CN117630386A - 包含抗原结合结构域和运送部分的多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及：包括抗原结合结构域和运送部分且具有比单独存在的抗原结合结构域更长的半衰期的多肽，其中所述运送部分具有用于抑制抗原结合结构域的抗原结合活性的抑制结构域；用于制备和筛选该多肽的方法；含有该多肽的药物组合物，用于制备和筛选通过与特定的VL/VH/VHH缔合而使其抗原结合活性受抑制的单结构域抗体的方法；以及包含通过与特定的VL/VH/VHH缔合而使其抗原结合活性受抑制的单结构域抗体的融合多肽的文库。

Description

包含抗原结合结构域和运送部分的多肽
本申请是国际申请日为2017年11月28日、国际申请号为PCT/JP2017/042542于2019年7月12日进入中国国家阶段、申请号201780083314.4、发明名称“包含抗原结合结构域和运送部分的多肽”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及包含抗原结合结构域和运送部分且具有比单独存在的抗原结合结构域更长的半衰期的多肽，其中所述运送部分具有抑制抗原结合结构域的抗原结合活性的抑制结构域，用于制备和筛选所述多肽的方法，含有所述多肽的药物组合物，用于制备和筛选能够通过与特定的VL、VH或VHH缔合而使其抗原结合活性受抑制的单结构域抗体的方法，以及包含能够通过与特定的VL、VH或VHH缔合而使其抗原结合活性受抑制的单结构域抗体的融合多肽的文库。
背景技术
因为抗体在血浆中是高度稳定的并且引起很少的不良反应，因此已经作为药物受到关注。其中许多IgG型抗体药物已推出，并且目前正在开发大量抗体药物(非专利文献1和2)。
迄今为止，针对CD20的利妥昔单抗(Rituxan)、针对EGFR的西妥昔单抗(cetuximab)、针对HER2的曲妥珠单抗(Herceptin)等已被批准为使用抗体药物的癌症治疗药物(非专利文献3)。这些抗体分子与他们在癌细胞上表达的抗原相结合，从而通过ADCC活性等针对癌细胞发挥细胞毒性。已知这种基于ADCC活性等的细胞毒性活性取决于治疗性抗体的靶细胞上所表达的抗原数目(非专利文献4)。因此，从治疗性抗体的效果的观点来看，靶向抗原的高表达水平是优选的。然而，如果抗原(尽管具有高表达水平)是在正常组织中表达，则针对正常细胞发挥基于ADCC活性等的细胞毒性。因此，不良反应成为了严重问题。因此，治疗性抗体作为癌症治疗药物所靶向的抗原，优选在癌细胞上特异性表达。例如，针对已知为癌抗原的EpCAM的抗体分子，作为癌症治疗药物被认为是有前景的。但是已知EpCAM也会在胰腺中表达。实际上，在临床试验中已有报道，由于针对胰腺的细胞毒性，施用抗EpCAM抗体导致胰腺炎作为不良反应(非专利文献5)。
在基于ADCC活性发挥细胞毒性的抗体药物成功之后，已经报道了发挥强大细胞毒性活性的第二代改良抗体分子作为以下各项的结果：例如，通过从天然人IgG1Fc区的N连接寡糖去除海藻糖来增强ADCC活性(非专利文献6)，或通过经由天然人IgG1Fc区的氨基酸置换增强与FcγRIIIa的结合而增强ADCC活性(非专利文献7)。也已经报道了改进的抗体分子和小分子抗体作为在机制下发挥不同于如上所述的NK细胞介导的ADCC活性的针对癌细胞的细胞毒活性的抗体药物，其中所述改进的抗体分子发挥更强的细胞毒性活性，诸如含有与具有强细胞毒性活性的药物缀合的抗体的抗体药物缀合物(ADC)(非专利文献8)，其中所述小分子抗体通过招募T至癌细胞来发挥对癌细胞的细胞毒活性(非专利文献9)。
这样的发挥更强细胞毒活性的抗体分子对即使表达不高水平的抗原的癌细胞也发挥细胞毒活性，但也对低水平表达抗原的正常组织发挥细胞毒活性，与癌细胞类似。实际上，与西妥昔单抗(针对EGFR的天然的人IgG1)相比，EGFR-BiTE(一种针对CD3和EGFR的双特异性抗体)能够通过将T细胞招募到癌细胞而对癌细胞发挥强烈的细胞毒活性并发挥抗肿瘤作用。另一方面，还发现通过将EGFR-BiTE施用至食蟹猴出现严重的不良反应，因为EGFR也在正常组织中表达(非专利文献10)。此外，由于CD44v6也在正常组织中表达，因此临床上已经发现含有与针对CD44v6的抗体缀合的DM1细胞毒的ADC比伐珠单抗DM1细胞毒会引起严重的皮肤毒性和肝毒性，其中所述CD44v6在癌细胞上高表达(非专利文献11)。
如上所述，使用能够对低水平表达抗原的癌细胞发挥强细胞毒活性的抗体需要靶抗原以极其癌症特异性的方式表达。然而，考虑到曲妥珠单抗的靶抗原HER2或西妥昔单抗的靶抗原EGFR也在正常组织中表达，只有有限数量的癌抗原可以以极其癌症特异性的方式表达。因此，尽管可以增强针对癌症的细胞毒性活性，可归因于对正常组织的细胞毒性作用的不良反应可能成为问题。
最近，伊匹木单抗，其通过抑制导致癌症免疫抑制的CTLA4来增强肿瘤免疫力，已经显示出延长转移性黑素瘤的总体存活率(非专利文献12)。然而，尽管增强了肿瘤免疫力，但由于免疫的全身激活，伊匹木单抗全身性地抑制CTLA4并因此引起自身免疫疾病样严重的不良反应(非专利文献13)。
同时，已知通过抑制炎症或自身免疫疾病中的炎性细胞因子而发挥治疗作用的抗体药物作为针对癌症以外的疾病的抗体药物(非专利文献14)。已知例如靶向TNF的英利昔单抗(Remicade)或阿达木单抗(Humira)和靶向IL-6R的托珠单抗(Actemra)对类风湿性关节炎发挥高治疗效果，然而由于这些细胞因子的全身中和，而将感染性疾病视为不良反应(非专利文献15)。
已经开发了各种技术作为适用于第二代抗体药物的技术。例如，已经报道了改善效应子功能、抗原结合能力、药代动力学或稳定性或降低免疫原性风险的技术(非专利文献16)。然而，仍有一些关于允许抗体药物特异性作用于靶组织以解决如上所述的不良反应的技术的报道。所报道的技术包括一种方法，该方法包括：通过在病变部位(诸如癌组织或炎性组织)处表达的蛋白酶切割的接头将抗体与掩蔽肽连接，从而用掩蔽肽掩蔽抗体的抗原结合位点，并抑制该抗体的抗原结合活性；通过该接头的蛋白酶切割使掩蔽肽解离，以便抗体恢复其抗原结合活性，并且变得能够与靶病理组织中的抗原结合(非专利文献17和18以及专利文献1)。
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发明概述
[发明要解决的问题]
本发明人已经想过，通过蛋白酶切割，使抑制抗体的抗原结合活性的掩蔽肽解离以便抗体恢复其抗原结合活性的技术，如上所述可能引起不良反应，原因在于由于蛋白酶的切割是不可逆的，因而在病变部位切割的抗体能够通过血流分布到正常组织。
本发明是基于这样的想法而完成的。本发明的一个目的是提供一种用于疾病治疗的具有减少的不良反应的药物组合物，及其活性成分。本发明的另一个目的是提供筛选和制备药物组合物和活性成分的方法。
[问题的解决手段]
本发明人进行了勤勉的研究，并因此开发了包含抗原结合结构域和运送部分并具有比单独存在的抗原结合结构域更长的半衰期的多肽，所述运送部分具有抑制抗原结合结构域的结合活性的抑制结构域。据认为使用该多肽可以使抗原结合结构域恢复其在疾病组织中的抗原结合活性，并在疾病组织中发挥抗原结合活性。此外，由于包含其抗原结合活性被抑制的抗原结合结构域的多肽与包含其抗原结合活性被恢复的抗原结合结构域的多肽之间的半衰期不同，活化形式的抗原结合结构域的全身分布可以得到抑制。此外，本发明人发现该多肽或包含该多肽的药物组合物可用于疾病治疗，并且还发现：该多肽或该药物组合物可用于包括施用多肽的疾病治疗；该多肽可用于制备用于疾病治疗的药物。本发明人进一步开发了用于筛选和制备多肽的方法，用于制备和筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定的VL、VH或VHH缔合而被抑制，和含有单结构域抗体的文库，其中所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定的VL、VH或VHH缔合而被抑制，完成了本发明。
本发明基于这些发现，并且具体涵盖下述的示例性实施方案。
(1)包含抗原结合结构域和运送部分的多肽，所述运送部分具有抑制抗原结合结构域的抗原结合活性的抑制结构域，并且所述抗原结合结构域比运送部分具有更短的在血液中的半衰期。
(2)根据(1)所述的多肽，其中所述抗原结合结构域的分子量小于运送部分的分子量。
(3)根据(1)或(2)所述的多肽，其中抗原结合结构域的分子量为60kDa或更小。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的多肽，其中所述运送部分具有FcRn结合活性，并且抗原结合结构域不具有FcRn结合活性或具有比运送部分弱的FcRn结合活性。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合结构域能够从所述多肽释放，并且从多肽释放的抗原结合结构域具有比释放前更高的抗原结合活性。
(6)根据(1)至(5)中任一项所述的多肽，其中所述运送部分的抑制结构域与所述抗原结合结构域缔合，从而抑制所述抗原结合结构域的抗原结合活性。
(7)根据(5)所述的多肽，其中所述多肽包含切割位点，其中所述切割位点被切割使得抗原结合结构域变得能够从多肽中释放。
(8)根据(6)所述的多肽，其中所述多肽包含切割位点，其中切割位点被切割，从而消除了运送部分的抑制结构域与抗原结合结构域的缔合。
(9)根据(7)或(8)的多肽，其中所述切割位点包含蛋白酶切割序列。
(10)根据(9)所述的多肽，其中所述蛋白酶是靶组织特异性蛋白酶。
(11)根据(10)所述的多肽，其中靶组织是癌组织或炎性组织。
(12)根据(9)所述的多肽，其中蛋白酶是选自蛋白裂解酶、尿激酶(uPA)和金属蛋白酶中的至少一种蛋白酶。
(13)根据(12)所述的多肽，其中蛋白酶是选自MT-SP1、uPA、MMP2、MMP9、ADAMTS5、MMP7和MMP13中的至少一种蛋白酶。
(14)根据(9)所述的多肽，其中蛋白酶切割序列包含选自SEQ ID NO:12，25，34，35，70至73，75，76，91，178和193至195的序列。
(15)根据(9)至(14)中任一项所述的多肽，其中第一柔性接头进一步连接至蛋白酶切割序列的一端。
(16)根据(15)所述的多肽，其中第二柔性接头进一步连接到蛋白酶切割序列的另一端。
(17)根据(15)所述的多肽，其中所述第一柔性接头是由甘氨酸-丝氨酸聚合物组成的柔性接头。
(18)根据(16)所述的多肽，其中所述第二柔性接头是由甘氨酸-丝氨酸聚合物组成的柔性接头。
(19)根据(1)至(18)中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合结构域包含单结构域抗体或者是单结构域抗体，其中所述运送部分的抑制结构域抑制所述单结构域抗体的抗原结合活性。
(20)根据(19)所述的多肽，其中所述单结构域抗体为VHH、本身具有抗原结合活性的VH或本身具有抗原结合活性的VL。
(21)根据(1)至(20)中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合结构域包含单结构域抗体，并且所述运送部分的抑制结构域是VHH、抗体VH或抗体VL，其中所述单结构域抗体的抗原结合活性被VHH、抗体VH或抗体VL抑制。
(22)根据(1)至(21)中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合结构域包含单结构域抗体，并且运送部分的抑制结构域是VHH、抗体VH或抗体VL，其中所述单结构域抗体的抗原结合活性通过与VHH、抗体VH或抗体VL缔合而被抑制。
(23)根据(19)至(22)中任一项所述的多肽，其中所述单结构域抗体是VHH或本身具有抗原结合活性的VH，且所述运送部分的抑制结构域是抗体VL，其中所述VHH或所述本身具有抗原结合活性的VH的抗原结合活性通过与抗体VL缔合而被抑制。
(24)根据(19)至(23)中任一项所述的多肽，其中所述单结构域抗体为VHH，其中所述VHH在选自氨基酸位置37、44、45和47(所有根据Kabat编号)的至少一个位置具有氨基酸置换。
(25)根据(19)至(23)中任一项所述的多肽，其中所述单结构域抗体是VHH，其中所述VHH含有选自氨基酸37V、44G、45L和47W(均根据Kabat编号)的至少一个氨基酸。
(26)根据(19)至(23)中任一项所述的多肽，其中所述单结构域抗体是VHH，其中所述VHH含有选自氨基酸置换F37V、Y37V、E44G、Q44G、R45L、H45L、G47W、F47W、L47W、T47W和S47W的至少一个氨基酸置换(均根据Kabat编号)。
(27)根据(19)至(23)中任一项所述的多肽，其中所述单结构域抗体是VHH，其中所述VHH在选自位置37/44、位置37/45、位置37/47、位置44/45、位置44/47、位置45/47、位置37/44/45、位置37/44/47、位置37/45/47、位置44/45/47和位置37/44/45/47(全部按照Kabat编号)的至少一组位置上具有氨基酸置换。
(28)根据(19)至(23)中任一项所述的多肽，其中所述单结构域抗体是VHH，其中所述VHH含有选自37V/44G、37V/45L、37V/47W、44G/45L、44G/47W、45L/47W、37V/44G/45L、37V/44G/47W、37V/45L/47W、44G/45L/47W、37V/44G/45L/47W(全部按照Kabat编号)的至少一组氨基酸。
(29)根据(19)至(23)中任一项所述的多肽，其中单结构域抗体是VHH，其中所述VHH含有选自F37V/R45L、F37V/G47W、R45L/G47W和F37V/R45L/G47W的至少一组氨基酸置换(全部按照Kabat编号)。
(30)根据(19)至(22)中任一项所述的多肽，其中所述单结构域抗体是本身具有抗原结合活性的VL，并且运送部分的抑制结构域是抗体VH，其中本身具有抗原结合活性的VL的抗原结合活性通过与抗体VH缔合而抑制。
(31)根据(1)至(30)中任一项所述的多肽，其中所述运送部分具有FcRn结合区。
(32)根据(1)至(31)中任一项所述的多肽，其中所述运送部分包含抗体恒定区。
(33)根据(32)所述的多肽，其中所述运送部分的抗体恒定区和所述抗原结合结构域通过接头或不通过接头而融合。
(34)根据(32)所述的多肽，其中所述运送部分包含抗体重链恒定区，其中所述抗体重链恒定区和所述抗原结合结构域通过接头或不通过接头而融合。
(35)根据(32)所述的多肽，其中所述运送部分包含抗体轻链恒定区，其中所述抗体轻链恒定区和所述抗原结合结构域通过接头或不通过接头而融合。
(36)根据(34)所述的多肽，其中在多肽中，运送部分的抗体重链恒定区的N末端和所述抗原结合结构域的C末端通过接头或不通过接头而融合，且所述多肽还具有蛋白酶切割序列，其中所述蛋白酶切割序列位于抗原结合结构域的序列内，或者与抗体重链恒定区的氨基酸位置122(EU编号)相比位于抗原结合结构域侧。
(37)根据(35)所述的多肽，其中在多肽中，所述运送部分的抗体轻链恒定区的N末端和所述抗原结合结构域的C末端通过接头或不通过接头而融合，且所述多肽还具有蛋白酶切割序列，其中蛋白酶切割序列位于抗原结合结构域的序列内，或者与抗体轻链恒定区的氨基酸位置113(EU编号)(Kabat编号位置113)相比位于抗原结合结构域侧。
(38)根据(33)至(35)中任一项所述的多肽，其中在多肽中，所述运送部分的抗体恒定区的N末端和所述抗原结合结构域的C末端通过接头或不通过接头融合，所述抗原结合结构域是由VH或VHH制备的单结构域抗体，并且所述多肽进一步具有蛋白酶切割序列，其中所述蛋白酶切割序列位于所述抗体恒定区的序列内，或与所述抗原结合结构域的单结构域抗体的氨基酸位置109(Kabat编号)相比位于抗体恒定区侧。
(39)根据(33)所述的多肽，其中在所述多肽中，所述运送部分的抗体恒定区的N末端和所述抗原结合结构域的C末端通过接头或不通过接头而融合，且所述多肽进一步具有蛋白酶切割序列，其中所述蛋白酶切割序列位于抗原结合结构域和抗体恒定区之间的边界附近。
(40)根据(34)所述的多肽，其中在所述多肽中，所述运送部分的抗体重链恒定区的N末端和所述抗原结合结构域的C末端通过接头或不通过接头而融合，且所述多肽进一步具有蛋白酶切割序列，其中所述蛋白酶切割序列位于抗原结合结构域和抗体重链恒定区之间的边界附近。
(41)根据(35)所述的多肽，其中在所述多肽中，所述运送部分的抗体轻链恒定区的N末端和所述抗原结合结构域的C末端通过接头或不通过接头而融合，且所述多肽进一步具有蛋白酶切割序列，其中所述蛋白酶切割序列位于抗原结合结构域和抗体轻链恒定区之间的边界附近。
(42)根据(40)所述的多肽，其中所述抗原结合结构域是由VH或VHH制备的单结构域抗体，并且所述蛋白酶切割序列位于抗原结合结构域的单结构域抗体的氨基酸位置109(Kabat编号)和抗原重链恒定区的氨基酸位置122(EU编号)之间的任何位置。
(43)根据(41)的多肽，其中所述抗原结合结构域是由VH或VHH制备的单结构域抗体，并且所述蛋白酶切割序列位于抗原结合结构域的单结构域抗体的氨基酸位置109(Kabat编号)和抗原轻链恒定区的氨基酸位置113(EU编号)(Kabat编号位置113)之间的任何位置。
(44)根据(40)所述的多肽，其中所述抗原结合结构域是由VL制备的单结构域抗体，并且所述蛋白酶切割序列位于抗原结合结构域的单结构域抗体的氨基酸位置104(Kabat编号)和抗体重链恒定区的氨基酸位置122(EU编号)之间的任何位置。
(45)根据(41)的所述多肽，其中所述抗原结合结构域是由VL制备的单结构域抗体，并且所述蛋白酶切割序列位于抗原结合结构域的单结构域抗体的氨基酸位置109(Kabat编号)和抗体轻链恒定区的氨基酸位置113(EU编号)(Kabat编号位置113)之间的任何位置。
(46)根据(32)至(45)中任一项所述的多肽，其中所述多肽的抗体恒定区是IgG抗体恒定区。
(47)根据(1)至(46)中任一项所述的多肽，其中所述多肽是IgG抗体样分子。
(48)根据(1)至(47)中任一项所述的多肽，其中当通过使用BLI(生物层干涉测定法)(Octet)在未释放状态下测定所述抗原结合结构域时，没有观察到抗原结合结构域结合到抗原。
(49)根据(1)至(48)中任一项所述的多肽，其中第二抗原结合结构域进一步与抗原结合结构域连接。
(50)根据(49)所述的多肽，其中所述第二抗原结合结构域具有与抗原结合结构域不同的抗原结合特异性。
(51)根据(49)或(50)所述的多肽，其中所述第二抗原结合结构域包含第二单结构域抗体。
(52)根据(51)所述的多肽，其中所述抗原结合结构域是单结构域抗体，所述第二抗原结合结构域是第二单结构域抗体，并且抗原结合结构域和第二抗原结合结构域能够从多肽释放，其中所述单结构域抗体和所述第二单结构域抗体在抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的释放状态下形成双特异性抗原结合分子。
(53)根据(49)至(52)中任一项所述的多肽，其中所述第二抗原结合结构域针对作为靶抗原的HER2或GPC3。
(54)根据(1)至(53)中任一项所述的多肽，其中所述多肽进一步具有不同于抗原结合结构域的另外的抗原结合结构域，其中所述另外的抗原结合结构域的抗原结合活性也通过连接到多肽的运送部分而被抑制。
(55)根据(54)所述的多肽，其中所述另外的抗原结合结构域和抗原结合结构域在抗原结合特异性方面不同。
(56)根据(1)至(55)中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合结构域是针对作为靶抗原的丛状蛋白A1、IL6R或CD3的抗原结合结构域。
(57)一种药物组合物，其包含(1)-(56)中任一项所述的多肽。
(58)一种制备(1)至(56)中任一项所述的多肽的方法。
(59)根据(58)的制备方法，其包括以下步骤：
(a)获得与靶抗原结合的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体与运送部分连接，使得单结构域抗体的抗原结合活性被运送部分的抑制结构域抑制，以形成多肽前体；和
(c)将蛋白酶切割序列引入多肽前体中。
(60)根据(58)的制备方法，其包括以下步骤：
(a)获得与靶抗原结合的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体与运送部分连接，使得单结构域抗体的抗原结合活性被运送部分的抑制结构域抑制，以形成多肽前体；和
(c)将蛋白酶切割序列引入单结构域抗体和运送部分之间的边界附近。
(61)根据(58)的制备方法，其包括以下步骤：
(a)获得与靶抗原结合的单结构域抗体；和
(b)通过蛋白酶切割序列将步骤(a)中获得的单结构域抗体与运送部分连接，使得单结构域抗体的抗原结合活性被运送部分的抑制结构域抑制，以形成一种多肽。
(62)根据(59)至(61)中任一项所述的制备方法，其进一步包括以下步骤：
(d)证实掺入多肽或多肽前体中的单结构域抗体对靶抗原的结合活性被削弱或丧失。
(63)根据(59)至(62)中任一项所述的制备方法，其进一步包括以下步骤：
(e)通过蛋白酶切割序列的蛋白酶切割来释放单结构域抗体，并证实释放的单结构域抗体与抗原结合。
(64)根据(58)所述的制备方法，其中所述多肽是IgG抗体样分子。
(65)根据(64)所述的制备方法，其包括以下步骤：
(a)获得与靶抗原结合的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体作为IgG抗体的VH的替代物与VL缔合，或将单结构域抗体作为IgG抗体的VL的替代物与VH缔合，使得单结构域抗体的抗原结合活性被抑制，以形成含有单结构域抗体的IgG抗体样分子前体；和
(c)将蛋白酶切割序列引入含有单结构域抗体的IgG抗体样分子前体中。
(66)根据(64)所述的制备方法，其包括以下步骤：
(a)获得与靶抗原结合的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体作为IgG抗体的VH的替代物与VL缔合，或将单结构域抗体作为IgG抗体的VL的替代物与VH缔合，使得单结构域抗体的抗原结合活性被抑制，以形成含有单结构域抗体的IgG抗体样分子前体；和
(c)将蛋白酶切割序列引入IgG抗体样分子前体中单结构域抗体和抗体恒定区之间的边界附近。
(67)根据(64)所述的制备方法，其包括以下步骤：
(a)获得与靶抗原结合的单结构域抗体；和
(b)通过蛋白酶切割序列将步骤(a)中获得的单结构域抗体作为IgG抗体VH或VL的替代物连接至IgG抗体重链恒定区或轻链恒定区，使得单结构域抗体的抗原结合活性被抑制，以形成含有单结构域抗体的IgG抗体样分子。
(68)根据(65)至(67)中任一项所述的制备方法，其进一步包括以下步骤：
(d)证实IgG抗体样分子或IgG抗体样分子前体中含有的单结构域抗体对靶抗原的结合活性减弱或丧失。
(69)根据(65)至(68)中任一项所述的制备方法，其进一步包括以下步骤：
(e)通过蛋白酶切割序列的蛋白酶切割来释放单结构域抗体，并证实释放的单结构域抗体与靶抗原结合。
(70)根据(64)的制备方法，其包括以下步骤：
(a)置换单结构域抗体中涉及单结构域抗体与抗体VH缔合的氨基酸残基，或置换单结构域抗体中涉及单结构域抗体与抗体VL缔合的氨基酸残基，以制备保持单结构域抗体对靶抗原的结合活性的单结构域抗体变体；
(b)将步骤(a)中制备的单结构域抗体变体与抗体VL缔合，或将单结构域抗体变体与抗体VH缔合，使得单结构域抗体变体的抗原结合活性受到抑制，以形成含有单结构域抗体变体的IgG抗体样分子前体；和
(c)将蛋白酶切割序列引入含有单结构域抗体变体的IgG抗体样分子前体中。
(71)根据(64)的制备方法，其包括以下步骤：
(a)置换单结构域抗体中涉及与抗体VH缔合的氨基酸残基，或置换单结构域抗体中涉及与抗体VL缔合的氨基酸残基，以制备保持单结构域抗体对靶抗原的结合活性的单结构域抗体变体；
(b)将步骤(a)中制备的单结构域抗体变体与抗体VL缔合，或将单结构域抗体变体与抗体VH结合，使得单结构域抗体变体的抗原结合活性受到抑制，以形成含有单结构域抗体变体的IgG抗体样分子前体；和
(c)将蛋白酶切割序列引入IgG抗体样分子前体中的单结构域抗体变体与恒定区之间的边界附近。
(72)根据(64)所述的制备方法，其包括以下步骤：
(a)置换单结构域抗体中涉及与抗体VH缔合的氨基酸残基，或置换单结构域抗体中涉及与抗体VL缔合的氨基酸残基，以制备保持单结构域抗体对靶抗原的结合活性的单结构域抗体变体；和
(b)通过蛋白酶切割序列将步骤(a)中制备的单结构域抗体变体与IgG抗体重链恒定区连接，或通过蛋白酶切割序列将所述单结构域抗体变体与IgG抗体轻链恒定区连接，使得单结构域抗体变体的抗原结合活性受到抑制，以形成含有单结构域抗体变体的IgG抗体样分子。
(73)根据(70)至(72)中任一项所述的制备方法，其进一步包括以下步骤：
(d)证实IgG抗体样分子中含有的单结构域抗体变体的结合活性或IgG抗体样分子前体中含有的单结构域抗体变体与靶抗原的结合活性被削弱或丧失。
(74)根据(70)至(73)中任一项中所述的制备方法，其进一步包括以下步骤：
(e)通过用蛋白酶来切割蛋白酶切割序列而释放单结构域抗体变体，并证实释放的单结构域抗体变体与靶抗原结合。
(75)一种多核苷酸，其编码(1)～(56)中任一项所述的多肽。
(76)一种载体，其包含根据(75)所述的多核苷酸。
(77)一种宿主细胞，其包含根据(75)所述的多核苷酸或根据(76)所述的载体。
(78)根据(1)至(56)中任一项的制备多肽的方法，其包括培养根据(77)所述的宿主细胞的步骤。
(79)一种筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VL缔合，与特定VH缔合或与特定VHH缔合而被抑制。
(80)根据(79)的筛选方法，其中所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VL缔合而被抑制。
(81)根据(80)的筛选方法，其包括以下步骤：
(a)获得具有靶抗原结合活性的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体与特定VL缔合；和
(c)与缔合前相比，证实步骤(b)中与特定VL缔合的单结构域抗体对抗原的结合活性减弱或丧失。
(82)根据(80)的筛选方法，其包括以下步骤：
(a)将单结构域抗体与特定VL缔合；
(b)基于步骤(a)中与特定VL缔合的单结构域抗体针对抗原没有结合活性或具有预定值或更低的结合活性，选择VL和单结构域抗体的缔合物；和
(c)证实步骤(b)中选择的缔合物中的单结构域抗体在不与特定VL缔合的状态下比在与其缔合的状态下对抗原具有更强的结合活性。
(83)如(79)所述的筛选方法，其中，所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VH缔合而被抑制。
(84)根据(83)所述的筛选方法，其包括以下步骤：
(a)获得具有靶抗原结合活性的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体与特定VH相缔合；和
(c)与缔合前相比，证实步骤(b)中与特定VH缔合的单结构域抗体对抗原的结合活性减弱或丧失。
(85)根据(83)所述的筛选方法，其包括以下步骤：
(a)将单结构域抗体与特定VH缔合；
(b)基于步骤(a)中与特定VH缔合的单结构域抗体针对抗原没有结合活性或具有预定值或更低的结合活性，选择VH和单结构域抗体的缔合物；和
(c)证实步骤(b)中选择的缔合物中的单结构域抗体在不与特定VH缔合的状态下比在与其缔合的状态下对抗原具有更强的结合活性。
(86)根据(79)的筛选方法，其中所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VHH结合而被抑制。
(87)根据(86)所述的筛选方法，其包括以下步骤：
(a)获得具有靶抗原结合活性的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体与特定VHH缔合；和
(c)与缔合前相比，证实步骤(b)中与特定VHH缔合的单结构域抗体对抗原的结合活性减弱或丧失。
(88)根据(86)所述的筛选方法，其包括以下步骤：
(a)将单结构域抗体与特定VHH缔合；
(b)基于步骤(a)中与特定VHH缔合的单结构域抗体针对抗原没有结合活性或具有预定值或更低的结合活性，选择VHH和单结构域抗体的缔合物；和
(c)证实步骤(b)中选择的缔合物中的单结构域抗体在不与特定VHH缔合的状态下比在与其缔合的状态下对抗原具有更强的结合活性。
(89)一种制备单结构域抗体的方法，其中所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VL缔合，与特定VH缔合或与特定VHH缔合而被抑制。
(90)如(89)所述的制备方法，其中所述方法是用于制备单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定的VL缔合而被抑制。
(91)根据(90)所述的制造方法，其包括以下步骤：
(a)置换单结构域抗体中涉及与抗体VL缔合的氨基酸残基，以制备保留单结构域抗体对靶抗原的结合活性的单结构域抗体变体。
(92)根据(91)所述的制备方法，其进一步包括以下步骤：
(b)将步骤(a)中制备的单结构域抗体变体与VL缔合；和
(c)与缔合前相比，证实与VL缔合的单结构域抗体变体的抗原结合活性减弱或丧失。
(93)如(89)所述的制备方法，其中所述方法是制备单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定的VH缔合而被抑制。
(94)根据(93)的制备方法，其包括以下步骤：
(a)置换单结构域抗体中涉及与IgG抗体样分子VH缔合的氨基酸残基，以制备保留单结构域抗体对靶抗原的结合活性的单结构域抗体变体。
(95)根据(94)所述的制备方法，其进一步包括以下步骤：
(b)将步骤(a)中制备的单结构域抗体变体与VH缔合；和
(c)与缔合前相比，证实与VH缔合的单结构域抗体变体的抗原结合活性减弱或丧失。
(96)如(89)所述的制备方法，其中所述方法是用于制备单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定的VHH缔合而被抑制。
(97)根据(96)的制备方法，其包括以下步骤：
(a)置换单结构域抗体中涉及与VHH缔合的氨基酸残基，以制备保留单结构域抗体对靶抗原的结合活性的单结构域抗体变体。
(98)根据(97)所述的制备方法，其进一步包括以下步骤：
(b)将步骤(a)中制备的单结构域抗体变体与VHH缔合；和
(c)与缔合前相比，证实与VHH缔合的单结构域抗体变体的抗原结合活性减弱或丧失。
(99)包含多个单结构域抗体的融合多肽的文库，每个单结构域抗体连接到第一缔合维持结构域，其中单结构域抗体包括：其抗原结合活性能够通过与特定VL缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体，其抗原结合活性能够通过与特定VH缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体，或其抗原结合活性能够通过与特定VHH缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体。
(100)根据(99)所述的文库，其中文库中融合多肽的单结构域抗体部分包括获自骆驼(Camelidae)科动物或携带能够产生该单结构域抗体的基因的转基因动物的单结构域抗体，或其人源化抗体；通过免疫骆驼科动物或携带能够产生该单结构域抗体的基因的转基因动物而获得的单结构域抗体，或其人源化抗体；或源自人抗体VH或VL的人工制备的单结构域抗体。
(101)根据(99)或(100)所述的文库，其是包含多个单结构域抗体融合多肽的文库，每个单结构域抗体与第一缔合维持结构域连接，其中单结构域抗体包括其抗原结合活性能够通过与特定VL缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体。
(102)根据(99)或(100)所述的文库，其是包含多个单结构域抗体融合多肽的文库，每个单结构域抗体与第一缔合维持结构域连接，其中单结构域抗体包括其抗原结合活性能够通过与特定VH缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体。
(103)根据(99)或(100)所述的文库，其是包含多个单结构域抗体融合多肽的文库，每个单结构域抗体与第一缔合维持结构域连接，其中单结构域抗体包括其抗原结合活性能够通过与特定VHH缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体。
