JP2016538839A - アグリカナーゼ関連疾患の治療のためのアグリカナーゼ型adamts種に対するヒト抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
[2] Tortorella MD, Malfait AM, Deccico C, Arner E. The role of ADAM-TS4 (aggrecanase-1) and ADAM-TS5 (aggrecanase-2) in a model of cartilage degradation. Osteoarthritis Cartilage. 2001; 9: 539-52.
[3] Pratta MA, Yao W, Decicco C, Tortorella MD, Liu RQ, Copeland RA, et al. Aggrecan protects cartilage collagen from proteolytic cleavage. J Biol Chem. 2003; 278: 45539-45.
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[1]ヒトアグリカナーゼに特異的に結合し、且つそのアグリカナーゼのアグリカナーゼ活性を阻害する抗体。
[2]ヒトアグリカナーゼがヒトADAMTS4である、[1]記載の抗体。
[3]更にヒトADAMTS5のアグリカナーゼ活性を阻害する、[2]記載の抗体。
[4]配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むエピトープにおいて、ヒトADAMTS4に結合する、[2]又は[3]記載の抗体。
[5]軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
(1)該軽鎖可変領域が、配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むCDR2及び配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号5で表されるアミノ酸配列を含むCDR2及び配列番号6で表されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む;又は
(2)該軽鎖可変領域が、配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むCDR2及び配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号5で表されるアミノ酸配列を含むCDR2及び配列番号6で表されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む、
(但し、配列番号1〜3で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加しており、且つ/或いは、
配列番号4〜6で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加している)
ことを特徴とする[2]〜[4]のいずれか記載の抗体。
[6]該軽鎖可変領域が配列番号7で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む、[5]記載の抗体。
[7]ヒト抗体である、[1]〜[6]のいずれか記載の抗体。
[8][1]〜[7]のいずれか記載の抗体を含む医薬組成物。
[9][1]〜[7]のいずれか記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
[10][9]記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[11][10]記載のベクターを含む形質転換体。
[12]ヒトアグリカナーゼに特異的に結合し、且つ該アグリカナーゼのアグリカナーゼ活性を阻害する抗体を含む、関節炎の予防又は治療剤。
[13]ヒトアグリカナーゼがヒトADAMTS4である、[12]記載の剤。
[14]抗体が[1]〜[7]のいずれか記載の抗体である、[12]又は[13]記載の剤。
[15]哺乳動物に対して、ヒトアグリカナーゼに特異的に結合し、且つ該アグリカナーゼのアグリカナーゼ活性を阻害する抗体の有効量を投与することを含む、当該哺乳動物における関節炎の予防又は治療方法。
[16]ヒトアグリカナーゼがヒトADAMTS4である、[15]記載の方法。
[17]抗体が[1]〜[7]のいずれか記載の抗体である、[15]又は[16]記載の方法。
[18]関節炎の予防又は治療において使用するための、ヒトアグリカナーゼに特異的に結合し、且つ該アグリカナーゼのアグリカナーゼ活性を阻害する抗体。
[19]ヒトアグリカナーゼがヒトADAMTS4である、[18]記載の抗体。
[20][1]〜[7]のいずれか記載の抗体である、[18]又は[19]記載の抗体。
[21]関節炎の予防又は治療剤を製造するための、ヒトアグリカナーゼに特異的に結合し、且つ該アグリカナーゼのアグリカナーゼ活性を阻害する抗体の使用。
[22]ヒトアグリカナーゼがヒトADAMTS4である、[21]記載の使用。
[23]抗体が[1]〜[7]のいずれか記載の抗体である、[21]又は[22]記載の使用。
ヒトADAMTS4の代表的なアミノ酸配列を配列番号15に、
ヒトADAMTS4の代表的なcDNA配列を配列番号14に、
ヒトADAMTS5の代表的なアミノ酸配列を配列番号17に、
ヒトADAMTS5の代表的なcDNA配列を配列番号16に、
それぞれ示す。
配列番号9で表されるアミノ酸配列からなるエピトープ、
配列番号10で表されるアミノ酸配列(GGKYCEGRRTRF)からなるエピトープ、
配列番号11で表されるアミノ酸配列(GKYCEGRRTRFR)からなるエピトープ、
