JP2012531902A - ポリペプチドおよび治療の方法 - Google Patents
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Abstract
ヒトADAMTS5に結合することができる少なくとも1つの第1の免疫グロブリン可変ドメインを含んでなる単離した抗原結合タンパク質を本明細書に提供する。モノクローナル抗体である本発明の抗原結合タンパク質、前記抗原結合タンパク質を含んでなる医薬組成物および治療法も提供する。
Description
本発明は、アグリカナーゼ、特に、ADAMTS5を阻害することによって、軟骨におけるアグリカンの分解を減少させる方法に関する。
軟骨は、様々な機械的および生化学的刺激に反応する軟骨細胞と呼ばれる特殊な細胞が集合した無血管組織である。軟骨は、関節の内張り、間質結合組織、および基底膜に存在し、II型コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、およびラミニンを含んでなるいくつかの基質成分を含んでなる細胞外基質を含んでなる。
正常な軟骨において、細胞外基質の合成は細胞外基質の分解によって相殺され、正常な基質の代謝回転をもたらす。受信信号(複数可)に応じて、次の反応は、(基質の産生および/もしくは修復を引き起こす)同化作用または(基質の分解、細胞のアポトーシス、機能喪失、および疼痛を引き起こす)異化作用のいずれかであり得る。
圧迫障害および/または炎症性メディエーター(例えば、炎症性サイトカイン)への曝露に応答して、軟骨細胞は基質産生を減少させ、複数の基質分解酵素の産生を増加させる。基質分解酵素の例として、アグリカナーゼ(ADAMTS)と基質メタロプロテイナーゼ(MMP)が挙げられる。これらの酵素の活性が軟骨基質の分解をもたらす。アグリカナーゼ(ADAMTS)は、MMPと共に、関節軟骨に存在するアグリカン、すなわちプロテオグリカン集合体を分解する。変形性関節症(OA)の関節軟骨において、プロテオグリカン染色の喪失が、初期のOAの表面ゾーンおよび中等度から重度のOAにおける軟骨侵食の隣接領域に観察される。
アグリカナーゼによって媒介されるアグリカンの異化は、アグリカンの中の特定の保存された部位で生じる。(配列番号44として図5に示す)ヒトADAMTS4および(配列番号43として図4に示す)ADAMTS5は、ネオエピトープARGSVIL(配列番号1)を産生するアミノ酸E373とA374の間でアグリカンを切断することが示されている。
細胞外基質の過剰分解が、疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、術後の疼痛、関節リウマチ、変形性関節症、スポーツ外傷、びらん性関節炎、強直性脊椎症、神経痛、神経障害、痛覚、神経損傷、虚血、神経変性、軟骨変性、脳卒中、失禁、炎症性疾患、過敏性腸症候群、歯周病、異常な血管新生、腫瘍の浸潤、および転移、角膜潰瘍、糖尿病の合併症を含んでなる多くの疾患および病状の発病に関与している。
従って、アグリカナーゼ活性および軟骨分解を阻害することができる化合物に対するニーズがある。
本発明は、ヒトADAMTS5に結合することができ、かつ/またはヒトADAMTS5を中和することができる少なくとも1つの可変ドメインを含んでなる単離したポリペプチドを提供する。
本発明のポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドも提供する。
本発明の少なくとも1つのポリペプチドを含んでなる医薬組成物も提供する。
本発明の医薬組成物を用いて、軟骨の疾患を患っている患者を治療する方法を本明細書に提供する。
「ポリヌクレオチド」は、一般的に、修飾されていないRNAもしくはDNA、または修飾されたRNAもしくはDNAであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを表す。「ポリヌクレオチド」には、1本鎖および2本鎖のDNA、1本鎖および2本鎖の領域の混合物であるDNA、1本鎖および2本鎖のRNA、ならびに1本鎖および2本鎖の領域の混合物であるRNA、1本鎖、より典型的には、2本鎖であり得るか、または1本鎖および2本鎖の領域の混合物であり得るDNAおよびRNAを含んでなるハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されない。さらに、「ポリヌクレオチド」は、RNAもしくはDNAまたはRNAおよびDNAの両方を含んでなる3本鎖領域を表す。ポリヌクレオチドという用語には、1個以上の修飾塩基を含んでなるDNAまたはRNA、安定性のために、もしくは他の理由のために修飾された骨格を有するDNAまたはRNAも含まれる。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの独特の塩基が含まれる。様々な修飾がDNAおよびRNAに行われるので、「ポリヌクレオチド」は、通常、自然界に見られるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的な修飾形態、ならびにウイルスおよび細胞に典型的なDNAおよびRNAの化学形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドと称されることが多い比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスターにより互いに結合している2個以上のアミノ酸を含んでなる任意のペプチドまたはタンパク質を表す。「ポリペプチド」は、一般に、ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと称される短鎖、および一般にタンパク質と称される長鎖の両方を表す。ポリペプチドは、遺伝子によりコードされた20種のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセス、または当該技術分野で公知の化学修飾法のいずれかにより修飾されたアミノ酸配列を含んでなる。このような修飾は、基本的なテキスト、より詳細な研究書、および多数の研究文献に詳しく記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含んでなるポリペプチドのどこにでも生じ得る。同じ種類の修飾が、所定のポリペプチドのいくつかの部位で、同じ程度または異なる程度で存在し得ることは理解されよう。所定のポリペプチドは多くの種類の修飾も含み得る。ポリペプチドはユビキチン化の結果として分枝状であってもよく、分岐の有無にかかわらず、環状であってもよい。環状、分枝状、および分枝環状のポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスから生じるか、または合成法によって作製され得る。修飾には、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのトランスファーRNAによるタンパク質へのアミノ酸の付加、ならびにユビキチン化が含まれる。例えば、PROTEINS−STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York,1993 and Wold,F.,Posttranslational Protein Modifications:Perspectives and Prospects,pgs.1−12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,1983;Seifter,et al.,“Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors”,Meth.Enzymol.(1990)182:626−646、ならびにRattan,et al.,“Protein Synthesis:Posttranslational Modifications and Aging”,Ann NY Acad Sci(1992)663:48−62を参照されたい。
本明細書で使用する「変異体」という用語は、それぞれ参照ポリヌクレオチドまたは参照ポリペプチドとは異なるが、本質的な特性は保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、別の参照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列の点で異なる。変異体のヌクレオチド配列における変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と変わっていてもよく、変わっていなくてもよい。以下で論じるように、ヌクレオチドの変化は、参照配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、およびトランケーションをもたらし得る。ポリペプチドの典型的な変異体は、別の参照ポリペプチドとアミノ酸配列の点で異なる。一般的に、差異は、参照ポリペプチドおよび変種の配列が全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるように限定されている。変異体および参照ポリペプチドは、1つ以上の置換、付加、欠失の任意の組み合わせによりアミノ酸配列において異なっていてもよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされる残基であっても、またはそうでなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体のように天然に存在してもよく、または天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然変異体は、突然変異誘発技術または直接合成により作製され得る。
「単離」とは、その天然状態から「ヒトの手により」変更されることを意味する。すなわち、それが天然に存在する場合、それはその元の環境から変化もしくは除去されているか、またはその両方である。例えば、天然の状態で生物に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、その天然状態で共存物質から分離された同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されており、これは、このようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドが導入されて、戻される時を含んでなるが、これに限定されない。
「単離された」または「実質的に純粋」な核酸またはポリヌクレオチド(例えば、RNA、DNAもしくは混合ポリマー)は、その天然宿主細胞内のネイティブポリヌクレオチドを天然に伴う他の細胞成分、例えば、それに天然に付随するリボソーム、ポリメラーゼ、およびゲノム配列から実質的に分離された核酸またはポリヌクレオチドである。この用語は、(1)その天然環境から除去された核酸またはポリヌクレオチド、(2)「単離されたポリヌクレオチド」が自然界に見られるポリヌクレオチドの全部もしくは一部と会合していない核酸またはポリヌクレオチド、(3)天然には連結されていないポリヌクレオチドと作動可能に連結されている核酸またはポリヌクレオチド、または(4)天然に存在しない核酸またはポリヌクレオチドを包含する。「単離」または「実質的に純粋」という用語は、組換えDNA分離体もしくはクローン化DNA分離体、化学合成ポリヌクレオチド類似体、または異種システムにより生物学的に合成されたポリヌクレオチド類似体に関しても用いられ得る。
しかし、「単離」は、必ずしも、そのように記述される核酸またはポリヌクレオチドが、それ自体、その天然の環境から物理的に除去されている必要はない。例えば、生物のゲノム内の内在性核酸配列は、異種配列がこの内在性核酸配列に隣接して配置される結果、この内在性核酸配列の発現が変わる、例えば、増加する、減少する、または除去される場合、本明細書で「単離された」と考えられる。この文脈で、異種配列は、この異種配列がそれ自体、(同一宿主細胞もしくはその子孫から生じる)内在性または(異なる宿主細胞もしくはその子孫から生じる)外来性であろうとなかろうと、この内在性核酸配列と天然では隣接していない配列である。例として、プロモーター配列を、宿主細胞のゲノム中の遺伝子のネイティブプロモーターと(例えば、相同組換えによって)置換することができ、その結果、この遺伝子の発現パターンは変化し得る。この遺伝子は、天然ではその側面に位置する配列の少なくとも一部から分離されているので、今や「単離」されたことになる。
核酸は、それがゲノム内の対応する核酸中に天然には生じない任意の修飾を含んでなる場合にも、「単離された」と考えられる。例えば、内在性コード配列は、それが人工的に、例えば、ヒトの介入によって導入される挿入、欠失または点変異を含んでなる場合に、「単離された」と考えられる。「単離された核酸配列」は、非相同部位において宿主細胞染色体に組込まれる核酸およびエピソームとして存在する核酸コンストラクトも含んでなる。さらに、「単離された核酸配列」は、実質的に他の細胞物質を含まないか、組換え技術によって産生される時に実質的に培地を含まないか、または化学合成される時に実質的に化学的前駆体もしくは他の化学物質を含んでなることができない。
本明細書で使用する「炎症性メディエーター」には、炎症プロセスを誘発することができる任意の化合物が含まれる。炎症という用語は、一般に、傷害に対する血管新生した生体組織の反応プロセスを表す。このプロセスには、血流の増加、血管透過性の増加、および白血球滲出が含まれるが、これらに限定されない。炎症反応に動員される白血球は、強力な酵素および酸素フリーラジカル(すなわち、炎症性メディエーター)を放出することができるので、この炎症反応は、かなりの組織損傷を媒介することができる。炎症性メディエーターの例として、プロスタグランジン(例えば、PGE2)、ロイコトリエン(例えば、LTB4)、腫瘍壊死因子α(TNFα)、インターロイキン1(IL−1)、およびインターロイキン6(IL−6)などの炎症性サイトカイン、一酸化窒素(NO)、メタロプロテイナーゼ、および熱ショックタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する「基質タンパク質」には、軟骨の細胞外基質を形成するために細胞から放出されるタンパク質が含まれる。軟骨の細胞外基質は、いくつかの別々のプロテオグリカンのファミリーに属するプロテオグリカンからなる。これらには、パールカン、ならびにアグリカンおよびバーシカンに代表されるヒアレクタン(hyalectans)、デコリン、バイグリカン、およびフィブロモジュリンを含んでなるプロテオグリカンの小さなロイシンリッチファミリーが含まれるが、これらに限定されない。細胞外基質は、また、軟骨オリゴマー基質タンパク質(COMP)、リンクタンパク質、およびフィブロネクチンなどのアクセサリータンパク質と共に、3つのコラーゲンアイソタイプ、すなわち、II型コラーゲン、IX型コラーゲン、およびXI型コラーゲンを含んでなるハイブリッドコラーゲン繊維からなる。軟骨は、ヒアレクチンと非共有結合を形成するヒアルロニン(hyaluronin)も含んでなる。さらに、特殊な細胞周囲基質は、プロテオグリカン、VI型コラーゲン、およびアンコリン(anchorin)などのコラーゲン受容体タンパク質からなる軟骨細胞を取り囲んでいる。
本明細書で使用する「基質分解酵素」は、細胞外基質タンパク質を切断することができる酵素を表す。軟骨細胞外基質の代謝回転は、軟骨細胞外基質タンパク質を分解するために活性化を必要とする潜在的な酵素前駆体として合成される基質メタロプロテイナーゼ(MMP)によって調節される。酵素の3つのクラス、すなわち、ネイティブなコラーゲン繊維の分解に関与する(MMP−13を含んでなるが、これに限定されない)コラゲナーゼ、プロテオグリカン、およびIX型コラーゲンを分解する(MMP−3を含んでなるが、これに限定されない)ストロメリシン、ならびに変性コラーゲンを分解する(MMP−2およびMMP−9を含んでなるが、これらに限定されない)ゼラチナーゼは、細胞外基質タンパク質の代謝回転を調節すると考えられている。OA内の軟骨分解に最も関係があると思われる基質分解酵素の群には、それらが、ジスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼのドメイン、ならびにそれらの構造内のトロンボスポンジンモチーフを保有するので、ADAMTSと呼ばれるメタロプロテイナーゼのサブ群が含まれる。ADAMTS4(アグリカナーゼ1)はOA関節内で増加することが報告され、ADAMTS−5(アグリカナーゼ−2)と共に、ヒト変形性関節症軟骨で発現することが示されている。これらの酵素は、MMPが加わることなくアグリカン分解に関与すると思われる。
本明細書で使用するアグリカナーゼ活性の「減少(reduce)」または「減少(reducing)」は、ADAMTS4およびADAMTS5を含んでなるが、これらに限定されない少なくとも1種類の天然に存在するアグリカナーゼと関連する活性のいずれかおよび/または全てにおける低下を表す。例えば、少なくとも1つのADAMTS5活性の「減少」は、天然に存在するADAMTS5と関連する活性のいずれかおよび/または全てにおける低下を表す。例として、哺乳類におけるADAMTS5活性の減少を、ADAMTS5に結合することができる少なくとも1つのポリペプチドの対象への投与後に測定し、ADAMTS5に結合することができるポリペプチドの投与前の、同一対象におけるADAMTS5活性と比較するか、またはプラセボを投与した第2の対象と比較することができる。本明細書で使用する少なくとも1つのADAMTS5の「減少」には、少なくとも1つ以上の酵素活性の減少が含まれる。少なくとも1つのADAMTS5活性の減少には、少なくとも1つのADAMTS5の完全抑止が含まれる。少なくとも1つの酵素活性の量の減少も本定義の範囲内に含まれる。すなわち、ADAMTS5は、同一酵素の第2の活性が減少する間に維持される2種類以上の活性を有し得る。
本明細書で使用する「軟骨分解に関連する疾患」には、癌、疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、術後の疼痛、変形性関節症、スポーツ外傷、びらん性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライム関節炎、若年性関節炎、強直性脊椎症、神経痛、神経障害、痛覚、神経損傷、虚血、神経変性、炎症性疾患、軟骨変性、喉頭、気管、耳道、椎間板、靱帯、腱、関節包や骨の発達に影響を与える疾患、無脊椎の椎間板変性、骨減少症、または歯周病、急性関節損傷、および/または関節破壊に関連した疾患が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する「同時投与(co−administration)」または「同時投与(co−administering)」は、同一患者への2種類以上の化合物の投与を表す。このような化合物の同時投与は、同時もしくはほぼ同じ時(例えば、同じ時間内)であってもよく、またはそれは、互いに数時間内もしくは数日以内であってもよい。例えば、第1の化合物は週1回投与されるが、第2の化合物は毎日同時に投与されてもよい。
本明細書で使用する「減衰(attenuate)」または「減衰(attenuating)」は、異化刺激への暴露後に、細胞が産生および/または放出する基質分解酵素、炎症性メディエーター、または基質タンパク質の量の正常化(すなわち、増加または減少のいずれか一方)を表す。例えば、IL−1への暴露後に、プロテオグリカンなどの基質タンパク質の軟骨細胞産生は減少するが、基質分解酵素(例えば、MMP−13、ADAMTS4)および活性酸素種(例えば、NO)の産生は増加する。減衰は、異化刺激の非存在下で観察されるレベルへのこれらの多様な反応の正常化を表す。
「ドメイン抗体」または「dAb」は、抗原に結合することができる「単一可変ドメイン」と同じであると考えられ得る。単一可変ドメインは、ヒトの抗体可変ドメインであり得るが、(例えば、国際特許WO00/29004に開示されているような)齧歯類、テンジクザメやラクダ科の動物などの他の種のVHH dAbに由来する単一抗体可変ドメインも含んでなる。ラクダ科の動物のVHHは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含んでなる種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインのポリペプチドであり、これは、天然に軽鎖を欠く重鎖の抗体を産生する。このようなVHHドメインは、当該技術分野で利用可能な標準的な技術に従ってヒト化され得、このようなドメインは「ドメイン抗体」であると考えられる。本明細書で使用するVHには、ラクダ科の動物VHHドメインが含まれる。
「単一可変ドメイン」という語句は、異なる可変領域または可変ドメインとは無関係に、抗原またはエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質可変ドメイン(例えば、VH、VHH、VL)を表す。
本明細書で使用する「抗原結合タンパク質」という用語は、抗原に結合できる抗体、抗体断片、ならびに可変ドメインおよびドメイン抗体に限定されないドメインなどの他のタンパク質コンストラクトを表す。
抗体の抗原結合ドメインは、2つの別々の領域:重鎖可変ドメイン(VH)および軽鎖可変ドメイン(VL:これはVκまたはVλのいずれか一方であり得る)を含んでなる。この抗原結合部位自体は、6つのポリペプチドループ:VHドメインの3つ(H1、H2およびH3)ならびにVLドメインの3つ(L1、L2およびL3)によって形成される。