(104)用于针对融合多肽筛选根据(99)或(100)所述的文库的方法，所述融合多肽包含其抗原结合活性能够通过与特定VL缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体，其抗原结合活性能够通过与特定VH缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体，或其抗原结合活性能够通过与特定VHH缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体。
(105)用于针对融合多肽筛选根据(101)所述的文库的方法，所述融合多肽包含其抗原结合活性能够通过与特定VL缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体。
(106)根据(105)所述的筛选方法，其包括以下步骤：
(a)体外展示所述文库的融合多肽；
(b)提供与特定VL融合的第二缔合维持结构域的缔合配偶体；
(c)将步骤(a)中展示的融合多肽与步骤(b)中提供的缔合配偶体体相缔合，并选择在单结构域抗体与所述VL缔合的状态下不与抗原结合或具有预定值或更低的抗原结合活性的融合多肽；和
(d)从步骤(c)中由此选择的融合多肽中选择如下融合多肽：其在其中所含的单结构域抗体不与所述VL缔合的状态下，与抗原结合或者具有预定值或更高的抗原结合活性。
(107)根据(106)所述的筛选方法，其中步骤(b)中提供的缔合配偶体进一步包含蛋白酶切割序列，并且步骤(d)包括通过蛋白酶处理切割缔合配偶体，使得单结构域抗体与VL的缔合被取消。
(108)根据(107)所述的筛选方法，其中步骤(b)中提供的缔合配偶体的蛋白酶切割序列位于特定VL和第二缔合维持结构域之间的边界附近。
(109)根据(106)所述的筛选方法，其中所述文库的融合多肽进一步包含蛋白酶切割序列，并且步骤(d)包括通过蛋白酶处理切割融合多肽，以使单结构域抗体与VL的缔合被取消。
(110)根据(109)所述的筛选方法，其中每个融合多肽中包含的蛋白酶切割序列位于单结构域抗体和第一缔合维持结构域之间的边界附近。
(111)根据(106)所述的筛选方法，其中步骤(d)包括在体外再次展示在步骤(c)中选择的融合多肽的全长或其包含单结构域抗体的部分。
(112)根据(106)所述的筛选方法，其中步骤(d)包括在体外再次展示在步骤(c)中选择的融合多肽的全长并选择这样的融合多肽：在仅与第二缔合维持结构域相缔合的状态下，其与抗原结合或具有预定值或更高的抗原结合活性。
(113)用于针对融合多肽筛选根据(102)所述的文库的方法，所述融合多肽包含其抗原结合活性能够通过与特定VH缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体。
(114)根据(113)的筛选方法，其包括以下步骤：
(a)体外展示所述文库的融合多肽；
(b)提供与特定VH融合的第二缔合维持结构域的缔合配偶体；
(c)将步骤(a)中展示的融合多肽与步骤(b)中提供的缔合配偶体体相缔合，并选择在单结构域抗体与所述VH缔合的状态下不与抗原结合或具有预定值或更低的抗原结合活性的融合多肽；和
(d)从步骤(c)中由此选择的融合多肽中选择如下融合多肽：其在其中所含的单结构域抗体不与VH缔合的状态下，与抗原结合或者具有预定值或更高的抗原结合活性。
(115)根据(114)所述的筛选方法，其中步骤(b)中提供的缔合配偶体进一步包含蛋白酶切割序列，并且步骤(d)包括通过蛋白酶处理切割缔合配偶体，使得单结构域抗体与VH的缔合被取消。
(116)根据(115)所述的筛选方法，其中步骤(b)中提供的缔合配偶体的蛋白酶切割序列位于特定VH和第二缔合维持结构域之间的边界附近。
(117)根据(114)所述的筛选方法，其中所述文库的融合多肽进一步包含蛋白酶切割序列，并且步骤(d)包括通过蛋白酶处理切割融合多肽，以使单结构域抗体与VH的缔合被取消。
(118)根据(117)所述的筛选方法，其中每个融合多肽中包含的蛋白酶切割序列位于单结构域抗体和第一缔合维持结构域之间的边界附近。
(119)根据(114)所述的筛选方法，其中步骤(d)包括在体外再次展示在步骤(c)中选择的融合多肽的全长或其包含单结构域抗体的部分。
(120)根据(114)所述的筛选方法，其中步骤(d)包括在体外再次展示在步骤(c)中选择的融合多肽的全长并选择这样的融合多肽：在仅与第二缔合维持结构域相缔合的状态下，其与抗原结合或具有预定值或更高的抗原结合活性。
(121)用于针对融合多肽筛选根据(103)所述的文库的方法，所述融合多肽包含其抗原结合活性能够通过与特定VHH缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体。
(122)根据(121)所述的筛选方法，其包括以下步骤：
(a)体外展示所述文库的融合多肽；
(b)提供与特定VHH融合的第二缔合维持结构域的缔合配偶体；
(c)将步骤(a)中展示的融合多肽与步骤(b)中提供的缔合配偶体体相缔合，并选择在单结构域抗体与VHH缔合的状态下不与抗原结合或具有预定值或更低的抗原结合活性的融合多肽；和
(d)从步骤(c)中由此选择的融合多肽中选择如下融合多肽：其在其中所含的单结构域抗体不与VHH缔合的状态下，与抗原结合或者具有预定值或更高的抗原结合活性。
(123)根据(122)所述的筛选方法，其中步骤(b)中提供的缔合配偶体进一步包含蛋白酶切割序列，并且步骤(d)包括通过蛋白酶处理切割缔合配偶体，使得单结构域抗体与VHH的缔合被取消。
(124)根据(123)所述的筛选方法，其中步骤(b)中提供的缔合配偶体的蛋白酶切割序列位于特定VHH和第二缔合维持结构域之间的边界附近。
(125)根据(122)所述的筛选方法，其中所述文库的融合多肽进一步包含蛋白酶切割序列，并且步骤(d)包括通过蛋白酶处理切割融合多肽，以使单结构域抗体与VH的缔合被取消。
(126)根据(125)所述的筛选方法，其中每个融合多肽中包含的蛋白酶切割序列位于单结构域抗体和第一缔合维持结构域之间的边界附近。
(127)根据(122)所述的筛选方法，其中步骤(d)包括在体外再次展示在步骤(c)中选择的融合多肽的全长或其包含单结构域抗体的部分。
(128)根据(122)所述的筛选方法，其中步骤(d)包括在体外再次展示在步骤(c)中选择的融合多肽的全长并选择这样的融合多肽：在仅与第二缔合维持结构域相缔合的状态下，其与抗原结合或具有预定值或更高的抗原结合活性。
(129)根据(106)至(112)，(114)至(120)和(122)至(128)中任一项所述的筛选方法，其中在步骤(b)中提供缔合配偶体的步骤是将缔合配偶体和融合多肽一起展示的步骤。
(130)根据(99)至(103)中任一项所述的文库，其中所述第一缔合维持结构域包含IgG抗体CH1结构域或抗体轻链恒定区。
(131)根据(106)至(112)、(114)至(120)和(122)至(128)中任一项所述的筛选方法，其中所述第一缔合维持结构域包含IgG抗体CH1结构域，且所述第二缔合维持结构域包含抗体轻链恒定区。
(132)根据(106)至(112)，(114)至(120)和(122)至(128)中任一项所述的筛选方法，其中所述第一缔合维持结构域包含抗体轻链恒定区，且所述第二缔合维持结构域包含IgG抗体CH1结构域。
(133)根据(105)所述的筛选方法，其包括以下步骤：
(a)体外展示所述文库的融合多肽；
(b)提供与特定VL融合的第二缔合维持结构域的缔合配偶体；
(c)选择包含结合抗原或具有预定值或更高的抗原结合活性的单结构域抗体的融合多肽；和
(d)将步骤(c)中由此选择的融合多肽与步骤(b)中提供的缔合配偶体相缔合，并选择在单结构域抗体与VL缔合的状态下不与抗原结合或具有预定值或更低的抗原结合活性的融合多肽。
(134)根据(129)所述的筛选方法，其中步骤(d)包括在体外再次展示步骤(c)中选择的融合多肽。
(135)根据(133)所述的筛选方法，其中步骤(c)包括将融合多肽仅与第二缔合维持结构域相缔合或证实仅与第二缔合维持结构域相缔合的融合多肽中所包含的单结构域抗体的抗原结合。
(136)根据(113)所述的筛选方法，其包括以下步骤：
(a)体外展示所述文库的融合多肽；
(b)提供与特定VH融合的第二缔合维持结构域的缔合配偶体；
(c)选择包含与抗原结合或具有预定值或更高的抗原结合活性的单结构域抗体的融合多肽；和
(d)将步骤(c)中由此选择的融合多肽与步骤(b)中提供的缔合配偶体相缔合，并选择在单结构域抗体与VH缔合的状态下不与抗原结合或具有预定值或更低的抗原结合活性的融合多肽。
(137)根据(136)所述的筛选方法，其中步骤(d)包括在体外再次展示在步骤(c)中选择的融合多肽。
(138)根据(136)所述的筛选方法，其中步骤(c)包括将融合多肽仅与第二缔合维持结构域相缔合或证实仅与第二缔合维持结构域相缔合的融合多肽中所包含的单结构域抗体的抗原结合。
(139)根据(121)所述的筛选方法，其包括以下步骤：
(a)体外展示所述文库的融合多肽；
(b)提供与特定VHH融合的第二缔合维持结构域的缔合配偶体；
(c)选择包含与抗原结合或具有预定值或更高的抗原结合活性的单结构域抗体的融合多肽；和
(d)将步骤(c)中由此选择的融合多肽与步骤(b)中提供的缔合配偶体相缔合，并选择在单结构域抗体与VHH缔合的状态下不与抗原结合或具有预定值或更低的抗原结合活性的融合多肽。
(140)根据(139)所述的筛选方法，其中步骤(d)包括在体外再次展示在步骤(c)中选择的融合多肽。
(141)根据(139)所述的筛选方法，其中步骤(c)包括将融合多肽仅与第二缔合维持结构域相缔合或证实仅与第二缔合维持结构域相缔合的融合多肽中所包含的单结构域抗体的抗原结合。
(142)根据(133)至(141)中任一项所述的筛选方法，其中在步骤(d)中将融合多肽与缔合配偶体缔合的步骤是将缔合配偶体和融合多肽一起展示的步骤。
(143)根据(133)至(142)中任一项所述的筛选方法，其中所述第一缔合维持结构域包含IgG抗体CH1结构域，且所述第二缔合维持结构域包含抗体轻链恒定区。
(144)根据(133)至(142)中任一项所述的筛选方法，其中所述第一缔合维持结构域包含抗体轻链恒定区，且所述第二缔合维持结构域包含IgG抗体CH1结构域。
[附图说明]
[图1]图1图示Probody技术的构思。Probody是抗体分子，其抗原结合活性通过由接头将抗体连接到使抗体的抗原结合位点掩蔽的肽而被抑制，所述接头被在病变部位表达的蛋白酶切割。
[图2]图2图示了Probody可能表现出的不良反应的原因。积聚在血液中的活化Probody可能通过与正常组织中表达的抗原结合而表现出不良反应。
[图3]图3图示了Probody可能表现出的不良反应的原因。Probody在通过接头连接的掩蔽肽与抗原结合位点结合的状态和掩蔽肽解离的状态之间处于平衡状态。处于解离状态的分子可以与抗原结合。
[图4]图4图示了Probody可能表现出的不良反应的原因。针对掩蔽肽的抗药物抗体(抗掩蔽肽抗体)可以在激活前与Probody的掩蔽肽结合，从而在没有蛋白酶切割的情况下激活Probody。
[图5]图5图示了包含抗原结合结构域和运送部分的多肽的构思。(A)具有与运送部分连接的抗原结合结构域的多肽具有长的半衰期并且不与抗原结合。(B)通过例如在切割位点切割将抗原结合结构域释放以与抗原结合，由此释放的抗原结合结构域具有短的半衰期。
[图6]图6图示了用于制备本发明多肽的方法的一个实施方案。在本实施方案中，目的多肽是IgG抗体样分子。(A)获得与靶抗原结合的单结构域抗体。(B)单结构域抗体作为IgG抗体的VH的替代物而与VL缔合，使得单结构域抗体的抗原结合活性受到抑制。(C)将蛋白酶切割序列引入到含有单结构域抗体的IgG抗体样分子前体中。
[图7]图7图示了本发明的多肽的一个实施方案。在本实施方案中，多肽是IgG抗体样分子，并且抗原结合结构域分别建立在对应于IgG抗体的两个可变区的部分。两个抗原结合结构域可以具有相同的抗原结合特异性或可具有不同的抗原结合特异性。
[图8]图8图示了其中第二抗原结合结构域进一步与本发明的抗原结合结构域连接的实施方案。在这一实施方案中，抗原结合结构域和第二抗原结合结构域在释放后形成双特异性抗原结合分子。图8(A)是显示处于未释放状态的多肽的图。抗原结合结构域的抗原结合活性受到抑制。图8(B)图示了由抗原结合结构域和第二抗原结合结构域形成的双特异性抗原结合分子的释放。图8(C)图示了针对例如T细胞表面抗原和癌细胞表面抗原的双特异性抗原结合分子，作为释放后双特异性抗原结合分子的示例。
[图9A]图9A图示了用于从包含多个单结构域的抗体融合多肽的文库中，筛选融合多肽的方法的一个实施例，其中各个单结构域抗体均与第一缔合维持结构域相连接，其中所述融合多肽包含其抗原结合活性能够通过与特定抑制结构域相缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体。图9A(1)图示了包含多个单结构域的抗体融合多肽的文库，每个单结构域抗体与第一缔合维持结构域连接。图9A(2)图示了证实在融合多肽与缔合配偶体相缔合的状态下每个单结构域抗体的抗原结合活性。选择包含单结构域抗体的融合多肽，所述单结构域抗体在此缔合状态下不结合靶抗原或具有预定值或更低的抗原结合活性。图9A(3)图示了(2)中选择的融合多肽中的单结构域抗体与缔合配偶体中的抑制结构域的缔合被消除，并且证实单结构域抗体的抗原结合活性。选择包含单结构域抗体的融合多肽，所述单结构域抗体在此非缔合状态下结合靶抗原或具有预定值或更高的抗原结合活性。图9A(2')图示了证实每种融合多肽中单结构域抗体的抗原结合活性。选择包含单结构域抗体的融合多肽，所述单结构域抗体在单独存在的融合多肽的这种状态下结合靶抗原或具有预定值或更高的抗原结合活性。图9A(3')图示了证实在(2')中选择的融合多肽与缔合配偶体相缔合的状态下，单结构域抗体的抗原结合活性。选择包含单结构域抗体的融合多肽，所述单结构域抗体在此缔合状态下不结合靶抗原或具有预定值或更低的抗原结合活性。
[图9B]图9B图示了从包含多个单结构域抗体融合多肽的文库中，用于筛选融合多肽的方法的另一个具体实施例，其中各个单结构域抗体与第一缔合维持结构域相连接，其中所述融合多肽包含其抗原结合活性能够通过与特定抑制结构域相缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体。(1)将各自包含单结构域抗体和第一缔合维持结构域的融合多肽和在抑制结构域和第二缔合维持结构域之间具有蛋白酶切割序列的缔合配偶体一起展示，以形成Fab样结构；(2)从如此展示的Fab样结构中，选择不与抗原结合或具有预定值或更低的抗原结合活性的结构；和(3)通过蛋白酶将缔合配偶体进行切割，并选择包含结合抗原或具有预定值或更高的抗原结合活性的单结构域抗体的片段。
[图9C]图9C图示了从包含多个单结构域抗体融合多肽的文库中，用于筛选融合多肽的方法的又一个具体实施例，其中各个单结构域抗体与第一缔合维持结构域相连接，其中所述融合多肽包含其抗原结合活性能够通过与特定抑制结构域相缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体。(1)将在单结构域抗体和第一缔合维持结构域之间各自含有蛋白酶切割序列的融合多肽和与第二缔合维持结构域相连接的抑制结构域的缔合配偶体一起展示，形成Fab样结构。(2)从如此展示的Fab样结构中，选择不与抗原结合或具有预定值或更低的抗原结合活性的结构；和(3)通过蛋白酶将融合多肽进行切割，并选择包含结合抗原或具有预定值或更高的抗原结合活性的单结构域抗体的片段。
[图9D]图9D图示了从包含多个单结构域抗体融合多肽的文库中，用于筛选融合多肽的方法的一个备选实施例，其中各个单结构域抗体与第一缔合维持结构域相连接，其中所述融合多肽包含其抗原结合活性能够通过与特定抑制结构域相缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体。(1)将各自包含单结构域抗体和第一缔合维持结构域的融合多肽和与第二缔合维持结构域相连接的抑制结构域的缔合配偶体一起展示，以形成Fab样结构，并且从如此展示的Fab样结构中，选择不与抗原结合或具有预定值或更低的抗原结合活性的结构；和(2)再次展示在(1)中如此选择的Fab样结构中包含单结构域抗体的部分，以便不与其同时表达抑制结构域，并且选择结合抗原或具有预定值或更高的抗原结合活性的片段。图9D(2')和9D(2”)各自图示了备选的实施方案，其中再次展示(2)中的包含单结构域抗体的部分，以便不与其一起表达抑制结构域。(1)和(2)、(2')或(2”)的顺序可以是(2)、(2')或(2”)然后(1)。具体地，显示包含单结构域抗体的部分以便不与其一起表达抑制结构域，并选择具有预定值或更高的抗原结合活性的片段。接下来，将各自包含单结构域抗体和第一缔合维持结构域的融合多肽和与第二缔合维持结构域连接的抑制结构域的缔合配偶体一起展示以形成Fab样结构，其中所述单结构域抗体包含预定或更高结合的片段，从如此展示的Fab样结构中，选择不与抗原结合或具有预定值或更低的抗原结合活性的结构。
[图10]图10图示了抗体样分子与人IL6R结合的评价结果，其中该抗体样分子是通过将各种轻链与IL6R90-G1m缔合而制备的，其中IL6R90-G1m含有与人IgG1恒定区(CH1-hinge-CH2-CH3)融合的抗人IL6R VHH(IL6R90)。抗原样分子在抗原固定化传感器上作用的起始时间为横坐标的起点。
[图11]图11(A)图示了通过在IL6R90-G1m中的VHH和恒定区之间的边界附近插入蛋白酶切割序列而制备的抗体样分子模型。图11(B)图示了每个制备的抗体重链的名称、氨基酸序列的插入位点和插入的氨基酸序列。插入位点由[插入]表示。
[图12-1]图12-1图示了通过蛋白酶(MT-SP1)处理IL6R90-G1m或抗体样分子(通过在IL6R90-G1m的VHH和恒定区之间的边界附近插入蛋白酶切割序列而制备)后通过还原SDS-PAGE评价切割程度的结果。在由蛋白酶处理产生的两个新条带中，出现在25kDa或更小的条带是来自于VHH的条带，出现在25-50kDa位置的条带是来自于恒定区的条带。
[图12-2]图12-2续接图12-1。
[图13]图13图示了IL6R90-G1m或在IL6R90-G1m中的VHH和恒定区之间的边界附近插入蛋白酶切割序列而制备的抗体样分子或他其蛋白酶(MT-SP1)处理后的样品的人IL6R结合的评价结果。蛋白酶-描绘了评价蛋白酶未处理的抗体样分子与抗原结合的传感图，蛋白酶+描绘了评价蛋白酶处理的抗体样分子与抗原结合的传感图。在抗体样分子在抗原固定化传感器上作用的起始之前30秒是横坐标的起点。
[图14]图14图示了抗体样分子与人IL6R结合的评价结果，其中该抗体样分子是通过将各种轻链与20A11-G1m缔合而制备的，其中20A11-G1m含有与人IgG1恒定区(CH1-hinge-CH2-CH3)融合的抗人IL6R VHH(20A11)。在抗体样分子在抗原固定化传感器上作用的起始时间之前30秒是横坐标的起点。
[图15]图15图示了20A11-G1m或抗体样分子的人IL6R结合的评价结果，其中所述抗体样分子通过将突变引入20A11和VL之间的界面处的氨基酸并将各种轻链与20A11hu-G1m缔合而制备，其中20A11hu-G1m含有由此制备的与人IgG1恒定区(CH1-hinge-CH2-CH3)融合的20A11hu。在抗体样分子在抗原固定化传感器上作用的起始时间之前60秒是横坐标的起点。
[图16]图16图示了通过蛋白酶(MT-SP1)处理20A11-G1m或4种抗体样分子(通过在20A11-G1m中的20A11hu和恒定区之间的边界附近插入蛋白酶切割序列而制备)后通过还原SDS-PAGE评价切割程度的结果。在由蛋白酶处理产生的两个新条带中，出现在25kDa或更小的条带是来自于VHH的条带，出现在25-50kDa位置的条带是来自于恒定区的条带。
[图17]图17图示了20A11hu-G1m或在20A11hu-G1m中的VHH和恒定区之间的边界附近插入蛋白酶切割序列而制备的抗体样分子或将他其蛋白酶(MT-SP1)处理后的样品与人IL6R结合的评价结果。蛋白酶-描绘评价了蛋白酶未处理的抗体样分子与抗原结合的传感图，蛋白酶+描绘了评价蛋白酶处理的抗体样分子与抗原结合的传感图。在抗体样分子在抗原固定化传感器作用的起始之前60秒是横坐标的起始点。具有术语“未测试”的样品表示未测定样品。
[图18]图18图示了在蛋白酶(MT-SP1)处理抗体样分子(在其重链可变区内具有抗人CD3 VHH，并通过在VHH和重链恒定区之间的边界附近插入蛋白酶切割序列来制备)之后，通过还原SDS-PAGE的迁移和CBB检测来评价切割程度的结果。在由蛋白酶处理产生的两个新条带中，出现在10-15kDa附近的条带是来自于VHH的条带，出现在37kDa附近的条带是来自于重链恒定区的条带。
[图19]图19图示了在蛋白酶(MT-SP1)处理抗体样分子(在其重链可变区内具有抗人CD3 VHH，并通过在VHH和重链恒定区之间的边界附近插入蛋白酶切割序列来制备之后)，样品的人CD3ed-Fc结合的评价结果。蛋白酶-描绘了评价蛋白酶未处理的抗体样分子与抗原结合的传感图，蛋白酶+描绘了评价蛋白酶处理的抗体样分子与抗原结合的传感图。在抗体样分子与抗原固定化传感器上作用的起始之前30秒是横坐标的起始点。当将抗原结合前的应答定义为0，并且将抗体作用前的应答定义为100时，显示结合。显示在抗体作用前30秒开始的时间。
[图20]图20图示了在蛋白酶(MT-SP1)处理具有IL6R90-G1m作为重链和Vk1-39-k0MT作为轻链的分子或抗体样分子(在具有IL6R90-G1m作为重链和Vk1-39-k0MT作为轻链的分子的轻链可变区和轻链恒定区之间的边界附近插入蛋白酶切割序列来制备的)之后，通过还原SDS-PAGE的迁移和CBB检测来评价切割程度的结果。通过蛋白酶处理产生来自于轻链的两条条带，并且轻链被蛋白酶切割。
[图21]图21图示了在蛋白酶(MT-SP1)处理具有IL6R90-G1m作为重链和Vk1-39-k0MT作为轻链的分子或抗体样分子(在具有在IL6R90-G1m作为重链和Vk1-39-k0MT作为轻链的分子的轻链可变区和轻链恒定区之间的边界附近插入蛋白酶切割序列来制备)之后，样品的人IL6R结合的评价结果。蛋白酶-描绘了评价蛋白酶未处理的抗体样分子与抗原结合的传感图，蛋白酶+描绘了评价蛋白酶处理的抗体样分子与抗原结合的传感图。证实与IL6R结合的抗体(MRA)用作阳性对照。抗体样分子在抗原固定化传感器上作用的起始的时间为横坐标上的起点。
[图22]图22图示了评价具有与人丛状蛋白A1结合的掺入VHH的IgG抗体样分子的蛋白酶切割的SDS-PAGE结果。蛋白酶(+)泳道描绘了通过蛋白酶切割处理的样品，蛋白酶(-)泳道描绘了没有蛋白酶切割处理的阴性对照样品。
[图23]图23图示了评价人丛状蛋白A1与VHH结合的Octet传感图，其中VHH是通过蛋白酶切割，从具有与人丛状蛋白A1结合的掺入VHH的IgG抗体样分子中释放的。蛋白酶+描绘了通过蛋白酶切割处理的样品，且蛋白酶-描绘了没有蛋白酶切割处理的样品。所用IgG抗体样分子的浓度记载于图的左侧。
[图24]图24图示了评价含有双特异性VHH-VHH的多肽的蛋白酶切割的SDS-PAGE结果。
[图25]图25图示了蛋白酶切割之前和之后的荧光素酶活性。虚线描绘了没有蛋白酶处理的样品，实线描绘了具有蛋白酶处理的样品。
[图26]图26图示了蛋白酶切割之前和之后的荧光素酶活性。虚线描绘了没有蛋白酶处理的样品，实线描绘了具有蛋白酶处理的样品。
[图27]图27图示了含有抗人IL6R VHH的IgG抗体样分子的蛋白酶切割的SDS-PAGE评价。
[图28]图28图示了在其轻链中含有蛋白酶切割序列的IgG抗体样分子的蛋白酶切割的评价。
[图29]图29图示了基于存在或不存在蛋白酶处理的在其轻链中具有蛋白酶切割序列的IgG样抗体分子的活化程度的评价。
[图30A]图30A图示了在其重链中含有蛋白酶切割序列的IgG抗体样分子的蛋白酶切割的评价。
[图30B]图30B图示了在其重链中含有蛋白酶切割序列的IgG抗体样分子的蛋白酶切割的评价。使用测定缓冲液(MMP活性测定试剂盒(Fluorometric-Green)(ab112146),组分C：测定缓冲液)进行蛋白酶切割。
[实施方案描述]
根据本发明的多肽通常是指长度为4个氨基酸或更长长度的肽，和蛋白质。而且，根据本发明的多肽通常是由人工设计的序列组成的多肽，但不限于此。例如，可以使用来自生物体的多肽。备选地，根据本发明的多肽可以是天然多肽、合成多肽、重组多肽等中的任何一种。此外，这些多肽的片段也包括在本发明的多肽中。
在本说明书中，每个氨基酸由单字母代码或三字母代码或两者表示，表示为，例如Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I或Val/V。为了表达位于特定位置的氨基酸，可以适当地使用表示特定位置的数字与氨基酸的单字母代码或三字母代码组合的表达。例如，37V氨基酸，其为单结构域抗体中含有的氨基酸，代表位于由Kabat编号定义的37位的Val。
为了改变多肽氨基酸序列中的氨基酸，可适当地采用本领域已知的方法，诸如定点诱变(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或重叠延伸PCR。也可以采用本领域已知的多种方法作为用天然氨基酸以外的氨基酸置换氨基酸的改变方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249；andProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如，具有与琥珀抑制子tRNA结合的非天然氨基酸的含有tRNA的无细胞翻译系统(Clover Direct(Protein Express))也是优选使用的。在本说明书中，改变的实例包括但不限于置换。
在本说明书中，用于表示氨基酸改变位点的术语“和/或”意在包括由“和”和“或”适当表示的每种组合。具体地，例如，短语“位置37、45和/或47处的氨基酸被置换”包括以下氨基酸改变的变体：(a)位置37，(b)位置45，(c)位置47，(d)位置37和45，(e)位置37和47，(f)位置45和47，和(g)位置37、45和47。
在本说明书中，可适当使用以下方式用来表达氨基酸改变：在代表特定位置的数字之前或之后使用改变前或改变后的单字母代码或三字母代码。例如，改变F37V或Phe37Val，其用于置换包含在抗体可变区或单结构域抗体中的氨基酸，表示在Kabat编号定义的37位的Phe被Val置换。具体地，所述数字代表由Kabat编号定义的氨基酸位置；数字前面的氨基酸的单字母代码或三字母代码代表置换前的氨基酸；并且数字后边的氨基酸的单字母代码或三字母代码表示置换后的氨基酸。同样地，用于置换抗体恒定区中包含的Fc区中的氨基酸的改变P238A或Pro238Ala，表示了在EU编号定义的238位的Pro被Ala置换。具体地，该数字表示由EU编号定义的氨基酸位置；数字前面的氨基酸的单字母代码或三字母代码代表置换前的氨基酸；并且数字后边的氨基酸的单字母代码或三字母代码表示置换后的氨基酸。
在本说明书中，术语“抗体”以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单结构域抗体和抗体片段，只要该抗体显示出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指除完整抗体外的分子，其含有完整抗体的一部分并与和完整抗体结合的抗原相结合。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本说明书中可互换使用，并且是指具有与天然抗体结构基本相似的结构的抗体，或具有包含有本说明书中定义的Fc区的重链的抗体。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体结合于抗原的抗体重链或轻链的区域或结构域。通常，抗体重链和轻链可变结构域(分别为VH和VL)在结构上相似并且各自含有4个保守框架区(FR)和3个互补决定区(CDR)(参见例如Kindt等人,Kuby Immunology,第六版,W.H.Freeman and Co.,91页(2007))。一个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。
本说明书中使用的术语“互补决定区”或“CDR”在序列中是高变的，和/或形成结构上确定的环(“高变环”)，和/或指抗原接触残基(“抗原接触”)或抗体可变区的每个区域。通常，抗体含有6个CDR：3个(H1、H2和H3)在VH中，3个(L1、L2和L3)在VL中。在本说明书中，示例性CDR包括以下各项：
(a)在氨基酸残基26至32(L1)、50至52(L2)、91至96(L3)、26至32(H1)、53至55(H2)和96至101(H3)处形成的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；
(b)在氨基酸残基24至34(L1)、50至56(L2)、89至97(L3)、31至35b(H1)、50至65(H2)和95至102(H3)形成的CDR(Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；
(c)在氨基酸残基27c至36(L1)、46至55(L2)、89至96(L3)、30至35b(H1)、47至58(H2)和93至101(H3)处形成的抗原接触(MacCallum等，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，其含有HVR氨基酸残基46至56(L2)、47至56(L2)、48至56(L2)、49至56(L2)、26至35(H1)，26至35b(H1)、49至65(H2)、93至102(H3)和94至102(H3)。
在本说明书中，除非另有说明，可变结构域中的CDR残基和其他残基(例如FR残基)根据Kabat等编号(同上)。
术语“框架”或“FR”是指除互补决定区(CDR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域中的FR由4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，CDR和FR的序列通常以下列顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
在本说明书中，术语“恒定区”或“恒定结构域”是指抗体中可变区以外的区或结构域。例如，IgG抗体是约150,000Da的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链和两条相同的重链通过二硫键连接而构成。从N末端到C末端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后是含有CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域的重链恒定区(CH)。同样地，从N末端向C末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻链(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将天然抗体的轻链归为被称为κ和λ的两种类型中的一种。
在本说明书中，术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，包括至少一部分恒定区。该术语包括具有天然序列和突变Fc区的Fc区。在一个实施方案中，人IgG1的重链Fc区自Cys226或Pro230跨越至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)或甘氨酸-赖氨酸(Gly446-Lys447)可存在或不存在。在本说明书中，除非另有说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基根据Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD 1991中描述的EU编号系统(也称为EU索引)编号。
抗体的“类”是指由抗体重链携带的恒定结构域或恒定区的类型。抗体具有5个主要类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类的免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
