MX2011010681A - Secuencias mejoradas de aminoacidos dirigidas contra il-6r y polipeptidos que comprenden el mismo para el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con il-6r. - Google Patents

Secuencias mejoradas de aminoacidos dirigidas contra il-6r y polipeptidos que comprenden el mismo para el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con il-6r.

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Abstract

La presente invención relaciona con secuencias de aminoácidos que se dirigen contra y/o que se pueden unir específicamente al receptor de interleucina-6 (IL-6R) con afinidad y/o avidez mejoradas, y/o que tenga una eficacia y/o potencia mejoradas, y que sean capaces de (parcial, o de preferencia totalmente) de bloquear la interacción IL-6/IL-6R y/o inhibir la señalización a través de IL-6, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R. La invención se relaciona además con compuestos o estructuras, y en particular proteínas y polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente de una o más de estas secuencias de aminoácidos. La invención también se relaciona con ácidos nucleicos que codifican para las secuencias de aminoácidos y polipéptidos, con métodos para preparar estas secuencias de aminoácidos y polipéptidos, con células hospederas que expresan o son capaces de expresar estas secuencias de aminoácidos o polipéptidos, con composiciones, y en particular con composiciones farmacéuticas que comprenden estas secuencias de aminoácidos, polipéptidos, ácidos nucleicos y/o células hospederas y con los usos de estas secuencias de aminoácidos o polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospederas y/o composiciones, en particular para fines profilácticos, terapéuticos o de diagnóstico.

Description

SECUENCIAS MEJORADAS DE AMINOÁCIDOS DIRIGIDAS CONTRA IL-6R Y POLIPEPTIDOS QUE COMPRENDEN EL MISMO PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES Y TRASTORNOS RELACIONADOS CON IL-6R CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con secuencias de aminoácidos que se dirigen contra y/o que se pueden unir específicamente (como se define en la presente) al receptor de Interleucina-6 (IL-6R), así como también los compuestos o estructuras, en proteínas y polipéptidos particulares que comprenden o que consisten esencialmente de una o : más de estas secuencias de aminoácidos (también denominadas en la presente como "secuencias de aminoácidos de la invención", "compuestos de la invención", "estructuras de la invención" y "polipéptidos de la invención", respectivamente) .
La invención también se relaciona con ácidos nucleicos que codifican para estas secuencias de aminoácidos y polipéptidos (también denominados en la presente como "ácidos nucleicos de la invención" o "secuencias de nucleotidos de la invención") ; con los métodos para preparar estas secuencias de aminoácidos y los polipéptidos; son células hospederas que expresan o son capaces de expresar estas secuencias de aminoácidos o polipéptidos; con composiciones, y en particular con composiciones farmacéuticas que comprenden estas secuencias de aminoácidos, polipéptidos, ácidos nucleicos y/o células hospederas; y/o con los usos de estas secuencias de aminoácidos o polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospederas y/o composiciones, en particular para fines profilácticos, terapéuticos o de diagnóstico, tales como los fines profilácticos, terapéuticos o de diagnóstico mencionados en la presente.
Otros aspectos, modalidades, ventajas y aplicaciones de la invención se harán evidentes a partir de la descripción adicional en la presente.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La interacción de IL-6, una proteina identificada adicionalmente como un factor de diferenciación de linfocitos B (Hirano et al., 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 5490-4; EP 0257406), con IL-6R (Yamasaki et al., 1988, Science, 241: 825-8; EP 0325474) que resulta en la formación del complejo IL-6/IL-6R. Este complejo se une a gpl30 (Taga et al., 1989, Cell, 58: 573-81; EP 0411946), una proteina de membrana o una célula blanco que transmite diversas acciones fisiológicas de IL-6. IL-6 actualmente se sabe que está implicado -entre otras cosas- la regulación de la respuesta inmunitaria, hematopoyesis, la respuesta en fase aguda, metabolismo óseo, angiogenesis, e inflamación. La desregulación de la producción de IL-6 está implica en la patología de diversos procesos de enfermedades proliferativas auto-inmunitarias y crónico-inflamatorias (Ishihara and Hirano, 2002, Biochim. Biophys . Acta, 1592: 281-96). Como consecuencia, los inhibidores de la señalización inducida por IL-6 han atraído mucho la atención en el pasado (Hirano et al., 1990, Immunol. Today, 11: 443-9). Los polipéptidos que se unen específicamente a IL-6 (Klein et al., 1991,, Blood, 78: 1198-204; EP 0312996), IL-6R (EP 0409607) o gpl30 (Saito et al., 1993, J. Immunol. Methods, 163: 217-223; EP 0572118) probaron exhibir un efecto inhibidor sobre el funcionamiento de IL-6.
La superproducción y señalización de IL-6 (y en particular la denominada señalización trans) están implicadas en diversas enfermedades y trastornos, tales como sepsis (Starnes et al., 1999, J. Immunol., 148: 1968) y diversas formas de cáncer tales como enfermedad de mieloma múltiple (MM) , carcinoma de células renales (RCC) , leucemia de células en plasma (Klein et al., 1991), linfoma, trastorno B-linfoproliferativo (BLPD) y cáncer de próstata. Los ejemplos no limitantes de otras enfermedades provocadas por la producción o señalización excesiva de IL-6 incluyen resorción ósea (osteoporosis) (Roodman et al., 1992, J. Bone Miner.
Res., 7: 475-8; Jilka et al., 1992, Science, 257: 88-91), caquexia (Strassman et al., 1992, J. Clin. Invest. 89: 1681-1684), psoriasis, glomerulonefritis proliferativa mesangial, sarcoma de Kaposi, linfoma relacionado con SIDA (Emilie et al., 1994, Int. J. Immunopharmacol . 16: 391-6), enfermedades y trastornos inflamatorios tales como, artritis reum^atoide, artritis idiopática juvenil de inicio sistémico, hipergammaglobulinemia (Grau et al., 1990, J. Exp. Med. 172: 1505-8); enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa,1 lupus eritematoso sistémico (SLE) , esclerosis múltiple, enfermedad de Castleman, IgM gammopatía, mixoma cardíaco, asma (en particular, asma alérgico) y diabetes mellitus dependiente de insulina autoinmune (Campbell et al., 1991, J. Clin. Invest. 87: 739-742). Otros trastornos relacionados de IL-6 se harán evidentes para el experto en la técnica.
Como se puede observar por ejemplo a partir de las referencias anteriores, la técnica anterior describe anticuerpos y fragmentos de anticuerpos dirigidos contra la proteína IL-6 humana, contra la IL-6R humana y contra la proteína gpl30 humana para la prevención y tratamiento de los trastornos relacionados con IL-6. Los ejemplos son Tocilizumab (véase Woo et al., 2005, Arthritis Res. Ther. 7: 1281-8; Nishimoto et al., 2005, Blood 106: 2627-32; Ito et al., 2004, Gastroenterology, 126: 989-96; Choy et al., 2002, Arthritis Rheum. 46: 3143-50), BE8 (véase Bataille et al., 1995, Blood 86: 685-91; Emilie et al., 1994, Blood 84: 2472-9; Beck et al . , 1994, N . Engl. J. Med. 330: 602-5; Wendling et al.# 1993, J. Rheumatol. 20: 259-62) y CNTO-;328 de Centocor (véase Journal of Clinical Oncology, 2004, 22/14S: 2560; Journal of Clinical Oncology, 2004, 22/14S: 2608; Int. J. Cáncer, 2004, 111:592-5). Otro principio activo conocido en la técnica para la prevención y tratamiento de los trastornos relacionados con IL-6 es una fusión Fe de gpl30 soluble (véase Becker et al. 2004, Immunity, 21: 491-501; Doganci et al., 2005, J. Clin. Invest. 115: 313-25; Nowell et al., 2003, J. Immunol. 171: 3202-9; Atreya et al., 2000, Nat. Med. 6: 583-8). Las secuencias de aminoácidos y Nanobody dirigidos contra IL-6R y los polipéptidos que comprenden los mismos se describen en la WO 08/020079.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objetivo especifico, aunque no limitante de la presente invención es proporcionar secuencias de aminoácidos, polipéptidos y compuestos terapéuticos y composiciones que tengan propiedades terapéuticas y/o farmacológicas mejoradas, además de otras propiedades ventajosas (tales como, por ejemplo, facilidad de preparación mejorada y/o costos reducidos de partículas) , en comparación con las secuencias de aminoácidos, anticuerpos y Nanobody de la técnica anterior. Estas propiedades mejoradas y ventajosas se harán evidentes a partir de la descripción adicional en la presente. Sin ser limitantes, las secuencias de aminoácidos, polipéptidos y compuestos terapéuticos y composiciones proporcionados por la invención pueden tener una unión y/o afinidad mejorada, una avidez mejorada, una eficacia y/o potencia mejoradas, una selectividad aumentada y/o pueden ser capaces de bloquear parcial o de preferencia totalmente la interacción de IL-6/IL-6R, y/o inhibir la señalización a través de IL-6, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R.
En general, un objetivo de la invención es proporcionar agentes farmacológicamente activos, asi como también las composiciones que comprenden los mismos,! que se puedan utilizar en el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de uno o más trastornos relacionados con IL-6R (como se define en la presente) ; y proporcionar los métodos para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de estas enfermedades y/o trastornos que implican la administración y/o uso de estos agentes y composiciones.
La presente invención también se relaciona con las secuencias de aminoácidos (también denominadas como "secuencias de aminoácidos de la invención") que se dirigen contra y/o se pueden unir específicamente (como se define en la presente) al receptor de interleucina-6 (IL-6R) con afinidad y/o avidez mejoradas, y/o que puedan tener una eficacia y/o potencia mejoradas, y que son capaces de bloquear (parcialmente, o de preferencia totalmente) la interacción de IL-6/IL-6R y/o inhibir la señalización a través de IL-6, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R. Más particularmente, la presente invención proporciona secuencias de aminoácidos que comprenden uno o más alargamientos de residuos del aminoácido seleccionados de los siguientes: a) Las SEC ID NOs : 80-82; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 80-82, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos comprenda el alargamiento de residuos de aminoácidos que se une a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos y la diferencia de aminoácido 2 ó 1, la afinidad según se mide por resonancia de plasmones superficiales; y/o c) Las SEC ID NOs: 84-91; o d) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácido con una SEC ID NOs: 84-91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R, con la misma, con aproximadamente la misma o con una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales; y/o e) Las SEC ID NOs : 93-95; o f) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-95, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales .
Para la unión a su epitope sobre IL-6R, una secuencia de aminoácidos por lo general contendrá dentro de su secuencia de aminoácidos uno o más residuos de aminoácidos o uno o más alargamientos de residuos de aminoácidos 1 (como se define adicionalmente en la presente; es decir, con cada "alargamiento" que comprende dos o más residuos de aminoácidos que estén adyacentes entre sí en proximidad cercana entre sí, es decir en la estructura primaria o terciaria de la secuencia de aminoácidos) vía la cual la secuencia de aminoácidos de la invención se puede unir al epítope sobre IL-6R. Estos residuos de aminoácidos o alargamientos de residuos de aminoácidos forman aquí el "sitio" para unión al epítope sobre IL-6R (también denominada en la presente como el "sitio de antígenos de unión", como se definirá adicionalmente en la presente) .
La presente invención proporciona varios alargamientos de residuos de aminoácidos (como se define en la presente) que son particularmente adaptados para la unión a un epítope específico sobre IL-6R. Estos alargamientos de residuos de aminoácidos pueden estar presentes en, y/o se puede incorporar en, una secuencia de aminoácidos de la invención, en particular de tal modo que forma (parte de) el sitio de unión con antígenos de la secuencia de aminoácidos de la invención. Como tales, las secuencias de aminoácidos resultantes, se unen a un epítope específico sobre IL-6R que se encuentra, forma parte, o se superpone con (es decir, en la estructura primaria o terciaria) o está en proximidad cercana a (es decir, en la estructura primaria o terciaria) al sitio de unión IL-6 sobre IL-6R (por ejemplo, competitivamente con IL-6) ; y como tales, las secuencias de aminoácidos resultantes son capaces de bloquear parcial o de preferencia totalmente la interacción IL-6/IL-6R y/o inhibir la señalización a través de IL-ß, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R. En este contexto, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención de preferencia son tales que pueden competir con IL-6 para la unión al receptor IL-6. Las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la invención de preferencia son tales que pueden competir para la unión al receptor IL-6 con el anticuerpo anti-IL6R mo oclonal reconstituido quimérico de humano-ratón disponible comercialmente Tocilizumab (MRA) (Chugai/Roche) o un fragmento de unión con antigeno del mismo (véase, por ejemplo la WO 92/19759 y la patente europea EP 0628639 correspondiente, así como también Shinkura et al.; 1998, Anticancer Research 18, 1217-1222), por ejemplo en el análisis descrito en Ejemplo 11; y/o de tal forma, que se puedan unir al mismo epítope o sitio de unión sobre IL-6R como Tocilizumab, o a un epítope cercano al sitio de unión y/o la superposición con el sitio de unión.
También, las secuencias de aminoácidos1 de la invención de preferencia son tales que puedan competir para la unión al receptor IL-6 con el IgG de referencia según se define por las SEC ID NOs : 1 y 2 y/o el FAb de referencia según se define por las SEC ID NOs: 3 y 4 (véase el Ejemplo 1); y/o de tal forma que se puedan unir al mismo epitope o sitio de unión sobre IL-6R como el IgG de referencia o el Fab de referencia, o a un epitope cercano al sitio de unión y/o que se superpone con el sitio de unión. Para la preparación y la secuenciación del IgG de referencia y el Fab de referencia, se hace referencia al Ejemplo 1 más adelante, asi como también a las SEC ID NOs: 1 a 4.
Se debe observar que la invención en su sentido más amplio no se limita a un desempeño o función estructural especifico ya que estos alargamientos de residuos de aminoácidos pueden tener en la secuencia de aminoácidos de la invención, siempre y cuando estos alargamientos de residuos de aminoácidos permitan que la secuencia de aminoácidos de la invención se una al epitope especifico sobre IL-6R con una cierta afinidad y/o potencia (como se definirá más adelante en la presente) . De esta forma, en general, la invención en su sentido más amplio comprende cualquier secuencia de aminoácidos que sea capaz de unirse al epitope especifico sobre IL-6R o que comprenda uno o más alargamientos de residuos de aminoácidos según se describe en la presente (y en particular una combinación adecuada de dos o más de estos alargamientos de residuos de aminoácidos) que se enlacen adecuadamente entre si via una o más secuencias de aminoácidos adicionales, de tal forma que la secuencia de aminoácidos total constituya un dominio de unión y/o una unidad de unión que sea capaz de unirse al epítope específico sobre IL-6R. Sin embargo, se debe observar que la presencia de sólo uno de estos alargamientos de residuos de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la invención por si mismo ya puede ser suficiente para proporcionar una secuencia de aminoácidos de la invención que sea capaz de unirse al epítope específico sobre IL-6R (se hace referencia por ejemplo nuevamente a los denominados "fragmentos acelerados" descritos en la WO 03/050531) .
Las secuencias de aminoácidos que comprenden uno o más de estos alargamientos específicos de residuos de aminoácidos muestran propiedades mejoradas tales como por ejemplo unión y/o afinidad mejoradas, avidez mejorada, eficacia y potencia mejorada, y/o una selectividad aumentada, además de su capacidad para bloquear parcial o totalmente la interacción de IL-6/IL-6R, y/o inhibir la señalización a través de IL-6, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R.
Más en particular, las secuencias de aminoácidos de la invención que comprenden uno o más de estos alargamientos específicos de residuos de aminoácidos se pueden unir a IL-6R con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (real o evidente) , un valor KA (real o evidente) , un índice kon y/o un índice kQff, o alternativamente como un valor IC50Í como se describirá adicionalmente en la presente) de preferencia de tal forma que se: Unen a hIL-6R con una constante de disociación (KD) de 1 nM hasta 1 pM o menos, de preferencia 500 pM hasta 1 pM o menos, de mayor preferencia 100 pM hasta 1 pM o menos, 0 incluso de mayor preferencia a aproximadamente 50 pM hasta 1 pM o menos; y/o de tal forma que se: Unen a cyno IL-6R con una constante de disociación (KD) de 1 nM hasta 1 pM o menos, de preferencia 500 pM hasta 1 pM o menos, de mayor preferencia 100 pM hasta 1 pM o menos, o incluso de mayor preferencia aproximadamente 50 pM hasta 1 pM o menos; y/o de tal forma que se: Unen a hIL-6R con un índice de kon entre 104 M~ 1s"1 hasta aproximadamente 107 M~1s~1, de preferencia entre 105 M"1s_1 y 107 M_1s-1, de mayor preferencia aproximadamente 106 M~ 1s-1 o más; y/o de tal forma que se: Unen a cyno IL-6R con un índice de kon entre 104 M_1s_1 hasta aproximadamente 107 M^s"1, de preferencia entre 105 M"1s"1 y 107 M_1s_1, de mayor preferencia aproximadamente 106 M_1s_1 o más; y/o de tal forma que se: Unen a hIL-6R con un índice de k0ff entre 10"3 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10"6 s"1 (proporcionando un complejo irreversible cercano con un ti ? de múltiples días) , de preferencia entre 10~4 s"1 y 10"6 s"1, de mayor preferencia entre 10"5 s"1 y 10"6 s"1, tal como aproximadamente 10-5 s-1 o menos; y/o de tal forma que se: Unen a cyno IL-6R con un índice de k0ff entre 10"3 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10"6 s"1 (proporcionando un complejo irreversible cercano con ti/2 de múltiples días), de preferencia entre 10"4 s"1 y 10"6 s-1, de mayor preferencia entre 10"5 s"1 y 10~6 s-1, tal como aproximadamente 10"5 s'1 o menos .
Algunos valores de unión IC50 preferidos de las secuencias de aminoácidos de la invención a IL-6R se harán evidentes a partir de la descripción adicional y los ejemplos en la presente.
Por ejemplo, en el análisis TF-1 como se describe por Kitamura et al. (1989, J. , Cell Physiol., 140: 323), la secuencia de aminoácidos de la invención pueden tener, valores IC50 (a 100 IU/mL IL-6) entre 10 nM y 50 pM, de preferencia entre 5 nM y 50 pM, de mayor preferencia entre 1 nM y 50 pM o menos, tales como aproximadamente 750 ó 500 pM o menos. En este análisis TF-1 las secuencias de aminoácidos de la invención pueden tener valores IC50 (a 5000 IU/mL IL-6) entre 50 nM y 1 nM, de preferencia entre 25 n y 1 nM, de mayor preferencia entre 10 nM y 1 nM o menos, tal como aproximadamente 8 nM o menos. En este análisis TF÷-1, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden tener valores IC50 que sean al menos iguales y de preferencia mejores al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación con el valor IC50 obtenido para el IgG de referencia según se define por las SEC ID NOs: 1 y 2 o el Fab de referencia según se define por las SEC ID NOs: 3 y 4 (véase el Ejemplo 1) . En este análisis TF-1, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden tener valores IC50 que sean al menos iguales y de mayor preferencia menores al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación con el valor IC50 obtenido para Tocilizumab (MRA) .
En un análisis para potencia de plasma a valores EC50 de IL-6 (por ejemplo en presencia de 27.29 ng/mL IL-6 según se describe en el Ejemplo 45) , las secuencias de aminoácidos de la invención pueden tener valores IC50 entre 500 pM y 50 pM, de preferencia entre 250 pM y 50 pM, de mayor preferencia entre 200 pM y 50 pM o menos, como 150 pM o menos. En un análisis para potencia en plasma a valores EC95 de IL-6 (por ejemplo en presencia de 885 ng/mL IL-ß según se describe en el Ejemplo 45) las secuencias de aminoácidos de la invención pueden tener valores IC5o entre 1000 pM y 100 pM, de preferencia entre 750 pM y 100 pM, de mayor preferencia entre 500 pM y 100 pM o menos, tal como 400 pM o menos. En este análisis para potencia en plasma, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden tener valores IC50 que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación con el valor IC50 obtenido para el IgG de referencia según se define por las SEC ID NOs: 1 y 2 o el Fab de referencia según se define por las SEC , ID NOs: 3 y 4 (véase el Ejemplo 1) . En este análisis para potencia en plasma, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden tener valores IC50 que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación al valor IC50 obtenido para Tocilizumab (MRA) .
En un análisis para definir la unión a la membrana IL-6R sobre células CHO, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden tener valores IC50 entre 10 n y 100 pM, de preferencia entre 5 nM y 100 pM, de mayor preferencia entre 2 nM y 10 pM o menos, tal como 2 nM o menos.
En un aspecto preferido, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden comprende dos o más alargamientos de residuos de aminoácidos seleccionados de los siguientes: a) Las SEC ID NOs : 80-82; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 80-82, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos comprenda el alargamiento de residuos de aminoácidos que se une a IL-6R con lá misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos y la diferencia de aminoácido 2 ó 1, la afinidad según se mide por resonancia de plasmones superficiales; y/o c) las SEC ID NOs: 84-91; o d) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácido con una SEC ID NOs: 84-91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R, con aproximadamente la misma u/o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales; y/o e) las SEC ID NOs : 93-95; o f) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-95, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales .
De tal forma que (i) cuando el primer alargamiento de residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con a) , o b) , el segundo alargamiento de residuos de aminoácidos corresponde a una o más de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con c) , d) , e) o f) ; (ii) cuando el primer alargamiento de residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con c) o d) , el segundo alargamiento de residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con a) , b) , e) o f ) ; o (iii) cuando el primer alargamiento de residuos de aminoácidos que corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con e) o f) , el segundo alargamiento de residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b) , c) o d) .
Incluso de mayor preferencia, las secuencias de aminoácidos de la invención comprenden tres 1 o más alargamientos de residuos de aminoácidos en los cuales el primer alargamiento de residuos de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de: a) Las SEC ID NOs : 80-82; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 80-82, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos comprenda el alargamiento de residuos de aminoácidos que se une a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos y la diferencia de aminoápido 2 ó 1, la afinidad según se mide por resonancia de plasmones superficiales; y/o el segundo alargamiento de residuos de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de: c) Las SEC ID NOs: 84-91; o d) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácido con una SEC ID NOs: 84-91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, con aproximadamente la misma u/o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales; y/o y el tercer alargamiento de residuos de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de: e) Las SEC ID NOs: 93-95; o f) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-95, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales .
Se debe observar que la invención no se limita al origen de la secuencia de aminoácidos de la invención (o de la secuencia de nucleótidos de la invención utilizada para expresarla) , ni a la forma en que la secuencia de aminoácidos o la secuencia de nucleótidos de la invención es (o se ha) generado u obtenido. De esta forma, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden ser secuencias de aminoácidos que se presentan en la naturaleza (a partir de cualesquiera especies adecuadas) o secuencias de aminoácidos sintéticas o semi-sintéticas .
En un aspecto especifico, aunque no limitante, la secuencia de aminoácidos de la invención puede ser una secuencia de aminoácidos que comprenda un pliegue de inmunoglobulina o una secuencia de aminoácidos que, bajo condiciones adecuadas (tales como condiciones fisiológicas) sea capaz de formar un pliegue del inmunoglobulina (es decir, mediante plegado) . Se hace referencia inter alia a la revisión de Halaby et al. (1999, J. Protein Eng. 12: 563-71). De preferencia, cuando se pliegan adecuadamente para formar un pliegue de inmunoglobulina, los alargamientos de residuos de aminoácidos pueden ser capaces de formar adecuadamente el sitio de unión con antigenos para la unión al epitope especifico sobre IL-6R; y de mayor preferencia capaces de unirse a su epitope sobre IL-6R con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente), un índice kon y/o un ; índice k0ff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) que es como se define en la presente .
En otro aspecto específico, aunque no limitante, las secuencias de aminoácidos de la invención son secuencias de inmunoglobulina . En particular, sin limitación, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden ser secuencias de aminoácidos que consisten esencialmente de 4 regiones de armazón (FR1 a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente) ; o cualquier fragmento adecuado de esta secuencia de aminoácidos que todavía se una al . epitope específico sobre IL-6R.
En esta secuencia de aminoácidos de la invención, las secuencias de armazón pueden ser cualesquiera secuencias de armazón adecuadas, y los ejemplos de las secuencias de armazón adecuadas se harán evidentes para el experto, por ejemplo con base en los manuales estándar y la exposición adicional y la técnica anterior mencionada en la presente.
Las secuencias de armazón de preferencia (una combinación adecuada de) secuencias de armazón de inmunoglobulina o secuencias de armazón que se hayan derivado de las secuencias de armazón de inmunoglobulina (por ejemplo, mediante optimización de secuencias tal como humanización o camelización) . Por ejemplo, las secuencias de armazón pueden ser secuencias de armazón derivadas de un dominio variable de cadena ligera (por ejemplo una secuencia VL) y/o a partir de un dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia VH) . Cuando la secuencia de aminoácidos de la invención es una secuencia con dominio variable de cadena pesada, ésta puede ser una secuencia con dominio variable de cadena pesada que se deriva de un anticuerpo convencional de cuatro cadenas (tal como, sin limitación, una secuencia VH que se deriva de un anticuerpo humano) o será una secuencia denominada VHH (como se define en la presente) que sé deriva de un denominado "anticuerpo de cadena pesada" (como se define en la presente) . En un aspecto particularmente preferido, las secuencias de armazón son ya sea secuencias de armazón que se hayan derivado de una secuencia VHH (en1 la cual las secuencias de armazón opcionalmente pueden haber sido parcial o totalmente humanizadas) o ser secuencias VH convencionales que se hayan camelizado (como se define en la presente) .
Para una descripción general de los anticuerpos de cadena pesada y los dominios variables de los mismos, se hace referencia ínter alia a la técnica anterior citada en la presente, asi como también a la técnica anterior mencionada en la página 59 de la O 08/020079 y a la lista de referencias mencionadas en las páginas 41-43 de la solicitud internacional WO 06/040153, la técnica anterior ' y las referencias se incorporan en la presente como referencia.
La secuencia de aminoácidos de la invención en particular puede ser un anticuerpo dominio (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para utilizarse como un anticuerpo dominio) , un anticuerpo dominio individual (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para utilizarse como un anticuerpo dominio individual), un "dAb" (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para utilizarse como un dAb) o un Nanobody (como se define en la presente, y que incluye de manera enunciativa una secuencias VHH) ; otros dominios variables individuales, o cualquier fragmento adecuado de cualquiera de los mismos.
En particular, la secuencia de aminoácidos de la invención puede ser un Nanobody® (como se define; en la presente) o un fragmento adecuado del mismo. [Nota: Nanobody®, Nanobodies® y Nanoclone® son marcas registradas de Ablynx N.V.] Estos Nanobodies dirigidos contra IL-6R también se denominarán en la presente como "Nanobodies¦ de la invención." En general, un Nanobody se puede definir como una secuencia de aminoácidos con la estructura (general) : FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 en la cual FR1 hasta FR4 se refieren a las regiones de armazón 1 hasta 4, respectivamente, y en las cuales CDR1 hasta CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 hasta 3, respectivamente, y en las cuales uno o más de residuos Hallmark son como se definen en la WO 08/020079 (Tablas A-3 hasta A-8).
En general, los Nanobodies (en particular las secuencias VHH y los Nanobodies parcialmente humanizados) en particular se pueden caracterizar por la presencia de uno o más "residuos Hallmark" en una o más de las secuencias de armazón (como por ejemplo se describe adicionalmente én la WO 08/020079, página 61, linea 24 hasta la página 98, linea 3) .
Con respeto a esto, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden consistir esencialmente de 4 regiones de armazón (FR1 hasta FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 hasta CDR3, respectivamente) en las cuales: -CDR1 se selecciona del grupo que consiste de: a) Las SEC ID NOs : 80-82; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs : 80-82, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos comprenda el alargamiento de residuos de aminoácidos que se une a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos y la diferencia de aminoácido 2 ó 1, la afinidad según se mide por resonancia de plasmones superficiales; y/o - CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: c) Las SEC ID NOs: 84-91; o d) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácido con una SEC ID NOs: 84-91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, con aproximadamente la misma u/o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales; y CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: e) Las SEC ID NOs: 93-95; o f) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs : 93-95, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales.
Estas regiones determinantes de complementariedad preferidas (CDR1 hasta CDR3, respectivamente) también se denominan como los "CDR de la invención." De preferencia, las secuencias de aminoácidos de la invención esencialmente consisten de 4 regiones de armazón (FR1 hasta FR , respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 hasta CDR3, respectivamente) en las cuales: -CDR1 se selecciona del grupo que consiste de: a) Las SEC ID NOs: 80-82; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 80-82, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos comprenda el alargamiento de residuos de aminoácidos que se une a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos y la diferencia de aminoácido 2 ó 1, la afinidad según se mide por resonancia de plasmones superficiales; y/o - CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: c) Las SEC ID NOs : 84-91; o d) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácido con una SEC ID NOs: 84-91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, con aproximadamente la misma u/o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales; y CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: e) Las SEC ID NOs: 93-95; o f) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-95, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R: con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales.
Estos Nanobodies se pueden derivar de cualquier forma adecuada y a partir de cualquier fuente adecuada, y por ejemplo pueden ser secuencias VHH que se presentan en la naturaleza (es decir, a partir de una especie adecuada de Camélido) o secuencias de aminoácidos sintéticos ó semi-sintéticos .
En un aspecto especifico, las secuencias de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 80; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 80, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos o el Nanobody que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos o el Nanobody que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó; 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales.
En otro aspecto especifico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos seleccionados de las SEC ID NOs: 84, 89 ó 91; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no , más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 84, 89 ó 91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos o el Nanobody que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos o el Nanobody que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de píasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuéncia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende l menos la SEC ID NO: 84; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 84, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos o el Nanobody que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos o el Nanobody que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos seleccionados de las SEC ID NOs: 93-94; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-94, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos o el Nanobody que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos o el Nanobody que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 93; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia nó más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 93, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos o el Nanobody que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sé una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos o el Nanobody que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó ! 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales. ; Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 80 y la SEC ID NO: 84.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 80 y la SEC ID NO: 93.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 84 y la SEC ID NO: 93.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende ál menos la SEC ID NO: 80, la SEC ID NO: 84 y la SEC ID NO: 93.
Otras combinaciones preferidas de las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 también se muestran en la Tabla A-l.
La secuencia de aminoácidos preferida de la invención se pueden seleccionar del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 60-69; una secuencias que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR de la invención con una de las SEC ID NOs : 60-69, siempre y cuando la secuencias de polipéptido con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia del aminoácido en una, dos o todas sus CDR de la invención1 se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la unión de uno de las SEC ID NOs: 60-69, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales; y una secuencias que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 60-69, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs,: 60-69 unidas a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la unión mediante uno de las SEC ID NOs: 60-69, afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales.
Estas secuencias de aminoácidos de la invención de preferencia deben ser capaces de unirse específicamente al epítope específico sobre IL-6R, e incluso de mayor preferencia capaces de unirse al epítope específico sobre IL-6R con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , un índice de kon y/o un índice kQff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) que es como se define en la presente. Estas secuencias de aminoácidos de la invención de preferencia también, deben tener una potencia de base celular y una potencia en plasma como se define en la presente.
Las secuencias de aminoácidos y los Nanbbodies proporcionados por la invención de preferencia están en forma esencialmente aislada (como se define en la presente) , o forman parte de una proteina o polipéptido de la invención (también denominado como "polipéptido de la invención" o "proteina de la invención") que puede comprender o consistir esencialmente de una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies de la invención y que opcionalmente . pueden comprender además una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies (todo enlazados opcionalmente vía uno o más enlazantes adecuados) .
Por consiguiente, en otro aspecto, la invención se relaciona con un compuesto o estructura, y en particular una proteina o polipéptido (también denominado en la présente como "enfoque de la invención" o "polipéptido , de la invención", respectivamente) que comprende o consiste esencialmente de una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies de la invención (o los fragmentos adecuados de los mismos), y opcionalmente comprende además uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión. Como será evidente para un experto a partir de la exposición adicional en la presente, estos grupos adicionales, residuos, porciones, unidades de unión o secuencias de aminoácidos pueden o no proporcionar funcionalidad adicional a la secuencia de aminoácidos de la invención (y/o el compuesto, estructura o polipéptido en el cual están presentes) y pueden o no modificar las propiedades de la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención.
Por ejemplo, estos grupos adicionales, residuos, porciones o unidades de unión pueden ser una o más secuencias de aminoácidos adicionales, de tal forma que el compuesto, estructura o polipéptido sea una proteina (de fusión) o un polipéptido (de fusión) . En un aspecto preferido aunque no limitnante, uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión son secuencias de inmunoglobulina .. Incluso de mayor preferencia, uno o más de los otros : grupos, residuos, porciones o unidades de unión se seleccionan del grupo que consiste de anticuerpos dominio, secuencias de aminoácidos que sean adecuadas para utilizarse como un anticuerpo dominio, anticuerpos de dominio individuales, secuencias de aminoácidos que sean adecuadas para utilizarse, un anticuerpo dominio individual, "dAb", secuencias de aminoácidos que sean adecuadas para utilizarse como un dAb, o Nanobodies .
Alternativamente, estos grupos, residuos, porciones o unidades de unión por ejemplo pueden ser grupos quimicos, residuos, porciones que pueden o no por si mismos ser biológica y/o farmacológicamente activos. Por ejemplo, y sin limitación, estos grupos pueden estar enlazados a una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies de la invención para proporcionar un "derivado" de una secuencia de aminoácidos o polipéptido de la invención, como se describirá adicionalmente en la presente.
También, dentro del alcance de la presente invención se encuentran compuestos, estructuras o polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente de uno o más derivados como se describe en la presente, y opcionalmente comprenden además uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión, enlazados opcionalmente vía uno o más enlazantes. De preferencia, uno o más de los otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión son secuencias de aminoácidos.
En los compuestos, estructuras o polipéptidos descritos anteriormente, uno o más de las secuencias de aminoácidos o Nanobodies de la invención y uno o más de los grupos, residuos, porciones o unidades de unión se pueden enlazar directamente entre si y/o via uno o más enlazantes o separadores adecuados. Por ejemplo, cuando uno o más grupos, residuos, porciones o unidades de unión son secuencias de aminoácidos, todos los enlazantes también pueden ser secuencias de aminoácidos, de tal forma que el compuesto, estructura o polipéptido resultante sea una fusión (proteina) o fusión (polipéptido) .
El proceso para diseñar/seleccionar y/o preparar un compuesto o polipéptido de la invención, que inicia a partir de una secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención, también se denomina en la presente como "formatear" la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención; y una secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención que sea y forme parte de un compuesto o polipéptido de la invención es el que será "formateado" o estará "en el formato de" el compuesto o polipéptido de la invención. Los ejemplos de las formas en las cuales se puede formatear una secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención y los ejemplos de estos formatos se harán evidentes para el experto con base en la exposición en la presente; y estas secuencias de aminoácidos o Nanobodies formateados forman un aspecto adicional de la invención.
Por ejemplo, y sin limitación, una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies de la invención se pueden utilizar como una unidad de unión en la proteina o polipéptido, que opcionalmente pueden contener una o más secuencias de aminoácidos que puedan servir como unidad de unión (es decir, contra otros epítopes sobre IL-6R y/ó contra uno o más de otros antígenos, proteínas o blancos distintos de IL-6R) , para proporcionar un polipéptido monovalente, multivalente, multiparatópico o multiespecifico de la invención, respectivamente, todos como se describen en la presente. La presente invención de esta forma también se relaciona con un compuesto, estructura o polipéptido que sea una estructura monovalente que comprende o esencialmente consiste de una secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención. La presente invención de esta forma también se relaciona con un compuesto, estructura o polipéptido que sea una estructura multivalente, tal como por ejemplo una estructura bivalente o trivalente. La presente invención también se relaciona a un compuesto, estructura o polipéptido que sea una estructura multiespecifica, tal como por ejemplo una estructura bisespecífica o triespecífica . La presente invención también se relaciona con un compuesto, estructura o polipéptido que es una estructura multiparatópica, tal como por ejemplo una estructura biesparatópica o triparatópica .
En un aspecto específico de la invención, un compuesto de la invención o un polipéptido de la invención puede tener una vida media aumentada, en comparación con la secuencia de aminoácidos o el Nanobody correspondiente de la invención. Algunos ejemplos preferidos, aunque no limitantes de estos compuestos y polipéptidos se harán evidentes ; para el experto con base en la exposición adicional en la presente, y por ejemplo comprenden las secuencias de aminoácidos, Nanobodies o polipéptidos de la invención que se hayan modificado químicamente para aumentar la vida media; de los mismos (por ejemplo, por medio de pegilación) ; las secuencias de aminoácidos o Nanobodies de la invención que comprenden al menos un sitio de unión adicional para unirse a una proteína sérica (tal como, albúmina sérica) ; o los polipéptidos de la invención, que comprenden al menos una secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención que se enlaza al menos a una porción (y en particular al menos una secuencia de aminoácidos) que aumenta la vida media de la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención. Los ejemplos de los polipéptidos, secuencias de aminoácidos o Nanobodies de la invención que comprenden estas porciones para extensión de la vida media se harán evidentes para el experto con ; base en la exposición adicional en la presente; e incluyen por ejemplo, sin limitación, los polipéptidos en los cuales una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies de la invención se enlazan a una o más proteínas séricas o fragmentos; de las mismas (tal como la albúmina sérica (humana) o los fragmentos adecuados de las misma o a una o más unidades de unión que se pueden unir a las proteínas séricas (tales como, por ejemplo, los anticuerpos dominio, las secuencias de aminoácidos que son adecuadas para utilizarse como un anticuerpo dominio, anticuerpos de dominio individuales, secuencias de aminoácidos que son adecuados para utilizarse como un anticuerpo dominio individual, "dAb", secuencias de aminoácidos que son adecuados para utilizarse como un dAb, o Nanobodies que se pueden unir a proteínas séricas tales como albúmina sérica (tal como albúmina de suero humano) , inmunoglobulinas séricas tales como IgG, o transferrina ; se hace referencia a la descripción adicional y las referencias mencionadas en la presente) ; polipéptidos en las cuales una secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención se enlaza a una porción Fe (tal como un Fe humano) o una parte o fragmento adecuado del mismo; o los polipéptidos en los cuales una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies de la invención se enlazan adecuadamente a una o más proteínas pequeñas o péptidos que se pueden unir a proteínas séricas (tal como, sin limitación, las proteínas y péptidos descritos en la WO 91/01743, la WO 01/45746, ka WO 02/076489) .
En general, los compuestos o los polipéptidos de la invención con vida media aumentada de preferencia tienen una vida media que es al menos 1.5 veces, de preferencia al menos 2 veces, tal como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la vida media de la secuencia de aminoácidos o el Nanobody correspondiente de la invención per se.
En un aspecto preferido, aunque no limitante, estos compuestos o polipéptidos de la invención tiene una vida media en suero que se aumenta con más de 1 hora, de preferencia más de 2 horas, de mayor preferencia más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o incluso más de 24, 48 ó 72 horas, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente o el Nanobody de la invención per se.
En otro aspecto preferido, aunque no limitante, estos compuestos o polipéptidos de la invención exhiben una vida media en suero en un ser humano de al menos aproximadamente 12 horas, de preferencia al menos 24 horas, de mayor preferencia al menos 48 horas, incluso de mayor preferencia al menos 72 horas o más. Por ejemplo, los compuestos o los polipéptidos de la invención pueden tener una vida media de al menos 5 dias (tal como entre aproximadamente 5 hasta 10 dias) , de preferencia al menos 9 dias (tal como aproximadamente 9 hasta 14 dias), de mayor preferencia al menos aproximadamente 10 dias (tal como aproximadamente 10 hasta 15 dias) , o al menos aproximadamente 11 dias (tal como aproximadamente 11 hasta 16 dias), de mayor preferencia al menos aproximadamente 12 días (tal como aproximadamente 12 hasta 18 días o más) , o más de 14 días (tal como aproximadamente 14 hasta 19 días) .
Esta proteína, polipéptido, compuesto o estructura también puede estar en forma esencialmente aislada (como se define en la presente) .
Algunos compuestos, estructuras o polipéptidos preferidos de la invención incluyen las siguientes secuencias de polipéptidos: a) Las SEC ID NOs: 70-72; b) una secuencias de polipéptidos que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR de la invención con una de las SEC ID NOs: 70-72, siempre y cuando la secuencias de polipéptido con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia del aminoácido en una, dos o todas sus CDR de la invención se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la unión de uno de las SEC ID NOs: 70-72, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales; una secuencias del polipéptido que no tenga más de 2, de preferencia no! más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 70-72, siempre y cuando la secuencias del polipéptido con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 70-72 unidas a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la unirse por uno de las SEC ID NOs: 70-72, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales.
Los polipéptidos con estas secuencias muestran propiedades ventajosas para utilizarse como agentes farmacológicamente activos tales como por ejemplo buenas características de unión (alta afinidad y/o avidez) , alta eficacia y/o potencia, además de su capacidad para bloquear (parcial o totalmente) la interacción IL-6/IL-6R y/o inhibir la señalización a través de, IL-6, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R.
Más particularmente, estos polipéptidos y compuestos de la invención se pueden unir a IL-6R con una afinidad (medida y/o expresadas adecuadamente como un valor KD (real o aparente) , un valor K¾ (real o aparente) , un índice de kon y/o un índice k0ff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) de preferencia de tal forma que se: unen a hIL-6R con una constante de disociación (KD) de 1 nM hasta 1 pM moles/litro o menos, de preferencia 500 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, de mayor preferencia 100 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, o incluso de mayor preferencia aproximadamente 50 pM hasta 1 pM o menos; y/o de tal forma que se: unen a cyno IL-6R con una constante de disociación (KD) de 1 nM hasta 1 pM moles/litro o menos, de preferencia 500 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, de mayor preferencia 100 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, o incluso de mayor preferencia aproximadamente 50 pM hasta ,1 pM o menos; y/o de tal forma que se: Unen a hIL-6R con un índice kon de entre 104 M~ 1s"1 hasta aproximadamente 107 "1s~1, de preferencia entre 105 M"1s"1 y 107 M"1s"1, de mayor preferencia aproximadamente 106 M" is-i o mas; y/o de tal forma que se: Se unan a cyno IL-6R con un índice de kon entre 104 "1s-1 hasta aproximadamente 107 M"1s"1, de preferencia entre 105 _1s_1 y 107 -1s_1, de mayor preferencia aproximadamente 106 M s o mas; y/o de tal forma que se: Unen a hIL-6R con un índice de k0ff entre 10"3 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10"6 s-1 (proporcionando un complejo irreversible cercano con un ti/2 de múltiples días) , de preferencia entre 10"4 s"1 y 10"6 s"1, de mayor preferencia entre 10"5 s"1 y 10-5 s"1, tal como aproximadamente 10"5 s"1 o menos; y/o de tal forma que se: Unen a cyno IL-6R con un índice de k0ff entre 10"3 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10"6 s"1 (proporcionando un complejo irreversible cercano con un ti2 de múltiples días) , de preferencia entre 1CT4 s"1 y 1CT6 s"1, de mayor preferencia entre 1CT5 s"1 y 10"6 s"1, como aproximadamente 10~5 s-1 o menos.
Algunos valores IC50 preferidos para la unión de los polipéptidos y compuestos de la invención a IL-6R se harán evidentes a partir de la descripción adicional y los ejemplos en la presente.
Por ejemplo, en el análisis TF-1 como se describe por Kitamura et al. (J. Cell Physiol. 1989; 140: 323), los polipéptidos y compuestos de la invención pueden tener valores IC50 (a 100 IU/mL IL-6) entre 10 nM y 50 pM, de preferencia entre 5 nM y 50 pM, de mayor preferencia entre 1 nM y 50 pM o menos, tal como aproximadamente 750 ó 500 pM o menos. En este análisis TF-1 los polipéptidos y los compuestos de la invención pueden tener valores IC50 (a 5000 IU/mL IL-6) entre 50 nM y 1 nM, de preferencia entre 25 nM y 1 nM, de mayor preferencia entre 10 nM y 1 nM o menos, tal como aproximadamente 8 nM o menos. En este análisis TF-1, los polipéptidos y los compuestos de la invención pueden tener valores IC50 que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación con el valor IC50 obtenido para el IgG de referencia como se define por las SEC ID NOs : 1 y 2 o el Fab de referencia como se define por las SEC ID NOs: 3 y 4 (véase el Ejemplo 1) . En este análisis TF-1, las secuencias de aminoácidos, de la invención pueden tener valores IC50 que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, inqluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación el valor IC50 obtenido para Tocilizumab (MRA) .
En un análisis para potencia en plasma a valores EC50 de IL-6 (por ejemplo en presencia de 27.29 ng/mL IL-6 como se describe en el Ejemplo 45) los polipéptidos y los compuestos de la invención pueden tener valores IC50 entre 500 pM y 50 pM, de preferencia entre 250 p y 50 pM, de mayor preferencia entre 200 pM y 50 pM o menos, tal como 150 pM o menos. En un análisis para potencia en plasma a valores EC95 de IL-6 (por ejemplo en presencia de 885 ng/mL IL-6 como se describe en el Ejemplo 45) los polipéptidos y los compuestos de la invención pueden tener valores IC50 entre 1000 pM y 100 pM, de preferencia entre 750 pM y 100 pM, dé mayor preferencia entre 500 pM y 100 pM o menos, tal como 400 pM o menos. En este análisis para potencia en plasma, los polipéptidos y los compuestos de la invención pueden tener valores IC50 que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación con el valor IC50 obtenido para el IgG de referencia como se define por las SEC ID NOs : 1 y 2 o el Fab de referencia como se define por las SEC ID NOs: 3 y 4 (véase el Ejemplo 1) . En este análisis para potencia en plasma, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden tener valores IC50 que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación al valor IC50 obtenido para Tocilizumab (MRA) .
En un análisis para definir la unión a la membrana IL-6R de células CHO, los polipéptidos y los compuestos de la invención pueden tener valores IC50 entre 10 n y 100, pM, de preferencia entre 5 nM y 100 pM, de mayor preferencia entre 2 nM y 10 pM o menos, como 2 nM o menos.
En otro aspecto especifico, el polipéptido, compuesto o estructura de la invención consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 70.
En otro aspecto especifico, el polipéptido, compuesto o estructura de la invención consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 71.
Los compuestos o los polipéptidos de la invención en general se pueden preparar mediante un método que comprende al menos el paso de enlazar adecuadamente una o más de las secuencia de aminoácidos, Nanobody o la estructura monovalente de la invención a uno o más grupos, residuos, porciones o unidades de unión, adicionales, opcionalmente vía uno o más enlazantes, para proporcionar el compuesto o polipéptido de la invención. Los polipéptidos de la invención, también se pueden preparar mediante un método que en general comprende al menos los pasos de proporcionar un ácido nucleico que codifica para un polipéptido ' de la invención, que expresa el ácido nucleico de una forma adecuada, y recuperar el polipéptido expresado de la invención. Estos métodos se pueden realizar de una manera conocida per se, que será evidente para un experto, por ejemplo, con base en los métodos y técnicas descritos adicionalmente en la presente.
Por consiguiente, la presente invención también se relaciona con el uso de una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o una estructura monovalente de la invención para preparar un compuesto, estructura o polipéptido multivalente . El método para la preparación de un compuesto, estructura o polipéptido multivalente comprenderá la unión de una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o una estructura monovalente de la invención, al menos un grupo, residuo, porción o unidad de unión, opcionalmente vía uno o más enlazantes .
En general, cuando una secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención (o un compuesto, estructura o polipéptido que comprende el mismo) se pretende para administración a un sujeto (por ejemplo para: fines terapéuticos y/o de diagnóstico como se describe . en la presente) , de preferencia ya sea una secuencia de aminoácidos o el Nanobody que no se presente naturalmente, en el sujeto o, cuando se presente naturalmente en el sujeto en forma esencialmente aislada (como se define en la presente) .
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos y compuestos de la invención se dirigen! contra IL-6R a partir de seres humanos. Sin embargo, de preferencia también deben tener reactividad cruzada con I.L-6R a partir de monos cynomolgus (Macaca fascicularis) por lo cual se debe entender que estas secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos y compuestos también se "dirigen contra" (como se define en la presente) y/o son capaces de unión especifica a (como se define en la presente) IL-6R a partir monos cynomolgus {Macaca fascicularis) . Esta reactividad cruzada, puede tener ventajas desde un punto de vista para el desarrollo de fármacos, debido a que permite qué las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos y compuestos contra IL-6R humano se probará en un modelo con enfermedad de mono cynomolgus.
Una secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención (asi como también los compuestos, estructuras y polipéptidos que comprenden el mismo) tiene "reactividad cruzada" con IL-6R a partir de seres humanos y monos cynomolgus lo que significa que la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención (asi como también los compuestos, estructuras y polipéptidos que comprenden el mismo) se unen a IL-6R a partir de un mono cynomolgus con una afinidad; (medida y expresada adecuadamente como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , un índice de kon y/o un índice koff, o alternativamente con un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) que sea igual o al menos del 70% de (de preferencia al menos 80% de, de mayor preferencia al menos 90%, incluso de mayor preferencia al menos 95% de) la afinidad con la cual la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención (así como los compuestos, estructuras y polipéptidos que comprenden los mismos) se une a IL-6R a partir de humanos. Para la secuencia IL-6R y la secuencias de ADNc correspondiente del mono cynomolgus, también se hace referencia a la O 09/010539 presentada por Ablynx N.V. el 16 de julio de 2008 titulada "Receptor for interleukin-6 (IL-6) from Macaca fascicularis" ; véase la SEC ID NO: 3 y la figura IB para la secuencias de ADNc y la SEC ID NO: 4 y la figura 3B para la secuencia de aminoácidos) .
También, dentro del alcance de la invención para utilizar partes, fragmentos, análogo, mutantes, variantes, alelos y/o derivados de las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos de la invención, y/o para el uso de proteínas o polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente de una o más de estas partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivados, siempre y cuando estos sean adecuados para los usos predichos en la presente Estas partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivados por lo general contendrán (al menos parte de) un sitio de unión con antígenos funcional para unirse contra el epitope específico sobre IL-6R; y de mayor preferencia tendrán la capacidad de unión específica con el epitope específico sobre IL-6R, e incluso de mayor preferencia con capacidad de unión al epitope específico sobre IL-6R con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (real o aparente), un valor KA (real o aparente), un índice kon y/o un índice koff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) que es como se define en la presente. Estas partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivado por lo general también tendrán una potencia con base celular y una potencia en plasma como se define en la presente. Algunos ejemplos no limitantes de estas partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos, derivados, proteínas y/o polipéptidos serán evidentes a partir de la descripción adicional en la presente. Los fragmentos o polipéptidos adicionales de la invención también se pueden proporcionar mediante una combinando adecuada (es decir mediante unión o fusión genética) uno o más partes (menores) o fragmentos como se describe en la presente.
En otro aspecto, la invención se relaciona, con un ácido nucleico o una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos de la invención, un Nanobody de la invención o un polipéptido de la invención (o un fragmento adecuado de los mismos) . Este ácido nucleico también se denominará en la presente como un "ácido nucleico de la invención" y por ejemplo puede estar en la forma de una estructura genética, como se describe adicionalmente en la presente. Por consiguiente, la presente invención también se relaciona con un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos que esté en la forma de una estructura genética.
Las secuencias del nucleótidos de la invención pueden se secuencias de nucleótidos que se presenten en la naturaleza o secuencias sintéticas o semi-sintéticas, y por ejemplo, pueden ser secuencias que se aislan mediante PCR a partir de un molde adecuado que se presenta en la naturaleza (por ejemplo ADN o ARN aislado de una célula), las secuencias de nucleótidos que se hayan aislado de una biblioteca (y en particular, una biblioteca de extensión) , las secuencias de nucleótidos que se hayan preparado al introducir mutaciones en una secuencia de nucleótidos que se presenta 1 en la naturaleza (utilizando cualquier técnica adecuada conocida per se, tal como PCR mal apareada) , la secuencia de nucleótidos que se haya preparado mediante PCR utilizando cebadores de superposición o las secuencias de nucleótidos que se hayan preparado utilizando técnicas para síntesis de ADN conocidas per se.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un hospedero o célula hospedera que expresa (o que bajo circunstancias adecuadas sea capaz de expresar) una secuencia de aminoácidos de la invención, un Nanobody de la invención y/o un polipéptido de la invención; y/o que contiene un ácido nucleico de la invención. Algunos ejemplos preferidos, aunque no limitantes de estos hospederos o células hospederas serán evidentes a partir de la descripción adicional en la presente .
La invención se relaciona además con un producto o composición que contiene o que comprende al menos una secuencia de aminoácidos de la invención (o un fragmento adecuado de la misma) , al menos un Nanobody de la invención, al menos un polipéptido de la invención, al menos un compuesto o estructura de la invención, al menos una estructura monovalente de la invención y/o al menos un ácido nucleico de la invención, y opcionalmente uno o más componentes adicionales de estas composiciones conocidas per se, es decir dependiendo del uso destinado de la composición. Este producto o composición por ejemplo puede ser una composición farmacéutica (como se describe en la presente) , una composición veterinaria o un producto o composición para uso en diagnóstico (también como se describe en la presente) . Algunos ejemplos preferidos aunque no limitantes, dé estos productos o composiciones se harán evidentes a partir de la descripción adicional en la presente.
La invención se relaciona además con métodos para preparar las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospederas, productos y composiciones descritas en la presente. El método para producir una secuencia de aminoácidos de la invención, un Nanobody de la invención, un polipéptido de la invención, o una estructura monovalente de la invención pueden comprender los siguientes pasos: a) Expresar, en una célula hospedera adecuada un organismo hospedero o en otro sistema de expresión adecuado, un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos de la invención, o una estructura genética de la invención; seguida opcionalmente al: b) Aislar y/o purificar la secuencia de aminoácidos, el Nanobody, el polipéptido, o la estructura monovalente de la invención asi obtenida.
El método para producir una secuencia de aminoácidos, un Nanobody, un polipéptido, o una estructura monovalente de la invención puede comprender los pasos de: a) Cultivar y/o mantener un hospedero o célula hospedera de la invención bajo condiciones que sean tales que el hospedero o célula hospedera exprese y/o produzca al menos una secuencia de aminoácidos, Nanobody, polipéptido, o una estructura monovalente de la invención, seguida opcionalmente al: b) Aislar y/o purificar la secuencia de aminoácidos, el Nanobody, el polipéptido, o la estructura monovalente de la invención asi obtenida.
La invención se relaciona además con las aplicaciones y usos de las secuencias de aminoácidos, polipéptidos, compuestos, estructuras, ácidos nucleicos, células hospederas, productos y composiciones descritas en la presente, asi como también con los métodos para la prevención y/o tratamiento para enfermedades y trastornos asociados con IL-6R. Algunas aplicaciones preferidas, aunque no limitantes, y usos se harán evidentes a partir de la descripción adicional en la presente.
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos, compuestos, estructuras y composiciones de la presente invención en general se pueden utilizar para modular, y en particular inhibir y/o prevenir, la unión de IL-6R a IL-6 y la unión posterior al complejo IL-6/IL-6R para gpl30 y de esta forma modular, y en particular inhibir y/o prevenir, la señalización que se produce mediante IL-6R, IL-6, el complejo IL-6/IL-6R y/o gpl30, para modular las trayectorias biológicas en las cuales IL-6R, IL-6, el complejo IL-6/IL-6R y/o gpl30 están implicados, y/o para modular el mecanismo biológico, las respuestas y efectos asociados con esta señalización o estas trayectorias.
En un aspecto, la invención proporciona las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos, estructuras y los compuestos que estén, y/o que se! puedan utilizar como, un antagonista de IL-6R, o una señalización suministrada por IL-6R, y/o de los mecanismos de trayectorias biológicas, respuestas y/o efectos en los cuales están implicados IL-6R y/o la señalización suministrada por IL-6R.
Con respecto a esto, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos , compuestos, estructuras j y las composiciones de la presente invención son tales que; (a) se unen específicamente (como se define en la presente) al receptor IL-6; y (b) son capaces de sub-regular el receptor IL-6 y/o son capaces de inhibir, disminuir o sub-regular la señalización del receptor IL-6 y/o la trayectorias, mecanismos o la señalización en la cual está implicado IL-6 o IL-6R. Como será evidente para un experto, esta secuencia de aminoácidos, Nanobody, polipéptido, compuesto o estructura en general se pueden utilizar como un antagonista de IL-6, del receptor IL-6 receptor y/o de las trayectorias biológicas, mecanismos o efectos en los cuales está implicada la señalización suministrada por IL-6, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R. Cualquier disminución o sub-regulación (que puede ser al menos 1%, tal como al menos 5%, tal como al meños 10%, o más de 10%, o hasta el 50% o el 100% o más en un parámetro relevante, en comparación con el mismo parámetro bajo condiciones en las cuales la secuencia de aminoácidos, Nanobody, polipéptido, compuesto o estructura no se! une al receptor IL-6), se pueden medir de cualquier forma adecuada conocida per se, por ejemplo, utilizando una de las trayectorias descritas anteriormente y/o en lá parte experimental y/o mencionadas en la presente.
Más particularmente, y además de (a) , y (b) anteriores, estas secuencias de aminoácidos antagónicas, Nanobodies, polipéptidos, compuestos y estructuras se¡ unen a IL-6R de tal forma que en (c) la unión de IL-6 a IL-6R se bloquee, se inhiba o reduzca; en comparación con la unión de IL-6 a su receptor sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la invención.
Sin limitación, estas secuencias de aminoácidos antagónicas, Nanobodies, polipéptidos, compuestos y estructuras se pueden unir a un epitope especifico sobre IL-6R cercano al costado de interacción IL-6 sobre IL-6R.
También, además de (a) y (b) anteriores, y además de (c) anterior, estas secuencias de aminoácidos antagónicas y polipéptidos se pueden unir a IL-6R (es decir, tal ¡como se presentan en el complejo IL-6/IL-6R) de tal forma que' (d) la formación del complejo IL-6/IL-6R se inhiba o afecte (por ejemplo, se interrumpa total o parcialmente) de tal forma que la unión del complejo a -por ejemplo su afinidad para- gpl30 se reduzca (o se invierta, que la unión de gpl30 a -por ejemplo su afinidad para- el complejo se reduce), de tal forma que la señalización inducida/suministra por la unión del complejo a gpl30 se modula (por ejemplo se reduce); en comparación con la formación del complejo y su unión a gpl30 sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, Nanobody, polipéptido, compuesto o estructura de la invención.
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos, compuestos, estructuras y composiciones de la invención también de preferencia son (aunque sin limitación) tales que llevan a cabo una disminución (es decir,; en al menos 1 por ciento tal como al menos 10 por ciento, de preferencia al menos 30 por ciento, de mayor preferencia al menos 50 por ciento, incluso de mayor preferencia al menos el 75 por ciento o más) o una inhibición total de la inducción de la proteina C reactiva (CRP) en un mamífero (tal como en un sujeto humano o en un modelo adecuado de animal para inflamación tal como el mono cynomolgus) cuando se administra al mamífero en una cantidad terapéuticamente relevante en comparación con un mamífero que no recibe la secuencia de aminoácidos, Nanobody, polipéptido, compuesto, estructura o composición de la invención.
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos, compuestos, estructuras y composiciones de la invención también de preferencia (aunque sin limitación) son tales que llevan a cabo una disminución (es decir,, en al menos 1 por ciento tal como en al menos 10 por ciento, de preferencia al menos 30 por ciento, de mayor preferencia al menos 50 por ciento, incluso de mayor preferencia al menos 75 por ciento o más) o una inhibición total de la inducción del conteo de plaquetas en un mamífero (tal como en un sujeto humano o en un modelo adecuado de animal para inflamación tal como como el mono cynomolgus) cuando se administran al mamífero en una cantidad terapéuticamente relevante en comparación con un mamífero que no recibe la secuencia de aminoácidos, Nanobody, polipéptido, compuesto, estructura o las composiciones de la invención.
Las secuencias de aminoácidos, Nanúbodies, polipéptidos , compuestos, estructuras y composiciones de la invención también de preferencia son (aunque sin limitación) tales que lleven a cabo una disminución (es decir en al menos 1 por ciento tal como al menos 10 por ciento, de preferencia al menos 30 por ciento, de mayor preferencia al menos 50 por ciento, incluso de mayor preferencia al menos 75 por ciento o más) o una inhibición total de la inducción del fibrinógeno en un mamífero (tal como en un sujeto humano o en modelo adecuado de animal para inflamación tal como mono cynomolgus) cuando se administran al mamífero en una cantidad terapéuticamente relevante en comparación con un mamífero que no recibe la secuencia de aminoácidos, Nanobody, polipéptido, compuesto, estructura o composiciones de la invención.
