JP2003510038A - 哺乳動物インターロイキン−12p40およびインターロイキンb30、その組成物、抗体、薬学的組成物における使用 - Google Patents
哺乳動物インターロイキン−12p40およびインターロイキンb30、その組成物、抗体、薬学的組成物における使用Info
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Abstract
Description
理学を制御することにおいて機能するタンパク質に関連する、組成物および方法
に関する。特に、本発明は、例えば、種々の細胞型(造血系細胞を含む)の、活
性化、発生、分化および機能を調節するのに有用な、精製された遺伝子、タンパ
ク質、抗体、関連試薬、および方法を提供する。
主への導入を介して、その後のプロセシングのためにベクター中に組み込み、そ
れによって移入された遺伝情報が、新規な環境においてコピーおよび/または発
現される、技術をいう。一般に、遺伝情報は、所望のタンパク質産物をコードす
るメッセンジャーRNA(mRNA)に由来する相補的DNA(cDNA)の形
態において存在する。キャリアは、しばしば、宿主において後の複製のためにc
DNAを組み込む能力、および、いくつかの場合において、cDNAの発現を実
際に制御し、それによって宿主においてコードされる産物の合成を指向する能力
を有するプラスミドである。
、一連の複雑な細胞相互作用に基づくことが知られている。例えば、Paul(
1998)Fundamental Immunology(第4版)Rave
n Press,NYを参照のこと。近年の研究は、このネットワークの内部作
用についての新たな洞察を提供した。この応答の多くが、実際、リンパ球、マク
ロファージ、顆粒球、および他の細胞のネットワーク様の相互作用を中心に動く
ことは明らかなままであるが、免疫学者らは、現在、一般に、リンホカイン、サ
イトカイン、またはモノカインとして知られる可溶性タンパク質が、これらの細
胞相互作用の制御において重要な役割を果たすという意見を主張する。従って、
細胞調節因子の単離、特徴付け、および作用機構にかなりの興味があり、これら
を理解することは、多数の医学的異常(例えば、免疫系障害)の診断および治療
において重大な進歩を導く。これらの因子のいくつかは、造血系増殖因子である
(例えば、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF))。例えば、Thompso
n(編、1998)The Cytokine Handbook(第3版)A
cademic Press ,San Diego;Mire−Sluis
and Thorpe,(編、1998)Cytokine Academic
Press,San Diego;MetcalfおよびNicola(19
95)The Hematopoietic Colony Stimulat
ing Factors Cambridge University Pre
ss;ならびにAggarwalおよびGutterman(1991)Hum
an Cytokines Blackwell Pubを参照のこと。この免
疫系の細胞によるサイトカイン発現が、免疫応答の調節に重要な役割を果たす。
ほとんどのサイトカインは、多面発現性であり、そして複数の生物学的活性(抗
原提示;活性化;CD4+T細胞サブセットの増殖および分化;B細胞による抗
体応答;ならびに過敏症の症状の発現を含む)を有する。さらに、サイトカイン
は、免疫系および/または造血細胞に、直接または間接的に関わる変性状態また
は異常状態の広範な診断および治療において使用され得る。
は、多能性の造血肝細胞の増殖、成長、および/または、複雑な免疫系を構成す
る多様な細胞系譜を含む膨大な数の子孫への、分化を支持することを示した。細
胞成分の間の適切なおよび釣合いのとれた相互作用は、健常な免疫応答のために
必要である。異なる細胞系譜は、リンホカインが、他の薬剤と組合わせて投与さ
れる場合、しばしば、異なる様式において応答する。
細胞(これは免疫グロブリン(外来物質を認識し、そして結合してその除去を達
成する能力を有するタンパク質)を生成および分泌し得る)、ならびに種々のサ
ブセットのT細胞(これは、リンホカインを分泌し、そしてB細胞および免疫ネ
ットワークを構成する種々の他の細胞(他のT細胞を含む)を誘導または抑制す
る)。これらのリンパ球は、他の多くの細胞型と相互作用する。
に関連する)の発見および開発は、免疫系および/または造血細胞に、直接また
は間接的に関わる変性状態または異常状態の広い範囲の新しい治療に貢献する。
特に、公知のリンホカインの有益な活性を増強または強化するリンホカインの発
見および開発が、非常に有利である。元々、新規の遺伝子IL−B30が、その
予期される構造に基づく潜在的なサイトカインとして同定され、そしてIL−6
およびG−CSFのような長鎖サイトカインとして分類された(国際特許出願P
CT/US98/15423(WO99/05280))。IL−6ならびにオ
ンコスタチンM、白血病阻害因子(LIF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)
およびカルディオトロフィン−1のような関連するサイトカインが、造血、血小
板新生、急性期応答の誘導、破骨細胞形成、ニューロン分化および生存、ならび
に心臓肥大に関する生物学的活性を有する。マウスにおけるIL−B30のトラ
ンスジェニック発現が、マウスにおけるIL−6の過剰発現後に観察されるのと
類似の表現型(倭小、全身性炎症、不妊および死を含む)を誘導した。IL−B
30が、炎症に関わる新規のサイトカインであるようである。
タンパク質といわれる)の生理学的役割、ならびに免疫応答における役割、の発
見に基づく。特に、IL−B30の役割は、炎症、感染性疾患、造血の発達、お
よびウイルス感染に関係する経路において、説明されている。本発明は、特に、
インターロイキン−B30(IL−B30)とのIL−12 p40サブユニト
の組み合わせを含む組成物およびそれらの生物学的活性に関する。これは、ポリ
ペプチドまたは融合タンパク質の両方の核酸コードならびにそれらの産生および
使用の方法を含む。本発明の核酸は、部分的に、本明細書中に開示される相補的
DNA(cDNA)配列に対する相同性により、および/または機能的アッセイ
により特徴付けられる。また、ポリペプチド、抗体、およびそれらの使用の方法
(核酸発現方法を使用することを含む)も提供される。増殖因子依存性生理学ま
たは免疫応答の制御における調節または干渉の方法が、提供される。
B30サイトカイン(以前に、例えば、USSN 08/900,905および
09/122,443において記載される)ともまた関連する発見に、部分的に
基づく。従って、2つのポリペプチドと一緒の同時発現が、機能的レセプター結
合およびシグナリングを生じる。
くとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグメントを含む、実質的に純粋なポ
リペプチドおよびIL−B30由来の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別
個のセグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドの両方;b)IL−12
p40由来の少なくとも11連続するアミノ酸を含む、実質的に純粋なポリペプ
チド;およびIL−B30由来の少なくとも11連続するアミノ酸を含む、実質
的に純粋なポリペプチドの両方;c)以下の両方を含む実質的に純粋なポリペプ
チド:IL−12 p40の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグ
メント;およびIL−B30の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセ
グメント;またはd)以下の両方を含む実質的に純粋なポリペプチド:IL−1
2 p40の少なくとも11連続するアミノ酸のセグメントおよびIL−B30
の少なくとも11連続するアミノ酸のセグメント。種々の実施形態としては、以
下のような組成物が挙げられる:a)ここで記載される少なくとも7連続するア
ミノ酸の複数の別個のセグメントが、少なくとも9連続するアミノ酸の1つのセ
グメントを含むか;b)ここで、記載される少なくとも7連続するアミノ酸の複
数の別個のセグメントが、少なくとも9連続するアミノ酸の両方であるか;c)
ここで、記載されるIL−12 p40の少なくとも11連続するアミノ酸のセ
グメントが、少なくとも15連続するアミノ酸であるか;d)ここで、記載され
るIL−B30の少なくとも11連続するアミノ酸のセグメントが、少なくとも
15連続するアミノ酸であるか;e)水、生理食塩水、および/または緩衝液を
含む水性化合物より選択されるキャリアをさらに含むか;f)経口投与、直腸投
与、経鼻投与、局所投与、または非経口投与で処方されるか;あるいはg)これ
は、滅菌した組成物である、組成物。他の実施形態は、以下を含む:a)ここで
、少なくとも1つの前記ポリペプチドが以下であるか:i)検出可能に標識され
るか;ii)組換え的に産生されるか;iii)グリコシル化されていないか;
iv)変性されるか;v)固体物質に結合されるか;またはvi)別の化学的部
分に結合体化される;b)実質的に純粋なIL−12 p40ポリペプチドおよ
び実質的に純粋なIL−B30ポリペプチドの両方を含むか;c)IL−B30
に融合されたIL−12 p40を含む、実質的に純粋なポリペプチドを含むか
;あるいはd)IL−18、IL−12、放射線療法もしくは化学療法、免疫ア
ジュバント、または抗ウイルス性と組み合わされる。キットの実施形態としては
、記載されるキット中に、記載される組成物およびa)記載されるポリペプチド
を含む区画;またはb)試薬の使用もしくは処分についての説明書、を含むもの
が挙げられる。
酸を含む:a)IL−12 p40由来の少なくとも7連続するアミノ酸の複数
の別個のセグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチド;およびii)IL−
B30由来の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグメントを含む、
実質的に純粋なポリペプチド、の両方;b)IL−12 p40由来の少なくと
も11連続するアミノ酸を含む、実質的に純粋なポリペプチド;およびIL−B
30由来の少なくとも11連続するアミノ酸を含む、実質的に純粋なポリペプチ
ド、の両方;c)以下の両方を含む実質的に純粋なポリペプチド:IL−12
p40の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグメント;およびIL
−B30の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグメント;またはd
)以下の両方を含む実質的に純粋なポリペプチド:IL−12 p40の少なく
とも11連続するアミノ酸のセグメントおよびIL−B30の少なくとも11連
続するアミノ酸のセグメント。種々の実施形態としては以下のような核酸を含む
:a)ここで、前記少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグメントが
、少なくとも9連続するアミノ酸の1つのセグメントを含むか;b)ここで、前
記少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグメントが、少なくとも9連
続するアミノ酸の両方であるか;c)ここで、前記IL−12 p40の少なく
とも11連続するアミノ酸のセグメントが、少なくとも15連続するアミノ酸で
あるか;d)ここで、前記IL−B30の少なくとも11連続するアミノ酸のセ
グメントが、少なくとも15連続するアミノ酸であるか;e)ここで記載される
IL−12 p40が霊長類由来であるか;f)記載されるIL−B30が霊長
類由来であるか;g)発現ベクターであるか;h)複製起点をさらに含むか;i
)検出可能な標識を含むか;j)合成ヌクレオチド配列を含むか;k)6kb未
満、好ましくは3kb未満であるか;またはl)霊長類由来である、核酸。また
、記載される組換え核酸を含む細胞が提供され、これは以下が挙げられ、ここで
、記載される細胞は、原核生物細胞、真核生物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫
細胞、哺乳動物細胞、マウス細胞、霊長類細胞、またはヒト細胞である、細胞。
キットの実施形態としては、以下を含む実施形態が挙げられる:記載される核酸
および以下:a)記載される核酸を含む区画;b)記載される霊長類IL−12
p40ポリペプチドをさらに含む区画;c)霊長類IL−B30ポリペプチド
をさらに含む区画;またはd)キット中の試薬の使用もしくは処理についての説
明書、を含む、キット。
に、50℃で30分間および1M未満の塩の洗浄条件下で;ならびにb)霊長類
IL−B30の天然の成熟コード部分に、50℃で30分間および1M未満の塩
の洗浄条件下で、ハイブリダイズする、核酸を提供する。種々の実施形態として
は、以下のように記載される核酸が挙げられる:a)IL−12 p40につい
ての記載される洗浄条件が、60℃および400mM未満の塩である;b)IL
−B30についての記載される洗浄条件が、60℃および400mM未満の塩で
ある;c)記載される核酸が、霊長類IL−12 p40をコードする配列に、
少なくとも50ヌクレオチドのストレッチを超える同一性を示す;ならびに/ま
たはd)記載される核酸が、霊長類IL−B30をコードする配列に、少なくと
も50ヌクレオチドのストレッチを超える同一性を示す、核酸。好ましいい実施
形態としては、以下のような核酸が挙げられる:a)IL−12 p40につい
ての記載される洗浄条件が、60℃および400mM未満の塩である;b)IL
−B30についての記載される洗浄条件が、60℃および400mM未満の塩で
ある;c)記載される核酸が、霊長類IL−12 p40をコードする配列に、
少なくとも50ヌクレオチドのストレッチを超える同一性を示す;ならびに/ま
たはd)記載される核酸が、霊長類IL−B30をコードする配列に、少なくと
も50ヌクレオチドのストレッチを超える同一性を示す、核酸。
えば、TNFαアンタゴニスト、IL−12アンタゴニスト、IL−10、また
はステロイド、と組み合わされる。
この抗体は、特異的にIL−12 p40/IL−B30組成物に結合し;IL
−12 p40ポリペプチドまたはIL−B30ポリペプチドのいずれにも結合
せず、記載される組成物は、a)実質的に純粋なIL−12 p40ポリペプチ
ドおよび実質的に純粋なIL−B30ポリペプチド両方を含む、実質的に純粋な
ポリペプチドを含むか、またはb)IL−B30に融合されたIL−12 p4
0を含む、実質的に純粋なポリペプチド、を含む。他の結合化合物としては、以
下のような結合化合物を含む:a)記載される結合化合物が容器中であるか;b
)記載される結合化合物がFv、Fab、もしくはFab2フラグメントである
か;c)記載される結合化合物が別の化学的部分に結合体化されるか;またはd
)記載される抗体が以下:i)IL−12 p40/IL−B30組成物に対し
て惹起されるか;ii)免疫選択されるか;iii)ポリクローナル抗体である
か;iv)抗原に対して少なくとも30mMのKdを示すか;v)ビーズまたは
プラスチック膜を含む固体物質に付着されるか;vi)滅菌した組成物中である
か;もしくはvii)放射活性標識または蛍光標識を含む、検出可能に標識され
るかである、結合化合物。特定の好ましい形態としては、以下を含む組成物が挙
げられる:a)記載されるのような、滅菌した結合化合物;あるいはb)記載さ
れるの結合化合物およびキャリアであって、ここで記載されるキャリアは:i)
水、生理食塩水、および/もしくは緩衝液を含む水性化合物である;ならびに/
またはii)経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与、または非経口投与で処
方される、組成物。さらに、キットの実施形態が提供され、これは、記載される
結合化合物および:a)記載される結合化合物を含む区画;またはb)記載され
るキット中の試薬の使用または処分についての説明書、を含む。
法は、適切な条件下で霊長類IL−12 p40/IL−B30組成物を記載さ
れる結合化合物と接触させ、これによって記載される複合体を形成させる工程を
包含する。種々の方法としては、以下を含む:a)記載される複合体が、他のサ
イトカインから精製されるか;b)記載される複合体が、他の抗体から精製され
るか;c)記載される接触工程が、サイトカインを含むサンプルと行われるか;
d)記載される接触工程が、記載される抗原の定量的検出を可能にするか;e)
記載される接触工程が、記載される抗体を含むサンプルと行われるか;またはf
)記載される接触工程が、記載される抗体の定量的検出を可能にする、方法。
ンタゴニストと接触させる工程を包含する、記載される細胞または組織の生理学
または発達を調節する、方法を提供する。1つの好ましい方法は、IL−12
p40/IL−B30組成物と細胞を接触させる工程を包含し、そして記載され
る接触工程がIFNγの産生における増加を生じる、記載される細胞の生理学ま
たは発達を調節する。代表的には、記載される細胞は、宿主生物体にあって、そ
して記載される生物体は増強されたTh1応答(例えば、抗腫瘍効果;アジュバ
ント効果;抗ウイルス性効果;または拮抗するアレルギー効果、より選択される
応答)を示す。しばしば、この接触工程は、IL−18;IL−12;放射線療
法または化学療法;免疫アジュバント;または抗ウイルス性治療、と組み合わせ
られる。
ブユニットβ1に対する抗体である。従って、本発明はまた、記載されるような
方法を包含し、ここで記載される接触工程は、アンタゴニストと行われ、そして
記載される接触工程がIFNγの産生における相対的減少を生じる。従って、本
発明は、宿主生物体中の細胞の生理学あるいは発達を調節する方法を提供し、記
載される方法は、記載されるアンタゴニストを記載される生物体に投与する工程
を包含し、ここで、記載される接触工程は、自己免疫状態;または慢性炎症状態
、の回復を生じる。
せる方法(このような方法は、IL−12 p40を含む記載されるIL−B3
0を発現する工程を包含する);またはb)霊長類IL−12 p40の分泌を
増加させる方法(このような方法は、IL−B30を含む記載されるIL−12
p40を発現する工程を包含する)を提供する。好ましくは、a)記載される
増加が少なくとも3倍であるか;またはb)記載される発現する工程が、IL−
B30およびIL−12 p40をコードする組換え核酸を発現する工程である
かのいずれかである。
ついてスクリーニングする方法が提供され、記載される方法は、例えば、複合体
が記載されるレセプターに結合し得る条件下で、記載されるレセプターを発現す
る細胞に記載される複合体を接触させ、それにより検出可能な相互作用を形成さ
せる工程を包含する。好ましくは、記載される相互作用が、記載される細胞中に
生理学的応答を生じる。
し、記載される方法は、治療的量の、哺乳動物IL−B30タンパク質のアゴニ
スト;または哺乳動物IL−B30タンパク質のアンタゴニストと、この動物に
おける単球/マクロファージ系統細胞を接触されることを包含する。好ましい実
施形態としては、以下が挙がられる:哺乳動物IL−B30タンパク質が霊長類
タンパク質である;および/またはアンタゴニストが記載される哺乳動物IL−
B30に結合する抗体である、方法。特定の実施形態は、以下が挙げられる:記
載される単球/マクロファージ系統細胞としては、小グリア細胞または樹状細胞
が挙げられるか、または記載される動物は、炎症、白血球増殖、神経変性、また
は外傷後状態の兆候または症状を示す。好ましい実施形態としては、以下が挙げ
られ、記載される兆候または症状は、肺組織;肝臓組織;神経組織;リンパ性組
織;骨髄性組織;膵臓;胃腸組織;甲状腺組織;筋肉組織;あるいは皮膚組織ま
たはコラーゲン組織である。
がアゴニストである場合を含む。好ましくは、このアゴニストは、哺乳動物のI
L−B30である。
自己免疫;慢性関節リウマチ;変形性関節炎;アテローム硬化症;多発性硬化症
;脈管炎;遅延型過敏症;皮膚移植;移植;脊髄損傷;発作(stroke);
神経変性;感染疾患;虚血;癌;腫瘍;多発性骨髄腫;キャッスルマン病;閉経
後の骨粗鬆症またはIL−6関連疾患の徴候または症状を経験している場合を含
む。この投与は、抗炎症性サイトカインアゴニストまたはアンタゴニスト;鎮痛
薬;抗炎症剤;またはステロイドと組み合わされ得る。
投与がアンタゴニストである場合に提供される。好ましくは、アンタゴニストは
、哺乳動物のIL−B30に結合する抗体;またはIL−B30レセプターに対
する結合において哺乳動物IL−B30と競合する、哺乳動物IL−B30のム
テインであるが、実質的にシグナル伝達しない。種々の実施形態において、この
方法は、動物が創傷治癒または血餅形成の徴候または症状を経験している場合に
適用される。この投与は、しばしば、脈管形成因子;増殖因子(FGFまたはP
DGFを含む);抗生物質;または凝固因子と組み合わされ得る。
よって記憶T細胞の増殖を誘導する方法を提供する。
願が具体的にかつ個々に参考として援用されることを示したのと同程度まで、本
明細書中に参考として援用される。
ルを媒介し得る分泌分子)を作製するための哺乳動物タンパク質の対形成の記載
および教示を提供する。例えば、Paul(1998)Fundamental
Immunology(第4版)Raven Press,N.Y.を参照の
こと。特定の可溶性因子は、ヘテロダイマーポリペプチド(例えば、IL−6お
よびIL−12)から作製される。このダイマー形態(これは、生理学的形態で
あるようである)およびフラグメント、またはアンタゴニストは、例えば、レセ
プターを発現する細胞の生理学的調節において有用である。p40/IL−B3
0複合体を含む機能的サイトカインは、造血細胞(例えば、T細胞、B細胞、ナ
チュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、樹状細胞、造血前駆体などのよ
うなリンパ球を含む)に対して刺激効果または阻害効果のいずれかを有するよう
である。このタンパク質はまた、タンパク質上の種々のエピトープ(直鎖状エピ
トープまたは立体配置的エピトープの両方)に対する抗体を惹起するための抗原
(例えば、免疫原)として有用である。
、米国特許第5547852号;ScottおよびTrinchieri、米国
特許第5571515号;Gatelyら、米国特許第5650492号;Li
esehkeおよびMulligan、米国特許第5891680号;Warn
eら、米国特許第5744132号;および登録番号gbM86671、gbA
F133197、gbU16674、gbU83184、embY07762、
embY11129.1、gbM65272、gbAF007576、gbU1
9841、gbU11815、gbU57752、gbAF004024、gb
U49100、gbU19834、およびembX97019を参照のこと。I
L−B30をコードする配列は、ヒトゲノム配列から同定された。この分子は、
huIL−B30と指定された。齧歯類配列(例えば、マウス由来)もまた記載
された。例えば、USSN08/900,905号および同第09/122,4
43号を参照のこと。本発明は、これらの2つのポリペプチド(例えば、p40
およびIL−B30)の組み合わせを含む組成物および両方の配列をコードする
核酸構築物を含む。この組み合わせを認識する抗体もまた提供され、そしてこの
2つのメッセージまたはポリペプチドを例えば、共同して生成する方法もまた提
供される。
様タンパク質をコードする。psortで推定されたシグナル配列は、おそらく
約17残基であり、そしてMetからAlaあたりにわたる。表1ならびに配列
番号1および配列番号2を参照のこと。IL−B30は、長鎖サイトカインのメ
ンバーの構造モチーフ特性を示す。例えば、IL−B30、G−CSF、および
IL−6(GenBankから入手可能な配列)を比較のこと。USSN08/
900,905および同第09/122,443号もまた参照のこと。
の分子の関連した機能を示唆する。しかし、IL−12 p40ポリペプチドと
IL−B30ポリペプチドとの会合の認識は、活性p40/IL−B30ダイマ
ーの生物学的アッセイを可能にする。IL−12 p40/IL−B30組成物
は、個々のポリペプチドの各々を示す異なるポリペプチド、またはIL−12
p40とIL−B30との融合構築物のどちらかから作製され得る。観察により
、このダイマーが、種々の細胞型(例えば、PBMC)によるインターフェロン
−γ(IFN−γ)生成を誘導し得、このことは、ダイマーが用いられる生物学
的機能を示唆する。さらに、実験により、IL−12レセプターβ1サブユニッ
トがp40/IL−B30ダイマーについてのレセプターの成分であることが示
される。
化する。これはまた、クラスIおよびクラスIIのMHC分子発現を調節し(単
球/マクロファージおよび樹状細胞上でのクラスII分子のアップレギュレーシ
ョンを含む)、そして上皮細胞、内皮細胞、および他の細胞(これらの細胞に抗
原提示させ得る)上での発現を誘導する。このサイトカインは、Th1様CD4
+ T細胞の発生を促進するが、Th2様T細胞の発生を阻害するTh1様サイ
トカインである。これは、Bリンパ球によるIL−4誘導性IgEおよびIgG
4合成の強力かつ比較的特異的なインヒビターであるが、より高い濃度では、全
ての抗体アイソタイプの生成を非特異的に阻害する。IFNγは、細胞内生物な
らびにNK細胞およびCTLにより媒介される腫瘍に対する細胞障害性得免疫応
答を増大させる。IL−12のように、IFNγは、細胞媒介性細胞障害性応答
を促進する傾向を有する一方で、アレルギー性炎症およびIgE合成を阻害する
。例えば、Karupiah(1997編)Gamma Interferon
in Antiviral Defense Chapman&Hall;J
affe(1992編)Anti−infective Applicatio
ns of Interferon−Gamma Marcel Dekker
(ISBN:0824786882);Sutterwalaら(1999)J
.Leukoc.Biol.65:543−551;Billiauら(199
8)Ann.NY Acad.Sci.856:22−32;およびGessa
niら(1998)Cytokine Growth Factor Rev.
9:117−123。
トまたはレセプターアンタゴニスト(例えば、これらは、それらそれぞれのレセ
プターに対するIL−6もしくはIL−12結合または反対の作用の媒介をブロ
ックする)として作用し得る。従って、IL−B30またはそのアンタゴニスト
は、異常な医学的状態(例えば、T細胞免疫欠損、慢性炎症、または組織拒絶の
ような免疫障害を含む)の処置において、または心血管状態または神経生理学的
状態において有用であり得る。アゴニストは、細胞媒介性免疫を増強する治療的
状況において(例えば、抗腫瘍、アジュバント、および抗ウイルス状況において
)またはアレルギー性応答を拮抗するために使用されるようである。アンタゴニ
ストは、このような増強された免疫をブロックする状況において(例えば、自己
免疫疾患または慢性炎症状態に対する細胞の寄与において)使用されるようであ
る。
の生化学的応答を媒介し得る。好ましい実施形態は、ヒト由来であるが、他の霊
長類、または他の種の対応物は、天然に存在する。他の哺乳動物種(例えば、霊
長類、イヌ、ネコおよび齧歯類)におけるさらなるタンパク質配列もまた利用可
能であるはずである。
いる。IL−12 p40およびIL−B30分子は、ともに進化しているはず
である。この2つが機能的に会合する場合、それらは、IL−12の様式でとも
に作用し得る。例えば、Trinchieri(1998)Adv.Immun
ol.70:83−243;Gatelyら(1998)Ann.Rev.Im
munol.16:495−521;およびTrinchieri(1998)
Int.Rev.Immunol.16:365−396を参照のこと。
おいて2つの高いシグナル伝達レセプターと相互作用することが予測される。こ
のことは、IL−12レセプターサブユニットβ1の場合に確認された。他の関
連レセプターは、可溶性複合体に対する結合について試験され得る。シグナル伝
達し得る種々のこれらの高いレセプターを安定に発現する一連の細胞(例えば、
BAF/3)を構築した。
(または1つの組み合わせ構築物)の上清を用いて、増殖シグナル伝達応答また
は他のシグナル伝達応答が存在するか否かを確認するために、これらの種々の細
胞を試験した。このように、サイトカインの生理学的効果の大部分は、タンパク
質の複合体に起因し得る。このように、サイトカインから生じる生物学の以下の
説明の多くは、実際に、サブユニットの組み合わせを含む複合体により生理学的
にもたらされ得る。
。IL−12 p40サブユニットとIL−B30との融合物を構築した(例え
ば、ハイパーIL−6(hyper IL−6))。例えば、Fischerら
(1997)Nature Biotechnol.15:142−145;R
akemannら(1999)J.Biol.Chem.274:1257−1
266;およびPetersら(1998)J.Immunol.161:35
75−3581;これらは、本明細書中に参考として援用される。さらに、サイ
トカイン複合体とIL−12レセプターサブユニットβ1を含むレセプターとの
適合は、サイトカイン複合体のレセプターアンタゴニストとして、そのサブユニ
ットに対する抗体の同定を可能にする。
される。このタンパク質をコードする他の天然に存在する核酸は、提供された配
列を用いて標準的な手順(例えば、PCR技術、すなわち、ハイブリダイゼーシ
ョンにより)により単離され得る。これらのアミノ酸配列(アミノからカルボキ
シまで提供される)は、このタンパク質抗原を他のタンパク質から区別し、そし
て多くの改変体を例示することを可能にするサイトカインサブユニットについて
の配列情報を提供することにおいて重要である。さらに、このペプチド配列は、
セグメントを認識する抗体を生成するためのペプチドの調製を可能にし、そして
ヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドプローブの調製を可能にする。これら
の両方は、このような配列をコードする遺伝子の検出または単離(例えば、クロ
ーニング)のためのストラテジーである。
ク質の状況で用いられる場合、配列番号2に由来する可溶性ポリペプチドに対応
するアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。それらの重要なフラグメントは、
しばしば、類似の機能(例えば、抗原性)を保持する。好ましい実施形態は、複
数の異なる(例えば、重複しない)特定の長さのセグメントを含む。代表的には
、複数とは、少なくとも2、より通常には、少なくとも3、そして好ましくは、
5、7、またはそれ以上ですらある。最小限の長さが記載されるが、種々のサイ
ズのより長い長さは、適切であり得る(例えば、長さ7のうちの1および長さ1
2のうちの2)。類似の特徴は、IL−12 p40ポリペプチドに適用し、そ
していずれかまたは両方のポリヌクレオチドに適用する。
0複合体に高親和性(少なくとも約100nM、通常には、約30nMより良好
、好ましくは、約10nMより良好、およびより好ましくは、約3nMより良好
)で結合する。対応タンパク質複合体は、ヒト以外の哺乳動物種(例えば、他の
霊長類、有蹄類または齧歯類)において見出される。非哺乳動物種はまた、構造
的にまたは機能的に関連する遺伝子およびタンパク質を有するはずである(例え
ば、鳥類または両生類)。
またはセグメントを含み、そして少なくとも約8アミノ酸、一般には、少なくと
も約12アミノ酸、代表的には、少なくとも約16アミノ酸、好ましくは少なく
とも約20アミノ酸、および特に好ましい実施形態において、少なくとも約30
以上のアミノ酸(例えば、35、40、45、50など)のアミノ酸残基のスト
レッチを含む。このようなフラグメントは、IL−B30またはIL−12 p
40サブユニットいずれかについての全ての実際の組み合わせにおいて実質的に
全ての位置で始まり、そして/または終わる(例えば、1、2、3などで始まり
、そして例えば、175、174、173などで終わる)末端を有する。特に目
的のペプチドは、構造ドメイン境界(例えば、IL−B30のヘリックスA、B
、C、および/もしくはD、またはIL−12 p40のIgドメイン)に対応
する末端を有する。以下を参照のこと。
L−B30複合体に特異的に結合する(例えば、抗体−抗原相互作用において)
分子をいう。この特異性は、多かれ少なかれ、特定の実施形態(または関連する
実施形態の群(例えば、霊長類、齧歯類など)に)に特異的であることを含む。
枯渇または吸収は、例えば、いずれかのポリペプチド成分に単独で結合する抗体
を枯渇させるために、所望の選択性を提供し得る。化合物(例えば、天然の生理
学的に関連する、共有結合または非共有結合いずれかのタンパク質−タンパク質
相互作用を含む、IL−12 p40/IL−B30複合体と特異的に会合する
タンパク質)もまた提供される。この分子は、ポリマーまたは化学試薬であり得
る。機能的アナログは、構造改変を有するタンパク質であってもよいし、適切な
結合決定基と相互作用する分子形状を有する分子であってもよい。この化合物は
、レセプター結合相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストとして働き得る。
例えば、Goodmanら(編)、Goodman&Gilman’s:The
Pharmacological Bases of Therapeuti
cs(最新版)Pergamon Pressを参照のこと。
ンパク質が、最初の供給源生物に由来する他の夾雑タンパク質、核酸、または他
の生物学的物質を含まないことを意味する。純度は、標準的な方法により(代表
的には、重量により)アッセイされ得、そして通常、少なくとも約40%純粋、
一般には、少なくとも約50%純粋、しばしば、少なくとも約60%純粋、代表
的には、少なくとも約80%純粋、好ましくは、少なくとも約90%純粋、およ
び最も好ましい実施形態において、少なくとも約95%純粋である。キャリアま
たは賦形剤がしばしば添加される。実質的に純粋なIL−12 p40およびI
L−B30を含む組成物は、この2つのポリペプチドの複合体と天然には会合し
ない、多量の外来のポリペプチドを有さない。
する。多くのパラメーターは、ポリペプチドの可溶性(温度を含む)、電解質環
境、ポリペプチドのサイズおよび分子特性、ならびに溶媒の性質に影響する。代
表的には、このポリペプチドが使用される温度は、約4℃〜約65℃の範囲であ
る。通常には、使用時の温度は、約18℃より高い。診断目的では、この温度は
、通常、ほぼ室温または室温より高いが、このアッセイにおける成分の変性温度
より低い。治療目的では、この温度は、通常体温であり、代表的には、ヒトおよ
びマウスに関しては約37℃であるが、特定の状況下では、この温度は、インサ
イチュまたはインビボで上昇されるか、または低下され得る。
在し、そして通常は、変性状態ではない。このポリペプチドは、例えば、可溶性
を与えるために、四次構造において他のポリペプチドと結合し得るか、または脂
質または界面活性剤と結合し得る。特に、この2つのポリペプチドの結合で構成
された複合体は、融合組成物のように好ましい。
生物学的に適合する緩衝液であり、そして生理学的な水性溶媒に通常は近い。通
常、この溶媒は、中性pH、代表的には、約5と10との間を有し、好ましくは
約7.5を有する。いくつかの場合において、1つ以上の界面活性剤(代表的に
は、タンパク質の構造または生理学的特徴の有意な破壊を避けるために、弱い非
変性界面活性剤(例えば、CHS(コレステリルヘミスクシネート)またはCH
APS(3−[3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンス
ルホネート))、あるいは十分に低濃度)が添加される。他の例において、強力
な界面活性剤が、十分な変性をもたらすのに使用され得る。
異的に免疫反応するIL−B30ポリペプチドは、定義された免疫原に対して生
成される。例えば、配列番号2のアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは
配列番号1の核酸から生成されるポリペプチドからなる免疫原は、代表的には、
免疫アッセイにおいて決定される。本明細書中で構造的および機能的に定義され
るような原型的なIL−B30ポリペプチドに対して生成されるポリクローナル
抗体に選択的に結合するポリペプチドをコードする、本明細書中に記載されるそ
れらの核酸配列(機能的改変体を含む)は、本発明の境界内に含まれる。免疫ア
ッセイは代表的に、例えば、配列番号2のタンパク質を含む複合体に対して惹起
されるポリクローナル抗血清を使用する。この抗血清は、適切な他の密接に関連
した(好ましくは、同一種由来)ファミリーメンバーに対して低い交差反応性を
有するように選択、または枯渇され、そして任意のこのような交差反応性は、免
疫吸着または枯渇によって除去され、その後、免疫アッセイにおいて使用される
。特に、IL−12 p40ポリペプチドまたはIL−B30ポリペプチド単独
に結合する抗体は、免疫枯渇のための標的である。適切な選択的血清調製物は、
単離され、そして特徴付けられ得る。
例えば、配列番号2のタンパク質を含む複合体(compls)は、本明細書中
に記載の通りに単離される。例えば、組換えタンパク質は、哺乳動物細胞株にお
いて産生され得る。適切な宿主(例えば、マウスの近交系(例えば、Balb/
c))を、標準的なアジュバント(例えば、フロイントアジュバント)および標
準的なマウス免疫化プロトコル(HarlowおよびLaneを参照のこと)を
使用して配列番号2のタンパク質を含む複合体で免疫する。あるいは、本明細書
中に開示された配列由来の実質的に全長の合成ペプチド構築物は、免疫原として
使用され得る。ポリクローナル血清を収集し、そして適切な枯渇または選択と共
に免疫アッセイ(例えば、固体支持体上に固定された免疫原を用いる固相免疫ア
ッセイ)において免疫原タンパク質に対する力価を測定する。104以上の力価
を有するポリクローナル抗血清を選択し、そして他の密接に関連したファミリー
メンバー(例えば、LIF、CT−1、CNTF、またはIL−6ファミリーの
他のメンバー)に対するそれらの交差反応性についてHarlowおよびLan
e(前出、570〜573頁)に記載のアッセイのように競合結合免疫アッセイ
を使用して試験する。好ましくは、少なくとも2つの個々のIL−6/IL−1
2ファミリーメンバーは、この標的と共にこの測定において使用される。これら
の長鎖のサイトカインファミリーメンバーは、組換えタンパク質として産生され
得、そして本明細書中に記載の標準的な分子生物学およびタンパク質化学技術を
使用して単離され得る。従って、IL−12 p40/IL−B30ファミリー
メンバーのサブセットについて所望の選択性または特異性を有する抗体調製物が
同定または産生され得る。あるいは、IL−12 p40およびIL−B30を
含む複合体の融合ポリペプチド形態に結合する抗体が、調製され得る。
えば、融合タンパク質は、固体支持体に固定され得る。このアッセイに添加され
たタンパク質は、固定化抗原に対する選択的抗血清の結合と競合する。上記タン
パク質の固定化タンパク質に対する選択的抗血清の結合と競合する能力は、融合
タンパク質と比較される。上記タンパク質についての交差反応性パーセントを、
標準的な計算を用いて算定する。上記に列挙したタンパク質の各々と10%未満
の交差反応性を有する抗血清を選択およびプールする。次いで、交差反応する選
択的抗体を、上記に列挙したタンパク質を用いる免疫吸着によってプールした抗
血清から除去する。
おいて使用し、第2のタンパク質を免疫原融合タンパク質と比較する。この比較
を行うために、2つのタンパク質は、各々、広範な濃度でアッセイされ、そして
固定化融合タンパク質に対する選択的抗血清の結合の50%を阻害するのに必要
な各々のタンパク質量が決定される。必要とされる第2のタンパク質量が、必要
とされる融合タンパク質量の2倍未満である場合、この第2のタンパク質は、免
疫原に対して生成された選択的抗体に特異的に結合すると言われる。
的なアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはペプチドを含む複合体を包含
する。改変体としては、種改変体、多型性改変体、または対立遺伝子改変体が挙
げられる。
て、もし必要であるなら、必要に応じてギャップを導入することによって決定さ
れる。Needlehamら、(1970)J.Mol.Biol.48:44
3−453;Sankoffら、(1983)第1章、Time Warps,
String Edits,およびMacromolecules:The T
heory and Practice of Sequence Compa
rison,Addison−Wesley,Reading,MA;およびI
ntelliGenetics,Mountain View,CA製のソフト
ウェアパッケージ;ならびにthe University of Wisco
nsin Genetics Computer Group,Madison
,WIをまた参照のこと。配列同一性は、一致する保存的置換を考慮する場合、
変化する。保存的置換としては、代表的に、以下の群内の置換が挙げられる:グ
リシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタ
ミン酸;アスパラギン、グルタミン;セリン、スレオニン;リシン、アルギニン
;およびフェニルアラニン、チロシン。保存は、生物学的特徴、機能的特徴、ま
たは構造的特徴に適用し得る。相同なアミノ酸配列は、代表的に、タンパク質配
列の天然の多型改変体または対立遺伝子改変体および種間改変体が含まれること
が意図される。代表的な相同タンパク質またはペプチドは、IL−B30のアミ
ノ酸配列と25〜100%同一性(ギャップが導入され得る場合)から50〜1
00%同一性(保存的置換が含まれる場合)を有する。同一性の尺度は、少なく
とも約35%、一般的には少なくとも約40%、しばしば少なくとも約50%、
代表的には少なくとも約60%、通常、少なくとも約70%、好ましくは少なく
とも約80%、およびより好ましくは少なくとも約90%である。
換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、および短いヌクレオチドストレッチ
の転置によって容易に改変され得る。これらの改変は、これらの抗原、類似の生
理学的活性、免疫原活性、抗原活性または他の機能的な活性を有するそれらの誘
導体、またはタンパク質をコードする新規なDNA配列を生じる。これらの改変
配列は、変異体抗原を産生するためか、または発現を促進するために使用され得
る。発現の促進は、遺伝子増幅、転写の増加、翻訳の増加、そして他の機構が含
まれ得る。「変異体IL−B30」は、上記のIL−B30の配列同一性の定義
内の別のポリペプチドを包含するが、欠失、置換、または挿入のいずれかによっ
て、天然で通常見出されるようなIL−B30のアミノ酸配列とは、異なるアミ
ノ酸配列を有する。これは、一般的には、配列番号2の配列を有するタンパク質
と有意な同一性を有するタンパク質、およびその配列と種々の生物学的活性(例
えば、抗原性または免疫原性)を共有するタンパク質を含み、そして好ましい実
施形態において、天然の全長の開示された配列のほとんどを含む。短縮バージョ
ンがまた有用であるが、全長配列は代表的には好ましい。同様に、天然の供給源
から見出された遺伝子またはタンパク質は、代表的には最も望ましい。類似の概
念が、異なるIL−B30タンパク質、特に種々の温血動物(例えば、哺乳動物
および鳥類)において見出されるIL−B30タンパク質に適用される。これら
の説明は、一般的に、種々のIL−B30タンパク質を包含することを意味する
が、特定の霊長類の実施形態を特に議論することは限定しない。
入またはアミノ酸欠失を作製することによって行われ得る。置換、欠失、挿入、
または任意の組み合わせが、最終構築物に到達するように作製され得る。挿入と
しては、アミノ末端またはカルボキシ末端の融合体が挙げられる。ランダム変異
誘発は、標的コドンにおいて行われ得、次いで、発現された変異体は、所望の活
性についてスクリーニングされ得る。公知の配列を有するDNA内の所定の部位
で置換変異体を作製する方法は、当該分野で周知である(例えば、M13プライ
マー変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術による)。例えば、S
ambrookら、(1989);Ausubelら、(1987および補遺)
;およびKunkelら、(1987)Methods in Enzymol
.154:367−382を参照のこと。好ましい実施形態としては、ヌクレオ
チドレベルまたはアミノ酸レベルにおいて、例えば、1倍、2倍、3倍、5倍、
7倍など、好ましくは、保存的置換が挙げられる。好ましくは、この置換は、保
存されたシステインから離れて、しばしばヘリックス構造ドメインから離れた領
域内にある。このような改変体は、特定の抗体を作製するのに有用であり得、そ
してしばしば、多くのまたは全ての生物学的特性を共有する。サイトカイン構造
の認識は、レセプター相互作用において所望の変化をもたらすように改変され得
る残基の構造および位置に関する重要な洞察を提供する。また、IL−12 p
40のIL−B30タンパク質との相互作用は、相互作用する表面における相補
的な構造的特徴を必要とする。構造分析は、さらに、複合体形成および複合体の
レセプターとの相互作用の両方において決定的な表面残基の予測を可能にする。
質(例えば、異種融合タンパク質)を提供する。異種融合タンパク質は、天然で
あり、同一の様式で通常融合されていないタンパク質またはセグメントの融合で
ある。類似の概念が、異種核酸配列に適用される。
することで作製され得る。例えば、標的結合セグメントまたは他のセグメントが
、異なる新規な融合ポリペプチドまたはフラグメント間で「交換」され得る。例
えば、Cunninghamら、(1989)Science 243:133
0−1336;およびO’Dowdら、(1988)J.Biol.Chem.
