CN110997717A - 结合adamts5、mmp13和聚蛋白聚糖的多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合聚蛋白聚糖以及ADAMTS5和/或MMP13的多肽，更具体而言，涉及包含或基本上由结合聚蛋白聚糖的免疫球蛋白以及结合ADAMTS5的免疫球蛋白和/或结合MMP13的免疫球蛋白组成的多肽(在本文中也分别称为“本发明的多肽”和“本发明的免疫球蛋白”)。本发明还涉及包含此类免疫球蛋白如免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)或多肽以及编码此类免疫球蛋白或多肽的核酸(在本文中也称为“本发明的核酸”)的构建体；用于制备此类免疫球蛋白、多肽和构建体的方法；表达或能够表达此类免疫球蛋白或多肽的宿主细胞；包含此类免疫球蛋白、多肽、构建体、核酸和/或宿主细胞的组合物，并特别是药物组合物；以及免疫球蛋白、多肽、构建体、核酸、宿主细胞和/或组合物的用途，特别是用于预防和/或治疗目的，例如本文提及的预防和/或治疗目的。通过本文的进一步描述，本发明的其他方面、实施方案、优点和应用将变得清楚。

Description

结合ADAMTS5、MMP13和聚蛋白聚糖的多肽
1发明领域
本发明涉及结合聚蛋白聚糖以及ADAMTS5和/或MMP13的多肽，并且更特别地涉及包含或基本上由结合聚蛋白聚糖的免疫球蛋白以及结合ADAMTS5的免疫球蛋白和/或结合MMP13的免疫球蛋白组成的多肽(在本文中也分别称为“本发明的多肽”和“本发明的免疫球蛋白”)。本发明还涉及包含这样的免疫球蛋白例如免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)或多肽以及编码这样的免疫球蛋白或多肽的核酸(在本文中也称为“本发明的核酸”)的构建体；用于制备这样的免疫球蛋白、多肽和构建体的方法；表达或能够表达这样的免疫球蛋白或多肽的宿主细胞；包含这样的免疫球蛋白、多肽、构建体、核酸和/或宿主细胞的组合物，并且尤其是药物组合物；和免疫球蛋白、多肽、构建体、核酸、宿主细胞和/或组合物的用途，特别是用于预防和/或治疗目的，例如本文所述的预防和/或治疗目的。通过本文的进一步描述，本发明的其他方面、实施方案、优点和应用将变得清楚。
2发明背景
骨关节炎(OA)是全世界最常见的致残原因之一。它影响了三千万美国人并且是最常见的关节病症。预计到2025年，该病将影响超过20％的美国人口。该疾病是非系统性疾病并通常仅限于少量关节。然而，该疾病可以发生在所有关节，最常见的是膝盖、臀部、手和脊椎。OA的特征在于关节软骨(覆盖骨骼的软骨)的逐渐侵蚀，导致慢性疼痛和残疾。最终，该疾病导致关节软骨的完全破坏，下面的骨骼的硬化，骨赘的形成等，所有这些都导致丧失运动和疼痛。骨关节炎可以定义为多组病况，其特征在于关节症状，关节软骨缺损而产生的体征以及包括骨骼、肌腱和肌肉在内的相邻组织中的变化的组合。OA最突出的症状是疼痛并且这最通常是患者寻求医疗帮助的原因。不能治愈OA，即现有的治疗不抑制OA关节的结构性退化。疾病管理最好仅限于姑息治疗，而对于解决疾病发展的根本原因却作用不大。
人们强烈寻求疾病修饰抗骨关节炎药剂(DMOAD)，其可以被定义为抑制结构性疾病进展并且理想地还改善症状和/或功能的药剂。在老龄化人口的这种慢性疾病中，可能需要长期开具DMOAD，因此需要在具有多合并症和潜在的药剂与药剂相互作用的目标人群中获得出色的安全性数据。
尽管疾病的起始可以是多因素的，但软骨破坏似乎是细胞外基质(ECM)的不受控制的蛋白水解破坏的结果。关节软骨中最丰富的ECM组分是胶原蛋白(最主要的胶原蛋白II)和蛋白聚糖，主要是聚蛋白聚糖(Kiani等，2002Cell Research 12:19-32)。
聚蛋白聚糖在关节软骨的正常运作中很重要，因为它提供了水合的凝胶结构，赋予了软骨以承重特性。聚蛋白聚糖是由软骨细胞表达的大的多模块分子(2317个氨基酸)。它的核心蛋白由三个球状结构域(G1、G2和G3)和一个位于G2和G3之间用于糖胺聚糖链附着的大延伸区域组成。该延伸区域包含两个结构域，一个结构域被硫酸角质素链取代(KS结构域)并且一个结构域被硫酸软骨素链取代(CS结构域)。CS结构域具有附着到其上的100-150个糖胺聚糖(GAG)链。聚蛋白聚糖与透明质酸形成大复合物，其中50-100个聚蛋白聚糖分子通过G1结构域和Link Protein与一个透明质酸分子相互作用。摄入水后(由于GAG含量)，这些复合物形成抗压缩的可逆变形凝胶。关节软骨的结构、液体滞留和功能与聚蛋白聚糖的基质含量以及与完整核心蛋白结合的硫酸软骨素的量有关。在结构上，OA的特征在于聚蛋白聚糖的降解，逐渐释放结构域G3和G2(导致软骨“放气”)并最终释放G1结构域和降解胶原蛋白，不可逆地破坏软骨结构。OA发病机理中最重要的聚蛋白聚糖裂解位点位于序列TEGE373↓374ARGS。该裂解位点位于聚蛋白聚糖的球间结构域(IGD)中，位于G1和G2结构域之间。
识别374ARGS新表位的抗体导致发现聚蛋白聚糖-1(它被证明是ADAMTS4)和聚蛋白聚糖-2(它是ADAMTS5)。随后，其他相关的ADAMTS酶，包括ADAMTS1、-8、-9、-15和-20，被证明具有聚蛋白聚糖酶活性。ADAMTS16和18也是弱的聚蛋白聚糖酶。多种证据链表明，ADAMTS5是参与骨关节炎发病机制的主要酶。在人软骨外植体和软骨细胞中，ADAMTS5的敲低减弱了聚蛋白聚糖的分解，表明该酶可能与人体组织有关。细胞因子(如白介素-1和抑瘤素-M)增强该酶的表达，这些因子引起组织中聚蛋白聚糖的分解。在OA患者的滑膜液和血清中检测到ADAMTS5生成的聚蛋白聚糖片段(Germaschewski等人,2014Osteoarthritis Cartilage22:690-697)。几家制药公司一直在开发DMOAD。据称这些化合物中的某些对ADAMTS5具有特异性，而其他化合物也对其他ADAMTS成员或甚至对基质金属蛋白酶也有作用。这些针对MMP的交叉抑制作用尤其被认为是肌肉骨骼综合征(MSS)的原因，这是由广谱抑制剂引起的副作用并且涉及关节痛、肌痛、关节僵硬和肌腱炎(Santamaria等人,2015Biochem J 471:391-401)。这些副作用是停止进一步开发的原因。Pfizer聚蛋白聚糖酶抑制剂AGG-523已在OA的I期临床试验中使用，但没有得到进一步的应用。其他小分子ADAMTS抑制剂也没有作为潜在的DMOAD进入任何进一步的临床开发(Bondeson等人,2015Drug Discovery 10:5-14)。Galapagos/Servier ADAMTS5抑制剂GLPG1972最近完成了I期试验，但其功效尚待确定。实际上，尽管最近有许多专门研究DMOAD的临床试验，但至今尚未批准此类治疗方法(ElBakali等人,2014Future Medicinal Chemistry(Review)6:1399)。针对ADAMTS5间隔子结构域的Rottapharm单克隆抗体(mAb)CRb0017的研究表明，在小鼠中，该mAb的关节内施用以剂量依赖性方式显著阻止了疾病的发展(Chiusaroli等人,2013OsteoarthritisCartilage 21:1807)。但是，没有与全身施用的比较，也没有评估mAb从滑膜间隙漏出的程度。另一项研究对小鼠进行了mAb 12F4的全身施用，证明了结构性疾病的改变和疼痛相关行为的缓解(Miller等人,2014Osteoarthritis Cartilage 22iii，S35)。但是，在食蟹猴中单次施用mAb 12F4引起局灶性出血，剂量依赖性平均动脉压升高和心脏电导异常(更具体地讲，心电图上的ST升高和室性心律不齐)表明心脏缺血，这种现象持续到单一剂量施用后8个月(Larkin等人,2014Osteoarthritis Cartilage 22iii,S483)。同样在这种情况下，副作用终止了mAb 12F4的进一步临床开发。
除了ADMATS酶，有令人信服的证据表明基质金属蛋白酶(MMP)在与OA相关的组织破坏中起主要作用。MMP是锌依赖性内肽酶的一个家族，参与细胞外基质的降解和组织重塑。MMP家族成员约有28个，可分为多个亚组，包括胶原蛋白酶、明胶酶、基质溶解素(stromelysin)、膜类型MMP，基质分解素(matrilysin)、釉质溶解素(enamelysin)等。包含MMP1、MMP8、MMP13和MMP18的胶原蛋白酶能够将三螺旋原纤维胶原蛋白降解为独特的3/4和1/4片段。此外，MMP14也被证明可以裂解纤维状胶原蛋白，并且有证据表明MMP2也能够进行胶原蛋白溶解。长期以来，MMP被认为是治疗OA的有吸引力的治疗靶标。但是，如上所述，由于疼痛、关节僵硬的副作用即MSS，用于治疗关节炎而开发的广谱MMP抑制剂在临床试验中失败了。
难以将药剂靶向关节软骨进一步阻碍了关节的治疗干预。由于关节软骨是无血管和无淋巴组织，因此传统的药剂递送途径(口服、静脉内、肌肉内)最终取决于通过被动扩散将药剂从滑膜毛细血管向软骨的透滑膜转移。这促进了药物的关节内(IA)递送的发展。尽管IA递送规避了被动扩散的问题，但IA递送治疗性蛋白质受到其从关节间隙的快速清除和软骨内缺乏滞留的限制。值得注意的，药剂在关节中的滑膜停留时间通常少于24h(Edwards2011Vet J 190:15-21；Larsen et al.,2008J Pham Sci 97:4622-4654)。由于大多数IA注射药剂的快速清除，需要频繁注射以维持有效浓度(Owen等人,1994 Br.J.ClinPharmacol.38:349-355)。然而，由于疼痛和不适，不希望经常注射IA，它们可能引起挑战性的患者依从性，以及引入关节感染的风险。
仍然需要有效的DMOAD。
3发明概述
本发明的目的是提供与现有技术的氨基酸序列和抗体相比，除其他有利特性(例如，改进的易制备性、良好的稳定性和/或降低的商品成本)之外，具有改善的预防、治疗和/或药理学特性的抗OA的多肽和构建体。特别地，本发明旨在提供抑制ADAMTS5和/或MMP13，同时在关节中保留延长的时间段的多肽。
认识到骨关节炎的发展并不均匀，病变的发展速度可能会变化很大——在极端情况下，骨关节炎可能会保持稳定数十年，而在其他患者中，OA进展非常迅速，从而在几个月中完全破坏了软骨——，本发明人假设(但是不受理论的束缚)这种可变的疾病进展模式可能是由于多种蛋白酶的不均匀活性模式引起的。
在通过创造性和非常规的筛选、表征和组合策略，从不同家族和软骨锚定部分鉴定有效蛋白酶抑制剂之后，本发明人开发了其中结合了多种功能的组合。工程改造了两个双重特异性多肽，其包含结合聚蛋白聚糖的软骨锚定部分(CAP)和ADAMTS5抑制剂或MMP13抑制剂，以及包含ADAMTS5抑制剂、MMP13抑制剂和CAP结合物的三特异性多肽。
已经证明，即使参照分子(Wyeth和Pfizer)不起作用，本发明的多肽在代表不同OA状态的多种模型系统中仍然保持有效。
本发明人能够鉴定和重新工程化即使与其他两个部分结合仍保持有效的CAP结合物。还证明了本发明多肽的CAP部分导致在关节中的保留增加。
还证明了本发明的多肽在关节中保持稳定。
因此，本发明的多肽一方面将在OA患者中广泛使用，而另一方面，将减轻(IA)施用时间表的负担。另外，通过将多个部分组合在一个分子中，可以增加有效剂量。
因此，本发明涉及多肽，其选自(a)包含至少2个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)的多肽，其中第一ISVD特异性结合基质金属蛋白酶(MMP)并且第二ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，并且所述多肽可选地包含特异性结合聚蛋白聚糖的第三ISVD；(b)包含至少2个ISVD的多肽，其中第一ISVD特异性结合具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶(ADAMTS)并且第二ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，并且所述多肽可选地包含特异性结合聚蛋白聚糖的第三ISVD；和(c)包含至少3个ISVD的多肽，其中第一ISVD特异性结合基质金属蛋白酶(MMP)，第二ISVD特异性结合ADAMTS并且第三ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，并且所述多肽可选地包含特异性结合聚蛋白聚糖的第四ISVD。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中第一ISVD特异性结合MMP，第二ISVD特异性结合ADAMTS，第三ISVD特异性结合聚蛋白聚糖并且第四ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，优选地所述MMP是MMP13。
在一方面，本发明提供了本文所述的ISVD，其中所述ISVD具有结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中CDR1、CDR2和CDR3如本文所定义，并且FR1、FR2、FR3和FR4是框架序列。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述特异性结合MMP13的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中(i)(a)CDR1是SEQ ID NO：8；和(b)与SEQ ID NO：8具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；(ii)(c)CDR2是SEQ ID NO：10；和(d)与SEQ ID NO：10具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；和(iii)(e)CDR3是SEQ ID NO：12和(f)与SEQ ID NO：12具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；优选地其中CDR1是SEQ ID NO：8，CDR2是SEQ ID NO：10并且CDR3是SEQ ID NO：12；甚至更优选地其中所述特异性结合MMP13的ISVD由SEQ ID NO：2表示。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述ADAMTS是ADAMTS5，优选地，其中所述特异性结合ADAMTS5的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中(i)(a)CDR1是SEQ ID NO：14[GRTVSSYAMG]；和(b)与SEQ IDNO：14具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；(ii)(c)CDR2是SEQ ID NO：16[GISRSAERTY]；和(d)与SEQ ID NO：16具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；和(iii)(e)CDR3是SEQ ID NO：18[DLDPNRIFSREEYAY]；和(f)与SEQ ID NO：18具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；甚至更优选地，其中CDR1是SEQ ID NO：14，CDR2是SEQ ID NO：16并且CDR3是SEQ ID NO：18；和甚至更优选地，其中所述特异性结合ADAMTS5的ISVD由SEQ ID NO：3表示。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中(i)(a)CDR1是SEQ ID NO：19；和(b)与SEQ ID NO：19具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；(ii)(c)CDR2是SEQ ID NO：21；和(d)与SEQ ID NO：21具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；和(iii)(e)CDR3是SEQ ID NO：23；和(f)与SEQ ID NO：23具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；更优选地，其中CDR1是SEQ ID NO：19，CDR2是SEQ ID NO：21并且CDR3是SEQ ID NO：23；甚至更优选地，其中所述特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD由SEQ ID NO：4表示。
在本发明所有方面的优选实施方案中，根据本发明的免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)优选地基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3组成，如在本文上下文中所述。优选的框架序列例如在下表A-2中公开并且可以用于本发明的ISVD中。优选地，表A-2中描述的CDR与相同ISVD构建体的各自框架区匹配。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述ISVD通过接头彼此连接，优选地所述接头选自SEQ ID NO：24至40，优选地SEQ ID NO：28[9GS]或SEQ ID NO：35[35GS]。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISVD特异性结合MMP13，所述第二ISVD特异性结合ADAMTS5，所述第三ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，并且所述第四ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，优选地由SEQ ID NO：1或62表示。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISVD特异性结合MMP13，所述第二ISVD特异性结合聚蛋白聚糖并且所述第三ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，优选地由SEQ ID NO：5或63表示。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISVD特异性结合ADAMTS5，所述第二ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，并且所述第三ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，优选地由SEQ ID NO：6或64表示。
在一方面，本发明涉及构建体，其包含或基本上由本文所述的多肽组成，其还包含一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元，可选地经由一个或多个肽接头连接。
在一方面，本发明涉及核酸，其编码本文所述的多肽，或本文所述的构建体。
在一方面，本发明涉及表达载体，其包含本文所述的核酸。
在一方面，本发明涉及宿主或宿主细胞，其包含本文所述的核酸，或本文所述的表达载体。
在一方面，本发明涉及组合物，其包含本文所述的多肽、本文所述的构建体或本文所述的核酸。
在一方面，本发明涉及产生本文所述的多肽的方法，所述方法至少包括以下步骤：a)在合适的宿主细胞、宿主生物或合适的表达系统中表达本文所述的核酸；可选地随后b)分离和/或纯化本文所述的多肽。
在一方面，本发明涉及如本文所述的组合物，其是药物组合物，优选地所述组合物还包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且可选地包含一种或多种其他药学上活性的多肽和/或化合物。
在一方面，本发明涉及如本文所述的组合物、本文所述的多肽或本文所述的构建体，用作药物。
在一方面，本发明涉及如本文所述的组合物、本文所述的多肽或本文所述的构建体，用于预防以下的症状或治疗以下：关节病和软骨营养不良，关节炎疾病，例如骨关节炎，类风湿性关节炎，痛风性关节炎，银屑病关节炎，外伤性破裂或脱离，软骨发育不全，肋软骨炎，脊椎干骺端发育异常，椎间盘突出症，腰椎间盘退变疾病，退变性关节疾病，复发性多发性软骨炎，剥离性骨软骨炎、聚蛋白聚糖病变、NASH，慢性牙周炎和腹主动脉瘤。
在一方面，本发明涉及预防个体的疾病或病症的症状或者治疗个体的疾病或病症的方法，所述方法包括以有效治疗或预防关节病和软骨营养不良，关节炎疾病，例如骨关节炎，类风湿性关节炎，痛风性关节炎，银屑病关节炎，外伤性破裂或脱离，软骨发育不全，肋软骨炎，脊椎干骺端发育异常，椎间盘突出症，腰椎间盘退变疾病，退变性关节疾病，复发性多发性软骨炎，剥离性骨软骨炎、聚蛋白聚糖病变、NASH，慢性牙周炎和腹主动脉瘤的症状的量，施用本文所述的多肽、本文所述的构建体或本文所述的的组合物给所述个体。
根据本文的进一步公开，多肽和组合物的其他方面、优点、应用和用途将变得清楚。在本说明书的文本中引用了一些文件。无论是上文还是下文，本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)均通过引用将其全部并入本文。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于这样的公开。
4附图说明
图1：在基于FRET的酶活性测定法中，多肽949(“C010100949”，SEQ ID NO：1)对物种ADAMTS5的功能抑制。Vi：被抑制的酶反应的速度(进度曲线斜率)；V0：未被抑制的反应的速度。每个点代表技术上重复测量的平均值。误差线：技术上重复的标准偏差。该图是3个独立实验的代表。
图2：在基于FRET的酶活性测定法中，多肽949对人、食蟹猴和大鼠MMP13的功能抑制。左：多肽949(ALX-1011)对物种cdMMP13的抑制。右：对物种活化的proMMP13(多肽949被标示为C010100949)的抑制。Vi：被抑制的酶反应的速度(进度曲线斜率)，V0：未被抑制的反应的速度。Cd：催化结构域；pro：活化的pro-MMP13。每个点代表技术上重复测量的平均值。误差线：技术上重复的标准偏差。图是至少2个独立的实验的代表。
图3：多肽949(“NB949”)在牛软骨外植体测定法中的功效。与在这些条件下完全抑制IL-1α刺激的GAG释放(其设定为100％)的参考小分子聚蛋白聚糖酶抑制剂(AGG-523，Wyeth)相比，计算了功效，未诱导的软骨设定为0％。
图4：多肽949在人软骨外植体测定法中的功效。与在这些条件下完全抑制IL-1α刺激的GAG释放(其设定为100％)的参考小分子聚蛋白聚糖酶抑制剂(AGG-523，Wyeth)相比，计算了功效，未诱导的软骨设定为0％。
图5：在牛外植体测定法中多肽的CAP介导的软骨锚定作用。
图6：多肽949(“C010100949”或“MAC949”)抑制了共培养物中C2M(Col II降解＝结构)和C3M(Col III降解＝与症状相关)的释放。
图7：软骨保留：大鼠中不同时间点的局部纳米抗体构建体浓度。
图8：不同组中胫骨内侧实质性软骨退变宽度。
图9：内侧胫骨软骨退变宽度。
图10：走秀步态分析。
图11：在骨关节炎大鼠和健康大鼠中，每关节(右膝)一次关节内注射400μg纳米抗体构建物，血清浓度(以ng/ml为单位的平均浓度)对比多肽的首次剂量后的时间(h)。点代表健康动物中的个别浓度；三角形代表OA动物中的个别浓度；线代表平均浓度。
5详细说明
仍然需要安全有效的OA药物，特别是DMOAD。这些药物应符合多种且经常对立的需求，尤其是在打算采用广泛适用的格式时。这样的格式应当优选地在广泛的患者中有用。格式应当优选地是安全的，并且不会因频繁IA施用而引起感染。另外，格式应当优选地是患者友好的，例如允许方便的给药方案和施用途径，例如全身施用。例如，优选的在施用后不立即从循环中除去格式。然而，延长半衰期应当优选地不引入脱靶活性和副作用或限制功效。
本发明实现了这些需求中的至少一项。
基于非常规的筛选、表征和组合策略，本发明人令人惊讶地观察到免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)在体外和体内实验中表现异常优异。
此外，本发明人能够对ISVD进行重新工程改造以在缓解OA方面进一步优于竞品药剂。另外，还证明了本发明的ISVD比现有技术化合物明显更安全。
另外，发明人证明，组合包括MMP13抑制剂、ADAMTS5抑制剂和聚蛋白聚糖结合物的多种功能，与使用任何一种抑制剂相比都获得了甚至更好的效果。
本发明旨在提供了拮抗ADAMTS特别是ADAMTS5的ISVD和/或拮抗MMP13特别是MMP13的ISVD的组合，与CAP结合物(例如聚蛋白聚糖结合物)缀合，其与现有技术氨基酸序列和抗体相比具有改善的预防、治疗和/或药理学特性，包括更安全的特征。
因此，本发明涉及多肽，选自
(a)包含至少2个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)的多肽，其中第一ISVD特异性结合基质金属蛋白酶(MMP)并且第二ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，并且所述多肽可选地包含特异性结合聚蛋白聚糖的第三ISVD；
(b)包含至少2个ISVD的多肽，其中第一ISVD特异性结合具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶(ADAMTS)并且第二ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，并且所述多肽可选地包含特异性结合聚蛋白聚糖的第三ISVD；和
(c)包含至少3个ISVD的多肽，其中第一ISVD特异性结合MMP，第二ISVD特异性结合ADAMTS并且第三ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，并且所述多肽可选地包含特异性结合聚蛋白聚糖的第四ISVD。
除非另有说明或定义，否则所使用的所有术语具有其在本领域中的通常含义，这对本领域技术人员将是清楚的。参考例如标准手册，例如Sambrook等人(MolecularCloning:ALaboratory Manual(2nd Ed.)Vols.1-3,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)，F.Ausubel等人(Current protocols in molecular biology,GreenPublishing and Wiley Interscience,New York,1987)，Lewin(Genes II,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,1985)，Old等人(Principles of Gene Manipulation:AnIntroduction to Genetic Engineering(2nd edition)University of CaliforniaPress,Berkeley,CA,1981)；Roitt等人(Immunology(6th Ed.)Mosby/Elsevier,Edinburgh,2001)，Roitt等人(Roitt’s Essential Immunology(10th Ed.)Blackwell Publishing,UK,2001)，和Janeway等人(Immunobiology(6th Ed.)Garland Science Publishing/ChurchillLivingstone,New York,2005)，以及本文引用的一般背景技术。
除非另外指出，可以以本身已知的方式执行并且已经执行未具体描述的所有方法、步骤、技术和操作，对本领域技术人员将是清楚的。再次参考例如本文提到的标准手册和一般背景技术，以及其中引用的其他参考文献。以及例如以下综述Presta(Adv.DrugDeliv.Rev.58(5-6):640-56,2006)，Levin和Weiss(Mol.Biosyst.2(1):49-57,2006)，Irving等人(J.Immunol.Methods 248(1-2):31-45,2001)，Schmitz等人(Placenta21Suppl.A:S106-12,2000)，Gonzales等人(Tumour Biol.26(1):31-43,2005)，其描述了用于蛋白质工程改造的技术，例如亲和力成熟和用于改善蛋白质例如免疫球蛋白的特异性和其他所需特性的其他技术。
必须注意的是，除非上下文另外明确指出，否则本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。因此，例如，对“反应剂”的提及包括一个或多个这样的不同反应剂，并且对“该方法”的提及包括对本领域普通技术人员已知的可以修改或替代本文所述方法的等价步骤和方法的提及。
除非另有说明，否则一系列元件之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个元件。仅通过常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等价形式。这样的等价形式旨在涵盖在本发明中。
术语“和/或”在本文中无论在何处使用均包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元件的所有或任何其他组合”的含义。
本文所用的术语“约”或“大约”是指给定值或范围的20％以内，优选地15％以内，更优选地10％以内，并且最优选地5％以内。
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”之类的变体将被理解为暗示包括所述整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包括”可以用术语“包含”或“含有”代替，或者有时在本文中使用用术语“具有”代替。
如本文所用，术语“序列”(例如，诸如“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白质序列”之类的术语)通常应理解为包括相关的氨基酸序列以及编码该氨基酸序列的核酸或核苷酸序列，除非上下文要求更严格的解释，
根据上下文，氨基酸序列被解释为表示单个氨基酸或者两个或更多个氨基酸的无支链序列。核苷酸序列被解释为表示3个或更多个核苷酸的无支链序列。
氨基酸是天然存在的蛋白质中常见的那些L-氨基酸。氨基酸残基将根据标准的三个字母或一个字母的氨基酸代码表示。参考例如WO 08/020079的第48页上的表A-2。那些包含D-氨基酸的氨基酸序列不旨在被该定义所涵盖。包含翻译后修饰的氨基酸的任何氨基酸序列都可以描述为使用该表A-2中所示的符号最初翻译的带有修饰位置的氨基酸序列，修饰位置例如羟基化或糖基化，但是这些修饰不应在氨基酸序列中明确显示。可以被表示为序列修饰的键、交联和末端帽、非肽基键等的任何肽或蛋白质都被该定义所涵盖，都如本领域所知道的。
术语“蛋白质”、“肽”、“蛋白质/肽”和“多肽”在整个本公开内容中可互换使用，并且各自对于本公开内容具有相同的含义。每个术语是指由两个或更多个氨基酸的线性链组成的有机化合物。化合物可以具有十个或更多个氨基酸；二十五个或更多个氨基酸；五十个或更多个氨基酸；一百个或更多个氨基酸，两百个更多个氨基酸，并且甚至三百个或更多个氨基酸。技术人员将理解，尽管不存在区分多肽和蛋白质的氨基酸数目的本领域公认的临界点，但是多肽通常包含的氨基酸少于蛋白质；多肽可以通过化学合成或重组方法制备；并且蛋白质通常通过本领域已知的重组方法在体外或体内制备。按照惯例，多肽一级结构中的酰胺键的顺序按照所写氨基酸的顺序，其中多肽的胺末端(N末端)始终在左侧，而酸末端(C末端)在右侧。
核酸或氨基酸序列被认为是“(以)(基本上)分离的(形式)”-例如，与从中获得了该核酸或氨基酸序列的反应介质或培养基相比-当其已经与通常在所述来源和介质中与之附着的至少一种其他组分分离，其他组分例如另一种核酸、另一种蛋白质/多肽、另一种生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或次要组分。特别地，当核酸或氨基酸序列已经纯化了至少2倍，特别是至少10倍，更特别是至少100倍，并且最高达1000倍或更多时，则认为是“(基本上)分离的”。如使用合适的技术，例如合适的色谱技术，例如聚丙烯酰胺-凝胶电泳所确定的，“(基本上)分离的形式”的核酸或氨基酸优选地是基本上均质的。
