BR112019025147A2 - Polipeptídeos que ligam adamts5, mmp13 e aggrecan - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a polipeptídeos que ligam Aggrecan, bem como a ADAMTS5 e/ou MMP13, mais especificamente a polipeptídeos que compreendem ou consistem essencialmente em imunoglobulinas que ligam Aggrecan, bem como imunoglobulinas que ligam ADAMTS5 e/ou imunoglobulinas que ligam MMP13 (também aqui referidos como "polipeptídeos da invenção" e "imunoglobulina (s) da invenção", respectivamente). A invenção também se refere a construtos compreendendo essas imunoglobulinas, como domínios variáveis únicos de imunoglobulina (ISVDs) ou polipeptídeos, bem como ácidos nucleicos que codificam essas imunoglobulinas ou polipeptídeos (também aqui referidos como "ácido nucleico da invenção"; a métodos para preparar tais imunoglobulinas, polipeptídeos e construtos; células hospedeiras que expressam ou são capazes de expressar tais imunoglobulinas ou polipeptídeos; a composições e, em particular, a composições farmacêuticas que compreendem essas imunoglobulinas, polipeptídeos, construtos, ácidos nucleicos e/ou células hospedeiras; e a usos de imunoglobulinas, polipeptídeos, construtos, ácidos nucleicos, células hospedeiras e/ou composições, em particular para fins profiláticos e/ou terapêuticos, tais como os fins profiláticos e/ou terapêuticos aqui mencionados. Outros aspectos, modalidades, vantagens e aplicações da invenção ficarão claros a partir da descrição adicional aqui.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPEPTÍDEOS QUE LIGAM ADAMTS5, MMP13 E AGGRECAN". 1 CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a polipeptídeos que ligam Aggrecan, bem como a ADAMTS5 e/ou MMP13, mais especificamente a polipeptídeos que compreendem ou consistem essencialmente em imunoglobulinas que ligam Aggrecan, bem como imunoglobulinas que ligam ADAMTS5 e/ou imunoglobulinas que ligam MMP13 (também aqui referido como "polipeptídeos da invenção" e "imunoglobulina (s) da invenção", respectivamente). A invenção também se refere o construtos compreendendo essas imunoglobulinas, como domínios variáveis únicos de imunoglobulina (ISVDs) ou polipeptídeos, bem como ácidos nucleicos que codificam essas imunoglobulinas ou polipeptídeos (também aqui referidos como "ácido nucleico da invenção"; a métodos para preparar tais imunoglobulinas, polipeptídeos e construtos; a células hospedeiras que expressam ou são capazes de expressar tais imunoglobulinas ou polipeptídeos; a composições e, em particular, a composições farmacêuticas que compreendem essas imunoglobulinas, polipeptídeos, construtos, ácidos nucleicos e/ou células hospedeiras; e a usos de imunoglobulinas, polipeptídeos, construtos, ácidos nucleicos, células hospedeiras e/ou composições, em particular para fins profiláticos e/ou terapêuticos, tais como os fins profiláticos e/ou terapêuticos aqui mencionados. Outros aspectos, modalidades, vantagens e aplicações da invenção ficarão claros a partir da descrição adicional aqui. 2 ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A osteoartrite (OA) é uma das causas mais comuns de incapacidade em todo o mundo. Afeta 30 milhões de americanos e é o distúrbio articular mais comum. Prevê-se que afete mais de 20% da população dos EUA até 2025. A doença não é sistêmica e geralmente é restrita a algumas articulações. No entanto, a doença pode ocorrer em todas as articulações, na maioria das vezes nos joelhos, quadris, mãos e coluna vertebral. A OA é caracterizada por erosão progressiva da cartilagem articular (cartilagem que cobre os ossos), resultando em dor crônica e incapacidade. Eventualmente, a doença leva à destruição total da cartilagem articular, esclerose do osso subjacente, formação de osteófitos etc., tudo levando à perda de movimento e dor. A osteoartrite pode ser definida como um grupo diversificado de condições, caracterizado por uma combinação de sintomas articulares, sinais decorrentes de defeitos na cartilagem articular e alterações nos tecidos adjacentes, incluindo ossos, tendões e músculos. O sintoma mais proeminente da OA é a dor e esse é o motivo pelo qual os pacientes procuram ajuda médica. Não existe cura para a OA, isto é, os tratamentos atuais não inibem a deterioração estrutural da articulação da OA. O gerenciamento de doenças é limitado a tratamentos que são paliativos, na melhor das hipóteses, e pouco fazem para abordar a causa subjacente da progressão da doença.

[003] Fármacos antiosteoartríticos modificadores de doenças (DMOADs), que podem ser definidos como fármacos que inibem a progressão estrutural da doença e, idealmente, também melhoram os sintomas e/ou a função, são intensamente procuradas. É provável que os DMOADs sejam prescritos por longos períodos nesta doença crônica de uma população em envelhecimento, exigindo, portanto, excelentes dados de segurança em uma população alvo com múltiplas comorbidades e o potencial de interações medicamentosas.

[004] Embora o início da doença possa ser multifatorial, a destruição da cartilagem parece resultar da destruição proteolítica descontrolada da matriz extracelular (ECM). Os componentes de ECM mais abundantes da cartilagem articular são o colágeno (principal colágeno II) e os proteoglicanos, principalmente o aggrecan (Kiani et al.

2002 Cell Research 12: 19-32).

[005] O Aggrecan é importante no bom funcionamento da cartilagem articular, pois fornece uma estrutura de gel hidratado que confere à cartilagem propriedades de suporte de carga. O aggrecan é uma molécula grande e multimodular (2317 aminoácidos) expressa por condrócitos. Sua proteína principal é composta por três domínios globulares (G1, G2 e G3) e uma grande região estendida entre G2 e G3 para ligação da cadeia glicosaminoglicana. Esta região estendida compreende dois domínios, um substituído com cadeias de sulfato de queratan (domínio KS) e outro com cadeias de sulfato de condroitina (domínio CS). O domínio CS possui 100-150 cadeias de glicosaminoglicano (GAG) ligadas a ele. O aggrecan forma grandes complexos com hialuronano, nos quais 50 a 100 moléculas de aggrecano interagem via domínio G1 e proteína de ligação com uma molécula de hialuronano. Após a captação de água (devido ao conteúdo de GAG), esses complexos formam um gel reversivelmente deformável que resiste à compressão. A estrutura, a retenção de líquidos e a função da cartilagem articular estão ligadas ao conteúdo da matriz de Aggrecan e à quantidade de sulfato de condroitina ligada à proteína do núcleo intacta. Estruturalmente, a OA é caracterizada pela degradação do Aggrecan, liberando progressivamente os domínios G3 e G2 (resultando em 'deflação' da cartilagem) e, eventualmente, liberando o domínio G1 e a degradação do colágeno, destruindo irreversivelmente a estrutura da cartilagem. O sítio de clivagem de Aggrecan mais significativo na patogênese de OA está localizado na sequência TEGE373 ↓ 374ARGS. Este sítio de clivagem está posicionado no domínio interglobular (IGD) de Aggrecan, localizado entre os domínios G1 e G2.

[006] Os anticorpos que reconhecem o neo-epítopo 374ARGS levaram à descoberta da aggrecanase-1, que provou ser ADAMTS4 e aggrecanase-2, que é ADAMTS5. Posteriormente, outras enzimas da ADAMTS relacionadas, incluindo ADAMTS1, -8, -9, -15 e -20, mostraram ter atividade da agrecanase.

ADAMTS16 e 18 também são agrecanases fracas.

Várias linhas de evidência indicam que a ADAMTS5 é uma enzima principal envolvida na patogênese da osteoartrite.

Nos explantes e condrócitos da cartilagem humana, a eliminação da ADAMTS5 atenuou a degradação do Aggrecan, sugerindo que esta enzima pode estar envolvida nos tecidos humanos.

A expressão da enzima é aumentada por citocinas como a interleucina- 1 e oncostatina-M, que provocam a degradação do Aggrecan nos tecidos.

Os fragmentos de Aggrecan gerados pelo ADAMTS5 são detectados no fluido sinovial e no soro de pacientes com OA (Germaschewski et al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22: 690-697). Várias empresas farmacêuticas têm desenvolvido DMOADs.

Alguns desses compostos são reivindicados como específicos para a ADAMTS5, enquanto outros também têm efeito contra outros membros da ADAMTS, ou mesmo contra metaloproteinases da matriz.

Essas inibições cruzadas contra as MMPs, em particular, são consideradas responsáveis pela síndrome músculo-esquelética (MSS), um efeito colateral causado por inibidores de amplo espectro e envolvendo artralgia, mialgia, rigidez articular e tendinite (Santamaria et al., 2015 Biochem J 471: 391-401). Esses efeitos colaterais foram um motivo para interromper o desenvolvimento.

O inibidor da aggrecanase da Pfizer AGG-523 foi usado em um ensaio clínico de fase I em OA, mas não foi levado mais longe.

Os outros inibidores de ADAMTS de molécula pequena também não entraram em nenhum desenvolvimento clínico adicional como DMOAD potencial (Bondeson et al., 2015 Drug Discovery 10: 5-14). O inibidor GLPG1972 de Galapagos / Servier ADAMTS5 terminou recentemente um estudo de fase I, mas sua eficácia ainda não foi determinada.

De fato, apesar de vários ensaios clínicos recentes que investigam especificamente DMOADs, nenhum tratamento foi aprovado até o momento (El Bakali et al., 2014 Future Medicinal Chemistry (Review) 6: 1399). Um estudo do anticorpo monoclonal Rottapharm (mAb) CRB0017, direcionado contra o domínio espaçador da ADAMTS5, mostrou que em camundongos, a administração intra-articular desse mAb impediu significativamente a progressão da doença de maneira dependente da dose (Chiusaroli et al., 2013 Osteoartrite Cartilagem 21: 1807). No entanto, não houve comparação com a administração sistêmica, nem foi avaliado em que grau o mAb vazou do espaço sinovial. Outro estudo usou a administração sistêmica do mAb 12F4 em camundongos, que demonstrou a modificação estrutural da doença e o alívio do comportamento relacionado à dor (Miller et al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22iii, S35). No entanto, uma única administração de mAb 12F4 em macaco cinomolgo causou hemorragia focal, um aumento da pressão arterial média dependente da dose e anormalidades na condutância cardíaca (mais especificamente elevações de ST e arritmias ventriculares no ECG) indicando isquemia cardíaca, que foi mantida por até 8 meses após a administração da dose única (Larkin et al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22iii, S483). Também neste caso, os efeitos colaterais interromperam o desenvolvimento clínico adicional do mAb 12F4.

[007] Ao lado das enzimas ADAMTS, há evidências convincentes de que também as metaloproteinases da matriz (MMPs) têm um papel importante na destruição dos tecidos associados à OA. As MMPs são uma família de endopeptidases dependentes de zinco envolvidas na degradação da matriz extracelular e na remodelação de tecidos. Existem cerca de 28 membros da família MMP, que podem ser classificados em vários subgrupos, incluindo colagenases, gelatinases, estromelisinas, MMPs do tipo membrana, matrilisinas, enamelisinas e outros. As colagenases, compreendendo MMP1, MMP8, MMP13 e MMP18, são capazes de degradar colágenos fibrilares triplos helicoidais em fragmentos distintos 3/4 e 1/4. Além disso, também foi demonstrado que a MMP14 cliva o colágeno fibrilar e há evidências de que a MMP2 também é capaz de colagenólise. As MMPs são consideradas alvos terapêuticos atraentes para o tratamento da OA. No entanto, como mencionado acima, os inibidores de MMP de amplo espectro desenvolvidos para o tratamento da artrite falharam em ensaios clínicos devido a efeitos colaterais dolorosos e de rigidez articular, isto é, MSS.

[008] As intervenções terapêuticas nas articulações foram ainda mais dificultadas pela dificuldade de direcionar medicamentos à cartilagem articular. Como a cartilagem articular é um tecido avascular e alinfático, as rotas tradicionais de entrega da fármaco (oral, intravenosa, intramuscular) dependem, em última análise, da transferência transsinovial de fármacos dos capilares sinoviais para a cartilagem por difusão passiva. Isso levou ao desenvolvimento de entrega intra-articular (IA) de medicamentos. Embora a entrega IA contornasse o problema da difusão passiva, a administração de proteínas terapêuticas por IA foi limitada pela rápida remoção do espaço articular e pela principal falta de retenção na cartilagem. Notavelmente, o tempo de permanência sinovial de uma fármaco na articulação geralmente é inferior a 24 h (Edwards 2011 Vet J 190: 15-21; Larsen et al., 2008 J Pham Sci 97: 4622-4654). Devido à rápida eliminação da maioria dos medicamentos injetados com IA, seriam necessárias injeções frequentes para manter uma concentração eficaz (Owen et al., 1994 Br J Clin Pharmacol 38: 349-355). No entanto, injeções frequentes de IA são indesejadas devido à dor e desconforto, pois podem causar desafios à adesão do paciente, bem como ao risco de introdução de infecções nas articulações.

[009] Permanece a necessidade de DMOADs eficazes.

3 SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[010] A presente invenção visa a fornecer polipeptídeos e construtos contra OA com propriedades profiláticas, terapêuticas e/ou farmacológicas aprimoradas, além de outras propriedades vantajosas (como, por exemplo, facilidade de preparação aprimorada, boa estabilidade e/ou custos reduzidos de mercadorias), em comparação com as sequências de aminoácidos e anticorpos da técnica anterior. Em particular, a presente invenção visa a fornecer polipeptídeos que inibem ADAMTS5 e/ou MMP13, enquanto são retidos por longos períodos nas articulações.

[011] Percebendo que a osteoartrite não evolui uniformemente e que o ritmo da progressão da lesão pode ser muito variável - em casos extremos, a osteoartrite pode permanecer estável por décadas, enquanto em outros pacientes a OA progride muito rapidamente para concluir a destruição da cartilagem no espaço de um alguns meses -, os presentes inventores levantaram a hipótese (sem estarem limitados pela teoria) que um padrão variável de progressão da doença pode ser devido a um padrão de atividade não homogêneo de várias proteases.

[012] Depois de identificar inibidores eficazes da protease de diferentes famílias e porções de ancoragem da cartilagem por triagem criativa e não convencional, caracterização e estratégias combinatórias, os presentes inventores desenvolveram combinações nas quais várias funcionalidades foram unidas. Dois polipeptídeos duplos específicos foram projetados compreendendo porções de ancoragem de cartilagem que ligam Aggrecan (CAP) e um inibidor de ADAMTS5 ou um inibidor de MMP13, bem como polipeptídeos tri-específicos compreendendo um inibidor de ADAMTS5, um inibidor de MMP13 e ligantes de CAP.

[013] Foi demonstrado que os polipeptídeos da invenção permaneceram eficazes em vários sistemas modelo, representando diferentes estados de OA, mesmo quando as moléculas de referência

(Wyeth e Pfizer) não eram.

[014] Os presentes inventores foram capazes de identificar e reprojetar os aglutinantes de CAP que permaneceram eficazes mesmo quando combinados com duas outras porções. Também foi demonstrado que a porção CAP dos polipeptídeos da invenção resultou em uma retenção aumentada na articulação.

[015] Também foi demonstrado que os polipeptídeos da invenção permaneceram estáveis na articulação.

[016] Portanto, os polipeptídeos da presente invenção seriam, por um lado, amplamente úteis em pacientes com OA, enquanto, por outro lado, a carga do cronograma de administração (IA) seria aliviada. Além disso, combinando as várias porções em uma molécula, a dose efetiva pode ser aumentada.

[017] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo escolhido do grupo que consiste em (a) polipeptídeos compreendendo pelo menos 2 domínios variáveis únicos de imunoglobulina (ISVD), nos quais um primeiro ISVD liga especificamente uma matriz metaloproteinase (MMP) e um segundo ISVD liga especificamente Aggrecan, e opcionalmente compreendendo um terceiro ISVD que liga especificamente Aggrecan; (b) polipeptídeos compreendendo pelo menos 2 ISVDs, nos quais um primeiro ISVD liga especificamente uma desintegrina e metaloproteinase com motivos de trombospondina (ADAMTS) e um segundo ISVD liga especificamente Aggrecan, e opcionalmente compreendendo um terceiro ISVD que liga especificamente Aggrecan; e (c) polipeptídeos compreendendo pelo menos 3 ISVDs, nos quais um primeiro ISVD liga especificamente uma MMP, um segundo ISVD liga especificamente uma ADAMTS e um terceiro ISVD liga especificamente Aggrecan, e opcionalmente compreendendo um quarto ISVD que liga especificamente Aggrecan.

[018] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito aqui, no qual um primeiro ISVD liga especificamente uma MMP, um segundo ISVD liga especificamente uma ADAMTS, um terceiro ISVD liga especificamente Aggrecan e um quarto ISVD liga especificamente Aggrecan, de preferência a referida MMP é MMP13.

[019] Em um aspecto, a presente invenção fornece um ISVD como aqui descrito, em que o referido ISVD tem a estrutura FR1-CDR1-FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4, na qual CDR1, CDR2 e CDR3 são como aqui definidas e FR1, FR2, FR3 e FR4 são sequências de estrutura.

[020] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido ISVD que liga MMP13 especificamente consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FR4, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente), nas quais (i) (a) CDR1 é SEQ ID NO: 8; e (b) sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferenças (s) de aminoácido com a SEQ ID NO: 8; (ii) (c) CDR2 é SEQ ID NO: 10; e (d) sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 10; e (iii) (e) CDR3 é SEQ ID NO: 12; e (f) sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 12; de preferência em que CDR1 é SEQ ID NO: 8, CDR2 é SEQ ID NO: 10 e CDR3 é SEQ ID NO: 12; ainda mais preferivelmente em que o referido ISVD que liga especificamente MMP13 é representado pela SEQ ID NO:

2.

[021] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que a referida ADAMTS é ADAMTS5, de preferência, em que o referido ISVD que especificamente liga ADAMTS5 consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FR4, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3 respectivamente), em que (i) (a)

CDR1 é SEQ ID NO: 14 [GRTVSSYAMG]; e (b) sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 14; (ii) (c) CDR2 é SEQ ID NO: 16 [GISRSAERTY]; e (d) sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 16; e (iii) (e) CDR3 é SEQ ID NO: 18 [DLDPNRIFSREEYAY]; e (f) sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 18; ainda mais preferivelmente, em que CDR1 é SEQ ID NO: 14, CDR2 é SEQ ID NO: 16 e CDR3 é SEQ ID NO: 18; e ainda mais preferivelmente, em que o referido ISVD que especificamente liga ADAMTS5 é representado pela SEQ ID NO: 3.

[022] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido ISVD que liga especificamente Aggrecan consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FR4, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente), nas quais (i) (a) CDR1 é SEQ ID NO: 19; e (b) sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 19; (ii) (c) CDR2 é a SEQ ID NO: 21; e (d) sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 21; e (iii) (e) CDR3 é a SEQ ID NO: 23; e (f) sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 23; mais preferivelmente, em que CDR1 é SEQ ID NO: 19, CDR2 é SEQ ID NO: 21 e CDR3 é SEQ ID NO: 23; ainda mais preferivelmente, em que o referido ISVD que liga especificamente Aggrecan é representado pela SEQ ID NO: 4.

[023] Em modalidades preferidas de todos os aspectos da invenção, um domínio variável único de imunoglobulina (ISVD) de acordo com a invenção consiste preferivelmente em ou consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FR4, respectivamente)

e três regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3, conforme descrito aqui acima e abaixo. As sequências estruturais preferidas são divulgadas, por exemplo, na tabela A-2 abaixo e podem ser usadas em um ISVD da invenção. De preferência, os CDRs representados na Tabela A-2 são combinados com as respectivas regiões estruturais da mesma construto ISVD.

[024] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que os referidos ISVDs estão ligados entre si por meio de um ligante, de preferência o referido ligante é escolhido do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 24 a 40, preferivelmente SEQ ID NO: 28 [9GS] ou SEQ ID NO: 35 [35GS].

[025] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo conforme descrito aqui, no qual o referido primeiro ISVD liga especificamente MMP13, o segundo ISVD liga especificamente ADAMTS5, o referido terceiro ISVD liga especificamente Aggrecan e o referido quarto ISVD liga especificamente Aggrecan, de preferência representado por SEQ ID NO: 1 ou 62.

[026] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, no qual o referido primeiro ISVD liga especificamente MMP13, o segundo ISVD liga especificamente Aggrecan e o referido terceiro ISVD liga especificamente Aggrecan, de preferência representado por SEQ ID NO: 5 ou 63.

[027] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, no qual o referido primeiro ISVD liga especificamente ADAMTS5, o referido segundo ISVD liga especificamente Aggrecan e o referido terceiro ISVD liga especificamente Aggrecan, de preferência representado por SEQ ID NO: 6 ou 64.

[028] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um construto que compreende ou consiste essencialmente em um polipeptídeo como aqui descrito, que compreende ainda um ou mais outros grupos, resíduos, porções ou unidades de ligação, opcionalmente ligados por meio de um ou mais ligantes peptídicos.

[029] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo como aqui descrito, ou um construto como aqui descrito.

[030] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico como aqui descrito.

[031] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um hospedeiro ou célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico como aqui descrito, ou um vetor de expressão como aqui descrito.

[032] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo um polipeptídeo como aqui descrito, um construto como aqui descrito ou um ácido nucleico como aqui descrito.

[033] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a produção de um polipeptídeo, como aqui descrito, o referido método compreendendo pelo menos as etapas de: a) expressar, em uma célula hospedeira, organismo hospedeiro ou sistema de expressão adequado, um ácido nucleico como aqui descrito; opcionalmente seguido por b) isolar e/ou purificar o polipeptídeo como aqui descrito.

[034] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição como aqui descrita, que é uma composição farmacêutica, preferivelmente a referida composição compreende ainda pelo menos um veículo, diluente ou excipiente e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, compreende um ou mais polipeptídeos farmaceuticamente ativos e/ou compostos.

[035] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição como aqui descrita, a um polipeptídeo como aqui descrito, ou a um construto como aqui descrito, para uso como medicamento.

[036] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição como aqui descrita, um polipeptídeo como aqui descrito, ou um construto como aqui descrito, para uso na prevenção de um sintoma ou tratamento de artropatias e condrodistrofias, doença artrítica, como osteoartrite, artrite reumatoide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura ou descolamento traumático, acondroplasia, costocondrite, displasia espondilo-epimetafisária, hérnia de disco vertebral, doença de degeneração do disco lombar, doença articular degenerativa, policondrite recidivante, osteecondrite dissecante, período menstrual e doença de garganta.

[037] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método de prevenção de um sintoma ou tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, o método compreendendo a administração de um polipeptídeo como aqui descrito, um construto como aqui descrito ou uma composição como aqui descrita ao referido indivíduo em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir um sintoma de artropatias e condrodistrofias, doença artrítica, tais como osteoartrite, artrite reumatoide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura ou descolamento traumático, acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafisária, hérnia de disco, doença articular degenerativa, policondrite recidivante, osteocondrite dissecante, agrecanopatias, NASH, periodontite crônica e aneurismas da aorta abdominal.

[038] Outros aspectos, vantagens, aplicações e usos dos polipeptídeos e composições ficarão claros a partir da divulgação adicional aqui. Vários documentos são citados ao longo do texto deste relatório descritivo. Cada um dos documentos citados neste documento (incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, especificações do fabricante, instruções, etc.), supra ou infra, são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem o direito de anteceder essa divulgação em virtude da invenção anterior. 4 LEGENDAS DE FIGURAS

[039] Figura 1: Inibição funcional da espécie ADAMTS5 pelo polipeptídeo 949 ("C010100949", SEQ ID NO: 1) no ensaio de atividade enzimática à base de FRET. Vi: velocidade (inclinação da curva de progresso) da reação enzimática inibida; V0: velocidade da reação não inibida. Cada ponto representa a média das medições técnicas duplicadas. Barras de erro: desvio padrão entre as duplicatas técnicas. Este gráfico é representativo de 3 experimentos independentes.

[040] Figura 2: Inibição funcional da MMP13 de humano, cinomolgo e rato pelo polipeptídeo 949 no ensaio de atividade enzimática à base de FRET. Esquerda: Inibição da espécie cdMMP13 pelo polipeptídeo 949 (ALX-1011). Direita: Inibição da proMMP13 ativada por espécie (o polipeptídeo 949 é designado como C010100949). Vi: velocidade (inclinação da curva de progresso) da reação enzimática inibida; V0: velocidade da reação desinibida. Cd: domínio catalítico; pro: pro-MMP13 ativada. Cada ponto representa a média das medições técnicas duplicadas. Barras de erro: desvio padrão entre as duplicatas técnicas. As figuras são representativas de pelo menos dois experimentos independentes.

[041] Figura 3: Eficácia do polipeptídeo 949 ("NB949") no ensaio de explante de cartilagem bovina. A eficácia foi calculada em comparação com um inibidor de Aggrecanase de molécula pequena de referência (AGG-523, Wyeth) que, nessas condições, inibe completamente a liberação de GAG estimulada por IL-1α, que foi fixada em 100%, a cartilagem não induzida foi fixada em 0%.

[042] Figura 4: Eficácia do polipeptídeo 949 em um ensaio de explante de cartilagem humana. A eficácia foi calculada em comparação com um inibidor de Aggrecanase de molécula pequena de referência (AGG-523, Wyeth) que, nessas condições, inibe completamente a liberação de GAG estimulada por IL-1α, que foi fixada em 100%, a cartilagem não induzida foi fixada em 0%.

[043] Figura 5: Efeito da ancoragem de polipeptídeos na cartilagem mediada por CAP no ensaio de explante bovino.

[044] Figura 6: Polipeptídeo 949 ("C010100949" ou "MAC949") inibe a liberação de cocultura de C2M (degradação de Col II = estrutura) e C3M (degradação de Col III = associado a sintomas).

[045] Figura 7: Retenção de cartilagem: concentrações locais de construto de nanocorpos em diferentes momentos no rato.

[046] Figura 8: Largura substancial da degeneração da cartilagem tibial medial em diferentes grupos.

[047] Figura 9: Largura da degeneração da cartilagem tibial medial.

[048] Figura 10: Análise da marcha por passarela.

[049] Figura 11: Concentrações séricas (concentração média em ng/ml) versus tempo após a primeira dose (h) de polipeptídeos em ratos com osteoartrite e ratos saudáveis, recebendo uma única injeção intra- articular de 400 µg de construto de nanocorpo por articulação (joelho direito). Pontos representam concentrações individuais em animais saudáveis; triângulos representam concentrações individuais em animais com OA; e linhas representam concentrações médias. 5 DESCRIÇÃO DETALHADA

[050] Ainda existe a necessidade de medicamentos OA seguros e eficazes, em particular DMOADs. Esses medicamentos devem atender a vários e frequentemente opostos requisitos, especialmente quando se pretende um formato amplamente aplicável. Esse formato deve ser preferivelmente útil em uma ampla gama de pacientes. O formato deve preferivelmente ser seguro e não induzir infecções devido à administração frequente. Além disso, o formato deve preferivelmente ser amigável ao paciente, tal como permitir um regime de dosagem conveniente e via de administração, por exemplo, administração sistêmica. Por exemplo, é preferido que o formato não seja removido instantaneamente da circulação após a administração. No entanto, prolongar a meia-vida não deve preferivelmente introduzir atividade fora do alvo e efeitos colaterais ou limitar a eficácia.

[051] A presente invenção realiza pelo menos um desses requisitos.

[052] Com base na triagem não convencional, caracterização e estratégias combinatórias, os presentes inventores observaram surpreendentemente que os domínios variáveis únicos de imunoglobulina (ISVDs) tiveram um desempenho excepcionalmente bom em experimentos in vitro, ex vivo e in vivo.

[053] Além disso, os presentes inventores foram capazes de reprojetar os ISVDs, superando ainda mais os medicamentos comparadores na melhoria da OA. Além disso, os ISVDs da invenção também demonstraram ser significativamente mais seguros do que os compostos da técnica anterior.

[054] Além disso, os inventores demonstraram que, combinando várias funcionalidades, incluindo inibidores de MMP13, inibidores de ADAMTS5 e ligantes de Aggrecan, foi obtido um efeito ainda melhor do que com qualquer um dos inibidores.

[055] A presente invenção pretende fornecer combinações de ISVDs que antagonizam ADAMTSs, em particular ISVDs que antagonizam ADAMTS5 e/ou MMPs, em particular MMP13, acopladas a ligantes de CAP (por exemplo, ligantes de Aggrecan), com melhores propriedades profiláticas, terapêuticas e/ou farmacológicas, incluindo um perfil mais seguro, em comparação com as sequências de aminoácidos e anticorpos da técnica anterior.

[056] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a polipeptídeos escolhidos do grupo que consiste em

(a) polipeptídeos compreendendo pelo menos 2 domínios variáveis únicos de imunoglobulina (ISVD), nos quais um primeiro ISVD liga especificamente uma matriz metaloproteinase (MMP) e um segundo ISVD liga especificamente Aggrecan, e opcionalmente compreendendo um terceiro ISVD que liga especificamente Aggrecan; (b) polipeptídeos compreendendo pelo menos 2 ISVDs, nos quais um primeiro ISVD liga especificamente uma desintegrina e metaloproteinase com motivos de trombospondina (ADAMTS) e um segundo ISVD liga especificamente Aggrecan, e opcionalmente compreendendo um terceiro ISVD que liga especificamente Aggrecan; e (c) polipeptídeos compreendendo pelo menos 3 ISVDs, nos quais um primeiro ISVD liga especificamente uma MMP, um segundo ISVD liga especificamente uma ADAMTS e um terceiro ISVD liga especificamente Aggrecan, e opcionalmente compreendendo um quarto ISVD que liga especificamente Aggrecan.

[057] A menos que indicado ou definido de outra forma, todos os termos usados têm o significado usual na técnica, o que será claro para o especialista. É feita referência, por exemplo, aos manuais padrão, como Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2º Ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), F. Ausubel et al. (Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, Nova Iorque, 1987), Lewin (Genes II, John Wiley & Sons, Nova Iorque, N.I., 1985), Old et al. (Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2º edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981); Roitt et al. (Immunology (6º Ed.) Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001), Roitt et al. (Roitt’s Essential Immunology (10º Ed.) Blackwell Publishing, UK, 2001), e Janeway et al. (Immunobiology (6º Ed.) Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, Nova Iorque, 2005), bem como à técnica geral de base aqui citada.

[058] Salvo indicação em contrário, todos os métodos, etapas, técnicas e manipulações que não são especificamente descritas em detalhes podem ser executados e foram executados de uma maneira conhecida per se, como ficará claro para o especialista. É feita referência, por exemplo, novamente aos manuais padrão e à técnica de fundamentos geral aqui mencionada e às referências adicionais citadas; bem como, por exemplo, as seguintes análises: Presta (Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640-56, 2006), Levin and Weiss (Mol. Biosyst. 2(1): 49- 57, 2006), Irving et al. (J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45, 2001), Schmitz et al. (Placenta 21 Suppl. A: S106-12, 2000), Gonzales et al. (Tumour Biol. 26(1): 31-43, 2005), que descrevem técnicas para engenharia de proteínas, como maturação por afinidade e outras técnicas para melhorar a especificidade e outras propriedades desejadas de proteínas como imunoglobulinas.

[059] Deve-se notar que, conforme usado aqui, as formas singulares "a", "o", "uma" e "um" incluem referências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um reagente" inclui um ou mais desses reagentes diferentes e a referência ao "método" inclui referência a etapas e métodos equivalentes conhecidos pelos versados na técnica que podem ser modificados ou substituídos pelo métodos aqui descritos.

[060] Salvo indicação em contrário, o termo "pelo menos" que precede uma série de elementos deve ser entendido como referente a todos os elementos da série. Os especialistas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar, usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descritas. Tais equivalentes pretendem ser abrangidos pela presente invenção.

[061] O termo "e/ou" onde quer que seja utilizado aqui inclui o significado de "e", "ou" e "toda ou qualquer outra combinação dos elementos conectados pelo referido termo".

[062] O termo "cerca de" ou "aproximadamente" como aqui utilizado significa dentro de 20%, preferivelmente dentro de 15%, mais preferivelmente dentro de 10% e mais preferivelmente dentro de 5% de um determinado valor ou faixa.

[063] Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações a seguir, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra "compreender" e variações como "compreende" e "compreendendo" serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro declarado ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de número inteiro ou etapa. Quando usado aqui, o termo "compreendendo" pode ser substituído pelo termo "contendo" ou "incluindo" ou, às vezes, quando usado aqui com o termo "tendo".

[064] O termo "sequência", conforme usado aqui (por exemplo, em termos como "sequência de imunoglobulina", "sequência de anticorpo", "sequência de domínio variável", "sequência de VHH" ou "sequência de proteínas"), deve geralmente ser entendido como incluindo ambas a sequência de aminoácido relevante bem como ácidos nucleicos ou sequências de nucleotídeos que codificam os mesmos, a menos que o contexto exija uma interpretação mais limitada.

[065] Sequências de aminoácidos são interpretadas como significando um único aminoácido ou uma sequência não ramificada de dois ou mais aminoácidos, dependendo do contexto. Sequências nucleotídicas são interpretadas como significando uma sequência não ramificada de 3 ou mais nucleotídeos.

[066] Aminoácidos são aqueles L-aminoácidos normalmente encontrados em proteínas que ocorrem naturalmente. Os resíduos de aminoácidos serão indicados de acordo com o código padrão de três letras ou uma letra. Por exemplo, é feita referência à Tabela A-2 na página 48 do documento WO 08/020079. Essas sequências de aminoácidos contendo D-aminoácidos não se destinam a ser adotadas por esta definição. Qualquer sequência de aminoácido que contém aminoácidos modificados após a tradução pode ser descrita como a sequência de aminoácido que é inicialmente traduzida usando os símbolos mostrados nesta Tabela A-2 com as posições modificadas; por exemplo, hidroxilações ou glicosilações, mas essas modificações não devem ser mostradas explicitamente na sequência de aminoácido. Qualquer peptídeo ou proteína que pode ser expresso como uma sequência de ligações modificadas, ligações cruzadas e ligações não peptidílicas, de extremidade coberta etc., é englobado por esta definição, tudo como conhecido na técnica.