263:15985−15992を参照のこと。
etts.22:1859−1862によって記載されるホスホラミダイト法は
、適切な合成DNAフラグメントを作製する。二本鎖フラグメントは、しばしば
、相補鎖を合成し、そして適切な条件下で互いの鎖をアニーリングするか、また
は適切なプライマー配列と共にDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を付加するか
(例えば、PCR技術)のいずれかによって得られる。
伝子に適用され得る。このファミリーとしては、例えば、IL−6、IL−11
、IL−12、G−CSF、LIF、OSM、CNTF、およびObが挙げられ
る。ヒトおよびマウスIL−B30配列の、IL−6ファミリーの他のメンバー
とのアラインメントは、構造的特徴の規定を可能にするはずである。特に、β−
シート残基およびα−ヘリックス残基は、例えば、RASMOLプログラム(B
azanら、(1996)Nature 379:591;Lodiら、(19
94)Science 263:1762−1766;SayleおよびMil
ner−White,(1995)TIBS 20:374−376;ならびに
Gronenbergら、(1991)Protein Engineerin
g 4:263−269を参照のこと)を用いて決定され得る。Wilkins
ら、(1997年版)Proteome Research:New Fron
tiers in Functional Genomics Springe
r−Verlag,NYをまた、参照のこと。置換のために好ましい残基として
は、レセプターと相互作用すると推定される表面に曝露された残基が挙げられる
。機能を保存するべきである他の残基は、保存的置換である。特に表面に曝露さ
れた残基から遠い位置における保存的置換である。
、リガンドのそのレセプターへの結合の競合的阻害から生じ得る。レセプターの
1つのサブユニットの同定は、記載されるようなさらなる特徴付け、およびこの
複合体との結合および/またはシグナル伝達をブロックするサブユニットへの抗
体の使用を可能にする。
これらのタンパク質のレセプター結合セグメントを含む可溶性フラグメント、ま
たは固相基体に結合されたフラグメントを使用する。これらのアッセイはまた、
セグメント変異体および改変体、またはサイトカイン変異体および改変体(例え
ば、IL−12 p40/IL−B30複合体アナログ)のいずれかの結合の影
響の診断決定を可能にする。
ター結合フラグメントが、試験化合物と競合する、競合的薬物スクリーニングア
ッセイの使用を意図する。
る形態由来のアミノ酸配列変異体(グリコシル化改変体)が挙げられ、そして他
の化学的部分と共有結合または集合結合する。共有結合誘導体は、IL−12
p40/IL−B30複合体アミノ酸側鎖またはN末端もしくはC末端において
見出される基への官能基の連結によって調製され得る(例えば、標準的手段によ
って)。例えば、LundbladおよびNoyes、(1988)Chemi
cal Reagents for Protein Modificatio
n、第1〜2巻、CRC Press,Inc.,Boca Ratton,F
L;Hugli、(1989年版)Techniques in Protei
n Chemistry,Academic Press,San Diego
,CA;およびWong,(1991)Chemistry of Prote
in Conjugation and Cross Linking,CRC
Press,Boca Raton,FLを参照のこと。
ロセシング工程においてポリペプチドのグリコシル化パターンを変更することに
よって作製されるグリコシル化改変体が含まれる。例えば、Elbein,(1
987)Ann.Rev.Biochem.56:497−534を参照のこと
。リン酸化アミノ酸残基(例えば、リン酸化チロシン、リン酸化セリン、または
リン酸化スレオニン)を含む他の小さな変更を有する同一の一次アミノ酸配列を
有するペプチドのバージョンがまた、包含される。
る。多くのサイトカインレセプターまたは他の表面タンパク質は、マルチマー(
例えば、ホモダイマー)物質であり、そして繰り返し構築物は、タンパク質分解
に対する感受性を減少することを含む種々の利点を有し得る。代表的な例は、レ
ポーターポリペプチド(例えば、ルシフェラーゼ)の、タンパク質のセグメント
またはドメイン(例えば、レセプター結合セグメント)との融合であり、その結
果、融合リガンドの存在または位置は、容易に決定され得る。例えば、Dull
ら、米国特許第4,859,609号を参照のこと。他の遺伝子融合パートナー
としては、細菌β−ガラクトシダーゼ、trpE、プロテインA,β−ラクタマ
ーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酵母α交配因子、および検
出タグまたは精製タグ(例えば、His6配列のFLAG配列)が挙げられる。
例えば、Godowskiら、(1988)Science 241:812−
816を参照のこと。例えば、同時投与されるが、タンパク質分解されない他の
治療物質との融合構築物がまた提供される。
によって作製される。核酸操作および発現のための技術は、一般的には、例えば
、Sambrookら、(1989)Molecular Cloning:A
Laboratory Manual(第2版)、第1〜3巻、Cold S
pring Harbor Laboratory;およびAusubelら、
(1993年版)Current Protocols in Molecul
ar Biology,GreeneおよびWiley,NYに記載される。ペ
プチド合成のための技術は、例えば、Merrifield,(1963)J.
Amer.Chem.Soc.85:2149−2156;Merrifiel
d,(1986)Science 232:341−347;Atherton
ら、(1989)Solid Phase Peptide Synthesi
s:A Practical Approach,IRL Press,Oxf
ord;ならびにGrant,(1992)Synthetic Peptid
es:A User’s Guide,W.H.Freeman,NYに記載さ
れる。リフォールディング方法は、合成タンパク質に適用可能であり得る。
のIL−12 p40タンパク質またはIL−B30タンパク質の誘導体の使用
を包含する。このような誘導体は、化学的な部分またはタンパク質キャリアと共
有結合または集合結合を含み得る。共有結合誘導体または集合結合誘導体は、免
疫原として、免疫アッセイにおける試薬または精製法(例えば、結合パートナー
(他の抗原)のアフィニティ精製のための)における試薬として有用である。I
L−12 p40またはIL−B30は、抗IL−12 p40抗体もしくは抗
IL−B30抗体あるいは代替の結合組成物のアッセイまたは精製において使用
するために、当該分野で周知の方法によって固体支持体(例えば、ブロモシアン
活性化SEPHAROSE)に共有結合することによって固定され得るか、ある
いはグルタルアルデヒド交差結合を有するか、有さないポリオレフィン表面上に
吸着され得る。IL−12 p40、IL−B30、もしくは融合タンパク質は
また、検出可能な基(例えば、診断アッセイにおける使用のため)を用いて標識
され得る。IL−12 p40/IL−B30複合体の精製は、ポリペプチドも
しくは配列成分または相補的結合パートナー(例えば、レセプターの結合部分)
のいずれかに対する固定化抗体によってもたらされ得る。
メントは、結合に特異的な抗血清または抗体の産生のための免疫原として使用さ
れ得る。精製された抗原を使用して、天然の抗体(例えば、Fab、Fab’、
F(ab)2など)の抗原結合フラグメントを包含する、モノクローナル抗体ま
たは抗原結合フラグメントをスクリーニングし得る。精製したIL−12 p4
0/IL−B30抗原はまた、異常な状態または特定の生理学的な状態または疾
患状態を診断し得る、サイトカイン複合体の上昇したレベルの存在に応答して生
成される抗体を検出するための試薬として使用され得る。本発明は、配列番号1
において示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、または
このアミノ酸配列を含むタンパク質のフラグメントに対して惹起される抗体が意
図される。特に、本発明は、特定のドメイン(例えば、IL−B30のヘリック
スA、B、C、またはD、あるいはIL−12 p40のIgドメイン)に対し
て結合親和性を有する抗体またはこのドメインに対して惹起される抗体を意図す
る。
ト分析およびノーザンブロット分析は、類似の遺伝的物質が、他の哺乳動物にお
いて存在することを確立する。IL−B30が、種改変体(例えば、げっ歯動物
、ウサギ、肉食動物、偶蹄目、奇蹄類、および霊長類)において広範囲に及んで
いるようである。
原の群を単離する手段を提供する。分子の多くの生理学的効果の解明は、さらに
別の種またはこれらの多型改変体の単離および特徴付けにより非常に加速される
。詳細には、本発明は、異なる種におけるさらなる相同的な遺伝実体を同定する
ための有用なプローブを提供する。
パク質を欠きかつ負のバックグラウンド活性を示す種の型または細胞のいずれか
)の形質転換を可能にする。このことは、未形質転換コントロール細胞と比較す
る際にIL−B30の機能の分析を可能にする。
要素の分析は、現代の分子生物学の標準的技術を用いて、特に、関連するクラス
のメンバーを比較することで可能である。例えば、Cunninghamら、(
1989)Science 243:1339−1336に記載されるホモログ
スキャニング変異誘発技術(homolog−scanning mutage
nesis technique);およびO’Dowdら、(1988)J.
Biol.Chem.263:15985−15992;およびLechlei
terら、(1990)EMBO J.9:4381−4390で用いられるア
プローチを参照のこと。
質のインターナリゼーションは、特定の環境下で生じ得、そして細胞内成分とサ
イトカインとの間の相互作用が生じ得る。IL−B30と相互作用する成分との
相互作用の特定のセグメントは、変異誘発手段または直接的生化学手段(例えば
、架橋法またはアフィニティー法)により同定され得る。結晶学または他の物理
的方法による構造分析もまた適用可能である。シグナル伝達の機構のさらなる調
査は、アフィニティー手段によりまたは遺伝子手段(例えば、変異体の相補性分
析)により単離可能であり得る関連する成分の研究を含む。
係する制御エレメントは、異なる生理学的パターン、発生パターン、組織特異的
パターン、または他の発現パターンを示すはずである。上流または下流の遺伝子
領域(例えば、コントロールエレメント)が目的物である。
またはアンタゴニスト特性を示すアナログ)の設計を導く。このことは、活性の
所望のスペクトルを示す抗原を単離するために以前に記載されたスクリーニング
法と組合され得る。
々のp40/IL−B30タンパク質のエピトープ(種改変体、多型改変体もし
くは対立遺伝子改変体を含む)およびそれらのフラグメントに対して惹起され得
る。さらに、抗体は、それらの活性化形態または不活性化形態(ネイティブバー
ジョンまたは変性バージョン)のいずれかのIL−B30に対して惹起され得る
。抗イディオタイプ抗体もまた意図される。
単鎖バージョンを含む)は、フラグメントと免疫原性タンパク質との結合体を用
いる動物の免疫化により惹起され得る。モノクローナル抗体は、所望の抗体を分
泌する細胞から調製される。これらの抗体は、正常IL−B30または欠損IL
−B30に結合するために分泌され得るか、またはアゴニスト活性またはアンタ
ゴニスト活性(例えば、レセプターを介する)についてスクリーニングされ得る
。抗体は、例えば、レセプターに対する結合を立体的にブロックすることによる
、アゴニスト性またはアンタゴニスト性であり得る。これらのモノクローナル抗
体は、通常、少なくとも、約1mM、より通常は、少なくとも、約300μM、
代表的には、少なくとも、約100μM、より代表的には、少なくとも30μM
、好ましくは、少なくとも約10μM、およびより好ましくは、少なくとも約3
μM以下のKDで結合する。
の場合、これらは、レセプターに対する結合を阻害することなく抗原に結合する
能力についてスクリーニングされ得る。中和抗体の場合、これらは競合結合アッ
セイにおいて有用であり得る。これらはまた、IL−B30タンパク質またはそ
のレセプターを検出または定量する際に有用であり得る。例えば、Chan(1
987年編)Immunology:A Practical Guide,A
cademic Press,Orlando,FL;PriceおよびNew
man(1991年編)Principles and Practice o
f Immunoassay,Stockton Press,N.Y.;およ
びNgo(1988年編)Nonisotopic Immunoassay,
Plenum Press,N.Y.を参照のこと。交叉吸収または他の試験は
、特異性(固有のまたは共有された種の特異性)の種々の範囲を示す抗体を同定
する。
物学的応答を惹起し得るレセプターに)結合しそして機能的結合を阻害する強力
なアンタゴニストであり得る。これらはまた、非中和抗体として有用であり得、
そして毒素または放射性核種に結合され得、その結果、抗体が抗原に結合する場
合、それを(例えば、その表面上に)発現する細胞は殺傷される。さらに、これ
らの抗体は、リンカーの様式で直接的または間接的のいずれかで薬物または他の
治療剤に結合体化し得、そして薬物標的化をもたらし得る。
結合される場合、他の物質(特に、ポリペプチド)に連結され得る。抗原および
そのフラグメントは、種々の免疫原(例えば、キーホールリンペットヘモシアニ
ン、ウシ血清アルブミン、破傷風毒素など)に融合または共有結合され得る。ポ
リクローナル抗血清を調製する方法の記載については、Microbiolog
y,Hober Medical Division,HarperおよびRo
w,1969;Landsteiner(1962)Specificity
of Serological Reactions,Dover Publi
cations,New York;Williamsら(1967)Meth
ods in Immunology and Immunochemistr
y、第1巻、Academic Press,New York;およびHar
lowおよびLane,(1988)Antibodies:A Labora
tory Manual,CSH Press,NYを参照のこと。
類、ヒトなど)由来のモノクローナル抗体を調製することが望ましい。このよう
なモノクローナル抗体を調製するための技術の記載は、例えば、Stitesら
(編)Basic and Clinical Immunology(第4版
)、Lange Medical Publication,Los Alto
s,CA,および本明細書中で引用される参考文献;HarlowおよびLan
e,(1988)Antibodies:A Laboratory Manu
al,CSH Press,NY;Goding,(1986)Monoclo
nal Antibodies:Principles and Practi
ce(第2版)、Academic Press,New York;および、
特に、KohlerおよびMilstein,(1975)Nature 25
6:495−497(これらは、モノクローナル抗体を生成する1つの方法を考
察する)に見出され得る。
またはファージまたは類似のベクターの中の抗体のライブラリーの選択に関する
。Huseら(1989)「Generation of Large Com
binatorial Library of Immunoglobulin
Repertoire in Phage Lambda」,Science
246:1275−1281」;およびWardら、(1989)Natur
e 341:544−546」を参照のこと。本発明のポリペプチドおよび抗体
は、キメラ抗体またはヒト化抗体を含む、修飾を伴ってまたは伴わないで、用い
られ得る。頻繁に、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する
物質を共有的または非共有的のいずれかで結合することにより標識される。広範
な種々の標識技術および結合体化技術は公知であり、そして科学文献および特許
明細書の両方において広範に報告されている。適切な標識としては、放射性核種
、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子など
が挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第3,
817,837号;同第3,850,752号;同第3,939,350号;同
第3,996,345号;同第4,277,437号;4,275,149号;
および同第4,366,241号が挙げられる。また、組換え免疫グロブリンが
生成され得る、Cabilly,米国特許第4,816,567号;Moore
ら、米国特許第4,642,334号;およびQeenら、(1989年)Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029−10033を参
照のこと。
フィーのために用いられ得る。カラムは、抗体が固体支持体に連結される場合、
調製され得る。例えば、Wilchekら、(1984年)Meth.Enzy
mol.104:3−55を参照のこと。対照的に、タンパク質は、選択的、特
異的に結合する組成物を調製するための枯渇または交叉吸収のために用いられ得
る。
するために用いられる。これらは、それぞれの抗原の発現に関連する種々の免疫
学的条件を検出または診断するのに有用である。
30の両方をコードするDNAクローン(例えば、天然の供給源由来)を検出、
単離、または同定するのに有用である。代表的には、哺乳動物由来の遺伝子を単
離するのに有用であり、そして類似の手順は、他の種(例えば、鳥および哺乳動
物のような、温血動物)から遺伝子を単離するために適用される。交叉ハイブリ
ダイゼーションは、同じ種(例えば、多型改変体)または他の種からのIL−1
2p40またはIL−B30の単離を可能にする。多数の異なるアプローチが、
適切な核酸クローンを首尾良く単離するために利用可能である。このような遺伝
子は、同時発現構築物または融合構築物の構築を可能にする。
を生成させるために有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク質は、モノク
ローナル抗体またはポリクローナル抗体を生成する免疫系に存在し得る。例えば
、Coligan,(1991)Current Protocols in
Immunology Wiley/Green;and Harlow an
d Lane,(1989)Antibodies:A Laboratory
Manual,Cold Spring Harbor Pressを参照の
こと。
する細胞株から作製される発現ライブラリーのスクリーニングのために用いられ
得る。細胞内発現のスクリーニングは、種々の染色または免疫蛍光手順により行
われ得る。結合組成物は、表面融合タンパク質を発現する細胞をアフィニティー
精製または選別するために用いられ得る。
オリゴヌクレオチドを選択または同定するために用いられ得る。遺伝子コードは
、スクリーニングに関するプローブとして有用な適切なオリゴヌクレオチドを選
択するために用いられ得る。例えば、GenBankおよび配列番号1を参照の
こと。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術と組合せて、合成オリゴヌクレオチ
ドは、ライブラリーから正確なクローンを選択する際に有用である。相補的配列
はまた、プローブ、プライマー、またはアンチセンス鎖として用いられる。種々
のフラグメントは、例えば、アンカーベクターもしくはポリA相補鎖のPCR技
術、または他のペプチドの相補鎖DNAと相まって、特に有用であるはずである
。
するIL−12p40およびIL−B30ポリペプチドの生物学的に活性な複合
体をコードする、単離されたDNAまたはフラグメントの使用を意図する。さら
に、本発明は、生物学的に活性な融合タンパク質またはポリペプチドコードし、
そして本明細書中に記載されるDNA配列と適切な条件下でハイブリダイズし得
る、単離されたまたは組換えのDNAを含む。この生物学的に活性なタンパク質
またはポリペプチドは、インタクトな抗原、またはフラグメントであり得、そし
て例えば、配列番号2に開示されるアミノ酸配列(特に、成熟した分泌タンパク
質)を有する。さらに、本発明は、単離されたDNAもしくは組換えDNA、ま
たはそのフラグメントの使用を含む。これは、分泌IL−12p49/IL−B
30複合体に対する高い同一性を示す。単離されたDNAは、5’および3’に
隣接するそれぞれの調節配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ−A
追加シグナルなど)を有し得る。あるいは、発現は、コードセグメントを異種プ
ロモーターに作動可能に連結させることにより(例えば、外来遺伝子の上流にプ
ロモーターを挿入することにより)もたらされ得る。例えば、Trecoら、W
O96/29411またはUSSN08/406,030を参照のこと。
、および/または本来の種に隣接するゲノム配列)を天然で伴う、他の外来の成
分から実質的に分離される、核酸(例えば、RNA、DNA、または混合ポリマ
ー)である。用語は、その天然に存在する環境から取り出されている核酸配列を
採用し、そして組換えまたはクローン化DNA単離物、および化学合成アナログ
または異種系により生物学的に合成されたアナログを含む。実質的に純粋な分子
は、分子の単離形態(例えば、単離された染色体とは異なる)を含む。一般に、
核酸は、約50kb未満、通常約30kb未満、代表的には、約10kb未満、
そして好ましくは6kb未満のベクターまたはフラグメント内にある。
では、わずかな不均一性を含む。この不均一性は、代表的には、所望の生物学的
機能または活性に重要ではない、ポリマー末端または部分で見出される。
。その産生の方法に関して(例えば、あるプロセスにより作製される産物)、プ
ロセスは、組換え核酸技術(例えば、ヌクレオチド配列内の人為的介入を伴う(
代表的には、選択または産生))の使用である。あるいは、お互いに天然では連
続しない2つのフラグメントの融合物を含む配列を生成することにより作製され
る核酸であり得るが、これは天然の産物(例えば、天然存在する変異体)を排除
することを意味する。従って、任意の合成オリゴヌクレオチドプロセスを用いて
誘導される配列を含む核酸である場合、例えば、天然に存在しないベクターを用
いて細胞を形質転換することにより作製した産物が含まれる。このようなことは
、しばしば、同じアミノ酸または保存されたアミノ酸をコードする縮重コドンと
あるコドンとを置換するように行われるが、代表的には、配列認識部位を導入す
るかまたは取り出すように行われる。
み合わせを含む、単一の遺伝実体を生成させるための、所望の機能の核酸セグメ
ント同士を連結することが行われる。制限酵素認識部位は、しばしば、このよう
な人為的相さの標的であるが、他の部位特異的標的(例えば、プロモーター、D
NA複製部位、調節配列、制御配列、コントロール配列、または他の有用な特性
)は、設計に含まれ得る。類似の概念は、組換え(例えば、融合)ポリペプチド
についても意図される。特に含まれるものは、遺伝子コードの縮重により、これ
らの抗原のフラグメントに類似するポリペプチド、および種々の異なる種または
多型改変体由来の配列の融合物をコードする、合成核酸である。
、一般に、少なくとも約22ヌクレオチド、通常は、少なくとも約29ヌクレオ
チド、より頻繁には、少なくとも約35ヌクレオチド、代表的には、少なくとも
約41ヌクレオチド、通常は、少なくとも約47ヌクレオチド、好ましくは、少
なくとも約55ヌクレオチド、の連続するセグメントであり、そして好ましい実
施形態では、少なくとも約60以上のヌクレオチド(例えば、67、73、81
、89、95など(100および/または1000を含む))である。
ク質、ならびに異なる種由来の相同タンパク質をコードするDNAをコードする
、遺伝子、mRNA、およびcDNA種を同定するのに、特に有用である。これ
らは、他の種(霊長類動物、げっ歯類動物、イヌ、ネコ、およびトリを含む)に
相同である。種々のIL−B30タンパク質は相同であるはずであり、そして本
明細書中に含まれる。しかし、これらは十分に相同である場合でさえ、この抗原
に対してより離れた進化的関係を有するタンパク質が、これらの配列を用いる適
切な条件下で容易に単離され得る。霊長類IL−B30タンパク質が、特に目的
のタンパク質である。IL−12p40と同様に、このタンパク質は、融合構築
物または組合せ組成物についての第一の標的である。
ンスジェニック細胞および生物を含む、トランスジェニック研究、および遺伝子
治療に有用である。例えば、Goodnow,(1992)「Transgen
ic Animals」,Roitt(編)Encyclopedia of
Immunology,Academic Press,San Diego,
1502−1504頁;Travis,(1992)Science 256:
1392−1394;Kuhnら、(1991)Science 254:70
7−710;Capecchi(1989)Science 244:1288
;Robertson,(1987編)Teratocarcinomas a
nd Embryonic Stem Cells:A Practical
Approach,IRL Press,Oxford;およびRosenbe
rg,(1992)J.Clinical Oncology 10:180−
199を参照のこと。
場合にセグメントまたはその相補鎖のいずれかは、最適にアラインメントさせた
場合に、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って、少なくとも約50%のヌ
クレオチド、一般に、少なくとも約58%、通常は、少なくとも約65%、しば
しば、少なくとも約71%、代表的には、少なくとも約77%、通常は、少なく
とも約85%、好ましくは、少なくとも約95〜98%以上、そして特定の実施
形態では、約99%と同じくらい高いか、または約99%以上のヌクレオチドと
同一である。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下でハ
イブリダイズする場合に、鎖またはその相補鎖(代表的には、IL−12p40
および/またはIL−B30(例えば、配列番号1)の配列を用いる)に対して
、実質的相同性が存在する。代表的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少
なくとも約30ヌクレオチドのストレッチにわたり少なくとも約55%、約25
ヌクレオチドのストレッチにわたり好ましくは少なくとも約75%、そして最も
好ましくは、約20ヌクレオチドにわたり少なくとも約90%の同一性が存在す
る場合に生じる。Kanehisa,(1984)Nuc.Acids Res
.12:203−213を参照のこと。記載されるように、同一性比較の長さは
、より長いストレッチにわたり得、そして特定の実施形態では、少なくとも約1
7ヌクレオチド、通常は、少なくとも約28ヌクレオチド、代表的には、少なく
とも約40ヌクレオチド、そして好ましくは、少なくとも約75〜100以上の
ヌクレオチドのストレッチにわたる。
照のこと)は、塩、温度、有機溶媒、および他のパラメーター(代表的には、ハ
イブリダイゼーション反応で制御されるもの)のストリンジェントな組合せ条件
である。ストリンジェントな温度条件は、通常、約30℃を超える温度、通常は
、約37℃を超える温度、代表的には、約55℃を超える温度、より代表的には
、約60℃または65℃を超える温度、および好ましくは約70℃を超える温度
を含む。ストリンジェントな塩条件は、通常、約1000mM未満、通常、約4
00mM未満、代表的には、約250mM未満、好ましくは、約150mM未満
(100mM、50mM、または20mMでさえ含む)。しかし、パラメーター
の組合せは、任意の単一のパラメーターの測定よりも、さらにより重要である。
例えば、WetmurおよびDavidson,(1968)J.Mol.Bi
ol.31:349−370を参照のこと。ストリンジェントな条件下のハイブ
リダイゼーションは、バックグラウンドを超えて少なくとも約2倍、好ましくは
、少なくとも3〜5倍以上のバックグラウンドを与えるはずである。
して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列お
よび参照配列は、コンピューターにインプットされ、必要な場合、サブ配列座標
が指定され、そして、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。
次いで配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて
、参照配列と比較して、試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。
erman(1981)Adv.Appl.Math.2:482の局所的相同
性アルゴリズムによって、NeedlemanおよびWunsch(1970)
J.Mol.Biol.48:443の相同性アラインメントアルゴリズムによ
って、PearsonおよびLipman(1988)Proc.Natl.A
cad.USA 85:2444の類似性方法のためのサーチによって、これら
のアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software
Package,Genetics Computer Group,575
Science Dr.,Madison,WIにおけるGAP、BESTFI
T、FASTAおよびTFASTA)のコンピューター化された実施によってか
、または、視覚的検査(例えば、一般的にはAusubelら、前出)によって
、行なわれ得る。
係およびパーセント配列同一性を示すために、進行性の、対を成すアラインメン
トを使用して、関連した配列の群から多数配列アラインメントを作製する。これ
はまた、アラインメントを作製するために使用されたクラスター形成関係を示す
系図または樹状図をプロットする。PILEUPは、FengおよびDooli
ttle(1987)J.Mol.Evol.35:351−360の進行性ア
ラインメント方法の単純化したものを使用する。使用される方法は、Higgi
nsおよびSharp(1989)CABIOS 5:151−153によって
記載される方法に類似している。このプログラムは、300配列をアラインメン
トさせることが可能で、それぞれの最大長は5,000ヌクレオチドまたは5,
000アミノ酸である。多数アラインメント手順は、2つの最も類似した配列の
対を成すアラインメントで始まり、2つのアラインメント配列の群を生成する。
次いで、このクラスターは、次に最も関連した配列またはアラインメントされた
配列のクラスターにアラインメントされる。配列の2つのクラスターは、対を成
す2つの個々の配列のアラインメントの単純な伸長によってアラインメントされ
る。最終のアラインメントは、一連の進行性の、対を成すアラインメントによっ
て、達成される。配列比較領域のための特定の配列およびそれらのアミノ酸また
はヌクレオチド座標を指定することによって、およびプログラムパラメーターを
指定することによって、このプログラムは実行される。例えば、参照配列は、以
下のパラメーター:デフォルトギャップ重量(3.0)、デフォルトギャップ長
重量(0.10)、および重量末端ギャップを使用して、パーセント配列同一性
関係を決定するための他の試験配列と比較され得る。
別の例は、BLASTアルゴリズムである。これは、Altschulら、(1
990)J.Mol.Biol.215:403−410に記載される。BLA
ST分析を実行するためのソフトウェアは、National Center
for Biotechnology Informationを介して公に入
手可能である(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/)。こ
のアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードを用いてアライ
ンメントされる場合、いくつかの正の値の閾値Tに適合するかまたはそれを満足
するかどちらかの照会配列における短いワード長Wを同定することによって、高
スコア配列対(HSP)を最初に同定することを含む。Tは、近隣ワードスコア
閾値として参照される(Altschulら、前出)。これらの最初の近隣ワー
ドヒットは、それらを含むより長いHSPを見出するためのサーチを開始するた
めの種子として作用する。次いで、このワードヒットは、累積アラインメントス
コアが増加し得る限り、それぞれの配列に沿って、両方向へ伸長される。以下の
場合:累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Xだけ不足する場合
;累積スコアが、1以上のネガティブスコアリング残基アラインメントの蓄積に
起因して、0またはそれ以下に進む場合;またはどちらかの配列の末端に達する
場合に、それぞれの方向におけるワードヒットの伸長は停止する。BLASTア
ルゴリズムパラメーターW、T、およびXは、アラインメントの感度およびスピ
ードを決定する。BLASTアルゴリズムプログラムは、11のワード長(W)
、50のBLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoffおよび
Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
89:10915を参照のこと)アラインメント(B)、10の期待値(E)
、M=5、N=4、および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。
、2つの配列の間の類似性の統計学的分析を実施する(例えば、Karlinお
よびAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 90:5873−5787を参照のこと)。BLASTアルゴリズムによ
って提供される同一性の1つの測定は、最小合計可能性(P(N))であり、こ
れは、2つのヌクレオチドまたは2つのアミノ酸配列の間の適合が偶然に発生す
る可能性の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における
最も小さい合計可能性が約0.1未満、さらに好ましくは、約0.01未満、そ
して、最も好ましくは、約0.001未満の場合、核酸は参照配列に類似してい
ると考えられる。
以下に記載されるように、第1の核酸によってコードされるポリペプチドが、第
2の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であるとい
うことである。従って、ポリペプチドは、代表的には実質上第2のポリペプチド
に同一である(例えば、2つのペプチドが保存的な置換のみによって異なる場合
)。2つの核酸配列が実質上同一であるという別の指標は、以下に記載されるよ
うに、ストリンジェントな条件下で、お互いにハイブリダイズするということで
ある。
ゼーションによってクローニングされ得、そして、単離され得る。かすかに関連
した種間の相同性は比較的低く、従って、比較的密接に関連した種のハイブリダ
イゼーションが得策である。あるいは、より種特異性を示さない抗体の調製は、
発現クローニングアプローチにおいて有用であり得る。
るDNAは、化学合成、cDNAライブラリーのスクリーニング、または広範な
種々の細胞株もしくは組織サンプルから調製されたゲノムライブラリーのスクリ
ーニングによって獲得され得る。例えば、OkayamaおよびBerg(19
82)Mol.Cell.Biol.2:161−170;Gublerおよび
Hoffman(1983)Gene 25:263−269;ならびにGlo
ver(1984年編)DNA Cloning:A Practical A
pproach,IRL Press,Oxfordを参照のこと。あるいは、
本明細書中で提供される配列は、有用なPCRプライマーを提供するかまたはI
L−12 p40もしくはIL−B30をコードする適切な遺伝子の合成かもし
くは他の調製を可能にし;天然に存在する形態を含む。
抗体を産生するために;使用され得る全長IL−12 p40およびIL−B3
0またはフラグメントの合成のために;結合の研究のために;改変された分子の
構築および発現のために;ならびに構造/機能研究のために広範な種々の細胞に
おいて発現され得る。
オファージ、組み込み可能なDNAフラグメント、ならびにDNAフラグメント
を宿主のゲノムに組み込み可能な他の賦形剤を含む。例えば、Pouwelsら
(1985年および補遺)Cloning Vectors:A Labora
tory Mannual,Elsevier,N.Y.;ならびにRodri
guezら(1988年編)Vectors:A Survey of Mol
ecular Cloning Vectors and Their Use
s,Buttersworth,Boston,MAを参照のこと。
能に連結されている。例えば、シグナルペプチドまたは分泌リーダーについての
DNAは、それが、前タンパク質として発現されるかまたは細胞膜へのポリペプ
チド指向またはポリペプチドの分泌に参加する場合、ポリペプチドに作動可能に
連結されている。プロモーターは、それがポリペプチドの転写を制御する場合、
コード配列に作動可能に連結されており;リボソーム結合部位は、翻訳可能なよ
うに配置される場合、コード配列に作動可能に連結されている。通常、作動可能
に連結されるは、連続的およびリーディングフレーム中を意味するが、抑制遺伝
子などの特定の遺伝エレメントは、連続的に連結されていないが、代わりに発現
を制御する操作配列になおも結合されている。例えば、Rodriguezら、
第10章、205〜236頁;BalbasおよびBolivar(1990)
Methods in Enzymology 185:14−37;ならびに
Ausubelら(1993)Current Protocols in M
olecular Biology,GreeneおよびWiley,NY.を
参照のこと。2つのコード配列の同時発現は、本明細書中において特に興味深い
。 適切な発現ベクターの代表的な例としては、pCDNA1;pCD(Oka
yamaら(1985)Mol.Cell Biol.5:1136−1142
を参照のこと);pMC1neo Poly−A(Thomasら(1987)
Cell 51:503−512を参照のこと);およびpAC373またはp
AC610などのバキュロウイルスベクター(Miller(1988)Ann
.Rev.Microbiol.42:177−199を参照のこと)が挙げら
れる。
40および/またはIL−B30ポリペプチドを発現することがしばしば所望で
ある。例えば、LuckowおよびSummers(1988)Bio/Tec
hnology 6:47−55;ならびにKaufman(1990)Met
h.Enzymol.185:487−511を参照のこと。
、細胞膜に連結されたホスファチジルイノシトール(PI)となるように操作さ
れ得るが、ホスファチジルイノシトール切断酵素(例えば、ホスファチジルイノ
シトールホスホリパーゼC)を用いる処置によって、膜から取り出され得る。こ
れは、生物学的に活性な形態の抗原を放出し、そして、タンパク質化学の標準的
手順による精製を可能とする。例えば、Low(1989)Biochim.B
iophys.Acta 988:427−454;Tseら(1985)Sc
ience 230:1003−1008;ならびにBrunnerら(199
1)J.Cell.Biol.114:1275−1283を参照のこと。
グメントまたは誘導体は、ペプチドを合成するための慣例的なプロセスによって
調製され得る。これらとしては、StewartおよびYoung(1984)
Solid Phase Peptide Synthesis,Pierce
Chemical Co.,Rockford,IL;Bodanszkyおよ
びBodanszky(1984)The Practice of Pept
ide Syntesis,Springer−Verlag,New Yor
k;Bocanszky(1984)The Principles of P
eptide Synthesis,Springer−Verlag,New
York;ならびにVillafranca(1991年編)Techniqu
es in Protein Chmistry II,Academic P
ress,San Diego,Caに記載されるようなプロセスを含む。
得る試薬を提供する(例えば、IL−12 p40/IL−B30複合体媒介条
件においてかまたは診断のためのキットの以下の記載において)。遺伝子は、法
医科学において有用であり得る(例えば、ヒトとげっ歯類を区別するためかまた
は差次的な発現または改変パターンを示す異なった細胞間で区別するためのマー
カーとして)。提供された組成物は、例えば、インビトロアッセイ、科学的研究
、および核酸、ポリペプチド、もしくは抗体の合成または製造において、有用な
試薬である。
供する。複合体またはそれらの個々の成分に対する結合親和性を有すると同定さ
れた化合物と共に、IL−12 p40/IL−B30複合体(天然に存在する
かまたは組換えの)、そのフラグメント、それに対する抗体は、分子生物学、免
疫学、または生理学の技術を教示するための試薬として有用であるべきである。
適切なキットは、試薬を使用して調製される(例えば、タンパク質、抗体、クロ
ーニング方法、組織学などの産生または使用における実際の研究室演習において
)。
処置において有用であり得る。これらは、相互作用する成分の存在または非存在
のためのインビトロ試験において有用であり得、これは、特定の処置ストラテジ
ーの成功に相関し得る。特に、種々の細胞の生理学的改変(例えば、造血性また
はリンパ系の)は、本明細書中で提供される組成物を使用する処置のための適切
な方法によって達成される。例えば、Thomson(1994年;編)The
Cytokine Handbook(第2版)Academic Pres
s,San Diego;MetcalfおよびNicola(1995)Th
e Hematopoietic Colony Stimulating F
actors Cambridge University Press;なら
びにAggarwalおよびGutterman(1991)Human Cy
tokines Blackwell Pubを参照のこと。
への有用な洞察を提供する。特に、IFNγ産生は、細胞媒介免疫の増加を生じ
る。例えば、Paul(1998)Fundamental Immunolo
gy(第4版)Raven Press,NY;ならびにDelvesおよびR
oitt(1998年編)The Encyclopedia of Immu
nology Academic Press(ISBN:012226765
6)を参照のこと。従って、細胞性応答の増強は、抗腫瘍活性を増強するため、
ワクチン反応を増強するため(体液性および細胞性免疫の両方)、抗ウイルス効
果を増強するため、そして、発達の特定の潜伏期間(window)におけるア
レルギー性反応に拮抗するために、文脈において有用である。例えば、Rose
およびMackay(1998年編)The Autoimmune Dise
ases(第3編)Academic Press,San Diego;なら
びにKay(1997年版)Allergy and Allergic Di
seases,Blackwell Science,Malden MAを参
照のこと。逆に、アンタゴニストは、IFNγ増強などを阻害するかまたは予防
するために使用され得、それによって、細胞性増強の強さまたは強度を減少する
。これらは、例えば、自己免疫状態(多発性硬化症もしくは乾癬など)または慢
性的炎症状態(関節炎リウマチまたは炎症性腸疾患など)において有用である。
例えば、Samterら(編)Immunological Diseases
第1巻および第2巻、Little,Brown and Coを参照のこと。
最初の結果は、p40/IL−B30の役割が、慢性炎症状態の維持においてよ
り重要であることを示す。従って、状態の最初の発症後に、妨害物が有効であり
得る。
治療法と組み合わせられ得る(例えば、炎症の他のモジュレーターと)。従って
、アゴニストは、しばしば、組み合わせられる(例えば、IL−18、IL−1
2、放射線療法または化学療法による治療、ワクチンアジュバント、および/ま
たは抗ウイルス療法と)。あるいは、アンタゴニストは、TNFαアンタゴニス
ト、IL−12アンタゴニスト、IL−10および/またはステロイドと組み合
わせられ得る。サイトカインのウイルス相同体もまた使用され得る。
伝達に関連した疾患または障害は、アゴニストまたはアンタゴニストの標的とな
るべきである。新しいサイトカインは、造血細胞(例えば、リンパ細胞(これは
、免疫学的応答(例えば、炎症および/または自己免疫障害)に影響する)の制
御または発達における役割を果たすべきである。あるいは、血管生理学もしくは
血管発達に影響するか、またはニューロンに影響し得る。状態の開始または維持
と比較した治療薬の投与の時期もまた重要であり得る。特に、サイトカイン複合
体は、種々の文脈において、細胞によるサイトカイン合成、増殖などを媒介する
。IL−12p40/IL−B30のアンタゴニスト(天然に存在する形態また
は阻害抗体のムテイン改変体など)は、免疫応答(例えば、炎症性または自己免
疫応答などの状態における)を阻害する選択的および強力な方法を提供し得る。
例えば、Samterら(編)Immunological Disease第
1巻および第2巻、Little,Brown and Coをまた参照のこと
。
性硬化症のモデルに有用であり得る)における肺状態(喘息および線維症の両方
)、糖尿病、および腸炎症が挙げられる。例えば、喘息について、Barnes
ら(1998)Mol.Med.Today 4:452−458;Pauwe
lsら(1998)Clin.Exp.Allergy Aug.28、補遺3
:1−5;Durham(1998)Clin.Exp.Allergy Ju
n.28、補遺2:11−16;Leung(1997)Pediatr.Re
s.42:559−568;Pretolaniら(1997)Res.Imm
unol.148:33−38;Lamkhiouedら(1996)Ann.
