MX2012000055A - Polipeptidos y metodo de tratamiento. - Google Patents

Abstract

Se proporciona en la presente memoria una proteína de unión a antígeno aislada que comprende al menos un primer dominio variable de inmunoglobulina capaz de unirse a la ADAMTS5 humana; también se proporcionan proteínas de unión a antígeno de la presente invención que son anticuerpos monoclonales, composiciones farmacéuticas que comprenden dichas proteínas de unión a antígeno y métodos de tratamiento.

Description

POLIPÉPTIDOS Y METODO DE TRATAMIENTO CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a métodos para inhibir la agrecanasa, particular, ADAMTS5, reduciendo de este modo la degradación de agrecano cartílago.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cartílago es un tejido avascular poblado por células especializadas denominadas condrocitos, que responden a diversos estímulos mecánicos y bioquímicos. El cartílago está presente en los revestimientos de las articulaciones, tejidos conectivos intersticiales y membranas básales y está compuesto por una matriz extracelular compuesta por varios componentes de la matriz, incluyendo colágeno tipo II, proteoglicanos, fibronectina y laminina.

En el cartílago normal, la síntesis de matriz extracelular está compensada por la degradación de matriz extracelular, dando como resultado una renovación normal de la matriz. Dependiendo de la señal o señales recibidas, la respuesta resultante puede ser anabólica (conduciendo a la producción y/o reparación de la matriz) o catabólica (conduciendo a la degradación de la matriz, apoptosis celular, pérdida de función y dolor).

En respuesta a una compresión perjudicial y/o una exposición a mediadores inflamatorios (por ejemplo, citocinas inflamatorias) los condrocitos disminuyen la producción de matriz y aumentan la producción de múltiples enzimas de degradación de la matriz. Los ejemplos de enzimas de degradación de la matriz incluyen agrecanasas (ADAMTS) y metaloproteasas de la matriz (MMP). Las actividades de estas enzimas dan como resultado la degradación de la matriz de cartílago. Las agrecanasas (ADAMTS), junto con las MMP, degradan el agrecano, un proteoglicano agregante presente en el cartílago articular. En el cartílago articular artrósico (OA) se observa una pérdida de tinción de proteoglicano en la zona superficial en la OA temprana y adyacente a áreas de erosión de cartílago en la OA de moderada a grave.

El catabolismo del agrecano, como está mediado por la agrecanasa, se produce en ciertos sitios conservados en el agrecano. Se ha demostrado que la ADAMTS4 humana (mostrada en la Figura 5 como SEQ ID NO: 44) y la ADAMTS5 (mostrada en la Figura 4 como SEQ ID NO: 43) escinden el agrecano entre los aminoácidos E373 y A374, produciendo el neoepitopo ARGSVIL (SEQ ID NO: 1).

Una degradación excesiva de la matriz extracelular está implicada en la patogénesis de muchas enfermedades y afecciones, incluyendo dolor, dolor crónico, dolor neuropátíco, dolor postoperatorio, artritis reumatoide, artrosis, lesiones deportivas, artritis erosiva, neuralgia, neuropatías, algesia, lesión nerviosa, isquemia, neurodegeneración, degeneración del cartílago, ictus, incontinencia, trastornos inflamatorios, síndrome de colon irritable, enfermedad periodontal, angiogénesis aberrante, invasión tumoral y metástasis, ulceración corneal y en complicaciones de la diabetes.

Por lo tanto existe la necesidad de compuestos capaces de inhibir la actividad agrecanasa y la degradación del cartílago.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona polipéptidos aislados que comprenden al menos un dominio variable capaz de unirse a y/o neutralizar la ADAMTS5 humana.

También se proporcionan polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos de la presente invención.

Además, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un polipéptido de la presente invención.

Se proporcionan en la presente memoria métodos para tratar a un paciente que padece una enfermedad del cartílago con una composición farmacéutica de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 : Inhibición in vitro de la generación del neoepítopo ARGSVIL (SEQ ID NO: 1 ) de mAb de ADAMTS5.

Figura 2: Inhibición dependiente de la concentración in vitro de la generación del neoepítopo ARGSVIL (SEQ ID NO: 1) para el mAb murino 7B4.1 E11.

Figura 3: Puntuación articular total media para ratones tratados con anticuerpos de ADAMTS5 seleccionados frente al control in vivo Figura 4: Secuencia de aminoácidos de la ADAMTS5 humana (SEQ ID NO: 43).

Figura 5: Secuencia de aminoácidos de la ADAMTS4 humana (SEQ ID NO: 44).

Figura 6: Unión de los anticuerpos anti-ADAMTS5 humanizados a antigeno recombinante.

Figura 7: Unión de los anticuerpos anti-ADAMTS5 humanizados a antigeno recombinante.

Figura 8: Unión de los anticuerpos anti-ADAMTS5 humanizados a antigeno recombinante.

Figura 9: Unión de los anticuerpos anti-ADAMTS5 humanizados a antigeno recombinante.

Figura 10: Porcentaje de inhibición de la actividad de ADAMTS5.

Figura 1 1 : Porcentaje de inhibición de la actividad de ADAMTS5.

Figura 12: Unión de los anticuerpos anti-ADAMTS5 purificados a antigeno recombinante.

Figura 13: El modelado estructural predice los sitios de interacción de Ag/Ab.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El término "polinucleótido" se refiere en general a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Los "polinucleótidos" incluyen, sin limitación, ADN mono- y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones mono- y bicatenarias, ARN mono- y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones mono- y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias, o una mezcla de regiones mono- y bicatenarias. Además, el término "polinucleótido" se refiere a regiones de triple cadena que comprenden ARN o ADN, o tanto ARN como ADN. El término "polinucleótido" también incluye ADN o ARN que contienen una o más bases modificadas y ADN o ARN con cadenas principales modificadas por estabilidad o por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases poco habituales tales como inosina. Se han realizado una diversidad de modificaciones en el ADN y ARN; por lo tanto, el término "polinucleótido" incluye formas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente modificadas de polinucleótidos como se encuentran típicamente en la naturaleza, asi como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células. El término "polinucleótido" también incluye polinucleótidos relativamente cortos, con frecuencia denominados olígonucleótidos.

El término "polipéptido" se refiere a cualquier péptido o proteina que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptidicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres peptídicos. El término "polipéptido" se refiere tanto a cadenas cortas, comúnmente denominadas péptidos, oligopéptidos u oligómeros, como a cadenas más largas, generalmente denominadas proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes. Los "polipéptidos" incluyen secuencias de aminoácidos modificadas por procesos naturales, tales como procesamiento postraduccional, o por procedimientos de modificación química que son bien conocidos en la técnica. Dichas modificaciones están bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una prolífica bibliografía de investigación. Pueden producirse modificaciones en cualquier parte de un polipéptido, incluyendo la cadena principal peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos terminales amino o carboxilo. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en grados variables en varios sitios de un polipéptido dado. Además, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden estar ramificados como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden ser el resultado de procesos naturales postraduccionales o pueden generarse por métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lipido, unión covalente de fosfatidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de enlaces cruzados covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, premiación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN transferente, tal como arginilación y ubiquitinación. Véase, por ejemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2a Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York, 1 993 y Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, págs. 1-12 en POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, 1983; Seifter, et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182: 626-646 y Rattan, et al., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663: 48-62.

Una "variante", como se usa el término en la presente memoria, es un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, respectivamente, pero que conserva propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en su secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden o no alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se analiza a continuación. Una variante típica de un politécnico difiere en su secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. En general, las diferencias son limitadas, de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante sean muy similares en su conjunto y, en muchas regiones, idénticas. Un polipéptido variante y de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, deleciones, en cualquier combinación. Un resto aminoacidico sustituido o insertado puede o no ser uno codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser de origen natural, tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se conozca que aparezca en la naturaleza. Pueden generarse variantes de polinucleótidos y polipéptidos de origen no natural mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.

El término "aislado" significa alterado "por la mano del hombre" desde su estado natural, es decir, si aparece en la naturaleza, se ha modificado o retirado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido presente de forma natural en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado" incluyendo, pero sin limitación, cuando dicho polinucleótido o polipéptido se introduce de nuevo en una célula.

Un ácido nucleico o polinucleótido (por ejemplo, un ARN, ADN o un polímero mixto) "aislado" o "sustancialmente puro" es uno que está sustancialmente separado de otros componentes celulares que acompañan de forma natural al polinucleótido nativo en su célula hospedadora natural, por ejemplo, ribosomas, polimerasas y secuencias genómicas con las que se asocia de forma natural. El término incluye un ácido nucleico o polinucleótido que (1) se ha retirado de su entorno de origen natural, (2) no está asociado con toda o una parte de un polinucleótido en el que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (3) está unido operativamente a un polinucleótido con el que no está unido en la naturaleza o (4) no aparece en la naturaleza. El término "aislado" o "sustancialmente puro" también puede usarse en referencia a aislados de ADN clonados o recombinantes, análogos de polinucleótidos sintetizados químicamente o análogos de polinucleótidos que se sintetizan biológicamente por sistemas heterólogos.

Sin embargo, el término "aislado" no requiere necesariamente que el propio polinucleótido o ácido nucleico así descrito se haya retirado físicamente de su entorno nativo. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico endógena en el genoma de un organismo se considera "aislada" en la presente memoria si se coloca una secuencia heteróloga adyacente a la secuencia de ácido nucleico endógena, de modo que la expresión de esta secuencia de ácido nucleico endógena se altera, por ejemplo, se aumenta, disminuye o elimina. En este contexto, una secuencia heteróloga es una secuencia que de forma natural no está adyacente a la secuencia de ácido nucleico endógena, independientemente de que la propia secuencia heteróloga sea endógena (originada de la misma célula hospedadora o progenie de la misma) o exógena (originada de una célula hospedadora o progenie de la misma diferente). A modo de ejemplo, una secuencia promotora puede sustituir (por ejemplo, por recombinación homologa) al promotor nativo de un gen en el genoma de una célula hospedadora, de modo que este gen tenga un patrón de expresión alterado. Este gen se convertiría ahora en "aislado", porque está separado de al menos algunas de las secuencias que lo flanquean de forma natural.

Un ácido nucleico también se considera "aislado" si contiene cualquier modificación que no aparezca de forma natural en el ácido nucleico correspondiente en un genoma. Por ejemplo, una secuencia codificante endógena se considera "aislada" si contiene una inserción, deleción o una mutación puntual introducida de forma artificial, por ejemplo, por intervención humana. Un "ácido nucleico aislado" también incluye un ácido nucleico integrado en un cromosoma de una célula hospedadora en un sitio heterólogo y una construcción de ácido nucleico presente como un episoma. Además, un "ácido nucleico aislado" puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o sustancialmente libre de medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores quimicos u otros compuestos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Como se usan en la presente memoria, los "mediadores inflamatorios" incluyen cualquier compuesto capaz de desencadenar un proceso inflamatorio. El término inflamación se refiere generalmente al proceso de reacción de un tejido vivo vascularizado a una lesión. Este proceso incluye, pero sin limitación, un aumento del flujo sanguíneo, aumento de la permeabilidad vascular y exudación leucocitica. Debido a que los leucocitos reclutados hacia las reacciones inflamatorias pueden liberar potentes enzimas y radicales libres de oxígeno (es decir, mediadores inflamatorios), la respuesta inflamatoria es capaz de mediar una lesión tisular considerable. Los ejemplos de mediadores inflamatorios incluyen, pero sin limitación, prostaglandinas (por ejemplo, PGE2), leucotrienos (por ejemplo -LTB4), citocinas inflamatorias, tales como factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), interleucina 1 (IL-1) e interleucina 6 (IL-6); óxido nítrico (NO); metaloproteinasas y proteínas de choque térmico.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "proteína de la matriz" incluye proteínas liberadas de células para formar la matriz extracelular de cartílago. La matriz extracelular de cartílago consiste en proteoglicanos que pertenecen a varias familias de proteoglicanos diferentes. Éstos incluyen, pero sin limitación, perlecano y los hialectanos, ejemplificados por agrecano y versicano, y la pequeña familia de proteoglicanos ricos en leucina, incluyendo decorina, biglicano y fibromodulina. La matriz extracelular también consiste en fibras de colágeno híbridas compuestas por tres isotipos de colágeno, en concreto colágenos tipo II, tipo IX y tipo XI, junto con proteínas accesorias tales como proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP), proteína de enlace y fibronectina. El cartílago también contiene hialuronina, que forma una asociación no covalente con las hialectinas. Además, una matriz pericelular especializada rodea al condrocito, que consiste en proteoglicanos, colágeno tipo VI y proteínas receptores de colágeno, tales como ancorina.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "enzimas de degradación de la matriz" se refiere a enzimas capaces de escindir proteínas de la matriz extracelular. La renovación de la matriz extracelular del cartílago está regulada por metaproteasas de la matriz (MMP), que se sintetizan como proenzimas latentes que requieren activación para degradar las proteínas de la matriz extracelular del cartílago. Se cree que tres clases de enzimas regulan la renovación de las proteínas de la matriz extracelular, en concreto colagenasas (incluyendo, pero sin limitación, MMP-13), responsables de la degradación de fibras de colágeno nativo, estromelisinas (incluyendo, pero sin limitación, MMP-3) que degradan el proteoglicano y el colágeno tipo IX, y gelatinasas (incluyendo, pero sin limitación, MMP-2 y MMP-9), que degradan el colágeno desnaturalizado. El grupo de enzimas de degradación de la matriz que parece más importante en la degradación del cartílago en la OA incluye un subgrupo de metaloproteinasas denominadas ADAMTS, porque poseen dominios desintegrina y metaloproteinasa y un motivo tromboespondina en su estructura. Se ha descrito que la ADAMTS4 (agrecanasa-1 ) está elevada en articulaciones con OA, y se ha demostrado que junto con la ADAMTS-5 (agrecanasa-2) se expresa en cartílago artrósico humano. Estas enzimas parecen ser responsables de la degradación del agrecano sin participación de MMP.

Como se usan en la presente memoria, los términos "reducir" o "que reduce" la actividad agrecanasa se refieren a una disminución en cualquiera y/o todas las actividades asociadas con al menos una agrecanasa de origen natural, incluyendo, pero sin limitación, ADAMTS4 y ADAMTS5. Por ejemplo, la expresión "que reduce" al menos una actividad de ADAMTS5 se refiere a una disminución en cualquiera y/o todas las actividades asociadas con la ADAMTS5 de origen natural. A modo ejemplo, la reducción de ADAMTS5 en una actividad de mamíferos puede medirse después de la administración de al menos un polipéptido capaz de unirse a ADAMTS5 a un sujeto y en comparación con la actividad de ADAMTS5 en el mismo sujeto antes de la administración del polipéptido capaz de unirse a ADAMTS5, o en comparación con un segundo sujeto a que se le administra placebo. Corno se usa en la presente memoria, la expresión "que reduce" al menos una ADAMTS5 incluye la reducción de al menos una o más actividades enzimáticas. Una reducción en al menos una actividad de ADAMTS5 incluye una supresión completa de al menos una ADAMTS5. También se incluye en esta definición una cantidad reducida de al menos una actividad enzimática. Es decir, la ADAMTS5 puede tener más de una actividad, que se mantiene mientras se reduce una segunda actividad de la misma enzima.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "enfermedades asociadas con degradación de cartílago" incluye, pero sin 4 limitación, cáncer, dolor, dolor crónico, dolor neuropático, dolor postoperatorio, artrosis, lesiones deportivas, artritis erosiva, artritis reumatoide, artritis psoriásica, artritis de Lyme, artritis juvenil, neuralgia, neuropatías, algesia, lesión nerviosa, isquemia, neurodegeneración, enfermedades inflamatorias, degeneración del cartílago, enfermedades que afectan a la laringe, tráquea, canal auditivo, discos intervertebrales, ligamientos, tendones, cápsulas articulares o al desarrollo del hueso, degeneración de discos intervertebrales, osteopenia o enfermedades periodontales, lesión articular aguda y/o una enfermedad relacionada con la destrucción articular.

Como se usan en la presente memoria, los términos "coadministración" o "coadministrar", como se usan en la presente memoria, se refieren a administración de dos o más compuestos al mismo paciente. La coadministración de dichos compuestos puede ser simultánea o a aproximadamente el mismo tiempo (por ejemplo, dentro de la misma hora) o puede ser con un intervalo de varias horas o días uno de otro. Por ejemplo, un primer compuesto puede administrarse una vez por semana mientras que un segundo compuesto se coadministra diariamente.

Como se usan en la presente memoria, los términos "atenuar" o "que atenúa", se refieren a una normalización (es decir, un aumento o disminución) de la cantidad de enzima de degradación de la matriz, mediador inflamatorio o proteína de la matriz producida y/o liberada por una célula, después de la exposición a un estímulo catabólico. Por ejemplo, después de la exposición a IL-1 , la producción de condrocitos de proteínas de la matriz, tales como proteoglicanos, se reduce, mientras que la producción de enzimas de degradación de la matriz (por ejemplo, MMP- 3, ADAMTS4) y especies de oxígeno reactivo (por ejemplo, NO) se aumenta. La atenuación se refiere a la normalización de estas respuestas diversas a los niveles observados en ausencia de un estímulo catabólico.

Un "anticuerpo de dominio" o "dAb" puede considerarse lo mismo que un "dominio variable sencillo" que es capaz de unirse a un antígeno. Un dominio variable sencillo puede ser un dominio variable de anticuerpo humano, pero también incluye dominios variables de anticuerpo sencillos de otras especies tales como dAb de roedor (por ejemplo, como se describe en el documento WO 00/29004), tiburón nodriza y VHH de camélido. Las VHH de cámelido son polipéptidos de dominio variable sencillo de inmunoglobulina que proceden de especies incluyendo camello, llama, alpaca, dromedario y guanaco, que producen anticuerpos de cadena pesada naturalmente desprovistos de cadenas ligeras. Dichos dominios VHH pueden humanizarse de acuerdo con procedimientos convencionales disponibles en la técnica, y dichos dominios se considera que son "anticuerpos de dominio". Como se usa en la presente memoria, VH incluye dominios VHH de camélido.

La expresión "dominio variable sencillo" se refiere a un dominio variable de proteina de unión a antígeno (por ejemplo, VH, VHH, VL) que se une específicamente a un antígeno o epitopo independientemente de un domino o región variable diferente.

La expresión "proteína de unión a antigeno", como se usa en la presente memoria, se refiere a anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otras construcciones de proteínas, tales como dominios, pero sin limitación, a dominios variables y anticuerpos de dominio que son capaces de unirse a un antígeno.

El dominio de unión a antígeno de un anticuerpo comprende dos regiones separadas: un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL: que puede ser VK o V?J. El propio sitio de unión a antígeno está formado por seis bucles polipeptídicos: tres del dominio VH (Hi , H2 y H3) y tres del dominio VL (L1 , L2 y L3).

El análisis de las estructuras y secuencias de anticuerpos ha demostrado que cinco de los seis bucles de unión a antígeno (H1 , H2, L1 , L2, L3) poseen un número limitado de conformaciones de cadena principal o estructuras canónicas (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901 ; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877). Las conformaciones de cadena principal están determinadas por (i) la longitud del bucle de unión a antígeno, y (ii) restos particulares, o tipos de restos, en determinada posición clave en el bucle de unión a antígeno y la cadena principal de anticuerpo. El análisis de las longitudes de bucle y restos clave ha permitido predecir las conformaciones de cadena principal de H1 , H2, L1 , L2 y L3 codificadas por la mayoría de secuencias de anticuerpos humanas (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220). Aunque la región H3 es mucho más diversa en términos de secuencia, longitud y estructura (debido al uso de segmentos D), también forma un número limitado de conformaciones de cadena principal para longitudes de bucle cortas que dependen de la longitud y de la presencia de restos particulares, o tipos de restos, en posiciones clave en el bucle y la cadena principal de anticuerpo (Martin et al. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1.

