KR100894359B1 - 포유동물의 사이토카인, 이와 관련된 시약 및 이러한 시약의 사용 방법 - Google Patents
포유동물의 사이토카인, 이와 관련된 시약 및 이러한 시약의 사용 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 포유류의 사이토카인을 암호화하는 정제된 유전자; 정제된 단백질, 특정의 항체 및 당해 분자를 암호화하는 핵산을 포함한 시약을 제공한다.
또한, 본 발명은, 이러한 시약을 사용하는 방법 및 진단용 킷트도 제공한다.
사이토카인, IL-B30, IL-12 p40, 면역 반응
Description
본 발명은 포유동물 세포 (예를 들면, 포유동물의 면역 시스템에 속하는 세포)의 생물학적 측면 및 생리학적 측면을 조절하는 기능을 하는 단백질과 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명에서는, 예를 들면, 다양한 유형의 세포 (조혈 세포를 포함)의 활성화, 발생(development), 분화 및 기능의 조절에 유용한 정제된 유전자, 단백질, 항체, 관련된 시약 및 방법을 제공한다.
일반적으로, 재조합 DNA 기술은 공여원(donor source)의 유전 정보를 벡터에 혼입하여 소정의 공정 (예를 들면, 숙주내로 도입)을 거치게 하는 기술로서, 이로 인해 이전된 유전 정보는 새로운 환경내에서 복제 및/또는 발현된다. 통상적으로, 상기한 유전 정보는, 목적하는 단백질 생성물을 암호화하는 전령 RNA(mRNA)에서 유도된 상보성 DNA (cDNA)의 형태로 존재한다. 상기 담체는, 대개, 숙주 내에서 추후에 복제할 수 있도록 cDNA를 혼입할 능력을 가진 플라스미드이며, 소정의 경우에는 cDNA의 발현을 조절하여 숙주 내에서 상기 암호화된 생성물의 직접적인 합성을 지시할 수 있는 능력을 가진 플라스미드이다.
포유동물의 면역 반응은, "면역 네트워크(immune network)"라고 불리는 일련의 복잡한 세포 상호작용에 기초한 것으로 알려져 왔다 {참조: 예를 들면, Paul, (1998) Fundamental Immunology (4th ed.) Raven Press, NY}. 최근의 연구에서는, 이러한 네트워크의 내부 작동에 대한 새로운 통찰력을 제공해주고 있다. 실제로 이러한 반응의 대부분은 림프구, 대식세포, 과립구 및 기타의 세포의 네트워크-유사 상호작용에 관련된 것이 확실하지만, 현재 면역학자들은 가용성 단백질 (림포카인, 사이토카인 또는 모노카인으로 알려져 있음)이 이러한 세포 상호작용을 조절하는 데에 핵심 역할을 수행하는 것으로 일반적으로 생각하고 있다. 따라서, 세포 조절 인자의 분리, 특성 분석 및 메카니즘에 대한 관심이 매우 크며, 이러한 부분에 대한 이해로 인해 수많은 의학적 이상 증세(예를 들면, 면역 시스템 질환)의 진단 및 치료에 큰 발전을 가져올 것이다. 이러한 인자 중 몇몇은 조혈세포 성장인자 (예를 들면, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)이다 {참조: 예를 들면, Thomson (ed.1998) The Cytokine Handbook(3d ed.) Academic Press, San Diego; Mire-Sluis 및 Thorpe, (ed.1998) Cytokines Academic Press, San Diego; Metcalf and Nicola, (1995) The Hematopoietic Colony Stimulating Factors Cambridge University Press; 및 Aggarwal 및 Gutterman, (1991) Human Cytokines Blackwell Pub.}. 면역 시스템 세포에 의한 사이토카인의 발현은, 면역 반응의 조절에 중요한 역할을 한다. 많은 사이토카인은 다면 작용성(pleiotropic)이며, 생물학적으로 다중 활성 (CD4+ T 세포 서브세트의 항원 제시, 활성화, 증식 및 분화; B세포의 항체 반응; 및 과민반응을 포함)을 가진다. 또한, 사이토카인은, 면역 시스템 및/또는 조혈 세포와 직접적 또는 간접적으로 관련된 광범위한 퇴행성 또는 비정상적인 상태의 진단 및 치료에 사용될 수 있다.
림포카인은 다양한 방식으로 세포 활성을 중재하는 것이 분명하다. 림포카인은, 다능성 조혈 간세포(pluripotential hematopoietic stem cell)의 증식, 성장 및/또는 복잡한 면역 시스템을 구성하는 다양한 세포주를 포함하는 다수의 전구세포 (progenitor)로의 분화를 보조하는 것으로 관찰되었다. 상기 세포 성분들간의 적합하고 균형잡힌 상호작용은 건강한 면역 반응에 필수적이다. 상이한 세포주는, 림포카인을 다른 제제와 함께 투여하는 경우, 종종 상이한 방식으로 반응한다.
특히 면역 반응에 중요한 세포 계통(lineage)에는, 2가지 종류의 림프구가 포함된다: 면역 글로불린(외부 물질을 인식하여 결합함으로써 이를 제거할 수 있는 능력을 가진 단백질)을 생산 및 방출할 수 있는 B 세포; 및 림포카인을 방출하며, B 세포 및 면역 네트워크를 구성하는 다양한 다른 세포 (기타의 T 세포를 포함)를 유도 또는 억제하는, 다양한 T 세포 서브세트.
상기한 바와 같이, 새로운 림포카인 [예를 들면, G-CSF 및/또는 인터류킨(IL)-6와 관련된 림포카인)의 발견 및 개발은, 면역 시스템 및/또는 조혈 세포에 직접적 또는 간접적으로 관련된 광범위한 퇴행성 또는 비정상적인 상태에 대한 새로운 치료법 개발에 기여할 수 있다는 것은 분명하다. 특히, 공지의 림포카인의 유용한 활성을 향상시키거나 강화시키는 림포카인의 발견 및 개발은 매우 유용할 것이다. 처음에 새로운 유전자 IL-B30은, 예상되는 구조에 근거하여 사이토카인일 것으로 동정되었으며, IL-6 및 G-CSF (국제특허출원 PCT/US98/15423(WO99/05280))와 유사한 장쇄 사이토카인으로 분류되었다. IL-6 및 이와 관련된 사이토카인 (예를 들면, 온코스타틴 M, 백혈병 억제 인자 (LIF), 섬모체 향신경성 인자(CNTF) 및 카디오트로핀-1)은, 조혈, 혈소판 형성, 급성기 반응의 유도, 파골세포(osteoclast) 형성, 뉴론 분화와 생존, 및 심장 비대에 대한 생물학적 활성을 가진다. 마우스에서 IL-6를 형질전환 발현시킴으로써 마우스에 IL-6를 과발현시킨 후에 관찰된 바와 유사한 표현형(소모증후군, 전신성 염증, 무생식 및 사망)을 유도하였다. IL-B30은, 염증 반응에 관련된 신규한 사이토카인으로 생각된다.
발명의 요약
본 발명은, 부분적으로는 IL-B30 (본원에서는 "IL-B30 단백질"로도 지칭함)의 생리학적 역할 및 이의 면역 반응에서의 역할의 발견에 기초한 것이다. 특히, IL-B30의 역할은, 염증, 감염성 질환, 조혈 발생 및 바이러스 감염에 관련된 경로에서 밝혀졌다. 특히, 본 발명은, 인터류킨(IL)-B30 (IL-B30)와 인터류킨(IL)-12 p40 (IL-12 p40) 소단위(subunit)를 함께 포함하는 조성물 및 이의 생물학적 활성에 관한 것이다. 본 발명은, 상기 2가지의 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산, 및 이의 제조방법 및 용도를 포함한다. 본 발명의 핵산은, 부분적으로는, 본원에 개시된 상보성 DNA(cDNA) 서열과의 상동성 및/또는 기능성 분석 특성을 가진다. 또한, 본 발명에서는, 핵산 발현 방법의 사용을 포함한, 폴리펩티드, 항체 및 이의 사용방법을 제공한다. 본 발명에서는, 성장인자-의존 생리 반응 또는 면역 반응의 조절에 대한 조정방법 또는 개입방법을 제공한다.
본 발명은, IL-12의 p40 소단위가 예전에 공지된 천연형태의 IL-B30 사이토카인 (예를 들면, USSN 08/900,905 및 09/122,443)과 결합한다는 발견에 부분적으로 기초한 것이다. 따라서, 상기한 2가지의 폴리펩티드가 함께 공-발현(coexpression)되면, 기능성 수용체 결합 및 신호전달이 이루어지게 된다.
본 발명에서는
(a) IL-12 p40의 적어도 7개의 연속적인 아미노산으로 된 다수의 상이한 절편(segment)을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩티드와, IL-B30의 적어도 7개의 연속적인 아미노산으로 된 다수의 상이한 절편을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 포함하거나;
(b) IL-12 p40의 적어도 11개의 연속적인 아미노산을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩티드와, IL-B30의 적어도 11개의 연속적인 아미노산을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 포함하거나;
(c) IL-12 p40의 적어도 7개의 연속적인 아미노산으로 된 다수의 상이한 절편과, IL-B30의 적어도 7개의 연속적인 아미노산으로 된 다수의 상이한 절편을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 포함하거나; 또는
(d) IL-12 p40의 적어도 11개의 연속적인 아미노산으로 된 절편과, IL-B30의 적어도 11개의 연속적인 아미노산으로 된 절편을 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다양한 양태에서는
(a) 적어도 7개의 연속적인 아미노산으로 된 상기한 다수의 상이한 절편이, 적어도 9개의 연속적인 아미노산으로 된 하나의 절편을 포함하거나;
(b) 적어도 7개의 연속적인 아미노산으로 된 상기한 다수의 상이한 절편이, 모두 적어도 9개의 연속적인 아미노산이거나;
(c) IL-12 p40의 적어도 11개의 연속적인 아미노산으로 된 상기한 절편이, 적어도 15개의 연속적인 아미노산이거나;
(d) IL-B30의 적어도 11개의 연속적인 아미노산으로 된 상기한 절편이, 적어도 15개의 연속적인 아미노산이거나;
(e) 수성 화합물 (물, 염수 포함) 및/또는 완충액 중에서 선택된 담체를 추가로 포함하거나;
(f) 경구 투여, 직장 투여, 비강 투여, 국소 투여 또는 비경구 투여용으로 제형화되거나; 또는
(g) 멸균 조성물인 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에서는
(a) 상기 폴리펩티드 중 적어도 하나가 (i) 검출가능하게 표지되거나, (ii) 재조합 방법으로 생성되거나, (iii) 글리코실화(glycosylation)되지 않거나, (iv) 변성되거나, (v) 고형 기질에 부착되거나, 또는 (vi) 다른 화합물 잔기에 접합되거나;
(b) 실질적으로 순수한 IL-12 p40 폴리펩티드와, 실질적으로 순수한 IL-B30 폴리펩티드 둘다를 포함하거나;
(c) IL-B30에 융합된 IL-12 p40를 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 포함하거나; 또는
(d) IL-18, IL-12, 방사선 또는 화학치료, 면역 보조제 또는 항바이러스제와 배합된 조성물을 포함한다.
본 발명의 킷트 양태는, 상기한 조성물, 및 (a) 상기한 폴리펩티드를 포함하는 구획; 또는 (b) 본 킷트내의 시약의 사용 또는 폐기에 관한 지시사항을 포함한다.
본 발명의 핵산 조성물은, 예를 들면,
(a) IL-12 p40의 적어도 7개의 연속적인 아미노산으로 된 다수의 상이한 절편(segment)을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩티드와, IL-B30의 적어도 7개의 연속적인 아미노산으로 된 다수의 상이한 절편을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩티드 둘다를 암호화하거나;
(b) IL-12 p40의 적어도 11개의 연속적인 아미노산을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩티드와, IL-B30의 적어도 11개의 연속적인 아미노산을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩티드 둘다를 암호화하거나;
(c) IL-12 p40의 적어도 7개의 연속적인 아미노산으로 된 다수의 상이한 절편과, IL-B30의 적어도 7개의 연속적인 아미노산으로 된 다수의 상이한 절편 둘다를 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 암호화하거나; 또는
(d) IL-12 p40의 적어도 11개의 연속적인 아미노산으로 된 절편과, IL-B30의 적어도 11개의 연속적인 아미노산으로 된 절편 둘다를 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 암호화하는, 분리된 또는 재조합 핵산을 포함한다.
본 발명의 다양한 양태에서는
(a) 적어도 7개의 연속적인 아미노산으로 된 상기한 다수의 상이한 절편이, 적어도 9개의 연속적인 아미노산으로 된 하나의 절편을 포함하거나;
(b) 적어도 7개의 연속적인 아미노산으로 된 상기한 다수의 상이한 절편이, 모두 적어도 9개의 연속적인 아미노산이거나;
(c) IL-12 p40의 적어도 11개의 연속적인 아미노산으로 된 상기한 절편이, 적어도 15개의 연속적인 아미노산이거나;
(d) IL-B30의 적어도 11개의 연속적인 아미노산으로 된 상기한 절편이, 적어도 15개의 연속적인 아미노산이거나;
(e) 상기한 IL-12 p40이 영장류에서 기원하거나;
(f) 상기한 IL-B30이 영장류에서 기원하거나;
(g) 발현 벡터이거나;
(h) 복제 시발점(origin)을 추가로 포함하거나;
(i) 검출가능한 표지를 포함하거나;
(j) 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하거나;
(k) 6kb (바람직하게는, 3kb) 미만이거나; 또는
(l) 영장류에서 기원한 핵산을 포함한다.
또한, 본 발명에서는, 상기한 재조합 핵산을 포함하는 세포를 제공하며, 이 세포는 원핵 세포, 진핵 세포, 세균, 효모, 곤충 세포, 포유류 세포, 마우스 세포, 영장류 세포 또는 사람 세포이다.
본 발명의 킷트 양태는, 상기한 핵산, 및 (a) 상기한 핵산을 포함하는 구획(compartment); (b) 영장류 IL-12 p40 폴리펩티드를 추가로 포함하는 구획; (c) 영장류 IL-B30 폴리펩티드를 추가로 포함하는 구획; 또는 (d) 킷트내의 시약의 사용 또는 폐기에 대한 지시사항을 포함한다.
또는, 본 발명에서는,
(a) 30분간 50℃, 1M 미만의 염 농도하의 세척 조건하에서, 영장류 IL-12 p40의 천연 성숙-암호화 부위 (natural mature coding portion)와 하이브리드화되고;
(b) 30분간 50℃, 1M 미만의 염 농도하의 세척 조건하에서, 영장류 IL-B30의 천연 성숙-암호화 부위와 하이브리드화되는 핵산을 제공한다.
본 발명의 다양한 양태에서는
(a) IL-12 p40에 대한 상기 세척조건이 60℃, 400mM 염 농도 미만이고/이거나;
(b) IL-B30에 대한 상기 세척조건이 60℃, 400mM 염 농도 미만이고/이거나;
(c) 영장류 IL-12 p40를 암호화하는 서열에 대해 적어도 50개의 일련의 뉴클레오티드에 걸쳐 동일성을 보이고/보이거나;
(d) 영장류 IL-B30를 암호화하는 서열에 대해 적어도 50개의 일련의 뉴클레오티드에 걸쳐 동일성을 보이는 핵산을 포함한다.
본 발명의 바람직한 양태에서는
(a) IL-12 p40에 대한 상기 세척조건이 65℃, 150mM 염 농도 미만이고/이거나;
(a) IL-12 p40에 대한 상기 세척조건이 65℃, 150mM 염 농도 미만이고/이거나;
삭제
(b) IL-B30에 대한 상기 세척조건이 65℃, 150mM 염 농도 미만이고/이거나;
(c) 영장류 IL-12 p40을 암호화하는 서열에 대해 적어도 90개의 일련의 뉴클레오티드에 걸쳐 동일성을 보이고/보이거나/
(d) 영장류 IL-B30를 암호화하는 서열에 대해 적어도 90개의 일련의 뉴클레오티드에 걸쳐 동일성을 보이는 핵산을 포함한다.
본 발명에서는, 예를 들면, 종양괴사인자(TNF)-알파 길항제, IL-12 길항제, IL-10 또는 스테로이드와 결합된, IL-12 p40/IL-B30 조성물에 대한 길항제를 제공한다.
또한, 본 발명에서는, 하기 폴리펩티드를 포함하는 IL-12 p40/IL-B30 조성물에 특이적으로 결합하는(단, IL-12 p40 또는 IL-B30 폴리펩티드에는 특이적으로 결합하지 않음) 항체의 항원-결합 부위를 포함하는, 결합 화합물을 제공한다:
(a) 실질적으로 순수한 IL-12 p40 폴리펩티드와, 실질적으로 순수한 IL-B30 폴리펩티드 둘다를 포함하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드; 또는 (b) IL-B30에 융합된 IL-12 p40를 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩티드.
본 발명의 다른 양태에서는
(a) 용기 내에 포함되어 있거나;
(b) Fv, Fab 또는 Fab2 단편이거나;
(c) 다른 화학 잔기에 접합되어 있거나; 또는
(d) (i) 상기 항체가 IL-12 p40/IL-B30 조성물에 대해 생성되거나, (ii) 상기 항체가 면역선택되거나, (iii) 상기 항체가 폴리클로날 항체이거나, (iv) 상기 항체의 항원에 대한 Kd가 30mM 이상이거나, (v) 상기 항체가 고형 기질(비드 또는 플라스틱 막을 포함)에 부착되거나, (vi) 상기 항체가 멸균 조성물속에 존재하거나, 또는 (vii) 상기 항체가 검출가능하게 표지된(방사선 표지 또는 형광 표지) 결합 화합물을 포함한다.
본 발명의 소정의 바람직한 양태에서는,
(a) 상기한 바와 같은, 멸균 결합 화합물; 또는
(b) 상기한 결합 화합물 및 담체 {여기서, 담체는 (i) 수성 화합물 (물, 염수 및/또는 완충액을 포함) 및/또는 (ii) 경구, 직장, 비강, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된 것이다}를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 킷트 양태는, 상기한 결합 화합물, 및 (a) 상기 결합 화합물을 포함하는 구획; 또는 (b) 킷트내의 시약의 사용 또는 폐기에 대한 지시사항을 포함한다.
게다가, 본 발명에서는, 적합한 조건하에서, 영장류 IL-12 p40/IL-B30 조성물을 상기한 결합 화합물과 접촉시켜 항원 : 항원 복합체를 형성하는 것을 포함하는, 항원:항체 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서는
(a) 상기 복합체가 기타의 다른 사이토카인으로부터 정제되거나;
(b) 상기 복합체가 기타의 다른 항체로부터 정제되거나;
(c) 상기 접촉 단계가, 사이토카인을 포함하는 샘플과 접촉되거나;
(d) 상기 접촉 단계를 통해, 상기 항원을 정량적으로 검출하거나;
(e) 상기 접촉 단계가, 상기 항체를 포함하는 샘플과 접촉시켜 수행되거나; 또는
(f) 상기 접촉 단계를 통해, 상기 항체를 정량적으로 검출하는 다양한 방법을 포함한다.
또한, 본 발명에서는, 상기 세포를 IL-12 p40/IL-B30 조성물 또는 이의 길항제와 접촉시키는 것을 포함하여, 세포 또는 조직의 생리 또는 발생을 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 한 양태는, 상기 세포를 IL-12 p40/IL-B30 조성물과 접촉시켜 IFNγ의 생산을 증가시키는 것을 포함하여, 세포의 생리 또는 발생을 조절하는 방법에 관한 것이다. 통상적으로, 상기 세포는 숙주 유기체내에 있으며, 이러한 유기체는 강화된 Th1 반응 (예를 들면, 항종양 효과, 보조제 효과, 항바이러스 효과 및 알레르기 길항 효과중에서 선택된 하나의 효과)을 보인다. 종종, 상기 접촉 단계는, IL-18, IL-12, 방사선 치료 또는 화학 치료, 면역 보조제 또는 항 바이러스 치료제와 함께 병용하여 수행된다.
본 발명의 다른 양태에서는, 상기 길항제가 IL-12 수용체의 β1 소단위에 대한 항체이다. 따라서, 본 발명은, 상기 접촉 단계가 길항제와 함께 수행되어 IFNγ의 생산을 상대적으로 감소시키는 방법을 포함한다. 따라서, 본 발명에서는, 상기 길항제를 상기 유기체에 투여함을 포함하여, 숙주 유기체내의 세포의 생리 또는 발생을 조절하는 방법을 제공한다 {여기서, 상기 접촉 단계를 통해, 자가면역 상태 또는 만성 염증 상태가 완화된다}.
상기 2가지의 소단위의 결합을 확인함으로써, (a) IL-12 p40을 갖는 상기 폴리펩티드를 발현시킴을 포함하여, 영장류 IL-B30의 방출을 증가시키거나; 또는 (b) IL-B30을 갖는 상기 IL-12 p40을 발현시킴을 포함하여, 영장류 IL-12 p40의 방출을 증가시키는 방법이 제공된다. 바람직하게는, (a) 상기 방출 증가의 정도가 적어도 3배이거나, (b) 상기 발현의 대상이 IL-B30 및 IL-12 p40를 암호화하는 재조합 핵산이다.
본 발명에서는, 예를 들면, 상기 복합체가 상기 수용체에 결합할 수 있는 조건하에서, 상기 수용체를 발현하는 세포에 상기 복합체를 접촉시켜 검출가능한 상호작용을 형성시킴을 포함하여, 상기한 IL-12 p40/IL-B30 조성물에 결합하는 수용체를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 이러한 상호작용을 통해, 상기 세포내에서 생리 반응이 일어난다.
또한, 본 발명에서는, 동물내의 단핵세포/대식세포 계통의 세포를 치료학적 유효량의 포유류 IL-B30 단백질 (효능제) 또는 포유류 IL-B30 단백질 (길항제)과 접촉시킴을 포함하여, 동물내에서 백혈구의 추적 또는 활성화를 조절하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서는, 상기한 포유류 IL-B30 단백질이 영장류 단백질이고/이거나, 상기한 길항제가 포유류 IL-B30에 결합하는 항체인 방법을 제공한다. 본 발명의 소정의 양태에서는, 상기한 단핵세포/대식세포 계통의 세포가 미세아교 세포 (microglial cell) 또는 가지 세포 (dendritic cell)인 방법; 또는 상기 동물이 염증 상태, 백혈구 증식 상태, 신경변성 상태 또는 외상후 상태의 징후 또는 증상을 나타내는 방법을 제공한다. 바람직한 양태는 당해 징후 또는 증상이 폐 조직; 간 조직; 신경 조직; 림프양 조직; 골수 조직; 췌장; 위장 조직; 갑상샘 조직; 근육 조직; 또는 피부 또는 아교질 조직내에서 발생하는 경우를 포함한다.
본 발명의 다른 방법으로는, 상기 조절이 백혈구의 기능을 억제하는 방법; 및/또는 효능제를 투여하는 방법이 포함된다. 바람직하게는, 상기 효능제는 포유류 IL-B30이다.
본 발명의 소정의 양태에서는, 상기 동물이 하기의 징후 또는 증상을 경험하는 것을 포함한다: 자가면역, 염증, 조직-특이적 자가면역, 퇴행성 자가면역, 류마티스 관절염, 골관절염, 죽상경화증, 다발성 경화증, 맥관염, 지연성 과민증상, 피부 이식(skin grafting), 이식(transplant), 척수 손상, 뇌졸증, 신경세포 퇴행, 감염성 질환, 허혈, 암, 종양, 다발성 골수증, 카스틀만 질환(Castleman's disease), 폐경기후 골다공증 또는 IL-6 관련 질환. 상기 투여는, 소염 사이토카인 효능제 또는 길항제, 진통제, 소염제 또는 스테로이드와 함께 병용투여될 수 있다.
상기 조절이 백혈구 기능을 강화시키고/거나, 길항제를 투여하는, 기타의 다양한 방법이 제공된다. 바람직하게는, 상기 길항제는, 포유류 IL-B30에 결합하는 항체; 또는 IL-B30 수용체에 결합함에 있어서 포유류 IL-B30와 경쟁하지만 실질적으로 신호를 보내지는 않는, 포유류 IL-B30의 뮤테인(mutein)이다. 본 발명의 다양한 양태에서, 상기 방법은, 상처 치유 증상 또는 혈전 형성 징후 또는 증상을 경험하는 상기 동물에게 적용된다. 종종, 상기 투여는 신생혈관생성 인자, 성장 인자 (FGF 또는 PCGF 등), 항생제 또는 응고 인자와 함께 수행된다.
마지막으로, 본 발명에서는, IL-B30 또는 이의 효능제를 투여하여, 메모리 T세포의 증식을 유도하는 방법을 제공한다.
바람직한 양태에 대한 상세한 설명
본원의 모든 참조문헌은, 각각의 개별 문헌 또는 특허출원이 특별히 개개별로 참조문헌으로 포함된 것과 동일하게 본원에 참고로 인용되어 있다.