Como tales, las secuencias de aminoácidos, polipéptidos, compuestos, estructuras y composiciones de la presente invención se pueden utilizar para la prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con IL-6R, con IL-6, con el complejo IL-6/IL-6R (opcionalmente en complejo adicional con gpl30) , y/o con la trayectoria de señalización) y/o las funciones biológicas y respuestas en las cuales están implicados IL-6, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R (opcionalmente el complejo adicional con gpl30), y en particular para la prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con IL-6R, IL-6, con el complejo IL-6/IL-6R (opcionalmente el complejo adicional con gpl30) , y/o con la trayectoria de señalización) y/o las funciones biológicas y respuestas en las cuales están implicados IL-6R, IL-6 y/o el complejo IL-6/IL-6R (opcionalmente el Complejo adicional con gpl30) , que se caracterizan por una señalización excesiva y/o no deseada suministrada por IL-6R o mediante las trayectorias en las cuales está implicado IL-6R. Los ejemplos de estos trastornos asociados con IL-6R, con IL-6, con el complejo IL-6/IL-6R, y/o con las trayectorias de señalización y/o las funciones biológicas y respuestas en las cuales están implicados IL-6, IL-6R y/o el complejo ÍL-6/IL-6R, se harán evidentes para los expertos con base en la exposición en la presente, y por ejemplo incluyen las siguientes enfermedades y trastornos: Sepsis (Starnes et al., 1999, J. , Immunol., 148: 1968) y diversas formas de, cáncer tales como enfermedad de mieloma múltiple (MM) , carcinoma de células renales (RCC) , leucemia de células en plasma (Klein et al., 1991, Blood, 78: 1198-1204), linfoma, trastorno B-linfoproliferativo (BLPD) y cáncer de próstata. Los ejemplos no limitantes de otras enfermedades provocadas por la producción excesiva de IL-6 o la señalización incluyen resorción ósea (osteoporosis ) (Roodman et al., 1992, J. , Clin. Invest. 89: 45-52; Jilka et al., 1992, Sciende, 257: 88-91), caquexia (Strassman et al., 1992, J. , Clin, invest., 89: 1681-1684), psoriasis, glomerulonefritis proliferativa mesangial, sarcoma de Kaposi, linfoma relacionado con SIDA (Emilie et al., 1994, Blood, 84: 2472-2479), enfermedades inflamatorias y trastornos tales como artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil de aparición sistémica, hipergammaglobulinemia (Grau et al., 1990, J. , Exp. Med., 172: 1505-1508); enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis múltiple, enfermedad de Castleman, gammopatia Ig , mixoma cardiaco, asma (en particular asma alérgico) y diabetes mellitus dependiente de insulina auto-inmune (Campbell et al., 1991, J. Clin. Invest. 87: 739-742). Otros trastornos relacionados con IL-6R, IL-6 y/o el complejo IL-6/IL-6R se harán eyidentes para el experto. Estas enfermedades y trastornos en general también se denominan en la presente como "enfermedades y trastornos relacionados con IL-6R." De esta forma, sin estar limitados a lo mismo, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos, compuestos, estructuras y composiciones de la invención por ejemplo se pueden utilizar para prevenir y/o tratar todas las enfermedades y trastornos que actualmente se¡ están previniendo o tratando con principios activos que pueden modular la señalización suministrada por IL-6R, tal como aquellos mencionados en la técnica anterior : citada anteriormente. También se debe prever que las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos, compuestos, estructuras y las composiciones de la invención sé pueden utilizar para prevenir y/o para tratar todas las enfermedades y trastornos para las cuales se está desarrollando el tratamiento con estos principios activos, se ha propuesto, o se propondrá o se desarrollará en el futuro. Además, se produce, debido a sus propiedades favorables como se describe adicionalmente en la presente, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos, compuestos, estructuras y composiciones de la presente invención se pueden ¡utilizar para la prevención y tratamiento de otras enfermedades y trastornos distintos de aquellos para los cuáles se utilizarán estos principios activos conocidos o se propondrán o desarrollarán; y/o que las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos, compuestos, estructuras y composiciones de la presente invención puedan proporcionar nuevos métodos y regímenes para el tratamiento j de las enfermedades y trastornos descritos en la presente. j t Por consiguiente, la presente invención también se relaciona con un método para la prevención y/o tratamiento de al menos una enfermedad o trastorno que se pueda prevenir y/o i tratar al administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una secuencia de aminoácidos de la invención, un Nanobody de la invención, un polipéptido de la invención, : o una estructura monovalente de la invención, el método comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de al menos una secuencia de aminoácidos de la invención, un Nanobody de la invenjción, un polipéptido de la invención, un compuesto de la invención, o una estructura (monovalente) de la invención, i o una composición de la invención. ! La invención también se relaciona con el usó de una secuencia de aminoácidos de la invención, un Nanobody de la invención, un polipéptido de la invención, un compuesto de la invención, o una estructura (monovalente) de la invención, una preparación de una composición farmacéutica ¡para la prevención y/o tratamiento de al menos una | de las enfermedades y trastornos asociados con IL-6, con IL^6R, con el complejo IL-6/IL-6R y/o con las trayectorias de señalización y/o las funciones biológicas y las respuestas en las cuales están implicados IL-6, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R; y/o para utilizarse en uno o más de los ; métodos descritos en la presente.
La invención se relaciona además con una secuencia de aminoácidos de la invención, un Nanobody de la invención, un polipéptido de la invención, un compuesto de la invención, o una estructura (monovalente) de la invención para utilizarse en la prevención y/o tratamiento de al m$nos una de las enfermedades y trastornos asociados con IL-6, con IL-6R, con el complejo IL-6/IL-6R y/o con las trayectorias de señalización y/o las funciones biológicas y respuestas en las cuales están implicados IL-6, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R; y/o para utilizarse en uno o más de los métodos descritos en la presente.
En particular, la presente invención proporciona las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies, las proteínas, los polipéptidos, los compuestos y/o las estructuras que sean adecuadas para uso profiláctico, terapéutico y/o de diagnóstico en un animal de sangre caliente, y en particular en un mamífero, y más en particularmente en un ser humano.
Más particularmente, la presente invención proporciona estas secuencias de aminoácidos, Nanobodies, proteínas, polipéptidos, compuestos y/o estructuras que se pueden utilizar para la prevención, tratamiento, alivio y/o diagnóstico de uno o más trastornos relacionados con IL-6R (como se define en la presente) en un animal de: sangre caliente, en particular un mamífero, y más particularmente en un ser humano.
Otras aplicaciones y usos de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos y compuestos de la invención se harán evidentes para un experto a partir de la exposición adicional en la presente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Análisis de la respuesta inmunitaria en llamas 81 y 82 mediante ELISA como se describe en el Ejemplo 2.
Figura 2A, 2B y 2C: Análisis de la respuesta inmunitaria en llamas 81 y 82 mediante FACS com se describe en el Ejemplo 2. Leyenda: L181 pre: Suero pre-inmune proveniente de la llama 81; L181 PBL1: Suero recolectado en el día 28 de la llama 81; L182 pre: Suero pre-inmune proveniente de la llama 82; L182 PBL2 : Suero recolectado en el día 43 de la llama 82.
Figura 3: Representación esquemática de los análisis Alphascreen utilizados para identificar los Nanobodies contra el sitio de unión de IL-6 sobre IL-6R.
Figura 4: Secuencias de aminoácidos de los Nanobodies anti-IL-6R.
Figura 5: SDS-PAGE de Nanobodies purificados obtenidos como se describe en el Ejemplo 6.
Figuras 6A, 6B, 6C: Inhibición de la interacción IL-6/IL-6R mediante Nanobodies seleccionados según se mide en Alphascreen. MAb BR-6 y el fragmento Fab de referencia (descrito en el Ejemplo 1) se utilizaron como un control.
Figura 7: Unión de los Nanobodies anti-IL-6R a células U266 analizadas mediante FACS.
Figura 8: Unión de los Nanobodies anti-IL-6R a células U266 en ausencia (superior) y presencia (inferior) de plasma humano.
Figura 9: Perfiles de concentración-tiempo en plasma observados individuales (símbolos) y modelos predichos (línea continua) de IL6R304 en un mono cynomolgus después de la administración i.v. con 1 mg/kg (o), 5 mg/kg (?) , 10 mg/kg ( + ) , 25 mg/kg (?) y 100 mg/kg (0).
Figura 10: Unión de los Nanobodies IL-6R de ratón y humano. En cada grupo de tres barras, la barra en la izquierda indica IL 6R humano, la barra a la mitad indica IL 6R de ratón y la barra a la derecha indica un espacio en blanco .
Figura 11: SDS-PAGE de Nanobodies biespecificos purificados .
Figura 12: Inhibición de la interacción IL-6/IL-6R mediante Nanobodies biespecificos según se mide en Alphascreen.
Figura 13: Análisis de FACS de Nanobodies bivalente que se unen a células U266.
Figura 14: Análisis de FACS de Nanobodies trivalente que se unen a células U266.
Figura 15: Alineación de las secuencias : IL6R03, IL6R04 y IL6R13 con 5 lineas germinales humanas más homologas. Para una explicación adicional véase el Ejemplo 23.
Figura 16A y 16B: Secuencias de aminoácidos de las variantes utilizadas de secuencias de IL6R03, IL6R04 e IL6R13. Para una explicación adicional véase el Ejemplo 23.
Figura 17: Inhibición de la interacción IL-6/IL-6R mediante las variantes utilizadas por secuencias de IL6R03.
Figura 18: Inhibición de la interacción IL-6/IL-6R mediante las variantes utilizadas por secuencias de IL6R04.
Figura 19: Inhibición de la interacción IL-6/IL-6R mediante las variantes utilizadas por secuencias de IL6R13.
Figura 20: Inhibición de la interacción IL-6/IL-6R mediante las variantes utilizadas por secuencias de IL6R13.
Figura 21: Inhibición de la interacción IL^-6/IL-6R mediante Nanobodies anti-IL-6R tipo silvestre optimizados por secuencia .
Figuras 22A, 22B y 22C: Potencia de base celular de los Nanobodies optimizados por secuencia contra los Nanobodies tipo silvestre.
Figuras 23A, 23B: ELISA para potencia en plasma de los Nanobodies optimizados por secuencias en plasma humano (A) y cyno (B) .
Figura 24: ELISA para potencia en plasma de los Nanobodies optimizados por secuencia a la EC50 (izquierda) y el EC95 (derecha) de IL-6.
Figuras 25A, 25B, 25C y 25D: Mapeo de epitopes de Nanobodies IL-6R según se describe en el Ejemplo 29: Análisis de competencia sobre una micro-plaqueta recubierta con IL-6R (A-C) o una recubierta con IL-6.
Figura 26: Secuencias de aminoácidos de las variantes IL6R65 con afinidad madura.
Figura 27: Curvas de unión del Nanobody, IL6R65 (denominado como Nanobody original) y sus variantes de afinidad madura.
Figuras 28A, 28B: Evaluación de IL6R65 y 5 variantes de afinidad madura en un análisis para potencia de plasma humano y cyno.
Figura 29: Inhibición de la proliferación dependiente de IL-6 de células TF-1 mediante Nanobodies con afinidad madura. Las células crecieron en presencia de 2 ng/ml de IL-6 humano y diversas concentraciones del Nanobody. La proliferación se midió mediante la incorporación de 3H-timidina.
Figuras 30A, 30B y 30C: Competencia de IL-6 con dos Nanobodies con afinidad madura (B-C) en comparación con la competencia de IL-6 con el IL6R65 (A) según se mide en Biacore .
Figura 31: Secuencias de los Nanobodies de unión a IL-6R después de un segundo ciclo de maduración de afinidad (bibliotecas combinatorias CDRl/2 + CDR3) .
Figura 32: Inhibición de la proliferación dependiente de IL-6 de células TF-1. Las células crecieron en presencia de 2 ng/ml de IL-6 humano y diversas concentraciones del Nanobody. La proliferación se midió mediante la incorporación de 3H-timidina.
Figuras 33A, 33B: Evaluación de IL6R65 y el; segundo ciclo de las variantes con afinidad madura en un análisis para potencia de plasma humano y cyno. Original = IL6R65.
Figura 34: Unión de IL6R65 y PMP20A11 a los PBMC humanos en sangre entera.
Figura 35: Inhibición de la actividad IL-6R en membrana mediante Nanobodies formateados e IgG de referencia. Las células TF-1 se pre-incubaron con una dilución en serie de IL6R304(B), IL6R305 (A) , IL6R306(T) o IgG(«) de referencia después de lo cual se indujo la proliferación con 100 IU/mL de IL-6. Después de 72 horas de incubación, se evaluó la proliferación celular mediante la incorporación ¡ de 3H-timidina. Se muestra la media ± e.s. de las mediciones por triplicado .
Figura 36: Inhibición del IL-6R de membrana mediante los Nanobodies formateados y el IgG de referencia a altos niveles de IL-6. Las células TF-1 se pre-incubaron con una dilución en serie de 20A11 (?) , IL6R304 (¦) , IL6R305(A) , IL6R306(T) o el IgG(») de referencia, después de lo cual se induce la proliferación con 5000 IU/mL de IL-6. Después de 72 horas de incubación, se evaluó la proliferación celular mediante la incorporación de 3H-timidina. Se muestra la media ± e.s. de las mediciones por triplicado.
Figura 37: Efecto de IL6R304 e IL6R305 sobre la proliferación de células TF-1. Las células TF-1 se sembraron a una densidad de 12500 células/pocilio y se incubarón con o sin IL6R304 o IL6R305 50 nM. La proliferación se indujo con 100 IU/mL de IL-6 o las células se incubaron en ausencia de los factores de crecimiento. Después de 72 horas a incubación, se evaluó la proliferación celular mediante la incorporación de 3H-timidina. Cada punto de datos se midió 30 veces. Se muestra la media ± e.s.
Figuras 38A, 38B, 38C y 38D: ELISA para potencia en plasma humano. Neutralización de la unión de IL-6 humano a plasma sIL-6R mediante el IgG (·) de referencia, IL6R20A11 (?), IL6R304 (¦) , IL6R305 (A), IL6R306 (?) o un NB (x) irrelevante. Se muestra la media ± e.s. de las mediciones por duplicado. A, B: Competencia con 25 ng/mL de IL-6 (EC50) . C.D: Competencia con 885 ng/mL de IL-6 (EC95) .
Figuras 39A, 39B: Unión de IL6R20A11 y las variantes formateadas para células CHO. Las células CHO que expresan IL-6R (A) o células CHO negativas (B) se incubaron con IL6R20A11 (?) , IL6R304 (¦) , IL6R305 (A) o IL6R306 (T) . El Nanobody unido se detectó utilizando MAb el.5.3.1 y anti-ratón-PE.
Figura 40: Unión de Nanobodies IL-6R sobre los PBL humanos en sangre entera. Izquierda: Linfocitos (L, negro), monocitos (M, gris oscuro) y granulocitos (G, gris claro) se seleccionaron con base en sus propiedades FSC/SSC. Centro: Fondo de fluorescencia PE de las tres poblaciones seleccionadas. Derecha: Fluorescencia PE después de la incubación con 1 µ de IL6R305.
Figura 41: Unión de Nanobodies IL-6R a los PBL humanos. La sangre tratada con EDTA proveniente de 2 donadores se incubó con IL6R20A11 (?) , IL6R304 (¦) , IL6R305 (A) o IL6R306 (T) . El Nanobody unido se detectó utilizando MAb el.5.3.1 y anti-ratón-PE . A: Linfocitos; B: Monocitos; C: Granulocitos .
Figura 42: Curvas de unión de los Nanobodies formateados con afinidad madura sobre albúmina dé suero humano y cyno.
Figura 43: Curvas de unión de los Nanobodies formateados con afinidad madura a IL-6R humano y cyno.
Figura 44: ELISA para potencia en plasma, en plasma cyno. Neutralización de unión de IL-6 humano a sIL-6R en plasma cyno mediante el IgG (·) de referencia, IL6R20A11 (?) , IL6R304 (¦) , IL6R305 (A), IL6R306 (?) o un NB (x) irrelevante.
Figura 45: Reactividad cruzada de IL6R20A11 con sIL-6R proveniente de otras especies. Izquierda: Unión de IL6R20A11 a sIL-6R humano sobre la placa después de la pre-incubación con el sIL-6R recombinante proveniente de humano (·) , cyno (¦) o ratón (A) . Derecha: Unión de IL6R20A11 a sIL-6R humano después de la pre-incubación con plasma humano (·), cyno (¦) , ratón (A) o cobayo (T) .
Figura 46: ELISA de unión competitiva. IL6R20A11 (0.05 nM) se pre-incubó con diferentes concentraciones de IL-6R (·), LIF-R (¦) , CNTF-R (A), OSM-R (?) O IL-llR/Fc (?) . El IL6R20A11 libre se capturó sobre SIL-6R y se detectó vía anti-His .
Figura 47: Diseño de estudio para el análisis PK/PD in vivo de IL6R304 e IL6R305.
Figuras 48A, 48B, 48C y 48D: Efecto del IgG de referencia, IL6R304 e IL6R305 sobre los niveles CRP aumentados por hIL-6 en monos cynomolgus individuales. (A) los animales 27, 28 y 29 sirvieron como controles negativos y recibieron sólo hIL-6. El IgG de referencia (B, símbolos en negros rellenos) , diferentes dosis de IL6R304 (C, símbolos azules) y diferentes dosis de IL6R305 (D, símbolos rojos) donde se administraron i.v. seguido por inyecciones s.c. de hIL-6 a una dosis de 5 pg/kg una vez al día durante 7 días.
Figura 49: Niveles medios CRP para todos los grupos obtenidos en el estudio PK/PD in vivo con IL6R304 e IL6R305.
Figuras 50A, 50B, 50C, 50D: Efecto del : IgG de referencia, IL6R304 e IL6R305 sobre los niveles de fibrinógenos aumentados mediante hIL-6 en monos cynomolgus individuales. (A) los animales 27, 28 y 29 sirvieron como controles negativos y recibieron únicamente hIL-6. El IgG de referencia (B, símbolos en negro rellenos), diferentes dosis de IL6R304 (C, símbolos azules) y diferentes dosis de :IL6R305 (D, símbolos rojos) se administraron i.v. seguida por inyecciones s.c. de hIL-6 a dosis de 5 pg/kg una vez al día durante 7 días. Los resultados se normalizaron a los niveles básicos .
Figura 51: Niveles medios de fibrinógeno para todos los grupos obtenidos en el estudio PK/PD in vivo con IL6R304 e IL6R305.
Figuras 52A, 52B, 52C y 52D: Efecto del IgG de referencia, IL6R304 e IL6R305 sobre conteos de plaquetas aumentados mediante hIL-6 en monos cynomolgus individuales. (A) los animales 27, 28 y 29 sirvieron como controles negativos y recibieron únicamente hIL-6. El IgG de referencia (A, símbolos en negro rellenos) , diferentes dosis de IL6R304 (B, símbolos azules) y diferentes dosis de IL6R305 (C, símbolos rojos) se administraron i.v. seguida por inyecciones s.c. de hIL-6 a una dosis de 5 g/kg una vez al día durante 7 días. Los resultados se normalizaron a los niveles básicos.
Figura 53: Media de conteo de plaquetas para todos los grupos obtenidos en el estudio PK/PD in vivo con IL6R304 e IL6R305.
Figura 54: Gráficas de tiempo de la concentración plasmática observada individual después del bolo i.v. administración de IL6R304 (0.4-2-10 mg/kg) en monos cynomolgus. llm, 12m y 13f son las tres gráficas a la izquierda; 17m, 18f y 14m son las gráficas medias y 15m y 16f son las gráficas a la derecha.
Figura 55: Gráficas de concentración-tiempo de plasma observados individuales después de la administración en bolo i.v. de IL6R305 (0.4-2-10 mg/kg) en monos cynpmolgus. 19m, 20f y 21f son las tres gráficas a la izquierda; 25m, 26f y 22m son las gráficas medias y 23m y 24f son las gráficas a la derecha.
Figura 56: Gráficas de la concentración media observada en plasma contra el tiempo después de la administración de bolo i.v. de IL6R304 (0.4-2-10 mg/kg) e IL6R202 (2 mg/kg, dosis normalizada a 0.4-10 mg/kg) en monos cynomolgus .
Figura 57: Inmunodetección de anticuerpos anti-IL6R304 a la pre-dosificación y diferentes dias después de la administración i.v. de IL6R304. Las placas ELISA se recubrieron con IL6R304. La leyenda en cada una de las figuras corresponde a los agrupamientos de gráficas de barra que inician de izquierda a derecha.
Figura 58: Inmunodetección de anticuerpos anti-IL6R304 a pre-dosificación y diferentes dias después de la administración i.v. de IL6R304. Las placas ELISA se recubrieron con IL6R300. La leyenda en cada una de las figuras corresponde a los agrupamientos de la gráfica de barra que inicia de izquierda a derecha.
Figura 59: Inmunodetección de anticuerpos anti-IL6R304 a pre-dosificación y diferentes días después de la administración i.v. de IL6R304. Las placas ELISA se recubrieron con ALB8. La leyenda en cada una de las , figuras corresponde a los agrupamientos de la gráfica de barra que inicia de izquierda a derecha.
Figura 60: Inmunodetección de anticuerpos anti-IL6R305 a pre-dosificación y diferentes días después de la administración i.v. de IL6R305. Las placas ELISA se recubrieron con IL6R305. La leyenda en cada una de las figuras corresponde a los agrupamientos de la gráfica de barra que inicia de izquierda a derecha.
Figura 61: Inmunodetección de anticuerpos anti-IL6R305 a pre-dosificación y diferentes dias después de la administración i.v. de IL6R305. Las placas ELISA se recubrieron con IL6R300. La leyenda en cada una de las figuras corresponde a los agrupamientos de la gráfica de barra que inicia de izquierda a derecha.
Figura 62: Inmunodetección de anticuerpos anti-IL6R305 a pre-dosificación y diferentes dias después de la administración i.v. de IL6R305. Las placas ELISA se recubrieron con ALB8. La leyenda en cada una de las figuras corresponde a los agrupamientos de la gráfica de barra que inicia de izquierda a derecha.
Figuras 63A, 63B y 63C: Niveles de sIL-6R en plasma en monos cynomolgus después de una dosificación única de bolo IV de Nanobodies IL6R. A: 2 animales trataron con el IgG de referencia a 5 mg/kg (¦, ·) o vehículo (A), B: 3 animales con IL6R304 a 0.04 mg/kg, C: 3 animales con IL6R305 a 0.04 mg/kg.
Figuras 64A, 64B y 64C: Niveles de sIL-6R en plasma total en monos cynomolgus después de una sola dosificación en bolo IV de Nanobodies IL6R. A: Animales tratados con IL6R304 (A, ¦, ·) , IgG de referencia (T) o vehículo (O) ; B: Animales treatados con IL6R305 (A, ¦, ·) , IgG de referencia (T) o vehículo ( ). Se muestra la media ± e.s. por grupo.
Figuras 65A, 65B, 65C y 65D: Niveles de IL-6 en plasma total en monos cynomolgus después de u a sola dosificación de bolo i.v. de Nanobodies IL6R. Concentraciones de IL-6 en plasma total, IL-6 tanto cyno endógeno como humano inyectado, se midieron vía la plataforma Gyroláb. Las muestras que están por debajo del límite de cuantificación se representan como 9.6 pg/mL. A: IL6R304; B: IL6R305; C: (IgG de referencia) positivo y control negativo (amortiguador) . Se representa la media al grupo de tratamiento ± e.s. (n=3 para 0.4 y 2 mg/kg; n=2 para 10 mg/kg). D: Concentraciones de IL-6 en plasma cyno endógeno en animales individuales después de la inyección por bolo i.v. de 10 mg/kg IL6R304 : (¦,·), IL6R305 (A,T) o el Nanobody irrelevante (O, ·) . Se muestra la media ± e.s. de 2 mediciones.
Figuras 66A y 66B: Niveles en plasma de SIL6R total (A) y libre (B) en monos cynomolgus después de una sola administración i.v. de diferentes dosis de IL6R304. Se muestran las concentraciones plasmáticas medias de cada biomarcador ± SD por grupo. El vehículo o IL6R304 a dosis determinadas se administraron en punto de tiempo 0. Para la leyenda, véase la Figura 66B.
Figura 67: Niveles en plasma de sIL6R total y libre y la concentración de IL6R304 en monos cynomolgus después de una sola administración i.v. de 25 mg/kg de IL6R304. Se muestra la media ± SD para el grupo con dosificación específica. El sIL6R total (línea continua, símbolos cuadrados) , el sIL6R libre (línea continua, símbolos redondos) y las concentraciones de IL6R304 (línea punteada, delta) se grafican contra tiempo (días) .
Figura 68: Gráficas de concentración-tiempo de sIL6R total observado individualmente (símbolos) y predicho en modelo (líneas continuas) después de la administración i.v. con 1 mg/kg (o), 5 mg/kg (?) , 10 mg/kg ( + ) , 25 mg/kg (x) y 100 mg/kg (0) de IL6R304.
Figura 69: Perfiles de la media de concentración en plasma - tiempo de IL6R304 en monos cynomolgus después de la inyección en bolo i.v. con 1, 5, 10, 25 ó 100 mg/kg de IL6R304.
Figura 70: Modelo farmacocinético de tres compartimientos abiertos con intercambio lineal y no lineal a partir del compartimiento central. CLNON-IL6R es el intercambio lineal no mediado por IL6R, Vc el volumen del compartimiento central, Vd el volumen del compartimiento periférico profundo, CLd el flujo inter-compartimental entre los compartimientos central y profundo, Vs el volumen del compartimiento periférico poco profundo, CLS el flujo de inter-compartimental entre el compartimiento central y poco profundo y CLIL6R es el intercambio no lineal mediado por IL6R (con Vmax la tasa metabólica máxima y Km la concentración IL6R304 correspondiente al 50% de Vmax) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la presente descripción, ejemplos y reivindicaciones : a) A menos que se indique o defina de otra manera, todos los términos utilizados tienen significado usual en el estado de la técnica, los cuales serán claros para un experto en la materia. Se hace referencia por ejemplo a los manuales estándar, tal como Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2a Ed. ) , Vols. 1-3 , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al., eds . , "Current protocole in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Oíd et al., "Principies of Gene Manipulation : An Introduc'tion to Genetic Engineering", 2a edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., "Immunológy" (6a Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt' s Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001); y Janeway et al., "Immunobiology" (6th Ed. ) , Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005) , asi como también la técnica antecedente general citada en la presente; b) a menos que se indique de otra manera, el término "secuencias de inmunoglobulina" -ya sea que se utilice en la presente para hacer referencia a un anticuerpo de cadena pesada o a un anticuerpo de 4 cadenas convencional-se utiliza como un término general para incluir tanto el anticuerpo de tamaño total, las cadenas individuales del mismo, asi como también todas las partes, dominios o fragmentos del mismo (incluyendo de manera enunciativa los dominios de unión a antigenos o los fragmentos tales como los dominios VHH o los dominios VH/VL, respectivamente) . Además, el término "secuencia" en el sentido en el que se utiliza en la presente (por ejemplo, en términos similares, "secuencias de inmunoglobulina", "secuencias de anticuerpos", "secuencias de dominio variable", "secuencias de VHH" O "secuencias de proteínas") , en general se debe entender que incluye tanto la secuencia de aminoácidos relevante así como también los ácidos nucleicos o secuencias de nucleótidos que codifican para los mismos, a menos que el contexto requiera una interpretación más limitada. También, el término "secuencia de nucleótidos" en el sentido en el que se utiliza en la presente, también abarca una molécula de ácido nucleico con la secuencia de nucleótidos, de tal forma que los términos "secuencia de nucleótidos" y "ácido nucleico" se deben considerar equivalentes y se utilizan de manera indistinta en la presente; c) a menos que se indique de otra manera, los métodos, pasos, técnicas y manipulaciones que no se describan específicamente en detalle se pueden realizar y se han realizado de una forma conocida per se, como será evidente para el experto. Por ejemplo, se hace referencia nuevamente a los manuales estándar y a la técnica antecedente general mencionado en la presente y a las referencias adicionales implicadas en la presente; así como también por ejemplo a las siguientes revisiones Presta, 2006, Adv. Drug Deliv. Rev., 58 (5-6): 640-56; Levin and Weiss, 2006, Mol. Biosyst., 2(1): 49-57; Irving et al., 2001, J. Immunol. Methods, 248(1-2): 31-45; Schmitz et al., 2000, Placenta, 21 Suppl. A, S106-12; Gonzales et al., 2005, Tumour Biol., 26(1): 31-43, que describen las técnicas para el diseño por ingeniería de proteínas, tal como la maduración por afinidad y otras técnicas para mejorar la especificidad y otras propiedades deseadas de proteínas tales como inmunoglobulinas ; d) los residuos de aminoácidos se indicarán de acuerdo con el código de aminoácidos estándar de tres letras o una sola letra, como se menciona en la Tabla A-2; Tabla A-2 : Código de aminoácidos de una sola letra y tres letras No polar, no cargado, Alanina Ala A (a pH 6.0-7.0) 131 Valina Val V Leucina Leu L Isoleucina lie I Fenilalanina Phe F Metionina (1) Met M Triptofano Trp W Prolina Pro P Polar, no cargado Glicina(2) Gly G (a pH 6.0-7.0) Serina Ser S Treonina Thr T Cisteína Cys c Asparagina Asn N Glutamina Gln Q Tirosina Tyr Y Polar, cargado Lisina Lys K (a pH 6.0-7.0) Arginina Arg R Histidina(4> His H Aspartato Asp D Glutamato Glu E Notas: (1) Algunas veces también se considera que será un aminoácido no cargado polar.
Algunas veces también se considerará que será un aminoácido no cargado, no polar.
Como será evidente para el experto, el hecho de que un residuo de aminoácido se denomine en esta Tabla para ya sea estar cargado o sin cargar pH 6.0 a 7.0 no refleja de ninguna forma la carga que el residuo de aminoácido puede tener a un pH menor de 6.0 y/o a un pH superior de 7.0; los residuos de aminoácidos mencionados en la Tabla pueden estar ya sea cargados y/o sin cargar a este pH mayor o menos, como será evidente para el experto.
Como se muestra en la técnica, la carga dé un residuo His depende en gran medida incluso de pequeños desplazamientos en el pH, aunque el residuo His en general se considerará esencialmente no cargado a un pH de aproximadamente 6.5. e) con el fin de comparar dos o más secuencias de nucleótidos, el porcentaje de la "identidad de secuencia" entre una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos se puede calcular al dividir [el número de nucleótidos en la primera secuencia que sean idénticos a los nucleótidos en las posiciones correspondientes en la segunda secuencia de nucleótidos] por [el número total de nucleótidos en la primera secuencia de nucleótidos] y multiplicar por [100%] en el cual cada supresión, inserción, sustitución o adición de un nucleótido en la segunda secuencia de nucleótidos -en comparación con la primera secuencia de nucleótidos- se considera como una diferencia en un nucleótido individual (posición) .
Alternativamente, el grado de identidad de secuencias entre dos o más secuencias de nucleótidos se puede calcular utilizando un algoritmo computarizado conocido para la alineación de secuencias tal como NCBI Blast v2.0 utilizando ajustes estándar.
Algunas otras técnicas, algoritmos computarizados y ajustes para determinar el grado de la identidad de secuencias se encuentran por ejemplo descritos eri la WO 04/037999, EP 0967284, EP 1085089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 y GB 2357768-A.
Por lo general, con el fin de determinar el porcentaje de "identidad de secuencias" entre dos secuencias de nucleótidos de acuerdo con el método de cálculo señalado anteriormente, la secuencia de nucleótidos con el mayor número de nucleótidos se tomará como la "primera" secuencia de nucleótidos, y la otra secuencia de nucleótidos se tomará como la "segunda" secuencia de nucleótidos; f) con el fin de comparar dos o más secuencias de aminoácidos, el porcentaje de "identidad de secuencia" entre una primera secuencia de aminoácidos y una segunda secuencia de aminoácidos (también denominada en la presente como "identidad del aminoácido") se pueden calcular al dividir [el número de residuos de aminoácidos en la primera secuencia de aminoácidos que son idénticos a los residuos de aminoácidos en las posiciones correspondientes en la segunda secuencia de aminoácidos] por [el número total de residuos de aminoácidos en la primera secuencia de aminoácidos] y al multiplicar por [100%] en el cual cada supresión, inserción, sustitución o adición de un residuo de aminoácidos en la segunda secuencia de aminoácidos -en comparación con la primera secuencia de aminoácidos- se considera como una diferencia en un residuo de aminoácidos individual (posición) , es decir, como una "diferencia de aminoácido" según se define en la presente.
Alternativamente, el grado de identidad de secuencias entre las dos secuencias de aminoácidos se puede calcular utilizando un algoritmo computarizado conocido, tal como aquellos mencionados anteriormente para determinar el grado de identidad de secuencia para las secuencias de nucleótidos, utilizando nuevamente ajustes estándar.
Por lo general, con el fin de determinar el porcentaje de "identidad de secuencia" entre dos secuencias de aminoácidos de acuerdo con el método de cálculo señalado anteriormente, la secuencia de aminoácidos con el mayor número de residuos de aminoácidos se tomará como la "primera" secuencia de aminoácidos, y la otra secuencia de aminoácidos se tomará como la "segunda" secuencia de aminoácidos.
También, para determinar el grado de identidad de secuencia entre las dos secuencias de aminoácidos, el! experto puede tomar en cuenta las denominadas sustituciones "conservadoras" de aminoácidos, que en general se; pueden describir como sustituciones de aminoácidos en las cuales un residuo de aminoácido se reemplaza con otro residuo de aminoácido de estructura química similar y el cual tiene poca o ninguna influencia esencialmente sobre la función, actividad u otras propiedades biológicas del polipéptido. Estas sustituciones conservadoras de aminoácidos son bien conocidas en la técnica, por ejemplo a partir de la WO 04/037999, la GB 335 768-A, la WO 98/49185, la WO 00/46383 y la WO 01/09300; y los tipos (preferidos) y/o combinaciones de estas sustituciones se pueden seleccionar con base! en las enseñanzas pertinentes a partir de la WO 04/037999 así como también la WO 98/49185 y a partir de las referencias adicionales citadas en la presente.
Estas sustituciones conservadoras de preferencia son sustituciones en las cuales un aminoácido dentro de los siguientes grupos (a) -(e) se sustituye mediante otro residuo de aminoácidos dentro del mismo grupo: (a) Los residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro y Gly; (b) los residuos polares, cargados negativamente y sus amidas (sin cargar) : Asp, Asn, Glú y Gln; (c) los residuos polares, cargados positivamente: His, Arg y Lys; (d) los residuos alifáticos largos, no polares: et, Leu, lie, Val y Cys; y (e) los residuos aromáticos: Phe, Tyr y Trp.
Las sustituciones conservadoras particularmente preferidas son como sigue: Ala en Gly o en Ser; Arg en Lys; Asn en Gln o en His; Asp en Glu; Cys en Ser; Gln en Asn; Glu en Asp; Gly en Ala o en Pro; His en Asn o en Gln; lie en Leu o en Val; Leu en lie o en Val; Lys en Arg, en Gln o en Glu; Met en Leu, en Tyr o en lie; Phe en Met, en Leu o en Tyr; Ser en Thr; Thr en Ser; Trp en Tyr; Tyr en Trp; y/o Phe en Val, en lie o en Leu.
Cualesquiera sustituciones de aminoácidos aplicadas a los polipéptidos descritos en la presente también se pueden basar en el análisis de las frecuencias de las variaciones de aminoácido entre proteínas homologas de diferentes especies desarrolladas por Schulz et al. (1978, "Principies of Protein Structure", Springer-Verlag) , sobre el análisis de estructura que forma los potenciales desarrollados por Chou and Fasman (1974, Biochemistry 13: 211, and 1978, Adv. Enzymol., 47: 45-149), y sobre el análisis de los patrones de hidrofobicidad en las proteínas desarrolladas por Eisenberg et al. (1984, Proc. Nati. Acad Sci . USA 81: 140-144), Kyte y Doolittle (1981, J. Molec. Biol. 157: 105-132), and Goldman ! et al. 1986, Ann. Rev. Biophys . Chem. 15: 321-353),; todas incorporadas en la presente en su totalidad como referencia. La información sobre la estructura primaria, secundaria y terciaria de los Nanobodies se proporciona en la descripción en la presente y en la técnica antecedente general citada anteriormente. También, para este fin, la estructura cristalina de un dominio VHH proveniente de una llama por ejemplo se proporciona mediante Desmyter et al. (1996,: Nature Structural Biology, 3 (9): 803), Spinelli et al. (1996, Natural Structural Biology, 3: 752-757) y Decanniere et al. (1999, Structure, 7 (4) : 361) . La información adicional relacionada con algunos de residuos de aminoácidos que en los dominios de VH convencionales forman la interfaz VH/VL y las sustituciones de camelización potenciales sobre estas posiciones se pueden encontrar en la técnica anterior citada anteriormente; g) las secuencias de aminoácidos y las secuencias de ácidos nucleicos se dice que serán "exactamente las mismas" si tienen el 100% de identidad de secuencias (como se define en la presente) sobre su longitud total; h) cuando se comparan dos secuencias de aminoácidos, el término "diferencia de aminoácido" se refiere a una inserción, supresión o sustitución de un residuo de aminoácidos individual sobre una posición de la primera secuencia, en comparación con la segunda secuencias; se debe entender que dos secuencias de aminoácidos pueden contener uno, dos o más de estas diferencias de aminoácidos; i) cuando se dice que una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos "comprende" otra secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos, respectivamente, o que "consista esencialmente de" otra secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos, se debe entender que la última secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos se ha incorporado en la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente, respectivamente, aunque de manera más general esto significa que la secuencias de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos mencionada en primer lugar comprende dentro de su secuencias un alargamiento de nucleótidos o residuos de aminoácidos, respectivamente, que tenga la misma secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos, respectivamente, al igual que la última secuencia, sin importar la forma en que la secuencia mencionada en primer lugar realmente se haya generado u obtenido (lo cual por ejemplo, puede ser mediante cualquier método adecuado descrito en la presente) . Por medio de un ejemplo no limitante, cuando una secuencia de aminoácidos , de la invención se dice que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos, esto puede significar que el alargamiento de residuos de aminoácidos se ha incorporado en la secuencia de aminoácidos de la invención, aunque por lo general esto significa que la secuencia de aminoácidos de la invención contiene dentro de su secuencia el alargamiento de residuos de aminoácidos independientes sin importar la forma en que la secuencia de aminoácidos de la invención se haya generado u obtenido. Cuando un Nanobody de la invención se dice que comprende una secuencias CDR, esto puede significar que la secuencia CDR se ha incorporado en el Nanobody de la invención, aunque de manera más general significa que el Nanobody de la invención contiene dentro de su secuencias un alargamiento de residuos de aminoácidos dentro de la misma secuencia de aminoácidos al igual que las secuencias CDR, sin importar si el Nanobody de la invención se ha generado u obtenido .
También se debe observar que cuando la última secuencia de aminoácidos tenga una función biológica o estructural especifica, de preferencia tiene esencialmente la misma o una equivalente función biológica o estructural en las secuencias de aminoácidos mencionada en primer lugar (en otras palabras, la secuencia de aminoácidos mencionada en primer lugar de preferencia es tal que la última secuencias es capaz de realizar esencialmente la misma, una similar o una función equivalente biológica o estructural) . Por ejemplo, cuando un Nanobody de la invención se dice que comprende una secuencia CDR o secuencias de armazón, o que funciona como una secuencia CDR o una secuencia de Nanobody respectivamente. También, cuando se dice que una secuencias de nucleótidos comprende otra secuencia de nucleótidos, la secuencias de nucleótido mencionada en primer lugar de preferencia es tal que, cuando se expresa en un producto de expresión (por ejemplo un polipéptido) , la secuencia de aminoácidos codificada por la última secuencia de nucleótidos forma parte del producto de expresión (en otras palabras, que la última secuencia de nucleótidos es la misma trama de lectura como la secuencia de nucleótidos mayor, mencionada en primer lugar) ; j ) se considera que una secuencias de ácidos nucleicos o una secuencia de aminoácidos estará " (en) (forma) esencialmente aislada" -por ejemplo, en comparación con su fuente biológica natural y/o el medio de reacción o medio de cultivo a partir del cual se haya obtenido- cuando haya separado de al menos otro componente con el cual por lo general se asocia en la fuente o medio, tal como otro ácido nucleico, otra proteina/polipéptido, otro componente biológico o macromolécula de al menos un contaminante, impureza o componente menor. En particular, una secuencias de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos se considera "esencialmente aislada" cuando se haya purificado al menos 2 veces, en particular al menos 120 veces, más particularmente al menos 100 veces, y hasta 1000 veces o más. Una secuencias de ácido nucleico una secuencia de aminoácidos que está "en forma esencialmente aislada" de preferencia es esencialmente homogénea, según se determina utilizando una técnica adecuada, tal como una técnica cromatográfica adecuada, tal como electroforesis en gel de poliacrilamida; k) el término "el dominio" en el sentido en el que se utiliza en la presente en general se refiere a una región globular de una secuencia de aminoácidos (tal como una cadena de anticuerpos, y en particular con una región globular de un anticuerpo de cadena pesada) , o con un polipéptido que consiste esencialmente de esta región globular. Por lo general, este dominio comprenderá hazas de péptidos (por ejemplo, 3 ó 4 hazas de péptidos) estabilizadas, por ejemplo, como una hoja o mediante enlaces disulfuro. El término "dominio de unión" se refiere a este dominio que se dirige contra un determinante antigénico (como se define en la presente) ; 1) el término "determinante antigénico" se refiere al epitope sobre el antigeno reconocido . por la molécula de unión con antigenos (tal como, una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o un polipéptido de la invención) y más particularmente mediante el sitio de unión con antígenos de la molécula. Los términos "determinante antigénico" y "epitope" también se pueden utilizar indistintamente en la presente . m) una secuencia de aminoácidos (tal como un Nanobody, un anticuerpo, un polipéptido de la invención, o en general una proteina de unión con antigeno o un polipéptido o un fragmento de los mismos) que se pueda unir (específicamente) a, que tenga una afinidad para y/o que tenga especificidad para un determinante antigénico específico, epitope, antígeno o proteína (o para al menos una parte, fragmento o epitope del mismo) se dice que será "contra" o "se dirigirá contra" el determinante antigénico, epitope, antígeno o proteína; n) el término "especificidad" se refiere al número de diferentes tipos de antígenos o determinantes antigénicos a los cuales se pueda unir una molécula de unión con antígenos o una molécula proteínica de unión con antígenos (tal como una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o un polipéptido de la invención) . La especificidad, de una proteina de unión con antigenos se puede determinar Con base en la afinidad y/o avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antigeno con una proteina de unión con antigenos (KD) , es una medición para la resistencia de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión con antigenos sobre la proteina de unión con antigenos: Entre menor sea el valor del KD, mayor \ será la resistencia de unión entre un determinante antigénico y la molécula de unión con antigenos (alternativamente, la afinidad también se puede expresar como la constante de afinidad (K¾) que es 1/KD) . Como será evidente para un experto (por ejemplo, con base en la exposición adicional en la presente) , la afinidad se puede determinar de una manera conocida per se, dependiendo del antigeno especifico de interés. La avidez es la medición de la resistencia de unión entre una molécula de unión con antigenos (tal como una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o un polipéptido de la invención) y el antigeno pertinente. La avidez se relaciona tanto con la afinidad entre un determinante antigénico como con su sitio de unión con antigenos sobre la molécula de unión con antigenos y el número de sitios de unión pertinentes presentes en la molécula de unión con antígenos.
Típicamente, las proteínas de unión con antígenos se unirán a su antígeno con una constante de disociación (KD) de 10"5 hasta 10-12 moles/litro o menos, y de preferencia 10"7 hasta 10-12 moles/litro o menos y de mayor preferencia 10"8 hasta 10-12 moles/litro (es decir, con una constante de disociación (KA) de 105 hasta 1012 litro/moles o más, y de preferencia 107 hasta 1012 litros/moles o más de preferencia 108 hasta 1012 litros/moles) . Cualquier valor KD mayor que 104 mol/litro (o cualquier valor KA menor de 104 M"1) litros/mol en general se considera que indica una unión no específica. De preferencia, una secuencia de inmunoglobulina monovalente de la invención se unirá al antígeno deseado con una afinidad menor de 500 nM, de preferencia menor de 200 nM, de mayor preferencia menor de 10 nM, tal como menos de 500 pM. La unión específica de una proteína de unión con antígenos a un antígeno o determinante antigénico se puede determinar de cualquier forma adecuada conocida per se, incluyendo, por ejemplo, análisis Scatchard y/o análisis de unión competitiva, tal como radioinmunoanálisis (RIA) , inmunoanálisis enzimáticas (EIA) y análisis de competencia emparedada, y las diferentes variantes de los mismos conocidas per se en la técnica; así como también las otras técnicas mencionadas en la presente.
La constante de disociación puede ser la constante de disociación real o aparente, como será evidente para el experto. Los métodos para determinar la constante de disociación se harán evidentes para el experto, y por ejemplo incluyen las técnicas mencionadas en la presente. Con respecto a esto, también será evidente que puede , no ser posible medir las constantes de disociación de más de 10"4 moles/litro o 10"3 moles/litro (por ejemplo, de 10"2 moles/litro) . Opcionalmente, también como será evidente para el experto, la constante de disociación (real o aparente) se puede calcular con base en la constante de disociación (KA) (real o aparente) , por medio de la relación [KD - 1/KA] .
La afinidad denota la resistencia o estabilidad de una interacción molecular. La afinidad comúnmente se proporciona como por el KD, o por la constante de disociación que tiene unidades de mol/litro (o M) . La afinidad también se puede expresar como una constante de asociación, KA que es igual a 1/KD y tiene unidades (mol/litro)"1 (o M-1) . En la presente especificación, la estabilidad de la interacción entre dos moléculas (tales como la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o el polipéptido de la invención y su: blanco pretendido) principalmente se expresará en los términos del valor KD de su interacción; que será evidente para el experto que en vista de la relación KA =1/KD, que especifica la resistencia de la interacción molecular mediante su valor KD también se pueden utilizar para calcular el valor KA correspondiente. El valor KD caracteriza la resistencia de una interacción molecular también en un sentido termodinámico según se relaciona con la energía libre (DG) de unión mediante la relación bien conocida DG=R¡T . ln ( KD) (equivalentemente DG=-RT. ln (KA) ) , donde R es igual a la constante gaseosa, T es igual a la temperatura absoluta y ln denota el logaritmo natural.
El KD para las interacciones biológicas : que se consideran significativas (por ejemplo, específicas) típicamente están en la variación de 10"10M (0.1 nM) ,a 10"5M (10000 nM) . Entre mayor sea una interacción, menor será su El KD también se puede expresar como la proporción de la constante de velocidades de disociación de un complejo, denotado como koff, con la velocidad de asociación, denotada kon (de tal forma que KD = k0ff/kon y K¾ = kon/k0ff) . La velocidad k0ff tiene unidades M"1s~1 (donde s es la notación unitaria SI del segundo) . El índice kon tiene unidades M~1s"1. El índice on puede variar entre 102 M^s"1 hasta aproximadamente 107 M^s-1, alcanzando la constante de velocidad de asociación de difusión limitada para interacciones bimoleculares . El índice off se relaciona con la vida media de una interacción molecular determinada mediante la relación ti 2=ln (2 ) /k0ff · El índice off puede variar entre 10"6 s"1 (complejo irreversible cercano con un ti/2 de múltiples días) para 1 s"1 (ti/2=0.69 s).
La afinidad de una interacción molecular entre dos moléculas se pueden medir vía diferentes técnicas conocidas per se, tal como la bien conocida resonancia con plasmones superficiales (SPR) técnica con biodetectores (véase por ejemplo, Ober et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001) donde una molécula se inmoviliza sobre la micro-plaqueta con biodetectores y la otra molécula se hace pasar sobre la molécula inmovilizada bajo condiciones de flujo que proporcionan mediciones kon, k0ff y por lo tanto valores KD (o KA) . Por ejemplo esto se puede realizar utilizando los instrumentos bien conocidos BIACORE.
También será evidente para el experto que el KD medido puede corresponder al KD aparente si el proceso de medición influye de algún modo en la afinidad de unión intrínseca de las moléculas implicadas por ejemplo mediante artefactos relacionados con el recubrimiento sobre el biodetector de una molécula. También, un KD aparente se puede medir si una molécula contiene más de un sitio de reconocimiento para la otra molécula. En esta situación la afinidad medida se puede afectar por la avidez de la interacción mediante las dos moléculas.
Otro procedimiento que se puede utilizar para valorar la afinidad es el procedimiento ELISA de 2 pasos (ensayo inmunosorbente ligado a una enzima) de Friguet et al. (1985, J., Immunol. Methods, 77: 305-19). Este método establece una medición de equilibrio de unión en fase de solución y evita posibles artefactos que se relacionan con la adsorción de una de las moléculas sobre un soporte tal como plástico.
Sin embargo, la medición exacta de KD puede ser muy laboriosa y como consecuencia con frecuencia, los valores KD aparentes se determinan para valorar la resistencia de unión de dos moléculas. Se debe observar que mientras que todas las mediciones se realizan de una forma consistente (por ejemplo, manteniendo las condiciones de análisis sin cambios) se pueden utilizar mediciones KD aparentes como una aproximación del KD verdadero y por lo tanto en el presente documento, el KD y KD aparente se deben tratar con igual importancia o relevancia.
Por último, se debe observar que en muchas situaciones, el científico experimentado puede juzgar que será conveniente determinar la afinidad de unión con relación a alguna molécula de referencia. Por ejemplo, para evaluar la resistencia de unión entre las moléculas A y B, por ejemplo se puede utilizar una molécula de referencia C que se sabe se une a B y que se marca adecuadamente con un fluoróforo o grupo cromóforo u otra porción química, tal como biotina para una fácil detección en un ELISA o FACS (clasificación celular activada por fluorescencia) u otro formato (el fluoróforo para la detección por fluorescencia, el cromóforo para la detección por absorción de luz, la biotina para la detección ELISA suministrada por estreptavidina) . Típicamente, la molécula de referencia C se mantiene a una concentración fija y la concentración de A se varia para una concentración determinada o una cantidad de B. Como resultado se obtiene un valor IC50 correspondiente a la concentración de A en la cual se divide la señal medida para C en ausencia de A. Siempre que KD ref, se sale de la molécula de referencia, así como también la concentración total Cref de la molécula de referencia, el KD aparente de la interacción A-B se puede obtener a partir de la siguiente fórmula: KD = IC50/ ( 1+Cref/KD ref) . Obsérvese que si Cref << KD ref/- KD » IC50. Con la condición de que la medición del IC50 se realice en una forma consistente (por ejemplo, manteniendo el Cref fijo) para los aglutinantes que se comparan, la resistencia o estabilidad de una interacción molecular se puede evaluar mediante el IC50 y se juzga que esta medición es equivalente al KD o al KD aparente a través de todo este texto; o) la vida media de una secuencia de aminoácidos, un Nanobody, un compuesto o un polipéptido de la invención en general se puede definir como el tiempo que toma la concentración sérica de la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido que se reducirá al 50%, in vivo, por ejemplo debido a la degradación de la secuencias o compuesto y/o el intercambio o la secuestración i de la secuencias o compuesto mediante mecanismos naturales. Esta vida media in vivo de una secuencia de aminoácidos, un Nanobody, un compuesto o un polipéptido de la inverición se puede determinar de cualquier forma conocida per se, tal como mediante análisis farmacocinético . Las técnicas adecuadas serán evidentes para el experto en la técnica, y por ¡ejemplo en general pueden implicar los pasos de administrar adecuadamente a un animal de sangre caliente (es decir, a un ser humano o a otro mamífero adecuado, tal como un ratón, conejo, rata, cerdo, perro o un primate, por ejemplo monos provenientes del género Macaca (tal como, y en particular, monos cynomolgus {Macaca fascicularis) y/o monos' rhesus {Macaca mulatta) ) y mandriles (Papio ursinus) ) una dosis adecuada de la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido de la invención; recolectar muestras sanguíneas u otras muestras del animal; determinar el riivel o concentración de la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido de la invención en la · muestra sanguínea; y calcular a partir (una gráfica de) los datos así obtenidos, el tiempo hasta que el nivel o concentración de la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido de la invención se haya reducido al 50% en comparación con el nivel inicial con la dosificación. Por ejemplo se hace referencia a la Parte Experimental más adelante, asi como también a los manuales estándar, tales como, Kenneth A et al. (Chemical Stability of Pharmaceuticals : A Handbóok for Pharmacists) y Peters et al. (1996, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach) . También se hace referencia a Gibaldi M and Perron D (1982, "Pharmacokinetics" , publicada por Marcel Dekker, 2a edición revisada) .
También será evidente para el experto (véanse por ejemplo las páginas 6 y 7 de la WO 04/003019 y en las referencias adicionales citadas en la presente) , la vida media se puede expresar utilizando parámetros tales como la tl/2-alfa, tl/2-beta y el área bajo la curva (AUC). En la presente especificación, un "aumento en la vida media" se refiere a un aumento en cualquiera de estos parámetros, tales como cualquiera de dos de estos parámetros, o esencialmente los tres parámetros. En el sentido en el que se utiliza en la presente "aumento en la vida media" o "vida media aumentada" en particular se refiere a un aumento en la tl/2-beta, ya sea con o sin un aumento en la tl/2-alfa y/o la AUC o ambas; p) en el contexto de la presente invención, "modular" o "para modular" en general significa ya sea reducir o inhibir la actividad, o alternativamente aumentar la actividad de un blanco o antigeno, según se mide utilizando un análisis in vitro, celular o in vivo adecuado. En particular, "modular" o "para modular" puede significar ya sea reducir o inhibir la actividad, o alternativamente aumentar una actividad biológica (relevante o pretendida) , de un blanco o antigeno, según se mide utilizando un análisis in i vitro, celular o in vivo adecuado (el cual por lo general dependerá del blanco o antigeno implicado) , mediante al menos 1%, de preferencia al menos 5%, tal como al menos 10% o al menos 25%, por ejemplo, mediante al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, ó 90% o más, en comparación con la actividad del blanco o antígeno en el mismo análisis bajo las mismas condiciones aunque sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, el Nanobody, el polipéptido, el compuesto o estructura de la invención.
Como será evidente para el experto, "modular" también puede implicar llevar a cabo un cambio (el cu l puede ser ya sea un aumento o una disminución) en la afinidad, avidez, especificidad y/o selectividad de un blanco o antigeno para uno o más de sus ligandos, adjuntos de unión, adjuntos para asociación con una forma homomultimérica o heteromultimérica o sustratos; y/o levar a cabo un cambio (que puede ser ya sea un aumento o disminución) en la sensibilidad del blanco o antigeno para una o más condiciones en el medio o los alrededores en los cuales está presente el blanco o antigeno (tal como pH, resistencia iónica, la presencia de co-factores, etc. ) , en comparación con las mismas condiciones aunque sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, el Nanobody, el polipéptido, el compuesto o la estructura de la invención. Como será evidente para el experto, esto se puede determinar nuevamente en cualquier forma adecuada y/o utilizar cualquier análisis adecuado conocido per se, dependiendo del blanco o antigeno implicado.
"Modular" también puede significar llevar a cabo un cambio (es decir una actividad como un agonista, como un antagonista o como un agonista inverso, respectivamente, dependiendo del blanco o antigeno y el efecto biológico o fisiológico deseado) con respecto a uno o más mecanismos biológicos o fisiológicos, efectos, respuestas, funciones, trayectorias o actividades en los cuales el blanco o antigeno (o en los cuales están implicados sus sustratos, ligandos o trayectorias tales como, su trayectoria de señalización o trayectoria metabólica y sus efectos biológicos o fisiológicos asociados) . Nuevamente, como será evidente para el experto, esta acción como un agonista o un antagonista se puede determinar de cualquier manera adecuada y/o utilizar cualquier análisis adecuado {in vitro y usualmente celular o en análisis) conocido per se, dependiendo del blanco o antigeno implicado. En particular, una acción como un agonista o antagonista puede ser tal que una actividad biológica o fisiológica pretendida se aumente o disminuya, respectivamente, al menos el 1%, de preferencia al menos un 5%, tal como al menos el 10% o al menos el 25%, por ejemplo mediante al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, o el 90% o más, en comparación 1 con la actividad biológica o fisiológica en el mismo análisis bajo las mismas condiciones aunque sin la presencia , de la secuencia de aminoácidos, Nanobody, polipéptido, compuesto o estructura de la invención.
Modular por ejemplo, también puede implicar una modulación alostérica del blanco o antigeno; y/o reducir o inhibir la unión del blanco o antigeno a uno de sus sustratos o ligandos y/o competir con un ligando natural, sustrato, el sustrato para unión al blanco o antigeno. Modular también puede implicar activar el blanco o antigeno o el mecanismo o trayectoria en el cual esté implicado. Modular por ejemplo también puede implicar llevar a cabo un cambio con respeto al pliegue o confirmación del blanco o antigeno, o con respecto a la capacidad del blanco o antigeno para plegarse, para cambiar su confirmación (por ejemplo, con la unión de un ligando) , para asociarse con otras (sub-unidades, o para disociarse. Modular por ejemplo también puede implicar llevar a cabo un cambio en la capacidad del blanco o antigeno para transportar otros compuestos o para servir como un canal para otros compuestos (tales como iones).
Modular puede ser reversible o irreversible, aunque para fines farmacéuticos y farmacológicos por lo general será de una manera reversible.
En el contexto de la presente invención, "modular" o "para modular" en general significa ejercen un efecto agonista o antagonista, respectivamente, con respecto a IL-6, IL-6R y/o las trayectorias biológicas, respuestas, señalización, mecanismos o efectos en los cuales está implicado IL-6 y/o IL-6R. En particular, "modular" ó "para modular" puede significar ya sea un efecto agonista o antagonista (es decir, un efecto agonista o antagonista total o parcial, respectivamente) , según se mide utilizando un análisis in vitro, celular o in vivo adecuado (tal como aquellos mencionados en la presente) , que conduzca a un cambio en un parámetro relevante en al menos el de preferencia al menos el 5%, tal como al menos el 10% o al menos el 25%, por ejemplo por mediante al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, o el 90% o más, en comparación con el mismo parámetro en el mismo análisis bajo las mismas condiciones aunque sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, Nanobody, polipéptido, compuesto o estructura de la invención.
En el contexto de la presente invención "modular, inhibir y/o prevenir la unión del complejo IL-6/IL-6R a gpl30" significa que las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos, compuestos o estructuras de presente invención se unirán al epitope especifico IL-6R (es decir, tal como se presentan en el complejo IL-6/IL-6R) de tal una forma que la formación del complejo IL-6/IL-6R se afecte, inhiba y/o evite (por ejemplo, se interrumpa total o parcialmente) de tal forma que la unión del complejo a -por ejemplo su afinidad para- gpl30 se reduzca, inhiba y/o evite (o inversamente, que la unión de gpl30 a -por ejemplo, su afinidad para- el complejo se reduce, inhibe y/o evita) , de tal forma que la señalización inducida/suministrada por la unión del complejo A gpl30 se module (por ejemplo, reduzca, inhiba y/o evite) en comparación con la formación del complejo y su unión a gpl30 sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, Nanobodies, polipéptido, compuesto o estructura de la invención; q) Con respeto a un blanco o antigeno, el¦ término "sitio de interacción" en el blanco o antígeno significa un sitio, epitope, determinante antigénico, parte, dominio o alargamiento de residuos de aminoácidos sobre el blanco o antigeno que es un sitio por unión a un ligando, receptor u otro adjunto de unión, un sitio catalítico, un sitio de segmentación, un sitio para interacción alostérica, un sitio implicado en la multimerización (tal como, la homomerización o heterodimerización) del blanco o antígeno; o cualquier otro sitio, epítope, determinante antigénico, parte, dominio o alargamiento de residuos de aminoácidos sobre el blanco o antígeno que esté implicado en una acción o mecanismo biológico del blanco o antígeno. De manera más general, un "sitio de interacción" puede ser cualquier sitio, epítope, determinante antigénico, parte, dominio o alargamiento de residuos de aminoácidos sobre el blanco o antígeno al cual se puede unir una secuencia de aminoácidos, un Nanobody, un polipéptido, un compuesto o una estructura de la invención de tal forma que el blanco o antígeno (y/o cualquier trayectoria, interacción, señalización, mecanismo biológico o efecto biológico en el cual esté implicado el blanco o antígeno) se moduló (como se define en la presente) ; r) un "alargamiento de residuos de aminoácidos" significa dos o más residuos de aminoácidos que son adyacentes entre sí o en proximidad cercana entre sí, es i decir, en la estructura primaria o terciaria de la secuencia de aminoácidos. En el contexto de la presente invención, el "alargamiento de residuos del aminoácido" será (al menos parcialmente) responsable para la unión de la secuencia de aminoácidos, el Nanobody, el polipéptido, el compuesto o estructura de la invención a su epitope especifico sobre IL-6R; s) una secuencia de aminoácidos, un Nanobody, un polipéptido, un compuesto o se estructura se dice que será "especifico para" un primer blanco o antigeno en comparación con un segundo blanco o antígeno cuando se une al1 primer antigeno con una afinidad (como describió anteriormente, y se expresa adecuadamente como un KD, un valor KA , un índice Koff y/o un índice Kon) que es al menos 10 veces, tal como al menos 100 veces, y de preferencia al menos 1000 veces, y hasta 10,000 veces o más mejor que la afinidad con la cual la secuencia de aminoácidos, el Nanobody, el polipéptido, el compuesto o estructura se une al segundo blanco o polipéptido. Por ejemplo, la primera secuencia de aminoácidos, Nanobody, polipéptido, compuesto o estructura se pueden unir al blanco o antígeno con un valor KD que es al menos 10 veces menor, tal como al menos 100 veces menor, y de preferencia al menos 1000 veces menor, tal como 10,000 veces menor o incluso menos, del KD con el cual la secuencia de aminoácidos, el Nanobody, el polipéptido, el compuesto o estructura se une al segundo blanco o polipéptido. De preferencia, cuando una secuencia de aminoácidos, un Nanobody, un polipéptido, un compuesto o una estructura es "específico para" un primer blanco o antígeno en comparación con un segundo blanco o antígeno, se dirige contra (como se define en la presente) el primer blanco o antígeno, aunque no se dirige contra el segundo blanco o antígeno; t) Una secuencia de aminoácidos o un Nanobody de la invención (así como también los compuestos, estructuras y polipéptidos que comprenden los mismos) es "reactivo cruzado" con IL-6R proveniente de dos diferentes especies (es decir, una primera especie y una segunda especie) significa que la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención (así como también los compuestos, estructuras y polipéptidos que comprenden el mismo) se une a IL-6R proveniente : de una segunda especie con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor D (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , un índice kon y/o un índice kof f , o alternativamente como un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) , que es igual o menos el 70% (de preferencia al menos el 80%, de mayor preferencia al menos el 90%, o incluso de mayor preferencia al menos el 95%) de la afinidad con la cual la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención (así como también, los compuestos, las estructuras y los polipéptidos que comprenden el mismo) se une a IL-6R a partir de una primera especie; u) como se describe adicionalmente en la presente, el número total de residuos de aminoácidos en un Nanobody puede estar en la región de 110-120, de preferencia es 112-115, y con mayor preferencia es 113. Sin embargo, se debe observar que las partes, fragmentos, análogos o derivados (como se describen adicionalmente en la presente) de un Nanobody no se limitan particularmente a su longitud y/o tamaño, siempre y cuando estas partes, fragmentos, análogos o derivados cumplan con los requisitos adicionales señalados en la presente y también de preferencia sean adecuados para los fines descritos en la presente; v) los residuos de aminoácidos de un Nanobody se enumeran de acuerdo con la numeración general para los dominios VH proporcionados por Kabat et al. ("Sequénce of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), según se aplica a los dominios VHH provenientes de Camélidos, en el articulo de Riechmann and Muyldermans (2000, J. Immunol. Methods 240 (1-2) : 185-195; véase por ejemplo la figura 2 de esta publicación); o se hace referencia en la presente. De acuerdo con esta numeración, FR1 de un Nanobody comprende residuos de aminoácidos en las posiciones 1-30, CDR1 de un Nanobody comprende residuos de aminoácidos en las posiciones 31-35, FR2 de un Nanobody comprende los aminoácidos en las posiciones 36-49, CDR2 de un Nanobody comprende residuos de aminoácidos en las posiciones 50-65, FR3 de un Nanobody comprende residuos de aminoácidos en las posiciones 56-94, CDR3 de un Nanobody comprende residuos de aminoácidos en las posiciones 95-102, y FR4 de un Nanobody comprende residuos de aminoácidos en las posiciones 103-113. [con respecto a esto, se debe observar que -como es bien conocido en el técnica parea el dominio VH y para los dominios VHH_ el número total de residuos de aminoácidos en cada uno de los CDR puede variar y puede no corresponder al número total de residuos de aminoácidos indicado por la numeración Kabat (es decir, una o más posiciones de acuerdo con la numeración Kabat puede no estar ocupadas en la secuencia real, o la secuencias real puede contener más residuos de aminoácidos que el' número permitido por la numeración Kabat) . Esto significa que, en general, la numeración de acuerdo con Kabat puede o no corresponder a la numeración real de residuos de aminoácidos en la secuencia real. Sin embargo, en general, se puede decir que, de acuerdo con la numeración de Kabat sin importar el número de residuos de aminoácidos en las CDR, la posición 1 de acuerdo con la numeración Kabat corresponde al inicio de FR1 y viceversa, la posicione 36 de acuerdo con la numeración Kabat corresponde al inicio de FR2 y viceversa, la posicione 66 de acuerdo con la numeración Kabat corresponde al: inicio de FR3 y viceversa, y la posiciona 103 de acuerdo con la numeración Kabat corresponde al inicio de FR4 y viceversa.].
