JP6454893B2

JP6454893B2 - アグリカナーゼ関連疾患の治療のためのアグリカナーゼ型ａｄａｍｔｓ種に対するヒト抗体

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Publication number: JP6454893B2
Application number: JP2016524160A
Authority: JP
Inventors: 陽宮越; 美紀子中村; 周久古城; 早月望月; 岡田　保典; 保典岡田
Original assignee: Keio University; Genefrontier Corp
Current assignee: Keio University; Genefrontier Corp
Priority date: 2013-10-15
Filing date: 2014-10-14
Publication date: 2019-01-23
Anticipated expiration: 2034-10-14
Also published as: EP3057992B1; AU2014335251B2; CA2927525C; JP2016538839A; EP3057992A1; ZA201603098B; CA2927525A1; AU2014335251A1; CN105849128B; US20190233541A1; US10640573B2; CN105849128A; EP3057992A4; US20160304622A1; WO2015056808A1

Description

本発明は、抗ヒトアグリカナーゼ抗体、及びその医薬用途に関する。

アグリカン分解及びそれに続くコラーゲン原線維の分解は変形性関節症（OA）及び関節リウマチ（RA）を含むヒト関節疾患における軟骨の破壊のための中心経路である。コラーゲン分解は、主には、MMP-1、MMP-8及びMMP-13のような、コラーゲンを分解するマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）によって行われる[1-3]。一方で、アグリカナーゼと呼ばれるアグリカンを分解するマトリックスメタロプロテイナーゼが、アグリカン分解において中心的な役割を果たすと考えられている[4, 5]。アグリカナーゼは、ADAMTS (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs) 遺伝子ファミリーに属し、ADAMTS1、4、5、8、9及び15がアグリカナーゼ活性を有することが知られている[4, 6]。ADAMTS4及びADAMTS5ノックアウトマウスを用いた最近の研究により、ADAMTS4ではなくADAMTS5がマウス関節炎におけるアグリカン分解において不可欠な役割を果たすことが示唆された[7, 8]。しかしながら、マウスADAMTS4及びADAMTS5の生化学的特性、発現パターン又は遺伝子プロモーター構造については殆ど情報がないため、ノックアウトマウスからのデータは慎重に解釈されなければならず、ヒト疾患OA及びRAに外挿すべきではない[9, 10]。ヒト軟骨細胞においては、ADAMTS4はインターロイキン1（IL-1）のようなサイトカインによる処理により誘導可能であるが、ADAMTS5の発現は恒常的である[9, 11-13]。我々の最近の研究は、アグリカナーゼ型ADAMTS種の中でも、ADAMTS4が、軟骨破壊の程度と直接的相関を伴いながらヒト変形性関節症軟骨において選択的に過剰発現するのに対して、ADAMTS5は正常及び変形性関節症の軟骨の両方において恒常的に発現していることを示した[10]。これらのことは、ヒト変形性関節症軟骨において、ADAMTS4が主要なアグリカナーゼであることを示唆する。ADAMTS4はRAにおける滑膜細胞及び関節軟骨細胞においても過剰発現することから、RA関節の軟骨破壊におけるこのプロテイナーゼの関与が示唆される。ADAMTS4及びADAMTS5は、アグリカンのみならずバーシカン及びブレビカンを含むプロテオグリカンレクチカンファミリーの他のメンバーをも分解することが出来る。バーシカンは、皮膚及び血管壁における主要なプロテオグリカンなので、ADAMTS4及びADAMTS5によるその分解は、皮膚の慢性潰瘍及び線維症、並びに様々な血管炎の様な病的な条件下における皮膚及び血管壁の組織破壊及び修復にも関与する。また、多形性膠芽腫における腫瘍細胞がADAMTS5を過剰発現することが知られており、腫瘍細胞由来ADAMTS5がブレビカンの切断による浸潤において役割を果たしていることが示唆される[14]。

ファージディスプレイ法は、機能を持ったペプチドやタンパク質とそれをコードするDNAとがファージ粒子という形で一対一に対応付けられることで試験管内高速選択を実現したディスプレイ技術の1つである。このファージディスプレイ法は抗体選択に応用され、この手法で取得された抗体の医薬品開発も数多く行われている［15］。更に、ヒト人工抗体ライブラリーとファージディスプレイ法を組み合わせて特異的な抗体を得る手法も確立しており、これらの手法はMorphoSys社のHuCAL(Human Combinatorial Antibody Library)を始めとして複数社により実用化が進められてきている。

[1] Dahlberg L, Billinghurst RC, Manner P, Nelson F, Webb G, Ionescu M, et al. Selective enhancement of collagenase-mediated cleavage of resident type II collagen in cultured osteoarthritic cartilage and arrest with a synthetic inhibitor that spares collagenase 1 (matrix metalloproteinase 1). Arthritis Rheum. 2000; 43: 673-82.
[2] Tortorella MD, Malfait AM, Deccico C, Arner E. The role of ADAM-TS4 (aggrecanase-1) and ADAM-TS5 (aggrecanase-2) in a model of cartilage degradation. Osteoarthritis Cartilage. 2001; 9: 539-52.
[3] Pratta MA, Yao W, Decicco C, Tortorella MD, Liu RQ, Copeland RA, et al. Aggrecan protects cartilage collagen from proteolytic cleavage. J Biol Chem. 2003; 278: 45539-45.
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[5] Struglics A, Larsson S, Pratta MA, Kumar S, Lark MW, Lohmander LS. Human osteoarthritis synovial fluid and joint cartilage contain both aggrecanase- and matrix metalloproteinase-generated aggrecan fragments. Osteoarthritis Cartilage. 2006; 14: 101-13.
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[8] Stanton H, Rogerson FM, East CJ, Golub SB, Lawlor KE, Meeker CT, et al. ADAMTS5 is the major aggrecanase in mouse cartilage in vivo and in vitro. Nature. 2005; 434: 648-52.
[9] Song RH, Tortorella MD, Malfait AM, Alston JT, Yang Z, Arner EC, et al. Aggrecan degradation in human articular cartilage explants is mediated by both ADAMTS-4 and ADAMTS-5. Arthritis Rheum. 2007; 56: 575-85.
[10] Naito S, Shiomi T, Okada A, Kimura T, Chijiiwa M, Fujita Y, et al. Expression of ADAMTS4 (aggrecanase-1) in human osteoarthritic cartilage. Pathol Int. 2007; 57: 703-11.
[11] Bau B, Gebhard PM, Haag J, Knorr T, Bartnik E, Aigner T. Relative messenger RNA expression profiling of collagenases and aggrecanases in human articular chondrocytes in vivo and in vitro. Arthritis Rheum. 2002; 46: 2648-57.
[12] Moulharat N, Lesur C, Thomas M, Rolland-Valognes G, Pastoureau P, Anract P, et al. Effects of transforming growth factor-beta on aggrecanase production and proteoglycans degradation by human chondrocytes in vitro. Osteoarthritis Cartilage. 2004; 12: 296-305.
[13] Hui W, Barksby E, Young DA, Cawston TE, McKie N, Rowan AD. Oncostatin M in combination with tumour necrosis factor alpha induces a chondrocyte membrane-associated aggrecanase that is distinct from ADAMTS aggrecanase-1 or -2. Ann Rheum Dis. 2005; 64: 1624-32.
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[15] Rothe, C. et al. J. Mol. Biol. 2008; 376:1182-1200