抗体の構造および配列の分析は、6つの抗原結合ループのうちの5つ(H1、H2、L1、L2、L3)が、限られた数の主鎖の構造または標準構造を有することを示している(Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.,196:901;Chothia et al.(1989)Nature,342:877)。主鎖の構造は、(i)抗原結合ループの長さ、ならびに(ii)抗原結合ループおよび抗体フレームワークの中の特定の重要な位置における特定の残基、または残基の種類によって決定される。ループの長さおよび重要な残基の分析により、大部分のヒト抗体配列によってコードされるH1、H2、L1、L2、およびL3の主鎖の構造を予測することが可能になった(Chothia et al.(1992)J.Mol.Biol.,227:799;Tomlinson et al.(1995)EMBO J.,14:4628;Williams et al.(1996)J.Mol.Biol.,264:220)。このH3領域は配列、長さ、および構造の点で(Dセグメントの使用のため)遥かに多様であるが、これは短いループ長のために限られた数の主鎖の構造も形成し、この構造は、このループおよび抗体フレームワークの中の重要な位置における特定残基の長さおよび存在、または残基の種類によって決まる(Martin et al.(1996)J.Mol.Biol.,263:800;Shirai et al.(1996)FEBS Letters,399:1)。
VHとVL領域の相補対を含んでなる2重特異性抗体が当該技術分野で公知である。これらの2重特異性抗体は、VHとVLの2対を含まねばならず、各VH/VL対は単一の抗原またはエピトープに結合する。記載する方法には、ハイブリッドハイブリドーマ(Milstein&CuelloAC,Nature 305:537−40)、ミニボディ(Hu et al.,(1996)Cancer Res 56:3055−3061)、ダイアボディ(Holliger et al.,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,6444−6448;国際特許WO94/13804)、キレート組換え抗体(CRAbs;Neri et al.,(1995)J.Mol.Biol.246,367−373)、biscFv(例えば、Atwell et al.,(1996)Mol.Immunol.33,1301−1312)、「ノブインホール(knobs in holes)」安定化抗体(Carter et al.,(1997)Protein Sci.6,781−788)が含まれる。それぞれの場合において、各抗体種は2つの抗原結合部位を含み、それぞれがVHおよびVLドメインの相補対によって構築される。それによって各抗体は、2つの異なる抗原またはエピトープに同時に結合することができ、各抗原またはエピトープへの結合は、VHドメインおよびその相補的VLドメインによって媒介される。これらの技術のそれぞれにはそれ特有の不都合があり、例えば、ハイブリッドハイブリドーマの場合には、不活性VH/VL対が2重特異性IgGの画分を非常に減少させることができる。さらに、ほとんどの2重特異性アプローチは、2つの異なるVH/VL結合部位を再形成するために、異なるVH/VL対の会合またはVH鎖とVL鎖の会合に依存している。したがって、構築された分子において各抗原またはエピトープに対する結合部位の比を制御することは不可能であるので、構築された分子の多くは一方の抗原またはエピトープと結合するが、他方の抗原またはエピトープとは結合しないであろう。いくつかの場合において、両方の抗原もしくはエピトープに対する結合部位を有する分子の数を改善するために、サブユニットの界面に重鎖または軽鎖を遺伝子工学処理することが可能になったが(Carter et al.,1997)、これによって全ての分子が両方の抗原またはエピトープに結合するようには決してならない。
2つの異なる抗体結合特異性を同じ結合部位に組み込むことができるという証拠がいくつかあるが、これらは一般に、構造的に関連した抗原もしくはエピトープに対応するか、または広く交差反応する抗体に対応する2つ以上の特異性を表す。例えば、交差反応性の抗体について記載されており、通常、ニワトリ卵白のリゾチームおよびシチメンチョウのリゾチーム(McCafferty et al.,国際特許WO92/01047)、または遊離ハプテンおよび担体に結合したハプテン(Griffiths AD et al.,EMBO J 1994 13:14 3245−60)などの2つの抗原は配列および構造において関連する。さらなる例として、国際特許WO02/02773(Abbott Laboratories)は、「2重特異性」を有する抗体分子について記載している。言及する抗体分子は、それらの特異性が単一の抗原より多くに及ぶように、複数の抗原に対して産生または選択された抗体である。国際特許WO02/02773に記載の抗体の各相補的VH/VL対は、構造的に関連した2つ以上の抗原に対する単一結合特異性を示し、このような相補対のVHドメインおよびVLドメインはそれぞれ別々の特異性を保有しない。したがって、これらの抗体は構造的に関連する2つの抗原を包含する広範な単一特異性を有する。さらに、多反応性である天然の自己抗体について記載されており(Casali&Notions,Ann.Rev.Immunol.7,515−531)、これは、構造的に無関係の少なくとも2つ(通常はそれ以上)の異なる抗原またはエピトープと反応する。モノクローナル抗体に対するファージディスプレイ法を用いたランダムペプチドレパートリーの選択が、その抗原結合部位に適合する様々な範囲のペプチド配列を同定することも示されている。これらの配列の一部は高度に関連し、コンセンサス配列に適合するが、その他は非常に異なり、ミモトープと名付けられている(Lane&Stephen,Current Opinion in Immunology,1993,5,268−271)。したがって、会合した相補的VHドメインおよびVLドメインを含んでなる天然の4本鎖抗体が、非常に多数の既知抗原からの多くの異なる抗原と結合する能力を有することは明らかである。同一の抗体の中の2つの所定の抗原、特に、必ずしも構造的に関連のない抗原に対する結合部位を形成する方法はあまり分かっていない。
これに関係し得るタンパク質工学的方法が提唱されている。例えば、1つの可変ドメインを介して金属イオンに結合する活性を有し、かつこの金属イオンおよび相補的可変ドメインとの接触を介してハプテン(基質)と結合する活性を有する触媒抗体を作製できることも提案されている(Barbas et al.,1993 Proc.Natl.Acad.Sci USA 90,6385−6389)。しかし、この場合には、基質(第1の抗原)の結合および触媒作用は、金属イオン(第2の抗原)の結合を必要とすると提唱されている。したがって、VH/VL対への結合は、単一だが多成分の抗原に関係する。
ラクダ抗体の重鎖単一ドメインから2重特異性抗体を作製する方法について記載されており、その中で、1つの抗原に対する結合接点を1つの可変ドメインの中に作り、第2の抗原に対する結合接点を第2の免疫グロブリン可変ドメインの中に作る。しかし、これらの可変ドメインは相補的ではなかった。したがって、第1の重鎖可変ドメインを第1の抗原に対して選択し、第2の重鎖可変ドメインを第2の抗原に対して選択し、その後、両ドメインを同一鎖上で連結して、2重特異性抗体断片を得る(Conrath et al.,J.Biol.Chem.270,27589−27594)。しかしながら、このラクダ重鎖単一ドメインは、それらが軽鎖をもたない天然のラクダ抗体に由来するという点で普通ではなく、実際、この重鎖単一ドメインは相補的なVHとVLの対を形成するようにラクダ軽鎖と会合することができない。
通常、軽鎖と会合している天然の抗体に由来する(モノクローナル抗体からの、またはドメインのレパートリーからの;ヨーロッパ特許EP−A−0368684参照)単一重鎖可変ドメインについても記載されている。これらの重鎖可変ドメインは、1つ以上の関連抗原と特異的に相互作用することが示されているが、2つ以上の異なる抗原に対する特異性を有するリガンドを作製するために、他の重鎖または軽鎖の可変ドメインと組み合わされたことはない。さらに、これらの単一ドメインは非常に短い生体内半減期を有することが示されている。したがって、このようなドメインの治療上の価値は限られたものとなる。
異なる特異性の重鎖可変ドメインを(上記に記載したように)共に連結させることによって、2重特異性抗体断片を作製することが提案されている。このアプローチに伴う不都合は、単離した抗体可変ドメインが、通常は軽鎖と相互作用し、かつ溶媒に暴露される疎水性界面を有すること、ならびに「粘着性」であって、この単一ドメインを疎水性表面に結合させることができる可能性があることである。さらに、パートナーである軽鎖が存在しない場合において、2つ以上の異なる重鎖可変ドメインの組合せ、およびおそらく、それらの疎水性界面を介するそれらの会合により、それらが分離して結合することができるリガンドの両方ではなく一方に結合することを防ぐことができる。さらに、この場合において、この重鎖可変ドメインは相補的な軽鎖可変ドメインと会合しないので、安定性に乏しく、容易にアンフォールディングしてしまう(Worn&Pluckthun,1998 Biochemistry 37,13120−7)。
本明細書で使用する、「抗体」という用語には、2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖をジスルフィド結合により相互に連結した4つのポリペプチド鎖を含んでなる免疫グロブリン分子が含まれる。各重鎖は、(本明細書でVHと省略する)重鎖可変領域および重鎖定常領域を含んでなる。この重鎖定常領域は、3つのドメイン、すなわち、CH1、CH2、およびCH3を含んでなる。各軽鎖は、(本明細書でVLと省略する)軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含んでなる。任意の脊椎動物種に由来する抗体(免疫グロブリン)の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)とラムダ(λ)と呼ばれる2つの明らかに異なる種類の1つに割り当てられ得る。κ軽鎖の可変領域を本明細書でVΚと称する。本明細書で使用するVL発現は、κ型軽鎖(VΚ)およびλ型軽鎖の可変領域の両方を含んでなることを意図している。この軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLを含んでなる。このVHおよびVLの領域には、より保存されたフレームワーク領域(FR)と呼ばれる領域と共に分散される、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変領域が含まれる。それぞれのVHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFRを含み、以下の順番:FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される。
これらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を異なるクラスに割り当てることができる。5つの主要なインタクトな抗体のクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、およびIgA2にさらに分けられ得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は公知である。本発明は、前述のクラスまたはサブクラス(アイソタイプ)の全ての抗体を含んでなる。
本明細書で使用する「抗体」という用語は、模倣抗体を含み、すなわち抗体もしくは特定断片もしくはその一部の構造および/または機能を模倣する抗体の部分を含み、一本鎖抗体およびそれらの断片を含んでなる抗体、消化断片、それらの特定部分ならびにそれらの変異体を包含するとも意図され、それぞれは少なくとも1つのCDRを含んでなる。機能的断片には、ADAMTS5抗原に結合する抗原結合断片が含まれる。例えば、(例えば、パパイン消化による)Fab断片、(例えば、プラスミン消化による)facb断片、(例えば、ペプシンまたはプラスミン消化による)pFc’断片、(例えば、ペプシン消化、部分的還元、および再凝集による)Fd断片、(例えば、分子生物学的手法による)Fv断片もしくはscFv断片を含んでなるが、これらに限定されないADAMTS5またはその一部に結合することができる抗体断片は、本発明に包含される。抗体断片は、例えば、ドメイン除去抗体、ダイアボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多特異性抗体を含んでなることも意図される。
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を表し、例えば、この集団を含んでなる個々の抗体は、天然の可能性のある突然変異または存在し得るマイナーな翻訳後の変異を除いて実質的に同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一抗原部位に対して作られる。さらに、通常、異なる決定基(エピトープ)に対して作られる異なる抗体を含んでなる従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体はこの抗原上の単一の決定基に対して作られる。修飾因子「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは、組換えDNA法によって作製されるか、または本明細書の他の場所で記載するスクリーニング法によって得られる。
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は「キメラ」抗体(免疫グロブリン)を含み、それらが所望の生物学的活性を示す限り、キメラ抗体中の重鎖および/または軽鎖の一部は、特定の種に由来する抗体中の対応する配列と同一もしくは相同であるか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属するが、この鎖(複数可)の残りは、別の種(例えば、マウスまたはラット)に由来する抗体中の対応する配列と同一もしくは相同であるか、または別の抗体クラスまたはサブクラス、ならびにこのような抗体の断片に属する(Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851−6855(1984))。本明細書における対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、アカゲザルまたはカニクイザルなどの旧世界ザル)に由来する可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含んでなる「霊長類化」抗体が含まれる(米国特許第5,693,780号)。
したがって、本発明には、例えば、キメラ重鎖および/またはキメラ軽鎖を含んでなるキメラモノクローナル抗体が含まれる。このキメラ重鎖は、本明細書に記載の重鎖可変(VH)領域、または非ヒト抗体もしくはヒト抗体の重鎖定常領域に融合した重鎖可変領域の突然変異体もしくは変異体の全てを含み得る。このキメラ軽鎖は、本明細書に記載の軽鎖可変(VL)領域、または非ヒト抗体もしくはヒト抗体の軽鎖定常領域に融合した軽鎖可変領域の突然変異体もしくは変異体の全てを含み得る。
本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語には、カバットら(Kabat,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91−3242参照)によって記載されるようなヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変領域および定常領域を有する抗体が含まれる。本発明のヒト抗体は、例えば、CDR、特に、CDR3において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列がコードしないアミノ酸残基(例えば、インビトロのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボの体細胞突然変異によって導入される変異)を含み得る。このヒト抗体は、アミノ酸残基、例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列がコードしない、活性を高めるアミノ酸残基と置換される少なくとも1つの位置を有することができる。本発明の文脈において、このヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の一部ではないアミノ酸残基と置換される最大で20の位置を有することができる。他の実施形態において、最大10、最大5、最大3、または最大2つの位置が置換される。しかし、本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列に由来するCDR配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含んでなることを意図しない。
「組換えヒト抗体」という語句には、宿主細胞にトランスフェクトされる組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体などの組換え手段によって調製、発現、作製または単離されるヒト抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック動物から単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを含んでなる任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離される抗体が含まれる。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する(Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91−3242参照)。本発明による組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発(または、ヒトIg配列のトランスジェニック動物を用いる時は、インビボ体細胞変異誘発)に共されたヒト生殖系列免疫グロブリン配列を含んでなるので、この組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のVH配列およびVL配列に由来し、かつ関連するが、インビボのヒト抗体生殖系列のレパートリー内に天然には存在し得ない配列である。しかし、特定の実施形態において、このような組換え抗体は、選択的変異誘発法もしくは逆突然変異またはその両方の結果である。
本発明の抗体は単離された抗体であり得る。本明細書で使用する「単離された抗体」には、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体が含まれる。さらに、単離された抗体には、他の細胞物質および/または化学物質が実質的に含まれ得ない。
インタクトな抗体には、少なくとも2つの重鎖および2つの軽鎖を含んでなるヘテロ多量体の糖タンパク質が含まれる。IgMは別として、インタクトな抗体は、通常、2つの同一の軽(L)鎖と2つの同一の重(H)鎖を含んでなる約150Kdaのヘテロ4量体の糖タンパク質である。典型的には、各軽鎖は、1つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されているが、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖および各軽鎖は、鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン(VH)を有し、その後多くの定常領域が続く。各軽鎖は、その他端に可変ドメイン(VL)および定常領域を有する。この軽鎖の定常領域は、この重鎖の第1の定常領域と整列し、この軽鎖可変ドメインは、この重鎖の可変ドメインと整列する。ほとんどの脊椎動物種の抗体軽鎖を、この定常領域のアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる2種類のうちの1種類に割り当てることができる。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、ヒト抗体を、5つの異なるクラス、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMに割り当てることができる。IgGおよびIgAを、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2のサブクラスにさらに分けることができる。種の変異体は、少なくともIgG2a、IgG2bを有するマウスおよびラットに存在する。この抗体の可変ドメインは、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる特定の可変性を示す特定領域で抗体に結合特異性を与える。この可変領域のより保存された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。インタクトな重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ3つのCDRが結合した4つのFRを含んでなる。各鎖のCDRはFR領域が近接してまとまり、他の鎖のCDRと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。これらの定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、Fcγ受容体への結合による食作用、新生児Fcレセプター(FcRn)による半減期/クリアランス率および補体カスケードのC1q成分による補体依存性細胞傷害などの様々なエフェクター機能を示す。
