TW202323287A - 包含抗原結合域與運送部分的多胜肽 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於包含抗原結合域以及具有抑制抗原結合域之抗原結合活性之抑制域之運送部分，且比起單獨存在之抗原結合域有較長半衰期的多胜肽、該多胜肽之製造方法與篩選方法、含有該多胜肽之醫藥組合物、藉由與特定之VL/VH/VHH締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體之製造方法及篩選方法、以及含有藉由與特定之VL/VH/VHH締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體之融合多胜肽之資料庫。

Description

包含抗原結合域與運送部分的多胜肽
本發明係關於包含抗原結合域以及具有抑制抗原結合域之抗原結合活性之抑制域的運送部分，且比起單獨存在之抗原結合域有更長半衰期之多胜肽，該多胜肽之製造方法與篩選方法、含有該多胜肽之醫藥組合物、藉由與特定VL/VH/VHH締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體之製造方法、以及篩選方法、含有藉由與特定VL/VH/VHH締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體之融合多胜肽之資料庫。
抗體在血漿中的安定性高、副作用少，故作為醫藥品受到重視。其中IgG型的抗體醫藥已有多數個上市，現在也有許多抗體醫藥品正在開發 (非專利文獻1、非專利文獻2)。
作為使用抗體醫藥之癌治療藥，至今認可的已有針對CD20抗原之Rituxan、針對EGFR抗原之Cetuximab、針對HER2抗原之Herceptin等(非專利文獻3)。該等抗體分子結合於在癌細胞表現的抗原，利用ADCC活性等發揮對於癌細胞之傷害活性。如此的利用ADCC活性等的細胞傷害活性，已知係依存於治療用抗體在目標細胞表現的抗原的數目 (非專利文獻4)，所以從治療用抗體之效果之觀點，成為目標之抗原之表現量高較佳。但是即使抗原的表現量高，若正常組織有抗原表現，會對於正常細胞發揮ADCC活性等傷害活性，所以副作用成為大問題。所以，作為癌治療藥的治療用抗體所標靶的抗原，宜為於癌細胞特異性地表現較佳。例如:針對已知為癌抗原之EpCAM抗原的抗體分子，作為癌治療藥被認為有前景，但是已知EpCAM抗原在胰臟也會表現，實際上，在臨床試驗已有報告因投予抗EpCAM抗體，觀察到由於對於胰臟之細胞傷害活性引起的胰炎的副作用(非專利文獻5)。
受惠利用發揮ADCC活性所致之細胞傷害活性之抗體醫藥之成功，已有報告藉由將天然型人類IgG1之Fc區之N型糖鏈之海藻糖除去而獲致ADCC活性之增強(非專利文獻6)、利用天然型人類IgG1之Fc區之胺基酸置換獲致對於FcγRIIIa之結合增強而得之ADCC活性之增強(非專利文獻7)等以發揮強大細胞傷害活性的第二代之改良抗體分子。作為以上述NK細胞仲介之ADCC活性以外的機轉對於癌細胞發揮傷害活性的抗體醫藥，也有報告將有強大細胞傷害活性的藥物和抗體接合而成的Antibody Drug Conjugate(ADC)(非專利文獻8)、及藉由於癌細胞中增援(recruit)T細胞而發揮對癌細胞之傷害活性的低分子抗體(非專利文獻9)等來發揮強大細胞傷害活性的改良抗體分子。
如此的發揮更強大的細胞傷害活性的抗體分子，即使對於抗原表現不多的癌細胞仍能發揮細胞傷害活性，另一方面，對於抗原表現少的正常組織也和癌細胞同樣會發揮細胞傷害活性。實際上，相較於針對EGFR抗原之天然型人類IgG1即Cetuximab，針對CD3與EGFR之雙特異性抗體EGFR-BiTE能藉由於癌細胞中增援T細胞、以對於癌細胞發揮強大的細胞傷害活性，並發揮抗腫瘤效果。另一方面， EGFR在正常組織也會表現，所以也已觀測到將EGFR-BiTE投予食蟹獼猴時出現嚴重的副作用(非專利文獻10)。又，在針對癌細胞中為高表現之CD44v6的抗體結合mertansine而得的bivatuzumab mertansine，由於CD44v6在正常組織也會表現，所以臨床上已觀測到嚴重的皮膚毒性及肝毒性 (非專利文獻11)。
如上，當使用即使對於抗原表現少的癌細胞仍能發揮強大的細胞傷害活性的抗體時，目標抗原是極為癌特異性地表現是必須的，但是如同Herceptin之目標抗原HER2、Cetuximab之目標抗原EGFR在正常組織也會表現般，據認為極度癌特異性地表現的癌抗原的數目有限。所以，即使能夠強化對於癌之細胞傷害活性，對於正常組織之細胞傷害作用造成的副作用仍可能是問題。
又，最近，有揭示藉由抑制癌中有助免疫抑制之CTLA4而增強腫瘤免疫的ipilimumab，會使轉移性黑色素瘤的整體存活(Overall survival)延長(非專利文獻12)。但是ipilimumab會將CTLA4予以全身性地抑制，所以腫瘤免疫增強的另一方面，會因全身性免疫活化造成自體免疫病症狀的嚴重副作用，成為問題(非專利文獻13)。
另一方面，作為對付癌以外之病症的抗體醫藥，已知藉由抑制發炎性・自體免疫病症中的發炎細胞介素能發揮治療效果的抗體醫藥(非專利文獻14)。例如以TNF作為目標的Remicade、Humira、及將IL-6R作為目標之Actemra，對於類風濕性關節炎發揮高治療效果，但另一方面，也已知由於該等細胞介素全身性地被中和，而觀察到感染症的副作用(非專利文獻15)。
作為能應用在第二代抗體醫藥的技術，已開發出各種技術，已有報告使效應子機能、抗原結合能力、藥物動態、安定性提高、或使用免疫原性風險減低的技術等 (非專利文獻16)，但用以解決如上述副作用之能將抗體醫藥對於目標組織特異性地作用的技術相關的報告仍少。就已有報告的技術而言，有下列方法，藉由以會被在如癌組織、發炎性組織之病變部位表現的蛋白酶切斷的連結子將遮罩胜肽與抗體予以連接，而將抗體的抗原結合部位以遮罩胜肽予以遮蔽，抑制抗體之抗原結合活性，並使此連結子以蛋白酶切斷，而使遮罩胜肽解離，使抗體的抗原結合活性回復，能於目標的病態組織結合於抗原(非專利文獻17、18、專利文獻1）。 [先行技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]　國際公開WO2010/081173號 [非專利文獻]
[非專利文獻1]　Monoclonal antibody successes in the clinic. Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073 - 1078 [非專利文獻2] The therapeutic antibodies market to 2008. Pavlou AK, Belsey MJ., Eur. J. Pharm. Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396 [非專利文獻3]　Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Weiner LM, Surana R, Wang S., Nat. Rev. Immunol. (2010) 10 (5), 317-327 [非專利文獻4] Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185HER2 monoclonal antibodies. Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, Shepard HM, Cancer Immunol. Immunotherapy (1993) 37, 255-263 [非專利文獻5] ING-1, a monoclonal antibody targeting Ep-CAM in patients with advanced adenocarcinomas. de Bono JS, Tolcher AW, Forero A, Vanhove GF, Takimoto C, Bauer RJ, Hammond LA, Patnaik A, White ML, Shen S, Khazaeli MB, Rowinsky EK, LoBuglio AF, Clin. Cancer Res. (2004) 10 (22), 7555-7565 [非專利文獻6] Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generation therapeutic antibodies. Satoh M, Iida S, Shitara K., Expert Opin. Biol. Ther. (2006) 6 (11), 1161-1173 [非專利文獻7] Optimizing engagement of the immune system by anti-tumor antibodies: an engineer's perspective. Desjarlais JR, Lazar GA, Zhukovsky EA, Chu SY., Drug Discov. Today (2007) 12 (21-22), 898-910 [非專利文獻8] Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Alley SC, Okeley NM, Senter PD., Curr. Opin. Chem. Biol. (2010) 14 (4), 529-537 [非專利文獻9] BiTE: Teaching antibodies to engage T-cells for cancer therapy. Baeuerle PA, Kufer P, Bargou R., Curr. Opin. Mol. Ther. (2009) 11 (1), 22-30 [非專利文獻10] T cell-engaging BiTE antibodies specific for EGFR potently eliminate KRAS- and BRAF-mutated colorectal cancer cells. Lutterbuese R, Raum T, Kischel R, Hoffmann P, Mangold S, Rattel B, Friedrich M, Thomas O, Lorenczewski G, Rau D, Schaller E, Herrmann I, Wolf A, Urbig T, Baeuerle PA, Kufer P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2010) 107 (28), 12605-12610 [非專利文獻11] Phase I trial with the CD44v6-targeting immunoconjugate bivatuzumab mertansine in head and neck squamous cell carcinoma. Riechelmann H, Sauter A, Golze W, Hanft G, Schroen C, Hoermann K, Erhardt T, Gronau S., Oral Oncol. (2008) 44 (9), 823-829 [非專利文獻12] Ipilimumab in the treatment of melanoma. Trinh VA, Hwu WJ., Expert Opin. Biol. Ther., (2012) Apr 14 (doi:10.1517/14712598.2012.675325) [非專利文獻13] IPILIMUMAB - A NOVEL IMMUNOMODULATING THERAPY CAUSING AUTOIMMUNE HYPOPHYSITIS: A CASE REPORT AND REVIEW. Juszczak A, Gupta A, Karavitaki N, Middleton MR, Grossman A., Eur. J. Endocrinol. (2012) Apr 10 (doi: 10.1530/EJE-12-0167) [非專利文獻14] The Japanese experience with biologic therapies for rheumatoid arthritis. Takeuchi T, Kameda H., Nat. Rev. Rheumatol. (2010) 6 (11), 644-652 [非專利文獻15] Current evidence for the management of rheumatoid arthritis with biological disease-modifying antirheumatic drugs: a systematic literature review informing the EULAR recommendations for the management of RA. Nam JL, Winthrop KL, van Vollenhoven RF, Pavelka K, Valesini G, Hensor EM, Worthy G, Landewe R, Smolen JS, Emery P, Buch MH., Ann. Rheum. Dis. (2010) 69 (6), 976-986 [非專利文獻16] Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies. Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Mol. Cells. (2005) 20 (1), 17-29 [非專利文獻17] Tumor-specific activation of an EGFR-targeting probody enhances therapeutic index. Desnoyers LR, Vasiljeva O, Richardson JH, Yang A, Menendez EE, Liang TW, Wong C, Bessette PH, Kamath K, Moore SJ, Sagert JG, Hostetter DR, Han F, Gee J, Flandez J, Markham K, Nguyen M, Krimm M, Wong KR, Liu S, Daugherty PS, West JW, Lowman HB. Sci Transl Med. 2013 Oct 16;5(207):207ra144. [非專利文獻18] Probody therapeutics for targeting antibodies to diseased tissue. Polu KR, Lowman HB. Expert Opin Biol Ther. 2014 Aug;14(8):1049-53.
(發明欲解決之課題)
本案發明人等思考到，藉由如前述蛋白酶切斷使抑制抗體之抗原結合活性之遮罩胜肽解離，使抗體之抗原結合活性回復的技術，因為蛋白酶所為之切斷為不可逆，所以在病變部位被切斷的抗體會乘著血流而分布到正常組織，可能引起副作用。 本發明係基於如此的考量，目的之一在於提供副作用減少的對於病症治療有用的醫藥組合物、與其有效成分。又，目的之一在於提供該醫藥組合物與該有效成分之篩選方法以及製造方法。 (解決課題之方式)
本案發明人等努力研究，結果創作出包含抗原結合域以及具有抑制抗原結合域之結合活性之抑制域之運送部分，且比起單獨存在的抗原結合域有更長半衰期之多胜肽。藉由使用該多胜肽，在病症組織，抗原結合域之抗原結合活性回復，據認為能在病症組織發揮抗原結合活性。又，由於抗原結合域之抗原結合活性受抑制之狀態之多胜肽、與抗原結合域之抗原結合活性已回復之狀態之多胜肽之半衰期之差異，能夠抑制活化狀態之抗原結合域向全身分佈。又，本案發明人等發現該多胜肽或含有該多胜肽之醫藥組合物對病症治療有用，並發現投予該多胜肽的步驟對於病症治療有用、與該多胜肽在病症治療用之醫藥製造為有用。又，本案發明人等創作該多胜肽之篩選方法與製造方法、藉由與特定的VL或VH或VHH締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體之製造方法與篩選方法、以及含有藉由與特定的VL或VH或VHH締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體之資料庫，而完成本發明。
本發明係基於如此的知見，具體而言包括以下例示記載的實施態樣。 (1) 一種多胜肽，該多胜肽包含抗原結合域與運送部分，該運送部分具有抑制該抗原結合域之抗原結合活性之抑制域，該抗原結合域具有比起該運送部分短的血中半衰期。 (2) 如(1)記載之多胜肽，其中，前述抗原結合域之分子量比起前述運送部分之分子量小。 (3) 如(1)或(2)記載之多胜肽，其中，前述抗原結合域之分子量為60kDa以下。 (4) 如(1)至(3)中任一項記載之多胜肽，其中，前述運送部分具有FcRn結合活性，前述抗原結合域不具FcRn結合活性或具有比起前述運送部分弱的FcRn結合活性。 (5) 如(1)至(4)中任一項記載之多胜肽，其中，該抗原結合域能夠從該多胜肽游離，該抗原結合域藉由從該多胜肽游離，抗原結合活性比起游離前提高。 (6) 如(1)至(5)中任一項記載之多胜肽，其中，藉由該抗原結合域與該運送部分之該抑制域締合，該抗原結合域之抗原結合活性受抑制。 (7) 如(5)記載之多胜肽，其中，該多胜肽含有切斷位點，藉由該切斷位點被切斷，該抗原結合域可從該多胜肽游離。 (8) 如(6)記載之多胜肽，其中，該多胜肽含有切斷位點，藉由該切斷位點被切斷，解除該抗原結合域與該運送部分之該抑制域之締合。 (9) 如(7)或(8)記載之多胜肽，其中，前述切斷位點含有蛋白酶切斷序列。 (10) 如(9)記載之多胜肽，其中，前述蛋白酶為目標組織特異性的蛋白酶。 (11) 如(10)記載之多胜肽，其中，前述目標組織為癌組織或發炎組織。 (12) 如(9)記載之多胜肽，其中，前述蛋白酶係選自Matriptase、尿激酶(uPA)、金屬蛋白酶中之至少一種蛋白酶。 (13) 如(12)記載之多胜肽，其中，前述蛋白酶係選自MT-SP1、uPA、MMP2、MMP9、ADAMTS5、MMP7、MMP13中之至少一種蛋白酶。 (14) 如(9)記載之多胜肽，其中，前述蛋白酶切斷序列含有選自序列編號：12、25、34、35、70~73、75、76、91、178、193~195中之序列。 (15) 如(9)至(14)中任一項記載之多胜肽，其中，在前述蛋白酶切斷序列一端更附加有第一可動連結子。 (16) 如(15)記載之多胜肽，其中，在前述蛋白酶切斷序列另一端更附加有第二可動連結子。 (17) 如(15)記載之多胜肽，其中，前述第一可動連結子係由甘胺酸-絲胺酸聚合物所形成之可動連結子。 (18) 如(16)記載之多胜肽，其中，前述第二可動連結子係由甘胺酸-絲胺酸聚合物構成之可動連結子。 (19) 如(1)至(18)中任一項記載之多胜肽，其中，前述抗原結合域含有單域抗體、或為單域抗體，前述運送部分之前述抑制域抑制該單域抗體之抗原結合活性。 (20) 如(19)記載之多胜肽，其中，前述單域抗體為VHH、或以單域具有抗原結合活性之VH、或以單域具有抗原結合活性之VL。 (21) 如(1)至(20)中任一項記載之多胜肽，其中，前述抗原結合域含有單域抗體，前述運送部分之前述抑制域為VHH、或抗體VH、或抗體VL，前述單域抗體藉由該VHH、或抗體VH、或抗體VL而抗原結合活性受抑制。 (22) 如(1)至(21)中任一項記載之多胜肽，其中，前述抗原結合域含有單域抗體，前述運送部分之前述抑制域為VHH、或抗體VH、或抗體VL，前述單域抗體藉由與該VHH、或抗體VH、或抗體VL締合而抗原結合活性受抑制。 (23) 如(19)至(22)中任一項記載之多胜肽，其中，前述單域抗體為VHH、或以單域具有抗原結合活性之VH，前述運送部分之前述抑制域為抗體VL，前述VHH或以單域具抗原結合活性之VH藉由與前述抗體VL締合而抗原結合活性受抑制。 (24) 如(19)至(23)中任一項記載之多胜肽，其中，前述單域抗體為VHH，該VHH在選自37號、44號、45號、或47號(皆為Kabat編號)之胺基酸中之至少一個位置經胺基酸置換。 (25) 如(19)至(23)中任一項記載之多胜肽，其中，前述單域抗體為VHH，該VHH含有選自37V、44G、45L、或47W(皆為Kabat編號)之胺基酸中之至少一個胺基酸。 (26) 如(19)至(23)中任一項記載之多胜肽，其中，前述單域抗體為VHH，該VHH含有選自F37V、Y37V、E44G、Q44G、R45L、H45L、G47W、F47W、L47W、T47W、或S47W(皆為Kabat編號)之胺基酸置換中之至少一個胺基酸置換。 (27) 如(19)至(23)中任一項記載之多胜肽，其中，前述單域抗體為VHH，該VHH在選自37號/44號、37號/45號、37號/47號、44號/45號、44號/47號、45號/47號、37號/44號/45號、37號/44號/47號、37號/45號/47號、44號/45號/47號、37號/44號/45號/47號(皆為Kabat編號)中之至少一組位置經胺基酸置換。 (28) 如(19)至(23)中任一項記載之多胜肽，其中，前述單域抗體為VHH，該VHH含有選自37V/44G、37V/45L、37V/47W、44G/45L、44G/47W、45L/47W、37V/44G/45L、37V/44G/47W、37V/45L/47W、44G/45L/47W、37V/44G/45L/47W(皆為Kabat編號)中之至少一組胺基酸。 (29) 如(19)至(23)中任一項記載之多胜肽，其中，前述單域抗體為VHH，該VHH含有選自F37V/R45L、F37V/G47W、R45L/G47W、F37V/R45L/G47W(皆為Kabat編號)中之至少一組胺基酸置換。 (30) 如(19)至(22)中任一項記載之多胜肽，其中，前述單域抗體係以單域具抗原結合活性之VL，前述運送部分之前述抑制域為抗體VH，前述以單域具抗原結合活性之VL藉由與前述抗體VH締合而抗原結合活性受抑制。 (31) 如(1)至(30)中任一項記載之多胜肽，其中，前述運送部分具有FcRn結合區。 (32) 如(1)至(31)中任一項記載之多胜肽，其中，前述運送部分含有抗體恆定區。 (33) 如(32)記載之多胜肽，其中，前述運送部分之抗體恆定區與前述抗原結合域介隔連結子、或未介隔連結子而融合。 (34) 如(32)記載之多胜肽，其中，前述運送部分含有抗體重鏈恆定區，該抗體重鏈恆定區與前述抗原結合域介隔連結子、或未介隔連結子而融合。 (35) 如(32)記載之多胜肽，其中，前述運送部分含有抗體輕鏈恆定區，該抗體輕鏈恆定區與前述抗原結合域介隔連結子、或未介隔連結子而融合。 (36) 如(34)記載之多胜肽，其中，前述多胜肽是前述運送部分之抗體重鏈恆定區之N末端與前述抗原結合域之C末端介隔連結子或未介隔連結子而融合，且更具有蛋白酶切斷序列，該蛋白酶切斷序列位於前述抗原結合域之序列中，或位在比起前述重鏈抗體恆定區之122號(EU編號)之胺基酸更靠前述抗原結合域側。 (37) 如(35) 記載之多胜肽，其中，前述多胜肽是前述運送部分之抗體輕鏈恆定區之N末端與前述抗原結合域之C末端介隔連結子或未介隔連結子而融合，更具有蛋白酶切斷序列，該蛋白酶切斷序列位在前述抗原結合域之序列中，或位在比起前述輕鏈抗體恆定區之113號(EU編號)(Kabat編號113號)之胺基酸更靠前述抗原結合域側。 (38) 如(33)至(35)中任一項記載之多胜肽，其中，前述多胜肽是前述運送部分之抗體恆定區之N末端與前述抗原結合域之C末端介隔連結子或未介隔連結子而融合，前述抗原結合域係由VH製作的單域抗體或VHH，前述多胜肽更具有蛋白酶切斷序列，該蛋白酶切斷序列位在前述抗體恆定區之序列中，或位在比起前述抗原結合域之單域抗體之109號(Kabat編號)之胺基酸更靠前述抗體恆定區側。 (39) 如(33)記載之多胜肽，其中，前述多胜肽是前述運送部分之抗體恆定區之N末端與前述抗原結合域之C末端介隔連結子或未介隔連結子而融合，且更具有蛋白酶切斷序列，該蛋白酶切斷序列位在前述抗原結合域與前述抗體恆定區之交界附近。 (40) 如(34)記載之多胜肽，其中，前述多胜肽是前述運送部分之抗體重鏈恆定區之N末端與前述抗原結合域之C末端介隔連結子或未介隔連結子而融合，更具有蛋白酶切斷序列，該蛋白酶切斷序列位在前述抗原結合域與前述抗體重鏈恆定區之交界附近。 (41) 如(35)記載之多胜肽，其中，前述多胜肽是前述運送部分之抗體輕鏈恆定區之N末端與前述抗原結合域之C末端介隔連結子或未介隔連結子而融合，更具有蛋白酶切斷序列，該蛋白酶切斷序列位在前述抗原結合域與前述抗體輕鏈恆定區之交界附近。 (42) 如(40)記載之多胜肽，其中，前述抗原結合域係由VH製作的單域抗體或VHH，前述蛋白酶切斷序列位在前述抗原結合域之單域抗體之109號(Kabat編號)之胺基酸與前述抗體重鏈恆定區之122號(EU編號)之胺基酸之間。 (43) 如(41) 記載之多胜肽，其中，前述抗原結合域係由VH製作的單域抗體或VHH，前述蛋白酶切斷序列位在前述抗原結合域之單域抗體之109號(Kabat編號)之胺基酸與前述抗體輕鏈恆定區之113號(EU編號)(Kabat編號113號)之胺基酸之間。 (44) 如(40)記載之多胜肽，其中，前述抗原結合域係由VL製作之單域抗體，前述蛋白酶切斷序列位在前述抗原結合域之單域抗體之104號(Kabat編號)之胺基酸與前述抗體重鏈恆定區之122號(EU編號)之胺基酸之間。 (45) 如(41)記載之多胜肽，其中，前述抗原結合域係由VL製作之單域抗體，前述蛋白酶切斷序列位在前述抗原結合域之單域抗體之109號(Kabat編號)之胺基酸與前述抗體輕鏈恆定區之113號(EU編號)(Kabat編號113號)之胺基酸之間。 (46) 如(32)至(45)中任一項記載之多胜肽，其中，前述多胜肽之抗體恆定區為IgG抗體恆定區。 (47) 如(1)至(46)中任一項記載之多胜肽，其中，前述多胜肽為類IgG抗體分子。 (48) 如(1)至(47)中任一項記載之多胜肽，其中，前述抗原結合域在未游離之狀態中，當使用BLI(Bio-Layer Interferometry)法(Octet)實施測定時，未觀察到抗原結合域與抗原之結合。 (49) 如(1)至(48)中任一項記載之多胜肽，其中，前述抗原結合域更連結第2抗原結合域。 (50) 如(49)之多胜肽，其中，前述第2抗原結合域具有與前述抗原結合域不同的抗原結合特異性。 (51) 如(49)或(50)記載之多胜肽，其中，前述第2抗原結合域含有第2單域抗體。 (52) 如(51)記載之多胜肽，其中，前述抗原結合域為單域抗體，前述第2抗原結合域為第2單域抗體，前述抗原結合域與前述第2抗原結合域能夠從前述多胜肽游離，在前述抗原結合域與前述第2抗原結合域之游離狀態，前述單域抗體與前述第2單域抗體形成雙特異性的抗原結合分子。 (53) 如(49)至(52)中任一項記載之多胜肽，其中，前述第2抗原結合域以HER2或GPC3作為目標抗原。 (54) 如(1)至(53)中任一項記載之多胜肽，其中，前述多胜肽更具有前述抗原結合域以外的其他抗原結合域，該其他抗原結合域也藉由與前述多胜肽之前述運送部分連結而抗原結合活性受抑制。 (55) 如(54)記載之多胜肽，其中，前述其他抗原結合域與前述抗原結合域有不同的抗原結合特異性。 (56) 如(1)至(55)中任一項記載之多胜肽，其中，前述抗原結合域係以PlexinA1、IL6R或CD3作為目標抗原之抗原結合域。 (57) 一種醫藥組合物，含有如(1)至(56)中任一項之多胜肽。 (58)一種製造如(1)至(56)中任一項記載之多胜肽之方法。 (59) 如(58)記載之製造方法，包括下列步驟： (a) 取得會結合於目標抗原之單域抗體之步驟； (b) 以(a)步驟取得之單域抗體之抗原結合活性會因運送部分之抑制域而受抑制之方式，使該單域抗體與該運送部分連結而形成多胜肽前驅物之步驟； (c) 對於前述多胜肽前驅物導入蛋白酶切斷序列之步驟。 (60) 如(58) 記載之製造方法，包括下列步驟： (a) 取得會結合於目標抗原之單域抗體之步驟； (b) 以(a)步驟取得之單域抗體之抗原結合活性會受運送部分之抑制域而抑制之方式，使該單域抗體與該運送部分連結而形成多胜肽前驅物之步驟； (c) 對於前述單域抗體與前述運送部分之交界附近導入蛋白酶切斷序列之步驟。 (61) 如(58)記載之製造方法，包括下列步驟： (a) 取得會結合於目標抗原之單域抗體之步驟； (b) 以(a)步驟取得之單域抗體之抗原結合活性會受運送部分之抑制域而抑制之方式，使該單域抗體介隔蛋白酶切斷序列而與該運送部分連結而形成多胜肽之步驟。 (62) 如(59)至(61)中任一項記載之製造方法，更包括下列步驟： (d) 確認已納入到前述多胜肽或前述多胜肽前驅物中之前述單域抗體的對於前述目標抗原之結合活性減弱或喪失之步驟。 (63) 如(59)至(62)中任一項記載之製造方法，更包括下列步驟： (e) 確認藉由將前述蛋白酶切斷序列以蛋白酶予以切斷，而使前述單域抗體游離，游離之單域抗體結合於抗原之步驟。 (64) 如(58)記載之製造方法，其中，前述多胜肽為類IgG抗體分子。 (65) 如(64)記載之製造方法，包括下列步驟： (a) 取得會結合於目標抗原之單域抗體之步驟； (b) 以(a)步驟取得之單域抗體之抗原結合活性會受抑制之方式，使該單域抗體替代IgG抗體之VH而與VL締合，或該使單域抗體替代IgG抗體之VL而與VH締合，藉此形成導入了前述單域抗體之類IgG抗體分子前驅物之步驟； (c) 對於導入了前述單域抗體之類IgG抗體分子前驅物導入蛋白酶切斷序列之步驟。 (66) 如(64)記載之製造方法，包括下列步驟： (a) 取得會結合於目標抗原之單域抗體之步驟； (b) 以(a)步驟取得之單域抗體之抗原結合活性會受抑制之方式，使該單域抗體替代IgG抗體之VH而與VL締合，或使該單域抗體替代IgG抗體之VL而與VH締合，藉此形成導入了前述單域抗體之類IgG抗體分子前驅物之步驟； (c) 對於前述單域抗體與前述類IgG抗體分子前驅物中之抗體恆定區之交界附近導入蛋白酶切斷序列之步驟。 (67) 如(64)記載之製造方法，包括下列步驟： (a) 取得會結合於目標抗原之單域抗體之步驟； (b) 以(a)步驟取得之單域抗體之抗原結合活性會受抑制之方式，使該單域抗體替代IgG抗體VH或VL而介隔蛋白酶切斷序列與IgG抗體之重鏈恆定區或輕鏈恆定區連結，形成導入了前述單域抗體之類IgG抗體分子之步驟。 (68) 如(65)至(67)中任一項記載之製造方法，更包括下列步驟： (d)確認已導入到前述類IgG抗體分子或前述類IgG抗體分子前驅物之前述單域抗體對於前述目標抗原之結合活性減弱或喪失之步驟。 (69) 如(65)至(68)中任一項記載之製造方法，更包括下列步驟： (e) 確認藉由以蛋白酶切斷前述蛋白酶切斷序列，使前述單域抗體游離，游離之單域抗體會結合於前述目標抗原之步驟。 (70) 如(64)記載之製造方法，包括下列步驟： (a) 將單域抗體中之涉及與抗體VH之締合之胺基酸殘基置換，或將單域抗體中之涉及與抗體VL之締合之胺基酸殘基置換，製作保持該單域抗體之對於目標抗原之結合活性之改變單域抗體之步驟； (b) 以抑制(a)步驟製作之改變單域抗體之抗原結合活性之方式，使該改變單域抗體與抗體VL締合，或使該改變單域抗體與抗體VH締合，藉此，形成導入了該改變單域抗體之該類IgG抗體分子前驅物之步驟； (c) 對於導入了前述改變單域抗體之類IgG抗體分子前驅物導入蛋白酶切斷序列之步驟。 (71) 如(64)記載之製造方法，包括下列步驟： (a) 將單域抗體中之涉及與抗體VH之締合之胺基酸殘基置換，或將單域抗體中之涉及與抗體VL之締合之胺基酸殘基置換，製作保持該單域抗體之對於目標抗原之結合活性之改變單域抗體之步驟； (b) 以抑制(a)步驟製作之改變單域抗體之抗原結合活性之方式，使該改變單域抗體與抗體VL締合，或使該改變單域抗體與抗體VH締合，藉此形成導入了該改變單域抗體之該類IgG抗體分子前驅物之步驟； (c) 在前述改變單域抗體與前述類IgG抗體分子前驅物之恆定區之交界附近導入蛋白酶切斷序列之步驟。 (72) 如(64)記載之製造方法，包括下列步驟： (a) 將單域抗體中之涉及與抗體VH之締合之胺基酸殘基置換、或將單域抗體中之涉及與抗體VL之締合之胺基酸殘基置換，製作保持該單域抗體對於目標抗原之結合活性之改變單域抗體之步驟； (b) 以抑制(a)步驟製作之改變單域抗體之抗原結合活性之方式，使該改變單域抗體介隔蛋白酶切斷序列而與IgG抗體之重鏈恆定區連結，或使該改變單域抗體介隔蛋白酶切斷序列而與IgG抗體之輕鏈恆定區連結，形成導入了該改變單域抗體之該類IgG抗體分子之步驟。 (73) 如(70)至(72)中任一項記載之製造方法，更包括下列步驟： (d) 確認已導入到前述類IgG抗體分子或前述類IgG抗體分子前驅物之前述改變單域抗體對於前述目標抗原之結合活性減弱或喪失。 (74) 如(70)至(73)中任一項記載之製造方法，更包括下列步驟： (e) 確認藉由將前述蛋白酶切斷序列以蛋白酶予以切斷而使前述改變單域抗體游離，游離的改變單域抗體結合於前述目標抗原之步驟。 (75) 一種聚核苷酸，編碼如(1)至(56)中任一項記載之多胜肽。 (76) 一種載體，含有如(75)記載之聚核苷酸。 (77) 一種寄主細胞，含有如(75)記載之聚核苷酸或如(76)記載之載體。 (78) 一種製造如(1)至(56)中任一項記載之多胜肽之方法，包括培養如(77)記載之寄主細胞之步驟。 (79) 一種單域抗體之篩選方法，係藉由與特定的VL締合、或藉由與特定的VH締合、或藉由與特定的VHH締合，而篩選抗原結合活性受抑制之單域抗體。 (80) 如(79)記載之篩選方法，係藉由與特定的VL締合而篩選抗原結合活性受抑制之單域抗體。 (81) 如(80)記載之篩選方法，包括下列步驟： (a) 取得有目標抗原結合活性之單域抗體之步驟； (b) 使於(a)步驟取得之單域抗體與特定的VL締合之步驟； (c) 確認於(b)步驟與特定的VL締合而得的前述單域抗體對於前述抗原之結合活性相較於締合前減弱、或喪失之步驟。 (82) 如(80)記載之篩選方法，包括下列步驟： (a) 使單域抗體與特定的VL締合之步驟； (b) 選擇(a)步驟中與特定的VL締合而得的前述單域抗體的對於前述抗原沒有結合活性或為一定値以下的VL與單域抗體的締合體之步驟； (c) 確認(b)步驟選出的締合體中之單域抗體在未與前述特定的VL締合之狀態的對於前述抗原之結合活性相較於締合時增強之步驟。 (83) 如(79)記載之篩選方法，係藉由與特定的VH締合而篩選抗原結合活性受抑制之單域抗體。 (84) 如(83)記載之篩選方法，包括下列步驟： (a) 取得有目標抗原結合活性之單域抗體之步驟； (b) 使於(a)步驟取得之單域抗體與特定的VH締合之步驟； (c) 確認於(b)步驟中與特定的VH締合而得之前述單域抗體的對於前述抗原之結合活性相較於締合前減弱、或喪失之步驟。 (85) 如(83)記載之篩選方法，包括下列步驟： (a) 使單域抗體與特定的VH締合之步驟； (b) 選擇於(a)步驟與特定的VH締合而得的前述單域抗體對於前述抗原無結合活性或為一定値以下的VH與單域抗體的締合體之步驟； (c) 確認(b)步驟選出的締合體中之單域抗體於未與前述特定的VH締合之狀態對於前述抗原之結合活性相較於締合時增強之步驟。 (86) 如(79)記載之篩選方法，係藉由與特定的VHH締合而篩選抗原結合活性受抑制之單域抗體。 (87) 如(86)記載之篩選方法，包括下列步驟： (a) 取得有目標抗原結合活性之單域抗體之步驟； (b) 使於(a)步驟取得之單域抗體與特定的VHH締合之步驟； (c) 確認於(b)步驟與特定的VHH締合而得的前述單域抗體對於前述抗原之結合活性相較於締合前減弱或喪失之步驟。 (88) 如(86)記載之篩選方法，包括下列步驟： (a) 使單域抗體與特定的VHH締合之步驟； (b) 選擇於(a)步驟與特定的VHH締合而得的前述單域抗體對於前述抗原無結合活性或為一定値以下之VHH與單域抗體之締合體之步驟； (c) 確認(b)步驟選擇出之締合體中之單域抗體在未和前述特定的VHH締合之狀態對於前述抗原之結合活性相較於締合時增強之步驟。 (89) 一種單域抗體之製造方法，係藉由與特定的VL締合、或藉由與特定的VH締合、或藉由與特定的VHH締合，而抗原結合活性受抑制。 (90) 如(89)記載之製造方法，係製造藉由與特定的VL締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體。 (91) 如(90)記載之製造方法，包括下列步驟： (a)將單域抗體中之涉及與抗體VL之締合之胺基酸殘基置換，製作保持該單域抗體對於目標抗原之結合活性之改變單域抗體之步驟。 (92) 如(91)記載之製造方法，更包括下列步驟： (b) 使於(a)步驟製作之改變單域抗體與前述VL締合之步驟； (c) 確認與該VL締合而得之前述改變單域抗體之抗原結合活性相較於締合前減弱或喪失之步驟。 (93) 如(89)記載之製造方法，製造藉由與特定的VH締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體。 (94) 如(93)記載之製造方法，包括下列步驟： (a) 將單域抗體中之涉及與類IgG抗體分子之VH之締合之胺基酸殘基置換，製作保持該單域抗體對於目標抗原之結合活性之改變單域抗體之步驟。 (95) 如(94)記載之製造方法，更包括下列步驟： (b) 使於(a)步驟製作之改變單域抗體與前述VH締合之步驟； (c) 確認與該VH締合而得之前述改變單域抗體之抗原結合活性相較於締合前減弱或喪失之步驟。 (96) 如(89)記載之製造方法，製造藉由與特定的VHH締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體。 (97) 如(96)記載之製造方法，包括下列步驟： (a) 將單域抗體中之涉及與VHH之締合之胺基酸殘基置換，製作保持該單域抗體對於目標抗原之結合活性之改變單域抗體之步驟。 (98) 如(97)記載之製造方法，更包括下列步驟： (b) 使於(a)步驟製作之改變單域抗體與前述VHH締合之步驟； (c) 確認與該VHH締合之前述改變單域抗體之抗原結合活性相較於締合前減弱或喪失之步驟。 (99)一種資料庫，含有多數使單域抗體與第1締合支持域連結而得之融合多胜肽之資料庫，前述單域抗體包括:藉由與特定的VL締合而抗原結合活性受抑制或喪失之單域抗體、或藉由與特定的VH締合而抗原結合活性受抑制或喪失之單域抗體、或藉由與特定的VHH締合而抗原結合活性受抑制或喪失之單域抗體。 (100) 如(99)記載之資料庫，其中，前述資料庫中之融合多胜肽之單域抗體部分，係從駱駝科動物或導入了能生產單域抗體之基因之基因轉殖動物取得的單域抗體或其人源化抗體、或藉由對於駱駝科動物或導入了能生產單域抗體之基因之基因轉殖動物進行免疫而取得之單域抗體或其人源化抗體、或從人源抗體VH或VL出發而人工製作之單域抗體。 (101) 如(99)或(100)記載之資料庫，含有多數使單域抗體與第1締合支持域連結而得的融合多胜肽，前述單域抗體含有藉由與特定的VL締合而抗原結合活性受抑制或喪失之單域抗體。 (102) 如(99)或(100)記載之資料庫，含有多數使單域抗體與第1締合支持域連結而得的融合多胜肽，前述單域抗體含有藉由與特定的VH締合而抗原結合活性受抑制或喪失之單域抗體。 (103) 如(99)或(100)記載之資料庫，含有多數使單域抗體與第1締合支持域連結而得的融合多胜肽，前述單域抗體包括藉由與特定的VHH締合而抗原結合活性受抑制或喪失之單域抗體。 (104) 一種融合多胜肽之篩選方法，係從(99)或(100)記載之資料庫篩選含有藉由與特定的VL締合而抗原結合活性受抑制或喪失之單域抗體、或藉由與特定的VH締合而抗原結合活性受抑制或喪失之單域抗體、或藉由與特定的VHH締合而抗原結合活性受抑制或喪失之單域抗體之融合多胜肽。 (105) 一種篩選融合多胜肽之方法，係從(101)記載之資料庫篩選含有藉由與特定的VL締合而抗原結合活性受抑制或喪失之單域抗體之融合多胜肽。 (106) 如(105)記載之篩選方法，包括下列步驟： (a) 使前述資料庫之融合多胜肽於試管內(in vitro)呈現之步驟； (b) 準備由特定的VL與第2締合支持域融合成的締合夥伴之步驟； (c) 使於(a)步驟呈現之融合多胜肽及於(b)步驟準備的締合夥伴締合，選擇單域抗體與前述VL締合的狀態時不與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以下的融合多胜肽之步驟； (d) 從(c)步驟選出的融合多胜肽，選擇所含之單域抗體與前述VL不締合之狀態時會與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上之融合多胜肽之步驟。 (107) 如(106)記載之篩選方法，其中，前述(b)步驟準備的締合伙伴更含有蛋白酶切斷序列，前述(d)步驟中，利用蛋白酶處理將前述締合伙伴切斷，使前述單域抗體與前述VL之締合解除。 (108) 如(107)記載之篩選方法，其中，前述(b)步驟準備的締合夥伴的前述蛋白酶切斷序列，位在前述特定的VL與前述第2締合支持域之交界附近。 (109) 如(106)記載之篩選方法，其中，前述資料庫之融合多胜肽更含有蛋白酶切斷序列，前述(d)步驟中利用蛋白酶處理將前述融合多胜肽切斷，使前述單域抗體與前述VL締合解除。 (110) 如(109)記載之篩選方法，其中，前述融合多胜肽中含有的蛋白酶切斷序列位在前述單域抗體與前述第1締合支持域之交界附近。 (111) 如(106)記載之篩選方法，其中，前述(d)步驟中，使於前述(c)步驟選出的融合多胜肽的全長或含單域抗體之部分再度於試管內(in vitro)呈現。 (112) 如(106)記載之篩選方法，其中，前述(d)步驟中，使於前述(c)步驟選擇之融合多胜肽之全長再度於試管內(in vitro)呈現，選擇僅與第2締合支持域締合之狀態會與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上的融合多胜肽。 (113) 一種融合多胜肽之篩選方法，係從(102) 記載之資料庫篩選含有藉由與特定的VH締合而抗原結合活性受抑制或喪失之單域抗體之融合多胜肽。 (114) 如(113)記載之篩選方法，包括下列步驟： (a) 使前述資料庫之融合多胜肽於試管內(in vitro)呈現之步驟； (b) 準備特定的VH與第2締合支持域融合成的締合夥伴之步驟； (c) 使於(a)步驟呈現之融合多胜肽與於(b)步驟準備的締合夥伴締合，選擇單域抗體與前述VH締合之狀態不與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以下之融合多胜肽之步驟； (d) 從(c)步驟選出的融合多胜肽，選出所含之單域抗體在不與前述VH締合之狀態會與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上之融合多胜肽之步驟。 (115) 如(114)記載之篩選方法，於前述(b)步驟準備的締合夥伴更含有蛋白酶切斷序列，前述(d)步驟中，藉由蛋白酶處理將前述締合夥伴切斷，使前述單域抗體與前述VH之締合解除。 (116) 如(115)記載之篩選方法，其中，前述(b)步驟準備的締合夥伴的前述蛋白酶切斷序列位在前述特定的VH與前述第2締合支持域之交界附近。 (117) 如(114)記載之篩選方法，其中，前述資料庫之融合多胜肽更含有蛋白酶切斷序列，前述(d)步驟利用蛋白酶處理將前述融合多胜肽切斷，使前述單域抗體與前述VH締合解除。 (118) 如(117)記載之篩選方法，其中，前述融合多胜肽中含有的蛋白酶切斷序列位在前述單域抗體與前述第1締合支持域之交界附近。 (119) 如(114)記載之篩選方法，其中，前述(d)步驟中，使於前述(c)步驟選出的融合多胜肽之全長或含單域抗體之部分再度於試管內(in vitro)呈現。 (120) 如(114)記載之篩選方法，其中，前述(d)步驟中，使於前述(c)步驟選出的融合多胜肽的全長再度於試管內(in vitro)呈現，選出於僅與第2締合支持域締合之狀態會與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上之融合多胜肽。 (121) 一種融合多胜肽之篩選方法，包括從(103) 記載之資料庫篩選含有藉由與特定的VHH締合而抗原結合活性受抑制或喪失之單域抗體之融合多胜肽。 (122) 如(121)記載之篩選方法，包括下列步驟： (a) 使前述資料庫之融合多胜肽於試管內(in vitro)呈現之步驟； (b) 準備特定的VHH與第2締合支持域融合成之締合夥伴之步驟； (c) 使於(a)步驟呈現之融合多胜肽與於(b)步驟準備的締合夥伴締合，選擇在單域抗體與前述特定的VHH締合之狀態不與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以下之融合多胜肽之步驟； (d) 從(c)步驟選出的融合多胜肽，選出在含有的單域抗體在不與前述VHH締合狀態會與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上之融合多胜肽之步驟。 (123) 如(122)記載之篩選方法，其中，前述(b)步驟準備的締合夥伴更含有蛋白酶切斷序列，於前述(d)步驟，藉由蛋白酶處理將前述締合夥伴予以切斷，使前述單域抗體與前述VHH之締合解除。 (124) 如(123)記載之篩選方法，其中，於前述(b)步驟準備的締合夥伴的前述蛋白酶切斷序列位在前述特定的VHH與前述第2締合支持域之交界附近。 (125) 如(122)記載之篩選方法，其中，前述資料庫之融合多胜肽更含有蛋白酶切斷序列，前述(d)步驟藉由蛋白酶處理將前述融合多胜肽予以切斷，使前述單域抗體與前述VHH之締合解除。 (126) 如(125)記載之篩選方法，其中，前述融合多胜肽中含有的蛋白酶切斷序列位在前述單域抗體與前述第1締合支持域之交界附近。 (127) 如(122)記載之篩選方法，其中，前述(d)步驟中，使於前述(c)步驟選出的融合多胜肽的全長或含單域抗體之部分再度於試管內(in vitro)呈現。 (128) 如(122)記載之篩選方法，其中，於前述(d)步驟使於前述(c)步驟選出的融合多胜肽的全長再度於試管內(in vitro)呈現，選擇僅與第2締合支持域締合之狀態會與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上之融合多胜肽。 (129) 如(106)至(112)、(114)至(120)、(122)至(128)中任一項記載之篩選方法，其中，前述(b)步驟中之準備締合夥伴之步驟，係使締合夥伴與融合多胜肽同時呈現之步驟。 (130) 如(99)至(103)中任一項記載之資料庫，其中，前述第1締合支持域含有IgG抗體CH1域或抗體輕鏈恆定區。 (131) 如(106)至(112)、(114)至(120)、(122)至(128)中任一項記載之篩選方法，其中，前述第1締合支持域含有IgG抗體CH1域，前述第2締合支持域含有抗體輕鏈恆定區。 (132) 如(106)至(112)、(114)至(120)、(122)至(128)中任一項記載之篩選方法，其中，前述第1締合支持域含有抗體輕鏈恆定區，前述第2締合支持域含有IgG抗體CH1域。 (133) 如(105)記載之篩選方法，包括下列步驟： (a) 使前述資料庫之融合多胜肽於試管內(in vitro)呈現之步驟； (b) 準備特定的VL與第2締合支持域融合成之締合夥伴之步驟； (c) 選擇前述融合多胜肽中含有的單域抗體會與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上之融合多胜肽之步驟； (d) 使於(c)步驟選出的融合多胜肽與於(b)步驟準備的締合夥伴締合，選出單域抗體與前述VL締合之狀態不與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以下之融合多胜肽之步驟。 (134) 如(129)記載之篩選方法，其中，前述(d)步驟使於前述(c)步驟選出的融合多胜肽再度於試管內(in vitro)呈現。 (135) 如(133)記載之篩選方法，其中，前述(c)步驟確認前述融合多胜肽僅與第2締合支持域締合、或融合多胜肽僅與第2締合支持域締合之狀態時融合多胜肽中含有的單域抗體之抗原結合。 (136) 如(113)記載之篩選方法，包括下列步驟： (a) 使前述資料庫之融合多胜肽於試管內(in vitro)呈現之步驟； (b) 準備特定的VH與第2締合支持域融合成之締合夥伴之步驟； (c) 選擇前述融合多胜肽中含有的單域抗體會與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上之融合多胜肽之步驟； (d) 使(c)步驟選出之融合多胜肽與於(b)步驟準備的締合夥伴締合，選擇在單域抗體與前述VH締合之狀態不與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以下之融合多胜肽之步驟。 (137) 如(136)記載之篩選方法，其中，於前述(d)步驟使於前述(c)步驟選出的融合多胜肽再度於試管內(in vitro)呈現。 (138) 如(136)記載之篩選方法，其中，前述(c)步驟中確認前述融合多胜肽僅與第2締合支持域締合、或融合多胜肽僅與第2締合支持域締合之狀態，融合多胜肽中含有的單域抗體之抗原結合。 (139) 如(121)記載之篩選方法，包括下列步驟： (a) 使前述資料庫之融合多胜肽於試管內(in vitro)呈現之步驟； (b) 準備特定的VHH與第2締合支持域融合成之締合伙伴之步驟； (c) 選擇前述融合多胜肽中含有的單域抗體會與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上之融合多胜肽之步驟； (d) 使於(c)步驟選出的融合多胜肽與於(b)步驟準備的締合夥伴締合，選擇在單域抗體與前述VHH締合之狀態不與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以下之融合多胜肽之步驟。 (140) 如(139)記載之篩選方法，其中，於前述(d)步驟，使於前述(c)步驟選出的融合多胜肽再度於試管內(in vitro)呈現。 (141) 如(139)記載之篩選方法，其中，前述(c)步驟中，確認前述融合多胜肽僅與第2締合支持域締合、或融合多胜肽僅與第2締合支持域締合之狀態時，融合多胜肽中含有的單域抗體之抗原結合。 (142) 如(133)至(141)中任一項記載之篩選方法，其中，前述(d)步驟中之使融合多胜肽與締合夥伴締合之步驟係使締合夥伴與融合多胜肽同時呈現之步驟。 (143) 如(133)至(142)中任一項記載之篩選方法，其中，前述第1締合支持域含有IgG抗體CH1域，前述第2締合支持域含有抗體輕鏈恆定區。 (144) 如(133)至(142)中任一項記載之篩選方法，其中，前述第1締合支持域含有抗體輕鏈恆定區，前述第2締合支持域含有IgG抗體CH1域。
本發明中，多胜肽通常係指有4個胺基酸左右以上之長度之胜肽、及蛋白質。又，本發明中，多胜肽通常係由人工設計的序列構成的多胜肽，但不特別限定，例如也可為生物來源的多胜肽。又，也可以是天然多胜肽、或合成多胜肽、重組多胜肽等中任一者。再者，上述多胜肽之斷片也包括在本發明之多胜肽。
本說明書中，例如以Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V表示之方式，胺基酸以單字母碼或3字母碼、或其兩者表示記載。當表達位在特定位置的胺基酸時，可適用使用將表達特定位置之數字與胺基酸之單字母碼或3字母碼併記的表達。例如，單域抗體中含有的胺基酸37V這樣的胺基酸，係代表位在Kabat編號表示之37位位置的Val。
為了改變多胜肽之胺基酸序列中之胺基酸，可適當採用部位專一的變異誘發法(Kunkel等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))、Overlap extension PCR等公知方法。又，作為置換成天然胺基酸以外之胺基酸的胺基酸改變方法，也有多數個公知方法可採用 (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357)。例如:含有終止碼之一即UAG密碼子 (Amber codon)的互補amber suppressor tRNA結合了非天然胺基酸而得的tRNA無細胞轉譯系系統(Clover Direct(Protein Express))等亦為佳。本說明書中，改變可列舉置換，但不限定於此。
本說明書中，表示胺基酸之改變部位時使用之「及/或」之用語之意義，包括「及」與「或」適當組合的各種組合。具體而言，例如「37號、45號、及/或47號之胺基酸經置換」，包括以下胺基酸之改變的變化形； (a) 37號、(b)45號、(c)47號、(d) 37號及45號、(e) 37號及47號、(f) 45號及47號、(g) 37號及45號及47號。
本說明書中，又，就表達胺基酸改變的方式，可適當使用在代表特定位置的數字前後加註改變前與改變後之胺基酸之單字母碼或3字母碼的表達方式。例如，於抗體可變區或單域抗體所含之胺基酸施加置換時使用之F37V或Phe37Val這類改變，代表Kabat編號表示之37位之Phe置換成Val。亦即，數字代表Kabat編號表示之胺基酸位置，於其前記載之胺基酸之單字母碼或3字母碼代表置換前之胺基酸、其後記載之胺基酸之單字母碼或3字母碼代表置換後之胺基酸。同樣，對於抗體恆定區所含之Fc區施加胺基酸置換時使用的P238A或Pro238Ala這類改變，表示EU編號表示之238位之Pro置換為Ala。亦即，數字代表EU編號表示之胺基酸位置，在其前記載之胺基酸之單字母碼或3字母碼代表置換前之胺基酸，其後記載之胺基酸之單字母碼或3字母碼代表置換後的胺基酸。
本說明書，用語「抗體」係以最廣的含意使用，只要能顯示所望的抗原結合活性即可，並不限於此等，包括單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如:雙特異性抗體)、單域抗體、及抗體斷片各種抗體結構。
「抗體斷片」係指包括會和完整抗體所結合之抗原結合之該完整抗體之一部分的該完全抗體以外之分子。抗體斷片之例不僅限於此，包括Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、雙體抗體(diabody)、線狀抗體、單鏈抗體分子(例如:scFv)、及由抗體斷片形成之多特異性抗體。
用語「全長抗體」、「完整抗體」、及「全部抗體」，在本說明書可交互替代，係指有實質類似天然型抗體結構的結構、或具有包含在本說明書定義之Fc區域之重鏈之抗體。
用語「可變區」或「可變域」，係指涉及使抗體結合於抗原之抗體之重鏈或輕鏈之域。抗體之重鏈及輕鏈之可變域(各為VH及VL)，通常各域有4個保守的框架區 (FR) 及3個互補性決定區 (CDR) 的類似結構。(例如參照Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)。)能以1個VH或VL域給予充分的抗原結合特異性。
本說明書使用之用語「互補性決定區」或「CDR」，係指序列為超可變，及/或形成結構上指定的圈環(loop)(「超可變圈環(loop)」)、及/或抗原接觸殘基(「抗原接觸」)、抗體之可變域之各區。通常抗體包括6個CDR：3個VH (H1、H2、H3)、及3個VL(L1、L2、L3)。本說明書之例示的CDR包括下列者： (a) 胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、及96-101 (H3)之處產生的超可變圈環(loop) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))； (b) 胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 及95-102 (H3) 之處產生的CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))； (c) 胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、及93-101 (H3) 之處產生的抗原接觸 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；及、 (d)包括 HVR胺基酸殘基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、及94-102 (H3)之(a)、(b)、及/或(c)之組合。 若無特別限定，CDR殘基及可變域中之其他殘基(例如:FR殘基)，在本說明書係依照上述Kabat等人賦予編號。
「框架」或「FR」，係指互補性決定區(CDR)殘基以外之可變域殘基。可變域之FR，通常由4個FR分域：FR1、FR2、FR3、及FR4構成。因應此， CDR及FR之序列通常依下列順序出現在VH(或VL)：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
本說明書中，用語「恆定區」或「恆定域」係指抗體之可變區以外之部分。例如，IgG抗體，係以雙硫鍵鍵結的2個相同輕鏈與2個相同重鏈構成的約150,000道爾吞的雜四聚物糖蛋白，從N末端朝C末端，各重鏈具有也稱為可變重鏈域或重鏈可變域的可變區 (VH)，然後是含有CH1域、鉸鏈區、CH2域、CH3域之重鏈恆定區(CH)。同樣，從N末端朝C末端，各輕鏈具有也稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域之可變區 (VL)，然後是固定輕鏈(CL)域。天然型抗體之輕鏈，可依據其恆定域之胺基酸序列，歸屬在稱為kappa(κ)及lamda (λ)之2類型中之1個類型。
本說明書中，用語「Fc區」係為了要定義至少含有恆定區之一部分之免疫球蛋白重鏈之C末端區。此用語包括天然型序列Fc區及變異體Fc區。一實施態樣中，人類IgG1的情形，重鏈Fc區從Cys226、或從Pro230，延伸到重鏈的羧基末端。惟Fc區之C末端之離胺酸 (Lys447) 或甘胺酸‐離胺酸(Gly446-Lys447)可存在亦可不存在。本說明書中，若無特別限制，則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係依Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 記載之EU編號系統(也稱為EU索引)。
抗體的「類別」，係指抗體之重鏈所具備的恆定域恆定區的類型。抗體有5個主要的類別：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM。並且其中有一些更進一步可區分成次類別(isotype)。例如:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及IgA2。不同類別的免疫球蛋白所對應的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ、及μ。
本說明書中，「抗原結合域」係限於和作為目的之抗原結合。抗原結合域只要能與作為目的之抗原結合即可，任意結構域皆可使用。如此的域，例如但不限於抗體之重鏈可變區(VH)與抗體之輕鏈可變區(VL)、單域抗體(sdAb)、生物體內存在之細胞膜蛋白質Avimer所含之約35個胺基酸之稱為A分域之模組(WO2004/044011、WO2005/040229)、包含於細胞膜表現之糖蛋白質fibronectin中之蛋白質所結合之域10Fn3分域之Adnectin(WO2002/032925)、以構成由ProteinA之58個胺基酸構成的3個螺旋束(bundle)的IgG結合分域為支架(scaffold)的Affibody(WO1995/001937)、具含33個胺基酸殘基之轉彎(turn)與2個反向並行之螺旋以及迴圈的次單元返覆層疊的構造的ankyrin返覆(ankyrin repeat：AR)之分子表面所露出之區DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(國際公開WO2002/020565)、將嗜中性球明膠酶結合lipocalin (neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等lipocalin分子中高度保守的8個反向並行的股中央方向扭曲成的活塞桶(barrel)構造的單側予以支撐的4個迴圈區Anticalin等(國際公開WO2003/029462)、就八目鰻、沼田鰻等無顎類之獲得免疫系統而言不具免疫球蛋白之構造的可變性淋巴球受體(variable lymphocyte receptor(VLR))之富含白胺酸殘基之返覆(leucine-rich-repeat(LRR))模組返覆疊層而獲得之馬蹄形構造之內部之平行型片構造之中空區(國際公開WO2008/016854)。
本發明之抗原結合域之較佳例可列舉，僅該抗原結合域構成之分子便能發揮抗原結合機能之抗原結合域、從連結之其他胜肽游離後單獨可發揮抗原結合機能之抗原結合域等。如此的抗原結合域，例如但不限於單域抗體、scFv、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2等。
本發明之抗原結合域之佳例之一，可列舉分子量60kDa以下之抗原結合域。如此的抗原結合域，例如但不限於單域抗體、scFv、Fab、Fab'。分子量為60kDa以下之抗原結合域通常以單體形式存在於血中時，利用腎臓廓清的可能性高(參照J Biol Chem. 1988 Oct 15;263(29):15064-70)。 由其他觀點，本發明之抗原結合域之佳例之一可列舉血中半衰期為12小時以下之抗原結合域。如此的抗原結合域，例如但不限於單域抗體、scFv、Fab、Fab'等。
本發明之抗原結合域之一較佳例可列舉單域抗體(sdAb)。
本說明書中，用語「單域抗體」只要其域單獨即可發揮抗原結合活性即可，其結構不限定。IgG抗體等例示之通常之抗體、VH與VL之配對而形成可變區之狀態會顯示抗原結合活性，相對於此，單域抗體不與其他分域配對，已知單域抗體本身的分域結構即單獨可發揮抗原結合活性。單域抗體為通常有較低分子量，以單體之形態存在。 單域抗體，例如但不限於含有駱駝科之動物之VHH、鯊之V NAR之類的先天欠缺輕鏈的抗原結合分子、或含有抗體之VH域全部或一部分或VL域全部或一部分之抗體斷片。含有抗體之VH/VL域全部或一部分之抗體斷片即單域抗體，例如但不限於美國專利第6,248,516號B1等記載之人類抗體VH或人類抗體VL為出發，人工製作的單域抗體。本發明之一些實施態樣中，1個單域抗體具有3個CDR(CDR1、CDR2及CDR3)。 單域抗體可藉由從可產生單域抗體之動物、或將可產生單域抗體之動物進行免疫而取得。可產生單域抗體之動物，例如但不限於駱駝科動物、導入了可產生單域抗體之基因之基因轉殖動物(transgenic animals)。駱駝科動物包括駱駝、駱馬、羊駝、一瘤駱駝與原駝等。作為導入了能產生單域抗體之基因之基因轉殖動物，例如但不限於國際公開WO2015/143414號、美國專利公開US2011/0123527號A1記載之基因轉殖動物。藉由從動物取得之單域抗體之框架序列為人類生殖系序列或與其類似的序列，也可取得人源化的單域抗體。人源化的單域抗體(例如:人源化VHH)亦為本發明之單域抗體之一實施態樣。 又，單域抗體可由含有單域抗體之多胜肽資料庫，利用ELISA、淘選等以取得。含有單域抗體之多胜肽資料庫，例如但不限於從各種動物或人類取得之天然抗體資料庫(例：Methods in Molecular Biology 2012 911 (65-78)、Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 2006 1764:8 (1307-1319))、對於各種動物免疫以取得之抗體資料庫(例：Journal of Applied Microbiology 2014 117:2 (528-536))、或由各種動物或人類之抗體基因作成之合成抗體資料庫(例：Journal of Biomolecular Screening 2016 21:1 (35-43)、Journal of Biological Chemistry 2016 291:24 (12641-12657)、AIDS 2016 30:11 (1691-1701))。
本說明書中，「抗原」僅由含有抗原結合域所結合之抗原決定基。抗原之較佳例不僅限於例如:來自動物或人類之胜肽、多胜肽、蛋白質。由目標組織起因的適合用於治療病症使用的抗原，較佳例不限於例如:目標細胞(例：癌細胞、發炎細胞)之表面表現之分子、在含有目標細胞之組織中之其他細胞表面表現之分子、對於目標細胞與含有目標細胞之組織有免疫學作用之細胞之表面表現之分子、存在於含有目標細胞之組織之間質中的大分子等。
