antikörper werden anschließend aus vereinigten Antiseren mittels Immunoabsorption unter Verwendung der oben genannten Proteine entfernt.
Die immunoabsorbierten und vereinigten Antiseren werden anschließend in einem wie oben beschriebenen kompetitiven Bindungsimmunoassay verwendet, um ein zweites Protein mit dem Immunogen Fusionsprotein zu vergleichen. Um diesen Vergleich durchführen zu können werden die beiden Proteine jeweils bei einem weiten Bereich an Konzentration untersucht und die Menge jedes Proteins, die benötigt wird, um 50% der Bindung der selektiven Antiseren an das immobilisierte Fusionsprotein zu hemmen wird bestimmt. Sofern die benötigte Menge des zweiten Proteins weniger als die doppelte Menge des benötigten Fusionsproteins beträgt, kann man davon ausgehen, daß das zweite Protein selektiv an den Antikörper bindet, der mit dem Immunogen erzeugt wurde.
III. Physikalische Varianten
Hierin werden ferner Komplexe beschrieben, die Proteine oder Peptide umfassen, die eine wesentliche Aminosäuresequenzidentität mit den Aminosäuresequenzen des IL-12 p40/IL-B30 Antigens aufweisen. Diese Varianten umfassen Arten, polymorphe oder allelische Varianten.
Aminosäuresequenz-Homologie oder Sequenzidentität wird bestimmt, indem die Übereinstimmungen der Rest optimiert werden, sofern notwendig durch die Aufnahme von Leerstellen. Siehe auch Needleham et al., (1970) J. Mol. Biol. 48:443–453; Sankoff et al., (1983) Kapitel 1 in Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA; und Softwarepakete von IntelliGenetics, Mountain View, CA; und der University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI. Die Sequenzidentität verändert sich, sofern konservative Substitution als Übereinstimmung angesehen werden. Konservative Substitutionen umfassen typischerweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Glyzin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin. Die Konservierung kann im Hinblick auf biologische Merkmale, funktionale Merkmale oder strukturale Merkmale betrachtet werden. Homologe Aminosäuresequenzen sollen üblicherweise natürliche polymorphe oder allelische Interspezies Variationen einer Proteinsequenz umfassen. Typische Homologien bei Proteinen oder Peptiden werden daher eine Identität von 25–100% (sofern Leerstellen aufgenommen werden können) bis 50–100% sofern konservative Substitutionen aufgenommen werden) mit der Aminosäuresequenz des IL-B30 aufweisen. Identitätsberechnungen werden mindestens etwa 35%, allgemein mindestens etwa 40%, häufig mindestens etwa 50%, typischerweise mindestens etwa 60%, üblicherweise mindestens etwa 70%, vorzugsweise mindestens etwa 80%, und besonders bevorzugt mindestens etwa 90% betragen.
Die isolierte IL-12 p40 oder IL-B30 DNA kann unmittelbar durch Nukleotidsubstitutionen, Nukleotiddeletionen, Nukleotidinsertionen und Inversionen kurzer Peptidabschnitte verändert werden. Die Veränderungen erzeugen neue DNA Sequenzen, welche für diese Antigene, deren Derivate oder Proteine mit ähnlichen physiologischen, immunogenen, Antigenen oder anderen funktional Aktivitäten kodieren. Diese veränderten Sequenzen können zur Herstellung mutierter Antigene oder zur Steigerung der Expression verwendet werden. Eine gesteigerte Expression kann die Genamplifikation, gesteigerte Transkription, gesteigerte Translation und weitere Mechanismen umfassen. „Mutiertes IL-B30" umfaßt ein Polypeptid, das anderweitig in die Sequenzidentitätsdefinition des IL-B30 fällt, wie oben dargestellt wurde, jedoch eine Aminosäuresequenz aufweist, welche von der üblicherweise in der Natur gefundenen Sequenz des IL-B30 durch Deletion, Substitution oder Insertion abweicht. Dies umfaßt allgemein Proteine, die signifikante Identität mit einem Protein der Sequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist und verschiedene biologische Aktivitäten, z. B. Antigene oder Immunogene, mit den Sequenzen teilt und in bevorzugten Ausführungsformen die meisten der natürlichen Sequenzen vollständiger Länge enthält. Sequenzen vollständiger Länge werden üblicherweise bevorzugt, obwohl trunkierte Versionen auch nützlich sein werden. In ähnlicher Weise werden Gene oder Proteine, die in natürlichen Quellen gefunden werden, üblicherweise am meisten bevorzugt. Ähnliche Konzepte gelten für verschiedene IL-B30 Proteine, insbesondere solche, die in verschiedenen warmblütigen Tieren, z. B. Säugetieren und Vögeln, gefunden werden. Es wird davon ausgegangen, daß die Beschreibungen allgemein verschiedene IL-B30 Proteine umfassen und nicht auf die bestimmte Primaten Ausführungsformen, die hier diskutiert wurden, beschränkt sind.
IL-12 p40 oder IL-B30 Mutagenese kann auch durch Aminosäureinsertion oder -deletion erzielt werden. Substitutionen, Deletionen, Insertionen, oder beliebige Kombinationen können durchgeführt werden, um zu dem finalen Konstrukt zu gelangen. Insertionen umfassen Amino- oder Carboxy-terminale Fusionen. Zufällige Mutagenese kann bei einem Zielkodon durchgeführt werden und die exprimierten Mutanten können anschließend auf die gewünschte Aktivität hin untersucht werden. Verfahren zur Durchführung von Substitutionsmutationen an vorbestimmte Stellen in der DNA mit bekannter Sequenz sind im Stand der Technik gut bekannt, z. B. durch M13 Primer Mutagenese oder Polymerase Kettenreaktionen (PCR). Siehe z. B. Sambrook et al., (1989); Ausubel el al., (1987 und Supplemente); und Kunkel et al., (1987) Methods in Enzymol. 154:367–382. Bevorzugte Ausführungsformen umfassen z. B. 1-fach, 2-fach, 3-fach, 5-fach, 7-fach, etc., vorzugsweise Konservativsubstitutionen auf der Nukleotid oder Aminosäureebene. Vorzugsweise werden die Substitutionen in einiger Entfernung von den konservierten Cysteinen durchgeführt und häufig in den Regionen mit Entfernung zu den helikalen Strukturdomänen. Entsprechende Varianten können nützlich sein, um spezifische Antikörper zu erzeugen und werden häufig viele oder alle biologische Eigenschaften teilen. Die Erkennung der Zytokinstruktur stellt eine wichtige Einsicht in die Struktur und Positionen der Reste zur Verfügung, die verändert werden können, um gewünschte Veränderungen in der Rezeptorinteraktion zu erwirken. Die Interaktion des IL-12 p40 mit dem IL-B30 Protein benötigt ferner komplementäre Strukturmerkmale in der Interaktionsfläche. Eine strukturelle Analyse wird die Voraussetzung schaffen, um die Oberflächenreste zu bestimmen, die sowohl für die Bildung des Komplexes und für die Komplexrezeptorinteraktion kritisch sind.
Ferner werden rekombinante Proteine offenbart, z. B. heterologe Fusionsproteine, die Abschnitte aus diesen Proteinen verwenden. Ein heterologes Fusionsprotein stellt eine Fusion der Proteine oder Abschnitte dar, die natürlicherweise nicht in dieser Art fusioniert vorliegen. Eine ähnliches Konzept ist auf heterologe Nukleinsäuresequenzen anwendbar.
Zusätzlich können neue Konstrukte durch Kombination ähnlicher funktionaler Domänen anderer Proteine hergestellt werden. Die Bindung des Ziels oder anderer Abschnitte können zwischen verschiedenen neuen Fusionspolypeptiden oder Fragmenten „getauscht" werden. Siehe z. B. Cunningham et al., (1989) Science 243:1330–1336; und O'Dowd et al., (1988) J. Biol. Chem. 263:15985–15992.
Das Phosphoramidit-Verfahren, das von Beaucage und Carruthers beschrieben wurde (1981) Tetra Letts. 22:1859–1862, wird geeignete synthetische DNA Fragmente erzeugen. Ein doppelsträngiges Fragment wird üblicherweise durch Synthese des komplementären Strangs und Anlagerung des Stranges unter geeigneten Bedingungen oder durch Zugabe des komplementären Strangs unter Verwendung von DNA Polymerase und einer geeigneten Primersequenz, z. B. PCR Verfahren, erhalten.
Die strukturelle Analyse kann auf diese Gen im Vergleich zu den IL-6 Familie der Zytokine angewendet werden. Die Familie umfaßt, z. B. IL-6, IL-11, IL-12, G-CSF, LIF, OSM, CNTF und Ob. Die Anlagerung der menschlichen und Maus IL-B30 Sequenzen mit anderen Mitgliedern der IL-6 Familie sollte es ermöglichen, strukturelle Merkmale zu definieren. Insbesondere können die β-Faltblatt und α-Helixreste mittels z. B. dem RASMOL Programm bestimmt werden, siehe Bazan et al., (1996) Nature 379:591; Lodi et al., (1994) Science 263:1762–1766; Sayle und Milner-White (1995) TIBS 20:374–376; und Gronenberg et al., (1991) Protein Engineering 4:263–269. Siehe ferner Wilkins et al, (Herausgegeben, 1997) Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics Springer-Verlag, NY. Bevorzugte Reste für Substitutionen umfassen die Oberflächenexponierten Reste, von denen angenommen werden kann, daß sie mit dem Rezeptor interagieren. Weitere Rest, welche die Funktion konservieren sollten werden konservativ substituiert, insbesondere bei einer Position, die weit von einem Oberflächenexponierten Rest entfernt ist.
IV. Funktionale Varianten
Die Blockierung der physiologischen Reaktion des IL-12 p40/IL-B30 Komplexes kann in der kompetitiven Hemmung der Bindung des Liganden an den Rezeptor führen. Die Identifizierung einer Untereinheit des Rezeptors, welche die weitere Kennzeichnung wie beschrieben ermöglicht, und die Verwendung von Antikörpern gegen diese Untereinheit, mittels derer die Bindung und/oder Signalgebung durch den Komplex gehemmt wird, stellen weiter Ausführungsformen dar.
In vitro Assays, die hierin beschrieben werden, verwenden häufig isolierte Komplexe, Proteine, lösliche Fragmente, die Rezeptorbindende Abschnitte dieser Proteine oder Fragment an ei ne fest Phase gebunden enthalten. Diese Assays können auch für die Diagnostische Bestimmungen der Wirkungen der Mutationen und Veränderungen in dem Bindungsabschnitt oder der Mutationen und Veränderungen in dem Zytokin verwendet werden, z. B. IL-12 p40/IL-B30 Komplex Analoga. Die Erfindung sieht die Verwendung kompetitiver Wirkstoffscreeningassays vor, z. B. solche in denen neutralisierende Antikörper gegen den Zytokinkomplex oder Rezeptor bindende Fragmente mit einer Testverbindung konkurrieren.
„Derivate" der IL-12 p40/IL-B30 Antigene umfassen Aminosäuresequenzmutanten, der natürlicherweise auftretenden Formen, Glykosilierungsvarianten und kovalente oder aggregierte Konjugate mit weiteren chemischen Gruppen. Kovalente Derivate können durch Verknüpfung der Funktionen der Gruppen, die in den Aminosäureseitenketten des IL-12 p40/IL-B30 Komplexes gefunden werden oder an dem N- oder C-Terminus, z. B. mittels Standardverfahren. Siehe z. B. Lundblad und Noyes, (1988) Chemical Reagents for Protein Modification, vol. 1–2, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL; Hugli (Herausgegeben, 1989) Techniques in Protein Chemistry, Academic Press, San Diego, CA; und Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Press, Boca Raton, FL.
Insbesondere sind Veränderungen der Glykosilierung umfaßt, z. B. Veränderungen des Glykosilierungsmuster eines Polypeptids während der Synthese und der Prozessierung oder in weiteren Prozessierungsschritten. Siehe, z. B. Elbein (1987) Ann. Rev. Biochem. 56:497–534. Ferner umfaßt sind Versionen der Peptide mit derselben primären Aminosäuresequenz, die weitere geringere Veränderungen aufweisen, darunter phosphorylierte Aminosäurereste, z. B. Phosphotyrosine, Phosphoserine, Phosphotreonin.
Fusionspolypeptide zwischen dem IL-12 p40 und IL-B30 werden ferner zur Verfügung gestellt. Viele Zytokinrezeptoren oder andere Oberflächenproteine sind multimer, z. B. homodimere Einheiten und ein Repeatkonstrukt kann verschiedene Vorteile aufweisen, darunter verringerte Anfälligkeit für proteolytischen Verdau. Typische Beispiele sind Fusionen eines Reporterpolypeptids, z. B. Luciferase mit einem Abschnitt oder einer Domäne eines Proteins, z. B. einem Rezeptorbindenden Abschnitt, so daß die Gegenwart oder der Aufenthaltsort des fusionierten Liganden schnell bestimmt werden kann. Siehe z. B. Dull et al., U.S. Patentnummer 4,859 609 . Weitere Genfusionspartner umfassen bakterielle β-Galaktosidase, trpE, Protein A, β-Laktamase, alpha Amylase, Alkoholdehydrogenase, Hefe alpha mating factor und Nachweis oder Reinigungs Tags wie eine FLAG Sequenz oder HisE Sequenz. Siehe z. B. Godowski et al., (1988) Science 241:812–816. Es werden ferner Fusionskonstrukte mit weiteren therapeutischen Einheiten zur Verfügung gestellt, z. B. solche die gemeinsam verabreicht aber proteolytisch verdaut werden.
Fusionspolypeptide werden üblicherweise mittels rekombinanter Nukleinsäureverfahren oder durch synthetische Polypeptidverfahren hergestellt. Verfahren der Veränderung von Nukleinsäurenexpression sind allgemein im Stand der Technik beschrieben, z. B. in Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage), vol. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory; und Ausubel et al., (Herausgegeben 1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene und Wiley, NY. Verfahren zur Synthese der Polypeptide werden z. B. in Merrifield, (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149–2156; Merrifield, (1986) Science 232:341–347; Atherton et al., (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Pratical Approach, IRL Press, Oxford; und Grant, (1992) Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman, NY. Renaturierungsverfahren können auf synthetische Proteine angewendet werden.
Die Erfindung sieht ferner die Verwendung der Derivate der IL-12 p40 oder IL-B30 Proteine vor, die über die Variation in der Aminosäuresequenz oder der Glykosilierung hinausgehen. Entsprechende Derivate können kovalent oder aggregiert mit Chemischen Gruppen oder Proteinträgern assoziiert sein. Kovalente oder aggregierte Derivate können als Immunogene, Reagenzien für Immunoassays oder in Reinigungsverfahren, wie für die Affinitätsreinigung der Bindungspartner, z. B. weitere Antigene verwendet werden. Ein IL-12 p40 oder IL-B30 kann mittels kovalenter Bindung an einen festen Träger, wie Cyanogenbromid aktivierte Sepharose durch im Stand der Technik gut bekannte Verfahren immobilisiert oder auf Polyolefinflächen mit oder ohne Glutaraldehydvernetzung absorbiert werden, damit diese für Assays auf Reinheit der Anti-IL-12 p40 oder IL-B30 Antikörper oder eines alternativen Bindemittels hin untersucht werden können. Die IL-12 p40/IL-330 Polyfusionsproteine können ferner mit einer nachweisbaren Gruppe markiert werden, z. B. zur Verwendung in Diagnostischen Assays. Die Reinigung des IL-12 p40/IL-B30 Komplexes kann durch einen immobilisierten Antikörper gegen einen der Polypeptidsequenzbestandteil oder komplementären Bindungspartner durchgeführt werden, z. B. Bindungsteil eines Rezeptors.
Ein erfindungsgemäßes gelöstes IL-12 p40/IL-B30 Polypeptid oder ein Fragment davon kann als Immunogen für die Herstellung von Antiseren oder Antikörpern mit spezifischer Bindung verwendet werden. Das gereinigte Antigen kann dazu verwendet werden, um monoklonale Antikörper oder Antigen-bindende Fragmente davon, darunter Antigenbindende Fragmente natürlicher Antikörper, z. B. Fab, Fab', F(ab)₂, etc. Gereinigte IL-12 p40/IL-B30 Antigene können ferner als Reagenz für den Nachweis von Antikörper verwendet werden, die in Reaktion auf die Gegenwart der gesteigerten Mengen des Zytokinkomplexes gebildet werden, was ein diagnostischer Hinweis auf ein nicht-normalen oder spezifisch physiologisch oder Krankheitszustand gibt. Ferner werden Antikörper offenbart, die gegen Aminosäuresequenzen gezogen wurden, für welche die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nukleotidse quenz oder Fragmente von Proteinen, welche diese enthalten, gerichtet sind. Insbesondere werden Antikörper offenbart, die eine Bindungsaffinität für oder gegen bestimmte Domänen gerichtet sind, z. B. Helices, A, B, C oder D des IL-B30 oder Ig Domäne des IL-12 p40.
Ferner wird die Isolierung weiterer nahe verwandter Artvarianten überschrieben. Southern und Northern Blot Analysen konnten zeigen, daß ähnliche genetische Einheiten in weiteren Säugetieren existieren. Es erscheint wahrscheinlich, daß IL-B30 in vielen verschiedenen Artvarianten vorliegt, z. B. Nager, hasenartige, Karnivoren, Paarhufer, Unpaarhufer und Primaten.
Die Erfindung betrifft ferner Mittel zur Isolierung einer Gruppe Verwandter Antigene, welche sowohl Unterschiede und Ähnlichkeiten in Struktur, Expression und Funktion enthalten. Die Aufklärung verschiedener physiologischer Wirkungen der Moleküle wird durch die Isolierung und Kennzeichnung weiterer bestimmter Arten oder polymorpher Varianten davon schnell beschleunigt werden. Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere nützliche Sonden zur Identifizierung weiterer homologer genetischer Einheiten in verschiedenen Arten zur Verfügung.
Die isolierten Gene ermöglichen eine Transformation von Zellen, welche keine IL-B30 Expression aufweisen z. B. entweder Zellen der selben Art, welche entsprechende Proteine nicht enthalten und einen negativen Hintergrund an Aktivität aufweisen. Dies sollte eine Analyse der Funktion des IL-B30 im Vergleich zu nicht-transformierten Kontrollzellen ermöglichen.