Métodos alternativos para numerar los residuos de aminoácidos de los dominios VH, los métodos también se pueden aplicar de una forma análoga con los dominios VHH a partir de Camélidos y con Nanobodies, son el método descrito por Chothia et al. (1989, Nature 342: 877-883), la denominada "definición AbM" y la denominada "definición de contacto." Sin embargo, en la presente descripción, las reivindicaciones y las figuras, la numeración correspondiente a Kabat según se aplica a los dominios VHH por Riechmann and Muyldermans se seguirá, a menos que se indique de otra manera; y w) las figuras, el listado de secuencias y la Parte/Ejemplos Experimentales se proporcionan únicamente para ilustrar adicionalmente la invención y no se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención y/o de las reivindicaciones anexas de ninguna forma, a menos que se indique explícitamente de otra manera en la presente.
La presente invención proporciona alargamientos de residuos de aminoácidos (SEC ID NOs: 80-82, SEC ID NOs : 84-91 y SEC ID NOs: 93-95) que son particularmente adecuados para la unión a IL-6R. Estos alargamientos de residuos de aminoácidos pueden estar presentes en, y/o se pueden incorporar en, una secuencia de aminoácidos de la invención, en particular de tal modo que formen (parte de) el sitio de unión con antígenos de la secuencia de aminoácidos de la invención. Estos alargamientos de residuos de aminoácidos se han generado como secuencias CDR de anticuerpos de; cadena pesada o secuencias VHH que se aumentaron contra el IL-6R y que tuvieron una afinidad madurada adicional (véase la sección de ejemplo) para aumentar adicionalmente su afinidad para la unión a IL-6R asi como también otras propiedades tales como su eficacia y/o potencia, y/o su selectividad, además de su capacidad para bloquear parcial o totalmente la interacción IL-6/IL-6R, y/o inhibir la señalización a través de, IL-6, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R. Estos alargamientos de residuos de aminoácidos también se denominan en la presente como "secuencias CDR de la invención" (es decir, como "secuencias CDR1 de la invención", "secuencias CDR2 de la invención" y "secuencias de CDR3 de la invención", respectivamente) .
Sin embargo, se debe observar que la invención en su más amplio sentido no se limita a un papel o función estructurales específicos ya que estos alargamientos de residuos de aminoácidos pueden tener en una secuencia de aminoácidos de la invención, siempre y cuando estos alargamientos de residuos de aminoácidos permitan que la secuencia de aminoácidos de la invención se una a IL-6R. De esta forma, en general, la invención en su sentido más amplio proporciona secuencias de aminoácidos que sean capaces de unirse a IL-6R con una cierta afinidad especifica, avidez, eficacia y/o potencia además de su capacidad para bloquear parcial o totalmente la interacción IL-6/IL-6R, y/o inhibir la señalización a través de, IL-ß, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R y que comprende una o más secuencias CDR según se describe en la presente y, en particular una combinación adecuada de dos más de estas secuencias CDR, que se enlazan adecuadamente entre si, vía una o más secuencias de aminoácidos adicionales, de tal forma que la secuencia de aminoácidos total forme un dominio de unión y/o una unidad de unión que sea capaz de unirse a IL-6R. Sin embargo, : también se debe observar que la presencia de sólo una dé estas secuencias CDR en una secuencia de aminoácidos de la invención por si misma ya puede ser suficiente para proporcionarle a las secuencias de aminoácidos de la invención la capacidad de unirse a IL-6R; por ejemplo se hace referencia nuevamente a los denominados "fragmentos acelerados" descritos en la WO 03/050531.
De esta forma, en un aspecto especifico, aunque no limitante, la secuencia de aminoácidos de la invención puede comprender al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de: Las secuencias CDR1: a) Las SEC ID NOs: 80-82; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que i no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 80-82, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos comprenda el alargamiento de residuos de aminoácidos que se une a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos y la diferencia de aminoácido 2 ó 1, la afinidad según se mide por resonancia de plasmones superficiales; y/o - las secuencias CDR2 : c) SEC ID NOs: 84-91; o d) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácido con una SEC ID NOs: 84-91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, con aproximadamente la misma u/o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales ;¦ y/o las secuencias CDR3: e) SEC ID NOs: 93-95; o f) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-95, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales .
En particular, una secuencia de aminoácidos de la invención puede ser una secuencia de aminoácidos que comprenda al menos un sitio de unión con antigenos, en donde el sitio de unión con antigenos comprende al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de las secuencias CDR1, las secuencias CDR2 y las secuencias CDR3 como se describió anteriormente (o cualquier combinación adecuada de las mismas) . En un aspecto preferido, sin embargo, la secuencia de aminoácidos de la invención comprende más de uno, tal como dos o más alargamientos de residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de las secuencias CDR1 de la invención, las secuencias CDR2 de la invención y/o las secuencias CDR3 de la invención.
Por consiguiente, la presente invención también se relaciona con las secuencias de aminoácidos que comprenden dos o más alargamientos de residuos de aminoácidos seleccionados de los siguientes: Las secuencias CDR1; a) las SEC ID NOs: 80-82; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 80-82, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos comprenda el alargamiento de residuos de aminoácidos que se une a IL-6R- con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos y la diferencia de aminoácido 2 ó 1, la afinidad según se mide por resonancia de plasmones superficiales; y/o - las secuencias CDR2: c) Las SEC ID NOs: 84-91; o d) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácido con una SEC ID NOs: 84-91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, con aproximadamente la misma u/o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales; y/o las secuencias CDR3: e) SEC ID NOs: 93-95; o f) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-95, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una á IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales; de tal forma que (i) cuando el primer alargamiento de residuos de aminoácidos corresponda a una o más secuencias de aminoácidos de acuerdo con a) , o b) , el segundo alargamiento de residuos de aminoácidos corresponde á una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con c) , d) , e) o f ) ; (ii) cuando el primer alargamiento de residuos de aminoácidos corresponde a una o más de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con c) o d) , el segundo alargamiento de residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b) , e) o f) ; o (iii) cuando el primer alargamiento de residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con e) o f ) , el segundo alargamiento de residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con a) , b) / c) o d) .
En un aspecto especifico, la presente invención también se relaciona con secuencias de aminoácidos que comprenden tres o más alargamientos de residuos de aminoácidos en los cuales el primer alargamiento de residuos de aminoácidos se selecciona de la siguiente secuencia CDR1 siguientes : a) Las SEC ID NOs : 80-82; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 80-82, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos comprenda el alargamiento de residuos de aminoácidos que se une a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos y la diferencia de aminoácido 2 ó 1, la afinidad según se mide por resonancia de plasmones superficiales; y/o el segundo alargamiento de residuos de aminoácidos se selecciona de las siguientes secuencias CDR2 : c) Las SEC ID NOs : 84-91; o d) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácido con una SEC ID NOs: 84-91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, con aproximadamente la misma u/o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales; y el tercer alargamiento de residuos de aminoácidos se selecciona de las siguientes secuencias CDR3: e) Las SEC ID NOs: 93-95; o f) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-95, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales .
Como se describe en la presente, la presente invención también abarca las secuencias de aminoácidos que comprenden uno o más alargamientos de residuos de aminoácidos que tengan no más de 2, de preferencia no más : de una diferencia de aminoácidos con uno de los alargamientos de residuos de aminoácidos especificados en a), c) y/o e) , es decir, con una de las secuencias CDR1 específicas (es decir con una de las SEC ID NOs: 80-82), con una de las secuencias CDR2 específicas (es decir con una de las SEC ID NOs: 84-91) y/o con una de las secuencias CDR3 específicas (es decir con una de las SEC ID NOs: 93-95).
El término "diferencia de aminoácido", se refiere a una inserción, supresión o sustitución de un residuo de aminoácidos individual en una posición del alargamiento de residuos de aminoácidos (o las secuencias CDR) especificada en b) , d) o f ) , en comparación con el alargamiento de residuos de aminoácidos (o las secuencias CDR) de respectivamente a) , c) o e) se debe entender que el alargamiento de residuos de aminoácidos (o secuencias CDR) de b) , d) y f ) puede contener uno o máximo dos diferencias de aminoácidos en comparación con el alargamiento de residuos de aminoácidos de respectivamente a) , c) o e) .
La "diferencia de aminoácidos" puede ser cualquiera de una o un máximo de dos sustituciones, supresiones o inserciones, o cualquier combinación de las mismas, que mejoren ya sea las propiedades de la secuencia de aminoácidos de la invención o que al menos no resten demasiado las propiedades deseadas o el equilibrio o una combinación de las propiedades deseadas de la secuencia de aminoácidos de la invención. Con respeto a esto, la secuencia de aminoácidos resultante de la invención debe al menos unirse a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una afinidad superior en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el único o más alargamientos de residuos de aminoácidos sin una o máximo dos sustituciones, supresiones o inserciones, la afinidad según se mide mediante resonancia por p'lasmones superficiales .
Por ejemplo, y dependiendo del organismo hospedero utilizado para expresar la secuencia de aminoácidos de la invención, estas supresiones y/o sustituciones se pueden designar de tal forma que uno o más sitios para la modificación pos-traduccional (tal como uno o más sitios de glucosilación) se retiran, como quedará dentro de la capacidad del experto en la técnica.
En un aspecto preferido de la invención, la "diferencia de aminoácidos" es una sustitución de aminoácidos. La sustitución de aminoácidos puede ser cualquiera de uno o un máximo de dos sustituciones qué ya sea mejoren las propiedades de la secuencia de aminoácidos de la invención o que al menos no resten demasiado las propiedades deseadas o el equilibrio o combinación de las propiedades deseadas de la secuencia de aminoácidos de la invención. Con respeto a esto, la secuencia de aminoácidos resultante de la invención debe al menos unirse a IL-6R con la1 misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende uno o más alargamientos de residuos de aminoácidos sin una o máximo dos sustituciones, la afinidad según se mide mediante resonancia por plasmones superficiales.
La sustitución de aminoácidos en uno : o más alargamientos de residuos de aminoácidos puede ser una sustitución conservadora de aminoácidos. Las sustituciones "conservadoras" de aminoácidos en general son sustituciones de aminoácidos en las cuales un residuo de aminoácido se reemplaza con otro residuo de aminoácido de ¡ similar estructura química y que tenga poca o esencialmente ninguna influencia sobre la función, actividad u otras propiedades biológicas de la secuencia de aminoácidos resultante. Estas sustituciones conservadoras de aminoácidos son bien conocidas en la técnica, por ejemplo a partir de la WO 04/037999, la GB 3357768-A, la WO 98/49185, la WO 00/46383 y la WO 01/09300; y los tipos (preferidos) y/o combinaciones de estas sustituciones se pueden detectar con base en las enseñanzas pertinentes a partir de la WO 04/037999 asi como también la WO 98/49185 y a partir de las referencias adicionales ; citadas en la presente.
Estas sustituciones conservadoras de preferencia son sustituciones en las cuales un aminoácido dentro de los siguientes grupos (a) -(e) se sustituye por otro residuo de aminoácido dentro del mismo grupo: (a) Los residuos pequeños, alifáticos no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro y Gly; (b) los residuos cargados negativamente, polares y sus amidas (no cargadas) : Asp, Asn, Glu y Gln; (c) los residuos cargados positivamente, polares: His, Arg y Lys; (d) los residuos grandes alifáticos, no polares: Met, Leu, lie, Val y Cys; y (e) los residuos aromáticos: Phe, Tyr y Trp.
Las sustituciones conservadoras particularmente preferidas son como sigue: Ala en Gly o en Ser; Arg en Lys; Asn en Gln o en His; Asp en Glu; Cys en Ser; Gln en Asn; Glu en Asp; Gly en Ala o en Pro; His en Asn o en Gln; lie en Leu o en Val; Leu en lie o en Val; Lys en Arg, en Gln o en Glu; Met en Leu, en Tyr o en lie; Phe en Met, en Leu o en Tyr; Ser en Thr; Thr en Ser; Trp en Tyr; Tyr en Trp; /o Phe en Val, en lie o en Leu.
En otro aspecto de la invención, las sustituciones de aminoácidos en uno o más alargamientos de residuos de aminoácidos puede proporcionar a la secuencias de aminoácido con una afinidad aumentada para la unión a IL-6R. Esto se puede realizar mediante técnicas tales como mutágénesis aleatoria o sitio dirigida y/u otras técnicas para la maduración de afinidad conocida per se, tal como por ejemplo, las descritas en la WO 09/004065, la WO 2009/004066, la WO 05/003345, la WO 06/023144, la EP 527809, la EP 397834.
Sin estar limitados, las reglas (seguida parcial o totalmente) para las sustituciones de residuos de aminoácidos en las CDR pueden ser como sigue (es decir, la sustitución con aminoácidos con similares químicas de cadena lateral) : K se sustituye por R; R se sustituye por K; A se sustituye por S o T; S se sustituye por A o T; T se sustituye por A o S; I se sustituye por L o V; L se sustituye por I o V; V se sustituye por I o L; F se sustituye por Y; — Y se sustituye por F - N se sustituye por D - D se sustituye por N - Q se sustituye por E - E se sustituye por Q - G se sustituye por A - M se sustituye por L H, C, y P se mantienen constantes.
Además, y también sin limitación, las ! reglas (seguidas parcial o totalmente) para las sustituciones de residuos de aminoácidos en las CDR pueden ser alternativamente como sigue para las sustituciones en las posiciones 27 a 35 y las posiciones 50 a 58 (utilizando el sistema de numeración Kabat), en donde para las posiciona 27 a 35: El residuo del aminoácido original en la posición 27 (numeración Kabat utilizada) se sustituye por F; G; R; S; 2 fuera de F, G, R, S; 3 fuera de F, G, R, S; o todos los mismos, de preferencia todos los mismos; el residuo del aminoácido original en la posición 28 (numeración Kabat utilizada) se sustituye por A; I; S; T; 2 fuera de A, I, S, T; 3 fuera de A, I, S, T; o todos los mismos, de preferencia todos los mismos; el residuo del aminoácido original en la posición 29 (numeración Kabat utilizada) se sustituye por F; G; L; S; 2 fuera de F, G, L, S; 3 fuera de F, G, L, S; o todos los mismos, de preferencia todos los mismos; el residuo del aminoácido original en la posición 30 (numeración Kabat utilizada) se sustituye por D; G; S; T; 2 fuera de D, G, S, T; 3 fuera de D, G, S, T; o todos los mismos, de preferencia todos los mismos; el residuo del aminoácido original en la posición 31 (numeración Kabat utilizada) se sustituye por D; I; N; S; T; 2 fuera de D, I, N, S, T; 3 fuera de D, I, N, S, T; o todos los mismos, de preferencia todos los mismos; el residuo del aminoácido original en la posición 32 (numeración Kabat utilizada) se sustituye por D; N;Y; 2 fuera de D, n, Y; o todos los mismos, de preferencia todos los mismos; el residuo del aminoácido original 1 en la posición 33 (numeración Kabat utilizada) se sustituye por A; G; T; V; 2 fuera de A, G, T, V; 3 fuera de A, G, T, V; o todos los mismos, de preferencia todos los mismos; el residuo del aminoácido original en la posición 34 (numeración Kabat utilizada) se sustituye por I; ; o todos los mismos, de preferencia todos los mismos; el residuo del aminoácido original en la posición 35 (numeración Kabat utilizada) se sustituye por A; G; S; 2 fuera de A, G, S; o todos los mismos, de preferencia todos los mismos; y en donde para la posición 50 hasta 58 y la secuencia de aminoácidos original no tiene una secuencia de aminoácidos en la posición 52a (numeración Kabat utilizada) , el residuo del aminoácido original; en la posición 50 (numeración Kabat utilizada) se sustituye por A; C; G; S; T; 2 fuera de A, C, G, S, T; 3 fuera de A, C, G, S, T; 4 fuera de A, C, G, S, T; o todos los mismos, de preferencia todos los mismos; el residuo del aminoácido original en la posición 51 (numeración Kabat utilizada) se sustituye ;por I; el residuo del aminoácido original en la posición 52 (numeración Kabat utilizada) se sustituye por N; R; S; T; 2 fuera de N, R, S, T; 3 fuera de N, R, S, T; o todos los mismos, de preferencia todos los mismos; el residuo del aminoácido original en la posición 52a (numeración Kabat utilizada) se sustituye por R; S; T; W; 2 fuera de R, S, T, W; 3 fuera de R, S, T, W; o todos los mismos, de preferencia todos los mismos; el residuo del aminoácido original en la posición 53 (numeración Kabat utilizada) se sustituye por D; G; N; S; T; 2 fuera de D, G, N, S, T; 3 fuera de D, G, N, S, T; 4 fuera de D, G, N, S, T; o todos los mismos, de preferencia todos los mismos; el residuo del aminoácido original en la posición 54 (numeración Kabat utilizada) se sustituye' por D; i G; o todos los mismos, de preferencia todos los mismos; el residuo del aminoácido original , en la posición 55 (numeración Kabat utilizada) se sustituye por D; G; S; 2 fuera de D, G, S; o todos los mismos, de preferencia todos los mismos; el residuo del aminoácido original en la posición 56 (numeración Kabat utilizada) se sustituye por I; N; R; S; T; 2 fuera de I, N, R, S, T; 3 fuera de I, N, R, S, T; 4 fuera de I, N, R, S, T; o todos los mismos, de preferencia todos los mismos; el residuo del aminoácido original en la posición 57 (numeración Kabat utilizada) se sustituye por T; el residuo del aminoácido original en la posición 58 (numeración Kabat utilizada) se sustituyé por D; H; N; S; Y; 2 fuera de D, H, N, S, Y; 3 fuera de D, H, N, S, Y; 4 fuera de D, H, N, S, Y; o todos los mismos, de preferencia todos los mismos; después de lo cual una o más de las sustituciones potencialmente útiles (o combinaciones de las mismas) : de esta forma determinadas se pueden introducir en la secuencia CDR (de cualquier forma conocida per se, como se describe adicionalmente en la presente) y las secuencias de aminoácidos resultantes se pueden probar para afinidad para IL-6R, y/o para otras propiedades deseadas tales como la capacidad de (parcial o de preferencia totalmente) la interacción IL-6/IL-6R y/o inhibir la señalización a través de, IL-6, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R. De esta forma, por medio de un grado limitado de ensayo y error, sé pueden determinar por el experto con base en la exposición en la presente otras sustituciones adecuadas en la CDR (o combinaciones adecuadas de las mismas) .
La secuencia de aminoácidos de la invención puede ser cualquier secuencia de aminoácidos que comprenda al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos, en el cual el alargamiento de residuos de aminoácidos tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de al menos una de las secuencias CDR definidas en la presenté. Esta secuencia de aminoácidos puede o no comprender un pliegue de inmunoglobulina . Por ejemplo, y sin limitación, esta secuencia de aminoácidos puede ser un fragmento adecuado de una secuencias de inmunoglobulina que comprende al menos una de estas secuencias CDR (como se definió anteriormente), aunque no sea tan largo como para formar un pliegue de inmunoglobulina (completo) (por ejemplo si hace referencia a los "fragmentos acelerados" descritos en la WO 03/050531) .
Alternativamente, esta secuencia de aminoácidos puede ser un "armazón proteínico" adecuado que comprende al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos que corresponde a las secuencias CDR según se define en la presente pkra las secuencias de aminoácidos de la invención (es decir como parte de su sitio de unión con antigenos) . Los armazones adecuados para presentar las secuencias de aminoácidos serán evidentes para el experto, y por ejemplo comprenden, sin limitación, armazones de unión con base o derivados a partir de inmunoglobulinas (es decir, distintos de las secuencias de inmunoglobulina ya descritas en la presente) , los armazones proteinicos derivados de los dominios de la proteína A (tales como Affibodies™) , tendamistat, fibronectina, lipocalina, CTLA-4, receptores de linfocitos T, repeticiones diseñadas de anquirina, avímeros y dominios PDZ (Binz et al., 2005, Nat. Biotech., 23: 1257), y porciones de unión con base en ADN o ARN incluyendo de manera enunciativa aptámeros de ADN o ARN (Ulrich et al., 2006, Comb. Chem. High Throughput Screen 9(8): 619-32) .
Nuevamente, cualquier secuencia de aminoácidos de la invención que comprende una o más de las secuencias CDR como se define en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención (es decir "CDR de la invención") de preferencia es tal que se puede unir específicamente (como se define en la presente) a IL-6R, y más particularmente de tal forma que se pueda unir a IL-6R con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (real o aparente), un valor KA (real o aparente), un índice k0n y/o un índice koff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) , que es como se define en la presente. Cualquier secuencia de aminoácidos de la invención que comprende uno o más de las secuencias CDR como se define en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención de preferencia es tal que tiene una potencia de base celular y una potencia en plasma como se define en la presente.
Además, también será evidente para el experto que puede ser posible "injertar" una o más de las CDR definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención (es decir "las CDR de la invención") ¡u otro "armazones", incluyendo de manera enunciativa armazones humanos o sobre-armazones inmunoglobulina . Los armazones y técnicas adecuadas para este injerto de CDR serán evidentes para el experto y son bien conocidas en la técnica, véase, por ejemplo, la US 7,180,370, la WO 01/27160, la EP 0605522, la EP 0460167, la US 7,054,297, Nicaise et al. (2004, Protein Science, 13: 1882-1891), Ewert et al. (2004, Methods, 34(2): 184-199), Kettleborough et al. (1991, Protein Eng. 4(7): 773-783), O'Brien and Jones (2003, Methods Mol. Biol.207: 81-100),Skerra (2000, J. Mol. Recognit. 13: 167-187), y Saerens et al. (2005, J. Mol. Biol. 352(3): 597-607), y las referencias adicionales citadas en la presente. Por ejemplo, las técnicas conocidas per se para injertar las CDR de ratón o rata sobre armazones humanos y los armazones se' pueden utilizar de una forma análoga para proporcionar proteínas quiméricas que comprenden una o más de las secuencias CDR definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención y una o más regiones de armazón humanas o secuencias .
De esta forma, en un aspecto específico, la invención también abarca secuencias de aminoácidos quiméricos que comprenden al menos una secuencia CDR seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR1 de la invención, las secuencias CDR2 de la invención y las secuencias CDR3 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) . De preferencia,: estas secuencias de aminoácidos quiméricos comprenden al menos una secuencias CDR seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR1 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) , y también al menos una secuencias CDR seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR2 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) o al menos una secuencias de CDR seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de CDR1 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) y al menos una secuencias de CDR seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de CDR3 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) ; o un polipéptido quimérico puede comprende al menos una secuencias CDR seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR2 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) y también al menos una secuencias CDR seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR3 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) . Por ejemplo, este polipéptido quimérico puede comprender una secuencias CDR seleccionada del grupo que consiste! de las secuencias CDR3 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) , una secuencias CDR seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR1 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) y una secuencias CDR seleccionada del grupo que consiste, de las secuencias CDR2 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) . Las combinaciones de la CDR que se mencionan en la presente se preferirán para las secuencias de aminoácidos de la invención (véase la Tabla A-l) que por lo general también se prefieren estos polipéptidos quiméricos.
En los polipéptidos quiméricos, la CDR se pueden enlazar a secuencias de aminoácidos adicionales, las secuencias y/o se pueden enlazar entre si via secuencias de aminoácidos en las cuales las secuencias de aminoácidos de preferencia son secuencias de armazón o son secuencias de aminoácidos que actúan como secuencias de armazón, o con untamente forman un armazón para presentar las CDR.
De acuerdo con una modalidad no limitante, las secuencias de aminoácidos quiméricos comprenden al menos dos secuencias CDR (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) enlazadas via al menos una secuencias de armazón, en la cual de preferencia al menos una de las dos secuencias CDR es una secuencia CDR3, con · la otra secuencias CDR que será una secuencia CDR1 o CDR2. De' acuerdo con una modalidad preferida aunque no limitante, las secuencias de aminoácidos quiméricos comprenden al menos tres secuencias CDR de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) enlazadas a al menos dos secuencias de armazón en las cuales de preferencia al menos una de las tres secuencias CDR es una secuencias CDR3, con las otras dos secuencias CDR que serán las secuencias CDR1 o CDR2, y de preferencia que será una secuencias CDR1 y una secuencias CDR2. De acuerdo con una modalidad preferida específicamente, aunque no limitante, las secuencias de aminoácidos quiméricos tienen la estructura FR1 ' - CDR1 - FR2 ' - CDR2 - FR3' - CDR3 - FR4 ' , en ,1a cual CDR1, CDR2 y CDR3 son como se define en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención, y FR1' , FR2 ' , FR3' y FR4 ' son secuencias de armazón. FR1' , FR2 ' , FR3 ' y ' FR ' en particular pueden ser las secuencias de armazón 1, armazón 2, armazón 3 y armazón 4, respectivamente, de un anticuerpo humano (tal como las secuencias VH3) y/o las partes o fragmentos de estas secuencias de armazón. También es posible utilizar partes o fragmentos de un polipéptido quimérico con la estructura FR1' - CDR1 - FR2' - CDR2 - FR3' - CDR31 - FR4'. De preferencia, estas partes o fragmentos son tales que cumplen con los criterios establecidos para las secuencias de aminoácidos de la invención.
En esta secuencia de aminoácidos de la invención, las secuencias de armazón pueden ser cualesquiera secuencias de armazón adecuadas, y los ejemplos de las secuencias de armazón adecuadas serán evidentes para el experto, por ejemplo con base en los manuales estándar y la exposición adicional y la técnica anterior mencionada en la presente.
Las secuencias de armazón de preferencia son (una combinación adecuada de) secuencias de armazón de inmunoglobulina o secuencias de armazón que se hayan derivado de las secuencias de armazón de inmunoglobulina (por ejemplo, mediante la optimización de secuencias tal como la humanización o camelización) . Por ejemplo, las secuencias de armazón pueden ser secuencias de armazón derivadas de un dominio de variable de cadena ligera (por ejemplo una secuencia VL) y/o un dominio de variable de cadena pesada (por ejemplo una secuencia VH) . En un aspecto particularmente preferido, las secuencias de armazón son ya sea secuencias de armazón que se hayan derivado de una secuencia VHH (en la cual las secuencias de armazón opcionalmente se puedé haber humanizado parcial o totalmente) o son secuencias VH convencionales que se hayan camelizado (como se define en la presente ) .
Las secuencias de armazón de preferencia pueden ser tales que la secuencia de aminoácidos de la invención es un anticuerpo dominio (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para utilizarse como un anticuerpo dominio); es un anticuerpo de dominio individual (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para utilizarse como un anticuerpo dominio individual); es un "dAb" (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para utilizarse como un dAb) ; o es un Nanobody (incluyendo de manera enunciativa la secuencias VHH) · Nuevamente, las secuencias de ¡armazón adecuadas serán evidentes para el experto, por ejemplo con base en los manuales estándar y la exposición adiciorlal y la técnica anterior mencionadas en la presente.
En particular, las secuencias de armazón presentes en las secuencias de aminoácidos de la invención pueden contener uno o más residuos Hallmark (como se define en la WO 08/020079 (Tablas A-3 a A-8)) , de tal forma que la secuencia de aminoácidos de la invención sea un Nanobody. Algunos ejemplos preferidos, aunque no limitantes de, (combinaciones adecuadas de) estas secuencias de armazón serán evidentes a partir de la exposición adicional en la presente (véase, por ejemplo la Tabla A-l). En general, los Nanobodies (en particular las secuencias VHH y las secuencias 1 de VHH (parcialmente humanizadas) en particular se pueden caracterizar por la presencia de uno o más "residuos Hallmark" en una o más secuencias de armazón (como por ejemplo se describen adicionalmente en la WO 08/020079, página 61, linea 24 hasta la página 98, linea 3) .
En un aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos de la invención comprende un pliegue de inmunoglobulina que es capaz, bajo condiciones adecuadas de formar un pliegue de inmunoglobulina . De preferencia, la secuencia de aminoácidos de la invención es una secuencias de inmunoglobulina; e incluso de mayor preferencia la secuencia de aminoácidos de la invención tiene la estructura de: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 Por consiguiente, la presente invención también se relaciona con una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente de 4 regiones de armazón ( FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente) en las cuales: CDR1 se selecciona del grupo que consiste de: a) Las SEC ID NOs : 80-82; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 80-82, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos comprenda el alargamiento de residuos de aminoácidos que se une a IL-6R con la; misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos y la diferencia de aminoácido 2 ó 1, la afinidad según se mide por resonancia de plasmones superficiales; y/o CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: c) Las SEC ID NOs: 84-91; o d) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácido con una SEC ID NOs: 84-91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, con aproximadamente la misma u/o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales; y/o CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: e) Las SEC ID NOs: 93-95; o f) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-95, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales.
En esta modalidad, las secuencias de aminoácidos comprenden al menos una secuencias CDR seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de CDR1 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) , las secuencias CDR2 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) , o las secuencias CDR3 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) . De preferencia, las secuencias de aminoácidos comprenden al menos dos secuencias CDR seleccionadas del grupo que consiste de las secuencias CDR1 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención), las secuencias CDR2 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) , o las secuencias CDR3 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención), tal como al menos una de las secuencias CDR seleccionada del grupo que consiste , de las secuencias CDR1 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) y al menos una secuencias de CDR seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR2 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) ; o al menos una secuencias CDR seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR1 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) y al menos una secuencias CDR seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR3 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) ; o al menos una secuencias CDR seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR2 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) y al menos una secuencias CDR seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR3 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) ; o al menos una secuencia de aminoácidos puede comprende tres secuencias de CDR seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR1 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) , las secuencias CDR2 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) y las secuencias CDR3 de la invención (definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención) . La presente invención también se relaciona con una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente de 4 regiones de armazón (FR1 a FR , respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 á CDR3, respectivamente) en las cuales: CDR1 se selecciona del grupo que consiste de: a) Las SEC ID NOs : 80-82; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 80-82, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos comprenda el alargamiento de residuos de aminoácidos que se une a IL-6R con lá misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos y la diferencia de aminoácido 2 ó 1, la afinidad según se mide por resonancia de plasmones superficiales; y CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: c) Las SEC ID NOs: 84-91; o d) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tengan más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácido con una SEC ID NOs: 84-91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, con aproximadamente la misma u/o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales; y CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: e) Las SEC ID NOs : 93-95; o f) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferéncia de i aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-95, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales .
Las combinaciones preferidas de las secuencias CDR para las secuencias de aminoácidos de la invención se muestran en la Tabla A-l.
Las secuencias de aminoácidos de la invención esencialmente pueden consistir de una secuencia con dominio de variable con cadena pesada que se deriva de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional o esencialmente puede consistir de una secuencia con dominio variable de 1 cadena pesada que se deriva de un anticuerpo de cadena pesada. Las secuencias de aminoácidos de la invención esencialmente pueden consistir en un anticuerpo dominio (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para utilizarse como un anticuerpo dominio) , o un anticuerpo dominio individual (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para utilizarse como un anticuerpo dominio individual) , de un "dAb" (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para utilizarse como un dAb) o de un Nanobody.
Para una descripción general de los anticuerpos de dominio (individual) , se hace referencia a la técnica anterior citada anteriormente, asi como también a; la EP 0368684. Para el término "dAb", se hace referencia por ejemplo a Ward et al. (1989, Nature 341: 544-6), to Holt et al. (2003, Trends Biotechnol. 21: 484-490); asi como también al ejemplo de la WO 06/030220, la WO 06/003388 y otras solicitudes de patentes publicadas de Domantis Ltd. También se debe entender que, aunque se prefieren en menor medida en el contexto de la presente invención debido a que no son de origen mamífero, los anticuerpos de dominio individual o los dominio de variable individual se pueden derivar de ciertas especies de tiburón (por ejemplo, los denominados "dominios IgNAR", véase por ejemplo la WO 05/18629) .
En particular, la secuencia de aminoácidos; de la invención consiste esencialmente puede ser un Nanobody® (como se define en la presente) o un fragmento adecuado del: mismo. [Nota: Nanobody®, Nanobodies® y Nanoclone® son marcas registradas de Ablynx N.V.] Estos Nanobodies dirigidos contra IL-6R también se denominaran en la presente como Nanobodies de la invención." Para una descripción general de los Nanobodies, se hace referencia a la descripción adicional más adelante, asi como también a la técnica anterior citada en la presente, tal como por ejemplo la descrita en la WO 08/020079 (página 16) .
En un aspecto especifico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 80; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tenga más de 2, de preferencia no, más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 80, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
En otro aspecto especifico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos seleccionados de las SEC ID NOs: 84, 89 ó 91; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 84, 89 ó 91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia para plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto especifico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 84; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no. más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 84, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6 con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos escogido de las SEC ID NOs: 93-94; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID ÑOs : 93-94, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 93; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 93, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o una mayor afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 80; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no , más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 80; y al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos escogido de las SEC ID NOs : 84, 89 ó 91; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no] más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 84, 89 ó 91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 80; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 80; y al menos SEC ID NO: 84; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 84, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia con i plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 80; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 80'; y al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos escogido de SEC ID NOs: 93-94; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no ; más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-94, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 1 ó 2 aminoácido, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 80; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 80; y al menos la SEC ID NO: 93; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 93, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos seleccionados de las SEC ID NOs : 84, 89, ó 91; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2 , de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 84, 89, o 91; y al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos seleccionados de las SEC ID NOs: 93-94; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene . más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-94, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos seleccionados de las SEC ID NOs : 84, 89, o 91; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 84, 89, o 91; y al menos SEC ID NO: 93; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 93, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 84; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 84; y al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos escogido de SEC ID NOs: 93-94; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no: más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-94, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 84; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 84; y al menos SEC ID NO: 93; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 93, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R; con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 80 y la SEC ID NO: 84.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 80 y la SEC ID NO: 93.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 84 y la SEC ID NO: 93.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 80; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 80; y al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos escogido de las SEC ID NOs: 84, 89, ó 91; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia; no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 84, 89, ó 91; y al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos escogido de SEC ID NOs: 93-94; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs : 93-94, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 80; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 80; y al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos escogido de las SEC ID NOs: 84, 89, ó 91; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 84, 89, ó 91; y al menos la SEC ID NO: 93; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 93, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 80; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de i una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 80; y al menos SEC ID NO: 84; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 84; y al menos un alargamiento de residuos de aminoácidos escogido de SEC ID NOs: 93-94; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-94, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido sé una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide medíante resonancia con plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 80; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 8Q; y al menos SEC ID NO: 84; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 84; y al menos SEC ID NO: 93; o un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 93, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácido se una a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Todavía en otro aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos la SEC ID NO: 80, la SEC ID NO: 84 y la SEC ID NO: 93.
En la Tabla A-l también se muestran las combinaciones preferidas de las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 definidas en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención.
En un aspecto preferido, las secuencias de aminoácidos de la invención se seleccionan del grupo que consiste de: a) Las SEC ID NOs : 60-69; b) una secuencia de aminoácidos que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus secuencias de CDR con una de ¡las SEC ID NOs: 60-69, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia del aminoácido en uno, dos o todas sus secuencias CDR se unan a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NOs: 60-69, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; y c) una secuencias que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 60-69, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 60-69 unidas a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NOs: 60-69, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
En otro el aspecto preferido, se seleccionan las secuencias de aminoácidos de la invención del grupo que consiste de: a) Las SEC ID NOs: 65-69; b) una secuencia de aminoácidos que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus secuencias de CDR con una de las SEC ID NOs: 65-69, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia del aminoácido en uno, dos o todas sus secuencias CDR se unan a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NOs: 65-69, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; y c) una secuencias que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 65-69, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs1: 65-69 unidas a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NOs: 65-69, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Todavía en otro el aspecto prefirió, se seleccionan las secuencias de aminoácidos de la invención del grupo que consiste de: a) Las SEC ID NOs: 66; b) una secuencia de aminoácidos que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus secuencias de CDR con la SEC; ID NO: 66, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con' no más de 2, de preferencia no más de una diferencia del aminoácido en uno, dos o todas sus secuencias CDR se unan a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la unión de una de la SEC ID NO: 66, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; y c) una secuencias que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 66, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de 1 aminoácido de diferencia unida a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la unión1 de una de la SEC ID NO: 66, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Cuando se comparan dos alargamientos de residuos de aminoácidos (o dos secuencias CDR) , el término "diferencia de aminoácido en una, dos o todas sus CDR" se refiere a una inserción, supresión o sustitución de un residuo de aminoácidos individual en una posición de un alargamiento de residuos de aminoácidos (o la secuencia CDR) comprendidos en la secuencia de aminoácidos de la invención especificados en b) , en comparación con el alargamiento de residuos de aminoácidos (o secuencias de CDR) comprendidos en la secuencia de aminoácidos de la invención especificados en a) ; se debe entender que los alargamientos de residuos de aminoácidos (o las secuencias CDR) pueden contener una o un máximo de dos de estas diferencias de aminoácidos.
Por "diferencia de aminoácidos en una, dos ó todas sus CDR" se debe entender que la secuencia de aminoácidos de la invención puede tener no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDRl y/o no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR2, y/o no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR3 en comparación con CDRl, CDR2 y/o CDR3 en una de las secuencias de aminoácidos de a) (es decir una de las SEC ID NOs : 60-69); tal como no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDRl en comparación con CDRl en una de las secuencias de aminoácidos de a) (es decir una de las SEC ID NOs: 60^-69); o no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR2 en comparación con CDR2 en una de las secuencias de aminoácidos de a)' (es decir una de las SEC ID NOs: 60-69); o no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR3 en comparación con CDR3 en una de las secuencias de aminoácidos de a) (es decir una de las SEC ID NOs: 60-69); o no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDRl en comparación con CDRl en una de las secuencias de aminoácidos de a) (es decir en una de las SEC ID NOs: 60-69) y no: más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR2 en comparación con CDR2 en una de las secuencias de aminoácidos de a) (es decir en una de las SEC ID NOs: 60-69); o no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDRl en comparación con CDRl en una de las secuencias de aminoácidos de a) (es decir en una de las SEC ID NOs: 60-69) y no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR3 en comparación con CDR3 en una de las SEC ID NOs: 60-69; o no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR2 en comparación con CDR2 en una de las secuencias de aminoácidos de a) (es decir en una de las SEC ID NOs: 60-69) y no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR3 en comparación con CDR3 en una de las secuencias de aminoácidos de a) (es decir en una de las SEC ID NOs: 60-69); o no más de 2, de preferencia no más; de una diferencia de aminoácidos en su CDRl en comparación con CDRl en una de las secuencias de aminoácidos de a) (es décir en una de las SEC ID NOs: 60-69), no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR2 en comparación con CDR2 en una de las secuencias de aminoácidos de a) (es decir en una de las SEC ID NOs: 60-69) y no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR3 en comparación con CDR3 en una de las secuencias de aminoácidos de a) (es decir en una de las SEC ID NOs: 60-69) .
"La diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR" puede ser cualquiera de una o un máximo de dos sustituciones, supresiones o inserciones en una o más, de las CDR, o cualquier combinación de las mismas, que ya sea mejore las propiedades de la secuencia de aminoácidos de la invención o que al menos no reste demasiadas propiedades deseadas o el equilibrio o combinación de las propiedades deseadas de la secuencia de aminoácidos de la invención. Con respecto a esto, la secuencia de aminoácidos resultante de la invención debe al menos unirse a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende uno 1 o más alargamientos de residuos de aminoácidos sin una o máximo dos sustituciones, supresiones o inserciones, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales. Las secuencias de aminoácidos resultantes de preferencia son tales que se pueden unir al epitope especifico sobre el receptor IL-6, con afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (real o aparente) , un Valor KA (real o aparente) , un índice kon y/o un índice koff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) que es como se define en la presente. Las secuencias de aminoácidos resultantes de preferencia también tienen una potencia de base celular y una potencia en plasma según se define en la presente.
En un aspecto de la invención, "la diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR" es una sustitución de aminoácidos. La sustitución de aminoácidos puede ser una o un máximo de dos sustituciones en una o más de las CDR que ya sea mejoren las propiedades de la secuencia de aminoácidos de la invención o que al menos no reste demasiadas propiedades deseadas del equilibrio o combinación de las propiedades deseadas de la secuencia de aminoácidos de la invención. Con respecto a esto, la secuencia de aminoácidos resultante de la invención debe al menos unirse a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende uno o más alargamientos de residuos de aminoácidos sin una o un máximo de dos sustituciones, la afinidad según se mide mediante resonancia con plasmones superficiales. La secuencia de aminoácidos resultante es de preferencia tal que se. pueden unir al epítope específico sobre el receptor IL-ß, con la afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (real o aparente), un valor KA (real o aparente), un! Indice k0n y/o un índice k0ff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) que es según se define en la presente. Las secuencias de aminoácidos resultantes de preferencia también tienen una potencia de base celular y una potencia en plasma según se define en la presente .
Como se indicó anteriormente, la sustitución de aminoácidos en las CDR puede ser cualquier sustitución posible tal como una "sustitución conservadora" (como se define en la presente) , se puede conducir mediante ciertas reglas (como se define en la presente) , y/o puede : inducir propiedades mejoradas a las secuencias de aminoácidos resultantes. , La invención también se relaciona con una secuencia de aminoácidos que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de (la secuencias total de) las SEC ID NOs : 60-69.
Cuando se comparan dos secuencias de aminoácidos, el término "diferencia de aminoácidos" se refiere a una inserción, supresión o sustitución de un residuo de aminoácidos individual en una posición de la ; primera secuencia de aminoácidos, en comparación con la segunda secuencia de aminoácidos; se debe entender que dos secuencias de aminoácidos pueden contener una o un máximo de 1 dos de estas diferencias de aminoácidos.
"La diferencia de aminoácidos" puede ser cualquiera de una o un máximo de dos sustituciones, supresiones o inserciones en la secuencia de aminoácidos, es decir en una o más de las regiones de armazón o en una o más de las1 CDR, o cualquier combinación de las mismas, que ya sea mejoren las propiedades de la secuencia de aminoácidos de la invención o que al menos no reste demasiado de las propiedades deseadas o el equilibrio o combinación de las propiedades deseadas de la secuencia de aminoácidos de la invención. Con respecto a esto, la secuencia de aminoácidos resultante de la invención debe al menos unirse a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos sin una o máximo dos sustituciones, supresiones o inserciones, la afinidad como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales. Las secuencias de aminoácidos resultantes de preferencia son tales que se pueden : unir al epitope especifico sobre el receptor IL-6, con la afinidad i (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD; (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , un índice kon y/o un índice k0ff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) que es como se define en la presente. Las secuencias de aminoácidos resultantes de preferencia también tienen una potencia de base celular y una potencia en plasma como se define en la presente. El experto en general será capaz de determinar y seleccionar las sustituciones adecuadas, supresiones o inserciones, ó las combinaciones adecuadas de la misma, y determinar su influencia sobre las propiedades de la secuencia de aminoácidos obtenidas.
En un aspecto de la invención, la "diferencia de aminoácidos" es una sustitución de aminoácidos. La sustitución de aminoácidos puede ser una o un máximo, de dos sustituciones en una o más de las regiones de armazón o en i una o más de las CDR, o cualquier combinación de los mismos, que ya sea mejoren las propiedades de la secuencia de aminoácidos de la invención o que al menos no reste demasiadas propiedades deseadas o del equilibrio o combinación de las propiedades deseadas de la secuencia de aminoácidos de la invención. Con respecto a esto, la secuencia de aminoácidos resultante de la invención debe al menos unirse a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la secuencia de aminoácidos sin una o un máximo de dos sustituciones, la afinidad como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales. Las secuencias de aminoácidos resultantes de preferencia son tales que se pueden unir al epitope especifico sobre el receptor IL-6, con la afinidad ; (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , un índice kon y/o un índice k0ff, o alternativamente como un valor IC50 como se describe adicionalmente en la presente) que es como se define en la presente. Las secuencias de aminoácidos resultantes de preferencia también tienen una potencia de base celular y una potencia en plasma como se define en la presente. El experto en general será capaz de determinar y seleccionar las sustituciones adecuadas, y determinar su influencia sobre las propiedades de las secuencias de aminoácidos así obtenidas.
Como se indicó anteriormente, las sustituciones, inserciones o supresiones pueden ser en una o más de las regiones de armazón y/o en una o más de las CDR. Como se analizó anteriormente, la sustitución de aminoácidos en una o más de las CDR puede ser cualquier sustitución tal como una "sustitución conservadora" (como se define en la presente), y se puede conducir mediante ciertas reglas (como se define en la presente), y/o puede inducir propiedades mejoradas a las secuencias de aminoácidos resultantes.
Cuando se realizan estas sustituciones, inserciones o supresiones en una o más de las regiones de armazón, las mismas se pueden realizar en uno o más de residuos Hallmark (como por ejemplo se define en la WO 08/020079; Tablas A-3 a A-8) y/o en una o más de las otras posiciones en los residuos de armazón, aunque las sustituciones, inserciones o supresiones a los residuos Hallmark en general se prefieren en menos medida (a menos que halla sustituciones de humanización adecuada como se describe en la presente) . Por medio de ejemplos no limitantes, una sustitución por :ejemplo puede ser una sustitución conservadora (como se describe en la presente) y/o un residuo de aminoácidos se: puede reemplazar por otro residuo de aminoácidos que se presente en la naturaleza en la misma posición en otro dominio VHH: (véase la WO 08/020079, Tablas A-5 a A-8), aunque la invención en general no se limita a los mismos.
Las sustituciones, inserciones o supresiones hechas (de preferencia) en una o más de las regiones de armazón pueden ser sustituciones para la optimización de secuencias de las regiones de armazón tales como por ejemplo una sustitución humanizante. Algunas sustituciones humanizantes preferidas, aunque no limitantes, (y combinaciones adecuadas de las mismas) se harán evidentes para el experto con base en la exposición en la presente. Las sustituciones humanizantes potencialmente útiles se pueden deducir al comparar la secuencias de las regiones de armazón de una de la secuencia de aminoácidos de la invención definida en a) con la secuencias de armazón correspondiente de una o más secuencias VH humanas relacionadas estrechamente, después de lo cual una o más de las sustituciones humanizantes potencialmente útiles (o combinaciones de las mismas) asi determinadas se, pueden introducir en la secuencia de aminoácidos de la invención definida en a) (de cualquier forma conocida per se, como se describe adicionalmente en la presente) y la secuencia de aminoácidos humanizada resultante se puede probar para afinidad para IL-6R, para estabilidad, para facilidad y el nivel de expresión, y/o para otras propiedades deseadas definidas en la presente. De esta forma, por medio de un grado limitado de ensayo y error, se pueden determinar por el experto con base en la exposición en la presente otras sustituciones humanizantes adecuadas (o combinaciones adecuadas de las mismas) .
Dependiendo del organismo hospedero utilizado para expresar la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o el polipéptido de la invención, estas supresiones y/o sustituciones también se pueden diseñar de tal forma que se retiren uno o más sitios para la modificacióh pos-traduccional (tal como uno o más sitios de glucosilación ) según quedará dentro de la capacidad del experto: én la técnica. Alternativamente, las sustituciones p las inserciones se pueden diseñar para introducir uno o más sitios de unión de grupos funcionales (como se describe en la presente) , por ejemplo para permitir la pegilación sitio-especifica (nuevamente como se describe en la presente1) .
Como se puede observar a partir de los datos en la entropía de VHH y la variabilidad de VHH proporcionadas, en las Tablas AN-5-A-8 de la WO 08/020079, algunos residuos de aminoácidos en las regiones de armazón están más conservadas que otras. En general, aunque la invención en su más amplio sentido no se limita a las mismas, de preferencia se realizan sustituciones, supresiones o inserciones en las posiciones que estén menos conservadas. También, en general, se prefieren sustituciones de aminoácidos sobre las supresiones o inserciones de aminoácidos. : Las secuencias de aminoácidos resultantes, de la invención o el Nanobodies de la invención de preferencia se deben unir a IL-6R con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente), un índice kon y/o un índice :koff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) de preferencia de tal forma que se: Unen a hIL-6R con una constante de disóciación (KD) de 1 nM hasta 1 p moles/litro o menos, de preferencia 500 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, de mayor preferencia 100 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, o incluso de mayor preferencia aproximadamente 50 pM hasta 1 pM o menos; y/o de tal forma que se: Unen a cyno IL-6R con una constante de disociación (KD) de 1 nM hasta 1 pM moles/litro o menos, de preferencia 500 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, de mayor preferencia 100 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, o incluso de mayor preferencia aproximadamente 50 pM hasta 1 pM o menos ; y/o de tal forma que se: Unen a hIL-6R con un índice kon entre 104 M"1s"1 hasta aproximadamente 107 M~1s"1, de preferencia entre ÍO5 M_1s~ 1 y 107 M^s-1, de mayor preferencia aproximadamente 106 M~1s"1 o más ; y/o de tal forma que se: Unen a cyno IL-6R con un índice kon de entre 104 ~1s~1 a aproximadamente 107 "1s"1, de preferencia entre 105 M"1s"1 y 107 M"1s"1, de mayor preferencia aproximadamenté 106 M" """s"1 o más; y/o de tal forma que se: Unen a hIL-6R con un índice koff entre 10"3 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10"6 s"1 (proporcionando un complejo irreversible cercano con un ti 2 de múltiples días), de preferencia entre 10"4 s"1 y 10"6 s"1, de mayor preferencia entre 10~5 s-1 y 10~6 s"1, tal como aproximadamente 10~5 s"1 o menos; y/o de tal forma que se: Unen a cyno IL-6R con un índice k0ff entre 10~3 s"1 (ti/2=0.69 s) y 1CT6 s-1 (proporcionando un complejo irreversible cercano con ti 2 de múltiples días) , de preferencia entre 10"4 s"1 y 10~6 s-1, de mayor preferencia i entre 1CT5 s"1 y 10"6 s"1, tal como aproximadamente 10"5 s"1 o menos .
Algunos valores IC50 preferidos para la unión de las secuencias de aminoácidos de la invención a IL-6R se harán evidentes a partir de la descripción adicional y los ejemplos en la presente.
La potencia y/o eficacia de las secuencias de aminoácidos y Nanobodies de la invención, y de las composiciones que comprenden los mismos, se pueden probar utilizando cualquier análisis in vitro adecuado, análisis de base celular, análisis in vivo y/o modelo animal conocido per se, o cualquier combinación de los mismos, dependiendo de la enfermedad o trastorno específicos implicados. Los análisis adecuados y modelos animales se harán evidentes para el experto, y por ejemplo incluyen análisis de proliferación utilizando líneas celulares dependientes de IL-6 que incluyen TF-1, XG1 y 7TD1, modelo de artritis inducida por colágeno, modelo de trasplante de tejido sinovial en ratones SCID, modelos de xenoinjertos de diversos cánceres humanos, incluyendo linfoma, mieloma, cáncer de próstata y carcinoma de células renales, modelos IBD incluyendo TNBS, modelos de primates (tales como por ejemplo descritos en Shinkura et al., 1998, Anticancer Research 18: 1217-1222), modelos de primates no humanos de enfermedad artrítica (como se describe por ejemplo, en Vierboom et al., 2008, Drug Discov.> Today: Dis Model doi:10.1016/j. ddmod. 2008.06.003) así como :también los análisis y modelos animales utilizados en la parte experimental más adelante y en la técnica anterior citada en la presente Peake et al., 2006, Rheumatology 45: ;1485-9; Wahid et al., 2000, Clin. Exp. Immunol., 122: 133-142; Matsuno et al., 1998, Arthritis and rheumatism 41: 2014-2021; O 08/020079) .
Por ejemplo, en el análisis TF-1 como se describe por Kitamura et al. (1989, J. Cell Physiol. 140: 323), las secuencias de aminoácidos de la invención o los Nanobodies de la invención pueden tener valores IC50 (a 100 IU/mL IL-6) entre 10 nM y 50 pM, de preferencia entre 5 nM y 50 pM, de mayor preferencia entre 1 nM y 50 pM o menos, tal como aproximadamente 750 ó 500 pM o menos. En este análisis TF-1 las secuencias de aminoácidos de la invención o los Nanobodies de la invención pueden tener valores IC50 (a 5000 IU/mL IL-6) entre 50 nM y 1 nM, de preferencia entre 25 nM y 1 nM, de mayor preferencia entre 10 nM y 1 nM o menos, tal como aproximadamente 8 nM o menos. En este análisis TF-1, las secuencias de aminoácidos de la invención o los Nanobodies de la invención pueden tener valores IC50 que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación al valor IC50 obtenido para el IgG de referencia como se define por las SEC ID NOs: 1 y 2 o el Fab de referencia como se define por las SEC ID NOs: 3 y 4 (véase el Ejemplo 1) . En este análisis TF-1, las secuencias de aminoácidos de la invención o los Nanobodies de la invención pueden tener valores IC50 que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación al valor IC50 obtenido para Tocilizumab (MRA) .
En un análisis para potencia en plasma a valores EC50 de IL-6 (por ejemplo en presencia de 27.29 ng/mL IL-6 como se describe en el Ejemplo 45), las secuencias de aminoácidos de la invención o los Nanobodies de la invención pueden tener valores IC50 entre 500 pM y 50 pM, de preferencia entre 250 pM y 50 pM, de mayor preferenciá entre 200 pM y 50 pM o menos, tal como 150 pM o menos. En un análisis para potencia en plasma a valores EC95 de IL-6 (por ejemplo en presencia de 885 ng/mL IL-6 como se describe en el Ejemplo 45) las secuencias de aminoácidos de la invención o los Nanobodies de la invención pueden tener valores IC50 entre 1000 pM y 100 pM, de preferencia entre 750 pM y 100 pM, de mayor preferencia entre 500 pM y 100 pM o menos, t¡al como 400 pM o menos. En este análisis para potencia en plasma, las secuencias de aminoácidos de la invención o los Nanobodies de la invención pueden tener valores IC50 que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro: veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación al valor IC50 obtenido para el IgG de referencia como se define por las SEC ID NOs: 1 y 2 o el Fab de referencia como se define por las SEC ID NOs: 3 y 4 (véase el Ejemplo 1) . En este análisis para poteñcia en plasma, las secuencias de aminoácidos de la invención o Nanobodies de la invención pueden tener' valores IC50 que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación al valor IC50 obtenido para Tocilizumab (MRA) .
En un análisis para definir la unión a la membrana IL-6R sobre células CHO, las secuencias de aminoácidos de la invención o los Nanobodies de la invención pueden tener valores IC50 entre lOnM y 100 pM, de preferencia entre 5 nM y 100 pM, de mayor preferencia entre 2 nM y 10 pM o menos, tal como 2 nM o menos.
Como también será evidente a partir ¡ de la exposición en la presente, también queda dentro del alcance de la invención el uso de partes o fragmentos, o combinaciones de dos o más partes o fragmentos, de las secuencias de aminoácidos o los Nanobodies de la invención como se define en la presente, y en particular las partes o fragmentos de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID NOs: 60-69. De esta forma, de acuerdo con una modalida'd de la invención, el término "secuencia de aminoácidos de la invención" o "Nanobody de la invención" en su sentido más amplio también cubre estas partes o fragmentos.
En general, estas partes o fragmentos ;de las secuencias de aminoácidos o los Nanobodies de la invención (incluyendo los análogo de los mismos) tienen secuencias de aminoácidos en las cuales, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la secuencias de aminoácido o Nanobody de longitud total de la invención correspondiente, uno o: más de residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal, uno o más residuos de aminoácidos en el extremo C-terminal, uno o más residuos de aminoácidos internos contiguos, o cualquier combinación de los mismos, se han suprimido y/o eliminado.
Las partes o fragmentos de preferencia son tales que se puedan unir al epitope especifico sobre el receptor IL-6, con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , un índice kon y/o un índice koff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe adicionalmentei en la presente) que es como se define en la presente.
En particular, las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies, y las partes o fragmentos de preferencia son tales que se: Une a hIL-6R con una constante de disociación (KD) de 1 nM hasta 1 pM moles/litro o menos, de preferencia 500 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, de mayor preferencia 100 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, o incluso de mayor preferencia aproximadamente 50 pM hasta 1 pM o menos; y/o de tal forma que se: Unen a cyno IL-6R con una constante de disociación (KD) de 1 nM hasta 1 pM moles/litro o menos, de preferencia 500 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, de mayor preferencia 100 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, o ¡incluso de mayor preferencia aproximadamente 50 pM hasta 1 pM o menos; y/o de tal forma que se: Unen a hIL-6R con un índice kon de entre 104 ~ 1s"1 a aproximadamente 107 "1s"1, de preferencia entre 105 M"1 s"1 y 107 M"1s"1, de mayor preferencia aproximadamente 1Q6 M^s-1 o mayor; y/o de tal forma que se: Unen a cyno IL-6R con un índice kon de entre 104 M"1s"1 a aproximadamente 107 M-1s-1, de preferencia entre 105 M_1s_1 y 107 M_1s-1, de mayor preferencia aproximadamente1 106 M"1 s"1 o mayor; ylo de tal forma que se: Unen a hIL-6R con un índice k0ff entre 10~3 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10"6 s"1 (proporcionando un c mplejo irreversible cercano con ti/2 de múltiples días), de preferencia entre 10~4 s"1 y 10"6 s-1, de mayor preferencia entre 1CT5 s"1 y 10"6 s"1, tal como aproximadamente 10÷5 s"1 o menos; y/o de tal forma que se: Unen a cyno IL-6R con un índice koff entre 1CT3 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10"6 s"1 (proporcionando un complejo irreversible cercano con ti/2 de múltiples días) , de preferencia entre 10"4 s"1 y 1CT6 s"1, de mayor preferencia entre 10"5 s"1 y 10"6 s"1, tal como aproximadamente 10"5 s"1 o menos .
La afinidad de las partes o fragmentos contra el receptor IL-ß, se puede determinar de una forma conocida per se, por ejemplo utilizando el análisis descrito 1 en la presente.
Cualquier parte o fragmento de preferencia tal que comprende al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, de preferencia al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, de mayor preferencia al menos 30 residuos de aminoácidos contiguos, tal como al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, de la secuencia de aminoácidos de la secuencias de aminoácido o Nanobody de longitud total correspondiente de la invención.
También, cualquier parte o fragmento de éste de preferencia comprende al menos una CDR1, CDR2 y/o CDR3 o al menos parte de las mismas (y en particular al menos CDR3 o al menos parte de la misma) . De mayor preferencia, cualquier parte o fragmento es tal que comprende al menos una · de las CDR (de preferencia al menos CDR3 o una parte de la misma) y al menos otros CDR (es decir CDRl o CDR2) o al menos parte de la misma, de preferencia conectada mediante secuencias de armazón adecuadas o al menos parte de las mismas. De mayor preferencia, cualquier parte o fragmento es tal que comprende al menos una de las CDR (y de preferencia al menos CDR3 o parte de la misma) y al menos parte de las dos CDR restante, nuevamente de preferencia conectadas mediante las secuencias de armazón adecuadas o al menos una parte de la misma.
De acuerdo con otra modalidad particularmente preferida, aunque no limitante, esta parte o fragmento comprende al menos CDR3, al menos una FR3, CDR3 y tal como FR4 del Nanobody de longitud total correspondiente¡ de la invención, es decir, como se describe por ejemplo en la Solicitud Internacional WO 03/050531 (Lasters et al.).
Como ya se mencionó anteriormente, también es posible combinar dos o más de estas partes o fragmentos (es decir, a partir de las mismas o diferentes secuencias de aminoácidos o Nanobodies de la invención) , es decir para proporcionar partes o fragmentos adicionales (como se define en la presente) de una secuencia de aminoácidos o un Nanobody de la invención. Por ejemplo, también es posible combinar una o más partes o fragmentos de una secuencia de aminoácidos o un Nanobody de la invención con una o más partes o fragmentos de un dominio VH humano.
De acuerdo con una modalidad preferida, las partes o fragmentos tienen un grado de identidad de secuencias de al menos el 50%, de preferencia al menos el 60%, dé mayor preferencia al menos el 70%, incluso de mayor preferencia al menos el 80%, tal como al menos el 90%, 95% ó 99% o más con una de las secuencias de aminoácidos o los Nanobodies de las SEC ID NOs: 60-69.
Las partes y fragmentos, y las secuencias ácidas nucleicas que codifican para las mismas, se pueden proporcionar y combinar opcionalmente de cualquier forma conocida per se. Por ejemplo, estas partes o fragmentos se pueden obtener al insertar un codón de paro en un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de tamaño total o un Nanobody de la invención, y luego expresar el ácido nucleico asi obtenido de una forma conocida per se (por ejemplo, como se describe en la presente). Alternativamente, los ácidos nucleicos que codifican para estas partes o fragmentos se pueden obtener al restringir adecuadamente un ácido nucleico que codifica para una secuencia de ácido nucleico de tamaño total o un Nanobody de la invención o al sintetizar este ácido nucleico de una forma conocida per se. Las partes o fragmentos también se pueden proporcionar utilizando técnicas para síntesis de péptidos conocidas per se.
La invención se relaciona además con compuestos o estructuras, que comprenden o consisten esencialmente, de una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies de la invención, y comprenden opcionalmente además uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión, enlazados opcionalmente vía uno o más enlazantes. En un aspecto preferido uno o más de los otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión son secuencias de aminoácidos. En otro aspecto preferido, uno o más enlazantes son una ó más secuencias de aminoácidos. Estos componentes o estructuras también se denominan como "polipéptidos de la invención." Un polipéptido de la invención, puede comprender una secuencia de aminoácidos o un Nanobody de la invención que se fusiona en su extremo amino terminal y extremo ¡carboxi terminal, o ambos en su extremo amino-terminal y, en su extremo carboxi-terminal, a' al menos una secuencia de aminoácidos adicional. Es decir, para proporcionar una proteína de fusión que comprenda la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención y una o más de la secuencia de aminoácidos adicionales.
Una o más de las secuencias de aminoácidos adicionales pueden ser cualesquiera secuencias de aminoácidos adecuadas y/o deseadas. La secuencia de aminoácidos adicional puede o no puede cambiar, alterar o de otra manera influir en las propiedades (biológicas) de la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención, y puede o no agregar funcionalidad adicional a la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o el polipéptido de la invención. De preferencia, la secuencia de aminoácidos adicional es tal que confiere una o más propiedades o funcionalidades deseadas a la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o el polipéptido de la invención.
Un ejemplo de estas secuencias de aminoácidos será evidente para el experto, y en general puede comprender todas las secuencias de aminoácidos que se utilizan en las fusiones de péptidos con base en los anticuerpos y fragmentos convencionales de los mismos (incluyendo de manera enunciativa los ScFv y los anticuerpos de dominio individuales) . Por ejemplo, se hace referencia a la revisión de Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005) .
