ES2619845T3

ES2619845T3 - Anticuerpos anti-IL-23 diseñados por ingeniería genética

Info

Publication number: ES2619845T3
Application number: ES06802592.3T
Authority: ES
Inventors: Leonard G. Presta; Peter Orth; Brian M. Beyer; Yan-Hui Liu; Richard N. Ingram
Original assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2005-08-31
Filing date: 2006-08-29
Publication date: 2017-06-27
Anticipated expiration: 2026-08-29
Also published as: US20070048315A1; EP3190125A1; HUS1900050I1; CY2019041I2; CN101296944A; EP2354160A1; WO2007027714A3; CA2620802A1; JP2009505677A; EP1931710B1; PL1931710T3; US7807160B2; HRP20170444T1; LTPA2019520I1; SG165322A1; HUE032131T2; SG10201402712QA; JP2011130771A; ME02705B; DK1931710T3

Abstract

Un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une a IL-23p19 humana en un epítopo que comprende los restos 82-95 y los restos 133-140 de SEQ ID NO: 29.

Description

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Un "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de unión al antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades de antígeno. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos (véase más adelante).

5 Como se usa en el presente documento, la expresión anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv" se refiere a fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, estando estos dominios presentes en una sola cadena polipeptídica. En general, el polipéptido Fv puede comprender además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL, que hace posible que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de sFv, véase Pluckthun (1994) “THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES”, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. SpringerVerlag, Nueva York, pág. 269315.

Los anticuerpos monoclonales del presente documento también incluyen anticuerpos camélidos de un solo dominio. Véase, por ejemplo, Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmann et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:25; documento WO 94/04678; documento WO 94/25591; patente de EE.UU. n.º 6.005.079). En una

15 realización, la presente divulgación proporciona anticuerpos de un solo dominio que comprenden dos dominios VH con modificaciones de modo que se forman anticuerpos de un solo dominio.

Como se usa en el presente documento, el término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión al antígeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VHVL oVLVH). Usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, el documento EP 404.097; el documento WO 93/11161; y Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 64446448. Para una revisión de

25 variantes de anticuerpo diseñadas por ingeniería genética, véase, en general, Holliger y Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:11261136.

Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos), así como anticuerpos humanos. Dichos anticuerpos contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá esencialmente todo de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o esencialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana, y todas o esencialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una parte de una región constante (Fc) de

35 inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana. El prefijo "hum" se añade a las denominaciones del clon de anticuerpo cuando es necesario distinguir los anticuerpos humanizados (por ejemplo, hum6H12) de los anticuerpos parentales de roedor (por ejemplo, 6H12 de ratón o “m6H12”). Las formas humanizadas de anticuerpos de roedor, en general, comprenderán las mismas secuencias de CDR de los anticuerpos parentales de roedor, aunque pueden incluirse ciertas sustituciones de aminoácidos para aumentar la afinidad o aumentar la estabilidad del anticuerpo humanizado.

Los anticuerpos desvelados en el presente documento también incluyen anticuerpos con regiones Fc modificadas (o bloqueadas) para proporcionar funciones efectoras alteradas. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.º 5.624.821; el documento W02003/086310; el documento W02005/120571; el documento W02006/0057702; Presta

45 (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:640656. Dicha modificación se puede usar para potenciar o suprimir diversas reacciones del sistema inmune, con posibles efectos beneficiosos en el diagnóstico y la terapia. Las alteraciones de la región Fc incluyen cambios de aminoácidos (sustituciones, eliminaciones e inserciones), glucosilación o desglucosilación, y la adición de múltiples Fc. Los cambios en Fc también pueden alterar la semivida de los anticuerpos en anticuerpos terapéuticos, y una semivida más larga provocaría una dosificación menos frecuente, con el aumento concomitante de la comodidad y la reducción del uso de material. Véase, Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol.116:731 a 73435.

La expresión "anticuerpo completamente humano" se refiere a un anticuerpo que solo comprende secuencias de la proteína inmunoglobulina humana. Un anticuerpo completamente humano puede contener cadenas murinas de

55 hidrato de carbono si se produce en un ratón, en una célula de ratón o en un hibridoma derivado de una célula de ratón. Asimismo, "anticuerpo de ratón" se refiere a un anticuerpo que solo comprende secuencias de inmunoglobulina de ratón.

