JP2020523986A - Adamts5、mmp13およびアグリカンに結合するポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アグリカンならびにADAMTS5および/またはMMP13に結合するポリペプチドに、より特に、アグリカンに結合する免疫グロブリンならびにADAMTS5に結合する免疫グロブリンおよび/またはMMP13に結合する免疫グロブリンを含むかまたは本質的にそれからなるポリペプチド(本明細書ではそれぞれ、「本発明の免疫グロブリン」および「本発明のポリペプチド」とも呼ばれる)に関する。本発明はまた、免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)などのかかる免疫グロブリンまたはポリペプチドを含む構築物、ならびにかかる免疫グロブリンまたはポリペプチドをコードする核酸(本明細書では「本発明の核酸」とも呼ばれる)に;かかる免疫グロブリン、ポリペプチドおよび構築物を調製する方法に;かかる免疫グロブリンまたはポリペプチドを発現するかまたは発現可能な宿主細胞に;かかる免疫グロブリン、ポリペプチド、構築物、核酸および/または宿主細胞を含む組成物、および特に医薬組成物に;特に、本明細書に記載の予防および/または治療目的などの予防および/または治療目的のための、免疫グロブリン、ポリペプチド、構築物、核酸、宿主細胞および/または組成物の使用に、関する。本発明の他の側面、態様、利点および用途は、本明細書のさらなる説明から明らかになるであろう。
変形性関節症(OA)は、世界中に及ぶ廃疾の最も一般的な原因の1つである。3,000万人のアメリカ人がこれに罹患しており、最も一般的な関節障害である。米国人口の20%以上が、2025年までにこれに罹患すると予測されている。この疾患は全身性ではなく、通常は少数の関節に限定されている。しかし、この疾患はすべての関節で、ほとんどの場合は膝、股関節、手、肩、および脊椎で発生する。OAは、慢性的な痛みと障害をもたらす関節軟骨(骨を覆う軟骨)の進行性の侵食によって特徴付けられる。最終的にこの疾患は、関節軟骨の完全な破壊、その下にある骨の硬化、骨棘形成などにつながり、すべて運動の喪失と痛みにつながる。変形性関節症は、関節症状、関節軟骨の欠損に起因する徴候、ならびに骨、腱、および筋肉などを含む隣接組織における変化の組合せを特徴とする、多様な状態群として定義できる。OAの最も顕著な症状は痛みであり、これは多くの場合、患者が医療的援助を求める理由となる。OAに治療法はなく、すなわち現在の処置はOAの関節の構造的劣化を抑制しない。疾患管理はせいぜい緩和的な処置に限られ、疾患の進行の根本的な原因にはほとんど対処できない。
疾患の開始は多因子性であり得るが、軟骨の破壊は、細胞外マトリックス(ECM)の制御されないタンパク質分解の結果であると考えられる。関節軟骨の最も豊富なECM成分は、コラーゲン(主にコラーゲンII)およびプロテオグリカン、主にアグリカンである(Kiani et al. 2002 Cell Research 12:19-32)。
374ARGSネオエピトープを認識する抗体は、ADAMTS4であることが証明されたアグリカナーゼ1およびADAMTS5であるアグリカナーゼ2の発見につながった。その後、ADAMTS1、−8、−9、−15、−20を含む他の関連ADAMTS酵素が、アグリカナーゼ活性を有することが示された。様々な証拠が、ADAMTS5が変形性関節症の病因に関与する主要な酵素であることを示している。ヒト軟骨外植片および軟骨細胞において、ADAMTS5のノックダウンはアグリカン分解を減衰させ、この酵素がヒト組織に関与し得ることを示唆した。この酵素の発現は、インターロイキン1およびオンコスタチンMなどのサイトカインによって増強され、組織内のアグリカンの分解を引き起こす。ADAMTS5によって生成されたアグリカン断片は、OA患者の滑液および血清から検出される(Germaschewski et al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22:690-697)。
効果的なDMOADの必要性が残されている。
本発明は、他の有利な特性に加えて、従来技術のアミノ酸配列および抗体と比較した場合に、改善された予防的、治療的および/または薬理学的特性(例えば、改善された調製の容易さ、良好な安定性、および/または商品のコスト削減)を有する、OAに対するポリペプチドおよび構築物を提供することを目的とする。特に本発明は、関節内で長時間保持されながら、ADAMTSおよび/またはMMP13を阻害し、特にADAMTS5を阻害するポリペプチドを提供することを目的とする。
異なるファミリーおよび軟骨アンカー部分からの効果的なプロテアーゼ阻害剤を、創造的で従来にないスクリーニング、特性評価、および組み合わせ戦略によって特定した後、本発明者らは、様々な機能が結合した組み合わせを開発した。アグリカン(CAP)に結合する軟骨アンカー部分、およびADAMTS5阻害剤またはMMP13阻害剤のいずれかを含む、2つの二重特異性ポリペプチド、ならびに、ADAMTS5阻害剤、MMP13阻害剤、CAP結合剤を含む三重特異性ポリペプチドを、操作した。
本発明のポリペプチドは、異なるOA状態を表す様々なモデルシステムにおいて、ベンチマーク分子(WyethおよびPfizer)がそうでない場合であっても、有効性を維持することが実証された。
本発明のポリペプチドは、関節内で安定したままであることも実証された。
したがって、本発明のポリペプチドは、一方ではOA患者に広く有用であり、他方では(IA)投与スケジュールの負担が軽減されるであろう。さらに、1つの分子内にさまざまな部分を組み合わせることにより、有効用量を増やすことができる。
したがって本発明は、以下からなる群から選択される、ポリペプチドに関する:(a)少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)を含むポリペプチドであって、ここで第1のISVDはマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)に特異的に結合し、第2のISVDはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第3のISVDを含む、前記ポリペプチド;(b)少なくとも2つのISVDを含むポリペプチドであって、ここで第1のISVDはトロンボスポンジンモチーフを有するAディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ(ADAMTS)に特異的に結合し、第2のISVDはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第3のISVDを含む、前記ポリペプチド;および(c)少なくとも3つのISVDを含むポリペプチドであって、ここで第1のISVDはMMPに特異的に結合し、第2のISVDはADAMTSに特異的に結合し、第3のISVDはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第4のISVDを含む、前記ポリペプチド。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のISVDを提供し、前記ISVDは、構造FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4を有し、式中、CDR1、CDR2およびCDR3は本明細書で定義されるとおりであり、FR1、FR2、FR3およびFR4は、フレームワーク配列である。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、MMP13に特異的に結合するISVDは4つのフレームワーク領域(それぞれFR1〜FR4)および3つの相補性決定領域(それぞれCDR1〜CDR3)から本質的になり、ここで、(i)(a)CDR1は、配列番号8;および(b)配列番号8と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり;(ii)(c)CDR2は、配列番号10;および(d)配列番号10と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり;および(iii)(e)CDR3は、配列番号12;および(f)配列番号12と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり;好ましくは、ここで、CDR1は配列番号8であり、CDR2は配列番号10であり、CDR3は配列番号12であり;さらにより好ましくは、ここで、MMP13に特異的に結合するISVDは、配列番号2で表される。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、前記ISVDはリンカーを介して互いに連結され、好ましくは前記リンカーは、配列番号24〜40からなる群から、好ましくは配列番号28[9GS]または配列番号35[35GS]から、選択される。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで第1のISVDはMMP13に特異的に結合し、第2のISVDはADAMTS5に特異的に結合し、第3のISVDはアグリカンに特異的に結合し、および第4のISVDはアグリカンに特異的に結合し、好ましくは、配列番号1または62で表される。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、第1のISVDはADAMTS5に特異的に結合し、第2のISVDはアグリカンに特異的に結合し、および第3のISVDはアグリカンに特異的に結合し、好ましくは、配列番号6または64で表される。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドを含むか、または本質的にそれからなる構築物に関し、これはさらに、任意に1つ以上のペプチドリンカーを介して連結される、1つ以上の他の基、残基、部分または結合単位を含む。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは本明細書に記載の構築物をコードする、核酸に関する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載の核酸を含む、発現ベクターに関する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、本明細書に記載の構築物、または本明細書に記載の核酸を含む、組成物に関する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドを生産する方法に関し、前記方法は、少なくとも以下のステップを含む:a)適切な宿主細胞、宿主生物または適切な発現系において、本明細書に記載の核酸を発現させること;任意にこれに続いて、b)本明細書に記載のポリペプチドを単離および/または精製すること。
一側面において、本発明は、医薬組成物である、本明細書に記載の組成物に関し、好ましくは前記組成物はさらに、少なくとも1つの薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤および/またはアジュバントを含み、任意に1つ以上のさらなる医薬活性ポリペプチドおよび/または化合物を含む。
一側面において、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載の組成物、本明細書に記載のポリペプチド、または本明細書に記載の構築物に関する。
一側面において、本発明は、個体の疾患または障害の症状を予防または処置する方法に関し、該方法は、本明細書に記載のポリペプチド、本明細書に記載の構築物、または本明細書に記載の組成物を、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎、アグリカノパチー、NASH、慢性歯周炎および腹部大動脈瘤の症状を処置または予防するための有効量で、前記個体に投与することを含む。
安全で効果的なOA医薬品、特にDMOADの必要性が残されている。これらの医薬は、特に広く適用可能なフォーマットが意図される場合、様々な頻繁に対立する要件に適合する必要がある。かかるフォーマットは、好ましくは広範囲の患者に有用であるべきである。フォーマットは好ましくは安全であり、頻繁な投与による感染を誘発しない。加えてフォーマットは、好ましくは患者に優しく、例えば、便利な投与計画および投与経路、例えば全身投与を許容する。例えば、投与されると、フォーマットは循環から即座に除去されないことが好ましい。ただし、半減期を延長しても、好ましくは標的外の活性や副作用が生じたり、有効性が制限されるべきではない。
本発明は、これらの要件の少なくとも1つを実現する。
従来にはないスクリーニング、特性評価、および組み合わせ戦略に基づいて、本発明者らは驚くべきことに、免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)が、in vitro、ex vivoおよびin vivo実験で非常に良好に機能することを観察した。
さらに本発明者らは、MMP13阻害剤、ADAMTS5阻害剤およびアグリカン結合剤を含む様々な機能性を組み合わせることにより、阻害剤のいずれかよりもさらに優れた効果が得られることを実証した。
本発明は、CAP結合剤に結合した、ADAMTS、特にADAMTS5に拮抗するISVD、および/またはMMP、特にMMP13に拮抗するISVDの組み合わせであって、従来技術のアミノ酸配列および抗体と比較して、より安全なプロファイルを含む改善された予防的、治療的および/または薬理学的特性を有するものを提供することを意図する。
(a)少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)を含むポリペプチドであって、ここで第1のISVDはマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)に特異的に結合し、第2のISVDはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第3のISVDを含む、前記ポリペプチド;
(b)少なくとも2つのISVDを含むポリペプチドであって、ここで第1のISVDはトロンボスポンジンモチーフを有するAディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ(ADAMTS)に特異的に結合し、第2のISVDはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第3のISVDを含む、前記ポリペプチド;および
(c)少なくとも3つのISVDを含むポリペプチドであって、ここで第1のISVDはMMPに特異的に結合し、第2のISVDはADAMTSに特異的に結合し、第3のISVDはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第4のISVDを含む、前記ポリペプチド。
特に明記しない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連のすべての要素を指すと理解されるべきである。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載された本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。かかる均等物は、本発明に含まれることが意図されている。
用語「および/または」は、本明細書で使用される場合は常に、「および」、「または」、および「前記用語によって接続される要素のすべてまたは任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通して、文脈が特に必要としない限り、「含む」という単語、および「含む」および「含むこと」などの変形は、述べられた整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを含むが、任意の他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを除外しない、ということを意味する。本明細書で使用する場合、「含む(comprising)」という用語は、「含有する(containing)」または「含む(including)」という用語で置き換えることができ、または場合によっては本明細書において、「有する」という用語を使用することもできる。