Por ejemplo, esta secuencia de aminoácidos puede ser una secuencia de aminoácidos que aumente la vida media, la solubilidad, o la absorción, reduzca la inmunogenicidad o la toxicidad, elimine o atenúe los efectos secundarios indeseables, y/o confiera otras propiedades ventajosas y/o reduzca las propiedades no deseadas de los polipéptidos de la invención, en comparación con la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención per se. Algunos ejemplos no limitantes de estas secuencias de aminoácidos son proteínas séricas, tales como albúmina de suero humano (véase por ejemplo la WO 00/27435) o moléculas hapténicas (por ejemplo, los haptenos que se reconocen mediante anticuerpos en circulación, véase por ejemplo la WO 98/22141) . : La secuencia de aminoácidos adicional también puede proporcionar un segundo sitio de unión, el sitio de unión se puede dirigir contra cualquiera proteina, polipéptido, antigeno, determinante antigénico o epitope deseado (incluyendo de manera enunciativa la misma proteina, polipéptido, antigeno, determinante antigénico o epitope contra los cuales se dirige la secuencia de aminoácidbs o el Nanobody de la invención, o una proteina, polipéptido, antigeno, determinante antigénico o epitope diferente) . Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos adicional puede proporcionar un segundo sitio de unión que se dirige contra una proteina sérica (tal como, por ejemplo, albúmina de suero humano u otra proteina sérica tal como IgG) , para proporcionar una vida media aumentada en suero., Estas secuencias de aminoácidos por ejemplo incluyen Nanobodies, asi como también los péptidos pequeños y proteínas de unión descritos en la WO 91/01743, la WO 01/45746 y la WO 027076489 y los dAb descritos en la WO 03/002609 y la WO 04/.003019. También se hace referencia a Harmsen et al. (2005, Vaccine, 23 (41): 4926-42), así como también a EP 0368684, así como también a WO 08/028977, WO 08/043821, WO 08/043822 y WO 08/068280 de Ablynx N.V.
Las secuencias de aminoácido preferidas que; pueden proporcionar las secuencias de aminoácidos o los Nanobodies de la invención con vida media aumentada se ; pueden seleccionar de las SEC ID NOs : 97-99.
Estas secuencias de aminoácidos en particular se pueden dirigir contra albúmina sérica (y más particularmente la albúmina de suero humano) y/o contra IgG (y más particularmente IgG humano) . Por ejemplo, estas secuencias de aminoácidos pueden ser secuencias de aminoácidos que se dirijan contra albúmina de suero (humano) y las secuencias de aminoácidos que se pueden unir a los residuos de aminoácidos o a la albúmina de suero (humano) que no esté implicada en la unión de la albúmina de suero a FcRn (véase, por ejemplo la WO 06/0122787) y/o las secuencias de aminoácidos que sean capaces de unirse a los residuos de aminoácidos sobre la albúmina sérica que no forma parte del dominio III de la albúmina sérica (véase nuevamente, por ejemplo, la WO 06/0122787); las secuencias de aminoácidos que téngan o puedan proporcionar una vida media aumentada (véase, por ejemplo la WO 08/028977); las secuencias de aminoácidos contra la albúmina de suero humano que tengan reacción cruzada con la albúmina sérica proveniente de al menos una especies de mamífero, y en particular con al menos una especies de primate (tal como, por ejemplo, sin limitación, monos provenientes del género Macaca (tal como, y en particular, monos cynomolgus {Macaca fascicularis) y/o monos rhesus (Macaca mulatta) ) y babuinos {Papio ursinus) , nuevamente se hace referencia a la WO 08/028977) ; las secuencias de aminoácidos que se pueden unir a la albúmina sérica de una forma independiente del pH (véase, por .ejemplo la WO 08/043821) y/o las secuencias de aminoácidos que son aglutinantes condicionales (véase, por ejemplo ' la WO 08/043822). ! De acuerdo con otra modalidad, una o más de las secuencias de aminoácidos adicionales pueden comprender una o más partes, fragmentos o dominios de los anticuerpos de 4 cadena convencionales (y en particular anticuerpos humanos) y/o de anticuerpos de cadena pesadas. Por ejemplo, aunque por lo general se prefieren en menor medida, una secuencia de aminoácidos o un Nanobody de la invención se pueden enlazar a un dominio VH o VL convencional (de preferencia humano); o a un análogo natural o sintético de un dominio VH o VL, nuevamente de manera opcionalmente vía una secuencia enlazante (incluyendo de manera enunciativa otros anticuerpos de dominio, (individual) , tal como los dAb descritos por (Ward et al . ) .
Por consiguiente, en el compuesto o estructura de la invención, uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión se pueden seleccionar del grupo que consiste de anticuerpos dominio, las secuencias de aminoácidos que son adecuadas para utilizarse como un anticuerpo dominio, los anticuerpos dominio individuales, las secuencias de aminoácidos que son adecuadas para utilizarse como un anticuerpo dominio individual, los "dAb", las secuencias de aminoácidos que son adecuadas para utilizarse como un dAb, o los Nanobodies.
En un aspecto específico de la invención, el compuesto, estructura o polipéptido de la invención que comprende al menos una secuencia de aminoácidos o un Nanobody de la invención puede tener una vida media aumentada, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente o el Nanobody de la invención. Algunos ejemplos preferidos, aunque no limitantes, de estos compuestos, estructuras y polipéptidos serán evidentes para el experto con basé en la exposición adicional en la presente, y pueden ser por ejemplo compuestos, estructuras y polipéptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos, Nanobodies o polipéptidos de la invención que se hayan modificado químicamente para aumentar la vida media de los mismos (por ejemplo, por medio de pegilación) ; o los polipéptidos de la invención que comprenden al menos una secuencia de aminoácidos o un Nanobody de la invención que se enlaza al menos una porción (y en particular al menos una secuencia de aminoácidos) que aumenta la vida media del Nanobody de la invención. Los ejemplos de compuestos, estructuras o polipéptidos de la invención pueden comprender porciones para extender la vida meda o las secuencias de aminoácidos serán evidentes para el experto con base en la exposición adicional en la presente; y por ejemplo incluye, sin limitación, los polipéptidos; en los cuales una o más de las secuencias de aminoácidos o los Nanobodies de la invención se enlazan adecuadamente á una o más proteínas séricas o fragmentos de las mismas (tales como albúmina sérica o fragmentos adecuados de la misma) o a una o más unidades de unión que se puedan unir a proteínas iséricas (tales como, por ejemplo, los Nanobodies o los anticuerpos dominio (individuales) que se puedan unir a las proteínas séricas tales como albúmina sérica, inmunoglobulina sérica tales como IgG, o transferrina) ; los polipéptidos en los cuales una secuencia de aminoácidos o un Nanobody; de la invención se enlaza a una porción Fe (tal como un Fe humano) o una parte o fragmento adecuado de los mismos; o polipéptidos en los cuales una o más de las secuencias de aminoácidos o Nanobodies de la invención se enlazan adecuadamente a una o más proteínas pequeñas o peptidos que se puedan unir a las proteínas séricas (tal como, sin limitación, las proteínas y péptidos descritos en la WO 91/01743, la WO 01/45746, la WO 02/076489) .
Al menos una secuencia de aminoácidos o un Nanobody también se pueden enlazar a uno o más dominios CH1, CH2 y/o CH3, (de preferencia humanos) opcionalmente vía una secuencia enlazante. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos o un Nanobody enlazado a un dominio CH1 adecuado por ejemplo si se podría utilizar bien -junto con cadenas ligeras adecuadas-para generar los fragmentos/estructuras de anticuerpos análogos para los fragmentos Fab convencionales i o los fragmentos F(ab')2, aunque en los cuales uno o ambos (en el caso de un fragmento F(ab')2) de los dominios VH convencionales se hayan reemplazado mediante una secuencia de aminoácidos o un Nanobody de la invención. También, dos secuencias de aminoácidos o Nanobodies se podrían enlazar a un CH3 (opcionalmente vía un enlazante) para proporcionar una estructura con vida media aumentada in vivo.
De acuerdo con un aspecto específico de un polipéptido de la invención, una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies de la invención se pueden enlazar opcionalmente vía una región enlazante o de articulación adecuada a uno o más dominios constantes (por ejemplo, 2 ó 3 dominios constantes que se pueden utilizar como parte de/para formar una porción Fe) , para una porción Fe y/o para una o más partes de anticuerpos, fragmentos o dominios que confieren una o más funciones efectoras al polipéptidó de la invención y/o pueden conferir la capacidad de unirse a uno o más receptores Fe. Por ejemplo, para este fin, y sin estar limitados al mismo, una o más secuencias de aminoácidos adicionales pueden comprender uno o más dominios CH2 y/o CH3 de un anticuerpo, tal como de un anticuerpo de cadena pesada (como se describe en la presente) y de mayor preferencia a partir de un anticuerpo humano de 4 cadenas convencional; y/o puede formar (parte de) y la región Fe, por ejemplo a partir de IgG (por ejemplo, partir de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4), a partir de IgE o a partir de otro Ig humano tal como XgA, IgD o IgM. Por ejemplo, la WO 94/04678 describe anticuerpos de cadena pesada que comprenden un dominio VHH Camélido o un derivado humanizado del mismo (es decir, un Nanobody) en el cual el dominio CH2 y/o CH3 de Camélido se ha reemplazado por los dominios CH2 y CH3 humanos, para proporcionar una inmunoglobulina que consiste de 2 cadenas pesadas cada una que comprende un Nanobody y los dominios CH2 y CH3 humanos (aunque no el dominio CH1), en el cual la inmunoglobulina tiene la función efectora proporcionada por los dominios CH2 y CH3 y la inmunoglobulina puede funcionar sin la presencia de cualesquiera cadena ligeras. Otras secuencias de aminoácidos que se pueden enlazar adecuadamente a las secuencias de aminoácidos o los Nanobodies de la invención para proporcionar una función efectora serán evidentes para el experto, y se pueden seleccionar con base en las funciones efectoras deseadas. Se hace referencia por ejemplo a la WO 04/058820, la WO 99/42077, la WO 02/056910 y la WO 05/017148, así como también a la revisión de Holliger and Hudson, supra; y a la WO 09/068628). El acoplamiento de una secuencia de aminoácidos o un Nanobody de la invención a una porción Fe también pueden conducir a una vida media aumentada, en comparación con la secuencia de aminoácidos o Nanobody de correspondientes la invención. Para algunas aplicaciones, el uso de una porción Fe y/o de dominios constantes (es decir, los dominios CH2 y/o CH3) puede conferir una vida media aumentada sin cualquier función efectora biológicamente significativa puede ser adecuada o incluso preferida. Otras estructuras adecuadas que comprenden una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies y uno o más dominios constantes con vida media aumentada in vivo se harán evidentes para el experto, y por ejemplo, pueden comprender dos secuencias de aminoácidos o Nanobodies enlazados a un dominio CH3, opcionalmente vía una secuencia enlazante. En general, cualquier proteína de fusión o derivado con vida; media aumentada de preferencia tendrán un peso molecular nó mayor de 50 kD, el valor de corte para la absorción renal.
En otro aspecto específico, aunque no limitante, para formar un polipéptido de la invención, una o más secuencias de aminoácidos de la invención se pueden enlazar (opcionalmente vía en enlazante o región de articulación adecuados) algunas constantes que se presentan : en la naturaleza, sintéticos o semi-sintéticos (o análogos, variantes, mutantes, partes o fragmentos de los mismps) que tengan una tendencia reducida (o esencialmente que no tengan) una tendencia para auto-asociarse en dimeros (es decir, en comparación con los dominios constantes que se presentan en la naturaleza en anticuerpos de 4 cadenas convencionales) . Estas variantes de cadena Fe monoméricas (es decir, que no son de auto-asociación), o fragmentos de los mismos; serán evidentes para el experto. Por ejemplo, Helm et al. (1,996, J. Biol. Chem. 271: 7494), describen las variantes de cadena Fe monomérica que se pueden utilizar en las cadenas de polipéptidos de la invención.
También, estas variantes de cadena Fe monomérica de preferencia son tales que todavía sean capaces de unirse al complemento de los receptores Fe irrelevantes) (dependiendo de la porción Fe de la cual se derivan) , y/o tales que todavía tengan alguna o todas las funciones efectoras de la porción Fe de la cual se derivan (o a un nivel reducido todavía sean adecuados para el uso destinado) . Alternativamente, en esta cadena de polipéptidos de la invención, la cadena Fe monomérica se puede utilizar para conferir una vida media aumentada en la cadena del polipéptido en cuyo caso la cadena Fe monomérica también puede tener o no tener esencialmente funciones efectoras.
En general, las secuencias de aminoácidos o los Nanobodies de la invención (o los compuestos, estructuras o polipéptidos que comprenden los mismos) con vida media aumentada de preferencia tienen una vida media que es al menos 1.5 veces, de preferencia al menos 2 veces, tal como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la vida media de la secuencia de aminoácidos o Nanobody de la invención correspondientes per se. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies, los compuestos, las estructuras o polipéptidos de la invención con vida media aumentada pueden tener una vida media que se aumente con más de 1 horas, de preferencia más de 2 horas, de mayor preferencia más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o incluso más de 24, 48 ó 72 horas, en comparación con la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención correspondiente per se.
Un aspecto preferido, aunque no limitante de la invención, estas secuencias de aminoácidos, Nanobodies, compuesto, estructuras o polipéptidos de la invención exhiben una vida media sérica en un suero humano de al menos aproximadamente 12 horas, de preferencia al menos 24 horas, de mayor preferencia al menos 48 horas, incluso de mayor preferencia al menos 72 horas o más. Por ejemplo, los compuestos o polipéptidos de la invención pueden tener una vida media de al menos 5 dias (tal como aproximadamente 5 hasta 10 dias) , de preferencia al menos 9 dias (tal como aproximadamente 9 a 14 dias) , de mayor preferencia al menos aproximadamente 10 dias (tal como aproximadamente 10 a 15 dias), o al menos aproximadamente 11 dias (tal como aproximadamente 11 a 16 dias), de mayor preferencia al menos aproximadamente 12 dias (tal como aproximadamente 12 a 18 dias o más) , o más de 14 dias (tal como aproximadamente 14 a 19 dias) .
La secuencia de aminoácidos adicional también puede formar una secuencias de señal o una secuencias líder que dirija la secreción de la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o el polipéptido de la invención a partir de una célula hospedera con la síntesis (por ejemplo, para proporcionar una pre-, pro- o prepro-forma del polipéptido de la invención, dependiendo de la célula hospedera utilizada para expresar el polipéptido de la invención) .
La secuencia de aminoácidos adicional también puede formar una secuencias o señal que permita que la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o el polipéptido de la inven'ción se dirijan hacia y/o penetren o inqresen en órganos, tejidos, células, o partes o compartimientos específicos de las células, y/o que permita que la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o el polipéptido de la invención penetren o crucen una barrera biológica tal como una membrana celular, üna capa celular tal como una capa de células epiteliales, un tumor incluyendo tumores sólidos, o la barrera hemato-encefálica . Los ejemplos adecuados de estas secuencias de aminoácidos se harán evidentes para un experto, e incluyen, por ejemplo, de manera enunciativa, los vectores "Peptrans" mencionados anteriormente, las secuencias descritas por Cardinale¡ et al. y las secuencias de aminoácidos y los fragmentos de anticuerpos conocidos per se que se pueden utilizar para expresar o producir los Nanobodies y polipéptidos de la invención denominados "intra-cuerpos", por ejemplo como se describe en la WO 94/02610, la WO 95/22618, la US 7, 004, 940, la WO 03/014960, la WO 99/07414; la WO 05/01690; la EP 1512696; y en Cattaneo A. and Biocca S. (1997, Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landés and Springer-Verlag) y en Kontermann, (2004, Methods 34: 163-170), y las referencias adicionales descritas en las mismas.
De acuerdo con una modalidad preferida, aunque no limitante, la modalidad, la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprende al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody adicional, para proporcionar un polipéptido de la invención que comprende al menos dos, tal como dos, tres, cuatro, cinco o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies en las cuales las secuencias de aminoácidos o Nanobodies opcionalmente se pueden enlazar via una o más secuencia enlazantes (como se define en la presente) . Los polipéptidos de la invención pueden comprender dos o más i secuencias de aminoácidos o Nanobodies de los cuales al menos uno es una secuencia de aminoácidos o un Nanobody de la invención, también se denominarán en la presente como poipéptidos "multivalentes" de la invención, y las secuencias de aminoácidos o los Nanobodies presentes en estos polipéptidos también se denominarán en la presente en un "formato multivalente". Por ejemplo un polipéptido "bivalente" de la invención comprende dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies, enlazados opcionalmente via una secuencia enlazante, mientras que un polipéptido "trivalente" de la invención comprende tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies, enlazados opcionalmente via dos secuencia enlazantes; etc.; en las cuales al menos una de las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies presentes en el polipéptido, y hasta la totalidad de las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies presentes en el polipéptido, son una secuencia de aminoácidos y/o un Nanobody de la invención.
En un polipéptido multivalente de la invención, las dos o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies pueden ser iguales o diferentes, y se pueden dirigir contra el mismo antigeno o determinante antigénico (por ejemplo, contra las mismas partes o epitopes o contra diferentes partes o epitopes) o alternativamente se pueden dirigir ; contra diferentes antigenos o determinantes antigénicos; o cualquier combinación adecuada de los mismos. Por ejemplo, el polipéptido bivalente de la invención puede comprender (a) dos secuencias de aminoácidos o Nanobodies idénticas; j(b) una primera secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigidos contra un primer determinante antigénico de una proteina o antigeno y una segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigidos contra el mismo determinante antigénico de la proteina o antigeno que sea diferente de la primera secuencia de aminoácidos o Nanobody; (c) una primera secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigidos contra un primer determinante antigénico de una proteina o antigeno1 y una segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigidos contra otro determinante antigénico de la proteina o antigeno,; o (d) una primera secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigidos contra una primera proteina o antigeno y una segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigidos contra una segunda proteina o antigeno (es decir diferente del primer antigeno) . De manera similar, un polipéptido trivalente de la invención por ejemplo puede y sin limitarse al mismo comprender (a) tres secuencias de aminoácidos idénticos o Nanobodies; (b) dos secuencias de aminoácidos idénticos o Nanobody contra un primer determinante antigénico de un antigeno y una tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigidos contra un determinante antigénico diferente del mismo antigeno; (c) dos secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies contra el primer determinante antigénico de un antigeno y una tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigidos contra un segundo antigeno diferente del primer antigeno; (d) una primera secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigidos contra un primer determinante antigénico! de un primer antigeno, una segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigido contra un segundos determinante antigénico del primer antigeno y una tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigido contra un segundo antigeno diferente del primer antigeno; o (e) una primera secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigido contra un primer antigeno, una segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigido contra un segundo antigeno diferente del primer antigeno, y una tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigido contra un tercer antigeno diferente del primero y segundo antigeno.
Los polipéptidos de la invención pueden contener al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies en los cuales al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody se dirige contra un primer antigeno (es decir contra el receptor IL-6) y al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody se dirige contra un segundo antigeno (es decir diferente del receptor IL-6) , también se denominarán como polipéptidos "multiespecificos" de la invención, y las secuencias de aminoácidos o los Nanobodies presentes en estos polipéptidos también se denominaron en la presente como un "formato multiespecifico" . De es forma, por ejemplo, un poüpéptido "biespecifico" de la invención es un poüpéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos o un Nanobody dirigido contra un primer antigeno (es decir, el receptor IL- 6) y al menos una secuencia de aminoácidos adicional o i Nanobody dirigido contra un segundo antigeno (es decir, diferente del receptor IL-6) , mientras que un poüpéptido "el triespecifico" de la invención es un poüpéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigido contra un primer antigeno (es decir, el receptor IL-6) , al menos una secuencia de aminoácidos adicional o Nanobody dirigido contra un segundo antigeno (es , decir, diferente del receptor IL-6) y al menos una secuencia de aminoácidos adicional o Nanobody dirigidos contra un tercer antigeno (es decir, diferentes del receptor IL-6, y el segundo antigeno) ; etc.
Por consiguiente, en su forma más simple, un poüpéptido biespecifico de la invención es un poüpéptido bivalente de la invención (como se define en la présente) , que comprende una primera secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigió contra el receptor IL-6, y una segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigido contra un segundo antigeno en el cual la primera y segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody opcionalmente se pueden enlazar vía una secuencia enlazante (como se define en la presente); mientras que un polipéptido triespecífico de la invención en su forma más simple es un polipéptido trivalente de la invención (como se define en la presente) , que comprende una primera secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigió contra el receptor IL-6, una segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigido contra un segundo antigeno y una tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigido contra un tercer antigeno en el cual la primera, segunda y tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody opcionalmente pueden estar enlazados vía una o más, y en particular una y más en particular dos, secuencia enlazante.
En un aspecto específico, el polipéptido: de la invención es un polipéptido biespecífico, trivalente. Un polipéptido biespecífico trivalente, de la invención en su forma más simple pueden ser un polipéptido trivalente de la invención (como se define en la presente), que comprende dos secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies contra el receptor IL-6 y una tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigido contra otro antigeno, en el cual la primera segunda y tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody opcionalmente se pueden enlazar via una o más,; y en particular una y más en particular dos, secuencia enlazantes.
En otro aspecto específico, el polipéptido de la invención es un polipéptido biespecífico . Un polipéptido biespecífico de la invención en su forma más simple puede ser un polipéptido bivalente de la invención (como se define en la presente) , que comprende una primera secuenbia de aminoácidos o Nanobody contra el receptor IL-6 y una !segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigido contra otro antígeno en las cuales la primera y segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody opcionalmente se pueden enlajar vía una secuencia enlazante.
En un ejemplo preferido, aunque no limitante, el polipéptido multiespecífico de la invención comprende al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody de la invención y al menos un Nanobody que proporciona una vida media aumentada. Algunos ejemplos preferidos, aunque no limitantes, de estos Nanobodies incluyen Nanobodies dirigidos contra proteínas séricas, tales como albúmina de suero humano, proteína de unión con tiroxina, transferrina (humana) , fibrinógeno, un inmunoglobulina tal como IgG, IgE o IgM, o una de las otras proteínas séricas listadas en la WO 04/003019.
Por ejemplo, para experimentos en ratones, se pueden utilizar Nanobodies contra albúmina de suero de ratón (MSA) , mientras que para uso farmacéutico, se pueden utilizar Nanobodies contra albúmina de suero humano.
Otra modalidad de la presente invención , es una estructura de polipéptidos según se describió anteriormente mientras que al menos una proteína de suero (humano) es cualquiera de albúmina de suero (humano) , inmunoglobulinas de suero (humano) , proteína de unión con tiroxina (humano) , transferrina (humano), fibrinógeno (humano), etc.
Por consiguiente, en un aspecto específico, el polipéptido de la invención es un polipéptido biespecifico, trivalente, que comprende dos secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies contra el receptor IL-6 y una tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigido contra albúmina de suero (humano) , en el cual la primera, segunda y tercera secuencias de aminoácidos o Nanobody opcionalmente se pueden enlazar vía una o más, y en particular una y más, en particular dos, secuencia enlazantes.
En otro aspecto específico, el polipéptido de la invención es un polipéptido de biespecifico que comprende una primera secuencia de aminoácidos o Nanobody contra el receptor IL-6 y una segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody dirigido contra albúmina de suero (humano) en el cual la primera y segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody opcionalmente se puede enlazar vía una secuencia enlazante.
De acuerdo con un aspecto especifico, aunque no limitante de la invención, los polipéptidos de la invención contienen, junto con una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies de la invención, al menos un Nanobody contra albúmina de suero humano. Aunque estos Nanobodies contra albúmina de suero humano en general se pueden describir en las solicitudes por Ablynx N.V. citadas anteriormente (véase, por ejemplo, la 04/062551), de acuerdo con una modalidad particularmente preferida, aunque no limitante, el Nanobody contra albúmina de suero humano esencialmente consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID NOs: 97-99.
Algunos ejemplos preferidos, aunque no limitantes, de los ejemplos de polipéptidos de la invención que comprenden al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody contra IL-6R y al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody que proporciona vida media aumentada son: a) Las SEC ID NOs: 70-72; b) una secuencias del polipéptido que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR de la invención con una de las SEC ID NOs: 70-72, siempre y cuando la secuencias del polipéptido con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR de la invención unida a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NOs: 70-72, la afinidad tal como ¿e mide mediante resonancia con plasmones superficiales; y c) una secuencia de polipéptidos que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 70-72, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las , SEC ID NOs: 70-72 unidas a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NOs: 70-72, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Algunos ejemplos preferidos aunque no limitantes, de polipéptidos biespecificos trivalentes de la invención son : a) Las SEC ID NOs: 71-72; b) una secuencia de polipéptidos que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR de la invención con una de las SEC ID NOs: 71-72, siempre y cuando la secuencias del polipéptido con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR de la invención unida a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NOs: 71-72, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; y c) una secuencia de polipéptidos que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 71-72, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 71-72 unidas a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NOs: 71-72, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Algunos ejemplos preferidos aunque no limitantes, de los polipéptidos biespecifico de la invención que comprenden una secuencia de aminoácidos o Nanobody contra IL-6R y una secuencia de aminoácidos o Nanobody que proporciona una vida aumentada son: a) La SEC ID NOs: 70; b) una secuencia de polipéptidos que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR de la invención con la SEC ID NO: 70, siempre y cuando la secuencias del polipéptido con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR de la invención unida a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la unión de una de la SEC ID NO: ; 70, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; y c) una secuencia de polipéptidos que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 70, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 70 unidas a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NO: 70, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Cuando se comparan dos alargamientos de residuos de aminoácidos (o dos secuencias CDR) , el término "diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR de la invención" se refiere a una inserción, supresión o sustitución de un residuo de aminoácidos individual en una posición de un alargamiento de residuos de aminoácidos (o las secuencias CDR) de la invención comprendidos en el polipéptido de la invención especificado en b) en comparación con el alargamiento de residuos de aminoácidos (o las secuencias CDR) de la invención comprendidos en el polipéptido de la invención especificados en a) ; se debe entender que dos alargamientos de residuos de aminoácidos (o las secuencias CDR) de la invención pueden contener una o máximo dos diferencias de aminoácidos.
Por "diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR de la invención" se debe entender que la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprendido en el polipéptido de la invención puede tener no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDRl y/o no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR2, y/o no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR3 (es decir en CDRl, CDR2 y/o CDR3 que forman el sitio de unión con antigenos para la unión mediante el compuesto o polipéptido de la invención al epitope especifico sobre IL-.6R) en comparación con CDRl, CDR2 y/o CDR3 en la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprendido en uno del polipéptidos de a) (es decir en una de las SEC ID NOs : 60-69); tal como no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDRl (es decir CDRl que forma el sitio de unión con antigenos para unión mediante el compuesto o polipéptido de la invención al epitope especifico sobre IL-6R) en comparación con CDR1 en la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprendido, en uno de los polipéptidos de a) (es decir CDR1 en una de las SEC ID NOs: 60-69); o no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR2 (es decir CDR2 que forma el sitio de unión con antigenos para unión mediante el compuesto o el polipéptido de la invención al epitope especifico sobre IL-6R) en comparación con CDR2 en la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprendido en uno del polipéptidos de a) (es decir CDR2 en una de las SEC ID NOs: 60-69); o no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR3 (es decir CDR3 que forma el sitio de unión con antigenos para unión mediante el compuesto o el polipéptido de la invención al epitope especifico sobre IL-6R) en comparación con CDR3 en la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprendido en uno del los polipéptidos de a) (es deqir CDR3 en una de las SEC ID NOs: 60-69); no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR1 (es decir CDR1 que forma el sitio de unión con antigenos para unión mediante el compuesto o el polipéptido de la invención al epitope especifico sobre IL-6R) en comparación con CDR1 en la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprendido en uno del polipéptidos de a) (es decir CDR1 en una de las SEC ID NOs: 60-69) y no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR2 (es decir CDR2 que forma el sitio de unión con antígenos para unión mediante el compuesto o el polipéptido de la invención al epitope especifico sobre IL-6R) en comparación con CDR2 en la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprendido en uno del polipéptidos de a) (es decir CDR2 en una de las SEC ID NOs: 60-69); o no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR1 (es decir CDR1 que forma el sitio de unión con antigenos para unión mediante el compuesto o el polipéptido de la invención al epitope especifico sobre IL-6R) en comparación con CDR1 en la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprendido en uno del polipéptidos de a) (es decir CDR1 en Í una de las SEC ID NOs: 60-69) y no más de 2 , de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR3 (es decir CDR3 que forma el sitio de unión con antigenos para unión mediante el compuesto o el polipéptido de la invención al epitope especifico sobre IL-6R) en comparación con CDR3 en la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprendido en uno del polipéptidos de a) (es decir CDR3 en una de las SEC ID NOs: 60-69); o no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR2 (es decir CDR2 que forma el sitio de unión con antigenos para unión mediante el compuesto o el polipéptido de la invención al epitope especifico sobre IL-6R) en comparación con CDR2 en la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprendido en uno del polipéptidos de a) (es decir CDR2 en una de las SEC ID NOs : 60-69) y no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR3 (es decir CDR3 que forma el sitio de unión con antigenos para unión mediante el compuesto o el polipéptido de la invención al epitope especifico sobre IL-6R) en comparación con CDR3 en la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprendido en uno del polipéptidos de a) (es decir CDR3 en una de las SEC ID NOs: 60-69); no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR1 (es decir CDR1 que forma el sitio de unión con antigenos para unión mediante el compuesto o el polipéptido de la invención al epitope especifico sobre IL-6R) en comparación con CDR1 en la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprendido en uno del polipéptidos de a) (es decir CDR1 en una de las SEC ID NOs: 60-69) y no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR2 (es decir CDR2 que forma el sitio de unión con antigenos para unión mediante el compuesto o el polipéptido de la invención al epitope especifico sobre IL-6R) en comparación con CDR2 en la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprendido en uno del polipéptidos de a) (es decir CDR2 en una de las SEC ID NOs : 60-69) y no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en su CDR3 (es decir CDR3 que forma el sitio de unión con antigenos para unión mediante el compuesto o el polipéptido de la invención al epitope especifico sobre IL-6R) en comparación con CDR3 en la secuencia de aminoácidos o el Nanobody de la invención comprendido en uno del polipéptidos de a) (es decir CDR3 en una de las SEC ID NOs: 60-69).
La "diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR" puede ser cualquiera de una o un máximo de dos sustituciones, supresiones o inserciones en una o más de las CDRs de la invención, o cualquier combinación de las mismas, que ya sea mejoren las propiedades del compuesto o polipéptido de la invención o que al menos no reste demasiadas propiedades deseadas del equilibrio o combinación de las propiedades deseadas del compuesto o el polipéptido de la invención. Con respecto a esto, el compuesto o polipéptido resultante de la invención al menos se debe unir a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma o una superior afinidad en comparación con el compuesto o polipéptido que comprende una o más de las CDR de la invención sin una o máximo dos sustituciones, supresiones o inserciones, la afinidad según sea mediante resonancia con plasmones superficiales. Los compuestos o polipéptidos resultantes de preferencia son tales que se pueden unir al epítope especifico del receptor IL-6, con afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o apárente) , un índice kon y/o un índice k0ff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) que es como se define en la presente. Los compuestos o polipéptidos resultantes también de preferencia tienen una potencia de base celular y una potencia en plasma según se define en la presente.
En un aspecto de la invención, la "diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR" es una sustitución de aminoácidos. La sustitución de aminoácidos puede ser cualquiera de una o un máximo de dos sustituciones en una o más CDR de la invención que ya sea mejoren las propiedades del compuesto o el polipéptido de la invención o que al menos no reste demasiadas de las propiedades deseadas o el equilibrio o combinación de las propiedades deseadas del compuesto o estructura de la invención. Con respecto a esto, el compuesto o polipéptido resultante de la invención debe al menos unirse a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con el compuesto o estructura que comprende uno o más CDR de la invención sin una o un máximo de dos sustituciones, la afinidad tal , como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales. Los compuestos o polipéptidos resultantes de preferencia son tales que se pueden unir al epitope especifico sbbre el receptor IL-6, con la afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , un índice kon y/o un índice k0ff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) que es como se define en la presente. Los compuestos o polipéptidos resultantes de preferencia también tienen una potencia de base celular y una potencia en plasma según se define en la presente. El experto en general será capaz de determinar y seleccionar las sustituciones adecuadas, con base en la exposición1 en la presente y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación rutinaria, que por ejemplo puede implicar introducir un número limitado de posibles sustituciones y determinar su influencia sobre las propiedades de los compuestos o polipéptidos así obtenidos.
La sustitución de aminoácidos en una o más de las CDR de la invención puede ser cualquier posible sustitución tal como una "sustitución conservadora" (como se define en la presente) , se puede conducir mediante ciertas reglas (como se define en la presente) , y/o puede inducir propiedades mejoradas a los compuestos o polipéptidos resultantes (como se describe adicionalmente en la presente) .
La invención también se relaciona con un compuesto o polipéptido que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las (la secuencias total de) SEC ID NOs: 70-72.
Cuando se comparan dos compuestos o polipéptidos, el término "diferencia de aminoácidos" se refiere; a una inserción, supresión o sustitución de un residuo de aminoácidos individual en una posición del primer compuesto o polipéptido, en comparación con el segundo compuesto o polipéptido; que se debe entender que los dos compuestos o polipéptidos pueden contener una o un máximo de dos de estas diferencias de aminoácidos.
La "diferencia de aminoácidos" puede ser una o un máximo de dos sustituciones, supresiones o inserciones en el compuesto o polipéptido, es decir, en una o más regiones de armazón o en una o más de las CDR (que pueden estar en una CDR de la invención (es decir, presentes en una secuencia de aminoácidos o Nanobody de la invención) o en otra CDR (es decir, presentes en la SEC ID NO: 98)), en una secuencia enlazante, o cualquier combinación de las mismas, que ya sea mejoren las propiedades del compuesto o polipéptido de la invención o que al menos no resten demasiado de las propiedades deseadas o el equilibrio o una combinación de las propiedades deseadas del compuesto o el polipéptido de la invención. Con respecto a esto, el compuesto o polipéptido resultante de la invención debe al menos unirse a IL-6R con la misma, aproximadamente la misma, o superior afinidad en comparación con el compuesto o el polipéptido sin una o máximo dos sustituciones, supresiones o inserciones, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales. Los compuestos o polipéptidos resultantes de preferencia son tales que se pueden unir al epitope especifico sobre el receptor IL-6, con la afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (real o aparente) , un valor K¾ (real o aparente) , un índice kon y/o un índice koff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) que es como se define en la presente. Los compuestos o polipéptidos resultantes de preferencia también tienen una potencia de base celular y una potencia en plasma según se define en la presente.
En un aspecto de la invención, la "diferencia de aminoácidos" es una sustitución de aminoácidos. La sustitución de aminoácidos puede ser cualquiera de una o un máximo de cualquiera de dos sustituciones en las regiones de armazón, en una o más de las CDR (que pueden estar en una CDR de la invención (es decir presentes en una secuencia de aminoácidos o Nanobody de la invención) o en otra CDR (es decir presente en la SEC ID NO: 98)), en una secuencia enlazante, o cualquier combinación de los mismos, que ya sea mejoren las propiedades del compuesto o polipéptidp de la invención o que al menos no reste demasiadas propiedades deseadas o el equilibrio o combinación de las propiedades deseadas del compuesto o el polipéptido de la invención. Con respecto a esto, el compuesto o polipéptido resultante de la invención debe al menos unirse a IL-6R con la : misma, aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con el compuesto o el polipéptido sin una o un máximo de dos sustituciones, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales. Los compuestos o polipéptidos resultantes de preferencia son tales que se pueden unir al epitope especifico sobre el receptor IL-ß, con afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (real o aparente), un valor KA (real o aparente), un' Indice kon y/o un índice k0ff, o alternativamente como un valor IC50, como se describe adicionalmente en la presente) que es como se define en la presente. Los compuestos o polipéptidos resultantes de preferencia también tienen una potencia de base celular y una potencia en plasma según se define en la presente .
Como se indicó anteriormente, las sustituciones, inserciones o supresiones pueden ser en una o más de las regiones de armazón, en una o más de las CDR, y/o en una o más de las secuencia enlazante. Las sustituciones, inserciones o supresiones en las CDR pueden ser cualesquiera sustitución, inserciones o supresiones posibles tales como "sustitución conservadora" (como se define en la présente) , se pueden dirigir mediante ciertas reglas (como se define en la presente), y/o pueden inducir propiedades mejoradas a los compuestos o polipéptidos resultantes.
Cuando se realizan estas sustituciones, inserciones o supresiones en una o más de las regiones de armazón, pueden ser cualesquiera sustituciones, inserciones o supresiones posibles. Las mismas se pueden realizar en uno o más de residuos Hallmark (como se define por ejemplo en la WO 08/020079; Tablas A-3 a A-8) y/o a una o más de las otras posiciones en los residuos de armazón, aunque en general se prefieren en menor medida las sustituciones, inserciones o supresiones en los residuos Hallmark (a menos que éstas sean sustituciones humanizantes adecuadas como se describe en la presente) . Por medio de ejemplos no limitantes, por ejemplo, una sustitución puede ser una sustitución conservadora (como se describe en la presente) y/o el residuo de aminoácidos se puede reemplazar por otro residuo del aminoácido que se presenta naturalmente en la misma posición en otro dominio V HH (véase la WO 08/020079, Tablas A-5 a A-8), aunque la invención en general no se limita a los mismos.
Las sustituciones, inserciones o supresiones hechas (de preferencia) en una o más de las regiones de : armazón pueden ser sustituciones para optimización de secuencias tales como por ejemplo una sustitución humanizante. Algunas sustituciones humanizantes preferidas, aunque no limitantes, (y las combinaciones adecuadas de las mismas) serán evidentes para el experto con base en la exposición en la presente. Las sustituciones humanizantes potencialmente útiles se pueden determinar al comparar la secuencias de las regiónes de armazón de una de la secuencia de aminoácidos o Nanobodies comprendidos en uno de los polipéptidos de la invención definidos en a) con la secuencias de armazón correspondiente de una o más secuencias VH humanas relacionadas estrechamente, después de lo cual una o más de las sustituciones humanizantes potencialmente útiles (o combinaciones de las mismas) determinadas de esta forma se pueden introducir en la secuencia de aminoácidos o Nanobody comprendidos en uno de los polipéptidos de la invención definido en a) (en cualquier forma conocida per se, como se describe adicionalmente en la presente) y el polipéptido humanizado resultante se pueden probar para afinidad para IL-6R, para estabilidad, para facilidad y nivel de expresión, y/o para otras propiedades deseadas definidas en la presente. De esta forma, por medio de un grado limitado de ensayo y error, con base en la exposición de la presente se pueden determinar por el experto otras sustituciones humanizantes adecuadas (o combinaciones adecuadas de las mismas) .
Dependiendo del organismo hospedero utilizado para expresar el compuesto o el polipéptido de la invención, las supresiones y/o sustituciones también se pueden diseñar de tal forma que uno o más sitios para modificación pos-traduccional (tales como uno o más sitios de glucosilación) se eliminan, ya que quedará dentro de la capacidad del experto en la técnica. Alternativamente, las sustituciones o inserciones se pueden diseñar para introducir uno 1 o más sitios para unión de grupos funcionales (como se describe en la presente) , por ejemplo para permitir la pegilación sitio-especifica (nuevamente como se describe en la presente) .
Como se puede observar a partir de los datos en la entropía de VHH y la variabilidad de VHH proporcionadas en las Tablas A-5-A-8 de la WO 08/020079, algunos residuos de aminoácidos en las regiones de armazón se conservan más que otros. En general, aunque la invención en su sentido más amplio no se limita a la misma, cualesquiera sustituciones, supresiones o inserciones de preferencia se hacen en las posiciones que estén menos conservadas. También, en general, las sustituciones de aminoácidos se prefieren con respecto a las supresiones o inserciones de aminoácidos. ; Los compuestos resultantes de la invención o los polipéptidos de la invención de preferencia se unen a IL-6R con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , un índice kon y/o un índice k0ff, o alternativamente como un valor IC5o, como se describe adicionalmente en la presente) de preferencia son tales que se: Unen a hIL-6R con una constante de disociación (KD) de 1 nM hasta 1 pM moles/litro o menos, de preferencia 500 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, de mayor preferencia 100 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, o incluso de mayor preferencia aproximadamente 50 pM hasta 1 pM o menos; y/o son tales que se: Unen a cyno IL-6R con una constante de disociación (KD) de 1 nM hasta 1 pM moles/litro o menos, de preferencia 500 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, dé mayor preferencia 100 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, o incluso de mayor preferencia aproximadamente 50 pM hasta 1 pM o menos; y/o son tales que se: Unen a hIL-6R con un índice kon de entre 104 M" 1s"1 a aproximadamente 107 "1s"1, de preferencia entre :105 M"1 s"1 y 107 M"1s"1, de mayor preferencia aproximadamente Í06 M^s"1 o más; y/o son tales que se: Unen a cyno IL-6R con un índice kon de entre 104 M_1s_1 a aproximadamente 107 M-1s_1, de preferencia entre 105 M^s-1 y 107 M~1s~1, de mayor preferencia aproximadamente 106 M"1 s-1 o más; y/o son tales que se: Unen a hIL-6R con un índice k0ff entre < 10"3 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10"6 s"1 (proporcionando un complejo irreversible cercano con ti2 de múltiples días), de preferencia entre 10~4 s"1 y 10~6 s-1, de mayor preferencia entre 10"5 s"1 y 10"6 s"1, como aproximadamente 1CTS s-1 o menos; y/o son tales que se: Unen a cyno IL-6R con un índice kQff entre lCf3 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10"6 s"1 (proporcionando un complejo irreversible cercano con ti/2 de múltiples días) , de preferencia entre 10"4 s"1 y 10"6 s"1, de mayor preferencia entre 10~5 s"1 y 10"6 s"1, como aproximadamente 10"5 s'1 o menos.
Algunos valores de unión IC50 preferidos de los compuestos o los polipéptidos de la invención a IL-6R se harán evidentes a partir de la descripción adicional y ejemplos. : La potencia y/o eficacia de los polipéptidos y compuestos de la invención, y de las composiciones que comprenden los mismos, se pueden probar utilizando cualquier análisis in vitro, el análisis de base célular, análisis in vivo y/o modelo animal conocidos per se, o cualquier combinación de los mismos, dependiendo de la enfermedad o trastorno específicos implicados. Los análisis adecuados y los modelos animales serán evidentes para el experto, y por ejemplo incluye análisis de proliferación utilizando líneas celulares dependientes de IL-6, incluyendo TF-1, XG1 ,y 7TD1, con modelo de artritis inducida por colágeno, modelo de trasplante de tejido sinovial en ratones SCID, modelo de xenoinjerto de diversos cánceres humanos, entre los que se incluyen, mieloma, cáncer de próstata y carcinoma de ¡células renales, modelos IBD que incluyen TNBS, modelos de ¡primate (tales como por ejemplo descritos en Shinkura et al. 1998, Anticancer Research 18: 1217-1222), modelos de primates no humanos de enfermedad artrítica (por ejemplo como se describe en Vierboom et al., 2008, Drug Discov. Today: Dis Model doi: 10.1016/j .ddmod. 2008.06.003), así como también los análisis y modelos animales utilizados en la , parte experimental más adelante y en la técnica anterior citada en la presente Peake et al., 2006, Rheumatology 45: 1485-9; Wahid et al., 2000, Clin. Exp. Immunol., 122: 1ß3-142; Matsuno et al., 1998, Arthritis and rheumatism 41: 2014-2021; WO 08/020079) .
Por ejemplo, en el análisis TF-1 como se describe por Kitamura et al. (1989, J. Cell Physiol. 140: 323), los compuestos de la invención o los polipéptidos de la invención pueden tener valores IC50 (a 100 IU/mL IL-ß) entre 10 nM y 50 pM, de preferencia entre 5 nM y 50 pM, de mayor preferencia entre 1 nM y 50 pM o menos, tal como aproximadamente 750 ó 500 pM o menos. En este análisis TF-1 los compuestos de la invención o los polipéptidos de la invención pueden tener valores IC50 (a 5000 IU/mL IL-6) entre 50 nM y 1 nM, de preferencia entre 25 nM y 1 nM, de mayor preferencia entre 10 nM y 1 nM o menos, tal como aproximadamente 8 nM o menos. En este análisis TF-1, los compuestos de la invenció o los polipéptidos de la invención pueden tener valores IC50 que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o, más de 7 veces mejores en comparación el valor IC5o obtenido para el IgG de referencia como se define por las SEC ID NOs : 1 y 2 o el Fab de referencia como se define por las SEC ID NOs: 3 y 4 (véase el Ejemplo 1) . En este análisis TF-1, los compuestos de la invención o los polipéptidos de la invención , pueden tener valores IC5o que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación el valor IC50 obtenido para Tocilizumab ( RA) .
En un análisis para potencia en plasma a valores EC50 de IL-6 (por ejemplo en presencia de 27.29 ng/mL IL-6 como se describe en el Ejemplo 45) , los compuestos de la invención o los polipéptidos de la invención pueden tener valores IC50 entre 500 pM y 50 pM, de preferencia entre 250 pM y 50 pM, de mayor preferencia entre 200 pM y 50 pM o menos, como 150 pM o menos. En un análisis para potencia en plasma a valores EC95 de IL-6 (por ejemplo en presencia de 885 ng/mL IL-6 como se describe en el Ejemplo 45) los compuestos de la invención o los polipéptidos de la invención pueden tener valores IC50 entre 1000 pM y 100 pM, de preferencia entre 750 pM y 100 pM, de mayor preferencia entre 500 pM y 100 pM o menos, tal como 400 pM o menos. En este análisis de potencia en plasma, los compuestos de la invención o los polipéptidos de la invención pueden tener valores IC50 que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación el valor IC50 obtenido para el IgG de referencia como se define por las SEC ID NOs: 1 y 2 o el Fab de referencia como se define por las SEC ID NOs : 3 y 4 (véase el Ejemplo 1) . En este análisis para potencia en plasma, los compuestos de la invención o los polipéptidos de la invención pueden tener valores IC5o que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación el valor IC50 obtenido para Tocilizumab (MRA) .
En un análisis para determinar la unión a la membrana IL-6R sobre células CHO, los compuestos de la invención o los polipéptidos de la invención pueden tener valores IC50 entre 10 nM y 100 pM, de preferencia entrq 5 nM y 100 pM, de mayor preferencia entre 2 nM y 10 pM o menos, tal como 2 nM o menos.
En un aspecto preferido, el compuesto o el polipéptido de la invención tiene o esencialmente consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 70. En otro preferido el aspecto, el compuesto o el polipéptido de la invención tiene o esencialmente consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 71. Los polipéptidos con estas secuencias de aminoácidos muestran propiedades mejoradas tales como por ejemplo unión y/o afinidad mejoradas, , avidez mejorada, eficacia y potencia mejoradas, y/o una selectividad aumentada, además de su capacidad para bloquear parcial o totalmente la interacción IL-6/IL-6R, y/o inhibir la señalización a través de, IL-ß, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R.
La invención también se relaciona a una estructura monovalente (también denominada como "estructura monovalente de la invención"), que comprende o que consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos o un Nanobody de la invención. Las estructuras monovalentes preferidas de la invención comprenden o esencialmente consisten de las SEC ID NOs: 60-69, tales como las SEC ID NOs: 65-69, tales como por ejemplo la SEC ID NO: 66. Estas estructuras monovalentes, asi como también las secuencias de aminoácidos y los Nanobodies de la invención se pueden utilizar para la preparación de un compuesto o polipéptido de la invención, tal como por iejemplo los compuestos o polipéptidos multivalentes y/o multiespecificos de la invención.
Por consiguiente, la presente invención también se relaciona con el uso de una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o una estructura monovalente de la invención para la preparación de un compuesto, estructura o polipéptido de la invención. La invención además se relaciona con un método para la preparación de un compuesto, estructura o polipéptido de la invención, que comprende la unión de una secuencia de aminoácidos, Nanobody o estructura monovalente de la invención a uno o más grupos, residuos, porciones o unidades de unión. Este método puede comprender la unión de una secuencia de aminoácidos, Nanobody o estructura monovalente de la invención a uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión vía uno o más enlazantes i En un aspecto preferido, uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión son unidades de unión, tales como las secuencias de aminoácidos o Nanobodies.
Por consiguiente, la presente invención también se relaciona con el uso de una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o una estructura monovalente de la invención para la preparación de un compuesto multivalente y/o multiespecifico, estructura o polipéptido de la invención. La invención además se relaciona con un método para la preparación de un compuesto multivalente y/o multiespecifico, estructura o polipéptido de la invención, que comprende la unión de una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o una estructura monovalente de la invención a una o más de otras unidades de unión, tales como las secuencias de aminoácidos o los Nanobodies. Este , método puede comprender la unión de una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o una estructura monovalente de la invención á una o más unidades de unión via uno o más enlazantes.
En un aspecto especifico, la presente invención también se relaciona con uso de una estructura monovalente que comprende o esencialmente consiste de una de las SEC ID NOs: 60-69 (de preferencia las SEC ID NOs : 65-69, de mayor preferencia la SEC ID NO: 66) para la preparación de un compuesto multivalente y/o multiespecífico, estructura o polipéptido de la invención. La invención se relaciona además con un método para la preparación de un compuesto multivalente y/o multiespecífico, estructura o polipéptido de la invención, que comprende la unión de una estructura monovalente que comprende o esencialmente consiste de una de las SEC ID NOs: 60-69 (de preferencia las SEC ID NOs: 65-69, de mayor preferencia la SEC ID NO: 66) a una o más de otras unidades de unión, tales como las secuencias de aminoácidos o Nanobodies. Este método puede comprender la unión de una estructura monovalente que comprende o esencialmente consiste de una de las SEC ID NOs: 60-69 (de preferencia las SEC ID NOs: 65-69, de mayor preferencia la SEC ID NO: 66) a una o más unidades de unión vía uno o más enlazantes.
En otro aspecto específico, la presente invención se relaciona con el uso de una estructura monovalente que comprende o esencialmente consiste de una de las SEC ID NOs: 60-69 (de preferencia las SEC ID NOs: 65-69, de mayor preferencia la SEC ID NO: 66) para la preparación de un compuesto multivalente y/o multiespecífico, estructura o polipéptido que comprende o esencialmente consiste de una de las SEC ID NOs : 70-72 (de preferencia las SEC ID NOs : 70-71, de mayor preferencia la SEC ID NO: 70 o la SEC ID NO: 71) . La invención se relaciona además con un método para la preparación de un compuesto multivalente y/o multiespécifico, estructura o polipéptido que comprende o esencialmente consiste de una de las SEC ID NOs: 70-72 (de preferencia LAS SEC ID NOs: 70-71, de mayor preferencia la SEC ID NO: :70 o la SEC ID NO: 71), que comprende la unión de una estructura monovalente que comprende o esencialmente consiste en una de las SEC ID NOs: 60-69 (de preferencia las SEC ID NOs:: 65-69, de mayor preferencia la SEC ID NO: 66) a una secuencia de aminoácidos que comprende o esencialmente consiste de una SEC ID NO: 98 vía uno o más enlazantes.
Los separadores enlazantes adecuados , para utilizarse en los polipéptidos multivalentes y/o multiespécificos serán evidentes para el experto, en general pueden ser cualquier enlazante o separador utilizado en la técnica para enlazar secuencias de aminoácidos. De preferencia, el enlazante separador es adecuado para utilizarse en la construcción de proteínas o polipéptidos que se destina para uso farmacéutico.
Algunos separadores particularmente preferidos incluyen los separadores y enlazantes que se utilizan en la técnica para enlazar fragmentos de anticuerpos o dominios de anticuerpos. Éstos incluyen los enlazantes mencionados en la técnica antecedente general citada anteriormente, asi como también por ejemplo los enlazantes que se utilizan en la técnica para construir diacuerpos o frgmentos ScFv (con respecto a esto, sin embargo, su debe observar que, mientras que en los diacuerpos y en los fragmentos ScFv, la secuencia enlazante utilizada debe tener una longitud, un grado de flexibilidad y otras propiedades que permitan que los dominios VH y VL pertinentes vengan juntos para formar el sitio de unión con antigenos completo, no existe limitación particular sobre la longitud o la flexibilidad del enlazante utilizado en el polipéptido de la invención, ya que cada secuencia de aminoácidos o Nanobody por si mismo forma un sitio de unión con antigenos completo) .
Por ejemplo, un enlazante puede ser una secuencia de aminoácidos adecuada, y en particular las secuencias de aminoácidos particulares entre 1 y 50, de preferencia entre 1 y 30, tal como entre 1 y 20 o entre 1 y 10 residuos de aminoácidos. Algunos ejemplos preferidos de estas secuencias de aminoácidos incluyen enlazantes gly-ser, por ejemplo del tipo (glyxsery)z, tal como (por ejemplo (gly4sér)3 o (gly3ser2)3, como se describe en la WO 99/42077, regiones similares a articulación tal como las regiones de articulación de los anticuerpos de cadena pesada que se presentan en la naturaleza o secuencias similares (tal como se describe en la O 94/04678).
Algunos otros enlazantes particularmente preferidos son poli-alanina (tal como AAA) , asi como también los enlazantes mencionaron en la Tabla B-8 de los cuales se prefieren particularmente AAA, GS-7 y GS-9.
Otros enlazantes adecuados en general comprenden compuestos orgánicos o polímeros, en particular aquellos adecuados para utilizarse en proteínas para uso farmacéutico. Por ejemplo, las porciones de poli (etilenglicol ) se han utilizado para enlazar dominios de anticuerpos, véase, por ejemplo la WO 04/081026.
Dentro del alcance de la invención se abarca la longitud, el grado de flexibilidad y/u otras propiedades de los enlazantes utilizados (aunque no decisivos, como es usual para los enlazantes utilizados en los fragmentos ScFv) pueden tener alguna influencia sobre las propiedades del polipéptido final de la invención, incluyendo de manera enunciativa la afinidad, especificidad o avidez del receptor IL-6, o para uno o más de los otros antígenos. Con base en la exposición en la presente, el experto será capaz de determinar los enlazantes óptimos para utilizarse en un polipéptido específico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos rutinarios limitados.
También dentro del alcance de la invención se encuentran los enlazantes utilizados que confieren una más de otras propiedades favorables o funcionalidad a los polipéptidos de la invención, y/o proporcionan uno; o más sitios para la formación de los derivados y/o para la unión de grupos funcionales (por ejemplo como se describe en la presente para los derivado de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, compuestos y polipéptidos de la invención) . Por ejemplo, los enlazantes que contienen uno o más residuos de aminoácidos cargados pueden proporcionar propiedades hidrofilicas mejoradas, mientras que los enlazantes que forman o contienen pequeños epitopes o marcas se pueden utilizar para los fines de detección, identificación y/o purificación. Nuevamente, con base en la exposición; en la presente, el experto será capaz de determinar los enlazantes óptimos para utilizarse en un polipéptido especifico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos rutinarios limitados.
Por último, cuando se utilizan dos o más enlazantes en los polipéptidos de la invención, estos enlazantes pueden ser iguales o diferentes. Nuevamente, con base en la exposición en la presente, el experto será capaz de determinar los enlazantes óptimos para utilizarse ; en un polipéptido específico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos rutinarios limitados.
Por lo general, para facilitar la expresión y producción, un polipéptido de la invención será un polipéptido lineal. Sin embargo, la invención en su sentido más amplio no se limita al mismo. Por ejemplo, cuando un polipéptido de la invención comprende tres o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies, es posible enlazarlos mediante el uso de un enlazante con tres o más "ramificaciones", cada "ramificación" se enlazará a una secuencia de aminoácidos o Nanobody, para proporcionar una estructura "con forma de estrella". También es posible, aunque en general se prefiere menos, utilizar estructuras circulares.
La invención en su sentido más amplio también comprende derivados de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, compuestos o polipéptidos de la invención. Estos derivados en general se pueden obtener mediante modificación, y en particular mediante la modificación química y/o biológica (por ejemplo, enzimática) , de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, compuestos o polipéptidos de la invención y/o de uno o más de residuos de aminoácidos que forman las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, compuestos o polipéptidos de la invención.
Los ejemplos de estas modificaciones, así como también los ejemplos de residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos, la secuencia de Nanobody, el compuesto o las secuencias de polipéptidos que se; pueden modificar de esta forma (es decir ya sea sobre la estructura de la proteina aunque de preferencia sobre una ; cadena lateral) , los métodos y técnicas que se pueden utilizar para introducir estas modificaciones y los usos potenciales y ventajas de estas modificaciones serán evidentes para el experto.
Por ejemplo, Esta modificación puede implicar la introducción (por ejemplo, mediante unión covalente o de otra forma adecuada) de uno o más grupos funcionales, residuos o porciones en o sobre la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido de la invención, y en particular de uno o más grupos funcionales, residuos o porciones que confieran una o más propiedades deseadas o f ncionalidades a la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido de la invención. Un ejemplo de estos grupos funcionales será evidente para el experto.
Por ejemplo, esta modificación puede comprender la introducción (por ejemplo, mediante unión covalente o en cualquier otra forma adecuada) de uno o más grupos funcionales que puedan aumentar la vida media, la solubilidad y/o la absorción de la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido de la invención, que reducen la inmunogenicidad y/o la toxicidad de la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido de la invención que elimina o atenúa cualesquier efectos secundarios no deseados de la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o el polipéptido de la invención y/o que confieren otras propiedades ventajosas a y/o reducen las propiedades no deseadas de la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido de la invención; o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. Los ejemplos de estos grupos funcionales y de las técnicas para introducirlos serán evidentes para el experto, y en general pueden comprender todos los grupos funcionales y técnicas mencionados en la técnica antecedente general citada anteriormente así como también los grupos funcionales y técnicas conocidas per se para la modificación de proteínas farmacéuticas, y en particular para la modificación de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (incluyendo los ScFv y los anticuerpos de dominio individual) , para lo cual se hace referencia por ejemplo a Remington's Pharmaceutical Sciences (1980, 16th ed., ack Publishing Co., Easton, PA) . Estos grupos funcionales por ejemplo se pueden enlazar directamente (por ejemplo, covalentemente) a una secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido de la invención, u opcionalmente vía un enlazante o separador adecuado, como nuevamente será evidente para el experto.
Una de las técnicas utilizadas más ampliamente para aumentar la vida media y/o reducir la inmunogenicidad de las proteínas farmacéuticas comprende la unión de un polímero farmacológicamente aceptable adecuado, tal como poli (etilenglicol) (PEG) o derivados del mismo (tal como metoxipoli (etilenglicol) o mPEG) . En general, se puede utilizar cualquier forma de pegilación adecuada, tal como la pegilación utilizada en la técnica por los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (incluyendo de manera enunciativa los anticuerpos de dominio (individual) y ScFv) ; se hace referencia por ejemplo a Chapman (2002, Nat. Biotechnol., 54: 531-545) ; by Veronese and Harris (2003, Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 453-456), by Harris and Chess (2003, Nat. Rev. Drug. Discov., 2: 214-21) y en la WO 04/060965. También están comercialmente disponibles diversos reactivos para la pegilación de proteínas, por ejemplo de Nektar Therapeutics, USA.
De preferencia, se utiliza pegilación sitio-dirigida, en particular vía un residuo de cisteína (véase, por ejemplo, Yang et al. (2003, Protein Engineering, 16 (10): 761-770) . Por ejemplo, para este fin, PEG puede estar unido a un residuo de cisteína que se presente en la naturaleza en una secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido de la invención, una secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido de la invención se pueden modificar para introducir adecuadamente uno o más residuos de cisteína para unión de PEG, o una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más residuos de cisteína para la unión de PEG se puede fusionar al término N y/o C de la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido ; de la invención, todos utilizando técnicas para el diseño por ingeniería de proteínas conocido per se por el experto.
De preferencia, para las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, compuestos o polipéptidos de la invención, se utiliza PEG con un peso molecular mayor de 5000, tál como mayor de 10,000 y menor de 200,000, tal como menos de 100,000; por ejemplo en una variación de 20,000-80,000, Otra modificación por lo general menos preferida comprende glucosilación N-enlazada u O-enlazada, por lo general como parte de una modificación co-traduccional y/o pos-traduccional , dependiendo de la célula hospedera utilizada para expresar la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido de la invención.
Todavía otra modificación puede comprender la introducción de una o más marcas adecuadas u otros grupos o porciones para generación de señales, dependiendo del uso destinados de la secuencia de aminoácidos marcada, Nanobody, compuesto o polipéptido de la invención. Las marcas y técnicas adecuadas para unirlas, utilizarlas y detectarlas serán evidentes para el experto, y por ejemplo incluyen de manera enunciativa, marcas fluorescentes (tales como, fluoresceina, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o ftaldehido, y fluorescamina y metales fluorescentes tales como 152Eu u otros metales provenientes de la serie de lantánidos) , marcas fosforescentes, marcas quimioluminiscentes o marcas bioluminescentes (tales como, luminal, isoluminol, éster de acridinio teromático, sales de acridinio, éster de o'xalato, dioxetano o GFP y sus análogo) , radio-isótopos (tales como 3H, 125I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36C1, 57Co, 58Co, 59Fe, y 75Se), metales, quelatos metálicos o cationes metálicos (por ejemplo, cationes metálicos tales como 99mTc, 123I, 11:1In, 131I, 97Ru, 67Cu, 67Ga, y 68Ga u otros metales o cationes metálicos que en particular sean adecuados para utilizarse para diagnóstico in vivo, in vitro o in situ y para la formación de imágenes, (tal como 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr, y 56Fe) , asi como también cromóforos y enzimas (tales como 1 malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocócsica, isomerasa délta-V-esteroidea, deshidrogenasa alcohólica de levadura, deshidrogenesa alfa-glicerofosfato, isomerasa triosa fosfato, biotinavidina peroxidasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, ß-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-VI-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolina esterasa) . Otras marcas adecuadas serán evidentes para el experto, y por ejemplo incluyen porciones que se! puedan detectar utilizando espectroscopia nMR o ESR.
Estas secuencias de aminoácidos marcadas, Nanobodies, compuestos o polipéptidos de la invención por ejemplo se pueden utilizar para análisis in vitro, in vivo o in situ (incluyendo inmunoanálisis conocidos per sé tales como ELISA, RIA, EIA y otro "análisis emparedados", etc.) asi como también para fines de diagnóstico in vivo y para formación de imágenes, dependiendo de la elección de la marca especifica .
Como será evidente para el experto, otra modificación puede implicar la introducción de un: grupo quelante, por ejemplo para quelar uno de los metales o cationes metálicos a las que se hizo referencia anteriormente. Los grupos quelantes adecuados por ejemplo incluyen, sin limitación, ácido dietilentriaminpentaacetico (DTPA) o ácido etilenediamintetraacético (EDTA) .
Todavía otra modificación puede comprender la introducción de un grupo funcional que sea una parte' de un par de unión especifico, tal como el par de unión biotina (estrept ) avidina . Este grupo funcional se puede utilizar para enlazar la secuencia de aminoácidos, el Nanobody, el compuesto o polipéptido de la invención a otra proteina, polipéptido o compuesto químico que se une a la otra mitad del par de unión, es decir a través de la formación del par i de unión. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido de la invención sé puede conjugar para biotina, y enlazar para otra proteína, polipéptido, compuesto o portador conjugado para avidina o estreptavidina . Por ejemplo, tal como una secuencia conjugada de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido de la invención, se puede utilizar como un reportero, por ejemplo en un sistema de diagnóstico donde se conjuga un agente para producir señales detectables para avidina o estreptavidina. Estos pares de unión por ejemplo, también se pueden utilizar para unir la secuencia de aminoácidos, el Nanobody, el compuesto o polipéptido de la invención a un portador, incluyendo los portadores adecuados para fines farmacéuticos. Un ejemplo no limitante son las formulaciones de liposomas descritas por Cao and Suresh (2000, Journal of Drug i Targetting, 8 (4): 257). Estos pares de unión también se pueden utilizar para enlazar un agente terapéuticamente activo a la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o el polipéptido de la invención.