Como se usa en el presente documento, la expresión "región hipervariable" se refiere a los restos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende los restos de aminoácido de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, los restos 2434 (CDRL1), 5056 (CDRL2) y 8997 (CDRL3) del dominio variable de cadena ligera y los restos 3135 (CDRH1), 5065 (CDRH2) y 95102 (CDRH3) del dominio variable de cadena pesada (Kabat et al., (1991) “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.)) y/o los restos de 65 un "bucle hipervariable" (es decir, los restos 2632 (L1), 5052 (L2) y 9196 (L3) del dominio variable de cadena ligera y 2632 (H1), 5355 (H2) y 96101 (H3) del dominio variable de cadena pesada (Chotia y Lesk (1987) J. Mol.

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efectos secundarios o efectos tóxicos significativos. El efecto provocará una mejora de una medición o de un parámetro de diagnóstico en al menos un 5 %, habitualmente en al menos un 10 %, más habitualmente en al menos un 20 %, lo más habitualmente en al menos un 30 %, preferentemente en al menos un 40 %, más preferentemente en al menos un 50 %, lo más preferentemente en al menos un 60 %, lo ideal en al menos un 70 %, más ideal en al

5 menos un 80 % y lo más ideal en al menos un 90 %, definiéndose el 100 % como el parámetro de diagnóstico mostrado por un sujeto normal (véase, por ejemplo, Maynard, et al. (1996) “A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice”, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., Londres, RU).

10 El término "exógeno" se refiere a sustancias que se producen fuera de un organismo, de una célula o de un cuerpo humano, dependiendo del contexto. El término "endógeno" se refiere a sustancias que se producen dentro de una célula, de un organismo o de un cuerpo humano, dependiendo del contexto.

Las expresiones "afección inmune" o "trastorno inmune" engloban, por ejemplo, inflamación patológica, un trastorno

15 inflamatorio, y un trastorno o una enfermedad autoinmune. La "afección inmune" también se refiere a infecciones, infecciones persistentes y afecciones proliferativas, tales como cáncer, tumores y angiogénesis, incluyendo infecciones, tumores y cánceres que resisten a ser erradicados por el sistema inmune. La expresión "afección cancerosa" incluye, por ejemplo, cáncer, células cancerosas, tumores, angiogénesis y afecciones precancerosas tales como la displasia.

20 La expresión "trastorno inflamatorio" significa un trastorno o una afección patológica en el que la patología se produce, en conjunto o en parte, por, por ejemplo, un cambio en la cantidad, un cambio en la velocidad de migración

o un cambio en la activación de las células del sistema inmune. Las células del sistema inmune incluyen, por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B, monocitos o macrófagos, células presentadoras de antígeno (APC), células

25 dendríticas, microglia, linfocitos NK, linfocitos NKT, neutrófilos, eosinófilos, mastocitos o cualquier otra célula asociada específicamente con la inmunología, por ejemplo, células endoteliales o epiteliales productoras de citocinas.

Una "célula productora de IL17" significa un linfocito T que no es un linfocito T de tipo TH1 clásica o linfocito T de

30 tipo TH2 clásico, conocido como linfocitos TH17. Los linfocitos TH17 se tratan en mayor detalle en Cua y Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557559; Tato y O'Shea (2006) Nature 441:166168; Iwakura e Ishigame (2006) J. Clin. Invest. 116:12181222. La expresión "célula productora de IL17" también significa un linfocito T que expresa un gen

o un polipéptido de la Tabla 10B de la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.º 2004/0219150 (por ejemplo, proteína P sensible a mitógenos; ligando quimiocina 2; interleucina17 (IL17); factor de transcripción RAR 35 relacionado; y/o supresor de la señalización de citocinas 3), donde la expresión con tratamiento mediante un agonista de IL23 es superior que con el tratamiento con un agonista de IL12, donde "superior a" se define a continuación. La expresión con un agonista de IL23 es habitualmente al menos 5 veces superior, normalmente al menos 10 veces superior, más normalmente al menos 15 veces superior, lo más normalmente al menos 20 veces superior, preferentemente al menos 25 veces superior y lo más preferentemente al menos 30 veces superior, que

40 con tratamiento con IL12. La expresión se puede medir, por ejemplo, con el tratamiento de una población de células productoras de IL17 esencialmente puras.