[067] Os termos "proteína", "peptídeo", "proteína/peptídeo" e "polipeptídeo" são usados de forma intercambiável ao longo da divulgação e cada um tem o mesmo significado para os fins desta divulgação. Cada termo refere-se a um composto orgânico feito de uma cadeia linear de dois ou mais aminoácidos. O composto pode ter dez ou mais aminoácidos; vinte e cinco ou mais aminoácidos; cinquenta ou mais aminoácidos; cem ou mais aminoácidos, duzentos ou mais aminoácidos e até trezentos ou mais aminoácidos. O especialista na técnica compreenderá que os polipeptídeos geralmente compreendem menos aminoácidos que as proteínas, embora não exista um ponto de corte reconhecido pela técnica do número de aminoácidos que distinguem um polipeptídeo e uma proteína; que os polipeptídeos podem ser produzidos por síntese química ou métodos recombinantes; e que as proteínas são geralmente produzidas in vitro ou in vivo por métodos recombinantes, como conhecido na técnica. Por convenção, a ligação amida na estrutura primária dos polipeptídeos está na ordem em que os aminoácidos são escritos, nos quais a extremidade amina (N-

terminal) de um polipeptídeo está sempre à esquerda, enquanto a extremidade ácida (C-terminal)) está à direita.

[068] Uma sequência de ácido nucleico ou aminoácido é considerada "(em) (forma) (essencialmente) isolada" - por exemplo, em comparação com o meio de reação ou meio de cultivo do qual foi obtida - quando foi separada de pelo menos outro componente ao qual geralmente está associada na referida fonte ou meio, tal como outro ácido nucleico, outra proteína / polipeptídeo, outro componente biológico ou macromolécula ou pelo menos um contaminante, impureza ou componente menor. Em particular, uma sequência de ácido nucleico ou aminoácido é considerada "(essencialmente) isolada" quando foi purificada pelo menos 2 vezes, em particular pelo menos 10 vezes, mais em particular pelo menos 100 vezes e até 1000 ou mais. Um ácido nucleico ou aminoácido que está "na forma (essencialmente) isolada" é preferivelmente essencialmente homogêneo, conforme determinado usando uma técnica adequada, como uma técnica cromatográfica adequada, como eletroforese em gel de poliacrilamida.

[069] Quando uma sequência nucleotídica ou sequência de aminoácido é dita que "compreende" outra sequência nucleotídica ou sequência de aminoácido, respectivamente, ou "consiste essencialmente em" outra sequência nucleotídica ou sequência de aminoácido, isso pode significar que a última sequência nucleotídica ou sequência de aminoácido foi incorporada na primeira sequência nucleotídica ou sequência de aminoácido mencionada, respectivamente, porém mais comumente isso de um modo geral significa que a primeira sequência nucleotídica ou sequência de aminoácido mencionada compreende dentro de sua sequência um trecho de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos, respectivamente, que possui a mesma sequência nucleotídica ou sequência de aminoácido, respectivamente, que a última sequência,

independentemente de como a primeira sequência mencionada foi realmente gerada ou obtida (que pode ser, por exemplo, por qualquer método adequado aqui descrito). Por meio de um exemplo não limitativo, quando se diz que um polipeptídeo da invenção compreende um domínio variável único de imunoglobulina ("ISVD"), isso pode significar que a referida sequência de domínio variável único de imunoglobulina foi incorporada na sequência do polipeptídeo da invenção, porém mais comumente de um modo geral significa que o polipeptídeo da invenção contém dentro de sua sequência a sequência dos domínios variáveis únicos da imunoglobulina, independentemente de como o referido polipeptídeo da invenção foi gerado ou obtido.

Além disso, quando se diz que um ácido nucleico ou sequência nucleotídica compreende outra sequência nucleotídica, o primeiro nucleotídeo ou sequência nucleotídica mencionada é preferivelmente tal que, quando expressos em um produto de expressão (por exemplo, um polipeptídeo), a sequência de aminoácido codificada pela última sequência nucleotídica faz parte do referido produto de expressão (em outras palavras, que a última sequência nucleotídica está no mesmo quadro de leitura que a primeira sequência de ácidos nucleicos ou nucleotídeo maior mencionados). Além disso, quando se diz que um construto da invenção compreende um polipeptídeo ou ISVD, isso pode significar que o referido construto inclui pelo menos o referido polipeptídeo ou ISVD, respectivamente, porém mais comumente isso significa que o referido construto abrange grupos, resíduos (por exemplo, resíduos de aminoácidos), porções e/ou unidades de ligação além do referido polipeptídeo ou ISVD, independentemente de como o referido polipeptídeo ou ISVD esteja conectado aos referidos grupos, resíduos (por exemplo, resíduos de aminoácidos), porções e/ou unidades de ligação e independentemente de como o referido construto foi gerado ou obtido.

[070] Por "consistir essencialmente em" significa que o ISVD usado na invenção é exatamente o mesmo que o ISVD da invenção ou corresponde a um ISVD da invenção, tendo um número limitado de resíduos de aminoácidos, como 1-20 amino resíduos de aminoácido, por exemplo, 1-10 resíduos de aminoácidos e preferivelmente 1-6 resíduos de aminoácidos, como 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 resíduos de aminoácidos, adicionados na extremidade do terminal amino, na extremidade do terminal carbóxi, ou na extremidade do terminal amino e na extremidade do terminal carbóxi do ISVD.

[071] Para fins de comparação de duas ou mais sequências de nucleotídeos, a porcentagem de "identidade de sequência" entre uma primeira sequência de nucleotídeos e uma segunda sequência de nucleotídeos pode ser calculada dividindo [o número de nucleotídeos na primeira sequência de nucleotídeos que são idênticos aos nucleotídeos nas posições correspondentes na segunda sequência de nucleotídeos] pelo [número total de nucleotídeos na primeira sequência de nucleotídeos] e multiplicando por [100%], em que cada exclusão, inserção, substituição ou adição de um nucleotídeo na segunda sequência de nucleotídeos - comparada com a primeira sequência de nucleotídeos - é considerada uma diferença em um único nucleotídeo (posição). Alternativamente, o grau de identidade de sequência entre duas ou mais sequências de nucleotídeos pode ser calculado usando um algoritmo de computador conhecido para alinhamento de sequência, como NCBI Blast v2.0, usando configurações padrão. Algumas outras técnicas, algoritmos de computador e configurações para determinar o grau de identidade de sequência são, por exemplo, descritos nos documentos WO 04/037999, EP 0967284, EP 1085089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 e GB 2357768. Geralmente, com o objetivo de determinar a porcentagem de "identidade de sequência" entre duas sequências de nucleotídeos de acordo com o método de cálculo descrito acima, a sequência de nucleotídeos com o maior número de nucleotídeos será tomada como a "primeira" sequência nucleotídica e a outra sequência nucleotídica será tomada como a "segunda" sequência nucleotídica.

[072] Para fins de comparação de duas ou mais sequências de aminoácidos, a porcentagem de "identidade de sequência" entre uma primeira sequência de aminoácido e uma segunda sequência de aminoácido (também aqui denominada "identidade de aminoácidos") pode ser calculada dividindo [o número de resíduos de aminoácidos na primeira sequência de aminoácido que são idênticos aos resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes na segunda sequência de aminoácido] por [o número total de resíduos de aminoácidos na primeira sequência de aminoácido] e multiplicando por [100%], em que cada exclusão, inserção, substituição ou adição de um resíduo de aminoácido na segunda sequência de aminoácido - em comparação com a primeira sequência de aminoácido - é considerada uma diferença em um único resíduo de aminoácido (posição), isto é, como uma "diferença de aminoácido", conforme aqui definido. Alternativamente, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos pode ser calculado usando um algoritmo de computador conhecido, tal como os mencionados acima para determinar o grau de identidade de sequência para sequências de nucleotídeos, novamente usando definições padrão. Geralmente, com o objetivo de determinar a porcentagem de "identidade de sequência" entre duas sequências de aminoácidos de acordo com o método de cálculo descrito acima, a sequência de aminoácido com o maior número de resíduos de aminoácidos será tomada como a "primeira" sequência de aminoácido e a outra sequência de aminoácido será tomada como a "segunda" sequência de aminoácido.

[073] Além disso, ao determinar o grau de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos, o especialista pode levar em consideração as chamadas substituições de aminoácidos "conservadoras", que geralmente podem ser descritas como substituições de aminoácidos nas quais um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido de estrutura química semelhante e que tem pouca ou praticamente nenhuma influência na função, atividade ou outras propriedades biológicas do polipeptídeo. Tais substituições conservadoras de aminoácidos são bem conhecidas na técnica, por exemplo, nos documentos WO 04/037999, GB 335768, WO 98/49185, WO 00/46383 e WO 01/09300; e tipos (preferidos) e/ou combinações de tais substituições podem ser selecionadas com base nos ensinamentos pertinentes do documento WO 04/037999, bem como do documento WO 98/49185 e das referências adicionais aqui citadas.

[074] Tais substituições conservadoras são preferivelmente substituições nas quais um aminoácido dentro dos seguintes grupos (a) - (e) é substituído por outro resíduo de aminoácido dentro do mesmo grupo: (a) pequenos resíduos alifáticos, não polares ou levemente polares: Ala, Ser, Thr, Pro e Gly; (b) resíduos polares carregados negativamente e suas amidas (não carregadas): Asp, Asn, Glu e Gln; (c) resíduos polares carregados positivamente: His, Arg e Lys; (d) resíduos alifáticos grandes, não polares: Met, Leu, Ile, Val e Cys; e (e) resíduos aromáticos: Phe, Tyr e Trp. As substituições conservadoras particularmente preferidas são as seguintes: Ala em Gly ou em Ser; Arg em Lys; Asn em Gln ou em Seu; Asp em Glu; Cys em Ser; Gln em Asn; Glu em Asp; Gly em Ala ou Pro; Dele em Asn ou em Gln; Ile em Leu ou em Val; Leu em Ile ou em Val; Lys em Arg, em Gln ou em Glu; Conheci Leu, Tyr ou Ile; Phe em Met, em Leu ou em Tyr; Ser em Thr; Thr em Ser; Trp em Tyr; Tyr em Trp; e/ou Phe em Val, em Ile ou em Leu.

[075] Quaisquer substituições de aminoácidos aplicadas aos polipeptídeos aqui descritos também podem ser baseadas na análise das frequências de variações de aminoácidos entre proteínas homólogas de diferentes espécies desenvolvidas por Schulz et al. ("Principles of Protein Structure", Springer-Verlag, 1978), sobre as análises dos potenciais de formação de estruturas desenvolvidas por Chou e Fasman (Biochemistry 13: 211, 1974; Adv. Enzymol., 47: 45- 149, 1978) e na análise de padrões de hidrofobicidade em proteínas desenvolvidas por Eisenberg et al. (Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140- 144, 1984), Kyte e Doolittle (J. Molec. Biol. 157: 105-132, 1981) e Goldman et al. (Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986), todos aqui incorporados na sua totalidade por referência. As informações sobre a estrutura primária, secundária e terciária dos Nanocorpos são fornecidas na descrição aqui e na técnica geral citada acima. Além disso, para esse fim, a estrutura cristalina de um domínio VHH de uma lhama é, por exemplo, dada por Desmyter et al. (Nature Structural Biology, 3: 803, 1996), Spinelli et al. (Natural Structural Biology, 3: 752- 757, 1996) e Decanniere et al. (Structure, 7 (4): 361, 1999). Mais informações sobre alguns dos resíduos de aminoácidos que em domínios VH convencionais formam a interface VH/VL e possíveis substituições de camelídios nessas posições podem ser encontradas na técnica anterior citada acima.

[076] Sequências de aminoácidos e sequências de ácidos nucleicos são consideradas "exatamente iguais" se elas tiverem 100% de identidades de sequência (conforme definido aqui) em todo o seu comprimento.

[077] Ao comparar duas sequências de aminoácidos, o termo "diferença (s) de aminoácidos" refere-se a uma inserção, exclusão ou substituição de um único resíduo de aminoácido na posição da primeira sequência, em comparação com a segunda sequência; sendo entendido que duas sequências de aminoácidos podem conter uma,

duas ou mais dessas diferenças de aminoácidos. Mais particularmente, nos ISVDs e/ou polipeptídeos da presente invenção, o termo "diferença de aminoácidos (s)" refere-se a uma inserção, exclusão ou substituição de um único resíduo de aminoácido em uma posição da sequência CDR especificada em (b), (d) ou (f), em comparação com a sequência CDR de respectivamente (a), (c) ou (e); entendendo-se que a sequência CDR de (b), (d) e (f) pode conter uma, duas, três, quatro ou cinco diferenças máximas de aminoácidos em comparação com a sequência CDR de respectivamente (a), (c) ou (e)

[078] A "diferença (s) de aminoácidos" pode ser qualquer uma, duas, três, quatro ou no máximo cinco substituições, deleções ou inserções, ou qualquer combinação dos mesmos, que melhorem as propriedades do ISVD da invenção, isto é, aglutinante ADAMTS5, aglutinante MMP13 e/ou aglutinante Aggrecan da invenção, como o polipeptídeo da invenção ou que pelo menos não diminui muito as propriedades desejadas ou o equilíbrio ou combinação de propriedades desejadas dos ISVDs da invenção, isto é, aglutinante ADAMTS5, aglutinante MMP13 e/ou aglutinante Aggrecan da invenção, tal como os polipeptídeos da invenção compreendendo um aglutinante Aggrecan e um aglutinante MMP13 e/ou um aglutinante ADAMTS5. A este respeito, o (s) polipeptídeo (s) resultante (s) da invenção deve pelo menos ligar Aggrecan e MMP13 e/ou ADAMTS5 com o mesmo, aproximadamente o mesmo, ou uma afinidade mais alta em comparação com o polipeptídeo que compreende as uma ou mais sequências de CDR sem a mesma, duas, três, quatro ou no máximo cinco substituições, deleções ou inserções. A afinidade pode ser medida por qualquer método adequado conhecido na técnica, mas é preferivelmente medido por um método como descrito na seção de exemplos.

[079] A este respeito, a sequência de aminoácido das CDRs de acordo com (b), (d) e/ou (f), conforme indicado aqui, pode ser uma sequência de aminoácido que é derivada de uma sequência de aminoácido de acordo com (a), (c) e/ou (e), respectivamente, por meio de maturação por afinidade, utilizando uma ou mais técnicas de maturação por afinidade conhecidas per se ou como descritas nos Exemplos. Por exemplo, e dependendo do organismo hospedeiro usado para expressar o polipeptídeo da invenção, essas deleções e/ou substituições podem ser projetadas de tal maneira que um ou mais sítios para modificação pós-traducional (como um ou mais sítios de glicosilação) são removidos, como estará dentro da capacidade do versado na técnica (cf. Exemplos).

[080] Uma "família de nanocorpos", "família de VHH" ou "família", conforme usada na presente relatório descritivo, refere-se a um grupo de sequências de nanocorpos e/ou VHH que possuem comprimentos idênticos (isto é, eles têm o mesmo número de aminoácidos em sua sequência) e dos quais a sequência de aminoácido entre a posição 8 e a posição 106 (de acordo com a numeração de Kabat) tem uma identidade de sequência de aminoácido de 89% ou mais.

[081] Os termos "epítopo" e "determinante antigênico", que podem ser usados de forma intercambiável, referem-se à parte de uma macromolécula, como um polipeptídeo ou proteína que é reconhecido por moléculas de ligação ao antígeno, como imunoglobulinas, anticorpos convencionais, domínios variáveis únicos de imunoglobulina e/ou polipeptídeos da invenção, e mais particularmente pelo sítio de ligação ao antígeno das referidas moléculas. Os epítopos definem o sítio de ligação mínimo para uma imunoglobulina e, portanto, representam o alvo da especificidade de uma imunoglobulina.

[082] A parte de uma molécula de ligação ao antígeno (como uma imunoglobulina, um anticorpo convencional, um domínio variável único de imunoglobulina e/ou um polipeptídeo da invenção) que reconhece o epítopo é chamada de "parátopo".

[083] Uma sequência de aminoácido (tal como um domínio variável único de imunoglobulina, um anticorpo, um polipeptídeo da invenção ou geralmente uma proteína ou polipeptídeo de ligação ao antígeno ou um fragmento do mesmo) que pode "se ligar a" ou "se ligar especificamente a", que "tem afinidade para" e/ou "que tem especificidade para" um determinado epítopo, antígeno ou proteína (ou para pelo menos uma parte, fragmento ou epítopo do mesmo) é considerado "contra" ou "direcionado contra" o referido epítopo, antígeno ou proteína ou é uma molécula de "ligação" em relação a esse epítopo, antígeno ou proteína, ou é considerado como "anti"epítopo, "anti"antígeno ou "anti"proteína (por exemplo, "anti" Aggrecan, "anti" MMP13 e/ou "anti" ADAMTS5).

[084] A afinidade denota a força ou a estabilidade de uma interação molecular. A afinidade é comumente dada como KD, ou constante de dissociação, que possui unidades de mol/litro (ou M). A afinidade também pode ser expressa como uma constante de associação KA, que é igual a 1/KD e possui unidades de (mol/litro)-1 (ou M-1). Na presente relatório descritivo, a estabilidade da interação entre duas moléculas irá principalmente ser expressa em termos do valor KD de sua interação; fica claro para o especialista que, tendo em vista a relação KA = 1/KD, que especificar a força da interação molecular pelo seu valor KD também pode ser usado para calcular o valor KA correspondente. O valor KD caracteriza a força de uma interação molecular também no sentido termodinâmico, pois está relacionada à mudança de energia livre (DG) de ligação pela conhecida relação DG = RT.ln (KD) (equivalente DG = -RT.ln (KA)), onde R é igual à constante do gás, T é igual à temperatura absoluta e ln indica o logaritmo natural.

[085] A KD para interações biológicas que são consideradas significativas (por exemplo, específicas) está tipicamente na faixa de 10- 12 M-12 (0,001 nM) a 10-5 M (10000 nM). Quanto mais forte é a interação,

menor é a sua KD.

[086] A KD também pode ser expressa como a razão entre a constante da taxa de dissociação de um complexo, denotada como koff, e a taxa de sua associação, denotada kon (de modo que KD = koff / kon e KA = kon / koff). A taxa off koff possui as unidades s-1 (onde s é a notação de unidade SI do segundo). A taxa on kon possui unidades M-1s-1. A taxa de ativação pode variar entre 102 M-1s-1 e cerca de 107 M-1s-1, aproximando-se da constante da taxa de associação limitada por difusão para interações bimoleculares. A taxa off está relacionada à meia-vida de uma dada interação molecular pela relação t1/2 = ln(2)/koff. A taxa off pode variar entre 10-6 s-1 (complexo quase irreversível com t1/2 de vários dias) a 1 s-1 (t1/2 = 0,69 s).

[087] A ligação específica de uma proteína de ligação ao antígeno, como um ISVD, a um antígeno ou determinante antigênico pode ser determinada de qualquer maneira adequada conhecida per se, incluindo, por exemplo, ensaios de ligação à saturação e/ou ensaios de ligação competitivos, tais como rádio-imunoensaios (RIA), imunoensaios enzimáticos (EIA) e ensaios de competição em sanduíche e suas diferentes variantes conhecidas per se na técnica; bem como as outras técnicas mencionadas aqui.

[088] A afinidade de uma interação molecular entre duas moléculas pode ser medida por meio de diferentes técnicas conhecidas per se, como a bem conhecida técnica de biossensor de ressonância plasmônica de superfície (SPR) (vide, por exemplo, Ober et al. 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559), onde uma molécula é imobilizada no chip de biossensor e a outra molécula é passada sobre a molécula imobilizada sob condições de fluxo, produzindo medições de kon, koff e, portanto, valores de KD (ou KA). Por exemplo, isso pode ser realizado usando os conhecidos instrumentos BIACORE® (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia). O ensaio de exclusão cinética (KINEXA®) (Drake et al. 2004, Analytical Biochemistry 328: 35-43) mede eventos de ligação em solução sem marcação dos parceiros de ligação e baseia-se na exclusão cinética da dissociação de um complexo. A análise de afinidade em solução também pode ser realizada usando o sistema de imunoensaio GYROLAB®, que fornece uma plataforma para bioanálise automatizada e retorno rápido da amostra (Fraley et al. 2013, Bioanalysis 5: 1765-74) ou ELISA.

[089] Também ficará claro para o especialista que a KD medida pode corresponder à KD aparente se o processo de medição influenciar de alguma forma a afinidade de ligação intrínseca das moléculas implícitas, por exemplo, por artefatos relacionados ao revestimento no biossensor de uma molécula. Além disso, uma KD aparente pode ser medida se uma molécula contiver mais de um sítio de reconhecimento para a outra molécula. Em tal situação, a afinidade medida pode ser afetada pela avidez da interação pelas duas moléculas. Em particular, a medição precisa de KD pode ser bastante trabalhosa e, como consequência, frequentemente são determinados valores aparentes de KD para avaliar a força de ligação de duas moléculas. Deve-se notar que, desde que todas as medições sejam feitas de maneira consistente (por exemplo, mantendo as condições do ensaio inalteradas), as medições aparentes de KD podem ser usadas como uma aproximação da KD verdadeira e, portanto, no presente documento, KD e KD aparente devem ser tratadas com igual importância ou relevância.

[090] O termo "especificidade" refere-se ao número de diferentes tipos de antígenos ou determinantes antigênicos aos quais uma molécula de ligação ao antígeno particular ou molécula de proteína de ligação ao antígeno (como um ISVD ou polipeptídeo da invenção) pode se ligar. A especificidade de uma proteína de ligação ao antígeno pode ser determinada com base na afinidade e/ou avidez, por exemplo, como descrito nas páginas 53-56 do documento WO 08/020079 (incorporado aqui por referência), que também descreve algumas técnicas preferidas para medir a ligação entre uma molécula de ligação ao antígeno (tal como um polipeptídeo ou ISVD da invenção) e o antígeno pertinente. Normalmente, as proteínas de ligação ao antígeno (como os ISVDs e/ou polipeptídeos da invenção) irão se ligar a seu antígeno com uma constante de dissociação (KD) de 10-5 a 10-12 litro/moles ou menos e, de preferência, 10-7 a 10-12 litro/moles ou menos e, mais preferivelmente, 10-8 a 10-12 litro/moles (isto é, com uma constante de associação (KA) de 105 a 1012 litros / moles ou mais, e preferivelmente 107 a 1012 litros / moles ou mais, e mais preferivelmente 108 a 1012 litro/moles). Qualquer valor de KD superior a 10-4 mol/litro (ou qualquer valor de KA inferior a 104 litro/moles) é geralmente considerado para indicar ligação não específica. De preferência, um ISVD monovalente da invenção se ligará ao antígeno desejado com uma afinidade menor que 500 nM, preferivelmente menor que 200 nM, mais preferivelmente menor que 10 nM, como menor que 500 pM, como por exemplo, entre 10 e 5 pM ou menos. Também é feita referência ao parágrafo n) nas páginas 53-56 do documento WO 08/020079.

[091] Diz-se que um ISVD e/ou polipeptídeo é "específico para" um (primeiro) alvo ou antígeno em comparação com outro (segundo) alvo ou antígeno quando se liga ao primeiro antígeno com uma afinidade (como descrito acima, e adequadamente expresso como um Valor KD, valor KA, taxa koff e/ou taxa kon) que é pelo menos 10 vezes, como pelo menos 100 vezes, e preferivelmente pelo menos 1000 vezes ou mais do que a afinidade com a qual o ISVD e/ou polipeptídeo se liga ao segundo alvo ou antígeno. Por exemplo, o ISVD e/ou o polipeptídeo pode se ligar ao primeiro alvo ou antígeno com um valor de KD que é pelo menos 10 vezes menor, como pelo menos 100 vezes menos e, de preferência pelo menos 1000 vezes menos ou até menos que isso, do que a KD com a qual o referido ISVD e/ou polipeptídeo se liga ao segundo alvo ou antígeno. De preferência, quando um ISVD e/ou polipeptídeo é "específico para" um primeiro alvo ou antígeno comparado a um segundo alvo ou antígeno, ele é direcionado contra (como aqui definido) o referido primeiro alvo ou antígeno, mas não direcionado contra o referido segundo alvo ou antígeno.

[092] A ligação específica de uma proteína de ligação ao antígeno a um antígeno ou determinante antigênico pode ser determinada de qualquer maneira adequada conhecida per se, incluindo, por exemplo, ensaios de ligação à saturação e/ou ensaios de ligação competitivos, como radioimunoensaios (RIA), imunoensaios enzimáticos (EIA) e suas diferentes variantes conhecidas na técnica; bem como as outras técnicas mencionadas aqui.

[093] Uma abordagem preferida que pode ser usada para avaliar a afinidade é o procedimento ELISA em duas etapas (Ensaio de Imunoabsorção Enzimática) de Friguet et al. 1985 (J. Immunol. Methods 77: 305-19). Este método estabelece uma medição do equilíbrio de ligação da fase da solução e evita possíveis artefatos relacionados à adsorção de uma das moléculas em um suporte tal como o plástico. Como ficará claro para o especialista, a constante de dissociação pode ser a constante de dissociação real ou aparente. Os métodos para determinar a constante de dissociação serão claros para o especialista e, por exemplo, incluem as técnicas mencionadas nas páginas 53-56 de WO 08/020079.

[094] Finalmente, deve-se notar que, em muitas situações, o cientista experiente pode julgar conveniente determinar a afinidade de ligação relativa a alguma molécula de referência. Por exemplo, para avaliar a força de ligação entre as moléculas A e B, uma pode por exemplo, usar uma molécula de referência C conhecida por se ligar a B e que esteja adequadamente rotulada com um grupo fluoróforo ou cromóforo ou outra porção química, como biotina para detecção fácil em um ELISA ou FACS (classificação de células ativadas por fluorescência) ou outro formato (o fluoróforo para detecção de fluorescência, cromóforo para detecção de absorção de luz, a biotina para detecção de ELISA mediada por estreptavidina). Normalmente, a molécula de referência C é mantida em uma concentração fixa e a concentração de A é variada para uma dada concentração ou quantidade de B. Como resultado, é obtido um valor de IC50 correspondente à concentração de A na qual o sinal medido para C na ausência de A é reduzida pela metade. Desde que a KD ref, a KD da molécula de referência, seja conhecida, bem como a concentração total de cref da molécula de referência, a KD aparente para a interação A-B pode ser obtida da seguinte fórmula: KD = IC50/(1+cref/KDref). Note que se cref<<KD ref, KD IC50.Desde que a medição de IC50 seja realizada de maneira consistente (por exemplo, mantendo o cref fixo) para os aglutinantes que são comparados, a diferença de força ou estabilidade de uma interação molecular pode ser avaliada comparando a IC50 e essa medição é considerada equivalente a KD ou KD aparente ao longo deste texto.

[095] A metade da concentração inibitória máxima (IC50) também pode ser uma medida da eficácia de um composto na inibição de uma função biológica ou bioquímica, por exemplo, um efeito farmacológico. Essa medida quantitativa indica quanto do polipeptídeo ou ISVD (por exemplo, um Nanocorpo) é necessário para inibir um determinado processo biológico (ou componente de um processo, isto é, uma enzima, célula, receptor celular, quimiotaxia, anaplasia, metástase, invasividade, etc.) pela metade. Em outras palavras, é a concentração inibitória (IC) metade máxima (50%) de uma substância (50% IC ou IC50). Os valores de IC50 podem ser calculados para um determinado antagonista, como o polipeptídeo ou ISVD (por exemplo, um Nanocorpo) da invenção, determinando a concentração necessária para inibir metade da resposta biológica máxima do agonista. A KD de um medicamento pode ser determinada construindo uma curva de dose- resposta e examinando o efeito de diferentes concentrações de antagonista, como o polipeptídeo ou ISVD (por exemplo, um Nanocorpo) da invenção na reversão da atividade agonista.

[096] O termo concentração efetiva à metade máxima (EC50) refere-se à concentração de um composto que induz uma resposta a meio caminho entre a linha de base e a máxima após um tempo de exposição especificado. No presente contexto, é usado como uma medida de um polipeptídeo, ISVD (por exemplo, um Nanocorpo), sua potência. A EC50 de uma curva de resposta à dose graduada representa a concentração de um composto em que 50% de seu efeito máximo é observado. A concentração é preferivelmente expressa em unidades molares.

[097] Em sistemas biológicos, pequenas alterações na concentração de ligantes normalmente resultam em rápidas alterações na resposta, após uma função sigmoidal. O ponto de inflexão no qual o aumento da resposta com o aumento da concentração de ligandos começa a diminuir é o EC50. Isso pode ser determinado matematicamente por derivação da linha de melhor ajuste. Confiar em um gráfico para estimativa é conveniente na maioria dos casos. Caso a EC50 seja fornecida na seção de exemplos, os experimentos foram projetados para refletir a KD o mais preciso possível. Em outras palavras, os valores de EC50 podem então ser considerados como valores de KD. O termo "KD média" refere-se ao valor médio de KD obtido em pelo menos 1, mas preferivelmente em mais de 1, como pelo menos 2 experimentos. O termo "média" refere-se ao termo matemático "média" (somas de dados divididas pelo número de itens nos dados).

[098] Também está relacionado à IC50, que é uma medida de um composto e sua inibição (50% de inibição). Para ensaios de ligação à competição e ensaios antagonistas funcionais, a IC50 é a medida sumária mais comum da curva dose-resposta. Para ensaios de agonista / estimulador, a medida sumária mais comum é a EC50.

[099] A constante de inibição (Ki) é uma indicação de quão potente é um inibidor; é a concentração necessária para produzir metade da inibição máxima. Ao contrário da IC50, que pode mudar dependendo das condições experimentais, Ki é um valor absoluto e é frequentemente referido como a constante de inibição de um medicamento. A constante de inibição Ki pode ser calculada usando a equação de Cheng-Prusoff: 𝐼𝐶50 𝐾𝑖 = [𝐿] +1

𝐾𝐷 em que [L] é a concentração fixa do ligando.

[100] O termo "potência" de um polipeptídeo e/ou ISVD da invenção, como aqui utilizado, é uma função da quantidade de polipeptídeo e/ou ISVD da invenção necessária para que seu efeito específico ocorra. Refere-se à capacidade do referido polipeptídeo e/ou ISVD da invenção de modular e/ou inibir parcial ou totalmente uma atividade de MMP13 e/ou de modular e/ou inibir parcial ou totalmente uma atividade de ADAMTS5.

[101] Em particular, pode se referir à capacidade do referido polipeptídeo para reduzir ou mesmo inibir totalmente a atividade de MMP13 como aqui definido. Como tal, pode se referir à capacidade do referido polipeptídeo de inibir a proteólise, como atividades da endeaseptidase da atividade da protease, ligando um substrato, como, por exemplo, Aggrecan, Colágeno II, Colágeno I, Colágeno III, Colágeno IV, Colágeno IX, Colágeno IX, Colágeno X, colágeno XIV e gelatina. A potência pode ser medida por qualquer ensaio adequado conhecido na técnica ou aqui descrito.

[102] Em particular, pode se referir à capacidade do referido polipeptídeo e/ou ISVD para reduzir ou mesmo inibir totalmente uma atividade de ADAMTS5 como aqui definida e/ou uma atividade de

MMP13 como aqui definida. A potência pode ser medida por qualquer ensaio adequado conhecido na técnica ou aqui descrito. Como aqui utilizado, "atividade da agrecanase" é definida como a clivagem proteolítica do Aggrecan.

[103] A "eficácia" do polipeptídeo da invenção mede a força máxima do próprio efeito, em saturar as concentrações do polipeptídeo. A eficácia indica a resposta máxima alcançável a partir do polipeptídeo da invenção. Refere-se à capacidade de um polipeptídeo de produzir o efeito (terapêutico) desejado.

[104] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo se liga a ADAMTS5 com uma KD entre 1E-07 M e 1E-13 M, tal como entre 1E-08 M e 1E-12 M, preferivelmente no máximo 1E-07 M, preferivelmente menor do que 1E- 08 M ou 1E-09 M, ou até mesmo menor do que 1E-10 M, tais como 5E-11 M, 4E-11 M, 3E-11 M, 2E-11 M, 1.7E-11 M, 1E-11 M, ou mesmo 5E-12 M, 4E- 12 M, 3E-12 M, 1E-12 M, para casos como determinado por Gyrolab ou KinExA..

[105] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo se liga a MMP13 com uma KD entre 1E-07 M e 1E-13 M, tal como entre 1E-08 M e 1E-12 M, preferivelmente no máximo 1E-07 M, preferivelmente menor do que 1E- 08 M ou 1E-09 M, ou até mesmo menor do que 1E-10 M, tais como 5E-11 M, 4E-11 M, 3E-11 M, 2E-11 M, 1.7E-11 M, 1E-11 M, ou mesmo 5E-12 M, 4E- 12 M, 3E-12 M, 1E-12 M, para casos como determinado por Gyrolab ou KinExA.

[106] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo se liga a Aggrecan com uma KD entre 1E-07 M e 1E-13 M, tal como entre 1E-08 M e 1E-12 M, preferivelmente no máximo 1E-07 M, preferivelmente menor do que 1E- 08 M ou 1E-09 M, ou até mesmo menor do que 1E-10 M, tais como 5E-11

M, 4E-11 M, 3E-11 M, 2E-11 M, 1.7E-11 M, 1E-11 M, ou mesmo 5E-12 M, 4E- 12 M, 3E-12 M, 1E-12 M, para casos como determinado por Gyrolab ou KinExA..

[107] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo se liga a ADAMTS5 com uma taxa off menor que 5E-04 s-1, tais como, por exemplo, menor do que 1E-04 s-1 ou 5E-05 s-1, ou mesmo menor do que 1E-05 s-1, para casos como determinado por SPR.

[108] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo se liga a MMP13 com uma taxa off menor do que 5E-04 s-1, como menos de 1E-04 s-1 ou 5E-05 s-1, ou até menos que 1E-05 s-1, por exemplo, conforme determinado por SPR.

[109] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo se liga a Aggrecan com uma taxa off menor do que 5E-04 s-1, tal como menor do que 1E-04 s-1 ou 5E-05 s-1, ou até mesmo menor do que 1E-05 s-1, por exemplo, conforme determinado por SPR.

[110] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo modula uma atividade de ADAMTS5 e/ou uma atividade de MMP13 com uma EC50 entre 1E-07 M e 1E-12 M, como entre 1E-08 M e 1E-11 M, por exemplo, conforme determinado pela ligação ELISA (para determinar a atividade de ADAMTS5) ou por exemplo ELISA de competição, ELISA de TIMP- 2 de competição, ensaio de peptídeos fluorogênicos, ensaio de colágeno fluorogênico ou ensaio colagenolítico (para determinar a atividade de MMP13).

[111] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo inibe uma atividade de ADAMTS5 e/ou MMP13 com um IC50 entre 1E-07 M e 1E-12 M, como entre 1E-08 M e 1E-11 M, por exemplo, conforme determinado pelo teste FRET em humano ou AlphaLISA em humano (para determinar a atividade da ADAMTS5) ou por exemplo ELISA de competição, ELISA de TIMP-2 de competição, ensaio de peptídeos fluorogênicos, ensaio de colágeno fluorogênico ou ensaio colagenolítico (para determinar a atividade da MMP13).