抗原可列舉如以下分子:17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-異-PGF2a、8-側氧基-dG、A1 腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、活化素(activin)、活化素A、活化素AB、活化素B、活化素C、活化素RIA、活化素RIA ALK-2、活化素RIB ALK-4、活化素RIIA、活化素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、位址素(Addressin)、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、Alpha -1-抗胰蛋白酶(antitrypsin)、Alpha -V/Beta -1拮抗劑、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房性鈉利尿因子、av/b3整合素、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴球刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3 成骨素(Osteogenin)、BMP-4 BMP-2b、BMP-5、BMP-6 Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、鈴蟾素(Bombesin)、骨來源神經營養因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補體因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、抑血鈣素(Calcitonin)、cAMP、癌胎兒性抗原(CEA)、癌關連抗原、細胞自溶酶(cathepsin) A、細胞自溶酶B、細胞自溶酶C/DPPI、細胞自溶酶D、細胞自溶酶E、細胞自溶酶H、細胞自溶酶L、細胞自溶酶O、細胞自溶酶S、細胞自溶酶V、細胞自溶酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白質)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒桿菌毒素、產氣莢膜梭菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、PD1、PDL1、LAG3、TIM3、galectin-9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、細胞角蛋白腫瘤關連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補體控制因子(Decay accelerating factor)、des(1-3)-IGF-I(腦IGF-1)、Dhh、地穀新(Digoxin)、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、內皮受體、腦啡肽酶(Enkephalinase)、eNOS、Eot、伊紅趨素(Eotaxin)1、EpCAM、EphrinB2/EphB4、EPO、ERCC、E-選擇蛋白(selectin)、ET-1、第IIa因子、第VII因子、第VIIIc因子、第IX因子、纖維母細胞活化蛋白質(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、鐵蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纖維蛋白(Fibrin)、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵泡刺激激素、Fractalkine、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(myostatin)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-Alpha 1、GFR-Alpha 2、GFR-Alpha 3、GITR、升糖素、Glut4、糖蛋白質IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、成長激素釋放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB外膜糖蛋白質、HCMV gH外膜糖蛋白質、HCMV UL、造血成長因子(HGF)、Hep B gp120、肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、單純皰疹病毒(HSV) gB糖蛋白質、HSV gD糖蛋白質、HGFA、高分子量黑色素腫瘤關連抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3迴圈、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人類心肌肌凝蛋白、人類細胞巨大病毒(HCMV)、人類成長激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受體、IgE、IGF、IGF結合蛋白質、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-21、IL-23、IL-27、幹擾素(INF)-Alpha 、INF-Beta 、INF-gamma、抑制素(inhibin)、iNOS、胰島素A鏈、胰島素B鏈、類胰島素增殖因子1、整合素Alpha 2、整合素Alpha 3、整合素Alpha 4、整合素Alpha 4/Beta 1、整合素Alpha 4/Beta 7、整合素Alpha 5(Alpha V)、整合素Alpha 5/Beta 1、整合素Alpha 5/Beta 3、整合素Alpha 6、整合素Beta 1、整合素Beta 2、干擾素gamma、IP-10、I-TAC、JE、激肽釋放素2、激肽釋放素5、激肽釋放素6、激肽釋放素11、激肽釋放素12、激肽釋放素14、激肽釋放素15、激肽釋放素L1、激肽釋放素L2、激肽釋放素L3、激肽釋放素L4、KC、KDR、角質細胞生長因子(KGF)、laminin 5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潛在的TGF-1、潛在的TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、路易士-Y抗原、路易士-Y關連抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-選擇蛋白、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黃體形成激素、淋巴毒素Beta 受體、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受體、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-Alpha 、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、黏蛋白(Muc1)、MUC18、Muellerian管抑制物質、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-C adherin、NCA 90、NCAM、NCAM、Neprilysin、neurotrophin-3、-4、或-6、neurturin、神經成長因子(NGF)、NGFR、NGF-Beta 、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲狀腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-Cadherin、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤性鹼性磷解酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰島素前體、prorelaxin、Protein C、PS、PSA、PSCA、前列腺專一膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、relaxin A鏈、relaxin B鏈、腎活素(renin)、呼吸器多核體病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、類風濕性因子(Rheumatoid factor)、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(腫瘤關連糖蛋白質-72)、TARC、TCA-3、T細胞受體(例如:T細胞受體Alpha /Beta )、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP狀鹼性磷解酶、TfR、TGF、TGF-Alpha 、TGF-Beta 、TGF-Beta  Pan Specific、TGF-Beta RI(ALK-5)、TGF-Beta RII、TGF-Beta RIIb、TGF-Beta RIII、TGF-Beta 1、TGF-Beta 2、TGF-Beta 3、TGF-Beta 4、TGF-Beta 5、凝血酶、胸腺Ck-1、甲狀腺刺激激素、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-Alpha 、TNF-Alpha Beta 、TNF-Beta 2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配體、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配體 ODF、OPG配體)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配體、DR3配體)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配體、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配體 AITR配體、TL6)、TNFSF1A(TNF-a Conectin (Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配體 gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配體 CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配體 Apo-1配體、APT1配體)、TNFSF7(CD27配體 CD70)、TNFSF8(CD30配體 CD153)、TNFSF9(4-1BB配體 CD137配體)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、運鐵蛋白受體、TRF、Trk、TROP-2、TLR(Toll-like receptor)1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TSG、TSLP、腫瘤關連抗原CA125、腫瘤關連抗原表現路易士Y關連碳水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-Cadherin、VE-cadherin-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素、von Willebrand因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、 CD97、 CD98、 DDR1、 DKK1、 EREG、Hsp90、 IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、 PCSK9、 prekallikrein 、 RON、 TMEM16F、SOD1、 Chromogranin A、 Chromogranin B、tau、 VAP1、高分子Kininogen、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、 C1q、 C1r、 C1s、 C2、 C2a、 C2b、 C3、 C3a、 C3b、 C4、 C4a、C4b、 C5、 C5a、 C5b、 C6、 C7、 C8、 C9、 factor B、factor D、 factor H、 properdin、sclerostin、fibrinogen、 fibrin、 prothrombin、thrombin、 組織因子、 factor V, factor Va、 factor VII、factor VIIa、 factor VIII、 factor VIIIa、 factor IX、 factor IXa、 factor X、 factor Xa、 factor XI、 factor XIa、 factor XII、 factor XIIa、 factor XIII、 factor XIIIa、 TFPI、 antithrombin III、 EPCR、 thrombomodulin、TAPI, tPA、 plasminogen、plasmin、 PAI-1, PAI-2、GPC3、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、LPA、S1P以及激素及成長因子用的受體。
上述抗原例示也有記載受體，該等受體係即使於活體體液中以可溶型存在的情形，仍可使用作為本發明之抗原結合域所結合的抗原。如此之可溶型受體之一非限定態樣，例如:Mullberg等人類(J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968)之可溶型IL-6R，即由序列編號：35表示之蛋白質。
上述抗原之例示包括在細胞膜表現的膜型分子、及從細胞分泌到細胞外的可溶型分子。本發明之抗原結合域係結合於從細胞分泌之可溶型分子時，該抗原結合域宜為具有中和活性。
對可溶型分子所存在之溶液無限定，本可溶型分子能存在活體液，亦即填滿活體內之脈管或組織・細胞之間的所有液體。非限定之一態樣中，本發明之抗原結合域結合之可溶型分子，可存在於細胞外液。細胞外液，在脊椎動物係指血漿、組織間液、淋巴液、緻密的結締組織、腦脊髓液、髓液、穿刺液、或關節液等骨及軟骨中之成分、肺泡液(支氣管肺泡洗滌液)、腹水、胸水、心囊水、囊泡液、或眼房液(房水)等細胞穿透液(細胞之主動輸送・分泌活動之結果所產生的各種腺腔內的液體、及消化管腔等其他體腔內液)的總稱。
意指抗原中存在之抗原決定基之抗原決定部位，係指本說明書揭示之抗原結合域所結合之抗原上之部位。因此，例如，抗原決定部位可由其結構定義。又，該抗原決定部位也可由認識該抗原決定部位之抗原結合域中，對於抗原之結合活性定義。抗原為胜肽或多胜肽時，也可利用構成抗原決定部位之胺基酸殘基指定抗原決定部位。又，抗原決定部位為糖鏈時，也可利用特定糖鏈構造來指定抗原決定部位。
線狀抗原決定部位，係包含認識胺基酸一次序列的抗原決定部位的抗原決定部位。線狀抗原決定部位典型在固有序列中至少含有3個，且最普通為至少5個，例如約8至約10個，6至20個胺基酸。
立體抗原決定部位，與線狀抗原決定部位相對照，係指含有抗原決定部位之胺基酸之一次序列並非所認識之抗原決定部位之單一規定成分的抗原決定部位(例如，胺基酸之一次序列不一定由規定抗原決定部位之抗體所認識之抗原決定部位)。立體抗原決定部位，可能包含對於線狀抗原決定部位為更多之數之胺基酸。關於立體抗原決定部位之認識，抗原結合域認識胜肽或蛋白質之三維結構。例如，蛋白質分子折疊形成三維結構時，形成立體抗原決定部位之某個胺基酸及/或多胜肽主鏈，可以並排，抗體可認識抗原決定部位。決定抗原決定部位之立體結構之方法，包含例如X射線結晶學、二維核磁共振分光學及部位特異性旋轉標誌及電磁常磁性共振分光學，但不限於該等。例如參考:Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996)、第66卷、Morris(編)。
與抗原決定部位結合之抗原結合域之結構，稱為互補位(paratope)。利用在抗原決定部位與互補位之間作用之氫鍵、靜電力、凡得瓦力、疏水鍵等，使得抗原決定部位與互補位安定結合。此抗原決定部位與互補位間之結合力，稱為親和性(affinity)。複數個抗原與複數個抗原結合域結合時之結合力之總和，稱為結合性(avidity)。當包含複數個抗原結合域之(亦即多價之)抗體等結合於複數個抗原決定部位時，結合力(affinity)會相乘地作用，因此結合性高於親和性。
特定的實施態樣中，本說明書提供之抗原結合域，有≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM或≦0.001nM(例如:10 -8M以下，例如10 -8M~10 -13M，例如10 -9M~10 -13M)之解離常數 (Kd)。
以下例示含有對IL-6R之抗原結合域、或含有抗原結合域之多胜肽之對於抗原決定部位之結合的確認方法，但是含有對IL-6R以外之抗原的抗原結合域、或含有抗原結合域之多胜肽之對於抗原決定部位之結合的確認方法，也可依照下列例示適當實施。
例如，對IL-6R之抗原結合域會認識IL-6R分子中存在之線狀抗原決定部位之情事，例如可以如下方式確認。為了上述目的，合成由構成IL-6R之細胞外域之胺基酸序列所形成的線狀胜肽。該胜肽可由化學合成。或利用IL-6R之cDNA中之編碼為相當於細胞外分域之胺基酸序列之區域，以基因工程方法可獲得。其次，評價由構成細胞外分域之胺基酸序列所構成的線狀胜肽與針對IL-6R之抗原結合域間的結合活性。例如，利用已經固定化之線狀胜肽作為抗原之ELISA，可評價該抗原結合域對於該胜肽之結合活性。或，依據對IL-6R表現細胞中，該抗原結合域之結合時，由於線狀胜肽所致抑制的水平，可以明確獲得對於線狀胜肽之結合活性。利用該等試驗，可以明確獲得該抗原結合域對於線狀胜肽之結合活性。
又，針對IL-6R之抗原結合域是認識立體抗原決定部位之一事，可依以下方式確認。為了上述目的，製備表現IL-6R之細胞。例如當針對IL-6R之抗原結合域接觸IL-6R表現細胞時，對於該細胞強力結合，另一方面，該抗原結合域對於經固定化之由IL-6R之細胞外分域之胺基酸序列所構成的線狀胜肽、或該抗原結合域對於以胍等一般的變性劑變性而得的IL-6R的細胞外域的胺基酸序列構成的線狀胜肽實質上不結合時等。在此，實質上不結合，係指對於人類IL-6R表現細胞之結合活性之80%以下、通常為50%以下，較佳為30%以下，尤佳為15%以下之結合活性。
又，就確認抗原結合域之抗原結合活性之方法而言，例如有利用放射性標識抗原結合測定法 (radiolabeled antigen binding assay: RIA) 測定Kd値之方法。一實施態樣中，RIA係使用目的之抗原結合域及其抗原實施。例如，針對抗原之抗原結合域在溶液中結合親和性，可藉由於非標識抗原之漸增量系列存在下最小濃度之 (125I) 標識抗原使抗原結合域平衡化，然後將已結合之抗原以披覆抗原結合域的板捕捉以測定。(例如參照Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999))。
若依其他實施態樣，Kd係依使用了BIACORE(註冊商標)之表面電漿子共振法測定。例如使用BIACORE(註冊商標)-2000或BIACORE(註冊商標)-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 之測定法，係使用固定了約10反應單位 (response unit: RU) 之抗原之CM5晶片於25℃實施。一實施態樣中，羧基甲基化葡聚糖生物感測器晶片 (CM5、BIACORE, Inc.)係依供給商的指示，使用N-乙基-N'- (3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) 與N-羥基琥珀醯亞胺 (NHS)活化。在將抗原以和約10反應單位 (RU)之蛋白質達成結合的方式，以5μl/分之流速注入前，使用10mM乙酸鈉、pH4.8稀釋為5μg/ml(約0.2μM)。抗原注入後，為了阻斷未反應基，注入1M乙醇胺。為了測定動力學，在25℃、約25μl/分之流速，注入含有0.05% polysorbate 20(TWEEN-20(商標))界面活性劑之PBS (PBST) 中之抗原結合域之2倍階段稀釋物 (0.78nM~500nM)。結合速度 (kon) 與解離速度 (koff) ，係使用單純的1對1 Langmuir結合模型(BIACORE(註冊商標)評價軟體版本3.2)，將結合與解離之感測圖同時擬合以計算。平衡解離常數 (Kd) 係以koff/kon比的方式計算。再者，藉由使用平衡法解析，可求得表觀的解離常數(Kd)。該等方法係參照BIACORE(註冊商標)附帶的實驗手冊。例如參照Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) 、Methods Enzymol. 2000;323:325-40.。又，表面電漿子共振分析中，固相化之蛋白質量、反應使用之蛋白質量、溫度、溶液組成，只要是該技術領域中有通常知識者即可任意變更。上述表面電漿子共振分析時on速度超過10 6M -1s -1時，on速度可使用分光計(例如停止流式分光光度計 (Aviv Instruments) 或使用攪拌比色槽之8000系列的SLM-AMINCO(商標)分光光度計 (ThermoSpectronic))測定、測定於漸增濃度之抗原存在下之PBS、pH7.2中20nM之抗原結合域之25℃之螢光發光強度(激發=295nm；發光=340nm、條帶路徑16nm)之增加或減少之螢光消光技術決定。
又，抗原結合域之抗原結合活性可依電化學發光法等既知之分子間相互作用之測定方法測定。
測定針對IL-6R之抗原結合域對於IL-6R表現細胞之結合活性之方法，例如:Antibodies A Laboratory Manual記載之方法(Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420)。亦即，可利用以IL-6R表現細胞為抗原之ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting)之原理進行評價。
ELISA方式中，針對IL-6R之抗原結合分域的對於IL-6R表現細胞之結合活性，可利用比較酵素反應所生成之信號水平而進行定量評價。亦即，在將IL-6R表現細胞固定化之ELISA板添加待驗多胜肽締合體，利用認識待驗抗原結合域之酵素標記檢測結合於細胞之待驗抗原結合域。或FACS中，製作待驗抗原結合域之稀釋系列，決定對於IL-6R表現細胞之抗體結合力價(titer)，藉此可比較待驗抗原結合域對於IL-6R表現細胞之結合活性。
待驗抗原結合域對於在懸浮於緩衝液等之細胞表面上所表現之抗原之結合，可利用流式細胞計數器檢測。流式細胞計數器已知例如如下裝置 FACSCantoTM II FACSAriaTM FACSArrayTM FACSVantageTM SE FACSCaliburTM (皆是BD Biosciences公司商品名) EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500 EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC(皆為Beckman Coulter公司的商品名)
例如，針對IL-6R之抗原結合域的對於抗原之結合活性之較佳測定方法，例如以下方法。首先，以認識與表現IL-6R之細胞反應之待驗抗原結合域的經FITC標定的二次抗體染色。將待驗抗原結合域以適當適合的緩衝液稀釋，可將該抗原結合域調配成所望濃度。例如可使用10μg/ml至10 ng/ml之間的任一濃度。其次，以 FACSCalibur(BD公司)測定螢光強度及細胞數。抗體對於該細胞之結合量，反映於使用CELL QUEST 軟體(BD公司)解析所得之螢光強度，亦即幾何平均值(Geometric Mean)。亦即，藉由獲得該幾何平均之値，可測定待驗抗原結合域之結合量所代表之待驗抗原結合域之結合活性。
IL-6R之抗原結合域與某抗原結合域共有抗原決定部位之情事，可藉由兩者對於相同抗原決定部位之競爭而確認。抗原結合域間之競爭，可利用交叉阻斷試驗等檢測。例如競爭ELISA試驗(Competitive ELISA)為較佳的交叉阻斷試驗。
具體而言，交叉阻斷試驗中，將披覆在微滴定板之孔上的IL-6R蛋白質，於候選的競爭抗原結合域存在下或非存在下，進行預備溫育後，添加待驗抗原結合域。孔中之結合於IL-6R蛋白質之待驗抗原結合域之量，間接相關於對於相同抗原決定部位為競爭候選的競爭抗原結合域之結合能力。亦即，競爭抗原結合域對於相同抗原決定部位之親和性愈大，則待驗抗原結合域對於披覆有IL-6R蛋白質之孔的結合活性愈低。
經由IL-6R蛋白質而結合於孔之待驗抗原結合域之量，可藉由預先標記抗原結合域而容易測定。例如，經生物素標記之抗原結合域，可藉由使用抗生物素蛋白過氧化酶接合體及適當基質測定。利用過氧化酶等酵素標記之交叉阻斷試驗，尤其稱為競爭ELISA試驗。抗原結合域可以用能檢測或測定之其他標記物質予以標記。具體而言，放射標記或螢光標記等為公知。
比起於不存在候選之競爭抗原結合域締合體下所實施之對照試驗中獲得之結合活性，競爭抗原結合域若能阻斷對IL-6R之抗原結合域之結合至少20%，較佳為至少20-50%，更佳為至少50%，則該待驗抗原結合域係與競爭抗原結合域實質上結合於相同抗原決定部位，或對於相同抗原決定部位之結合為競爭之抗原結合域。
已經鑑定IL-6R之抗原結合域所結合之抗原決定部位的結構時，待驗抗原結合域與對照抗原結合域共有抗原決定部位之情事，可藉由比較兩者之抗原結合域對於構成該抗原決定部位之胜肽導入胺基酸變異而成之胜肽或多胜肽結合活性而予以評價。
作為如此測定結合活性之方法，例如可藉由比較前述ELISA方式中，待驗抗原結合域及對照抗原結合域對於導入有變異的線狀胜肽的結合活性而測定。就ELISA以外之方法而言，也可藉由將對於結合於管柱之該變異胜肽的結合活性，以使待驗抗原結合域與對照抗原結合域流下該管柱後，對溶出到溶出液中之抗原結合域進行定量而測定。使變異胜肽例如與GST之融合胜肽吸附於管柱之方法為公知。
又，當鑑定的抗原決定部位為立體抗原決定部位時，待驗抗原結合域與對照抗原結合域共有抗原決定部位之情事，可藉由以下方法評價。首先，製備表現IL-6R之細胞以及表現對抗原決定部位導入有變異之IL-6R的細胞。對於將該等細胞懸浮於PBS等適當緩衝液而成的細胞懸浮液，添加待驗抗原結合域與對照抗原結合域。其次，對於經適當緩衝液洗滌的細胞懸浮液，添加能夠認識待驗抗原結合域與對照抗原結合域的經FITC標記的抗體。利用FACSCalibur(BD公司)測定由標記抗體染色之細胞之螢光強度及細胞數。將待驗抗原結合域與對照抗原結合域之濃度以適當緩衝液適當稀釋以製備為所望濃度後使用。例如可使用10μg/ml至10 ng/ml之間的任一濃度。標記抗體對於該細胞之結合量，反映於使用CELL QUEST 軟體(BD公司)解析所獲得之螢光強度，亦即幾何平均值。亦即藉由獲得該幾何平均值，可以測定以標記抗體之結合量所代表之待驗抗原結合域與對照抗原結合域之結合活性。
進一步，抗原結合域與別的抗原結合域對於相同抗原決定部位競爭之確認，除了可利用上述ELISA、FACS以外，也可利用放射性標識抗原結合測定法 (radiolabeled antigen binding assay: RIA)、BIACORE(註冊商標)表面電漿子共振分析、電化學發光法等。
本方法中，例如「實質上不結合於變異IL-6R表現細胞」之情事，可藉由以下方法判斷。首先，將已結合於表現變異IL-6R細胞之待驗抗原結合域與對照抗原結合域以標記抗體染色。接著，檢測細胞之螢光強度。螢光檢測使用FACSCalibur當做流式細胞計數儀時，獲得之螢光強度可以使用CELL QUEST 軟體解析。從多胜肽締合體存在下及非存在下之幾何平均值，將其比較値(ΔGeo-Mean)依下列式1計算，可以求得抗原結合域之結合所致之螢光強度之增加比例。
(式1) ΔGeo-Mean＝Geo-Mean (多胜肽締合體存在下)/ Geo-Mean (多胜肽締合體非存在下)
將由解析獲得之反映待驗抗原結合域對於變異IL-6R表現細胞之結合量的幾何平均比較値(變異IL-6R分子ΔGeo-Mean値)，與反映待驗抗原結合域對於IL-6R表現細胞之結合量的ΔGeo-Mean值比較値進行比較。於該情形，求取對於變異IL-6R表現細胞及IL-6R表現細胞之ΔGeo-Mean比較値時使用之待驗抗原結合域之濃度調整為彼此相同或實質上為相同濃度尤佳。可利用預先確認認識IL-6R中之抗原決定部位的抗原結合域當做對照抗原結合域。
待驗抗原結合域對於變異IL-6R表現細胞之ΔGeo-Mean比較値，若比起待驗抗原結合域對於IL-6R表現細胞之ΔGeo-Mean比較値之至少80%、較佳為50%、更佳為30%、尤佳為15%還小，則判定為「實質上不結合於變異IL-6R表現細胞」。求取Geo-Mean値(Geometric Mean)之計算式，記載於CELL QUEST Software User’s Guide(BD biosciences公司)。若比較比較値而其實質上可視為相同之程度，則可評價待驗抗原結合域與對照抗原結合域之抗原決定部位為相同。
本說明書中，用語「運送部分」係指多胜肽中之抗原結合域以外之部分。本發明之運送部分通常係由胺基酸構成的胜肽或多胜肽，就具體的一實施態樣而言，多胜肽中之運送部分介隔切斷位點而與抗原結合域連結。本發明之運送部分可為由醯胺鍵連接的一系列胜肽或多胜肽，也可為多數胜肽或多胜肽利用雙硫鍵等共價鍵或氫鍵、疏水性交互作用等非共價鍵而形成的複合體。
本發明之運送部分，具有抑制抗原結合域之抗原結合活性之抑制域。本說明書中之用語「抑制域」，僅限定在抑制抗原結合域之抗原結合活性。抑制域只要能夠抑制抗原結合域之抗原結合活性即可，任何結構的分域皆可使用。如此的抑制域，例如但不限於抗體之重鏈可變區(VH)、抗體之輕鏈可變區(VL)、pre-B細胞受體、與單域抗體。抑制域可由運送部分的全部構成，也可由運送部分的一部分構成。
本發明之一些實施態樣中，抗原結合域藉由從多胜肽游離，抗原結合活性比起游離前更高。換言之，在抗原結合域未從多胜肽游離的狀態，其抗原結合活性處於受抑制域抑制的狀態。作為確認抗原結合域之抗原結合活性由抑制域抑制的方法，有FACS(fluorescence activated cell sorting)、ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)、ECL(electrogenerated chemiluminescence、電化學發光法)、SPR(Surface Plasmon Resonance、表面電漿子共振)法(Biacore)、BLI(Bio-Layer Interferometry)法(Octet)等。本發明之一些實施態樣中，比起抗原結合域未從多胜肽游離的狀態的結合活性，抗原結合域已從多胜肽游離之狀態之抗原結合活性，成為2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、或3000倍以上之値。本發明之更具體的一些實施態樣中，游離前之抗原結合域在利用選自前述方法中之一方法測定抗原結合域之抗原結合活性時，未觀測到抗原結合域與抗原之結合。 本發明之一些態樣中，藉由切斷位點被切斷能使抗原結合域從多胜肽游離，如此的態樣中的抗原結合活性之比較，能夠藉由比較多胜肽切斷前後之抗原結合活性來進行。亦即，相較於使用未切斷之多胜肽測得的抗原結合活性，使用切斷後之多胜肽測得的抗原結合活性，成為2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、或3000倍以上之値。更具體的一些實施態樣中，未切斷的多胜肽，在利用選自前述方法中之一方法測定抗原結合活性時，未觀測到抗原結合域與抗原之結合。 本發明之一些態樣中，切斷位點被蛋白酶切斷，故如此的態樣中之抗原結合活性之比較，可利用比較多胜肽之蛋白酶處理前後之抗原結合活性來進行。亦即相較於使用未實施蛋白酶處理之多胜肽測定之抗原結合活性，使用蛋白酶處理後之多胜肽測得之抗原結合活性成為2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、或3000倍以上之値。更具體的一些實施態樣中，未經蛋白酶處理之多胜肽在利用選自前述方法中之一方法測定抗原結合活性時，未觀測到抗原結合域與抗原之結合。
本發明中，相較於單獨存在的抗原結合域，包含抗原結合域與運送部分之多胜肽有較長血中半衰期。為了更加延長多胜肽之半衰期，本發明之一些實施態樣中，設計成運送部分有更長的血中半衰期。就延長運送部分之血中半衰期之實施態樣，例如可列舉但不限於增大運送部分之分子量、或運送部分有FcRn結合性、或運送部分有白蛋白結合性、或運送部分經PEG化。又，本發明之一些實施態樣中，運送部分比起抗原結合域有更長血中半衰期(換言之，抗原結合域比起運送部分有更短血中半衰期)。
本發明中，抗原結合域單獨時與多胜肽時之半衰期之比較、或抗原結合域與運送部分之血中半衰期之比較，宜比較在人類之血中半衰期較佳。測定人類的血中半衰期有困難時，可以基於小鼠(例如:正常小鼠、人類抗原表現基因轉殖小鼠、人類FcRn表現基因轉殖小鼠等)或猴(例如:食蟹獼猴等)的血中半衰期來預測於人類的血中半衰期。
作為延長運送部分之血中半衰期之一實施態樣，可列舉增大運送部分之分子量。作為使運送部分之血中半衰期長於抗原結合域之血中半衰期之一實施態樣，可列舉使運送部分之分子量大於抗原結合域之分子量。
作為延長運送部分之血中半衰期之一實施態樣，可列舉使運送部分帶有FcRn結合性。為了使運送部分帶有FcRn結合性，通常有於運送部分中設置FcRn結合區之方法。FcRn結合區係指帶有對於FcRn之結合性區域，只要對於FcRn有結合性即可，可使用任意結構。 含有FcRn結合區之運送部分，能夠利用FcRn之再利用(salvage)路徑於攝入細胞內後再回到血漿中。例如:IgG分子之血漿中滯留性較長(消失慢)者，已知是作為IgG分子之再利用受體的FcRn作用的原故。由於胞飲作用而攝入到內體(endosome)的IgG分子，於內體內的酸性條件下和內體內表現的FcRn結合。未能和FcRn結合的IgG分子則進到溶體而被分解，但是與FcRn結合的IgG分子會移動到細胞表面，於血漿中之中性條件下從FcRn解離，藉此再回到血漿中。 FcRn結合區宜為直接和FcRn結合之區域較佳。FcRn結合區之佳例，可以列舉抗體之Fc區。但是能夠和白蛋白、IgG等具有對於FcRn之結合能力的多胜肽結合之區域，能介隔白蛋白、IgG等而間接地與FcRn結合，所以本發明中， FcRn結合區也可為具有和如此的FcRn之結合能力之多胜肽所結合之區域。
本發明中，FcRn結合區之對於FcRn，尤其對人類FcRn之結合活性，可如前述結合活性之項目所述，該技術領域中有通常知識者公知之方法測定，針對條件，可由該技術領域中有通常知識者適當決定。對於人類FcRn之結合活性，可就KD(Dissociation constant：解離常數)、表觀的KD(Apparent dissociation constant：表觀的解離常數)、解離速度kd(Dissociation rate：解離速度)、或表觀的kd(Apparent dissociation：表觀的解離速度)等評價。此等可依該技術領域中有通常知識者公知之方法測定。例如可使用Biacore(GE healthcare)、Scatchard plot、流式細胞計數儀等。
測定FcRn結合區之對於FcRn之結合活性時之條件，可由該技術領域中有通常知識者適當選擇，並無特殊限制。例如可如WO2009/125825記載般，於MES緩衝液、37℃之條件測定。又，本發明之FcRn結合區之對於FcRn之結合活性之測定可依該技術領域中有通常知識者公知之方法實施，例如，可使用Biacore(GE Healthcare)等測定。FcRn結合區與FcRn之結合活性之測定，可藉由對於已固定了FcRn結合區或含有FcRn結合區之運送部分或FcRn之晶片，分別流過作為分析物的FcRn或FcRn結合區或含FcRn結合區之運送部分以進行評價。