本明細書で使用される場合、用語「配列」(例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「VHH配列」または「タンパク質配列」などの用語)は、一般に、文脈がより限定された解釈を必要としない限り、関連するアミノ酸配列ならびにこれをコードする核酸またはヌクレオチド配列の両方を含むと理解されるべきである。
アミノ酸配列は、文脈に依存して、単一のアミノ酸または、2つ以上のアミノ酸の分岐していない配列を意味すると解釈される。ヌクレオチド配列は、3つ以上のヌクレオチドの非分岐配列を意味すると解釈される。
2つ以上のヌクレオチド配列を比較するために、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の間の「配列同一性」のパーセンテージは、次のように計算することができる:[第2ヌクレオチド配列内の対応する位置のヌクレオチドと同一の、第1ヌクレオチド配列内のヌクレオチドの数]を、[第1ヌクレオチド配列内のヌクレオチドの総数]で除算し、[100%]を掛ける;ここで、第1ヌクレオチド配列と比較した、第2ヌクレオチド配列内のヌクレオチドの各欠失、挿入、置換または追加は、単一のヌクレオチド(位置)における違いと見なされる。代替的に、2つ以上のヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、NCBI Blast v2.0などの配列アラインメントのための既知のコンピューターアルゴリズムを使用して、標準設定を用いて計算され得る。配列同一性の程度を決定するための他のいくつかの技術、コンピューターアルゴリズムおよび設定は、例えば、WO 04/037999、EP 0967284、EP 1085089、WO 00/55318、WO 00/78972、WO 98/49185およびGB 2357768に記載されている。通常、上記で概説した計算方法に従って2つのヌクレオチド配列間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的で、最大数のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列が「第1」ヌクレオチド配列とされ、他のヌクレオチド配列が「第2」ヌクレオチド配列とされる。
2つのアミノ酸配列を比較する場合、用語「アミノ酸差異(amino acid difference)」は、第2の配列と比較した、第1の配列の位置にある単一のアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換を指す;2つのアミノ酸配列が、1つ、2つまたはそれ以上のかかるアミノ酸差異を含み得ることが理解されている。より具体的には、本発明のISVDおよび/またはポリペプチドにおいて、用語「アミノ酸差異」は、(b)、(d)または(f)で特定されるCDR配列の位置上の、それぞれ(a)、(c)または(e)のCDR配列と比較した、単一アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換を指す。(b)、(d)および(f)のCDR配列は、それぞれ(a)、(c)または(e)のCDR配列と比較して、1、2、3、4または最大5個のかかるアミノ酸差異を含み得ることが理解される。
本明細書で使用される「ナノボディファミリー」、「VHHファミリー」または「ファミリー」とは、同一の長さを有するナノボディおよび/またはVHH配列のグループを指し(すなわち、それらはその配列内に同じ数のアミノ酸を有する)、そのうち、位置8と位置106(Kabat番号付けによる)の間のアミノ酸配列は、89%以上のアミノ酸配列同一性を有する。
エピトープを認識する抗原結合分子(免疫グロブリン、従来の抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび/または本発明のポリペプチドなど)の一部は、「パラトープ」と呼ばれる。
特定のエピトープ、抗原またはタンパク質(またはその少なくとも一部、断片またはエピトープ)に対して、「結合」または「特異的に結合」できるか、「親和性を有する」か、および/または「特異性を有する」アミノ酸配列(本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、抗体、ポリペプチド、または一般にその抗原結合タンパク質またはポリペプチドまたは断片)は、前記エピトープ、抗原またはタンパク質に「対する」または「向けられる」と言われるか、またはかかるエピトープ、抗原またはタンパク質に関する「結合」分子であるか、または「抗」エピトープ、「抗」抗原または「抗」タンパク質(例えば、「抗」アグリカン、「抗」MMP13、および/または「抗」ADAMTS5)であると言われる。
重要(例えば特異的)と考えられる生物学的相互作用のKDは、通常10−12M(0.001nM)〜10−5M(10000nM)の範囲である。相互作用が強いほど、KDは低くなる。
ISVDなどの抗原結合タンパク質の、抗原または抗原決定基への特異的結合は、例えば飽和結合アッセイおよび/または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素免疫測定法(EIA)およびサンドイッチ競合アッセイを含む、それ自体既知の任意の適切な方法、および当技術分野でそれ自体知られているそれらの様々な変形、ならびに本明細書で言及される他の技術により、決定することができる。
親和性を評価するために使用できる好ましいアプローチは、Friguet et al. 1985 (J. Immunol. Methods 77: 305-19)の2ステップELISA(酵素結合免疫吸着検定法)手順である。この方法は、液相結合平衡測定を確立し、プラスチックなどの支持体への1つの分子の吸着に関連する、起こりうるアーチファクトを回避する。当業者には明らかなように、解離定数は実際のまたは見かけの解離定数であってよい。解離定数を決定する方法は当業者には明らかであり、例えばWO 08/020079の53〜56頁に記載されている技術が含まれる。
生物学的システムにおいて、リガンド濃度のわずかな変化は、典型的には、S字関数に従った急速な応答の変化をもたらす。リガンド濃度の増加に伴う応答の増加が鈍化し始める変曲点が、EC50である。これは、適合線の導出によって数学的に決定できる。推定のためにグラフに依存することは、ほとんどの場合に便利である。EC50が実施例の節で提供されている場合、実験は、KDを可能な限り正確に反映するように設計されている。すなわち、EC50値はKD値と見なされる。用語「平均KD」は、少なくとも1回、しかし好ましくは1回より多くの、例えば少なくとも2回の実験で得られた、平均KD値に関する。「平均」という用語は、数学用語の「平均」(データの合計をデータのアイテムの数で割ったもの)を指す。
阻害定数(Ki)は、阻害剤がどれだけ強力かを示す指標である;これは、半数阻害をもたらすのに必要な濃度である。実験条件に応じて変化するIC50とは異なり、Kiは絶対値であり、しばしば薬物の阻害定数と呼ばれる。阻害定数Kiは、次のCheng-Prusoff方程式を使用して計算できる:
特にこれは、前記ポリペプチドの、本明細書で定義されるMMP13活性を低下させるか、または完全に阻害する能力を指す場合がある。したがってこれは、前記ポリペプチドのタンパク質分解を阻害する能力、例えばアグリカン、コラーゲンII、コラーゲンI、コラーゲンIII、コラーゲンIV、コラーゲンIX、コラーゲンX、コラーゲンXIVおよびゼラチンなどの基質と結合する、プロテアーゼ活性、エンドペプチダーゼ活性を阻害する能力を指し得る。
本発明のポリペプチドの「有効性」は、効果自体の最大強度を、飽和ポリペプチド濃度において測定する。有効性は、本発明のポリペプチドから達成可能な最大応答を示す。これは、ポリペプチドが所望の(治療)効果を生み出す能力を指す。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ADAMTS5に、例えばGyrolabまたはKinExAによって決定される場合、KDとして1E−07M〜1E−13Mの間、例えば1E−08M〜1E−12Mの間、好ましくは最大で1E−07M、好ましくは1E−08Mもしくは1E−09M未満、または1E−10M未満、例えば5E−11M、4E−11M、3E−11M、2E−11M、1.7E−11M、1E−11Mなど、または5E−12M、4E−12M、3E−12M、1E−12Mなどで、結合する
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、アグリカンに、例えばGyrolabまたはKinExAによって決定される場合、KDとして1E−07M〜1E−13Mの間、例えば1E−08M〜1E−12Mの間、好ましくは最大で1E−07M、好ましくは1E−08Mもしくは1E−09M未満、または1E−10M未満、例えば5E−11M、4E−11M、3E−11M、2E−11M、1.7E−11M、1E−11Mなど、または5E−12M、4E−12M、3E−12M、1E−12Mなどで、結合する
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えばSPRにより決定される場合、オフレートとして5E−04s−1未満、例えば1E−04s−1または5E−05s−1未満、またはさらに1E−05s−1未満で、MMP13に結合する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えばSPRにより決定される場合、オフレートとして5E−04s−1未満、例えば1E−04s−1または5E−05s−1未満、またはさらに1E−05s−1未満で、アグリカンに結合する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えば結合ELISA(ADAMTS5活性の決定のため)、または競合ELISA、競合TIMP−2 ELISA、蛍光発生ペプチドアッセイ、蛍光発生コラーゲンアッセイ、もしくはコラーゲン分解アッセイ(MMP13活性の決定のため)によって決定される場合、EC50として1E−07M〜1E−12Mの間、例えば1E−08M〜1E−11Mの間で、ADAMTS5活性および/またはMMP13活性を調節する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、IC50として最大1E−07M、好ましくは1E−08M、5E−09M、または4E−9M、3E−9M、2E−9M、例えば1E−9Mなどで、ADAMTS5および/またはMMP13の酵素活性を阻害する。
ADAMTS5の関連する構造情報は、例えば、以下の表B−1に示すように、UniProtアクセッション番号に見出すことができる(表Bを参照)。
表B−1
MMP13は、CLG3またはコラゲナーゼ3、MANDP1、MMP−13、マトリックスメタロペプチダーゼ13、またはMDSTとしても知られている。MMP13に関連する構造情報は、たとえば、以下の表B−2に示すように、UniProtアクセッション番号に見出すことができる(表Bを参照)。
表B−2
アグリカンは、アグリカン1、ACAN、AGC1、AGCAN、CSPGCP、MSK16、SEDK、軟骨特異的プロテオグリカンコアタンパク質(CSPCP)またはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン1(CSPG1)としても知られている。アグリカンは、ヒトにおいて、染色体Chr15:q26.1に位置するACAN遺伝子によってコードされる。アグリカンに関連する構造情報は、たとえば、以下の表B−3に示すUniProtアクセッション番号に見出すことができる(表Bを参照)。
標的(交差)ブロックに向けられた免疫グロブリン、抗体、ISVD、ポリペプチド、または他の結合剤が、本明細書で定義されるように(交差)ブロッキングが可能か、競合的に結合するか、または(交差)競合するかを決定するための他の方法は、例えば実施例の節で説明されているような、SPRベースの「サンドイッチアッセイ」によって評価することができる。他の適切な方法は、例えばXiao-Chi Jia et al. (Journal of Immunological Methods 288: 91-98, 2004)、Miller et al. (Journal of Immunological Methods 365: 118-125, 2011)に説明されている。
したがって、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ADAMTS5および/またはMMP13の活性を調節し、好ましくはADAMTS5および/またはMMP13の活性を阻害する。
したがって、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ADAMTS5の基質への結合、例えばアグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカン、デコリン、および/またはビグリカンなどの基質への結合をブロックし、ここで前記基質は、好ましくはアグリカンである。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えばELISAで決定される、ADAMTS5のアグリカンへの結合を、少なくとも20%、例えば少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、またはそれ以上、ブロックする。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ADAMTS5の活性に拮抗またはこれを阻害し、例えば(i)プロテアーゼ活性、好ましくはアグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカン、デコリン、および/またはビグリカンなどの切断、好ましくはアグリカンの切断;好ましくは、ADAMTS5のアグリカナーゼ活性に、拮抗またはこれを阻害し;(ii)基質のADAMTS5への結合、例えばADAMTS5のエキソサイト例えばディスインテグリン様ドメイン、中央トロンボスポンジンI型様(TS)リピート、システインリッチドメイン、スペーサー領域または追加のTSモチーフなどへの結合に、拮抗またはこれを阻害する。
したがって、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、MMP13の基質への結合をブロックする、例えば、アグリカン、コラーゲンII、コラーゲンI、コラーゲンIII、コラーゲンIV、コラーゲンIX、コラーゲンX、コラーゲンXIVおよび/またはゼラチンなどの基質への結合をブロックし、ここで前記コラーゲンは、好ましくはコラーゲンIIである。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えばELISAベースの競合アッセイで決定される、MMP13のコラーゲンおよび/またはアグリカンへの結合を、少なくとも20%、例えば少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、またはそれ以上、ブロックする(Howes et al. 2014 J. Biol. Chem. 289:24091-24101を参照)。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、該ポリペプチドは、MMP13の活性に拮抗またはこれを阻害し、例えば(i)プロテアーゼ活性、好ましくはアグリカンおよび/またはコラーゲンの切断、ここで、前記コラーゲンは好ましくはコラーゲンIIである;(ii)コラーゲンのヘモペキシン様ドメインへの結合、に拮抗または阻害する。
ADAM、ADAMTS、およびMMPは、配列および全体の形状の両方で非常に類似している、アグリカンへの結合部位を共有し、例えばADAMTS4およびADAMTS5の触媒ドメインは高度の配列類似性を共有するが、本発明者らは、実施例の節で実証するように、標的特異的なISVDを同定することができた。標的特異性はまた、広域スペクトル阻害剤によって引き起こされる副作用である筋骨格症候群を、回避するか、少なくとも制限する。
一側面において、本発明は、本発明のISVDおよびポリペプチドなどのMMP13結合剤に関し、ここで、該MMP13結合剤は、MMP1および/またはMMP14(膜型)に結合しない。好ましくは、本発明は、MMP13に結合する前記ISVDが、MMP1またはMMP14に結合しない、本明細書で定義されるポリペプチドに関する。
特に明記しない限り、用語「免疫グロブリン」および「免疫グロブリン配列」は、本明細書において重鎖抗体または従来の4鎖抗体を指すために使用されるかどうかにかかわらず、フルサイズの抗体、その個々の鎖の両方、ならびにそのすべての部分、ドメインまたは断片(それぞれ、抗原結合ドメインまたは断片、例えばVHHドメインまたはVH/VLドメインなどを含むが、これらに限定されない)を含む一般用語として使用される。