[112] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo inibe uma atividade enzimática de ADAMTS5 e/ou MMP13 com um IC50 de no máximo 1E- 07 M, preferivelmente 1E-08 M, 5E-09 M ou 4E-9 M, 3E-9 M, 2E-9 M, como 1E-9 M.

[113] Diz-se que uma sequência de aminoácido, como um ISVD ou polipeptídeo, é "reativa cruzada" para dois antígenos ou determinantes antigênicos diferentes (como, por exemplo, ADAMTS5 de diferentes espécies de mamíferos, tais como, por exemplo, ADAMTS5 de humano, ADAMTS5 de bovino, ADAMTS5 de rato, ADAMTS5 de porquinho-da-índia, ADAMTS5 de camundongo ou ADAMTS5 de cinomolgo ou tal como, por exemplo, MMP13 de diferentes espécies de mamíferos, tais como por exemplo, MMP13 de humano, MMP13 de cão, MMP13 de bovino, MMP13 de rato, MMP13 de suíno, MMP13 de camundongo, MMP13 de coelho, MMP13 de cinomolgo e/ou MMP13 de rhesus ou tal como, por exemplo, Aggrecan de diferentes espécies de mamíferos, tais como, por exemplo, Aggrecan de humano, Aggrecan de cão, Aggrecan de bovino, Aggrecan de rato, Aggrecan suíno, Aggrecan de camundongo, Aggrecan de coelho, Aggrecan de cinomolgo e/ou Aggrecan de rhesus) se for específico para (como aqui definido) esses diferentes antígenos ou determinantes antigênicos. Será apreciado que um ISVD ou polipeptídeo possa ser considerado reativo cruzado, embora a afinidade de ligação para os dois antígenos diferentes possa diferir, como por um fator 2, 5, 10, 50, 100 ou mais, desde que seja específico para (como aqui definido) esses diferentes antígenos ou determinantes antigênicos.

[114] ADAMTS5 também é conhecido como ADAMTS11, ADMP- 2 ou Aggrecanase-2. Informações estruturais relevantes para a ADAMTS5 podem ser encontradas, por exemplo, nos números de acesso UniProt, conforme mostrado na Tabela B-1 abaixo (consulte a Tabela B). Tabela B-1 Proteína Acc. Gene Organismo Q9UNA0 ADAMTS5 H.sapiens Q9TT92 ADAMTS5 B.taurus Q6TY19 ADAMTS5 R.norvegicus H0VFP0 ADAMTS5 Cavia Porcellus Q9R001 ADAMTS5 M.musculus F6Z3S6 ADAMTS5 M.mulatta

[115] "ADAMTS5 de humano" refere-se a ADAMTS5 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 67. Em um aspecto, o polipeptídeo da invenção liga-se especificamente a ADAMTS5 de Human sapiens, Mus musculus, Cavia Porcellus, Bos taurus, Macaca mulatta e/ou Rattus norvegicus, preferivelmente ADAMTS5 de humano, preferivelmente SEQ ID NO: 67.

[116] MMP13 também é conhecida como CLG3 ou Colagenase 3, MANDP1, MMP-13, Matrix metalopeptidase 13 ou MDST. Informações estruturais relevantes para MMP13 podem ser encontradas, por exemplo, nos números de acesso da UniProt, como mostrado na Tabela B-2 abaixo (consulte a Tabela B).

Tabela B-2 Proteína Acc. Gene Organismo NP_002418.1 MMP13 H.sapiens XP_001154361.1 MMP13 P.troglodytes XP_001098996.1 MMP13 M.mulatta XP_536598.3 MMP13 C.lupus NP_776814.1 MMP13 B.taurus NP_032633.1 Mmp13 M.musculus NP_598214.1 Mmp13 R.norvegicus XP_003640635.1 MMP13 G.gallus

[117] "MMP13 de humano" refere-se à MMP13 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 66. Em um aspecto, o polipeptídeo da invenção liga-se especificamente a MMP13 de Human sapiens, Mus musculus, Canis lupus, Bos taurus, Macaca mulatta, Rattus norvegicus, Gallus gallus e/ou P. trogloditas, preferivelmente MMP13 de humano, preferivelmente SEQ ID NO: 66.

[118] Aggrecan também é conhecido como aggrecan 1, ACAN, AGC1, AGCAN, CSPGCP, MSK16, SEDK, proteína principal do proteoglicano específico da cartilagem (CSPCP) ou proteoglicano 1 do sulfato de condroitina (CSPG1). Aggrecan está em humanos codificados pelo gene ACAN, localizado no cromossomo Chr 15: q26.1. Informações estruturais relevantes para Aggrecan podem ser encontradas, por exemplo, nos números de acesso da UniProt, conforme mostrado na Tabela B-3 abaixo (consulte a Tabela B).

Tabela B-3 Proteína Acc. Gene Organismo P16112 ACAN H.sapiens XP_003952775.2 ACAN P.troglodytes XP_002804990.1 ACAN M.mulatta Q28343 ACAN C.lupus P13608 ACAN B.taurus Q61282 ACAN M.musculus P07897 ACAN R.norvegicus Q29011 ACAN S.scrofa G1U677-1 ACAN O.cuniculus NP_990286.2 ACAN G.gallus

[119] "Aggrecan de humano" refere-se a Aggrecan compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 68. Em um aspecto, o polipeptídeo da invenção liga-se especificamente a Aggrecan de Human sapiens, Mus musculus, Bos taurus, Macaca mulatta, Pan troglodytes, Gallus gallus, Canis lupus, Sus scrofa, Oryctolagus cuniculus e/ou Rattus norvegicus, preferivelmente Aggrecan de humano, preferivelmente SEQ ID NO: 68.

[120] Os termos "bloqueio (cruzado)", "bloqueado (cruzado)", "bloqueando (cruzado)", "ligação competitiva", "competir (cruzado)", "competindo (cruzado)", e "competição (cruzado)" são usados de forma intercambiável aqui para significar a capacidade de uma imunoglobulina, anticorpo, ISVD, polipeptídeo ou outro agente de ligação interferir com a ligação de outras imunoglobulinas, anticorpos, ISVDs, polipeptídeos ou agentes de ligação a um determinado alvo. A extensão em que uma imunoglobulina, anticorpo, ISVD, polipeptídeo ou outro agente de ligação é capaz de interferir com a ligação de outro ao alvo e, portanto, se pode ser dito que ele bloqueia de forma cruzada ou não de acordo com a invenção, pode ser determinado usando ensaios de ligação de competição, que são comuns na técnica, tal como, por exemplo, triando ISVDs purificados contra ISVDs exibidos no fago em um ELISA de competição. Os ensaios quantitativos de bloqueio cruzado quantitativos particularmente adequados incluem ELISA.

[121] Outros métodos para determinar se uma imunoglobulina, anticorpo, ISVD, polipeptídeo ou outro agente de ligação direcionado contra um bloco (cruzado) alvo é capaz de bloquear (de forma cruzada), se liga competitivamente ou é competitivo (cruzado), conforme definido aqui, pode ser avaliado por um "ensaio em sanduíche" baseado em SPR, como, por exemplo, descrito na seção Exemplos. Outros métodos adequados são descritos por exemplo, em Xiao-Chi Jia et al. (Journal of Immunological Methods 288: 91–98, 2004), Miller et al. (Journal of Immunological Methods 365: 118–125, 2011).

[122] "Atividades ADAMTS5" e "atividades de ADAMTS5" (estes termos são usados aqui de forma intercambiável) incluem, mas não estão limitadas a atividades enzimáticas, como proteólise, por exemplo, atividade de protease (também chamada atividade de proteinase ou peptidase) e atividades de endopeptidase, por um lado, e as atividades dos exossítios, como por exemplo, reconhecer e/ou ligar o substrato, por exemplo, por domínio do tipo desintegrina, repetição do tipo I da trombospondina central (TS) central, domínio rico em cisteína, região espaçadora e/ou motivos adicionais de TS. As atividades da ADAMTS5 incluem a ligação e/ou proteólise de substratos, como proteínas extracelulares de proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG) de ligação a hialuronano, tais como Aggrecan, Versican, Brevican, Neurocan, Decorin e Biglycan. Como aqui utilizado, proteólise é a quebra de proteínas em polipeptídeos ou aminoácidos menores por hidrólise das ligações peptídicas que ligam aminoácidos juntos em uma cadeia polipeptídica.

[123] "Atividades MMP13" e "atividades de MMP13" (esses termos são usados de forma intercambiável aqui) incluem, mas não estão limitadas a, proteólise, tais como atividade de protease (também chamada atividade de proteinase ou peptidase) e atividades de endopeptidase, por um lado, e ligação do substrato, por exemplo, pelo domínio tipo hemopexina e domínio de ligação a peptidoglicano. As atividades da MMP13 incluem a ligação e/ou proteólise de substratos tais como Aggrecan, Colágeno II, Colágeno I, Colágeno III, Colágeno IV, Colágeno IX, Colágeno IX, Colágeno X, Colágeno XIV e Gelatina. Como aqui utilizado, proteólise é a quebra de proteínas em polipeptídeos ou aminoácidos menores por hidrólise das ligações peptídicas que ligam aminoácidos juntos em uma cadeia polipeptídica.

[124] No contexto da presente invenção, "modular" ou "para modular" geralmente significa alterar uma atividade por ADAMTS5 e/ou MMP13, conforme medido usando um ensaio in vitro, celular ou in vivo adequado (como os mencionados aqui). Em particular, "modular" ou "para modular" pode significar reduzir ou inibir uma atividade de, ou aumentar alternativamente uma atividade de ADAMTS5 e/ou MMP13, conforme medido usando um ensaio in vitro, celular ou in vivo adequado (por exemplo, como os mencionados aqui), em pelo menos 1%, preferivelmente pelo menos 5%, como pelo menos 10% ou pelo menos 25%, por exemplo, em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, em pelo menos 80%, ou 90% ou mais, em comparação com a atividade da ADAMTS5 e/ou MMP13 no mesmo ensaio nas mesmas condições, mas sem a presença do ISVD ou polipeptídeo da invenção.

[125] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo modula uma atividade de ADAMTS5 e/ou MMP13, preferivelmente inibindo uma atividade de ADAMTS5 e/ou MMP13.

[126] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo inibe a atividade de protease de ADAMTS5, tal como inibe a proteólise de um substrato, tais como Aggrecan, Versican, Brevican, Neurocan, Decorin e/ou Biglycan.

[127] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo bloqueia a ligação da ADAMTS5 a um substrato, tais como Aggrecan, Versican, Brevican, Neurocan, Decorin e/ou Biglycan, em que o referido substrato é preferivelmente Aggrecan.

[128] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo bloqueia a ligação da ADAMTS5 a Aggrecan de pelo menos 20%, como pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais, por exemplo, conforme determinado pelo ELISA.

[129] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo antagoniza ou inibe uma atividade de ADAMTS5, como (i) uma atividade de protease, preferivelmente a clivagem de Aggrecan, Versican, Brevican, Neurocan, Decorin e/ou Biglycan, preferivelmente clivagem de Aggrecan; preferivelmente antagoniza a atividade de agrecanase de ADAMTS5; (ii) ligação de um substrato a ADAMTS5, como um exossítio da ADAMTS5, por exemplo, o domínio do tipo desintegrina, a repetição central do tipo I da trombospondina (TS), o domínio rico em cisteína, a região espaçadora ou o motivo TS adicional.

[130] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo conforme descrito aqui, em que o referido polipeptídeo inibe a atividade de protease de MMP13, como inibe a proteólise de um substrato, tais como Aggrecan, Colágeno II, Colágeno I, Colágeno I, Colágeno III, Colágeno IV, Colágeno IX, Colágeno X, Colágeno XIV e/ou Gelatina.

[131] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo bloqueia a ligação de MMP13 a um substrato, tais como Aggrecan, Colágeno II, Colágeno I, Colágeno III, Colágeno IV, Colágeno IX, Colágeno X, Colágeno X, Colágeno XIV e/ou gelatina, em que o referido colágeno é preferivelmente Colágeno II.

[132] Em um aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito aqui, em que o referido polipeptídeo bloqueia a ligação de MMP13 ao colágeno e/ou aggrecano de pelo menos 20%, como pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70 %, 80%, 90%, 95% ou até mais, por exemplo, conforme determinado por ensaios de competição baseados em ELISA (cf. Howes et al. 2014 J. Biol. Chem. 289: 24091– 24101).

[133] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo antagoniza ou inibe uma atividade da MMP13, tal como (i) uma atividade de protease, preferivelmente a clivagem de Aggrecan e/ou colágeno, em que o referido colágeno é preferivelmente o colágeno II; (ii) ligação de Colágeno ao domínio stipo hemopexina.

[134] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo inibe a atividade de protease de ADAMTS5 e/ou MMP13, de preferência em pelo menos 5%, como 10%, 20%, 30%, 40%, 50 % ou mais, como pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais, conforme determinado por qualquer método adequado conhecido na técnica, como por exemplo, por ensaios de competição ou conforme descrito na seção de Exemplos.

[135] Embora os ADAMs, ADAMTSs e MMPs compartilhem um sítio de ligação com o Aggrecan que é muito semelhante tanto na sequência quanto na forma geral, por exemplo, os domínios catalíticos da ADAMTS4 e ADAMTS5 compartilham um alto grau de similaridade de sequência, os inventores foram capazes de identificar ISVDs que foram alvo específico, como demonstrado nos exemplos. A especificidade do alvo também evitaria ou pelo menos limitaria a síndrome músculo-esquelética, que é um efeito colateral causado por inibidores de amplo espectro.

[136] Em um aspecto, a invenção refere-se a um aglutinante ADAMTS5, como um ISVD e polipeptídeo da invenção, em que o referido aglutinante ADAMTS5 não liga ADAMTS4, ADAMTS1, ADAMTS15, MMP1 e/ou MMP14 (tipo de membrana). Preferivelmente, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui definido, em que o referido ISVD ligando ADAMTS5 não liga ADAMTS4, MMP1 ou MMP14.

[137] Em um aspecto, a invenção refere-se a um aglutinante MMP13, tal como um ISVD e polipeptídeo da invenção, em que o referido aglutinante MMP13 não liga MMP1 e/ou MMP14 (tipo de membrana). Preferivelmente, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui definido, em que o referido ISVD ligando MMP13 não liga MMP1 ou MMP14.

[138] Salvo indicação em contrário, os termos "imunoglobulina" e "sequência de imunoglobulina" – se usados aqui para se referir a um anticorpo de cadeia pesada ou a um anticorpo convencional de 4 cadeias - são usados como um termo geral para incluir o anticorpo em tamanho real, as cadeias individuais das mesmas, bem como todas as partes, domínios ou fragmentos das mesmas (incluindo, sem limitação, domínios ou fragmentos de ligação ao antígeno, como o domínios VHH ou domínios VH/VL, respectivamente).

[139] O termo "domínio" (de um polipeptídeo ou proteína), conforme usado aqui, refere-se a uma estrutura de proteína dobrada que tem a capacidade de reter sua estrutura terciária independentemente do restante da proteína. Geralmente, os domínios são responsáveis por propriedades funcionais discretas das proteínas e, em muitos casos, podem ser adicionados, removidos ou transferidos para outras proteínas sem perda de função do restante da proteína e/ou do domínio.

[140] O termo "domínio de imunoglobulina", conforme usado aqui, refere-se a uma região globular de uma cadeia de anticorpos (como, por exemplo, uma cadeia de um anticorpo convencional de 4 cadeias ou de um anticorpo de cadeia pesada) ou a um polipeptídeo que consiste essencialmente em um tal região globular. Os domínios de imunoglobulina são caracterizados por reterem a característica de desdobramento de imunoglobulina das moléculas de anticorpo, que consiste em um sanduíche de duas camadas de cerca de sete beta- filamentos antiparalelos dispostos em duas folhas beta, opcionalmente estabilizadas por uma ligação dissulfeto conservada.

[141] O termo "domínio variável de imunoglobulina", conforme usado aqui, significa um domínio de imunoglobulina consistindo essencialmente em quatro "regiões estruturais" que são referidas na técnica e aqui abaixo como "região estrutural 1" ou "FR1"; como "região estrutural 2" ou "FR2"; como "região estrutural 3" ou "FR3"; e como "região estrutural 4" ou "FR4", respectivamente; quais regiões estruturais são interrompidas por três "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs", que são referidas na técnica e aqui abaixo como "região determinante de complementaridade 1" ou "CDR1"; como "região determinante de complementaridade 2" ou "CDR2"; e como "região determinante de complementaridade 3" ou "CDR3", respectivamente. Assim, a estrutura ou sequência geral de um domínio variável de imunoglobulina pode ser indicada como se segue: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. São os domínios variáveis da imunoglobulina que conferem especificidade a um anticorpo para o antígeno carregando o sítio de ligação ao antígeno.

[142] O termo "domínio variável único de imunoglobulina"

(abreviado aqui como "ISVD" ou "ISV") e usado de forma intercambiável com "domínio variável único" define as moléculas em que o sítio de ligação ao antígeno está presente e é formado por um único domínio de imunoglobulina. Isso define domínios variáveis únicos de imunoglobulina além das imunoglobulinas "convencionais" ou seus fragmentos, em que dois domínios de imunoglobulina, em particular dois domínios variáveis, interagem para formar um sítio de ligação ao antígeno. Tipicamente, nas imunoglobulinas convencionais, um domínio variável da cadeia pesada (VH) e um domínio variável da cadeia leve (VL) interagem para formar um sítio de ligação ao antígeno. Neste último caso, as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de VH e VL contribuirão para o sítio de ligação ao antígeno, isto é, um total de 6 CDRs estarão envolvidas na formação do sítio de ligação ao antígeno.

[143] Tendo em vista a definição acima, o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo convencional de 4 cadeias (tais como uma molécula de IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE; conhecido na técnica) ou de um fragmento Fab, um F(ab’)2, um fragmento Fv, como um Fv ligado por dissulfeto ou um fragmento scFv, ou um diacorpo (todos conhecidos na técnica) derivado desse anticorpo convencional de 4 cadeias, normalmente não seria considerado um domínio variável único de imunoglobulina, como, nesses casos, a ligação ao epítopo respectivo de um antígeno normalmente não ocorreria por um (único) domínio da imunoglobulina, mas por um par de (associando) domínios da imunoglobulina, como domínios variáveis de cadeia leve e pesada, isto é, por um par VH-VL de domínios de imunoglobulina, que se ligam conjuntamente a um epítopo do respectivo antígeno.

[144] Em contraste, os ISVDs são capazes de se ligar especificamente a um epítopo do antígeno sem parear com um domínio variável adicional da imunoglobulina. O sítio de ligação de um ISVD é formado por um único domínio VHH, VH ou VL. Portanto, o sítio de ligação ao antígeno de um ISVD é formado por não mais que três CDRs.

[145] Como tal, o domínio variável único pode ser uma sequência de domínio variável da cadeia leve (por exemplo, uma sequência VL) ou um seu fragmento adequado; ou uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (por exemplo, uma sequência VH ou sequência VHH) ou um seu fragmento adequado; desde que seja capaz de formar uma única unidade de ligação ao antígeno (isto é, uma unidade funcional de ligação ao antígeno que consiste essencialmente no único domínio variável, de modo que o único domínio de ligação ao antígeno não precise interagir com outro domínio variável para formar uma unidade de ligação ao antígeno funcional).

[146] Em uma modalidade da invenção, os ISVDs são sequências de domínio variável de cadeia pesada (por exemplo, uma sequência de VH); mais especificamente, os ISVDs podem ser sequências de domínio variável de cadeia pesada que são derivadas de um anticorpo convencional de quatro cadeias ou sequências de domínio variável de cadeia pesada que são derivadas de um anticorpo de cadeia pesada.

[147] Por exemplo, o ISVD pode ser um anticorpo de domínio (único) (ou um aminoácido adequado para uso como um anticorpo de domínio (único)), um "dAb" ou sdAb (ou um aminoácido adequado para uso como um dAb) ou um Nanocorpo (como definido aqui, e incluindo, mas não limitado a, um VHH); outros domínios variáveis únicos ou qualquer fragmento adequado de qualquer um deles.

[148] Em particular, o ISVD pode ser um Nanobody® (como aqui definido) ou um fragmento adequado. [Nota: Nanobody®, Nanobodies® e Nanoclone® são marcas registradas da Ablynx N.V.] Para uma descrição geral dos Nanocorpos, é feita referência à descrição adicional abaixo, bem como à técnica anterior citada aqui, como por exemplo, descrito em WO 08/020079 (página 16).

[149] "Domínios VHH", também conhecidos como VHHs, domínios

VHH, fragmentos de anticorpos VHH e anticorpos VHH, foram originalmente descritos como o domínio (variável) da imunoglobulina de ligação ao antígeno de "anticorpos da cadeia pesada" (isto é, de "anticorpos desprovidos de cadeias leves Hamers-Casterman et al. 1993 Nature 363: 446-448). O termo "domínio VHH" foi escolhido para distinguir esses domínios variáveis dos domínios variáveis de cadeia pesada que estão presentes nos anticorpos convencionais de 4 cadeias (que são aqui referidos como "domínios VH" ou "domínios VH") e dos domínios variáveis da cadeia leve que estão presentes nos anticorpos convencionais de 4 cadeias (que são aqui referidos como "domínios VL" ou "domínios VL"). Para uma descrição adicional dos VHHs e Nanocorpos, é feita referência ao artigo de revisão de Muyldermans (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001), bem como aos seguintes pedidos de patente, mencionados como técnica de fundamento: WO 94/04678, WO 95/04079 e WO 96/34103 da Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 e WO 02/48193 da Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 e WO 03/055527 do Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB); WO 03/050531 de Algonomics N.V. e Ablynx N.V.; WO 01/90190 pelo Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá; WO 03/025020 (= EP 1433793) pelo Institute of Antibodies; bem como WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, WO 06/122786, WO 06/122787 e WO 06/122825, da Ablynx NV e os outros pedidos de patente publicados pela Ablynx N.V.

Também são feitas referências à técnica anterior mencionada nesses pedidos e, em particular, à lista de referências mencionadas nas páginas 41-43 do Pedido internacional WO 06/040153, cuja lista e referências são aqui incorporadas por referência.

Conforme descrito nessas referências, os nanocorpos (em particular as sequências de VHH e os nanocorpos parcialmente humanizados) podem ser caracterizados em particular pela presença de um ou mais "resíduos de Característica" em uma ou mais das sequências estruturais. Uma descrição adicional dos Nanocorpos, incluindo humanização e/ou camelização de Nanocorpos, bem como outras modificações, partes ou fragmentos, derivados ou "Fusões de Nanocorpos", construtos multivalentes (incluindo alguns exemplos não limitativos de sequências de ligação) e diferentes modificações para aumentar a meia-vida dos nanocorpos e suas preparações podem ser encontradas, por exemplo, nos documentos WO 08/101985 e WO 08/142164. Para uma descrição geral adicional dos nanocorpos, é feita referência à técnica anterior citada aqui, como por exemplo, descrito em WO 08/020079 (página 16).

[150] Em particular, as sequências estruturais presentes nos aglutinantes Aggrecan, ADAMTS5 e/ou MMP13 da invenção, como os ISVDs e/ou polipeptídeos da invenção, podem conter um ou mais resíduos de Característica (por exemplo, como descrito em WO 08/020079 (Tabelas A-3 a A-8)), de modo que o aglutinante Aggrecan, ADAMTS5 e/ou MMP13 da invenção seja um Nanocorpo. Alguns exemplos preferidos, mas não limitativos, de (combinações adequadas) de tais sequências estruturais, ficarão claros a partir da divulgação adicional aqui (vide, por exemplo, Tabela A-2). Geralmente, os nanocorpos (em particular as sequências VHH e os nanocorpos parcialmente humanizados) podem ser caracterizados, em particular, pela presença de um ou mais "resíduos Característica" em uma ou mais das sequências estruturais (como por exemplo, descrição adicional em WO 08/020079, página 61, linha 24 à página 98, linha 3). Tal como aqui utilizado "representado por" no contexto de qualquer SEQ ID NO é equivalente a "compreende ou consiste em" a referida SEQ ID NO e preferivelmente equivalente a "consiste em" a referida SEQ ID NO.

[151] Mais particularmente, a invenção fornece aglutinantes Aggrecan, ADAMTS5 e/ou MMP13 compreendendo pelo menos um domínio variável único de imunoglobulina que é uma sequência de aminoácido com a estrutura (geral): FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 em que FR1 a FR4 se refere às regiões de estrutura 1 a 4, respectivamente, e em que CDR1 a CDR3 se refere às regiões determinantes de complementaridade 1 a 3, respectivamente, e que: i) possuir pelo menos 80%, mais preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 95% de identidade de aminoácidos com pelo menos uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 2, 3 ou 4 (vide Tabela A-1), nas quais para fins de determinação do grau de identidade de aminoácidos, os resíduos de aminoácidos que formam as sequências de CDR são desconsiderados. A esse respeito, também é feita referência à Tabela A-2, que lista as sequências da estrutura 1 (SEQ ID NO: 7), sequências da estrutura 2 (SEQ ID NOs: 9, 15 e 20), sequências da estrutura 3 (SEQ ID NOs: 11, 17 e 22) e sequências da estrutura 4 (SEQ ID NO: 13) dos domínios variáveis únicos de imunoglobulina das SEQ ID NOs: 2, 3 e 4; ou ii) combinações de sequências estruturais, conforme ilustrado na Tabela A-2; e em que: iii) preferivelmente, um ou mais dos resíduos de aminoácidos nas posições 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 e 108 de acordo com a numeração de Kabat são escolhidos a partir dos resíduos da Característica, por exemplo, como mencionado na Tabela A-3 à Tabela A-8 do documento WO 08/020079.

[152] Os aglutinantes Aggrecan, ADAMTS5 e/ou MMP13 da invenção, como os ISVDs e/ou polipeptídeos da invenção, também podem conter as mutações / resíduos de aminoácidos específicos descritos nas seguintes aplicações provisórias copendentes nos EUA, todas intituladas "Improved immunoglobulin variable domaisn": US 61/994552 depositado em 16 de maio de 2014; US 61/014.015 depositado em 18 de junho de 2014; US 62/040.167 depositado em 21 de agosto de 2014; e US 62/047.560, depositado em 8 de setembro de 2014 (todos atribuídos à Ablynx N.V.).

[153] Em particular, os aglutinantes Aggrecan, ADAMTS5 e/ou MMP13 da invenção, tais como os ISVDs e/ou polipeptídeos da invenção, podem conter adequadamente (i) um K ou Q na posição 112; ou (ii) um K ou Q na posição 110 em combinação com um V na posição 11; ou (iii) um T na posição 89; ou (iv) um L na posição 89 com um K ou Q na posição 110; ou (v) um V na posição 11 e um L na posição 89; ou qualquer combinação adequada de (i) a (v).

[154] Como também descrito nos referidos pedidos provisórios copendentes dos EUA, quando os aglutinantes Aggrecan, ADAMTS5 e/ou MMP13 da invenção, como os ISVDs e/ou polipeptídeos da invenção, contêm as mutações de acordo com um de (i) a (v) acima (ou uma combinação adequada dos mesmos): o resíduo de aminoácido na posição 11 é preferivelmente escolhido dentre L, V ou K (e é mais preferivelmente V); e/ou o resíduo de aminoácido na posição 14 é de preferência escolhido adequadamente de A ou P; e/ou o resíduo de aminoácido na posição 41 é de preferência adequadamente escolhido de A ou P; e/ou o resíduo de aminoácido na posição 89 é de preferência escolhido adequadamente entre T, V ou L; e/ou o resíduo de aminoácido na posição 108 é de preferência escolhido adequadamente de Q ou L; e/ou o resíduo de aminoácido na posição 110 é de preferência escolhido adequadamente entre T, K ou Q; e/ou o resíduo de aminoácido na posição 112 é de preferência adequadamente escolhido de S, K ou Q.

[155] Como mencionado nas referidas aplicações provisórias copendentes nos EUA, as referidas mutações são eficazes na prevenção ou redução da ligação dos chamados "anticorpos preexistentes" às imunoglobulinas e compostos da invenção. Para esse fim, os aglutinantes Aggrecan, ADAMTS5 e/ou MMP13 da invenção, como os ISVDs e/ou polipeptídeos da invenção, também podem conter (opcionalmente em combinação com as referidas mutações) uma extensão do C-terminal (X)n (em que n é 1 a 10, preferivelmente 1 a 5, como 1, 2, 3, 4 ou 5 (e preferivelmente 1 ou 2, como 1); e cada X é um resíduo de aminoácido (de preferência natural) que é escolhido independentemente e de preferência escolhido independentemente do grupo que consiste em alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ou isoleucina (I)), vide, por exemplo Pedidos provisórios dos EUA, bem como WO 12/175741. Em particular, um aglutinante Aggrecan, ADAMTS5 e/ou MMP13 da invenção, como um ISVD e/ou polipeptídeo da invenção, pode conter uma extensão C-terminal quando formar a extremidade C-terminal de uma proteína, polipeptídeo ou outro composto ou construto compreendendo o mesmo (vide, por exemplo, os referidos pedidos provisórios dos EUA, bem como o documento WO 12/175741).

[156] Um aggrecan, ADAMTS5 e/ou aglutinante MMP13 da invenção pode ser uma imunoglobulina, como um domínio variável único de imunoglobulina, derivada de qualquer maneira adequada e de qualquer fonte adequada, e pode, por exemplo, ser sequências de VHH de ocorrência natural (isto é, de uma espécie adequada de Camelídeo) ou sequências de aminoácidos sintéticas ou semissintéticas, incluindo, mas não se limitando a, sequências de nanocorpos ou VHH "humanizadas" (como aqui definidas), sequências de imunoglobulinas

"camelizadas" (como aqui definidas) (e em particular sequências de domínio variável cadeia pesada camelizadas), bem como nanocorpos que foram obtidos por técnicas como maturação por afinidade (por exemplo, a partir de sequências sintéticas, aleatórias ou de imunoglobulina de ocorrência natural), enxerto de CDR, revestimento, combinação de fragmentos derivados de diferentes sequências de imunoglobulina, montagem de PCR usando iniciadores sobrepostos e técnicas semelhantes para engenharia de sequências de imunoglobulinas bem conhecidas dos versados na técnica; ou qualquer combinação adequada de qualquer um dos anteriores, como descrito aqui mais detalhadamente. Além disso, quando uma imunoglobulina compreende uma sequência de VHH, a referida imunoglobulina pode ser adequadamente humanizada, como aqui descrito mais detalhadamente, de modo a fornecer uma ou mais outras imunoglobulinas humanizadas (parcial ou totalmente) da invenção. Da mesma forma, quando uma imunoglobulina compreende uma sequência sintética ou semissintética (como uma sequência parcialmente humanizada), a referida imunoglobulina pode opcionalmente ser humanizada adequadamente, novamente como descrito aqui, novamente, de modo a fornecer um ou mais imunoglobulinas humanizadas (parcial ou totalmente) da invenção.

[157] "Anticorpos de domínio", também conhecidos como "Dab"s, "Anticorpos de domínio" e "dAbs" (os termos "Anticorpos de Domínio" e "dAbs" usados como marcas registradas pelo grupo de empresas GlaxoSmithKline) foram descritos em, por exemplo, EP 0368684, Ward et al. (Nature 341: 544-546, 1989), Holt et al. (Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003) e WO 03/002609, bem como, por exemplo, WO 04/068820, WO 06/030220, WO 06/003388 e outros pedidos de patente publicados da Domantis Ltd. Os anticorpos de domínio correspondem essencialmente aos domínios VH ou VL de mamíferos não camelídeos,

em particular anticorpos humanos de 4 cadeias. Para ligar um epítopo como um único domínio de ligação ao antígeno, isto é, sem ser emparelhado com um domínio VL ou VH, respectivamente, é necessária uma seleção específica para essas propriedades de ligação ao antígeno, por exemplo, usando bibliotecas de sequências humanas de domínio único VH ou VL. Os anticorpos de domínio têm, como VHHs, um peso molecular de aproximadamente 13 a aproximadamente 16 KDa e, se derivados de sequências totalmente humanas, não requerem humanização para, por exemplo, uso terapêutico em humanos.

[158] Deve-se notar também que, embora menos preferidos no contexto da presente invenção, por não serem de origem mamífera, domínios variáveis únicos podem ser derivados de certas espécies de tubarão (por exemplo, os chamados "domínios IgNAR", vide por exemplo, WO 05/18629).

[159] A presente invenção refere-se particularmente a ISVDs, em que os referidos ISVDs são escolhidos a partir do grupo que consiste em VHHs, VHH humanizados e VH camelizados.

[160] Os resíduos de aminoácidos de um domínio VHH são numerados de acordo com a numeração geral para domínios VH dada por Kabat et al. ("Sequência de proteínas de interesse imunológico", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publicação No. 91), como aplicado aos domínios VHH de Camelídeos, como mostrado, por exemplo, na Figura 2 de Riechmann e Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999), todos como conhecidos na técnica. Métodos alternativos para numerar os resíduos de aminoácidos dos domínios VH, métodos que também podem ser aplicados de maneira análoga aos domínios VHH, são conhecidos na técnica. No entanto, na presente descrição, reivindicações e figuras, a numeração de acordo com Kabat aplicada aos domínios VHH como descrito acima será seguida, a menos que indicado de outra forma.

[161] Deve-se notar que - como é bem conhecido na técnica para domínios VH e para domínios VHH - o número total de resíduos de aminoácidos em cada uma das CDRs pode variar e pode não corresponder ao número total de resíduos de aminoácidos indicado pela Numeração Kabat (isto é, uma ou mais posições de acordo com a numeração Kabat podem ser ocupadas na sequência real ou a sequência real pode conter mais resíduos de aminoácidos que o número permitido pela numeração Kabat). Isto significa que, geralmente, a numeração de acordo com Kabat pode ou não corresponder à numeração real dos resíduos de aminoácidos na sequência real. O número total de resíduos de aminoácidos em um domínio VH e um domínio VHH estará geralmente na faixa de 110 a 120, geralmente entre 112 e 115. No entanto, deve-se notar que sequências menores e mais longas também podem ser adequadas para os fins aqui descritos.

[162] No que diz respeito às CDRs, como é bem conhecido na técnica, existem várias convenções para definir e descrever as CDRs de um fragmento VH ou VHH, como a definição de Kabat (que é baseada na variabilidade de sequência e é a mais usada) e a definição de Chothia (que se baseia na localização das regiões do loop estrutural). Por exemplo, é feita referência ao site http://www.bioinf.org.uk/abs/. Para os fins da presente relatório descritivo e reivindicações, as CDRs são preferivelmente definidas com base na definição Abm (que é baseada no software de modelagem de anticorpos AbM da Oxford Molecular), pois esse é considerado um compromisso ideal entre as definições de Kabat e Chothia (cf. http://www.bioinf.org.uk/abs/). Como aqui utilizado, FR1 compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 1-25, CDR1 compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 26-35, FR2 compreende os aminoácidos nas posições 36-49, CDR2 compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 50-58, FR3 compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 59-94,

CDR3 compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 95-102 e FR4 compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 103-113.