Se conocen en la técnica anticuerpos biespecificos que comprenden pares complementarios de regiones VH y VL. Estos anticuerpos biespecificos deben comprender dos pares de VH y VLi uniéndose cada par de VH/VL a un solo antígeno o epitopo. Los métodos descritos implican hibridomas híbridos (Milstein y Cuello AC, Nature 305: 537-40), minicuerpos (Hu et al., (1996) Cáncer Res 56: 3055-3061 ), diacuerpos (Holliger et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448; documento WO 94/13804), anticuerpos recombinantes quelantes (CRAb; Neri et al., (1995) J. Mol. Biol. 246, 367-373), biscFv (por ejemplo, Atwell et al., (1996) Mol. Immunol. 33, 1301-1312), anticuerpos estabilizados de "botón en ojal" (Cárter et al., (1997) Protein Sci. 6, 781-788). En cada caso cada especie de anticuerpo comprende dos sitios de unión a antígeno, cada uno formado por un par complementario de dominios de VH y VL. Por lo tanto, cada anticuerpo es capaz de unirse a dos antígenos o epitopos diferentes al mismo tiempo, estando la unión a cada antígeno o epitopo mediada por VH y su dominio VL complementario. Cada una de estas técnicas presenta sus desventajas particulares; por ejemplo, en el caso de los hibridomas híbridos, los pares de VH/VL inactivos pueden reducir enormemente la fracción de IgG biespecífica. Además, la mayoría de las estrategias biespecíficas dependen de la asociación de los diferentes pares de VH y VL o la asociación de cadenas de VHA/L para recrear los dos sitios de unión VH/VL diferentes. Por lo tanto, es imposible controlar la proporción de sitios de unión respecto a cada antígeno o epitopo en la molécula ensamblada y, por lo tanto, muchas de las moléculas ensambladas se unirán a un antígeno o epitopo pero no al otro. En algunos casos, ha sido posible modificar por ingeniería genética las cadenas pesadas o ligeras en las superficies de contacto de subunidades (Cárter et al., 1997) para mejorar el número de moléculas que tienen sitios de unión para ambos antígenos o epítopos pero esto nunca da como resultado que todas las moléculas presenten unión a ambos antígenos o epítopos.

Existen algunas pruebas de que dos especificidades de unión a anticuerpo diferentes podrían incorporarse en el mismo sitio de unión, pero éstas representan generalmente dos o más especificidades que se corresponden con antígenos o epítopos estructuralmente relacionados o con anticuerpos que presentan una amplia reactividad cruzada. Por ejemplo, se han descrito anticuerpos que presentan reactividad cruzada habitualmente cuando los dos antígenos están relacionados en secuencia y estructura, tal como la lisozima de clara de huevo de gallina y la lisozima de pavo (McCafferty et al. , documento WO 92/01047) o con hapteno libre y hapteno conjugado con vehículo (Griffiths AD et al. EMBO J 1994 13: 14 3245-60). En un ejemplo adicional, el documento WO 02/02773 (Abbott Laboratories) describe moléculas de anticuerpo con una "especificidad doble". Las moléculas de anticuerpo a las que se hace referencia son anticuerpos generados o seleccionados contra múltiples antígenos, de modo que su especificidad abarca más de un solo antigeno. Cada par de VH/VL complementarias en los anticuerpos del documento WO 02/02773 especifica una sola especificidad de unión para dos o más antígenos estructuralmente relacionados; los dominios VH y VL en dichos pares complementarios no poseen cada uno una especificidad distinta. Por lo tanto, los anticuerpos tienen una sola especificidad amplia que incluye dos antígenos que están estructuralmente relacionados. Además, se han descrito autoanticuerpos naturales que son polirreactivos (Casali & Notkins, Ann. Rev. Immunol. 7, 515-531 ), reaccionando con al menos dos (habítualmente más) antígenos o epítopos diferentes que no están estructuralmente relacionados. También se ha demostrado que selecciones de repertorios de péptidos aleatorios usando tecnología de presentación en fago en un anticuerpo monoclonal identificarán un intervalo de secuencias peptídicas que encajen en el sitio de unión a antígeno. Algunas de las secuencias están altamente relacionadas, ajustándose a una secuencia consenso, mientras que otras son muy diferentes y se han denominado mimótopos (Lañe y Stephen, Current Opinión in Immunology, 1993, 5, 268-271 ). Por lo tanto, está claro que un anticuerpo de cuatro cadenas natural, que comprende dominios VH y VL complementarios y asociados, tiene el potencial de unirse a muchos antígenos diferentes de un gran universo de antigenos conocidos. Está menos claro cómo generar un sitio de unión para dos antigenos dados en el mismo anticuerpo, particularmente los que no están necesariamente estructuralmente relacionados.

Se han sugerido métodos de modificación por ingeniería genética de proteínas que pueden tener influencia sobre esto. Por ejemplo, también se ha propuesto que podría generarse un anticuerpo catalítico con una actividad de unión a un ion metálico por medio de un dominio variable y a un hapteno (sustrato) por medio de contactos con el ión metálico y un dominio variable complementario (Barbas et al., 1993 Proc. Nati. Acad. Sci USA 90, 6385-6389). Sin embargo, en este caso se propone que la unión y catálisis del sustrato (primer antígeno) requieren la unión del ión metálico (segundo antígeno). Por lo tanto, la unión al emparejamiento VH/VL se refiere a un solo antígeno pero multicomponente.

Se han descrito métodos para la creación de anticuerpos biespecificos a partir de dominios sencillos de cadena pesada de anticuerpo de camello en los que se generan contactos de unión para un antígeno en un dominio variable, y para un segundo antígeno en un segundo dominio variable de ¡nmunoglobulina. Sin embargo, los dominios variables no eran complementarios. Por lo tanto, se selecciona un primer dominio variable de cadena pesada contra un primer antígeno, y un segundo dominio variable de cadena pesada contra un segundo antígeno, y después ambos dominios se unen entre sí en la misma cadena para dar un fragmento de anticuerpo biespecífico (Conrath et al., J. Biol. Chem. 270, 27589-27594). Sin embargo, los dominios sencillos de cadena pesada de camello son poco habituales en el sentido de que proceden de anticuerpos de camello naturales que no tienen cadenas ligeras y, de hecho, los dominios sencillos de cadena pesada son incapaces de asociarse con cadenas ligeras de camello para formar pares de VH y VL complementarios.

También se han descrito dominios variables de cadena pesada sencillos procedentes de anticuerpos naturales que normalmente están asociados con cadenas ligeras (de anticuerpos monoclonales o de repertorios de dominios; véase el documento EP-A-0368684). Se ha demostrado que estos dominios variables de cadena pesada interaccionan específicamente con uno o más antigenos relacionados pero no se han combinado con otros dominios variables de cadena ligera o pesada para generar un ligando con una especificidad para dos o más antígenos diferentes. Además, se ha demostrado que estos dominios sencillos tienen una semivida in vivo muy corta. Por lo tanto, dichos dominios son de un valor terapéutico limitado.

Se ha sugerido generar fragmentos de anticuerpo biespecíficos por unión entre sí de dominios variables de cadena pesada de diferente especificidad (como se ha descrito anteriormente). La desventaja con esta estrategia es que los dominios variables de anticuerpo aislados pueden tener una superficie de contacto hidrófoba que normalmente genera interacciones con la cadena ligera y se expone a disolvente y puede ser "adhesiva", permitiendo al dominio sencillo unirse a superficies hidrófobas. Además, en ausencia de una cadena ligera compañera, la combinación de dos o más dominios variables de cadena pesada diferentes y su asociación, posiblemente por medio de sus superficies de contacto hidrófobas, puede evitar que se unan a uno, si no a ambos ligandos a los que pueden unirse en aislamiento. Además, en este caso los dominios variables de cadena pesada no se asociarían con dominios variables de cadena ligera complementarios y, por lo tanto, pueden ser menos estables y desplegarse fácilmente (Worn y Pluckthun, 1998 Biochemistry 37, 13120-7).

Como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptidicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente memoria como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente memoria como VL) y una región constante de cadena ligera. Las cadenas ligeras de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (?) y lambda (?), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Las regiones variables de cadenas ligeras kappa se denominan en la presente memoria VK. La expresión VL, como se usa en la presente memoria, pretende incluir tanto las regiones variables de cadenas ligeras tipo kappa (VK) como de cadenas ligeras tipo lambda. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL incluyen regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones flanqueantes (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, organizadas desde el extremo amino-terminal al carboxi-terminal en el orden siguiente: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos pueden asignarse a clases diferentes. Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varios de estos pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA e lgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de anticuerpos se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. La presente invención incluye anticuerpos de cualquiera de las clases o subclases (isotipos) mencionados anteriormente.

La expresión "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, también pretende incluir anticuerpos, fragmentos de digestión, porciones específicas y variantes de los mismos, incluyendo miméticos de anticuerpos o comprendiendo porciones de anticuerpos que mimeticen la estructura y/o función de un anticuerpo o fragmento especificado o porción del mismo, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla y fragmentos de los mismos; conteniendo cada uno al menos una CDR. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de unión a antígeno que se unen a un antígeno ADAMTS5. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo capaces de unirse a ADAMTS5 o una porción de la misma, incluyendo, pero sin limitación, fragmentos Fab (por ejemplo, por digestión con papaina), facb (por ejemplo, por digestión con plasmina), pFc' (por ejemplo, por digestión con pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, por digestión con pepsina, reducción parcial y reagregación), Fv o scFv (por ejemplo, por técnicas de biología molecular), se incluyen en la presente invención. Los fragmentos de anticuerpo también pretenden incluir, por ejemplo, anticuerpos de dominio delecionado, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son sustancialmente idénticos excepto por mutaciones de origen natural posibles o variaciones postraduccionales minoritarias que pueden estar presentes. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, al contrario que las preparaciones de anticuerpo convencional (policlonal), que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra determinantes diferentes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antigeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse que requiere la producción del anticuerpo por ningún método particular. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención se generan preferiblemente por métodos de ADN recombinante o se obtienen por métodos de exploración como se describe en otra parte de la presente memoria.

La expresión "anticuerpos monoclonales", como se usa en la presente memoria, incluye anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena ligera y/o pesada es idéntica a u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular, o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas son idénticas a u homologas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie (por ejemplo, ratón o rata) o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, asi como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 816851 -6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente memoria incluyen anticuerpos "primatizados", que comprenden secuencias de unión antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, monos del viejo mundo, tal como babuino, mono rhesus o cynomolgus) y secuencias de región constante humana (Patente de Estados Unidos N° 5,693,780).

Por lo tanto, la presente invención incluye, por ejemplo, anticuerpos monoclonales quiméricos que comprenden una cadena pesada quimérica y/o una cadena ligera quimérica. La cadena pesada quimérica puede comprender cualquiera de las regiones variables de cadena pasada (VH) descritas en la presente memoria o mutantes o variantes de las mismas fusionada a una región constante de cadena pesada de un anticuerpo humano o no humano. La cadena ligera quimérica puede comprender cualquiera de las regiones variables de cadena ligera (VL) descritas en la presente memoria o mutantes o variantes de la misma fusionada a una región constante de cadena ligera de un anticuerpo humano o no humano.

La expresión "anticuerpo humano", como se usa en la presente memoria, incluye anticuerpos que tienen regiones constantes y variables que se corresponden con secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana, como se describe por Kabat et al. (Véase Kabat, et al. ( 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health y Human Services, Publicación NIH N° 91-3242). Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos aminoacídicos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la linea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDR y, en particular, CDR3. El anticuerpo humano puede tener al menos una posición sustituida con un resto aminoacídico, por ejemplo un resto aminoacídico potenciador de la actividad que no esté codificado por la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En el contexto de la presente invención, el anticuerpo humano puede tener hasta veinte posiciones sustituidas con restos aminoacídicos que no sean parte de la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En otras modalidades, se sustituyen hasta diez, hasta cinco, hasta tres o hasta dos posiciones. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en la presente memoria, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como ratón, se ha injertado en secuencias flanqueantes humanas.

La expresión "anticuerpo humano recombinante" incluye anticuerpos humanos que se preparan, expresan, generan, aislan por medios recombinantes, tal como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora, anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatoria recombinante, anticuerpos aislados de un animal que sea transgénico para genes de inmunoglobulina humanos, o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal , humana (Véase Kabat, E. A.., et al. (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health y Human Services, Publicación NIH N° 91-3242). De acuerdo con la presente invención, los anticuerpos humanos recombinantes incluyen secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana que se han sometido a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y, por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpo recombinantes son secuencias que, aunque proceden de y están relacionadas con secuencias de VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo. En ciertas modalidades, sin embargo, dichos anticuerpos recombinantes son el resultado de una estrategia de mutagénesis selectiva o retromutación o ambas.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos aislados. Un "anticuerpo aislado", como se usa en la presente memoria, incluye un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o compuesto químico.

Los anticuerpos intactos incluyen glicoproteínas heteromultiméricas que comprenden al menos dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Aparte de IgM, los anticuerpos intactos son habitualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150 Kda, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H).

Típicamente, cada cadena ligera se une a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente mientras que el número de enlaces disulfuro entre las cadenas pesadas de isotipos de inmunoglobulinas diferentes varía. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de un número de regiones constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL) y una región constante en su otro extremo; la región constante de la cadena ligera se alinea con la primera región constante de la cadena pesada y el domino variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Las cadenas ligeras de anticuerpos de la mayoría de especies de vertebrados pueden asignarse a uno de dos tipos denominados Kappa y Lambda, basándose en la secuencia de aminoácidos de la región constante. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos humanos pueden asignarse a cinco clases diferentes, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. IgG e IgA pueden subdividirse adicionalmente en subclases, lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4; e lgA1 e lgA2. Existen variantes de especies con ratón y rata que tienen al menos lgG2a, lgG2b. El dominio variable del anticuerpo confiere especificidad de unión en el anticuerpo presentando ciertas regiones una variabilidad particular denominada regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las porciones más conservadas de la región variable se denominan regiones flanqueantes (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera intactas comprenden cada uno cuatro FR conectadas por tres CDR. Las CDR en cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las regiones FR y con las CDR de la otra cadena contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de anticuerpos. Las regiones constantes no están directamente implicadas en la unión del anticuerpo al antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras tales como participación en la citotoxiciad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis por medio de unión a receptor de Fcy, semivida/tasa de aclaramiento por medio del receptor de Fe neonatal (FcRn) y citotoxicidad dependiente del complemento por medio del componente C1q de la cascada del complemento.

Pueden producirse anticuerpos humanos por varios métodos conocidos por los expertos en la materia. Pueden generarse anticuerpos humanos por el método de hibridoma usando líneas celulares de mieloma humano o heteromieloma de ratón-humano, véase Kozbor J. Immunol 133, 3001 , (1984) y Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987). Los métodos alternativos incluyen el uso de bibliotecas de fagos o ratones transgénicos, utilizando ambos repertorios de región V humana (véase Winter G, (1994), Annu. Rev. Immunol 12,433-455, Green LL (1999), J.lmmunol.methods 231 , 1-23).

Actualmente están disponibles varias cepas de ratones transgénicos en los que sus loci de inmunoglobulina de ratón se han sustituido con segmentos génicos de inmunoglobulina humana (véase Tomizuka K, (2000) PNAS 97, 722-727; Fishwild D. M (1996) Nature Biotechnol. 14, 845- 851 , Méndez MJ, 1997, Nature Genetics, 15,146-156). Tras la exposición a antigeno, dichos ratones son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos a partir del que pueden seleccionarse anticuerpos de interés. Es de interés particular el sistema Trímera™ (véase Eren R et al, (1998) Immunology 93: 154-161 ) en el que se trasplantan linfocitos humanos a ratones irradiados, el Sistema de Anticuerpos de Linfocitos Seleccionados (SLAM, véase Babcook et al, PNAS (1996) 93: 7843-7848) en el que linfocitos humanos (o de otra especie) se pasan eficazmente por un procedimiento de generación de anticuerpos in vitro combinado masivo seguido de un procedimiento de selección y dilución limitante deconvolucionado y el Xenomouse II™ (Abgenix Inc). Está disponible una estrategia alternativa en Morphotek Inc usando la tecnología Morphodoma™.

Puede usarse tecnología de presentación en fago para producir anticuerpos humanos (y fragmentos de los mismos), véase McCafferty; Nature, 348, 552-553 (1990) y Griffiths AD et al (1994) EMBO 13:3245-3260. De acuerdo con esta técnica, se clonan genes de dominio V de anticuerpo en fase de lectura en un gen de proteína de cubierta principal o secundaria de un bacteriófago filamentoso tal como M13 o fd, y se presentan (habitualmente con la ayuda de un fago auxiliar) como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula de fago. Selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra esas propiedades. La técnica de presentación en fago puede usarse para seleccionar anticuerpos específicos de antigeno de bibliotecas generadas a partir de células B humanas tomadas de individuos aquejados de una enfermedad o trastorno descrito anteriormente o, como alternativa, a partir de donantes humanos no inmunizados (véase arks; J. Mol. Bio. 222, 581-597, 1991). Cuando se desee un anticuerpo humano intacto que comprenda un dominio Fe es necesario volver a clonar el fragmento derivado presentado en fago en un vector de expresión de mamífero que comprenda las regiones constantes deseadas y establecer lineas celulares de expresión estable.

La técnica de maduración por afinidad (Marks; Bio/technol 10, 779-783 (1992)) puede usarse para mejorar la afinidad de unión, donde la afinidad del anticuerpo humano primario se mejora sustituyendo de forma secuencial las regiones V de cadena H y L con variantes de origen natural y seleccionando basándose en afinidades de unión mejoradas. Actualmente también están disponibles variantes de esta técnica tales como "huella epitópica", véase el documento WO 93/06213. Véase también Waterhouse; Nucí. Acids Res 21 , 2265-2266 (1993).

En ciertas modalidades, las proteínas de unión a antígeno de la presente invención tienen una afinidad de al menos alrededor de 5x104 litros/mol, 1x105 litros/mol, 5x105 litros/mol ó 1x106 litros/mole medido con una constante de asociación (Ka). En otras modalidad, las proteínas de unión a antígeno de la presente invención se unen a un epitopo neutralizante de ADAMTS5 de humano con una constante de disociación (Kd) de menos de alrededor de 5x10 litros/segundo, 1x10 5 litros/segundo, 5x10~5 3 litros/segundo ó 1x10 6 litros/segundo.