本明細書で使用される用語「免疫グロブリンドメイン」とは、抗体鎖の球状領域(例えば、従来の4鎖抗体または重鎖抗体の鎖など)、またはかかる球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、抗体分子に特徴的な免疫グロブリン折り畳みを保持するという特徴があり、これは、2つのβシートに配置された約7つの逆平行β鎖の2層サンドイッチで構成され、任意に、保存されたジスルフィド結合によって安定化される。
対照的にISVDは、追加の免疫グロブリン可変ドメインとペアリングすることなく、抗原のエピトープに特異的に結合することができる。ISVDの結合部位は、単一のVHH、VHまたはVLドメインによって形成される。したがって、ISVDの抗原結合部位は、3つ以下のCDRによって形成される。
本発明の一側面において、ISVDは重鎖可変ドメイン配列(例えば、VH配列)である;より具体的には、ISVDは、従来の4本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、または重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であり得る。
特に、ISVDは、Nanobody(登録商標)(本明細書で定義)またはその適切な断片であり得る。[注:Nanobody(登録商標)、Nanobodies(登録商標)およびNanoclone(登録商標)は、Ablynx N.Vの登録商標である。]ナノボディの一般的な説明については、以下の詳細な説明、および本明細書で引用した先行技術、例えばWO 08/020079(16頁)に記載されている。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
ここにおいてFR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜4を指し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜3を指し、および前記免疫グロブリン単一可変ドメインは:
i)配列番号2、3または4(表A−1を参照)のアミノ酸配列の少なくとも1つと、少なくとも80%、より好ましくは90%、さらにより好ましくは95%のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸の同一性の程度を決定する目的で、CDR配列を形成するアミノ酸残基は無視される。この点において表A−2も参照し、この表は、配列番号2、3または4の免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク1配列(配列番号7)、フレームワーク2配列(配列番号9、15および20)、フレームワーク3配列(配列番号11、17および22)を列挙する;または、
ii)表A−2に示すフレームワーク配列の組み合わせ;
およびここで:
iii)好ましくは、Kabatの番号付けによる位置11、37、44、45、47、83、84、103、104および108における1つ以上のアミノ酸残基は、例えばWO 08/020079の表A−3から表A−8に記載されているようなホールマーク残基から選択される。
特に、本発明のISVDおよび/またはポリペプチドなどの本発明のアグリカン、ADAMTS5および/またはMMP13結合剤は、以下を好適に含有し得る:(i)位置112にKまたはQ;または(ii)位置11のVと組み合わせた、位置110のKまたはQ;または(iii)位置89のT;または(iv)位置89のLおよび位置110のKまたはQ;または(v)位置11のVおよび位置89のL;または(i)〜(v)の適切な組み合わせ。
−位置11のアミノ酸残基は、好ましくはL、V、またはKから選択される(およびVが最も好ましい);および/または
−位置14のアミノ酸残基は、好ましくはAまたはPから適切に選択される;および/または
−位置41のアミノ酸残基は、好ましくはAまたはPから適切に選択される;および/または
−位置89のアミノ酸残基は、好ましくはT、VまたはLから適切に選択される;および/または
−位置108のアミノ酸残基は、好ましくはQまたはLから適切に選択される;および/または
−位置110のアミノ酸残基は、好ましくはT、KまたはQから適切に選択される;および/または
−位置112のアミノ酸残基は、好ましくはS、KまたはQから適切に選択される。
本発明は特にISVDに関し、ここで該ISVDは、VHH、ヒト化VHHおよびラクダ化VHからなる群から選択される。
VHHドメインのアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)によるVHドメインの一般的な番号付けに従って、例えばRiechmann and Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999)の図2に示されるように、ラクダのVHHドメインに適用されたものと同様になされる;これらはすべて当技術分野で知られている。VHドメインのアミノ酸残基に番号付けする代替方法は、同様の方法でVHHドメインにも適用することができ、当技術分野で知られている。しかし、本明細書、特許請求の範囲、および図面では、特に明記しない限り、上記のようにVHHドメインに適用されるKabatによる番号付けに従う。
本発明の意味において、用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「単一可変ドメイン」は、非ヒト源、好ましくはラクダ科動物、好ましくはラクダ科動物の重鎖抗体に由来するポリペプチドを含む。本明細書に記載されるように、それらはヒト化されてもよい。さらにこの用語は、非ラクダ科の供給源、例えばマウスまたはヒトであって、本明細書に記載されるように「ラクダ化」されたものに由来する、ポリペプチドを含む。
好ましいCDRを、表A−2に示す。
(i)CDR1は、配列番号8;および配列番号8と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり;
(ii)CDR2は、配列番号10;および配列番号10と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり;および
(iii)CDR3は、配列番号12;および配列番号12と1、2、3または4個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列である。
特に、本発明は本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ISVDはMMP13に特異的に結合し、4つのフレームワーク領域(それぞれFR1〜FR4)および3つの相補性決定領域(それぞれCDR1〜CDR3)から本質的になり、ここで、CDR1は配列番号8であり、CDR2は配列番号10であり、およびCDR3は配列番号12である。
(i)CDR1は、配列番号14[GRTVSSYAMG];および配列番号14と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり;
(ii)CDR2は、配列番号16[GISRSAERTY];および配列番号16と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり;および
(iii)CDR3は、配列番号18[DLDPNRIFSREEYAY];および配列番号18と1、2、3または4個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列である。
特に、本発明は本明細書に記載のISVDに関し、ここで前記ISVDはADAMTS5に特異的に結合し、4つのフレームワーク領域(それぞれFR1〜FR4)および3つの相補性決定領域(それぞれCDR1〜CDR3)から本質的になり、ここで、CDR1は配列番号14であり、CDR2は配列番号16であり、およびCDR3は配列番号18である。
(i)CDR1は、配列番号19;および配列番号19と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり;
(ii)CDR2は、配列番号21;および配列番号21と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり;および
(iii)CDR3は、配列番号23;および配列番号23と1、2、3または4個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列である。
特に、本発明は本明細書に記載のISVDに関し、ここで前記ISVDはアグリカンに特異的に結合し、4つのフレームワーク領域(それぞれFR1〜FR4)および3つの相補性決定領域(それぞれCDR1〜CDR3)から本質的になり、ここで、CDR1は配列番号19であり、CDR2は配列番号21であり、およびCDR3は配列番号23である。
特に、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記のADAMTS5に特異的に結合するISVDは、配列番号3である。
特に、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記のアグリカンに特異的に結合するISVDは、配列番号4である。
さらに好ましい態様において、本発明のアグリカン、ADAMTS5および/またはMMP13結合剤は、少なくとも2つのCDR1配列、少なくとも2つのCDR2配列および少なくとも2つのCDR3配列を含み、各々は以下の表から独立して選択される:
さらに好ましい態様において、本発明のアグリカン、ADAMTS5および/またはMMP13結合剤は、好ましくは、少なくとも以下の表に列挙されたCDR配列を含む:
当該技術は、変形性関節症などの関節の軟骨に影響を与える障害に対する、より効果的な治療を必要としている。関節内に投与された場合でも、罹患した軟骨を処置するためのほとんどの薬物の滞留時間は不十分である。理論に束縛されることなく、本発明者らは、本発明の構築物、ポリペプチドおよびISVDなどの治療薬の有効性は、治療薬を、関節内に薬物を「固定」しその結果薬物の保持を増加させるが、治療薬の有効性は邪魔しない部分に結合することによって、調節できるとの仮説をたてた(この部分は、本明細書では「軟骨固定タンパク質」または「CAP」とも呼ばれる)。この固定の概念は、薬物の有効性を調節するのみでなく、毒性と副作用を減らすことによって罹患した関節の操作上の特異性を調節することができ、それにより、可能性のある有用な薬物の数を増加させた。
「CAPビルディングブロック」は、他の例えば治療用のビルディングブロック、例えばMMP13および/またはADAMTS5に結合するISVDなどを、例えば関節などの所望の部位に、誘導、固定、および/または保持するために使用され、ここで前記他の例えば治療用のビルディングブロックは、例えばMMP13および/またはADAMTS5の結合および/または阻害などの、その効果を発揮する。
様々な独創的な免疫化、スクリーニング、および特性評価方法を使用して、本発明者らは、関節内において延長された保持時間を可能にする、優れた選択性、安定性、および特異性を備えた様々なアグリカン結合剤を特定することができた。
一側面において本発明は、関節からの、組成物、ポリペプチドまたは構築物の流出を低減および/または阻害する方法に関し、前記方法は、本発明による少なくとも1つのポリペプチド、本発明による構築物、または本発明による組成物の薬学的活性量を、それを必要とする人へ投与することを含む。
MMP13および/またはADAMTS5が関与する疾患、例えば関節炎、変形性関節症、脊椎骨端異形成症、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、関節リウマチ、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチーなどの次に、本発明のアグリカン結合剤はまた、軟骨に影響を与える様々な他の疾患、例えば、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、(例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離)、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎(本明細書では一般に「アグリカン関連疾患」と示される)にも使用できることが予想される。
好ましいCAPビルディングブロックは、ISVD結合アグリカン、好ましくはヒトアグリカンであり、好ましくは表Bに示されるように配列番号68で表される。
したがって本発明は、好ましくは配列番号4で表されるISVDから選択される、アグリカンに特異的に結合する少なくとも1つのISVDをさらに含む、本発明によるポリペプチドまたは構築物に関する。
一側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合する少なくとも2つのISVDを含む、本明細書に記載のポリペプチドに関する。
一側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合する少なくとも2つのISVDを含む本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、アグリカンに特異的に結合する前記少なくとも2つのISVDは、同一でも異なっていてもよい。
一側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合するISVDを含む、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、アグリカンに特異的に結合する前記ISVDは、ヒトアグリカン[配列番号68]に特異的に結合する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、アグリカンに特異的に結合する前記ISVDは、ヒトアグリカン(配列番号68)、イヌアグリカン、ウシアグリカン、ラットアグリカン、ブタアグリカン、マウスアグリカン、ウサギアグリカン、カニクイザルアグリカンおよび/またはアカゲザルのアグリカンに特異的に結合する。
本発明のISVD、ポリペプチドおよび構築物は、好ましくは安定であることが理解されるであろう。本発明のポリペプチド、構築物またはISVDの安定性は、当業者に知られている日常的なアッセイにより測定することができる。典型的なアッセイには、(限定はされないが)ポリペプチド、構築物またはISVDの活性が測定され、続いて滑液中で所望の期間インキュベートされ、その後活性が再度測定されるアッセイが含まれる。
一側面において、本発明は、滑液(SF)中37℃で、少なくとも7日、例えば少なくとも14日、21日、1ヶ月、2ヶ月、または3ヶ月間も、安定性を有する、本発明のISVD、ポリペプチドまたは構築物に関する。
本発明の多価ポリペプチドまたは構築物中のMMP13および/またはADAMTS5に結合するISVDなどの、治療用ビルディングブロックの望ましい活性は、当業者に知られている日常的なアッセイにより測定することができる。典型的なアッセイには(限定されないが)、実施例の節に詳述されているGAG放出アッセイが含まれる。
(a)少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)を含むポリペプチドであって、アグリカンに特異的に結合する第1のISVDおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)に特異的に結合する第2のISVDを含む、前記ポリペプチド;
(b)少なくとも2つのISVDを含むポリペプチドであって、アグリカンに特異的に結合する第1のISVDおよび、トロンボスポンジンモチーフを有するAディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ(ADAMTS)に特異的に結合する2番目のISVDを含む、前記ポリペプチド;および
(c)少なくとも3つのISVDを含むポリペプチドであって、アグリカンに特異的に結合する第1のISVD、ADAMTSに特異的に結合する第2のISVD、およびMMPに特異的に結合する第3のISVDを含む、前記ポリペプチド。
本発明のポリペプチドにおいて、ISVDは、直接連結されても、リンカーを介して連結されてもよい。さらにより好ましくは、本発明のポリペプチドは、C末端伸長を含む。本明細書で詳述するように、C末端伸長は、ヒト対象/患者のほとんどの試料中の既存の抗体/因子の結合を、本質的に防止/除去する。C末端伸長は、最後の(最もC末端に位置する)ISVDの最後のアミノ酸残基(通常はセリン残基)のC末端に存在する。