[163] No significado da presente invenção, o termo "domínio variável único de imunoglobulina" ou "domínio variável único" compreende polipeptídeos derivados de uma fonte não humana, preferivelmente um camelídeo, preferivelmente um anticorpo de cadeia pesada de camelídeo. Eles podem ser humanizados, como aqui descrito. Além disso, o termo compreende polipeptídeos derivados de fontes não camelídeos, por exemplo, camundongo ou humano, que foram "camelizados", conforme descrito aqui.

[164] Portanto, ISVDs como anticorpos de domínio e nanocorpos (incluindo domínios de VHH) podem ser submetidos à humanização. Em particular, ISVDs humanizados, como Nanocorpos (incluindo domínios VHH) podem ser ISVDs que são geralmente definidos aqui, mas nos quais pelo menos um resíduo de aminoácido está presente (e em particular, em pelo menos um dos resíduos da estrutura) que é e/ou corresponde a uma substituição humanizada (como aqui definido). As substituições humanizadas potencialmente úteis podem ser determinadas comparando a sequência das regiões estruturais de uma sequência VHH de ocorrência natural com a sequência estrutural correspondente de uma ou mais sequências humanas de VH intimamente relacionadas, após as quais uma ou mais das substituições humanizadas potencialmente úteis (ou suas combinações) assim determinadas pode ser introduzidas na referida sequência de VHH (de qualquer maneira conhecida per se, conforme descrito aqui mais adiante) e as sequências de VHH humanizadas resultantes podem ser testadas quanto à afinidade para o alvo, quanto à estabilidade, facilidade e nível de expressão e/ou para outras propriedades desejadas. Desta maneira, por meio de um grau limitado de tentativa e erro, outras substituições humanizadas adequadas (ou combinações adequadas das mesmas) podem ser determinadas pelo especialista com base na divulgação aqui apresentada. Além disso, com base no exposto, (as regiões estruturais de) um ISVD, como um Nanocorpo (incluindo domínios VHH) pode ser parcialmente humanizado ou totalmente humanizado.

[165] Outra classe particularmente preferida de ISVDs da invenção compreende ISVDs com uma sequência de aminoácido que corresponde à sequência de aminoácido de um domínio VH de ocorrência natural, mas que foi "camelizada", isto é, substituindo um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácido de um domínio VH de ocorrência natural a partir de um anticorpo convencional de 4 cadeias por um ou mais resíduos de aminoácidos que ocorrem na (s) posição (s) correspondente (s) em um domínio VHH de um anticorpo de cadeia pesada. Isso pode ser realizado de uma maneira conhecida per se, que será clara para o especialista, por exemplo, com base na descrição aqui contida. Tais substituições de "camelídeos" são preferivelmente inseridas nas posições de aminoácidos que se formam e/ou estão presentes na interface VH-VL e/ou nos chamados resíduos de característica Camelidae, conforme aqui definido (vide também, por exemplo, o documento WO 94/04678 e Davies e Riechmann (1994 e 1996)). De preferência, a sequência VH que é usada como material de partida ou ponto de partida para gerar ou projetar os domínios variáveis únicos da imunoglobulina camelizada é preferivelmente uma sequência VH de um mamífero, mais preferivelmente a sequência VH de um ser humano, como uma sequência VH3. No entanto, deve-se notar que esses domínios variáveis únicos da imunoglobulina camelizada da invenção podem ser obtidos de qualquer maneira adequada conhecida per se e, portanto, não são estritamente limitados a polipeptídeos que foram obtidos utilizando um polipeptídeo que compreende um domínio VH de ocorrência natural como um material de início. É feita referência a Davies e Riechmann (FEBS 339: 285-290, 1994; Biotechnol. 13: 475- 479, 1995; Prot. Eng. 9: 531-537, 1996) e Riechmann e Muyldermans (J. Immunol. Methods 231 : 25-38, 1999)

[166] Por exemplo, novamente como descrito aqui mais adiante, tanto a "humanização" quanto a "camelização" podem ser realizadas fornecendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um domínio VHH de ocorrência natural ou domínio VH, respectivamente, e depois alterando, de uma maneira conhecida per se, um ou mais códons na referida sequência nucleotídica de tal maneira que a nova sequência nucleotídica codifique um ISVD "humanizado" ou "camelizado" da invenção, respectivamente. Este ácido nucleico pode então ser expresso de uma maneira conhecida per se, de modo a fornecer os ISVDs desejados da invenção. Alternativamente, com base na sequência de aminoácido de um domínio VHH ou domínio VH de ocorrência natural, respectivamente, a sequência de aminoácido dos ISVDs humanizados ou camelizados desejados da invenção, respectivamente, pode ser projetada e depois sintetizada de novo usando técnicas para síntese peptídica conhecidas per se. Além disso, com base na sequência de aminoácido ou sequência nucleotídica de um domínio VHH ou domínio VH de ocorrência natural, respectivamente, uma sequência nucleotídica que codifica os ISVDs humanizados ou camelizados desejados da invenção, respectivamente, pode ser projetada e depois sintetizada de novo usando técnicas para síntese de ácido nucleico conhecida per se, após o que o ácido nucleico assim obtido pode ser expresso de uma maneira conhecida per se, de modo a fornecer os ISVDs desejados da invenção.

[167] ISVDs tais como anticorpos de Domínio e Nanocorpos (incluindo domínios VHH e domínios VHH humanizados), também podem ser submetidos à maturação por afinidade, introduzindo uma ou mais alterações na sequência de aminoácido de uma ou mais CDRs,

alterações que resultam em uma afinidade aprimorada do ISVD resultante para seu respectivo antígeno, em comparação com a respectiva molécula parental. Moléculas ISVD maturadas por afinidade da invenção podem ser preparadas por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito por Marks et al. (Biotechnology 10: 779-783, 1992), Barbas, et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813, 1994), Shier et al. (Gene 169: 147-155, 1995), Yelton et al. (Immunol. 155: 1994-2004, 1995), Jackson et al. (J. Immunol. 154: 3310-9, 1995), Hawkins et al. (J. MoI. Biol. 226: 889 896, 1992), Johnson e Hawkins (maturação por afinidade de anticorpos utilizando exibição de fagos, Oxford University Press, 1996).

[168] O processo de projetar / selecionar e/ou preparar um polipeptídeo, a partir de um ISVD, como um VH, VL, VHH, anticorpo de Domínio ou um Nanocorpo, também é referido aqui como "formatação" do referido ISVD; e um ISVD que é feito parte de um polipeptídeo é dito estar "formatado" ou estar "no formato" do referido polipeptídeo. Exemplos de maneiras pelas quais um ISVD pode ser formatado e exemplos de tais formatos serão claros para o especialista com base na divulgação aqui; e esse domínio variável único de imunoglobulina formatado constitui um aspecto adicional da invenção.

[169] CDRs preferidos estão representados na Tabela A-2.

[170] Em particular, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido ISVD que liga MMP13 especificamente consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FR4, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente), nas quais (i) CDR1 é SEQ ID NO: 8; e sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 8; (ii) CDR2 é SEQ ID NO: 10; e sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO:

10; e (iii) CDR3 é SEQ ID NO: 12; e sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO:

12.

[171] Em particular, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido ISVD que liga MMP13 especificamente consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FR4, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente), nas quais CDR1 é SEQ ID NO: 8, CDR2 é SEQ ID NO: 10 e CDR3 é SEQ ID NO: 12.

[172] Em particular, a presente invenção refere-se a um ISVD como aqui descrito, em que o referido ISVD que especificamente liga ADAMTS5 consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FR4, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente), nas quais (i) CDR1 é SEQ ID NO: 14 [GRTVSSYAMG]; e sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 14; (ii) CDR2 é SEQ ID NO: 16 [GISRSAERTY]; e sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 16; e (iii) CDR3 é SEQ ID NO: 18 [DLDPNRIFSREEYAY]; e sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferenças de aminoácidos com a SEQ ID NO: 18.

[173] Em particular, a presente invenção refere-se a um ISVD como descrito aqui, em que o referido ISVD que especificamente liga ADAMTS5 consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FR4, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente), nas quais CDR1 é SEQ ID NO: 14, CDR2 é SEQ ID NO: 16 e CDR3 é SEQ ID NO: 18.

[174] Em particular, a presente invenção refere-se a um ISVD como aqui descrito, em que o referido ISVD que liga especificamente Aggrecan consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FR4, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente), nas quais (i) CDR1 é SEQ ID NO: 19; e sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 19; (ii) CDR2 é SEQ ID NO: 21; e sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 21; e (iii) CDR3 é SEQ ID NO: 23; e sequências de aminoácidos que possuem 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO:

23.

[175] Em particular, a presente invenção refere-se a um ISVD como aqui descrito, em que o referido ISVD que liga especificamente Aggrecan consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FR4, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente), nas quais CDR1 é SEQ ID NO: 19, CDR2 é SEQ ID NO: 21 e CDR3 é SEQ ID NO: 23.

[176] Em particular, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido ISVD que liga MMP13 especificamente é a SEQ ID NO: 2.

[177] Em particular, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido ISVD que especificamente liga ADAMTS5 é a SEQ ID NO: 3.

[178] Em particular, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido ISVD que liga especificamente Aggrecan é a SEQ ID NO: 4.

[179] Em uma outra modalidade preferida, o aglutinador Aggrecan,

ADAMTS5 e/ou MMP13 da invenção compreende pelo menos duas sequências CDR1, pelo menos duas sequências CDR2 e pelo menos duas sequências CDR3, cada uma selecionada independentemente da tabela a seguir: CDR1 CDR2 CDR3 SEQ ID NO: 8 (CDR1a) SEQ ID NO: 10 (CDR2a) SEQ ID NO: 12 (CDR3a) SEQ ID NO: 14 (CDR1b) SEQ ID NO: 16 (CDR2b) SEQ ID NO: 18 (CDR3b) SEQ ID NO: 19 (CDR1c) SEQ ID NO: 21 (CDR2c) SEQ ID NO: 23 (CDR3c)

[180] No aggrecan acima mencionado, aglutinante ADAMTS5 e/ou MMP13, a ordem das sequências é preferivelmente CDR1a-CDR2a- CDR3a-Ligante-CDR1b-CDR2b-CDR3b, em que Ligante é um polipeptídeo com mais de 5 aminoácidos, adequado para ligar o primeiro conjunto de CDRs (CDR1a-CDR2a-CDR3a) ao segundo conjunto (CDR1b-CDR2b-CDR3b). De preferência, o Ligante é selecionado da Tabela C abaixo e, mais preferivelmente, é um Ligante com uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 35. Em uma modalidade mais preferida, o aglutinante Aggrecan, ADAMTS5 e/ou MMP13 compreende todas as nove sequências de CDR da tabela acima, em que as sequências de CDR e os polipeptídeos ligantes estão na seguinte ordem: CDR1a-CDR2a-CDR3a-Ligante1-CDR1b-CDR2b- CDR3b-Ligante2-CDR1c-CDR2c-CDR3c, em que Ligante1 e Ligante2 são polipeptídeos de pelo menos 5 aminoácidos e em que as sequências polipeptídicas de Ligante1 e Ligante2 são idênticas umas às outras ou não idênticas umas às outras. De preferência, o Ligante1 e o Ligante2 são cada um selecionado independentemente um do outro da Tabela C abaixo e mais preferivelmente pelo menos um (preferivelmente ambos) dos ligantes possui / possuem a sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 35.

[181] Em uma outra modalidade preferida, o aglutinante Aggrecan, ADAMTS5 e/ou MMP13 da invenção compreende preferivelmente pelo menos as sequências de CDR listadas na tabela a seguir:

SEQ ID NO: 8 (CDR1a) SEQ ID NO: 10 (CDR2a) SEQ ID NO: 12 (CDR3a) SEQ ID NO: 14 (CDR1b) SEQ ID NO: 16 (CDR2b) SEQ ID NO: 18 (CDR3b) SEQ ID NO: 19 (CDR1c) SEQ ID NO: 21 (CDR2c) SEQ ID NO: 23 (CDR3c) SEQ ID NO: 19 (CDR1d) SEQ ID NO: 21 (CDR2d) SEQ ID NO: 23 (CDR3d)

[182] Na modalidade mencionada acima, a ordem das sequências de CDR pode ser CDR1a-CDR2a-CDR3a-Ligante1-CDR1b-CDR2b- CDR3b-Ligante2-CDR1c-CDR2c-CDR3c-Ligante3-CDR1d-CDR2d- CDR3d; em que Ligante1, Ligante2 e Ligante3 são cada um polipeptídeos de pelo menos 5 aminoácidos e em que as sequências polipeptídicas de Ligante1, Ligante2 e Ligante 3 são idênticas entre si ou não são idênticas entre si. Preferivelmente, Ligante1, Ligante2 e Ligante3 são selecionados independentemente um do outro da Tabela C abaixo e mais preferivelmente pelo menos um (preferivelmente todos os três) dos ligantes possui / possuem a sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 35. Entende-se que nas modalidades preferidas descritas no contexto das duas tabelas acima, as sequências de CDR podem ser ligadas umas às outras por meio de sequências de estrutura como aqui descritas em outro lugar e, de preferência, as sequências de estrutura divulgadas na Tabela A-2 podem ser usadas a este respeito.

[183] Será apreciado que, sem limitação, os domínios variáveis únicos de imunoglobulina da presente invenção podem ser utilizados como um "bloco de construção" para a preparação de um polipeptídeo, que pode opcionalmente conter um ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina adicionais que podem servir como um bloco de construção.

[184] A técnica necessita de terapias mais eficazes para distúrbios que afetam a cartilagem nas articulações, como a osteoartrite. Mesmo quando administrados intra-articularmente, o tempo de permanência da maioria dos medicamentos para o tratamento da cartilagem afetada é insuficiente. Sem estar limitado pela teoria, os presentes inventores levantaram a hipótese de que a eficácia de um medicamento terapêutico, como um construto, polipeptídeo e ISVD da invenção, pode ser modulada acoplando a fármaco terapêutica a uma porção que "ancoraria" a fármaco na articulação e consequentemente aumentaria a retenção da fármaco, mas que não deve prejudicar a eficácia da referida fármaco terapêutica (esta porção é aqui também indicada como "proteína de ancoragem da cartilagem" ou "CAP"). Esse conceito de ancoragem pode não apenas modular a eficácia de um medicamento, mas também a especificidade operacional de uma articulação doente, diminuindo a toxicidade e os efeitos colaterais, ampliando o número de possíveis medicamentos úteis.

[185] Previu-se que um formato de uma molécula para uso clínico compreende um ou dois blocos de construção, tais como ISVDs, ligando MMP13 e/ou ADAMTS5 e um ou mais blocos de construção, por exemplo, ISVDs, com esse modo de retenção de ação e possivelmente outras partes. É demonstrado na presente invenção que esses formatos retêm a ligação a MMP13 e/ou ADAMTS5 e um efeito terapêutico, por exemplo, atividade inibitória, bem como propriedades de retenção. Os um ou mais blocos de construção, como ISVDs, com um modo de retenção de ação podem ser qualquer bloco de construção com efeito de retenção ("bloco de construção CAP") em doenças nas quais MMP13 e/ou ADAMTS5 estão envolvidos, como doença artrítica, osteoartrite, displasia espondiloepimetafisária, doença degenerativa do disco lombar, doença articular degenerativa, artrite reumatoide, osteocondrite dissecante, agrecanopatias.

[186] Um "bloco de construção CAP" é usado para direcionar, ancorar e/ou reter outros, por exemplo, blocos de construção, terapêuticos, como ISVDs que ligam MMP13 e/ou ADAMTS5 em um sítio desejado, como por exemplo em uma articulação, na qual o referido outro, por exemplo, bloco de construção terapêutico deve exercer o seu efeito, por exemplo, ligando e/ou inibindo MMP13 e/ou ADAMTS5.

[187] Novamente, sem estar vinculado à teoria, os presentes inventores levantaram a hipótese de que aglutinantes Aggrecan, como ISVD (s) que ligam Aggrecan, podem funcionar potencialmente como uma âncora, embora Aggrecan seja fortemente glicosilado e degradado em vários distúrbios que afetam a cartilagem nas articulações. Além disso, tendo em vista os custos e testes extensivos em vários modelos animais necessários para que uma fármaco possa entrar na clínica, esses aglutinantes de aggrecan devem ter preferivelmente uma ampla reatividade cruzada, por exemplo, os aglutinantes Aggrecan devem se ligar a Aggrecan de várias espécies.

[188] Utilizando vários métodos engenhosos de imunização, triagem e caracterização, os presentes inventores foram capazes de identificar vários aglutinantes de Aggrecan com características superiores de seletividade, estabilidade e especificidade, o que permitiu retenção e atividade prolongadas na articulação.

[189] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para reduzir e/ou inibir o efluxo de uma composição, um polipeptídeo ou um construto de uma articulação, em que o referido método compreende administrar uma quantidade farmaceuticamente ativa de pelo menos um polipeptídeo de acordo com a invenção, um construto de acordo com a invenção ou uma composição de acordo com a invenção a uma pessoa que dela necessite.

[190] Na presente invenção, o termo "redução e/ou inibição do efluxo" significa reduzir e/ou inibir o fluxo externo da composição, polipeptídeo ou construto de dentro de uma articulação para o exterior. De preferência, o efluxo é reduzido e/ou inibido em pelo menos 10%, tais como pelo menos 20%, 30%, 40% ou 50% ou até mais, tais como pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou mesmo 100%, em comparação com o efluxo da composição, polipeptídeo ou construto acima mencionados em uma articulação nas mesmas condições, mas sem a presença do aglutinante Aggrecan da invenção, por exemplo, ISVD (s) que liga Aggrecan.

[191] Junto às doenças nas quais MMP13 e/ou ADAMTS5 estão envolvidas, tais como doença artrítica, osteoartrite, displasia espondiloepimetafisária, degeneração do disco lombar, doença articular degenerativa, artrite reumatoide, osteocondrite dissecante e agrecanopatias, é antecipado que os aglutinantes Aggrecan também podem ser usados em várias outras doenças que afetam a cartilagem, como artropatias e condrodistrofias, doença artrítica (como osteoartrite, artrite reumatoide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura ou descolamento traumático), acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafisária, hérnia de disco lombar, doença de degeneração do disco lombar, doença articular degenerativa, e policondrite recidivante (geralmente indicada aqui como "doenças associadas a Aggrecan").

[192] O referido componente básico do CAP, por exemplo, ISVD (s) que liga Aggrecan, de preferência liga-se ao tecido cartilaginoso, como cartilagem e/ou menisco. Em um aspecto preferido, o bloco de construção CAP é reativo cruzado para outras espécies e liga especificamente um ou mais Aggrecan de humano (SEQ ID NO: 68), Aggrecan de cão, Aggrecan de bovino, Aggrecan de rato; Aggrecan de porco; Aggrecan de camundongo, Aggrecan de coelho; Aggrecan de cinomolgo e/ou Aggrecan de rhesus. Informações estruturais relevantes para Aggrecan podem ser encontradas, por exemplo, em Números de Acesso (UniProt), conforme mostrado na Tabela B-3 acima.

[193] Um bloco de construção CAP preferido é um ISVD que liga Aggrecan, preferivelmente Aggrecan de humano, de preferência representado pela SEQ ID NO: 68, como representado na Tabela B.

[194] A presente invenção refere-se assim a um polipeptídeo ou construto de acordo com a invenção, compreendendo ainda pelo menos um bloco de construção CAP.

[195] A presente invenção refere-se, assim, a um polipeptídeo ou construto de acordo com a invenção, compreendendo ainda pelo menos um ISVD que liga especificamente Aggrecan, de preferência o referido ISVD é representado pela SEQ ID NO: 4.

[196] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, compreendendo pelo menos 2 ISVDs que se ligam especificamente a Aggrecan.

[197] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, compreendendo pelo menos 2 ISVDs que se ligam especificamente a Aggrecan, em que os referidos pelo menos 2 ISVDs que se ligam especificamente a Aggrecan podem ser iguais ou diferentes.

[198] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, compreendendo pelo menos 2 ISVDs que ligam especificamente Aggrecan, em que cada um dos referidos pelo menos 2 ISVDs que ligam especificamente Aggrecan é representado pela SEQ ID NO: 4.

[199] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, compreendendo um ISVD que liga especificamente Aggrecan, em que o referido ISVD que liga especificamente Aggrecan, se liga especificamente a Aggrecan de humano [SEQ ID NO: 68].

[200] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido ISVD que liga especificamente Aggrecan, liga especificamente Aggrecan de humano (SEQ ID NO: 68), Aggrecan de cão, Aggrecan de bovino, Aggrecan de rato, Aggrecan de porco, Aggrecan de camundongo, Aggrecan de coelho, Aggrecan de cinomolgo e/ou Aggrecan de rhesus.

[201] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido ISVD que liga especificamente Aggrecan se liga preferivelmente ao tecido cartilaginoso, como cartilagem e/ou menisco.

[202] Será apreciado que o ISVD, o polipeptídeo e o construto da invenção são preferivelmente estáveis. A estabilidade de um polipeptídeo, construto ou ISVD da invenção pode ser medida por ensaios de rotina conhecidos do especialista na técnica. Os ensaios típicos incluem ensaios (sem limitação) nos quais é determinada a atividade do referido polipeptídeo, construto ou ISVD, seguida de incubação em Fluido Sinovial por um período de tempo desejado, após o qual a atividade é determinada novamente.

[203] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um ISVD, polipeptídeo ou construto da invenção com uma estabilidade de pelo menos 7 dias, como pelo menos 14 dias, 21 dias, 1 mês, 2 meses ou até 3 meses em fluido sinovial (SF) a 37 ºC.

[204] A atividade desejada do bloco de construção terapêutico, por exemplo, um ISVD ligando MMP13 e/ou ADAMTS5 no polipeptídeo multivalente ou construto da invenção pode ser medida por ensaios de rotina conhecidos do especialista na técnica. Os ensaios típicos incluem (sem limitar) os ensaios de liberação de GAG, conforme detalhado na seção Exemplos.

[205] O polipeptídeo da invenção (também aqui indicado como "construto de nanocorpos") é escolhido do grupo que consiste em (a) polipeptídeos compreendendo pelo menos 2 domínios variáveis únicos de imunoglobulina (ISVDs), compreendendo um primeiro ISVD que liga especificamente Aggrecan e um segundo ISVD que liga especificamente uma matriz metaloproteinase (MMP); (b) polipeptídeos compreendendo pelo menos 2 ISVDs, compreendendo um primeiro ISVD que liga especificamente Aggrecan e um segundo ISVD que liga especificamente uma desintegrina A e metaloproteinase com motivos de trombospondina (ADAMTS); e (c) polipeptídeos compreendendo pelo menos 3 ISVDs, compreendendo um primeiro ISVD que liga especificamente um Aggrecan, um segundo ISVD que liga especificamente uma ADAMTS e um terceiro ISVD que liga especificamente MMP.

[206] Em um polipeptídeo da invenção, os ISVDs podem ser diretamente ligados ou ligados através de um ligante. Ainda mais preferivelmente, o polipeptídeo da invenção compreende uma extensão do C-terminal. Como será detalhado aqui, a extensão do C-terminal evita / remove essencialmente a ligação de anticorpos / fatores preexistentes na maioria das amostras de indivíduos / pacientes humanos. A extensão do C-terminal está presente no C-terminal do último resíduo de aminoácido (geralmente um resíduo serina) do último ISVD (localizado no mais para o C-terminal).

[207] Como infra elaborado adicionalmente, os ISVDs podem ser derivados de um domínio VHH, VH ou VL, no entanto, os ISVDs são escolhidos de modo a não formarem pares complementares de domínios VH e VL nos polipeptídeos da invenção. O nanocorpo, o VHH e o VHH humanizado são incomuns, pois são derivados de anticorpos de camelídeos naturais que não possuem cadeias leves e, de fato, esses domínios são incapazes de se associar a cadeias leves de camelídeos para formar pares complementares de VHH e VL. Assim, os polipeptídeos da presente invenção não compreendem ISVDs complementares e/ou formam pares de ISVD complementares, tal como, por exemplo, pares VH / VL complementares.

[208] Geralmente, polipeptídeos ou construtos que compreendem ou consistem essencialmente em um único bloco de construção, ISVD único ou Nanocorpo único serão referidos como polipeptídeos "monovalentes" e "construtos monovalentes", respectivamente.

Polipeptídeos ou construtos que compreendem dois ou mais blocos de construção (como, por exemplo, ISVDs) também serão referidos como polipeptídeos ou construtos "multivalentes", e os blocos de construção / ISVDs presentes nesses polipeptídeos ou construtos também serão aqui referidos como sendo em um "formato multivalente". Por exemplo, um polipeptídeo "bivalente" pode compreender dois ISVDs, opcionalmente ligados via uma sequência de ligação, enquanto um polipeptídeo "trivalente" pode compreender três ISVDs, opcionalmente ligados através de duas sequências de ligação; considerando que um polipeptídeo "tetravalente" pode compreender quatro ISVDs, opcionalmente ligados por três sequências de ligação, etc.

[209] Em um polipeptídeo multivalente, os dois ou mais ISVDs podem ser iguais ou diferentes e podem ser direcionados contra o mesmo antígeno ou determinante antigênico (por exemplo, contra a (s) mesma (s) parte (s) ou epítopo (s) ou contra diferentes partes ou epítopos) ou pode, alternativamente, ser dirigido contra diferentes antígenos ou determinantes antigênicos; ou qualquer combinação adequada dos mesmos, tal como, por exemplo, dirigido contra Aggrecan. Polipeptídeos e construtos que contêm pelo menos dois blocos de construção (como, por exemplo, ISVDs) nos quais pelo menos um bloco de construção é direcionado contra um primeiro antígeno (por exemplo, Aggrecan) e pelo menos um bloco de construção é direcionado contra um segundo antígeno (isto é, diferente do Aggrecan, como, por exemplo, direcionado contra a ADAMTS5) também será chamado de polipeptídeos e construtos "multiespecíficos", e os blocos de construção (como, por exemplo, ISVDs) presentes nesses polipeptídeos e construtos também serão referidos neste documento como estando em um "formato multiespecífico". Assim, por exemplo, um polipeptídeo "biespecífico" da invenção é um polipeptídeo que compreende pelo menos um ISVD direcionado contra um primeiro antígeno (por exemplo, Aggrecan) e pelo menos um ISVD adicional direcionado contra um segundo antígeno (isto é, diferente do Aggrecan, tal como, por exemplo, direcionado contra a ADAMTS5), enquanto um polipeptídeo "triespecífico" da invenção é um polipeptídeo que compreende pelo menos um ISVD direcionado contra um primeiro antígeno (por exemplo, Aggrecan), pelo menos um ISVD adicional direcionado contra um segundo antígeno (isto é, diferente de Aggrecan, tal como por exemplo, direcionado contra ADAMTS5) e pelo menos um ISVD adicional direcionado contra um terceiro antígeno (isto é, diferente de Aggrecan e ADAMTS5, tal como, por exemplo, direcionado contra MMP); etc.

[210] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo, compreendendo pelo menos 2 ISVDs, em que pelo menos um ISVD liga especificamente uma MMP, preferivelmente MMP13, mais preferivelmente o referido um ISVD é representado pela sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

[211] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo, compreendendo pelo menos 2 ISVDs, em que pelo menos um ISVD liga especificamente ADAMTS, preferivelmente ADAMTS5, mais preferivelmente o referido um ISVD é representado pela sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.

[212] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo, compreendendo pelo menos 2 ISVDs, em que pelo menos um ISVD liga especificamente Aggrecan, mais preferivelmente, o referido ISVD é representado pela sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4.

[213] Polipeptídeos "multiparatópicos" e construtos "multiparatópicos", tais como, por exemplo, polipeptídeos ou construtos "biparatópicos" e polipeptídeos ou construtos "triparatópicas", compreendem ou consistem essencialmente em dois ou mais blocos de construção, cada um com um parátopo diferente.

[214] Os um ou mais ISVDs da invenção podem ser usados como um bloco de construção em tal polipeptídeo ou construto, de modo a fornecer um polipeptídeo monovalente, multivalente ou multiparatópico ou construto da invenção, respectivamente, todos como aqui descritos.

[215] A presente invenção também se refere a um polipeptídeo ou construto que é um polipeptídeo multivalente ou construto multivalente, respectivamente, como por exemplo, um polipeptídeo bivalente ou trivalente ou construto compreendendo ou consistindo essencialmente em dois ou mais ISVDs da invenção (para polipeptídeos multivalentes e multiespecíficos contendo um ou mais domínios VHH e sua preparação, referência também é feita a Conrath et al. (J. Biol. Chem. 276: 7346- 7350, 2001), bem como, por exemplo, WO 96/34103, WO 99/23221 e WO 2010/115998).

[216] Em outro aspecto, o polipeptídeo multivalente ou construto da invenção pode ser um polipeptídeo biespecífico ou construto da invenção, compreendendo um primeiro ISVD, como um Nanocorpo, direcionado contra Aggrecan, e um segundo ISVD, como um Nanocorpo, direcionado contra um segundo antígeno, como, por exemplo, ADAMTS5 ou MMP13, no qual os referidos primeiro e segundo ISVDs, como nanocorpos, podem opcionalmente ser ligados por meio de uma sequência de ligante (como aqui definido); ao passo que um polipeptídeo multivalente ou construto da invenção também pode ser um polipeptídeo trispecífico ou construto da invenção, compreendendo um primeiro ISVD, como um Nanocorpo, direcionado contra ADAMTS5, um segundo ISVD, como um Nanocorpo, direcionado contra um segundo antígeno, como, por exemplo, Aggrecan, e um terceiro ISVD, como um Nanocorpo, direcionado contra um terceiro antígeno, como, por exemplo, MMP13, no qual os referidos primeiro, segundo e terceiro ISVDs, como Nanocorpos, podem opcionalmente ser ligados via um ou mais e, em particular, duas sequências de ligação.

[217] A invenção refere-se ainda a um polipeptídeo multivalente que compreende ou (essencialmente) consiste em pelo menos uma ADAMTS5 de ligação a ISVD (ou fragmentos adequados), preferivelmente ADAMTS5 de humano, e um ISVD adicional, como um ISVD que liga Aggrecan.

[218] Polipeptídeos ou construtos bivalentes, biespecíficos, particularmente preferidos, e polipeptídeos ou construtos tetravalentes, triespecíficos de acordo com a invenção, são aqueles mostrados nos Exemplos aqui descritos e na Tabela A-1 (por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 5, 6, 62, 63 ou 64).

[219] Os dois ou mais ISVDs presentes no polipeptídeo ou construto multivalente da invenção podem consistir em uma sequência de domínio variável da cadeia leve (por exemplo, uma sequência VL) ou em uma sequência do domínio variável da cadeia pesada (por exemplo, uma sequência VH); eles podem consistir em uma sequência de domínio variável de cadeia pesada que é derivada de um anticorpo convencional de quatro cadeias ou em uma sequência de domínio variável de cadeia pesada que é derivada de anticorpo de cadeia pesada. Em um aspecto preferido, eles consistem em um anticorpo de Domínio (ou um aminoácido adequado para uso como um anticorpo de domínio), de um anticorpo de domínio único (ou um aminoácido adequado para uso como um anticorpo de domínio único), de um "dAb" (ou um aminoácido que é adequado para uso como dAb), de um Nanobody® (incluindo mas não limitado a VHH), de uma sequência humanizada de VHH, de uma sequência camelizada de VH; ou de uma sequência VHH que foi obtida por maturação por afinidade. Os dois ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina podem consistir em um Nanocorpo parcial ou totalmente humanizado ou em uma VHH parcial ou totalmente humanizada.

[220] Em um aspecto particularmente preferido, o polipeptídeo ou construto da invenção compreende ou consiste essencialmente em quatro ou mais ISVDs, dos quais pelo menos dois ISVDs são direcionados contra Aggrecan. Será apreciado que os referidos pelo menos dois ISVDs direcionados contra o Aggrecan podem ser iguais ou diferentes, podem ser direcionados contra o mesmo epítopo ou epítopos diferentes de Aggrecan, podem pertencer ao mesmo compartimento de epítopo ou a diferentes compartimentos de epítopo e/ou podem ligar o mesmo ou diferentes domínios de Aggrecan.

[221] As afinidades relativas podem depender da localização dos ISVDs no polipeptídeo. Será apreciado que a ordem dos ISVDs em um polipeptídeo da invenção (orientação) pode ser escolhida de acordo com as necessidades dos versados na técnica. A ordem dos ISVDs individuais, bem como se o polipeptídeo compreende um ligante, é uma questão de escolha do projeto. Algumas orientações, com ou sem ligantes, podem fornecer características de ligação preferidas em comparação com outras orientações. Por exemplo, a ordem de um primeiro ISVD (por exemplo, ISVD 1) e um segundo ISVD (por exemplo, ISVD 2) no polipeptídeo da invenção pode ser (do N-terminal para o C- terminal): (i) ISVD 1 (por exemplo, Nanocorpo 1) - [ligante] - ISVD 2 (por exemplo, Nanocorpo 2) - [extensão do C-terminal]; ou (ii) ISVD 2 (por exemplo, Nanocorpo 2) - [ligante] - ISVD 1 (por exemplo, Nanocorpo 1) - [extensão do C-terminal]; (em que as porções entre os colchetes, isto é, o ligante e a extensão do C-terminal, são opcionais). Todas as orientações são abrangidas pela invenção. Polipeptídeos que contêm uma orientação de ISVDs que fornece as características de ligação desejadas podem ser facilmente identificados por triagem de rotina, por exemplo, como exemplificado na seção de exemplos.

