JP2004244339A - Ａｄａｍｔｓ４の機能阻害剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】ＡＤＡＭＳＴ４の機能を抑制する薬剤、およびＡＤＡＭＳＴ４を標的分子とする医薬品のためのスクリーニング方法の提供を課題とする。
【解決手段】ＡＤＡＭＴＳ４の生理学的意義を明らかにするために、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子欠損マウスを作製し解析を行った結果、ＡＤＡＭＴＳ４が発生の初期段階で決定的な役割を果たしていることが明らかになった。ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現の抑制あるいは活性の抑制に基づいた避妊薬となるものと考えられる。また、ＡＤＡＭＳＴ４を標的分子とすることにより、上記避妊のための医薬品のスクリーニングが可能である。
【選択図】 なし
【解決手段】ＡＤＡＭＴＳ４の生理学的意義を明らかにするために、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子欠損マウスを作製し解析を行った結果、ＡＤＡＭＴＳ４が発生の初期段階で決定的な役割を果たしていることが明らかになった。ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現の抑制あるいは活性の抑制に基づいた避妊薬となるものと考えられる。また、ＡＤＡＭＳＴ４を標的分子とすることにより、上記避妊のための医薬品のスクリーニングが可能である。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【従来の技術】
ほぼ３０種類のＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）ファミリーの分子が分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）からヒトに至る各種生物で同定されている。いずれの分子も保存された特徴的なドメイン構造を有している。Ｎ末端のシグナル配列の後に、プロドメイン、メタロプロテアーゼドメイン、ディスインテグリンドメインおよびＥＧＦリピートを含むシステインに富んだ領域が続く。ほとんどのメンバーは膜貫通性ドメインを有し、その後にＣ末端細胞質テールを含んでいる。
【０００２】
ＡＤＡＭは細胞接着や細胞表面分子のタンパク質分解プロセッシング等の多様な過程に関係することが示されている。精子のヘテロ二量体タンパク質であるファーティリン（ｆｅｒｔｉｌｉｎ）αおよびβ（ＡＤＡＭ１およびＡＤＡＭ２）ならびにｃｙｒｉｔｅｓｔｉｎ（ＡＤＡＭ３）は、受精中の精子−卵融合に必須である（非特許文献１参照）。メルトリン（Ｍｅｌｔｒｉｎ）α（ＡＤＡＭ１２）は、筋肉発生における筋芽細胞融合に何らかの役割を担っている（非特許文献２参照）。ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ１７）は、細胞外ＴＮＦα等の細胞表面膜貫通性増殖因子における活性領域のタンパク質分解・放出に関係している（非特許文献３参照）。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のメタロプロテアーゼディスインテグリンＫＵＺ（ｋｕｚｂａｎｉａｎ、線虫のＳＵＰ−１７、哺乳動物のＡＤＡＭ１０）（非特許文献４参照）は、ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）およびノッチリガンドＤｅｌｔａ（非特許文献５および６参照）のプロセッシングが関連した神経発生に重要である。ＭＤＣはヒト乳癌の腫瘍サプレッサー分子の候補であり、ＭＳ２はマクロファージ表面抗原である。しかしながら、ＡＤＡＭファミリーの大部分のメンバーに関しては、生理学的機能が未解明のままである。
【０００３】
ＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）は、ＡＤＡＭのサブファミリーであり、哺乳動物および無脊椎動物のいずれにも見いだされる新規な細胞外プロテアーゼファミリーである。現在のところ、哺乳動物のＡＤＡＭＴＳファミリーは１４種のメンバーからなる。このファミリーのメンバーは、トロンボスポンジン１様の繰り返し配列を複数コピー含み、Ｃ末端領域（非特許文献７参照）の膜貫通性ドメインが欠けている等の性質から、他のＡＤＡＭファミリーメンバーとは異なっている。従って、ほとんどが細胞表面に局在するＡＤＡＭファミリーメンバーとは異なり、ＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーは、細胞外マトリックスタンパク質を構成していると考えられる（非特許文献８参照）。
【０００４】
ＡＤＡＭＴＳ１を最初に発見したのは久野らである。これは、癌悪液質を誘起するマウス大腸癌細胞株で選択的に発現する遺伝子である。リポ多糖（ＬＰＳ）で誘導されるマウスの全身性炎症によって、心臓および腎臓でＡＤＡＭＴＳ１の選択的発現が高まった（非特許文献９参照）。このことは、ＡＤＡＭＴＳ１の役割が炎症反応に関係している可能性を示唆するものである。
【０００５】
哺乳動物細胞で調製した組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１およびその近縁の相同体であるＡＤＡＭＴＳ８は、角膜ポケットアッセイにおいてＦＧＦ−２誘導性の血管形成を抑制した。また、漿尿膜アッセイにおいてＶＥＧＦ誘導性血管形成を阻害した。また、いずれのタンパク質も、内皮細胞の増殖を阻害したが、線維芽細胞もしくは平滑筋細胞の増殖を阻害することはなかった（非特許文献１０参照）。
【０００６】
マウスＡＤＡＭＴＳ１遺伝子の破壊によって、さらに生理学的機能が明らかになった。ＡＤＡＭＴＳ１−／−マウスでは、著しい成長遅滞と脂肪組織の形成不全を示した。また、子宮と卵巣が組織学的に変化しており、雌の受精能が低下した。さらに、毛細血管形成を伴わない異常な副腎髄質構造がみられた。さらに著しいのは、腎杯が肥大し、尿管腎盂移行部から尿管にかけて繊維化が起こっていたことである（非特許文献１１参照）。このような特異的な形質は、ＡＤＡＭＴＳ１の転写産物が腎臓に豊富に存在することと一致し、器官形成中に起こる細胞外マトリックスのリモデリングにプロテアーゼ活性が重要であることを支持する。さらに、最近、ＡＤＡＭＴＳ１が、ディファレンシャルディスプレー法を用いてラット内皮細胞からクローン化された。この転写産物のレベルは、肝硬変状態にある肝臓内皮細胞において下方制御される。このことは、ＡＤＡＭＴＳ１が肝臓の線維化の過程でも重要であることを示唆するものである。
【０００７】
ヒトのエーラース−ダンロス症候群（Ｅｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＥＤＳ）は、皮膚、関節、血管および靱帯等の生体力学的性質の変化によって特徴付けられる一群の先天性結合組織疾患である。ＶＩＩＣ型ＥＤＳおよびウシの皮膚剥離症（ｄｅｒｍａｔｏｓｐａｒａｓｉｓ）、ウシおよびヒツジにおける類似した疾患は、Ｉ型プロコラーゲンのＮ末端プロセッシング異常による皮膚の重度の脆弱性によって特徴付けられる。ＡＤＡＭＴＳ２はプロコラーゲンＮプロテアーゼであることが報告されている。Ｃｏｌｉｇｅらは、ヒトＡＤＡＭＴＳ２遺伝子をクローン化し、複数のＶＩＩＣ型ＥＤＳ患者の変異、および皮膚剥離疾患の仔牛における対応する変異を同定した（非特許文献１２参照）。こうして、ＡＤＡＭＴＳファミリーの中でも、ＡＤＡＭＴＳ２は、その生理学的基質、および対応する遺伝的疾患が初めて同定されたメンバーである。
【０００８】
最近、ＡＤＡＭＴＳファミリーの他のメンバーが関係する遺伝性疾患が明らかにされた。Ｇａｌｌｉａらは、ヒト先天性血栓性血小板減少性紫斑（ＴＴＰ）の４家系についてゲノムの連鎖解析を実施し、ＡＤＡＭＴＳ１３の欠損がＴＴＰの分子論的機序であることを示す１２種類の変異を、ＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子中に同定した（非特許文献１３参照）。
【０００９】
ＡＤＡＭＴＳ４およびＡＤＡＭＴＳ５は、ＡＤＡＭＴＳ１に非常によく似た相同体であり、インターロイキン１で刺激したウシの関節軟骨細胞の培養培地から精製された（非特許文献１４参照）。これらは、軟骨アグリカンを切断するので、アグリカナーゼ１およびアグリカナーゼ２と命名されている（非特許文献１５参照）。最近の報告よれば、ヒト抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体のみでアグリカン切断活性の７５％を阻害することから（非特許文献１６参照）、ＡＤＡＭＴＳ４はアグリカン切断に最も重要なプロテアーゼであると考えられている。慢性関節リウマチ（ＲＡ）および変形性関節症（ＯＡ）の場合には、ＡＤＡＭＴＳ４はアグリカンを球間ドメイン（ＩＧＤ）のＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４結合部位で切断し、軟骨を分解する（非特許文献１７参照）。さらに、最近では、内因性ＴＩＭＰ−３阻害因子が、ＡＤＡＭＴＳ４活性を阻害することが報告されている（非特許文献１８参照）。
【００１０】
アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）は単に、ＡＤＡＭＴＳ４の生理学的基質であるだけではない。ブレビカン（ｂｒｅｖｉｃａｎ）は、脳特異的細胞外マトリックスとしてのプロテオグリカンであり、ヒトおよびラットの神経膠腫細胞株ではその発現が大幅に増加している。最近の報告では、高度に浸潤的なＣＮＳ−１神経膠腫細胞株の脳内移植片の浸潤においてブレビカンの合成と切断が一定の役割を果たしており（非特許文献１９参照）、ＡＤＡＭＴＳ４はブレビカンの切断活性に重要であることが示されている。ＡＤＡＭＴＳ４は、バーシカン（ｖｅｒｓｉｃａｎ）等の他のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンをインビトロで切断することもできる（非特許文献２０参照）。ＡＤＡＭＴＳ４の転写産物のレベルに関しては、成体の組織では遍在性であり、脳、心臓および肺でより多く発現している。例えば、軟骨細胞および軟骨の外植培養片では、レチノイン酸およびフィブロネクチンの断片（非特許文献２１参照）、およびＩＬ−１、ＴＮＦα、ＩＬ−６（非特許文献２２参照）、ＩＬ−１７（非特許文献２３参照）等の複数のサイトカイン類によってＡＤＡＭＴＳ４による切断が誘導される（非特許文献２４参照）。ＦＬＳ（線維芽細胞様の滑膜細胞）では、ＴＧＦβによって、ＡＤＡＭＴＳ４の遺伝子発現が大幅に増加する（非特許文献２５参照）。βアミロイドで処理した場合にも、ラットの星状細胞でＡＤＡＭＴＳ４の転写産物レベルが亢進した（非特許文献２６参照）。このことは、脳の細胞外マトリックスの分解によってアルツハイマー疾患が増悪することと関連があることを示唆する。さらに、管状構造に分化しつつあるヒト内皮細胞の遺伝子の差分発現プロフィールを調べるための新規のｍＲＮＡ包括プロフィール化技術を用いることによって、内皮管状形成中にＡＤＡＭＴＳ４が上方制御されることが明らかになった（非特許文献２７参照）。このことは、この酵素が血管のプロテオグリカンの代謝に潜在的な役割を持つことを示唆するものであり、つまり血管形成に関係することを示唆するものである。
【００１１】
このように、ＡＤＡＭＴＳ４は、細胞外マトリックスタンパク質に結合する広範な活性と機能を備えたメタロプロテアーゼであると考えられているものの、生理学的意義は不明のままであった。
【００１２】
【非特許文献１】
Ｂｌｏｂｅｌ， Ｃ．Ｐ．ら著、「Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ａｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｌｉｇａｎｄ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖｅ ｉｎ ｓｐｅｒｍ−ｅｇｇ ｆｕｓｉｏｎ．」、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２年、Ｖｏｌ．３５６、ｐ．２４８−５２
【非特許文献２】
Ｙａｇａｍｉ−Ｈｉｒｏｍａｓａ， Ｔら著、「Ａ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ−ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｎｇ ｉｎ ｍｙｏｂｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ．」、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５年、Ｖｏｌ．３７７、ｐ．６５２−６．
【非特許文献３】
Ｂｌａｃｋ， Ｒ．Ａ．ら著、「Ａ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ｔｈａｔ ｒｅｌｅａｓｅｓ ｔｕｍｏｕｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ− ａｌｐｈａ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ １９９７年、Ｖｏｌ．３８５、ｐ．７２９−３３
【非特許文献４】
Ｗｅｎ， Ｃ．外２名著、「ＳＵＰ−１７， ａ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＡＤＡＭ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＫＵＺＢＡＮＩＡＮ， ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ＬＩＮ−１２／ＮＯＴＣＨ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９７年、Ｖｏｌ．１２４、ｐ．４７５９−６７
【非特許文献５】
Ｐａｎ， Ｄ． および Ｒｕｂｉｎ， Ｇ．Ｍ著、「Ｋｕｚｂａｎｉａｎ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｌａｔｅｒａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｎｄ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．」、Ｃｅｌｌ、１９９７年、Ｖｏｌ．９０、ｐ．２７１−８０
【非特許文献６】
Ｑｉ， Ｈ．ら著、「Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｔｃｈ ｌｉｇａｎｄ ｄｅｌｔａ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ Ｋｕｚｂａｎｉａｎ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、Ｖｏｌ．２８３、ｐ．９１−４
【非特許文献７】
Ｋｕｎｏ， Ｋ．ら著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ− ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｍｏｔｉｆｓ ａｓ ａｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ．」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ 、１９９７年、Ｖｏｌ．２７２、ｐ．５５６−６２
【非特許文献８】
Ｋｕｎｏ， Ｋ． および Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ， Ｋ．著、「ＡＤＡＭＴＳ−１ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｃｈｏｒｓ ａｔ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｔｙｐｅ Ｉ ｍｏｔｉｆｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｐａｃｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ．」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ 、１９９８年、Ｖｏｌ．２７３、ｐ．１３９１２−７
【非特許文献９】
Ｋｕｎｏ， Ｋ．外３名著、「Ｔｈｅ ｅｘｏｎ／ｉｎｔｒｏｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ＡＤＡＭＴＳ−１ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ＡＤＡＭ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ＴＳＰ ｍｏｔｉｆｓ．」、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ 、１９９７年、Ｖｏｌ．４６， ｐ．４６６−７１
【非特許文献１０】
Ｖａｚｑｕｅｚ， Ｆ．ら著、「ＭＥＴＨ−１， ａ ｈｕｍａｎ ｏｒｔｈｏｌｏｇ ｏｆ ＡＤＡＭＴＳ−１， ａｎｄ ＭＥＴＨ−２ ａｒｅ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ａｎｇｉｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ．」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ 、１９９９年、Ｖｏｌ．２７４、ｐ．２３３４９−５７
【非特許文献１１】
Ｓｈｉｎｄｏ， Ｔ．ら著、「ＡＤＡＭＴＳ−１： ａ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ， ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ， ａｎｄ ｏｒｇａｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．」、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ 、２０００年、Ｖｏｌ．１０５、ｐ．１３４５−５２
【非特許文献１２】
Ｃｏｌｉｇｅ， Ａ．ら著、「Ｈｕｍａｎ Ｅｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｙｐｅ ＶＩＩ Ｃ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｄｅｒｍａｔｏｓｐａｒａｘｉｓ ａｒｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ Ｎ−ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ．」、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ 、１９９９年、Ｖｏｌ．６５、ｐ．３０８−１７
【非特許文献１３】
Ｌｅｖｙ， Ｇ．Ｇ．ら著、「Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＡＭＴＳ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｃａｕｓｅ ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ．」、Ｎａｔｕｒｅ 、２００１年、Ｖｏｌ．４１３， ｐ．４８８−９４
【非特許文献１４】
Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ， Ｍ．Ｄ．ら著、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−１： ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＡＭＴＳ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ 、１９９９年、Ｖｏｌ．２８４、ｐ．１６６４−６
【非特許文献１５】
Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ， Ｍ．Ｄ．外３名著、「Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＡＤＡＭ−ＴＳ４ （ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−１） ａｎｄ ＡＤＡＭ−ＴＳ５ （ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−２） ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．」、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ 、２００１年、Ｖｏｌ．９、ｐ．５３９−５２
【非特許文献１６】
Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｈ．ら著、「Ｂｒｅｖｉｃａｎ ｉｓ ｄｅｇｒａｄｅｄ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−１ （ＡＤＡＭＴＳ４） ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｔｅｓ．」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ 、２０００年、Ｖｏｌ．２７５、ｐ．３８８８５−９０
【非特許文献１７】
Ｓａｎｄｙ， Ｊ．Ｄ．外３名著、「Ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ａｇｇｒｅｃａｎ ｉｎ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍａｊｏｒ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｇｌｏｂｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ．」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ 、１９９１年、Ｖｏｌ．２６６、ｐ．８６８３−５
【非特許文献１８】
Ｋａｓｈｉｗａｇｉ， Ｍ．外３名著、「ＴＩＭＰ−３ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ １ （ＡＤＡＭ−ＴＳ４） ａｎｄ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ ２ （ＡＤＡＭ−ＴＳ５）．」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００１年、Ｖｏｌ． ２７６、ｐ．１２５０１−４
【非特許文献１９】
Ｍａｔｔｈｅｗｓ， Ｒ．Ｔら著、「 Ｂｒａｉｎ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｂｉｎｄｉｎｇ （ＢＥＨＡＢ）／ｂｒｅｖｉｃａｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ ａ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｍｏｔｉｆｓ （ＡＤＡＭＴＳ） ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ．」、２０００年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、Ｖｏｌ． ２７５、ｐ．２２６９５−７０３
【非特許文献２０】
Ｓａｎｄｙ， Ｊ．Ｄ．ら著、「Ｖｅｒｓｉｃａｎ Ｖ１ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｏｒｔａ ｉｎ ｖｉｖｏ ｏｃｃｕｒｓ ａｔ ｔｈｅ Ｇｌｕ４４１− Ａｌａ４４２ ｂｏｎｄ， ａ ｓｉｔｅ ｔｈａｔ ｉｓ ｃｌｅａｖｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＤＡＭＴＳ−１ ａｎｄ ＡＤＡＭＴＳ− ４．」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ 、２００１年、Ｖｏｌ．２７６、ｐ．１３３７２−８
【非特許文献２１】
Ｈｏｍａｎｄｂｅｒｇ， Ｇ．Ａ．外３名著、「Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｃｈｏｎｄｒｏｌｙｓｉｓ ｂｙ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃａｕｓｅｓ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ａｇｇｒｅｃａｎ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｉｔｅ ａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｃａｒｔｉｌａｇｅ．」、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ、１９９７年、Ｖｏｌ．５、ｐ．４５０−３．
【非特許文献２２】
Ｆｌａｎｎｅｒｙ， Ｃ．Ｒ．ら著、「ＩＬ−６ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｕｇｍｅｎｔ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ．」、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ 、２０００年、Ｖｏｌ．１９、ｐ．５４９−５３
【非特許文献２３】
Ｃａｉ， Ｌ．ら著、「Ｐａｔｈｗａｙｓ ｂｙ ｗｈｉｃｈ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １７ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．」、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、２００１年、Ｖｏｌ．１６、ｐ．１０−２１
【非特許文献２４】
Ａｒｎｅｒ， Ｅ．Ｃ．外４名著、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ．」、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ 、１９９８年、Ｖｏｌ．６、ｐ．２１４−２８
【非特許文献２５】
Ｙａｍａｎｉｓｈｉ， Ｙ．ら著、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ ｉｎ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ： ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＴＧＦ− ｂｅｔａ．」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ 、２００２年、Ｖｏｌ．１６８、ｐ．１４０５−１２
【非特許文献２６】
Ｓａｔｏｈ， Ｋ．，外２名著、「ＡＤＡＭＴＳ−４ （ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｍｏｔｉｆｓ） ｉｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ ｔｒｅａｔｅｄ ｒａｔ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．」、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ、２０００年、Ｖｏｌ． ２８９、ｐ．１７７−８０
【非特許文献２７】
Ｋａｈｎ， Ｊ． ら著、「Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．」、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、２０００年、Ｖｏｌ． １５６， ｐ．１８８７−９００
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＡＤＡＭＳＴ４の生理学的および病理学的な役割を解明することにある。さらに本発明は、この解明された知見を基に、ＡＤＡＭＳＴ４タンパク質の機能阻害物質を有効成分として含有する薬剤、およびＡＤＡＭＳＴ４タンパク質をターゲットとする医薬品のためのスクリーニング方法の提供を目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはＡＤＡＭＴＳ４の生理学的意義を明らかにするために、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子欠損マウスを作製し解析を行った。ＡＤＡＭＴＳ４のヘテロ接合体は外見でも異常がなく生殖も正常だったが、ヘテロ同士を交配しサザンブロットで解析した結果、１８７匹の子供のうちにホモ接合体は観られなかった。ホモ接合体の致死時期を各妊娠段階で調べた結果、妊娠８．５日目の段階でも胚子の存在がなく、子宮には吸収された残留物もないことが分かった。最終的にＩ−ＰＥＰ−ＰＣＲの技術で、８細胞期や２細胞期でホモ接合体を見つけることができた。しかし、胚子の形態が異常で未分裂や断片化を呈していた。さらに受精に関わる他の細胞も調べたところ、ＡＤＡＭＴＳ４が受精卵と続発する発生段階の胚子に特異的に発現していることが分かった。さらに受精卵でＡＤＡＭＴＳ４発現の局在を蛍光免疫染色で明らかにした。インビトロの実験系では受精卵の分裂が抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体によって用量依存的に阻害され、発育阻害された卵子は未分裂や断片化を呈し、形態上はＡＤＡＭＴＳ４ホモ接合体の表現と一致していることが分かった。