本発明の目的は、プロテオグリカンであるレクチカンファミリー分子の分解が認められる関節炎を代表とする種々の疾患の進展の予防又は治療に有用な抗ヒトアグリカナーゼ抗体（特に、抗ヒトADAMTS4抗体）を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するため、ヒトアグリカナーゼに結合する抗ヒトアグリカナーゼ抗体を複数作製した。その結果、作製した抗ヒトADAMTS4抗体がヒトADAMTS4の酵素活性を阻害し、関節炎の際に生じる関節軟骨細胞によるアグリカン分解を阻止できることを見出した。更に特定のエピトープを認識する抗体が、ヒトADAMTS4以外のアグリカナーゼにも交差反応性を有し、その活性をも阻害することを見出した。以上の知見に基づき、関節炎を代表とした、アグリカナーゼが組織破壊に作用する疾患の治療薬開発を目指して、更に検討を加え、本発明を完成した。

即ち、本発明は以下に関する。
［1］ヒトアグリカナーゼに特異的に結合し、且つそのアグリカナーゼのアグリカナーゼ活性を阻害する抗体。
［2］ヒトアグリカナーゼがヒトADAMTS4である、［1］記載の抗体。
［3］更にヒトADAMTS5のアグリカナーゼ活性を阻害する、［2］記載の抗体。
［4］配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むエピトープにおいて、ヒトADAMTS4に結合する、［2］又は［3］記載の抗体。
［5］軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
（1）該軽鎖可変領域が、配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むCDR2及び配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号5で表されるアミノ酸配列を含むCDR2及び配列番号6で表されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む；又は
（2）該軽鎖可変領域が、配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むCDR2及び配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号5で表されるアミノ酸配列を含むCDR2及び配列番号6で表されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む、
（但し、配列番号1〜3で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加しており、且つ／或いは、
配列番号4〜6で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加している）
ことを特徴とする［2］〜［4］のいずれか記載の抗体。
［6］該軽鎖可変領域が配列番号7で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む、［5］記載の抗体。
［7］ヒト抗体である、［1］〜［6］のいずれか記載の抗体。
［8］［1］〜［7］のいずれか記載の抗体を含む医薬組成物。
［9］［1］〜［7］のいずれか記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
［10］［9］記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［11］［10］記載のベクターを含む形質転換体。
［12］ヒトアグリカナーゼに特異的に結合し、且つ該アグリカナーゼのアグリカナーゼ活性を阻害する抗体を含む、関節炎の予防又は治療剤。
［13］ヒトアグリカナーゼがヒトADAMTS4である、［12］記載の剤。
［14］抗体が［1］〜［7］のいずれか記載の抗体である、［12］又は［13］記載の剤。
［15］哺乳動物に対して、ヒトアグリカナーゼに特異的に結合し、且つ該アグリカナーゼのアグリカナーゼ活性を阻害する抗体の有効量を投与することを含む、当該哺乳動物における関節炎の予防又は治療方法。
［16］ヒトアグリカナーゼがヒトADAMTS4である、［15］記載の方法。
［17］抗体が［1］〜［7］のいずれか記載の抗体である、［15］又は［16］記載の方法。
［18］関節炎の予防又は治療において使用するための、ヒトアグリカナーゼに特異的に結合し、且つ該アグリカナーゼのアグリカナーゼ活性を阻害する抗体。
［19］ヒトアグリカナーゼがヒトADAMTS4である、［18］記載の抗体。
［20］［1］〜［7］のいずれか記載の抗体である、［18］又は［19］記載の抗体。
［21］関節炎の予防又は治療剤を製造するための、ヒトアグリカナーゼに特異的に結合し、且つ該アグリカナーゼのアグリカナーゼ活性を阻害する抗体の使用。
［22］ヒトアグリカナーゼがヒトADAMTS4である、［21］記載の使用。
［23］抗体が［1］〜［7］のいずれか記載の抗体である、［21］又は［22］記載の使用。

本発明によれば、関節炎の進展を予防又は治療することに有用な抗ヒトアグリカナーゼ抗体、（特に、抗ヒトADAMTS4抗体）が提供される。

ADAMTS4及びADAMTS5への候補Fabの免疫反応性、及びそれらによるADAMTS4 アグリカナーゼ活性の阻害。(A) PVDF膜上に転写した、組み換え型ADAMTS4（左）及びADAMTS5（右）（各100 ng/レーン）を、各候補Fab（クローン237-1、237-5、237-21、237-43又は237-53）と反応し、その後イムノブロッティングした。(B) FabによるADAMTS4活性の阻害。組み換え型ADAMTS4 (180 ng)を、1：1のモル比で各Fab（クローン237-1、237-5、237-21、237-43又は237-53）又はコントロールFabと反応させ、次にアグリカン(100 μg)と37℃にて16時間インキュベートした。ADAMTS4のアグリカナーゼ活性を、抗アグリカンネオエピトープ(NITEGE³⁹²)抗体によるイムノブロッティングにより評価した。TS(-)、緩衝液単独；Fab(-)、FabなしでインキュベートしたADAMTS4；コントロール、コントロールFab。

ADAMTS、ADAM及びMMP種に対する抗ADAMTS抗体(クローン237-53)の免疫反応性。(A) ADAMTS4、5及び1、ADAM10、12及び17、並びにMMP1、2、3、9及び13の銀染色したゲル。試料(100 ng/レーン)をSDS-PAGEに供し、ゲルを銀染色キットにより染色した。(B) ADAMTS、ADAM及びMMP種に対する抗ADAMTS抗体(クローン237-53)の免疫反応性。PVDF膜上に転写した試料を抗ADAMTS抗体クローン237-53によりイムノブロットした。抗体はADAMTS4及びADAMTS5と反応するが、他のADAMTS、ADAM及びMMP種とは反応しないことに留意されたい。