Eine Zergliederung der kritischen strukturellen Elemente, welche die verschiedenen physiologischen Wirkungen verursachen, die durch diese Antigene vermittelt werden, kann unter Verwendung von Standardverfahren der molekularen Biologie durchgeführt werden, insbesondere durch Vergleich von Mitgliedern der verwandten Klasse. Sie z. B. die Homologie Scanning Mutageneseverfahren die von Cunningham et al. beschrieben werden (1989) Science 243:1339–1336; und die von O'Dowd et al. genutzten Ansätze (1988) J. Biol. Chem. 263:15985–15992; und Lechleiter et al., (1990) EMBO J. 9:4381–4390.
Intrazelluläre Wirkungen bedingen voraussichtlich die Signalgebung des Rezeptors. Proteininteranalysierung kann jedoch unter bestimmten Umständen auftreten und Interaktionen zwischen Intrazellulären Bestandteilen und einem Zytokin können vorkommen. Spezifische Interaktionsabschnitte des IL-B30 mit interagierenden Bestandteilen können durch Mutagenese oder unmittelbare biochemische Mittel identifiziert werden, z. B. durch Vernetzung oder Affinitätsverfahren. Strukturelle Analyse mittels kristallographischer oder anderer physikalischer Verfahren angewendet werden. Weitere Untersuchungen des Mechanismus der Signalweiterleitung werden die Analyse assoziierter Bestandteile umfassend, die mittels Affinitätsverfahren oder durch genetische Mittel isolierbar sind, z. B. durch Komplementationsanalyse der Mutanten.
Weitere Studien zur Expression und Kontrolle des IL-B30 werden durchgeführt. Die Kontrollelemente, die mit diesen Antigenen assoziiert sind, sollten differenzielle physiologische, entwicklungsbiologische, gewebespezifische und weitere Expressionsmuster aufweisen. Stromaufwärts oder stromabwärts liegende genetische Bereiche, z. B. Kontrollelemente sind von besonderem Interesse.
Strukturelle Studien des IL-B30 Antigens werden zum Design neuer Antigene führen, insbesondere zu Analoga, die Agonist oder Antagonist-Eigenschaften des Moleküls aufweisen. Dies kann mit den zuvor beschriebenen Screeningverfahren dazu kombiniert werden, um Antigene mit dem gewünschten Aktivitätsspektrum zu isolieren.
V. Antikörper
Wie hierin offenbart, können Antikörper gegen verschiedene Epitope des p40/IL-B30 Proteins gebildet werden, darunter artspezifische, polymorphe oder allele Varianten und Fragmente davon, sowohl in ihrer natürlicherweise vorkommenden Form, als auch in deren rekombinanten Formen. Wie ebenfalls hierin offenbart, können Antikörper ferner gegen die aktive Form oder die inaktive Form des IL-B30 gebildet werden, was native oder denaturierte Versionen umfaßt. Anti-idiotypische Antikörper sind ebenfalls vorgesehen.
Antikörper, umfassend Bindungsfragmente und Einzelkettenversionen, gegen bestimmte Fragmente der Antigene können durch Immunisierung eines Tier mit Konjugaten der Fragmente und immunogenen Proteinen erzeugt werden. Monoklonale Antikörper werden aus den Zellen, welche den gewünschten Antikörper sekretieren, hergestellt. Diese Antikörper können auf Bindung an normales oder defektes IL-B30 gescreent werden oder auf agonistische oder antagonistische Aktivität hin gescreent werden, z. B. durch einen Rezeptor vermittelt. Antikörper können agonistisch oder antagonistisch sein, z. B. durch sterische Blockierung der Rezeptorbindung. Die monoklonalen Antikörper werden üblicherweise mit eine KD von mindestens etwa 1 mM, noch üblicher mindestens etwa 300 μM, typischerweise mindestens etwa 100 μM, noch typischer mindestens etwa 30 μM, vorzugsweise mindestens etwa 10 μM und am meisten bevorzugt mindestens etwa 3 μM oder besser binden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können für diagnostische Anwendungen genutzt werden. Als neutralisierender Antikörper können sie für kompetitive Bindungsassays benutzt werden. Sie sind ferner für den Nachweis und die Quantifizierung des IL-B30 Proteins und seines Rezeptors zu verwenden. Siehe z. B. Chan, (herausgegeben 1987) Immunology: A Practical Guide, Aca demic Press, Orlando, FL; Price und Newman, (herausgegeben 1991) Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press, N. Y.; und Ngo, (herausgegeben 1988) Nonisotopic Immunoassy, Plenum Press, N. Y. Kreuzabsorptionen oder weitere Tests werden Antikörper identifizieren, die verschiedene Spezifitätsspektra aufweisen, z. B. einzigartige oder gemeinsame Artspezifitäten.
Die erfindungsgemäßen Antikörper, darunter Antigenbindungsfragmente können ferner starke Antagonisten sein, welche das Antigen binden und eine funktional Bindung hemmen, z. B. an einen Rezeptor, der eine biologische Reaktion auslösen kann. Sie können auch als nicht-neutralisierende Antikörper nützlich sein und können an Toxine oder Radionuklide gekoppelt werden, so daß bei Bindung des Antikörpers an sein Antigen eine Zelle, welche dieses exprimiert, z. B. auf ihrer Oberfläche, getötet wird. Diese Antikörper können ferner mit Wirkstoffen und anderen therapeutischen Agentien entweder unmittelbar oder mittelbar unter Verwendung eines Linkers konjugiert werden und können Wirkstofftargeting bewirken.
Antigenfragmente können mit anderen Materialien verknüpft werden, insbesondere Polypeptiden, durch Fusion oder kovalente Verbindungen der Polypeptide, um als Immunogen verwendet zu werden. Ein Antigen und seine Fragmente können mit einer Vielzahl an Immunogenen fusioniert oder kovalent verknüpft werden, wie beispielsweise Keyhole Limpet Hämocyanin, bovines Serumalbumin, Tetanustoxoid, etc. Siehe Microbiology; Hoeber Medical Divison, Harper and Row, 1969; Landsteiner, (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York; Williams et al., (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, vol. 1, Academic Press, New York; and Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY, für Beschreibungen von Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antiseren.
In einigen Fällen ist es gewünscht, monoklonale Antikörper aus verschiedenen Säugetierwirten zu erzeugen, wie aus Mäusen, Nagern, Primaten, Menschen, etc. Die Verfahren zur Herstellung entsprechender monoklonaler Antikörper wurden beschrieben und können gefunden werden in, z. B. Stites et al., (Herausgeber) Basic and Clinical Immunology (4. Ausgabe), Lange Medical Publications, Los Altos, CA und die Literaturstellen, die darin zitiert werden; Harlowe and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding; (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. Ausgabe), Academic Press, New York; und insbesondere Kohler und Milstein, (1975) Nature 256:495–497, in dem ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper diskutiert wird.
Weitere geeignete Verfahren umfassen in vitro Umsetzung von Lymphozyten mit antigenen Polypeptid oder alternativ die Selektion von Bibliotheken von Antikörpern, Phagen oder ähnlichen Vektoren. Siehe Huse et al., (1989) „Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda" Science 246:1275–1281; und Ward et al., (1989) Nature 341:544–546. Die erfindungsgemäßen Polypeptide und Antikörper können mit oder ohne Veränderungen verwendet werden, darunter chimäre oder humanisierte Antikörper. Die Polypeptide und Antikörper werden häufig markiert, indem diese entweder kovalent oder nicht-kovalent mit einer Substanz verknüpft werden, die ein nachweisbares Signal bereitstellt. Eine Vielzahl von Markierungen und Verknüpfungsverfahren sind bekannt und sowohl in der wissenschaftlichen als auch in der Patentliteratur umfassend beschrieben. Entsprechende Markierungen umfassen Radioloquide, Enzyme, Substrate, Co-faktoren, Inhibitoren, fluoreszierende Gruppen, chemilumineszierende Gruppen, magnetische Partikel und ähnliche. Patente, welche die Verwendung entsprechender Markierungen lehren, umfassen US Patent Nummern 3,817,837 ; 3,850,752 ; 3,939,350 ; 3,996,345 ; 4,277,437 ; 4,275,149 ; und 4,366,241 . Rekombinante Immunoglobuline können ferner hergestellt werden, siehe Cabilly US Patent Nummer 4,816,567 ; Moore et al., US Patent Nummer 4,642,234 ; und Queen et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch zur Affinitätschromatographie für die Isolierung des Proteins verwendet werden. Die Säulen können hergestellt werden, in denen die Antikörper mit dem ersten Träger verknüpft werden. S. z. B. Wilchek et al., (1984) Meth. Enzymol. 104:3–55. Im Gegensatz dazu kann das Protein zur Abreinigung oder als Absorption verwendet werden, um selektiv spezifische Bindungszusammensetzungen zu erhalten.
Ferner werden Antikörper offenbart, die gegen IL-B30 erzeugt wurden und die dazu geeignet sind anti-idiotypische Antikörper zu erzeugen. Diese können für den Nachweis oder die Diagnose verschiedener immunologischer Zustände nützlich sein, welche mit der Expression der entsprechenden Antigene verknüpft sind.
VI. Nukleinsäuren
Die beschriebenen Peptidsequenzen und die verwandten Reagenzien sind für den Nachweis, die Isolierung oder Identifizierung eines DNA Klons nützlich, welcher sowohl IL-12 p40 oder IL-B30 kodiert, z. B. aus einer natürlichen Quelle. Üblicherweise werden sie dazu genutzt Gene aus einem Säugetier zu isolieren und ähnliche Verfahren können angewendet werden, um Gene aus anderen Arten zu isolieren, z. B. warmblütigen Tieren, wie Vögel und Säugetieren. Kreuzhybridisierung ermöglicht die Isolierung von IL-12 p40 oder IL-B30 aus denselben, z. B. polymorphe Varianten oder andere Arten. Eine Anzahl verschiedener Ansätze stehen zur Verfügung, um geeignete Nukleinsäureklone erfolgreich zu isolieren. Entsprechende Gene ermöglichen die In struktion von Koexpressionskonstrukten oder Fusionskonstrukten.
Das gereinigte Protein oder die Polypeptide können zur Herstellung von Antikörpern mittels der oben beschriebenen Standardverfahren verwendet werden. Synthetische Peptide oder gereinigtes Protein kann einem Immunsystem präsentiert werden, um monoklonale oder polyklonale Antikörper zu erzeugen. Siehe z. B. Coligen, (1991), Current Protocols in Immunology Wiley/Green; and Harlo and Lane, (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press.
Spezifische Bindemittel können beispielsweise für das Screening einer Expressionsbibliothek verwendet werden, die aus einer Zellinie gewonnen wurde, welche sowohl IL-12 p40 und IL-B30 exprimiert. Das Screening der intrazellulären Expression kann unter Verwendung verschiedener Färbe- oder Immunofluoreszenzverfahren durchgeführt werden. Die Bindemittel können für die Affinitätsreinigung oder zur Aussortierung von Zellen, welche ein Fusionsprotein auf der Oberfläche exprimieren, genutzt werden.
Die Peptidabschnitte können auch für die Selektion oder Identifizierung geeigneter Oligonukleotide durch Screening einer Bibliothek benutzt werden. Der genetische Code kann dazu verwendet werden, geeignete Oligonukleotide auszuwählen, die für das Screening als Sonden verwendet werden können. Siehe z. B. GenBank und SEQ ID NO: 1. In Kombination mit dem Verfahren der Polymerase Kettenreaktion (PCR), werden synthetische Oligonukleotide für die Auswahl richtiger Klone aus einer Bibliothek nützlich sein. Komplementäre Sequenzen werden ebenfalls als Sonden, Primer oder Antisensestränge benutzt. Verschiedene Fragmente können von besonderem Nutzen sein, z. B. wenn sie mit einem Vektor verbunden sind oder mit Poly-A komplementären PCR Verfahren oder mit komplementärer DNA anderer Peptide.
Die Erfindung sieht vor, daß isolierte DNA oder Fragmente, die für biologisch aktive Komplexe der entsprechenden IL-12 p40 und IL-B30 Polypeptide kodieren, insbesondere den Teil nicht aufweisen, der für die nicht-translatierten Bereiche der ausgewählten Sequenzen kodiert. Die Erfindung umfaßt ferner isolierte oder rekombinante DNA, die für biologisch aktive Fusionsproteine oder Polypeptide kodiert und die in der Lage ist, unter geeigneten Bedingungen mit den oben beschriebenen DNA Sequenzen zu hybridisieren. Das biologisch aktive Protein oder Polypeptid kann ein Antigen oder Fragment sein und eine Aminosäuresequenz aufweisen, die offenbart wird in z. B. SEQ ID NO:2, insbesondere ein reifes, sekretiertes Polypeptid. Ferner wird die Verwendung der isolierten oder rekombinanten DNA oder deren Fragmente die für die Proteine kodieren, die eine hohe Identität mit dem sekretierten IL-12 p40 IL-B30 Komplex aufweisen offenbart. Die isolierte DNA kann entsprechende regulatorische Sequenzen im 5'- und 3'-flankierenden Bereich aufweisen, Promotoren, Enhancer, Poly-A Additionssignale und weitere. Alternativ dazu kann die Expression bewirkt werden, indem der kodierende Abschnitt operativ mit einem heterologen Promoter verknüpft wird, z. B. durch Insertion eines Promotors stromaufwärts des endogenen Gens. Siehe z. B. Treco et al. WO96/29411 oder USSN 08/406,030.
Eine „isolierte" Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, z. B. eine RNA, DNA oder ein gemischter Polymer, welcher im wesentlichen von weiteren externen Bestandteilen getrennt wurde, die natürlicherweise die native Sequenz begleiten, z. B. Ribosomen, Polymerasen und/oder flankierende genomische Sequenzen aus der Ursprungsart. Der Begriff umfaßt eine Nukleinsäuresequenz, die aus der Umgebung, aus der sie natürlicherweise vorkommt, entfernt wurde und umfaßt rekombinante oder klonierte DNA Isolate und chemisch synthetisierte Analoga oder Analoga, die in heterologen Systemen biologisch synthetisiert wurden. Ein im we sentlichen reines Molekül umfaßt isolierte Formen des Moleküls, z. B. getrennt von einem isolierten Chromosomen. Im allgemeinen wird die Nukleinsäure einen Vektor oder ein Fragment mit weniger als etwa 50 kb sein, üblicherweise weniger als etwa 30 kb, typischerweise weniger als etwa 10 kb und vorzugsweise weniger als etwa 6 kb.
Eine isolierte Nukleinsäure wir im allgemeinen eine homogene Zusammensetzung von Molekülen darstellen, kann jedoch in einigen Ausführungsformen kleinere Heterogenitäten aufweisen. Diese Heterogenität wird typischerweise an den polymeren Enden oder Teilen gefunden, die nicht kritisch für die gewünschte biologische Funktion oder Aktivität sind.
Eine „rekombinante" Nukleinsäure wird entweder als Verfahren der Produktion oder Struktur definiert. Unter Bezugnahme auf das Herstellungsverfahren, z. B. ein Produkt, das durch ein Verfahren hergestellt wird, wobei das Verfahren die Verwendung rekombinanter Nukleinsäuretechniken darstellt, z. B. menschliches Eingreifen in die Nukleotidsequenz umfaßt, typischerweise durch Selektion oder Herstellung. Alternativ dazu kann die Nukleinsäure durch Erzeugung einer Sequenz hergestellt werden, die eine Fusion aus zwei Fragmenten umfaßt, welche natürlicherweise nicht miteinander verbunden sind, was jedoch natürliche Produkte ausschließt, z. B. natürlicherweise vorkommende Mutanten. Produkte, die z. B. durch Transformation von Zellen mit einem nicht natürlicherweise auftretenden Vektor hergestellt werden, sind daher umfaßt genauso wie Nukleinsäuren, die eine Sequenz umfassen, die von irgendeinem synthetischen Oligonukleotid-Verfahren abgeleitet wurde. Entsprechendes wird häufig ausgeführt, um ein Kodon durch ein redundantes Kodon zu ersetzen, das für dieselbe oder eine konservierte Aminosäure kodiert, wobei typischerweise eine Sequenzerkennungsstelle eingefügt oder entfernt wird.
Alternativ dazu können Nukleinsäureabschnitte mit gewünschten Funktionen miteinander verknüpft werden, um einzelne genetische Einheiten zu erzeugen, die eine gewünschte Kombination der Funktionen umfassen, die üblicherweise in natürlichen Formen nicht vorhanden ist. Restriktionsenzymschnittstellen sind häufig das Ziel entsprechender künstlicher Manipulationen, aber auch andere spezifische Zielstellen, z. B. Promotoren, DNA, Replikationsstellen, Regulationssequenzen, Kontrollsequenzen oder andere nützliche Merkmale können durch Design aufgenommen werden. Ein ähnliches Konzept ist für ein rekombinantes Polypeptid, z. B. Fusion, vorgesehen. Insbesondere sind synthetische Nukleinsäuren umfaßt, die für Redundanz des genetischen Codes für Polypeptide kodieren, die ähnlich zu Fragmenten dieses Antigens sind und Fusionen der Sequenzen mit verschiedenen Arten oder polymorphen Varianten.
Wie hierin beschrieben, besteht ein signifikantes „Fragment" im Hinblick auf Nukleinsäuren aus einem kontinuierlichen Abstand von mindestens etwa 17 Nukleotiden, allgemein mindestens etwa 22 Nukleotiden, üblicherweise mindestens etwa 29 Nukleotiden, häufiger mindestens etwa 35 Nukleotiden, typischerweise mindestens etwa 41 Nukleotiden, üblicherweise mindestens etwa 47 Nukleotiden, bevorzugt mindestens etwa 55 Nukleotiden und im besonders bevorzugten Ausführungsformen können mindestens etwa 60 oder mehr Nukleotide enthalten sein, z. B. 67, 73, 81, 89, 95 etc., umfassend Hunderte und/oder Tausende.
Eine DNA, die für ein IL-B30 Protein kodiert, wird besonders geeignet sein, Gene, mRNA und cDNA Arten zu identifizieren, welche für Verwandte oder ähnliche Proteine kodieren, sowie DNA, die für homologe Proteine anderer Arten kodieren. Homologe werden in anderen Arten gefunden, darunter Primaten, Nager, Hunde, Katzen und Vögel. Verschiedene IL-B30 Proteine sollten homolog sein und sind auch hierin offenbart. Sogar Proteine mit einem entfernteren Evolutionsverhältnis zu dem Antigen können über unter geeigneten Bedingungen unter Verwendung dieser Sequenzen isoliert werden, soweit diese ausreichend homolog sind. Primaten IL-B30 Proteine sind von besonderem Interesse. Ähnliches gilt für das IL-12 p40, deren Proteine ein primäres Ziel für Fusionskonstrukte oder Kombinationszusammensetzungen darstellt.