在本说明书中，“抗原结合结构域”仅限于与目的抗原结合。抗原结合结构域可以是具有任何结构的结构域，只要所用结构域用于与目的抗原结合即可。这种结构域的示例包括但不限于抗体重链可变区(VH)，抗体轻链可变区(VL)，单结构域抗体(sdAb)，体内细胞膜蛋白avimer中包含的约35个氨基酸的被称为A结构域的模块(国际公开No.WO2004/044011和WO2005/040229)，含有10Fn3结构域的adnectin，所述10Fn3结构域作为源自在细胞膜上表达的糖蛋白纤连蛋白的蛋白结合结构域(国际公开No.WO2002/032925)，含有IgG结合结构域支架的亲合体(Affibody)，所述IgG结合结构域支架构成由蛋白A的58个氨基酸组成的三螺旋束(国际公开No.WO1995/001937)，DARPins(设计的锚蛋白重复序列蛋白)，其是锚蛋白重复序列(AR)的分子表面暴露区域，各自具有折叠成转角亚基的33个氨基酸残基结构、两个反平行螺旋和环(国际公开No.WO2002/020565)，具有连接八个反向平行链的四个环区域的抗替卡林(anticalin)，其在桶状结构的一端向中心轴弯曲，所述桶状结构在诸如中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的脂质运载蛋白分子中高度保守(国际公开No.WO2003/029462)，和在一个马蹄形折叠的内部平行板结构中的凹陷区域，其由不具有免疫球蛋白结构的可变淋巴细胞受体(VLR)的重复亮氨酸富集重复(LRR)模块组成，如在七鳃鳗或八目鳗等无颌脊椎动物的获得性免疫系统中所见(国际公开No.WO2008/016854)。
本发明的抗原结合结构域的优选实施例包括能够通过仅由抗原结合结构域构成的分子发挥抗原结合功能的抗原结合结构域，以及在从与其连接的另外的肽释放之后能够自身发挥抗原结合功能的抗原结合结构域。这种抗原结合结构域的示例包括但不限于单结构域抗体、scFv、Fv、Fab、Fab'和F(ab')2。
本发明抗原结合结构域的一个优选实施例包括分子量为60kDa或更小的抗原结合结构域。这种抗原结合结构域的示例包括但不限于单结构域抗体、scFv、Fab和Fab'。当在血液中作为单体存在时，分子量为60kDa或更小的抗原结合结构域通常可能引起通过肾的清除(参见J Biol Chem.1988年10月15日；263(29):15064-70)。
从另一个观点来看，本发明的抗原结合结构域的一个优选实施例包括具有在血液中的半衰期为12小时或更短的抗原结合结构域。这种抗原结合结构域的实施例包括但不限于单结构域抗体、scFv、Fab和Fab'。
本发明的抗原结合结构域的一个优选实施例包括单结构域抗体(sdAb)。
在本说明书中，术语“单结构域抗体”不受其结构的限制，只要该结构域本身可以发挥抗原结合活性即可。已知一般抗体，例如IgG抗体，在通过VH和VL的配对形成可变区的状态下表现出抗原结合活性，而单结构域抗体的自身结构域结构本身能够发挥抗原结合活性，而不与另一结构域配对。通常，单结构域抗体具有相对低的分子量并以单体的形式存在。
单结构域抗体的示例包括但不限于先天缺乏轻链的抗原结合分子，例如骆驼科动物的VHH和鲨鱼的VNAR，以及含有抗体VH结构域的全部或部分，或含有抗体VL结构域的全部或部分的抗体片段。其为包含抗体VH或VL结构域的全部或部分的抗体片段的单结构域抗体的示例包括但不限于美国专利号6,248,516B1等中所记载的人工制备的源自人抗体VH或人抗体VL的单结构域抗体。在本发明的一些实施方案中，一个单结构域抗体具有三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。
单结构域抗体可以从能够产生单结构域抗体的动物中获得，或者通过免疫能够产生单结构域抗体的动物获得。能够产生单结构域抗体的动物的示例包括但不限于骆驼科动物，以及含有能够产生单结构域抗体的基因的转基因动物。骆驼科(Camelidae)的动物包括骆驼、美洲驼(lamas)、羊驼(alpacas)、单峰驼和原驼(guanacos)等。含有能够产生单结构域抗体的基因的转基因动物的示例包括但不限于，国际公开No.WO2015/143414和美国专利公开No.US2011/0123527A1中所描述的转基因动物。可以将从动物获得的单结构域抗体的框架序列转化为人种系序列或与其类似的序列，以获得人源化单结构域抗体。人源化单结构域抗体(例如，人源化VHH)也是本发明的单结构域抗体的一个实施方案。
备选地，单结构域抗体能够通过ELISA、淘选等从含有单结构域抗体的多肽文库中获得。含有单结构域抗体的多肽文库的示例包括但不限于从各种动物或人获得的初始抗体(naive antibody)文库(例如，Methods in Molecular Biology 2012 911(65-78)；和Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics 2006 1764:8(1307-1319))，通过各种动物的免疫获得的抗体文库(例如，Journal of Applied Microbiology2014 117：2(528-536))，以及由各种动物或人的抗体基因制备的合成抗体文库(例如，Journal of Biomolecular Screening 2016 21:1(35-43)；Journal of BiologicalChemistry2016 291:24(12641-12657)；和AIDS2016 30:11(1691-1701))。
在本说明书中，“抗原”仅限于含有与抗原结合结构域相结合的表位。抗原的优选示例包括但不限于动物或人衍生的肽、多肽和蛋白质。用于治疗由靶组织引起的疾病的抗原的优选示例包括但不限于在靶细胞(例如，癌细胞和炎性细胞)表面上表达的分子，在含有靶细胞组织中的其他细胞表面上表达的分子，在对靶细胞和含有靶细胞的组织具有免疫学作用的细胞表面上表达的分子，以及存在于含有靶细胞的组织的基质中的大分子。
抗原的示例可包括以下分子：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIAALK-2、激活素RIB ALK-4、激活素RIIA、激活素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ，APP、APRIL、AR、ARC、ART、artemin、抗Id、ASPARTIC、心房利钠因子、av/b3整合素、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴细胞刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2BMP-2a、BMP-3成骨素、BMP-4BMP-2b、BMP-5、BMP-6Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a，OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、铃蟾肽、骨源性神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4，CD5，CD6，CD7，CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61，CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒杆菌毒素、产气荚膜梭菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、PD1、PDL1、LAG3、TIM3，半乳凝素-9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、衰变加速因子、des(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-1、脱氧核糖核酸酶、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、内皮素受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸细胞活化趋化因子1、EpCAM、肝配蛋白B2/EphB4、EPO、ERCC、E-选择素、ET-1、因子IIa、因子VII、因子VIIIc、因子IX、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纤维蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、促卵泡激素、CXXXC趋化分子(fractalkine)、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14，CDMP-1))，GDF-6(BMP-13，CDMP-2)、GDF-7(BMP-12，CDMP-3)、GDF-8(肌肉生长抑制素)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(HGF)、Hep B gp120、乙酰肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIVIIIB gp 120V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10，IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-21、IL-23、IL-27、干扰素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰岛素链A、胰岛素链B、胰岛素样生长因子1、整合素α2、整合素α3、整合素α4、整合素α4/β1、整合素α4/β7、整合素α5(αV)、整合素α5/β1、整合素α5/β3、整合素α6、整合素β1、整合素β2、干扰素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、层粘连蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜伏TGF-1、潜伏TGF-1bp1、LBP、LDGF、LECT2、左肝素、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黄体生成素、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金属蛋白酶、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、M IF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Muc1)、MUC18、缪勒管抑制物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、NC adherin、NCA90、NCAM、NCAM、脑啡肽酶、神经营养因子-3、-4或-6、神经秩蛋白(neurturin)、神经生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙粘蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰岛素原、前松弛素(prorelaxin)、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T细胞受体(如T细胞受体α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-βPan特异性、TGF-βRI(ALK-5)、TGF-beta RII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲状腺激素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-α/β、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2，DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5，KILLER，TRICK-2A，TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1，LIT，TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2，TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R，TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF，TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA，LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ，TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a，p55-60)、TNFRSF1B(TNF RIICD120b，p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII，TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35，TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1，APT1，CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68，TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137，ILA))、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3，LARD，TR-3，TRAMP，WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体，TL2))、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF，OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体，DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS，TALL1，THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体，LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体，TL6)、TNFSF1A(TNF-a Conectin、DIF，TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b Lta，TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC，p33)、TNFSF4(OX40配体gp34，TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154，gp39，HIGM1，IMD3，TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体，APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、转铁蛋白受体、TRF、Trk、TROP-2、TLR(toll样受体)1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原CA125、肿瘤相关抗原表达Lewis-Y相关碳水化合物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙粘蛋白、VE-钙粘蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素、血管假性血友病因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、前激肽释放酶、RON、TMEM16F、SOD1、嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、tau、VAP1、高-分子量激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav 1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、因子B、因子D、因子H、备解素、硬化蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白、凝血酶原、凝血酶、组织因子、因子V、因子Va、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子VIIIa、因子IX、因子Ixa、因子X、因子Xa，因子XI、因子XIa、因子XII、因子XIIa、因子XIII、因子XIIIa、TFPI、抗凝血酶III、EPCR、血栓调节蛋白、TAPI，tPA，纤溶酶原、纤溶酶、PAI-1、PAI-2、GPC3、多配体蛋白聚糖-1(syndecan-1)、多配体蛋白聚糖-2(syndecan-2)、多配体蛋白聚糖-3(syndecan-3)、多配体蛋白聚糖-4(syndecan-4)、LPA、S1P以及激素或生长因子的受体。
尽管上述所列的抗原示例也包括受体，这些受体即使在体液中以可溶型存在，仍可用作本发明抗原结合结构域所结合的抗原。这种可溶型受体的一个非限制性示例可包括SEQ ID NO:35所示的蛋白，其为Mullberg等人(J.Immunol.(1994)152(10),4958-4968)所描述的可溶IL-6R。
上述所列的抗原示例包括在细胞膜上表达的膜分子，和从细胞分泌到细胞外的可溶性分子。当本发明的抗原结合结构域与自细胞分泌的可溶性分子结合时，抗原结合结构域优选具有中和活性。
含有可溶性分子的溶液不受限制，并且该可溶性分子可存在于体液(即生物体内组织或细胞之间填充的每种血管液体或每种液体)中。在非限制性方面，本发明的抗原结合结构域所结合的可溶性分子可存在于细胞外液中。细胞外液是指在脊椎动物中的血浆、细胞间液、淋巴、紧密结缔组织、脑脊髓液、脊髓液、穿刺液(aspirate)、滑液或骨和软骨中的此种成分，肺泡液(支气管肺泡灌洗液)、腹水、胸腔积液、心脏积液、囊液、房水(水样)或此类跨细胞液(由细胞的主动运输或分泌活动引起的腺体腔内的各种液体，以及肠腔和其他体腔内的液体)的通用名称。
存在于抗原中的表位(意指抗原决定簇)是指抗原上与本说明书中公开的抗原结合结构域所结合的位点。因此，例如，表位能够通过其结构来定义。或者，表位能够通过识别表位的抗原结合结构域的抗原结合活性来定义。当抗原是肽或多肽时，表位能够通过构成表位的氨基酸残基来鉴定。当表位是糖链时，表位能够通过特定的糖链结构鉴定。
线性表位是指包含被其一级氨基酸序列识别的表位的表位。线性表位在其独特序列中通常含有至少3个，最普遍为至少5个，例如约8个至约10个或者6至20个氨基酸。
与线性表位相反，构象表位是指包含在氨基酸的一级序列中的表位，所述一级序列含有待识别表位的单一限定组分以外的组分(例如，其氨基酸一级序列可能不被确定表位的抗体所识别的表位)。与线性表位相比，构象表位可含有增加数量的氨基酸。至于构象表位的识别，抗原结合结构域识别肽或蛋白质的三维结构。例如，当折叠蛋白质分子以形成三维结构时，构成构象表位的某些氨基酸和/或多肽骨架平行排列以允许抗体识别表位。用于确定表位构象的方法的示例包括但不限于X射线晶体学、二维核磁共振光谱学，以及位点特异性自旋标记和电子顺磁共振光谱学。参见，例如，Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology(1996),Vol.66,Morris编辑。
与表位结合的抗原结合结构域的结构称为互补位。互补位通过在表位和互补位之间起作用的氢键、静电力、范德华力、疏水键等稳定地结合到表位。表位和互补位之间的这种结合力称为亲和力。当多个抗原结合结构域与多个抗原结合时的总结合力称为亲合力。当例如包含多个抗原结合结构域的抗体(即多价抗体)与多个表位结合时，亲和力协同作用。因此，亲合力高于亲和力。
在一个具体实施方案中，本说明书中提供的抗原结合结构域的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在下文中，将显示用于证实针对IL-6R的抗原结合结构域或包含所述抗原结合结构域的多肽与表位结合的示例性方法。然而，根据下面给出的实施例，还可以适当地进行证实针对除IL-6R以外的抗原的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的多肽与表位结合的方法。
例如，可以证实针对IL-6R的抗原结合结构域是否识别IL-6R分子中存在的线性表位，例如，如下：为了上述目的，合成包含构成IL-6R细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽。可化学合成该肽。或者，使用编码对应于IL-6R cDNA中细胞外结构域的氨基酸序列的区域，通过基因工程手段获得肽。接下来，评价针对IL-6R的抗原结合结构域对含有构成细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽的结合活性。例如，可以使用固定化线性肽作为抗原，通过ELISA评价抗原结合结构域对肽的结合活性。或者，可以基于线性肽抑制抗原结合结构域与IL-6R表达细胞结合的水平来确定对线性肽的结合活性。这些测试可以确定抗原结合结构域对线性肽的结合活性。
此外，可以如下证实针对IL-6R的抗原结合结构域是否识别构象表位：制备IL-6R表达细胞用于上述目的。针对IL-6R的抗原结合结构域对构象表位的识别被证实，例如，当针对IL-6R的抗原结合结构域一与IL-6R表达细胞接触时，就对该细胞强烈结合，而抗原结合结构域基本上不与包含构成IL-6R细胞外结构域的氨基酸序列的固定化线性肽结合，或者不与包含构成IL-6R细胞外结构域的氨基酸序列的变性(使用通常的变性剂，例如胍)线性肽结合。在本文中，术语“基本上不结合”是指对于人IL-6R表达细胞的结合活性的80％或更少，通常为50％或更少，优选为30％或更少，特别优选为15％或更少的结合活性。
用于证实抗原结合结构域的抗原结合活性的方法还包括通过例如放射性标记的抗原结合测定(RIA)来测量Kd值的方法。在一个实施方案中，使用目的抗原结合结构域及其抗原进行RIA。例如，抗原结合结构域对抗原的溶液中的结合亲和力，能够通过以下方式来测量：在未标记抗原的滴定系列存在下用最小浓度的(125I)标记的抗原平衡抗原结合结构域，和随后通过涂有抗原结合结构域的平板来捕获所结合的抗原(参见例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。
根据备选的实施方案，Kd通过使用BIACORE(R)的表面等离子体共振方法测量。例如，使用具有约10个响应单位(RU)的抗原固定在其上CMAC芯片，在25℃下进行使用BIACORE(R)-2000或BIACORE(R)-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的测定。在一个实施方案中，根据供应商的说明，使用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIAcore,Inc.)。用10mm乙酸钠(pH4.8)将抗原稀释至5μg/mL(约0.2μm)，然后以5μl/min的流速注入其中，以便获得约10个响应单元(RU)的蛋白质结合。在抗原注射后，向其中注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将在含有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20(TM))作为表面活性剂(PBST)的PBS中的2倍稀释(0.78nM至500nM)的抗原结合结构域在25℃以约25μl/min的流速注入其中。通过使用简单的1:1Langmuir结合模型(BIACORE(R)评价软件版本3.2)同时拟合关联和解离的传感图来计算结合率(kon)和解离率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon的比率。此外，表观解离常数(Kd)能够通过使用平衡分析来确定。对于这些步骤，请参阅BIACORE(R)附带的方案。参见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)andMethods Enzymol.2000；323:325-40。在表面等离子共振测定中，本领域技术人员可以多方面地变更固定化蛋白质的量、反应中使用的蛋白质的量、温度和溶液组成。当上述表面等离子体共振测定中的结合速率(on-rate)超过106M-1s-1时，能够通过以下方式来确定结合速率：在渐增浓度的抗原存在下，在25℃针对PBS(pH7.2)中的20nM抗原结合结构域，使用光谱仪的荧光猝灭技术(例如，停流分光光度计(Aviv Instruments,Inc.)或使用搅拌比色皿的SLM-AMINCO(TM)分光光度计8000系列(Thermo Spectronic/Thermo Fisher ScientificInc.))以测量荧光强度的增加或减少(激发＝295nM；发射＝340nM，带路径：16nM)。
此外，抗原结合结构域的抗原结合活性也能够通过已知的分子-分子相互作用测量方法如电致化学发光来测量。
用于测量针对IL-6R的抗原结合结构域对IL-6R表达细胞的结合活性的方法的示例包括Antibodies:A Laboratory Manual中所记载的方法(Ed Harlow,David Lane,ColdSpring Harbor Laboratory(1988)359-420)。具体地，可以使用IL-6R表达细胞作为抗原，基于ELISA或FACS(荧光激活细胞分选)的原理评价结合活性。
在ELISA形式中，通过比较通过酶促反应生成的信号水平，定量评价针对IL-6R的抗原结合结构域对IL-6R表达细胞的结合活性。具体地，将测试多肽缔合物添加至其上固定有IL-6R表达细胞的ELISA板。然后，通过使用识别该测试抗原结合结构域的酶标记抗体来检测与细胞结合的测试抗原结合结构域。或者，在FACS中，制备稀释系列的测试抗原结合结构域，并且可以确定表达IL-6R的细胞的抗体结合效价，以比较测试抗原结合结构域对于IL-6R表达细胞的结合活性。
可以使用流式细胞仪来检测测试抗原结合结构域与悬浮在缓冲溶液等中的细胞表面上表达的抗原的结合。流式细胞仪已知为例如以下装置：
FACSCanto(TM)II
FACSAria(TM)
FACSArray(TM)
FACSVantage(TM)SE
FACSCalibur(TM)(均为BD Biosciences的商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均为Beckman Coulter,Inc.的商品名)
用于测量针对IL-6R的抗原结合结构域的抗原结合活性的方法的一个优选示例包括以下方法：首先，用识别该测试抗原结合结构域的FITC标记的二级抗体，将与该测试抗原结合结构域反应的IL-6R表达细胞进行染色。用合适的缓冲溶液适当稀释测试抗原结合结构域，以制备所需浓度的抗原结合结构域以供使用。抗原结合结构域可以以例如10μg/mL至10ng/mL的任何浓度使用。接下来，使用FACSCalibur(Becton，Dickinson and Company)测量荧光强度和细胞数。与细胞结合的抗原结合结构域的量反映在通过使用CELL QUEST软件(Becton，Dickinson and Company)分析获得的荧光强度(即几何平均值)中。简而言之，能够通过获得几何平均值来确定由测试抗原结合结构域的结合量所表示的测试抗原结合结构域的结合活性。
针对IL-6R的抗原结合结构域是否与某种抗原结合结构域共享表位能够通过这些抗原结合结构域之间对相同表位的竞争来确定。抗原结合结构域之间的竞争通过交叉阻断测定等检测。交叉阻断测定优选为例如竞争性ELISA测定。
具体地，在交叉阻断测定中，在存在或不存在候选竞争者抗原结合结构域的情况下，将微量滴定板的IL-6R蛋白包被的孔进行预温育。然后，向其中加入测试抗原结合结构域。与孔中的IL-6R蛋白结合的测试抗原结合结构域的量，间接地与竞争结合相同表位的候选竞争者抗原结合结构域的结合能力相关。简而言之，竞争者抗原结合结构域对相同表位的较大的亲和力意味着测试抗原结合结构域对IL-6R蛋白包被的孔的较低的结合活性。
测试抗原结合结构域通过IL-6R蛋白质与孔结合的量，能够通过预先标记抗原结合结构域而容易地测量。例如，通过使用抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物和合适的底物来测定生物素标记的抗原结合结构域。特别地，可将利用酶标记物如过氧化物酶的交叉阻断测定法称为竞争性ELISA测定法。可以用替代的可检测或可测量的标记材料来标记抗原结合结构域。具体地，放射性标记、荧光标记等在本领域中是已知的。
假如，与在不存在候选竞争者抗原结合结构域缔合物情况下进行的对照测试中获得的结合活性相比，竞争者抗原结合结构域可阻断针对IL-6R的抗原结合结构域至少20％，优选至少20至50％，更优选至少50％的结合，则可确定测试抗原结合结构域是基本上结合到与竞争者抗原结合结构域相同表位的，或竞争相同表位的结合的抗原结合结构域。
当针对IL-6R的抗原结合结构域结合的表位具有经鉴定的结构时，能够通过比较这些抗原结合结构域对通过将氨基酸突变引入构成表位的肽而制备的肽或多肽的结合活性，来评价测试抗原结合结构域和对照抗原结合结构域是否共享表位。
在这种测量结合活性的方法中，例如，可以以上述ELISA形式，来比较测试抗原结合结构域和对照抗原结合结构域对含有导入突变的线性肽的结合活性。在除ELISA之外的方法中，能够通过使测试抗原结合结构域和对照抗原结合结构域在柱中流动，然后定量洗脱液中洗脱的抗原结合结构域，来测量对于与柱结合的突变肽的结合活性。用于将突变肽(例如，具有GST的融合肽)吸附到柱上的方法是本领域已知的。
当经鉴定的表位是构象表位时，能够通过以下方法评价测试抗原结合结构域和对照抗原结合结构域是否共享表位：首先，制备IL-6R表达细胞和表达表位引入突变的IL-6R的细胞。将测试抗原结合结构域和对照抗原结合结构域添加到细胞悬浮液中，所述细胞悬浮液含有悬浮于适当缓冲溶液(例如PBS)中的这些细胞。随后，用缓冲溶液适当洗涤细胞悬浮液，然后向其中加入能够识别测试抗原结合结构域和对照抗原结合结构域的FITC标记抗体。使用FACSCalibur(Becton，Dickinson and Company)测量具有标记抗体染色的细胞的荧光强度和数量。用合适的缓冲溶液适当稀释测试抗原结合结构域和对照抗原结合结构域，并以一定浓度使用，从而调节至所需的浓度。这些抗原结合结构域例如以10μg/mL至10ng/mL的任何浓度使用。与细胞结合的标记抗体的量反映在通过使用CELL QUEST软件(Becton，Dickinson and Company)分析获得的荧光强度(即几何平均值)中。简而言之，能够通过获得几何平均值来确定由标记抗体的结合量表示的测试抗原结合结构域和对照抗原结合结构域的结合活性。
除了上述ELISA或FACS以外，抗原结合结构域与另一抗原结合结构域对于相同表位的竞争也能够通过使用放射性标记的抗原结合测定(RIA)、BIACORE(R)表面等离子体共振测定，电致化学发光等证实。
在本方法中，是否“基本上不与表达突变IL-6R的细胞结合”能够通过例如以下方法确定：首先，用标记抗体对与表达IL-6R突变的细胞相结合测试抗原结合结构域和对照抗原结合结构域进行染色。随后，检测细胞的荧光强度。在通过流式细胞术进行荧光检测中使用FACSCalibur的情况下，可以使用CELL QUEST软件分析获得的荧光强度。从存在和不存在多肽缔合物时获得的几何平均值，可以根据下面给出的表达式1计算他们的比较值(ΔGeo-Mean)，以确定由抗原结合结构域的结合而引起的荧光强度增加率。
(表达式1)
ΔGeo-Mean＝Geo-Mean(在多肽缔合物存在下)/Geo-Mean(在不存在多肽缔合物的情况下)
将通过分析由此获得的几何平均比较值(突变的IL-6R分子的ΔGeo-Mean值)与ΔGeo-Mean比较值进行比较，其中所述几何平均比较值反映了与表达突变IL-6R的细胞相结合的测试抗原结合结构域的量，其中ΔGeo-Mean比较值反映了与IL-6R表达细胞相结合的测试抗原结合结构域的量。在这一情况下，特别优选地将用于测定表达突变IL-6R的细胞和表达IL-6R的细胞的ΔGeo-Mean比较值的测试抗原结合结构域的浓度调节至相等或基本相等的浓度。将已被证实识别IL-6R中表位的抗原结合结构域用作对照抗原结合结构域。