配列番号12で表されるアミノ酸配列(KYCEGRRTRFRS)からなるエピトープ、及び
配列番号13で表されるアミノ酸配列(YCEGRRTRFRSC)からなるエピトープ
を挙げることができる。
(1)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む、抗体;
(2)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む、抗体
(但し、配列番号1、2及び3で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加しており、且つ/或いは、
配列番号4、5及び6で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加している)。
(1’)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が配列番号7で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む、抗体。
ファージディスプレイライブラリーのパニング及びFabの作製
ADAMTS4及びADAMTS5に特異的なモノクローナルFab抗体はHuman Combinatorial Antibody Library (HuCAL; MorphoSys AG, Martinried, Germany)を用いて作製した。組み換え型ADAMTS4及びADAMTS5 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)をビオチン化し、HuCALとともにインキュベートした。結合したFab発現ファージを3回の連続的パニングラウンドにより濃縮した。Fab遺伝子のプールをファージミドから単離した後、大腸菌発現ベクターに挿入し、Strep-tag IIが付加されたFabとして機能する形でペリプラズムに発現させた。形質転換後、個々のコロニーをピックアップし、マイクロタイタープレート中で増殖させた。イソプロピル-β-チオガラクトピラノシドで抗体の発現誘導を一晩行った後、細胞を酵素的に溶解し、粗抽出物を酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により評価した。ELISAで抗原に対し強いシグナルを認めたクローンについて、抗体のVH CDR領域のDNA配列を決定した。Fabを含有する複数のコロニーを選択し、精製に供した。また、そのうち幾つかのFabは更なる解析のために、完全ヒトIgG1に再構成した。
C末端にStrep-tag IIを有するヒトADAMTS4の残基Phe213-Cys685(これは、ADAMTS4のメタロプロテイナーゼ、ディスインテグリン、トロンボスポンジン及びシステインリッチドメインに相当する)をコードするcDNA断片を含有する発現ベクターを、リポフェクタミン(Life Technologies, Rockville, MD)を用いてHEK293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから2日後、培養培地を回収し、Strep-Tactinセファロースを用いて、製造者の指示書(IBA Biotechnica, Hanover, Germany)に従って、組み換え型ヒトADAMTS4を精製した。メタロプロテイナーゼ、ディスインテグリン及びトロンボスポンジンドメイン(ADAMTS5の残基Ser262-Pro622)を含む組み換え型ADAMTS5はR&D Systems Inc.から購入した。
組み換え型ヒトADAMTS1 (R&D Systems)、ADAMTS4、ADAMTS5 (R&D Systems)、ADAMTS15 (R&D Systems)、ADAM10 (R&D Systems)、ADAM12 (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.、Tokyo、Japan)、ADAM17 (R&D Systems)及びMMP-13 (Millipore, Billerica, MA) 並びに精製ヒトMMP-1、MMP-2、MMP-3及びMMP-9 (Daiichi Fine Chemical, Co., Ltd., Toyama, Japan)を、還元条件下で、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)に供し、ゲル上で分離した試料をポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜に転写した。当該膜を、4℃にて16時間、ADAMTS種に対するFabの候補(5 mg/ml;クローン237-1、237-5、237-21、237-43及び237-53)とインキュベートした。0.1% Tween 20を含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、当該膜を、室温にて1時間、ヒトIgGに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体(Invitrogen, Carlsbad, CA)で反応させた。化学発光試薬(Pierce ECL western blotting substrate; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)を用い、標識されたタンパク質バンドを可視化した。全ての試料は、silver stain kit (Cosmo Bio Co., Ltd, Carlsbad, CA)により調製した銀染色ゲル上でも評価した。