抗ADAMTS抗体（クローン237-53）のドメインマッピング解析。(A及びB) ADAMTS4の各ドメインに対する抗体の免疫反応性。ADAMTS4のメタロプロテイナーゼ (Met)ドメイン、ディスインテグリン及びトロンボスポンジンドメイン (Dis/TSP)、ディスインテグリン (Dis)ドメイン又はトロンボスポンジン(TSP)ドメインに対応する組み換え型FLAG/DHFRタグ化タンパク質を、PUREfrexにより調製した。これらのタンパク質を抗FLAG抗体（陽性コントロール；左）又は抗体クローン237-53（右）によりイムノブロットした。

抗ADAMTS抗体（クローン237-53）によるADAMTS4及びADAMTS5のアグリカナーゼ活性の阻害、及びIL-1a刺激軟骨細胞におけるADAMTS種の発現及びアグリカナーゼ活性に対する抗体の効果。(A) 抗ADAMTS抗体（クローン237-53）によるADAMTS4及びADAMTS5のアグリカナーゼ活性の阻害。組み換え型ADAMTSタンパク質を抗ADAMTS抗体と1 : 0.2 - 5（酵素：抗体）のモル比で反応させるか、コントロール正常IgG（コントロール；1 : 5モル比）と反応させ、次にアグリカンとインキュベートした。アグリカン分解を抗アグリカンネオエピトープ抗体によるイムノブロッティングによりモニターした（上段）。阻害はイムノブロットのデンシトメトリー解析により評価した（下段）。(B) IL-1a刺激軟骨細胞におけるADAMTS4及びADAMTS5のmRNA発現、並びにアグリカナーゼ活性に対する抗体（クローン237-53）の効果。変形性関節症軟骨細胞をIL-1a及び抗ADAMTS抗体又はコントロール正常IgG（コントロール）の存在下又は非存在下で培養した。次に、これらのADAMTS種のmRNA発現（左）及び調整培地中でのアグリカナーゼ活性（右）をRT-PCR及び抗アグリカンネオエピトープ抗体により、それぞれ調べた。GAPDHをロードした試料のためのコントロールとした。

本発明は、ヒトアグリカナーゼに対する特異的結合活性を有し、且つ該アグリカナーゼのアグリカナーゼ活性を阻害する抗体を提供する。

アグリカナーゼは、ADAMTS (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs)タンパク質ファミリーのメンバーである公知のタンパク質分解酵素であり、アグリカンとして知られるプロテオグリカンに作用しこれを分解する。アグリカナーゼとしては、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS1、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS15等が包含される。
ヒトADAMTS4の代表的なアミノ酸配列を配列番号15に、
ヒトADAMTS4の代表的なcDNA配列を配列番号14に、
ヒトADAMTS5の代表的なアミノ酸配列を配列番号17に、
ヒトADAMTS5の代表的なcDNA配列を配列番号16に、
それぞれ示す。

本発明の抗体は、ヒトアグリカナーゼに対する特異的結合活性を有する。

「ヒトアグリカナーゼ」とは、アグリカナーゼのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列が、ヒトにおいて天然に発現しているアグリカナーゼのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を有することを意味する。「実質的に同一」とは、着目したアミノ酸配列又はヌクレオチド配列が、ヒトにおいて天然に発現している特定のアグリカナーゼのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と70％以上（好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは95％以上、最も好ましくは99％以上）の同一性を有しており、且つ該特定のヒトアグリカナーゼの機能を有することを意味する。ヒト以外の生物種や、アグリカナーゼ以外のタンパク質、遺伝子、それらの断片についても同様に解釈する。

抗体による抗原Xへの「特異的結合」とは、抗原抗体反応における、抗体の抗原Xに対する結合親和性が、非特異的な抗原（例、牛血清アルブミン（BSA））に対する結合親和性よりも高いことを意味する。

本発明の抗体は、ヒトアグリカナーゼの酵素活性を阻害する活性を有する。ヒトアグリカナーゼの酵素活性とは、具体的にはヒトアグリカナーゼがアグリカン（例、ヒト又はブタアグリカン）を切断する活性を意味する。ヒトアグリカナーゼがアグリカンを切断する活性は、例えばYatabe T, et.al. Ann Rheum Dis. 2009; 68: 1051-8およびHashimoto G, et al. J Biol Chem. 2004; 279: 32483-91に記載された方法により、ブタアグリカンをヒトアグリカナーゼと37℃にて16時間インキュベート後、コンドロイチナーゼABC及びケラタナーゼにより脱グリコシル化し、得られた反応産物を、抗NITEGE³⁹²アグリカンネオエピトープ抗体を用いたイムノブロッティングで解析することにより評価することができる。

好ましい態様において、本発明の抗体は、ヒトADAMTS4に対する特異的結合活性を有し、且つヒトADAMTS4のアグリカナーゼ活性を阻害する。

該態様の抗体は、好ましくは、ヒトADAMTS4のアグリカナーゼ活性に加え、ヒトADAMTS5のアグリカナーゼ活性をも阻害する。

本明細書において、「抗体」は、全長抗体及びそのいかなる抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）又はその一重鎖を含むものとして使用する。「抗体」は、ジスルフィド結合で連結された少なくとも2個の重鎖（H）と2個の軽鎖（L）を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分を称する。各重鎖は、重鎖可変領域（本文においてV_Hと略す。）と重鎖定常領域とから構成されている。重鎖定常領域は、3個のドメインC_H1、C_H2およびC_H3から構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本文においてV_Lと略す。）と軽鎖定常領域から構成されている。軽鎖定常領域は、1個のドメインC_Lで構成されている。V_HおよびV_L領域は、更に、相補性決定領域（CDR）と称される変異性の高い領域に小分割され、それらには、フレームワーク領域（FR）と称され、より保存性の高い領域が散在している。各V_HおよびV_Lは、3個のCDRと4個のFRで構成され、下記の順序、すなわち、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置されている。当該重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含んでいる。抗体の定常領域は、イムノグロブリンの宿主組織または因子への結合を媒介でき、それらには、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および旧来の補体系の第1成分（C1q）が含まれる。