Otras modificaciones químicas y enzimáticas potenciales serán evidentes para el experto. Éstas también se pueden utilizar para fines de investigación (por ejemplo, para estudiar las relaciones de función-actividad) . Por ejemplo se hace referencia a Lundblad and Bradshaw (1997, Biotechnol. Appl. Biochem. , 26: 143-151).
De preferencia, los derivado son tales que se unen al epítope específico sobre el receptor IL-6, don una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor KD (real o aparente), un valor K¾ (real o aparente), un índice k0n y/o un índice oif, o alternativamente como un valor IC5o, como se describe adicionalmente en la presente) que es como se define en la presente.
En particular, estos derivados de la invención de preferencia son tales que se: Unen a hIL-6R con una constante de disociación (KD) de 1 nM hasta 1 pM moles/litro o menos, de preferencia 500 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, de mayor preferencia 100 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, o incluso dé mayor preferencia aproximadamente 50 pM hasta 1 pM o menos ; y/o son tales que se: Unen a cyno IL-6R con una constante de disociación (KD) de 1 nM hasta 1 pM moles/litro o menos, de preferencia 500 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, de mayor preferencia 100 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, o incluso de mayor preferencia aproximadamente 50 pM hasta 1 pM o menos; y/o son tales que se: Unen a hIL-6R con un índice kon de entre, 104 M"1 s_1 a aproximadamente 107 M_1s_1, de preferencia entre ID5 M^s"1 y 107 M"1s"1, de mayor preferencia aproximadamente 106 M~1s_1 o más ; y/o son tales que se: Unen a cyno IL-6R con un índice kon de entre 104 M"1s"1 a aproximadamente 107 M_1s_1, de preferencia entre 105 ^s-1 y 107 M"1s"1, de mayor preferencia aproximadamente 106 M"1 s-1 o más; y/o son tales que se: Unen a hIL-6R con un índice k0ff entre 10"3 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10"6 s"1 (proporcionando un complejo irreversible cercano con ti2 de múltiples días) , de preferencia entre 10~4 s"1 y 10"6 s"1, de mayor preferencia entre 10"5 s"1 y 10-6 s"1, tal como aproximadamente 10"5 s-1 o menos ; y/o son tales que se: Unen a cyno IL-6R con un índice k0ff entre 10"3 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10"6 s"1 (proporcionando un complejo irreversible cercano con ti2 de múltiples días), de preferencia entre 10"4 s"1 y 10"6 s-1, de mayor preferencia entre 10"5 s"1 y 10"6 s-1, como aproximadamente 10"5 s"1 o' menos.
Como se mencionó anteriormente, la invención también se relaciona con proteínas o polipéptidos que consisten esencialmente o comprenden al menos una secuencia de aminoácidos, un Nanobody, un compuesto o polipéptido de la invención. Por "consiste esencialmente de" se debe entender que la secuencia de aminoácidos de la proteína o polipéptido de la invención ya sea es exactamente la misma que la secuencia de aminoácidos, el Nanobody, el compuesto o polipéptido de la invención o corresponde a la secuencia de aminoácidos, el Nanobody, el compuesto o el polipéptido de la invención que tiene un número limitado de residuos de aminoácidos, tal como 1-20 residuos de aminoácidos, por ejemplo 1-10 residuos de aminoácidos y de preferencia 1-6 residuos de aminoácidos, tal como 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, agregados en el extremo amino terminal, en el extremo carboxi-terminal, o tanto en el extremo amido-terminal como el extremo carboxi-terminal de la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido.
Los residuos de aminoácidos pueden o no cambiar, alterar o de otra manera influir en las propiedades (biológicas) de la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido de la invención y pueden o no agregar una funcionalidad adicional a la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido. Por ejemplo,, estos residuos de aminoácidos: a) Pueden comprender un residuo Met N-terminal, por ejemplo como resultado de la expresión en una célula hospedera heterologa u organismo hospedero. b) pueden formar una secuencia de señal o secuencia líder que dirige la secreción de la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptidos a partir de una célula hospedera con la síntesis. Los péptidos líderes secretorios adecuados serán evidentes para el experto, y se pueden describir adicionalmente en la presente. Usualmente, esta secuencia líder se enlazará al término N de la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido, aunque la invención en su sentido más amplio no se limita al mismo; c) pueden formar una secuencia o señal que permita que la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido se dirija hacia y/o penetre o ingrese en los órganos tejidos, células, o partes o compartimientos de células específicos, y/o que permita que la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o polipéptido penetre o cruce una barrera biológica tal como una membrana celular, una capa celular tal como una capa de células epiteliales, un tumor incluyendo tumores sólidos, o la barrera hematoencefálica . Los ejemplos de estas secuencias de aminoácidos serán evidentes para el experto. Algunos ejemplos no limitantes son vectores de péptidos pequeños ("vectores Pep-trans") descritos en la WO 03/026700 y en Temsamani et al., Expert Opin. Biol. Ther.f 1, 773 (2001); Temsamani and Vidal, Drug Discov. Today, 9, 1012 (004) and Rousselle, J. Pharmacol. Exp. Ther., 296, 124-131 (2001), y la secuencias translocadora de membranas descrita por Zhao et al., Apoptosis, 8, 631-637 (2003) . Las secuencias de aminoácido C-terminales y N-terminales para la dirección intracelülar de fragmentos de anticuerpos por ejemplo se describen por Cardinale et al., Methods, 34, 171 (2004). Otras técnicas adecuadas para dirección intracelülar implican la expresión y/o uso de los denominados "intra-cuerpos" que comprenden una secuencia de aminoácidos, un Nanobody, un compuesto o un polipéptido de la invención, como se mencionará más adelante; d) pueden formar una "marca", por ejemplo una secuencia de aminoácidos o residuo que permita o facilite la purificación de la secuencia de aminoácidos, el Nanobody, compuesto o polipéptido, por ejemplo utilizando técnicas de afinidad dirigidas contra la secuencia o residuo. Después de esto, la secuencia o el residuo se pueden eliminar (por ejemplo mediante segmentación química o enzimática) para proporcionar la secuencia de aminoácidos, el Nanobody, el compuesto o el polipéptido (para este fin, la marca se puede enlazar opcionalmente a la secuencia de aminoácidos, Nanobody, compuesto o la secuencia polipéptidos vía una secuencias enlazante segmentable o contener un ! motivo segmentable) . Algunos ejemplos preferidos aunque no limitantes, de estos residuos son múltiples residuos de histidina, residuos de glutatión y una marca myc tal como AAAEQKLISEEDLNGAA (SEC ID NO: 100); e) pueden ser uno o más residuos de aminoácidos que se hayan funcionalizado y/o que puedan servir Como un sitio para la unión de grupos funcionales. Los residuos de aminoácidos adecuados y los grupos funcionales pueden ser evidentes para el experto e incluyen, de manera enunciativa, los residuos de aminoácidos y grupos funcionales mencionados en la presente para los derivados de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, compuestos o polipéptidos de la invención.
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos y ácidos nucleicos de la invención se pueden preparar de una forma conocida per se, como será evidente para el experto a partir de la descripción adicional en la presente. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipetidos de la invención se pueden preparar de cualquier forma conocida per se para la preparación de anticuerpos y en particular para la preparación de fragmentos de anticuerpos (incluyendo de manera enunciativa anticuerpos de dominio (individual) y fragmentos ScFv) . Algunos métodos preferidos, aunque no limitantes, para preparar la secuencia de aminoácidos Nanobodies, polipéptidos y ácidos nucleicos incluyen los métodos y técnicas descritos en la presente.
Como será evidente para el experto, un método particularmente útil para preparar una secuencia de aminoácidos, Nanobody y/o polipéptido de la invención en general comprende los pasos de: La expresión, en una célula hospedera adecuada u organismo hospedero (también denominado en la presente como un "hospedero de la - invención") o en otro sistema de expresión adecuado de un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la invención (también denominado en la presente como "ácido nucleico de la invención"), opcionalmente seguido por: Aislamiento y/o purificación de la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la invención asi obtenido.
En particular, este método puede comprender los pasos de: Cultivar y/o mantener un hospedero : de la invención bajo condiciones que sean tales que el hospedero de la invención exprese y/o produzca al menos una secuencia de aminoácidos, un Nanobody y/o un polipéptido de la invención; opcionalmente seguido por: Aislamiento y/o purificación de la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la invención asi obtenido .
Por consiguiente, la presente invención también se relaciona a una secuencia de ácido nucleico o nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos, un Nanobody, un polipéptido o una estructura monovalente de la invención (también denominado como "ácido nucleico de la invención" o "secuencia de nucleótidos de la invención") . Un ácido nucleico de la invención puede estar en la forma de ADN o ARN de cadena individual o doble, y de preferencia está en la forma de ADN de doble cadena. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden ser ADN genómico, : ADNc O ADN sintético (tal como ADN con un uso de codon.es que específicamente se haya adaptado para la expresión en la célula hospedera destinada u organismo hospedero) .
De acuerdo con una modalidad de la invención, el ácido nucleico de la invención está en forma esencialmente aislada, como se define en la presente. El ácido nucleico de la invención también puede estar en la forma de, estar presente en y/o ser parte de un vector, tal como por ejemplo un plásmido, cósmido o YAC que nuevamente puede estar en forma esencialmente aislada.
Los ácidos nucleicos de la invención se , pueden preparar u obtener de una forma conocida per se, con ;base en la información sobre las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies y/o polipéptidos de la invención proporcionados en la presente, y/o se pueden aislar de una fuente natural adecuada. También, como será evidente para el experto, para preparar un ácido nucleico de la invención, también diversas secuencias de nucleótidos, tales como al menos una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos o Nanobody y por ejemplo los ácidos nucleicos que codifican para uno o más enlazantes se pueden enlazar conjuntamente de una forma adecuada.
Las técnicas para generar los ácidos nucleicos de la invención serán evidentes para el experto y por ejemplo pueden incluir, de manera enunciativa, síntesis automatizada de ADN; mutagénesis sitio-dirigidas; combinación de dos o más secuencias que se presentan en la naturaleza y/o sintéticas (o dos o más partes de las mismas) , la introducción de mutaciones que conduzcan a la expresión de un producto de expresión truncado; la introducción de uno o más sitios de restricción (por ejemplo para crear casetes y/o regiones que se puedan digerir fácilmente y/o ligar utilizando enzimas de restricción adecuadas), y/o la introducción de mutaciqnes por medio de una reacción PCR utilizando uno o más cebadores "mal apareados". Estas y otras técnicas serán evidentes para el experto, y nuevamente se hace referencia a los manuales estándar, tales como Sambrook et al. and Ausubel ét al., mencionados anteriormente, asi como también a los ejemplos más adelante.
El ácido nucleico de la invención también puede estar en la forma de, estar presente en y/o ser parte de una estructura genética, como será evidente para el experto. Estas estructuras genéticas en general comprenden al menos un ácido nucleico de la invención que se enlaza opcionalmente a uno o más elementos de las estructuras genéticas conocidas per se, tales como por ejemplo uno o más elementos reguladores adecuados (tales como promotores adecuados, intensificadores, terminadores, etc.) y los elementos adicionales de las estructuras genéticas a las que se hizo referencia en la presente. Estas estructuras genéticas que comprenden al menos un ácido nucleico de la invención también se denominarán en la presente como "estructuras genéticas de la invención".
Las estructuras genéticas de la invención pueden ser ADN o ARN, y de preferencia son ADN de doble cadena. Las estructuras genéticas de la invención también pueden estar en una forma adecuada para la transformación de la célula hospedera destinada u organismo hospedero, en una forma adecuada para la integración en el ADN genómico de la¡ célula hospedera destinada o en una forma adecuada para una replicación independiente, mantenimiento y/o herencia en el organismo hospedero destinado. Por ejemplo, las estructuras genéticas de la invención pueden estar en la forma: de un vector, tal como por ejemplo un plásmido, cósmido, YAC, un vector viral o transposón. En particular, el vector puede ser un vector de expresión, es decir un vector que pueda proporcionar la expresión in vitro y/o in vivo (por ejemplo en una célula hospedera adecuada, un organismo hospedero y/o un sistema de expresión) .
En una modalidad preferida aunque no limitante, una estructura genética de la invención comprende: a) Al menos un ácido nucleico de la invención; conectado funcionalmente a b) uno o más elementos reguladores, tales como un promotor y opcionalmente un terminador adecuado; y opcionalmente también c) uno o más elementos adicionales de estructuras genéticas conocidos per se; en los cuales los términos "elemento regulador", "promotor", "terminador" y "conectado funcionalmente" tienen su significado usual en la técnica (como se describe adicionalmente en la presente) ; y en los cuales los "elementos adicionales" presentes en las estructuras genéticas por ejemplo pueden ser secuencias 3'- o 5'-UTR, secuencias líder, marcadores de selección, marcadores de expresión/genes reporteros, y/o elementos que , puedan facilitar o aumentar (la eficiencia de) la transformación o integración. Estos y otros elementos adecuados de estas estructuras genéticas serán evidentes para el experto, y por ejemplo pueden depender del tipo de estructura utilizado, la célula hospedera destinada o el organismo hospedero; la forma en la cual la secuencias de nucleótidos de la invención de interés se expresarán (por ejemplo, vía una expresión constitutiva, transitoria o inducible) ; y/o la técnica de transformación que se utilizará. Por ejemplo, las secuencias reguladoras, promotores y terminadores conocidos per se para la expresión y producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (incluyendo de manera enunciativa anticuerpos de dominio (individual) y fragmentos ScFv) se pueden utilizar en una forma esencialmente análoga.
De preferencia, en las estructuras genéticas de la invención, al menos un ácido nucleico de la invención y los elementos reguladores, y opcionalmente uno o más elementos adicionales, se "enlazan funcionalmente" lo cual en general significa que están en una relación funcional entre :si. Por ejemplo, un promotor se considera "enlazado funcionalmente" a una secuencias codificante si el promotor es capaz de iniciar o de otra manera controlar/regular la transcripción , y/o la expresión de una secuencias codificante (en la cual la secuencia codificante se debe entender que estará "bajo el control de" el promotor) . En general, cuando se enlazan funcionalmente dos secuencias de nucleótidos, las mismas estarán en la misma orientación y por lo general también en el mismo marco de lectura. Las mismas por lo general también estarán esencialmente contiguas, aunque puede que esto tampoco no se requiera.
De preferencia, los elementos reguladores y adicionales de las estructuras genéticas de la invención son tales que son capaces de proporcionar su función biológica destinada en la célula hospedera destinada u organismo hospedero.
Por ejemplo, un promotor, intensificador o terminador deberá ser "funcional" en la célula hospedera destinada u organismo hospedero lo cual significa que (por ejemplo) el promotor debe ser capaz de iniciar o de otra manera controlar/regular la transcripción y/o la expresión de una secuencia de nucleótidos -por ejemplo una secuencias codificante- a la cual sé enlaza funcionalmente (como se define en la presente) .
Algunos promotores particularmente preferidos incluyen, de manera enunciativa, los promotores conocidos per se para la expresión en las células hospederas mencionadas en la presente; y en particular los promotores para la expresión en las células bacterianas, tales como aquellas mencionadas en la presente y/o aquellos utilizadas en los ejemplos; Un marcador de selección debe ser tal que permita -es decir bajo condiciones de selección adecuadas- que las células hospederas y/u organismos hospederos se hayan transformado (exitosamente) con la secuencia de nucleótidos de la invención que se distinguirá de las células hospederas/organismos que no se hayan transformado (exitosamente) . Algunos ejemplos preferidos aunque no limitantes, de estos marcadores son los genes que proporcionan resistencia contra antibióticos (tales como, canamicina o ampicilina) , los genes que proporcionan resistencia a la temperatura, o los genes que permiten que la célula hospedera u organismo hospedero se mantenga en ausencia de ciertos factores, compuestos y/o componentes (alimenticios) en el medio que son esenciales para la supervivencia de las células no transformadas u organismos.
Una secuencias líder debe ser tal que -en la célula hospedera destinada u organismo hospedero- permita que las modificaciones pos-traduccionales deseadas y/o de tal forma que dirija el ARNm transcrito a una parte deseada u organelo de una célula. Una célula líder también puede permitir la secreción del producto de expresión de la célula. Como tal, la secuencias líder puede ser cualquier pro-, pre-, o prepro-secuencia funcional en la célula hospedera u organismo hospedero. Las secuencias líder puede que no se requieran para la expresión en una célula bacteriana. Por ejemplo, las secuencias líder conocidas per se para la expresión y producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (incluyendo de manera enunciativa anticuerpos de dominio individual y fragmentos ScFv) se pueden utilizar de una manera esencialmente análoga.
Un marcador de expresión o gen reportero deben ser tales que -en la célula hospedera u organismo hospedero-permita la detección de la expresión de (un gen o secuencias de nucleótido presente en) la estructura genética. Un marcador de expresión opcionalmente también puede permitir la localización del producto expresado, por ejemplo, en una parte específica u organelo de una célula y/o en (a) células específicas, tejidos, órganos o partes de un organismo multicelular. Estos genes reporteros también se 1 pueden expresar como una fusión de proteínas con la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o el polipéptido de la invención. Algunos ejemplos preferidos, aunque no limitantes, incluyen proteínas fluorescentes tales como GFP.
Algunos ejemplos preferidos aunque no limitantes, de promotores adecuados, un terminador y el'ementos adicionales incluyen aquellos que se pueden utilizar para la expresión en las células hospederas mencionadas en la presente; y en particular aquellas que sean adecuadas para la expresión en células bacterianas, tales como aquellas mencionadas en la presente y/o aquellas utilizadas en los ejemplos más adelante. Para ejemplos (adicionales) no limitantes de los promotores, marcadores de selección, secuencias líder, marcadores de expresión y elementos adicionales que puedan estar presentes/utilizarse en las estructuras genéticas de la invención -tales como terminadores, intensificadores transcripcionales: y/o traduccionales y/o factores de integración- se hace referencia a los manuales generales tales como Sambrook et al. And Ausubel et al. mencionados anteriormente, así como también a los ejemplos que se proporcionan en la WO 95/07463, la WO 96/23810, la WO 95/07463, la WO 95/21191, la WO 97/11094, la WO 97/42320, la WO 98/06737, la WO 98/21355, la US 7,207,410, la US 5,693,492 y la EP 1085089. Otros ejemplos serán evidentes para el experto. También se hace referencia a la técnica antecedente general citada anteriormente y las referencias adicionales citadas en la presente.
Las estructuras genéticas de la invención en general se pueden proporcionar al carecer adecuadamente de las secuencias de nucleótidos de la invención para uno o más elementos adicionales descritos anteriormente, por ejemplo utilizando las técnicas descritas en los manuales generales tales como Sambrook et al. And Ausubel et al., mencionadas anteriormente .
Con frecuencia, las estructuras genéticas de la invención se obtendrán al insertar una secuencia de nucleótidos de la invención en un vector (de expresión) adecuado conocido per se. Algunos ejemplos preferidos, aunque no limitantes, de vectores de expresión adecuados son aquellos utilizados en los ejemplos más adelante, asi como también aquellos mencionados en la presente.
Los ácidos nucleicos de la invención y/o las estructuras genéticas de la invención se pueden utilizar para transformar una célula hospedera u organismo hospedero, es decir para la expresión y/o producción de la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o polipéptido de la invención. Los hospederos adecuados de células hospederas serán evidentes para el experto, y por ejemplo pueden ser cualquier célula fungal, procariota o eucariota adecuada, o línea celular o cualquier organismo fungal, procariota o eucariota adecuado, por ejemplo: Una cepa bacteriana, incluyendo de : manera enunciativa cepas gram-negativas tales como las cepas de Escherichia coli; de Proteus, por ejemplo de Proteus mirabilis; de Pseudomonas, por ejemplo de Pseüdomonas fluorescens; y las cepas gram-positivas tales como las cepas de Bacillus, por ejemplo de Bacillus subtilis o de Bacillus brevis; de Streptomyces, por ejemplo de Streptomyces lividans; de Staphylococcus, por ejemplo de Staphylococcus carnosus; y de Lactococcus, por ejemplo de Lactococcus lactis; una célula fungal, que incluye de manera enunciativa las células provenientes de las especies de Trichoderma , por ejemplo de Trichoderma reeséi; de Neurospora , por ejemplo de Neurospora crassa; de So.rdaria, por ejemplo de Sordaria macrospora; de Aspergillus, por ejemplo de Aspergillus niger o de Aspergillus sojae; o a partir de otros hongos filamentosos; - una célula de levadura, incluyendo de manera enunciativa células provenientes de la especie de Saccharomyces, por ejemplo de Saccharomyces cerevisiae,- de Schizosaccharo yces, por ejemplo de Schizosaccharomyces po be; de Pichia, por ejemplo de Pichia pastoris o de Pichia methanolica; de Hansenula , por ejemplo de Hansenula polymorpha; de Kluyveromyces, por ejemplo de Kluyveromyces lactis; de Arxula, por ejemplo de Arxula adeninivorans; de Yarrowia, por ejemplo de Yarrowia lipolytica; una célula de anfibio o linea celular, tal como Xenopus oocytes; una célula derivada de insecto o; linea celular, tal como las células/lineas celulares derivadas de lepidópteros, incluyendo de manera enunciativa células SF9 y Sf21 de Spodoptera o células/lineas celulares derivadas de Drosophila, tales como células de Schneider y Kc; una planta o célula vegetal, por ejemplo en plantas de tabaco; y/o una célula mamifera o linea celular, por ejemplo una célula o linea celular derivada de un ser humano, una célula o una linea celular derivada de mamíferos incluyendo de manera enunciativa células CHO, células BHK (por ejemplo, células BHK-21) y células humanas o líneas celulares tales como HeLa, COS (por ejemplo COS-7) y células PER.C6; así como también otros hospederos o células hospederas conocidas per se para la expresión y producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (incluyendo de manera enunciativa anticuerpos del dominio (individual) y fragmentos ScFv) lo cual será evidente para el experto. También se hace referencia a la técnica antecedente general citada anteriormente, asi como también por ejemplo a la WO 94/29457; la WO 96/34103; la WO 99/42077; Frenken et al. (1998, Res. Immunol. 149(6): 589-99), Riechmann and Muyldermans (1999, J. Immunol. Methods, 231(1-2): 25-38), van der Linden (2000, J. Biotechnol. 80(3): 261-70), Joosten et al. (2003, Microb. Cell Fact. 2(1): 1), Joosten et al. (2005, Appl. Microbiol. Biotechnol. 66(4): 384-92.); y las referencias adicionales citadas en la presente.
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la invención también se pueden introducir y expresar en una o más células, tejidos u órganos de un organismo multicelular, por ejemplo para fines profilácticos y/o terapéuticos (por ejemplo, como una terapia génica) . Para este fin, las secuencias de nucleótidos de la invención se pueden introducir en las células o tejidos de cualquier forma adecuada, por ejemplo tal como (por ejemplo, utilizando liposomas) o después de que se hayan insertado en un vector para terapia génica adecuada (por ejemplo, derivado de retrovirus tales como adenovirus, o parvovirus tales como virus adeno-asociado) . Como también será evidente para el experto, esta terapia génica se puede realizar in vivo y/o in situ en el cuerpo de un paciente al administrar un ácido nucleico de la invención o un vector para terapia génica adecuada que codifica para el mismo al paciente o a células especificas o un tejido especifico u órgano del paciente; o las células adecuadas (con frecuencia extraídas del; cuerpo del paciente que será tratado, tal como linfocitos explantados, aspirados de médula ósea o biopsias de .tejido) se pueden tratar in vitro con una secuencia de nucleótidos de la invención y luego se pueden (re-) introducir adecuadamente en el cuerpo del paciente. Todo esto se puede realizar utilizando vectores para terapia génica, las técnicas y sistemas de suministro que son bien conocidos por el experto, y por ejemplo se describen en Culver K. W. (1994/ "Gene Therapy", p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y), Giordano (1996, Nature F Medicine 2: 534-539), Schaper (1996, Circ. Res. 79: 911-919), Anderson (1992, Science 256: 808-813), Verma (1994, Nature 389: 239); Isner (1996, Lancet 348: 370-374), Muhlhauser (1995, Circ. Res. 77: 1077-1086); Onodera (1998, Blood 91: 30-36); Verma; (1998, Gene Ther. 5: 692-699); Nabel (1997, Ann. N.Y. Acad, Sci., 811: 289-292), Verzeletti (1998, Hum. Gene Ther. 9: 2243-51); Wang 1996, Nature Medicine 2: 714-716), WO 94/29469, WO 97/00957, US 5,580,859, o Schaper (1996, Current Opinión in Biotechnology 7: 635-640). Por ejemplo, la expresión in situ de fragmentos ScFv (Afanasieva et al. (2003, Gene Ther., 10: 1850-1859) and of diabodies (Blanco et al., 2003, J. Immunol., 171: 1070-1077) se ha descrito en la técnica.
Para la expresión de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies o polipéptidos en una célula, los mismos también se pueden expresar como los denominados "intra-cuerpos", como se describe por ejemplo en la O 94/02610, la O 95/22618, la US 7, 004, 940, la WO 03/014960, en Cattaneo A. and Biocca S. (1997, Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag) and in Kontermann (2004, Methods 34: 163-170).
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la invención por ejemplo también se1 pueden producir en la leche de mamíferos transgénicos, por :ejemplo en la leche de conejos, vacas, cabras u ovejas (véase por ejemplo la US 6, 741, 957, la US 6,304, 489 y la US 6, 849,992 para las técnicas generales para introducir transgénes en mamíferos) , en plantas o partes de plantas incluyendo de manera enunciativa sus hojas, flores, frutas, semilla, raíces o tubérculos (por ejemplo en tabaco, maíz, soya o alfalfa) o por ejemplo en las pupas del gusano de seda Bombix mori.
Además, las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies y los polipéptidos de la invención también se pueden expresar y/o producir en sistemas de expresión! libres de células, y los ejemplos adecuados de estos sistemas serán evidentes para el experto. Algunos ejemplos preferidos, aunque no limitantes, incluyen la expresión en el sistema de germen de trigo; en Usados de reticulocitos de conejo; o en el sistema de E. coli de Zubay.
Como se mencionó anteriormente, una de las entajas del uso de Nanobodies es que los polipéptidos con base, en los mismos se pueden preparar a través de la expresión en un sistema bacteriano adecuado, y los sistemas de expresión bacteriana adecuados, vectores, células hospederas, elementos reguladores, etc., serán evidentes para el experto, por ejemplo, a partir de las referencias citadas anteriormente. Sin embargo, se debe observar que la invención en su sentido más amplio no se limita a la expresión en sistemas bacterianos.
De preferencia, en la invención, un sistema de expresión (in vivo o in vitro) tal como un sistema de expresión bacteriana, se utiliza y proporciona a los polipéptidos de la invención en una forma que sea adecuada para uso farmacéutico, y estos sistemas de expresión nuevamente serán evidentes para el experto. También será evidente para el experto, que los polipéptidos de la invención adecuados para uso farmacéutico se pueden preparar utilizando técnicas para síntesis de péptidos.
Para producción a escala industrial, los hospederos heterólogos preferidos para la producción (industrial) de Nanobodies o terapéuticos de proteina que contengan Nanobody incluyen cepas de E. coli, Pichia pastoris , S. cerevisiae que son adecuadas para la expresión/producción/fermentación a gran escala, y en particular para la expresión/producción/fermentación farmacéutica a gran ¡escala. Los ejemplos adecuados de estas cepas serán evidentes ¡para el experto. Estas cepas y los sistemas para producción/expresión también están disponibles por compañías tales como Biovitrum (Uppsala, Suecia) .
Alternativamente, las líneas celulares de mamíferos, en particular células ováricas de hámster chino (CHO) , se pueden utilizar para la expresión/producción/fermentación a gran escala, y en particular para la expresión/producción/fermentación farmacéutica a gran escala. Nuevamente, estos sistemas de expresión/producción también están disponibles por algunas de las compañías mencionadas anteriormente.
La elección del sistema de expresión específico podría depender en parte del requerimiento para ciertas modificaciones pos-traduccionales, más específicamente glucosilación . La producción de una proteína recombinante que contiene Nanobody para la cual se desea o requiere la i glucosilación podrían necesitar el uso de hospederos de expresión de mamíferos que tengan la capacidad de glucosilar la proteína expresada. Con respecto a esto, será evidente para el experto que el patrón de glucosilación obtenido (es decir, el tipo, número y posición de residuos unidos) dependerá de la célula o línea celular que se utilice para la expresión. De preferencia, se utiliza ya sea una' célula humana o una línea celular (es decir, que conduzca a una proteína que esencialmente tiene un patrón de glucosilación humano) o se utiliza otra línea celular de mamífero que pueda proporcionar un patrón de glucosilación que sea esencial y/o funcionalmente el mismo que la glucosilación humana o que imite la glucosilación humana. En general, los hospederos procariotas tales como E. coli no tienen la capacidad de glucosilar proteínas, y el uso de eucariotas menores tales como levadura por lo general conduce a un patrón de glucosilación que difiere de la glucosilación humana. No obstante, se debe entender que todas las células hospederas anteriores y los sistemas de expresión se pueden expresar en la invención, dependiendo de la secuencia deseada de aminoácidos, el Nanobody o el polipéptido que será obtenido.
De eta forma, de acuerdo con una modalidad no limitante de la invención, se glucosila la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o polipéptido de la invención. De acuerdo con otra modalidad no limitante de la invención, no se glucosila la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o el polipéptido de la invención.
De acuerdo con otra modalidad no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, el Nanobody ó el se polipéptido de la invención se produce en una célula bacteriana, en particular una célula bacteriana adecuada para producción farmacéutica a gran escala, tales las células de las cepas mencionadas anteriormente.
De acuerdo con otra modalidad no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o el polipéptido de la invención se produce en una célula de levadura, en particular una célula de levadura adecuada para una producción farmacéutica a gran escala, tales como las células de las especies mencionadas anteriormente.
Todavía de acuerdo con otra modalidad no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o el polipéptido de la invención se produce en una célula de mamífero, en particular en una célula de un ser humano o en una célula de línea celular humana, y más en particular en una célula de un ser humano o como las líneas celulares mencionadas anteriormente en una célula de una línea celular humana que es adecuada para la producción farmacéutica a gran escala.
Cuando se utiliza la expresión en una célula hospedera para producir las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies y los polipéptidos de la invención, las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies y los polipéptidos de la invención se pueden producir ya sea intracelularmente (por ejemplo en el citosol, en el periplasma o en cuerpos de inclusión) y luego se aisla de las células hospederas y opcionalmente se purifica adicionalmente; o se puede producir extracelularmente (por ejemplo en el medio en el cual se cultivan las células hospederas) y luego se aisla del medio de cultivo y opcionalmente se purifica adicionalmente., Cuando se utilizan células eucariotas, se prefiere en general la producción extracelular debido a que esto facilita considerablemente el aislamiento adicional y el procesamiento en la dirección 3' de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos y proteínas obtenidos. Las células bacterianas tales como las cepas de E. coli mencionadas anteriormente normalmente no secretan proteínas extracelularmente, excepto para unas cuantas clases de proteínas tales como toxinas y hemolisina, y la producción secretora en E. coli se refiere a la translocación de proteínas a través de la membrana interna hacia el espacio periplásmico. La producción periplásmica proporciona diversas ventajas con respecto a la producción citosólica. Por ejemplo, la secuencia de aminoácido N-terminal del producto secretado puede ser idéntica al producto génico natural después de la segmentación de la secuencia de señal de secreción mediante una peptidasa de señal especifica. También, parece haber mucho menos actividad de proteasa en el periplasma que en el citoplasma. Además, la producción de proteínas es más simple debido a proteínas contaminantes menores en el periplasma. Otra ventaja es que los enlaces disulfuro correctos se pueden formar debido a que el periplasma proporciona un entorno más oxidativo que el citoplasma. La sobre-expresión de proteínas en E. coli con frecuencia encontrado en agregados insolubles, se denominan ? cuerpos de inclusión. Estos cuerpos de inclusión se pueden ubicar en el citosol o en el periplasma; la recuperación de proteínas biológicamente activas a partir de estos cuerpos de inclusión requiere un proceso de desnaturalización/repliegue. Muchas proteínas recombinantes , incluyendo proteínas terapéuticas, se recuperan de los cuerpos de inclusión. Alternativamente, como será evidente para el experto, se pueden utilizar las cepas recombinantes de bacterias , que se hayan modificado genéticamente para secretar una proteína deseada, y en particular una secuencia de aminoácidos, Nanobody o un polipéptido de la invención.
De esta forma, de acuerdo con una modalidad no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o el polipéptido de la invención es una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido que se haya producido intracelularmente y que se haya aislado de la ; célula hospedera, y en particular de una célula bacteriana o de un cuerpo de inclusión en una célula bacteriana. De acuerdo con otra modalidad no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o polipéptido de la invención1 es una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido que se haya producido extracelularmente, y que se haya aislado del medio en el cual se cultivo la célula hospedera.
Algunos promotores preferidos, aunque no limitante, para utilizarse con estas células hospederas incluyen, para la expresión en el promotor de E. coli: lac (y derivados del mismo tales como el promotor lacUV5) ; el promotor de arabinosa; el promotor hacia la izquierda, (PL) y hacia la derecha (PR) del fago lambda; el promotor del operón trp; los promotores híbridos lac/trp (tac y trc) ; el promotor T7 (más específicamente que del gen 10 del fago T7) y otros promotores del fago T; el promotor del gen de resistencia a tetraciclina TnlO; las variantes diseñadas por ingeniería de los promotores anteriores que incluyen una o más copias de una secuencias operadora reguladora extraña; para la expresión en S. cerevisiae: constitutivo: ADH1 (deshidrogenasa 1 alcohólica) , ENO (enolasa) , CYC1 (citocromo c iso-1), GAPDH (gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa) , PGK1 ( fosfogliceratos quinasa) , PYK1 (piruvatos quinasa) ; regulado: GAL1,10,7 (enzimas metabólicas de galactosa) , ADH2 (deshidrogenasa 2 alcohólica);, PH05 (fosfatasa ácida) , CUP1 (metalotioneina de cobre); heterólogos: CaMV (promotor de virus mosaico 35S de coliflor) ; para la expresión en Pichia pastoris: el promotor A0X1 (oxidasa 1 alcohólica) ; para la expresión en células mamiferas: citomegalovirus humano (hCMV) intensificador/promotor inmediatamente anterior; citomegalovirus humano (hCMV) variante del promotor inmediatamente anterior que contiene dos secuencias operadoras de tetraciclina de tal forma que el promotor se puede regular mediante el represor Tet; promotor de timidina quinasa (TK) del Virus de Herpes Simplex; intensificador/promotor de repetición terminal larga del Virus de Sarcoma Rous (RSV LTR) ; promotor del factor la de alargamiento (hEF-lcc) proveniente de humano, chimpancé,, ratón o rata; el promotor SV40 anterior; el promotor de repetición terminal larga de VIH-1; el promotor de ß-actina; algunos vectores preferidos, aunque no limitante, para utilizarse con estas células hospederas incluyen: Vectores para expresión en células mamiferas: pMAMneo (Clontech) , pcDNA3 ( Invitrogen) , pMClneo (Stratagene) , pSG5 (Stratagene) , EB0-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-M Tneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC37199) , pRSVneo (ATCC37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) and 1ZD35 (ATCC 37565), asi t como también los sistemas de expresión de base viral, tales como aquellos de base en adenovirus; vectores para expresión en células bacterianas: vectores pET (Novagen) y vectores pQE (Qiágen) ; vectores para expresión en levadura ú otras células fúngales: pYES2 (Invitrogen) y vectores para expresión de Pichia (Invitrogen); vectores para expresión en células de insecto: pBlueBacII (Invitrogen) y otros vectores de baculovirus; vectores para expresión en plantas o células vegetales: por ejemplo vectores con base en el virus mosaico de coliflor o el virus mosaico de tabaco, cepas adecuadas de Agrobacterium, o vectores a base del plásmido Ti.
Algunas secuencias secretoras preferidas, aunque no limitante, para utilizarse en estas células hospederas incluyen: Para uso en células bacterianas tales como E. coli: PelB, Bla, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, StlI, PhoA, PhoE, MalE, Lpp, LamB, y lo semejante; el péptido señal TAT, la señal para secreción C-terminal de hemolisina; para uso en levadura: prepro-secuencia del factor de unión cc-fosfatasa (phol) , invertasa (Suc), etc.; para uso en células mamiferas: señal autóctona en el caso de la proteina blanco es de origen eucariota; el péptido de señal V-J2-C de la cadana k de Ig murino; etc.
Las técnicas adecuadas para transformar un hospedero o célula hospedera de la invención se harán evidentes para el experto y pueden depender de la célula hospedera/organismo hospedero destinado y la estructura genética que se utilizará. Nuevamente se hace referencia a los manuales y solicitudes anteriores mencionadas anteriormente .
Después de la transformación, se puede realizar un paso para detectar y seleccionar aquellas células hospederas u organismos hospederos que se hayan transformado exitosamente con la secuencia de nucleótidos/estructura genética de la invención. Por ejemplo, este puede ser un paso de selección con base en un marcador seleccionable presente en la estructura genética de la invención o un paso que implique la detección de la secuencia de aminoácidos de la invención, por ejemplo utilizando anticuerpos específicos.
La célula hospedera transformada (que puede estar en la forma de una línea celular estable) o los organismos hospederos (que pueden estar en la forma de una línea mutante estable o cepa) forman aspectos adicionales de la presente invención. : De preferencia, estas células hospederas u organismos hospederos son tales que se expresan, o (al menos) son capaces de expresar (por ejemplo bajo condiciones adecuadas) , una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la invención (y en el caso de un organismo hospedero: en al menos una célula, parte, tejido u órgano del mismo) . La invención también incluye generaciones adicionales, progenie y/o descendiente de la célula hospedera u organismo hospedero de la invención que por ejemplo se pueda obtener mediante división celular o mediante reproducción sexual o asexual.
Para producir/obtener la expresión de las secuencias de aminoácidos de la invención, la célula hospedera transformada o el organismo hospedero transformado en general se puede conservar, mantener y/o cultivar bajo condiciones tales que se exprese/produzca la secuencia de aminoácidos (deseada) , Nanobody o polipéptido de la invención. Las condiciones adecuadas serán evidentes para el experto y por lo general dependerán de la célula hospedera/organismo hospedero utilizado, asi como también de los elementos reguladores que controlen la expresión de la secuencia de nucleótidos (relevante) de la invención.
Nuevamente, se hace referencia a los manuales y solicitudes de patente mencionadas anteriormente en los párrafos sobre las estructuras genéticas de la invención.
En general, las condiciones adecuadas ; pueden incluir el uso de un medio adecuado, la presencia j de una fuente adecuada de alimento y/o nutrientes adecuados,: el uso de una temperatura adecuada, y opcionalmente la presencia de un factor inductor adecuado o compuesto (por ejemplo,! cuando las secuencias de nucleótidos de la invención estén ¡bajo el control de un promotor inducible) ; todos se | pueden seleccionar por el experto. Nuevamente, bajo estas condiciones, las secuencias de aminoácidos de la invención se pueden expresar de una forma constitutiva, de una forma transitoria, o sólo cuando se induzcan adecuadamente.
También será evidente para el experto | que la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o el polipéptido de la invención (primero) se pueden generar en una forma inmadura (como se mencionó anteriormente) el cual luego se puede someter a modificación pos-traduccional , dependiendo de la célula hospedera/organismo hospedero utilizado. También, la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o el polipéptido de la invención se pueden glucosilar, nuevamente pendiendo de la célula hospedera/organismo hospedero utilizado.
La secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la invención luego se puede aislar de la , célula hospedera/organismo hospedero utilizado y/o del medio en el cual se cultivó la célula hospedera u organismo hospedero, utilizando técnicas de aislamiento y/o purificación de proteínas conocidas per se, tales como cromatografía (preparativa) y/o técnicas de electroforesis, técnicas de precipitación diferencial, técnicas de afinidad (por ejemplo, utilizando una secuencias de aminoácido específica, segmentable fusionada con la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la invención) y/o técnicas inmunológicas preparativas (es decir, utilizando anticuerpos contra la secuencia de aminoácidos que se aislará) .
En general, para uso farmacéutico, los polipéptidos de la invención se pueden formular como una preparación farmacéutica o composiciones que comprendan al menos una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido , de la invención y al menos un portador diluyente o excipiente y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos. Por medio de ejemplos no limitantes, esta formulación puede estar en una forma adecuada para administración oral, para administración parenteral (tal como mediante inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea o infusión intravenosa) , para administración tópica, para administración mediante inhalación, mediante un parche cutáneo, mediante un implante, mediante un supositorio, etc. Estas formas de administración adecuadas -que pueden ser sólidas,! semi-sólidas o líquidas, dependiendo la forma de administración-así como también los métodos y portadores para utilizarse en la preparación de los mismos, serán evidentes para el experto, y se describen adicionalmente en la presente.
De esta forma, en un aspecto adicional, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que contenga al menos un aminoácido de la invención, al menos un Nanobody de la invención o al menos un polipéptido de la invención y al menos un portador diluyente o excipiente adecuados, (es decir, adecuados para uso farmacéutico) , y opcionalmente una o más sustancias activas adicionales. En un aspecto particular, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que contenga la SEC ID NO: 70 y al menos un portador diluyente o excipiente adecuado (es decir, adecuado para uso farmacéutico) , y opcionalmente una o más sustancias activas adicionales. En otro aspecto particular, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que contenga la SEC ID NO: 71 y al menos un portador diluyente o excipiente adecuado (es decir adecuados para uso farmacéutico) , y opcionalmente una o más sustancias activas adicionales .
En general, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la invención se pueden formular y administrar de cualquier forma adecuadas conocidas por se para la cual por ejemplo se hace referencia a la técnica antecedente general citada anteriormente (y en particular a la WO 04/041862, la WO 04/041863, la WO 04/041865 y la WO 04/041867) asi como también a los manuales estándar, tales como Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. , Mack Publishing Company, USA (1990) or Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005) .
Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la invención se pueden formular y administrar de cualquier forma conocida per se para anticuerpos convencionales y fragmentos de anticuerpos (incluso los ScFv y diacuerpos) y otras proteínas farmacéuticamente activas. Estas formulaciones y métodos para preparar los mismos serán evidentes para el experto, y por ejemplo incluyen las preparaciones adecuada para administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraluminal, intra-arterial o intratecal) o para administración tópica (es decir, transdérmia o intradérmica ) .
Las preparaciones para la administración parenteral por ejemplo pueden ser soluciones, suspensiones, dispersiones o emulsiones estériles que sean adecuadas para infusión o inyección. Los portadores o diluyentes adecuados para estas preparaciones incluyen por ejemplo, sin limitación, agua estéril y amortiguadores acuosos y soluciones tales como solución salina fisiológica amortiguada con fosfato, soluciones Ringer, solución de dextrosa, y solución de Hank; aceites acuosos; glicerol; etanol; glicoles tales como propilenglicol o también aceites minerales, aceites animales y aceites vegetales, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soya, así como también mezclas adecuadas de los mismos. Por lo general, se preferirán las soluciones o suspensiones acuosas .
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la invención también se pueden administrar utilizando métodos de terapia génica par suministro. Véase, por ejemplo, la US 5,399,346 que se incorpora como referencia en su totalidad. Al utilizar un método de terapia génica para suministro, las células primarias transíectadas con la codificación génica, una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la invención se puede transfectar adicionalmente con promotores de tejido específicos hacia órganos específicos blanco, tejido, injertos, tumores, o células y adicionalmente se puede transfectar con una señal y secuencias de estabilización para una expresión localizada sub-celularmente .
De esta forma, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la invención se pueden administrar sistémicamente, por ejemplo, oralmente, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. Los mismos se pueden encerrar en cápsulas de gelatina dura o cubierta suave, se pueden comprimir en tabletas, o se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta del paciente. Para administración terapéutica oral, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la invención se pueden combinar con uno o más excipiéntes y utilizar en la forma de tabletas no digeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y lo semejante. Estas composiciones y preparaciones deben contener al menos 0.1% de la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la invención. Su porcentaje en las composiciones y preparaciones por supuesto se puede variar y convenientemente puede estar entre aproximadamente 2 hasta aproximadamente 60% en peso de una forma de dosificación unitaria determinada. La cantidad de la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la invención en estas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá un nivel efectivo de dosificación.
Las tabletas, trociscos, pildoras, cápsulas, y lo semejante también puede contener lo siguiente: aglutinantes tales como goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato de dicalcio; un agente desintegrante tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y lo semejante; un lubricante tal como estearato de magnesio; y agente edulcorante tal como sacarosa, fructosa, lactosa o aspartame o se puede agr.egar un agente saborizante tal como menta, aceite de gaultéria, o saborizante de cereza. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, esta puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido, tal como un aceite vegetal o un polietilenglicol . Pueden estar presentes otros diversos materiales como recubrimientos o para de otra manera modificar la forma física de la forma sólida de dosificación unitaria. Por ejemplo, las tabletas, pildoras, o cápsulas se pueden requerir con gelatina, cera, laca o azúcar y lo semejante. Un jarabe o elixir puede contener las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la invención, sacarosa o fructosa corno1 agente edulcorante, metilo y propilparabenos como conservadores, un tinte y un saborizante tal como sabor a cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado para preparar cualquier forma de dosificación unitaria debe ser farmacéuticamente aceptable y prácticamente no tóxico1 en las cantidades empleadas. Además, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la invención se pueden incorporar en preparaciones y dispositivos de liberación sostenida.
Las preparaciones o formulaciones para administración oral, también se pueden proporcionar ; con un recubrimiento entérico que proporcionará las estructuras de la invención para resistir el entorno gástrico y para que pasen en los intestinos. De manera más general, las preparaciones y formulaciones para administración oral se pueden formular adecuadamente para suministro en cualquier parte deseada del tracto gastrointestinal. Además, se pueden utilizar supositorios adecuados para el suministro y el tracto gastrointestinal.
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la invención también se pueden administrar intravenosa o intraperitonealmente mediante infusión o inyección. Las soluciones de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la invención o sus sales se pueden preparar en agua, o se pueden mezclar opcionalmente con un tensioactivo no tóxico. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, triacetina, y mezclas de los mismos y en aceite. Bajo condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para evitar el desarrollo de microorganismos.
Las formas farmacéuticas de dosificación adecuadas para inyección o infusión pueden incluir soluciónes o dispersiones acuosas estériles o polvos estériles que comprenden el ingrediente activo que se adaptarán para la preparación extemporánea de las soluciones o dispersiones inyectables o infusibles, opcionalmente encapsuladas, en el liposomas. En todos los casos, la forma de dosificación última debe ser estéril, fluida y estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. El portador o vehículo líquido puede ser un solvente o un medio de dispersión líquida, que comprende, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicoles líquidos, y lo semejante) , aceites vegetales, glicerilésteres no tóxicos, y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante la formación de liposomas, mediante el mantenimiento del tamaño requerido de partícula en el caso de las dispersiones o mediante el uso de tensioactivos . La prevención de la acción de microorganismos se puede ,obtener mediante diversos agentes antibacterianos y antihongos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido sórbico, timerosal, y lo semejante. En muchos casos, se preferirá incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, amortiguadores o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede obtener mediante el uso en las composiciones de agentes para retardar la absorción, por ejemplo, monoéstearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se preparan al incorporar las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la invención en la cantidad requerida en el solvente adecuado con los otros diversos ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguida por esterilización por filtro. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacio y liofilización, que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualesquiera ingredientes deseados adicionales presentes en las soluciones filtradas estériles anteriores.
Para administración tópica, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la invención se pueden aplicar en forma pura, es decir, cuando son líquidos. Sin embargo, en general será conveniente administrarlas a la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un portador dermatológicamente aceptable, que puede ser un sólido o un liquido.
Los portadores sólidos útiles incluyen sólidos divididos finamente tales como, talco, arcilla, celulosa microcristalina, sílice, alúmina y lo semejante. Los portadores líquidos adecuados incluyen agua, hidroxialquilo o glicoles o combinaciones de agua-alcohol/glicol, en las cuales las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies y los polipéptidos de la invención se pueden disolver o dispersar a niveles efectivos, opcionalmente con la ayuda de tensioactivos no tóxicos. Para optimizar las propiedades para un uso determinado se pueden agregar adyuvantes tales como fragancias y agentes antimicrobianos originales. Las composiciones líquidas resultantes se pueden aplicar a partir de tampones absorbentes, se pueden usar para impregnar vendajes y otros apositos, o rociar sobre el área afectada utilizando rociadores tipo bomba o aerosol.
También se pueden emplear espesantes tales como polímeros sintéticos, ácidos grasos, sales de ácido graso y ésteres, alcoholes grasos, celulosas modificadas o materiales minerales modificados con los portadores líquidos para1 formar pastas untables, geles, ungüentos, jabones, y lo sem jante, para aplicación directamente a la piel del usuario.
Los ejemplos de composiciones dermatológicas útiles que se pueden utilizar para suministrar las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la invención a la piel se conocen en la técnica; por ejemplo, véase, Jatiquet et al. (US 4,608,392), Geria (US 4,992,478), Smith et al. (US 4,559,157) and Wortzman (US 4,820,508).
Las dosificaciones útiles de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la invención se pueden determinar al comparar su actividad in vitro, y la actividad in vivo en modelos animales. Los métodos para la extrapolación de dosificaciones efectivas en ratones, y otros animales, a seres humanos se conocen en la técnica; por ejemplo, véase la US 4,938,949.
En general, la concentración de la secuencia de aminoácidos, los Nanobodies y los polipéptidos de la invención en una composición liquida, tal como una loción, será entre aproximadamente 0.1-25% en peso, de preferencia de aproximadamente 0.5-10% en peso. La concentración en una composición semi-sólida o sólida tal como un gel o un polvo será de aproximadamente 0.1-5% en peso, de preferencia aproximadamente 0.5-2.5% en peso.
La cantidad de las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies y los polipéptidos de la invención requeridos para utilizarse en el tratamiento variará no sólo con la secuencia de aminoácidos particular, el Nanobody o los polipéptidos seleccionados sino que también con la vía de administración, la naturaleza de la condición que será tratada y la edad y condición del paciente y por último quedará a discreción del médico o clínico que esté atendiendo. También la dosificación de las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies ; y los polipéptidos de la invención varía, dependiendo de la célula blanco, tumor, tejido, injerto, u órgano.
La dosificación deseada convenientemente se puede presentar en una dosificación individual tal como dosis divididas administradas a intervalos adecuados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más sub-dosis al dia. La sub-dosis misma se puede dividir adicionalmente, por ejemplo, en varias administraciones separadas aproximadamente discretas; tales como múltiples inhalaciones provenientes de un insuflador o mediante la aplicación de una pluralidad de gotas en el ojo. Un régimen de administración podría incluir un tratámiento diario, a largo plazo. Por "a largo plazo" se debe entender al menos dos semanas y de preferencia, varias semanas, meses, o años de duración. Las modificaciones necesarias én esta variación de dosificación se pueden determinar por un experto I en la técnica utilizado únicamente en la experimentación de rutina proporcionada en las enseñanzas de la presente. Véase, Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. La dosificación también se puede ajustar por el médico individual en caso de cualquier complicación .
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la prevención y/o tratamiento de al menos una enfermedad y/o trastornos relacionados con IL-6R, el, método comprende administrar, a un sujeto que necesita del, mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un Nanobody de la invención, de un polipéptido de la invención, de un compuesto de la invención, de una estructura de la invención y/o de una composición farmacéutica que los comprenda.
En el contexto de la presente invención, el término "prevención y/o tratamiento" no sólo comprende prevenir y/o tratar la enfermedad, sino que también en general comprende prevenir la aparición de la enfermedad, disminuir o invertir el progreso de la enfermedad, prevenir o disminuir el inicio de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, reducir y/o aliviar uno o más síntomas asociados con la enfermedad, reducir la gravedad y/o la duración de la enfermedad1 y/o de cualesquiera síntomas asociados con la misma y/o prevenir un aumento adicional en la gravedad de la enfermedad y/o cualesquiera síntomas asociados con la misma, prevenir, reducir o invertir cualquier daño fisiológico provocado por la enfermedad, y en general cualquier acción farmacológica que sea benéfica para el paciente que será tratado.
El sujeto que será tratado puede ser cualquier animal de sangre caliente, aunque en particular es un mamífero, y más particularmente un ser humano. Como será evidente para el experto, el sujeto que será tratado en particular será una persona que padece de, o está en riesgo de, las enfermedades y trastornos mencionados en la presente.
La invención se relaciona con un método para la prevención y/o tratamientos de al menos una enfermedad y/o trastorno que se asocia con IL-6, con IL-6R, con el complejo IL-6/IL-6R, con su actividad biológica o farmacológica, y/o con las trayectorias biológicas o la señalización en la cual están implicados IL-6, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R el método comprende administrar, al sujeto que necesita del mismo una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un Nanobody de la invención, de un polipéptido de la invención, de un compuesto de la invención, de una estructura de la invención y/o de una composición farmacéutica que comprende los mismos. En particular, la invención se relaciona con un método para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad y/o trastorno que se pueda prevenir y/o tratar mediante la modulando de IL-6, IL-6R, el complejo IL-6/IL-6R, su actividad biológica o farmacológica, y/o las trayectorias biológicas o la señalización en la cual está implicado IL-6, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R, el método comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un Nanobody de la invención, ; de un polipéptido, o de un compuesto de la invención, de una estructura de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprenda los mismos. En particular, la cantidad farmacéuticamente efectiva puede ser una dantidad que sea suficiente para modular IL-6, IL-6R, el complejo IL-6/IL-6R, su actividad biológica o farmacológica, y/o las trayectorias biológicas o la señalización en la cual están implicados IL-6. IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R.
La invención también se relaciona con un método para la prevención y/o tratamiento de al menos una enfermedad y/o trastorno que se pueda prevenir y/o tratar al administrar una secuencia de aminoácidos de la invención, un Nanobody de la invención o un polipéptido de la invención a un paciente, el método comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un Nanobody de la invención, de un polipéptido de la invención, de un compuesto de la invención, de una estructura de la invención y/o: de una composición farmacéutica que comprende el mismo.
Más en particularmente, la invención se relaciona con un método para la prevención y/o tratamiento de al menos una enfermedad y/o trastornos seleccionados del grupo que consiste de las enfermedades y trastornos listados1 en la presente, el método que comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un Nanobody de la invención, de un polipéptido de la invención, de un compuesto de la invención, de una estructura de la invención y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo.
En particular, la presente invención se relaciona con un método para la prevención y/o tratamiento de sepsis, diversas formas de cáncer, resorción ósea, osteoporosis, caquexia, psoriasis, glomerulonefritis proliferativa mesangial, sarcoma de Kaposi, linfoma relacionado con SIDA, y enfermedades inflamatorias, el método comprende administrar una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un Nanobody de la invención, de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo. Las diversas formas de cáncer se pueden seleccionar del grupo que consiste de enfermedad de mieloma múltiple (MM) , carcinoma de células renales (RCC) , leucemia de células en plasma, linfoma, trastorno B-linfoproliferativo (BLPD) , y cáncer de próstata. Las enfermedades inflamatorias se pueden seleccionar del grupo que consiste de artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil de aparición sistémica, hipergammaglobulinemia, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis múltiple, enfermedad de Castleman, IgM gammopatia, , mixoma cardiaco, asma, asma alérgico y diabetes mellitus dependiente de insulina autoinmune.
En otro aspecto particular, la presente invención se relaciona con un método para la prevención y/o tratamiento de sepsis, diversas formas de cáncer, resorción ósea, osteoporosis, caquexia, psoriasis, glomerulonefritis proliferativa mesangial, sarcoma de Kaposi, linfoma relacionado con SIDA, y enfermedades inflamatorias, el método comprende administrar una cantidad farmacéuticamente activa de la SEC ID NO: 70, y/o de una composición farmacéutica que comprende la misma. En otro aspecto particular, la presente invención se relaciona con un método para la prevención y/o sepsis, diversas formas de cáncer, resorción : ósea, osteoporosis, caquexia, psoriasis, glomerulonefritis proliferativa mesangial, sarcoma de Kaposi, linfoma relacionado con SIDA, y enfermedades inflamatorias, el: método comprende administrar una cantidad farmacéuticamente activa de la SEC ID NO: 71, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo. Las diversas formas de cáncer se pueden seleccionar del grupo que consiste de enfermedad de mieloma múltiple (M ) , carcinoma de células renales (RCC) , leucemia de células en plasma, linfoma, trastorno B-linfoproliferativo (BLPD) , y cáncer de próstata. Las enfermedades inflamatorias se pueden seleccionar del grupo que consiste de artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil de aparición sistémica, hipergammaglobulinemia, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, lupus eritematoso sistémico : (SLE) , esclerosis múltiple, enfermedad de Castleman, IgM gammopatia, mixoma cardiaco, asma, asma alérgico y diabetes mellitus dependiente de insulina autoinmune.
En otra modalidad, la invención se relaciona1 con un método para inmunoterapia, y en particular para inmunoterapia pasiva, el método comprende administrar, al sujeto que padece de o está en riesgo de la enfermedad y trastornos mencionados en la presente, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un Nanobody de la invención, de un polipéptido de la invención, de un compuesto de la invención, de una estructura de la invención y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo.
En los métodos anteriores, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos, compuestos y/o estructuras de la invención y/o las composiciones que comprenden los mismos se pueden administrar de cualquier forma adecuada, dependiendo de la formulación farmacéutica especifica o composición que se utilizará. De esta forma, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos, compuestos y/o estructuras de la invención y/o las composiciones que comprenden los mismos por ejemplo se pueden administrar oral, intraperitoneal (por ejemplo intravenosa, subcutánea, intramuscularmente, o via cualquier otra ruta de administración que rodee el tracto gastrointestinal), intranasal, transdérmia, tópicamente, por medio de un supositorio, mediante inhalación, nuevamente dependiendo de la formulación o composición farmacéutica especifica que se utilizará. El médico será capaz de seleccionar una via adecuada de administración y una formulación o composición farmacéutica adecuada que se utilizará en esta administración, dependiendo de la enfermedad y/o trastorno que se evitará o tratará y otros factores bien conocidos por el médico.
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos, compuestos y/o estructuras de la invención y/o las composiciones que comprenden los mismos se administran de acuerdo con un régimen de tratamiento que se adecuado para prevenir y/o tratar la enfermedad y/o trastorno que será evitado o tratado. El médico en general será capaz de determinar un régimen de tratamiento adecuado, dependiendo de factores tales como la enfermedad o trastorno que será evitado o tratado, la gravedad de la enfermedad que será tratada y/o la gravedad de los síntomas de la misma, las secuencias de aminoácidos específicas, el Nanobpdy, el polipéptido, el compuesto o estructura de la invención que se utilizará, la vía específica de administración y la formulación o composición farmacéutica que se utilizará, la edad, género, peso, dieta, condición general del paciente, y factores similares bien conocidos por el médico.
En general, el régimen de tratamiento comprenderá la administración de una o más secuencias de aminqácidos, Nanobodies, polipéptidos, compuestos y/o estructuras de la invención, o de una o más composiciones que comprenden los mismos en una o más cantidades farmacéuticamente efectivas o dosificaciones. Las cantidades específicas o dosificaciones que se administrarán, se pueden determinar por el médico, nuevamente con base en los factores citados anteriormente.
En general, para la prevención y/o tratamiento de las enfermedades y trastornos mencionados en la presente y dependiendo de la enfermedad o trastorno específico que será tratado, la potencia de la secuencia de aminoácidos específica, Nanobody, polipéptido, compuesto y estructura de la invención que se utilizará, la via especifica de administración y la formulación o composición farmacéutica especifica utilizada, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos, compuestos y estructuras; de la invención en general se administrarán en una cantidad entre 1 gramo y 0.01 microgramos por kg de peso corporal al dia, de preferencia entre 0.1 gramo y 0.1 microgramos por el kg de peso corporal al día, tal como aproximadamente 1, 10, 100 ó 1000 microgramos por kg de peso corporal al día, ya sea continuamente (por ejemplo mediante infusión) , como una sola dosificación diaria o como múltiples dosificaciones divididas durante el día. El médico en general será capaz de determinar una dosificación diaria adecuada, dependiendo de los factores mencionados en la presente. También será evidente que en casos específicos, el médico puede seleccionar desviarse de estas cantidades, por ejemplo con base en los factores citados anteriormente y su juicio experto. En general,: alguna guía sobre las cantidades que se administrarán se pueden obtener a partir de las cantidades por lo general administradas para anticuerpos convencionales comparables o fragmentos de anticuerpos contra el mismo blanco administradas vía esencialmente la misma ruta, tomando en cuenta sin embargo las diferencias de afinidad a nivel eficacia y/o distribución, vida media, y factores similares bien conocidos por el experto.
Por lo general, en el método anterior, se utiliza una secuencia de aminoácidos individual, Nanobody, polipéptido, compuesto o estructura de la invención. Sin embargo, queda dentro del alcance de la invención utilizar dos o más secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos , compuestos y/o estructuras de la invención en combinación .
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos, compuestos y estructuras de la invención también se pueden utilizar en combinación con uno o más compuestos o principios farmacéuticamente activos adicionales, es decir como un régimen de tratamiento combinado que pueda o no conducir a un efecto sinérgico. Nuevamente, el médico será capaz de seleccionar estos compuestos o principios adicionales, así como también el régimen de tratamiento combinado adecuado, con base en los factores citados anteriormente y su juicio experto.
En particular, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos, compuestos y estructuras de la invención se pueden utilizar en combinación con otros compuestos o principios farmacéuticamente activos qüe se utilicen o se puedan utilizar para la prevención y/o tratamiento de las enfermedades y trastornos citados en la presente como resultado de lo cual puede no obtenerse un efecto sinérgico. Los ejemplos de estos compuestos y principios, asi como también las vías, métodos y formulaciones o composiciones farmacéuticas para administrarlas serán evidentes para el médico.
Cuando se utilicen dos o más sustancias o principios como parte de un régimen de tratamiento combinado, los mismos se pueden administrar via la misma ruta de administración o via diferentes rutas de administración, esencialmente al mismo tiempo o a diferentes tiempos (por ejemplo esencialmente de manera simultánea, consecutivamente, o de acuerdo con un régimen alternativo) . Cuando las sustancias o principios se administrarán simultáneamente via la misma ruta de administración, los mismos se administrarán como diferentes formulaciones o composiciones farmacéuticas o como parte de una formulación o composición farmacéutica combinada, como será evidente para el experto.
También, cuando se utilizarán dos o más sustancias o principios activos como parte de un régimen de tratamiento combinado, cada una de las sustancias o principios se podrá administrar en la misma cantidad y de acuerdo con el mismo régimen utilizado cuando el compuesto o principio se utiliza por si mismo, y este uso combinado puede o no conducir a un efecto sinérgico. Sin embargo, cuando el uso combinado de dos o más sustancias o principios activos conduce a un efecto sinérgico, también puede ser posible reducir la cantidad de uno, más o todas las sustancias o principios que se administrarán, mientras que todavía se alcance la acción terapéutica deseada. Por ejemplo, esto puede ser útil para evitar, limitar o reducir cualesquiera efectos secundarios no deseados que se asocian con el uso de una o más de las sustancias o principios que se utilizan en sus cantidades usuales, mientras que todavía se obtenga el efecto farmacéutico o terapéutico deseado.
