JP2023510994A - リガンド結合融合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

本発明の目的は、サイトカインまたはケモカイン等のそのリガンド部分を標的組織において選択的に活性化することができる融合タンパク質を提供することである。本発明は、サイトカインまたはケモカイン等のリガンド部分に結合するが、プロテアーゼの存在下でリガンド部分を遊離させることができるリガンド結合部分に、ペプチドリンカーを介して接続されたリガンド部分を含む、融合タンパク質を提供する。本発明はまた、それらの製造方法、それらの使用、およびそのような融合タンパク質を含有する医薬組成物も提供する。本発明はまた、そのような融合タンパク質の改善された改変体にも関する。さらに、いくつかのサイトカインについて、改変体のインビトロ活性を評価した。

Description

本発明は、リガンド部分が、該リガンド部分に結合するリガンド結合部分にペプチドリンカーを介して接続されている、融合タンパク質に関する。本発明はまた、それらの製造方法、それらの使用、およびそのような融合タンパク質を含む医薬組成物にも関する。
抗体は、血漿中での安定性が高く、副作用も少ないことから、医薬品として注目されている。それらの中で、IgG型の抗体医薬は多数上市されており、現在も数多くの抗体医薬が開発されている（非特許文献1および2）。
抗体医薬を用いた癌治療薬としてこれまで、CD20に対するリツキサン、EGFRに対するセツキシマブ、HER2に対するハーセプチン等が承認されている（非特許文献3）。これらの抗体分子は、癌細胞上に発現しているその抗原に結合し、それによりADCCやシグナル阻害等によって癌細胞に対する細胞傷害活性を発揮する。
癌細胞上に高発現している癌抗原に結合する抗体分子と融合した、サイトカイン等の生理活性を有するリガンドを含有するイムノサイトカインによって、リガンドを固形癌に送達する方法もまた、知られている。イムノサイトカインによって固形癌に送達されたサイトカインは、免疫を活性化し、それにより抗腫瘍効果を発揮する。IL-2、IL-12、およびTNFを含むサイトカインは、強い毒性を有するため、これらのサイトカインの癌に対する局所作用について、抗体による癌への局所送達が、副作用を軽減しつつ、それらの効果を強めることが期待されている（非特許文献4、5、および6）。しかし、これらのサイトカインはすべて、例えば、全身投与では臨床で十分な効果を示さない；その治療ウィンドウ（therapeutic window）が狭い；および強い毒性のために全身投与ができない、という問題により、未だに医薬品として承認されていない。
これは主に、イムノサイトカインを含むサイトカインは、全身投与した場合に、全身に曝露され、したがって全身作用により毒性を発揮し得るため、または、サイトカインは、毒性を回避するために非常に低い用量でしか投与できないためである。癌抗原に結合する抗体と融合したIL-2を含有するイムノサイトカインと、癌抗原に結合しない抗体と融合したIL-2を含有するイムノサイトカインとの間で、抗腫瘍効果は変わらなかったこともまた報告されている（非特許文献7）。
上記の問題を回避する方法として、癌において高発現しているプロテアーゼにより切断されるリンカーを介して接続されたサイトカインとサイトカイン受容体とを含有する分子が報告されている。サイトカインは、リンカーを介して接続されたサイトカイン受容体によって阻害されているが、リンカーのプロテアーゼ切断によってサイトカイン受容体から自由になり、それにより活性型になる。例として、uPAにより切断されるリンカーを介して接続されたTNF-αとTNF-Rとを含有する分子（非特許文献8）が報告され、MMP-2により切断されるリンカーを介して接続されたIL-2とIL-2Rとを含有する分子（非特許文献9）が報告されている。しかし、これらの分子中のサイトカインは、リンカーの切断前であっても活性を有しており、リンカーの切断によっておよそ10倍しか活性が改善されない。一方で、MMPにより切断されるリンカーを介して、サイトカイン受容体の代わりに抗サイトカインscFvに接続されたサイトカインを含有する分子（非特許文献9および10）もまた報告されている。いくつかの他の文書（例えば、特許文献1～6）もまた、切断可能な一部分を含有する融合ポリペプチドに関する。
WO 2009/025846 WO 2011/123683 WO 2018/097307 WO 2019/107380 WO 2019/010219 WO 2019/010224
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本発明は、これらの情況に鑑みて行われている。本発明の目的は、サイトカインまたはケモカイン等のそのリガンド部分を標的組織において選択的に活性化することができる融合タンパク質、その製造方法、使用、および該融合タンパク質を含む医薬組成物を提供することである。
本発明者らは、目的を達成するために鋭意研究を行い、結果的に、リガンド部分（例えば、サイトカインまたはケモカイン）が、ペプチドリンカーを介してリガンド結合部分に接続されている融合タンパク質であって、該リガンド結合部分が、該リガンド部分に結合するが、プロテアーゼの存在下で該リガンド部分を遊離させることができる融合タンパク質を開発した。本発明者らはまた、そのような融合タンパク質または該融合タンパク質を含む医薬組成物が、リガンドを用いた疾患の治療に有用であることも見出し、かつまた、融合タンパク質または医薬組成物が、融合タンパク質を投与することを含む疾患の治療に有用であること；および融合タンパク質が、疾患の治療用の医薬品の製造に有用であることも見出した。本発明者らはまた、融合タンパク質を製造する方法も開発して、本発明を完成させた。本発明の融合タンパク質の分子形式は、より高い発現レベルおよびより高い活性を可能にし得る点で、先行技術分野において既知の他の分子形式を上回って有利である。
本発明は、これらの知見に基づくものであり、具体的には下記の例示的な態様を包含する。
［1］（a）リガンド結合ドメインと少なくとも1つの第1のプロテアーゼ切断サイトとを含む、リガンド結合部分；
（b）少なくとも1つのリガンド部分；および
（c）少なくとも1つのリガンド部分をリガンド結合部分のC末端領域に接続する、少なくとも1つのペプチドリンカー
を含む、融合タンパク質であって、
該リガンド結合ドメインが、該少なくとも1つのリガンド部分に結合し、かつプロテアーゼの存在下で該少なくとも1つのリガンド部分を遊離させることができる、
融合タンパク質。
［2］前記少なくとも1つのペプチドリンカーが、いかなるプロテアーゼ切断サイトも含まない、［1］の融合タンパク質。
［3］前記少なくとも1つのペプチドリンカーが、第2のプロテアーゼ切断サイトを含む、［1］の融合タンパク質。
［4］前記リガンド結合ドメインが、抗体可変領域を含む、［1］～［3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［5］前記リガンド結合ドメインが、互いに会合するVH領域およびVL領域を含む、［4］の融合タンパク質。
［6］前記リガンド結合部分が、CH1領域およびCL領域をさらに含む、［4］または［5］の融合タンパク質。
［7］前記少なくとも1つの第1のプロテアーゼ切断サイトのうちの少なくとも1つが、VHまたはVL領域とCH1またはCL領域との間の境界付近に位置している、［6］の融合タンパク質。
［8］前記リガンド結合部分が、Fc領域をさらに含む、［4］～［7］のいずれか1つの融合タンパク質。
［8-1］リンカーを含む定常領域を含む、［8］の融合タンパク質。
［8-2］配列番号：901（C1）の配列を含む定常領域を含む、［8-1］の融合タンパク質。
［8-3］配列番号：905（C2）または配列番号：932（C5）の配列を含む定常領域を含む、［8-1］の融合タンパク質。
［8-4］重鎖および軽鎖を含み、重鎖の220位のCys（C220）（EUナンバリング）と軽鎖の214位のCys（C214）（EUナンバリング）との間のジスルフィド結合形成が促進されるように、前記リンカーがヒンジ領域中に位置づけられている、［8-1］の融合タンパク質。
［8-5］前記ヒンジ領域が、216位（EUナンバリング）から以下のアミノ酸配列：EPKSCGGGGSGGGGSDKTHTCPPCP（配列番号：935）を含む、［8-4］の融合タンパク質。
［8-6］前記リガンド結合部分が、重鎖および軽鎖を含み、重鎖の220位（EUナンバリング）と軽鎖の214位（EUナンバリング）との間にいかなるジスルフィド結合も形成されないように、重鎖および軽鎖中のアミノ酸残基が改変されている、［8-1］の融合タンパク質。
［8-7］前記軽鎖がC214S（EUナンバリング）改変を含み、前記重鎖がC220S（EUナンバリング）改変を含む、［8-6］の融合タンパク質。
［8-8］配列番号：908（C3）の配列を含む定常領域を含む、［8-1］の融合タンパク質。
［8-9］前記リガンド結合部分が、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が、重鎖の131位（EUナンバリング）と軽鎖の214位（EUナンバリング）との間のジスルフィド結合形成を可能にするように改変されている、［8-1］の融合タンパク質。
［8-10］前記重鎖が、S131C（EUナンバリング）およびC220S（EUナンバリング）の改変を含む、［8-9］の融合タンパク質。