就測定條件使用之pH而言，FcRn結合區與FcRn之結合親和性可以於pH4.0~pH6.5之任意pH進行評價。較佳為為了決定FcRn結合區與人類FcRnと之結合親和性，使用接近生物體內之早期內體內之pH的pH5.8~pH6.0之pH。就測定條件使用之溫度而言，FcRn結合區與FcRn之結合親和性可以於10℃~50℃之任意溫度評價。較佳為為了決定FcRn結合區與人類FcRn之結合親和性，使用15℃~40℃之溫度。更佳為也將如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、與35℃中之任一20℃至35℃的任意溫度同樣地使用在用以決定FcRn結合區與FcRn之結合親和性。25℃之溫度為本發明之態樣之一非限定例。
FcRn結合區之一例不限於例如可列舉，IgG抗體Fc區。使用IgG抗體之Fc區時，其種類不受限定，能夠使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等的Fc區。例如可使用含有選自序列編號：21、22、23、24表示之胺基酸序列中之一序列之Fc區。
又，天然型IgG抗體之Fc區當然若具有FcRn結合性，則可使用有一或更多胺基酸被置換而得的改變Fc區。 例如可使用含有選自IgG抗體Fc區之EU編號第237號、第238號、第239號、第248號、第250號、第252號、第254號、第255號、第256號、257號、第258號、第265號、第270號、第286號、第289號、第297號、第298號、第303號、第305號、第307號、第308號、第309號、第311號、第312號、第314號、第315號、第317號、第325號、第332號、第334號、第360號、第376號、第380號、第382號、第384號、第385號、第386號、第387號、第389號、第424號、第428號、第433號、第434號與第436號中之至少1個胺基酸置換為其他胺基酸之胺基酸序列的改變Fc區。
更具體而言，可使用含有選自下列中之含有至少1個胺基酸置換之改變Fc區， IgG抗體Fc區之EU編號 第237號之Gly置換為Met之胺基酸置換、 第238號之Pro置換為Ala之胺基酸置換、 第239號之Ser置換為Lys之胺基酸置換、 第248號之Lys置換為Ile之胺基酸置換、 第250號之Thr置換為Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、或Tyr之胺基酸置換、 第252號之Met置換為Phe、Trp、或Tyr之胺基酸置換、 第254號之Ser置換為Thr之胺基酸置換、 第255號之Arg置換為Glu之胺基酸置換、 第256號之Thr置換為Asp、Glu、或Gln之胺基酸置換、 第257號之Pro置換為Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val之胺基酸置換、 第258號之Glu置換為His之胺基酸置換、 第265號之Asp置換為Ala之胺基酸置換、 第270號之Asp置換為Phe之胺基酸置換、 第286號之Asn置換為Ala或Glu之胺基酸置換、 第289號之Thr置換為His之胺基酸置換、 第297號之Asn置換為Ala之胺基酸置換、 第298號之Ser置換為Gly之胺基酸置換、 第303號之Val置換為Ala之胺基酸置換、 第305號之Val置換為Ala之胺基酸置換、 第307號之Thr置換為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr之胺基酸置換、 第308號之Val置換為Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr之胺基酸置換、 第309號之Leu或Val置換為Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg之胺基酸置換、 第311號之Gln置換為Ala、His、或Ile之胺基酸置換、 第312號之Asp置換為Ala或His之胺基酸置換、 第314號之Leu置換為Lys或Arg之胺基酸置換、 第315號之Asn置換為Ala或His之胺基酸置換、 第317號之Lys置換為Ala之胺基酸置換、 第325號之Asn置換為Gly之胺基酸置換、 第332號之Ile置換為Val之胺基酸置換、 第334號之Lys置換為Leu之胺基酸置換、 第360號之Lys置換為His之胺基酸置換、 第376號之Asp置換為Ala之胺基酸置換、 第380號之Glu置換為Ala之胺基酸置換、 第382號之Glu置換為Ala之胺基酸置換、 第384號之Asn或Ser置換為Ala之胺基酸置換、 第385號之Gly置換為Asp或His之胺基酸置換、 第386號之Gln置換為Pro之胺基酸置換、 第387號之Pro置換為Glu之胺基酸置換、 第389號之Asn置換為Ala或Ser之胺基酸置換、 第424號之Ser置換為Ala之胺基酸置換、 第428號之Met置換為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr之胺基酸置換、 第433號之His置換為Lys之胺基酸置換、 第434號之Asn置換為Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr之胺基酸置換、及 第436號之Tyr或Phe置換為His之胺基酸置換。
從其他方面考量，可使用含有選自下列的至少1個胺基酸的Fc區， IgG抗體Fc區中之EU編號 第237號之胺基酸之Met、 第238號之胺基酸之Ala、 第239號之胺基酸之Lys、 第248號之胺基酸之Ile、 第250號之胺基酸之Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、或Tyr、 第252號之胺基酸之Phe、Trp、或Tyr、 第254號之胺基酸之Thr、 第255號之胺基酸之Glu、 第256號之胺基酸之Asp、Glu、或Gln、 第257號之胺基酸之Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val、 第258號之胺基酸之His、 第265號之胺基酸之Ala、 第270號之胺基酸之Phe、 第286號之胺基酸之Ala或Glu、 第289號之胺基酸之His、 第297號之胺基酸之Ala、 第298號之胺基酸之Gly、 第303號之胺基酸之Ala、 第305號之胺基酸之Ala、 第307號之胺基酸之Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr、 第308號之胺基酸之Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr、 第309號之胺基酸之Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg、 第311號之胺基酸之Ala、His、或Ile、 第312號之胺基酸之Ala或His、 第314號之胺基酸之Lys或Arg、 第315號之胺基酸之Ala或His、 第317號之胺基酸之Ala、 第325號之胺基酸之Gly、 第332號之胺基酸之Val、 第334號之胺基酸之Leu、 第360號之胺基酸之His、 第376號之胺基酸之Ala、 第380號之胺基酸之Ala、 第382號之胺基酸之Ala、 第384號之胺基酸之Ala、 第385號之胺基酸之Asp或His、 第386號之胺基酸之Pro、 第387號之胺基酸之Glu、 第389號之胺基酸之Ala或Ser、 第424號之胺基酸之Ala、 第428號之胺基酸之Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr、 第433號之胺基酸之Lys、 第434號之胺基酸之Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr、與 第436號之胺基酸之His。
使運送部分有FcRn結合性，並不是意指使抗原結合域不具FcRn結合性。就運送部分之血中半衰期長於抗原結合域之血中半衰期之實施態樣而言，抗原結合域不具FcRn結合性係當然，即使抗原結合域有FcRn結合性，只要具有比起運送部分弱的FcRn結合性即可。
又，作為延長運送部分之血中半衰期之一實施態樣，有使運送部分與白蛋白結合之方法。白蛋白不受腎排泄且有FcRn結合性，故血中半衰期為17~19日之長(J Clin Invest. 1953 Aug; 32(8): 746-768.)。所以，結合有白蛋白之蛋白質的體積增大，且能間接地與FcRn結合，故據認報血中半衰期會增加(Antibodies 2015, 4(3), 141-156)。
又，就延長運送部分之血中半衰期之一實施態樣而言，有將運送部分予以PEG化的方法。藉由將蛋白質予以PEG化，蛋白質的體積加大，同時抑制由於血中之蛋白酶所致分解，據認為蛋白質之血中半衰期會延長(J Pharm Sci. 2008 Oct;97(10):4167-83.)。
本發明之一些實施態樣中，運送部分含有抗體Fc區。就具體的一實施態樣而言，運送部分含有人類IgG抗體之CH2域及CH3域。就具體的一實施態樣而言，運送部分含有從人類IgG1抗體重鏈Cys226、或從Pro230延伸到重鏈之羧基末端的部分。惟Fc區之C末端之離胺酸 (Lys447) 或甘胺酸‐離胺酸(Gly446-Lys447)可存在也可不存在。
本發明之一些實施態樣中，運送部分含有抗體恆定區。於較佳的實施態樣中，運送部分含有IgG抗體恆定區。於更佳的實施態樣中，運送部分含有人類IgG抗體恆定區。
又，本發明之一些實施態樣中，運送部分，包括:與抗體重鏈恆定區實質上有類似結構區域，以及與該區域利用雙硫鍵等共價鍵或氫鍵、疏水性交互作用等非共價鍵而鍵結的與抗體輕鏈實質上有類似結構的區域。
本說明書中，「包含抗原結合域與運送部分之多胜肽」，通常係由醯胺鍵連接的一系列多胜肽、或含有多數由醯胺鍵連接的一系列多胜肽的蛋白質。
本發明之一些實施態樣中，抗原結合域可以從多胜肽游離，抗原結合域藉由從多胜肽游離，提高抗原結合活性。本說明書中，用語「游離」係指多胜肽的二個部分相互分開。抗原結合域從多胜肽游離，可能因為抗原結合域與運送部分的相互作用解除的原故。納入到多胜肽的抗原結合域的抗原結合活性受抑制，故抗原結合域從多胜肽游離的現象的確認，可藉由測定對象物之抗原結合活性，並比較已納入到多胜肽之狀態之抗原結合域之抗原結合活性以進行。
一些實施態樣中，多胜肽含有切斷位點，由於該切斷位點被切斷，抗原結合域從多胜肽游離。切斷位點例如可被酵素切斷，或被還原劑還原、或光分解。切斷位點，能使抗原結合域游離、且游離後之抗原結合域之抗原結合活性不喪失，則可配置在多胜肽中之任意位置。又，除了為了使抗原結合域游離之切斷位點，多胜肽也可進一步含有其他切斷位點。本發明之一實施態樣中，切斷位點含有蛋白酶切斷序列，可藉由蛋白酶切斷。
本說明書中，用語「被切斷」，係指藉由蛋白酶所致切斷位點之改變及/或切斷位點之半胱胺酸-半胱胺酸雙硫鍵之還原及/或光活化後之抗原結合域與運送部分分開的狀態。本說明書中，用語「未被切斷」，係指不存在藉由蛋白酶所致切斷位點之切斷及/或不存在切斷位點之半胱胺酸-半胱胺酸雙硫鍵之還原及/或不存在光之抗原結合域與運送部分為連結的狀態。
切斷位點之切斷，可藉由將含有含切斷位點之多胜肽之溶液進行SDS-PAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳)，並測定斷片分子量、或檢測切斷前後之分子量變化以檢測。
切斷位點，可利用藥劑(亦即，蛋白酶、還原劑、光)，以約0.001~1500×10 4M -1S -1或至少0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250、或1500×10 4M -1S -1的速度特異性地修飾(切斷、還原或光分解)。
利用蛋白酶所為之特異性的切斷，係進行蛋白酶與切斷位點或含切斷位點之分子之間之接觸。於有充分的酵素活性存在下時，能將切斷位點予以切斷。充分的酵素活性，係指與切斷位點接觸而將其切斷之酵素能力。
本說明書中，用語 「蛋白酶」，係指將胜肽鍵水解的內切胜肽酶或外切胜肽酶等酵素，通常稱為內切胜肽酶。本發明中使用的蛋白酶僅限於能切斷蛋白酶切斷序列者，其種類無特殊限制。在一些實施態樣中，可使用目標組織特異性的蛋白酶。目標組織特異性的蛋白酶，例如: (1)在目標組織以比起正常組織更高水平表現之蛋白酶、 (2)在目標組織有比起正常組織更高活性之蛋白酶、 (3)在目標細胞以比起正常細胞高水平表現之蛋白酶、 (4)在目標細胞有比起正常細胞更高活性之蛋白酶 中之任一者。 更具體的實施態樣中，可使用癌組織特異性的蛋白酶或發炎組織特異性的蛋白酶。
本說明書中，用語「目標組織」係指含有至少一個目標細胞之組織。本發明之一些實施態樣中，目標組織為癌組織。本發明之一些實施態樣中，目標組織為發炎組織。
用語「癌組織」，係指含有至少一個癌細胞之組織。因此，例如癌組織含有癌細胞與血管的方式，指貢獻於形成含有癌細胞與內皮細胞之腫瘤(tumor mass)之全部細胞型。本說明書中，腫瘤稱為腫瘤組織巢(a foci of tumor tissue)。「腫瘤」之用語，一般用在指良性新生物或惡性新生物。
本說明書中，「發炎組織」例如可列舉如下。 ・類風濕性關節炎、變形性關節症中之關節 ・支氣管氣喘、COPD中的肺(肺泡) ・發炎性腸病症、克隆氏病、潰瘍性大腸炎中的消化器官 ・肝臟、腎臟、肺之纖維化症中之纖維化組織 ・因臟器移植引起排斥反應的組織 ・動脈硬化、心臟衰竭之血管、心臟(心肌) ・代謝症候群中之內臟脂肪 ・異位性皮膚炎其他皮膚炎中之皮膚組織 ・椎間盤突出、慢性腰痛中的脊髓神經
一些種類之目標組織中，已知有特異性的表現或特異性的活化的蛋白酶或據認為和目標組織病症狀態相關的蛋白酶(目標組織特異性的蛋白酶)。例如:國際公開WO2013/128194號、國際公開WO2010/081173號、國際公開WO2009/025846號等揭示在癌組織特異性的表現的蛋白酶。又，J Inflamm (Lond). 2010; 7: 45.、Nat Rev Immunol. 2006 Jul;6(7):541-50.、Nat Rev Drug Discov. 2014 Dec;13(12):904-27.、Respir Res. 2016 Mar 4;17:23.、Dis Model Mech. 2014 Feb;7(2):193-203.、Biochim Biophys Acta. 2012 Jan;1824(1):133-45.揭示據認為和發炎相關的蛋白酶。 除了在目標組織特異性的表現的蛋白酶以外，也存在於目標組織特異性的活化的蛋白酶。例如:蛋白酶有以不活化型表現，之後成為活化型的情況，在許多組織存在有抑制活化型蛋白酶之物質，利用活化處理與抑制劑之存在來控制活性 (Nat Rev Cancer. 2003 Jul;3(7):489-501.)。目標組織中，有時活化型蛋白酶從受抑制狀態脫逃，而被特異性地活化。 活化型蛋白酶之測定方法，可使用認識活化型蛋白酶之抗體之方法(PNAS 2013 Jan 2; 110(1): 93-98.)、將蛋白酶所認識之胜肽予以螢光標識並在切斷前消光(淬滅)，但切斷後發光之方法(Nat Rev Drug Discov. 2010 Sep;9(9):690-701. doi: 10.1038/nrd3053.)進行測定。 從一觀點，用語「目標組織特異性的蛋白酶」可指下列中之任一者: (i) 在目標組織比起在正常組織以更高位準表現之蛋白酶、 (ii) 在目標組織比起在正常組織有更高活性之蛋白酶、 (iii) 在目標細胞比起在正常細胞以更高位準表現之蛋白酶、 (iv) 在目標細胞比起在正常細胞有更高活性之蛋白酶。
雖不限定解釋，但具體的蛋白酶可列舉:半胱胺酸蛋白酶(包括細胞自溶酶(Cathepsin)家族B、L、S等)、天冬胺醯基蛋白酶(細胞自溶酶D、E、K、O等)、絲胺酸蛋白酶((包括第二型跨膜絲胺酸蛋白酶(Matriptase)(包括MT-SP1)、細胞自溶酶A及G、凝血酶、胞漿素、尿激酶(uPA)、組織胞漿素原活化因子(tPA)、彈性蛋白酶、Proteinase3、凝血酶、激肽釋放素(kallikrein)、中性蛋白酶(tryptase)、凝乳酶(chymase))、金屬蛋白酶包括(膜結合型(MMP14-17及MMP24-25)及分泌型(MMP1-13及MMP18-23及MMP26-28)兩者之金屬蛋白酶(MMP1-28))、蛋白酶之A disintegrin及金屬蛋白酶(ADAM)、具有A disintegrin或thrombospondin功能域之金屬蛋白酶(ADAMTS)、Meprin(Meprinα(meprin alpha)、Meprinβ(meprin beta)))、CD10(CALLA)、以及前列腺特異性的抗原(PSA)、Legumain、TMPRSS3、TMPRSS4、嗜中性球彈性蛋白酶(HNE)、beta分泌酶(secretase)(BACE)、纖維母細胞活化蛋白質alpha (FAP)、顆粒酶B(Granzyme B)、胍基苯甲酸酶(guanidino−benzoatase)(GB)、Hepsin、neprilysin、NS3/4A、HCV-NS3/4、calpain、ADAMDEC1、腎活素(renin)、細胞自溶酶C、細胞自溶酶V/L2、細胞自溶酶 X/Z/P、Cruzipain、otubain2、激肽釋放素關連胜肽酶(KLKs(KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14))、骨形成蛋白質1(BMP-1)、活化Protein  C、血液凝固關連蛋白酶(Factor VIIa、Factor IXa、Factor Xa、Factor XIa、Factor XIIa)、HtrA1、乳鐵蛋白、Marapsin、PACE4、DESC1、二肽基肽酶4(DPP-4)、TMPRSS2、細胞自溶酶F、細胞自溶酶H、細胞自溶酶L2、細胞自溶酶O、細胞自溶酶S、顆粒酶(Granzyme) A、Gepsin calpain 2、麩胺酸羧基胜肽酶2、AMSH-Like Proteases、AMSH、gamma分泌酶(gamma secretase)、A抗胞漿素切斷酵素(APCE)、Decysin 1、N-Acetylated Alpha-Linked Acidic Dipeptidase-Like 1(NAALADL1)、furin(furin)等。
從其他觀點，目標組織特異性的蛋白酶可以指癌組織特異性的蛋白酶或發炎組織特異性的蛋白酶。 癌組織特異性的蛋白酶，例如:國際公開WO2013/128194號、國際公開WO2010/081173號、國際公開WO2009/025846號等揭示之在癌組織特異性的表現的蛋白酶。
就癌組織特異性的蛋白酶之種類而言，在治療對象之癌組織之表現特異性越高，則越可獲得副作用減低效果。癌組織特異性的蛋白酶，在癌組織之濃度為高出正常組織之濃度之5倍以上較佳，高10倍以上更佳，高100倍以上進而更佳，高500倍以上特別佳，高1000倍以上最佳。又，癌組織特異性的蛋白酶，在癌組織之活性為高出正常組織之活性之2倍以上較佳，高3倍以上、高4倍以上、高5倍以上、高10倍以上更佳，高100倍以上進而更佳，高500倍以上特別佳，高1000倍以上最佳。 又，癌組織特異性的蛋白酶，可為結合在癌細胞之細胞膜者，也可為不結合在細胞膜而是分泌到細胞外者。癌組織特異性的蛋白酶未結合在癌細胞之細胞膜時，利用免疫細胞所為之細胞傷害因為係對於癌細胞有特異性，故癌組織特異性的蛋白酶宜存在於癌組織之內部或附近較佳。本說明書中，「癌組織之附近」，係指癌組織特異性的蛋白酶切斷序列被切斷而抗原結合域發揮抗原結合活性之範圍內。惟宜儘可能不傷害正常細胞之範圍較佳。 由另一觀點，癌組織特異性的蛋白酶，係下列中之任一者: (i) 在癌組織比起在正常組織以更高位準表現之蛋白酶、 (ii) 在癌組織比起在正常組織有更高活性之蛋白酶、 (iii) 在癌細胞比起在正常細胞以更高位準表現之蛋白酶、 (iv) 在癌細胞比起在正常細胞有更高活性之蛋白酶。 癌組織特異性的蛋白酶可為單獨1種也可將2種以上組合。癌組織特異性的蛋白酶之種類數，可由該技術領域中有通常知識者考慮治療對象之癌種類而適當設定。
由以上之觀點，癌組織特異性的蛋白酶宜為上述例示之蛋白酶中之絲胺酸蛋白酶與金屬蛋白酶較佳，Matriptase(包括MT-SP1)、尿激酶(uPA)與金屬蛋白酶更佳，MT-SP1、uPA、MMP2、MMP9進而更佳。
就發炎組織特異性的蛋白酶的種類而言，在治療對象之發炎組織之表現特異性越高，則越可獲得副作用減低效果。發炎組織特異性的蛋白酶，宜為在發炎組織之濃度為高出在正常組織之濃度之5倍以上較佳，高10倍以上更佳，高100倍以上進而更佳，高500倍以上特別佳，高1000倍以上最佳。又，發炎組織特異性的蛋白酶，宜為在發炎組織之活性為高出在正常組織之活性之2倍以上較佳，高3倍以上、高4倍以上、高5倍以上、高10倍以上更佳，高100倍以上進而更佳，高500倍以上特別佳，高1000倍以上最佳。 又，發炎組織特異性的蛋白酶，可為結合在發炎組織之細胞膜者，也可為不結合在細胞膜在而是分泌到細胞外者。發炎組織特異性的蛋白酶未結合在發炎組織之細胞膜時，利用免疫細胞所為之細胞傷害因為係對於發炎組織有特異性，故發炎組織特異性的蛋白酶宜存在於發炎組織之內部或附近較佳。本說明書中，「發炎組織之附近」，係指發炎組織特異性的蛋白酶切斷序列被切斷而抗原結合域發揮抗原結合活性之範圍內。惟宜儘可能不傷害正常細胞之範圍較佳。 由其他觀點，發炎組織特異性的蛋白酶，係下列中之任一者: (i) 在發炎組織比起在正常組織以更高位準表現之蛋白酶、 (ii) 在發炎組織比起在正常組織有更高活性之蛋白酶、 (iii) 在發炎細胞比起在正常細胞以更高位準表現之蛋白酶、 (iv) 在發炎細胞比起在正常細胞有更高活性之蛋白酶。 發炎組織特異性的蛋白酶可為單獨1種也可將2種以上組合。發炎組織特異性的蛋白酶之種類數，可由該技術領域中有通常知識者考慮治療對象之病狀而適當設定。
由以上之觀點，發炎組織特異性的蛋白酶宜為上述例示之蛋白酶中之金屬蛋白酶較佳，金屬蛋白酶中之ADAMTS5、MMP2、MMP7、MMP9、MMP13更佳。
蛋白酶切斷序列，係當於水溶液中多胜肽由於目標組織特異性的蛋白酶而受到水解時，被該目標組織特異性的蛋白酶特異性的認識的特定胺基酸序列。 蛋白酶切斷序列，考慮減低副作用之觀點，宜為能夠被在治療對象之目標組織/細胞較特異性表現、或在治療對象之目標組織/細胞較特異性的活化的目標組織特異性的蛋白酶以高特異性水解之胺基酸序列較佳。 具體的蛋白酶切斷序列，例如:國際公開WO2013/128194號、國際公開WO2010/081173號、國際公開WO2009/025846號等揭示的由上述例示之癌組織特異性的表現的蛋白酶、發炎組織特異性的蛋白酶等，進行特異性的水解的目標序列。也可使用能夠被藉由既知之蛋白酶進行特異性的水解的目標序列導入適當胺基酸變異等予以人工改變而得的序列。又，蛋白酶切斷序列也可使用如Nature Biotechnology 19, 661 - 667 (2001)所記載之該技術領域中有通常知識者公知之方法鑑定者。 又，也可使用天然存在的蛋白酶切斷序列。例如可使用TGFβ因接受蛋白酶之切斷而變化為潛在型的，這類由於接受蛋白酶之切斷而改變分子形之蛋白質中之接受蛋白酶切斷之序列。 又，也可使用天然存在的蛋白酶切斷序列。例如可使用TGFβ因接受蛋白酶之切斷而變化為潛在型的這類由於接受蛋白酶之切斷而改變分子形之蛋白質中之接受蛋白酶切斷之序列。
蛋白酶切斷序列，例雖不限定於此，但可使用國際公開WO2015/116933號、國際公開WO2015/048329號、國際公開WO2016/118629號、國際公開WO2016/179257號、國際公開WO2016/179285號、國際公開WO2016/179335號、國際公開WO2016/179003號、國際公開WO2016/046778號、國際公開WO2016/014974號、美國專利公開US2016/0289324號、美國專利公開US2016/0311903號、PNAS (2000) 97: 7754-7759.、Biochemical Journal (2010) 426: 219-228.、Beilstein J Nanotechnol. (2016) 7: 364-373.中揭示的序列。 蛋白酶切斷序列，如上述，更宜為利用適當的目標組織特異性的蛋白酶予以更佳特異性的水解的胺基酸序列更佳。利用目標組織特異性的蛋白酶予以特異性的水解的胺基酸序列中，包括以下之胺基酸序列的序列較佳。 LSGRSDNH(序列編號：12、可利用MT-SP1、uPA切斷) PLALAG(序列編號：25、可利用MMP2、MMP9切斷) VPLSLTMG(序列編號：26、可利用MMP7切斷) 蛋白酶切斷序列也可使用下列序列。 TSTSGRSANPRG(序列編號：74、可利用MT-SP1、uPA切斷) ISSGLLSGRSDNH(序列編號：75、可利用MT-SP1、uPA切斷) AVGLLAPPGGLSGRSDNH(序列編號：76、可利用MT-SP1、uPA切斷) GAGVPMSMRGGAG(序列編號：77、可利用MMP1切斷) GAGIPVSLRSGAG(序列編號：78、可利用MMP2切斷) GPLGIAGQ(序列編號：79、可利用MMP2切斷) GGPLGMLSQS(序列編號：80、可利用MMP2切斷) PLGLWA(序列編號：81、可利用MMP2切斷) GAGRPFSMIMGAG(序列編號：82、可利用MMP3切斷) GAGVPLSLTMGAG(序列編號：83、可利用MMP7切斷) GAGVPLSLYSGAG(序列編號：84、可利用MMP9切斷) AANLRN(序列編號：85、可利用MMP11切斷) AQAYVK(序列編號：86、可利用MMP11切斷) AANYMR(序列編號：87、可利用MMP11切斷) AAALTR(序列編號：88、可利用MMP11切斷) AQNLMR(序列編號：89、可利用MMP11切斷) AANYTK(序列編號：90、可利用MMP11切斷) GAGPQGLAGQRGIVAG(序列編號：91、可利用MMP13切斷) PRFKIIGG(序列編號：92、可利用尿激酶原切斷) PRFRIIGG(序列編號：93、可利用尿激酶原切斷) GAGSGRSAG(序列編號：94、可利用uPA切斷) SGRSA(序列編號：95、可利用uPA切斷) GSGRSA(序列編號：96、可利用uPA切斷) SGKSA(序列編號：97、可利用uPA切斷) SGRSS(序列編號：98、可利用uPA切斷) SGRRA(序列編號：99、可利用uPA切斷) SGRNA(序列編號：100、可利用uPA切斷) SGRKA(序列編號：101、可利用uPA切斷) QRGRSA(序列編號：102、可利用tPA切斷) GAGSLLKSRMVPNFNAG(序列編號：103、可利用細胞自溶酶B切斷) TQGAAA(序列編號：104、可利用細胞自溶酶B切斷) GAAAAA(序列編號：105、可利用細胞自溶酶B切斷) GAGAAG(序列編號：106、可利用細胞自溶酶B切斷) AAAAAG(序列編號：107、可利用細胞自溶酶B切斷) LCGAAI(序列編號：108、可利用細胞自溶酶B切斷) FAQALG(序列編號：109、可利用細胞自溶酶B切斷) LLQANP(序列編號：110、可利用細胞自溶酶B切斷) LAAANP(序列編號：111、可利用細胞自溶酶B切斷) LYGAQF(序列編號：112、可利用細胞自溶酶B切斷) LSQAQG(序列編號：113、可利用細胞自溶酶B切斷) ASAASG(序列編號：114、可利用細胞自溶酶B切斷) FLGASL(序列編號：115、可利用細胞自溶酶B切斷) AYGATG(序列編號：116、可利用細胞自溶酶B切斷) LAQATG(序列編號：117、可利用細胞自溶酶B切斷) GAGSGVVIATVIVITAG(序列編號：118、可利用細胞自溶酶L 切斷) APMAEGGG(序列編號：119、可利用Meprinα、Meprinβ切斷) EAQGDKII(序列編號：120、可利用Meprinα、Meprinβ切斷) LAFSDAGP(序列編號：121、可利用Meprinα、Meprinβ切斷) YVADAPK(序列編號：122、可利用Meprinα、Meprinβ切斷) RRRRR(序列編號：123、可利用furin切斷) RRRRRR(序列編號：124、可利用furin切斷) GQSSRHRRAL(序列編號：125、可利用furin切斷) SSRHRRALD(序列編號：126) RKSSIIIRMRDVVL(序列編號：127、可利用胞漿素原(Plasminogen)切斷) SSSFDKGKYKKGDDA(序列編號：128、可利用Staphylokinase切斷) SSSFDKGKYKRGDDA(序列編號：129、可利用Staphylokinase切斷) IEGR(序列編號：130、可利用Factor Xa切斷) IDGR(序列編號：131、可利用Factor Xa切斷) GGSIDGR(序列編號：132、可利用Factor Xa切斷) GPQGIAGQ(序列編號：133、可利用膠原蛋白酶切斷) GPQGLLGA(序列編號：134、可利用膠原蛋白酶切斷) GIAGQ(序列編號：135、可利用膠原蛋白酶切斷) GPLGIAG(序列編號：136、可利用膠原蛋白酶切斷) GPEGLRVG(序列編號：137、可利用膠原蛋白酶切斷) YGAGLGVV(序列編號：138、可利用膠原蛋白酶切斷) AGLGVVER(序列編號：139、可利用膠原蛋白酶切斷) AGLGISST(序列編號：140、可利用膠原蛋白酶切斷) EPQALAMS(序列編號：141、可利用膠原蛋白酶切斷) QALAMSAI(序列編號：142、可利用膠原蛋白酶切斷) AAYHLVSQ(序列編號：143、可利用膠原蛋白酶切斷) MDAFLESS(序列編號：144、可利用膠原蛋白酶切斷) ESLPVVAV(序列編號：145、可利用膠原蛋白酶切斷) SAPAVESE(序列編號：146、可利用膠原蛋白酶切斷) DVAQFVLT(序列編號：147、可利用膠原蛋白酶切斷) VAQFVLTE(序列編號：148、可利用膠原蛋白酶切斷) AQFVLTEG(序列編號：149、可利用膠原蛋白酶切斷) PVQPIGPQ(序列編號：150、可利用膠原蛋白酶切斷) LVPRGS(序列編號：151、可利用凝血酶切斷) TSTSGRSANPRG(序列編號：178、可利用uPA及MT-SP1切斷)
本發明之一實施態樣中，可進一步於蛋白酶切斷序列的一端或兩端附加可動連結子。蛋白酶切斷序列一端之可動連結子可稱呼為第一可動連結子，另一端之可動連結子可稱呼為第二可動連結子。於特定之實施形態，蛋白酶切斷序列與可動連結子包括下式中之一者。 (蛋白酶切斷序列) (第一可動連結子)-(蛋白酶切斷序列) (蛋白酶切斷序列)-(第二可動連結子) (第一可動連結子)-(蛋白酶切斷序列)-(第二可動連結子) 本實施態樣中，可動連結子宜為胜肽連結子較佳。第一可動連結子與第二可動連結子，係各自獨立且任意地存在且含有至少1個可撓性胺基酸(Gly等)之相同或不同之可動連結子。例如:含有蛋白酶切斷序列會獲得所望之蛋白酶接近性之程度之充分數目的殘基(從Arg、Ile、Gln、Glu、Cys、Tyr、Trp、Thr、Val、His、Phe、Pro、Met、Lys、Gly、Ser、Asp、Asn、Ala等任意選擇的胺基酸、尤其是Gly、Ser、Asp、Asn、Ala，進而是Gly及Ser，特別是Gly等)。
適合使用在蛋白酶切斷序列兩端之可動連結子，通常係會增進蛋白酶對於蛋白酶切斷序列之接近且提升蛋白酶之切斷效率者。適合的可動連結子可輕易地選擇，可從1個胺基酸(Gly等)至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、或4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸或7個胺基酸至8個胺基酸為主，而從3個胺基酸至12個胺基酸等不同長度當中選擇適合者。本發明之一些實施態樣中，可動連結子係1至7個胺基酸之胜肽連結子。
可動連結子，例如下列但不限定，例如:甘胺酸聚合物(G)n、甘胺酸-絲胺酸聚合物(例如包括 (GS)n、(GSGGS：序列編號：27)n及(GGGS：序列編號：28)n，n為至少1之整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物、習知技術周知之其他可動連結子。 其中，甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物受重視，理由是該等胺基酸相對地較不結構化，容易作為成分中之中性繫鏈的作用。 由甘胺酸-絲胺酸聚合物構成之可動連結子，例如以下但不限定，例如: Ser Gly・Ser(GS) Ser・Gly(SG) Gly・Gly・Ser(GGS) Gly・Ser・Gly(GSG) Ser・Gly・Gly(SGG) Gly・Ser・Ser(GSS) Ser・Ser・Gly(SSG) Ser・Gly・Ser(SGS) Gly・Gly・Gly・Ser(GGGS、序列編號：28) Gly・Gly・Ser・Gly(GGSG、序列編號：29) Gly・Ser・Gly・Gly(GSGG、序列編號：46) Ser・Gly・Gly・Gly(SGGG、序列編號：47) Gly・Ser・Ser・Gly(GSSG、序列編號：48) Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGS、序列編號：49) Gly・Gly・Gly・Ser・Gly(GGGSG、序列編號：33) Gly・Gly・Ser・Gly・Gly(GGSGG、序列編號：30) Gly・Ser・Gly・Gly・Gly(GSGGG、序列編號：32) Gly・Ser・Gly・Gly・Ser(GSGGS、序列編號：27) Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGG、序列編號：51) Gly・Ser・Ser・Gly・Gly(GSSGG、序列編號：52) Gly・Ser・Gly・Ser・Gly(GSGSG、序列編號：31) Ser・Gly・Gly・Ser・Gly(SGGSG、序列編號：53) Gly・Ser・Ser・Ser・Gly(GSSSG、序列編號：34) Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGGS、序列編號：50) Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGGG、序列編號：54) Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGGGS、序列編號：55) Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGGGG、序列編號：56) (Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGS、序列編號：49))n (Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGG、序列編號：51))n 等。