Rekombinate Klone, die von den genomischen Sequenzen abgeleitet werden, z. B. Introns enthalten, sind für transgene Untersuchungen geeignet, z. B. transgene Zellen und Organismen und Gentherapie. Siehe z. B. Goodnow, (1992) „Transgenic Animals" in Roitt (Herausgeber) Encyclopedia of Immunology, Academic Press, San Diego, S. 1502–1504; Travis, (1992) Science 256:1392–1394; Kuhn et al., (1991) Science 254:707–710; Capecchi (1989) Science 244:1288; Robertson (Herausgeber 1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; and Rosenberg (1992) J. Clinical Oncology 10:180–199.
Wesentliche Homologie, z. B. Identität in dem Nukleinsäurevergleich zeigt, daß die Abschnitte oder deren komplementären Strenge sofern die verglichen werden, identisch sind, wenn sie optimal aneinander gelagert werden, mit geeigneten Nukleotidinsertionen oder Deletionen bei mindestens etwa 50% der Nukleotide, allgemein mindestens etwa 58%, üblicherweise mindestens etwa 65%, häufig mindestens etwa 71%, typischerweise mindestens etwa 77%, üblicherweise mindestens etwa 85%, vorzugsweise mindestens etwa 95–98% oder mehr und besonders bevorzugt bis mindestens etwa 99% oder mehr der Nukleotide. Alternativ dazu liegt wesentliche Homologie vor, wenn die Abschnitte unter ausgewählten Hybridisierungs-Bedingungen mit einem Strang oder seinem Komplement hybridisieren, wobei typischerweise eine IL-12 p40 und/oder IL-B30 Sequenz verwendet wird, z. B. SEQ ID NO: 1. Typischerweise wird selektive Hybridisierung erfolgen, wenn mindestens etwa 55% Identität die beiden Abschnitt von mindestens 30 Nukleotide vorliegt, vorzugsweise mindestens etwa 75% über einem Abschnitt von etwa 25 Nukleotiden und besonders bevorzugt mindestens etwa 90% über ein Abschnitt von etwa 20 Nukleotiden. Siehe Kanehisa, (1984) Nucl. Acids Res. 12:203–213. Die Länge des hierin beschriebenen Identitätsvergleichs kann längere Abschnitte betreffen und wir in bestimmten Ausführungsformen dieser Offenbarung über einen Abschnitt von mindestens etwa 17 Nukleotiden, üblicherweise mindestens etwa 28 Nukleotiden, typischerweise mindestens 40 Nukleotiden und bevorzugt mindestens 75 bis 100 oder mehr Nukleotide umfassen.
Stringente Bedingungen, die einer Homologie im Sinne der Hybridisierung entsprechen, stellen stringente Bedingungen an Salz, Temperatur, organischen Lösungsmitteln und anderen Parametern dar, die üblicherweise Hybridisierungsreaktionen kontrollieren. Stringente Temperaturbedingungen umfassen üblicherweise Temperaturen von mehr als etwa 30°C, üblicherweise 4 mehr als etwa 37°C, typischerweise mehr als etwa 55°C noch typischer mehr als etwa 60 oder 65°C und vorzugsweise mehr als etwa 70°C. Stringente Salzbedingungen sind üblicherweise weniger als etwa 1000 mM, üblicherweise weniger als etwa 400 mM, typischerweise weniger als etwa 250 mM, vorzugsweise weniger als etwa 150 mM, darunter etwa 100, 50 oder sogar 20 mM. Die Kombination der Parameter ist jedoch noch wichtige als die Bestimmung eines einzelnen Parameters. Siehe z. B. Wetmur und Davidson, (1968) J. Mol. Biol. 31:349–370. Eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen sollte ein Hintergrund von mindestens in zweifachen des Hintergrunds erzeugen, vorzugsweise mindestens 3 bis 5-fach oder mehr.
Bei einem Sequenzvergleich wirkt eine Sequenz typischerweise als Vergleichssequenz, mit der Testsequenzen verglichen werden. Sofern ein Sequenzvergleichsalgorithmus verwendet wird, werden die Test- und Vergleichssequenzen in den Computer ein gegeben, Teilsequenzkoordinaten ausgewählt, soweit notwendig und die Programmparameter des Sequenzalgorithmus bestimmt. Der Vergleichsalgorithmus berechnet anschließend die prozentuale Sequenzidentität der Testsequenzen im Verhältnis zur Vergleichssequenz auf der Grundlage der ausgewählten Programmparameter.
Optische Anlagerung der Vergleichssequenzen kann erzielt werden, z. B. durch den örtlichen Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman, (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, durch den Homologie-Anlagerungsalgorithmus von Needleman und Wunsch, (1970), J. Mol.Biol. 48:443 durch das auf einer Suche nach Ähnlichkeit basierende Verfahren von Pearson und Lipman, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, durch computerimplementierte Anwendung dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASIA und TFASTA, die indem Wisconsin Genetics Software Package der Genetics Computer Group, 575 Science Dr. Madison, WI enthalten sind) oder visuelle Inspektion (siehe allgemein Ausubel et al., supra).
Ein nützlicher Algorithmus ist PILEUP. PILEUP erzeugt viele Sequenzanlagerungen aus einer Gruppe verwandter Sequenzen unter Verwendung progressiver paarweise Anlagerungen, um das Verhältnis und die prozentuale Sequenzidentität zu zeigen. Es wird ferner ein Stamm oder Dendogramm erstellt, daß die Cluster der Verhältnisse zeigt, die zur Herstellung der Anlagerung verwendet worden. PILEUP verwendet eine Vereinfachung des progressiven Verfahrens der Anlagerung von Feng und Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351–360. Das Verfahren ist ähnlich zu dem von Higgins und Sharp beschriebenen Verfahren (1989) CABIOS 5:151-153. Das Programm kann bis zu 300 Sequenzen anlagern, jede mit einer maximalen Gesamtlänge von 5000 Nukleotiden oder Aminosäuren. Verfahren der mehrfachen Anlagerungen beginnen mit einer paarweisen Anlagerung der beiden ähnlichsten Sequenzen, wodurch ein Cluster von zwei angelagerten Sequenzen ent steht. Dieser Cluster wird anschließend an die nächste Sequenz mit höchstem Ähnlichkeitsgrad oder einem Cluster angelagerter Sequenzen angelagert. Zwei Cluster der Sequenzen werden durch einfache Verlängerung der paarweisen Anlagerung zweier einzelner Sequenzen angelagert. Die finale Anlagerung wird durch eine Reihe progressiver paarweiser Anlagerung erzielt. Das Programm läuft, indem spezifische Sequenzen und deren Aminosäuren oder Nukleotidsequenzen für die Bereiche des Sequenzvergleichs angegeben und die Programmparameter angegeben werden. Eine Vergleichssequenz kann beispielsweise mit anderen Testsequenzen verglichen werden, um das Verhältnis der prozentualen Sequenzidentität zu bestimmen, wobei die folgenden Parameter verwendet werden können: vorgegebenes gap Gewicht (3.00), vorgegebenes gap Längengewicht (0.10) und gewichtete end gaps.
Ein weiters Beispiel eines Algorithmus, der zur Bestimmung einer prozentualen Sequenzidentität und Sequenzähnlichkeit geeignet ist, stellt der BLAST Algorithmus dar, welcher in Altschul et al., beschrieben wurde (1990) J. Mol. Biol. 215:403–410. Software zur Durchführung von BLAST Analysen ist von dem National Center for Biotechnology Information öffentlich erhältlich (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/). Dieser Algorithmus umfaßt zunächst Identifizierung von Sequenzpaaren mit hoher Wertung (HSPs), die als kurze Worte mit einer Länge W in der Abfragesequenz identifiziert werden, welche entweder passen oder einen positiv gewerteten Grenzwert T bei Anlagerungen mit einem Wort der selben Länge in einer Datenbanksequenz erfüllen. T ist der Grenzwert für die Punktzahl der benachbarten Worte (Altschul et al., supra). Die Treffer der ursprünglich benachbarten Worte fungieren als Grundlage für die Durchführung weiterer Recherchen nach längeren HSPs welche diese enthalten. Die Worttreffer werden dann in beide Richtungen entlang jeder Sequenz verlängert, soweit der kumulative Anlagerungswert ansteigt. Die Verlängerung der Worttreffer in jede Richtung werden angehalten, soweit: der kumulative Anlagerungswert um mehr als eine Menge X von dem maximal erzielten Wert abfällt; der kumulative Wert auf null oder aufgrund der Vermehrung von einem oder mehreren Anlagerungen mit negativer Punktzahl auf Null abfällt oder darunter; oder das Ende der Sequenz erreicht wird. Die Parameter des BLAST Algorithmus, W, T und X, bestimmen die Sensitivität und die Geschwindigkeit der Anlagerungen. Das BLAST verwendet eine voreingestellte Wortlänge (W) von 11, die durch BLOSUM62 Werte Matrize (siehe Henikoff und Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) Anlagerungen (B) von 50, Erwartungen (E) von 10, M = 5, N = 4 und einen Vergleich beider Stränge.
Zusätzlich zur Berechnung der prozentualen Sequenzidentität kann der BLAST Algorithmus eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen beiden Sequenzen durchführen (siehe z. B. Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873–5787). Ein Ähnlichkeitswert, der von dem BLAST Algorithmus zur Verfügung gestellt wird, stellt die kleinste Summe der Wahrscheinlichkeit dar (P(N)), welche ein Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit ergibt, mittels derer eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotiden oder Aminosäuresequenzen in der Natur auftrete würde. Eine Nukleinsäure wird beispielsweise im Verhältnis zu einer Vergleichssequenz als ähnlich betrachtet, wenn die kleinste Summe der Wahrscheinlichkeit im Vergleich der Testnukleinsäure zur Vergleichsnukleinsäure weniger als etwa 0,1, vorzugsweise weniger als etwa 0,01 und besonders bevorzugt weniger als etwa 0,001 ist.
Ein weiterer Hinweis darauf, daß zwei Nukleinsäuresequenzen von Polypeptiden im wesentlichen identisch sind liegt darin, daß das Polypeptid, für das die erste Nukleinsäure kodiert, immunologisch kreuzreaktiv mit dem Polypeptid ist, für das die zweite Nukleinsäure kodiert, wie nachfolgend beschrieben. Ein Polypeptid ist üblicherweise im wesentlichem identisch zu einem zweiten Polypeptid, z. B. wenn sich zwei Peiltide nur im konservativen Substitutionen unterscheiden. Ein weiterer Hinweis darauf, daß zwei Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen identisch sind, besteht darin, daß die beiden unter stringenten Bedingungen miteinander hybridisieren, wie nachfolgend beschrieben.
IL-B30 von anderen Säugetierarten kann durch artübergreifende Hybridisierung nahe verwandter Arten kloniert und isoliert werden. Die Homologien zwischen entfernt Verwandten Arten sind relativ gering und es ist daher ratsam, relativ nahe verwandte Arten miteinander zu hybridisieren. Alternativ dazu kann es nützlich sein Antikörper herzustellen, welche weniger Artspezifität aufweisen und diese für Expressionsklonierungs-Ansätze verwenden.
VII. Herstellung von p40/IL-B30 Kombinationen; Mimetika
DNA, welche für IL-12 p40 oder IL-B40 oder Fragmente davon kodiert, kann chemischer Synthese, dem Screening von cDNA Bibliotheken oder dem Screening von genomischen Bibliotheken, die aus einer Vielzahl von Zelllinien oder Gewebeproben hergestellt wurden, erhalten werden. Siehe z. B. Okayama und Berg (1982) Mol. Cell. Biol. 2:161–170; Gubler und Hoffman (1983) Gene 25:263–269; und Glover (Herausgeber 1984) DNA Cloning: A Practical Approach, IRL Press Oxford. Alternativ dazu können die hierin zur Verfügung gestellten Sequenzen nützliche PCR primer sein oder synthetische oder andere Herstellungsverfahren für geeignete Gene ermöglichen, welche für IL-12 p40 oder IL-B30 kodieren; darunter natürlicherweise vorkommende Ausführungsformen.
Diese DNA kann der Vielzahl von Wirtszellen zur Synthese eines IL-12 p40 und IL-B30 vollständiger Länge oder von Fragmenten davon genutzt werden, welche wiederum z. B. verwendet werden, um polyklonale oder monoklonale Antikörper zu erzeugen; für Bindungsstudien; für die Herstellung und Expression von veränderten Molekülen; und zur Durchführung von Struktur/Funktionsstudien.
Die hierin verwendeten Vektor umfassen Plasmide, Vieren, Bakteriophagen, integrierbare DNA Fragmente und andere Vehicle, welche die Integration von DNA Fragmenten in das Genom eines Wirts ermöglichen. Siehe z. B. Pouwels et al., (1985 und Supplemente) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N. Y.; und Rodriguez et al., (Herausgeber 1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses, Buttersworth, Boston, MA.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die DNA Sequenzen operativ verknüpft, wenn sie funktional miteinander in Beziehung stehen sollen. Die DNA führt eine Vorsequenz oder eine sekretorische Leadersequenz kann beispielsweise mit einem Polypeptid operativ verknüpft werden, wenn es als Prä-Protein exprimiert wird oder an der Steuerung des Polypeptids zur Zellmembran oder bei der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist. Ein Promoter wird operativ mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn er die Transkription des Polypeptids kontrollieren soll; eine Ribosomen-Bindungsstelle wird operativ mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn diese in eine Position gebracht wird, welche Translation ermöglicht. Operativ verknüpft heiß üblicherweise kontinuierlich und im Leseraster, bestimmte genetische Elemente, wie Repressorgene, werden jedoch nicht kontinuierlich verknüpft, sondern binden an Operatorsequenzen, die wiederum die Expression kontrollieren. Siehe z. B. Rodriguez et al., Chapter 10 S. 205–236; Balbas und Bolivar (1990) Methods in Enzymology 185:14–37; und Aususbel et al., (1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, NY. Die Koexpression von zwei kodierenden Sequenzen ist von besonderem Interesse hierin.
Ausgewählte Beispiele geeigneter Expressionsvektor umfassen pCDNAl; pCD, siehe Okayama et al., (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136–1142; pMClneo Poly-A, siehe Thomas et al., (1987) Cell 51:503–12; und einen Baculovirusvektor, wie pAC 373 oder pAC 610. Siehe z. B. Miller (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42:177–199.
Es wird häufig gewünscht, ein IL-12 p40 und/oder IL-B30 Polypeptid in einem System zu exprimieren, daß ein spezifisches und definiertes Glykosylierungsmuster erzeugt. Siehe z. B. Lukkow und Summers (1988) Bio/Technology 6:47–55; und Kaufman (1990) Meth. Enzymol. 185:487–511.
Das IL-12 p40 und/oder IL-B30 oder ein Fragment davon kann so verändert werden, daß es über Phosphatidyl Inositol (PI) mit einer Zellmembran vernetzt wird, von dem Membran jedoch mit einem Phosphatidyl Inositol schneidenden Enzym entfernt wird, z. B. Phosphatidyl Inositol Phospholipase-C. Dieses Vorgehen setzt das Antigen in biologisch aktiver Form frei und ermöglicht die Reinigung mittels Standardverfahren der Proteinchemie. Siehe z. B. Low (1989) Biochim. Biophys. Acta 988:427–454; Tse et al., (1985) Science 230:1003–1008; und Brunner et al., (1991) J. Cell Biol. 114:1275–1283.
Da IL-12 p40 und IL-B30 nunmehr charakterisiert wurden, können Fragmente oder Derivate davon mittels üblicher Verfahren zur Peptidsynthese hergestellt werden. Diese Verfahren umfassen solche, die in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben werden: Steward und Young, (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky und Bodanszky, (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; Bodanszky, (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; und Villafranca (Herausgeber 1991) Verfahren zur Proteinchemie II, Academic Press, San Diego, Ca.
VIII. Verwendungen
Die vorliegende Erfindung stellt Reagenzien zur Verfügung, die Anwendung in diagnostischen Verfahren, die an anderen Stellen hierin beschrieben wurden, finden werden, z. B. bei Zuständen, die von dem IL-12 p40/IL-B30 Komplex vermittelt werden oder in den nachfolgend beschriebenen Diagnosekits. Das Gen kann für forensische Untersuchungen genutzt werden, z. B. um zwischen Nagern und Menschen zu unterscheiden, oder als Marker, um zwischen verschiedenen Zellen zu unterscheiden, die ein differentielles Expressions- oder Veränderungsmuster aufweisen. Die bereitgestellten Zusammensetzungen sind nützliche Reagenzien, z. B. für in vitro Assays, die wissenschaftliche Forschung und die Synthese oder zur Herstellung von Nukleinsäuren, Polypeptiden oder Antikörpern.
Die Erfindung stellt ferner Reagenzien zur Verfügung, die bedeutendes kommerzielles und/oder therapeutisches Potential aufweisen. Der IL-12 p40/IL-B30 Komplex (natürlicherweise vorkommend oder rekombinant), Fragmente davon und Antikörper dagegen zusammen mit Verbindungen, die eine Bindungsaffinität an den Komplex oder einzelne Bestandteile davon aufweisen, sollten als Reagenzien zur Durchführung von Verfahren in dem Bereich Molekularbiologie, Immunologie oder Physiologie geeignet sein. Entsprechende Kits können mit den Reagenzien hergestellt werden, z. B. für die Durchführung von Laboruntersuchungen in der Produktion oder zur Verwendung als Proteine, Antikörper, Klonierungsverfahren, für die Histologie, etc.
Die Reagenzien sind auch für die Behandlung von Zuständen geeignet, die mit einer abnormalen Physiologie oder Entwicklung assoziiert werden, darunter Entzündungskrankheiten. Sie können für die Durchführung von in vitro Tests auf die Gegenwart oder Abwesenheit von interagierenden Verbindungen verwendet werden, die mit dem Erfolg einzelner Behandlungsstrategien vorgelegt werden können. Die Veränderung der Physiologie verschiedener z. B. hämatopoetischer oder lymphoider, Zellen wird insbesondere durch geeignete Verfahren zur Behandlung erzielt, welche die hierin beschriebenen Zusammensetzungen verwenden. Siehe z. B. Thomson, (1994; Herausgeber) The Cytokine Handbook (zweite Auflage) Academic Press, San Diego; Metalf und Nicola, (1995) The Hematopoietic Colony Stimulating Factors Cambridge University Press; und Aggarwal und Gutterman, (1991) Human Cytokines Blackwell Pub.