NY Acad.Sci.796:203−208;Erbら(1996)Im
munol.Cell.Biol.74:206−208;ならびにAnder
sonら(1994)Trends Pharmacol.Sci.15:32
4−332;肺繊維症について、Cokerら(1998)Eur.Respi
r.J.11:1218−1221;ならびにBienkowskiら(199
5)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.209:118−140;
EAEモデルについて(多発性硬化症について)、PearsonおよびMcD
evitt(1999)Curr.Top.Microbiol.Immuno
l.238:79−122;MillerおよびShevach(1998)R
es.Immunol.149:753−759;HoffmanおよびKar
pus(1998)Res.Immunol.149:790−794(846
−847および855−860に考察される);Segal(1998)Res
.Immunol.149:811−820(850−851および855−8
60に考察される);Liblauら(1997)Immnol.Today
18:599−604;Goldら(1997)Crit.Rev.Immno
l.17:507−510;Spack(1997)Crit.Rev.Imm
unol.17:529−536;ならびにLenardら(1997)Cri
t.Rev.Immnol.17:545−553;糖尿病について、Alma
wiら(1999)J.Clin.Endocrinol.Metab.84:
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.5.155−159。
生じる。p40/IL−B30での刺激後、CD69Lは高度に発現され、そし
て、CD54は劇的に減少する。付着分子の発現におけるこれらの変化は、第1
および第2のリンパ節T/DC細胞リッチ領域に侵入する記憶細胞の調節を可能
にし得る(例えば、高い内皮細静脈(HEV)を介して)。記憶細胞はまた、I
L−12刺激に対して感受性となるように初回刺激される。従って、迅速なおよ
び高度なIFN産生が、抗原によるIL−12産生後すぐ後に続く。従って、p
40/IL−B30は、応答速度を増加することによって、記憶細胞数を増加す
ることによって、または、両方によって、記憶細胞による免疫応答を促進し得る
。p40/IL−B30は、未処理の細胞に対してより効果を与えないかまたは
全く与えないかで、記憶細胞について特異的な差次的な効果を有し得る。逆に、
多数の慢性炎症状態において(例えば、関節炎リウマチ、慢性腸疾患、乾癬など
)活性病変は、記憶CD45Rblow細胞に依存している。このように、アンタ
ゴニストは、このような炎症性状態の慢性局面を効果的に阻害し得る。
L−12 p40および/またはIL−B30 mRNAの両方を生成すること
が公知である。Berkow(編)The Merck Manual of
Diagnosis and Therapy,Merck&Co.,Rahw
ay,N.J.;Thornら、Harrison’s Principles
of Internal Medicine,McGraw−Hill,N.
Y.;ならびにWeatherallら(編)Oxford Textbook
of Medicine,Oxford University Press
,Oxfordを参照のこと。多数の他の医療状態および疾患は、マクロファー
ジまたは単球による活性化を含み、そして、これらの多数が、本明細書中に提供
されるアゴニストまたはアンタゴニストによる処置に反応性である。例えば、S
titesおよびTerr(1991年編)Basic and Clinic
al Immunology Appleton and Lange,Nor
walk,Connecticut;ならびにSamterら(編)、Immu
nological Diseases Little,Brown and
Coを参照のこと。これらの問題は、本明細書中に提供される組成物を使用する
予防または処置に対して影響されやすいべきである。
体などは、精製され得、次いで(獣医学のまたはヒトの)患者に投与され得る。
これらの試薬を、生理学的に無害の安定化剤、賦形剤または保存剤とともに、例
えば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤(例えば、免疫アジュバ
ント)中で、追加の活性または不活性成分と、治療用途のために組み合わせ得る
。これらの組み合わせを滅菌濾過し、そして投与バイアル中の凍結乾燥によるよ
うな投与形態で、または安定化した水性調製物中での貯蔵に置かれ得る。本発明
はまた、補体結合しない形態を含む抗体またはその結合フラグメントの使用を意
図する。
トを使用する薬物スクリーニングは、会合した成分の単離を含む、IL−12
p40/IL−B30機能への結合親和性またはIL−12 p40/IL−B
30に対する他の関連する生物学的効果を有する化合物を同定するために実施さ
れ得る。次いで、その後の生物学的アッセイは、候補化合物が本来の刺激活性を
有するかどうか、そして従って、これがサイトカイン複合体の活性をブロックす
るという点で、ブロッカーまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するため
に利用され得る。同様に、固有の刺激活性を有する化合物は、シグナル伝達経路
を活性化し得、従って、これがこのサイトカイン複合体の活性を刺激するという
点で、アゴニストである。本発明は、さらに、アンタゴニストとしてのIL−1
2 p40、IL−B30、またはこの複合体に対するブロッキング抗体の治療
的使用およびアゴニストとしてのIL−12 p40、IL−B30、またはこ
の複合体の刺激抗体の治療的使用を意図する。このアプローチは、他のIL−1
2 p40またはIL−B30の種改変体に特に有用であるはずである。
および投与される他の製剤を含む、多くの異なる因子に依存する。従って、処置
投薬量は、安全性および効率を最適にするために滴定されるべきである。代表的
には、インビトロで使用される投薬量は、これらの試薬のインサイチュ投与に有
用な量で有用なガイダンスを提供し得る。特定の障害の処置に有効な用量の動物
試験は、ヒト投薬量の予測指標をさらに提供する。種々の考察が、例えば、Gi
lmanら(1990編)Goodman and Gilman’s:The
Pharmacological Bases of Therapeuti
cs(第8版)Pergamon Press;およびRemington’s
Pharmaceutical Sciences(第17版)(1990)
、Mack Publishing Co.,Easton,Penn.に記載
される。投与方法は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、または筋肉内投与、経皮
拡散などについて、本明細書中および以下に議論される。薬学的に受容可能なキ
ャリアには、水、生理食塩水、緩衝液、および例えば、Merck Index
,Merck&Co.,Rahway,New Jerseyに記載の他の化合
物が挙げられる。投与量範囲は、適切なキャリアとともに、通常は1mMより低
い濃度、代表的には約10μMより低い濃度、通常は約100nMより低い濃度
、好ましくは約10pM(ピコモル濃度)より低い濃度、および最も好ましくは
約1fM(フェムトモル濃度)より低い濃度の量であると予測される。徐放性処
方物、または徐放性装置は、しばしば、連続または長期の投与に利用される。例
えば、Langer(1990)Science 249:1527−1533
を参照のこと。
そのフラグメント、およびこれらもしくはこれらのフラグメントに対する抗体、
アンタゴニスト、およびアゴニストは、処置される宿主に直接投与され得るか、
あるいは化合物のサイズに依存して、投与前にオボアルブミンまたは血清アルブ
ミンのようなキャリアタンパク質にそれらを結合体化することが望ましくあり得
る。治療処方物は、多くの従来の投与処方物中で投与され得る。活性成分が単独
で投与されることは可能であるが、薬学的処方物としてそれを提示することが好
ましい。処方物は、代表的には、その1つ以上の受容可能なキャリアとともに、
上記で定義したように、少なくとも1つの活性成分を含む。各キャリアは、他の
成分と適合可能であるという意味で薬学的かつ生理学的の両方で受容可能である
べきであり、そして患者に有害であってはならない。処方物は、経口投与、直腸
投与、経鼻投与、局所投与または非経口(皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を
含む)投与に適切なものを含む。処方物は、便利に単位投与形態で提示され得、
そして薬学の技術分野で周知の多くの方法によって調製され得る。例えば、Gi
lmanら(1990編)Goodman and Gilman’s:The
Pharmacological Bases of Therapeuti
cs(第8版)Pergamon Press;およびRemington’s
Pharmaceutical Sciences(第17版)(1990)
、Mack Publishing Co.,Easton,Penn.;Av
isら(編、1993)Pharmaceutical Dosage For
ms:Parenteral Medications,Dekker,New
York;Liebermanら(編、1990)Pharmaceutic
al Dosage Forms:Tablets、Dekker,New Y
ork;およびLiebermanら(編、1990)Pharmaceuti
cal Dosage Forms:Disperse Systems、De
kker,New Yorkを参照のこと。本発明の治療は、他の薬剤(例えば
、他のサイトカイン(IL−6またはG−CSFまたは他のそれぞれのアンタゴ
ニストを含む)と併用されるか、あるいは関連して使用され得る。
両方が、タンパク質への結合活性について化合物をスクリーニングし得るキット
およびアッセイ方法に、特に有用である。自動化アッセイのいくつかの方法が、
短期間で数万の化合物のスクリーニングを可能にするように、近年開発されてい
る。例えば、Fodorら(1991)Science 251:767−77
3(これは、固体基材上で合成した複数の規定のポリマーによる結合親和性の試
験のための手段を記載する)を参照のこと。適切なアッセイの開発は、本発明に
よって提供されるような大量の精製された可溶性IL−12 p40/IL−B
30サイトカイン複合体の利用可能性によって、非常に容易にされ得る。
ー相互作用中の重要な残基を決定し得る。変異分析が実行されて(例えば、So
mozaら(1993)J.Exptl.Med.178:549−558を参
照のこと)、相互作用および/またはシグナル伝達において重要な特異的な残基
を決定し得る。PHD(RostおよびSander(1994)Protei
ns 19:55−72)およびDSC(KingおよびSternberg(
1996)Protein Sci.5:2298−2310)は、αヘリック
ス(H)、β鎖(E)、およびコイル(L)の二次構造予測を提供し得る。ヘリ
ックスAおよびDは、レセプター相互作用において典型的に最も重要であり、D
ヘリックスが、最も重要な領域である。
ータ)定義されると、アンタゴニストが、通常見いだされ得る。潜在的な相互作
用アナログを試験をすることは、現在、精製されたIL−12 p40/IL−
B30複合体を使用する、高度に自動化されたアッセイ法の開発の際に可能であ
る。特に、新しいアゴニストおよびアンタゴニストは、本明細書中に記載される
スクリーニング技法を使用することによって発見される。複数のIL−12 p
40/IL−B30分子についての組み合わせ結合親和性を有することが見いだ
された化合物、例えば、サイトカイン複合体の種改変体に対するアンタゴニスト
としてはたらき得る化合物が、特に重要である。
現する組換えDNA分子で安定に形質転換される真核生物または原核生物宿主細
胞を利用する。他の分子からの単離において、IL−12 p40/IL−B3
0を発現する細胞を単離し得る。このような細胞は、生存可能なまたは固定され
た形態のいずれかで、標準的な結合パートナー結合アッセイのために使用され得
る。Parceら(1989)Science 246:243−247;およ
びOwickiら(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
87:4007−4011(これらは、細胞性応答を検出するための感度の高
い方法を記載する)も参照のこと。
に対する適切な結合親和性を有する化合物についての高い処理能力のスクリーニ
ングを提供するアプローチを包含し、そしてGeysen,ヨーロッパ特許出願
第84/03564号(1984年9月13日に公開)に詳細に記載される。最
初に、多数の異なる小ペプチド試験化合物を、固体基材(例えば、プラスチック
ピンまたはいくつかの他の適切な表面)上で合成する。Fodorら(1991
)を参照のこと。次いで、すべてのピンを、可溶化した未精製のp40/IL−
B30または可溶化した精製p40/IL−B30と反応させ、そして洗浄する
。次の工程は、結合したp40/IL−B30を検出する工程を包含する。
たはアナログの分子形状の構造研究に基づき得る。エフェクターは、結合に応じ
て他の機能を媒介する他のタンパク質、または通常p40/IL−B30と相互
作用する他のタンパク質(例えば、レセプター)であり得る。どの部位が特定の
他のタンパク質と相互作用するかを決定するための1つの手段は、物理的構造決
定(例えば、x線結晶学または2次元NMR技法)である。これらは、どのアミ
ノ酸残基が、例えば、他のサイトカイン−レセプターモデルに対してモデルされ
るように分子接触領域を形成するかについてのガイダンスを提供する。タンパク
質構造決定の詳細な記載については、例えば、BlundellおよびJohn
son (1976) Protein Crystallography A
cademic Press,New Yorkを参照のこと。
ための種々の診断キットおよび方法における、p40/IL−B30タンパク質
、そのフラグメント、ペプチド、およびそれらの融合産物の使用を意図する。代
表的には、キットは、規定のp40、p40/IL−B30、またはIL−B3
0のペプチドまたは遺伝子セグメント、あるいは一方もしくは他方を認識する試
薬のいずれか(例えば、p40/IL−B30融合フラグメントまたは抗体)を
含む区画を有する。
るためのキットは、代表的に以下を含む:試験化合物;標識化合物(例えば、p
40/IL−B30に対する既知の結合親和性を有する結合パートナーまたは抗
体);p40/IL−B30の供給源(天然に存在するかまたは組換え);およ
び遊離の標識化合物から結合を放すための手段(例えば、分子の固定化のための
固相)。一旦化合物がスクリーニングされると、抗原に対して適切な結合親和性
を有するものが、それらがアゴニストまたはアンタゴニストとしてp40/IL
−B30シグナル伝達経路に作用するかどうかを決定するために、当該技術分野
で周知のように、適切な生物学的アッセイで評価され得る。組換えIL−12
p40/IL−B30融合ポリペプチドの利用可能性はまた、このようなアッセ
イを較正するための十分定義された標準を提供する。
ットは、代表的には、抗原に対する公知の結合親和性を有する標識化化合物(例
えば、結合パートナーまたは抗体)、サイトカインの供給源(天然に存在するま
たは組換え)、および遊離の標識された化合物から結合したものを分離するため
の手段(例えば、p40/IL−B30を固定するための固相)を含む。試薬を
含む区画、および説明書が、通常提供される。
ントを含む)は、p40、IL−B30、p40/IL−B30および/または
これらのフラグメントの上昇したレベルの存在を検出するための診断適用に有用
である。このような診断アッセイは、溶解物、生存細胞、固定した細胞、免疫蛍
光、細胞培養物、体液、を用い得、そしてさらに、血清中の抗原に関連する抗原
の検出などを包含し得る。診断アッセイは、均質(遊離の試薬と抗原−パートナ
ー複合体との間の分離工程なし)または不均質(分離工程あり)であり得る。種
々の市販のアッセイが存在し、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素
結合イムノソルベント検定法(ELISA)、酵素免疫検定法(EIA)、酵素
増倍免疫検定法(EMIT)、基質標識蛍光イムノアッセイ(SLFIA)など
である。例えば、Van Vunakisら(1980)Meth Enzym
ol.70:1−525;HarlowおよびLane(1980)Antib
odies:A Laboratory Manual,CSH Press,
NY;およびColiganら(編、1993)Current Protoc
ols in Immunology,Greene and Wiley,N
Y.を参照のこと。
場合、p40/IL−B30に対する抗体の存在を診断するための類似の用途を
有し得る。例えば、p40/IL−B30の過剰産生は、特に、癌または異常な
活性化または分化のような増殖性細胞状態において、異常な生理学的状態の診断
となり得る、種々の免疫学的反応の生成を生じ得る。
、キット中に供給される。本発明については、アッセイの性質に依存して、プロ
トコル、および標識、標識されたまたは標識されていない抗体または結合パート
ナー、あるいは標識されたp40/IL−B30が提供される。これは、通常、
緩衝液、安定化剤、酵素に対する基質のようなシグナル産生に必要な物質などの
ような、他の添加物と一緒である。好ましくは、このキットはまた、適切な使用
および使用後の内容物の処理の仕方の指示書を含む。代表的には、このキットは
、各有用な試薬のためのコンパートメントを有する。望ましくは、これらの試薬
が、アッセイを行うための試薬の適切な濃度を提供する水性媒体中で再構成され
得る場合、試薬は、乾燥した凍結乾燥した粉末として提供される。
なしで使用され得、あるいは種々の方法で改変され得る。例えば、標識すること
は、検出可能なシグナルを直接または間接的に提供する部分を共有または非共有
結合することによって達成され得る。これらのアッセイの多くにおいて、結合パ
ートナー、試験化合物、p40/IL−B30、またはこれらに対する抗体は、
直接または間接的に標識され得る。直接的に標識するための可能性は、以下の標
識群を包含する:125Iのような放射性標識、ペルオキシダーゼおよびアルカリ
ホスファターゼのような酵素、および蛍光強度、波長シフト、または蛍光極性化
の変化をモニタリングし得る蛍光標識(米国特許第3,940,475号)。間
接的に標識するための可能性は、1つの構成成分のビオチン化、次いで上記の標
識群の1つにカップリングしたアビジンへの結合によるものを含む。
化合物から結合したものを分離する多くの方法がある。p40/IL−B30は
、種々のマトリクス上に固定化され得、次いで洗浄され得る。適切なマトリクス
には、ELISAプレートのようなプラスチック、フィルター、およびビーズが
挙げられる。例えば、Coliganら(編、1993)Current Pr
otocols in Immunology,第1巻、第2章、Greene
and Wiley,NY.を参照のこと。他の適切な分離技法には、限定す
ることなく、Rattleら (1984) Clin. Chem. 30:
1457−1461に記載のフルオレセイン抗体磁化可能粒子方法、および米国
特許第4,659,678号に記載のような二重抗体磁性粒子分離方法が挙げら
れる。
く報告されており、本明細書中に詳細に議論する必要はない。技法の多くは、ペ
プチド結合を形成するためにカルボジイミドまたは活性エステルのいずれかの使
用による活性化されたカルボキシル基の使用、連結のためのクロロアセチルのよ
うな活性化ハロゲンまたはマレイミドのような活性化オレフィンとメルカプト基
との反応によるチオエーテルの形成などを包含する。融合タンパク質はまた、こ
れらの適用における使用を見いだす。
オチドまたはポリヌクレオチド配列の使用を包含する。これらの配列は、異常状
態、例えば、炎症または自己免疫を有する疑いのある患者からの試料においてp
40またはIL−B30メッセージのレベルを検出するためのプローブとして使
用され得る。サイトカインは活性化のマーカーまたはメディエーターであり得る
ので、これは、例えば、効果が有意になる前および効果が有意に進行する前に予
防的な様式で、例えば、いつさらなる治療を呼ぶかもしれないかを決定するため
に、活性化細胞の数を決定するのに有用であり得る。RNAヌクレオチド配列お
よびDNAヌクレオチド配列の両方の調製、その配列の標識化、およびその配列
の好ましいサイズは、文献において広い説明および議論を受け入れている。例え
ば、Langer−Saferら(1982)Proc.Natl..Acad
.Sci.79:4381−4385;Caskey(1987)Scienc
e 236:962−967;およびWilchekら(1988)Anal.
Biochem.171:1−32を参照のこと。
、意図される。診断または予後は、マーカーとして使用される多数の指標の組み
合わせに依存し得る。従って、キットは、マーカーの組み合わせについて試験し
得る。例えば、Vialletら(1989) Progress in Gr
owth Factor Res. 1:89−97を参照のこと。他のキット
が、他の細胞サブセットを評価するために使用され得る。
を単離するための方法が存在する。Gearingら(1989)EMBO J
.8:3667−3676を参照のこと。例えば、レセプターへの結合を妨害す
ることなくIL−B30サイトカインを標識するための手段が、決定され得る。
例えば、アフィニティー標識が、リガンドのアミノ末端またはカルボキシ末端の
いずれかに融合され得る。このような標識は、FLAGエピトープタグまたは例
えば、IgもしくはFcドメインであり得る。発現ライブラリーは、細胞分類に
よってか、またはこのような結合成分を発現する亜集団を検出するための他のス
クリーニングによって、サイトカインの特異的結合に関してスクリーニングされ
得る。例えば、Hoら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 90:11267−11271;およびLiuら(1994)J.Imm
unol.152:1821−29を参照のこと。あるいは、パニング方法が使
用され得る。例えば、SeedおよびAruffo(1987)Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 84:3365−3369を参照のこと。
カイン複合体の結合パートナーが単離され得る。これは、例えば、リガンド−レ
セプター様形式でサイトカインと特異的に相互作用するタンパク質の同定を可能
にする。
p40/IL−B30に対する応答に関与するか否かが決定される。これらの機
能レセプター複合体がp40/IL−B30レセプター複合体と、特異的レセプ
ターサブユニットもしくはアクセサリーレセプターサブユニットのいずれかと、
多くまたは全ての成分を共有することはまた、かなり可能性がある。
なくなされ得、同様に当業者に明らかである。本明細書中に記載される特定の実
施形態は、例示目的のためのみに提供され、そして本発明は、特許請求の範囲が
与えられるものと等価物な完全な範囲と共に、このような添付の特許請求の範囲
の用語によってのみ制限される。
niatisら(1982)Molecular Cloning,A Lab
oratory Manual,Cold Spring Harbor La
boratory,Cold Spring Harbor Press,NY
;Sambrookら(1989)Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,(第二版),1−3巻、CSH Pre
ss,NY;Ausubelら,Biology,Greene Publis
hing Associates,Brooklyn,NY;Ausubelら
(1987および増刊)Current Protocols in Mole
cular Biology,Wiley/Greene,New York;
Innisら編(1990)PCR Protocols:A Guide t
o Methods and Applications Academic
Press,NY;Bonifacinoら、Current Protoco
ls in Cell Biology Wiley,NY;ならびにDoyl
eら、CellおよびTissue Culture:Laboratory
Protocols Wiley,NY。タンパク質の精製方法には、硫酸アン
モニウム沈殿、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化等の方
法が挙げられる。例えば、Ausubelら(1987および定期増刊);De
utscher(1990)「Guide t Protein Purifi
cation」Methods in Enzymology 第182巻およ
びこのシリーズの他の巻;Coliganら(1995および増刊)Curre
nt Protocols in Protein Science John
Wiley and Sons,New York,NY;Matsudai
ra編(1993)A Practical Guuide to Prote
in and Peptide Purification for Micr
osequencing,Academic Press,San Diego
,CA;ならびにタンパク質精製製品の使用に関する製造業者の文献(例えば、
Pharmacia,Piscataway,N.J.またはBio−Rad,
Richmond,CA)を参照。組換え技術を併用することにより、適切なセ
グメント(例えば、タグ)(例えば、プロテアーゼ除去配列により融合され得る
FLAG配列または等価物)に融合させる。例えば、Hochuli(1990
)「Purification of Recombinant Protei
ns with Metal Chelate Absorbent」Setl
ow(編)Genetic Engineering,Principle a
nd Methods 12:87−98,Plenum Press,N.Y
.;およびCroweら(1992)OIAexpress:The High
Level Expression & Protein Purifica
tion System QIAGEN,Inc.,Chatsworth,C
Aを参照。
s Computer Group(GCG)、Madison、WI、NCB
I(NIH)、ならびにGenBank、NCBI、EMBO、および他の公の
配列の供給源からのものを含む利用可能なソフトウエアプログラムを使用して、
コンピューター配列分析を行う。他の分析供給源としては、例えば、RASMO
Lプログラム(Bazanら(1996)Nature379:591;Lod
iら(1994)Science 263:1762−1766;Sayleお
よびMilner−White(1995)TIBS20:374−376;お
よびGronenbergら(1991)Protein Engineeri
ng4:263−269を参照のこと);ならびにDSC(KingおよびSt
ernberg(1996)Protein Sci.5:2298−2310
を参照のこと)が挙げられ得る。また、Wilkinsら編(1997)Pro
teome Research:New Frontiers in Func
tional Genomics Springer−Verlag,NY;S
alzbergら編(1998)Computational Methods
in Molecular Biology Elsevier,NY;およ
びBirrenら編(1997)Genome Analysis:A Lab
oratory Manual Cold Spring Harbor Pr
ess,Cold Spring Harbor,NYを参照のこと。
gら編(1996)Weir’s Handbook of Experime
ntal Immunology 第1〜4巻、Blackwell Scie
nce;Coligan(1991および最新版)Current Proto
cols in Immunology Wiley/Greene,NY;お
よびMethods in Enzymology 第70、73、74、84
、92、93、108、116、121、132、150、162、および16
3巻。サイトカインアッセイが、例えば、以下に記載される:Thomsonら
(1994)The Cytokine Handbook(第2版)Acad
emic Press,San Diego;MetcalfおよびNicol
a(1995)The Hematopoietic Colony Stim
ulating Factors Cambrige University
Press;ならびにAggarwalおよびGutterman(1991)
Human Cytokines Blackwell Pub。
、腫瘍、または他の組織(例えば、動脈性平滑筋増殖(例えば、Koyomaら
(1996)Cell87:1069−1078)を参照のこと)における血管
形成活性および血管拡張活性、血管上皮へのモノサイト接着(McEvoyら(
1997)J.Exp.Med.185:2069−2077を参照のこと)な
どをカバーする。また、Ross(1993)Nature362:801−8
09;RekhterおよびGordon(1995)Am.J.Pathol
.147:668−677;Thybergら(1990)Aheroscle
rosis10:966−990;ならびにGumbiner(1996)Ce
ll84:345−357を参照のこと。
Wouterlood編(1995)Neuroscience Protoc
ols modules10、Elsevier;Mehods in Neu
rosciences Academic Press;およびNeurome
thods Humana Press,Totowa,NJ。発育系の方法論
は、例えば、以下に記載される:Meisami(編)Handbook of
Human GrowthおよびDevelopmental Biolog
y CRC Press;ならびにChrispeels(編)Molecul
ar TechniquesおよびApproaches in Develo
pmental Biology Interscience。
w CytometryおよびSorting Wiley−Liss,Inc
.,New York,NY;Shapiro(1988)Practical
Flow Cytometry Liss,New York,NY;ならび
にRobinsonら(1993)Handbook of Flow Cyt
ometry Methods Wiley−Liss,New York,N
Y。
である。IL−B30遺伝子の配列は、表1に提供されている。この配列は、ゲ
ノムヒト配列から誘導される。
プローブの調製を可能にする。この配列は、メッセージをコードするゲノムDN
Aの単離を可能にする。
胞分布を決定するためにプローブされる。PCR産物を、例えば、TAクローニ
ングキット(Invitrogen)を使用してクローニングされる。この得ら
れたcDNAプラスミドは、自動配列決定装置(Applied Biosys
tems)において両末端から配列決定される。
マーを調製する。代表的に、このプローブを、例えば、ランダムプライミングに
より標識する。両方のサブユニットの協調発現が最も重要であり、ここで、p4
0/IL−B30複合体が興味深い。
サイトカインまたは複合体を発現するものに対してスクリーニングする。あるい
は、組換え構築物の組合せが作製され得る。種々の細胞株をスクリーニングし、
そして処置の際にそれらの都合の良い特性について選択した。その後、個々のサ
ブユニットの個々の単離および組合せにより、いくつかのダイマー形成が得られ
得る。天然のIL−B30を、天然源から、または適切な発現ベクターを使用す
る形質転換された細胞からの発現により単離され得る。アデノウイルス構築物を
また、産生/発現のために使用し得る。
るか、または細胞溶解物または上清から高い効率で効率的な精製のための操作手
段と組み合わせられ得る。特に、p40とIL−B30の融合は、適切なリンカ
ーを用いるかまたは用いることなく、処理または精製のための高度に効率的な方
法で得られ得る。FLAGまたはHis6セグメントは、このような精製機能の
ために使用され得る。あるいは、親和性クロマトグラフィーは、以下に参照され
るように特定の抗体と共に使用され得る。
いて産生される。
ナル抗体を産生するための免疫系に存在する。例えば、Coligan(199
1)Current Protocols in immunology Wi
ley/Greene;およびHarlowおよびLane(1989)Ant
ibodies:A Laboratory Manual Cold Spr
ing Harbor Pressを参照のこと。免疫選択または除去方法は、
得られた抗体が、個々の成分自体によって提示される抗体決定と異なる、ポリペ
プチドの複合体によって提示された抗体決定に対して特異的であることを保証す
るように適用され得る。ポリクローナル血清、またはハイブリドーマが、調製さ
れ得る。適切な状況において、この結合剤は、上記(例えば、蛍光など)のよう
に標識されるか、または方法をパニングするために基質に免疫化されるかのいず
れかでえある。免疫選択、免疫除去、および関連する技術は、例えば、2個のサ
ブユニット間の複合体に対して所望される場合、選択薬剤を調製するために利用
される。
た。このIgドメインは、タンパク質Aに結合し、そしてこのポリペプチドを沈
殿させ得る。IL−B30Etag(N末端のFLAGモチーフで標的されたエ
ピトープ)構築物をまた調製した。このポリペプチドは、M2抗体で免疫沈降可
能である。この発現構築物を、IL−12 p40−Ig構築物単独、IL−B
30Etag構築物単独、または両方一緒のいずれかで293T細胞に形質転換
した。細胞を、35Sメチオニンを用いて標識した。IL−12 p40構築物単
独を用いると、可溶性タンパク質は、タンパク質Aを使用する細胞上清中で検出
されなかった。同様に、FLAG−IL−B30構築物を用いると、可溶性タン
パク質は、M2抗体を使用する細胞上清中で検出されなかった。しかし、この2
つの発現構築物の同時形質移入を用いると、この細胞上清により、タンパク質A
薬剤またはM2抗体のいずれかと共に沈殿する可溶性複合体が産生された。この
複合体のPEGE分析により、タンパク質A沈殿複合体は、2つの予測されたポ
リペプチドIL−12 p40−Ig融合およびFLAG−IL−B30ポリペ
プチドに対応するポリペプチドから作製されることが明らかとなった。対応して
、M2抗体で沈殿した複合体は、FLAG−IL−B30ポリペプチドおよびI
L−12 p40−Ig融合タンパク質から作製された。
を用いた同様の実験により、予測された結果が得られた。FLAG−IL−B3
0構築物を用いる形質移入では、有意な可溶性タンパク質が得られなかった。両
方の発現ベクターの霊長類細胞への同時形質移入により、M2抗体と免疫沈降し
た複合体の効果的な分泌物が得られた。得られた複合体のPAGE分析により、
この複合体がFLAG−IL−B30ポリペプチドおよびIL−12−p40ポ
リペプチドから作製されることを確認した。
から作製される。p40/IL−B30の融合構築物は、レセプターサブユニッ
トβ1を発現する細胞と結合する。
ユニットβ1(サブユニットβ2ではない)との結合を遮断し得る。このp40
サブユニットは、p40/IL−B30複合体の成分であるので、IL−12レ
セプターサブユニットβ1が、p40/IL−B30の融合構築物に対するレセ
プター成分であり得るかどうかを試験した。IL−12レセプターサブユニット
β1に対する抗体は、レセプターサブユニットβ1を発現する細胞と融合タンパ
ク質との結合を遮断する。このp40/p70複合体に対する抗体(主に、p4
0サブユニットを認識する)は、p40/IL−B30組成物の効果を遮断し得
、このp40成分は、レセプター相互作用において重要であることを示唆する。
これらの観測は、レセプターβ1がp40/IL−B30融合構築物と結合する
ことを示唆する。関連するレセプターの中で共有されている共通のgp130サ
ブユニットの関与を試験する同様の実験によると、このgp130は、p40/
IL−B30に対するレセプターと関連するサブユニットではないことを示唆す
る。
開始する。1つのサブユニットを発現するが、結合を示さない細胞を、さらなる
サブユニットを発現クローニングするために使用する。他のレセプターサブユニ
ットβ2ホモログがスクリーニングされる。あるいは、適切な細胞からのライブ
ラリーが、標準的な発現クローニング方法において使用され得る。
−6とG−CSFとの間の配列および構造相同性に基づいて試験する。最初に、
IL−6またはG−CSFの生物学的活性を示したアッセイについて試験した。
アッセイは、組換え複合体または融合構築物のいずれかにおいて実施した。融合
構築物は、IL−B30の成熟配列に融合した適切な長さのser/gly富化
リンカー配列に融合した成熟IL−12 p40配列に融合したN末端FLAG
エピトープに結合したIL−12 p40シグナル配列を有する構築物からなる
。この構築物の両方は、十分に発現し、分泌され、そしてエピトープタグは、精
製および局在化の両方を可能にする。マウスおよびヒトの両方の配列形態が、産
生された。個々のポリペプチドおよび融合タンパク質の両方のアデノウイルス発
現構築物がまた、利用可能となる。
胞、プレ−B細胞、プレ−T細胞、および繊維芽細胞型が挙げられる。例えば、
マクロファージ/単球細胞を、細胞表面マーカーの変化(例えば、MHCクラス
II、B7、CD40、および関連ファミリー);サイトカインおよびケモカイ
ンの産生;ならびに抗原提示能について評価する。CD4+T細胞、両方のネイ
ティブCD45Rbhiおよび記憶CD45RblowT細胞を、例えば、増殖およ
び活性マーカーについて、およびエフェクター機能(例えば、サイトカインおよ
びケモカインの産生)についてアッセイする。細胞傷害CD4+、CD8+およ
びNK細胞が、産生および機能の効果について評価される。抗体産生の効果は、
例えば、脾臓細胞およびMLN B細胞について試験される。樹状細胞は、ファ
クター産生を含む、産生、成熟、および機能について評価される。アポトーシス
アッセイがまた、展開される。
ter培地)の調節おける効果について、ストローマ細胞およびB細胞前駆体の
産生および分化(Whitlock−Witte培地)の調節について、ならび
に初期骨髄群およびBリンパ群を調節するための潜在性の評価について試験され
る。
投薬応答分析を、関連するサイトカインIL−6、G−CSFなどと組合せて実
施する。サイトセンサーマシン(cytosensor machine)が使
用され得、これにより細胞の代謝および増殖を検出する(Molecular
Devices,Sunnyvale,CA)。
を、抗−CD3または抗−CD3と抗−CD28の両方を用いて刺激した。抗−
CD3刺激は、必須であるようである。ヒトp40/IL−B30融合タンパク
質はまた、活性化したTh1またはTh2細胞クローンの増殖を増強するが、活
性化していないTh1またはTh2細胞クローンはそうではない。
融合タンパク質は、抗−CD3で刺激した場合に、CD4+CD45RblowC
Di62LlowCD44hi細胞(記憶/活性化したT細胞)の増殖を支持した。
融合タンパク質による刺激は、抗−CD28同時刺激によって増強されない。こ
れは、IL−2の存在にほとんど依存しない。このことは、p40/IL−B3
0が、記憶表現型を有する細胞群を展開し、そして/または免疫性記憶を産生ま
たは維持するための重要な因子であり得ることを示唆する。このサイトカインは
、Th1表現型(例えば、IFNγ(IL−4またはIL−5ではない)を産生
する細胞)を含む活性化記憶細胞を選択的に支持するようである。
らを、抗CD3および抗IL−2の存在下で、そしてCD32、CD58、およ
びCD80を発現する照射した線維芽細胞とともに例えば、2週間培養し、それ
によってT細胞を活性化し、かつ増殖した。T細胞培養物を、増殖または分化に
対する種々のサイトカインの効果について評価した。個々の細胞を、FACS分
析によってサイトカイン産生について評価した。p40/IL−B30融合タン
パク質は、IFNγを産生し、IL−4を産生しない(Th1細胞に特徴的なサ
イトカイン発現プロフィール)T細胞の増殖および分化を支持した。
精製する。簡単には、3×108個のフィコール帯単核細胞(ficoll b
anded mononuclear cell)を、例えば、200μlのα
CD2(Leu−5A)、200μlのαCD3(Leu−4)、100μlの
αCD8(Leu2a)、100μlのαCD19(Leu−12)、100μ
lのαCD20(Leu−16)、100μlのαCD56(Leu−19)、
100μlのαCD67(IOM 67;Immunotech,Westbr
ook,ME)、および抗グリコホリン抗体(10F7MN,ATCC,Roc
kvile,MD)からなるモノクローナル抗体(Becton−Dickin
son;Mountain View,CA)のカクテルとともに氷上でインキ
ュベートする。抗体結合細胞を洗浄し、次いでヒツジ抗マウスIgG結合体化磁
気ビーズ(Dynal,Oslo,Norway)とともに(20:1のビーズ
対細胞の比)、インキュベートする。抗体結合細胞を、磁場の適用によって単球
から分離する。その後、ヒト単球を、IL−B30、IL−6,G−CSFまた
は組み合わせの非存在下または存在下で1%ヒトAB血清を含むYssel培地
(Gemini Bioproducts,Calabasas,CA)におい
て培養する。
ば、2×105個の精製したヒト単球を、1%ヒト血清を含むリン酸緩衝化生理
食塩水(PBS)中で、氷上で20分間インキュベートする。細胞を200×g
でペレット化する。細胞を、20mlのPEまたはFITCで標識したmAb中
に再懸濁する。さらに氷上で20分間インキュベーション後、細胞を、1%ヒト
血清を含むPBSにおいて洗浄し、続いてPBS単独で2回洗浄する。細胞を、
1%パラホルムアルデヒドを含むPBSにおいて固定し、そしてFACScan
フローサイトメーター(Becton Dickinson;Mountain
View,CA)で分析する。例示的なmAb(例えば、Becton−Di
ckinsonのCD11b(抗mac1)、CD11c(a gp150/9
5)、CD14(Leu−M3)、CD54(Leu 54)、CD80(抗B
B1/B7)、HLA−DR(L243)ならびにCD86(FUN 1;Ph
armingen)、CD64(32.2;Medarex)、CD40(mA
b89;Schering−Plough France) )を使用する。
ロウイルス発現物質)の非存在下または存在下で1%ヒトAB血清を含むYss
el培地(Gemini Bioproducts,Calabasas,CA
)において培養する。さらに、単球を、IL−B30の非存在下または存在下で
LPS(E.coli 0127:B8 Difco)を用いて刺激し、そして
細胞培養上清中のサイトカイン(IL−1β、IL−6、TNFα、GM−CS
F、およびIL−10)の濃度をELISAによって決定する。
LPS(E.coli 0127:B8 Difco)ならびに10mg/ml
のBrefeldin A(Epicentre technologies
Madison WI)の非存在下または存在下でYssel培地において12
時間培養する(100万個/ml)。細胞をPBSにおいて洗浄し、そしてRT
で20分間2%ホルムアミド/PBS溶液においてインキュベートする。その後
、細胞を洗浄し、透過化緩衝液(PBS/BSA(0.5%)/Azide(1
mM)中0.5%サポニン(Sigma))中に再懸濁し、そしてRTで20分
間インキュベートする。細胞(2×105個)を遠心分離し、そしてRTで20
分間、透過化緩衝液において10倍に希釈された20mlの直接結合体化抗サイ
トカインmAb中に再懸濁する。以下の抗体が使用され得る:IL−1α−PE
(364−3B3−14);IL−6−PE(MQ2−13A5);TNFα−
PE(MAb11);GM−CSF−PE(BVD2−21C11);ならびに
IL−12−PE(C11.5.14;Pharmingen San Die
go,CA)。その後、細胞を透過化緩衝液において2回洗浄し、そしてPBS
/BSA/Azideにおいて1回洗浄し、そしてFACScanフローサイト
メーター(Becton Dickinson;Mountain View,
CA)で分析する。
てIFNγを産生した。この効果は、IL−2と相乗的であった。融合産物は、
休止T細胞、休止Th1細胞クローンまたは休止Th2細胞クローンではなくて
、活性化細胞によってIFNγ産生を促進した。
ール水溶性造影剤を通じる遠心分離によって単離する。PBMCを、IL−B3
0の非存在下または存在下で96ウェルプレート(Falcon,Becton
−Dickinson,NJ)において1%ヒトAB血清を含む200μl Y
ssel培地(Gemini Bioproducts,Calabasas,
CA)中で培養する。細胞を、培地単独か、または100U/ml IL−2(
R&D Systems)と組み合わせた培地中で120時間培養する。3H−
チミジン(0.1mCi)を培養の残り6時間の時に添加し、そして3H−チミ
ジン取り込みを、液体シンチレーション計測することによって決定した。
他の生物学的アッセイ系におけるアゴニスト活性およびアンタゴニスト活性につ
いて、例えば、T細胞、B細胞、NK、マクロファージ、樹状細胞、造血細胞前
駆体などに対して試験する。IL−6およびG−CSFの構造相関のために、こ
れらの活性に関連するアッセイを、分析するべきである。
質転換細胞およびコントロールに対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活
性について評価する。例えば、Hoら(1993)Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 90,11267−11271;Hoら(1995)Mo
l.Cell.Biol.15:5043−5053;およびLiuら(199
4)J.Immunol.152:1821−1829を参照のこと。
ッセイ、抗原または同種異系刺激に応答するT細胞サイトカイン産生および増殖
における効果について評価する。例えば、de Waal Malefytら(
1991)J.Exp.Med.174:1209−1220;de Waal
Malefytら(1991)J.Exp.Med.174:915−924
;Fiorentinoら(1991)J.Immunol.147,3815
−3822;Fiorentinoら(1991)J.Immunol.146
:3444−3451;およびGrouxら(1996)J.Exp.Med.