如果，针对表达突变IL-6R的细胞的测试抗原结合结构域的ΔGeo-Mean比较值，小于表达IL-6R的细胞的测试抗原结合结构域的ΔGeo-Mean比较值的至少80％、优选50％、更优选30％、特别优选15％，则测试抗原结合结构域“基本上不与表达突变IL-6R的细胞结合”。用于确定Geo-Mean值(几何平均值)的计算表达式在CELL QUEST软件用户指南(BDbiosciences)中描述。作为比较结果，当其比较值被视为基本上相同时，则测试抗原结合结构域和对照抗原结合结构域的表位可以被评价为是相同的。
在本说明书中，术语“运送部分”是指多肽中除抗原结合结构域之外的部分。本发明的运送部分通常是由氨基酸构成的肽或多肽。在一个具体实施方案中，多肽中的运送部分通过切割位点与抗原结合结构域相连接。本发明的运送部分可以是通过酰胺键连接的一系列肽或多肽，或者可以是通过诸如二硫键的共价键或诸如氢键或疏水相互作用的非共价键由多个肽或多肽形成的复合物。
本发明的运送部分具有抑制抗原结合结构域的抗原结合活性的抑制结构域。在本说明书中，术语“抑制结构域”仅受限于抗原结合结构域的抗原结合活性的限制。抑制结构域可以是具有任何结构的结构域，只要所用结构域能够抑制抗原结合结构域的抗原结合活性即可。这样一种抑制结构域的示例包括但不限于抗体重链可变区(VH)、抗体轻链可变区(VL)、pre-B细胞受体和单结构域抗体。抑制结构域可以构成整个运送部分或可以构成运送部分的一部分。
在本发明的一些实施方案中，从多肽释放的抗原结合结构域具有比释放前更高的抗原结合活性。换言之，抗原结合结构域的抗原结合活性在抗原结合结构域未从多肽释放的状态下由抑制结构域抑制。通过诸如FACS(荧光激活细胞分选)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、ECL(电致化学发光)，SPR(表面等离子共振)方法(Biacore)、BLI(生物层干涉测定法)(Octet)的方法证实抗原结合结构域的抗原结合活性是否被抑制结构域抑制。在本发明的一些实施方案中，从多肽释放的抗原结合结构域的抗原结合活性是等于未从多肽释放的抗原结合结构域的结合活性的值，或者是未从多肽释放的抗原结合结构域的结合活性的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍或3000倍大的值。在本发明的一些更具体的实施方案中，当通过选自上述方法中的一种方法来测量抗原结合结构域的抗原结合活性时，没有观察到抗原结合结构域在释放前与抗原的结合。
在本发明的一些方面，切割位点被切割，使得抗原结合结构域变得能够从多肽中释放。因此，在这些方面，可以在切割多肽之前和之后比较抗原结合活性。具体地，使用经切割的多肽所测量的抗原结合活性是等于使用未切割多肽所测量的抗原结合活性的值，或者是使用未切割多肽所测量的抗原结合活性的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍，100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍或3000倍大的值。在一些更具体的实施方案中，当通过选自上述方法中的一种方法来测量抗原结合活性时，没有观察到未切割多肽的抗原结合结构域与抗原的结合。
在本发明的一些方面，切割位点被蛋白酶切割。因此，在这些方面，可以在蛋白酶处理多肽之前和之后比较抗原结合活性。具体地，使用蛋白酶处理后的多肽所测量的抗原结合活性等于使用未经蛋白酶处理的多肽所测量的抗原结合活性的值，或者是使用未经蛋白酶处理的多肽所测量的抗原结合活性的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍或3000倍大的值。在一些更具体的实施方案中，当通过选自上述方法中的一种方法来测量抗原结合活性时，未观察到蛋白酶未处理的多肽的抗原结合结构域与抗原的结合。
在本发明中，包含抗原结合结构域和运送部分的多肽在血液中的半衰期比单独存在的抗原结合结构域的半衰期长。在本发明的一些实施方案中，对于多肽的较长半衰期，设计运送部分以便在血液中具有更长的半衰期。在这样的实施方案中，延长运送部分的在血液中的半衰期的方法的示例包括但不限于运送部分的大分子量、运送部分具有的FcRn结合活性，运送部分具有的白蛋白结合活性和运送部分的PEG化。在本发明的一些实施方案中，运送部分比抗原结合结构域具有更长的在血液中的半衰期(换言之，抗原结合结构域比运送部分具有更短的在血液中的半衰期)。
在本发明中，单独抗原结合结构域和多肽的半衰期，或抗原结合结构域和运送部分的在血液中的半衰期，优选地在人类血液中的半衰期方面进行比较。如果血液中的半衰期难以在人类中测量，那么人类血液中的半衰期可以根据他们在小鼠(例如，正常小鼠、表达人抗原的转基因小鼠、表达人FcRn的转基因小鼠)或猴(例如食蟹猴)的血液中的半衰期来预测。
在一个实施方案中，延长运送部分的在血液中的半衰期的方法包括运送部分的大分子量。在一个实施方案中，使运送部分在血液中的半衰期长于抗原结合结构域在血液中的半衰期的方法包括比抗原结合结构域的分子量大的运送部分的分子量。
在一个实施方案中，延长运送部分的在血液中的半衰期的方法包括运送部分具有的FcRn结合活性。运送部分通常能够通过在运送部分中建立FcRn结合区的方法而具有FcRn结合活性。FcRn结合区是指对FcRn具有结合活性的区域，并且可以具有任何结构，只要所用区域具有针对FcRn的结合活性即可。
含有FcRn结合区的运送部分能够被吸收到细胞中，然后通过FcRn的补救途径返回到血浆中。例如，IgG分子在血浆中具有相对长的循环时间(缓慢消失)，原因在于已知作为IgG分子补救受体的FcRn起作用。通过胞饮作用摄入内体的IgG分子在内体内酸性条件下与内体中表达的FcRn结合。未能与FcRn结合的IgG分子移动至溶酶体并在其中降解，而与FcRn结合的IgG分子转移至细胞表面，然后在血浆中的中性条件下与FcRn解离，从而返回到血浆中。
FcRn结合区优选是直接结合FcRn的区域。FcRn结合区的优选实例可包括抗体Fc区。然而，能够结合诸如白蛋白或IgG的多肽(例如)的区域(其具有FcRn结合能力)能够通过白蛋白、IgG等间接结合到FcRn。因此，根据本发明的FcRn结合区可以是与这样一种具有FcRn结合能力的多肽相结合的区域。
根据本发明的FcRn结合区对于FcRn，特别是对于人FcRn的结合活性，可以如上文关于结合活性的部分所述，通过本领域技术人员已知的方法测量。其条件可由本领域技术人员适当确定。对人FcRn的结合活性可以评价为KD(解离常数)、表观KD(表观解离常数)、kd(解离速率)或表观kd(表观解离速率)等。这些值能够通过本领域技术人员已知的方法测量。例如，可以使用Biacore(GE Healthcare Japan Corp.)，Scatchard plot、流式细胞仪等。
用于测量FcRn结合区对FcRn结合活性的条件没有特别限制，可以由本领域技术人员适当选择。可如WO2009/125825中所记载的，在包含诸如MES缓冲液和37℃的条件下测量结合活性。此外，本发明的FcRn结合区对FcRn的结合活性能够通过本领域技术人员已知的方法测量，并且可以使用诸如Biacore(GE Healthcare Japan Corp.)测量。在测量FcRn结合区对FcRn的结合活性时，可以将FcRn和FcRn结合区或含有FcRn结合区的运送部分作为分析物注射到芯片上，其中所述芯片上分别固定有FcRn结合区或含有FcRn结合区的运送部分和FcRn，然后进行评价。
至于用于测量条件的pH，可以在pH 4.0-6.5的任何pH下评价FcRn结合区对FcRn的结合亲和力。优选地，pH 5.8-6.0，其接近体内早期内体中的pH，用于测定FcRn结合区对人FcRn的结合亲和力。至于在测量条件下使用的温度，可以在10℃-50℃的任何温度下评价FcRn结合区对FcRn的结合亲和力。优选地，15℃-40℃的温度用于确定FcRn结合区对人FcRn的结合亲和力。更优选地，20℃-35℃的任何温度，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34中的任何一个，也用于测定FcRn结合区对FcRn的结合亲和力。25℃的温度是本发明温度的一个非限制性示例。
FcRn结合区的一个示例包括但不限于IgG抗体Fc区。在使用IgG抗体Fc区的情况下，其类型不受限制，例如，可以使用IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。例如，可以使用含有选自SEQ ID NO:21、22、23和24所示氨基酸序列的一个序列的Fc区。
可以使用天然IgG抗体Fc区以及具有一个或更多个氨基酸置换的Fc区变体，只要Fc区具有FcRn结合活性即可。
例如，可使用含有如下氨基酸序列的Fc区变体：所述氨基酸序列源自IgG抗体Fc区，通过用另一氨基酸置换选自EU编号位置237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434和436的至少一个氨基酸。
更具体地，可使用含有选自IgG抗体Fc区中至少一个以下氨基酸置换的Fc区变体：
将237位Gly替换为Met的氨基酸置换，
将238位Pro替换为Ala的氨基酸置换，
将239位Ser替换为Lys的氨基酸置换，
将248位Lys替换为Ile的氨基酸置换，
将250位Thr替换为Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp或Tyr的氨基酸置换，
将252位Met替换为Phe、Trp或Tyr的氨基酸置换，
将254位Ser替换为Thr的氨基酸置换，
将255位Arg替换为Glu的氨基酸置换，
将256位Thr替换为Asp,Glu或Gln的氨基酸置换，
将257位Pro替换为Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr或Val的氨基酸置换，
将258位Glu替换为His的氨基酸置换，
将265位Asp替换为Ala的氨基酸置换，
将270位Asp替换为Phe的氨基酸置换，
将286位Asn替换为Ala或Glu的氨基酸置换，
将289位Thr替换为His的氨基酸置换,
将297位的Asn替换为Ala的氨基酸置换，
将298位的Ser替换为Gly的氨基酸置换，
将303位的Val替换为Ala的氨基酸置换，
将305位的Val替换为Ala的氨基酸置换，
将307位的Thr替换为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr的氨基酸置换，
将308位的Val替换为Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln或Thr的氨基酸置换，
将309位的Leu or Val替换为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg的氨基酸置换，
将311位的Gln替换为Ala、His或Ile的氨基酸置换，
将312位的Asp替换为Ala或His的氨基酸置换，
将314位的Leu替换为Lys或Arg的氨基酸置换，
将315位的Asn替换为Ala或His的氨基酸置换，
将317位的Lys替换为Ala的氨基酸置换，
将325位的Asn替换为Gly的氨基酸置换，
将332位的Ile替换为Val的氨基酸置换，
将334位的Lys替换为Leu的氨基酸置换，
将360位的Lys替换为His的氨基酸置换，
将376位的Asp替换为Ala的氨基酸置换，
将380位的Glu替换为Ala的氨基酸置换，
将382位的Glu替换为Ala的氨基酸置换，
将384位的Asn或Ser替换为Ala的氨基酸置换，
将385位的Gly替换为Asp或His的氨基酸置换，
将386位的Gln替换为Pro的氨基酸置换，
将387位的Pro替换为Glu的氨基酸置换，
将389位的Asn替换为Ala或Ser的氨基酸置换，
将424位的Ser替换为Ala的氨基酸置换，
将428位的Met替换为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr的氨基酸置换，
将433位的His替换为Lys的氨基酸置换，
将434位的Asn替换为Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr的氨基酸置换，和
将436位的Tyr或Phe替换为His的氨基酸置换(全部根据EU编号)。
从另一角度来看，可使用含有选自IgG抗体Fc区中至少一个以下氨基酸的Fc区：
Met作为第237位的氨基酸，
Ala作为238位的氨基酸，
Lys作为239位的氨基酸，
Ile作为248位的氨基酸，
Ala，Phe，Ile，Met，Gln，Ser，Val，Trp或Tyr作为250位的氨基酸，
Phe，Trp或Tyr作为252位的氨基酸，
Thr作为254位的氨基酸，
Glu作为255位的氨基酸，
Asp，Glu或Gln作为256位的氨基酸，
Ala，Gly，Ile，Leu，Met，Asn，Ser，Thr或Val作为257位的氨基酸，
His作为第258位的氨基酸，
Ala作为265位的氨基酸，
Phe作为270位的氨基酸，
Ala或Glu作为286位的氨基酸，
His作为289位的氨基酸，
Ala作为297位的氨基酸，
Gly作为298位的氨基酸，
Ala作为303位的氨基酸，
Ala作为305位的氨基酸，
Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr作为307位的氨基酸，
Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln或Thr作为308位的氨基酸、
Ala、Asp、Glu、Pro或Arg作为309位的氨基酸，
Ala、His或Ile作为311位的氨基酸，
Ala或His作为312位的氨基酸，
Lys或Arg作为314位的氨基酸，
Ala或His作为315位的氨基酸
Ala作为317位的氨基酸，
Gly作为325位的氨基酸，
Val作为332位的氨基酸，
Leu作为334位的氨基酸，
His作为360位的氨基酸，
Ala作为376位的氨基酸，
Ala作为380位的氨基酸，
Ala作为382位的氨基酸，
Ala作为384位的氨基酸，
Asp或His作为385位的氨基酸，
Pro作为386位的氨基酸，
Glu作为387位的氨基酸，
Ala或Ser作为389位的氨基酸，
Ala作为424位的氨基酸，
Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr作为428位的氨基酸，
Lys作为433位的氨基酸，
Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr作为434位的氨基酸，和
His作为436位的氨基酸(全部根据EU编号)。
运送部分具有的FcRn结合活性并不意味着抗原结合结构域不具有FcRn结合活性。在运送部分具有比抗原结合结构域更长的在血液中的半衰期的实施方案中，抗原结合结构域当然可以不具有FcRn结合活性，或者抗原结合结构域可以具有FcRn结合活性，只要其FcRn结合活性弱于运送部分的FcRn结合活性即可。
在一个实施方案中，延长运送部分的在血液中的半衰期的方法包括将运送部分与白蛋白结合。由于白蛋白不经历肾排泄并具有FcRn结合活性，因此其在血液中的半衰期长达17至19天(J Clin Invest.1953年8月；32(8):746-768)。因此，据报道，与白蛋白结合的蛋白质变得庞大并且能够间接结合FcRn，并从而增加了在血液中的半衰期(Antibodies2015,4(3),141-156)。
在一个实施方案中，延长运送部分在血液中的半衰期的备选方法包含将运送部分PEG化。蛋白质的PEG化被认为使蛋白质变得庞大并且还抑制其通过血液中的蛋白酶的降解，从而延长蛋白质的在血液中的半衰期(J Pharm Sci.2008年10月；97(10):4167-83)。
在本发明的一些实施方案中，运送部分含有抗体Fc区。在一个具体实施方案中，运送部分含有人IgG抗体的CH2结构域和CH3结构域。在一个具体实施方案中，运送部分含有自人IgG1抗体重链Cys226或Pro230跨越至重链羧基末端的部分。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)或甘氨酸-赖氨酸(Gly446-Lys447)可以存在或不存在。
在本发明的一些实施方案中，运送部分含有抗体恒定区。在更优选的实施方案中，运送部分含有IgG抗体恒定区。在进一步优选的实施方案中，运送部分含有人IgG抗体恒定区。
在本发明的一些实施方案中，运送部分含有：结构与抗体重链恒定区基本相似的区域；结构与抗体轻链基本相似的区域，通过共价键(例如二硫键)或非共价键(例如氢键或疏水相互作用)连接到该区域。
在本说明书中，“包含抗原结合结构域和运送部分的多肽”通常是通过酰胺键连接的一系列多肽，或含有通过酰胺键连接的多个多肽的蛋白质。
在本发明的一些实施方案中，所述抗原结合结构域能够从所述多肽释放，并且从多肽释放的抗原结合结构域具有更高的抗原结合活性。在本说明书中，术语“释放”是指多肽的两个部分的相互分离。从多肽释放抗原结合结构域可归因于抗原结合结构域和运送部分之间相互作用的消除。掺入多肽中的抗原结合结构域的抗原结合活性受到抑制。因此，能够通过测量受试者的抗原结合活性并将其与掺入多肽中的抗原结合结构域的抗原结合活性进行比较，来证实从多肽释放的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，多肽包含切割位点，并且切割位点被切割，使得抗原结合结构域从多肽释放。切割位点能够通过例如酶切割，可以用还原剂还原，或者可以被光降解。切割位点可以置于多肽中的任何位置，只要抗原结合结构域可以被释放并且在释放后不会丧失其抗原结合活性。多肽可以进一步含有除了用于释放抗原结合结构域的切割位点之外的另外的切割位点。在本发明的一个实施方案中，切割位点包含蛋白酶切割序列并且可以被蛋白酶切割。
在本说明书中，术语“切割的”是指在通过蛋白酶改变切割位点，在切割位点还原半胱氨酸-半胱氨酸二硫键和/或光活化之后，抗原结合结构域和运送部分彼此分离的状态。在本说明书中，术语“未切割的”是指在不存在切割位点的蛋白酶切割的情况下，在不存在半胱氨酸-半胱氨酸二硫键在切割位点还原的情况下和/或没有光的情况下，抗原结合结构域与运送部分连接的状态。
切割位点的切割能够通过使含有含切割位点多肽的溶液经受SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)并测量片段的分子量或检测切割之前和之后分子量的变化来检测。
裂解位点能够通过试剂(即蛋白酶、还原剂或光)以约0.001至1500×104M-1S-1，或以至少0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250或1500×104M-1S-1的比率被特异性地修饰(裂解、还原或光降解)。
蛋白酶的特异性切割是通过蛋白酶与切割位点或含有切割位点的分子之间的接触来进行的。可以在足够的酶活性存在下将切割切割位点。足够的酶活性可以指酶在与切割位点接触时发生切割的能力。
在本说明书中，术语“蛋白酶”是指酶，例如水解肽键的内肽酶或外肽酶，通常是内肽酶。用于本发明的蛋白酶仅受限于能够切割蛋白酶切割序列的限制，并且不受其类型的特别限制。在一些实施方案中，使用靶组织特异性蛋白酶。靶组织特异性蛋白酶可以指例如如下的任何一种：
(1)在靶组织中比在正常组织中以更高水平表达的蛋白酶，
(2)在靶组织中比在正常组织中具有更高活性的蛋白酶，
(3)在靶细胞中比在正常细胞中以更高水平表达的蛋白酶，和
(4)在靶细胞中比在正常细胞中具有更高活性的蛋白酶。
在更具体的实施方案中，使用癌组织特异性蛋白酶或炎性组织特异性蛋白酶。
在本说明书中，术语“靶组织”意指含有至少一种靶细胞的组织。在本发明的一些实施方案中，所述靶组织是癌组织。在本发明的一些实施方案中，所述靶组织是炎性组织。
术语“癌组织”是指含有至少一种癌细胞的组织。因此，考虑到例如所述癌组织含有癌细胞和血管，有助于形成含有癌细胞和内皮细胞的肿瘤块的每种细胞类型都包括在本发明的范围内。在本说明书中，所述肿瘤块是指肿瘤组织的病灶。术语“肿瘤”通常用于指良性肿瘤或恶性肿瘤。
在本说明书中，“炎性组织”的示例包括以下各项：
类风湿性关节炎或骨关节炎的关节组织，
支气管哮喘或COPD的肺(肺泡)组织
炎症性肠病、克罗恩病或溃疡性结肠炎的消化器官组织，
肝脏、肾脏或肺纤维化中的纤维化组织，
器官移植排斥的组织，
动脉硬化或心力衰竭中的血管或心脏(心肌)组织，
代谢综合征中的内脏脂肪组织，
特应性皮炎和其他皮炎的皮肤组织，和
椎间盘突出或慢性腰痛的脊髓神经组织。
对于某些类型的靶组织，特异性表达或特异性活化的蛋白酶，或被认为与靶组织(靶组织特异性蛋白酶)的疾病状态相关的蛋白酶是已知的。例如，国际公开No.WO2013/128194、WO2010/081173和WO2009/025846公开了在癌组织中特异性表达的蛋白酶。此外，JInflamm(Lond).2010；7:45,Nat Rev Immunol.2006年7月；6(7):541-50、Nat Rev DrugDiscov.2014年12月；13(12):904-27,Respir Res.2016年3月4日；17:23,Dis ModelMech.2014年2月；7(2):193-203和Biochim Biophys Acta.2012年1月；1824(1):133-45公开了据认为与炎症有关的蛋白酶。
除了在靶组织中特异性表达的蛋白酶之外，还存在着在靶组织中特异性激活的蛋白酶。例如，蛋白酶可以以无活性形式表达，然后转化为活化型。许多组织含有抑制活性蛋白酶的物质，并通过活化过程和抑制剂的存在来控制活性(Nat Rev Cancer.2003年7月；3(7):489-501)。在靶组织中，活性蛋白酶能够通过逃避抑制而被特异性激活。
能够通过使用识别活性蛋白酶的抗体的方法(PNAS2013年1月2日；110(1):93-98)，或荧光标记蛋白酶可识别的肽，以荧光便在切割之前淬灭但在切割后发光的方法(NatRev Drug Discov.2010年9月；9(9):690-701.doi:10.1038/nrd3053)，来测量所述活性蛋白酶。
从一个观点来看，术语“靶组织特异性蛋白酶”可以指以下的任何一种：
(i)在靶组织中比在正常组织中以更高水平表达的蛋白酶，
(ii)在靶组织中比在正常组织中具有更高活性的蛋白酶，
(iii)在靶细胞中比正常细胞中以更高水平表达的蛋白酶，和
(iv)在靶细胞中比在正常细胞中具有更高活性的蛋白酶。
蛋白酶的具体示例包括但不限于半胱氨酸蛋白酶(包括组织蛋白酶家族B、L、S等)、天冬氨酰蛋白酶(组织蛋白酶D、E、K、O等)、丝氨酸蛋白酶(包括蛋白裂解酶(包括MT-SP1)、组织蛋白酶A和G、凝血酶，纤溶酶、尿激酶(uPA)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、弹性蛋白酶、蛋白酶3、凝血酶、激肽释放酶、类胰蛋白酶和糜蛋白酶)、金属蛋白酶(金属蛋白酶(MMP1-28)(其包含膜结合形式(MMP14-17和MMP24-25)和分泌形式(MMP1-13、MMP18-23和MMP26-28))、解整合素和金属蛋白酶(ADAM)，具有血小板反应蛋白基序的解整合素和金属蛋白酶(ADAMTS)、穿膜肽酶(穿膜肽酶α和穿膜肽酶β)、CD10(CALLA)、前列腺特异性抗原(PSA)、豆荚蛋白(legumain)、TMPRSS3、TMPRSS4、人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、β分泌酶(BACE)、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、颗粒酶B，胍基苯甲酸酶(GB)、hepsin、脑啡肽酶、NS3/4A、HCV-NS3/4、钙蛋白酶、ADAMDEC1、肾素、组织蛋白酶C、组织蛋白酶V/L2、组织蛋白酶X/Z/P、cruzipain、otubain 2、激肽释放酶相关肽酶(KLK(KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13和KLK14))、骨形态生成蛋白1(BMP-1)、活化蛋白C、凝血相关蛋白酶(因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子XIa和因子XIIa)、HtrA1、乳铁蛋白、marapsin、PACE4、DESC1、二肽基肽酶4(DPP-4)、TMPRSS2、组织蛋白酶F、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L2、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、颗粒酶A、蛋白酶钙蛋白酶2、谷氨酸羧肽酶2、AMSH样蛋白酶、AMSH、γ分泌酶、抗纤溶酶切割酶(APCE)、decysin 1、N-乙酰化α-连接的酸性二肽酶样1(NAALADL1)和弗林蛋白酶。
从另一个观点来看，所述靶组织特异性蛋白酶可以指癌组织特异性蛋白酶或炎性组织特异性蛋白酶。
癌组织特异性蛋白酶的示例包括国际公开No.WO2013/128194、WO2010/081173和WO2009/025846中公开的在癌组织中特异性表达的蛋白酶。
至于癌组织特异性蛋白酶的类型，在所述待治疗的癌组织中具有较高表达特异性的蛋白酶对于减少不良反应更有效。优选的癌组织特异性蛋白酶在癌组织中的浓度是其正常组织中浓度的至少5倍，更优选至少10倍，进一步优选至少100倍，特别优选至少500倍，最优选至少1000倍。此外，优选的癌组织特异性蛋白酶在癌组织中具有的活性是其在正常组织中的活性的至少2倍，更优选至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍，进一步优选至少100倍，特别优选至少500倍，最优选至少1000倍。
癌组织特异性蛋白酶可以是与癌细胞膜结合的形式，或者可以是细胞外分泌而不与细胞膜结合的形式。当癌组织特异性蛋白酶不与癌细胞膜结合时，对于癌细胞特异性的免疫细胞介导的细胞毒性，优选癌组织特异性蛋白酶应存在于癌组织内或癌组织附近。在本说明书中，“癌组织附近”是指落入对癌组织特异性蛋白酶切割序列被切割的位置范围内，使得抗原结合结构域发挥抗原结合活性。然而，优选的是，在该位置范围内应该使对正常细胞的损害最小化。
从备选的角度来看，癌组织特异性蛋白酶是以下的任何一种：
(i)在癌组织中比在正常组织以更高水平表达的蛋白酶，
(ii)在癌组织中比在正常组织中具有更高活性的蛋白酶，
(iii)在癌细胞中比正常细胞中以更高水平表达的蛋白酶，和
(iv)在癌细胞中比在正常细胞中具有更高活性的蛋白酶。
可以单独使用一种癌组织特异性蛋白酶，或者可以组合两种或更多种癌组织特异性蛋白酶。考虑到待治疗的癌症类型，本领域技术人员可以适当地设定癌症组织特异性蛋白酶的类型的数量。
从这些观点来看，癌组织特异性蛋白酶优选为上文所列蛋白酶中的丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，更优选为蛋白裂解酶(包括MT-SP1)、尿激酶(uPA)或金属蛋白酶，进一步优选为MT-SP1、uPA、MMP2或MMP9。
至于炎性组织特异性蛋白酶的类型，在待治疗的炎性组织中具有较高表达特异性的蛋白酶对于减少不良反应更有效。优选的炎性组织特异性蛋白酶在炎性组织中的浓度是其正常组织中浓度的至少5倍，更优选至少10倍，进一步优选至少100倍，特别优选至少500倍，最优选至少1000倍高。此外，优选的炎性组织特异性蛋白酶在炎性组织中具有活性至少2倍，更优选至少3倍、至少4倍、至少5倍、或至少10倍，进一步优选至少100倍，特别优选至少500倍，最优选至少1000倍于其在正常组织中的活性高。
所述炎性组织特异性蛋白酶可以是与炎性细胞膜结合的形式，或者可以是细胞外分泌而不与细胞膜结合的形式。当所述炎性组织特异性蛋白酶不与炎性细胞膜结合时，对于炎性细胞特异性的免疫细胞介导的细胞毒性，优选炎性组织特异性蛋白酶应存在于炎性组织内或炎症组织附近。在本说明书中，“炎性组织附近”是指落入对所述炎性组织特异性的蛋白酶切割序列被切割的位置范围内，使得抗原结合结构域发挥抗原结合活性。然而，优选的是，在该位置范围内应该使对正常细胞的损害最小化。
从备选的角度来看，炎性组织特异性蛋白酶是以下各项的任何一种：(i)在炎症组织中比在正常组织中以更高水平表达的蛋白酶，
(ii)在炎症组织中比在正常组织中具有更高活性的蛋白酶，
(iii)在炎性细胞中比在正常细胞中以更高水平表达的蛋白酶，和(iv)在炎性细胞中比在正常细胞中具有更高活性的蛋白酶。
可以单独使用一种类型的炎性组织特异性蛋白酶，或者可以组合两种或更多种类型的炎性组织特异性蛋白酶。考虑到待治疗的病理状况，本领域技术人员可以适当地设定所述炎性组织特异性蛋白酶的类型的数量。
从这些观点来看，所述炎性组织特异性蛋白酶优选是上文列出的蛋白酶中的金属蛋白酶。金属蛋白酶更优选为ADAMTS5、MMP2、MMP7、MMP9或MMP13。
所述蛋白酶切割序列是当所述多肽被水溶液中的所述靶组织特异性蛋白酶水解时被靶组织特异性蛋白酶特异性识别的特定氨基酸序列。
从减少不良反应的角度来看，蛋白酶切割序列优选是通过靶组织特异性蛋白酶以高特异性水解的氨基酸序列，其中所述靶组织特异性蛋白酶在待治疗的靶组织或细胞中特异性表达，或在待治疗的靶组织/细胞中特异性活化。
蛋白酶切割序列的具体示例包括由国际公开No.WO2013/128194、WO2010/081173和WO2009/025846中公开的在癌组织中特异性表达的上述蛋白酶特异性水解的靶序列，对炎症组织具有特异性的蛋白酶等。还可以使用人工改变的序列，例如通过将适当的氨基酸突变引入由已知蛋白酶特异性水解的靶序列。备选地，可以使用通过如NatureBiotechnology 19,661-667(2001)中所记载的本领域技术人员已知的方法而鉴定的蛋白酶切割序列。
此外，可以使用天然存在的蛋白酶切割序列。例如，通过蛋白酶切割将TGFβ转化为潜伏形式。同样，也可以使用通过蛋白酶切割改变其分子形式的蛋白质中的蛋白酶切割序列。
可以使用的蛋白酶切割序列的示例包括但不限于国际公开No.WO2015/116933、国际公开No.WO2015/048329、国际公开No.WO2016/118629、国际公开No.WO2016/179257，国际公开No.WO2016/179285、国际公开No.WO2016/179335、国际公开No.WO2016/179003、国际公开No.WO2016/046778、国际公开No.WO2016/014974、美国专利公开号US2016/0289324、美国专利公开号US2016/0311903、PNAS(2000)97:7754-7759,Biochemical Journal(2010)426:219-228和Beilstein J Nanotechnol.(2016)7:364-373中公开的序列。
蛋白酶切割序列更优选是通过如上所述的合适的靶组织特异性蛋白酶特异性水解的氨基酸序列。由靶组织特异性蛋白酶特异性水解的氨基酸序列优选为包含以下任何氨基酸序列的序列：
LSGRSDNH(SEQ ID NO:12，可由MT-SP1或uPA切割)，
PLALAG(SEQ ID NO:25，可由MMP2或MMP9切割)，和
VPLSLTMG(SEQ ID NO:26，可由MMP7切割)。
以下任何序列也可用作蛋白酶切割序列：
TSTSGRSANPRG(SEQ ID NO:74，可由MT-SP1或uPA切割)，
ISSGLLSGRSDNH(SEQ ID NO:75，可被MT-SP1或uPA切割)，
AVGLLAPPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO:76，可由MT-SP1或uPA切割)，
GAGVPMSMRGGAG(SEQ ID NO:77，可由MMP1切割)，
GAGIPVSLRSGAG(SEQ ID NO:78，可被MMP2切割)，
GPLGIAGQ(SEQ ID NO:79，可由MMP2切割)，
GGPLG MLSQS(SEQ ID NO:80，可由MMP2切割)，
PLGLWA(SEQ ID NO:81，可由MMP2可切割)，
GAGRPFSMIMGAG(SEQ ID NO:82，可由MMP3可切割)，
GAGVPLSLTMGAG(SEQ ID NO:83，可由MMP7可切割)，
GAGVPLSLYSGAG(SEQ ID NO:84，可由MMP9可切割)，
AANLRN(SEQ ID NO:85，可由MMP11切割)，
AQAYVK(SEQ ID NO:86，可由MMP11切割)，
AANYMR(SEQ ID NO:87，可由MMP11切割)，
AAALTR(SEQ ID NO:88，可由MMP11切割)，