개요
I. 일반적인 내용
II. 정제된 IL-12 p40/IL-B30 복합체
A. 물리적 특성 B. 생물학적 특성
III. 물리적 변이체
A. 서열 변이체, 단편
B. 전사후(post-translation) 변이체
1. 글리코실화
2. 기타
2. 기타
IV. 기능성 변이체
A. 유사체, 단편
1. 효능제 2. 길항제
B. 모사체(mimetics)
1. 단백질 2. 화합물 C. 종 변이체
V. 항체
A. 폴리클로날 항체 B. 모노클로날 항체 C. 단편, 결합 조성물
VI. 핵산
A. 천연 분리물; 방법 B. 합성 유전자 C. 분리방법
VII. p40/IL-B30 복합체, 모사체의 제조방법
A. 재조합 방법 B. 합성 방법 C. 천연 정제
VIII. 용도
A. 진단 B. 치료
IX. 킷트
A. 핵산 시약 B. 단백질 시약 C. 항체 시약
X. p40/IL-B30 복합체에 대한 수용체의 분리
I. 일반적인 내용
본 발명에서는, 포유류 단백질을 쌍을 짓게 하여 가용성 사이토카인 (예를 들면, 면역 세포 또는 기타 세포 사이의 신호를 중재할 수 있는 방출된 분자)을 제조하는 방법에 대해 교시하고 있다 {참조: 예를 들면, Paul, (1998) Fundarmental Immunology (4th ed.) Raven Press, N.Y}. 소정의 가용성 인자들은, 이질이합체(heterodimer) 폴리펩티드 (예를 들면, IL-6 및 IL-12)로 이루어져 있다. 예를 들면, 수용체를 발현하는 세포의 생리학적 조절에 있어서, 생리학적 형태와 유사하게, 이러한 이합체 형태 및 단편 또는 길항제가 유용할 것이다. p40/IL-B30 복합체를 포함하는 기능성 사이토카인은, 조혈 세포 (예를 들면, T 세포, B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 가지 세포, 조혈 전구세포 등과 같은 림프계 세포)에 대해 자극 효과 또는 억제 효과를 가질 가능성이 있다. 또한, 상기 단백질은, 이러한 단백질 상의 다양한 에피토프 (선형 및 형태 에피토프)에 대한 항체를 발생시키기 위한 항원 (예를 들면, 면역원)으로서 유용할 것이다.
IL-12 p40 소단위는 이미 공지되어 있다 {참조: Seiler 등, 미국 특허 제5,547,852호; Scott 및 Trinchieri, 미국 특허 제5,571,515호; Gately 등, 미국 특허 제5,650,492호; Liesehke 및 Mulligan, 미국 특허 제5,891,680호; Warne 등, 미국 특허 제5,744,132호; 접근번호 gbM86671, gbAF133197, gbU16674, gbU83184, embY07762, embY11129.1, gbM65272, gbAF007576, gbU19841, gbU11815, gbU57752, gbAF004024, gbU49100, gbU19834, embX97019}. IL-B30을 암호화하는 서열은 사람의 게놈 서열로부터 동정하였다. 이 분자는 huIL-B30로 지정하였다. 또한, 설치류 (예를 들면, 마우스)의 서열도 이미 기술되어 있다 {참조: USSN 08/900,905 및 09/122,443}. 본 발명은, 상기 2가지의 폴리펩티드 (예를 들면, p40 및 IL-B30)의 복합체를 포함하는 조성물, 및 상기 2가지 서열을 모두 암호화하는 핵산 작제물을 포함한다. 또한, 본 발명에서는, 이러한 복합체를 인식하는 항체, 및 상기 2가지의 메시지 (즉, 폴리펩티드)를, 예를 들면, 통합적으로 생산하는 방법을 제공한다.
사람의 IL-B30 유전자는, 약 198개의 아미노산으로 된 크기가 작은 가용성 사이토카인-유사 단백질을 암호화한다. 예측되는 시그널 서열(signal sequence)은, 약 17개의 잔기이며, Met에서부터 Ala까지 이어진다 (참조: 하기 표 1 및 서열1 및 2). IL-B30은, 장쇄 사이토카인이 속하는 그룹이 가지는 구조 모티프 특성을 보인다. 예를 들면, IL-B30, G-CSF 및 IL-6를 서로 비교해 보아라 (서열은 GenBank에서 입수가능; USSN 08/900,905 및 09/122,443 참조).
[표 1]
영장류 (예를 들면, 사람)의 IL-B30를 암호화하는 핵산 (서열 1) 및 이의 해독된 아미노산 서열 (서열 2)
암호화 서열:
설치류 (예를 들면, 마우스)의 IL-B30 (서열 3 및 4)
관련된 사이토카인 단백질과 IL-B30의 구조적인 상동성은, 이 분자가 가지는 기능이 서로 관련성을 가질 것을 시사한다. 하지만, IL-12 p40 폴리펩티드와 IL-B30 폴리펩티드의 결합을 인식함으로써, 활성 p40/IL-B30 이합체에 대해 생물학적 분석이 가능해진다. IL-12 p40/IL-B30 조성물은, 각각의 개별 폴리펩티드를 발현하는 상이한 폴리펩티드이거나, IL-12 p40와 IL-B30의 융합 작제물로 이루어질 수 있다. 상기 이합체는 다양한 유형의 세포 (예를 들면, PBMC)에 의해 인터페론-γ(IFNγ)의 생산을 유도할 수 있는 것으로 관찰되었는 데, 이는 상기 이합체가 사용될 생물학적 기능을 암시해준다. 또한, IL-12 수용체 β1 소단위가 p40/IL-B30 이합체에 대한 수용체의 한 성분임을 여러 실험에서 보여주고 있다.
IFNγ는 대식세포를 활성화시키고, 살종양활성(tumoricidal activity) 및 살균 활성을 자극한다. 또한, IFNγ는 MHC 부류 I 및 II 분자의 발현을 조절[단핵세포/대식세포 상에서의 부류 II 분자의 발현 상승 조절 (up-regulation) 등]하며; 표피세포, 내피세포 및 기타의 세포 상에서의 발현을 유도함으로써 항원 전달(antigen presentation)을 가능케 한다. 상기 사이토카인은, Th1-유사 CD4+ T 세포의 발생을 촉진하지만 Th2-유사 T 세포의 발생은 억제하는, Th1-유사 사이토카인이다. 이는, 높은 농도에서는 모든 항체 동형(isotype)의 생산을 비-특이적으로 억제하지만, B 림프구에 의한 IL-4-유도 IgE 및 IgG4 합성을 비교적 특이적으로 억제하는 강력한 억제 인자이다. IFNγ는, NK 세포 및 CTL에 의해 매개되는 종양 및 세포내 유기체에 대한 세포독성 면역 반응을 증강시킨다. IL-12과 유사하게, IFNγ는 세포-매개 세포독성 반응을 증진시키는 한편, 알레르기성 염증 및 IgE 합성을 억제하는 경향이 있다 {참조: 예를 들면, Karupiah, (ed.1997) Gamma Interferon in Antiviral Defense Chapman & Hall; Jaffe, (ed.1992) Anti-Infective Applications of Interferon-Gamma Marcel Dekker (ISBN: 0824786882); Sutterwala 등, (1999) J.Leukoc.Biol.65:543-551; Billiau 등, (1998) Ann.NY Acad.Sci.856:22-32; 및 Gessani 등 (1998) Cytokine Growth Factor Rev. 9:117-123}.
또한, IL-B30 효능제 또는 길항제는, 예를 들면, IL-6 또는 IL-12가 이의 수용체에 결합하는 것 또는 이와 반대되는 작용을 중재하는 것을 차단하는, 기능성 또는 수용체 길항제로서 작용할 수 있다. 따라서, IL-B30 또는 이의 길항제는, T 세포 면역 결핍, 만성 염증 또는 조직 이식거부와 같은 면역 질환과 같은 의학적으로 비정상적인 상태; 또는 심혈관 또는 신경생리 상태의 치료에 유용할 수 있다. 효능제는, 예를 들면 항-종양 상황, 보조 상황 및 항바이러스 상황에서 세포-중재된 면역을 증강시키는 치료에 사용될 수 있으며, 또는 알레르기 반응을 길항하는 데에 사용될 수 있을 것이다. 길항제는, 예를 들면, 세포가 자가면역 질환 또는 만성 염증 상태를 유발하는 상황에서, 상기 강화된 면역성을 차단하는 데에 사용될 수 있을 것이다.
상기한 천연 항원은, 표적 세포에서 생물학적 또는 생리학적 반응을 유도하는 다양한 생화학적 반응을 매개할 수 있다. 바람직한 양태는, 사람에서 유래한 항원이지만, 기타의 영장류 또는 다른 종에서 유래한 항원도 자연에서 존재하고 있다. 기타의 다른 포유류 종 (예를 들면, 영장류, 개, 고양이 및 설치류)의 단백질에 대한 추가의 서열도 입수가능하다.
특히, IL-12 p40 소단위와 IL-B30의 결합에 대해서는 이미 확인되었다. IL-12 p40 및 IL-B30 분자는 함께 진화되어 왔다. 상기 2가지가 기능적으로 관련되어 있다면, IL-12의 형식으로 서로 작용할 것이다 {참조: 예를 들면, Trinchieri (1998) Adv.Immunol. 70:83-243; Gately 등, (1998) Ann.Rev.Immunol. 16:495-521; 및 Trinchieri (1998) Int.Rev.Immunol. 16:365-396}.
하지만, 복합체로서, 상기 복합체는 사이토카인 수용체 패밀리에 속하는 2가지의 긴 신호전달 수용체와 상호작용할 것으로 예상된다. 이는, IL-12 수용체 소단위 β1의 경우에는 이미 확인되었다. 기타의 다른 관련된 수용체에 대해서는, 상기한 가용성 복합체와 결합할 수 있는 지 여부를 테스트할 수 있다. 신호 전달을 할 수 있는 상기 다양한 긴 수용체를 안정되게 발현하는 일련의 세포 (예를 들면, BAF/3)는 이미 작제되었다.
동일 세포내의 IL-12 p40 및 IL-B30의 형질감염체 (즉 단일 복합 작제물)의 상등액을 사용하여, 상기 다양한 세포들을 테스트하여 증식 또는 기타의 신호전달 반응이 있는 지를 확인하였다. 상기 사이토카인의 대부분의 생리 반응은 상기 단백질 복합체에 기인한 것일 수 있다. 상기 사이토카인에 의한 많은 생물학적 반응들은, 상기 소단위 조합체를 포함하는 복합체에 의해 실질적으로 생리 효과를 발휘하는 것일 것 같다.
또한, 하기 내용은 IL-12 p40/IL-B30 복합체에도 적용될 수 있다. IL-12 p40 소단위와 IL-B30의 융합체(예를 들면, 하이퍼 IL-6)를 작제하였다 {참조: Fischer 등 (1997) Nature Biotechnol. 15:142-145; Rakemann 등 (1999) J.Biol.Chem. 274:1257-1266; 및 Peters 등 (1998) J.Immunol.161:3575-3581 - 모두 본원의 참조문헌으로 포함되어 있음}. 게다가, IL-12 수용체 소단위 β1을 포함하는 수용체와 상기 사이토카인 복합체를 매칭(matching)시킴으로써, 상기 사이토카인 복합체의 수용체 길항제로서의 상기 소단위에 대한 항체를 동정할 수 있다.
II. 정제된 p40/IL-B30 복합체
사람의 IL-B30 아미노산 서열은, 본 발명의 한 양태로서 서열 2 내에 기재되어 있다. 상기 단백질을 암호화하는 기타의 다른 천연 핵산은, 상기 제공된 서열을 사용하는 표준 공정 (예를 들면, PCR 기법) 또는 하이브리드화 방법에 의해 분리될 수 있다. 이러한 아미노산 서열 (아미노에서 카복시 쪽으로)은, 상기 단백질 항원을 다른 단백질과 구분시켜주며 다양한 변이체를 예시해주는, 상기 사이토카인 소단위에 대한 서열 정보를 얻는 데에 중요하다. 또한, 상기 펩티드 서열을 통해 펩티드를 제조함으로써 절편을 인식하는 항체를 생산할 수 있으며, 뉴클레오티드 서열을 통해 올리고뉴클레오티드 프로브를 제조할 수 있다. 이러한 2가지 모두, 상기 서열을 암호화하는 유전자의 검출 또는 분리 (예를 들면, 클로닝)를 위한 전략이다.
본원에서 용어, "사람의 가용성 IL-B30"은, 단백질 개념으로 사용되는 경우, 서열 2의 가용성 폴리펩티드에 상응하는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함한다. 이의 주요 단편은, 종종 유사한 기능 (예를 들면, 항원성)을 유지할 것이다. 본 발명의 바람직한 양태에서는, 특정 길이를 갖는 다수의 상이한 (예를 들면, 중첩되지 않는) 절편을 포함한다. 상기 다수는, 통상적으로는 적어도 2 이상을 의미하며, 보다 통상적으로는 적어도 3 이상을 의미하며, 바람직하게는 5, 7 또는 그 이상이다. 상기한 길이의 최소치가 기재되어 있을 수 있는 데, 다양한 크기의 더 긴 길이(예를 들면, 길이 7의 절편 1개, 및 길이 12의 절편 2개)가 적합할 수 있다. 유사한 특징이, 상기 IL-12 p40 폴리펩티드에 적용되며, 상기 둘 중 하나 또는 모두의 폴리뉴클레오티드에도 적용된다.
통상적으로, 결합 성분 (예를 들면, 항체)은 IL-12 p40/IL-B30 복합체와 고친화적으로(예를 들면, 적어도 약 100nM, 통상적으로 약 30nM 보다 우수하게, 바람직하게는 약 10nM 보다 우수하게, 보다 바람직하게는 약 3nM 보다 우수하게) 결합한다. 이에 상대하는(counterpart) 단백질 복합체는, 사람 이외의 포유류 종 (예를 들면, 기타의 영장류, 유제류 또는 설치류)에서 발견될 것이다. 또한, 비-포유류 종 (예를 들면, 조류 또는 양서류)들도 구조적 또는 기능적으로 관련된 유전자 및 단백질을 가질 것이다.
본원에서 "폴리펩티드"는, 주요 단편(fragment) 또는 절편을 포함하며, 적어도 약 8개의 아미노산 {일반적으로 적어도 약 12개의 아미노산, 통상적으로 적어도 약 16개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 약 20개의 아미노산, 특히 바람직하게는 적어도 약 30개 또는 그 이상 (예를 들면, 35, 40, 45, 50개 등)의 아미노산} 잔기의 길이를 포함한다. 상기 단편은, 상기 IL-B30 또는 IL-12 p40 소단위에 대한 모든 실용적인 조합에 있어서, 실질적으로 모든 위치에서 시작 및/또는 종료 (예를 들면, 잔기 1, 2, 3 등에서 시작하고 잔기 175, 174, 173 등에서 종료)하는 말단을 가질 수 있다. 특히 주목받는 펩티드는, 구조 도메인 경계 (예를 들면, IL-B30의 나선 A, B, C 및/또는 D 이거나, IL-12 p40의 Ig 도메인)에 상응하는 말단을 가진다 (하기 참조).
용어 "결합 조성물"은, 예를 들면, 항체-항원 상호작용에 있어서, IL-12 p40/IL-B30 복합체에 특이적으로 결합하지만 개개의 성분만에는 결합하지 않는 분자를 의미한다. 상기 특이성은, 다소 특정 양태 또는 관련 양태 그룹 (예를 들면, 영장류, 설치류 등)을 포함할 수 있다 (예를 들면, 특이적이다). 고갈(depletion) 또는 흡수(absorption)를 통해 목적하는 선택성을 부여하여, 예를 들면, 상기 두가지 중 하나의 폴리펩티드 성분에만 결합하는 항체를 고갈시킬 수 있다. 또한, 본 발명에서는, 천연 생리적으로 관련된 단백질-단백질 상호작용 (공유 또는 비공유 상호작용)을 포함한, IL-12 p40/IL-B30 복합체와 특이적으로 결합하는 화합물 (예를 들면, 단백질)을 제공한다. 이러한 분자는 중합체 또는 화학 시약일 수 있다. 기능 유사체는, 구조적으로 변형된 단백질일 수 있거나, 적합한 결합-결정인자 (binding determinant)와 상호작용하는 분자 형태를 가지는 분자일 수 있다. 이러한 화합물은 수용체-결합 상호작용의 효능제 또는 길항제일 수 있다 {참조: 예를 들면, Goodman 등 (eds.), Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (최근호) Pergamon Press}.
예를 들면, 단백질의 경우, 용어 "실질적으로 순수한(substantially pure)"은, 상기 단백질이 본래의 공급원 유기체에서 유래한 기타의 단백질, 핵산 또는 다른 생물재로 오염되지 않은 것을 통상적으로 의미한다. 순도는, 통상적으로 중량을 이용하여 표준 방법에 의해 측정될 수 있으며, 대개 적어도 약 40%, 일반적으로는 적어도 약 50%, 종종 적어도 60%, 통상적으로 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%일 것이다. 담체 또는 부형제가 종종 첨가된다. 실질적으로 순수한 IL-12 p40 및 IL-B30를 포함하는 조성물은, 상기 2가지의 폴리펩티드로 된 복합체와 자연적으로 결합되지 않는 외인성 폴리펩티드를 다량 포함하지는 않을 것이다.
폴리펩티드 또는 단편의 가용성은, 외부 환경 및 폴리펩티드 자체에 따라 달라진다. 여러 가지의 매개변수(온도, 전해질 환경, 폴리펩티드의 크기 및 분자 특성, 용매의 특성 등)가 폴리펩티드의 가용성에 영향을 미친다. 통상적으로, 폴리펩티드가 사용되는 온도는 약 4 내지 약 65℃이다. 대개, 사용되는 온도는 약 18℃보다 높다. 진단용으로 사용되는 경우, 상기 온도는 대개 실온 정도 또는 이보다 높지만, 분석시 성분의 변성 온도보다는 낮게 한다. 치료용으로 사용되는 경우, 상기 온도는 대개 체온 (통상적으로, 사람과 마우스의 경우에 약 37℃)이며, 소정의 조건에서는 반응계내(in situ) 또는 실험실 내에서 (in vitro)에서 상기 온도를 상승 또는 하강시킬 수 있다.
상기 폴리펩티드의 크기 및 구조는, 실질적으로 안정된 상태에 있어야 하는 것이 일반적이며, 변성된 상태 (denatured state)에 있어서는 안된다. 상기한 폴리펩티드는 4차 구조로 기타의 다른 폴리펩티드와 결합되어, 예를 들면, 가용성을 부여할 수 있으며, 지질 또는 세척제와 결합할 수도 있다. 특히, 융합 조성물과 마찬가지로, 상기 2가지의 폴리펩티드의 결합으로 된 복합체가 바람직하다.
상기한 용매 및 전해질은, 생물학적 활성을 보존하기 위해 사용되는 유형의 생물학적으로 병용 가능한 완충액인 것이 일반적이며, 생리학적 수성 용매와 대개 비슷하다. 대개, 상기 용매는 중성 pH을 가지는 데, 통상적으로는 pH가 약 5 내지 10이며, 바람직하게는 약 7.5이다. 소정의 경우에는, 하나 이상의 세척제가 첨가되는 데, 통상적으로 순한 비-변성 세척제 {예를 들면, CHS (콜레스테릴 헤미석시네이트) 또는 CHAPS (3-[3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판 설포네이트} , 또는 단백질의 구조적인 또는 생리적인 특성이 크게 파괴되지 않을 정도의 낮은 농도의 세척제가 첨가된다.
소정의 면역원 (예를 들면, 서열 2의 아미노산 서열 또는 이의 단편으로 이루어진 면역원 또는 서열 1의 핵산으로부터 생성된 폴리펩티드)에 대해 생성된 항체 (예를 들면, 폴리클로날 항체)와 특이적으로 결합하거나 항체와 특이적으로 면역반응하는 IL-B30 폴리펩티드를 면역분석을 통해 통상적으로 결정한다. 본원에서 구조적으로 및 기능적으로 정의되어 있는 프로토타입 IL-B30 폴리펩티드에 대해 제조된 폴리클로날 항체에 선별적으로 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는, 본원에 기재되어 있는 핵산 서열(이의 기능성 변이체를 포함)도 본 발명에 포함된다. 면역분석 (immunoassay)에서는, 예를 들면, 서열 2의 단백질을 포함하는 복합체에 대해 생성된 폴리클로날 항혈청을 통상적으로 사용한다. 기타의 밀접하게 관련된 적합한 패밀리 구성원 (바람직하게는, 동일한 종에서 유래)에 대해 낮은 교차반응을 하는 항혈청은 선별 제거하고, 면역분석에서 사용하기 이전에 면역흡수 또는 고갈에 의해 이러한 교차반응을 제거한다. 특히, IL-12 p40 또는 IL-B30 폴리펩티드에만 결합하는 항체는 면역제거(immunodepletion)의 대상이다. 적합한 선별적인 혈청 제조물을 분리하고 및 특성분석할 수 있다.
본원에 기재된 바에 따라, 면역분석에 사용할 항혈청을 제조하기 위해, 상기 단백질 (예를 들면, 서열 2의 단백질)을 포함하는 복합체를 분리한다. 예를 들면, 재조합 단백질을 포유류 세포주에서 생산할 수 있다. 표준 보조제 (예를 들면, Freund 보조제) 및 표준적인 마우스 면역화 프로토콜 (참조: Harlow 및 Lane)을 사용하여, 서열 2의 단백질을 포함하는 복합체로 적합한 숙주 (예를 들면, Balb/c와 같은 동계교배된 마우스 품종)를 면역성을 부여한다. 이와 달리, 본원에 기재된 서열에서 유도된, 실질적으로 전장(full-length)의 합성 펩티드 작제물을 면역원으로 사용할 수도 있다. 적합한 고갈 또는 선별과 함께, 면역분석 (예를 들면, 고형 지지물상에서 고착된 면역원을 이용한 고상 면역분석)에서 상기 면역원 단백질에 대해 폴리클로날 혈청을 수집 및 적정한다. 104 이상의 적가를 가지는 폴리클로날 혈청을 선별하고, 경쟁적인 결합 면역분석 (예를 들면, Harlow 및 Lane의 문헌 pp.570-573에 기재된 면역분석)을 이용하여 기타의 밀접하게 관련된 패밀리 구성원 (예를 들면, LIF, CT-1, CNTF 또는 IL-6 패밀리에 속하는 기타의 패밀리 구성원)에 대한 교차반응성을 테스트한다. 표적과 함께 이러한 테스트에서는, 바람직하게는, 적어도 2가지의 IL-6/IL-12 패밀리 구성원을 사용한다. 이러한 장쇄 사이토카인 패밀리 구성원은, 재조합 단백질로서 제조될 수 있으며, 본원에 기재된 바와 같은 표준적인 분자 생물학 및 단백질 화학기법을 이용하여 분리될 수 있다. 따라서, IL-12 p40/IL-B30 패밀리 구성원의 서브셋트에 대해 목적하는 선별성 또는 특이성을 가지는 항체 제제물이 동정 또는 생성될 수 있다. 이와 달리, IL-12 p40 및 IL-B30를 포함하는 융합 폴리펩티드 형태의 복합체에 결합하는 항체를 제조할 수 있다.
삭제
경쟁적인 결합 형식으로의 면역분석은, 교차반응성 측정에 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 융합 단백질은 고형 지지물에 고정될 수 있다. 상기 분석에 첨가된 단백질은, 상기 고정된 항원과 결합하기 위해 선별 항혈청과 경쟁하게 된다. 상기 단백질이 상기 고정된 항원과 결합하기 위해 선별 항혈청과 경쟁할 수 있는 능력을 상기 융합 단백질과 비교한다. 표준 계산방법을 사용하여, 상기 단백질에 대한 교차반응율 (%)을 계산한다. 상기 나열된 각각의 단백질과의 교차반응성이 10% 미만인 항혈청을 선별하여 모아둔다. 그리고 나서, 상기 나열된 단백질과 면역흡수를 통해, 교차반응하는 선별된 항체를 상기 모아둔 항혈청으로부터 제거한다.
그리고 나서, 상기 면역흡수되고 모아둔 항혈청을 사용하여 상기한 바와 같은 경쟁적인 결합 분석을 수행하여, 제2의 단백질을 상기 면역원 융합 단백질과 비교한다. 이러한 비교를 위해, 넓은 범위의 농도를 사용하여 상기 2가지의 단백질을 각각 분석하고, 상기 선별적인 항혈청의 상기 고착된 융합 단백질에 대한 결합을 50% 억제하는 데에 필요한 각 단백질의 양을 측정한다. 필요한 제2 단백질의 양이 필요한 융합 단백질의 양보다 2배 미만인 경우, 제2 단백질은 상기 면역원에 대해 생성된 선별적인 항체에 특이적으로 결합한다고 말한다.
III. 물리적인 변이체
또한, 본 발명은, IL-12 p40/IL-B30 항원의 아미노산 서열과의 일치성이 매우 큰 (substantial identity) 단백질 또는 펩티드를 포함하는 복합체를 제공한다. 이러한 변이체에는, 종 변이체, 다형성 변이체 또는 대립형질 변이체가 포함된다.