【００１５】
ＡＤＡＭファミリーメンバーのファーティリンαおよびβやｃｙｒｉｔｅｓｔｉｎが受精に関与していることがよく知られているが、糖鎖のある細胞外基質を構成するプロテオグライカンを分解するタンパク質としてのＡＤＡＭＴＳ４が発生の初期段階で決定的な役割を果たしていることが本発明者らにより初めて明らかになった。
【００１６】
本発明者らによって今回見出された知見に基づけば、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質を標的とすることにより、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現の阻害あるいは活性の阻害に基づいた医薬品候補化合物をスクリーニングすることが可能である。このスクリーニングにより得られる化合物は、避妊薬となるものと大いに期待される。
【００１７】
例えば、ＡＤＡＭＴＳ４の機能阻害剤あるいは発現阻害剤を受精卵に対して適用することにより、受精卵の発育阻害作用が期待されるため、避妊作用が考えられる。本発明の薬剤はヒトに対して使用する以外に、野生動物または家畜に対しても適用可能である。
【００１８】
即ち、本発明は、ＡＤＡＭＳＴ４タンパク質の機能阻害物質を有効成分として含有する薬剤、およびＡＤＡＭＳＴ４タンパク質をターゲットとする医薬品のためのスクリーニング方法に関し、より具体的には、
〔１〕 ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能阻害物質を有効成分として含有する、受精卵の発育阻害作用を有する薬剤、
〔２〕 ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能阻害物質を有効成分として含有する、避妊用薬剤、
〔３〕 ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能阻害物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を含む、〔１〕または〔２〕に記載の薬剤、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＡＤＡＭＴＳ４タンパク質変異体
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する抗体
（ｃ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する低分子化合物
〔４〕 ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現阻害物質を有効成分として含有する、受精卵の発育阻害作用を有する薬剤、
〔５〕 ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現阻害物質を有効成分として含有する、避妊用薬剤、
〔６〕 ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現阻害物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を含む、〔４〕または〔５〕に記載の薬剤、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写産物、またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現を、ＲＮＡｉ効果による阻害作用を有する核酸
〔７〕 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、不妊症治療のための薬剤、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む、ＡＤＡＭＴＳ４変異体タンパク質であって、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質と機能的に同等なタンパク質
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ
〔８〕 ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質がマウス由来である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の薬剤、
〔９〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊用薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合活性を測定する工程
（ｃ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと結合する化合物を選択する工程
〔１０〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊用薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１１〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊用薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１２〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊用薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞へ被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該細胞におけるＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現量または活性を測定する工程、
（ｃ）被検化合物に非存在下において測定した場合と比較して、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現量または活性を低下させる化合物を選択する工程
〔１３〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ＡＤＡＭＴＳ４プロテアーゼ活性阻害剤のスクリーニング方法、
（ａ）プロテオグリカンと、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質および被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のプロテオグリカンを基質とする切断活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記切断活性を低下させる化合物を選択する工程
〔１４〕 プロテオグリカンが、アグリカン、ブレビカン、またはバーシカンである、〔１３〕に記載のスクリーニング方法、
〔１５〕 ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする哺乳動物細胞、を提供するものである。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明者らによって、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子ノックアウトマウスは、初期胚分化が正常に行われず、初期段階で死亡することが見出された。即ち、ＡＤＡＭＴＳ４が発生初期段階で決定的な役割を果たしていることが明らかになった。また、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質は受精卵と続発する発育段階の胚子に特異的に発現しており、さらに、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能を阻害することにより受精卵の発育が阻害されることが示された。従ってＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能阻害物質を有効成分として含有する薬剤は、受精卵の発育を阻害する作用を有するものと考えられる。
【００２０】
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能阻害物質を有効成分として含有する、受精卵の発育を阻害する作用を有する薬剤を提供する。受精卵の発育阻害によって、妊娠の進行が止まり人工的な早産（流産）が誘起されると考えられる。従って、本発明の上記薬剤は、例えば避妊用薬剤として有効である。所謂、中絶用薬剤あるいは堕胎用薬剤もまた、本発明の避妊用薬剤に含まれる。また、本発明の避妊用薬剤は、初期胚分化の段階において適用されることが好ましい。本発明における「初期」の胚とは、通常、８細胞期以前の段階の胚を指すが、必ずしもこの段階に限定されるものではない。
【００２１】
さらに本発明は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能阻害物質を有効成分として含有する薬剤を提供する。該薬剤は、受精卵の発育阻害作用を有する薬剤であり、例えば、避妊用薬剤である。本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能を阻害する物質は、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＡＤＡＭＴＳ４タンパク質変異体、
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する抗体、
（ｃ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する低分子化合物、からなる群より選択される。
【００２２】
「ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＡＤＡＭＴＳ４タンパク質変異体」とは、該タンパク質をコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す。
【００２３】
また、本発明者らは、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する抗体によって受精卵の分裂が用量依存的に阻害されることを見出した。従って、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する、受精卵の発育を阻害する作用を有する避妊用薬剤を提供する。
【００２４】
ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する抗体（抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体）は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質、あるいはＧＳＴとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントＡＤＡＭＴＳ４タンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質若しくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
【００２５】
本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する限り、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかに、ヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。
【００２６】
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばマウス、ヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。
【００２７】
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が挙げられる。本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。
【００２８】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウィルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
【００２９】
本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する抗体は、例えば、避妊を目的とした使用が考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
【００３０】
さらに、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能を阻害し得る物質として、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する低分子量物質も含有する。本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する低分子量物質は、天然または人工の化合物であってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いることによって製造または取得可能な化合物である。また本発明の化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することが可能である。低分子化合物には、例えば、低分子プロテアーゼ阻害剤が挙げられる。
【００３１】
また、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現を阻害する物質を有効成分として含有する薬剤を提供する。該薬剤は、受精卵の発育を阻害する作用を有する薬剤であり、例えば、避妊用薬剤となるものと考えられる。ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現を阻害する物質は、例えば、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写産物、またはその一部に対するアンチセンス核酸、
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸、
（ｃ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果による阻害作用を有する核酸、からなる群より選択される。
【００３２】
本発明における「核酸」とはＲＮＡまたはＤＮＡを意味する。特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上， 新生化学実験講座２ 核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現， 日本生化学会編， 東京化学同人， １９９３， ３１９−３４７．）。
【００３３】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用によりＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現を阻害してもよい。一つの態様としては、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで、所望の動物へ形質転換できる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。
【００３４】
また、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ Ｐに含まれるＭ１ ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子， タンパク質核酸酵素， １９９０， ３５， ２１９１．）。
【００３５】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， １９８８， ２２８， ２２８．）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， １９８８， ２３９， ２８５．、小泉誠および大塚栄子， タンパク質核酸酵素， １９９０， ３５， ２１９１．、Ｋｏｉｚｕｍｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， １９８９， １７， ７０５９．）。
【００３６】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ， ＪＭ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９８６， ３２３， ３４９．）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ， Ｙ． ＆ Ｓａｓａｋｉ， Ｎ．， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， １９９１， １９， ６７５１．、菊池洋， 化学と生物， １９９２， ３０， １１２．）。このように、リボザイムを用いて本発明におけるＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
【００３７】
内在性遺伝子の発現の阻害は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｃｅ；ＲＮＡｉ）によっても行うことができる。ＲＮＡｉとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも阻害される現象のことを指す。ＲＮＡｉの機構の詳細は明らかではないが、最初に導入した二本鎖ＲＮＡが小片に分解され、何らかの形で標的遺伝子の指標となることにより、標的遺伝子が分解されると考えられている。ＲＮＡｉに用いるＲＮＡは、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好ましい。
【００３８】
さらに本発明は、不妊症治療のための薬剤を提供する。該薬剤に含まれる有効成分は、例えば、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質、
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む、ＡＤＡＭＴＳ４変異体タンパク質であって、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質と機能的に同等なタンパク質、
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、のいずれかを含む。
【００３９】
本発明の薬剤の有効成分である「ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質」は、天然のタンパク質の他、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えばＡＤＡＭＴＳ４タンパク質が発現していると考えられる細胞外マトリックス等の組織の抽出液に対し、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。
【００４０】
本発明において、「機能的に同等なタンパク質」とは、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質において明らかにされている活性と同様の活性を備えたタンパク質である。
【００４１】
あるいはＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のアミノ酸配列に対して、たとえば９０％以上、望ましくは９５％以上、更に望ましくは９９％以上の相同性を有するタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質と機能的に同等なタンパク質として示すことができる。
【００４２】
本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質は、その由来する生物に特に制限はなく、例えば、マウス、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、鳥など、ペット、家畜等を挙げることができる。ヒトの疾患の治療や予防に用いる場合には、好ましくは哺乳動物由来であり、最も好ましくはヒト由来である。
【００４３】
また、本発明の薬剤の有効成分であるＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードするＤＮＡもまた、本発明に含まれる。本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードするＤＮＡは、染色体ＤＮＡであっても、ｃＤＮＡであってもよい。ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードする染色体ＤＮＡは、例えば、細胞等から染色体ＤＮＡのライブラリ−を調製し、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードするＤＮＡにハイブリダイズするプローブを用いた、該ライブラリーのスクリーニングにより取得することができる。またＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードするｃＤＮＡは、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質が発現していると考えられる細胞外マトリックス等の組織からＲＮＡ試料を抽出し、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードするＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術により取得することができる。
【００４４】
本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質または該タンパク質をコードするＤＮＡは、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質と機能的に同等であれば、その塩基配列やアミノ配列が改変された変異体であってもよい。このような変異体は、天然のものでも人工のものでもよい。人工的に変異体を調製するための方法は当業者に公知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ， Ｔ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４， ３６７−３８２ （１９８７））、ダブルプライマー法（Ｚｏｌｌｅｒ， Ｍ． Ｊ． ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｍ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４， ３２９−３５０ （１９８７））、カセット変異法（Ｗｅｌｌｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ３４， ３１５−２３ （１９８５））、メガプライマー法（Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． ａｎｄ Ｓｏｍｍｅｒ， Ｓ． Ｓ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８， ４０４−４０７ （１９９０））などが知られている。
【００４５】
本発明の上記薬剤は、例えば、不妊症に対する治療効果を有するものと考えられる。
【００４６】
本発明におけるＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードする遺伝子は、マウスをはじめ、種々の哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、鳥など、ペット、家畜等において存在することが知られている。
【００４７】
本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のアミノ酸配列、および該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列についての情報は、当業者においては、ＧｅｎＢａｎｋ等の公共の遺伝子データベースを利用して、容易に取得することができる。例えば、マウスＡＤＡＭＴＳ４遺伝子のＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号は、ＮＭ＿１７２８４５である。また、マウスＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の塩基配列を配列番号：１に、また該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００４８】
また本発明は、避妊用薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００４９】
その一つの態様は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合を指標とする方法である。通常、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと結合する化合物は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能を阻害する効果を有することが期待される。本発明の上記方法においては、まず、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物を接触させる。ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドは、被検化合物との結合を検出するための指標に応じて、例えば、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドの精製された形態、細胞内または細胞外に発現した形態、あるいはアフィニティーカラムに結合した形態であり得る。この方法に用いる被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
【００５０】
本方法においては、次いで、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合を検出する。ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合は、例えば、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドに結合した被検化合物に付された標識によって検出することができる。また、細胞内または細胞外に発現しているＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドへの被検化合物の結合により生じるＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の活性の変化を指標として検出することもできる。
【００５１】
本方法においては、次いで、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと結合する被検化合物を選択する。
【００５２】
本方法により単離される化合物は、受精卵の発育阻害作用を有することが期待され、例えば、避妊用薬剤として有用である。また、不妊症のメカニズム解明の研究等に有用である。
【００５３】
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現を指標とする方法である。ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現量を低下させるような化合物は、避妊のための医薬品候補化合物となることが期待される。
【００５４】
本方法においては、まず、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、鳥など、ペット、家畜等に由来する細胞が挙げられるが、これら由来に制限されない。「ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞」としては、内因性のＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現している細胞、または外因性のＡＤＡＭＴＳ４遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外因性のＡＤＡＭＴＳ４遺伝子が発現した細胞は、通常、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
【００５５】
本方法に用いる被検化合物としては、特に制限はない。例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。