当说核苷酸序列或氨基酸序列分别“包含”另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或“基本上由”另一个核苷酸序列或氨基酸序列“组成”时，这可以表示后一个核苷酸序列或氨基酸序列已分别并入第一个提及的核苷酸序列或氨基酸序列，但是更通常，这通常是指第一个提及的核苷酸序列或氨基酸序列在其序列内分别包含一段核苷酸或氨基酸残基，其具有与后一个序列分别具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列，而与实际上如何产生或获得第一个提及的序列无关(例如，可以通过本文所述的任何合适的方法)。通过非限制性实例，当说本发明的多肽包含免疫球蛋白单可变结构域(“ISVD”)时，这可能意味着所述免疫球蛋白单可变结构域序列已被并入本发明多肽的序列中，但是更通常地，这通常意味着本发明的多肽在其序列内包含免疫球蛋白单可变结构域的序列，而与如何产生或获得所述本发明的多肽无关。同样，当说核酸或核苷酸序列包含另一个核苷酸序列时，第一个提及的核酸或核苷酸序列优选地是这样的，使得当其被表达成表达产物(例如多肽)时，由后一个核苷酸序列编码的氨基酸序列形成所述表达产物的一部分(换句话说，后一个核苷酸序列与第一个提及的更大的核酸或核苷酸序列处于同一阅读框中)。同样，当说本发明的构建体包含多肽或ISVD时，这可能意味着所述构建体至少分别包含所述多肽或ISVD，但是更通常地，这意味着所述构建体包含除所述多肽或ISVD之外的基团、残基(例如氨基酸残基)、部分和/或结合单元，无论所述多肽或ISVD如何与所述基团、残基(例如氨基酸残基)、部分和/或结合单元连接，并且与所述构建体的结构如何产生或获得无关。
“基本上由...组成”是指本发明中使用的ISVD与本发明的ISVD完全相同，或者对应于本发明的ISVD，其具有添加在ISVD的氨基末端、羧基末端或氨基末端和羧基末端两者的有限数目的氨基酸残基，例如1-20个氨基酸，例如1-10个氨基酸残基，和优选地1-6个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸残基。
为了比较两个或更多个核苷酸序列，可以通过将[第一核苷酸序列中与在第二核苷酸序列中相应位置处的核苷酸相同的核苷酸数目]除以[第一核苷酸序列中核苷酸的总数]并乘以[100％]来计算第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性”百分比，其中与第一核苷酸序列相比，第二核苷酸序列中核苷酸的每个缺失、插入、取代或添加被认为是单个核苷酸(位置)上的差异。备选地，使用用于序列比对的已知计算机算法，例如NCBIBlast v2.0，使用标准设置，来计算两个或更多个核苷酸序列之间的序列同一性程度。用于确定序列同一性程度的一些其他技术、计算机算法和设置例如在WO 04/037999、EP0967284、EP 1085089、WO 00/55318、WO 00/78972、WO 98/49185和GB 2357768中进行了描述。通常为了根据上文概述的计算方法确定两个核苷酸序列之间的“序列同一性”的百分比，将具有最大核苷酸数的核苷酸序列作为“第一”核苷酸序列，并将另一个核苷酸作为该序列作为“第二”核苷酸序列。
为了比较两个或更多个氨基酸序列，可以通过将[第一氨基酸序列中与在第二氨基酸序列中相应位置处的氨基酸相同的氨基酸残基数目]除以[第一氨基酸序列中氨基酸残基的总数]并乘以[100％]来计算第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”(在本文中也称为“氨基酸同一性”)百分比，其中与第一氨基酸序列相比，第二氨基酸序列中氨基酸残基的每个缺失、插入、取代或添加均被认为是单个氨基酸残基(位置)的差异，即如本文所定义的“氨基酸差异”。备选地，使用已知的计算机算法例如上述用于确定核苷酸序列的序列同一性程度的算法，再次使用标准设置，来计算两个氨基酸序列之间的序列同一性程度。通常，为了根据上文概述的计算方法确定两个氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分比，将具有最大氨基酸残基数量的氨基酸序列作为“第一”氨基酸序列，并且将另一个氨基酸序列作为“第二”氨基酸序列。
同样，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可以描述为这样的氨基酸取代，其中氨基酸残基被替换为具有相似化学结构的另一个氨基酸残基并且其对多肽的功能、活性或其他生物学特性影响很小或基本没有影响。这样的保守氨基酸取代在本领域中是众所周知的，例如WO 04/037999、GB 335768、WO 98/49185、WO 00/46383和WO 01/09300；并且可以基于来自WO 04/037999和WO 98/49185以及来自从其中引用的其他参考文献的相关教导来选择这种取代的(优选)类型和/或组合。
这样的保守取代优选地是其中以下组(a)-(e)中的一个氨基酸被相同组中的另一个氨基酸残基取代：(a)小的脂肪、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性带正电荷的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和(e)芳族残基：Phe、Tyr和Trp。特别优选的保守取代如下：Ala取代为Gly或取代为Ser；Arg取代为Lys；Asn取代为Gln或取代为His；Asp取代为Glu；Cys取代为Ser；Gln取代为Asn；Glu取代为Asp；Gly取代为Ala或取代为Pro；His取代为Asn或取代为Gln；Ile取代为Leu或取代为Val；Leu取代为Ile或取代为Val；Lys取代为Arg、取代为Gln或取代为Glu；Met取代为Leu、取代为Tyr或取代为Ile；Phe取代为Met、取代为Leu或取代为Tyr；Ser取代为Thr；Thr取代为Ser；Trp取代为Tyr；Tyr取代为Trp；和/或Phe取代为Val，取代为Ile或取代为Leu。
应用于本文所述多肽的任何氨基酸取代也可以基于由Schulz等人(“Principlesof Protein Structure”,Springer-Verlag,1978)开发的不同物种的同源蛋白质之间氨基酸变异的频率的分析，基于由Chou和Fasman(Biochemistry 13:211,1974；Adv.Enzymol.,47:45-149,1978)开发的结构形成潜能的分析，以及基于Eisenberg等人(Proc.Natl.AcadSci.USA 81:140-144,1984)、Kyte和Doolittle(J.Molec.Biol.157:105-132,1981)和Goldman等人(Ann.Rev.Biophys.Chem.15:321-353,1986)开发的蛋白质中疏水性模式的分析，全部通过引用将其全部并入本文。关于纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息在本文的描述和以上引用的一般背景技术中给出。再次，出于该目的，来自美洲驼的VHH结构域的晶体结构例如由Desmyter等人(Nature Structural Biology,3:803,1996)、Spinelli等人(Natural Structural Biology,3:752-757,1996)和Decanniere等人(Structure,7(4):361,1999)给出。关于在常规VH结构域中形成VH/VL界面的一些氨基酸残基以及这些位置上潜在的骆驼化取代的进一步信息可以在上面引用的现有技术中找到。
如果氨基酸序列和核酸序列在其整个长度上具有100％的序列同一性(如本文所定义)，则称它们“完全相同”。
当比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比，在第一序列的位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应当理解，两个氨基酸序列可以包含一个、两个或更多个这样的氨基酸差异。更具体地，在本发明的ISVD和/或多肽中，术语“氨基酸差异”是指分别与(a)、(c)或(e)的CDR序列相比，(b)、(d)或(f)中指定的CDR序列的位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应当理解，分别与(a)、(c)或(e)的CDR序列相比，(b)、(d)和(f)的CDR序列可包含1、2、3、4或最大5个这样的氨基酸差异。
“氨基酸差异”可以是改善本发明的ISVD，即本发明的ADAMTS5结合物、MMP13结合物和/或聚蛋白聚糖结合物例如本发明的多肽的特性，或者至少不会太多减损本发明的的ISVD，即本发明的ADAMTS5结合物、MMP13结合物和/或聚蛋白聚糖结合物例如包含聚蛋白聚糖结合物和MMP13结合物和/或ADAMTS5结合物的本发明的多肽的所需特性或者所需特性的平衡或组合的任何1、2、3、4或最大5个取代、缺失或插入，或其任意组合。在这方面，与包含一个或多个CDR序列而不具有1、2、3、4或最大5个取代、缺失或插入的多肽相比，本发明的所得的多肽应至少以相同、大约相同或更高的亲和力结合聚蛋白聚糖和MMP13和/或ADAMTS5。亲和力可以通过本领域已知的任何合适的方法来测量，但是优选地通过实施例部分中描述的方法来测量。
在这方面，如本文所示根据(b)、(d)和/或(f)的CDR的氨基酸序列可以是分别衍生自根据(a)、(c)和/或(e)的氨基酸序列的氨基酸序列，通过亲和力成熟使用一种或多种本身已知或如实施例中所述的亲和力成熟技术。例如，并且取决于用于表达本发明多肽的宿主生物，可以以将一种或多种用于翻译后修饰的位点(例如一个或多个糖基化位点)除去的方式设计这样的缺失和/或取代，这在本领域技术人员的能力范围内(参阅实施例)。
本说明书中使用的“纳米抗体家族”、“VHH家族”或“家族”是指一组具有相同长度(即，其序列中具有相同数目的氨基酸)的纳米抗体和/或VHH序列，并且其中位置8和位置106之间的氨基酸序列(根据Kabat编号)具有89％或更高的氨基酸序列同一性。
可以互换使用的术语“表位”和“抗原决定簇”是指大分子例如多肽或蛋白质的一部分，其被抗原结合分子例如本发明的免疫球蛋白、常规抗体、免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽识别，并且更特别地被所述分子的抗原结合位点识别。表位定义了免疫球蛋白的最小结合位点，并因此代表了免疫球蛋白的特异性得靶标。
识别表位的抗原结合分子(例如本发明的免疫球蛋白、常规抗体、免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽)的一部分被称为“互补位”。
可以“结合”或“特异性结合”某些表位、抗原或蛋白质(或其至少一部分、片段或表位)，对其具有“亲和力”和/或“具有特异性”的氨基酸序列(例如本发明的免疫球蛋白单可变结构域、抗体、多肽或通常地其抗原结合蛋白或多肽或片段)被称为“对”或“针对”所述表位、抗原或蛋白质蛋白质或者是关于这样的表位、抗原或蛋白质的“结合”分子，或者被称为“抗”表位、“抗”抗原或“抗”蛋白质(例如“抗”-聚蛋白聚糖、“抗”-MMP13和/或“抗”-ADAMTS5)。
亲和力表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和力通常以KD或解离常数给出，其单位是mol/L(或M)。亲和力也可以表示为缔合常数KA，其等于1/KD并具有(mol/升)-1(或M-1)的单位。在本说明书中，两个分子之间相互作用的稳定性将主要根据其相互作用的KD值来表示；对于技术人员显而易见的是，鉴于关系KA＝1/KD，通过其KD值指定分子相互作用的强度，也可以用于计算相应的KA值。KD值在热力学意义上也表征了分子相互作用的强度，因为它通过众所周知的关系DG＝RT.ln(KD)(等效地DG＝RT.ln(KA))与结合的自由能(DG)的变化有关，其中R等于气体常数，T等于绝对温度并且ln表示自然对数。
被认为有意义的(例如特异性的)生物学相互作用的KD通常在10-12M(0.001nM)至10-5M(10000nM)的范围内。相互作用越强，其KD越低。
KD还可以表示为复合物的解离速率常数(表示为koff)与其缔合速率(表示为kon)的比率(因此KD＝koff/kon和KA＝kon/koff)。解离速率koff的单位为s-1(其中s为秒的SI单位表示法)。缔合速率Kon的单位为M-1s-1。缔合速率可在102M-1s-1至约107M-1s-1之间变化，接近双分子相互作用的扩散受限缔合速率常数。离解速率与给定分子相互作用的半衰期有关，关系为t1/2＝ln(2)/koff。解离速率可以在10-6s-1(接近不可逆复合物，t1/2为数天)至1s-1(t1/2＝0.69s)之间变化。
抗原结合蛋白(例如ISVD)与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以通过本身已知的任何合适方式来确定，包括例如饱和结合测定法和/或竞争性结合测定法，例如放射性免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA)和夹心竞争测定法，以及它们本身在本领域中已知的不同变体；以及本文提及的其他技术。
可以通过本身已知的不同技术来测量两个分子之间的分子相互作用的亲和力，例如众所周知的表面等离振子共振(SPR)生物传感器技术(参见例如Ober等人，2001，Intern.Immunology 13:1551-1559)，其中一个分子固定化在生物传感器芯片上，另一个分子在流动条件下通过固定化的分子，产生kon、koff测量值并从而得出KD(或KA)值。这可以例如使用众所周知的
Figure BDA0002377170790000171
仪器(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala,Sweden)来执行。Kinetic Exclusion Assay(
Figure BDA0002377170790000172
)(Drake等人,2004,AnalyticalBiochemistry 328:35-43)在不标记结合配偶体的情况下测量溶液中的结合事件，并且基于动力学排除复合物的解离。溶液中(in-solution)亲和力分析也可以使用
Figure BDA0002377170790000173
免疫测定系统执行，该系统提供了自动化生物分析和快速样品周转的平台(Fraley等人，2013，Bioanalysis 5:1765-74)，或ELISA。
对于本领域技术人员而言还将清楚的是，如果测量过程例如通过与一个分子的生物传感器上的涂层有关的假象(artifacts)在某种程度上影响隐含分子的固有结合亲和力，则所测量的KD可以对应于表观KD。同样，如果一个分子包含用于另一个分子的一个以上识别位点，则可以测量表观KD。在这种情况下，两个分子相互作用的亲合力(avidity)可能影响所测得的亲和力。特别是，KD的准确测量可能会非常费力，并因此，通常会确定明显的KD值来评估两个分子的结合强度。应当指出的是，只要所有测量均以一致的方式进行(例如，保持测定法条件不变)，表观KD测量就可以用作真实KD的近似值，并因此在本文档中，以相等的重要性或相关性对待KD和表观KD。
术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的ISVD或多肽)分子可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。可以基于亲和力(affinity)和/或亲合力(avidity)来确定抗原结合蛋白的特异性，如WO 08/020079的第53-56页所述(通过引用并入本文)，该文献也描述了用于测量抗原结合分子(例如本发明的多肽或ISVD)和相关抗原之间的结合的一些优选技术。通常，抗原结合蛋白(例如本发明的ISVD和/或多肽)将以10-5至10-12摩尔/升或更低，和优选地10-7至10-12摩尔/升或更低和更优选地10-8至10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即缔合常数(KA)是105至1012升/摩尔或更高，和优选地107至1012升/摩尔或更高，和更优选地108至1012升/摩尔)结合其抗原。通常认为任何大于10-4mol/升的KD值(或任何小于104升/mol的KA值)都表示非特异性结合。优选地，本发明的单价ISVD将以小于500nM，优选地小于200nM，更优选地小于10nM，例如小于500pM，例如10至5pM或更低的亲和力结合所需抗原。再次参考WO 08/020079的第53-56页的段落n)。
当ISVD和/或多肽与第一抗原结合的亲和力(如上所述，并且适当地表示为KD值、KA值、Koff速率和/或Kon速率)是ISVD和/或多肽结合第二靶标或抗原的亲和力的至少10倍，例如至少100倍，和优选地至少1000倍或更好时，认为它与另一个(第二)靶标或抗原相比对(第一)靶标或抗原是“特异性的”。例如，ISVD和/或多肽可以以比所述ISVD和/或多肽结合第二靶标或抗原的KD低至少10倍，例如低至少100倍，和优选地低至少1000倍或甚至更低的KD值结合第一靶标或抗原。优选地，当ISVD和/或多肽与第二靶标或抗原相比对第一靶标或抗原是“特异性的”时，其针对(如本文所定义)所述第一靶标或抗原，而不针对所述第二靶标或抗原。
抗原结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以通过本身已知的任何合适方式来确定，包括例如饱和结合测定法和/或竞争性结合测定法，例如放射免疫测定法(RIA)，酶免疫测定法(EIA)和其本领域已知的不同变体；以及本文提及的其他技术。
可用于评估亲和力的优选方法是Friguet等人1985(J.Immunol.Methods77:305-19)的2步ELISA(酶联免疫吸附测定法)程序。该方法建立了溶液相结合平衡测量，并避免了与分子之一在例如塑料的支持物上吸附有关的可能的假象。如本领域技术人员将清楚的，解离常数可以是实际或表观解离常数。确定解离常数的方法对技术人员是清楚的，并且例如包括WO 08/020079的第53-56页提到的技术。
最后，应注意，在许多情况下，有经验的科学家可以断定，确定相对于某些参考分子的结合亲和力很方便。例如，为了评估分子A和B之间的结合强度，可以例如使用已知结合B并适当标记有荧光团或发色团或其他化学部分(例如生物素)的参考分子C，以便在ELISA或FACS(荧光激活细胞分选)或其他格式中容易检测(荧光团用于荧光检测，生色团用于光吸收检测，生物素用于链霉亲和素介导的ELISA检测)。通常，参考分子C保持固定的浓度，并且A的浓度随B的给定浓度或量而变化。结果，获得的IC50值对应于A的浓度，在该浓度对于在缺失A的情况对C测得的信号减半。如果已知KD ref，即参考分子的KD，以及参考分子的总浓度cref，则可以从以下公式获得相互作用A-B的表观KD：KD＝IC50/(1+cref/KDref)。注意，如果cref<<KD ref，则KD≈IC50。如果对被比较的结合物以一致的方式(例如，保持cref固定)执行IC50的测量，则可以通过比较IC50来评估分子相互作用的强度或稳定性的差异，并且在本文中将该测量判断为等同于KD或表观KD。
半数最大抑制浓度(IC50)也可以是对化合物抑制生物学或生化功能(例如，药理作用)的有效性的量度。该定量量度表明抑制给定的生物学过程(或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体、趋化性、再生障碍、转移、侵袭性等)的一半需要多少多肽或ISVD(例如纳米抗体)。换句话说，它是物质的半最大(50％)抑制浓度(IC)(50％IC或IC50)。通过确定抑制激动剂最大生物学反应一半所需的浓度，可以计算给定拮抗剂如本发明的多肽或ISVD(例如纳米抗体)的IC50值。可以通过构建剂量-应答曲线并检查不同浓度的拮抗剂(例如本发明的多肽或ISVD(例如，纳米抗体))对逆转激动剂活性的作用来确定药剂的KD。
术语半最大有效浓度(EC50)是指在指定的暴露时间后，诱导在基线和最大值之间一半的应答的化合物的浓度。在本文中，它用作对多肽ISVD(例如纳米抗体)效力的量度。分级的剂量应答曲线的EC50代表化合物的浓度，在该浓度观察到其最大作用的50％。浓度优选地以摩尔单位表示。
在生物系统中，配体浓度的小变化通常导致遵循s函数(sigmoidal function)的应答的快速变化。随着配体浓度增加，应答增加开始减慢的拐点是EC50。这可以通过推导最佳拟合线来在数学上确定。在大多数情况下，依靠图进行估计很方便。如果在实施例部分中提供了EC50，则将实验设计为尽可能准确地反映KD。换句话说，EC50值然后可以被认为是KD值。术语“平均KD”涉及在至少1个，但优选地大于1个，例如至少2个实验中获得的平均KD值。术语“平均”是指数学术语“平均”(数据总和除以数据中项目的数量)。
它还与IC50有关，IC50是对化合物其抑制(50％抑制)的量度。对于竞争结合测定法和功能性拮抗剂测定法，IC50是剂量-应答曲线的最常见的综合量度。对于激动剂/刺激物测定法，最常见的综合测量是EC50。
抑制常数(Ki)是对于抑制剂的效力的指示；它是产生半最大抑制所需的浓度。与可以根据实验条件改变的IC50不同，Ki是绝对值并通常被称为药物的抑制常数。抑制常数Ki可以通过使用Cheng-Prusoff方程来计算：
Figure BDA0002377170790000201
其中[L]是配体的固定浓度。
如本文所用，术语本发明的多肽和/或ISVD的“效力(potency)”是其特定的作用发生所需的本发明的多肽和/或ISVD的量的函数。它是指所述本发明的多肽和/或ISVD调控和/或部分地或完全地抑制MMP13的活性和/或调控和/或部分地或完全地抑制ADAMTS5的活性的能力。
特别地，它可以指所述多肽减少或甚至完全抑制本文定义的MMP13活性的能力。这样，它可以指所述多肽抑制蛋白水解的能力，所述蛋白水解例如蛋白酶活性内肽酶活性，结合底物的能力，底物例如聚蛋白聚糖、胶原蛋白II、胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白IX、胶原蛋白X、胶原蛋白XIV和明胶。可以通过本领域已知或本文描述的任何合适的测定法来测量效力。
特别地，它可以指所述多肽和/或ISVD减少或甚至完全抑制本文定义的ADAMTS5活性，和/或本文定义的MMP13活性的能力。可以通过本领域已知或本文描述的任何合适的测定法来测量效力。如本文所用，“聚蛋白聚糖酶活性”定义为对聚蛋白聚糖的蛋白水解裂解。
本发明的多肽的“功效(efficacy)”是测量在饱和多肽浓度，作用本身的最大强度。功效指示可从本发明的多肽可获得的最大应答。它是指多肽产生所需(治疗)作用的能力。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽结合ADAMTS5，其KD是1E-07M至1E-13M之间，例如1E-08M至1E-12M，优选地最多1E-07M，优选地低于1E-08M或1E-09M，或甚至低于1E-10M，例如5E-11M，4E-11M，3E-11M，2E-11M，1.7E-11M，1E-11M或甚至5E-12M，4E-12M，3E-12M，1E-12M，例如通过Gyrolab或KinExA确定的。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽结合MMP13，其KD是1E-07M至1E-13M之间，例如1E-08M至1E-12M，优选地最多1E-07M，优选地低于1E-08M或1E-09M，或甚至低于1E-10M，例如5E-11M，4E-11M，3E-11M，2E-11M，1.7E-11M，1E-11M或甚至5E-12M，4E-12M，3E-12M，1E- 12M，例如通过Gyrolab或KinExA确定的。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽结合聚蛋白聚糖，其KD是1E-07M至1E-13M之间，例如1E-08M至1E-12M，优选地最多1E-07M，优选地低于1E-08M或1E-09M，或甚至低于1E-10M，例如5E-11M，4E-11M，3E-11M，2E-11M，1.7E-11M，1E-11M或甚至5E-12M，4E-12M，3E-12M，1E-12M，例如通过Gyrolab或KinExA确定的。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽结合ADAMTS5，其解离速率小于5E-04s-1，例如小于1E-04s-1或5E-05s-1，或甚至小于1E-05s-1，例如通过SPR确定的。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽结合MMP13，其解离速率小于5E-04s-1，例如小于1E-04s-1或5E-05s-1，或甚至小于1E-05s-1，例如通过SPR确定的。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽结合聚蛋白聚糖，其解离速率小于5E-04s-1，例如小于1E-04s-1或5E-05s-1，或甚至小于1E-05s-1，例如通过SPR确定的。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽调控ADAMTS5活性和/或MMP13活性，其EC50是1E-07M至1E-12M，例如1E-08M至1E-11M，例如通过结合ELISA(用于确定ADAMTS5活性)或例如竞争ELISA、竞争TIMP-2ELISA、荧光肽测定法、荧光胶原蛋白测定法或胶原溶解测定法(用于确定MMP13活性)。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制ADAMTS5和/或MMP13的活性，其IC50是1E-07M至1E-12M，例如1E-08M至1E-11M，例如通过人FRET测定法或人AlphaLISA(用于确定ADAMTS5活性)或例如竞争ELISA、竞争TIMP-2ELISA、荧光肽测定法、荧光胶原蛋白测定法或胶原溶解测定法(用于确定MMP13活性)。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制ADAMTS5和/或MMP13的活性，其IC50最多是1E-07M，优选地1E-08M，5E-09M，或4E-9M，3E-9M，2E-9M，例如1E-9M。
如果氨基酸序列(例如ISVD或多肽)对两种不同的抗原或抗原决定簇(例如来自不同哺乳动物物种的ADAMTS5，例如人ADAMTS5、牛ADAMTS5、大鼠ADAMTS5、豚鼠ADAMTS5、小鼠ADAMTS5或食蟹猴ADAMTS5，或例如来自不同哺乳动物物种的MMP13，例如人MMP13、狗MMP13、牛MMP13、大鼠MMP13、猪MMP13、小鼠MMP13、兔MMP13、食蟹猴MMP13和/或恒河猴MMP13，或例如来自不同哺乳动物物种的聚蛋白聚糖，例如人聚蛋白聚糖、狗聚蛋白聚糖、牛聚蛋白聚糖、大鼠聚蛋白聚糖、猪聚蛋白聚糖、小鼠聚蛋白聚糖、兔聚蛋白聚糖、食蟹猴聚蛋白聚糖和/或恒河猴聚蛋白聚糖)具有特异性(如本文所定义)，则称氨基酸序列(例如ISVD或多肽)对这两种不同的抗原或抗原决定簇是“交叉反应性的”。应当理解，尽管对于两种不同抗原的结合亲和力可以不同，例如相差倍数2、5、10、50、100或甚至更多，只要对这些不同的抗原或抗原决定簇具有特异性(如本文所定义)，则ISVD或多肽可以被认为是交叉反应性的。
ADAMTS5也称为ADAMTS11、ADMP-2或聚蛋白聚糖酶-2。ADAMTS5的相关结构信息可以在例如下表B-1(参阅表B)中所示的UniProt登录号处找到。
表B-1
Figure BDA0002377170790000231
“人ADAMTS5”是指包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的ADAMTS5。在一方面，本发明的多肽特异性结合来自人、小家鼠、豚鼠、牛、恒河猴和/或褐家鼠的ADAMTS5，优选地人ADAMTS5，优选地SEQ ID NO：67。
MMP13也称为CLG3或胶原蛋白酶3、MANDP1、MMP-13、基质金属肽酶13或MDST。MMP13的相关结构信息可以在例如下表B-2(参阅表B)中所示的UniProt登录号处找到。
表B-2
Figure BDA0002377170790000232
“人MMP13”是指包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的MMP13。在一方面，本发明的多肽特异性结合来自人、小家鼠、狼、牛、恒河猴、褐家鼠、原鸡和/或黑猩猩的MMP13，优选地人MMP13，优选地SEQ ID NO：66。
聚蛋白聚糖也被称为聚集蛋白聚糖1、ACAN、AGC1、AGCAN、CSPGCP、MSK16、SEDK、软骨特异性蛋白聚糖核心蛋白(CSPCP)或硫酸软骨素蛋白聚糖1(CSPG1)。聚蛋白聚糖在人类中由ACAN基因编码，该基因位于染色体Chr 15：q26.1。聚蛋白聚糖的相关结构信息可在以下表B-3(参阅表B)中所示的UniProt登录号中找到。
表B-3
Figure BDA0002377170790000241
“人类聚蛋白聚糖”是指包含SEQ ID NO：68氨基酸序列的聚蛋白聚糖。在一个方面，本发明的多肽特异性地结合来自人，小家鼠、牛、恒河猴、黑猩猩、原鸡、狼疮、猪、兔和/或褐家鼠，优选地人聚蛋白聚糖，优选地SEQ ID NO：68。
术语“(交叉)阻断”，“(交叉)阻断的”，“(交叉)阻断性”，“竞争性结合”，“(交叉)竞争”，“(交叉)竞争性”和“(交叉)竞争型”在本文中可互换使用，是指免疫球蛋白、抗体、ISVD、多肽或其他结合试剂干扰其他免疫球蛋白、抗体、ISVD、多肽或结合试剂与给定靶标结合的能力。免疫球蛋白、抗体、ISVD、多肽或其他结合试剂能够干扰另一种与靶标结合的程度，并因此是否可以说是根据本发明的交叉阻断，可以通过使用竞争结合测定法来确定，所述竞争结合测定法是本领域常见的，例如，通过在竞争ELISA中针对在噬菌体上展示的ISVD筛选纯化的ISVD。特别合适的定量交叉阻断测定法包括ELISA。
用于确定针对靶标(交叉)-嵌段的免疫球蛋白、抗体、ISVD、多肽或其他结合试剂是否能够如本文所定义的(交叉)-阻断、竞争性结合或(交叉)竞争性的其他方法可以通过基于SPR的“夹心测定法”来评价，例如在实施例部分中描述的。描述了其他合适的方法，例如在Xiao-Chi Jia等人(Journal of Immunological Methods 288：91-98，2004)，Miller等人(Journal of Immunological Methods 365:118-125,2011)中描述。
“ADAMTS5活性”和“ADAMTS5的活性”(这些术语在本文可互换使用)包括但不限于酶促活性，例如蛋白水解，例如蛋白酶活性(也称为蛋白酶或肽酶活性)和肽链内切酶活性，另一方面，和外结合位点(exosite)的活性，例如识别和/或结合底物，例如通过去整合素样结构域、I型中央血小板反应蛋白(TS)重复序列、富含半胱氨酸的结构域、间隔子区和/或其他TS基序。ADAMTS5活性包括底物的结合和/或蛋白水解，底物例如透明质酸结合的硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)细胞外蛋白，例如聚蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖(Versican)、短小蛋白聚糖(Brevican)、神经蛋白聚糖(Neurocan)，核心蛋白聚糖(Decorin)和二聚糖(Biglycan)。如本文所用，蛋白水解是通过水解将多肽链中的氨基酸连接在一起的肽键将蛋白质分解成更小的多肽或氨基酸。
“MMP13活性”和“MMP13的活性”(这些术语在本文可互换使用)包括但不限于蛋白水解，例如蛋白酶活性(也称为蛋白酶或肽酶活性)，和肽链内切酶活性，另一方面，和结合底物，例如通过血色素结合蛋白样结构域和肽聚糖结合结构域。MMP13活性包括底物的结合和/或蛋白水解，底物例如聚蛋白聚糖、胶原蛋白II、胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白IX、胶原蛋白X、胶原蛋白XIV和明胶。如本文所用，蛋白水解是通过对将多肽链中的氨基酸连接在一起的肽键进行水解而将蛋白质分解成更小的多肽或氨基酸。