本說明書中，「締合」意指例如2個以上之多胜肽區交互作用的狀態。一般而言，成為對象之多胜肽區之間會有疏水鍵、氫鍵、離子鍵等，形成締合體。常見之締合之一例已知有在天然型抗體為代表之抗體中，重鏈可變區(VH)與輕鏈可變區(VL)藉由兩者間的非共價鍵等而保持配對結構。
本發明的一些實施態樣中，運送部分的抑制域與抗原結合域締合。抑制域可以為運送部分的一部分，也可為運送部分的全部。從其他觀點，運送部分中之與抗原結合域締合的部分可換言之稱為抑制域。 就更具體的實施態樣而言，單域抗體之抗原結合域、與VL或VH或VHH之抑制域，形成如抗體VH與抗體VL的締合。就更具體的實施態樣而言，單域抗體之抗原結合域與VL或VH或VHH之抑制域，形成如抗體VH與抗體VL之締合，且於已形成該締合之狀態，抑制域藉由立體結構上妨礙抗原結合域與抗原之結合、或改變抗原結合域之抗原結合部位之立體結構，而使該單域抗體之抗原結合活性受該VL或VH或VHH抑制。利用VHH作為單域抗體之實施態樣中，若VHH之主要抗原結合部位的CDR3或其附近的部位存在於與抑制域締合的界面，據認為會因抑制域導致VHH與抗原之結合受立體結構上的妨礙。 又，抑制域與抗原結合域之締合，例如可藉由將切斷位點予以切斷而解除。締合之解除，例如可換言之為解除2個以上之多胜肽區之交互作用狀態。可將2個以上之多胜肽區之交互作用全部解除，也可將2個以上之多胜肽區的交互作用之中之一部分解除。
本說明書中，「界面」通常指締合(交互作用)時之締合面，形成界面之胺基酸殘基，通常係指供其締合之多胜肽區中含有的1或多數胺基酸殘基，更佳係指締合時接近且涉及交互作用之胺基酸殘基。該交互作用，具體而言，包括締合時接近的胺基酸殘基彼此形成氫鍵、靜電的交互作用、鹽橋時等非共價鍵。
本說明書中，「形成界面之胺基酸殘基」，若詳述之，係指構成界面之多胜肽區中，該多胜肽區中所含有的胺基酸殘基。構成界面之多胜肽區，若舉一例，係指抗體、配體、受體、基質等中，負責其分子內、或分子間之選擇性的結合的多胜肽區。具體而言，抗體中，可列舉重鏈可變區、輕鏈可變區等，在本發明之一些實施態樣，可列舉抗原結合域與抑制域。 形成界面之胺基酸殘基，例如但不限於此等，例如可列舉締合時接近的胺基酸殘基。締合時接近的胺基酸殘基，例如可藉由解析多胜肽的立體結構，並檢查該多胜肽締合時形成界面之多胜肽區之胺基酸序列來找出。
本發明之一些實施態樣中，為了促進抗原結合域與抑制域之締合，可以改變涉及抗原結合域中之締合之胺基酸殘基、或涉及抑制域中之締合之胺基酸殘基。作為更具體的實施態樣，可改變抗原結合域中的形成與抑制域之界面之胺基酸殘基、或抑制域中的形成與抗原結合域之界面之胺基酸殘基。較佳的實施態樣中，形成界面之胺基酸殘基之改變，係以形成界面之2個殘基以上之胺基酸殘基成為異種電荷的方式，於該界面導入胺基酸殘基之變異之方法。成為異種電荷之胺基酸殘基之改變，包括從有正電荷之胺基酸殘基改變為有負電荷之胺基酸殘基或改變為沒有電荷之胺基酸殘基、從有負電荷之胺基酸殘基改變為有正電荷之胺基酸殘基或改變為沒有電荷之胺基酸殘基、與從沒有電荷之胺基酸殘基改變為有正或負電荷之胺基酸殘基。如此的胺基酸改變，係為了促進締合，只要能達成締合促進的目的，胺基酸改變的位置、胺基酸的種類不限定。改變，例如可列舉置換，但不限定於此。
本發明之一些實施態樣中，抗原結合域VHH係與抑制域VL締合。VHH中之涉及與VL之締合之胺基酸殘基，例如可指形成VHH與VL之界面之胺基酸殘基。又，VHH中之涉及與VL之締合之胺基酸殘基，例如但不限於37位、44位、45位、47位之胺基酸殘基(J. Mol. Biol. (2005) 350, 112-125.)。藉由促進VHH與VL之締合，可以抑制VHH的活性。同時，VL中之涉及與VHH之締合之胺基酸殘基，例如可指形成VHH與VL之界面之胺基酸殘基。
為了促進VHH與VL之締合，可以改變VHH中之涉及與VL之締合之胺基酸殘基。作為如此的胺基酸置換之例，例如但不限於F37V、Y37V、E44G、Q44G、R45L、H45L、G47W、F47W、L47W、T47W、或/及S47W。又，也可以不改變VHH中之各殘基，而從開始便使用有37V、44G、45L、或/及47W之胺基酸殘基之VHH。 又，只要能夠達成促進VHH與VL之締合之目的，可以不改變VHH中之胺基酸，而改變VL中之涉及與VHH之締合之胺基酸殘基，也可進一步於VHH與VL兩者皆導入胺基酸改變。
本發明之一些其他實施態樣中，可以使用VHH作為抗原結合域，使用VH或VHH作為抑制域，使抗原結合域與抑制域締合。為了促進抗原結合域VHH、與抑制域VH或VHH之締合，可以特定抗原結合域VHH中之涉及與抑制域VH或VHH之締合之胺基酸殘基，並將此等胺基酸殘基改變。又，可指定抑制域VH或VHH中之涉及與抗原結合域VHH締合之胺基酸殘基，並改變此等的胺基酸殘基。
又，使用VHH以外之單域抗體作為抗原結合域時，也可依同樣方式指定抗原結合域或抑制域中之涉及締合之胺基酸殘基，並對此等胺基酸殘基加以改變。
本發明之一些實施態樣，運送部分與抗原結合域係介隔連結子而融合。就更具體的實施態樣而言，運送部分與抗原結合域係介隔包括切斷位點之連結子而融合。於其他具體的實施態樣而言，運送部分與抗原結合域係介隔連結子而融合，融合後之融合蛋白質中含有切斷位點。
就本發明之另一實施態樣而言，運送部分與抗原結合域未介隔連結子而融合。更具體的實施態樣中，在運送部分之N末端胺基酸與抗原結合域之C末端胺基酸之間形成胺基鍵，並形成融合蛋白質。形成的融合蛋白質含有切斷位點。於特定的實施態樣，改變運送部分之N末端之1個胺基酸~數個胺基酸或/及抗原結合域C末端的1個胺基酸~數個胺基酸，並使運送部分之N末端與抗原結合域之C末端融合，以在融合位置附近形成切斷位點。更具體而言，例如可使抗原結合域C末端的4個胺基酸成為LSGR序列，使運送部分的N末端的4個胺基酸成為SDNH序列，而形成切斷位點。
本發明之一些實施態樣中，含有運送部分與抗原結合域之多胜肽的切斷位點，包括蛋白酶切斷序列。蛋白酶切斷序列當受到蛋白酶的切斷時，會使抗原結合域游離，且只要游離後之抗原結合域之抗原結合活性不喪失，可配置在多胜肽的任意部分。
本發明之一些實施態樣中，運送部分含有抗體恆定區，該抗體恆定區之N末端與抗原結合域之C末端介隔連結子或不介隔連結子而融合。 特定的實施態樣中，蛋白酶切斷序列位在運送部分中所含有的抗體恆定區內。於此情形，蛋白酶切斷序列，只要是位在當受到蛋白酶切斷時能使抗原結合域游離的抗體恆定區內即可。具體的實施態樣中，蛋白酶切斷序列位在運送部分中所含有的抗體重鏈恆定區內，更具體而言，位在比起抗體重鏈恆定區中之140號(EU編號)胺基酸更靠抗原結合域側，較佳為位在比起抗體重鏈恆定區中之122號(EU編號)胺基酸更靠抗原結合域側。於另一具體的實施態樣中，蛋白酶切斷序列位在運送部分中所含有的抗體輕鏈恆定區內，更具體而言，位在比起抗體輕鏈恆定區中之130號(EU編號)(Kabat編號130號)胺基酸更靠抗原結合域側，較佳為位在比起抗體輕鏈恆定區中之113號(EU編號)(Kabat編號113號)胺基酸更靠抗原結合域側。
本發明之一些實施態樣中，抗原結合域為單域抗體，該單域抗體之C末端與運送部分之N末端介隔連結子或未介隔連結子而融合。 特定的實施態樣中，蛋白酶切斷序列位在單域抗體內。更具體的實施態樣中，單域抗體係由VH作成的單域抗體或VHH，蛋白酶切斷序列位在比起該單域抗體之35b號(Kabat編號)胺基酸更靠運送部分側，較佳為位在比起該單域抗體之95號(Kabat編號)胺基酸更靠運送部分側，更佳為位在比起該單域抗體之109號(Kabat編號)胺基酸更靠運送部分側。於其他具體的實施態樣中，單域抗體係由VL作成的單域抗體，蛋白酶切斷序列位在比起該單域抗體之32號(Kabat編號)胺基酸更靠運送部分側，較佳為位在比起該單域抗體之91號(Kabat編號)胺基酸更靠運送部分側，更佳為位在比起該單域抗體之104號(Kabat編號)胺基酸更靠運送部分側。
本發明之一些實施態樣中，運送部分含有抗體恆定區，抗原結合域為單域抗體，該抗體恆定區與該單域抗體介隔連結子或未介隔連結子而融合。更具體的一實施態樣中，抗體恆定區之N末端與該單域抗體之C末端介隔連結子或未介隔連結子而融合。於另一具體的實施態樣中，抗體恆定區之C末端與該單域抗體的N末端介隔連結子或未介隔連結子而融合。 特定的實施態樣中，蛋白酶切斷序列位在運送部分中所含有的抗體恆定區內。更具體的實施態樣中，蛋白酶切斷序列位在比起抗體重鏈恆定區中之140號(EU編號)胺基酸更靠單域抗體側，較佳為位在比起抗體重鏈恆定區中之122號(EU編號)胺基酸更靠單域抗體側。於另一具體的實施態樣中，蛋白酶切斷序列位在比起抗體輕鏈恆定區中之130號(EU編號)(Kabat編號130號)胺基酸更靠抗原結合域側，較佳為位在比起抗體輕鏈恆定區中之113號(EU編號)(Kabat編號113號)胺基酸更靠抗原結合域側。 特定的實施態樣中，蛋白酶切斷序列位在單域內。更具體的實施態樣中，單域抗體係由VH作成的單域抗體或VHH，蛋白酶切斷序列位在比起該單域抗體之35b號(Kabat編號)胺基酸更靠抗體恆定區側，較佳為位在比起該單域抗體之95號(Kabat編號)胺基酸更靠抗體恆定區側，更佳為位在比起該單域抗體之109號(Kabat編號)胺基酸更靠抗體恆定區側。於另一具體的實施態樣中，單域抗體係由VL作成的單域抗體，蛋白酶切斷序列位在比起該單域抗體之32號(Kabat編號)胺基酸更靠抗體恆定區側，較佳為位在比起該單域抗體之91號(Kabat編號)胺基酸更靠抗體恆定區側，更佳為位在比起該單域抗體之104號(Kabat編號)胺基酸更靠抗體恆定區側。 特定的實施態樣中，蛋白酶切斷序列位在抗原結合域與運送部分之交界附近。抗原結合域與運送部分之交界附近，係指抗原結合域與運送部分連結的部位前後，不會大幅影響抗原結合域之二維結構的部分。 更具體的實施態樣中，抗原結合域與運送部分中所含有的抗體恆定區連結，蛋白酶切斷序列位在抗原結合域與抗體恆定區之交界附近。抗原結合域與抗體恆定區之交界附近，可以指抗原結合域與抗體重鏈恆定區之交界附近、或抗原結合域與抗體輕鏈恆定區之交界附近。抗原結合域係由VH作成的單域抗體或VHH，且與抗體重鏈恆定區連結時，抗原結合域與抗體恆定區之交界附近，可指從單域抗體101號(Kabat編號)之胺基酸到抗體重鏈恆定區140號(EU編號)之胺基酸之間，較佳為指單域抗體109號(Kabat編號)之胺基酸到抗體重鏈恆定區122號(EU編號)之胺基酸之間。抗原結合域係由VH作成之單域抗體或VHH，且與抗體輕鏈恆定區連結時，抗原結合域與抗體輕鏈恆定區之交界附近，可指單域抗體101號(Kabat編號)之胺基酸至抗體輕鏈恆定區130號(EU編號)(Kabat編號130號)之胺基酸之間，較佳為可指單域抗體109號(Kabat編號)之胺基酸至抗體輕鏈恆定區113號(EU編號)(Kabat編號113號)之胺基酸之間。抗原結合域係由VL作成之單域抗體時，抗原結合域與抗體恆定區之交界附近，係指從單域抗體96號(Kabat編號)，較佳為從單域抗體104號(Kabat編號)。
本發明之一些實施態樣中，多胜肽為類IgG抗體分子。如此的實施態樣，例如但不限於運送部分含有IgG抗體恆定區，為抗原結合域之單域抗體取代IgG抗體之VH，因VL而抗原結合活性受抑制之實施態樣、或運送部分含有IgG抗體恆定區，為抗原結合域之單域抗體替代IgG抗體之VL，因VH而抗原結合活性受抑制之實施態樣、或運送部分含有IgG抗體恆定區，為抗原結合域之單域抗體替代IgG抗體之VH/VL中之一者，抑制抗原結合域之抗原結合活性之其他單域抗體替代IgG抗體之VH/VL之另一者的實施態樣等。
本說明書使用之用語「類IgG抗體分子」，係為了定義具有和如IgG抗體之恆定域或恆定區之結構有實質類似的部分、及具有和如IgG抗體之可變域或可變區之結構有實質類似的部分，且帶有與IgG抗體實質類似之立體結構的分子而使用。惟本說明書之「類IgG抗體分子」，不限定為保持著類似於IgG抗體之結構而發揮抗原結合活性。
多胜肽中含有的抗原結合域可為一個也可為多數個。分別抑制多數抗原結合域之抗原結合活性的抑制域亦可為一個也可為多數個。也可多數抗原結合域分別和抑制域形成締合。多數抗原結合域也可分別和運送部分融合。多數抗原結合域可分別從多胜肽游離。用以使多數抗原結合域游離的切斷位點，可對應各抗原結合域而為多數。
多胜肽為類IgG抗體分子時，如第7圖所示，在相當於IgG抗體之二個可變區的部分各設置抗原結合域之實施態樣，為接觸到本發明的該技術領域中有通常知識者能理解的實施態樣。裝在其兩臂的抗原結合域，具有同樣的抗原結合特異性、具有不同的抗原結合特異性，皆為若是接觸本發明之該技術領域中有通常知識者則當然可理解的實施態樣，顯然未脫離本發明之範圍。
本發明之一些實施態樣中，抗原結合域更與第2抗原結合域連結。第2抗原結合域之例，但不限於此等，可列舉單域抗體、抗體斷片、存在於活體內之細胞膜蛋白質Avimer所含之約35個胺基酸之稱為A分域之模組(國際公開WO2004/044011、WO2005/040229)、包含於細胞膜表現之糖蛋白質fibronectin中之蛋白質所結合之域10Fn3分域之Adnectin(WO2002/032925)、以構成由ProteinA之58個胺基酸構成的3個螺旋束(bundle)的IgG結合分域為支架(scaffold)的Affibody(WO1995/001937)、具含33個胺基酸殘基之轉彎(turn)與2個反向並行之螺旋以及迴圈的次單元返覆層疊的構造的ankyrin返覆(ankyrin repeat：AR)之分子表面所露出之區DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(國際公開WO2002/020565)、將嗜中性球明膠酶結合lipocalin (neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等lipocalin分子中高度保守的8個反向並行的股中央方向扭曲成的活塞桶(barrel)構造的單側予以支撐的4個迴圈區之Anticalin等(WO2003/029462)、就八目鰻、沼田鰻等無顎類之獲得免疫系統而言不具免疫球蛋白之構造的可變性淋巴球受體(variable lymphocyte receptor(VLR))之富含白胺酸殘基之返覆(leucine-rich-repeat(LRR))模組返覆疊層而獲得之馬蹄形構造之內部之平行型片構造之中空區(國際公開WO2008/016854)。 較佳的實施態樣中，第2抗原結合域具有與抗原結合域不同的抗原結合特異性。較佳的實施態樣中，連結的抗原結合域與第2抗原結合域的分子量為60kDa以下。 更具體的一些實施態樣中，抗原結合域與第2抗原結合域為有各自不同之抗原結合特異性之單域抗體，連結的抗原結合域與第2抗原結合域可從多胜肽游離，游離後之抗原結合域與第2抗原結合域形成雙特異性的抗原結合分子。如此的雙特異性的抗原結合分子，例如但不限於抗原結合域特異性地結合於目標細胞表面抗原，第2抗原結合域特異性地結合於免疫細胞表面抗原之雙特異性的抗原結合分子、抗原結合域與第2抗原結合域結合在同一抗原之不同次單元的雙特異性的抗原結合分子、抗原結合域與第2抗原結合域結合於同一抗原中之不同抗原決定部位之雙特異性的抗原結合分子等。如此的雙特異性的抗原結合分子，被認為能夠用在治療起因於目標細胞之病症時，將免疫細胞增援到目標細胞的附近。 第2抗原結合域的抗原結合活性，可由運送部分抑制，也可不由運送部分抑制。又，第2抗原結合域可以和運送部分的一部分結構形成締合，也可不形成締合。尤其，抗原結合域與第2抗原結合域具有不同的抗原結合特異性時，例如如第8圖所示，即使第2抗原結合域之抗原結合活性不受抑制、第2抗原結合域與運送部分之一部分結構不形成締合，在抗原結合域不游離的狀態中，抗原結合域之抗原結合活性無法發揮，抗原結合域與第2抗原結合域連結之雙特異性的抗原結合分子，無法發揮雙特異性地結合於2種抗原的功能。 第8圖例示抗原結合域更與第2抗原結合域連結之一態樣。
本說明書中，用語「特異性」，係指特異性地結合的分子中其中一分子對於其一或多數之結合的對象分子以外之分子實質上不結合的性質。也使用在抗原結合域對於特定的抗原中含有的抗原決定部位有特異性的情形。又，也使用在抗原結合域對於某抗原中含有的多數抗原決定部位中的特定的抗原決定部位有特異性的情形。在此，實質上不結合係依結合活性的項目記載的方法決定，係指特異性結合分子針對前述對象以外之分子之結合活性，為針對前述對象分子之結合活性之80%以下、通常50%以下，較佳為30%以下，尤佳為15%以下之結合活性。
又，本發明係關於含有本發明之多胜肽與醫藥上可容許之擔體之醫藥組合物(藥劑)。
本說明書使用之「治療」(及其在文法上之衍生語，例如「治療之」、「治療之事」等)，係指企圖改變受治療之個體之自然過程的臨床性介入，在為了預防、在臨床的病態之過程之間都可實施。所期望的治療效果不限於此，包括防止病症發生或再發、症狀之減輕、減弱因病症所致任意之直接的或間接的病理的影響、防止轉移、減低病症進行速度、病症狀態之回復或緩和、及預後之寛解或改善。一些實施態樣中，本發明之多胜肽可以用在延遲病症之發作、或減慢病症之進行。
本發明中，醫藥組合物通常係指為了病症之治療或預防、或檢查・診斷的藥劑。又，本發明中，「包括多胜肽之醫藥組合物」的用語，也可代換為「包括將多胜肽投予給治療對象之步驟的病症的治療方法」，也可代換為「用於製造治療病症之醫藥之多胜肽之用途」。再者「包括多胜肽之醫藥組合物」，也可代換為「用於治療病症之多胜肽之用途」。
本發明之醫藥組合物，能以該技術領域之人士公知之方法製劑化。例如:能與水或其他藥學上可容許之液體的無菌性溶液、或懸浮液劑之注射劑之形式以非經口的使用。例如:藥理學上可容許之擔體或介質，具體而言，可考慮適當組合滅菌水或生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、運載劑、防腐劑、黏結劑等，以一般認可的製藥實務要求的單位用量形態混合而製劑化。該等製劑中的有效成分量，可設定為可獲得指示範圍之適當容量。
用於注射之無菌組合物，可使用如注射用蒸餾水之運載劑而依通常之製劑實務進行調配。注射用之水溶液，例如生理食鹽水、含葡萄糖或含其他輔助藥(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉)之等張溶液。也可併用適當的溶解輔助劑，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(聚山梨糖醇酸酯80(TM)、HCO-50等)。
油性液，例如麻油、大豆油，溶解輔助劑可併用苯甲酸苄酯及/或苯甲醇。又，也可摻合緩衝劑(例如:磷酸鹽緩衝液及醋酸鈉緩衝液)、止痛劑(例如:鹽酸普羅卡因)、安定劑(例如:苯甲醇及酚)、抗氧化劑。製備的注射液通常充填在適當的安瓿。
本發明之醫藥組合物較佳為以非經口投予而投予。例如可製成注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予型之組合物。例如可利用靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等對於全身或局部投予。
投予方法可視患者之年齡、症狀適當選擇。含多胜肽之醫藥組合物之投予量，例如可設定為每次為體重每1 kg為0.0001 mg至1000 mg之範圍。或，可定為例如每位患者為0.001~100000 mg之投予量，但本發明不一定限於該等數値。投予量及投予方法，視患者之體重、年齡、症狀等而變動，但如為該技術領域之人士，可考慮該等條件，設定適當的投予量及投予方法。
又，本發明也關於製造包括具抑制域之運送部分與抗原結合域之多胜肽之方法。 作為製造本發明之多胜肽之一方法，有下列方法:取得有抗原結合活性之抗原結合域，以該抗原結合域之抗原結合活性會受抑制域抑制的方式，使抗原結合域與運送部分連結而形成多胜肽前驅物，於該多胜肽前驅物更插入切斷位點、或將該多胜肽前驅物之一部分改變為切斷位點。只要能於多胜肽前驅物導入切斷位點即可，切斷位點之導入方法可為切斷位點之插入與多胜肽前驅物之一部分之改變中的任意者。也可將兩種手法合用，於多胜肽前驅物導入改變位點，針對於此，對於接觸本說明書之該技術領域中有通常知識者為顯而易見，未脫離本發明之範圍。 又，作為製造本發明之多胜肽之其他的方法，有下列方法:取得有抗原結合活性之抗原結合域，以該抗原結合域之抗原結合活性會受抑制域抑制的方式，將抗原結合域與運送部分介隔切斷位點而連結，並形成多胜肽。當將抗原結合域與運送部分介隔切斷位點而連結時，可為在抗原結合域與運送部分之間夾持切斷位點的形態，也可將抗原結合域之一部份或/及運送部分之一部分改變而作為切斷位點之一部分使用的形態。
針對使用單域抗體作為抗原結合域並使用蛋白酶切斷序列作為切斷位點之實施態樣，記載下列多胜肽製造方法。
本發明之一實施態樣中，含有具抑制域之運送部分與抗原結合域之多胜肽之製造方法包括下列步驟： (a) 取得會結合於目標抗原之單域抗體之步驟； (b) 以(a)步驟取得之單域抗體之抗原結合活性會受運送部分之抑制域抑制的方式，使該單域抗體與該運送部分連結而形成多胜肽前驅物之步驟； (c) 於前述多胜肽前驅物導入蛋白酶切斷序列之步驟。
本發明之一實施態樣中，含有具抑制域之運送部分與抗原結合域之多胜肽之製造方法，包括下列步驟： (a) 取得會結合於目標抗原之單域抗體之步驟； (b)以(a)步驟取得之單域抗體之抗原結合活性會受運送部分之抑制域抑制的方式，使該單域抗體與該運送部分連結而形成多胜肽前驅物之步驟； (c)於前述單域抗體與前述運送部分之交界附近導入蛋白酶切斷序列之步驟。
本發明之一實施態樣中，含有具抑制域之運送部分與抗原結合域之多胜肽之製造方法，包括下列步驟： (a) 取得會與目標抗原結合之單域抗體之步驟； (b)以(a)步驟取得之單域抗體之抗原結合活性會受運送部分之抑制域抑制的方式，使該單域抗體介隔蛋白酶切斷序列而與該運送部分連結，形成多胜肽之步驟。
特定的實施態樣中，含有具抑制域之運送部分與抗原結合域之多胜肽之製造方法，更包括下列步驟： (d) 確認納入到前述多胜肽或前述多胜肽前驅物中之前述單域抗體的對於前述目標抗原之結合活性減弱、或喪失之步驟。 本發明中，「結合活性減弱」，係指相較於連結前，對於目標抗原之結合活性減少，不論減少的程度。
特定的實施態樣中，含有具抑制域之運送部分與抗原結合域之多胜肽之製造方法更包括下列步驟： (e) 確認藉由將前述蛋白酶切斷序列以蛋白酶切斷，使前述單域抗體游離，游離之單域抗體結合於抗原之步驟。
本發明之一實施態樣中，含有具抑制域之運送部分與抗原結合域之類IgG抗體分子多胜肽之製造方法，包括下列步驟： (a) 取得會與目標抗原結合之單域抗體之步驟； (b) 以(a)步驟取得之單域抗體之抗原結合活性會受抑制的方式，將該單域抗體代替IgG抗體之VH而與VL締合，或將該單域抗體代替IgG抗體之VL而與VH締合，形成導入了前述單域抗體之類IgG抗體分子前驅物之步驟； (c) 於導入了前述單域抗體之類IgG抗體分子前驅物導入蛋白酶切斷序列之步驟。
本發明之一實施態樣中，含有具抑制域之運送部分與抗原結合域之類IgG抗體分子多胜肽之製造方法，包括下列步驟： (a) 取得會與目標抗原結合之單域抗體之步驟； (b) 以(a)步驟取得之單域抗體之抗原結合活性受抑制之方式，將該單域抗體取代IgG抗體之VH而與VL締合，或將該單域抗體取代IgG抗體之VL而與VH締合，藉此形成導入了前述單域抗體之類IgG抗體分子前驅物之步驟； (c) 在前述單域抗體與前述類IgG抗體分子前驅物中之抗體恆定區之交界附近導入蛋白酶切斷序列之步驟。
本發明之一實施態樣中，含有具抑制域之運送部分與抗原結合域之類IgG抗體分子多胜肽之製造方法，包括下列步驟： (a) 取得會與目標抗原結合之單域抗體之步驟； (b) 以(a)步驟取得之單域抗體之抗原結合活性會受抑制之方式，將該單域抗體取代IgG抗體VH或VL，而介隔蛋白酶切斷序列與IgG抗體之重鏈恆定區或輕鏈恆定區連結，形成導入了前述單域抗體之類IgG抗體分子之步驟。
特定的實施態樣中，含有具抑制域之運送部分與抗原結合域之類IgG抗體分子多胜肽之製造方法，更包括下列步驟： (d) 確認對於前述類IgG抗體分子或前述類IgG抗體分子前驅物所導入的前述單域抗體針對前述目標抗原之結合活性減弱、或喪失之步驟。 本發明中，「結合活性減弱」係指相較於締合前或連結前，對於目標抗原的結合活性減少，不論減少的程度。
特定的實施態樣中，含有具抑制域之運送部分與抗原結合域之類IgG抗體分子多胜肽之製造方法，更包括下列步驟： (e) 確認藉由將前述蛋白酶切斷序列以蛋白酶切斷，使前述單域抗體游離，游離的單域抗體結合於前述目標抗原之步驟。
使用VH/VL/VHH作為抑制域時，使單域抗體之抗原結合活性受運送部分之抑制域所抑制之方法，有使單域抗體與VH/VL/VHH締合之方法。抑制準備的單域抗體之抗原結合活性之VH/VL/VHH，可藉由使既知之VH/VL/VHH與該單域抗體締合，比較締合前後之單域抗體之抗原結合活性以篩選。 又，作為使單域抗體之抗原結合活性以特定的VH/VL/VHH抑制之其他方法，可藉由置換單域抗體中之涉及與VH/VL/VHH之締合之胺基酸殘基而促進締合、或使用此等胺基酸殘基為從起初便能夠促進締合之胺基酸的單域抗體，以準備締合前後之抗原結合活性之差處於所望程度的單域抗體/抑制域配對。
本發明之一實施態樣中，含有具抑制域之運送部分與抗原結合域之類IgG抗體分子多胜肽之製造方法，包括下列步驟： (a) 將單域抗體中之涉及與抗體VH之締合之胺基酸殘基置換，或將單域抗體中之涉及與抗體VL之締合之胺基酸殘基置換，製作保持該單域抗體針對目標抗原之結合活性之改變單域抗體之步驟； (b) 以抑制(a)步驟製作之改變單域抗體之抗原結合活性之方式，使該改變單域抗體與抗體VL締合，或使該改變單域抗體與抗體VH締合，藉此形成導入了該改變單域抗體之類IgG抗體分子前驅物之步驟； (c) 對於導入了前述改變單域抗體之類IgG抗體分子前驅物導入蛋白酶切斷序列之步驟。
本發明之一實施態樣中，含有具抑制域之運送部分與抗原結合域之類IgG抗體分子多胜肽之製造方法，包括下列步驟： (a) 將單域抗體中之涉及與抗體VH之締合之胺基酸殘基置換，或將單域抗體中之涉及與抗體VL之締合之胺基酸殘基置換，製作保持該單域抗體針對目標抗原之結合活性之改變單域抗體之步驟； (b) 以抑制(a)步驟製作之改變單域抗體之抗原結合活性的方式，使該改變單域抗體與抗體VL締合，或使該改變單域抗體與抗體VH締合，藉此形成導入了該改變單域抗體之類IgG抗體分子前驅物之步驟； (c) 於前述改變單域抗體與前述類IgG抗體分子前驅物之恆定區之交界附近導入蛋白酶切斷序列之步驟。
本發明之一實施態樣中，含有具抑制域之運送部分與抗原結合域之類IgG抗體分子多胜肽之製造方法，包括下列步驟： (a) 將單域抗體中之涉及與抗體VH之締合之胺基酸殘基置換，或將單域抗體中之涉及與抗體VL之締合之胺基酸殘基置換，製作保持該單域抗體針對目標抗原之結合活性之改變單域抗體之步驟； (b) 以抑制(a)步驟製作之改變單域抗體之抗原結合活性之方式，將該改變單域抗體介隔蛋白酶切斷序列而與IgG抗體之重鏈恆定區連結，或將該改變單域抗體介隔蛋白酶切斷序列而與IgG抗體之輕鏈恆定區連結，形成導入了該改變單域抗體之類IgG抗體分子之步驟。
特定的實施態樣中，含有具抑制域之運送部分與抗原結合域之類IgG抗體分子多胜肽之製造方法，更包括下列步驟： (d) 確認於前述類IgG抗體分子或前述類IgG抗體分子前驅物導入的前述改變單域抗體針對前述目標抗原之結合活性減弱、或喪失之步驟。 本發明中，「結合活性減弱」，係指相較於締合前或連結前，針對目標抗原之結合活性減少，不論減少的程度。
特定的實施態樣中，含有具抑制域之運送部分與抗原結合域之類IgG抗體分子多胜肽之製造方法更包括下列步驟： (e) 確認藉由將前述蛋白酶切斷序列以蛋白酶切斷而使前述改變單域抗體游離，游離的改變單域抗體結合於前述目標抗原。
又，本發明也關於編碼含有具抑制域之運送部分與抗原結合域之多胜肽的聚核苷酸。
又，本發明之中聚核苷酸通常被載持(插入)於適當載體並導入寄主細胞。該載體只要可安定地保持插入之核酸即不特別限定，例如寄主使用大腸菌，則選殖用載體較佳為pBluescript載體(Stratagene社製)等，可利用市售之各種載體。為了生產本發明之多胜肽而使用載體之情形，尤以表現載體為有用的。表現載體只要是在試管內、大腸菌內、培養細胞內、生物個體內表現多胜肽之載體，即不特別限制，例如如於試管內表現，較佳為pBEST載體(Promega社製)、於大腸菌則較佳為pET載體(Invitrogen社製)、於培養細胞則較佳為pME18S-FL3載體(GenBank Accession No. AB009864)、於生物個體則較佳為pME18S載體(Mol Cell Biol. 8:466-472(1988))等。本發明之DNA插入載體可依常法，例如利用使用限制酶部位之接合酶反應來進行(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons.Section 11.4-11.11)。
上述寄主細胞不特別限定，可視目的使用各種寄主細胞。用於表現多胜肽之細胞，例如:細菌細胞(例：鏈球菌、葡萄球菌、大腸菌、鏈黴菌、枯草菌)、真菌細胞(例：酵母、麴菌)、昆蟲細胞(例：果蠅S2、斜紋夜蛾(Spodoptera)SF9)、動物細胞(例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes 黑色素瘤(Melanoma)細胞)及植物細胞。載體對寄主細胞之導入，例如可利用磷酸鈣沉澱法、電穿孔法(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons.Section 9.1-9.9)、脂質體(Lipofectamine)法(GIBCO-BRL社製)、微注射法等公知之方法進行。
為了使寄主細胞之中表現之多胜肽分泌至微胞體之內腔、細胞周邊腔或細胞外之環境，可將適當之分泌信號嵌入目的多胜肽。該等信號對於目的多胜肽可為內因性也可為異種信號。
上述製造方法之中多胜肽之回收，當本發明之多胜肽分泌至培養基之情形，將培養基回收。當本發明之多胜肽產生於細胞內時，先將該細胞溶解之後將多胜肽回收。
自重組細胞培養物將本發明之多胜肽回收並精製時，可利用包含硫酸銨或乙醇沉澱、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性交互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析及凝集素(lectin)層析之公知方法。
又，本發明之一些實施態樣中使用的抗原結合域可列舉單域抗體，在此等實施態樣中，該單域抗體藉由與特定的VL締合、或藉由與特定的VH締合、或藉由與特定的VHH締合，抗原結合活性會受抑制。本發明亦關於篩選如此的單域抗體的方法。
作為抑制單域抗體之抗原結合活性之VL/VH/VHH可列舉序列已知之VL/VH/VHH，例如序列已登錄於IMGT、Kabat資料庫者。又，也可使用從人類抗體資料庫等新鑑別出的序列作為VL/VH/VHH。藉由將該等序列組合並製備蛋白質，使用前述方法測定結合活性，可選擇會抑制單域抗體之結合活性之VL/VH/VHH。
本發明之一些實施態樣中，就抑制單域抗體之抗原結合活性之VL/VH/VHH而言，可使用具有人類抗體生殖系序列者。例如:使用VL作為抑制域時，可使用有kappa鏈之框架序列之VL、具有lamda鏈之框架序列之VL。又，也可使用如將kappa鏈之框架序列與lamda鏈之框架序列組合而得的框架序列般的，有經改變之框架序列的VL。
本發明之一實施態樣中提供一種篩選藉由與特定的VL締合會抑制抗原結合活性之單域抗體之方法，包括下列步驟： (a) 取得有目標抗原結合活性之單域抗體之步驟； (b) 使於(a)步驟取得之單域抗體與特定的VL締合之步驟； (c) 確認於(b)步驟與特定的VL締合而得的前述單域抗體對於前述抗原的結合活性減弱、或喪失之步驟。 本發明中，「結合活性減弱」，係指相較於締合前，針對目標抗原之結合活性減少，不論減少的程度。
本發明之一實施態樣中，提供一種篩選藉由與特定的VH締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體之方法，包括下列步驟： (a) 取得有目標抗原結合活性之單域抗體之步驟； (b) 使於(a)步驟取得之單域抗體與特定的VH締合之步驟； (c) 確認於(b)步驟與特定的VH締合而得的前述單域抗體對於前述抗原之結合活性減弱、或喪失之步驟。 本發明中，「結合活性減弱」，係指相較於締合前，針對目標抗原之結合活性減少，不論減少的程度。
本發明之一實施態樣中提供一種篩選藉由與特定的VHH締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體之方法，包括下列步驟： (a) 取得具有目標抗原結合活性之單域抗體之步驟； (b) 使於(a)步驟取得之單域抗體與特定的VHH締合之步驟； (c) 確認於(b)步驟與特定的VHH締合而得的前述單域抗體對於前述抗原之結合活性減弱、或喪失。 本發明中，「結合活性減弱」，係指相較於締合前，針對目標抗原之結合活性減少，不論減少的程度之步驟。
作為使單域抗體與特定的VL/VH/VHH締合之方法，例如設計將完全抗體、Fab、Fab'、(Fab)2等包括VH與VL兩者的抗體或抗體斷片中之VH與VL的其中一者的序列替代為使用單域抗體的序列的分子，並使具該序列之多胜肽表現之方法。