Beobachtungen haben gezeigt, daß der Zytokinkomplex IFNγ Mengen induzieren kann, wodurch eine nützliche Einsicht in das therapeutische Potential gegeben wird. IFNγ Herstellung führt insbesondere zu einer verstärkten zellvermittelten Immunität. Siehe z. B. Paul (1998) Fundamental Immunology (4. Auflage) Raven Press, NY; und Delves und Roitt (Herausgeber 1998) The Encyclopedia of Immunology Academic Press (ISBN: 0122267656). Die Steigerung der zellulären Reaktionen werden daher im Zusammenhang mit der Verstärkung der anti-Tumor Aktivitäten, mit der Verstärkung von Impfstoffreaktionen (sowohl humorale als auch zelluläre Immunität), mit der Verstärkung anti-viraler Wirkungen und zur Hemmung allergischer Reaktionen in bestimmten Entwicklungsphasen nützlich sein. Siehe z. B. Rose und Makkay (Herausgeber 1998) The Autoimmune Diseases (3. Auflage) Academic Press, San Diego; und Kay (Herausgeber 1997) Allergy and Allergic Diseases Blackwell Science, Malden MA. Im Gegensatz dazu würden Antagonisten benutzt werden, um die Steigerung des IFNγ zu blockieren oder zu verhindern, wodurch die Stärke oder Intensität der zellulären Reaktionen gehemmt werden würde. Entsprechende Aktivitäten können z. B. für Autoimmune Zustände (wie Multiple Sklerose oder Psoriasis) oder chronisch entzündliche Zustände (wie Rheumatische Arthritis oder Kolitis Ulcerosa) eingesetzt werden. Siehe z. B. Samter et al., (Herausgeber) Immunological Diseases Vols. 1 und 2, Little, Brown and Co. Die ersten Ergebnisse weisen darauf hin, daß die Bedeutung des p40/IL-B30 für die Aufrechterhaltung des chronischen Entzündungsreaktionen kritischer ist. Die Blockierung kann daher auch nach der Entwicklung der Erkrankung wirksam sein.
Für diese Therapieziele werden die Agonisten oder Antagonisten mit bestehenden Therapeutika kombiniert, z. B. mit anderen Regulatoren von Entzündungen. Die Agonisten können daher häufig mit z. B. IL-18, IL-12, Radio- oder Chemotherapiebehandlungen, Impf-Adjuvanzien und/oder anti-viralen Medikamenten kombiniert werden. Alternativ dazu werden die Antagonisten mit TNFα Antagonisten, IL-12 Antagonisten, mit- IL-10 und/oder Steroiden kombiniert. Virale homologe Zytokine können auch verwendet werden.
Eine Erkrankung oder Störung die beispielsweise mit abnormaler Expression oder abnormalem Signalweg durch ein IL-12 p40/IL-B30 verbunden ist, sollte ein mögliches Ziel für einen Agonisten oder Antagonisten sein. Das neue Zytokin sollte eine Rolle bei der Regulation oder Entwicklung hämatopoetischer Zellen aufweisen, z. B. auf Lymphzellen, welche Immunreaktionen beeinflussen, z. B. Entzündungen und/oder Autoimmune Erkrankungen. Alternativ dazu können die vaskuläre Physiologie oder Entwicklung oder neuronale Entwicklungen beeinflußt werden. Der Zeitpunkt der Verabreichung des Arzneimittels im Verhältnis zu dem Beginn oder der Aufrechterhaltung des Zustandes kann wichtig sein. Der Zytokinkomplex sollte unter verschiedenen Bedingungen die Zytokinsynthese durch die Zellen vermitteln, Proliferation etc. Antagonisten des IL-12 p40/IL-B30, wie mutierte Varianten einer natürlicherweise vorkommenden Form oder blockieren der Antikörper, können selektive und wirksame Mittel bereitstellen, Immunreaktionen zu hemmen, z. B. in Situationen wie die Entzündungs- oder Autoimmunreaktion. Siehe auch Samter et al., (Herausgeber) Immunological Diseases vols. 1 und 2, Little, Brown and Co.
Spezielle Ziele für die therapeutische Verwendung umfassen z. B. Krankheiten der Lunge, sowohl Asthma wie Fibrose, in EAE Modellen (die nützliche Modelle für die Multiple Sklerose darstellen), Diabetes und Entzündungen des Magens. Siehe z. B. Barnes et al., (1998) Mol. Med. Today 4:452–458; Pauwels et al., (1998) Clin. Exp. Allergy August 28 Suppl. 3:1–5; Durham, (1998) Clin. Exp. Allergy Jun. 28 Suppl. 2:11–16; Leung, (1997) Pediatr. Res. 42:559–568; Pretolani et al., (1997) Res. Immunol. 148:33–38; Lamkhioued et al., (1996) Ann. NY Acad. Sci. 796:203–208; Erb et al., (1996) Immunol. Cell. Biol. 74:206–208; und Anderson et al., (1994) Trends Pharmacol. Sci. 15:324–332 für Asthma; Coker et al., (1998) Eur. Respir. J. 11:1218–1221; und Bienkowski et al., (1995) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 209:118–140 für Lungenfibrose; Person und McDevitt, (1999) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 238:79–122; Miller und Shevach, (1998) Res. Immunol. 149:753–759; Hoffman und Karpus, (1998) Res. Immunol. 149:790–794 (mit Diskussion 846–847 und 855–860); Segal, (1998) Res. Immunol. 149:811–820 (mit Diskussion 850–851 und 855–860); Liblau et al., (1997) Immunol. Today 18:599–604; Gold et al., (1997) Crit. Rev. Immunol. 17:507–510; Spack, (1997) Crit. Rev. Immunol. 17:529–536; und Leonard et al., (1997) Crit. Rev. Immunol. 17:545–553 für EAE Modelle (für Multiple Sklerose); Almawi et al., (1999) J. Clin. Endocrinol. Metab. 84:1497–1502; Rabinovitch et al., (1998) Biochem. Pharmacol. 55:1139–1149; und Rabinovitch, (1998) Diabetes Metab. Rev. 14:129–151 für Diabetes; und Leach et al., (1999) Toxicol. Pathol. 27:123–133; Braun et al., (1999) Curr. Opin Rheumatol. 11:68–74; Rugtveit et al., (1997) Gastroenterology 112:1493–1505; Strober et al., (1997) Immunol. Today 18:61–64; und Ford et al., (1996) Semin. Peiatr. Surg. 5:155–159 zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen des Magen/Darms.
Die p40/IL-B30 Stimulierung der Gedächtniszellen verursacht phänotypische Veränderungen, die Adhäsions-Moleküle umfassen. CD69L ist nach Stimulation mit p40/IL-B30 stark exprimiert, während CD54 dramatisch reduziert wird. Diese Veränderung in der Expression der Adhäsionsmoleküle ermöglichen Veränderungen in den Gedächtniszellen, welche in den T/DC-zellreichen Bereich der primären und sekundären Lymphknoten einwandern, z. B. über hohe endotheliale Venolen (HIV). Die Gedächtniszellen werden ferner darauf vorbereitet, Sensitivität gegenüber einer IL-12 Stimulierung zu entwickeln. Schnelle und hohe IFN Produktionen würden daher einer IL-12 Induktion durch ein Antigen schnell folgen. p40/IL-B30 kann eine Immunreaktion durch Gedächtniszellen daher beschleunigen, entweder durch eine Steigerung der Reaktionsrate, eine Steigerung der Gedächtniszellzahl oder durch beide Wege. p40/IL-B30 weist differentielle Wirkungen auf bestimmte Gedächtniszellen auf, wobei geringere oder keine Wirkung auf naive Zellen erfolgen. Im Gegensatz dazu hängen bei vielen chronischen Entzündungskrankheiten, z. B. rheumatische Arthritis, Colitis Ulcerosa, Psoriasis, etc. die aktiven Läsionen von Gedächtnis CD45Rb^low Zellen ab. Antagonisten können daher die Chronische Phase entsprechender Entzündungskrankheiten wirksam blockieren.
Verschiedene abnorme Zustände sind für jeden dieser Zelltypen bekannt und es konnte mittels Northern Blot Analyse gezeigt werden, daß sie sowohl IL-12 p40 und/oder IL-B30 produzieren. Siehe Berkow (Herausgeber) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N. J.; Thorn et al., Harrison's Principels of Internal Medicine, McGraw-Rill, N. Y., und Weatherall et al., (Herausgeber) Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, Oxford. Viele weitere medizinische Zustände und Erkrankungen umfassen die Aktivierung die Makrophagen oder Monozyten und vielen davon werden auf eine Behandlung durch einen hierin zur Verfügung gestellten Agonisten oder Antagonisten reagieren. Siehe z. B. Stites und Terr (Herausgeber 1991) Basic and Clinical Immunology Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut; und Samter et al. (Herausgeber), Immunological Diseases Little, Brown and Co. Diese Probleme sollten einer Prävention oder Behandlung unter Verwendung der hierin beschriebenen Zusammensetzungen zugänglich sein.
Der IL-12 p40/IL-B30 Zytokinkomplex, die Antagonisten, die Antikörper, etc. können gereinigt anschließend an einen Patienten, ein Tier oder einen Menschen verabreicht werden. Die Reagenzien können für die therapeutische Verwendung mit weiteren aktiven oder inerten Stoffen kombiniert werden, z. B. üblichen pharmazeutisch aktiven Trägern oder Verdünnungsmitteln, z. B. immunogenen Adjuvanzien, zusammen mit physiologisch inerten Stabilisierungsmitteln, Arzneimittelträgern oder Konservierungsmitteln. Diese Kombinationen können steril filtriert und in Dosiereinheiten verpackt werden, wie durch Lyophilisierung in Dosierröhrchen oder als stabilisierte wäßrige Zusammensetzungen gelagert werden. Die Erfindung sieht die Verwendung von Antikörpern oder Bindungsfragmenten davon vor, darunter nicht komplementbindende Formen.
Wirkstoff-Screening unter Verwendung des IL-12 p40/IL-B30, Fusionsprotein oder Fragment davon kann durchgeführt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die Bindungsaffinität mit oder relevante biologische Wirkungen auf IL-12 p40/IL-B30 Funktionen aufweisen, darunter die Isolierung assoziierter Verbindungen. Nachfolgende biologische Assays können anschließend dazu benutzt werden, um zu bestimmen, ob eine Kandidatenverbindung intrinsische stimulierende Aktivität aufweist und daher einen Blocker oder Antagonist darstellt, insoweit als dieser die Aktivität des Zytokinkomplexes blockiert. In ähnlicher Weise kann eine Verbindung, welche intrinsisch stimulierende Aktivität aufweist, den Signalstoffwechselweg aktivieren und insoweit ein Agonist darstellen, als das die Aktivität des Zyto kinkomplexes stimuliert wird. Die Erfindung sieht ferner die therapeutische Verwendung blockierender Antiköper gegen IL-12 p40/IL-B30 Komplex als Antagonisten und die Verwendung stimulierender Antikörper als Agonisten. Dieser Ansatz sollte insbesondere mit Artvarianten des IL-12 p40 oder IL-B30 nützlich sein.
Die Mengen der für eine wirksame Therapie benötigten Reagenzien hängen von vielen verschiedenen Faktoren ab, darunter die Mittel der Verabreichung, die Targetstelle, den physiologischen Zustand des Patienten und die weiteren Arzneimittel, die verabreicht wurden. Das Behandlungsprotokoll sollte daher so austitiriet sein, daß Sicherheit und Wirksamkeit optimiert werden. Typischerweise dient die in vitro ermittelte Dosierung als nützliche Richtlinie für die in situ nützlichen Mengen bei der Verabreichung dieser Reagenzien. Wirksame Dosierungen zur Behandlung bestimmter Erkrankungen können in Tieren getestet werden, was weitere Vorhersagen auf die menschliche Dosierung ermöglicht. Verschiedene Überlegungen werden im Folgenden beschrieben, z. B. in Gilman et al., (Herausgeber 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, B. Ausgabe, Pergamon Press; und Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Ausgabe (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Verfahren zur Verabreichung werden hierin beschrieben und nachfolgend dargestellt, z. B. zur oralen, intravenösen, intraperitonealen oder intramuskulären Verabreichung, transdermalen Diffusion und weitere. Pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen Wasser, Salz, Puffer und weitere Bestandteile, die z. B. im Merck Index beschrieben werden, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Es sollte normalerweise davon ausgegangen werden, daß die Dosierungsbereiche in Konzentrationen von weniger als etwa 1 mM, typischerweise weniger als etwa 10 μM, üblicherweise weniger als etwa 100 mM, vorzugsweise weniger als etwa 10 pM (picomolar) und besonders bevorzugt weniger als etwa 1 fM (femtomolar) mit einem geeigneten Träger. Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder eine Vorrichtung für verzögerte Freisetzung werden häufig für kontinuierliche oder Langzeitverabreichungen verwendet. Siehe z. B. Langer (1990) Science 249:1527–1533.
IL-12 p40/IL-B30 Zytokinkomplex, Fusionsprotein und Antikörper dagegen oder gegen die Fragmente, Antagonisten und Agonisten können unmittelbar an den zu behandelnden Wirt verabreicht werden oder, in Abhängigkeit der Größe der Verbindungen, kann es gewünscht sein, diese vor deren Verabreichung an Trägerproteine zu binden, wie Ovalbumin oder Serumalbumin. Die therapeutischen Formulierungen können in vielen üblichen Dosierungsformulierungen verabreicht werden. Obwohl es möglich ist bei den Wirkstoff alleine zu verabreichen, ist es bevorzugt, diesen als pharmazeutische Formulierung zu präsentieren. Formulierungen umfassen üblicherweise mindestens ein wie oben definierten Wirkstoff zusammen mit einem oder mehreren verträgliche Trägern. Jeder Träger sollte sowohl pharmazeutisch als auch physiologisch in dem Sinne verträglich sein, als er zu den anderen Inhaltsstoffen paßt und nicht gesundheitsschädlich für den Patienten sein sollte. Formulierungen umfassen solche, die für orale, rektale, nasale, topische oder parenterale (darunter subkutan, intramuskuläre, intravenöse und intradermale) Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen können üblicherweise in Form einer Einheitsdosierung vorliegen und können durch eine Vielzahl im Stand der Technik bekannter Verfahren der Pharmazie hergestellt werden. Siehe z. B. Gilman et al., (Herausgeber 1990) Goodman and Gilmans's: The Pharmacological Bases of Therapeutics B. Ausgabe, Pergamon Press; und Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Ausgabe (1990) Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis et al., (Herausgeber 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, New York; und Lieberman et al., (Herausgeber 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, New York; und Lieberman et al., (Herausgeber 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, New York. Die erfindungsgemäße Therapie kann mit anderen Wirkstoffen kombiniert oder in Assoziation verwendet werden, z. B. weitere Zytokine, darunter IL-6 oder G-CSF oder deren entsprechende Antagonisten.
Sowohl natürlicherweise vorkommende und rekombinante Formen des IL-B30 der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich für Kits und Assayverfahren, mittels derer Verbindung mit Bindunsaktivität für diese Proteine gescreent werden. Verschiedene Verfahren zur Automatisierung von Assays sind in den letzten Jahren entwickelt worden, was ein Screening von zehntausenden von Verbindungen in kurzen Zeitabständen ermöglicht. Siehe z. B. Fodor et al., (1991) Science 251:767–773, worin Mittel zur Untersuchung der Bindungsaffinität einer Mehrzahl von definierten Biopolymeren beschrieben werden, die auf einem festen Träger synthetisiert wurden. Die Entwicklung entsprechender Assays wird durch die Verfügbarkeit von großen Mengen an gereinigtem, löslichem IL-12 p40/IL-B30 Zytokinkomplex, der durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt wird, wesentlich erleichtert.
Weitere Verfahren können verwendet werden, um kritische Reste in den IL-12 p40/IL-B30 Komplex Rezeptor Interaktion zu bestimmen. Mutationsanalyse kann durchgeführt werden, z. B. Somoza et al., (1993) J. Exptl. Med. 178:549–558, um spezifische Reste zu bestimmen, die für die Interaktion und/oder Signalgebung kritisch sind. PHD (Rost und Sander, (1994) Proteins 19:55–72) und DSC (King und Sternberg, (1996) Protein Sci. 5:2298–2310) können Vorhersagen zur Sekundärstruktur einer α-Helix (H), eines β-Stranges (E) oder einer Spule (L) erstellen. Helices A und D sind typischerweise die wichtigsten für Rezeptorinteraktion, wobei D der noch wichtigere Bereich ist. Antagonisten können üblicherweise gefunden werden, sobald das Antigen und/oder der Rezeptor strukturell definiert wurde, z. B. über Tertiärstrukturdaten. Die Untersuchung von möglicherweise interagierenden Analoga wird durch die Entwicklung von hochautomatisierten Assayverfahren, die ein gereinigtes IL-12 p40/IL-B30 Komplex verwenden, ermöglicht. Neue Agonisten und Antagonisten werden insbesondere unter Verwendung der hierin beschriebenen Screeningverfahren entdeckt. Von besonderer Bedeutung sind Verbindungen, die eine kombinierte Bindungsaffinität für ein Spektrum der IL-12 p40/IL-B30 Moleküle aufweisen, z. B. Verbindungen, die als Antagonisten für Artvarianten des Zytokinkomplexes dienen können.
Ein Verfahren zum Wirkstoff-Screening verwendet eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, die stabil mit den rekombinanten DNA Molekülen transformiert wurden, welche IL-12 p40/IL-B30 exprimieren. Die Zellen, welche IL-12 p40/IL-B30 in Abwesenheit anderer Moleküle exprimieren können isoliert werden. Entsprechende Zellen entweder in lebendiger und fixierter Form können in Standardassays für Bindungspartner verwendet werden. Siehe auch Parce et al., (1989) Science 246:243–247; und Owicki et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4007–4011, welche Sensitivverfahren zum Nachweis von zellulärer Reaktionen beschreiben.
Weitere Verfahren zum Screening von Wirkstoffen umfassen eine Ansatz, welcher Hochdurchsatz-Screeningverfahren für Verbindungen verwendet, die geeignete Bindungsaffinität an IL-12 p40/IL-B30 aufweisen und wird im Detail in Geysen, europäische Patentanmeldung 84/03564 . beschrieben, welche am 13. September 1984 publiziert wurde. Zunächst werden große Anzahlen verschiedener, kleiner Peptidtestverbindungen auf einem festen Träger synthetisiert, z. B. auf Plastikstäbchen oder irgendeiner geeigneten Oberfläche; siehe Fodor et al., (1991). Anschließend werden alle Pins mit gelöstem, nicht gereinigtem oder gelöstem gereinigtem p40/IL-B30 umgesetzt und gewaschen.