Además, la expresión "célula productora de IL17" incluye una célula progenitora o precursora que está comprometida, en una vía de desarrollo celular o diferenciación celular, a diferenciarse en una célula productora de 45 IL17, como se ha definido anteriormente. Una célula progenitora o precursora a la célula productora de IL17 puede encontrarse en un ganglio linfático de drenaje (DLN). Además, "célula productora de IL17" engloba una célula productora de IL17, como se ha definido anteriormente, que, por ejemplo, se ha activado, por ejemplo, mediante un éster de forbol, ionóforo y/o carcinógeno, se ha diferenciado además, almacenado, congelado, desecado, inactivado, degradado parcialmente, por ejemplo, por apoptosis, proteolisis u oxidación lipídica, o modificado, por ejemplo,

50 mediante tecnología recombinante.

Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de ácido nucleico aislada" se refiere a una molécula de ácido nucleico que está identificada y separada de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está habitualmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido

55 nucleico aislada es diferente de la forma o del entorno en que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas, por lo tanto, se distinguen de la molécula de ácido nucleico que existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que expresan habitualmente el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de la de células naturales.

60 La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un determinado organismo hospedador. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente, una secuencia operadora y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y

65 potenciadores.

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Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se sitúa en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder de secreción está unido operativamente al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un

5 sitio de unión al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está situado de modo que facilite la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se están uniendo son contiguas y, en el caso de un líder de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La unión se consigue mediante en enlace en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se usan adaptadores o enlazadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Como se usan en el presente documento, el término "célula", y las expresiones "línea celular" y "cultivo celular" se usan indistintamente y la totalidad de dichas denominaciones incluye la descendencia. Así pues, el término "transformantes" y la expresión "células transformadas" incluyen la célula diana primaria y cultivos derivados a partir

15 de la misma independientemente del número de transferencias. También se entiende que toda la descendencia puede no ser exactamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica determinada en la célula originalmente transformada. Cuando se pretendan usar denominaciones distintas, quedará claro a partir del contexto.

Como se usa en el presente documento, "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento o a una técnica en los que cantidades insignificantes de un fragmento específico de ácido nucleico, ARN y/o ADN, se amplifican como se describe en, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.º 4.683.195. En general, se tiene que disponer de la información de secuencia de los extremos de la región de interés o más allá, de modo que

25 puedan diseñarse cebadores oligonucleotídicos; estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a las cadenas opuestas del molde que se vaya a amplificar. Los nucleótidos del extremo 5' de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR se puede usar para amplificar secuencias específicas de ARN, secuencias específicas de ADN de un ADN genómico total, y ADNc transcrito a partir de un ARN celular total, secuencias bacteriófagas o plasmídicas, etc. Véase, en líneas generales, Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.) Como se usa en el presente documento, se considera que la PCR es un ejemplo, aunque no el único, de un método de reacción de la polimerasa del ácido nucleico para amplificar una muestra de ensayo de ácido nucleico que comprende el uso de un ácido nucleico conocido como cebador y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar una parte específica de ácido nucleico.

35 Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia de línea germinal" se refiere a una secuencia de secuencias de ADN de inmunoglobulina no reordenada. Se puede usar cualquier fuente adecuada de inmunoglobulina no reordenada.

Los términos "inhibidores" y "antagonistas" o "activadores" y "agonistas" se refieren a moléculas inhibidoras o activadoras, respectivamente, por ejemplo, para la activación de, por ejemplo, un ligando, receptor, cofactor, un gen, célula, tejido u órgano. Un modulador de, por ejemplo, un gen, un receptor, un ligando o una célula, es una molécula que altera una actividad del gen, receptor, ligando o célula, donde la actividad se puede activar, inhibir o alterar en sus propiedades reguladoras. El modulador puede actuar solo o puede usar un cofactor, por ejemplo, una proteína,