又，本發明除了篩選藉由與特定的VL締合、或藉由與特定的VH締合、或藉由與特定的VHH締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體以外，也係關於製造藉由促進單域抗體與特定的VL/VH/VHH的締合、藉由促進與特定的VL之締合、或藉由促進與特定的VH的締合、或藉由促進與特定的VHH的締合，而抗原結合活性受抑制之單域抗體之方法。
本發明之一實施態樣中，提供一種製造藉由與特定的VL締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體之方法，包括下列步驟： (a) 置換單域抗體中之涉及與抗體VL之締合之胺基酸殘基，製作保持該單域抗體對於目標抗原之結合活性之改變單域抗體之步驟。
於特定的實施態樣中，提供一種製造藉由與特定的VL締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體之方法，更包括下列步驟： (b) 使於(a)步驟製作之改變單域抗體與特定的VL締合之步驟； (c) 確認與該VL締合而得的前述改變單域抗體之抗原結合活性減弱、或喪失之步驟。 本發明中，「結合活性減弱」，係指相較於締合前，針對目標抗原之結合活性減少，不論減少的程度。
本發明之一實施態樣中，提供一種製造藉由與特定的VH締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體之方法，包括下列步驟： (a) 置換單域抗體中之涉及與抗體VH之締合之胺基酸殘基，製作保持該單域抗體對於目標抗原之結合活性之改變單域抗體之步驟。
於特定的實施態樣中，提供一種製造藉由與特定的VH締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體之方法，更包括下列步驟： (b) 使於(a)步驟製作之改變單域抗體與特定的VH締合之步驟； (c) 確認與該VH締合而得的前述改變單域抗體之抗原結合活性減弱、或喪失之步驟。 本發明中，「結合活性減弱」，係指相較於締合前，針對目標抗原之結合活性減少，不論減少的程度。
本發明之一實施態樣中，提供一種製造藉由與特定的VHH締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體之方法，包括下列步驟： (a) 置換單域抗體中之涉及與VHH之締合之胺基酸殘基，製作保持該單域抗體對於目標抗原之結合活性之改變單域抗體之步驟。
於特定的實施態樣中，提供一種製造藉由與特定的VHH締合而抗原結合活性受抑制之單域抗體之方法，更包括下列步驟： (b) 使於(a)步驟製作之改變單域抗體與特定的VHH締合之步驟； (c) 確認與該VHH締合而得的前述改變單域抗體之抗原結合活性減弱、或喪失之步驟。 本發明中，「結合活性減弱」，係指相較於締合前，針對目標抗原之結合活性減少，不論減少的程度。
單域抗體與特定的VL/VH/VHH締合之步驟，可利用設計完全抗體、Fab、Fab'、(Fab)2等包括VH與VL兩者的抗體或抗體斷片中之VH與VL的其中一者的序列替代為單域抗體之序列者，並使具該序列之多胜肽表現之方法實施。
依本發明之一實施態樣，藉由與本發明之特定的VL/VH/VHH締合而抑制或喪失抗原結合活性之單域抗體，可以從含有多數單域抗體與第1締合支持域連結而得的融合多胜肽的資料庫取得。
本說明書中，就「資料庫」之實施態樣而言，可提供能夠以良好效率取得藉由與特定的VL/VH/VHH締合而抑制或喪失抗原結合活性之單域抗體的資料庫。
本說明書中，「資料庫」係指有各自不同序列之多數融合多胜肽、或編碼該等融合多胜肽的核酸或聚核苷酸之集合。資料庫中含有的多數融合多胜肽不是單一序列，而是序列互異的融合多胜肽。
本說明書中，在序列互異之多數融合多胜肽的記載中的「序列互異」的用語，係指資料庫中之各個融合多胜肽的序列互異。更佳為資料庫中之各個融合多胜肽中之單域抗體部分的序列不同。亦即，資料庫中的互異的序列數係反映出資料庫中之序列相異的獨立選殖體的數目，有時也稱呼為「資料庫大小」。通常的噬菌體呈現資料庫為10 6至10 12，可藉由採用核糖體呈現法等公知之技術而將資料庫大小擴大到10 14。但是噬菌體資料庫之淘選時使用的噬菌體粒子的實際數目，通常比起資料庫大小大了10至10,000倍。此冗餘的倍數也稱為「資料庫當量數」，表示有相同胺基酸序列的各個選殖體可能存在10至10,000個。所以本發明中「序列互異」的用語，係指資料庫當量數除外的資料庫中之各個多胜肽的序列互異，更具體而言，係指序列互異的多胜肽存在10 6至10 14個分子，較佳為10 7至10 12個分子。
又，本發明之由多數融合多胜肽為主形成的資料庫的記載中的「多數」的用語，例如係指本發明之多胜肽、聚核苷酸分子、載體或病毒通常為此物質的2種以上之種類的集合。例如:某2種以上之物質就特定形質而言互異時，代表此物質存在2種種類以上。舉例而言，在胺基酸序列中之特定的胺基酸位置觀察到的變異體胺基酸。例如:除了露出在表面的非常多樣化的胺基酸位置的特定的變異體胺基酸以外為實質上相同，較佳當有為相同序列之本發明之2個以上之多胜肽時，本發明之多胜肽存在多數個。於其他例中，編碼露出在表面的非常多樣化的胺基酸位置的特定的變異體胺基酸之鹼基以外係實質上相同，較佳為若有為相同序列之本發明之2種以上之聚核苷酸分子時，本發明之聚核苷酸分子有多數個存在。
作為以結合活性作為指標之融合多胜肽之篩選方法，宜使用利用噬菌體載體之淘選法。藉由將編碼單域抗體的基因、與編碼IgG抗體CH1域或輕鏈恆定區之基因，以適當的實施態樣連結，可形成融合多胜肽。藉由將編碼融合多胜肽之基因插入到噬菌體載體，可取得表面表現融合多胜肽之噬菌體。使此噬菌體與所望抗原接觸後，回收結合於抗原的噬菌體，可以回收編碼有目的之結合活性之融合多胜肽的DNA。藉由視需要重複此操作，可以濃縮有所望之結合活性之融合多胜肽。
噬菌體呈現法以外，就使用資料庫並利用淘選來取得融合多胜肽的技術而言，已知有使用無細胞轉譯系的技術、在細胞或病毒表面提示融合多胜肽之技術、使用乳劑的技術等。例如:使用無細胞轉譯系之技術可使用:藉由去除終止密碼子等而介由核糖體形成mRNA與經轉譯之蛋白質之複合體的核糖體展示法、利用嘌呤黴素(puromycin)等化合物使基因序列和經轉譯之蛋白質共價鍵結之cDNA展示法、mRNA展示法、使用對應核酸之結合蛋白質形成基因和轉譯之蛋白質之複合體之CIS 展示法等。又，作為在細胞或病毒表面展示融合多胜肽之技術，可使用噬菌體展示法，除此以外可使用E. coli展示法、格蘭氏陽性菌展示法、酵母展示法、哺乳類細胞展示法、病毒展示法等。作為使用乳劑之技術，可使用使基因及轉譯關連分子內包在乳劑中的試管內(in vitro)病毒展示法等。該等方法已為公知 (Nat Biotechnol. 2000 Dec;18(12):1287-92、Nucleic Acids Res. 2006;34(19):e127、Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Mar 2;101(9):2806-10、Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jun 22;101(25):9193-8、Protein Eng Des Sel. 2008 Apr;21(4):247-55、Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Sep 26;97(20):10701-5、MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):508-18、Methods Mol Biol. 2012;911:183-98)。
作為從含有多數使單域抗體與第1締合支持域連結而得之融合多胜肽之資料庫，取得目的之單域抗體之方法，可以利用使抑制域與第2締合支持域連結而得的締合夥伴。 本說明書中，「第1締合支持域」、「第2締合支持域」，係指彼此能以疏水鍵、氫鍵、離子鍵等鍵結交互作用並形成締合體之分域。第1締合支持域與第2締合支持域之較佳例，例如但不限於抗體之輕鏈恆定區(CL)與重鏈恆定區之CH1域。
第1締合支持域與第2締合支持域係交互作用，無論單域抗體與抑制域之締合性之程度，融合多胜肽與締合夥伴能形成締合。
本發明之另一實施態樣中，提供含有多數使單域抗體與IgG抗體輕鏈恆定區連結而得的融合多胜肽的資料庫，且係含有前述單域抗體中藉由與特定的VL/VH/VHH締合而抗原結合活性受抑制或喪失的單域抗體的資料庫、及從該資料庫篩選藉由與特定的VL/VH/VHH締合會抑制或喪失抗原結合活性之單域抗體之方法。
具體的一實施態樣中，如第9A圖之(1)(2)(3)、第9B圖、第9C圖所示， (1)將由單域抗體與第1締合支持域連結而得的融合多胜肽利用噬菌體呈現等呈現法呈現在噬菌體等表面； (2)準備抑制域與第2締合支持域連結而得的締合夥伴，使融合多胜肽與締合夥伴締合。選擇於此融合多胜肽與締合夥伴締合的狀態，不結合於目標抗原、或抗原結合活性為一定値以下之融合多胜肽； (3)將(2)所選擇的融合多胜肽中之單域抗體與締合夥伴中之抑制域的締合解除，選擇於單域抗體與抑制域不締合之狀態會和目標抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上的融合多胜肽。 在此，作為解除單域抗體與抑制域之締合之方法，可使用如第9B圖所示之將締合夥伴之抑制域與第2締合支持域之交界附近予以切斷的方法、如第9C圖所示之將融合多胜肽之單域抗體與第1締合支持域之交界附近予以切斷的方法等。
本發明之其他實施態樣中，提供一種比較單域抗體之結合活性差異的方法，係將第9A圖至第9C圖表示之比較單域抗體與抑制域之締合解除/非解除狀態之單域抗體之結合活性差異，替代為如第9D圖表示之比較使單域抗體與抑制域同時表現時/不同時表現抑制域之狀態且表現單域抗體時之單域抗體之結合活性之差異。 如第9D圖(1)所示，使單域抗體與抑制域同時表現而形成締合，選擇包括於該狀態不結合於抗原、或抗原結合活性為一定値以下之單域抗體的融合多胜肽，如第9D圖(2)/(2')/(2'')所示，於不同時表現抑制域之狀態使單域抗體表現，選擇包括於該狀態與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上之單域抗體之融合多胜肽，以從含有多數使單域抗體與第1締合支持域連結而得的融合多胜肽的資料庫，可篩選藉由與特定的抑制域，例如VH/VL/VHH締合而抗原結合活性受抑制或喪失之單域抗體。於不同時表現抑制域之狀態使單域抗體表現，選擇包括於該狀態會與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上之單域抗體的多胜肽，之後使單域抗體與抑制域同時表現而形成締合，選擇包括於該狀態不與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以下之單域抗體的多胜肽的方法，也可以從含有多數使單域抗體與第1締合支持域連結而得的融合多胜肽的資料庫，篩選出藉由與特定的抑制域，例如VH/VL/VHH締合而受抑制或喪失抗原結合活性的單域抗體。又藉由如第9D圖(2)/(2')/(2'')表示之不同時表現抑制域之狀態使單域抗體表現(僅使單域抗體表現、或僅使包含單域抗體與第1締合支持域之融合多胜肽表現、或使含有單域抗體與第1締合域之融合多胜肽僅與第2締合支持域締合)，選擇含有於該狀態會與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上之單域抗體之融合多胜肽，從選出的融合多胜肽，來選擇如第9D圖(1)表示之含有使單域抗體與抑制域同時表現而形成締合，於該狀態不與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以下之單域抗體的融合多胜肽，也可以從含有多數使單域抗體與第1締合支持域連結而得的融合多胜肽的資料庫篩選出藉由與特定的抑制域，例如VH/VL/VHH締合而抗原結合活性受抑制或喪失的單域抗體。 「抗原結合活性為一定値以下」，可指例如依本願說明書例示之方法測定抗原結合活性時，低於一定的基準的抗原結合活性。「抗原結合活性為一定値以上」，同樣可指例如依本願說明書例示之方法測定抗原結合活性時，高於一定的基準的抗原結合活性。抗原結合活性為一定値以上融合多胜肽，比起抗原結合活性為一定値以下的融合多胜肽更強地結合於抗原。
上述(3)選擇的融合多胜肽，包括於與抑制域締合之狀態無或為弱抗原結合活性，在未與抑制域締合的狀態有或為強抗原結合活性的單域抗體。若解析依如此的方法選擇的融合多胜肽的序列，可解明其中含有的單域抗體的序列，可製造該單域抗體。
對於使用融合多胜肽與締合夥伴來篩選含有目的單域抗體之融合多胜肽之方法而言，重要的是比較單域抗體之與抑制域在締合/非締合狀態的抗原結合活性。如第9(A)圖(2')(3')所示，先確認呈現的融合多胜肽的抗原結合活性，並選擇與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上之融合多胜肽後，使它們的融合多胜肽與締合夥伴締合，選擇於締合狀態下不與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以下之融合多胜肽的方法，也可以取得含有目的之單域抗體之融合多胜肽。
以下，針對使用IgG抗體CH1域作為第1締合支持域，使用IgG抗體CL作為第2締合支持域的一些實施態樣説明。 可以從含有多數使單域抗體與IgG抗體CH1域連結而得的融合多胜肽的資料庫篩選含有目的之單域抗體之融合多胜肽。
本發明之一些實施態樣中，提供含有多數使單域抗體與IgG抗體CH1域連結而得之融合多胜肽之資料庫，該資料庫含有前述單域抗體中藉由與特定的VL/VH/VHH締合而抗原結合活性受抑制或喪失之單域抗體、及從該資料庫篩選含有藉由與特定的VL/VH/VHH締合、抗原結合活性會受抑制或喪失之單域抗體之融合多胜肽之方法。
於特定的實施態樣中，提供從含有多數使單域抗體與IgG抗體CH1域連結而得的融合多胜肽的資料庫，篩選含有藉由與特定的VL締合而抗原結合活性受抑制或喪失之單域抗體之融合多胜肽的方法。 具體而言，提供一種單域抗體的篩選方法，包括下列步驟： (a) 使本發明之資料庫之融合多胜肽於試管內(in vitro)呈現之步驟； (b) 準備特定的VL與IgG抗體輕鏈恆定區融合而得的締合夥伴之步驟； (c) 將於(a)步驟呈現的融合多胜肽與於(b)步驟準備的締合夥伴締合，選擇於單域抗體與前述VL締合之狀態不結合於抗原、或抗原結合活性為一定値以下的融合多胜肽之步驟； (d) 選擇於(c)步驟選擇的融合多胜肽中含有的單域抗體在前述VL未締合的狀態會與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上的融合多胜肽之步驟。
前述(b)步驟準備的締合夥伴更含有蛋白酶切斷序列，前述(d)步驟可藉由蛋白酶處理解除前述單域抗體與前述VL之締合，確認在單域抗體與VL未締合的狀態時單域抗體之抗原結合活性。締合夥伴中之蛋白酶切斷序列，只要切斷時單域抗體與VL之締合會解除即可，位置不限定。蛋白酶切斷序列位置，例如可以位在締合夥伴之VL與IgG抗體輕鏈恆定區之交界附近，較佳為位於VL之96號(Kabat編號)胺基酸至抗體輕鏈恆定區130號(EU編號)(Kabat編號130號)胺基酸之間，更佳為VL之104號(Kabat編號)胺基酸至抗體輕鏈恆定區113號(EU編號)(Kabat編號113號)胺基酸之間。 又，可將使用含有蛋白酶切斷序列之締合夥伴替代為在資料庫中之融合多胜肽導入蛋白酶切斷序列，藉由融合多胜肽被蛋白酶切斷而解除單域抗體與VL之締合。融合多胜肽中之蛋白酶切斷序列，只要在切斷時會解除單域抗體與VL之締合，且切斷後仍保持單域抗體之抗原結合活性即可，其位置不限定。蛋白酶切斷序列位置之例，例如可位在融合多胜肽中之單域抗體與IgG抗體CH1域之交界附近。
又，前述(d)步驟中，可使於(c)步驟選擇之融合多胜肽全長或含有單域抗體之部分再度呈現，確認於單域抗體與VL未締合之狀態時單域抗體之抗原結合活性。
特定的實施態樣中，提供從含有多數使單域抗體與IgG抗體輕鏈恆定區連結而得的融合多胜肽的資料庫，篩選含有藉由與特定的VH締合抗原結合活性會受抑制或喪失之含有單域抗體之融合多胜肽的方法。具體而言，提供一種含有單域抗體之融合多胜肽之篩選方法，包括下列步驟： (a) 使本發明之資料庫之融合多胜肽於試管內(in vitro)呈現之步驟； (b) 準備特定的VH與IgG抗體CH1域融合而得的締合夥伴之步驟； (c) 將於(a)步驟呈現的融合多胜肽與在(b)步驟準備的締合夥伴締合，選擇於單域抗體與前述VH締合的狀態不與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以下的融合多胜肽之步驟； (d) 選擇於(c)步驟選擇之融合多胜肽中含有的單域抗體與前述VH未締合之狀態時與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上之融合多胜肽之步驟。
前述(b)步驟準備的締合夥伴更含有蛋白酶切斷序列，前述(d)步驟中，可藉由蛋白酶處理使前述單域抗體與前述VH之締合解除，能夠確認單域抗體與VH未締合之狀態時單域抗體之抗原結合活性。締合夥伴中之蛋白酶切斷序列，只要切斷時單域抗體與VH之締合會解除即可，位置不限定。蛋白酶切斷序列位置之例，例如可以位在締合夥伴之VH與IgG抗體CH1域之交界附近，較佳為VH之101號(Kabat編號)胺基酸至抗體重鏈恆定區140號(EU編號)胺基酸之間，又更佳為VH之109號(Kabat編號)胺基酸至抗體重鏈恆定區122號(EU編號)胺基酸之間。 又，藉由使用含有蛋白酶切斷序列之締合夥伴，替代為在資料庫中之融合多胜肽導入蛋白酶切斷序列，使融合多胜肽被蛋白酶切斷，以解除單域抗體與VH之締合。融合多胜肽中之蛋白酶切斷序列，只要在切斷時單域抗體與VH之締合會解除，且切斷後仍保持單域抗體之抗原結合活性即可，其位置不限定。蛋白酶切斷序列位置，例如可位在融合多胜肽中之單域抗體與IgG抗體輕鏈恆定區之交界附近。
又，前述(d)步驟中，可使於(c)步驟選擇之融合多胜肽之全長或含有單域抗體之部分再度呈現，確認於單域抗體與VH未締合之狀態時單域抗體之抗原結合活性。
本發明記載之胺基酸序列中含有的胺基酸，有時會受到轉譯後修飾(例如:利用N末端的麩醯胺酸的焦麩胺醯基(pyroglutamyl)化而修飾為焦麩胺酸為該技術領域中有通常知識者周知的修飾)，如此方式胺基酸經轉譯後修飾的情形，也當然包括於本發明記載之胺基酸序列。
本說明書記載之一或多數實施態樣予以任意組合者，只要基於該技術領域中有通常知識者之技術常識在技術方面不矛盾，該技術領域中有通常知識者當然理解為包括在本發明中。 [實施例]
以下為本發明之方法與組合物之實施例。應可理解參照上述一般的記載可實施各種其他的實施態樣。
實施例1　既存的蛋白酶活化抗體的課題 有報告藉由以在如癌組織、發炎性組織之病變部位表現的蛋白酶切斷，才會發揮抗原結合活性的抗體的製作方法。稱為Probody的同抗體，係如第1圖所示，藉由將遮蓋抗體之抗原結合部位的胜肽以在病變部位表現的蛋白酶切斷的連結子和抗體連結，而妨礙抗體之抗原結合活性的抗體分子(非專利文獻18)。構成Probody的連結子藉由被在目標病態部位表現的蛋白酶切斷而將遮罩胜肽解離，生成抗原結合活性回復的抗體分子，能夠於目標的病態組織與抗原結合。 Probody據認為利用如上述機轉於目標的之病態部位選擇性地與抗原結合而能擴大治療窗(therapeutic window)。但是Probody之利用蛋白酶所為的抗體的切斷為不可逆，故據認為在病態部位被切斷的抗體，可能會從病態部位再回到血中，可能乘著血流而分佈到正常組織，結合於正常組織表現的抗原。被蛋白酶活化的Probody，因為與活化前的Probody同樣保有Fc區，所以擁有長的血中滯留性。因此，被在病態部位表現的蛋白酶活化的抗體長時間滯留於血中的可能性。又，即使是在病態部位表現上昇的蛋白酶，如此的蛋白酶在正常組織仍以低水平表現，且在病態部位產生的游離型蛋白酶也可能漏出到血中(The Chinese-German Journal of Clinical Oncology Jun. 2004, Vol. 3, No. 2 P78-P80)，所以如此的游離型蛋白酶可能會將Probody活化。所以，據認為Probody可能在病態部位以外也被活化，如此被活化的Probody也同樣會長期滯留在血中。如此，Probody在病態部位、正常組織、血中被持續地活化，被活化的Probody若有長的血中滯留性，則可能蓄積在血中。蓄積在血中的被活化的Probody有與在正常組織表現的抗原結合而發生副作用的可能性(第2圖)。 Probody會利用連結子而藉由與抗體連結成的遮罩胜肽造成其抗原結合活性受抑制，但抗原結合活性不會完全被抑制。Probody，經由連結子連結成的遮罩胜肽會處在結合於抗原結合部位的狀態與解離狀態之平衡狀態，解離狀態之分子可以與抗原結合(第3圖)。實際上，非專利文獻17記載之抗EGFR Probody，在經由蛋白酶之連結子切斷前亦對於EGFR有結合活性。藉由利用蛋白酶所為之連結子切斷，會觀察到30-100倍之結合活性上昇，但是活化前的Probody也有活化後Probody的1/30-1/100之結合活性，所以活化前的Probody若以高濃度存在，有會與在正常組織表現的抗原結合，而發生副作用的可能性。 又，Probody，為了遮蓋抗體之抗原結合部位，係使用人工的胜肽。人工胜肽有天然人類蛋白質不存在的序列，可能於人類有免疫原性。免疫原性已知會由於誘發抗藥物抗體而減低抗體醫藥的作用 (Blood. 2016 Mar 31;127(13):1633-41.)。 進一步，就針對Probody之抗藥物抗體而言，可考慮有針對抗體與遮罩胜肽之複合體(活化前之Probody)之抗藥物抗體、針對遮罩胜肽解離後的抗體(活化後的Probody)的抗藥物抗體、針對遮罩胜肽(從活化後的Probody解離的遮罩胜肽)的抗藥物抗體等。其中，針對遮罩胜肽的抗藥物抗體(抗遮罩胜肽抗體)，藉由結合於活化前之Probody之遮罩胜肽，有即使不發生利用蛋白酶所為之切斷仍活化Probody之可能性(第4圖)。因為抗遮罩胜肽抗體而活化的Probody，有結合於在正常組織表現的抗原而發生副作用的可能性。
實施例2　利用了單域抗體的蛋白酶活化多胜肽的概念 如實施例1所示，Probody技術存有下列課題。 1.　因為蛋白酶所為之切斷而活化的Probody有長的血中滯留性 2.　即使利用蛋白酶所為之切斷前之Probody仍對於抗原有結合活性 3.　遮罩胜肽為人工的非人類序列，可能誘發抗遮罩胜肽抗體 為了提供解決了該等課題的在病態部位發揮活性的抗體醫藥，據認為符合下列條件係有用。 1.　因為蛋白酶所為之切斷而活化的抗原結合域有短的血中半衰期 2.　利用蛋白酶所為之切斷前之分子之抗原結合活性最少化 3.　不使用有人工的非人類序列的遮罩胜肽 就符合上述條件之多胜肽之一例而言，可考量第5圖所示之分子。抗原結合域與運送部分已連結的狀態之多胜肽有長的半衰期，抗原結合域的抗原結合活性受抑制，不結合於抗原(A)。抗原結合域游離後，抗原結合活性回復，半衰期也短(B)。 第5圖所示之多胜肽有各式各樣的變化型，當使用類IgG抗體分子時，可利用如第6圖例示之製造方法製造。首先，取得會結合於目標抗原的單域抗體(例：VH或VHH)(A)。將獲得之單域抗體替代到有生殖系序列之IgG抗體之VH與VL中之一者，和VH與VL中之另一者締合，形成類IgG抗體分子 (B)。於類IgG抗體分子中導入蛋白酶切斷序列(C)。導入位置，例如可列舉已導入之單域抗體(VH或VHH)與恆定區(CH1或CL)之交界附近。 單域抗體以單域存在時有抗原結合活性，但若與VL/VH/VHH等形成可變區則喪失抗原結合活性。VL/VH因為是有生殖系序列之天然人類抗體序列，故免疫原性之風險低，誘發出認識同VL/VH之抗藥物抗體的可能性極低。又，當使用VHH與單域抗體形成可變區時，藉由將VHH予以人源化，可減小免疫原性的風險，降低認識同人源化VHH之抗藥物抗體的可能性。藉由將已插入到類IgG抗體分子的蛋白酶切斷序列以蛋白酶切斷，單域抗體會游離。游離的單域抗體有抗原結合活性。被蛋白酶切斷前的類IgG抗體分子因為有與一般的IgG分子類似的結構，有長的血中滯留性，而反觀被蛋白酶切斷而游離的單域抗體，不保有Fc區，分子量為約13kDa，因此會因為腎排泄而迅速消失。實際上，全長IgG的半衰期為約2~3週 (Blood. 2016 Mar 31;127(13):1633-41.) ，反觀單域抗體的半衰期為約2小時(Antibodies 2015, 4(3), 141-156)。所以，被蛋白酶活化的抗原結合分子的血中半衰期短，與正常組織的抗原結合的可能性降低。 單域抗體為VL時，藉由將蛋白酶切斷序列導入到例如VL與CL的交界附近，可達成同樣的概念。
實施例3　利用結合於IL6R之VHH之蛋白酶活化多胜肽之製作 3-1　納入了與IL6R結合之VHH之多胜肽之製備 依該技術領域中有通常知識者公知之方法製備編碼國際公開WO2010/115998號記載之對人類IL6R有結合與中和活性之VHH的IL6R90(序列編號：1)融合於人類IgG1之恆定區(CH1-hinge-CH2-CH3)的IL6R90-G1m(序列編號：2)表現載體。 依該技術領域中有通常知識者公知之方法製備編碼作為具有人類生殖系序列之各式各樣次類型的輕鏈(可變區-恆定區)的VK1-39-k0MT(序列編號：3)、VK2-28-k0MT(序列編號：4)、VK3-20-k0MT(序列編號：5)、VL1-40-lamL(序列編號：6)、VL1-44-lamL(序列編號：7)、VL2-14-lamL(序列編號：8)、VL3-21-lamL(序列編號：9)、k0(序列編號：10)、lamL(序列編號：11)的表現載體。 依該技術領域中有通常知識者公知之方法利用使用FreeStyle293細胞 (Invitrogen)之暫時性表現來表現類IgG抗體分子之IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT(重鏈序列編號：2、輕鏈序列編號：3)、IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT(重鏈序列編號：2、輕鏈序列編號：4)、IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT(重鏈序列編號：2、輕鏈序列編號：5)、IL6R90-G1m/VL1-40-lamL(重鏈序列編號：2、輕鏈序列編號：6)、IL6R90-G1m/VL1-44-lamL(重鏈序列編號：2、輕鏈序列編號：7)、IL6R90-G1m/VL2-14-lamL(重鏈序列編號：2、輕鏈序列編號：8)、IL6R90-G1m/VL3-21-lamL(重鏈序列編號：2、輕鏈序列編號：9)、IL6R90-G1m/k0(重鏈序列編號：2、輕鏈序列編號：10)、IL6R90-G1m/lamL(重鏈序列編號：2、輕鏈序列編號：11)，並依使用蛋白質A之該技術領域中有通常知識者公知之方法精製。
3-2　納入了與人類IL6R結合之VHH之多胜肽之IL6R結合評價 IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT、IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT、IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT、IL6R90-G1m/VL1-40-lamL、IL6R90-G1m/VL1-44-lamL、IL6R90-G1m/VL2-14-lamL、IL6R90-G1m/VL3-21-lamL、IL6R90-G1m/k0、IL6R90-G1m/lamL的對於人類IL6R之結合活性依下列方法評價。 依下列方式製備作為抗原之重組人類IL6R。以該技術領域中有通常知識者公知之方法建構J. Immunol. 152, 4958-4968 (1994)報告的N末端側1號至357號之胺基酸序列構成的可溶型人類IL-6R(以下也稱為hsIL-6R、IL6R或IL-6R)的CHO穩定表現株並培養，使其表現hsIL-6R。從獲得之培養上清利用Blue Sepharose 6 FF管柱層析、凝膠過濾管柱層析的2個步驟精製出hsIL-6R。將最終步驟作為主峰部溶出的區分(fraction)作為最終精製品。 使用OctetHTX ( ForteBio )實施各分子與hsIL6R之結合評價。具體而言，使各分子結合於Biosensor / Protein A (ProA) ( ForteBio, 18-5013 ) ，使hsIL-6R作用，評估於30℃之結合。以OctetHTX測定的表示經時的結合量的感測圖示於第10圖。VL缺損的IL6R90-G1m/k0與IL6R90-G1m/lamL會結合於hsIL-6R，但與VL形成了可變區的IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT、IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT、IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT、IL6R90-G1m/VL1-40-lamL、IL6R90-G1m/VL1-44-lamL、IL6R90-G1m/VL2-14-lamL顯示不能與hsIL-6R結合。由此可見藉由對於人類IL6R有結合活性的VHH與VL締合而形成可變區，能夠使IL6R結合活性喪失。
3-3　對於納入了會結合於IL6R之VHH的多胜肽導入蛋白酶切斷序列 探討在抗人類IL6R VHH之IL6R90與CH1之交界附近插入蛋白酶切斷序列。設計在據報告會被癌特異性地表現的尿激酶(uPA)與MT-SP1切斷的序列之胜肽即序列A(序列編號：12)以有或無甘胺酸-絲胺酸連結子的方式插入於IL6R90與CH1之交界附近3處的第11圖所示的6種重鏈。依該技術領域中有通常知識者公知之方法製作編碼IL6R90H1001(序列編號：13)、IL6R90H1002(序列編號：14)、IL6R90H1003(序列編號：15)、IL6R90H1004(序列編號：16)、IL6R90H1005(序列編號：17)、IL6R90H1006(序列編號：18)的表現載體。 使用該等重鏈與作為輕鏈之VK1-39-k0MT(序列編號：3)，依該技術領域中有通常知識者公知之方法以使用了FreeStyle293細胞 (Invitrogen)利用暫時性表現來表現類IgG抗體分子IL6R90H1001/VK1-39-k0MT(重鏈序列編號：13、輕鏈序列編號：3)、IL6R90H1002/VK1-39-k0MT(重鏈序列編號：14、輕鏈序列編號：3)、IL6R90H1003/VK1-39-k0MT(重鏈序列編號：15、輕鏈序列編號：3)、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT(重鏈序列編號：16、輕鏈序列編號：3)、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT(重鏈序列編號：17、輕鏈序列編號：3)、IL6R90H1006/VK1-39-k0MT(重鏈序列編號：18、輕鏈序列編號：3)，並依使用了蛋白質A之該技術領域中有通常知識者公知之方法精製。
3-4　導入了蛋白酶切斷序列之多胜肽之利用蛋白酶切斷所為之活化 將IL6R90H1001/VK1-39-k0MT、IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1003/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT、IL6R90H1006/VK1-39-k0MT利用蛋白酶切斷，並驗證對於IL6R有結合活性之VHH是否游離。 依該技術領域中有通常知識者公知之方法製備可溶型人類IL6R。將製備之可溶型人類IL6R依該技術領域中有通常知識者公知之方法進行生物素化。 為了於可溶型人類IL-6R(也稱為hsIL-6R或可溶型人類IL6R，序列編號：35)之C末端附加生物素，在編碼hsIL-6R之基因斷片之下游，藉由連結子來連結編碼利用生物素連接酶附加了生物素的特異性序列(AviTag序列、序列編號：36)的基因斷片。將編碼hsIL-6R與AviTag序列連結成的蛋白質(hsIL6R-Avitag、序列編號：37)的基因斷片納入到動物細胞表現用載體，將構建的質體載體使用293Fectin (Invitrogen)導入到FreeStyle293細胞 (Invitrogen)。此時將表現EBNA1(序列編號：57)之基因與表現生物素連接酶(BirA、序列編號：58)之基因同時導入，為了將hsIL-6R-Avitag進行生物素標識而進一步添加生物素。將依前述步驟而導入了基因的細胞於37℃、8% CO 2培養，使目的蛋白質( hsIL-6R-BAP1 )分泌到培養上清中。將此細胞培養液以0.22μm瓶頂濾器過濾，獲得培養上清。 依製造商的實驗手冊，製作於HiTrap NHS-activated HP (GE Healthcare)固定了抗人類IL-6R抗體的管柱(抗人類IL-6R抗體管柱)。於經TBS平衡化的抗人類IL-6R抗體管柱供給培養上清，以2 M Arginine, pH4.0使吸附的hsIL-6R溶出。然後，於經TBS平衡化之SoftLink Avidin 管柱(Promega)，注入經同樣緩衝液稀釋的抗人類IL-6R抗體管柱溶出液，以5 mM 生物素, 50 mM Tris-HCl, pH8.0與2 M Arginine, pH4.0使hsIL-6R-BAP1溶出。將此溶出液利用Superdex200(GE Healthcare)的凝膠過濾層析，去除hsIL-6R-BAP1的締合體，獲得緩衝液置換為D-PBS, 0.05% CHAPS的精製hsIL-6R-BAP1。 使用作為蛋白酶之重組人類Matriptase/ST14 觸媒域 ( R&D Systems, 3946-SE-010 ) ，於蛋白酶12.5nM、類IgG抗體分子 100ug/mL、PBS、37℃之條件下反應20小時後，以還原SDS-PAGE來評價利用蛋白酶所為之切斷，結果示於第12圖。其結果，確認IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT、IL6R90H1006/VK1-39-k0MT中，蛋白酶切斷序列在VHH與重鏈恆定區之交界附近被蛋白酶切斷。 然後使用OctetHTX( ForteBio )進行對利用蛋白酶處理而游離的VHH與IL6R之結合評價。具體而言，使hsIL-6R-BAP1 結合於鏈親和素感測器( ForteBio, 18-5021 )，使切斷的類IgG抗體分子作用，評價於30℃之結合。將以OctetHTX測定的經時的結合量的感測圖示於第13圖。其結果，確認IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT、IL6R90H1006/VK1-39-k0MT有結合。IL6R90-G1m/k0、IL6R90-G1m/lamL以2價結合，所以以avidity結合，反觀游離的VHH以affinity結合，所以經蛋白酶處理的IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT、IL6R90H1006/VK1-39-k0MT相較於IL6R90-G1m/k0、IL6R90-G1m/lamL，顯示從IL6R的解離速度較快。又，VHH相較於IL6R90-G1m/k0、IL6R90-G1m/lamL，分子量較小，因此結合量(回應)較低。 由該等結果，IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT、IL6R90H1006/VK1-39-k0MT原本對於IL6R未顯示結合活性，但是經蛋白酶處理，於VHH及重鏈恆定區之交界附近插入的胜肽序列A被切斷，結果VHH域游離，游離的VHH確認對於IL6R能結合。由此可說能夠實際製作實施例2記載的概念的分子。