一般に、単一のビルディングブロック、単一のISVDまたは単一のナノボディを含むかまたは本質的にそれらからなるポリペプチドまたは構築物は、それぞれ「一価」ポリペプチドおよび「一価構築物」と呼ばれる。2つ以上のビルディングブロック(例えばISVDなど)を含むポリペプチドまたは構築物は、「多価」ポリペプチドまたは構築物とも呼ばれ、かかるポリペプチドまたは構築物に存在するビルディングブロック/ISVDは、本明細書において、「多価フォーマット」であると言及される。例えば、「二価」ポリペプチドは、リンカー配列を介して任意に連結された2つのISVDを含み得るが、「三価」ポリペプチドは、2つのリンカー配列を介して任意に連結された3つのISVDを含み得;一方、「四価」ポリペプチドは、3つのリンカー配列を介して任意に連結された4つのISVDを含み得る、などである。
一側面において、本発明は、少なくとも2つのISVDを含むポリペプチドに関し、ここで少なくとも1つのISVDは、ADAMTS、好ましくはADAMTS5に特異的に結合し、より好ましくは前記1つのISVDは、配列番号3のアミノ酸配列によって表される。
一側面において、本発明は、少なくとも2つのISVDを含むポリペプチドに関し、ここで少なくとも1つのISVDはアグリカンに特異的に結合し、より好ましくは、前記1つのISVDは、配列番号4のアミノ酸配列によって表される。
「多重パラトピック」ポリペプチドおよび「多重パラトピック」構築物、例えば「二重パラトピック」ポリペプチドまたは構築物および「三重パラトピック」ポリペプチドまたは構築物は、それぞれ異なるパラトープを有する2つ以上のビルディングブロックを含むか、本質的にそれらからなる。
したがって本発明は、例えば、本発明の2つ以上のISVDを含むかまたは本質的にそれらからなる二価または三価ポリペプチドまたは構築物などの、多価ポリペプチドまたは多価構築物であるポリペプチドまたは構築物にも関する(1つ以上のVHHドメインを含む多価および多重特異性ポリペプチドおよびそれらの調製については、Conrath et al. (J. Biol. Chem. 276: 7346-7350, 2001)、ならびに例えばWO96/34103、WO99/23221およびWO 2010/115998も参照)。
本発明はさらに、ADAMTS5、好ましくはヒトADAMTS5に結合する少なくとも1つのISVD(またはその適切な断片)、およびアグリカンに結合するISVDなどの追加の1つのISVDを含むか、または(本質的に)それからなる、多価ポリペプチドに関する。
本発明の多価ポリペプチドまたは構築物に存在する2つ以上のISVDは、軽鎖可変ドメイン配列(例えば、VL配列)または重鎖可変ドメイン配列(例えば、VH配列)からなり得る;それらは、従来の4本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、または重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列で構成されていてもよい。好ましい側面において、それらは、ドメイン抗体(またはドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸)、単一ドメイン抗体(または単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸)、または「dAb」(またはdAbとしての使用に適したアミノ酸)、Nanobody(登録商標)(VHHを含むがこれに限定されない)、ヒト化VHH配列、ラクダ化VH配列;または親和性成熟によって得られたVHH配列からなる。2つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、部分的または完全にヒト化されたナノボディまたは部分的または完全にヒト化されたVHHからなることができる。
相対的親和性は、ポリペプチド内のISVDの位置に依存し得る。本発明のポリペプチドにおけるISVDの順序(配向)は、当業者の必要性に従って選択され得ることが理解されるであろう。個々のISVDの順序、およびポリペプチドがリンカーを含むかどうかは、設計選択の問題である。リンカーの有無にかかわらず、一部の配向は、他の配向と比較して優先される結合特性を提供し得る。例えば、本発明のポリペプチドにおける第1のISVD(例:ISVD1)および第2のISVD(例:ISVD2)の順序は、(N末端からC末端へ):(i)ISVD1(例:ナノボディ1)−[リンカー]−ISVD2(例:ナノボディ2)−[C末端伸長];または(ii)ISVD2(例:ナノボディ2)−[リンカー]−ISVD1(例ナノボディ1)−[C末端伸長];(ここで、角括弧内の部分、すなわちリンカーおよびC末端伸長は、任意である)。すべての配向が本発明に包含される。所望の結合特性を提供するISVDの配向を含むポリペプチドは、例えば実施例の節で例示されるように、日常的なスクリーニングにより容易に同定され得る。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、これは、配列番号1(ALX−1011)、配列番号5(MMP13−CAP−CAP)、および配列番号6(ATS5−CAP−CAP)、配列番号62、配列番号63および配列番号64からなる群から選択される。
一側面において、本発明は、血清アルブミンに結合するISVDを含む、本明細書に記載のポリペプチドに関する。
一般に、半減期が増加した本発明の構築物またはポリペプチドは、好ましくは、対応する本発明の構築物またはポリペプチドそれ自体、すなわち半減期の増加をもたらす部分がない場合の半減期よりも長い、少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも2倍、例えば少なくとも5倍、例えば少なくとも10倍または20倍より長い、半減期を有する。例えば、半減期が増加した本発明の構築物またはポリペプチドは、対応する本発明の構築物またはポリペプチド自体と比較して、すなわち半減期の増加をもたらす部分がない場合と比較して、例えばヒトにおいて、半減期の増加が1時間超、好ましくは2時間超、より好ましくは6時間超、例えば12時間超、またはさらに24、48または72時間を超え得る。
本発明の別の好ましい側面において、本発明の構築物およびポリペプチドは、ヒトにおいて少なくとも約12時間、好ましくは少なくとも24時間、より好ましくは少なくとも48時間、さらにより好ましくは少なくとも72時間またはそれ以上の、血清半減期を示す。例えば、本発明の構築物またはポリペプチドは、血清半減期として、少なくとも5日(約5〜10日など)、好ましくは少なくとも9日(約9〜14日など)、より好ましくは少なくとも約10日(約10〜15日など)、または少なくとも約11日(約11〜16日など)、より好ましくは少なくとも約12日(約12〜18日またはそれ以上など)、または14日以上(約14〜19日など)を有し得る。
一側面において、本発明は、血清タンパク質結合部分を含むポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで前記血清タンパク質結合部分は、非抗体ベースのポリペプチドである。
一側面において、以下で言及されるように、本発明は、半減期延長を付与する部分を含むポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで、前記部分はPEGである。したがって本発明はまた、PEGを含む本発明の構築物またはポリペプチドに関する。
a)N末端Met残基を、例えば異種宿主細胞または宿主生物での発現の結果として含むことができる;
b)合成時に宿主細胞からのポリペプチドの分泌を指示するシグナル配列またはリーダー配列を、形成し得る(例えば、本発明のポリペプチドを発現するために使用する宿主細胞に応じて、本発明のポリペプチドのプレ、プロまたはプレプロ形態を提供するため)。適切な分泌リーダーペプチドは、当業者には明らかであり、本明細書でさらに説明されているとおりであってよい。通常、かかるリーダー配列はポリペプチドのN末端に連結されるが、ただし最も広い意味での本発明はこれに限定されない;
d)官能化された、および/または官能基の結合部位として機能することができる、1つ以上のアミノ酸残基であってもよい。適切なアミノ酸残基および官能基は当業者には明らかであり、本発明のポリペプチドの誘導体について本明細書で言及されるアミノ酸残基および官能基が含まれるが、これらに限定はされない。
他の基、残基、部分または結合単位は、例えば化学基、残基、部分であってよく、これらは例えば、それ自体で生物学的および/または薬理学的に活性であってもなくてもよい。例えば、限定されないが、かかる基は、本発明のポリペプチドまたは構築物の「誘導体」を提供するために、本発明の1つ以上のISVDまたはポリペプチドに連結され得る。
したがって本発明は、その最も広い意味で、本発明の構築物および/またはポリペプチドの誘導体である、構築物および/またはポリペプチドも含む。かかる誘導体は一般に、本発明の構築物および/またはポリペプチド、および/または本発明のポリペプチドを形成する1つ以上のアミノ酸残基の、修飾によって、および特に化学的および/または生物学的(例えば酵素的)修飾によって、得ることができる。
例えば、かかる修飾は、1つ以上の(官能)基、残基または部分の、本発明のポリペプチド内またはこれの上への導入(例えば、共有結合によるかまたは他の適切な様式による)、および特に、本発明の構築物および/またはポリペプチドに1つ以上の所望の特性または機能性を付与する、1つ以上の(官能)基、残基または部分の導入を、含み得る。かかる官能基の例は、当業者には明らかであろう。
好ましくは、本発明の構築物またはポリペプチドについては、5000を超える分子量、例えば10,000超および200,000未満、例えば100,000未満;例えば、20,000〜80,000の範囲の分子量を有するPEGが使用される。
さらに別の修飾は、本発明のポリペプチドまたは構築物の意図する使用に応じた、1つ以上の検出可能な標識または他のシグナル生成基もしくは部分の導入を含み得る。それらを結合、使用および検出するための適切な標識および技術は、当業者には明らかであり、例えば、以下を含むがこれに限定はされない:蛍光標識(例えばフルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルデヒド(phthaldehyde)、およびフルオレスカミンおよび152Euなどの蛍光金属、またはランタニド系のその他の金属など)、リン光標識、化学発光標識または生物発光標識(例えばルミナール、イソルミノール、セロマティック(theromatic)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ジオキセタンまたはGFPおよびそのアナログ)、放射性同位体(例えば3H、125I、32P、35S、14C、51Cr、36Cl、57Co、58Co、59Fe、および75Seなど)、金属、金属キレート、または金属カチオン(例えば金属カチオン、例:99mTc、123I、111In、131I、97Ru、67Cu、67Ga、および68Ga、またはin vivo、in vitroもしくはin situ診断およびイメージングでの使用に特に適した他の金属または金属カチオン、例えば(157Gd、55Mn、162Dy、52Crおよび56Fe))、ならびに発色団および酵素(例えばリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−V−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチナビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−VI−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ)。他の適切な標識は当業者には明らかであり、例えば、NMRまたはESR分光法を使用して検出可能な部分を含む。
当業者には明らかであるように、別の修飾は、例えば上記の金属または金属カチオンの1つをキレート化するためのキレート基の導入を伴い得る。適切なキレート基には、例えば限定するものではないが、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)が含まれる。
好ましくは、構築物、ポリペプチドおよび/または誘導体は、アグリカンおよびADAMTS5および/またはMMP13に、本明細書で定義される親和性(本明細書でさらに説明されるように、KD値(実際または見かけの値)、KA値(実際または見かけの値)、konレートまたはオンレート、および/またはkoffまたはオフレート、あるいは代替的にIC50値として、適切に測定および/または表示される)で結合する(本発明のポリペプチドについて定義されるように)。
本発明のかかる構築物および/またはポリペプチドならびにその誘導体はまた、本質的に単離された形態(本明細書で定義される)であってもよい。
一側面において、本発明は、1つ以上の他の基、残基、部分または結合単位が、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはその断片、血清タンパク質に結合可能な結合単位、Fc部分、および血清タンパク質に結合可能な小タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、本発明の構築物に関する。
いくつかの他の特に好ましいリンカーは、GS9(WO 06/122825の配列番号84も参照)およびGS35、ならびにポリアラニン(AAAなど)、およびリンカーGS30(WO 06/122825の配列番号85も参照)である。
他の適切なリンカーは一般に、有機化合物またはポリマー、特に医薬用途のタンパク質での使用に適したものを含む。例えばポリ(エチレングリコール)部分は、抗体ドメインを連結するために使用されている;例えばWO 04/081026を参照。
例えば、アグリカンおよび別の標的、例えばADAMTS5および/またはMMP13に向けられた、ビルディングブロック、ISVDまたはナノボディを含む本発明の多価ポリペプチドにおいて、リンカーの長さおよび柔軟性は、ポリペプチド中の本発明のISVDなどの各ビルディングブロックが、その同族の標的、例えば各標的の抗原決定基に結合することを可能にするようなものであることが好ましい。再び、本明細書の開示に基づいて、当業者は、本発明のポリペプチドなどの本発明の特定の構築物で使用するための最適なリンカーを、任意にいくつかの限定された日常的実験の後に決定することができるであろう。
通常、発現および生産を容易にするために、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物は、線状ポリペプチドである。しかし本発明は、その最も広い意味でこれに限定されない。例えば、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物が3つ以上のビルディングブロック、ISVDまたはナノボディを含む場合、3つ以上の「アーム」を有するリンカーの使用によりそれらを連結することが可能であり、それぞれの「アーム」は、ビルディングブロック、ISVDまたはナノボディに連結されて「星形」の構築物を提供する。通常はあまり好ましくはないが、円形の構築物を使用することも可能である。
したがって本発明は、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで、第1のISVDおよび/または第2のISVDおよび/またはおそらく血清アルブミンに結合するISVDが、リンカーを介して連結されている。
したがって本発明は、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで、前記リンカーは、9GS、35GS、3A、5GS、7GS、10GS、15GS、18GS、20GS、25GS、30GS、poly−A、8GS、40GS、G1ヒンジ、9GS−G1ヒンジ、ラマ上部の長いヒンジ領域、およびG3ヒンジ、のリンカーからなる群から選択され、例えば表C(配列番号28、35、24〜27、29〜34および36〜40)に示されている。
本発明はさらに、本明細書に記載の構築物、ポリペプチド、ISVD、核酸、宿主細胞、および組成物を調製する方法に関する。