［8-11］配列番号：910（C4）の配列を含む定常領域を含む、［8-1］の融合タンパク質。
［9］前記リガンド結合部分が、全長抗体を含む、［8］の融合タンパク質。
［10］前記全長抗体が、IgG抗体である、［9］の融合タンパク質。
［11］前記少なくとも1つのリガンド部分が、2つのリガンド部分を含み、かつ前記少なくとも1つのペプチドリンカーが、2つのペプチドリンカーを含み、各リガンド部分が、各ペプチドリンカーを介してリガンド結合部分のC末端領域に接続されている、［9］または［10］の融合タンパク質。
［12］前記少なくとも1つのリガンド部分が、前記少なくとも1つのペプチドリンカーを介して、Fc領域のCH3領域の表面上に露出したアミノ酸残基に接続されている、［8］～［11］のいずれか1つの融合タンパク質。
［13］前記少なくとも1つのリガンド部分が、前記少なくとも1つのペプチドリンカーを介してリガンド結合部分のC末端アミノ酸残基に接続されている、［1］～［12］のいずれか1つの融合タンパク質。
［14］第3のプロテアーゼ切断サイトを含む切断可能リンカーをさらに含み、前記少なくとも1つのリガンド部分が、該切断可能リンカーを介してリガンド結合部分のN末端領域に接続されている、［1］～［13］のいずれか1つの融合タンパク質。
［15］第3のプロテアーゼ切断サイトを含む切断可能リンカーをさらに含み、前記少なくとも1つのリガンド部分が、該切断可能リンカーを介して、リガンド結合部分のN末端から1～230番目のアミノ酸残基のうちの1つに接続されている、［8］～［13］のいずれか1つの融合タンパク質。
［16］前記少なくとも1つのリガンド部分が、前記切断可能リンカーを介してリガンド結合部分のN末端アミノ酸残基に接続されている、［14］または［15］の融合タンパク質。
［17］前記少なくとも1つのリガンド部分が、生物活性を有し、リガンド部分に対するリガンド結合ドメインの結合が、該リガンド部分の生物活性を阻害する、［1］～［16］のいずれか1つの融合タンパク質。
［18］前記少なくとも1つのリガンド部分が、生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドを含む、［17］の融合タンパク質。
［19］前記少なくとも1つのリガンド部分が、サイトカインまたはケモカインを含む、［18］の融合タンパク質。
［20］前記少なくとも1つのリガンド部分が、CXCL10、IL-2、IL-12、IL-22、PD-1、またはIL-6Rからなる群より選択されるリガンドタンパク質またはポリペプチドを含む、［18］の融合タンパク質。
［21］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-12を含み、かつ前記融合タンパク質が、以下からなる群より選択される抗体重鎖および軽鎖を含む、［1］～［20］のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）配列番号：874のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：875のアミノ酸配列を含む重鎖；
（b）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：880のアミノ酸配列を含む重鎖；
（c）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：881のアミノ酸配列を含む重鎖；
（d）配列番号：874のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：884のアミノ酸配列を含む重鎖；
（e）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：885のアミノ酸配列を含む重鎖；
（f）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：886のアミノ酸配列を含む重鎖；
（g）配列番号：887のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：888のアミノ酸配列を含む重鎖；
（h）配列番号：890のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：891のアミノ酸配列を含む重鎖；
（i）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：904のアミノ酸配列を含む重鎖；
（j）配列番号：906のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：907のアミノ酸配列を含む重鎖；
（k）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：909のアミノ酸配列を含む重鎖；ならびに
（l）（a）～（k）に記載される抗体重鎖および抗体軽鎖と競合する、抗体重鎖および軽鎖。
［21-a］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-12を含み、かつ前記リガンド結合部分が、以下の（a）～（l）から選択されるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域、またはそれに対して機能的に等価の抗体可変領域のH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、［1］～［20］のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：875に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：874に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（b）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：880に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（c）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：881に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（d）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：884に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：874に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（e）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：885に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（f）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：886に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（g）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：888に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：887に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（h）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：891に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：890に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（i）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：904に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（j）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：907に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：906に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（k）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：909に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；ならびに
（l）（a）～（k）に記載される抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域と競合する抗体可変領域に含まれる、H鎖およびL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3。