ヒト抗体は、当該技術者に公知の多くの方法により産生され得る。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫細胞株またはマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株を用いるハイブリドーマ法によって作製することができる。Kozbor J.Immunol 133,3001,(1984)およびBrodeur,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp51−63(Marcel Dekker Inc,1987)を参照されたい。代替方法にはファージライブラリーまたはトランスジェニックマウスの使用が含まれ、それらの両方はヒトV領域のレパートリーを利用する(Winter G,(1994),Annu.Rev.Immunol 12,433−455,Green LL(1999),J.Immunol.methods 231,11−23参照)。
トランスジェニックマウスのいくつかの系統が現在利用可能であり、それらのマウスの免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト免疫グロブリン遺伝子部分と置換されている(Tomizuka K,(2000)PNAS 97,722−727;Fishwild D.M(1996)Nature Biotechnol.14,845−851,Mendez MJ,1997,Nature Genetics,15,146−156参照)。抗原負荷の際、このようなマウスはヒト抗体のレパートリーを産生することができ、そのレパートリーから対象の抗体を選択することができる。特に注目すべきは、ヒトのリンパ球を放射線照射したマウスに移植するTrimera(商標)システム(Eren R et al,(1998)Immunology 93:154−161参照)、ヒト(または他の種)のリンパ球に対して、大規模プールインビトロ抗体の産生手順、その後にデコンビュレートされた(deconvulated)限界希釈および選択手順を効果的に施す選択リンパ球抗体システム(SLAM,Babcook et al,PNAS(1996)93:7843−7848参照)、ならびにXenomouse II(商標)(Abgenix Inc)である。別のアプローチは、モルフォテック社(Morphotek Inc)から入手可能であるMorphodoma(商標)技術を用いる。
ファージディスプレイ技術を用いて、ヒト抗体を(およびその断片)を産生することができる。McCafferty;Nature,348,552−553(1990)およびGriffiths AD et al(1994)EMBO 13:3245−3260を参照されたい。この手法によると、抗体Vドメイン遺伝子を、M13またはfdなどの糸上バクテリオファージのメジャーコートタンパク質またはマイナーコートタンパク質のいずれか一方の遺伝子にインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面上の機能性抗体断片として(通常はヘルパーファージの助けを借りて)提示させる。この抗体の機能的特性に基づく選択は、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。ァージディスプレイ法を用いて、上記に記載の疾患または障害を患っている固体、または、免疫されていないヒトドナーから得られるヒトB細胞から作製されるライブラリーから抗原特異的抗体を選択することができる(Marks;J.Mol.Bio.222,581−597,1991参照)。インタクトなヒト抗体がFcドメインを含んでなることが望まれる場合、所望の定常領域を含み、安定な発現細胞株を確立する哺乳類発現ベクターに、ファージディスプレイ由来の断片を再クローニングすることが必要である。
親和性成熟技術(Marks;Bio/technol 10,779−783(1992))を用いて結合親和性を改善してもよく、ヒト1次抗体の親和性は、天然に存在する変異体でH鎖およびL鎖のV領域を連続して置換し、改善された結合親和性に基づいて選択することによって改善される。「エピトープインプリンティング」などのこの技術の変法も今日では利用可能である。国際特許WO93/06213を参照されたい。Waterhouse;Nucl.Acids Res 21,2265−2266(1993)も参照されたい。
特定の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、結合定数(Ka)を測定すると、少なくとも約5×104L/モル、1×105L/モル、5×105L/モル、または1×106L/モルの親和性を有する。別の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、約5×10−4L/秒、1×10−5L/秒、5×10−5L/秒、または1×10−6L/秒未満の解離定数(Kd)でヒトADAMTS5の中和エピトープに結合する。
ヒトの疾患または障害の治療におけるインタクトな非ヒト抗体の使用は、今日十分に確立された免疫原性の問題が起きる可能性を伴い、この免疫原性は患者の免疫システムであり、非ヒトのインタクトな抗体を非自己として認識し、中和反応を開始する。この反応は、ヒト患者への非ヒト抗体の複数投与の際に特に顕著である。様々な技術がこれらの問題を克服するために長年にわたって開発され、一般的に、免疫された動物、例えば、マウス、ラットまたはウサギから非ヒト抗体を得ることに相対的な容易さを維持しつつ、インタクトな抗体中の非ヒトアミノ酸配列の組成の減少を含んでなる。大まかに2つのアプローチを用いてこれを達成する。第1のアプローチは、一般的に、ヒト定常領域に融合させた非ヒト(例えば、マウスなどの齧歯類)の可変ドメインを含んでなるキメラ抗体である。抗体の抗原結合部位は可変領域内に局在しているので、このキメラ抗体はこの抗原に対するその結合親和性を保持するが、ヒト定常領域のエフェクター機能を獲得するので、上記に記載したようなエフェクター機能を実行することができる。キメラ抗体は、典型的には、組換えDNA法を用いて産生される。これらの抗体をコードするDNA(例えば、cDNA)を、(例えば、本発明の抗体のH鎖およびL鎖をコードする遺伝子、例えば、上記に記載の配列番号2、3、4、5、6、および7をコードするDNAに特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)従来の方法を用いて単離および配列解析をする。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの典型的な供給源として役立つ。単離した時点で、このDNAを発現ベクター中に置き、その後、抗体の合成をするために免疫グロブリンタンパク質を別の方法で産生しない大腸菌、COS細胞、CHO細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトする。このDNAは、ヒトのL鎖およびH鎖のコード配列を、対応する非ヒト(例えば、マウス)のH定常領域およびL定常領域に対して置換することによって改変されてもよい(Morrison;PNAS 81,6851(1984)参照)。
第2のアプローチはヒト化抗体の産生を伴い、この抗体の非ヒト内容物は、これらの可変領域をヒト化することによって減少する。ヒト化抗体は、CDR移植によって作製することができる。CDRはこの抗体のN−末端近くにループを形成し、そこでCDRは、フレームワーク領域によって提供される足場に取り付けられた面を形成する。この抗体の抗原結合特異性は、主に局所分布によって、およびそのCDR表面の化学的特性によって定義される。これらの特徴は、順番に、個々のCDR構造によって、これらのCDRの相対的配置によって、ならびにこれらのCDRを含んでなる残基の側鎖の性質および配置によって決定される。大規模な免疫原性の減少は、ヒトフレームワーク(「アクセプターフレームワーク」)および定常領域上に非ヒト(例えば、マウス)抗体(「ドナー」抗体)のCDRのみを移植することによって達成することができる(Jones et al(1986)Nature 321,522−525およびVerhoeyen M et al(1988)Science 239,1534−1536参照)。しかし、CDR移植それ自体は、抗原結合特性の完全な保持をもたらすことができず、重要な抗原結合親和性を回復すべき場合には、このドナー抗体の(「逆突然変異」とも呼ばれる場合がある)いくつかのフレームワーク残基は、ヒト化分子内に保持される必要があることが頻繁に明らかになっている(Queen C et al(1989)PNAS 86,10,029−10,033,Co,M et al(1991)Nature 351,501−502)。この場合において、ヒトフレームワーク(FR)を提供するために、この非ヒトドナー抗体に最も配列相同性を示すヒトV領域をデータベースから選択する。ヒトFRの選択は、ヒトコンセンサスまたは個々のヒト抗体のいずれか一方から行うことができる。このドナー抗体の必須の重要な残基をヒトアクセプターフレームワークの中に置換し、CDR構造を維持する。この抗体のコンピューターモデリングの使用は、このような構造的に重要な残基を同定するのにおそらく役立つ(国際特許WO99/48523参照)。
あるいは、ヒト化は、「上張り(veneering)」プロセスによって達成することができる。独特なヒトおよびマウスの免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の統計解析により、露出した残基の正確なパターンはヒトおよびマウスの抗体で異なっており、ほとんどの個々の表面の位置が、少数の異なる残基に対して優先度が高いことが明らかになった(Padlan E.A.et al;(1991)Mol.Immunol.28,489−498およびPedersen J.T.et al(1994)J.Mol.Biol.235;959−973参照)。したがって、通常、ヒト抗体に見られるものとは異なる、そのフレームワーク領域内の露出した残基を置換することによって、非ヒトFvの免疫原性を減少させることができる。タンパク質の抗原性は表面接触性と相関し得るので、これらの表面残基の置換は、ヒトの免疫システムに対してこのマウス可変領域を隠すのに十分であり得る(Mark G.E.et al(1994)in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113:The pharmacology of monoclonal Antibodies,Springer−Verlag,pp105−134も参照)。このヒト化の方法は、抗体の表面のみを変えるので、「上張り」とも呼ばれ、これらの支持残基は影響を受けないままである。
したがって、本発明は、アグリカナーゼに結合することができる少なくとも1つの第1の免疫グロブリン可変ドメインを含んでなる、単離した抗原結合タンパク質を提供する。一実施形態において、このアグリカナーゼはヒトADAMTS5である。いくつかの場合において、この抗原結合タンパク質は抗体またはその断片である。いくつかの場合において、この抗体は、ADAMTS5に特異的に結合する。この抗体はモノクローナル抗体またはその断片であってもよい。いくつかの場合において、本発明のモノクローナル抗体またはその断片は、マウス、キメラ、ヒト化、または完全なヒトの抗体またはその断片である。
別の実施形態において、この抗原結合タンパク質は、少なくとも1つの相補性決定領域を含んでなる。いくつかの場合において、本発明の抗原結合タンパク質は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含んでなる重鎖ならびにCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含んでなる軽鎖を含んでなるモノクローナル抗体であり、この重鎖の相補性決定領域(CDR)は、
アミノ酸配列DAWMD(配列番号2)と少なくとも約80%の配列同一性を有するCDRHl;
アミノ酸配列EIRHKANDHAIFYXESVKG(配列番号3)と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を有するCDRH2;
アミノ酸配列TYYYGSSYGYCDV(配列番号4)またはPFAY(配列番号5)と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を有するCDRH3;
の群から選択され、かつこの軽鎖の相補性決定領域は、
アミノ酸配列KASQSVGTTIV(配列番号6)またはRTSENIYSYLA(配列番号7)と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を有するCDRLl;
アミノ酸配列NAKTLAE(配列番号8)もしくはSASNRXT(配列番号9)と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、または98%の配列同一性を有するCDRL2;
アミノ酸配列QQYSSYPFT(配列番号10)またはQHHYGTPWT(配列番号11)と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を有するCDRL3;
の群から選択される。
アミノ酸配列DAWMD(配列番号2)と少なくとも約80%の配列同一性を有するCDRHl;
アミノ酸配列EIRHKANDHAIFYXESVKG(配列番号3)と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を有するCDRH2;
アミノ酸配列TYYYGSSYGYCDV(配列番号4)またはPFAY(配列番号5)と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を有するCDRH3;
の群から選択され、かつこの軽鎖の相補性決定領域は、
アミノ酸配列KASQSVGTTIV(配列番号6)またはRTSENIYSYLA(配列番号7)と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を有するCDRLl;
アミノ酸配列NAKTLAE(配列番号8)もしくはSASNRXT(配列番号9)と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、または98%の配列同一性を有するCDRL2;
アミノ酸配列QQYSSYPFT(配列番号10)またはQHHYGTPWT(配列番号11)と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を有するCDRL3;
の群から選択される。
一実施形態において、CDRH2は、EIRHKANDHAIFYAESVKG(配列番号12)、EIRNKANNHARHYAESVKG(配列番号13)、EIRHKANDYAIFYDESVKG(配列番号14)、EIRHKANDHAIFYDESVKG(配列番号15)、DIRNTANNHATFYAESVKG(配列番号16)、およびEIRHKANDHAIFYDESVKG(配列番号17)から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を有する。
一実施形態において、CDRH3は、アミノ酸配列PFAY(配列番号5)を含んでなる。
さらに別の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、CDRH1、CDRH2およびCDRH3を含んでなる重鎖ならびにCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含んでなる軽鎖を含んでなるモノクローナル抗体であり、この重鎖の相補性決定領域(CDR)は、
CDRH1が、アミノ酸配列DAWMD(配列番号2)であり;
CDRH2が、アミノ酸配列EIRHKANDHAIFYAESVKG(配列番号12)、EIRNKANNHARHYAESVKG(配列番号13)、EIRHKANDYAIFYDESVKG(配列番号14)、EIRHKANDHAIFYDESVKG(配列番号15)、DIRNTANNHATFYAESVKG(配列番号16)、またはEIRHKANDHAIFYDESVKG(配列番号17)であり;
CDRH3が、TYYYGSSYGYCDV(配列番号18)またはPFAY(配列番号5)である;
から選択され、かつこの軽鎖の相補性決定領域は、
CDRL1が、アミノ酸配列KASQSVGTTIV(配列番号19)、RTSENIYSYLA(配列番号20)、またはKASQNVGTAVV(配列番号21)から選択され;
CDRL2が、アミノ酸配列NAKTLAE(配列番号22)、SASNRHT(配列番号23)、SASTRYT(配列番号24)、またはSASNRYT(配列番号25)から選択され;
CDRL3が、アミノ酸配列QQYSSYPFT(配列番号26)、QHHYGTPWT(配列番号27)、QQYVNYPFT(配列番号28)、またはQQYTSYPFT(配列番号29)から選択される;
から選択される。
CDRH1が、アミノ酸配列DAWMD(配列番号2)であり;
CDRH2が、アミノ酸配列EIRHKANDHAIFYAESVKG(配列番号12)、EIRNKANNHARHYAESVKG(配列番号13)、EIRHKANDYAIFYDESVKG(配列番号14)、EIRHKANDHAIFYDESVKG(配列番号15)、DIRNTANNHATFYAESVKG(配列番号16)、またはEIRHKANDHAIFYDESVKG(配列番号17)であり;
CDRH3が、TYYYGSSYGYCDV(配列番号18)またはPFAY(配列番号5)である;
から選択され、かつこの軽鎖の相補性決定領域は、
CDRL1が、アミノ酸配列KASQSVGTTIV(配列番号19)、RTSENIYSYLA(配列番号20)、またはKASQNVGTAVV(配列番号21)から選択され;
CDRL2が、アミノ酸配列NAKTLAE(配列番号22)、SASNRHT(配列番号23)、SASTRYT(配列番号24)、またはSASNRYT(配列番号25)から選択され;
CDRL3が、アミノ酸配列QQYSSYPFT(配列番号26)、QHHYGTPWT(配列番号27)、QQYVNYPFT(配列番号28)、またはQQYTSYPFT(配列番号29)から選択される;
から選択される。
したがって、本発明の一実施形態において、6つのCDRを含んでなる単離したモノクローナル抗体を提供し、その中のCDRH1はDAWMD(配列番号2)であり、CDRH2はEIRNKANNHARHYAESVKG(配列番号13)であり、CDRH3はTYYYGSSYGYCDV(配列番号18)であり、CDRL1はRTSENIYSYLA(配列番号20)であり、CDRL2はNAKTLAE(配列番号22)であり、CDRL3はQHHYGTPWT(配列番号27)である。
本発明の別の実施形態において、6つのCDRを含んでなる単離したモノクローナル抗体を提供し、その中のCDRH1はDAWMD(配列番号2)であり、CDRH2はEIRHKANDHAIFYDESVKG(配列番号15)であり、CDRH3はPFAY(配列番号5)であり、CDRL1はKASQSVGTTIV(配列番号19)であり、CDRL2はSASNRHT(配列番号23)であり、CDRL3はQQYTSYPFT(配列番号29)である。
さらに別の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含んでなる重鎖ならびにCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含んでなる軽鎖を含んでなるモノクローナル抗体であり、その中の重鎖の相補性決定領域(CDR)は、以下から選択される:
CDRH1が、アミノ酸配列DAWMD(配列番号2)であり、配列番号2の全てのアミン酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている;
CDRH2が、アミノ酸配列EIRHKANDHAIFYAESVKG(配列番号12)、EIRNKANNHARHYAESVKG(配列番号13)、EIRHKANDYAIFYDESVKG(配列番号14)、EIRHKANDHAIFYDESVKG(配列番号15)、DIRNTANNHATFYAESVKG(配列番号16)、またはEIRHKANDHAIFYDESVKG(配列番号17)から選択され、配列番号12〜17の全てのアミノ酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている;
CDRH3が、TYYYGSSYGYCDV(配列番号18)またはPFAY(配列番号5)であり、配列番号18および配列番号5の全てのアミノ酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている;
ならびに、この軽鎖の相補性決定領域は、以下から選択される:
CDRL1が、アミノ酸配列KASQSVGTTIV(配列番号19)、RTSENIYSYLA(配列番号20)、またはKASQNVGTAVV(配列番号21)から選択され、配列番号19〜21の全てのアミノ酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている;
CDRL2が、アミノ酸配列NAKTLAE(配列番号22)、SASNRHT(配列番号23)、SASTRYT(配列番号24)、またはSASNRYT(配列番号25)から選択され、配列番号22〜25の全てのアミノ酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている;
CDRL3が、アミノ酸配列QQYSSYPFT(配列番号26)、QHHYGTPWT(配列番号27)、QQYVNYPFT(配列番号28)、またはQQYTSYPFT(配列番号29)から選択され、配列番号26〜29の全てのアミノ酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている。
CDRH1が、アミノ酸配列DAWMD(配列番号2)であり、配列番号2の全てのアミン酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている;