El uso de anticuerpos no humanos intactos en el tratamiento de enfermedades o trastornos humanos acarrea el potencial de los problemas de inmunogenicidad actualmente bien establecidos, que son que el sistema inmune del paciente puede reconocer el anticuerpo intacto no humano como no propio y montar una respuesta neutralizante. Esta reacción es particularmente evidente tras la administración múltiple del anticuerpo no humano a un paciente humano. Se han desarrollado diversas técnicas con los años para superar estos problemas y generalmente implican reducir la composición de secuencias de aminoácidos no humanas en el anticuerpo intacto, al tiempo que se mantiene la facilidad relativa de obtención de anticuerpos no humanos a partir de un animal inmunizado, por ejemplo, ratón, rata o conejo. En líneas generales se han usado dos estrategias para conseguir esto. La primera son anticuerpos quiméricos, que generalmente comprenden un dominio variable no humano (por ejemplo, de roedor tal como ratón) fusionado a una región constante humana. Debido a que el sitio de unión a antigeno de un anticuerpo se localiza dentro de las regiones variables, el anticuerpo quimérico conserva su afinidad de unión por el antígeno pero adquiere las funciones efectoras de la región constante humana y, por lo tanto, es capaz de realizar funciones efectoras como las descritas anteriormente. Los anticuerpos quiméricos se producen típicamente usando métodos de ADN recombinante. El ADN que codifica los anticuerpos (por ejemplo, ADNc) se aisla y secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas oligonucleotidícas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas H y L del anticuerpo de la invención, por ejemplo, ADN que codifica las SEC ID N° 2, 3, 4, 5, 6 y 7 descritas anteriormente. Las células de hibridoma sirven como fuente típica de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se coloca en vectores de expresión que después se transfectan en células hospedadoras tales como E. coli, células COS, células CHO o células de mieloma que de otro modo no producen proteína de inmunoglobulina para obtener síntesis del anticuerpo. El ADN puede modificarse sustituyendo con la secuencia codificante de cadenas L y H humanas las regiones constantes H y L no humanas correspondientes (por ejemplo, murinas); véase, por ejemplo, Morrison; PNAS 81 , 6851 (1984).

La segunda estrategia implica la generación de anticuerpos humanizados en los que el contenido no humano del anticuerpo se reduce humanizando las regiones variables. Pueden generarse anticuerpos humanizados por injerto de CDR. Las CDR construyen bucles próximos al extremo N-terminal del anticuerpo donde forman una superficie montada en un armazón proporcionado por las regiones flanqueantes. La especificidad de unión a antígeno del anticuerpo está definida principalmente por la topografía y por las características químicas de su superficie de CDR. Estas características están determinadas a su vez por la conformación de las CDR individuales, por la disposición relativa de las CDR y por la naturaleza y disposición de las cadenas laterales de los restos que comprenden las CDR. Puede conseguirse una gran disminución de la inmunogenicidad por injerto solo de las CDR de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) (anticuerpos "donantes") sobre regiones constantes y flanqueantes humanas ( "región flanqueante aceptora") (véase Jones et al (1986) Nature 321 , 522-525 y Verhoeyen M et al (1988) Science 239, 1534-1536). Sin embargo, el injertado de CDR por sí mismo puede no dar como resultado una retención completa de las propiedades de unión a antígeno y con frecuencia se encuentra que algunos restos de la región flanqueante (a veces denominadas "retromutaciones") del anticuerpo donante tienen que preservarse en la molécula humanizada si se va a recuperar una afinidad de unión a antígeno significativo (véase Queen C et a/ (1989) PNAS 86, 10.029-10.033, Co, M et al (1991) Nature 351 , 501-502). En este caso, se seleccionan regiones V humanas que muestren la mayor homología de secuencia con el anticuerpo donante no humano de una base de datos para proporcionar la región flanqueante humana (FR). La selección de FR humanas puede estar constituida por anticuerpos humanos individuales o de consenso humanos. Cuando es necesario, los restos clave del anticuerpo donante se sustituyen en la región flanqueante aceptora humana para preservar las conformaciones de CDR. Puede usarse modelado por ordenador del anticuerpo para ayudar a identificar dichos restos estructuralmente importantes, véase el documento W099/48523.

Como alternativa, puede conseguirse la humanización mediante un proceso de "revestimiento". Un análisis estadístico de regiones variables de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina murina y humana únicas puso de manifiesto que los patrones exactos de restos expuestos son diferentes en los anticuerpos humanos y murinos, y la mayoría de posiciones superficiales individuales tienen una fuerte preferencia por un pequeño número de restos diferentes (véase, Padlan E. A. et al; (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498 y Pedersen J. T. ef al (1994) J.Mol.Biol. 235; 959-973). Por lo tanto, es posible reducir la inmunogenicidad de un Fv no humano sustituyendo los restos expuestos en sus regiones flanqueantes que difieren de los que se encuentran habitualmente en anticuerpos humanos. Debido a que la antigenicidad de la proteína puede correlacionarse con la accesibilidad superficial, la sustitución de los restos superficiales puede ser suficiente para volver a la región variable de ratón "invisible" para el sistema inmune humano (véase también, Mark G. E. et al (1994) en Handbook of Experimental Pharmacology vol.113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, págs. 105-134). Este procedimiento de humanización se denomina "revestimiento", porque sólo se altera la superficie del anticuerpo, permaneciendo sin alteraciones los restos de soporte.

Por lo tanto, la presente invención proporciona proteínas de unión a antígeno aisladas que comprenden al menos un primer dominio variable de inmunoglobulina capaz de unirse a una agrecanasa. En una modalidad, la agrecanasa es ADAMTS5 humana. En algunos casos, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo o fragmento del mismo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo. En algunos casos, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos de la presente invención son de ratón, quiméricos, humanizados o totalmente humanos.

En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno comprende al menos una región determinante de complementariedad. En algunos casos, la proteina de unión a antigeno de la presente invención es un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende CDRH1 , CDRH2 y CDRH3 y una cadena ligera que comprende CDRL1 , CDRL2 y CDRL3, en el que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena pesada se seleccionan del grupo de: CDRH1 que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 80% con la secuencia de aminoácidos DAWMD (SEQ ID NO: 2); CDRH2 que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 98% con la secuencia de aminoácidos EIRHKANDHAIFYXESVKG (SEQ ID NO: 3); y CDRH3 que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 98% con la secuencia de aminoácidos TYYYGSSYGYCDV (SEQ ID NO: 4) o PFAY (SEQ ID NO: 5); y las regiones determinantes de complementariedad de la cadena ligera se seleccionan del grupo de: CDRL1 que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 98% con la secuencia de aminoácidos KASQSVGTTIV (SEQ ID NO: 6) o RTSENIYSYLA (SEQ ID NO: 7); CDRL2 que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 98% con la secuencia de aminoácidos NAKTLAE (SEQ ID NO: 8) o SASNRXT (SEQ ID NO: 9); y CDRL3 que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 98% con la secuencia de aminoácidos QQYSSYPFT(SEQ ID NO: 10) o QHHYGTPWT (SEQ ID NO: 1 1).

En una modalidad, la CDRH2 tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 98% con una secuencia de aminoácidos seleccionada de EIRHKANDHAIFYAESVKG (SEQ ID NO: 12), EIRNKANNHARHYAESVKG (SEQ ID NO: 13), EIRHKANDYAIFYDESVKG (SEQ ID NO: 14), EIRHKANDHAIFYDESVKG (SEQ ID NO: 15), DIRNTANNHATFYAESVKG (SEQ ID NO: 16) y EIRHKANDHAIFYDESVKG (SEQ ID NO: 17). En una modalidad, la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos PFAY (SEQ ID NO: 5).

En otra modalidad más, las proteínas de unión a antígeno de la presente invención son anticuerpos monoclonales que comprenden una cadena pesada que comprende CDRH1 , CDRH2 y CDRH3 y una cadena ligera que comprende CDRL1 , CDRL2 y CDRL3, en los que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena pesada se seleccionan de: la CDRH1 es la secuencia de aminoácidos DAWMD (SEQ ID NO: 2); la CDRH2 se selecciona de las secuencias de aminoácidos EIRHKANDHAIFYAESVKG (SEQ ID NO: 12), EIRNKANNHARHYAESVKG (SEQ ID NO: 13), EIRHKANDYAIFYDESVKG (SEQ ID NO: 14), EIRHKANDHAIFYDESVKG (SEQ ID NO: 15), DIRNTANNHATFYAESVKG (SEQ ID NO: 16) o EIRHKANDHAIFYDESVKG (SEQ ID NO: 17); y la CDRH3 es TYYYGSSYGYCDV (SEQ ID NO: 18) o PFAY (SEQ ID NO: 5); y las regiones determinantes de complementariedad de la cadena ligera se seleccionan de: la CDRL1 se selecciona de las secuencias de aminoácidos KASQSVGTTIV (SEQ ID NO: 19), RTSENIYSYLA (SEQ ID NO: 20), o KASQNVGTAW (SEQ ID NO: 21); la CDRL2 se selecciona de las secuencias de aminoácidos NAKTLAE (SEQ ID NO. 22), SASNRHT (SEQ ID NO: 23), SASTRYT (SEQ ID NO: 24) o SASNRYT (SEQ ID NO: 25); y la CDRL3 se selecciona de las secuencias de aminoácidos QQYSSYPFT (SEQ ID NO: 26), QHHYGTPWT (SEQ ID NO: 27), QQYVNYPFT (SEQ ID NO: 28) o QQYTSYPFT (SEQ ID NO: 29).

Por lo tanto, en una modalidad de la presente invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que comprende seis CDR, en las que la CDRH1 es DAWMD (SEQ ID NO: 2), la CDRH2 es EIRNKANNHARHYAESVKG (SEQ ID NO: 13) y la CDRH3 es TYYYGSSYGYCDV (SEQ ID NO: 18 ) y la CDRL1 es RTSENIYSYLA (SEQ ID NO: 20), la CDRL2 es NAKTLAE (SEQ ID NO: 22) y la CDRL3 es QHHYGTPWT (SEQ ID NO: 27). En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que comprende seis CDR en las que la CDRH1 es DAWMD (SEQ ID NO: 2), la CDRH2 es EIRHKANDHAIFYDESVKG (SEQ ID NO: 15) y la CDRH3 es PFAY (SEQ ID NO: 5) y la CDRL1 es KASQSVGTTIV (SEQ ID NO: 19), la CDRL2 es SASNRHT (SEQ ID NO: 23) y la CDRL3 es QQYTSYPFT (SEQ ID NO: 29).

En otra modalidad más, las proteínas de unión a antigeno de la presente invención son anticuerpos monoclonales que comprenden una cadena pesada que comprende CDRH1 , CDRH2 y CDRH3 y una cadena ligera que comprende CDRL1 , CDRL2 y CDRL3, en los que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena pesada se seleccionan de: la CDRH1 es la secuencia de aminoácidos DAWMD (SEQ ID NO: 2), en la que cualquier aminoácido de la SEQ ID NO: 2 se sustituye en una posición por un aminoácido seleccionado de histidina, ¡soleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, alanina, arginina, ácido aspártico, cisteina, cistina, ácido glutámico, glutamina, glicina, ornitina, prolina, serina, taurina y tirosina; la CDRH2 se selecciona de las secuencias de aminoácidos EIRHKANDHAIFYAESVKG (SEQ ID NO: 12), EIRNKANNHARHYAESVKG (SEQ ID NO: 13), EIRHKANDYAIFYDESVKG (SEQ ID NO: 14), EIRHKANDHAIFYDESVKG (SEQ ID NO: 15), DIRNTANNHATFYAESVKG (SEQ ID NO: 16) o EIRHKANDHAIFYDESVKG (SEQ ID NO: 17), en las que cualquier aminoácido de las SEQ ID NO: 12-17 se sustituye en una posición por un aminoácido seleccionado de histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, alanina, arginina, ácido aspártico, cisteina, cistina, ácido glutámico, glutamina, glicina, ornitina, prolina, serina, taurina y tirosina; y la CDRH3 es TYYYGSSYGYCDV (SEQ ID NO: 18) o PFAY (SEQ ID NO: 5), en la que cualquier aminoácido de las SEQ ID NO: 18 y 5 se sustituye en una posición por un aminoácido seleccionado de histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, alanina, arginina, ácido aspártico, cisteina, cistina, ácido glutámico, glutamina, glicina, ornitina, prolina, serina, taurina y tirosina; y las regiones determinantes de complementariedad de la cadena ligera se seleccionan de: la CDRL1 se selecciona de las secuencias de aminoácidos KASQSVGTTIV (SEQ ID NO: 19), RTSENIYSYLA (SEQ ID NO: 20) o KASQNVGTAW (SEQ ID NO: 21), en las que cualquier aminoácido de las SEQ ID NO: 19-21 se sustituye en una posición por un aminoácido seleccionado de histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, alanina, arginina, ácido aspártico, cisteina, cistina, ácido glutámico, glutamina, glicina, ornitina, prolina, serina, taurina y tirosina; la CDRL2 se selecciona de las secuencias de aminoácidos NAKTLAE (SEQ ID NO: 22), SASNRHT (SEQ ID NO: 23), SASTRYT (SEQ ID NO: 24) o SASNRYT (SEQ ID NO: 25), en las que cualquier aminoácido de las SEQ ID NO: 22-25 se sustituye en una posición por un aminoácido seleccionado de histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, alanina, arginina, ácido aspártico, cisteina, cistina, ácido glutámico, glutamina, glicina, ornitina, prolina, serina, taurina y tirosina; y la CDRL3 se selecciona de las secuencias de aminoácidos QQYSSYPFT (SEQ ID NO: 26), QHHYGTPWT (SEQ ID NO: 27), QQYVNYPFT (SEQ ID NO: 28) o QQYTSYPFT (SEQ ID NO: 29), en las que cualquier aminoácido de las SEQ ID NO: 26-29 se sustituye en una posición por un aminoácido seleccionado de histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, alanina, arginina, ácido aspártico, cisteina, cistina, ácido glutámico, glutamina, glicina, ornitina, prolina, serina, taurina y tirosina.

En ciertas modalidades, Thr4 de NAKTLAE (SEQ ID NO:22) es leucina, isoleucina o metionina. En ciertas modalidades, His3 de QHHYGTPWT (SEQ ID NO.27) es valina. En ciertas modalidades, Gly5 de QHHYGTPWT (SEQ ID NO:27) es triptófano, tirosina, fenilalanina, o metionina. En ciertas modalidades, His9 de EIRNKANNHARHYAESVKG (SEQ ID NO: 13) es fenilalanina o tirosina. En ciertas modalidades, Ser6 de TYYYGSSYGYCDV (SEQ ID NO: 18) es fenilalanina o tirosina.

Las CDR L1 , L2, L3, H1 y H2 tienden a presentar estructuralmente una de un número finito de conformaciones de cadena principal. La clase de estructura canónica particular de una CDR se define tanto por la longitud de la CDR como por el empaquetamiento de bucles, determinado por restos localizados en posiciones clave tanto en las CDR como en las regiones flanqueantes (restos estructuralmente determinantes o SDR). Martin y Thornton (1996; J Mol Biol 263: 800-815) han generado un método automático para definir los moldes canónicos de "restos clave". Se usa análisis de grupos para definir las clases canónicas para conjuntos de CDR y después se identifican moldes canónicos por análisis de interacciones hidrófobas enterradas, restos de formación de enlaces de hidrógeno y glicinas y prolinas conservadas. Las CDR de secuencias de anticuerpos pueden asignarse a clases canónicas por comparación de las secuencias con los moldes de restos clave y puntuación de cada molde usando matrices de identidad o similitud.

Se proporcionan a continuación ejemplos de canónicos de CDR dentro del alcance de la invención. La numeración de aminoácidos usada es la de Kabat.

Los ejemplos de canónicos para la CDRH1 como se expone en la SEQ ID NO: 144 o una variante de la misma son: la Ala 32 se sustituye por lie, His, Tyr, Phe, Thr, Asn, Cys, Glu o Asp; el Trp 33 se sustituye por Tyr, Ala, Gly, Thr, Leu o Val; la Met 34 se sustituye por He, Val o Trp; y el Asp 35 se sustituye por His, Glu, Asn, Gln, Ser, Tyr o Thr.

Los ejemplos de canónicos para la CDRH2 como se expone en la SEQ ID NO: 144 o una variante de la misma son: el Glu 50 se sustituye por Arg o Gln; y la He 51 se sustituye por Leu, Val, Thr, Ser o Asn., Los ejemplos de canónicos para la CDRH3 como se expone en la SEQ ID NO: 144 o una variante de la misma son: la Tyr 102 se sustituye por His, Val, He, Ser, Asp o Gly.

Los ejemplos de canónicos para la CDRL1 como se expone en la SEQ ID NO: 146 o una variante de la misma son: la Ser 28 se sustituye por Asn, Asp, Thr o Glu; la Val 29 se sustituye por lie; la Gly 30 se sustituye por Asp, Leu, Tyr, Val, lie, Ser, Asn, Phe, His o Thr; la Thr 31 se sustituye por Ser, Asn, Lys o Gly; la Thr 32 se sustituye por Phe, Tyr, Asn, Ala, His, Ser o Arg; la lie 33 se sustituye por Met, Leu, Val o Phe; y la Val 34 se sustituye por Ala, Gly, Asn, Ser, His o Phe.

Los ejemplos de canónicos para la CDRL3 como se expone en la SEQ ID NO: 146 o una variante de la misma son: la Gln 89 se sustituye por Ser, Gly, Phe o Leu; la Gln 90 se sustituye por Asn o His; la Tyr 91 se sustituye por Asn, Phe, Gly, Ser, Arg, Asp, His, Thr o Val; la Thr 92 se sustituye por Asn, Tyr, Trp, Ser, Arg, Gln, His, Ala o Asp; la Ser 93 se sustituye por Gly, Asn, Thr, Arg, Glu, Ala o His; la Tyr 94 se sustituye por Asp, Thr, Val, Leu, His, Asn, lie, Trp, Pro o Ser; y la Phe 96 se sustituye por Pro, Leu, Tyr, Arg, He o Trp.

En otros aspectos, la proteina de unión a antigeno es un fragmento de Fab o F(ab)2- En otra modalidad, el primer dominio variable de inmunoglobulina es un dominio variable de cadena sencilla.

En una modalidad de la presente invención, se proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención descrita en la presente memoria y que comprende una región de dominio constante de modo que el anticuerpo tiene una funcionalidad efectora o activación de complemento y/o ADCC reducida. En una modalidad de este tipo el dominio constante puede comprender una región constante naturalmente inutilizada de isotipo lgG2 o lgG4 o un dominio constante de lgG1 mutado. Se describen ejemplos de modificaciones adecuadas en el documento EP0307434. Un ejemplo comprende las sustituciones de restos de alanina en las posiciones 235 y 237 (numeración de índice EU). En una modalidad, un anticuerpo de este tipo comprende la cadena pesada de la SEQ ID NO: 158.

En una modalidad, la proteina de unión a antigeno o un fragmento de la misma comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 76, 80, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 136, 138, 140, 142 y 144.

En una modalidad, la proteína de unión a antígeno o un fragmento de la misma comprende un dominio VL de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 78, 82, 130, 132, 134 y 146.

En una modalidad, la proteína de unión a antígeno o un fragmento de la misma comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 76, 80, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 136, 138, 140, 142 y 144 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 78, 82, 130, 132, 134 y 146.

En una modalidad, la proteina de unión a antigeno o un fragmento de la misma comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 76 y un dominio VL que comprende la SEQ ID NO: 78.

En una modalidad, la proteína de unión a antigeno o un fragmento de la misma comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 80 y un dominio VL que comprende la SEQ ID NO. 82.

En una modalidad, la proteina de unión a antígeno o un fragmento de la misma comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 6, 1 18, 120, 122, 124, 126 y 128 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 130, 132 y 134.

En una modalidad, la proteína de unión a antigeno o un fragmento de la misma comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142 y 144 y un dominio VL que comprende la SEQ ID NO: 146.

En una modalidad, la proteína de unión a antígeno o un fragmento de la misma comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 68, 72, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 104, 106, 108, 1 10, 112 y 158.

En una modalidad, la proteina de unión a antigeno o un fragmento de la misma comprende una cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 70, 74, 98, 100, 102 y 1 14.