在本发明的上下文中，“调控的”或“调控”通常是指通过ADAMTS5和/或MMP13改变活性，如使用合适的体外、细胞或体内测定法(例如本文所述的那些)所测量的。特别地，“调控的”或“调控”可以表示与在相同条件但不存在本发明的ISVD或多肽的情况下在相同测定法中的ADAMTS5和/或MMP13活性相比，降低或抑制ADAMTS5和/或MMP13的活性，或者备选地增加ADAMTS5和/或MMP13的活性至少1％，优选地至少5％，例如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多，如使用合适的体外、细胞或体内测定法(例如本文所述的那些)所测量的。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽调控ADAMTS5和/或MMP13的活性，优选地抑制ADAMTS5和/或MMP13的活性。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制ADAMTS5的蛋白酶活性，例如抑制底物例如聚蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、神经蛋白聚糖，核心蛋白聚糖和和/或二聚糖的蛋白水解。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽阻断ADAMTS5与底物例如聚蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、神经蛋白聚糖，核心蛋白聚糖和和/或二聚糖的结合，其中所述底物优选地是聚蛋白聚糖。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽阻断ADAMTS5与聚蛋白聚糖的结合至少20％，例如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至更高，例如通过ELISA确定的。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽拮抗或抑制ADAMTS5的活性，例如(i)蛋白酶活性，优选地裂解聚蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、神经蛋白聚糖，核心蛋白聚糖和和/或二聚糖，优选地裂解聚蛋白聚糖；优选地拮抗ADAMTS5的聚蛋白聚糖酶活性；(ii)底物结合ADAMTS5，例如ADAMTS5的外结合位，例如去整合素样结构域、I型中央血小板反应蛋白(TS)重复序列、富含半胱氨酸的结构域、间隔子区和/或其他TS基序。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制MMP13的蛋白酶活性，例如抑制对底物例如聚蛋白聚糖、胶原蛋白II、胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白IX、胶原蛋白X、胶原蛋白XIV和/或明胶的蛋白水解。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽阻断MMP13与底物例如聚蛋白聚糖、胶原蛋白II、胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白IX、胶原蛋白X、胶原蛋白XIV和/或明胶的结合，其中所述胶原蛋白优选地是胶原蛋白II。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽阻断MMP13与胶原蛋白和/或聚蛋白聚糖的结合至少20％，例如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至更高，例如通过基于ELISA的竞争测定法(参阅Howes等人,2014J.Biol.Chem.289:24091–24101)确定的。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽拮抗或抑制MMP13的活性，例如(i)蛋白酶活性，优选地裂解聚蛋白聚糖和/或胶原蛋白，其中所述胶原蛋白优选地是胶原蛋白II；(ii)胶原蛋白与血色素结合蛋白样结构域的结合。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制ADAMTS5和/或MMP13的蛋白酶活性，优选地至少5％，例如10％、20％、30％、40％、50％或甚至更多，例如至少60％、70％、80％、90％、95％或甚至更高，如通过本领域已知的任何合适的方法确定的，例如通过竞争测定法或如在实施例部分中所述的。
尽管ADAM、ADAMTS和MMP与聚蛋白聚糖共有的结合位点在序列和总体形状上都非常相似，例如，ADAMTS4和ADAMTS5的催化结构域共有高度的序列相似性，但发明人能够鉴定出靶标特异性的ISVD，如实施例所示。靶标特异性还可以避免或至少限制肌肉骨骼综合征，这是由广谱抑制剂引起的副作用。
在一方面，本发明涉及ADAMTS5结合物，例如本发明的ISVD和多肽，其中所述ADAMTS5结合物不结合ADAMTS4、ADAMTS1、ADAMTS15、MMP1和/或MMP14(膜类型)。优选地，本发明涉及如本文定义的多肽，其中所述结合ADAMTS5的ISVD不结合ADAMTS4、MMP1或MMP14。
在一方面，本发明涉及MMP13结合物，例如本发明的ISVD和多肽，其中所述MMP13结合物不结合MMP1和/或MMP14(膜类型)。优选地，本发明涉及本文所定义的多肽，其中所述结合MMP13的ISVD不结合MMP1或MMP14。
除非另有说明，否则术语“免疫球蛋白”和“免疫球蛋白序列”-无论在本文中用于指重链抗体还是常规的4-链抗体-均用作通用术语以包括全尺寸抗体、其单个链以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段，例如分别地VHH结构域或VH/VL结构域)。
如本文所用，术语(多肽或蛋白质的)“结构域”是指折叠的蛋白质结构，其具有独立于蛋白质的其余部分而保留其三级结构的能力。通常，结构域负责蛋白质的离散功能特性，并且在许多情况下，可以添加、去除或转移至其他蛋白质而不会损失蛋白质的其余部分和/或结构域的功能。
如本文所用，术语“免疫球蛋白结构域”是指抗体链(例如，常规4链抗体或重链抗体的链)的球状区域，或指基本上由这样的球状区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域的特征在于它们保留了抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，其由排列在两个β折叠中的约7条反平行β链的两层三明治组成，并可选地由保守的二硫键稳定。
如本文所用，术语“免疫球蛋白可变结构域”是指基本上由以下组成的免疫球蛋白结构域：四个“框架区”，所述“框架区”在本领域中和在下文中分别称为“框架区1”或“FR1”；“框架区域2”或“FR2”；“框架区域3”或“FR3”；和“框架区域4”或“FR4”；这些框架区被三个“互补决定区”或“CDR”间断，后者在本领域中和在下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；和“互补决定区3”或“CDR3”。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可以如下所示：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域通过携带抗原结合位点而赋予抗体针对抗原的特异性。
术语“免疫球蛋白单可变结构域”(在本文中缩写为“ISVD”或“ISV”)，并且与“单可变结构域”互换使用，定义了其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白域上并由其形成的分子。这将免疫球蛋白单可变结构域与“常规”免疫球蛋白或其片段分开，其中两个免疫球蛋白结构域，特别是两个可变结构域相互作用而形成抗原结合位点。通常，在常规的免疫球蛋白中，重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)相互作用而形成抗原结合位点。在后一种情况下，VH和VL的互补决定区(CDR)将有助于抗原结合位点，即，总共6个CDR将参与抗原结合位点的形成。
鉴于以上定义，常规4链抗体(例如本领域已知的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子)或者衍生自这样的常规4链抗体的Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段(例如二硫键连接的Fv或scFv片段)或双抗体(所有都是本领域中已知的)的抗原结合结构域通常不被视为免疫球蛋白单可变结构域，在这些情况下，通常不通过一个(单个)免疫球蛋白结构域而是通过一对(相关的)免疫球蛋白结构域例如轻链和重链可变结构域，即通过免疫球蛋白结构域的VH-VL对(它们共同结合相应抗原的表位)，发生与抗原的各个表位的结合。
相反，ISVD能够特异性结合抗原的表位，而无需与另外的免疫球蛋白可变结构域配对。ISVD的结合位点由单个VHH、VH或VL结构域形成。因此，ISVD的抗原结合位点由不超过三个的CDR形成。
这样，单可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如，VL序列)或其合适的片段；或者重链可变结构域序列(例如，VH序列或VHH序列)或其合适的片段；只要它能够形成单个抗原结合单元(即基本上由单可变结构域组成的功能性抗原结合单元，这样单个抗原结合域就不需要与另一个可变结构域相互作用即可形成功能性抗原结合单元)。
在本发明的一个实施方案中，ISVD是重链可变结构域序列(例如，VH序列)；更具体地说，ISVD可以是衍生自常规四链抗体的重链可变结构域序列或衍生自重链抗体的重链可变结构域序列。
例如，ISVD可以是(单)结构域抗体(或适合用作(单)结构域抗体的氨基酸)，“dAb”或sdAb(或适合用作dAb的氨基酸)或纳米抗体(如本文所定义，包括但不限于VHH)；其他单可变结构域，或其任何一个的任何合适的片段。
特别地，ISVD可以是
Figure BDA0002377170790000291
(如本文所定义的)或其合适的片段。[注：
Figure BDA0002377170790000292
和
Figure BDA0002377170790000293
是Ablynx N.V.的注册商标。]对于Nanobody的一般描述，请参考下面的进一步描述，以及本文引用的现有技术，例如在WO 08/020079(第16页)中描述的。
“VHH结构域”，也称为VHH、VHH结构域、VHH抗体片段和VHH抗体，最初被描述为“重链抗体”的抗原结合免疫球蛋白(可变)结构域(即“不含轻链的抗体”；Hamers-Casterman等人，1993Nature 363：446-448)。选择术语“VHH结构域”是为了将这些可变结构域与常规4链抗体中存在的重链可变结构域(在本文中称为“VH结构域”或“VH结构域”)和存在于常规4-链抗体中的轻链可变结构域(在本文中称为“VL结构域”或“VL结构域”)相区分。对于VHH和纳米抗体的进一步描述，参考Muyldermans的综述文章(Reviews in Molecular Biotechnology74:277-302，2001)，以及以下专利申请，其被作为一般背景技术提及：布鲁塞尔自由大学(Vrije Universiteit Brussel)的WO 94/04678、WO 95/04079和WO 96/34103；联合利华(Unilever)的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voorBiotechnologie(VIB)的WO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016和WO03/055527；Algonomics N.V.和Ablynx N.V.的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会的WO01/90190；抗体研究所的WO 03/025020(＝EP 1433793)；以及Ablynx N.V.的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787和WO 06/122825，以及Ablynx N.V.的其他公开的专利申请。也参考了这些申请中提到的其他现有技术，特别是国际申请WO06/040153的第41-43页提及的参考文献列表，该列表和参考文献通过引用并入本文。如这些参考文献中所述，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)尤其特征在于在一个或多个框架序列中存在一个或多个“标志残基(Hallmark residue)”。纳米抗体的进一步描述，包括纳米抗体的人源化和/或骆驼化，以及其他修饰、部分或片段、衍生物或“纳米抗体融合体”、多价构建体(包括接头序列的一些非限制性示例)和延长纳米抗体的半衰期的不同修饰，并且它们的制备方法可以可见于WO 08/101985和WO 08/142164。对于纳米抗体的进一步一般性描述，参考本文引用的现有技术，例如在WO 08/020079(第16页)中描述。
特别地，在本发明的聚蛋白聚糖、ADAMTS5和/或MMP13结合物(例如本发明的ISVD和/或多肽)中存在的框架序列，可以包含一个或多个标志残基(例如，在WO 08/020079中所述(表A-3至A-8))，使得本发明的聚蛋白聚糖、ADAMTS5和/或MMP13结合物是纳米抗体。通过本文的进一步公开(参见例如表A-2)，这些框架序列(的合适组合)的一些优选但非限制性实例将变得清楚。通常，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)可以特别地特征在于一个或多个框架序列中存在一个或多个“标志残基”(例如，在WO 08/020079，第61页第24行到第98页第3行中进一步描述)。如本文所用在任何SEQ ID NO的上下文中的“由…表示”等同于“包含或由所述SEQ ID NO组成”并且优选地等同于“由所述SEQ ID NO组成”。
更特别地，本发明提供了聚蛋白聚糖、ADAMTS5和/或MMP13结合物，其包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域，其是具有(一般)结构的氨基酸序列。
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3，并且其中：
i)与SEQ ID NO：2、3或4(参见表A-1)的至少一个氨基酸序列具有至少80％，更优选地90％，甚至更优选地95％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度，忽略形成CDR序列的氨基酸残基。在这方面，也参考表A-2，其列出了SEQ ID NO：2、3和4的免疫球蛋白单可变结构域的框架1序列(SEQ ID NO：7)，框架2序列(SEQ ID NO：9、15和20)，框架3序列(SEQ ID NO：11、17和22)和框架4序列(SEQ ID NO：13)；或
ii)如表A-2所示的框架序列的组合；
并且其中：
iii)优选地，在根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108的一个或多个氨基酸残基选自例如WO 08/020079的表A-3至表A-8中所述的标志残基。
本发明的聚蛋白聚糖、ADAMTS5和/或MMP13结合物，例如本发明的ISVD和/或多肽，还可以包含以下共同待决的美国临时申请中描述的特定突变/氨基酸残基，其全部以“Improved immunoglobulin variable domains”为标题：2014年5月16日提交的US 61/994552；2014年6月18日提交的US 61/014,015；2014年8月21日提交的US 62/040,167；以及2014年9月8日提交的US62/047,560(均转让给Ablynx N.V.)。
特别地，本发明的聚蛋白聚糖、ADAMTS5和/或MMP13结合物，例如本发明的ISVD和/或多肽，可以适当地包含(i)在位置112的K或Q；或(ii)在位置110的K或Q与在位置11的V相组合；或(iii)在位置89的T；或(iv)在位置89的L，以及在位置110的K或Q；或(v)在位置11的V和位置89的L；或者(i)至(v)的任何适当组合。
也如在所述共同待决的美国临时申请中所述，当本发明的聚蛋白聚糖、ADAMTS5和/或MMP13结合物，例如本发明的ISVD和/或多肽，包含根据上述(i)至(v)之一的突变(或适当的组合)时：
位置11的氨基酸残基优选地选自L、V或K(并且最优选地V)；和/或
位置14的氨基酸残基优选地选自A或P；和/或
位置41的氨基酸残基优选地选自A或P；和/或
位置89的氨基酸残基优选地选自T、V或L；和/或
位置108的氨基酸残基优选地选自Q或L；和/或
位置110的氨基酸残基优选地选自T、K或Q；和/或
位置112的氨基酸残基优选地选自S、K或Q。
如在所述同待决的美国临时申请中所提到的，所述突变在防止或减少所谓的“预先存在的抗体”与本发明的免疫球蛋白和化合物的结合方面是有效的。为此，本发明的聚蛋白聚糖、ADAMTS5和/或MMP13结合物，例如本发明的ISVD和/或多肽，还可包含(可选地与所述突变组合)C末端延伸(X)n(其中n是1至10，优选地1至5，例如1、2、3、4或5(并且优选地1或2，例如1)；并且每个X是独立选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，并且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I))，参见例如美国临时申请以及WO 12/175741。特别地，当本发明的聚蛋白聚糖、ADAMTS5和/或MMP13结合物，例如本发明的ISVD和/或多肽形成蛋白质、多肽或包含蛋白质、多肽的其他化合物或构建体的C末端时，可以包含这种C末端延伸(参见例如所述美国临时申请以及WO 12/175741)。
本发明的聚蛋白聚糖、ADAMTS5和/或MMP13结合物可以是以任何合适的方式并且从任何合适的来源衍生的免疫球蛋白，例如免疫球蛋白单可变结构域，并且可以例如是天然存在的VHH序列(即，来自合适种类的骆驼科动物)或者合成或半合成氨基酸序列，包括但不限于“人源化”(如本文定义)纳米抗体或VHH序列，“骆驼化”(如本文定义)免疫球蛋白序列(尤其是骆驼化重链可变结构域序列)，以及已经通过例如亲和力成熟(例如，从合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列开始)、CDR嫁接、贴面、组合来自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装和技术人员熟知的用于工程改造免疫球蛋白序列的相似技术的技术获得的纳米抗体；或本文进一步描述的任何前述的任何合适的组合。再次，当免疫球蛋白包含VHH序列时，如本文进一步所述，所述免疫球蛋白可以被适当地人源化，以提供本发明的一种或多种其他(部分地或完全地)人源化免疫球蛋白。类似地，当免疫球蛋白包含合成的或半合成的序列(例如部分地人源化的序列)时，所述免疫球蛋白可以可选地被进一步合适地人源化，再次如本文所述，从而再次提供本发明的一个或多个(部分地或全部地)人源化的免疫球蛋白。
“结构域抗体”，也称为“Dab”、“结构域抗体”和“dAb”(术语“结构域抗体”和“dAb”被葛兰素史克集团公司作为商标使用)已在例如EP 0368684、Ward等人(Nature 341:544-546，1989)、Holt等人(Tends in Biotechnology 21:484-490，2003)和WO 03/002609以及例如WO 04/068820、WO 06/030220、WO 06/003388和Domantis Ltd.的其他公开的专利申请中描述。结构域抗体基本上对应于非骆驼科哺乳动物，尤其是人4链抗体的VH或VL结构域。为了将表位作为单个抗原结合结构域进行结合，即，不与VL或VH结构域分别配对，需要对这种抗原结合特性进行特异性选择，例如通过使用人单个VH或VL结构域序列的文库。像VHH一样，结构域抗体具有约13至约16kDa的分子量，并且如果衍生自完整的人序列，则不需要人源化用于例如在人类中的治疗用途。
还应当注意，尽管在本发明的上下文中由于它们不是哺乳动物起源而次级优选，但是单可变结构域可以衍生自某些鲨鱼物种(例如，所谓的“IgNAR结构域”，参见例如WO05/18629)。
本发明特别涉及ISVD，其中所述ISVD选自VHH、人源化的VHH和骆驼化的VH。
VHH结构域的氨基酸残基根据Kabat等人("Sequence of proteins ofimmunological interest",US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,PublicationNo.91)给出的VH结构域的通用编号进行编号，如应用于来自骆驼科动物的VHH结构域那样，例如Riechmann和Muyldermans(J.Immunol.Methods 231:25-38,1999)的图2所示，所有都是本领域已知的。对VH结构域的氨基酸残基进行编号的替代方法，该方法也可以以类似的方式应用于VHH结构域，是本领域已知的。但是，在本说明书、权利要求书和附图中，除非另有说明，否则将遵循如上所述应用于VHH域的根据Kabat的编号。
应当注意的是-如本领域对于VH结构域和VHH结构域所公知的-每个CDR中的氨基酸残基总数可以变化并且可以不对应于通过Kabat编号表示的氨基酸残基的总数(即，根据Kabat编号的一个或多个位置可以不在实际序列中被占据，或者实际序列可以包含比Kabat编号所允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，根据Kabat的编号可以对应于或可以不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。VH结构域和VHH结构域中的氨基酸残基总数通常为110至120，通常为112至115。但是，应注意，更小和更长的序列也可以适用于此本文所述的目的。
关于CDR，如本领域公知的，存在多种约定来定义和描述VH或VHH片段的CDR，例如Kabat定义(其基于序列可变性并且是最常用的)和Chothia定义(基于结构环区域的位置)。例如参考网站http://www.bioinf.org.uk/abs/。为了本说明书和权利要求书的目的，最优选地基于Abm定义(其基于Oxford Molecular的AbM抗体建模软件)来定义CDR，因为这被认为是Kabat和Chothia定义之间的最佳折衷方案(请参阅http://www.bioinf.org.uk/abs/)。如本文所用，FR1包含在位置1-25的氨基酸残基，CDR1包含在位置26-35的氨基酸残基，FR2包含在位置36-49的氨基酸，CDR2包含在位置50-58的氨基酸残基，FR3包含在位置59-94的氨基酸残基，CDR3包含在位置95-102的氨基酸残基，并且FR4包含在位置103-113的氨基酸残基。
在本发明的含义中，术语“免疫球蛋白单可变结构域”或“单可变结构域”包括衍生自非人类来源的多肽，优选地骆驼科动物，优选地骆驼科动物重链抗体。如本文所述，它们可以被人源化。此外，该术语包括衍生自非骆驼科动物来源的多肽，例如小鼠或人类，其已经被“骆驼化”，如本文所述。
因此，可以将ISVD例如结构域抗体和纳米抗体(包括VHH域)进行人源化。特别地，人源化的ISVD，例如纳米抗体(包括VHH结构域)可以是如本文一般定义的ISVD，但是其中存在至少一个氨基酸残基(特别是在至少一个框架残基中)是和/或对应于人源化取代(如本文所定义)。可以通过将天然存在的VHH序列的框架区序列与一个或多个紧密相关的人VH序列的相应框架序列进行比较来确定潜在有用的人源化取代，然后，可以将由此确定的一个或多个潜在有用的人源化取代(或其组合)引入所述VHH序列中(以本身已知的任何方式，如本文进一步所述)，并且可以测试所得的人源化的VHH序列与靶标的亲和力、稳定性、表达的容易程度和水平、和/或其他所需属性。以此方式，借助于有限程度的反复试验，技术人员可以基于本文的公开内容确定其他合适的人源化取代(或其合适的组合)。而且，基于前述，ISVD例如纳米抗体(包括VHH结构域)的(框架区)可以被部分地人源化或完全人源化。
本发明的另一类特别优选的ISVD包括具有与天然存在的VH结构域的氨基酸序列相对应的氨基酸序列、但是已被“骆驼化”的ISVD，即将来自常规4链抗体的天然存在VH结构域的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基取代为在重链抗体的VHH结构域中相应位置的一个或多个氨基酸残基。这可以以本身已知的方式来执行，这对于本领域技术人员而言将是清楚的，例如基于本文的描述。如本文所定义，优选地将这种“骆驼化”取代插入形成和/或存在于VH-VL界面和/或于所谓的骆驼科标志残基的氨基酸位置(也参见例如WO 94/04678以及Davies和Riechmann(1994和1996))。优选地，用作产生或设计骆驼化的免疫球蛋白单可变结构域的起始材料或起点的VH序列优选地是来自哺乳动物的VH序列，更优选地人的VH序列，例如VH3序列。然而，应注意的是，本发明的这种骆驼化的免疫球蛋白单可变结构域可以以本身已知的任何合适方式获得并因此并不严格限于使用包含天然存在的VH结构域的多肽作为起始材料获得的多肽。参考Davies和Riechmann(FEBS 339:285-290,1994；Biotechnol.13:475-479,1995；Prot.Eng.9:531-537,1996)以及Riechmann和Muyldermans(J.Immunol.Methods 231:25-38,1999)
例如，再次如本文进一步所述，“人源化”和“骆驼化”都可以通过提供分别编码天然存在的VHH结构域或VH结构域的核苷酸序列，然后以本身已知的方式改变所述核苷酸序列中的一个或多个密码子使得新核苷酸序列分别编码本发明的“人源化的”或“骆驼化的”ISVD来执行。然后可以以本身已知的方式表达该核酸，以提供所需的本发明的ISVD。备选地，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列，可以分别设计所需的本发明的人源化或骆驼化ISVD的氨基酸序列，然后使用本身已知的肽合成技术从头合成。再次，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，可以分别设计编码所需的人源化或骆驼化的本发明的ISVD的核苷酸序列，然后使用本身已知的核酸合成技术从头合成，然后可以以本身已知的方式表达由此获得的核酸，从而提供所需的本发明的ISVD。
ISVD例如结构域抗体和纳米抗体(包括VHH结构域和人源化VHH结构域)也可以通过在一个或多个CDR的氨基酸序列中引入一个或多个改变来进行亲和力成熟，这种改变可导致与各自的亲本分子相比，所得ISVD对于其各自抗原的亲和力提高。本发明的亲和力成熟的ISVD分子可以通过本领域已知的方法来制备，例如，如Marks等人(Biotechnology 10:779-783,1992)，Barbas等人(Proc.Nat.Acad.Sci，USA 91:3809-3813,1994)，Shier等人(Gene 169:147-155，1995)，Yelton等人(Immunol.155:1994-2004,1995)，Jackson等人(J.Immunol.154:3310-9,1995)，Hawkins等人(J.Mol.Biol.226:889 896,1992)，Johnson和Hawkins(Affinity maturation of antibodies using phage display,OxfordUniversity Press,1996)所述。
从诸如VH、VL、VHH、结构域抗体或纳米抗体的ISVD开始，设计/选择和/或制备多肽的过程在本文中也被称为“格式化”所述ISVD；并且构成多肽部分的ISVD被称为被“格式化的”或以所述多肽的“格式”。基于本文公开内容，其中ISVD可以被格式化的方式的实例以及这样的格式的实例对于本领域技术人员将是清楚的；并且这种格式化的免疫球蛋白单可变结构域构成了本发明的另一方面。
优选的CDR在表A-2中描述。
特别地，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述特异性结合MMP13的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1是SEQ ID NO：8；和与SEQ ID NO：8具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2是SEQ ID NO：10；和与SEQ ID NO：10具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(iii)CDR3是SEQ ID NO：12；和与SEQ ID NO：12具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列。
特别地，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述特异性结合MMP13的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中CDR1是SEQ ID NO：8，CDR2是SEQ ID NO：10并且CDR3是SEQ ID NO：12。
特别地，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述特异性结合ADAMTS5的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1是SEQ ID NO：14[GRTVSSYAMG]；和与SEQ ID NO：14具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2是SEQ ID NO：16[GISRSAERTY]；和与SEQ ID NO：16具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(iii)CDR3是SEQ ID NO：18[DLDPNRIFSREEYAY]；和与SEQ ID NO：18具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列。
特别地，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述特异性结合ADAMTS5的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中CDR1是SEQ ID NO：14，CDR2是SEQ ID NO：16并且CDR3是SEQ ID NO：18。
特别地，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1是SEQ ID NO：19；和与SEQ ID NO：19具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2是SEQ ID NO：21；和与SEQ ID NO：21具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(iii)CDR3是SEQ ID NO：23；和与SEQ ID NO：23具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列。
特别地，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中CDR1为SEQ ID NO：19，CDR2是SEQ ID NO：21并且CDR3是SEQ ID NO：23。
特别地，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述特异性结合MMP13的ISVD是SEQID NO：2。
特别地，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述特异性结合ADAMTS5的ISVD是SEQ ID NO：3。
特别地，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD为SEQ ID NO：4。
在另一个优选的实施方案中，本发明的聚蛋白聚糖、ADAMTS5和/或MMP13结合物包含至少两个CDR1序列，至少两个CDR2序列和至少两个CDR3序列，各自独立地选自下表：
CDR1 CDR2 CDR3
SEQ ID NO:8(CDR1a) SEQ ID NO:10(CDR2a) SEQ ID NO:12(CDR3a)
SEQ ID NO:14(CDR1b) SEQ ID NO:16(CDR2b) SEQ ID NO:18(CDR3b)
SEQ ID NO:19(CDR1c) SEQ ID NO:21(CDR2c) SEQ ID NO:23(CDR3c)
在上述聚蛋白聚糖、ADAMTS5和/或MMP13结合物中，序列的顺序优选地是CDR1a-CDR2a-CDR3a-接头-CDR1b-CDR2b-CDR3b，其中接头是长于5个氨基酸的多肽，其适合于连接第一组CDR(CDR1a-CDR2a-CDR3a)至第二组(CDR1b-CDR2b-CDR3b)。优选地，接头选自下表C并且最优选地是具有根据SEQ ID NO：35的氨基酸序列的接头。在一个更优选的实施方案中，聚蛋白聚糖、ADAMTS5和/或MMP13结合物包含来自上表的所有九个CDR序列，其中CDR序列和接头多肽的顺序如下：CDR1a-CDR2a-CDR3a-接头1-CDR1b-CDR2b-CDR3b-接头2-CDR1c-CDR2c-CDR3c，其中接头1和接头2各自是至少5个氨基酸的多肽并且其中接头1和接头2的多肽序列彼此相同或彼此不同。优选地，接头1和接头2各自独立地选自下表C并且最优选地接头中的至少一个(优选两个)具有根据SEQ ID NO：35的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，本发明的聚蛋白聚糖、ADAMTS5和/或MMP13结合物优选地至少包含下表所列的CDR序列：
Figure BDA0002377170790000371
Figure BDA0002377170790000381