184:19−29を参照のこと。
アッセイは、例えば、Hsuら(1992)Internat.Immunol
.4:563−569;およびSchwarzら(1994)J.Immuno
ther.16:95−104に基づき得る。
J.Exp.Med.175:671−682;Roussetら(1992)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1890−1893に
記載の例えば、IgG2およびIgA2スイッチ因子アッセイを含む方法論によ
って分析される。
な動物は、特定の組織か、または完全な生物全体における遺伝子の過剰発現の効
果を決定するのに有用である。このようなことは、種々の段階における動物また
は特定の組織の発達に関する興味深い洞察を提供し得る。さらに、生物学的スト
レスへの種々の応答に対する効果は、上昇し得る。例えば、Hoganら(19
95)Manipulating the Mouse Embryo:A L
aboratory Manual(第2版)Cold Spring Har
bor Laboratory Pressを参照のこと。
能である。例えば、Hittら(1997)Adv.Pharmacol.40
:137−195;およびQuantum Biotechnologies,
Montreal,Canadaの文献を参照のこと。動物は、種々の発達また
は生理学的に機能的な動物系に対するこの遺伝子の効果を決定するために有用で
あり得る。
してCMVエンハンサーβ−アクチンプロモーターおよびウサギβ−グロビンポ
リアデニル化シグナル(以前にNiwaら(1991)Gene 108:19
3−200によって記載された)を含む発現ベクターにクローニングした。ベク
ター配列からの導入遺伝子の分離は、Mannら(1993)「Factor
Influencing Production Frequency of
Transgenic Mice」、Methods in Enzymolo
gy 225:771−781によって記載される帯状スクロース勾配遠心分離
によって達成された。導入遺伝子を含む画分をプールし、Microcon−1
00フィルターを介してマイクロ遠心分離し、そして微量注入緩衝液(5mM
Tris−HCl(pH7.4)、5mM NaCl、0.1mM EDTA)
で5回洗浄した。
)、5mM NaCl、0.1mM EDTA)中に最終濃度が1〜5ng/m
lになるように再懸濁し、卵([C57BL/6J×DBA/2]F1;The
Jackson Laboratory)中に微量注入した。次いで、Hog
anら(1994)Manipulation of the Mouse E
mbryo,Plainview,NY,Cold Spring Harbo
r Laboratory Pressによって公開された手順に従って、IC
R(Sprague−Dawley)養母の卵管に移した。生存から10日目に
、得られる動物の尾部の小片を、DNA分析のために切り取った。トランスジェ
ニック創始体の同定を、以前にLiraら(1990)Proc.Natl.A
cad.Sci.USA,87:7215−7219によって記載されたポリメ
ラーゼ連鎖反応(PCR)分析によって実施した。IL−B30トランスジェニ
ックマウスの同定は、マウス尾部DNAの増幅によって達成された。内因性LD
L遺伝子のための増幅反応プライマーのための内部コントロールとして使用した
。このプライマーは、IL−B30導入遺伝子の200bpセグメントおよびL
DL遺伝子の397bpセグメントを増幅する。PCR条件は以下の通りであっ
た:95℃、30秒;60℃、30秒;72℃、60秒を30サイクル。トラン
スジェニック動物を、無病原体条件下に保持した。
TX)の詳説に従って、RNA STAT−60を用いて組織から抽出した。全
RNA(20mg)を変性し、Biotrans membrane(ICN
Biomedicals,Costa Mesa,CA)上にブロットした。導
入遺伝子発現を、ハイブリダイゼーションによって評価し、L−30 cDNA
(Stratagene,La Jolla,CA)を無作為に標識した。全R
NAを、マウスヘモペキシン遺伝子、マウスα−1酸グリコタンパク質遺伝子、
およびマウスハプトグロビン遺伝子の無作為に標識したPCRセグメントとハイ
ブリダイズさせることによって急性期肝臓遺伝子発現を評価した。
行った。マウスIL−2(感受性<3pg/ml)、マウスIL−1b(感受性
<3pg/ml)、マウスIFN−γ(感受性<2pg/ml)およびマウスT
NF−α(感受性<5.1pg/ml)のためのELISAキットを、R &
D systems(Minneapolis,MN)から購入した。マウスI
L−6 ELISAキット(感受性<8pg/ml)を、Biosource
International(Camarillo,CA)から購入した。マウ
スIL−1α ELISAキット(感受性<6pg/ml)を、Endogen
(Cambridge,MA)から購入した。
gen(San Diego,CA)から購入した抗体対を用いて、製造業者の
ガイドラインに従って行った。抗マウスIgM(クローン11/41)、抗マウ
スIgA(クローンR5−140)、抗マウスIgG1(クローンA85−3)
、抗マウスIgG2a(クローンR11−89)および抗マウスIgG2b(ク
ローンR9−91)を、捕獲抗体として使用した。精製したマウスIgM(クロ
ーンG155−228)、IgA(クローンM18−254)、IgG1(クロ
ーン107.3)、IgG2a(クローンG155−178)およびIgG2b
(クローン49.2)を使用して、標準曲線を作製した。ビオチン抗マウスIg
M(クローンR6−60.2)、ビオチン抗マウスIgA(クローンR5−14
0)、ビオチン抗マウスIgG1(クローンA85−1)、ビオチン抗マウスI
gG2a(クローンR19−15)およびビオチン抗マウスIgG2b(クロー
ンR12−3)を検出抗体として使用した。
chols Institute,San Juan Capistrano,
CA)によって提供される指示に従って、酸−エタノール抽出された後にマウス
IGF−1をまた認識する、ヒトIGF−1についての市販のラジオイムノアッ
セイを用いて決定した。
%リン酸緩衝化ホルマリン中に浸すことによって固定するかのいずれかを行った
。ホルマリン固定組織を、慣用的に5mmに処理し、そしてヘマトキシリン−エ
オシン(H & E)を用いて染色した。免疫染色に関して、急速凍結部分をア
セトンで固定し、そして風乾した。
ner Systems,Becton Dickinson,Rutherf
ord,NJ)に眼窩下洞から収集した。血液学的な値を、自動化システム(A
bbot Cell−Dyn 3500,Abbot Park,IL)を用い
て決定した。過度な凝集または過度に大きな血小板のために機器が正確な血小板
数を提供できない場合、血小板計数を手動によって行った。血液スミアを、自動
化染色機(Bayer Hema−Tek 2000,Elkhart,IN)
を用いて、改変されたライト−ギームザ染色(Hema−Tek Stain
Pack,Bayer Corp.,Elkhart,IN)で染色し、そして
未成熟細胞および血小板、赤血球、および白血球形態学について手動で試験した
。
によって骨髄を排出した。骨髄細胞を、一度洗浄し、そして致命的に照射した(
1000RAD)レシピエントマウスにi.v.注射した。
ニックマウスにおいてNiwaら(1991)Gene 108:193−20
0によって記載されたCMVエンハンサー/アクチンプロモーターの制御下で発
現させた。このエンハンサー/プロモーターカセットは、高レベルの導入遺伝子
の発現を主に骨格筋および膵臓に指向するが、この導入遺伝子は、実質的に全て
の生物および細胞において発現され得る。Liraら(1990)Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 87:7215−7219を参照のこと。
成長阻害動物であった。IL−B30トランスジェニックマウスの体重の増加速
度は、広範に変化したが、コントロール同腹子において見出された体重よりも明
らかに低かった。IL−B30トランスジェニックマウスおよびコントロール同
腹子の筋肉または皮膚のいずれかから抽出されたRNAのノーザンブロット分析
は、IL−B30 cDNAにハイブリダイズした。これは、IL−B30 m
RNAが、全てのIL−B30トランスジェニックマウスの筋肉および皮膚の両
方において検出されたが、コントロール同腹子においては検出されなかったこと
を示した。これは、成長阻害された成長がIL−B30の発現と常に関係してい
たことを実証した。
存し、そして阻害された成長、腹部膨脹症、乱れた柔皮、不妊症、および突然死
によって示されるようにIL−B30の発現によって影響した。このように、I
L−B30のトランスジェニック発現は、IL−B30トランスジェニック子孫
の産生を妨害する表現型を生じた。ここで示された結果は、IL−B30トラン
スジェニック創始マウスの予備的分析から導かれる。
って、複数部位(肺、皮膚、食道、小腸および肝臓(胆管)、大腸、および膵臓
を含む)における最少から温和な炎症が、明らかになった。炎症性浸潤は、好中
球、リンパ球、および/またはマクロファージからなった。皮膚における炎症は
、数匹のマウスにおいて、表皮肥厚および/または潰瘍と関連した。肺において
、気管支周囲の単核細胞浸潤は、ときどき顕著であり、肺胞壁は、増化した数の
白血球を含み、そして内皮の内層気道は、過形成であった。最小の門脈周囲の単
核細胞浸潤がまた、肝臓において一般的であった。リンパ節の皮質は、しばしば
、散在した細胞性かつ欠損した小胞性の発達であった。
は、脾臓において特に顕著であった。3匹のトランスジェニックマウスおよび1
匹のコントロールマウス由来の脾臓を、T細胞(抗−CD3)、B細胞(抗−B
220)、およびマクロファージ(抗−F4/80)に関して免疫組織学的染色
後試験した。トランスジェニックマウスにおいて、CD3陽性細胞、B220陽
性細胞、およびF4/80陽性細胞が、これらの正常な位置に存在した。しかし
、白色脾髄は、赤色脾髄中でEMHによって分離され、そして赤色脾髄内で陽性
に染色される細胞は、低い強度で染色された造血細胞が散在するか、または種々
の抗体を用いて陽性に染色されなかった。これらの観察は、IL−30のトラン
スジェニック発現がEMHと関連する全身性炎症を誘導することを示す。
めに、完全な血液分析を実行した。IL−B30トランスジェニックマウスの血
液中の好中球数は、コントロール同腹仔中の最も高い好中球数に対して3〜11
倍増加した。末梢血好中球における増加は、炎症に典型的であり、そして種々の
組織で感察された好中球浸潤と相関する。従って、骨髄系(顆粒球)/赤血球系
の割合は、骨髄において増加した。
30トランスジェニックマウスにおいて3倍まで増加した。増加した数の血小板
は、増加した数の巨核球、または巨核球による血小板の産生における増加のいず
れかに由来し得た。いずれかの可能性を試験するために、IL−B30トランス
ジェニックマウス由来の末梢血、骨髄および脾臓を、顕微鏡分析した。末梢血に
おいて、血小板の奇異な形態(伸長しそして紡錘形態の血小板を含む)が、頻繁
に検出された。数匹のマウスの骨髄および脾臓において、巨核球は、細胞質量の
増加に起因して拡大していた。対照的に、骨髄および脾臓において、巨核球の数
が増加しなかった。これは、IL−B30が、巨核球による血小板産生を加速す
ることによって、血小板の数の増加を誘導することを示唆する。
および明らかな変化する程度の再生をともなって、温和から中程度の小球性低色
素性貧血をうけた。ヘマトクリット値は、コントロール平均よりも30〜70%
低かった。小球性低色素性貧血の存在は、ヘモグロビン産生における欠損を示唆
する。
サイトカインの変更された発現と関連するか否かを試験するために、本発明者ら
は、末梢血中のIL−1、TNFα、IL−6、およびIFNγの濃度を決定し
た。試験された全てのIL−B30トランスジェニックマウスにおいて、TNF
αおよびIFNγのレベルが増加した。さらに、IL−1のレベルは、試験され
たIL−B30トランスジェニックマウスの25%で増加した。IL−B30ト
ランスジェニックマウス中で見出されたIL−1およびTNFαの濃度は、LP
Sによる急性炎症応答の誘導と関連したレベルに達した。驚くべきことに、IL
−6の発現が炎症状態下で高度に誘導され(Reineckerら(1993)
Clin.Exp.Immunology 94:174−181;Steve
nsら(1992)Dig.Dis.Sci.37:818−826)そしてT
NFα、IL−1およびIFNγによって直接誘導され得る(Helleら(1
988)Eur.J.Immunol.18:957−959)のにも関わらず
、IL−6は、IL−B30トランスジェニックマウスの末梢血中に検出されな
かった。
急性期応答を伴って炎症に対して反応する。IL−B30トランスジェニックマ
ウスが全身性炎症の表現型特徴を示すので、本発明者らは、IL−B30トラン
スジェニックマウスおよびコントロール同腹仔の肝臓における急性期遺伝子の発
現を試験した。急性期肝臓遺伝子α−1酸グリコプロテイン、ハプトグロブリン
、およびヘモペキシンは、試験された全てのIL−B30トランスジェニックマ
ウスにおいて高度に発現し、一方、これらの遺伝子の発現は、コントロール同腹
仔では検出されなかった。これは、急性期肝臓遺伝子が、IL−B30トランス
ジェニックマウスで構成的に発現されることを示す。
グロブリン合成を誘導する。免疫グロブリン合成がIL−B30トランスジェニ
ックマウスにおいて変化されたか否かを試験するために、末梢血中の免疫グロブ
リンアイソタイプの濃度を、決定した。7匹のIL−B30トランスジェニック
マウスのうちの2匹において、IgAの濃度が、コントロール同腹仔と比較した
場合、6〜9倍に増加した。さらに、IgG1、IgG2aおよびIgG2bの
濃度は、コントロール同腹仔と比較した場合、試験された全てのIL−B30ト
ランスジェニックマウスにおいて2.5〜6倍に増加した。対照的に、IgMま
たはIgEの力価における有意な増加は、試験されたいずれのIL−B30トラ
ンスジェニックマウスにおいても検出され得なかった。事実、7匹のIL−B3
0トランスジェニックマウスのうちの4匹は、顕著に減少したレベルのIgM合
成を示した。要約すると、IL−B30トランスジェニックマウスのサブセット
は、免疫グロブリンアイソタイプIgAおよびIgGの濃度において6〜9倍の
増加を示したが、免疫グロブリンアイソタイプIgMおよびIgEの濃度には、
有意な増加は検出されなかった。
roenterology 91:830−836;Laursenら(199
5)Arch.Dis.Child.72:494−497)またはトランスジ
ェニック動物におけるサイトカインの過剰発現(De Benedettiら(
1994)J.Clin.Invest.93:2114−2119)は、イン
スリン様増殖因子−1(IGF−1)の減少と関連する増殖欠損を引き起こし得
る。IL−B30トランスジェニックマウスの発育阻害された増殖がIGF−1
の減少したレベルへさかのぼり得るか否かを試験するために、トランスジェニッ
クマウスの血清サンプルを、IGF−1に関してアッセイした。試験された全て
のIL−B30トランスジェニックマウスにおいて、血清中のIGF−1の量は
、年齢の一致したコントロール同腹仔中で見出されるレベルの12〜14%であ
った。これは、IL−B30のトランスジェニック発現、ならびに生成される引
き続く炎症性応答が、IL−B30トランスジェニックマウス中のIGF−1の
減少を引き起こし、そして結果として成長障害および不妊症の原因となり得るこ
とを示唆する(Gayら(1997)Endocrinology 137(7
):2937−2947)。
泌タンパク質である。IL−B30がサイトカインとして機能するか否かおよび
離れた多器官の炎症および急性期肝臓応答を誘導し得るか否かを試験するために
、本発明者らは、IL−B30トランスジェニック骨髄を、致死的に照射された
野生型レシピエントマウスに移した。
た急性期タンパク質SAAの濃度を、移動後35日の早さでIL−B30骨髄レ
シピエント中に検出し得、そしてSAAレベルは時間が経っても増加した。末梢
血中の漸増する濃度のSAAの同時発生によって、波立った毛衣ならびに口吻お
よび喉の辺りの炎症した皮膚の出現によって判定されるように、IL−B30骨
髄レシピエントの健康は悪化した。対照的に、野生型骨髄のレシピエントは、血
液において上昇したレベルのSAAを有さず、病気のようにも見えなかった。
は、IL−B30トランスジェニック骨髄のレシピエントの骨髄および脾臓中に
検出され得たが、野生型骨髄のレシピエントの器官では検出され得なかった。I
L−B30トランスジェニックドナーの場合、皮膚、肺、肝臓および胃腸管は、
IL−B30トランスジェニック骨髄のレシピエント中で炎症であったが、野生
型骨髄のレシピエント中では炎症ではなかった。さらに急性期肝臓遺伝子(ヘモ
ペキシン、AGP−1)は、IL−B30トランスジェニック骨髄レシピエント
中で高度に発現されたが、IL−6は、血清中で検出され得なかった。これらの
結果は、IL−B30が長期の特徴を有する真のサイトカインであることを示唆
する。
た(runting)全身性炎症、不妊症および死によって特徴付けられる著し
い表現型を誘導する。IL−B30トランスジェニック動物は、肺、肝臓、皮膚
、および消化管中の炎症性細胞の浸潤を伴う全身性炎症を有する。
らは、IL−6のトランスジェニック発現のいくつかのモデルのものと著しく類
似した)を引き起こした。IL−6のトランスジェニック発現の効果またはマウ
スへの組換えIL−6の投与後と類似して、好中球浸潤および貧血が、IL−B
30のトランスジェニック発現の結果として動物中で観察された。IL−6トラ
ンスジェニック動物と同様に、IL−B30トランスジェニック創始動物の成長
障害は、これらの動物において観察される全身性炎症と関連し得る減少したレベ
ルのIGF−1に関連する。
接的な効果としてかまたはIL−1およびTNFα発現のIL−B30媒介アッ
プレギュレーションのいずれかによる、アップレギュレートされたIL−6発現
によって引き起こされ得る。IL−1およびTNFαは、IL−6の既知の誘導
因子であり、そして増加した濃度のTNFαおよびIL−1が、IL−B30ト
ランスジェニックマウスの末梢血に見出された。
かったことは、IL−B30動物の表現型がこの新規サイトカインの過剰発現に
直接関連すること、およびこれらの配列相同性によって暗示されているように、
IL−B30がIL−6と類似の生物学的活性を有することを示唆する。
およびB細胞分化を誘導する多面発現性サイトカインである。
プトグロビン、ヘモペキシンおよび血清アミロイドAタンパク質のような急性期
肝臓遺伝子を発現する。類似した表現型は、IL−6のトランスジェニック過剰
発現の効果としてまたは組換えIL−6の投与後に、マウス中で示される。さら
に、IL−B30のトランスジェニック発現は、多くの血小板が奇異な形態(伸
長した見かけ、大きなサイズ、および/または紡錘形態)を有するという点で異
常である血小板増加症を引き起した。本発明者らは、IL−B30および他のみ
調節されていないサイトカインが、正常な血小板産生に対する効果を有すること
を疑った。これはまた、IL−B30が、IL−6およびその関連物と生物学的
活性を共有することを示唆する。
ニック過剰発現は、プラスマ細胞腫を引き起こし、そしてIL−6欠損マウスは
、減少したIgG応答を示す。本発明者らは数匹のIL−B30トランスジェニ
ックマウスにおいてIgGおよびIgA産生に増加を見出したが、この知見は、
異なる創始動物間で一致しなかった。従って、潜在的なB細胞分化因子としてI
L−B20をさらに特徴付けるさらなる分析が必要である。
は、種々の組織における炎症事象と一致したが、赤血球パラメーターにおける変
化は、簡単に説明できなかった。IL−1、TNF−α、IFN−γは、通常、
慢性疾患貧血(ACD)と呼ばれる症候群(これは、一般的に、正球性貧血、正
色素性貧血、非再生(または最小限に再生性の)貧血として存在し、そして種々
の慢性炎症性疾患に見いだされる)のメディエーターである。慢性疾患貧血はま
た、数人のヒト患者において、小球性貧血、低色素性貧血として存在する。この
症候群は、改変された鉄代謝およびエリトロポイエチンに対する減少した応答に
起因する。IL−B30マウスで観察される小球性低色素性貧血は、末梢サイト
カイン濃度における増加によって示差される様に、ACDに起因する。しかし、
小球性低色素性貧血の最も一般的な原因は、鉄欠乏であり、これは、IL−B3
0マウスで見出される部分骨髄応答(再生)および血小板増加症とより一致する
。血清フェリチン、鉄および総鉄結合能力(これは、鉄欠乏貧血からACDの分
化を可能にする)の測定を含むさらなる研究は、発症したマウスから妥当な血液
を得ることが困難なことに起因して行われなかった。
IL−6発現は、通常、炎症応答の間にアップレギュレーションされる。従って
、IL−6がIL−B30トランスジェニック動物の末梢血中で検出され得なか
ったことは、驚くべきことである。これは、IL−B30が未だ同定されていな
い機構によるIL−6発現に対するネガティブ効果を有することを示唆する。実
際、IL−B30トランスジェニック動物中にIL−6がないことは、これらの
動物中で観察される高いレベルのIl−1およびTNF−αを説明し得る。なぜ
なら、IL−6は、マウス中の循環しているIL−1およびTNF−αの濃度に
ネガティブな効果を有するからである。IL−B30トランスジェニックマウス
中に観察される高い濃度の循環しているTNF−αはまた、増加した濃度のIF
N−γの結果であり得る。IFN−γは、IL−2活性化T細胞またはIL−4
活性化B細胞によって産生され、そして単球およびマクロファージにおいてTN
F−αの発現を誘導する。IFN−γの発現がIL−B30によって直接、また
はIL−B30によって誘導される他のサイトカインによって媒介されるか否か
は、決定されるべきままである。要約すると、本発明者らの結果は、IL−B3
0が、IL−6と広範な種々の生物学的活性を共有することを示唆する。これら
の生物学的活性が通常のレセプター、シグナル伝達エレメントまたはIL−6と
共有される転写因子によって媒介されるか否かは、理解されるべきままである。
これらの問題は、できれば、遺伝的アプローチまたは生化学的アプローチによっ
て進行中の実験により明確にされる。
許出願が詳細にかつ個々に、すべての目的に対してその全体が参考として援用さ
れるようにしめされるのと同じ程度に、本明細書中に参考として援用される。
なくなされ得、同様に当業者に明らかである。本明細書中に記載される特定の実
施形態は、例示目的のためのみに提供され、そして本発明は、特許請求の範囲が
与えられるものと等価物な完全な範囲と共に、このような添付の特許請求の範囲
の用語によってのみ制限される。
理機能を制御することにおいて機能するタンパク質に関連する、組成物および方
法に関する。特に、本発明は、例えば、種々の細胞型(造血系細胞を含む)の、
活性化、発生、分化および機能を調節するのに有用な、精製された遺伝子、タン
パク質、抗体、関連試薬、および方法を提供する。
主への導入を介して、その後のプロセシングのためにベクター中に組み込み、そ
れによって移入された遺伝情報が、新規な環境においてコピーおよび/または発
現される、技術をいう。一般に、遺伝情報は、所望のタンパク質産物をコードす
るメッセンジャーRNA(mRNA)に由来する相補的DNA(cDNA)の形
態において存在する。キャリアは、しばしば、宿主において後の複製のためにc
DNAを組み込む能力、および、いくつかの場合において、cDNAの発現を実
際に制御し、それによって宿主においてコードされる産物の合成を指向する能力
を有するプラスミドである。
、一連の複雑な細胞相互作用に基づくことが知られている。例えば、Paul(
1998)Fundamental Immunology(第4版)Rave
n Press,NYを参照のこと。近年の研究は、このネットワークの内部作
用についての新たな洞察を提供した。この応答の多くが、実際、リンパ球、マク
ロファージ、顆粒球、および他の細胞のネットワーク様の相互作用を中心に動く
ことは明らかなままであるが、免疫学者らは、現在、一般に、リンホカイン、サ
イトカイン、またはモノカインとして知られる可溶性タンパク質が、これらの細
胞相互作用の制御において重要な役割を果たすという意見を保持する。従って、
細胞調節因子の単離、特徴付け、および作用機構にかなりの興味があり、これら
を理解することは、多数の医学的異常(例えば、免疫系障害)の診断および治療
において重大な進歩を導く。これらの因子のいくつかは、造血系増殖因子である
(例えば、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF))。例えば、Thomson
(編、1998)The Cytokine Handbook(第3版)Ac
ademic Press ,San Diego;Mire−Sluis a
nd Thorpe,(編、1998)Cytokines Academic
Press,San Diego;MetcalfおよびNicola(19
95)The Hematopoietic Colony Stimulat
ing Factors Cambridge University Pre
ss;ならびにAggarwalおよびGutterman(1991)Hum
an Cytokines Blackwell Pubを参照のこと。この免
疫系の細胞によるサイトカイン発現が、免疫応答の調節に重要な役割を果たす。
ほとんどのサイトカインは、多面発現性であり、そして複数の生物学的活性(抗
原提示;活性化;CD4+T細胞サブセットの増殖および分化;B細胞による抗
体応答;ならびに過敏症の症状の発現を含む)を有する。さらに、サイトカイン
は、免疫系および/または造血細胞を直接または間接的に含む変性状態または異
常状態の広範な診断および治療において使用され得る。
は、多能性の造血幹細胞の増殖、成長、および/または、複合免疫系を構成する
多様な細胞系統を含む膨大な数の子孫への分化を支持することを示した。細胞成
分の間の適切なおよび釣合いのとれた相互作用は、健常な免疫応答のために必要
である。異なる細胞系統は、リンホカインが、他の薬剤と組合わせて投与される
場合、しばしば、異なる様式において応答する。
細胞(これは免疫グロブリン(外来物質を認識し、そして結合してその除去を達
成する能力を有するタンパク質)を生成および分泌し得る)、ならびに種々のサ
ブセットのT細胞(これは、リンホカインを分泌し、そしてB細胞および免疫ネ
ットワークを構成する種々の他の細胞(他のT細胞を含む)を誘導または抑制す
る)。これらのリンパ球は、他の多くの細胞型と相互作用する。
に関連する)の発見および開発は、免疫系および/または造血細胞を直接または
間接的に含む広い範囲の変性状態または異常状態の新しい治療に貢献し得ること が明らかである 。特に、公知のリンホカインの有益な活性を増強または強化する
リンホカインの発見および開発が、非常に有利である。元々、新規の遺伝子IL
−B30が、その推定構造に基づいて潜在的なサイトカインとして同定され、そ
してIL−6およびG−CSFのような長鎖サイトカインとして分類された(国
際特許出願PCT/US98/15423(WO99/05280))。IL−
6ならびにオンコスタチンM、白血病阻害因子(LIF)、毛様体神経栄養因子
(CNTF)およびカルジオトロフィン−1(cardiothorophin −1) のような関連するサイトカインが、造血、血小板新生、急性期応答の誘導
、破骨細胞形成、ニューロン分化および生存、ならびに心臓肥大に関する生物学
的活性を有する。マウスにおけるIL−B30のトランスジェニック発現が、マ
ウスにおけるIL−6の過剰発現後に観察されるのと類似の表現型(倭小、全身
性炎症、不妊および死を含む)を誘導した。IL−B30は、炎症に関わる新規
のサイトカインであるようである。
タンパク質といわれる)の生理学的役割、ならびに免疫応答における役割、の発
見に基づく。特に、IL−B30の役割は、炎症、感染性疾患、造血の発達、お
よびウイルス感染に関係する経路において、説明されている。本発明は、特に、
インターロイキン−B30(IL−B30)とのIL−12 p40サブユニト
の組み合わせを含む組成物およびそれらの生物学的活性に関する。これは、ポリ
ペプチドまたは融合タンパク質の両方をコードする核酸ならびにそれらの産生お
よび使用の方法を含む。本発明の核酸は、部分的に、本明細書中に開示される相
補的DNA(cDNA)配列に対する相同性により、および/または機能的アッ
セイにより特徴付けられる。また、ポリペプチド、抗体、およびそれらの使用の
方法(核酸発現方法を使用することを含む)も提供される。増殖因子依存性生理 機能 または免疫応答の制御における調節または干渉の方法が、提供される。
B30サイトカイン(以前に、例えば、USSN 08/900,905および
09/122,443において記載される)ともまた関連する発見に、部分的に
基づく。従って、2つのポリペプチドが一緒の同時発現は、機能的レセプター結
合およびシグナル伝達を生じる。
くとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグメントを含む、実質的に純粋なポ
リペプチドおよびIL−B30由来の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別
個のセグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドの両方;b)IL−12
p40由来の少なくとも11連続するアミノ酸を含む、実質的に純粋なポリペプ
チドおよびIL−B30由来の少なくとも11連続するアミノ酸を含む、実質的
に純粋なポリペプチドの両方;c)IL−12 p40の少なくとも7連続する
アミノ酸の複数の別個のセグメントおよびIL−B30の少なくとも7連続する
アミノ酸の複数の別個のセグメントの両方を含む実質的に純粋なポリペプチド;
またはd)IL−12 p40の少なくとも11連続するアミノ酸のセグメント
およびIL−B30の少なくとも11連続するアミノ酸のセグメントの両方を含 む実質的に純粋なポリペプチド 。種々の実施形態としては、以下のような組成物
が挙げられる:a)ここで上記少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセ
グメントが、少なくとも9連続するアミノ酸の1つのセグメントを含むか;b)
ここで、上記少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグメントが、少な
くとも9連続するアミノ酸の両方であるか;c)ここで、上記IL−12 p4
0の少なくとも11連続するアミノ酸のセグメントが、少なくとも15連続する
アミノ酸であるか;d)ここで、上記IL−B30の少なくとも11連続するア
ミノ酸のセグメントが、少なくとも15連続するアミノ酸であるか;e)水、生
理食塩水、および/または緩衝液を含む水性化合物より選択されるキャリアをさ
らに含むか;f)経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与、または非経口投与
で処方されるか;あるいはg)これは、滅菌した組成物である、組成物。他の実
施形態は、以下を含む:a)ここで、少なくとも1つの上記ポリペプチドが以下
であるか:i)検出可能に標識されるか;ii)組換え的に産生されるか;ii
i)グリコシル化されていないか;iv)変性されるか;v)固体基材に結合さ
れるか;またはvi)別の化学的部分に結合体化される;b)実質的に純粋なI
L−12 p40ポリペプチドおよび実質的に純粋なIL−B30ポリペプチド
の両方を含むか;c)IL−B30に融合されたIL−12 p40を含む、実
質的に純粋なポリペプチドを含むか;あるいはd)IL−18、IL−12、放
射線もしくは化学療法剤、免疫アジュバント、または抗ウイルス剤と組み合わさ
れる。キットの実施形態としては、上記キット中に、上記のような組成物および
a)上記ポリペプチドを含む区画;またはb)試薬の使用もしくは廃棄について
の説明書、を含むものが挙げられる。
え核酸を含む:a)IL−12 p40由来の少なくとも7連続するアミノ酸の
複数の別個のセグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドおよびIL−B3
0由来の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグメントを含む、実質
的に純粋なポリペプチド、の両方;b)IL−12 p40由来の少なくとも1
1連続するアミノ酸を含む、実質的に純粋なポリペプチドおよびIL−B30由
来の少なくとも11連続するアミノ酸を含む、実質的に純粋なポリペプチド、の
両方;c)IL−12 p40の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個の
セグメントおよびIL−B30の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個の
セグメントの両方を含む実質的に純粋なポリペプチド;またはd)IL−12
p40の少なくとも11連続するアミノ酸のセグメントおよびIL−B30の少
なくとも11連続するアミノ酸のセグメントの両方を含む実質的に純粋なポリペ プチド 。種々の実施形態としては以下のような核酸を含む:a)ここで、上記少
なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグメントが、少なくとも9連続す
るアミノ酸の1つのセグメントを含むか;b)ここで、上記少なくとも7連続す
るアミノ酸の複数の別個のセグメントが、少なくとも9連続するアミノ酸の両方
であるか;c)ここで、上記IL−12 p40の少なくとも11連続するアミ
ノ酸のセグメントが、少なくとも15連続するアミノ酸であるか;d)ここで、 上記 IL−B30の少なくとも11連続するアミノ酸のセグメントが、少なくと
も15連続するアミノ酸であるか;e)ここで上記IL−12 p40が霊長類
由来であるか;f)ここで、上記IL−B30が霊長類由来であるか;g)発現
ベクターであるか;h)複製起点をさらに含むか;i)検出可能な標識を含むか
;j)合成ヌクレオチド配列を含むか;k)6kb未満、好ましくは3kb未満
であるか;またはl)霊長類由来である、核酸。また、上記組換え核酸を含む細
胞が提供され、これには、上記細胞が、原核生物細胞、真核生物細胞、細菌細胞
、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、マウス細胞、霊長類細胞、またはヒト細
胞である、細胞が挙げられる。キットの実施形態としては、上記キット中に、以
下を含む実施形態が挙げられる:上記核酸および以下:a)上記核酸を含む区画
;b)霊長類IL−12 p40ポリペプチドをさらに含む区画;c)霊長類I
L−B30ポリペプチドをさらに含む区画;またはd)試薬の使用もしくは廃棄 についての説明書を含む、キット。
に、50℃で30分間および1M未満の塩の洗浄条件下で;ならびにb)霊長類
IL−B30の天然の成熟コード部分に、50℃で30分間および1M未満の塩
の洗浄条件下で、ハイブリダイズする、核酸を提供する。種々の実施形態として
は、上記のような核酸が挙げられ、ここで:a)IL−12 p40についての 上記 洗浄条件が、60℃および400mM未満の塩である;b)IL−B30に
ついての上記洗浄条件が、60℃および400mM未満の塩である;c)上記核
酸が、霊長類IL−12 p40をコードする配列に、少なくとも50ヌクレオ
チドのストレッチにわたる同一性を示す;ならびに/またはd)上記核酸が、霊
長類IL−B30をコードする配列に、少なくとも50ヌクレオチドのストレッ
チにわたる同一性を示す、核酸。好ましいい実施形態としては、以下のような核
酸が挙げられ、ここで:a)IL−12 p40についての上記洗浄条件が、6 5 ℃および150mM未満の塩である;b)IL−B30についての上記洗浄条
件が、65℃および150mM未満の塩である;c)上記核酸が、霊長類IL−
12 p40をコードする配列に、少なくとも90ヌクレオチドのストレッチに わたる 同一性を示す;ならびに/またはd)上記核酸が、霊長類IL−B30を
コードする配列に、少なくとも90ヌクレオチドのストレッチにわたる同一性を
示す、核酸。
えば、TNFαアンタゴニスト、IL−12アンタゴニスト、IL−10、また
はステロイド、と組み合わされる。
この抗体は、特異的にIL−12 p40/IL−B30組成物に結合し;IL
−12 p40ポリペプチドまたはIL−B30ポリペプチドのいずれにも結合
せず、上記のように、この組成物は、a)実質的に純粋なIL−12 p40ポ
リペプチドおよび実質的に純粋なIL−B30ポリペプチド両方を含む、実質的