組み換え型ADAMTS4(180 ng)、及びADAMTS5(180 ng)を、ヒト抗ADAMTS抗体(IgG1;クローン237-53)と共に、1: 0.2-5(酵素:抗体)のモル比で、又はヒトコントロール正常IgG1(R&D Systems)と共に、37℃にて30分間インキュベートし、次にブタアグリカン(100 mg)とともに37℃にて16時間インキュベートした。コンドロイチナーゼABC及びケラタナーゼ(Seikagaku Corporation, Tokyo, Japan)によるアグリカンの脱グリコシル化の後、アグリカナーゼ活性を、抗NITEGE392アグリカンネオエピトープ抗体(1.2 mg/ml)(Hashimoto G, et al. J Biol Chem. 2004; 279: 32483-91)を用いたイムノブロッティングによりモニターした。タンパク質バンドの密度をImage J analysis software (National Institute of Health, Bethesda, MD)を用いたデンシトメトリーにより評価した。
FLAGおよびジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)によりタグ化した、ADAMTS4の各ドメイン、及びNH2-又はCOOH-末端欠損のトロンボスポンジンドメインの組換え型タンパク質を、無細胞翻訳系(PUREfrex)(Gene Frontier Corporation, Chiba, Japan)を用いて合成した。これらの試料をSDS-PAGEに供し、次に抗FLAG抗体(Sigma-Aldrich, St Louis, MO; 2 mg/ml)または抗ADAMTS抗体(クローン237-53; 2 mg/ml)でイムノブロットした。
組み換え型ADAMTS種を、CM5センサーチップのフローチャンバー(GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)上にアミンカップリングにより共有結合で固相化した。BIAcore 3000 (GE Healthcare Life Sciences)を用いて、クローン237-53のIgG1をチャンバーに注入した。測定されたKa及びKdからKD値(親和性)を算出した。
ヒト変形性関節症軟骨から酵素的分離により単離された軟骨細胞を、10%ウシ胎仔血清及び25 mg/mlのアスコルビン酸を添加したダルベッコ改変イーグル培地/ハムF-12培地(Sigma-Aldrich)中で培養し、0.2% ラクトアルブミン加水分解物を含有する培地中での培養による血清飢餓の後に、インターロイキン1α(IL-1a (1 ng/ml; Dainippon Sumitomo Pharmaceutical Company Ltd., Okada, Japan)有り又は無しで24時間処理した。これらを、ADAMTS抗体(5 mg/ml, クローン237-53)又はヒトコントロールIgG(5 mg/ml; Invitrogen, Carlsbad, CA)と共に1時間処理し、次にアグリカン(100 mg)の存在中で16時間インキュベートした。脱グリコシル化の後に、濃縮した培地をSDS-PAGEに供し、PVDF膜へ転写した。アグリカナーゼ活性を、抗NITEGE392ネオエピトープ抗体(1.2 mg/ml)によるイムノブロッティングにより評価した。病院の倫理ガイドラインに従って、切除標本の実験的使用のためのインフォームドコンセントを変形性関節症の患者から得た。
ADAMTS4及びADAMTS5に対するヒト抗体のスクリーニング
ファージディスプレイ法を用いてヒト抗体ライブラリー(HuCAL)をスクリーニングすることにより、ADAMTS4及びADAMTS5の両方に反応する全部で5つのクローン(237-1, 237-5, 237-21, 237-43及び237-53)をELISAにより得ることができた。イムノブロッティング解析により、全てのクローンが組み換え型ADAMTS4及びADAMTS5を認識するが、ADAMTS5に対する反応性はクローンによって異なることが示された(図1A)。候補クローンがADAMTS4のアグリカナーゼ活性を阻害するか調べるため、これらのクローンのFab種をADAMTS4と共に、1:1のモル比でインキュベートし、次に活性をネオエピトープ(NITEGE392)特異的抗体を用いたイムノブロッティングによりモニターした。図1Bに示すように、5つの候補クローンの中でも、クローン237-53がアグリカナーゼ活性を阻害した。
クローン237-53がADAMTS4に対して阻害活性を示したので、この抗体に着目した。ADAMTS、ADAM及びMMP種に対する抗体の交差反応性をイムノブロッティングにより調べると、クローン237-53はADAMTS4及びADAMTS5に反応した。しかしながら、ADAMTS1、ADAMTS15、ADAM10、ADAM12、ADAM17、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9又はMMP-13に対する免疫反応性は得られなかった(図2)。このデータは、クローン237-53がADAMTS4及びADAMTS5において共通に存在するある領域に反応することを示唆する。
クローン237-53によるADAMTS4の免疫反応性ドメインを決定するため、我々は、まず、PUREfrexにより調製したADAMTS4のメタロプロテイナーゼドメイン単独、又はディスインテグリン及びトロンボスポンジンドメインの組み換え型タンパク質に対する反応性を調べた。図3Aに示す通り、抗体はディスインテグリン及びトロンボスポンジンドメインのタンパク質のみを認識した。そこで、我々は、更にディスインテグリン又はトロンボスポンジンドメインへの免疫反応性を調べ、抗体はトロンボスポンジンドメインのみを認識することを見出した(図3B)。このことは、ADAMTS4のトロンボスポンジンドメインが抗体のエピトープを含むことを示す。
L鎖 VLk4