［21-b］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-12を含み、かつ前記リガンド結合部分が、以下の（a）～（l）から選択される重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）の組み合わせのいずれか1つを含む、［1］～[20]のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）配列番号：875に含まれるVH；および配列番号：874に含まれるVL；
（b）配列番号：880に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；
（c）配列番号：881に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；
（d）配列番号：884に含まれるVH；および配列番号：874に含まれるVL；
（e）配列番号：885に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；
（f）配列番号：886に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；
（g）配列番号：888に含まれるVH；および配列番号：887に含まれるVL；
（h）配列番号：891に含まれるVH；および配列番号：890に含まれるVL；
（i）配列番号：904に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；
（j）配列番号：907に含まれるVH；および配列番号：906に含まれるVL；
（k）配列番号：909に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；ならびに
（l）（a）～（k）に記載されるVHおよびVLと競合する、VHおよびVL。
［21-c］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-12を含み、かつ前記融合タンパク質が、以下の（a）～（d）から選択される組み合わせのいずれか1つを含む、［1］～[20]のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）配列番号：876の配列を含む第1の軽鎖、配列番号：881の配列を含む第1の重鎖、配列番号：882の配列を含む第2の軽鎖、および配列番号：883の配列を含む第2の重鎖；
（b）配列番号：876の配列を含む第1の軽鎖、配列番号：886の配列を含む第1の重鎖、配列番号：882の配列を含む第2の軽鎖、および配列番号：883の配列を含む第2の重鎖；
（c）配列番号：887の配列を含む第1の軽鎖、配列番号：888の配列を含む第1の重鎖、配列番号：882の配列を含む第2の軽鎖、および配列番号：883の配列を含む第2の重鎖；ならびに
（d）配列番号：890の配列を含む第1の軽鎖、配列番号：891の配列を含む第1の重鎖、配列番号：882の配列を含む第2の軽鎖、および配列番号：883の配列を含む第2の重鎖。
［21-2］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-22を含み、かつ前記融合タンパク質が、以下からなる群より選択される抗体重鎖および軽鎖を含む、［1］～[20]のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）配列番号：912のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：913のアミノ酸配列を含む重鎖；
（b）配列番号：915のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：916のアミノ酸配列を含む重鎖；
（c）配列番号：912のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：929のアミノ酸配列を含む重鎖；
（d）配列番号：912のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：930のアミノ酸配列を含む重鎖；ならびに
（e）（a）～（d）に記載される抗体重鎖および抗体軽鎖と競合する、抗体重鎖および軽鎖。
［21-2a］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-22を含み、かつ前記リガンド結合部分が、以下の（a）～（e）から選択されるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域、またはそれに対して機能的に等価の抗体可変領域のH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、［1］～［20］のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：913に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：912に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（b）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：916に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：915に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（c）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：929に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：912に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（d）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：930に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：912に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；ならびに
（e）（a）～（d）に記載される抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域と競合する抗体可変領域に含まれる、H鎖およびL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3。
［21-2b］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-22を含み、かつ前記リガンド結合部分が、以下の（a）～（e）から選択される重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）の組み合わせのいずれか1つを含む、［1］～[20]のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）配列番号：913に含まれるVH；および配列番号：912に含まれるVL；
（b）配列番号：916に含まれるVH；および配列番号：915に含まれるVL；
（c）配列番号：929に含まれるVH；および配列番号：912に含まれるVL；
（d）配列番号：930に含まれるVH；および配列番号：912に含まれるVL；ならびに
（e）（a）～（d）に記載されるVHおよびVLと競合する、VHおよびVL。
［21-3］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-2を含み、かつ前記融合タンパク質が、以下からなる群より選択される抗体重鎖および軽鎖を含む、［1］～[20]のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）配列番号：920のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：919のアミノ酸配列を含む重鎖；
（b）配列番号：923のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：922のアミノ酸配列を含む重鎖；ならびに
（c）（a）～（b）に記載される抗体重鎖および抗体軽鎖と競合する、抗体重鎖および軽鎖。
［21-3a］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-2を含み、かつ前記リガンド結合部分が、以下の（a）～（e）から選択されるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域、またはそれに対して機能的に等価の抗体可変領域のH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、［1］～［20］のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：919に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：920に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（b）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：922に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：923に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；ならびに