本発明の多価ポリペプチドは一般に、少なくとも本発明のISVDおよび/または一価ポリペプチドを、場合により1つ以上の適切なリンカーを介して、1つ以上のさらなるISVDに適切に連結するステップを含む方法によって調製することができ、こうして本発明の多価ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドはまた、少なくとも、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供するステップ、前記核酸を適切な方法で発現するステップ、および発現された本発明のポリペプチドを回収するステップを含む方法によっても、調製することができる。かかる方法は、それ自体既知の様式で実行することができ、これは当業者には、例えば本明細書でさらに説明する方法および技術に基づいて、明らかであろう。
本発明のポリペプチドおよび核酸は、本明細書のさらなる説明から当業者に明らかなように、それ自体既知の様式で調製することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体の調製、特に抗体断片((単一)ドメイン抗体およびScFv断片を含むがこれらに限定されない)の調製のための、それ自体既知の任意の様式で調製することができる。ポリペプチドおよび核酸を調製するためのいくつかの好ましいが非限定的な方法には、本明細書に記載の方法および技術が含まれる。
特に、かかる方法は、以下のステップを含んでもよい:本発明の宿主を、本発明の宿主が本発明の少なくとも1つのポリペプチドを発現および/または生産するような条件下で、培養および/または維持すること;続いて任意に、こうして得られた本発明のポリペプチドを単離および/または精製すること。
本発明の核酸は、一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAの形態であり得る。本発明の一態様によれば、本発明の核酸は、本明細書で定義されるように、本質的に単離されている。本発明の核酸はまた、発現ベクターなどのベクター、例えばプラスミド、コスミドまたはYAC(これもまた本質的に単離された形態であり得る)の形態であっても、その中に存在しても、および/またはベクターの一部であってもよい。したがって本発明はまた、本発明の核酸またはヌクレオチド配列を含む、発現ベクターにも関する。
a)本発明の少なくとも1つの核酸;
b)1つ以上の調節要素に動作可能に接続されている、例えばプロモーター、および任意に適切なターミネーター;および任意にまた
c)それ自体知られている、遺伝子構築物の1つ以上のさらなる要素;
ここで、用語「調節要素」、「プロモーター」、「ターミネーター」、および「動作可能に接続された」は、当技術分野における通常の意味を有する。
本発明の遺伝子構築物は一般に、本発明のヌクレオチド配列を、例えば上記のSambrook et al.およびAusubel et al.など一般的なハンドブックに記載された技術を使用して、上記の1つ以上のさらなる要素に適切に連結することにより提供され得る。
一側面において、本発明は、少なくとも以下のステップを含む、本発明による構築物、ポリペプチドまたはISVDを生産する方法に関する:(a)適切な宿主細胞または宿主生物または別の適切な発現系において、本発明による核酸配列を発現するステップ;これに続いて任意に(b)本発明による構築物、ポリペプチドまたはISVDを単離および/または精製するステップ。
一側面において、本発明は、本発明による構築物、ポリペプチド、ISVDまたは核酸を含む、組成物に関する。
したがって本発明は、先行技術のアミノ酸配列および抗体と比較して、より安全なプロファイルを含む、改善された予防的、治療的および/または薬理学的特性を有する組成物、構築物および/またはポリペプチドを提供する。
一側面において、本発明は、医薬として使用するための、本発明による組成物、本発明によるポリペプチド、および/または本発明による構築物に関する。
別の側面において、本発明は、少なくともADAMTS5および/またはMMP13関連疾患、例えばOAなどの、予防および/または処置のための医薬組成物の調製における、および/または本明細書に記載の処置方法の1つ以上で使用するための、本発明の組成物、ポリペプチドおよび/または構築物の使用に関する。
本発明は、本発明による組成物、ポリペプチドおよび/または構築物の使用であって、MMPの活性を調節し好ましくはMMP13の活性を阻害することにより予防および/または処置することができる少なくとも1つの疾患または障害の、予防および/または処置のための医薬組成物の調製における、前記使用にも関する。
本発明はまた、本発明のISVD、ポリペプチド、組成物および/または構築物の使用であって、本発明のISVD、ポリペプチド、組成物および/または構築物を患者に投与することにより予防および/または処置することができる少なくとも1つの疾患、障害または状態の予防および/または処置のための医薬組成物の調製における、前記使用に関する。
本発明のADAMTS5結合剤は、軟骨に影響を与える様々な疾患において、例えば関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチーおよび非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)(本明細書では一般的に「ADAMTS5関連疾患」として示される)、好ましくはOAにおいて、使用可能であることが予想される。
一側面において、本発明は、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、再発性多発性軟骨炎、NASH、慢性歯周炎および腹部大動脈瘤、好ましくはOAを予防または処置するための方法に関し、ここで前記方法は、それを必要とする対象に、少なくとも本発明による組成物、免疫グロブリン、ポリペプチド、または構築物の薬学的活性量を投与することを含む。
また、アグリカンに結合することにより、本発明のISVD、構築物および/またはポリペプチドは、セリンプロテアーゼファミリーのメンバー、カテプシン、例えばMMP20などのマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP13以外のMMP)だけではなく、アグリカンの分解におけるADAMTS4(アグリカナーゼ1)および/またはADAMTS11の活性を、低下または阻害し得ることが期待される。
一般に処置計画は、本発明の1つ以上のポリペプチドおよび/もしくは構築物、またはそれを含む1つ以上の組成物の、1以上の薬学的有効量または用量での投与を含む。投与されるべき特定の量または用量は、臨床医により、再度上記の要因に基づいて決定することができる。本発明の組成物、構築物、および/またはポリペプチドの有用な用量は、それらのin vitro活性と動物モデルにおけるin vivo活性とを比較することにより決定することができる。マウスおよび他の動物での有効用量をヒトに外挿する方法は、当技術分野で知られている;例えば、US 4,938,949を参照。
本発明の組成物、構築物、および/またはポリペプチドの、処置における使用に必要とされる量は、選択された特定の組成物、ポリペプチド、および/または構築物だけでなく、投与経路、処置される状態の性質、患者の年齢および状態によっても異なり、最終的には担当医または臨床医の裁量に委ねられる。また、本発明の組成物、構築物、および/またはポリペプチドの用量は、標的細胞、組織、または臓器に応じて変化する。
投与計画には、長期にわたる毎日の処置が含まれ得る。「長期」とは、少なくとも2週間、好ましくは数週間、数ヶ月、または数年の期間を意味する。この用量範囲の必要な修正は、本明細書の教示および通常の実験のみを使用して、当業者により決定され得る。Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PAを参照。投与量は、任意の合併症の場合には、個々の医師が調整することもできる。組成物、ポリペプチドおよび構築物は非常に安定であり、長期間有効であることが示されている。
本発明の組成物、ポリペプチドおよび/または構築物は、1つ以上のさらなる薬学的に活性な化合物または成分と組み合わせて、すなわち、併用治療計画として使用することができ、これは、相乗効果をもたらすことも、そうでない場合もある。
医薬組成物はまた、少なくとも1つのさらなる活性剤、例えば1つ以上のさらなる抗体またはその抗原結合断片、ペプチド、タンパク質、核酸、有機および無機分子を含み得る。
特に、本発明の組成物、ポリペプチドおよび/または構築物は、本明細書に引用される疾患、障害および状態の予防および/または処置に使用されるかまたは使用できる、他の薬学的に活性な化合物または成分と、組み合わせて使用することができ、その結果、相乗効果が得られる場合も得られない場合もある。かかる化合物および成分の例、ならびにそれらを投与するための経路、方法および医薬製剤または組成物は、臨床医には明らかであろう。
したがって、さらなる側面において、本発明は、本発明の少なくとも1つの構築物、または本発明の少なくとも1つのポリペプチド、および少なくとも1つの適切な担体、希釈剤または賦形剤(すなわち、医薬用途に適した)、および任意に1つ以上のさらなる活性物質を含む、医薬組成物に関する。特定の側面において、本発明は、少なくとも1つの本発明による組成物、構築物、またはポリペプチドを含む医薬組成物に、好ましくは配列番号1と62、配列番号5と6、配列番号63と64、配列番号5と64、または配列番号63と6の少なくとも1つ、および少なくとも1つの適切な担体、希釈剤または賦形剤(すなわち、医薬用途に適したもの)、および任意に1つ以上のさらなる活性物質を含む、医薬組成物に関する。
本発明はまた、in vitro(例えば、in vitroまたは細胞アッセイ)またはin vivo(例えば、単一細胞または多細胞生物、および特に哺乳動物、より具体的にはヒト、例えば本発明の疾患、障害または状態のリスクがあるか、またはこれに罹患しているヒト)のいずれかで使用するための組成物(例えば、限定されることなく、本明細書にさらに記載の医薬組成物または製剤など)にも関する。
一般に、医薬用途では、本発明の組成物、構築物、ポリペプチドおよび/またはISVDは、少なくとも1つの本発明の構築物、ポリペプチドおよび/またはISVDおよび、少なくとも1つの薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤および/またはアジュバント、ならびに任意に1つ以上の薬学的に活性なポリペプチドおよび/または化合物を含む、医薬製剤または組成物として製剤化することができる。非限定的な例として、かかる製剤は、経口投与のため、非経口投与のため(例えば関節内、静脈内、筋肉内または皮下注射または静脈内注入など)、局所投与のため、吸入による投与のために、皮膚パッチ、インプラント、座薬などに適した形態であることができ、ここで非経口投与が好ましい。かかる適切な投与形態−これは投与の様式に応じて固体、半固体または液体であり得る−およびその調製に使用するための方法および担体は、当業者には明らかであり、本明細書でさらに説明される。かかる医薬製剤または組成物は、一般に、本明細書において「医薬組成物」と呼ばれる。
一般に、本発明の構築物、ポリペプチド、および/またはISVDは、それ自体既知の任意の適切な様式で、製剤化および投与することができる。例えば、上記で引用された一般的な背景技術(および特にWO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867およびWO 08/020079)、ならびに標準のハンドブック、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)、Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005);またはthe Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007(例えば、252〜255頁参照)を参照。
本発明の組成物、構築物、ポリペプチド、および/またはISVDは、従来の抗体および抗体断片(ScFvおよびダイアボディを含む)および他の薬学的に活性なタンパク質についてのそれ自体既知の任意の様式で、製剤化および投与され得る。かかる製剤およびそれを調製する方法は、当業者には明らかであり、例えば、非経口投与(例えば、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、管腔内、動脈内、脊髄内、鼻腔内または気管支内投与)、またさらに局所(すなわち、経皮または皮内)投与に好ましく適している製剤を含む。
本発明の組成物、構築物、ポリペプチド、および/またはISVDはまた、遺伝子治療から知られている送達方法を用いて投与することもでき、例えば、その遺伝子治療送達方法に関して参照により組み込まれる米国特許第5,399,346号を参照されたい。遺伝子治療の送達方法を使用して、本発明の構築物、ポリペプチド、および/またはISVDをコードする遺伝子でトランスフェクトされた一次細胞は、特定の臓器、組織、移植片、腫瘍、または細胞を標的とする組織特異的プロモーターでさらにトランスフェクトされ得、さらに、細胞内局在発現のためのシグナルおよび安定化配列でトランスフェクトされ得る。
最後に本発明は、本発明による少なくとも1つの組成物、ポリペプチドまたは構築物、前記成分をコードする少なくとも1つの核酸配列、本発明のベクターまたはベクターシステム、および/または本発明による宿主細胞を含む、キットに関する。キットは、異なる形態、例えば診断キットとして提供され得ることが企図される。
本出願を通して引用されるすべての参考文献(文献参照、発行済み特許、公開特許出願、および同時係属中の特許出願を含む)の全内容は、特に上記で参照された教示に関して、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
配列は、明細書の本文および、WIPO標準ST.25による別個の配列リストに記載されている。特定の番号で指定された配列は、明細書本文と別個の配列リストにおいて同一であるべきである。例として、配列番号1は、明細書本文と別個の配列リストの両方で、同じ配列を定義すべきである。
発明者らは、理論に拘束されることなく、ADAMTS5とMMP13の両方を阻害することが以下の点で潜在的により効果的であると仮定した:
(1)より広範囲のOA誘導性かつ持続性のプロテアーゼが阻害される;
(2)患者を異なるグループに分ける必要なしに、より広範囲の患者を標的にすることができる;および
(3)より広範囲の病気の発症を処置することができる。
患者への優しさのために、阻害剤は関節内で長期間保持され活性であることが好ましい。
したがって、本発明者らは、MMP13に特異的に結合するISVD、ADAMTS5に特異的に結合するISVD、およびアグリカンに特異的に結合するISVDの単離および特性評価に着手した。その後、ISVDをさまざまなフォーマットで組み合わせ、さまざまなin vitro、ex vivo、およびin vivoモデルで試験した。
1.1 抗MMP13 ISVD 62C02
10E7より多くのクローンをスクリーニングした後、MMP13に特異的なISVD 62C02を、蛍光発生ペプチドアッセイ、コラーゲン分解アッセイ、蛍光発生コラーゲンアッセイで同定した。
簡潔に言えば、ヒト、カニクイザル、ラット、イヌおよびウシのMMP13蛍光発生ペプチドアッセイ、ならびにヒトMMP1およびMMP14蛍光発生ペプチドアッセイの設定は次のとおりである。活性化されたMMPを、蛍光発生ペプチド基質Mca−PLGL−Dpa−AR−NH2(R&DSystems #ES001)およびペリプラズム抽出物の1/5希釈液または精製ナノボディ/陽性対照の希釈系列(総容量=アッセイバッファー:50mMのTris、pH7.5、100mMのNaCl、10mMのCaCl2、0.01%Tween20中、20μl)を用いて、37℃で2時間インキュベートした。蛍光の線形の増加(v0−15〜45分間のインキュベーション)を酵素活性の尺度として使用し、阻害%を、式:100−100(試験ナノボディの存在下でのv0/陰性対照ナノボディ(Cablys)の存在下でのv0)により計算した。
蛍光発生コラーゲンアッセイの設定は、基本的に次のとおりである:ウシ皮膚からの100μg/mlのDQ(登録商標)I型コラーゲン(フルオレセインコンジュゲート、Molecular Probes #D-12060 lot 1149062)を、10nMの活性化MMP13および精製ナノボディ/陽性対照の希釈系列と共に、40μlアッセイバッファー(50mMのTris−Cl、pH7.5、100mMのNaCl、10mMのCaCl2、0.01%Tween-20)中、37℃で2時間インキュベートした。蛍光の線形の増加(v0−15〜45分間のインキュベーション)を酵素活性の尺度として使用し、阻害%を、式:100−100(試験ナノボディの存在下でのv0/陰性対照ナノボディ(Cablys)の存在下でのv0)により計算した。
表1.1.