AQNLMR(SEQ ID NO:89，可由MMP11切割)，
AANYTK(SEQ ID NO:90，可由MMP11切割)，
GAGPQGLAGQRGIVAG(SEQ ID NO:91，可由MMP13切割)，
PRFKIIGG(SEQ ID NO:92，可由尿激酶原切割)，
PRFRIIGG(SEQ ID NO:93，可由尿激酶原切割)，
GAGSGRSAG(SEQ ID NO:94，可由uPA切割)，
SGRSA(SEQ ID NO:95，可由uPA切割)，
GSGRSA(SEQ ID NO:96，可由uPA切割)，
SGKSA(SEQ ID NO:97，可由uPA切割)，
SGRSS(SEQ ID NO:98，可由uPA切割)，
SGRRA(SEQ ID NO:99，可由uPA切割)，
SGRNA(SEQ ID NO:100，可由uPA切割)，
SGRKA(SEQ ID NO:101，可由uPA切割)，
QRGRSA(SEQ ID NO:102，可由tPA切割)，
GAGSLLKSRMVPNFNAG(SEQ ID NO:103，可由组织蛋白酶B切割)
TQGAAA(SEQ ID NO:104，可由组织蛋白酶B切割)，
GAAAAA(SEQ ID NO:105，可由组织蛋白酶B切割)，
GAGAAG(SEQ ID NO:106，可由组织蛋白酶B切割)，
AAAAAG(SEQ ID NO:107，可由组织蛋白酶B切割)，
LCGAAI(SEQ ID NO:108，可由组织蛋白酶B切割)，
FAQALG(SEQ ID NO:109，可由组织蛋白酶B切割)，
LLQANP(SEQ ID NO:110，可由组织蛋白酶B切割)，
LAAANP(SEQ ID NO:111，可由组织蛋白酶B切割)，
LYGAQF(SEQ ID NO:112，可由组织蛋白酶B切割)，
LSQAQG(SEQ ID NO:113，可由组织蛋白酶B切割)，
ASAASG(SEQ ID NO:114，可由组织蛋白酶B切割)，
FLGASL(SEQ ID NO:115，可由组织蛋白酶B切割)，
AYGATG(SEQ ID NO:116，可由组织蛋白酶B切割)，
LAQATG(SEQ ID NO:117，可由组织蛋白酶B切割)，
GAGSGVVIATVIVITAG(SEQ ID NO:118，可由组织蛋白酶L切割)，
APMAEGGG(SEQ ID NO:119，可由穿膜肽酶α或穿膜肽酶β切割)，
EAQGDKII(SEQ ID NO:120，可由穿膜肽酶α或穿膜肽酶β切割)，
LAFSDAGP(SEQ ID NO:121，可由穿膜肽酶α或穿膜肽酶β切割)，
YVADAPK(SEQ ID NO:122，可由穿膜肽酶α或穿膜肽酶β切割)，
RRRRR(SEQ ID NO:123，可由弗林蛋白酶切割)，
RRRRRR(SEQ ID NO:124，可由弗林蛋白酶切割)，
GQSSRHRRAL(SEQ ID NO:125，可由弗林蛋白酶切割)，
SSRHRRALD(SEQ ID NO:126)，
RKSSIIIRMRDVVL(SEQ ID NO:127，可由纤溶酶原切割)，
SSSFDKGKYKKGDDA(SEQ ID NO:128，可由葡萄球菌激酶切割)，
SSSFDKGKYKRGDDA(SEQ ID NO:129，可由葡萄球菌激酶切割)，
IEGR(SEQ ID NO:130，可由因子Xa切割)，
IDGR(SEQ ID NO:131，可由因子Xa切割)，
GGSIDGR(SEQ ID NO:132，可由因子Xa切割)，
GPQGIAGQ(SEQ ID NO:133，可由胶原酶切割)，
GPQGLLGA(SEQ ID NO:134，可由胶原酶切割)，
GIAGQ(SEQ ID NO:135，可由胶原酶切割)，
GPLGIAG(SEQ ID NO:136，可由胶原酶切割)，
GPEGLRVG(SEQ ID NO:137，可由胶原酶切割)，
YGAGLGVV(SEQ ID NO:138，可由胶原酶切割)，
AGLGVVER(SEQ ID NO:139，可由胶原酶切割)，
AGLGISST(SEQ ID NO:140，可由胶原酶切割)，
EPQALAMS(SEQ ID NO:141，可由胶原酶切割)，
QALAMSAI(SEQ ID NO:142，可由胶原酶切割)，
AAYHLVSQ(SEQ ID NO:143，可由胶原酶切割)，
MDAFLESS(SEQ ID NO:144，可由胶原酶切割)，
ESLPVVAV(SEQ ID NO:145，可由胶原酶切割)，
SAPAVESE(SEQ ID NO:146，可由胶原酶切割)，
DVAQFVLT(SEQ ID NO:147，可由胶原酶切割)，
VAQFVLTE(SEQ ID NO:148，可由胶原酶切割)，
AQFVLTEG(SEQ ID NO:149，可由胶原酶切割)，
PVQPIGPQ(SEQ ID NO:150，可由胶原酶切割)，
LVPRGS(SEQ ID NO:151，可由凝血酶切割)，和
TSTSGRSANPRG(SEQ ID NO:178，可被uPA或MT-SP1切割)。
在本发明的一个实施方案中，柔性接头被进一步附接至蛋白酶切割序列的一端或两端。所述蛋白酶切割序列一端的柔性接头可称为第一柔性接头，另一端的柔性接头可称为第二柔性接头。在一个特定实施方案中，所述蛋白酶切割序列和所述柔性接头具有以下任何通式：
(蛋白酶切割序列)，
(第一个柔性接头)-(蛋白酶切割序列)，
(蛋白酶切割序列)-(第二柔性接头)，和
(第一柔性接头)-(蛋白酶切割序列)-(第二柔性接头)。
根据本实施方案的所述柔性接头优选是肽接头。第一柔性接头和第二柔性接头各自独立地且任意地存在，并且其是各自接头含有至少一个柔性氨基酸(Gly等)的相同的或不同的柔性接头。所述柔性接头包含，例如，用于所述蛋白酶切割序列的足够数量的残基(任意选自Arg、Ile、Gln、Glu、Cys、Tyr、Trp、Thr、Val、His、Phe、Pro、Met、Lys、Gly、Ser、Asp、Asn、Ala等的氨基酸，特别是Gly、Ser、Asp、Asn和Ala，特别是Gly和Ser，尤其是Gly等)，以获得所需的蛋白酶可及性。
适用于所述蛋白酶切割序列两端的所述柔性接头通常是这样的柔性接头：其改善蛋白酶对所述蛋白酶切割序列的接触并提高所述蛋白酶的切割效率。可容易地选择合适的柔性接头，并且优选地可以选自不同长度，例如1个氨基酸(Gly等)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、或3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸。在本发明的一些实施方案中，所述柔性接头是1至7个氨基酸的肽接头。
所述柔性接头的示例包括但不限于甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS:SEQ ID NO:27)n和(GGGS:SEQ ID NO:28)n，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和常规技术中公知的其他柔性接头。
其中，甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物受到关注，因为这些氨基酸相对非结构化的并且易于作为组分之间的中性系链发挥作用。
由甘氨酸-丝氨酸聚合物组成的柔性接头的示例包括但不限于：
Ser
Gly·Ser(GS)
Ser·Gly(SG)
Gly·Gly·Ser(GGS)
Gly·Ser·Gly(GSG)
Ser·Gly·Gly(SGG)
Gly·Ser·Ser(GSS)
Ser•Ser•Gly(SSG)
Ser•Gly·Ser(SGS)
Gly•Gly·Gly·Ser(GGGS,SEQ ID NO:28)
Gly•Gly·Ser·Gly(GGSG,SEQ ID NO:29)
Gly•Ser·Gly·Gly(GSGG,SEQ ID NO:46)
Ser·Gly·Gly·Gly(SGGG,SEQ ID NO:47)
Gly·Ser·Ser·Gly(GSSG,SEQ ID NO:48)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(GGGGS,SEQ ID NO:49)
Gly·Gly·Gly·Ser·Gly(GGGSG,SEQ ID NO:33)
Gly·Gly·Ser·Gly·Gly(GGSGG,SEQ ID NO:30)
Gly·Ser·Gly·Gly·Gly(GSGGG,SEQ ID NO:32)
Gly·Ser·Gly·Gly·Ser(GSGGS,SEQ ID NO:27)
Ser·Gly·Gly·GlyYGly(SGGGG,SEQ ID NO:51)
Gly·Ser·Ser·Gly·Gly(GSSGG,SEQ ID NO:52)
Gly·Ser·Gly·Ser·Gly(GSGSG,SEQ ID NO:31)
Ser·Gly·Gly·Ser·Gly(SGGSG,SEQ ID NO:53)
Gly·Ser·Ser·Ser·Gly(GSSSG,SEQ ID NO:34)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(GGGGGS,SEQ ID NO:50)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SGGGGG,SEQ ID NO:54)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(GGGGGGS,SEQ ID NO:55)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SGGGGGG,SEQ ID NO:56)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(GGGGS,SEQ ID NO:49))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SGGGG,SEQ ID NO:51))n
在本说明书中，所述“缔合”可以指，例如，两个或更多个多肽区域彼此相互作用的状态。通常，在预期的多肽区域之间形成疏水键、氢键、离子键等以便形成缔合物。作为常见缔合的一个示例，已知以天然抗体为代表的抗体通过其间的非共价键等保留重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的配对结构。
在本发明的一些实施方案中，运送部分的抑制结构域与抗原结合结构域缔合。抑制结构域可以构成运送部分的一部分或可以构成整个运送部分。从另一个角度来看，抑制结构域也可以定义为运送部分中与抗原结合结构域相缔合的部分。
在更具体的实施方案中，抗原结合结构域和抑制结构域形成如抗体VH和抗体VL之间发现的缔合，其中所述抗原结合结构域为单结构域抗体，所述抑制结构域为VL、VH或VHH。在进一步的具体实施方案中，抗原结合结构域和抑制结构域形成如抗体VH和抗体VL之间发现的缔合，其中所述抗原结合结构域为单结构域抗体，所述抑制结构域为VL、VH或VHH，并且在由此形成的缔合状态下，抑制结构域构象地抑制抗原结合结构域与抗原的结合，或构象地改变抗原结合结构域的抗原结合位点，使得单结构域抗体的抗原结合活性被VL、VH或VHH抑制。在使用VHH作为单结构域抗体的实施方案中，认为当CDR3(VHH的主要抗原结合位点)或其邻近位点存在于与抑制结构域缔合的界面时，VHH与抗原的结合受到抑制结构域的构象抑制。
可以例如通过切割切割位点来消除抗原结合结构域与抑制结构域的缔合。该缔合的取消可以与例如两个或更多个多肽区域彼此相互作用的状态的消除互换使用。可以完全消除两个或更多个多肽区域之间的相互作用，或者可以部分地消除两个或更多个多肽区域之间的相互作用。
在本说明书中，“界面”通常是指两个区域彼此缔合或相互作用的面。形成界面的氨基酸残基通常是每个多肽区域中包含的经受缔合的一个或更多个氨基酸残基，并且更优选地是指在缔合时彼此接近并参与相互作用的氨基酸残基。具体地，相互作用包括在缔合时彼此接近的氨基酸残基之间的非共价键，例如氢键、静电相互作用或盐桥形成。
在本说明书中，“形成界面的氨基酸残基”具体是指包含在构成界面的多肽区域中的氨基酸残基。作为一个示例，构成界面的多肽区域是指在抗体、配体、受体、底物等中负责分子内或分子间选择性结合的多肽区域。抗体中此类多肽区域的具体示例可包括重链可变区和轻链可变区。在本发明的一些实施方案中，此类多肽区域的示例可包括抗原结合结构域和抑制结构域。
形成界面的氨基酸残基的示例包括但不限于缔合时彼此接近的氨基酸残基。例如，通过分析多肽的构象并检查多肽缔合时形成界面的多肽区域的氨基酸序列，可以发现缔合时彼此接近的氨基酸残基。
在本发明的一些实施方案中，可以改变抗原结合结构域中参与缔合的氨基酸残基，或抑制结构域中参与缔合的氨基酸残基，以促进抗原结合结构域与抑制结构域的缔合。在进一步具体实施方案中，可以改变在抗原结合结构域中的与抑制结构域形成界面的氨基酸残基，或在抑制结构域中的与抗原结合结构域形成界面的氨基酸残基。在优选的实施方案中，形成界面的氨基酸残基能够通过向界面氨基酸残基引入突变的方法改变，使得形成界面的两个或更多个氨基酸残基具有不同的电荷。导致不同电荷的氨基酸残基改变包括：带正电荷的氨基酸残基改变为带负电荷的氨基酸残基或不带电荷的氨基酸残基，带负电荷的氨基酸残基改变为带正电荷的氨基酸残基酸残基或不带电荷的氨基酸残基，以及不带电荷的氨基酸残基改变为带正电荷或带负电荷的氨基酸残基。这样的氨基酸改变是为了促进缔合而进行的，并且不受氨基酸改变的位置或氨基酸的类型的限制，只要可以实现促进缔合的目的即可。改变的示例包括但不限于置换。
在本发明的一些实施方案中，用作抗原结合结构域的VHH与作为抑制结构域的VL缔合。在VHH中参与与VL缔合的氨基酸残基可以指例如形成VHH和VL之间界面的氨基酸残基。在VHH中参与与VL缔合的氨基酸残基的示例包括但不限于37、44、45和47位的氨基酸残基(J.Mol.Biol.(2005)350,112-125)。通过促进VHH和VL之间的缔合来抑制VHH的活性。同样，VL中参与与VHH缔合的氨基酸残基可以指例如形成VHH和VL之间界面的氨基酸残基。
可以改变VHH中参与与VL缔合的氨基酸残基，以促进VHH和VL之间的缔合。这样一种氨基酸置换的示例包括但不限于F37V、Y37V、E44G、Q44G、R45L、H45L、G47W、F47W、L47W、T47W或/和S47W。可以使用最初具有氨基酸残基37V、44G、45L或/和47W的VHH，而不是改变VHH中的每个残基。
可以改变VH中参与与VHH缔合的氨基酸残基，而不是VHH氨基酸，并且也可以将氨基酸改变引入VHH和VL二者，只要可以实现促进VHH和VL之间缔合的目的即可。
在本发明的一些备选实施方案中，抗原结合结构域和抑制结构域能够通过使用VHH作为抗原结合结构域并使用VH或VHH作为抑制结构域而彼此缔合。可以鉴定和改变在用作抗原结合结构域的VHH中的、参与与作为抑制结构域的VH或VHH相缔合的氨基酸残基，以促进抗原结合结构域VHH与抑制结构域VH或VHH的缔合。此外，可以鉴定和改变在作为抑制结构域的VH或VHH中的、参与与作为抗原结合结构域的VHH相缔合的氨基酸残基。
在使用除VHH之外的单结构域抗体作为抗原结合结构域的情况下，也可以与上文类似地鉴定和改变在抗原结合结构域或抑制结构域中的参与缔合的氨基酸残基。
在本发明的一些实施方案中，运送部分和抗原结合结构域通过接头融合。在更具体的实施方案中，运送部分和抗原结合结构域通过含有切割位点的接头融合。在备选的具体实施方案中，运送部分和抗原结合结构域通过接头融合，且由此形成的融合蛋白含有切割位点。
在本发明的另一个实施方案中，运送部分和抗原结合结构域在没有接头的情况下融合。在更具体的实施方案中，在运送部分的N-末端氨基酸和抗原结合结构域的C-末端氨基酸之间形成氨基键，以形成融合蛋白。形成的融合蛋白含有切割位点。在特定的实施方案中，改变运送部分的一个至若干个N-末端氨基酸或/和抗原结合结构域的一个至若干个C-末端氨基酸，并且融合运送部分的N末端和抗原结合结构域的C末端，以便在融合位置附近形成切割位点。更具体地，切割位点可以例如通过将抗原结合结构域的四个C-末端氨基酸转换为LSGR序列并将运送部分的四个N-末端氨基酸转化为SDNH序列来形成。
在本发明的一些实施方案中，包含运送部分和抗原结合结构域的多肽的切割位点包含蛋白酶切割序列。蛋白酶切割序列可以置于多肽中的任何位置，只要通过蛋白酶切割将抗原结合结构域释放并且其在释放后不丧失其抗原结合活性即可。
在本发明的一些实施方案中，运送部分包含抗体恒定区，并且抗体恒定区的N末端和抗原结合结构域的C末端通过接头或不通过接头融合。
在特定的实施方案中，蛋白酶切割序列位于包含在运送部分中的抗体恒定区内。在这种情况下，蛋白酶切割序列可以位于抗体恒定区内，使得抗原结合结构域通过蛋白酶切割释放。在具体实施方案中，蛋白酶切割序列位于包含在运送部分中的抗体重链恒定区内，更具体地位于相对于抗体重链恒定区中140位氨基酸(EU编号)的抗原结合结构域侧，优选地位于相对于抗体重链恒定区中122位氨基酸(EU编号)的抗原结合结构域侧。在备选的实施方案中，蛋白酶切割序列位于包含在运送部分中的抗体轻链恒定区内，并且更具体地位于相对于抗体轻链恒定区中130位氨基酸(EU编号)(Kabat编号第130位)的抗原结合结构域侧，优选地位于相对于抗体轻链恒定区中113位氨基酸(EU编号)(Kabat编号113位)的抗原结合结构域侧。
在本发明的一些实施方案中，抗原结合结构域是单结构域抗体，并且单结构域抗体的C末端和运送部分的N末端通过接头或不通过接头融合。
在特定实施方案中，蛋白酶切割序列位于单结构域抗体内。在更具体的实施方案中，单结构域抗体是由VH或VHH制备的单结构域抗体，并且蛋白酶切割序列位于相对于单结构域抗体的35b(Kabat编号)位氨基酸的运送部分侧，优选位于相对于单结构域抗体的95(Kabat编号)位氨基酸的运送部分侧，更优选位于相对于单结构域抗体的109(Kabat编号)位氨基酸的运送部分侧。在备选的具体实施方案中，单结构域抗体是由VL制备的单结构域抗体，并且蛋白酶切割序列位于相对于单结构域抗体的氨基酸位置32(Kabat编号)位氨基酸的运送部分侧，优选位于单结构域抗体的91(Kabat编号)位氨基酸的运送部分侧，更优选位于单结构域抗体的104(Kabat编号)位氨基酸的运送部分侧。
在本发明的一些实施方案中，运送部分包含抗体恒定区，抗原结合结构域是单结构域抗体，并且抗体恒定区和单结构域抗体通过接头或不通过接头融合。在更具体的实施方案中，抗体恒定区的N末端和单结构域抗体的C末端通过接头或不通过接头融合。在备选的具体实施方案中，抗体恒定区的C末端和单结构域抗体的N末端通过接头或不通过接头融合。
在特定实施方案中，蛋白酶切割序列位于运送部分中所含的抗体恒定区内。在更具体的实施方案中，蛋白酶切割序列位于相对于抗体重链恒定区中140(EU编号)位氨基酸的单结构域抗体侧，优选地在相对于抗体重链恒定区中122(EU编号)位氨基酸的单结构域抗体侧。在备选的具体实施方案中，蛋白酶切割序列位于相对于抗体轻链恒定区中130(EU编号)(Kabat编号位置130)位氨基酸的抗原结合结构域侧，优选位于相对于抗体轻链恒定区中113(EU编号)(Kabat编号位置113)位氨基酸的抗原结合结构域侧。
在特定实施方案中，蛋白酶切割序列位于单结构域抗体内。在更具体的实施方案中，单结构域抗体是由VH或VHH制备的单结构域抗体，并且蛋白酶切割序列位于相对于单结构域抗体的35b(Kabat编号)位氨基酸的抗体恒定区侧，优选地位于相对于单结构域抗体的95(Kabat编号)位氨基酸的抗体恒定区侧，更优选地位于相对于单结构域抗体的109(Kabat编号)位氨基酸的抗体恒定区侧。在备选的具体实施方案中，单结构域抗体是由VL制备的单结构域抗体，并且蛋白酶切割序列位于单结构域抗体的32(Kabat编号)位氨基酸的抗体恒定区侧，优选地位于单结构域抗体的91(Kabat编号)位氨基酸的抗体恒定区侧，更优选地位于单结构域抗体的104(Kabat编号)位氨基酸的抗体恒定区侧。
在特定实施方案中，蛋白酶切割序列位于抗原结合结构域和运送部分之间的边界附近。短语“在抗原结合结构域和运送部分之间的边界附近”是指位于抗原结合结构域和运送部分之间的连接位点的上游或下游，并且不会在很大程度上影响抗原结合结构域二级结构的部分。
在更具体的实施方案中，抗原结合结构域与包含在运送部分中的抗体恒定区连接，蛋白酶切割序列位于抗原结合结构域和抗体恒定区之间的边界附近。短语“抗原结合结构域和抗体恒定区之间的边界附近”可以指抗原结合结构域和抗体重链恒定区之间的边界附近，或抗原结合结构域和抗体轻链恒定区之间的边界附近。当抗原结合结构域是由VH或VHH制备的单结构域抗体并与抗体重链恒定区连接时，短语“抗原结合结构域和抗体恒定区之间的边界附近”可以指在单结构域抗体的101(Kabat编号)位氨基酸和抗体重链恒定区的140(EU编号)位氨基酸之间，且优选地可以指在单结构域抗体的109(Kabat编号)位氨基酸和抗体重链恒定区的122(EU编号)位氨基酸之间。当抗原结合结构域是由VH或VHH制备的单结构域抗体并与抗体轻链恒定区连接时，短语“抗原结合结构域和抗体轻链恒定区之间的边界附近”可以指在单结构域抗体的101(Kabat编号)位氨基酸和抗体轻链恒定区的氨基酸位置130(EU编号)(Kabat编号位置130)位氨基酸之间，且优选地可以指在单结构域抗体的109(Kabat编号)位氨基酸和抗体轻链恒定区的氨基酸位置113(EU编号)(Kabat编号位置113)位氨基酸之间。当抗原结合结构域是由VL制备的单结构域抗体时，短语“在抗原结合结构域和抗体恒定区之间的边界附近”是指在单结构域抗体的96(Kabat编号)位氨基酸和抗体恒定区的指定位置之间，优选在单结构域抗体的104(Kabat编号)氨基酸和抗体恒定区的指定位置之间。
在本发明的一些实施方案中，多肽是IgG抗体样分子。这种实施方案的示例包括但不限于：运送部分包含IgG抗体恒定区，用作抗原结合结构域的单结构域抗体代替IgG抗体的VH，和抗原结合活性被VL抑制的实施方案；运送部分包含IgG抗体恒定区，用作抗原结合结构域的单结构域抗体代替IgG抗体的VL，并且抗原结合活性被VH抑制的实施方案；和运送部分包含IgG抗体恒定区，用作抗原结合结构域的单结构域抗体代替IgG抗体的VH和VL之一，和另外的已知抗原结合结构域的抗原结合活性的单结构域抗体代替IgG抗体的其他结构域。
本说明书中使用的术语“IgG抗体样分子”用于定义具有如下部分的分子：在结构上与IgG抗体中的恒定结构域或恒定区基本相似的部分，和在结构上与IgG抗体中的可变结构域或可变区基本相似的部分，并且所述分子具有与IgG抗体基本相似的构象。然而，在本说明书中，“IgG抗体样分子”可发挥或可不发挥抗原结合活性，同时保留与IgG抗体类似的结构。
所述多肽可包含一个或更多个抗原结合结构域。一个或更多个抑制结构域可以抑制多个抗原结合结构域的抗原结合活性。多个抗原结合结构域可各自与抑制结构域相缔合。多个抗原结合结构域可各自与运送部分融合。多个抗原结合结构域可各自能够从多肽中释放。用于释放多个抗原结合结构域的切割位点可以是对应于抗原结合结构域数目的多个切割位点。
当多肽是IgG抗体样分子时，可以在对应于IgG抗体的两个可变区的部分分别建立抗原结合结构域，如图7所示。参考本发明，本领域技术人员应该理解这样的实施方案。掺入两个臂中的抗原结合结构域可具有相同的抗原结合特异性或不同的抗原结合特异性。参考本发明，本领域技术人员应该理解这样的实施方案。显然，这些实施方案包括在本发明的范围内。
在本发明的一些实施方案中，抗原结合结构域进一步与第二抗原结合结构域连接。第二抗原结合结构域的示例包括但不限于单结构域抗体，抗体片段，体内细胞膜蛋白avimer中包含的约35个氨基酸的被称为A结构域的模块(国际公开No.WO2004/044011和WO2005/040229)，含有10Fn3结构域的adnectin，其作为源自在细胞膜上表达的糖蛋白纤连蛋白的蛋白结合结构域(国际公开No.WO2002/032925)，含有IgG结合结构域支架的亲合体(Affibody)，所述IgG结合结构域支架构成由蛋白A的58个氨基酸组成的三螺旋束(国际公开No.WO1995/001937)，DARPins(设计的锚蛋白重复序列蛋白)，其是锚蛋白重复序列(AR)的分子表面暴露区域，各自具有折叠成转角亚基的33个氨基酸残基结构、两个反平行螺旋和环(国际公开No.WO2002/020565)，具有连接八个反向平行链的四个环区域的抗替卡林(anticalin)，其在桶状结构的一端向中心轴弯曲，所述桶状结构在诸如中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的脂质运载蛋白分子中高度保守(国际公开No.WO2003/029462)，和在一个马蹄形折叠的内部平行板结构中的凹陷区域，其由不具有免疫球蛋白结构的可变淋巴细胞受体(VLR)的重复亮氨酸富集重复(LRR)模块组成，如在七鳃鳗或八目鳗等无颌脊椎动物的获得性免疫系统中所见(国际公开No.WO2008/016854)。在优选的实施方案中，第二抗原结合结构域具有不同于抗原结合结构域的抗原结合特异性。在优选的实施方案中，连接的抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的分子量为60kDa或更小。
在一些更具体的实施方案中，抗原结合结构域和第二抗原结合结构域是抗原结合特异性不同的单结构域抗体，连接的抗原结合结构域和第二抗原结合结构域能够从多肽中释放，抗原结合结构域和第二抗原结合结构域在释放后形成双特异性抗原结合分子。这种双特异性抗原结合分子的示例包括但不限于：具有特异性结合靶细胞抗原的抗原结合结构域的双特异性抗体结合分子和特异性结合免疫细胞表面抗原的第二抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子，具有抗原结合结构域和结合至相同抗原的不同亚基的第二抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子，和具有抗原结合结构域和结合至相同抗原的不同表位的第二抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子。这样一中双特异性抗原结合分子可以将免疫细胞招募到靶细胞附近，因此被认为可用于治疗由靶细胞引起的疾病。
第二抗原结合结构域的抗原结合活性可以或可以不被运送部分抑制。第二抗原结合结构域可以或可以不与运送部分的部分结构相缔合。特别地，当抗原结合结构域和第二抗原结合结构域在抗原结合特异性方面不同时，未释放状态的抗原结合结构域不能发挥抗原结合活性，例如图8所示，即使第二抗原结合结构域的抗原结合活性不被抑制和即使第二抗原结合结构域不与运送部分的部分结构相缔合。此包含与第二抗原结合结构域连接的抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子不能发挥双特异性结合两种抗原的功能。
图8显示了一种示例性形式，其中抗原结合结构域进一步与第二抗原结合结构域连接。
在本说明书中，术语“特异性”是指特异性结合分子之一基本上不与其一种或更多种结合配偶体分子以外的分子相结合的性质。当抗原结合结构域对特定抗原中包含的表位具有特异性时，也使用该术语。当抗原结合结构域对抗原中包含的多个表位中的特定表位具有特异性时，也使用该术语。在本文中，术语“基本上不结合”是根据关于结合活性的部分中所描述的方法确定的，并且意指特异性结合分子对结合配偶体以外的分子的结合活性为其对结合配偶体分子的结合活性的80％或更少，通常为50％或更少，优选为30％或更少，特别优选为15％或更少。
本发明还涉及包含本发明多肽和药学上可接受的载体的药物组合物(药物)。
本说明书中使用的“治疗(treatment)”(及其语法衍生的词，例如“治疗(treat)”和“治疗(treating)”)是指旨在改变待治疗个体的自然进程的临床干预，并且可在预防和临床病理状态进程期间进行。所述治疗的理想效果包括但不限于预防疾病的发展或复发、减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理影响、预防转移、减少疾病的进展速度、疾病状况的恢复或缓解、和改良或改善预后。在一些实施方案中，本发明的多肽用于延迟疾病的发作或延迟疾病的进展。
在本发明中，药物组合物通常是指用于治疗或预防疾病或用于检查或诊断的药物。在本发明中，术语“包含多肽的药物组合物”可与“治疗疾病的方法，包括将多肽施用至待治疗的受试者”互换使用，并且可与“多肽用于制备治疗疾病的药物的用途，”互换使用。此外，术语“包含多肽的药物组合物”可与“多肽用于治疗疾病的用途”互换使用。
能够通过使用本领域技术人员已知的方法配制本发明的药物组合物。例如，药物组合物可以无菌溶液或悬浮液的注射形式进行肠胃外使用，所述无菌溶液或悬浮液具有水或任何其他药学上可接受的液体。药物组合物能够通过以下来配制：例如将多肽与药理学上可接受的载体或介质，特别是无菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂、载体、防腐剂、粘合剂等适当组合，并将他们混合成普遍接受的药学实践所需的单位剂型。设置这些制剂中活性成分的量，以便在指定的范围内给出适当容量。
可根据常规药学实践使用诸如注射蒸馏水的载体，来配制用于注射的无菌组合物。可注射水溶液的示例包括含有生理盐水、葡萄糖或其他佐剂(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化钠)的等渗溶液。水溶液可以与适当的增溶剂组合使用，例如，醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)或非离子表面活性剂((Polysorbate 80(TM),HCO-50等)。
油溶液的示例包括芝麻油和大豆油。油溶液也可以与苯甲酸苄酯和/或苯甲醇组合使用作为增溶剂。油溶液可以补充有缓冲液(例如磷酸盐缓冲溶液和乙酸钠缓冲溶液)、安抚剂(例如盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如苯甲醇和苯酚)和抗氧化剂。通常将制备的注射溶液装入合适的的安瓿中。
本发明的药物组合物优选通过肠胃外途径施用。例如，将具有注射、经鼻、经肺或经皮剂型的组合物进行施用。药物组合物能够通过例如静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射或皮下注射全身或局部施用。
施用方法可根据患者的年龄和症状适当选择。含有多肽的药物组合物的剂量可以设定在例如每此给药每千克体重0.0001mg至1000mg的范围内。或者，含有多肽的药物组合物的剂量可以设定至例如每位患者0.001至100000mg的剂量。然而，本发明不一定受这些数值的限制。尽管所述剂量和施用方法根据患者的体重、年龄、症状等而变化，但是本领域技术人员可以考虑到这些条件设定适当的剂量和施用方法。
本发明还涉及制备多肽的方法，所述多肽包含具有抑制结构域的运送部分和抗原结合结构域
制备本发明多肽的一种方法是包括以下的方法：获得具有抗原结合活性的抗原结合结构域；将抗原结合结构域与运送部分连接，使得抗原结合结构域的抗原结合活性被抑制结构域抑制，以形成多肽前体，并且进一步将切割位点插入到多肽前体内，或将多肽前体的一部分改变为切割位点。引入切割位点的方法可以是任何切割位点的插入和多肽前体的一部分的改变，只要可以将切割位点引入多肽前体中即可。或者，能够通过两种方法的组合将改变位点引入多肽前体中。对于本领域技术人员而言，参考本说明书这样的实施例应该是显而易见的，并且包括在本发明的范围内。
制备本发明多肽的另一种方法是包括以下的方法：获得具有抗原结合活性的抗原结合结构域；通过切割位点将抗原结合结构域与运送部分连接，使得抗原结合结构域的抗原结合活性被抑制结构域抑制，以便形成多肽。当抗原结合结构域通过切割位点与运送部分连接时，切割位点可以夹在抗原结合结构域和运送部分之间，或者抗原结合结构域的一部分或/和运送部分的一部分可以被改变并用作切割位点的一部分。
在使用单结构域抗体作为抗原结合结构域并使用蛋白酶切割序列作为切割位点的实施方案中，产生多肽的方法将在下面。
在本发明的一个实施方案中，用于制备包含具有抑制结构域的运送部分和抗原结合结构域的多肽的方法是包括以下步骤的制备方法：
(a)获得与靶抗原结合的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体与运送部分连接，使得单结构域抗体的抗原结合活性被运送部分的抑制结构域抑制，以形成多肽前体；和
(c)将蛋白酶切割序列引入多肽前体。
在本发明的一个实施方案中，用于制备包含具有抑制结构域的运送部分和抗原结合结构域的多肽的方法是包括以下步骤的制备方法：
(a)获得与靶抗原结合的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体与运送部分连接，使得单结构域抗体的抗原结合活性被运送部分的抑制结构域抑制，以形成多肽前体；和