Der nächste Schritt umfaßt den Nachweis von gebundenem p40/IL-B30.
Rational Wirkstoffentwicklung also auf strukturelle Studien der molekularen Form des p40/IL-B30 und anderer Effektoren oder Analoge begründet werden. Die Effektoren können andere Proteine darstellen, welche weitere Funktionen als Reaktion der Bindung vemitteln oder andere Proteine, die üblicherweise mit p40/IL-B30 interagieren, z. B. ein Rezeptor. Ein Mittel zur Bestimmung, ob die Stellen mit bestimmten anderen Proteinen interagieren stellt die physikalische Strukturaufklärung dar, z. B. X-Strahle Kristallographie oder zweidimensionale NMR Verfahren. Diese werden Richtlinien zur Verfügung stellen, welche Aminosäurereste die molekularen Kontaktbereiche bilden, wie modelliert, z. B. gegen andere Zytokin-Rezeptormodelle. Für eine detaillierte Beschreibung strukturelle Bestimmung von Proteinen siehe z. B. Blundell und Johnson, (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York.
IX. Kits
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von p40/IL-B30 Proteinen, Fragmenten davon, Peptiden und deren Fusionsprodukte in einer Vielzahl verschiedener Diagnostik-Kits und Verfahren zum Nachweis der Gegenwart anderer p40/IL-B30 oder von Bindungspartnern. Typischerweise wird das Kit einen Bestandteil enthalten, der entweder ein definiertes p40, p40/IL-B30 oder IL-B30 Peptid oder Gen-Abschnitt oder Reagenz enthält, welches eines oder das andere erkennt, z. B. p40/IL-B30 Fusionsfragmente oder Antikörper.
Ein Kit zur Bestimmung der Bindungsaffinität einer Testverbindung gegenüber IL-12 p40/IL-B30 wird typischerweise eine Testverbindung, eine markierte Verbindung, z. B. ein Bindungspartner oder Antikörper mit bekannter Bindungsaffinität für p40/IL-B30, eine Quelle für p40/IL-530 (natürlich vorkommend oder rekombinant) und Mittel zur Auftrennung von gebundener und freier markierter Verbindung, wie eine feste Phase zur Immobilisierung des Moleküls, enthalten. Sobald die Verbindungen gescreent wurden, können solche, die geeignete Verbindungsaffinität für das Antigen aufweisen, in geeigneten biologischen Assays, die dem Fachmann wohlbekannt sind, daraufhin untersucht werden, ob diese als Agonisten oder Antagonisten des p40/IL-B30 Signalweges wirken. Die Verfügbarkeit des rekombinanten IL-12 p40/IL-B30 Fusionspolypeptids stellt ferner gut definierte Standard für die Kalibrierung entsprechender Assays zu Verfügung.
Ein bevorzugter Kit zur Bestimmung der Konzentration von z. B. eine p40/IL-B30 in einer Probe umfaßt typischerweise eine markierte Verbindung, z. B. einen Bindungspartner oder Antikörper, der eine bekannte Bindungsaffinität für das Antigen aufweist, eine Quelle für das Zytokin (natürlicherweise vorkommend oder rekombinant) und ein Mittel zur Auftrennung der gebundenen von der freien markierten Verbindung, z. B. eine feste Phase zur Immobilisierung des p40/IL-B30. Bestandteile, welche Reagenzien und Anweisungen enthalten werden üblicherweise zur Verfügung gestellt.
Antikörper, darunter die Gen-bindenden Fragmente, mit Spezifität für p40/IL-B30 oder für Fragmente davon können für diagnostische Anwendung verwendet werden, um die Gegenwart gesteigerter Mengen des p40, IL-B30, p40/IL-B30 und/oder von deren Fragmenten bestimmen. Entsprechende diagnostische Assays können Lysate, lebende Zellen, fixierte Zellen, Immunofluoreszenz, Zellkulturen, Körperflüssigkeiten nutzen und können ferner den Nachweis des Antigens, daß in Relation zu dem Antigen Serum steht, oder ähnliches einbeziehen. Diagnostische Assays können homogen sein (ohne ein Auftrennungsschritt zwischen den freien Reagenz und Antigen-Bindungspartnerkomplex) oder hete rogen (mit einem Aufteilungsschritt). Verschiedene kommerzielle Assays sind vorhanden, wie Radioimmunoassay (RIA), Enzymlinked Immunosorbent Assay (ELISA), Enzym Immonoassay (EIA), Enzym-Multiglied Immunoassay Technique (EMIT9; Substratelabeled Fluorescent Immunoassay (SLFIA), und ähnliche. Siehe z. B. Van Vunakis jet al., (1980) Meth Enzymol. 70:1–525; Harlow und Lande, (1980) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY; und Coligan et al., (Herausgeber 1993) Current Protocols in Immunology, Greene und Wiley, NY.
Anti-idiotiypische Antikörper können in ähnlicher Weise für die Diagnose der Gegenwart von Antikörpern gegen p40/IL-B30 verwendet werden, was als solches eine Diagnose verschiedener abnormaler Zustände beschreiben kann. Eine Überproduktion an p40/IL-330 kann beispielsweise in der Herstellung verschiedener immunologischer Reaktionen führen, die diagnostisch für die abnormalen physiologischen Zustände sind, insbesondere bei proliferativen Zellstörungen wie Krebs oder abnormaler Aktivierung oder Differenzierung.
Die Reagenzien für diagnostische Assays werden häufig als Kits angeboten, um die Sensitivität des Assays zu optimieren. Für die vorliegende Erfindung wird in Abhängigkeit der Natur des Assays das Protokoll, und die Markierung, entweder markierter oder unmarkierter Antikörper oder Bindungspartner oder markiertes p40/IL-330 zu Verfügung gestellt. Diese erfolgt üblicherweise im Zusammenhang mit weiteren Hilfsstoffen, wie Puffern, Stabilisierungsmitteln, Materialien, die für die Signalerzeugung notwendig sind, wie Substraten für Enzyme, und ähnliches. Das kit wird vorzugsweise auch Anweisungen zur richtigen Verwendung und Beseitigung des Inhalts nach der Nutzung enthalten. Typischerweise weist das kit einzelne Bestandteile für jedes nützliche Reagenz auf. Es ist erwünscht, daß die Reagenzien als trockenes lyophilisiertes Pulver zur Verfügung gestellt werden, wobei die Reagenzien in einem flüssigen Medi um rekonstruiert werden können, wodurch die geeigneten Konzentrationen der Reagenzien zur Durchführung des Assays erhalten werden.
Viele der vorgenannten Bestanteile für das Wirkstoff-Screening und die diagnostischen Assays können ohne Veränderungen benutzt werden oder können in einer Vielzahl von Arten abgewandelt werden. Die Markierung beispielsweise erhalten werden, indem eine Gruppe kovalent oder nicht-kovalent verknüpft wird, die unmittelbar oder mittelbar ein nachweisbare Signal zur Verfügung stellt. In vielen dieser Assays kann der Bindungspartner, die Testverbindung, p40/IL-B30 oder Antikörper dagegen entweder unmittelbar oder mittelbar markiert sein. Möglichkeiten zur unmittelbaren Markierung umfassen markierte Gruppen: Radiomarkierung, wie ¹²⁵I, Enzyme, wie Peroxidase und Alkaline Phosphatase, und fluoreszierende Markierung ( U.S. Patent Nr. 3,940,475 ), welche eine Überwachung der Veränderung der Fluoreszenzintensität, eine Veränderung der Wellenlänge oder Fluoreszenzpolarisierung ermöglichen. Möglichkeiten zur indirekten Markierung und umfassen Biotinylierung einer der Bestandteile, gefolgt von Avidinbindung, welches mit einer der oben genannten markierten Gruppen verknüpft wurde.
Es gibt auch viele Verfahren zur Auftrennung des gebundenen von dem freien p40/IL-B30 oder alternativ zur Auftrennung des gebundenen von der freien Testverbindung. Das p40/IL-B30 kann auf verschiedenen Matrizes immobilisiert werden, was von einem Waschgang befolgt wird. Geeignete Matrizes umfassen Plastik, die eine ELISA Platte, Filter und Kügelchen. Sieh z. B. Coligan et al., (Herausgeber 1993) Current Protocols Immunology, Vol. 1, Chapter 2 Greene und Wiley, NY. Weitere geeignete Auftrennungsverfahren umfassen ohne Beschränkung das Fluoreszin Antikörper magnetische Partikelverfahren, daß in Rattle et al., beschrieben wird (1984) Clin. Chem. 30:1457–1491 und die Auftrennung unter Verwendung von zwei Antikörpern und magnetischen Partikeln, wie in U.S. Patent Nr. 4,659,678 beschrieben.
Verfahren zur Verbindung von Proteinen oder deren Fragmenten mit verschiedenen Markierungen sind in der Literatur umfassend beschrieben und benötigen hier keine detaillierte Diskussion. Viele der Verfahren umfassen die Verwendung aktivierter Carboxygruppen, entweder durch die Verwendung von Carbodiimid oder aktiven Estern, zur Ausbildung von Peptidbindungen, zur Ausbildung von Thioethern durch Reaktion einer Mercaptogruppe mit einem aktivierten Halogen, wie Chloracetyl oder ein aktiviertes Olefin, wie Maleimid für die Bindung oder ähnliches. Fusionsproteine können auch für diese Anwendung genutzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weitere diagnostische Aspekte, darunter die Verwendung der Oligonukleotide oder Polynukleotidsequenzen, die von der Sequenz des p40/IL-B30 abgeleitet worden. Diese Sequenzen können als Sonden verwendet werden zum Nachweis von Menge der p40 oder IL-B30 messenger in Patientenproben, die im Verdacht stehen einen abormalen Zustand aufzuweisen, z. B. Entzündung oder Autoimmunerkrankung. Da die Zytokin ein Marker oder Vermittler für Aktivierung sein können, kann es nützlich sein die Anzahl der aktivierten Zellen zu bestimmen, z. B. zur Bestimmung des Zeitpunkts für weitere Therapien für z. B. als Prävention, bevor die Wirkung voranschreiten und signifikant werden. Die Herstellung von RNA als auch DNA der Nukleoditsequenzen, die Markierung dieser Sequenzen und die bevorzugte Größe der Sequenzen nur dem Stand der Technik umfassend beschrieben und diskutiert. Siehe z. B. Langer-Safer et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4381–4385; Caskey (1987) Science 236:962–967; und Wilchek et al., (1988) Anal. Biochem. 171:1–32.
Diagnostik-Kits, die auch die Qualität oder Quantität der Expression anderer Moleküle untersuchen können, sind ebenfalls vorgesehen. Diagnose oder Prognose kann von der Kombination vieler Anzeichen abhängen, die als Marker gewertet werden. Kits können daher Kombinationen von Markern nachweisen. Siehe z. B. Viallet et al., (1989) Progress in Growth Factors Res. 1:89–987. Weitere kits können zur Bewertung anderer Teilpopulationen von Zellen verwendet werden.
X. Isolierung eines p40/IL-B30 Rezeptors
Durch die Isolierung eines Liganden einer bestimmten Liganden-Rezeptor-Interaktion werden Verfahren zur Isolierung des Rezeptors zur Verfügung gestellt. Siehe Gearing et al., (1989) EMBO J. 8:3667–3676. Mittel zur Markierung des IL-B30 Zytokins ohne Beeinflussung der Bindung an sein Rezeptor können beispielsweise bestimmt werden. Eine Affinitätsmarkierung kann beispielsweise entweder an das Amino- oder Carboxy-terminale Ende des Liganden fusioniert werden. Solche entsprechende Markierung kann ein FLAG-Epitop-Tag oder z. B. ein Ig oder Fc Domäne sein. Eine Expressionsbibliothek kann auf spezifische Bindung an das Zytokin gescreent werden, z. B. durch Zellsortierung oder andere Screeningverfahren, mit denen Zellpopulationen identifiziert werden können, welche eine Bindungskomponente exprimieren. Siehe z. B. Ho et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11267–11271; und Liu et al., (1994) J. Immunol. 152:1821–29. Alternativ dazu kann ein Panningverfahren verwendet werden. Siehe z. B. Seed und Aruffo, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3365–3369.
Proteinvernetzungsverfahren mit Markierung können zur Isolierung von Bindungspartnern des p40/IL-B30 Zytokinkomplexes verwendet werden. Dies ermöglicht die Identifizierung von Proteinen, die spezifisch mit dem Zytokin interagieren, z. B. in einer Ligand-Rezeptor ähnlichen Art.
Frühere Experimente werden durchgeführt, um zu bestimmen, ob die bekannten IL-6 oder G-CSF Rezeptor Bestandteile an den Reaktionen auf p40/IL-B30 beteiligt sind. Es ist ferner möglich, daß diese funktionalen Rezeptorkomplexe viele oder alle Bestandteile mit einem p40/IL-B30 Rezeptorkomplex teilen, entweder eine bestimmte Rezeptoruntereinheit oder eine accessorische Untereinheit.
BEISPIELE
I. Allgemeine Verfahren
Viele nachfolgende Standardverfahren werden beschrieben oder durch Zitat aufgenommen z. B. in Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.) Vols. 1–3, CSH Press, NY; Ausubel et al., Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; Ausubel et al., (1987 und Supplements) Current Protocols in Molecular Biology Wiley/Greene, NY; Innis et al., (eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, NY; Bonifacino et al., Current Protocols in Cell Biology Wiley, NY; and Doyle et al., Cell and Tissue Culture: Laboratory Protocols Wiley, NY. Verfahren zur Reinigung von Proteinen umfassen Verfahren wie Ammoniumsulfatfällung, Säulenchromatographie, Elektrophorese, Zentrifugation, Krystallisation und weitere. Siehe z. B. Ausubel et al., (1987 und periodic supplements); Deutscher, (1990) „Guide to Protein Purification", Methods in Enzymology vol. 182, und andere Inhalte in diesen Serien, Coligan et al., (1995 und supplements) Current Protocols in Protein Science John Wiley und Sons, New York, NY; Matsudaira, (Herausgeber 1993) A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing, Academic Press, San Diego, CA; und manufacturer's literature an use of Protein Purification products, z. B. Pharmavia, Pis cataway, NJ, oder Bio-Rad, Richmond, CA. Eine Kombination mit rekombinanten Verfahren ermöglicht die Fusion in geeigneten Abschnitten (Epitope-Tags), z. B. eine FLAG-Sequenz oder ein Äquivalent, das fusioniert werden kann, z. B. mittels Proteaseentfernbarer Sequenz. Siehe z. B. Hochuli (1990) „Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Aborbent" in Setlow (Herausgeber) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87–98, Plenum Press, NY und Crowe et al., (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUTAGEN, Inc. Chatsworth, CA.
Computer-Sequenzanalysen werden durchgeführt, z. B. unter Verwendung verfügbarer Software, darunter die von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI, dem NCBI der NIH und GenBank, NCBI, EMBO und weitere Quellen öffentlicher Sequenzen. Weitere Analyse-Quellen umfassen z. B. RASMOL program, siehe Bazan et al., (1996) Nature 379:591; Lodi et al., (1994) Science 263:1762–1766; Sayle und Milner-White, (1995) TIBS 20:374–376; und Gronenberg et al., (1991) Protein Engineering 4:263–269; und DSC, siehe King und Sternberg, (1996) Protein Sci. 5:2298–2310. Siehe, also Wilkins et al., (Herausgeber 1997) Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics Springer-Verlag, NY; Salzberg et al., (Herausgeber 1998) Computational Methods in Molecular Biology Elsevier, NY; und Girren et al., (Herausgeber 1997) Genome Analysis: A. Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.
Übliche immunologische Verfahren werden beschrieben in, z. B. in Hertzenberg et al., (Herausgeber 1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology vols. 1–4, Blackwell Science; Coligan, (1991 und Verbesserungen) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; und Methods in Enzymology vols. 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 und 163. Zytokine Assaya sind beschrieben, z. B. in Thomson, (Herausgeber 1994) The Cytokine Handbook (zweiter Herausgeber) Academic Press, San Diego; Metcal und Nicola, (1995) The Hematopoietic Colony Stimulating Factors Cambridge University Press; und Aggarwal und Gutterman, (1991) Human Zytokines Blackwell Pub.
Assays zur Analyse vaskulärer biologischer Aktivitäten sind im Stand der Technik wohl bekannt. Sie umfassen antiogene und andgiostatische Aktivitäten in Tumor oder weiteren Geweben, z. B. der Proliferation der glatten Muskulatur von Arterien (siehe z. B. Koyoma et al., (1996) Cell 887:1069–1078), monocyte adhesion to vascular epithelium (siehe McEvoy et al., (1997) J. Exp. Med. 185:2069–2077), etc. Siehe Ross, (1993) Nature 362:801-809; Rekhter und Gordon, (1995) Am J. Pathol. 147:668–677; Thyberg et al., (1990) Atherosclerosis 10:966–990; und Gumbiner, (1996) Cell 84:345–357.
Assays für neurale Zellen biologischer Aktivitäten sind beschrieben, z. B. in Wouterlood, (Herausgeber 1995) Neuroscience Protocols modules 10, Elsevier; Methods in Neurosciences Academic Press; und Neuromethods Humana Press, Totowa, NJ. Methodology of developmental Systeme ist beschrieben, z. B., in Meisami (Herausgeber) Handbook of Human Growth and Developmental Biology CRC Press; und Chrispeels (Herausgeber) Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology Interscience.
FACS Analysen sind beschrieben in Melamed et al., (1990) Flow Cytometry und Sorting Wiley-Liss, Inc., New York; Shapiro, (1998) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY, und Robinson et al., (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY.
II. Klonierung des humanen p40 und/oder IL-B30
IL-12 p40 Sequenzen sind von verschiedenen Sequenzdatenbanken erhältlich, wie zuvor beschrieben. Die Sequenz des IL-B30 Gens wird in Tabelle 1 gezeigt. Die Sequenz wurde von der genomischen humanen Sequenz abgeleitet.
Diese Sequenzen ermöglichen die Herstellung von PCR Primern oder Sonden, um die zelluläre Verteilung dieser Gene zu bestimmen. Die Sequenzen ermöglichen die Isolierung genomischer DNA, welche für den Messenger kodiert.
Unter Verwendung einer Sonde oder unter Verwendung von PCR Primern werden verschiedene Gewebe oder Zelltypen untersucht, um die zelluläre Verteilung zu bestimmen. Die PCR Produkte werden unter Verwendung von z. B. einem TA Klonierungs-Kit (Invitrogen) kloniert. Die resultierenden cDNA Plasmide werden von beiden Enden auf einem automatischen Sequenzierer (Applied Biosystems) sequenziert.