45 ión metálico o molécula pequeña. Los inhibidores son compuestos que reducen, bloquean, previenen, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan o regulan negativamente, por ejemplo, un gen, una proteína, un ligando, un receptor o una célula. Los activadores son compuestos que aumentan, activan, facilitan, potencian la activación, sensibilizan o regulan positivamente, por ejemplo, un gen, una proteína, un ligando, un receptor o una célula. Un inhibidor también puede definirse como una composición que reduce, bloquea o inactiva una actividad constitutiva. Un "agonista" es un compuesto que interacciona con una diana para causar o promover un aumento en la activación de la diana. Un "antagonista" es un compuesto que se opone a las acciones de un agonista. Un antagonista evita, reduce, inhibe o neutraliza la actividad de un agonista. Un antagonista también puede prevenir, inhibir o reducir la actividad constitutiva de una diana, por ejemplo, un receptor diana, incluso cuando no hay agonista identificado.

55 Para examinar el grado de inhibición, por ejemplo, se tratan muestras o ensayos que comprenden, por ejemplo, una proteína, un gen, una célula o un organismo dado, con un agente activador o inhibidor potencial, y se comparan con muestras de control sin el agente. Las muestras de control, es decir, no tratadas con agente, reciben un valor de actividad relativa del 100 %. La inhibición se consigue cuando el valor de actividad con respecto al control es de aproximadamente el 90 % o inferior, normalmente del 85 % o inferior, más normalmente del 80 % o inferior, lo más normalmente del 75 % o inferior, en general, del 70 % o inferior, más en general del 65 % o inferior, mucho más en general del 60 % o inferior, normalmente del 55 % o inferior, habitualmente del 50 % o inferior, más habitualmente del 45 % o inferior, lo más habitualmente del 40 % o inferior, preferentemente del 35 % o inferior, más preferentemente del 30 % o inferior, todavía más preferentemente del 25 % o inferior, y lo más preferentemente inferior al 25 %. La activación se consigue cuando el valor de actividad con respecto al control es del

65 aproximadamente el 110 %, en general, de al menos el 120 %, más en general de al menos el 140 %, más en general de al menos el 160 %, a menudo de al menos el 180 %, más a menudo de al menos el doble, mucho más a

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dicho documento; Harlow y Lane (1988) “ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL” CSH Press; Goding (1986) “MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE” (2ª ed.) Academic Press, Nueva York, NY, se puede encontrar una descripción de las técnicas de preparación de dichos anticuerpos monoclonales. Así pues, se pueden obtener anticuerpos monoclonales mediante varias técnicas familiares para los investigadores especializados en la 5 técnica. Por lo general, se inmortalizan esplenocitos de un animal inmunizado con un antígeno deseado, comúnmente por fusión con una célula de mieloma. Véase Kohler y Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511519. Los métodos alternativos de inmortalización incluyen la transformación con virus de Epstein Barr, oncogenes o retrovirus, u otros métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Doyle et al. (eds. 1994 y suplementos periódicos) “CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES”, John Wiley and Sons, Nueva York, NY. Las colonias que surgen de las células inmortalizadas individuales se exploran en busca de la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseadas por el antígeno, y es posible potenciar el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por dichas células mediante diversas técnicas, incluyendo inyección en la cavidad peritoneal de un hospedador vertebrado. Como alternativa, es posible aislar secuencias de ADN que codifiquen un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo explorando una biblioteca de ADN de linfocitos B

15 humanos de acuerdo, por ejemplo, con el protocolo general esbozado por Huse et al. (1989) Science 246:12751281.

Otras técnicas adecuadas implican la selección de bibliotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Véase, por ejemplo, Huse et al., Science 246:12751281 (1989); y Ward et al., Nature 341:544546 (1989). Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención se pueden usar con o sin modificación, incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos se marcarán uniendo, bien de forma covalente o no covalente, una sustancia que proporcione una señal detectable. Se conoce una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación, y se presentan de forma exhaustiva en la bibliografía tanto científica como de patentes. Los marcadores adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, fracciones fluorescentes,

25 fracciones quimioluminescentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso de dichos marcadores incluyen las patentes de EE.UU. n.º 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. Además, se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes, véase Cabilly, patente de EE.UU. n.º 4.816.567; y Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 86:1002910033; o prepararse en ratones transgénicos, véase Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146156.Véanse también las tecnologías Abgenix y Medarex.