아미노산 서열 상동성 (즉, 서열 일치성)은, 필요한 경우에는 요구되는 갭(gap)을 도입하여, 잔기 정합 (residue match)을 최적화함으로써 결정된다 {참 조: Needleham 등, (1970) J.Mol.Biol.48:443-453; Sankoff 등, (1983) Chapter one in Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA; IntelliGenetics사 (캘리포니아 마운틴 뷰 소재)의 소프트웨어 패키지; 및 the University of Wisconsin Genetics Computer Group (위스콘신 매디슨 소재)}. 서열 일치성은, 보존 치환 (conservative substitution)을 정합으로 생각하면 달라진다. 통상적으로, 보존 치환에는 하기 그룹내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 쓰레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 이러한 보존은, 생물학적 특성, 기능적 특성 또는 구조적 특성에 적용될 수 있다. 상동적인 아미노산 서열은, 소정의 단백질 서열의 천연적인 다형 또는 대립형질 및 종간 변이를 통상적으로 포함한다. 통상적인 상동 단백질 또는 펩티드는, 상기한 IL-B30의 아미노산 서열과 25-100%의 일치성 (갭을 도입할 수 있는 경우)에서 50-100%의 일치성 (보존 치환을 포함하는 경우)을 가진다. 일치성은, 적어도 약 35%, 일반적으로 적어도 약 40%, 종종 적어도 약 50%, 통상적으로 적어도 약 60%, 일반적으로 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 80%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%를 가지는 것으로 측정될 것이다.
상기 분리된 IL-12 p40 또는 IL-B30 DNA는, 뉴클레오티드의 치환, 결실 및 삽입과 짧은 뉴클레오티드의 역전에 의해 용이하게 변형될 수 있다. 이러한 변형으로 인해, 상기 항원, 이의 변이체, 또는 유사한 생리적 활성, 면역원성, 항원성 또는 기타의 기능적인 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 신규한 DNA 서열을 얻을 수 있다. 이렇게 변형된 서열을 사용하여, 돌연변이 항원을 생산하는 데에 사용될 수 있으며, 발현을 증가시키는 데에 사용될 수 있다. 증가된 발현은, 유전자 증폭, 증가된 전사, 증가된 해독, 및 기타의 대사를 포함할 수 있다. "돌연변이(mutant) IL-B30"는, 상기한 IL-B30의 서열 일치성 정의내에 포함되지만, 자연 상태에서 일반적으로 발견되는 IL-B30의 아미노산 서열과는 상이한 아미노산 서열을 가지는, 폴리펩티드를 포함한다. 일반적으로, 상기한 돌연변이 IL-B30은, 서열 2의 서열을 가지는 단백질과 상당한 정도의 일치성을 가지며, 상기 서열과 다양한 생물학적 활성 (예를 들면, 항원성 또는 면역원성)을 공유하는 단백질을 포함하며, 바람직한 양태에서는 개시된 천연의 전장 서열의 대부분을 함유한다. 절단된 (truncated) 서열도 유용하지만, 전장 서열(full-length sequence)이 통상적으로 바람직하며, 자연에서 발견되는 유전자 또는 단백질이 통상적으로 가장 바람직하다. 이와 유사한 개념이, 상이한 IL-B30 단백질 (특히, 포유류 및 조류와 같은 다양한 온혈동물에서 발견되는 IL-B30 단백질)에도 적용된다. 이러한 기재내용은, 일반적으로 다양한 IL-B30 단백질을 포함하는 것을 의미하며, 특별히 개시된 영장류 양태에 한정되지는 않는다.
IL-12 p40 또는 IL-B30 돌연변이유발은, 아미노산을 삽입하거나 결실시킴으로써 수행할 수도 있다. 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합을 통해 최종 작제물을 얻을 수 있다. 삽입에는, 아미노 말단 융합 또는 카복시 말단 융합이 포함된다. 표적 코돈에 무작위적인 돌연변이를 일으켜, 발현된 돌연변이를 목적하는 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, M13 프라이머 돌연변이 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기법에 의해, 공지의 서열을 가지는 DNA의 소정의 부위에 치환 돌연변이를 일으키는 방법은 이미 잘 알려져 있다 {참조: 예를 들면, Sambrook 등, (1989); Ausubel 등, (1987 및 보충내용); 및 Kunkel 등 (1987) Methods in Enzymol.154:367-382}. 바람직한 양태는, 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 1배, 2배, 3배, 5배, 7배 등의 보존 치환을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 치환은, 보존된 시스테인과는 멀리 떨어져 있으며, 나선 구조 도메인에서 멀리 떨어진 부위에서 종종 일어난다. 이러한 변이체는, 특정의 항체를 생산하는 데에 유용할 수 있으며, 여러 가지 또는 모든 생물학적 특성을 공유할 것이다. 상기한 사이토카인의 구조를 알게 되면, 수용체 상호작용에 있어서 목적하는 변화를 주기 위해 변형될 수 있는 잔기의 구조 및 위치에 대한 중요한 통찰력을 가질 수 있다. 또한, IL-12 p40와 IL-B30의 상호작용에는, 상호작용하는 표면에서 상보적인 구조 특성을 필요로 한다. 구조 분석을 통해, 복합체 형성 및 수용체 상호작용에 대한 복합체에 있어서 핵심적인 표면 잔기를 예측할 수도 있다.
또한, 본 발명에서는, 상기 단백질에서 유래한 절편을 이용한 이종 융합 단백질 (heterologous fusion protein)과 같은, 재조합 단백질을 제공한다. 이종 융합 단백질은, 자연적으로는 통상적으로 동일한 방식으로 융합되지 않는 단백질 또는 절편의 융합체이다. 이와 유사한 개념이, 이종 핵산 서열에도 적용된다.
게다가, 다른 단백질에서 유래한 유사한 기능을 가지는 도메인을 결합시킴으로써 새로운 작제물을 제조할 수 있다. 예를 들면, 표적-결합 또는 기타의 절편이, 상이한 새로운 융합 폴리펩티드 또는 단편 사이에서 "교환(swapping)"될 수 있다 {참조: 예를 들면, Cunningham 등, (1989) Science 243:1330-1336; 및 O'Dowd 등, (1988) J.Biol.Chem.263:15985-15992}.
하기 문헌에 기재된 포스포르아미디트 방법은, 적합한 합성 DNA 단편을 생산생산할 것이다 {참조: Beaucage 및 Carruthers, (1981) Tetra.Letts.22:1859-1862}. 종종, 이중쇄 단편은, 상보성 쇄를 합성하여 적합한 조건하에서 어닐링하는 방법, 또는 적합한 프라이머 서열과 함께 DNA 폴리머라제를 이용하여 상보성 쇄를 첨가하는 방법 (예를 들면, PCR 기법)에 의해 수득된다.
IL-6 패밀리에 속하는 사이토카인과 비교하여, 이러한 유전자에 대해 구조 분석을 수행할 수 있다. 이러한 패밀리에는, 예를 들면, IL-6, IL-11, IL-12, G-CSF, LIF, OSM, CNTF 및 Ob가 포함된다. 기타의 다른 IL-6 패밀리 구성원과 사람 및 마우스 IL-B30 서열과의 정렬 (alignment)을 통해, 구조 특성을 정의할 수 있다. 특히, 예를 들면, RASMOL 프로그램을 이용하여, β-시이트(β-sheet) 및 α헬릭스(α-helix) 잔기를 결정할 수 있다 {참조: Bazan 등 (1996) Nature 379:591; Lodi 등 (1994) Science 263:1762-1766; Sayle 및 Milner-White (1995) TIBS 20:374-376; Gronenberg 등 (1991) Protein Engineering 4:263-269; Wilkins 등 (1997) Proteome Research: New Frontiers in Foundational Genomics Springer-Verlag, NY}. 치환하기에 바람직한 잔기에는, 수용체와 상호작용하는 것으로 예상되는 표면-노출된 잔기가 포함된다. 기능을 유지하는 기타의 잔기는, 특히 상기 표면-노출된 잔기에서 멀리 떨어진 위치에서의 보존성 치환체(conservative substitution)가 될 것이다.
IV. 기능성 변이체
상기한 IL-12 p40/IL-B30 복합체에 대한 생리 반응의 차단은, 상기 복합체 리간드의 수용체에 대한 결합을 경쟁적으로 억제함으로써 유도될 수 있다. 이러한 수용체의 하나의 소단위를 동정하게 되면 상기한 바와 같이 추가로 특성을 분석할 수 있으며, 이러한 소단위에 대한 항체를 사용하여 복합체와의 결합 및/또는 신호전달을 차단할 수 있다.
본 발명에 대한 실험실내 분석에서는, 종종, 고상 기질에 부착된 상기 단백질의 절편 또는 단편에 결합하는 수용체를 포함하는 가용성 단편, 단백질, 분리된 복합체를 사용한다. 이러한 분석을 통해, 결합-절편의 돌연변이 및 변형이나 사이토카인의 돌연변이 및 변형(예를 들면, IL-12 p40/IL-B30 복합체 유사체)의 효과를 진단 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에서는, 상기한 사이토카인 복합체에 대한 중화 항체 또는 수용체-결합 단편이 테스트 화합물과 서로 경쟁하는, 경쟁적인 약물 스크리닝 분석의 사용을 포함한다.
IL-12 p40/IL-B30 항원의 "유도체"에는, 자연 발생형, 글리코실화 변이체, 및 기타의 화합물 잔기와의 공유(covalent) 또는 응집(aggregate) 접합체의 아미노산 서열의 돌연변이체가 포함된다. 공유결합 유도체는, 예를 들면 표준적인 수단을 이용하여, IL-12 p40/IL-B30 복합체 아미노산 측쇄, 또는 N-말단 또는 C-말단에서 발견되는 그룹에 기능성을 연결시킴으로써 제조할 수 있다 {참조:예를 들면, Lundblad 및 Noyes, (1988) Chemical Reagents for Protein Modification, vols.1-2, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL; Hugli, (ed.1989) Techniques in Protein Chemistry, Academic Press, San Diego, CA; 및 Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Press, Boca Raton, FL}.
특히, 글리코실화 변형(glycosylation alteration)에는, 예를 들면, 합성 또는 프로세싱 동안에 폴리펩티드의 글리코실화 패턴의 변형 또는 추가의 프로세싱 단계에 의해 수행되는 것이 포함된다 {참조: 예를 들면, Elbein (1987) Ann.Rev.Biochem.56:497-534}. 또한, 인산화된 아미노산 잔기 (예를 들면, 포스포티로신, 포스포세린 또는 포스포쓰레오닌) 등과 같은, 주요 아미노산 서열은 동일하고 기타 서열에 사소한 변형을 가지는 펩티드가 포함된다.
또한, 본 발명에서는 IL-12 p40와 IL-B30의 융합 폴리펩티드가 제공된다. 많은 사이토카인 수용체 또는 기타의 표면 단백질은 동질이합체(homodimer)와 같은 다량체 (multimer)이며, 반복 작제물 (repeat construct)은 다양한 잇점 (예를 들면, 단백질 가수분해될 가능성이 적음)을 가질 수 있다. 전형적인 예로는, 리포터 폴리펩티드 (예를 들면, 루시페라제)와 소정의 단백질 절편 또는 도메인 (예를 들면, 수용체-결합 절편)과의 융합이 있는 데, 이렇게 융합된 리간드의 존재여부 또는 위치는 용이하게 측정할 수 있다 {참조: 예를 들면, Dull 등, 미국 특허 제4,859,609호}. 기타의 유전자 융합 파트너로는, 세균의 β-갈락토시데이즈, trpE, 단백질 A, β-락타메이즈, α-아밀레이즈, 알코올 데하이드로게네이즈, 효모의 α-교배 인자(α-mating factor), 및 검출 또는 정제 태그 (예를 들면, His6 서열의 FLAG 서열)이 포함된다 {참조: 예를 들면, Godowski 등, (1988) Science 241:812-816}. 또한 본 발명에서는, 예를 들면, 병용 투여되나 단백질 가수분해되어질 기타의 다른 치료제와의 융합 작제물이 제공된다.
통상적으로, 융합 펩티드는, 재조합 핵산 방법 또는 합성 폴리펩티드 방법에 의해 제조된다. 핵산의 조작 및 발현 기법은 일반적으로 하기 문헌에 기재되어 있다 {참조: 예를 들면, Sambrook 등 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory: 및 Ausubel 등 (eds.1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene 및 Wiley, NY}. 폴리펩티드 합성 기법은 하기 문헌에 기재되어 있다 {참조: 예를 들면, Merrifield (1963) J.Amer.Chem.Soc.85:2149-2156; Merrifield (1986) Science 232:341-347; Atherton 등 (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; 및 Grant (1992) Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H.Freeman, NY}. 합성 단백질에 리폴딩 방법 (refolding method)을 적용할 수도 있다.
또한, 본 발명은, 아미노산 서열의 변이 또는 글리코실화가 아닌, IL-12 p40 또는 IL-B30 단백질의 유도체의 용도를 포함한다. 이러한 유도체에는, 화합물 잔기 또는 단백질 담체와의 공유결합 또는 응집 결합이 포함된다. 공유결합 유도체 또는 응집 유도체는, 면역원, 면역분석의 시약, 정제 방법 (예를 들면, 다른 항원과 같은 결합 파트너의 친화성 정제방법)에서의 시약으로서 유용할 것이다. 항-IL-12 p40 또는 IL-B30 항체 또는 다른 결합 조성물의 분석 또는 정제에 사용하기 위해, 글루타르알데히드 가교를 가지거나 가지지 않는, 폴리올레핀 표면에 부착시키는 공지된 방법에 따라, 고형 지지체 (예를 들면, 시아노젠 브로마이드-활성화된 SEPHAROSE)에 공유 결합시킴으로써, IL-12 p40 또는 IL-B30를 고정시킬 수 있다. 또한, 이러한 IL-12 p40, IL-B30, 또는 융합 단백질은 검출가능한 그룹으로 표지시켜, 예를 들면 진단분석에 사용할 수 있다. IL-12 p40/IL-B30 복합체의 정제는, 폴리펩티드 또는 서열 성분이거나 상보적인 결합 파트너 (예를 들면, 수용체의 결합 부위)에 대한 고정된 항체에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 가용화된 IL-12 p40/IL-B30 폴리펩티드 또는 단편은, 특이적으로 결합하는 항혈청 또는 항체를 생산하기 위한 면역원으로서 사용할 수 있다. 정제된 항원은, 모노클로날 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들면, Fab, Fab', F(ab)2 등)을 스크리닝하는 데에 사용될 수 있다. 또한, 정제된 IL-12 p40/IL-B30 항원은, 사이토킨 복합체 항원의 수준 증가에 반응하여 생산되는 항체를 검출하기 위한 시약로서 사용될 수 있어서, 비정상적이거나 특정 생리 또는 질환 상태를 검출할 수 있다. 본 발명에서는, 서열 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열에 대한 항체, 또는 이를 함유하는 단백질 단편을 포함한다. 특히, 본 발명에서는, 특정 도메인 (예를 들면, IL-B30의 헬릭스 A, B, C 또는 D; 또는 IL-12 p40의 Ig 도메인)에 대한 결합 친화성을 가지는 항체 (즉, 특정 도메인에 대해 유도된 항체)를 포함한다.
본 발명은, 추가적으로 매우 관련성이 큰 종 변이체(species variant)의 분리를 포함한다. 서던 및 노던 블랏 분석을 통해, 다른 포유류 동물에 유사한 유전체가 존재함을 확인할 수 있다. IL-B30는 종 변이체(예를 들면, 설치류, 토끼목, 육식 동물, 우제목, 기제목 및 영장류)에 널리 퍼져있는 것 같다.
또한, 본 발명에서는, 구조면, 발현면 및 기능면에 있어서의 특이성과 유사성을 모두 가지는, 관련된 항원 그룹을 분리하는 수단을 제공한다. 이러한 분자의 여러가지 생리 효과는, 이러한 분자의 상이한 종 변이체 또는 다형 변이체를 추가적으로 분리 및 특성 파악에 의해 매우 급속하게 밝혀질 수 있을 것이다. 특히, 본 발명에서는, 상이한 종에서의 추가적인 동종 유전체를 확인하기 위한 유용한 프로브를 제공한다.
상기 분리된 유전자를 통해, IL-B30가 발현되지 않는 세포 {예를 들면, 상응하는 단백질이 없거나 네가티브 배경활성 (negative background activity)을 보이는 종 유형 또는 세포}를 형질전환시킬 수 있다. 이로 인해, 형질전환되지 않은 대조군 세포와 비교하여, IL-B30의 기능을 분석할 수 있다.
특히, 관련된 클래스 구성원을 비교함에 있어서, 현대 분자 생물학의 표준 기법을 사용하여, 이러한 항원을 통해 매개되는 다양한 생리 기능을 보이는 핵심적인 구조 성분을 절단할 수 있다 {참조: 예를 들면, 상동성 스캐닝 돌연변이유발 기법 (Cunningham 등, 1989, Science 243:1339-1336); O'Dowd 등 (1988, J.Biol.Chem.263:15985-15992) 및 Lechleiter 등 (1990, EMBO J. 9:4381-4390)의 기법}.
세포내 기능에는, 수용체 신호전달이 포함될 수 있다. 하지만, 단백질 내부수용 (internalization)은 소정의 환경하에서 발생할 수 있으며, 세포내 성분과 사이토카인 사이의 상호작용이 발생할 수 있다. 상호작용 성분과 상호작용하는 IL-B30의 특정 절편은, 돌연변이유발 또는 직접적인 생화학 수단 (예를 들면, 가교 또는 친화성 방법)을 사용하여 동정될 수 있다. 또한, 결정학 방법 또는 기타의 물리적인 방법에 의한 구조 분석을 적용할 수도 있다. 신호전달 메카니즘을 추가로 조사하는 것으로는, 친화성 방법 또는 유전적인 수단으로 분리가능할 수 있는 결합된 성분에 대한 연구 (예를 들면, 돌연변이체의 상보성 분석)가 포함된다.
IL-B30의 발현 및 조절에 대해 추가 연구를 수행할 것이다. 상기한 항원과 관련된 조절 인자는, 상이한 생리학적, 발생학적, 조직 특이적 또는 기타의 발현 패턴을 보여줄 것이다. 조절 인자와 같은, 업스트림(upstream) 또는 다운스트림(downstream) 유전자 부위는 관심의 대상이 된다.
IL-B30 항원의 구조에 대한 연구를 통해, 새로운 항원, 특히 이 항원분자에 대해 효능제 또는 길항제로서의 특성을 보이는 유사체를 설계할 수 있다. 이는, 목적하는 활성을 가지는 항원을 분리하기 위한 상기한 스크리닝 방법과 함께 사용될 수 있다.
V. 항체
천연 형태 및 재조합 형태의 p40/IL-B30 단백질의 각종 에피토프(이의 종 변이체, 다형 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함)에 대한 항체를 제조할 수 있다. 또한, 활성 형태 및 비활성 형태(본래의 형태 또는 변형된 형태를 포함)의 IL-B30에 대한 항체를 제조할 수 있다. 또한, 항-유전형 항체(anti-idiotypic antibody)도 포함된다.
소정의 상기 항원의 단편에 대한 항체 (결합 단편 및 단일쇄 형태를 포함)는, 상기 단편과 면역원 단백질의 접합체를 이용하여 동물에 면역화시킴으로써 얻을 수 있다. 목적하는 항체를 방출하는 세포로부터 모노클로날 항체를 제조한다. 이러한 항체는, 정상적인 또는 결함있는 IL-B30에 결합하는 지 여부를 통해 스크리닝하거나, 예를 들면 수용체를 통해 중재되는 효능 또는 길항 활성 여부를 통해 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, 수용체에 대해 입체적으로 결합을 차단함으로써, 항체는 효능 활성 또는 길항 활성을 가질 수 있다. 이러한 모노클로날 항체의 KD는, 대개는 적어도 약 1mM, 보다 대개는 적어도 약 300μM, 통상적으로는 적어도 약 100μM, 보다 통상적으로는 적어도 약 30μM, 바람직하게는 적어도 약 10μM, 보다 바람직하게는 적어도 약 3μM 이다.
또한, 본 발명의 항체는 진단용으로서 유용할 수 있다. 본 발명의 항체는, 포획 또는 비-중화 항체로서, 수용체에 결합하는 것을 억제하지 않고 상기 항원에 대한 결합 능력이 있는 지를 스크리닝할 수 있다. 본 발명의 항체는, 중화 항체로서, 경쟁적인 결합 분석에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 IL-B30 단백질 또는 이의 수용체의 검출 또는 정량화에 유용하다 {참조: 예를 들면, Chan (ed.1987) Immunology: A Practical Guide, Academic Press, Orlando, FL; Price 및 Newman, (eds.1991) Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press, N.Y.; 및 Ngo (ed.1988) Nonisotopic Immunoassay, Plenum Press, N.Y.}. 교차 흡 수 또는 기타의 테스트를 통해, 다양한 특이성 (예를 들면, 특이한 또는 서로 공유하는 종 특이성)을 보이는 항체를 동정한다.
게다가, 본 발명의 항체 (항원-결합 단편을 포함)는, 상기 항원에 결합하고, 예를 들면 생물학적 반응을 나타낼 수 있는 수용체에 대한 기능적인 결합을 억제하는, 강력한 길항제일 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는, 비-중화 항체로서 유용할 수 있으며, 독소 또는 방사핵종(radionuclide)에 커플링할 수 있어서, 본 발명의 항체가 항원에 결합할 때에 이를 발현하는 세포 (예를 들면, 표면에 발현하는 세포)는 사멸된다. 또한, 이러한 항체는, 직접적 또는 간접적 (링커를 이용)으로 약물 또는 기타의 치료제에 접합될 수 있으며, 약물 표적화를 수행할 수 있다.
항원 단편은, 기타의 물질, 특히 면역원으로서 사용될 수 있는 융합 또는 공유결합된 폴리펩티드로서의 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 항원 및 이의 단편은, 다양한 면역원{예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 소혈청 알부민, 테타누스 독소 등)에 융합 또는 공유결합될 수 있다. 폴리클로날 항혈청의 제조방법에 대해서는 하기의 문헌을 참조하라: Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York; Williams 등 (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, vol.1, Academic Press, New York; 및 Harlow 및 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY.
소정의 경우, 다양한 포유류 숙주 (예를 들면, 마우스, 설치류, 영장류, 사람 등)로부터 모노클로날 항체를 제조하는 것이 바람직하다. 이러한 모노클로날 항체를 제조하는 기법에 대해서는 하기 문헌에 기재되어 있다 {참조: 예를 들면, Stites 등., (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA; Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.), Academic Press, New York; 및 특히 모노클로날 항체를 생성시키는 하나의 방법을 기술하고 있는 문헌, Kohler and Milstein (1975), Nature 256:495-497}.
기타의 다른 적합한 기법에서는, 실험실내에서 파지 또는 이와 유사한 벡터내의 선별된 항체 라이브러리 또는 항원성 폴리펩티드에 림프구를 노출시키는 것을 포함한다 {참조: Huse 등 (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda," Science 246:1275-1281; 및 Ward 등 (1989) Nature 341:544-546}. 본 발명의 폴리펩티드 및 항체(키메라 또는 사람화 항체를 포함)는, 변형한 상태 또는 변형없는 상태로 사용될 수 있다. 종종, 검출가능한 신호를 제공하는 물질을 공유적 또는 비공유적으로 결합시킴으로써, 상기 폴리펩티드 및 항체를 표지시킨다. 매우 다양한 표지 및 접합 기법이 알려져 있으며, 과학 문헌 및 특허 문헌에 광범위하게 기재되어 있다. 적합한 표지로는, 방사핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제인자, 형광 잔기, 화학발광 잔기, 자기 입자 등이 포함된다. 이러한 표지의 이용에 대해서는 하기 특허에서 기재하고 있다: 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호 및 제4,366,241호. 또한, 재조합 면역글로불린을 제조할 수 있다 {참조: Cabilly, 미국 특허 제4,816,567호; Moore 등, 미국 특허 제4,642,334호; Queen 등 (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033}.
또한, 본 발명의 항체는, 상기 단백질의 분리시 친화성 크로마토그래피에 사용될 수 있다. 상기 항체가 고형 지지물에 결합하는 칼럼을 제조할 수 있다 {참조: 예를 들면, Wilchek 등 (1984) Meth.Enzymol.104:3-55}. 이와 달리, 소정의 결합 조성물을 선택적으로 제조하기 위한 고갈 또는 교차 흡수용으로 단백질을 사용할 수 있다.
또한, 각각의 IL-B30에 대한 항체는, 항-유전형 항체를 생성시키는 데에 유용하다. 이러한 항체는, 각 항원의 발현과 관련된 다양한 면역학적 조건들을 검출 또는 진단하는 데에 유용하다.
VI. 핵산
상기한 펩티드 서열 및 이와 관련된 시약은, 예를 들면, 천연 공급원으로부터 IL-12 p40 및 IL-B30를 모두 암호화하는 DNA 클론을 검출, 분리 또는 동정하기에 유용하다. 이는, 통상적으로, 포유류에서 유래한 유전자를 분리하는 데에 유용하며, 이와 유사한 공정을 이용하여 다른 종 (예를 들면, 조류 및 포유류와 같은 온혈동물)에서 유래한 유전자를 분리하는 데에 사용한다. 교차 하이브리드화를 통해, 동일한 종 (예를 들면, 다형 변이체) 또는 상이한 종으로부터 IL-12 p40 또는 IL-B30를 분리할 수 있다. 적합한 핵산 클론을 성공적으로 분리하기 위해, 다수의 다른 방법을 사용할 수 있다. 이러한 유전자를 이용하여, 공발현 작제물 또는 융합 작제물을 제조할 수 있다.