En una modalidad, la proteina de unión a antígeno o un fragmento de la misma comprende un cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 68, 72, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 104, 106, 108, 1 10, 1 12 y 158 y una cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consisten en las SEQ ID NO: 70, 74, 98, 100, 102 y 1 14.

En una modalidad, la proteína de unión a antígeno o un fragmento de la misma comprende un cadena pesada de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 68 y una cadena ligera de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 70.

En una modalidad, la proteína de unión a antígeno o un fragmento de la misma comprende un cadena pesada de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 72 y una cadena ligera de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 74.

En una modalidad, la proteína de unión a antígeno o un fragmento de la misma comprende un cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 84, 86, 88, 90, 92, 94 y 96 y una cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 98, 100 y 102.

En una modalidad, la proteína de unión a antígeno o un fragmento de la misma comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 104, 106, 108, 1 10, 112 y 158 y una cadena ligera de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 114.

Otro aspecto de la invención incluye un anticuerpo que compite por la unión a ADA TS5 con uno cualquiera de los anticuerpos enumerados en el cuadro 3. Éstos incluyen los anticuerpos 1G10.1C9, 2D3.1 D4, 3A12.1 D7, 5F10.1 H6, 1 1 F12.1 D12, 12F4.1 H7 y 7B4.1 E1 1.

En otra modalidad más, la proteína de unión a antígeno comprende además un segundo dominio variable de inmunoglobulina capaz de unirse a un segundo antígeno. El segundo dominio variable de inmunoglobulina puede unirse a un antígeno que puede actuar como vehículo tras la administración del péptido de unión a antígeno. Por ejemplo, el segundo dominio variable de inmunoglobulina puede unirse a una proteína de la sangre tal como, pero sin limitación, albúmina sérica humana o transferrina. Además, el segundo dominio variable de inmunoglobulina puede unirse a un antigeno asociado con la modulación del dolor en un mamífero, tal como, pero sin limitación, factor de crecimiento nervioso (NGF), péptido intestinal vasoactivo (VIP) y/o TRPV1 u otro receptor vaniloide. Además, el segundo dominio variable de inmunoglobulina puede unirse a una citocina o receptor de citocina asociado con una respuesta inflamatoria y/o una enfermedad autoinmune tal como, pero sin limitación, oncostatina M (OSM), TNF-a, IL-6, TRPV4, RANKL y IL-1. El segundo antígeno también puede unirse a una segunda agrecanasa, tal como, pero sin limitación, ADAMTS4 y/o ADAMTS5 y/o un segundo epitopo en ADAMTS5 y/o varias metaloproteasas tales como, pero sin limitación, MP-13. El segundo dominio variable de inmunoglobulina también puede unirse a un agrecano, colágeno II, proteoglicano u otras moléculas asociadas con cartílago. En un aspecto de la presente invención, el segundo dominio variable de inmunoglobulina se une a un antígeno seleccionado del grupo de: albúmina sérica humana, ADAMTS4, NGF, OSM, TNF-a, IL-6, VIP, TRPV1 , TRPV4, ADAMTS1 , agrecano, Colágeno II, RANKL y/o IL-1.

Delgado, et al. Nature Med. 7, 563-568 describen que el tratamiento con VIP suprime la producción de mediadores proinflamatorios, así como la expresión de la metaloproteinasa gelatinasa (MMP-2). Se cree que la MMP-2 contribuye a la destrucción articular en patas de ratones artríticos. Los estudios in vitro indican que el VIP puede actuar directamente sobre los sinoviocitos, aunque una acción indirecta también podría estar mediada por una producción aumentada de citocinas Th2. No obstante, el VIP parece afectar a la función sinovial a múltiples niveles en el modelo de ratón CIA. El péptido suprime la función de Th1 pero aumenta la función de Th2, "reequilibrando" posiblemente el sistema inmune. Además, el VIP tiene efectos directos e indirectos sobre macrófagos y sinoviocitos, conduciendo a una expresión disminuida de IL-1 , TNF-a, quimiocinas y enzimas de degradación de la matriz, protegiendo la integridad de la articulación. Firestein Nature Medicine 7, 537-538 (2001).

El péptido intestinal vasoactivo (VIP) se identificó en el liquido sinovial de pacientes con artritis hace casi 20 años y el objetivo de este estudio era examinar si el VIP podía estar implicado en la generación del dolor por OA. Se usó la carga de peso de la extremidad posterior como medida del dolor articular, mientras que la algesimetría con pelo de von Frey aplicada a la superficie plantar de la pata trasera ipsilateral sirvió de ensayo para la hiperalgesia mecánica secundaria. La inyección intraarticular de VIP en articulaciones de rodilla de rata normal causaba un cambio significativo en la carga de peso a favor de la extremidad posterior no inyectada contralateral, causando también una reducción en el umbral de retirada de la pata ipsilateral. Estas respuestas al dolor se bloquearon por coadministración de un antagonista de receptor VPAC. Los antagonistas que inhiben la actividad de VIP pueden demostrar ser beneficiosos en el alivio del dolor por OA. McDougall, et al. Pain 2006 Jul; 123(1-2): 98-105.

El factor de crecimiento nervioso (NGF) fue la primera neurotrofina que se identificó y su papel en el desarrollo y supervivencia de neuronas tanto centrales como periféricas se ha caracterizado bien. Se ha demostrado que el NGF es un factor de mantenimiento y supervivencia crítico en el desarrollo de neuronas sensitivas embrionarias y simpáticas periféricas y de neuronas colinérgicas prosencefálicas básales. Smeyne et al., Nature 368: 246-249 (1994) y Crowley et al., Cell 76: 1001-101 1 (1994). El NGF regula positivamente la expresión de neuropéptidos en neuronas sensitivas (Lindsay y Harmer, Nature 337: 362-364 (1989)) y su actividad está mediada por dos receptores unidos a membrana diferentes, el receptor TrkA y el receptor de neurotrofina común p75 (a veces denominados receptores de NGF de "alta afinidad" y "baja afinidad", respectivamente). Chao et al., Science 232: 518-521 (1986). Para una revisión sobre el NGF, véase Huang et al., Annu. Rev. Neurosci. 24: 677-736 (2001 ); Bibel et al., Genes Dev. 14: 2919-2937 (2000). La estructura cristalina del NGF y del NGF en complejo con el receptor trkA se ha determinado. Véase Nature 254: 411 (1991); Nature 401 : 184-188 (1996).

La oncostatina M es una glicoproteina de 28 KDa que pertenece a la familia de citocinas de la interleucina 6 (IL-6), que incluye IL-6, Factor Inhibidor de Leucemia (LIF), factor neurotrófico ciliar (CNTF), cardiotropina-1 (CT-1) y citocina similar a cardiotropina-1 (Véase Kishimoto T et al (1995) Blood 86: 1243-1254), que comparte el receptor de señalización transmembrana gp130 (Véase Taga T y Kishimoto T (1997) Annu. Rev. Immunol. 15: 797-819). La OSM se descubrió originariamente por su capacidad para inhibir el crecimiento de la línea celular de melanoma A375 (Véase Malik N (1989) et al Mol Cell Biol 9: 2847-2853). Posteriormente, se descubrieron más efectos y se descubrió que era un mediador multifuncional como otros miembros de la familia de IL-6. La OSM se produce en una diversidad de tipos celulares incluyendo macrófagos, células T activadas (Véase, Zarling JM (1986) PNAS (USA) 83: 9739-9743), neutrófilos polimorfonucleares (Véase, Grenier A et al (1999) Blood 93: 1413-1421), eosinófilos (Véase, Tamura S et al (2002) Dev. Dyn. 225: 327-31), células dendriticas (Véase, Suda T et al (2002) Cytokine 17: 335-340). También se expresa en páncreas, riñon, testículos, bazo, estómago y cerebro (Véase, Znoyko I et al (2005) Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 283: 182- 86) y médula ósea (Véase, Psenak O et al (2003) Acta Haematol 109: 68-75). Sus efectos biológicos principales incluyen la activación del endotelio (Véase, Brown TJ et al (1993) Blood 82: 33-7), la activación de la respuesta de fase aguda (Véase, Benigni F et al (1996) Blood 87: 1851-1854), la inducción de la proliferación o diferenciación celular, la modulación de la liberación de mediadores inflamatorios y la hematopoyesis (Véase, Tanaka M et al (2003) 102: 3154-3162), la remodelación del hueso (Véase, de Hooge ASK (2002) Am J Pathol 160: 1733-1743) y la estimulación de la angiogénesis (Véase, Vasse M et al (1999) Arterioscler Thromb Vasc Biol 19:1835-1842) y la cicatrización de heridas.

La citocina conocida como factor de necrosis tumoral a (TNFa; también denominada caquectina) es una proteína secretada principalmente por monocitos y macrófagos en respuesta a endotoxina u otros estímulos como un homotrímero soluble de subunidades proteicas de 17 kD (Smith, R.

A. et al., J. Biol. Chem. 262: 6951-6954 (1987)). También se ha descrito una forma precursora unida a membrana de 26 kD de TNF (Kriegler, M. et al ., Cell 53: 45-53 (1988)).

Las pruebas acumuladas indican que TNF es una citocina reguladora con actividades biológicas pleiotrópicas. Estas actividades incluyen: inhibición de la síntesis de lipoproteina lipasa (actividad de "caquectina") (Beutler, B. et al., Nature 316: 552 (1985)), activación de leucocitos polimorfonucleares (Klebanoff, S. J. et al., J. Immunol. 136: 4220 (1986); Perussia, B., et al., J. Immunol. 138: 765 (1987)), inhibición del crecimiento celular o estimulación del crecimiento celular (Vilcek, J. et al. , J. Exp. Med. 163: 632 (1986); Sugarman, B. J. et al., Science 230:943 (1985); Lachman, L. B. et al., J. Immunol. 138: 2913 (1987)), acción citotóxica sobre ciertos tipos celulares transformados (Lachman, L. B. et al., anteriormente; Darzynkiewicz, Z. et al., Canc. Res. 44: 83 (1984)), actividad antiviral (Kohase, M. et al., Cell 45: 659 (1986); Wong, G. H. W. et al., Nature 323: 819 (1986)), estimulación de la resorción ósea (Bertolini, D. R. et al., Nature 319: 516 (1986); Saklatvala, J., Nature 322: 547 (1986)), estimulación de la producción de colagenasa y prostaglandina E2 (Dayer, J.-M. et al., J. Exp. Med. 162: 2163 (1985)); y acciones inmunorreguladoras, incluyendo la activación de células T (Yokota, S. et al., J. Immunol. 140: 531 (1988)), células B (Kehrl, J. H. et al., J. Exp. Med. 166: 786 (1987)), monocitos (Philip, R. et al., Nature 323: 86 (1986)), timocitos (Ranges, G. E. et al., J. Exp. Med. 167: 1472 (1988)) y estimulación de la expresión en superficie celular de moléculas de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I y clase II (Collins, T. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83: 446 (1986), Pujol-Borrel, R. et al., Nature 326: 304 (1987)).

La interleucina-6 (IL-6) es una glicoproteína secretada de 22 a 27 kDa que presenta actividades proinflamatorias y estimulantes del crecimiento. La IL-6 también se conoce como interferón-p2 (IFN-P2), proteína de 26-kDa inducible IL-1 , factor estimulante de hepatocitos, factor de diferenciación de células T citotóxicas y factor estimulante de células B. (Trikha et al., Clin. Cáncer Res. 9: 4653-4665 (2003)). La IL-6 se secreta por diversos tipos celulares. La IL-6 ejerce sus actividades por medio de la unión a un complejo receptor de alta afinidad que consiste en dos glicoproteinas de membrana: un receptor componente de 80 kDa que se une a IL-6 con baja afinidad (IL-6R) y un componente transductor de señal de 130 kDa (gp130) que no se une a IL-6 por sí mismo, pero que es necesario para una alta afinidad de unión de IL-6 por el complejo. El IL-6R puede escindirse mediante una metaloproteinasa transmembrana para dar el IL-6R soluble.

RANK es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF; se parece más a CD40 en la región extracelular. De forma similar a CD40, RANK se asocia con TRAF2 y TRAF3 (según se determina por ensayos de coinmunoprecipitación sustancialmente como se describe por Rothe et al., Cell 83: 1243, 1995). Los TRAF son críticamente importantes en la regulación de la respuesta inflamatoria e inmune. Por medio de su asociación con diversos miembros de la superfamilia de receptores de TNF, se transduce una señal a una célula. Esa señal da como resultado la proliferación, diferenciación o apoptosis de la célula, dependiendo de qué receptor o receptores se desencadenen y qué TRAF se asocie con el receptor o receptores. Pueden transducirse diferentes señales a una célula por medio de coordinación de diversos acontecimientos de señalización. Por lo tanto, una señal transducida por medio de un miembro de esta familia puede ser proliferativa, de diferenciación o apoptótica, dependiendo de otras señales que se estén transduciendo a la célula y/o del estado de diferenciación de la célula. Dicha regulación exquisita de esta ruta proliferativa/apoptótica es necesaria para desarrollar y mantener una protección frente a patógenos, desequilibrios pueden dar como resultado una enfermedad autoinmune.

RANK se expresa en células epiteliales, algunas lineas de células B y en células T activadas. Sin embargo, su expresión en células T activadas es tardía, aproximadamente cuatro días después de la activación. Este curso de tiempo de expresión coincide con la expresión de Fas, un agente de apoptosis conocido. RANK puede actuar como una señal antiapoptótica, rescatando a las células que expresen RANK de la apoptosis como se sabe que hace CD40. Como alternativa, RANK puede confirmar una señal apoptótica en las circunstancias apropiadas, de nuevo de forma similar a CD40. RANK y su ligando es probable que desempeñen un papel integral en la regulación de la respuesta inmune e inflamatoria.

El ligando, que se denomina RANKL, es una proteína transmembrana Tipo 2 con un dominio intracelular de menos de aproximadamente 50 aminoácidos, un dominio transmembrana y un dominio extracelular de aproximadamente 240 a 250 aminoácidos. De forma similar a otros miembros de la familia de TNF a la que pertenece, RANKL tiene una región "espadadora" entre el dominio transmembrana y el dominio de unión a receptor que no es necesaria para la unión del receptor. Por consiguiente, las formas solubles de RANKL pueden comprender el dominio extracelular completo o fragmentos del mismo que incluyen la región de unión al receptor.

El receptor de canal TRPV4 es uno de seis miembros conocidos de la familia vaniloide de canales receptores de potencial transitorio y comparte una identidad de 51 % a nivel de nucleótidos con TRPV1 , el receptor de capsaicina. Pueden encontrarse ejemplos de polipéptidos y polinucleótidos que codifican formas de receptores vaniloides humanos, incluyendo el receptor de canal TRPV4 de seres humanos, en el documento EP 1170365 asi como en el documento WO 00/32766. Como los otros miembros de la familia, el receptor de canal TRPV4 es un canal catiónico dependiente de ligando no selectivo permeable de Ca2+ que es sensible a diversos estímulos tales como una osmolaridad reducida, una temperatura elevada y pequeños ligandos moleculares. Véase, por ejemplo, Voets, et al., J. Biol. Chem. (2002) 277 33704-47051 ; Watanabe, et al., J. Biol. Chem. (2002) 277: 47044-47051 ; Watanabe, et al., J. Biol. Chem. (2002) 277: 13569-47051 ; Xu, et al., J. Biol. Chem. (2003) 278: 11520-11527. A partir de una exploración de tejidos corporales, el receptor de canal TRPV4 humano se expresa más prominentemente en cartílago. Una exploración de cultivo de células clónales y primarias muestra una expresión significativa solamente en condrocitos.

Dichas respuestas también se provocan por análogos estructurales de la capsaicina, que comparten un resto vaniloide común. Un análogo de este tipo es la resiniferatoxina (RTX), un producto natural de plantas Euphorbia. El término de receptor vaniloide (VR) se acuñó para describir el sitio de reconocimiento de la membrana neuronal para la capsaicina y dichos compuestos irritantes relacionados. La respuesta de la capsaicina se inhibe competitivamente y (por lo tanto se antagoniza) por otro análogo de la capsaicina, la capsazepina, y también se inhibe por el bloqueante de canales catiónicos no selectivo rojo de rutenio. Estos antagonistas se unen a VR con una afinidad no más que moderada (típicamente con valores de K¡ de no más de 140 µ?).

Recientemente, se clonaron receptores de rata y humanos para capsaicina a partir de células de los ganglios de las raices dorsales. Dichos receptores también se han denominado VR1 y las expresiones "VR1 " y "receptor de capsaicina" se usan indistintamente en la presente memoria para referirse a receptores de rata y/o humano de este tipo, así como a homólogos de mamíferos. El papel de VR1 en la sensación dolorosa se ha confirmado usando ratones que carecen de este receptor, que no presentan comportamiento doloroso provocado por vaniloide y que presentan respuestas alteradas al calor y a la inflamación. El receptor de capsaicina es un canal catiónico no selectivo con un umbral para su apertura que se disminuye en respuesta de temperaturas elevadas, bajo pH y agonistas del receptor de capsaicina. Por ejemplo, el canal se abre habitualmente a temperaturas superiores a aproximadamente 45°C. La apertura del canal receptor de capsaicina viene seguida generalmente de la liberación de péptidos inflamatorios de neuronas que expresan el receptor y otras neuronas cercanas, aumentando la respuesta dolorosa. Después de la activación inicial por capsaicina, el receptor de capsaicina experimenta una desensibilización rápida por medio de la fosforilación por proteína quinasa dependiente de AMPc.

La proteína de unión a antígeno de la presente invención puede caracterizarse por una constante de disociación igual o menor a aproximadamente 9.0 x 10~9 M para ADAMTS5 humana, en algunos casos es menor de o igual a aproximadamente 2.5 x 10~ 10 M. La afinidad de proteína de unión a antígeno por una diana tal como la ADAMTS5 humana puede medirse por resonancia de plasmón superficial, tal como, pero sin limitación, BIACORE u Octet. El análisis cinético BIAcore puede usarse para determinar las velocidades de asociación y disociación de la unión de anticuerpos o fragmentos de los mismos a un antígeno ADAMTS5. El análisis cinético BIAcore comprende analizar la unión y la disociación de un antígeno ADAMTS5 de microplacas con anticuerpos inmovilizados o fragmentos de los mismos en su superficie (véase la sección de Ejemplos a continuación).

La presente mención también proporciona proteínas de unión a antígeno que bloquean y/o reducen al menos una actividad de ADAMTS5. En algunos casos, las proteínas de unión a antígeno de la presente invención bloquean y/o reducen la escisión de agrecano por ADAMTS5 en el sitio de escisión Glu373-Ala374. En algunos aspectos, las proteínas de unión a antigeno de la presente invención son capaces de penetrar en el cartílago, incluso cuando se administran por una vía de administración no articular. Por ejemplo, las proteínas de unión a antígeno de la presente invención pueden administrarse por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía oral, intranasal y/o por administración peritoneal.

También se proporcionan en la presente invención polinucleótidos aislados que codifican una proteina de unión a antígeno de esta invención.

En una modalidad, el polinucleótido aislado codifica una proteina de unión a antígeno o un fragmento de la misma que comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 76, 80, 116, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 136, 138, 140, 142 y 144. En una modalidad, el polinucleótido aislado se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 75, 79, 1 15, 1 17, 119, 121 , 123, 125, 127, 135, 137, 139, 141 , 143 y 159. En una modalidad, el polipéptido es un anticuerpo producido a partir de una célula que expresa un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 79, 1 15, 117, 1 19, 121 , 123, 125, 127, 135, 137, 139, 141 , 143 y 159.