La efectividad del régimen de tratamiento utilizado de acuerdo con la invención se puede determinar y/o seguir de cualquier forma conocida per se para la enfermedad y/o trastorno implicados, como será evidente para el médico. El médico también será capaz, cuando sea adecuado y sobre una base de caso por caso, de cambiar o modificar un régimen de tratamiento particular, para alcanzar el efecto terapéutico deseado, para evitar, limitar o reducir los efectos secundarios no deseados, y/o para alcanzar un equilibrio adecuado entre alcanzar el efecto terapéutico deseado; por un lado y evitar, limitar o reducir los efectos secundarios no deseados por otro lado.
En general, el régimen de tratamiento se seguirá hasta que se alcance el efecto terapéutico deseado y/o mientras que se mantenga el efecto terapéutico deseado. Nuevamente, esto se puede determinar por el médico.
En otro aspecto, la invención se relaciona ; con el uso de una secuencia de aminoácidos, Nanobody, polipéptido, compuesto o estructura (monovalente) de la invención en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de al menos uno de los trastornos relacionados con IL-6R.
La invención también se relaciona con uso de una secuencia de aminoácidos, Nanobody, polipéptido, compuesto o estructura (monovalente) de la invención, en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de al menos una de las enfermedades y trastornos asociados con IL-6, con IL-6R, con el complejo IL-6/IL-6R y/o con las trayectorias de señalización y/o las funciones biológicas y respuestas en las cuales IL-6, IL-6R :y/o el complejo IL-6/IL-6R están implicados; y/o para utilizarse en uno o más de los métodos descritos en la presente.
La invención también se relaciona con el uso de una secuencia de aminoácidos, Nanobody, polipéptido, compuesto o estructura de la invención en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de al menos de una enfermedad o trastorno que se pueda evitar y/o tratar al modular IL-6, IL-6R, el complejo IL-6/IL-6R, su actividad biológica o farmacológica, y/o las trayectorias biológicas o la señalización en la cual están implicados IL-6, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R.
La invención también se relaciona con el uso de una secuencia de aminoácidos, Nanobody, polipéptido, compuesto o estructura de la invención en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de al menos de una enfermedad o trastorno que se pueda prevenir y/o tratar al administrar una secuencia de aminoácidos, Nanobody, polipéptido, compuesto o estructura de la invención a un paciente.
Más particularmente, la invención se relaciona con el uso de una secuencia de aminoácidos, Nanobody, polipéptido, compuesto o estructura de la invenció en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de trastornos relacionados con IL-6R, y en particular para la prevención y tratamiento de una sepsis, diversas formas de cáncer, resorción ósea, osteoporosis, caquexia, psoriasis, glomerulonefritis proliferativa mesangial, sarcoma de Kaposi, linfoma relacionado con SIDA, y enfermedades inflamatorias, el método comprende administrar una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácido de la invención, ¡ de un Nanobody de la invención, de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende los mismos. Las diversas formas de cáncer se pueden seleccionar del grupo que consiste de enfermedad de mieloma múltiple (M ) , carcinoma de células renales (RCC) , leucemia de células en plasma, linfoma, trastorno B-linfoproliferativo (BLPD) , y cáncer de próstata. Las enfermedades inflamatorias se pueden seleccionar del grupo que consiste de artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil de aparición sistémica, hipergammaglobulinemia, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, lupus eritematoso sistémico (SLE) , esclerosis múltiple, enfermedad de Castleman, IgM gammopatia, mixoma cardiaco, asma, asma alérgico y diabetes mellitus dependiente de insulina autoinmune.
La invención se relaciona además con una secuencia de aminoácidos, un Nanobody, un compuesto o estructura, un polipéptido, una estructura monovalente de la invención o una composición farmacéutica que comprenden los mismos para utilizarse en la prevención y/o tratamiento de al menos de una enfermedad y/o trastorno relacionado con IL-6R.
La invención se relaciona además con una secuencia de aminoácidos, un Nanobody, un compuesto o estructura, un polipéptido, una estructura monovalente de la invención o una composición farmacéutica que comprende los mismos para utilizarse en la prevención y/o tratar al menos una enfermedad y/o trastornos asociados con IL-6, con IL-6R, con el complejo IL-6/IL-6R, con su actividad biológica o farmacológica, y/o las trayectorias biológicas 1 o la señalización en la cual está implicado IL-6, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R.
La invención se relaciona además con una secuencia de aminoácidos, un Nanobody, un compuesto o estructura, un polipéptido, una estructura monovalente de la invención o una composición farmacéutica que comprenden el mismo para para utilizarse en la prevención y/o tratamiento de al menos de una enfermedad y/o trastorno que se pueda prevenir y/o tratar al modular IL-6, IL-6R, el complejo IL-6/IL-6R, su actividad biológica o farmacológica, y/o las trayectorias biológicas o la señalización en la cual están implicados IL-6, IL^6R y/o el complejo IL-6/IL-6R.
La invención se relaciona además con una secuencia de aminoácidos, un Nanobody, un compuesto o estructura, un polipéptido, una estructura monovalente de la invención o una composición farmacéutica que comprende los mismos para utilizarse en la prevención y/o tratamiento de al menos una enfermedad y/o trastorno que se pueda prevenir y/o tratar al administrar una secuencia de aminoácidos de la invención, un Nanobody de la invención o un polipéptido de la invención a un paciente.
La invención además se relaciona con una secuencia de aminoácidos, un Nanobody, un compuesto o estructura, un polipéptido, una estructura monovalente de la invención o una composición farmacéutica que comprenden los mismos para utilizarse en la prevención y/o tratamiento de jSepsis, diversas formas de cáncer, resorción ósea, osteoporosis, caquexia, psoriasis, glomerulonefritis proliferativa mesangial, sarcoma de Kaposi, linfoma relacionado con SIDA, y enfermedades inflamatorias, el método comprende administrar una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácido de la invención, de un Nanobody de la invención, de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende los mismos. Las diversas formas de cáncer se pueden seleccionar del grupo que consiste de enfermedad de mieloma múltiple (MM) , carcinoma de células renales (RCC) , leucemia de células en plasma, linfoma, trastorno B-linfoproliferativo (BLPD) , y cáncer de próstata. Las enfermedades inflamatorias se pueden seleccionar del grupo que consiste de artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil de aparición sistémica, hipergammaglobulinemia, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, lupus eritematoso sistémico (SLE) , esclerosis múltiple, enfermedad de Castleman, IgM gammopatia, , mixoma cardiaco, asma, asma alérgico y diabetes mellitus dependiente de insulina autoinmune.
El sujeto que será tratado puede ser cualquier animal de sangre caliente, aunque en particular es un mamífero, y más particularmente un ser humano. Como será evidente para el experto, el sujeto que será tratado en particular será una persona que padezca de, o esté en riesgo de, las enfermedades y trastornos mencionados en la presente.
Nuevamente, en esta composición farmacéutica, una o más de las secuencias de aminoácidos, Nanóbodies, polipéptidos, compuestos o estructuras de la invención también se pueden combinar adecuadamente con uno o más de los otros principios activos, tales como aquellos mencionados en la presente.
La presente invención se ilustra adiciorialmente mediante los siguientes ejemplos, que no se deben interpretar como limitantes adicionales. Los contenidos totales de todas las referencias (incluyendo las referencias bibliográficas, patentes otorgadas, solicitudes de patentes publicadas, y solicitudes de patente co-pendientes) citados a todo lo largo de esta solicitud se incorporan expresamente en la presente como referencia, en particular para la enseñanza a la que se hizo referencia anteriormente.
ASPECTOS Aspecto 1. La secuencia de aminoácidos dirigida contra IL-6R, que comprende uno o más alargamientos de residuos de aminoácidos seleccionados de lo siguiente: a) Las SEC ID NOs : 80-82; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 80-82, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; y/o c) las SEC ID NOs: 84-91; o d) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 84-91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL÷-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; y/o e) las SEC ID NOs : 93-95; o f) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una difere'ncia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-95, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL^6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 1 ó¡ 2, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Aspecto 2. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto 1, que comprende dos o más alargamientos de residuos de aminoácidos seleccionados de lo siguiente : a) Las SEC ID NOs: 80-82; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 80-82, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL^6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; y/o c) SEC ID NOs: 84-91; o d) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 84-91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; y/o e) SEC ID NOs: 93-95; o f) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-95, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 1 ó 2, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales .
Tal que (i) cuando el primer alargamiento de residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), o b) , el segundo alargamiento de residuos de aminoácidos corresponde a una o de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con c) , d) , e) o f ) ; (ii) cuando el primer alargamiento de residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con c) o d) , el segundo alargamiento de residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con a) , b) , e) o f ) ; o (iii) cuando el primer alargamiento de residuos de aminoácidos que corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con e) o f) , el segundo alargamiento de residuos de aminoácidos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con a), b) , c) o d) .
Aspecto 3. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 ó 2, que comprende tres o más alargamientos de residuos de aminoácidos en las cuales el primer alargamiento de residuos de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de: a) Las SEC ID NOs : 80-82; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs : 80-82, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; el segundo alargamiento de residuos de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de: c) Las SEC ID NOs: 84-91; o d) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 84-91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; y el tercer alargamiento de residuos de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de: e) Las SEC ID NOs: 93-95; o f) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs : 93-95, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 1 ó' 2, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Aspecto 4. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 3 que comprende un pliegue de inmunoglobulina o el cual bajo condiciones adecuadas es capaz de formar un pliegue de inmunoglobulina.
Aspecto 5. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 4 que , es una secuencias de inmunoglobulina.
Aspecto 6. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 5, que consiste esencialmente de 4 regiones de armazón (FR1 hasta FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 hasta CDR3, respectivamente) en los cuales : CDR1 se selecciona del grupo que consiste de: a) Las SEC ID NOs: 80-82; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 80-82, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL^6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; y/o CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: c) Las SEC ID NOs: 84-91; o d) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 84-91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó , 1, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; y/o CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: e) Las SEC ID NOs: 93-95; o f) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-95, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a ILj-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 1 ó 2, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales .
Aspecto 7. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto 6, que consiste esencialmente de 4 regiones de armazón (FRl hasta FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 hasta CDR3, respectivamente) en las cuales: CDRl se selecciona del grupo que consiste de: a) Las SEC ID NOs: 80-82; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 80-82, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a ILr6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó: 1, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; y CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: c) Las SEC ID NOs: 84-91; o d) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 84-91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a ILL6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; y CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: e) Las SEC ID NOs: 93-95; o f) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-95, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 1 ó 2, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Aspecto 8. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 7 que comprende al menos : a) La SEC ID NO: 80; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 80, siempre y cuándo la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 6 1, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Aspecto 9. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 8 que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de: a) Las SEC ID NO: 84, 89 ó 91; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs : 84, 89 ó 91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 1 ó 2, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales .
Aspecto 10. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 9 que comprende al menos : a) La SEC ID NO: 84; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 84, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Aspecto 11. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 10 que comprende un alargamiento de residuos de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de: a) Las SEC ID NOs : 93-94; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-94, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 1 ó, 2, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales .
Aspecto 12. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 11 que comprende al menos: a) La SEC ID NO: 93; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 93, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Aspecto 13. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 12 que comprende dos alargamientos de residuos de aminoácidos al menos seleccionó de: a) Las SEC ID NO: 80 y SEC ID NO: 84; b) las SEC ID NO: 80 y SEC ID NO: 93; o c) las SEC ID NO: 84 y SEC ID NO: 93.
Aspecto 14. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 13 que comprende las SEC ID NO: 80, SEC ID NO: 84 y SEC ID NO: 93.
Aspecto 15. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 14, que consiste esencialmente en una secuencia de dominio variable con cadena pesada que se deriva de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional o esencialmente puede consistir de una secuencia con dominio variable de cadena pesada que se deriva de un anticuerpo de cadena pesada.
Aspecto 16. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 15, que consiste esencialmente en un anticuerpo dominio (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para utilizarse como un anticuerpo dominio) , o un anticuerpo dominio individual (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para utilizarse como un anticuerpo dominio individual) , de un "dAb" (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para utilizarse como un dAb) o de un Nanobody.
Aspecto 17. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 16 seleccionada del grupo que consiste de: a) Las SEC ID NO: 60-69; b) una secuencias que no tenga más det 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos ;en una, dos o todas sus CDR con una de las SEC ID NOs : 60-69, isiempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en uno, dos o todos su CDR se unan a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NO: 60-69, la afinidad tal como áe mide mediante resonancia con plasmones superficiales; c) una secuencias que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 60-69, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 60-69 unidas a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NOs: 60-69, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Aspecto 18. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto 17 seleccionado del grupo que consiste de: a) Las SEC ID NOs : 65-69; b) una secuencias que no tenga más del 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR con una de las SEC ID NOs: 65-69, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en uno, dos o todos su CDR unidas a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la unión; de una de las SEC ID NOs: 65-69, la afinidad tal como Se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; c) una secuencias que no tenga más de 2 , de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 65-69, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 65-69 unidas a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NOs: 65-69, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Aspecto 19. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto 18 seleccionado del grupo que consiste de: a) La SEC ID NO: 66; b) una secuencias que no tenga más de¡ 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR con SEC ID NO: 66, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en uno, dos o todos su CDR unidas a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NO: 66, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; c) una secuencias que no tenga más de, 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos ¡ con la SEC ID NO: 66, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 66 unidas a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la unión por la SEC ID NO: 66, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales. : Aspecto 20. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 19, que se unen específicamente a hIL-6R con una constante de disociación (KD) de 1 n hasta 1 p moles/litro o menos, de preferencia 500 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, de mayor preferencia 100 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, o incluso de mayor preferencia aproximadamente 50 pM hasta 1 pM o menos.
Aspecto 21. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 20, que se unen específicamente a cyno IL-6R con una constante de disociación (KD) de 1 nM hasta 1 pM o menos, de preferencia 500 pM hasta 1 pM o menos, de mayor preferencia 100 pM hasta 1 pM o menos, o incluso de mayor preferencia aproximadamente 50 pM hasta 1 pM o menos.
Aspecto 22. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 21, que se unen específicamente a hIL-6R con un índice kon de entre 104 M"1s"1 a aproximadamente 107 M"1s"1, de preferencia entre 105 ,M"1s~1 y 107 M_1s_1, de mayor preferencia aproximadamente 106 ~1s"1 o más .
Aspecto 23. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 22, que se unen específicamente a cyno IL-6R con un índice kon de entren 104 M"1 s"1 a aproximadamente 107 M"1s"1, de preferencia entre 105 M"1s"1 y 107 M~1s"1, de mayor preferencia aproximadamente 106 M_1s_:L o más .
Aspecto 24. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 23, que se unen específicamente a hIL-6R con un índice koff entre 10"3 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10"6 s_1 (proporcionando un complejo irreversible cercano con ti/2 de múltiples días), de preferencia entre 10"4 s"1 y 10~6 s-1, de mayor preferencia entre 10"5 s-1 y 10~6 s"1, tal como aproximadamente 10~5 s"1 o menos.
Aspecto 25. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 24, que se unen específicamente a cyno IL-6R con un índice k0ff entre 10~3 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10"6 s"1 (proporcionando un complejo irreversible cercano con ti/2 de múltiples días) , de preferencia entre 10~4 s"1 y 10"6 s-1, de mayor preferencia entre 10~5 s"1 y 10~6 s_1, tal como aproximadamente 10~5 s"1 o menos.
Aspecto 26. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 25, que, en el análisis de TF-1, tiene valores IC50 (a 100 IU/mL IL-6) entre 10 nM y 50 pM, de preferencia entre 5 nM y 50 pM, de mayor preferencia entre 1 nM y 50 pM o menos, como aproximadamente 750 ó 500 pM o menos.
Aspecto 27 La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 26, que, en el análisis de TF-1, tiene IC50 (a 5000 IU/mL IL-6) entre 50 nM y 1 nM, de preferencia entre 25 nM y 1 nM, de mayor preferencia entre 10 nM y 1 nM o menos, como aproximadamente 8 nM o menos.
Aspecto 28. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 27, que> en el análisis de TF-1, tiene valores IC5o que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación el valor IC5o obtenido para el IgG de referencia como se define por las SEC ID NOs : 1 y 2 p el Fab de referencia como se define por las SEC ID NOs: 3 y 4 Aspecto 29. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 28, que, en el análisis de TF-1, tiene valores IC50 que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación el valor IC50 obtenido para Tocilizumab (MRA) .
Aspecto 30. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 29, que t ene, en un análisis para potencia en plasma a valores EC50 de IL-6, valores IC50 entre 500 pM y 50 pM, de preferencia entre 250 pM y 50 pM, de mayor preferencia entre 200 pM y 50 pM o menos, como 150 pM o menos.
Aspecto 31. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 30, que tiene, en un análisis para potencia en plasma, a valores EC95 de IL-6, valores IC5o entre 1000 pM y 100 pM, de preferencia entre 750 pM y 100 pM, de mayor preferencia entre 500 pM y 100 pM o menos, como 400 pM o menos.
Aspecto 32. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 31, que tiene, en un análisis para potencia en plasma de aspectos 30, ó 31, valores IC5o que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación el valor IC50 obtenido para el IgG de referencia como se define por las SEC ID NOs: 1 y 2 o el Fab de referencia como se define por las SEC ID NOs: 3 y 4.
Aspecto 33. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 32, que tiene, en un análisis para potencia en plasma de aspectos 30 ó 31, valores IC50 que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación el valor IC50 obtenido para Tocilizumab (MRA) .
Aspecto 34. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 33, que tiene, la unión a la membrana IL-6R sobre células CHO, valores IC50 entre 10 nM y 100 pM, de preferencia entre 5 nM y 100 pM, de mayor preferencia entre 2 nM y 10 pM o menos, como 2 nM o menos.
Aspecto 35. El compuesto o estructura que comprende o consiste esencialmente de una o más secuencias de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos, y opcionalmente comprende además uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión, enlazados opcionalmente vía unido o más enlazantes.
Aspecto 36. El compuesto o estructura de acuerdo con el aspecto 35 en el cual uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión se seleccionan del grupo que consiste de anticuerpos dominio, las secuencias de aminoácidos que sean adecuados para utilizarse cpmo un anticuerpo dominio, anticuerpos de dominio individual, las secuencias de aminoácidos que sean adecuados para utilizarse como un anticuerpo de dominio individual, "dAb", las secuencias de aminoácidos que sean adecuadas para utilizarse como un dAb, o Nanobodies.
Aspecto 37. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 ó 36 que es una estructura multivalente tal como por ejemplo una estructura bivalente o trivalente.
Aspecto 38. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 37 que es una estructura multiespecifica tal como por ejemplo una estructura biespecifica o triespecifica .
Aspecto 39. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos que 35 a 38 que tiene una vida media aumentada en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de acuerdo con cualquiera' de los aspectos 1 a 34 per se.
Aspecto 40. El compuesto o estructura de acuerdo con el aspecto 39 en el cual uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión proporcionan el compuesto o estructura con vida media aumentada, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondientes de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 20.
Aspecto 41. El compuesto o estructura de acuerdo con el aspecto 39 en el cual uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión que proporcionan el compuesto o estructura con vida media aumentada se selecciona del grupo que consiste de proteínas séricas o fragmentos de las mismas, las unidades de unión que se unen a las proteínas séricas, y la porción Fe, y pequeñas proteínas o péptidos que se pueden unir a las proteínas séricas.
Aspecto 42. El compuesto o estructura de acuerdo con el aspecto 39 en el cual uno o más de otros i grupos, i residuos, porciones o unidades de unión que proporcionan el compuesto o estructura con una vida media aumentada se selecciona del grupo que consiste de albúmina de suero humano o fragmentos de la misma.
Aspecto 43. El compuesto o estructura de acuerdo con el aspecto 39 en el cual uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión que proporcionan el compuesto o estructura con la vida media aumentada se selecciona del grupo que consiste de unidades de unión que pueden unir a la albúmina sérica (tal como albúmina de suero humano) o una inmunoglobulina sérica (tal como IgG) .
Aspecto 44. El compuesto o estructura de ¡acuerdo con el aspecto 39 en el cual uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión que proporcionan el compuesto o estructura con la vida media aumentada se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos del dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuados para utilizarse como un anticuerpo del dominio, los anticuerpos de dominio individuales, secuencias de aminoácidos que son adecuados para utilizarse como un anticuerpo dominio individual, "dAb", secuencias de aminoácidos que son adecuados para utilizarse tal como un dAb, o Nanobodies que se puede unir a la albúmina sérica (tal como la albúmina de suero humano) o una inmunoglobulina de suero (tal como IgG) .
Aspecto 45. El compuesto o estructura de acuerdo con el aspecto 39 en el cual una o más de las otras unidades de unión que proporcionan al compuesto o estructuran con vida media aumentada se seleccionan de las SEC ID NOs : 97-99.
Aspecto 46. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 45-, se selecciona de la siguiente secuencia de polipéptidos : a) Las SEC ID NOs: 70-72; b) una secuencia de polipéptidos que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR de la invención con una de las SEC ID NOs: 70-72, siempre y cuando la secuencias del polipéptido con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR de la invención unida a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NOs: 70-72, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; c) una secuencia de polipéptidos que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 70-72, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs : 70-72 unidas a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NOs: 70-72, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Aspecto 47. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 46, se selecciona de la siguiente secuencia de polipéptidos : a) Las SEC ID NOs: 70-71; b) una secuencia de polipéptidos que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR de la invención con una de las SEC ID NOs: 70-71, siempre y cuando la secuencias del polipéptido con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR de la invención unida a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la unión de una : de las SEC ID NOs: 70-71, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; c) una secuencia de polipéptidos que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 70-71, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 70-71 unidas a IL-6R con aproximadamente la :misma o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NOs: 70-71, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
Aspecto 48. El compuesto o estructura de 1 acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 47, que tiene o esencialmente consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 70.
Aspecto 49. El compuesto o estructura desacuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 47, que tiene o esencialmente consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 71.
Aspecto 50. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 49, que se unen específicamente a hIL-6R con una constante de disociación (KD) de 1 nM hasta 1 pM moles/litro o menos, de preferencia 500 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, de mayor preferencia 100 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, o incluso dé mayor preferencia aproximadamente 50 pM hasta 1 pM o menos. , Aspecto 51. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 50, que se unen específicamente a cyno IL-6R con una constante de disociación (KD) de 1 nM hasta 1 pM o menos, de preferencia 500 pM hasta 1 pM o menos, de mayor preferencia 100 pM hasta 1 pM o menos, o incluso de mayor preferencia aproximadamente 50 pM hasta 1 pM o menos.
Aspecto 52. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 51, que se unen específicamente a hIL-6R con un índice kon de entre 1Ó4 M"1s"1 a aproximadamente 107 M_1s-1, de preferencia entre 105 M"1s"1 y 107 M-1s-1, de mayor preferencia aproximadamente 106 M^s-1 o más .
Aspecto 53. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 52, que se unen específicamente a cyno IL-6R con un índice kon de entre 104 M"1 s"1 a aproximadamente 107 _1s_1, de preferencia entre 1Ó5 M"1s"1 y 107 M"1s"1, de mayor preferencia aproximadamente 106 M"1s"1 o más.
Aspecto 54. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 53, que se unen específicamente a hIL-6R con un índice k0ff entre 10"3 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10~6 s-1 (proporcionando un complejo irreversible cercano con ti/2 de múltiples días) , de preferencia entre 10~4 s"1 y 10"6 s-1, de mayor preferencia entre 10~5 s"1 y 10~6 s"1, como aproximadamente 10"5 s_1 o menos.
Aspecto 55. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 54, que se unen específicamente a cyno IL-6R con un índice k0ff entre 10~3 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10"6 s"1 (proporcionando un complejo irreversible cercano con ti/2 de múltiples días) , de preferencia entre 10"4 s"1 y 10"6 s-1, de mayor preferencia entre 10~5 s"1 y 10"6 s"1, como aproximadamente 10~5 s"1 o1 menos.
Aspecto 56. El compuesto o estructura de lacuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 55, que, en el análisis de TF-1, tiene valores IC50 (a 100 IU/mL IL-6) entre 10 nM y 50 pM, de preferencia entre 5 nM y 50 pM, de mayor preferencia entre 1 nM y 50 pM o menos, como aproximadamente 750 ó 500 pM o menos.
Aspecto 57. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 56, que, en el análisis de TF-1, tiene IC50 (a 5000 IU/mL IL-6) entre 50 nM y 1 nM, de preferencia entre 25 nM y 1 nM, de mayor preferencia entre 10 nM y 1 nM o menos, como aproximadamente 8 nM o menos. ; Aspecto 58. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 57, que, en el análisis de TF-1, tiene valores IC50 que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso dé mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación el valor IC50 obtenido para el IgG de referencia como se define por las SEC ID NOs: 1 y 2 o el Fab de referencia como se define por las SEC ID NOs : 3 y 4 Aspecto 59. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 58, que, en el análisis de TF-1, tiene valores IC5o que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación el valor IC5o obtenido para Tocilizumab (MRA) .
Aspecto 60. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 59, que tiene,1 en un análisis para potencia en plasma a valores EC50 dé IL-6, valores IC50 entre 500 p y 50 p , de preferencia entre 250 pM y 50 pM, de mayor preferencia entre 200 pM y 50 pM o menos, como 150 pM o menos.
Aspecto 61. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 60, que tiene,, en un análisis para potencia en plasma a valores EC95 de IL-6, valores IC5o entre 1000 pM y 100 pM, de preferencia entre 750 pM y 100 pM, de mayor preferencia entre 500 pM y 100 pM o menos, como 400 pM o menos.
Aspecto 62. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 61, que tiene, en un análisis para potencia en plasma de aspectos 60 ó 61, valores IC5o que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación el valor IC50 obtenido para el IgG de referencia como se define por las SEC ID NOs : 1 y 2 o el Fab de referencia como se define por las SEC ID NOs: 3 y 4.
Aspecto 63. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 62, que tiene, en un análisis para potencia en plasma de aspectos 60 ó 61, valores IC5o que sean al menos iguales y de preferencia mejores, al menos dos veces, de preferencia tres veces, de mayor preferencia cuatro veces, incluso de mayor preferencia 5 veces, 7 veces o más de 7 veces mejores en comparación el valor IC50 obtenido para Tocilizumab (MRA) .
Aspecto 64. El compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 63, que tiene, la unión a la membrana IL-6R sobre células CHO, valores IC50 entre 10 nM y 100 pM, de preferencia entre 5 nM y 100 pM, de mayor preferencia entre 2 nM y 10 pM o menos, como 2 nM o menos.
Aspecto 65. La estructura monovalente', que comprende o esencialmente consiste de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34.
Aspecto 66. El uso de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34 o una estructura monovalente de acuerdo con el aspecto 65, preparando un compuesto multivalente o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 37 a 64.
Aspecto 67. El método para la preparación de un compuesto multivalente o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 37 a 64, mientras que comprende la unión de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34 o una estructura monovalente de acuerdo con el aspecto 65 a uno o más grupos, residuos, porciones o unidades de unión.
Aspecto 68. El método de acuerdo con el aspecto 67, para la preparación de un compuesto multivalente o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 37 a 64, mientras que comprende la unión de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34 o una estructura monovalente de acuerdo con el aspecto 65 a otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión vía uno o más enlazantes.
Aspecto 69. El ácido nucleico o la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34 un compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 64 que es tal que se puede obtener mediante la expresión de un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos que codifican al mismo, o una estructura monovalente de acuerdo con el aspecto 65.
Aspecto 70. El ácido nucleico o secuencia de nucleótidos de acuerdo con el aspecto 69, que está en la forma de una estructura genética.
Aspecto 71. Un hospedero o célula hospedera que expresa, o que bajo condiciones adecuadas es capaz de expresar, una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34, un compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 64 que es tal que se puede obtener mediante la expresión de un ácido nucleico o una secuencia de nucleótidos que codifica para el mismo, o una estructura monovalente de acuerdo con el aspecto 65; y/o que comprende un ácido nucleico o una secuencia de nucleótidos de acuerdo con el aspecto 69, o una estructura genética de acuerdo con el aspecto 70.
Aspecto 72. El método para producir una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34, un compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 64 que es tal que se puede obtener mediante la expresión de un ácido nucleico' o una secuencia de nucleótidos que codifica para el mismo, o una estructura monovalente de acuerdo con el aspectos '65, el método comprende al menos los pasos de: a) Expresar, en una célula hospedera adecuada u organismo hospedero o en otro sistema de expresión adecuado, un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos de acuerdo con el aspecto 69, o una estructura genética de acuerdo : con el aspecto 70; seguido opcionalmente por: b) Aislamiento y/o purificación de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34, el compuesto o la estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 64 que es tal que se puede obtener mediante la expresión de un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos que codifican el mismo, o los estructura monovalente de acuerdo con el aspecto 65 asi obtenido.
Aspecto 73. El método para producir una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera ;de los aspectos 1 a 34, un compuesto o una estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 64 que es tal que se puede obtener mediante la expresión de un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos que codifica el mismo, o una estructura monovalente de acuerdo con el aspecto 65, del método que comprende los pasos al menos1 de: a) Cultivar y/o mantener un hospedero o célula hospedera de acuerdo con el aspecto 71 bajo condiciones que sean tales que el hospedero o célula hospedera exprese y/o produzca al menos una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34, el compuesto o la estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 64 que es tal que se puede obtener mediante la expresión de un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos que codifica el mismo, o una estructura monovalente de acuerdo con el 'aspecto 65, opcionalmente seguido por: b) Aislamiento y/o purificación de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34, el compuesto o la estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 64 que es tal que se puede obtener mediante la expresión de un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos que codifica el mismo, o una estructura monovalente de acuerdo con el aspecto 65 obtenido.
Aspecto 74. Una composición, que comprende al menos una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34, un compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 64, una estructura monovalente de acuerdo con el aspecto 65, o un ácido nucleico o una secuencia de nucleótidos de acuerdo con los aspeptos 69 ó 70.
Aspecto 75. La composición de acuerdo con el aspecto 74 que es una composición farmacéutica.
Aspecto 76. La composición de acuerdo con el aspecto 74 que es una composición farmacéutica que comprende además al menos porteador, diluyente o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable, y que comprende opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales.
Aspecto 77. Un método para la prevención y/o tratamiento de al menos una de las enfermedades y trastornos asociados con IL-6, con IL-6R, con el complejo IL-6/IL-6R y/o con la trayectoria de señalización y/o las funciones biológicas y respuestas en las cuales están implicados IL-6, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R, el método comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de al menos una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34, un compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 64, o una estructura monovalente de acuerdo con el aspecto 65, o una composición de acuerdo con cualquiera de los aspectos 75 a 76.
Aspecto 78. El método de acuerdo con el aspecto 77, en donde las enfermedades y trastornos asociados con IL-6R y/o con el complejo IL-6/IL-6R y/o con las trayectorias de señalización y/o las funciones biológicas y respuestas en las cuales están implicadas IL-6 y/o el complejo IL-6/IL-6R se seleccionan del grupo que consiste de sepsis, diversas formas de cáncer, resorción ósea, osteoporosis , caquexia, psoriasis, glomerulonefritis proliferativa mesangial, sarcoma de Kaposi, linfoma relacionado con SIDA, y enfermedades inflamatorias.
Aspecto 79. El método de acuerdo con el aspecto 78, en donde las diversas formas de cáncer se seleccionan del grupo que consiste de enfermedad de mieloma múltiple (MM) , carcinoma de células renales (RCC) , leucemia de células en plasma, linfoma, trastorno B-linfoproliferativo (BLPD) , y cáncer de próstata.
Aspecto 80. El método de acuerdo con el aspecto 78, en donde las enfermedades inflamatorias se seleccionan de artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil de aparición sistémica, hipergammaglobulinemia, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, lupus eritematoso sistémico (SLE) , esclerosis múltiple, enfermedad de Castleman, IgM gammopatia, mixoma cardiaco, asma, asma alérgico y diabetes mellitus dependiente de insulina autoinmune.
Aspecto 81. Un método para la prevención y/o tratamiento de al menos una enfermedad o trastorno que se pueda prevenir y/o tratar al administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34, un compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 64, o una estructura monovalente de acuerdo con el aspecto 65, el método comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de al menos una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera , de los aspectos 1 a 34, un compuesto o una estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 64, o una estructura monovalente de acuerdo con el aspecto 65, o una composición de acuerdo con cualquiera de los aspectos 75 a 76.
Aspecto 82. El uso de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34, un compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 64, o una estructura monovalente de acuerdo con el aspecto 65, en la preparación de una composición farmacéutica para prevención y/o tratamiento de al menos una de las enfermedades y trastornos asociados con IL-6, con IL-6R, con el complejo IL-6/IL-6R y/o con las trayectorias de señalización y/o las funciones biolóqicas y respuestas en las cuales están implicados IL-6, IL-6R y/o el complejo ÍL-6/IL-6R; y/o para utilizarse en uno o más de los métodos de acuerdo con los aspectos 77 a 81.
Aspecto 83. Una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34, un compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 64, o una estructura monovalente de acuerdo con el aspecto 65 para utilizarse en la prevención y/o tratamiento de al menos una de las enfermedades o trastornos asociados con IL-6, con IL-6R, con el complejo IL-6/IL-6R y/o con las trayectorias de señalización y/o las funciones biológicas y respuestas en las cuales están implicados IL-6, IL-6R y/o el complejo ÍL-6/IL-6R ; y/o para el uso en uno o más de los métodos de 'acuerdo con los aspectos 77 a 81.
Aspecto 84. Un derivado de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34, un compuesto o una estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 64, o una estructura monovalente de acuerdo con el aspecto 65.
Aspecto 85. Un derivado de acuerdo con el aspecto 84, que se puede unir específicamente a IL-6R.
Aspecto 86. El derivado de acuerdo con cualquiera de los aspectos 84 a 85, que tiene una vida media sérica que es al menos 1.5 veces, de preferencia al menos 2 veces, tal como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la vida media de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34 per se, el compuesto o estructura de ácuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 64 per se, o la estructura monovalente de acuerdo con el aspecto 65 per se.
Aspecto 87. El derivado de acuerdo con cualquiera de los aspectos 84 a 86, que tiene una vida media sérica que se aumenta con más de 1 horas, de preferencia más de 2 horas, de mayor preferencia más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o incluso aun más de 24, 48 ó 72 horas, en comparación con la secuencia de aminoácido correspondiente de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 34 per ¡ se, un compuesto o estructura de acuerdo con cualquiera de los aspectos 35 a 64 per se, o una estructura monovalente de acuerdo con el aspecto 65 per se.
Aspecto 88. Un derivado de acuerdo con cualquiera de los aspectos 84 a 87, que tiene una vida sérica en un ser humano de al menos aproximadamente 12 horas, de preferencia al menos 24 horas, de mayor preferencia al menos 48 horas, incluso de mayor preferencia al menos 72 horas o más; por ejemplo, al menos 5 días (tal como aproximadamente 5 a 10 días) , de preferencia al menos 9 días (tal como aproximadamente 9 a 14 días) , de mayor preferencia al menos aproximadamente 10 días (tal como aproximadamente 10 a 15 días), o al menos aproximadamente 11 días (tal como aproximadamente 11 a 16 días), de mayor preferencia al menos aproximadamente 12 días (tal como aproximadamente 12 a 18 días o más) , o más de 14 días (tal como aproximadamente 14 a 19 días) .
Aspecto 89. El derivado de acuerdo con cualquiera de los aspectos 84 a 88, que es un derivado pegilado.
Aspecto 90. Una composición, que comprende al menos un derivado de acuerdo con cualquiera de los aspectos 84 a 89.
EJEMPLOS I. Aislamiento de los Nanobodies de unión a IL-6R Ejemplo 1: Materiales Los materiales utilizados para el aislamiento de los Nanobodies de unión IL-6R se proporcionan en la Tabla C-1.
Como compuestos de la referencia se generaron y utilizaron dos inmunoglobulinas de IL-6R anti-humano representativas descritas en la EP 0628639 (un fragmento Fab y un IgG de tamaño total). El fragmento Fab y el IgG de tamaño total se construyeron con base en la cadena L denominada "RVLa" (véase la EP 0628639 Bl, Tabla 2, .versión (a) ) y la cadena H denominada "RVHf" (véase la EP 0628,639 Bl, Tabla 3, versión (f)). La cadena L y la cadena H particulares se seleccionaron con el fin de construir los compuestos de referencia debido a que, de acuerdo con la EP 0628639 Bl (véase por ejemplo el párrafo
[0074]), un anticuerpo humano reconfigurado que comprende la cadena L y la cadena H, exhiben una capacidad para unirse a IL-6R humano al mismo nivel que P 1, un anticuerpo monoclonal de ratón contra IL-6R humano (véase nuevamente la EP 0628639 Bl, párrafo [009] y las referencias adicionales citadas en la presente) .
El índice de referencia de longitud total IgG consistió de las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 1 (cadena pesada) y SEC ID NO: 2 (cadena ligera) . El fragmento Fab consistió de las secuencias de aminoácidos SEC ID NO: 3 (las regiones de cadena pesadas VLb y VHf fusionadas a la región CH1 de IgGl humano) y la SEC ID NO: 4 (cadena ligera variable de PM-1 humano reconfigurada fusionada a Ckappa humano) .
Se generaron fragmentos de ADN codificante mediante PCR de ensamble utilizando oligonucleotidos de traslapamiento parcial. Los productos PCR se clonaron en un vector individual, bi-cistrónico que permitió la expresión , de los fragmentos Fab funcionales, enlazados con disulfuro; en el periplasma de E. coli. El IgG de longitud total se produjo en células CHO transfectadas con 2 vectores de expresión que contienen los genes para las cadenas ligera y pesada.1 El gen que codifica para la cadena pesada se creó al fusionar VHf a la región constante de IgGl humano. La cadena ligera fue como se describe en la EP 0628639.
Ejemplo 2: Inmunizaciones Se inmunizaron dos llamas (81 y 82) con IL-6R humano (Peprotech) de acuerdo con el esquema de inmunización descrito en la Tabla C-2.
Después de terminar el esquema de inmunización, mediante ELISA se analizó la respuesta inmunitaria en cada animal. Para este fin, se capturó el IL-6R biotinilado (2 g/ml) en una placa microtituladora recubierta con neutravidina . Se agregaron (dilución de inicio: 1/500) diluciones en serie de muestras séricas recolectadas en los días 0, 28, 39 y 43 y el IgG de llama unido se detectó mediante la adición de IgG anti-llama de cabra marcado con HRP. Como un sustrato se utilizó TMB. En la figura 1 se muestran los resultados.
Mediante FACS también se analizaron las respuestas inmunitarias : diluciones en serie (dilución de inicio: 1/100) de muestras séricas recolectadas en los días 0, 28 y 43 se incubaron con células U266 (mieloma humano) . El IgG de llama unido se detectó mediante IgG anti-llama de cabra marcado con IgG FITC. En la figura 2 se muestran los resultados.
Conjuntamente estos datos muestran que los animales generaron una buena respuesta inmunitaria contra IL-6R y que al menos una fracción de IgG de llama reconoció a IL-6R sobre la superficie de las células U266.
Ejemplo 3: Construcción de bibliotecas Se utilizó ARN extraído de los PBL y nodo linfático como material de partida para RT-PCR para amplificar el Nanobody que codifica para los fragmentos génicos: Estos fragmentos se clonaron en un vector de expresión derivado de pUC119 que contuvo al promotor LacZ, una secuencia codificante de la proteína de colifago pIII, un gen de resistencia para ampicilina o carbenicilina, un sitio de multiclonacion y la secuencias líder gen3. En la trama con la secuencia que codifica para el Nanobody, el vector codificado para una marca c-myc C-término y una marca (His)6. El fago se preparó de acuerdo con un protocolo estándar y se almacenó después de la esterilización con filtro a 4°C para uso adicional. En la Tabla C-3, se muestran las características de las bibliotecas construidas.
Ejemplo 4: Selecciones Se llevaron a cabo selecciones con las bibliotecas anteriores utilizando diversas condiciones según se resume en la Tabla C-4.
Sólo se realizó un ciclo de selección individual para todas las condiciones. Cada salida de selección se analizó para el factor de enriquecimiento (# fago presente en el eluido con relación al control), diversidad (perfilamiento Hinfl) y porcentaje de los clones IL-6R positivos (ELISA) . Con base en estos parámetros las mejores selecciones se escogieron para análisis adicionales. Para este fin, la salida de cada selección se volvió a clonar como una .reunión en un vector de expresión derivado de pUC119 que contuvo al promotor LacZ, un gen de resistencia para ampicilina o carbenicilina, un sitio de multiclonación y la secuencias líder gen3. En la trama con la secuencia que codifica para el Nanobody, el vector codificado para la marca c-myc C-t'erminal y una marca (His)6. Las colonias se seleccionaron y crecieron en placas de 96 pocilios (volumen 1 mi) y se indujeron mediante la adición de IPTG para la expresión del Nanobody. Se prepararon extractos periplásmicos de acuerdo 'con el protocolo estándar.
Ejemplo 5: Exploración Los extractos periplásmicos se analizaron primero para su capacidad para inhibir la interacción IL-6^IL-6R. Para este fin, se prepararon 2 análisis Alphascreen independientes que se representan esquemáticamente en la figura 3. En el análisis 1, los extractos periplásmicos se incubaron con el receptor IL-6 soluble (1 nM) , IL-6 biotinilado (3 nM) , perlas donadoras recubiertas de estreptavidina y perlas aceptoras recubiertas con MAb BN-12 (20 pg/ml) . Los Nanobodies positivos en este análisis podrian ya sea inhibir la interacción IL-6/IL-6R o la interacción o IL-6R-MAb BN-12. Para discriminar entre estas 2 posibilidades, se preparó un segundo análisis (Análisis 2). En este análisis se incubaron extractos periplásmicos con bio-IL-6R (0.3 n ) , las perlas donadoras recubiertas de estreptavidinas y perlas aceptoras recubiertas MAb BN-12 (10 g/ml) . Los Nanobodies positivos en el análisis 1 ' aunque negativos en el análisis 2 se consideraron como los inhibidores IL-6-IL-6R.
Los extractos periplásmicos se diluyeron 25 veces en ambos análisis lo cual corresponde aproximadamente a una concentración final de 40 nM. En la Tabla C-5 más adelante se muestra una perspectiva general estadística del esfuerzo de exploración. Los Nanobodies que muestran la inhibición más fuerte se seleccionaron para el análisis fuera de índice en Biacore y secuenciación de ADN. La figura 4, muestra las secuencias proteínicas de Nanobodies inhibidores que se seleccionaron para análisis adicional en análisis de base celular. La Tabla C-6 muestra los valores koff de estos Nanobodies inhibidores.
Ejemplo 6: Expresión y purificación de Nanobody Los Nanobodies seleccionados se expresaron en E. coli como c-myc, y proteínas marcadas con (His) 6; en un volumen de cultivo de 50 ó 250 mi. La expresión se, indujo mediante la adición de IPTG 1 mm y se dejó continuar ;durante 4h a 37°C. Después de centrifugar los cultivos celulares, se prepararon extractos periplásmicos al congelar-destíongelar los sedimentos. Estos extractos se utilizaron como material de partida para la cromatografía de afinidad con metal inmoviizado (IMAC). Los Nanobodies se eluyeron a partir de la columna con imidazol 150 mm y posteriormente se realizaron contra PBS. El rendimiento total y el rendimiento por litro del cultivo celular se lista en la Tabla C-7. En la figura 5 se muestra el SDS-PAGE de los Nanobodies purificados (excepto para P P28E11) .
Ejemplo 7: Análisis de competencia a base de proteínas Los 14 Nanobodies purificados se probaron en Alphascreen para inhibición de la interacción IL-6/IL-6R. Diluciones en serie de proteínas purificadas (la variación de concentración: 500 nM-10 pM) se agregaron a IL-6R (0.3 nM) y se incubaron durante 15 minutos. Posteriormente, se agregaron bio-IL-6 3 nM y perlas aceptoras recubiertas con BN-12 y esta mezcla se incubó durante 1 hora. Por último, se agregaron perlas donadoras de estreptavidina y después de 1 hora se eluyó el incubador de placas en el lector de microplacas Evision. El fragmento BR-6 y Fab descrito en ejemplo 1 se incluyeron como referencia. En las figuras 6A, 6B y 6C se muestran los resultados.
Se observaron curvas de respuesta a la dosis para los 14 Nanobodies con valores IC5o que varían de 48 pM hasta 1.7 nM (Tabla C-8) . Los Nanobodies más potente en este análisis fueron PMP32C9 y P P35H4. Para PMP33A3 sólo se podría alcanzar una inhibición parcial (-50%) de la interacción IL-6/IL-6R.
Ejemplo 8: Determinación de la afinidad de los Nanobodies obtenidos Las constantes de afinidad (Kd) de los Nanobodies individuales y el fragmento Fab de referencia descrito en el Ejemplo 1 se determinaron mediante resonancia con plasmones superficiales (SPR) en un instrumento Biacore 3000. En resumen, IL-6R fue amina-acoplado con una micro-plaqueta detectora de CM5 a una densidad de 800-1000 RU . Los Nanobodies se inyectaron a 5 diferentes concentraciones entre 1 y 50 nM. La magnitud de flujo fue 45 µ?/min en todos los experimentos. Las fases de asociación y disociación fueron 3 y 10 min, respectivamente. La micro-plaqueta se generó utilizando glicina/HCl pH 1.5. Se utilizaron curvas de unión a diferentes concentraciones del Nanobody para calcular los parámetros cinéticos kon, koff y Kd (Tabla C-9) .
Ejemplo 9: Potencia de base celular de los Nanobodies en el análisis XG1 Todos los Nanobodies purificados se probaron en el análisis XG1. XG1 es una linea celular de mieloma humano dependiente de IL-6. La proliferación media máxima se alcanzó a ~20 pg/ml de IL-6. Los análisis se realizaron esencialmente como se describe por Zhang et al. (1994, Blood 83 i 3654-3663) . El fragmento FAb de referencia como se describe en el Ejemplo 1 se incluyó como una referencia. Los valores IC50 variaron de 90 pM hasta 50 nM como se lista en la Tabla C-10. Un pequeño subconjunto de Nanobodies también se probó en este análisis en presencia de 1 mg/ml de HSA.
Ejemplo 10: Potencia de base celular de los Nanobodie$ en el análisis TF1 También se probó la capacidad de los Nanobodies para inhibir la proliferación dependiente de IL-6 de las células TF-1 (ECACC no.93022307; 1989, J. Cell Physiol., 140: 323; 1993, Exp. Cell Res., 208: 35) mediante el bloqueó de la unión IL-6 a IL-6R sobre la superficie celular. Para este fin, se pre-incubaron diluciones en serie de Nanobody con una cantidad fija de células TF-1 durante 2 horas a 37°C. i Posteriormente, se agregó IL-6 a una concentración final de 2 ng/ml. Se permitió que la proliferación de células dependientes de IL-6 continuara durante 72 horas y se midió mediante la incorporación de timidina marcada con tritio. En la Tabla C-ll se listan los valores IC50.
Ejemplo 11: Competencia con el Fab de referencia por la unión a IL-6R Se analizó la capacidad de los 14 Nanobodies para inhibir la unión del Fab de referencia como se describe en el Ejemplo 1 a IL-6R en un análisis a base de Alphascreen. En este análisis, se incubaron 100 nM de Nanobody purificado con 0.4 nM de IL-6R biotinilado. Las perlas aceptoras recubiertas con Fab de referencia y las perlas donadoras recubiertas con estreptavidina se agregaron y se midió la concentración del complejo Fab/IL-6R de referencia. Los valores obtenidos en presencia del Nanobody se compararon con un control donde no se agregó ningún Nanobody y las proporciones entre los dos 2 valores, expresados como %, se listan en la Tabla C-12. Todos los Nanobodies, excepto IL6R03, no mostraron o sólo mostraron una inhibición parcial del Fab de referencia que se unen a IL-6R, lo que sugiere que sus epitopes no se superponen o sólo se superponen parcialmente con el epitope del Fab de referencia.
Ejemplo 12: Unión de los Nanobodies a células U266 La unión de los Nanobodies a IL-6R unido por membrana expresado en células U266 se analizó en FÁCS. El análisis se realizó para los Nanobodies purificados a partir de clones seleccionados (IL6R04, IL6R09, IL6R11, IL6R13 e IL6R14). En la figura 7 se muestran los resultados. Todos los Nanobodies fueron capaces de unirse al IL-6R humano sobre la superficie celular.
Ejemplo 13: Unión de los Nanobodies a IL-6R humano derivado de plasma IL-6R soluble está presente en plasma humanó a una concentración de 80-400 ng/ml. Para determinar si los Nanobodies IL6R03, IL6R04 e IL6R13 son capaces de unirse a IL-6R derivado de plasma, se evaluó el efecto de la unión del plasma humano sobre el Nanobody a células U266. El plasma humano inhibió la unión a las células U266, lo que indica que los 3 Nanobodies son capaces de unirse al IL-6R humano derivado de plasma (véase Figura 8) .
Ejemplo 14: Reactividad cruzada de los Nanobodies para IL-6R de ratón En ELISA se analizó la reactividad cruzada de los Nanobodies para IL-6R de ratón. Para este fin, se aplicaron 500nM de los Nanobodies a una placa microtituladora recubierta con 1 µ?/p?? de IL-6R ratón y humano. La detección se realizó con anti-myc y anti-ratón-HRP como el primero y segundo anticuerpo respectivamente. En la figura 1 10 se muestran las densidades ópticas. Para ninguno de los Nanobodies probados se observó unión al IL-6R de ratón.
Ejemplo 15: Resumen del aislamiento de los Nanobodies de unión a IL-6R La inmunización de 2 llamas con el IL-6R recombinante dio por resultado en un panel de 24 Nanobodies únicos que fueron capaces de bloquear la interacción entre IL-6 y IL-6R. Este panel se analizó en detalle y se basa en todos los datos experimentales. Para un desarrollo adicional se seleccionaron los Nanobodies IL6R03, IL6R04 e IL6R13. En la Tabla C-13 se resumen las características más importantes de los e Nanobody.
II. Forma teo de los Nanobodies anti-IL-6R Ejemplo 16: Preparación de las estructuras multivalentes Los Nanobodies anti-IL-6R descritos en los párrafos anteriores también se expresaron como estructuras biespecificas que consisten de un Nanobody anti-SA C-terminal (ALB1) , un enlazante de Gly/Ser de 9 aminoácidos y un Nanobody anti-IL-6R N-terminal. Además, se construyeron 4 Nanobodies biespecificos, trivalentes, que consistieron de un Nanobody anti-SA (ALB1) en C-terminal y N-terminal, un Nanobody anti-IL-6R, a la mitad, o todos conectados vía 9 enlazantes de aminoácidos Gly/Ser. En la Tabla C-14 se listan los ID de estos Nanobodies.
Ejemplo 17: Expresión de los Nanobodies anti-IL-6R biespecificos .
Las estructuras de Nanobody biespecificos se expresaron en E. coli como c-myc, proteínas marcadas con (His)6 y posteriormente se purificaron a partir del medio de cultivo mediante cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) y cromotografía por exclusión de tamaño (SEC) . El rendimiento total y el rendimiento por litro de cultivo celular se listan en la Tabla C-15. En la figura 11 se muestra SDS-PAGE de los Nanobodies purificados.
Ejemplo 18: Análisis de competencia a base de proteínas Se probaron los Nanobodies biespecífieos purificados en Alphascreen para la inhibición de la interacción IL-6/IL-6R. Se agregaron diluciones en serie de proteínas purificadas (variación de concentración: 2|50 nM-5 pM) a IL-6R (0.3 nM) y se incubaron durante 15 minutos. Posteriormente, se agregaron perlas aceptoras recubiertas con bio-IL-6 y BN-12 3 nM y esta mezcla se incubó durante 1 hora. Por último, se agregaron perlas donadoras de estreptavidina y después de 1 hora, la placa incubadora se leyó sobre el lector de microplacas Envision. Se incluyeron como referencia BR-6 y el fragmento Fab descrito en el Ejemplo 1. En la figura 12 se muestran los resultados.
Se observaron curvas de respuesta a la dosis para todos los Nanobodies con valores IC5o que varían de 1 123 pM hasta 1.67 nM (Tabla C-16) .
Ejemplo 19: Potencia de base celular de los Nanobodies en el análisis XG1 En el análisis de proliferación XG1 se probaron Nanobodies biespecífieos . Los valores IC50 variaron de 60 pM hasta 65 nM. Los Nanobodies también se analizaron en este análisis en presencia de 1 mg/mL de albúmina de suero humano. Los valores IC50 varían de 190 pM hasta 90 nM para Nanobodies biespecíficos . El IgG de referencia como se describe en el Ejemplo 1, se incluyó como referencia. En la Tabla C-17 se listan los valores IC50.
Se observó una pérdida en potencia cuando los Nanobodies formateados se probaron en el análisis XG1 en presencia de albúmina. Las potencias de los Nanobodies formateados IL6R24, IL6R44 y IL6R49 fueron superiores a o en la misma variación que el IgG de referencia en presencia de albúmina sérica.
Ejemplo 20: Determinación de la afinidad para IL-6R La unión de Nanobodies biespecíficos a IL-6R se analizó mediante resonancia con plasmones superficiales. En la Tabla C-18 se determinaron y se listan los parámetros cinéticos. No se observó ninguna pérdida significativa en la afinidad para IL-6R para los Nanobodies en el formato bivalente (IL6R23, IL6R24, IL6R33) .
Ejemplo 21: Determinación de la afinidad para albúmina sérica Mediante resonancia con plasmones superficiales se analizó la unión de los Nanobodies formateados a albúmina sérica. En la Tabla C-19 se determinaron y se listan las constantes de afinidad (Kd) . Para comparación se incluyó el Nanobody de unión con obligatorio Alb-1 (SEC ID NO: 97) . Las afinidades estuvieron en la variación de los Nanobodies formateados anteriormente que contienen el mismo bloque de construcción para albúmina anti-suero, sin embargo en general se observó una menor afinidad. Éste fue particularmente el caso para la afinidad de albúmina de suero de ratón.
Ejemplo 22: Unión de los Nanobodies formateados a ;células U266 Mediante FACS se analizó la unión de Nanobodies formateados a partir de clones seleccionados (IL6R23, IL6R24, IL6R29, IL6R33, IL6R44 e IL6R53) a células U266. En las figuras 13 y 14 se muestran los resultados. Los Nanobodies bivalentes IL6R23, IL6R24, IL6R29 y IL6R33 mostraron unión reducida en comparación con los bloques de construcción monovalente, mientras que se observó una unión similar para los Nanobodies trivalentes IL6R44 e IL6R53.
III. Optimización de secuencias de los Nanobodies anti- IL-6R Ejemplo 23: Estrategia para optimización de secuencias Las secuencias proteinicas de los Nanobodies IL6R03, IL6R04 e IL6R13 se alinearon cada una con las 5 lineas germinales humanas más cercanas que comparten el mayor grado de homología (Figura 15) . La diferencia de aminoácidos en las regiones de armazón con relación a secuencia consensual de la línea germinal humana se codifican por color. La diferencia de aminoácidos resaltada en gris claro se seleccionaron para conversión en la contraparte ^humana, mientras que los aminoácidos resaltaron en gris oscuro se dejaron sin tocar. Inicialmente se generó un panel de 4 variantes optimizadas de secuencia para cada uno de los 3 Nanobodies (fase 1) . Estas variantes se analizaron para un número de parámetros y los resultados obtenidos se obtuvieron para diseñar un segundo conjunto de Nanobodies (fase 2) . En las figuras 16A y 16B se muestran todas las variantes optimizadas de las secuencias para las secuencias de proteína.
Ejemplo 24: Fase 1 de la optimización de secuencias En la fase 1 del proceso para optimización de secuencias se crearon y analizaron 12 variantes: IL6R03: IL6R61, IL6R62, IL6R63 y IL6R64 IL6R04: IL6R71, IL6R72, IL6R73 y IL6R74 IL6R13: IL6R81, IL6R82, IL6R83 y IL6R84 Las secuencias de aminoácidos de estas diferentes variantes se muestran en la figura 16.
Evaluación de los Nanobodies optimizados por secuencia en el análisis de competencia IL-6/IL-6R Los clones optimizados por secuencias de IL6R03, IL6R04 e IL6R13 se probaron en Alphascreen para la inhibición de la interacción IL-6/IL-6R. Se agregaron diluciones en serie de Nanobodies purificados a IL-6R (0.3 nM) y se incubaron durante 15 minutos. Posteriormente, se agregaron perlas aceptoras recubiertas con bio-IL-6 y BN-12 3 nM y esta mezcla se incubó durante 1 hora. Por último, se agregaron perlas donadoras de estreptavidina y después de 1 hora de incubación, la placa se leyó sobre un lector de microplacas Envision. Se incluyeron como referencia los clones originales. En la figura 17, la figuran 18 y la figuran 19 se muestran los resultados.
Las variantes optimizadas por secuencias de IL6R03 (IL6R61, 62 y 64) tuvieron valores IC50 dentro de 2 veces el valor IC50 de IL6R03, mientras que IL6R63 exhibe un valor IC50 menor de ~4 veces.
Para las variantes optimizadas por secuencias de IL6R04, no se observaron diferencias significativas en los valores IC50 entre IL6R04 y las 4 variantes optimizadas por secuencias. Para la variante optimizada por secuencias IL6R13, los valores IC50 de IL6R81 e IL6R83 fueron casi idénticos a los de IL6R13 mientras que las 2 variantes que portan la mutación RAT ? KGL en el armazón 2 (IL6R82 e IL6R84) tuvo una caída de potencia.
Determinación de la afinidad Las variantes optimizadas por secuencias de ¡IL6R03, IL6R04 e IL6R13 también se analizaron en Biacore para ¡unión a IL-6R. En la Tabla C-20 se listan los parámetros cinéticos.
Para las variantes optimizadas por secuencias de IL5R03, los valores Kd de IL6R61, 62 y 63 estuvieron todos dentro de 2 veces el valor Kd de IL6R03. No se determinó el Kd de IL6R64. : Para las variantes optimizadas por secuencia de IL6R04, no se observaron diferencias significativas en los valores Kd entre IL6R04 y las 4 variantes optimizadas por secuencias.
Para las variantes optimizadas por secuencia de IL6R13, los valores Kd de IL6R81 e IL6R83 fueron muy o similares al Kd de IL6R13 mientras que las 2 variantes que portan la mutación RAT —> KGL en el armazón 2 (IL6R82 e IL6R84) exhibieron una seria caída de afinidad.
En general, estas observaciones están en perfecto acuerdo con los resultados obtenidos en el análisis de competencia a base de Alphascreen.
Ejemplo 25: Fase 2 para la optimización de secuencias Con base en los datos de afinidad y potencia de la fase 1 se decidió generar el siguiente conjunto de variantes: • Para IL6R03 todas las mutaciones presentes en las variantes IL6R61, 62, 63 y 64 se combinaron para proporcionar ILR65.
• Para IL6R04 todas las mutaciones presentes en las variantes IL6R71, 72, 73 y 74 se combinaron para proporcionar ILR75.
• Para IL6R13 se creó un conjunto de 6 variantes nuevas (IL6R85-90) que portan diferentes (combinaciones de) mutaciones en la secuencias RAT en FR2. Estas mutaciones se introdujeron en el IL6R83 antecedente ya que esta variante optimizada por secuencias no se pudo distinguir de, IL6R13 tanto en afinidad como en potencia.
Análisis de índices cancelados de las variantes optimizadas por secuencias de IL6R13 Las variantes optimizadas por secuencias IL6R85-90 analizaron como extractos periplásmicos en Biacore. Se utilizaron curvas de disociación para calcular los valores k0ff (Tabla C-21) . Los índices cancelados de los Nanobodies IL6R87-89 fueron similares a los de IL6R13 mientras que los Nanobodies IL6R85, 86 y 90 tuvieron un índice cancelado mayor de 10 veces.
Evaluación de ios Nanobodies optimizados por secuencia en el análisis de competencia IL-6/IL-6R Las variantes optimizadas por secuencias IL6R85-90 se probaron como extractos periplásmicos por su capacidad para bloquear la interacción IL-6/IL-6R en Alphascreen. En la figura 20 se muestran los resultados.
Los Nanobodies IL6R87, 88 y 89 fueron más potentes que las variantes IL6R13, 85, 86 y 90 en bloqueando la interacción IL-6/IL-6R. Estos resultados están en perfecto acuerdo con las observaciones en Biacore. La comparación de la secuencia de aminoácidos de las variantes 1 IL6R13 optimizadas por secuencias revelaron que la mutación T45L fue responsable de la reducción en el índice cancelado y potencia. Por lo tanto, la mayoría de variantes humanas sin la mutación T45L, es decir IL6R88, se seleccionó para caracterización adicional.
Esta variante se expresó, purificó y analizó para inhibición de la interacción IL-6/IL-6R junto con los clones purificados IL6R65 e IL6R75. No se observaron diferencias significativas entre los diferentes clones optimizados por secuencia (IL6R65, IL6R75 e IL6R88) y sus versiones optimizadas sin secuencia correspondiente (IL6R03, IL5R04 e IL6R13, respectivamente) (Figura 21) Determinación de afinidad La constante de afinidad (Ka) de los ; clones optimizados por secuencia de IL6R65, 75 y 88 para IL-6R humano se determinaron mediante resonancia con plasmones superficiales en un instrumento Biacore 3000. En resumen, el IL-6R humano fue amina acoplado a una micro-plaqueta detectora de CM5 a una densidad de 800-1000 RU . Se inactivaron los grupos reactivos restantes. La unión de los Nanobody se evaluó a diversas concentraciones que varían de 0.5 hasta 50 n . Cada muestra se inyectó durante 4 minutos a una magnitud de flujo de 45 µ?/min para permitir la unión a un antígeno unido en micro-placas. Después, el amortiguador de unión sin el Nanobody se envió sobre la micro-placa a la misma magnitud de flujo para permitir la disociación del Nanobody separado. En la Tabla C-22 se proporcionan los parámetros cinéticos de las variantes optimizadas por secuencia de IL6R03, 04 y 13.
No se observaron diferencias mayores én las constantes de afinidad entre los Nanobodies originales y optimizados por secuencia.
Análisis para potencia de base celular Los Nanobodies optimizados por secuencia se analizaron en el análisis XG-1. En las figuras 22A, 22B y 22C se muestran los resultados. En la Tabla C-23 se resumen los valores IC50. La optimización por secuencias no tuvo: ningún efecto significativo sobre la potencia para neutralizar la proliferación inducida por IL-6 en el análisis de base celular.
IV. Caracterización adicional de los Nanobodies optimizados por secuencia Ejemplo 26: Determinación de la afinidad para cyno IL-6R La afinidad de IL6R03-IL6R65 , IL6R04-IL6R75 e IL6R13-IL-6R88 para cyno IL-6R se determinó mediante SPR en un instrumento Biacore 3000. En resumen, cyno IL-6R fue amina-acoplado a una micro-plaqueta detectora de CM5 a una densidad de 760 Rü. Se inactivaron los grupos reactivos restantes. La unión de Nanobody se evaluó a diversas concentraciones que varían de 1.25 a 100 nM. Cada muestra se inyectó durante 4 minutos a una magnitud de flujo de 45 µ?/min para permitir la unión del antigeno unido a la micro-plaqueta. Después, el amortiguador de unión sin el Nanobody se envió sobre la micro-plaqueta a la misma magnitud de flujo para permitir la disociación del Nanobody separado. En la Tabla C-245 se resumen los parámetros cinéticos.