(c)将蛋白酶切割序列引入单结构域抗体和运送部分之间的边界附近。
在本发明的一个实施方案中，用于制备包含具有抑制结构域的运送部分和抗原结合结构域的多肽的方法是包括以下步骤的制备方法：
(a)获得与靶抗原结合的单结构域抗体；和
(b)通过蛋白酶切割序列将步骤(a)中获得的单结构域抗体与运送部分连接，使得单结构域抗体的抗原结合活性被运送部分的抑制结构域抑制，以形成一种多肽。
在特定实施方案中，用于制备包含具有抑制结构域的运送部分和抗原结合结构域的多肽的方法是进一步包括以下步骤的制备方法：
(d)证实掺入多肽或多肽前体中的单结构域抗体对靶抗原的结合活性被削弱或丧失。
在本发明中，短语“结合活性被削弱”是指与连接前相比，对靶抗原的结合活性降低，并且该降低的程度不受限制。
在特定实施方案中，用于制备包含具有抑制结构域的运送部分和抗原结合结构域的多肽的方法是进一步包括以下步骤的制备方法：
(e)通过蛋白酶切割序列的蛋白酶切割来释放单结构域抗体，并证实释放的单结构域抗体与抗原结合。
在本发明的一个实施方案中，用于制备多肽的方法是包括以下步骤的制备方法，其中所述多肽为包含具有抑制结构域的运送部分和抗原结合结构域的IgG抗体样分子：
(a)获得与靶抗原结合的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体作为IgG抗体的VH的替代物与VL缔合，或将单结构域抗体作为IgG抗体的VL的替代物与VH结合，使得单结构域抗体的抗原结合活性被抑制，以形成含有单结构域抗体的IgG抗体样分子前体；和
(c)将蛋白酶切割序列引入到含有单结构域抗体的IgG抗体样分子前体内。
在本发明的一个实施方案中，用于制备多肽的方法是包括以下步骤的制备方法，其中所述多肽为包含具有抑制结构域的运送部分和抗原结合结构域的IgG抗体样分子：
(a)获得与靶抗原结合的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体作为IgG抗体的VH的替代物与VL缔合，或将单结构域抗体作为IgG抗体的VL的替代物与VH结合，使得单结构域抗体的抗原结合活性被抑制，以形成含有单结构域抗体的IgG抗体样分子前体；和
(c)将蛋白酶切割序列引入到IgG抗体样分子前体中单结构域抗体和抗体恒定区之间的边界附近。
在本发明的一个实施方案中，用于制备多肽的方法是包括以下步骤的制备方法，其中所述多肽为包含具有抑制结构域的运送部分和抗原结合结构域的IgG抗体样分子：
(a)获得与靶抗原结合的单结构域抗体；和
(b)通过蛋白酶切割序列将步骤(a)中获得的单结构域抗体作为IgG抗体VH或VL的替代物连接至IgG抗体重链恒定区或轻链恒定区，使得单结构域抗体的抗原结合活性被抑制，以形成含有单结构域抗体的IgG抗体样分子。
在特定实施方案中，用于制备多肽的方法是进一步包括以下步骤的制备方法，其中所述多肽为包含具有抑制结构域的运送部分和抗原结合结构域的IgG抗体样分子：
(d)证实引入到IgG抗体样分子或IgG抗体样分子前体内的单结构域抗体对靶抗原的结合活性被削弱或丧失。
在本发明中，短语“结合活性被削弱”是指与缔合或连接前相比，对靶抗原的结合活性降低，并且该降低的程度不受限制。
在特定实施方案中，用于制备多肽的方法是进一步包括以下步骤的制备方法，其中所述多肽为包含具有抑制结构域的运送部分和抗原结合结构域的IgG抗体样分子：
(e)通过蛋白酶切割序列的蛋白酶切割来释放单结构域抗体，并证实释放的单结构域抗体与靶抗原结合。
在使用VH、VL或VHH作为抑制结构域的情况下，通过运送部分的抑制结构域来抑制单结构域抗体的抗原结合活性的方法，包括将单结构域抗体与VH、VL或VHH缔合的方法。能够通过以下来筛选抑制所提供的单结构域抗体的抗原结合活性的VH、VL或VHH：将已知的VH、VL或VHH与单结构域抗体相缔合，并比较缔合之前和之后单结构域抗体的抗原结合活性。
在通过特定VH、VL或VHH抑制单结构域抗体的抗原结合活性的另一种方法中，可以将单结构域抗体中参与与VH、VL或VHH缔合的氨基酸残基置换，以促进缔合；或者，通过使用最初具有可促进该缔合的氨基酸(本身为氨基酸残基)的单结构域抗体，也可以提供单结构域抗体/抑制结构域对，其中所述单结构域抗体/抑制结构域对在缔合之前和之后具有所期望的抗原结合活性差异。
在本发明的一个实施方案中，用于制备多肽的方法是包括以下步骤的制备方法，其中所述多肽为包含具有抑制结构域的运送部分和抗原结合结构域的IgG抗体样分子：
(a)将单结构域抗体中参与与抗体VH缔合的氨基酸残基置换，或将单结构域抗体中参与与抗体VL缔合的氨基酸残基置换，以制备保留了单结构域抗体对靶抗原的结合活性的单结构域抗体变体；
(b)将步骤(a)中制备的单结构域抗体变体与抗体VL缔合，或将单结构域抗体变体与抗体VH结合，使得单结构域抗体变体的抗原结合活性受到抑制，以形成含有单结构域抗体变体的IgG抗体样分子前体；和
(c)将蛋白酶切割序列引入到含有单结构域抗体变体的IgG抗体样分子前体内。
在本发明的一个实施方案中，用于制备多肽的方法是包括以下步骤的制备方法，其中所述多肽为包含具有抑制结构域的运送部分和抗原结合结构域的IgG抗体样分子：
(a)将单结构域抗体中参与与抗体VH缔合的氨基酸残基置换，或将单结构域抗体中参与与抗体VL缔合的氨基酸残基置换，以制备单结构域抗体变体，其保留了单结构域抗体对靶抗原的结合活性；
(b)将步骤(a)中制备的单结构域抗体变体与抗体VL缔合，或将单结构域抗体变体与抗体VH结合，使得单结构域抗体变体的抗原结合活性受到抑制，以形成含有单结构域抗体变体的IgG抗体样分子前体；和
(c)将蛋白酶切割序列引入到IgG抗体样分子前体中单结构域抗体变体与恒定区之间的边界附近。
在本发明的一个实施方案中，用于制备多肽的方法是包括以下步骤的制备方法，其中所述多肽为包含具有抑制结构域的运送部分和抗原结合结构域的IgG抗体样分子：
(a)将单结构域抗体中参与与抗体VH缔合的氨基酸残基置换，或将单结构域抗体中参与与抗体VL缔合的氨基酸残基置换，以制备单结构域抗体变体，其保留了单结构域抗体对靶抗原的结合活性；和
(b)通过蛋白酶切割序列将步骤(a)中制备的单结构域抗体变体与IgG抗体重链恒定区连接，或通过蛋白酶切割序列将单结构域抗体变体与IgG抗体轻链恒定区连接，使得单结构域抗体变体的抗原结合活性受到抑制，以形成含有单结构域抗体变体的IgG抗体样分子。
在特定实施方案中，用于制备多肽的方法是进一步包括以下步骤的制备方法，其中所述多肽为包含具有抑制结构域的运送部分和抗原结合结构域的IgG抗体样分子：
(d)证实包含在IgG抗体样分子或IgG抗体样分子前体内的单结构域抗体变体对靶抗原的结合活性被削弱或丧失。
在本发明中，短语“结合活性被削弱”是指与缔合或连接前相比，对靶抗原的结合活性降低，并且该降低的程度不受限制。
在特定实施方案中，用于制备多肽的方法是进一步包括以下步骤的制备方法，其中所述多肽为包含具有抑制结构域的运送部分和抗原结合结构域的IgG抗体样分子：
(e)通过蛋白酶切割序列的蛋白酶切割来释放单结构域抗体变体，并证实所释放的单结构域抗体变体与靶抗原结合。
本发明还涉及编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含具有抑制结构域的运送部分和抗原结合结构域。
根据本发明的多核苷酸通常由适当的载体携带(或插入)并转染到宿主细胞中。载体没有特别限制，只要载体可以稳定地保留所插入的核酸即可。例如，当使用大肠杆菌作为宿主时，优选将pBluescript载体(Stratagene Corp.制造)等作为克隆载体。可以使用各种市售载体。在使用载体用于产生本发明多肽的情况下，表达载体是特别有用的。表达载体没有特别限制，只要载体允许多肽在体外、在大肠杆菌内、在培养细胞内或生物体个体中表达即可。表达载体优选为，例如，用于体外表达的pBEST载体(由Promega Corp.制造)、用于大肠杆菌的pET载体(由Invitrogen Corp.制造)、用于所培养的细胞的pME18S-FL3载体(GenBank登录号AB009864)和用于生物个体的pME18S载体(Mol Cell Biol.8:466-472(1988))。将本发明的DNA插入载体中能够通过常规方法进行，例如，使用限制性位点的连接酶反应(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel等(1987)年出版.JohnWiley&Sons.Section 11.4-11.11)。
宿主细胞没有特别限制，可根据目的使用各种宿主细胞。用于表达多肽的细胞的示例可包括细菌细胞(例如，链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、真菌细胞(例如酵母和曲霉菌(Aspergillus))、昆虫细胞(例如果蝇(Drosophila)S2和草地夜蛾(Spodoptera)SF9)、动物细胞(例如，CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293和Bowes黑素瘤细胞)和植物细胞。载体向宿主细胞的转染能够通过本领域已知的方法进行，例如，磷酸钙沉淀法、电穿孔法(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel等,(1987)出版.JohnWiley&Sons.Section 9.1-9.9)、脂质体转染方法(由GIBCO-BRL/Thermo FisherScientific Inc.制造)或显微注射方法。
可以将合适的分泌信号掺入目的多肽中，以便将宿主细胞中表达的多肽分泌到内质网腔、周质间隙或细胞外环境中。信号对于目的多肽可以是内源的，或者可以是外来信号
当本发明的多肽分泌到培养基中时，在该制备方法中所述多肽的回收通过回收培养基进行。当本发明的多肽产生于细胞内时，首先裂解细胞，然后回收多肽。
包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱的本领域已知的方法可用于从所述重组细胞培养物中回收和纯化本发明的多肽。
本发明的一些实施方案中所用的抗原结合结构域的示例包括单结构域抗体。在这些实施方案中，单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VL缔合、与特定VH缔合或与特定VHH缔合而被抑制。本发明还涉及筛选这样一种单结构域抗体的方法。
具有已知序列的VL、VH或VHH，例如具有在IMGT或Kabat数据库中登记的序列的VL、VH或VHH，可用作抑制单结构域抗体的抗原结合活性的VL、VH或VHH。此外，可以使用从人抗体文库等新鉴定的VL、VH或VHH序列。可以藉由通过这些序列的组合制备蛋白质并通过使用上述方法测量结合活性，来选择抑制单结构域抗体结合活性的VL、VH或VHH。
在本发明的一些实施方案中，具有人抗体种系序列的VL、VH或VHH可用作抑制单结构域抗体的抗原结合活性的VL、VH或VHH。在使用例如VL作为抑制结构域的情况下，可以使用具有κ链框架序列的VL或具有λ链框架序列的VL。而且，可以使用具有修饰的框架序列的VL，例如κ链和λ链框架序列的组合框架序列。
在一个实施方案中，本发明提供筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VL缔合而被抑制，其包括以下步骤：
(a)获得具有靶抗原结合活性的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体与特定VL相缔合；和
(c)证实步骤(b)中与特定VL相缔合的单结构域抗体对抗原的结合活性被削弱或丧失。
在本发明中，短语“结合活性被削弱”是指与缔合前相比，对靶抗原的结合活性降低，并且该降低的程度不受限制。
在一个实施方案中，本发明提供筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VH缔合而被抑制，其包括以下步骤：
(a)获得具有靶抗原结合活性的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体与特定VH相缔合；和
(c)证实步骤(b)中与特定VH相缔合的单结构域抗体对抗原的结合活性被削弱或丧失。
在本发明中，短语“结合活性被削弱”是指与缔合前相比，对靶抗原的结合活性降低，并且该降低的程度不受限制。
在一个实施方案中，本发明提供筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VHH缔合而被抑制，其包括以下步骤：
(a)获得具有靶抗原结合活性的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体与特定VHH相缔合；和
(c)证实步骤(b)中与特定VHH相缔合的单结构域抗体对抗原的结合活性被削弱或丧失。
在本发明中，短语“结合活性被削弱”是指与缔合前相比，对靶抗原的结合活性降低，并且该降低的程度不受限制。
将单结构域抗体与特定VL、VH或VHH缔合的方法的示例包括如下方法：设计具有单结构域抗体序列的分子，用其替换诸如完整抗体、Fab、Fab'或(Fab)2的抗体或包含VH和VL二者的抗体片段中的VH和VL其中一者的序列，并表达具有该序列的多肽。
本发明还涉及制备单结构域抗体的方法，上述单结构域抗体的抗原结合活性是通过以下各项而被抑制：促进单结构域抗体与特定VL、VH或VHH的缔合，促进单结构域抗体与特定VL的缔合，促进单结构域抗体与特定VH的结合，或促进单结构域抗体与特定VHH的结合，还有筛选通过与特定VL缔合、与特定VH缔合或与特定VHH缔合而抑制其抗原结合活性的单结构域抗体。
在一个实施方案中，本发明提供了制备单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性通过与特定VL缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
(a)将单结构域抗体中参与与抗体VL缔合的氨基酸残基置换，以制备保留单结构域抗体对靶抗原的结合活性的单结构域抗体变体。
在特定实施方案中，本发明提供了制备单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性通过与特定VL缔合而被抑制，所述方法进一步包括以下步骤：
(b)将步骤(a)中制备的单结构域抗体变体与特定VL相缔合；和
(c)证实与VL相缔合的单结构域抗体变体的抗原结合活性被削弱或丧失。
在本发明中，短语“结合活性被削弱”是指与缔合前相比，对靶抗原的结合活性降低，并且该降低的程度不受限制。
在一个实施方案中，本发明提供了制备单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性通过与特定VH缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
(a)将单结构域抗体中参与与抗体VH缔合的氨基酸残基置换，以制备保留单结构域抗体对靶抗原的结合活性的单结构域抗体变体。
在特定实施方案中，本发明提供了制备单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性通过与特定VH缔合而被抑制，所述方法进一步包括以下步骤：
(b)将步骤(a)中制备的单结构域抗体变体与特定VH相缔合；和
(c)证实与VH相缔合的单结构域抗体变体的抗原结合活性被削弱或丧失。
在本发明中，短语“结合活性被削弱”是指与缔合前相比，对靶抗原的结合活性降低，并且该降低的程度不受限制。
在一个实施方案中，本发明提供了制备单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性通过与特定VHH缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
(a)将单结构域抗体中参与与抗体VHH缔合的氨基酸残基置换，以制备保留单结构域抗体对靶抗原的结合活性的单结构域抗体变体。
在特定实施方案中，本发明提供了制备单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性通过与特定VHH缔合而被抑制，所述方法进一步包括以下步骤：
(b)将步骤(a)中制备的单结构域抗体变体与特定VHH相缔合；和
(c)证实与VHH相缔合的单结构域抗体变体的抗原结合活性被削弱或丧失。
在本发明中，短语“结合活性被削弱”是指与缔合前相比，对靶抗原的结合活性降低，并且该降低的程度不受限制。
将单结构域抗体与特定VL、VH或VHH缔合的步骤是通过以下方法进行的：设计具有单结构域抗体序列的分子，用其替换诸如完整抗体、Fab、Fab'或(Fab)2的抗体中或包含VH和VL二者的抗体片段中的VH和VL其中一者的序列，并表达具有该序列的多肽。
根据本发明的某一实施方案，可从包含各自与第一缔合维持结构域相连接的多个单结构域抗体的融合多肽的文库中获得本发明单结构域抗体，其抗原结合活性通过与特定VL、VH或VHH缔合而被抑制或丧失。
在本说明书中，“文库”的实施方案可提供如下文库：其允许有效获得单结构域抗体，所述单结构域抗体的抗原结合活性通过与特定VL、VH或VHH缔合而被抑制或丧失。
在本说明书中，“文库”是指一组具有不同序列的多个融合多肽，或编码这些融合多肽的核酸或多核苷酸。包含在文库中的多个融合多肽是序列彼此不同的融合多肽，不具有单一序列。
在本说明书中，序列彼此不同的多个融合多肽中的术语“序列彼此不同”是指文库中的单个融合多肽具有不同的序列。更优选地，该术语意指文库中各个融合多肽的单结构域抗体部分具有不同的序列。具体地，文库中不同序列的数量反映了在文库中序列不同的独立克隆的数量，并且也称为“文库大小”。通常的噬菌体展示文库的文库大小为106至1012，并且能够通过应用本领域已知的技术(例如核糖体展示方法)扩展至1014。然而，用于噬菌体文库淘选选择的噬菌体颗粒实际数量通常比文库大小大10至10,000倍。此过量倍数，也称为“文库的当量数”，表示10至10,000个单个克隆可具有相同的氨基酸序列。因此，根据本发明的术语“序列彼此不同”是指文库中除了文库的当量数之外的各个多肽具有不同的序列，更具体地是指文库具有106至1014个分子，优选107至1012个分子的序列彼此不同的多肽的。
基本上由多个根据本发明的融合多肽组成的文库中的术语“多个”通常是指一组关于例如本发明的多肽、多核苷酸分子、载体或病毒的两种或更多种类型的物质。如果，例如两种或更多种物质的特定性质彼此不同，这意味着物质是两种或更多种类型。其示例可包括在氨基酸序列中的特定氨基酸位置处观察到的突变氨基酸。例如，除了表面暴露的、高度多样化的氨基酸位置上的特定突变氨基酸之外，具有基本上相同，优选相同序列的两种或更多种本发明多肽被认为是本发明的多个多肽。在另一个示例中，除了编码在表面暴露的、高度多样化的氨基酸位置处的特定突变氨基酸的碱基之外，具有基本上相同的，优选相同的两种或更多种本发明的多核苷酸分子序列，被认为是本发明的多个多核苷酸分子。
利用噬菌体载体的淘选方法也优选用作筛选具有结合活性作为指标的融合多肽的方法。编码每个单结构域抗体的基因和编码IgG抗体CH1结构域或轻链恒定区的基因可以以适当的形式连接，以形成融合多肽。可以将编码由此形成的融合多肽的基因插入到噬菌体载体中，以获得在表面上表达融合多肽的噬菌体。在噬菌体与所需抗原接触后，可以回收与抗原结合的噬菌体，以回收编码具有目的结合活性的融合多肽的DNA。如果需要，可以重复该操作以富集具有所需结合活性的融合多肽。
除了噬菌体展示方法之外，以下是使用文库通过淘选来获得融合多肽的已知技术：使用无细胞翻译系统的技术、在细胞或病毒表面上展示融合多肽的技术、使用乳剂的技术等。例如，以下均可作为使用无细胞翻译系统的技术：通过去除终止密码子等经由核糖体形成mRNA和翻译蛋白的复合物的核糖体展示方法，使用诸如嘌呤霉素的化合物将基因序列与翻译蛋白共价结合的cDNA或mRNA展示方法，或使用结合蛋白的核酸形成基因和翻译蛋白质的复合物的CIS展示方法。例如，以下均可作为在细胞或病毒表面上展示融合多肽的技术：噬菌体展示方法以及大肠杆菌展示方法、革兰氏阳性细菌展示方法、酵母展示方法、哺乳动物细胞展示方法或病毒展示方法。例如，使用含有基因和翻译相关分子的乳剂的体外病毒展示方法可以用作使用乳剂的技术。这些方法在本领域中是已知的(NatBiotechnol.2000年12月；18(12):1287-92,Nucleic Acids Res.2006；34(19):e127,ProcNatl Acad Sci U S A.2004年3月2日；101(9):2806-10,Proc Natl Acad Sci U S A.2004年6月22日；101(25):9193-8,Protein Eng Des Sel.2008年4月；21(4):247-55,Proc NatlAcad Sci U S A.2000年9月26日；97(20):10701-5,MAbs.2010年9-10月；2(5):508-18,Methods Mol Biol.2012；911:183-98)。
与第二缔合维持结构域连接的抑制结构域的缔合配偶体，可用于从文库中获得目的单结构域抗体的方法，其中所述文库包含多个各自与第一缔合维持结构域相连接的单结构域抗体的融合多肽。
在本说明书中，“第一缔合维持结构域”和“第二缔合维持结构域”是指能够通过诸如疏水键、氢键或离子键的键彼此相互作用以形成缔合物的结构域。第一缔合维持结构域和第二缔合维持结构域的优选示例包括但不限于抗体轻链恒定区(CL)和重链恒定区的CH1结构域。
无论单结构域抗体和抑制结构域之间的缔合(associativity)程度如何，第一缔合维持结构域和第二缔合维持结构域可以彼此相互作用，并形成融合多肽与缔合配偶体的缔合。
在备选的实施方案中，本发明提供了包含多个与IgG抗体轻链恒定区连接的单结构域抗体的融合多肽的文库，其中单结构域抗体包括其抗原结合活性通过与特定VL、VH或VHH缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体，以及用于筛选单结构域抗体的文库的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定的VL、VH或VHH缔合而被抑制或丧失。
在具体实施方案中，如图9A(1)、9A(2)、9A(3)、9B和9C所示，
(1)通过诸如噬菌体展示的展示方法，在噬菌体等的表面上展示各自与第一缔合维持结构域连接的单结构域抗体的融合多肽。
(2)提供与第二缔合维持结构域连接的抑制结构域的缔合配偶体，并且融合多肽与缔合配偶体相缔合。在融合多肽与缔合配偶体相缔合的这种状态下，选择不与靶抗原结合或具有预定值或更低的抗原结合活性的融合多肽。
(3)取消(2)中选择的融合多肽中单结构域抗体与缔合配偶体中抑制结构域的缔合。在单结构域抗体不与抑制结构域缔合的状态下，选择与靶抗原缔合或具有预定值或更高的抗原结合活性的融合多肽。
在本文中，例如，可使用以下方法作为取消单结构域抗体与抑制结构域缔合的方法：如图9B所示，在抑制结构域和第二缔合维持结构域之间的边界附近，切割缔合配偶体的方法；或如图9C所示，在单结构域抗体合第一缔合维持结构域之间的边界附近，切割融合多肽的方法。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种方法，包括如图9D所示，在单结构域抗体和抑制结构域一起表达时和在表达单结构域抗体以便不与其一起表达抑制结构域时，比较单结构域抗体结合活性之间的差异，而不是如图9A至9C所示，在消除单结构域抗体与抑制结构域缔合与不消除单结构域抗体与抑制结构域缔合之间，比较单结构域抗体的结合活性的差异。
如图9D(1)所示，单结构域抗体和抑制结构域一起表达以形成缔合。选择包括单结构域抗体的融合多肽，所述单结构域抗体在这一状态下不与抗原结合或具有预定值或更低的抗原结合活性。如图9D(2)、9D(2')和9D(2”)所示，表达单结构域抗体以便不与其一起表达抑制结构域。选择包含单结构域抗体的融合多肽，所述单结构域抗体在这一状态下与抗原结合或具有预定值或更高的抗原结合活性。结果，可以从包含多个各自与第一缔合维持结构域相连接的单结构域抗体的融合多肽的文库中，筛选其抗原结合活性通过与特定抑制结构域(例如VH、VL或VHH)缔合，而被抑制或丧失的单结构域抗体。备选地，表达单结构域抗体以便不与其一起表达抑制结构域。选择包含单结构域抗体的融合多肽，所述单结构域抗体在这一状态下与抗原结合或具有预定值或更高的抗原结合活性。然后，单域抗体和抑制结构域一起表达以形成缔合。选择包含单结构域抗体的多肽，所述单结构域抗体在该状态下，不与抗原结合或具有预定值或更低的抗原结合活性。同样通过该方法，可以从包含多个各自与第一缔合维持结构域相连接的单结构域抗体的融合多肽的文库中，筛选其抗原结合活性通过与特定抑制结构域(例如VH、VL或VHH)缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体。备选地，如图9D(2)、9D(2')和9D(2”)所示，表达单结构域抗体以便不与其一起表达抑制结构域(仅表达单结构域抗体；仅表达包含单结构域抗体和第一缔合维持结构域的融合多肽；或者包含单结构域抗体和第一缔合维持结构域的融合多肽仅与第二缔合维持结构域相缔合)，和选择包含单结构域抗体的融合多肽，所述单结构域抗体在这一状态下与抗原结合或具有预定值或更高的抗原结合活性。然后，如图9D(1)所示，在选择的融合多肽中的单结构域抗体和抑制结构域一起表达以形成缔合。选择包含单结构域抗体的融合多肽，所述单结构域抗体在这一状态下不与抗原结合或具有预定值或更低的抗原结合活性。结果，还可以从包含多个各自与第一缔合维持结构域相连接的单结构域抗体的融合多肽的文库中，筛选其抗原结合活性通过与特定抑制结构域(例如VH、VL或VHH)缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体。
“预定值或更低的抗原结合活性”可以指，例如，当通过本说明书中所列的方法测量抗原结合活性时，抗原结合活性低于预定参考。同样地，“预定值或更高的抗原结合活性”可以指，例如，当通过本说明书中所列的方法测量抗原结合活性时，抗原结合活性超过预定参考。与具有预定值或更低的抗原结合活性的融合多肽相比，具有预定值或更高的抗原结合活性的融合多肽与抗原的结合更强。
在上述(3)中选择的融合多肽包含单结构域抗体，所述单结构域抗体在与抑制结构域缔合的状态下，没有或具有弱的抗原结合活性，并且在与抑制结构域非缔合状态下，具有(强)抗原结合活性。能够通过这种方法分析选择的融合多肽的序列，以同样阐明其中所包含的单结构域抗体的序列。因此，可以制备单结构域抗体。
对于通过使用融合多肽和缔合配偶体筛选包含目的单结构域抗体的融合多肽的方法，重要的是比较单结构域抗体在与抑制结构域的缔合状态和非缔合状态之间的抗原结合活性。如图9A(2')和9A(3')所示，首先证实所展示的融合多肽的抗原结合活性，并且选择与抗原结合或具有预定值或更高抗原结合活性的融合多肽。然后，将如此选择的融合多肽与缔合配偶体相缔合。选择在这一缔合状态下不与抗原结合或具有预定值或更低抗原结合活性的融合多肽。也通过这一方法，可以获得包含目的单结构域抗体的融合多肽。
在下文中，将描述使用IgG抗体CH1结构域作为第一缔合维持结构域，并使用IgG抗体CL作为第二缔合维持结构域的一些实施方案。
可以从包含多个各自与IgG抗体CH1结构域连接的单结构域抗体的融合多肽的文库中，筛选包含目的单结构域抗体的融合多肽。
在一些实施方案中，本发明提供了包含多个各自与IgG抗体CH1结构域连接的单结构域抗体的融合多肽的文库，其中单结构域抗体包括通过其抗原结合活性通过与特定抑制结构域(例如VH、VL或VHH)缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体，并提供了用于筛选包含单结构域抗体的融合多肽文库的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定的VL、VH或VHH结合而被抑制或丧失。
在特定实施方案中，本发明提供了从包含多个各自与IgG抗体CH1结构域连接的单结构域抗体的融合多肽的文库中筛选融合多肽的方法，所述融合多肽包含单结构域抗体，该单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VL缔合而被抑制或丧失。具体地，本发明提供了一种筛选单结构域抗体的方法，其包括以下步骤：
(a)体外展示根据本发明的文库的融合多肽；
(b)提供与特定VL融合的IgG抗体轻链恒定区的缔合配偶体；
(c)将步骤(a)中展示的融合多肽与步骤(b)中提供的缔合配偶体相缔合，并选择在单结构域抗体与VL缔合的状态下，不与抗原结合或具有预定值或更低抗原结合活性的融合多肽；和
(d)从步骤(c)中由此选择的融合多肽中，选择在其中所包含的单结构域抗体不与VL相缔合的状态下，与抗原结合或具有预定值或更高抗原结合活性的融合多肽。
步骤(b)中所提供的缔合配偶体进一步包含蛋白酶切割序列。在这种情况下，在步骤(d)中，通过蛋白酶处理，单结构域抗体与VL的缔合被消除，并且可以在单结构域抗体不与VL缔合的状态下，证实单结构域抗体的抗原结合活性。缔合配偶体中的蛋白酶切割序列不受其位置的限制，只要通过切割，单结构域抗体与VL的缔合可被消除即可。作为位置的示例，蛋白酶切割序列可以位于例如缔合配偶体中VL和IgG抗体轻链恒定区之间的边界附近，优选位于VL的96(Kabat编号)位氨基酸和抗体轻链恒定区130(EU编号)(Kabat编号位置130)位氨基酸之间的任何位置，更优选位于VL的104(Kabat编号)位氨基酸和抗体轻链恒定区113(EU编号)(Kabat编号位置113)位氨基酸之间的任何位置。
可以将蛋白酶切割序列引入文库中的融合多肽中，而不是使用包含蛋白酶切割序列的缔合配偶体，并且能够通过蛋白酶切割融合多肽，使得单结构域抗体与VL的缔合被取消。每个融合多肽中的蛋白酶切割序列不受其位置的限制，只要通过切割消除单结构域抗体与VL的缔合，并且单结构域抗体即使在切割后也保持其抗原结合活性即可。作为位置的示例，蛋白酶切割序列可以位于例如融合多肽中单结构域抗体和IgG抗体CH1结构域之间的边界附近。
在步骤(d)中，可以再次展示在步骤(c)中选择的融合多肽的全长或其包含单结构域抗体的部分，并且可以证实在单结构域抗体不与VL缔合的状态下单结构域抗体的抗原结合活性。
在特定实施方案中，本发明提供了从包含多个各自与IgG抗体轻链恒定区连接的单结构域抗体的融合多肽的文库中筛选融合多肽的方法，所述融合多肽包含单结构域抗体，该单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VH缔合而被抑制或丧失。具体地，本发明提供了一种筛选含有单结构域抗体的融合多肽的方法，其包括以下步骤：
(a)体外展示根据本发明的文库的融合多肽；
(b)提供与特定VH融合的IgG抗体CH1结构域的缔合配偶体；
(c)将步骤(a)中展示的融合多肽与步骤(b)中提供的缔合配偶体相缔合，并选择在单结构域抗体与VH缔合的状态下，不与抗原结合或具有预定值或更低抗原结合活性的融合多肽；和
(d)从步骤(c)中由此选择的融合多肽中，选择在其中所包含的单结构域抗体不与VH相缔合的状态下，与抗原结合或具有预定值或更高抗原结合活性的融合多肽。
步骤(b)中所提供的缔合配偶体进一步包含蛋白酶切割序列。在这种情况下，在步骤(d)中，通过蛋白酶处理，单结构域抗体与VH的缔合被消除，并且可以在单结构域抗体不与VH缔合的状态下，证实单结构域抗体的抗原结合活性。缔合配偶体中的蛋白酶切割序列不受其位置的限制，只要通过切割，单结构域抗体与VH的缔合可被消除即可。作为位置的示例，蛋白酶切割序列可以位于例如缔合配偶体中VH和IgG抗体CH1结构域之间的边界附近，优选位于VH的101(Kabat编号)位氨基酸和抗体重链恒定区140(EU编号)位氨基酸之间的任何位置，更优选位于VH的109(Kabat编号)位氨基酸和抗体重链恒定区122(EU编号)位氨基酸之间的任何位置。
可以将蛋白酶切割序列引入文库中的融合多肽中，而不是使用包含蛋白酶切割序列的缔合配偶体，并且能够通过蛋白酶切割融合多肽，使得单结构域抗体与VH的缔合被取消。每个融合多肽中的蛋白酶切割序列不受其位置的限制，只要通过切割消除单结构域抗体与VH的缔合，并且单结构域抗体即使在切割后也保持其抗原结合活性即可。作为位置的示例，蛋白酶切割序列可以位于例如融合多肽中单结构域抗体和IgG抗体轻链恒定区之间的边界附近。
在步骤(d)中，可以再次展示在步骤(c)中选择的融合多肽的全长或其包含单结构域抗体的部分，并且可以在单结构域抗体不与VH缔合的状态下证实单结构域抗体的抗原结合活性。
本发明中描述的每个氨基酸序列中包含的氨基酸可以是翻译后修饰(例如，通过焦谷氨酰化将N-末端谷氨酰胺修饰成焦谷氨酸是本领域技术人员公知的修饰)。当然，这种含有翻译后修饰的氨基酸的氨基酸序列也包括在本发明所述的氨基酸序列中。
本领域技术人员应该理解，本说明书中描述的一个或更多个实施方案的任意组合也包括在本发明中，除非基于本领域技术人员的技术常识存在技术矛盾。