III. Zelluläre Expression des p40 und IL-B30
Eine geeignete Sonde oder Primer mit Spezifität für cDNA, welche für die genannten Gene kodiert, wird hergestellt. Typischerweise ist die Sonde markiert, z. B. durch zufälliges Priming. Die koordinierte Expression beider Untereinheiten ist besonders wichtig, soweit der p40/IL-B30 Komplex von Interesse ist.
IV. Reinigung des p40/IL-B30 Proteins
Viele transfizierte Zelllinien werden gescreent, um eine zu erhalten, die das Zytokin oder den Komplex im großen Mengen im Verhältnis zu anderen Zellen exprimiert. Alternativ dazu kann ein kombiniertes rekombinantes Konstrukt hergestellt werden. Verschiedene Zelllinien werden gescreent und ausgewählt aufgrund ihrer vorteilhaften Eigenschaften bei der Handhabung.
Eine Isolierung der entsprechenden Untereinheiten und nachfolgende Kombination kann zur Bildung von einigen Dimeren führen. IL-B30 kann aus natürlichen Quellen isoliert werden oder durch Überexpression einer transformierten Zelle unter Verwendung eines geeigneten Expressionsvektor. Adenovirale Konstrukte können zur Herstellung/Expression verwendet werden.
Die Reinigung der exprimierten Untereinheiten oder des Komplexes wird unter Verwendung von Standardverfahren ausgeführt oder kann mir veränderten Mitteln zur wirksamen Reinigung in hoher Effizienz aus Zelllysaten oder Überständen kombiniert werden. Insbesondere eine Fusion aus p40 und IL-B30 mit oder ohne einen geeigneten Linker kann zu hocheffizienten Verfahren zur Prozessierung oder Reinigung führen. FLAG oder ^His6 Abschnitte können für entsprechende Reinigungsverfahren verwendet werden. Alternativ dazu Affinitätschromatografie unter Verwendung spezifischer Antikörper wie nachfolgend beschrieben genutzt werden.
Das Protein wird in Coli, Insektenzellen oder Säugetier-Expressionssytemen wie beschrieben hergestellt.
V. Herstellung der Antikörper mit Spezifität für p40/IL-B30
Synthetische Peptide oder gereinigte Proteine werden dem Immunsystem präsentiert, um monoklonale oder polyklonale Antikörper zu erzeugen. Siehe z. B. Coligan, (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; und Harlow und Lane, (1989) Antibodies: A. Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press. Immunoselektionen oder Depletionsverfahren können verwendet werden, um sicherzustellen, daß die erhaltenden Antikörperspezifität für die Antigendeterminanten aufweisen, welche durch den Komplex der Polypeptide präsentiert werden, die sich von den der einzelnen Bestandteile des selben unterscheiden. Polyklonale Serum oder Hybridoma können hergestellt werden. In geeig neten Umständen, kann das Bindungsreagenz entweder wie oben beschrieben markiert, z. B. mit Fluoreszenz oder anderweitig, oder an einer Oberfläche für Panningverfahren immunisiert werden. Immunoselektion, Immunodepletion und verwandte Verfahren sind verfügbar, um selektive Reagenzien wie gewünscht zu erhalten, z. B. für den Komplex zwischen zwei Untereinheiten.
VI. IL-12 p40 und IL-B30 Kopräzipitat
Ein Maus IL-12 p40-Ig Fusionskonstrukt wurde in einem Expressionsvektor hergestellt. Die Ig Domäne bindet an Protein A und kann das Polypeptid fällen. Ein IL-B30E-tag (ein Epitop-Tag mit einem groß FLAG Motiv am N-Terminus) Konstrukt wurde ebenfalls hergestellt, wobei das Polypeptid mit dem M2 Antikörper Immunopräzipitat werden konnte. Die Expressionskonstrukte wurden in 293 T Zellen transfiziert, entweder mit dem IL-12 p40-Ig Konstrukt allein, dem IL-B30E-tag Konstrukt alleine oder bei zusammen. Die Zellen wurden mit ³⁵S Methionin markiert. Mit dem IL-12 p40 Konstrukt alleine konnte kein lösliches Protein in den Zellüberständen unter Verwendung von Protein A nachgewiesen werden. In ähnlicher Weise mit dem FLAG-IL-B30 Konstrukt wurde kein lösliches Protein im Zellüberstand unter Verwendung des M2 Antikörpers nachgewiesen. Kotransfektion der beiden Expressionskonstrukte erzeugte jedoch einen löslichen Komplex im Zellüberstand, de sowohl mit Protein A Reagenz als auch mit dem M2 Antikörper gefällt werden konnte. PAGE Analye des Komplexes zeigte, daß der mit Protein A gefällte Komplex aus Polypeptiden besteht, welche den beiden erwartete Polypeptiden IL-12 p40Ig Fusion und dem FLAG-IL-B30 Polypeptid entsprechen. Dementsprechend bestand der Komplex, der mit dem M2 gefällt wurde, aus FLAG-IL-B30 Polypeptid und dem IL-12 p40-Ig Protein. Ähnliche Experimente mit einem menschlichen FLAG IL-12 p-40-Ig Konstrukt ergaben die selben Ergebnisse. Transfektion mit dem FLAG-IL-B30 Konstrukt ergab kein signifikantes lösliches Protein. Kotransfektion der beiden Expressionsvekto ren in Primaten Zellen erzeugten die wirksame Sekretion eines Komplexe, der mit dem M2 Antikörper gefällt werden konnte. PA-GE Analyse des haltenden Komplexes bestätigte, daß der Komplex aus dem FLAG-IL-B30 Polypeptid und dem IL-12 p40 Polypeptid spannt.
VII. Rezeptor-Identifikation
Der IL-12 Rezeptor besteht aus dem ILO-12 Rezeptor Untereinheiten β1 und β2. Ein Fusionskonstrukt des p40/IL-830 bindet an Zellen, welche die Rezeptoruntereinheit β1 exprimieren.
Ein Homodimer der IL-12 p40 Untereinheit kann die Bindung des IL-12 an die Maus Untereinheit β1 aber nicht an die Untereinheit β2 verhindern. Die p40 Untereinheit ist ein Bestandteil des p40/Il-B30 Komplexes, daher wurde untersucht, ob die IL-12 Rezeptor Untereinheit β1 ein Bestandteil des Rezeptors für ein Fusionskonstrukt aus p40/IL-B30 sein könnte. Antikörper gegen die IL-12 Rezeptor Untereinheit β1 blockierten die Bindung des Fusionskonstruktes an Zellen, welche die Rezeptoruntereinheit β1 exprimierten. Antikörper gegen den p40/p70 Komplex, die primär die p40 Untereinheit erkennen, können die Wirkung der p40/IL-830 Zusammensetzung blockiere, was darauf hindeutet, daß die p40 Komponente für Rezeptorinteraktion wichtig ist. Dieses Beobachtung bestätigen, daß die Rezeptoruntereinheit β1 das Fusionskonstrukt p40/IL-830 bindet. Ähnliche Experimente zur Untersuchung einer Beteiligung der weiterverbreiteten gp130 Untereinheit, die von vielen Rezeptoren geteilt wird, weisen daraufhin, daß gp130 keine relevante Untereinheit des Rezeptors für p40/IL-B30 ist.
Da eine Untereinheit des Rezeptors identifiziert wurde, wurden Expressionsklonierungsbemühungen begonnen. Zellen, welche diese Untereinheit exprimieren, aber keine Bindung aufweisen, werden für die Expressionsklonierung einer weiteren Unterein heit verwendet. Andere Rezeptoruntereinheiten mit Homologie zu β2 werden gescreent. Alternativ dazu können Bibliotheken von geeigneten Zellen den Standard-Expressionsklonierungsverfahren verwendet werden.
VIII. Bewertung der Breite der biologischen Funktion Biologische Aktivitäten des p40/IL-B30 Komplexes werden getestet auf der Grundlage, z. B. der Sequenz- und Strukturhomologie zwischen IL-B30 und IL-6 und G-CSF. Zunächst wurden Assays untersucht, dem die biologische Aktivitäten des IL-6 oder G-CSF gezeigt wurde. Die Assays wurden entweder mit einem rekombinanten Komplex oder ein Fusionskonstrukt durchgeführt. Fusionskonstrukte bestehen aus einem Konstrukt mit der IL-12 p40 Signalsequenz, die mit einem N-terminalen FLAG Epitop zu der reifen IL-12 p40 Sequenz fusioniert wurden, welche mit einem kleinen ser/gly reichen Linker geeigneter Länge an dir reife Sequenz des IL-B30 fusioniert wurden. Das Konstrukt wird gut exprimiert, sekretiert und Epitop-Tag erlaubt sowohl die Reinigung als auch die Lokalisierung. Sowohl Maus und humane Sequenzvarianten wurden hergestellt. Adenovirale Expressionskonstrukte der beiden verschiedenen Polypeptide und Fusionsproteine werden zur Verfügung gestellt.
Zielzelltypen umfassen lymphoide, myeloide, Mast, pre-B, pre-T und Fibroblasten-endotheliale Zelltypen. Macrophagen/Monocyten Zellen werden beispielsweise im Hinblick auf Veränderungen ihrer Zelloberflächenmarker z. B. MHC Klasse II, B7, CD40 und verwandte Familien; Zytokin und Chemokin Herstellung; und Antigen Präsentationskapazität bewertet. CD4+T Zellen sowohl naive CD45Rb^hi und Gedächtnis CD45Rb^low T Zellen, werden untersucht, z. B. auf Wachstum und Aktivierung von Markern und auf Effektorfunktionen, z. B. Zytokin und Chemokin Herstellung. Cytotoxische CD4+, CD8+ und NK Zellen werden auf die Wirkung im Hinblick auf Bildung und Funktion bewertet. Die Wirkung einer Antikörperproduktion wird z. B. auf Milz und MLN B Zellen untersucht. Dendritische Zellen werden auf Bildung, Reifung und Funktion untersucht, darunter die Herstellung des Faktors. Apoptose Assays werden ebenfalls entwickelt.
Langzeit Knochenmarkskulturen werden auf die Wirkung auf Veränderungen der Stromazellen und der Stammzellbildung und Differenzierung (Dexter Kulturen)auf Veränderungen der Stromazellen und B Zell Vorläuferbildung und Differenzierung (Whitlock-Witte Kulturen) und zur Bewertung des Potential für die Regulierung primitiver myeloider und B-lymphoider Populationen untersucht.
A Wirkung auf Proliferation von Zellen
Die Wirkung auf die Proliferation verschiedener Zelltypen werden in verschiedenen Konzentrationen des Zytokins untersucht. Eine Dosis-Response-Analyse wird durchgeführt in Kombination mit den Verwandten Zytokin IL-6, G-CSF, etc. Eine Zytosensorvorichtung kann verwendet werden, welche Zellmetabolismus und Wachstum bestimmt (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Menschliches p40/ILB30 Fusionsprotein steigerte die Proliferation menschlicher PHA Glasts, die mit Anti-CD3 oder sowohl Anti-CD28 stimuliert worden waren. Die Anti-CD3 Stimulierung scheint notwendig zu sein. Menschliches p40/IL-B30 Fusionsprotein steigerte auf die Proliferation der aktivierten Th1 oder Th2 Zellklone, aber nicht der ruhenden Th1 oder Th2 Zellklone.
Sowohl Maus als auch humanes Fusionsprotein wirkte auf Mauszielzellen. Das Fusionsprotein stützte die Proliferation der CD4+ CD45Rb^low CD62L^low CD44^hi Zellen (Gedächtnis/Aktivierte T-Zellen) sofern diese mit Anti-CD3 stimuliert wurden. Die Stimulierung durch das Fusionsprotein wurde durch Anti-CD28 Costimulierung nicht verstärkt. Diese hängt nicht stark von der Gegenwart des IL-2 ab. Dies deutet darauf hin, daß p40/IL-B30 ein wichtiger Faktor für die Expansion einer Population von Zellen mit einem Gedächtnisphänotyp ist und/oder für die Bildung und Aufrechterhaltung des immunologischen Gedächtnisses wichtig ist. Dieses Zytokin scheint aktivierte Gedächtniszellen des Th1 Phänotyp selektiv zu stützen, z. B. Zellen, welche IFN-γ aber nicht IL-4 oder IL-5 produzieren.
B. Wirkungen auf die Differenzierung naiver T-Zellen
Humane Nabelschnurblut-zellen wurden gesammelt und naive CD4+ T-Zellen wurden isoliert. Diese wurden in Kultur gezogen, z. B. für 2 Wochen in Gegenwart von Anti-CD3 und IL-2 und mit bestrahlten Fibroblasten, welche CD32, CD58 und CD80 exprimieren, wodurch T-Zellen aktiviert werden und proliferieren. Die T-Zellkultur wurde auf die Wirkung der verschiedenen Zytokine auf die Proliferation oder Differenzierung hin bewertet. Einzelne Zellen wurden im Hinblick auf die Zytokinherstellung mittels FACS Analyse bewertet. Das p40/IL-B30 Fusionsprotein stützte die Proliferation Differenzierung der T-Zellen, die IFN-γ und kein IL-4 erzeugen, ein Zytokinexpressionsprofil, das für Th1 Zellen kennzeichnend ist.
C. Wirkungen der Expression auf Zelloberflächenmoleküle
Monozyten werden mittels negativer Selektion aus peripheren blutmononuklearen Zellen von gesunden menschlichen Spendern gereinigt. In Kürze, 3 × 108 mononukleare Zellen aus einer Ficoll Bande wurden auf Eis mit einem Cocktail monoklonaler Antikörper inkubiert (Becton-Dickinson; Mountain View, CA) bestehend aus, z. B., 200 μl eines αCD2 (Leu-5A), 200 μl eines αCD3 (Leu-4), 100 μl eines αCD8 (Leu2a), 100 μl eines αCD19 (Leu-12), 100 μl eines αCD20 (Leu-16), 100 μl eines αCD56 (Leu-19), 100 μl eines αCD67 (IOM 67; Immunotech, Westbrook, ME) und ein Antiglycophorin Antikörper (10F7MN, ATCC, Rockville, MD). An tikörper gebundene Zellen wurden gewaschen und anschließend mit Schaf-Anti-Maus IgG inkubiert, das an magnetische Kügelchen gebunden war (Dynal, Oslo, Norwegen) in einem Verhältnis von Kügelchen zu Zellen von 20:1. Antikörper gebundene Zellen wurden von den Monozyten durch Anwendung eines magnetischen Feldes getrennt. Anschließend wurden die humanen Monozyten in Yssels Medium in Kultur gezogen (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA), daß 1% humanes AB Serum enthielt in Abwesenheit oder Gegenwart von IL-B30, IL-6, G-CSF oder Kombinationen davon.
Die Analysen der Expression der Zelloberflächenmoleküle können mittels direkter Immunofluoreszenz durchgeführt werden. 2 × 105 gereinigte humane Monozyten können beispielsweise in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) inkubiert werden, die 1% humanes Serum enthält, auf Eis für 20 Minuten. Die Zellen werden bei 20 × g pelletiert. Die Zellen werden bei 20 ml PE oder FITC markiertem mAb resuspendiert. Nach einer 20minütigen Inkubation auf Eis werden die Zellen mit PBS gewaschen, das 1% humanes Serum enthielt, gefolgt von 2 Waschschritten PBS alleine. Die Zellen werden in PBS 1% Paraformaldehyd fixiert und auf einem FACS Scann Flow Cytometer analysiert (Becton-Dickinson; Mountain View, CA). Beispielhaft mAbs werden verwendet, z. B.: CD11b (anti-mac1), CD11c (ein pf150/95), CD14 (Leu-M), CD54 (Leu 54), CD80 (anti-BB1/B7), HLA-DR (L243) von Reckton-Dickinson und CD86 (FUN 1; Pharmingen), CD64 (32.2; Medarex), CD40 (mAb89; Schering-Plough, Frankreich).
D. Wirkungen der Zytokin Herstellung auf menschliche Zellen
Humane Monozyten wurden wie beschrieben isoliert und in Yssels Medium kultiviert (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA), das 1% humanes AB Serum in Abwesenheit oder Gegenwart des IL-B10 (1/100 Verdünnung Baculovirus exprimiertes Material) enthielt. Zusätzlich wurden die Monozyten mit LPS stimuliert (E. coli 0127:B8 Difco) in Abwesenheit oder Gegenwart des IL-B30 und die Konzentration der Zytokine (IL-1β, IL-6, TNFα, GM-CSF und IL-10) im Zellkulturüberstand wurde mittels ELISA bestimmt.
Zur intrazytoplasmatischen Färbung der Zytokine wurden Monozyten in Kultur gezogen (1 Millionen/ml) in Yssels Medium in Abwesenheit oder Gegenwart des IL-B30 und LPS (E. coli 0127:B8 Difco) und 10mg/ml Brefeldin A (Epicentre technologies Madison, WI) für 12 Stunden. Die Zellen wurden in PBS gewaschen und in 2% Formalehyd/PBS Lösung für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden anschließend gewaschen, in einem Permeabilisationspuffer (0,5% Saponin (Sigma) in PBS/BSA (0,5%)/Azid (1 mN)) resuspendiert und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen (2 × 105) wurden zentrifugiert und in 20 ml unmittelbar konjugiertem Anticytokin mAbs, 1:10 in Permeabilisierungspuffer verdünnt, für 20 Minuten bei Raumtemperatur resuspendiert. Die folgenden Antikörper können verwendet werden: IL-1α-PE (364-3B3-14); IL-6-PE (MQ2-13A5); TNFα-PE (Mabll); GM-CFS-PE (BVD2-21C11); und IL-12-PE (C11.5.14; Pharmingen San Diego, CA). Nachfolgend wurden die Zellen zweifach im Permeabilisierungspuffer gewaschen und einmal im PBS/BSA/Azid und unter Verwendung des FACScan flow Cytometers analysiert (Becton-Dickinson; Mountain View, CA).
Menschliche PHA Glasts erzeugten IFNγ als Reaktion auf die Umsetzung mit menschlichem p40/IL-B30 Fusionskonstrukt. Die Wirkungen waren mit IL-2 synergistisch. Das Fusionsprodukt steigerte die IFNγ Herstellung aktivierter aber nicht ruhender T-Zellen, ruhender Th1 Zellklone oder ruhender Th2 Zellklone.