CDRH2が、アミノ酸配列EIRHKANDHAIFYAESVKG(配列番号12)、EIRNKANNHARHYAESVKG(配列番号13)、EIRHKANDYAIFYDESVKG(配列番号14)、EIRHKANDHAIFYDESVKG(配列番号15)、DIRNTANNHATFYAESVKG(配列番号16)、またはEIRHKANDHAIFYDESVKG(配列番号17)から選択され、配列番号12〜17の全てのアミノ酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている;
CDRH3が、TYYYGSSYGYCDV(配列番号18)またはPFAY(配列番号5)であり、配列番号18および配列番号5の全てのアミノ酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている;
ならびに、この軽鎖の相補性決定領域は、以下から選択される:
CDRL1が、アミノ酸配列KASQSVGTTIV(配列番号19)、RTSENIYSYLA(配列番号20)、またはKASQNVGTAVV(配列番号21)から選択され、配列番号19〜21の全てのアミノ酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている;
CDRL2が、アミノ酸配列NAKTLAE(配列番号22)、SASNRHT(配列番号23)、SASTRYT(配列番号24)、またはSASNRYT(配列番号25)から選択され、配列番号22〜25の全てのアミノ酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている;
CDRL3が、アミノ酸配列QQYSSYPFT(配列番号26)、QHHYGTPWT(配列番号27)、QQYVNYPFT(配列番号28)、またはQQYTSYPFT(配列番号29)から選択され、配列番号26〜29の全てのアミノ酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている。
特定の実施形態において、NAKTLAE(配列番号22)のThr4はロイシン、イソロイシンまたはメチオニンである。特定の実施形態において、QHHYGTPWT(配列番号27)のHis3はバリンである。特定の実施形態において、QHHYGTPWT(配列番号27)のGly5はトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、またはメチオニンである。特定の実施形態において、EIRNKANNHARHYAESVKG(配列番号13)のHis9はフェニルアラニンまたはチロシンである。特定の実施形態において、TYYYGSSYGYCDV(配列番号18)のSer6はフェニルアラニンまたはチロシンである。
CDRのL1、L2、L3、H1、およびH2は、構造的に、有限数の主鎖の構造のうちの1つを示す傾向がある。CDRの特定の標準構造クラスは、CDRの長さおよびループのパッキングの両方によって定義され、これらのCDRおよびこれらのフレームワーク領域(構造決定残基、すなわちSDR)の両方の中の重要な位置にある残基によって決定される。MartinおよびThornton(1996;J Mol Biol 263:800−815)は、「重要な残基」の標準的な鋳型を定義するための自動化法を作製している。クラスター分析を用いて、CDRセットの標準的なクラスを定義し、その後、標準的な鋳型を、埋もれている疎水性の水素結合残基、保存されているグリシンおよびプロリンを分析することによって同定する。抗体配列のCDRを、重要な残基の鋳型とこれらの配列を比較し、同一性または類似性の行列を用いて各鋳型をスコア化することにより、標準クラスに割り当てることができる。
本発明の範囲内のCDR標準の例を以下に示す。使用するアミノ酸の番号付けはカバットである。
配列番号144に記載のCDRH1またはその変異体の標準の例は以下である:
Ala32がIle、His、Tyr、Phe、Thr、Asn、Cys、GluまたはAspに置換されている;Trp33がTyr、Ala、Gly、Thr、LeuまたはValに置換されている;Met34がIle、ValまたはTrpに置換されている;Asp35がHis、Glu、Asn、Gln、Ser、TyrまたはThrに置換されている。
Ala32がIle、His、Tyr、Phe、Thr、Asn、Cys、GluまたはAspに置換されている;Trp33がTyr、Ala、Gly、Thr、LeuまたはValに置換されている;Met34がIle、ValまたはTrpに置換されている;Asp35がHis、Glu、Asn、Gln、Ser、TyrまたはThrに置換されている。
配列番号144に記載のCDRH2またはその変異体の標準の例は以下である:
Glu50がArgまたはGlnに置換されている;Ile51がLeu、Val、Thr、SerまたはAsnに置換されている。
Glu50がArgまたはGlnに置換されている;Ile51がLeu、Val、Thr、SerまたはAsnに置換されている。
配列番号144に記載のCDRH3またはその変異体の標準の例は以下である:
Tyr102がHis、Val、Ile、Ser、AspまたはGlyに置換されている。
Tyr102がHis、Val、Ile、Ser、AspまたはGlyに置換されている。
配列番号146に記載のCDRL1またはその変異体の標準の例は以下である:
Ser28がAsn、Asp、ThrまたはGluに置換されている;Val29がIleに置換されている;Gly30がAsp、Leu、Tyr、Val、Ile、Ser、Asn、Phe、HisまたはThrに置換されている;Thr31がSer、Asn、LysまたはGlyに置換されている;Thr32がPhe、Tyr、Asn、Ala、His、SerまたはArgに置換されている;Ile33がMet、Leu、ValまたはPheに置換されている;Val34がAla、Gly、Asn、Ser、HisまたはPheに置換されている。
Ser28がAsn、Asp、ThrまたはGluに置換されている;Val29がIleに置換されている;Gly30がAsp、Leu、Tyr、Val、Ile、Ser、Asn、Phe、HisまたはThrに置換されている;Thr31がSer、Asn、LysまたはGlyに置換されている;Thr32がPhe、Tyr、Asn、Ala、His、SerまたはArgに置換されている;Ile33がMet、Leu、ValまたはPheに置換されている;Val34がAla、Gly、Asn、Ser、HisまたはPheに置換されている。
配列番号144に記載のCDRL3またはその変異体の標準の例は以下である:
Gln89がSer、Gly、PheまたはLeuに置換されている;Gln90がAsnまたはHisに置換されている;Tyr91がAsn、Phe、Gly、Ser、Arg、Asp、His、ThrまたはValに置換されている;Thr92がAsn、Tyr、Trp、Ser、Arg、Gln、His、AlaまたはAspに置換されている;Ser93がGly、Asn、Thr、Arg、Glu、AlaまたはHisに置換されている;Tyr94がAsp、Thr、Val、Leu、His、Asn、Ile、Trp、ProまたはSerに置換されている;Phe96がPro、Leu、Tyr、Arg、IleまたはTrpに置換されている。
Gln89がSer、Gly、PheまたはLeuに置換されている;Gln90がAsnまたはHisに置換されている;Tyr91がAsn、Phe、Gly、Ser、Arg、Asp、His、ThrまたはValに置換されている;Thr92がAsn、Tyr、Trp、Ser、Arg、Gln、His、AlaまたはAspに置換されている;Ser93がGly、Asn、Thr、Arg、Glu、AlaまたはHisに置換されている;Tyr94がAsp、Thr、Val、Leu、His、Asn、Ile、Trp、ProまたはSerに置換されている;Phe96がPro、Leu、Tyr、Arg、IleまたはTrpに置換されている。
他の態様において、この抗原結合タンパク質は、Fab断片またはF(ab)2断片である。別の実施形態において、第1の免疫グロブリン可変ドメインは、一本鎖可変ドメインである。
本発明の一実施形態において、本明細書に記載の本発明による、定常ドメイン領域を含んでなる抗体を提供し、その結果、この抗体は、ADCCおよび/または補体活性化またはエフェクター機能性を減少させた。このような一実施形態において、この定常ドメインは、IgG2またはIgG4アイソタイプの天然の機能しない定常領域または変異IgGl定常ドメインを含み得る。適切な修飾の例は、ヨーロッパ特許EP0307434に記載されている。一例として、235位および237位(EUインデックス番号付け)のアラニン残基の置換が挙げられる。一実施形態において、このような抗体は、配列番号158の重鎖を含んでなる。
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号76、80、116、118、120、122、124、126、128、136、138、140、142、および144からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体VHドメインを含んでなる。
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号78、82、130、132、134、および146からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体VLドメインを含んでなる。
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号76、80、116、118、120、122、124、126、128、136、138、140、142、および144からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体VHドメイン、ならびに配列番号78、82、130、132、134、および146からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるVLドメインを含んでなる。
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号76含んでなる抗体VHドメインおよび配列番号78を含んでなるVLドメインを含んでなる。
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号80含んでなる抗体VHドメインおよび配列番号82を含んでなるVLドメインを含んでなる。
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号116、118、120、122、124、126、および128からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体VHドメイン、ならびに配列番号130、132、および134からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるVLドメインを含んでなる。
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号136、138、140、142、および144からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体VHドメイン、ならびに配列番号146を含んでなるVLドメインを含んでなる。
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号68、72、84、86、88、90、92、94、96、104、106、108、110、112、および158からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖を含んでなる。
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号70、74、98、100、102、および114からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる。
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号68、72、84、86、88、90、92、94、96、104、106、108、110、112、および158からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖、ならびに配列番号70、74、98、100、102、および114からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる。
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号68を含んでなる抗体重鎖および配列番号70を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる。
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号72を含んでなる抗体重鎖および配列番号74を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる。
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号84、86、88、90、92、94、および96からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖、ならびに配列番号98、100、および102からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる。
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号104、106、108、110、112、および158からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖、ならびに配列番号114を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる。
本発明の別の態様は、ADAMTS5への結合に対して、表3にまとめる抗体のいずれか1つと競合する抗体を含んでなる。これらには、抗体1G10.1C9、2D3.1D4、3A12.1D7、5F10.1H6、11F12.1D12、12F4.1H7、および7B4.1E11が含まれる。
さらに別の実施形態において、この抗原結合タンパク質は、第2の抗原に結合することができる第2の免疫グロブリン可変ドメインをさらに含んでなる。この第2の免疫グロブリン可変ドメインは、抗原結合ペプチドの投与の際に担体として機能を果たし得る抗原に結合することができる。例えば、この第2の免疫グロブリン可変ドメインは、ヒトの血清アルブミンまたはトランスフェリン(これらに限定されない)などの血液タンパク質に結合し得る。さらに、この第2の免疫グロブリン可変ドメインは、神経成長因子(NGF)、血管作動性腸管ペプチド(VIP)、および/もしくはTRPVlまたは他のバニロイド受容体(これらに限定されない)などの哺乳類の痛みの調節に関連する抗原に結合し得る。さらに、この第2の免疫グロブリン可変ドメインは、オンコスタチンM(OSM)、TNF−α、IL−6、TRPV4、RANKL、およびIL−1(これらに限定されない)などの炎症反応および/または自己免疫疾患に関連するサイトカインまたはサイトカイン受容体に結合し得る。この第2の抗原は、ADAMTS4および/もしくはADAMTS5(これらに限定されない)などの第2のアグリカナーゼ、ならびに/またはADAMTS5上の第2のエピトープ、ならびに/またはMMP−13(これに限定されない)などの多くのメタロプロテイナーゼにも結合し得る。
この第2の免疫グロブリン可変ドメインは、アグリカン、コラーゲンII、プロテオグリカンまたは軟骨に関連する他の分子にも結合し得る。本発明の一態様において、この第2の免疫グロブリン可変ドメインは、ADAMTS4、NGF、OSM、TNF−α、IL−6、VIP、TRPV1、TRPV4、ADAMTS1、アグリカン、コラーゲンII、RANKL、シンデカン4、ヘッジホッグ、および/またはIL−1からなる群から選択される抗原に結合する。
Delgado,et al.Nature Med.7,563−568は、VIP治療が、炎症誘発メディエーターの産生、ならびにメタロプロテイナーゼゼラチナーゼ(MMP−2)の発現を抑制すると報告している。MMP−2は、関節炎マウスの足の関節破壊に寄与すると考えられている。インビトロ試験は、間接的な作用もTh2サイトカインの産生の増強を経て仲介され得るが、VIPは滑膜細胞に直接作用し得ることを示している。それにもかかわらず、VIPは、CIAマウスモデルにおいて複数レベルで滑膜機能に影響を与えるように思われる。このペプチドはTh1機能を抑制するが、Th2機能を増大させ、おそらく免疫システムの「バランスを再びとる」。さらに、VIPは、マクロファージならびに滑膜細胞に直接的および間接的に影響を与え、IL−1、TNF−α、ケモカイン、および基質分解酵素の発現低下をもたらし、関節の完全性を保護する(Firestein Nature Medicine 7,537−538(2001))。
血管作動性腸管ペプチド(VIP)は、約20年前にリウマチ患者の滑液中で同定されており、本研究の目的は、VIPがOAの痛みの発生に関与し得るかどうかを検討することであった。後肢体重負荷は関節痛の方法として用いられるが、フォンフレイヘア(von Frey hair)疼痛計を、2次性の機械的痛覚過敏について試験する同側後肢の足底面に適用した。正常ラットの膝関節へのVIPの関節内注射は、反対側の注射していない後肢に対する体重負荷で重要な変化を引き起こし、かつ同じ側足引っ込め閾値の低下を引き起こした。これらの疼痛反応を、VPAC受容体アンタゴニストの同時投与によって阻止した。VIP活性を阻害するアンタゴニストは、OAの痛みの緩和に有効であると立証することができる(McDougall,et al.Pain 2006 Jul;123(1−2):98−105)。
神経成長因子(NGF)は同定された最初のニューロトロフィンであり、末梢神経および中枢神経の両方の発達および生存におけるその役割は十分に特徴づけられている。NGFは、末梢交感神経細胞および胚の感覚神経細胞の発達ならびに前脳基底部コリン作動性神経細胞の発達における重要な生存維持因子であることが示されている(Smeyne et al.,Nature 368:246−249(1994)およびCrowley et al.,Cell 76:1001−1011(1994))。NGFは感覚神経細胞における神経ペプチドの発現を上方制御し(Lindsay and Harmer,Nature 337:362−364(1989))、その活性は、2つの異なる膜結合受容体、すなわちTrkA受容体およびp75共通ニューロトロフィン受容体(それぞれ、「高親和性」NGF受容体および「低親和性」NGF受容体と呼ばれることもある)を介して媒介される(Chao et al.,Science 232:518−521(1986))。NGFについての概説として、Huang et al.,Annu.Rev.Neurosci.24:677−736(2001);Bibel et al.,Genes Dev.14:2919−2937(2000)を参照されたい。NGFおよびTrkA受容体と複合体を形成しているNGFの結晶構造が決定されている(Nature 254:411(1991);Nature 401:184−188(1996)参照)。
オンコスタチンMは、サイトカインのインターロイキン6(IL−6)ファミリーに属する28KDaの糖タンパク質であり、このIL−6ファミリーには、IL−6、白血病抑制因子(LIF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、カルジオトロフィン−1(CT−1)およびカルジオトロフィン−1様サイトカインが含まれ(Kishimoto T et al(1995)Blood 86:1243−1254)参照)、gp130膜貫通シグナル伝達受容体を共有する(Taga T and Kishimoto T(1997)Annu.Rev.Immunol.15:797−819参照)。OSMは、もともとメラノーマ細胞株A375の成長を阻害するその能力によって発見された(Malik Net al(1989)Mol Cell Biol 9:2847−2853)。その後、より多くの効果が発見され、それは、IL−6ファミリーの他のメンバーのような多機能メディエーターであることがわかった。OSMは、マクロファージ、活性化T細胞(Zarling JM(1986)PNAS(USA)83:9739−9743)参照)、多形核好中球(Grenier A et al(1999)Blood 93:1413−1421)参照)、好酸球(Tamura S et al(2002)Dev.Dyn.225:327−31)、樹状細胞(Suda T et al(2002)Cytokine 17:335−340)参照)を含んでなる様々な細胞型で産生される。OSMは、膵臓、腎臓、精巣、脾臓、胃、および脳(Znoyko I et al(2005)Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 283:182−186)参照)、ならびに骨髄(Psenak O et al(2003)Acta Haematol 109:68−75参照)でも発現している。その主要な生物学的効果には、内皮の活性化(Brown TJ et al(1993)Blood 82:33−7参照)、急性期反応の活性化(Benigni F et al(1996)Blood 87:1851−1854参照)、細胞の増殖または分化の誘導、炎症性メディエーターの放出、および造血の調節(Tanaka M et al(2003)102:3154−3162参照)、骨のリモデリング(de Hooge ASK(2002)Am J Pathol 160:1733−1743参照)、血管形成の促進(Vasse M et al(1999)Arterioscler Thromb Vasc Biol 19:1835−1842参照)、ならびに創傷治癒が含まれる。