정제된 단백질 또는 폴리펩티드는, 상기한 바와 같은 표준 방법을 이용하여 항체를 생산하는 데에 유용하다. 합성 펩티드 또는 정제된 단백질을 면역 시스템에 노출시켜, 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 제조할 수 있다 {참조: 예를 들면, Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; 및 Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press}.
예를 들면, 소정의 결합 조성물은, IL-12 p40 및 IL-B30를 모두 발현하는 세포주에서 제조한 발현 라이브러리를 스크리닝하는 데에 사용될 수 있다. 세포내 발현의 스크리닝은, 다양한 염색 공정 또는 면역형광 공정에 의해 수행될 수 있다. 결합 조성물은, 표면 융합 단백질을 발현하는 세포를 친화 정제하거나 분리하는 데에 사용될 수 있다.
또한, 상기 펩티드 절편은, 적합한 올리고뉴클레오티드를 선별 또는 동정하여 라이브러리를 스크리닝하는 데에 사용될 수 있다. 유전 암호를 이용하여, 스크리닝용 프로브로서 사용하기에 유용한 적합한 올리고뉴클레오티드를 선별할 수 있다 {참조: 예를 들면, GenBank 및 서열 1}. PCR 기법과 함께, 라이브러리로부터 정확한 클론을 선별하는 데에 합성 올리고뉴클레오티드가 유용할 것이다. 또한, 상보적 서열은, 프로브, 프라이머 또는 안티센스 쇄로서 유용하다. 앵커-벡터 (anchored vector) 또는 폴리-A 상보적인 PCR 기법과 커플링된, 또는 기타의 펩티드의 상보적인 DNA와 커플링된, 다양한 절편이 특히 유용하다.
본 발명은, 상응하는 IL-12 p40 및 IL-B30 폴리펩티드의 생물학적 활성 복합체 (특히, 상기 서열의 해독되지 않은 부위를 암호화하는 부위가 결여)를 암호화하는 데에 분리된 DNA 또는 이의 단편을 이용하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명에서는, 적합한 조건하에서 본원에 기재된 DNA 서열과 하이브리드화할 수 있고, 생물학적 활성 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는, 분리된 DNA 또는 재조합 DNA를 포함한다. 상기한 생물학적 활성 단백질 또는 폴리펩티드는, 순수한 항원 (intact antigen) 또는 이의 단편일 수 있으며, 예를 들면 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다 (특히, 성숙한 분비된 폴리펩티드). 또한, 본 발명은, 분비된 IL-12 p40/IL-B30 복합체와 높은 동일성을 가지는 단백질을 암호화하는, 분리된 또는 재조합 DNA 또는 이의 단편의 사용을 포함한다. 상기 분리된 DNA는, 5' 및 3' 플랭크(flank)에 각각의 조절 서열 (예를 들면, 프로모터, 인헨서, 폴리-A 첨가 신호 등)을 가질 수 있다. 이와 달리, 예를 들면, 내인성 유전자의 업스트림에 프로모터를 삽입함으로써, 외인성 프로모터에 암호화 절편을 작동가능하게 결합시킴으로써 발현시킬 수 있다 {참조: 예를 들면, Treco 등, WO96/29411 또는 USSN 08/406,030}.
"분리된(isolated)" 핵산은, 기원하는 종에서 유래한 리보좀, 폴리머라제 및/또는 플랭킹 게놈 서열과 같은 본래의 서열에 자연적으로 수반되는 기타의 외생 성분으로부터 실질적으로 분리된 핵산 (예를 들면, RNA, DNA 또는 혼합된 중합체)이다. 상기 용어는, 천연 상태에서 제거된 핵산 서열을 포함하며, 재조합 또는 클로닝된 DNA 분리물 및 화학적으로 합성된 유사체 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 유사체를 포함한다. 실질적으로 순수한 분자에는, 예를 들면 분리된 염색체와는 상이한, 이러한 분자의 분리된 형태가 포함된다. 상기한 핵산은, 일반적으로는 약 50kb 미만, 대개는 약 30kb 미만, 통상적으로는 약 10kb 미만, 바람직하게는 약 6kb 미만의 벡터 또는 단편내에 있다.
일반적으로, 분리된 핵산은, 동종 분자 조성물이며, 소정의 경우에는 약간의 이종성을 가진다. 통상적으로, 이러한 이종성 (heterogeneity)은, 목적하는 생물학적 기능 또는 활성에 핵심적이지 않은 부위 또는 중합체 말단부에서 발견된다.
"재조합" 핵산은, 이의 제조방법 또는 구조에 의해 정의된다. 제조방법은, 예를 들면, 뉴클레오티드 서열에 대한 사람의 개입 (통상적으로는, 선별 또는 생산)을 포함한, 재조합 핵산 기법의 사용을 사용한다. 이와 달리, 상기한 재조합 핵산은, 자연적으로는 서로 인접하지 않은 2개의 단편이 융합된 서열을 제조하여 생성된 핵산일 수 있으며, 자연적인 산물 (예를 들면, 자연발생적인 돌연변이체)은 제외된다. 따라서, 모든 합성 올리고뉴클레오티드 공정을 사용하여 유도된 서열을 포함하는 핵산과 마찬가지로, 예를 들면, 비-자연적으로 발생하는 벡터로 세포를 형질전환시켜 제조한 산물은 포함된다. 동일한 또는 보존된 아미노산을 암호화하는 중복 코돈 (redundant codon)으로 코돈을 대체하고, 통상적으로 서열-인식 부위를 도입 또는 제거하는 일이 종종 있다.
이와 달리, 목적하는 기능을 가진 핵산 절편을 서로 결합시켜, 일반적으로 자연 형태에서는 발견되지 않는 기능의 바람직한 조합을 포함하는 단일 유전체 (single genetic entity)를 생성할 수 있다. 종종, 제한효소 인식부위가 이러한 조작의 표적이 되지만, 기타의 다른 부위-특이적 표적 (예를 들면, 프로모터, DNA 복제 부위, 조절 서열, 통제 서열) 또는 기타의 유용한 특징을 설계하여 혼입할 수 있다. 이와 유사한 개념이 재조합 폴리펩티드 (예를 들면, 융합 폴리펩티드)에도 적용된다. 유전자 암호 중복 (genetic code redundancy)에 의해, 이러한 항원의 단편에 유사한 폴리펩티드를 암호화하는 합성 핵산, 다양한 종 또는 다형 변이체에서 유래한 서열의 융합체가 특히 포함된다.
핵산에 있어서 중요한 "단편 (fragment)"은, 적어도 약 17개, 일반적으로 적어도 약 22개, 대개 적어도 약 29개, 보다 종종 적어도 약 35개, 통상적으로 적어도 약 41개, 대개 적어도 약 47개, 바람직하게는 적어도 약 55개, 특히 바람직하게는 적어도 약 60개 이상 (예를 들면, 67개, 73개, 81개, 89개, 95개, 수백 및/또는 수천 등)의 뉴클레오티드로 된 연속적인 절편(contiguous segment)이다.
IL-B30 단백질을 암호화하는 DNA는, 관련되거나 유사한 단백질을 암호화하는 유전자, mRNA 및 cDNA와, 상이한 종에서 유래한 동종 단백질을 암호화하는 DNA를 동정하는 데에 특히 유용하다. 영장류, 설치류, 개과, 고양이과 및 조류를 포함한 다른 종에 있어서, 동종체(homolog)가 있을 것이다. 다양한 IL-B30 단백질은 동종이어야 하며, 본원에서 포함된다. 하지만, 상기 항원에 대해 계통학적으로 상관성이 보다 먼 단백질도, 충분히 동종성을 가지는 경우, 적합한 조건하에서 이러한 서열을 이용하여 용이하게 분리할 수 있다. 영장류의 IL-B30 단백질이 특히 관심의 대상이다. 이와 마찬가지로, IL-12 p40 단백질은 융합 작제물 또는 조합 조성물 제조를 위한 주요 표적이다.
게놈 서열로부터 유도된 재조합 클론 (예를 들면, 인트론을 함유)은, 예를 들면, 형질전환 세포 및 유기체를 포함한 형질전환 연구 및 유전자 치료에 유용하다 {참조: 예를 들면, Goodnow (1992) "Transgenic Animals" in Roitt (ed.) Encyclopedia of Immunology, Academic Press, San Diego, pp.1502-1504; Travis (1992) Science 256:1392-1394; Kuhn 등 (1991) Science 254:707-710; Capecchi (1989) Science 244:1288; Robertson (ed.1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; 및 Rosenberg (1992) J.Clinical Oncology 10:180-199}.
핵산서열 비교에 있어서 상당한 정도의 상동성(substantial homology) (예를 들면, 일치성)은, 최적으로 정렬하여 비교하는 경우, 적합한 정도의 뉴클레오티드 삽입 또는 결실이 있으면서, 상기한 절편 또는 이의 상보적인 쇄가, 적어도 약 50%, 대개 적어도 약 58%, 대개 적어도 약 65%, 종종 적어도 약 71%, 통상적으로는 적어도 약 77%, 대개 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 95 내지 98% 이상, 특정 양태에서는 약 99% 이상의 뉴클레오티드가 서로 일치한다. 이와 달리, 선택적인 하이브리드화 조건하에서, 상기 절편은, IL-12 p40 및/또는 IL-B30 서열 (예를 들면, 서열 1)을 통상적으로 이용하여, 소정의 쇄 또는 이의 상보적인 쇄와 하이브리드화한다. 통상적으로는 적어도 약 30개의 뉴클레오티드에 있어서 적어도 약 55%의 일치성이 있을 때, 바람직하게는 적어도 약 25개의 뉴클레오티드 길이에 걸쳐서 적어도 약 75%의 일치성이 있을 때, 가장 바람직하게는 약 20개의 뉴클레오티드에 있어서 적어도 약 90%의 일치성이 있을 때, 선택적인 하이브리드화가 일어난다 {참조: Kanehisa (1984) Nuc.Acids Res. 12:203-213}. 상기 기재한 바와 같은 일치성 비교 길이는 보다 더 긴 길이에 대해 이루어질 수 있으며, 소정의 양태에서는 적어도 약 17개의 뉴클레오티드, 대개 적어도 약 28개의 뉴클레오티드, 통상적으로는 적어도 약 40개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 약 75 내지 100개 이상의 뉴클레오티드에 걸쳐 이루어진다.
하이브리드화에서의 상동성과 관련하여, 스트린전트 조건(stringent condition)은, 통상적으로 하이브리드화 반응에서 통제되는 염, 온도, 유기 용매 및 기타의 매개변수와의 조합된 스트린전트 조건이다. 스트린전트 온도 조건은, 대개 약 30℃ 이상, 약 37℃ 이상, 통상적으로는 약 55℃ 이상, 보다 통상적으로는 약 60 또는 65℃ 이상, 및 바람직하게는 약 70℃ 이상이다. 스트린전트 염 조건은, 대개 약 1000mM 미만, 약 400mM 미만, 통상적으로는 약 250mM 미만, 바람직하게는 약 150mM 미만 (약 100mM 미만, 약 50mM 미만, 약 20mM 미만 등)이다. 하지만, 단일 매개변수의 측정보다는 매개변수의 조합이 보다 중요하다 {참조: 예를 들면, Wetmur 및 Davidson (1968) J.Mol.Biol.31:349-370}. 스트린전트 조건하에서의 하이브리드화는, 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 3 내지 5배 이상의 배경 (background)을 가지게 된다.
서열 비교의 경우, 통상적으로 하나의 서열을 기준 서열 (reference sequence)로 하여, 테스트할 서열을 이와 비교한다. 서열비교 알고리즘을 이용하는 경우, 테스트 서열 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력한 후, 연속 좌표 (subsequence coordinate)를 지정하고, 필요한 경우에는 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 그리고 나서, 상기 서열비교 알고리즘이, 상기 지정된 프로그램 매개변수에 기초하여, 기준 서열에 대한 테스트 서열의 서열 일치성 %를 계산한다.
스미쓰(Smith) 및 워터만(Waterman) (1981){Adv.Appl.Math.2:482}의 로컬 상동성 알고리즘, 니들만(Needleman) 및 분슈(Wunsch) (1970) {J.Mol.Biol.48:443}의 상동성 정렬 알고리즘, 피어슨(Pearson) 및 립만(Lipman) (1988) {Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444}의 유사성 검색방법, 이러한 알고리즘의 컴퓨터 수행 {GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA; Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI} 또는 시각 검색 {참조: 일반적으로, 상기한 Ausubel 등}에 의해, 비교할 서열을 광학적으로 정렬할 수 있다.
유용한 알고리즘의 한 예는 PILEUP이다. PILEUP은, 진행적이며 쌍을 이룬 정렬(progressive, pairwise alignment)을 이용하여 관련된 서열 그룹으로부터 다수의 서열 정렬을 만들어, 상관성 및 서열 일치성 %를 보여준다. 또한, 이는, 상기 정렬을 만드는 데에 사용된 클러스터 상관성(clustering relationship)을 보여주는 나무(tree) 또는 덴드로그램(dendrogram)을 플랏팅(plotting)한다. PILEUP은, 팽(Feng) 및 둘리틀(Doolittle)의 진행성 정렬방법 {참조: (1987) J.Mol.Evol. 35:351-360}을 단순화시켜 사용한다. 이러한 방법은, 히긴스(Higgins) 및 샤프(Sharp)의 방법 {참조: (1989) CABIOS 5:151-153}과 유사하다. 상기 프로그램은, 최대 300개의 서열을 정렬할 수 있으며, 각각 서열이 가질 수 있는 최장의 뉴클레오티드 또는 아미노산은 5,000개이다. 상기한 다수 정렬 공정은, 2개의 가장 유사한 서열을 쌍으로 정렬하여 2개의 정렬된 서열 클러스터를 얻는 것으로부터 시작한다. 그리고 나서, 이러한 클러스터는, 그 다음으로 가장 상관성이 있는 서열 또는 정렬된 서열 클러스터에 정렬시킨다. 2개의 개개의 서열을 쌍으로 정렬한 것을 단순히 연장시킴으로써, 2개의 서열 클러스터를 정렬시킨다. 진행성의 쌍을 이룬 일련의 정렬을 통해, 최종 정렬을 얻게 된다. 서열 비교 부위를 위해 특정의 서열 및 이의 아미노산 또는 뉴클레오티드 좌표를 지정하고, 프로그램의 매개변수를 지정함으로써, 상기 프로그램은 수행된다. 예를 들면, 기준 서열을 다른 테스트 서열과 비교하여, 하기 매개변수를 이용하여 서열 일치 상관성 %를 측정할 수 있다: 디폴트 갭 가중치(3.00), 디폴트 갭 길이 가중치 (0.10) 및 가중된 말단 갭.
서열 일치성 % 및 서열 유사성 %를 측정하는 데에 적합한 알고리즘의 다른 예는 BLAST 알고리즘 {참조: Altschul 등, (1990) J.Mol.Biol.215:403-410}이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 NCBI (National Center for Biotechnology Information; http:www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 공개되어 있다. 이러한 알고리즘에는, 데이터 베이스 서열에서 동일한 길이를 갖는 단어와 정렬되었을 때에 소정의 (+) 수치의 역치 T와 정합하거나 이를 만족시키는, 조회 서열 (query sequence)에서의 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 고수치 서열쌍(High Scoring Sequence Pair, HSP)을 먼저 확인하는 것을 포함한다. T는, 인접 단어 수치 역치 (neighborhood word score threshold; 상기한 Altschul 등 참조)이다. 이러한 최초 인접 단어 히트(initial neighborhood word hit)는, 검색을 시작하기 위한 발판 (seed)로서 작용하여, 이를 함유하는 보다 긴 HSP를 발견하게 된다. 그리고 나서, 상기 단어 히트는, 누적된 정렬 수치가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 양방향으로 연장된다. 각 방향으로의 단어 히트의 연장은 다음과 같은 상황에서 중단된다: 누적된 정렬 수치가 최대 수치로부터 X 양만큼 떨어진 경우, 하나 이상의 (-)수치의 잔기 정렬로 인해 누적된 정렬 수치가 0 이하로 떨어진 경우, 또는 서열 중 하나의 말단에 도달한 경우. BLAST 알고리즘 파라미터인 W, T 및 X는, 상기 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은, 디폴트(default)로서 11의 단어길이 (W), BLOSUM62 스코어링 매트릭스, {참조: Henikoff 및 Henikoff (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915}, 50의 정렬 (B), 10의 기대치 (E), M=5, N=4, 양 쇄의 비교를 이용한다.
서열 일치성 %를 계산함과 더불어, BLAST 알고리즘은 2개의 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석도 수행한다 {참조: 예를 들면, Karlin 및 Altschul, (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787}. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성을 측정하는 것 중에 하나는, 가능성 최소합계(P(N))으로서, 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 우연히 정합될 확률을 나타낸다. 예를 들면, 테스트하는 핵산과 기준 핵산을 비교한 결과 가능성 최소합계 (the smallest sum probability)가 약 0.1 미만 (보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만)인 경우, 소정의 핵산이 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2개의 폴리펩티드의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 것을 또 보여주는 것은, 아래에 기재한 바와 같이, 제1 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응을 보이는 경우이다. 따라서, 예를 들면, 2개의 펩티드가 보존적 치환만큼만 상이한 경우, 통상적으로, 소정의 폴리펩티드는 제2의 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 것을 보여주는 다른 것은, 아래에 기재한 바와 같이, 스트린전트 조건하에서 서로 하이브리드화하는 것이다.
다른 포유류 종에서 유래하는 IL-B30은, 매우 밀접한 관련성을 가진 종과의 종-교차 하이브리드화에 의해 클로닝 및 분리될 수 있다. 상관성이 먼 종 사이에는 상동성이 상대적으로 낮을 수 있으므로, 상대적으로 상관성이 큰 종과의 하이브리드화가 바람직하다. 이와 달리, 종 특이성이 낮은 항체의 제조는, 발현 클로닝 방법에 유용할 수 있다.
VII. p40/IL-B30 조합의 제조; 모사체
IL-12 p40 또는 IL-B30을 암호화하는 DNA 또는 이의 단편은, 화학 합성, cDNA 라이브러리의 스크리닝 또는 다양한 세포주 또는 조직 샘플에서 얻은 게놈 라이브러리의 스크리닝을 통해 수득될 수 있다 {참조: 예를 들면, Okayama 및 Berg (1982) Mol.Cell.Biol.2:161-170; Gubler 및 Hoffman (1983) Gene 25:263-269; 및 Glover 등 (ed.1984) DNA Cloning: A Practical Approach, IRL Press, Oxford}. 이와 달리, 본원에서 제공되는 서열은, 유용한 PCR 프라이머를 제공하며, 자연에서 발생하는 양태를 포함한 IL-12 p40 또는 IL-B30를 암호화하는 적합한 유전자를 합성 등 제조할 수 있게 해준다.
이러한 DNA는 다양한 숙주 세포에서 발현되어, 전장의 IL-12 p40 및 IL-B30 또는 이의 단편을 합성할 수 있으며, 예를 들면, 결합 연구, 변형된 분자의 작제 및 발현 연구와 구조/기능 연구를 위한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 생산하는 데에 사용될 수 있다.
본원에서의 벡터에는, 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 통합가능한 DNA 단편, 및 DNA 단편을 숙주의 게놈에 통합시킬 수 있는 기타의 비히클이 포함된다 {참조: 예를 들면, Pouwels 등 (1985 및 추가본) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y.; 및 Rodriguez 등 (eds.1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworth, Boston, MA}.
본 발명의 목적을 위해, DNA 서열은 서로 기능적으로 관련성을 가질 때에는 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 예비 서열(presequence) 또는 분비성 리더(secretory leader)용 DNA는, 폴리펩티드를 세포막으로 인도하거나 폴리펩티드를 방출하는 데에 참여자로서 또는 예비 단백질(preprotein)으로 발현되는 경우, 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는, 폴리펩티드의 전사를 통제하는 경우에 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 리보좀-결합 부위는, 해독을 할 수 있는 자리에 위치하는 경우, 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 대개, "작동가능하게 연결된(operably linked)"의 의미는, 연속적이고 판독 프레임내에 있는 것을 의미하지만, 리프레서 유전자(repressor gene)와 같은 소정의 유전 인자는 연속적으로 연결되어 있지는 않지만 오퍼레이터 서열(operator sequence)에 결합하여 발현을 조절한다 {참조: 예를 들면, Rodriguez 등, Chapter 10, pp.205-236; Balbas 및 Bolivar, (1990) Methods in Enzymology 185:14-37; 및 Ausubel 등, (1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene 및 Wiley, NY}. 2개의 암호화 서열을 함께 발현시키는 것이 본원에서는 특히 주요 관심사이다.
적합한 발현 벡터의 대표적인 예로는, pCDNA1; pCD {참조: Okayama 등 (1985) Mol.Cell Biol.5:1136-1142}; pMC1neo 폴리-A {참조: Thomas 등, (1987) Cell 51:503-512}; pAC373 또는 pAC610과 같은 바쿨로바이러스 벡터 {참조: 예를 들면, Miller (1988) Ann.Rev.Microbiol. 42:177-199}가 있다.
종종, 특정 또는 정의된 글리코실화 패턴을 제공하는 시스템에서 IL-12 p40 및/또는 IL-B30 폴리펩티드를 발현시키는 것이 바람직할 것이다 {참조: 예를 들면, Luckow 및 Summers, (1988) Bio/Technology 6:47-55; 및 Kaufman (1990) Meth.Enzymol.185:487-511}.
IL-12 p40 및/또는 IL-B30 또는 이의 단편은, 조작되어 세포막에 결합된 포스파티딜 이노시톨 (PI)이 되도록 가공할 수 있으며, 포스파티딜 이노시톨-절단 효소 (예를 들면, 포스파티딜 이노시톨 포스포리파제 C)로 처리하여 막으로부터 제거할 수 있다. 이로 인해, 생물학적 활성 형태의 항원을 방출하게 되며, 단백질 화학의 표준 공정을 이용하여 정제할 수 있다 {참조: 예를 들면, Low (1989) Biochim.Biophys.Acta 988:427-454; Tse 등 (1985) Science 230:1003-1008; 및 Brunner 등, (1991) J.Cell Biol.114-1275-1283}.
IL-12 p40 및 IL-B30의 특성이 규명되면, 펩티드를 합성하는 기존의 공정을 이용하여 이의 단편 또는 유도체를 제조할 수 있다. 이러한 공정은 하기 문헌에 기재되어 있다: Stewart 및 Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky 및 Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; 및 Villafranca (ed.1991) Techniques in Protein Chemistry II, Academic Press, San Diego, CA}.
VIII. 용도
본 발명에서는, 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들면 IL-12 p40/IL-B30 복합체가 중재한 조건에서 진단용으로 사용하는 시약 또는 진단용 킷트를 제공한다. 상기 유전자는, 예를 들면 설치류와 사람을 구별하는 법의학 분야에 유용할 수 있으며, 상이한 발현 또는 변형 패턴을 보이는 상이한 세포를 구별하는 마커로서 유용할 수 있다. 본 발명에서 제공되는 조성물은, 예를 들면, 실험실내 분석, 과학 연구, 핵산, 폴리펩티드 또는 항체의 합성 또는 제조용 시약으로 유용하다.
또한, 본 발명에서는, 상당한 정도의 상업적 및/또는 치료학적 효능을 가지는 시약을 제공한다. IL-12 p40/IL-B30 복합체 (천연 또는 재조합 형태), 이의 단편, 이에 대한 항체, 이러한 복합체 또는 개별 성분에 대해 결합 친화성을 가지는 것으로 확인된 화합물은, 분자 생물학 기법, 면역학 기법 또는 생리학 기법을 가르치는 데에 시약으로서 유용하다. 예를 들면, 단백질, 항체, 클로닝 방법, 조직학 등의 제조 또는 이용시 실제적으로 실험실에서 사용하는, 상기 시약을 가진 적합한 킷트가 제조될 수 있다.
또한, 상기 시약은, 비정상적인 생리 또는 발생과 관련된 상태 (염증 상태 등)의 치료에 유용할 것이다. 상기 시약은, 상호작용하는 성분의 존재 또는 부재 여부를 실험실내에서 테스트하는 데에 유용할 수 있으며, 이는 특정 치료 전략의 성공여부와 관련될 수 있는 문제이다. 특히, 다양한 세포 (예를 들면, 조혈 또는 림프계 세포)의 생리학적 조절은, 본 발명에서 제공하는 조성물을 이용한 적합한 치료방법에 의해 수행될 것이다 {참조: 예를 들면, Thomson (1994, ed.) The Cytokine Handbook (2d ed.) Academic Press, San Diego; Metcalf 및 Nicola (1995) The Hematopoietic Colony Stimulating Factors Cambridge University Press; 및 Aggarwal 및 Gutterman (1991) Human Cytokines Blackwell Pub.}.