在前述实施方案中，CDR序列的顺序可以是CDR1a-CDR2a-CDR3a-接头1-CDR1b-CDR2b-CDR3b-接头2-CDR1c-CDR2c-CDR3c-接头3-CDR1d-CDR2d-CDR3d。其中，接头1、接头2和接头3各自是至少5个氨基酸的多肽并且其中接头1、接头2和接头3的多肽序列彼此相同或彼此不同。优选地，连接子1、连接子2和连接子3彼此独立地选自下表C并且最优选地接头的至少一个(优选所有三个)具有根据SEQ ID NO：35的氨基酸序列。理解在以上两个表的上下文中概述的优选实施方案中，CDR序列可以通过如本文别处所述的框架序列彼此连接并且优选地在这方面可以使用在表A-2中公开的那些框架序列。
应当理解，但不限于，本发明的免疫球蛋白单可变结构域可以用作制备多肽的“构件”，所述多肽可以可选地包含一个或多个另外的免疫球蛋白单可变结构域，其可以用作构件。
本领域需要更有效的疗法用于影响关节软骨的病症，例如骨关节炎。即使当关节内施用时，用于治疗受影响的软骨的大多数药物的滞留时间也不足。不受理论限制，本发明人假设可以通过将治疗药剂缀合至这样的部分来调控治疗药剂例如本发明的构建体、多肽和ISVD的功效，所述部分将药剂“锚定”在关节中并因此增加药剂保留，但不应破坏所述治疗药剂的功效(该部分在本文中也表示为“软骨锚定蛋白”或“CAP”)。通过降低毒性和副作用，这种锚定概念不仅可以调控药剂的功效，而且可以调控患病关节的操作特异性，从而扩大了可能的有用药剂的数量。
预期用于临床用途的分子的格式包括一个或两个构件，例如ISVD，其结合MMP13和/或ADAMTS5，和一个或多个构件，例如ISVD，具有这种保留作用模式，以及可能的其他部分。在本发明中证明了这种格式保留了MMP13和/或ADAMTS5结合和治疗作用，如抑制活性，以及保留特性。具有保留作用模式的一个或多个构件，例如ISVD，可以是在其中涉及MMP13和/或ADAMTS5的疾病(如关节炎疾病、骨关节炎、脊椎干骺端发育不良、腰椎间盘退变疾病、退行性关节疾病、类风湿性关节炎、剥离性骨软骨炎、聚蛋白聚糖病变)中具有保留作用的任何构件(“CAP构件”)。
“CAP构件”用于引导、锚定和/或保留其他构件，例如，治疗性构件，例如在所需位点的结合MMP13和/或ADAMTS5的ISVD，例如在关节中，其中所述其他构件，例如治疗性构件发挥其作用，例如结合和/或抑制MMP13和/或ADAMTS5。
再次不受理论的限制，本发明人进一步假设，尽管聚蛋白聚糖在影响关节软骨的多种病症中被严重糖基化和降解，但聚蛋白聚糖结合物，例如结合聚蛋白聚糖的ISVD，可能潜在地起着这样的锚的作用。而且，考虑到药剂进入临床之前所需的多种动物模型的成本和广泛测试，这种聚蛋白聚糖结合物应优选地具有宽的交叉反应性，例如聚蛋白聚糖结合物应与多种物种的聚蛋白聚糖结合。
使用多种巧妙的免疫、筛选和表征方法，本发明人能够鉴定具有优异的选择性、稳定性和特异性特征的多种聚蛋白聚糖结合物，其能够延长在关节中的保留和活性。
在一方面，本发明涉及用于减少和/或抑制组合物、多肽或构建体从关节流出的方法，其中所述方法包括施用药学上有效量的至少一个根据本发明的多肽、根据本发明的构建体或根据本发明的组合物提供给有此需要的人。
在本发明中，术语“减少和/或抑制流出”是指减少和/或抑制组合物、多肽或构建体从关节内向外流动。优选地，与在相同条件下但不存在本发明的聚蛋白聚糖结合物例如结合聚蛋白聚糖的ISVD的情况下前述组合物、多肽或构建体在关节中的流出相比，流出减少和/或抑制至少10％，例如至少20％、30％、40％或50％，或者甚至更多，例如至少60％、70％、80％、90％或甚至100％。
除了其中涉及MMP13和/或ADAMTS5的疾病，例如关节炎疾病，骨关节炎，脊椎干骺端发育不良，腰椎间盘退变疾病，退变性关节疾病，类风湿性关节炎，剥离性骨软骨炎和聚蛋白聚糖病变，预期本发明的聚蛋白聚糖结合物也可以用在影响软骨的多种其他疾病中，例如关节病和软骨营养不良，关节炎疾病(例如骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、银屑病关节炎、外伤性破裂或脱离)，软骨发育不全，肋软骨炎，脊椎干骺端发育不良，椎间盘突出症，腰椎间盘退变疾病，退化性关节疾病，和复发性多发性软骨炎(在本文中通常称为“聚蛋白聚糖相关疾病”)。
所述CAP构件，例如结合聚蛋白聚糖的ISVD，优选地结合软骨组织，例如软骨和/或半月板。在一个优选的方面，CAP构件对其他物种具有交叉反应性并且特异性结合人的聚蛋白聚糖(SEQ ID NO：68)、狗聚蛋白聚糖、牛聚蛋白聚糖、大鼠聚蛋白聚糖；猪聚蛋白聚糖；小鼠聚蛋白聚糖，兔聚蛋白聚糖；食蟹猴聚蛋白聚糖和/或恒河猴聚蛋白聚糖中的一种或多种。聚蛋白聚糖的相关结构信息可以例如以在上表B-3中描绘的(UniProt)登录号找到。
优选的CAP构件是结合聚蛋白聚糖，优选地人聚蛋白聚糖，优选地由表B所示的SEQID NO：68表示的人聚蛋白聚糖的ISVD。
因此，本发明涉及根据本发明的多肽或构建体，还包含至少一个CAP构件。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽或构建体，还包含至少一个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD，优选地所述ISVD由SEQ ID NO：4表示。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含至少2个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含至少2个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD，其中所述至少2个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD可以相同或不同。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含至少2个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD，其中所述至少2个特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD各自由SEQ ID NO：4表示。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD，其中所述特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD特异性结合人聚蛋白聚糖[SEQ ID NO：68]。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述ISVD特异性结合聚蛋白聚糖特异性结合人聚蛋白聚糖(SEQ ID NO：68)，狗聚蛋白聚糖，牛聚蛋白聚糖，大鼠聚蛋白聚糖，猪聚蛋白聚糖，小鼠聚蛋白聚糖，兔聚蛋白聚糖，食蟹猴聚蛋白聚糖和/或恒河猴聚蛋白聚糖。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD优选地结合软骨组织，例如软骨和/或半月板。
应当理解，本发明的ISVD、多肽和构建体优选地是稳定的。本发明的多肽、构建体或ISVD的稳定性可以通过本领域技术人员已知的常规测定法来测量。典型的测定法包括(但不限于)这样的测定法，其中确定所述多肽、构建体或ISVD的活性，然后在滑膜液中孵育所需的时间段，然后再次确定活性。
在一方面，本发明涉及本发明的ISVD、多肽或构建体，其在滑膜液(SF)中在37℃具有至少7天，例如至少14天，21天，1个月，2个月或甚至3个月的稳定性。
可以通过本领域技术人员已知的常规测定法测量治疗性构件例如本发明的多价多肽或构建体中结合MMP13和/或ADAMTS5的ISVD的所需活性。典型的测定法包括(但不限于)GAG释放测定法，如在实施例部分中详细描述的。
本发明的多肽(本文也称为“纳米抗体构建体”)选自下组：
(a)包含至少2个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)的多肽，其包含特异性结合聚蛋白聚糖的第一ISVD和特异性结合基质金属蛋白酶(MMP)的第二ISVD；
(b)包含至少2个ISVD的多肽，其包含特异性结合聚蛋白聚糖的第一ISVD和特异性结合具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶(ADAMTS)的第二ISVD；和
(c)包含至少3个ISVD的多肽，其包含特异性结合聚蛋白聚糖的第一ISVD，特异性结合ADAMTS的第二ISVD和特异性结合MMP的第三ISVD。
在本发明的多肽中，ISVD可以直接连接或通过接头连接。甚至更优选地，本发明的多肽包含C末端延伸。如将在本文中详细描述的，C末端延伸基本上防止/去除了人类受试者/患者的大多数样品中预先存在的抗体/因子的结合。C末端延伸存在于最后一个(位于最C末端)ISVD的最后一个氨基酸残基(通常是丝氨酸残基)的C-末端。
如下文进一步详述，ISVD可以衍生自VHH、VH或VL结构域，但是，选择ISVD使得它们在本发明的多肽中不形成VH和VL结构域的互补对。纳米抗体、VHH和人源化的VHH是不寻常的，因为它们衍生自没有轻链的天然骆驼科动物抗体，并且实际上这些结构域无法与骆驼科动物轻链连接以形成互补的VHH和VL对。因此，本发明的多肽不包含互补的ISVD和/或形成互补的ISVD对，例如互补的VH/VL对。
通常，包含或基本上由单个构件、单个ISVD或单个纳米抗体组成的多肽或构建体将分别称为“单价”多肽和“单价构建体”。包含两个或更多个构件(例如，ISVD)的多肽或构建体也称为“多价”多肽或构建体，并且在这种多肽或构建体中存在的构件/ISVD将在本文中也称为处于“多价格式”。例如，“二价”多肽可以包含两个ISVD，可选地通过接头序列连接，而“三价”多肽可以包含三个ISVD，可选地通过两个接头序列连接；而“四价”多肽可包含四个ISVD，可选通过三个接头序列连接，等等。
在多价多肽中，两个或更多个ISVD可以相同或不同，并且可以针对相同的抗原或抗原决定簇(例如针对相同的部分或表位或者针对不同的部分或表位)或者可以备选地针对不同的抗原或抗原决定簇；或者其任何合适的组合，例如针对聚蛋白聚糖。包含至少两个构件(例如ISVD)的多肽和构建体，其中至少一个构件针对第一抗原(例如聚蛋白聚糖)，而至少一个构件针对第二抗原(即，与聚蛋白聚糖不同，例如针对ADAMTS5)也将被称为“多特异性”多肽和构建体，并且在这种多肽和构建体中存在的构件(例如ISVD)在本文中也将被称为“多特异性格式”。因此，例如，本发明的“双特异性”多肽是包含至少一个针对第一抗原(例如聚蛋白聚糖)的ISVD和至少一个针对第二抗原(即，与聚蛋白聚糖不同，例如针对ADAMTS5)的另外ISVD的多肽，而本发明的“三特异性”多肽是包含至少一个针对第一抗原(即聚蛋白聚糖)的ISVD，至少一个针对第二抗原(即，与聚蛋白聚糖不同，例如针对ADAMTS5)的另外ISVD，和至少一个针对第三种抗原(即与与聚蛋白聚糖和ADAMTS5不同，例如针对MMP)的另外ISVD的多肽；等等。
在一方面，本发明涉及多肽，其包含2个ISVD，其中至少一个ISVD特异性结合MMP，优选地MMP13，更优选地所述一个ISVD由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示。
在一方面，本发明涉及多肽，其包含至少2个ISVD，其中至少一个ISVD特异性结合ADAMTS，优选地ADAMTS5，更优选地所述一个ISVD由SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示。
在一方面，本发明涉及多肽，其包含至少2个ISVD，其中至少一个ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，更优选地所述一个ISVD由SEQ ID NO：4的氨基酸序列表示。
“多互补位”多肽和“多互补位”构建体，例如“双互补位”多肽或构建体和“三互补位”多肽或构建体，包含或基本上由两个或更多个各自具有不同互补位的构件组成。
本发明的一个或多个ISVD可以用作这种多肽或构建体中的构件，从而分别提供本发明的单价、多价或多互补位多肽或构建体，全部如本文所述。
因此，本发明还涉及多肽或构建体，其分别是多价多肽或多价构建体，例如包含或基本由两个或更多个本发明的ISVD组成的二价或三价多肽或构建体(对于包含一个或多个VHH结构域的多价和多特异性多肽及其制备，也参考Conrath等人(J.Biol.Chem.276:7346-7350,2001)，以及例如WO 96/34103，WO 99/23221和WO 2010/115998)。
在另一方面，本发明的多价多肽或构建体可以是本发明的双特异性多肽或构建体，其包含针对聚蛋白聚糖的第一ISVD，例如纳米抗体，和针对第二抗原例如ADAMTS5或MMP13的第二ISVD，例如纳米抗体，其中所述第一和第二ISVD，例如纳米抗体，可以可选地通过接头序列(如本文所定义)连接；而本发明的多价多肽或构建体也可以是本发明的三特异性多肽或构建体，其包含针对ADAMTS5的第一ISVD，例如纳米抗体，针对第二抗原例如聚蛋白聚糖的第二ISVD，例如纳米抗体，和针对第三抗原例如MMP13的第三ISVD，例如纳米抗体，其中所述第一、第二和第三ISVD，例如纳米抗体，可以通过一个或多个，特别是两个接头序列，连接在一起。
本发明进一步涉及多价多肽，其包含或(基本上)由结合ADAMTS5，优选地人ADAMTS5的至少一个ISVD(或其合适的片段)，和一个另外的ISVD，例如结合聚蛋白聚糖的ISVD组成。
根据本发明的特别优选的二价、双特异性多肽或构建体和四价、三特异性多肽或构建体是本文所述的实施例和表A-1中所示的那些(例如SEQ ID NO：1、5、6、62、63或64)。
存在于本发明的多价多肽或构建物中的两个或更多个ISVD可以由轻链可变结构域序列(例如VL序列)或重链可变结构域序列(例如VH序列)组成；它们可以由衍生自常规四链抗体的重链可变结构域序列或衍生自重链抗体的重链可变结构域序列组成。在优选的方面，它们由结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸)，单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸)，“dAb”(或适合用作dAb的氨基酸)，
Figure BDA0002377170790000431
(包括但不限于VHH)，人源化的VHH序列，骆驼化的VH序列；或通过亲和力成熟获得的VHH序列组成。两个或更多个免疫球蛋白单可变结构域可以由部分地或完全地人源化的纳米抗体或者部分地或完全地人源化的VHH组成。
在一个特别优选的方面，本发明的多肽或构建体包含或基本上由四个或更多个ISVD组成，其中至少两个ISVD针对聚蛋白聚糖。应当理解，所述至少两个针对聚蛋白聚糖的ISVD可以相同或不同，可以针对聚蛋白聚糖的相同表位或不同表位，可以属于相同表位组或不同表位组，和/或可以结合聚蛋白聚糖的相同或不同结构域。
相对亲和力可以取决于ISVD在多肽中的位置。应当理解，可以根据本领域技术人员的需要选择本发明的多肽中的ISVD的顺序(方向)。各个ISVD的顺序以及多肽是否包含接头都是设计选择的问题。与其他方向相比，具有或不具有接头的某些方向可以提供优选的结合特性。例如，本发明的多肽中第一ISVD(例如ISVD 1)和第二ISVD(例如ISVD 2)的顺序可以是(从N末端到C末端)：(i)ISVD 1(例如纳米抗体1)-[接头]-ISVD 2(例如纳米抗体2)-[C-末端延伸]；或(ii)ISVD 2(例如，纳米抗体2)-[接头]-ISVD 1(例如纳米抗体1)-[C-末端延伸]；(其中方括号之间的部分，即接头和C端延伸是可选的)。本发明涵盖所有方向。可以通过常规筛选容易地鉴定包含提供期望的结合特征的ISVD的方向的多肽，例如在实施例部分中举例说明的。
以优选的顺序，结合聚蛋白聚糖的ISVD位于多肽的C-末端侧。特别优选的顺序是从N末端到C末端：结合ADAMTS5的ISVD-[接头]-结合聚蛋白聚糖的ISVD-[C末端延伸]，或结合MMP13的ISVD-[接头]-结合聚蛋白聚糖的ISVD-[C末端延伸]，其中方括号之间的部分是可选的。另一个特别优选的顺序是从N末端到C末端：结合ADAMTS5的ISVD-[接头]-结合聚蛋白聚糖的ISVD-[接头]-结合聚蛋白聚糖的ISVD-[C末端延伸]，或结合MMP13的ISVD-[接头]-结合聚蛋白聚糖的ISVD-[接头]-结合聚蛋白聚糖的ISVD-[C末端延伸]，其中方括号之间的部分是可选的。例如，优选的顺序是从N末端到C末端：结合MMP13的ISVD-[接头]-结合ADAMTS5的ISVD-[接头]-结合聚蛋白聚糖的ISVD-[C末端延伸]，其中方括号之间的部分是可选的。例如，特别优选的顺序是从N末端到C末端：结合MMP13的ISVD-[接头]-结合ADAMTS5的ISVD-[接头]-结合聚蛋白聚糖的ISVD-[接头]-结合聚蛋白聚糖的ISVD-[C末端延伸]，其中方括号之间的部分是可选的。
在另一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：1、5、6、62、63或64中的任一个具有至少80％、90％、95％或100％的序列同一性。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其选自SEQ ID NO：1(ALX-1011)、SEQID NO：5(MMP13-CAP-CAP)、和SEQ ID NO：6(ATS5-CAP-CAP)、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64。
在本发明的特定方面，与没有所述部分的本发明的相应构建体或多肽相比，本发明的构建体或多肽可具有赋予增加的半衰期的部分。基于本文的进一步公开，本发明的此类构建体和多肽的一些优选但非限制性的实例对于本领域技术人员将变得清楚，并且例如包含已被化学修饰以增加其半衰期(例如，通过聚乙二醇化)的本发明的ISVD或多肽；本发明的多肽或构建体，其包含至少一个用于结合血清蛋白(例如血清白蛋白)的另外的结合位点；或者包含至少一个本发明的ISVD的本发明的多肽，该ISVD与增加本发明的氨基酸序列的半衰期的至少一个部分(特别是至少一个氨基酸序列)连接。基于本文的进一步公开，包含此类半衰期延长部分或ISVD的本发明的构建体和本发明的多肽的实例对于本领域技术人员将变得清楚；并且例如包括但不限于多肽，其中本发明的一个或多个ISVD合适地连接至一个或多个血清蛋白或其片段(例如(人)血清白蛋白或其合适的片段)或者一个或多个可以结合血清蛋白的结合单位(例如结构域抗体、适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域，单结构域抗体，适合用作单结构域抗体的ISVD，dAb，适合用作dAb的ISVD或者可以结合血清蛋白例如血清白蛋白(例如人血清白蛋白)、血清免疫球蛋白(例如IgG)或转铁蛋白的纳米抗体；参考进一步说明和本文提及的参考文献)；其中本发明的氨基酸序列连接至Fc部分(例如人Fc)或者其合适部分或片段的多肽；或者其中本发明的一个或多个免疫球蛋白单可变结构域适当地连接至一个或多个可结合血清蛋白的小蛋白或肽的多肽，例如WO91/01743、WO 01/45746、WO 02/076489、WO2008/068280、WO2009/127691和PCT/EP2011/051559中所述的蛋白和肽。
在一方面，本发明提供了本发明的多肽和构建体，其中所述构建体或所述多肽还包含血清蛋白结合部分或血清蛋白。优选地，所述血清蛋白结合部分结合血清白蛋白，例如人血清白蛋白。
在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含结合血清白蛋白的ISVD。
通常，具有增加的半衰期的本发明的构建体或多肽优选地具有的半衰期是本发明相应的构建体或多肽本身(即没有赋予增加的半衰期的部分)的半衰期的至少1.5倍，优选地至少2倍，例如至少5倍，例如至少10倍或大于20倍。例如，与本发明的相应的构建体或多肽本身(即不具有赋予增加的半衰期的部分)相比，具有增加的半衰期的本发明的构建体或多肽可以具有半衰期例如在人中增加大于1小时，优选地大于2小时，更优选地大于6小时，例如大于12小时，或甚至大于24、48或72小时。
在本发明的一个优选的方面，与本发明的相应的构建体或多肽本身(即不具有赋予增加的半衰期的部分)相比，本发明的构建体和本发明的多肽具有血清半衰期例如在人中增加大于1小时，优选地大于2小时，更优选大于6小时，例如大于12小时，或甚至大于24、48或72小时。
在本发明的另一个优选的方面，本发明的此类构建体和多肽显示在人中的血清半衰期是至少约12小时，优选地至少24小时，更优选地至少48小时，甚至更优选地至少72小时或更多。例如，本发明的构建体或多肽具有半衰期是至少5天(例如约5至10天)，优选地至少9天(例如约9至14天)，更优选地至少约10天(例如约10至15天)，或至少约11天(例如约11至16天)，更优选地至少约12天(例如约12至18天或更多)，或大于14天(例如大约14到19天)。
在本发明的一个特别优选的方面，本发明提供了本发明的构建体和本发明的多肽，其包含除了一个或多个结合聚蛋白聚糖的构件和一个或多个结合ADAMTS5和/或MMP13构件，至少一个结合血清白蛋白的构件，例如结合血清白蛋白例如本文所述的人血清白蛋白的ISVD。优选地，所述结合血清白蛋白的ISVD包含或基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中CDR1是SFGMS，CDR2是SISGSGSDTLYADSVKG，并且CDR3是GGSLSR。优选地，所述结合人血清白蛋白的ISVD选自Alb8、Alb23、Alb129、Alb132、Alb11、Alb11(S112K)-A、Alb82、Alb82-A、Alb82-AA、Alb82-AAA、Alb82-G、Alb82-GG、Alb82-GGG、Alb92或Alb223(参见表D)。
在一个实施方案中，本发明涉及本发明的构建体，例如包含血清蛋白结合部分的多肽，其中所述血清蛋白结合部分是非基于抗体的多肽。
在一方面，本发明涉及如本文所述的构建体，其包含至少一个ISVD或多肽和一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元。一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元优选地选自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可以结合血清蛋白的结合单元、Fc部分和可以结合血清蛋白的小蛋白或肽、其他氨基酸残基、标签或其他功能部分结合，例如毒素、标签、放射化学物质等。
在一个实施方案中，如下文所述，本发明涉及本发明的构建体，例如包含赋予半衰期延长的部分的多肽，其中所述部分是PEG。因此，本发明还涉及包含PEG的本发明的构建体或多肽。
所述另外的氨基酸残基可以或可以不改变、更改或以其他方式影响本发明的多肽的其他(生物学)性质，并且可以或可以不向本发明的多肽添加其他功能性。例如，这样的氨基酸残基：
a)可以包含N末端Met残基，例如作为在异源宿主细胞或宿主生物中表达的结果。
b)可以形成信号序列或前导序列，其指导合成后从宿主细胞分泌多肽(例如，根据用于表达本发明多肽的宿主细胞的不同，提供本发明多肽的前、原或前原形式)。合适的分泌前导肽对技术人员将是清楚的，并且可以如本文进一步描述。通常，这种前导序列将与多肽的N-末端连接，尽管本发明在最广泛的意义上不限于此。
c)可以形成“标签”，例如允许或促进多肽纯化的氨基酸序列或残基，例如使用针对所述序列或残基的亲和技术。此后，可以除去所述序列或残基(例如通过化学或酶促裂解)以提供多肽(为此目的，标签可以可选地通过可裂解的接头序列或包含可裂解的基序而连接至氨基酸序列或多肽序列)。这种残基的一些优选但非限制性实例是多个组氨酸残基、谷胱甘肽残基和myc标签例如AAAEQKLISEEDLNGAA；
d)可以是已经被官能化和/或可以用作附着官能团的位点的一个或多个氨基酸残基。合适的氨基酸残基和官能团对本领域技术人员将是清楚的，并且包括但不限于本文中针对本发明的多肽的衍生物提及的氨基酸残基和官能团。
本发明还包括包含本发明的多肽和/或ISVD的构建体，其还包含其他功能性部分，例如毒素、标签、放射化学物质等。
其他基团、残基、部分或结合单元可以是例如化学基团、残基、部分，其本身可以具有或可以不具有生物学和/或药理学活性。例如但不限于，这样的基团可与本发明的一个或多个ISVD或多肽连接，以提供本发明的多肽或构建体的“衍生物”。
因此，本发明在其最广泛的意义上还包括作为本发明的构建体和/或多肽的衍生物的构建体和/或多肽。这样的衍生物通常可通过对本发明的构建体和/或多肽和/或形成本发明多肽的一个或多个氨基酸残基进行修饰，特别是通过化学和/或生物学(例如，酶促)修饰而获得。
这样的修饰的实例，以及可以以这种方式(即在蛋白质主链上，但优选地在侧链上)修饰的多肽序列内氨基酸残基的实例，可用于引入这样的修饰的方法和技术以及这样的修饰的潜在用途和优点对本领域技术人员将是清楚的(还参见Zangi等人,NatBiotechnol 31(10):898-907,2013)。
例如，这样的修饰可涉及将一个或多个(官能)基团、残基或部分(例如，通过共价连接或以任何其他合适的方式)引入本发明的多肽中或上，并且特别是赋予本发明的构建体和/或多肽以一种或多种所需特性或功能的一个或多个官能团、残基或部分。这样的官能团的实例对于技术人员将是清楚的。
例如，这种修饰可以包括引入(例如，通过共价结合或以任何其他合适的方式)一个或多个功能部分，其增加本发明的构建体或多肽的半衰期、溶解度和/或吸收，降低本发明的构建体或多肽的免疫原性和/或毒性，消除或减弱本发明的构建体或多肽的任何不良副作用，和/或赋予其他有利的特性和/或降低本发明的构建体或多肽的不良性质；或上述两个或更多个的任意组合。这样的功能性部分和用于引入它们的技术的实例对于技术人员将是清楚的，并且通常可以包括上文引用的一般背景技术中提及的所有功能性部分和技术，以及本身已知的用于修饰药物蛋白，特别是用于修饰抗体或抗体片段(包括ScFv和单结构域抗体)的功能性部分和技术，例如可参考Remington(Pharmaceutical Sciences，16thed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1980)。这样的功能性部分可以例如直接(例如共价地)连接至本发明的多肽，或可选地通过合适的接头或间隔子连接，这对于本领域技术人员将是清楚的。
一个具体实例是本发明的衍生多肽或构建体，其中本发明的多肽或构建体已被化学修饰以增加其半衰期(例如，通过聚乙二醇化)。这是增加药物蛋白的半衰期和/或降低其免疫原性的最广泛使用的技术之一，并且包括附着合适的药理学可接受的聚合物，例如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。通常，可以使用任何合适形式的聚乙二醇化，例如本领域中用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv)的聚乙二醇化；参考例如Chapman(Nat.Biotechnol.54:531-545,2002)，Veronese和Harris(Adv.Drug Deliv.Rev.54:453-456,2003)，Harris和Chess(Nat.Rev.Drug.Discov.2:214-221,2003)和WO 04/060965。用于蛋白质聚乙二醇化的多种反应剂也是可商购的，例如购自美国的Nektar Therapeutics。
优选地，使用定点聚乙二醇化，特别是通过半胱氨酸残基(参见例如Yang等人(Protein Engineering 16:761-770,2003)。例如，为此目的，PEG可以附着至天然存在于本发明的多肽中的半胱氨酸残基，可以修饰本发明的构建体或多肽以适当地引入一个或多个半胱氨酸残基用于PEG的附着，或者将包含用于PEG附着的一个或多个半胱氨酸残基的氨基酸序列融合到本发明的构建体或多肽的N-和/或C-末端，都使用本身是本领域技术人员已知的蛋白质工程改造的技术。
优选地，对于本发明的构建体或多肽，使用分子量大于5000，例如大于10,000并且小于200,000，例如小于100,000，例如在20,000-80,000范围内的PEG。
另一个通常次级优选的修饰包括N-连接或O-连接的糖基化，通常作为共翻译和/或翻译后修饰的一部分，这取决于用于表达本发明多肽的宿主细胞。
根据本发明的多肽或构建体的预期用途，另一种修饰可以包括引入一个或多个可检测的标签或其他产生信号的基团或部分。合适的标签以及用于附着、使用和检测它们的技术对于技术人员将是清楚的，并且例如包括但不限于荧光标签(例如荧光素、异硫氰酸盐、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯甲醛以及荧光胺和荧光金属例如152Eu或镧系元素中的其他金属)，磷光标签，化学发光标签或生物发光标签(例如，鲁米诺、异鲁米诺、热吖啶鎓酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶鎓盐、草酸酯、二氧杂环丁烷或GFP及其类似物)，放射性同位素(例如3H、125I、32P、35S、14C、51Cr、36Cl、57Co、58Co、59Fe和75Se)，金属，金属螯合物或金属阳离子(例如金属阳离子，例如99mTc、123I、111In、131I、97Ru、67Cu、67Ga和68Ga或者其他特别适用于体内、体外或原位诊断和成像的金属或金属阳离子，例如(157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe))，以及生色团和酶(例如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-甾族异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸三糖异构酶、生物素亲和素蛋白过氧化物酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶)。其他合适的标签对于技术人员将是清楚的，并且例如包括可以使用NMR或ESR光谱法检测的部分。
这样标记的本发明的多肽和构建体也可以例如用于体外、体内或原位测定法(包括本身已知的免疫测定法，例如ELISA、RIA、EIA和其他“夹心测定法”等)以及体内诊断和成像的目的，取决于特定标签的选择。
如本领域技术人员将清楚的，另一种修饰可以包括引入螯合基团，例如以螯合上述金属或金属阳离子中的一种。合适的螯合基团例如包括但不限于二乙撑三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
另一修饰可以包括引入功能部分，其是特异性结合对的一部分，例如生物素-(链)亲和素结合对。这种功能部分可用于将本发明的多肽与结合至结合对的另一半的另一个蛋白质、多肽或化合物连接，即通过形成结合对。例如，本发明的构建体或多肽可以与生物素缀合，并与与亲和素或链霉亲和素缀合的另一种蛋白质、多肽、化合物或载体连接。例如，这种缀合的本发明的构建体或多肽可以用作报告子，例如在诊断系统中，其中可检测的信号产生剂与亲和素或链霉亲和素缀合。这样的结合对还可例如用于将本发明的构建体或多肽与载体结合，所述载体包括适合于药学目的的载体。一个非限制性实例是由Cao和Suresh(Journal of Drug Targeting 8:257,2000)描述的脂质体制剂。这样的结合对还可用于将治疗活性剂连接至本发明的多肽。
其他潜在的化学和酶修饰对技术人员将是清楚的。也可以出于研究目的(例如，研究功能-活动关系)引入这样的修饰。参考例如Lundblad和Bradshaw(Biotechnol.Appl.Biochem.26:143-151,1997)。
优选地，构建体、多肽和/或衍生物使得它们以本文定义的(例如，如针对本发明的多肽所定义的)亲和力(适当地测量和/或表达为KD值(实际或表观)、KA值(实际或表观)，kon-速率或结合速率和/或koff-速率或解离速率，或备选地以IC50值，如本文进一步描述的)结合聚蛋白聚糖和ADAMTS5和/或MMP13。
本发明的这样的构建体和/或多肽及其衍生物也可以是基本上分离的形式(如本文所定义)。
在一方面，本发明涉及本发明的构建体，其包含或基本上由根据本发明的ISVD或根据本发明的多肽组成，并且还包含一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元，其可选地通过一个或多个肽接头连接。
在一方面，本发明涉及本发明的构建体，其中一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段，可以结合血清蛋白的结合单元、Fc部分和可以结合血清蛋白的小蛋白或肽。
在本发明的构建体，例如本发明的多肽中，两个或更多个构件，例如ISVD，和可选的一个或多个其他基团、药剂、试剂、残基、部分或结合单元可以彼此直接连接(例如，如WO99/23221中所述)和/或可以通过一个或多个合适的间隔子或接头彼此连接，或其任何组合。用于多价和多特异性多肽的合适的间隔子或接头对本领域技术人员将是清楚的，并且通常可以是本领域中用于连接氨基酸序列的任何接头或间隔子。优选地，所述接头或间隔子适合用于构建旨在用于药学用途的构建体、蛋白质或多肽。