腫瘍壊死因子−α(TNFα;カケクチンとも称される)として知られるサイトカインは、エンドトキシンまたは他の刺激に応答して、17kDタンパク質サブユニットの可溶性ホモ3量体として、主に単球およびマクロファージから分泌されるタンパク質である(Smith,R.A.et al.,J.Biol.Chem.262:6951−6954(1987))。TNFの膜結合26kD前駆体型についても記載されている(Kriegler,M.et al.,Cell 53:45−53(1988))。
TNFが多面的な生物学的活性を有する調節サイトカインであることを示す証拠が蓄積している。これらの活性には、リポタンパク質のリパーゼ合成の阻害(「カケクチン」活性)(Beutler,B.et al.,Nature 316:552(1985))、多形核白血球の活性化(Klebanoff,S.J.et al.,J.Immunol.136:4220(1986);Perussia,B.,et al.,J.Immunol.138:765(1987))、細胞増殖の阻害または細胞増殖の刺激(Vilcek,J.et al.,J.Exp.Med.163:632(1986);Sugarman,B.J.et al.,Science 230:943(1985);Lachman,L.B.et al.,J.Immunol.138:2913(1987))、特定の形質転換細胞型に対する細胞毒性作用(上述のLachman,L.B.et al.;Darzynkiewicz,Z.et al.,Canc.Res.44:83(1984))、抗ウイルス活性(Kohase,M.et al.,Cell 45:659(1986);Wong,G.H.W.et al.,Nature 323:819(1986))、骨吸収の刺激(Bertolini,D.R.et al.,Nature 319:516(1986);Saklatvala,J.,Nature 322:547(1986))、コラゲナーゼ、およびプロスタグランジンE2の産生の刺激(Dayer,J.−M.et al.,J.Exp.Med.162:2163(1985))、T細胞の活性化を含んでなる免疫調節作用(Yokota,S.et al.,J.Immunol.140:531(1988))、B細胞(Kehrl,J.H.et al.,J.Exp.Med.166:786(1987))、単球(Philip,R.et al.,Nature 323:86(1986))、胸腺細胞(Ranges,G.E.et al.,J.Exp.Med.167:1472(1988))、ならびに主要組織適合遺伝子複合体(MHC)のクラスI分子およびクラスII分子の細胞表面発現の刺激(Collins,T.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:446(1986);Pujol−Borrel,R.et al.,Nature 326:304(1987))が含まれる。
インターロイキン−6(IL−6)は、増殖刺激および炎症誘発活性を示す22〜27kDaの分泌糖タンパク質である。IL−6は、インターフェロン−β2(IFN−β2)、IL−1誘導性26−kDaタンパク質、肝細胞刺激因子、細胞独性T細胞分化因子、およびB細胞刺激因子としても知られる(Trikha et al.,Clin.Cancer Res.9:4653−4665(2003))。IL−6は種々な細胞型から分泌される。IL−6は、2種類の膜糖タンパク質からなる高親和性受容体複合体への結合を経てその活性を発揮し、その2種類の膜糖タンパク質は、低い親和性でIL−6に結合する80kDaの構成受容体、および単独ではIL−6には結合しないが、複合体によるIL−6の高親和性結合に必要である130kDaのシグナル伝達構成成分(gp130)である。IL−6Rを膜貫通メタロプロテイナーゼにより切断して、可溶性IL−6Rを得ることができる。
RANKはTNF受容体スーパーファミリーのメンバーであり、細胞外領域のCD40と最も厳密に似ている。CD40と同様に、(Rothe et al.,Cell 83:1243,1995に記載の共免疫沈降アッセイによって実質的に決定されるように)RANKは、TRAF2およびTRAF3と会合する。TRAFは、免疫反応および炎症反応の調節において非常に重要である。TNF受容体スーパーファミリーの様々なメンバーとの会合を経て、シグナルが細胞に伝達される。そのシグナルは、受容体(複数可)が誘発し、TRAF(複数可)がこの受容体(複数可)と会合することによって、細胞の増殖、分化またはアポトーシスをもたらし、異なるシグナルは、様々なシグナル伝達事象の協調により細胞に伝達され得る。したがって、このファミリーの一員を介して伝達されるシグナルは、この細胞に伝達される他のシグナルならびに/またはこの細胞の分化の状態に応じて、増殖性シグナル、分化のシグナルまたはアポトーシスシグナルであり得る。この増殖/アポトーシス経路のこのように絶妙な調節は、病原体からの保護を発展させ、維持するために必要であり、不均衡が自己免疫疾患をもたらし得る。
RANKは、上皮細胞、一部のB細胞株、および活性化T細胞上で発現する。しかし、活性化T細胞上でのその発現は、活性化の約4日後と遅い。発現のこの時間的経過は、アポトーシスの既知の作用因子であるFasの発現と一致する。RANKは、CD40が行うことを知られているように抗アポトーシスシグナルとしての機能を果たし、RANKを発現する細胞をアポトーシスから救出し得る。あるいは、RANKは、再びCD40と同じように、適切な状況下でアポトーシスシグナルを確認することができる。RANKおよびそのリガンドは、免疫反応および炎症反応の調節に不可欠な役割を果たしている可能性がある。
RANKLと呼ばれるリガンドは、約50個未満のアミノ酸の細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および約240〜250個のアミノ酸の細胞外ドメインを有する2型膜貫通タンパク質である。それが属するTNFファミリーの他のメンバーと同様に、RANKLは膜貫通ドメインと受容体結合に必要ではない受容体結合ドメインの間に「スペーサー」の領域を有する。したがって、RANKLの可溶型は、この受容体結合領域を含んでなる全細胞外ドメインまたはその断片を含み得る。
TRPV4チャネル受容体は、一過性の受容体電位チャネルのバニロイドファミリーの6つの既知のメンバーの1つであり、TRPV1とヌクレオチドレベルで51%の同一性を共有する。ヒトのTRPV4チャネル受容体を含んでなるヒトバニロイド受容体型をコードするポリペプチドおよびポリヌクレオチドの例は、ヨーロッパ特許EP1170365および国際特許WO00/32766の中で見つけることができる。他のファミリーメンバーと同様に、TRPV4チャネル受容体は、Ca2+透過性の、非選択的リガンド依存性陽イオンチャネル(ligand−gated cation channel)であり、浸透圧の低下、温度上昇、および小分子リガンドなどの様々な刺激に応答する(例えば、Voets,et al.,J.Biol.Chem.(2002)277 33704−47051;Watanabe,et al.,J.Biol.Chem.(2002)277:47044−47051;Watanabe,et al.,J.Biol.Chem.(2002)277:13569−47051;Xu,et al.,J.Biol.Chem.(2003)278:11520−11527参照)。体組織のスクリーニングから、ヒトTRPV4チャネル受容体が軟骨で最も顕著に発現している。1次細胞培養およびクローン細胞培養のスクリーニングは、軟骨細胞のみにおいて顕著に発現していることを示す。
このような応答は、共通のバニロイド部分を共有するカプサイシンの構造類似体によっても引き起こされる。このような類似体の1つは、レシニフェラトキシン(RTX)、ユーホルビアの植物の天然産物である。バニロイド受容体(VR)という用語は、カプサイシンおよびこのような関連する刺激性化合物の神経細胞膜の認識部位について記載するために作り出された。カプサイシン応答は、別のカプサイシン類似体のカプサゼピンによって競合阻害され(かつそれによって拮抗され)、非選択的陽イオンチャネル阻害薬であるルテニウムレッドによっても阻害される。これらのアンタゴニストは、わずか中程度の親和性(典型的には、140μM以上のKi値)でVRに結合する。
最近、ラットおよびヒトのカプサイシン受容体が、後根神経節細胞からクローニングされた。かかる受容体はVR1とも呼ばれており、「VR1」および「カプサイシン受容体」という用語は、この種のラットおよび/またはヒトの受容体、ならびに哺乳類ホモログを表すために本明細書中で互換的に使用される。痛覚におけるVR1の役割は、バニロイド誘発疼痛行動を示さず、熱と炎症に対する反応が損なっているこの受容体を欠損したマウスを用いて確認されている。このカプサイシン受容体は、温度上昇、低いpH、およびカプサイシン受容体アゴニストに反応して低下する、開口の閾値を有する非選択的陽イオンチャネルである。例えば、このチャネルは、通常、約45℃よりも高い温度で開口する。このカプサイシン受容体チャネルが開口すると、一般に、この受容体を発現する神経細胞および近くの他の神経細胞からの炎症性ペプチドの放出が続き、疼痛反応を増加する。カプサイシンによる初期の活性化後、このカプサイシン受容体は、cAMP依存性タンパク質キナーゼによるリン酸化により迅速な脱感作を受ける。
本発明の抗原結合タンパク質を、ヒトADAMTS5に対して約9.0×10−9M以下の解離定数によって特徴づけることができ、いくつかの場合において、それは、約2.5×10−10M以下である。ヒトADAMTS5などの標的に対する抗原結合タンパク質の親和性は、BIACOREまたはOctet(これらに限定されない)などの表面プラズモン共鳴によって測定することができる。BIAcore動態解析を用いて、ADAMTS5抗原に対する抗体またはその断片の結合定数および解離定数を決定することができる。BIAcore動態解析には、チップの表面上に抗体またはその断片を固定したチップからのADAMTS5抗原の結合および解離を解析することが含まれる(以下の実施例の欄参照)。
本発明は、ADAMTS5の少なくとも1つの活性を阻止する、かつ/または減少させる抗原結合タンパク質も提供する。いくつかの場合において、本発明の抗原結合タンパク質は、Glu373−Ala374切断部位におけるADAMTS5によるアグリカンの切断を阻止する、かつ/または減少させる。いくつかの態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、非関節投与経路によって投与される時でも、軟骨を透過することができる。例えば、本発明の抗原結合タンパク質は、静脈内投与、筋肉内投与、関節内投与、皮下投与、経口投与、鼻腔内投与、および/または腹腔投与により投与されてもよい。
本発明の抗原結合タンパク質をコードする単離したポリヌクレオチドも本発明の中で提供する。
一実施形態において、この単離したポリヌクレオチドは、配列番号76、80、116、118、120、122、124、126、128、136、138、140、142、および144からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体VHドメインを含んでなる抗原結合タンパク質またはその断片をコードする。一実施形態において、この単離したポリヌクレオチドは、配列番号75、79、115、117、119、121、123、125、127、135、137、139、141、143、および159からなる群から選択される。一実施形態において、このポリペプチドは、配列番号75、79、115、117、119、121、123、125、127、135、137、139、141、143、および159からなる群から選択されるポリヌクレオチドを発現する細胞から産生される抗体である。
一実施形態において、この単離したポリヌクレオチドは、配列番号78、82、130、132、134、および146からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体VLドメインを含んでなる抗原結合タンパク質またはその断片をコードする。一実施形態において、この単離したポリヌクレオチドは、配列番号77、81、129、131、133、および145からなる群から選択される。一実施形態において、このポリペプチドは、配列番号77、81、129、131、133、および145からなる群から選択されるポリヌクレオチドを発現する細胞から産生される抗体である。
一実施形態において、この単離したポリヌクレオチドは、配列番号68、72、84、86、88、90、92、94、96、104、106、108、110、112、および158からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖を含んでなる抗原結合タンパク質またはその断片をコードする。一実施形態において、この単離したポリヌクレオチドは、配列番号67、71、83、85、87、89、91、93、95、103、105、107、109、111、および159からなる群から選択される。一実施形態において、このポリペプチドは、配列番号67、71、83、85、87、89、91、93、95、103、105、107、109、111、および159からなる群から選択されるポリヌクレオチドを発現する細胞から産生される抗体である。
一実施形態において、この単離したポリヌクレオチドは、配列番号70、74、98、100、102、および114からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる抗原結合タンパク質またはその断片をコードする。一実施形態において、この単離したポリヌクレオチドは、配列番号69、73、97、99、101、および115からなる群から選択される。一実施形態において、このポリペプチドは、配列番号69、73、97、99、101、および115からなる群から選択されるポリヌクレオチドを発現する細胞から産生される抗体である。
本発明の抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞および前記宿主細胞でこの抗原結合タンパク質を発現させる方法も提供する。さらに、本発明の抗原結合タンパク質を作製する方法を提供する。
本発明のベクター、宿主細胞、および抗体を作製する方法には、宿主細胞における複製および発現、ならびに/または宿主細胞からの分泌を制御することができる従来の調節制御配列と、この抗体のコード配列とを作動可能に結合させることによって作製される従来の発現ベクターまたは組換えプラスミドを用いることが含まれる。調節配列には、プロモーター配列、例えば、CMVプロモーター、および他の既知の抗体に由来し得るシグナル配列が含まれる。同様に、相補的な抗体軽鎖または重鎖をコードするDNA配列を有する第2の発現ベクターを作製することができる。好ましくは、この第2の発現ベクターは、できるだけ各ポリペプチド鎖が機能的に発現することを保証するために、コード配列および選択マーカーに関する限りを除いて第1の発現ベクターと同一である。あるいは、改変抗体の配列をコードする重鎖および軽鎖は、単一ベクター上に存在してもよい。
選択される宿主細胞を、従来の技術により、第1および第2のベクターの両方でコトランスフェクト(または、単一ベクターでトランスフェクト)して、組換えもしくは合成の軽鎖および重鎖の両方を含んでなる本発明のトランスフェクト宿主細胞を作る。その後、このトランスフェクト細胞を従来の技術により培養し、本発明の遺伝子工学処理した抗体を産生する。組換え重鎖および/または軽鎖の両方の会合を含んでなる抗体を、ELISAまたはRIAなどの適切なアッセイによって培養物からスクリーニングする。同様の従来の技術を使用して、他の改変抗体および改変分子を構築してもよい。
本発明の方法および組成物の構築に使用されるクローニングステップおよびサブクローニングステップに適切なベクターは、当該技術者によって選択され得る。例えば、従来のpUCシリーズのクローニングベクターを用いてもよい。1つのベクター、pUC19は、アマシャム社(バッキンガムシャー州、英国)またはファルマシア社(ウプサラ、スウェーデン)などの供給メーカーから市販されている。さらに、容易に複製でき、多数のクローニング部位および選択遺伝子(例えば、抗生物質耐性)を有し、容易に操作できる任意のベクターをクローニングに用いてもよい。したがって、このクローニングベクターの選択は、本発明の制限要素ではない。
同様に、当該技術者が、抗体の発現に使用するベクターを任意の従来のベクターから選択してもよい。これらのベクターは、選択された宿主細胞における異種DNA配列の複製および発現を指示する(CMVプロモーターまたはRSVプロモーターなどの)選択された調節配列も含んでなる。これらのベクターは、この抗体または改変免疫グロブリンコード領域をコードする上記に記載のDNA配列を含んでなる。さらに、これらのベクターに、素早い操作で、所望の制限部位を挿入することによって改変し、選択した免疫グロブリン配列を組み込んでもよい。
発現ベクターは、異種DNA配列、例えば、哺乳類のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(DHFR)の発現を増幅するのに適した遺伝子によっても特徴付けられ得る。他の好ましいベクター配列には、ウシ成長ホルモン(BGH)などに由来するポリAシグナル配列およびβグロビンのプロモーター配列(betaglopro)が含まれる。本明細書で有用な発現ベクターは、当該技術者に公知の技術によって合成されてもよい。
このようなベクターの構成要素、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、およびシグナル配列などは、商業的または天然の供給源から入手するか、または選択宿主における組換えDNA産物の発現および/または分泌を指示するのに使用する公知の手順により合成してもよい。当該技術分野で公知である、哺乳類、細菌、昆虫、酵母、および真菌での発現のための多数の種類のうちの他の適切な発現ベクターも、この目的のために選択されてもよい。
本発明は、これらの抗体またはその改変された免疫グロブリン分子のコード配列を含んでなる組換えプラスミドでトランスフェクトした細胞株も包含する。これらのクローニングベクターのクローニングおよび他の操作に有用な宿主細胞も従来のものである。しかし、最も望ましくは、大腸菌の種々の菌株の細胞を、本発明の改変抗体の構築におけるクローニングベクターの複製および他のステップに用いる。
本発明の抗体の発現に適した宿主細胞または細胞株は、好ましくは、NS0、Sp2/0、CHO(例えば、DG44)、COS、線維芽細胞(例えば、3T3)、および骨髄腫細胞などの哺乳類細胞であり、より好ましくは、CHOまたは骨髄腫細胞である。ヒト細胞を用いてもよいので、この分子をヒトのグリコシル化パターンで修飾することが可能になる。あるいは、他の真核生物の細胞株を使用してもよい。適切な哺乳類宿主細胞ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物生成、および精製のための方法の選択は、当該技術分野で公知である(例えば、上記で引用したSambrook et al参照)。
細菌細胞が、本発明の組換えFabの発現に適した宿主細胞として有用であると判明し得る(例えば、Pluckthun,A.,Immunol.Rev.,130:151−188(1992)参照)。しかし、細菌細胞内で発現したタンパク質の傾向が折り畳まれていない形態か、不適切に折り畳まれた形態か、または非グリコシル化形態であるため、細菌の細胞内で産生された組換えFabは、抗原結合能の保持についてスクリーニングされなければならない。細菌細胞が発現した分子が正しく折り畳まれた形態で産生された場合は、その細菌細胞は望ましい宿主であろう。例えば、発現に用いられる大腸菌の様々な菌株は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞として公知である。枯草菌、放線菌、および他の桿菌などの様々な菌株も、本方法で使用されてもよい。
望まれる場合、当該技術者に公知の酵母細胞株、ならびに昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ、鱗翅目、およびウイルスの発現システムも、宿主細胞として利用可能である(例えば、Miller et al.,Genetic Engineering,8:277−298,Plenum Press(1986)および本明細書で引用する参考文献参照)。
これらのベクターを構築することができる一般的な方法、本発明の宿主細胞を産生するのに必要とされるトランスフェクション法、およびこのような宿主細胞から本発明の抗体を産生するのに必要な培養方法は全て従来技術である。典型的には、本発明の培養方法は、通常、無血清な懸濁液中で細胞を培養することによる無血清培養法である。同様に、産生した時点で、本発明の抗体を、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、およびゲル電気泳動などを含んでなる当該技術分野の標準的な手順に従って細胞培養内容物から精製してもよい。このような技術は、当該技術者の技量の範囲内であり、本発明を限定するものではない。例えば、改変抗体の調製は国際特許WO99/58679およびWO96/16990に記載されている。
抗体の発現のさらに別の方法は、米国特許第4,873,316号などに記載されているトランスジェニック動物における発現を利用してもよい。これは動物のカゼインプロモーターを用いる発現系に関し、そのカゼインプロモーターが哺乳類にトランスジェニック技術で組込まれた場合、そのメスはそのミルク中に所望の組換えタンパク質を産生することが可能になる。