【００５７】
本方法においては、次いで、該ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現レベルを測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞からｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。また、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。さらに、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。
【００５８】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、避妊のための医薬品候補化合物となる。さらに、上記発現レベルを上昇させる化合物は、不妊症の治療のための薬剤となることが期待される。
【００５９】
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、本発明のＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現量を低下させるような化合物を、レポーター遺伝子を利用して同定する方法に関する。
【００６０】
本方法においては、まず、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。ここで「機能的に結合した」とは、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。
【００６１】
本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなく、例えば、ＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびＧＦＰ遺伝子等が挙げられる。「ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」として、例えば、このような構造が挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのＤＮＡ構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。
【００６２】
「ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを添加したものを挙げることができる。
【００６３】
本方法における「接触」は、「ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、または該ＤＮＡを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である。
【００６４】
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。
【００６５】
本方法においては、次いで、測定したレポーター遺伝子の発現レベルを、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、低下させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、避妊のための医薬品候補化合物となる。
【００６６】
また、本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質は、アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）、ブレビカン（ｂｒｅｖｉｃａｎ）、バーシカン（ｖｅｒｓｉｃａｎ）等のプロテオグリカンを基質として切断するプロテアーゼ活性を有する。従って、ＡＤＡＭＴＳ４のプロテオグリカンに対する切断活性を指標とすることにより、ＡＤＡＭＴＳ４プロテアーゼ活性阻害剤のスクリーニングを行うことが可能である。即ち、切断活性を低下させるような化合物は、プロテアーゼ阻害剤となるものと期待される。本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ＡＤＡＭＴＳ４プロテアーゼ活性阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
（ａ）プロテオグリカンと、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質および被検化合物とを接触させる工程、
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のプロテオグリカンを基質とする切断活性（プロテアーゼ活性）を測定する工程、
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記切断活性を低下させる化合物を選択する工程
【００６７】
通常、ペプチドの切断（プロテアーゼ活性）を検出することは、当業者においては簡便に行い得ることであり、上記工程（ｂ）の切断活性の測定は、一般的な方法、例えば、アクリルアミドゲル電気泳動法、または質量分析装置等を利用した方法により、適宜、実施することが可能である。
【００６８】
本発明の方法のＡＤＡＭＴＳ４のプロテアーゼ活性の基質となり得るプロテオグリカンとしては、好ましくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを挙げることができる。本発明のプロテオグリカンの具体例としては、例えば、アグリカン、ブレビカン、バーシカンを好適に例示することができる。これらのプロテオグリカンは、ＡＤＡＭＴＳ４が切断し得る部位（領域）を含むものであれば、上記プロテオグリカンを構成する部分断片（部分ペプチド）であってもよい。例えば、本発明の方法においてアグリカンの部分断片を用いる場合には、球間ドメイン（ＩＧＤ）のＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４を含む部分断片であることが好ましい。
【００６９】
また、上記方法に使用するＡＤＡＭＴＳタンパク質は、変異を含まない全長タンパク質であることが好ましいが、プロテアーゼ活性を有するものであれば、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の一部のアミノ酸配列が置換・欠失されたタンパク質であってもよい。
【００７０】
本発明の上記方法によって取得されるＡＤＡＭＴＳ４プロテアーゼ活性阻害剤は、避妊用薬剤となるものと期待される。従って、上記工程（ａ）〜（ｃ）を含む避妊用薬剤の候補化合物のスクリーニング方法もまた、本発明に含まれる。
【００７１】
本発明の薬剤の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、
ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００７２】
上記薬剤の剤型の種類としては、例えば経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。また、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードするＤＮＡを生体内に投与する場合には、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターを利用することができる。投与方法としては、ｉｎ ｖｉｖｏ法およびｅｘ ｖｉｖｏ法を例示することができる。
【００７３】
本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。
【００７４】
さらに、本発明は、ＡＤＭＡＴＳ４遺伝子の発現が人為的に抑制されている哺乳動物細胞に関する。本発明者らは、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現が人為的に抑制されている遺伝子改変哺乳動物細胞の解析を行うことで、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の人為的な抑制が、初期胚の分裂異常および胚の致死に対して関連性があることを見出した。従って、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現の抑制あるいは活性の抑制に関連する疾患のモデル細胞として有用なＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現が人為的に抑制されている遺伝子改変哺乳動物細胞を提供する。このような遺伝子改変哺乳動物細胞は、不妊症治療のための薬剤のスクリーニングに用いることが可能であり、また、不妊症のメカニズム解明の研究等に有用である。
【００７５】
本発明の上記細胞を利用したスクリーニング方法においては、まず被検化合物をＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現を人為的に抑制した哺乳動物細胞と接触させる。次いで、該細胞におけるＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現の抑制あるいは活性の抑制に関連する変化を検出し、被検化合物を投与していない場合（対照）と比較して、そのような変化を起こさせない化合物を選択する。
【００７６】
本方法において「遺伝子の発現を人為的に抑制」とは、完全な抑制および部分的な抑制の両方が含まれる。また遺伝子対の一方の発現が抑制されている場合も含まれる。抑制する方法として、当業者においては一般的に公知の方法によって行うことができる。例えば、遺伝子改変技術（標的遺伝子部位の組み換えを促進する酵素、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘにおけるＣｒｅ、の導入による条件的遺伝子改変技術も含む）を用いた方法、アンチセンスＤＮＡを用いた方法、または、ＲＮＡｉ技術を用いた方法等が挙げられる。
【００７７】
本方法における「哺乳動物細胞」とは、ヒトを含む脊椎動物や無脊椎動物の細胞を意味する。具体的には、ヒト、またはマウスやラット等のげっ歯類由来の細胞を挙げることができるが、最も好適にはマウス由来の細胞である。
【００７８】
遺伝子改変動物の作製は、例えば次にようにして行うことができる。まず、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片をクローニングして、これを基に、内在性の標的遺伝子改変のための相同組み換え用ベクターを構築する。該相同組み換え用ベクターには、標的遺伝子またはその発現制御領域の少なくとも１部を欠失および／または変異させた核酸配列、標的遺伝子またはその発現制御領域にヌクレオチドやポリヌクレオチドが挿入された核酸配列、標的遺伝子またはその発現制御領域に他の遺伝子が挿入された核酸配列を含むが、標的遺伝子の活性が失われる核酸配列であれば、前記の欠失および／または変異部位および挿入部位は限定されない。
【００７９】
挿入される遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素遺伝子等が挙げられる。また、これらの組み合わせも考えられる。該相同組み換え用ベクターの基本骨格は、特に、制限はなく、ｐＫＯＮｅｏ（レキシコン）等を用いることができる。
【００８０】
構築した相同組み換え用ベクターを、個体へ分化させることが可能な哺乳動物細胞（例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞））に導入し、内因性の標的遺伝子との相同組み換えを行うことで、遺伝子改変哺乳動物細胞を作製する。遺伝子対の双方の発現が抑制されている該細胞を作製するには、例えば、高濃度のネオマイシンで細胞を選択する方法で得ることが可能である。相同組み換え用ベクターの細胞への導入は、当業者に公知の方法によって行うことができる。具体的には、エレクトロポレーション法等を例示することができる。
【００８１】
本方法において個体へ分化させることが可能な動物細胞としてＥＳ細胞を用いた場合は、例えば、該細胞を胚盤胞に注入することによりキメラ胚を作製し、偽妊娠させた動物の子宮に移植して産仔を得る。遺伝子改変ＥＳ細胞由来の組織を有するキメラ動物を選別できるようにするために、より好適には、作製された個体の外部的特徴（例えば、毛色）が、遺伝子改変ＥＳ細胞由来の組織と胚盤胞由来の組織とで異なるように、胚盤胞を選択する。また、遺伝子改変ＥＳ細胞由来の生殖組織を有するキメラ動物であるか否かの判定は、一般的には、該キメラ哺乳動物と適当な系統の同種哺乳動物との交配により得られた仔の毛色で行うが、その他の方法として、例えば、該キメラ哺乳動物の生殖細胞から抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を行い、挿入された遺伝子の有無を検出する方法を用いることも可能である。
【００８２】
該キメラ動物と適当な系統の同種動物との交配により得られた仔が、ヘテロ接合型遺伝子改変動物であるか否かは、例えば、該動物細胞から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲやサザンハイブリダイゼーションで判定することができる。また、ヘテロ接合型遺伝子改変動物同士の交配により、ホモ接合型遺伝子改変動物細胞を作製することができる。交配により得られた細胞が、ホモ接合型遺伝子を有する改変動物細胞であるか否かも上記の判定法に従い実施することができる。
【００８３】
遺伝子改変動物細胞の作製は、上記の方法に制限されない。例えば、体細胞クローン動物の作製技術に従って遺伝子改変動物細胞を作製することもできる。具体的には、ＥＳ細胞以外の体細胞（例えば、皮膚細胞等）を用いて、ＥＳ細胞の場合と同様な方法に従って遺伝子改変動物細胞を作製することができる。
【００８４】
さらに本発明は、不妊症の検査方法に関する。本実施例においてＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能が阻害されると、胚発生の初期段階で細胞分裂に異常を示した。従って、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の変異や発現状態を指標とすることにより、不妊症の検査を行うことが可能である。
【００８５】
また本発明は、不妊症の検査方法に用いられる検査薬に関する。その一つの態様は、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子または該遺伝子の制御領域にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む検査薬である。
【００８６】
該オリゴヌクレオチドは、好ましくはＡＤＡＭＴＳ４遺伝子または該遺伝子制御領域の塩基配列に特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，第２版１９８９に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。
【００８７】
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子または該遺伝子制御領域の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。上記の領域としては、例えば、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子のエクソン領域、イントロン領域、プロモーター領域、エンハンサー領域等を挙げることができる。
【００８８】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子または該遺伝子制御領域の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。プローブがハイブリダイズする領域としては、例えば、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子のエクソン領域、イントロン領域、プロモーター領域、エンハンサー領域等が挙げられる。
【００８９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【００９０】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００９１】
本発明の検査薬の他の一つの態様として、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する抗体を含む検査薬を挙げることができる。抗体は、検査に用いることが可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばポリクローナル抗体やモノクローナル抗体が挙げられる。抗体は必要に応じて標識される。これら抗体は上述の方法によって作製することができる。
【００９２】
本発明の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【００９３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
〔実施例１〕 ＡＤＡＭＴＳ４のゲノムクローンの単離
ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により、ＡＤＡＭＴＳ４の６８０塩基対からなるプローブをマウス１３．５日胚のｃＤＮＡから増幅した。用いた２つのプライマーを以下に示す。
・フォーワードプライマー：５’−ｔｔｔｇａｃａｃａｇｃｃａｔｔｃｔｇｔｔ（配列番号：３）
・リバースプライマー：５’−ｔｇｇａｇｃａｇｔｃａｃｃｃｃａｔｇｇ（配列番号：４）
【００９４】
上記プライマーの塩基配列は公開済みのヒトＡＤＡＭＴＳ４の配列（ＥＳＴ ＡＢ０１４５８８）に基づいて設計した。ＰＣＲ産物は、ｐＣＲＴＭＩＩ−ＴＯＰＯ ＴＡベクター（インビトロジェン、米国）にクローン化した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いてプラスミドを精製し、Ｍ１３フォーワードプライマーおよびＭ１３リバースプライマーを用いてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０遺伝子解析装置により配列を決定した。クローン番号１２のｃＤＮＡクローンの配列は、ＡＢ０１４５８８に対し８７％の相同性を示した。このことは、実際に得られたクローンがマウスＡＤＡＭＴＳ４遺伝子に対応することを示している。
【００９５】
クローン番号１２のプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ＱＩＡＥＸＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて、ＤＮＡ断片を０．７％アガロースから抽出し、プローブとして用いた。このｃＤＮＡプローブを３２Ｐ−ｄＣＴＰ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）で標識し、λＦＩＸＩＩベクター（ストラタジーン）に挿入された１２９ｓｖｊ株に由来するマウスのゲノムライブラリーのスクリーニングに用いた。１ ｘ １０７個のプラークから陽性クローンが１個得られた。標準的なアルカリ溶解法を用いて、ファージＤＮＡを単離した。ファージＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｐｏＩ、ＸｈｏＩ（宝酒造、Ｊａｐａｎ）で消化し、制限酵素地図を作製した。このゲノムクローンの制限酵素地図を図１に示す。上記のプローブを用いたサザンブロット分析で、エクソンを含むと考えられる断片を同定した。さらに配列解析を行うために、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等の制限酵素によって得られた消化断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋ ベクター（ストラタジーン）にサブクローニングし、配列を決定した。ゲノムクローンはそのサイズが約１３．９ｋｂであった。この配列をヒトおよびラットのＡＤＡＭＴＳ４ ｃＤＮＡ配列およびゲノム配列と比較し、エクソン−イントロン境界の正確な位置を決定した。表１に、マウスＡＤＡＭＴＳ４のエクソン／イントロン境界を示す。エクソン配列を大文字で示す。イントロンのスプライス部位のヌクレオチドコンセンサス配列は太文字で示す。この表１から分かるようにエクソン／イントロン境界の配列は、報告されているスプライスドナー（ＧＴ）およびアクセプター（ＡＧ）のコンセンサス配列と合致する。このゲノムＤＮＡは、エクソン１〜９を含む領域を含んでいた。
【００９６】
【表１】
【００９７】
マウスＡＤＡＭＴＳ４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、エクソンをつなぎ合わせ、ヒトＡＤＡＭＴＳ４の配列と比較して構築した。この配列は、長さが２５０２塩基対であり、８３４アミノ酸をコードする（図２、配列番号：１および２）。このＯＲＦは、典型的なシグナル配列をＮ末端に含み、その後ろにｃｙｓ１９０にシステインスイッチと推定されるプロペプチドドメイン、および触媒ドメインの前に潜在的ｆｕｒｉｎ開裂部位を含む。触媒ドメインは、ＭＭＰとＡＤＡＭに存在するｚｉｎｃ結合に類似したモチーフであるＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨ モチーフを含む。また、ＡＤＡＭＴＳ４はディスインテグリン様ドメインを含むが、膜貫通性ドメインもしくは細胞質テールは有していない。その代わり、ＣＯＯＨ末端ドメインにＡＤＡＭＴＳ１に存在するものと類似したトロンボスポンジンのＩ型モチーフを有している。
【００９８】
また、ＡＤＡＭＴＳ４アミノ酸配列のメタロプロテイナーゼドメインとＡＤＡＭＴＳ１およびＡＤＡＭＴＳ５のアミノ酸配列を比較したところ、それぞれ同一性が５０％および４０％という結果になった（図３）。
【００９９】
〔実施例２〕 ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子ターゲティング
マウスＡＤＡＭＴＳ４遺伝子のゲノム構造および機能性ドメインに基づき、機能的にプロテオグリカンを切断するメタロプロテアーゼドメインがエクソン３に存在することが分かった。図４に示すように、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を破壊するターゲティングベクターは、エクソン２〜４を含む２．０ｋｂのＡｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をネオマイシン耐性遺伝子およびそれと隣接したチミヂンキナーゼ遺伝子で置換することによって構築した。ＮｏｔＩによりこのプラスミドを線状化し、エレクトロポレーションで胚性幹（ＥＳ）細胞１２９／ＳＭ−１に導入した。ＥＳ細胞を、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８および２μｍｏｌ／ｌのガンシクロビルを含む培地で選択した。ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡを単離し、ＸｈｏＩで消化して電気泳動を行った。プローブ１もしくはプローブ２のいずれかを用いて、得られた相同組換え体をサザンブロット分析によって確認した。
【０１００】
さらに、ターゲティングしたＥＳ細胞クローンをＣ５７ＢＬ／６の胚盤胞に注入して、キメラを作製した。次に、キメラをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配した。ヘテロ接合体ＡＤＡＭＴＳ４ ＋／−マウスは生存可能であり、成体に至るまで生存し、見かけ上は正常でかつ受精可能であった。
【０１０１】
〔実施例３〕 ＡＤＡＭＴＳ＋／−マウス交配より得た仔の遺伝子型分析
マウス発生におけるＡＤＡＭＴＳ４遺伝子欠失の効果を明らかにする目的で、ホモ接合体ＡＤＡＭＴＳ４−／−の仔を得るために、ＡＤＡＭＴＳ４＋／−マウス同士を交配した。ＡＤＡＭＴＳ＋／−マウス同士の異種交配あるいは野生型マウスとＡＤＡＭＴＳ＋／−マウスの交配により得た仔マウスのゲノムＤＮＡ２０μｇを、サザンブロット分析に供した。
【０１０２】
しかしながら、離乳時に遺伝子型を調べた個体１８７匹中には１匹もＡＤＡＭＴＳ４−／−マウスはいなかった。得られた仔の遺伝的分布については、ヘテロ接合体と野生型同腹子間の出生率の比が約２対１（１２７／６０）で、雄対雌の分布は同等（９０／９７）（表２）であり、このことはヌル変異が劣性で胚性致死であり、この致死率が精子・卵融合によるものではないことを示唆している。
【０１０３】
【表２】
【０１０４】
更に、ターゲッティングによるＡＤＡＭＴＳ４の破壊効果を調べるために、実施例４に示すようにマウスゲノムＤＮＡのサザンブロット分析（図５Ａ）、実施例５に示すように新生仔マウス脳より抽出したトータルＲＮＡのノーザンブロット分析（図５Ｂ）、および実施例７に示すように新生仔マウス脳から抽出したタンパク質のウエスタンブロット分析（図５Ｃ）を行った。
【０１０５】
〔実施例４〕 サザンブロット分析
０．２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む５００μｌのゲノム溶解緩衝液（１ ｘ ＳＳＣ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ）中で、１センチメートル角のマウスの尾を５５℃で一昼夜インキュベートした。ゲノムＤＮＡをフェノール−クロロホルム処理により二回抽出し、１容量の２−プロパノールで沈殿させた。これを７５％のエタノールで洗浄し、２０分間乾燥させた。４℃で一昼夜かけて完全に溶解させた後、２０μｇのゲノムＤＮＡを１００ＵのＸｈｏＩで３７℃にて一昼夜消化した。０．９％アガロースで電気泳動した制限酵素処理断片をナイロン（登録商標）膜ハイボンドＮ＋（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）に転写した。
【０１０６】
サザン用のプローブ１および２（図４）は、ＰＣＲによって増幅し、配列解析によって確認した。メガプライムＤＮＡ標識システム（ＭｅｇａｐｒｉｍｅＴＭ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で、プローブをランダム標識し、Ｃｅｎｔｒｉ−ＳＥＰスピンカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ， Ａｄｅｌｐｈｉａ， ＮＪ）で精製した。Ｐｅｒｆｅｃｔ ＨｙｂＴＭ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（東洋紡、Ｊａｐａｎ）で３０分間プレハイブリダイゼーションを実施したのち、熱変性させたプローブ（２．０ｘ１０５ｃｐｍ／ｍｌ）を用いて膜を６８℃で６時間ハイブリダイズした。次に、６８℃にて、膜を２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１５分間、および０．１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで５分間、順次洗浄した後、コダック（Ｋｏｄａｋ）フィルムに−７０℃で２日間露光した。
【０１０７】
ＡＤＡＭＴＳ４の発現は、野生型同腹子マウスと比較して約２分の１であったが、成長速度およびサイズは野生型同腹子とほぼ同等であった。
【０１０８】
〔実施例５〕 ＡＤＡＭＴＳ４の発現に関するノーザンブロット分析
トータルＲＮＡ２０μｇを新生仔マウスの脳から調製し、６．６％のホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲルで電気泳動を行った。毛細管反応で、ＲＮＡを一昼夜ナイロン（登録商標）膜に転写し、ベイキングにより固定した。メガプライムＤＮＡ標識システム（ＭｅｇａｐｒｉｍｅＴＭ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ；アマシャム・ライフサイエンス）を用いて、クローン番号１２のｃＤＮＡプローブを３２Ｐ−ｄＣＴＰ（３０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック）で標識し、Ｃｅｎｔｒｉ−ＳＥＰスピンカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ， Ａｄｅｌｐｈｉａ， ＮＪ）で精製した。Ｐｅｒｆｅｃｔ ＨｙｂＴＭ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（東洋紡、Ｊａｐａｎ）で３０分間プレハイブリダイゼーションを実施したのち、熱変性させたプローブ（２．０ ｘ １０５ ｃｐｍ／ｍｌ）を用いて膜を６８℃で６時間ハイブリダイズした。次に、６８℃にて、膜を２ ｘ ＳＳＣ， ０．１％ ＳＤＳで１５分間、および０．１ ｘ ＳＳＣ， ０．１％ ＳＤＳで１５分間、順次洗浄した後、ＡＤＡＭＴＳ４に関してはコダックのフィルムに−７０℃で１４日間露光した。膜からプローブを除去した後、３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識したマウスＧＡＰＤＨ遺伝子で再ハイブリダイズし、１２時間露光した。
【０１０９】
〔実施例６〕 ＡＤＡＭＴＳ４ポリクローナル抗体の調製
ＡＤＡＭＴＳ４のＣＯＯＨ末端の特異的な部分（最も相同な遺伝子であるマウスＡＤＡＭＴＳ１遺伝子と比較して）をコードする２種類のｃＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した。プライマーセットを以下に示す。
【０１１０】
ＰＣＲ断片をＴＡベクターにサブクローンし、配列解析によって確認した。
【０１１１】