[222] Em uma ordem preferida, o ISVD que liga Aggrecan está localizado no lado do C-terminal do polipeptídeo. Uma ordem particularmente preferida é do N-terminal para o C-terminal: ISVD ligando ADAMTS5 - [Ligante] - ISVD ligando Aggrecan - [extensão do C-terminal] ou ISVD ligando MMP13 - [Ligante] - ISVD ligando Aggrecan - [extensão C-terminal], em que as porções entre os colchetes são opcionais. Uma ordem particularmente preferida é do N-terminal para o C-terminal: ISVD ligando ADAMTS5 - [Ligante] - ISVD ligando Aggrecan - [Ligante] - ISVD ligando Aggrecan - [extensão do C-terminal] ou ISVD ligando MMP13 - [Ligante] - ISVD ligando Aggrecan - [Ligante] - ISVD ligando Aggrecan - [extensão do C-terminal], em que as porções entre os colchetes são opcionais. Por exemplo, uma ordem preferida é do N- terminal para o C-terminal: ISVD ligando MMP13 - [Ligante] - ISVD ligando ADAMTS5 - [Ligante] - ISVD ligando Aggrecan - [extensão do C-terminal], em que as porções entre os colchetes são opcionais. Por exemplo, uma ordem particularmente preferida é do N-terminal para o C-terminal: ISVD ligando MMP13 - [Ligante] - ISVD ligando ADAMTS5 - [Ligante] - ISVD ligando Aggrecan - [Ligante] - ISVD ligando Aggrecan - [extensão C-terminal], em que as porções entre colchetes são opcionais.

[223] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que o referido polipeptídeo tem pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 5, 6, 62, 63 ou 64.

[224] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, que é escolhido do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 (ALX-1011), SEQ ID NO: 5 (MMP13-CAP-CAP) e SEQ ID NO: 6 (ATS5-CAP-CAP), SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64.

[225] Em um aspecto específico da invenção, um construto ou polipeptídeo da invenção pode ter uma porção que confere uma meia- vida aumentada, em comparação com o construto ou polipeptídeo correspondente da invenção sem a referida porção.

Alguns exemplos preferidos, mas não limitativos, de tais construtos e polipeptídeos da invenção tornar-se-ão claros para o especialista com base na divulgação adicional deste documento e, por exemplo, incluem ISVDs ou polipeptídeos da invenção que foram quimicamente modificados para aumentar a metade sua meia-vida (por exemplo, por meio de peguilação); os polipeptídeos ou construtos da invenção que compreendem pelo menos um sítio de ligação adicional para ligação a uma proteína sérica (como albumina sérica); ou polipeptídeos da invenção que compreendem pelo menos um ISVD da invenção que está ligado a pelo menos uma porção (e em particular a pelo menos uma sequência de aminoácido) que aumenta a meia-vida da sequência de aminoácido da invenção.

Exemplos de construtos da invenção e polipeptídeos da invenção compreendendo essas porções de extensão da meia-vida ou ISVDs tornar-se-ão claros para o especialista com base na divulgação adicional aqui; e, por exemplo, incluem, sem limitação, polipeptídeos nos quais os um ou mais ISVDs da invenção estão adequadamente ligados a uma ou mais proteínas séricas ou fragmentos das mesmas (como albumina sérica (humana) ou fragmentos adequados) ou a uma ou mais unidades de ligação que podem se ligar a proteínas séricas (como, por exemplo, anticorpos de domínio, imunoglobulina domínios variáveis únicos adequados para uso como anticorpo de domínio, anticorpos de domínio único, ISVDs adequados para uso como anticorpo de domínio único, dAbs, ISVDs que são adequados para uso como dAb ou Nanocorpos que podem se ligar a proteínas séricas tais como albumina sérica (tal como albumina sérica humana), imunoglobulinas séricas como IgG ou transferrina; referência é feita à descrição adicional e referências mencionadas aqui); polipeptídeos nos quais uma sequência de aminoácido da invenção está ligada a uma porção Fc (como uma Fc humana) ou a uma parte adequada ou fragmento da mesma; ou polipeptídeos nos quais os um ou mais domínios variáveis únicos da imunoglobulina da invenção são adequados ligados a uma ou mais proteínas pequenas ou peptídeos que podem se ligar às proteínas séricas, como, por exemplo, as proteínas e peptídeos descritos no documento WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489, WO2008/068280, WO2009/127691 e PCT/EP2011/051559.

[226] Em um aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo e um construto da invenção, em que o referido construto ou o referido polipeptídeo compreende ainda uma porção de ligação à proteína no soro ou uma proteína no soro. De preferência, a referida porção de ligação à proteína sérica liga a albumina sérica, tal como a albumina sérica humana.

[227] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, compreendendo uma ISVD ligando albumina sérica.

[228] Geralmente, os construtos ou polipeptídeos da invenção com meia-vida aumentada têm preferivelmente uma meia-vida que é pelo menos 1,5 vez, preferivelmente pelo menos 2 vezes, como pelo menos 5 vezes, por exemplo, pelo menos 10 vezes ou mais de 20 vezes, superior à meia-vida dos construtos ou polipeptídeos correspondentes da invenção per se, isto é, sem a porção conferindo o aumento da meia- vida. Por exemplo, os construtos ou polipeptídeos da invenção com meia-vida aumentada podem ter uma meia-vida, por exemplo, em humanos que é aumentada por mais de 1 hora, preferivelmente mais de 2 horas, mais preferivelmente mais de 6 horas, como mais de 12 horas, ou até mais de 24, 48 ou 72 horas, em comparação com os construtos ou polipeptídeos correspondentes da invenção per se, isto é, sem a porção que confere o aumento da meia-vida.

[229] Em um aspecto preferido da invenção, os construtos da invenção e os polipeptídeos da invenção possuem uma meia-vida sérica, por exemplo, em humanos que é aumentada com mais de 1 hora, preferivelmente mais de 2 horas, mais preferivelmente com mais de 6 horas, como mais de 12 horas, ou mesmo mais que 24, 48 ou 72 horas, em comparação com os construtos ou polipeptídeos correspondentes da invenção per se, isto é, sem a porção que confere o aumento da meia-vida.

[230] Em outro aspecto preferido da invenção, esses construtos e polipeptídeos da invenção exibem uma meia-vida sérica em humanos de pelo menos cerca de 12 horas, preferivelmente pelo menos 24 horas, mais preferivelmente pelo menos 48 horas, ainda mais preferivelmente pelo menos 48 horas, ainda mais preferivelmente pelo menos 72 horas ou mais. Por exemplo, construtos ou polipeptídeos da invenção podem ter uma meia-vida de pelo menos 5 dias (como cerca de 5 a 10 dias), preferivelmente pelo menos 9 dias (como cerca de 9 a 14 dias), mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 dias (como cerca de 10 a 15 dias) ou pelo menos cerca de 11 dias (como cerca de 11 a 16 dias), mais preferivelmente pelo menos cerca de 12 dias (como cerca de 12 a 18 dias ou mais) ou mais de 14 dias (como cerca de 14 a 19 dias).

[231] Em um aspecto particularmente preferido da invenção, a invenção fornece um construto da invenção e um polipeptídeo da invenção, compreendendo além de um ou mais blocos de construção que ligam Aggrecan e um ou mais blocos de construção que ligam ADAMTS5 e/ou MMP13, pelo menos um bloco de construção que liga albumina sérica, tal como um ISVD que liga albumina sérica, tal como albumina sérica humana, como aqui descrita. De preferência, a referida ISVD que liga albumina sérica compreende ou consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FR4, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3 respectivamente), nas quais CDR1 é SFGMS, CDR2 é

SISGSGSDTLYADSVKG e CDR3 é GGSLSR. De preferência, o referido ISVD que liga albumina sérica é escolhido do grupo que consiste em Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG, Alb82- GGG, Alb92 ou Alb223 (cf. Tabela D).

[232] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um construto da invenção, tal como um polipeptídeo compreendendo uma porção de ligação à proteína do soro, em que a referida porção de ligação à proteína do soro é um polipeptídeo não baseado em anticorpos.

[233] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um construto como aqui descrito compreendendo pelo menos um ISVD ou polipeptídeo e um ou mais outros grupos, resíduos, porções ou unidades de ligação. Os um ou mais outros grupos, resíduos, frações ou unidades de ligação são preferivelmente escolhidos do grupo que consiste em uma molécula de polietileno glicol, proteínas séricas ou seus fragmentos, unidades de ligação que podem se ligar a proteínas séricas, uma porção Fc e pequenas proteínas ou peptídeos que podem liga-se a proteínas séricas, resíduos de aminoácidos adicionais, etiquetas ou outras porções funcionais, por exemplo, toxinas, marcadores, produtos radioquímicos, etc.

[234] Em uma modalidade, como mencionado abaixo, a presente invenção refere-se a um construto da invenção, tal como um polipeptídeo compreendendo uma porção que confere extensão de meia-vida, em que a referida porção é um PEG. Portanto, a presente invenção também se refere a um construto ou polipeptídeo da invenção compreendendo PEG.

[235] Os resíduos de aminoácidos adicionais podem ou não alterar, alterar ou influenciar outras propriedades (biológicas) do polipeptídeo da invenção e podem ou não adicionar funcionalidade adicional ao polipeptídeo da invenção.

Por exemplo, esses resíduos de aminoácidos: a) podem compreender um resíduo Met de N-terminal, por exemplo, como resultado da expressão em uma célula hospedeira heteróloga ou organismo hospedeiro. b) pode formar uma sequência de sinal ou sequência líder que direciona a secreção do polipeptídeo de uma célula hospedeira após a síntese (por exemplo, para fornecer uma pré, pró- ou pré-pró- forma do polipeptídeo da invenção, dependendo da célula hospedeira usada para expressar o polipeptídeo da invenção). Os peptídeos líderes secretores adequados serão claros para o especialista, e podem ser aqui descritos mais detalhadamente.

Normalmente, essa sequência líder será ligada ao N-terminal do polipeptídeo, embora a invenção em seu sentido mais amplo não esteja limitada a ela; c) pode formar uma "etiqueta", por exemplo, uma sequência ou resíduo de aminoácido que permite ou facilita a purificação do polipeptídeo, por exemplo, utilizando técnicas de afinidade direcionadas contra a referida sequência ou resíduo.

Posteriormente, a referida sequência ou resíduo pode ser removida (por exemplo, por clivagem química ou enzimática) para fornecer o polipeptídeo (para essa finalidade, a etiqueta pode opcionalmente ser ligada à sequência de aminoácido ou sequência polipeptídica por meio de uma sequência de ligação clivável ou conter um motivo clivável) Alguns exemplos preferidos, mas não limitativos, de tais resíduos são múltiplos resíduos de histidina, resíduos de glutationa e um marcador myc como AAAEQKLISEEDLNGAA; d) pode ser um ou mais resíduos de aminoácidos que foram funcionalizados e/ou que podem servir como um local para ligação de grupos funcionais.

Os resíduos de aminoácidos e grupos funcionais adequados serão claros para o especialista e incluirão, mas não estão limitados aos resíduos de aminoácidos e grupos funcionais mencionados aqui para os derivados dos polipeptídeos da invenção.

[236] Também estão incluídas na presente invenção construtos que compreendem um polipeptídeo e/ou ISVD da invenção, que compreendem ainda outras porções funcionais, por exemplo, toxinas, marcadores, radioquímicos, etc.

[237] Os outros grupos, resíduos, porções ou unidades de ligação podem, por exemplo, ser grupos químicos, resíduos, porções, que podem ou não ser biologicamente e/ou farmacologicamente ativos. Por exemplo, e sem limitação, esses grupos podem ser ligados a um ou mais ISVDs ou polipeptídeos da invenção, de modo a fornecer um "derivado" do polipeptídeo ou construto da invenção.

[238] Por conseguinte, a invenção em seu sentido mais amplo também compreende construtos e/ou polipeptídeos que são derivados dos construtos e/ou polipeptídeos da invenção. Tais derivados podem geralmente ser obtidos por modificação, e em particular por modificação química e/ou biológica (por exemplo, enzimática), dos construtos e/ou polipeptídeos da invenção e/ou de um ou mais dos resíduos de aminoácidos que formam um polipeptídeo da invenção.

[239] Exemplos de tais modificações, bem como exemplos de resíduos de aminoácidos nas sequências polipeptídicas que podem ser modificados dessa maneira (isto é, no esqueleto da proteína, mas preferivelmente em uma cadeia lateral), métodos e técnicas que podem ser usados para introduzir tais modificações e os possíveis usos e vantagens de tais modificações serão claros para o especialista (vide também Zangi et al., Nat Biotechnol 31 (10): 898-907, 2013).

[240] Por exemplo, essa modificação pode envolver a introdução (por exemplo, por ligação covalente ou de qualquer outra maneira adequada) de um ou mais grupos (funcionais), resíduos ou porções dentro ou sobre o polipeptídeo da invenção e, em particular, um ou mais grupos funcionais, resíduos ou porções que conferem uma ou mais propriedades ou funcionalidades desejadas ao construto e/ou polipeptídeo da invenção. Exemplos de tais grupos funcionais serão claros para o especialista.

[241] Por exemplo, essa modificação pode compreender a introdução (por exemplo, por ligação covalente ou de qualquer outra maneira adequada) de uma ou mais porções funcionais que aumentam a meia-vida, a solubilidade e/ou a absorção do construto ou polipeptídeo da invenção, que reduzem a imunogenicidade e/ou a toxicidade do construto ou polipeptídeo da invenção, que eliminam ou atenuam quaisquer efeitos colaterais indesejáveis do construto ou polipeptídeo da invenção e/ou que conferem outras propriedades vantajosas e/ou reduzem a propriedades indesejadas do construto ou polipeptídeo da invenção; ou qualquer combinação de dois ou mais dos itens anteriores. Exemplos de tais porções funcionais e de técnicas para introduzi-las serão claros para o especialista, e geralmente podem compreender todas as porções e técnicas funcionais mencionadas na técnica geral citada acima, bem como as porções e técnicas funcionais conhecidas per se para a modificação de proteínas farmacêuticas e, em particular, para a modificação de anticorpos ou fragmentos de anticorpos (incluindo ScFv e anticorpos de domínio único), para os quais é feita referência, por exemplo, a Remington (Pharmaceutical Sciences, 16ª ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980). Tais porções funcionais podem, por exemplo, ser ligadas diretamente (por exemplo, covalentemente) a um polipeptídeo da invenção, ou opcionalmente através de um ligante ou espaçador adequado, como será novamente claro para o especialista.

[242] Um exemplo específico é um polipeptídeo derivado ou construto da invenção em que o polipeptídeo ou construto da invenção foi quimicamente modificado para aumentar a meia-vida do mesmo (por exemplo, por meio de pegilação). Esta é uma das técnicas mais amplamente utilizadas para aumentar a meia-vida e/ou reduzir a imunogenicidade de proteínas farmacêuticas e compreende a fixação de um polímero farmacologicamente aceitável adequado, como poli (etilenoglicol) (PEG) ou seus derivados (como metoxipoli (etilenoglicol) ou mPEG). Geralmente, qualquer forma adequada de pegilação pode ser usada, como a pegilação usada na técnica para anticorpos e fragmentos de anticorpos (incluindo, mas não se limitando a, anticorpos de domínio único e ScFv); é feita referência a, por exemplo, Chapman (Nat. Biotechnol. 54: 531-545, 2002), Veronese e Harris (Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 453-456, 2003), Harris e Chess (Nat. Rev Drug. Discov. 2: 214-221, 2003) e WO 04/060965. Também estão disponíveis comercialmente vários reagentes para a pegilação de proteínas, por exemplo, da Nektar Therapeutics, EUA.

[243] De preferência, é usada a pegilação direcionada ao sítio, em particular por meio de um resíduo de cisteína (vide, por exemplo, Yang et al. (Protein Engineering 16: 761-770, 2003). Por exemplo, para esse fim, o PEG pode ser ligado a um resíduo de cisteína que ocorre naturalmente em um polipeptídeo da invenção, um construto ou polipeptídeo da invenção pode ser modificado de modo a introduzir adequadamente um ou mais resíduos de cisteína para ligação de PEG, ou uma sequência de aminoácido compreendendo um ou mais resíduos de cisteína para ligação de PEG pode ser fundida ao N e/ou C-terminal de um construto ou polipeptídeo da invenção, todos usando técnicas de engenharia de proteínas conhecidas per se pelo versado.

[244] De preferência, para os construtos ou polipeptídeos da invenção, um PEG é usado com um peso molecular superior a 5000, como mais de 10.000 e menor que 200.000, como inferior a 100.000; por exemplo, na faixa de 20.000 a 80.000.

[245] Outra modificação, geralmente menos preferida,

compreende glicosilação ligada a N ou ligada a O, geralmente como parte da modificação cotraducional e/ou pós-traducional, dependendo da célula hospedeira usada para expressar o polipeptídeo da invenção.

[246] Ainda outra modificação pode compreender a introdução de um ou mais marcadores detectáveis ou outros grupos ou porções de geração de sinal, dependendo do uso pretendido do polipeptídeo ou construto da invenção. Rótulos e técnicas adequados para anexá-los, utilizá-los e detectá-los serão claros para os especialistas e, por exemplo, incluem, mas não estão limitados a, rótulos fluorescentes (tais como fluoresceína, isotiocianato, rodamina, fitoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído e fluorescamina, e metais fluorescentes, 152 como Eu ou outros metais da série dos lantanídeos), rótulos fosforescentes, rótulos quimioluminescentes ou rótulos bioluminescentes (como luminal, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazol, sais de acridínio, éster de oxalato, dioxetano ou GFP e seus análogos), radioisótopos (tais como 3H, 125 I, 32 P, 35 S, 14 C, 51 36 57 58 59 75 Cr, Cl, Co, Co, Fe, e Se), metais, quelatos ou cátions 99m 123 111 131 metálicos (por exemplo, cátions metálicos como Tc, I, In, I, 97 Ru, 67Cu, 67Ga, e 68Ga ou outros metais ou cátions metálicos que são particularmente adequados para uso em diagnóstico e imagem in vivo, in vitro ou in situ, como (157Gd, 55 Mn, 162 Dy, 52 Cr, e 56 Fe)), bem como cromóforos e enzimas (tais como malato desidrogenase, nuclease estafilocócica, isomerase delta-V-esteroide, álcool desidrogenase de leveduras, alfa-glicerofosfato desidrogenase, fosfato triose isomerase, biotinavidina peroxidase, peroxidase de rábano, glicose oxidase, β- galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-VI-fosfato desidrogenase, glucoamilase e acetilcolina esterase). Outros marcadores adequados serão claros para o especialista e, por exemplo, incluem porções que podem ser detectadas usando espectroscopia de RMN ou ESR.

[247] Tais polipeptídeos marcados e construtos da invenção podem, por exemplo, ser usados para ensaios in vitro, in vivo ou in situ (incluindo imunoensaios conhecidos per se, como ELISA, RIA, EIA e outros "ensaios em sanduíche", etc.), bem como em fins diagnósticos e de imagem in vivo, dependendo da escolha do rótulo específico.

[248] Como ficará claro para o especialista, outra modificação pode envolver a introdução de um grupo quelante, por exemplo, para quelar um dos metais ou cátions metálicos mencionados acima. Grupos quelantes adequados, por exemplo, incluem, sem limitação, ácido dietil- enetriaminapentacético (DTPA) ou ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA).

[249] Ainda outra modificação pode compreender a introdução de uma porção funcional que é uma parte de um par de ligação específico, tal como o par de ligação de biotina-(estreptina)avidina. Uma porção funcional pode ser usada para ligar o polipeptídeo da invenção a outra proteína, polipeptídeo ou composto químico que está ligado à outra metade do par de ligação, isto é, através da formação do par de ligação. Por exemplo, um construto ou polipeptídeo da invenção pode ser conjugado à biotina e ligada a outra proteína, polipeptídeo, composto ou veículo conjugado à avidina ou estreptavidina. Por exemplo, tal construto ou polipeptídeo conjugado da invenção pode ser usado como repórter, por exemplo, em um sistema de diagnóstico onde um agente produtor de sinal detectável é conjugado com avidina ou estreptavidina. Tais pares de ligação podem, por exemplo, também ser utilizados para ligar o construto ou polipeptídeo da invenção a um veículo, incluindo veículos adequados para fins farmacêuticos. Um exemplo não limitativo são as formulações lipossômicas descritas por Cao e Suresh (Journal of Drug Targeting 8: 257, 2000). Tais pares de ligação também podem ser utilizados para ligar um agente terapeuticamente ativo ao polipeptídeo da invenção.

[250] Outras modificações químicas e enzimáticas em potencial serão claras para o especialista. Tais modificações também podem ser introduzidas para fins de pesquisa (por exemplo, para estudar relações função-atividade). Por exemplo, é feita referência a Lundblad e Bradshaw (Biotechnol. Appl. Biochem. 26: 143-151, 1997).

[251] De preferência, os construtos, polipeptídeos e/ou derivados são tais que ligam Aggrecan e ADAMTS5 e/ou MMP13, com uma afinidade (adequadamente medida e/ou expressa como um valor KD (real ou aparente), um valor KA (real ou aparente), uma taxa kon ou taxa on e/ou koff ou taxa off, ou alternativamente como um valor de IC50, conforme descrito aqui mais adiante) que é como aqui definido (por exemplo, como definido para os polipeptídeos da invenção).

[252] Tais construtos e/ou polipeptídeos da invenção e seus derivados também podem estar na forma essencialmente isolada (como aqui definido).

[253] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um construto da invenção, que compreende ou consiste essencialmente em um ISVD de acordo com a invenção ou um polipeptídeo de acordo com a invenção e que compreende ainda um ou mais outros grupos, resíduos, frações ou unidades de ligação, que são opcionalmente ligadas por meio de um ou mais ligantes peptídicos.

[254] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um construto da invenção, no qual um ou mais outros grupos, resíduos, frações ou unidades de ligação são escolhidos do grupo que consiste em uma molécula de polietilenoglicol, proteínas séricas ou seus fragmentos, unidades de ligação que podem se ligar a proteínas séricas, uma porção Fc e pequenas proteínas ou peptídeos que podem se ligar a proteínas séricas.

[255] Nos construtos da invenção, tal como os polipeptídeos da invenção, os dois ou mais blocos de construção, como, por exemplo, os

ISVDs e, opcionalmente, um ou mais outros grupos, fármacos, agentes, resíduos, porções ou unidades de ligação podem estar diretamente ligados entre si (como por exemplo, descrito em WO 99/23221) e/ou podem estar ligados entre si através de um ou mais espaçadores ou ligantes adequados, ou qualquer combinação dos mesmos. Os espaçadores ou ligantes adequados para uso em polipeptídeos multivalentes e multiespecíficos serão claros para os especialistas, e geralmente podem ser qualquer ligante ou espaçador usado na técnica para ligar sequências de aminoácidos. De preferência, o referido ligante ou espaçador é adequado para uso na construção de construtos, proteínas ou polipeptídeos que se destinam ao uso farmacêutico.

[256] Por exemplo, o polipeptídeo da invenção pode, por exemplo, ser um polipeptídeo trivalente e específico, compreendendo um bloco de construção, como um ISVD que liga Aggrecan, uma ADAMTS5 de ligação a ISVD e potencialmente outro bloco de construção, como uma terceira MMP13 de ligação a ISVD, em que os referidos primeiro, segundo e terceiro blocos de construção, como ISVDs, podem opcionalmente ser vinculados por meio de uma ou mais e, em particular, 2, sequências de ligação. Além disso, a presente invenção fornece um construto ou polipeptídeo da invenção compreendendo um primeiro ISVD que liga Aggrecan e possivelmente um segundo ISVD que liga Aggrecan e/ou possivelmente um terceiro ISVD que liga ADVAMTS5 e/ou possivelmente um quarto ISVD que liga MMP13, em que o referido primeiro ISVD e/ou o referido segundo ISVD e/ou possivelmente o referido terceiro SVD e/ou possivelmente o referido quarto ISVD estão ligados através de Ligantes, em particular 3 Ligantes.

[257] Alguns ligantes particularmente preferidos incluem os ligantes utilizados na técnica para ligar fragmentos de anticorpo ou domínios de anticorpo. Isso inclui os ligantes mencionados na técnica geral de base citada acima, bem como, por exemplo, os ligantes usados na técnica para construir diabetes ou fragmentos de ScFv (nesse sentido, no entanto, deve-se notar que, enquanto nos diabéticos e no ScFv fragmentos, a sequência do ligante usada deve ter um comprimento, um grau de flexibilidade e outras propriedades que permitam que os domínios VH e VL pertinentes se juntem para formar o sítio completo de ligação ao antígeno, não há limitação específica no comprimento ou na flexibilidade do ligante utilizado no polipeptídeo da invenção, uma vez que cada ISVD, como Nanocorpos, por si só formam um sítio completo de ligação ao antígeno).

[258] Por exemplo, um ligante pode ser uma sequência de aminoácido adequada e, em particular, sequências de aminoácidos entre 1 e 50, preferivelmente entre 1 e 30, como entre 1 e 10 resíduos de aminoácidos. Alguns exemplos preferidos dessas sequências de aminoácidos incluem ligantes gly-ser, por exemplo, do tipo (glyxsery)2, como (por exemplo (gly4ser)3 ou (gly3ser2)3, conforme descrito em WO 99/42077 e ligantes GS30, GS15, GS9 e GS7 descritos nos pedidos de Ablynx mencionados aqui (vide, por exemplo, WO 06/040153 e WO 06/122825), bem como regiões tipo dobradiças, como as regiões articuladas de anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural ou similares 94004678. Os ligantes preferidos estão representados na Tabela C.

[259] Alguns ligantes particularmente preferidos são GS9 (vide também SEQ ID NO: 84 em WO 06/122825) e GS35, bem como polialananina (como AAA) e o ligante GS30 (vide também SEQ ID NO: 85 em WO 06/122825).

[260] Outros ligantes adequados geralmente compreendem compostos ou polímeros orgânicos, em particular aqueles adequados para uso em proteínas para uso farmacêutico. Por exemplo, foram utilizadas porções de poli (etilenoglicol) para ligar domínios de anticorpos, vide, por exemplo, WO 04/081026.

[261] É abrangido no escopo da invenção que o comprimento, o grau de flexibilidade e/ou outras propriedades do (s) ligante (s) utilizado (s) (embora não sejam críticos, como geralmente é para ligantes usados em fragmentos de ScFv) podem ter alguma influência sobre as propriedades do construto final da invenção, como o polipeptídeo da invenção, incluindo, mas não se limitando, à afinidade, especificidade ou avidez de uma quimiocina ou de um ou mais dos outros antígenos. Com base na divulgação deste documento, o especialista poderá determinar o ligante (s) ideal para uso em um construto específico da invenção, como o polipeptídeo da invenção, opcionalmente após algumas experimentos limitados de rotina.

[262] Por exemplo, em polipeptídeos multivalentes da invenção que compreendem blocos de construção, ISVDs ou Nanocorpos direcionados contra Aggrecan e outro alvo, como por, exemplo, ADAMTS5 e/ou MMP13, o comprimento e a flexibilidade do ligante são preferivelmente tal que permitem que cada bloco de construção, como um ISVD, da invenção presente no polipeptídeo se ligue ao seu alvo cognato, por exemplo, o determinante antigênico em cada um dos alvos. Novamente, com base na divulgação deste documento, o versado poderá determinar o ligante (s) ideal para uso em um construto específico da invenção, como um polipeptídeo da invenção, opcionalmente após alguns experimentos limitados de rotina.

[263] Também está dentro do escopo da invenção que o ligante (s) utilizado confere uma ou mais propriedades ou funcionalidades favoráveis aos construtos da invenção, como os polipeptídeos da invenção, e/ou fornece um ou mais sítios para a formação de derivados e/ou para a ligação de grupos funcionais (por exemplo, como aqui descrito para os derivados dos ISVDs da invenção). Por exemplo, ligantes contendo um ou mais resíduos de aminoácidos carregados podem fornecer propriedades hidrofílicas aprimoradas, enquanto ligantes que formam ou contêm pequenos epítopos ou marcadores podem ser usados para fins de detecção, identificação e/ou purificação. Novamente, com base na divulgação aqui contida, o especialista poderá determinar os ligantes ideais para uso em um polipeptídeo específico da invenção, opcionalmente após alguns experimentos de rotina limitados.

[264] Finalmente, quando dois ou mais ligantes são utilizados nos construtos, tais como polipeptídeos da invenção, esses ligantes podem ser iguais ou diferentes. Novamente, com base na divulgação aqui contida, o especialista poderá determinar os ligantes ideais para uso em um construto ou polipeptídeo específico da invenção, opcionalmente após alguns experimentos de rotina limitados.

[265] Normalmente, para a facilidade de expressão e produção, um construto da invenção, como um polipeptídeo da invenção, será um polipeptídeo linear. No entanto, a invenção em seu sentido mais amplo não se limita a ele. Por exemplo, quando um construto da invenção, como um polipeptídeo da invenção compreende três ou mais blocos de construção, ISVDs ou Nanocorpos. É possível vinculá-los usando um ligante com três ou mais "braços", sendo que cada "braço" está vinculado a um bloco de construção, ISVD ou Nanocorpo, de modo a fornecer um construto em forma de estrela. Também é possível, embora usualmente menos preferido, usar construtos circulares.

[266] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um construto da invenção, tal como um polipeptídeo da invenção, em que os referidos ISVDs estão diretamente ligados entre si ou através de um ligante.

[267] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um construto da invenção, como um polipeptídeo da invenção, em que um primeiro ISVD e/ou um segundo ISVD e/ou possivelmente um ISVD que liga albumina sérica são ligados por meio de um ligante.

[268] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um construto da invenção, como um polipeptídeo da invenção, em que o referido ligante é escolhido do grupo que consiste em ligantes de 9GS, 35GS, 3A, 5GS, 7GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS, poli-A, 8GS, 40GS, dobradiça G1, dobradiça 9GS-G1, região de dobradiça longa superior da lhama, e dobradiça G3, como por exemplo apresentado na Tabela C (SEQ ID NOs: 28, 35, 24-27, 29-34 e 36-40).

[269] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um construto da invenção, tal como um polipeptídeo da invenção, em que o referido polipeptídeo é escolhido a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 62-64, 1, 5 e 6.

[270] A invenção refere-se ainda a métodos para preparar os construtos, polipeptídeos, ISVDs, ácidos nucleicos, células hospedeiras e composições aqui descritas.

[271] Os polipeptídeos multivalentes da invenção podem geralmente ser preparados por um método que compreende pelo menos a etapa de ligar adequadamente o ISVD e/ou polipeptídeo monovalente da invenção a um ou mais ISVDs adicionais, opcionalmente através dos um ou mais ligantes adequados, de modo a fornecer o polipeptídeo multivalente da invenção. Os polipeptídeos da invenção também podem ser preparados por um método que geralmente compreende pelo menos as etapas de fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção, expressando o referido ácido nucleico de maneira adequada e recuperando o polipeptídeo expresso da invenção. Tais métodos podem ser realizados de uma maneira conhecida per se, que será clara para o especialista, por exemplo, com base nos métodos e técnicas descritos aqui.

[272] Um método para preparar polipeptídeos multivalentes da invenção pode compreender pelo menos as etapas de ligação de dois ou mais ISVDs da invenção e, por exemplo, um ou mais ligantes juntos de uma maneira adequada. Os ISVDs da invenção (e ligantes) podem ser acoplados por qualquer método conhecido na técnica e conforme descrito aqui. As técnicas preferidas incluem a ligação das sequências de ácidos nucleicos que codificam os ISVDs da invenção (e ligantes) para preparar um construto genético que expressa o polipeptídeo multivalente. Técnicas para vincular aminoácidos ou ácidos nucléicos serão claras para o especialista, e novamente é feita referência aos manuais padrão, como Sambrook et al. e Ausubel et al., mencionados acima, bem como os Exemplos abaixo.

[273] Por conseguinte, a presente invenção também se refere ao uso de um ISVD da invenção na preparação de um polipeptídeo multivalente da invenção. O método para preparar um polipeptídeo multivalente compreenderá a ligação de um ISVD da invenção a pelo menos mais um ISVD da invenção, opcionalmente através de um ou mais ligantes. O ISVD da invenção é então usado como um domínio de ligação ou um componente básico no fornecimento e/ou preparação do polipeptídeo multivalente compreendendo 2 (por exemplo, em um polipeptídeo bivalente), 3 (por exemplo, em um polipeptídeo trivalente), 4 (por exemplo, em um tetravalente) ou mais (por exemplo, em um polipeptídeo multivalente) blocos de construção. A este respeito, o ISVD da invenção pode ser usado como um domínio de ligação ou unidade de ligação no fornecimento e/ou preparação de um polipeptídeo multivalente, tais como bivalente, trivalente ou tetravalente da invenção compreendendo 2, 3, 4 ou mais blocos de construção.

[274] Por conseguinte, a presente invenção também se refere ao uso de um polipeptídeo ISVD da invenção (como aqui descrito) na preparação de um polipeptídeo multivalente. O método para a preparação do polipeptídeo multivalente compreenderá a ligação do ISVD da invenção a pelo menos mais um ISVD da invenção, opcionalmente através de um ou mais ligantes.

[275] Os polipeptídeos e ácidos nucleicos da invenção podem ser preparados de uma maneira conhecida per se, como será claro para o especialista na descrição adicional aqui. Por exemplo, os polipeptídeos da invenção podem ser preparados de qualquer maneira conhecida per se para a preparação de anticorpos e em particular para a preparação de fragmentos de anticorpo (incluindo, mas não se limitando a, anticorpos de domínio único e fragmentos de ScFv). Alguns métodos preferidos, mas não limitativos, para a preparação dos polipeptídeos e ácidos nucleicos incluem os métodos e técnicas aqui descritos.

[276] O método para produzir um polipeptídeo da invenção pode compreender as seguintes etapas: a expressão, em uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro adequado (também aqui referido como um "hospedeiro da invenção") ou em outro sistema de expressão adequado de um ácido nucleico que codifica o referido polipeptídeo da invenção (também aqui referido como um "ácido nucleico da invenção"); opcionalmente seguido pelo isolamento e/ou purificação do polipeptídeo da invenção assim obtido.

[277] Em particular, esse método pode compreender as etapas de: cultivar e/ou manter um hospedeiro da invenção sob condições tais que o referido hospedeiro da invenção expresse e/ou produza pelo menos um polipeptídeo da invenção; opcionalmente seguido pelo isolamento e/ou purificação do polipeptídeo da invenção assim obtido.

[278] Por conseguinte, a presente invenção também se refere a um ácido nucleico ou sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, ISVD ou construto da invenção (também conhecido como "ácido nucleico da invenção").

[279] Um ácido nucleico da invenção pode estar na forma de DNA ou RNA de filamento simples ou duplo. De acordo com uma modalidade da invenção, o ácido nucleico da invenção é essencialmente isolado de, como aqui definido. O ácido nucleico da invenção também pode estar na forma de, estar presente e/ou fazer parte de um vetor, por exemplo, vetor de expressão, como, por exemplo, um plasmídeo, cosmídeo ou YAC, que novamente pode estar na forma essencialmente isolada. Por conseguinte, a presente invenção também se refere a um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico ou sequência de nucleotídeos da invenção.