상기한 사이토카인 복합체가 IFNγ 수준을 유도할 수 있다는 관찰을 통해, 치료학적으로 가능성이 있음을 알 수 있다. 특히, IFNγ생산은 세포 중재된 면역을 증강시킨다 {참조: 예를 들면, Paul (1998) Fundamental Immunology (4th ed.) Raven Press, NY; 및 Delves 및 Roitt (eds.1998) The Encyclopedia of Immunology Academic Press (ISBN: 0122267656)}. 따라서, 세포 반응의 증강은, 항-종양 활성을 증진시키고, 백신 반응 (체액 면역 및 세포 면역)을 증진시키고, 항-바이러스 효과를 증진시키고, 소정의 발생단계에서 알레르기 반응을 억제하는 데에 유용할 것이다 {참조: 예를 들면, Rose 및 Mackay (eds.1998) The Autoimmune Diseases (3d ed.) Academic Press, San Diego; Kay (ed. 1997) Allergy and Allergic Diseases Blackwell Science, Malden MA}. 이와 반대로, 길항제를 사용하여 IFNγ증강을 차단 또는 방해함으로써, 세포 증강의 세기 또는 강도를 감소시킬 수 있다. 이는, 예를 들면, 자가면역 상태 (예를 들면, 다발성 경화증 또는 건선) 또는 만성 염증 상태 (예를 들면, 류마티스 관절염 또는 염증성 장 질환)에 유용할 수 있다 {참조: 예를 들면, Samter 등 (eds.) Immunological Diseases vols.1 및 2, Little, Brown and Co.}. 초기 결과는, 상기한 p40/IL-B30의 역할이 만성 염증 상태의 유지에 보다 핵심적이라고 시사해주고 있다. 따라서, 이러한 상태가 초기에 발생된 후에 차단하는 것이 효과적일 수 있다.
이러한 치료 표적과 함께, 예를 들면 기타의 염증 조절제와 함께, 효능제 또는 길항제를 현존하는 치료제와 병용한다. 따라서, 효능제는, 예를 들면, IL-18, IL-12, 방사선 치료 또는 화학 치료, 백신 보조제 및/또는 항바이러스 치료제와 함께 종종 병용한다. 이와 달리, 길항제는, TNFα 길항제, IL-12 길항제, IL-10 및/또는 스테로이드와 병용할 수 있다. 상기 사이토카인의 바이러스 동종체를 사용할 수도 있다.
예를 들면, IL-12 p40/IL-B30에 의한 비정상적인 발현 또는 비정상적인 신호전달과 관련된 질병 또는 장애는, 길항제 또는 효능제의 표적으로 사용할 수 있을 것이다. 상기한 새로운 사이토카인은, 염증 및/또는 자가면역 질환과 같은 면역반응에 영향을 끼치는 조혈 세포(예를 들면, 림프계 세포)의 조절 또는 발생에 역할을 수행할 것이다. 또는, 상기한 새로운 사이토카인은, 혈관 생리 또는 발생, 또는 신경 효과에 영향을 미칠 수 있다. 상기한 상태의 시발 또는 유지에 대한 치료제의 투여 시기가 중요할 수 있다. 특히, 상기한 사이토카인 복합체는, 상기 세포에 의한 사이토카인 합성, 증식 등을 매개한다. 천연 형태의 뮤테인 변이체 또는 차단 항체와 같은 IL-12 p40/IL-B30의 길항제는, 염증 반응 또는 자가면역 반응과 같은 상황에서 면역 반응을 차단하는 데에 있어 선택적이고 강력한 방법을 제공한다 {참조: 예를 들면, Samter 등 (eds.) Immunological Diseases vols. 1 및 2, Little, Brown and Co.}.
치료용으로 사용될 수 있는 특정 표적으로는, 예를 들면, EAE 모델(다발성 경화증에 대한 유용한 모델일 수 있음)에서의 폐 상태 (천식 및 섬유증식), 당뇨 및 장 염증이 포함된다 {참조: 예를 들면, 천식 관련 - Barnes 등, (1998) Mol.Med.Today 4:452-458; Pauwels 등 (1998) Clin.Exp.Allergy Aug.28 Suppl 3: 1-5; Durham (1998) Clin.Exp.Allergy Jun 28 Suppl 2: 11-16; Leung (1997) Pediatr. Res. 42:559-568; Pretolani 등, (1997) Res.Immunol.148:33-38; Lamkhioued 등 (1996) Ann.NY Acad.Sci. 796:203-208; Erb 등 (1996) Immunol.Cell.Biol. 74:206-208; 및 Anderson 등 (1994) Trends Pharmacol.Sci. 15:324-332; 폐섬유증 관련 - Coker 등 (1998) Eur.Respir.J.11:1218-1221; Bienkowski 등 (1995) Proc.Soc.Exp.Biol.Med.209:118-140; EAE 모델 (다발성 경화증) 관련 - Pearson 및 McDevitt (1999) Curr.Top.Microbiol.Immunol.238:79-122; Miller 및 Shevach (1998) Res.Immunol.149:753-759; Hoffman 및 Karpus (1998) Res.Immunol.149:790-794 (846-847 및 855-860에서의 토의 포함); Segal (1998) Res.Immunol.149:811-820 (850-851 및 855-860에서의 토의 포함); Liblau 등 (1997) Immunol.Today 18:599-604; Gold 등 (1997) Crit.Rev.Immunol. 17:507-510; Spack (1997) Crit.Rev.Immunol. 17:529-536; Leonard 등 (1997) Crit.Rev.Immunol. 17:545-553; 당뇨 관련 - Almawi 등 (1999) J.Clin.Endocrinol.Metab. 84:1497-1502; Rabinovitch 등 (1998) Biochem.Pharmacol. 55:1139-1149; Rabinovitch (1998) Diabetes Metab.Rev.14:129-151; 장/소장 염증 상태 관련 - Leach 등 (1999) Toxicol.Pathol. 27:123-133; Braun 등 (1999) Curr.Opin.Rheumatol.11:68-74; Rugtveit 등 (1997) Gastroenterology 112:1493-1505; Strober 등 (1997) Immunol.Today 18:61-64; Ford 등 (1996) Semin.Pediatr.Surg.5:155-159}.
p40/IL-B30의 메모리-활성화된 세포 자극은, 부착 분자 (adhesion molecule)을 포함한 표현형 변화가 초래된다. CD69L은 p40/IL-B30에 의한 자극이 있게 되면 많이 발현되고, CD54는 크게 감소한다. 부착 분자의 발현에 있어서의 이러한 변화는, 예를 들면 내피 세정맥 (HEV)을 통해, 제1차 및 제2차 림프절의 메모리 세포가 T/DC 세포가 풍부한 부위로 진입하는 것을 조절할 수 있도록 한다. 이러한 메모리 세포는, 프라임 (prime)되어 IL-12 자극에 민감하게 된다. 따라서, 항원에 의해 IL-12이 유도되면, IFN이 급격하게 다량 생산된다. 따라서, p40/IL-B30은, 반응속도의 증가 및/또는 메모리 세포수의 증가를 통해, 메모리 세포에 의한 면역 반응을 가속화시킬 수 있다. p40/IL-B30은, 순수한 세포 (naive cell)에 대해서는 효과가 적거나 없는 반면, 메모리 세포에 대해서는 특이적인 상이한 효과를 가질 수 있다. 이와 반대로, 많은 만성 염증 상태 (예를 들면, 류마티스 관절염, 염증성 장질환, 건선 등)에서, 활성 병변은 메모리 CD45Rblow 세포에 의존한다. 이와 같이, 길항제는 이러한 염증 상태의 만성기를 효과적으로 차단할 수 있다.
노던 블랏 분석에 의해 IL-12 p40 및/또는 IL-B30 mRNA를 생산하는 것으로 나타나는 각 세포 유형에 있어서, 다양한 비정상적인 상태가 알려져 있다 {참조: Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; Thorn 등, Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, N.Y.; Weatherall 등 (eds.) Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, Oxford}. 기타의 많은 의학적 상태 및 질병들은, 대식세포 또는 단핵세포에 의한 활성화가 관여하며, 이들 중 많은 질병들은 본 발명에 의해 제공되는 효능제 또는 길항제에 의한 치료에 반응을 보일 것이다 {참조: 예를 들면, Stites 및 Terr (eds.1991) Basic and Clinical Immunology Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut; Samter 등 (eds.) Immunological Diseases Little, Brown and Co.}. 이러한 문제점들은, 본 발명에 의해 제공되는 조성물을 이용한 예방 또는 치료에 반응을 보일 것이다.
IL-12 p40/IL-B30 사이토카인 복합체, 길항제, 항체 등을 정제하여 환자 (동물 또는 사람)에게 투여할 수 있다. 이러한 시약은, 예를 들면, 통상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 내에, 추가의 활성 또는 불활성 성분 (예를 들면, 면역원 보조제와 함께, 생리학적 접종 안정화제, 부형제 또는 방부제)과 함께 치료용으로 배합될 수 있다. 이러한 배합물은, 멸균 여과시킨 후에, 용얄 바이알 내에 동결건조시키거나 안정화된 수성 제제내에 보관하여, 용량형으로 만든다. 또한, 본 발명은, 보체-결합(complement binding)이 아닌 형태를 포함한 항체 또는 이의 결합 단편의 용도를 포함한다.
IL-12 p40/IL-B30, 융합 단백질 또는 이의 단편을 이용한 약물 스크리닝을 수행하여, 결합 친화성을 가지는 화합물 또는 IL-12 p40/IL-B30 기능에 기타의 관련된 생물학적 효과를 가지는 화합물을 동정할 수 있다 (관련된 성분의 분리도 포함). 그리고 나서, 생물학적 분석을 수행하여, 후보 화합물이 내재된 자극 활성을 가짐으로써 상기 사이토카인 복합체의 활성을 차단하는 차단물질 또는 길항제인 지 여부를 결정한다. 이와 유사하게, 내재된 자극 활성을 가지는 화합물은, 신호경로를 활성화시킬 수 있으므로, 상기한 사이토카인 복합체의 활성을 자극한다는 점에서 효능제이다. 또한, 본 발명은, 길항제로서 IL-12 p40, IL-B30 또는 복합체에 대한 차단 항체의 치료학적 용도, 및 효능제로서 자극 항체의 치료학적 용도를 포함한다. 이러한 접근방식은, 기타의 IL-12 p40 또는 IL-B30 종 변이체에도 특히 유용할 것이다.
효과적인 치료에 필수적인 시약의 양은, 많은 상이한 요인 (투여수단, 표적 부위, 환자의 생리 상태, 기타의 투여약물 등)에 따라 결정될 것이다. 따라서, 치료 용량은 안전성과 효능을 최적화하도록 적정하여야 한다. 통상적으로, 실험실내에서 사용되는 용량은, 이러한 시약의 원위치 투여에 유용한 양에 대한 지침이 될 수 있다. 특정 장애에 대한 효과적인 동물 투여량 테스트는, 사람에 대한 용량을 예측하는 데에 도움을 줄 것이다. 하기 문헌에는 다양한 고려사항들이 기재되어 있다: Gilman 등 (eds.1990) Goodman 및 Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; and Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed.(1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.}. 예를 들면, 경구, 정맥내, 복강내 또는 근육내 투여, 경피내 확산 등의 투여 방법은 아래에 기재되어 있다. 약제학적으로 허용되는 담체로는, 물, 염수, 완충액 및 기재되어 있는 기타의 화합물 {참조: Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey}이 포함된다. 용량 범위는, 적합한 담체와 함께, 1mM 농도 미만, 통상적으로는 약10μM 농도 미만, 대개 약 100nM 미만, 바람직하게는 약 10pM 미만, 가장 바람직하게는 약 1fM 미만인 것으로 예상된다. 연속적 또는 장기간에 걸친 투여에 서방형 제형 또는 서방 장치가 종종 사용된다 {참조: 예를 들면, Langer (1990) Science 249:1527-1533}.
IL-12 p40, IL-B30, 사이토카인 복합체, 융합 단백질, 이의 단편, 이에 대한 항체 또는 이의 단편, 길항제 및 효능제를 치료할 대상에게 직접 투여할 수 있다. 또는, 화합물의 크기에 따라, 오브알부민 또는 혈청 알부민과 같은 담체 단백질에 이를 접합시킨 후에 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 치료 제형은, 다수의 기존 용량 제형으로 투여할 수 있다. 활성 성분만을 투여할 수도 있지만, 약제학적 제형으로 투여하는 것이 바람직하다. 통상적으로, 제형은 상기한 하나 이상의 활성 성분 및 하나 이상의 허용되는 담체를 포함한다. 각 담체는, 다른 성분과 병용가능하고 환자에게 해를 끼치지 않는다는 의미에서 약제학적 및 생리학적으로 허용되어야 한다. 제형에는, 경구, 직장, 비강, 국부 또는 비경구 투여 (피하, 근육내, 정맥내 및 경피 투여 등)에 적합한 제형이 포함된다. 제형은, 약제학 분야에 잘 알려져 있는 많은 방법에 의해 제조될 수 있으며, 단위 용량형으로 간편하게 제공될 수 있다 {참조: 예를 들면, Gilman 등 (eds.1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis 등, (eds.1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, New York; Lieberman 등 (eds.1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, New York; Lieberman 등 (eds.1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, New York}. 본 발명의 치료법은, 기타의 다른 제제 (예를 들면, IL-6 또는 G-CSF) 또는 이의 길항제와 함께 배합하거나 결합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 IL-B30의 자연발생 형태 및 재조합 형태는, 상기 단백질에 결합 활성을 가지는 화합물을 스크리닝할 수 있는 킷트 및 분석 방법에 특히 유용하다. 몇가지의 자동 분석(automating assay)방법이 최근에 개발되어, 짧은 기간내에 수십만 개의 화합물을 스크리닝할 수 있게 되었다 {참조: 예를 들면, Fodor 등 (1991) Science 251:767-773}. 상기 문헌에서는, 고형 기질상에서 합성된 다수의 정의된 중합체에 의한 결합 친화성 테스트 방법을 기재하고 있다. 본 발명에 의해 다량의 정제된 가용성 IL-12 p40/IL-B30 사이토카인 복합체가 제공될 수 있음으로 인해, 적합한 분석법의 개발은 매우 빨라질 수 있을 것이다.
기타의 다른 방법을 이용하여, IL-12 p40/IL-B30 복합체-수용체 상호작용에 있어서 핵심적인 잔기를 결정할 수 있다. 돌연변이 분석을 수행하여 상호작용 및/또는 신호전달에 핵심적인 특정 잔기를 결정할 수 있다 {참조: 예를 들면, Somoza 등, (1993) J.Exptl.Med. 178:549-558}. PHD {Rost 및 Sander, (1994) Proteins 19:55-72} 및 DSC {King 및 Sternberg, (1996) Proteins Sci. 5:2298-2310}는, α-헬릭스 (H), β-쇄 (E) 또는 코일 (L)의 2차 구조를 예측할 수 있게 해준다. 통상적으로 헬릭스 A 및 D는 수용체 상호작용에 가장 중요한 부위이며, 헬릭스 D가 보다 더 중요한 부위이다.
예를 들면, 상기 항원 및/또는 수용체가 3차 구조 데이터 등에 의해 구조적으로 정의되면, 길항제는 대개 발견할 수 있다. 강력한 상호작용 유사체에 대한 테스트는, 정제된 IL-12 p40/IL-B30 복합체를 이용하는 고도로 자동화된 분석법이 개발되어 현재 가능하다. 특히, 새로운 길항제 및 효능제가 본원에 기재된 스크리닝 기법을 사용하여 발견될 것이다. 일련의 IL-12 p40/IL-B30 분자에 대해 조합된 결합 친화성을 가지는 화합물 (예를 들면, 상기 사이토카인 복합체의 종 변이체에 대한 길항제로서 작용할 수 있는 화합물)이 특히 중요하다.
약물 스크리닝 방법 중 하나는, IL-12 p40/IL-B30을 발현하는, 재조합 DNA 분자로 안정되게 형질전환된 진핵 숙주세포 또는 원핵 숙주세포를 이용한다. 다른 분자와 분리되어 IL-12 p40/IL-B30을 발현하는 세포를 분리할 수 있다. 생존가능한 형태 또는 고착된 형태의 상기 세포는, 표준 결합 파트너 결합 분석에 사용될 수 있다 {참조: Parce 등, (1989) Science 246:243-247; Owicki 등 (1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4007-4011}. 상기 문헌에서는, 세포 반응을 검출하는 민감한 방법을 기재하고 있다.
약물 스크리닝 기법 중 다른 기법에서는, IL-12 p40/IL-B30에 대한 적합한 결합 친화성을 가지는 화합물을 찾기 위한 고효율 스크리닝을 가능케 하는 방식을 제공하며, 하기 문헌에 상세히 기재되어 있다 {참조: Geysen, 유럽특허출원 제84/03564호 (공개일: 1984년 9월 13일)}. 첫째 단계에서는, 다수의 상이한 작은 펩티드 테스트 화합물을 고형 기질(예를 들면, 플라스틱 핀 또는 기타의 적합한 표면)상에서 합성한다 {참조: Fodor 등 (1991)}. 그리고 나서, 가용화되고 비정제되거나 가용화되고 정제된 p40/IL-B30과 모든 핀을 반응시킨 후에 세척한다. 다음 단계에서는, 결합된 p40/IL-B30을 검출하는 것을 포함한다.
또한, 합리적인 약물 설계는, p40/IL-B30 및 다른 이펙터 (effector) 또는 유사체의 분자 형상에 대한 구조 연구에 기초할 수 있다. 이펙터는, 결합에 반응하여 다른 기능을 매개하는 다른 단백질이거나, 정상상태에서 p40/IL-B30과 상호작용하는 다른 단백질 (예를 들면, 수용체)일 수 있다. 기타 특정의 단백질과 상호작용하는 부위가 어디인지를 결정하는 한 방법은, 물리적인 구조 결정방법 (예를 들면, x선 결정분석법 또는 2차원 NMR 기법)이다. 이를 통해, 예를 들면 다른 사이토카인-수용체 모델에 대해 모델화된, 어떠한 아미노산 잔기가 분자 접촉 부위를 형성하는 지에 대한 지침을 제공한다. 단백질 구조 결정에 대한 상세한 기재내용은 하기 문헌을 참조하라 {참조: 예를 들면, Blundell 및 Johnson, (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York}.
IX. 킷트
또한, 본 발명에서는, 다양한 진단 킷트내에서 p40/IL-B30 단백질, 이의 단편, 펩티드, 이의 융합체를 사용하는 용도를 포함하며, 다른 p40/IL-B30 또는 결합 파트너의 존재 여부를 검출하는 방법을 포함한다. 통상적으로, 상기 킷트는, 정의된 p40, p40/IL-B30, IL-B30 펩티드 또는 이를 인식하는 유전자 절편 또는 시약 (예를 들면, p40/IL-B30 융합 단편 또는 항체)을 함유하는 구획을 가질 것이다.
테스트 화합물의 IL-12 p40/IL-B30에 대한 결합 친화성을 측정하는 킷트는, 테스트 화합물; 표지된 화합물 (예를 들면, p40/IL-B30에 대한 공지된 결합 친화성을 가지는 결합 파트너 또는 항체); p40/IL-B30 공급원 (천연 또는 재조합); 및 부착된 표지 화합물과 부착되지 않은 표지 화합물을 분리하기 위한 수단 (예를 들면, 상기 분자를 고정화시키기 위한 고체상)을 통상적으로 포함한다. 화합물을 스크리닝하고 나면, 상기 항원에 대한 적합한 결합 친화성을 가지는 화합물을 적합한 생물학적 분석을 통해 공지된 방법으로 평가하여, 이 화합물이 p40/IL-B30 신호전달 경로에서 효능제 또는 길항제로서 작용하는 지 여부를 결정할 수 있다. 또한, 재조합 IL-12 p40/IL-B30 융합 폴리펩티드를 얻을 수 있음으로 인해, 이러한 분석을 확인할 수 있는 표준이 제공된다.
샘플내의, 예를 들면, p40/IL-B30의 농도를 측정하기 위한 바람직한 킷트는, 표지된 화합물 (예를 들면, 상기 항원에 대한 공지된 결합 친화력을 가지는 결합 파트너 또는 항체), 사이토카인의 공급원 (천연 또는 재조합), 및 결합된 표지 화합물과 결합되지 않은 표지 화합물을 분리하기 위한 수단 (예를 들면, p40/IL-B30를 고정시키기 위한 고체상)을 통상적으로 포함한다. 시약을 포함하는 구획 및 지시사항이 대개 제공된다.
p40/IL-B30 또는 이의 단편에 특이적인 항체 (항원-결합 단편을 포함)는, p40, IL-B30, p40/IL-B30 및/또는 이의 단편의 수준이 증가되었는 지 여부를 검출하는 진단용으로서 유용하다. 이러한 진단 분석에서는, 용해물, 살아있는 세포, 고정된 세포, 면역형광, 세포 배양물, 체액을 포함할 수 있으며, 혈청에서 상기 항원에 관련된 항원을 검출하는 것 등을 추가로 포함할 수 있다. 진단 분석은, 동종 (유리 시약과 항원-결합 파트너 복합체 사이의 분리단계가 없음) 또는 이종 (분리 단계가 있음)일 수 있다. 현재 시판되고 있는 다양한 분석법으로는, 예를 들면, 방사선면역분석법 (RIA), 효소-결합 면역용매 분석법 (ELISA), 효소 면역분석법 (EIA), 효소-증폭 면역분석법 (EMIT), 기질-표지된 형광 면역분석법 (SLFIA) 등이 있다 {참조: 예를 들면, Van Vunakis 등 (1980) Meth Enzymol. 70:1-525; Harlow 및 Lane (1980) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY; Coligan 등 (eds.1993) Current Protocols in Immunology, Greene and Wiley, NY}.
항-유전형 항체는, 다양한 비정상적인 상태를 진단할 수 있는, p40/IL-B30에 대한 항체의 존재여부를 진단하는 데에 사용되는 유사한 용도를 가지고 있다. 예를 들면, p40/IL-B30의 과생산은 다양한 면역반응을 생기게 할 수 있어서, 비정상적인 생리 상태, 특히 증식성 세포 상태 (예를 들면, 암 또는 비정상적인 활성화 또는 분화)를 진단할 수 있다.
종종, 진단분석의 민감도를 최적화하기 위해, 진단분석용 시약을 킷트내에 공급한다. 본 발명에 있어서, 상기 분석의 성질에 따라, 프로토콜, 표지 (표지된 또는 표지되지 않은 항체 또는 결합 파트너), 또는 표지된 p40/IL-B30이 제공된다. 대개, 이는 기타의 첨가제 (예를 들면, 완충액, 안정화제, 효소에 대한 기질과 같이 신호전달에 필수적인 물질 등)와 함께 사용된다. 바람직하게는, 상기 킷트는, 적합한 사용 및 사용후의 처분에 대한 지시사항을 포함한다. 통상적으로, 상기 킷트는 각 유용한 시약을 담는 구획을 가진다. 바람직하게는, 상기 시약은 동결건조 분말로서 제공되며, 상기 분석을 수행하기 위해서 시약의 적합한 농도를 제공하는 수성 매질에서 재구성될 수 있다.
약물 스크리닝 및 진단 분석에 있어서 상기한 많은 구성성분들은, 변형없이 사용될 수도 있고, 다양한 방법으로 변형될 수도 있다. 예를 들면, 직접적 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 제공하는 잔기를 공유적 또는 비-공유적으로 결합시킴으로써 표지화할 수 있다. 많은 이러한 분석에 있어서, 결합 파트너, 테스트 화합물, p40/IL-B30 또는 이에 대한 항체는 직접적 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 직접적으로 표지화하는 것으로는, 방사선 표지 (예를 들면, 125I), 효소 (예를 들면, 퍼옥시데이즈 및 알칼라인 포스파타제), 및 형광강도, 파장 쉬프트 또는 형광 극성의 변화를 모니터링할 수 있는 형광 표지 (미국 특허 제3,940,475호) 등의 표지 그룹이 포함된다. 간접적으로 표지화하는 것으로는, 하나의 성분을 비오틴화한 후, 상기 표지 그룹에 속하는 하나의 표지에 커플링된 아비딘에 결합시키는 방법이 포함된다.