（c）（a）～（b）に記載される抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域と競合する抗体可変領域に含まれる、H鎖およびL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3。
［21-3b］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-2を含み、かつ前記リガンド結合部分が、以下の（a）～（c）から選択される重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）の組み合わせのいずれか1つを含む、［1］～[20]のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）配列番号：919に含まれるVH；および配列番号：920に含まれるVL；
（b）配列番号：922に含まれるVH；および配列番号：923に含まれるVL；ならびに
（c）（a）～（b）に記載されるVHおよびVLと競合する、VHおよびVL。
［22］各プロテアーゼ切断サイトが、標的組織に特異的なプロテアーゼによって独立して切断可能である、［1］～［21-2］のいずれか1つの融合タンパク質。
［23］前記標的組織が、癌組織である、［22］の融合タンパク質。
［24］各プロテアーゼ切断サイトが、マトリプターゼ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（uPA）、およびメタロプロテアーゼからなる群より選択されるプロテアーゼによって独立して切断可能である、［23］の融合タンパク質。
［25］各プロテアーゼ切断サイトが、配列番号：2～135および160～870からなる群より選択されるプロテアーゼ切断配列を独立して含む、［1］～［24］のいずれか1つの融合タンパク質。
［26］各プロテアーゼ切断サイトが、同じプロテアーゼにより切断可能である、［1］～［25］のいずれか1つの融合タンパク質。
［27］各プロテアーゼ切断サイトが、同じプロテアーゼ切断配列を含む、［1］～［26］のいずれか1つの融合タンパク質。
［28］各プロテアーゼ切断サイトが、配列番号：873のアミノ酸配列を含む、［27］の融合タンパク質。
［29］前記リガンド結合部分が、少なくとも1つの第1のプロテアーゼ切断サイトの一端に付加された第1の可動リンカーをさらに含む、［1］の融合タンパク質。
［30］前記リガンド結合ドメインが、少なくとも1つの第1のプロテアーゼ切断サイトの他端に付加された第2の可動リンカーをさらに含む、［29］の融合タンパク質。
［31］前記第1の可動リンカーが、グリシン-セリンポリマーからなる、［29］または［30］の融合タンパク質。
［32］前記第2の可動リンカーが、グリシン-セリンポリマーからなる、［30］または［31］の融合タンパク質。
［33］前記少なくとも1つのペプチドリンカーが、可動リンカーを含む、［2］の融合タンパク質。
［34］前記可動リンカーが、グリシン-セリンポリマーからなる、［33］の融合タンパク質。
［35］前記少なくとも1つのペプチドリンカーが、第2のプロテアーゼ切断サイトの一端に付加された第3の可動リンカーをさらに含む、［3］の融合タンパク質。
［36］前記少なくとも1つのペプチドリンカーが、第2のプロテアーゼ切断サイトの他端に付加された第4の可動リンカーをさらに含む、［35］の融合タンパク質。
［37］前記第3の可動リンカーが、グリシン-セリンポリマーからなる、［35］または［36］の融合タンパク質。
［38］前記第4の可動リンカーが、グリシン-セリンポリマーからなる、［36］または［37］の融合タンパク質。
［39］前記切断可能リンカーが、第3のプロテアーゼ切断サイトの一端に付加された第5の可動リンカーをさらに含む、［15］の融合タンパク質。
［40］前記切断可能リンカーが、第3のプロテアーゼ切断サイトの他端に付加された第6の可動リンカーをさらに含む、［39］の融合タンパク質。
［41］前記第5の可動リンカーが、グリシン-セリンポリマーからなる、［39］または［40］の融合タンパク質。
［42］前記第6の可動リンカーが、グリシン-セリンポリマーからなる、［40］または［41］の融合タンパク質。
［43］前記グリシン-セリンポリマーが、
Ser；
Gly Ser (GS)；
Ser Gly (SG)；
Gly Gly Ser (GGS)；
Gly Ser Gly (GSG)；
Ser Gly Gly (SGG)；
Gly Ser Ser (GSS)；
Ser Ser Gly (SSG)；
Ser Gly Ser (SGS)；
Gly Gly Gly Ser (GGGS、配列番号：136)；
Gly Gly Ser Gly (GGSG、配列番号：137)；
Gly Ser Gly Gly (GSGG、配列番号：138)；
Ser Gly Gly Gly (SGGG、配列番号：139)；
Gly Ser Ser Gly (GSSG、配列番号：140)；
Gly Gly Gly Gly Ser (GGGGS、配列番号：141)；
Gly Gly Gly Ser Gly (GGGSG、配列番号：142)；
Gly Gly Ser Gly Gly (GGSGG、配列番号：143)；
Gly Ser Gly Gly Gly (GSGGG、配列番号：144)；
Gly Ser Gly Gly Ser (GSGGS、配列番号：145)；
Ser Gly Gly Gly Gly (SGGGG、配列番号：146)；
Gly Ser Ser Gly Gly (GSSGG、配列番号：147)；
Gly Ser Gly Ser Gly (GSGSG、配列番号：148)；
Ser Gly Gly Ser Gly (SGGSG、配列番号：149)；
Gly Ser Ser Ser Gly (GSSSG、配列番号：150)；
Gly Gly Gly Gly Gly Ser (GGGGGS、配列番号：151)；
Ser Gly Gly Gly Gly Gly (SGGGGG、配列番号：152)；
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser (GGGGGGS、配列番号：153)；
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly (SGGGGGG、配列番号：154)；
(Gly Gly Gly Gly Ser (GGGGS、配列番号：141))n；および
(Ser Gly Gly Gly Gly (SGGGG、配列番号：146))n
（nは1以上の整数である）
からなる群より選択される、［31］、［32］、［34］、［37］、［38］、［41］、および［42］のいずれか1つの融合タンパク質。
［44］前記リガンド結合ドメインが、非抗体タンパク質またはポリペプチドを含む、［1］～［3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［45］前記非抗体タンパク質またはポリペプチドが、スキャフォールドペプチド、ペプチドアプタマー、およびIL-12受容体からなる群より選択される、［44］の融合タンパク質。
［46］［1］～［45］のいずれか1つの融合タンパク質を含む、医薬組成物。
［47］癌の治療における使用のためである、［46］の医薬組成物。
［48］癌の治療用の医薬組成物の製造のための、［1］～［45］のいずれか1つの融合タンパク質の使用。
［49］（a）リガンド結合ドメインと少なくとも1つの第1のプロテアーゼ切断サイトとを含む、リガンド結合分子、
（b）少なくとも1つのリガンド分子、および
（c）少なくとも1つのペプチドリンカー
を提供する工程；ならびに
少なくとも1つのペプチドリンカーを介して、少なくとも1つのリガンド分子をリガンド結合分子のC末端領域に接続する工程；
を含む、［1］～［45］のいずれか1つの融合タンパク質を製造する方法であって、
該リガンド結合ドメインが、該リガンド分子に結合し、
該リガンド結合ドメインが、プロテアーゼの存在下で該リガンド分子を遊離させることができる、
方法。
［50］切断可能リンカーを介して、少なくとも1つのリガンド分子をリガンド結合分子のN末端領域に接続する工程をさらに含む、［49］の方法。
［51］［1］～［41］のいずれか1つの融合タンパク質または［46］もしくは［47］の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、癌を治療する方法。
［52］［1］～［45］のいずれか1つの融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
［53］［52］のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［54］［52］のポリヌクレオチドまたは［53］のベクターを含む、宿主細胞。
［55］［54］の宿主細胞を培養する工程を含む、［1］～［45］のいずれか1つの融合タンパク質を製造する方法。