En una modalidad, el polinucleótido aislado codifica una proteína de unión a antígeno o un fragmento de la misma que comprende un dominio VL de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 78, 82, 130, 132, 134 y 146. En una modalidad, el polinucleótido aislado se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 77, 81 , 129, 131 , 133 y 145. En una modalidad, el polipéptido es un anticuerpo producido a partir de una célula que expresa un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 77, 81 , 129, 131 , 133 y 145.

En una modalidad, el polinucleótido aislado codifica una proteína de unión a antigeno o un fragmento de la misma que comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 68, 72, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 104, 106, 108, 1 10, 112 y 158. En una modalidad, el polinucleótido aislado se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 67, 71 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 103, 105, 107, 109, 1 1 1 y 159. En una modalidad, el polipéptido es un anticuerpo producido a partir de una célula que expresa un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 67, 71 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 103, 105, 107, 109, 1 1 1 y 159.

En una modalidad, el polinucleótido aislado codifica una proteína de unión a antígeno o un fragmento de la misma que comprende una cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 70, 74, 98, 100, 102 y 1 14. En una modalidad, el polinucleótido aislado se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 69, 73, 97, 99, 101 y 1 15. En una modalidad, el polipéptido es un anticuerpo producido a partir de una célula que expresa un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 69, 73, 97, 99, 101 y 1 15.

También se proporcionan células hospedadoras que comprenden los polinucleótidos que codifican las proteínas de unión a antígeno de la presente invención y métodos de expresión de las proteínas de unión a antígeno de dichas células hospedadoras. Además, se proporcionan métodos para generar las proteínas de unión a antigeno de la presente invención.

Los métodos de generación de vectores, células hospedadoras y anticuerpos de la presente invención incluyen el uso de vectores de expresión convencionales o plásmidos recombinantes producidos por colocación de secuencias codificantes para el anticuerpo en asociación operativa con secuencias de control reguladoras convencionales capaces de controlar la replicación y la expresión en, y/o la secreción de una célula hospedadora. Las secuencias reguladoras incluyen secuencias promotoras, por ejemplo, promotor de CMV, y secuencias señal que pueden proceder de otros anticuerpos conocidos. De forma similar, puede producirse un segundo vector de expresión que tenga una secuencia de ADN que codifique una cadena pesada o ligera de anticuerpo complementaria. Preferiblemente, este segundo vector de expresión es idéntico al primero excepto en la medida que concierne a las secuencias codificantes y marcadores de selección, para asegurar tanto como sea posible que cada cadena polipeptídica se exprese funcionalmente.

Como alternativa, las secuencias codificantes de cadena ligera y pesada para el anticuerpo modificado pueden residir en un solo vector.

Una célula hospedadora seleccionada se cotransfecta por técnicas convencionales con tanto con el primer como el segundo vector (o simplemente se transfecta por un solo vector) para generar la célula hospedadora transfectada de la invención que comprende ambas cadenas ligera y pesada recombinantes o sintéticas. La célula transfectada se cultiva después por técnicas convencionales para producir el anticuerpo modificado por ingeniería genética de la invención. El anticuerpo que incluye la asociación de tanto la cadena ligera como la cadena pesada recombinante, se explora a partir del cultivo mediante un ensayo apropiado, tal como ELISA o RIA. Pueden emplearse técnicas convencionales similares para construir otros anticuerpos y moléculas modificadas.

Los vectores adecuados para las etapas de clonación y subclonación empleados en los métodos y en la construcción de las composiciones de esta invención pueden seleccionarse por un experto en la materia. Por ejemplo, puede usarse la serie pUC convencional de vectores de clonación. Un vector, pUC 9, está disponible en el mercado de proveedores comerciales, tales como Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) o Pharmacia (Uppsala, Suecia). Además, cualquier vector que sea capaz de replicarse fácilmente, que tenga una abundancia de sitios de clonación y genes de selección (por ejemplo, resistencia a antibióticos) y que se manipule fácilmente pueden usarse para la clonación. Por lo tanto, la selección del vector de clonación no es un factor limitante en esta invención.

De forma similar, los vectores empleados para la expresión de los anticuerpos pueden seleccionarse por un experto en la materia de cualquier vector convencional. Los vectores también contienen secuencias reguladoras seleccionadas (tales como promotores CMV o RSV) que dirigen la replicación y la expresión de secuencias de ADN heterólogas en células hospedadoras seleccionadas. Estos vectores contienen las secuencias de ADN descritas anteriormente que codifican el anticuerpo o la región codificante de inmunoglobulina modificada. Además, los vectores pueden incorporar las secuencias de inmunoglobulina seleccionadas modificadas por inserción de sitios de restricción deseables para una manipulación sencilla.

Los vectores de expresión también pueden caracterizarse por genes adecuados para amplificar la expresión de las secuencias de ADN heterólogas, por ejemplo, el gen de la dihidrofolato reductasa de mamífero (DHFR). Otras secuencias de vector preferibles incluyen una secuencia señal poli A, tal como de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y la secuencia promotora de betaglobina (betaglopro). Los vectores de expresión útiles en la presente memoria pueden sintetizarse por técnicas bien conocidas por los expertos en la materia.

Los componentes de dichos vectores por ejemplo, replicones, genes de selección, potenciadores, promotores, secuencias señal y similares, pueden obtenerse a partir de fuentes naturales o comerciales o sintetizarse por procedimientos conocidos para su uso en la dirección de la expresión y/o secreción del producto de ADN recombinante en un hospedador seleccionado. Otros vectores de expresión apropiados de los que se conocen numerosos tipos en la técnica para expresión en mamíferos, bacterias, insectos, levaduras y hongos también pueden seleccionarse con este fin.

La presente invención también incluye una línea celular transfectada con un plásmido recombinante que contiene las secuencias codificantes de los anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina modificadas de los mismos. Las células hospedadoras útiles para la clonación y otras manipulaciones de estos vectores de clonación también son convencionales. Sin embargo, de forma más deseable, se usan células de diversas cepas de E. coli para la replicación de los vectores de clonación y otras etapas en la construcción de anticuerpos modificados de esta invención.

Las células o líneas celulares hospedadoras adecuadas para la expresión del anticuerpo de la invención son preferiblemente células de mamífero tales como NSO, Sp2/0, CHO (por ejemplo, DG44), COS, una célula fibroblástica (por ejemplo, 3T3) y células de mieloma, y más preferiblemente una célula CHO o de mieloma. Pueden usarse células humanas, permitiendo por lo tanto que la molécula se modifique con patrones de glicosilación humanos. Como alternativa, pueden emplearse otras lineas celulares eucariotas. La selección de células hospedadoras de mamífero adecuadas y métodos para la transformación, cultivo, amplificación, exploración y producción y purificación de productos se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente.

Las células bacterianas pueden demostrar utilidad como células hospedadoras adecuadas para la expresión de los Fab recombinantes de la presente invención (véase, por ejemplo, Plückthun, Un., Immunol. Rev., 130: 151-188 (1992)). Sin embargo, debido a la tendencia de proteínas expresadas en células bacterianas a estar en una forma no plegada o plegada de forma inapropiada o en una forma no glicosilada, cualquier Fab recombinante producido en una célula bacteriana tendría que explorarse para determinar la retención de la capacidad de unión a antigeno. Si la molécula expresada por la célula bacteriana se producía en una forma plegada apropiadamente, esa célula bacteriana sería un hospedador deseable. Por ejemplo, diversas cepas de E. coli usadas para la expresión son bien conocidas como células hospedadoras en el campo de la biotecnología. Diversas cepas de B. subtilis, Streptomyces, otros bacilos y similares también pueden emplearse en este método.

Cuando se desee, también están disponibles cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la materia como células hospedadoras, asi como células de insecto, por ejemplo, de Drosophila y Lepidópteros y sistemas de expresión virales. Véase, por ejemplo, Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298, Plenum Press (1986) y referencias citadas en el mismo.

Los métodos generales por los que pueden construirse los vectores, los métodos de transición necesarios para producir las células hospedadoras de la invención y los métodos de cultivo necesarios para producir el anticuerpo de la invención a partir de dicha célula hospedadora son todas técnicas convencionales. Típicamente, el método de cultivo de la presente invención es un método de cultivo sin suero, habitualmente por cultivo de células sin suero en suspensión. Asimismo, una vez producidos, los anticuerpos de la invención pueden purificarse a partir del contenido del cultivo celular de acuerdo con procedimientos convencionales en la técnica incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares. Dichos procedimientos se incluyen en la especialidad en la técnica y no limitan esta invención. Por ejemplo, la preparación de anticuerpos modificados se describe en los documentos WO 99/58679 y WO 96/16990.

Otro método más de expresión de los anticuerpos puede utilizar la expresión en un animal transgénico, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4,873,316. Esto se refiere a un sistema de expresión que usa el promotor de caseína de animales, que cuando se incorpora transgénicamente en un mamífero permite a la hembra producir la proteína recombinante deseada en su leche.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona un método de producción de un anticuerpo de la invención, comprendiendo dicho método la etapa de cultivar una célula hospedadora transformada o transfectada con un vector que codifica la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo de la invención y recuperar el anticuerpo producido por la misma.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método de inhibición de la actividad de ADAM y ADAMTS5 proporcionando una molécula que se une simultáneamente a ambos dominios catalítico y desintegrina. En ciertas modalidades el ADAMTS es ADAMTS 4 o ADAMTS 5. El modelado informático de la estructura de 'mejor ajuste' ("best fit") mediante simulación por ordenador usando estructuras cristalinas separadas para la ADAMTS5 y el mAb de ADAMTS5 12F4.1 H7 y 7B4.1 E1 1 sugieren interacciones de antigeno/anticuerpo simultáneas entre ambos dominios catalítico y desintegrina de ADAMTS5. Los dominios catalítico y desintegrina de las proteasas ADAM y ADAMTS están separados por una región bisagra que confiere flexibilidad entre los dominios que puede actuar regulando la función o permitiendo la localización de sustrato en el sitio catalítico. La unión de mAb de alta afinidad observada en este dominio que abarca el epítopo probablemente 'bloquea' los dominios catalítico y desintegrina de ADAMTS5 a la vez, neutralizando de este modo la actividad enzimática. En una modalidad, la molécula es un anticuerpo que se une a ambos dominios desintegrina y catalítico simultáneamente. En otra modalidad, la molécula es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención involucra un anticuerpo que neutraliza la actividad catalítica de AMAMTS5 y en la que el anticuerpo se une simultáneamente a los dominios catalítico y de desintegrina con un KD de menos de alrededor de 1 10"9 ó 2x10"10 como se mide con BiaCore u Octet QK.

En otra modalidad de la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una de las proteínas de unión a antígeno descritas en la presente memoria. La invención actual también proporciona el uso de al menos una proteina de unión a antígeno a ADAMTS5 en la fabricación de un medicamento para reducir al menos una actividad de ADAMTS5 en un ser humano. La presente invención proporciona el uso de al menos una proteina de unión a antígeno a ADAMTS5 para reducir al menos una actividad de ADAMTS5 en un ser humano que comprende administrar a un paciente que lo necesite una composición que comprende al menos una proteina de unión a antígeno a ADAMTS5.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender además una segunda proteina de unión a antígeno. En algún caso, la segunda proteína de unión a antígeno puede ser un anticuerpo monoclonal. En una modalidad, el segundo anticuerpo monoclonal se une a al menos un antígeno seleccionado del grupo de ADAMTS4, ADAMTS5, NGF, OSM, TNF-a, IL-6, VIP, TRPV1 , TRPV4, ADAMTS1 , Agrecano, Colágeno II, RANKL y/o IL-1. A modo de ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender una primera proteina de unión a antígeno que puede ser un anticuerpo monoclonal contra ADAMTS5 y un segundo anticuerpo monoclonal que también puede unirse a ADAMTS5. A modo de otro ejemplo, una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender una primera proteína de unión a antigeno que es un anticuerpo monoclonal que se une a ADAMTS5 y una segunda proteína de unión a antígeno que es un anticuerpo monoclonal que se une a uno de los siguientes: ADAMTS4, NGF, OSM, TNF-a, IL-6, VIP, TRPV1 , TRPV4, ADAMTS1 , Agrecano, Colágeno II, RANKL y/o IL-1.

También se proporcionan métodos de tratamiento de un paciente que lo necesite que comprenden administrar al menos una dosis de composición farmacéutica de la presente invención. En algunos aspectos, el paciente padece una enfermedad del cartílago. Un paciente puede padecer una o más enfermedades seleccionadas del grupo de: cáncer, dolor, dolor crónico, dolor neuropático, dolor postoperatorio, artrosis, lesiones deportivas, artritis erosiva, artritis reumatoide, artritis psoriásica, artritis de Lyme, artritis juvenil, neuralgia, neuropatías, algesia, lesión nerviosa, isquemia, neurodegeneracíón, enfermedades inflamatorias, degeneración cartilaginosa, enfermedades que afectan a la laringe, tráquea, canal auditivo, discos intervertebrales, ligamentos, tendones, cápsulas articulares o al desarrollo del hueso, degeneración de discos intervertebrales, osteopenia o enfermedades periodontales, lesión articular aguda y/o enfermedades relacionadas con la destrucción articular. En algunos casos, el paciente padece artrosis.

En otra modalidad, la administración de al menos una dosis de dicha composición farmacéutica reduce la degradación de cartílago en dicho paciente. En otra modalidad, la administración de al menos una dosis de dicha composición farmacéutica inhibe y/o reduce la escisión de agrecano en dicho paciente.

También se proporcionan en la presente memoria composiciones farmacéuticas capaces de tratar una enfermedad asociada con degradación de cartílago o aliviar los síntomas producidos por la misma y formuladas para los métodos y usos descritos en la presente memoria. La presente invención proporciona un anticuerpo de ADAMTS5 para su uso en el tratamiento de enfermedades del cartílago, para su administración en solitario o en combinación con al menos otro compuesto terapéutico, incluyendo, pero sin limitación, al menos un esteroide y/o analgésico. Las proteínas de unión a antígeno de la presente invención pueden coadministrarse con otros compuestos terapéuticos en la misma dosis o por separado. La presente invención también proporciona anticuerpos contra ADAMTS5 o fragmentos de los mismos para todos los métodos y usos descritos en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, el término "paciente" se refiere a un ser humano u otro animal.

Como se usa en la presente memoria, el término "tratamiento" significa: (1) la mejoría o prevención de la afección que está tratando o una o más de las manifestaciones biológicas de la afección que está tratando, (2) la interferencia con (a) uno o más puntos en la cascada biológica que conduce a o es responsable de la afección que está tratando o (b) una o más de las manifestaciones biológicas de la afección que está tratando o (3) el alivio de uno o más de los síntomas o efectos asociados con la afección que está tratando. El especialista apreciará que la "prevención" no es un término absoluto. En medicina, el término "prevención" se entiende que se refiere a la administración profiláctica de un fármaco para disminuir sustancialmente la probabilidad o gravedad de una afección o manifestación biológica de la misma o para retrasar la aparición de dicha afección o manifestación biológica de la misma.

Como se usa en la presente memoria, una "cantidad segura y eficaz" se refiere a una cantidad de al menos una proteína de unión a antigeno suficiente para inducir significativamente una modificación positiva en la afección a tratar pero lo bastante reducida para evitar efectos secundarios graves (a una relación riesgo/beneficio razonable) dentro del alcance del buen juicio médico. Una cantidad segura y eficaz de al menos una proteína de unión a antigeno de la invención variará con el compuesto particular seleccionado (por ejemplo, se considera a la potencia, eficacia y semivida del compuesto); la vía de administración elegida; la afección que esté tratando; la gravedad de la afección que esté tratando; la edad, tamaño, peso y estado físico del paciente que se esté tratando; la historia médica del paciente que se esté tratando; la duración del tratamiento; la naturaleza de la terapia concurrente; el efecto terapéutico deseado; y factores similares pero, no obstante, puede determinarse de forma rutinaria por el experto en la materia.

Las proteínas de unión a antigeno de la invención pueden administrarse por cualquier vía de administración adecuada, incluyendo tanto la administración sistémica como la administración tópica. La administración sistémica incluye la administración oral, administración parenteral, administración transdérmica, administración rectal y administración por inhalación. La administración parenteral se refiere a vías de administración distintas de la enteral, transdérmica o por inhalación y típicamente es por inyección o infusión. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intramuscular y subcutánea. La inhalación se refiere a la administración en los pulmones del paciente ya sea inhalado por la boca o por los orificios nasales. La administración tópica incluye la aplicación en la piel, asi como la administración infraocular, ótica, intravaginal e intranasal.

Las proteínas de unión a antígeno de la invención pueden administrarse una vez o de acuerdo con un régimen de dosificación en el que se administran varias dosis a intervalos de tiempo variables durante un periodo de tiempo dado. Por ejemplo, las dosis pueden administrarse una, dos, tres o cuatro veces al día. La dosis pueden administrarse hasta que se consiga el efecto terapéutico deseado o indefinidamente para mantener el efecto terapéutico deseado. Los regímenes de dosificación adecuados para una proteína de unión a antigeno de la invención dependen de las propiedades farmacocinéticas de ese compuesto, tal como la absorción, distribución y semivida, que pueden determinarse por el experto en la materia. Además, los regímenes de dosificación adecuados, incluyendo la duración de dichos regímenes, se administran para un compuesto de la invención dependen de la afección que se trate, de la gravedad de la afección que se trate, de la edad y afección física del paciente que se trate, de la historia médica del paciente que se trate, de la naturaleza de la terapia concurrente, del efecto terapéutico deseado, y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del experto en la materia. Se entenderá además por dichos expertos en la materia que los regímenes de dosificación adecuados pueden requerir un ajuste dada la respuesta de un paciente individual al régimen de dosificación o con el tiempo a medida que el paciente individual necesite un cambio.

En ciertas modalidades, el anticuerpo se usa para administrar un fármaco al cartílago. Dicho fármaco podría ser un inhibidor de agrecanasa, un fármaco antiinflamatorio, un esferoide o un fármaco relacionado con el tratamiento del dolor. Por consiguiente, en un aspecto la invención es un método de administración de un fármaco a cartílago que comprende revestir con el fármaco un anticuerpo de la presente invención. Dicha administración puede realizarse in vitro, ex vivo o in vivo.

En otra modalidad, el anticuerpo se usa para administrar un factor de crecimiento al cartílago que promovería el crecimiento de nuevo cartílago. Dichos factores de crecimiento incluyen proteínas morfogénicas óseas, particularmente BMP-7. Dicha administración puede realizarse in vitro, ex vivo o in vivo.

EJEMPLOS Los ejemplos siguientes ilustran diversos aspectos de esta invención.

EJEMPLO 1 Producción de Mab contra ADAMTS4 humana y ADAMTS5 humana Se produjeron proteínas ADAMTS5 y ADAMTS4 humanas en células CHO transfectadas y/o células HEK293 transducidas BacMam y se asislaron por métodos de cromatografía convencionales.

Se coinmunizaron ratones SJL con ADAMTS4 purificada (longitud completa) y ADAMTS5 (truncada, de longitud completa, dominios Cat, Cat/dis). Se ensayó la inmunogenicidad en sueros de extracciones de sangre seriadas.

Se aislaron esplenocitos y ganglios linfáticos y se fusionaron a células de mieloma de ratón usando un compañero de fusión derivado de P3X63/Ag8.653. Se generaron células productoras de anticuerpo inmortalizadas. Se usó selección con HAT para deseleccionar las células de mieloma no fusionadas.

Se exploraron los sobrenadantes de hibridoma resultantes de cultivos activos para determinar su unión específica y su neutralización de ADAMTS5 y ADAMTS4 humanas recombinantes. Se identificaron los éxitos, se confirmaron y se clonaron hasta obtener monoclonales por dilución limitante o cultivo en medio semisólido.