MMP13に対するISVD 62C02の選択性を決定するために、MMP1およびMMP14の蛍光発生ペプチドアッセイを使用した。MMP1およびMMP14は、密接に関連する2つのMMPファミリーメンバーである。これらのアッセイでは、TIMP−2を陽性対照として使用した。例1.1で説明したものと同様の設定を使用した。
ISVD 62C02は高度に選択的であり、MMP1またはMMP14阻害を示さないことが実証された(データは示さず)。
2.1 抗ADAMTS5 ISVD 02F03
この場合においても、ADAMTS5に特異的に結合するISVD 02F03を識別するために、10E7を超えるクローンをスクリーニングした。ISVD 02F03は、ADAMTS5媒介性のアグリカンの切断の阻害について、FRETベースアッセイおよびAlphaLISAアッセイを介してさらに特性評価した。
簡潔に言えば、ISVD 02F03のペリプラズム抽出物を、組換えヒトADAMTS5への結合について、結合ELISAにより試験した。次に、ISVD 02F03は、FRETベースのヒトADAMTS5酵素アッセイにおいて、ADAMTS5媒介性のアグリカンの切断を防止できることが確認された。FRETベースのアッセイの次に、AlphaLISA(Perkin Elmer, Waltham, MA, US)ベースのヒトADAMTS5アッセイを、基質としてビオチン化43マーアグリカンオリゴペプチドを用いて実施した。この基質のADAMTS5切断により、ビオチン化ARGSVネオエピトープ産物が放出され、これは、ストレプトアビジン−AlphaScreenドナービーズおよび抗マウスIgG被覆AlphaLISAアクセプタービーズで捕捉されたα−ネオエピトープ(「ARGSV」)抗体により検出することができ、レーザー励起時に発光AlphaScreen信号の生成がもたらされる。
ISVD 02F03がADAMTS5媒介性の基質の切断を防止する能力を判断するために、シグナルの減少をISVD 02F03濃度の関数として分析し、IC50値を計算した。ADAMTS4活性とADAMTS5活性の両方を阻害する小分子MSC2310852Aを、陽性対照として使用した。
表2.1.1 ヒトFRETおよびAlphaLISA酵素アッセイにおけるISVD 02F03および参照化合物についてのADAMTS5の効力(IC50)および阻害%
結果を表2.1.2にまとめる。
表2.1.2 ウシ外植片アッセイにおけるISVD 02F03のIC50値
種の交差反応性は、初めにSPRベースのオフレート分析により、Biacore T100機器で評価した。ポリペプチドは、ヒト、カニクイザル(「cyno」)、モルモット、マウス、およびウシADAMTS5への結合について試験した。この目的のために、組換えADAMTS5を、EDCおよびNHSを使用したアミンカップリングによりCM5チップ上に固定化した。精製したISVD 02F03を100nMの濃度で2分間注入し、45μl/分の流量で15分間解離させた。個々のADAMTS5のオフレートは、BIA評価ソフトウェアを使用して、1:1相互作用モデル(ラングミュアモデル)を個々の解離曲線に適合させることにより決定した。参照として、ヒトADAMTS5のオフレートを各実験で決定した。
表2.1.3 ISVD 02F03の種交差反応性データの概要
ADAMTS5に対するISVD 02F03の選択性を確認するために、MMP1、MMP14、およびADAMTS4の酵素活性の阻害を、それぞれの酵素を使用したFRETベースのアッセイおよびヒトADAMTS4AlphaLISAを介して評価した。
活性化されたヒトMMP1またはMMP14を、室温で30分間、10μlのISVD 02F03の希釈系列とともにインキュベートした。インキュベーション後、20μlの5μMまたは2.5μM蛍光発生ペプチド基質(Mca−PLGL−Dpa−AR−NH2蛍光発生MMP基質(R&D Systems cat #ES001))をそれぞれ添加した。ISVD 02F03の、MMP1およびMMP14媒介性の切断を防ぐ能力を、Tecan Infinite M1000プレートリーダーで37℃で2時間、毎分監視した。
ヒトADAMTS4の阻害を評価するために、ヒトADAMTS5AlphaLISAと同様のアッセイを、本質的に例2.1に記載されているようにして、ただしヒトADAMTS4(R&D Systems, Minneapolis, US; cat #4307-AD)を使用して実施した。ISVD 02F03の基質の、ヒトADAMTS4媒介性の切断を防ぐ能力を決定するために、シグナルの減少をISVD 02F03濃度の関数で分析し、IC50値を計算した。
小分子MSC2310852AはヒトADAMTS4活性を阻害したが、ISVD 02F03またはmAb 12F4は阻害活性を示さなかった(データは示さず)。モノクローナル抗体mAb 12F4(H4L0)は、WO 2011/002968においてADAMTS4よりも選択的であると記載された。
3.1 抗アグリカンISVD 114F08
アグリカン特異的ISVD 114F08を、大規模なスクリーニングキャンペーンの後に単離および特性評価した。ラマを、組換えヒトアグリカン(G1−IGD−G2ドメイン、R&D Systems #1220-PG)で免疫化し、特異的で高い血清力価を与えた。しかし、単離されたナノボディのごく一部のみが、アグリカンのG1ドメインへの結合と幅広い種の交差反応性を示すという2つの要件を満たした。困難な試みの後、本質的に同様の特性を示すさまざまなファミリーが同定された(CDRでの配列変異については表3.1A〜表3.1Cを参照)。最終的に、ISVD 114F08(「C0101PMP114F08」)がさらなる特性評価のために選択された。
表3.1.1
表3.1A
表3.1B
表3.1C
軟骨での保持を評価するための確立されたアッセイがないため、本発明者らは、ウシ軟骨を使用するex vivo軟骨保持アッセイを開発した。
ISVD 114F08を含むポリペプチドが軟骨において長期間保持される能力を、軟骨への比較的短い暴露(関節内注射の際に予想される)の後に決定した。アッセイは通常、ナノボディ試料あたり4つの軟骨ディスクを使用して実行した;2枚のディスクを、ポリペプチドのインキュベーション直後(t0)に分析して、結合したポリペプチドの初期量を決定した;2枚のディスクを洗浄後に分析した(t1〜5日)。保持の程度は、t1〜5日とt0で検出されたポリペプチドの量の比率として定義した。この比率の決定は、ウェスタンブロットの目視検査で0〜6のスコアを与えることにより実施し、ここで0は保持なし、6は完全保持である。2つの不活性なISVD ALB26で構成されるダミー構築物C0101030(「30」)は、結合を示さなかった。
表3.2:ALB26フォーマットされた抗アグリカンISVD 114F08の軟骨保持。*スコアは、1〜4の独立したex vivoウシ軟骨保持アッセイの、0〜6のスケールでの平均である:0は保持なし、および6は完全保持である。
ex vivoのウシ軟骨での保持データに基づいて、ISVD 114F08を、ヒト、カニクイザル、ラット、イヌ、およびウシのアグリカンからの組換えG1−IGD−G2領域上でのELISAでさらに特性評価し、その種交差反応性を決定し(例3.1も参照)、および、組換えヒトニューロカンおよびブレビカンについて特性評価して、その選択性を決定した。決定されたEC50値を表3.3に示す。
表3.3 ALB26フォーマットの抗アグリカンISVD 114F08のELISAによる特性評価。
本発明のポリペプチドは、in vitroでアグリカンに、およびex vivoで軟骨に特異的に結合することが、上記で実証された。加えてこれらのポリペプチドはまた、関節の他の組織には結合しないかまたは結合が少ないが、関節の軟骨に結合することが好ましい。
ISVD 114F08を含むポリペプチドの、滑膜、腱、および筋外膜への結合は、ex vivo軟骨結合アッセイと同じ設定を使用して評価した。ポリペプチド放出およびウェスタンブロット分析を、ポリペプチドとのONインキュベーション後、組織の短時間の洗浄(30分)の後に実施した。
表3.4:組織の特異性。ALB26フォーマットの抗アグリカンISVD 114F08の、関節軟骨、滑膜、腱、および筋外膜への結合。スコアは0〜6のスケールで、0は結合なし、6は観察された最大結合である。
患者の利便性および安全性を含むさまざまな理由から、ポリペプチドが滑膜中でより長期間安定であることが好ましい。
したがって、ISVD 114F08を含むポリペプチドの滑液(SF)での安定性を、ポリペプチドのウシSF中での37℃で最大7日間のインキュベーションにより評価した。
結果を表3.5にまとめる。
表3.5:ISVD 114F08を含むポリペプチドのウシSFにおける安定性。
ポリペプチド754を、35GSリンカー(M−C−C)を使用して、抗MMP13 ISVD 62C02と2つの抗アグリカンISVD 114F08を遺伝的に連結することにより、操作した。ポリペプチド754−9はポリペプチド754と類似であったが、ここでは9GSリンカーを使用する。得られたアミノ酸配列を、それぞれ配列番号5および63として表A−1に示す。
ポリペプチド954を、35GSリンカー(A−C−C)を使用して、抗ADAMTS5 ISVD 2F03と2つの抗アグリカンISVD 114F08を遺伝的に連結することにより、操作した。ポリペプチド954−9(「973」を参照)はポリペプチド954と類似であったが、ここでは9GSリンカーを使用する。得られたアミノ酸配列を、それぞれ配列番号6および64として表A−1に示す。
ポリペプチド949は、35GSリンカー(M−A−C−C)を使用して、抗MMP13 ISVD 62C02、抗ADAMTS5 ISVD 2F03、および2つの抗アグリカンISVD 114F08を遺伝的に連結することにより、操作した。ポリペプチド949−9はポリペプチド949と類似であったが、ここでは9GSリンカーを使用する。得られたアミノ酸配列を、それぞれ配列番号1および62として表A−1に示す。
5.1 ポリペプチド949の、ヒト、カニクイザル、ラットのADAMTS5に対する親和性
ポリペプチド949の、ヒト、カニクイザル、およびラットADAMTS5に対する溶液中の親和性を、KinExAを使用して決定した。20pMの固定濃度(最終濃度)のポリペプチド949を、ヒト、カニクイザルまたはラットADAMTS5の16ポイント1/2.2連続希釈用量反応曲線に対して、24時間平衡化した;各時点は20nMで開始し、最終時点はブランク(=ADAMTS5なし)である。すべての希釈液は、試料バッファー(PBS+0.1%BSA+0.02%NaN3)中で調製した。アグリカンの干渉を試験するために、選択された実験において、組換えアグリカンG1−IGD−G2をこのプレインキュベーションに2nMの濃度で添加した(=ポリペプチド949のKDの100倍以上、下記参照)。
表5.1に示した結果は、ポリペプチド949のヒトADAMTS5に対する親和性が、G1−IGD−G2の非存在下で32.69pM、アグリカンの存在下で26.56pMであることを示す。KD値でのCIの重複に基づいて、アグリカンの存在は、ADAMTS5に対するポリペプチド949の親和性を妨げない。カニクイザルとラットADAMTS5に対する親和性は、それぞれ24.35pMと25.17pMであり、両方のKD値がヒトKDのCI内にあるため、ポリペプチド949の両方の種に対する結合交差反応性を示す。
表5.1:ポリペプチド949の、アグリカンG1−IGD−G2の非存在下または存在下でのヒトADAMTS5に対する親和性、およびカニクイザルとラットADAMTS5に対する親和性
C010100949によるヒト、カニクイザル、およびラットのADAMTS5の機能的阻害を、FRETベースの動態アッセイを使用して研究した。このアッセイは、FRETアッセイバッファー(MilliQ中、50mMのHEPES、pH7.5、100mMのNaCl、5mMのCaCl2*2H20、5%グリセロール、0.1%CHAPS)を使用して実施した。10nMの固定濃度(最終濃度)のそれぞれの種のADAMTS5を混合し、50nM(最終濃度)から始まる、ポリペプチド949の11ポイント(12番目=ブランク)1/1.7連続希釈DRCを用いて平衡化した。次に、30μM(最終濃度)の種特異的蛍光発生ADAMTS5基質を追加した。この基質、消光剤(2,4−ジニトロフェニル、Dnp)および蛍光色素(アミノ安息香酸、Abz)で標識されたアグリカンペプチドは、ADAMTS5によって酵素的に切断され、結果として生じる蛍光(励起波長340nm/発光波長430nm)を、1分ごとに2時間、Tecan F200マイクロプレートリーダーを使用して動力学的に測定した。得られた進行曲線(反応時間の関数での蛍光シグナル)は、GraphPad Prismソフトウェアを使用して、各進行曲線の線形部分を直線(Y=勾配*X+Y切片)に適合することにより分析した。得られた勾配または反応速度(vi)は、すべてのブランク試料の平均勾配(非阻害反応速度、v0)に対して正規化し、ポリペプチド949濃度の関数としてプロットし、非対称5パラメーターロジスティックス(5PL)曲線近似に適合させて、阻害曲線を取得する。