［101］リガンド結合部分を含み、かつ一般式（I）：
[リガンド結合ドメイン]-[Lx]-[Cx]-[Ly]-[リガンド部分]（I）
によって表される、融合タンパク質であって、
式中、
Lxは、第1のプロテアーゼ切断サイトを任意で含む第1のペプチドリンカーを表すか、またはLxは存在せず、
Cxは、第2のペプチドリンカーと、任意でシステインからまたはシステインに改変されている1個または複数個のアミノ酸残基とを含む定常領域を表し、
Lyは、第3のペプチドリンカーを表し；
該リガンド結合ドメインが、該リガンド部分に結合し、かつプロテアーゼの存在下で該リガンド部分を遊離させることができる、
融合タンパク質。
［101-1］2セットのリガンド結合ドメイン、リガンド部分、第1のペプチドリンカー、定常領域、および第3のペプチドリンカーを含む、［101］の融合タンパク質。
［101-2］一般式（II）：
[リガンド結合ドメイン]-[Lx]-[Cx]-[Ly]-[リガンド部分]//[非リガンド結合ドメイン]-[Lz]-[Cz]（II）
によって表される、融合タンパク質であって、
式中、
Lx、Cx、およびLyは、請求項1に定義されている通りであり、
Lzは、第1のプロテアーゼ切断サイトを任意で含む第4のペプチドリンカーを表すか、またはLzは存在せず、
Czは、任意で第5のペプチドリンカーと、任意でシステインからまたはシステインに改変されている1個または複数個のアミノ酸残基とを含む第2の定常領域を表す、
［101］の融合タンパク質。
［101-3］前記リガンド部分が、CXCL10、IL-2、IL-12、IL-22、PD-1、またはIL-6Rを含む、［101］または［101-2］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-11］前記第1の（または第4の）ペプチドリンカー（Lx（またはLz））が、配列番号：873（L1）の配列を含むリンカーである、［101］～［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-12］前記定常領域（または第2の定常領域）が、配列番号：901（C1）の配列を含む、［101］～［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-13］前記第3のペプチドリンカー（Ly）が、配列番号：903（L4）または配列番号：873もしくは879（L3）または配列番号：927（L5）の配列を含むリンカーである、［101］～［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-14］配列番号：876の軽鎖および配列番号：885の重鎖を含むホモ二量体（Mab80-L1-C1-L4-IL12）である、［101］、［101-1］、および［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-15］配列番号：912の軽鎖および配列番号：913の重鎖を含むホモ二量体（087B03-L1-C1-L3-IL22）である、［101］、［101-1］、および［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-21］前記定常領域（または第2の定常領域）が、配列番号：905（C2）または932（C5）の配列を含む、［101］～［101-3］のいずれか1つのいずれか1つの融合タンパク質。
［101-22］重鎖、軽鎖を含み、重鎖の220位のCys（C220）（EUナンバリング）と軽鎖の214位のCys（C214）（EUナンバリング）との間のジスルフィド結合形成が促進されるように、前記第2のリンカーがヒンジ領域中に位置づけられている、［101］～［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-23］前記ヒンジ領域が、216位（EUナンバリング）から以下のアミノ酸配列：EPKSCGGGGSGGGGSDKTHTCPPCP（配列番号：935）を含む、［101-22］の融合タンパク質。
［101-24］配列番号：876の軽鎖および配列番号：904の重鎖を含むホモ二量体（Mab80-L1-C2-L4-IL12）である、［101］、［101-1］、および［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-25］配列番号：912の軽鎖および配列番号：929の重鎖を含むホモ二量体（087B03-L1-C2-L3-IL22）である、［101］、［101-1］、および［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-26］配列番号：920の軽鎖および配列番号：919の重鎖を含むホモ二量体（Cx-L1-C5-L5-IL2.N88D）である、［101］、［101-1］、および［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-27］配列番号：923の軽鎖および配列番号：922の重鎖を含むホモ二量体（16C3-L1-C5-L5-IL2.N88D）である、［101］、［101-1］、および［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-31］前記リガンド結合部分が、重鎖および軽鎖を含み、重鎖の220位（EUナンバリング）と軽鎖の214位（EUナンバリング）との間にいかなるジスルフィド結合も形成されないように、重鎖および軽鎖中のアミノ酸残基が改変されている、［101］～［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-32］前記軽鎖がC214S（EUナンバリング）改変を含み、かつ前記重鎖がC220S（EUナンバリング）改変を含む、［101-31］の融合タンパク質。
［101-33］前記定常領域（または第2の定常領域）が、配列番号：908（C3）の配列を含む、［101］～［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-34］配列番号：906の軽鎖および配列番号：907の重鎖を含むホモ二量体（Mab80-L1-C3-L4-IL12）である、［101］、［101-1］、および［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-35］配列番号：915の軽鎖および配列番号：916の重鎖を含むホモ二量体（087B03-L1-C3-L3-IL22）である、［101］、［101-1］、および［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-41］前記リガンド結合部分が、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が、重鎖の131位（EUナンバリング）と軽鎖の214位（EUナンバリング）との間のジスルフィド結合形成を可能にするように改変されている、［101］～［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-42］前記重鎖が、S131C（EUナンバリング）およびC220S（EUナンバリング）の改変を含む、［101-41］の融合タンパク質。
［101-43］前記定常領域（または第2の定常領域）が、配列番号：910（C4）の配列を含む、［101］～［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-44］配列番号：876の軽鎖および配列番号：909の重鎖を含むホモ二量体（Mab80-L1-C4-L4-IL12）である、［101］、［101-1］、および［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［101-45］配列番号：912の軽鎖および配列番号：930の重鎖を含むホモ二量体（087B03-L1-C4-L3-IL22）である、［101］、［101-1］、および［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［102］前記少なくとも1つのペプチドリンカーが、いかなるプロテアーゼ切断サイトも含まない、［101］～［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［102-1］Cxおよび/またはLyが、いかなるプロテアーゼ切断サイトも含まない、［101］～［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［103］前記少なくとも1つのペプチドリンカーが、第2のプロテアーゼ切断サイトを含む、［101］～［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［103-1］Lyが、第2のプロテアーゼ切断サイトを含む、［101］～［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［104］前記リガンド結合ドメインが、抗体可変領域を含む、［101］～［103-1］のいずれか1つの融合タンパク質。
［105］前記リガンド結合ドメインが、互いに会合するVH領域およびVL領域を含む、［104］の融合タンパク質。
［106］Cxが、CH1領域およびCL領域を含む、［104］または［105］の融合タンパク質。