Se pueden generar anticuerpos o composiciones de unión contra fragmentos predeterminados de IL23 mediante la inmunización de animales con conjugados del polipéptido, fragmentos, péptidos o epítopos con proteínas vehículo. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos

35 anticuerpos pueden explorarse en busca de la unión a IL23 normal o defectuosa. Estos anticuerpos monoclonales normalmente se unirán con al menos una Kd de aproximadamente 1 µM, más normalmente de al menos aproximadamente 300 nM, normalmente de al menos aproximadamente 30 nM, preferentemente de al menos aproximadamente 10 nM, más preferentemente de al menos aproximadamente 3 nM o mejor, normalmente determinada por ELISA. Los anticuerpos no humanos adecuados también se pueden identificar usando los ensayos biológicos descritos en el Ejemplo 5, que se presenta más adelante.

IV. Humanización de anticuerpos específicos de IL23

Se puede usar cualquier anticuerpo no humano adecuado como fuente para la región hipervariable. Las fuentes para

45 anticuerpos no humanos incluyen, pero sin limitación, murinos, lagomorfos (incluyendo conejos), bovinos y primates. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de la región hipervariable del receptor están remplazados por restos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región marco conservada (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana se remplazan por restos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para perfeccionar más el rendimiento del anticuerpo en la actividad biológica deseada. Para detalles adicionales, véase Jones et al. (1986) Nature 321:522525; Reichmann et al. (1988) Nature 332:323329; y Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593596.

55 Se han descrito métodos de diseño de forma recombinante de anticuerpos, por ejemplo, por Boss et al. (patente de EE.UU. n.º 4.816.397), Cabilly et al. (patente de EE.UU. n.º 4.816.567) Law et al. (publicación de solicitud de patente europea n.º 438 310) y Winter (publicación de solicitud de patente europea n.º 239400).

Se preparan variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo antiIL23 humanizado introduciendo cambios apropiados de nucleótidos en el ADN del anticuerpo antiIL23 humanizado o mediante síntesis peptídica. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, eliminaciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de restos dentro de la secuencia de aminoácidos mostrada para el F(ab) antiIL23 humanizado (por ejemplo, como en las SEQ ID NO: 1 y 2). Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se realiza para llegar a la construcción final, con la 65 condición de que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos posteriores a la traducción del anticuerpo antiIL23 humanizado, tal como cambiando el

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número o la posición de los sitios de glicosilación.

Un método útil para la identificación de ciertos restos o regiones del polipéptido del anticuerpo antiIL23p19 humanizado que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis, se denomina "mutagénesis por rastreo de alanina"

5 según lo descrito por Cunningham y Wells (1989) Science 244: 10811085. En el presente documento, se identifica un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se remplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (lo más preferentemente alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el antígeno IL23. Los restos de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se perfeccionan entonces introduciendo variantes adicionales o diferentes en o para los sitios de sustitución. Así pues, aunque el sitio de introducción de una variación en la secuencia de aminoácidos está predeterminado, no tiene que predeterminarse la naturaleza de la mutación en sí. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se realiza mutagénesis por rastreo de Ala o aleatoria en el codón o en la región diana, y las variantes expresadas del anticuerpo antiIL23p19 humanizado se exploran en busca de la actividad deseada.

15 Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilterminales que varían en longitud desde un resto hasta polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones dentro de la secuencia de un solo resto de aminoácido o múltiples restos de aminoácidos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen el anticuerpo antiIL23 humanizado con un resto metionilo Nterminal o el anticuerpo fusionado a una marca epitópica. Otras variantes de inserción de la molécula del anticuerpo antiIL23 humanizado incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo antiIL23 humanizado de una enzima o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un resto de

25 aminoácido en la molécula del anticuerpo antiIL23p19 humanizado eliminado y un resto diferente insertado en su sitio. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen los bucles hipervariables, pero también se contemplan alteraciones en la FR. Los restos de la región hipervariable o restos de FR que participan en la unión al antígeno, en general, están sustituidos de una manera relativamente conservativa.

Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo modifica el patrón original de glicosilación del anticuerpo. El término “modifica” pretende significar la eliminación de una o más fracciones de hidrato de carbono encontradas en el anticuerpo y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glicosilación de los anticuerpos normalmente está ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la unión de la fracción de hidrato de carbono a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas

35 asparaginaXserina y asparaginaXtreonina, donde X es cualquier aminoácido a excepción de prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la fracción de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Así pues, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación. La glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares Nacetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, lo más comúnmente serina o treonina, aunque también se pueden usar 5hidroxiprolina o 5hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se realiza convenientemente mediante la modificación de la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación ligados a N). La modificación también puede hacerse realizarse mediante la adición

45 de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glicosilación ligados a O).

Otro tipo más de variante de aminoácido es la sustitución de restos para proporcionar mayor estabilidad química del anticuerpo humanizado final. Por ejemplo, se puede cambiar un resto de asparagina (N) para reducir el potencial de formación de isoaspartato en cualquier secuencia NG dentro de una CDR de roedor. En una realización, la asparagina se cambia a glutamina (Q). La formación de isoaspartato puede debilitar o suprimir por completo la unión de un anticuerpo a su antígeno diana. Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 en 734. Además, los restos de metionina en las CDR de roedor pueden cambiarse para reducir la posibilidad de que el azufre de la metionina se oxide, lo que podría reducir la afinidad de unión al antígeno y también contribuir a la heterogeneidad molecular en la

55 preparación final de anticuerpos. Id. En una realización, la metionina se cambia a alanina (A). Los anticuerpos con dichas sustituciones se exploran posteriormente para asegurar que las sustituciones no reduzcan la afinidad de unión a IL23p19 a niveles inaceptables.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo humanizado específico de IL23 se preparan mediante varios métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida), mutagénesis por PCR y mutagénesis con casete de una variante preparada previamente o una versión no variante del anticuerpo antiIL23p19 humanizado.

65 Habitualmente, las variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo antiIL23 humanizado tendrán una

15

secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos del anticuerpo humanizado original de bien la cadena pesada o la cadena ligera, más preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 % y lo más preferentemente al menos un 95 %. La identidad u homología con respecto a esta secuencia se

5 define en el presente documento como el porcentaje de restos de aminoácidos de la secuencia candidata que son idénticos a los restos de antiIL23 humanizado, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. Ninguna extensión, eliminación o inserción Nterminal, Cterminal, o interna en la secuencia del anticuerpo se interpretará como aquella que afecta en la identidad u homología de secuencia.

El anticuerpo humanizado puede seleccionarse de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. Se puede usar cualquier isotipo de IgG, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. También se contemplan variantes de los isotipos IgG. El anticuerpo humanizado puede

15 comprender secuencias de más de una clase o isotipo. La optimización de las secuencias del dominio constante necesarias para generar la actividad biológica deseada se consigue fácilmente explorando los anticuerpos en los ensayos biológicos descritos más adelante.

Asimismo, se puede usar cualquier clase de cadena ligera en las composiciones y los métodos del presente documento. En concreto, son útiles kappa, lambda o variantes de las mismas en las presentes composiciones y métodos.

Se puede usar cualquier parte adecuada de las secuencias CDR del anticuerpo no humano. Las secuencias CDR pueden mutagenizarse por sustitución, inserción o eliminación de al menos un resto, de modo que la secuencia CDR

25 sea distinta de la secuencia de anticuerpo humano y no humano empleada. Se contempla que dichas mutaciones sean mínimas. Por lo general, al menos el 75 % de los restos del anticuerpo humanizado corresponderá a los de los restos CDR no humanos, más a menudo el 90 % y lo más preferentemente más del 95 %.

Se puede usar cualquier parte adecuada de las secuencias de FR del anticuerpo humano. Las secuencias de FR se pueden mutagenizar por sustitución, inserción o eliminación de al menos un resto de modo que la secuencia de FR sea distinta de la secuencia del anticuerpo no humano y humano empleada. Se contempla que dichas mutaciones serían mínimas. Por lo general, al menos el 75 % de los restos del anticuerpo humanizado corresponderá con los de los restos de FR humanos, más a menudo el 90 % y lo más preferentemente más del 95 %.