实施例
在下文中，将描述本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，可以根据上述一般描述来实施各种其他实施方案。
实施例1现有蛋白酶活化抗体的问题
已经报道了一种制备抗体的方法，该抗体仅通过在病变部位如癌组织或炎性组织中表达的蛋白酶切割而发挥抗原结合活性。这种抗体称为Probody，是一种抗体分子，如图1所示，其抗原结合活性通过将抗体连接到肽通过被在病变部位表达的蛋白酶切割的接头来掩蔽抗体的抗原结合位点而受到抑制(非专利文献18)。通过在靶病理部位处表达的蛋白酶切割组分接头，使掩蔽肽与Probody解离，使得所得抗体分子恢复其抗原结合活性并变得能够与靶病理组织中的抗原相结合。
据信Probody可以在如上所述的机制下在靶病理部位选择性地结合抗原并由此扩展治疗窗。然而，由于蛋白酶对抗体的切割在Probody的情况下是不可逆的，因此在病理部位切割的抗体可能会从病理部位带回到血液中，并作为通过血流将抗体分布到正常组织的结果，与正常组织中表达的抗原结合。由蛋白酶激活的Probody保留着与激活前Probody中相同的Fc区，因此其在血液中具有长循环时间。因此，在病理部位表达的蛋白酶所激活的抗体可能在血液中长时间循环。甚至在病理部位以高水平表达的蛋白酶，其在正常组织中也以低水平表达，并且在病理部位产生的游离蛋白酶可能泄漏到血液中(The Chinese-German Journal of Clinical Oncology Jun.2004,Vol.3,No.2P78-P80)。因此，Probody可以被这种游离蛋白酶激活。因此，可存在Probody在病理部位以外的部位被激活的可能性。由此激活的Probody也在血液中长时间循环。因此，存在着Probody在病理部位、在正常组织中和在血液中连续激活的可能性，如果活化的Probody具有在血液中的长的循环时间，则在血液中积累。血液中积累的活化Probody可能通过与正常组织中表达的抗原结合而表现出不良反应(图2)。
Probody的抗原结合活性通过接头与抗体连接的掩蔽肽抑制，但抗原结合活性未被完全抑制。Probody在以下两种状态之间处于平衡状态：通过接头连接的掩蔽肽与抗原结合位点相结合的状态，和掩蔽肽解离的状态。处于解离状态的分子可以与抗原结合(图3)。实际上，甚至在蛋白酶切割接头之前，非专利文献17中描述的抗EGFR Probody也具有针对EGFR的结合活性。虽然通过接头的蛋白酶切割使抗原结合活性增加30至100倍，但是在活化前以高浓度存在的Probody可能通过与正常组织中表达的抗原结合而表现出不良反应，原因在于活化前的Probody具有活化Probody的1/30至1/100的结合活性。
Probody使用人工肽来掩蔽抗体的抗原结合位点。该人工肽具有天然人蛋白质中不存在的序列，因此可能在人体中具有免疫原性。已知这种免疫原性通过诱导抗药物抗体来降低抗体药物的作用(Blood.2016年3月31日；127(13):1633-41)。
针对Probody的可能的抗药物抗体是针对抗体和掩蔽肽的复合物(活化前的Probody)的抗药物抗体、针对从掩蔽肽解离的抗体(活化的Probody)的抗药物抗体、针对掩蔽肽(从活化的Probody解离的掩蔽肽)的抗药物抗体等。其中，针对掩蔽肽的抗药物抗体(抗掩蔽肽抗体)可以在活化前与Probody的掩蔽肽结合，从而在没有蛋白酶切割的情况下激活Probody(图4)。由抗掩蔽肽抗体激活的Probody可能通过与正常组织中表达的抗原结合而表现出不良反应。
实施例2包含单结构域抗体的蛋白酶活化多肽的构思
如实施例1所示，Probody技术存在以下问题：
1.由蛋白酶切割激活的Probody在血液中具有长的循环时间。
2.即使蛋白酶切割前的Probody也具有针对抗原的结合活性。
3.掩蔽肽是人工的非人序列，并且可以诱导抗掩蔽肽抗体。
本发明人认为，解决这些问题并提供在病理部位发挥活性的抗体药物的有用方法是满足以下条件：
1.由蛋白酶切割激活的抗原结合结构域在血液中具有短的半衰期。
2.蛋白酶切割前分子的抗原结合活性最小化。
3.不使用具有人工的非人序列的掩蔽肽。
本发明人设计了图5中所示的分子作为满足上述条件的多肽的一个示例。具有与运送部分连接的抗原结合结构域的多肽具有长的半衰期，并且不与抗原结合，原因在于抗原结合结构域的抗原结合活性受到抑制(A)。释放抗原结合结构域，由此释放的抗原结合结构域恢复其抗原结合活性，并且还具有短的半衰期(B)。
图5中所示的多肽具有各种变体。在使用IgG抗体样分子的情况下，能够通过如图6中所示的制备方法来制备多肽。首先，获得与靶抗原结合的单结构域抗体(例如，VH或VHH)(A)。所获得的单结构域抗体作为具有种系序列的IgG抗体的VH和VL之一的替代物，与另一个(VL或VH)缔合，以形成IgG抗体样分子(B)。将蛋白酶切割序列引入IgG抗体样分子(C)中。引入位置的示例包括所含有的单结构域抗体(VH或VHH)和恒定区(CH1或CL)之间边界附近的位置。
单结构域抗体单独存在时具有抗原结合活性，但在与VL、VH或VHH等形成可变区时失去其抗原结合活性。VL或VH是具有种系序列的天然人抗体序列，因此具有低免疫原性风险，并且不太可能诱导识别该VL或VH的抗药物抗体。在用VHH与单结构域抗体形成可变区的情况下，VHH的人源化降低了免疫原性的风险，并降低了诱导识别该人源化VHH的抗药物抗体的可能性。插入IgG抗体样分子中的蛋白酶切割序列被蛋白酶切割，从而释放单结构域抗体。释放的单结构域抗体具有抗原结合活性。蛋白酶切割前的IgG抗体样分子在结构上与一般IgG分子相似，因此在血液中具有长循环时间，而蛋白酶切割释放的单结构域抗体具有约13kDa的分子量而不保留Fc区，并因此通过肾脏排泄迅速消失。实际上，全长IgG的半衰期大约为2至3周(Blood.2016年3月31日；127(13):1633-41)，而单结构域抗体的半衰期是大约2小时(Antibodies 2015,4(3),141-156)。因此，由蛋白酶激活的抗原结合分子在血液中具有短的半衰期，并且变得不可能与正常组织中的抗原结合。
当单结构域抗体是VL时，例如通过将蛋白酶切割序列引入VL和CL之间的边界附近，可以实现与上述相同的构思。
实施例3使用IL6R结合VHH来制备蛋白酶活化多肽
3-1具有与IL6R结合的掺入VHH的多肽的制备
通过本领域技术人员已知的方法来制备表达载体，其中所述表达载体编码含有IL6R90(SEQ ID NO:1)的IL6R90-G1m(SEQ ID NO:2)，如国际公开No.WO2010/115998中所述的具有针对人IL6R的结合和中和活性的VHH，其与人IgG1恒定区相融合(CH1-铰链-CH2-CH3)。
通过本领域技术人员已知的方法来制备表达载体，所述表达载体编码VK1-39-k0MT(SEQ ID NO:3)、VK2-28-k0MT(SEQ ID NO:4)、VK3-20-k0MT(SEQ ID NO:5)、VL1-40-lamL(SEQ ID NO:6)、VL1-44-lamL(SEQ ID NO:7)、VL2-14-lamL(SEQ ID NO:8)、VL3-21-lamL(SEQ ID NO:9)，k0(SEQ ID NO:10)和lamL(SEQ ID NO:11)作为具有人种系序列的各种亚类的轻链(可变区-恒定区)。
IgG抗体样分子IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT(重链：SEQ ID NO:2，轻链：SEQ ID NO:3)、IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT(重链：SEQ ID NO)：2，轻链：SEQ ID NO:4)、IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT(重链：SEQ ID NO:2，轻链：SEQ ID NO:5)、IL6R90-G1m/VL1-40-lamL(重链：SEQ IDNO:2，轻链：SEQ ID NO:6)、IL6R90-G1m/VL1-44-lamL(重链：SEQ ID NO:2，轻链：SEQ IDNO:7)、IL6R90-G1m/VL2-14-lamL(重链：SEQ ID NO:2，轻链：SEQ ID NO:8)、IL6R90-G1m/VL3-21-lamL(重链：SEQ ID NO:2，轻链：SEQ ID NO:9)、IL6R90-G1m/k0(重链：SEQ ID NO:2，轻链：SEQ ID NO:10)和IL6R90-G1m/lamL(重链：SEQ ID NO:2，轻链：SEQ ID NO:11)通过本领域技术人员已知的方法使用FreeStyle 293细胞(Invitrogen Corp.)通过瞬时表达来表达，并通过本领域技术人员已知的方法用蛋白A纯化。
3-2具有与人IL6R结合的掺入VHH的多肽的IL6R结合评价
通过以下方法评价IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT、IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT、IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT、IL6R90-G1m/VL1-40-lamL、IL6R90-G1m/VL1-44-lamL、IL6R90-G1m/VL2-14-lamL、IL6R90-G1m/VL3-21-lamL、IL6R90-G1m/k0和IL6R90-G1m/1mL对人IL6R的结合活性。
如下制备用作抗原的重组人IL6R：稳定表达如J.Immunol.152,4958-4968(1994)中报道的可溶性人IL-6R的CHO系(下文中，也称为hsIL-6R、IL6R或IL-6R)通过本领域技术人员已知的方法构建，培养，并使其表达hsIL-6R，所述可溶性人IL-6R由N末端开始计数的1至357位的氨基酸序列组成。从得到的培养上清液中，hsIL-6R通过Blue Sepharose6FF柱层析和凝胶过滤柱层析的两个步骤纯化。将在最终步骤中作为主峰洗脱的级分用作最终纯化产物。
使用Octet HTX(Pall ForteBio Corp.)进行各分子hsIL-6R结合评价。具体地，将每个分子与生物传感器/蛋白A(ProA)(Pall ForteBio Corp.,18-5013)结合，并使hsIL-6R作用于其上，然后在30℃下进行结合评价。显示OctetHTX测量的实时结合反应的传感图显示在图10中。缺乏VL的IL6R90-G1m/k0和IL6R90-G1m/lamL与hsIL-6R结合，而含有与VL形成的可变区的IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT、IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT、IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT、IL6R90-G1m/VL1-40-lamL、IL6R90-G1m/VL1-44-lamL和IL6R90-G1m/VL2-14-lamL则显示不能与hsIL-6R结合。由此，发现具有针对人IL6R的结合活性的VHH能够通过与VL缔合形成可变区而丧失其IL6R结合活性。
3-3将蛋白酶切割序列引入到具有与IL6R结合的掺入VHH的多肽中
进行研究以在抗人IL6R VHH IL6R90和CH1之间的边界附近插入蛋白酶切割序列。如下设计图11中所示的六种类型的重链：将具有或不具有甘氨酸-丝氨酸接头的肽序列A(SEQ ID NO:12)插入到IL6R90和CH1之间边界附近的3个位点处，其中所述肽序列A是能够通过癌症特异性表达的尿激酶(uPA)和MT-SP1切割的报道的序列。通过本领域技术人员已知的方法来制备编码IL6R90H1001(SEQ ID NO:13)，IL6R90H1002(SEQ ID NO:14)，IL6R90H1003(SEQ ID NO:15)，IL6R90H1004(SEQ ID NO:16)，IL6R90H1005(SEQ ID NO:17)和IL6R90H1006(SEQ ID NO:18)的表达载体。
IgG抗体样分子IL6R90H1001/VK1-39-k0MT(重链：SEQ ID NO:13，轻链：SEQ IDNO:3)、IL6R90H1002/VK1-39-k0MT(重链：SEQ ID NO:14，轻链：SEQ ID NO:3)、IL6R90H1003/VK1-39-k0MT(重链：SEQ ID NO:15，轻链：SEQ ID NO:3)、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT(重链：SEQ ID NO:：16，轻链：SEQ ID NO:3)，IL6R90H1005/VK1-39-k0MT(重链：SEQID NO:17，轻链：SEQ ID NO:3)和IL6R90H1006/VK1-39-k0MT(重链：SEQ ID NO:18，轻链：SEQ ID NO:3)通过本领域技术人员已知的方法，通过使用这些重链和VK1-39-k0MT(SEQ IDNO:3)作为轻链并使用FreeStyle 293细胞(Invitrogen Corp.)通过瞬时表达来表达，并使用蛋白A通过本领域技术人员已知的方法纯化。
3-4通过蛋白酶切割来激活携带蛋白酶切割序列的多肽
证实了IL6R90H1001/VK1-39-k0MT、IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1003/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT和IL6R90H1006/VK1-39-k0MT是否通过蛋白酶切割而释放具有针对IL6R结合活性的VHH。
通过本领域技术人员已知的方法制备可溶性人IL6R。通过本领域技术人员已知的方法将制备的可溶性人IL6R生物素化。
为了将生物素连接到可溶性人IL-6R(也称为hsIL-6R或可溶性人IL6R；SEQ IDNO:35)的C末端，通过编码接头的基因片段，将编码待通过生物素连接酶生物素化的特定序列(AviTag序列；SEQ ID NO:36)的基因片段与编码hsIL-6R的基因片段的下游连接。将编码含有与AviTag序列连接的hsIL-6R的蛋白质(hsIL-6R-Avitag；SEQ ID NO:37)的基因片段整合到用于在动物细胞中表达的载体中。使用293Fectin(Invitrogen Corp.)将构建的质粒载体转染到FreeStyle 293细胞(Invitrogen Corp.)中。在该操作中，细胞用EBNA1(SEQID NO:57)表达基因和生物素连接酶基因(BirA；SEQ ID NO:58)表达基因共转染，并且为了将hsIL-6R-Avitag进行生物素标记而进一步加入生物素。将根据上述方法转染的细胞在37℃，8％CO2下培养，使目的蛋白质(hsIL-6R-BAP1)分泌到培养上清液中。将该细胞培养液通过0.22μm的瓶顶过滤器过滤以得到培养上清液。
根据制造商的方案，将抗人IL-6R抗体固定在HiTrap NHS活化的HP(GEHealthcare Japan Corp.)上以制备柱(抗人IL-6R抗体柱)。将培养上清液应用于用TBS平衡的抗人IL-6R抗体柱，然后用2M精氨酸(pH4.0)洗脱结合的hsIL-6R。接下来，用TBS稀释来自抗人IL-6R抗体柱的洗脱液，然后将其应用于用TBS平衡的SoftLink Avidin柱(PromegaCorp.)，然后用5mm生物素、50mm Tris-HCL(pH 8.0)和2M精氨酸(pH 4.0)洗脱hsIL-6R-BAP1。从该洗脱液中，使用Superdex 200(GE Healthcare Japan Corp.)通过凝胶过滤色谱法除去hsIL-6R-BAP1的聚集体，以获得纯化的hsIL-6R-BAP1，其中缓冲液被D-PBS和0.05％CHAPS替换。
将重组人Matriptase/ST14催化结构域(R&D Systems,Inc.,3946-SE-010)用作蛋白酶。将12.5nM蛋白酶和100μg/mL的各个IgG抗体样分子在PBS中在37℃的条件下温育20小时。然后，通过还原SDS-PAGE来评价蛋白酶的切割。结果显示在图12中。其结果，在IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT和IL6R90H1006/VK1-39-k0MT中证实了VHH和重链恒定区之间的边界附近的蛋白酶切割序列的蛋白酶切割。
接下来，使用Octet HTX(Pall ForteBio Corp.)进行蛋白酶处理释放的VHH的IL6R结合评价。具体地，将hsIL-6R-BAP1与链霉亲和素传感器(Pall ForteBio Corp.,18-5021)结合，并使每个被切割的IgG抗体样分子作用于其上，然后在30℃下进行结合评价。显示使用Octet HTX测量的实时结合反应的传感图示于图13中。结果，在IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT和IL6R90H1006/VK1-39-k0MT中证实了结合。IL6R90-G1m/k0和IL6R90-G1m/lamL以亲合力二价结合，而释放的VHH以亲和力结合。因此，相比于IL6R90-G1m/k0和IL6R90-G1m/lamL，蛋白酶处理的IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT和IL6R90H1006/VK1-39-k0MT显示出从IL6R的解离速率较快。此外，VHH的分子量小于IL6R90-G1m/k0和IL6R90-G1m/lamL的分子量。因此，他的响应、结合量较低。
这些结果证明IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT或IL6R90H1006/VK1-39-k0MT原本未显示针对IL6R的结合活性，但是通过蛋白酶处理，切割插入到VHH和重链恒定区之间边界附近的肽序列A，从而释放VHH结构域，且释放的VHH能够结合IL6R。由此可以得出结论，符合实施例2中所描述的构思的分子实际上能够制备。
实施例4通过使用与IL6R结合的VHH的改变来制备蛋白酶活化的多肽
4-1与IL6R结合的掺入VHH的多肽的IL6R结合评价
通过本领域技术人员已知的方法来制备表达载体，其中所述表达载体编码含有20A11(SEQ ID NO:19)的20A11-G1m(SEQ ID NO:38)，如国际公开No.WO2010/115998中所述的具有针对IL6R的结合和中和活性的VHH，其以与实施例3中相同的方式与人IgG1恒定区融合(CH1-铰链-CH2-CH3)。
多肽20A11-G1m/VK1-39-k0MT、20A11-G1m/VK2-28-k0MT、20A11-G1m/VK3-20-k0MT、20A11-G1m/VL1-40-lamL、20A11-G1m/VL1-44-lamL、20A11-G1m/VL2-14-lamL和20A11-G1m/VL3-21-lamL通过本领域技术人员已知的方法，以与实施例3相同的方式，使用该重链和VK1-39-k0MT(SEQ ID NO:3)、VK2-28-k0MT(SEQ ID NO:4)、VK3-20-k0MT(SEQ IDNO:5)、VL1-40-lamL(SEQ ID NO:6)、VL1-44-lamL(SEQ ID NO:7)、VL2-14-lamL(SEQ IDNO:8)和VL3-21-lamL(SEQ ID NO:9)作为轻链，来表达和纯化。
以与实施例3相同的方式，对所获得的20A11-G1m/VK1-39-k0MT(重链：SEQ ID NO:38,轻链：SEQ ID NO:3),20A11-G1m/VK2-28-k0MT(重链：SEQ ID NO:38,轻链：SEQ ID NO:4),20A11-G1m/VK3-20-k0MT(重链：SEQ ID NO:38,轻链：SEQ ID NO:5),20A11-G1m/VL1-40-lamL(重链：SEQ ID NO:38,轻链：SEQ ID NO:6),20A11-G1m/VL1-44-lamL(重链：SEQ IDNO:38,轻链：SEQ ID NO:7),20A11-G1m/VL2-14-lamL(重链：SEQ ID NO:38,轻链：SEQ IDNO:8)和20A11-G1m/VL3-21-lamL(重链：SEQ ID NO:38,轻链：SEQ ID NO:9)与IL6R的结合进行评价。结果显示在图14中。结果，通过与含有20A11的重链相缔合，该实施例中所使用的轻链均未抑制20A11的IL6R结合活性，其中所述20A11与人种系IgG1恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)融合。
这可能是因为20A11没有与本实施例中使用的VL形成稳定可变区。
4-2在掺入不丧失抗原结合的VHH的多肽中，在VHH和VL之间的界面位置引入氨基 酸改变
为了在20A11和VL之间形成稳定的可变区，对于存在于20A11和VL之间的界面处的氨基酸引入突变。通过本领域技术人员已知的方法来制备表达载体，其中所述表达载体编码含有20A11hu(通过引入突变衍生自20A11，在37位用V置换F(F37V)，在45位用L置换R，在47位用W置换G(均根据Kabat编号))(SEQ ID NO:20)的20A11hu-G1m(SEQ ID NO:39)，所述20A11hu以实施例3中相同的方式与人IgG1恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)融合。
多肽20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT(重链：SEQ ID NO:39，轻链：SEQ ID NO:3)、20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT(重链：SEQ ID NO:39，轻链：SEQ ID NO:4)、20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT(重链：SEQ ID NO:39，轻链：SEQ ID NO:5)、20A11hu-G1m/VL1-40-lamL(重链：SEQID NO:39，轻链：SEQ ID NO:6)、20A11hu-G1m/VL1-44-lamL(重链：SEQ ID NO:39，轻链：SEQID NO:7)、20A11hu-G1m/VL2-14-lamL(重链：SEQ ID NO:39，轻链：SEQ ID NO:8)和20A11hu-G1m/VL3-21-lamL(重链：SEQ ID NO:39，轻链：SEQ ID NO:9)以与实施例3相同的方式，使用该重链和VK1-39-k0MT(SEQ ID NO:3)、VK2-28-k0MT(SEQ ID NO:4)、VK3-20-k0MT(SEQ ID NO:5)、VL1-40-lamL(SEQ ID NO:6)、VL1-44-lamL(SEQ ID NO:7)、VL2-14-lamL(SEQ ID NO:8)和VL3-21-lamL(SEQ ID NO:9)作为轻链，来表达和纯化。
4-3具有掺入VHH的多肽与IL6R的结合评价，其中所述多肽在VHH和VL之间的界面 位置处含有氨基酸改变
在30℃或25℃，以与实施例3中相同的方式，对所获得的20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT、20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT、20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT、20A11hu-G1m/VL1-40-lamL、20A11hu-G1m/VL1-44-lamL、20A11hu-G1m/VL2-14-lamL和20A11hu-G1m/VL3-21-lamL与IL6R的结合进行评价。结果显示在图15中。
结果，显示20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT、20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT、20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT、20A11hu-G1m/VL1-40-lamL、20A11hu-G1m/VL1-44-lamL和20A11hu-G1m/VL2-14-lamL不能与IL6R结合。
这些结果表明，实施例3所使用的VHH 20A11可以与VL形成稳定的可变区，其中所述VHH 20A11并不通过与VL缔合而丧失其IL6R结合活性，并且能够通过以下而丧失其IL6R结合活性：将存在于VHH与VL之间界面位置处的氨基酸，转变为37V、45L和47W(Kabat编号)，从而将20A11改变为20A11hu。
4-4将蛋白酶切割序列引入到具有掺入VHH的多肽中，其中所述多肽在VHH和VL之 间的边界位点处具有氨基酸改变
以与实施例3中相同的方式制备重链20A11huH1001(SEQ ID NO:40)、20A11huH1002(SEQ ID NO:41)、20A11huH1004(SEQ ID NO:42)和20A11huH1006(SEQ IDNO:43)，使得将蛋白酶切割序列(SEQ ID NO:12)或与柔性接头连接的蛋白酶切割序列(SEQID NO:44)插入20A11hu和CH1之间的边界附近。
多肽20A11huH1001/VK1-39-k0MT(重链：SEQ ID NO:40，轻链：SEQ ID NO:3)、20A11huH1002/VK1-39-k0MT(重链：SEQ ID NO:41，轻链：SEQ ID NO:3)、20A11huH1004/VK1-39-k0MT(重链：SEQ ID NO:42，轻链：SEQ ID NO:3)和20A11huH1006/VK1-39-k0MT(重链：SEQ ID NO:43，轻链：SEQ ID NO:3)以与实施例3相同的方式，使用这些重链和VK1-39-k0MT(SEQ ID NO:3)作为轻链，来表达和纯化。
4-5通过蛋白酶切割的包含蛋白酶切割序列的多肽的激活
以与实施例3相同的方式，用蛋白酶切割20A11huH1001/VK1-39-k0MT、20A11huH1002/VK1-39-k0MT、20A11huH1004/VK1-39-k0MT和20A11huH1006/VK1-39-k0MT，并且通过还原SDS-PAGE来评价切割的程度。结果如图16所示。
结果，证实了20A11huH1002/VK1-39-k0MT、20A11huH1004/VK1-39-k0MT和20A11huH1006/VK1-39-k0MT在VHH和CH1之间的边界附近经受蛋白酶切割。
接下来，以与实施例3相同的方式，在30℃或25℃下进行通过蛋白酶处理释放的VHH的IL6R结合评价。Octet传感图显示在图17中。
结果，证实了在VHH和CH1之间的边界附近经受蛋白酶切割的20A11huH1002/VK1-39-k0MT、20A11huH1004/VK1-39-k0MT和20A11huH1006/VK1-39-k0MT中的IL6R结合。
这些结果表明，即使掺入多肽中的VHH在与特定VL缔合后不立即失去其抗原结合活性，该抗原结合活性也能通过向VHH和VL之间的界面处存在的氨基酸引入缔合促进突变而丧失。
从这些结果可以得出结论，除了如实施例3的方式将轻链与预先获得的VHH相结合的方法之外，还能够通过将轻链与含有涉及轻链缔合的置换氨基酸的VHH相结合的方法，来制备符合实施例2中描述的构思的分子。
实施例5使用衍生自免疫羊驼的VHH制备蛋白酶活化的多肽
5-1获得来自免疫羊驼的VHH
通过本领域技术人员已知的方法，用IL6R、CD3或plexin A1免疫羊驼。4周和8周后，收集PBMC。从收集的PBMC中，参照J.Immunol.Methods(2007)324,13.中描述的方法扩增VHH基因。将扩增的VHH基因片段与基因3基因连接，并插入噬菌粒载体中。通过电穿孔方法将具有VHH片段插入物的噬菌粒载体转染到大肠杆菌中，并通过本领域技术人员已知的方法获得展示VHH的噬菌体。通过ELISA评价获得的噬菌体与IL6R、CD3或plexin A1的结合。通过本领域技术人员已知的方法分析结合克隆的序列，以鉴定VHH与抗原的结合。
5-2结合至CD3的VHH的富集
从实施例5-1中构建的VHH文库中，鉴定与人CD3结合的VHH。使用含有与人抗体恒定区(人CD3ed-Fc)连接的人CD3ε和人CD3δ的生物素标记的蛋白作为抗原，，将具有针对人CD3的结合能力的VHH克隆进行富集。人CD3ed-Fc如下制备：将具有编码SEQ ID NO:59所示氨基酸序列的基因的动物细胞表达载体，编码SEQ ID NO:60所示氨基酸序列的基因和编码BirA(SEQ ID NO:58)的基因，转染到FreeStyle 293细胞(Invitrogen Corp.)中。转染后，向其中加入L-生物素，并在培养液中进行生物素化。根据方案，通过在37℃下震荡培养进行细胞培养。4至5天后，收集上清液。从上清液中，使用蛋白A柱(Eshmuno A(Merck KGaA))获得与抗体恒定区融合的蛋白质。为了进一步仅获得CD3εδ异源二聚体，使用抗-FLAG M2柱，将与抗体恒定区融合的CD3εδ异源二聚体的级分(称为人CD3ed-Fc)进行分离。随后，进行凝胶过滤色谱(Superdex 200,GE Healthcare Japan Corp.)，以获得目的CD3εδ异源二聚体的级分(称为人CD3ed-Fc)。
从保留了构建的用于噬菌体展示的噬菌粒的大肠杆菌，进行噬菌体制备。在噬菌体产生后，通过向大肠杆菌的培养液中加入2.5M NaCl/10％PEG，将噬菌体群进行沉淀，然后用TBS稀释以获得噬菌体文库溶液。接下来，将BSA添加到噬菌体文库溶液中，以达到4％的最终BSA浓度。参考使用固定在磁珠上的抗原的一般淘选方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9；J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203；Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20；和Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)进行淘选。使用的磁珠是NeutrAvidin包被的珠子(FG beads NeutrAvidin)或链霉亲和素包被的珠子(DynabeadsMyOne Streptavidin T1)。
具体地，将100pmol生物素标记的抗原加入到制备的噬菌体文库溶液中，并使噬菌体文库溶液在室温下与抗原接触60分钟。向其中加入用BSA封闭的磁珠，并将抗原和噬菌体的复合物在室温下与磁珠结合15分钟。用0.5mL TBST(含有0.1％Tween 20的TBS；TBS由Takara Bio Inc.制造)洗涤珠子两次，然后用0.5mL TBS进一步洗涤一次。然后，向其中加入0.5mL 1mg/mL胰蛋白酶，并将珠子在室温下悬浮15分钟，然后立即使用磁力架分离以回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液加入20mL指数生长期的大肠杆菌系ER2738(OD600：0.4-0.5)中。将大肠杆菌在37℃温和搅拌下培养1小时，然后用噬菌体感染。将感染的大肠杆菌接种到225mm×225mm的平板上。然后，从接种大肠杆菌的培养液中回收噬菌体以制备噬菌体文库溶液。这一循环称为淘选，重复两次。在第二轮淘选循环中，珠子用TBST洗涤三次，然后用TBS洗涤两次。此外，在淘选针对人CD3ed-Fc的情况下，加入4nMol人Fc。
5-3具有与CD3结合的掺入VHH的蛋白酶活化的IgG抗体样分子的制备
通过实施例3中描述的方法，将编码实施例5-1或5-2中获得的针对人CD3的各个结合克隆的VHH序列(表1)的核苷酸序列，连接到编码蛋白酶切割位点和恒定区的核苷酸序列上，并插入动物细胞的表达载体中。将所得物作为IgG抗体样分子的重链使用。
[表1]
与人CD3结合的VHH
VHH SEQ ID NO
bC3edL1R1N160H01 61
bC3edL1R1N161HO1 62
bC3edL1R1N164H01 63
通过本领域技术人员已知的方法，使用FreeStyle 293细胞(Invitrogen Corp.)通过瞬时表达，将下表2中所示的蛋白酶活化的IgG抗体样分子进行表达，并通过本领域技术人员已知的方法，使用蛋白A对其进行纯化。.