本発明のさらなる態様において、本発明の抗体を産生する方法を提供し、その方法は、本発明の抗体の軽鎖および/または重鎖をコードするベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を培養するステップおよびそれによって産生した抗体を回収するステップを含んでなる。
一態様において、本発明は、触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインの両方に同時に結合する分子を提供することによって、ADAMおよびADAMTS活性を阻害する方法を提供する。特定の実施形態において、このADAMTSは、ADAMTS4またはADAMTS5である。ADAMTS5ならびにADAMTS5mAbの12F4.1H7および7B4.1E11について別々の結晶構造を用いるインシリコの構造「最良適合」コンピューターモデルは、ADAMTS5の触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインの両方の間での同時抗体/抗原相互作用を示唆する。ADAMプロテアーゼおよびADAMTSプロテアーゼの触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインは、これらのドメイン間に可動性を与えるヒンジ領域で分離されており、このヒンジ領域は機能を調節するか、またはこの触媒部位への基質局在化を可能にするように作用し得る。エピトープに及ぶこのドメインで観察される高親和性mAb結合は、ADAMTS5の触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインを共に固定するように思われ、それによって酵素活性を中和する。一実施形態において、この分子は、ディスインテグリンドメインおよび触媒ドメインの両方に同時に結合する抗体である。別の実施形態において、この分子は、本発明の抗体または抗体断片である。別の実施形態において、本発明は、AMAMTS5の酵素活性を中和する抗体に関係し、その中で、この抗体は、BiaCoreまたはOctet QKによって測定した時、約1×10−9または2×10−10未満のKDで触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインに同時に結合する。
本発明の別の実施態様において、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の少なくとも1つを含んでなる医薬組成物を提供する。本発明は、ヒトにおける少なくとも1つのADAMTS5活性を減少させる薬剤の製造において、ADAMTS5に対する少なくとも1つの抗原結合タンパク質の使用も提供する。本発明は、ヒトにおける少なくとも1つのADAMTS5活性を減少させるために、ADAMTS5に対する少なくとも1つの抗原結合タンパク質の使用を提供し、それは、ADAMTS5に対する少なくとも1つの抗原結合タンパク質を含んでなる組成物を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる。
本発明の医薬組成物は、さらに、第2の抗原結合タンパク質を含んでもよい。いくつかの場合において、この第2の抗原結合タンパク質はモノクローナル抗体であってもよい。一実施形態において、この第2のモノクローナル抗体は、ADAMTS4、ADAMTS5、NGF、OSM、TNF−α、IL−6、VIP、TRPV1、TRPV4、ADAMTS1、アグリカン、コラーゲンII、RANKL、および/またはIL−1の群から選択される少なくとも1つの抗原に結合する。例として、本発明の医薬組成物は、ADAMTS5に対するモノクローナル抗体およびADAMTS5にも結合し得る第2のモノクローナル抗体であり得る第1の抗原結合タンパク質を含み得る。別の例として、本発明の医薬組成物は、ADAMTS5に結合するモノクローナル抗体である第1の抗原結合タンパク質、ならびに以下のADAMTS4、NGF、OSM、TNF−α、IL−6、VIP、TRPV1、TRPV4、ADAMTS1、アグリカン、コラーゲンII、RANKL、および/またはIL−1のうちの1つに結合するモノクローナル抗体である第2の抗原結合タンパク質を含み得る。
本発明の医薬組成物の少なくとも一回用量(one dose)を投与することを含んでなる、治療を必要としている患者を治療する方法も提供する。いくつかの態様において、この患者は、軟骨の疾患を患っている。患者は、癌、疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、術後の疼痛、変形性関節症、スポーツ外傷、びらん性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライム関節炎、若年性関節炎、強直性脊椎症、神経痛、神経障害、痛覚、神経損傷、虚血、神経変性、炎症性疾患、軟骨変性、咽頭、気管、耳管、椎間板、靱帯、腱、関節包、または骨の発達に影響を与える疾患、椎間板変性、骨減少症、または歯周病、急性関節損傷、および/または関節破壊に関連する疾患の群から選択される1つ以上の疾患を患っている可能性がある。いくつかの場合において、この患者は変形性関節症を患っている。
別の実施形態において、前記医薬組成物の少なくとも一回用量を投与することで、前記患者における軟骨分解が減少する。別の実施形態において、前記医薬組成物の少なくとも一回用量を投与することで、前記患者におけるアグリカン切断が阻害され、かつ/または減少する。
本明細書に記載の方法および使用によって産生および処方され、軟骨分解に関連する疾患を治療するか、または症状を緩和することができる医薬組成物も本明細書に提供する。本発明は、単独で投与するか、または少なくとも1種類のステロイドおよび/または鎮痛剤を含んでなるがそれらに限定されない少なくとも1つの他の治療薬と組み合わせて投与するための、軟骨の疾患の治療に使用するADAMTS5抗体を提供する。本発明の抗原結合タンパク質は、同じ用量でまたは別々に他の治療薬と同時投与することができる。本発明は、本明細書に記載の方法および使用の全てのためのADAMTS5抗体またはその断片も提供する。
本明細書で使用する「患者」は、ヒトまたは他の動物を表す。
本明細書で使用する「治療」は、(1)治療される病状または治療される病状の生物学的徴候の1つ以上の改善もしくは予防、(2)(a)治療される病状につながるか、もしくは関与する生物学的カスケードの1つ以上のポイント、または(b)治療される病状の生物学的徴候の1つ以上との干渉、または(3)治療される病状に関連する症状もしくは効果の1つ以上の緩和を意味する。当該技術者は、「予防」が絶対的な言葉ではないことを理解するであろう。医学において、「予防」は、病状もしくはその生物学的徴候の可能性または重症度を実質的に軽減させるか、またはそのような病状もしくはその生物学的徴候の発症を遅らせる薬剤の予防投与を表すと理解されている。
本明細書で使用する、「安全な有効量」とは、健全な医学的判断の範囲内で治療される病状の肯定的な変更を顕著に誘導するのに十分であるが、重篤な副作用を(妥当な利点/リスク比で)避けるのに十分低い少なくとも1つの抗原結合タンパク質の量を意味する。本発明の少なくとも1つの抗原結合タンパク質の安全な有効量は、(例えば、この化合物の効力、有効性、および半減期を考慮して)選択される特定の化合物、選択される投与経路、治療される病状、治療される病状の重症度、治療される患者の年齢、サイズ、体重、および健康状態、治療される患者の病歴、治療期間、併用療法の性質、および所望の治療効果などの要因により変化するであろうが、それでも日常的に当該技術者によって決定され得る。
本発明の抗原結合タンパク質は、全身投与と局所投与の両方を含んでなる任意の適切な投与経路によって投与され得る。全身投与には、経口投与、非経口投与、経皮投与、直腸投与、および吸入による投与が含まれる。非経口投与は、経腸投与、経皮投与、または吸入以外の投与経路を表し、典型的には注射または点滴による。非経口投与には、静脈内投与、筋肉内投与、および皮下注射または点滴、関節内投与が含まれる。吸入は、口から吸入しようが、鼻腔から吸入しようが、患者の肺への投与を表す。局所投与には、皮膚への塗布、ならびに眼内投与、耳内投与、膣内投与、および鼻腔内投与が含まれる。
本発明の抗原結合タンパク質は、1回だけまたは投与計画に従って投与されてもよく、その投与計画の中で、複数の用量が一定の期間中様々な時間間隔で投与される。例えば、用量は、1日あたり1、2、3、または4回投与され得る。用量は、所望の治療効果が達成されるまで、または所望の治療効果を維持するために無期限に投与され得る。本発明の抗原結合タンパク質に適した投与計画は、吸収、分布、および半減期などのその化合物の薬物動態学的特性によって決まり、当該技術者が決定することができる。さらに、このような療法が管理される機関を含んでなる、本発明の化合物に適した投与計画は、当該技術者の知識および専門知識内の治療される病状、治療される病状の重症度、治療される患者の年齢、および健康状態、治療される患者の病歴、併用療法の性質、所望の治療効果などの要因によって決まる。適切な投与計画が、個々の患者がこの投与計画へ反応するように施される調節または時間と共に個々の患者が変化を必要とするような調節を必要とし得ることを、かかる当該技術者はさらに理解するであろう。
特定の実施形態において、この抗体を用いて、軟骨に薬物を送達する。このような薬剤は、アグリカナーゼ阻害剤、抗炎症薬、ステロイドまたは疼痛管理に関連する薬物であり得る。したがって、一態様において、本発明は薬物を軟骨に送達する方法であり、本発明の抗体に薬物を裏打ちすることを含んでなる方法である。このような送達は、インビトロ、エキソビボ、またはインビボで行われ得る。
別の実施形態において、この抗体を用いて軟骨に成長因子を送達し、これは、新しい軟骨の成長を促進する。このような成長因子には、骨形成タンパク質、特に、BMP−7が含まれる。このような送達は、インビトロ、エキソビボ、またはインビボで行われ得る。
以下の実施例は、本発明の様々な態様を説明する。
実施例1−ヒトADAMTS4およびヒトADAMTS5に対するMabの産生
ヒトADAMTS5タンパク質およびヒトADAMTS4タンパク質を、トランスフェクトしたCHO細胞および/またはBacMamにより形質転換したHEK293細胞内で産生し、従来のクロマトグラフィー法により単離した。
ヒトADAMTS5タンパク質およびヒトADAMTS4タンパク質を、トランスフェクトしたCHO細胞および/またはBacMamにより形質転換したHEK293細胞内で産生し、従来のクロマトグラフィー法により単離した。
SJLマウスを、精製したADAMTS4(完全長)およびADAMTS5(切断型、完全長、Catドメイン、Cat/disドメイン)で共免疫化した。免疫原生を、一連の出血の血清で試験した。
脾細胞およびリンパ節を単離し、P3X63/Ag8.653由来の融合パートナーを用いてマウス骨髄腫細胞と融合させた。不死化抗体産生細胞を作製した。HAT選択を用いて、融合していない骨髄腫細胞を除外した。
活性培養物から得られたハイブリドーマの上清を、組換えヒトADAMTS5およびADAMTS4の特異的結合および中和についてスクリーニングした。ヒットを、限界希釈または半固体培地での増殖のいずれか一方によって同定、確認およびクローニングし、単一クローンにした。
所望の特性を有するモノクローナル抗体を、液体培養でスケールアップし、この抗体を標準的なクロマトグラフィー法により精製した。その後、得られた精製抗体クローンを、結合親和性と機能的効力についてさらに特徴づけた。
実施例2−マウス抗体の特徴づけ
ADAMTS5mAbを、インビトロアグリカン基質切断アッセイを用いて、中和力価について特徴づけた(表1)。ADAMTS5mAbを、Octet QK(表1)およびBiaCore(同程度だが図示せず)の両方の科学技術を用いて親和性について特徴づけた。抗体も、celTRFおよびOctet QKによってヒトADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS13、MMP1、MMP3、MMP9およびMMP13に対する交差反応について試験し、それらの全ては陰性であった(図示せず)。全てのmAb、マウス、イヌ、およびカニクイザルのADAMTS5に対する結合および中和によるオルソログ交差反応についても評価した(表1)。ラットADAMTS5に対する結合も検出された(図示せず)。Octet QKにおける抗ヒトADAMTS5mAbのマウス型およびキメラ型の親和性比較を表2にまとめる。
ADAMTS5mAbを、インビトロアグリカン基質切断アッセイを用いて、中和力価について特徴づけた(表1)。ADAMTS5mAbを、Octet QK(表1)およびBiaCore(同程度だが図示せず)の両方の科学技術を用いて親和性について特徴づけた。抗体も、celTRFおよびOctet QKによってヒトADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS13、MMP1、MMP3、MMP9およびMMP13に対する交差反応について試験し、それらの全ては陰性であった(図示せず)。全てのmAb、マウス、イヌ、およびカニクイザルのADAMTS5に対する結合および中和によるオルソログ交差反応についても評価した(表1)。ラットADAMTS5に対する結合も検出された(図示せず)。Octet QKにおける抗ヒトADAMTS5mAbのマウス型およびキメラ型の親和性比較を表2にまとめる。
実施例3−配列
実施例2で同定した特徴に基づいて、6個のモノクローナル抗体を同定した。これらの抗体の可変領域の配列決定を行った。アラインメントを以下に示す(表3)。コンセンサス(大多数)の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、以下の配列番号30および31に示す。12F4.1H7、1G10.1C9、2D3.1D4、3A12.1D7、5F10.1H6、および7B4.1E11と命名するmAbの重鎖可変領域を、それぞれ、配列番号32〜37に示し、それぞれ配列番号147、157、151、153、155、および149がコードする。2D3.1D4、3A12.1D7、5F10.1H6、7B4.1E11、および12F4.1H7と命名するmAbの軽鎖可変領域を、それぞれ、配列番号38〜42に示し、それぞれ、配列番号152、154、156、150、および148がコードする。
実施例2で同定した特徴に基づいて、6個のモノクローナル抗体を同定した。これらの抗体の可変領域の配列決定を行った。アラインメントを以下に示す(表3)。コンセンサス(大多数)の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、以下の配列番号30および31に示す。12F4.1H7、1G10.1C9、2D3.1D4、3A12.1D7、5F10.1H6、および7B4.1E11と命名するmAbの重鎖可変領域を、それぞれ、配列番号32〜37に示し、それぞれ配列番号147、157、151、153、155、および149がコードする。2D3.1D4、3A12.1D7、5F10.1H6、7B4.1E11、および12F4.1H7と命名するmAbの軽鎖可変領域を、それぞれ、配列番号38〜42に示し、それぞれ、配列番号152、154、156、150、および148がコードする。
実施例4−ヒトOA軟骨外植片
ドナーのヒトOA軟骨を膝の置換手術から得た。軟骨を骨から処理し、直径3mmのディスクに切断した。ディスクを任意抽出し、96ウェルプレートで培養した。これらの組織中の内因性疾患因子が、エキソビボでの軟骨分解の進行を可能にした。試料を、以下の調和させた対照IgGアイソタイプ、(7B4.1E11および12F4.1H7と命名し)選択した抗ADAMTS5抗体、(7E8.1E3と命名し)選択した抗ADAMTS4抗体、または以下のGSK571949(CAS番号329040−94−0)などの既知のアグリカナーゼ/MMP阻害剤で処理した。各処理条件を、各ドナープレート上で8回試験した。ARGSVIL(配列番号1)ネオエピトープ放出の阻害を、実験の過程の間の多数の時点で各試料について測定した。
ドナーのヒトOA軟骨を膝の置換手術から得た。軟骨を骨から処理し、直径3mmのディスクに切断した。ディスクを任意抽出し、96ウェルプレートで培養した。これらの組織中の内因性疾患因子が、エキソビボでの軟骨分解の進行を可能にした。試料を、以下の調和させた対照IgGアイソタイプ、(7B4.1E11および12F4.1H7と命名し)選択した抗ADAMTS5抗体、(7E8.1E3と命名し)選択した抗ADAMTS4抗体、または以下のGSK571949(CAS番号329040−94−0)などの既知のアグリカナーゼ/MMP阻害剤で処理した。各処理条件を、各ドナープレート上で8回試験した。ARGSVIL(配列番号1)ネオエピトープ放出の阻害を、実験の過程の間の多数の時点で各試料について測定した。
以前に記載したとおり、典型的には、アグリカナーゼによるアグリカンの切断は、アグリカンの球間ドメイン内の保存領域で起こる。酵素切断は、アグリカンのN末端アミノ酸配列(ARGSVIL)を有するネオエピトープを含んでなる遊離断片を産生する。この切断ネオエピトープを、この切断型に特異的に結合するが、インタクトなアグリカンには結合しないモノクローナル抗体を用いて検出および定量化することができる。ADAMTS5抗体およびADAMTS5阻害剤の両方は、対照およびADAMTS4抗体よりも、ARGSVIL放出を著しく阻害することを示した。ARGSVIL放出の阻害率(%)のまとめを図1に示す。これらの結果は、ADAMTS5特異的mAbが、小分子アッセイの対照化合物と比較して、2〜3週間の評価期間中に約70%の割合で分解を阻害することができることを示す。これらの結果は、多くの個々のドナー試料内でおよび個々のドナー試料の全てで一貫している。
実施例5−ヒトOA軟骨外植片におけるADAMTS5抗体用量反応
ARGSVIL放出の阻害率(%)を、選択した抗ADAMTS5抗体の用量反応について実施例4に記載したとおりに試験した(図2参照)。マウス抗体7B4.1E11を、以下の用量:1340n、670nM、335nM、81.25nMで試験した。対照アグリカナーゼ/MMP阻害剤も用いた。ARGSVIL放出率(%)は、抗ADAMTS5の最高用量において最低であり、低用量で治療した際に減少した。調和させたアイソタイプ対照抗体の治療用量(図示せず)を用いて0%阻害を決定し、単一有効量のGSK571949を用いて100%阻害を計算した。このmAb治療は、670nMの用量で最大効果に達するように思える用量反応を示す(図2)。しかし、670nMの用量ポイントでドナーが多く(n=22)示されたが、他の用量ではドナーは少ない(n≦5)ことは留意すべきである。
ARGSVIL放出の阻害率(%)を、選択した抗ADAMTS5抗体の用量反応について実施例4に記載したとおりに試験した(図2参照)。マウス抗体7B4.1E11を、以下の用量:1340n、670nM、335nM、81.25nMで試験した。対照アグリカナーゼ/MMP阻害剤も用いた。ARGSVIL放出率(%)は、抗ADAMTS5の最高用量において最低であり、低用量で治療した際に減少した。調和させたアイソタイプ対照抗体の治療用量(図示せず)を用いて0%阻害を決定し、単一有効量のGSK571949を用いて100%阻害を計算した。このmAb治療は、670nMの用量で最大効果に達するように思える用量反応を示す(図2)。しかし、670nMの用量ポイントでドナーが多く(n=22)示されたが、他の用量ではドナーは少ない(n≦5)ことは留意すべきである。
実施例6−DMMのインビボ研究
抗ADAMTS5抗体の有効性を評価するために、不安定化内側半月(DMM)モデルを用いて、OAをマウスにおいて誘導した。2つの別々の実験を示す。DMM手術の3日前に、マウスを以下の抗体:抗ADAMTS5(7B4.1E11)、抗ADAMTS5(12F4.1H7)、またはIgGアイソタイプのうちの1つを0.5mg/用量で投与した。対照群には、DMM手術で処理していないマウス、偽手術を行ったマウス、および正常マウスが含まれた。投与後6日目に、マウスを屠殺し、盲目の研究者が病理組織診断を行い、そこから、関節スコアを評価した各マウスの膝に与えた。抗ADAMTS5抗体は、IgG1アイソタイプ対照と比較して、著しく良好な平均関節スコアを示した。さらに、偽手術した膝および正常な膝の平均関節スコアは、未処理の膝およびIgGアイソタイプと比較して、著しく良好であった。
抗ADAMTS5抗体の有効性を評価するために、不安定化内側半月(DMM)モデルを用いて、OAをマウスにおいて誘導した。2つの別々の実験を示す。DMM手術の3日前に、マウスを以下の抗体:抗ADAMTS5(7B4.1E11)、抗ADAMTS5(12F4.1H7)、またはIgGアイソタイプのうちの1つを0.5mg/用量で投与した。対照群には、DMM手術で処理していないマウス、偽手術を行ったマウス、および正常マウスが含まれた。投与後6日目に、マウスを屠殺し、盲目の研究者が病理組織診断を行い、そこから、関節スコアを評価した各マウスの膝に与えた。抗ADAMTS5抗体は、IgG1アイソタイプ対照と比較して、著しく良好な平均関節スコアを示した。さらに、偽手術した膝および正常な膝の平均関節スコアは、未処理の膝およびIgGアイソタイプと比較して、著しく良好であった。
実施例7−モノクローナル抗体は、インビトロおよびインビボで軟骨を透過する。
治療抗体が組織を透過し、疾患部位に到達する能力およびそれらの特異的標的は、有効性にとって重要である。アグリカナーゼは、分泌タンパク質として分類されるが、軟骨基質内の軟骨細胞の細胞周囲の領域に優先的に局在することが示されている。そのために、治療mAbがアグリカナーゼの標的に到達するためには、軟骨基質を透過する必要性があり得る。
治療抗体が組織を透過し、疾患部位に到達する能力およびそれらの特異的標的は、有効性にとって重要である。アグリカナーゼは、分泌タンパク質として分類されるが、軟骨基質内の軟骨細胞の細胞周囲の領域に優先的に局在することが示されている。そのために、治療mAbがアグリカナーゼの標的に到達するためには、軟骨基質を透過する必要性があり得る。