に純粋なポリペプチドを含むか;またはb)IL−B30に融合されたIL−1
2 p40を含む、実質的に純粋なポリペプチド、を含む。他の結合化合物とし
ては、以下のような結合化合物が挙げられる:a)上記結合化合物が容器中であ
るか;b)上記結合化合物がFvフラグメント、Fabフラグメント、もしくは
Fab2フラグメントであるか;c)上記結合化合物が別の化学的部分に結合体
化されるか;またはd)上記抗体が以下:i)IL−12 p40/IL−B3
0組成物に対して惹起されるか;ii)免疫選択されるか;iii)ポリクロー
ナル抗体であるか;iv)抗原に対して少なくとも30mMのKdを示すか;v
)ビーズまたはプラスチック膜を含む固体基材に付着されるか;vi)滅菌した
組成物中であるか;もしくはvii)放射活性標識または蛍光標識を含む、検出
可能に標識されるかである、結合化合物。特定の好ましい形態としては、以下を
含む組成物が挙げられる:a)上記のような、滅菌した結合化合物;あるいはb
)上記結合化合物およびキャリアであって、ここで上記キャリアは:i)水、生
理食塩水、および/もしくは緩衝液を含む水性化合物である;ならびに/または
ii)経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与、または非経口投与で処方され
る、組成物。さらに、キットの実施形態が提供され、これは、上記キット中に、 上記結合化合物および:a)上記結合化合物を含む区画;またはb)試薬の使用
または廃棄についての説明書、を含む。
適切な条件下で霊長類IL−12 p40/IL−B30組成物を上記結合化合
物と接触させ、これによって上記複合体を形成させる工程を包含する。種々の方
法としては、以下が挙げられる:a)上記複合体が、他のサイトカインから精製
されるか;b)上記複合体が、他の抗体から精製されるか;c)上記接触工程が
、サイトカインを含むサンプルと行われるか;d)上記接触工程が、上記抗原の
定量的検出を可能にするか;e)上記接触工程が、上記抗体を含むサンプルと行
われるか;またはf)上記接触工程が、上記抗体の定量的検出を可能にする、方
法。
ンタゴニストと接触させる工程を包含する、上記細胞または組織の生理機能また
は発達を調節する、方法を提供する。1つの好ましい方法は、IL−12 p4
0/IL−B30組成物と細胞を接触させる工程を包含し、そして上記接触工程
がIFNγの産生における増加を生じる、上記細胞の生理機能または発達を調節
する。代表的には、上記細胞は、宿主生物体にあって、そして上記生物体は増強
されたTh1応答(例えば、抗腫瘍効果;アジュバント効果;抗ウイルス性効果
;または拮抗するアレルギー効果、より選択される応答)を示す。しばしば、こ
の接触工程は、IL−18;IL−12;放射線療法または化学療法;免疫アジ
ュバント;または抗ウイルス性治療、と組み合わせられる。
ニットβ1に対する抗体である。従って、本発明はまた、上記ような方法を包含
し、ここで上記接触工程は、アンタゴニストと行われ、そして上記接触工程がI
FNγの産生における相対的減少を生じる。従って、本発明は、宿主生物体中の
細胞の生理機能あるいは発達を調節する方法を提供し、上記方法は、上記アンタ
ゴニストを上記生物体に投与する工程を包含し、ここで、上記接触工程は、自己
免疫状態または慢性炎症状態、の回復を生じる。
せる方法(このような方法は、IL−12 p40を有する上記ポリペプチドを
発現する工程を包含する);またはb)霊長類IL−12 p40の分泌を増加
させる方法(このような方法は、IL−B30を有する上記IL−12 p40
を発現する工程を包含する)を提供する。好ましくは、a)上記増加が少なくと
も3倍であるか;またはb)上記発現する工程が、IL−B30およびIL−1
2 p40をコードする組換え核酸を発現する工程であるかのいずれかである。
スクリーニングする方法が提供され、記載される方法は、例えば、複合体が上記 レセプターに結合し得る条件下で、上記レセプターを発現する細胞に上記複合体
を接触させ、それにより検出可能な相互作用を形成させる工程を包含する。好ま
しくは、上記相互作用が、上記細胞中に生理学的応答を生じる。
し、記載される方法は、治療的量の、哺乳動物IL−B30タンパク質のアゴニ
スト;または哺乳動物IL−B30タンパク質のアンタゴニストと、この動物に
おける単球/マクロファージ系統細胞を接触させることを包含する。好ましい実
施形態としては、以下が挙がられる:哺乳動物IL−B30タンパク質が霊長類
タンパク質である;および/またはアンタゴニストが哺乳動物IL−B30に結
合する抗体である。特定の実施形態は、以下が挙げられる:単球/マクロファー
ジ系統細胞として、小グリア細胞または樹状細胞が挙げられるか、または動物が 、炎症、白血球増殖、神経変性、または外傷後状態の兆候または症状を示す。好
ましい実施形態としては、上記の兆候または症状が、肺組織;肝臓組織;神経組
織;リンパ性組織;骨髄性組織;膵臓;胃腸組織;甲状腺組織;筋肉組織;ある
いは皮膚組織またはコラーゲン組織である実施形態が挙げられる。
ニストである場合を含む。好ましくは、このアゴニストは、哺乳動物のIL−B
30である。
脈管炎;遅延型過敏症;皮膚移植;移植;脊髄損傷;発作;神経変性;感染疾患
;虚血;癌;腫瘍;多発性骨髄腫;キャッスルマン病;閉経後の骨粗鬆症または
IL−6関連疾患の徴候または症状を経験している場合を含む。この投与は、抗
炎症性サイトカインアゴニストまたはアンタゴニスト;鎮痛薬;抗炎症剤;また
はステロイドと組み合わされ得る。
または投与はアンタゴニストである。好ましくは、アンタゴニストは、哺乳動物
のIL−B30に結合する抗体;またはIL−B30レセプターに対する結合に
おいて哺乳動物IL−B30と競合するが、実質的にシグナル伝達しない哺乳動
物IL−B30のムテインである。種々の実施形態において、この方法は、動物
が創傷治癒または血餅形成の徴候または症状を経験している場合に適用される。
この投与は、しばしば、脈管形成因子;増殖因子(FGFまたはPDGFを含む
);抗生物質;または凝固因子と組み合わされる。
よって記憶T細胞の増殖を誘導する方法を提供する。
願が具体的にかつ個々に参考として援用されることを示したのと同程度まで、本
明細書中に参考として援用される。
ルを媒介し得る分泌分子)を作製するための哺乳動物タンパク質の対形成の記載
および教示を提供する。例えば、Paul(1998)Fundamental
Immunology(第4版)Raven Press,N.Y.を参照の
こと。特定の可溶性因子は、ヘテロダイマーポリペプチド(例えば、IL−6お
よびIL−12)から作製される。このダイマー形態(これは、生理学的形態で
あるようである)およびフラグメント、またはアンタゴニストは、例えば、レセ
プターを発現する細胞の生理学的調節において有用である。p40/IL−B3
0複合体を含む機能的サイトカインは、造血細胞(例えば、T細胞、B細胞、ナ
チュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、樹状細胞、造血前駆体などのよ
うなリンパ球を含む)に対して刺激効果または阻害効果のいずれかを有するよう
である。このタンパク質はまた、タンパク質上の種々のエピトープ(直鎖状エピ
トープまたは立体配置的エピトープの両方)に対する抗体を惹起するための抗原
(例えば、免疫原)として有用である。
、米国特許第5547852号;ScottおよびTrinchieri、米国
特許第5571515号;Gatelyら、米国特許第5650492号;Li
esehkeおよびMulligan、米国特許第5891680号;Warn
eら、米国特許第5744132号;および登録番号gbM86671、gbA
F133197、gbU16674、gbU83184、embY07762、
embY11129.1、gbM65272、gbAF007576、gbU1
9841、gbU11815、gbU57752、gbAF004024、gb
U49100、gbU19834、およびembX97019を参照のこと。I
L−B30をコードする配列は、ヒトゲノム配列から同定された。この分子は、
huIL−B30と称された。齧歯類配列(例えば、マウス由来)もまた記載さ
れた。例えば、USSN08/900,905号および同第09/122,44
3号を参照のこと。本発明は、これらの2つのポリペプチド(例えば、p40お
よびIL−B30)の組み合わせを含む組成物および両方の配列をコードする核
酸構築物を含む。この組み合わせを認識する抗体もまた提供され、そしてこの2
つのメッセージまたはポリペプチドを例えば、同等に生成する方法もまた提供さ
れる。
タンパク質をコードする。psortで推定されたシグナル配列は、おそらく約
17残基であり、そしてMetからAlaあたりにわたる。表1ならびに配列番
号1および配列番号2を参照のこと。IL−B30は、長鎖サイトカインのメン
バーの構造モチーフ特性を示す。例えば、IL−B30、G−CSF、およびI
L−6(GenBankから入手可能な配列)を比較のこと。USSN08/9
00,905および同第09/122,443号もまた参照のこと。
の分子の関連した機能を示唆する。しかし、IL−12 p40ポリペプチドと
IL−B30ポリペプチドとの会合の認識は、活性p40/IL−B30ダイマ
ーの生物学的アッセイを可能にする。IL−12 p40/IL−B30組成物
は、個々のポリペプチドの各々を示す異なるポリペプチド、またはIL−12
p40とIL−B30との融合構築物のどちらかから作製され得る。観察により
、このダイマーが、種々の細胞型(例えば、PBMC)によるインターフェロン
−γ(IFN−γ)生成を誘導し得、このことは、ダイマーが用いられる生物学
的機能を示唆する。さらに、実験により、IL−12レセプターβ1サブユニッ
トがp40/IL−B30ダイマーについてのレセプターの成分であることが示
される。
化する。これはまた、クラスIおよびクラスIIのMHC分子発現を調節し(単
球/マクロファージおよび樹状細胞上でのクラスII分子のアップレギュレーシ
ョンを含む)、そして上皮細胞、内皮細胞、および他の細胞(これらの細胞に抗
原提示させ得る)上での発現を誘導する。このサイトカインは、Th1様CD4
+ T細胞の発生を促進するが、Th2様T細胞の発生を阻害するTh1様サイ
トカインである。これは、Bリンパ球によるIL−4誘導性IgEおよびIgG
4合成の強力かつ比較的特異的なインヒビターであるが、より高い濃度では、全
ての抗体アイソタイプの生成を非特異的に阻害する。IFNγは、細胞内生物な
らびにNK細胞およびCTLにより媒介される腫瘍に対する細胞障害性得免疫応
答を増大させる。IL−12のように、IFNγは、細胞媒介性細胞障害性応答
を促進する傾向を有する一方で、アレルギー性炎症およびIgE合成を阻害する
。例えば、Karupiah(1997編)Gamma Interferon
in Antiviral Defense Chapman&Hall;J
affe(1992編)Anti−infective Applicatio
ns of Interferon−Gamma Marcel Dekker
(ISBN:0824786882);Sutterwalaら(1999)J
.Leukoc.Biol.65:543−551;Billiauら(199
8)Ann.NY Acad.Sci.856:22−32;およびGessa
niら(1998)Cytokine Growth Factor Rev.
9:117−123。
トまたはレセプターアンタゴニスト(例えば、これらは、それらそれぞれのレセ
プターに対するIL−6もしくはIL−12結合または反対の作用の媒介をブロ
ックする)として作用し得る。従って、IL−B30またはそのアンタゴニスト
は、異常な医学的状態(例えば、T細胞免疫欠損、慢性炎症、または組織拒絶の
ような免疫障害を含む)の処置において、または心血管状態または神経生理学的
状態において有用であり得る。アゴニストは、細胞媒介性免疫を増強する治療的
状況において(例えば、抗腫瘍、アジュバント、および抗ウイルス状況において
)またはアレルギー性応答を拮抗するために使用されるようである。アンタゴニ
ストは、このような増強された免疫をブロックする状況において(例えば、自己
免疫疾患または慢性炎症状態に対する細胞の寄与において)使用されるようであ
る。
の生化学的応答を媒介し得る。好ましい実施形態は、ヒト由来であるが、他の霊
長類、または他の種の対応物は、天然に存在する。他の哺乳動物種(例えば、霊
長類、イヌ、ネコおよび齧歯類)におけるさらなるタンパク質配列もまた利用可
能であるはずである。
いる。IL−12 p40およびIL−B30分子は、ともに進化しているはず
である。この2つが機能的に会合する場合、それらは、IL−12の様式でとも
に作用し得る。例えば、Trinchieri(1998)Adv.Immun
ol.70:83−243;Gatelyら(1998)Ann.Rev.Im
munol.16:495−521;およびTrinchieri(1998)
Int.Rev.Immunol.16:365−396を参照のこと。
おいて2つの高いシグナル伝達レセプターと相互作用することが予測される。こ
のことは、IL−12レセプターサブユニットβ1の場合に確認された。他の関
連レセプターは、可溶性複合体に対する結合について試験され得る。シグナル伝
達し得る種々のこれらの高いレセプターを安定に発現する一連の細胞(例えば、
BAF/3)を構築した。
(または1つの組み合わせ構築物)の上清を用いて、増殖シグナル伝達応答また
は他のシグナル伝達応答が存在するか否かを確認するために、これらの種々の細
胞を試験した。このように、サイトカインの生理学的効果の大部分は、タンパク
質の複合体に起因し得る。このように、サイトカインから生じる生物学の以下の
説明の多くは、実際に、サブユニットの組み合わせを含む複合体により生理学的
にもたらされ得る。
。IL−12 p40サブユニットとIL−B30との融合物を構築した(例え
ば、ハイパーIL−6(hyper IL−6))。例えば、Fischerら
(1997)Nature Biotechnol.15:142−145;R
akemannら(1999)J.Biol.Chem.274:1257−1
266;およびPetersら(1998)J.Immunol.161:35
75−3581;これらは、本明細書中に参考として援用される。さらに、サイ
トカイン複合体とIL−12レセプターサブユニットβ1を含むレセプターとの
適合は、サイトカイン複合体のレセプターアンタゴニストとして、そのサブユニ
ットに対する抗体の同定を可能にする。
される。このタンパク質をコードする他の天然に存在する核酸は、提供された配
列を用いて標準的な手順(例えば、PCR技術、すなわち、ハイブリダイゼーシ
ョンにより)により単離され得る。これらのアミノ酸配列(アミノからカルボキ
シまで提供される)は、このタンパク質抗原を他のタンパク質から区別し、そし
て多くの改変体を例示することを可能にするサイトカインサブユニットについて
の配列情報を提供することにおいて重要である。さらに、このペプチド配列は、
セグメントを認識する抗体を生成するためのペプチドの調製を可能にし、そして
ヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドプローブの調製を可能にする。これら
の両方は、このような配列をコードする遺伝子の検出または単離(例えば、クロ
ーニング)のためのストラテジーである。
ク質の状況で用いられる場合、配列番号2に由来する可溶性ポリペプチドに対応
するアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。それらの重要なフラグメントは、
しばしば、類似の機能(例えば、抗原性)を保持する。好ましい実施形態は、複
数の異なる(例えば、重複しない)特定の長さのセグメントを含む。代表的には
、複数とは、少なくとも2、より通常には、少なくとも3、そして好ましくは、
5、7、またはそれ以上ですらある。最小限の長さが記載されるが、種々のサイ
ズのより長い長さは、適切であり得る(例えば、長さ7のうちの1および長さ1
2のうちの2)。類似の特徴は、IL−12 p40ポリペプチドに適用し、そ
していずれかまたは両方のポリヌクレオチドに適用する。
0複合体に高親和性(少なくとも約100nM、通常には、約30nMより良好
、好ましくは、約10nMより良好、およびより好ましくは、約3nMより良好
)で結合する。対応タンパク質複合体は、ヒト以外の哺乳動物種(例えば、他の
霊長類、有蹄類または齧歯類)において見出される。非哺乳動物種はまた、構造
的にまたは機能的に関連する遺伝子およびタンパク質を有するはずである(例え
ば、鳥類または両生類)。
またはセグメントを含み、そして少なくとも約8アミノ酸、一般には、少なくと
も約12アミノ酸、代表的には、少なくとも約16アミノ酸、好ましくは少なく
とも約20アミノ酸、および特に好ましい実施形態において、少なくとも約30
以上のアミノ酸(例えば、35、40、45、50など)のアミノ酸残基のスト
レッチを含む。このようなフラグメントは、IL−B30またはIL−12 p
40サブユニットいずれかについての全ての実際の組み合わせにおいて実質的に
全ての位置で始まり、そして/または終わる(例えば、残基1、2、3などで始
まり、そして例えば、175、174、173などで終わる)末端を有し得る。
特に目的のペプチドは、構造ドメイン境界(例えば、IL−B30のヘリックス
A、B、C、および/もしくはD、またはIL−12 p40のIgドメイン)
に対応する末端を有する。以下を参照のこと。
L−B30複合体に特異的に結合する(例えば、抗体−抗原相互作用において)
分子をいう。この特異性は、多かれ少なかれ、特定の実施形態(または関連する
実施形態の群(例えば、霊長類、齧歯類など)に)に特異的であることを含む。
枯渇または吸収は、例えば、いずれかのポリペプチド成分に単独で結合する抗体
を枯渇させるために、所望の選択性を提供し得る。化合物(例えば、天然の生理
学機能に関連する、共有結合または非共有結合いずれかのタンパク質−タンパク
質相互作用を含む、IL−12 p40/IL−B30複合体と特異的に会合す
るタンパク質)もまた提供される。この分子は、ポリマーまたは化学試薬であり
得る。機能的アナログは、構造改変を有するタンパク質であってもよいし、適切
な結合決定基と相互作用する分子形状を有する分子であってもよい。この化合物
は、レセプター結合相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストとして働き得る
。例えば、Goodmanら(編)、Goodman&Gilman’s:Th
e Pharmacological Bases of Therapeut
ics(最新版)Pergamon Pressを参照のこと。
ンパク質が、最初の供給源生物に由来する他の夾雑タンパク質、核酸、または他
の生物学的物質を含まないことを意味する。純度は、標準的な方法により(代表
的には、重量により)アッセイされ得、そして通常、少なくとも約40%純粋、
一般には、少なくとも約50%純粋、しばしば、少なくとも約60%純粋、代表
的には、少なくとも約80%純粋、好ましくは、少なくとも約90%純粋、およ
び最も好ましい実施形態において、少なくとも約95%純粋である。キャリアま
たは賦形剤がしばしば添加される。実質的に純粋なIL−12 p40およびI
L−B30を含む組成物は、この2つのポリペプチドの複合体と天然には会合し
ない、多量の外来のポリペプチドを有さない。
する。多くのパラメーターは、ポリペプチドの可溶性(温度を含む)、電解質環
境、ポリペプチドのサイズおよび分子特性、ならびに溶媒の性質に影響する。代
表的には、このポリペプチドが使用される温度は、約4℃〜約65℃の範囲であ
る。通常には、使用時の温度は、約18℃より高い。診断目的では、この温度は
、通常、ほぼ室温または室温より高いが、このアッセイにおける成分の変性温度
より低い。治療目的では、この温度は、通常体温であり、代表的には、ヒトおよ
びマウスに関しては約37℃であるが、特定の状況下では、この温度は、インサ
イチュまたはインビボで上昇されるか、または低下され得る。
在し、そして通常は、変性状態ではない。このポリペプチドは、例えば、可溶性
を与えるために、四次構造において他のポリペプチドと結合し得るか、または脂
質または界面活性剤と結合し得る。特に、この2つのポリペプチドの結合で構成
された複合体は、融合組成物のように好ましい。
生物学的に適合する緩衝液であり、そして生理学的な水性溶媒に通常は近い。通
常、この溶媒は、中性pH、代表的には、約5と10との間を有し、好ましくは
約7.5を有する。いくつかの場合において、1つ以上の界面活性剤(代表的に
は、タンパク質の構造または生理学的特徴の有意な破壊を避けるために、弱い非
変性界面活性剤(例えば、CHS(コレステリルヘミスクシネート)またはCH
APS(3−[3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンス
ルホネート))、あるいは十分に低濃度)が添加される。他の例において、強力
な界面活性剤が、十分な変性をもたらすのに使用され得る。
異的に免疫反応するIL−B30ポリペプチドは、定義された免疫原に対して生
成される。例えば、配列番号2のアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは
配列番号1の核酸から生成されるポリペプチドからなる免疫原は、代表的には、
免疫アッセイにおいて決定される。本明細書中で構造的および機能的に定義され
るような原型的なIL−B30ポリペプチドに対して生成されるポリクローナル
抗体に選択的に結合するポリペプチドをコードする、本明細書中に記載されるそ
れらの核酸配列(機能的改変体を含む)は、本発明の境界内に含まれる。免疫ア
ッセイは代表的に、例えば、配列番号2のタンパク質を含む複合体に対して惹起
されるポリクローナル抗血清を使用する。この抗血清は、適切な他の密接に関連
した(好ましくは、同一種由来)ファミリーメンバーに対して低い交差反応性を
有するように選択、または枯渇され、そして任意のこのような交差反応性は、免
疫吸着または枯渇によって除去され、その後、免疫アッセイにおいて使用される
。特に、IL−12 p40ポリペプチドまたはIL−B30ポリペプチド単独
に結合する抗体は、免疫枯渇のための標的である。適切な選択的血清調製物は、
単離され、そして特徴付けられ得る。
例えば、配列番号2のタンパク質を含む複合体(compls)は、本明細書中
に記載の通りに単離される。例えば、組換えタンパク質は、哺乳動物細胞株にお
いて産生され得る。適切な宿主(例えば、マウスの近交系(例えば、Balb/
c))を、標準的なアジュバント(例えば、フロイントアジュバント)および標
準的なマウス免疫化プロトコル(HarlowおよびLaneを参照のこと)を
使用して配列番号2のタンパク質を含む複合体で免疫する。あるいは、本明細書
中に開示された配列由来の実質的に全長の合成ペプチド構築物は、免疫原として
使用され得る。ポリクローナル血清を収集し、そして適切な枯渇または選択と共
に免疫アッセイ(例えば、固体支持体上に固定された免疫原を用いる固相免疫ア
ッセイ)において免疫原タンパク質に対する力価を測定する。104以上の力価
を有するポリクローナル抗血清を選択し、そして他の密接に関連したファミリー
メンバー(例えば、LIF、CT−1、CNTF、またはIL−6ファミリーの
他のメンバー)に対するそれらの交差反応性についてHarlowおよびLan
e(前出、570〜573頁)に記載のアッセイのように競合結合免疫アッセイ
を使用して試験する。好ましくは、少なくとも2つの個々のIL−6/IL−1
2ファミリーメンバーは、この標的と共にこの測定において使用される。これら
の長鎖のサイトカインファミリーメンバーは、組換えタンパク質として産生され
得、そして本明細書中に記載の標準的な分子生物学およびタンパク質化学技術を
使用して単離され得る。従って、IL−12 p40/IL−B30ファミリー
メンバーのサブセットについて所望の選択性または特異性を有する抗体調製物が
同定または産生され得る。あるいは、IL−12 p40およびIL−B30を
含む複合体の融合ポリペプチド形態に結合する抗体が、調製され得る。
。例えば、融合タンパク質は、固体支持体に固定され得る。このアッセイに添加
されたタンパク質は、固定化抗原に対する選択的抗血清の結合と競合する。上記
タンパク質の固定化タンパク質に対する選択的抗血清の結合と競合する能力は、
融合タンパク質と比較される。上記タンパク質についての交差反応性パーセント
を、標準的な計算を用いて算定する。上記に列挙したタンパク質の各々と10%
未満の交差反応性を有する抗血清を選択およびプールする。次いで、交差反応す
る選択的抗体を、上記に列挙したタンパク質を用いる免疫吸着によってプールし
た抗血清から除去する。
おいて使用し、第2のタンパク質を免疫原融合タンパク質と比較する。この比較
を行うために、2つのタンパク質は、各々、広範な濃度でアッセイされ、そして
固定化融合タンパク質に対する選択的抗血清の結合の50%を阻害するのに必要
な各々のタンパク質量が決定される。必要とされる第2のタンパク質量が、必要
とされる融合タンパク質量の2倍未満である場合、この第2のタンパク質は、免
疫原に対して生成された選択的抗体に特異的に結合すると言われる。
的なアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはペプチドを含む複合体を包含
する。改変体としては、種改変体、多型性改変体、または対立遺伝子改変体が挙
げられる。
て、もし必要であるなら、必要に応じてギャップを導入することによって決定さ
れる。例えば、Needlehamら、(1970)J.Mol.Biol.4
8:443−453;Sankoffら、(1983)第1章、Time Wa
rps,String Edits,およびMacromolecules:T
he Theory and Practice of Sequence C
omparison,Addison−Wesley,Reading,MA;
およびIntelliGenetics,Mountain View,CA製
のソフトウェアパッケージ;ならびにthe University of W
isconsin Genetics Computer Group,Mad
ison,WIをまた参照のこと。配列同一性は、一致する保存的置換を考慮す
る場合、変化する。保存的置換としては、代表的に、以下の群内の置換が挙げら
れる:グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸
、グルタミン酸;アスパラギン、グルタミン;セリン、スレオニン;リシン、ア
ルギニン;およびフェニルアラニン、チロシン。保存は、生物学的特徴、機能的
特徴、または構造的特徴に適用し得る。相同なアミノ酸配列は、代表的に、タン
パク質配列の天然の多型改変体または対立遺伝子改変体および種間改変体が含ま
れることが意図される。代表的な相同タンパク質またはペプチドは、IL−B3
0のアミノ酸配列と25〜100%同一性(ギャップが導入され得る場合)から
50〜100%同一性(保存的置換が含まれる場合)を有する。同一性の尺度は
、少なくとも約35%、一般的には少なくとも約40%、しばしば少なくとも約
50%、代表的には少なくとも約60%、通常、少なくとも約70%、好ましく
は少なくとも約80%、およびより好ましくは少なくとも約90%である。
換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、および短いヌクレオチドストレッチ
の転置によって容易に改変され得る。これらの改変は、これらの抗原、類似の生
理学的活性、免疫原活性、抗原活性または他の機能的な活性を有するそれらの誘
導体、またはタンパク質をコードする新規なDNA配列を生じる。これらの改変
配列は、変異体抗原を産生するためか、または発現を促進するために使用され得
る。発現の促進は、遺伝子増幅、転写の増加、翻訳の増加、そして他の機構が含
まれ得る。「変異体IL−B30」は、上記のIL−B30の配列同一性の定義
内の別のポリペプチドを包含するが、欠失、置換、または挿入のいずれかによっ
て、天然で通常見出されるようなIL−B30のアミノ酸配列とは、異なるアミ
ノ酸配列を有する。これは、一般的には、配列番号2の配列を有するタンパク質
と有意な同一性を有するタンパク質、およびそれらの配列と種々の生物学的活性
(例えば、抗原性または免疫原性)を共有するタンパク質を含み、そして好まし
い実施形態において、天然の全長の開示された配列のほとんどを含む。短縮バー
ジョンもまた有用であるが、全長配列が代表的に好ましい。同様に、天然の供給
源から見出された遺伝子またはタンパク質は、代表的には最も望ましい。類似の
概念が、異なるIL−B30タンパク質、特に種々の温血動物(例えば、哺乳動
物および鳥類)において見出されるIL−B30タンパク質に適用される。これ
らの説明は、一般的に、種々のIL−B30タンパク質を包含することを意味す
るが、特定の霊長類の実施形態を特に議論することに限定されない。
入またはアミノ酸欠失を作製することによって行われ得る。置換、欠失、挿入、
または任意の組み合わせが、最終構築物に到達するように作製され得る。挿入と
しては、アミノ末端またはカルボキシ末端の融合体が挙げられる。ランダム変異
誘発は、標的コドンにおいて行われ得、次いで、発現された変異体は、所望の活
性についてスクリーニングされ得る。公知の配列を有するDNA内の所定の部位
で置換変異体を作製する方法は、当該分野で周知である(例えば、M13プライ
マー変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術による)。例えば、S
ambrookら、(1989);Ausubelら、(1987および補遺)
;およびKunkelら、(1987)Methods in Enzymol
.154:367−382を参照のこと。好ましい実施形態としては、ヌクレオ
チドレベルまたはアミノ酸レベルにおいて、例えば、1倍、2倍、3倍、5倍、
7倍などの置換、好ましくは、保存的置換が挙げられる。好ましくは、この置換
は、保存されたシステインから離れて、しばしばヘリックス構造ドメインから離
れた領域内にある。このような改変体は、特定の抗体を作製するのに有用であり
得、そしてしばしば、多くのまたは全ての生物学的特性を共有する。サイトカイ
ン構造の認識は、レセプター相互作用において所望の変化をもたらすように改変
され得る残基の構造および位置に関する重要な洞察を提供する。また、IL−1
2 p40のIL−B30タンパク質との相互作用は、相互作用する表面におけ
る相補的な構造的特徴を必要とする。構造分析は、さらに、レセプター相互作用 に対する複合体形成および複合体の両方 において重要な表面残基の予測を可能に
する。
質(例えば、異種融合タンパク質)を提供する。異種融合タンパク質は、天然で
あり、同一の様式で通常融合されていないタンパク質またはセグメントの融合体 である。類似の概念が、異種核酸配列に適用される。
ントが、異なる新規な融合ポリペプチドまたはフラグメント間で「交換」され得
る。例えば、Cunninghamら、(1989)Science 243:
1330−1336;およびO’Dowdら、(1988)J.Biol.Ch
em.263:15985−15992を参照のこと。
etts.22:1859−1862によって記載されるホスホラミダイト法は
、適切な合成DNAフラグメントを作製する。二本鎖フラグメントは、しばしば
、相補鎖を合成し、そして適切な条件下で互いの鎖をアニーリングするか、また
は適切なプライマー配列と共にDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を付加するか
(例えば、PCR技術)のいずれかによって得られる。
伝子に適用され得る。このファミリーとしては、例えば、IL−6、IL−11
、IL−12、G−CSF、LIF、OSM、CNTF、およびObが挙げられ
る。ヒトおよびマウスIL−B30配列の、IL−6ファミリーの他のメンバー
とのアラインメントは、構造的特徴の規定を可能にするはずである。特に、β−
シート残基およびα−ヘリックス残基は、例えば、RASMOLプログラム(B
azanら、(1996)Nature 379:591;Lodiら、(19
94)Science 263:1762−1766;SayleおよびMil
ner−White,(1995)TIBS 20:374−376;ならびに
Gronenbergら、(1991)Protein Engineerin
g 4:263−269を参照のこと)を用いて決定され得る。例えば、Wil
kinsら、(1997年版)Proteome Research:New
Frontiers in Functional Genomics Spr
inger−Verlag,NYをまた、参照のこと。置換のために好ましい残
基としては、レセプターと相互作用すると推定される表面に曝露された残基が挙
げられる。機能を保存するべきである他の残基は、保存的置換である。特に表面
に曝露された残基から遠い位置における保存的置換である。
、リガンドのそのレセプターへの結合の競合的阻害から生じ得る。レセプターの
1つのサブユニットの同定は、記載されるようなさらなる特徴付け、およびこの
複合体との結合および/またはシグナル伝達をブロックするサブユニットへの抗
体の使用を可能にする。
これらのタンパク質のレセプター結合セグメントを含む可溶性フラグメント、ま
たは固相基体に結合されたフラグメントを使用する。これらのアッセイはまた、
セグメント変異体および改変体、またはサイトカイン変異体および改変体(例え
ば、IL−12 p40/IL−B30複合体アナログ)のいずれかの結合の影
響の診断決定を可能にする。
ター結合フラグメントが、試験化合物と競合する、競合的薬物スクリーニングア
ッセイの使用を意図する。
る形態由来のアミノ酸配列変異体(グリコシル化改変体)、および他の化学的部
分との共有結合体または凝集結合体が挙げられる。共有結合誘導体は、IL−1
2 p40/IL−B30複合体アミノ酸側鎖またはN末端もしくはC末端にお
いて見出される基への官能基の連結によって調製され得る(例えば、標準的手段
によって)。例えば、LundbladおよびNoyes、(1988)Che
mical Reagents for Protein Modificat
ion、第1〜2巻、CRC Press,Inc.,Boca Raton,
FL;Hugli、(1989年版)Techniques in Prote
in Chemistry,Academic Press,San Dieg
o,CA;およびWong,(1991)Chemistry of Prot
ein Conjugation and Cross Linking,CR
C Press,Boca Raton,FLを参照のこと。
ロセシング工程においてポリペプチドのグリコシル化パターンを変更することに
よって作製されるグリコシル化改変体が含まれる。例えば、Elbein,(1
987)Ann.Rev.Biochem.56:497−534を参照のこと
。リン酸化アミノ酸残基(例えば、リン酸化チロシン、リン酸化セリン、または
リン酸化スレオニン)を含む他の小さな変更を有する同一の一次アミノ酸配列を
有するペプチドのバージョンがまた、包含される。
る。多くのサイトカインレセプターまたは他の表面タンパク質は、マルチマー(
例えば、ホモダイマー)物質であり、そして繰り返し構築物は、タンパク質分解
に対する感受性を減少することを含む種々の利点を有し得る。代表的な例は、レ
ポーターポリペプチド(例えば、ルシフェラーゼ)の、タンパク質のセグメント
またはドメイン(例えば、レセプター結合セグメント)との融合であり、その結
果、融合リガンドの存在または位置は、容易に決定され得る。例えば、Dull
ら、米国特許第4,859,609号を参照のこと。他の遺伝子融合パートナー
としては、細菌β−ガラクトシダーゼ、trpE、プロテインA,β−ラクタマ
ーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酵母α交配因子、および検
出タグまたは精製タグ(例えば、His6配列のFLAG配列)が挙げられる。
例えば、Godowskiら、(1988)Science 241:812−
816を参照のこと。例えば、同時投与されるが、タンパク質分解されない他の
治療物質との融合構築物がまた提供される。
によって作製される。核酸操作および発現のための技術は、一般的には、例えば
、Sambrookら、(1989)Molecular Cloning:A
Laboratory Manual(第2版)、第1〜3巻、Cold S
pring Harbor Laboratory;およびAusubelら、
(1993年版)Current Protocols in Molecul
ar Biology,GreeneおよびWiley,NYに記載される。ペ
プチド合成のための技術は、例えば、Merrifield,(1963)J.