[280] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser preparados ou obtidos de uma maneira conhecida per se, com base nas informações sobre os polipeptídeos da invenção aqui apresentados e/ou podem ser isolados de uma fonte natural adequada. Além disso, como será claro para o especialista, para preparar um ácido nucleico da invenção, também várias sequências nucleotídicas, tal como pelo menos dois ácidos nucleicos que codificam ISVDs da invenção e, por exemplo, ácidos nucleicos que codificam um ou mais ligantes podem ser ligado de maneira adequada. As técnicas para gerar os ácidos nucleicos da invenção serão claras para o especialista e podem, por exemplo, incluir, mas não estão limitadas a, síntese automatizada de DNA; mutagênese dirigida a sítio; combinação de duas ou mais sequências sintéticas e/ou naturais (ou duas ou mais partes), introdução de mutações que levam à expressão de um produto de expressão truncado; introdução de um ou mais sítios de restrição (por exemplo, para criar cassetes e/ou regiões que possam ser facilmente digeridas e/ou ligadas usando enzimas de restrição adequadas) e/ou a introdução de mutações por meio de uma reação de PCR usando um ou mais iniciadores "incompatíveis". Essas e outras técnicas serão claras para o especialista, e novamente será feita referência aos manuais padrão, como Sambrook et al. e Ausubel et al., mencionados acima, bem como aos Exemplos abaixo.

[281] Em uma modalidade preferida, mas não limitativa, um construto genético da invenção compreende a) pelo menos um ácido nucleico da invenção;

b) operacionalmente conectado a um ou mais elementos reguladores, como um promotor e, opcionalmente, um terminador adequado; e opcionalmente também c) um ou mais elementos adicionais de construtos genéticos conhecidos per se; em que os termos "elemento regulador", "promotor", "terminador" e "operacionalmente conectado" têm seu significado usual na técnica.

[282] Os construtos genéticos da invenção podem geralmente ser fornecidos pela ligação adequada da sequência (s) de nucleotídeos da invenção a um ou mais elementos descritos acima, por exemplo, utilizando as técnicas descritas nos manuais gerais, como Sambrook et al. e Ausubel et al., mencionados acima.

[283] Os ácidos nucleicos da invenção e/ou os construtos genéticos da invenção podem ser usados para transformar uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro, isto é, para expressão e/ou produção do polipeptídeo da invenção. Hospedeiros ou células hospedeiras adequados serão claros para o especialista e podem, por exemplo, ser qualquer célula fúngica, procariótica ou eucariótica ou linhagem celular adequada ou qualquer organismo fúngico, procariótico ou eucariótico (não humano) adequado, bem como todas as outras células hospedeiras ou hospedeiros (não humanos) conhecidos per se pela expressão e produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos (incluindo, mas não limitados a, anticorpos de domínio único e fragmentos de ScFv), que serão claros para o especialista. Também é feita referência à técnica geral citada acima, bem como a, por exemplo, WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al. (Res Immunol. 149: 589-99, 1998); Riechmann e Muyldermans (1999), supra; van der Linden (J. Biotechnol. 80: 261-70, 2000); Joosten et al. (Microb. Cell Fact. 2: 1, 2003); Joosten et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 384-

92, 2005); e as referências adicionais citadas aqui. Além disso, os polipeptídeos da invenção também podem ser expressos e/ou produzidos em sistemas de expressão sem células, e adequados Os exemplos de tais sistemas serão claros para o especialista. As técnicas adequadas para transformar um hospedeiro ou célula hospedeira da invenção serão claras para o especialista e podem depender da célula hospedeira / organismo hospedeiro pretendido e do construto genético a ser usado. É feita novamente referência aos manuais e pedidos de patente mencionados acima. A célula hospedeira transformada (que pode estar na forma ou em uma linhagem celular estável) ou em organismos hospedeiros (que podem estar na forma de uma linhagem mutante estável ou cepa) formam outros aspectos da presente invenção. Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um hospedeiro ou célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico de acordo com a invenção ou um vetor de expressão de acordo com a invenção. De preferência, essas células hospedeiras ou organismos hospedeiros são tais que expressam ou são (pelo menos) capazes de expressar (por exemplo, sob condições adequadas), um polipeptídeo da invenção (e no caso de um organismo hospedeiro: em pelo menos uma célula, parte, tecido ou órgão do mesmo). A invenção também inclui gerações futuras, descendentes e/ou progenitoras da célula hospedeira ou organismo hospedeiro da invenção, que podem, por exemplo, ser obtidas por divisão celular ou por reprodução sexual ou assexuada.

[284] Para produzir / obter expressão dos polipeptídeos da invenção, a célula hospedeira transformada ou o organismo hospedeiro transformado pode geralmente ser retido, mantido e/ou cultivado sob condições tais que o polipeptídeo (desejado) da invenção seja expresso / produzido. As condições adequadas serão claras para o especialista e dependerão geralmente da célula hospedeira / organismo hospedeiro utilizado, bem como dos elementos reguladores que controlam a expressão da sequência nucleotídica (relevante) da invenção. Novamente, é feita referência aos manuais e pedidos de patente mencionados acima nos parágrafos sobre os construtos genéticos da invenção.

[285] O polipeptídeo da invenção pode então ser isolado da célula hospedeira / organismo hospedeiro e/ou do meio em que a referida célula hospedeira ou organismo hospedeiro foi cultivado, utilizando técnicas de isolamento e/ou purificação de proteínas conhecidas per se, como técnicas de cromatografia e/ou eletroforese (preparativas), técnicas de precipitação diferencial, técnicas de afinidade (por exemplo, usando uma sequência de aminoácido específica e clivável fundida com o polipeptídeo da invenção) e/ou técnicas imunológicas preparativas (isto é, usando anticorpos contra o polipeptídeo a ser isolado).

[286] Em um aspecto, a invenção se refere ao método para produzir um construto, polipeptídeo ou ISVD de acordo com a invenção, compreendendo pelo menos as etapas de: (a) expressar, em uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro adequado ou em outro sistema de expressão adequado, uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção; opcionalmente seguida por (b) isolamento e/ou purificação do construto, polipeptídeo ou ISVD de acordo com a invenção.

[287] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição compreendendo um construto, polipeptídeo, ISVD ou ácido nucleico de acordo com a invenção.

[288] Como mencionado supra, permanece a necessidade de medicamentos de OA seguros e eficazes. Primeiro, os presentes inventores identificaram proteínas de ancoragem de cartilagem muito eficazes, isto é, ISVD que liga Aggrecans, que foram usadas como blocos de construção para projetar moléculas que também ligavam ADAMTS5 e/ou MMP13. As moléculas resultantes tinham uma retenção aumentada em um objeto e podiam ser administradas sistemicamente,

mantendo a atividade. Os presentes inventores subsequentemente demonstraram que uma combinação de ambos os inibidores de ADAMTS5, bem como os inibidores de MMP13, era mais eficaz na melhoria da OA do que na inibição de qualquer um dos alvos isoladamente. Além disso, os polipeptídeos e construtos da invenção também demonstraram ser significativamente mais eficazes do que os compostos da técnica anterior.

[289] A presente invenção fornece assim composições, construtos e/ou polipeptídeos com propriedades profiláticas, terapêuticas e/ou farmacológicas aprimoradas, incluindo um perfil mais seguro, em comparação com sequências de aminoácidos e anticorpos da técnica anterior.

[290] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um método de tratamento ou prevenção de doenças ou distúrbios em um indivíduo, por exemplo, no qual a atividade de ADAMTS5 e/ou MMP13 está envolvida, o método compreendendo a administração de uma composição, polipeptídeo e/ou construto de acordo com a invenção ao referido indivíduo em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir (um sintoma) da referida doença ou distúrbio.

[291] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição de acordo com a invenção, a um polipeptídeo de acordo com a invenção e/ou a um construto de acordo com a invenção para uso como medicamento.

[292] Em outro aspecto, a invenção refere-se ao uso de uma composição, polipeptídeo e/ou construto de acordo com a invenção na preparação de uma composição farmacêutica para prevenção e/ou tratamento de pelo menos uma doença associada a ADAMTS5 e/ou MMP13, como OA; e/ou para uso em um ou mais dos métodos de tratamento mencionados neste documento.

[293] A invenção também se refere ao uso de uma composição,

polipeptídeo e/ou construto de acordo com a invenção na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento de pelo menos uma doença ou distúrbio que pode ser prevenido e/ou tratado modulando a atividade de uma ADAMTS, preferivelmente inibindo uma atividade da ADAMTS5.

[294] A invenção também se refere ao uso de uma composição, polipeptídeo e/ou construto de acordo com a invenção na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento de pelo menos uma doença ou distúrbio que pode ser prevenido e/ou tratado por modular a atividade de um MMP, preferivelmente inibindo a atividade da MMP13.

[295] A invenção também se refere ao uso de um ISVD, polipeptídeo, composição e/ou construto da invenção na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento de pelo menos uma doença, distúrbio ou condição que pode ser evitado e/ou tratado pela administração de um ISVD, polipeptídeo, composição e/ou construto da invenção a um paciente.

[296] A invenção refere-se ainda a um ISVD, composição, polipeptídeo e/ou construto da invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo os mesmos para uso na prevenção e/ou tratamento de pelo menos uma doença associada a ADAMTS5 e/ou doença associada a MMP13.

[297] Prevê-se que os aglutinantes ADAMTS5 da invenção possam ser utilizados em várias doenças que afetam a cartilagem, como artropatias e condrodistrofias, doenças artríticas, como osteoartrite, artrite reumatoide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura ou descolamento traumático, acondroplasia, costocondroplasia, displasia espondiloepimetafisária, hérnia de disco espinhal, doença de degeneração do disco lombar, doença articular degenerativa e policondrite recidivante, osteocondrite dissecante e agrecanopatias e esteato-hepatite não alcoólica (NASH) (geralmente indicada aqui como "doenças associadas a ADAMTS5"), de preferência OA.

[298] Prevê-se que os ligantes MMP13 da invenção possam ser utilizados em várias doenças que afetam a cartilagem, como artropatias e condrodistrofias, doenças artríticas, como osteoartrite, artrite reumatoide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura ou descolamento traumático, acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafisária, hérnia de disco espinhal, doença de degeneração do disco lombar, doença articular degenerativa, policondrite recidivante, osteocondrite dissecante, agrecanopatias, periodontite crônica e aneurismas da aorta abdominal (geralmente aqui indicados como "doenças associadas à MMP13"), preferivelmente OA.

[299] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição, um ISVD, um polipeptídeo e/ou um construto de acordo com a invenção para uso no tratamento ou prevenção de um sintoma de uma doença associada a ADAMTS5 e/ou doença associada a MMP13, como por exemplo, artropatias e condrodistrofias, doenças artríticas, como osteoartrite, artrite reumatoide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura ou descolamento traumático, acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafisária, doença degenerativa do disco espinhal, degeneração da articulação espinhal, hérnia de disco lombar, doença degenerativa de disco lombar, doença articular degenerativa, policondrite recidivante, osteocondrite dissecante, agrecanopatias, NASH, periodontite crônica e aneurismas da aorta abdominal, preferivelmente OA.

[300] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para prevenir ou tratar artropatias e condrodistrofias, doenças artríticas, como osteoartrite, artrite reumatoide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura ou descolamento traumático, acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafisária, hérnia de disco espinhal, doença de degeneração do disco lombar, doença degenerativa articular, policondrite recidivante, NASH, periodontite crônica e aneurismas da aorta abdominal, preferivelmente OA, em que o referido método compreende a administração, a um objeto em necessidade do mesmo, de uma quantidade farmaceuticamente ativa de pelo menos uma composição, imunoglobulina, polipeptídeo e/ou construto de acordo com a invenção a uma pessoa em necessidade do mesmo.

[301] Em um aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de um ISVD, polipeptídeo, composição e/ou construto de acordo com a invenção, na preparação de uma composição farmacêutica para tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio, como artropatias e condrodistrofias, doença artrítica, tais como osteoartrite, artrite reumatoide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura ou descolamento traumático, acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafisária, hérnia de disco espinhal, doença de degeneração do disco lombar, doença articular degenerativa, policlorodrite recidivante e aneurismas da aorta abdominal, preferivelmente OA.

[302] Também é esperado que, ao se ligar a Aggrecan, que os ISVDs, construtos e/ou polipeptídeos da invenção possam reduzir ou inibir uma atividade de um membro da família da serina protease, catepsinas, matrizes x metaloproteinases (MMPs diferentes de MMP13), como por exemplo, MMP20, mas também ADAMTS4 (Aggrecanase-1) e/ou ADAMTS11 na degradação do Aggrecan.

[303] No contexto da presente invenção, o termo "prevenção e/ou tratamento" não apenas compreende a prevenir e/ou tratar a doença, mas também geralmente compreende a prevenção do início da doença, retardando ou revertendo o progresso da doença, prevenindo ou retardando o início de um ou mais sintomas associados à doença, reduzindo e/ou aliviando um ou mais sintomas associados à doença,

reduzindo a gravidade e/ou a duração da doença e/ou de quaisquer sintomas associados a ela e/ou impedindo uma aumento adicional da gravidade da doença e/ou de quaisquer sintomas associados a ela, prevenindo, reduzindo ou revertendo qualquer dano fisiológico causado pela doença e, geralmente, qualquer ação farmacológica que seja benéfica para o paciente em tratamento.

[304] O regime de dosagem será determinado pelo médico assistente e por fatores clínicos. Como é bem conhecido nas áreas médicas, a dosagem para qualquer paciente depende de muitos fatores, incluindo o tamanho, peso, área de superfície corporal, idade, o composto específico a ser administrado, a atividade do polipeptídeo empregado (incluindo anticorpos), hora e via de administração, saúde geral e combinação com outras terapias ou tratamentos. A matéria farmaceuticamente ativa proteica pode estar presente em quantidades entre 1 ge 100 mg/kg de peso corporal por dose; no entanto, doses abaixo ou acima desse intervalo exemplar também são previstas. Se o regime for uma infusão contínua, pode estar na faixa de 1 pg a 100 mg por quilograma de peso corporal por minuto.

[305] Um ISVD, polipeptídeo ou construto da invenção pode ser empregado em uma concentração de, por exemplo, 0,01, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20 ou 50 pg/ml, a fim de inibir e/ou neutralizar uma atividade de ADAMTS5 e/ou MMP13 em pelo menos cerca de 50%, preferivelmente 75%, mais preferivelmente 90%, 95% ou até 99% e mais preferivelmente aproximadamente 100% (essencialmente completamente) como testado por métodos bem conhecidos na técnica.

[306] Geralmente, o regime de tratamento compreenderá a administração de um ou mais polipeptídeos e/ou construtos da invenção, ou de uma ou mais composições compreendendo os mesmos, em uma ou mais quantidades ou doses farmaceuticamente eficazes. A quantidade ou doses específicas a serem administradas podem ser determinadas pelo clínico, novamente com base nos fatores citados acima. As dosagens úteis das composições, construtos e/ou polipeptídeos da invenção podem ser determinadas por comparação de sua atividade in vitro e atividade in vivo em modelos animais. Os métodos para a extrapolação de dosagens eficazes em camundongos e outros animais para humanos são conhecidos na técnica; por exemplo, vide US 4.938.949.

[307] Geralmente, dependendo da doença, distúrbio ou condição específica a ser tratada, a potência do polipeptídeo específico e/ou construto da invenção a ser usada, a via de administração específica e a formulação ou composição farmacêutica específica usada, o clínico será capaz de determinar um regime de dosagem adequado.

[308] A quantidade de composições, construtos e/ou polipeptídeos da invenção necessários para uso no tratamento variará não apenas com a composição, polipeptídeo e/ou construto específico selecionado, mas também com a via de administração, a natureza da condição a ser tratada e idade e condição do paciente e, em última análise, ficará a critério do médico ou clínico assistente. Também a dosagem das composições, construtos e/ou polipeptídeos da invenção varia dependendo da célula, tecido ou órgão alvo.

[309] A dose desejada pode ser convenientemente apresentada em uma dose única ou – menos preferido - como doses divididas administradas em intervalos apropriados, por exemplo, como duas, três, quatro ou mais subdoses por dia. A própria subdosagem pode ser adicionalmente dividida, por exemplo, em várias administrações discretamente espaçadas.

[310] Um regime de administração pode incluir tratamento diário, de longo prazo. Por "longo prazo" entende-se pelo menos duas semanas e, de preferência, várias semanas, meses ou anos de duração. As modificações necessárias nesta faixa de dosagem podem ser determinadas por um especialista na técnica, utilizando apenas experimentação de rotina, de acordo com os ensinamentos deste documento. Vide Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. A dosagem também pode ser ajustada pelo médico em caso de qualquer complicação. Foi demonstrado que as composições, polipeptídeos e construtos são extremamente estáveis e permanecem eficazes por longos períodos de tempo.

[311] Normalmente, no método acima, serão utilizados uma composição, polipeptídeo e/ou construto da invenção. No entanto, está dentro do escopo da invenção usar duas ou mais composições, polipeptídeos e/ou construtos da invenção em combinação, como, por exemplo, uma combinação de SEQ ID NOs: 5 e 6, SEQ ID NOs: 63 e 64, SEQ I D NOs: 5 e 64, ou SEQ ID NOs: 63 e 6.

[312] As composições, polipeptídeos e/ou construtos da invenção podem ser usados em combinação com um ou mais outros compostos ou princípios farmaceuticamente ativos, isto é, como um regime de tratamento combinado, que pode ou não levar a um efeito sinérgico.

[313] A composição farmacêutica também pode compreender pelo menos um agente ativo adicional, por exemplo, um ou mais anticorpos adicionais ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos, moléculas orgânicas e inorgânicas.

[314] Novamente, o clínico poderá selecionar outros compostos ou princípios, bem como um regime de tratamento combinado adequado, com base nos fatores citados acima e em seu julgamento especializado.

[315] Em particular, composições, polipeptídeos e/ou construtos da invenção podem ser usados em combinação com outros compostos ou princípios farmaceuticamente ativos que são ou podem ser utilizados para a prevenção e/ou tratamento das doenças, distúrbios e condições aqui citados, como um resultado de cujo um efeito sinérgico pode ou não ser obtido. Exemplos de tais compostos e princípios, bem como rotas, métodos e formulações ou composições farmacêuticas para administrá-los, serão claros para o clínico.

[316] Quando duas ou mais substâncias ou princípios devem ser utilizados, como por exemplo, (uma composição compreendendo) um polipeptídeo compreendendo um ISVD inibindo ADAMTS5 e outro polipeptídeo compreendendo um ISVD inibindo MMP13, como parte de um regime de tratamento combinado, tal como, por exemplo, uma combinação de SEQ ID NOs: 5 e 6, SEQ ID NOs: 63 e 64, SEQ ID NOs: 5 e 64 ou SEQ ID NOs: 63 e 6, eles podem ser administrados pela mesma via de administração ou por diferentes vias de administração, essencialmente ao mesmo tempo ou em momentos diferentes (por exemplo, essencialmente simultaneamente, consecutivamente ou de acordo com um regime alternado). Quando as substâncias ou princípios devem ser administrados simultaneamente pela mesma via de administração, eles podem ser administrados como formulações ou composições farmacêuticas diferentes ou como parte de uma formulação ou composição farmacêutica combinada, como ficará claro para o especialista.

[317] Além disso, quando duas ou mais substâncias ou princípios ativos devem ser utilizados como parte de um regime de tratamento combinado, tal como, por exemplo, um polipeptídeo (composição compreendendo a) compreendendo um ISVD inibindo ADAMTS5 e outro polipeptídeo compreendendo um ISVD inibindo MMP13, cada um de substâncias ou princípios pode ser administrado na mesma quantidade e de acordo com o mesmo regime usado quando o composto ou princípio é utilizado isoladamente, e esse uso combinado pode ou não levar a um efeito sinérgico. No entanto, quando o uso combinado de duas ou mais substâncias ou princípios ativos leva a um efeito sinérgico, também pode ser possível reduzir a quantidade de uma,

mais ou todas as substâncias ou princípios a serem administrados, enquanto ainda atinge a ação terapêutica desejada. Isso pode, por exemplo, ser útil para evitar, limitar ou reduzir quaisquer efeitos colaterais indesejados associados ao uso de uma ou mais substâncias ou princípios quando usados nas quantidades usuais, enquanto ainda obtém o efeito farmacêutico ou terapêutico desejado.

[318] A eficácia do regime de tratamento utilizado de acordo com a invenção pode ser determinada e/ou seguida de qualquer maneira conhecida per se para a doença, distúrbio ou condição envolvida, como ficará claro para o clínico. O clínico também poderá, quando apropriado e caso a caso, alterar ou modificar um regime de tratamento específico, de modo a alcançar o efeito terapêutico desejado, evitar, limitar ou reduzir efeitos colaterais indesejados e/ou para alcançar um equilíbrio apropriado entre alcançar o efeito terapêutico desejado, por um lado, e evitar, limitar ou reduzir efeitos colaterais indesejados, por outro lado.

[319] Geralmente, o regime de tratamento será seguido até que o efeito terapêutico desejado seja alcançado e/ou enquanto o efeito terapêutico desejado for mantido. Novamente, isso pode ser determinado pelo clínico.

[320] Assim, em um aspecto adicional, a invenção se refere a uma composição farmacêutica que contém pelo menos um construto da invenção ou pelo menos um polipeptídeo da invenção e pelo menos um veículo, diluente ou excipiente adequado (isto é, adequado para uso farmacêutico), e opcionalmente uma ou mais outras substâncias ativas. Em um aspecto particular, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende pelo menos uma composição, construto ou polipeptídeo de acordo com a invenção, preferivelmente pelo menos uma das SEQ ID NOs: 1 e 62, ou uma combinação de SEQ ID NOs: 5 e 6, SEQ ID NOs: 63 e 64, SEQ ID NOs: 5 e 64 ou SEQ ID NOs: 63 e 6 e pelo menos um veículo, diluente ou excipiente adequado (isto é,

adequado para uso farmacêutico), e opcionalmente uma ou mais outras substâncias ativas.

[321] O objeto a ser tratado pode ser qualquer animal de sangue quente, mas é particularmente um mamífero e, mais especificamente, um ser humano. Em aplicações veterinárias, o objeto a ser tratado inclui qualquer animal criado para fins comerciais ou mantido como animal de estimação. Como ficará claro para o especialista, o objeto a ser tratado será, em particular, uma pessoa que sofre ou corre o risco de ter doenças, distúrbios e condições aqui mencionados. Portanto, em uma modalidade preferida da invenção, as composições farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo da invenção são para uso em medicina ou diagnóstico. De preferência, as composições farmacêuticas são para uso em medicina humana, mas também podem ser usadas para fins veterinários.

[322] Novamente, em uma composição farmacêutica, os um ou mais composições, polipeptídeos e/ou construtos da invenção, ou nucleotídeo que codifica os mesmos e/ou uma composição farmacêutica compreendendo os mesmos, também podem ser adequadamente combinados com um ou mais outros ativos princípios, como os aqui mencionados.

[323] A invenção também se refere a uma composição (tal como, sem limitação, uma composição ou preparação farmacêutica conforme descrito aqui mais adiante) para uso, in vitro (por exemplo, em um ensaio in vitro ou celular) ou in vivo (por exemplo, em um organismo de única célula ou multicelular, e em particular em um mamífero, e mais em particular em um ser humano, tal como em um ser humano que esteja em risco ou sofra de uma doença, distúrbio ou condição da invenção).

[324] Deve ser entendido que a referência ao tratamento inclui tanto o tratamento dos sintomas estabelecidos quanto o tratamento profilático, a menos que seja explicitamente indicado o contrário.

[325] Geralmente, para uso farmacêutico, as composições, construtos, polipeptídeos e/ou ISVDs da invenção podem ser formulados como uma preparação ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um construto, polipeptídeo e/ou ISVD da invenção e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável, diluente ou excipiente e/ou adjuvante e, opcionalmente, um ou mais polipeptídeos e/ou compostos farmaceuticamente ativos. Por meio de exemplos não limitativos, essa formulação pode estar em uma forma adequada para administração oral, para administração parenteral (como por injeção intra-articular, intravenosa, intramuscular ou subcutânea ou infusão intravenosa), para administração tópica, para administração por inalação, por um adesivo de pele, por um implante, por um supositório, etc., em que a administração parentérica é preferida. Tais formas de administração adequadas - que podem ser sólidas, semissólidas ou líquidas, dependendo da maneira de administração - bem como métodos e veículos para uso na preparação das mesmas, serão claras para o especialista, e serão descritas aqui mais adiante. Essa preparação ou composição farmacêutica será geralmente referida aqui como uma "composição farmacêutica".

[326] Como excipientes exemplares, desintegradores, aglutinantes, preenchedores e lubrificantes podem ser mencionados. Exemplos de desintegradores incluem ágar-ágar, alginas, carbonato de cálcio, celulose, dióxido de silício coloide, gomas, silicato de alumínio e magnésio, metilcelulose e amido. Exemplos de aglutinantes incluem celulose microcristalina, hidroximetilcelulose, hidroxipropilcelulose e polivinilpirrolidona. Exemplos de preenchedores incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, sulfato de cálcio tribásico, carboximetilcelulose de cálcio, celulose, dextrina, dextrose, frutose, lactitol, lactose, carbonato de magnésio, óxido de magnésio, maltitol, maltodextrina, maltose, sorbitol, amido, sacarose, sacarose, açúcar e xilitol. Exemplos de lubrificantes incluem ágar, oleato de etila, laureado de etila, glicerina, palmitostearato de glicerila, óleo vegetal hidrogenado, óxido de magnésio, estearatos, manitol, poloxâmero, glicóis, benzoato de sódio, lauril sulfato de sódio, estearil de sódio, sorbitol e talco. Estabilizadores comuns, conservantes, agentes umectantes e emulsificantes, agentes para melhorar a consistência, agentes para melhorar o sabor, sais para variar a pressão osmótica, substâncias tampão, solubilizadores, diluentes, emolientes, corantes e agentes mascarantes e antioxidantes são considerados como adjuvantes farmacêuticos.

[327] Os veículos adequados incluem, entre outros, carbonato de magnésio, estearato de magnésio, talco, açúcar, lactose, pectina, dextrina, amido, gelatina, tragacanta, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, cera de baixo ponto de fusão, manteiga de cacau, água, álcoois, polióis, glicerol, óleos vegetais e similares.

[328] Geralmente, os construtos, polipeptídeos e/ou ISVDs da invenção podem ser formulados e administrados de qualquer maneira adequada conhecida per se. É feita referência, por exemplo, à técnica de fundamento geral citada acima (e em particular a WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041867 e WO 08/020079), bem como a manuais padrão, tais como Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed., Mack Publishing Company, EUA (1990), Remington, Science and Practice of Pharmacy, 21ª edição, Lippincott Williams e Wilkins (2005); ou o Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (vide, por exemplo, páginas 252-255).

[329] Em um aspecto particular, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende pelo menos uma composição, construto, polipeptídeo, ISVD ou ácido nucleico de acordo com a invenção, e que compreende ainda pelo menos um veículo, diluente ou excipiente e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável e/ou adjuvante e opcionalmente compreende um ou mais polipeptídeos e/ou construtos farmaceuticamente ativos.

[330] As composições, construtos, polipeptídeos e/ou ISVDs da invenção podem ser formuladas e administradas de qualquer maneira conhecida per se para anticorpos convencionais e fragmentos de anticorpos (incluindo ScFv's e diabetes) e outras proteínas farmaceuticamente ativas. Tais formulações e métodos para preparar o mesmo serão claros para o especialista e, por exemplo, incluem preparações preferíveis para administração parentérica (por exemplo, administração intra-articular, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intraluminal, intra-arterial, intratecal intranasal ou intrabrônquica), mas também para administração tópica (isto é, transdérmica ou intradérmica).

[331] As preparações para administração parentérica podem, por exemplo, ser soluções estéreis, suspensões, dispersões ou emulsões adequadas para infusão ou injeção. Os veículos ou diluentes adequados para tais preparações, por exemplo, incluem, sem limitação, os mencionados na página 143 da WO 08/020079. Geralmente, soluções ou suspensões aquosas serão preferidas.

[332] As composições, construtos, polipeptídeos e/ou ISVDs da invenção também podem ser administradas usando métodos de entrega conhecidos a partir de terapia genética, vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.399.346, que é incorporada por referência para seus métodos de entrega de terapia genética. Ao usar um método de entrega de terapia gênica, as células primárias transfectadas com o gene que codifica um construto, polipeptídeo e/ou ISVD da invenção podem adicionalmente ser transfectadas com promotores específicos de tecido para atingir órgãos, tecidos, enxertos, tumores ou células específicas e podem transfira adicionalmente com sequências de sinal e estabilização para expressão localizada subcelularmente.

[333] De acordo com aspectos adicionais da invenção, as composições, construtos e/ou polipeptídeo da invenção podem ser utilizadas em aplicações adicionais in vivo e in vitro. Por exemplo, composições, construtos e/ou polipeptídeos da invenção podem ser empregues para fins de diagnóstico, por exemplo, em ensaios projetados para detectar e/ou quantificar a presença de ADAMTS5 e/ou MMP13 e/ou para purificar ADAMTS5 e/ou MMP13. As composições, polipeptídeos e/ou construtos também podem ser testadas em modelos animais de doenças particulares e para a realização de estudos de toxicologia, segurança e dosagem.

[334] Finalmente, a invenção refere-se a um kit que compreende pelo menos uma composição, polipeptídeo ou construto de acordo com a invenção, pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica os referidos componentes, o vetor ou sistema de vetores da invenção e/ou uma célula hospedeira de acordo com a invenção. Está contemplado que o kit pode ser oferecido em diferentes formas, por exemplo, como um kit de diagnóstico.

[335] A invenção será agora descrita mais detalhadamente por meio dos seguintes aspectos, exemplos e figuras preferenciais não limitativos.

[336] Todo o conteúdo de todas as referências (incluindo referências de literatura, patentes emitidas, solicitações de patentes publicadas e solicitações de patentes pendentes) citadas ao longo deste pedido é expressamente incorporado por referência, em particular para o ensino aqui mencionado acima.

[337] Sequências são divulgadas no corpo principal da descrição e em uma listagem de sequências separada, de acordo com a norma WIPO ST.25. Uma SEQ ID especificada com um número específico deve ser a mesma no corpo principal da descrição e na listagem de sequência separada. A título de exemplo, a SEQ ID NO: 1 deve definir a mesma sequência em ambos, no corpo principal da descrição e na listagem de sequências separada. As sequências são divulgadas no corpo principal da descrição e em uma listagem de sequências separada, de acordo com a norma WIPO ST.25. Uma SEQ ID especificada com um número específico deve ser a mesma no corpo principal da descrição e na listagem de sequência separada. A título de exemplo, a SEQ ID NO: 1 deve definir a mesma sequência em ambos, no corpo principal da descrição e na listagem de sequências separada. Se houver uma discrepância entre uma definição de sequência no corpo principal da descrição e a listagem de sequências separada (se, por exemplo, a SEQ ID No.: 1 no corpo principal da descrição corresponder erroneamente à SEQ ID NO.: 2 na listagem de sequência separada), então, uma referência a uma sequência específica no pedido, em particular de modalidades específicas, deve ser entendida como uma referência à sequência no corpo principal do pedido e não à listagem de sequências separada. Em outras palavras, uma discrepância entre uma definição / designação de sequência no corpo principal da descrição e o listagem de sequência separada deve ser resolvida corrigindo a listagem de sequências separada para as sequências e sua designação divulgada no corpo principal do pedido, que inclui a descrição, exemplos, figuras e reivindicações.

6. EXEMPLOS

[338] Sem estarem ligados à teoria, os inventores levantaram a hipótese de que a inibição de ADAMTS5 e MMP13 seria potencialmente mais eficaz nesse sentido. (1) uma gama mais ampla de proteases indutoras e sustentadoras de OA seria inibida; (2) uma gama mais ampla de pacientes pode ser direcionada, por exemplo, sem a necessidade de separar pacientes em diferentes grupos; e (3) uma gama mais ampla de desenvolvimento de doenças pode ser tratada.

[339] Para conforto do paciente, os inibidores são preferivelmente retidos e ativos nas articulações por períodos prolongados.

[340] Por conseguinte, os inventores decidiram isolar e caracterizar ISVDs que ligam especificamente MMP13, ISVDs que ligam especificamente ADAMTS5, bem como ISVDs que ligam especificamente Aggrecan. Posteriormente, os ISVDs foram combinados em diferentes formatos e testados em vários modelos in vitro, ex vivo e in vivo. Exemplo 1 ISVDs MMP13

1.1 ISVD anti-MMP13 62C02

[341] Após triagem de mais de 10E7 clones, o ISVD específico de MMP13 62C02 foi identificado em ensaios de peptídeos fluorogênicos, ensaios colagenolíticos e ensaios de colágeno fluorogênico.

[342] Em resumo, a configuração de ensaios de peptídeos fluorogênicos MMP13 de humanos, cinomolgos, ratos, cães e bovinos, bem como ensaios de peptídeos fluorogênicos MMP1 e MMP14 de humanos é a seguinte. MMP ativado foi incubado com substrato peptídico fluorogênico Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2 (R&D Systems # ES001) e uma diluição 1/5 do extrato periplásmico ou uma série de diluições de Nanocorpo purificado / controle positivo (volume total = 20 µl no ensaio tampão Tris 50 mM, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2, Tween20 a 0,01%), durante 2 h a 37 ºC. O aumento linear da fluorescência (v0- entre 15 e 45 min de incubação) foi utilizado como medida da atividade enzimática e a % de inibição foi calculada com a fórmula 100 - 100 (v0 na presença do teste Nanocorpo / v0 na presença de Nanocorpo de controle negativo). (Cablys)).

[343] A configuração do ensaio colagenolítico é resumida como segue: 250 ng/ml de colágeno humano de grau de imunização (Chondrex # 20052) foram incubados com 5 nM de MMP13 ativada em

100 µl de tampão de ensaio (Tris-Cl 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, CaCl2 10 mM, Tween-20 a 0,01%). Após 1,5 h de incubação a 35 ºC, a reação foi neutralizada com EDTA (10 µl de estoque 30 mM). O colágeno clivado por MMP13 foi ainda degradado com elastase por 20 min a 38 ºC para evitar o recozimento do colágeno II degradado (10 µl de estoque diluído a 1/3 fornecido no kit de detecção de colágeno tipo II (Chondrex # 6009)). O colágeno intacto restante foi detectado por ELISA (reagentes fornecidos no kit de detecção de colágeno tipo II (Chondrex # 6009)).