例如，本发明的多肽可以是例如三价、三特异性多肽，包含一个构件，例如结合聚蛋白聚糖的ISVD，结合ADAMTS5的ISVD，以及潜在地另一个构件，例如结合MMP13的第三ISVD，其中所述第一、第二和第三构件，如ISVD，可以可选地通过一个或多个，并且特别是2个接头序列连接。而且，本发明提供了本发明的构建体或多肽，其包含结合聚蛋白聚糖的第一ISVD和可能地结合聚蛋白聚糖的第二ISVD和/或可能地第三ISVD ADAMTS5和/或可能地结合MMP13的第四ISVD，其中所述第一ISVD和/或所述第二ISVD和/或可能地所述第三ISVD和/或可能地所述第四ISVD经由接头连接，特别是3个接头。
一些特别优选的接头包括本领域中用来连接抗体片段或抗体结构域的接头。这些包括上文引用的一般背景技术中提及的接头，以及例如本领域中用于构建双抗体或ScFv片段的接头(然而，在这方面，应注意，尽管在双抗体和ScFv片段中，所用的接头序列应具有一定长度、一定程度的柔韧性和其他特性，以使相关的VH和VL结构域结合在一起形成完整的抗原结合位点，对在本发明的多肽中使用的接头的长度或柔韧性没有特殊限制，因为每个ISVD，如纳米抗体，其本身形成完整的抗原结合位点)。
例如，接头可以是合适的氨基酸序列，并且特别是1至50，优选地1至30，例如1至10个氨基酸残基的氨基酸序列。这样的氨基酸序列的一些优选实例包括gly-ser接头，例如(glyxsery)2类型，例如(例如(gly4ser)3或(gly3ser2)3，如WO 99/42077中所述和在本文提及的Ablynx的申请中描述的GS30、GS15、GS9和GS7接头(参见例如WO 06/040153和WO 06/122825)，以及铰链样区域，例如天然存在的重链抗体的铰链区或类似序列(如WO 94/04678中所述)。表C中描述了优选的接头。
一些特别优选的接头是GS9(也参见WO 06/122825中的SEQ ID NO:84)和GS35，以及聚丙氨酸(例如AAA)和接头GS30(也参见WO 06/122825中的SEQ ID NO：85)。
其他合适的接头通常包含有机化合物或聚合物，特别是适合用于药学用途的蛋白质的那些。例如，聚(乙二醇)部分已用于连接抗体结构域，参见例如WO 04/081026。
在本发明的范围内包括所用接头的长度、柔韧性的程度和/或其他性质(尽管不是关键性的，因为通常对于ScFv片段中所用的接头而言)可能对本发明的最终构建体例如本发明的多肽的性质有一定影响，包括但不限于对趋化因子或对一个或多个其他抗原的亲和力、特异性或亲合力。基于本文的公开内容，技术人员将能够可选地在一些有限的常规实验之后，确定用于本发明的特定构建体例如本发明的多肽的最佳接头。
例如，在包含针对聚蛋白聚糖和另一个靶标例如ADAMTS5和/或MMP13的构件、ISVD或纳米抗体的本发明的多价多肽中，接头的长度和柔韧性优选地使得其允许在多肽中存在的本发明的每个构件例如ISVD结合其同源靶标，例如每个靶标上的抗原决定簇。再次，基于本文的公开内容，本领域技术人员将能够可选地在一些有限的常规实验之后确定用于本发明的特定构建体例如本发明的多肽的最佳接头。
也在本发明的范围内，所使用的接头为本发明的构建体例如本发明的多肽赋予一种或多种其他有利的性质或功能性，和/或为衍生物的形成和/或为官能团的附着提供一个或多个位点(例如，如本文针对本发明的ISVD的衍生物所述)。例如，含有一个或多个带电荷的氨基酸残基的接头可以提供改善的亲水性，而形成或含有小的表位或标签的接头可以用于检测、鉴定和/或纯化的目的。再次，基于本文的公开内容，本领域技术人员将能够可选地在一些有限的常规实验之后确定用于本发明的特定多肽的最佳接头。
最后，当在本发明的构建体例如多肽中使用两个或更多个接头时，这些接头可以相同或不同。再次，基于本文的公开内容，本领域技术人员将能够可选地在一些有限的常规实验之后确定用于本发明的特定构建体或多肽的最佳接头。
通常，为了易于表达和生产，本发明的构建体，例如本发明的多肽，将是线性多肽。然而，本发明在最广泛的意义上不限于此。例如，当本发明的构建体，例如本发明的多肽，包含三个或更多个构件、ISVD或纳米抗体时，可以通过使用具有三个或更多个“臂”的接头将它们连接起来，其中每个“臂”连接至构件、ISVD或纳米抗体，从而提供“星形”构建体。尽管通常次级优选，但也可以使用环形构建体。
因此，本发明涉及本发明的构建体，例如本发明的多肽，其中所述ISVD彼此直接连接或通过接头连接。
因此，本发明涉及本发明的构建体，例如本发明的多肽，其中第一ISVD和/或第二ISVD和/或可能地结合血清白蛋白的ISVD通过接头连接。
因此，本发明涉及本发明的构建体，例如本发明的多肽，其中所述接头选自9GS、35GS、3A、5GS、7GS、10GS、15GS、18GS、20GS、25GS、30GS、poly-A,8GS、40GS、G1铰链、9GS-G1铰链、美洲驼上长铰链区域和G3铰链的接头，例如表C中所示(SEQ ID NO：28、35、24-27、29-34和36-40)。
因此，本发明涉及本发明的构建体，例如本发明的多肽，其中所述多肽选自SEQ IDNO：62-64、1、5和6。
本发明进一步涉及用于制备本文所述的构建体、多肽、ISVD、核酸、宿主细胞和组合物的方法。
本发明的多价多肽通常可以通过这样的方法来制备，该方法至少包括以下步骤：将本发明的ISVD和/或单价多肽适当地连接至一个或多个另外的ISVD，可选地经由一个或多个合适的接头，以便提供本发明的多价多肽。本发明的多肽还可以通过这样的方法来制备，该方法通常至少包括以下步骤：提供编码本发明多肽的核酸，以合适的方式表达所述核酸，并回收表达的本发明多肽。这样的方法可以以本身已知的方式执行，这对于本领域技术人员来说是清楚的，例如基于本文进一步描述的方法和技术。
制备本发明的多价多肽的方法可以至少包括以下步骤：以合适的方式将两个或更多个本发明的ISVD和例如一个或多个接头连接在一起。本发明的ISVD(和接头)可以通过本领域已知的和本文进一步描述的任何方法缀合。优选的技术包括连接编码本发明的ISVD(和接头)的核酸序列以制备表达多价多肽的遗传构建体。连接氨基酸或核酸的技术对技术人员将是清楚的，并且再次参考标准手册，例如上面提到的Sambrook等人和Ausubel等人，以及下面的实施例。
因此，本发明还涉及本发明的ISVD在制备本发明的多价多肽中的用途。制备多价多肽的方法将包括本发明的ISVD与至少一个本发明的另外的ISVD的连接，可选地经由一个或多个接头。然后，本发明的ISVD在提供和/或制备包含2个(例如，在二价多肽中)、3个(例如，三价多肽)、4个(例如，四价)或更多个(例如，在多价多肽中)构件的多价多肽中用作结合结构域或构件。在这方面，本发明的ISVD可用作提供和/或制备包含2、3、4或更多个构件的本发明的多价，例如二价、三价或四价多肽的结合结构域或结合单元。
因此，本发明还涉及本发明的ISVD多肽(如本文所述)在制备多价多肽中的用途。制备多价多肽的方法将包括本发明的ISVD与至少一个本发明的另外的ISVD的连接，可选地经由一个或多个接头。
本领域技术人员从本文的进一步描述中可以清楚地理解，可以以本身已知的方式制备本发明的多肽和核酸。例如，可以以本身已知的、用于制备抗体，特别是用于制备抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的任何方式来制备本发明的多肽。用于制备多肽和核酸的一些优选但非限制性的方法包括本文所述的方法和技术。
用于产生本发明的多肽的方法可以包括以下步骤：在合适的宿主细胞或宿主生物(在本文中也称为“本发明的宿主”)中或在编码所述的本发明的多肽的核酸的另一合适的表达系统(在本文中也称为“本发明的核酸”)中表达；可选地，随后分离和/或纯化由此获得的本发明的多肽。
特别地，这种方法可以包括以下步骤：在使得所述的本发明的宿主表达和/或产生至少一个本发明的多肽的条件下培养和/或维持本发明的宿主；可选地，随后分离和/或纯化由此获得的本发明的多肽。
因此，本发明还涉及编码本发明的多肽、ISVD或构建体的核酸或核苷酸序列(也称为“本发明的核酸”)。
本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式。根据本发明的一个实施方案，本发明的核酸基本上分离的形式，如本文所定义的。本发明的核酸也可以是载体的形式，存在于载体中和/或作为载体的一部分，载体例如表达载体，例如质粒、粘粒或YAC，它们也可以基本上是分离的形式。因此，本发明还涉及包含本发明的核酸或核苷酸序列的表达载体。
基于本文给出的关于本发明的多肽的信息，可以以本身已知的方式制备或获得本发明的核酸，和/或可以从合适的天然来源分离。同样，如本领域技术人员将清楚的那样，为了制备本发明的核酸，还可以将几个核苷酸序列，例如至少两个编码本发明的ISVD的核酸和例如编码一个或多个接头的核酸以适当的方式连接一起。产生本发明的核酸的技术对于技术人员将是清楚的，并且可以例如包括但不限于自动化DNA合成；定点诱变；组合两个或更多个天然存在的和/或合成的序列(或者其两个或更多个部分)，引入导致截短的表达产物表达的突变；引入一个或多个限制酶切位点(例如，使用合适的限制酶容易产生易被消化和/或连接的盒和/或区域)，和/或通过使用一种或多种“错配”引物的PCR反应引入突变。这些和其他技术对于本领域技术人员将是清楚的，并且再次参考标准手册，例如上文提到的Sambrook等人和Ausubel等人，以及下面的实施例。
在优选但非限制性的实施方案中，本发明的遗传构建体包含
a)至少一个本发明的核酸；
b)可操作地连接至一个或多个调节元件，例如启动子和可选地合适的终止子；并且还可选地
c)本身已知的遗传构建体的一个或多个其他元件；
其中术语“调节元件”、“启动子”、“终止子”和“可操作地连接”具有其在本领域中通常的含义。
通常可以通过将本发明的核苷酸序列与上述一个或多个其他元件适当地连接来提供本发明的遗传构建体，例如使用一般手册中描述的技术，例如上文提到的Sambrook等人和Ausubel等人。
本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可用于转化宿主细胞或宿主生物，即用于表达和/或产生本发明的多肽。合适的宿主或宿主细胞对技术人员将是清楚的，并且可以是例如任何合适的真菌、原核或真核细胞或细胞系或者任何合适的真菌、原核或(非人)真核生物以及所有其他宿主细胞或(非人)宿主，它们本身已知用于表达和产生抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)，这对技术人员将是清楚的。还参考了上文引用的一般背景技术，以及例如WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken等人(Res Immunol.149:589-99,1998)；Riechmann和Muyldermans(1999)，同上；van derLinden(J.Biotechnol.80:261-70,2000)；Joosten等人(Microb.Cell Fact.2:1,2003)；Joosten等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.66:384-92,2005)；以及本文引用的其他参考文献。此外，本发明的多肽还可以在无细胞表达系统中表达和/或产生，并且这样的系统的合适实例对技术人员将是清楚的。转化本发明的宿主或宿主细胞的合适技术对技术人员将是清楚的，并且可以取决于预期的宿主细胞/宿主生物和所使用的遗传构建体。再次参考上述手册和专利申请。转化的宿主细胞(可以是稳定的细胞系的形式)或宿主生物(可以是稳定的突变体系或菌株的形式)构成了本发明的其他方面。因此，本发明涉及包含根据本发明的核酸或根据本发明的表达载体的宿主或宿主细胞。优选地，这些宿主细胞或宿主生物使得它们表达或(至少)能够表达(例如在合适的条件下)本发明的多肽(并且在宿主生物的情况下：在其至少一个细胞、部分、组织或器官中)。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物的另外的世代、子代和/或后代，其可以例如通过细胞分裂或者通过有性或无性繁殖获得。
为了产生/获得本发明的多肽的表达，通常可以在表达/产生本发明的(期望的)多肽的条件下保持、维持和/或培养转化的宿主细胞或转化的宿主生物。合适的条件对技术人员将是清楚的，并且通常取决于所用的宿主细胞/宿主生物，以及取决于控制本发明(相关)核苷酸序列表达的调节元件。再次，参考以上关于本发明的遗传构建体的段落中提到的手册和专利申请。
然后可以使用本身已知的蛋白质分离和/或纯化技术，例如(制备性)层析和/或电泳技术、差异沉淀技术、亲和力技术(例如，使用与本发明的多肽融合的特异的、可裂解的氨基酸序列)和/或制备性免疫技术(即，使用针对待分离的多肽的抗体)，从宿主细胞/宿主生物和/或从其中培养所述宿主细胞或宿主生物的培养基中分离本发明的多肽。
在一方面，本发明涉及生产根据本发明的构建体、多肽或ISVD的方法，其至少包括以下步骤：(a)在合适的宿主细胞或宿主生物或另一合适的表达系统中表达根据本发明的核酸序列；可选地，随后是(b)分离和/或纯化根据本发明的构建体、多肽ISVD。
在一方面，本发明涉及包含根据本发明的构建体、多肽、ISVD或核酸的组合物。
如上所述，仍然需要安全有效的OA药物。首先，本发明人鉴定了非常有效的软骨锚定蛋白，即结合聚蛋白聚糖的ISVD，其用作构件来工程改造还结合ADAMTS5和/或MMP13的分子。所得分子在受试者内的保留增加并且可以全身施用同时保持活性。本发明人随后证明，ADAMTS5抑制剂和MMP13抑制剂的组合与单独抑制任一靶标相比在改善OA方面更有效。此外，也证明了本发明的多肽和构建体比现有技术化合物显著更有效。
本发明因此提供了与现有技术核酸分子和抗体相比，具有改善的预防、治疗和/或药理学特性，包括更安全的特征的化合物、构建体和/或多肽。
在一方面，本发明涉及在个体中治疗或预防疾病或病症的方法，例如其中涉及ADAMTS5和/或MMP13活性，所述方法包括以有效治疗或预防所述疾病或病症(的症状)的量施用根据本发明的组合物、多肽和/或构建体给所述个体。
在一方面，本发明涉及根据本发明的组合物、根据本发明的多肽和/或根据本发明的构建体，用作药物。
在另一方面，本发明涉及根据本发明的组合物、多肽和/或构建体在制备用于预防和/或治疗至少ADAMTS5和/或MMP13相关疾病例如OA的药物组合物中的用途；和/或用于本文提及的一种或多种治疗方法。
本发明还涉及本发明的组合物、多肽和/或构建体在制备用于预防和/或治疗至少一种疾病或病症的药物组合物中的用途，可以通过调控ADAMTS，优选地抑制ADAMTS5的活性来预防和/或治疗所述疾病或病症。
本发明还涉及根据本发明的组合物、多肽和/或构建体在制备用于预防和/或治疗至少一种疾病或病症的药物组合物中的用途，可以通过调控MMP的活性，优选地抑制MMP13的活性来预防和/或治疗所述疾病或病症。
本发明还涉及本发明的ISVD、多肽、组合物和/或构建体在制备用于预防和/或治疗至少一种疾病、病症或病况的药物组合物中的用途，可以通过向患者施用本发明的ISVD、多肽、组合物和/或构建体来预防和/或治疗所述疾病、病症或病况。
本发明进一步涉及本发明的ISVD、组合物、多肽和/或构建体或者包含其的药物组合物，用于预防和/或治疗至少AMDAMTS5相关疾病和/或MMP13相关疾病。
预期本发明的AMDAMTS5结合物可用于多种影响软骨的疾病，例如关节病和软骨营养不良，关节炎疾病，例如骨关节炎，类风湿性关节炎，痛风性关节炎，银屑病关节炎，外伤性破裂或脱离，软骨发育不全，肋软骨炎，脊椎干骺端发育不良，椎间盘突出症，腰椎间盘退变疾病，退变性关节疾病，和复发性多发性软骨炎，剥离性骨软骨炎和聚蛋白聚糖病变和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)(在本文中通常称为“ADAMTS5相关疾病”)，优选地OA。
预期本发明的MMP13结合物可以用于多种影响软骨的疾病，例如关节炎和软骨营养不良，关节炎疾病，例如骨关节炎，类风湿性关节炎，痛风性关节炎，银屑病性关节炎，外伤性破裂或脱离，软骨发育不全，肋软骨炎，脊椎干骺端发育不良，椎间盘突出症，腰椎间盘退变疾病，退变性关节疾病，复发性多发性软骨炎，剥离性骨软骨炎、聚蛋白聚糖病变、慢性牙周炎和腹主动脉瘤(在本文中通常称为“MMP13相关疾病”)，优选地OA。
在一方面，本发明涉及根据本发明的组合物、ISVD、多肽和/或构建体，用于治疗或预防ADAMTS5相关疾病和/或MMP13相关疾病的症状，ADAMTS5相关疾病和/或MMP13相关疾病例如是关节炎和软骨营养不良，关节炎疾病，例如骨关节炎，类风湿性关节炎，痛风性关节炎，银屑病性关节炎，外伤性破裂或脱离，软骨发育不全，肋软骨炎，脊椎干骺端发育不良，椎间盘突出症，腰椎间盘退变疾病，退变性关节疾病，复发性多发性软骨炎，剥离性骨软骨炎、聚蛋白聚糖病变、NASH、慢性牙周炎和腹主动脉瘤，优选地OA。
在一个方面，本发明涉及预防或治疗关节炎和软骨营养不良，关节炎疾病，例如骨关节炎，类风湿性关节炎，痛风性关节炎，银屑病性关节炎，外伤性破裂或脱离，软骨发育不全，肋软骨炎，脊椎干骺端发育不良，椎间盘突出症，腰椎间盘退变疾病，退变性关节疾病，复发性多发性软骨炎，剥离性骨软骨炎、聚蛋白聚糖病变、NASH、慢性牙周炎和腹主动脉瘤，优选地OA的方法，其中所述方法包括向有此需要的受试者施用药学活性量的至少一个根据本发明的组合物、免疫球蛋白、多肽和/或构建体提供给有此需要的人。
在一个方面，本发明涉及本发明的ISVD、多肽、组合物和/或构建体在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物组合物中的用途，所述疾病或病症例如是关节炎和软骨营养不良，关节炎疾病，例如骨关节炎，类风湿性关节炎，痛风性关节炎，银屑病性关节炎，外伤性破裂或脱离，软骨发育不全，肋软骨炎，脊椎干骺端发育不良，椎间盘突出症，腰椎间盘退变疾病，退变性关节疾病，复发性多发性软骨炎，剥离性骨软骨炎、聚蛋白聚糖病变、NASH、慢性牙周炎和腹主动脉瘤，优选地OA。
还预期通过结合聚蛋白聚糖，本发明的ISVD、构建体和/或多肽可以降低或抑制丝氨酸蛋白酶家族的成员，组织蛋白酶，基质金属蛋白酶(除MMP13以外的MMP)，例如MMP20，但是以及ADAMTS4(聚蛋白聚糖酶-1)和/或ADAMTS11降解聚蛋白聚糖的活性。
在本发明的上下文中，术语“预防和/或治疗”不仅包括预防和/或治疗疾病，而且通常还包括预防疾病的发作，减慢或逆转疾病的进展，预防或减慢与疾病有关的一种或多种症状的发作，减轻和/或缓解与疾病有关的一种或多种症状，减少疾病和/或与其有关的任何症状的严重性和/或持续时间，和/或预防疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度进一步增加，预防、减少或逆转由疾病引起的任何生理损害，以及通常有益于在治疗患者的任何药理作用。
剂量方案将由主治医师和临床因素决定。如医学领域众所周知的，任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的身材、体重、体表面积、年龄，待施用的特定化合物，所用多肽(包括抗体)的活性，施用的时间和途径，总体健康状况以及与其他疗法或疗法的组合。蛋白质性药物活性物质的存在量是每剂量1g至100mg/kg体重；然而，也可以设想低于或高于该示例性范围的剂量。如果方案是连续输注，则其范围可以是每分钟每公斤体重1pg至100mg。
本发明的ISVD、多肽或构建体可以以例如0.01、0.1、0.5、1、2、5、10、20或50pg/ml的浓度使用，以抑制和/或中和ADAMTS5和/或MMP13的活性至少约50％，优选地75％，更优选地90％，95％或至多99％，和最优选地约100％(基本上完全)，如通过本领域公知的方法测定的。
通常，治疗方案将包括以一个或多个药学有效量或剂量施用一个或多个本发明的多肽和/或构建体，或者包含其的一个或多个组合物。再次基于上述因素，临床医生可以确定待施用的具体量或剂量。本发明的组合物、构建体和/或多肽的有用剂量可以通过在动物模型中比较它们的体外活性和体内活性来测定。将在小鼠和其他动物中的有效剂量向人外推的方法是本领域已知的；例如，参见US 4,938,949。
通常，取决于待治疗的特定疾病、病症或病况，所使用的本发明的特定多肽和/或构建体的效力，特定的施用途径和所使用的特定药物制剂或组合物，临床医生将能够确定合适的给药方案。
用于治疗所需的本发明的组合物、构建体和/或多肽的量不仅会随所选择的特定组合物、多肽和/或构建体而变化，而且还会随施用途径、在治疗病症的性质以及患者的年龄和状况而变化，并且最终将由主治医师或临床医生决定。同样，本发明的组合物、构建体和/或多肽的剂量根据靶细胞、组织、移植物、关节或器官而变化。
所需剂量可以方便地是单剂量或-次级优选地-适当间隔施用的分剂量，例如每天两次、三次、四个或更多次亚剂量。所述亚剂量本身可以进一步分为例如多个离散的松散间隔施用。
施用方案可包括长期、每日治疗。“长期”是指至少两周，并且优选地数周、数月或数年的持续时间。本领域普通技术人员可以仅使用本文教导的常规实验来确定该剂量范围内的必要修饰。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(Martin,E.W.,ed.4),MackPublishing Co.,Easton,PA.。在发生任何并发症的情况下，剂量也可以由个别医生进行调整。已经显示组合物、多肽和构建体在延长的时间段极端稳定和保持有效。
通常，在以上方法中，将使用本发明的组合物、多肽和/或构建体。然而，组合使用两个或更多个本发明的组合物、多肽和/或构建体也在本发明的范围内，例如SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：63和64、SEQ ID NO：5和64、或SEQ ID NO：63的6的组合。
本发明的组合物、多肽和/或构建体可以与一个或多个其他药物活性化合物或原理组合使用，即，作为组合治疗方案，这可以产生或不产生协同作用。
药物组合物还可包含至少一种其他活性剂，例如一种或多种其他抗体或其抗原结合片段、肽、蛋白质、核酸、有机和无机分子。
再次，临床医生将能够根据上述因素和他的专家判断，选择这样的其他化合物或原理，以及合适的组合治疗方案。
特别地，本发明的组合物、多肽和/或构建体可以与其他药物活性化合物或原理组合使用，所述化合物或原理是或可以用于预防和/或治疗本文所引用的疾病、病症和病况，其结果是可以获得或不会获得协同效果。这样的化合物和原理的实例，以及施用它们的途径、方法和药物制剂或组合物对于临床医生将是清楚的。
当将两种或更多种物质或原理，例如(包含以下的组合物)包含抑制ADAMTS5的ISVD的多肽和包含抑制MMP13的ISVD的另一种多肽，用作组合治疗方案的一部分时，例如，SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：63和64、SEQ ID NO：5和64或SEQ ID NO：63和6的组合，可以在基本上相同的时间或不同的时间(例如，基本上同时、连续地或根据交替方案)，通过相同的施用途径或通过不同的施用途径施用它们。当通过相同的施用途径同时施用物质或原理时，它们可以作为不同的药物制剂或组合物或者组合的药物制剂或组合物的一部分来施用，这对于本领域技术人员将是清楚的。
同样，当两种或更多种活性物质或原理用作组合治疗方案的一部分时，例如(包含以下的组合物)包含抑制ADAMTS5的ISVD的多肽和包含抑制MMP13的ISVD的另一种多肽，每种物质或原理可以以与当单独使用化合物或原理时使用的相同量和根据相同的方案使用，并且这种组合使用可以产生或不产生协同效应。然而，当两种或更多种活性物质或原理的组合使用产生协同作用时，也可能减少一种、多种或所有待施用的物质或原理的量，同时仍实现所需的治疗作用。这例如可以用于避免、限制或减少与一种或多种物质或原理以其通常量使用时的使用相关的任何不良副作用，同时仍获得所需的药物或治疗效果。
可以以针对所涉及的疾病、病症或病况本身已知的方式来确定和/或跟踪根据本发明使用的治疗方案的有效性，这对于临床医生将是清楚的。在适当的情况下，临床医生还将能够根据具体情况改变或修改特定的治疗方案，以达到所需的治疗作用，避免、限制或减少不良的副作用，和/或在一方面达到所需的治疗作用与另一方面避免、限制或减少不良副作用之间取得适当的平衡。
通常，将遵循治疗方案直到达到期望的治疗作用和/或只要保持期望的治疗效果。再次，这可以由临床医生确定。
因此，在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一个本发明的构建体或至少一个本发明的多肽和至少一个合适的载体、稀释剂或赋形剂(即，适合于药物用途)，以及可选地一个或多个其他活性物质。在一个特定的方面，本发明涉及药物组合物，其包含根据至少一个本发明的组合物、构建体或多肽，优选地SEQ ID NO：1和62，或SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：63和64、SEQ ID NO：5和64或SEQ ID NO：63和6的组合中的至少一个和至少一个合适的载体、稀释剂或赋形剂(即，适用于药物用途)，以及可选的一个或多个其他活性物质。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但特别是哺乳动物，更特别是人类。在兽医应用中，待治疗的受试者包括为商业目的饲养或作为宠物饲养的任何动物。对本领域技术人员将清楚的是，待治疗的受试者将特别是患有或处于本文所述的疾病、病症和病况风险中的人。因此，在本发明的优选实施方案中，包含本发明的多肽的药物组合物用于医学或诊断学。优选地，药物组合物用于人类医学，但是它们也可以用于兽医目的。
再次，在这样的药物组合物中，本发明的一种或多种组合物、多肽和/或构建体，或编码它们的核苷酸，和/或包含它们的药物组合物也可以适当地与一个或多个活性原理组合，例如本文提及的那些。
本发明还涉及用于体外(例如在体外或细胞测定法中)或体内(例如在单细胞中或多细胞生物，尤其是在哺乳动物中，并且更特别是在人类中，例如在具有本发明的疾病、病症或病况的风险中或患有本发明的疾病、病症或病况的人中)使用的组合物(例如但不限于本文进一步描述的药物组合物或制备物)。
应当理解，除非另外明确指出，否则对治疗的提及既包括对已建立症状的治疗也包括预防性治疗。
通常，对于药物用途，可以将本发明的组合物、构建体、多肽和/或ISVD配制成包含至少一个本发明的构建体、多肽和/或ISVD和至少一个药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂以及可选地一个或多个药物活性多肽和/或化合物的药物制备物或组合物。通过非限制性实例，这样的制剂可以是适合于口服施用，肠胃外施用(例如通过关节内、静脉内、肌肉内或皮下注射或静脉内输注)，局部施用，通过吸入施用，通过皮肤贴剂，通过植入物，通过栓剂等的形式，其中胃肠外施用是优选的。这样的合适的施用形式(可以是固体、半固体或液体，取决于施用方式)以及用于制备其的方法和载体对于本领域技术人员将是清楚的，并且在本文中进一步描述。这样的药物制备物或组合物在本文中通常被称为“药物组合物”。
作为示例性的赋形剂，可以提及崩解剂、粘合剂、填充剂和润滑剂。崩解剂的实例包括琼脂、藻酸盐、碳酸钙、纤维素、胶体二氧化硅、树胶、硅酸铝镁、甲基纤维素和淀粉。粘合剂的实例包括微晶纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。填充剂的实例包括碳酸钙、磷酸钙、三碱式硫酸钙、羧甲基纤维素钙、纤维素、糊精、右旋糖、果糖、乳糖醇、乳糖、碳酸镁、氧化镁、麦芽糖醇、麦芽糖糊精、麦芽糖、山梨糖醇、淀粉、蔗糖、糖和木糖醇。润滑剂的实例包括琼脂、油酸乙酯、月桂酸乙酯、甘油、棕榈硬脂酸甘油酯、氢化植物油、氧化镁、硬脂酸酯、甘露醇、泊洛沙姆、乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、硬脂酸钠、山梨糖醇和滑石。通常的稳定剂、防腐剂、湿润和乳化剂、稠度改善剂、风味改善剂、用于改变渗透压的盐、缓冲物质、增溶剂、稀释剂、润肤剂、着色剂和掩蔽剂以及抗氧化剂均考虑作为药物佐剂。
合适的载体包括但不限于碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂、水、醇类、多元醇、甘油、植物油等。
通常，本发明的构建体、多肽和/或ISVD可以以本身已知的任何合适方式配制和施用。参考例如以上引用的一般背景技术(并且尤其是参考WO 04/041862、WO 04/041863、WO04/041865、WO 04/041867和WO 08/020079)以及标准手册，如Remington’sPharmaceutical Sciences,18th Ed.,Mack Publishing Company,USA(1990),Remington,the Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Lippincott Williams andWilkins(2005)；或the Handbook of Therapeutic Antibodies(S.Dubel,Ed.),Wiley,Weinheim,2007(参见例如第252-255页)。
在一个特定的方面，本发明涉及药物组合物，其至少包含根据本发明的组合物、构建体、多肽、ISVD或核酸，并且还包含至少一个药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且可选地包含一个或多个其他药物活性多肽和/或构建体。
本发明的组合物、构建体、多肽和/或ISVD可以以用于常规抗体和抗体片段(包括ScFv和双抗体)和其他药物活性蛋白的本身已知的任何已知方式配制和施用。这样的制剂和制备它们的方法对于技术人员将是清楚的，并且例如包括优选适于肠胃外施用(例如关节内、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、腔内、动脉内、鞘内鼻内或支气管内施用)，但是也用于局部(即透皮或皮内)施用的制备物。
肠胃外施用的制备物可以是例如适于输注或注射的无菌溶液、悬浮液、分散液或乳剂。用于这种制备物的合适的载体或稀释剂例如包括但不限于WO 08/020079的第143页提到的那些。通常，水溶液或悬浮液将是优选的。
本发明的组合物、构建体、多肽和/或ISVD也可以使用基因疗法中已知的递送方法进行施用，参见例如美国专利号5,399,346，其基因疗法递送方法通过引用并入本文。使用递送的基因疗法方法，用编码本发明的构建体、多肽和/或ISVD的基因转染的原代细胞可以另外地用组织特异性启动子转染以靶向特定的器官、组织、移植物、肿瘤或细胞，并且还可以用信号和稳定化序列转染用于亚细胞局部表达。
根据本发明的其他方面，本发明的组合物、构建体和/或多肽可以用于体内和体外的其他应用。例如，可以将本发明的组合物、构建体和/或多肽用于诊断目的，例如在设计为检测和/或定量ADAMTS5和/或MMP13的存在和/或纯化ADAMTS5和/或MMP13的测定法中。也可以在特定疾病的动物模型中测试组合物、多肽和/或构建体，并进行毒理学、安全性和剂量研究。
最后，本发明涉及试剂盒，其包括至少一个根据本发明的组合物、多肽和/或构建体，至少一个编码所述组分的核酸序列，本发明的载体或载体系统和/或根据本发明的宿主细胞。可以设想，试剂盒可以以不同的形式提供，例如，作为诊断试剂盒。
现在将通过以下非限制性的优选方面、实施例和附图进一步描述本发明。
在本申请全文中引用的所有参考文献(包括文献参考文献、授权专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)的全部内容在此明确地通过引用并入，特别是对于上文所引用的教导。
根据WIPO标准ST.25，在说明书的主体和单独的序列表中公开了序列。在说明书的主体和单独的序列表中，使用特定编号指定的SEQ ID应相同。通过示例的方式，SEQ IDNo.：1应当在说明书的主体和单独的序列表中定义相同的序列。根据WIPO标准ST.25，在说明书的主体和单独的序列表中公开了序列。在说明书的主体和单独的序列表中，使用特定编号指定的SEQ ID应相同。通过示例的方式，SEQ ID No.：1应当在说明书的主体和单独的序列表中定义相同的序列。说明书主体中的序列定义与单独的序列表之间存在差异(例如，说明书主体中的SEQ ID no.:1错误地对应于单独序列中的SEQ ID no.:2)，则对本申请中特定序列的引用，尤其是在特定实施方案中，应理解为对本申请主体中序列的引用，而不是对单独序列表的引用。换句话说，说明书主体与单独的序列表中的序列定义/名称之间的差异应通过将单独的序列表校正为在本申请的主体中公开的序列及其名称来解决，本申请的主体包括包括说明、示例、附图和权利要求。
6实施例
不受理论的束缚，发明人假设抑制ADAMTS5和MMP13两者在以下方面更有效。
(1)将抑制更广泛的OA诱导和维持蛋白酶；
(2)可以靶向更广泛的患者，例如无需将患者分为不同的组；和
(3)可以治疗更广泛的疾病进展。
为了患者友好，抑制剂优选地长时间在关节中保留并有活性。
因此，发明人着手分离和表征特异性结合MMP13的ISVD、特异性结合ADAMTS5的ISVD以及特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD。随后，将ISVD组合成不同的格式，并在各种体外、离体和体内模型中进行测试。
实施例1MMP13 ISVD
1.1抗MMP13 ISVD 62C02