［107］少なくとも1つのプロテアーゼ切断サイトが、VHまたはVL領域とCH1またはCL領域との間の境界付近に位置している、［106］の融合タンパク質。
［107-1］Lxが、VHまたはVL領域とCH1またはCL領域との間の境界付近に位置している少なくとも1つのプロテアーゼ切断サイトを含む、［106］の融合タンパク質。
［108］Fc領域を含む、［104］～［107-1］のいずれか1つの融合タンパク質。
［109］全長抗体を含む、［108］の融合タンパク質。
［110］前記全長抗体が、IgG抗体である、［109］の融合タンパク質。
［111］前記融合タンパク質が、2つのリガンド部分および2つのペプチドリンカーを含み、各リガンド部分が、各ペプチドリンカーを介してリガンド結合部分のC末端領域に接続されている、［109］または［110］の融合タンパク質。
［111-1］前記融合タンパク質が、2つのリガンド部分および2つのペプチドリンカーを含み、各リガンド部分が、Lyを介してCxのC末端領域に接続されている、［109］または［110］の融合タンパク質。
［112］少なくとも1つのリガンド部分が、少なくとも1つのペプチドリンカーを介して、Fc領域のCH3領域の表面上に露出したアミノ酸残基に接続されている、［108］～［111-2］のいずれか1つの融合タンパク質。
［112-1］少なくとも1つのリガンド部分が、Lyを介して、Fc領域のCH3領域の表面上に露出したアミノ酸残基に接続されている、［108］～［111-1］のいずれか1つの融合タンパク質。
［113］少なくとも1つのリガンド部分が、少なくとも1つのペプチドリンカーを介してリガンド結合部分のC末端アミノ酸残基に接続されている、［101］～［112-1］のいずれか1つの融合タンパク質。
［113-1］少なくとも1つのリガンド部分が、Lyを介してCxのC末端アミノ酸残基に接続されている、［101］～［112-1］のいずれか1つの融合タンパク質。
［114］第3のプロテアーゼ切断サイトを含む切断可能リンカーをさらに含む、前記融合タンパク質であって、少なくとも1つのリガンド部分が、該切断可能リンカーを介してリガンド結合部分（ドメイン）のN末端領域に接続されている、［101］～［113-1］のいずれか1つの融合タンパク質。
［115］第3のプロテアーゼ切断サイトを含む切断可能リンカーをさらに含む、前記融合タンパク質であって、少なくとも1つのリガンド部分が、該切断可能リンカーを介して、リガンド結合部分（ドメイン）のN末端から1～230番目のアミノ酸残基のうちの1つに接続されている、［108］～［113-1］のいずれか1つの融合タンパク質。
［116］前記少なくとも1つのリガンド部分が、切断可能リンカーを介してリガンド結合部分（ドメイン）のN末端アミノ酸残基に接続されている、［114］または［115］の融合タンパク質。
［117］少なくとも1つのリガンド部分が、生物活性を有し、リガンド部分に対するリガンド結合ドメインの結合が、該リガンド部分の生物活性を阻害する、［101］～［116］のいずれか1つの融合タンパク質。
［118］前記少なくとも1つのリガンド部分が、生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドを含む、［117］の融合タンパク質。
［119］前記少なくとも1つのリガンド部分が、サイトカインまたはケモカインを含む、［118］の融合タンパク質。
［120］前記少なくとも1つのリガンド部分が、CXCL10、IL-2、IL-12、IL-22、PD-1、またはIL-6Rからなる群より選択されるリガンドタンパク質またはポリペプチドを含む、［118］の融合タンパク質。
［121］少なくとも1つのリガンド部分が、IL-12を含み、かつ前記融合タンパク質が、以下からなる群より選択される抗体重鎖および軽鎖を含む、［101］～[120]のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）配列番号：874のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：875のアミノ酸配列を含む重鎖；
（b）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：880のアミノ酸配列を含む重鎖；
（c）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：881のアミノ酸配列を含む重鎖；
（d）配列番号：874のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：884のアミノ酸配列を含む重鎖；
（e）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：885のアミノ酸配列を含む重鎖；
（f）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：886のアミノ酸配列を含む重鎖；
（g）配列番号：887のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：888のアミノ酸配列を含む重鎖；
（h）配列番号：890のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：891のアミノ酸配列を含む重鎖；
（i）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：904のアミノ酸配列を含む重鎖；
（j）配列番号：906のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：907のアミノ酸配列を含む重鎖；
（k）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：909のアミノ酸配列を含む重鎖；ならびに
（l）（a）～（k）に記載される抗体重鎖および抗体軽鎖と競合する、抗体重鎖および軽鎖。
［121-a］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-12を含み、かつ前記リガンド結合部分が、以下の（a）～（l）から選択されるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域、またはそれに対して機能的に等価の抗体可変領域のH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、［101］～［120］のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：875に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：874に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（b）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：880に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（c）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：881に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（d）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：884に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：874に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（e）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：885に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（f）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：886に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（g）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：888に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：887に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（h）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：891に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：890に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（i）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：904に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（j）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：907に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：906に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（k）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：909に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；ならびに