또한, 결합된 p40/IL-B30과 자유 p40/IL-B30을 분리하는 방법, 또는 결합된 테스트 화합물과 자유 테스트 화합물을 분리하는 방법은 다수 존재한다. p40/IL-B30은 다양한 매트릭스 상에 고정시킨 후에 세척시킬 수 있다. 적합한 매트릭스로는, ELISA 플레이트와 같은 플라스틱, 필터 및 비드 등이 포함된다 {참조: 예를 들면, Coligan 등 (eds.1993) Current Protocols in Immunology, Vol.1, Chapter 2, Greene and Wiley, NY}. 기타의 다른 적합한 분리 방법으로는, 형광 자기화-가능 입자 방법 {참조: Rattle 등 (1984) Clin.Chem. 30:1457-1461} 및 이중 항체 자기입자 분리 방법 {참조: 미국 특허 제4,659,678호}이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기한 다양한 표지에 단백질 또는 이의 단편을 결합시키는 방법은, 문헌에 광범위하게 기재되어 있어서, 본원에서는 상세하게 논의할 필요가 없다. 이러한 방법 중 많은 방법에서는, 펩티드 결합을 형성하기 위해 카보디이미드 또는 활성 에스테르의 이용을 통한 활성화된 카복시 그룹의 이용, 결합을 위해 활성화된 할로겐 (예를 들면, 클로로아세틸) 또는 활성화된 올레핀 (예를 들면, 말레이미드)과 머캅토 그룹을 반응시켜 티오에테르를 형성하는 것 등을 포함한다. 또한, 융합 단백질이 이러한 용도에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 진단 양태에서는, p40/IL-B30 서열에서 유래한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 것을 포함한다. 이러한 서열은, 비정상적인 상태 (예를 들면, 염증 또는 자가면역)를 가지는 것으로 의심되는 환자의 샘플에서 p40 또는 IL-B30 메시지 수준을 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 상기 사이토카인은 활성화에 대한 마커 또는 매개물질일 수 있기 때문에, 활성화된 세포 수를 측정하여, 그 효과가 심하게 되거나 심하게 진행되기 이전에 예방적 차원에서 추가의 치료가 언제 필요한지 등을 결정할 수 있다. RNA 및 DNA 뉴클레오티드 서열의 제조, 상기 서열의 표지화, 및 상기 서열의 바람직한 크기에 대해서는, 하기 문헌에 충분히 기재되어 있다 {참조: 예를 들면, Langer-Safer 등 (1982) Proc.Natl.Acad.Sci. 79:4381-4385; Casky (1987) Science 236:962-967; Wilchek 등 (1988) Anal.Biochem. 171:1-32}.
또한, 본 발명에서는, 기타의 다른 분자의 발현을 정량적 또는 정성적으로 테스트하기 위한 진단 킷트를 포함한다. 진단 또는 예후 (prognosis)는, 마커로 사용되는 다중 지시사항의 조합에 의존할 수 있다. 따라서, 킷트는 마커의 조합을 테스트할 수 있다 {참조: 예를 들면, Viallet 등 (1989) Progress in Growth Factor Res. 1:89-97}. 다른 킷트는, 다른 세포 서브세트를 평가하는 데에 사용될 수 있다.
X. p40/IL-B30 수용체의 분리
특정의 리간드-수용체 상호작용을 하는 리간드를 분리하는 것을 포함하는 수용체 분리방법이 있다 {참조: Gearing 등 (1989) EMBO J. 8:3667-3676}. 예를 들면, IL-B30 사이토카인이 이의 수용체에 결합하는 것을 방해하지 않고 표지화하는 수단을 결정할 수 있다. 예를 들면, 친화성 표지를 상기 리간드의 아미노 말단 또는 카복시 말단에 융합시킬 수 있다. 이러한 표지는, FLAG 에피토프 태그 또는 Ig 또는 Fc 도메인일 수 있다. 예를 들면, 세포 분류 또는 결합 성분을 발현하는 서브집단을 검출하기 위한 기타의 스크리닝에 의해, 발현 라이브러리를 스크리닝하여 상기 사이토카인의 특정 결합을 파악할 수 있다 {참조: 예를 들면, Ho 등 (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:11267-11271; 및 Liu 등 (1994) J.Immunol.152:1821-29}. 이와 달리, 패닝(panning) 방법을 사용할 수 있다 {참조: 예를 들면, Seed and Aruffo (1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3365-3369}.
표지를 이용한 단백질 가교결합 기법은, p40/IL-B30 사이토카인 복합체의 결합 파트너를 분리하는 데에 적용할 수 있다. 이를 통해, 예를 들면 리간드-수용체와 유사한 방식으로, 상기 사이토카인과 특이적으로 상호작용하는 단백질을 동정할 수 있다.
공지의 IL-6 또는 G-CSF 수용체 성분이 p40/IL-B30에 대한 반응에 관여하는 지 여부를 측정하기 위한 실험이 초기에 이루어질 것이다. 또한, 이러한 기능성 수용체 복합체는, p40/IL-B30 수용체 복합체와 많은 또는 모든 성분 (특이적인 수용체 소단위 또는 악세서리 수용체 소단위)을 공유할 수 있다.
본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 본 발명의 많은 변형 및 변이가 생성될 수 있다는 것은 당업자에게는 명백할 것이다. 본원의 특정의 양태들은 단지 예시를 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기의 특허청구범위 및 이의 균등한 부분으로 제한된다.
I. 일반적인 방법
아래의 많은 표준 방법들이 기재 또는 인용되고 있다: 예를 들면, Maniatis 등 (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook 등 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.) Vols.1-3, CSH Press, NY; Ausubel 등, Biology Greene Publishing Assotiates, Brooklyn, NY; Ausubel 등 (1987 및 추가본) Current Protocols in Molecular Biology Wiley/Greene, NY; Innis 등 (eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, NY; Bonifacino 등, Current Protocols in Cell Biology Wiley, NY; Doyle 등, Cell and Tissue Culture: Laboratory Protocols Wiley, NY.
단백질 정제방법으로는, 암모늄 설페이트 침전, 칼럼 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 결정 등의 방법이 포함된다 {참조: 예를 들면, Ausubel 등 (1987 및 정기 추가분); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification," Methods in Enzymology vol.182 및 해당 시리즈의 다른 권; Colligan 등 (1995 및 추가분) Current Protocols in Protein Science John Wiley and Sons, New York, NY; Matsudaira (ed. 1993) A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing, Academic Press, San Diego, CA; 단백질 정제물의 사용에 관한 제조자 문헌 (예를 들면, Pharmacia, Piscataway, NJ 또는 Bio-Rad, Richmond, CA}. 재조합 기법과 병용함으로써, 적합한 절편 (에피토프 태그; 예를 들면, 프로티에이즈-제거가능한 서열을 통해 융합될 수 있는 FLAG 서열 또는 이의 균등물)에 융합될 수 있다 {참조: 예를 들면, Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY; 및 Crowe 등 (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA}.
예를 들면, 위스콘신주 매디슨 소재의 the University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), NIH의 NCBI, GenBank, NCBI, EMBO 및 기타의 공공서열 공급기관 등으로부터 공급되는 소트트웨어 프로그램을 포함한, 입수가능한 소프트웨어 프로그램을 이용하여, 컴퓨터 서열분석을 수행한다. 기타의 분석 공급원으로는, 예를 들면, RASMOL 프로그램 {참조: Bazan 등 (1996) Nature 379: 591; Lodi 등 (1994) Science 263: 1762-1766; Sayle and Milner-White (1995) TIBS 20:374-376; 및 Gronenberg 등 (1991) Protein Engineering 4:263-269}; DSC {참조: King 및 Sternberg (1996) Protein Sci.5:2298-2310}이 포함된다. 또한, 하기 의 문헌을 참조하라: Wilkins 등 (eds. 1997) Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics Springer-Verlag, NY; Salzberg 등 (eds.1998) Computational Methods in Molecular Biology Elsevir, NY; Birren 등 (eds.1997) Genome Analysis: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.
표준적인 면역학적 기법들이 하기 문헌에 기재되어 있다: 예를 들면, Hertzenberg 등 (eds.1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology vols.1-4, Blackwell Science; Coligan (1991 및 추가본) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; Methods in Enzymology vols.70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 및 163. 사이토카인 분석법은 아래 문헌에 기재되어 있다: 예를 들면, Thomson (ed.1994) The Cytokine Handbook (2d ed.) Academic Press, San Diego; Metcalf and Nicola (1995) The Hematopoietic Colony Stimulating Factors Cambridge University Press; 및 Aggarwal 및 Gutterman (1991) Human Cytokines Blackwell Pub.
혈관 생물활성에 대한 분석에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 분석에는, 동맥 평활근 증식과 같이 종양 또는 기타의 조직에 있어서의 혈관형성(angiogenesis) 및 지혈(angiostasis) 활성 {참조: 예를 들면, Koyoma 등 (1996) Cell 87:1069-1078}, 혈관 내피에의 단핵세포 부착 {참조: McEvoy 등 (1997) J.Exp.Med.185:2069-2077} 등이 포함된다. 또한, 아래 문헌을 참조하라: Ross (1993) Nature 362:801-809; Rekhter 및 Gordon (1995) Am.J.Pathol.147:668-677; Thyberg 등 (1990) Atherosclerosis 10:966-990; 및 Gumbiner (1996) Cell 84:345-357.
신경세포의 생물학적 활성 분석에 대해서는 하기 문헌에 기재되어 있다: 예를 들면, Wouterlood (ed.1995) Neuroscience Protocols modules 10, Elsevier; Methods in Neurosciences Academic Press; 및 Neuromethods Humana Press, Totowa, NJ. 발생 시스템에 대한 방법론에 대해서는 하기 문헌에 기재되어 있다: 예를 들면, Meisami (ed.) Handbook of Human Growth and Developmental Biology CRC Press; 및 Chrispeels (ed.) Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology Interscience.
FACS 분석법에 대해서는 하기 문헌에 기재되어 있다: Melamed 등 (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY; 및 Robinson 등 (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY.
II. 사람 p40 및/또는 IL-B30의 클로닝
IL-12 p40 서열은, 상기한 다양한 서열 데이터베이스에서 입수가능하다. IL-B30 유전자 서열은 표 1에 기재되어 있다. 상기 서열은 사람의 게놈 서열에서 유래한 것이다.
상기 서열을 이용하여, PCR 프라이머 또는 프로브를 제조하여, 상기 유전자의 세포 분배를 측정할 수 있다. 상기 서열을 통해, 상기 메시지를 암호화하는 게놈 DNA를 분리할 수 있다.
상기한 프로브 또는 PCR 프라이머를 이용하여, 세포 분배를 측정하기 위해 다양한 조직 또는 세포 유형을 프로브한다. PCR 생성물은, 예를 들면, TA 클로닝 킷트 (Invitrogen)를 사용하여 클로닝된다. 이렇게 수득한 cDNA 플라스미드는, 자동 서열기 (Applied Biosystems) 상의 양 말단(terminus)에서부터 서열분석한다.
III. p40 및 IL-B30의 세포 발현
각 유전자를 암호화하는 cDNA에 특이적인 적합한 프로브 또는 프라이머를 제조한다. 통상적으로, 상기 프로브는, 예를 들면 무작위 프라이밍 (random priming)으로 표지화한다. p40/IL-B30 복합체가 중요한 경우, 양 소단위의 조화로운 발현이 가장 중요하다.
IV. p40/IL-B30 단백질의 정제
다중 형질감염된 세포주를 스크리닝하여, 다른 세포에 비해 상기 사이토카인 또는 복합체를 높은 수준으로 발현하는 세포주를 선별한다. 이와 달리, 배합 재조합 작제물 (combination recombinant construct)을 제조할 수 있다. 다양한 세포주를 스크리닝하여, 조작하기에 좋은 특성을 가진 세포주를 선별한다. 각각의 소단위 및 이의 조합을 분리하면, 소정의 이합체가 형성된다. 천연 IL-B30은, 천연 공급원으로부터 분리될 수 있으며, 또는 적합한 발현 벡터를 이용하여 형질감염된 세포로부터 발현시켜 분리할 수도 있다. 또한, 아데노바이러스 작제물을 사용하여 생산/발현시킬 수 있다.
발현된 소단위 또는 복합체의 정제는, 표준 공정을 이용하여 수행될 수 있으며, 또는 세포 용해물 또는 상층물로부터 고효율로 효과적으로 정제할 수 있는 공학적 수단과 함께 수행될 수도 있다. 특히, 링커 (linker)를 사용하거나 사용하지 않고, p40과 IL-B30을 융합하게 되면, 고효율의 처리 또는 정제방법이 될 수 있다. FLAG 또는 His6 절편은, 이러한 정제 특성용으로 사용될 수 있다. 이와 달리, 하기와 같이, 특정 항체를 이용한 친화성 크로마토그래피를 사용할 수 있다.
단백질은, 대장균, 곤충세포 또는 포유류 발현 시스템에서 생성되는 것이 바람직하다.
V. p40/IL-B30에 특이적인 항체의 제조
합성 펩티드 또는 정제된 단백질을 면역 시스템에 노출시켜, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 생성한다 {참조: 예를 들면, Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; 및 Harlow 및 Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press}. 면역선별 또는 고갈 방법을 사용하여, 수득한 항체가, 개개의 성분에 의해 제시되는 항원 결정체 (antigenic determinant)와는 상이한, 상기 폴리펩티드 복합체에 의해 제시되는 항원 결정체에 특이적인 지를 확인한다. 폴리클로날 혈청 또는 하이브리도마를 제조할 수 있다. 적합한 조건하에서, 결합 시약은 상기한 바와 같이 표지(예를 들면, 형광 등)시키거나, 패닝 방법(panning method)을 위한 기질에 고정시킨다. 면역선별, 면역고갈 및 이와 관련된 기법들은, 바람직하게는 예를 들면 상기한 2가지의 소단위 사이의 복합체에 대한 선별적인 시약을 제조하는 데에 사용할 수 있다.
VI. IL-12 p40 및 IL-B30 공침전물 (coprecipitate)
발현 벡터내에서 마우스의 IL-12 p40-Ig 융합 작제물을 제조하였다. Ig 도메인은 단백질 A에 결합하여, 이 폴리펩티드를 침전시킬 수 있다. IL-B30Etag (N 말단에서 FLAG 모티프로 태그된 에피토프) 작제물을 제조하였으며, 이 폴리펩티드는 M2 항체와 면역침전가능하다. 상기 발현 작제물(IL-12 p40-Ig 작제물 단독 및/또는 IL-B30Etag 작제물 단독)을 293T 세포에 감염시켰다. 35S 메티오닌으로 세포를 표지시켰다. IL-12 p40 작제물 단독의 경우, 단백질 A를 이용한 세포 상층물내에서 가용성 단백질이 검출되지 않았다. 이와 유사하게, FLAG-IL-B30 작제물의 경우, M2 항체를 이용한 세포 상층물내에서 가용성 단백질이 검출되지 않았다. 하지만, 상기 2가지의 발현 작제물 모두를 함께 형질감염시키는 경우, 세포 상층물은 단백질 A 시약 또는 M2 항체와 침전가능한 가용성 복합체를 생산하였다. 상기 복합체에 대해 PAGE 분석한 결과, 단백질 A와 침전된 상기 복합체는 2가지의 예상되는 폴리펩티드 (IL-12 p40-Ig 융합 및 FLAG-IL-B30 폴리펩티드)에 상응하는 폴리펩티드로 이루어져 있었다. 이와 같이, M2 항체와 침전된 상기 복합체는 IL-12 p40-Ig 융합 단백질 및 FLAG-IL-B30 폴리펩티드로 이루어져 있었다.
사람 IL-12 p40 발현 작제물 및 사람 FLAG-IL-B30 작제물을 이용한 유사한 실험 결과, 상기 예상된 결과를 얻었다. FLAG-IL-B30 작제물과의 형질감염 결과, 상당한 정도의 가용성 단백질은 없었다. 상기 2가지의 발현 벡터를 영장류 세포에 공-형질감염 (cotransfection)시킨 결과, M2 항체와 면역침전가능한 복합체가 효과적으로 방출되었다. 수득한 복합체에 대한 PAGE 분석을 통해, 상기 복합체는 IL-12 p40 폴리펩티드 및 FLAG-IL-B30 폴리펩티드로 이루어져 있음을 확인하였다.
VII. 수용체 동정
IL-12 수용체는, IL-12 수용체 소단위 β1 및 β2로 이루어져 있다. 융합 작제물 p40/IL-B30은 수용체 소단위 β1을 발현하는 세포에 결합한다.
IL-12 p40 소단위 동질이합체는, IL-12가 마우스의 소단위 β1에 결합하는 것을 차단하지만 소단위 β2에 결합하는 것을 차단하지는 않는다. 상기한 p40 소단위는 p40/IL-B30 복합체 성분이므로, IL-12 수용체 소단위 β1이 융합 작제물 p40/IL-B30에 대한 수용체 성분이 될 수 있는 지를 테스트하였다. IL-12 수용체 소단위 β1에 대한 항체는, 수용체 소단위 β1을 발현하는 세포에 상기 융합 작제물이 결합하는 것을 차단하였다. p40 소단위를 주로 인식하는 p40/p70 복합체에 대한 항체는, p40/IL-B30 조성물의 효과를 차단할 수 있어서, p40 성분이 수용체 상호작용에 중요함을 시사해 주었다. 이러한 관찰결과는, 수용체 소단위 β1이 p40/IL-B30 융합 작제물에 결합함을 시사해준다. 관련된 수용체 사이에서 공유하고 있는 gp130 소단위의 관여 여부를 테스트한 유사 실험에서는, gp130이 p40/IL-B30에 대한 수용체의 관련 소단위가 아님을 시사해주었다.
발현 클로닝을 시작하여, 상기 수용체의 하나의 소단위를 동정하였다. 하나의 소단위를 발현하지만 결합하지는 않는 세포를 사용하여, 추가의 소단위를 발현 클로닝하였다. 다른 수용체 소단위 β2 동종체를 스크리닝하였다. 이와 달리, 적합한 세포에서 유래한 라이브러리를 표준 발현 클로닝 방법에 사용할 수 있다.
VIII. 생물학적 기능의 범위 평가
예를 들면, IL-B30, IL-6 및 G-CSF 사이의 서열 및 구조 동종성에 기초하여, p40/IL-B30 복합체의 생물학적 활성을 테스트한다. 먼저, IL-6 또는 G-CSF의 생물학적 활성을 보이는 분석에 대해 검사하였다. 재조합 복합체 또는 융합 작제물에 대해 분석하였다. IL-B30의 성숙 서열에 융합된 적합한 길이의 ser/gly이 풍부한 링커 서열에 융합된 IL-12 p40의 성숙 서열에 융합된 N 말단 FLAG 에피토프에 결합된 IL-12 p40 서열의 시그널 서열(signal sequence)을 갖는 작제물로 이루어져 있다. 이 작제물은, 발현이 잘 이루어지며 방출된다. 상기 에피토프 태그를 통해, 정제 및 위치확인이 가능하다. 마우스 및 사람의 서열형태를 제조하였다. 또한, 별개의 폴리펩티드 및 융합 단백질의 아데노바이러스 발현 작제물도 제조가능하다.
표적 세포의 유형에는, 림프계, 골수계, 비만세포, 예비 B세포, 예비 T세포 및 섬유아세포 내피세포 유형이 포함된다. 예를 들면, 세포 표면 마커의 변화, MHC 클래스 II, B7, CD40 및 이와 관련된 패밀리; 사이토카인 및 케모카인 생성; 및 항원 제시 능력에 대해 대식세포/단핵세포를 평가한다. CD4+ T 세포 (naive CD45Rbhi 및 CD45Rblow T 세포)를 성장, 활성화 마커, 이펙터 기능 (예를 들면, 사이토카인 및 케모카인 생성)에 대해 분석한다. 세포독성 CD4+, CD8+ 및 NK 세포에 대해, 생성 및 기능에 대한 효과를 평가한다. 예를 들면, 비장 및 MLN B 세포에 대한, 항체 생산에 대한 효과를 테스트한다. 가지 세포에 대해, 생성, 성숙 및 기능 (인자 생성을 포함)에 대해 평가한다. 세포사멸 분석(apoptosis assay)도 개발되고 있다.
장기간의 골수 배양물에 대해, 기질 세포 및 줄기세포의 생성 및 분화의 조절에 미치는 효과 (Dexter 배양), 기질 세포 및 B 세포 전구세포 (progenitor)의 생성 및 분화의 조절 (Whitlock-Witte 배양), 및 원시 골수계 및 B 림프계의 집단을 조절하는 능력 여부를 테스트한다.
A. 세포 증식에 미치는 효과
다양한 세포 유형의 증식에 대한 효과는, 다양한 농도의 사이토카인을 이용하여 평가한다. 관련된 사이토카인 IL-6, G-CSF 등과 함께, 투여량 반응 분석을 수행한다. 세포의 대사 및 성장을 검출하는 세포감지 기계 (cytosensor machine)를 사용할 수 있다 {참조: Molecular Devices, Sunnyvale, CA}.
사람 p40/IL-B30 융합 단백질은, 항-CD3, 또는 항-CD3와 항-CD28에 의해 자극받은 사람 PHA 블래스트 (blast)의 증식을 강화시켰다. 항-CD3 자극이 필수적인 것으로 보인다. 또한, 사람 p40/IL-B30 융합 단백질은, 활성화된 Th1 또는 Th2 세포 클론의 증식을 증진시켰지만, 휴지기의 Th1 또는 Th2 세포 클론의 증식을 증진시키지는 않았다.
마우스 또는 사람의 융합 단백질은 마우스 표적 세포에 대해 작용하였다. 융합 단백질은, 항-CD3로 자극되면, CD4+ CD45Rblow CD62Llow CD44hi 세포 (메모리/활성화된 T 세포)의 증식을 지지하였다. 융합 단백질에 의한 자극은, 항-CD28 공-자극 (costimulation)에 의해서는 증진되지 않는다. 이는, IL-2의 존재와는 전반적으로 무관하다. 이는, 메모리 표현형을 가지는 세포 집단을 증가시키고/증가시키거나 면역적 메모리를 생성 또는 유지하는 데에 있어서, p40/IL-B30가 중요한 인자가 될 수 있음을 시사한다. 이 사이토카인은, Th1 표현형을 가지는 활성화된 메모리 세포 (예를 들면, IFNγ를 생산하지만, IL-4 또는 IL-5를 생산하지 않는 세포)를 선택적으로 지지하는 것 같다.
B. 나이브(naive) T 세포의 분화에 미치는 효과
사람의 제대혈세포를 수집한 후, 나이브 CD4+ T 세포를 분리하였다. 이를, 항-CD3 및 IL-2의 존재하에, CD32, CD58 및 CD80을 발현하는 방사선을 조사한 섬유아세포와 함께, 예를 들면 2주 동안 배양하여, T 세포를 활성화 및 증식시켰다. 상기 T 세포 배양물에 대해, 다양한 사이토카인이 증식 또는 분화에 미치는 효과를 평가하였다. FACS 분석에 의해, 개개의 세포의 사이토카인 생성에 대해 평가하였다. 상기한 p40/IL-B30 융합 단백질은, IFNγ는 생성하지만 IL-4는 생성하지 않는 T 세포 (Th1 세포의 사이토카인 발현 프로파일 특징)의 증식 및 분화를 도왔다.
C. 세포 표면 분자의 발현에 미치는 효과
정상적인 건강한 수여자의 말초 혈액 단핵 세포로부터 네가티브 선별을 통해, 단핵세포를 정제한다. 간략하게는, 3×108 피콜 밴드-단핵 세포를 모노클로날 항체의 칵테일{예를 들면, αCD2 (Leu-5A) 200㎕, αCD3 (Leu-4) 200㎕, αCD8 (Leu-2a) 100㎕, αCD19 (Leu-12) 100㎕, αCD20 (Leu-16) 100㎕, αCD56 (Leu-19) 100㎕, αCD67 (IOM 67; Immunotech, Westbrook, ME) 100㎕, 및 항-글루코포린 항체 (10F7MN, ATCC, Rockville, MD)로 이루어짐}과 함께 얼음 위에서 인큐베이션시킨다 {참조: Becton-Dickinson; Mountain View, CA}. 항체-결합된 세포를 세척한 후, 자기 비드(Dynal, Oslo, Norway)에 커플링된 양 항-마우스 IgG (비드:세포 = 20:1)와 함께 인큐베이션시켰다. 자기장을 이용하여, 항체-결합된 세포를 단핵세포와 분리한다. 그리고 나서, 1% 사람 AB 혈청을 함유하는 Yssel 배지 (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA)에서, IL-B30, IL-6, G-CSF 또는 이의 조합의 존재 또는 부재하에, 사람 단핵세포를 배양한다.
세포표면 분자의 발현에 대한 분석은, 직접 면역형광법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 2×105개의 정제된 사람 단핵세포는, 1% 사람 혈청을 함유하는 포스페이트-완충된 염수 (PBS)내에서 20분간 얼음 위에서 인큐베이션시킨다. 200×g의 속도로 세포를 펠렛화시킨다. 20ml의 PE 또는 FITC-표지된 mAb에서 세포를 재현탁시킨다. 얼음 위에서 20분간 추가로 인큐베이션시킨 후, 1% 사람 혈청을 함유하는 PBS 내에서 세포를 세척한 후에, PBS 만으로 2회 세척한다. 1% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS내에 세포를 고정시킨 후, FACS 스캔 플로우 세포계측기 (Becton Dickinson; Mountain View, CA) 상에서 분석한다. 사용되는 mAb의 예는 다음과 같다: Becton Dickinson의 CD11b (항-mac1), CD11c(gp150/95), CD14(Leu-M3), CD54(Leu54), CD80(항-BB1/B7), HLA-DR(L243); CD86 (FUN1; Pharmingen); CD64 (32.2; Medarex); CD40 (mAb89; Schering-Plough France).