Los anticuerpos monoclonales con las características deseadas se aumentaron a escala en cultivo liquido y el anticuerpo se purificó por métodos de cromatografía convencionales. Después, se caracterizaron adicionalmente los clones de anticuerpos purificados resultantes para determinar su afinidad de unión y su potencia funcional.

EJEMPLO 2 Caracterización de Anticuerpos Murinos Se caracterizaron mAb contra ADAMTS5 mAb para determinar su potencia de neutralización usando ensayos de escisión de sustrato agrecano in vitro (cuadro 1). Se caracterizaron mAb contra ADAMTS5 para determinar su afinidad usando tecnologías tanto Octet QK (cuadro 1) como BiaCore (comparable, pero no se muestra). También se ensayaron anticuerpos para determinar su reactividad cruzada con ADAMTS1 , ADAMTS4, ADAMTS13, MMP1 , MMP3, MMP9 y MP13 humanas mediante celTRF y Octet QK, siendo todos negativos (no se muestra). Todos los mAbs se evaluaron también para determinar su reactividad cruzada con ortólogos por unión y neutralización contra ADAMTS5 de ratón, canina y mono cynomologus (cuadro 1). También se detectó la unión contra ADAMTS5 de rata (no se muestra). Se resumen comparaciones de afinidad para formas murinas y quiméricas de mAb anti-ADAMTS5 humana en Octet QK en la cuadro 2.

CUADRO 1 Caracterización de anticuerpos monoclonales anti-ADAMTS5 humana purificados Afinidad (Qctet QK) Escisión de Ortólogo de ADAMTS5 Sustrato (Unión/Neutralización) Agrecano mAb Ka Kd KD NeutralizaRatón Cynomolgus Canino ción CI50 (nM) 1 G10.1 C9 4.47E+(V 8.43E-06 1.88E- 10 0.375 (+/+) (+/+) (+/+) 2D3.1 D4 6.67E+OÍ 5.75E-06 8.62E-11 0.031 (+/+) (+/+) (+/+) 3A12.1 D7 5.67E+f> 4.67E-06 8.24E-11 0.769 (+/+) (+/+) (+/+) 5F10.1 H6 5.53E+CM 6.99E-06 1.26E-10 0.05 (+/+) (+/+) (+/+) 11 F12.1 D12 6.57E+04 4.33E-05 6.58E- 10 2.527 (+/+) (+/+) (+/+) 12F4.1 H7 3.31 E+04 1.44E-05 4.36E-10 0.06 (+/+) (+/+) (+/+) 7B4.1 E 11 4.86E+04 4.36E-05 8.99E-10 0.08 (+/+) (+/+) (+/+) CUADRO 2 Comparación directa mAb anti-DA TS5 humana murinos y quiméricos purificados Afinidad (Qctet QK) mAb Ka Kd KD 12F4.1 H7 Murino 5.64E+04 3.86E-06 6.85E-1 1 12F4.1 H7 Quimérico 5.55E+04 4.43E-06 7.99E-1 1 7B4.1 E11 Murino 7.65E+04 2.74E-05 3 58E-10 7B4.1 E11 Quimérico 7.18E+04 2.47E-05 3.45E-10 EJEMPLO 3 Secuencias Basándose en las características identificadas en el Ejemplo 2, se identificaron seis anticuerpos monoclonales. Las regiones variables de estos anticuerpos se secuenciaron. Los alineamientos se muestran a continuación (cuadro 3). Una región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada consenso (mayoría) están representadas por las SEQ ID NO: 30 y 31 a continuación. Las regiones variables de cadena pesada para las denominaciones de mAb 12F4.1H7, 1G10.1C9, 2D3.1D4, 3A12.1D7, 5F10.1H6 y 7B4.1E11 están representados por las SEQ ID NO: 32-37, respectivamente, y codificadas por las SEQ ID NO: 147, 157, 151, 153, 155 y 149, respectivamente. Las regiones variables de cadena ligera para las denominaciones de mAb 2D3.1D4, 3A12.1D7, 5F10.1H6, 7B4.1E11 y 12F4.1H7 están representados por las SEQ ID NO: 38-42, respectivamente, y codificadas por las SEQ ID NO: 152, 154, 156, 150 y 148, respectivamente.

CUADRO 3 Alineamiento de secuencias de CDR de mAb anti-ADAMTS5 Alineamientos de CDR de VH CDRH1 E V K L E E S G G G L V Q P G G S K L S C A A S G F T F S D AWM DWV Q S Mayoría + + + — +- 10 20 30 40 + - + + +- 1 EVKLE E SGGGLVO PGGS MKLS CTASGF T F S DAWMDWVRQS 12F4.1H7 VH.pro 1 EVK LE E SGGGLGQ PGGS M KLS CAASG F NF S DAWMDWVRQS 1G10.1C9 VH.pro 1 EVKLE E SGGGLVQ PGG S MKL SCAASG ITFS DAWMDWVRQS 2D3.1D4 VH.pro 1 EVKFE E SGG GLVQ PGG SM K LS CAASGF I FS DAWMDWVRQS 3A12.1D7 VH.pro 1 E V LE E SGGG LVQ PG G S M KLSCAASG FTF S DAWMDWVRQS 5F10.1H6 VH.pro 1 E VK LE E SGGGLVQ PGG S MK LS CAASG FTSSDAWMDWVRQS 7B4.1E11 VH.pro CDR H2 PE K G LEWVAEIRHKANDHAI FYXESVKG RFTI S RDDSK S I Mayoría + + — - + +. 50 60 70 80 + +— + +. 41 PE G LEWVAEIRHKANDHAI FY DESVKG R FTI S RDDSKN I 12F4.1H7 VH.pro 41 PE KG LEWVAEIR HKAN DHAI F Y A E S V K G R F T I S R D D S K S S 1G10.1C9 VH.pro 41 PE K G L E W VA DIR NT A N N H A T F YÁ E S VK G R F T I S R D DS K S T 2D3.1D4 VH.pro 41 PE KG LEWVAEIR HKANDYAI FYDESVKGRFT I S RD DSKS I 3A12.1D7 VH pro 41 E KG LEWVAEIRHKAN DHAI FY DESVKGR FT IS DDSKS I 5F10.1H6 VH.pro 41 PE KG L EWVAE IRNKANNHARHYAESVKGR FT I S R D DSKSS 7B4.1E11 VH.pro CDR H3 VY LQ NSLR PE DTG IYYCT S PFAY WG QGT LVTVSA Mayoría (SEQ ID NO: 30) 90 100 110 120 81 VY L Q MNS L R P E DT G IYY CT S PFÁY WGQ G T L VT VSA 12F41H7 VH.pro (SEC ID N°: 32) 81 VY L Q M N S L RA E DT G I YY CT S P FAY WG Q GT LVT V S A 1G10.1C9 VH.pro (SEC ID N°: 33) 81 VY L Q M NT L R P E DT G I Y Y CT S P FAY WGQ G T L VT VS A 2D3.1D4 VH.pro (SEC ID N°: 34) 81 VY L Q M NN L R P E DT G IY Y CT S P FAY WG Q G T L VT VS A 3A12.1D7 VH.pro (SEC ID N°: 35) 81 VY L Q M N S L R P E DT G I Y Y CT S P FAY WGQ GT L VT VS A 5F10.1H6 VH.pro (SEC ID N°: 36) 81 VY L Q M NS L RA E DS G I Y Y CT RTYYY G S S Y GY C DVW GT G T T VT VS S 7B4.1E11 VH.pro (SEC ID N°: 37) Alineamientos de CDR de VL CDR L1 DIVMTQSQ KF MSVTVGDRVS ITC KA SQSVGTT I. WY QQKP Mayoría 10 20 30 40 + + + + 1 DIVMTQSQKF MSTTVGDRVS ITCKASQN V.G TAVVWF QQ K P 2D3.1D4 VL.pro 1 DIVMTQSQKF MSVTVGDRVS ITCKASQS V G T T I VWY QQK P 3A12.1D7 VL pro 1 DIVMTQSQRF MSVTVGDRVS ITC K A S Q,S V G T T I VWYQQKP 5F10.1H6 VL.pro 1 DIQMTQSPA SL SASVGE TVT IT C SE NÍ Y.SYLAWY QQKQ 7B4.1E11 VL.pro 1 DIVMTQSQKF MSVTVGDRVS ITCKASQSVGTTI VWY QQKP 12F4.1H7 VL.pro CDR L2 GQS P KLL IY SAS NRXT GVP DR F TGSG SGTDF I LT INNVQS Mayoría + + + + 50 60 70 80 + + + + 41 GQ S P K LL IY SÁS RYTRVP DR F TGSGSGT DFTLT IS NVQS 2D3.1D4 VL.pro 41 GQ SP KLL lYSAS NRHTGVP DRFTGSGSGTDF ILTIS NVQS 3A12.1D7 VLpro 41 GQ SP K L L IY SASTRYTGVP DRF TGGGSGT DF I LT I N NVQS 5F10.1H6 VL.pro 41 GKSPQLLVYNA K T LAEGVPS R FSGSGS GTQF S L K INSL QP 7B4.1 E 11 VL.pro 41 GQSP K LL IYSASNRHTGVP DR FTGSGSGTDF I LTIN NVQS 12F4.1H7 VL.pro CDR L3 E DLADYFCQQYSSY PFTFG SGTK LE I K RA Mayoría (SEQ ID NO: 31) 90 100 81 E D LADYFCQQYVNY PFTF GSGTK LE I K RA 2D3.1D4 VL.pro (SEC ID N°: 38) 81 E D LADY F C Q Q Y S'SY PFT F GSGTKLE I KRA 3A12.1D7 VL.pro (SEC ID N°: 39) 81 E D LADYFCQQYS SY PFTF G SGTKLE IK RA 5F10.1H6 VL.pro (SEC ID N°: 40) 81 ED F G SY SCQHHYGT PWT F G G G T K L E I K R A 7B4.1E11 VL.pro (SEC ID N°: 41) 81 ED LADYFCQQYTSYPFT FG S GT KLE IK RA 12F4.1H7 VL.pro (SEC ID N°: 42) EJEMPLO 4 Explante de Cartílago OA Humano Se obtuvo cartílago OA humano de donante a partir de cirugías de reemplazo de rodilla. Se procesó el cartílago a partir del hueso y se cortó en discos de diámetro de 3 mm. Los discos se aleatorizaron y se cultivaron en placas de 96 pocilios. Se dejó que los factores de enfermedad endógenos en los tejidos evolucionaran para la degradación de cartílago ex vivo. Se trataron las muestras con lo siguiente: isotipo de IgG de control correspondiente, anticuerpos anti-ADAMTS5 seleccionados (denominados 7B4.1 E1 1 y 12F4.1 H7), un anticuerpo anti-ADAMTS4 seleccionado (denominado 7E8.1 E3) o un inhibidor de agrecanasa/MMP conocido, mostrado como GSK571949 (No. CAS 329040-94-0) a continuación. Cada condición de tratamiento se ensayó en múltiplos de 8 en cada placa donante. Se midió la inhibición de la liberación de neoepitopo ARGSVIL (SEQ ID NO: 1) para cada muestra en numerosos puntos a lo largo del transcurso del experimento. o GSK571949 Como se ha descrito anteriormente, la escisión de agrecano por agrecanasa se produce típicamente en una región conservada dentro del dominio interglobular del agrecano. La escisión enzimática producirá un fragmento liberado que contiene un neoepitopo con una secuencia de aminoácidos N-terminal (ARGSVIL) del agrecano. Este neoepitopo de escisión puede detectarse y cuantificarse usando un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a las formas escindidas, peor no al agrecano intacto. Tanto los anticuerpos contra ADAMTS5 como el inhibidor de ADAMTS5 mostraban una inhibición significativamente superior de la liberación de ARGSVIL que el control y el anticuerpo contra ADAMTS4. Un resumen del porcentaje de inhibición de la liberación de ARGSVIL se muestra en la Figura 1. Los resultados demuestran que los mAbs específicos de ADAMTS5 son capaces de inhibir la degradación en un índice de aproximadamente 70% durante el periodo de evaluación de 2-3 semanas en comparación con un compuesto de control de ensayo molecular pequeño. Estos resultados son uniformes dentro de y entre muchas muestras de donantes individuales.

EJEMPLO 5 Respuesta a la Dosis de Anticuerpo contra APAMTS5 en Explante de Cartílago OA Humano Se ensayó el porcentaje de inhibición de la liberación de ARGSVIL como se describe en el Ejemplo 4 para determinar la respuesta de la dosis de un anticuerpo anti-ADAMTS5 seleccionado (véase la Figura 2). Se ensayó el anticuerpo murino 7B4.1 E11 a las dosis siguientes: 1340 nM, 670 nM, 335 nM, 81.25 nM. También se usó inhibidor de agrecanasa/MMP de control. El porcentaje de liberación de ARGSVIL era inferior con las mayores dosis de ant¡-ADAMTS5 y disminuía tras el tratamiento con dosis inferiores. Se usaron dosis de tratamiento con anticuerpo de control de isotipo correspondiente (no se muestra) para determinar la inhibición de 0% y se usó una sola dosis eficaz de GSK571949 para calcular la inhibición de 100%. Este tratamiento con mAb demuestra una respuesta a la dosis que parece alcanzar un efecto máximo a la dosis de 670 nM (Figura 2). Sin embargo, debería observarse que estaban representados más donantes (n = 22) en el punto de dosis de 670 nM mientras que las otras dosis incluían menos donantes (n<5).

EJEMPLO 6 Estudios in vivo de DMM Se indujo OA en ratones usando un modelo de Desestabilización de Menisco Medial (DMM) para la evaluación de la eficacia de un anticuerpo anti-ADAMTS5 (véase la Figura 3). Se muestran dos experimentos separados. Tres días antes de la DMM quirúrgica, se administró a los ratones 0.5 mg/dosis de uno de los anticuerpos siguientes: anti-ADAMTS5 (7B4.1 E1 1 ), anti-ADAMTS5 (12F4.1 H7) o isotipo de IgG. Los grupos de control incluían ratones sin tratar con cirugía de DMM, ratones con una cirugía simulada y ratones normales. Seis días después de la dosificación, se sacrificaron los ratones y se realizó la histopatologia por investigadores a ciegas a partir de lo cual se dio una puntuación articular a cada rodilla de ratón evaluada. Los anticuerpos anti-ADAMTS5 mostraron puntuaciones articulares medias significativamente mejores en comparación con el control de isotipo de lgG1. Además, las rodillas con cirugía simulada y las rodillas normales tenían puntuaciones articulares medias significativamente mejores en comparación con las rodillas sin tratar y tratadas con el isotipo de IgG.

EJEMPLO 7 Los anticuerpos monoclonales penetran en el cartílago in vitro e in vivo La capacidad de los anticuerpos terapéuticos para penetrar en el tejido y alcanzar el sitio en la enfermedad y su diana específica es típica para su eficacia. Las agrecanasas, aunque clasificadas como proteínas secretadas, se ha demostrado que se localizan preferentemente en las regiones pericelulares de los condrocitos dentro de la matriz de cartílago. Por lo tanto, para que un mAb terapéutico alcance una diana de agrecanasa puede requerir la penetración a través de la matriz de cartílago.

Inicialmente, la evaluación de la capacidad de un mAb para penetrar en el cartílago humano se realizó sobre el tejido ex vivo usando mAb con especificidades múltiples, incluyendo mAb anti-ADAMTS5 seleccionados. Se colocaron tapones de cartílago de espesor completo, que atravesaban la superficie sinovial a través del hueso subcondral, de muestras quirúrgicas de reemplazo de rodilla en cultivo de tejidos por duraciones definidas en presencia de anticuerpos monoclonales de ratón con especificidades por proteínas humanas localizadas en la superficie de los condrocitos o controles de isotipo inespecíficos. Al final de cada punto temporal los tejidos se procesaron para evaluación del espesor total, se seccionaron y se tiñeron usando un anticuerpo de detección anti-ratón marcado con FITC. La penetración se define por la profundidad y la intensidad de la tinción de condrocitos dentro del tejido de cartílago. Independientemente de la especificidad de diana, se observó que la penetración de mAb era un proceso dependiente de tiempo y concentración que se origina principalmente desde la superficie sinovial del cartílago y avanza hasta la penetración del espesor total en 3-4 días dependiendo de la concentración (no se muestra). No se observó tinción para tapones de cartílago tratados con mAb de control de isotipo (no se muestra).

La evaluación ¡n vivo de la penetración de cartílago se realizó usando anticuerpos monoclonales marcados con un colorante próximo al infrarrojo (NIR), incluyendo mAb selectivos para ADAMTS4, ADAMTS5 y controles de isotipo. Los mAb marcados con NIR se administraron por vía sistémíca (por vía intraperitoneal) (dosis de 0.5 mg) a ratones que seis semanas antes se habían sometido a una inducción quirúrgica de artrosis (DMM). La biodistribución de mAb se controló en todo el animal a numerosos puntos temporales después de la administración usando un sistema Licor Odyssey. Cuatro días después de la administración de mAb los ratones se sacrificaron y se realizó formación de imágenes de la articulación de la rodilla en el Odyssey. Después se procesaron las articulaciones de la rodilla y se seccionaron para un análisis de alta resolución en un microcopio equipado con filtros y una cámara para detección de NIR. Dentro de los cuatro días siguientes a la administración sistémica de mAb podía observarse penetración del espesor total del cartílago para un mAb anti-ADAMTS5 y anti-ADAMTS4, mientras que no observó tinción específica para el mAb de control de isotipo (no se muestra). Se observaron patrones de tinción de condrocitos pericelulares característicos para mAb específicos de ADAMTS5 y ADA TS4 (no se muestra).

EJEMPLO 8 Humanización de Anticuerpos - Clonación de Regiones Variables de Hibridoma Se extrajo el ARN total de células de hibridoma 7B4.1 E1 1 y 12F4.1 H7, después se generó la secuencia de ADNc del dominio variable de la cadena ligera y pesada mediante transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). El cebador directo para RT-PCR era una mezcla de cebadores degenerados específicos para secuencias líder de gen de inmunoglobulina murina y el cebador inverso era específico para las regiones constantes de anticuerpo, en este caso isotipo lgG1 para 7B4.1 E11 e lgG2 para 12F4.1 H7. Se diseñaron cebadores basándose en una estrategia descrita por Jones y Bendig (Bio/Technology 9: 88, 1991). La RT-PCR se realizó para ambas secuencias de la región V para permitir la verificación posterior de las secuencias de región V correctas. Los productos de región V generados por la RT-PCR se clonaron (Invitrogen TA Cloning Kit) y se obtuvieron los datos de secuencia.

EJEMPLO 9 Humanización de Anticuerpos - Clonación de la Quimera Se prepararon construcciones de expresión de ADN que codificaban el anticuerpo quimérico de novo por acumulación del oligonucleótido solapantes incluyendo sitios de restricción para su clonación en vectores de expresión de mamífero, así como una secuencia señal humana. Se introdujeron sitios de restricción HindIII y Spel para flanquear el dominio VH que contiene la secuencia señal (SEQ ID NO: 45) para su clonación en vectores de expresión de mamífero que contienen la región constante ?1 humana. Se introdujeron sitios de restricción HindIII y BsiWI para flanquear el dominio VL que contenía la secuencia señal (SEQ ID NO: 45) para su clonación en un vector de expresión de mamífero que contiene la región constante kappa humana.