Aunque hubo muy poca diferencia en las constantes de afinidad de IL6R04 e IL6R75, a partir de este experimento fue evidente que la afinidad de ambas moléculas para cyno IL-6R fue mucho menor que para la humana. Por el contrario, las constantes de afinidad de IL6R03 e IL6R65 para cyno IL-6R estuvieron en la misma variación que para el IL-6R !humano. Sorprendentemente, la estructura cristalina del complejo IL-6/IL-6R/gpl30 (Boulanger et al.) reveló que el sitio de unión a IL-6 sobre IL-6R se conservó completamente entre el humano y cyno, lo que sugiere que IL6R04 se está uniendo a un epitope diferente.
Ejemplo 27: Prueba de los Nanobodies optimizados por secuencia en el análisis para potencia en; plasma utilizando plasma humano y cyno Con el fin de evaluar la reactividad cruzada de IL6R65 e IL6R75 con el IL-6R de mono cynomolgus, se realizó ELISA para potencia en plasma utilizando, plasma ya sea humano o cyno como una fuente de sIL-6R. En este análisis, una dilución en serie de los Nanobodies se pre-incübó con plasma e IL-6 humano (50 ng/mL) . Posteriormente, se capturó SIL-6R en plasma sobre una placa recubierta con BN-12, y se detectó el IL-6 unido utilizando anticuerpos policlonales biotinilados y estreptavidina-HRP .
Como se puede observar en la figura 23A, tanto IL6R201 como IL6R65 fueron capaces de bloquear totalmente la unión de IL-6 a sIL-6R humano, aunque IL6R65 pareció ser menos potente que IL6R201, y que el IgG de referencia y el FAb de referencia descritos en el Ejemplo 1. Como se puede observar en la figura 23B, el IL6R65 fue capaz de bloquear completamente la unión de IL-6 a cyno sIL-6R con una potencia i comparable al Fab de referencia descrito en el ejemplo 1.
Ejemplo 28: Prueba de los Nanobodies optimizados por secuencia en un análisis para potencia en plasma a una alta concentración de IL-6 El análisis para potencia en plasma en plasma humano también se utilizó para probar la capacidad de los Nanobodies para bloquear las altas concentraciones de IL-6., IL6R04, IL6R65 y el Fab de referencia descrito en el Ejemplo 1 se probaron a EC50 de IL-6 (50 ng/mL) y al EC95 de IL-6 (885 ng/mL). En la figura 24 se representan los resultados. Claramente, IL6R04 pareció ser el compuesto más potente en el EC50 de IL-6. En el EC95 el Fab de referencia y el IL6R65 todavia podrían bloquear completamente el sIL-6R en plasma, aunque a mayores concentraciones, lo que indica que estas 2 moléculas se unen a un epítope que se superpone con el sitio de unión con IL-6. El IC50 del Fab de referencia aumentó de 0.55 nM hasta 8.47 nM y el IC50 de IL6R65 aumentó de 2.61 nM hasta 66.25 nM.
Ejemplo 29: Estudios de competencia Biacore Se llevaron a cabo experimentos Biacore para investigar si IL-6 e IL6R65 fueron capaces de unirse a IL-6R simultáneamente. El Fab de referencia (Figura 25A) , IL6R201/75 (Figura 25B) o IL6R65 (Figura 25C) se capturaron en IL-6R después de lo cual se dejó que IL-6 se uniera al complejo. Con el Fab de referencia e IL6R65 casi no se: podría observar la unión de IL-6. Cuando se capturó IL-6 sobre IL-6R y se inyectaron los Nanobodies, pareció que todos los Nanobodies fueron capaces de unirse al complejo. Sin embargo, en el caso del Fab de referencia e IL-6R65 esto probablemente fue debido a que IL-6 se desplazó debido a la menor afinidad de IL-6 para IL-6R.
Por último, se dejó que IL-6R se uniera a una micro-plaqueta recubierta con IL-6 en presencia o ausencia de los Nanobodies (Figura 25D) . Esto confirmó los resultados anteriores, a saber, IL-6R no se podría capturar en presencia del Fab de referencia o IL6R65.
En conclusión, los experimentos de mapeo con epitopes Biacore mostraron que tanto el Fab de referencia como el IL6R65 se dirigieron al mismo epitope que IL-6. Mientras que IL6R65 y el Fab de referencia fueron capaces de bloquear completamente la unión de IL-6 a IL-6R, IL6R201 fue incapaz de evitar la unión de IL-6 a IL-6R cuando el Nanobody se unió al receptor.
V. Maduración por afinidad del IL6R65 Ejemplo 30: Estrategia de diversificación para la maduración por afinidad Las regiones CDR del Nanobody IL6R65 se sortearon aleatoriamente utilizando las 2 siguientes estrategias: 1. Cada residuo CDR se reemplazó por un conjunto de residuos con químicas individuales de cadena lateral: K <-» R A <- S <-> ? I <- L V F <-» Y N D Q <?· E G <-» A M <?· L H, C, , P se mantuvieron constantes 2. Cada residuo CDR se reemplazó por un panel de aminoácidos que se presentan en la naturaleza en esa posición. Sólo los aminoácidos que se presentan con mayor frecuencia en cada posición se introdujeron para limitar la diversidad por posición. Este procedimiento sólo se utilizó para el sorteo aleatorio de CDRl y CDR2.
El sorteo aleatorio concurrente de CDRl y 2 se realizó utilizando las 2 estrategias descritas anteriormente y CDR3 se sorteó aleatoriamente por separado siguiendo la estrategia 1 dando por resultado en un número total de 3 bibliotecas. Las 3 bibliotecas se realizaron con equipo propio mediante extensión de superposición por PCR utilizando oligos degenerados. La diversidad teórica para cada una de las bibliotecas fue de aproximadamente Ixl0e6. Los fragmentos que codifican para las variantes de Nanobody se clonaron en el vector para exhibición de fagos. El tamaño real de las 3 bibliotecas fue de aproximadamente Ixl0e8 (lOOx de cobertura de diversidad teórica) . El ciclo de selección se realizó utilizando diferentes concentraciones de IL-6R biotinilado (0, 1, 10 y 100 pM) en solución. No se observó enriquecimiento para la biblioteca CDR3 bajo estas condiciones, mientras que se observó enriquecimiento dependiente de la dosis para ambas bibliotecas CDR1/2. Los resultados de las bibliotecas CDR1/2 se analizaron como extractos periplásmicos en ELISA y posteriormente se probaron en Biacore los clones con las señales más altas. Los 30 clones superiores en ELISA mostraron índices cancelados entre 2.1xl0e-3 y 2.6xl0e-4 s-1. Los 5 Nanobodies con los menores índices cancelados se secuenciaron, se expresaron y purificaron (Figura 26).
Ejemplo 31: Expresión y purificación de Nanobody Los Nanobodies madurados por afinidad se expresaron en E. coli como c-myc, proteínas marcadas con (His)6 en un volumen de cultivo de 250 mi. La expresión se indujo mediante la adición de 1 mm de IPTG y se dejó continuar durante 4 horas a 37°C. Después de centrifugar los cultivos celulares, se prepararon extractos periplásmicos al congelar-descongelar los sedimentos. Estos extractos se utilizaron como material de partida para la cromatografía por afinidad de metal inmovilizado (IMAC) . Los Nanobodies se eluyeron a partir de la columna con imidazol 150 mm y posteriormente se desalificaron sobre una columna Hiprep26/10.
Ejemplo 32: Determinación de la afinidad de las variantes maduras por afinidad en Biacore El Nanobody IL6R65 (secuencia optimizada) y las 5 variantes maduradas por afinidad se analizaron sobre Biacore. Las curvas de unión a diferentes concentraciones del Nanobody purificado se registraron y utilizaron para calcular las constantes de afinidad. Los valores Kd para estos 5 clones fueron entre 0.34 y 0.95 nM lo que corresponde a una mejora de 13 veces con relación a IL6R65 (Nanobody original) para la mejor variante (Figura 27).
Ejemplo 33: Evaluación de las variantes maduradas por afinidad en un análisis para potencia en plasma Los 5 Nanobodies valorados por afinidad y el Nanobody optimizado por secuencias también se probaron en un análisis para potencia en plasma. En este análisis, se mezclaron diferentes concentraciones de Nanobody con IL-6R soluble que contuvo el plasma proveniente de ya sea humano o de mono cynomolgus y una concentración fija de IL-6 humano (2.4 ó 42 nM) . Después de 1 hora de incubación la mezcla se transfirió a una placa Maxisorp recubierta con el MAb BN-12 anti-IL-6R (Diaclone) . La cantidad de IL-6 unido se determinó mediante la adición posterior del anticuerpo policlonal anti-IL-6 biotinilado (R&D Systems) y estreptavidina-HRP . Como sustrato se utilizó T B. La conversión por sustrato se midió a 450 nm (Figuras 28A, 28B) .
Ejemplo 34: Evaluación de las variantes maduradas por afinidad en el análisis TF-1 Los Nanobodies madurados por afinidad también se i probaron por su capacidad para inhibir la proliferación dependiente de IL-6 de células TF-1 (ECACC no. 93022307; 1989, J. Cell Physiol. 140: 323; 1993, Exp. Cell Res . 208: 35) debido al bloqueo de la unión de IL-6 a IL-6R Sobre la superficie celular. Para este fin, se pre-incubaron diluciones en serie del Nanobody con una cantidad fija de células TF-1 durante 2 horas a 37°C. Posteriormente, se agregó IL-6 a una concentración final de 2 ng/ml. La proliferación celular dependiente de IL-6 se dejó continuar durante 72 horas y se midió mediante la incorporación de timidina marcada tritio (Figura 29) .
Los valores IC50 de los Nanobodies madurados por afinidad fueron hasta 17 veces mejores que los de: IL6R65 aunque todas las variantes todavía fueron menos potentes que el -IgG de referencia.
Ejemplo 35: Estudios de competencia Biacore Se llevaron a cabo experimentos Biacore para investigar si IL-6 es capaz de unirse a IL-6R simultáneamente con IL6R65 y con 2 de sus variantes madurados por afinidad (7D6 y 7C4). En estos experimentos IL-6R se capturó sobre una micro-plaqueta recubierta con BN-12 y se saturó con el Nanobody IL6R65 (Figura 30A) , 7D6 (Figura 30B) o 7C4 (Figura 30C) . Después, la unión del complejo de IL-6 a IL-6R-Nanobody se valoró mediante inyección de la citoquina a una concentración de 100 nM. Además, también se determinó la unión de los 3 Nanobodies al complejo IL-6R con IL-6.
Los resultados para IL6R65 (Figura 30A) son comparables con los resultados observados anteriormente y confirman que IL6R65 e IL-6 reconocen al mismo epitope sobre IL-6R. Como se esperó, las variantes maduradas por afinidad de IL6R65 e IL-6 también reconocieron el mismo epitope sobre IL-6R (Figura 30B-C) .
Ejemplo 36: Maduración por afinidad adicional Después, se generó un panel de 47 Nanobodies que contuvieron diferentes combinaciones de mutaciones benéficas en CDRl/2 y CDR3. Estas mutaciones se identificaron mediante un análisis total de las secuencias proteinicas y los índices cancelados de todos los clones de Nanobody aislado de las bibliotecas del sorteo aleatorio CDR. Los índices cancelados de estos clones de 2a generación variaron de 4.2E-04 hasta 4.5E-05 s-1. Se seleccionaron 5 clones que muestran los menores índices cancelados para análisis adicional : (20F6, 20A11, 20E10, 21A10, 21D11) . En la figura 31 se listan las secuencias .
Ejemplo 37: Expresión y purificación del Nanobody : de las variantes de segundo ciclo Los Nanobodies madurados por afinidad se expresaron en E. coli como c-myc, proteínas marcadas con (His) 6 en un volumen de cultivo de 250 mi. La expresión se indujo mediante la adición de 1 mm de IPTG y se dejó continuar durante 4 horas a 37°C. Después de centrifugar los cultivos celulares, los extractos periplásmicos se prepararon al congelar-descongelar los sedimentos. Estos extractos se utilizaron como material de partida para la cromatografía de afinidad con metal inmovilizado (IMAC). Los Nanobodies se eluyeron a partir de la columna con 150 mm de imidazol y posteriormente se desalificaron sobre una columna Hiprep26/10.
Ejemplo 38: Determinación de las temperaturas de fusión La estabilidad de la temperatura de los Nanobodies se analizó en el análisis de desplazamiento térmico. Los valores Tm fueron similares para todos los Nanobodies madurados por afinidad y ligeramente superiores en comparación con IL6R65. Los valores Tm se listan en la Tabla Ejemplo 39: Determinación de la afinidad de las variantes sobre Biacore de 2° ciclo Los parámetros cinéticos para el Nanobody¡ IL6R65 (secuencia optimizada) y las 5 variantes maduradas por afinidad se determinaron sobre Biacore T100. Los índices de asociación (ka) se determinaron a partir de las curvas de unión a 2 diferentes concentraciones del Nanobody purificado y una concentración fija de IL-6R que se capturó en la micro-plaqueta vía mAb BN-12. Los índices cancelados se determinaron a una concentración individual de Nanobody utilizando IL-6R acoplado covalentemente a micro-plaquetas. En la Tabla C-26 se listan los valores para ka, kd y Kd.
Ejemplo 40: Evaluación de las variantes de 2° ciclo' en el análisis TF-1 La actividad biológica de las variantes de 2'° ciclo se evaluó en el análisis TF1 y los datos se presentan en la figura 32. Los clones madurados por afinidad del 2P ciclo tuvieron una potencia superior a 5-8 veces que el clon 7C4 del primer ciclo y fueron 2.5-4 veces más potente que el IgG en el punto de referencia descrito Ejemplo 1. El clon que se desarrolla mejor fue 20A11 con un IC50 de 0.4 nM (4 veces más potente que el comparado con el punto de referencia) .
Ejemplo 41: Evaluación de las variantes sobre el 2° ciclo en análisis para potencia en plasma La inhibición de IL-6R soluble se analizó en el análisis para potencia en plasma a concentraciones altas y bajas de IL-6. Las variantes del 2° ciclo fueron al menos tan potentes como el IgG de referencia en el análisis para potencia en plasma (0.1-0.2 nM) lo cual fue el limite de sensibilidad de este análisis. A una alta concentración de IL-6 (EC95) , los mutantes de afinidad todavía fueron capaces de bloquear la unión de IL-6 a sIL-6R y parecieron ser 3-4 veces más potente que el IgG de referencia. No se podría observar ninguna diferencia entre las variantes del Io y 2° ciclos en este análisis. Como se esperaba, todos los^ clones probados tuvieron reacción cruzada cyno (Figuras 33A, 33B) .
Ejemplo 42: unión a los PBMC humanos en sangre total Los Nanobodies purificados IL6R65 y PMP20A11 se probaron en FACS para la unión a los PBMC humanos. La unión celular se detectó utilizando un mAb anti-his biotinilado y estreptavidina marcada con PE (Figura 34). Tanto IL6R65 como la variante madurada por afinidad PMP20A11 se podrían unir a neutrófilos, monocitos y a una subpoblación de linfocitos. Esto está de acuerdo con el perfil de expresión de IL-6R.
VI. Formateo del Nanobody maduro por afinidad Ejemplo 43: Preparación de las estructuras multivalentes PMP20A11 se formateo como los Nanobodies bivalente y trivalente con el Nanobody ALB8 de unión con albúmina. En la Tablas C-27 se presenta una perspectiva general de los diferentes Nanobodies.
Ejemplo 44: Neutralización de la membrana IL-6R en el análisis TF-1 En un primer experimento, se verificó si los Nanobodies formateados inhibieron la señalización a través de IL-6R utilizando la linea celular TF-1 como sistema modelo. Los Nanobodies 20A11, IL6R304, IL6R305 e IL6R306 bloquearon de manera dependiente de la dosis y totalmente la proliferación inducida por IL-6 de las células TF-1 suministradas por la membrana IL-6R (Figura 35, Tabla C-28) .
Estos resultados demuestran que todos los Nanobodies formateados fueron más potentes en comparación con el IgG de referencia según se describe en el Ejemplo 1 para inhibir la actividad de la membrana IL-6R. En comparación con su IL6R304 equivalente monovalente, IL6R305 inhibió ~7 veces más potencia las respuestas provocadas por IL-6, lo que demuestra la interacción ávida de IL6R305 con la membrana IL-6R. IL6R306 fue menos potente que IL6R305 y sólo mostró una mejor potencia de 2 veces que IL6R304. Esto demuestra que el formato de IL6R306 es menos favorable y además indica que la unión de avidez de IL6R306 no es posible.
Después, se verificó si los Nanobodies formateados todavía podrían inhibir completamente la señalización a través de IL-6R a concentraciones patolóqicas de IL-6. En efecto, 20A11, IL6R304, IL6R305 e IL6R306 bloquearon dependiendo de la dosis y totalmente la proliferación1 de las células de TF-1 inducidas por 5000 IU/mL y IL-6 (Figura 36, Tabla C-29) . Como se esperaba, los IC5o se desplazaron en comparación con los experimentos realizados con 100 IU/mL. De acuerdo con los resultados anteriores, IL6R305 fue más potente para bloquear la señalización inducida por 1 IL-6 a través de la membrana IL-6R.
Debido a que los Nanobodies interactúan con; IL-6R, se verificó si la unión de los Nanobodies a este receptor podría inducir una actividad celular que conduce; a la proliferación celular. Se incubaron células TF-1 con un exceso de Nanobody en presencia o ausencia de 100 IU/mL IL-6 (Figura 37) . Como se esperaba, tanto IL6R304 como ÍL6R305 evitaron completamente la proliferación suministrada por IL-6. En efecto, IL6R305 e IL6R306 inhibieron la proliferación de IL-6 al mismo nivel que el antecedente (incorporación de 3H-timidina medida en ausencia de los factores de crecimiento) , lo que demuestra que IL6R304 e 1 IL6R305 bloquearon completamente el efecto de IL-6.
IL6R304 e IL6R305 no indujeron la proliferación de células TF-1 en ausencia de los factores de crecimiento, lo que sugiere que estos compuestos no tienen un efecto agonista sobre las células TF-1.
Ejemplo 45: Neutralización de SIL-6R en ELISA mediante los Nanobodies madurados por afinidad formateados La capacidad del bloque de construcción IL6R20A11 y sus variantes formateadas para evitar la unión del IL-6 humano a sIL-6R en plasma se analizó en ELISA para potencia en plasma. Debido a que la concentración de sIL-6R en plasma es variable, es necesario utilizar el mismo plasma a través de los diferentes análisis para comparar la potencia ¡ de los Nanobodies. También, una valoración de IL-6 se incubó primero en el plasma para determinar la concentración de IL-6 que se podría utilizar con los Nanobodies. Los valores EC50 y EC95 de IL-6 en plasma humano se determinaron para ser 27.29 ng/mL y 885 ng/mL, respectivamente. Estas concentraciones posteriormente se utilizaron para probar la potencia de los Nanobodies a concentraciones normales y altas de IL-6.
IL6R20A11 las variantes formateadas se compararon con el IgG de referencia según se describe en el Ejemplo 1.
Los valores IC50 resultantes para los diferentes Nanobodies se resumen en la Tabla C-30. En el EC50 de IL-6 (Figura 38A, 38B) ambos de los Nanobodies IL-6R monovalentes y bivalentes estuvieron en la misma variación que el IgG de referencia. Aunque IL6R304 tuvo únicamente un sitio de unión, tuvo un IC50 similar al IgG de referencia (0.229 n contra 0.258 nM) . IL6R305 pareció ser dos veces tan potente como IL6R304 (IC50 de 0.137 nM) que está en linea con sus dos sitios de unión. Sin embargo, IL6R306 pareció ser menos potente que IL6R304 y el IgG de referencia y tuvo un IC50 de 0.412 nM.
De manera más probable, el limite de análisis se alcanzó en los términos de sensibilidad. En efecto, la concentración de sIL-6R en plasma fue ~30 ng/mL o 0.6 nM. Por lo tanto, sólo se necesitaron 0.3 nM de SIL-6R para ser bloqueado por los Nanobodies (plasma al 50%) lo cual significa que el IC50 mínimo que se puede obtener es 0.15 nM. Esto corresponde a los valores IC50 que se obtuvieron. Sin embargo, si la concentración IL-6 se pudiera aumentar a 885 ng/mL podría ser más difícil para los Nanobodies competir con IL-6 y una mayor diferencia en la potencia se podría detectar. En efecto, a altas concentraciones de IL-6, IL6R20A11, IL6R304 e IL6R305 fueron claramente más potentes que el IgG de referencia, mientras que IL6R306 no lo fue (la Figura 38C, 38D) . La proporción de IC50 a altas y bajas concentraciones de IL-6 se muestra en la Tabla C-30. Claramente, el IgG de referencia e IL6R306 se afectaron en mayor medida al aumentar IL-6 que los otros Nanobodiés. Esto también se observó en el análisis TF-1 (véase el ejemplo 44) .
Ejemplo 46: Unión de los Nanobodiés madurados por afinidad formateados a la membrana IL-6R Para bloquear la señalización de IL-6, fue necesario neutralizar IL-6R tanto soluble como de membrana mediante los Nanobodiés. Por lo tanto, mediante citóme/tría de flujo se analizó la unión de los diferentes Nanobodiés formateados para células que expresan IL-6R.
Unión a células CHO que expresan IL-6R Células CHO transfectadas establemente que expresan IL-6R humanos se utilizaron para analizar la unión 1 de los Nanobodiés anti-IL-6R a la membrana IL-6R (Figura 39A) . Las células CHO IL-6R negativas se utilizaron como un control negativo (Figura 39B) . Todos los 4 Nanobodiés mostraron una unión saturada a células que expresan IL-6R, mientras que sólo se detectaron señales muy bajas a altas concentraciones de Nanobody sobre células IL-6R-negativas .
La fluorescencia PE media se exportó a GraphPad y las curvas 4PL se ajustaron para determinar los valores EC50.
Estos se resumen en la Tabla C-31. Contrario al análisis TF-1, IL6R305 no pareció beneficiarse de un efecto de avidez en este ajuste: sólo fue un factor 2 más potente que IL6R304 (0.8984 contra 1.939 nM) . Como también fue el caso en el TF-1 y en ELISA en plasma, IL6R306 se unió menos bien a las células IL-6R positivas.
Unión a leucocitos sanguíneos periféricos Se utilizaron los PBL humanos para demostrar la unión de los Nanobodies a la membrana IL-6R bajo condiciones fisiológicas. Esta matriz es bastante relevante para la situación in vivo, ya que contiene HSA (-50 mg/mL) , SIL-6R (~30 ng/mL) , células que expresan la membrana IL-6R (CD4+ linfocitos T, monocitos, granulocitos) y células IL-6R-negativas (la mayoría linfocitos B en circulación, CD8+ linfocitos T) . Los Nanobodies se incubaron en sangre tratada con EDTA proveniente de 2 donadores y el Nanobody unido se detectó mediante citometría de flujo. Los linfocitos, monocitos y granulocitos se circuitaron con base en las propiedades FSC/SSC (Figura 40) y los Nanobodies unidos se detectaron en el canal PE.
Como se puede observar en la Figura 40 (derecha), los granulocitos y monocitos se tiñen uniformemente por los Nanobodies. Por el contrario, sólo se tiñó una parte de los linfocitos. Esto se puede observar como un doble pico en el histograma PE. La fluorescencia media de las 3 poblaciones circuitadas después de la incubación con diferentes concentraciones de los Nanobodies se representa en la Figura 41 y los valores EC50 resultantes se resumen en la Tabla C-32.
Ejemplo 47: Afinidad de los Nanobodies maduros por afinidad formateados para la albúmina de suero humano y cyno Un análisis cinético de los Nanobodies bi-específicos, bivalentes y trivalentes, IL6R304 IL6R305 e IL6R306 sobre albúmina de suero humano y cyno se realizó mediante SPR en un instrumento Biacore 3000. En la figura 42 se muestran los resultados y se resumen en la Tabla C- 3. Los Nanobodies IL6R304, 305 y 306 mostraron constantes d índice cinético similares y afinidades (17-23 nM) para el SA humano y cyno. La afinidad de los Nanobodies IL-6R formateados para el SA fue 6.5x menor en comparación con el Nanobody ALB11 anti-SA monovalente mediante una disminución de un factor 2.5 en el índice de asociación y un aumento de un factor de 2.5 en el índice de disociación.
Ejemplo 48: Afinidad para IL-6R humano y cyno El análisis cinético sobre IL-6R humano y cyno se realizó mediante SPR en un instrumento Biacore T100. Debido a las indicaciones de un cambio conformacional de IL-6R cuando se inmoviliza directamente a la micro-placa sobre índices se midieron sobre IL-6R capturado por BN-12. Los ¡índices congelados se midieron sobre el IL-6R inmovilizado directamente, debido a la falta de disponibilidad de una herramienta de captura con un menor índice de disociación que la interacción del Nanobody-IL-6R. En la Tabla C-34 y la Figura 43 se muestran los resultados.
El índice cancelado de 20A11 (IL6R300; SEC ID NO: 66) disminuyó menos de un factor 2 mediante el formateo con un bloque de construcción anti-SA (IL6R304). El 1 índice cancelado para IL6R304 sobre IL-6R humano fue en el límite de detección o por debajo del mismo del instrumento Biacore. El índice cancelado sobre IL-6R cyno fue 2 veces mayor que sobre IL-6R humano, aunque cerca del límite de detección. Las afinidades calculadas para IL6R304 fueron 14 pM sobré IL-6R humano y 25 pM sobre IL-6R cyno.
Ejemplo 49: Reactividad cruzada de las especies de IL6R20A11 Utilizando plasma cyno en el ELISA para potencia en plasma se analizó la reactividad cruzada de IL6R20A11 y sus variantes formateadas con sIL-6R cynomolgus . También, se utilizó ELISA de competencia para determinar la reactividad cruzada de IL6R20A11 con SIL-6R cyno y de ratón.
ELISA para potencia en plasma Una valoración del IL-6 humano que se incubó primero en plasma cyno y el valor EC50 de IL-6 se determinó para ser 50.11 ng/mL. Esta concentración de IL-6 se utilizó posteriormente para probar la reactividad cruzada de los Nanobodies con el sIL-6R en plasma cyno. Como se puede observar en la figura 44, el IL6R20A11 y las variantes formateadas fueron de reacción cruzada claramente con sIL-6R cynomolgus. La misma clasificación se puede observar en un plasma humano y la proporción de los valores IC50 en: plasma humano contra cyno fue similar para todos los compuestos (Tabla C-35) .
ELISA de competencia El ELISA para potencia en plasma sólo sé puede utilizar si BN-12 es capaz de capturar SIL-6R en¦ plasma proveniente de su especie particular y si se puede detectar la unión de IL-6 a sIL-6R. Por lo tanto, se desarrolló un ELISA de competencia más genérico. Este análisis se basa en la unión de IL6R20A11 a IL-6R-bio capturado por neutravidina .
En resumen, 0.4 nM de IL6R20A11 se pre-incubaron con una serie de valoraciones de plasma a partir de diferentes especies que contienen el sIL-6R endógeno después de lo cual se capturó el IL6R20A11 libre sobre sIL-6R humano biotinilado inmovilizado sobre una placa recubierta con neutravidina, y se detectó con un anti-VHH mAbrFITC y anti-FITC-HRP . La concentración de IL6R20A11 de 0.4 nM corresponde a la concentración que proporciona el 50% de la señal máxima (EC50 de 0.35 ± 0.021 nM; n=4) .
Como se puede observar en la figura 45, IL6R20A11 claramente tuvo reacción cruzada con sIL-6R cyno que confirma los resultados Biacore. Por el contrario, no se podría observar ninguna unión a sIL-6R de ratón. El plasma humano y cyno también compitió con la unión de IL6R20A11 para el sIL-6R recombinante, mientras que el plasma de ratón no lo hizo. De hecho, se observaron señales cada vez mayores a altas concentraciones de plasma de ratón lo cual probablemente es debido a la detección de las inmunoglobulinas de ratón en el análisis.
Ejemplo 50: Especificidad de IL6R20A11 para IL-6R IL-6R pertenece a la familia de receptores de citoquina tipo I. Debido a que la región de unión con citoquina de estos receptores se conserva, la especificidad de IL6R20A11 para IL-6R se analizó al analizar la unión a los receptores relacionó con IL-6R. La unión de IL6R20A11 a LIF-R, CNTF-R, OSM-R e IL-11R/Fc se analizó en un ELISA de unión competitiva. Como se puede observar en la figura 46, el sIL-6R de control positivo inhibió la unión de IL6R20A11 a la placa. El IC50 para sIL-6R (0.03 nM) estuvo en linea con el IC50 esperado con base en la cantidad de IL6R20A11 que se utilizó (0.025 nM contra 0.05 nM) . Ninguna de las proteínas relacionadas con IL-6R pareció competir con la unión de IL6R20A11 a sIL-6R, incluso a un exceso molar de 100 veces (5 nM) . En una preparación similar, se mostró que CLF-1/CLC, IL12-p40, IL-27B y gpl30/Fc tampoco interactuaron con 0.05 nM de IL6R20A11, incluso a concentraciones tan altas como 100 nM (no se muestran los resultados) .
VII. Análisis PK/PD in vivo de IL6R304 e IL6R305 El objetivo de este estudio fue analizar la farmacocinética en plasma (PK) , la farmacodinámica (PD) y la inmunogenicidad de dos secuencias optimizadas, los Nanobodies del receptor de anti-interleucina 6 (IL-6R) madurados por afinidad, a saber IL6R304 e IL6R305, el mono cynomolgus después de una administración intravenosa en bolo individual. La administración de los Nanobodies fue seguida por inyecciones subcutáneas durante 7 días del IL-6 humano (h) recombinante que inicia 24 horas después de la administración del Nanobody. El objetivo final de este estudio para eficacia in vivo fue valorar la capacidad de estos Nanobodies anti-IL-6R para inhibir los parámetros inducidos por hIL-6 y comparar su eficacia con cada uno y con la referencia del punto de referencia del Ejemplo 1.
En primates no humanos y en humanos, se ha reportado que el hIL-6 recombinante induce la síntesis de proteínas en fase agudas. Las proteínas en fase aguda se definen como una clase de proteínas en plasma, tales como la proteína C-reactiva (CRP) , suero amiloide A, haptoglobina, fibrinógenogen, albúmina y transferrina cuyas concentraciones en plasma aumentan o disminuyen en al menos el 25% en respuesta a la inflamación, principalmente debido a cambios en su producción mediante hepatocitos. Los patrones de la producción de citoquinas y la respuesta en fase aguda difieren en diferentes condiciones inflamatorias. Por lo tanto, los cambios en fase aguda reflejan la presencia e intensidad de inflamación, haciéndoles diagnósticamente relevantes. Los principales estimuladores de la producción de proteínas en fase aguda son las citoquinas asociadas con la inflamación, que se producen durante procesos inflamatorios: IL-6, IL-?ß, factor- de necrosis tumoral (TNF-a) , interferon-? ( (INF-?) , factor ß de crecimiento transformante (TGF-ß) y posiblemente IL-8.
Ejemplo 51: Diseño del estudio En este estudio 6 grupos (los grupos 6 a 11, Tabla C-36) de 2-3 animales recibieron una inyección i.v. individual de IL6R304 o IL6R305. De ambos Nanobodies, se probaron 3 diferentes dosificaciones, a saber 0.4, 2 ó 10 mg/kg. Además, los animales en el grupo 12 (n = 3) recibieron el vehículo y sirvieron como control negativo, mientras que los animales del grupo 13 (n =3) se inyectaron con 5 mg/kg IgG de referencia (Tabla C-36) .
Iniciando en TD1, es decir 24 horas después de la administración del artículo de prueba, todos los animales se inyectaron una vez diariamente durante 7 días con hIL-6 (5 µg/kg; Figura 47) .
Se recolectaron muestras sanguíneas vía la vena cefálica o safena magna antes y después de la inyección de hIL-6 en puntos de tiempo predeterminados (véase la figura 47). Se extrajeron muestras de sangres extra en TDO para análisis PK (véase la Tabla C-37).
Ejemplo 52: El efecto de los Nanobodies sobre una respuesta en fase aguda inducida por hIL-6 (fase 2) El efecto de los Nanobodies y el IgG de referencia positivo se analizó sobre la inducción de una respuesta en fase aguda mediante 7 inyecciones diarias consecutivas de hIL-6. Las lecturas de salida fueron niveles CRP, los niveles de fibrinógeno y el conteo de plaquetas.
En el grupo de control negativo (grupo 12), los niveles CRP se elevaron inmediatamente después de la ¡primera inyección de hIL-6 y en el día 2 ya se alcanzaron los niveles del máximo. Los niveles máximos logrados fueron entre 0.2-0.8 mg/mL y este plato se mantuvo hasta el dia 8 que es el día después de la última inyección de hIL-6 (figura 48A) .
Estos cambios se inhibieron completamente mediante el pre-tratamiento con 5 mg/kg del IgG de referencia (figura 48B) . También un pretratramiento individual con una dosificación comparable (2 mg/kg) o una dosificación superior a 5 veces (10 mg/kg) de los Nanobodies IL6R304 e IL6R305 proporcionó casi la inhibición completa de la inducción de CRP durante el curso total del experimento (Figura 48C y 48D) . Sólo el animal No. 18 en el grupo de dosificación más alta de IL6R304 mostró alguna inducción, alcanzando niveles CRP en suero máximos de aproximadamente 0.1 mg/mL. En el grupo de dosificación menor (0.4 mg/kg), ambos Nanobodies proporcionaron una inhibición completa durante 7 diás. Los niveles CRP aumentaron únicamente en el dia 8 a niveles comparables como en el grupo de control negativo (Figura 48A, 48B, 48C, 48D) . Los niveles CRP medios de todos los grupos se pueden encontrar en la figura 49.
Los niveles de fibrinogeno aumentaron lentamente en el grupo control negativo a un máximo promedio de 5 veces los valore iniciales (Figura 50A) . Este máximo se alcanzó en el dia 6 y se mantuvo durante 2 días más. En el dia 14, los niveles de fibrinogeno regresaron a los valores iniciales. El IgG de referencia fue capaz de inhibir completamente la inducción de fibrinogeno (Figura 50B) . Ambos Nariobodies mostraron una inhibición dependiente de la dosis de la inducción de fibrinogeno (Figura 50C y 50D) . En los grupos con la dosificación más alta, la inhibición fue casi completa para ambos animales pre-tratados con IL6R304 y para 1 de los 2 animales pre-tratados con IL6R305. Hubo algunos aumentos menores en los niveles del fibrinogeno del animal No. 25 (10 mg/kg IL6R305) y de todos los animales de los grupos con dosificación media y menor de ambos Nanobodies. Sin embargo, en estos animales, los niveles de fibrinógenoi nunca excedieron 2-3 veces los valores iniciales. Los niveles de del fibrinogeno medios de todos los grupos se pueden encontrar en la Figura 51.
Para todos los animales en el grupo control negativo, los conteos de plaquetas aumentaron lentamente desde el dia 5 hacia adelante. Los niveles máximos se alcanzaron en el día 8 hasta el día 14 y fueron entre 160-190% de los valores iniciales. El efecto de hIL-6 sobre los conteos de plaquetas se bloqueo completamente mediante un pre-tratamiento individual con 5 mg/kg del IgG de referencia > 2 mg/kg de los Nanobodies. Una inducción en el conteo de plaquetas sólo se observó en el grupo con dosificación menor de los Nanobodies, iniciando en todos los animales en el día 8. La inducción máxima fue de aproximadamente 120-150% de valores iniciales para IL6R304, mientras que los máximos conteos de plaquetas para IL6R305 fueron entre 160-180% de los valores iniciales (52A, 52B, 52C,52D y 53).
En conclusión, IL6R304 e IL6R305 mostraron una inhibición dependiente de la dosis similar y completa de la totalidad de los tres parámetros de respuesta en fase aguda.
Ejemplo 53: Concentraciones en plasma después de la administración i.v. de IL6R304 o IL6R305 (0.4-2- 10 mg/kg) en monos cynomolgus Se extrajeron muestras sanguíneas para análisis farmacocinético en plasma (PK) y para análisis de muestra en ELISA a la pre-dosis y en los siguientes puntos de tiempo después de la administración de IL6R304 o IL6R305: 5 y 30 minutos, 3 y 8 horas, día 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 14, 21 y 29.
En la figura 54 y la figura 55, respectivaménte, se muestran las gráficas de concentración-tiempo en plasma observados individuales después de la administración i.v. de IL6R304 (0.4-2-10 mg/kg) e IL6R305 (0.4-2-10 mg/kg) a monos cynomolgus.
Ejemplo 54: Análisis farmacocinético no compartimental de IL6R304 e IL6R305 (0.4-2-10 mq/kq) en monos cynomolgus En la Tabla C-38, Tabla C-39, Tabla C-40, Tabla C- 41, Tabla C-42 y Tabla C-43 se proporciona una perspectiva general de los parámetros PK básicos obtenidos mediante análisis PK no compartimental de IL6R304 (0.4-2-10 mg/kg) e IL6R305 (0.4-2-10 mg/kg) en monos cynomolgus. Los parámetros PK analizados en la presente se obtuvieron utilizando análisis no compartimental (NCA) utilizando el Software WinNonlin Professional Versión 5.1 (Pharsight Corp). Los parámetros terminales para algunos de los animales se calcularon con dos puntos de datos únicamente (R2 es uno por omisión) .
Para ambos Nanobodies administrados intravenosamente en monos cynomolgus, las concentraciones en plasma parecieran disminuir de una forma trifásica. Durante los primeros dos días después de la administración, hubo una fase de disposición inicial, seguida por una fase dominante menor. Un declinación gradual a las menores concentraciones da por resultado en una fase terminal caracterizada por una vida media corta.
Debido a que se detectaron anticuerpos antifármacos en las muestras en plasma de la mayoría de monos cynomolgus, el cambio en la vida media terminal a menores concentraciones se podría vincular con un mecanismo de intercambio inmuno-suministrado. Sin embargo, es poco probable la examinación de los perfiles PK: a la dosificación menor la vida media más corta se ha observado en los puntos de tiempo donde no se detectó inmunogenicidad . Además, a pesar de la presencia de títulos detectables a las dosis mayores, todavía existe una tendencia a vidas medias mayores (por ejemplo, IL6R304 10 mg/kg i.v.).
Con base en las observaciones del perfil , PK, se espera que ambos Nanobodies se aclaren de la circulación vía al menos dos mecanismos. En esta situación, un mecanismo de intercambio no saturable lineal puede representar la degradación específica de un compuesto. Un segundo mecanismo de intercambio podría ser un blanco suministrado (por ejemplo, la internalización de la unión del fármaco a la membrana de IL-6R unido y un intercambio posterior) . A mayores concentraciones de Nanobody, se espera que el mecanismo de intercambio posterior se sature y sea insignificante en comparación con el intercambio lineal no saturable: el intercambio lineal es dominante (dando por resultado en una vida media dominante) . Sin embargo, a menores concentraciones, el índice de metabolismo es mayor para una concentración determinada de Nanobody, dando por resultado en un cambio de pendiente terminal.
Debido al intercambio suministrado por blancos, los parámetros PK obtenidos vía análisis NCA tales como el intercambio y la vida media parecieron ser dependientes de la dosis y el tiempo. El intercambio total es el mayor a menor dosificación: 24.8 y 35 mL/día/kg para IL6R304 e IL6R305 después de 0.4 mg/kg i.v. en comparación con 10.4-9.00 y 5.93-7.76 mL/día/kg para IL6R304 e IL6R305 a las dosificaciones mayores. Correspondientemente, la exposición normalizada de dosis será menor a la dosis menor (dosis = CL x AUC) .
La vida media dominante de IL6R304 disminuyó de 6.61 días a 5.00 días y 1.73 días después de la administración i.v. de 10, 2 y 0.4 mg/kg. La vida media dominante de IL6R305 disminuyó de 7.37 días hasta 4.29 días y 1.64 días después de la administración i.v. de 10, 2 y 0.4 mg/kg. Debido a que más puntos de datos están disponibles en puntos de tiempo anteriores, la fase terminal se caracterizó mejor a la menor dosificación: una vida media terminal corta de 0.530 días y 0.470 días se observó después, de la administración i.v. de 0.4 mg/kg IL6R304 e ÍL6R305, respectivamente.
Con base en estos hallazgos PK, se considera que serán similares las propiedades farmacocinéticas de IIÍ6R304 e IL6R305.
En el día de prueba 29 para el mono 14m y él mono 15f (i.v. 2 mg/kg) todavía fueron detectables bajos niveles de concentración de IL6R304. Con base en los perfiles PK de los otros monos, estas observaciones fueron inesperadas. Es posible que esto indique un segundo tipo de unión blanco saturable, que sólo se hace evidente a muy; bajas concentraciones. Sin embargo, estas observaciones también podrían ser un artefacto del análisis de muestras PK ELISA.
Los volúmenes reportados de distribución calculados vía análisis NCA fueron la variación baja de una a dos veces el volumen en plasma de aproximadamente 40 mL/kg para ambos Nanobodies, lo que sugiere una distribución limitada fuera del espacio vascular. Sin embargo, el verdadero Vss se puede sub-estimar debido a errores metodológicos vinculados con NCA (por ejemplo, la distribución de Nanobody y la degradación posterior en el espacio periférico podría no ser atribuidos al término de distribución pero al intercambio sistémico total). El Vss parece realmente constante a través de los diferentes niveles de dosificación.
Para ilustrar los posibles efectos de la unión blanco sobre el perfil PK, la figura 56 compara los perfiles PK medianos de IL6R304 (i.v. 0.4-2-10 mg/kg) e IL6R202 (i.v. 2 mg/kg, SEC ID EN: 73) . Para fines ilustrativos el perfil PK de IL6R202 (i.v. 2 mg/kg) se normalizó también a una dosis de 0.4 mg/kg y 10 mg/kg. Se mostró que IL6R304 se une a IL-6R en mono cynomolgus, mientras que para IL6R202 hubo una falta de unión blanco en mono cynomolgus (WO 09/010539) . Correspondientemente, a altas concentraciones donde el intercambio lineal es dominante, el perfil (y las vidas medias correspondientes) de ambos Nanobodies fueron similares. A concentraciones menores, se observó un cambio gradual en pendiente para IL6R304 más probablemente debido al intercambio suministrado por blancos, mientras que para IL6R202 no hubo cambio en la pendiente terminal. Sin m a go, las menores concentraciones de IL6R304 e IL6R305 también podrían ser algo sub-estimadas debido a la interferencia de IL-6R en el PK ELISA, en especial si están presentes altos niveles de IL-6R.
Ejemplo 55: Detección de los anticuerpos de anti-IL6R304 y anti-IL6R305 Una serie de muestras de plasma extraídas a la pre-dosis y ha diferentes días después de la administración de IL6R304 o IL6R305 se seleccionaron para la presencia de anticuerpos de mono (isotipo IgG) capaces de unirse al Nanobody o uno o más de sus bloques de construcción. Las muestras provenientes de los animales dosificados con IL6R304 se analizaron en placas recubiertas con ya sea IL6R304 (Figura 57), IL6R300 (Figura 58) o ALB8 (Figura 59). Las muestras provenientes de animales dosificados con IL6R305 se analizaron en placas que se recubrieron con ya sea IL6R305 (Figura 60), IL6R300 (Figura 61) o ALB8 (Figura 62).
En la Tabla C-44 se proporciona un resumen de la aparición de los anticuerpos anti-fármaco (ADA) para un Nanobody total (IL6R304 e IL6R305) . Se observó una respuesta menor o ninguna respuesta para IL6R300 y Alb8. En conclusión, después de la inyección i.v. de IL6R304, ADA : fueron detectables en todos los monos (excepto para el animal No. 16 en el cual no se podría hacer una determinación ADA debido a los altos valores de pre-dosis) . Los anticuerpos aparecieron después de 1 semana posterior a la administración para los monos dosificados a 0.4 mg/kg y después de 2 semanas posteriores a la administración para los dosificados a 2 mg/kg y 10 mg/kg. En los animales No. 11 y 13, se obtuvieron los mayores títulos ADA (ambos a partir de la dosificación de 0.4 mg/kg). Después de la inyección i.v. de IL6R305, fueron detectables ADA en todos los monos (excepto para el animal No. 23 en el cual no se detectó ADA). Los anticuerpos aparecieron después de 1 semana posterior a la administración para los monos dosificados a 0.4 mg/kg y después de 2 semanas posteriores a la administración para los monos dosificados a 2 mg/kg y 10 mg/kg. En los animales 22 y 24 se obtuvieron los títulos superiores ADA (ambos provenientes de la dosificación 2 mg/kg) y en los animales No. 25 y 26 (ambos a partir de la dosificación los 10 mg/kg) .
Ejemplo 56: El efecto de los Nanobodies sobre los niveles SIL-6R Como se esperó con base en los datos disponibles al público (Nishimoto et al., 2008, Blood 112(10): 3959-64), el tratamiento con IgG de Ref condujo a un aumento en sIÍL-6R en plasma, mientras que el tratamiento con vehículo no lo hizo (Figura 63A) . De manera similar, la dosificación baja de IL6R304 indujo a un aumento rápido en los niveles de SIL-6R en la totalidad de tres monos (Figura 63B) . En los animales tratados con IL6R305 también aumentó el SIL-6R en plasma, aunque no tan pronunciado como en los otros grupos de tratamiento (Figura 63C) .
VIII. Eficacia de IL6R304 Ejemplo 57: El efecto de los Nanobodies sobre los niveles de sIL-6R en el estudio de eficacia Via ELISA se midieron los niveles totales de SIL-6R en plasma (libre, unido a Nanobody y unido a IL-6) . Como se esperó con base en los datos publicados (Nishimoto et al., 2008, Blood 112(10): 3959-64), con tratamiento con IgG de Ref condujo a un aumento en el SIL-6R en plasma, mientras, que el tratamiento con vehículo no lo hizo (Figura 64A) . De manera similar, todos los animales tratados con Nanobody mostraron un rápido aumento en los niveles de sIL-6R. Esto sé puede explicar por un intercambio más lento del complejo IgG de Ref o NB-sIL-6R en comparación con el sIL-6R libre.
El nivel máximo de sIL-6R y la duración del efecto fueron claramente dependientes de la dosis. También, el efecto de los Nanobodies parece ser más pronunciado que para el IgG de Ref (comparar la dosificación de 2 mg/kg de los Nanobodies al IgG de Ref en la Figura 64). Esto posiblemente se puede explicar debido a un intercambio más ' rápido suministrado por Fe de los complejos inmunitarios de anticuerpos. Sin embargo, sorprendentemente, el aumento en SIL-6R y la duración del efecto fueron más pronunciados para IL6R304 (Figura 64A) en comparación con IL6R305 (Figura 64B) .
Ejemplo 58: El efecto de los Nanobodies sobre los niveles de IL-6 en el estudio de eficacia Los niveles totales de IL-6 en el plasma (libre, sIL-6R-unido) se midieron vía la plataforma Gyrolab. Para este análisis, se utilizó un mAb IL-6 anti-humano de rata biotinilado para capturar el IL-6 y un mAb IL-6 anti-humano de ratón marcado con Alexa para la detección. El análisis mide tanto IL-6 de mono cynomolgus endógeno como él IL-6 humano recombinante que se inyecta diariamente de los dias 1-8. Por lo tanto, es necesario realizar una distinción entre el IL-6 que se puede medir hasta el día 1 (= sólo él IL-6 cyno endógeno) y desde los dias 2-29 (= IL-6 humano administrado + IL-6 cyno endógeno) .
Como se puede observar en las Figuras 65A, 65B, 65C y 65D, la administración de IL6R304, IL6R305, el IgG de Ref y a un grado menor el placebo, condujo a un aumento transitorio en IL-6 el cual alcanzó su máximo a 8 horas después de la administración. Después, este aumento fue marcadamente superior en los grupos tratados con Nanobody. El efecto sobre IL-6 no parece ser especifico para los Nanobodies que se dirigen a IL-6R, debido a que la administración de un Nanobody irrelevante también conduce a una respuesta IL-6 transitoria (Figura 65D) . El primer aumento en IL-6 dé manera más probable se puede explicar por el estrés debido a la manipulación de los animales y potencialmente a un aumento adicional en la producción de IL-6 en minutos de las cantidades de endotoxinas en las preparaciones de Nanobody.
Durante la fase de tratamiento de IL-6 se muestreo la sangre antes de cada inyección diaria de IL-6. En el grupo placebo, que recibió IL-6 pero no los Nanobodies o el IgG de Ref , casi no se detectó IL-6 (Figura 65C) . Esto está en linea con la media vida corta del IL-6 humano después de la inyección SC (Tsigos, et al., 1997, J. , Clin. Endocrinol . Metab. 82: 4167-70). Sin embargo, en todos los animales tratados con 2-10 mg/kg del IgG de Ref, IL6R304 o IL6R305, IL-6 se detectó de los días 2-8. Esto se puede explicar mediante el bloqueo del intercambio suministrado por el receptor de IL-6, prolongando con esto su media vida (Nishimoto et al., 2008, Blood 112(10): 3959-64). Por lo tanto, el IL-6 en circulación podría servir como un biomarcador farmacodinámico para la neutralización de IL-6R.
IX. Farmacodinámica de IL6R304 Ejemplo 59: Efectos farmacodinámicos después de la disificación individual en monos Cynomolgus Cambios en las concentraciones en plasma de sIL6R también se midieron después de la administración i.v. individual de IL6R304 en monos cynomolgus sanos (es decir no estimulados) . En este estudio PK/PD de dosificación individual, las dosificaciones variaron de 1-100 mg/kg. Se realizó un muestreo sanguíneo para análisis farmacocinéticos, de inmunogenicidad y farmacodinámicos . Se utilizó un análisis a base de ELISA para medir los niveles totales de SIL6R y un análisis para unión de ligandos utilizando la plataforma GyrolabMR para medir los niveles de sIL6R libres. Para el análisis total de sIL6R, se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-IL6R no neutralizante para capturar el sIL6R (libre + el complejo) y una herramienta anti-IL6R biotinilada policlonal en combinación con estreptavidina-HRP para la detección. Para el análisis libre de sIL6R, se utilizó un bloque de construcción de 20A11 biotinilado para capturar el sIL6R libre y el anticuerpo monoclonal anti-IL6R de un neutralizante marcado con Alexa para la detección.
Los resultados del estudio PK/PD de dosificación individual confirmaron el efecto dependiente de la dosis de IL6R304 sobre (i) las concentraciones totales máximas de sIL6R Figura 66A) , (ii) la duración de (sIL6R total aumentado (Figura 66A) y (iii) la duración de la supresión del sIL6R libre (Figura 66B) . En general, las concentraciones totales y libres de sIL6R regresaron a los niveles de los valores iniciales después de un tiempo determinado (dependiente de la dosis, elevación mayor y la supresión se observan con la mayor dosificación) . Las concentraciones de sIL6R libre después de la administración a una baja dosis de 1 mg/kg IL6R304 se disminuyeron durante aproximadamente 8 dias y luego aumentaron a concentraciones por encima de aquéllas de los animales tratados con vehículo.
Se observó una buena correlación inversa entre los niveles totales de sIL6R, los niveles libres de sIL6R (PD) y las concentraciones de IL6R304 que confirman que se puede utilizar sIL6R como un biomarcador para la presencia del fármaco activo. La figura 67 muestra un ejemplo para aclarar la interacción entre los 3 parámetros (el grupo con dosificación media se seleccionó como el regreso a valores iniciales como se puede mostrar en este grupo) : la administración de IL6R304 a un aumento en las concentraciones totales de sIL6R y se formó un complejo estabilizado de fármaco-sIL6R. A medida que aumentaron las concentraciones en plasma de IL6R304, las concentraciones de sIL6R total también disminuyeron en paralelo al igual que la mayoría del sIL6R total constituido del receptor complejado. Esto se qonfirma por bajas concentraciones libres de sIL6R que regresan a los niveles de valores iniciales con la eliminación de IL6R304 de la circulación. Las bajas concentraciones de sIL6R libre confirman que el sIL6R total medido en efecto es inactivo y se complejo con IL6R304 (Figura 67) .
Ejemplo 60: Descripción de los efectos farmacodinámicos vía modelación PK/PD La influencia de la administración de IL6R3Ó4 sobre los niveles totales de sIL6R se puede explicar mediante la unión directo de IL6R304 al receptor -el complejo permanece en circulación vía la porción de extensión de vida media de IL6R304 (es decir la unión de albúmina) . Ya que los ¡niveles mensurables en las concentraciones totales de sIL6R siguen a una cinética retardada por tiempo, un modelo de respuesta indirecta se describe mejor en la relación PK/PD y se utilizó para describir el efecto del IL6R304 administrado i.v. sobre la acumulación de los niveles del complejo sIL6R-IL6R304. El modelo describe una respuesta a fármacos que resulta de la inhibición de la eliminación de sIL6R cuando se unió a IL6R304. En este modelo de respuesta indirecta, el índice de cambio del complejo total de SIL6R-IL6R304 (respuesta R) se describe por: dR C" ? = «¿entro ~ */,(e™ * [* ~ * fCS0" + C»1 * " Con Kdentroí el índice de síntesis de orden cero; R, el sIL6R total; Imaxr la inhibición máxima; C, la concentración en plasma de IL6R304; n, el factor de configuración de respuesta a la dosis; y Kfuera, la constante del índice de eliminación de primer orden de sIL6R.
Todos los datos de sIL6R total, i.v disponibles a partir del estudio PK/PD de dosis individual se afectaron simultáneamente al modelo (WinNonlin Professional Software Versión 5.1, Pharsight Corporation, Mountain View California, USA) utilizando la función farmacocinética como se describe en el Ejemplo 61 como la función de entrada para el modelo PK/PD de respuesta indirecta.
La figura 68, muestras los datos de concentración-tiempo de sIL6R total observados individuales y predichos por el modelo en monos cynomolgus después de la administración de i.v. de 1, 5, 10, 25 {o 100 mg/kg. Los parámetros farmacodinámicos estimados de IL6R304, en monos cynomolgus, se listan en la Tabla C-45. Todos los parámetros se estimaron con un grado suficiente de precisión como se indica por los valores CV% por debajo del 50%.
Todos los datos después de la administración i.v., a partir del estudio PK/PD de dosificación individual, se ajustaron simultáneamente a un modelo de respuesta indirecta que describe el comportamiento de SIL6R, IL6R304 y el complejo de SIL6R-IL6R304.
La vida media promedio de sIL6R se estimó para ser aproximadamente 5.8 horas (=In2/Kfuera con Kfuera=Kdentro/R0) y un índice de producción estimada de 2.49 ng/mL/h. IL6R304 fue capaz de inhibir casi completamente la inhibición de sIL6R vía la trayectoria primaria (Imax=97%) . Por lo tanto, el índice de eliminación cambió a un nuevo kfuera disminuido máximo que se correlaciona con el de la albúmina sérica en monos cynomolgus. Posteriormente, se estableció el nuevo nivel de valores iniciales del sIL6R total. Con un IC50 estimado de 125 ng/mL o 4.48 nM, se mostró que IL6R304 será un inhibidor potente de la eliminación del sIL6R no complejado en monos cynomolgus.
X. Farmacocinética de IL6R304 Ejemplo 61: Farmacocinética en el Mono Cynomolgus Esta sección resume los datos que caracterizan el comportamiento farmacocinético de IL6R304 administrado i.v. en una especie con reacción cruzada (mono cynomolgus).
En monos cynomolgus sanos (no inducidos) , se midieron las concentraciones de IL6R304 utilizando un método DELFIA calificado ( fluoro-inumoanálisis de lantánidos mejorado por disociación) . Por medio de un análisis dependiente de IL6R304 se midieron las concentraciones totales del IL6R activo.
En un estudio PK/PD de dosificación individual, se administró IL6R304 a monos cynomolgus machos sanos como un bolo i.v. individual de 0, 1, 5, 10, 25 y 100 mg/kg. Se recolectaron muestras sanguíneas para fines de análisis PK, ADA (anticuerpos anti-fármacos) y PD de todos los animales a la pre-dosificación y en los puntos de tiempo seleccionados después de la dosificación. Las muestras se analizaron para PK, PD y ADA (véase también el Ejemplo 62) .
Se utilizó un análisis de selección por puenteo y confirmación electroquimioluminiscente validado (ECL) para detectar los anticuerpos anti-IL6R30 . En resumen, se utilizó IL6R304 para capturar y detectar anticuerpos anti-fármacos (ADA) en un formato de análisis homogéneo utilizando un formador de imágenes por sectores MSD 2400.
Para el análisis PK, se capturó IL6R304 vía una herramienta anti-Nanobody biotinilado (3E8biv-bio) : sobre placa recubiertas con estreptavidina. Después de un paso de complejación con el IL6R blanco, se utilizó un mAb marcado con Europium contra IL6R para generar una señal de fluorescencia en solución de intensificación.
En la figura 69 se exhiben los perfiles de concentración-tiempo en plasma medios de IL6R304. En la Tabla C-46 se proporciona un resumen de los parámetros farmacocinéticos clave de IL6R304, después de un bolo i.v. individual de 1, 5, 10, 25 óo 100 mg/kg.
El perfil farmacocinético, después de la administración i.v, mostró una declinación trifásica. Durante los primeros dos días después de la administración, se observó una fase de distribución seguida por una fase dominante más lenta y una primera fase terminal. La fase de distribución se puede dividir adicionalmente en una1 rápida (compartimiento poco profundo) y una distribución lenta (compartimiento profundo) . Con base en la fase de eliminación, IL6R304 probablemente se aclaró vía dos mecanismos, un mecanismo de intercambio no saturable lineal (eliminación no específica o CLNON-IL6R) y uno saturable no lineal (blanco suministrado o eliminación específica o LIL6R) . Lo último podría ser el resultado de la internalización de IL6R304 unido a la membrana de IL6R unido y el posterior intercambio del complejo IL6R304-mIL6R.
Ya que el intercambio de IL6R304 es una combinación de trayectorias saturables y no saturables, la cinética en plasma en monos cynomolgus mostró un comportamiento no: lineal con una vida media que depende de la dosificación y a un nivel determinado de dosificación, también depende del tiempo.
Cuando el CLIL6R es saturado, y el CL total se determina principalmente por CLNON-IL6R^ Ia vida media reportada de IL6R304 en mono cynomolgus varió de 5.8 hasta 8.9 días y fue similar a la reportada para la albúmina sérica de monos cynomolgus (Nguyen et al., 2006, Protein Eng. Des. Sel. 19:291) . Esto estuvo en linea con las expectativas y con la reactividad cruzada confirmada de la porción de unión con albúmina de IL6R304 para la albúmina de mono cynomolgus.
Las exposiciones promedio, después de la administración de una dosificación individual, aumentaron algo más que las proporcionales de dosificación entré 1 y 5 mg/kg y 10 y 25 mg/kg y las proporcionales de dosificación entre 5 y 10 mg/kg. El resultado del grupo de dosificación 100 mg/kg se tuvo que tomar con precaución y sólo se incluyó un animal en este grupo de dosificación. En general, debido al número limitado de monos por grupo de dosificación, fue exploratoria la valoración de proporcionalidad por dosificación.
La unión de IL6R304 a sIL6R dio por resultado en un aumento de la concentración total medida de sIL6R que comprendió del complejo sIL6R y sIL6R-IL6R304 ; se cree que este aumento será debido a un intercambio más lento del complejo en comparación con el sIL6R solo.
Con base en los datos de inmunogenicidad, PK y PD disponibles, se concluyó que los ADA emergentes probablemente han impactado el perfil de PK/PD de IL6R304 en dos animales provenientes del grupo con mayor dosificación (animales 15 y 17) . Ambos animales mostraron una disminución inesperada en los niveles en plasma de IL6R304 concurrentes ;con la emergencia de ADA mensurable y con un efecto farmacodinámico reducido. Por lo tanto, estos animales no se consideraron en el análisis PK/PD. Los ADA emergentes en los otros animales parecen no tener un efecto evidente sobre los perfiles! PK/PD, por lo tanto se concluyeron estos datos en el análisis.
Para un animal (animal 3) en el grupo de dosificación 1 mg/kg, no se observó ningún intercambio suministrado por blanco, aunque se esperó esto para esta dosis baja. Para un animal (animal 6) en el grupo de dosificación 5 mg/kg, todavía se observó un intercambio suministrado por blanco a pesar de la mayor dosificación y la saturación esperada de esta trayectoria. Ya que la variabilidad de las concentraciones endógenas de IL6R entre animales puede ser alta, el intercambio suministrando por blanco se sometió a una alta variabilidad inter-individual . Adicionalmente, cuando las concentraciones IL6R304 están cercanas al valor KM estimado (aquí: 0.718 µg/mL) , un pequeño cambio en la concentración de IL6R304 dio por resultado en un cambio mayor en el intercambio no lineal. La combinación de ambos puede conducir a una evidencia mensurable del blanco o sólo un intercambio suministrados en blanco en los grupos con menor dosificación lo cual se refleja en una alta variabilidad en los valores de vida media terminales. Los parámetros PK de los animales 3 y 6 se excluyeron de las estadísticas descriptivas a medida que la variabilidad biológica excluye una valoración significativa ; de la precisión de los métodos aplicados (Tabla C-46) .
Ninguno de los animales del grupo placebo se expusieron sistemáticamente a IL6R304. Todas muestras de predosis de los animales tratados con IL6R304 estuvieron por debajo del límite menor de calificación (LLOQ) . Los animales de los grupos tratados con el activo, mostraron un aumento en las concentraciones en plasma de IL6R304 con un aumento en el nivel de dosificación. La exposición total media más alta (AUCinf) se observó en el grupo con la dosificación más alta (100 mg/kg) y fue 540612 g.h/mL.
Los valores AUCinf normalizados por dosis1 media aumentaron la dosificación predominantemente por encima de 5 a 10 mg/kg de la variación de dosificación y algo más: que la dosificación proporcional entre 1 y 5 mg/kg y 10 y 25 mg/kg (1.3 y 1.4, respectivamente). El aumento mayor proporcional de dosificación de 25 hasta 100 mg/kg se debe tomar con precaución ya que sólo se incluyó un animal en el grupo de dosificación mayor. En general, debido al número limitado de monos por grupo de dosificación, la valoración de dosificación-proporcionalidad fue exploratoria.
Notablemente, los datos provenientes del análisis no compartimental indicaron una diferencia en la vida media en el nivel de dosificación de 1 mg/kg en comparación con los mayores niveles de dosificación probados. Esto se puede atribuir a la mayor contribución de mecanismos de intercambio suministrados por el blanco saturable en comparación con las mayores dosificaciones donde prevalecen los mecanismos no saturables.