Amer.Chem.Soc.85:2149−2156;Merrifiel
d,(1986)Science 232:341−347;Atherton
ら、(1989)Solid Phase Peptide Synthesi
s:A Practical Approach,IRL Press,Oxf
ord;ならびにGrant,(1992)Synthetic Peptid
es:A User’s Guide,W.H.Freeman,NYに記載さ
れる。リフォールディング方法は、合成タンパク質に適用可能であり得る。
のIL−12 p40タンパク質またはIL−B30タンパク質の誘導体の使用
を包含する。このような誘導体は、化学的な部分またはタンパク質キャリアと共
有結合または凝集結合を含み得る。共有結合誘導体または凝集結合誘導体は、免
疫原として、免疫アッセイにおける試薬または精製法(例えば、結合パートナー
(例えば、他の抗原)のアフィニティ精製のための)における試薬として有用で
ある。IL−12 p40またはIL−B30は、抗IL−12 p40抗体も
しくは抗IL−B30抗体あるいは代替の結合組成物のアッセイまたは精製にお
いて使用するために、当該分野で周知の方法によって固体支持体(例えば、ブロ
モシアン活性化SEPHAROSE)に共有結合することによって固定され得る
か、あるいはグルタルアルデヒド架橋を有するか、有さないポリオレフィン表面
上に吸着され得る。IL−12 p40、IL−B30、もしくは融合タンパク
質はまた、検出可能な基(例えば、診断アッセイにおける使用のため)を用いて
標識され得る。IL−12 p40/IL−B30複合体の精製は、ポリペプチ
ドもしくは配列成分または相補的結合パートナー(例えば、レセプターの結合部
分)のいずれかに対する固定化抗体によってもたらされ得る。
メントは、結合に特異的な抗血清または抗体の産生のための免疫原として使用さ
れ得る。精製された抗原を使用して、天然の抗体(例えば、Fab、Fab’、
F(ab)2など)の抗原結合フラグメントを包含する、モノクローナル抗体ま
たは抗原結合フラグメントをスクリーニングし得る。精製したIL−12 p4
0/IL−B30抗原はまた、異常な状態または特定の生理学的な状態または疾
患状態を診断し得る、サイトカイン複合体の上昇したレベルの存在に応答して生
成される抗体を検出するための試薬として使用され得る。本発明は、配列番号1
において示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、または
このアミノ酸配列を含むタンパク質のフラグメントに対して惹起される抗体が意
図される。特に、本発明は、特定のドメイン(例えば、IL−B30のヘリック
スA、B、C、またはD、あるいはIL−12 p40のIgドメイン)に対し
て結合親和性を有する抗体またはこのドメインに対して惹起される抗体を意図す
る。
ト分析およびノーザンブロット分析は、類似の遺伝実体が、他の哺乳動物におい
て存在することを確立する。IL−B30が、種改変体(例えば、げっ歯動物、
ウサギ、肉食動物、偶蹄目、奇蹄類、および霊長類)において広範囲に及んでい
るようである。
原の群を単離する手段を提供する。分子の多くの生理学的効果の解明は、さらに
別の種またはこれらの多型改変体の単離および特徴付けにより非常に加速される
。詳細には、本発明は、異なる種におけるさらなる相同的な遺伝実体を同定する
ための有用なプローブを提供する。
パク質を欠きかつ負のバックグラウンド活性を示す種の型または細胞のいずれか
)の形質転換を可能にする。このことは、未形質転換コントロール細胞と比較す
る際にIL−B30の機能の分析を可能にする。
要素の分析は、現代の分子生物学の標準的技術を用いて、特に、関連するクラス
のメンバーを比較することで可能である。例えば、Cunninghamら、(
1989)Science 243:1339−1336に記載されるホモログ
スキャニング変異誘発技術(homolog−scanning mutage
nesis technique);およびO’Dowdら、(1988)J.
Biol.Chem.263:15985−15992;およびLechlei
terら、(1990)EMBO J.9:4381−4390で用いられるア
プローチを参照のこと。
質のインターナリゼーションは、特定の環境下で生じ得、そして細胞内成分とサ
イトカインとの間の相互作用が生じ得る。IL−B30と相互作用する成分との
相互作用の特定のセグメントは、変異誘発手段または直接的生化学手段(例えば
、架橋法またはアフィニティー法)により同定され得る。結晶学または他の物理
的方法による構造分析もまた適用可能である。シグナル伝達の機構のさらなる調
査は、アフィニティー手段によりまたは遺伝子手段(例えば、変異体の相補性分
析)により単離可能であり得る関連する成分の研究を含む。
係する制御エレメントは、異なる生理学的パターン、発生パターン、組織特異的
パターン、または他の発現パターンを示すはずである。上流または下流の遺伝子
領域(例えば、コントロールエレメント)が目的物である。
またはアンタゴニスト特性を示すアナログ)の設計を導く。このことは、活性の
所望のスペクトルを示す抗原を単離するために以前に記載されたスクリーニング
法と組合され得る。
々のp40/IL−B30タンパク質のエピトープ(種改変体、多型改変体もし
くは対立遺伝子改変体を含む)およびそれらのフラグメントに対して惹起され得
る。さらに、抗体は、それらの活性化形態または不活性化形態(ネイティブバー
ジョンまたは変性バージョン)のいずれかのIL−B30に対して惹起され得る
。抗イディオタイプ抗体もまた意図される。
単鎖バージョンを含む)は、フラグメントと免疫原性タンパク質との結合体を用
いる動物の免疫化により惹起され得る。モノクローナル抗体は、所望の抗体を分
泌する細胞から調製される。これらの抗体は、正常IL−B30または欠損IL
−B30に結合するために分泌され得るか、またはアゴニスト活性またはアンタ
ゴニスト活性(例えば、レセプターを介する)についてスクリーニングされ得る
。抗体は、例えば、レセプターに対する結合を立体的にブロックすることによる
、アゴニスト性またはアンタゴニスト性であり得る。これらのモノクローナル抗
体は、通常、少なくとも、約1mM、より通常は、少なくとも、約300μM、
代表的には、少なくとも、約100μM、より代表的には、少なくとも30μM
、好ましくは、少なくとも約10μM、およびより好ましくは、少なくとも約3
μM以下のKDで結合する。
の場合、これらは、レセプターに対する結合を阻害することなく抗原に結合する
能力についてスクリーニングされ得る。中和抗体の場合、これらは競合結合アッ
セイにおいて有用であり得る。これらはまた、IL−B30タンパク質またはそ
のレセプターを検出または定量する際に有用であり得る。例えば、Chan(1
987年編)Immunology:A Practical Guide,A
cademic Press,Orlando,FL;PriceおよびNew
man(1991年編)Principles and Practice o
f Immunoassay,Stockton Press,N.Y.;およ
びNgo(1988年編)Nonisotopic Immunoassay,
Plenum Press,N.Y.を参照のこと。交叉吸収または他の試験は
、特異性(固有のまたは共有された種の特異性)の種々の範囲を示す抗体を同定
する。
物学的応答を惹起し得るレセプターに)結合しそして機能的結合を阻害する強力
なアンタゴニストであり得る。これらはまた、非中和抗体として有用であり得、
そして毒素または放射性核種に結合され得、その結果、抗体が抗原に結合する場
合、それを(例えば、その表面上に)発現する細胞は殺傷される。さらに、これ
らの抗体は、リンカーの様式で直接的または間接的のいずれかで薬物または他の
治療剤に結合体化され得、そして薬物標的化をもたらし得る。
結合される場合、他の物質(特に、ポリペプチド)に連結され得る。抗原および
そのフラグメントは、種々の免疫原(例えば、キーホールリンペットヘモシアニ
ン、ウシ血清アルブミン、破傷風毒素など)に融合または共有結合され得る。ポ
リクローナル抗血清を調製する方法の記載については、Microbiolog
y,Hoeber Medical Division,HarperおよびR
ow,1969;Landsteiner(1962)Specificity
of Serological Reactions,Dover Publ
ications,New York;Williamsら(1967)Met
hods in Immunology and Immunochemist
ry、第1巻、Academic Press,New York;およびHa
rlowおよびLane,(1988)Antibodies:A Labor
atory Manual,CSH Press,NYを参照のこと。
類、ヒトなど)由来のモノクローナル抗体を調製することが望ましい。このよう
なモノクローナル抗体を調製するための技術の記載は、例えば、Stitesら
(編)Basic and Clinical Immunology(第4版
)、Lange Medical Publication,Los Alto
s,CA,および本明細書中で引用される参考文献;HarlowおよびLan
e,(1988)Antibodies:A Laboratory Manu
al,CSH Press;Goding,(1986)Monoclonal
Antibodies:Principles and Practice(
第2版)、Academic Press,New York;および、特に、
KohlerおよびMilstein,(1975)Nature 256:4
95−497(これらは、モノクローナル抗体を生成する1つの方法を考察する
)に見出され得る。
あるいはファージまたは類似のベクターの中の抗体のライブラリーの選択に関す
る。Huseら(1989)「Generation of Large Co
mbinatorial Library of Immunoglobuli
n Repertoire in Phage Lambda」,Scienc
e 246:1275−1281」;およびWardら、(1989)Natu
re 341:544−546」を参照のこと。本発明のポリペプチドおよび抗
体は、キメラ抗体またはヒト化抗体を含む、修飾を伴ってまたは伴わないで、用
いられ得る。頻繁に、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供す
る物質を共有的または非共有的のいずれかで結合することにより標識される。広
範な種々の標識技術および結合体化技術は公知であり、そして科学文献および特
許明細書の両方において広範に報告されている。適切な標識としては、放射性核
種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子な
どが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第3
,817,837号;同第3,850,752号;同第3,939,350号;
同第3,996,345号;同第4,277,437号;4,275,149号
;および同第4,366,241号が挙げられる。また、組換え免疫グロブリン
が生成され得る、Cabilly,米国特許第4,816,567号;Moor
eら、米国特許第4,642,334号;およびQeenら、(1989年)P
roc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029−10033を
参照のこと。
フィーのために用いられ得る。カラムは、抗体が固体支持体に連結される場合、
調製され得る。例えば、Wilchekら、(1984年)Meth.Enzy
mol.104:3−55を参照のこと。対照的に、タンパク質は、選択的、特
異的に結合する組成物を調製するための枯渇または交叉吸収のために用いられ得
る。
するために用いられる。これらは、それぞれの抗原の発現に関連する種々の免疫
学的条件を検出または診断するのに有用である。
30の両方をコードするDNAクローン(例えば、天然の供給源由来)を検出、
単離、または同定するのに有用である。代表的には、哺乳動物由来の遺伝子を単
離するのに有用であり、そして類似の手順は、他の種(例えば、鳥および哺乳動
物のような、温血動物)から遺伝子を単離するために適用される。交叉ハイブリ
ダイゼーションは、同じ種(例えば、多型改変体)または他の種からのIL−1
2p40またはIL−B30の単離を可能にする。多数の異なるアプローチが、
適切な核酸クローンを首尾良く単離するために利用可能である。このような遺伝
子は、同時発現構築物または融合構築物の構築を可能にする。
抗体を生成させるために有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク質は、モ
ノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を生成する免疫系に存在し得る。例
えば、Coligan,(1991)Current Protocols i
n Immunology Wiley/Green;and Harlow
and Lane,(1989)Antibodies:A Laborato
ry Manual,Cold Spring Harbor Pressを参
照のこと。
する細胞株から作製される発現ライブラリーのスクリーニングのために用いられ
得る。細胞内発現のスクリーニングは、種々の染色または免疫蛍光手順により行
われ得る。結合組成物は、表面融合タンパク質を発現する細胞をアフィニティー
精製または選別するために用いられ得る。
オリゴヌクレオチドを選択または同定するために用いられ得る。遺伝子コードは
、スクリーニングに関するプローブとして有用な適切なオリゴヌクレオチドを選
択するために用いられ得る。例えば、GenBankおよび配列番号1を参照の
こと。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術と組合せて、合成オリゴヌクレオチ
ドは、ライブラリーから正確なクローンを選択する際に有用である。相補的配列
はまた、プローブ、プライマー、またはアンチセンス鎖として用いられる。種々
のフラグメントは、例えば、アンカーベクターもしくはポリA相補鎖のPCR技
術、または他のペプチドの相補鎖DNAと相まって、特に有用であるはずである
。
するIL−12p40およびIL−B30ポリペプチドの生物学的に活性な複合
体をコードする、単離されたDNAまたはフラグメントの使用を意図する。さら
に、本発明は、生物学的に活性な融合タンパク質またはポリペプチドコードし、
そして本明細書中に記載されるDNA配列と適切な条件下でハイブリダイズし得
る、単離されたまたは組換えのDNAを含む。この生物学的に活性なタンパク質
またはポリペプチドは、インタクトな抗原、またはフラグメントであり得、そし
て例えば、配列番号2に開示されるアミノ酸配列(特に、成熟した分泌ポリペプ
チド)を有する。さらに、本発明は、単離されたDNAもしくは組換えDNA、
またはそのフラグメントの使用を含む。これは、分泌IL−12p49/IL−
B30複合体に対する高い同一性を示すタンパク質をコードする。単離されたD
NAは、5’および3’に隣接するそれぞれの調節配列(例えば、プロモーター
、エンハンサー、ポリ−A追加シグナルなど)を有し得る。あるいは、発現は、
コードセグメントを異種プロモーターに作動可能に連結させることにより(例え
ば、外来遺伝子の上流にプロモーターを挿入することにより)もたらされ得る。
例えば、Trecoら、WO96/29411またはUSSN08/406,0
30を参照のこと。
、および/または本来の種に隣接するゲノム配列)を天然で伴う、他の外来の成
分から実質的に分離される、核酸(例えば、RNA、DNA、または混合ポリマ
ー)である。用語は、その天然に存在する環境から取り出されている核酸配列を
採用し、そして組換えまたはクローン化DNA単離物、および化学合成アナログ
または異種系により生物学的に合成されたアナログを含む。実質的に純粋な分子
は、分子の単離形態(例えば、単離された染色体とは異なる)を含む。一般に、
核酸は、約50kb未満、通常約30kb未満、代表的には、約10kb未満、
そして好ましくは6kb未満のベクターまたはフラグメント内にある。
では、わずかな不均一性を含む。この不均一性は、代表的には、所望の生物学的
機能または活性に重要ではない、ポリマー末端または部分で見出される。
。その産生の方法に関して(例えば、あるプロセスにより作製される産物)、プ
ロセスは、組換え核酸技術(例えば、ヌクレオチド配列内の人為的介入を伴う(
代表的には、選択または産生))の使用である。あるいは、お互いに天然では連
続しない2つのフラグメントの融合物を含む配列を生成することにより作製され
る核酸であり得るが、これは天然の産物(例えば、天然存在する変異体)を排除
することを意味する。従って、任意の合成オリゴヌクレオチドプロセスを用いて
誘導される配列を含む核酸である場合、例えば、天然に存在しないベクターを用
いて細胞を形質転換することにより作製した産物が含まれる。このようなことは
、しばしば、同じアミノ酸または保存されたアミノ酸をコードする縮重コドンと
あるコドンとを置換するように行われるが、代表的には、配列認識部位を導入す
るかまたは取り出すように行われる。
み合わせを含む、単一の遺伝実体を生成させるための、所望の機能の核酸セグメ
ント同士を連結することが行われる。制限酵素認識部位は、しばしば、このよう
な人為的操作の標的であるが、他の部位特異的標的(例えば、プロモーター、D
NA複製部位、調節配列、制御配列、コントロール配列、または他の有用な特性
)は、設計に含まれ得る。類似の概念は、組換え(例えば、融合)ポリペプチド
についても意図される。特に含まれるものは、遺伝子コードの縮重により、これ
らの抗原のフラグメントに類似するポリペプチド、および種々の異なる種または
多型改変体由来の配列の融合物をコードする、合成核酸である。
、一般に、少なくとも約22ヌクレオチド、通常は、少なくとも約29ヌクレオ
チド、より頻繁には、少なくとも約35ヌクレオチド、代表的には、少なくとも
約41ヌクレオチド、通常は、少なくとも約47ヌクレオチド、好ましくは、少
なくとも約55ヌクレオチド、の連続するセグメントであり、そして好ましい実
施形態では、少なくとも約60以上のヌクレオチド(例えば、67、73、81
、89、95など(100および/または1000を含む))である。
ク質、ならびに異なる種由来の相同タンパク質をコードするDNAをコードする
、遺伝子、mRNA、およびcDNA種を同定するのに、特に有用である。これ
らは、他の種(霊長類動物、げっ歯類動物、イヌ、ネコ、およびトリを含む)に
相同である。種々のIL−B30タンパク質は相同であるはずであり、そして本
明細書中に含まれる。しかし、これらは十分に相同である場合でさえ、この抗原
に対してより離れた進化的関係を有するタンパク質が、これらの配列を用いる適
切な条件下で容易に単離され得る。霊長類IL−B30タンパク質が、特に目的
のタンパク質である。IL−12p40と同様に、このタンパク質は、融合構築
物または組合せ組成物についての第一の標的である。
ンスジェニック細胞および生物を含む、トランスジェニック研究、および遺伝子
治療に有用である。例えば、Goodnow,(1992)「Transgen
ic Animals」,Roitt(編)Encyclopedia of
Immunology,Academic Press,San Diego,
1502−1504頁;Travis,(1992)Science 256:
1392−1394;Kuhnら、(1991)Science 254:70
7−710;Capecchi(1989)Science 244:1288
;Robertson,(1987編)Teratocarcinomas a
nd Embryonic Stem Cells:A Practical
Approach,IRL Press,Oxford;およびRosenbe
rg,(1992)J.Clinical Oncology 10:180−
199を参照のこと。
場合にセグメントまたはその相補鎖のいずれかは、最適にアラインメントさせた
場合に、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って、少なくとも約50%のヌ
クレオチド、一般に、少なくとも約58%、通常は、少なくとも約65%、しば
しば、少なくとも約71%、代表的には、少なくとも約77%、通常は、少なく
とも約85%、好ましくは、少なくとも約95〜98%以上、そして特定の実施
形態では、約99%と同じくらい高いか、または約99%以上のヌクレオチドと
同一であることを意味する。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーシ
ョン条件下でハイブリダイズする場合に、鎖またはその相補鎖(代表的には、I
L−12p40および/またはIL−B30(例えば、配列番号1)の配列を用
いる)に対して、実質的相同性が存在する。代表的には、選択的ハイブリダイゼ
ーションは、少なくとも約30ヌクレオチドのストレッチにわたり少なくとも約
55%、約25ヌクレオチドのストレッチにわたり好ましくは少なくとも約75
%、そして最も好ましくは、約20ヌクレオチドにわたり少なくとも約90%の
同一性が存在する場合に生じる。Kanehisa,(1984)Nuc.Ac
ids Res.12:203−213を参照のこと。記載されるように、同一
性比較の長さは、より長いストレッチにわたり得、そして特定の実施形態では、
少なくとも約17ヌクレオチド、通常は、少なくとも約28ヌクレオチド、代表
的には、少なくとも約40ヌクレオチド、そして好ましくは、少なくとも約75
〜100以上のヌクレオチドのストレッチにわたる。
照のこと)は、塩、温度、有機溶媒、および他のパラメーター(代表的には、ハ
イブリダイゼーション反応で制御されるもの)のストリンジェントな組合せ条件
である。ストリンジェントな温度条件は、通常、約30℃を超える温度、通常は
、約37℃を超える温度、代表的には、約55℃を超える温度、より代表的には
、約60℃または65℃を超える温度、および好ましくは約70℃を超える温度
を含む。ストリンジェントな塩条件は、通常、約1000mM未満、通常、約4
00mM未満、代表的には、約250mM未満、好ましくは、約150mM未満
である(100mM、50mM、または20mMでさえ含む)。しかし、パラメ
ーターの組合せは、任意の単一のパラメーターの測定よりも、さらにより重要で
ある。例えば、WetmurおよびDavidson,(1968)J.Mol
.Biol.31:349−370を参照のこと。ストリンジェントな条件下の
ハイブリダイゼーションは、バックグラウンドを超えて少なくとも約2倍、好ま
しくは、少なくとも3〜5倍以上のバックグラウンドを与えるはずである。
して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列お
よび参照配列は、コンピューターにインプットされ、必要な場合、サブ配列座標
が指定され、そして、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。
次いで配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて
、参照配列と比較して、試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。
erman(1981)Adv.Appl.Math.2:482の局所的相同
性アルゴリズムによって、NeedlemanおよびWunsch(1970)
J.Mol.Biol.48:443の相同性アラインメントアルゴリズムによ
って、PearsonおよびLipman(1988)Proc.Natl.A
cad.USA 85:2444の類似性方法のためのサーチによって、これら
のアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software
Package,Genetics Computer Group,575
Science Dr.,Madison,WIにおけるGAP、BESTFI
T、FASTAおよびTFASTA)のコンピューター化された実施によってか
、または、視覚的検査(例えば、一般的にはAusubelら、前出)によって
、行なわれ得る。
係およびパーセント配列同一性を示すために、進行性の、対を成すアラインメン
トを使用して、関連した配列の群から多数配列アラインメントを作製する。これ
はまた、アラインメントを作製するために使用されたクラスター形成関係を示す
系図または樹状図をプロットする。PILEUPは、FengおよびDooli
ttle(1987)J.Mol.Evol.35:351−360の進行性ア
ラインメント方法の単純化したものを使用する。使用される方法は、Higgi
nsおよびSharp(1989)CABIOS 5:151−153によって
記載される方法に類似している。このプログラムは、300配列をアラインメン
トさせることが可能で、それぞれの最大長は5,000ヌクレオチドまたは5,
000アミノ酸である。多数アラインメント手順は、2つの最も類似した配列の
対を成すアラインメントで始まり、2つのアラインメント配列の群を生成する。
次いで、このクラスターは、次に最も関連した配列またはアラインメントされた
配列のクラスターにアラインメントされる。配列の2つのクラスターは、対を成
す2つの個々の配列のアラインメントの単純な伸長によってアラインメントされ
る。最終のアラインメントは、一連の進行性の、対を成すアラインメントによっ
て、達成される。配列比較領域のための特定の配列およびそれらのアミノ酸また
はヌクレオチド座標を指定することによって、およびプログラムパラメーターを
指定することによって、このプログラムは実行される。例えば、参照配列は、以
下のパラメーター:デフォルトギャップ重量(3.0)、デフォルトギャップ長
重量(0.10)、および重量末端ギャップを使用して、パーセント配列同一性
関係を決定するための他の試験配列と比較され得る。
別の例は、BLASTアルゴリズムである。これは、Altschulら、(1
990)J.Mol.Biol.215:403−410に記載される。BLA
ST分析を実行するためのソフトウェアは、National Center
for Biotechnology Informationを介して公に入
手可能である(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/)。こ
のアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードを用いてアライ
ンメントされる場合、いくつかの正の値の閾値Tに適合するかまたはそれを満足
するかどちらかの照会配列における短いワード長Wを同定することによって、高
スコア配列対(HSP)を最初に同定することを含む。Tは、近隣ワードスコア
閾値と称される(Altschulら、前出)。これらの最初の近隣ワードヒッ
トは、それらを含むより長いHSPを見出するためのサーチを開始するためのシ ード として作用する。次いで、このワードヒットは、累積アラインメントスコア
が増加し得る限り、それぞれの配列に沿って、両方向へ伸長される。以下の場合
:累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Xだけ不足する場合;累
積スコアが、1以上のネガティブスコアリング残基アラインメントの蓄積に起因
して、0またはそれ以下に進む場合;またはどちらかの配列の末端に達する場合
に、それぞれの方向におけるワードヒットの伸長は停止する。BLASTアルゴ
リズムパラメーターW、T、およびXは、アラインメントの感度およびスピード
を決定する。BLASTプログラムは、11のワード長(W)、50のBLOS
UM62スコアリングマトリックス(HenikoffおよびHenikoff
(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1091
5を参照のこと)アラインメント(B)、10の期待値(E)、M=5、N=4
、および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。
、2つの配列の間の類似性の統計学的分析を実施する(例えば、Karlinお
よびAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 90:5873−5787を参照のこと)。BLASTアルゴリズムによ
って提供される同一性の1つの尺度は、最小合計確率(P(N))であり、これ
は、2つのヌクレオチド配列または2つのアミノ酸配列の間の適合が偶然に発生
する確率の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における 最小合計確率 が約0.1未満、さらに好ましくは、約0.01未満、そして、最
も好ましくは、約0.001未満の場合、核酸は参照配列に類似していると考え
られる。
以下に記載されるように、第1の核酸によってコードされるポリペプチドが、第
2の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であるとい
うことである。従って、ポリペプチドは、代表的には実質上第2のポリペプチド
に同一である(例えば、2つのペプチドが保存的な置換のみによって異なる場合
)。2つの核酸配列が実質上同一であるという別の指標は、以下に記載されるよ
うに、ストリンジェントな条件下で、お互いにハイブリダイズするということで
ある。
ゼーションによってクローニングされ得、そして、単離され得る。かすかに関連
した種間の相同性は比較的低く、従って、比較的密接に関連した種のハイブリダ
イゼーションが得策である。あるいは、より種特異性を示さない抗体の調製は、
発現クローニングアプローチにおいて有用であり得る。
るDNAは、化学合成、cDNAライブラリーのスクリーニング、または広範な
種々の細胞株もしくは組織サンプルから調製されたゲノムライブラリーのスクリ
ーニングによって獲得され得る。例えば、OkayamaおよびBerg(19
82)Mol.Cell.Biol.2:161−170;Gublerおよび
Hoffman(1983)Gene 25:263−269;ならびにGlo
ver(1984年編)DNA Cloning:A Practical A
pproach,IRL Press,Oxfordを参照のこと。あるいは、
本明細書中で提供される配列は、有用なPCRプライマーを提供するかまたはI
L−12 p40もしくはIL−B30をコードする適切な遺伝子の合成かもし
くは他の調製を可能にし;天然に存在する形態を含む。
抗体を産生するために;使用され得る全長IL−12 p40およびIL−B3
0またはフラグメントの合成のために;結合の研究のために;改変された分子の
構築および発現のために;ならびに構造/機能研究のために広範な種々の細胞に
おいて発現され得る。
オファージ、組み込み可能なDNAフラグメント、ならびにDNAフラグメント
を宿主のゲノムに組み込み可能な他の賦形剤を含む。例えば、Pouwelsら
(1985年および補遺)Cloning Vectors:A Labora
tory Mannual,Elsevier,N.Y.;ならびにRodri
guezら(1988年編)Vectors:A Survey of Mol
ecular Cloning Vectors and Their Use
s,Buttersworth,Boston,MAを参照のこと。
能に連結されている。例えば、シグナルペプチドまたは分泌リーダーについての
DNAは、それが、前タンパク質として発現されるかまたは細胞膜へのポリペプ
チド指向またはポリペプチドの分泌に参加する場合、ポリペプチドに作動可能に
連結されている。プロモーターは、それがポリペプチドの転写を制御する場合、
コード配列に作動可能に連結されており;リボソーム結合部位は、翻訳可能なよ
うに配置される場合、コード配列に作動可能に連結されている。通常、作動可能
に連結されるは、連続的およびリーディングフレーム中を意味するが、抑制遺伝
子などの特定の遺伝エレメントは、連続的に連結されていないが、代わりに発現
を制御する操作配列になおも結合されている。例えば、Rodriguezら、
第10章、205〜236頁;BalbasおよびBolivar(1990)
Methods in Enzymology 185:14−37;ならびに
Ausubelら(1993)Current Protocols in M
olecular Biology,GreeneおよびWiley,NY.を
参照のこと。2つのコード配列の同時発現は、本明細書中において特に興味深い
。適切な発現ベクターの代表的な例としては、pCDNA1;pCD(Okay
amaら(1985)Mol.Cell Biol.5:1136−1142を
参照のこと);pMC1neo Poly−A(Thomasら(1987)C
ell 51:503−512を参照のこと);およびpAC373またはpA
C610などのバキュロウイルスベクター(Miller(1988)Ann.
Rev.Microbiol.42:177−199を参照のこと)が挙げられ
る。
40および/またはIL−B30ポリペプチドを発現することがしばしば所望で
ある。例えば、LuckowおよびSummers(1988)Bio/Tec
hnology 6:47−55;ならびにKaufman(1990)Met
h.Enzymol.185:487−511を参照のこと。
、細胞膜に連結されたホスファチジルイノシトール(PI)となるように操作さ
れ得るが、ホスファチジルイノシトール切断酵素(例えば、ホスファチジルイノ
シトールホスホリパーゼC)を用いる処置によって、膜から取り出され得る。こ
れは、生物学的に活性な形態の抗原を放出し、そして、タンパク質化学の標準的
手順による精製を可能とする。例えば、Low(1989)Biochim.B
iophys.Acta 988:427−454;Tseら(1985)Sc
ience 230:1003−1008;ならびにBrunnerら(199
1)J.Cell.Biol.114:1275−1283を参照のこと。
グメントまたは誘導体は、ペプチドを合成するための慣例的なプロセスによって
調製され得る。これらとしては、StewartおよびYoung(1984)
Solid Phase Peptide Synthesis,Pierce
Chemical Co.,Rockford,IL;Bodanszkyおよ
びBodanszky(1984)The Practice of Pept
ide Syntesis,Springer−Verlag,New Yor
k;Bocanszky(1984)The Principles of P
eptide Synthesis,Springer−Verlag,New
York;ならびにVillafranca(1991年編)Techniqu
es in Protein Chmistry II,Academic P
ress,San Diego,Caに記載されるようなプロセスを含む。
得る試薬を提供する(例えば、IL−12 p40/IL−B30複合体媒介条
件においてかまたは診断のためのキットの以下の記載において)。遺伝子は、法
医科学において有用であり得る(例えば、ヒトとげっ歯類を区別するためかまた
は差次的な発現または改変パターンを示す異なった細胞間で区別するためのマー
カーとして)。提供された組成物は、例えば、インビトロアッセイ、科学的研究
、および核酸、ポリペプチド、もしくは抗体の合成または製造において、有用な
試薬である。
供する。複合体またはそれらの個々の成分に対する結合親和性を有すると同定さ
れた化合物と共に、IL−12 p40/IL−B30複合体(天然に存在する
かまたは組換えの)、そのフラグメント、それに対する抗体は、分子生物学、免
疫学、または生理学の技術を教示するための試薬として有用であるべきである。
適切なキットは、試薬を使用して調製される(例えば、タンパク質、抗体、クロ
ーニング方法、組織学などの産生または使用における実際の研究室演習において
)。
の処置において有用であり得る。これらは、相互作用する成分の存在または非存
在のためのインビトロ試験において有用であり得、これは、特定の処置ストラテ
ジーの成功に相関し得る。特に、種々の細胞の生理学的改変(例えば、造血性ま
たはリンパ系の)は、本明細書中で提供される組成物を使用する処置のための適
切な方法によって達成される。例えば、Thomson(1994年;編)Th
e Cytokine Handbook(第2版)Academic Pre
ss,San Diego;MetcalfおよびNicola(1995)T
he Hematopoietic Colony Stimulating
Factors Cambridge University Press;な
らびにAggarwalおよびGutterman(1991)Human C
ytokines Blackwell Pubを参照のこと。
への有用な洞察を提供する。特に、IFNγ産生は、細胞媒介免疫の増加を生じ
る。例えば、Paul(1998)Fundamental Immunolo
gy(第4版)Raven Press,NY;ならびにDelvesおよびR
oitt(1998年編)The Encyclopedia of Immu
nology Academic Press(ISBN:012226765
6)を参照のこと。従って、細胞性応答の増強は、抗腫瘍活性を増強するため、
ワクチン反応を増強するため(体液性および細胞性免疫の両方)、抗ウイルス効
果を増強するため、そして、発達の特定の潜伏期間(window)におけるア
レルギー性反応に拮抗するために、文脈において有用である。例えば、Rose
およびMackay(1998年編)The Autoimmune Dise
ases(第3編)Academic Press,San Diego;なら
びにKay(1997年版)Allergy and Allergic Di
seases,Blackwell Science,Malden MAを参
照のこと。逆に、アンタゴニストは、このようなIFNγ増強を阻害するかまた
は予防するために使用され得、それによって、細胞性増強の強さまたは強度を減
少する。これらは、例えば、自己免疫状態(多発性硬化症もしくは乾癬など)ま
たは慢性的炎症状態(関節炎リウマチまたは炎症性腸疾患など)において有用で
ある。例えば、Samterら(編)Immunological Disea
ses第1巻および第2巻、Little,Brown and Coを参照の
こと。最初の結果は、p40/IL−B30の役割が、慢性炎症状態の維持にお
いてより重要であることを示す。従って、状態の最初の発症後に、妨害物が有効
であり得る。
治療法と組み合わせられ得る(例えば、炎症の他のモジュレーターと)。従って
、アゴニストは、しばしば、組み合わせられる(例えば、IL−18、IL−1
2、放射線療法または化学療法による治療、ワクチンアジュバント、および/ま
たは抗ウイルス療法と)。あるいは、アンタゴニストは、TNFαアンタゴニス
ト、IL−12アンタゴニスト、IL−10および/またはステロイドと組み合
わせられ得る。サイトカインのウイルス相同体もまた使用され得る。
となるべきである。新しいサイトカインは、造血細胞(例えば、リンパ細胞(こ
れは、免疫学的応答(例えば、炎症および/または自己免疫障害)に影響する)
の制御または発達における役割を果たすべきである。あるいは、血管生理学もし
くは血管発達に影響するか、またはニューロンに影響し得る。状態の開始または
維持と比較した治療薬の投与の時期もまた重要であり得る。特に、サイトカイン
複合体は、種々の文脈において、細胞によるサイトカイン合成、増殖などを媒介
する。IL−12p40/IL−B30のアンタゴニスト(天然に存在する形態
または阻害抗体のムテイン改変体など)は、免疫応答(例えば、炎症性または自
己免疫応答などの状態における)を阻害する選択的および強力な方法を提供し得
る。例えば、Samterら(編)Immunological Diseas
e第1巻および第2巻、Little,Brown and Coをまた参照の
こと。
性硬化症のモデルに有用であり得る)における肺状態(喘息および線維症の両方
)、糖尿病、および腸炎症が挙げられる。例えば、喘息について、Barnes
ら(1998)Mol.Med.Today 4:452−458;Pauwe
lsら(1998)Clin.Exp.Allergy Aug.28、補遺3
:1−5;Durham(1998)Clin.Exp.Allergy Ju
n.28、補遺2:11−16;Leung(1997)Pediatr.Re
s.42:559−568;Pretolaniら(1997)Res.Imm
unol.148:33−38;Lamkhiouedら(1996)Ann.
NY Acad.Sci.796:203−208;Erbら(1996)Im
munol.Cell.Biol.74:206−208;ならびにAnder
sonら(1994)Trends Pharmacol.Sci.15:32
4−332;肺繊維症について、Cokerら(1998)Eur.Respi
r.J.11:1218−1221;ならびにBienkowskiら(199
5)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.209:118−140;
EAEモデルについて(多発性硬化症について)、PearsonおよびMcD
evitt(1999)Curr.Top.Microbiol.Immuno
l.238:79−122;MillerおよびShevach(1998)R
es.Immunol.149:753−759;HoffmanおよびKar
pus(1998)Res.Immunol.149:790−794(846
−847および855−860に考察される);Segal(1998)Res
.Immunol.149:811−820(850−851および855−8
60に考察される);Liblauら(1997)Immnol.Today
18:599−604;Goldら(1997)Crit.Rev.Immno
l.17:507−510;Spack(1997)Crit.Rev.Imm
unol.17:529−536;ならびにLoenardら(1997)Cr
it.Rev.Immnol.17:545−553;糖尿病について、Alm
awiら(1999)J.Clin.Endocrinol.Metab.84
:1497−1502;Rabinovitchら(1998)Biochem
.Pharmacol.55:1139−1149;ならびにRabinovi
tch(1998)Diabetes Metab.Rev.14:129−1
51;ならびに、腸/腸管の炎症状態について、Leachら(1999)To
xicol.Pathol.27:123−133;Braunら(1999)
Curr.Opin.Rheumatol.11:68−74;Rugtvei
tら(1997)Gastroenterology 112:1493−15
05;Stroberら(1997)Immunol.Today 18:61
−64;ならびにFordら(1996)Semin.Pediatr.Sur
g.5.155−159を参照のこと。
生じる。p40/IL−B30での刺激後、CD69Lは高度に発現され、そし
て、CD54は劇的に減少する。付着分子の発現におけるこれらの変化は、第1
および第2のリンパ節のT/DC細胞リッチ領域に侵入する記憶細胞の調節を可
能にし得る(例えば、高い内皮細静脈(HEV)を介して)。記憶細胞はまた、
IL−12刺激に対して感受性となるように初回刺激される。従って、迅速なお
よび高度なIFN産生が、抗原によるIL−12産生後すぐ後に続く。従って、
p40/IL−B30は、応答速度を増加することによって、記憶細胞数を増加
することによって、または、両方によって、記憶細胞による免疫応答を促進し得
る。p40/IL−B30は、未処理の細胞に対してより効果を与えないかまた
は全く与えないかで、記憶細胞について特異的な差次的な効果を有し得る。逆に
、多数の慢性炎症状態において(例えば、関節炎リウマチ、慢性腸疾患、乾癬な
ど)活性病変は、記憶CD45Rblow細胞に依存している。このように、ア
ンタゴニストは、このような炎症性状態の慢性局面を効果的に阻害し得る。
L−12 p40および/またはIL−B30 mRNAの両方を生成すること
が公知である。Berkow(編)The Merck Manual of
Diagnosis and Therapy,Merck&Co.,Rahw
ay,N.J.;Thornら、Harrison’s Principles
of Internal Medicine,McGraw−Hill,N.