本明細書において、抗体の「抗原結合部分」とは、特異的に抗原（例えば、ヒトADAMTS4）に結合する能力を保持する抗体の1個以上の断片を称するものとして使用する。抗体の抗原結合機能は全長抗体の断片によって行われることが明らかとなっている。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合断片の例として、（i）V_L、V_H、C_LおよびC_H1ドメインから構成される1価の断片であるFab断片、（ii）ヒンジ領域中ジスルフィド架橋で結合した2個のFab断片を含む2価の断片であるF（ab’）₂断片、（iii）ヒンジ領域の部分を持つ本来的FabであるFab’断片（FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3rd ed. 1993参照）、（iv）V_HおよびC_H1ドメインから構成されるFd断片、（v）抗体のシングルアームのV_LおよびV_Hドメインで構成されるFv断片、（vi）V_Hドメインから構成されるdAb断片（Wardら、（1989）Nature 341：544-546）、（vii）単離相補性決定領域（CDR）および（viii）単一可変ドメインと二つの定常領域を含む重鎖可変領域であるナノボディを含む。更に、Fv断片の2個のドメインであるV_LおよびV_Hは別々の遺伝子によりコードされているが、それらは、組換え技術を用いてそれらを単一タンパク質鎖として作製できる合成リンカーにより連結でき、この鎖中では、V_LおよびV_H領域が対となって1価の分子を形成する（単一鎖のFv（scFv）として知られている；例えば、Birdら（1988）Science 242: 423-426；およびHustonら、（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85: 5879-5883参照）。このような単一鎖の抗体も、抗体の「抗原結合部分」に包含される。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、当該断片について、未改変抗体の場合と同様に有用性を求めてスクリーニングされる。

本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」とは、単一分子組成物の抗体分子の調製物をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一結合特異性と親和性を示す。

本発明の抗体は、好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体である。「ヒト抗体」とは、フレームワークとCDR領域の両方ともにヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体をいう。更に、抗体が定常領域を含む場合には、この定常領域もヒト生殖細胞系列イムノグロブリン配列に由来する。本明細書において、「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列イムノグロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロにおけるランダムまたは部位特異的変異誘発またはインビボにおける体細胞変異により導入される変異）を含む態様をも包含する。また、本明細書において、「ヒト化抗体」とは、マウスのようなヒト以外の動物種の生殖細胞系列に由来するCDR配列をヒトフレームワーク配列上に融合させた抗体をいう。

本明細書において、ヒト抗体には「再構成ヒト抗体」が包含される。再構成ヒト抗体とは、第1のヒトドナー抗体に含まれる少なくとも1つのCDRが、第2のヒトアクセプター抗体において、第2のヒトアクセプター抗体のCDRの代わりに用いられる改変型抗体をいう。好ましくは、6つのCDR全てが置換される。より好ましくは、第1のヒトドナー抗体の抗原結合領域（例えば、Fv、FabまたはF（ab'）2）全体が第2のヒトアクセプター抗体における対応領域の代わりに用いられる。より好ましくは、第1のヒトドナー抗体のFab領域が第2のヒトアクセプター抗体の適切な定常領域と機能可能なように連結して全長抗体を形成する。

再構成ヒト抗体は、例えば、EP125023、WO96/02576、上記文献15等に開示された、一般的な遺伝子組換え手法を用いて製造することができる。具体的には、例えばドナーヒト抗体中の目的のCDRとアクセプターヒト抗体中の目的のフレームワーク領域（FR）とを連結するように設計したDNA配列を、CDRおよびFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成する（WO98/13388に記載の方法を参照）。得られたDNAをヒト抗体定常領域もしくはヒト抗体定常領域改変体をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより再構成ヒト抗体を得ることができる（EP125023、WO96/02576参照）。

また本明細書において、ヒト抗体には「人工ヒト抗体」が包含される。人工ヒト抗体は、例えば、上記文献15等に開示された、一般的な遺伝子組換え手法を用いて製造することができる。

本発明の抗体には、上述の抗体と他のペプチド又はタンパク質とが融合した融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al.， BioTechnology （1988） 6, 1204-1210）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein Cの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、GST（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β-ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと融合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。

また本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）やヒアルロン酸などの高分子物質、放射性物質、蛍光物質、発光物質、酵素、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。尚、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている（例えば、US5057313、US5156840）。

本発明の抗体は単離又は精製されていることが好ましい。「単離又は精製」とは、天然に存在する状態から、目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。単離又は精製された本発明の抗体の純度（全タンパク質重量に対する、本発明の抗体の重量の割合）は、通常50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上（例えば実質的に100％）である。

特定の態様において、本発明の抗体は、配列番号9で表されるアミノ酸配列（YCEGRRTRF）を含むエピトープにおいて、ヒトADAMTS4と特異的に結合し、且つヒトADAMTS4のアグリカナーゼ活性を阻害する。

配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むエピトープとしては、配列番号15で表されるアミノ酸配列の連続する部分配列であって、配列番号9で表されるアミノ酸配列を含み、好ましくは20アミノ酸長以下、より好ましくは12アミノ酸長以下の部分配列からなるエピトープを挙げることができる。配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むエピトープとしては、具体的には、
配列番号9で表されるアミノ酸配列からなるエピトープ、
配列番号10で表されるアミノ酸配列（GGKYCEGRRTRF）からなるエピトープ、
配列番号11で表されるアミノ酸配列（GKYCEGRRTRFR）からなるエピトープ、
配列番号12で表されるアミノ酸配列（KYCEGRRTRFRS）からなるエピトープ、及び
配列番号13で表されるアミノ酸配列（YCEGRRTRFRSC）からなるエピトープ
を挙げることができる。

配列番号9で表されるアミノ酸配列は、ヒトADAMTS4の部分アミノ酸配列であり、ヒトADAMTS5の対応部分配列との同一性は必ずしも高くないが、驚くべきことに、配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むエピトープにおいて、ヒトADAMTS4と特異的に結合する抗体は、ヒトADAMTS4のアグリカナーゼ活性に加え、ヒトADAMTS5のアグリカナーゼ活性をも阻害し得る。

ヒトADAMTS4と特異的に結合し、且つヒトADAMTS4のアグリカナーゼ活性を阻害する抗体の具体例としては、以下の（1）又は（2）に記載の抗体を挙げることができる：
（1）軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む、抗体；
（2）軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む、抗体
（但し、配列番号1、2及び3で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加しており、且つ／或いは、
配列番号4、5及び6で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加している）。

（2）の態様においては、好ましくは、軽鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列においてのみ、1〜3個（好ましくは1又は2個、より好ましくは1個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加している。