Con base en la fase de eliminación, IL6R304 probablemente se aclaró vía dos mecanismos, un mecanismo de intercambio lineal y uno no lineal. Este mecanismo de intercambio lineal probablemente se relaciona con la eliminación suministrada no saturable, sin IL6R de IL6R304 y corresponde a la degradación proteolitica lenta ¡ y no especifica de IL6R304. El proceso de intercambio no lineal y suministrado por IL6R es un mecanismo de intercambio saturable; lo que representa de manera más probable la unión de IL6R304 a la membrana de IL6R unido y la posterior internalización y intercambio.
El comportamiento farmacocinética no lineal de IL6R304 en el mono cynomolgus se capturó al ajustar los datos a un modelo farmacocinético tri-compartmental abierto con un intercambio lineal y uno no lineal a partir del compartimiento central. En la figura 70 se representa el modelo estructural.
Todos los datos de concentración en plasma i.v. individuales disponibles de un estudio PK/PD de dosificación individual se ajustaron simultáneamente al modelo (WinNonlin Professional Software Versión 5.1 (Pharsight Corporation, Mountain View California, USA) utilizando re-pesado iterativo (l/y*y), donde y es la concentración en plasma predicha. La figura 71 exhibe las gráficas de concentración-tiempo en plasma, observadas individuales y pre-dichas por modelo de IL6R304 en monos cynomolgus después de la administración i.v. de 1, 5, 10, 25 o 100 mg/kg. En la Tabla C-47 se listan los parámetros farmacocinéticos estimados de IL6R304.
Todos los datos provenientes del estudio PK/PD de dosificación individual, se ajustaron simultáneamente a un modelo tri-compartimental abierto con intercambio lineal (CLNON-IL6R) y no lineal (CLIL6 ) a partir del compartimiento central. A bajas concentraciones de IL6R304 (C«<Km) , la contribución del intercambio suministrado por IL6R (CLIL6R) es predominante e iguala Vraax/Km. A altas concentraciones de IL6R304 (C»>Km) , la trayectoria de intercambio suministrada por IL6R se satura y procederá a la rotación de masa máxima (es decir Vmax) . Por consiguiente, el intercambio total (CL) se domina por la trayectoria suministrada lineal, sin-IL6R (CLN0N-IL6R) .
El componente suministrado de IL6R no lineal en el intercambio explica la dependencia tanto del tiempo como de la dosificación en la vida media de IL6R304 en monos cynomolgus.
TABLAS Tabla A-l: Combinaciones preferidas de las secuencias CDR Nanobody SEC FR1 SEC CDR 1 SEC FR2 SEC CDR 2 SEC FR3 SEC CDR 3 SEC FR4 SEC ID ID ID ID ID ID ID ID PMP7F4 60 EVQLVE5GGGLVQPG 74 VNVMA 81 WYRQAPG 83 GIINGGSTT 90 RFTISRDNAKNTLYLQM 92 VTTNSDY 95 WGQGT 96 GSLRLSCAASGTTFK KGRELVA YADSVKG NSLRPEDTAVYYCAF DLGRDY LVTVSS PMP7C4 61 EVQLVESGGGLVQPG 75 INVMA 81 WYRQAPG 83 GIITNGSTS 85 RFTISRDNAKNTLYLQM 92 VTTNSDY 95 WGQGT 96 GSLRLSCAASGTTFR KGRELVA YADSVKG NSLRPEDTAVYYCAF DLGRDY LVTVSS P P7D6 62 EVQLVESGGGLVQPG 76 VNVMA 81 WYRQAPG 83 AVINGGTT 86 RFTISRDNAKNTLYLQM 92 VTTNSDY 95 WGQGT 96 GSLRLSCAASGSIFR KGRELVA TYADSVKG NSLRPEDTAVYYCAF DLGRDY LVTVSS PMP7G7 63 EVQLVESGGGLVQPG 74 INIMA 82 WYRQAPG 83 GVITGGNT 87 RFTISRDNAKNTLYLQM 92 VTTNSDY 95 WGQGT 96 GSLRLSCAASGTTFK KGRELVA TYADSVKG NSLRPEDTAVYYCAF DLGRDY LVTVSS PMP7G8 64 EVQLVESGGGLVQPG 77 INVMA 80 WYRQAPG 83 GVINDGST 88 RFTISRDNAKNTLYLQM 92 VTTNSDY 95 WGQGT 96 GSLRLSCAASGSTFR KGRELVA TYADSVKG NSLRPEDTAVYYCAF DLGRDY LVTVSS P P20F6 65 EVQLVESGGGLVQPG 78 INVMA 80 WYRQAPG 83 GIVSGGST 89 RFTISRDNAKNTLYLQM 92 ITTNSDY 94 WGQGT 96 GSLRLSCAASGSVFK KGRELVA SYADSVKG NSLRPEDTAVYYCAF DLGRRY LVTVSS PMP20A11 66 EVQLVESGGGLVQPG 78 INVMA 80 WYRQAPG 83 GIISGGSTS 84 RFTISRDNAKNTLYLQM 92 ITTESDY 93 WGQGT 96 GSLRLSCAASGSVFK KGRELVA YADSVKG NSLRPEDTAVYYCAF DLGRRY LVTVSS P P20E10 67 EVQLVESGGGLVQPG 78 INVMA 80 WYRQAPG 83 GIVSGGST 89 RFTISRDNAKNTLYLQM 92 ITTESDY 93 WGQGT 96 GSLRLSCAASGSVFK KGRELVA SYADSVKG NSLRPEDTAVYYCAF DLGRRY LVTVSS PMP21A10 68 EVQLVESGGGLVQPG 79 INVMA 80 WYRQAPG 83 GIVTGGST 91 RFTISRDNAKNTLYLQM 92 ITTESDY 93 WGQGT 96 GSLRLSCAASGSIFK KGRELVA SYADSVKG NSLRPEDTAVYYCAF DLGRRY LVTVSS P P21D11 69 EVQLVESGGGLVQPG 78 INVMA 80 WYRQAPG 83 GIVTGGST 91 RFTISRDNAKNTLYLQM 92 ITTESDY 93 WGQGT 96 GSLRLSCAASGSVFK KGRELVA SYADSVKG NSLRPEDTAVYYCAF DLGRRY LVTVSS Tabla B-l : Secuencias de aminoácidos que constituyen los compuestos de referencia CADENA PESADA DE IGG DE REFERENCIA, SEC ID NO: 1 QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYNP SL SRVT LRDTS NQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDY GQGSLVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFN YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNG EYKC VSNKALPAPIE TISKA GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK ¡ CADENA LIGERA DE IGG DE REFERENCIA, SEC ID NO: 2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRF SGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC CADENA PESADA DE FAB DE REFERENCIA, SC ID NO: 3 QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHA SWVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYNP SLKSRVTMLRDTS NQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDY GQGSLVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC Tabla B-2: Secuencias proteinicas de los Nanobodies anti-IL-6R PMP40H5, SEC ID NO: 5 ' ' EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCMDSSSGTTSTYYS DSVKGRFTISRDDAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADGHLNWGQRYVPCSQISWRGWNDY G QGTQVTVSS PMP35E11, SEC ID NO: 6 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYAIGWFRQAPGKEHEGVSCISSSDGSTYYADS VKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAERDVPARSLCGSYYWYDYRGQGTQVTVSS PMP32C9/IL6R04, SEC ID NO: 7 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYDIGWFRQAPGKEREGVSGISSSDGNTYYADS VKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEPPDSSWYLDGSPEFFKYWGQGiTQVTVSS PMP35H4/IL6R13, SEC ID NO: 8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGRATEWVSAISWNGNNTYYTES KGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCVKGSTAIVGVPPTYPDEYDYWGQGTQVTVSS PMP32E10, SEC ID NO: 9 ; EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSYDMSWVRQAPGKGPEWVSAINSGGGSTYYADS VKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCATDWRYSDYDLPLPPPGDY GQGTQVTVSS PMP30C11, SEC ID NO: 10 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYDMGWYRQAPGKEREFVAVISRSGSSTYYADS VKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCKAEVVAGDYDYWGQGTQVTVSS PMP35C10, SEC ID NO: 11 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYDMGWYRQAPGKEREFVAVIHWSSGSTYYADP VKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCNAFLPGPEGFHDYWGQGTQVTVSS' PMP34G9, SEC ID NO: 12 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTSSSYDMTWYRQVPGKEREFVAVISWSGGSTYYADS VKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCNAYTGGGDDYWGQGTQVTVSS PMP31A4/IL6R03, SEC ID NO: 13 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFKVNAMGWYRQAPGKQRELVAGIISGGSTNYADS VKGRLTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCSFVTTNSDYDLGRDYWGQGTQVTVSS PMP32E2, SEC ID NO: 14 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGNIFDDNTMGWTWNRQPPGKQRELVAIIATDGSTNYA DSVKGRFTISRDNAKNTVYLQ NSLKPEDTAVYYCNLFSLRLGRDYWGQGTQVTVSS PMP33A3, SEC ID NO: 15 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYGAIG FRQAPGKEREGVSCISSSTGSTYYAD SVKGRFTISRDNGKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADKMWSPCLVAANEEALFEYDYWGQGTQ TVSS P P34A12, SEC ID NO: 16 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFSLDYYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGSTYYAD SVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL PEDTAVYYCAADLLRTPEFCVDSAPYDYWGQGTQVTVS ¡3 PMP28E11, SEC ID NO: 17 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPLDYYAIGWFRQAPG EREGVSCISSSDGSTYYAD SVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCALVHTTAQATGVPQREYEYEWWGQGTQVT VSS PMP35F4, SEC ID NO: 18 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYDMGWYRQAPGKEREFVAIITWNSSTYYADS VKGRFTISRDNAKNTVYLQ NSLKPEDTAIYYCNAQYGLGYAEDYWGQGTQVTVSS Tabla B-3: Secuencias proteinicas en los Nanobodies anti-IL-6R muí ivalentes IL6R22, SEC ID NO: 19 evqlvesggglvqaggslrlscaasgrtfssydmgwyrqapgkerefvavisrsgsstyyad svkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtaiyyckaevvagdydywgqgtqvtvssggggsg ggsAVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTL YADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS IL6R23, SEC ID NO: 20 evqlvesggglvqaggslrlscaasgsifkvnamgwyrqapgkqrelvagiisggstnyads vkgrltisrdnakntvylqmnslkpedtavyycsfvttnsdydlgrdywgqgtqvtvssggg gsgggsAVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPG EPEWVSSISGSGS DTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS IL6R24, SEC ID NO: 21 evqlvesggglvqaggslrlscaasgftfddydigwfrqapgkeregvsgisssdgntyyad svkgrftissdnakntvylqmnslkpedtavyycaaeppdsswyldgspeffkywgqgtqvt vssggggsgggsAVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSS ISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVS S IL6R25, SEC ID NO: 22 evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfgsydmswvrqapgkgpewvsainsgggstyyad svkgrftisrdnakntlylqmnslkpedtavyycatdwrysdydlplpppgdywgqgtqvtv ssggggsgggsAVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSI SGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNA TTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS IL6R26, SEC ID NO: 23 evqlvesggglvqaggslrlscaasgnifddntmgwtwnrqppgkqrelvaiiatdgstnya dsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycnlfslrlgrdywgqgtqvtvssggggs gggsAVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDT LYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS IL6R28, SEC ID NO: 24 evqlvesggglvqpggslrlscvasgfsldyyvigwfrqapgkeregvscisssdgstyyad svkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycaadllrtpefcvdsapydywgqgtqvtv SsggggsgggsAVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMS VRQAPGKEPÉWVSSI SGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTV SS ; IL6R29, SEC ID NO: 25 evqlvesggglvqaggslrlscaasgrtsssydmtwyrqvpgkerefvaviswsggstyyad svkgrftisrdnakntvylgmnslkpedtaiyycnaytgggddywgqgtqvtvssggggsgg gsAVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFG SWVRQAPGKEPE VSSISGSGSDTLY ADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS IL6R30, SEC ID NO: 26 evqlvesggglvqaggslrlscaasgrtfssydmgwyrqapgkerefvavihwssgstyyad pvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtaiyycnaflpgpegfhdywgqgtqvtvssgggg sgggsAVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSD TLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS IL6R31, SEC ID NO: 27 evqlvesggglvqaggslrlscaasgftfddyaigwfrqapgkehegvscisssdgstyyad svkgrftissdnakntvylqmnslkpedtavyycaaerdvparslcgsyywydyrgqgtqvt vssggggsgggsAVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFG SWVRQAPGKEPEWVSS ISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTV SS IL6R32, SEC ID NO: 28 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYDMGWYRQAPGKEREFVAIIT NSSTYYADS VKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCNAQYGLGYAEDYWGQGTQVTVSSggggsg ggsAVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTL YADSV GRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS : IL6R33, SEC ID NO: 29 evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfddygmswvrqapgratewvsaiswngnntyyte smkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycvkgstaivgvpptypdeydywgqgtqvt vssggggsgggsAVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMS VRQAPGKEPEWVSS ISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSS6GTQVTV SS IL6R34, SEC ID NO: 30 ' evqlvesggglvqpggslrlscaasgfsldyyaigwfrqapgkeregvscmdsssgttstyy sdsvkgrftisrddakntvylqmnslkpedtavyycaadghlnwgqryvpcsqiswrgwndy wgqgtqvtvssggggsgggsAVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFG SWVRQAPG KEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSR SSQGTQVTVSS IL6R43, SEC ID NO: 31 evqlvesggglvqaggslrlscaasgsifkvnamgwyrqapgkqrelvagiisggstnyads vkgrltisrdnakntvylqmnslkpedtavyycsfvttnsdydlgrdywgqgtqvtyssggg gsgggsAVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGS DTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSevq lvesggglvqaggslrlscaasgsifkvnamgwyrqapgkqrelvagiisggstnyadsvkg rltisrdnakntvylqmnslkpedtavyycsfvttnsdydlgrdywgqgtqvtvss IL6R44, SEC ID NO: 32 evqlvesggglvqaggslrlscaasgftfddydigwfrqapgkeregvsgisssdghtyyad svkgrftissdnakntvylqmnslkpedtavyycaaeppdsswyldgspeffkywgqgtqvt vssggggsgggsAVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMS VRQAPGKEPEWVSS ISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVT VSSggggsgggsevqlvesggglvqaggslrlscaasgftfddydigwfrqapgkeregvsg isssdgntyyadsvkgrftissdnakntvylqmnslkpedtavyycaaeppdsswyídgspe ffkywgqgtqvtvss IL6R49, SEC ID NO: 33 evqlvesggglvqaggslrlscaasgrtsssydmtwyrqvpgkerefvaviswsggstyyad svkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtaiyycnaytgggddywgqgtqvtvssggggsgg gsAVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLY ADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSggggsgg gsevqlvesggglvqaggslrlscaasgrtsssydmtwyrqvpgkerefvaviswsggstyy adsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtaiyycnaytgggddywgqgtqvtvss IL6R53, SEC ID NO: 34 evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfddygmswvrqapgratewvsaiswngnntyyte smkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycvkgstaivgvpptypdeydywgqgtqvt vssggggsgggsAVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPE VSS ISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVT VSSggggsgggsevql esggglvqpggslrlscaasgftfddygmswvrqapgratewvsa iswngnntyytesmkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycvkgstaivgvpptypd eydywgqgtqvtvs s Tabla B- : Secuencias proteinicas de los Nanobodies optimizados por secuencia IL6R61, SEC ID NO: 40 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFKVNAMG YRQAPGKGRELVAGIISGGSTNYADS VKGRLTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCSFVTTNSDYDLGRDYWGQGTLVTVSS IL6R62, SEC ID NO: 41 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFKV AMGWYRQAPGKGRELVAGIISGGSTNYADS VKGRFTISRDNAKNTVYLQ NSLRPEDTAVYYCSFVTTNSDYDLGRDY GQGTLVTVSS IL6R63, SEC ID NO: 42 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSI FKVNAMGWYRQAPGKGRELVAG11SGGSTNYADS VKGRLTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCSFVTTNSDYDLGRDYWGQGTLVTVSS IL6R64, SEC ID NO: 43 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFKVNAMG YRQAPGKGRELVAGIISGGSTNYADS VKGRLTI SRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAFVTTNSDYDLGRDYWGQGTLVTVSS IL6R65, SEC ID NO: 44 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFKVNAMGWYRQAPGKGRELVAGIISGGSTNYADS VKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFVTTNSDYDLGRDYWGQGTLVTVSS IL6R71, SEC ID NO: 45 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYDIGWFRQAPGKGREGVSGISSSDGNTYYAD SVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAEPPDSSWYLDGSPEFFKYWGQGTLVTVSS IL6R72, SEC ID NO: 46 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDIGWFRQAPGKGREGVSGISSSDGNTYYAD SVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAEPPDSSWYLDGSPEFFKYWGQGTLVTVSS IL6R73, SEC ID NO: 47 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYDIGWFRQAPGKGREGVSGISSSDGNTYYAD SVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAEPPDSSWYLDGSPEFFKYWGQGTLVTVSS IL6R74, SEC ID NO: 48 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYDIGWFRQAPGKGREGVSGISSSDGNTYYAD SVKGRFTISSDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAEPPDSS YLDGSPEFFKYWGQGTLVTVSS IL6R75, SEC ID NO: 49 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDIGWFRQAPGKGREGVSGISSSDGNTYYAD SVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAEPPDSSWYLDGSPEFFKYWGQGTLVTVSS IL6R81, SEC ID NO: 50 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGRATEWVSAISWNGNNTYYTE SMKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVKGSTAIVGVPPTYPDEYDYWGQGTLVTVSS IL6R82, SEC ID NO: 51 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISWNGNNTYYTE SMKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCVKGSTAIVGVPPTYPDEYDYWGQGTLVTVSS IL6R83, SEC ID NO: 52 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGRATEWVSAISWNGNNTYYTE SMKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCVKGSTAIVGVPPTYPDEYDYWGQGTLVTVSS IL6R84, SEC ID NO: 53 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISWNGNNTYYTE SMKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCVKGSTAIVGVPPTYPDEYDYWGQGTLVTVSS IL6R85, SEC ID NO: 54 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGRGLEWVSAISWNGNNTYYTE SMKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCVKGSTAIVGVPPTYPDEYDYWGQGTLVTVSS IL6R86, SEC ID NO: 55 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGRALEWVSAISWNGNNTYYTE SMKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCVKGSTAIVGVPPTYPDEYDYWGQGTLVTVSS IL6R87, SEC ID NO: 56 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKATEWVSAISWNGNNTYYTE SMKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCVKGSTAIVGVPPTYPDEYDYWGQGTLVTVSS IL6R88, SEC ID NO: 57 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGTEWVSAISWNGNNTYYTE SMKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCVKGSTAIVGVPPTYPDEYDYWGQGTLVTVSS IL6R89, SEC ID NO: 58 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGRGTEWVSAISWNGNNTYYTE SMKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCVKGSTAIVGVPPTYPDEYDYWGQGTLVTVSS IL6R90, SEC ID NO: 59 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKALEWVSAISWNGNNTYYTE SMKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCVKGSTAIVGVPPTYPDEYDYWGQGTLVTVSS Tabla B-5: Secuencias proteinicas de los Nanobodies madurados por afinidad PMP7F4, SEC ID NO: 60 ; EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGTTFKVNVMAWYRQAPGKGRELVAGIINGGSTTYADS VKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFVTTNSDYDLGRDYWGQGTLVTVSS PMP7C4, SEC ID NO: 61 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGTTFRINV AWYRQAPGKGRELVAGIITNGSTSYADS VKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFVTTNSDYDLGRDYWGQGTLVTVSS PMP7D6, SEC ID NO: 62 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFRVNVMAWYRQAPGKGRELVAAVINGGTTTYADS VKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFVTTNSDYDLGRDYWGQGTLVTVSS P P7G7, SEC ID NO: 63 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGTTFKINIMAWYRQAPGKGRELVAGVITGGNTTYADS VKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFVTTNSDYDLGRDYWGQGTLVTVSS P P7G8, SEC ID NO: 64 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFRINVMAWYRQAPGKGRELVAGVINDGSTTYADS VKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFVTTNSDYDLGRDYWGQGTLVTVSS PMP20F6, SEC ID NO: 65 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMAWYRQAPGKGRELVAGIVSGGSTSYADS VKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFITTNSDYDLGRRYWGQGTLVTVSS PMP20A11, IL6R300, SEC ID NO: 66 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMAWYRQAPGKGRELVAGIISGGSTSYADS VKGRFTISRDNAKNTLYLQ NSLRPEDTAVYYCAFITTESDYDLGRRYWGQGTLVTVSS PMP20E10, SEC ID NO: 67 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMAWYRQAPGKGRELVAGIVSGGSTSYADS VKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFITTESDYDLGRRYWGQGTLVTySS PMP21A10, SEC ID NO: 68 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFKINVMAWYRQAPGKGRELVAGIVTGGSTSYADS VKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFITTESDYDLGRRYWGQGTLVTVSS PMP21D11, SEC ID NO: 69 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMAWYRQAPGKGRELVAGIVTGGSTSYADS VKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFITTESDYDLGRRYWGQGTLVTVSS Tabla B-6: Secuencias proteinicas de los Nanobodies madurados por afinidad/optimizados por secuencia formateados IL6R304, SEC ID NO: 70 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINV A YRQAPGKGRELVAGIISGGSTSYAD SVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFITTESDYDLGRRY GQGTLVTVSSg gggsgggsEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISG SGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ NSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS IL6R305, SEC ID NO: 71 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMAWYRQAPGKGRELVAGIISGGSTSYAD SVKGRFTISRDNA NTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFITTESDYDLGRRY GQGTLVTVSSg gggsgggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMA YRQAPGKGRELVAGIIS GGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFITTESDYDLGRRYWGQG TLVTVSSggggsgggsEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGL EWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSS QGTLVTVSS .
IL6R306, SEC ID NO: 72 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMAWYRQAPGKGRELVAGIISGGSTSYAD SVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFITTESDYDLGRRYWGQGTLVTVSSg gggsgggsEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISG SGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVS SggggsgggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMAWYRQAPGKGRELVAGI ISGGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFITTESDYDLGRRYWG QGTLVTVSS ' IL6R202, SEC ID NO: 73 evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdydigwfrqapgkgregvsgisssdgntyya dsvkgrftisrdnakntlylqmnslrpedtavyycaaeppdsswyldgspeffkywgqgtl vtvssggggsgggsEvqlvesggglvqpgnslrlscaasgftfssfgmswvrqapgkglew vssisgsgsdtlyadsvkgrftisrdnakttlylqmnslrpedtavyyctiggslsrssqg tlvtvss Tabla B-7 : Ejemplos preferidos, aunque no limitantes, de Nanobodies de unión con albúmina ALB-1, SEC ID NO: 97 AVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADS VKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS ALB-8 (humanized ALB-1), SEC ID NO: 98 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADS VKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS ALB-2, SEC ID NO: 99 AVQLVESGGGLVQGGGSLRLACAASERIFDLNLMGWYRQGPGNERELVATCITVGDSTNYADS VKGRFTISMDYTKQTVYLHMNSLRPEDTGLYYCKIRRTWHSELWGQGTQVTVSS Tabla B-8 : Listado de secuencias de enlazantes GS30, SEC ID NO: 101 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GS15, SEC ID NO: 102 GGGGSGGGGSGGGGS GS9, SEC ID NO: 103 GGGGSGGGS GS7, SEC ID NO: 104 ; SGGSGGS Región del armazón superior largo de Llama, SEC ID NO: 105 EPKTPKPQPAAA Tabla C-l: Materiales utilizados para el aislamiento de los Nanobodies de unión con IL-6R Proveedor Descripción IL-6 humano Diaclone Proteína recombinante producida en E. coli Bio-IL-6 humano Diaclone/PE IL-6 humano proveniente de Diaclone biotinilado por PE (6 biotinas/molécüla) IL-6R soluble humano Peprotech Proteína recombinante producida jen células HEK293 (cat.# 200-06R) IL-6R soluble humano R&D Systems Proteína recombinante producida en células S/21 (cat.# 227-SR) MAb BR-6 Diaclone MAb anti-IL-6R neutralizante MAb BN-12 Diaclone MAb anti-IL-6R no neutralizante MAb M182 BD Biosciences Mab anti-lL-6R biotinilado IgG de llama (h&l) Bethyl Labs PAb contra IgG de llama obtenido en cabra Anticuepro HRP conjugados Línea cellular TF-1 ECACC J Cell Physiol 1989;140:323; Exp Cell Res no.93022307 1993:208:35 Tabla C-2 : Esquema de inmunización Día Llama 081 Llama 082 Recolección de tejido 0 100 pg 100 pg 10 mi de sangre pre-inmune 7 100 pg 100 pg - 14 50 pg 50 pg - 21 50 pg 50 pg - 28 50 pg 50 pg 10 mi de sangre inmune 35 50 pg 50 pg - 39 150 mi de sangre immune de los PBL1 Biposia de medula de nodulo linfático 43 150 mi de sangre inmune de los PBL2 52 50 pg 50 pg 59 100 mi de sangre inmune NC1 Tabla C-3 : Características de las bibliotecas de Nanobody obtenidos a partir de llamas inmunizadas Tamaño de la biblioteca % de injerto Llama 81 6xl07 87 Llama 82 5xl07 78 Tabla C-4 : Condiciones utilizadas para la selección de los Nanobodies Método Inmovilización/ Antígeno Concentración/ Elución captura cantidad Perlas Estreptavidina bio-IL-6R 0, 1, 10, 100 ng Tripsina magnéticas Solución Tabletas de bio-IL-6R 0, 0.01, 0.1, 1 nM Tripsina estreptavidina Placa BN-12 IL-6R (Peprotech) 0, 1, 10, 100 nM Tripsina Placa BN-12 IL-6R (R&D) 0, 1, 10, 100 nM Tripsina Tabla C-5 : Estadísticas de selección Análisis Número de clones Número de Número de clones Número de seleccionados inhibidores (%) secuenciados secuencias únicas IL-6-IL-6R 1536 72 (4.7%) 46 14 Tabla C-6 : Valores Ko£f de Nanobodies inhibidores Nanobody ID Nanobody ID Koff tS 1) Nanobody ID Nanobody ID Koff tS 1) PMP40H5 IL6R14 l,14E-04 PMP34G9 IL6R09 1.39E-03 PMP35E11 IL6R11 4,17E-04 PMP31A4 IL6R03 l,60E-03 PMP32C9 IL6R04 l,50E-04 PMP32E2 IL6R06 8,86É-04 PMP35H4 IL6R13 l,78E-04 PMP33A3 IL6R07 2,42E-04 PMP32E10 IL6R05 l,27E-03 PMP34A12 IL6R08 ND PMP30C11 IL6R02 2,94E-03 PMP28E11 IL6R01 ND PMP35C10 IL6R10 5.09E-04 PMP35F4 IL6R12 8,96E-04 Tabla C-7 : Rendimientos de cultivos celulares de Nonobody Rendimiento Rendimiento Nanobody Rendimiento Rendimiento Nanobody ID (mg) (mg/l) ID (mg) (mg/l) ; PMP40H5 0.14 0.6 PMP34G9 0.09 1.8 PMP35E11 0.65 2.6 PMP31A4 1.06 4.2 PMP32C9 0.33 6.5 PMP32E2 1.57 6.3 PMP35H4 0.49 9.8 PMP33A3 0.33 1.3 PMP32E10 0.78 3.1 PMP34A12 0.57 2.3 PMP30C11 0.63 2.5 PMP28E11 0.08 1.6 PMP35C10 0.53 2.1 PMP35F4 0.24 1.0 Tabla C-8 : Valores IC50 de Nanobodies seleccionados Nanobody ID Muestra IC50 (M) IL6R01 PMP28E11 7.26E-10 IL6R02 P P30C11 1.69E-09 IL6R03 PMP31A4 7.16E-10 IL6R04 PMP32C9 9.30E-11 IL6R05 PMP32E10 6.26E-10 IL6R06 P P32E2 1.21E-09 IL6R07 PMP33A3 1.44E-09 IL6R08 PMP34A12 1.18E-09 IL6R09 PMP34G9 2.38E-10 IL6R10 P P35C10 5.96E-10 IL6R11 P P35E11 1.58E-10 IL6R12 P P35F4 5.17E-10 IL6R13 PMP35H4 4.77E-11 IL6R14 PMP40H5 2.22E-10 Tabla C-9: Parámetros cinéticos para un sub-conjunto seleccionado de 14 Nanobodies anti-IL-6R inhibidores Nanobody ID Nanobody ID koft ís 1) kon(l/Ms) Kd (nM) IL6R01 PMP28E11 1.10E-04 2.62E+05 0.4 2.94E-03 8.40E+05 5.9 IL6R02 PMP30C11 4.95E-03 1.47E-03 4.84E+05 3.0 IL6R03 PMP31A4 1.60E-03 9.42E-05 3.65E+05 0.3 IL6R04 PMP32C9 1.50E-04 1.41E-03 1.44E+05 9.8 IL6R05 PMP32E10 1.27E-03 8.86E-04 1.07E+06 7.1 IL6R06 PMP32E2 7.57E-03 IL6R07 PMP33A3 2.42E-04 ND ND IL6R08 PMP34A12 1.97E-03 1.94E+05 10.2 1.29E-03 6.41E+05 2.0 IL6R09 PMP34G9 1.30E-03 1.11E+06 1.2 1.39E-03 5.26E-04 4.14E+05 1.3 IL6R10 PMP35C10 5.09E-04 3.40E-04 3.91E+05 0.9 IL6R11 PMP35E11 3.96E-04 2.15E+05 1.9 4.17E-04 1.16E-03 6.78E+05 1.7 IL6R12 PMP35F4 8.96E-04 1.21E-04 2.31E+05 0.5 IL6R13 PMP35H4 1.09E-04 1.37E+05 0.8 1.78E-04 1.00E-04 4.02E+05 0.3 IL6R14 PMP40H5 1.14E-04 Tabla C-10: Valores IC50 para la inhibición de Nanobody de proliferación í de células XG-1 Nanobody ID IC50 (nM) IC50 (nM) + HSA IL6R01 ND IL6R02 31.0 IL6R03 16.2 17.5 IL6R04 0.1 0.1 IL6R05 7.3 IL6R06 42.1 IL6R07 50.5 IL6R08 36.6 IL6R09 2.7 3.0 IL6R10 2.5 IL6R11 5.4 IL6R12 2.8 IL6R13 1.4 1.3 IL6R14 0.6 0.8 Fab de referencia 6.0 Tabla C-ll: Valores IC50 para la inhibición de Nanobody de proliferación de células TF1 Nanobody ID IC50 (nM) IL6R01 ND IL6R02 94.7 IL6R03 62.1 IL6R04 0.4 IL6R05 38.0 IL6R06 137.9 IL6R07 374.9 IL6R08 24.3 IL6R09 8.7 IL6R10 9.9 IL6R11 9.9 IL6R13 5.2 IL6R14 1.5 Fab de referencia 9.2 Tabla C-12: Competencia con el Fab de referencia para IL-6R de unión según se determina en un análisis Alphascreen Fab de referencia residual Nanobody ID que se une a IL-6R (%) IL6R01 49 IL6R02 86 IL6R03 5 IL6R04 50 IL6R05 64 IL6R06 36 IL6R07 80 IL6R08 99 IL6R09 62 IL6R10 102 IL6R11 40 IL6R12 103 IL6R13 25 IL6R14 96 Tabla C-13: Resumen de las características de Nanobody ID Kd (nM) IC50 (nM) IC50 (nM) IC50 (nM) Competencia dé (IL-6/IL-6R) XG-1 TF-1 Fab de Ref (%) IL6R01 0.4 0.73 ND ND 49 IL6R02 5.9 1.69 31.0 94.7 86 IL6R03 3.0 0.72 16.2 62.1 5 IL6R04 0.3 0.09 0.1 0.4 50 IL6R05 9.8 0.63 7.3 38.0 64 IL6R06 7.1 1.21 42.1 137.9 36 IL6R07 ND 1.44 50.5 374.9 80 IL6R03 10.2 1.18 36.6 24.3 99 IL6R09 2.0 0.24 2.7 8.7 62 IL6R10 1.3 0.60 2.5 9.9 102 IL6R11 0.9 0.16 5.4 9.9 40 IL6R12 1.7 0.52 2.8 6.8 103 IL6R13 0.5 0.05 1.4 5.2 25 IL6R14 0.3 0.22 0.6 1.5 96 Tabla C-14: Nomenclatura (ID) de Nanobodies formateados ID formato SEC ID NO IL6 22 PMP30C11-9GS-ALB1 19 IL6R23 PMP31A4-9GS-ALB1 20 IL6R24 PMP32C9-9GS-ALB1 21 IL6R25 PMP32E10-9GS-ALB1 22 IL6R26 PMP32E2-9GS-ALB1 23 IL6R28 PMP34A12-9GS-ALB1 24 IL6R29 PM P34G9-9GS-ALB1 25 IL6R30 PMP35C10-9GS-ALB1 26 IL6R31 PMP35E11-9GS-ALB1 27 IL6R32 PMP35F4-9GS-ALB1 28 IL6R33 PMP35H4-9GS-ALB1 29 IL6R34 PMP40H5-9GS-ALB1 30 IL6R43 PMP31A4-9GS-ALB1-9GS-31A4 31 IL6R44 PMP32C9-9GS-ALB1-9GS-32C9 32 IL6R49 PM P34G9-9GS-ALB1-9GS-34G9 33 IL6R53 PMP35H4-9GS-ALB1-9GS-35H4 34 Tabla C-15: Rendimientos de expresión de Nanobodies anti biespecificos Nanobody Rendimiento Rendimiento Nanobody Rendimiento Rendimiento ID ID ID (mg) (mg/0 ID (mg) (mg l) PMP30C11 IL6R22 1.1 4.2 PMP34G9 IL6R29 3.3 13.2 PMP35C1 PMP31A4 IL6R23 0.3 0.6 IL6R30 0.9 3.7 0 PMP32C9 IL6R24 0.5 2.0 PMP35E11 IL6R31 1.8 7.3 PMP32E10 IL6R25 1.3 5.0 PMP35F4 IL6R32 0.5 1.1 PMP32E2 IL6R26 1.1 4.2 PMP35H4 IL6R33 1.9 7.5 PMP34A1 IL6R28 2.1 8.4 PMP40H5 IL6R34 0.4 0.9 2 Tabla C-16: Valores IC50 de Nanobodies bivalentes en un análisis de competencia Alphascreen Nanobody ID IC50 (M) IL6R22 5.59E-10 IL6R24 1.45E-10 IL6R25 6.43E-10 IL6R26 1.67E-09 IL6R28 3.26E-10 IL6R29 1.23E-10 IL6R30 3.43E-10 IL6R31 1.31E-10 IL6R32 2.68E-10 IL6R33 1.39E-10 IL6R34 1.46E-10 reference-Fab 5.92E-10 Tabla C-17 : Valores IC50 de los Nanobodies formateados en el análisis de proliferación XG-1 ID IC50 (nM) IC50 (nM) + HSA IL6R22 50.2 IL6R23 16.9 90.4 IL6R24 0.2 0.5 IL6R25 8.4 IL6R26 65.3 IL6R28 4.4 IL6R29 3.6 13.4 IL6R30 27.2 IL6R31 4.6 IL6R32 1.6 IL6R33 2.6 15.4 IL6R34 0.8 2.5 IL6R44 0.07 0.17 IL6R49 0.06 0.19 IL6R53 0.13 0.61 Ref-lgG 0.47 Tabla C-18: Parámetros cinéticos de la unión de IL-6R Nanobody ID Ms 1) ka (l/Ms) Kd (nM) IL6R22 5.7E-03 3.3E+05 16.9 IL6R23 1.5E-03 3.2E+05 4.6 IL6R24 1.1E-04 3.7E+05 0.3 IL6R25 1.2E-03 1.2E+05 10.3 IL6R26 6.9E-03 4.5E+05 15.5 IL6R28 5.3E-04 2.4E+05 2.2 IL6R29 1.5E-03 7.1E+05 2.1 IL6R30 1.2E-03 1.6E+05 7.5 IL6R31 3.8E-04 1.6E+05 2.3 IL6R32 1.3E-03 1.0E+06 1.3 IL6R33 1.25E-04 1.1E+05 1.1 IL6R34 1.1E-04 2.6E+05 0.4 Tabla C-19 : Valores d de Nanobodies formateados para la unión a albúmina sérica a partir de diferentes especies Humano Ratón Cyno Rhesus Babuino ID Kd (nM) Kd (nM) Kd (nM) Ka (nM) Ka (nM) IL6R22 11.1 108 IL6R23 16 275 27.6 23.8 23.2 IL6R24 15 122 28.3 28.3 40.3 IL6R25 13.9 122 IL6R26 9.4 73 IL6R28 10.6 180 IL6R29 10.8 83 19 20.6 26.8 IL6R30 12.1 113 IL6R31 13.4 86.8 IL6R32 10 179 IL6R33 27.3 98.6 24.5 24.6 32.3 IL6R34 9.2 111 15 14.7 18.9 IL6R44 51.4 993 43 IL6R53 35 497 ALB-1 0.6 6.5 Tabla C-20 : Parámetros cinéticos de las variantes optimizadas por secuencia de IL6R03, 04 y 13 IL6R61 KD (nM) 2 ka (1/Ms) 8.50E+05 kd (1/s) 1.70E-03 IL6R62 KD (nM) 2.2 ka (1/Ms) 9.29E+05 IL6R03 kd (1/s) 2.07E-03 (3.0 nM) IL6R63 KD (nM) 3.7 ka (1/Ms) 9.90E+05 kd (1/s) 3.65E-03 IL6R64 KD (nM) ND ka (1/Ms) ND kd (1/s) 1.00E-03 IL6R71 KD (nM) 0.2 ka (1/Ms) 7.03E+05 kd (1/s) 1.53E-04 IL6R72 KD (nM) 0.3 ka (1/Ms) 5.43E+05 IL6R04 kd (1/s) 1.80E-04 (0.3 nM) IL6R73 KD (nM) 0.3 ka (1/Ms) 6.98E+05 kd (1/s) 2.33E-04 IL6R74 KD (nM) 0.2 ka (1/Ms) 7.67E+05 kd (1/s) 1.22E-04 IL6R81 KD (nM) 0.4 ka (1/Ms) 3.20E+05 kd (1/s) 1.28E-04 IL6R82 KD (nM) 5.1 ka (1/Ms) 6.19E+05 IL6R13 kd (l/s) 3.14E-03 (0.7 nM) IL6R83 KD (nM) 0.3 ka (1/Ms) 3.50E+05 kd (1/s) 1.20E-04 IL6R84 KD (nM) 5.4 ka (1/Ms) 7.62E+05 kd (1/s) 4.09E-03 Tabla C-21 : Valores koff de las variantes optimizadas por secuencia de IL6R13 ID koff ls 1) IL6R13 2,lE-04 IL6R85 2,lE-03 IL6R86 l,7E-03 IL6R87 1,1?-04 IL6R88 2,6E-04 IL6R89 l,9E-04 IL6R90 l,9E-03 Tabla C-22 : Parámetros cinéticos de las variantes optimizadas por secuencia de IL6R03, 04 y 13 IL6R03 IL6R65 KD (nM) 4 (3.0 n ) ka (1/Ms) 6,00E+05 kd (1/s) 2,35E-03 IL6R04 IL6R75 KD (nM) 0,1 (0.3 nM) ka (1/Ms) l,00E+O6 kd (1/s) 1E-04 IL6R13 IL6R88 KD (nM) 0,9 (0.7 nM) ka (1/Ms) 2,30E+05 kd (1/s) 2,13E-04 Tabla C-23 : Valores IC50 de la secuencia optimizada y los Nanobodies WT en el análisis XG-1 Valores IC50 (nM) Parental Secuencia optimizada IL6R03 17 IL6R65 26 IL6R04 0.1 IL6R75 0.04 IL6R13 1.4 IL6R88 3.3 Tabla C-24: Parámetros cinéticos de la unión de Nanobody a IL-6R cyno ID ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) IL6R03 3.70E+05 1.64E-03 4.4 IL6R65 1.65E+05 1.97E-03 12 IL6R04 5.86E+04 1.00E-02 171 IL6R201* 2.18E+05 6.11E-03 28.1 *IL6R201 es la versión sin marca de IL6R75 Tabla C-25: Valores Tm de ILR65 y Nanobodies IL-6R madurados por afinidad Piimeia «ie< íuti-n G?? ^ etición Tin Tm fnomedio IL6R65 70,44 70,64 70,54 71,07 70,67 PMP7F4 76,68 76,55 76,58 76,44 76,56 21A10 74,56 74,22 74,39 74,39 74,39 20E10 75,29 75,22 75,31 75,38 75,30 20A11 74,42 74,03 74,12 74,19 74,19 21D11 74.03 74,29 74,45 74,25 74,26 20F6 74,36 74,29 74,45 74,32 74,36 Tabla C-26: Parámetros cinéticos para la afinidad de IL6R65 y las variantes maduradas por afinidad Nanobody k (M .s ) kd (s ) Kd (pM) a IL6 65 1.0E+06 3.8E-03 3800 20E10 1.0E+06* 3.3E-05 33 21D11 1.0E+06* 3.5E-05 35 21A10 1.0E+06* 1.2E-05 12 20F6 1.0E+06* 3.3E-05 33 20A11 1.0E+06 1.9E-05 19 *est¡mado Tabla C-27 : Formatos de Nanobodies anti-IL6R madurados por afinidad Formato Nanobody optimizado por secuencia Nombre anti-IL6R 20A11 - 9GS - ALB8 IL6R304 anti-HSA anti-IL6R anti-HSA 20?? - 9GS - 20A11 - 9GS - ALB8 IL6R305 anti-IL6R anti-IL6R 20A11 - 9GS - ALB8 - 9GS - 20A11 IL6R306 enti-ILSR anti-HSA Tabla C-28: Potencia de los Nanobodies formateados contra referencias en el análisis de proliferación TF-11 a 100 IU/mL IL-6 Compuesto IC50 (nM) Stdev (nM) Repeticiones 20A11 0.283 0.256 3 i IL6R304 0.715 0.390 2 ; IL6R305 0.098 0.046 4 IL6R306 0.341 0.162 3 Fab de referencia 6.262 0.706 2 IgG de referencia 0.921 0.275 4 Tabla C-29: Potencia de los Nanobodies formateados en el análisis de proliferación TF-1 a 5000 IU/mL IL-6 Compuesto IC50 (nM) 20A11 15.22 IL6R304 15.48 IL6R305 5.49 IL6R306 23.19 IgG de referencia 144.5 Tabla C-30: Valores IC50 (nM) de Nanobodies formateados para lá neutralización de IL-6 que se une a sIL-6R en plasma humano Compuesto IC50 aa IL-6 normal IC50 a IL-6 alto Proporción (alta/baja) reference IgG 0.258 1.69 6.54 IL6R20A11 0.198 0.356 1.80 IL6R304 0.229 0.634 2.77 IL6R305 0.137 0.335 2.44 IL6R306 0.412 2.39 5.80 Tabla C-31: Valores EC50 (nM) para la unión de los Nanobodies madurados por afinidad formateados a CHO 4D5 (4PL) Compuesto EC50 (nM) IL6R20A11 1.396 IL6R304 1.939 IL6R305 0.8984 IL6R306 6.154 Tabla C-32 : Valores IC50 (nM) para la unión de los Nanobodies madurados por afinidad formateados para los PBL a partir de 2 donadores Compuesto Ll L2 MI M2 Gl G2 IL6R20A11 3.65 2.924 3.621 4.777 2.415 5.614 IL6R304 9.273 20.68 8.241 14.17 5.985 17.32 IL6R305 4.282 25.79 2.906 4.262 2.434 Í4.927 IL6R306 60 49.59 49.38 59.34 53.99 77.68 L: linfocitos, M: monocitos; G: granulocitos Tabla C-33: Parámetros cinéticos para la unión de los Nanobodies madurados por afinidad formateados a albúmina de suero humano y cyno Nanobody Albúmina de suero humano Albúmina de suero cyno ka (M V1) KD (nM) ka (MV) kd (S 1) D (nM) ALB11 5.45E+05 1.68E-03 3.08 5.11E+05 1.53E-06 2.99 IL6R304 2.15E+05 4.75E-03 22.1 1.95E+05 4.56E-03 23.4 IL6R305 2.01E+05 4.07E-03 20.3 2.03E+05 3.87E-03 19.1 IL6R306 2.25E+05 3.83E-03 17.1 2.12E+05 3.70E-03 17.4 Tabla C-3 : Parámetros cinéticos para la unión de los Nanobodies madurados por afinidad formateados a IL-6R humano y cyno Nanobody IL-6R humano IL-6R cyno ka (MV) Ms 1) KD (pM) ka (MV) kd ís 1) KD (pM) IL6R300 1E+06 ND ND 1E+06 ND ND IL6R304 7E+05 < 1E-05 * =14 8E+05 2E-05 25 * Límite de detección del instrumento Tabla C-35 : Comparación de los valores IC50 (nM) para la neutralización de la unión de hIL-6 a SIL-6R en plasma en plasma cyno y humano Artículos de prueba IC50 en humano IC50 en cyno Proporción (humano/cyno) IgG de referencia 0.258 0.166 1.55 IL6R20A11 0.198 0.117 1.69 IL6R304 0.229 0.137 1.67 IL6R305 0.137 0.0791 1.73 IL6R306 0.412 0.321 1.29 Tabla C-36: Grupos de dosificación para análisis PK/PD in vivo de IL6R304 y IL6R305 Artículo Dosificación de Nanobody Dosificación de IL-6 N y sexo de No. de Grupo de prueba (mg/kg b.w., i.v.) (pg/kg b.w., s.c.) los animales referencia. 6 0.4 2 m, l f IV, 12, 13 7 IL6R304 2 l m, 2 f 14,15, 16 8 10 5 ug/kg, l m, l f 17, 18 Una vez al día 9 0.4 l m, 2 f 19, 20, 21 durante 7 días, 10 IL6R305 2 iniciando 24 horas 2 m, l f 22, 23, 24 11 10 después de la l m, l f 25, 26 administración del Control 12 0 Nanobody 2 m, l f 27, 28, 29 negativo Control 5 mg/kg de IgG de 13 l m, 2 f 30, 31, 32 positivo referencia Tabla C-37: Tiempos de muestreo para análisis PK Grupo Tiempos de muestreo por animal Número de muestras - Dia 0: pre-inyección del Nanobody, y 5 min, 30 min, 3 horas, y 8 horas después de la inyección del Grupos 6-13 Nanobody 352 - Díasl, 2, 3, 4, 5, 6, 7 : pre-inyección de IL-6 - Días 8, 14, 21 y 29 Tabla C-38: Parámetros PK básicos de IL6R304 después de administración en bolo i.v. individual a 0.4 mg/kg mono cynomolgus IL6R304: IV 0.4 mg/kg Parámetro Unidad llm 12m 13f Media CV % Vss mL/kg 45.1 44.6 38.8 42.8 8 CL mL/día/kg 24.8 28.2 21.5 24.8 14 MRT día 1.81 1.58 1.80 1.73 8 ti/, ??? día 1.92 1.54 1.72 1.73 11 ??? Inferior día 1 1 1 1.00 0 ??? Superior día 4 4 5 4.33 13 R2 t1/2 Xzl 0.998 0.997 0.999 0.998 0 ??/2 ??2 día 0.566 0.504 0.521 0.530 6 ??2 Inferior día 5 4 5 4.67 12 ??2 Superior día 7 6 7 6.67 9 R2 t1 2 Xz2 0.967 1.00 0.938 0.968 3 AUCIast (_?3*µ /Gp? 16.0 14.1 18.6 16.2 14 AUCextrap % 0.372 0.365 0.325 0.354 7 AUCinf ?3*µ?/??? 16.1 14.2 18.6 16.3 14 AUCinf/D día*kg/mL 0.040 0.036 0.047 0.041 14 Tabla C-39: Parámetros PK básicos de IL6R304 después de una administración en bolo i . v . individual a 2 mg/kg en mono cynomolgus . Los parámetros terminales p ra algunos de los animales se calcularon con dos puntos de datos únicamente (R2 es 1 por omisión) IL6R304: IV 2 mg/kg Parámetro Unidad 14m 15f 16f Media CV % Vss mL/kg 56.0 55.9 49.3 53.7 7 CL mL/day/kg 9.99 11.0 10.1 10.4 6 MRT día 5.60 5.06 4.86 5.17 7 ti/2 Azl día 5.79 4.34 4.87 5.00 15 ??? Inferior día 2 2 2 2 0 ??? Superior día 14 14 14 14 0 R2 ti 2 Azl 0.994 0.979 0.991 0.988 1 ti/2 Az2 día 1.51 1.52 1.30 1.44 9 ??2 Inferior día 14 14 14 14 0 ??2 Superior día 21 21 21 21 0 R2 ti 2 z2 1.00 1.00 1.00 1.00 0 t1/2 Xz3 día 5.61 5.95 - 5.78 4 ??3 Inferior día 21 21 - 21 0 ??3 Superior día 29 29 - 29 o R2 ti/2 ??3 1.00 1.00 1.00 1.00 0 AUCIast día*µg/mL 200 181 197 192 5 AUCextrap % 0.295 0.247 0.090 0.211 51 AUCinf día*ug/mL 200 181 197 193 5 AUCinf/D día*kg/mL 0.100 0.091 0.099 0.096 5 Tabla C-40 Parámetros PK básicos de IL6R304 después de una administración en bolo i.v. individual a 10 mg/kg en monos cynomolgus IL6R304: I 10 mg/kg Parámetro Unidad 17m 18f Media CV % Vss mL/kg 76.5 88.8 82.7 10 CL mL/día/kg 7.66 10.35 9.00 21 RT día 10.0 8.57 9.29 11 ti/2 Xzl día 7.15 6.08 6.61 11 ??? Inferior día 1 1 1 0 ??? Superior día 29 29 29 0 R211/2 ??? 0.990 0.990 0.990 0 AUCIast día*µg/mL 1230 932 1081 19 AUCextrap % 5.79 3.50 4.64 35 AUCinf día*µg mL 1306 966 1136 21 AUCinf/D día*kg/mL 0.131 0.097 0.114 21 Tabla C-41 : Parámetros PK básicos de IL6R305 después de una administración en bolo i.v. individual a 0.4 mg/kg en monos cinomolgus. Los parámetros terminales para algunos de los animales se calcularon con dos puntos de datos únicamente (R2 es 1 por omisión) IL6R305: IV 0.4 mg/kg Parámetro Unidad 19m 20f 21f Media CV % Vss mL/kg 59.2 72.5 63.9 65.2 ío ; CL mL/día/kg 33.5 38.0 36.0 35.8 6 MRT día 1.77 1.91 1.77 1.82 4 t1/2 Azl día 1.79 1.25 1.89 1.64 21 ??? Inferior día 1 1 1 1 0 ; ??? Superior día 5 5 4 4.67 12 R2 t1/2 Azl 0.997 0.981 0.997 0.992 1 t1/2 Az2 día 0.446 - 0.495 0.470 7 ??2 Inferior día 5 - 5 5 0 ??2 Superior día 6 - 6 6 0 R ti 2 ??2 1.00 - 1.00 1.00 0 AUCIast día*µg/mL 11.84 9.84 11.02 10.9 9 AUCextrap % 0.765 6.58 0.855 2.73 122 AUCinf día*µg/mL 11.9 10.5 11.1 11.2 6 AUCinf/D día*kg/mL 0.030 0.026 0.028 0.028 6 : Tabla C-42 : Parámetros PK básicos de IL6R305 después de una administración en bolo i.v. individual a 2 mg/kg en mono cynomolgus . Los parámetros terminales para algunos de los animales se calcularon con dos puntos de datos únicamente (R2 es 1 por omisión) IL6R305: IV 2 mg/kg Parámetro Unidad 22m 23m 24f Media CV % Vss mL/kg 27.5 28.0 30.4 28.6 5 CL mL/día/kg 5.81 5.30 6.68 5.93 12 MRT día 4.73 5.28 4.55 4.85 8 t1/2 Xzl día 4.26 4.56 4.04 4.29 6 ??? Inferior día 2 2 2 2 0 ??? Superior día 14 14 14 14 0 R2 t1/2 zl 0.985 0.954 0.986 0.975 2 t./2 Xz2 día 1.33 2.34 1.16 1.61 40 ??2 Inferior día 14 14 14 14 0 ??2 Superior día 21 21 21 21 0 R2 ti/2 Az2 1 1 1 1 0 AUCIast día*µg/mL 344 374 299 339 11 AUCextrap % 0.089 0.791 0.041 0.307 137 AUCinf día*µg/mL 344 377 299 340 11 AUCinf/D día*kg/mL 0.172 0.189 0.150 0.170 11 Tabla C-43 Parámetros PK básicos de IL6R305 después de una administración en bolo i . v individual a 2 mg/kg en mono cynomolgus . Los parámetros terminales para algunos de los animales se calcularon con dos puntos de datos únicamente (R2 es 1 por omisión) IL6R305: I 10 mg/kg Parámetro Unidad 25m 26f Media CV % Vss mL/kg 38.3 59.2 48.7 30 CL mL/día/kg 6.91 8.60 7.76 15 MRT día 5.54 6.88 6.21 15 ti/2 Xzl día 5.63 9.10 7.37 33 ??? Inferior día 2 2 2 0 ??? Superior día 14 14 14 0 R2 ti 2 Azl 0.941 0.968 0.955 2 ta/2 ??2 día 1.26 1.16 1.21 6 ??2 Inferior día 21 21 21 0 ??2 Supeiror día 29 29 29 0 R2 ti 2 Xz2 1.00 1.00 1.00 0 AUCIast día* g/mL 1447 1162 1305 15 AUCextrap % 0.008 0.009 0.008 11 AUCinf día* g/mL 1447 1162 1305 15 AUCinf/D día*kg/mL 0.145 0.116 0.130 15 Tabla C-44: Resumen de la aparición del anticuerpo anti-IL6R304 y anti-IL6R305 para el Nanobody total IL6R304 Cyno ADA positivo* IL6R305 Cyno ADA positivo* llm > 7 días 19m > 7 días 0,4 0,4 12m > 7 días 20f > 7 días mg/kg mg/kg 13f > 7 días 21f > 7 días 14m > 7 días 22m > 14 días 15f > 14 días 23m Sin ADA detectado 2 mg/kg Sin resultados debido 2 mg/kg 16f a altos valores de 24f > 14 días pre-dosificación 10 17m > 14 días 10 25m > 14 días mg/kg 18f > 14 días mg/kg 26f > 14 días * > 7 días: TD 7 Negativo,=TD 14 Positivo; > 14 días: TD 14 Negativo,=TD 21 Positivo Tabla C-45: Parámetros farmacocinéticos de IL6R304 en el mono cynomolgus Parámetro Estimado %CV K¡„ (ng/mL/h) 2.40 7.37 R0 (ng/mL) 21.4 5.23 Imax (%) 0.970 0.34 IC50 (µ^G??) 0.146 15.8 IC50 (nM) 5.23 Tabla C-46: Resumen de los parámetros PK clave media (± SD) de IL6R304 en el mono cynomolgus después de un bolo i.v. individual a l, 5, 10, 25 o 100 mg/kg Parámetro Unidad 1 mg/kg 5 mg/kg 10 mg/kg 25 mg/kg n Media SD n Media SD n Media SD n Media SD Co µ /??? 3 26.2 3.8 3 108.7 24.0 3 196.5 30.8 3 562.3 66.4 AUCinf µg.h/mL 2a 2015 190 2b 12338 768 2 25983 440 3 89526 28466 tl/2 d 2a 1.81 0.00 2b 5.01 0.76 2 6.37 0.19 3 6.24 0.76 CL mL/h/kg 2a 0.50 0.04 2b 0.41 0.02 2 0.39 0.01 3 0.30 0.11 Vz mL/kg 2a 46.5 3.0 2b 67.3 18.5 2 82.3 1.7 3 72.6 18.1 DN AUCinf µ§.?/???. 2a 2015 - 2b 2468 - 2 2598 - 3 3581 - Parámetro Unidad 100 mg/kg n Media SD Co µ§/Gp?. 1 2840.5 - AUCinf µg.h/mL 1 540612 -tl/2 d 1 8.9 - CL mL d/kg 1 0.18 - Vz mL/kg 1 57.6 - DN AUCinf µg.h/mL 1 5406 - DN: Dosis normalizada -a 1 mg/kg a Animal 3 excluido de las estadísticas descriptivas ya que no se observe un intercambio suministrado por blanco: tl/2 = 4.3 días b Animal 6 excluido de las estadísticas descriptivas ya que se observó un intercambio suministrado por blanco: t^ = 2.2 días Tabla C-47: Parámetros farmacocinéticos de IL6R304 en monos cynomolgus Parámetro Estimado % de CV Vc (mL/kg) 45.6 5.23 Vd (mL/kg) 14.8 15.2 Vs (mL/kg) 24.9 16.1 VdS3 (mL/kg) 85.3 CLNON-IL6 (mL/h/kg) 0.237 3.39 CLD (mL/h/kg) 0.0475 29.9 CL3 (mL/h/kg) 2.86 40.4 Vraax (pg/h/kg) 1.971 11.2 m (pg/mL) 0.714 30.4 CLIL6R (mL/h/kg) 2.76

Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES :
1. Una secuencia de aminoácidos dirigida; contra IL-6R, caracterizada porque comprende uno o más alargamientos de residuos de aminoácidos seleccionados de los siguientes: a) La SEC ID NO: 80; o b) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2 , de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de la SEC ID NO: 80, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiénto de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó 1, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; y/o c) las SEC ID NOs : 84, 89 y 91; o d) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 84, 89 y 91, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 2 ó; 1, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; y/o e) las SEC ID NOs : 93-94; o f) un alargamiento de residuos de aminoácidos que no tiene más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 93-94, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos se una a IL<-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la secuencia que comprende el alargamiento de residuos de aminoácidos sin la diferencia de aminoácidos 1 ó 2, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales .
2. La secuencia de aminoácidos de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende la SEC ID NO: 80, la SEC ID NO: 84 y la SEC ID NO: 93.
3. La secuencia de aminoácidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, seleccionada del grupo que consiste de: a) Las SEC ID NOs: 65-69; b) una secuencias que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR con una de las SEC ID NOs: 65-69, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más dé 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en uno, dos o todos sus CDR unidas a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NOs: 65-69, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; c) una secuencias que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 65-69, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 65-69 unido a IL-6R con aproximadamente la misma o áuperior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NOs: 65-69, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
4. El compuesto o estructura, caracterizado porque comprende o consiste esencialmente de una o más secuencias de aminoácidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y comprende además opcionalmente uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión, enlazados opcionalmente via uno o más enlazantes.
5. El compuesto o estructura de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque uno o más de los otros grupos, residuos, porciones o unidades de, unión proporcionan al compuesto o estructura con una vida media aumentada y en los cuales uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de unión se seleccionan del grupo que consiste de anticuerpos dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuados para utilizarse como un anticuerpo dominio, anticuerpos dominio individuales, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para utilizarse como un anticuerpo dominio individual, "dAb", secuencias de aminoácidos que son adecuados para utilizarse como un dAb, o Nanobodies que se pueden unir a albúmina sérica (tal como, albúmina de suero humano) o a inmunoglobulina sérica (tal como IgG) .
6. El compuesto o estructura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado porque se selecciona de la siguiente secuencia de polipéptidos : a) Las SEC ID NOs: 70-72; b) una secuencia de polipéptidos que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR de la invención con una, de las SEC ID NOs: 70-72, siempre y cuando la secuencias del polipéptido con no más de 2, de preferencia no más, de una diferencia de aminoácidos en una, dos o todas sus CDR de la invención unida a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NOs : 70-72, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales; c) una secuencia de polipéptidos que no tenga más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 70-72, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos con no más de 2, de preferencia no más de una diferencia de aminoácidos con una de las SEC ID NOs: 70-72 unidas a IL-6R con aproximadamente la misma o superior afinidad en comparación con la unión de una de las SEC ID NOs: 70-72, la afinidad tal como se mide mediante resonancia con plasmones superficiales.
7. El compuesto o la estructura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque tiene o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 70 o la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 71.
8. El compuesto o estructura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque se une específicamente a hIL-6R con una constante de disociación (KD) de 1 nM hasta 1 pM moles/litro o menos, de preferencia 500 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, de mayor preferencia 100 pM hasta 1 pM moles/litro o menos, o incluso de mayor preferencia aproximadamente 50 pM hasta 1 pM o menos.
9. La estructura monovalente, caracterizada porque comprende o consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
10. Un método para la preparación de un compuesto o estructura multivalente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque comprende la unión de una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una estructura monovalente de conformidad con la reivindicación 9 a uno o más grupos, residuos, porciones o unidades de unión.
11. El ácido nucleico o secuencia de nucleótidos caracterizado porque codifica para una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un compuesto o estructura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 que es tal que se pueda obtener mediante la expresión de un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos que codifican para el mismo, o una estructura monovalente de conformidad con la reivindicación 9, el ácido nucleico opcionalmente en la forma de una estructura genética.
12. Un hospedero o célula hospedera que expresa, o que bajo circunstancias adecuadas es capaz de expresar, una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un compuesto o estructura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 que es tal que se puede obtener mediante la expresión de un ácido nucleico o una secuencia de nucleótidos que codifica el mismo, o una estructura monovalente de conformidad con la reivindicación 9; y/o caracterizado porque comprende un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos o una estructura genética de conformidad con la reivindicación 11.
13. El método para producir una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un compuesto o estructura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 que es tal que se puede obtener mediante la expresión de un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos que codifica para el mismo, o una estructura monovalente de conformidad con la reivindicación 9, el método caracterizado porque comprende al menos los pasos de: a) Expresar, en una célula hospedera adecuada un organismo hospedero o en otro sistema de expresión adecuado, un ácido nucleico o una secuencia de nucleótidos o una estructura genética de conformidad con la reivindicación 11; o cultivar y/o mantener un hospedero o 1 célula hospedera de conformidad con la reivindicación 12, bajo condiciones que sean tales que el hospedero o célula hospedera exprese y/o produzca al menos una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el compuesto o estructura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 que es tal que se puede obtener mediante la expresión de un ácido nucleico o una secuencia de nucleótidos que codifica para el mismo, o una estructura monovalente de conformidad con la reivindicación 9, seguido opcionalmente por: b) Aislar y/o purificar la secuencia de aminoácidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el compuesto o estructura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 que es tal que se pueda obtener mediante la expresión de un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos que codifican para el mismo, o la estructura monovalente de conformidad con la reivindicación 9 asi obtenida.
14. Una composición, tal como una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un compuesto o estructura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, una estructura monovalente de conformidad con la reivindicación 9, o un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 11.
15. El método para la prevención y/o tratamiento de al menos una de las enfermedades y trastornos asociados con IL-6, con IL-6R, con el complejo IL-6/IL-6R y/o con las trayectorias de señalización y/o las funciones biológicas y respuestas en las cuales están implicados IL-6, IL-6R y/o el complejo IL-6/IL-6R seleccionados del grupo que consiste de sepsis, diversas formas de cáncer, resorción ósea, osteoporosis, caquexia, psoriasis, glomerulonefritis proliferativa mesangial, sarcoma de Kaposi, linfoma relacionado con SIDA, y enfermedades inflamatorias, el método caracterizado porque comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de al menos una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un compuesto o estructura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, o una estructura monovalente de conformidad con la reivindicación 9, o una composición de conformidad con la reivindicación 14.
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