[344] A configuração do ensaio de colágeno fluorogênico é essencialmente a seguinte: 100 µg/ml de colágeno DQ™ tipo I de pele bovina (conjugado de fluoresceína; Molecular Probes # D-12060 lote 1149062) foram incubados com MMP13 ativada a 10 nM e uma série de diluições de Nanocorpo purificado / controle positivo, por 2 h a 37 ºC em 40 µl de tampão de ensaio (Tris-Cl 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, CaCl2 10 mM, CaCl2 10 mM, Tween-20 a 0,01%). O aumento linear da fluorescência (v0- entre 15 e 45 min de incubação) foi usado como medida da atividade enzimática e a % de inibição foi calculada com a fórmula 100 - 100 (v0 na presença do teste Nanocorpo / v0 na presença de um Nanocorpo de controle negativo (Cablys)).

[345] A fim de caracterizar ainda mais o ISVD 62C02, este ISVD foi recolocado no vetor pAX129, transformado em E. coli e expresso e purificado de acordo com protocolos padrão (por exemplo, Maussang et al. 2013 J Biol Chem 288: 29562-72). Posteriormente, este ISVD foi submetido a vários ensaios funcionais in vitro. O TIMP-2, que é um inibidor não seletivo de MMP, foi usado como controle positivo nesses ensaios. Como comparador positivo, foi utilizada a fármaco de molécula pequena MSC2392891A. Uma visão geral das potências nos ensaios enzimáticos é fornecida na Tabela 1.1.

IC50 [nM] Ensaio de Ensaio de Ensaio de Ensaio de Ensaio de Ensaio Ensaio de peptídeo peptídeo peptídeo peptídeo peptídeo colagenol colágeno fluorogêni fluorogêni fluorogêni fluorogêni fluorogêni ítico em fluorogêni co em co em co em cão co em co em humano co humano rato bovino cino humano clone TIMP-2 0,5 0,4 0,9 1,1 0,4 0,4 2,4 62C02 1,4 1,1 1,0 3,1 1,4 1,4 8,3 MSC2392 Inibição 891A 3,7 0,7 0,7 8,5 3,0 4,7 parcial Tabela 1.1

[346] Em conclusão, o ISVD 62C02 teve um desempenho melhor em todos os ensaios em relação ao medicamento comparador MSC2392891A.

1.2. ISVD anti-MMP13 62C02 é seletivo

[347] Para determinar a seletividade de ISVD 62C02 para MMP13, foram utilizados ensaios de peptídeos fluorogênicos para MMP1 e MMP14. MMP1 e MMP14 são dois membros da família MMP intimamente relacionados. O TIMP-2 foi usado como controle positivo nesses ensaios. Uma configuração semelhante foi utilizada à descrita no Exemplo 1.1.

[348] Foi demonstrado que o ISVD 62C02 era altamente seletivo, não mostrando inibição da MMP1 ou MMP14 (dados não mostrados). Exemplo 2 ISVD ADAMTS5

2.1 anti-ADAMTS5 ISVD 02F03

[349] Também neste caso, mais de 10E7 clones foram triados, a fim de identificar o ISVD 02F 03, que liga especificamente a ADAMTS5. O ISVD 02F03 foi ainda caracterizado por inibir a clivagem do Aggrecan mediada por ADAMTS5 através de ensaios baseados em FRET e AlphaLISA.

[350] Em resumo, um extrato periplasmático de ISVD 02F03 foi testado quanto à ligação a ADAMTS5 de humano recombinante por ligação a ELISA. Em seguida, foi confirmado que o ISVD 02F03 foi capaz de impedir a clivagem do Aggrecan mediada por ADAMTS5 em um ensaio enzimático humano ADAMTS5 baseado em FRET. Junto ao ensaio à base de FRET, foi realizado um ensaio ADAMTS5 de humano à base de AlphaLISA (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA) com um oligopeptídeo Aggrecan biotinilado 43-mer como substrato. Após a clivagem da ADAMTS5 deste substrato, um produto neepítopo biotinilado de ARGSV é liberado e pode ser detectado pelas esferas doadoras estreptavidina-AlphaScreen e um anticorpo α-neo-epítopo ("ARGSV") capturado nas esferas aceitadoras AlphaLISA revestidas com IgG anticamundongo, resultando na geração de um sinal AlphaScreen de luminescência por excitação a laser. Para determinar a capacidade do ISVD 02F03 de impedir a clivagem do substrato mediada por ADAMTS5, a diminuição do sinal foi analisada em função da concentração de ISVD 02F03 e os valores de IC50 foram calculados.

[351] A molécula pequena MSC2310852A, que inibe a atividade de ADAMTS4 e a atividade de ADAMTS5, foi usada como controle positivo.

[352] Os resultados estão resumidos na Tabela 2.1.1. Tabela 2.1.1 Potência (IC50) e % de inibição de ADAMTS5 para ISVD 02F03 e compostos de referência em ensaios enzimáticos humanos FRET e AlphaLISA FRET em Humano AlphaLISA em Humano ID de Composto IC50 IC50 % de % de inibição [M] [M] inibição mAb 12F4 H4L0 1,0E-09 75 6,5E-11 100 02F03 1,8E-09 89 7,5E-11 100 MSC2310852A 6,0E-08 100 1,4E-07 99

[353] Embora seja comparável ao mAb bivalente 12F4, o ISVD 02F03 mostrou uma potência melhor do que a molécula pequena MSC2310852A.

[354] Além disso, o ISVD 02F03 foi ainda avaliado quanto à sua capacidade de bloquear a degradação da cartilagem em um ensaio ex vivo, no qual o substrato é apresentado em uma condição mais próxima da condição fisiológica em comparação com ensaios bioquímicos. Em resumo, chips de explantes de cartilagem bovina (diâmetro 4 mm) foram preparados recentemente a partir de articulações de joelho de vaca e incubados em placas de 96 poços na presença de IL-1α para induzir a degradação da cartilagem. Como medida da degradação da cartilagem / Aggrecan, a liberação de glicosaminoglicano (GAG) foi detectada no sobrenadante após 5 dias de incubação (37 ºC, 7,5% CO2) através do corante metacromático 1,9 azul de dimetilmetileno (emissão a 633 nm). O sulfato de condroitina foi incluído como padrão de ensaio. A eficácia foi definida por meio dos controles induzidos por IL-1α sem composto (0%) e na presença de MSC2310852A (efeito 100%).

[355] Os resultados estão resumidos na Tabela 2.1.2. Tabela 2.1.2 Valor de IC50 para ISVD 02F03 no ensaio de explante bovino.

ID IC50 [M] mAb 12F4 H4L0 3,2E-06 02F03 1,4E-08

[356] Neste ensaio ex vivo, o ISVD 02F03 mostrou uma potência melhor do que o mAb bivalente 12F4, isto é, o IC50 é cerca de 50 vezes menor.

[357] A reatividade cruzada das espécies foi avaliada inicialmente por análise taxa off baseada em SPR em um instrumento Biacore T100. Os polipeptídeos foram testados quanto à ligação a ADAMTS humano, de macaco cinomolgo ("cino"), porquinho da índia, camundongo e bovino. Para este fim, a ADAMTS5 recombinante foi imobilizado em um chip CM5 via acoplamento de amina usando EDC e NHS. O ISVD 02F03 purificado foi injetado por 2 minutos a uma concentração de 100 nM e deixado se dissociar por 15 minutos a uma taxa de fluxo de 45 µl/min. A taxa baixa para cada ADAMTS5 individual foi determinada ajustando um modelo de interação 1:1 (modelo Langmuir) nas curvas de dissociação individuais usando o software BIA Evaluation. Como referência, as taxas de off-line no ADAMTS5 de humano foram determinadas em cada experimento.

[358] Os resultados estão resumidos na Tabela 2.1.3. Tabela 2.1.3 Visão geral dos dados de reatividade cruzada de espécies da ISVD 02F03 ID de Taxa off baseada em SPR, kd (1/s) sobre ADAMTS-5 Nano- Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 corpo Humano Cino Porquinho- Humano Camundon- Humano Bovino da-Índa go 02F03 3,3E-05 2,2E-05 3,4E-05 6,5E-05 2,9E-04 9,7E-05 4,3E-05

[359] O ISVD 02F03 apresentou taxas comparáveis (reatividade cruzada) com ADAMTS de humanos, cinomolgos, porquinho-da-Índia e bovinos.

2.2. Seletividade do ISVD 02F03

[360] Para confirmar a seletividade de ISVD 02F03 para ADAMTS5, a inibição da atividade enzimática de MMP1, MMP14 e ADAMTS4 foi avaliada através de ensaios baseados em FRET e uma ADAMTS4 AlphaLISA humano, com as respectivas enzimas.

[361] MMP1 ou MMP14 de humano ativada foi incubada por 30 minutos em temperatura ambiente com 10 mL da série de diluições de ISVD 02F03. Após a incubação, foram adicionados 20 µL de substrato peptídico fluorogênico a 5 µM ou 2,5 µM, respectivamente (Substrato Fluorogênico MMP Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2 (R&D Systems cat # ES001)). A capacidade do ISVD 02F03 para impedir a clivagem mediada por MMP1- e MMP14 foi monitorada a cada minuto por 2 horas a 37ºC em um leitor de placas Tecan Infinite M1000.

[362] Enquanto os inibidores naturais TIMP2 e TIMP3 inibiram a atividade das MMP1 e MMP14, o ISVD 02F03 não mostrou nenhuma inibição (dados não mostrados).

[363] Para avaliar a inibição da ADAMTS4 humano, um ensaio semelhante ao AlphaLISA de ADAMTS5 de humano foi realizado, essencialmente como descrito no Exemplo 2,1, mas utilizando ADAMTS4 humano (R&D Systems, Minneapolis, EUA; cat # 4307-AD). Para determinar a capacidade do ISVD 02F03 de impedir a clivagem do substrato mediada por ADAMTS4 humano, a diminuição do sinal foi analisada em função da concentração de ISVD 02F03 e os valores de IC50 foram calculados.

[364] Enquanto a molécula pequena MSC2310852A inibiu a atividade da ADAMTS4 humano, o ISVD 02F03 ou o mAb 12F4 não apresentaram atividade inibitória (dados não mostrados). O anticorpo monoclonal mAb 12F4 (H4L0) foi descrito como seletivo em relação a ADAMTS4 no documento WO 2011/002968. Exemplo 3 ISVDs de Aggrecan

3.1. ISVD anti-Aggrecan 114F08

[365] O ISVD 114F08 específico da Aggrecan foi isolado e caracterizado após extensas campanhas de triagem. Lhamas foram imunizadas com Aggrecan de humano recombinante (domínios G1- IGD-G2, R&D Systems # 1220-PG) e deram titulações séricas específicas e altas. No entanto, apenas uma porção minuciosa dos Nanocorpos isolados satisfez os dois requisitos de ligação ao domínio G1 do Aggrecan e mostrou ampla reatividade cruzada de espécies. Após tentativas árduas, vários membros da família foram identificados, mostrando características essencialmente semelhantes (consulte a Tabela 3.1A à Tabela 3.1C para obter variações de sequência nas CDRs). Eventualmente, o ISVD 114F08 ("C0101PMP114F08") foi selecionado para posterior caracterização.

[366] Uma visão geral dos dados de mapeamento de domínio e reatividade cruzada de espécies é fornecida na Tabela 3.1.1. Tabela Extrato periplásmico ELISA. OD 450 nm

3.1.1 Mapeamen Clone Hu.G1- Ci. G1- Rato Cão G1- Bov. G1- -to IGD-G2 IGD-G2 G1- IGD-G2 IGD-G2 IGD-G2 G1 114F08 2,38 2,32 2,05 1,90 1,18

[367] Após a triagem primária, avaliação inicial da ligação via ELISA, determinação da reatividade cruzada de baixa taxa e espécies, o ISVD 114F08 foi submetido a caracterização adicional.

[368] A variabilidade da sequência nas CDRs dos membros da família da ISVD 114F08 está representada nas Tabelas 3,1A, 3,1B e 3,1C abaixo. As sequências de aminoácidos das CDRs do clone 114F08 foram usadas como referência, contra as quais as CDRs de todos os outros membros da família foram comparadas (CDR1 começa na posição Kabat 26, CDR2 começa na posição Kabat 50 e CDR3 começa na posição Kabat 95). Tabela 3.1A 114F08 CDR1* Numeração 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Kabat Numeração 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 absoluta Sequência G S T F I I N V V R tipo selvagem Mutações S M *Até 2 mutações CDR1 em um clone Tabela 3.1B 114F08 CDR2* Numeração 50 51 52 53 54 55 56 57 58 Kabat

Numeração 1 2 3 4 5 6 7 8 9 absoluta Sequência tipo T I S S G G N A N selvagem Mutações A R T T D *Até 5 mutações CDR2 em um clone Tabela 3.1C 114F08 CDR3* Numera- 100a 100b 100d 100e 100g 100c 100f 100 ção Kabat 95 96 97 98 99 Numera- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ção absoluta Sequência P T T H Y G G V Y Y G P Y tipo selvagem Mutações . . . R . . . D . . . . . *Até 2 mutações CDR3 em um clone

3.2. Retenção ex vivo de cartilagem bovina

[369] Uma vez que não existe um ensaio estabelecido para avaliar a retenção de cartilagem, os inventores desenvolveram um ensaio de retenção de cartilagem ex vivo utilizando cartilagem bovina.

[370] A capacidade de um polipeptídeo compreendendo ISVD 114F08 de ser retido na cartilagem por um período prolongado de tempo, após uma exposição relativamente curta de um polipeptídeo à cartilagem (o que pode ser esperado após injeção intra-articular) foi determinada. O ensaio foi tipicamente realizado com 4 discos de cartilagem por amostra de nanocorpos; 2 discos foram analisados logo após a incubação do polipeptídeo (t0) para determinar a quantidade inicial de polipeptídeo ligado; 2 discos foram analisados após a lavagem (t1-5 dias). O grau de retenção foi definido como a razão da quantidade de polipeptídeo detectado em t1-5 dias e t0. A determinação dessa proporção foi realizada por inspeção visual dos Western Blots dando uma pontuação de 0 a 6, em que 0 é sem retenção e 6 é com retenção total. Um construto fictício C0101030 ("30"), consistindo em 2 ISVDs inativos ALB26, não mostrou ligação.

[371] Um resumo dos resultados é mostrado na Tabela 3.2. Alvo Construto Descrição Retenção de cartilagem G1 118 ALB26-114F08-114F08 6,0 G1 54 114F08-ALB26 5,0 Fictício 30 ALB26-ALB26 0,0 Tabela 3.2: Retenção de cartilagem do ISVD anti-Aggrecan 114F08 formatado em ALB26. *Pontuações são uma média de 1 a 4 ensaios independentes de retenção de cartilagem bovina ex vivo em uma escala de 0 a 6: 0 é sem retenção e 6 é com retenção total.

[372] Verificou-se que os polipeptídeos compreendendo ISVD 114F08 foram retidos muito bem (pontuações 5-6) na cartilagem. Isso incluiu construtos compreendendo uma e duas unidades de ligação de ISVD 114F08.

3.3. Características de ligação - ELISA

[373] Com base nos dados de retenção de cartilagem bovina ex vivo, o ISVD 114F08 foi ainda caracterizado em ELISA na região G1- IGD-G2 recombinante de Aggrecan de humano, cinomolgo, rato, cão e bovino para determinar a reatividade cruzada de sua espécie (consulte também o Exemplo 3.1) e sobre Neurocan e Brevican humano recombinante para determinar sua seletividade. Os valores EC50 determinados estão listados na Tabela 3.3.

EC50 (M) Cons- Des- Huma- Cino Rato Cão Bovino Neuro- Brevi- truto crição no can can 54 114F08- 6,0E-09 4,4E-09 7,6E-09 3,0E-09 5,6E-09 Sem Sem ALB26 ligação ligação 118 ALB26- 1,1E-10 7,6E-11 1,9E-10 2,4E-10 3,7E-10 Sem Sem 114F08- ligação ligação 114F08 Fictício ALB26- Sem Sem Sem Sem Sem Sem Sem ALB26 ligação ligação ligação ligação ligação ligação ligação Tabela 3.3 Caracterização do anti-Aggrecan ISVD 114F08 formatado em ALB26 por ELISA.

3.4. Especificidade do tecido

[374] Foi demonstrado acima que os polipeptídeos da invenção se ligam especificamente a Aggrecan in vitro e à cartilagem ex vivo. Além disso, esses polipeptídeos também devem se ligar preferivelmente à cartilagem de uma articulação, enquanto a nenhum ou a menos outros tecidos de uma articulação.

[375] A ligação de polipeptídeos compreendendo ISVD 114F08 à membrana sinovial, tendão e epimísio foi avaliada usando a mesma configuração do ensaio de ligação à cartilagem ex vivo. A liberação do polipeptídeo e a análise Western Blot foram realizadas após uma breve lavagem dos tecidos (30 min) após incubação ON com os polipeptídeos.

[376] Os resultados estão resumidos na Tabela 3.4. Membrana Construto Descrição Cartilagem Tendão Epimísio sinovial 054 114F08-ALB26 6 1 1 1 ALB26-114F08- 118 6 1 1 1 114F08 Fictício ALB26-ALB26 1 1 1 0 Tabela 3.4: Especificidade do tecido. Ligação do ISVD anti-Aggrecan formatado em ALB26 114F08 à cartilagem articular, membrana sinovial, tendão e epimísio. As pontuações estão em uma escala de 0 a 6, na qual 0 não é sem ligação e 6 é o máximo de ligação.

[377] Os resultados mostram que os polipeptídeos compreendendo uma ou duas unidades de ligação de ISVD 114F08 mostram ligação preferencial à cartilagem, sobre os outros tecidos encontrados na articulação.

3.5. Estabilidade de nanocorpos em fluido sinovial bovino

[378] Por várias razões, incluindo conveniência e segurança do paciente, é preferível que os polipeptídeos permaneçam estáveis por períodos mais longos na sinóvia.

[379] Por conseguinte, a estabilidade dos polipeptídeos compreendendo ISVD 114F08 no Fluido Sinovial (SF) foi avaliada por incubação dos polipeptídeos no SF bovino por até 7 dias a 37ºC.

[380] Os resultados estão resumidos na Tabela 3.5. Estabilidade em SF Construto Descrição bovino, 37ºC 054 114F08-ALB26 > 7 days 118 ALB26-114F08-114F08 > 7 days Fictício ALB26-ALB26 > 7 days Tabela 3.5: Estabilidade de polipeptídeos compreendendo ISVD 114F08 em SF bovino.

[381] Nenhuma degradação de qualquer um dos construtos pôde ser detectada. Exemplo 4 Polipeptídeos

[382] O polipeptídeo 754 foi modificado por engenharia genética ligando ISVD anti-MMP13 62C02 e dois ISVDs anti-Aggrecan 114F08, usando ligantes 35GS (M-C-C). O polipeptídeo 754-9 era semelhante ao polipeptídeo 754, mas agora usando ligantes 9GS. As sequências de aminoácidos resultantes são mostradas na Tabela A-1 como SEQ ID NO: 5 e 63, respectivamente.

[383] O polipeptídeo 954 foi modificado por engenharia genética, ligando geneticamente ISVD anti-ADAMTS5 2F03 e dois ISVDs anti- Aggrecan 114F08, usando ligantes 35GS (A-C-C). O polipeptídeo 954- 9 (cf. "973") era semelhante ao polipeptídeo 954, mas agora usando ligantes 9GS. As sequências de aminoácidos resultantes são mostradas na Tabela A-1 como SEQ ID NO: 6 e 64, respectivamente.

[384] O polipeptídeo 949 foi modificado por engenharia genética ligando ISVD anti-MMP13 62C02, ISVD anti-ADAMTS5 2F03 e dois ISVDs anti-Aggrecan 114F08, usando ligantes 35GS (M-A-C-C). O polipeptídeo 949-9 era semelhante ao polipeptídeo 949, mas agora usando ligantes 9GS. As sequências de aminoácidos resultantes são mostradas na Tabela A-1 como SEQ ID NO: 1 e 62, respectivamente. Exemplo 5 Afinidade de polipeptídeos para ADAMTS5, MMP13 e Aggrecan de diferentes espécies

5.1 Afinidade do polipeptídeo 949 em relação a ADAMTS de humano, cinomolgo e rato

[385] A afinidade em solução do polipeptídeo 949 para ADAMTS5 de humano, cinomolgo e rato foi determinada usando KinExA. Uma concentração fixa de 20 pM (concentração final) do polipeptídeo 949 foi equilibrada por 24 horas com uma curva de resposta à dose diluída em série 1/2,2 de 16 pontos de ADAMTS5 de humano, cinomolgo ou de rato, cada vez começando em 20 nM com o último ponto sendo um em branco (= sem ADAMTS5). Todas as diluições foram preparadas em tampão de amostra (PBS + BSA a 0,1% + NaN3 a 0,02%). Para testar a interferência do Aggrecan, o Aggrecan G1-IGD-G2 recombinante foi adicionado a esta pré-incubação em experimentos selecionados, a uma concentração de 2 nM (= mais de 100x seu KD para o polipeptídeo 949, vide abaixo).

[386] Posteriormente, as misturas pré-incubadas (polipeptídeo ADAMTS5 DRC + 20 pM 949 ± Aggrecan G1-IGD-G2) foram injetadas através do autoamostrador do KinExA sobre uma coluna embalada com esferas de polimetilmetacrilato (PMMA) conjugado com ADAMTS5 de humano, para capturar construtos livres de nanocorpos nas esferas. Os construtos de Nanocorpos capturados foram detectados usando uma ferramenta anti-Nanocorpo marcada com 647 Alexa Fluor (AF) que reconhece o polipeptídeo 949. O construto de Nanocorpo livre de percentual foi plotado em função da concentração da ADAMTS5 e ajustado usando o KinExA Pro Software v3.6.5 para determinar a KD.

[387] Os resultados, apresentados na Tabela 5,1, mostram que a afinidade do polipeptídeo 949 em relação a ADAMTS5 de humano é 32,69 pM na ausência de G1-IGD-G2 e 26,56 pM na presença de Aggrecan. Com base na sobreposição dos ICs nos valores de KD, a presença de Aggrecan não interfere na afinidade do polipeptídeo 949 para ADAMTS5. As afinidades para ADAMTS5 de cinomolgo e rato foram 24,35 pM e 25,17 pM, respectivamente, demonstrando reatividade cruzada de ligação do polipeptídeo 949 para ambas as espécies, pois ambos os valores de KD caem dentro do IC da KD humana. Tabela 5.1: Afinidade do polipeptídeo 949 para ADAMTS5 de humano na ausência ou presença de Aggrecan G1-IGD-G2, e para ADAMTS5 de cinomolgo e rato N KD Média (pM) 95% CI sobre KD (pM) Humano 3 32,69 16,35 – 65,38 - Aggrecan Humano 3 26,56 16,38 – 58,46 + Aggrecan Cinomolgo 1 24,35 9,25 – 66,27 Rato 1 25,17

5.2 Inibição funcional de ADAMTS5 de humano, cinomolgo e ratos pelo polipeptídeo 949

[388] A inibição funcional de ADAMTS5 de humano, cinomolgo e rato por C010100949 foi estudada usando um ensaio cinético baseado em FRET. Este ensaio foi realizado utilizando um tampão de ensaio FRET (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, CaCl2 * 2H 2O 5 mM, glicerol a 5%, CHAPS a 0,1% em MilliQ). Uma concentração fixa de 10 nM (concentração final) das respectivas espécies ADAMTS5 foi misturada e equilibrada com uma DRC de 11 pontos (12º = em branco) 1/1,7 diluída em série do polipeptídeo 949 iniciando em 50 nM (concentração final). Em seguida, foram adicionados 30 µM (concentração final) do substrato fluorogênico ADAMTS5 específico da espécie. Este substrato, um peptídeo Aggrecan marcado com um arrefecedor (2,4-dinitrofenil, Dnp) e um fluorocromo (ácido aminobenzóico, Abz), foi clivado enzimaticamente por ADAMTS5 e a fluorescência resultante (comprimento de onda de excitação 340 nm / comprimento de onda de emissão 430 nm) foi cineticamente medido a cada minuto por 2 horas usando um leitor de microplacas Tecan F200. As curvas de progresso obtidas (sinal fluorescente em função do tempo de reação) foram analisadas usando o software GraphPad Prism, ajustando a parte linear de cada curva de progresso com uma linha reta (Y = inclinação * interceptação X + Y). As inclinações ou velocidades de reação resultantes (vi) foram normalizadas contra a inclinação média de todas as amostras em branco (velocidade de reação desinibida, v0), plotadas como uma função da concentração do polipeptídeo 949 e ajustadas com um ajuste de curva logística de 5 parâmetros (5PL) assimétrico para obter curvas de inibição.

[389] Os resultados estão resumidos na Figura 1, que é uma ilustração gráfica representativa dos resultados. Os resultados mostram a inibição completa e dependente da dose da atividade enzimática da ADAMTS5 de todas as espécies testadas pelo polipeptídeo 949 ("C010100949"), demonstrando que todos eles são totalmente inibidos funcionalmente pelo construto de Nanocorpos.

5.3 Afinidade do polipeptídeo 949 em relação a MMP13 de humano, cinomolgo e rato

[390] As atividades funcionais, bem como as constantes de inibição da enzima (KI) do polipeptídeo 949 em relação a MMP13 de diferentes espécies foram estudadas usando um ensaio cinético baseado em FRET. Todas as diluições foram feitas em tampão de ensaio (Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM, CaCl2 10 mM * 2H20, Tween20 a 0,01%). Uma DRC de 11 pontos (12º = em branco) diluída em série 1/3 do polipeptídeo 949, iniciando em 9 µM (concentração final) foi equilibrada com uma concentração constante de 0,2 nM de domínio catalítico da espécie (cd) MMP-13 ou entre 0,2 e 20 nM de pro-MMP13 ativada (concentração nominal) de cada espécie. Em seguida, uma concentração constante de 22 µM (concentração final) de substrato fluorogênico de MMP foi adicionada a todos os poços. Esse substrato à base de colágeno contém a sequência de clivagem genérica de MMP Prolina-Leucina-Glicina-Leucina (PLGL) e é rotulado com um fluorocromo, Mca e um arrefecedor, Dpa. A enzima ativa (não ligada ao construto de Nanocorpo) é capaz de clivar o substrato, levando à liberação do fluorocromo e resultando em um sinal fluorescente (comprimento de onda de excitação 320 nm / comprimento de onda de emissão 405 nm), enquanto é enzima neutralizada (ligada ao construto de Nanocorpo) não é. Começando dentro de um minuto após a adição do substrato, a fluorescência foi medida cineticamente a cada minuto durante um total de 120 ciclos (2 horas) usando um leitor de placas Tecan F200.

[391] As curvas de progresso obtidas (sinal fluorescente em função do tempo de reação) foram analisadas usando o software GraphPad Prism, ajustando a parte linear de cada curva de progresso com uma linha reta (Y = inclinação * interceptação X + Y). As inclinações ou velocidades de reação resultantes (vi) foram normalizadas contra a inclinação média de todas as amostras em branco (velocidade de reação desinibida, v0), plotadas em função da concentração do polipeptídeo 949 e ajustadas com uma curva de logística de 5 parâmetros (5PL) assimétrica, ajustada a obter curvas de inibição.

[392] Nestas condições de ensaio, o valor de IC50 obtido é igual à constante de inibição, KI.

[393] Os resultados da análise quantitativa estão resumidos na Tabela 5.3. Dois a seis experimentos independentes foram repetidos por interação. Com base em 6 experimentos repetidos independentes, a constante de inibição do polipeptídeo 949 em relação a cdMMP13 de humano foi determinada como sendo 27,86 nM (IC 95%: 25,67-30,23 nM). Com base em 3 experimentos repetidos independentemente, KI da pro-MMP13 de humano ativada foi determinado como sendo 2,92 nM (IC 95%: 0,61-14,02 nM). Os valores de KI em relação a MMP13 de cinomolgo e rato correspondem fortemente aos KI's de humanos para ambos os domínio catalíticos, bem como a pro-MMP13 ativada, indicativo de reatividade cruzada do polipeptídeo 949 para MMP13 de cinomolgo e rato. Forma MMP13 N KI Média (nM) CV (%) 95% CI sobre KI (nM) Humano cd 6 27,86 7,7 25,67 – 30,23 pro 3 2,92 52,7 0,61 – 14,02 Cinomologo cd 3 20,21 1,6 19,43 – 21,03 pro 2 3,72 5,5 2,27 – 6,11 Rato cd 3 26,59 9,2 21,19 – 33,36 pro 2 13,02 31,9 0,70 – 241,59 Tabela 5.3 Visão geral dos resultados da determinação de afinidade de polipeptídeo 949 em relação ao domínio catalítico de MMP13 de humano, cinomolgo e rato e pró-MMP13 ativada, Valores de KI médio bem como os intervalos de confiança de 95% (IC), foram calculados através de uma estimativa dos valores médios globais. Cd: domínio catalítico; pro: pro-MMP13 ativada; CV: coeficiente de variação.

[394] Inibição funcional de cdMMP13 de humano, cinomolgo e rato, bem como de pró-MMP13 ativada pelo polipeptídeo 949 foi avaliada simultaneamente nos experimentos que foram realizados para medir o KI (vide acima). A Figura 2 é uma ilustração gráfica representativa dos resultados. Estes resultados demonstram inibição funcional completa e dependente da dose da atividade enzimática de todas as espécies testadas, formas cdMMP13 e pro-MMP13 pelo construto Nanocorpo 949.

5.4 Afinidade do polipeptídeo 949 em relação a Aggrecan G1-IGD- G2 humano, cinomolgo e rato

[395] A determinação da afinidade do polipeptídeo 949 em relação a Aggrecan G1-IGD-G2 recombinante humano, de macaco e cinomolgo foi realizada usando ressonância plasmônica de superfície (SPR) em um instrumento de matriz de interação ProteOn XPR36 (BioRad, série No. 670BR6176). Em resumo, o Aggrecan G1-IGD-G2 recombinante ('ligante') foi imobilizado nas faixas de ligantes de um chip sensor de GLC (Biorad cat # 176-5011) por acoplamento de amina a uma concentração de 10 µg/ml em acetato de 10 mM pH 4,5 e vazão de 100 µl/min, visando um nível de imobilização de 400 unidades de ressonância (RU). O polipeptídeo 949 ("C010100949"; 'analito') foi injetado ao longo das faixas de analito do chip sensor sob um fluxo contínuo de 45 µl/min por 2 minutos em várias concentrações (0,5 - 1 - 2 - 4 - 6 - 10 nM) em 1x HBS-P + pH 7,4 como tampão de execução (GE Healthcare cat # R-1006-71). O tempo de dissociação foi de 10 min. Após cada injeção de amostra, as superfícies foram regeneradas com glicina 10 mM, pH 1,5. A interação entre o Aggrecan G1-IGD-G2 e o polipeptídeo 949 foi detectada como aumentos no índice refratário que ocorrem como resultado de alterações de massa no chip devido à ligação do polipeptídeo 949 a Aggrecan. Essa alteração no índice de refrativo causa uma alteração na intensidade e no ângulo da luz refletida, que é medida quantitativamente em tempo real e plotada como unidades de resposta (RU) versus tempo em um sensorgram. As constantes cinéticas foram calculadas a partir dos diagramas de sensores obtidos usando o software ProteOn Manager 3.1.0 versão

3.1.0.6 e o modelo 'cinético Langmuir ka/KD simultâneo'.

[396] Os resultados estão resumidos na Tabela 5.4. Com base em 2 a 4 experimentos repetidos independentemente, as afinidades médias de ligação (KD) do polipeptídeo 949 em relação a Aggrecan G1-IGD-G2 capturado foram determinadas como 14,0 pM, 16,0 pM e 16,6 pM para humanos, cinomolgos e ratos, respectivamente.

[397] Como o modo de ação (MoA) dos blocos de construção CAP do polipeptídeo 949 depende apenas da ligação a Aggrecan, que é diretamente refletida pela determinação de afinidade baseada em SPR, análises funcionais adicionais dos blocos de construção CAP não são relevantes. A partir desses dados de SPR, pode-se concluir que o polipeptídeo 949 demonstra reatividade cruzada completa em relação ao cinomolgo e a Aggrecan de rato sem diferença de afinidade em comparação com o humano. N KD Média (pM) 95% CI sobre KD (pM) Humano 4 14,0 5,9 – 33,7 Cinomólogo 2 16,0 NC (*) Rato 3 16,6 7,0 – 39,5 Tabela 5.4 Visão geral dos resultados da determinação de afinidade de 949 em relação a Aggrecan G1-IGD-G2 de humano, cinomolgo e rato. Os valores médios de KD, bem como os intervalos de confiança de 95% (CI) foram calculados através de uma estimativa dos valores médios globais. N: número de experimentos independentes; KD: constante de dissociação; NC: não calculado. (*) Para o cinomolgo, dois experimentos independentes produziram o mesmo resultado de 16,0 pM, portanto, nenhum CI poderia ser calculado, pois nenhuma informação de erro padrão na KD é fornecida pelo software ProteOn. Exemplo 6 Inibição de degradação ex vivo de Cartilagem em um modelo de explante bovino

[398] O polipeptídeo 949 (M-A-C-C: 62C02-2F03-114F08-114F08) foi testado em ensaios de explante de cartilagem bovina para inibição da degradação da cartilagem.

[399] Em resumo, o polipeptídeo foi incubado com explantes de cartilagem bovina que foram cultivados 5 dias com IL-1α para induzir um processo de degradação de cartilagem semelhante a OA. Dentro de 5 dias, ocorre a degradação principalmente do Aggrecan, enquanto a degradação do colágeno ocorre apenas após cerca de duas semanas, isto é, após o término dos experimentos aqui descritos. No final do experimento, o GAG (principalmente derivado de Aggrecan) que foi liberado da cartilagem degradante no sobrenadante da cultura foi quantificado. A eficácia da inibição da liberação de GAG pelo polipeptídeo foi calculada em comparação com um inibidor de pequenas moléculas, que nessas condições inibiu completamente a liberação de GAG estimulado por IL-1α.

[400] Os resultados estão representados na Figura 3.

[401] Pode-se observar que o polipeptídeo 949 (NB949 na figura) inibe completamente a degradação da cartilagem bovina de maneira dependente da dose. Exemplo 7 Inibição da degradação ex vivo de cartilagem em um modelo de explante humano

[402] O polipeptídeo 949 (M-A-C-C: 62C02-2F03-114F08-114F08) foi testado em ensaios de explante de cartilagem humana para inibição da degradação de cartilagem. Resumidamente, o polipeptídeo foi incubado com explantes de cartilagem humana que foram cultivados 7 dias com IL-1β + Oncostatina M (OSM). Dentro de 7 dias, ocorre a degradação principalmente do Aggrecan, enquanto a degradação do colágeno ocorre apenas após cerca de duas semanas, isto é, após o término dos experimentos aqui descritos. No final do experimento, o GAG (principalmente derivado de Aggrecan) que foi liberado da cartilagem degradante no sobrenadante da cultura foi quantificado. O IC50 foi calculado com base no nível de controle negativo (= liberação de GAG de explantes sem estímulo adicional) e no nível de IL-1 β + OSM, como medido para a perda máxima de GAG. O GAG é mostrado como liberação de GAG (em µg) por mg de cartilagem de cada explante individual.