D. 사람 세포에 의한 사이토카인 생산에 미치는 효과
IL-B30 (바쿨로바이러스-발현된 물질의 1/100 희석물)의 존재 또는 부재하에서, 1% 사람 AB 혈청을 함유하는 Yssel 배지 (Gemini Bioproducts, Calabasac, CA) 내에서 사람 단핵세포를 기술한 바와 같이 분리 및 배양시킨다. 또한, IL-B30의 존재 또는 부재하에서 LPS (이.콜라이 0127:B8 Difco)로 단핵세포를 자극하고, 세포 배양물 중 상층물에서의 사이토카인 (IL-1β, IL-6, TNFα, GM-CSF 및 IL-10)의 농도를 ELISA로 측정한다.
사이토카인에 대한 세포질내 염색을 위해, IL-B30, LPS (이.콜라이 0127:B8 Difco) 및 10mg/ml의 Brefeldin A (Epicentre technologies, 위스콘신주 매디슨 소재)의 존재 또는 부재하의 Yssel 배지에서 단핵세포(1×106/ml)를 12시간 동안 배양시킨다. PBS에서 세포를 세척하고, 실온에서 20분간 2% 포름알데히드/PBS 용액내에서 인큐베이션시킨다. 그리고 나서, 세포를 세척하고, 침투 완충액 (permeabilization buffer) [PBS/BSA (0.5%)/아지드 (1mM) 중의 0.5% 사포닌 (Sigma)]에서 재현탁시키고, 실온에서 20분간 인큐베이션시킨다. 세포 (2×105)를 원심분리시키고, 실온에서 20분 동안 침투 완충액내에서 1:10으로 희석시킨 20ml의 직접-접합된 항-사이토카인 mAb 내에서 재현탁시킨다. 하기의 항체를 사용할 수 있다: IL-1α-PE(364-3B3-14), IL-6-PE(MQ2-13A5), TNFα-PE(MAb11), GM-CSF-PE(BVD2-21C11), 및 IL-12-PE (C11.5.14; Pharmingen, San Diego, CA). 그리고 나서, 침투 완충액내에서 세포를 2회 세척하고, PBS/BSA/아지드 내에서 1회 세척하고, FACS 스캔 플로우 세포계측기 (Becton Dickinson; Mountain View, CA) 상에서 분석한다.
사람의 PHA 블라스트(blast)는, 사람의 p40/IL-B30 융합 작제물과 접촉하여 IFNγ를 생산하였다. 이는, IL-2를 함께 사용하는 경우에는 시너지 효과를 나타냈다. 융합 생성물은, 활성화된 T세포, Th1 세포 클론 또는 Th2 세포 클론에 의해 (휴지기의 T세포, Th1 세포 클론 또는 Th2 세포 클론이 아닌) IFNγ의 생성을 증가시켰다.
E. 사람의 말초혈액 단핵세포 (PBMC)의 증식에 대한 효과
피콜-하이파크(ficoll-hypaque)(참조: Boyum 등)를 통한 원심분리에 의해, 정상적인 건강한 공여자의 버피 코트 (buffy coat)로부터 총 PBMC를 분리한다. IL-B30의 존재 또는 부재하에서, 96개 웰 플레이트 (Falcon, Becton-Dickinson, NJ) 내에, 1% 사람 AB 혈청을 함유하는 200㎕의 Yssel 배지 (Gemini Bioproducts, Calabasac, CA)내에서 PBMC를 배양한다. 배지 단독 또는 100U/ml IL-2 (R&D Systems)와 함께, 120 시간 동안 세포를 배양시킨다. 배양 마지막 6시간 동안 3H-티미딘 (0.1mCi)을 첨가하고, 3H-티미딘 혼입 여부를 액체 섬광 계측으로 측정하였다.
많은 다른 생물학적 분석 시스템 (예를 들면, T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포, 가지 세포, 조혈 전구세포 등)에서, 상기한 천연, 재조합 및 융합 단백질에 대해 효능제 및 길항제 활성 여부를 테스트한다. IL-6 및 G-CSF의 구조상 관련성으로 인해, 이러한 활성과 관련한 분석에 대해 검토가 필요하다.
IL-6 또는 G-CSF 수용체를 발현하는 형질감염된 세포 및 대조군에 대한, p40/IL-B30의 효능제 또는 길항제 활성을 평가한다 {참조: 예를 들면, Ho 등 (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90, 11267-11271; Ho 등 (1995) Mol.Cell.Biol. 15:5043-5053; Liu 등 (1994) J.Immunol.152:1821-1829}.
항원 또는 알레르기 자극원에 대한 반응으로서 대식세포/가지 세포의 활성화 및 항원 제시 분석, T세포 사이토카인 생산 및 증식에 대한, p40/IL-B30의 효과를 평가한다 {참조: 예를 들면, de Waal Malefyt 등 (1991) J.Exp.Med.174:1209-1220; de Waal Malefyt 등 (1991) J.Exp.Med. 174:915-924; Fiorentino 등 (1991) J.Immunol.147, 3815-3822; Fiorentino 등 (1991) J.Immunol.146:3444-3451; Groux 등 (1996) J.Exp.Med.184:19-29}.
또한, NK 세포의 자극에 대한 p40/IL-B30의 효과를 평가한다. 분석은 하기 문헌에 기초하여 수행할 수 있다: Hsu 등 (1992) Internat.Immunol.4:563-569; Schwarz 등 (1994) J.Immunother.16:95-104.
B 세포 성장 및 분화 효과는 하기 문헌의 방법에 의해 분석한다 (IgG2 및 IgA2 스위치 인자 분석법 포함): 예를 들면, Defrance 등 (1992) J.Exp.Med.175:671-682; Rousset 등 (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1890-1893.
IX. 유전적으로 변형된 동물의 생성 및 분석
표준적인 방법으로 형질전환 마우스를 제조할 수 있다. 이러한 동물은, 특정 조직에서 또는 유기체 전체에 걸쳐 상기 유전자의 과발현의 효과를 측정하는 데에 유용하다. 이를 통해, 상기 동물의 발생 또는 다양한 단계에서의 특정 조직에 대한 통찰력을 얻을 수 있다. 또한, 생물학적 스트레스에 대한 다양한 반응에 미 치는 효과를 평가할 수도 있다 {참조: 예를 들면, Hogan 등 (1995) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (2d ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press}.
아데노바이러스 기법은, 다양한 세포 및 기관에서의 상기 유전자의 발현에 사용할 수 있다 {참조: 예를 들면, Hitt 등 (1997) Adv.Pharmacol.40:137-195; 및 Quantum Biotechnologies (Montreal, Canada)의 문헌}. 동물을 사용하여, 다양한 발생학적 또는 생리학적 기능성 동물 시스템에 상기 유전자가 미치는 영향을 측정하는 데에 유용할 수 있다.
IL-B30를 암호화하는 0.5kb cDNA를, CMV 인헨서 β-액틴 프로모터 및 토끼 β-글로빈 폴리아데닐와 신호를 함유하는 발현 벡터에 EcoRI 단편으로서 삽입하였다 {참조: Niwa 등 (1991) Gene 108:193-200}. 상기 트랜스 유전자 (transgene)을 벡터 서열로부터 분리하는 것은, 구역 수크로즈 구배 원심분리 (zonal sucrose gradient centrifugation)에 의해 이뤄졌다 {참조: Mann 등 (1993) "Factor Influencing Production Frequency of Transgenic Mice," Methods in Enzymology 225:771-781}. 상기 트랜스 유전자를 함유하는 분획을 수집한 후, Micron-100 필터를 통해 미세원심분리를 한 후, 미세주입 완충액(5mM Tris-HCl, pH 7.4, 5mM NaCl, 0.1mM EDTA)로 5회 세척하였다.
상기 트랜스 유전자를 미세주입 완충액(5mM Tris-HCl, pH 7.4, 5mM NaCl, 0.1mM EDTA)에서 재현탁시켜 1-5ng/ml의 최종 농도로 만든 후, ([C57BL/6J×DBA/2]F1; The Jackson Laboratory) 난자에 미세주입한 후, ICR (Sprague-Dawley) 양육 어미의 난관으로 이동시켰다 {참조: Hogan 등 (1994) Manipulation of the Mouse Embryo, Plainview, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press}. 10일 후, 상기 수득한 동물의 꼬리 일부분을 잘라내어 DNA 분석을 하였다. 폴리머라제 쇄 반응 (PCR)을 통해 형질전환 원조(founder)를 동정하였다 {참조: Lira 등 (1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87:7215-7219}. 마우스의 꼬리 DNA를 증폭시켜, IL-B30 형질전환 마우스를 동정하였다. 내인성 LDL 유전자를 상기 증폭반응 프라이머에 대한 내부 대조군으로서 사용하였다. 상기 프라이머는, IL-B30 트랜스유전자의 200bp 절편 및 LDL 유전자의 397bp 절편을 증폭시킨다. PCR 조건은 다음과 같다: 30 사이클 (95℃, 30초; 60℃, 30초; 72℃, 60초). 형질전환 동물을 무병균 상태에 보관하였다.
IL-B30 형질전환 마우스의 분석
제조원(TEL-TEST, Inc., Friendswood, TX)의 지시사항에 따라, RNA STAT-60을 사용하여 RNA를 조직으로부터 추출하였다. 총 RNA (20mg)를 변성시킨 후, Biotrans 막 (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA)에 블랏팅하였다. 무작위로 표지한 L-30 cDNA (Stratagene, La Jolla, CA)에 하이브리드화시켜, 트랜스 유전자 발현을 평가하였다. 쥐의 헤모펙신 유전자, 쥐의 알파-1-산 당단백질 및 쥐의 헵토글로빈 유전자의 무작위로 표지한 PCR 절편과 총 RNA를 하이브리드화시켜, 급성 간 유전자 발현을 평가하였다.
ELISA 킷트를 구입하여 제조원의 지시에 따라 사용하였다. 쥐의 IL-2 (민감도〈3pg/ml), 쥐의 IL-1b (민감도〈3pg/ml), 쥐의 IFN-감마 (민감도〈2pg/ml) 및 쥐의 TNF-알파 (민감도〈5.1pg/ml)에 대한 ELISA 킷트를 R&D Systems (Minneapolis, MN)에서 구입하였다. 쥐의 IL-6 ELISA 킷트 (민감도〈8pg/ml)는 Biosource International (Camarillo, CA)에서 구입하였다. 쥐의 IL-1알파 ELISA 킷트 (민감도〈6pg/ml)는 Endogen (Cambridge, MA)에서 구입하였다.
혈청 면역글로불린 수준에 대한 ELISA 분석은, PharMingen (San Diego, CA)에서 구입한 항체쌍을 이용하여 제조업자 지시에 따라 수행하였다. 항-마우스 IgM (클론 11/41), 항-마우스 IgA (클론 R5-140), 항-마우스 IgG1 (클론 A85-3), 항-마우스 IgG2a (클론 R11-89) 및 항-마우스 IgG2b (클론 R9-91)를 포획 항체 (capture antibody)로 사용하였다. 정제된 마우스 IgM (클론 G155-228), IgA (클론 M18-254), IgG1 (클론 107.3), IgG2a (클론 G155-178) 및 IgG2b (클론 49.2)를 사용하여, 표준 곡선을 얻었다. 비오틴 항-마우스 IgM (클론 R6-60.2), 비오틴 항-마우스 IgA (클론 R5-140), 비오틴 항-마우스 IgG1 (클론 A85-1), 비오틴 항-마우스 IgG2a (클론 R19-15) 및 비오틴 항-마우스 IgG2b (클론 R12-3)를 검출 항체로 사용하였다.
마우스 혈청내의 IGF-1의 수준은, 혈청 샘플을 산-에탄올로 추출한 이후에, 쥐의 IGF-1 또한 인식하는, 시판되고 있는 사람 IGF-1에 대한 방사선면역분석을 통해 측정되었다 {참조: Nichols Institute, San Juan Capistrano, CA}.
상기 마우스를 죽인 후, 조직을 동결절단하기 위해 동결 배지로 고속 냉동시키거나, 10% 포스페이트-완충된 포르말린내에 침윤시켜 고정시켰다. 포르말린으로 고정시킨 조직은, 통상적으로 하는 바와 같이 5mm로 절취한 후, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 고속 냉동 단편을 면역염색시키기 위해, 아세톤으로 고정시키고 공기 중에서 건조시켰다.
혈액 샘플을 상기 안와하굴(infra-orbital sinus)로부터 수집하여, EDTA (Vacutainer Systems, Becton Dickinson, Rutherford, NJ)가 첨가된 멸균 튜브로 이동시켰다. 자동화 시스템 (Abbot Cell-Dyn 3500, Abbot Park, IL)을 이용하여, 혈액 수치를 측정하였다. 혈소판이 과도하게 엉겨붙거나 큰 혈소판으로 인해 상기 장치가 정확한 혈소판의 수를 계측하지 못하는 경우, 수동으로 혈소판의 수를 계측하였다. 혈액 도말 (blood smear)을, 자동화 염색기 (Bayer Hema-Tek 2000, Elkhart, IN)를 사용하여 Modified Wright-Giemsa 염색 (Hema-Tek Stain Pack, Bayer Corp., Elkhart, IN) 처리하여, 미성숙된 세포 및 혈소판, 적혈구 및 백혈구의 형태를 수동으로 검사하였다.
골수 이식
대퇴골 및 경골에서 근육을 제거하고, PBS로 상기 뼈를 제거하여, 골수를 추출하였다. 골수를 1회 세척한 후에, 치명적인 정도로 방사선 조사 (1000 RAD)한 마우스에 정맥내 주사하였다.
IL-B30 형질전환 마우스의 표현형
IL-B30의 생물학적 기능을 분석하기 위해, 상기 유전자를 형질전환 마우스에서 CMV 인헨서/액틴 프로모터의 통제하에 발현시켰다 {참조: Niwa 등 (1991) Gene 108:193-200} 이러한 인헨서/프로모터 카세트는, 트랜스 유전자가 골근육 및 췌장에서 높은 수준으로 발현되도록 유도하지만, 상기 트랜스 유전자는 실제적으로 모든 기관 및 세포에서 발현될 수 있다 {참조: Lira 등 (1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:7215-7219}.
IL-B30 형질전환 마우스는, 대조군으로서 같은 배에서 태어난 마우스 (littermate)와 비교하여 발육부진했다. IL-B30 형질전환 마우스에 있어서의 체중 증가률은 매우 차이가 컸으나, 상기한 대조군 마우스와 비교하여 분명히 작았다. IL-B30 cDNA에 하이브리드화된 IL-B30 형질전환 마우스 및 상기한 대조군 마우스의 근육 또는 피부에서 추출한 RNA에 대해 노던 블랏 분석을 한 결과, 모든 IL-B30 형질전환 마우스의 근육 및 피부 모두에서 IL-B30 mRNA가 검출된 반면, 대조군의 마우스에서는 IL-B30 mRNA가 검출되지 않았다. 이는, 성장 부진은 IL-B30의 발현과 항상 관련이 있다는 것을 보여주었다.
수득한 IL-B30 형질전환 마우스 중에서, 25%는 성체가 될 때까지 살아남았고, IL-B30 발현에 따른 성장 부진, 복부 팽만, 헝클어진 털, 무생식 및 급사 등의 영향을 받았다. 따라서, IL-B30의 형질전환 발현으로 인해, IL-B30 형질전환 자손의 생성을 억제하는 표현형을 유도하였다. 본원에 기재된 결과는, IL-B30 형질전환 시조 마우스에 대한 예비 분석에서 유래한 것이다.
IL-B30 형질전환 마우스의 조직학적 분석
IL-B30 형질전환 마우스에서 수집한 조직의 현미경 관찰을 통해, 여러 부위(폐, 피부, 식도, 소장 및 간 (담낭관), 대장 및 췌장을 포함)에서 극소 내지 중간 정도의 염증이 발생함을 알 수 있었다. 염증성 침입물질(inflammatory infiltrate)은, 중성구, 림프구 및/또는 대식세포로 이루어져 있었다. 피부에서의 염증은, 소정의 마우스에서는 가시세포증 (acanthosis) 및/또는 궤양과 관련이 있었다. 폐에 있어서는, 말초 기관지의 단핵세포 침입물질이 때때로 두드러졌으며, 폐포벽에는 백혈구 세포수가 증가하였으며, 내피 기도가 과증식되었다. 또한, 간에서, 극소의 문맥 주위의 단핵세포 침입물질은 통상적이었다. 림프절의 피질(cortex)는 때때로 세포가 적었으며, 소포 (follicle) 발생이 되지 않았다.
간, 비장 및 림프절에서 골수외조혈 (EMH)이 관찰되었다. 비장에서 특히 EMH가 두드러졌다. 3마리의 형질전환 마우스 및 1마리의 대조군 마우스에서 채취한 비장에 대해, T세포 (항-CD3), B세포 (항-B220) 및 대식세포 (항-F4/80)에 대한 면역조직 염색을 한 후에 검사하였다. 형질전환 마우스에서, CD3-, B220- 및 F4/80-포지티브 세포가 정상 위치에서 발견되었다. 하지만, 백색 속질(shite pulp)은 적색 속질(red pulp)내의 EMH에 의해 분리되었으며, 적색 펄프내의 포지티브하게 염색된 세포는, 낮은 강도로 염색된 조혈세포와 함께 분산되거나, 상기 다양한 항체와는 포지티브하게 염식하지는 않았다. 이러한 관찰 결과는, IL-B30 형질전환 발현이 EMH-관련 전신 염증을 유도한다는 것을 보여준다.
말초 혈액에서의 백혈구 및 혈소판 계측에 IL-B30가 미치는 영향을 분석하기 위해, 완전한 혈액 분석을 수행하였다. IL-B30 형질전환 마우스의 혈액내의 중성구의 수는, 대조군 마우스에서의 최대 중성구 수에 비해 3배 내지 11배로 증가하였다. 말초 혈액 중성구의 증가는, 염증시 통상적인 것이며, 다양한 조직에서 관찰되는 중성구의 침입과 관련된다. 따라서, 골수계(과립구계)/적혈구계의 비율은 골수에서 증가하였다.
또한, 순환하는 혈소판의 수는, 대조군의 마우스에 비해 IL-B30 형질전환 마우스에서 최대 3배까지 증가하였다. 이렇게 증가된 혈소판의 수는, 거핵세포의 수의 증가 또는 거핵세포에 의한 혈소판의 생성 증가에 기인한 것일 수 있다. 상기한 2가지의 가능성을 테스트하기 위해, IL-B30 형질전환 마우스의 골수 및 비장을 현미경으로 관찰하였다. 말초 혈액내에는, 기이한 형상의 혈소판 (길이가 연장되고 방추 형상의 혈소판을 포함)이 종종 관찰되었다. 어떤 마우스의 골수 및 비장에서는, 세포질의 양이 증가하여 거핵세포의 크기가 증가되었다. 이와 달리, 골수 및 비장에서의 거핵세포의 수는 증가하지 않았다. 이는, IL-B30이 거핵세포의 생성을 가속시킴으로써 혈소판의 수를 증가시킴을 시사한다.
검사한 모든 IL-B30 형질전환 마우스는, 약한 정도에서 중간 정도의 (mild to moderate) 분열적혈구를 가진 소적혈구 저색소증 빈혈 (microcytic hypochromic anemia) 증상을 겪었으며, 재생 정도는 다양하였다. 적혈구 용적율 수치 (hematocrit value)는 대조군의 평균 보다 36 내지 70% 적었다. 소적혈구 저색소증 빈혈 증상을 겪는다는 것은, 헤모글로빈 생성에 결함이 있음을 의미한다.
IL-B30 형질전환 마우스의 사이토카인 프로파일
IL-B30 형질전환 마우스에서 보이는 전신성 염증이 프로-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인과 관련이 있는 지 여부를 테스트하기 위해, 말초 혈액에서 IL-1, TNFα, IL-6 및 IFNγ의 농도를 측정하였다. 테스트한 모든 IL-B30 형질전환 마우스에서, TNFα및 IFNγ의 수준이 증가하였다. 또한, 테스트한 IL-B30 형질전환 마우스 중 25%에서, IL-1의 수준이 증가하였다. IL-B30 형질전환 마우스에서의 IL-1 및 TNFα의 농도는, LPS에 의한 급성 염증반응의 유도와 관련있는 수준까지 증가하였다. 놀랍게도, 염증 조건하에서 IL-6의 발현이 크게 유도되었지만, IL-B30 형질전환 마우스의 말초혈액에서는 IL-6가 검출되지 않았으며 {Reinecker 등 (1993) Clin.Exp.Immunology 94:174-181; Stevens 등 (1992) Dig.Dis.Sci.37:818-826}, IL-1, TNFα및 IFNγ에 의해 직접적으로 유도될 수 있다 {참조: Helle 등 (1988) Eur.J.Immunol.18:957-959}.
IL-B30 형질전환 마우스의 간에서의 급성기 유전자
신체는, 간에서의 정의된 혈장 단백질의 발현이 특징인, 급성기 반응으로 염증에 반응한다. IL-B30 형질전환 마우스는 전신성 염증의 표현형 특성을 보이기 때문에, IL-B30 형질전환 마우스 및 대조군 마우스의 간에서의 급성기 유전자 (acute phase gene)의 발현을 검사하였다. 간의 급성기 유전자인 알파-1-산 당단백질, 헵토글로빈 및 헤모펙신은, 테스트한 모든 IL-B30 형질전환 마우스에서 많이 발현된 반면, 대조군 마우스에서는 전혀 검출되지 않았다. 이는, 간에서의 급성기 유전자는 IL-B30 형질전환 마우스에서 구조적으로(constitutively) 발현됨을 의미한다.
IL-B30 형질전환 마우스의 혈청 면역글로불린
면역 반응동안, 소정의 사이토카인은 B세포의 분화 및 면역글로불린 합성을 유도한다. 면역글로불린 합성이 IL-B30 형질전환 마우스에서 변경되었는 지 여부를 테스트하기 위해, 말초혈액내의 면역글로불린 동형의 농도를 측정하였다. 7마리의 IL-B30 형질전환 마우스 중 2마리에서, 대조군 마우스에 비해 IgA의 농도가 6배 내지 9배까지 증가하였다. 게다가, 테스트한 모든 IL-B30 형질전환 마우스에서, 대조군 마우스에 비해 IgG1, IgG2a 및 IgG2b의 농도는 2.5배 내지 6배 증가하였다. 반면, 시험한 어떠한 IL-B30 형질전환 마우스에서도, IgM 또는 IgE 역가가 크게 증가하지는 않았다. 사실상, 7마리의 IL-B30 형질전환 마우스 중 4마리에서는, IgM 합성이 크게 감소하였다. 요약하면, IL-B30 형질전환 마우스의 서브셋트(subset)는, 면역글로불린 동형 IgA 및 IgB의 농도가 6배 내지 9배 증가하였으나, 면역글로불린 동형 IgM 및 IgE의 농도에서는 큰 증가가 검출되지 않았다.
IL-B30 형질전환 마우스에서의 혈청 IGF-1의 수준
형질전환 동물에서의 만성 염증상태 {참조: Kirschner 및 Sutton (1986) Gastroenterology 91:830-836; Laursen 등 (1995) Arch.Dis.Child.72:494-497} 또는 사이토카인의 과발현 {참조: De Benedetti 등 (1994) J.Clin.Invest.93:2114-2119}은, 인슐린-유사 성장인자-1 (IGF-1)의 감소와 관련된 성장 손상을 유발할 수 있다. 발육이 부진한 IL-B30 형질전환 마우스의 경우에 IGF-1의 수준이 감소되는 지 여부를 테스트하기 위해, IGF-1에 대해 형질전환 마우스의 혈청 샘플을 분석하였다. 테스트한 모든 IL-B30 형질전환 마우스에 있어서, 혈청내의 IGF-1의 양은 나이가 맞는 대조군 마우스에서 발견되는 수준의 12 내지 14%였다. 이는, IL-B30의 형질전환 발현 및 이로 인한 염증반응으로 인해 IL-B30 형질전환 마우스에서 IGF-1이 감소되었으며, 이에 따라 성장 부진 및 무생식의 원인이 될 수 있음을 시사한다 {참조: Gay 등 (1997) Endocrinology 137(7):2937-2947}.
조혈세포에서의 생물학적으로 활성을 가진 IL-B30의 발현
사이토카인은, 면역 시스템을 국지적으로 조절하거나 장기간의 효과를 조절하는, 방출되는 단백질이다. IL-B30가 사이토카인으로서 작용하는 지 여부와 멀리 떨어져 있는 여러 기관에서의 염증 및 급성기 간반응을 유도할 수 있는 지 여부를 테스트하기 위해, IL-B30 형질전환 골수를 방사선으로 조사한 야생형 마우스에 투여하였다.
골수를 투여받은 마우스에 대해, 급성기 반응을 유도하기 위해 매주 모니터링하였다. 골수를 투여받은 후 35일 경과후에 IL-B30 골수를 투여받은 마우스에서 급성기 단백질 SAA의 농도가 증가하였음이 관찰되었으며, SAA의 수준은 시간이 경과함에 따라 증가하였다. 말초혈액내에서의 SAA의 농도가 증가하는 것과 함께, IL-B30 골수를 투여받은 마우스의 건강이 매우 악화되었다 (코 및 목 주위의 피부 염증 및 헝클어진 털을 통해 판단하였음). 반면, 야생형의 골수를 투여받은 마우스의 경우, 혈액내에서의 SAA 수준이 증가하였으나, 아픈 것 같지는 않았다.