（l）（a）～（k）に記載される抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域と競合する抗体可変領域に含まれる、H鎖およびL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3。
［121-b］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-12を含み、かつ前記リガンド結合部分が、以下の（a）～（l）から選択される重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）の組み合わせのいずれか1つを含む、［101］～[120]のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）配列番号：875に含まれるVH；および配列番号：874に含まれるVL；
（b）配列番号：880に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；
（c）配列番号：881に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；
（d）配列番号：884に含まれるVH；および配列番号：874に含まれるVL；
（e）配列番号：885に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；
（f）配列番号：886に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；
（g）配列番号：888に含まれるVH；および配列番号：887に含まれるVL；
（h）配列番号：891に含まれるVH；および配列番号：890に含まれるVL；
（i）配列番号：904に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；
（j）配列番号：907に含まれるVH；および配列番号：906に含まれるVL；
（k）配列番号：909に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；ならびに
（l）（a）～（k）に記載されるVHおよびVLと競合する、VHおよびVL。
［121-c］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-12を含み、かつ前記融合タンパク質が、以下の（a）～（d）から選択される組み合わせのいずれか1つを含む、［101］～[120]のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）配列番号：876の配列を含む第1の軽鎖、配列番号：881の配列を含む第1の重鎖、配列番号：882の配列を含む第2の軽鎖、および配列番号：883の配列を含む第2の重鎖；
（b）配列番号：876の配列を含む第1の軽鎖、配列番号：886の配列を含む第1の重鎖、配列番号：882の配列を含む第2の軽鎖、および配列番号：883の配列を含む第2の重鎖；
（c）配列番号：887の配列を含む第1の軽鎖、配列番号：888の配列を含む第1の重鎖、配列番号：882の配列を含む第2の軽鎖、および配列番号：883の配列を含む第2の重鎖；ならびに
（d）配列番号：890の配列を含む第1の軽鎖、配列番号：891の配列を含む第1の重鎖、配列番号：882の配列を含む第2の軽鎖、および配列番号：883の配列を含む第2の重鎖。
［121-2］少なくとも1つのリガンド部分が、IL-22を含み、かつ前記融合タンパク質が、以下からなる群より選択される抗体重鎖および軽鎖を含む、［101］～[120]のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）配列番号：912のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：913のアミノ酸配列を含む重鎖；
（b）配列番号：915のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：916のアミノ酸配列を含む重鎖；
（c）配列番号：912のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：929のアミノ酸配列を含む重鎖；
（d）配列番号：912のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：930のアミノ酸配列を含む重鎖；ならびに
（e）（a）～（d）に記載される抗体重鎖および抗体軽鎖と競合する、抗体重鎖および軽鎖。
［121-2a］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-22を含み、かつ前記リガンド結合部分が、以下の（a）～（e）から選択されるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域、またはそれに対して機能的に等価の抗体可変領域のH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、［101］～［120］のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：913に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：912に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（b）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：916に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：915に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（c）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：929に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：912に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（d）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：930に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：912に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；ならびに
（e）（a）～（d）に記載される抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域と競合する抗体可変領域に含まれる、H鎖およびL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3。
［121-2b］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-22を含み、かつ前記リガンド結合部分が、以下の（a）～（e）から選択される重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）の組み合わせのいずれか1つを含む、［101］～[120]のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）配列番号：913に含まれるVH；および配列番号：912に含まれるVL；
（b）配列番号：916に含まれるVH；および配列番号：915に含まれるVL；
（c）配列番号：929に含まれるVH；および配列番号：912に含まれるVL；
（d）配列番号：930に含まれるVH；および配列番号：912に含まれるVL；ならびに
（e）（a）～（d）に記載されるVHおよびVLと競合する、VHおよびVL。
［121-3］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-2を含み、かつ前記融合タンパク質が、以下からなる群より選択される抗体重鎖および軽鎖を含む、［101］～[120]のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）配列番号：920のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：919のアミノ酸配列を含む重鎖；
（b）配列番号：923のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：922のアミノ酸配列を含む重鎖；ならびに
（c）（a）～（b）に記載される抗体重鎖および抗体軽鎖と競合する、抗体重鎖および軽鎖。