初めに、mAbのヒト軟骨を透過する能力の評価を、選択した抗ADAMTS5mAbを含んでなる、複数の特異性を有するmAbを用いて、エキソビボ組織で行った。膝関節置換手術標本から、軟骨下骨を通って滑膜表面に及ぶ全層の軟骨プラグを、規定した期間、軟骨細胞または非特異的アイソタイプ対照の表面上に位置するヒトタンパク質に対して特異性を有するマウスモノクローナル抗体の存在下で組織培養した。各時点の終わりに、組織を全層評価のために処理し、切片を作り、FITC標識抗マウス検出抗体を用いて染色した。透過を、軟骨組織内の軟骨細胞染色の色の濃さと強度によって定義する。標的特異性に関係なく、mAb透過は主に軟骨の滑膜表面に由来し、濃度に依存して3〜4日以内に全層透過に進む濃度依存的および時間依存的なプロセスであることが観察された(図示せず)。アイソタイプ対照mAbで処理した軟骨プラグについての染色は観察されなかった(図示せず)。
軟骨透過のin vivo評価を、ADAMTS4、ADAMTS5、およびアイソタイプ対照に対する選択的mAbを含んでなる、近赤外(NIR)色素標識モノクローナル抗体を用いて行った。NIR標識mAbを、6週間前に変形性関節症の外科的誘導(DMM)を受けたマウスに全身(腹腔内)投与(0.5mg用量)した。mAbの体内分布を、Licor Odysseyシステムを用いて、投与後の多数の時点において動物の全体で監視した。mAb投与後4日目に、マウスを屠殺し、膝関節の画像化をOdysseyで行った。その後、NIR検出用のフィルタおよびカメラを備えた顕微鏡での高解像度解析のために、膝関節を処理し、切片を作った。mAbの全身投与後4日以内に、全層の軟骨透過を抗ADAMTS5mAbおよび抗ADAMTS4mAbでは観察することができたが、特異的な染色は、アイソタイプ対照mAbでは観察されなかった(図示せず)。特徴的な細胞周囲の軟骨細胞染色パターンは、ADAMTS5およびADAMTS4に特異的なmAbでは観察された(図示せず)。
実施例8−抗体のヒト化−ハイブリドーマ可変領域のクローニング
全RNAを、7B4.1E11および12F4.1H7のハイブリドーマ細胞から抽出し、その後、重鎖および軽鎖の可変ドメインcDNA配列を、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって作製した。RT−PCRのフォワードプライマーは、マウス免疫グロブリン遺伝子リーダー配列に特異的な縮重プライマーの混合物であり、リバースプライマーはこれらの抗体の定常領域に特異的であり、この場合、7B4.1E11に対してはアイソタイプIgG1、12F4.1H7に対してはIgG2であった。プライマーを、JonesとBendig(Bio/Technology 9:88,1991)によって記載された戦略に基づいて設計した。RT−PCRを両方のV領域配列について行い、正しいV領域配列の配列検証を可能にした。RT−PCRによって作製したV領域産物をクローニングし(インビトロジェンTAクローニングキット)、配列データを得た。
全RNAを、7B4.1E11および12F4.1H7のハイブリドーマ細胞から抽出し、その後、重鎖および軽鎖の可変ドメインcDNA配列を、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって作製した。RT−PCRのフォワードプライマーは、マウス免疫グロブリン遺伝子リーダー配列に特異的な縮重プライマーの混合物であり、リバースプライマーはこれらの抗体の定常領域に特異的であり、この場合、7B4.1E11に対してはアイソタイプIgG1、12F4.1H7に対してはIgG2であった。プライマーを、JonesとBendig(Bio/Technology 9:88,1991)によって記載された戦略に基づいて設計した。RT−PCRを両方のV領域配列について行い、正しいV領域配列の配列検証を可能にした。RT−PCRによって作製したV領域産物をクローニングし(インビトロジェンTAクローニングキット)、配列データを得た。
実施例9−抗体のヒト化−キメラのクローニング
キメラ抗体をコードするDNA発現コンストラクトを、哺乳類発現ベクターにクローニングするための制限部位およびヒトシグナル配列を含んでなる重複オリゴヌクレオチドを構築することにより新たに調製した。ヒトγ1定常領域を含んでなる哺乳類発現ベクター内にクローニングするために、HindIIIおよびSpeIの制限部位を導入し、シグナル配列(配列番号45)を含んでなるVHドメインを構成した。ヒトκ定常領域を含んでなる哺乳類発現ベクター内にクローニングするために、HindIIIおよびBsiWIの制限部位を導入し、シグナル配列(配列番号45)を含んでなるVLドメインを構成した。
キメラ抗体をコードするDNA発現コンストラクトを、哺乳類発現ベクターにクローニングするための制限部位およびヒトシグナル配列を含んでなる重複オリゴヌクレオチドを構築することにより新たに調製した。ヒトγ1定常領域を含んでなる哺乳類発現ベクター内にクローニングするために、HindIIIおよびSpeIの制限部位を導入し、シグナル配列(配列番号45)を含んでなるVHドメインを構成した。ヒトκ定常領域を含んでなる哺乳類発現ベクター内にクローニングするために、HindIIIおよびBsiWIの制限部位を導入し、シグナル配列(配列番号45)を含んでなるVLドメインを構成した。
実施例10−抗体のヒト化−ヒト化変異体のクローニング
ヒト化抗体の変異体をコードするDNA発現コンストラクトを、哺乳類発現ベクターにクローニングするための制限部位およびヒトシグナル配列を含んでなる重複オリゴヌクレオチドを構築することにより新たに調製した。ヒトγ1定常領域を含んでなる哺乳類発現ベクター内にクローニングするために、HindIIIおよびSpeIの制限部位を導入し、シグナル配列(配列番号45)を含んでなるVHドメインを構成した。ヒトκ定常領域を含んでなる哺乳類発現ベクター内にクローニングするために、HindIIIおよびBsiWIの制限部位を導入し、シグナル配列(配列番号45)を含んでなるVLドメインを構成した。
ヒト化抗体の変異体をコードするDNA発現コンストラクトを、哺乳類発現ベクターにクローニングするための制限部位およびヒトシグナル配列を含んでなる重複オリゴヌクレオチドを構築することにより新たに調製した。ヒトγ1定常領域を含んでなる哺乳類発現ベクター内にクローニングするために、HindIIIおよびSpeIの制限部位を導入し、シグナル配列(配列番号45)を含んでなるVHドメインを構成した。ヒトκ定常領域を含んでなる哺乳類発現ベクター内にクローニングするために、HindIIIおよびBsiWIの制限部位を導入し、シグナル配列(配列番号45)を含んでなるVLドメインを構成した。
実施例11−抗体のヒト化−(抗体の定量化を含んでなる)組換え抗体の発現
重鎖および軽鎖をコードする発現プラスミドをそれぞれHEK293 6E細胞に一過的に同時トランスフェクトし、小規模で発現させて、抗体を産生した。7B4および12F4キメラ抗体ならびに無関係の対照抗体の重鎖および軽鎖も発現させた。抗体をELISAで定量化した。ELISAプレートを、1μg/mlの抗ヒトIgG(シグマI3382)でコーティングし、ブロッキング溶液(トリス緩衝生理食塩水中4%BSA)でブロッキングした。組織培養上清の種々な希釈物を加え、このプレートを室温で1時間インキュベートした。既知の標準抗体の希釈物もこのプレートに加えた。このプレートをTBSTで洗浄し、結合を、ブロッキング溶液で1/1000希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(シグマA7164)を添加することによって検出した。このプレートを室温で1時間インキュベートし、TBSTで洗浄した。このプレートを、OPD基質(シグマP9187)を加えることによって展開し、色の展開を2M H2SO4の添加によって止めた。吸光度を490nmで測定し、検量線を、既知の標準希釈物のデータを用いてプロットした。この標準曲線を用いて、組織培養上清中の抗体の濃度を予測した。
重鎖および軽鎖をコードする発現プラスミドをそれぞれHEK293 6E細胞に一過的に同時トランスフェクトし、小規模で発現させて、抗体を産生した。7B4および12F4キメラ抗体ならびに無関係の対照抗体の重鎖および軽鎖も発現させた。抗体をELISAで定量化した。ELISAプレートを、1μg/mlの抗ヒトIgG(シグマI3382)でコーティングし、ブロッキング溶液(トリス緩衝生理食塩水中4%BSA)でブロッキングした。組織培養上清の種々な希釈物を加え、このプレートを室温で1時間インキュベートした。既知の標準抗体の希釈物もこのプレートに加えた。このプレートをTBSTで洗浄し、結合を、ブロッキング溶液で1/1000希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(シグマA7164)を添加することによって検出した。このプレートを室温で1時間インキュベートし、TBSTで洗浄した。このプレートを、OPD基質(シグマP9187)を加えることによって展開し、色の展開を2M H2SO4の添加によって止めた。吸光度を490nmで測定し、検量線を、既知の標準希釈物のデータを用いてプロットした。この標準曲線を用いて、組織培養上清中の抗体の濃度を予測した。
実施例12−ADAMTS5結合ELISA
結合ELISAを行い、細胞培養上清中の発現抗体の組換えADAMTS5への結合を試験した。ELISAプレートを、0.2μg/mlの組換えヒトADAMTS5でコーティングし、ブロッキング溶液(トリス緩衝生理食塩水中4%BSA)でブロッキングした。この組織培養上清の種々の希釈物を加え、このプレートを室温で1時間インキュベートし、TBSTで洗浄した。結合を、ブロッキング溶液で1/1000希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(シグマA7164)を添加することによって検出した。このプレートを室温で1時間インキュベートし、TBSTで洗浄した。このプレートを、OPD基質(シグマP9187)を加えることによって展開し、色の展開を2M H2SO4の添加によって止めた。吸光度を、プレートリーダーを用いて490nmで測定し、平均吸光度を濃度に対してプロットした。
結合ELISAを行い、細胞培養上清中の発現抗体の組換えADAMTS5への結合を試験した。ELISAプレートを、0.2μg/mlの組換えヒトADAMTS5でコーティングし、ブロッキング溶液(トリス緩衝生理食塩水中4%BSA)でブロッキングした。この組織培養上清の種々の希釈物を加え、このプレートを室温で1時間インキュベートし、TBSTで洗浄した。結合を、ブロッキング溶液で1/1000希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(シグマA7164)を添加することによって検出した。このプレートを室温で1時間インキュベートし、TBSTで洗浄した。このプレートを、OPD基質(シグマP9187)を加えることによって展開し、色の展開を2M H2SO4の添加によって止めた。吸光度を、プレートリーダーを用いて490nmで測定し、平均吸光度を濃度に対してプロットした。
図6〜9に、ヒト化抗ADAMTS5抗体の組換え抗原への結合を示す。
実施例13−BIAcore
抗ヒトIgG(Biacore(商標)、BR−1008−39)を、第一級アミンカップリングによりCM5チップ上に固定化した。その後、この表面を用いてヒト化抗体を捕獲し、ADAMTS5(R&D Systems 2198−AD)を、64nmの単一濃度でこの捕獲抗体の上を通過させ、100mMリン酸、続いて3M MgCl2を用いて再生を行った。結合曲線を、緩衝液注入(すなわち、0nM)で二重参照し、このデータを、1:1モデルを用いてT100解析ソフトウェアに適合させた。ランニング緩衝液としてHBS−EPを用いて、25℃でBIAcoreを稼働した。得られたデータを表5に示す。特定しない限り、全ての抗体を組織培養上清から捕獲した。
抗ヒトIgG(Biacore(商標)、BR−1008−39)を、第一級アミンカップリングによりCM5チップ上に固定化した。その後、この表面を用いてヒト化抗体を捕獲し、ADAMTS5(R&D Systems 2198−AD)を、64nmの単一濃度でこの捕獲抗体の上を通過させ、100mMリン酸、続いて3M MgCl2を用いて再生を行った。結合曲線を、緩衝液注入(すなわち、0nM)で二重参照し、このデータを、1:1モデルを用いてT100解析ソフトウェアに適合させた。ランニング緩衝液としてHBS−EPを用いて、25℃でBIAcoreを稼働した。得られたデータを表5に示す。特定しない限り、全ての抗体を組織培養上清から捕獲した。
実施例14 マウス、キメラ、およびヒト化したADAMTS5mAbの親和性の比較
親和性を、2種類の形式(Octet QKではセンサー上に抗原、およびBiacoreではセンサー上に抗体)でmAbについて評価した(表6)。細胞標的を代表するOctet QK形式の妥当性は、天然に存在する細胞とインビボで会合する酵素の形態により、ADAMTS5に関連する。しかし、ADAMTS5は分泌型でも見られ得るので、Biacoreを用いるセンサー形式でも抗体の親和性について評価した。OctetとBiacore解析との間で観察される違いは、形式の差異(すなわち、Octet QKではセンサー上に抗原およびBiacoreではセンサー上にmAb)ならびにシステム間の技術的な違いであり得る。しかし、同じ形式で稼働すると、これらのシステムは、これらのmAbの全体的なKDの観点から非常に似ていた。おそらく、機器の設計の違いにより、KdおよびKaの違いが観察された。
親和性を、2種類の形式(Octet QKではセンサー上に抗原、およびBiacoreではセンサー上に抗体)でmAbについて評価した(表6)。細胞標的を代表するOctet QK形式の妥当性は、天然に存在する細胞とインビボで会合する酵素の形態により、ADAMTS5に関連する。しかし、ADAMTS5は分泌型でも見られ得るので、Biacoreを用いるセンサー形式でも抗体の親和性について評価した。OctetとBiacore解析との間で観察される違いは、形式の差異(すなわち、Octet QKではセンサー上に抗原およびBiacoreではセンサー上にmAb)ならびにシステム間の技術的な違いであり得る。しかし、同じ形式で稼働すると、これらのシステムは、これらのmAbの全体的なKDの観点から非常に似ていた。おそらく、機器の設計の違いにより、KdおよびKaの違いが観察された。
ヒト化CSmAb(12F4 H4L0)は、Octet QKシステムの抗原ダウン形式(antigen down format)で測定した時、38.3pMの全体的な親和性(KD)を示す。12F4 H4L0 mAbは、BiacoreシステムのmAbダウン形式(mAb down format)において85pMのKDを示す。参考のために示す7B4 H0L0は、Octet QKシステムおよびBiacoreシステムにおいて、それぞれ205pMおよび869pMのKDを示す。各mAbのマウス型およびキメラ型の親和性の値を参考のために本明細書に示し、その親和性はヒト化後に維持されたことを示す。この実験の全mAbは、完全に機能的なFc部分を含んでいた(すなわち、Fcが機能しないことはなかった)。
実施例15.ヒトOA軟骨外植片実験のヒト化12F4 H4L0用量範囲
ヒト化12F4 H4L0のFcが機能しないmAbを、Fcが機能しない適切なアイソタイプ、他の陽性対照および陰性対照に対する用量反応形式で、ならびに単一用量における親のマウス12F4.1H7バージョンと比較して、このシステムにおいて評価した。複数ドナー(n=4)をこの研究において個々に評価し、結果を収集して、OA患者の集団全体の平均阻害スコアを作成した。GSK571949をアッセイ対照として単一濃度(2μM)で用い、最大阻害レベルを設定した。これらの結果は、無関係のヒト化アイソタイプ対照mAbの用量範囲(図10)と比較して、最大反応が最高用量(1333nm)で達成される明らかな12F4 H4L0用量反応を示す。GSK571949に関してARGSネオエピトープのほぼ完全な阻害は、最高用量(2μM)で達成された。さらに、12F4 H4L0の阻害のレベルは、これらのドナーの12F4.1H7を超えることが示され、ヒト化後に有効性が維持されることが示唆された。このmAbのヒト化バージョンの有効性のレベルは高いが、これが真の増加であるのか、またはmAb調製における違いによるものかどうかは明らかではない。追加のOAドナーを用いた別々の実験におけるmAbの12F4.1H7型で観察される有効性のレベル(図1)は、本明細書で観察されたものよりも高かったことは留意すべきである。このシステムのヒト疾患および観察される有効性との関連を考慮すると、このデータは、本方法およびこれらのmAbの確証を強く支持する。
ヒト化12F4 H4L0のFcが機能しないmAbを、Fcが機能しない適切なアイソタイプ、他の陽性対照および陰性対照に対する用量反応形式で、ならびに単一用量における親のマウス12F4.1H7バージョンと比較して、このシステムにおいて評価した。複数ドナー(n=4)をこの研究において個々に評価し、結果を収集して、OA患者の集団全体の平均阻害スコアを作成した。GSK571949をアッセイ対照として単一濃度(2μM)で用い、最大阻害レベルを設定した。これらの結果は、無関係のヒト化アイソタイプ対照mAbの用量範囲(図10)と比較して、最大反応が最高用量(1333nm)で達成される明らかな12F4 H4L0用量反応を示す。GSK571949に関してARGSネオエピトープのほぼ完全な阻害は、最高用量(2μM)で達成された。さらに、12F4 H4L0の阻害のレベルは、これらのドナーの12F4.1H7を超えることが示され、ヒト化後に有効性が維持されることが示唆された。このmAbのヒト化バージョンの有効性のレベルは高いが、これが真の増加であるのか、またはmAb調製における違いによるものかどうかは明らかではない。追加のOAドナーを用いた別々の実験におけるmAbの12F4.1H7型で観察される有効性のレベル(図1)は、本明細書で観察されたものよりも高かったことは留意すべきである。このシステムのヒト疾患および観察される有効性との関連を考慮すると、このデータは、本方法およびこれらのmAbの確証を強く支持する。
実施例16.ヒトOA軟骨外植片の治療的パルスチェイス実験
本実験を実施例15のように設計するが、これらのmAbまたはこのシステムの飽和を可能にする化合物を用いた5日の処理期間後に、この処理を止めて、この処理を行っていない新鮮な培地に置換した。このアッセイを4週間継続し、次の軟骨分解マーカーの評価のために培地を定期的にサンプリングした。各サンプリング後、サンプルの除去した量と同じ量の新鮮な培地で置換した。この形式は治療効果の効力および期間を調べることを目的としたものであり、この組織内のADAMTS5代謝回転速度を間接的に示唆する。4人の異なるヒトOAドナーを用いた同一実験から収集した結果を示す(図11)。これらの結果は、疾患状態が進行していても(すなわち、関節置換の時に)ヒトOA軟骨におけるADAMTS5mAb反応の期間が延長する証拠を提供する。さらに、これらの結果は、疾患組織におけるADAMTS5の低い代謝回転速度の証拠を提供する。
本実験を実施例15のように設計するが、これらのmAbまたはこのシステムの飽和を可能にする化合物を用いた5日の処理期間後に、この処理を止めて、この処理を行っていない新鮮な培地に置換した。このアッセイを4週間継続し、次の軟骨分解マーカーの評価のために培地を定期的にサンプリングした。各サンプリング後、サンプルの除去した量と同じ量の新鮮な培地で置換した。この形式は治療効果の効力および期間を調べることを目的としたものであり、この組織内のADAMTS5代謝回転速度を間接的に示唆する。4人の異なるヒトOAドナーを用いた同一実験から収集した結果を示す(図11)。これらの結果は、疾患状態が進行していても(すなわち、関節置換の時に)ヒトOA軟骨におけるADAMTS5mAb反応の期間が延長する証拠を提供する。さらに、これらの結果は、疾患組織におけるADAMTS5の低い代謝回転速度の証拠を提供する。
実施例17.Fcが機能しないヒト化抗体
ヒト化12F4 H4のVHドメインをコードする遺伝子を、改変ヒトγ1定常領域であるIgG1m(AA)にクローニングした。このIgG1m(AA)定常領域は、L235位およびG237位(EUインデックス番号付け)におけるCH2ドメインに2つのアラニン置換を含んでなる。これらの変異は、この得られた抗体が必要なFc受容体または補体成分C1qに結合できないようにするので、抗体依存性細胞毒性(ADCC)または補体依存性細胞毒性(CDC)を誘導する抗体の能力を無能にする。
ヒト化12F4 H4のVHドメインをコードする遺伝子を、改変ヒトγ1定常領域であるIgG1m(AA)にクローニングした。このIgG1m(AA)定常領域は、L235位およびG237位(EUインデックス番号付け)におけるCH2ドメインに2つのアラニン置換を含んでなる。これらの変異は、この得られた抗体が必要なFc受容体または補体成分C1qに結合できないようにするので、抗体依存性細胞毒性(ADCC)または補体依存性細胞毒性(CDC)を誘導する抗体の能力を無能にする。
抗体BPC1623(12F4キメラ)、BPC1659(12F4 H4L0 IgG1wt)およびBPC1661(12F4 H4L0 IgG1m(AA))の重鎖および軽鎖をコードする発現プラスミドをHEK細胞内で発現させた。抗体をタンパク質A親和性クロマトグラフィーにより精製し、分光光度法により定量化した。