동물이 심하게 아파보일 때에는 동물을 살상하였다. IL-B30의 발현은, IL-B30 형질전환 골수를 투여받은 마우스의 골수 및 비장에서 검출될 수 있었으나, 야생형의 골수를 투여받은 마우스의 기관에서는 검출되지 않았다. IL-B30 형질전환 공여 동물의 피부, 폐, 간 및 위장관에서와 마찬가지로, IL-B30 형질전환 골수를 이식받은 동물에서는 염증이 있었으나, 야생형의 골수를 이식받은 동물에서는 그러하지 않았다. 또한, 급성기 간 유전자 (헤모펙신, AGP-1)은 IL-B30 형질전환 골수를 이식받은 동물에서는 많이 발현되었으나, 혈청내에서 IL-6는 검출되지 않았다. 이는, IL-30가 광범위한 특성을 가지는 진정한 사이토카인임을 시사해준다.
IL-B30의 형질전환 발현으로 인해, 형질전환 동물의 발육 부진, 전신성 염증, 무생식 및 치사와 같은 특징을 유도한다. IL-B30 형질전환 동물은, 전신성 염증 및 염증 세포가 폐, 간, 피부 및 소화관내로 침입한다.
생체 내에서의 IL-B30의 과발현은, 성장 부진 및 염증의 표현형을 유도하였으며, 이는, 몇몇 IL-6 형질전환 발현 모델에서 보이던 결과와 매우 유사하다. IL-6의 형질전환 발현의 효과와 유사하게, 재조합 IL-6를 마우스에 투여한 후, IL-B30의 형질전환 발현에서와 같이 중성구 침입 및 빈혈이 관찰되었다. IL-6 형질전환 동물에서와 마찬가지로, IL-B30 형질전환 시조의 성장 부진은, 전신성 염증과 관련되어 있을 수 있는 IGF-1의 수준이 감소되는 것과 관련성이 있다.
이러한 IL-B30 형질전환 동물의 표현형은, IL-B30 과발현의 직접적인 효과로서의 증가된 IL-6 발현, 또는 IL-B30에 의해 중재되는 IL-1 및 TNFα 발현 증가에 의해 유발될 수 있다. IL-1 및 TNFα는 IL-6의 인듀서(inducer)로 알려져 있으며, IL-B30 형질전환 마우스의 말초 혈액에서 IL-1 및 TNFα의 농도가 증가되었음을 관찰하였다.
하지만, IL-B30 형질전환 동물의 혈액에서 IL-6가 발견될 수 없었다는 점은, IL-B30 동물의 표현형이 이러한 새로운 사이토카인의 과발현과 직접적으로 관련되어 있다는 것과, 서열 상동성을 통해 암시되는 바와 같이, IL-B30가 IL-6와 유사한 생물학적 활성을 가지고 있음을 시사해준다.
IL-6는, 여러 다양한 기능 중에서, 혈소판 증가증, 급성기 단백질 합성 및 B 세포 분화를 유도하는 다기능성 사이토카인이다.
사실상, IL-B30 형질전환 동물은, AGP-1, 헵토글로빈, 헤모펙신 및 혈청 아밀로이드 A 단백질과 같이, 급성기 간 유전자를 지속적으로(constitutively) 발현한다. IL-6의 형질전환과 발현의 효과로서, 또는 재조합 IL-6의 투여후, 유사한 표현형이 마우스에서 관찰되었다. 또한, IL-B30의 형질전환 발현으로 인해 혈소판 증가증이 유발되었는 데, 이는 많은 혈소판이 기이한 형상 (외형의 길이증가, 크기의 비대 및/또는 방추 형상)을 한다는 점에서 특이하다. 본 발명자들은, IL-B30 및/또는 기타의 발현증가된 사이토카인이 정상적인 혈소판의 생성에 영향을 끼치는 것으로 생각한다. 이는, IL-B30가 IL-6 및 이와 유사한 물질과 생물학적 활성을 공유하고 있음을 다시 한번 더 시사해준다.
또한, IL-6는 B세포 분화인자로서 알려져 있다. IL-6의 형질전환 과발현은 형질세포종(plasmocytoma)를 유도하며, IL-6-결핍 마우스는 IgG 반응이 감소된다. 몇몇 IL-B30 형질전환 마우스에서 IgG 및 IgA 생산이 증가되었으나, 다른 시조 마우스 (founder)에서의 결과와 일관되지는 않았다. 따라서, IL-B30가 B세포 분화인자로서 가능한 지 여부에 대해서는 추가의 분석이 필요하였다.
IL-B30 형질전환 마우스에서, 순환하는 중성구의 증가는 다양한 조직에서 명백한 염증 발생과 일치하였으나, 적혈구 세포 매개변수의 변화는 쉽게 설명되지 않는다. IL-1, TNFα및 IFN-γ는, 통상적으로 만성질환 빈혈 [ACD; 다양한 만성염증 질환에서 관찰되는, 정상적혈구빈혈, 정상색소빈혈, 비-재생성빈혈 (또는 최소한도의 재생성빈혈)로서 나타남]로 불리는 증상의 중재인자이다. 만성질환 빈혈 (ACD)은, 어떤 사람 환자에서는 소적혈구성 저색소성 빈혈로서 나타날 수도 있다. 이러한 증상은, 철 대사의 변화 및 에리트로포이에틴에 대한 반응 감소에 의한 것이다. IL-B30 마우스에서 관찰되는 소적혈구성 저색소성 빈혈은 ACD에 기인한 것일 수 있는 데, 이는 말초 사이토카인의 농도 증가에 의한 것으로 생각된다. 하지만, 소적혈구성 저색소성 빈혈의 가장 일반적인 이유는 철 결핍이며, 이는 IL-B30 마우스에서 관찰되는 부분적인 골수 반응 (재생) 및 혈소판 증가증과 더욱 일치한다. 마우스로부터 적합한 혈액을 얻는 것이 어려워서, 추가의 조사 (혈청 페리틴 측정, 및 철 결핍 빈혈로 인해 ACD가 발생할 수 있도록 하는 총 철-결합 능력의 측정을 포함)는 이루어지지 않았다.
IL-1 및 TNF-α는 IL-6 발현의 유도인자로 알려져 있으며, 염증 반응동안에 IL-6 발현은 대개 상향조절(upregulation)된다. 따라서, IL-B30 형질전환 마우스의 말초혈액에서는 IL-6가 검출될 수 없었다는 것은 놀라운 사실이다. 이는, 아직까지는 밝혀지지 않은 메카니즘에 의해 IL-B30가 IL-6 발현에 부정적인 효과를 가진다는 것을 시사해준다. 사실상, IL-6는 마우스에서 순환하는 IL-1 및 TNF-α의 농도에 부정적인 효과를 가지기 때문에, IL-B30 형질전환 동물에서 IL-6가 부재한다는 점은, 이러한 동물에서 관찰되는 IL-1 및 TNF-α의 높은 수준을 설명할 수 있다. 또한, IL-B30 형질전환 마우스에서 관찰되는 순환하는 TNFα의 높은 수준은, IFNγ의 농도 증가에 따른 결과일 수 있다. IFNγ는, IL-2-활성화된 T 세포 또는 IL-4-활성화된 B 세포에 의해 생산되며, 단핵세포 및 대식세포에서 TNFα의 발현을 유도한다. IFNγ발현이 IL-B30에 의해 직접적으로 또는 IL-B30에 의해 유도되는 다른 사이토카인에 의해 매개되는 지 여부는 아직 결정되어 있지 못하다. 요약하면, 본 발명자들의 연구 결과는, IL-B30가 IL-6와 다양한 생물학적 활성을 공유하고 있다는 것을 시사해준다. 이러한 생물학적 활성이, IL-6와 공통된 일반적인 수용체, 신호전달 인자 또는 전사인자에 의해 중재되는 지 여부는 앞으로 밝혀질 것이다. 이러한 문제는, 유전자 방법 및 생화학적 방법에 의해 앞으로 계속되는 실험에 의해 밝혀지기를 바란다.
본원의 모든 인용문헌들은, 개개의 간행물 또는 특허 출원서에 특히 기재되어 있으며 전체가 인용되어 있는 것과 동일한 정도로 참조문헌으로 포함되어 있다.
본 발명의 많은 변형체 및 변이체는 본 발명의 범위 및 정신을 벗어남이 없이 제조될 수 있다는 점은 당업자에게 명백할 것이다. 본원의 소정의 양태들은 단지 예시적인 것일 뿐, 본 발명은 하기 특허청구범위 및 이의 균등 범위로만 제한된다.
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<220>
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<222> (64)..(567)
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atg ctg ggg agc aga gct gta atg ctg ctg ttg ctg ctg ccc tgg aca 48
Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr
-20 -15 -10
gct cag ggc aga gct gtg cct ggg ggc agc agc cct gcc tgg act cag 96
Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln
-5 -1 1 5 10
tgc cag cag ctt tca cag aag ctc tgc aca ctg gcc tgg agt gca cat 144
Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His
15 20 25
cca cta gtg gga cac atg gat cta aga gaa gag gga gat gaa gag act 192
Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr
30 35 40
aca aat gat gtt ccc cat atc cag tgt gga gat ggc tgt gac ccc caa 240
Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln
45 50 55
gga ctc agg gac aac agt cag ttc tgc ttg caa agg atc cac cag ggt 288
Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly
60 65 70 75
ctg att ttt tat gag aag ctg cta gga tcg gat att ttc aca ggg gag 336
Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu
80 85 90
cct tct ctg ctc cct gat agc cct gtg gcg cag ctt cat gcc tcc cta 384
Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu
95 100 105
ctg ggc ctc agc caa ctc ctg cag cct gag ggt cac cac tgg gag act 432
Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr
110 115 120
cag cag att cca agc ctc agt ccc agc cag cca tgg cag cgt ctc ctt 480
Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu
125 130 135
ctc cgc ttc aaa atc ctt cgc agc ctc cag gcc ttt gtg gct gta gcc 528
Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala
140 145 150 155
gcc cgg gtc ttt gcc cat gga gca gca acc ctg agt ccc taa 570
Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro
160 165
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<212> PRT
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<223> Description of Unknown Organism: surmised Homo
sapiens
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Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr
-20 -15 -10
Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln
-5 -1 1 5 10
Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His
15 20 25
Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr
30 35 40
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45 50 55
Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly
60 65 70 75
Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu
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Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu
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Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr
110 115 120
Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu
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Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala
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Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro
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<220>
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cgcttagaag tcggactaca gagttagact cagaaccaaa ggaggtggat agggggtcca 60
caggcctggt gcagatcaca gagccagcca gatctgagaa gcagggaaca ag atg ctg 118
Met Leu
-20
gat tgc aga gca gta ata atg cta tgg ctg ttg ccc tgg gtc act cag 166
Asp Cys Arg Ala Val Ile Met Leu Trp Leu Leu Pro Trp Val Thr Gln
-15 -10 -5
ggc ctg gct gtg cct agg agt agc agt cct gac tgg gct cag tgc cag 214
Gly Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp Ala Gln Cys Gln
-1 1 5 10
cag ctc tct cgg aat ctc tgc atg cta gcc tgg aac gca cat gca cca 262
Gln Leu Ser Arg Asn Leu Cys Met Leu Ala Trp Asn Ala His Ala Pro
15 20 25
gcg gga cat atg aat cta cta aga gaa gaa gag gat gaa gag act aaa 310
Ala Gly His Met Asn Leu Leu Arg Glu Glu Glu Asp Glu Glu Thr Lys
30 35 40 45
aat aat gtg ccc cgt atc cag tgt gaa gat ggt tgt gac cca caa gga 358
Asn Asn Val Pro Arg Ile Gln Cys Glu Asp Gly Cys Asp Pro Gln Gly
50 55 60
ctc aag gac aac agc cag ttc tgc ttg caa agg atc cgc caa ggt ctg 406
Leu Lys Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile Arg Gln Gly Leu
65 70 75
gct ttt tat aag cac ctg ctt gac tct gac atc ttc aaa ggg gag cct 454
Ala Phe Tyr Lys His Leu Leu Asp Ser Asp Ile Phe Lys Gly Glu Pro
80 85 90
gct cta ctc cct gat agc ccc atg gag caa ctt cac acc tcc cta cta 502
Ala Leu Leu Pro Asp Ser Pro Met Glu Gln Leu His Thr Ser Leu Leu
95 100 105
gga ctc agc caa ctc ctc cag cca gag gat cac ccc cgg gag acc caa 550
Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Asp His Pro Arg Glu Thr Gln
110 115 120 125
cag atg ccc agc ctg agt tct agt cag cag tgg cag cgc ccc ctt ctc 598
Gln Met Pro Ser Leu Ser Ser Ser Gln Gln Trp Gln Arg Pro Leu Leu
130 135 140
cgt tcc aag atc ctt cga agc ctc cag gcc ttt ttg gcc ata gct gcc 646
Arg Ser Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Leu Ala Ile Ala Ala
145 150 155
cgg gtc ttt gcc cac gga gca gca act ctg act gag ccc tta gtg cca 694
Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu Val Pro
160 165 170
aca gct taaggatgcc caggttccca tggctaccat gataagacta atctatcagc 750
Thr Ala
175
ccagacatct accagttaat taacccatta ggacttgtgc tgttcttgtt tcgtttgttt 810
tgcgtgaagg gcaaggacac cattattaaa gagaaaagaa acaaacccca gagcaggcag 870
ctggctagag aaaggagctg gagaagaaga ataaagtctc gagcccttgg ccttggaagc 930
gggcaagcag ctgcgtggcc tgaggggaag ggggcggtgg catcgagaaa ctgtgagaaa 990
acccagagca tcagaaaaag tgagcccagg ctttggccat tatctgtaag aaaaacaaga 1050
aaaggggaac attatacttt cctgggtggc tcagggaaat gtgcagatgc acagtactcc 1110
agacagcagc tctgtacctg cctgctctgt ccctcagttc taacagaatc tagtcactaa 1170
gaactaacag gactaccaat acgaactgac aaa 1203
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<213> Unknown Organism
<220>
<223> Description of Unknown Organism: surmised Mus sp.
<400> 4
Met Leu Asp Cys Arg Ala Val Ile Met Leu Trp Leu Leu Pro Trp Val
-20 -15 -10
Thr Gln Gly Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp Ala Gln
-5 -1 1 5 10
Cys Gln Gln Leu Ser Arg Asn Leu Cys Met Leu Ala Trp Asn Ala His
15 20 25
Ala Pro Ala Gly His Met Asn Leu Leu Arg Glu Glu Glu Asp Glu Glu
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Thr Lys Asn Asn Val Pro Arg Ile Gln Cys Glu Asp Gly Cys Asp Pro
45 50 55
Gln Gly Leu Lys Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile Arg Gln
60 65 70 75
Gly Leu Ala Phe Tyr Lys His Leu Leu Asp Ser Asp Ile Phe Lys Gly
80 85 90
Glu Pro Ala Leu Leu Pro Asp Ser Pro Met Glu Gln Leu His Thr Ser
95 100 105
Leu Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Asp His Pro Arg Glu
110 115 120
Thr Gln Gln Met Pro Ser Leu Ser Ser Ser Gln Gln Trp Gln Arg Pro
125 130 135
Leu Leu Arg Ser Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Leu Ala Ile
140 145 150 155
Ala Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu
160 165 170
Val Pro Thr Ala
175
<210> 5
<211> 102
<212> PRT
<213> Unknown Organism
<220>
<223> Description of Unknown Organism: surmised Sus sp.
<400> 5
Ser Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly Leu Val Phe Tyr Glu Lys Leu
1 5 10 15
Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser Leu His Pro Asp Gly
20 25 30
Ser Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu Arg Gln Leu Leu
35 40 45
Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Glu Gln Thr Pro Ser Pro Ser
50 55 60
Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu Leu Arg Leu Lys Ile Leu Arg
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala Ala Arg Val Phe Ala His Gly
85 90 95
Ala Ala Thr Leu Ser Gln
100
Claims (50)
- (a) 사람 인터류킨(IL)-12 p40 폴리펩티드(미국 특허 제5,650,492호의 서열 1)을 갖는 폴리펩티드; 및(b) 사람 인터류킨(IL)-B30 폴리펩티드(서열 2의 1번 내지 168번 잔기)를 갖는 폴리펩티드가 서로 직접 결합되어 있는 복합체.
- 제1항에 따른 복합체를 포함하며,(a) 물, 염수 및 완충액을 포함하는 수성 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 담체를 추가로 포함하거나;(b) 경구 투여, 직장 투여, 비강 투여, 국소 투여 및 비경구 투여로 이루어진 그룹 중에서 선택된 투여용으로 제형화되거나; 또는(c) 멸균된, 염증 치료용 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 폴리펩티드 중 하나 또는 둘다가(a) 검출가능하게 표지되거나;(b) 재조합 방법으로 생성되거나;(c) 글리코실화(glycosylation)되지 않거나;(d) 고형 기질에 부착되거나; 또는(e) 다른 화합물 잔기에 접합된 복합체.
- 제1항에 따른 복합체를 포함하며,(a) IL-18;(b) IL-12;(c) 방사선 또는 화학치료요법에 대한 치료제;(d) 면역 보조제; 및(e) 항-바이러스 치료제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 제제를 추가로 포함하는, 자가면역 질환 또는 만성 염증 치료용 약제학적 조성물.
- (a) 사람 IL-12 p40 폴리펩티드(미국 특허 제5,650,492호의 서열 1)를 갖는 폴리펩티드; 및(b) 사람 IL-B30 폴리펩티드(서열 2의 1번 내지 168번 잔기)를 갖는 폴리펩티드가 서로 직접 결합되어 있는 복합체를 암호화하는 재조합 핵산.
- 제5항에 있어서,(a) 발현 벡터이거나;(b) 복제 시발점(origin)을 추가로 포함하거나;(c) 검출가능한 표지를 포함하거나; 또는(d) 합성 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 핵산.
- 제6항에 따른 재조합 핵산을 포함하는 세포.
- 제7항에 있어서,(a) 원핵 세포;(b) 진핵 세포;(c) 세균 세포;(d) 효모 세포;(e) 곤충 세포;(f) 포유류 세포;(g) 마우스 세포;(h) 영장류 세포 및(i) 사람 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세포.
- 삭제
- 제1항에 따른 복합체에 대한 항체, 또는 이의 Fv, Fab 또는 Fab2 단편.
- 제10항에 따른 항체 또는 이의 Fv, Fab 또는 Fab2 단편을 포함하고,(a) 종양괴사인자(TNF)α 항체;(b) IL-12 항체;(c) IL-10; 및(d) 스테로이드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 제제를 추가로 포함하는 조성물.
- 제10항에 있어서, 방사활성 또는 형광성 표지를 포함하는, 검출가능하게 표지된 항체 또는 이의 Fv, Fab 또는 Fab2 단편.
- 제1항에 따른 복합체를 제10항에 따른 항체 또는 이의 Fv, Fab 또는 Fab2 단편과 접촉시켜 항원:항체 복합체를 형성시킴을 포함하는, 항원:항체 복합체의 제조 방법.
- 제13항에 있어서,(a) 상기 접촉이 상기 항원의 적량적 검출을 허용하거나; 또는(b) 상기 접촉이 상기 항체 또는 이의 Fv, Fab 또는 Fab2 단편의 적량적 검출을 허용하는 방법.
- 제10항에 따른 항체 또는 이의 Fv, Fab 또는 Fab2 단편을,(a) 물, 염수 및 완충액을 포함하는 수성 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되거나; 또는(b) 경구 투여, 직장 투여, 비강 투여, 국소 투여 또는 비경구 투여로 이루어진 그룹 중에서 선택된 투여용으로 제형화된 담체속에 포함하는, 자가면역 질환 또는 만성 염증 치료용 약제학적 조성물.
- 제1항에 따른 복합체를 포함하는, 종양, 바이러스 질병 또는 알레르기 치료용 약제학적 조성물.
- 제1항에 따른 복합체를 포함하는, 보조제(adjuvant)로서 사용하기 위한 약제학적 조성물.
- 제16항에 있어서,(a) IL-18;(b) IL-12;(c) 방사선 치료요법 또는 화학치료요법;(d) 면역 보조제; 및(e) 항-바이러스 치료요법으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 제제와 배합된, 자가면역 질환 또는 만성 염증 치료용 약제학적 조성물.
- 사람 IL-12 p40 폴리펩티드(미국 특허 제5,650,492호의 서열 1)를 암호화하는 발현 작제물로 IL-B30 폴리펩티드(서열 2의 1번 내지 168번 잔기)를 발현하는 세포를 형질감염시킴을 포함하여, 당해 IL-B30 폴리펩티드의 분비를 증가시키는 방법.
- IL-B30 폴리펩티드(서열 2의 1번 내지 168번 잔기)를 암호화하는 발현 작제물로 사람 IL-12 p40 폴리펩티드(미국 특허 제5,650,492호의 서열 1)를 발현하는 세포를 형질감염시킴을 포함하여, 당해 사람 IL-12 p40 폴리펩티드의 분비를 증가시키는 방법.
- 제1항에 따른 복합체를, 당해 복합체에 결합하는 수용체를 발현하는 세포와 당해 복합체가 수용체에 결합하도록 하는 조건하에서 접촉시켜 검출가능한 상호작용을 형성시킴을 포함하여, 제1항에 따른 복합체에 결합하는 수용체를 스크리닝하는 방법.
- 제1항에 따른 복합체를 포함하는, 염증 반응 치료용 약제학적 조성물.
- 제22항에 있어서, 상기 염증 반응이 급성상 염증 반응인 약제학적 조성물.
- 제22항에 있어서, 염증 반응이 피부 조직; 폐 조직; 위장 조직 및 간 조직으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 조직에서 발견되는, 약제학적 조성물.
- 제10항에 따른 항체 또는 이의 Fv, Fab 또는 Fab2 단편을 포함하는, 자가면역 질환 또는 만성 염증 상태 치료용 약제학적 조성물.
- 제25항에 있어서, 자가면역 질환이 다발성 경화증인, 약제학적 조성물.
- 제25항에 있어서, 자가면역 질환이 건선인, 약제학적 조성물.
- 제25항에 있어서, 만성 염증 상태가 류마티스 관절염인, 약제학적 조성물.
- 제25항에 있어서, 만성 염증 상태가 염증성 장 질환인, 약제학적 조성물.
- 제10항에 따른 항체 또는 이의 Fv, Fab 또는 Fab2 단편을 포함하는, 급성상 염증 반응 치료용 약제학적 조성물.
- 제30항에 있어서, 급성상 염증 반응이 피부 조직; 폐 조직; 위장 조직 및 간 조직으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 조직에서 발견되는, 약제학적 조성물.
- 제30항에 있어서, 염증 반응이 천식인, 약제학적 조성물.
- 제30항에 있어서, 염증 반응이 섬유증인, 약제학적 조성물.
- 제30항에 있어서, 염증 반응이 당뇨병인, 약제학적 조성물.
- 제30항에 있어서, 염증 반응이 장 염증인, 약제학적 조성물.
- 삭제
- N-말단으로부터 C-말단까지,(a) 사람 IL-12 p40 폴리펩티드(미국 특허 제5,650,492호의 서열 1);(b) 링커; 및(c) IL-B30 폴리펩티드(서열 2의 1번 내지 168번 잔기)를 갖는 융합 단백질을 포함하는 조성물.
- N-말단으로부터 C-말단까지,(a) 사람 IL-12 p40 폴리펩티드(미국 특허 제5,650,492호의 서열 1);(b) 링커; 및(c) 사람 IL-B30 폴리펩티드(서열 2의 1번 내지 168번 잔기)를 갖는 융합 단백질을 암호화하는 재조합 핵산.
- a. (i) IL-12 p40 소단위(미국 특허 제5,650,492호의 서열 1)로부터의 11번 내지 306번의 연속된 아미노산을 갖는 폴리펩티드와 IL-B30 소단위(서열 2의 1번 내지 168번 잔기)로부터의 11번 내지 168번의 연속된 아미노산을 갖는 폴리펩티드가 서로 직접 결합되어 있는 복합체; 또는(ii) 상기 IL-12 p40 소단위로부터의 11번 내지 306번의 연속된 아미노산 및 상기 IL-B30 소단위로부터의 11번 내지 168번의 연속된 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 갖는 융합 단백질에 대한 결합 화합물을 생성시키는 단계; 및b. 상기 결합 화합물이 IL-B30/IL-12 p40 착물에 결합하는지를 확인하는 단계를 포함하여, IL-B30 소단위(서열 2의 1번 내지 168번 잔기) 및 IL-12 p40 소단위(미국 특허 제5,650,492호의 서열 1)를 갖는 복합체에 특이적으로 결합하는 결합 화합물을 제조하는 방법.
- 제39항에 있어서, 결합 화합물이 항체 또는 이의 Fv, Fab 또는 Fab2 단편인 방법.
- 제40항에 있어서, 항체 또는 이의 Fv, Fab 또는 Fab2 단편이 IL-B30 및 IL-12 p40 소단위 단독에는 결합하지 않는 방법.
- 제10항에 있어서, 사람 IL-12 p40 폴리펩티드 또는 IL-B30 폴리펩티드 단독에는 결합하지 않는 항체, 또는 이의 Fv, Fab 또는 Fab2 단편.
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