結果を図1に要約する;これは、結果の代表的な図解である。結果は、ポリペプチド949(「C010100949」)による、すべての試験種からのADAMTS5の酵素活性の用量依存的かつ完全な阻害を示し、これらはすべて、ナノボディ構築物によって完全に機能的に阻害されることを実証する。
ポリペプチド949の、異なる種からのMMP13に対する機能的活性および酵素阻害定数(KI)を、FRETベースの動態アッセイを使用して研究した。すべての希釈は、アッセイバッファー(50mMのTris(pH7.5)、100mMのNaCl、10mMのCaCl2*2H20、0.01%Tween20)中で実施した。9μM(最終濃度)から始まる、ポリペプチド949の1/3連続希釈11ポイント(12番目=ブランク)DRCを、0.2nMの一定濃度の種触媒ドメイン(cd)MMP13またはそれぞれの種の0.2〜20nMの活性化pro−MMP13(名目濃度)で平衡化した。次に、22μM(最終濃度)の一定濃度の蛍光発生MMP基質を、すべてのウェルに加えた。このコラーゲンベースの基質は、一般的なMMP切断配列であるプロリン−ロイシン−グリシン−ロイシン(PLGL)を含み、蛍光色素Mcaおよび消光剤Dpaで標識されている。活性酵素(ナノボディ構築物に結合されていない)は基質を切断することができ、蛍光色素の放出をもたらし、蛍光シグナル(励起波長320nm/発光波長405nm)をもたらすが、一方、中和された(ナノボディ構築物に結合した)酵素はそうではない。基質添加後1分以内に開始し、Tecan F200プレートリーダーを使用して、蛍光を、合計120サイクル(2時間)の間毎分動力学的に測定した。
これらのアッセイ条件において、得られたIC50値は阻害定数KIに等しい。
定量分析の結果を、表5.3にまとめる。2〜6回の独立した実験を相互作用ごとに繰り返した。6回の独立した反復実験に基づいて、ポリペプチド949のヒトcdMMP13に対する阻害定数は、27.86nM(95%CI:25.67〜30.23nM)であると決定された。独立して繰り返された3回の実験に基づいて、活性化ヒトpro−MMP13のKIは、2.92nM(95%CI:0.61〜14.02nM)と決定された。カニクイザルとラットMMP13に対するKI値は、触媒ドメインおよび活性化されたpro−MMP13の両方についてのヒトKIに強く対応しており、ポリペプチド949の、カニクイザルとラットMMP13に対する交差反応性を示す。
ポリペプチド949の、ヒト、カニクイザル、およびラットの組換えアグリカンG1−IGD−G2に対する親和性測定を、表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して、ProteOn XPR36相互作用アレイ機器(BioRad, serial n° 670BR6176)で実施した。簡潔に述べると、組換えアグリカンG1−IGD−G2(「リガンド」)を、10mM酢酸、pH4.5中、10μg/mLの濃度、および100μL/分の流量でアミンカップリングすることにより、GLCセンサーチップ(Biorad cat#176-5011)のリガンドレーンに固定し、400レゾナンスユニット(resonance unit)(RU)の固定レベルを目指した。ポリペプチド949(「C010100949」、「分析物」)を、45μL/分の連続流下でセンサーチップの分析レーンに沿って2分間、ランニングバッファーとして1xHBS−P+pH7.4(GE Healthcare cat#R-1006-71)中のさまざまな濃度(0.5−1−2−4−6−10nM)で注入した。解離時間は10分であった。各試料を注入した後、10mMグリシンpH1.5で表面を再生した。アグリカンG1−IGD−G2とポリペプチド949の相互作用は、ポリペプチド949のアグリカンへの結合によるチップ上の質量変化の結果として生じる屈折率(refractory index)の増加として検出した。この屈折率の変化により反射光の強度と角度が変化し、これはリアルタイムで定量的に測定され、センサーグラムにレスポンスユニット(response unit)(RU)対時間としてプロットされる。速度定数は、ProteOn Manager 3.1.0バージョン3.1.0.6ソフトウェアおよび「速度ラングミュアka/kd同時」モデルを使用して、得られたセンサーグラムから計算した。
ポリペプチド949のCAPビルディングブロックの作用機序(MoA)は、SPRベースの親和性決定に直接反映されるアグリカン結合のみに依存するため、CAPビルディングブロックのさらなる機能分析は関係しない。これらのSPRデータから、ポリペプチド949は、カニクイザルとラットアグリカンの両方に対して完全な交差反応性を示し、ヒトとの親和性の違いはないと結論付けることができる。
表5.4 949のヒト、カニクイザル、ラットのアグリカンG1−IGD−G2に対する親和性測定の結果の概要。平均KD値および95%信頼区間(CI)を、グローバル平均値の推定により計算した。N:独立した実験の数;KD:解離定数;NC:計算されず;(*)カニクイザルの場合、2回の独立した実験で同一の16.0pMの結果が得られ、ProteOnソフトウェアによってKDに関する標準エラー情報が提供されないために、CIは計算できなかった。
ポリペプチド949(M−A−C−C:62C02−2F03−114F08−114F08)を、ウシ軟骨外植片アッセイにおいて、軟骨分解の阻害について試験した。
簡潔に言えば、ポリペプチドを、IL−1αで5日間培養してOA様の軟骨分解プロセスを誘導したウシ軟骨外植片とインキュベートした。5日以内に主にアグリカンの分解が起こるが、コラーゲンの分解は約2週間後、すなわちここで記載される実験の終了後にのみ発生する。実験の最後に、分解した軟骨から培養上清に放出されたGAG(主にアグリカンに由来する)を定量化した。ポリペプチドによるGAG放出の阻害の有効性は、これらの条件下でIL−1α刺激によるGAG放出を完全に阻害した参照小分子阻害剤と比較して、計算した。
結果を図3に示す。
ポリペプチド949(図中のNB949)は、ウシ軟骨の分解を、用量依存的に完全に阻害することがわかる。
ポリペプチド949(M−A−C−C:62C02−2F03−114F08−114F08)を、ヒト軟骨外植片アッセイにおいて、軟骨分解の阻害について試験した。簡潔に言えば、ポリペプチドを、IL−1β+オンコスタチンM(OSM)で7日間培養したヒト軟骨外植片とインキュベートした。7日以内に主にアグリカンの分解が起こるが、コラーゲンの分解は約2週間後、すなわちここで記載される実験の終了後にのみ発生する。実験の最後に、分解した軟骨から培養上清に放出されたGAG(主にアグリカンに由来する)を定量化した。IC50は、最大のGAG損失の測定値として、陰性対照レベル(=追加刺激なしの外植片からのGAG放出)およびIL−1β+OSMレベルに基づいて計算した。GAGは、個々の外植片の軟骨1mgあたりのGAG放出(μg)として示される。
結果を図4に示す。
データは、ナノボディ構築物が、用量依存的にヒトOA軟骨からのGAG放出を阻害することを示し、計算されたIC50は0.03724μMである。
ポリペプチドを軟骨に固定するように機能するCAP部分の効果を評価するために、上記の外植片アッセイを、軟骨外植片のポリペプチドとのインキュベーションステップ(1h)に続き洗浄ステップを含むように修正した(図5、上部パネルを参照)。洗浄ステップの後、IL−1αを添加することにより軟骨の分解が開始された。さらに7日間インキュベートした後、培養上清へのGAG放出を定量化した。対照として、CAP結合部分(配列番号65)を含まないADAMTS5阻害ポリペプチド581が含まれた。
結果を図5に示す。
この実験は、対照ポリペプチド581、すなわちCAP結合部分を含まないポリペプチドが、ADAMTS5を阻害する効果をほとんど示さなかったことを示す。これは、洗浄ステップが省略されたアッセイとは非常に対照的である。一方、ポリペプチド949は、大規模な洗浄を行った後でも効果があった。現在のアッセイ条件下において、GAP放出がMMP13ではなくADAMTS5によって駆動されることを考えると、この結果は、CAP結合部分が実際にポリペプチドを軟骨に固定するように機能し、CAP結合部分がADAMTS5 ISVDの有効性に影響しないことを、強く示す。
OAには軟骨のみが関与するのではないことを知るため、ポリペプチド949をまた、滑膜(滑膜)および関節軟骨からの外植片で構成されるウシモデルで試験した。簡単に言えば、軟骨外植片と滑膜の比率1/1で、培地を定期的に交換しながら28日間共培養した。毎週、C2M(Col II分解)およびC3M(Col III分解)を共培養の上清で測定した。
結果(AUC=曲線下面積として)を図6に示す。
データは、軟骨外植片と滑膜との共インキュベーションが、C2M(左グラフ)とC3M(右グラフ)の放出を誘導することを示す。ポリペプチド949を3つの異なる濃度(1nM、10nM、100nM)でインキュベートした。ポリペプチド949の効果は、参照分子Wyeth(MSC2310852A-1)と比較して評価した。データは、例示的なポリペプチド949および参照化合物が、C2MおよびC3M放出を強く阻害することを示している。
in vivoでのナノボディ構築物の保持を決定するために、例示的なポリペプチド949を使用してラット軟骨保持研究を設計した。ポリペプチド949は4つのビルディングブロックを有するため(MACC)、ポリペプチド754および954はそれぞれ2つのアグリカン結合剤および1つの標的特異的ISVDを有して、基本的に同様に動作する。
ELISAベースのリガンド結合アッセイは、ラットの軟骨の局所ナノボディ構築物濃度を定量化するために開発し、リガンド結合アッセイ(MSDプラットフォーム)は、循環中のナノボディ構築物を定量化するために開発した。
結果を図7に示す。
結論として、例示的なポリペプチド949は、IA投与後112日までin vivoで軟骨に保持され、全身濃度(低pg/ml範囲)は、健康なラットにおいて最初のサンプリング時点(IA注射後2時間)でのみ検出可能であり、一方その後の時点(14日以上)ではポリペプチドを検出できなかった。
したがって、抗アグリカンISVD 114F08を含む構築物は安定であり、in vivoモデルで保持される。
ポリペプチド754(M−C−C;「ナノボディ754」)、ポリペプチド954(A−C−C;「ナノボディ954」)およびポリペプチド949(M−A−C−C、「ナノボディ949」)のin vivoでの有効性を実証するために、ラットで外科的に誘発された内側半月板断裂(Tear)(MMT)モデルを使用した。簡潔に言えば、ラットの片膝を手術して、OA様の症状を引き起こした。処置は、手術後3日目にIA注射により開始した。以下の用量を、手術後3日目に動物に投与した:ビヒクル(バッファー)、ポリペプチド754(300μg/ラット)、ポリペプチド949(4、40または400μg/ラット)およびポリペプチド954(300μg/ラット)。術後42日目に組織病理学を実施した。内側脛骨軟骨変性幅および内側脛骨総軟骨変性幅、ならびに軟骨変性の減少率を決定した。群当たり20匹の動物を使用した。
内側脛骨軟骨変性幅の結果を図8に示す。
(a)CAP部分は、構築物の活性に悪影響を与えない;
(b)CAP部分は、構築物の保持を可能にする;
(c)すべての構築物は、軟骨の幅にプラスの効果を有する;および
(d)ADAMTS5阻害剤とMMP13阻害剤の組み合わせは、ポリペプチドによって例示されるように、全体として最大の効果を示す。
例11(DMOAD試験1)に記載のin vivo有効性試験を、異なる投与計画で基本的に繰り返した。さらに、DMOAD試験1では、術後3日目に軽度のOAのみが存在した。したがってポリペプチドは、MMTモデルではOAのより進行した段階で評価し、一方処置は、手術の7日後に開始した。簡潔に述べると、内側脛骨軟骨変性幅は術後42日目に測定した。再度、ポリペプチド949を使用して、ADAMTS5とMMP13阻害剤の複合効果を実証した。
群ごとに20匹の動物で構成される最初の一連の実験では、各群は術後7日間にIA注射(400μg、800μg、ビヒクル)を1回受けた。処置の終了時に、400μgのポリペプチド949を投与した群は内側脛骨軟骨変性幅が21%減少したが、800μgの群は16%の減少を示した(図9参照)。これらの結果は、構築物の有効性を確認する。
群ごとに20匹の動物で構成される2回目の一連の実験では、各群は術後7日目と10日目に2回のIA注射(200μg、400μg、800μg、ビヒクル)を受けた。処置の終了時に、200μgのポリペプチド949を投与した群では脛骨幅が14%減少し、800μg群では31%減少し、一方400μg群では35%減少した(図9)。
ポリペプチドの症候性の利益を提供する能力を評価するために、ラットの外科的OAモデルを使用した。簡潔に言えば、ラットをACLtおよびtMx手術で処置して、0日目にOAを誘導した。ACLtおよびtMx外科的モデル(内側半月板切除で拡大された前十字靭帯切除)において、構築物を、異なる濃度(100μg、400μg、および1000μg)で1週目および8週目にIA投与した。ラットの1つの群は、抗神経成長因子(NGF)mAbであるタネズマブ(Pfizer)でIA処置し、これは、本試験での症状緩和の陽性対照として含まれた。2、5、9、および13週目に、歩行分析(CatWalk上)による症候性利益、および関節の直径の減少を決定した。
結果を図10に示す。