EJEMPLO 10 Humanización de Anticuerpos - Clonación de las Variantes Humanizadas Las construcciones de expresión de ADN que codifican las variantes de anticuerpos humanizados se prepararon de novo por acumulación de oligonucleótidos solapantes que incluían sitios de restricción para su clonación en vectores de expresión de mamífero, así como una secuencia señal humana. Se introdujeron sitios de restricción HindIII y Spel para flanquear el dominio VH que contiene la secuencia señal (SEQ ID NO: 45) para su clonación en vectores de expresión de mamífero que contienen la región constante ?1 humana. Se introdujeron sitios de restricción Hindlll y BsiWI para flanquear el dominio VL que contiene la secuencia señal (SEQ ID NO: 45) para su clonación en un vector de expresión de mamífero que contiene la región constante kappa humana.

CUADRO 4 Variantes de Anticuerpo ID Nombres Descripción SEC ID N°: SEC ID N°: Anticuerpo Alternativos de la de la secuencia de secuencia de nucleótidos aminoácidos BPC1622 Quimera de cadena pesada quimérica de 67 68 7B4 7B4 cadena ligera quimérica de 69 70 7B4 BPC1623 Quimera de cadena pesada quimérica de 71 72 12F4 12F4 cadena ligera quimérica de 73 74 12F4 BPC1634 7B4 H0L0 cadena pesada H0 de 7B4 83 84 cadena ligera LO de 7B4 97 98 BPC1635 7B4 H1 L0 cadena pesada H1 de 7B4 85 86 cadena ligera LO de 7B4 97 98 BPC1636 7B4 H2L0 cadena pesada H2 de 7B4 87 88 cadena ligera LO de 7B4 97 98 BPC1637 7B4 H3L0 cadena pesada H3 de 7B4 89 90 cadena ligera LO de 7B4 97 98 BPC1638 7B4 H4L0 cadena pesada H4 de 7B4 91 92 cadena ligera LO de 7B4 97 98 BPC1639 7B4 H5L0 cadena pesada H5 de 7B4 93 94 cadena ligera LO de 7B4 97 98 BPC1640 7B4 H6L0 cadena pesada H6 de 7B4 95 96 cadena ligera LO de 7B4 97 98 BPC1641 7B4 H0L1 cadena pesada H0 de 7B4 83 84 cadena ligera L1 de 7B4 99 100 BPC1642 7B4 H1 L1 cadena pesada H 1 de 7B4 85 86 cadena ligera L1 de 7B4 99 100 BPC1643 7B4 H2L 1 cadena pesada H2 de 7B4 87 88 cadena ligera L1 de 7B4 99 100 BPC1644 7B4 H3L 1 cadena pesada H3 de 7B4 89 90 cadena ligera L1 de 7B4 99 100 BPC1645 7B4 H4L1 cadena pesada H4 de 7B4 91 92 cadena ligera L1 de 7B4 99 100 BPC1646 7B4 H5L1 cadena pesada H5 de 7B4 93 94 cadena ligera L1 de 7B4 99 100 BPC16 7 7B4 H6L1 cadena pesada H6 de 7B4 95 96 cadena ligera L1 de 7B4 99 100 BPC1648 7B4 HOL2 cadena pesada HO de 7B4 83 84 cadena ligera L2 de 7B4 101 102 BPC1649 7B4 H1 L2 cadena pesada H1 de 7B4 85 86 cadena ligera L2 de 7B4 101 102 BPC 1650 7B4 H2L2 cadena pesada H2 de 7B4 87 88 cadena ligera L2 de 7B4 101 102 BPC1651 7B4 H3L2 cadena pesada H3 de 7B4 89 90 cadena ligera L2 de 7B4 101 102 BPC1652 7B4 H4L2 cadena pesada H4 de 7B4 91 92 cadena ligera L2 de 7B4 101 102 BPC1653 7B4 H5L2 cadena pesada H5 de 7B4 93 94 cadena ligera L2 de 7B4 101 102 BPC1654 7B4 H6L2 cadena pesada H6 de 7B4 95 96 cadena ligera L2 de 7B4 101 102 BPC1655 12F4 H0L0 cadena pesada HO de 12F4 103 104 cadena ligera LO de 12F4 113 114 BPC1656 12F4 H1 L0 cadena pesada H1 de 12F4 105 106 cadena ligera LO de 12F4 113 114 BPC1657 12F4 H2L0 cadena pesada H2 de 12F4 107 108 cadena ligera LO de 12F4 113 114 BPC1658 12F4 H3L0 cadena pesada H3 de 12F4 109 1 10 cadena ligera LO de 12F4 113 114 BPC1659 12F4 H4L0 cadena pesada H4 de 12F4 11 1 112 cadena ligera LO de 12F4 113 114 EJEMPLO 11 Humanización de Anticuerpos - Expresión de los anticuerpos recombinantes (incluyendo cuantificación de anticuerpos) Plásmidos de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera respectivamente se cotransfectaron de forma transitoria en células HEK 293 6E y se expresaron a pequeña a escala para producir anticuerpos. También se expresaron las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos quiméricos 7B4 y 12F4 y un anticuerpo de control irrelevante. Los anticuerpos se cuantificaron mediante ELISA. Se recubrieron placas de ELISA con anti-IgG humana (Sigma I3382) a 1 µg/ml y se bloquearon con solución de bloqueo (BSA al 4% en solución salina tamponada con Tris). Se añadieron diversas diluciones de los sobrenadantes de cultivo de tejido y la placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. También se añadieron a la placa diluciones de un anticuerpo patrón conocido. La placa se lavó en TBST y se detectó la unión por adición de un anticuerpo anti-cadena ligera kappa humana marcado con peroxidasa (Sigma A7164) a una dilución de 1/1000 en solución de bloqueo. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente antes de lavar en TBST. La placa se reveló por adición de sustrato OPD (Sigma P9187) y se interrumpió el desarrollo de color por adición de H2S04 2 M. La absorbancia se midió a 490 nm y se representó una curva patrón usando datos para las diluciones patrón conocidas. La curva patrón se usó para estimar la concentración de anticuerpo en los sobrenandantes de cultivo de tejido.

EJEMPLO 12 Elisa de unión a ADAMTS5 Se realizó un ELISA de unión para ensayar la unión de los anticuerpos expresados en sobrenadante de cultivo de células ADAMTS5 recombinante. Se recubrieron placas de ELISA con ADAMTS5 humano recombinante a 0.2 µg/m\ y se bloquearon con solución de bloqueo (BSA al 4% en solución salina tamponada con Tris). Se añadieron diversas diluciones de los sobrenadantes de cultivo de tejido y la placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente antes de lavar en TBST. Se detectó la unión por adición de un anticuerpo anti-cadena ligera kappa humana marcado con peroxidasa (Sigma A7164) a una dilución de 1/1000 en solución de bloqueo. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente antes de lavar en TBST. La placa se reveló por adición de sustrato OPD (Sigma P9187) y el desarrollo de color se interrumpió por adición de H2S04 2 M. Se midió la absorbancia a 490 nm con un vector de placas y la absorbancia media se representó frente a la concentración.

Las Figuras 6-9 muestran la unión de los anticuerpos anti-ADAMTS5 humanizados a antígeno recombinante.

EJEMPLO 13 BIAcore Se inmovilizó anti-lgG humana (Biacore , BR-1008-39) en una microplaca CM5 por acoplamiento con amina primaria. Después se usó esta superficie para capturar los anticuerpos humanizados, después se pasó ADAMTS5 (R&D Systems 2 98-AD) sobre el anticuerpo capturado a una sola concentración de 64 nM, se realizó la regeneración usando ácido fosfórico 100 mM seguido de gCI2 3 M. Las curvas de unión se dotaron de dobles referencias con inyección de tampón (es decir, 0 nM) y los datos se ajustaron al programa informático de análisis T100 usando el modelo 1 : 1. El procesamiento se realizó a 25°C, usando HBS-EP como tampón de procesamiento. Los datos obtenidos se muestran en el cuadro 5. Todos los anticuerpos se capturaron a partir de sobrenadante de cultivo de tejido a menos que se especifique otra cosa.

CUADRO 5 Cinética de la unión a ADAMTS5 Muestra ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) BPC1623 (purificado) 6.463E+05 4.700E-05 0.07273 BPC1622 (purificado) 8.723E+05 1.056E-03 1.211 BPC1622 1.159E+06 1.305E-03 1.125 BPC1623 6.234E+05 4.823E-05 0.07737 BPC1634 5.538E+05 4.811E-04 0.8687 BPC1635 7.041 E+05 8.258E-04 1.173 BPC1636 1.073E+06 8.963E-04 0.8357 BPC1837 1.119E+06 9.625E-04 0.8604 BPC1638 8.749E+05 8.309E-04 0.9497 BPC1639 9.271 E+05 8.937E-04 0.9639 BPC1640 7.870E+05 8.492E-04 1.079 BPC1641 7.144E+05 9.453E-04 1.323 BPC1642 8.874E+05 1.210E-03 1.364 BPC1643 1.362E+06 1.434E-03 1.053 BPC1644 1.491E+06 1.572E-03 1.054 BPC1645 1.119E+06 1.159E-03 1.036 BPC1646 1.788E+06 1.843E-03 1.031 BPC1647 1.485E+06 1.453E-03 0.9784 BPC1648 7.875E+05 9.512E -04 1.208 BPC1649 1.023E+06 1.297E-03 1.267 BPC1650 3.140E+06 3.427E-03 1.091 BPC1651 2.653E+06 3.150E-03 1.188 BPC1652 1.963E+06 2.122E-03 1.081 BPC1653 2.236E+06 2.597E-03 1.161 BPC1654 1.040E+06 1.137E-03 1.094 BPC1655 no se observó unión BPC1656 6.327E+05 3.950E-04 0.6243 BPC1657 5.850E+05 7.540E-05 0.1289 BPC1658 4.483E+05 1.398E-04 0.3119 BPC1659 4.894E+05 4.147E-05 0.08475 EJEMPLO 14 Afinidad comparativa de mAb de ADAMTS5 murinos, quiméricos y humanizados Se evaluó la afinidad para los mAb en dos formatos (antígeno sobre detector, Octet QK y anticuerpo sobre detector, Biacore) (cuadro 6). La relevancia del formato Octet QK, que sería representativo de una diana celular, es relevante para ADAMTS5 debido a la forma asociada con la célula de origen natural de la enzima in vivo. Sin embargo, puesto que ADAMTS5 también puede encontrarse en una forma secretada, también se evaluó la afinidad en un formato de anticuerpo sobre detector usando Biacore. Las diferencias observadas entre el análisis Octet y Biacore pueden representar variaciones de formato (es decir, antigeno sobre detector en Octet QK y mAb sobre detector en Biacore) y diferencias técnicas entre los sistemas. Sin embargo, cuando se procesaban en los mismos formatos los sistemas eran extraordinariamente similares en términos de KD global para estos mAb. Se observaron diferencias en Kd y Ka probablemente debido a diferencias de diseño de los instrumentos.

El mAb CS humanizado (12F4 H4L0) presenta una afinidad global (KD) de 38.3 pM según se mide en el formato de antígeno abajo en el sistema Octet QK. El mAb 12F4 H4L0 demuestra una KD de 85 pM, en el formato de mAb abajo en el sistema Biacore. El 7B4 HOLO mostrado como referencia, presenta una KD de 205 y 869 pM en los sistemas Octet QK y Biacore respectivamente. Se muestran valores de afinidad para las formas murina y quimérica de cada mAb en la presente memoria como referencia para demostrar que se conserva la afinidad después de la humanización. Todos los mAb en este experimento contuvieron porciones Fe completamente funcionales (es decir, no fueron deshabilitados para Fe).

CUADRO 6 Afinidad comparativa de mAb de ADAMTS5 murinos, quiméricos y humanizados Afinidad (Biacore) mAb abajo sin Afinidad (Octet QK) de antfgeno avidez abajo incluyendo avidez mAb a KD Ka Kd KD 12F4.1H7 murino 1.56E+06 1.04E-04 0.067 nM 6.99E+04 2.49E-06 0.0356 nM 12F4.1H7 1.56E+06 7.86E-05 0.051 nM 6.85E+04 2.96E-06 0.0431 nM quimérico 12F4.1H7 H4L0 4.89E+05 4.15E-05 0.085 nM 7.54E+04 2.88E-06 0.0383 nM humanizado 7B4.1E11 murino 4.81 E+06 2.32E-03 0.483 nM 9.25E+04 2.59E-05 0.280 nM 7B4.1E11 2.43E+06 1.14E-03 0.473 nM 1.00E+05 2.61 E-05 0.260 nM quimérico 7B4.1E11 HOLO 5.54E+05 4.81 E-04 0.869 nM 1.06E+05 2.16E-05 0.205 nM humanizado EJEMPLO 15 Intervalo de dosis de 12F4 H4L0 humanizado de experimento de explante de cartílago OA humano El mAb de Fe inutilizado 12F4 H4L0 humanizado se evaluó en este sistema en un formato de respuesta a la dosis frente a un isotipo de Fe inutilizado apropiado y otros controles positivos y negativos en comparación con la versión 12F4.1 H7 murina precursora en una sola dosis. Se evaluaron individualmente múltiples donantes (n = 4) en este estudio los resultados se recopilaron para generar una puntuación de inhibición media por toda una población de pacientes con OA. Se usó GSK571949 a una sola concentración (2 µ?) como control de ensayo para ajustar los niveles de inhibición máxima. Los resultados demuestran una clara respuesta a la dosis de 12F4 H4L0, consiguiéndose una respuesta máxima a la mayor dosis (1333 n ) en comparación con un intervalo de dosis de mAb de control de isotipo humanizado irrelevante (Figura 10). Se consiguió una inhibición casi completa del neoepítopo ARGS en relación con GSK571949 a la mayor dosis (2 ug/ml). Además, el nivel de inhibición para 12F4 H4L0 se demostró que era superior que el de 12F4.1 H7 en estos donantes, sugiriendo que se retenia la eficacia después de la humanización. Aunque el nivel de eficacia es superior para la versión humanizada del mAb no está claro si éste es un aumento verdadero o debido a diferencias en las preparaciones de mAb. Debería señalarse que el nivel de eficacia observado con la forma 12F4.1 H7 del mAb en experimentos separados con donantes con OA adicionales era superior al observado aquí (Figura 1). Teniendo en cuenta la importancia de este sistema para la enfermedad humana y la eficacia observada, estos datos confirman claramente la validación de esta estrategia y estos mAb.

EJEMPLO 16 Experimento de mareaje y seguimiento terapéutico de explante de cartílago OA humano Este experimento se diseñó como en el Ejemplo 15, sin embargo, después de una duración de tratamiento de 5 días con los mAb compuestos para permitir la saturación del sistema, se retiraron los tratamientos y se sustituyeron con medios recién preparados que carecían de tratamiento. El ensayo se continúo durante 4 semanas con muestreo periódico de los medios de cultivo para evaluación posterior de los marcadores de degradación de cartílago. Después de cada muestreo, el mismo volumen retirado en la muestra se sustituyó con medio recién preparado. Este formato se diseñó para abordar la potencia y la duración del efecto terapéutico y sugerir indirectamente la tasa de renovación durante ADAMTS5 dentro del tejido. Los resultados mostrados se recopilaron de experimentos idénticos usando 4 donantes con OA humanos diferentes (Figura 1 1). Estos resultados proporcionan pruebas de la duración prolongada de la respuesta de mAb de ADAMTS5 en cartílago OA humano incluso en un estado patológico avanzado (es decir, en el momento del reemplazo de la articulación). Además, estos resultados proporcionan pruebas de la baja tasa de renovación de ADAMTS5 en tejido enfermo.

EJEMPL0 17 Anticuerpo Humanizado de Fe Inutilizado El gen codificante del dominio VH H4 de 12F4 humanizado se clonó en la región constante gamma 1 humana modificada, lgG1 m(AA). La región constante de lgG m(AA) contiene dos sustituciones de alanina en el dominio CH2 en las posiciones L235 y G237 (numeración de índice EU). Estas mutaciones vuelven al anticuerpo resultante incapaz unirse a los receptores de Fe necesarios o al componente del complemento C1 q, inutilizando de este modo su capacidad para inducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

CUADRO 7 Secuencia de ADN Secuencia de aminoácidos BPC1659 12F4 H4L0 cadena pesada H4 de 12F4 159 158 lgG1 m(AA) cadena ligera LO de 12F4 113 114 Se expresaron plásmidos de expresión que codificaban las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos BPC1623 (Quimera de 12F4), BPC1659 (12F4 H4L0 IgGlwt) y BPC1661 (12F4 H4L0 lgG1 m(AA)) en células HEK. Se purificaron los anticuerpos por cromatografía de afinidad de proteina A y se cuantificaron por espectrofotometría.

Se realizó un ELISA de unión para comparar la unión de los anticuerpos purificados a ADAMTS5. Se incluyó como control negativo un anticuerpo irrelevante de isotipo IgGlwt y un anticuerpo de Fe inutilizado. En resumen, se recubrieron placas con ADAMTS5 humano recombinante a 0.2 µgím\ y se bloquearon con solución de bloqueo (BSA al 4% en solución salina tamponada con Tris). Se añadieron diversas concentraciones de anticuerpo purificado y la placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente antes del lavado con TBST (solución salina tamponada con Tris + Tween 20 al 0.05%). Se detectó la unión por adición de un anticuerpo anti-cadena ligera kappa humana marcado con peroxidasa (Sigma A7164) a una dilución de 1/1000 en solución de bloqueo. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente antes de lavar en TBST. La placa se reveló por adición de sustrato OPD (Sigma P9187) y se interrumpió el desarrollo de color por adición de H2S04 2 M. La absorbancia se midió a 490 nm con un lector de placas y la absorbancia media se representó frente a la concentración.

La Figura 12 muestra la unión de los anticuerpos anti-ADAMTS5 purificados a antígeno recombinante.

EJEMPLO 18 Biacore de Anticuerpo de Fe Inutilizado Se inmovilizó proteína A en una microplaca biodetectora CM5 por acoplamiento con amina primaria. Esta superficie se usó para capturar el anticuerpo anti-ADAMTS5 de Fe inutilizado, 12F4 H4L0 lgG1 m(AA) (BPC1661 ), (material expresado en CHO y HEK). Se usó ADAMTS5 humana recombinante (R&D Systems 2198-AD) como el analito a 64 nM, 16 nM, 4 nM, 1 nM, 0.25 nM y 0.0625 nM, usándose una inyección de tampón (es decir 0 nM) para dotar de doble referencia a las curvas de unión. La regeneración de la superficie de captura (es decir, renovación del anticuerpo capturado) era con NaOH 50 mM. El tampón de procesamiento era HBS-EP y el procesamiento se realizó en el Biacore T100 a 25°C. Los datos se ajustaron al modelo 1 :1 inherente al programa informático de análisis de las máquinas. Los resultados mostraban que no existían diferencias entre el material producido en diferentes líneas celulares en términos de afinidad de unión.