在筛选了超过10E7个克隆后，在荧光肽测定法、胶原蛋白溶解测定法和荧光胶原蛋白测定法中鉴定了MMP13特异性ISVD 62C02。
简言之，人、食蟹猴、大鼠、狗和牛MMP13荧光肽测定法以及人MMP1和MMP14荧光肽测定法的设置如下：将活化的MMP与荧光肽底物Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2(R&D Systems#ES001)和周质提取物的1/5稀释液或纯化的纳米抗体/阳性对照的系列稀释液(总体积＝20μl在测定法缓冲液50mM Tris pH 7.5、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01％Tween20)在37℃孵育2h。荧光的线性增加(v0-15至45分钟孵育)用作酶活性的量度并且使用公式100–100(存在测试纳米抗体的情况下的v0/存在阴性对照纳米抗体(Cablys)的情况下的v0)计算抑制％。
胶原蛋白溶解测定法的设置简述如下：将250ng/ml免疫级人胶原蛋白II(Chondrex#20052)与5nM活化的MMP13在100μl测定法缓冲液(50mM Tris-Cl pH 7.5、100mMNaCl、10mM CaCl2、0.01％Tween-20)中孵育。在35℃孵育1.5h后，反应用EDTA(10μl的30mM储备液)进行中和。将MMP13裂解的胶原蛋白在38℃用弹性蛋白酶进一步降解20分钟，以避免降解的II型胶原蛋白(10μl的II型胶原蛋白检测试剂盒(Chondrex#6009)提供的1/3稀释原液)重新退火。通过ELISA(II型胶原蛋白检测试剂盒(Chondrex#6009)中提供的试剂)检测剩余的完整胶原蛋白。
荧光胶原蛋白测定法的设置主要如下：将100μg/ml来自牛皮肤的I型DQTM胶原蛋白(荧光素缀合物；Molecular Probes#D-12060批号1149062)与10nM活化的MMP13和纯化的纳米抗体/阳性对照的系列稀释液在40μl测定缓冲液(50mM Tris-Cl pH 7.5、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01％Tween-20)中在37℃孵育2小时。荧光的线性增加(v0-15至45分钟孵育)用作酶活性的量度并且使用公式100–100(存在测试纳米抗体的情况下的v0/存在阴性对照纳米抗体(Cablys)的情况下的v0)计算抑制％。
为了进一步表征ISVD 62CO2，将该ISVD再克隆到载体pAX129中，转化到大肠杆菌(E.coli)中并根据标准方案进行表达和纯化(例如Maussang等人2013J Biol Chem 288:29562-72)。随后，对该ISVD进行多种功能性体外测定法。在这些测定法中，非选择性MMP抑制剂TIMP-2用作阳性对照。使用小分子药剂MSC2392891A作为阳性竞品。表1.1给出了酶促测定法中效力的概述。
Figure BDA0002377170790000661
表1.1
总之，相对于竞品药剂MSC2392891A，ISVD 62C02在所有测定法中均表现更好。
1.2抗MMP13 ISVD 62C02是选择性的
为了确定ISVD 62C02对MMP13的选择性，使用了针对MMP1和MMP14的荧光肽测定法。MMP1和MMP14是两个密切相关的MMP家族成员。在这些测定法中，将TIMP-2用作阳性对照。使用与实施例1.1中所述类似的设置。
证明ISVD 62C02是高度选择性的，未显示出MMP1或MMP14抑制(数据未显示)。
实施例2ADAMTS5 ISVD
2.1抗ADAMTS5 ISVD 02F03
同样在这种情况下，筛选了超过10E7个克隆，以鉴定特异性结合ADAMTS5的ISVD02F03。ISVD 02F03的特征还在于通过基于FRET和AlphaLISA的测定法抑制ADAMTS5介导的聚蛋白聚糖裂解。
简言之，通过结合ELISA测试了ISVD 02F03的周质提取物与重组人ADAMTS5的结合。接下来，证实了ISVD 02F03在基于FRET的人ADAMTS5酶法测定中能够防止ADAMTS5介导的聚蛋白聚糖裂解。在基于FRET的测定法之后，进行以生物素化的43-mer聚蛋白聚糖寡肽为底物的基于AlphaLISA(Perkin Elmer，Waltham，MA，US)的人ADAMTS5测定法。在ADAMTS5裂解该底物后，释放出生物素化的ARGSV新表位产物并且可用链霉亲和素-AlphaScreen供体珠和捕获在抗小鼠IgG包被的AlphaLISA受体珠上的α-新表位(“ARGSV”)抗体进行检测，导致在激光激发时产生发光的AlphaScreen信号。为了确定ISVD 02F03防止ADAMTS5介导的底物裂解的能力，分析了信号下降与ISVD 02F03浓度的关系并且计算了IC50值。
抑制ADAMTS4活性和ADAMTS5活性两者的小分子MSC2310852A被用作阳性对照。
结果总结在表2.1.1中。
表2.1.1在人FRET和AlphaLISA酶促测定法中，对于ISVD 02F03和参考化合物的ADAMTS5的效力(IC50)和抑制％。
Figure BDA0002377170790000671
尽管ISVD 02F03与二价mAb 12F4相当，但ISVD 02F03显示出比小分子MSC2310852A更好的效力。
另外，在离体测定法中还评估了ISVD 02F03阻断软骨降解的能力，其中与生化测定法相比，底物处于更接近生理条件的条件。简言之，从牛膝关节新鲜地制备牛软骨外植体片(直径4mm)，并在存在IL-1α的96孔板中孵育以诱导软骨降解。作为软骨/聚蛋白聚糖降解的测量，通过变色染料1,9二甲基亚甲基蓝(在633 nm处发射)在孵育(37℃，7.5％ CO2)5天后，在上清液检测到糖胺聚糖(GAG)的释放。硫酸软骨素作为测定标准品包括在内。通过没有化合物(0％)和存在MSC2310852A(100％作用)的IL-1α诱导的对照来定义功效。
结果总结在表2.1.2中。
表2.1.2牛外植体测定法中ISVD 02F03的IC50值。
ID IC50[M]
mAb 12F4 H4L0 3.2E-06
02F03 1.4E-08
在该体外测定法中，ISVD 02F03显示出比二价mAb 12F4更好的效力，即IC50是约50倍低。
物种交叉反应性最初是通过在Biacore T100仪器上基于SPR的解离速率分析进行评估的。测试了多肽与人、食蟹猴(“cyno”)、豚鼠、小鼠和牛ADAMTS5的结合。为此，使用EDC和NHS通过胺偶联将重组ADAMTS5固定化在CM5芯片上。将纯化的ISVD 02F03以100nM的浓度注射2分钟并以45ul/min的流速解离15分钟。使用BIA评估软件，通过将1：1相互作用模型(Langmuir模型)拟合到单个解离曲线上，确定了每个单个ADAMTS5的解离速率。作为参考，在每个实验中确定了在人ADAMTS5上的解离速率。
结果总结在表2.1.3中。
表2.1.3 ISVD 02F03的物种交叉反应性数据的概述
Figure BDA0002377170790000681
ISVD 02F03显示出与人、食蟹猴、豚鼠和牛ADAMTS5的相当的解离速率(交叉反应)。
2.2ISVD 02F03的选择性
为了证实ISVD 02F03对ADAMTS5的选择性，通过基于FRET的测定法和人ADAMTS4AlphaLISA(使用各自酶)评估了对MMP1、MMP14和ADAMTS4的酶促活性的抑制。
将活化的人MMP1或MMP14在室温与10μl的ISVD 02F03稀释系列液孵育30分钟。孵育后，加入20μl分别是5μM或2.5μM荧光肽底物(Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2荧光MMP底物(R&DSystems cat#ES001))。在Tecan Infinite M1000读板器上，在37℃每分钟监测ISVD 02F03防止MMP1-和MMP14介导的裂解的能力，持续2小时。
尽管天然抑制剂TIMP2和TIMP3抑制MMP1和MMP14活性，然而ISVD 02F03没有显示出任何抑制作用(数据未显示)。
为了评估对人ADAMTS4的抑制，基本上如实施例2.1中所述进行类似于人ADAMTS5AlphaLISA的测定法，但是使用人ADAMTS4(R&D Systems，Minneapolis，US；cat#4307-AD)。为了确定ISVD 02F03防止人ADAMTS4介导的底物裂解的能力，分析了信号的减少与ISVD02F03浓度的关系并且计算了IC50值。
尽管小分子MSC2310852A抑制人ADAMTS4活性，然而ISVD 02F03或mAb 12F4没有显示任何抑制活性(数据未显示)。在WO 2011/002968中描述了单克隆抗体mAb 12F4(H4L0)对ADAMTS4是选择性的。
实施例3：聚蛋白聚糖ISVD3.1抗聚蛋白聚糖ISVD 114F08
经过大量筛选活动后，分离并表征了聚蛋白聚糖特异性ISVD 114F08。用重组人聚蛋白聚糖(G1-IGD-G2结构域，R&D Systems#1220-PG)免疫美洲驼，并产生特异性和高血清滴度。但是，只有一小部分分离的纳米抗体满足了与聚蛋白聚糖的G1结构域结合并显示出广泛的物种交叉反应性的两个要求。经过艰苦的尝试，鉴定了显示出基本相似特征的多个家族成员(有关CDR中的序列变化，请参见表3.1A至表3.1C)。最终，选择了ISVD 114F08(“C0101PMP114F08”)进行进一步的表征。
表3.1.1提供了结构域作图和物种交叉反应数据的概述。
Figure BDA0002377170790000691
在初级筛选、通过ELISA对结合的初始评估、确定解离速率和物种交叉反应性之后，将ISVD 114F08用于进一步的表征。
在下表3.1A、3.1B和3.1C中描绘了ISVD 114F08的家族成员的CDR中的序列。克隆114F08的CDR的氨基酸序列用作参照，与之比较所有其他家族成员的CDR(CDR1从氨基酸残基26开始，CDR2从氨基酸残基50开始，并且CDR3从氨基酸残基95开始)。
表3.1A
Figure BDA0002377170790000692
*在一个克隆中多至2个CDR1突变
表3.1B
Figure BDA0002377170790000701
*在一个克隆中多至5个CDR2突变
表3.1C
Figure BDA0002377170790000702
*在一个克隆中多至2个CDR突变
3.2离体牛软骨保留
由于没有建立用于评估软骨保留的测定法，因此发明人开发了使用牛软骨的离体软骨保留测定法。
确定了包含ISVD 114F08的多肽在多肽相对短时间暴露于软骨后(可以在关节内注射后预期的)在软骨中保留延长的时间段的能力。通常每个纳米抗体样品用4个软骨盘执行测定法；多肽孵育后立即(t0)分析2个软骨盘，以确定结合多肽的初始量；洗涤后(t1-5天)分析2个软骨盘。保留程度定义为在t1-5天和t0检测到的多肽量的比率。通过目测Western印迹进行该比率的确定，给出0-6的得分，其中0是无保留并且6是完全保留。由2个非活性ISVDALB26组成的假构建体C0101030(“30”)显示没有结合。
结果总结如表3.2所示。
靶标 构建体 描述 软骨保留*
G1 118 ALB26-114F08-114F08 6.0
G1 54 114F08-ALB26 5.0
假 30 ALB26-ALB26 0.0
表3.2：ALB26格式的抗聚蛋白聚糖ISVD 114F08的软骨保留。*分数是1到4次独立的离体牛软骨保留测定法的平均值，范围为0-6：0是无保留而6是完全保留。
发现包含ISVD 114F08的多肽在软骨中保留得非常好(分数5-6)。这包括同时包含ISVD 114F08的一个和两个结合单元的构建体。
3.3结合特征-ELISA
基于离体牛软骨保留数据，在ELISA中在来自人、食蟹猴、大鼠、狗和牛聚蛋白聚糖的重组G1-IGD-G2区上，对ISVD 114F08进一步表征以确定其物种交叉反应性(也参见示例3.1)并在重组人神经蛋白聚糖和短蛋白聚糖上来确定其选择性。确定的EC50值在表3.3中列出。
Figure BDA0002377170790000711
表3.3通过ELISA对ALB26格式的抗聚蛋白聚糖ISVD 114F08的表征。
3.4组织特异性
上面证明了本发明的多肽在体外特异性结合聚蛋白聚糖和离体特异性结合软骨。另外，这些多肽还应优选结合关节的软骨，而不结合或很少结合关节中的其他组织。
使用与离体软骨结合测定法相同的设置，评估包含ISVD 114F08的多肽与滑膜、肌腱和肌外膜的结合。与多肽一起温育后，短暂洗涤组织(30分钟)后，执行多肽释放和Western印迹分析。
结果总结在表3.4中。
Figure BDA0002377170790000712
表3.4：组织特异性。ALB26格式的抗聚蛋白聚糖ISVD 114F08与关节软骨、滑膜、肌腱和肌外膜的结合。分数的范围是0-6，其中0是无结合而6是观察到的最大结合。
结果表明与关节中发现的其他组织相比，包含ISVD 114F08的一个或两个结合单元的多肽显示出与软骨的优先结合。
3.5牛滑膜液中的纳米抗体稳定性
由于各种原因，包括患者的便利性和安全性，优选多肽在滑膜中更长的时间段保持稳定。
因此，包含ISVD 114F08的多肽在滑膜液(SF)中的稳定性通过将多肽在牛SF中在37℃温育最多7天来评估。
结果总结在表3.5中。
Figure BDA0002377170790000721
表3.5：包含ISVD 114F08的多肽在牛SF中的稳定性。
没有检测到任何构建体的降解。
实施例4多肽
通过使用35GS接头(M-C-C)将抗MMP13 ISVD 62C02和两个抗聚蛋白聚糖ISVD114F08遗传连接而对多肽754进行工程改造。多肽754-9与多肽754相似，但现在使用9GS接头。所得的氨基酸序列在表A-1中分别示为SEQ ID NO：5和63。
通过使用35GS接头(A-C-C)将抗ADAMTS5 ISVD 2F03和两个抗抗聚蛋白聚糖ISVD114F08遗传连接而对多肽954工程改造。多肽954-9(参见“973”)与多肽954相似，但是现在使用9GS接头。所得的氨基酸序列在表A-1中分别显示为SEQ ID NO：6和64。
通过使用35GS接头(M-A-C-C)将抗MMP13 ISVD 62C02、抗ADAMTS5ISVD 2F03和两个抗聚蛋白聚糖ISVD 114F08遗传连接而对多肽949工程改造。多肽949-9与多肽949相似，但现在使用9GS接头。所得的氨基酸序列在表A-1中分别显示为SEQ ID NO：1和62。
实施例5多肽对不同物种的ADAMTS5，MMP13和聚蛋白聚糖的亲和力5.1多肽949对人、食蟹猴和大鼠ADAMTS5的亲和力
使用KinExA确定多肽949对人、食蟹猴和大鼠ADAMTS5的溶液内亲和力。用人、食蟹猴或大鼠ADAMTS5的16点1/2.2系列稀释的剂量响应曲线将固定浓度的20pM(最终浓度)多肽949平衡24小时，每次从20nM开始，最后一个点为空白(＝无ADAMTS5)。所有稀释液均在样品缓冲液(PBS+0.1％BSA+0.02％NaN3)中制备。为了测试对聚蛋白聚糖的干扰，在选定的实验中将重组聚蛋白聚糖G1-IGD-G2添加到该预温育中，浓度为2nM(＝多肽949的KD的100倍以上，见下文)。
随后，将预孵育的混合物(ADAMTS5 DRC+20pM多肽949±聚蛋白聚糖G1-IGD-G2)通过KinExA的自动进样器注射到装载人ADAMTS5缀合的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠的柱子上，以捕获在珠上的游离的纳米抗体构建体。使用Alexa Fluor(AF)647标记的抗纳米抗体工具(识别多肽949)检测捕获的纳米抗体构建体。将游离纳米抗体构建体的百分比作为ADAMTS5浓度的函数进行作图并且使用KinExAPro Software v3.6.5进行拟合以确定KD。
表5.1中给出的结果表明，在没有G1-IGD-G2的情况下，多肽949对人ADAMTS5的亲和力是32.69pM，在存在聚蛋白聚糖的情况下是26.56pM。基于CI在KD值上的重叠，聚蛋白聚糖的存在不干扰多肽949对ADAMTS5的亲和力。对食蟹猴和大鼠ADAMTS5的亲和力分别是24.35pM和25.17pM，证明了多肽949对这两个物种的结合交叉反应性，因为两个KD值都落在人KD的CI内。
表5.1：多肽949在不存在或存在聚蛋白聚糖G1-IGD-G2的情况下对人ADAMTS5的亲和力，以及对食蟹猴和大鼠ADAMTS5的亲和力
N 平均K<sub>D</sub>(pM) 对K<sub>D</sub>的95％CI(pM)
人-聚蛋白聚糖 3 32.69 16.35–65.38
人-聚蛋白聚糖 3 26.56 16.38–58.46
食蟹猴 1 24.35 9.25–66.27
大鼠 1 25.17
5.2多肽949对人、食蟹猴和大鼠ADAMTS5的功能抑制
使用基于FRET的动力学测定法，研究了C010100949对人、猕猴和大鼠ADAMTS5的功能性抑制。使用FRET测定缓冲液(MilliQ中的50mM HEPES pH 7.5，100mM NaCl，5mM CaCl2*2H2O，5％甘油，0.1％CHAPS)进行该测定法。将固定浓度的10nM(最终浓度)的各个物种ADAMTS5混合，并以50nM(最终浓度)开始的多肽949的11点(第12＝空白)1/1.7系列稀释的DRC进行平衡。接下来，添加30μM(最终浓度)的物种特异性荧光ADAMTS5底物。通过ADAMTS5酶促裂解该底物(用淬灭剂(2,4-二硝基苯基，Dnp)和荧光染料(氨基苯甲酸，Abz)标记的聚蛋白聚糖肽)，并且得到的荧光(激发波长340nm/发射波长430nm)通过使用Tecan F200微孔板读数器每分钟进行动力学测量，进行2小时。分析获得的进度曲线(荧光信号与反应时间的函数)，使用GraphPad Prism软件，将每个进度曲线的线性部分与直线拟合(Y＝斜率*X+Y-截距)。针对所有空白样品的平均斜率(未抑制的反应速度，v0)对所得的斜率或反应速度(vi)进行归一化，将其绘制为多肽949浓度的函数并使用非对称5参数对数(5PL)曲线进行拟合以获得抑制曲线。
结果总结在图1中，该图是结果的代表性图示。结果显示多肽949(“C010100949”)对来自所有测试物种的ADAMTS5的酶促活性具有剂量依赖性的和完全的抑制，表明它们均被纳米抗体构建体完全功能性抑制。
5.3多肽949对人、食蟹猴和大鼠MMP13的亲和力
使用基于FRET的动力学测定法研究多肽949对来自不同物种的MMP13的功能活性以及酶抑制常数(KI)。所有稀释液均在测定缓冲液(50mM Tris(pH 7.5)，100mM NaCl，10mMCaCl2*2H2O，0.01％Tween20)中制备。从9μM(最终浓度)开始的多肽949的1/3系列稀释的11点(第12个＝空白)DRC用恒定浓度的0.2nM物种催化结构域(cd)MMP-13或者0.2至20nM每个物种的活化的原MMP13(标称浓度)平衡。接下来，将恒定浓度的22μM(最终浓度)的荧光MMP底物添加到所有孔中。这种基于胶原蛋白的底物包含通用的MMP裂解序列脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-亮氨酸(PLGL)并且标记有荧光染料Mca和淬灭剂Dpa。活性酶(未与纳米抗体构建体结合)能够裂解底物，导致荧光染料释放并产生荧光信号(激发波长320nm/发射波长405nm)，而被中和(与纳米抗体构建体结合)的酶不是这样。在添加底物后一分钟内开始，使用Tecan F200读板器每分钟动力学测量荧光，共进行120个循环(2小时)。
分析获得的进度曲线(荧光信号与反应时间的函数)，使用GraphPad Prism软件，将每个进度曲线的线性部分与直线拟合(Y＝斜率*X+Y-截距)。针对所有空白样品的平均斜率(未抑制的反应速度，v0)对所得的斜率或反应速度(vi)进行归一化，将其绘制为多肽949浓度的函数并使用非对称5参数对数(5PL)曲线进行拟合以获得抑制曲线。
在这些测定条件下，获得的IC50值等于抑制常数KI。
定量分析的结果总结在表5.3中。每个相互作用重复进行2至6个独立实验。基于6个独立的重复实验，确定多肽949对人cdMMP13的抑制常数是27.86nM(95％CI：25.67-30.23nM)。基于3个独立重复的实验，确定活化的人类pro-MMP13的KI是2.92nM(95％CI：0.61-14.02nM)。针对食蟹猴和大鼠MMP13的KI值与针对催化结构域以及活化的原MMP13的人KI高度对应，表明多肽949对食蟹猴和大鼠MMP13的交叉反应性。
Figure BDA0002377170790000751
表5.3多肽949对人、食蟹猴和大鼠MMP13催化结构域域以及活化的原MMP13的亲和力测定结果概述。通过估算全局平均值计算平均KI值以及95％置信区间(CI)。Cd：催化结构域；pro：活化的原MMP13；CV：变异系数。
在用于测量KI的实验(参见上文)中同时评估了多肽949对人、食蟹猴和大鼠cdMMP13以及活化的pro-MMP13的功能性抑制。图2是结果的代表性图示。这些结果证明了纳米抗体构建体949对所有测试的物种cdMMP13和原MMP13形式的酶活性的剂量依赖性和完全功能性抑制。
5.4多肽949对人、食蟹猴和大鼠聚蛋白聚糖G1-IGD-G2的亲和力
使用表面等离振子共振(SPR)在ProteOn XPR36相互作用阵列仪器(BioRad，序列号670BR6176)上进行多肽949对人、食蟹猴和大鼠重组聚蛋白聚糖G1-IGD-G2的亲和力测定。简言之，通过胺偶联以10μg/mL的浓度在10mM乙酸盐pH 4.5中和100μL/min的流速将重组聚蛋白聚糖G1-IGD-G2(“配体”)固定化在GLC传感器芯片(Biorad cat#176-5011)的配体泳道上，旨在达到400个共振单位(RU)的固定化水平。沿传感器芯片的分析物泳道以在1xHBS-P+pH 7.4作为运行缓冲液(GE Healthcare cat#R-1006-71)中的不同浓度(0.5–1–2–4–6–10nM)以45μL/min的连续流速注射多肽949(“C010100949”；“分析物”)2分钟。解离时间为10分钟。每次样品注射后，用10mM甘氨酸pH 1.5再生表面。聚蛋白聚糖G1-IGD-G2和多肽949之间的相互作用被检测为耐性指数(refractory index)的增加，这是由于多肽949与聚蛋白聚糖结合导致芯片质量改变而导致的。折射率(refractive index)的这种变化会导致反射光的强度和角度发生变化，对其实时定量测量并作为响应单位(RU)对比时间绘制在传感图上。使用ProteOn Manager 3.1.0 3.1.0.6版软件和“kinetic Langmuir ka/kdsimultaneous”模型，从获得的传感图中计算动力学常数。
结果总结在表5.4中。根据2至4个独立重复的实验，确定多肽949对捕获的聚蛋白聚糖G1-IGD-G2的平均结合亲和力(KD)对于人、食蟹猴和大鼠分别是14.0pM，16.0pM和16.6pM。
由于多肽949的CAP构件的作用方式(MoA)仅依赖于聚蛋白聚糖结合，这直接通过基于SPR的亲和力测定来反映，因此CAP构件的进一步功能分析不相关。从这些SPR数据可以得出结论，多肽949表现出对食蟹猴和大鼠聚蛋白聚糖的完全交叉反应性，与人相比没有亲和力差异。
N 平均K<sub>D</sub>(pM) 对K<sub>D</sub>(pM)的95％CI
人 4 14.0 5.9–33.7
食蟹猴 2 16.0 NC(*)
大鼠 3 16.6 7.0–39.5
表5.4 949对人、食蟹猴和大鼠聚蛋白聚糖G1-IGD-G2的亲和力测定结果概述。通过估算全局平均值来计算平均KD值以及95％置信区间(CI)。N：独立实验的次数；KD：离解常数；NC：未计算。(*)对于食蟹猴，两个独立的实验均产生了16.0pM的相同结果，因此无法计算CI，因为ProteOn软件未提供有关KD的标准误差信息。
实施例6在牛外植体模型中对离体软骨降解的抑制
在牛软骨外植体测定法中测试了多肽949(M-A-C-C：62C02-2F03-114F08-114F08)对软骨降解的抑制。
简言之，将多肽与牛软骨外植体孵育，所述外植体与IL-1α培养5天以诱导OA样软骨降解过程。在5天内，相继发生了主要是聚蛋白聚糖的降解，而胶原蛋白降解仅在约两周后发生，即在本文所述的实验终止后。在实验结束时，定量从降解软骨而释放到培养上清液中的GAG(主要来自聚蛋白聚糖)。与参考小分子抑制剂相比，计算了多肽抑制GAG释放的功效，在这些条件下参考小分子抑制剂完全抑制IL-1α刺激的GAG释放。
结果如图3所示。
可以看出，多肽949(图中的NB949)以剂量依赖性方式完全抑制牛软骨降解。
实施例7在人外植体模型中对离体软骨降解的抑制
在人软骨外植体测定法中测试了多肽949(M-A-C-C：62C02-2F03-114F08-114F08)对软骨降解的抑制。简言之，将多肽与人软骨外植体一起孵育，所述外植体与IL-1β+抑瘤素M(OSM)培养7天。在7天之内，相继发生了主要是聚蛋白聚糖的降解，而胶原蛋白降解仅在约两周后发生，即在本文所述的实验终止后。在实验结束时，定量从降解软骨而释放到培养上清液中的GAG(主要来自聚蛋白聚糖)。IC50是根据阴性对照水平(＝无其他刺激时从外植体释放的GAG)和IL-1β+OSM水平作为最大GAG损失的量度来计算的。GAG显示为每个体外植体每毫克软骨的GAG释放量(以μg为单位)。
结果如图4所示。
数据表明，纳米抗体构建体以剂量依赖的方式抑制GAG从人OA软骨中的释放，计算出的IC50为0,03724μM。
实施例8CAP扩展多肽抑制软骨降解的离体功效
为了评估功能为将多肽锚定在软骨上的CAP部分的作用，对上述的牛外植体测定法进行了修改，使其包括在软骨外植体与多肽一起温育步骤(1h)之后的洗涤步骤(见图5，上图)。在洗涤步骤之后，通过添加IL-1α来引发软骨降解。另外的孵育7天后，定量释放到培养上清液中的GAG。作为对照，包括ADAMTS5抑制性多肽581，其不包含CAP结合部分(SEQ IDNO：65)。
结果如图5所示。
实验表明，对照多肽581，即不含CAP结合部分的多肽，显示几乎没有抑制ADAMTS5的功效。这与其中省略了洗涤步骤的测定法形成了鲜明的对比。另一方面，即使在大量洗涤后，多肽949仍然有效。考虑到在当前的测定条件下GAG的释放是由ADAMTS5驱动的，而不是由MMP13驱动的，这一结果有力地表明CAP结合部分确实起着将多肽锚定在软骨上的作用，而CAP结合部分没有影响ADAMTS5 ISVD的功效。
实施例9多肽949在牛软骨滑膜共培养系统中的作用
知道OA不仅涉及软骨，所以还在包含滑膜(滑液膜)和来自关节软骨的外植体的牛模型中测试了多肽949。简言之，将软骨外植体和滑膜以1/1的比例共培养28天并定期更换培养基。每周一次，在共培养物的上清液中测定C2M(Col II降解)和C3M(Col III降解)。
结果(以AUC＝曲线下的面积表示)如图6所示。
数据显示，软骨外植体与滑膜共同孵育诱导C2M(左图)和C3M(右图)释放。将多肽949以3种不同浓度(1nM、10nM、100nM)孵育。与参考分子Wyeth(MSC2310852A-1)相比，评价了多肽949的作用。数据显示示例性多肽949以及参考化合物强烈地抑制C2M和C3M释放。
实施例10软骨保留研究
为了确定纳米抗体构建体在体内的保留，设计了使用示例性多肽949的大鼠软骨保留研究。由于多肽949具有4个构件(M-A-C-C)，因此假设各自具有两个聚蛋白聚糖结合物和一个靶标特异性ISVD的多肽754和954的行为基本相似。
开发了基于ELISA的配体结合测定法来定量大鼠软骨中的局部纳米抗体构建体浓度，而开发了配体结合测定法(MSD平台)以定量循环中的纳米抗体构建体。
结果如图7所示。
总之，示例性多肽949体内保留在软骨中直至IA施用后112天，而在健康大鼠中仅在第一个采样时间点(IA注射后2小时)才可检测到全身浓度(低pg/ml范围)，而在以后的时间点(14天及以后)未检测到多肽。
因此，包含抗聚蛋白聚糖ISVD 114F08的构建体在体内模型中是稳定的并且得到保留。
实施例11大鼠体内MMT DMOAD研究1
为了证明多肽754(M-C-C；“纳米抗体754”)、多肽954(A-C-C；“纳米抗体954”)和多肽949(M-A-C-C，“纳米抗体949”)的体内功效，使用了在大鼠中通过手术诱导的内侧半月板撕裂(MMT)模型。简言之，在大鼠的一个膝盖中进行手术以诱导OA样症状。手术后3天通过单次IA注射开始治疗。手术后3天对动物施用以下剂量：媒介物(缓冲液)、多肽754(300μg/大鼠)，多肽949(4、40或400μg/大鼠)和多肽954(300μg/大鼠)。
手术后42天进行组织病理学检查。确定胫骨内侧软骨变性宽度和胫骨内侧总软骨变性宽度，以及软骨变性的减少百分比。每组使用20只动物。
胫骨内侧软骨退变宽度的结果如图8所示。
结果表明，与媒介物相比，所有纳米抗体构建体在42天后都显著降低胫骨内侧软骨宽度。这些结果进一步表明
(a)CAP部分对构建体的活性没有负面影响；
(b)CAP部分使得能够保留构建体；
(c)所有构建体均对软骨宽度产生积极影响；和
(d)ADAMTS5抑制剂和MMP13抑制剂的组合表现出总体上最大的效果，如多肽949示例显示的。
实施例12证实性大鼠体内MMT DMOAD研究2
用不同的给药方案基本上重复实施例11中所述的体内功效研究(DMOAD研究1)。此外，在DMOAD研究1中，手术后3天仅出现轻度OA。因此，现在在MMT模型中OA的更晚期评估多肽，同时在手术后7天开始治疗。简言之，在手术后第42天测量胫骨内侧软骨退变宽度，单位为μm。再次，多肽949用来示例显示ADAMTS5和MMP13抑制剂的组合作用。
在第一个实验系列中，每组20只动物，每组在手术后7天接受一次IA注射(400μg、800μg、媒介物)。在治疗结束时，接受400μg多肽949的组显示胫骨内侧软骨变性宽度降低21％，而800μg的组显示降低16％(见图9)。这些结果证实了构建体的功效。
在第二个实验系列中，也是每组20只动物，每组在手术后第7天和第10天接受两次IA注射(200μg、400μg、800μg、媒介物)。在治疗结束时，接受200μg多肽949的组显示胫骨宽度减少14％，800μg的组显示减少31％，而400μg组显示减少35％(图9)。
实施例13：体内症状益处
为了评估多肽提供症状益处的能力，使用了大鼠手术OA模型。简言之，大鼠在第0天接受ACLt和tMx手术以诱导OA。在ACLt和tMx手术模型(前交叉韧带切断并内侧半月板切除术)中，在第1周和第8周以不同浓度(100μg、400μg和1000μg)的IA施用构建体。一组大鼠用他那珠单抗(Pfizer)(抗神经生长因子(NGF)mAB)进行IA治疗，其在研究中被视为缓解症状的阳性对照。在第2、5、9和13周中，确定了通过步态分析(在猫步(CatWalk)上)的症状益处以及关节直径的减小。
结果如图10所示。
用多肽进行关节内治疗可产生高达43％的症状获益。
实施例14：健康和骨关节炎大鼠中CAP结合物的保留与体内相似
实施例10在健康大鼠的软骨保留研究中证明，在关节内(I.A.)注射后直至112天，本发明的多肽在软骨中都是可测量的。由于软骨组合物可影响全身循环中的软骨结合和吸收，因此通过及时追踪多肽的血清水平，在患病的骨关节炎和健康大鼠体内比较了本发明的多肽的药代动力学。
特别地，如实施例10中所述使用大鼠中手术诱导的内侧半月板撕裂(MMT)模型，但是具有一些修改。简言之，将本发明的多肽与抗MMP13 ISV和抗ADAMTS5 ISV(称为“949”、“0949”或“C010100949”纳米抗体)缀合。在大鼠的一个膝盖中进行手术以诱导OA样症状(OA组)。每个治疗组(健康和OA)均由15只动物组成，并在第7天(健康)或手术后7天(MMT)接受一次I.A.注射的400μg/30μl纳米抗体。在第0天、第7天(在0h＝给药前样品)、第8天(治疗后至24小时的不同时间)，第9天(治疗后48小时)，d10(治疗3天)，d14(治疗后7天)，d21(治疗后14天)和d42(治疗后35天)，从麻醉的大鼠收集血清样品。收集的血清样品用于基于电化学发光(ECL)的总PK测定法格式确定多肽浓度，然后进行非房室性分析。
多肽在健康大鼠和OA大鼠的血清中的保留情况如图11所示。
结果表明，在健康大鼠和OA大鼠中，多肽的血清浓度没有明显差异。因此，这些结果支持软骨降解对本发明多肽的药代动力学没有影响。
表A-1本发明多肽的名称和简短描述(“ID”)、SEQ ID NO：(“SEQ”)和氨基酸序列
Figure BDA0002377170790000811
Figure BDA0002377170790000821
表B：其他氨基酸序列：名称和简短描述(“ID”)、SEQ ID NO：(“SEQ”)和氨基酸序列(“序列”)
Figure BDA0002377170790000831
Figure BDA0002377170790000841
表C：多种接头序列(“ID”是指本文所使用的SEQ ID NO)
Figure BDA0002377170790000842
Figure BDA0002377170790000851
表D：结合血清白蛋白的ISVD序列(“ID”是指本文所用的SEQ ID NO)，包括CDR序列
Figure BDA0002377170790000861
Figure BDA0002377170790000871
序列表
<110> Merck Patent GmbH
Ablynx N.V.