實施例4　利用了因改變而結合於IL6R之VHH的蛋白酶活化多胜肽之製作 4-1　納入了會與IL6R結合之VHH之多胜肽之IL6R結合評價 依該技術領域中有通常知識者公知之方法製備編碼將國際公開WO2010/115998號記載之對於IL6R有結合與中和活性之VHH20A11(序列編號：19)與實施例3同樣地融合於人類IgG1之恆定區(CH1-hinge-CH2-CH3)的20A11-G1m(序列編號：38)的表現載體。 使用此重鏈、與作為輕鏈之VK1-39-k0MT(序列編號：3)、VK2-28-k0MT(序列編號：4)、VK3-20-k0MT(序列編號：5)、VL1-40-lamL(序列編號：6)、VL1-44-lamL(序列編號：7)、VL2-14-lamL(序列編號：8)、VL3-21-lamL(序列編號：9)，依與實施例3同樣的方法實施多胜肽20A11-G1m/VK1-39-k0MT、20A11-G1m/VK2-28-k0MT、20A11-G1m/VK3-20-k0MT、20A11-G1m/VL1-40-lamL、20A11-G1m/VL1-44-lamL、20A11-G1m/VL2-14-lamL、20A11-G1m/VL3-21-lamL的表現・精製。 依與實施例3同樣的方法，對獲得之20A11-G1m/VK1-39-k0MT(重鏈序列編號：38、輕鏈序列編號：3)、20A11-G1m/VK2-28-k0MT(重鏈序列編號：38、輕鏈序列編號：4)、20A11-G1m/VK3-20-k0MT(重鏈序列編號：38、輕鏈序列編號：5)、20A11-G1m/VL1-40-lamL(重鏈序列編號：38、輕鏈序列編號：6)、20A11-G1m/VL1-44-lamL(重鏈序列編號：38、輕鏈序列編號：7)、20A11-G1m/VL2-14-lamL(重鏈序列編號：38、輕鏈序列編號：8)、20A11-G1m/VL3-21-lamL(重鏈序列編號：38、輕鏈序列編號：9)進行對於IL6R之結合之評價，結果示於第14圖。結果，本實施例使用之輕鏈之中，並沒有藉由和20A11與人類生殖系IgG1之恆定區(CH1-hinge-CH2-CH3)融合成的重鏈締合，而喪失20A11之IL6R結合活性者。 理由據認為是20A11與本實施例使用之VL未形成安定的可變區。
4-2　納入了未喪失抗原結合之VHH之多胜肽中，於VHH與VL之界面部位之胺基酸改變之導入 為了使20A11與VL形成安定的可變區，對於20A11之與VL之界面存在的胺基酸導入變異。依該技術領域中有通常知識者公知之方法製備編碼將於對20A11導入將37號之F置換成V(F37V)、45號之R置換成L、47號之G置換成W(皆為Kabat編號)之變異之20A11hu(序列編號：20)與實施例3同樣地融合於人類IgG1之恆定區(CH1-hinge-CH2-CH3)的20A11hu-G1m(序列編號：39)的表現載體。 使用此重鏈、與作為輕鏈之VK1-39-k0MT(序列編號：3)、VK2-28-k0MT(序列編號：4)、VK3-20-k0MT(序列編號：5)、VL1-40-lamL(序列編號：6)、VL1-44-lamL(序列編號：7)、VL2-14-lamL(序列編號：8)、VL3-21-lamL(序列編號：9)，依與實施例3同樣的方法實施多胜肽之20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT(重鏈序列編號：39、輕鏈序列編號：3)、20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT(重鏈序列編號：39、輕鏈序列編號：4)、20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT(重鏈序列編號：39、輕鏈序列編號：5)、20A11hu-G1m/VL1-40-lamL(重鏈序列編號：39、輕鏈序列編號：6)、20A11hu-G1m/VL1-44-lamL(重鏈序列編號：39、輕鏈序列編號：7)、20A11hu-G1m/VL2-14-lamL(重鏈序列編號：39、輕鏈序列編號：8)、20A11hu-G1m/VL3-21-lamL(重鏈序列編號：39、輕鏈序列編號：9)之表現、精製。
4-3　納入了於VHH與VL之界面部位導入胺基酸改變之VHH的多胜肽的IL6R結合評價 依和實施例3同樣的方法評價獲得之20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT、20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT、20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT、20A11hu-G1m/VL1-40-lamL、20A11hu-G1m/VL1-44-lamL、20A11hu-G1m/VL2-14-lamL、20A11hu-G1m/VL3-21-lamL對於IL6R之於30℃或25℃之結合，結果示於第15圖。 結果顯示20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT、20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT、20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT、20A11hu-G1m/VL1-40-lamL、20A11hu-G1m/VL1-44-lamL、20A11hu-G1m/VL2-14-lamL不能與IL6R結合。 由該等結果顯示，對於實施例3使用的即使與VL締合仍不喪失IL6R結合活性的20A11，將其於VHH與VL之界面部位存在的胺基酸設為37V, 45L, 47W(Kabat編號)，改變成20A11hu，可使VHH與VL形成安定的可變區，使其喪失VHH之IL6R結合活性。
4-4　對於納入了在VL界面部位導入胺基酸改變的VHH的多胜肽導入蛋白酶切斷序列 依和實施例3同樣的方法，製作於20A11hu與CH1之交界附近插入了蛋白酶切斷序列(序列編號：12)或與可動連結子連結的蛋白酶切斷序列(序列編號：44)的重鏈20A11huH1001(序列編號：40)、20A11huH1002(序列編號：41)、20A11huH1004(序列編號：42)、20A11huH1006(序列編號：43)。 使用該等重鏈、與作為輕鏈之VK1-39-k0MT(序列編號：3)，依與實施例3同樣的方法實施多胜肽20A11huH1001/VK1-39-k0MT(重鏈序列編號：40、輕鏈序列編號：3)、20A11huH1002/VK1-39-k0MT(重鏈序列編號：41、輕鏈序列編號：3)、20A11huH1004/VK1-39-k0MT(重鏈序列編號：42、輕鏈序列編號：3)、20A11huH1006/VK1-39-k0MT(重鏈序列編號：43、輕鏈序列編號：3)之表現、精製。
4-5　導入了蛋白酶切斷序列之多胜肽之利用蛋白酶切斷所為之活化 將20A11huH1001/VK1-39-k0MT、20A11huH1002/VK1-39-k0MT、20A11huH1004/VK1-39-k0MT、20A11huH1006/VK1-39-k0MT依和實施例3同樣的方法利用蛋白酶切斷，並以還原SDS-PAGE來評價切斷的程度，結果示於第16圖。 結果，確認20A11huH1002/VK1-39-k0MT、20A11huH1004/VK1-39-k0MT、20A11huH1006/VK1-39-k0MT中，VHH與CH1之交界附近被蛋白酶切斷。 然後，依和實施例3同樣的方法實施利用蛋白酶處理而游離之VHH與IL6R於30℃或25℃之結合評價。Octet之感測圖示於第17圖。 其結果，確認經由蛋白酶處理將VHH與CH1之交界附近切斷的20A11huH1002/VK1-39-k0MT、20A11huH1004/VK1-39-k0MT、20A11huH1006/VK1-39-k0MT會對於IL6R結合。 由該等結果可確認，已納入VHH之多胜肽中，即使與特定的VL締合時不會立即喪失抗原結合活性的情形，藉由對於VHH之與VL之界面所存在的胺基酸導入締合促進之變異，能夠使抗原結合活性喪失。 由此結果顯示，依如實施例3的方式預先將獲得之VHH與輕鏈組合的方法以外，利用將涉及與輕鏈締合之胺基酸予以置換的VHH和輕鏈組合的方法，也能製作實施例2記載的概念的分子。
實施例5　利用了來自免疫羊駝之VHH的蛋白酶活化多胜肽之製作 5-1　來自免疫羊駝之VHH之取得 依該技術領域中有通常知識者公知之方法將IL6R、CD3與PlexinA1對於羊駝進行免疫，於4及8週後回收PBMC。從回收的PBMC，參考J. Immunol. Methods (2007) 324, 13記載的方法將VHH基因放大。將放大後的VHH基因斷片和gene3基因連接並插入到噬粒(phagemid)載體。將已插入了VHH斷片的噬粒載體以電穿孔法導入到大腸菌，依該技術領域中有通常知識者既知之方法獲得提示VHH的噬菌體。使用獲得之噬菌體，依ELISA法來評價對於IL6R、CD3或PlexinA1的結合，依該技術領域中有通常知識者公知之方法解析結合的選殖體的序列，鑑別會與抗原結合的VHH。
5-2　結合於CD3之VHH之濃縮 從實施例5-1建構的VHH資料庫鑑別會與人類CD3結合的VHH。使用經生物素標識之人類CD3ε及人類CD3δ連結於人類抗體恆定區而得的蛋白質(人類CD3ed-Fc)作為抗原，實施對於人類CD3具結合能力之VHH之濃縮。人類CD3ed-Fc依下列方式製備。將帶有編碼以序列編號：59所示之胺基酸序列之基因與編碼以序列編號：60所示之胺基酸序列之基因與編碼BirA(序列編號：58)之基因的動物細胞表現載體導入到FreeStyle293細胞(Invitrogen)。導入後加入L-生物素，於培養液中實施予以生物素化的步驟，細胞培養係依實驗手冊於37℃振盪培養，4至5日後回收上清。從上清使用ProteinA管柱(Eshmuno A (Merck))，獲得融合有抗體之恆定區的蛋白質。進一步為了僅取得CD3εδ異二聚體，使用Anti-FLAG M2管柱，區分出融合有抗體恆定區之CD3εδ異二聚體(稱為人類CD3ed-Fc)。然後，實施凝膠過濾層析(Superdex200、GE Healthcare)，分取目的之CD3εδ異二聚體(稱為人類CD3ed-Fc)。 從保持了建構之噬菌體呈現用噬粒的大腸菌來生產噬菌體。將於已生產噬菌體的大腸菌的培養液中添加2.5 M NaCl/10%PEG而沉澱出的噬菌體的集團以TBS稀釋，獲得噬菌體資料庫液。然後於噬菌體資料庫液添加BSA，使終濃度成為4%BSA。淘選方法係參考一般方法即使用了固定於磁珠之抗原的淘選方法(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(FG beads NeutrAvidin)或Streptavidin coated beads(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。 具體而言，於製備的噬菌體資料庫液加入100 pmol的生物素標識抗原，使該噬菌體資料庫液於室溫和抗原接觸60分鐘。加入經BSA阻斷的磁珠，使抗原與噬菌體之複合體和磁珠於室溫結合15分鐘。將珠粒以0.5 mL的TBST(含有0.1%Tween20之TBS, TBS為TaKaRa公司製) 洗淨2次後、再以0.5 mL的TBS洗淨1次。之後，將加了0.5 mL的1 mg/mL的胰蛋白酶的珠粒於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座將珠粒分離，回收噬菌體溶液。回收的噬菌體溶液添加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.5)的20 mL的大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。被感染的大腸菌接種到225 mm x 225 mm的盤。然後從已接種大腸菌的培養液回收噬菌體，以製備噬菌體資料庫液。此循環稱為淘選，全部重複2次。又，第2次淘選係進行以TBST將珠粒洗淨3次，然後以TBS進行2次。又，人類CD3ed-Fc與噬菌體之結合時添加4 nmol的人類Fc。
5-3　納入了會與CD3結合之VHH之蛋白酶活化類IgG抗體分子之製備 依實施例3記載的方法，將編碼由實施例5-1或5-2獲得之人類CD3結合選殖體之VHH序列(表1)之鹼基序列連接在編碼蛋白酶切斷位點與恆定區之鹼基序列，並插入到動物細胞表現載體，作為類IgG抗體分子之重鏈使用。
[表1]
Figure 02_image001
將以下表2所示之蛋白酶活化類IgG抗體分子依該技術領域中有通常知識者公知之方法，依使用了FreeStyle293細胞 (Invitrogen)的暫時性表現予以表現，並依使用了蛋白質A之該技術領域中有通常知識者公知之方法實施精製。
[表2]
Figure 02_image003
5-4　蛋白酶活化類IgG抗體分子之利用蛋白酶切斷所為之活化 依和實施例3同樣的方法將實施例5-3製備之類IgG抗體分子以蛋白酶切斷，利用還原SDS-PAGE評價切斷的程度，結果示於第18圖。又，蛋白酶濃度以25 nM實施，測定使用OctetRED ( ForteBio )。 結果，確認類IgG抗體分子中之蛋白酶切斷序列被蛋白酶切斷。 然後依和實施例3同樣的方法實施經蛋白酶處理游離的VHH與CD3之結合評價。Octet之感測圖示於第19圖。 其結果，確認bC3edL1R1N160H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT、bC3edL1R1N161H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT、bC3edL1R1N164H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT中，蛋白酶處理前之類IgG抗體分子未顯示抗原結合，反觀蛋白酶處理後確認具有抗原結合。又，以表1記載之VHH為同樣方法獲得之多數會結合CD3之VHH，也製作和表2記載之類IgG抗體分子含有同樣蛋白酶切斷位點之IgG樣分子，結果確認藉由蛋白酶處理而和抗原結合。由該等結果顯示，除了實施例3、4所示之多胜肽以外，藉由納入蛋白酶切斷序列，利用蛋白酶處理會將蛋白酶切斷序列切斷，抗原結合域游離，游離的抗原結合域能和抗原結合之類IgG抗體分子。
實施例6　於輕鏈導入了蛋白酶切斷序列的多胜肽 和實施例3同樣，製作在輕鏈的各位置納入蛋白酶切斷序列的VK1-39P-2-Pk0MT(序列編號：67)、VK1-39P-1-Pk0MT(序列編號：68)、VK1-39P-Pk0MT(序列編號：69)、VK1-39P+2-Pk0MT(序列編號：70)、VK1-39P+3-Pk0MT(序列編號：71)、VK1-39P+4-Pk0MT(序列編號：72)、及VK1-39P+5-Pk0MT(序列編號：73)。 依和實施例3同樣的方法實施該等輕鏈與使用作為重鏈之IL6R90-G1m(序列編號：2)之類IgG抗體分子之表現、精製。又，蛋白酶濃度係於25 nM實施。就未導入切斷序列之類IgG抗體分子而言，使用IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT(重鏈序列編號：2、輕鏈序列編號：3)。 然後將製備的類IgG抗體分子依和實施例3同樣的方法以蛋白酶切斷，利用還原SDS-PAGE評價切斷的程度，結果示於第20圖。其結果，VK1-39P+2-Pk0MT(序列編號：70)、VK1-39P+3-Pk0MT(序列編號：71)、VK1-39P+4-Pk0MT(序列編號：72)、及VK1-39P+5-Pk0MT(序列編號：73)中，確認蛋白酶切斷序列被蛋白酶切斷。進一步依和實施例3同樣的方法實施藉由蛋白酶處理而露出的VHH與IL6R之結合評價。Octet之感測圖示於第21圖。結果，可取得即使於輕鏈導入了切斷序列，仍偵測到藉由蛋白酶處理的結合，於輕鏈導入蛋白酶切斷序列而將輕鏈以蛋白酶切斷時，抗原結合域露出並顯示抗原結合能力的蛋白酶活化多胜肽。
實施例7　含有具抗原結合域之重鏈與導入了蛋白酶切斷序列之輕鏈之資料庫、及從該資料庫利用噬菌體呈現法取得蛋白酶活化多胜肽 如實施例6所確認般，即使於蛋白酶活化多胜肽之輕鏈導入蛋白酶切斷序列的情形，輕鏈切斷後抗原結合域仍會露出並與抗原結合。 於是，將含有單域抗體等抗原結合域之重鏈與已導入了蛋白酶切斷序列的輕鏈納入到噬粒，使於噬菌體提示。建構含有不同種類之抗原結合域的多數噬菌體呈現用噬粒，從保持著此等噬粒的大腸菌來生產噬菌體。藉由在已生產噬菌體的大腸菌的培養液添加2.5 M NaCl/10%PEG而沉澱出的噬菌體的集團以TBS稀釋，獲得噬菌體資料庫液。在噬菌體資料庫液添加BSA，使終濃度成為4%BSA。 從如上述製作的噬菌體資料庫利用淘選取得蛋白酶活化多胜肽。淘選方法係參考一般方法即使用了固定於磁珠之抗原的淘選方法(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)，蛋白酶添加前回收未結合於固定有抗原之磁珠的噬菌體，蛋白酶添加後回收結合於固定有抗原之磁珠之噬菌體。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated、FG beads NeutrAvidin)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。可從回收的噬菌體選出在前項記載的噬菌體ELISA會和抗原結合之選殖體，或將抗體基因次選殖到動物表現用載體，使用動物細胞表現，比較蛋白酶處理前後之結合活性，選出結合選殖體。
實施例8　含有具抗原結合域之重鏈與輕鏈之資料庫、及從該資料庫利用噬菌體呈現法取得以輕鏈控制抗原結合能力之重鏈 如實施例3所確認，利用輕鏈之締合能控制含有抗原結合域之重鏈之抗原結合能力。於是，利用噬菌體呈現法取得在已與輕鏈締合時喪失抗原結合能力，僅提示重鏈或重鏈與輕鏈恆定區時顯示抗原結合能力的重鏈。 將含有單域抗體等抗原結合域之重鏈納入到噬粒，使其於噬菌體提示。建構含有不同種類之抗原結合域的多數噬菌體呈現用噬粒，從保持著此等噬粒的大腸菌來生產噬菌體。將於已生產噬菌體的大腸菌的培養液添加2.5 M NaCl/10%PEG而沉澱出的噬菌體的集團以TBS稀釋，獲得噬菌體資料庫液。在噬菌體資料庫液添加BSA，使終濃度成為4%BSA。 從如上述製作之噬菌體資料庫，利用淘選取得當僅提示重鏈或重鏈與輕鏈恆定區時顯示抗原結合能力，當重鏈與輕鏈可變區締合時喪失抗原結合能力的重鏈。淘選方法可參照實施例5記載之使用固定於磁珠之抗原之淘選方法。從提示重鏈或重鏈與輕鏈恆定區之噬菌體資料庫，回收結合於已固定有抗原之磁珠的噬菌體。使回收的噬菌體感染大腸菌，使用表現輕鏈之輔助噬菌體來生產提示重鏈與輕鏈之噬菌體。從已生產噬菌體的大腸菌的培養液依上述方法獲得提示含有抗原結合域之重鏈與輕鏈之噬菌體。從提示了重鏈與輕鏈之噬菌體之集團，回收未結合於固定有抗原之磁珠的噬菌體。 又，如第9D圖所示，淘選有時會交換結合於固定有抗原之磁珠之提示僅重鏈或重鏈與輕鏈恆定區之噬菌體集團之回收、與未結合於固定有抗原之磁珠之提示重鏈與輕鏈之噬菌體集團之回收的順序而實施。又，除了使用輔助噬菌體來表現輕鏈的方法以外，有時會如通常在和重鏈同樣的噬粒納入編碼輕鏈的區域，於每次淘選納入編碼僅輕鏈恆定區或輕鏈全長之基因後使用。 可以從回收的噬菌體依前項記載的噬菌體ELISA來選出與抗原結合的選殖體，或將抗體基因次選殖到動物表現用載體，使用動物細胞表現，比較蛋白酶處理前後之結合活性，並選出結合選殖體。
實施例9　使用噬菌體呈現法取得利用輕鏈控制抗原結合能力之VHH及含有此VHH之類IgG抗體分子之製作 實施例3確認了藉由與輕鏈締合，含有將VH替代為VHH的重鏈的抗原結合能力受控制。於是，從提示來自免疫羊駝PBMC之將VHH及CH1予以連結者的噬菌體資料庫，取得與特定的輕鏈締合時會喪失抗原結合能力，僅提示重鏈或提示重鏈與輕鏈恆定區時，亦即未與輕鏈可變區締合時顯示抗原結合能力的VHH，製作含有該VHH之類IgG抗體分子。
9-1　納入了輕鏈表現單元之輕鏈表現輔助噬菌體之構建 依據國際公開公報WO2015/046554號記載的方法，在輔助噬菌體的基因體納入啟動子、信號序列、抗體輕鏈可變區及輕鏈恆定區之基因、或輕鏈恆定區之基因等，藉此以建構輕鏈表現輔助噬菌體。從感染了此輔助噬菌體的大腸菌，能夠表現抗體輕鏈可變區及輕鏈恆定區、或僅表現輕鏈恆定區。 具體而言，實施依國際公開公報WO2015/046554號記載的方法構建的輔助噬菌體M13KO7TC的基因體萃取，導入輕鏈表現單元。就導入的輕鏈基因而言，使用編碼輕鏈可變區及輕鏈恆定區(VK1-39-k0MTdC、序列編號：152)之基因、或編碼輕鏈恆定區(k0MTdC、序列編號： 153)之基因。將lac啟動子 - pelB信號序列 - 輕鏈基因依上述方法插入到M13KO7TC/SacI，依電穿孔法導入到大腸菌株ER2738。 培養獲得之大腸菌，於培養上清添加2.5 M NaCl/10%PEG，依PEG沉澱法精製輔助噬菌體。依一般的溶菌斑形成法確認獲得之輔助噬菌體M13KO7TC-Vk1-39-k0MTdC及M13KO7TC-k0MTdC之力價。
9-2　含有多數VHH-CH1之資料庫之製備 依該技術領域中有通常知識者公知之方法，將人類IL6R之細胞外域、人類CD3εγ異二聚體、猴CD3εγ異二聚體及人類PlexinA1之細胞域共4種作為免疫原，對於羊駝進行免疫，4週後回收PBMC。CD3εγ異二聚體係參考Journal of Molecular Biology (2000) 302:899-916.製備。從回收的PBMC參考J. Immunol. Methods (2007) 324, 13記載的方法將VHH基因放大。放大的VHH基因斷片與CH1-gene3基因連接並插入到噬粒載體，製備含有VHH與CH1連結成的多數個VHH-CH1的資料庫。
9-3　提示VHH-CH1/全長輕鏈、或VHH-CH1/輕鏈恆定區之噬菌體集團之製作方法 將已插入編碼VHH-CH1之基因的噬粒載體以電穿孔法導入到大腸菌，培養獲得之大腸菌，使其感染實施例9-1製備的輔助噬菌體M13KO7TC-Vk1-39-k0MTdC，可製作從噬粒載體表現的VHH-CH1與從輔助噬菌體表現的全長輕鏈形成Fab結構，在含有編碼VHH-CH1之基因之噬粒表面提示VHH-CH1/全長輕鏈(VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC)之噬菌體集團。又，培養導入了插入了編碼VHH-CH1之基因的噬粒載體的大腸菌，使其感染實施例9-1製備之輔助噬菌體M13KO7TC-k0MTdC，可製作由噬粒載體表現之VHH-CH1與由輔助噬菌體表現之輕鏈恆定區與VHH-CH1及CL締合而得的結構，且提示VHH-CH1/輕鏈恆定區(VHH-CH1/k0MTdC)的噬菌體集團。於培養上清添加2.5 M NaCl/10% PEG，能以PEG沉澱法精製噬菌體。可依一般的溶菌斑形成法確認獲得之噬菌體的力價。
9-4　從VHH-CH1噬菌體資料庫取得含有因與輕鏈可變區之締合會抑制抗原結合，於沒有輕鏈可變區時會顯示抗原結合能力的PlexinA1 VHH之VHH-CH1 從實施例9-2製作的VHH-CH1資料庫，利用淘選取得含有因與輕鏈可變區之締合會抑制抗原結合，當沒有輕鏈可變區時顯示抗原結合能力之VHH之VHH-CH1。 抗原使用參考實施例製作的經生物素標識之人類PlexinA1。 淘選方法依下列步驟進行： (1)對於實施例9-2製作之VHH-CH1噬菌體資料庫，以實施例9-3的方法製作提示VHH-CH1/輕鏈恆定區(VHH-CH1/k0MTdC)之噬菌體集團，從其中回收結合於已固定有抗原之磁珠的噬菌體； (2)對於回收的噬菌體依實施例9-3的方法製作提示VHH-CH1/全長輕鏈(VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC)之噬菌體集團，從其中回收未結合於已固定有抗原之磁珠的噬菌體； (3)對於回收的噬菌體，重複步驟(1)與(2)，回收所望的噬菌體。淘選之結果，選出多數個會因與輕鏈Vk1-39-k0MTdC 締合而抑制對於PlexinA1之結合，當沒有輕鏈可變區則顯示對於PlexinA1之結合能力的VHH-CH1。 又，就其他淘選方法，依下列步驟進行： (1) 對於實施例9-2製作之VHH-CH1噬菌體資料庫，以實施例9-3的方法製作提示VHH-CH1/輕鏈恆定區(VHH-CH1/k0MTdC)之噬菌體集團，從其中回收結合於已固定有抗原之磁珠的噬菌體； (2) 對於回收的噬菌體依實施例9-3的方法製作提示VHH-CH1/全長輕鏈(VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC)之噬菌體集團，從其中回收未結合於已固定有抗原之磁珠的噬菌體，並從回收的噬菌體進一步回收結合於固定有抗輕鏈抗體 (EY Laboratories, Cat. BAT-2107-2)之磁珠的噬菌體； (3) 對於回收的噬菌體，重複步驟(1)與(2)，回收所望的噬菌體。 淘選之結果，選出多數個會因與輕鏈Vk1-39-k0MTdC 締合而抑制對於PlexinA1之結合，當沒有輕鏈可變區則顯示對於PlexinA1之結合能力的VHH-CH1。 依淘選選出的VHH-CH1中之VHH，可用於類IgG抗體分子之製作。
9-5　納入了會結合於PlexinA1之VHH之蛋白酶活化類IgG抗體分子之製作 依實施例3記載的方法，將編碼實施例9-4選擇之VHH-CH1中含有的VHH的鹼基序列連接在編碼蛋白酶切斷位點與重鏈恆定區之鹼基序列，作為類IgG抗體分子之重鏈使用，與全長輕鏈VK1-39-k0MT(序列編號：3)組合，依該技術領域中有通常知識者公知之方法利用使用FreeStyle293細胞 (Invitrogen)之暫時性表現表現，並依該技術領域中有通常知識者公知之方法使用蛋白質A進行精製。 製作之類IgG抗體分子示於表3。
[表3]
Figure 02_image005
9-6　蛋白酶活化類IgG抗體分子之利用蛋白酶切斷所為之活化 依與實施例3同樣的方法，以蛋白酶將實施例9-4製備的類IgG抗體分子切斷，利用還原SDS-PAGE評價切斷程度，結果示於第22圖。又，蛋白酶濃度以25nM實施。 其結果，確認了製作的各類IgG抗體分子中之蛋白酶切斷序列會被蛋白酶切斷。 然後，依和實施例3同樣的方法實施利用蛋白酶處理而游離之VHH與人類PlexinA1之結合評價。Octet之感測圖示於第23圖。 其結果，確認製作的各類IgG抗體分子中，蛋白酶處理前之類IgG抗體分子未顯示抗原結合，反觀蛋白酶處理後有由游離VHH所為之抗原結合。
實施例10　含有雙特異性VHH-VHH之多胜肽 10-1　癌抗原與CD3結合之雙特異性VHH-VHH及含雙特異性VHH-VHH之多胜肽之製作 如第8圖所示，因蛋白酶而活化之抗原結合域也可以和第2抗原結合域形成雙特異性的抗原結合分子。 將認識人類Glypican3之VHH　HN3(序列編號：159)與認識CD3之VHH　G03(序列編號：160)介隔以甘胺酸與絲胺酸構成之連結子而連接，製作雙特異性的VHH-VHH　HN3G03，再介隔蛋白酶切斷序列而連接序列編號：161所示之抗體重鏈恆定區得到含雙特異性的VHH-VHH之重鏈HN3G03-cF760mnHIF(序列編號：162)，將其插入到動物表現用載體。 將認識Her2之VHH　HerF07(序列編號：163)與認識CD3之VHH　G03(序列編號：160)介隔以甘胺酸與絲胺酸構成之連結子連接，並製作雙特異性的VHH-VHH　HerF07G03，再介隔蛋白酶切斷序列而連接序列編號：161所示之抗體重鏈恆定區，將獲得的含雙特異性的VHH-VHH 重鏈HerF07G03-cF760mnHIF(序列編號：164)插入到動物表現用載體。 將各含雙特異性的VHH-VHH的重鏈、與分別插入輕鏈VK1.39-k0MT(序列編號：3)、及從鉸鏈區至C末端的人類恆定區序列VHn-Kn010dGK(序列編號：166)之動物表現用載體一起導入到Expi293細胞(Life technologies)，表現含有雙特異性VHH-VHH之多胜肽。之後，依該技術領域中有通常知識者公知之方法使用MonoSpin ProA 96孔盤型(GL science, Cat No.:7510-11312)精製含有雙特異性VHH-VHH之多胜肽。含有雙特異性的VHH-VHH　HN3G03之多胜肽，為HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT，含有雙特異性的VHH-VHH　HerF07G03之多胜肽，為HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT。 然後，就蛋白酶處理而言，於精製之含雙特異性VHH-VHH之多胜肽 40μg加入uPA(Recombinant Human u-Plasminogen Activator、R&D systems)，使終濃度成為25nM，於37℃保溫20小時以上。未經蛋白酶處理之樣本，代替蛋白酶而加入和蛋白酶同量的PBS並保溫。以還原SDS-PAGE確認已實施蛋白酶切斷之含雙特異性VHH-VHH之多胜肽是否如同目的般地被切斷，結果示於第24圖。如第24圖，顯示因蛋白酶切斷而將雙特異性的VHH-VHH從全體切離。
10-2　含GPC3與CD3之雙特異性的VHH-VHH之多胜肽之藉由蛋白酶切斷所致之CD3活化之評價 對於CD3之促效劑活性，使用Jurkat-NFAT 報告細胞(NFAT luc2_jurkat cell)評價。Jurkat-NFAT報告細胞，係表現CD3之來自人類急性T細胞性白血病之細胞融合NFAT回應元件與螢光酵素 (luc2P) 的細胞株，若CD3下游的信號活化則表現螢光酵素。就目標細胞而言，使用了使用GPC3的抗體為使來自人類肝癌之細胞株之SK-HEP-1強制表現human GPC3而樹立的SK-pca60細胞株。於白底、96孔分析盤(Costar, 3917)之各孔各加入目標細胞與效應子細胞，使其成為1.25E+04 cells /well, 7.50E+04 cells/well，於該孔添加有蛋白酶處理或無蛋白酶處理的HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT，使終濃度成為1, 10, 100nM。於5% CO2存在下，於37℃溫育24小時後， Luciferase酵素活性使用Bio-Glo luciferase assay system (Promega, G7940) ，依附帶的實驗手冊測定發光量。檢測使用2104 EnVision。結果如第25圖所示。無蛋白酶處理之樣本時，螢光酵素活性未上昇，反觀有蛋白酶處理之HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT，顯示螢光酵素活性上昇。亦即，有蛋白酶處理的HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT時，可確認對於CD3之促效劑活性，藉由蛋白酶切斷，從HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT游離出GPC3與CD3的雙特異性的VHH-VHH，發揮於未切斷時受抑制的CD3結合活性。