[表2]
具有与CD3结合的掺入VHH的蛋白酶活化IgG抗体样分子
5-4通过蛋白酶切割将蛋白酶活化的IgG抗体样分子激活
以与实施例3相同的方式，用蛋白酶切割实施例5-3中制备的IgG抗体样分子，并通过还原SDS-PAGE评价切割程度。结果显示在图18中。蛋白酶浓度设定至25 nM，并且在测定中使用Octet RED(Pall ForteBio Corp.)。
结果，证实IgG抗体样分子在蛋白酶切割序列处经历蛋白酶切割。
然后，以与实施例3相同的方式，进行蛋白酶处理所释放的VHH的CD3结合评价。Octet传感图显示在图19中。
结果，在蛋白酶处理之前，IgG抗体样分子bC3edL1R1N160H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT、bC3edL1R1N161H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT和bC3edL1R1N164H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT没有表现出抗原结合，而在蛋白酶处理后证实了抗原结合。以与表1中描述的VHH相同的方式获得的与CD3分子结合的多个VHH，也用于制备含有与表2中所述的IgG抗体样分子相同的蛋白酶切割位点的IgG样分子。结果，通过蛋白酶处理证实了抗原结合。这些结果表明，除了实施例3和4中所示的多肽之外，含有蛋白酶切割序列的IgG抗体样分子能够通过蛋白酶处理在蛋白酶切割序列处进行切割，从而释放抗原结合结构域，释放的抗原结合结构域可以与抗原结合。
实施例6在其轻链中含有蛋白酶切割序列的多肽
以与实施例3相同的方式，制备在各个位置具有蛋白酶切割序列的轻链VK1-39P-2-Pk0MT(SEQ ID NO:67)、VK1-39P-1-Pk0MT(SEQ ID NO:68)、VK1-39P-Pk0MT(SEQ ID NO:69)、VK1-39P+2-Pk0MT(SEQ ID NO:70)、VK1-39P+3-Pk0MT(SEQ ID NO:71)、VK1-39P+4-Pk0MT(SEQ ID NO:72)和VK1-39P+5-Pk0MT(SEQ ID NO:73)。
使用这些轻链和IL6R90-G1m(SEQ ID NO:2)作为重链，以与实施例3中相同的方式表达和纯化IgG抗体样分子。蛋白酶浓度设定至25nM。IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT(重链：SEQID NO:2，轻链：SEQ ID NO:3)用作不包含切割序列的IgG抗体样分子。
随后，以与实施例3相同的方式，通过蛋白酶切割制备的IgG抗体样分子，并通过还原SDS-PAGE评价切割程度。结果如图20所示。结果，证实了VK1-39P+2-Pk0MT(SEQ ID NO:70)、VK1-39P+3-Pk0MT(SEQ ID NO:71)、VK1-39P+4-Pk0MT(SEQ ID NO:72)和VK1-39P+5-Pk0MT(SEQ ID NO:73)在蛋白酶切割序列处经历蛋白酶切割。以与实施例3相同的方式，进一步进行通过蛋白酶处理暴露的VHH的IL6R结合评价。Octet传感图显示在图21中。结果，通过导入轻链中的切割序列的蛋白酶处理，证实了结合，证明了可以获得在其轻链中具有蛋白酶切割序列的蛋白酶活化的多肽，使得抗原结合结构域通过轻链的蛋白酶切割而暴露以显示出抗原结合能力。
实施例7含有具有抗原结合结构域的重链和包含蛋白酶切割序列的轻链的文库， 以及通过噬菌体展示方法从该文库中获得蛋白酶活化的多肽
如实施例6中所证实的，即使当蛋白酶切割序列被引入到蛋白酶活化的多肽的轻链中时，在轻链切割后，抗原结合结构域暴露并与抗原结合。
因此，将含有诸如单结构域抗体的抗原结合结构域的重链和含有蛋白酶切割序列的轻链掺入噬菌粒中，并通过噬菌体展示。构建含有不同类型抗原结合结构域的用于噬菌体展示的多个噬菌粒，然后从保留这些噬菌粒的大肠杆菌中制备噬菌体。在噬菌体制备之后，通过向大肠杆菌的培养液中加入2.5M NaCl/10％PEG，来沉淀噬菌体群，然后用TBS稀释以获得噬菌体文库溶液。将BSA添加到噬菌体文库溶液中，以达到4％的最终BSA浓度。
通过从由此制备的噬菌体文库中淘选来获得蛋白酶活化的多肽。参照使用固定在磁珠上的抗原的一般淘选方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9；J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203；Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20；和Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)进行淘选。在添加蛋白酶之前，回收未与抗原固定的磁珠相结合的噬菌体，并且在添加蛋白酶后回收与抗原固定的磁珠相结合的噬菌体。使用的磁珠是NeutrAvidin包被的珠子(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated,FGbeads NeutrAvidin)或链霉亲和素包被的珠子(Dynabeads M-280Streptavidin)。能够通过前面部分中所描述的噬菌体ELISA，从回收的噬菌体中选择抗原结合克隆，或者将抗体基因亚克隆到用于在动物中表达的载体中，并使用动物细胞表达，并且比较蛋白酶处理之前和之后的结合活性，以选择结合克隆。
实施例8含有具有抗原结合结构域的重链和轻链的文库，以及利用方法从该文库 中获得重链，所述重链的抗原结合能力是被轻链所控制的
如实施例3中所证实的，含有抗原结合结构域的重链的抗原结合能力是通过轻链的缔合而控制。因此，通过噬菌体展示方法，获得了重链，所述重链是当与轻链缔合时丧失其抗原结合能力，并且当单独存在或与轻链恒定区组合时表现出抗原结合能力的重链。
将含有诸如单结构域抗体的抗原结合结构域的重链掺入噬菌粒中，并通过噬菌体展示。构建含有不同类型抗原结合结构域的用于噬菌体展示的多个噬菌粒，然后从保留这些噬菌粒的大肠杆菌中产生噬菌体。在噬菌体制备之后，通过后向大肠杆菌的培养液中加入2.5M NaCl/10％PEG，来沉淀噬菌体群，然后用TBS稀释以获得噬菌体文库溶液。将BSA添加到噬菌体文库溶液中，以达到4％的最终BSA浓度。
通过从由此制备的噬菌体文库中淘选来获得如下重链：当单独存在或与轻链恒定区组合时表现出抗原结合能力，并且当与轻链可变区缔合时丧失其抗原结合能力。可参考实施例5中描述的使用固定在磁珠上的抗原的淘选方法进行淘选。从展示重链或具有轻链恒定区的重链的噬菌体文库中，回收固定有抗原的磁珠相结合的噬菌体。使回收的噬菌体感染大肠杆菌，并使用表达轻链的辅助噬菌体产生展示重链和轻链的噬菌体。在噬菌体制备之后，通过上述方法从大肠杆菌的培养液中，获得展示含有抗原结合结构域的重链和轻链的噬菌体。从展示重链和轻链的噬菌体群体中回收未与固定有抗原的磁珠相结合的噬菌体。
如图9D所示，能够通过改变以下的顺序来进行淘选：回收展示重链的与固定有抗原的磁珠相结合的噬菌体群，所述重链为单独的或与轻链恒定区组合的，以及回收展示重链和轻链但不与固定有抗原的磁珠相结合的噬菌体群。除了使用辅助噬菌体表达轻链的方法之外，编码轻链的区域和编码重链的区域可如通常一样掺入相同的噬菌粒，并且仅编码轻链恒定区或全长轻链的基因可掺入每个淘选循环中并使用。
能够通过前面部分中描述的噬菌体ELISA，从回收的噬菌体中选择抗原结合克隆，或者将抗体基因亚克隆到用于在动物中表达的载体中，并使用动物细胞表达，并且比较蛋白酶处理之前和之后的结合活性，以选择结合克隆。
实施例9通过噬菌体展示法，获得其抗原结合能力被轻链控制的VHH，以及制备含 有该VHH的IgG抗体样分子
在实施例3中证实了，作为重链中VH的替代物而含有的VHH的抗原结合能力通过与轻链缔合而控制。因此，从展示与来自免疫羊驼PBMC的VHH连接的CH1的噬菌体文库中获得如下VHH：所述VHH在与特定轻链缔合时丧失其抗原结合能力，并且当重链单独存在或与轻链恒定区组合时，即当不与轻链可变区缔合时，表现出抗原结合能力。制备含有该VHH的IgG抗体样分子。
9-1构建表达轻链的辅助噬菌体，其具有整合的轻链表达单元
在国际公开No.WO2015/046554中描述的方法的基础上，将启动子、信号序列、抗体轻链可变区和轻链恒定区基因或轻链恒定区基因等整合到辅助噬菌体的基因组中，以构建表达轻链的辅助噬菌体。用该辅助噬菌体感染的大肠杆菌能够表达抗体轻链可变区和轻链恒定区，或仅表达轻链恒定区。
具体地，从通过国际公开No.WO2015/046554中描述的方法所构建的辅助噬菌体M13KO7TC中提取基因组，并将轻链表达单元引入基因组。将编码轻链可变区和轻链恒定区的基因(VK1-39-k0MTdC；SEQ ID NO:152)，或编码轻链恒定区的基因(k0MTdC；SEQ ID NO:153)用作即将被引入的轻链基因。通过上述方法，将lac启动子-pelB信号序列-轻链基因插入到M13KO7TC/SacI中，并通过电穿孔法转染到大肠杆菌系ER2738中。
培养获得的大肠杆菌，并向培养上清液中加入2.5M NaCl/10％PEG以通过PEG沉淀法纯化辅助噬菌体。通过一般噬斑形成方法，证实获得的辅助噬菌体M13KO7TC-Vk1-39-k0MTdC和M13KO7TC-k0MTdC的滴度。
9-2制备含有多个VHH-CH1分子的文库
通过本领域技术人员已知的方法，使用4种类型的免疫原免疫羊驼：人IL6R细胞外结构域、人CD3εγ异源二聚体、猴CD3εγ异源二聚体和人丛状蛋白A1的细胞结构域。4周后，收集PBMC。参考Journal of Molecular Biology(2000)302:899-916制备CD3εγ异源二聚体。从收集的PBMC中参照J.Immunol.Methods(2007)324,13中描述的方法扩增VHH基因。将扩增的VHH基因片段与CH1-基因连接，并插入噬菌粒载体中，以制备含有多个含有与CH1连接的VHH的VHH-CH1分子的文库。
9-3制备展示VHH-CH1/全长轻链或VHH-CH1/轻链恒定区的噬菌体群的方法
将具有编码VHH-CH1的基因插入物的噬菌粒载体通过电穿孔方法转染到大肠杆菌中。可以培养所获得的大肠杆菌并通过实施例9-1中制备的辅助噬菌体M13KO7TC-Vk1-39-k0MTdC将其感染，以便从噬菌粒载体表达的VHH-CH1和从辅助噬菌体表达的全长轻链形成Fab结构，以制备在含有编码VHH-CH1的基因的噬菌粒表面上展示VHH-CH1/全长轻链(VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC)的噬菌体群。另外，可以培养含有编码VHH-CH1基因插入物的噬菌粒载体的大肠杆菌并通过实施例9-1中制备的辅助噬菌体M13KO7TC-k0MTdC将其感染，以便从噬菌粒载体表达的VHH-CH1和由辅助噬菌体表达的轻链恒定区形成VHH-CH1和CL相缔合的结构，以制备展示VHH-CH1/轻链恒定区(VHH-CH1/k0MTdC)的噬菌体群。可将2.5M NaCl/10％PEG加入培养上清液中以通过PEG沉淀法纯化噬菌体。所得噬菌体的滴度能够通过一般噬斑形成方法证实。
9-4从VHH-CH1噬菌体文库中，获得含有丛状蛋白A1 VHH的VHH-CH1，其抗原结合通 过与轻链可变区缔合而被抑制，并且在不存在轻链可变区的情况下显示出抗原结合能力
通过从实施例9-2中制备的VHH-CH1文库淘选，获得了含有VHH的VHH-CH1，其抗原结合通过与轻链可变区缔合而抑制，并且在不存在轻链可变区的情况下显示出抗原结合能力。
所使用的抗原是参考实施例中制备的生物素标记的人丛状蛋白A1。
淘选方法根据以下步骤进行：
(1)通过实施例9-3的方法，从实施例9-2中制备的VHH-CH1噬菌体文库中，制备展示VHH-CH1/轻链恒定区(VHH-CH1/k0MTdC)的噬菌体群，并从该噬菌体群中回收与固定有抗原的磁珠相结合的噬菌体。
(2)通过实施例9-3的方法，从回收的噬菌体中制备展示VHH-CH1/全长轻链(VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC)的噬菌体群，并从该噬菌体群中回收未与固定有抗原的磁珠相结合的噬菌体。
(3)将回收的噬菌体重复进行步骤(1)和(2)，以回收所需的噬菌体。
作为淘选的结果，能够选择多个VHH-CH1分子，其对丛状蛋白A1的结合通过与轻链Vk1-39-k0MTdC的缔合而被抑制，并且在没有轻链可变区的情况下，表现出对丛状蛋白A1的结合能力。
根据以下步骤进行另一种淘选方法：
(1)通过实施例9-3的方法，从实施例9-2中制备的VHH-CH1噬菌体文库中，制备展示VHH-CH1/轻链恒定区(VHH-CH1/k0MTdC)的噬菌体群，并从该噬菌体群中回收与固定有抗原的磁珠相结合的噬菌体。
(2)通过实施例9-3的方法，从回收的噬菌体中制备展示VHH-CH1/全长轻链(VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC)的噬菌体群体，并从该噬菌体群中回收未与固定有抗原的磁珠相结合的噬菌体。从回收的噬菌体中，进一步回收与固定有抗-轻链抗体(EY Laboratories,Inc.,Cat.BAT-2107-2)的磁珠相结合的噬菌体。
(3)将回收的噬菌体重复进行步骤(1)和(2)，以回收所需的噬菌体。
作为淘选的结果，能够选择多个VHH-CH1分子，其对丛状蛋白A1的结合能够通过与轻链Vk1-39-k0MTdC的缔合而被抑制，并且在没有轻链可变区的情况下，表现出对丛状蛋白A1的结合能力。
通过淘选由此选择的VHH-CH1中的VHH可用于制备IgG抗体样分子。
9-5制备蛋白酶活化的IgG抗体样分子，所述分子具有与plexin A1结合的掺入VHH
通过实施例3中描述的方法,将编码实施例9-4中选择的每个VHH-CH1分子中包含的VHH的核苷酸序列，连接到编码蛋白酶切割位点和重链恒定区的核苷酸序列上。所得物被用作IgG抗体样分子的重链，并与全长轻链VK1-39-k0MT(SEQ ID NO:3)组合。通过本领域技术人员已知的方法，使用FreeStyle 293细胞(Invitrogen Corp.)，通过瞬时表达来表达IgG抗体样分子，并通过本领域技术人员已知的方法使用蛋白A将其进行纯化。
所制备的IgG抗体样分子如表3所示。
[表3]
含有与人丛状蛋白A1结合的VHH的IgG抗体样分子
9-6通过蛋白酶切割，将蛋白酶活化的IgG抗体样分子激活
以与实施例3相同的方式，用蛋白酶切割实施例9-4中制备的IgG抗体样分子，并通过还原SDS-PAGE评价切割程度。结果显示在图22中。蛋白酶浓度设定至25nM。
结果，制备的IgG抗体样分子各自被证实在蛋白酶切割序列处经历蛋白酶切割。
接下来，以与实施例3相同的方式，将通过蛋白酶处理所释放的VHH与人丛状蛋白A1的结合进行评价。Octet传感图显示在图23中。
结果，在蛋白酶处理前，每一个制备的IgG抗体样分子都没有表现出抗原结合，而在蛋白酶处理后，证实了所释放的VHH的抗原结合。
实施例10含有双特异性VHH-VHH的多肽
10-1与癌抗原和CD3结合的双特异性VHH-VHH，以及含有双特异性VHH-VHH的多肽 的制备
如图8所示，蛋白酶活化的抗原结合结构域可以与第二抗原结合结构域形成双特异性抗原结合分子。
经由由甘氨酸和丝氨酸构成的接头，将识别人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的VHH HN3(SEQ ID NO:159)和识别CD3的VHH G03(SEQ ID NO:160)相连接，以制备双特异性VHH-VHHHN3G03。SEQ ID NO:161中所示的抗体重链恒定区经由蛋白酶切割序列进一步连接至其上，并将得到的含有双特异性VHH-VHH的重链HN3G03-cF760mnHIF(SEQ ID NO:162)插入到用于在动物中表达的载体中。
经由由甘氨酸和丝氨酸构成的接头，将识别Her2的VHH HerF07(SEQ ID NO:163)和识别CD3的VHH G03(SEQ ID NO:160)相连接，以制备双特异性VHH-VHH HerF07G03。经由蛋白酶切割序列，进一步连接SEQ ID NO:161中所示的抗体重链恒定区，并将得到的含有双特异性VHH-VHH的重链HerF07G03-cF760mnHIF(SEQ ID NO:164)插入到用于在动物中表达的载体中。
用含有双特异性VHH-VHH的各个重链和用于在动物中表达的载体共转染Expi293细胞(Life Technologies Corp.)，所述载体自铰链区到C末端分别具有轻链VK1.39-k0MT(SEQ ID NO:3)和人恒定区序列VHn-Kn010dGK(SEQ ID NO:166)的插入物，以表达含有双特异性VHH-VHH的多肽。然后，使用MonoSpin ProA 96孔板型(GL Sciences Inc.,Cat No.:7510-11312)，通过本领域技术人员已知的方法，纯化含有双特异性VHH-VHH的多肽。含有双特异性VHH-VHH HN3G03的多肽是HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT，含有双特异性VHH-VHH HerF07G03的多肽是HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT。
对于蛋白酶处理，将uPA(重组人u-纤溶酶原激活剂，R&D Systems,Inc.)(终浓度：25nM)加入到40μg含有双特异性VHH-VHH的各个纯化多肽中，并在37℃下温育20小时或更长时间。在加入与蛋白酶中相同量的PBS以代替蛋白酶后，温育未经蛋白酶处理的样品。通过还原SDS-PAGE证实了含有双特异性VHH-VHH的蛋白酶切割的多肽是否如期经历了切割。结果显示在图24中。如图24所示，表明双特异性VHH-VHH通过蛋白酶切割从整个分子中分离。
10-2通过蛋白酶切割的含有针对GPC3和CD3的双特异性VHH-VHH的多肽的CD3活化 评价
使用Jurkat-NFAT报告细胞(NFAT luc2_jurkat细胞)评价针对CD3的激动剂活性。Jurkat-NFAT报告细胞是表达CD3的人急性T细胞白血病衍生细胞的细胞系，其与NFAT反应元件和荧光素酶(luc2P)融合，并通过激活CD3下游的信号表达荧光素酶。用于基于GPC3的抗体的靶细胞是通过迫使人肝癌来源的细胞系SK-HEP-1表达人GPC3而建立的SK-pca60细胞。将靶细胞和效应细胞分别以1.25E+04细胞/孔和7.50E+04细胞/孔加入到白底96孔测定板(Costar，3917)的每个孔中。将具有或不具有蛋白酶处理的HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT以1、10或100nM的终浓度添加至孔中。在5％CO2存在下，于37℃温育24小时后，根据所附方案，使用Bio-Glo荧光素酶测定系统(Promega Corp.，G7940)，测量荧光素酶活性作为发光强度。2104EnVision用于检测。结果显示在图25中。在未经蛋白酶处理的样品中没有观察到荧光素酶活性的升高，而在用蛋白酶处理的HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT中观察到荧光素酶活性的升高。具体地，用蛋白酶处理的HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT能够被证实具有针对CD3的激动剂活性，而针对GPC3和CD3的双特异性VHH-VHH通过蛋白酶切割从HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT中释放，并发挥在未切割时被抑制的CD3结合活性。
10-3通过蛋白酶切割的对含有针对Her2和CD3的双特异性VHH-VHH的多肽的CD3活 化评价
使用Jurkat-NFAT报告细胞(NFAT luc2_jurkat细胞)评价针对CD3的激动剂活性。Jurkat-NFAT报告细胞(效应细胞)是表达CD3的人急性T细胞白血病衍生细胞的细胞系，其与NFAT反应元件和荧光素酶(luc2P)融合，并通过激活CD3下游的信号表达荧光素酶。使用的靶细胞是LS1034细胞系。将靶细胞和效应细胞分别以2.50E+04细胞/孔和7.50E+04细胞/孔加入到白底96孔测定板(Costar，3917)的每个孔中。将具有或不具有蛋白酶处理的HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT以0.01、0.1和1nM的终浓度添加至孔中。在5％CO 2存在下，于37℃温育24小时后，根据所附方案，使用Bio-Glo荧光素酶测定系统(Promega Corp.，G7940)，测量荧光素酶活性作为发光强度。2104EnVision用于检测。结果显示在图26中。未经蛋白酶处理的样品中没有观察到荧光素酶活性的升高，而在用蛋白酶处理的HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT中显示荧光素酶活性的升高。具体地，用蛋白酶处理的HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010ddKK/VK1.39-k0MT能够被证实具有针对CD3的激动剂活性，而针对Her2和CD3的双特异性VHH-VHH通过蛋白酶切割从HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT中释放，并发挥在未切割时被抑制的CD3结合活性。
实施例11将蛋白酶切割位点引入到具有掺入VHH的多肽中
11-1将蛋白酶切割序列引入到多肽中，其中所述多肽具有与IL6R结合的掺入VHH
通过本领域技术人员已知的方法来制备表达载体，其中所述表达载体编码含有IL6R90(SEQ ID NO:1)的IL6R90-G1T4(SEQ ID NO:167)，如国际公开No.WO2010/115998中所述的具有针对人IL6R的结合和中和活性的VHH，其与人IgG1恒定区相融合(CH1-铰链-CH2-CH3)。IgG抗体样分子IL6R90-G1T4/VK1-39-k0MT(重链：SEQ ID NO:167，轻链：SEQ IDNO:3)通过本领域技术人员已知的方法，使用FreeStyle 293细胞(Invitrogen Corp.)或Expi293细胞(Life Technologies Corp.)，通过瞬时表达来表达，并通过本领域技术人员已知的方法使用蛋白A纯化。
将SEQ ID NO:178中所示的蛋白酶切割序列插入到IL6R90-G1T4/VK1-39-k0MT的重链中VHH和CH1之间的边界附近，以制备包含蛋白酶切割序列的含VHH的重链IL6R90.12aa-G1T4(SEQ ID NO:189)。通过本领域技术人员已知的方法制备IL6R90.12aa-G1T4表达载体。
将IL6R90.12aa-G1T4与SEQ ID NO:3中所示的轻链组合。在VHH和CH1之间的边界附近具有蛋白酶切割序列的IgG1抗体样分子IL6R90.12aa-G1T4/VK1-39-k0MT通过本领域技术人员已知的方法，使用FreeStyle 293细胞(Invitrogen Corp.)或Expi293细胞(LifeTechnologies Corp.)，通过瞬时表达来表达，并通过本领域技术人员已知的方法使用蛋白A纯化。
11-2 IgG抗体样分子的蛋白酶切割评价，其中所述IgG抗体样分子含有抗人IL6R VHH，并在其重链区域含有蛋白酶切割序列
验证实施例11-1中所制备的IgG抗体样分子是否会被蛋白酶切割。使用重组人Matriptase/ST14催化结构域(MT-SP1)(R&D Systems，Inc.，3946-SE-010)作为蛋白酶。将10nM蛋白酶和50μg/mL抗体在PBS中在37℃的条件下反应20小时。然后，通过还原SDS-PAGE评价蛋白酶的切割。结果显示在图27中。结果，IgG抗体样分子IL6R90.12aa的蛋白酶处理产生了在37kDa附近的新条带。因此，证实了IgG抗体样分子在插入VHH和CH1之间的边界附近的蛋白酶切割序列(SEQ ID NO:178)处经历蛋白酶切割。此外，还证实当通过类似方法掺入IgG抗体中时由SEQ ID NO:178表示的蛋白酶切割序列被人uPA和小鼠uPA切割。
实施例12通过IgG抗体样分子的蛋白酶切割来评价活化程度，其中所述IgG抗体样 分子在其轻链中具有蛋白酶切割序列
通过本领域技术人员已知的方法制备表达载体，其中所述表达载体编码含有IL6R75(SEQ ID NO:190)的IL6R75-G1m(SEQ ID NO:191)，如国际公开No.WO2010/115998中所述的具有针对人IL6R的结合和中和活性的VHH，其与人IgG1恒定区相融合(CH1-铰链-CH2-CH3)。通过将氨基酸改变引入到VHH和VL之间的界面位置，以与实施例4-2中相同的方式来制备IL6R75hu-G1m(SEQ ID NO:192)。以与实施例3相同的方式，使用掺入蛋白酶切割序列的轻链VK1-39P+4-Pk0MT(SEQ ID NO:72)，以及作为重链的IL6R90-G1m(SEQ ID NO:2)、20A11hu-G1m(SEQ ID NO:39)和IL6R75hu-G1m(SEQ ID NO:192)，来表达和纯化IgG抗体样分子IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT(重链：SEQ ID NO:2，轻链：SEQ ID NO:72)、20A11hu-G1m/K1-39P+4-Pk0MT(重链：SEQ ID NO:39，轻链：SEQ ID NO:72)和IL6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT(重链：SEQ ID NO:192，轻链：SEQ ID NO:72)。
以与实施例3相同的方式，用蛋白酶切割IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT、20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT和IL6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT，并且评价切割程度。结果显示在图28中。具体地，将重组人Matriptase/ST14催化结构域(R&D Systems，Inc.，3946-SE-010)用作蛋白酶。将50nM蛋白酶和50μg/mL的每种IgG抗体样分子在PBS中在37℃的条件下反应20小时。然后，通过还原SDS-PAGE评价蛋白酶的切割。结果，证实了IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT、20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT和IL6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT在VL和CL之间的边界附近经历蛋白酶切割。
接下来，通过ELISA评价通过蛋白酶处理暴露的VHH的IL6R结合。具体地，将实施例3中使用的hsIL-6R-BAP1固定在链霉亲和素包被的384孔板(Greiner Bio-One GmbH，781990)上，并在室温下将各个裂解的IgG抗体样分子结合其上。反应30分钟后，使HRP标记的抗人IgG抗体(Sigma-Aldrich Co.LLC，SAB3701362-2MG)在室温下在其上作用10分钟，并使TMB Chromogen Solution(Life Technologies Corp.，002023)与之反应。在室温下反应30分钟后，用硫酸终止反应，然后使用Synergy HTX多模式读取机(BioTek Instruments，Inc。)在450nM处测量吸光度。计算抗原固定化孔与未固定化孔的吸光度比，并将其用作S/N比。针对横坐标上的各个IgG抗体样分子的浓度，在纵坐标上绘制了ELISA的S/N比(平均值)。结果如图29所示。这些结果表明，相比于未经蛋白酶处理的IgG抗体样分子，在其轻链中包含切割序列的经蛋白酶处理的IgG抗体样分子20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT，具有10倍或更多倍的IL6R结合活性，且相比于未经蛋白酶处理的分子，经蛋白酶处理的IgG抗体样分子IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT具有1000倍以上的IL6R结合活性。
实施例13包含多种蛋白酶切割序列的IgG抗体样分子的制备和评价
13-1制备含有多种蛋白酶切割序列的多肽
使用除尿激酶或matriptase之外的蛋白酶识别序列以与实施例3相同的方式来制备IgG抗体样分子。将已知被MMP-2、MMP-7、MMP-9或MMP-13切割的各种肽序列，分别插入到IL6R90-G1m的可变区和恒定区之间的边界附近，并且将含有由甘氨酸-丝氨酸聚合物组成的柔性接头的肽序列插入到这些切割序列的附近。插入的序列如表4所示.
[表4]
各种插入的序列
如此设计重链：将这些序列插入IL6R90-G1m的可变区和恒定区之间的边界附近。通过本领域技术人员已知的方法，来制备编码重链变体6R90EIVHEMP2.1-6R90EICHEMP2.1G1m(SEQ ID NO:165)、6R90EIVHEMP2.2-6R90EICHEMP2.2G1m(SEQ ID NO:202)、6R90EIVHEMP2.3-6R90EICHEMP2.3G1m(SEQ ID NO:203)、6R90EIVHEMP2.4-6R90EICHEMP2.4G1m(SEQ ID NO:204)、6R90EIVHEMP7.1-6R90EICHEMP7.1G1m(SEQ ID NO:205)、6R90EIVHEMP7.2-6R90EICHEMP7.2G1m(SEQ ID NO:206)、6R90EIVHEMP13-6R90EICHEMP13G1m(SEQ ID NO:207)、6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m(SEQ ID NO:196)、6R90EIVHEG4SMP2.2G4S-6R90EIVHEG4SMP2.2G4SG1m(SEQ ID NO:197)和6R90EIVHEG4SMP9G4S-6R90EIVHEG4SMP9G4SG1m(SEQ ID NO:198)的表达载体。
表5显示了IgG抗体样分子，其将这些重链变体与轻链组合并且在重链的可变区和恒定区之间的边界附近含有蛋白酶切割序列。这些IgG抗体样分子通过本领域技术人员已知的方法，使用FreeStyle 293细胞(Invitrogen Corp.)或Expi293细胞(LifeTechnologies Corp.)，通过瞬时表达来表达，并通过本领域技术人员已知的方法使用蛋白A纯化。
[表5]
IgG抗体样分子
13-2含有多种蛋白酶切割序列的IgG抗体样分子的蛋白酶切割评价
验证实施例13-1中制备的IgG抗体样分子是否会被蛋白酶切割。将重组人MMP-2(R&D Systems，Inc.，902-MP-010)、重组人MMP-7(R&D Systems，Inc.，907-MP-010)、重组人MMP-9(R&D Systems，Inc.，911-MP-010)或重组人MMP-13(R&D Systems，Inc.，511-MM-010)作为蛋白酶。mmP-2、MMP-7、MMP-9和MMP-13在各自与1MMP-氨基苯基汞乙酸盐(APMA；AbcamPLC，ab112146)混合后使用，并在37℃下活化1或24小时。50nM、100nM或500nM蛋白酶和50μg/mL或100μg/mL的各个IgG抗体样分子在PBS或20mm Tris-HCl、150mm NaCl和5mm CaCl2(pH7.2)(以下称为Tris)中反应，在37℃的条件下保持20小时。然后，通过还原SDS-PAGE评价蛋白酶的切割。结果显示在图30A和30B中。在图30B中，使用测定缓冲液(MMP活性测定试剂盒(Fluorometric-Green)(ab112146)，组分C：测定缓冲液)进行蛋白酶切割。
结果，证实了6R90EIVHEMP2.1-6R90EICHEMP2.1G1m/VK1-39-k0MT、6R90EIVHEMP2.2-6R90EICHEMP2.2G1m/VK1-39-k0MT、6R90EIVHEMP2.3-6R90EICHEMP2.3G1m/VK1-39-k0MT、6R90EIVHEMP2.4-6R90EICHEMP2.4G1m/VK1-39-k0MT、6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m/VK1-39-k0MT和6R90EIVHEG4SMP2.2G4S-6R90EICHEG4SMP2.2G4SG1m/VK1-39-k0MT被MMP-2切割。证实了6R90EIVHEMP7.1-6R90EICHEMP7.1G1m/VK1-39-k0MT和6R90EIVHEMP7.2-6R90EICHEMP7.2G1m/VK1-39-k0MT被MMP-7切割。证实了6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m/VK1-39-k0MT和6R90EIVHEG4SMP9G4S-6R90EICHEG4SMP9G4SG1m/VK1-39-k0MT被MMP-9切割。证实了6R90EIVHEMP13-6R90EICHEMP13G1m/VK1-39-k0MT被MMP-13切割。
参考实施例1生物素化的丛状蛋白A1的制备
通过本领域技术人员已知的方法制备生物素化的丛状蛋白A1(也称为生物素标记的人丛状蛋白A1)。具体地，通过编码由甘氨酸和丝氨酸构成的接头的基因片段，将编码待通过生物素连接酶生物素化的特定序列(AviTag序列；SEQ ID NO:36)的基因片段和编码FLAG标签序列的基因片段(SEQ ID NO:199；DYKDDDDK)连接到编码丛状蛋白A1细胞外区域的基因片段的下游。将编码含有与AviTag序列和FLAG标签序列连接的丛状蛋白A1的蛋白质(SEQ ID NO:200)的基因片段整合到用于在动物细胞中表达的载体中。使用293Fectin(Invitrogen Corp.)将构建的质粒载体转染到FreeStyle 293细胞(Invitrogen Corp.)中。在该操作中，细胞用EBNA1(SEQ ID NO:57)表达基因和生物素连接酶基因(BirA；SEQ IDNO:58)表达基因共转染，并且为了生物素标记丛状蛋白A1的目的而进一步加入生物素。将根据上述方法转染的细胞在37℃，8％CO2下培养，并使目的蛋白质(生物素化的丛状蛋白A1)分泌到培养上清液中。将该细胞培养液用0.22μm的瓶顶过滤器过滤以得到培养上清液。
用抗FLAG M2琼脂糖(Sigma-Aldrich Co.LLC，#A2220)填充柱以制备FLAG柱。用D-PBS(-)预先平衡FLAG柱。向其施加培养上清液，以将生物素化的丛状蛋白A1结合到柱上。随后，使用溶解在D-PBS(-)中的FLAG肽洗脱生物素化的丛状蛋白A1。通过凝胶过滤色谱法使用HiLoad26/600Superdex 200pg，320mL(GE Healthcare Japan Corp.，28-9893-36)从该洗脱液中除去聚集物，以获得纯化的生物素化的丛状蛋白A1。
参考实际的实施例和示例性实施例，详细描述了上述本发明的实施方案，其目的是帮助清楚理解。然而，本说明书中的描述和示例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利文献和科学文献的公开内容通过引用整体明确地并入本文。
工业性应用
本发明的多肽包含抗原结合结构域和运送部分，其具有比抗原结合结构域更长的在血液中的半衰期，并具有抑制抗原结合结构域的结合活性的抑制结构域，包含该多肽的药物组合物可以在血液中运输抗原结合结构域，同时抑制抗原结合结构域的抗原结合活性。而且，使用本发明的多肽可以使抗原结合结构域特异性地在疾病部位发挥其抗原结合活性。此外，由于抗原结合结构域在发挥其抗原结合活性时具有比在运输时更短的半衰期，因此降低了全身作用的风险。因此，本发明的多肽和药物组合物在治疗疾病中非常有用。
通过与特定VL、VH或VHH缔合而抑制其抗原结合活性的单结构域抗体，可以作为抗原结合结构域的一个示例进行筛选或制备，从而有效地制备本发明的多肽。此外，作为可用于本发明多肽中的抗原结合结构域的一个示例，当通过使用包含单结构域抗体的文库制备本发明的多肽时，可以有效地获得必需的抗原结合结构域，所述单结构域抗体的抗原结合活性通过与特定的VL、VH或VHH缔合而被抑制。

Claims (20)

1.一种筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VL缔合，与特定VH缔合或与特定VHH缔合而被抑制。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VL缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
(a)获得具有靶抗原结合活性的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体与特定VL缔合；
(c)证实步骤(b)中与特定VL缔合的单结构域抗体对抗原的结合活性与缔合前相比减弱或丧失。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VH缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
(a)获得具有靶抗原结合活性的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体与特定VH相缔合；
(c)证实步骤(b)中与特定VH缔合的单结构域抗体对抗原的结合活性与缔合前相比减弱或丧失。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VHH结合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
(a)获得具有靶抗原结合活性的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体与特定VHH缔合；
(c)证实步骤(b)中与特定VHH缔合的单结构域抗体对抗原的结合活性与缔合前相比减弱或丧失。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VL缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
(a)获得具有靶抗原结合活性的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体与特定VL缔合；
(c)基于步骤(b)中与特定VL缔合的单结构域抗体针对抗原没有结合活性或具有预定值或更低的结合活性，选择VL和单结构域抗体的缔合物；和
(d)证实步骤(c)中选择的缔合物中的单结构域抗体在不与特定VL缔合的状态下比在与其缔合的状态下对抗原具有更强的结合活性。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VH缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
(a)获得具有靶抗原结合活性的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体与特定VH缔合；
(c)基于步骤(b)中与特定VH缔合的单结构域抗体针对抗原没有结合活性或具有预定值或更低的结合活性，选择VH和单结构域抗体的缔合物；和
(d)证实步骤(c)中选择的缔合物中的单结构域抗体在不与特定VH缔合的状态下比在与其缔合的状态下对抗原具有更强的结合活性。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VHH结合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
(a)获得具有靶抗原结合活性的单结构域抗体；
(b)将步骤(a)中获得的单结构域抗体与特定VHH缔合；
(c)基于步骤(b)中与特定VHH缔合的单结构域抗体针对抗原没有结合活性或具有预定值或更低的结合活性，选择VHH和单结构域抗体的缔合物；和
(d)证实步骤(c)中选择的缔合物中的单结构域抗体在不与特定VHH缔合的状态下比在与其缔合的状态下对抗原具有更强的结合活性。
8.制备单结构域抗体的方法，其中所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VL缔合，与特定VH缔合或与特定VHH缔合而被抑制。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，其中所述方法是用于制备单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定的VL缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
(a)获得具有靶抗原结合活性的单结构域抗体；
(b)选择步骤(a)中获得的单结构域抗体中涉及单结构域抗体与特定VL缔合的氨基酸残基，并置换所选择的氨基酸残基，以制备保留单结构域抗体对靶抗原的结合活性的单结构域抗体变体；
(c)将步骤(b)中制备的单结构域抗体变体与特定VL缔合；和
(d)证实与特定VL缔合的单结构域抗体变体的抗原结合活性与缔合前相比减弱或丧失。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法是制备单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定的VH缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
(a)获得具有靶抗原结合活性的单结构域抗体；
(b)选择步骤(a)中获得的单结构域抗体中涉及单结构域抗体与特定VH缔合的氨基酸残基，并置换所选择的氨基酸残基，以制备保留单结构域抗体对靶抗原的结合活性的单结构域抗体变体；
(c)将步骤(b)中制备的单结构域抗体变体与特定VH缔合；和
(d)证实与特定VH缔合的单结构域抗体变体的抗原结合活性与缔合前相比减弱或丧失。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，其中所述方法是用于制备单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定的VHH缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
(a)获得具有靶抗原结合活性的单结构域抗体；
(b)选择步骤(a)中获得的单结构域抗体中涉及单结构域抗体与特定VHH缔合的氨基酸残基，并置换所选择的氨基酸残基，以制备保留单结构域抗体对靶抗原的结合活性的单结构域抗体变体，
(c)将步骤(b)中制备的单结构域抗体变体与特定VHH缔合；和
(d)证实与特定VHH缔合的单结构域抗体变体的抗原结合活性与缔合前相比减弱或丧失。
12.包含多个融合多肽的文库，其中每个融合多肽包含连接至第一缔合维持结构域的单结构域抗体，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VL、或特定VH、或特定VHH缔合而被抑制。
13.用于针对融合多肽筛选根据权利要求12所述的文库的方法，所述融合多肽包含其抗原结合活性能够通过与特定VL缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体，其抗原结合活性能够通过与特定VH缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体，或其抗原结合活性能够通过与特定VHH缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体。
14.包含抗原结合结构域和运送部分的多肽，所述运送部分具有抑制抗原结合结构域的抗原结合活性的抑制结构域，并且所述抗原结合结构域比运送部分具有更短的在血液中的半衰期。
15.药物组合物，其包含权利要求14所述的多肽。
16.生产权利要求14所述的多肽的方法。
17.多核苷酸，其编码权利要求14所述的多肽。
18.载体，其包含权利要求17所述的多核苷酸。
19.宿主细胞，其包含权利要求17所述的多核苷酸或权利要求18所述的载体。
20.生产权利要求14所述的多肽的方法，其包括培养权利要求19所述的宿主细胞的步骤。
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