Y.;ならびにWeatherallら(編)Oxford Textbook
of Medicine,Oxford University Press
,Oxfordを参照のこと。多数の他の医療状態および疾患は、マクロファー
ジまたは単球による活性化を含み、そして、これらの多数が、本明細書中に提供
されるアゴニストまたはアンタゴニストによる処置に反応性である。例えば、S
titesおよびTerr(1991年編)Basic and Clinic
al Immunology Appleton and Lange,Nor
walk,Connecticut;ならびにSamterら(編)、Immu
nological Diseases Little,Brown and
Coを参照のこと。これらの問題は、本明細書中に提供される組成物を使用する
予防または処置に対して影響されやすいべきである。
体などは、精製され得、次いで(獣医学のまたはヒトの)患者に投与され得る。
これらの試薬を、生理学的に無害の安定化剤、賦形剤または保存剤とともに、例
えば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤(例えば、免疫アジュバ
ント)中で、追加の活性または不活性成分と、治療用途のために組み合わせ得る
。これらの組み合わせを滅菌濾過し、そして投与バイアル中の凍結乾燥によるよ
うな投与形態で、または安定化した水性調製物中での貯蔵に置かれ得る。本発明
はまた、補体結合しない形態を含む抗体またはその結合フラグメントの使用を意
図する。
トを使用する薬物スクリーニングは、会合した成分の単離を含む、IL−12
p40/IL−B30機能への結合親和性またはIL−12 p40/IL−B
30に対する他の関連する生物学的効果を有する化合物を同定するために実施さ
れ得る。次いで、その後の生物学的アッセイは、候補化合物が本来の刺激活性を
有するかどうか、そして従って、これがサイトカイン複合体の活性をブロックす
るという点で、ブロッカーまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するため
に利用され得る。同様に、固有の刺激活性を有する化合物は、シグナル伝達経路
を活性化し得、従って、これがこのサイトカイン複合体の活性を刺激するという
点で、アゴニストである。本発明は、さらに、アンタゴニストとしてのIL−1
2 p40、IL−B30、またはこの複合体に対するブロッキング抗体の治療
的使用およびアゴニストとしてのIL−12 p40、IL−B30、またはこ
の複合体の刺激抗体の治療的使用を意図する。このアプローチは、他のIL−1
2 p40またはIL−B30の種改変体に特に有用であるはずである。
および投与される他の製剤を含む、多くの異なる因子に依存する。従って、処置
投薬量は、安全性および効率を最適にするために滴定されるべきである。代表的
には、インビトロで使用される投薬量は、これらの試薬のインサイチュ投与に有
用な量で有用なガイダンスを提供し得る。特定の障害の処置に有効な用量の動物
試験は、ヒト投薬量の予測指標をさらに提供する。種々の考察が、例えば、Gi
lmanら(1990編)Goodman and Gilman’s:The
Pharmacological Bases of Therapeuti
cs(第8版)Pergamon Press;およびRemington’s
Pharmaceutical Sciences(第17版)(1990)
、Mack Publishing Co.,Easton,Penn.に記載
される。投与方法は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、または筋肉内投与、経皮
拡散などについて、本明細書中および以下に議論される。薬学的に受容可能なキ
ャリアには、水、生理食塩水、緩衝液、および例えば、Merck Index
,Merck&Co.,Rahway,New Jerseyに記載の他の化合
物が挙げられる。投与量範囲は、適切なキャリアとともに、通常は1mMより低
い濃度、代表的には約10μMより低い濃度、通常は約100nMより低い濃度
、好ましくは約10pM(ピコモル濃度)より低い濃度、および最も好ましくは
約1fM(フェムトモル濃度)より低い濃度の量であると予測される。徐放性処
方物、または徐放性装置は、しばしば、連続または長期の投与に利用される。例
えば、Langer(1990)Science 249:1527−1533
を参照のこと。
そのフラグメント、およびこれらもしくはこれらのフラグメントに対する抗体、
アンタゴニスト、およびアゴニストは、処置される宿主に直接投与され得るか、
あるいは化合物のサイズに依存して、投与前にオボアルブミンまたは血清アルブ
ミンのようなキャリアタンパク質にそれらを結合体化することが望ましくあり得
る。治療処方物は、多くの従来の投与処方物中で投与され得る。活性成分が単独
で投与されることは可能であるが、薬学的処方物としてそれを提示することが好
ましい。処方物は、代表的には、その1つ以上の受容可能なキャリアとともに、
上記で定義したように、少なくとも1つの活性成分を含む。各キャリアは、他の
成分と適合可能であるという意味で薬学的かつ生理学的の両方で受容可能である
べきであり、そして患者に有害であってはならない。処方物は、経口投与、直腸
投与、経鼻投与、局所投与または非経口(皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を
含む)投与に適切なものを含む。処方物は、便利に単位投与形態で提示され得、
そして薬学の技術分野で周知の多くの方法によって調製され得る。例えば、Gi
lmanら(1990編)Goodman and Gilman’s:The
Pharmacological Bases of Therapeuti
cs(第8版)Pergamon Press;およびRemington’s
Pharmaceutical Sciences(第17版)(1990)
、Mack Publishing Co.,Easton,Penn.;Av
isら(編、1993)Pharmaceutical Dosage For
ms:Parenteral Medications,Dekker,New
York;Liebermanら(編、1990)Pharmaceutic
al Dosage Forms:Tablets、Dekker,New Y
ork;およびLiebermanら(編、1990)Pharmaceuti
cal Dosage Forms:Disperse Systems、De
kker,New Yorkを参照のこと。本発明の治療は、他の薬剤(例えば
、他のサイトカイン(IL−6またはG−CSFまたは他のそれぞれのアンタゴ
ニストを含む)と併用されるか、あるいは関連して使用され得る。
両方が、タンパク質への結合活性について化合物をスクリーニングし得るキット
およびアッセイ方法に、特に有用である。自動化アッセイのいくつかの方法が、
短期間で数万の化合物のスクリーニングを可能にするように、近年開発されてい
る。例えば、Fodorら(1991)Science 251:767−77
3(これは、固体基材上で合成した複数の規定のポリマーによる結合親和性の試
験のための手段を記載する)を参照のこと。適切なアッセイの開発は、本発明に
よって提供されるような大量の精製された可溶性IL−12 p40/IL−B
30サイトカイン複合体の利用可能性によって、非常に容易にされ得る。
ー相互作用中の重要な残基を決定し得る。変異分析が実行されて(例えば、So
mozaら(1993)J.Exptl.Med.178:549−558を参
照のこと)、相互作用および/またはシグナル伝達において重要な特異的な残基
を決定し得る。PHD(RostおよびSander(1994)Protei
ns 19:55−72)およびDSC(KingおよびSternberg(
1996)Protein Sci.5:2298−2310)は、αヘリック
ス(H)、β鎖(E)、およびコイル(L)の二次構造予測を提供し得る。ヘリ
ックスAおよびDは、レセプター相互作用において典型的に最も重要であり、D
ヘリックスが、最も重要な領域である。
ータによって)定義されると、アンタゴニストが、通常見いだされ得る。潜在的
な相互作用アナログを試験をすることは、現在、精製されたIL−12 p40
/IL−B30複合体を使用する、高度に自動化されたアッセイ法の開発の際に
可能である。特に、新しいアゴニストおよびアンタゴニストは、本明細書中に記
載されるスクリーニング技法を使用することによって発見される。IL−12
p40/IL−B30分子のスペクトルについての組み合わせ結合親和性を有す
ることが見いだされた化合物、例えば、サイトカイン複合体の種改変体に対する
アンタゴニストとしてはたらき得る化合物が、特に重要である。
現する組換えDNA分子で安定に形質転換される真核生物または原核生物宿主細
胞を利用する。他の分子からの単離において、IL−12 p40/IL−B3
0を発現する細胞を単離し得る。このような細胞は、生存可能なまたは固定され
た形態のいずれかで、標準的な結合パートナー結合アッセイのために使用され得
る。Parceら(1989)Science 246:243−247;およ
びOwickiら(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
87:4007−4011(これらは、細胞性応答を検出するための感度の高
い方法を記載する)も参照のこと。
に対する適切な結合親和性を有する化合物についての高い処理能力のスクリーニ
ングを提供するアプローチを包含し、そしてGeysen,ヨーロッパ特許出願
第84/03564号(1984年9月13日に公開)に詳細に記載される。最
初に、多数の異なる小ペプチド試験化合物を、固体基材(例えば、プラスチック
ピンまたはいくつかの他の適切な表面)上で合成する。Fodorら(1991
)を参照のこと。次いで、すべてのピンを、可溶化した未精製のp40/IL−
B30または可溶化した精製p40/IL−B30と反応させ、そして洗浄する
。次の工程は、結合したp40/IL−B30を検出する工程を包含する。
たはアナログの分子形状の構造研究に基づき得る。エフェクターは、結合に応じ
て他の機能を媒介する他のタンパク質、または通常p40/IL−B30と相互
作用する他のタンパク質(例えば、レセプター)であり得る。どの部位が特定の
他のタンパク質と相互作用するかを決定するための1つの手段は、物理的構造決
定(例えば、x線結晶学または2次元NMR技法)である。これらは、どのアミ
ノ酸残基が、例えば、他のサイトカイン−レセプターモデルに対してモデルされ
るように分子接触領域を形成するかについてのガイダンスを提供する。タンパク
質構造決定の詳細な記載については、例えば、BlundellおよびJohn
son (1976) Protein Crystallography A
cademic Press,New Yorkを参照のこと。
するための種々の診断キットおよび方法における、p40/IL−B30タンパ
ク質、そのフラグメント、ペプチド、およびそれらの融合産物の使用を意図する
。代表的には、キットは、規定のp40、p40/IL−B30、またはIL−
B30のペプチドまたは遺伝子セグメント、あるいは一方もしくは他方を認識す
る試薬のいずれか(例えば、p40/IL−B30融合フラグメントまたは抗体
)を含む区画を有する。
るためのキットは、代表的に以下を含む:試験化合物;標識化合物(例えば、p
40/IL−B30に対する既知の結合親和性を有する結合パートナーまたは抗
体);p40/IL−B30の供給源(天然に存在するかまたは組換え);およ
び遊離の標識化合物から結合を放すための手段(例えば、分子の固定化のための
固相)。一旦化合物がスクリーニングされると、抗原に対して適切な結合親和性
を有するものが、それらがアゴニストまたはアンタゴニストとしてp40/IL
−B30シグナル伝達経路に作用するかどうかを決定するために、当該技術分野
で周知のように、適切な生物学的アッセイで評価され得る。組換えIL−12
p40/IL−B30融合ポリペプチドの利用可能性はまた、このようなアッセ
イを較正するための十分定義された標準を提供する。
ットは、代表的には、抗原に対する公知の結合親和性を有する標識化化合物(例
えば、結合パートナーまたは抗体)、サイトカインの供給源(天然に存在するま
たは組換え)、および遊離の標識された化合物から結合したものを分離するため
の手段(例えば、p40/IL−B30を固定するための固相)を含む。試薬を
含む区画、および説明書が、通常提供される。
ントを含む)は、p40、IL−B30、p40/IL−B30および/または
これらのフラグメントの上昇したレベルの存在を検出するための診断適用に有用
である。このような診断アッセイは、溶解物、生存細胞、固定した細胞、免疫蛍
光、細胞培養物、体液、を用い得、そしてさらに、血清中の抗原に関連する抗原
の検出などを包含し得る。診断アッセイは、均質(遊離の試薬と抗原−パートナ
ー複合体との間の分離工程なし)または不均質(分離工程あり)であり得る。種
々の市販のアッセイが存在し、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素
結合イムノソルベント検定法(ELISA)、酵素免疫検定法(EIA)、酵素
増倍免疫検定法(EMIT)、基質標識蛍光イムノアッセイ(SLFIA)など
である。例えば、Van Vunakisら(1980)Meth Enzym
ol.70:1−525;HarlowおよびLane(1980)Antib
odies:A Laboratory Manual,CSH Press,
NY;およびColiganら(編、1993)Current Protoc
ols in Immunology,Greene and Wiley,N
Y.を参照のこと。
場合、p40/IL−B30に対する抗体の存在を診断するための類似の用途を
有し得る。例えば、p40/IL−B30の過剰産生は、特に、癌または異常な
活性化または分化のような増殖性細胞状態において、異常な生理学的状態の診断
となり得る、種々の免疫学的反応の生成を生じ得る。
、キット中に供給される。本発明については、アッセイの性質に依存して、プロ
トコル、および標識、標識されたまたは標識されていない抗体または結合パート
ナー、あるいは標識されたp40/IL−B30が提供される。これは、通常、
緩衝液、安定化剤、酵素に対する基質のようなシグナル産生に必要な物質などの
ような、他の添加物と一緒である。好ましくは、このキットはまた、適切な使用
および使用後の内容物の処理の仕方の指示書を含む。代表的には、このキットは
、各有用な試薬のためのコンパートメントを有する。望ましくは、これらの試薬
が、アッセイを行うための試薬の適切な濃度を提供する水性媒体中で再構成され
得る場合、試薬は、乾燥した凍結乾燥した粉末として提供される。
で使用され得、あるいは種々の方法で改変され得る。例えば、標識することは、
検出可能なシグナルを直接または間接的に提供する部分を共有または非共有結合
することによって達成され得る。これらのアッセイの多くにおいて、結合パート
ナー、試験化合物、p40/IL−B30、またはこれらに対する抗体は、直接
または間接的に標識され得る。直接的に標識するための可能性は、以下の標識群
を包含する:125Iのような放射性標識、ペルオキシダーゼおよびアルカリホ
スファターゼのような酵素、および蛍光強度、波長シフト、または蛍光偏光の変
化をモニタリングし得る蛍光標識(米国特許第3,940,475号)。間接的
に標識するための可能性は、1つの構成成分のビオチン化、次いで上記の標識群
の1つにカップリングしたアビジンへの結合によるものを含む。
、種々のマトリクス上に固定化され得、次いで洗浄され得る。適切なマトリクス
には、ELISAプレートのようなプラスチック、フィルター、およびビーズが
挙げられる。例えば、Coliganら(編、1993)Current Pr
otocols in Immunology,第1巻、第2章、Greene
and Wiley,NY.を参照のこと。他の適切な分離技法には、限定す
ることなく、Rattleら (1984) Clin. Chem. 30:
1457−1461に記載のフルオレセイン抗体磁化可能粒子方法、および米国
特許第4,659,678号に記載のような二重抗体磁性粒子分離方法が挙げら
れる。
く報告されており、本明細書中に詳細に議論する必要はない。技法の多くは、ペ
プチド結合を形成するためにカルボジイミドまたは活性エステルのいずれかの使
用による活性化されたカルボキシル基の使用、連結のためのクロロアセチルのよ
うな活性化ハロゲンまたはマレイミドのような活性化オレフィンとメルカプト基
との反応によるチオエーテルの形成などを包含する。融合タンパク質はまた、こ
れらの適用における使用を見いだす。
オチドまたはポリヌクレオチド配列の使用を包含する。これらの配列は、異常状
態、例えば、炎症または自己免疫を有する疑いのある患者からの試料においてp
40またはIL−B30メッセージのレベルを検出するためのプローブとして使
用され得る。サイトカインは活性化のマーカーまたはメディエーターであり得る
ので、これは、例えば、効果が有意になる前および効果が有意に進行する前に予
防的な様式で、例えば、いつさらなる治療が必要とされ得るかを決定するために
、活性化細胞の数を決定するのに有用であり得る。RNAヌクレオチド配列およ
びDNAヌクレオチド配列の両方の調製、その配列の標識化、およびその配列の
好ましいサイズは、文献において十分な説明および議論を受け入れている。例え
ば、Langer−Saferら(1982)Proc.Natl..Acad
.Sci.79:4381−4385;Caskey(1987)Scienc
e 236:962−967;およびWilchekら(1988)Anal.
Biochem.171:1−32を参照のこと。
、意図される。診断または予後は、マーカーとして使用される多数の指標の組み
合わせに依存し得る。従って、キットは、マーカーの組み合わせについて試験し
得る。例えば、Vialletら(1989) Progress in Gr
owth Factor Res. 1:89−97を参照のこと。他のキット
が、他の細胞サブセットを評価するために使用され得る。
ターを単離するための方法が存在する。Gearingら(1989)EMBO
J.8:3667−3676を参照のこと。例えば、レセプターへの結合を妨
害することなくIL−B30サイトカインを標識するための手段が、決定され得
る。例えば、アフィニティー標識が、リガンドのアミノ末端またはカルボキシ末
端のいずれかに融合され得る。このような標識は、FLAGエピトープタグまた
は例えば、IgもしくはFcドメインであり得る。発現ライブラリーは、細胞分
類によってか、またはこのような結合成分を発現する亜集団を検出するための他
のスクリーニングによって、サイトカインの特異的結合に関してスクリーニング
され得る。例えば、Hoら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci
.USA 90:11267−11271;およびLiuら(1994)J.I
mmunol.152:1821−29を参照のこと。あるいは、パニング方法
が使用され得る。例えば、SeedおよびAruffo(1987)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 84:3365−3369を参照のこと
。
カイン複合体の結合パートナーが単離され得る。これは、例えば、リガンド−レ
セプター様形式でサイトカインと特異的に相互作用するタンパク質の同定を可能
にする。
p40/IL−B30に対する応答に関与するか否かが決定される。これらの機
能レセプター複合体がp40/IL−B30レセプター複合体と、特異的レセプ
ターサブユニットもしくはアクセサリーレセプターサブユニットのいずれかと、
多くまたは全ての成分を共有することはまた、かなり可能性がある。
なくなされ得、同様に当業者に明らかである。本明細書中に記載される特定の実
施形態は、例示目的のためのみに提供され、そして本発明は、特許請求の範囲が
与えられるものと等価物な完全な範囲と共に、このような添付の特許請求の範囲
の用語によってのみ制限される。
niatisら(1982)Molecular Cloning,A Lab
oratory Manual,Cold Spring Harbor La
boratory,Cold Spring Harbor Press,NY
;Sambrookら(1989)Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,(第二版),1−3巻、CSH Pre
ss,NY;Ausubelら,Biology,Greene Publis
hing Associates,Brooklyn,NY;Ausubelら
(1987および増刊)Current Protocols in Mole
cular Biology,Wiley/Greene,New York;
Innisら編(1990)PCR Protocols:A Guide t
o Methods and Applications Academic
Press,NY;Bonifacinoら、Current Protoco
ls in Cell Biology Wiley,NY;ならびにDoyl
eら、Cell and Tissue Culture:Laborator
y Protocols Wiley,NY。タンパク質の精製方法には、硫酸
アンモニウム沈殿、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化等
の方法が挙げられる。例えば、Ausubelら(1987および定期増刊);
Deutscher(1990)「Guide to Protein Pur
ification」Methods in Enzymology 第182
巻およびこのシリーズの他の巻;Coliganら(1995および増刊)Cu
rrent Protocols in Protein Science J
ohn Wiley and Sons,New York,NY;Matsu
daira編(1993)A Practical Guide to Pro
tein and Peptide Purification for Mi
crosequencing,Academic Press,San Die
go,CA;ならびにタンパク質精製製品の使用に関する製造業者の文献(例え
ば、Pharmacia,Piscataway,NJまたはBio−Rad,
Richmond,CA)を参照。組換え技術を併用することにより、適切なセ
グメント(エピトープタグ)(例えば、プロテアーゼ除去配列により融合され得
るFLAG配列または等価物)に融合させる。例えば、Hochuli(199
0)「Purification of Recombinant Prote
ins with Metal Chelate Absorbent」Set
low(編)Genetic Engineering,Principle
and Methods 12:87−98,Plenum Press,NY ;およびCroweら(1992)OIAexpress:The High
Level Expression & Protein Purificat
ion System QIAGEN,Inc.,Chatsworth,CA
を参照。
s Computer Group(GCG)、Madison、WI、NCB
I(NIH)、ならびにGenBank、NCBI、EMBO、および他の公の
配列の供給源からのものを含む利用可能なソフトウエアプログラムを使用して、
コンピューター配列分析を行う。他の分析供給源としては、例えば、RASMO
Lプログラム(Bazanら(1996)Nature379:591;Lod
iら(1994)Science 263:1762−1766;Sayleお
よびMilner−White(1995)TIBS20:374−376;お
よびGronenbergら(1991)Protein Engineeri
ng4:263−269を参照のこと);ならびにDSC(KingおよびSt
ernberg(1996)Protein Sci.5:2298−2310
を参照のこと)が挙げられ得る。また、Wilkinsら編(1997)Pro
teome Research:New Frontiers in Func
tional Genomics Springer−Verlag,NY;S
alzbergら編(1998)Computational Methods
in Molecular Biology Elsevier,NY;およ
びBirrenら編(1997)Genome Analysis:A Lab
oratory Manual Cold Spring Harbor Pr
ess,Cold Spring Harbor,NYを参照のこと。
gら編(1996)Weir’s Handbook of Experime
ntal Immunology 第1〜4巻、Blackwell Scie
nce;Coligan(1991および最新版)Current Proto
cols in Immunology Wiley/Greene,NY;お
よびMethods in Enzymology 第70、73、74、84
、92、93、108、116、121、132、150、162、および16
3巻。サイトカインアッセイが、例えば、以下に記載される:Thomsonら
(1994)The Cytokine Handbook(第2版)Acad
emic Press,San Diego;MetcalfおよびNicol
a(1995)The Hematopoietic Colony Stim
ulating Factors Cambrige University
Press;ならびにAggarwalおよびGutterman(1991)
Human Cytokines Blackwell Pub。
、腫瘍、または他の組織(例えば、動脈性平滑筋増殖(例えば、Koyomaら
(1996)Cell87:1069−1078)を参照のこと)における血管
形成活性および血管抑制(angiostatic)活性、血管上皮へのモノサ
イト接着(McEvoyら(1997)J.Exp.Med.185:2069
−2077を参照のこと)などをカバーする。また、Ross(1993)Na
ture362:801−809;RekhterおよびGordon(199
5)Am.J.Pathol.147:668−677;Thybergら(1
990)Atherosclerosis10:966−990;ならびにGu
mbiner(1996)Cell84:345−357を参照のこと。
Wouterlood編(1995)Neuroscience Protoc
ols modules10、Elsevier;Mehods in Neu
rosciences Academic Press;およびNeurome
thods Humana Press,Totowa,NJ。発育系の方法論
は、例えば、以下に記載される:Meisami(編)Handbook of
Human Growth and Developmental Biol
ogy CRC Press;ならびにChrispeels(編)Molec
ular Techniques and Approaches in De
velopmental Biology Interscience。
w CytometryおよびSorting Wiley−Liss,Inc
.,New York,NY;Shapiro(1988)Practical
Flow Cytometry Liss,New York,NY;ならび
にRobinsonら(1993)Handbook of Flow Cyt
ometry Methods Wiley−Liss,New York,N
Y。
である。IL−B30遺伝子の配列は、表1に提供されている。この配列は、ゲ
ノムヒト配列から誘導される。
プローブの調製を可能にする。この配列は、メッセージをコードするゲノムDN
Aの単離を可能にする。
胞分布を決定するためにプローブされる。PCR産物を、例えば、TAクローニ
ングキット(Invitrogen)を使用してクローニングされる。この得ら
れたcDNAプラスミドは、自動配列決定装置(Applied Biosys
tems)において両末端から配列決定される。
マーを調製する。代表的に、このプローブを、例えば、ランダムプライミングに
より標識する。両方のサブユニットの協調発現が最も重要であり、ここで、p4
0/IL−B30複合体が興味深い。
サイトカインまたは複合体を発現するものについてスクリーニングする。あるい
は、組換え構築物の組合せが作製され得る。種々の細胞株をスクリーニングし、
そして取り扱いの際にそれらの都合の良い特性について選択した。その後、個々
のサブユニットの個々の単離および組合せにより、いくつかのダイマー形成が得
られ得る。天然のIL−B30を、天然源から、または適切な発現ベクターを使
用する形質転換された細胞からの発現により単離され得る。アデノウイルス構築
物をまた、産生/発現のために使用し得る。
るか、または細胞溶解物または上清から高い効率で効率的な精製のための操作手
段と組み合わせられ得る。特に、p40とIL−B30の融合は、適切なリンカ
ーを用いるかまたは用いることなく、処理または精製のための高度に効率的な方
法で得られ得る。FLAGまたはHis6セグメントは、このような精製機能の
ために使用され得る。あるいは、アフィニティークロマトグラフィーは、以下に
参照されるように特定の抗体と共に使用され得る。
いて産生される。
ナル抗体を産生するために免疫系に提示される。例えば、Coligan(19
91)Current Protocols in immunology W
iley/Greene;およびHarlowおよびLane(1989)An
tibodies:A Laboratory Manual Cold Sp
ring Harbor Pressを参照のこと。免疫選択または除去方法は
、得られた抗体が、個々の成分自体によって提示される抗体決定と異なる、ポリ
ペプチドの複合体によって提示された抗原決定基に対して特異的であることを保
証するように適用され得る。ポリクローナル血清、またはハイブリドーマが、調
製され得る。適切な状況において、この結合剤は、上記(例えば、蛍光など)の
ように標識されるか、またはパニング法のために基質に固定されるかのいずれか で ある。免疫選択、免疫除去、および関連する技術は、例えば、2個のサブユニ
ット間の複合体に対して所望される場合、選択薬剤を調製するために利用され得 る。
た。このIgドメインは、プロテインAに結合し、そしてこのポリペプチドを沈
殿させ得る。IL−B30Etag(N末端のFLAGモチーフでタグ化された
エピトープ)構築物をまた調製した。このポリペプチドは、M2抗体で免疫沈降
可能である。この発現構築物を、IL−12 p40−Ig構築物単独、IL−
B30Etag構築物単独、または両方一緒のいずれかで293T細胞にトラン スフェクト した。細胞を、35Sメチオニンを用いて標識した。IL−12 p
40構築物単独を用いると、可溶性タンパク質は、プロテインAを使用する細胞
上清中で検出されなかった。同様に、FLAG−IL−B30構築物を用いると
、可溶性タンパク質は、M2抗体を使用する細胞上清中で検出されなかった。し
かし、この2つの発現構築物の同時トランスフェクトを用いると、この細胞上清
により、プロテインA薬剤またはM2抗体のいずれかと共に沈殿可能な可溶性複
合体が産生された。この複合体のPEGE分析により、プロテインA沈殿複合体
は、2つの予測されたポリペプチドIL−12 p40−Ig融合およびFLA
G−IL−B30ポリペプチドに対応するポリペプチドから作製されたことが明
らかとなった。対応して、M2抗体で沈殿した複合体は、FLAG−IL−B3
0ポリペプチドおよびIL−12 p40−Ig融合タンパク質から作製された
。
を用いた同様の実験により、予測された結果が得られた。FLAG−IL−B3
0構築物を用いるトランスフェクションでは、有意な可溶性タンパク質が得られ
なかった。両方の発現ベクターの霊長類細胞への同時トランスフェクションによ
り、M2抗体と免疫沈降した複合体の効果的な分泌物が得られた。得られた複合
体のPAGE分析により、この複合体がFLAG−IL−B30ポリペプチドお
よびIL−12−p40ポリペプチドから作製されることを確認した。
から作製される。p40/IL−B30の融合構築物は、レセプターサブユニッ
トβ1を発現する細胞と結合する。
ユニットβ1(サブユニットβ2ではない)との結合を遮断し得る。このp40
サブユニットは、p40/IL−B30複合体の成分であるので、IL−12レ
セプターサブユニットβ1が、p40/IL−B30の融合構築物に対するレセ
プター成分であり得るかどうかを試験した。IL−12レセプターサブユニット
β1に対する抗体は、レセプターサブユニットβ1を発現する細胞と融合構築物 との結合を遮断する。このp40/p70複合体に対する抗体(主に、p40サ
ブユニットを認識する)は、p40/IL−B30組成物の効果を遮断し得、こ
のp40成分は、レセプター相互作用において重要であることを示唆する。これ
らの観測は、レセプターサブユニットβ1がp40/IL−B30融合構築物と
結合することを示唆する。関連するレセプターの中で共有されている共通のgp
130サブユニットの関与を試験する同様の実験によると、このgp130は、
p40/IL−B30に対するレセプターの関連するサブユニットではないこと
を示唆する。
開始する。この1つのサブユニットを発現するが、結合を示さない細胞を、さら
なるサブユニットを発現クローニングするために使用する。他のレセプターサブ
ユニットβ2ホモログがスクリーニングされる。あるいは、適切な細胞からのラ
イブラリーが、標準的な発現クローニング方法において使用され得る。
−6とG−CSFとの間の配列および構造相同性に基づいて試験する。最初に、
IL−6またはG−CSFの生物学的活性を示したアッセイについて試験した。
アッセイは、組換え複合体または融合構築物のいずれかにおいて実施した。融合
構築物は、IL−B30の成熟配列に融合した適切な長さのser/gly富化
リンカー配列に融合した成熟IL−12 p40配列に融合したN末端FLAG
エピトープに結合したIL−12 p40シグナル配列を有する構築物からなる
。この構築物は、十分に発現し、分泌され、そしてエピトープタグは、精製およ
び局在化の両方を可能にする。マウスおよびヒトの両方の配列形態が、産生され
た。個々のポリペプチドおよび融合タンパク質の両方のアデノウイルス発現構築
物がまた、利用可能となる。
胞、プレ−B細胞、プレ−T細胞、および繊維芽細胞−内皮細胞型が挙げられる
。例えば、マクロファージ/単球細胞を、細胞表面マーカーの変化(例えば、M
HCクラスII、B7、CD40、および関連ファミリー);サイトカインおよ
びケモカインの産生;ならびに抗原提示能について評価する。CD4+T細胞、
両方のネイティブCD45Rbhiおよび記憶CD45RblowT細胞を、例
えば、増殖および活性マーカーについて、およびエフェクター機能(例えば、サ
イトカインおよびケモカインの産生)についてアッセイする。細胞傷害CD4+
、CD8+およびNK細胞が、産生および機能の効果について評価される。抗体
産生の効果は、例えば、脾臓細胞およびMLN B細胞について試験される。樹
状細胞は、ファクター産生を含む、産生、成熟、および機能について評価される
。アポトーシスアッセイがまた、展開される。
ter培地)の調節おける効果について、ストローマ細胞およびB細胞前駆体の
産生および分化(Whitlock−Witte培地)の調節について、ならび
に初期骨髄群およびBリンパ群を調節するための潜在性の評価について試験され
る。
投薬応答分析を、関連するサイトカインIL−6、G−CSFなどと組合せて実
施する。サイトセンサーマシン(cytosensor machine)が使
用され得、これにより細胞の代謝および増殖を検出する(Molecular
Devices,Sunnyvale,CA)。
を、抗−CD3または抗−CD3と抗−CD28の両方を用いて刺激した。抗−
CD3刺激は、必須であるようである。ヒトp40/IL−B30融合タンパク
質はまた、活性化したTh1またはTh2細胞クローンの増殖を増強するが、活
性化していないTh1またはTh2細胞クローンはそうではない。
融合タンパク質は、抗−CD3で刺激した場合に、CD4+CD45Rblow CD62LlowCD44hi細胞(記憶/活性化したT細胞)の増殖を支持し
た。融合タンパク質による刺激は、抗−CD28同時刺激によって増強されない
。これは、IL−2の存在にほとんど依存しない。このことは、p40/IL−
B30が、記憶表現型を有する細胞群を増殖させ、そして/または免疫性記憶を 生成するかま たは維持するための重要な因子であり得ることを示唆する。このサ
イトカインは、Th1表現型(例えば、IFNγ(IL−4またはIL−5では
ない)を産生する細胞)を含む活性化記憶細胞を選択的に支持するようである。
らを、抗CD3および抗IL−2の存在下で、そしてCD32、CD58、およ
びCD80を発現する照射した線維芽細胞とともに例えば、2週間培養し、それ
によってT細胞を活性化し、かつ増殖した。T細胞培養物を、増殖または分化に
対する種々のサイトカインの効果について評価した。個々の細胞を、FACS分
析によってサイトカイン産生について評価した。p40/IL−B30融合タン
パク質は、IFNγを産生し、IL−4を産生しない(Th1細胞に特徴的なサ
イトカイン発現プロフィール)T細胞の増殖および分化を支持した。
精製する。簡単には、3×108個のフィコール帯単核細胞(ficoll b
anded mononuclear cell)を、例えば、200μlのα
CD2(Leu−5A)、200μlのαCD3(Leu−4)、100μlの
αCD8(Leu2a)、100μlのαCD19(Leu−12)、100μ
lのαCD20(Leu−16)、100μlのαCD56(Leu−19)、
100μlのαCD67(IOM 67;Immunotech,Westbr
ook,ME)、および抗グリコホリン抗体(10F7MN,ATCC,Roc
kvile,MD)からなるモノクローナル抗体(Becton−Dickin
son;Mountain View,CA)のカクテルとともに氷上でインキ
ュベートする。抗体結合細胞を洗浄し、次いでヒツジ抗マウスIgG結合体化磁
気ビーズ(Dynal,Oslo,Norway)とともに(20:1のビーズ
対細胞の比)、インキュベートする。抗体結合細胞を、磁場の適用によって単球
から分離する。その後、ヒト単球を、IL−B30、IL−6,G−CSFまた
は組み合わせの非存在下または存在下で1%ヒトAB血清を含むYssel培地
(Gemini Bioproducts,Calabasas,CA)におい
て培養する。
ば、2×105個の精製したヒト単球を、1%ヒト血清を含むリン酸緩衝化生理
食塩水(PBS)中で、氷上で20分間インキュベートする。細胞を200×g
でペレット化する。細胞を、20mlのPEまたはFITCで標識したmAb中
に再懸濁する。さらに氷上で20分間インキュベーション後、細胞を、1%ヒト
血清を含むPBSにおいて洗浄し、続いてPBS単独で2回洗浄する。細胞を、
1%パラホルムアルデヒドを含むPBSにおいて固定し、そしてFACScan
フローサイトメーター(Becton Dickinson;Mountain
View,CA)で分析する。例示的なmAb(例えば、Becton−Di
ckinsonのCD11b(抗mac1)、CD11c(a gp150/9
5)、CD14(Leu−M3)、CD54(Leu 54)、CD80(抗B
B1/B7)、HLA−DR(L243)ならびにCD86(FUN 1;Ph
armingen)、CD64(32.2;Medarex)、CD40(mA
b89;Schering−Plough France) )を使用する。
ロウイルス発現物質)の非存在下または存在下で1%ヒトAB血清を含むYss
el培地(Gemini Bioproducts,Calabasas,CA
)において培養する。さらに、単球を、IL−B30の非存在下または存在下で
LPS(E.coli 0127:B8 Difco)を用いて刺激し、そして
細胞培養上清中のサイトカイン(IL−1β、IL−6、TNFα、GM−CS
F、およびIL−10)の濃度をELISAによって決定する。
LPS(E.coli 0127:B8 Difco)ならびに10mg/ml
のBrefeldin A(Epicentre technologies
Madison WI)の非存在下または存在下でYssel培地において12
時間培養する(100万個/ml)。細胞をPBSにおいて洗浄し、そしてRT
で20分間2%ホルムアミド/PBS溶液においてインキュベートする。その後
、細胞を洗浄し、透過化緩衝液(PBS/BSA(0.5%)/Azide(1
mM)中0.5%サポニン(Sigma))中に再懸濁し、そしてRTで20分
間インキュベートする。細胞(2×105個)を遠心分離し、そしてRTで20
分間、透過化緩衝液において10倍に希釈された20mlの直接結合体化抗サイ
トカインmAb中に再懸濁する。以下の抗体が使用され得る:IL−1α−PE
(364−3B3−14);IL−6−PE(MQ2−13A5);TNFα−
PE(MAb11);GM−CSF−PE(BVD2−21C11);ならびに
IL−12−PE(C11.5.14;Pharmingen San Die
go,CA)。その後、細胞を透過化緩衝液において2回洗浄し、そしてPBS
/BSA/Azideにおいて1回洗浄し、そしてFACScanフローサイト
メーター(Becton Dickinson;Mountain View,
CA)で分析する。
てIFNγを産生した。この効果は、IL−2と相乗的であった。融合産物は、
休止T細胞、休止Th1細胞クローンまたは休止Th2細胞クローンではなくて
、活性化細胞によってIFNγ産生を促進した。
ール水溶性造影剤を通じる遠心分離によって単離する。PBMCを、IL−B3
0の非存在下または存在下で96ウェルプレート(Falcon,Becton
−Dickinson,NJ)において1%ヒトAB血清を含む200μl Y
ssel培地(Gemini Bioproducts,Calabasas,
CA)中で培養する。細胞を、培地単独か、または100U/ml IL−2(
R&D Systems)と組み合わせた培地中で120時間培養する。3H−
チミジン(0.1mCi)を培養の残り6時間添加し、そして3H−チミジン取
り込みを、液体シンチレーション計測することによって決定した。
他の生物学的アッセイ系におけるアゴニスト活性およびアンタゴニスト活性につ
いて、例えば、T細胞、B細胞、NK、マクロファージ、樹状細胞、造血細胞前
駆体などに対して試験する。IL−6およびG−CSFの構造相関のために、こ
れらの活性に関連するアッセイを、分析するべきである。
ニスト活性について評価する。例えば、Hoら(1993)Proc.Natl
.Acad.Sci.USA 90,11267−11271;Hoら(199
5)Mol.Cell.Biol.15:5043−5053;およびLiuら
(1994)J.Immunol.152:1821−1829を参照のこと。
ッセイ、抗原または同種異系刺激に応答するT細胞サイトカイン産生および増殖
における効果について評価する。例えば、de Waal Malefytら(
1991)J.Exp.Med.174:1209−1220;de Waal
Malefytら(1991)J.Exp.Med.174:915−924
;Fiorentinoら(1991)J.Immunol.147,3815
−3822;Fiorentinoら(1991)J.Immunol.146
:3444−3451;およびGrouxら(1996)J.Exp.Med.