E. Wirkungen der Proliferation auf humane periphere Blutmononukleare Zellen (PBMC)
Gesamt-PBMC werde aus Buffycoats von gesunden menschlichen Spendern mittels Zentrifugation durch Ficoll-Hypaque wie beschrieben (Boyum et al.) isoliert. PBMC wurden in 200 μl Yssels Medium (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) kultiviert, das 1% humanes AB Serum enthielt in Platten mit 96 Vertiefungen (Falcon, Becton-Dickinson, NJ) in Abwesenheit oder Gegenwart des IL-B30. Die Zellen wurden im Medium alleine oder in Kombination mit 100 U/ml IL-2 für 120 Stunden gezogen (R&D Systems). 3H-Thymidin (0.1 mCi) wurden zugegeben für die letzten 6 Stunden der Kultur und 3H-Thymidin Einbau wurde mittels flüssiger Scintillierungszählung bestimmt.
Das native, rekombinante und die Fusionsprotein würden auf agonistische und antagonistische Wirkungen in vielen weiteren biologischen Assaysystemen untersucht, z. B. auf T-Zellen, B-Zellen, NK, Makrophagen, dendritische Zellen, hämatopoetische Vorläuferzellen, etc. Aufgrund des strukturellen Verhältnisses zu IL-6 und G-CSF sollten Assays mit entsprechenden Wirkungen analysiert werden.
240/IL-B30 wird im Hinblick auf die Agonist- oder Antagonist-Aktivität auf transfizierte Zellen, die IL-6 oder G-CSF Rezeptoren und Kontrollen exprimieren bewertet, siehe z. B. Ho et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11267–11271; Ho et al., (1995) Mol. Cell. Biol. 15:5043–5053; und Liu et al., (1994) J. Immunol. 152:1821–1829.
p40/IL-B30 wird auf die Wirkung zur Aktivierung von Makrophagen/dendritischen Zellen und Antigenpräsentations-assays, T-Zell-Zytokin-Produktion und Proliferation in Reaktion zu dem antigenen oder allogenen Stimulus bewertet. Siehe z. B. de Waal Malefyt et al., (1991) J. Exp. Med. 174:1209–1220; de Waal Malefyt et al., (1991) J. Exp. Med. 174:915–924; Fiorentino et al., (1991) J. Immunol. 147:3815–3822; Fiorentino et al., (1991) J. Immunol. 146:3444–3451; und Groux et al., (1996) J. Exp. Med. 184:19–29.
Die Wirkungen des p40/IL-B30 auf NK-Zell-Stimulierung werden ferner bewertet. Die Assays können basieren auf z. B. Hsu et al., (1992) Internat. Immunol. 4:563–569; und Schwarz et al., (1994) J. Immunother. 16:95–104.
Die Wirkungen auf B-Zell-Wachstum und Differenzierung werden analysiert, z. B. mittels der Verfahren, die beschrieben wurden in z. B. in Defrance et al., (1992) J. Exp. Med. 175:671–682; Rousset et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1890–1893; inklusive IgG2 und IgA2 Wechsel-Faktor-Assays.
IX. Herstellung und Analyse genetisch veränderter Tiere
Transgene Tiere können mittels Standardverfahren erzeugt werden. Entsprechende Tiere sind für die Bestimmung der Wirkung der Überexpression der Gene in bestimmten Geweben oder allgemein im Organismus nützlich. Diese Untersuchungen können wichtig ö Einsichten in die Entwicklung des Tieres oder besonderer Gewebe in verschiedenen Stadien ermöglichen. Die Wirkung auf verschiedene Reaktionen auf biologischen Streß kann ferner bewertet werden. Siehe z. B. Hogan et al., (1995) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (2. Auflage) Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Adenovirale Techniken werden zur Expression der Gene in verschiedenen Zellen und Organen verwendet. Siehe z. B. Hitt et al., (1997) Adv. Pharmacol. 40:137–195; und Literatur von Quantum Biotechnologies, Montreal, Kanada. Tiere können zur Bestimmung der Wirkungen der Gene auf verschiedene Entwicklungs- oder physiologische Funktionen des Tieres nützlich sein.
Folgende Beispiele liegen außerhalb des Umfangs der vorliegenden Ansprüche, werden jedoch als relevanter technischer Hintergrund erhalten.
Eine 0,5 kb cDNA, die für IL-B30 kodiert, wurde als ein EcoRI Fragment in einen Expressionsvektor kloniert, der den CMV Enhancer β-Actin Promoter und das Kaninchen β-globin Polyadenylierungssignal enthielt und zuvor von Niwa et al., beschrieben worden war (1991) Gene 108:193–200. Die Auftrennung des Transgens von der Sektorsequenz wurde durch Sucrosedichtegradientenzentrifugation erreicht, wie von Mann et al., beschrieben (1993) „Factor Influencing Production Frequency of Transgenic Mice", Methods in Enzymology 225:771–781. Teile des Transgens wurden vereinigt, durch einen Microcon-100 Filter mikrozentrifugiert und 5fach mit Mikroinjektionspuffer gewaschen (5 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM NaCl, 0,1 mM EDTA).
Das Transgen wurde in Mikroinjektionspuffer resuspendiert (5 mM Tris-HCl, pH 7, 4, 5 mM NaCl, 0,1 mM EDTA) bis auf eine Endkonzentration von 1-5ng/ml, in Eizellen mikroinjiziert ([C578L/6J × DBA/2]F1; The Jackson Laboratory), die anschließend in die Eileiter von ICR (Sprague-Dawley) Ammen transferiert wurden gemäß den veröffentlichten Verfahren von Hogan et al., (1994) Manipulation of the Mouse Embryo, Plainview, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Nach 10 Tagen wurde ein Stück des Schwanzes des Tieres zur DNA Analyse entnommen. Die Identifizierung der transgenen Gründer wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wie zuvor von Lira et al., beschrieben ausgeführt (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7215–7219. Die Identifizierung der IL-B30 transgenen Mäuse wurde durch Amplifizierung der DNA aus den Mäuseschwänzen erreicht. Als interne Kontrolle wurde eine Amplifikationsreaktion mit Primern für das endogene LDL Gen durchgeführt. Die Primer amplifizierten am 200 bp Abschnitt des IL-830 Transgen und ein 397 bp Abschnitt des LDL Gens. Die PCR Bedingungen betrugen 95°C, 30 Sekunden, 60°C, 30 Sekunden, 72°C, 60 Sekunden für 30 Zyklen. Die transgenen Tiere wurden unter Bedingungen behalten, die frei von Erregern waren.
Die Analyse der IL-B30 transgenen Mäuse
RNA wurde aus den Geweben extrahiert unter Verwendung des RNA STAT-60 nach den Anweisungen des Herstellers (TEL-TEST, Inc. Friendswood, TX). Gesamt-RNA (20 mg) wurde denaturiert und auf Biotransmembran (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA) geblottet. Die Expression des Transgens wurde durch Hybridisierung an zufällig markierte L-30 cDNA bewertet (Strategene, La Jolla, CA). Die Expression von Lebergenen der akuten Phase wurde durch Hybridisierung der Gesamt-RNA mit einem zufällig markierten PCR Abschnitt des murinen Hämopexingens des murinen alpha-1 Säureglycoprotein und des murinen Haptoglobingens bewertet.
ELISA Kits wurden von kommerziellen Quellen erworben und gemäß der Anweisung der Hersteller ausgeführt. ELISA Kits für murines IL-2 (Sensitivität > 3 pg/ml), murines IL-1b (Sensitivität > 3 pg/ml), murines IFN-gamma (Sensitivität > 2 pg/ml), und murines TNF-alpha (Sensitivität > 5.1 pg/ml) wurden von R&D Systems erworben (Minneapolis, MN). ELISA Kits für murines IL-6 (Sensitivität > 8 pg/ml) wurden für von Biosource International (Camarillo, CA) erworben. ELISA Kits für murines IL-1a (Sensitivität > 6 pg/ml) wurden von Endogen erworben (Cambridge, MA).
ELISA Assays für Serum Immunoglobulinmengen wurden unter Verwendung eines Antikörperpaars nach den Richtlinien des Herstellers durchgeführt, das von Pharmingen (San Diego, CA) erworben wurde. Anti-Maus-IgM (Klon 11/41), Anti-Maus-IgA (Klon R5-140), Anti-Maus-IgGl (Klon A85-3), Anti-Maus-IgG2a (Klon R11-89) und IgG2b (Klon R9-91) wurden als Auffangantikörper verwendet. Gereinigtes Maus-IgM (Klon G155-228), IgA (Klon M18-254), IgG1 (Klon 107.3), IgG2a (Klon G155-178 und IgG2b (Klon 49.2) wurden zur Herstellung von Standardkurven verwen det. Biotin Anti-Maus IgM (Klon R6-60.2), Biotin Anti-Maus IgA (Klon R5-140), Biotin Anti-Maus Igel (Klon A85-1), Biotin Anti-Maus IgG2a (Klon R19-15) und Biotin Anti-Maus IgG2b (Klon R12-3) wurden als Nachweisantikörper verwendet.
Die Mengen an IGF-1 im Serum der Maus wurden unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Radioimmunoassays für humanes IGF-1 ermittelt, welches auch murines IGF-1 erkennt, wenn die Proben gemäß den Weisungen des Herstellers mit Säure-Ethanol extrahiert werden (Nichols Institute, San Juan Capistrano, CA).
Nach der Opferung wurden die Gewebe entweder schockgefroren oder in gefrorenem Medium für Cryosektionen gelagert oder durch Eintauchen in 10% Phosphat-gepuffertes Formalin fixiert. Formalin-fixierte Gewebe wurden mittels Routineverfahren bei 5 mm prozessiert und mit Hämatoxilin und Eosin (H&E) gefärbt. Zur Immunofärbung wurden schockgefrorene Schnitte mit Aceton fixiert und luftgetrocknet.
Blutproben wurden aus dem infra-orbitalen Sinus in sterile evakuierte Röhrchen mit zugegebenen EDTA gesammelt (Vacutainer Systems, Becton Dickinson, Rutherford, NJ). Hämatologische Werte wurden mittels eines automatischen Systems bestimmt (Abbot Cell-Dyn 3500, Abbot Park, IL). Die Auszählung der Thrombozyten wurde manuell durchgeführt, soweit das Instrument nicht in der Lage war, genaue Thrombozytenzahlen aufgrund von exzessiver Verklumpung oder exzessiv großen Thrombozyten zu erstellen. Blutabstriche wurden mittels der Modified Wright-Giemsa Färbung gefärbt (Hema-Tek Stain Pack, Bayer Corp., Elkhart, IN) unter Verwendung eines Färbeautomaten (Bayer Hema-Tek 2000, Elkhart, IN) und manuell auf unreife Zellen und Thrombozyten, rote Blutzellen und weiße Blutzellmorphologie untersucht.
Knochenmarkstransfer
Die Femur und Tibia wurden von Muskeln gereinigt und Knochenmark wurde gewonnen, indem der Knochen mit PBS geflutet wurde. Knochenmarkszellen wurden einmal in PBS gewaschen und i. v. in Empfängermäuse injiziert, die zuvor tödlich bestrahlt worden waren (1000 RAD).
Phänotyp der IL-B30 transgenen Mäuse
Um die biologisch Funktion des IL-B30 zu analysieren wurde das Gen unter der Kontrolle des CMV Enhancer/Actin Promoter, der von Niwa et al., beschrieben worden ist (1991) Gene 108:193–200 in transgenen Mäusen exprimiert. Diese Enhancer/Promoter Kassette richtet hohe Mengen der Expression des Transgens primär an den Skelettmuskel und Pankreas, das Transgen kann jedoch in nahezu allen Organen und Zellen exprimiert werden. Siehe Lira et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7215–7219.
IL-B30 transgene Mäuse waren im Vergleich zu Kontrolltieren zwergwüchsig. Das Ausmaß an Körpergewichtszunahme in IL-B30 transgenen Mäusen variierte stark, war jedoch eindeutig geringer als das, das in Kontrolltieren gefunden wurde. Northern Blot Analyse der RNA, die aus dem Muskel oder der Haut von IL-B30 transgenen Mäusen und aus Kontrolltieren isoliert wurde, wurde mit IL-B30 cDNA hybridisiert und zeigt, daß IL-B30 cDNA sowohl im Muskel und der Haut aller IL-B30 transgenen Mäuse nachgewiesen werden konnte, während ein IL-B30 mRNA in den Kontrolltieren nachgewiesen wurde. Dies zeigt, daß das verringerte Wachstum mit der Expression des IL-B30 assoziiert ist.
Von den IL-B30 transgenen Mäusen die erzeugt wurden, überlebten 25% bis zum Erwachsenenalter und waren von der Expression des IL-B30 betroffen, wie durch verringertes Wachstum, ge schwollenen Unterbauch, krauses Fell, Infertilität und plötzlichen Tod gekennzeichnet. Die transgene Expression des IL-B30 erzeugt ein Phänotyp, der die Erzeugung von IL-B30 transgenen Nachkommen verhindert. Die hier gezeigten Ergebnisse der vorläufigen Analysen beziehen sich auf die IL-B30 transgenen Gründermäuse.
Histologische Analyse der IL-B30 transgenen Mäuse
Mikroskopische Untersuchungen der von IL-B30 transgenen Mäuse gewonnenen Gewebe zeigten minimale bis moderate Entzündungen an vielen Stellen, darunter der Lunge, der Haut, dem Ösophagus, dem Dünndarm und der Leber (den Gallengängen), dem Dickdarm und dem Pankreas. Entzündliche Infiltrate bestanden aus Neutrophilen, Lymphozyten und/oder Makrophagen. Entzündungen der Haut waren mit Akanthose und/oder Ulceration bei einigen Mäusen verbunden. Peribronchale mononukleare Zellinfiltrate waren in einigen Lungen vorherrschend, die alveolaren Wände enthielten gesteigerte Anzahlen von Leukozyten und die Auskleidung des Epithels der Luftwege war hyperplastisch. Minimale periportale mononukleare Zellinfiltrate wurden möglicherweise in der Leber gefunden. Der Kortex der Lymphknoten war in einigen Fällen spärlich zellulär und es fehlte an follikulärer Entwicklung.
Extrameduläre Hämatopoese (EMH) wurde in der Leber, der Milz und in den Lymphknoten beobachtet. Die EMH war in der Milz besonders deutlich. Die Milz von drei transgenen Mäusen und einer Kontrollmaus wurden nach immunohistochemischer Färbung auf T-Zellen (anti-CD3), B-Zellen (anti-B220) und Makrophagen (anti-F4/80) untersucht. In transgenen Mäusen waren CD3-, B220-und F4/80-positive Zellen an ihren normalen Orten vorhanden. Die weiße Pulpa war jedoch durch das EMH von der roten Pulpa getrennt und die positive Färbung der Zellen innerhalb der roten Pulpa war mit hämatopoetischen Zellen vermischt, die weni ger intensiv gefärbt wurden oder von verschiedenen Antikörpern gar nicht positiv gefärbt werden konnten. Diese Beobachtungen zeigen, daß die transgene Expression des IL-B30 eine systemische Entzündung induziert, die mit EMH assoziiert ist.
Um die Wirkungen des IL-B30 auf Leukozyten und Thrombozytenzahlen im peripheren Blut zu analysieren, wurde die Analyse von vollständigem Blut durchgeführt. Die Anzahl der Neutrophilen im Blut von IL-B30 transgenen Mäusen war 3-11fach gegenüber der höchsten Neutrophilenzahl in Vergleichstieren erhöht. Steigerungen der Neutrophilen im peripheren Blut ist ein typisches Zeichen einer Entzündung und korrelieren mit der Infiltration von Neutrophilen in verschiedene Gewebe. Dementsprechend war das Verhältnis von myeloiden, (Granulozyten)/Erythroiden in Knochenmark erhöht.
Die Anzahl der zirkulierenden Thrombozyten war ferner bis zu 3fach in IL-B30 transgenen Mäusen im Vergleich zu Kontrolltieren erhöht. Eine gesteigerte Anzahl an Thrombozyten kann entweder durch eine gesteigerte Anzahl an Megakaryozyten oder durch eine Steigerung der Herstellung der Thrombozyten durch Megakaryozyten verursacht werden. Um diese Alternativen zu untersuchen, wurde peripheres Blut, Knochenmark und Milz aus IL-B30 transgenen Mäusen mikroskopisch untersucht. Im peripheren Blut wurden häufig Thrombozyten mit ungewöhnlicher Morphologie, darunter verlängerte und spindelförmige Thrombozyten gefunden. Im Knochenmark und in der Milz einiger Mäuse waren die Megakaryozyten aufgrund von gesteigerter Mengen an Zytoplasma vergrößert. Im Gegensatz dazu war die Anzahl der Megakaryozyten im Knochenmark und in der Milz nicht vergrößert. Dies deutet darauf hin, daß IL-B30 eine Steigerung in der Anzahl der Thrombozyten induziert, in dem deren Produktion durch Megakaryozyten beschleunigt wird.
Alle IL-530 transgenen Mäuse, die untersucht wurden, litten auch unter einer milden bis mittleren mikrozytischen hypochromischen Anämie mit Schistozyten und unterschiedlichem Ausmaß an nachweisbarer Regeneration. Der Hämatokritwert war geringer als der Durchschnittswert der Kontrolltiere, bei 36–70%. Die Gegenwart der mikrozystischen hypochromen Anämie verweist auf einen Defekt in der Hämoglobinherstellung.
Zytokin Profil der IL-B30 transgenen Mäuse
Um zu untersuchen, ob die systemische Entzündung, die in den IL-530 transgenen Mäusen beobachtet wurde, mit einer veränderten Expression der pro-inflammatorischen Zytokine verbunden ist, wurde die Konzentrationen von IL-1, TNFα, IL-6 und IFNγ im peripheren Blut bestimmt. In allen IL-530 transgenen Mäusen, die untersucht wurden, waren die Mengen an TNAα und IFNγ erhöht. Ferner, war die Menge an IL-1 in 25% der untersuchten IL-B30 transgenen Mäusen erhöht. Konzentrationen von IL-1 und TNFα, die IL-530 transgenen Mäusen gefunden wurden, erreichten Mengen, die mit akuter Entzündungsreaktion bei LPS assoziiert sind. Überraschenderweise wurde IL-6 im peripheren Blut der IL-530 transgenen Mäuse nicht gefunden, obwohl die Expression von IL-6 in Entzündungszuständen stark erhöht ist (Reinecker et al., (1993) Clin. Exp. Immunology 94:174–181; Stevens et al., (1992) Dig. Dis. Sci. 37:818–826) und unmittelbar durch TNFα, IL-1 und IFNγ induziert werden kann (Helle et al., (1988) Eur. J. Immunol. 18:957–959.