1又は複数のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法としては、例えば、部位特異的変異誘発法(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492)が挙げられる。該方法を用いて、抗体の所望のアミノ酸を目的の他のアミノ酸に置換することができる。又、フレームワークシャッフリング(Mol Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-60)およびCDR修復(US2006/0122377)等のライブラリー技術を用いることにより、フレームワークおよびCDRにおけるアミノ酸を適切な他のアミノ酸に置換することも可能である。

本発明の抗体において、CDRと連結される抗体のフレームワーク領域(FR)は、CDRが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。本発明の抗体に用いられるFRは特に限定されず、如何なるFRが用いられていてもよいが、ヒト抗体のFRが用いられることが好ましい。ヒト抗体のFRは天然配列を有するFRが用いられてもよいし、必要に応じ、CDRが適切な抗原結合部位を形成するように、天然配列を有するフレームワーク領域の1又は複数のアミノ酸を置換、欠失、付加及び／又は挿入等してもよい。例えば、アミノ酸を置換したFRを用いた抗体の抗原への結合活性を測定し評価することによって、所望の性質を有する変異FR配列が選択できる(Sato, K. et al.,Cancer Res.(1993)53, 851-856)。

（1）及び（2）の抗体においては、軽鎖については、好ましくはヒト抗体のVk4（Kabat database）のFRが、重鎖については、好ましくはヒト抗体のVH1a（Kabat database）のFRが用いられる。

本発明の抗体で用いられる定常領域は特に限定されず、如何なる定常領域が用いられてもよい。本発明の抗体で用いられる定常領域の好ましい例としては、ヒト抗体の定常領域（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM由来の定常領域など）を挙げることができる。例えばH鎖では、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cεを、L鎖ではCκ、Cλを使用することができる。

（1）及び（2）の抗体においては、軽鎖については、好ましくはヒト抗体のCκの定常領域が、重鎖については、好ましくはヒト抗体のCγ1の定常領域が用いられる。

本発明の好ましい抗体として以下のものを挙げることができる：
（1’）軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が配列番号7で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む、抗体。

上記（1’）の抗体は、上記（1）の抗体の好ましい態様に相当する。

上記（1）及び（2）の抗体は、好ましくは、ヒトADAMTS4のアグリカナーゼ活性に加え、ヒトADAMTS5のアグリカナーゼ活性をも阻害する。

特定の態様において、上記（1）及び（2）の抗体は、配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むエピトープにおいて、ヒトADAMTS4と特異的に結合し、且つヒトADAMTS4のアグリカナーゼ活性を阻害する。該抗体は、ヒトADAMTS4のアグリカナーゼ活性に加え、ヒトADAMTS5のアグリカナーゼ活性をも阻害し得る。

また、本発明は上記本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供するものである。該ポリヌクレオチドは、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。また、該ポリヌクレオチドは二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA：RNAのハイブリッドでもよい。

尚、本発明のポリヌクレオチドには、本発明の抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとの組み合わせが包含される。

本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体のアミノ酸配列情報、公知の配列情報や本明細書の配列表に記載された配列情報に基づき、公知の遺伝子組換え技術を利用することにより容易に製造することができる。例えば、配列情報に基づき適当なプライマーを設計し、本発明の抗体を構成する構成要素をコードするDNAをPCR反応によって増幅し、DNAフラグメントをリガーゼなどの適切な酵素を用いて連結することにより、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。或いは、本発明の抗体のアミノ酸配列情報に基づいて、ポリヌクレオチド合成装置により各構成要素をコードするポリヌクレオチドを合成してもよい。

取得された本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ポリヌクレオチドはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することができる。

本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは単離又は精製されている。単離又は精製された本発明のポリヌクレオチドの純度（全ポリヌクレオチド重量に対する、本発明のポリヌクレオチドの重量の割合）は、通常50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上（例えば実質的に100％）である。

本発明は、上記本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供するものである。本発明のベクターには、本発明の抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター、及び重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクターと、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクターとの組み合わせが包含される。該ベクターは好ましくは単離又は精製されている。ベクターとしては発現ベクター、クローニングベクター等を挙げることができ、目的に応じて選択することが可能であるが、好ましくは、ベクターは発現ベクターである。該発現ベクターは、本発明の抗体を発現し得る。該発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結することにより製造することができる。ベクターの種類としては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を挙げることができ、用いる宿主に応じて適宜選択することができる。

宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌（エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等）、バチルス属菌（バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）等）、酵母（サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等）、昆虫細胞（夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Sf細胞）等）、昆虫（カイコの幼虫等）、哺乳動物細胞（ラット神経細胞、サル細胞（COS-7等）、チャイニーズハムスター細胞（CHO細胞等）等）などが用いられる。

哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

プラスミドベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドベクター（例、pBR322，pBR325，pUC12，pUC13）、枯草菌由来のプラスミドベクター（例、pUB110，pTP5，pC194）、酵母由来プラスミドベクター（例、pSH19，pSH15）等を挙げることができ、用いる宿主の種類や使用目的に応じて適宜選択することができる。

ウイルスベクターの種類は、用いる宿主の種類や使用目的に応じて適宜選択することができる。例えば、宿主として昆虫細胞を用いる場合には、バキュロウイルスベクター等を用いることができる。また、宿主として哺乳動物細胞を用いる場合には、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター等のレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター等を用いることができる。

また、プロモーターは、用いる宿主の種類に対応して、該宿主内で転写を開始可能なものを選択することができる。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合、PHO5プロモーター、PGKプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。宿主が哺乳動物細胞である場合、サブゲノミック（26S）プロモーター、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。

本発明のベクターには、抗体分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。

本発明のベクターは、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジン（以下、SV40oriと略称する場合がある）などを、それぞれ機能可能な態様で含有していてもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、dhfrと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（MTX）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（Amp^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（Neo^rと略称する場合がある、G418耐性）等が挙げられる。

上記本発明のベクターを、自体公知の遺伝子導入法（例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、プロプラスト融合法、エレクトロポレーション法、DEAEデキストラン法、Gene Gunによる遺伝子導入法等）に従って上記宿主へ導入することにより、該ベクターが導入された形質転換体（本発明の形質転換体）を製造することができる。導入されるベクターとして発現ベクターを使用することにより、該形質転換体は本発明の抗体を発現し得る。本発明の形質転換体は、本発明の抗体の製造等に有用である。