10-3　含有Her2與CD3之雙特異性的VHH-VHH之多胜肽之藉由蛋白酶切斷所致之CD3活化之評價 對於CD3之促效劑活性，使用Jurkat-NFAT 報告細胞(NFAT luc2_jurkat cell)評價。Jurkat-NFAT報告細胞(Effector cell)，係表現CD3之來自人類急性T細胞性白血病之細胞融合NFAT回應元件與螢光酵素 (luc2P) 的細胞株，若CD3下游的信號活化則表現螢光酵素。就目標細胞而言，使用LS1034細胞株。於白底、96孔分析盤(Costar, 3917)之各孔各加入目標細胞與效應子細胞，使其成為2.5E+04 cells /well, 7.50E+04 cells/well，於該孔添加有蛋白酶處理或無蛋白酶處理的HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT，使終濃度成為0.01, 0.1, 1nM。於5% CO2存在下，於37℃溫育24小時後， Luciferase酵素活性使用Bio-Glo luciferase assay system (Promega, G7940) ，依附帶的實驗手冊測定發光量。檢測使用2104 EnVision。結果如第26圖所示。無蛋白酶處理之樣本時，螢光酵素活性未上昇，反觀有蛋白酶處理之HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT，顯示螢光酵素活性上昇。亦即，有蛋白酶處理的HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT時，可確認對於CD3之促效劑活性，藉由蛋白酶切斷，從HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT游離出Her2與CD3的雙特異性的VHH-VHH，發揮於未切斷時受抑制的CD3結合活性。
實施例11　對於納入了VHH之多胜肽之蛋白酶切斷位點的導入 11-1.對於納入了會與IL6R結合之VHH之多胜肽之蛋白酶切斷序列的導入 依該技術領域中有通常知識者公知之方法製備編碼將國際公開WO2010/115998號記載之對人類IL6R有結合與中和活性之VHH的IL6R90(序列編號：1)融合於人類IgG1之恆定區(CH1-hinge-CH2-CH3)的IL6R90-G1T4(序列編號：167)的表現載體。依該技術領域中有通常知識者公知之方法利用使用FreeStyle293細胞 (Invitrogen) 或Expi293細胞 (Life technologies)之暫時性表現來表現類IgG抗體分子IL6R90-G1T4/VK1-39-k0MT(重鏈序列編號：167、輕鏈序列編號：3)，並依使用了蛋白質A之該技術領域中有通常知識者公知之方法精製。 在IL6R90-G1T4/VK1-39-k0MT之重鏈之VHH與CH1之交界附近插入序列編號：178所示之蛋白酶切斷序列，製作插入了蛋白酶切斷序列之含VHH之重鏈IL6R90.12aa-G1T4(序列編號：189)。依該技術領域中有通常知識者公知之方法製作IL6R90.12aa-G1T4之表現載體。 將IL6R90.12aa-G1T4與序列編號：3所示之輕鏈組合，依該技術領域中有通常知識者公知之方法以使用了FreeStyle293細胞 (Invitrogen) 或Expi293細胞 (Life technologies)之暫時性表現來表現VHH與CH1之交界附近插入了蛋白酶切斷序列的類IgG1抗體分子IL6R90.12aa-G1T4/VK1-39-k0MT，依使用蛋白質A之該技術領域中有通常知識者公知之方法進行精製。
11-2　於重鏈區導入蛋白酶切斷序列而得的含抗人類IL6R VHH之類IgG抗體分子之藉由蛋白酶所為之切斷之評價 驗證實施例11-1製備之類IgG抗體分子是否會被蛋白酶切斷。蛋白酶使用重組人類Matriptase/ST14 觸媒域( MT-SP1 ) ( R&D Systems, 3946-SE-010 )，於蛋白酶 10nM、抗體 50μg/mL、PBS、37℃之條件下反應20小時後，於第27圖揭示利用還原SDS-PAGE評價藉由蛋白酶所為之切斷之結果。結果，類IgG抗體分子IL6R90.12aa藉由蛋白酶處理而在37kDa附近出現新的條帶。亦即，確認插入在類IgG抗體分子VHH與CH1之交界附近的序列編號：178所表示的蛋白酶切斷序列被蛋白酶切斷。又，依類似方法，也確認序列編號：178所示之蛋白酶切斷序列納入到IgG抗體時會被human uPA, mouse uPA切斷。
實施例12　於輕鏈導入蛋白酶切斷序列之類IgG抗體分子之利用蛋白酶切斷所為之活化之程度之評價 依該技術領域中有通常知識者公知之方法製備編碼國際公開WO2010/115998號記載之對於人類IL6R有結合與中和活性之VHH之IL6R75(序列編號：190)融合於人類IgG1之恆定區(CH1-hinge-CH2-CH3)而得的IL6R75-G1m(序列編號：191)的表現載體。與實施例4-2同樣地，製作在VHH與VL之界面部位導入了胺基酸改變之IL6R75hu-G1m(序列編號：192)。依與實施例3同樣的方法對於使用納入了蛋白酶切斷序列之輕鏈VK1-39P+4-Pk0MT(序列編號：72)、及作為重鏈之IL6R90-G1m(序列編號：2)、20A11hu-G1m(序列編號：39)、IL6R75hu-G1m(序列編號：192)之類IgG抗體分子IL6R90-G1m/ VK1-39P+4-Pk0MT(重鏈序列編號：2、輕鏈序列編號：72)、20A11hu-G1m/ VK1-39P+4-Pk0MT(重鏈序列編號：39、輕鏈序列編號：72)、IL6R75hu-G1m/ VK1-39P+4-Pk0MT(重鏈序列編號：192、輕鏈序列編號：72)之表現、精製。 將IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT、20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT、IL6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT依和實施例3同樣的方法以蛋白酶切斷，並評價切斷程度，結果示於第28圖。具體而言，蛋白酶使用重組人類Matriptase/ST14 觸媒域 ( R&D Systems, 3946-SE-010 ) ，於蛋白酶50nM、類IgG抗體分子 50μg/mL、PBS、37℃之條件下反應20小時後，以還原SDS-PAGE評價藉由蛋白酶所為之切斷。結果，確認IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT、20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT、IL6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT中，VL與CL之交界附近被蛋白酶切斷。 然後，依ELISA評價由於蛋白酶處理而露出的VHH與IL6R的結合。具體而言，於鏈親和素披覆384孔盤 ( Greiner, 781990 )將實施例3使用的hsIL-6R-BAP1 固定，於室溫使切斷的類IgG抗體分子結合。30分鐘反應後，使HRP標識抗人類IgG抗體 ( Sigma, SAB3701362-2MG ) 於室溫作用10分鐘，使其與TMB Chromogen Solution ( life technologies, 002023 ) 反應。於室溫反應30分鐘後，以硫酸使反應停止，以Synergy HTX 多模式讀取儀(BioTek) 測定450 nm吸光度。算出抗原作為固相的孔及未作為固相的孔的吸光度的比，定義為S/N比。將ELISA之S/N比(平均値)作為縱軸、各類IgG抗體分子之濃度作為橫軸，結果示於第29圖。由此結果得知，於輕鏈導入了切斷序列的類IgG抗體分子20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT經蛋白酶處理後，相較於未經蛋白酶處理之類IgG抗體分子，對於IL6R之結合活性成為10倍以上，類IgG抗體分子IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT時，經由蛋白酶處理，對於IL6R之結合活性成為1000倍以上。
實施例13　導入了多樣化蛋白酶切斷序列之類IgG抗體分子之製作與評價 13-1　導入了多樣化蛋白酶切斷序列之多胜肽之製作 使用尿激酶、Matriptase以外之蛋白酶之認識序列，與實施例3同樣地製作類IgG抗體分子。在IL6R90-G1m之可變區與恆定區之交界附近，插入已知會被MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-13切斷的各種胜肽序列，及在此等切斷序列附近含有由甘胺酸-絲胺酸聚合物構成的可動連結子的胜肽序列。插入的序列示於表4。
[表4]
Figure 02_image007
設計將此等序列插入到IL6R90-G1m之可變區與恆定區之交界附近之重鏈。依該技術領域中有通常知識者公知之方法製作編碼重鏈改變體6R90EIVHEMP2.1-6R90EICHEMP2.1G1m(序列編號：165)、6R90EIVHEMP2.2-6R90EICHEMP2.2G1m(序列編號：202)、 6R90EIVHEMP2.3-6R90EICHEMP2.3G1m(序列編號：203)、 6R90EIVHEMP2.4-6R90EICHEMP2.4G1m(序列編號：204)、6R90EIVHEMP7.1-6R90EICHEMP7.1G1m(序列編號：205)、6R90EIVHEMP7.2-6R90EICHEMP7.2G1m(序列編號：206)、6R90EIVHEMP13-6R90EICHEMP13G1m(序列編號：207)、6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m(序列編號：196)、6R90EIVHEG4SMP2.2G4S-6R90EIVHEG4SMP2.2G4SG1m(序列編號：197)、6R90EIVHEG4SMP9G4S-6R90EIVHEG4SMP9G4SG1m(序列編號：198)之表現載體。 將該等重鏈改變體與輕鏈組合，並在重鏈之可變區與恆定區之交界附近插入蛋白酶切斷序列，得到的類IgG抗體分子示於表5。將該等類IgG抗體分子依該技術領域中有通常知識者公知之方法以使用FreeStyle293細胞 (Invitrogen) 或Expi293細胞 (Life technologies)之暫時性表現予以表現，並依使用了蛋白質A之該技術領域中有通常知識者公知之方法精製。
[表5]
Figure 02_image009
13-2　導入了多樣化的蛋白酶切斷序列的類IgG抗體分子之利用蛋白酶所為之切斷之評價 驗證實施例13-1製備之類IgG抗體分子是否會被蛋白酶切斷。蛋白酶使用重組人類MMP-2( R&D Systems, 902-MP-010 )、重組人類MMP-7( R&D Systems, 907-MP-010)、重組人類MMP-9( R&D Systems, 911-MP-010 )、重組人類MMP-13( R&D Systems, 511-MM-010)。又，MMP-2、MMP-7、MMP-9及MMP-13，係和1 MMP-aminophenylmercuric acetate (APMA; abcam, ab112146 )混合，於37℃分別活化1或24小時後使用。於蛋白酶 50 nM、100 nM、或 500 nM、類IgG抗體分子50μg/mL或100μg/mL、PBS或 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2, pH 7.2 (以下、Tris)、37℃之條件下反應20小時後，依還原SDS-PAGE評價利用蛋白酶所為之切斷，結果示於第30A圖與第30B圖。第30B圖，利用蛋白酶所為之切斷係於assay buffer(MMP Activity Assay Kit (Fluorometric - Green) (ab112146), Component C: Assay Buffer)實施。 結果，確認MMP-2之6R90EIVHEMP2.1-6R90EICHEMP2.1G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.2-6R90EICHEMP2.2G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.3-6R90EICHEMP2.3G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.4-6R90EICHEMP2.4G1m/VK1-39-k0MT,6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m/VK1-39-k0MT、6R90EIVHEG4SMP2.2G4S-6R90EICHEG4SMP2.2G4SG1m/VK1-39-k0MT，MMP-7之6R90EIVHEMP7.1-6R90EICHEMP7.1G1m/VK1-39-k0MT、6R90EIVHEMP7.2-6R90EICHEMP7.2G1m/VK1-39-k0MT，MMP-9之6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m/VK1-39-k0MT、6R90EIVHEG4SMP9G4S-6R90EICHEG4SMP9G4SG1m/VK1-39-k0MT，MMP-13之6R90EIVHEMP13-6R90EICHEMP13G1m/VK1-39-k0MT被切斷。
參考實施例1　生物素化PlexinA1之製備 依該技術領域中有通常知識者公知之方法製備生物素化PlexinA1(也稱為經生物素標識之人類PlexinA1)。具體而言，將在編碼PlexinA1之細胞外區之基因斷片之下游，將編碼為能夠利用生物素連接酶附加生物素之特異性序列(AviTag序列、序列編號：36)之基因斷片與編碼FLAG標籤序列(序列編號：199、DYKDDDDK)之基因斷片介隔編碼甘胺酸與絲胺酸構成之連結子之基因斷片而連結。將編碼PlexinA1、AviTag序列與FLAG標籤序列連結成的蛋白質(序列編號：200)的基因斷片納入到動物細胞表現用載體，使用構建的質體載體293fectin(Invitrogen)導入到FreeStyle293細胞 (Invitrogen)。此時，同時導入表現EBNA1(序列編號：57)之基因與表現生物素連接酶(BirA、序列編號：201)之基因，並為了將PlexinA1進行生物素標識，添加生物素。將依前述步驟導入了基因的細胞於37℃、8% CO2培養，使目的蛋白質(生物素化PlexinA1)分泌到培養上清。將此細胞培養液以0.22μm瓶頂濾器過濾，獲得培養上清。 將Anti FLAG M2 agarose (Sigma-Aldrich, #A2220)填充於管柱，製作FLAG管柱。預先將FLAG管柱以D-PBS(-)平衡化，加注培養上清，使生物素化PlexinA1結合於管柱。然後，以溶於D-PBS(-)之FLAG 胜肽將生物素化PlexinA1溶出。將此溶出液利用使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg, 320mL (GE healthcare, 28-9893-36)之凝膠過濾層析去除締合體，獲得精製的生物素化PlexinA1。
前述發明係基於為了幫助明確的理解，使用實例與例示詳細記載，但本說明書之記載與例示並不應解釋為限定本發明之範圍。本說明書引用的所有專利文獻與科學文獻的揭示，其全體作為參照而明示的納入在本說明書中。 [產業利用性]
本發明之包含抗原結合域與比起抗原結合域有較長血中半衰期且具抑制抗原結合域之結合活性之抑制域之運送部分的多胜肽、以及含有此多胜肽的醫藥組合物，能抑制抗原結合域之抗原結合活性且將抗原結合域在血中運送。又，藉由使用本發明之多胜肽，能使抗原結合域之抗原結合活性於病症部位專一地發揮。再者，發揮抗原結合活性時，由於比起運送時有更短半衰期，故減少全身作用的疑慮，於病症治療極有用。 又，藉由與為抗原結合域之一例的特定的VL或VH或VHH締合，來篩選或製造抗原結合活性受抑制之單域抗體，能有效率地製造本發明之多胜肽。再者，若使用含有藉由與本發明之多胜肽能使用之作為抗原結合域之一例之特定的VL或VH或VHH締合，從而抗原結合活性受抑制之單域抗體之資料庫，能以良好效率取得製作前述多胜肽時必要的抗原結合域。
無
第1圖顯示Probody技術之概念。係將遮蔽抗體之抗原結合部位的胜肽，以會被在病變部位表現之蛋白酶切斷之連結子與抗體連接、而抑制抗體之抗原結合活性之抗體分子。 第2圖顯示Probody可能顯示副作用之一原因之圖。血中蓄積的活化的Probody藉由與在正常組織表現的抗原結合，可能會發生副作用。 第3圖顯示Probody可能顯示副作用之一原因之圖。Probody，處於利用連結子連結之遮罩胜肽結合於抗原結合部位之狀態與解離狀態之平衡狀態，已解離之狀態之分子能與抗原結合。 第4圖顯示Probody可能顯示副作用之一原因之圖。對遮罩胜肽之抗藥物抗體(抗遮罩胜肽抗體)，藉由與活化前之Probody之遮罩胜肽結合，即使不因為蛋白酶而切斷也可能將Probody活化。 第5圖顯示含有抗原結合域與運送部分之多胜肽之概念圖。(A)抗原結合域與運送部分連結之狀態之多胜肽有較長半衰期，且不與抗原結合。(B)藉由切斷位點之切斷等而抗原結合域游離並與抗原結合，游離後之抗原結合域有短半衰期。 第6圖顯示製造本發明之多胜肽之方法之一實施態樣。本實施態樣中，目的之多胜肽為類IgG抗體分子。(A)取得與目標抗原結合之單域抗體。(B)以單域抗體之抗原結合活性受抑制之方式，使單域抗體替代IgG抗體之VH與VL締合。(C)於已導入了單域抗體之類IgG抗體分子前驅物導入蛋白酶切斷序列。 第7圖顯示本發明之多胜肽之一實施態樣。本實施態樣中，多胜肽為類IgG抗體分子，相當於IgG抗體之二個可變區部分各設有抗原結合域。二個抗原結合域可具有同樣的抗原結合特異性，也可具有不同的抗原結合特異性。 第8圖顯示於本發明之抗原結合域更連結第2抗原結合域之實施態樣。此實施態樣中，游離後之抗原結合域與第2抗原結合域形成雙特異性的抗原結合分子。(A)顯示未游離狀態之多胜肽之圖。抗原結合域之抗原結合活性受抑制。(B)顯示抗原結合域與第2抗原結合域形成之雙特異性的抗原結合分子之游離之圖。(C)顯示就游離後之雙特異性的抗原結合分子之例而言，例如針對T細胞表面抗原與癌細胞表面抗原之雙特異性的抗原結合分子之圖。 第9A圖顯示從含有多數使單域抗體與第1締合支持域連結成之融合多胜肽之資料庫，篩選含有藉由與特定的抑制域締合而抗原結合活性減弱或喪失之單域抗體之融合多胜肽之方法之一例之圖。(1)顯示含有多數使單域抗體與第1締合支持域連結之融合多胜肽之資料庫之圖。(2)顯示融合多胜肽與締合夥伴締合之狀態，確認單域抗體之抗原結合活性。選擇含有於此締合狀態不與目標抗原結合、或抗原結合活性為一定値以下之單域抗體之融合多胜肽。(3)顯示由(2)選出之融合多胜肽中之單域抗體與締合夥伴中之抑制域之締合解除，確認單域抗體之抗原結合活性之圖。選出含有於此非締合狀態與目標抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上之單域抗體之融合多胜肽。(2')顯示確認融合多胜肽中之單域抗體之抗原結合活性之圖。選擇含有此融合多胜肽之單獨存在狀態會與目標抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上之單域抗體之融合多胜肽。(3')顯示確認於(2')選出之融合多胜肽與締合夥伴締合之狀態，單域抗體之抗原結合活性之圖。選出含有於此締合狀態不與目標抗原結合、或抗原結合活性為一定値以下之單域抗體之融合多胜肽。 第9B圖顯示從含有多數使單域抗體與第1締合支持域連結成之融合多胜肽之資料庫，篩選含有藉由與特定的抑制域締合而抗原結合活性減弱或喪失之單域抗體之融合多胜肽之方法之更具體的一例。(1)使含有單域抗體與第1締合支持域之融合多胜肽、及在抑制域與第2締合支持域之間導入了蛋白酶切斷序列之締合夥伴同時呈現，形成Fab狀結構；(2)選擇於呈現的Fab狀結構中不與抗原結合、或對於抗原之結合活性為一定値以下者；(3)選擇含有藉由以蛋白酶切斷締合夥伴而會與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上之單域抗體之斷片。 第9C圖顯示從含有多數使單域抗體與第1締合支持域連結成之融合多胜肽之資料庫，篩選含有藉由與特定的抑制域締合而抗原結合活性減弱或喪失之單域抗體之融合多胜肽之方法之更具體之另一例。(1)使於單域抗體與第1締合支持域間導入了蛋白酶切斷序列之融合多胜肽、與抑制域與第2締合支持域連結成的締合夥伴同時呈現，形成Fab狀結構；(2)從呈現的Fab狀結構中選出不與抗原結合、或對於抗原之結合活性為一定値以下者；(3)選擇含有利用蛋白酶而切斷融合多胜肽並與抗原結合、或抗原結合活性為一定値以上之單域抗體之斷片。 第9D圖顯示從含有使多數單域抗體與第1締合支持域連結成之融合多胜肽之資料庫，篩選含有藉由與特定的抑制域締合而抗原結合活性減弱或喪失之單域抗體之融合多胜肽之方法之另一例之圖。(1)使含有單域抗體與第1締合支持域之融合多胜肽、與抑制域與第2締合支持域連結成之締合夥伴同時呈現，形成Fab狀結構，選擇所呈現之Fab狀結構中不與抗原結合、或對於抗原之結合活性為一定値以下者；(2)使(1)選出之Fab狀結構中之含有單域抗體之部分以抑制域不同時表現的方式再度呈現，選擇會與抗原結合、或對於抗原之結合活性為一定値以上之斷片。(2')與(2'')係將(2)中之含有單域抗體之部分以抑制域不同時表現之方式再度呈現之其他實施態樣之圖。又，(1)與(2)/(2')/(2'')之順序可以為(2)/(2')/(2'')至(1)，亦即，使含有單域抗體之部分以與抑制域不同時表現之方式呈現，選擇針對抗原之結合活性為一定値以上之斷片。然後，使含有結合為一定以上之斷片之單域抗體與含有第1締合支持域之融合多胜肽、及抑制域與第2締合支持域連結成之締合夥伴同時呈現，形成Fab狀結構，選擇所呈現之Fab狀結構中不與抗原結合、或對於抗原之結合活性為一定値以下者。 第10圖顯示使抗人類IL6R VHH(IL6R90)融合於人類IgG1之恆定區(CH1-hinge-CH2-CH3)而得的IL6R90-G1m與各式各樣的輕鏈締合而作成的類抗體分子之對於人類IL6R之結合之評價結果之圖。使抗原固相化之感測器與類抗體分子之作用開始之時間為橫軸之開始點。 第11圖(A)顯示在IL6R90-G1m 之VHH與恆定區之交界附近插入蛋白酶切斷序列而作成之類抗體分子之模型之圖。(B)顯示作成之各抗體重鏈之名稱、插入胺基酸序列之部位、插入之胺基酸序列之圖。插入部位以 [insert]表示。 第12-1圖顯示藉由在IL6R90-G1m 或IL6R90-G1m 之VHH與恆定區之交界附近插入蛋白酶切斷序列而作成之類抗體分子以蛋白酶(MT-SP1)處理後，利用還原SDS-PAGE評價切斷程度之結果之圖。由於蛋白酶處理而產生的2條新條帶之中，在 25 kDa以下產生的條帶係來自VHH之條帶，出現在25-50 kDa之位置之條帶係來自恆定區之條帶。 第12-2圖接續第12-1圖。 第13圖顯示藉由在IL6R90-G1m 或IL6R90-G1m 之VHH與恆定區之交界附近插入蛋白酶切斷序列而作成之類抗體分子或將它們以蛋白酶(MT-SP1)處理後之樣本與人類IL6R之結合之評價結果。Protease- 係未經蛋白酶處理之類抗體分子與抗原之結合之評價感測圖，Protease+ 係評價經蛋白酶處理之類抗體分子與抗原之結合之感測圖。固定有抗原固相化之感測器與類抗體分子之作用開始30秒前為橫軸之開始點。 第14圖顯示使抗人類IL6R VHH(20A11)融合於人類IgG1之恆定區(CH1-hinge-CH2-CH3)而得的20A11-G1m與各式各樣的輕鏈締合而作成之類抗體分子之對於人類IL6R之結合之評價結果。固定有抗原之感測器與類抗體分子之作用開始之時間之30秒前為橫軸之開始點。 第15圖顯示使對於存在20A11-G1m或20A11之與VL之界面的胺基酸導入變異而作成的20A11hu融合於人類IgG1之恆定區(CH1-hinge-CH2-CH3)而得的20A11hu-G1m與各式各樣的輕鏈締合而作成之類抗體分子之對於人類IL6R之結合之評價結果。固定有抗原之感測器與類抗體分子之作用開始之時間之60秒前為橫軸之開始點。 第16圖顯示將於20A11-G1m或20A11hu-G1m之20A11hu與恆定區之交界附近插入蛋白酶切斷序列而製作之4種類抗體分子進行蛋白酶(MT-SP1)處理後，以還原SDS-PAGE評價切斷程度之結果。由於蛋白酶處理而產生的2條新條帶之中，在25 kDa 以下產生的條帶係來自VHH之條帶，出現在25-50 kDa之位置之條帶係來自恆定區之條帶。 第17圖顯示於20A11-G1m或20A11hu-G1m 之VHH與恆定區之交界附近插入蛋白酶切斷序列而作成之類抗體分子或將它們以蛋白酶(MT-SP1)處理後之樣本與人類IL6R之結合之評價結果。Protease- 為評價未經蛋白酶處理之類抗體分子與抗原之結合之感測圖，Protease+ 為評價經蛋白酶處理之類抗體分子與抗原之結合之感測圖。固定有抗原之感測器與抗體之作用開始60秒前為橫軸之開始點。not tested 代表記載的樣本未測定。 第18圖顯示重鏈可變區帶有抗人類CD3 VHH，且在VHH與重鏈恆定區之交界附近插入蛋白酶切斷序列而製作的類抗體分子以蛋白酶(MT-SP1)處理後，以還原SDS-PAGE進行電泳、以CBB檢測，而評價切斷程度之結果。藉由蛋白酶處理而產生的2條新條帶之中，在10-15 kDa 附近產生的條帶係來自VHH之條帶，在37kDa附近產生的條帶係來自重鏈恆定區之條帶。 第19圖顯示重鏈可變區帶有抗人類CD3 VHH，且在VHH與重鏈恆定區之交界附近插入蛋白酶切斷序列而製作之類抗體分子經蛋白酶(MT-SP1)處理後之樣本與人類CD3ed-Fc之結合之評價結果。Protease- 為評價未經蛋白酶處理之類抗體分子與抗原之結合之感測圖，Protease+ 為評價經蛋白酶處理之類抗體分子與抗原之結合之感測圖。固定有抗原之感測器與類抗體分子之作用開始30秒前為橫軸之開始點。顯示結合抗原前之結合量(回應)為0，使抗體作用前之結合量為100時之結合。從使抗體作用30秒前開始表示。 第20圖顯示以IL6R90-G1m 作為重鏈，Vk1-39-k0MT作為輕鏈之分子、或以IL6R90-G1m 作為重鏈，Vk1-39-k0MT作為輕鏈之分子之輕鏈可變區與輕鏈恆定區之交界附近插入蛋白酶切斷序列以製作之類抗體分子經蛋白酶(MT-SP1)處理後，以還原SDS-PAGE進行電泳，並以CBB檢測來評價切斷程度之結果。藉由蛋白酶處理產生來自輕鏈的2條條帶，輕鏈被蛋白酶切斷。 第21圖顯以在IL6R90-G1m 作為重鏈，Vk1-39-k0MT作為輕鏈之分子、或以IL6R90-G1m 作為重鏈，Vk1-39-k0MT作為輕鏈之分子之輕鏈可變區與輕鏈恆定區之交界附近插入蛋白酶切斷序列而製作之類抗體分子經蛋白酶(MT-SP1)處理後之樣本與人類IL6R之結合之評價結果。Protease- 為評價未經蛋白酶處理之類抗體分子與抗原之結合之感測圖，Protease+ 為評價經蛋白酶處理之類抗體分子與抗原之結合之感測圖。將確認結合於IL6R之抗體(MRA)作為正對照使用。固定有抗原之感測器與類抗體分子之作用開始之時為橫軸之開始點。 第22圖顯示評價納入結合了人類PlexinA1 之VHH的類IgG抗體分子之蛋白酶切斷之SDS-PAGE結果。Protease(+) 線道為實施蛋白酶切斷處理之樣本，protease(-) 線道為未接受蛋白酶切斷處理之負對照之樣本。 第23圖顯示納入了結合了人類PlexinA1之VHH的類IgG抗體分子藉由蛋白酶切斷而使VHH游離，評價游離之VHH與人類PlexinA1之結合之Octet感測圖。Protease + 係實施蛋白酶切斷處理之樣本，protease – 係未接受蛋白酶切斷處理之樣本。使用之類IgG抗體分子之濃度記載於圖左側。 第24圖顯示評價含有雙特異性VHH-VHH之多胜肽之蛋白酶切斷之SDS-PAGE結果之圖。 第25圖顯示蛋白酶切斷前後之螢光酵素活性。虛線為未經蛋白酶處理之樣本，實線為經蛋白酶處理之樣本。 第26圖顯示蛋白酶切斷前後之螢光酵素活性。虛線為未經蛋白酶處理之樣本，實線為經蛋白酶處理之樣本。 第27圖顯示將含有抗人類IL6R VHH之類IgG抗體分子利用蛋白酶所為之切斷以SDS-PAGE評價之圖。 第28圖顯示於輕鏈導入了蛋白酶切斷序列之類IgG抗體分子之蛋白酶切斷之評價之圖。 第29圖顯示於輕鏈導入了蛋白酶切斷序列之類IgG抗體分子之藉由有無蛋白酶處理所致之活化程度之評價之圖。 第30A圖顯示於重鏈導入了蛋白酶切斷序列之類IgG抗體分子之蛋白酶切斷之評價之圖。 第30B圖顯示於重鏈導入了蛋白酶切斷序列之類IgG抗體分子之蛋白酶切斷之評價。蛋白酶所為之切斷以assay buffer(MMP Activity Assay Kit (Fluorometric - Green) (ab112146), Component C: Assay Buffer)實施。
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Claims (20)

  1. 一種單域抗體之篩選方法，係篩選藉由與特定的VL締合、或藉由與特定的VH締合、或藉由與特定的VHH締合，而抗原結合活性可受抑制之單域抗體。
  2. 如請求項1所述之篩選方法，其中該方法為篩選與特定VL締合而可抑制抗原結合活性的單域抗體的方法。
  3. 如請求項2所述之篩選方法，其進一步包括以下步驟： (a)   取得具有目標抗原結合活性之單域抗體之步驟； (b)   以(a)步驟取得之單域抗體與特定的VL締合之步驟；以及 (c)   確認於(b)步驟與特定的VL締合而得的該單域抗體對於該抗原的結合活性相較於締合前減弱、或喪失之步驟。
  4. 如請求項2所述之篩選方法，其進一步包括以下步驟： (a)   使單域抗體與特定的VL的締合； (b)   選擇於基於步驟(a)中與特定的VL締合的該單域抗體對於該抗原無結合活性或為一定値以下的結合活性之該VL與該單域抗體的締合體之步驟；以及 (c)   確認(b)步驟選出的締合體中之單域抗體於未與該特定的VL締合之狀態對於該抗原之結合活性相較於締合狀態時更強之步驟。
  5. 如請求項1所述之篩選方法，其中該方法為篩選與特定的VH締合而可抑制抗原結合活性的單域抗體的方法。
  6. 如請求項5所述之篩選方法，其進一步包括以下步驟： (a)   取得具有目標抗原結合活性之單域抗體之步驟； (b)   以(a)步驟取得之單域抗體與特定的VH締合之步驟；以及 (c)   確認於(b)步驟與特定的VH締合而得的該單域抗體對於該抗原的結合活性相較於締合前減弱、或喪失之步驟。
  7. 如請求項5所述之篩選方法，其進一步包括以下步驟： (a)   使單域抗體與特定的VH締合； (b)   選擇於基於步驟(a)中與特定的VH締合的該單域抗體對於該抗原無結合活性或為一定値以下的結合活性之該VH與該單域抗體的締合體之步驟；以及 (c)   確認(b)步驟選出的締合體中之單域抗體於未與該特定的VH締合之狀態對於該抗原之結合活性相較於締合狀態時更強之步驟。
  8. 如請求項1所述之篩選方法，其中該方法為篩選與特定的VHH締合而可抑制抗原結合活性的單域抗體的方法。
  9. 如請求項8所述之篩選方法，其進一步包括以下步驟： (a)   取得具有目標抗原結合活性之單域抗體之步驟； (b)   以(a)步驟取得之單域抗體與特定的VHH締合之步驟；以及 (c)   確認於(b)步驟與特定的VHH締合而得的該單域抗體對於該抗原的結合活性相較於締合前減弱、或喪失之步驟。
  10. 如請求項8所述之篩選方法，其進一步包括以下步驟： (a)   使單域抗體與特定的VHH締合； (b)   選擇於基於步驟(a)中與特定的VHH締合的該單域抗體對於該抗原無結合活性或為一定値以下的結合活性之該VHH與該單域抗體的締合體之步驟；以及 (c)   確認(b)步驟選出的締合體中之單域抗體於未與該特定的VHH締合之狀態對於該抗原之結合活性相較於締合狀態時更強之步驟。
  11. 一種單域抗體之製造方法，係製造藉由與特定的VL締合、或藉由與特定的VH締合、或藉由與特定的VHH締合，而抗原結合活性可受抑制之單域抗體。
  12. 如請求項11所述之製造方法，其中該方法為製造與特定VL締合而可抑制抗原結合活性的單域抗體的方法。
  13. 如請求項12所述之製造方法，其進一步包括以下步驟： (a)   置換單域抗體中之涉及與抗體VL之締合之胺基酸殘基，以製作保持該單域抗體對於目標抗原之結合活性之改變單域抗體之步驟。
  14. 如請求項13所述之製造方法，其進一步包括以下步驟： (b)   使於(a)步驟製作之該改變單域抗體與該VL締合之步驟；以及 (c)   確認與該VL締合的該改變單域抗體之抗原結合活性相較於締合前減弱、或喪失之步驟。
  15. 如請求項11所述之製造方法，其中該方法為製造與特定VH締合而可抑制抗原結合活性的單域抗體的方法。
  16. 如請求項15所述之製造方法，其進一步包括以下步驟： (a)   置換單域抗體中之涉及與類IgG抗體分子VH之締合之胺基酸殘基，以製作保持該單域抗體對於目標抗原之結合活性之改變單域抗體之步驟。
  17. 如請求項16所述之製造方法，其進一步包括以下步驟： (b)   使於(a)步驟製作之該改變單域抗體與該VH締合之步驟；以及 (c)   確認與該VH締合的該改變單域抗體之抗原結合活性相較於締合前減弱、或喪失之步驟。
  18. 如請求項11所述之製造方法，其中該方法為製造與特定VHH締合而可抑制抗原結合活性的單域抗體的方法。
  19. 如請求項18所述之製造方法，其進一步包括以下步驟： (a)    置換單域抗體中之涉及與VHH之締合之胺基酸殘基，以製作保持該單域抗體對於目標抗原之結合活性之改變單域抗體之步驟。
  20. 如請求項19所述之製造方法，其進一步包括以下步驟： (b)   使於(a)步驟製作之該改變單域抗體與該VHH締合之步驟；以及 (c)    確認與該VHH締合的該改變單域抗體之抗原結合活性相較於締合前減弱、或喪失之步驟。
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