Ｗ１ではＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ、およびＷ２ではＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩを利用してＴＡベクターから切り出した。これを、ＧＳＴ融合タンパク質発現ベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔ−３（アマシャム・ファルマシア・バイオテック、Ｂｕｃｋｓ、 ＵＫ）のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。これらの発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に導入した。融合タンパク質の調製は以前に発表された方法に従って実施した（Ｙａｓｕｋａｗａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂｙ ｃｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０， ２５３２８−３１． （１９９５）．）。融合タンパク質による免疫、ならびに融合タンパク質ＧＳＴ−Ｗ１およびＧＳＴ−Ｗ２に対するポリクローナル抗体の作製は、以前に発表された方法に従って実施した（Ｓｕ， Ｓ．Ｂ．， Ｍｕｋａｉｄａ， Ｎ．， Ｗａｎｇ， Ｊ．， Ｎｏｍｕｒａ， Ｈ． ＆ Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ， Ｋ． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ａ Ｃ−Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ＣＣＲ１， ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＣＲ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ． Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ６０， ６５８−６６． （１９９６）．）。
【０１１２】
簡単に説明すると、２匹の白色ウサギを、フロインド完全アジュバント（シグマ・アルドリッチ、ＵＳＡ）と混合したＧＳＴ融合タンパク質４００μｇで初回免役し、各々をフロインド不完全アジュバント２００μｇで９回免役した。最終免疫から１週間後、ウサギを放血させ血清を採取した。
【０１１３】
次に、プロテインＡセファロースＴＭ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）カラムを用いて血清を分画し、ＩｇＧ分画を得た。調製したＡＤＡＭＴＳ４抗体の特異性を、完全長のＡＤＡＭＴＳ４−ＧＦＰトランスフェクタントを用いて確認した。
【０１１４】
〔実施例７〕 ウエスタンブロット分析
野生型同腹子およびヘテロ接合体マウスから切り出した新生児の脳の一部を、１０％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。タンパク質をニトロセルロース膜（０．４５μｍ）に、４ｍＡ／ｃｍ２で１時間転写した。膜をブロックＡＣＥ（大日本製薬、Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ））で一昼夜ブロッキングした後、ＴＢＳ緩衝液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）， １５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で、マウス抗ＡＤＡＭＴＳ４ポリクローナル抗体Ｗ１もしくは抗αチューブリン抗体（オンコジーン社）と室温にて１時間反応させ、次に、Ｗ１に関しては２０００倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）、α−チューブリンに関してはあるいは２０００倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧ抗体と室温で３０分間反応させた。ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体を化学発光（ＥＣＬ；アマシャム・ファルマシア・バイオテック）により検出し、オートラジオグラフィー用のコダックＸＡＲフィルムに露光した。
【０１１５】
〔実施例８〕 ポリメラーゼ連鎖反応による胚の遺伝子型分析
最近報告された改良型プライマー伸長−前増幅法（ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｉ−ＰＥＰ）−ＰＣＲ）（Ｈｅｉｎｍｏｌｌｅｒ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｔｏｗａｒｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｅｔｈａｎｏｌ− ｆｉｘｅｄ， ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ， ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｔａｉｎｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ８２， ４４３−５３． （２００２）．）のプロトコールを利用した。
【０１１６】
３０μｌのＩ−ＰＥＰ混合液（Ｒｏｃｈｅの１ｘ ＰＣＲ緩衝液Ｎｏ．３において最終濃度：０．０５ ｍｇ／ｍｌゲラチン、２０ ｍｏｌ／Ｌ（Ｎ）１５ランダムプライマー、各１ ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ、３ＵのＴａｑ Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、６ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２を含む）を、１個の胚を含む１０μｌの溶解緩衝液に添加してＩ−ＰＥＰ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲは以下の条件で５０サイクル行った。
【０１１７】
ステップ１：９５℃で２分間；
ステップ２：９５℃で３０秒間；
ステップ３：２８℃で９０秒間；
ステップ４：秒当たり０．１℃で５５℃まで上昇；
ステップ５：５５℃で２分間；
ステップ６：６８℃で３分間；
ステップ７：ステップ２に戻り、４９回繰り返す；
ステップ８：６８℃で１５分間；および
ステップ９：４℃。
【０１１８】
ネステッドＰＣＲ法でＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を増幅した。第１ラウンドのＰＣＲは、全プライマーの５’端に無関係な２０塩基のキメラ配列を有するＡＤＡＭＴＳ４に特異的な上流および下流のプライマーを用いて、複合ＰＣＲ法で実施した。プライマーセットの位置については図４に示す。
【０１１９】
フォーワードプライマーＵＴＳ：
５’−ｇｃｃｇｔｃｃｃａａａａｇｇｇｔｃａｇｔｃｃｔｃａａｃａｃｃｃｃｔａａｃｇａｃｔｃａ（配列番号：９）
リバースプライマーＵＴＡ：
５’−ｇｃｇｇｔｃｃｃａａａａｇｇｇｔｃａｇｔｇｇａｇｃａｔｇｔｔｇａａｇａｃａｔｇｇｃ（配列番号：１０）
【０１２０】
第２ラウンドのＰＣＲは、以下のプライマーセットを用いてネステッド条件で実施した。
【０１２１】
フォーワードプライマーＮＴＳ： ５’−ｃｔｇａｃｃａｃｔｔｔｇａｃａｃａｇｃｃａ（配列番号：１１）
リバースプライマーＮＴＡ：５’−ｃｃａｇｔｔｃａｔｇａｇｃａｇｃａｇｔｇａ （配列番号：１２）
【０１２２】
Ｉ−ＰＥＰ−ＰＣＲ産物を５μｌずつ分注して２５μｌの特異的ＰＣＲ第１ラウンドの混合液（それぞれの濃度が０．２ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．４μｍｏｌ／Ｌプライマー、０．５ＵのＴａｑ Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、および０．５Ｕの抗Ｔａｑ抗体（インビトロジェン））に加えた。第１ラウンドＰＣＲ産物を３μｌずつ分注して、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２； それぞれの濃度が０．２ ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ、０．４ ｍｍｏｌ／Ｌプライマー、および０．３Ｕの Ｔａｑ Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む２２μｌの混合液に加えた。ＰＣＲ条件は、第１ラウンドと第２ラウンドで同一であり：ステップ１が、９５℃で２分間、ステップ２が９５℃で３０秒間、ステップ３が５６℃で４５秒間、ステップ４が７２℃で１分間、ステップ５でステップ２に戻り、２９回繰り返した後、ステップ６で、７２℃で１０分間、ステップ７で４℃である。各実験において、野生型ゲノムＤＮＡによる陽性対照反応も実施した。２％ アガロースゲルで分画してＰＣＲ産物の有無を調べた。野生型およびヘテロ接合体で３９４ｂｐの産物が増幅される。
【０１２３】
ゲノムＤＮＡの増幅を確認する目的で、対照としてＧＡＰＤＨネステッドＰＣＲを実施した。ＧＡＰＤＨ対照のプライマー配列を以下に示す。
【０１２４】
第１ラウンドでは、
フォーワードプライマー：５’−ｃｃｔｔｃａｔｔｇａｃｃｔｃａａｃｔａ（配列番号：１３）、
リバースプライマー：５’−ａｇｔｇａｔｇｇｃａｔｇｇａｃｔｇｔｇｇｔ（配列番号：１４）
第２ラウンドでは、
フォーワードプライマー：５’−ａｇｔａｔｇａｃｔｃｃａｃｔｃａｃｇｇｃａａ（配列番号：１５）
リバースプライマー：５’−ａｇｔｇａｔｇｇｃａｔｇｇａｃｔｇｔｇｇｔ（配列番号：１６）
であり、３２０ｂｐの産物が増幅される。
【０１２５】
〔実施例９〕 致死時期の決定
複数の発育ステージにおける胚を調べて、致死のタイミングの決定を試みた。
【０１２６】
しかし、サザンブロット分析により、８．５日目の初期ステージの胚には、ホモ接合体を見いだすことができず、これらのステージの子宮では、吸収された残留物さえ観察されなかった。これらのデータは、胚が死に至るのは８．５日より前であることを示唆するものである。
【０１２７】
卵子着床前に死亡したのか後に死亡したのか調べるため、本発明者は、着床前の最終ステージである胚盤胞での遺伝子型を同定した。自然排卵および交配した３匹のマウスから得られた３．５日胚１９個には、１個もホモ接合体は見つからなかった。
【０１２８】
〔実施例１０〕 ＡＤＡＭＴＳ４欠損胚の遺伝子型
さらに、８細胞期の胚の遺伝子型を調べた。８細胞期の胚を、自然排卵および交配したマウスから調製した。遺伝子型を調べる前に個々の胚の顕微鏡像を撮像した。図４に示すプライマーセットにより、ゲノムＤＮＡをＩ−ＰＥＰ−ＰＣＲ、ＡＤＡＭＴＳ４特異的ネステッドＰＣＲによって増幅した。野生型およびヘテロ接合体について、３９５ｂｐの産物を増幅し、ホモ接合体と比較した。野生型マウスの尾から得たゲノムＤＮＡを陽性対照として用いた。また、ＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅を、Ｉ−ＰＥＰ−ＰＣＲによりゲノムＤＮＡが実際に増幅したことを確認するための対照とした。
【０１２９】
結果、異常な形態を示し、断片化あるいは細胞未分裂のホモ接合体ＡＤＡＭＴＳ−／−を見いだした（図６）。野生型もしくはヘテロ接合体の胚は８細胞期であった。ホモ接合体のＡＤＡＭＴＳ４−／−胚は８細胞期までしか存在せず、その形態から、ホモ接合体では分裂しないか断片化したことが分かる。この結果は、発育の超初期段階においてＡＤＡＭＴＳ−／−胚が死に至ることを示している。
【０１３０】
さらに本発明者は、２細胞期の胚を調べ、表３に示すように、ヌル胚に８細胞期同様の異常を検出した。つまり、これらの結果から、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子欠損卵子は、着床前に細胞分裂および生存に異常を来たすことが示唆される。
【０１３１】
【表３】
【０１３２】
〔実施例１１〕 生殖細胞におけるＡＤＡＭＴＳ４の発現
初期発育ステージの生殖関連細胞（卵子、精子および卵丘細胞）におけるＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡ発現を確認するために、ＲＴ−ネステッドＰＣＲを実施し、ＤＮＡ配列決定により増幅産物の確認を行った。
【０１３３】
２５個の卵子、単一マウス個体に由来する精子各種ステージの胚２０〜３０個、単一マウス個体の卵丘細胞から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン）を用いて製造元の説明書に従いトータルＲＮＡを調製し、これをＤＮａｓｅＩ処理した。ランダムプライマー（プロメガ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて製造元の説明書に従い２０μｌの反応混合液（インビトロジェン）にて４２℃で５０分間反応して、ｃＤＮＡの第１ストランド合成を行った。
【０１３４】
得られたｃＤＮＡサンプルについてネステッドＲＴ−ＰＣＲを実施した。ｃＤＮＡ産物を２μｌずつ分注して、１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２； 各濃度が０．２ ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ、０．４ ｍｍｏｌ／Ｌプライマー、および０．３ＵのＴａｑ Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む１８μｌの混合液に添加した。ＰＣＲ条件は、第１ラウンドと第２ラウンドで同一であり：ステップ１が、９５℃で２分間、ステップ２が９５℃で３０秒間、ステップ３が５６℃で４５秒間、ステップ４が７２℃で１分間、ステップ５でステップ２に戻り、２９回繰り返した後、ステップ６で、７２℃で１０分間、ステップ７で４℃である。ＡＤＡＭＴＳ４に対するプライマーは、イントロン配列をまたぐように設計されており、次のような配列からなる。
【０１３５】
第１ラウンド：
フォーワードプライマー：５’−ｔｔｔｇａｃａｃａｇｃｃａｔｔｃｔｇｔｔ（配列番号：１７）；
リバースプライマー：５’−ｇｇａｔａｃａｇｃｇｇｃｃｃｔｇｇａｃａ（配列番号：１８）；
第２ラウンド：
フォーワードプライマー：５’−ｔｇｔｃａｔｇｇｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｇｇ（配列番号：１９）；
リバースプライマー：５’−ｇｔｇｇｇｃａｃｔｔｃｔｃｃｇｔｇｔｔｇ（配列番号：２０）
【０１３６】
これらのプライマーにより、５６０ｂｐの産物が増幅する。これをＴＡベクターにサブクローニングし、配列を決定した。対照ＧＡＰＤＨのプライマーセットを以下に示す。
【０１３７】
第１ラウンド：
フォーワードプライマー：５’−ｃｃｔｔｃａｔｔｇａｃｃｔｃａａｃｔａ（配列番号：２１）；
リバースプライマー：５’−ａｇｔｇａｔｇｇｃａｔｇｇａｃｔｇｔｇｇｔ（配列番号：２２）；
第２ラウンド：
フォーワードプライマー：５’−ａｇｔａｔｇａｃｔｃｃａｃｔｃａｃｇｇｃａａ（配列番号：２３）；
リバースプライマー： ５’−ａｇｔｇａｔｇｇｃａｔｇｇａｃｔｇｔｇｇｔ（配列番号：２４）
【０１３８】
これらのプライマーにより、３２０ｂｐの産物が増幅する。ＰＣＲ産物を１％のアガロースゲル上で分画し、臭化エチジウムで染色して可視化した。同一の実験を再び繰り返した。
【０１３９】
結果、ＡＤＡＭＴＳ４は、０．５日卵子から胚盤胞までに発現したが、精子もしくは卵丘細胞では発現しなかった（図７）。従って、卵子以外の初期発育にＡＤＡＭＴＳ４が関与している可能性が否定された。
【０１４０】
さらに、ＡＤＡＭＴＳ＋／−雄と野生型の雌、もしくはＡＤＡＭＴＳ＋／−雌と野生型の雄の交配による受精は正常なので、ＡＤＡＭＴＳ４は直接精子・卵融合に関係するとは考えられない。
【０１４１】
〔実施例１２〕 卵子の免疫蛍光染色
自然排卵および交配から０．５日後に、野生型Ｃ５７／Ｂ６マウスを用いて、卵子を含む卵管膨大部を切り出し、ＰＢＳで洗浄した。これをＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ （Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．、Ｅｌｋｈａｒｔ、Ｉｎｄｉａｎａ、ＵＳＡ）に包埋して液体窒素で凍結した。試料をクリオスタットで７μｍの切片にした。Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅで内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害後、切片を１０μｇ／ｍｌの濃度のウサギ抗マウスＡＤＡＭＴＳ４ポリクローナル抗体Ｗ１、もしくは対照ウサギＩｇＧと１時間反応させた。それぞれをＰＢＳで２分間２回洗浄し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで２分間１回洗浄した後、１μｇ／ｍｌ濃度のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ． ＵＳＡ）で３０分間標識した。ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＫＯ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ、ＵＳＡ）で封入した。蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【０１４２】
結果、ＡＤＡＭＴＳ４は分泌タンパク質であることが報告されているが、抗ＡＤＡＭＴＳ４ポリクローナル抗体による免疫蛍光染色では、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質が、ほぼ卵子内に核周囲の網状パターンとして存在していた（図８）。
【０１４３】
〔実施例１３〕 抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体によるインビトロにおける卵子の阻害実験
ＡＤＡＭＴＳ４は、そのトロンボスポンジンドメインによりグリコサミノグリカンを認識し、ＩＧＤにおいて成体における生理学的機能を果たすためにプロテオグリカンを切断する分泌タンパク質であることが報告されている。ＡＤＡＭＴＳ４が卵子において生理学的役割を果たしているか否かを明らかにする目的で、抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体を用いて触媒過程を阻害するインビトロ実験を行った。
【０１４４】
Ｃ５７／ＢＬ６雌マウスに、５ＩＵの妊馬血清（ＰＭＳ）および５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を４８時間間隔で注射して、過排卵させ、すぐに交配した。ｈＣＧ注射後１３〜１５時間で卵管膨大部から０．５日卵子を採取し、４００μｌのＭ２培地滴に入れた。３００μｇ／ｍｌ濃度のＩＩＩ型ヒアルロニダーゼ（シグマ）を用いて卵丘細胞を除去し、第２極体もしくは前核を有する卵子を採取した。卵子培養には、０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、および４０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体、ならびに４０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＧＳＴ抗体を含む、３７℃ ５％ＣＯ２雰囲気化で平衡化したＭ１６培地を用いた。
【０１４５】
卵子回収から２４時間後に胚の形態を観察した結果、抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体による処理では、卵子は断片化もしくは非分裂形態を呈したが、対照では卵子が２細胞期胚まで成長した（図９Ａ）。
【０１４６】
また、卵子回収から２４時間インキュベーション後、２細胞期胚の数を計数したところ、２細胞期の胚の数は、抗体の用量依存的に減少した（図９Ｂ）。２細胞期の胚の比率（％）は、抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体を用いた場合、０μｇ／ｍｌでは７０．５％（ｎ＝１１９）、２０μｇ／ｍｌでは４１．５％（ｎ＝２１２）、３０μｇ／ｍｌでは２３．４％（ｎ＝１４１）、および４０μｇ／ｍｌでは５．２％（ｎ＝５８）あったが、対照の抗ＧＳＴ抗体を用いた場合には、４０μｇ／ｍｌでは７２．７％（ｎ＝９９）であった。
【０１４７】
【発明の効果】
本発明により、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能を制御する薬剤が提供された。また、本発明により、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現の抑制（阻害）あるいは活性の抑制に基づいた避妊薬のスクリーニング方法が提供された。本発明の薬剤または本発明のスクリーニング方法によって取得される化合物は、例えば、早期の避妊に有用である。
【０１４８】
また本発明の薬剤は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現の異常あるいは活性の異常に関連する疾患のメカニズム解明のための研究用試薬としても有用である。
【０１４９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスＡＤＡＭＴＳ４遺伝子のゲノム構造を示す図である。
（Ａ）マウスＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の制限酵素地図。制限酵素部位：Ｅ（ＥｃｏＲＩ）；Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ）；Ｂ（ＢａｍＨＩ）；Ａ（ＡｐｏＩ）；Ｘ（ＸｈｏＩ）。
（Ｂ）マウスＡＤＡＭＴＳ４遺伝子のエクソン／イントロン構造。ボックスはエクソンを表し、間の直線はイントロンを表す。ボックスで囲まれたエクソン内の斜線の領域は、コーディング配列である。
（Ｃ）マウスＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の機能性ドメイン。
【図２】ＡＤＡＭＴＳ４の推定アミノ酸配列を示す図である。ｆｕｒｉｎによる推定切断部位を矢印で示す。トロンボスポンジンのＩ型モジュールを下線で示した。ＭＭＰ様システインスイッチにおけるシステイン残基を黒丸印で示した。その他のシステイン残基については、星印で示した。ｆｕｒｉｎ切断部位までプレプロ領域が伸びており、触媒ドメインは、ｆｕｒｉｎ切断部位からディスインテグリン様配列までを含む。スペーサードメインの開始部位を示した。１文字アミノ酸コードを用いた。
【図３】ＡＤＡＭＴＳ４アミノ酸配列のメタロプロテイナーゼドメインの比較結果を示す図である。マウスＡＤＡＭＴＳ４（上段）およびＡＤＡＭＴＳ１あるいはＡＤＡＭＴＳ５（下段）に関するアミノ酸残基を示す。それぞれ、同一性は５０％および４０％であった。Ｚｉｎｃ結合モチーフには下線を付した。
【図４】遺伝子ターゲッティング法に用いたゲノム制限酵素地図（Ａ）ならびに野生型遺伝子座、ターゲッティングベクター、ターゲッティング後の遺伝子座（Ｂ）を表わした図である。
（Ａ）ＡＤＡＭＴＳ４のゲノム制限酵素地図。エクソン２〜４（メタロプロテイナーゼドメイン）を含むＡｐｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片は、ネオマイシン耐性遺伝子と置換されている。
Ｂ（ＢａｍＨＩ）；Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ）；Ａ（ＡｐｏＩ）；Ｅ（ＥｃｏＲＩ）；Ｘ（ＸｈｏＩ）。
（Ｂ）エクソンおよびイントロンは、それぞれ垂直および水平な線で示した。ＰＧＫプロモーター（ＰＧＫ−ｎｅｏ’）で制御されるネオマイシン耐性遺伝子、およびＰＭＣ１プロモーター（ＰＭＣ１−ｔｋ）で制御されるチミジンキナーゼ遺伝子を矢印で示した。サザンブロット分析用プローブを示した。Ｘで示した位置はＸｈｏＩ制限酵素部位に対応する。
【図５】マウスＡＤＡＭＴＳ４のターゲティングによる破壊の効果を示す写真である。
（Ａ）マウスゲノムＤＮＡのサザンブロット分析の結果を表わす写真。１１ｋｂのＸｈｏＩ消化断片は、プローブ１およびプローブ２における相同組換え対立遺伝子を示す。ＷＴは野性型、＋／−はヘテロ接合体である。
（Ｂ）各遺伝子型の新生仔マウス脳から抽出したトータルＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を表わす写真。
（Ｃ）各遺伝子型の新生仔マウス脳から抽出したタンパク質のウエスタンブロット分析の結果を表わす写真。
【図６】ＡＤＡＭＴＳ４欠損胚の遺伝子型および形質の分析を示す写真である。
【図７】生殖関連細胞におけるＡＤＡＭＴＳ４の発現を示す写真である。
トータルＲＮＡを卵子（１）、２細胞期胚（２）、８細胞期胚（３）、未分化胚芽細胞（４）、精子（５）および卵丘細胞（６）より抽出した。ＲＴ−ネステッドＰＣＲの結果、ＡＤＡＭＴＳ４は精子および卵丘細胞では発現が見られなかったが、卵子および胚では発現が観察された。トータルＲＮＡを陰性対照、心臓由来のｃＤＮＡを陽性対照として利用した。下段に、ＧＡＰＤＨのＲＴ−ネステッドＰＣＲの結果を示す。
【図８】卵子におけるＡＤＡＭＴＳ４の免疫蛍光の結果を示す写真である。
野性型Ｃ５７／Ｂ６マウス由来の自然排卵および交配後の０．５日胚をＯＣＴコンパウンド中に包埋し、７μｍの切片にした。切片標本は抗マウスＡＤＡＭＴＳ４抗体（Ｂ）およびウサギＩｇＧ（Ｃ）で染色し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｉｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧで標識した。ＡＤＡＭＴＳ４は、対照と比較したところ核の周辺領域に発現が見られた。光ｆｉｅｌｄ照明下の卵子は、卵丘細胞周囲の透明帯を有していた（Ａ）。
【図９】卵子発育における抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体の効果を示す写真および図である。
０．５日の卵子は、過排卵後に交配したＣ５７／ＢＬ６の雌から調製した。これを、抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体および対照抗ＧＳＴ抗体を各種の濃度で含むＭ１６培地でインキュベートした。２４時間インキュベーションした後、卵子の形態を観察した。抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体による処理では、卵子は断片化もしくは非分裂形態を呈したが、対照では卵子が２細胞期胚まで成長した（Ａ）。２４時間インキュベーション後、２細胞期胚の数を計数したところ、ＡＤＡＭＴＳ４の阻害効果は用量依存的であった（Ｂ）。
【従来の技術】
ほぼ３０種類のＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）ファミリーの分子が分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）からヒトに至る各種生物で同定されている。いずれの分子も保存された特徴的なドメイン構造を有している。Ｎ末端のシグナル配列の後に、プロドメイン、メタロプロテアーゼドメイン、ディスインテグリンドメインおよびＥＧＦリピートを含むシステインに富んだ領域が続く。ほとんどのメンバーは膜貫通性ドメインを有し、その後にＣ末端細胞質テールを含んでいる。
【０００２】
ＡＤＡＭは細胞接着や細胞表面分子のタンパク質分解プロセッシング等の多様な過程に関係することが示されている。精子のヘテロ二量体タンパク質であるファーティリン（ｆｅｒｔｉｌｉｎ）αおよびβ（ＡＤＡＭ１およびＡＤＡＭ２）ならびにｃｙｒｉｔｅｓｔｉｎ（ＡＤＡＭ３）は、受精中の精子−卵融合に必須である（非特許文献１参照）。メルトリン（Ｍｅｌｔｒｉｎ）α（ＡＤＡＭ１２）は、筋肉発生における筋芽細胞融合に何らかの役割を担っている（非特許文献２参照）。ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ１７）は、細胞外ＴＮＦα等の細胞表面膜貫通性増殖因子における活性領域のタンパク質分解・放出に関係している（非特許文献３参照）。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のメタロプロテアーゼディスインテグリンＫＵＺ（ｋｕｚｂａｎｉａｎ、線虫のＳＵＰ−１７、哺乳動物のＡＤＡＭ１０）（非特許文献４参照）は、ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）およびノッチリガンドＤｅｌｔａ（非特許文献５および６参照）のプロセッシングが関連した神経発生に重要である。ＭＤＣはヒト乳癌の腫瘍サプレッサー分子の候補であり、ＭＳ２はマクロファージ表面抗原である。しかしながら、ＡＤＡＭファミリーの大部分のメンバーに関しては、生理学的機能が未解明のままである。
【０００３】
ＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）は、ＡＤＡＭのサブファミリーであり、哺乳動物および無脊椎動物のいずれにも見いだされる新規な細胞外プロテアーゼファミリーである。現在のところ、哺乳動物のＡＤＡＭＴＳファミリーは１４種のメンバーからなる。このファミリーのメンバーは、トロンボスポンジン１様の繰り返し配列を複数コピー含み、Ｃ末端領域（非特許文献７参照）の膜貫通性ドメインが欠けている等の性質から、他のＡＤＡＭファミリーメンバーとは異なっている。従って、ほとんどが細胞表面に局在するＡＤＡＭファミリーメンバーとは異なり、ＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーは、細胞外マトリックスタンパク質を構成していると考えられる（非特許文献８参照）。