35 Los restos de CDR y FR se determinan de acuerdo con la definición de secuencia convencional de Kabat. Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, National Institutes of Health, Bethesda Md. (1987). Las SEQ ID NO: 516 y 3148 muestran las secuencias de dominio variable de cadena pesada de diversos anticuerpos antiIL23p19 humana de ratón, y las SEQ ID NO: 1728 y 4965 representan las secuencias de dominio variable de cadena ligera. Las SEQ ID NO: 6668 son secuencias de consenso para las CDR de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3), y se componen del resto de aminoácido más común en cada posición en las CDR de cadena pesada para la familia de anticuerpos que consisten en 7G10, 6H12, 13F11, 13B5, 7E2, 13G1, 11C10, 1E10, 30F11, 34E4, 5B12, 6H4, 9C9, 11B10, 30E1, 33D2, 20A9, 22E9, 29D5, 21A10 y 33B12. Las FIG. 1A1C proporcionan una alineación de secuencia de las cadenas pesadas de diversos anticuerpos de la presente invención.

45 Como se muestra en las FIG. 2A2C, las CDR de cadena ligera de los anticuerpos de la presente invención desvelada en el presente documento se agrupan en tres subfamilias, conocidas como (a), (b) y (c). La subfamilia de cadena ligera (a) consiste en los anticuerpos 7G10, 6H12, 13F11, 13B5, 7E2, 13G1, 11C10, 30F11, 34E4, 6H4, 33D2 y 33B12. La subfamilia de cadena ligera (b) consiste en anticuerpos 1E10, 20A9, 22E9, 29D5, 5B12, 9C9 y 11B10. La subfamilia de cadena ligera (c) consiste en los anticuerpos 10H11, 19E9, 10G8, 39G2, 35F12, 49A10, 34F9 y 7D7. Estas subfamilias de cadena ligera se usaron para derivar secuencias de consenso de CDR de CDRL1(a), CDRL1(b) y CDRL1(c) (SEQ ID NO: 6971) y las correspondientes secuencias de consenso CDRL2 (SEQ ID NO: 7274) y CDRL3 (SEQ ID NO: 7577) para cada subfamilia. Las secuencias consenso para las CDR de cadena ligera se componen del resto de aminoácido más común en cada posición en las CDR de cadena ligera para cada subfamilia de anticuerpos.

55 Las Tablas 2 y 3 definen diversos dominios de anticuerpos antiIL23p19 humanizados 6H12, 7G10, 10H11 y 22E9, así como y los dominios variables de cadena ligera y pesada de varios anticuerpos murinos de la presente invención. Los restos 119 de SEQ ID NO: 14 representan secuencias de señal para cadenas pesadas y ligeras de hum6H12 y hum7G10. Los dominios constantes de cadena ligera de hum6H12 y hum7G10 están en los restos 130233 de las SEQ ID NO: 2 y 4, respectivamente. Los dominios constantes de cadena pesada de hum6H12 y hum 7G10 están en los restos 135464 de SEQ ID NO: 1 y 3, respectivamente, con CH1 en los restos 135242, CH2+bisagra en los restos 243357 y CH3 en los restos 358464. El resto de los anticuerpos se presenta como regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada (VL y VH) y, por lo tanto, carecen de secuencias señal y dominios constantes.

65 Tabla 2

Secuencias y dominios de cadena ligera

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CLON DEL ANTICUERPO: SEQ ID NO: RESTOS DE VL RESTOS DE CDR DE CADENA LIGERA