184:19−29を参照のこと。
アッセイは、例えば、Hsuら(1992)Internat.Immunol
.4:563−569;およびSchwarzら(1994)J.Immuno
ther.16:95−104に基づき得る。
J.Exp.Med.175:671−682;Roussetら(1992)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1890−1893に
記載の例えば、IgG2およびIgA2スイッチ因子アッセイを含む方法論によ
って分析される。
な動物は、特定の組織か、または完全な生物全体における遺伝子の過剰発現の効
果を決定するのに有用である。このようなことは、種々の段階における動物また
は特定の組織の発達に関する興味深い洞察を提供し得る。さらに、生物学的スト
レスへの種々の応答に対する効果は、上昇し得る。例えば、Hoganら(19
95)Manipulating the Mouse Embryo:A L
aboratory Manual(第2版)Cold Spring Har
bor Laboratory Pressを参照のこと。
能である。例えば、Hittら(1997)Adv.Pharmacol.40
:137−195;およびQuantum Biotechnologies,
Montreal,Canadaの文献を参照のこと。動物は、種々の発達また
は生理学的に機能的な動物系に対するこの遺伝子の効果を決定するために有用で
あり得る。
してCMVエンハンサーβ−アクチンプロモーターおよびウサギβ−グロビンポ
リアデニル化シグナル(以前にNiwaら(1991)Gene 108:19
3−200によって記載された)を含む発現ベクターにクローニングした。ベク
ター配列からの導入遺伝子の分離は、Mannら(1993)「Factor
Influencing Production Frequency of
Transgenic Mice」、Methods in Enzymolo
gy 225:771−781によって記載される帯状スクロース勾配遠心分離
によって達成された。導入遺伝子を含む画分をプールし、Microcon−1
00フィルターを介してマイクロ遠心分離し、そして微量注入緩衝液(5mM
Tris−HCl(pH7.4)、5mM NaCl、0.1mM EDTA)
で5回洗浄した。
)、5mM NaCl、0.1mM EDTA)中に最終濃度が1〜5ng/m
lになるように再懸濁し、卵([C57BL/6J×DBA/2]F1;The
Jackson Laboratory)中に微量注入した。次いで、Hog
anら(1994)Manipulation of the Mouse E
mbryo,Plainview,NY,Cold Spring Harbo
r Laboratory Pressによって公開された手順に従って、IC
R(Sprague−Dawley)養母の卵管に移した。10日齢目までに、 産まれた 動物の尾部の小片を、DNA分析のために切り取った。トランスジェニ
ック創始体の同定を、以前にLiraら(1990)Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,87:7215−7219によって記載されたポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR)分析によって実施した。IL−B30トランスジェニッ
クマウスの同定は、マウス尾部DNAの増幅によって達成された。内因性LDL
遺伝子のための増幅反応プライマーのための内部コントロールとして使用した。
このプライマーは、IL−B30導入遺伝子の200bpセグメントおよびLD
L遺伝子の397bpセグメントを増幅する。PCR条件は以下の通りであった
:95℃、30秒;60℃、30秒;72℃、60秒を30サイクル。トランス
ジェニック動物を、無病原体条件下に保持した。
TX)の詳説に従って、RNA STAT−60を用いて組織から抽出した。総 RNA(20mg)を変性し、Biotrans membrane(ICN
Biomedicals,Costa Mesa,CA)上にブロットした。導
入遺伝子発現を、ハイブリダイゼーションによって評価し、L−30 cDNA
(Stratagene,La Jolla,CA)を無作為に標識した。総R
NAを、マウスヘモペキシン遺伝子、マウスα−1酸グリコタンパク質遺伝子、
およびマウスハプトグロビン遺伝子の無作為に標識したPCRセグメントとハイ
ブリダイズさせることによって急性期肝臓遺伝子発現を評価した。
行った。マウスIL−2(感受性<3pg/ml)、マウスIL−1b(感受性
<3pg/ml)、マウスIFN−γ(感受性<2pg/ml)およびマウスT
NF−α(感受性<5.1pg/ml)のためのELISAキットを、R &
D systems(Minneapolis,MN)から購入した。マウスI
L−6 ELISAキット(感受性<8pg/ml)を、Biosource
International(Camarillo,CA)から購入した。マウ
スIL−1α ELISAキット(感受性<6pg/ml)を、Endogen
(Cambridge,MA)から購入した。
gen(San Diego,CA)から購入した抗体対を用いて、製造業者の
ガイドラインに従って行った。抗マウスIgM(クローン11/41)、抗マウ
スIgA(クローンR5−140)、抗マウスIgG1(クローンA85−3)
、抗マウスIgG2a(クローンR11−89)および抗マウスIgG2b(ク
ローンR9−91)を、捕獲抗体として使用した。精製したマウスIgM(クロ
ーンG155−228)、IgA(クローンM18−254)、IgG1(クロ
ーン107.3)、IgG2a(クローンG155−178)およびIgG2b
(クローン49.2)を使用して、標準曲線を作製した。ビオチン抗マウスIg
M(クローンR6−60.2)、ビオチン抗マウスIgA(クローンR5−14
0)、ビオチン抗マウスIgG1(クローンA85−1)、ビオチン抗マウスI
gG2a(クローンR19−15)およびビオチン抗マウスIgG2b(クロー
ンR12−3)を検出抗体として使用した。
chols Institute,San Juan Capistrano,
CA)によって提供される指示に従って、酸−エタノール抽出された後にマウス
IGF−1をまた認識する、ヒトIGF−1についての市販のラジオイムノアッ
セイを用いて決定した。
%リン酸緩衝化ホルマリン中に浸すことによって固定するかのいずれかを行った
。ホルマリン固定組織を、慣用的に5mmに処理し、そしてヘマトキシリン−エ
オシン(H & E)を用いて染色した。免疫染色に関して、急速凍結部分をア
セトンで固定し、そして風乾した。
ner Systems,Becton Dickinson,Rutherf
ord,NJ)に眼窩下洞から収集した。血液学的な値を、自動化システム(A
bbot Cell−Dyn 3500,Abbot Park,IL)を用い
て決定した。過度な凝集または過度に大きな血小板のために機器が正確な血小板
数を提供できない場合、血小板計数を手動によって行った。血液スミアを、自動
化染色機(Bayer Hema−Tek 2000,Elkhart,IN)
を用いて、改変されたライト−ギームザ染色(Hema−Tek Stain
Pack,Bayer Corp.,Elkhart,IN)で染色し、そして
未成熟細胞および血小板、赤血球、および白血球形態学について手動で試験した
。
によって骨髄を排出した。骨髄細胞を、一度洗浄し、そして致命的に照射した(
1000RAD)レシピエントマウスにi.v.注射した。
ニックマウスにおいてNiwaら(1991)Gene 108:193−20
0によって記載されたCMVエンハンサー/アクチンプロモーターの制御下で発
現させた。このエンハンサー/プロモーターカセットは、高レベルの導入遺伝子
の発現を主に骨格筋および膵臓に指向するが、この導入遺伝子は、実質的に全て
の生物および細胞において発現され得る。Liraら(1990)Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 87:7215−7219を参照のこと。
成長阻害動物であった。IL−B30トランスジェニックマウスの体重の増加速
度は、広範に変化したが、コントロール同腹子において見出された体重よりも明
らかに低かった。IL−B30トランスジェニックマウスおよびコントロール同
腹子の筋肉または皮膚のいずれかから抽出されたRNAのノーザンブロット分析
は、IL−B30 cDNAにハイブリダイズした。これは、IL−B30 m
RNAが、全てのIL−B30トランスジェニックマウスの筋肉および皮膚の両
方において検出されたが、コントロール同腹子においては検出されなかったこと
を示した。これは、成長阻害された成長がIL−B30の発現と常に関係してい
たことを実証した。
存し、そして阻害された成長、腹部膨脹症、乱れた柔皮、不妊症、および突然死
によって示されるようにIL−B30の発現によって影響した。このように、I
L−B30のトランスジェニック発現は、IL−B30トランスジェニック子孫
の産生を妨害する表現型を生じた。ここで示された結果は、IL−B30トラン
スジェニック創始マウスの予備的分析から導かれる。
って、複数部位(肺、皮膚、食道、小腸および肝臓(胆管)、大腸、および膵臓
を含む)における最少から中程度の炎症が、明らかになった。炎症性浸潤は、好
中球、リンパ球、および/またはマクロファージからなった。皮膚における炎症
は、数匹のマウスにおいて、表皮肥厚および/または潰瘍と関連した。肺におい
て、気管支周囲の単核細胞浸潤は、ときどき顕著であり、肺胞壁は、増化した数
の白血球を含み、そして内皮の内層気道は、過形成であった。最小の門脈周囲の
単核細胞浸潤がまた、肝臓において一般的であった。リンパ節の皮質は、しばし
ば、散在した細胞性かつ欠損した小胞性の発達であった。
は、脾臓において特に顕著であった。3匹のトランスジェニックマウスおよび1
匹のコントロールマウス由来の脾臓を、T細胞(抗−CD3)、B細胞(抗−B
220)、およびマクロファージ(抗−F4/80)に関して免疫組織学的染色
後試験した。トランスジェニックマウスにおいて、CD3陽性細胞、B220陽
性細胞、およびF4/80陽性細胞が、これらの正常な位置に存在した。しかし
、白色脾髄は、赤色脾髄中でEMHによって分離され、そして赤色脾髄内で陽性
に染色される細胞は、低い強度で染色された造血細胞が散在するか、または種々
の抗体を用いて陽性に染色されなかった。これらの観察は、IL−30のトラン
スジェニック発現がEMHと関連する全身性炎症を誘導することを示す。
めに、完全な血液分析を実行した。IL−B30トランスジェニックマウスの血
液中の好中球数は、コントロール同腹仔中の最も高い好中球数に対して3〜11
倍増加した。末梢血好中球における増加は、炎症に典型的であり、そして種々の
組織で感察された好中球浸潤と相関する。従って、骨髄系(顆粒球性)/赤血球
系の割合は、骨髄において増加した。
30トランスジェニックマウスにおいて3倍まで増加した。増加した数の血小板
は、増加した数の巨核球、または巨核球による血小板の産生における増加のいず
れかに由来し得た。いずれかの可能性を試験するために、IL−B30トランス
ジェニックマウス由来の末梢血、骨髄および脾臓を、顕微鏡分析した。末梢血に
おいて、血小板の奇異な形態(伸長しそして紡錘形態の血小板を含む)が、頻繁
に検出された。数匹のマウスの骨髄および脾臓において、巨核球は、細胞質量の
増加に起因して拡大していた。対照的に、骨髄および脾臓において、巨核球の数
が増加しなかった。これは、IL−B30が、巨核球による血小板産生を加速す
ることによって、血小板の数の増加を誘導することを示唆する。
および明らかに変化する程度の再生をともなって、軽度から中程度の小球性低色
素性貧血を経験した。ヘマトクリット値は、コントロール平均よりも30〜70
%低かった。小球性低色素性貧血の存在は、ヘモグロビン産生における欠損を示
唆する。
サイトカインの変更された発現と関連するか否かを試験するために、本発明者ら
は、末梢血中のIL−1、TNFα、IL−6、およびIFNγの濃度を決定し
た。試験された全てのIL−B30トランスジェニックマウスにおいて、TNF
αおよびIFNγのレベルが増加した。さらに、IL−1のレベルは、試験され
たIL−B30トランスジェニックマウスの25%で増加した。IL−B30ト
ランスジェニックマウス中で見出されたIL−1およびTNFαの濃度は、LP
Sによる急性炎症応答の誘導と関連したレベルに達した。驚くべきことに、IL
−6の発現が炎症状態下で高度に誘導され(Reineckerら(1993)
Clin.Exp.Immunology 94:174−181;Steve
nsら(1992)Dig.Dis.Sci.37:818−826)そしてT
NFα、IL−1およびIFNγによって直接誘導され得る(Helleら(1
988)Eur.J.Immunol.18:957−959)のにも関わらず
、IL−6は、IL−B30トランスジェニックマウスの末梢血中に検出されな
かった。
急性期応答を伴って炎症に対して反応する。IL−B30トランスジェニックマ
ウスが全身性炎症の表現型特徴を示すので、本発明者らは、IL−B30トラン
スジェニックマウスおよびコントロール同腹仔の肝臓における急性期遺伝子の発
現を試験した。急性期肝臓遺伝子α−1酸グリコプロテイン、ハプトグロブリン
、およびヘモペキシンは、試験された全てのIL−B30トランスジェニックマ
ウスにおいて高度に発現し、一方、これらの遺伝子の発現は、コントロール同腹
仔では検出されなかった。これは、急性期肝臓遺伝子が、IL−B30トランス
ジェニックマウスで構成的に発現されることを示す。
グロブリン合成を誘導する。免疫グロブリン合成がIL−B30トランスジェニ
ックマウスにおいて変化されたか否かを試験するために、末梢血中の免疫グロブ
リンアイソタイプの濃度を、決定した。7匹のIL−B30トランスジェニック
マウスのうちの2匹において、IgAの濃度が、コントロール同腹仔と比較した
場合、6〜9倍に増加した。さらに、IgG1、IgG2aおよびIgG2bの
濃度は、コントロール同腹仔と比較した場合、試験された全てのIL−B30ト
ランスジェニックマウスにおいて2.5〜6倍に増加した。対照的に、IgMま
たはIgEの力価における有意な増加は、試験されたいずれのIL−B30トラ
ンスジェニックマウスにおいても検出され得なかった。事実、7匹のIL−B3
0トランスジェニックマウスのうちの4匹は、顕著に減少したレベルのIgM合
成を示した。要約すると、IL−B30トランスジェニックマウスのサブセット
は、免疫グロブリンアイソタイプIgAおよびIgGの濃度において6〜9倍の
増加を示したが、免疫グロブリンアイソタイプIgMおよびIgEの濃度には、
有意な増加は検出されなかった。
roenterology 91:830−836;Laursenら(199
5)Arch.Dis.Child.72:494−497)またはトランスジ
ェニック動物におけるサイトカインの過剰発現(De Benedettiら(
1994)J.Clin.Invest.93:2114−2119)は、イン
スリン様増殖因子−1(IGF−1)の減少と関連する増殖欠損を引き起こし得
る。IL−B30トランスジェニックマウスの発育阻害された増殖がIGF−1
の減少したレベルへさかのぼり得るか否かを試験するために、トランスジェニッ
クマウスの血清サンプルを、IGF−1に関してアッセイした。試験された全て
のIL−B30トランスジェニックマウスにおいて、血清中のIGF−1の量は
、年齢の一致したコントロール同腹仔中で見出されるレベルの12〜14%であ
った。これは、IL−B30のトランスジェニック発現、ならびに生成される引
き続く炎症性応答が、IL−B30トランスジェニックマウス中のIGF−1の
減少を引き起こし、そして結果として成長障害および不妊症の原因となり得るこ
とを示唆する(Gayら(1997)Endocrinology 137(7
):2937−2947)。
泌タンパク質である。IL−B30がサイトカインとして機能するか否かおよび
離れた多器官の炎症および急性期肝臓応答を誘導し得るか否かを試験するために
、本発明者らは、IL−B30トランスジェニック骨髄を、致死的に照射された
野生型レシピエントマウスに移した。
た急性期タンパク質SAAの濃度を、移動後35日の早さでIL−B30骨髄レ
シピエント中に検出し得、そしてSAAレベルは時間が経っても増加した。末梢
血中の漸増する濃度のSAAの同時発生によって、波立った毛衣ならびに口吻お
よび喉の辺りの炎症した皮膚の出現によって判定されるように、IL−B30骨
髄レシピエントの健康は悪化した。対照的に、野生型骨髄のレシピエントは、血
液において上昇したレベルのSAAを有さず、病気のようにも見えなかった。
は、IL−B30トランスジェニック骨髄のレシピエントの骨髄および脾臓中に
検出され得たが、野生型骨髄のレシピエントの器官では検出され得なかった。I
L−B30トランスジェニックドナーの場合、皮膚、肺、肝臓および胃腸管は、
IL−B30トランスジェニック骨髄のレシピエント中で炎症であったが、野生
型骨髄のレシピエント中では炎症ではなかった。さらに急性期肝臓遺伝子(ヘモ
ペキシン、AGP−1)は、IL−B30トランスジェニック骨髄レシピエント
中で高度に発現されたが、IL−6は、血清中で検出され得なかった。これらの
結果は、IL−B30が長期の特徴を有する真のサイトカインであることを示唆
する。
た(runting)全身性炎症、不妊症および死によって特徴付けられる顕著 な 表現型を誘導する。IL−B30トランスジェニック動物は、肺、肝臓、皮膚
、および消化管中の炎症性細胞の浸潤を伴う全身性炎症を有する。
らは、IL−6のトランスジェニック発現のいくつかのモデルの表現形と著しく
類似した)を引き起こした。IL−6のトランスジェニック発現の効果またはマ
ウスへの組換えIL−6の投与後と類似して、好中球浸潤および貧血が、IL−
B30のトランスジェニック発現の結果として動物中で観察された。IL−6ト
ランスジェニック動物と同様に、IL−B30トランスジェニック創始動物の成
長障害は、これらの動物において観察される全身性炎症と関連し得る減少したレ
ベルのIGF−1に関連した。
の直接的な効果としてかまたはIL−1およびTNFα発現のIL−B30媒介
アップレギュレーションのいずれかによる、アップレギュレートされたIL−6
発現によって引き起こされ得る。IL−1およびTNFαは、IL−6の既知の
誘導因子であり、そして増加した濃度のTNFαおよびIL−1が、IL−B3
0トランスジェニックマウスの末梢血に見出された。
かったことは、IL−B30動物の表現型がこの新規サイトカインの過剰発現に
直接関連すること、およびこれらの配列相同性によって暗示されていたように、
IL−B30がIL−6と類似の生物学的活性を有することを示唆する。
およびB細胞分化を誘導する多面発現性サイトカインである。
プトグロビン、ヘモペキシンおよび血清アミロイドAタンパク質のような急性期
肝臓遺伝子を発現する。類似した表現型は、IL−6のトランスジェニック過剰
発現の効果としてまたは組換えIL−6の投与後に、マウス中で示された。さら
に、IL−B30のトランスジェニック発現は、多くの血小板が奇異な形態(伸
長した見かけ、大きなサイズ、および/または紡錘形態)を有するという点で異
常である血小板増加症を引き起した。本発明者らは、IL−B30および/また は 他のアップレギュレートされたサイトカインが、正常な血小板産生に対する効
果を有することを疑った。これはまた、IL−B30が、IL−6およびその関
連物と生物学的活性を共有することを示唆する。
ニック過剰発現は、プラスマ細胞腫を引き起こし、そしてIL−6欠損マウスは
、減少したIgG応答を示す。本発明者らは数匹のIL−B30トランスジェニ
ックマウスにおいてIgGおよびIgA産生に増加を見出したが、この知見は、
異なる創始動物間で一致しなかった。従って、潜在的なB細胞分化因子としてI
L−B30をさらに特徴付けるさらなる分析が必要である。
は、種々の組織における炎症事象と一致したが、赤血球パラメーターにおける変
化は、簡単に説明できなかった。IL−1、TNF−α、およびIFN−γは、
通常、慢性疾患貧血(ACD)と呼ばれる症候群(これは、一般的に、正球性貧
血、正色素性貧血、非再生(または最小限に再生性の)貧血として現れ、そして
種々の慢性炎症性疾患に見いだされる)のメディエーターである。慢性疾患貧血
はまた、数人のヒト患者において、小球性貧血、低色素性貧血として現れ得る。
この症候群は、改変された鉄代謝およびエリトロポイエチンに対する減少した応
答に起因する。IL−B30マウスで観察される小球性低色素性貧血は、末梢サ
イトカイン濃度における増加によって示差される様に、ACDに起因し得る。し
かし、小球性低色素性貧血の最も一般的な原因は、鉄欠乏であり、これは、IL
−B30マウスで見出される部分骨髄応答(再生)および血小板増加症とより一
致する。血清フェリチン、鉄および総鉄結合能力の測定(これは、鉄欠乏貧血と ACDとの区別を可能にする)を含むさらなる研究は、発症したマウスから妥当
な血液を得ることが困難なことに起因して行われなかった。
IL−6発現は、通常、炎症応答の間にアップレギュレーションされる。従って
、IL−6がIL−B30トランスジェニック動物の末梢血中で検出され得なか
ったことは、驚くべきことである。これは、IL−B30が未だ同定されていな
い機構によるIL−6発現に対するネガティブ効果を有することを示唆する。実
際、IL−B30トランスジェニック動物中にIL−6がないことは、これらの
動物中で観察される高いレベルのIl−1およびTNF−αを説明し得る。なぜ
なら、IL−6は、マウス中の循環しているIL−1およびTNF−αの濃度に
ネガティブな効果を有するからである。IL−B30トランスジェニックマウス
中に観察される高い濃度の循環しているTNF−αはまた、増加した濃度のIF
N−γの結果であり得る。IFN−γは、IL−2活性化T細胞またはIL−4
活性化B細胞によって産生され、そして単球およびマクロファージにおいてTN
F−αの発現を誘導する。IFN−γの発現がIL−B30によって直接か、ま
たはIL−B30によって誘導される他のサイトカインによってのどちらで媒介
されるかは、決定されないままである。要約すると、本発明者らの結果は、IL
−B30が、IL−6と広範な種々の生物学的活性を共有することを示唆する。
これらの生物学的活性が通常のレセプター、シグナル伝達エレメントまたはIL
−6と共有される転写因子によって媒介されるか否かは、理解されないままであ
る。これらの問題は、できれば、遺伝的アプローチまたは生化学的アプローチに
よって、進行中の実験により明確にされる。
許出願が詳細にかつ個々に、すべての目的に対してその全体が参考として援用さ
れるようにしめされるのと同じ程度に、本明細書中に参考として援用される。
なくなされ得、同様に当業者に明らかである。本明細書中に記載される特定の実
施形態は、例示目的のためのみに提供され、そして本発明は、特許請求の範囲が
与えられるものと等価物な完全な範囲と共に、このような添付の特許請求の範囲
の用語によってのみ制限される。 (訂正の理由1) 特許請求の範囲を、別紙のとおり補正致しました。 (訂正の理由2) 平成14年3月8日に提出致しました翻訳文について、全体にわたって誤訳が
ありましたので、適正な訳文を提出致します。
Claims (50)
- 【請求項1】 以下を含む、組成物: a)以下の両方: i)IL−12 p40由来の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個の
セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチド;および ii)IL−B30由来の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグ
メントを含む、実質的に純粋なポリペプチド; b)以下の両方: i)IL−12 p40由来の少なくとも11連続するアミノ酸を含む、実質
的に純粋なポリペプチド;および ii)IL−B30由来の少なくとも11連続するアミノ酸を含む、実質的に
純粋なポリペプチド; c)以下の両方を含む実質的に純粋なポリペプチド: i)IL−12 p40の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグ
メント;および ii)IL−B30の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグメン
ト;または d)以下の両方を含む実質的に純粋なポリペプチド: i)IL−12 p40の少なくとも11連続するアミノ酸のセグメント;お
よび ii)IL−B30の少なくとも11連続するアミノ酸のセグメント。 - 【請求項2】 請求項1に記載の組成物であって、 a)ここで、前記少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグメントが、
少なくとも9連続するアミノ酸の1つのセグメントを含むか; b)ここで、前記少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグメントが、
少なくとも9連続するアミノ酸の両方であるか; c)ここで、前記IL−12 p40の少なくとも11連続するアミノ酸のセグ
メントが、少なくとも15連続するアミノ酸であるか; d)ここで、前記IL−B30の少なくとも11連続するアミノ酸のセグメント
が、少なくとも15連続するアミノ酸であるか; e)水、生理食塩水、および/または緩衝液を含む水性化合物より選択されるキ
ャリアをさらに含むか; f)経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与、または非経口投与で処方される
か;あるいは g)滅菌した組成物である、 組成物。 - 【請求項3】 請求項1に記載の組成物であって、 a)ここで、少なくとも1つの前記ポリペプチドが以下: i)検出可能に標識されるか; ii)組換え的に産生されるか; iii)グリコシル化されていないか; iv)変性されるか; v)固体物質に結合されるか;または vi)別の化学的部分に結合体化されるか であるか; b)以下: i)実質的に純粋なIL−12 p40ポリペプチド;および ii)実質的に純粋なIL−B30ポリペプチド の両方を含むか; c)IL−B30に融合されたIL−12 p40を含む、実質的に純粋なポリ
ペプチドを含むか;あるいは d)IL−18、IL−12、放射線療法もしくは化学療法、免疫アジュバント
、または抗ウイルス性と組み合わされる、 組成物。 - 【請求項4】 請求項1に記載の組成物および以下: a)前記ポリペプチドを含む区画;または b)キット中の試薬の使用もしくは処分についての説明書、 を含む、キット。
- 【請求項5】 以下をコードする、単離された核酸または組換え核酸: a)以下の両方: i)IL−12 p40由来の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個の
セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチド;および ii)IL−B30由来の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグ
メントを含む、実質的に純粋なポリペプチド; b)以下の両方: i)IL−12 p40由来の少なくとも11連続するアミノ酸を含む、実質
的に純粋なポリペプチド;および ii)IL−B30由来の少なくとも11連続するアミノ酸を含む、実質的に
純粋なポリペプチド; c)以下の両方を含む実質的に純粋なポリペプチド: i)IL−12 p40の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグ
メント;および ii)IL−B30の少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグメン
ト;または d)以下の両方を含む実質的に純粋なポリペプチド: i)IL−12 p40の少なくとも11連続するアミノ酸のセグメント;お
よび ii)IL−B30の少なくとも11連続するアミノ酸のセグメント。 - 【請求項6】 請求項5に記載の核酸であって、 a)ここで、前記少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグメントが、
少なくとも9連続するアミノ酸の1つのセグメントを含むか; b)ここで、前記少なくとも7連続するアミノ酸の複数の別個のセグメントが、
少なくとも9連続するアミノ酸の両方であるか; c)ここで、前記IL−12 p40の少なくとも11連続するアミノ酸のセグ
メントが、少なくとも15連続するアミノ酸であるか; d)ここで、前記IL−B30の少なくとも11連続するアミノ酸のセグメント
が、少なくとも15連続するアミノ酸であるか; e)該IL−12 p40が霊長類由来であるか; f)該IL−B30が霊長類由来であるか; g)発現ベクターであるか; h)複製起点をさらに含むか; i)検出可能な標識を含むか; j)合成ヌクレオチド配列を含むか; k)6kb未満、好ましくは3kb未満であるか;または l)霊長類由来である、 核酸。 - 【請求項7】 請求項6に記載の組換え核酸を含む、細胞。
- 【請求項8】 請求項7に記載の細胞であって、該細胞は以下: a)原核生物細胞; b)真核生物細胞; c)細菌細胞; d)酵母細胞; e)昆虫細胞; f)哺乳動物細胞; g)マウス細胞; h)霊長類細胞;または i)ヒト細胞、 である、細胞。
- 【請求項9】 請求項6に記載の核酸および以下: a)該核酸を含む区画; b)霊長類IL−12 p40ポリペプチドをさらに含む区画;もしくは c)霊長類IL−B30ポリペプチドをさらに含む区画;または d)キット中の試薬の使用もしくは処理についての説明書、 を含む、キット。
- 【請求項10】 a)霊長類IL−12 p40の天然の成熟コード部分に
、50℃で30分間および1M未満の塩の洗浄条件下で;ならびに b)霊長類IL−B30の天然の成熟コード部分に、50℃で30分間および1
M未満の塩の洗浄条件下で、 ハイブリダイズする、核酸。 - 【請求項11】 請求項10に記載の核酸であって、ここで: a)IL−12 p40についての前記洗浄条件が、60℃および400mM未
満の塩である; b)IL−B30についての前記洗浄条件が、60℃および400mM未満の塩
である; c)該核酸が、霊長類IL−12 p40をコードする配列に、少なくとも50
ヌクレオチドのストレッチを超える同一性を示す;ならびに/または d)該核酸が、霊長類IL−B30をコードする配列に、少なくとも50ヌクレ
オチドのストレッチを超える同一性を示す、 核酸。 - 【請求項12】 請求項10に記載の核酸であって、ここで: a)IL−12 p40についての前記洗浄条件が、65℃および150mM未
満の塩である; b)IL−B30についての前記洗浄条件が、65℃および150mM未満の塩
である; c)該核酸が、霊長類IL−12 p40をコードする配列に、少なくとも90
ヌクレオチドのストレッチを超える同一性を示す;ならびに/または d)該核酸が、霊長類IL−B30をコードする配列に、少なくとも90ヌクレ
オチドのストレッチを超える同一性を示す、 核酸。 - 【請求項13】 以下: a)TNFαアンタゴニスト; b)IL−12アンタゴニスト; c)IL−10;または d)ステロイド、 と組み合わされた、IL−12 p40/IL−B30のアンタゴニスト。
- 【請求項14】 抗体由来の抗原結合部分を含む結合化合物であって、該抗
体は、請求項1に記載の組成物に特異的に結合するが、IL−12 p40ポリ
ペプチドまたはIL−B30ポリペプチドのいずれにも結合せず、該組成物は、
以下: a)以下 i)実質的に純粋なIL−12 p40ポリペプチド;および ii)実質的に純粋なIL−B30ポリペプチド、 の両方を含む、実質的に純粋なポリペプチドを含むか;または b)IL−B30に融合されるIL−12 p40を含む、実質的に純粋なポリ
ペプチドを含む、 結合化合物。 - 【請求項15】 請求項14に記載の結合化合物であって、ここで: a)該結合化合物が容器中であるか; b)該結合化合物がFv、Fab、もしくはFab2フラグメントであるか; c)該結合化合物が別の化学的部分に結合体化されるか;または d)前記抗体が以下: i)請求項1に記載の組成物に対して惹起されるか; ii)免疫選択されるか; iii)ポリクローナル抗体であるか; iv)抗原に対して少なくとも30mMのKdを示すか; v)ビーズまたはプラスチック膜を含む固体物質に付着されるか; vi)滅菌した組成物中であるか;もしくは vii)放射活性標識または蛍光標識を含む、検出可能に標識されるか、 である、結合化合物。
- 【請求項16】 請求項15に記載の結合化合物および以下: a)該結合化合物を含む区画;または b)キット中の試薬の使用または処分についての説明書、 を含む、キット。
- 【請求項17】 抗原:抗体複合体を産生する方法であって、適切な条件下
で霊長類IL−12 p40/IL−B30組成物を請求項14に記載の抗体と
接触させ、これによって該複合体を形成させる工程を包含する、方法。 - 【請求項18】 請求項17に記載の方法であって、ここで: a)前記複合体が、他のサイトカインから精製されるか; b)該複合体が、他の抗体から精製されるか; c)前記接触工程が、サイトカインを含むサンプルと行われるか; d)該接触工程が、前記抗原の定量的検出を可能にするか; e)該接触工程が、該抗体を含むサンプルと行われるか;または f)該接触工程が、該抗体の定量的検出を可能にする、 方法。
- 【請求項19】 a)請求項14に記載の滅菌した結合化合物;あるいは b)請求項14に記載の結合化合物およびキャリアであって、ここで該キャリア
は: i)水、生理食塩水、および/もしくは緩衝液を含む水性化合物である;なら
びに/または ii)経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与、または非経口投与で処方さ
れる、 キャリア、 を含む、組成物。 - 【請求項20】 細胞を請求項1に記載の組成物またはそのアンタゴニスト
と接触させる工程を包含する、該細胞または組織の生理学または発達を調節する
、方法。 - 【請求項21】 細胞を請求項1に記載の組成物と接触させる工程を包含し
、そして該接触工程がIFNγの産生における増加を生じる、該細胞の生理学ま
たは発達を調節する、方法。 - 【請求項22】 請求項21に記載の方法であって、ここで、前記細胞は、
宿主生物体にあって、そして該生物体は増強されたTh1応答を示す、方法。 - 【請求項23】 請求項22に記載の方法であって、ここで、前記Th1応
答は以下: a)抗腫瘍効果; b)アジュバント効果; c)抗ウイルス性効果;または d)拮抗するアレルギー効果、 より選択される、方法。 - 【請求項24】 宿主生物体中の細胞の生理学または発達を調節する方法で
あって、該方法は、請求項1に記載の組成物を該生物体に投与する工程を包含し
、ここで、前記接触工程は以下: a)抗腫瘍効果; b)アジュバント効果; c)抗ウイルス性効果;または d)拮抗するアレルギー効果、 を生じる、方法。 - 【請求項25】 請求項24に記載の方法であって、ここで、前記接触工程
が以下: a)IL−18; b)IL−12; c)放射線療法または化学療法; d)免疫アジュバント;または e)抗ウイルス性治療、 と組み合わせられる、方法。 - 【請求項26】 請求項24に記載の方法であって、ここで、前記アンタゴ
ニストがIL−12レセプターサブユニットβ1に対する抗体である、方法。 - 【請求項27】 請求項24に記載の方法であって、ここで、前記接触工程
がアンタゴニストと行われ、そして該接触工程がIFNγの産生における相対的
減少を生じる、方法。 - 【請求項28】 宿主生物体中の細胞の生理学あるいは発達を調節する方法
であって、該方法は、前記アンタゴニストを該生物体に投与する工程を包含し、
ここで、前記接触工程は以下: a)自己免疫状態;または b)慢性炎症状態、 の回復を生じる、方法。 - 【請求項29】 a)IL−12 p40を含む霊長類IL−B30を発現
する工程を包含する、該IL−B30の分泌を増加させる、方法;または b)IL−B30を含む霊長類IL−12 p40を発現する工程を包含する、
該IL−12 p40の分泌を増加させる、方法。 - 【請求項30】 請求項29に記載の方法であって、ここで: a)前記増加が少なくとも3倍であるか;または b)前記発現する工程が、IL−B30およびIL−12 p40をコードする
組換え核酸を発現する工程である、 方法。 - 【請求項31】 請求項3に記載の組成物を結合するレセプターについてス
クリーニングする方法であって、該方法は、複合体が該レセプターに結合し得る
条件下で、該レセプターを発現する細胞に該複合体を接触させ、それにより検出
可能な相互作用を形成させる工程を包含する、方法。 - 【請求項32】 請求項31に記載の方法であって、ここで、前記相互作用
が前記細胞中に生理学的応答を生じる、方法。 - 【請求項33】 動物における炎症応答を調節する方法であって、該方法は
、該動物中の細胞を治療量の以下: a)哺乳動物IL−B30タンパク質のアゴニスト;または b)哺乳動物IL−B30タンパク質のアンタゴニスト、 と接触させる工程を包含する、方法。 - 【請求項34】 請求項33に記載の方法であって、ここで: a)哺乳動物IL−B30タンパク質が霊長類タンパク質であるか;または b)アンタゴニストが該哺乳動物IL−B30に結合する抗体であるか; c)アンタゴニストが哺乳動物IL−B30によって媒介されるシグナルをブロ
ックする抗体である、 方法。 - 【請求項35】 請求項33に記載の方法であって、ここで、前記動物が急
性期の炎症応答の徴候または症状を示す、方法。 - 【請求項36】 請求項33に記載の方法であって、ここで、前記徴候また
は症状が皮膚組織;肺組織;胃腸組織;または肝組織に見出される、方法。 - 【請求項37】 請求項35に記載の方法であって、ここで、前記徴候また
は症状が皮膚組織;肺組織;胃腸組織;または肝組織に見出される、方法。 - 【請求項38】 請求項33に記載の方法であって、ここで、前記調節が好
中球の血小板への成熟を加速する、方法。 - 【請求項39】 請求項33に記載の方法であって、ここで、前記調節がI
gAに対する効果を有する、方法。 - 【請求項40】 請求項33に記載の方法であって、ここで、前記調節がI
gGに対する効果を有する、方法。 - 【請求項41】 請求項38に記載の方法であって、前記投与が前記アゴニ
ストである、方法。 - 【請求項42】 請求項39に記載の方法であって、前記投与が前記アゴニ
ストである、方法。 - 【請求項43】 請求項40に記載の方法であって、前記投与が前記アゴニ
ストである、方法。 - 【請求項44】 請求項41に記載の方法であって、ここで: a)前記アゴニストが哺乳動物IL−B30タンパク質であるか;または b)前記動物が炎症状態の徴候または症状を体験する、 方法。
- 【請求項45】 請求項42に記載の方法であって、ここで: a)前記アゴニストが哺乳動物IL−B30タンパク質であるか;または b)前記動物が炎症状態の徴候または症状を体験する、 方法。
- 【請求項46】 請求項43に記載の方法であって、ここで: a)前記アゴニストが哺乳動物IL−B30タンパク質であるか;または b)前記動物が炎症状態の徴候または症状を体験する、 方法。
- 【請求項47】 請求項44に記載の方法であって、ここで、前記投与が以
下: a)抗炎症性サイトカインアゴニストもしくはアンタゴニスト; b)鎮痛薬; c)抗炎症剤;または d)ステロイド、 の組み合わせである、方法。 - 【請求項48】 請求項45に記載の方法であって、ここで、前記投与が以
下: a)抗炎症性サイトカインアゴニストもしくはアンタゴニスト; b)鎮痛薬; c)抗炎症剤;または d)ステロイド、 の組み合わせである、方法。 - 【請求項49】 請求項46に記載の方法であって、ここで、前記投与が以
下: a)抗炎症性サイトカインアゴニストもしくはアンタゴニスト; b)鎮痛薬; c)抗炎症剤;または d)ステロイド、 の組み合わせである、方法。 - 【請求項50】 IL−B30またはそのアゴニストを投与する工程による
、記憶T細胞の生存を誘導する、方法。
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