結合ELISAを行い、これらの精製抗体のADAMTS5への結合を比較した。無関係のIgG1wtアイソタイプの抗体およびFcが機能しない抗体を陰性対照として含めた。簡単に説明すると、プレートを、0.2μg/mlの組換えヒトADAMTS5でコーティングし、ブロッキング溶液(トリス緩衝生理食塩水中4%BSA)でブロッキングした。様々な濃度の精製抗体を加え、このプレートを室温で1時間インキュベートし、TBST(トリス緩衝生理食塩水+0.05% Tween 20)で洗浄した。結合を、ブロッキング溶液で1/1000希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(シグマA7164)を添加することによって検出した。このプレートを室温で1時間インキュベートし、TBSTで洗浄した。このプレートを、OPD基質(シグマP9187)を加えることによって展開し、色の展開を2M H2SO4の添加によって止めた。吸光度を、プレートリーダーを用いて490nmで測定し、平均吸光度を濃度に対してプロットした。
図12は、精製した抗ADAMTS5抗体の組換え抗原への結合を示す。
実施例18.Fcが機能しない抗体のBiacore
タンパク質Aを、第一級アミンカップリングによってCM5バイオセンサーチップ上に固定した。この表面を用いて、Fcが機能しない抗ADAMTS5抗体、12F4 H4L0 IgG1m(AA)(BPC1661)、(CHOおよびHEK発現物質)を捕獲した。組換えヒトADAMTS5(R&D Systems 2198−AD)を、64nM、16nM、4nM、1nM、0.25nM、および0.0625nMで検体として用い、緩衝液注入(すなわち、0nM)を用いて結合曲線を二重参照した。捕獲表面の再生(すなわち、捕獲抗体の除去)には50mM NaOHを用いた。ランニング緩衝液はHBS−EPであり、25℃でBIAcore T100を稼働させた。データを、この機械解析ソフトウェアに備わっている1:1モデルに適合させた。これらの結果は、結合親和性の観点から異なる細胞株で産生させた物質間で違いは無かったことを示した。
タンパク質Aを、第一級アミンカップリングによってCM5バイオセンサーチップ上に固定した。この表面を用いて、Fcが機能しない抗ADAMTS5抗体、12F4 H4L0 IgG1m(AA)(BPC1661)、(CHOおよびHEK発現物質)を捕獲した。組換えヒトADAMTS5(R&D Systems 2198−AD)を、64nM、16nM、4nM、1nM、0.25nM、および0.0625nMで検体として用い、緩衝液注入(すなわち、0nM)を用いて結合曲線を二重参照した。捕獲表面の再生(すなわち、捕獲抗体の除去)には50mM NaOHを用いた。ランニング緩衝液はHBS−EPであり、25℃でBIAcore T100を稼働させた。データを、この機械解析ソフトウェアに備わっている1:1モデルに適合させた。これらの結果は、結合親和性の観点から異なる細胞株で産生させた物質間で違いは無かったことを示した。
実施例19.抗原−抗体相互作用の結晶構造モデル−エピトープおよびMOAの意味
ADAMTS5およびADAMTS5mAbの12F4.1H7のそれぞれの結晶構造を用いるインシリコの構造「最適」コンピューターモデルは、ADAMTS5の触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインの両方の間の抗体/抗原相互作用が同時に起こることを示唆する。ADAMプロテアーゼおよびADAMTSプロテアーゼの触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインは、これらのドメイン間に可動性を与えるヒンジ領域で分離されており、このヒンジ領域は機能を調節するか、またはこの触媒部位への基質局在化を可能にするように作用し得る。エピトープに及ぶこのドメインで観察される高親和性mAb結合は、おそらく、ADAMTS5の触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインを共に固定し、それによって酵素活性を中和する。ADAMTS5と12F4.1H7mAbおよび7B4.1E11mAb間の相互作用の予測アミノ酸部位を図13に示す。
ADAMTS5およびADAMTS5mAbの12F4.1H7のそれぞれの結晶構造を用いるインシリコの構造「最適」コンピューターモデルは、ADAMTS5の触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインの両方の間の抗体/抗原相互作用が同時に起こることを示唆する。ADAMプロテアーゼおよびADAMTSプロテアーゼの触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインは、これらのドメイン間に可動性を与えるヒンジ領域で分離されており、このヒンジ領域は機能を調節するか、またはこの触媒部位への基質局在化を可能にするように作用し得る。エピトープに及ぶこのドメインで観察される高親和性mAb結合は、おそらく、ADAMTS5の触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインを共に固定し、それによって酵素活性を中和する。ADAMTS5と12F4.1H7mAbおよび7B4.1E11mAb間の相互作用の予測アミノ酸部位を図13に示す。
Claims (59)
- ヒトADAMTS5に結合することができる少なくとも1つの第1の免疫グロブリン可変ドメインを含んでなる、単離された抗原結合タンパク質。
- 前記抗原結合タンパク質が、抗体またはその断片である、請求項1に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体またはその断片である、請求項1または2に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記モノクローナル抗体またはその断片が、マウス、キメラ、ヒト化、または完全ヒトである、請求項3に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記抗原結合タンパク質が、少なくとも1つの相補性決定領域を含んでなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記抗原結合タンパク質が、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含んでなる重鎖と、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含んでなる軽鎖とを含んでなるモノクローナル抗体であって、
前記重鎖の相補性決定領域(CDR)が、
a)アミノ酸配列DAWMDと少なくとも約80%の配列同一性を有するCDRHl;
b)アミノ酸配列EIRHKANDHAIFYXESVKGと少なくとも約70%の配列同一性を有するCDRH2;および
c)アミノ酸配列TYYYGSSYGYCDVまたはPFAYと少なくとも約70%の配列同一性を有するCDRH3;
の群から選択され、かつ
前記軽鎖の相補性決定領域が、
d)アミノ酸配列KASQSVGTTIVまたはRTSENIYSYLAと少なくとも約70%の配列同一性を有するCDRLl;
e)アミノ酸配列NAKTLAEまたはSASNRXTと少なくとも約70%の配列同一性を有するCDRL2;および
f)アミノ酸配列QQYSSYPFTまたはQHHYGTPWTと少なくとも約70%の配列同一性を有するCDRL3;
の群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。 - 前記ポリペプチドが、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含んでなる重鎖と、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含んでなる軽鎖とを含んでなるモノクローナル抗体であって、
前記重鎖の相補性決定領域(CDR)が、
(a)CDRH1が、アミノ酸配列DAWMDである;
(b)CDRH2が、アミノ酸配列EIRHKANDHAIFYAESVKG、EIRNKANNHARHYAESVKG、EIRHKANDYAIFYDESVKG、EIRHKANDHAIFYDESVKG、DIRNTANNHATFYAESVKG、またはEIRHKANDHAIFYDESVKGから選択される;および
(c)CDRH3が、TYYYGSSYGYCDVまたはPFAYである;
から選択され、かつ
前記軽鎖の相補性決定領域が、
(d)CDRL1が、アミノ酸配列KASQSVGTTIV、RTSENIYSYLA、またはKASQNVGTAVVから選択される;
(e)CDRL2が、アミノ酸配列NAKTLAE、SASNRHT、SASTRYT、またはSASNRYTから選択される;および
(f)CDRL3が、アミノ酸配列QQYSSYPFT、QHHYGTPWT、QQYVNYPFT、またはQQYTSYPFTから選択される;
から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。 - CDRH3が、アミノ酸配列PFAYを含んでなる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記ポリペプチドが、FabまたはF(ab)2断片である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記第1の免疫グロブリン可変ドメインが、一本鎖可変ドメインである、請求項1に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記抗原結合タンパク質が、第2の抗原に結合することができる第2の免疫グロブリン可変ドメインをさらに含んでなる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記第2の免疫グロブリン可変ドメインが、ヒト血清アルブミン、ADAMTS4、NGF、OSM、TNF−α、IL−6、VIP、TRPV1、TRPV4、ADAMTS1、アグリカン、コラーゲンII、RANKL、シンデカン4、ヘッジホッグ、および/またはIL−1の群から選択される少なくとも1つの抗原に結合する、請求項11に記載の抗原結合タンパク質。
- ヒトADAMTS5に対して約2.5×10−10M以下の解離定数KD(off)によって特徴づけられる、請求項1〜12のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記抗原結合タンパク質が、ADAMTS5の少なくとも1つの活性を阻止する、かつ/または減少させる、請求項1〜13のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記抗原結合タンパク質が、Glu373−Ala374切断部位におけるADAMTS5によるアグリカンの切断を阻止する、かつ/または減少させる、請求項1〜14のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記抗原結合タンパク質が、動物に投与される時、軟骨を透過することができる、請求項1〜15のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項17に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、宿主細胞。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質の少なくとも1つを含んでなる、医薬組成物。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載の第1の抗原結合タンパク質と、第2のモノクローナル抗体とを含んでなる、医薬組成物。
- 前記第2のモノクローナル抗体が、ADAMTS4、ADAMTS5、NGF、OSM、TNF−α、IL−6、VIP、TRPV1、TRPV4、ADAMTS1、アグリカン、コラーゲンII、RANKL、および/またはIL−1の群から選択される抗原に結合する、請求項20に記載の医薬組成物。
- 治療を必要としている患者の治療方法であって、請求項19〜21のいずれか1項に記載の医薬組成物の少なくとも一回用量を前記患者に投与することを含んでなる、方法。
- 前記患者が軟骨の疾患を患っている、請求項22に記載の方法。
- 前記患者が、癌、疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、術後の疼痛、変形性関節症、スポーツ外傷、びらん性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライム関節炎、若年性関節炎、強直性脊椎症、神経痛、神経障害、痛覚、神経損傷、虚血、神経変性、炎症性疾患、軟骨変性、咽頭、気管、耳管、椎間板、靱帯、腱、関節包、または骨の発達に影響を与える疾患、椎間板変性、骨減少症、または歯周病、急性関節損傷、および/または関節破壊に関連する疾患の群から選択される少なくとも1つの疾患を患っている、請求項23に記載の方法。
- 前記患者が、変形性関節症を患っている、請求項24に記載の方法。
- 前記医薬組成物の少なくとも一回用量の投与が、前記患者における軟骨分解を減少させる、請求項22〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記医薬組成物の少なくとも一回用量の投与が、前記患者におけるアグリカン切断を阻害する、かつ/または減少させる、請求項22〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記医薬組成物が、静脈内投与、筋肉内投与、関節内投与、皮下投与、経口投与、鼻腔内投与、および/または呼吸吸入器により投与される、請求項22〜27のいずれか1項に記載の方法。
- CDRH1がDAWMD(配列番号2)であり、CDRH2がEIRNKANNHARHYAESVKG(配列番号13)であり、CDRH3がTYYYGSSYGYCDV(配列番号18)であり、CDRL1がRTSENIYSYLA(配列番号20)であり、CDRL2がNAKTLAE(配列番号22)であり、CDRL3がQHHYGTPWT(配列番号27)である、6つのCDRを含んでなる、単離されたモノクローナル抗体。
- CDRH1がDAWMD(配列番号2)であり、CDRH2がEIRHKANDHAIFYDESVKG(配列番号15)であり、CDRH3がPFAY(配列番号5)であり、CDRL1がKASQSVGTTIV(配列番号19)であり、CDRL2がSASNRHT(配列番号23)であり、CDRL3がQQYTSYPFT(配列番号29)である、6つのCDRを含んでなる、単離されたモノクローナル抗体。
- 請求項29または請求項30に記載の抗体と競合的にヒトADAMTS5と結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
- 結合定数(Ka)を測定すると、少なくとも約5×104L/モルの親和性でヒトADAMTS5の中和エピトープに結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体が、ヒト定常領域を含んでなる、請求項29〜31のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 免疫グロブリンクラスがIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、またはIgMである、請求項1に記載の抗体または抗原結合断片。
- 前記断片が、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびFvからなる群から選択される、請求項29〜34のいずれか1項に記載の抗原結合断片。
- 配列番号76、80、116、118、120、122、124、126、128、136、138、140、142、および144からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体VHドメインを含んでなる、抗原結合タンパク質またはその断片。
- 配列番号78、82、130、132、134、および146からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体VLドメインを含んでなる、抗原結合タンパク質またはその断片。
- 請求項36に記載の抗体VHドメインおよび請求項37に記載のVLドメインを含んでなる、抗原結合タンパク質またはその断片。
- 配列番号76を含んでなる抗体VHドメインおよび配列番号78を含んでなるVLドメインを含んでなる、請求項38に記載の抗原結合タンパク質またはその断片。
- 配列番号80を含んでなる抗体VHドメインおよび配列番号82を含んでなるVLドメインを含んでなる、請求項38に記載の抗原結合タンパク質またはその断片。
- 配列番号116、118、120、122、124、126、および128からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体VHドメイン、ならびに配列番号130、132、および134からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるVLドメインを含んでなる、請求項38に記載の抗原結合タンパク質またはその断片。
- 配列番号136、138、140、142、および144からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体VHドメイン、ならびに配列番号146を含んでなるVLドメインを含んでなる、請求項38に記載の抗原結合タンパク質またはその断片。
- 配列番号68、72、84、86、88、90、92、94、96、104、106、108、110、112、および158からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖を含んでなる、抗原結合タンパク質またはその断片。
- 配列番号70、74、98、100、102、および114からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる、抗原結合タンパク質またはその断片。
- 配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項43に記載の抗体重鎖、および請求項44に記載の抗体軽鎖を含んでなる、抗原結合タンパク質またはその断片。
- 配列番号68を含んでなる抗体重鎖および配列番号70を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる、請求項45に記載の抗原結合タンパク質またはその断片。
- 配列番号72を含んでなる抗体重鎖および配列番号74を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる、請求項45に記載の抗原結合タンパク質またはその断片。
- 配列番号84、86、88、90、92、94、および96からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖、ならびに配列番号98、100、および102からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる、請求項45に記載の抗原結合タンパク質またはその断片。
- 配列番号104、106、108、110、112、および158からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖、ならびに配列番号114を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる、請求項45に記載の抗原結合タンパク質またはその断片。
- 配列番号76、80、116、118、120、122、124、126、128、136、138、140、142、および144からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体VHドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号75、79、115、117、119、121、123、125、127、135、137、139、141、143、および159からなる群から選択される、請求項50に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号78、82、130、132、134、および146からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体VLドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号77、81、129、131、133、および145からなる群から選択される、請求項52に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号68、72、84、86、88、90、92、94、96、104、106、108、110、112、および158からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号67、71、83、85、87、89、91、93、95、103、105、107、109、111、および159からなる群から選択される、請求項54に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号70、74、98、100、102、および114からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号69、73、97、99、101、および115からなる群から選択される、請求項56に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 治療を必要としている患者の治療方法であって、請求項1〜16のいずれか1項に記載の少なくとも1つの抗原結合タンパク質を前記患者に投与することを含んでなる、方法。
- 約5×10−4L/秒未満の解離定数(Kd)でヒトADAMTS5の中和エピトープに結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
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