[403] Os resultados estão representados na Figura 4.

[404] Os dados mostram que o construto de Nanocorpos inibe a liberação de GAG da cartilagem OA humana de uma maneira dependente da dose com um IC50 calculado de 0,03724 µM. Exemplo 8 CAP estende ex vivo a eficácia de polipeptídeos que inibem a degradação da cartilagem

[405] Para avaliar o efeito da porção CAP, que funciona para ancorar o polipeptídeo na cartilagem, o ensaio de explante bovino descrito acima foi modificado para incluir etapas de lavagem após a etapa de incubação (1h) do explante de cartilagem com os polipeptídeos (vide Figura 5, painel superior). Após as etapas de lavagem, a degradação da cartilagem foi iniciada adicionando IL-1α. Após 7 dias de incubação adicional, liberação de GAG no sobrenadante da cultura foi quantificada. Como controle, foi incluído o polipeptídeo 581 inibidor de ADAMTS5, que não contém uma porção de ligação a CAP (SEQ ID NO: 65).

[406] Os resultados são mostrados na Figura 5.

[407] O experimento mostra que o polipeptídeo de controle 581, isto é, o polipeptídeo que não contém uma porção de ligação a CAP, não mostrou quase nenhuma eficácia na inibição de ADAMTS5. Isso contrasta amplamente com os ensaios nos quais as etapas de lavagem foram omitidas. Por outro lado, o polipeptídeo 949 permaneceu eficaz, mesmo após lavagem extensa. Dado que a liberação de GAG é conduzida por ADAMTS5, em vez de MMP13 nas atuais condições de ensaio, esse resultado é uma forte indicação de que a porção de ligação a CAP realmente funciona para ancorar os polipeptídeos à cartilagem e que a porção de ligação à CAP não afeta a eficácia da ADAMTS5 ISVD. Exemplo 9 Efeito do polipeptídeo 949 em um sistema de cocultura sinovial de cartilagem bovina

[408] Sabendo que OA não envolve apenas cartilagem, o polipeptídeo 949 também foi testado em um modelo bovino composto por membrana sinovial (sinóvia) e explantes de cartilagem articular. Resumidamente, os explantes de cartilagem e sinóvia em uma proporção de 1/1 foram cocultivados por 28 dias com trocas de meio regulares. Semanalmente, C2M (degradação de Col II) e C3M (degradação de Col III) foram determinados no sobrenadante das coculturas.

[409] Os resultados (como AUC = área sob a curva) são mostrados na Figura 6.

[410] Os dados mostram que a coincubação de explantes de cartilagem com sinóvia induz a liberação de C2M (gráfico da esquerda) e C3M (gráfico da direita). O polipeptídeo 949 foi incubado em 3 concentrações diferentes (1 nM, 10nM, 100 nM). O efeito do polipetídeo 949 foi avaliado em comparação com a molécula de referência Wyeth (MSC2310852A-1). Os dados mostram que o polipeptídeo exemplar 949, bem como o composto de referência, inibe fortemente a liberação de C2M e C3M. Exemplo 10 Estudos de retenção de cartilagem

[411] Para determinar a retenção dos construtos de Nanocorpos in vivo, um estudo de retenção de cartilagem de rato foi projetado usando o polipeptídeo exemplar 949. Como o polipeptídeo 949 tem 4 blocos de construção (MACC), assume-se que os polipeptídeos 754 e 954, cada um com dois aglutinantes de Aggrecan e um ISVD específico do alvo se comportam essencialmente de maneira semelhante.

[412] Um ensaio de ligação ao ligando baseado em ELISA foi desenvolvido para quantificar as concentrações de construto de nanocorpos locais na cartilagem de rato, enquanto um ensaio de ligação de ligantes (plataforma MSD) foi desenvolvido para quantificar o construto de nanocorpos em circulação.

[413] Os resultados são mostrados na Figura 7.

[414] Em conclusão, o polipeptídeo exemplar 949 é retido na cartilagem in vivo até 112 dias após a administração da IA, enquanto concentrações sistêmicas (baixo intervalo de pg/ml) eram detectáveis apenas no primeiro ponto de amostragem (2 horas após a injeção da IA) em ratos saudáveis enquanto nenhum polipeptídeo pode ser detectado em momentos posteriores (14 dias e além).

[415] Portanto, construtos compreendendo ISVDs anti-Aggrecan 114F08 são estáveis e retidos em modelos in vivo. Exemplo 11 Estudo 1 DMOAD MMT in vivo de rato

[416] Para demonstrar a eficácia in vivo do polipeptídeo 754 (M-C- C; "Nanocorpo 754"), do polipeptídeo 954 (A-C-C; "Nanocorpo 954") e do polipeptídeo 949 (M-A-C-C, "Nanocorpo 949"), um modelo Medial Meniscal Tear (MMT) induzido cirurgicamente em ratos foi utilizado. Em suma, os ratos foram operados em um joelho para induzir sintomas semelhantes a OA. O tratamento começou 3 dias após a cirurgia com uma única injeção IA. As seguintes doses foram administradas 3 dias após a cirurgia aos animais: veículo (tampão), polipeptídeo 754 (300 µg/rato), polipeptídeo 949 (4, 40 ou 400 µg/rato) e polipeptídeo 954 (300 µg/rato).

[417] A histopatologia foi realizada no dia 42 após a cirurgia. A largura da degeneração da cartilagem tibial medial e a largura da degeneração da cartilagem total tibial medial foram determinadas, bem como a redução percentual da degeneração da cartilagem. Por grupo, foram utilizados 20 animais.

[418] Os resultados da largura da degeneração da cartilagem tibial medial são mostrados na Figura 8.

[419] Os resultados demonstram que a largura da cartilagem tibial medial foi substancialmente reduzida por todos os construtos de Nanocorpo após 42 dias em comparação com o veículo. Esses resultados sugerem ainda que (a) a porção CAP não tem impacto negativo na atividade dos construtos; (b) a porção CAP permite a retenção dos construtos; (c) todos os construtos têm um efeito positivo na largura da cartilagem; e (d) a combinação de um inibidor de ADAMTS5 e um inibidor de MMP13 demonstra o maior efeito geral, como exemplificado pelo polipeptídeo 949. Exemplo 12 Estudo 2 confirmatório de DMOAD MMT in vivo em rato

[420] Os estudos de eficácia in vivo descritos no Exemplo 11 (estudo DMOAD 1) foram essencialmente repetidos com um regime de dosagem diferente. Além disso, no estudo DMOAD 1, apenas OA leve estava presente 3 dias após a cirurgia. Portanto, os polipeptídeos foram agora avaliados em um estágio mais avançado da OA no modelo MMT, enquanto o tratamento foi iniciado 7 dias após a cirurgia. Em resumo, a largura da degeneração da cartilagem tibial medial em µm foi medida no dia 42 após a cirurgia. Novamente, o polipeptídeo 949 foi usado para exemplificar o efeito combinado dos inibidores de ADAMTS5 e MMP13.

[421] Em uma primeira série de experimentos, consistindo em 20 animais por grupo, cada grupo recebeu uma única injeção de IA (400 µg, 800 µg, veículo) 7 dias após a cirurgia. No final do tratamento, o grupo que recebeu 400 µg do polipeptídeo 949 mostrou uma diminuição de 21% na largura da degeneração da cartilagem tibial medial, enquanto o grupo de 800 µg mostrou uma diminuição de 16% (vide Figura 9). Estes resultados confirmam a eficácia dos construtos.

[422] Em uma segunda série de experimentos, consistindo novamente em 20 animais por grupo, cada grupo recebeu duas injeções IA no dia 7 e no dia 10 após a cirurgia (200 µg, 400 µg, 800 µg, veículo). No final do tratamento, o grupo que recebeu 200 µg do polipeptídeo 949 mostrou uma diminuição de 14% na largura da tíbia, o grupo 800 µg mostrou uma diminuição de 31%, enquanto o grupo 400 µg mostrou uma diminuição de 35% (Figura 9). Exemplo 13 Benefício sintomático in vivo

[423] Para avaliar a capacidade dos polipeptídeos de proporcionar um benefício sintomático, foi utilizado um modelo cirúrgico de OA em ratos. Em resumo, os ratos foram submetidos à cirurgia ACLt e tMx para induzir OA no dia 0. No modelo cirúrgico ACLt e tMx (transecção do ligamento cruzado anterior estendido com meniscectomia medial) os construtos foram administrados IA na semana 1 e na semana 8 em diferentes concentrações (100 µg, 400 µg e 1000 µg). Um grupo de ratos foi tratado com IA com Tanezumab (Pfizer), um mAb do fator de crescimento anti-nervo (NGF), que foi incluído como controle positivo para alívio dos sintomas no estudo. Nas semanas 2, 5, 9 e 13, foram determinados o benefício sintomático via análise da marcha (no CatWalk) e a diminuição do diâmetro articular.

[424] Os resultados são mostrados na Figura 10.

[425] O tratamento intra-articular com os polipeptídeos resultou em um benefício sintomático de até 43%. Exemplo 14 Retenção de aglutinantes de CAP em ratos saudáveis e osteoartríticos é semelhante in vivo

[426] Foi demonstrado no Exemplo 10 em um estudo de retenção de cartilagem em ratos saudáveis que os polipeptídeos da invenção eram mensuráveis em cartilagem até 112 dias após a injeção intra- articular (I.A.). Uma vez que a composição da cartilagem pode ter influência na ligação e absorção da cartilagem na circulação sistêmica, a farmacocinética dos polipeptídeos da invenção foi comparada em ratos doentes com osteoartrite e saudáveis in vivo, seguindo o nível sérico dos polipeptídeos no tempo.

[427] Em particular, o modelo Medial Meniscal Tear (MMT) induzido cirurgicamente em ratos foi utilizado como descrito no Exemplo 10, mas com algumas modificações. Em resumo, os polipeptídeos da invenção foram acoplados a um ISV anti-MMP13 e um ISV anti- ADAMTS5 (designado como nanocorpos "949", "0949" ou "C010100949"). Os ratos foram operados em um joelho para induzir sintomas semelhantes a OA (grupo OA). Cada grupo de tratamento (saudável e OA) foi composto por 15 animais e recebeu uma única injeção I.A. de 400 µg / 30 µl de Nanocorpo no dia 7 (saudável) ou 7 dias após a cirurgia (MMT). Amostras de soro foram coletadas de ratos anestesiados no dia 0, no dia 7 (às 0h = amostra de pré-dose) no dia 8 (em momentos diferentes após o tratamento até 24h), dia 9 (48h após tratamento), d10 (3 dias após tratamento), d14 (7 dias após tratamento), d21 (14 dias após tratamento)) e d42 (35 dias após tratamento). As amostras de soro coletadas foram usadas para a determinação das concentrações de polipeptídeos em um formato de ensaio de PK total baseado em eletroquimoluminescência (ECL), seguido por uma análise não compartimental.

[428] A retenção dos polipeptídeos no soro de ratos saudáveis e OA é mostrada na Figura 11.

[429] Os resultados demonstram que não podem ser observadas diferenças óbvias nas concentrações séricas dos polipeptídeos em ratos saudáveis e ratos com OA. Portanto, estes resultados sustentam que a degradação da cartilagem não tem influência na farmacocinética dos polipeptídeos da invenção. Tabela A-1 Nome e descrição curtas ("ID"), SEQ ID NOs: ("SEQ") e sequências de aminoácidos dos polipeptídeos da invenção ID SEQ Sequência ALX-1011 1 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWV 949 RQAPGKGLEWVSSISDDGSKTYYADSVKGRFTISRDNS

KNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNTGYGATTTRPGRYWG QGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGR TVSSYAMGWFRQAPGKEREFVAGISRSAERTYYVDSLK GRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAADLDPNR IFSREEYAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGG SLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGG NANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALY YCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESG GGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRE LVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSL

RPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSA 62C02 2 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWV MMP13 RQAPGKGLEWVSSISDDGSKTYYADSVKGRFTISRDNS

KNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNTGYGATTTRPGRYWG

QGTLVTVSS 2F03 3 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTVSSYAMGWF ATS5 RQAPGKEREFVAGISRSAERTYYVDSLKGRFTISRDNSK

NTVYLQMNSLRPEDTALYYCAADLDPNRIFSREEYAYW

GQGTLVTVSS 114F08 4 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYR

CAP RAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNT VYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQG TLVTVSS

MCC 754 5 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWV

RQAPGKGLEWVSSISDDGSKTYYADSVKGRFTISRDNS KNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNTGYGATTTRPGRYWG QGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGST FIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRF TISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVY YGPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLS CAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYV DSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPT

THYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSA ACC 6 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTVSSYAMGWF 954 RQAPGKEREFVAGISRSAERTYYVDSLKGRFTISRDNSK

NTVYLQMNSLRPEDTALYYCAADLDPNRIFSREEYAYW GQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASG STFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRG RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGG VYYGPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLR LSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNAN YVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCN

VPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSA 114F08- 41 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYR Alb "054" RTPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFSISRDGAKN

AVDLQMNGLKPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQ GTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTF SSAVMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKG RFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRS SQGTLVTVSS

Alb- 42 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSAVMSWV 114F08- RQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNA 114F08 KTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVS "118" SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG

GSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTFIINVVRW YRRTPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFSISRDGA KNAVDLQMNGLKPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYGPYW GQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASG STFIINVVRWYRRTPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRG RFSISRDGAKNAVDLQMNGLKPEDTAVYYCNVPTTHYG

GVYYGPYWGQGTLVTVSS Alb-Alb 43 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSAVMSWV "030" RQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNA

KTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVS SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSAVMS WVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRD NAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVT

VSS 949-9GS 62 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWV "973" RQAPGKGLEWVSSISDDGSKTYYADSVKGRFTISRDNS

KNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNTGYGATTTRPGRYWG QGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLR LSCAASGRTVSSYAMGWFRQAPGKEREFVAGISRSAER TYYVDSLKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYC AADLDPNRIFSREEYAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGS EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYR RAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNT VYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQG TLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLS CAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYV DSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPT THYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSA

754-9GS 63 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWV

RQAPGKGLEWVSSISDDGSKTYYADSVKGRFTISRDNS KNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNTGYGATTTRPGRYWG QGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLR LSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNAN YVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCN VPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEV QLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRA PGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVY LQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTL

VTVSSA 954-9GS 64 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTVSSYAMGWF

RQAPGKEREFVAGISRSAERTYYVDSLKGRFTISRDNSK NTVYLQMNSLRPEDTALYYCAADLDPNRIFSREEYAYW GQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGS LRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGN ANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYY CNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGS EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYR RAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNT VYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQG

TLVTVSSA pp 581 65 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTVSSYAMGWF

RQAPGKEREFVAGISRSAERTYYVDSLKGRFTISRDNSK NTVYLQMNSLRPEDTALYYCAADLDPNRIFSREEYAYW GQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASG FTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSV KGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLS RSSQGTLVTVSSA

Tabela B: Sequências de aminoácidos diversas: Nome e descrição curtas ("ID"), SEQ ID NOs: ("SEQ") e sequências de aminoácidos ("sequências") ID SEQ Sequência MMP13 de 66 MHPGVLAAFLFLSWTHCRALPLPSGGDEDDLSEEDLQF humano AERYLRSYYHPTNLAGILKENAASSMTERLREMQSFFGL

EVTGKLDDNTLDVMKKPRCGVPDVGEYNVFPRTLKWSK MNLTYRIVNYTPDMTHSEVEKAFKKAFKVWSDVTPLNFT RLHDGIADIMISFGIKEHGDFYPFDGPSGLLAHAFPPGPN YGGDAHFDDDETWTSSSKGYNLFLVAAHEFGHSLGLDH SKDPGALMFPIYTYTGKSHFMLPDDDVQGIQSLYGPGD EDPNPKHPKTPDKCDPSLSLDAITSLRGETMIFKDRFFW RLHPQQVDAELFLTKSFWPELPNRIDAAYEHPSHDLIFIF RGRKFWALNGYDILEGYPKKISELGLPKEVKKISAAVHFE DTGKTLLFSGNQVWRYDDTNHIMDKDYPRLIEEDFPGIG DKVDAVYEKNGYIYFFNGPIQFEYSIWSNRIVRVMPANSI LWC

ADAMTS5 67 MLLGWASLLLCAFRLPLAAVGPAATPAQDKAGQPPTAA de humano AAAQPRRRQGEEVQERAEPPGHPHPLAQRRRSKGLVQ

NIDQLYSGGGKVGYLVYAGGRRFLLDLERDGSVGIAGFV PAGGGTSAPWRHRSHCFYRGTVDGSPRSLAVFDLCGG LDGFFAVKHARYTLKPLLRGPWAEEEKGRVYGDGSARI LHVYTREGFSFEALPPRASCETPASTPEAHEHAPAHSNP SGRAALASQLLDQSALSPAGGSGPQTWWRRRRRSISR ARQVELLLVADASMARLYGRGLQHYLLTLASIANRLYSH ASIENHIRLAVVKVVVLGDKDKSLEVSKNAATTLKNFCK WQHQHNQLGDDHEEHYDAAILFTREDLCGHHSCDTLG MADVGTICSPERSCAVIEDDGLHAAFTVAHEIGHLLGLSH DDSKFCEETFGSTEDKRLMSSILTSIDASKPWSKCTSATI TEFLDDGHGNCLLDLPRKQILGPEELPGQTYDATQQCNL TFGPEYSVCPGMDVCARLWCAVVRQGQMVCLTKKLPA VEGTPCGKGRICLQGKCVDKTKKKYYSTSSHGNWGSW GSWGQCSRSCGGGVQFAYRHCNNPAPRNNGRYCTGK RAIYRSCSLMPCPPNGKSFRHEQCEAKNGYQSDAKGVK TFVEWVPKYAGVLPADVCKLTCRAKGTGYYVVFSPKVT DGTECRLYSNSVCVRGKCVRTGCDGIIGSKLQYDKCGV CGGDNSSCTKIVGTFNKKSKGYTDVVRIPEGATHIKVRQ FKAKDQTRFTAYLALKKKNGEYLINGKYMISTSETIIDING TVMNYSGWSHRDDFLHGMGYSATKEILIVQILATDPTKP LDVRYSFFVPKKSTPKVNSVTSHGSNKVGSHTSQPQWV TGPWLACSRTCDTGWHTRTVQCQDGNRKLAKGCPLSQ RPSAFKQCLLKKC

Aggrecan 68 MTTLLWVFVTLRVITAAVTVETSDHDNSLSVSIPQPSPLR de humano VLLGTSLTIPCYFIDPMHPVTTAPSTAPLAPRIKWSRVSK

EKEVVLLVATEGRVRVNSAYQDKVSLPNYPAIPSDATLE VQSLRSNDSGVYRCEVMHGIEDSEATLEVVVKGIVFHYR AISTRYTLDFDRAQRACLQNSAIIATPEQLQAAYEDGFHQ CDAGWLADQTVRYPIHTPREGCYGDKDEFPGVRTYGIR DTNETYDVYCFAEEMEGEVFYATSPEKFTFQEAANECR RLGARLATTGHVYLAWQAGMDMCSAGWLADRSVRYPI SKARPNCGGNLLGVRTVYVHANQTGYPDPSSRYDAICY TGEDFVDIPENFFGVGGEEDITVQTVTWPDMELPLPRNI TEGEARGSVILTVKPIFEVSPSPLEPEEPFTFAPEIGATAF AEVENETGEATRPWGFPTPGLGPATAFTSEDLVVQVTA VPGQPHLPGGVVFHYRPGPTRYSLTFEEAQQACPGTG AVIASPEQLQAAYEAGYEQCDAGWLRDQTVRYPIVSPR TPCVGDKDSSPGVRTYGVRPSTETYDVYCFVDRLEGEV FFATRLEQFTFQEALEFCESHNATATTGQLYAAWSRGL DKCYAGWLADGSLRYPIVTPRPACGGDKPGVRTVYLYP NQTGLPDPLSRHHAFCFRGISAVPSPGEEEGGTPTSPS GVEEWIVTQVVPGVAAVPVEEETTAVPSGETTAILEFTTE PENQTEWEPAYTPVGTSPLPGILPTWPPTGAETEESTE GPSATEVPSASEEPSPSEVPFPSEEPSPSEEPFPSVRPF PSVELFPSEEPFPSKEPSPSEEPSASEEPYTPSPPEPSW TELPSSGEESGAPDVSGDFTGSGDVSGHLDFSGQLSG DRASGLPSGDLDSSGLTSTVGSGLTVESGLPSGDEERIE WPSTPTVGELPSGAEILEGSASGVGDLSGLPSGEVLETS ASGVGDLSGLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLETTA PGVEDISGLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLETTAP GVEDISGLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLETAAPG VEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGV EDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVE DISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDI SGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDIS GLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISG LPSGEVLETTAPGVEEISGLPSGEVLETTAPGVDEISGLP SGEVLETTAPGVEEISGLPSGEVLETSTSAVGDLSGLPS GGEVLEISVSGVEDISGLPSGEVVETSASGIEDVSELPSG EGLETSASGVEDLSRLPSGEEVLEISASGFGDLSGVPSG GEGLETSASEVGTDLSGLPSGREGLETSASGAEDLSGL PSGKEDLVGSASGDLDLGKLPSGTLGSGQAPETSGLPS GFSGEYSGVDLGSGPPSGLPDFSGLPSGFPTVSLVDST LVEVVTASTASELEGRGTIGISGAGEISGLPSSELDISGR ASGLPSGTELSGQASGSPDVSGEIPGLFGVSGQPSGFP DTSGETSGVTELSGLSSGQPGVSGEASGVLYGTSQPFG ITDLSGETSGVPDLSGQPSGLPGFSGATSGVPDLVSGTT SGSGESSGITFVDTSLVEVAPTTFKEEEGLGSVELSGLP SGEADLSGKSGMVDVSGQFSGTVDSSGFTSQTPEFSG LPSGIAEVSGESSRAEIGSSLPSGAYYGSGTPSSFPTVS LVDRTLVESVTQAPTAQEAGEGPSGILELSGAHSGAPD MSGEHSGFLDLSGLQSGLIEPSGEPPGTPYFSGDFASTT NVSGESSVAMGTSGEASGLPEVTLITSEFVEGVTEPTIS QELGQRPPVTHTPQLFESSGKVSTAGDISGATPVLPGS GVEVSSVPESSSETSAYPEAGFGASAAPEASREDSGSP DLSETTSAFHEANLERSSGLGVSGSTLTFQEGEASAAPE VSGESTTTSDVGTEAPGLPSATPTASGDRTEISGDLSGH TSQLGVVISTSIPESEWTQQTQRPAETHLEIESSSLLYSG EETHTVETATSPTDASIPASPEWKRESESTAAAPARSCA EEPCGAGTCKETEGHVICLCPPGYTGEHCNIDQEVCEE GWNKYQGHCYRHFPDRETWVDAERRCREQQSHLSSIV TPEEQEFVNNNAQDYQWIGLNDRTIEGDFRWSDGHPM QFENWRPNQPDNFFAAGEDCVVMIWHEKGEWNDVPC NYHLPFTCKKGTVACGEPPVVEHARTFGQKKDRYEINSL VRYQCTEGFVQRHMPTIRCQPSGHWEEPRITCTDATTY KRRLQKRSSRHPRRSRPSTAH

[430] Tabela C: Várias sequências do Ligante ("ID" refere-se à SEQ ID NO, conforme aqui utilizado) Nome ID Sequência de aminoácido A3 24 AAA ligante 5GS 25 GGGGS ligante 7GS 26 SGGSGGS ligante 8GS 27 GGGGGGGS ligante 9GS 28 GGGGSGGGS ligante 10GS 29 GGGGSGGGGS ligante 15GS 30 GGGGSGGGGSGGGGS ligante 18GS 31 GGGGSGGGGSGGGGGGGS ligante 20GS 32 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ligante 25GS 33 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ligante 30GS 34 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ligante 35GS 35 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ligante 40GS 36 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS dobradiça G1 37 EPKSCDKTHTCPPCP dobradça 9GS- 38 GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP G1 Região de 39 EPKTPKPQPAAA dobradiça longa superior de Lhama dobradiça G3 40 ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPR

CPEPKSCDTPPPCPRCP

Tabela A-2: Sequências para CDRs e estruturas, mais combinações preferidas conforme fornecidas na fórmula I, nomeadamente FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (os seguintes termos: "ID" refere-se à SEQ ID NO) ID Nanocorpo ID FR1 ID CDR1 ID FR2 ID CDR2 ID FR3 ID CDR3 ID FR4 2 62C02 7 EVQLVESGGG 8 GFAFSAAY 9 WVRQAPGKG 10 SISDDGSKTY 11 YADSVKGRFTIS 12 GYGATTTRPG 13 WGQGTLVTV MMP13 VVQPGGSLRL MS LEWVS RDNSKNTVYLQ RY SS

SCAAS MNSLRPEDTAL

YYCNT 3 02F03 7 EVQLVESGGG 14 GRTVSSYA 15 WFRQAPGKE 16 GISRSAERTY 17 YVDSLKGRFTIS 18 DLDPNRIFSR 13 WGQGTLVTV ATS5 VVQPGGSLRL MG REFVA RDNSKNTVYLQ EEYAY SS

SCAAS MNSLRPEDTAL 151/153

YYCAA 4 114F08 7 EVQLVESGGG 19 GSTFIINVV 20 WYRRAPGKQ 21 TISSGGNAN 22 YVDSVRGRFTIS 23 PTTHYGGVYY 13 WGQGTLVTV Aggrecan- VVQPGGSLRL R RELVA RDNSKNTVYLQ GPY SS

CAP SCAAS MNSLRPEDTAL YYCNV

Tabela D: Sequências ISVD de ligação à albumina sérica ("ID" refere- se à SEQ ID NO, conforme aqui utilizado), incluindo as sequências CDR Nome ID Sequência de aminoácido Alb8 44 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQA

PGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ

MNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS Alb23 45 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQA

PGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ

MNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS Alb129 46 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQA

PGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ

MNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA Alb132 47 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQA

PGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ

MNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA Alb11 48 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQA

PGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ

MNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS Alb11 49 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQA (S112K)-A PGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ

MNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSSA Alb82 50 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQA

PGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ

MNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS Alb82-A 51 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQA

PGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ

MNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA Alb82-AA 52 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQA

PGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ

MNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAA Alb82- 53 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQA

AAA PGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ

MNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAAA Alb82-G 54 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQA

PGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ

MNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSG Alb82-GG 55 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQA

PGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ

MNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGG Alb82- 56 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQA

GGG PGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ MNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGG

Alb92 57 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQA

PGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ

MNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS Alb223 58 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQA

PGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ

MNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA ALB 59 SFGMS CDR1 ALB 60 SISGSGSDTLYADSVKG CDR2 ALB 61 GGSLSR CDR3

Claims (30)

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que é escolhido do grupo que consiste em (a) polipeptídeo compreendendo pelo menos 2 domínios variáveis únicos de imunoglobulina (ISVD), nos quais um primeiro ISVD liga especificamente uma matriz metaloproteinase (MMP) e um segundo ISVD liga especificamente Aggrecan, e opcionalmente compreendendo um terceiro ISVD que liga especificamente Aggrecan; (b) polipeptídeo compreendendo pelo menos 2 ISVDs, nos quais um primeiro ISVD liga especificamente uma desintegrina A e Metaloproteinase com motivos de trombospondina (ADAMTS) e um segundo ISVD liga especificamente Aggrecan, e opcionalmente compreendendo um terceiro ISVD que liga especificamente Aggrecan; e (c) polipeptídeo compreendendo pelo menos 3 ISVDs, nos quais um primeiro ISVD liga especificamente uma matriz metaloproteinase (MMP), um segundo ISVD liga especificamente ADAMTS e um terceiro ISVD liga especificamente Aggrecan, e opcionalmente compreendendo um quarto ISVD que liga especificamente Aggrecan.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um primeiro ISVD liga especificamente uma MMP, um segundo ISVD liga especificamente uma ADAMTS, um terceiro ISVD liga especificamente Aggrecan e um quarto ISVD liga especificamente Aggrecan.

3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida MMP é MMP13.

4. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido ISVD que liga MMP13 especificamente compreende 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3 respectivamente), nas quais (i) CDR1 é SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de aminoácido que possui 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 8; (ii) CDR2 é SEQ ID NO: 10 ou uma sequência de aminoácido que possui 1, 2 ou 3 diferenças de aminoácidos com a SEQ ID NO: 10; e (iii) CDR3 é SEQ ID NO: 12 ou uma sequência de aminoácido que possui 1, 2 ou 3 diferenças de aminoácidos com a SEQ ID NO: 12.

5. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que CDR1 é SEQ ID NO: 8, CDR2 é SEQ ID NO: 10 e CDR3 é SEQ ID NO: 12.

6. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o referido ISVD que liga especificamente MMP13 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 2.

7. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a referida ADAMTS é ADAMTS5.

8. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido ISVD que liga ADAMTS5 especificamente compreende 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente), nas quais (i) CDR1 é SEQ ID NO: 14 [GRTVSSYAMG] ou uma sequência de aminoácido que possui 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 14; (ii) CDR2 é SEQ ID NO: 16 [GISRSAERTY] ou uma sequência de aminoácido que possui 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 16;

e (iii) CDR3 é SEQ ID NO: 18 [DLDPNRIFSREEYAY] ou uma sequência de aminoácido que possui 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 18.

9. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que CDR1 é SEQ ID NO: 14, CDR2 é SEQ ID NO: 16 e CDR3 é SEQ ID NO: 18.

10. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o referido ISVD que especificamente liga ADAMTS5 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 3.

11. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido ISVD que liga especificamente Aggrecan compreende 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente), nas quais (i) CDR1 é SEQ ID NO: 19 ou uma sequência de aminoácido que possui 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 19; (ii) CDR2 é SEQ ID NO: 21 ou uma sequência de aminoácido que possui 1, 2 ou 3 diferenças de aminoácidos com a SEQ ID NO: 21; e (iii) CDR3 é SEQ ID NO: 23 ou uma sequência de aminoácido que possui 1, 2 ou 3 diferença (s) de aminoácidos com a SEQ ID NO: 23.

12. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que CDR1 é SEQ ID NO: 19, CDR2 é SEQ ID NO: 21 e CDR3 é SEQ ID NO: 23.

13. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o referido ISVD que liga especificamente Aggrecan compreende ou consiste em SEQ ID NO: 4.

14. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que os referidos ISVDs estão ligados entre si por meio de um ligante.

15. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o referido ligante é escolhido do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 24 a 40, preferivelmente SEQ ID NO: 28 [9GS] ou SEQ ID NO: 35 [35GS]

16. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro ISVD liga especificamente MMP13, o segundo ISVD liga especificamente ADAMTS5, o referido terceiro ISVD liga especificamente Aggrecan e o referido quarto ISVD liga especificamente Aggrecan e em que o referido polipeptídeo preferivelmente compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1 ou 62 ou compreende ou consiste em um polipeptídeo que possui pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 62.

17. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro ISVD liga especificamente MMP13, o referido segundo ISVD liga especificamente Aggrecan e o referido terceiro ISVD liga especificamente Aggrecan, de preferência compreende ou consiste em SEQ ID NO: 5 ou 63.

18. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro ISVD liga especificamente ADAMTS5, o segundo ISVD liga especificamente Aggrecan e o referido terceiro ISVD liga especificamente Aggrecan, de preferência compreende ou consiste em SEQ ID NO: 6 ou 64.

19. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que (i) o referido ISVD que especificamente liga MMP13 consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FR4, respectivamente) e as referidas 3 regiões determinantes de complementaridade CDR1 a CDR3; e/ou

(ii) o referido ISVD que especificamente liga ADAMTS5 consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FR4, respectivamente) e as referidas 3 regiões determinantes da complementaridade CDR1 a CDR3; e/ou (iii) o referido ISVD que liga especificamente Aggrecan consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FR4, respectivamente) e nas referidas 3 regiões determinantes de complementaridade CDR1 a CDR3.

20. Construto que compreende ou consiste essencialmente em um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, e caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ou mais outros grupos, resíduos, porções ou unidades de ligação, opcionalmente ligados por meio de um ou mais ligantes peptídicos.

21. Ácido nucleico caracterizado pelo dato de que codifica um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 ou um construto como definido na reivindicação 20.

22. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico como definido na reivindicação 21.

23. Hospedeiro ou célula hospedeira caracterizados pelo fato de que compreendem um ácido nucleico como definido na reivindicação 21, ou um vetor de expressão como definido na reivindicação22.

24. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 ou um construto como definido na reivindicação20, ou um ácido nucleico como definido na reivindicação 21.

25. Método para produzir um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende pelo menos as etapas de: a) expressar, em uma célula hospedeira, organismo hospedeiro ou sistema de expressão adequado, um ácido nucleico como definido na reivindicação 21; opcionalmente seguido por b) isolar e/ou purificar o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.

26. Composição de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que é uma composição farmacêutica.

27. Composição, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável agente, diluente ou excipiente e/ou adjuvante e, opcionalmente, compreende um ou mais polipeptídeos e/ou compostos farmaceuticamente ativos.

28. Composição de acordo com a reivindicação 26 ou 27, polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19 ou construto de acordo com a reivindicação 20, caracterizados pelo fato de que são para uso como um medicamento.

29. Composição, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19 ou construto de acordo com a reivindicação 20, caracterizados pelo fato de que ssão para uso na prevenção de um sintoma ou tratamento de artropatias e condrodistrofias, doenças artríticas, tais como osteoartrite, artrite reumatoide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura ou descolamento traumático, acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafisária, hérnia de disco vertebral, doença de degeneração do disco lombar, doença articular degenerativa, policondrite recidivante, osteocondrite dissecante, agrecanopatias, NASH, periodontite crônica e aneurisma da aorta abddominal.

30. Método para prevenir um sintoma ou tratar uma doença ou distúrbio em um indivíduo, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, o construto como definido na reivindicação 20 ou a composição como definida na reivindicação 26 ou 27 ao referido indivíduo, em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir um sintoma de artropatias e condrodistrofias, doença artrítica, tais como osteoartrite, artrite reumatoide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura ou descolamento traumático, acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafisária, hérnia de disco espinhal, doença degenerativa do disco lombar, doença articular degenerativa, policondrite recidivante, osteocondrite dissecante, agrecanopatias, NASH, periodontite crônica e aneurismas da aorta abdominal.