【０００４】
ＡＤＡＭＴＳ１を最初に発見したのは久野らである。これは、癌悪液質を誘起するマウス大腸癌細胞株で選択的に発現する遺伝子である。リポ多糖（ＬＰＳ）で誘導されるマウスの全身性炎症によって、心臓および腎臓でＡＤＡＭＴＳ１の選択的発現が高まった（非特許文献９参照）。このことは、ＡＤＡＭＴＳ１の役割が炎症反応に関係している可能性を示唆するものである。
【０００５】
哺乳動物細胞で調製した組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１およびその近縁の相同体であるＡＤＡＭＴＳ８は、角膜ポケットアッセイにおいてＦＧＦ−２誘導性の血管形成を抑制した。また、漿尿膜アッセイにおいてＶＥＧＦ誘導性血管形成を阻害した。また、いずれのタンパク質も、内皮細胞の増殖を阻害したが、線維芽細胞もしくは平滑筋細胞の増殖を阻害することはなかった（非特許文献１０参照）。
【０００６】
マウスＡＤＡＭＴＳ１遺伝子の破壊によって、さらに生理学的機能が明らかになった。ＡＤＡＭＴＳ１−／−マウスでは、著しい成長遅滞と脂肪組織の形成不全を示した。また、子宮と卵巣が組織学的に変化しており、雌の受精能が低下した。さらに、毛細血管形成を伴わない異常な副腎髄質構造がみられた。さらに著しいのは、腎杯が肥大し、尿管腎盂移行部から尿管にかけて繊維化が起こっていたことである（非特許文献１１参照）。このような特異的な形質は、ＡＤＡＭＴＳ１の転写産物が腎臓に豊富に存在することと一致し、器官形成中に起こる細胞外マトリックスのリモデリングにプロテアーゼ活性が重要であることを支持する。さらに、最近、ＡＤＡＭＴＳ１が、ディファレンシャルディスプレー法を用いてラット内皮細胞からクローン化された。この転写産物のレベルは、肝硬変状態にある肝臓内皮細胞において下方制御される。このことは、ＡＤＡＭＴＳ１が肝臓の線維化の過程でも重要であることを示唆するものである。
【０００７】
ヒトのエーラース−ダンロス症候群（Ｅｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＥＤＳ）は、皮膚、関節、血管および靱帯等の生体力学的性質の変化によって特徴付けられる一群の先天性結合組織疾患である。ＶＩＩＣ型ＥＤＳおよびウシの皮膚剥離症（ｄｅｒｍａｔｏｓｐａｒａｓｉｓ）、ウシおよびヒツジにおける類似した疾患は、Ｉ型プロコラーゲンのＮ末端プロセッシング異常による皮膚の重度の脆弱性によって特徴付けられる。ＡＤＡＭＴＳ２はプロコラーゲンＮプロテアーゼであることが報告されている。Ｃｏｌｉｇｅらは、ヒトＡＤＡＭＴＳ２遺伝子をクローン化し、複数のＶＩＩＣ型ＥＤＳ患者の変異、および皮膚剥離疾患の仔牛における対応する変異を同定した（非特許文献１２参照）。こうして、ＡＤＡＭＴＳファミリーの中でも、ＡＤＡＭＴＳ２は、その生理学的基質、および対応する遺伝的疾患が初めて同定されたメンバーである。
【０００８】
最近、ＡＤＡＭＴＳファミリーの他のメンバーが関係する遺伝性疾患が明らかにされた。Ｇａｌｌｉａらは、ヒト先天性血栓性血小板減少性紫斑（ＴＴＰ）の４家系についてゲノムの連鎖解析を実施し、ＡＤＡＭＴＳ１３の欠損がＴＴＰの分子論的機序であることを示す１２種類の変異を、ＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子中に同定した（非特許文献１３参照）。
【０００９】
ＡＤＡＭＴＳ４およびＡＤＡＭＴＳ５は、ＡＤＡＭＴＳ１に非常によく似た相同体であり、インターロイキン１で刺激したウシの関節軟骨細胞の培養培地から精製された（非特許文献１４参照）。これらは、軟骨アグリカンを切断するので、アグリカナーゼ１およびアグリカナーゼ２と命名されている（非特許文献１５参照）。最近の報告よれば、ヒト抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体のみでアグリカン切断活性の７５％を阻害することから（非特許文献１６参照）、ＡＤＡＭＴＳ４はアグリカン切断に最も重要なプロテアーゼであると考えられている。慢性関節リウマチ（ＲＡ）および変形性関節症（ＯＡ）の場合には、ＡＤＡＭＴＳ４はアグリカンを球間ドメイン（ＩＧＤ）のＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４結合部位で切断し、軟骨を分解する（非特許文献１７参照）。さらに、最近では、内因性ＴＩＭＰ−３阻害因子が、ＡＤＡＭＴＳ４活性を阻害することが報告されている（非特許文献１８参照）。
【００１０】
アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）は単に、ＡＤＡＭＴＳ４の生理学的基質であるだけではない。ブレビカン（ｂｒｅｖｉｃａｎ）は、脳特異的細胞外マトリックスとしてのプロテオグリカンであり、ヒトおよびラットの神経膠腫細胞株ではその発現が大幅に増加している。最近の報告では、高度に浸潤的なＣＮＳ−１神経膠腫細胞株の脳内移植片の浸潤においてブレビカンの合成と切断が一定の役割を果たしており（非特許文献１９参照）、ＡＤＡＭＴＳ４はブレビカンの切断活性に重要であることが示されている。ＡＤＡＭＴＳ４は、バーシカン（ｖｅｒｓｉｃａｎ）等の他のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンをインビトロで切断することもできる（非特許文献２０参照）。ＡＤＡＭＴＳ４の転写産物のレベルに関しては、成体の組織では遍在性であり、脳、心臓および肺でより多く発現している。例えば、軟骨細胞および軟骨の外植培養片では、レチノイン酸およびフィブロネクチンの断片（非特許文献２１参照）、およびＩＬ−１、ＴＮＦα、ＩＬ−６（非特許文献２２参照）、ＩＬ−１７（非特許文献２３参照）等の複数のサイトカイン類によってＡＤＡＭＴＳ４による切断が誘導される（非特許文献２４参照）。ＦＬＳ（線維芽細胞様の滑膜細胞）では、ＴＧＦβによって、ＡＤＡＭＴＳ４の遺伝子発現が大幅に増加する（非特許文献２５参照）。βアミロイドで処理した場合にも、ラットの星状細胞でＡＤＡＭＴＳ４の転写産物レベルが亢進した（非特許文献２６参照）。このことは、脳の細胞外マトリックスの分解によってアルツハイマー疾患が増悪することと関連があることを示唆する。さらに、管状構造に分化しつつあるヒト内皮細胞の遺伝子の差分発現プロフィールを調べるための新規のｍＲＮＡ包括プロフィール化技術を用いることによって、内皮管状形成中にＡＤＡＭＴＳ４が上方制御されることが明らかになった（非特許文献２７参照）。このことは、この酵素が血管のプロテオグリカンの代謝に潜在的な役割を持つことを示唆するものであり、つまり血管形成に関係することを示唆するものである。
【００１１】
このように、ＡＤＡＭＴＳ４は、細胞外マトリックスタンパク質に結合する広範な活性と機能を備えたメタロプロテアーゼであると考えられているものの、生理学的意義は不明のままであった。
【００１２】
【非特許文献１】
Ｂｌｏｂｅｌ， Ｃ．Ｐ．ら著、「Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ａｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｌｉｇａｎｄ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖｅ ｉｎ ｓｐｅｒｍ−ｅｇｇ ｆｕｓｉｏｎ．」、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２年、Ｖｏｌ．３５６、ｐ．２４８−５２
【非特許文献２】
Ｙａｇａｍｉ−Ｈｉｒｏｍａｓａ， Ｔら著、「Ａ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ−ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｎｇ ｉｎ ｍｙｏｂｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ．」、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５年、Ｖｏｌ．３７７、ｐ．６５２−６．
【非特許文献３】
Ｂｌａｃｋ， Ｒ．Ａ．ら著、「Ａ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ｔｈａｔ ｒｅｌｅａｓｅｓ ｔｕｍｏｕｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ− ａｌｐｈａ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ １９９７年、Ｖｏｌ．３８５、ｐ．７２９−３３
【非特許文献４】
Ｗｅｎ， Ｃ．外２名著、「ＳＵＰ−１７， ａ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＡＤＡＭ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＫＵＺＢＡＮＩＡＮ， ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ＬＩＮ−１２／ＮＯＴＣＨ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９７年、Ｖｏｌ．１２４、ｐ．４７５９−６７
【非特許文献５】
Ｐａｎ， Ｄ． および Ｒｕｂｉｎ， Ｇ．Ｍ著、「Ｋｕｚｂａｎｉａｎ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｌａｔｅｒａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｎｄ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．」、Ｃｅｌｌ、１９９７年、Ｖｏｌ．９０、ｐ．２７１−８０
【非特許文献６】
Ｑｉ， Ｈ．ら著、「Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｔｃｈ ｌｉｇａｎｄ ｄｅｌｔａ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ Ｋｕｚｂａｎｉａｎ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、Ｖｏｌ．２８３、ｐ．９１−４
【非特許文献７】
Ｋｕｎｏ， Ｋ．ら著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ− ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｍｏｔｉｆｓ ａｓ ａｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ．」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ 、１９９７年、Ｖｏｌ．２７２、ｐ．５５６−６２
【非特許文献８】
Ｋｕｎｏ， Ｋ． および Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ， Ｋ．著、「ＡＤＡＭＴＳ−１ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｃｈｏｒｓ ａｔ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｔｙｐｅ Ｉ ｍｏｔｉｆｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｐａｃｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ．」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ 、１９９８年、Ｖｏｌ．２７３、ｐ．１３９１２−７
【非特許文献９】
Ｋｕｎｏ， Ｋ．外３名著、「Ｔｈｅ ｅｘｏｎ／ｉｎｔｒｏｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ＡＤＡＭＴＳ−１ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ＡＤＡＭ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ＴＳＰ ｍｏｔｉｆｓ．」、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ 、１９９７年、Ｖｏｌ．４６， ｐ．４６６−７１
【非特許文献１０】
Ｖａｚｑｕｅｚ， Ｆ．ら著、「ＭＥＴＨ−１， ａ ｈｕｍａｎ ｏｒｔｈｏｌｏｇ ｏｆ ＡＤＡＭＴＳ−１， ａｎｄ ＭＥＴＨ−２ ａｒｅ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ａｎｇｉｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ．」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ 、１９９９年、Ｖｏｌ．２７４、ｐ．２３３４９−５７
【非特許文献１１】
Ｓｈｉｎｄｏ， Ｔ．ら著、「ＡＤＡＭＴＳ−１： ａ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ， ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ， ａｎｄ ｏｒｇａｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．」、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ 、２０００年、Ｖｏｌ．１０５、ｐ．１３４５−５２
【非特許文献１２】
Ｃｏｌｉｇｅ， Ａ．ら著、「Ｈｕｍａｎ Ｅｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｙｐｅ ＶＩＩ Ｃ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｄｅｒｍａｔｏｓｐａｒａｘｉｓ ａｒｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ Ｎ−ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ．」、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ 、１９９９年、Ｖｏｌ．６５、ｐ．３０８−１７
【非特許文献１３】
Ｌｅｖｙ， Ｇ．Ｇ．ら著、「Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＡＭＴＳ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｃａｕｓｅ ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ．」、Ｎａｔｕｒｅ 、２００１年、Ｖｏｌ．４１３， ｐ．４８８−９４
【非特許文献１４】
Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ， Ｍ．Ｄ．ら著、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−１： ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＡＭＴＳ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ 、１９９９年、Ｖｏｌ．２８４、ｐ．１６６４−６
【非特許文献１５】
Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ， Ｍ．Ｄ．外３名著、「Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＡＤＡＭ−ＴＳ４ （ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−１） ａｎｄ ＡＤＡＭ−ＴＳ５ （ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−２） ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．」、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ 、２００１年、Ｖｏｌ．９、ｐ．５３９−５２
【非特許文献１６】
Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｈ．ら著、「Ｂｒｅｖｉｃａｎ ｉｓ ｄｅｇｒａｄｅｄ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−１ （ＡＤＡＭＴＳ４） ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｔｅｓ．」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ 、２０００年、Ｖｏｌ．２７５、ｐ．３８８８５−９０
【非特許文献１７】
Ｓａｎｄｙ， Ｊ．Ｄ．外３名著、「Ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ａｇｇｒｅｃａｎ ｉｎ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍａｊｏｒ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｇｌｏｂｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ．」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ 、１９９１年、Ｖｏｌ．２６６、ｐ．８６８３−５
【非特許文献１８】
Ｋａｓｈｉｗａｇｉ， Ｍ．外３名著、「ＴＩＭＰ−３ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ １ （ＡＤＡＭ−ＴＳ４） ａｎｄ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ ２ （ＡＤＡＭ−ＴＳ５）．」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００１年、Ｖｏｌ． ２７６、ｐ．１２５０１−４
【非特許文献１９】
Ｍａｔｔｈｅｗｓ， Ｒ．Ｔら著、「 Ｂｒａｉｎ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｂｉｎｄｉｎｇ （ＢＥＨＡＢ）／ｂｒｅｖｉｃａｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ ａ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｍｏｔｉｆｓ （ＡＤＡＭＴＳ） ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ．」、２０００年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、Ｖｏｌ． ２７５、ｐ．２２６９５−７０３
【非特許文献２０】
Ｓａｎｄｙ， Ｊ．Ｄ．ら著、「Ｖｅｒｓｉｃａｎ Ｖ１ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｏｒｔａ ｉｎ ｖｉｖｏ ｏｃｃｕｒｓ ａｔ ｔｈｅ Ｇｌｕ４４１− Ａｌａ４４２ ｂｏｎｄ， ａ ｓｉｔｅ ｔｈａｔ ｉｓ ｃｌｅａｖｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＤＡＭＴＳ−１ ａｎｄ ＡＤＡＭＴＳ− ４．」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ 、２００１年、Ｖｏｌ．２７６、ｐ．１３３７２−８
【非特許文献２１】
Ｈｏｍａｎｄｂｅｒｇ， Ｇ．Ａ．外３名著、「Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｃｈｏｎｄｒｏｌｙｓｉｓ ｂｙ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃａｕｓｅｓ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ａｇｇｒｅｃａｎ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｉｔｅ ａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｃａｒｔｉｌａｇｅ．」、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ、１９９７年、Ｖｏｌ．５、ｐ．４５０−３．
【非特許文献２２】
Ｆｌａｎｎｅｒｙ， Ｃ．Ｒ．ら著、「ＩＬ−６ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｕｇｍｅｎｔ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ．」、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ 、２０００年、Ｖｏｌ．１９、ｐ．５４９−５３
【非特許文献２３】
Ｃａｉ， Ｌ．ら著、「Ｐａｔｈｗａｙｓ ｂｙ ｗｈｉｃｈ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １７ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．」、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、２００１年、Ｖｏｌ．１６、ｐ．１０−２１
【非特許文献２４】
Ａｒｎｅｒ， Ｅ．Ｃ．外４名著、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ．」、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ 、１９９８年、Ｖｏｌ．６、ｐ．２１４−２８
【非特許文献２５】
Ｙａｍａｎｉｓｈｉ， Ｙ．ら著、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ ｉｎ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ： ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＴＧＦ− ｂｅｔａ．」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ 、２００２年、Ｖｏｌ．１６８、ｐ．１４０５−１２
【非特許文献２６】
Ｓａｔｏｈ， Ｋ．，外２名著、「ＡＤＡＭＴＳ−４ （ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｍｏｔｉｆｓ） ｉｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ ｔｒｅａｔｅｄ ｒａｔ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．」、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ、２０００年、Ｖｏｌ． ２８９、ｐ．１７７−８０
【非特許文献２７】
Ｋａｈｎ， Ｊ． ら著、「Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．」、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、２０００年、Ｖｏｌ． １５６， ｐ．１８８７−９００
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＡＤＡＭＳＴ４の生理学的および病理学的な役割を解明することにある。さらに本発明は、この解明された知見を基に、ＡＤＡＭＳＴ４タンパク質の機能阻害物質を有効成分として含有する薬剤、およびＡＤＡＭＳＴ４タンパク質をターゲットとする医薬品のためのスクリーニング方法の提供を目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはＡＤＡＭＴＳ４の生理学的意義を明らかにするために、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子欠損マウスを作製し解析を行った。ＡＤＡＭＴＳ４のヘテロ接合体は外見でも異常がなく生殖も正常だったが、ヘテロ同士を交配しサザンブロットで解析した結果、１８７匹の子供のうちにホモ接合体は観られなかった。ホモ接合体の致死時期を各妊娠段階で調べた結果、妊娠８．５日目の段階でも胚子の存在がなく、子宮には吸収された残留物もないことが分かった。最終的にＩ−ＰＥＰ−ＰＣＲの技術で、８細胞期や２細胞期でホモ接合体を見つけることができた。しかし、胚子の形態が異常で未分裂や断片化を呈していた。さらに受精に関わる他の細胞も調べたところ、ＡＤＡＭＴＳ４が受精卵と続発する発生段階の胚子に特異的に発現していることが分かった。さらに受精卵でＡＤＡＭＴＳ４発現の局在を蛍光免疫染色で明らかにした。インビトロの実験系では受精卵の分裂が抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体によって用量依存的に阻害され、発育阻害された卵子は未分裂や断片化を呈し、形態上はＡＤＡＭＴＳ４ホモ接合体の表現と一致していることが分かった。
【００１５】
ＡＤＡＭファミリーメンバーのファーティリンαおよびβやｃｙｒｉｔｅｓｔｉｎが受精に関与していることがよく知られているが、糖鎖のある細胞外基質を構成するプロテオグライカンを分解するタンパク質としてのＡＤＡＭＴＳ４が発生の初期段階で決定的な役割を果たしていることが本発明者らにより初めて明らかになった。
【００１６】
本発明者らによって今回見出された知見に基づけば、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質を標的とすることにより、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現の阻害あるいは活性の阻害に基づいた医薬品候補化合物をスクリーニングすることが可能である。このスクリーニングにより得られる化合物は、避妊薬となるものと大いに期待される。
【００１７】
例えば、ＡＤＡＭＴＳ４の機能阻害剤あるいは発現阻害剤を受精卵に対して適用することにより、受精卵の発育阻害作用が期待されるため、避妊作用が考えられる。本発明の薬剤はヒトに対して使用する以外に、野生動物または家畜に対しても適用可能である。
【００１８】
即ち、本発明は、ＡＤＡＭＳＴ４タンパク質の機能阻害物質を有効成分として含有する薬剤、およびＡＤＡＭＳＴ４タンパク質をターゲットとする医薬品のためのスクリーニング方法に関し、より具体的には、
〔１〕 ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能阻害物質を有効成分として含有する、受精卵の発育阻害作用を有する薬剤、
〔２〕 ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能阻害物質を有効成分として含有する、避妊用薬剤、
〔３〕 ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能阻害物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を含む、〔１〕または〔２〕に記載の薬剤、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＡＤＡＭＴＳ４タンパク質変異体
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する抗体
（ｃ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する低分子化合物
〔４〕 ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現阻害物質を有効成分として含有する、受精卵の発育阻害作用を有する薬剤、
〔５〕 ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現阻害物質を有効成分として含有する、避妊用薬剤、
〔６〕 ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現阻害物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を含む、〔４〕または〔５〕に記載の薬剤、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写産物、またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現を、ＲＮＡｉ効果による阻害作用を有する核酸
〔７〕 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、不妊症治療のための薬剤、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む、ＡＤＡＭＴＳ４変異体タンパク質であって、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質と機能的に同等なタンパク質