本発明の形質転換体を、宿主の種類に応じて、自体公知の方法で培養し、培養物から本発明の抗体を単離することにより、本発明の抗体を製造することができる。宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、LB培地やM9培地等の適切な培地中、通常約15〜43℃で、約3〜24時間行なわれる。宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、適切な培地中、通常約30〜40℃で、約6〜24時間行なわれる。宿主が酵母である形質転換体の培養は、バークホールダー培地等の適切な培地中、通常約20℃〜35℃で、約24〜72時間行なわれる。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体の培養は、約10％のウシ血清が添加されたGrace’s Insect medium等の適切な培地中、通常約27℃で、約3〜5日間行なわれる。宿主が動物細胞である形質転換体の培養は、約10％のウシ血清が添加されたMEM培地等の適切な培地中、通常約30℃〜40℃で、約15〜60時間行なわれる。いずれの培養においても、必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。

尚、遺伝子工学的に抗体を製造する方法については、例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137等を参照のこと。

培養物からの本発明の抗体の分離、精製は、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる。

クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えば、プロテインAを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose FF (GE Amersham Biosciences社製）等が挙げられる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された抗体も包含する。

また本発明は、上記本発明の抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。アグリカナーゼ（特に、ADAMTS4及び5）は、アグリカンを分解し、変形性関節症や関節リウマチ等の関節炎における軟骨破壊に寄与する。従って、本発明の抗体を投与することにより、アグリカナーゼ活性を阻害し、アグリカン分解を抑制し、軟骨破壊を抑制することにより、関節炎の進行を予防又は治療し得る。従って、本発明の抗体及び本発明の医薬組成物は関節炎の進展の予防又は治療剤等として有用である。特に、ヒトADAMTS4のアグリカナーゼ活性のみならず、ヒトADAMTS5のアグリカナーゼ活性をも阻害する態様の本発明の抗体は、複数種類のアグリカナーゼを同時に阻害し得るので、優れた軟骨変性又は破壊抑制効果、優れた関節炎予防又は治療効果が期待できる。関節炎の種類としては、アグリカナーゼ（特に、ADAMTS4及び5）によるアグリカン分解に起因する軟骨破壊又は変性を伴い、本発明の抗体による予防又は治療効果を達成し得る限り特に限定されないが、例えば、変形性関節炎、関節リウマチ、強直性関節炎、乾癬性関節炎等のアグリカン分解による関節軟骨変性又は破壊、および椎間板ヘルニアの際の椎間板の変性や破壊等が挙げられるが、これらに限定されない。

更に、脳腫瘍（glioblastoma multiforme）のブレビカン分解による脳腫瘍細胞の浸潤、難治性血管炎の際のバーシカン分解による血管破壊、皮膚慢性潰瘍やケロイドなどでのVersican分解とその産物による皮膚組織破壊と過剰な修復作用等にもADAMTS4や5が関与することが指摘されているので、本発明の抗体及び本発明の医薬組成物はこれらの疾患の進展予防又は治療剤等としても有用である。

本発明の抗体を「有効成分として含有する」とは、本発明の抗体を活性成分の少なくとも1つとして含むという意味であり、その含有率を制限するものではない。また、本発明の医薬組成物は、本発明の抗体と合わせて他の有効成分を含有してもよい。

本発明の抗体は、常法に従って製剤化することができる（例えば、Remington’s Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）。更に、必要に応じ、医薬的に許容される担体及び/または添加物を含んでもよい。例えば、界面活性剤（PEG、Tween等）、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、キレート剤（EDTA等）、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含むことができる。しかしながら、本発明の医薬組成物は、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜含んでいてもよい。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン及び免疫グロブリン等のタンパク質、並びに、アミノ酸を含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、本発明の抗体を、例えば、生理食塩水、ブドウ糖またはその他の補助薬を含む等張液に溶解する。補助薬としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、更に、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、PEG等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80、HCO-50）等と併用してもよい。

また、必要に応じポリペプチドをマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等)とすることもできる（Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition &, Oslo Ed. (1980)等参照）。更に、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、ポリペプチドに適用し得る（Langer et al., J.Biomed.Mater.Res.(1981) 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982)12: 98-105;米国特許第3，773，919号;欧州特許出願公開（EP）第58,481号; Sidman et al., Biopolymers(1983)22:547-56；EP第133，988号）。更に、本剤にヒアルロニダーゼを添加あるいは混合することで皮下に投与する液量を増加させることも可能である（例えば、WO2004/078140等）。

医薬組成物中の本発明の抗体の含有量は、例えば、医薬組成物全体の約0．01〜100重量％、好ましくは0．1〜99．9％である。

本発明の医薬組成物は、経口又は非経口のいずれでも投与可能であるが、好ましくは非経口投与される。具体的には、注射及び経皮投与により患者に投与される。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射または皮下注射等により全身又は局所的に投与することができる。治療部位又はその周辺に局所注入、特に筋肉内注射してもよい。経皮投与剤型の例としては、例えば、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿布剤、および貼付剤等があげられ、全身又は局所的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、1回につき体重1kgあたり本発明の抗体として0．5mg〜10mgの範囲で選ぶことが可能である。しかしながら、本発明の医薬組成物は、これらの投与量に制限されるものではない。

刊行物、特許文献等を含む、本明細書に引用されたすべての参考文献は、引用により、それらが個々に具体的に参考として援用されかつその内容全体が具体的に記載されているのと同程度まで、本明細書に援用される。

以下に、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。尚、実施例における各種遺伝子操作は、Molecular cloning third. ed. (Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)に記載の方法に従った。

材料及び方法
ファージディスプレイライブラリーのパニング及びFabの作製
ADAMTS4及びADAMTS5に特異的なモノクローナルFab抗体はHuman Combinatorial Antibody Library (HuCAL; MorphoSys AG, Martinried, Germany)を用いて作製した。組み換え型ADAMTS4及びADAMTS5 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)をビオチン化し、HuCALとともにインキュベートした。結合したFab発現ファージを3回の連続的パニングラウンドにより濃縮した。Fab遺伝子のプールをファージミドから単離した後、大腸菌発現ベクターに挿入し、Strep-tag IIが付加されたFabとして機能する形でペリプラズムに発現させた。形質転換後、個々のコロニーをピックアップし、マイクロタイタープレート中で増殖させた。イソプロピル-β-チオガラクトピラノシドで抗体の発現誘導を一晩行った後、細胞を酵素的に溶解し、粗抽出物を酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）により評価した。ELISAで抗原に対し強いシグナルを認めたクローンについて、抗体のVH CDR領域のDNA配列を決定した。Fabを含有する複数のコロニーを選択し、精製に供した。また、そのうち幾つかのFabは更なる解析のために、完全ヒトIgG1に再構成した。