Resultados Construcción ka kd KD (nM) 12F4 H4L0 lgG1 m(AA) (expresado en HEK) 9.43E+05 6.98E-05 0.074 12F4 H4L0 lgG1m(AA) (expresado en CHO) 8.30E+05 5.85E-05 0.070 EJEMPLO 19 Modelado de la estructura por cristalografía de la interacción antigeno- anticuerpo - Implicaciones para el epítopo y MOA El modelado informático de la estructura de 'mejor ajuste' mediante simulación por ordenador usando estructuras cristalinas separadas para la ADAMTS5 y el mAb de ADAMTS5 12F4.1 H7 sugiere interacciones de antígeno/anticuerpo simultáneas entre ambos dominios catalítico y desintegrina de ADAMTS5. Los dominios catalítico y desintegrina de las proteasas ADAM y ADAMTS están separados por una región bisagra que confiere flexibilidad entre los dominios que puede actuar regulando la función o permitiendo la localización de sustrato en el sitio catalítico. La unión de mAb de alta afinidad observada en este dominio que abarca el epítopo probablemente 'bloquea' los dominios catalítico y desintegrina de ADAMTS5 a la vez, neutralizando de este modo la actividad enzimática. Se muestran en la Figura 13 y en los cuadros A1 y A2 a continuación los sitios de aminoácidos predichos de la interacción entre ADAMTS5 y el mAb 12F4.1 H7.

CUADRO A1 cadañal n»l/atml cadena 2. Formación da anlacaa H i ** i da carga MacaH [D-A-AA]il 17,3- [A-o- OUNKA ARS2ei(NHl) 2,81 ASPl(ODl) OUNKL OD] .132,3· d_pamrldtd .22^· *_ptanartdad t-79,8" Nf+J...oI-) OUNKA A C20KCD) 3·8 PRO0S[CD) OUNKL ct : ... cu OUNKA ASP3S9(O02) 3,37 SER28(C8) OUN L ot-] - ct ] EnlacaH [D-A-AA]il69,8* [A-D- . - OUNKA ASP3eO(OD2) 2,82 SER2 B(OS) OUN L DO] 1100,3· -_;ptanaril)ad i 1,G» i"1 J— «-?· J EntaMH [D-A-AA]|139,0» [A-D- OU A ?5?3ßß(?) 3, 13 CLN27(OEl) OUNKL DO]>96.3<> d_ ptanatldad¦ l -33,9· N( ] ... « ) •_pranartdad ?67,9· OUNKA AS 30«(0) 3.13 SLN27(OEl) OUNKL Ot ] ... Ot] OUNKA CLU304CCB) 3,21 TVIWl(OH) OUNKL ct ) ...ot ] OUNKA CIUS04(CG) 3,34 ITR»I OUNKL t-t ]¦¦¦ OC ] OUNKA GLU304(C0) 3,36 TYR»l(OH) OUNKL cf ] ...ot f [D-A-AA] 189,3· [A-O- OH) OUNKL OO] ?12ß,9" d_ pta ,9· OUNKA GLU30 (OE1) 3,13 TTR91( raridad -33 ¦_(* na ndad i67,2°. o[-] ... o£ ] mal a_angulo(sp2) OUNKA GLUS04(CD) 2,98 SE JO(OG) OUNKL ct ) ...ot ] EntacaH [O-A-AA] |92,6* [A-O- OUN A GLU304(OE2) 2,67 SERSO(OG) OUNKL OO] 1138,3* -_iptanarld»d i84.9» o[-] ... ot ] -WacaH [D-A-AA] 1123,3* [A-D- OU A VALS22(0) 3,?ß ASN33(ND2) OUNKL DD]il4-V»* d_pa»ner -34,G» OC ] ... Nt ] m_ phnarldad · 123, O» OUN A ARS323(CA) 3.20 ASN33(ND2) OUNKL Ct ] ... N[ ] EnbO H [D-A-AA] 1133,4» [A-D- OUN A CtNS24(NE2) 2,74 SER32(0) OUNKL OO] 1149,9· -Uptanafidad '1-33,3· Nt] ...Ot ] ¦_ ptanarldad¦ 134, 9* [D-A-AA] 1120,0° [A-O- OUNKA ClN»4(OEl) 3,38 ARCJ4(NH1) OUNKL OD] ii34,7« d_jpamarMad'i7i,o* »_p*jnande<! i-59,i° . Ot ] ... Nt*] mata d_planart<Jad CUADRO A2 Interacción cadañal resl/atml dist res2/atm2 cadena 2 Formación de enlaces H de carga OUNKA ALA280(O) 3,01 PHE58(CE2) , OUNKH c; ].."cn OUNKA ALA280(O) 2,84 PHE58(CZ) OUNKH ci i ... g ] 1 t ErtaceH [D-A-AA]: 129,9* [A-D- OUNKA ARG 281(0) 2,75 ARG52(NH2); OUNKH DD]¡ 138,7s d.plenaridad -35,23 0[ ] ... NH OUNKA LEU232(0) 3,27 TRP33(CZ3) OU KH o[] ..." l" OUNKA LEU282(0) 3,13 TRP33(CH2) ¡ OUNKH 0[] OUNKA LEU282(C) 3,35 ¡ARG52(NH2) ¡OUNKH |c{ ] EiteeH [D-A-AA]! 100,6" [A-D- f OUNKA LEU282(0) .2,89 ¡ARG52(NH2) OUNKH DD]¡ 138,5° d_phntrided ¡13,0° 0[ ] a.planarided'i-es,^ ¡ OUNKA GLY2B4(CA) 3,20 ¡ARG52(NH1) | OUNKH :¾]...?[+] OUNKA ASP323(CG) ¡ 3,23 TYR59(0) ¡OU KH cn...cn OUNKA ASP323(OD2) 2,71TYR59(0) ¡OUNKH o[-] .oí] Descripciones de secuencia Identificador de secuencia (SEC ID N°) secuencia de secuencia de aminoácidos ADN Secuencia de péptido señal 46 45 Cadena pesada variable de ratón de 7B4 48 47 Cadena ligera variable de ratón de 7B4 50 49 Cadena pesada variable de ratón de 2F4 52 51 Cadena ligera variable de ratón de 12F4 54 53 CDRH1 de 7B4 55 CDRH2 de 7B4 56 CDRH3 de 7B4 57 CDRL1 de 7B4 58 CDRL2 de 7B4 59 CDRL3 de 7B4 60 CDRH1 de 12F4 61 CDRH2 de 12F4 62 CDRH3 de 12F4 63 CDRL1 de 12F4 64 CDRL2 de 12F4 65 CDRL3 de 12F4 66 Cadena pesada de quimera de 7B4 68 67 Cadena ligera de quimera de 7B4 70 69 Cadena pesada de quimera de 12F4 72 71 Cadena ligera de quimera de 12F4 74 73 Región variable de la cadena pesada de quimera 76 75 de 7B4 Región variable de la cadena ligera de quimera de 78 77 7B4 Región variable de la cadena pesada de quimera 80 79 de 12F4 Región variable de la cadena ligera de quimera de 82 81 12F4 Cadena pesada H0 de 7B4 84 83 Cadena pesada H1 de 7B4 86 85 Cadena pesada H2 de 7B4 88 87 Cadena pesada H3 de 7B4 90 89 Cadena pesada H4 de 7B4 92 91 Cadena pesada H5 de 7B4 94 93 Cadena pesada H6 de 7B4 96 95 Cadena ligera LO de 7B4 98 97 Cadena ligera L1 de 7B4 100 99 Cadena ligera L2 de 7B4 102 101 Cadena pesada H0 de 12F4 104 103 Cadena pesada H1 de 12F4 106 105 Cadena pesada H2 de 12F4 108 107 Cadena pesada H3 de 12F4 1 10 109 Cadena pesada H4 de 12F4 1 12 111 Cadena ligera LO de 12F4 1 14 113 Región variable de cadena pesada HO de 7B4 116 115 Región variable de cadena pesada H1 de 7B4 118 1 17 Región variable de cadena pesada H2 de 7B4 120 1 19 Región variable de cadena pesada H3 de 7B4 122 121 Región variable de cadena pesada H4 de 7B4 124 123 Región variable de cadena pesada H5 de 7B4 126 125 Región variable de cadena pesada H6 de 7B4 128 127 Región variable de cadena ligera LO de 7B4 130 129 Región variable de cadena ligera L1 de 7B4 132 131 Región variable de cadena ligera L2 de 7B4 134 133 Región variable de cadena pesada HO de 12F4 136 135 Región variable de cadena pesada H1 de 12F4 138 137 Región variable de cadena pesada H2 de 12F4 140 139 Región variable de cadena pesada H3 de 12F4 142 141 Región variable de cadena pesada H4 de 12F4 144 143 Región variable de cadena ligera LO de 12F4 146 145 Región variable de cadena pesada 12F4.1 H7 32 147 Región variable de cadena pesada 1G10.1C9 33 157 Región variable de cadena pesada 2D3.1 D4 34 151 Región variable de cadena ligera 3A12.1 D7 35 153 Región variable de cadena ligera 5F10.1H6 36 155 Región variable de cadena ligera 7B4.1 E11 37 149 Región variable de cadena pesada 2D3.1 D4 38 152 Región variable de cadena pesada 3A12.1 D7 39 154 Región variable de cadena pesada 5F10.1 H6 40 156 Región variable de cadena pesada 7B4.1 E11 41 150 Región variable de cadena pesada 12F4.1 H7 42 148 Cadena pesada 12F4 H4L0 lgG1 m(AA) 158 149

Claims (57)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1 . Una proteína de unión a antigeno aislada que comprende al menos un primer dominio variable de inmunoglobulina capaz de unirse a ADAMTS5 humana.

2. La proteina de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha proteína de unión a antígeno es un anticuerpo o un fragmento del mismo.

3. La proteína de unión a antígeno de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada además porque dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo.

4. La proteina de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque dicho anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo es de ratón, quimérico, humanizado o totalmente humano.

5. La proteína de unión a antígeno de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada además porque dicha proteína de unión a antígeno comprende al menos una región determinante de complementariedad.

6. La proteína de unión a antígeno de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada además porque dicha proteina de unión a antigeno es un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende la CDRH1 , CDRH 2 y CDRH3 y una cadena ligera que comprende la CDRL1 , CDRL 2 y CDRL 3, en el que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena pesada se seleccionan del grupo de: a) CDRH1 que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 80% con la secuencia de aminoácidos DAWMD; b) CDRH2 que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 70% con la secuencia de aminoácidos EIRHKANDHAIFYXESVKG; y c) CDRH3 que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 70% con la secuencia de aminoácidos TYYYGSSYGYCDV o PFAY; y las regiones determinantes de complementariedad de la cadena ligera se seleccionan del grupo de: d) CDRL1 que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 70% con la secuencia de aminoácidos KASQSVGTTIV o RTSENIYSYLA; e) CDRL2 que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 70% con la secuencia de aminoácidos NAKTLAE o SASNRXT; y f) CDRL3 que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 70% con la secuencia de aminoácidos QQYSSYPFT o QHHYGTPWT.

7. La proteina de unión a antígeno de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada además porque dicho polipéptido es un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende la CDRH1 , CDRH2 y CDRH3 y una cadena ligera que comprende la CDRL1 , CDRL2 y CDRL 3, en el que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena pesada se seleccionan de: a) la CDRH1 es la secuencia de aminoácidos DAWMD; b) la CDRH2 se selecciona de las secuencias de aminoácidos EIRHKANDHAIFYAESVKG, EIRNKANNHARHYAESVKG, EIRHKANDYAIFYDESVKG, EIRHKANDHAIFYDESVKG o DIRNTANNHATFYAESVKG, EIRHKANDHAIFYDESVKG, y c) la CDRH3 es TYYYGSSYGYCDV o PFAY; y las regiones determinantes de complementariedad de la cadena ligera se seleccionan de: d) la CDRL1 se selecciona de las secuencias de aminoácidos KASQSVGTTIV, RTSENIYSYLA, o KASQNVGTAW; e) la CDRL2 se selecciona de la secuencia de aminoácidos NAKTLAE, SASNRHT, SASTRYT o SASNRYT; y f) la CDRL3 se selecciona de la secuencia de aminoácidos QQYSSYPFT, QHHYGTPWT, QQYVNYPFT, o QQYTSYPFT.

8. La proteina de unión a antígeno de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada además porque la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos PFAY.

9. La proteína de unión a antígeno de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada además porque dicho polipéptido es un fragmento Fab o F(ab)2-

10. La proteína de unión a antigeno de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el primer dominio variable de inmunoglobulina es un dominio variable de cadena sencilla.

1 1. La proteína de unión a antígeno de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada además porque dicha proteina de unión a antígeno comprende además un segundo dominio variable de inmunoglobulina capaz de unirse a un segundo antigeno.

12. La proteína de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dicho segundo dominio variable de inmunoglobulina se une a al menos un antígeno seleccionado del grupo de: albúmina sérica humana, ADAMTS4, NGF, OSM, TNF-a, IL-6, VIP, TRPV1 , TRPV4, ADA TS1 , Agrecano, Colágeno II, RANKL, Syndecan 4, Hedgehog y/o IL-1.

13. La proteína de unión a antigeno de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada además porque tiene una constante de disociación KD(off) igual o menor a aproximadamente 2.5 x 10' 0 M para ADAMTS5 humana.

14. La proteína de unión a antigeno de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada además porque dicha proteina de unión a antigeno bloquea y/o reduce al menos una actividad de ADAMTS5.

15. La proteína de unión a antígeno de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada además porque dicha proteína de unión a antígeno bloquea y/o reduce la escisión de agrecano por ADAMTS5 en el sitio de escisión Glu373-Ala374.

16. La proteína de unión a antigeno de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada además porque dicha proteína de unión a antígeno es capaz de penetrar en el cartílago cuando se administra a un animal.

17. Un polinucleótido aislado que codifica una proteína de unión a antígeno de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

18. Una célula hospedadora que comprende el polinucleótido de la reivindicación 17.

19. Una composición farmacéutica que comprende al menos una de las proteínas de unión a antígeno de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

20. Una composición farmacéutica que comprende una primera proteína de unión a antígeno de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y un segundo anticuerpo monoclonal.

21. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque dicho segundo anticuerpo monoclonal se une a un antígeno seleccionado del grupo de ADAMTS4, ADAMTS5, NGF, OSM, TNF-a, IL-6, VIP, TRPV1 , TRPV4, ADAMTS1 , Agrecano, Colágeno II, RANKL, y/o IL-1.

22. El uso al menos una dosis de la composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 en la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente que padece una enfermedad del cartílago.

23. El uso como se reclama en la reivindicación 22 en el que el paciente padece al menos una enfermedad seleccionada del grupo de: cáncer, dolor, dolor crónico, dolor neuropático, dolor postoperatorio, artrosis, lesiones deportivas, artritis erosiva, artritis reumatoide, artritis psoriásica, artritis de Lyme, artritis juvenil, espondilosis anquilosante, neuralgia, neuropatías, algesia, lesión nerviosa, isquemia, neurodegeneración, enfermedades inflamatorias, degeneración del cartílago, enfermedades que afectan a la laringe, tráquea, canal auditivo, discos intervertebrales, ligamentos, tendones, cápsulas articulares o al desarrollo del hueso, degeneración de discos intervertebrales, osteopenia, o enfermedades periodontales, lesión articular aguda y/o enfermedad relacionada con destrucción articular.

24. El uso como se reclama en la reivindicación 23, en donde el paciente padece artrosis.

25. El uso como se reclama en una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en donde al menos una dosis de dicha composición farmacéutica reduce la degradación de cartílago en dicho paciente.

26. El uso como se reclama en una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, en donde al menos una dosis de dicha composición farmacéutica inhibe y/o reduce la escisión de agrecano en dicho paciente.

27. El uso como se reclama en una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, en donde dicha composición farmacéutica es adaptada para ser administrable por vía intravenosa, intramuscular, intraarticular, subcutánea, oral, intranasal y/o mediante un inhalador respiratorio.

28. Un anticuerpo monoclonal aislado que comprende seis CDR en donde la CDRH1 es DAWMD (SEQ ID NO: 2), la CDRH2 es EIRNKANNHARHYAESVKG (SEQ ID NO: 13) y la CDRH3 es TYYYGSSYGYCDV (SEQ ID NO: 18) y la CDRL1 es RTSENIYSYLA (SEQ ID NO. 20), la CDRL2 es NAKTLAE (SEQ ID NO. 22) y la CDRL3 es QHHYGTPWT (SEQ ID NO.27).

29. Un anticuerpo monoclonal aislado que comprende seis CDR, en donde la CDRH1 es DAWMD (SEQ ID NO: 2), la CDRH2 es EIRHKANDHAIFYDESVKG (SEQ ID NO: 15) y la CDRH3 es PFAY (SEQ ID NO. 5) y la CDRL1 es KASQSVGTTIV (SEQ ID NO: 19), la CDRL2 es SASNRHT (SEQ ID NO: 23) y la CDRL3 es QQYTSYPFT (SEQ ID NO: 29).

30. Un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo se une competitivamente a ADAMTS5 humana con un anticuerpo de la reivindicación 28 o de la reivindicación 29.

31. Un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo neutralizante de ADA TS5 con una afinidad de al menos 5x104 litros/mol según se mide por una constante de asociación (Ka).

32. El anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizado además porque dicho anticuerpo comprende una región constante humana.

33. El anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es la clase de inmunoglobulina lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4 o IgM.

34. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33, caracterizado además porque dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2 y Fv.

35. Una proteína de unión a antígeno o un fragmento de la misma, que comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 76, 80, 116, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 136, 138, 140, 142 y 144.

36. Una proteina de unión a antígeno o un fragmento de la misma, que comprende un dominio VL de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 78, 82, 130, 132, 134 y 146.

37. Una proteína de unión a antigeno o un fragmento de la misma, que comprende un dominio VH de anticuerpo de la reivindicación 35 y un dominio VL de la reivindicación 36.

38. La proteína de unión a antígeno o un fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada además porque comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 76 y un dominio VL que comprende la SEQ ID NO: 78.

39. La proteina de unión a antigeno o un fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada además porque comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 80 y un dominio VL que comprende la SEQ ID NO: 82.

40. La proteina de unión a antigeno o un fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada además porque comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126 y 128 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 130, 132 y 134.

41. La proteína de unión a antigeno o un fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada además porque comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142 y 144 y un dominio VL que comprende la SEQ ID NO: 146.

42. Una proteína de unión a antígeno o un fragmento de la misma, que comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 68, 72, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 104, 106, 108, 1 10, 1 12 y 158.

43. Una proteína de unión a antígeno o un fragmento de la misma, que comprende una cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 70, 74, 98, 100, 102 y 1 14.

44. Una proteína de unión a antígeno o un fragmento de la misma, que comprende una cadena pesada de anticuerpo de la reivindicación 42 y una cadena ligera de anticuerpo de la reivindicación 43.

45. La proteína de unión a antígeno o un fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 68 y una cadena ligera de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 70.

46. La proteína de unión a antígeno o un fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 72 y una cadena ligera de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 74.

47. La proteina de unión a antígeno o un fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 84, 86, 88, 90, 92, 94 y 96 y una cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 98, 100 y 102.

48. La proteína de unión a antígeno o un fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 104, 06, 108, 1 10, 1 12 y 158 y una cadena ligera de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 114.

49. Un polinucleótido aislado que codifica un dominio VH de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 76, 80, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 136, 138, 140, 142 y 144.

50. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porque dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 75, 79, 115, 117, 119, 121 , 123, 125, 127, 135, 137, 139, 141 , 143 y 159.

51. Un polinucleótido aislado que codifica un dominio VL de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 78, 82, 130, 132, 134 y 146.

52. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado además porque dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 77, 81 , 129, 131 , 133 y 145.

53. Un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 68, 72, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 104, 106, 108, 110, 112 y 158.

54. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 67, 71 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 103, 105, 107, 109, 111 y 159.

55. Un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 70, 74, 98, 100, 102 y 114.

56. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 69, 73, 97, 99, 101 y 115.

57. Un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epitopo neutralizante de ADAMTS5 con una constante de disociación (Kd) de menos de alrededor 5x10-4 litros/segundo.