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ
〔８〕 ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質がマウス由来である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の薬剤、
〔９〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊用薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合活性を測定する工程
（ｃ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと結合する化合物を選択する工程
〔１０〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊用薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１１〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊用薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１２〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊用薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞へ被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該細胞におけるＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現量または活性を測定する工程、
（ｃ）被検化合物に非存在下において測定した場合と比較して、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現量または活性を低下させる化合物を選択する工程
〔１３〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ＡＤＡＭＴＳ４プロテアーゼ活性阻害剤のスクリーニング方法、
（ａ）プロテオグリカンと、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質および被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のプロテオグリカンを基質とする切断活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記切断活性を低下させる化合物を選択する工程
〔１４〕 プロテオグリカンが、アグリカン、ブレビカン、またはバーシカンである、〔１３〕に記載のスクリーニング方法、
〔１５〕 ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする哺乳動物細胞、を提供するものである。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明者らによって、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子ノックアウトマウスは、初期胚分化が正常に行われず、初期段階で死亡することが見出された。即ち、ＡＤＡＭＴＳ４が発生初期段階で決定的な役割を果たしていることが明らかになった。また、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質は受精卵と続発する発育段階の胚子に特異的に発現しており、さらに、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能を阻害することにより受精卵の発育が阻害されることが示された。従ってＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能阻害物質を有効成分として含有する薬剤は、受精卵の発育を阻害する作用を有するものと考えられる。
【００２０】
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能阻害物質を有効成分として含有する、受精卵の発育を阻害する作用を有する薬剤を提供する。受精卵の発育阻害によって、妊娠の進行が止まり人工的な早産（流産）が誘起されると考えられる。従って、本発明の上記薬剤は、例えば避妊用薬剤として有効である。所謂、中絶用薬剤あるいは堕胎用薬剤もまた、本発明の避妊用薬剤に含まれる。また、本発明の避妊用薬剤は、初期胚分化の段階において適用されることが好ましい。本発明における「初期」の胚とは、通常、８細胞期以前の段階の胚を指すが、必ずしもこの段階に限定されるものではない。
【００２１】
さらに本発明は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能阻害物質を有効成分として含有する薬剤を提供する。該薬剤は、受精卵の発育阻害作用を有する薬剤であり、例えば、避妊用薬剤である。本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能を阻害する物質は、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＡＤＡＭＴＳ４タンパク質変異体、
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する抗体、
（ｃ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する低分子化合物、からなる群より選択される。
【００２２】
「ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＡＤＡＭＴＳ４タンパク質変異体」とは、該タンパク質をコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す。
【００２３】
また、本発明者らは、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する抗体によって受精卵の分裂が用量依存的に阻害されることを見出した。従って、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する、受精卵の発育を阻害する作用を有する避妊用薬剤を提供する。
【００２４】
ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する抗体（抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体）は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質、あるいはＧＳＴとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントＡＤＡＭＴＳ４タンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質若しくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
【００２５】
本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する限り、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかに、ヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。
【００２６】
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばマウス、ヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。
【００２７】
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が挙げられる。本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。
【００２８】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウィルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
【００２９】
本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する抗体は、例えば、避妊を目的とした使用が考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
【００３０】
さらに、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能を阻害し得る物質として、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する低分子量物質も含有する。本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する低分子量物質は、天然または人工の化合物であってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いることによって製造または取得可能な化合物である。また本発明の化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することが可能である。低分子化合物には、例えば、低分子プロテアーゼ阻害剤が挙げられる。
【００３１】
また、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現を阻害する物質を有効成分として含有する薬剤を提供する。該薬剤は、受精卵の発育を阻害する作用を有する薬剤であり、例えば、避妊用薬剤となるものと考えられる。ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現を阻害する物質は、例えば、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写産物、またはその一部に対するアンチセンス核酸、
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸、
（ｃ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果による阻害作用を有する核酸、からなる群より選択される。
【００３２】
本発明における「核酸」とはＲＮＡまたはＤＮＡを意味する。特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上， 新生化学実験講座２ 核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現， 日本生化学会編， 東京化学同人， １９９３， ３１９−３４７．）。
【００３３】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用によりＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現を阻害してもよい。一つの態様としては、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで、所望の動物へ形質転換できる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。
【００３４】
また、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ Ｐに含まれるＭ１ ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子， タンパク質核酸酵素， １９９０， ３５， ２１９１．）。
【００３５】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， １９８８， ２２８， ２２８．）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， １９８８， ２３９， ２８５．、小泉誠および大塚栄子， タンパク質核酸酵素， １９９０， ３５， ２１９１．、Ｋｏｉｚｕｍｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， １９８９， １７， ７０５９．）。
【００３６】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ， ＪＭ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９８６， ３２３， ３４９．）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ， Ｙ． ＆ Ｓａｓａｋｉ， Ｎ．， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， １９９１， １９， ６７５１．、菊池洋， 化学と生物， １９９２， ３０， １１２．）。このように、リボザイムを用いて本発明におけるＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
【００３７】
内在性遺伝子の発現の阻害は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｃｅ；ＲＮＡｉ）によっても行うことができる。ＲＮＡｉとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも阻害される現象のことを指す。ＲＮＡｉの機構の詳細は明らかではないが、最初に導入した二本鎖ＲＮＡが小片に分解され、何らかの形で標的遺伝子の指標となることにより、標的遺伝子が分解されると考えられている。ＲＮＡｉに用いるＲＮＡは、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好ましい。
【００３８】
さらに本発明は、不妊症治療のための薬剤を提供する。該薬剤に含まれる有効成分は、例えば、
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質、
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む、ＡＤＡＭＴＳ４変異体タンパク質であって、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質と機能的に同等なタンパク質、
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、のいずれかを含む。
【００３９】
本発明の薬剤の有効成分である「ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質」は、天然のタンパク質の他、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えばＡＤＡＭＴＳ４タンパク質が発現していると考えられる細胞外マトリックス等の組織の抽出液に対し、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。
【００４０】
本発明において、「機能的に同等なタンパク質」とは、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質において明らかにされている活性と同様の活性を備えたタンパク質である。
【００４１】
あるいはＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のアミノ酸配列に対して、たとえば９０％以上、望ましくは９５％以上、更に望ましくは９９％以上の相同性を有するタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質と機能的に同等なタンパク質として示すことができる。
【００４２】
本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質は、その由来する生物に特に制限はなく、例えば、マウス、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、鳥など、ペット、家畜等を挙げることができる。ヒトの疾患の治療や予防に用いる場合には、好ましくは哺乳動物由来であり、最も好ましくはヒト由来である。
【００４３】
また、本発明の薬剤の有効成分であるＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードするＤＮＡもまた、本発明に含まれる。本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードするＤＮＡは、染色体ＤＮＡであっても、ｃＤＮＡであってもよい。ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードする染色体ＤＮＡは、例えば、細胞等から染色体ＤＮＡのライブラリ−を調製し、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードするＤＮＡにハイブリダイズするプローブを用いた、該ライブラリーのスクリーニングにより取得することができる。またＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードするｃＤＮＡは、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質が発現していると考えられる細胞外マトリックス等の組織からＲＮＡ試料を抽出し、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードするＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術により取得することができる。
【００４４】
本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質または該タンパク質をコードするＤＮＡは、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質と機能的に同等であれば、その塩基配列やアミノ配列が改変された変異体であってもよい。このような変異体は、天然のものでも人工のものでもよい。人工的に変異体を調製するための方法は当業者に公知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ， Ｔ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４， ３６７−３８２ （１９８７））、ダブルプライマー法（Ｚｏｌｌｅｒ， Ｍ． Ｊ． ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｍ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４， ３２９−３５０ （１９８７））、カセット変異法（Ｗｅｌｌｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ３４， ３１５−２３ （１９８５））、メガプライマー法（Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． ａｎｄ Ｓｏｍｍｅｒ， Ｓ． Ｓ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８， ４０４−４０７ （１９９０））などが知られている。
【００４５】
本発明の上記薬剤は、例えば、不妊症に対する治療効果を有するものと考えられる。
【００４６】
本発明におけるＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードする遺伝子は、マウスをはじめ、種々の哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、鳥など、ペット、家畜等において存在することが知られている。
【００４７】
本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のアミノ酸配列、および該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列についての情報は、当業者においては、ＧｅｎＢａｎｋ等の公共の遺伝子データベースを利用して、容易に取得することができる。例えば、マウスＡＤＡＭＴＳ４遺伝子のＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号は、ＮＭ＿１７２８４５である。また、マウスＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の塩基配列を配列番号：１に、また該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００４８】
また本発明は、避妊用薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００４９】
その一つの態様は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合を指標とする方法である。通常、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと結合する化合物は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能を阻害する効果を有することが期待される。本発明の上記方法においては、まず、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物を接触させる。ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドは、被検化合物との結合を検出するための指標に応じて、例えば、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドの精製された形態、細胞内または細胞外に発現した形態、あるいはアフィニティーカラムに結合した形態であり得る。この方法に用いる被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
【００５０】
本方法においては、次いで、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合を検出する。ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合は、例えば、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドに結合した被検化合物に付された標識によって検出することができる。また、細胞内または細胞外に発現しているＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドへの被検化合物の結合により生じるＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の活性の変化を指標として検出することもできる。
【００５１】
本方法においては、次いで、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと結合する被検化合物を選択する。
【００５２】
本方法により単離される化合物は、受精卵の発育阻害作用を有することが期待され、例えば、避妊用薬剤として有用である。また、不妊症のメカニズム解明の研究等に有用である。
【００５３】
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現を指標とする方法である。ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現量を低下させるような化合物は、避妊のための医薬品候補化合物となることが期待される。
【００５４】
本方法においては、まず、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、鳥など、ペット、家畜等に由来する細胞が挙げられるが、これら由来に制限されない。「ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞」としては、内因性のＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現している細胞、または外因性のＡＤＡＭＴＳ４遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外因性のＡＤＡＭＴＳ４遺伝子が発現した細胞は、通常、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
【００５５】
本方法に用いる被検化合物としては、特に制限はない。例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。
【００５７】
本方法においては、次いで、該ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現レベルを測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞からｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。また、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。さらに、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。
【００５８】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、避妊のための医薬品候補化合物となる。さらに、上記発現レベルを上昇させる化合物は、不妊症の治療のための薬剤となることが期待される。
【００５９】
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、本発明のＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現量を低下させるような化合物を、レポーター遺伝子を利用して同定する方法に関する。
【００６０】
本方法においては、まず、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。ここで「機能的に結合した」とは、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。
【００６１】
本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなく、例えば、ＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびＧＦＰ遺伝子等が挙げられる。「ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」として、例えば、このような構造が挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのＤＮＡ構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。
【００６２】
「ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを添加したものを挙げることができる。
【００６３】
本方法における「接触」は、「ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、または該ＤＮＡを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である。
【００６４】
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。
【００６５】
本方法においては、次いで、測定したレポーター遺伝子の発現レベルを、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、低下させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、避妊のための医薬品候補化合物となる。
【００６６】
また、本発明のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質は、アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）、ブレビカン（ｂｒｅｖｉｃａｎ）、バーシカン（ｖｅｒｓｉｃａｎ）等のプロテオグリカンを基質として切断するプロテアーゼ活性を有する。従って、ＡＤＡＭＴＳ４のプロテオグリカンに対する切断活性を指標とすることにより、ＡＤＡＭＴＳ４プロテアーゼ活性阻害剤のスクリーニングを行うことが可能である。即ち、切断活性を低下させるような化合物は、プロテアーゼ阻害剤となるものと期待される。本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ＡＤＡＭＴＳ４プロテアーゼ活性阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
（ａ）プロテオグリカンと、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質および被検化合物とを接触させる工程、