ポリペプチドによる関節内処置は、最大43%の症候性の利益をもたらした。
健康なラットにおける軟骨保持試験の例10において、本発明のポリペプチドが関節内(I.A.)注射後112日まで軟骨で測定可能であることが示された。軟骨組成物は、全身循環における軟骨の結合および吸収に影響を与える可能性があるため、本発明のポリペプチドの薬物動態を、罹患した変形性関節症ラットと健康なラットにおいて、ポリペプチドの血清レベルをin vivoで時間とともに追跡することにより比較した。
本発明のCAP結合剤に融合したADAMTS5阻害剤のin vivo効力を実証するために、ラットで外科的に誘発された内側半月板断裂(MMT)モデルを使用した。簡単に述べると、抗ADAMTS5ナノボディを、CAP結合剤(ナノボディ構築物C010100954またはナノボディ構築物954として示される)に結合させた。ラットの片膝を手術して、OA様の症状を引き起こした。処置は、手術後3日目にIA注射により開始した。組織病理学を術後42日目に実施した。中間および最終血清試料を、探索的バイオマーカー分析のために採取した。内側および全体の実質的軟骨変性の幅、ならびに軟骨変性の減少率を決定した。群当たり20匹の動物を使用した。
特に、ラットで外科的に誘発された内側半月板断裂(MMT)モデルを、例10に記載されているように使用したが、いくつかの修正を加えた。簡潔に言えば、本発明のポリペプチドを、抗MMP13 ISVおよび抗ADAMTS5 ISV(「949」、「0949」または「C010100949」ナノボディと呼ぶ)に結合した。ラットの片膝を手術して、OA様の症状を引き起こした(OA群)。各処置群(健康およびOA)は15匹の動物で構成され、400μg/30μlのナノボディの単一のI.A.注射が、7日目(健康)または術後7日目(MMT)に与えられた。血清試料を麻酔ラットから以下の時点で収集した:0日目、および7日目(0時間=投与前試料)、8日目(処置後24時間までの異なる時間)、9日目(処置後48時間)、d10(処置後3日)、d14(処置後7日)、d21(処置後14日)およびd42(処置後35日)。収集した血清試料を、電気化学発光(ECL)ベースの総PKアッセイ形式でのポリペプチド濃度の決定に使用し、続いてノンコンパートメント解析を行った。
健康なラットとOAラットの血清中のポリペプチドの保持を、図11に示す。
結果は、健康なラットとOAラットのポリペプチドの血清濃度に明らかな違いが見られないことを示す。したがってこれらの結果は、軟骨の分解が本発明のポリペプチドの薬物動態に影響を及ぼさないことを支持する。
Claims (30)
- 以下からなる群から選択される、ポリペプチド:
(a)少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)を含むポリペプチドであって、ここで第1のISVDはマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)に特異的に結合し、第2のISVDはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第3のISVDを含む、前記ポリペプチド;
(b)少なくとも2つのISVDを含むポリペプチドであって、ここで第1のISVDはトロンボスポンジンモチーフを有するAディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ(ADAMTS)に特異的に結合し、第2のISVDはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第3のISVDを含む、前記ポリペプチド;および
(c)少なくとも3つのISVDを含むポリペプチドであって、ここで第1のISVDはマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)に特異的に結合し、第2のISVDはADAMTSに特異的に結合し、第3のISVDはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第4のISVDを含む、前記ポリペプチド。 - 第1のISVDがMMPに特異的に結合し、第2のISVDがADAMTSに特異的に結合し、第3のISVDがアグリカンに特異的に結合し、第4のISVDがアグリカンに特異的に結合する、請求項1に記載のポリペプチド。
- MMPがMMP13である、請求項1または2に記載のポリペプチド。
- MMP13に特異的に結合するISVDが3つの相補性決定領域(それぞれCDR1〜CDR3)を含む、請求項3に記載のポリペプチドであって、ここで
(i)CDR1は、配列番号8;または
配列番号8と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり;
(ii)CDR2は、配列番号10;または
配列番号10と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり;および
(iii)CDR3は、配列番号12;または
配列番号12と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列である、
前記ポリペプチド。 - CDR1が配列番号8であり、CDR2が配列番号10であり、CDR3が配列番号12である、請求項4に記載のポリペプチド。
- MMP13に特異的に結合するISVDが、配列番号2を含むかまたはそれからなる、請求項4または5に記載のポリペプチド。
- ADAMTSがADAMTS5である、請求項1〜6のいずれかに一項に記載のポリペプチド。
- ADAMTS5に特異的に結合するISVDが、3つの相補性決定領域(それぞれCDR1〜CDR3)を含む、請求項7に記載のポリペプチドであって、ここで
(i)CDR1は、配列番号14[GRTVSSYAMG]または
配列番号14と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり;
(ii)CDR2は、配列番号16[GISRSAERTY]または
配列番号16と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり;
および
(iii)CDR3は、配列番号18[DLDPNRIFSREEYAY]または
配列番号18と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列である、
前記ポリペプチド。 - CDR1が配列番号14であり、CDR2が配列番号16であり、CDR3が配列番号18である、請求項8に記載のポリペプチド。
- ADAMTS5に特異的に結合するISVDが、配列番号3を含むかまたはそれからなる、請求項8または9に記載のポリペプチド。
- アグリカンに特異的に結合するISVDが、3つの相補性決定領域(それぞれCDR1〜CDR3)を含む、請求項3に記載のポリペプチドであって、ここで、
(i)CDR1は、配列番号19または
配列番号19と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり;
(ii)CDR2は、配列番号21または
配列番号21と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり;および
(iii)CDR3は、配列番号23または
配列番号23と1、2または3個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列である、
前記ポリペプチド。 - CDR1が配列番号19であり、CDR2が配列番号21であり、CDR3が配列番号23である、請求項11に記載のポリペプチド。
- アグリカンに特異的に結合するISVDが、配列番号4を含むまたはそれからなる、請求項11または12に記載のポリペプチド。
- ISVDが、リンカーを介して互いに連結している、請求項1〜13のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- リンカーが、配列番号24〜40からなる群から、好ましくは配列番号28[9GS]または配列番号35[35GS]から選択される、請求項14に記載のポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドであって、ここで第1のISVDがMMP13に特異的に結合し、第2のISVDがADAMTS5に特異的に結合し、第3のISVDがアグリカンに特異的に結合し、第4のISVDがアグリカンに特異的に結合し、およびここで前記ポリペプチドは、好ましくは配列番号1もしくは62を含むかまたはそれからなるか、または配列番号1もしくは62と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドを含むかまたはそれからなる、前記ポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドであって、ここで第1のISVDがMMP13に特異的に結合し、第2のISVDがアグリカンに特異的に結合し、第3のISVDがアグリカンに特異的に結合し、好ましくは配列番号5または63を含むかまたはそれからなる、前記ポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドであって、ここで第1のISVDがADAMTS5に特異的に結合し、第2のISVDがアグリカンに特異的に結合し、第3のISVDがアグリカンに特異的に結合し、好ましくは配列番号6または64を含むかまたはそれからなる、前記ポリペプチド。
- 請求項1〜18のいずれかに一項に記載のポリペプチドであって、ここで、
(i)MMP13に特異的に結合するISVDが、4つのフレームワーク領域(それぞれFR1〜FR4)および3つの相補性決定領域CDR1〜CDR3から本質的になり;および/または
(ii)ADAMTS5に特異的に結合するISVDが、4つのフレームワーク領域(それぞれFR1〜FR4)および3つの相補性決定領域CDR1〜CDR3から本質的になり;および/または
(iii)アグリカンに特異的に結合するISVDが、4つのフレームワーク領域(それぞれFR1〜FR4)および3つの相補性決定領域CDR1〜CDR3から本質的になる、
前記ポリペプチド。 - 請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むか、または本質的にそれからなり、任意に1つ以上のペプチドリンカーを介して連結される1つ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含む、構築物。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項20に記載の構築物をコードする、核酸。
- 請求項21に記載の核酸を含む、発現ベクター。
- 請求項21に記載の核酸、または請求項21に記載の発現ベクターを含む、宿主または宿主細胞。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項19に記載の構築物、または請求項21に記載の核酸を含む、組成物。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドを生産する方法であって、前記方法が、少なくとも以下のステップ:
a)適切な宿主細胞、宿主生物または適切な発現系において、請求項21に記載の核酸を発現させること;任意にこれに続いて、
b)請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドを、単離および/または精製すること、
を含む、前記方法。 - 医薬組成物である、請求項24に記載の組成物。
- 少なくとも1つの薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤および/またはアジュバントをさらに含み、任意に1つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび/または化合物を含む、請求項26に記載の組成物。
- 医薬として使用するための、請求項26または27に記載の組成物、請求項1〜19のいずれかに一項に記載のポリペプチド、または請求項20に記載の構築物。
- 関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎、アグリカノパチー、NASH、慢性歯周炎および腹部大動脈瘤の、症状の予防または処置に使用するための、請求項26または27に記載の組成物、請求項1〜19のいずれかに一項に記載のポリペプチド、または請求項20に記載の構築物。
- 個体の疾患または障害の症状を予防または処置する方法であって、方法が、請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項20に記載の構築物、または請求項26もしくは27に記載の組成物を、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎、アグリカノパチー、NASH、慢性歯周炎および腹部大動脈瘤の症状を処置または予防するための有効量で、前記個体に投与することを含む、前記方法。
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