CDRL1: CDRL2 CDRL3

hum6H12: 2 20129 4353 6975 108116

hum7G10: 4 20129 4353 6975 108116

hum10H11: 91 1114 2438 5460 93101

hum22E9: 93 1116 2440 5662 95103

m6H12LC: 17 1108 2434 5056 8997

m7G10LC: 18 1108 2434 5056 8997

m13F11 LC: 19 1108 2434 5056 8997

m13B5LC: 20 1108 2434 5056 8997

m21A10 LC: 21 1108 2434 5056 8997

m33B12 LC: 22 1108 2434 5056 8997

m39G2 LC: 23 1112 2438 5460 93101

m35F12 LC: 24 1112 2438 5460 93101

m49A10 LC: 25 1112 2438 5460 93101

m34F9 LC: 26 1112 2438 5460 93101

m7D7 LC: 27 1112 2438 5460 93101

m3D7 LC: 28 1108 2434 5056 8997

m13G1 LC: 49 1108 2434 5056 8997

m11C10 LC: 50 1108 2434 5056 8997

m7E2 LC: 51 1108 2434 5056 8997

m30F11 LC: 52 1108 2434 5056 8997

m34E4 LC: 52 1108 2434 5056 8997

m6H4 LC: 54 1108 2434 5056 8997

m33D2 LC: 55 1108 2434 5056 8997

m1E10LC: 56 1114 2440 5662 95103

m20A9 LC: 57 1114 2440 5662 95103

m22E9 LC: 58 1114 2440 5662 95103

m29D5 LC: 59 1114 2440 5662 95103

m5B12LC: 60 1114 2440 5662 95103

m9C9 LC: 61 1114 2440 5662 95103

m11B10LC: 62 1114 2440 5662 95103

m10G8 LC: 63 1112 2438 5460 93101

m19E9LC: 64 1112 2438 5460 93101

m10H11 LC: 65 1112 2438 5460 93101

Tabla 3

Dominios y secuencias de cadena pesada

CLON DEL ANTICUERPO: SEQ ID NO: RESTOS DE VH RESTOS DE CDR DE CADENA PESADA

CDRH1: CDRH2 CDRH3

hum6H12: 1 20134 4554 6985 118123

hum7G10: 3 20134 4554 6985 118123

hum10H11: 90 1118 2635 5066 99107

hum22E9: 92 1115 2635 5066 99104

m6H12: 5 1115 2635 5066 99104

m7G10: 6 1115 2635 5066 99104

m13F11: 7 1115 2635 5066 99104

m13B5: 8 1116 2635 5066 99105

m21A10: 9 1115 2635 5066 99104

m33B12: 10 1115 2635 5066 99104

m39G2: 11 1118 2635 5066 99107

m35F12: 12 1118 2635 5066 99107

m49A10: 13 1119 2635 5066 99108

m3D7: 14 1122 2635 5066 99111

m34F9: 15 1124 2635 5066 99113

m7D7: 16 1124 2635 5066 99113

m13G1: 31 1115 2635 5066 99104

m11C10: 32 1115 2635 5066 99104

m7E2: 33 1115 2635 5066 99104

m30F11: 34 1115 2635 5066 99104

m34E4: 35 1115 2635 5066 99104

m6H4: 36 1115 2635 5066 99104

m33D2: 37 1115 2635 5066 99104

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26: VL de m34F9

27: VL de m7D7

28: VL de m3D7

29: IL23p19 humana

30: IL23p19 murina

31: VH de m13G1

32: VH de m11C10

33: VH de m7E2

34: VH de m30F11

35: VH de m34E4

36: VH de m6H4

37: VH de m33D2

38: VH de m1E10

39: VH de m20A9

40: VH de m22E9

41: VH de m29D5

42: VH de m5B12

43: VH de m9C9

44: VH de m11B10

45: VH de m30E1

46: VH de m10G8

47: VH de m19E9

48: VH de m10H11

49: VL de m13G1

50: VL de m11C10

51: VL de m7E2

52: VL de m30F11

53: VL de m34E4

54: VL de m6H4

55: VL de m33D2

56: VL de m1E10

57: VL de m20A9

58: VL de m22E9

59: VL de m29D5

60: VL de m5B12

61: VL de m9C9

62: VL de m11B10

63: VL de m10G8

64: VL de m19E9

65: VL de m10H11

66: CDRH1 Consenso

67: CDRH2 Consenso

68: CDRH3 Consenso

69: CDRL1(a) Consenso

70: CDRL1(b) Consenso

71: CDRL1(c) Consenso

72: CDRL2(a) Consenso

73: CDRL2(b) Consenso

74: CDRL2(c) Consenso

75: CDRL3(a) Consenso

76: CDRL3(b) Consenso

77: CDRL3(c) Consenso

78: CDRH1 Variable

79: CDRH2 Variable

80: CDRH3 Variable

81: CDRL1(a) Variable

82: CDRL1(b) Variable

83: CDRL1(c) Variable

84: CDRL2(a) Variable

85: CDRL2(b) Variable

86: CDRL2(c) Variable

87: CDRL3(a) Variable

88: CDRL3(b) Variable

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Claims

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