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のプロテオグリカンを基質とする切断活性（プロテアーゼ活性）を測定する工程、
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記切断活性を低下させる化合物を選択する工程
【００６７】
通常、ペプチドの切断（プロテアーゼ活性）を検出することは、当業者においては簡便に行い得ることであり、上記工程（ｂ）の切断活性の測定は、一般的な方法、例えば、アクリルアミドゲル電気泳動法、または質量分析装置等を利用した方法により、適宜、実施することが可能である。
【００６８】
本発明の方法のＡＤＡＭＴＳ４のプロテアーゼ活性の基質となり得るプロテオグリカンとしては、好ましくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを挙げることができる。本発明のプロテオグリカンの具体例としては、例えば、アグリカン、ブレビカン、バーシカンを好適に例示することができる。これらのプロテオグリカンは、ＡＤＡＭＴＳ４が切断し得る部位（領域）を含むものであれば、上記プロテオグリカンを構成する部分断片（部分ペプチド）であってもよい。例えば、本発明の方法においてアグリカンの部分断片を用いる場合には、球間ドメイン（ＩＧＤ）のＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４を含む部分断片であることが好ましい。
【００６９】
また、上記方法に使用するＡＤＡＭＴＳタンパク質は、変異を含まない全長タンパク質であることが好ましいが、プロテアーゼ活性を有するものであれば、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の一部のアミノ酸配列が置換・欠失されたタンパク質であってもよい。
【００７０】
本発明の上記方法によって取得されるＡＤＡＭＴＳ４プロテアーゼ活性阻害剤は、避妊用薬剤となるものと期待される。従って、上記工程（ａ）〜（ｃ）を含む避妊用薬剤の候補化合物のスクリーニング方法もまた、本発明に含まれる。
【００７１】
本発明の薬剤の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、
ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００７２】
上記薬剤の剤型の種類としては、例えば経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。また、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードするＤＮＡを生体内に投与する場合には、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターを利用することができる。投与方法としては、ｉｎ ｖｉｖｏ法およびｅｘ ｖｉｖｏ法を例示することができる。
【００７３】
本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。
【００７４】
さらに、本発明は、ＡＤＭＡＴＳ４遺伝子の発現が人為的に抑制されている哺乳動物細胞に関する。本発明者らは、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現が人為的に抑制されている遺伝子改変哺乳動物細胞の解析を行うことで、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の人為的な抑制が、初期胚の分裂異常および胚の致死に対して関連性があることを見出した。従って、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現の抑制あるいは活性の抑制に関連する疾患のモデル細胞として有用なＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現が人為的に抑制されている遺伝子改変哺乳動物細胞を提供する。このような遺伝子改変哺乳動物細胞は、不妊症治療のための薬剤のスクリーニングに用いることが可能であり、また、不妊症のメカニズム解明の研究等に有用である。
【００７５】
本発明の上記細胞を利用したスクリーニング方法においては、まず被検化合物をＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現を人為的に抑制した哺乳動物細胞と接触させる。次いで、該細胞におけるＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現の抑制あるいは活性の抑制に関連する変化を検出し、被検化合物を投与していない場合（対照）と比較して、そのような変化を起こさせない化合物を選択する。
【００７６】
本方法において「遺伝子の発現を人為的に抑制」とは、完全な抑制および部分的な抑制の両方が含まれる。また遺伝子対の一方の発現が抑制されている場合も含まれる。抑制する方法として、当業者においては一般的に公知の方法によって行うことができる。例えば、遺伝子改変技術（標的遺伝子部位の組み換えを促進する酵素、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘにおけるＣｒｅ、の導入による条件的遺伝子改変技術も含む）を用いた方法、アンチセンスＤＮＡを用いた方法、または、ＲＮＡｉ技術を用いた方法等が挙げられる。
【００７７】
本方法における「哺乳動物細胞」とは、ヒトを含む脊椎動物や無脊椎動物の細胞を意味する。具体的には、ヒト、またはマウスやラット等のげっ歯類由来の細胞を挙げることができるが、最も好適にはマウス由来の細胞である。
【００７８】
遺伝子改変動物の作製は、例えば次にようにして行うことができる。まず、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片をクローニングして、これを基に、内在性の標的遺伝子改変のための相同組み換え用ベクターを構築する。該相同組み換え用ベクターには、標的遺伝子またはその発現制御領域の少なくとも１部を欠失および／または変異させた核酸配列、標的遺伝子またはその発現制御領域にヌクレオチドやポリヌクレオチドが挿入された核酸配列、標的遺伝子またはその発現制御領域に他の遺伝子が挿入された核酸配列を含むが、標的遺伝子の活性が失われる核酸配列であれば、前記の欠失および／または変異部位および挿入部位は限定されない。
【００７９】
挿入される遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素遺伝子等が挙げられる。また、これらの組み合わせも考えられる。該相同組み換え用ベクターの基本骨格は、特に、制限はなく、ｐＫＯＮｅｏ（レキシコン）等を用いることができる。
【００８０】
構築した相同組み換え用ベクターを、個体へ分化させることが可能な哺乳動物細胞（例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞））に導入し、内因性の標的遺伝子との相同組み換えを行うことで、遺伝子改変哺乳動物細胞を作製する。遺伝子対の双方の発現が抑制されている該細胞を作製するには、例えば、高濃度のネオマイシンで細胞を選択する方法で得ることが可能である。相同組み換え用ベクターの細胞への導入は、当業者に公知の方法によって行うことができる。具体的には、エレクトロポレーション法等を例示することができる。
【００８１】
本方法において個体へ分化させることが可能な動物細胞としてＥＳ細胞を用いた場合は、例えば、該細胞を胚盤胞に注入することによりキメラ胚を作製し、偽妊娠させた動物の子宮に移植して産仔を得る。遺伝子改変ＥＳ細胞由来の組織を有するキメラ動物を選別できるようにするために、より好適には、作製された個体の外部的特徴（例えば、毛色）が、遺伝子改変ＥＳ細胞由来の組織と胚盤胞由来の組織とで異なるように、胚盤胞を選択する。また、遺伝子改変ＥＳ細胞由来の生殖組織を有するキメラ動物であるか否かの判定は、一般的には、該キメラ哺乳動物と適当な系統の同種哺乳動物との交配により得られた仔の毛色で行うが、その他の方法として、例えば、該キメラ哺乳動物の生殖細胞から抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を行い、挿入された遺伝子の有無を検出する方法を用いることも可能である。
【００８２】
該キメラ動物と適当な系統の同種動物との交配により得られた仔が、ヘテロ接合型遺伝子改変動物であるか否かは、例えば、該動物細胞から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲやサザンハイブリダイゼーションで判定することができる。また、ヘテロ接合型遺伝子改変動物同士の交配により、ホモ接合型遺伝子改変動物細胞を作製することができる。交配により得られた細胞が、ホモ接合型遺伝子を有する改変動物細胞であるか否かも上記の判定法に従い実施することができる。
【００８３】
遺伝子改変動物細胞の作製は、上記の方法に制限されない。例えば、体細胞クローン動物の作製技術に従って遺伝子改変動物細胞を作製することもできる。具体的には、ＥＳ細胞以外の体細胞（例えば、皮膚細胞等）を用いて、ＥＳ細胞の場合と同様な方法に従って遺伝子改変動物細胞を作製することができる。
【００８４】
さらに本発明は、不妊症の検査方法に関する。本実施例においてＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能が阻害されると、胚発生の初期段階で細胞分裂に異常を示した。従って、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の変異や発現状態を指標とすることにより、不妊症の検査を行うことが可能である。
【００８５】
また本発明は、不妊症の検査方法に用いられる検査薬に関する。その一つの態様は、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子または該遺伝子の制御領域にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む検査薬である。
【００８６】
該オリゴヌクレオチドは、好ましくはＡＤＡＭＴＳ４遺伝子または該遺伝子制御領域の塩基配列に特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，第２版１９８９に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。
【００８７】
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子または該遺伝子制御領域の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。上記の領域としては、例えば、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子のエクソン領域、イントロン領域、プロモーター領域、エンハンサー領域等を挙げることができる。
【００８８】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子または該遺伝子制御領域の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。プローブがハイブリダイズする領域としては、例えば、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子のエクソン領域、イントロン領域、プロモーター領域、エンハンサー領域等が挙げられる。
【００８９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【００９０】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００９１】
本発明の検査薬の他の一つの態様として、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する抗体を含む検査薬を挙げることができる。抗体は、検査に用いることが可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばポリクローナル抗体やモノクローナル抗体が挙げられる。抗体は必要に応じて標識される。これら抗体は上述の方法によって作製することができる。
【００９２】
本発明の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【００９３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
〔実施例１〕 ＡＤＡＭＴＳ４のゲノムクローンの単離
ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により、ＡＤＡＭＴＳ４の６８０塩基対からなるプローブをマウス１３．５日胚のｃＤＮＡから増幅した。用いた２つのプライマーを以下に示す。
・フォーワードプライマー：５’−ｔｔｔｇａｃａｃａｇｃｃａｔｔｃｔｇｔｔ（配列番号：３）
・リバースプライマー：５’−ｔｇｇａｇｃａｇｔｃａｃｃｃｃａｔｇｇ（配列番号：４）
【００９４】
上記プライマーの塩基配列は公開済みのヒトＡＤＡＭＴＳ４の配列（ＥＳＴ ＡＢ０１４５８８）に基づいて設計した。ＰＣＲ産物は、ｐＣＲＴＭＩＩ−ＴＯＰＯ ＴＡベクター（インビトロジェン、米国）にクローン化した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いてプラスミドを精製し、Ｍ１３フォーワードプライマーおよびＭ１３リバースプライマーを用いてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０遺伝子解析装置により配列を決定した。クローン番号１２のｃＤＮＡクローンの配列は、ＡＢ０１４５８８に対し８７％の相同性を示した。このことは、実際に得られたクローンがマウスＡＤＡＭＴＳ４遺伝子に対応することを示している。
【００９５】
クローン番号１２のプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ＱＩＡＥＸＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて、ＤＮＡ断片を０．７％アガロースから抽出し、プローブとして用いた。このｃＤＮＡプローブを３２Ｐ−ｄＣＴＰ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）で標識し、λＦＩＸＩＩベクター（ストラタジーン）に挿入された１２９ｓｖｊ株に由来するマウスのゲノムライブラリーのスクリーニングに用いた。１ ｘ １０７個のプラークから陽性クローンが１個得られた。標準的なアルカリ溶解法を用いて、ファージＤＮＡを単離した。ファージＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｐｏＩ、ＸｈｏＩ（宝酒造、Ｊａｐａｎ）で消化し、制限酵素地図を作製した。このゲノムクローンの制限酵素地図を図１に示す。上記のプローブを用いたサザンブロット分析で、エクソンを含むと考えられる断片を同定した。さらに配列解析を行うために、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等の制限酵素によって得られた消化断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋ ベクター（ストラタジーン）にサブクローニングし、配列を決定した。ゲノムクローンはそのサイズが約１３．９ｋｂであった。この配列をヒトおよびラットのＡＤＡＭＴＳ４ ｃＤＮＡ配列およびゲノム配列と比較し、エクソン−イントロン境界の正確な位置を決定した。表１に、マウスＡＤＡＭＴＳ４のエクソン／イントロン境界を示す。エクソン配列を大文字で示す。イントロンのスプライス部位のヌクレオチドコンセンサス配列は太文字で示す。この表１から分かるようにエクソン／イントロン境界の配列は、報告されているスプライスドナー（ＧＴ）およびアクセプター（ＡＧ）のコンセンサス配列と合致する。このゲノムＤＮＡは、エクソン１〜９を含む領域を含んでいた。
【００９６】
【表１】
マウスＡＤＡＭＴＳ４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、エクソンをつなぎ合わせ、ヒトＡＤＡＭＴＳ４の配列と比較して構築した。この配列は、長さが２５０２塩基対であり、８３４アミノ酸をコードする（図２、配列番号：１および２）。このＯＲＦは、典型的なシグナル配列をＮ末端に含み、その後ろにｃｙｓ１９０にシステインスイッチと推定されるプロペプチドドメイン、および触媒ドメインの前に潜在的ｆｕｒｉｎ開裂部位を含む。触媒ドメインは、ＭＭＰとＡＤＡＭに存在するｚｉｎｃ結合に類似したモチーフであるＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨ モチーフを含む。また、ＡＤＡＭＴＳ４はディスインテグリン様ドメインを含むが、膜貫通性ドメインもしくは細胞質テールは有していない。その代わり、ＣＯＯＨ末端ドメインにＡＤＡＭＴＳ１に存在するものと類似したトロンボスポンジンのＩ型モチーフを有している。
【００９８】
また、ＡＤＡＭＴＳ４アミノ酸配列のメタロプロテイナーゼドメインとＡＤＡＭＴＳ１およびＡＤＡＭＴＳ５のアミノ酸配列を比較したところ、それぞれ同一性が５０％および４０％という結果になった（図３）。
【００９９】
〔実施例２〕 ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子ターゲティング
マウスＡＤＡＭＴＳ４遺伝子のゲノム構造および機能性ドメインに基づき、機能的にプロテオグリカンを切断するメタロプロテアーゼドメインがエクソン３に存在することが分かった。図４に示すように、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を破壊するターゲティングベクターは、エクソン２〜４を含む２．０ｋｂのＡｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をネオマイシン耐性遺伝子およびそれと隣接したチミヂンキナーゼ遺伝子で置換することによって構築した。ＮｏｔＩによりこのプラスミドを線状化し、エレクトロポレーションで胚性幹（ＥＳ）細胞１２９／ＳＭ−１に導入した。ＥＳ細胞を、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８および２μｍｏｌ／ｌのガンシクロビルを含む培地で選択した。ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡを単離し、ＸｈｏＩで消化して電気泳動を行った。プローブ１もしくはプローブ２のいずれかを用いて、得られた相同組換え体をサザンブロット分析によって確認した。
【０１００】
さらに、ターゲティングしたＥＳ細胞クローンをＣ５７ＢＬ／６の胚盤胞に注入して、キメラを作製した。次に、キメラをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配した。ヘテロ接合体ＡＤＡＭＴＳ４ ＋／−マウスは生存可能であり、成体に至るまで生存し、見かけ上は正常でかつ受精可能であった。
【０１０１】
〔実施例３〕 ＡＤＡＭＴＳ＋／−マウス交配より得た仔の遺伝子型分析
マウス発生におけるＡＤＡＭＴＳ４遺伝子欠失の効果を明らかにする目的で、ホモ接合体ＡＤＡＭＴＳ４−／−の仔を得るために、ＡＤＡＭＴＳ４＋／−マウス同士を交配した。ＡＤＡＭＴＳ＋／−マウス同士の異種交配あるいは野生型マウスとＡＤＡＭＴＳ＋／−マウスの交配により得た仔マウスのゲノムＤＮＡ２０μｇを、サザンブロット分析に供した。
【０１０２】
しかしながら、離乳時に遺伝子型を調べた個体１８７匹中には１匹もＡＤＡＭＴＳ４−／−マウスはいなかった。得られた仔の遺伝的分布については、ヘテロ接合体と野生型同腹子間の出生率の比が約２対１（１２７／６０）で、雄対雌の分布は同等（９０／９７）（表２）であり、このことはヌル変異が劣性で胚性致死であり、この致死率が精子・卵融合によるものではないことを示唆している。
【０１０３】
【表２】
更に、ターゲッティングによるＡＤＡＭＴＳ４の破壊効果を調べるために、実施例４に示すようにマウスゲノムＤＮＡのサザンブロット分析（図５Ａ）、実施例５に示すように新生仔マウス脳より抽出したトータルＲＮＡのノーザンブロット分析（図５Ｂ）、および実施例７に示すように新生仔マウス脳から抽出したタンパク質のウエスタンブロット分析（図５Ｃ）を行った。
【０１０５】
〔実施例４〕 サザンブロット分析
０．２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む５００μｌのゲノム溶解緩衝液（１ ｘ ＳＳＣ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ）中で、１センチメートル角のマウスの尾を５５℃で一昼夜インキュベートした。ゲノムＤＮＡをフェノール−クロロホルム処理により二回抽出し、１容量の２−プロパノールで沈殿させた。これを７５％のエタノールで洗浄し、２０分間乾燥させた。４℃で一昼夜かけて完全に溶解させた後、２０μｇのゲノムＤＮＡを１００ＵのＸｈｏＩで３７℃にて一昼夜消化した。０．９％アガロースで電気泳動した制限酵素処理断片をナイロン（登録商標）膜ハイボンドＮ＋（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）に転写した。
【０１０６】
サザン用のプローブ１および２（図４）は、ＰＣＲによって増幅し、配列解析によって確認した。メガプライムＤＮＡ標識システム（ＭｅｇａｐｒｉｍｅＴＭ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で、プローブをランダム標識し、Ｃｅｎｔｒｉ−ＳＥＰスピンカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ， Ａｄｅｌｐｈｉａ， ＮＪ）で精製した。Ｐｅｒｆｅｃｔ ＨｙｂＴＭ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（東洋紡、Ｊａｐａｎ）で３０分間プレハイブリダイゼーションを実施したのち、熱変性させたプローブ（２．０ｘ１０５ｃｐｍ／ｍｌ）を用いて膜を６８℃で６時間ハイブリダイズした。次に、６８℃にて、膜を２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１５分間、および０．１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで５分間、順次洗浄した後、コダック（Ｋｏｄａｋ）フィルムに−７０℃で２日間露光した。
【０１０７】
ＡＤＡＭＴＳ４の発現は、野生型同腹子マウスと比較して約２分の１であったが、成長速度およびサイズは野生型同腹子とほぼ同等であった。
【０１０８】
〔実施例５〕 ＡＤＡＭＴＳ４の発現に関するノーザンブロット分析
トータルＲＮＡ２０μｇを新生仔マウスの脳から調製し、６．６％のホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲルで電気泳動を行った。毛細管反応で、ＲＮＡを一昼夜ナイロン（登録商標）膜に転写し、ベイキングにより固定した。メガプライムＤＮＡ標識システム（ＭｅｇａｐｒｉｍｅＴＭ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ；アマシャム・ライフサイエンス）を用いて、クローン番号１２のｃＤＮＡプローブを３２Ｐ−ｄＣＴＰ（３０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック）で標識し、Ｃｅｎｔｒｉ−ＳＥＰスピンカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ， Ａｄｅｌｐｈｉａ， ＮＪ）で精製した。Ｐｅｒｆｅｃｔ ＨｙｂＴＭ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（東洋紡、Ｊａｐａｎ）で３０分間プレハイブリダイゼーションを実施したのち、熱変性させたプローブ（２．０ ｘ １０５ ｃｐｍ／ｍｌ）を用いて膜を６８℃で６時間ハイブリダイズした。次に、６８℃にて、膜を２ ｘ ＳＳＣ， ０．１％ ＳＤＳで１５分間、および０．１ ｘ ＳＳＣ， ０．１％ ＳＤＳで１５分間、順次洗浄した後、ＡＤＡＭＴＳ４に関してはコダックのフィルムに−７０℃で１４日間露光した。膜からプローブを除去した後、３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識したマウスＧＡＰＤＨ遺伝子で再ハイブリダイズし、１２時間露光した。
【０１０９】
〔実施例６〕 ＡＤＡＭＴＳ４ポリクローナル抗体の調製
ＡＤＡＭＴＳ４のＣＯＯＨ末端の特異的な部分（最も相同な遺伝子であるマウスＡＤＡＭＴＳ１遺伝子と比較して）をコードする２種類のｃＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した。プライマーセットを以下に示す。
【０１１０】
【０１１１】
Ｗ１ではＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ、およびＷ２ではＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩを利用してＴＡベクターから切り出した。これを、ＧＳＴ融合タンパク質発現ベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔ−３（アマシャム・ファルマシア・バイオテック、Ｂｕｃｋｓ、 ＵＫ）のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。これらの発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に導入した。融合タンパク質の調製は以前に発表された方法に従って実施した（Ｙａｓｕｋａｗａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂｙ ｃｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０， ２５３２８−３１． （１９９５）．）。融合タンパク質による免疫、ならびに融合タンパク質ＧＳＴ−Ｗ１およびＧＳＴ−Ｗ２に対するポリクローナル抗体の作製は、以前に発表された方法に従って実施した（Ｓｕ， Ｓ．Ｂ．， Ｍｕｋａｉｄａ， Ｎ．， Ｗａｎｇ， Ｊ．， Ｎｏｍｕｒａ， Ｈ． ＆ Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ， Ｋ． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ａ Ｃ−Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ＣＣＲ１， ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＣＲ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ． Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ６０， ６５８−６６． （１９９６）．）。
【０１１２】
簡単に説明すると、２匹の白色ウサギを、フロインド完全アジュバント（シグマ・アルドリッチ、ＵＳＡ）と混合したＧＳＴ融合タンパク質４００μｇで初回免役し、各々をフロインド不完全アジュバント２００μｇで９回免役した。最終免疫から１週間後、ウサギを放血させ血清を採取した。
【０１１３】
次に、プロテインＡセファロースＴＭ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）カラムを用いて血清を分画し、ＩｇＧ分画を得た。調製したＡＤＡＭＴＳ４抗体の特異性を、完全長のＡＤＡＭＴＳ４−ＧＦＰトランスフェクタントを用いて確認した。
【０１１４】
〔実施例７〕 ウエスタンブロット分析
野生型同腹子およびヘテロ接合体マウスから切り出した新生児の脳の一部を、１０％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。タンパク質をニトロセルロース膜（０．４５μｍ）に、４ｍＡ／ｃｍ２で１時間転写した。膜をブロックＡＣＥ（大日本製薬、Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ））で一昼夜ブロッキングした後、ＴＢＳ緩衝液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）， １５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で、マウス抗ＡＤＡＭＴＳ４ポリクローナル抗体Ｗ１もしくは抗αチューブリン抗体（オンコジーン社）と室温にて１時間反応させ、次に、Ｗ１に関しては２０００倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）、α−チューブリンに関してはあるいは２０００倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧ抗体と室温で３０分間反応させた。ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体を化学発光（ＥＣＬ；アマシャム・ファルマシア・バイオテック）により検出し、オートラジオグラフィー用のコダックＸＡＲフィルムに露光した。
【０１１５】
〔実施例８〕 ポリメラーゼ連鎖反応による胚の遺伝子型分析