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYSSNNNYLAWYQQKPGQPPKLLIHTASARESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSVSITFGQGTKVEIKRT(配列番号7)
H鎖 VH1a
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFAISWVRQAPGQGLEWMGGIFPIFGQANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFSDWWEWQMDYWGQGTLVTVSS(配列番号8)
ADAMTS4及びADAMTS5のアグリカナーゼ活性を、アグリカンネオエピトープ特異的抗体を用いた、NITEGE392のCOOH末端配列を有する65kDaアグリカン断片のイムノブロッティング実験により評価した。図4Aに示すように、抗体クローン237-53は、ADAMTS4の活性をもとの活性の20%未満にブロックしたが、ADAMTS5活性は、わずかにもとの活性の70%程度にまで阻害した。正常コントロールIgGによっては阻害は観察されなかった(図4A)。BIAcoreを用いた動態解析により、この抗体が高い親和性でADAMTS種に対して結合することが実証され、ADAMTS4及びADAMTS5についてのKD値が、それぞれ、1.17×10-8 M及び1.46×10-9Mであることが示された。
Claims (23)
- ヒトアグリカナーゼに特異的に結合し、且つそのアグリカナーゼのアグリカナーゼ活性を阻害する抗体。
- ヒトアグリカナーゼがヒトADAMTS4である、請求項1記載の抗体。
- 更にヒトADAMTS5のアグリカナーゼ活性を阻害する、請求項2記載の抗体。
- 配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むエピトープにおいて、ヒトADAMTS4に結合する、請求項2又は3記載の抗体。
- 軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
(1)該軽鎖可変領域が、配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むCDR2及び配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号5で表されるアミノ酸配列を含むCDR2及び配列番号6で表されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む;又は
(2)該軽鎖可変領域が、配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むCDR2及び配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号5で表されるアミノ酸配列を含むCDR2及び配列番号6で表されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む、
(但し、配列番号1〜3で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加しており、且つ/或いは、
配列番号4〜6で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加している)
ことを特徴とする請求項2〜4のいずれか1項記載の抗体。 - 該軽鎖可変領域が配列番号7で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む、請求項5記載の抗体。
- ヒト抗体である、請求項1〜6のいずれか1項記載の抗体。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載の抗体を含む医薬組成物。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項9記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項10記載のベクターを含む形質転換体。
- ヒトアグリカナーゼに特異的に結合し、且つ該アグリカナーゼのアグリカナーゼ活性を阻害する抗体を含む、関節炎の予防又は治療剤。
- ヒトアグリカナーゼがヒトADAMTS4である、請求項12記載の剤。
- 抗体が請求項1〜7のいずれか1項記載の抗体である、請求項12又は13記載の剤。
- 哺乳動物に対して、ヒトアグリカナーゼに特異的に結合し、且つ該アグリカナーゼのアグリカナーゼ活性を阻害する抗体の有効量を投与することを含む、当該哺乳動物における関節炎の予防又は治療方法。
- ヒトアグリカナーゼがヒトADAMTS4である、請求項15記載の方法。
- 抗体が請求項1〜7のいずれか1項記載の抗体である、請求項15又は16記載の方法。
- 関節炎の予防又は治療において使用するための、ヒトアグリカナーゼに特異的に結合し、且つ該アグリカナーゼのアグリカナーゼ活性を阻害する抗体。
- ヒトアグリカナーゼがヒトADAMTS4である、請求項18記載の抗体。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載の抗体である、請求項18又は19記載の抗体。
- 関節炎の予防又は治療剤を製造するための、ヒトアグリカナーゼに特異的に結合し、且つ該アグリカナーゼのアグリカナーゼ活性を阻害する抗体の使用。
- ヒトアグリカナーゼがヒトADAMTS4である、請求項21記載の使用。
- 抗体が請求項1〜7のいずれか1項記載の抗体である、請求項21又は22記載の使用。
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