<120> 结合ADAMTS5、MMP13和聚蛋白聚糖的多肽
<130> MEPAT.0105
<150> EP17174404.8
<151> 2017-06-02
<160> 68
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 593
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
145 150 155 160
Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
165 170 175
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp
180 185 190
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Ser
195 200 205
Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Leu Lys Gly Arg Phe
210 215 220
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
225 230 235 240
Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Leu
245 250 255
Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln
260 265 270
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
275 280 285
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
305 310 315 320
Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
325 330 335
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr
340 345 350
Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser
355 360 365
Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile
370 375 380
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
385 390 395 400
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His
405 410 415
Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
420 425 430
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
465 470 475 480
Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
485 490 495
Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro
500 505 510
Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala
515 520 525
Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
530 535 540
Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
545 550 555 560
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val
565 570 575
Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
580 585 590
Ala
<210> 2
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu Tyr Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn
20 25 30
Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 434
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
145 150 155 160
Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
165 170 175
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp
180 185 190
Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser
195 200 205
Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr
210 215 220
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
225 230 235 240
Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr
245 250 255
His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
290 295 300
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
305 310 315 320
Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
325 330 335
Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala
340 345 350
Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn
355 360 365
Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
370 375 380
Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu
385 390 395 400
Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly
405 410 415
Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
420 425 430
Ser Ala
<210> 6
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu Tyr Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
145 150 155 160
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser
165 170 175
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val
180 185 190
Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly
210 215 220
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
225 230 235 240
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val
245 250 255
Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln
260 265 270
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
275 280 285
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
305 310 315 320
Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
325 330 335
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr
340 345 350
Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser
355 360 365
Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile
370 375 380
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
385 390 395 400
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His
405 410 415
Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
420 425 430
Thr Val Ser Ser Ala
435
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 8
Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 9
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 10
Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 11
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Thr
35
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 12
Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 13
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 14
Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr Ala Met Gly
1 5 10
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 15
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 16
Gly Ile Ser Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr
1 5 10
<210> 17
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 17
Tyr Val Asp Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala
35
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 18
Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu Tyr Ala Tyr
1 5 10 15
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 19
Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg
1 5 10
<210> 20
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 20
Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
1 5 10
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 21
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn
1 5
<210> 22
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 22
Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val
35
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 23
Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr
1 5 10
<210> 24
<400> 24
000
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 26
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 29
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 31
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 32
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 33
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 33
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 34
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 35
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 35
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 36
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 36
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 37
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 38
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 38
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
1 5 10 15
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20
<210> 39
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 39
Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 40
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 40
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 41
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn
20 25 30
Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Thr Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Ala Val Asp Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
145 150 155 160
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu
165 170 175
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala Val Met Ser Trp
180 185 190
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
210 215 220
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
225 230 235 240
Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly
245 250 255
Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
<210> 42
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
165 170 175
Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Thr Pro Gly
180 185 190
Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn
195 200 205
Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Gly Ala
210 215 220
Lys Asn Ala Val Asp Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr
225 230 235 240
Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr
245 250 255
Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
290 295 300
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
305 310 315 320
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile
325 330 335
Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Thr Pro Gly Lys Gln Arg Glu
340 345 350
Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser
355 360 365
Val Arg Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Ala Val
370 375 380
Asp Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
385 390 395 400
Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr
405 410 415
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
420 425
<210> 43
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
165 170 175
Phe Thr Phe Ser Ser Ala Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
180 185 190
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr
195 200 205
Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
210 215 220
Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
225 230 235 240
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser
245 250 255
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 44
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 45
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 47
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 48
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 49
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 50
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 52
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ala
115
<210> 53
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ala Ala
115
<210> 54
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly
115
<210> 55
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly
115
<210> 56
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly
115
<210> 57
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 58
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 59
Ser Phe Gly Met Ser
1 5
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 60
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 61
Gly Gly Ser Leu Ser Arg
1 5
<210> 62
<211> 515
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr Tyr Val Asp
180 185 190
Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
195 200 205
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ala Ala Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
275 280 285
Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro
290 295 300
Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala
305 310 315 320
Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
325 330 335
Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
340 345 350
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val
355 360 365
Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
385 390 395 400
Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
405 410 415
Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg
420 425 430
Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly
435 440 445
Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
450 455 460
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro
465 470 475 480
Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly
485 490 495
Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
500 505 510
Ser Ser Ala
515
<210> 63
<211> 382
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ala
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Asp Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Thr Gly Tyr Gly Ala Thr Thr Thr Arg Pro Gly Arg Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ile
145 150 155 160
Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu
165 170 175
Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val Asp Ser
180 185 190
Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr
210 215 220
Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly Pro Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val
260 265 270
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr
275 280 285
Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln
290 295 300
Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Val
305 310 315 320
Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
325 330 335
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu
340 345 350
Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr Gly
355 360 365
Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
370 375 380
<210> 64
<211> 385
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu Tyr Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
130 135 140
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser
145 150 155 160
Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys
165 170 175
Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr
180 185 190
Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
195 200 205
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala
210 215 220
Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
275 280 285
Gly Ser Thr Phe Ile Ile Asn Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro
290 295 300
Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ala
305 310 315 320
Asn Tyr Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
325 330 335
Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
340 345 350
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn Val Pro Thr Thr His Tyr Gly Gly Val
355 360 365
Tyr Tyr Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
370 375 380
Ala
385
<210> 65
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 65
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu Tyr Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
145 150 155 160
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn Ser
165 170 175
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
180 185 190
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
195 200 205
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
210 215 220
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu
225 230 235 240
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr
245 250 255
Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
260 265 270
Ser Ser Ala
275
<210> 66
<211> 471
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 66
Met His Pro Gly Val Leu Ala Ala Phe Leu Phe Leu Ser Trp Thr His
1 5 10 15
Cys Arg Ala Leu Pro Leu Pro Ser Gly Gly Asp Glu Asp Asp Leu Ser
20 25 30
Glu Glu Asp Leu Gln Phe Ala Glu Arg Tyr Leu Arg Ser Tyr Tyr His
35 40 45
Pro Thr Asn Leu Ala Gly Ile Leu Lys Glu Asn Ala Ala Ser Ser Met
50 55 60
Thr Glu Arg Leu Arg Glu Met Gln Ser Phe Phe Gly Leu Glu Val Thr
65 70 75 80
Gly Lys Leu Asp Asp Asn Thr Leu Asp Val Met Lys Lys Pro Arg Cys
85 90 95
Gly Val Pro Asp Val Gly Glu Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu Lys
100 105 110
Trp Ser Lys Met Asn Leu Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro Asp
115 120 125
Met Thr His Ser Glu Val Glu Lys Ala Phe Lys Lys Ala Phe Lys Val
130 135 140
Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Asn Phe Thr Arg Leu His Asp Gly Ile
145 150 155 160
Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe Gly Ile Lys Glu His Gly Asp Phe Tyr
165 170 175
Pro Phe Asp Gly Pro Ser Gly Leu Leu Ala His Ala Phe Pro Pro Gly
180 185 190
Pro Asn Tyr Gly Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Thr Trp Thr
195 200 205
Ser Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe
210 215 220
Gly His Ser Leu Gly Leu Asp His Ser Lys Asp Pro Gly Ala Leu Met
225 230 235 240
Phe Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Gly Lys Ser His Phe Met Leu Pro Asp
245 250 255
Asp Asp Val Gln Gly Ile Gln Ser Leu Tyr Gly Pro Gly Asp Glu Asp
260 265 270
Pro Asn Pro Lys His Pro Lys Thr Pro Asp Lys Cys Asp Pro Ser Leu
275 280 285
Ser Leu Asp Ala Ile Thr Ser Leu Arg Gly Glu Thr Met Ile Phe Lys
290 295 300
Asp Arg Phe Phe Trp Arg Leu His Pro Gln Gln Val Asp Ala Glu Leu
305 310 315 320
Phe Leu Thr Lys Ser Phe Trp Pro Glu Leu Pro Asn Arg Ile Asp Ala
325 330 335
Ala Tyr Glu His Pro Ser His Asp Leu Ile Phe Ile Phe Arg Gly Arg
340 345 350
Lys Phe Trp Ala Leu Asn Gly Tyr Asp Ile Leu Glu Gly Tyr Pro Lys
355 360 365
Lys Ile Ser Glu Leu Gly Leu Pro Lys Glu Val Lys Lys Ile Ser Ala
370 375 380
Ala Val His Phe Glu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Leu Phe Ser Gly Asn
385 390 395 400
Gln Val Trp Arg Tyr Asp Asp Thr Asn His Ile Met Asp Lys Asp Tyr
405 410 415
Pro Arg Leu Ile Glu Glu Asp Phe Pro Gly Ile Gly Asp Lys Val Asp
420 425 430
Ala Val Tyr Glu Lys Asn Gly Tyr Ile Tyr Phe Phe Asn Gly Pro Ile
435 440 445
Gln Phe Glu Tyr Ser Ile Trp Ser Asn Arg Ile Val Arg Val Met Pro
450 455 460
Ala Asn Ser Ile Leu Trp Cys
465 470
<210> 67
<211> 930
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 67
Met Leu Leu Gly Trp Ala Ser Leu Leu Leu Cys Ala Phe Arg Leu Pro
1 5 10 15
Leu Ala Ala Val Gly Pro Ala Ala Thr Pro Ala Gln Asp Lys Ala Gly
20 25 30
Gln Pro Pro Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gln Pro Arg Arg Arg Gln Gly
35 40 45
Glu Glu Val Gln Glu Arg Ala Glu Pro Pro Gly His Pro His Pro Leu
50 55 60
Ala Gln Arg Arg Arg Ser Lys Gly Leu Val Gln Asn Ile Asp Gln Leu
65 70 75 80
Tyr Ser Gly Gly Gly Lys Val Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Gly Gly Arg
85 90 95
Arg Phe Leu Leu Asp Leu Glu Arg Asp Gly Ser Val Gly Ile Ala Gly
100 105 110
Phe Val Pro Ala Gly Gly Gly Thr Ser Ala Pro Trp Arg His Arg Ser
115 120 125
His Cys Phe Tyr Arg Gly Thr Val Asp Gly Ser Pro Arg Ser Leu Ala
130 135 140
Val Phe Asp Leu Cys Gly Gly Leu Asp Gly Phe Phe Ala Val Lys His
145 150 155 160
Ala Arg Tyr Thr Leu Lys Pro Leu Leu Arg Gly Pro Trp Ala Glu Glu
165 170 175
Glu Lys Gly Arg Val Tyr Gly Asp Gly Ser Ala Arg Ile Leu His Val
180 185 190
Tyr Thr Arg Glu Gly Phe Ser Phe Glu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Ser
195 200 205
Cys Glu Thr Pro Ala Ser Thr Pro Glu Ala His Glu His Ala Pro Ala
210 215 220
His Ser Asn Pro Ser Gly Arg Ala Ala Leu Ala Ser Gln Leu Leu Asp
225 230 235 240
Gln Ser Ala Leu Ser Pro Ala Gly Gly Ser Gly Pro Gln Thr Trp Trp
245 250 255
Arg Arg Arg Arg Arg Ser Ile Ser Arg Ala Arg Gln Val Glu Leu Leu
260 265 270
Leu Val Ala Asp Ala Ser Met Ala Arg Leu Tyr Gly Arg Gly Leu Gln
275 280 285
His Tyr Leu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Ala Asn Arg Leu Tyr Ser His
290 295 300
Ala Ser Ile Glu Asn His Ile Arg Leu Ala Val Val Lys Val Val Val
305 310 315 320
Leu Gly Asp Lys Asp Lys Ser Leu Glu Val Ser Lys Asn Ala Ala Thr
325 330 335
Thr Leu Lys Asn Phe Cys Lys Trp Gln His Gln His Asn Gln Leu Gly
340 345 350
Asp Asp His Glu Glu His Tyr Asp Ala Ala Ile Leu Phe Thr Arg Glu
355 360 365
Asp Leu Cys Gly His His Ser Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val
370 375 380
Gly Thr Ile Cys Ser Pro Glu Arg Ser Cys Ala Val Ile Glu Asp Asp
385 390 395 400
Gly Leu His Ala Ala Phe Thr Val Ala His Glu Ile Gly His Leu Leu
405 410 415
Gly Leu Ser His Asp Asp Ser Lys Phe Cys Glu Glu Thr Phe Gly Ser
420 425 430
Thr Glu Asp Lys Arg Leu Met Ser Ser Ile Leu Thr Ser Ile Asp Ala
435 440 445
Ser Lys Pro Trp Ser Lys Cys Thr Ser Ala Thr Ile Thr Glu Phe Leu
450 455 460
Asp Asp Gly His Gly Asn Cys Leu Leu Asp Leu Pro Arg Lys Gln Ile
465 470 475 480
Leu Gly Pro Glu Glu Leu Pro Gly Gln Thr Tyr Asp Ala Thr Gln Gln
485 490 495
Cys Asn Leu Thr Phe Gly Pro Glu Tyr Ser Val Cys Pro Gly Met Asp
500 505 510
Val Cys Ala Arg Leu Trp Cys Ala Val Val Arg Gln Gly Gln Met Val
515 520 525
Cys Leu Thr Lys Lys Leu Pro Ala Val Glu Gly Thr Pro Cys Gly Lys
530 535 540
Gly Arg Ile Cys Leu Gln Gly Lys Cys Val Asp Lys Thr Lys Lys Lys
545 550 555 560
Tyr Tyr Ser Thr Ser Ser His Gly Asn Trp Gly Ser Trp Gly Ser Trp
565 570 575
Gly Gln Cys Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ala Tyr Arg
580 585 590
His Cys Asn Asn Pro Ala Pro Arg Asn Asn Gly Arg Tyr Cys Thr Gly
595 600 605
Lys Arg Ala Ile Tyr Arg Ser Cys Ser Leu Met Pro Cys Pro Pro Asn
610 615 620
Gly Lys Ser Phe Arg His Glu Gln Cys Glu Ala Lys Asn Gly Tyr Gln
625 630 635 640
Ser Asp Ala Lys Gly Val Lys Thr Phe Val Glu Trp Val Pro Lys Tyr
645 650 655
Ala Gly Val Leu Pro Ala Asp Val Cys Lys Leu Thr Cys Arg Ala Lys
660 665 670
Gly Thr Gly Tyr Tyr Val Val Phe Ser Pro Lys Val Thr Asp Gly Thr
675 680 685
Glu Cys Arg Leu Tyr Ser Asn Ser Val Cys Val Arg Gly Lys Cys Val
690 695 700
Arg Thr Gly Cys Asp Gly Ile Ile Gly Ser Lys Leu Gln Tyr Asp Lys
705 710 715 720
Cys Gly Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser Ser Cys Thr Lys Ile Val Gly
725 730 735
Thr Phe Asn Lys Lys Ser Lys Gly Tyr Thr Asp Val Val Arg Ile Pro
740 745 750
Glu Gly Ala Thr His Ile Lys Val Arg Gln Phe Lys Ala Lys Asp Gln
755 760 765
Thr Arg Phe Thr Ala Tyr Leu Ala Leu Lys Lys Lys Asn Gly Glu Tyr
770 775 780
Leu Ile Asn Gly Lys Tyr Met Ile Ser Thr Ser Glu Thr Ile Ile Asp
785 790 795 800
Ile Asn Gly Thr Val Met Asn Tyr Ser Gly Trp Ser His Arg Asp Asp
805 810 815
Phe Leu His Gly Met Gly Tyr Ser Ala Thr Lys Glu Ile Leu Ile Val
820 825 830
Gln Ile Leu Ala Thr Asp Pro Thr Lys Pro Leu Asp Val Arg Tyr Ser
835 840 845
Phe Phe Val Pro Lys Lys Ser Thr Pro Lys Val Asn Ser Val Thr Ser
850 855 860
His Gly Ser Asn Lys Val Gly Ser His Thr Ser Gln Pro Gln Trp Val
865 870 875 880
Thr Gly Pro Trp Leu Ala Cys Ser Arg Thr Cys Asp Thr Gly Trp His
885 890 895
Thr Arg Thr Val Gln Cys Gln Asp Gly Asn Arg Lys Leu Ala Lys Gly
900 905 910
Cys Pro Leu Ser Gln Arg Pro Ser Ala Phe Lys Gln Cys Leu Leu Lys
915 920 925
Lys Cys
930
<210> 68
<211> 2415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列
<400> 68
Met Thr Thr Leu Leu Trp Val Phe Val Thr Leu Arg Val Ile Thr Ala
1 5 10 15
Ala Val Thr Val Glu Thr Ser Asp His Asp Asn Ser Leu Ser Val Ser
20 25 30
Ile Pro Gln Pro Ser Pro Leu Arg Val Leu Leu Gly Thr Ser Leu Thr
35 40 45
Ile Pro Cys Tyr Phe Ile Asp Pro Met His Pro Val Thr Thr Ala Pro
50 55 60
Ser Thr Ala Pro Leu Ala Pro Arg Ile Lys Trp Ser Arg Val Ser Lys
65 70 75 80
Glu Lys Glu Val Val Leu Leu Val Ala Thr Glu Gly Arg Val Arg Val
85 90 95
Asn Ser Ala Tyr Gln Asp Lys Val Ser Leu Pro Asn Tyr Pro Ala Ile
100 105 110
Pro Ser Asp Ala Thr Leu Glu Val Gln Ser Leu Arg Ser Asn Asp Ser
115 120 125
Gly Val Tyr Arg Cys Glu Val Met His Gly Ile Glu Asp Ser Glu Ala
130 135 140
Thr Leu Glu Val Val Val Lys Gly Ile Val Phe His Tyr Arg Ala Ile
145 150 155 160
Ser Thr Arg Tyr Thr Leu Asp Phe Asp Arg Ala Gln Arg Ala Cys Leu
165 170 175
Gln Asn Ser Ala Ile Ile Ala Thr Pro Glu Gln Leu Gln Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Asp Gly Phe His Gln Cys Asp Ala Gly Trp Leu Ala Asp Gln Thr
195 200 205
Val Arg Tyr Pro Ile His Thr Pro Arg Glu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys
210 215 220
Asp Glu Phe Pro Gly Val Arg Thr Tyr Gly Ile Arg Asp Thr Asn Glu
225 230 235 240
Thr Tyr Asp Val Tyr Cys Phe Ala Glu Glu Met Glu Gly Glu Val Phe
245 250 255
Tyr Ala Thr Ser Pro Glu Lys Phe Thr Phe Gln Glu Ala Ala Asn Glu
260 265 270
Cys Arg Arg Leu Gly Ala Arg Leu Ala Thr Thr Gly His Val Tyr Leu
275 280 285
Ala Trp Gln Ala Gly Met Asp Met Cys Ser Ala Gly Trp Leu Ala Asp
290 295 300
Arg Ser Val Arg Tyr Pro Ile Ser Lys Ala Arg Pro Asn Cys Gly Gly
305 310 315 320
Asn Leu Leu Gly Val Arg Thr Val Tyr Val His Ala Asn Gln Thr Gly
325 330 335
Tyr Pro Asp Pro Ser Ser Arg Tyr Asp Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Glu
340 345 350
Asp Phe Val Asp Ile Pro Glu Asn Phe Phe Gly Val Gly Gly Glu Glu
355 360 365
Asp Ile Thr Val Gln Thr Val Thr Trp Pro Asp Met Glu Leu Pro Leu
370 375 380
Pro Arg Asn Ile Thr Glu Gly Glu Ala Arg Gly Ser Val Ile Leu Thr
385 390 395 400
Val Lys Pro Ile Phe Glu Val Ser Pro Ser Pro Leu Glu Pro Glu Glu
405 410 415
Pro Phe Thr Phe Ala Pro Glu Ile Gly Ala Thr Ala Phe Ala Glu Val
420 425 430
Glu Asn Glu Thr Gly Glu Ala Thr Arg Pro Trp Gly Phe Pro Thr Pro
435 440 445
Gly Leu Gly Pro Ala Thr Ala Phe Thr Ser Glu Asp Leu Val Val Gln
450 455 460
Val Thr Ala Val Pro Gly Gln Pro His Leu Pro Gly Gly Val Val Phe
465 470 475 480
His Tyr Arg Pro Gly Pro Thr Arg Tyr Ser Leu Thr Phe Glu Glu Ala
485 490 495
Gln Gln Ala Cys Pro Gly Thr Gly Ala Val Ile Ala Ser Pro Glu Gln
500 505 510
Leu Gln Ala Ala Tyr Glu Ala Gly Tyr Glu Gln Cys Asp Ala Gly Trp
515 520 525
Leu Arg Asp Gln Thr Val Arg Tyr Pro Ile Val Ser Pro Arg Thr Pro
530 535 540
Cys Val Gly Asp Lys Asp Ser Ser Pro Gly Val Arg Thr Tyr Gly Val
545 550 555 560
Arg Pro Ser Thr Glu Thr Tyr Asp Val Tyr Cys Phe Val Asp Arg Leu