最近報告された改良型プライマー伸長−前増幅法（ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｉ−ＰＥＰ）−ＰＣＲ）（Ｈｅｉｎｍｏｌｌｅｒ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｔｏｗａｒｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｅｔｈａｎｏｌ− ｆｉｘｅｄ， ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ， ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｔａｉｎｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ８２， ４４３−５３． （２００２）．）のプロトコールを利用した。
【０１１６】
３０μｌのＩ−ＰＥＰ混合液（Ｒｏｃｈｅの１ｘ ＰＣＲ緩衝液Ｎｏ．３において最終濃度：０．０５ ｍｇ／ｍｌゲラチン、２０ ｍｏｌ／Ｌ（Ｎ）１５ランダムプライマー、各１ ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ、３ＵのＴａｑ Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、６ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２を含む）を、１個の胚を含む１０μｌの溶解緩衝液に添加してＩ−ＰＥＰ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲは以下の条件で５０サイクル行った。
【０１１７】
ステップ１：９５℃で２分間；
ステップ２：９５℃で３０秒間；
ステップ３：２８℃で９０秒間；
ステップ４：秒当たり０．１℃で５５℃まで上昇；
ステップ５：５５℃で２分間；
ステップ６：６８℃で３分間；
ステップ７：ステップ２に戻り、４９回繰り返す；
ステップ８：６８℃で１５分間；および
ステップ９：４℃。
【０１１８】
ネステッドＰＣＲ法でＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を増幅した。第１ラウンドのＰＣＲは、全プライマーの５’端に無関係な２０塩基のキメラ配列を有するＡＤＡＭＴＳ４に特異的な上流および下流のプライマーを用いて、複合ＰＣＲ法で実施した。プライマーセットの位置については図４に示す。
【０１１９】
フォーワードプライマーＵＴＳ：
５’−ｇｃｃｇｔｃｃｃａａａａｇｇｇｔｃａｇｔｃｃｔｃａａｃａｃｃｃｃｔａａｃｇａｃｔｃａ（配列番号：９）
リバースプライマーＵＴＡ：
５’−ｇｃｇｇｔｃｃｃａａａａｇｇｇｔｃａｇｔｇｇａｇｃａｔｇｔｔｇａａｇａｃａｔｇｇｃ（配列番号：１０）
【０１２０】
第２ラウンドのＰＣＲは、以下のプライマーセットを用いてネステッド条件で実施した。
【０１２１】
フォーワードプライマーＮＴＳ： ５’−ｃｔｇａｃｃａｃｔｔｔｇａｃａｃａｇｃｃａ（配列番号：１１）
リバースプライマーＮＴＡ：５’−ｃｃａｇｔｔｃａｔｇａｇｃａｇｃａｇｔｇａ （配列番号：１２）
【０１２２】
Ｉ−ＰＥＰ−ＰＣＲ産物を５μｌずつ分注して２５μｌの特異的ＰＣＲ第１ラウンドの混合液（それぞれの濃度が０．２ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．４μｍｏｌ／Ｌプライマー、０．５ＵのＴａｑ Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、および０．５Ｕの抗Ｔａｑ抗体（インビトロジェン））に加えた。第１ラウンドＰＣＲ産物を３μｌずつ分注して、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２； それぞれの濃度が０．２ ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ、０．４ ｍｍｏｌ／Ｌプライマー、および０．３Ｕの Ｔａｑ Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む２２μｌの混合液に加えた。ＰＣＲ条件は、第１ラウンドと第２ラウンドで同一であり：ステップ１が、９５℃で２分間、ステップ２が９５℃で３０秒間、ステップ３が５６℃で４５秒間、ステップ４が７２℃で１分間、ステップ５でステップ２に戻り、２９回繰り返した後、ステップ６で、７２℃で１０分間、ステップ７で４℃である。各実験において、野生型ゲノムＤＮＡによる陽性対照反応も実施した。２％ アガロースゲルで分画してＰＣＲ産物の有無を調べた。野生型およびヘテロ接合体で３９４ｂｐの産物が増幅される。
【０１２３】
ゲノムＤＮＡの増幅を確認する目的で、対照としてＧＡＰＤＨネステッドＰＣＲを実施した。ＧＡＰＤＨ対照のプライマー配列を以下に示す。
【０１２４】
第１ラウンドでは、
フォーワードプライマー：５’−ｃｃｔｔｃａｔｔｇａｃｃｔｃａａｃｔａ（配列番号：１３）、
リバースプライマー：５’−ａｇｔｇａｔｇｇｃａｔｇｇａｃｔｇｔｇｇｔ（配列番号：１４）
第２ラウンドでは、
フォーワードプライマー：５’−ａｇｔａｔｇａｃｔｃｃａｃｔｃａｃｇｇｃａａ（配列番号：１５）
リバースプライマー：５’−ａｇｔｇａｔｇｇｃａｔｇｇａｃｔｇｔｇｇｔ（配列番号：１６）
であり、３２０ｂｐの産物が増幅される。
【０１２５】
〔実施例９〕 致死時期の決定
複数の発育ステージにおける胚を調べて、致死のタイミングの決定を試みた。
【０１２６】
しかし、サザンブロット分析により、８．５日目の初期ステージの胚には、ホモ接合体を見いだすことができず、これらのステージの子宮では、吸収された残留物さえ観察されなかった。これらのデータは、胚が死に至るのは８．５日より前であることを示唆するものである。
【０１２７】
卵子着床前に死亡したのか後に死亡したのか調べるため、本発明者は、着床前の最終ステージである胚盤胞での遺伝子型を同定した。自然排卵および交配した３匹のマウスから得られた３．５日胚１９個には、１個もホモ接合体は見つからなかった。
【０１２８】
〔実施例１０〕 ＡＤＡＭＴＳ４欠損胚の遺伝子型
さらに、８細胞期の胚の遺伝子型を調べた。８細胞期の胚を、自然排卵および交配したマウスから調製した。遺伝子型を調べる前に個々の胚の顕微鏡像を撮像した。図４に示すプライマーセットにより、ゲノムＤＮＡをＩ−ＰＥＰ−ＰＣＲ、ＡＤＡＭＴＳ４特異的ネステッドＰＣＲによって増幅した。野生型およびヘテロ接合体について、３９５ｂｐの産物を増幅し、ホモ接合体と比較した。野生型マウスの尾から得たゲノムＤＮＡを陽性対照として用いた。また、ＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅を、Ｉ−ＰＥＰ−ＰＣＲによりゲノムＤＮＡが実際に増幅したことを確認するための対照とした。
【０１２９】
結果、異常な形態を示し、断片化あるいは細胞未分裂のホモ接合体ＡＤＡＭＴＳ−／−を見いだした（図６）。野生型もしくはヘテロ接合体の胚は８細胞期であった。ホモ接合体のＡＤＡＭＴＳ４−／−胚は８細胞期までしか存在せず、その形態から、ホモ接合体では分裂しないか断片化したことが分かる。この結果は、発育の超初期段階においてＡＤＡＭＴＳ−／−胚が死に至ることを示している。
【０１３０】
さらに本発明者は、２細胞期の胚を調べ、表３に示すように、ヌル胚に８細胞期同様の異常を検出した。つまり、これらの結果から、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子欠損卵子は、着床前に細胞分裂および生存に異常を来たすことが示唆される。
【０１３１】
【表３】
〔実施例１１〕 生殖細胞におけるＡＤＡＭＴＳ４の発現
初期発育ステージの生殖関連細胞（卵子、精子および卵丘細胞）におけるＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡ発現を確認するために、ＲＴ−ネステッドＰＣＲを実施し、ＤＮＡ配列決定により増幅産物の確認を行った。
【０１３３】
２５個の卵子、単一マウス個体に由来する精子各種ステージの胚２０〜３０個、単一マウス個体の卵丘細胞から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン）を用いて製造元の説明書に従いトータルＲＮＡを調製し、これをＤＮａｓｅＩ処理した。ランダムプライマー（プロメガ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて製造元の説明書に従い２０μｌの反応混合液（インビトロジェン）にて４２℃で５０分間反応して、ｃＤＮＡの第１ストランド合成を行った。
【０１３４】
得られたｃＤＮＡサンプルについてネステッドＲＴ−ＰＣＲを実施した。ｃＤＮＡ産物を２μｌずつ分注して、１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２； 各濃度が０．２ ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ、０．４ ｍｍｏｌ／Ｌプライマー、および０．３ＵのＴａｑ Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む１８μｌの混合液に添加した。ＰＣＲ条件は、第１ラウンドと第２ラウンドで同一であり：ステップ１が、９５℃で２分間、ステップ２が９５℃で３０秒間、ステップ３が５６℃で４５秒間、ステップ４が７２℃で１分間、ステップ５でステップ２に戻り、２９回繰り返した後、ステップ６で、７２℃で１０分間、ステップ７で４℃である。ＡＤＡＭＴＳ４に対するプライマーは、イントロン配列をまたぐように設計されており、次のような配列からなる。
【０１３５】
第１ラウンド：
フォーワードプライマー：５’−ｔｔｔｇａｃａｃａｇｃｃａｔｔｃｔｇｔｔ（配列番号：１７）；
リバースプライマー：５’−ｇｇａｔａｃａｇｃｇｇｃｃｃｔｇｇａｃａ（配列番号：１８）；
第２ラウンド：
フォーワードプライマー：５’−ｔｇｔｃａｔｇｇｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｇｇ（配列番号：１９）；
リバースプライマー：５’−ｇｔｇｇｇｃａｃｔｔｃｔｃｃｇｔｇｔｔｇ（配列番号：２０）
【０１３６】
これらのプライマーにより、５６０ｂｐの産物が増幅する。これをＴＡベクターにサブクローニングし、配列を決定した。対照ＧＡＰＤＨのプライマーセットを以下に示す。
【０１３７】
第１ラウンド：
フォーワードプライマー：５’−ｃｃｔｔｃａｔｔｇａｃｃｔｃａａｃｔａ（配列番号：２１）；
リバースプライマー：５’−ａｇｔｇａｔｇｇｃａｔｇｇａｃｔｇｔｇｇｔ（配列番号：２２）；
第２ラウンド：
フォーワードプライマー：５’−ａｇｔａｔｇａｃｔｃｃａｃｔｃａｃｇｇｃａａ（配列番号：２３）；
リバースプライマー： ５’−ａｇｔｇａｔｇｇｃａｔｇｇａｃｔｇｔｇｇｔ（配列番号：２４）
【０１３８】
これらのプライマーにより、３２０ｂｐの産物が増幅する。ＰＣＲ産物を１％のアガロースゲル上で分画し、臭化エチジウムで染色して可視化した。同一の実験を再び繰り返した。
【０１３９】
結果、ＡＤＡＭＴＳ４は、０．５日卵子から胚盤胞までに発現したが、精子もしくは卵丘細胞では発現しなかった（図７）。従って、卵子以外の初期発育にＡＤＡＭＴＳ４が関与している可能性が否定された。
【０１４０】
さらに、ＡＤＡＭＴＳ＋／−雄と野生型の雌、もしくはＡＤＡＭＴＳ＋／−雌と野生型の雄の交配による受精は正常なので、ＡＤＡＭＴＳ４は直接精子・卵融合に関係するとは考えられない。
【０１４１】
〔実施例１２〕 卵子の免疫蛍光染色
自然排卵および交配から０．５日後に、野生型Ｃ５７／Ｂ６マウスを用いて、卵子を含む卵管膨大部を切り出し、ＰＢＳで洗浄した。これをＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ （Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．、Ｅｌｋｈａｒｔ、Ｉｎｄｉａｎａ、ＵＳＡ）に包埋して液体窒素で凍結した。試料をクリオスタットで７μｍの切片にした。Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅで内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害後、切片を１０μｇ／ｍｌの濃度のウサギ抗マウスＡＤＡＭＴＳ４ポリクローナル抗体Ｗ１、もしくは対照ウサギＩｇＧと１時間反応させた。それぞれをＰＢＳで２分間２回洗浄し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで２分間１回洗浄した後、１μｇ／ｍｌ濃度のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ． ＵＳＡ）で３０分間標識した。ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＫＯ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ、ＵＳＡ）で封入した。蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【０１４２】
結果、ＡＤＡＭＴＳ４は分泌タンパク質であることが報告されているが、抗ＡＤＡＭＴＳ４ポリクローナル抗体による免疫蛍光染色では、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質が、ほぼ卵子内に核周囲の網状パターンとして存在していた（図８）。
【０１４３】
〔実施例１３〕 抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体によるインビトロにおける卵子の阻害実験
ＡＤＡＭＴＳ４は、そのトロンボスポンジンドメインによりグリコサミノグリカンを認識し、ＩＧＤにおいて成体における生理学的機能を果たすためにプロテオグリカンを切断する分泌タンパク質であることが報告されている。ＡＤＡＭＴＳ４が卵子において生理学的役割を果たしているか否かを明らかにする目的で、抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体を用いて触媒過程を阻害するインビトロ実験を行った。
【０１４４】
Ｃ５７／ＢＬ６雌マウスに、５ＩＵの妊馬血清（ＰＭＳ）および５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を４８時間間隔で注射して、過排卵させ、すぐに交配した。ｈＣＧ注射後１３〜１５時間で卵管膨大部から０．５日卵子を採取し、４００μｌのＭ２培地滴に入れた。３００μｇ／ｍｌ濃度のＩＩＩ型ヒアルロニダーゼ（シグマ）を用いて卵丘細胞を除去し、第２極体もしくは前核を有する卵子を採取した。卵子培養には、０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、および４０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体、ならびに４０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＧＳＴ抗体を含む、３７℃ ５％ＣＯ２雰囲気化で平衡化したＭ１６培地を用いた。
【０１４５】
卵子回収から２４時間後に胚の形態を観察した結果、抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体による処理では、卵子は断片化もしくは非分裂形態を呈したが、対照では卵子が２細胞期胚まで成長した（図９Ａ）。
【０１４６】
また、卵子回収から２４時間インキュベーション後、２細胞期胚の数を計数したところ、２細胞期の胚の数は、抗体の用量依存的に減少した（図９Ｂ）。２細胞期の胚の比率（％）は、抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体を用いた場合、０μｇ／ｍｌでは７０．５％（ｎ＝１１９）、２０μｇ／ｍｌでは４１．５％（ｎ＝２１２）、３０μｇ／ｍｌでは２３．４％（ｎ＝１４１）、および４０μｇ／ｍｌでは５．２％（ｎ＝５８）あったが、対照の抗ＧＳＴ抗体を用いた場合には、４０μｇ／ｍｌでは７２．７％（ｎ＝９９）であった。
【０１４７】
【発明の効果】
本発明により、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能を制御する薬剤が提供された。また、本発明により、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現の抑制（阻害）あるいは活性の抑制に基づいた避妊薬のスクリーニング方法が提供された。本発明の薬剤または本発明のスクリーニング方法によって取得される化合物は、例えば、早期の避妊に有用である。
【０１４８】
また本発明の薬剤は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現の異常あるいは活性の異常に関連する疾患のメカニズム解明のための研究用試薬としても有用である。
【０１４９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスＡＤＡＭＴＳ４遺伝子のゲノム構造を示す図である。
（Ａ）マウスＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の制限酵素地図。制限酵素部位：Ｅ（ＥｃｏＲＩ）；Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ）；Ｂ（ＢａｍＨＩ）；Ａ（ＡｐｏＩ）；Ｘ（ＸｈｏＩ）。
（Ｂ）マウスＡＤＡＭＴＳ４遺伝子のエクソン／イントロン構造。ボックスはエクソンを表し、間の直線はイントロンを表す。ボックスで囲まれたエクソン内の斜線の領域は、コーディング配列である。
（Ｃ）マウスＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の機能性ドメイン。
【図２】ＡＤＡＭＴＳ４の推定アミノ酸配列を示す図である。ｆｕｒｉｎによる推定切断部位を矢印で示す。トロンボスポンジンのＩ型モジュールを下線で示した。ＭＭＰ様システインスイッチにおけるシステイン残基を黒丸印で示した。その他のシステイン残基については、星印で示した。ｆｕｒｉｎ切断部位までプレプロ領域が伸びており、触媒ドメインは、ｆｕｒｉｎ切断部位からディスインテグリン様配列までを含む。スペーサードメインの開始部位を示した。１文字アミノ酸コードを用いた。
【図３】ＡＤＡＭＴＳ４アミノ酸配列のメタロプロテイナーゼドメインの比較結果を示す図である。マウスＡＤＡＭＴＳ４（上段）およびＡＤＡＭＴＳ１あるいはＡＤＡＭＴＳ５（下段）に関するアミノ酸残基を示す。それぞれ、同一性は５０％および４０％であった。Ｚｉｎｃ結合モチーフには下線を付した。
【図４】遺伝子ターゲッティング法に用いたゲノム制限酵素地図（Ａ）ならびに野生型遺伝子座、ターゲッティングベクター、ターゲッティング後の遺伝子座（Ｂ）を表わした図である。
（Ａ）ＡＤＡＭＴＳ４のゲノム制限酵素地図。エクソン２〜４（メタロプロテイナーゼドメイン）を含むＡｐｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片は、ネオマイシン耐性遺伝子と置換されている。
Ｂ（ＢａｍＨＩ）；Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ）；Ａ（ＡｐｏＩ）；Ｅ（ＥｃｏＲＩ）；Ｘ（ＸｈｏＩ）。
（Ｂ）エクソンおよびイントロンは、それぞれ垂直および水平な線で示した。ＰＧＫプロモーター（ＰＧＫ−ｎｅｏ’）で制御されるネオマイシン耐性遺伝子、およびＰＭＣ１プロモーター（ＰＭＣ１−ｔｋ）で制御されるチミジンキナーゼ遺伝子を矢印で示した。サザンブロット分析用プローブを示した。Ｘで示した位置はＸｈｏＩ制限酵素部位に対応する。
【図５】マウスＡＤＡＭＴＳ４のターゲティングによる破壊の効果を示す写真である。
（Ａ）マウスゲノムＤＮＡのサザンブロット分析の結果を表わす写真。１１ｋｂのＸｈｏＩ消化断片は、プローブ１およびプローブ２における相同組換え対立遺伝子を示す。ＷＴは野性型、＋／−はヘテロ接合体である。
（Ｂ）各遺伝子型の新生仔マウス脳から抽出したトータルＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を表わす写真。
（Ｃ）各遺伝子型の新生仔マウス脳から抽出したタンパク質のウエスタンブロット分析の結果を表わす写真。
【図６】ＡＤＡＭＴＳ４欠損胚の遺伝子型および形質の分析を示す写真である。
【図７】生殖関連細胞におけるＡＤＡＭＴＳ４の発現を示す写真である。
トータルＲＮＡを卵子（１）、２細胞期胚（２）、８細胞期胚（３）、未分化胚芽細胞（４）、精子（５）および卵丘細胞（６）より抽出した。ＲＴ−ネステッドＰＣＲの結果、ＡＤＡＭＴＳ４は精子および卵丘細胞では発現が見られなかったが、卵子および胚では発現が観察された。トータルＲＮＡを陰性対照、心臓由来のｃＤＮＡを陽性対照として利用した。下段に、ＧＡＰＤＨのＲＴ−ネステッドＰＣＲの結果を示す。
【図８】卵子におけるＡＤＡＭＴＳ４の免疫蛍光の結果を示す写真である。
野性型Ｃ５７／Ｂ６マウス由来の自然排卵および交配後の０．５日胚をＯＣＴコンパウンド中に包埋し、７μｍの切片にした。切片標本は抗マウスＡＤＡＭＴＳ４抗体（Ｂ）およびウサギＩｇＧ（Ｃ）で染色し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｉｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧで標識した。ＡＤＡＭＴＳ４は、対照と比較したところ核の周辺領域に発現が見られた。光ｆｉｅｌｄ照明下の卵子は、卵丘細胞周囲の透明帯を有していた（Ａ）。
【図９】卵子発育における抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体の効果を示す写真および図である。
０．５日の卵子は、過排卵後に交配したＣ５７／ＢＬ６の雌から調製した。これを、抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体および対照抗ＧＳＴ抗体を各種の濃度で含むＭ１６培地でインキュベートした。２４時間インキュベーションした後、卵子の形態を観察した。抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体による処理では、卵子は断片化もしくは非分裂形態を呈したが、対照では卵子が２細胞期胚まで成長した（Ａ）。２４時間インキュベーション後、２細胞期胚の数を計数したところ、ＡＤＡＭＴＳ４の阻害効果は用量依存的であった（Ｂ）。
Claims (15)
- ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能阻害物質を有効成分として含有する、受精卵の発育阻害作用を有する薬剤。
- ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能阻害物質を有効成分として含有する、避妊用薬剤。
- ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の機能阻害物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を含む、請求項１または２に記載の薬剤。
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＡＤＡＭＴＳ４タンパク質変異体
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する抗体
（ｃ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に結合する低分子化合物 - ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現阻害物質を有効成分として含有する、受精卵の発育阻害作用を有する薬剤。
- ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現阻害物質を有効成分として含有する、避妊用薬剤。
- ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現阻害物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を含む、請求項４または５に記載の薬剤。
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写産物、またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現を、ＲＮＡｉ効果による阻害作用を有する核酸 - 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、不妊症治療のための薬剤。
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む、ＡＤＡＭＴＳ４変異体タンパク質であって、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質と機能的に同等なタンパク質
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ - ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質がマウス由来である、請求項１〜７のいずれかに記載の薬剤。
- 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊用薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合活性を測定する工程
（ｃ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその部分ペプチドと結合する化合物を選択する工程 - 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊用薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程 - 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊用薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程 - 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊用薬剤のための候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子を発現する細胞へ被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該細胞におけるＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現量または活性を測定する工程、
（ｃ）被検化合物に非存在下において測定した場合と比較して、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現量または活性を低下させる化合物を選択する工程 - 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ＡＤＡＭＴＳ４プロテアーゼ活性阻害剤のスクリーニング方法。
（ａ）プロテオグリカンと、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質および被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のプロテオグリカンを基質とする切断活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記切断活性を低下させる化合物を選択する工程 - プロテオグリカンが、アグリカン、ブレビカン、またはバーシカンである、請求項１３に記載のスクリーニング方法。
- ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする哺乳動物細胞。
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|---|---|---|---|---|
| WO2015056808A1 (en) * | 2013-10-15 | 2015-04-23 | Genefrontier Corporation | Human antibody against aggrecanase-type adamts species for therapeutics of aggrecanase-related diseases |
| JP2016053575A (ja) * | 2009-04-01 | 2016-04-14 | ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップＧａｌａｐａｇｏｓ Ｎ．Ｖ． | 変形性関節症の治療のための方法及び手段 |
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2003
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| US10640573B2 (en) | 2013-10-15 | 2020-05-05 | Genefrontier Corporation | Human antibody against aggrecanase-type ADAMTS species for therapeutics of aggrecanase-related diseases |
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