Gene der akute Phase in der Leber der IL-530 transgenen Mäuse
Der Körper reagiert auf Entzündungen mit einer akuten Phase-Reaktion, die durch die Expression von bestimmten Plasmaproteinen in der Leber gekennzeichnet ist. Da IL-530 transgenen Mäuse einen Phänotyp aufweisen, der für eine systemische Entzündung kennzeichnend ist, wurde die Expression der Gene der akuten Phase in der Leber der IL-B30 transgenen Mäuse und in Kontrolltieren untersucht. Die Lebergene der akuten Phase alpha-1-Säure Glycoprotein, Haptoglobin und Hämopexin, waren in allen IL-B30 transgenen Mäusen hoch exprimiert, während keine Expression dieser Gene in Kontrolltieren gefunden wurde. Dies zeigt, daß die Lebergene der akuten Phase in IL-B30 transgenen Mäusen konstitutiv exprimiert werden.
Serum Immunoglobuline der IL-B30 transgenen Mäuse
Während einer Immunreaktion induzieren einige Zytokine B-Zell-Differenzierung und nachfolgende Immunoglobulinsynthese. Um zu überprüfen, ob die Immunoglobulinsynthese der IL-B30 transgenen Mäuse verändert war, wurden die Konzentrationen der Immunoglobulinisotypen im peripheren Blut bestimmt. In 2 von 7 IL-330 transgenen Mäusen war die Konzentration des IgA 6–9fach erhöht im Vergleich zu Kontrolltieren. Die Konzentrationen des IgGl, IgG2a und IgG2b waren ferner 2,5–6fach in allen untersuchten IL-B30 transgenen Mäusen im Vergleich zu Kontrolltieren erhöht. Im Gegensatz dazu konnte keine signifikante Steigerung bei IgM oder IgE Titern in irgendeinem der untersuchten IL-B30 transgenen Mäuse nachgewiesen werden. 4 von 7 der IL-330 transgenen Mäuse zeigten tatsächlich deutlich verringerte Mengen an IgM Synthese. Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß eine Untergruppe von IL-B30 transgenen Mäusen eine 6–9fache Steigerung der Konzentration der Immunoglobulinisotypen IgA und IgG aufwies, während keine signifikante Steigerung in den Konzentrationen der Immunoglobulinisotypen IgM und IgG auftraten.
Serum IGF-1 Mengen in IL-B30 transgenen Mäusen
Chronische Entzündungsreaktionen (Kirschner und Sutton, (1986) Gastroenterology 91:830–836; Laursen et al., (1995) Arch. Dis. Child. 72:494–497) oder Überexpression der Zytokine in trans genen Tieren (De Benedetti et al., (1994) J. Clin. Invest. 93:2114–2119) kann Wachstumsstörungen verursachen, die mit einer Abnahme des Insulinähnlichen Wachstumsfaktors verbunden sind (IGF1). Um zu untersuchen, ob der Zwergwuchs der IL-530 transgenen Mäuse mit verringerten Mengen an IgF1 verbunden ist, wurden Serumproben der transgenen Mäuse auf IgF1 hin analysiert. In allen untersuchten IL-530 transgenen Mäusen war die Menge an IGF1 im Serum 12–14% der Menge, die in Kontrolltieren desselben Alters gefunden wurden. Dies legt nahe, daß die transgene Expression des IL-830, sowie die nachfolgende Entzündungsreaktion zu einer Verringerung des IGF1 in IL-530 transgenen Mäusen führt und nachfolgend der Grund für das gestörte Wachstum und die Unfruchtbarkeit sein könnte (Gay et al., (1997) Endocrinology 137(7):2937–2947).
Expression von biologisch aktivem IL-530 in hämatopoetischen Zellen
Zytokine sind sekretierte Proteine, welche das Immunsystem örtlich regulieren oder weitreichende Wirkungen vermitteln. Um zu überprüfen, ob die IL-530 als Zytokin aktiv ist und Entzündungen über Entfernungen in vielen Organen und eine akute Phase-Leber-Reaktion erzeugen kann, wurde IL-B30 transgenes Knochenmark in tödlich bestrahlte Wildtyp-Empfänger-Mäuse übertragen.
Die Knochenmarksempfänger wurden wöchentlich auf die Induktion einer Reaktion der akuten Phase untersucht. Gesteigerte Konzentrationen des akuten Phase-Proteins SAA konnte in den IL-B30 Knochenmarksempfängern bereits nach 35 Tagen nach der Übertragung gezeigt werden und die Mengen an SAA stiegen mit der Zeit an. In Übereinstimmung mit den gesteigerten Konzentrationen an SAA im peripheren Blut verschlechterte sich die Gesundheit der IL-B30 Knochenmarksempfänger, was durch das Aussehens des rauhen Fells, der entzündeten Haut um die Schnauze und am Hals ermittelt werden konnte. Im Gegensatz dazu wiesen die Empfänger von Wildtyp-Knochenmark keine gesteigerten Mengen an SAA in Blut auf und erschienen auch nicht krank.
Die Tiere wurden geopfert, wenn sie schwerkrank erschienen. Die Expression des IL-B30 konnte im Knochenmark und in der Milz der Empfänger des IL-B30 transgenen Knochenmarks nachgewiesen werden, jedoch nicht in den Organen der Empfänger des Wildtyp-Knochenmarks. Wie in den IL-B30 transgenen Spendern waren die Haut, Lunge, Leber und der Gastrointestinaltrakt bei den Empfängern der IL-B30 transgenen Knochenmarksspende entzündet, aber nicht bei den Empfängern der Wildtyp-Knochenmarksspende. Wiederum waren die Gene der akuten Phase der Leber (Hämopexin, AGP-1) in den Empfängern der IL-B30 transgenen Knochenmarksspende hoch exprimiert, aber kein IL-6 konnte im Blutserum nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß IL-B30 tatsächlich ein Zytokin mit weitreichenden Wirkungen ist.
Die Expression des transgenen IL-830 induziert ein auffälligen Phänotyp, der durch Zwergwuchs, systemische Entzündungen, Unfruchtbarkeit und Tod der transgenen Tiere gekennzeichnet ist. IL-B30 transgenen Tiere weisen systemische Entzündungen mit Infiltrationen der Entzündungszellen in die Lunge, Leber, Haut und das Verdauungsorgan auf.
Eine Überexpression des IL-B30 in vivo erzeugt einen Phänotyp mit gehemmtem Wachstum und Entzündungen, der auffällig ähnlich zu verschiedenen Modellen der transgenen Expression von IL-6 war. In ähnlicher Weise wirkt die transgene Expression des IL-6 oder die Verabreichung von rekombinanten IL-6 an Mäuse, da neutrophile Infiltration und Anämie bei Tieren als Ergebnis einer transgenen Expression des IL-B30 beobachtet wurden. Wie in IL-6 transgenen Tieren, war das gehemmte Wachstum der IL- 830 transgenen Gründer mit verringerten Mengen an IGF-1 verbunden, was durch die systemische Entzündung, die in diesen Tieren beobachtet wurde, erklärt werden kann.
Dieser Phänotyp der IL-830 transgenen Tiere könnte durch Hochregulation der IL-6 Expression verursacht werden, entweder als unmittelbare Wirkung der IL-B30 Überexpression oder durch eine IL-B30 vermittelte Hochregulierung der IL-1 und TNFα Expression. IL-1 und TNFα sind als Induktionsmittel für IL-6 bekannt und gesteigerte Konzentrationen an TNFα und IL-1 wurden in peripherem Blut von IL-830 transgenen Mäusen gefunden.
Es konnte jedoch kein IL-6 in dem Blut von IL-B30 transgenen Mäusen gefunden werden, was darauf hindeutet, daß der Phänotyp der IL-B30 Tiere unmittelbar mit einer Überexpression dieses neuen Zytokins verbunden ist und, wie durch deren Sequenzhomologien angezeigt, weist die IL-830 biologische Aktivitäten aus, die ähnlich zu denen des IL-6 sind.
IL-6 ist ein pleiotropes Zytokin, daß unter anderem eine Vielzahl von Funktionen induziert, darunter Thrombozytose, akute Phase Proteinsynthese, B-Zell-Differenzierung.
IL-B30 transgenen Mäuse exprimieren tatsächlich Lebergene der akuten Phase konstitutiv, wie AGP-1, Haptoglobin, Hämopexin und Serum Amyolid A Protein. Ein ähnlicher Phänotyp wurde als Wirkung einer transgenen Überexpression des IL-6 in Mäusen gezeigt oder nach Verabreichung von rekombinantem IL-6. Die transgene Expression des IL-830 erzeugt ferner Thrombozytose, die ungewöhnlich war, weil die Thrombozyten eine seltene Morphologie aufwiesen (verlängerte Form, besondere Größe und/oder Spindelform). Es ist davon auszugehen, daß IL-830 und/oder weitere hochregulierte Zytokine eine Wirkung auf die normale Produktion der Thrombozyten aufweist. Dies weist daraufhin, daß IL-B30 eine biologische Aktivität mit IL-6 und dessen Verwandten teilt.
IL-6 wurde auch als B-Zell-Differenzierungsfaktor identifiziert. Transgene Überexpression des IL-6 erzeugt Plasmozytome und IL-6-diffiziente Mäuse zeigen eine reduzierte IgG Reaktion. Obwohl Steigerungen im IgG und IgA Produktion in einigen IL-B30 transgenen Mäusen gefunden wurden, war diese Beobachtung unter verschiedenen Gründen nicht konsistent. Weitere Analysen werden benötigt, um IL-B30 im Hinblick auf einen möglichen B-Zell-Differenzierungsfaktor zu charakterisieren.
In den IL-B30 transgenen Mäusen wurden Steigerungen der zirkulierenden Neutrophile in Übereinstimmung mit der nachweisbaren Entzündung in verschiedenen Geweben gefunden, die Veränderungen der roten Blutzellparameter können jedoch nicht einfach erklärt werden. IL-1, TNFα und IFNγ sind Mittler eines Syndroms, das als Anämie chronischer Erkrankungen (ACD) bezeichnet wird, welches allgemein eine normozytische, normochromische, nicht-regenerative (oder minimal regenerative) Anämie darstellt und in einer Vielzahl chronischer Entzündungskrankheiten gesehen wird. Anämie chronischer Erkrankungen kann auch als mikrozytische hypochrome Anämie in einigen menschlichen Patienten auftreten. Dieses Syndrom wird durch einen veränderten leisen Metabolismus und eine verringerte Reaktion auf Erythropoietin verursacht. Die mikrozytische, hypochrome Anämie, die bei IL-B30 Mäusen beobachtet wurde, kann durch ACD verursacht werden, wie durch die Steigerung der peripheren Zytokinkonzentration nahegelegt wird. In den meisten Fällen wird mikrozytische, hypochrome Anämie jedoch durch Eisenmangel erzeugt, was mit der beschränkten Knochenmarksreaktion und Thrombozytose besser übereinstimmt, die in den IL-B30 Mäusen gesehen wurde. Weitere Untersuchung, darunter die Bestimmung des Serum Ferritin, Eisen und der Gesamteisenbindungskapazität, welche eine Differenzierung zwischen ACD und Eisendeffi zienzanämie ermöglichen würde, wurden nicht durchgeführt, aufgrund der Schwierigkeiten ausreichendes Blut von den betroffenen Mäusen zu erhalten.
IL-1 und TNFα sind bekannte Induktoren der IL-6 Expression und die IL-6 Expression wird üblicherweise in Entzündungsreaktionen hochreguliert. Es ist daher überraschend, daß IL-6 im peripheren, Blut der IL-B30 transgenen Mäuse nicht nachgewiesen werden konnte. Dies zeigt, daß IL-B30 eine negative Wirkung auf die IL-6 Expression über einen bisher unbekannten Mechanismus aufweist. Die Abwesenheit von IL-6 in IL-B30 transgenen Mäusen könnte tatsächlich die hohen Mengen an IL-1 und TNFα erklären, die in diesen Tieren beobachtet wurden, da IL-6 eine negative Wirkung auf die Konzentration von zirkulierendem IL-1 und TNFα in Mäusen aufweist. Die hohen Konzentrationen des zirkulierenden TNFα, die in IL-B30 transgenen Mäusen beobachtet wurde, könnten auch ein Ergebnis der gesteigerten Konzentration des IFNγ sein. IFNγ wird durch IL-2 aktivierte T-Zellen oder IL-4 aktivierte B-Zellen erzeugt und induziert die Expression von TNFα in Monozyten und Makrophagen. Es mußte auch bestimmt werden, ob die Expression des IFNγ unmittelbar durch IL-B30 vermittelt wird oder durch andere Zytokine, die von IL-B30 induziert werden. Zusammengefaßt kann festgestellt werden, daß die Ergebnisse darauf hindeuten, daß IL-B30 eine Vielzahl biologischer Aktivitäten mit IL-6 teilt. Es verbleibt offen, ob diese biologischen Aktivitäten über einen gemeinsamen Rezeptor, ein Signaltransduktionselement oder Transkriptionsfaktor vermittelt wird, der mit IL-6 geteilt wird. Diese Fragen werden hoffentlich durch laufende Untersuchungen unter Verwendung von genetischen und biochemischen Ansätzen geklärt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Zusammensetzung umfassend einen Komplex aus: i) einem im Wesentlichen reinen, reifen humanen IL-12 p40 Polypeptid; und ii) einem im Wesentlichen reinen, reifen Polypeptid der SEQ ID NO:2.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, die: a) des Weiteren einen Träger umfaßt, der aus einer wäßrigen Verbindung einschließlich Wasser, Salzlösung, und/oder Puffer ausgewählt ist; b) für die orale, rektale, nasale, topische oder parenterale Verabreichung formuliert ist; oder c) steril ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei mindestens ein Polypeptid: i) nachweisbar markiert ist; ii) rekombinant hergestellt ist; iii) unglykosiliert ist; iv) denaturiert ist; v) an ein festes Substrat angebracht ist; oder vi) an einen anderen chemischen Teil konjugiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, die des Weiteren: a) IL-18; b) IL-12; c) ein Therapeutikum für die Bestrahlung oder Chemotherapie; d) einen Immun-Hilfsstoff; oder e) ein anti-virales Therapeutikum umfaßt.
Rekombinante Nukleinsäure, die für die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 kodiert.
Rekombinante Nukleinsäure nach Anspruch 5, die: a) ein Expressionsvektor ist; b) des Weiteren einen Replikationsursprung umfaßt; c) eine nachweisbare Markierung umfaßt; d) ein synthetisches Nukleotid umfaßt; oder e) weniger als 6 kb, vorzugsweise weniger als 3 kb aufweist.
Antikörper oder bindendes Fragment davon, der/das spezifisch an eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 bindet, aber nicht an ein reifes humanes IL-12 p40 Polypeptid oder ein reifes Polypeptid der SEQ ID NO:2 alleine.
Zusammensetzung, die den Antikörper oder das bindende Fragment davon gemäß Anspruch 7 und: a) einen TNFα Antagonisten; b) einen IL-12 Antagonisten; c) IL-10; oder d) ein Steroid umfaßt.
Antikörper oder das bindende Fragment davon nach Anspruch 7, der/das: a) ein Fv, Fab, oder F(ab)2 Fragment ist; b) an einen anderen chemischen Teil konjugiert ist; c) ein polyklonaler Antikörper ist; d) eine Kd für das Antigen von mindestens 30 mM aufweist; e) an ein festes Substrat einschließlich ein Bead oder eine Plastikmembran angebracht ist; f) eine sterile Zusammensetzung ist; g) nachweisbar markiert ist, einschließlich einer radioaktiven oder Fluoreszenzmarkierung; h) ein monoklonaler Antikörper ist; i) ein chimärer Antikörper ist; j) ein humanisierter Antikörper ist; k) ein neutralisierender Antikörper ist; l) in einer Zusammensetzung vorliegt, die des Weiteren einen Träger umfaßt, der aus einer wäßrigen Verbindung einschließlich Wasser, Salzlösung und/oder Puffer ausgewählt ist; oder m) in einer Zusammensetzung vorliegt, die für die orale, rektale, nasale, topische oder parenterale Verabreichung formuliert ist.
Verwendung der Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikamentes zur Modulierung einer entzündlichen Reaktion.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die entzündliche Reaktion eine entzündliche Akute-Phase-Reaktion ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die entzündliche Akute-Phase-Reaktion im Hautgewebe, Lungengewebe, gastrointestinalen Gewebe oder Lebergewebe vorkommt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Medikament in Kombination mit: a) einem entzündungshemmenden Zytokin Agonisten oder Antagonisten; b) einem Analgetikum; c) einem entzündungshemmenden Agens; oder d) einem Steroid vorliegt.
Verwendung des Antikörpers oder bindenden Fragments davon gemäß Anspruch 7 für die Herstellung eines Medikamentes zur Modulierung der Physiologie oder Entwicklung einer Zelle, wobei die Modulierung zu einer Verbesserung von: a) einer Autoimmun-Erkrankung; oder b) einer chronischen entzündlichen Erkrankung führt.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Autoimmun-Erkrankung Multiple Sklerose ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Autoimmun-Erkrankung Psoriasis ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die chronische entzündliche Erkrankung Gelenkrheumatismus ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die chronische entzündliche Erkrankung eine entzündliche Darmerkrankung ist.
Verwendung des Antikörpers oder bindenden Fragments davon gemäß Anspruch 7 für die Herstellung eines Medikamentes zur Modulierung einer entzündlichen Reaktion.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die entzündliche Reaktion eine entzündliche Akute-Phase-Reaktion ist.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei die entzündliche Akute-Phase-Reaktion im Hautgewebe, Lungengewebe, gastrointestinalen Gewebe oder Lebergewebe vorkommt.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei das Medikament in Kombination mit: a) einem entzündungshemmenden Zytokin Agonisten oder Antagonisten; b) einem Analgetikum; c) einem entzündungshemmenden Agens; oder d) einem Steroid vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die entzündliche Reaktion Asthma ist.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die entzündliche Reaktion Fibrose ist.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die entzündliche Reaktion Diabetes ist.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die entzündliche Reaktion eine Darmentzündung ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei sowohl das reife humane IL-12 p40 Polypeptid und das reife Polypeptid der SEQ ID NO:2 Teil eines Fusionsproteins sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 27, wobei das Fusionsprotein vom N-Terminus zum C-Terminus das reife humane IL-12 p40 Polypeptid, einen Verknüpfer, und das reife Polypeptid der SEQ ID NO:2 umfaßt.
Rekombinante Nukleinsäure, die für die Zusammensetzung gemäß Anspruch 27 kodiert.