組み換え型ヒトADAMTS4及びADAMTS5
C末端にStrep-tag IIを有するヒトADAMTS4の残基Phe²¹³-Cys⁶⁸⁵（これは、ADAMTS4のメタロプロテイナーゼ、ディスインテグリン、トロンボスポンジン及びシステインリッチドメインに相当する）をコードするcDNA断片を含有する発現ベクターを、リポフェクタミン（Life Technologies, Rockville, MD）を用いてHEK293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから2日後、培養培地を回収し、Strep-Tactinセファロースを用いて、製造者の指示書(IBA Biotechnica, Hanover, Germany)に従って、組み換え型ヒトADAMTS4を精製した。メタロプロテイナーゼ、ディスインテグリン及びトロンボスポンジンドメイン（ADAMTS5の残基Ser²⁶²-Pro⁶²²）を含む組み換え型ADAMTS5はR&D Systems Inc.から購入した。

ヒト抗ADAMTS抗体のイムノブロッティング
組み換え型ヒトADAMTS1 (R&D Systems)、ADAMTS4、ADAMTS5 (R&D Systems)、ADAMTS15 (R&D Systems)、ADAM10 (R&D Systems)、ADAM12 (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.、Tokyo、Japan)、ADAM17 (R&D Systems)及びMMP-13 (Millipore, Billerica, MA) 並びに精製ヒトMMP-1、MMP-2、MMP-3及びMMP-9 (Daiichi Fine Chemical, Co., Ltd., Toyama, Japan)を、還元条件下で、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）に供し、ゲル上で分離した試料をポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜に転写した。当該膜を、4℃にて16時間、ADAMTS種に対するFabの候補（5 mg/ml；クローン237-1、237-5、237-21、237-43及び237-53）とインキュベートした。0.1% Tween 20を含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、当該膜を、室温にて1時間、ヒトIgGに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Invitrogen, Carlsbad, CA）で反応させた。化学発光試薬（Pierce ECL western blotting substrate; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を用い、標識されたタンパク質バンドを可視化した。全ての試料は、silver stain kit (Cosmo Bio Co., Ltd, Carlsbad, CA)により調製した銀染色ゲル上でも評価した。

ヒト抗ADAMTS抗体（クローン237-53）によるADAMTS4及び5のアグリカナーゼ活性の阻害
組み換え型ADAMTS4（180 ng）、及びADAMTS5（180 ng）を、ヒト抗ADAMTS抗体（IgG1；クローン237-53）と共に、1: 0.2-5（酵素：抗体）のモル比で、又はヒトコントロール正常IgG1（R&D Systems）と共に、37℃にて30分間インキュベートし、次にブタアグリカン（100 mg）とともに37℃にて16時間インキュベートした。コンドロイチナーゼABC及びケラタナーゼ（Seikagaku Corporation, Tokyo, Japan）によるアグリカンの脱グリコシル化の後、アグリカナーゼ活性を、抗NITEGE³⁹²アグリカンネオエピトープ抗体（1.2 mg/ml）（Hashimoto G, et al. J Biol Chem. 2004; 279: 32483-91）を用いたイムノブロッティングによりモニターした。タンパク質バンドの密度をImage J analysis software (National Institute of Health, Bethesda, MD)を用いたデンシトメトリーにより評価した。

抗ADAMTS抗体（クローン237-53）のドメインマッピング
FLAGおよびジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）によりタグ化した、ADAMTS4の各ドメイン、及びNH₂-又はCOOH-末端欠損のトロンボスポンジンドメインの組換え型タンパク質を、無細胞翻訳系（PUREfrex）（Gene Frontier Corporation, Chiba, Japan)を用いて合成した。これらの試料をSDS-PAGEに供し、次に抗FLAG抗体（Sigma-Aldrich, St Louis, MO; 2 mg/ml）または抗ADAMTS抗体（クローン237-53; 2 mg/ml）でイムノブロットした。

表面プラズモン共鳴相互作用（BIAcore）解析
組み換え型ADAMTS種を、CM5センサーチップのフローチャンバー（GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK）上にアミンカップリングにより共有結合で固相化した。BIAcore 3000 (GE Healthcare Life Sciences)を用いて、クローン237-53のIgG1をチャンバーに注入した。測定されたK_a及びK_dからK_D値（親和性）を算出した。

抗ADAMTS抗体（クローン237-53）による、培養した軟骨細胞中のアグリカナーゼ活性の阻害
ヒト変形性関節症軟骨から酵素的分離により単離された軟骨細胞を、10%ウシ胎仔血清及び25 mg/mlのアスコルビン酸を添加したダルベッコ改変イーグル培地／ハムF-12培地（Sigma-Aldrich）中で培養し、0.2% ラクトアルブミン加水分解物を含有する培地中での培養による血清飢餓の後に、インターロイキン1α（IL-1a (1 ng/ml; Dainippon Sumitomo Pharmaceutical Company Ltd., Okada, Japan）有り又は無しで24時間処理した。これらを、ADAMTS抗体（5 mg/ml, クローン237-53）又はヒトコントロールIgG（5 mg/ml; Invitrogen, Carlsbad, CA）と共に1時間処理し、次にアグリカン（100 mg）の存在中で16時間インキュベートした。脱グリコシル化の後に、濃縮した培地をSDS-PAGEに供し、PVDF膜へ転写した。アグリカナーゼ活性を、抗NITEGE³⁹²ネオエピトープ抗体(1.2 mg/ml)によるイムノブロッティングにより評価した。病院の倫理ガイドラインに従って、切除標本の実験的使用のためのインフォームドコンセントを変形性関節症の患者から得た。

ADAMTS4及び5のmRNA発現を調べるため、IL-1a (1 ng/ml)及びヒト抗ADAMTS抗体（クローン237-53）有り又は無しで18時間処理した軟骨細胞から全RNAを調製し、SuperScript II 逆転写酵素 (Life Technologies, Rockville, MD)を用いて、cDNAに逆転写した。以前記載したように（Naito S, et. al. Pathol Int. 2007;57:703-11）、ADAMTS4及び5、並びにハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素（GAPDH）に特異的なプライマーを用いたPCRによりcDNAを増幅した。