565 570 575
Glu Gly Glu Val Phe Phe Ala Thr Arg Leu Glu Gln Phe Thr Phe Gln
580 585 590
Glu Ala Leu Glu Phe Cys Glu Ser His Asn Ala Thr Ala Thr Thr Gly
595 600 605
Gln Leu Tyr Ala Ala Trp Ser Arg Gly Leu Asp Lys Cys Tyr Ala Gly
610 615 620
Trp Leu Ala Asp Gly Ser Leu Arg Tyr Pro Ile Val Thr Pro Arg Pro
625 630 635 640
Ala Cys Gly Gly Asp Lys Pro Gly Val Arg Thr Val Tyr Leu Tyr Pro
645 650 655
Asn Gln Thr Gly Leu Pro Asp Pro Leu Ser Arg His His Ala Phe Cys
660 665 670
Phe Arg Gly Ile Ser Ala Val Pro Ser Pro Gly Glu Glu Glu Gly Gly
675 680 685
Thr Pro Thr Ser Pro Ser Gly Val Glu Glu Trp Ile Val Thr Gln Val
690 695 700
Val Pro Gly Val Ala Ala Val Pro Val Glu Glu Glu Thr Thr Ala Val
705 710 715 720
Pro Ser Gly Glu Thr Thr Ala Ile Leu Glu Phe Thr Thr Glu Pro Glu
725 730 735
Asn Gln Thr Glu Trp Glu Pro Ala Tyr Thr Pro Val Gly Thr Ser Pro
740 745 750
Leu Pro Gly Ile Leu Pro Thr Trp Pro Pro Thr Gly Ala Glu Thr Glu
755 760 765
Glu Ser Thr Glu Gly Pro Ser Ala Thr Glu Val Pro Ser Ala Ser Glu
770 775 780
Glu Pro Ser Pro Ser Glu Val Pro Phe Pro Ser Glu Glu Pro Ser Pro
785 790 795 800
Ser Glu Glu Pro Phe Pro Ser Val Arg Pro Phe Pro Ser Val Glu Leu
805 810 815
Phe Pro Ser Glu Glu Pro Phe Pro Ser Lys Glu Pro Ser Pro Ser Glu
820 825 830
Glu Pro Ser Ala Ser Glu Glu Pro Tyr Thr Pro Ser Pro Pro Glu Pro
835 840 845
Ser Trp Thr Glu Leu Pro Ser Ser Gly Glu Glu Ser Gly Ala Pro Asp
850 855 860
Val Ser Gly Asp Phe Thr Gly Ser Gly Asp Val Ser Gly His Leu Asp
865 870 875 880
Phe Ser Gly Gln Leu Ser Gly Asp Arg Ala Ser Gly Leu Pro Ser Gly
885 890 895
Asp Leu Asp Ser Ser Gly Leu Thr Ser Thr Val Gly Ser Gly Leu Thr
900 905 910
Val Glu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Asp Glu Glu Arg Ile Glu Trp Pro
915 920 925
Ser Thr Pro Thr Val Gly Glu Leu Pro Ser Gly Ala Glu Ile Leu Glu
930 935 940
Gly Ser Ala Ser Gly Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu
945 950 955 960
Val Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro
965 970 975
Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser
980 985 990
Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Glu
995 1000 1005
Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro
1010 1015 1020
Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr
1025 1030 1035 1040
Thr Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val
1045 1050 1055
Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser
1060 1065 1070
Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly
1075 1080 1085
Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp
1090 1095 1100
Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly
1105 1110 1115 1120
Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala
1125 1130 1135
Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu
1140 1145 1150
Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly
1155 1160 1165
Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu
1170 1175 1180
Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile
1185 1190 1195 1200
Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val
1205 1210 1215
Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala
1220 1225 1230
Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu
1235 1240 1245
Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu
1250 1255 1260
Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro
1265 1270 1275 1280
Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Glu Glu Ile Ser
1285 1290 1295
Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Asp
1300 1305 1310
Glu Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro
1315 1320 1325
Gly Val Glu Glu Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr
1330 1335 1340
Ser Thr Ser Ala Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Gly Glu
1345 1350 1355 1360
Val Leu Glu Ile Ser Val Ser Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro
1365 1370 1375
Ser Gly Glu Val Val Glu Thr Ser Ala Ser Gly Ile Glu Asp Val Ser
1380 1385 1390
Glu Leu Pro Ser Gly Glu Gly Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Val Glu
1395 1400 1405
Asp Leu Ser Arg Leu Pro Ser Gly Glu Glu Val Leu Glu Ile Ser Ala
1410 1415 1420
Ser Gly Phe Gly Asp Leu Ser Gly Val Pro Ser Gly Gly Glu Gly Leu
1425 1430 1435 1440
Glu Thr Ser Ala Ser Glu Val Gly Thr Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser
1445 1450 1455
Gly Arg Glu Gly Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Ala Glu Asp Leu Ser
1460 1465 1470
Gly Leu Pro Ser Gly Lys Glu Asp Leu Val Gly Ser Ala Ser Gly Asp
1475 1480 1485
Leu Asp Leu Gly Lys Leu Pro Ser Gly Thr Leu Gly Ser Gly Gln Ala
1490 1495 1500
Pro Glu Thr Ser Gly Leu Pro Ser Gly Phe Ser Gly Glu Tyr Ser Gly
1505 1510 1515 1520
Val Asp Leu Gly Ser Gly Pro Pro Ser Gly Leu Pro Asp Phe Ser Gly
1525 1530 1535
Leu Pro Ser Gly Phe Pro Thr Val Ser Leu Val Asp Ser Thr Leu Val
1540 1545 1550
Glu Val Val Thr Ala Ser Thr Ala Ser Glu Leu Glu Gly Arg Gly Thr
1555 1560 1565
Ile Gly Ile Ser Gly Ala Gly Glu Ile Ser Gly Leu Pro Ser Ser Glu
1570 1575 1580
Leu Asp Ile Ser Gly Arg Ala Ser Gly Leu Pro Ser Gly Thr Glu Leu
1585 1590 1595 1600
Ser Gly Gln Ala Ser Gly Ser Pro Asp Val Ser Gly Glu Ile Pro Gly
1605 1610 1615
Leu Phe Gly Val Ser Gly Gln Pro Ser Gly Phe Pro Asp Thr Ser Gly
1620 1625 1630
Glu Thr Ser Gly Val Thr Glu Leu Ser Gly Leu Ser Ser Gly Gln Pro
1635 1640 1645
Gly Val Ser Gly Glu Ala Ser Gly Val Leu Tyr Gly Thr Ser Gln Pro
1650 1655 1660
Phe Gly Ile Thr Asp Leu Ser Gly Glu Thr Ser Gly Val Pro Asp Leu
1665 1670 1675 1680
Ser Gly Gln Pro Ser Gly Leu Pro Gly Phe Ser Gly Ala Thr Ser Gly
1685 1690 1695
Val Pro Asp Leu Val Ser Gly Thr Thr Ser Gly Ser Gly Glu Ser Ser
1700 1705 1710
Gly Ile Thr Phe Val Asp Thr Ser Leu Val Glu Val Ala Pro Thr Thr
1715 1720 1725
Phe Lys Glu Glu Glu Gly Leu Gly Ser Val Glu Leu Ser Gly Leu Pro
1730 1735 1740
Ser Gly Glu Ala Asp Leu Ser Gly Lys Ser Gly Met Val Asp Val Ser
1745 1750 1755 1760
Gly Gln Phe Ser Gly Thr Val Asp Ser Ser Gly Phe Thr Ser Gln Thr
1765 1770 1775
Pro Glu Phe Ser Gly Leu Pro Ser Gly Ile Ala Glu Val Ser Gly Glu
1780 1785 1790
Ser Ser Arg Ala Glu Ile Gly Ser Ser Leu Pro Ser Gly Ala Tyr Tyr
1795 1800 1805
Gly Ser Gly Thr Pro Ser Ser Phe Pro Thr Val Ser Leu Val Asp Arg
1810 1815 1820
Thr Leu Val Glu Ser Val Thr Gln Ala Pro Thr Ala Gln Glu Ala Gly
1825 1830 1835 1840
Glu Gly Pro Ser Gly Ile Leu Glu Leu Ser Gly Ala His Ser Gly Ala
1845 1850 1855
Pro Asp Met Ser Gly Glu His Ser Gly Phe Leu Asp Leu Ser Gly Leu
1860 1865 1870
Gln Ser Gly Leu Ile Glu Pro Ser Gly Glu Pro Pro Gly Thr Pro Tyr
1875 1880 1885
Phe Ser Gly Asp Phe Ala Ser Thr Thr Asn Val Ser Gly Glu Ser Ser
1890 1895 1900
Val Ala Met Gly Thr Ser Gly Glu Ala Ser Gly Leu Pro Glu Val Thr
1905 1910 1915 1920
Leu Ile Thr Ser Glu Phe Val Glu Gly Val Thr Glu Pro Thr Ile Ser
1925 1930 1935
Gln Glu Leu Gly Gln Arg Pro Pro Val Thr His Thr Pro Gln Leu Phe
1940 1945 1950
Glu Ser Ser Gly Lys Val Ser Thr Ala Gly Asp Ile Ser Gly Ala Thr
1955 1960 1965
Pro Val Leu Pro Gly Ser Gly Val Glu Val Ser Ser Val Pro Glu Ser
1970 1975 1980
Ser Ser Glu Thr Ser Ala Tyr Pro Glu Ala Gly Phe Gly Ala Ser Ala
1985 1990 1995 2000
Ala Pro Glu Ala Ser Arg Glu Asp Ser Gly Ser Pro Asp Leu Ser Glu
2005 2010 2015
Thr Thr Ser Ala Phe His Glu Ala Asn Leu Glu Arg Ser Ser Gly Leu
2020 2025 2030
Gly Val Ser Gly Ser Thr Leu Thr Phe Gln Glu Gly Glu Ala Ser Ala
2035 2040 2045
Ala Pro Glu Val Ser Gly Glu Ser Thr Thr Thr Ser Asp Val Gly Thr
2050 2055 2060
Glu Ala Pro Gly Leu Pro Ser Ala Thr Pro Thr Ala Ser Gly Asp Arg
2065 2070 2075 2080
Thr Glu Ile Ser Gly Asp Leu Ser Gly His Thr Ser Gln Leu Gly Val
2085 2090 2095
Val Ile Ser Thr Ser Ile Pro Glu Ser Glu Trp Thr Gln Gln Thr Gln
2100 2105 2110
Arg Pro Ala Glu Thr His Leu Glu Ile Glu Ser Ser Ser Leu Leu Tyr
2115 2120 2125
Ser Gly Glu Glu Thr His Thr Val Glu Thr Ala Thr Ser Pro Thr Asp
2130 2135 2140
Ala Ser Ile Pro Ala Ser Pro Glu Trp Lys Arg Glu Ser Glu Ser Thr
2145 2150 2155 2160
Ala Ala Ala Pro Ala Arg Ser Cys Ala Glu Glu Pro Cys Gly Ala Gly
2165 2170 2175
Thr Cys Lys Glu Thr Glu Gly His Val Ile Cys Leu Cys Pro Pro Gly
2180 2185 2190
Tyr Thr Gly Glu His Cys Asn Ile Asp Gln Glu Val Cys Glu Glu Gly
2195 2200 2205
Trp Asn Lys Tyr Gln Gly His Cys Tyr Arg His Phe Pro Asp Arg Glu
2210 2215 2220
Thr Trp Val Asp Ala Glu Arg Arg Cys Arg Glu Gln Gln Ser His Leu
2225 2230 2235 2240
Ser Ser Ile Val Thr Pro Glu Glu Gln Glu Phe Val Asn Asn Asn Ala
2245 2250 2255
Gln Asp Tyr Gln Trp Ile Gly Leu Asn Asp Arg Thr Ile Glu Gly Asp
2260 2265 2270
Phe Arg Trp Ser Asp Gly His Pro Met Gln Phe Glu Asn Trp Arg Pro
2275 2280 2285
Asn Gln Pro Asp Asn Phe Phe Ala Ala Gly Glu Asp Cys Val Val Met
2290 2295 2300
Ile Trp His Glu Lys Gly Glu Trp Asn Asp Val Pro Cys Asn Tyr His
2305 2310 2315 2320
Leu Pro Phe Thr Cys Lys Lys Gly Thr Val Ala Cys Gly Glu Pro Pro
2325 2330 2335
Val Val Glu His Ala Arg Thr Phe Gly Gln Lys Lys Asp Arg Tyr Glu
2340 2345 2350
Ile Asn Ser Leu Val Arg Tyr Gln Cys Thr Glu Gly Phe Val Gln Arg
2355 2360 2365
His Met Pro Thr Ile Arg Cys Gln Pro Ser Gly His Trp Glu Glu Pro
2370 2375 2380
Arg Ile Thr Cys Thr Asp Ala Thr Thr Tyr Lys Arg Arg Leu Gln Lys
2385 2390 2395 2400
Arg Ser Ser Arg His Pro Arg Arg Ser Arg Pro Ser Thr Ala His
2405 2410 2415

Claims (30)

1.选自以下的多肽：
(a)包含至少2个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)的多肽，其中第一ISVD特异性结合基质金属蛋白酶(MMP)并且第二ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，并且所述多肽可选地包含特异性结合聚蛋白聚糖的第三ISVD；
(b)包含至少2个ISVD的多肽，其中第一ISVD特异性结合具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶(ADAMTS)并且第二ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，并且所述多肽可选地包含特异性结合聚蛋白聚糖的第三ISVD；和
(c)包含至少3个ISVD的多肽，其中第一ISVD特异性结合基质金属蛋白酶(MMP)，第二ISVD特异性结合ADAMTS并且第三ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，并且所述多肽可选地包含特异性结合聚蛋白聚糖的第四ISVD。
2.根据权利要求1的多肽，其中第一ISVD特异性结合MMP，第二ISVD特异性结合ADAMTS，第三ISVD特异性结合聚蛋白聚糖并且第四ISVD特异性结合聚蛋白聚糖。
3.根据权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述MMP是MMP13。
4.根据权利要求3的多肽，其中所述特异性结合MMP13的ISVD包含3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)，其中
(i)CDR1是SEQ ID NO：8或
与SEQ ID NO：8具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2是SEQ ID NO：10或
与SEQ ID NO：10具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
(iii)CDR3是SEQ ID NO：12或
与SEQ ID NO：12具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列。
5.根据权利要求4的多肽，其中CDR1是SEQ ID NO：8，CDR2是SEQ ID NO：10并且CDR3是SEQ ID NO：12。
6.根据权利要求4或5所述的多肽，其中所述特异性结合MMP13的ISVD包含或由SEQ IDNO：2组成。
7.根据权利要求1至6中任一项的多肽，其中所述ADAMTS是ADAMTS5。
8.根据权利要求7的多肽，其中所述特异性结合ADAMTS5的ISVD包含3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)，其中
(i)CDR1是SEQ ID NO：14[GRTVSSYAMG]或
与SEQ ID NO：14具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2是SEQ ID NO：16[GISRSAERTY]或
与SEQ ID NO：16具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(iii)CDR3是SEQ ID NO：18[DLDPNRIFSREEYAY]或
与SEQ ID NO：18具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列。
9.根据权利要求8的多肽，其中CDR1是SEQ ID NO：14，CDR2是SEQ ID NO：16并且CDR3是SEQ ID NO：18。
10.根据权利要求8或9的多肽，其中所述特异性结合ADAMTS5的ISVD包含或由SEQ IDNO：3组成。
11.根据权利要求3的多肽，其中所述特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD包含3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)，其中
(i)CDR1是SEQ ID NO：19或
与SEQ ID NO：19具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2是SEQ ID NO：21或
与SEQ ID NO：21具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(iii)CDR3是SEQ ID NO：23或
与SEQ ID NO：23具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列。
12.根据权利要求11的多肽，其中CDR1是SEQ ID NO：19，CDR2是SEQ ID NO：21并且CDR3是SEQ ID NO：23。
13.根据权利要求11或12的多肽，其中所述特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD包含或由SEQID NO：4组成。
14.根据权利要求1至13中任一项的多肽，其中所述ISVD通过接头彼此连接。
15.根据权利要求14的多肽，其中所述接头选自SEQ ID NO：24至40，优选地SEQ ID NO：28[9GS]或SEQ ID NO：35[35GS]。
16.根据权利要求1的多肽，其中所述第一ISVD特异性结合MMP13，所述第二ISVD特异性结合ADAMTS5，所述第三ISVD特异性结合聚蛋白聚糖并且所述第四ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，并且其中所述多肽优选地包含或由SEQ ID NO：1或62组成，或者包含或由与SEQ IDNO：1或62具有至少95％序列同一性的多肽组成。
17.根据权利要求1的多肽，其中所述第一ISVD特异性结合MMP13，所述第二ISVD特异性结合聚蛋白聚糖并且所述第三ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，优选地包或含由SEQ ID NO：5或63组成。
18.根据权利要求1的多肽，其中所述第一ISVD特异性结合ADAMTS5，所述第二ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，并且所述第三ISVD特异性结合聚蛋白聚糖，优选地包含或由SEQ IDNO：6或64组成。
19.根据前述权利要求中任一项的多肽，其中
(i)所述特异性结合MMP13的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和所述3个互补决定区CDR1至CDR3组成；和/或
(ii)所述特异性结合ADAMTS5的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和所述3个互补决定区CDR1至CDR3组成；和/或
(iii)所述特异性结合聚蛋白聚糖的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和所述3个互补决定区CDR1至CDR3组成。
20.构建体，其包含或基本上由根据前述权利要求中任一项的多肽组成，并且其还包含一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元，可选地经由一个或多个肽接头连接。
21.核酸，其编码根据权利要求1至19中任一项的多肽或根据权利要求20的构建体。
22.表达载体，其包含根据权利要求21的核酸。
23.宿主或宿主细胞，其包含根据权利要求21的核酸或根据权利要求21的表达载体。
24.组合物，其包含根据权利要求1至19中任一项的多肽或根据权利要求19的构建体，或根据权利要求21的核酸。
25.产生根据权利要求1至19中任一项的多肽的方法，所述方法至少包括以下步骤：
a)在合适的宿主细胞、宿主生物或合适的表达系统中表达根据权利要求21的核酸；可选地随后
b)分离和/或纯化根据权利要求1至19中任一项的多肽。
26.根据权利要求24的组合物，其是药物组合物。
27.根据权利要求26的组合物，其还包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且可选地包含一种或多种其他药学上有活性的多肽和/或化合物。
28.根据权利要求26或27所述的组合物、根据权利要求1至19中任一项的多肽或根据权利要求20的构建体，用作药物。
29.根据权利要求26或27的组合物、根据权利要求1至19中任一项的多肽或根据权利要求20的构建体，用于预防以下的症状或治疗以下：关节病和软骨营养不良，关节炎疾病，例如骨关节炎，类风湿性关节炎，痛风性关节炎，银屑病关节炎，外伤性破裂或脱离，软骨发育不全，肋软骨炎，脊椎干骺端发育异常，椎间盘突出症，腰椎间盘退变疾病，退变性关节疾病，复发性多发性软骨炎，剥离性骨软骨炎，聚蛋白聚糖病变，NASH，慢性牙周炎和腹主动脉瘤。
30.预防个体的疾病或病症的症状或者治疗个体的疾病或病症的方法，所述方法包括以有效治疗或预防关节病和软骨营养不良，关节炎疾病，例如骨关节炎，类风湿性关节炎，痛风性关节炎，银屑病关节炎，外伤性破裂或脱离，软骨发育不全，肋软骨炎，脊椎干骺端发育异常，椎间盘突出症，腰椎间盘退变疾病，退变性关节疾病，复发性多发性软骨炎，剥离性骨软骨炎，聚蛋白聚糖病变，NASH，慢性牙周炎和腹主动脉瘤的症状的量，施用根据权利要求1至19中任一项的多肽、根据权利要求20的构建体或者根据权利要求26或27的组合物给所述个体。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7001615B2 (ja) 2016-11-28 2022-02-03 中外製薬株式会社 抗原結合ドメインおよび運搬部分を含むポリペプチド
EP4272822A3 (en) 2017-06-02 2024-03-27 Merck Patent GmbH Adamts binding immunoglobulins
US20240092939A1 (en) * 2022-09-07 2024-03-21 Synoa Therapeutics, Llc Methods and compositions comprising novel bispecific antibodies

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090202474A1 (en) * 2007-11-19 2009-08-13 Wyeth Expression of orphan gpr64 in inflammatory diseases
CN102482700A (zh) * 2009-07-02 2012-05-30 葛兰素集团有限公司 多肽和治疗方法
US20150323528A1 (en) * 2014-04-02 2015-11-12 Gwangju Institute Of Science And Technology Pharmaceutical compositions comprising inhibitors of zinc-zip8-mtf1 as active ingredients for preventing or treating a joint disease

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB335768A (en) 1929-10-24 1930-10-02 Jacoviac Maurice Improvements in protecting devices for gramophone disc records
US4938949A (en) 1988-09-12 1990-07-03 University Of New York Treatment of damaged bone marrow and dosage units therefor
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
DK1621554T4 (da) 1992-08-21 2012-12-17 Univ Bruxelles Immunoglobuliner blottet for lette kæder
DK0698097T3 (da) 1993-04-29 2001-10-08 Unilever Nv Produktion af antistoffer eller (funktionaliserede) fragmenter deraf afledt af Camelidae-immunoglobuliner med tung kæde
DK0702721T3 (da) 1993-06-09 2001-05-21 Unilever Nv Fremgangsmåde til fremstilling af fusionsproteiner, der omfatter ScFv fragmenter, ved hjælp af en transformeret skimmelsvamp
FR2708622B1 (fr) 1993-08-02 1997-04-18 Raymond Hamers Vecteur recombinant contenant une séquence d'un gène de lipoprotéine de structure pour l'expression de séquences de nucléotides.
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
ES2294799T3 (es) 1996-06-27 2008-04-01 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw. Moleculas de anticuerpos que interactuan especificamente con el sitio activo o hendidura de una molecula diana.
WO1998029560A1 (fr) 1996-12-26 1998-07-09 Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Anticorps monoclonal contre la collagenase 3 et procede de dosage immunologique utilisant cet anticorps
US6329516B1 (en) 1997-04-28 2001-12-11 Fmc Corporation Lepidopteran GABA-gated chloride channels
CN1203178C (zh) 1997-10-27 2005-05-25 尤尼利弗公司 多价抗原结合蛋白
WO1999037681A2 (en) 1998-01-26 1999-07-29 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
JP2003525016A (ja) 1998-02-19 2003-08-26 エクサイト セラピーズ， インコーポレイテッド リンパ球活性化を調節するための組成物および方法
EP0967284A1 (en) 1998-05-28 1999-12-29 Pfizer Limited Phosphodiesterases
AU3041100A (en) 1999-01-05 2000-07-24 Unilever Plc Binding of antibody fragments to solid supports
DK1144616T4 (da) 1999-01-19 2009-03-30 Unilever Nv Fremgangsmåde til fremstilling af antistoffragmenter
WO2000046383A2 (en) 1999-02-05 2000-08-10 Rijksuniversiteit Leiden Method of modulating metabolite biosynthesis in recombinant cells
AU784108B2 (en) 1999-03-15 2006-02-02 University Of British Columbia, The Methods and reagents for modulating cholesterol levels
AP1447A (en) 1999-04-22 2005-08-12 Unilever Plc Inhibition of viral infection using monovalent antigen-binding proteins.
CA2375787C (en) 1999-06-18 2007-03-27 Cv Therapeutics, Inc. Compositions and methods for increasing cholesterol efflux and raising hdl using atp binding cassette transporter protein abc1
AU6322900A (en) 1999-08-02 2001-02-19 Keygene N.V. Method for generating resistance against cgmmv in plants, genetic constructs for use in said method, and cgmmv-resistant plants obtained via said method
GB9922124D0 (en) 1999-09-17 1999-11-17 Pfizer Ltd Phosphodiesterase enzymes
US6479280B1 (en) 1999-09-24 2002-11-12 Vlaams Interuniversitair Institutuut Voor Biotechnologie Vzw Recombinant phages capable of entering host cells via specific interaction with an artificial receptor
DE19955408A1 (de) 1999-11-18 2001-05-23 Bayer Ag GABA-B-Rezeptoren
EP1242460B1 (en) 1999-11-29 2006-10-18 Unilever Plc Immobilisation of proteins using a polypeptide segment
ATE440111T1 (de) 1999-11-29 2009-09-15 Bac Ip B V Immobilisierte antigenbindende moleküle aus einer domäne
ES2270893T3 (es) 1999-12-24 2007-04-16 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones para prolongar la vida media de compuestos bioactivos.
DE60138333D1 (de) 2000-03-14 2009-05-28 Unilever Nv Variabele Domänen der schweren Kette eines Antikörpers gegen menschliche Ernährungslipasen und deren Verwendungen
CA2380443C (en) 2000-05-26 2013-03-12 Ginette Dubuc Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
AU2002229639A1 (en) 2000-12-13 2002-06-24 De Haard, Johannes Joseph Wilhelmus Camelidae antibody arrays
EP1377306A1 (en) 2001-03-09 2004-01-07 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
JP4303105B2 (ja) 2001-06-28 2009-07-29 ドマンティス リミテッド 二重特異性リガンドとその利用
US7371849B2 (en) 2001-09-13 2008-05-13 Institute For Antibodies Co., Ltd. Methods of constructing camel antibody libraries
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
AU2002351896A1 (en) 2001-12-11 2003-06-23 Ablynx N.V. Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts
US20050037358A1 (en) 2001-12-21 2005-02-17 Serge Muyldermans Method for cloning of variable domain sequences
JP2005517674A (ja) 2002-01-03 2005-06-16 フラームス・インテルウニフェルシタイル・インステイチュート・フォール・ビオテヒノロヒー・ヴェーゼットウェー 腫瘍の処置に有用な新規免疫コンジュゲート
AU2003284891A1 (en) 2002-10-23 2004-05-13 Ludwig Institute For Cancer Research A34 and a33-like 3 dna, proteins, antibodies thereto and methods of treatment using same
RU2455312C2 (ru) 2002-11-08 2012-07-10 Аблинкс Н.В. Однодоменные антитела, направленные против фактора некроза опухолей альфа, и их применение
EP1558646A2 (en) 2002-11-08 2005-08-03 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against interferon- gamma and uses thereof
CA2505326A1 (en) 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Camelidae antibodies against immunoglobulin e and use thereof for the treatment of allergic disorders
ATE444984T1 (de) 2002-12-31 2009-10-15 Nektar Therapeutics Al Corp Hydrolysestabile maleimidendgruppen-enthaltende polymere
EP2390270A1 (en) 2003-01-10 2011-11-30 Ablynx N.V. Therapeutic polypeptides, homologues thereof, fragments thereof and for use in modulating platelet-mediated aggregation
US7461263B2 (en) 2003-01-23 2008-12-02 Unspam, Llc. Method and apparatus for a non-revealing do-not-contact list system
AU2004220325B2 (en) 2003-06-30 2011-05-12 Domantis Limited Polypeptides
CA2535550A1 (en) 2003-08-12 2005-03-03 William M. Yarbrough Treatment for acne vulgaris and method of use
PT1687338E (pt) 2003-11-07 2011-01-20 Ablynx Nv Anticorpos de domínio único vhh de camelídeos direccionados para o receptor do factor de crescimento epidérmico e suas utilizações
CA2548513A1 (en) 2003-12-04 2005-07-07 Wyeth Biaryl sulfonamides and methods for using same
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
AU2005293752A1 (en) 2004-10-13 2006-04-20 Ablynx N.V. Single domain camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenarative neural diseases such as Alzheimer's disease
CA2595682A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
MX2007014359A (es) 2005-05-18 2008-02-06 Ablynx Nv Nanobodiestm (nanocuerpos) mejorados contra el factor alfa de necrosis del tumor.
SI2444424T1 (sl) 2005-05-20 2018-10-30 Ablynx N.V. Izboljšana protitelesa (TM) za zdravljenje z agregacijo posredovanih motenj
EP2057191A1 (en) 2006-08-18 2009-05-13 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of deseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
WO2008068280A1 (en) 2006-12-05 2008-06-12 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins
WO2008074840A2 (en) * 2006-12-19 2008-06-26 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against a metalloproteinase from the adam family and polypeptides comprising the same for the treatment of adam-related diseases and disorders
AU2008219216A1 (en) 2007-02-21 2008-08-28 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against vascular endothelial growth factor and polypeptides comprising the same for the treatment of conditions and diseases characterized by excessive and/or pathological angiogenesis or neovascularization
CA2687903C (en) 2007-05-24 2016-09-13 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against rank-l and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders
WO2009008414A1 (ja) 2007-07-10 2009-01-15 Shionogi & Co., Ltd. Ｍｍｐ１３に対する中和活性を有するモノクローナル抗体
JP2011516603A (ja) 2008-04-17 2011-05-26 アブリンクス エン．ヴェー． 血清タンパク質と結合することが可能なペプチド、並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド
MX2011010681A (es) 2009-04-10 2012-01-20 Ablynx Nv Secuencias mejoradas de aminoacidos dirigidas contra il-6r y polipeptidos que comprenden el mismo para el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con il-6r.
US11644471B2 (en) 2010-09-30 2023-05-09 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
CN108653728B (zh) 2011-06-23 2022-11-18 埃博灵克斯股份有限公司 用于预测、检测和减少涉及免疫球蛋白单可变结构域的测定法中的非特异性蛋白干扰的技术
FR2982283B1 (fr) 2011-11-07 2015-01-16 Faurecia Automotive Ind Procede de fabrication d'un voile continu de fibres comprenant des fibres longues naturelles, installation et voile associes
WO2013109829A1 (en) 2012-01-20 2013-07-25 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Ltd Anti-adamts4 antibodies and methods of treatment
FR2996003B1 (fr) 2012-09-25 2014-10-17 Commissariat Energie Atomique Methode pour detecter specifiquement dans un echantillon une metalloprotease matricielle (mmp) d'interet uniquement dans sa forme active
US20160304622A1 (en) 2013-10-15 2016-10-20 Genefrontier Corporation Human antibody against aggrecanase-type adamts species for therapeutics of aggrecanase-related diseases
US11142569B2 (en) 2015-11-13 2021-10-12 Ablynx N.V. Serum albumin-binding immunoglobulin variable domains
GB201617622D0 (en) 2016-10-18 2016-11-30 VIB VZW and Universiteit Gent Means and methods to treat inflammation

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090202474A1 (en) * 2007-11-19 2009-08-13 Wyeth Expression of orphan gpr64 in inflammatory diseases
CN102482700A (zh) * 2009-07-02 2012-05-30 葛兰素集团有限公司 多肽和治疗方法
US20150323528A1 (en) * 2014-04-02 2015-11-12 Gwangju Institute Of Science And Technology Pharmaceutical compositions comprising inhibitors of zinc-zip8-mtf1 as active ingredients for preventing or treating a joint disease

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. LARKIN ET AL.: "Translational development of an ADAMTS-5 antibody for osteoarthritis disease modification" *
R. CHIUSARODI ET AL.: "Targeting of ADAMTS5\'s ancillary domian with the recombinant mAb CRB0017 ameliorates disease progression in a spontaneous murine model of osteoarthritis" *
SHOICHI NAITO ET AL.: "Development of a Neutralizing Antibody Specific for the Active form of Matrix Metalloproteinase-13" *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2019143684A (ru) 2021-07-13
JP7249961B2 (ja) 2023-03-31
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EP3630817A1 (en) 2020-04-08
RU2019143684A3 (zh) 2021-11-10

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