結果
ADAMTS4及びADAMTS5に対するヒト抗体のスクリーニング
ファージディスプレイ法を用いてヒト抗体ライブラリー（HuCAL）をスクリーニングすることにより、ADAMTS4及びADAMTS5の両方に反応する全部で5つのクローン(237-1, 237-5, 237-21, 237-43及び237-53)をELISAにより得ることができた。イムノブロッティング解析により、全てのクローンが組み換え型ADAMTS4及びADAMTS5を認識するが、ADAMTS5に対する反応性はクローンによって異なることが示された（図1A）。候補クローンがADAMTS4のアグリカナーゼ活性を阻害するか調べるため、これらのクローンのFab種をADAMTS4と共に、1：1のモル比でインキュベートし、次に活性をネオエピトープ（NITEGE³⁹²）特異的抗体を用いたイムノブロッティングによりモニターした。図1Bに示すように、5つの候補クローンの中でも、クローン237-53がアグリカナーゼ活性を阻害した。

クローン237-53のADAMTS4及びADAMTS5との免疫反応性
クローン237-53がADAMTS4に対して阻害活性を示したので、この抗体に着目した。ADAMTS、ADAM及びMMP種に対する抗体の交差反応性をイムノブロッティングにより調べると、クローン237-53はADAMTS4及びADAMTS5に反応した。しかしながら、ADAMTS1、ADAMTS15、ADAM10、ADAM12、ADAM17、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9又はMMP-13に対する免疫反応性は得られなかった（図2）。このデータは、クローン237-53がADAMTS4及びADAMTS5において共通に存在するある領域に反応することを示唆する。

クローン237-53により認識されるADAMTS4のエピトープの決定
クローン237-53によるADAMTS4の免疫反応性ドメインを決定するため、我々は、まず、PUREfrexにより調製したADAMTS4のメタロプロテイナーゼドメイン単独、又はディスインテグリン及びトロンボスポンジンドメインの組み換え型タンパク質に対する反応性を調べた。図3Aに示す通り、抗体はディスインテグリン及びトロンボスポンジンドメインのタンパク質のみを認識した。そこで、我々は、更にディスインテグリン又はトロンボスポンジンドメインへの免疫反応性を調べ、抗体はトロンボスポンジンドメインのみを認識することを見出した（図3B）。このことは、ADAMTS4のトロンボスポンジンドメインが抗体のエピトープを含むことを示す。

更に詳細にエピトープを特定するため、ヒトADAMTS4の部分ペプチドを固定化したペプチドアレイを用いて、抗体237-53クローンについて、エピトープマッピングを行った。具体的には、下記の表のように、ヒトADAMTS4のthrombospondinドメインをカバーする配列に対して、残基数が12アミノ酸残基でオフセットが3アミノ酸残基のペプチド群からなるペプチドアレイを作製した。HRP標識した抗体237-53クローンをペプチドアレイと反応させた。

その結果、237-53は、上記ペプチド＃36〜＃39に特異的に結合した。この結果から、237-53のエピトープには、ペプチド＃36〜＃39に共通する配列番号9で表されるアミノ酸配列（YCEGRRTRF）が含まれることが示唆された。

得られたクローン237-53の大腸菌を培養し、プラスミドを回収(QIAprep Spin MiniPrep kit:QIAGEN社製)して塩基配列解析に使用した。表2に、237-53のH鎖及びL鎖のCDR（相補性決定領域）のアミノ酸配列を示す。

また、237-53のH鎖及びL鎖の可変領域の全長アミノ酸配列は以下の通りであった。
L鎖 VLk4
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYSSNNNYLAWYQQKPGQPPKLLIHTASARESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSVSITFGQGTKVEIKRT（配列番号7）
H鎖 VH1a
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFAISWVRQAPGQGLEWMGGIFPIFGQANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFSDWWEWQMDYWGQGTLVTVSS（配列番号8）

抗体クローン237-53によるADAMTS4及びADAMTS5のアグリカナーゼ活性の阻害
ADAMTS4及びADAMTS5のアグリカナーゼ活性を、アグリカンネオエピトープ特異的抗体を用いた、NITEGE³⁹²のCOOH末端配列を有する65kDaアグリカン断片のイムノブロッティング実験により評価した。図4Aに示すように、抗体クローン237-53は、ADAMTS4の活性をもとの活性の20%未満にブロックしたが、ADAMTS5活性は、わずかにもとの活性の70%程度にまで阻害した。正常コントロールIgGによっては阻害は観察されなかった（図4A）。BIAcoreを用いた動態解析により、この抗体が高い親和性でADAMTS種に対して結合することが実証され、ADAMTS4及びADAMTS5についてのK_D値が、それぞれ、1.17×10^-8 M及び1.46×10^-9Mであることが示された。

変形性関節症軟骨からの培養軟骨細胞はADAMTS5を発現したが、ADAMTS4は発現しなかった（図4B、左）。軟骨細胞をIL-1aで処理すると、ADAMTS4が誘導されたが、ADAMTS5の発現は変わらなかった（図4B、左）。非処理軟骨細胞のアグリカナーゼ活性は極小であったが、IL-1aによる刺激後に上昇した（図4B、右）。IL-1aで刺激した軟骨細胞を抗体クローン237-53で処理すると、アグリカナーゼ活性はコントロールレベルにまでに大幅に減少したが、正常コントロールIgGによる処理によっては阻害は観察されなかった（図4B、右）。

本発明によれば、関節炎の予防又は治療に有用な抗ヒトアグリカナーゼ抗体が提供される。

本出願は、米国仮特許出願シリアルNo. 61/891,087（出願日：2013年10月15日）を基礎としており、その内容はこの引用により本明細書に全て包含されるものである。

Claims

配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むエピトープにおいて、ヒトADAMTS4に特異的に結合し、且つヒトADAMTS4及びヒトADAMTS5のアグリカナーゼ活性を阻害する抗体。
軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
（1）該軽鎖可変領域が、配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むCDR2及び配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むCDR3を含み、且つ
（2）該重鎖可変領域が、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号5で表されるアミノ酸配列を含むCDR2及び配列番号6で表されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む；
ことを特徴とする請求項1記載の抗体。
該軽鎖可変領域が配列番号7で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む、請求項2記載の抗体。
ヒト抗体である、請求項1〜3のいずれか1項記載の抗体。
請求項1〜4のいずれか1項記載の抗体を含む医薬組成物。
請求項1〜4のいずれか1項記載の抗体を含む、関節炎の予防又は治療剤。
請求項1〜4のいずれか1項記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
請求項7記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項8記載のベクターを含む形質転換体。