［121-3a］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-2を含み、かつ前記リガンド結合部分が、以下の（a）～（e）から選択されるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域、またはそれに対して機能的に等価の抗体可変領域のH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、［101］～［120］のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：919に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：920に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（b）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：922に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：923に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；ならびに
（c）（a）～（b）に記載される抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域と競合する抗体可変領域に含まれる、H鎖およびL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3。
［121-3b］前記少なくとも1つのリガンド部分が、IL-2を含み、かつ前記リガンド結合部分が、以下の（a）～（c）から選択される重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）の組み合わせのいずれか1つを含む、［101］～[120]のいずれか1つの融合タンパク質：
（a）配列番号：919に含まれるVH；および配列番号：920に含まれるVL；
（b）配列番号：922に含まれるVH；および配列番号：923に含まれるVL；ならびに
（c）（a）～（b）に記載されるVHおよびVLと競合する、VHおよびVL。
［122］各プロテアーゼ切断サイトが、標的組織に特異的なプロテアーゼによって独立して切断可能である、［101］～［121-3b］のいずれか1つの融合タンパク質。
［123］前記標的組織が、癌組織である、［122］の融合タンパク質。
［124］各プロテアーゼ切断サイトが、マトリプターゼ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（uPA）、およびメタロプロテアーゼからなる群より選択されるプロテアーゼによって独立して切断可能である、［123］の融合タンパク質。
［125］各プロテアーゼ切断サイトが、配列番号：2～135および160～870からなる群より選択されるプロテアーゼ切断配列を独立して含む、［101］～［124］のいずれか1つの融合タンパク質。
［126］各プロテアーゼ切断サイトが、同じプロテアーゼにより切断可能である、［101］～［125］のいずれか1つの融合タンパク質。
［127］各プロテアーゼ切断サイトが、同じプロテアーゼ切断配列を含む、［101］～［126］のいずれか1つの融合タンパク質。
［128］各プロテアーゼ切断サイトが、配列番号：873のアミノ酸配列を含む、［127］の融合タンパク質。
［129］前記リガンド結合部分が、第1のプロテアーゼ切断サイトの一端に付加された第1の可動リンカーをさらに含む、［101］～［101-3］のいずれか1つの融合タンパク質。
［130］前記リガンド結合ドメインが、第1のプロテアーゼ切断サイトの他端に付加された第2の可動リンカーをさらに含む、［129］の融合タンパク質。
［131］前記第1の可動リンカーが、グリシン-セリンポリマーからなる、［129］または［130］の融合タンパク質。
［132］前記第2の可動リンカーが、グリシン-セリンポリマーからなる、［130］または［131］の融合タンパク質。
［133］少なくとも1つのペプチドリンカーが、可動リンカーを含む、［102］の融合タンパク質。
［134］前記可動リンカーが、グリシン-セリンポリマーからなる、［133］の融合タンパク質。
［135］少なくとも1つのペプチドリンカーが、第2のプロテアーゼ切断サイトの一端に付加された第3の可動リンカーをさらに含む、［103］の融合タンパク質。
［136］前記少なくとも1つのペプチドリンカーが、第2のプロテアーゼ切断サイトの他端に付加された第4の可動リンカーをさらに含む、［135］の融合タンパク質。
［137］前記第3の可動リンカーが、グリシン-セリンポリマーからなる、［135］または［136］の融合タンパク質。
［138］前記第4の可動リンカーが、グリシン-セリンポリマーからなる、［136］または［137］の融合タンパク質。
［139］前記切断可能リンカーが、第3のプロテアーゼ切断サイトの一端に付加された第5の可動リンカーをさらに含む、［115］の融合タンパク質。
［140］前記切断可能リンカーが、第3のプロテアーゼ切断サイトの他端に付加された第6の可動リンカーをさらに含む、［139］の融合タンパク質。
［141］前記第5の可動リンカーが、グリシン-セリンポリマーからなる、［139］または［140］の融合タンパク質。
［142］前記第6の可動リンカーが、グリシン-セリンポリマーからなる、［140］または［141］の融合タンパク質。
［143］前記グリシン-セリンポリマーが、
Ser；
Gly Ser (GS)；
Ser Gly (SG)；
Gly Gly Ser (GGS)；
Gly Ser Gly (GSG)；
Ser Gly Gly (SGG)；
Gly Ser Ser (GSS)；
Ser Ser Gly (SSG)；
Ser Gly Ser (SGS)；
Gly Gly Gly Ser (GGGS、配列番号：136)；
Gly Gly Ser Gly (GGSG、配列番号：137)；
Gly Ser Gly Gly (GSGG、配列番号：138)；
Ser Gly Gly Gly (SGGG、配列番号：139)；
Gly Ser Ser Gly (GSSG、配列番号：140)；
Gly Gly Gly Gly Ser (GGGGS、配列番号：141)；
Gly Gly Gly Ser Gly (GGGSG、配列番号：142)；
Gly Gly Ser Gly Gly (GGSGG、配列番号：143)；
Gly Ser Gly Gly Gly (GSGGG、配列番号：144)；
Gly Ser Gly Gly Ser (GSGGS、配列番号：145)；
Ser Gly Gly Gly Gly (SGGGG、配列番号：146)；
Gly Ser Ser Gly Gly (GSSGG、配列番号：147)；
Gly Ser Gly Ser Gly (GSGSG、配列番号：148)；
Ser Gly Gly Ser Gly (SGGSG、配列番号：149)；
Gly Ser Ser Ser Gly (GSSSG、配列番号：150)；
Gly Gly Gly Gly Gly Ser (GGGGGS、配列番号：151)；
Ser Gly Gly Gly Gly Gly (SGGGGG、配列番号：152)；
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser (GGGGGGS、配列番号：153)；
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly (SGGGGGG、配列番号：154)；
(Gly Gly Gly Gly Ser (GGGGS、配列番号：141))n；および
(Ser Gly Gly Gly Gly (SGGGG、配列番号：146))n
（nは1以上の整数である）
からなる群より選択される、［131］、［132］、［134］、［137］、［138］、［141］、および［142］のいずれか1つの融合タンパク質。
［144］前記リガンド結合ドメインが、非抗体タンパク質またはポリペプチドを含む、［101］～［103］のいずれか1つの融合タンパク質。
［145］前記非抗体タンパク質またはポリペプチドが、スキャフォールドペプチド、ペプチドアプタマー、およびIL-12受容体からなる群より選択される、［144］の融合タンパク質。
［146］［101］～［145］のいずれか1つの融合タンパク質を含む、医薬組成物。
［147］癌の治療における使用のためのものである、［146］の医薬組成物。
［148］癌の治療用の医薬組成物の製造のための、［101］～［145］のいずれか1つの融合タンパク質の使用。
［149］（a）リガンド結合ドメインと少なくとも1つの第1のプロテアーゼ切断サイトとを含む、リガンド結合分子、
（b）少なくとも1つのリガンド部分、および
（c）少なくとも1つのペプチドリンカー
を提供する工程；ならびに
少なくとも1つのペプチドリンカーを介して、少なくとも1つのリガンド部分をリガンド結合分子のC末端領域に接続する工程；
を含む、［101］～［145］のいずれか1つの融合タンパク質を製造する方法であって、
該リガンド結合ドメインが、該リガンド部分に結合し、
該リガンド結合ドメインが、プロテアーゼの存在下で該リガンド部分を遊離させることができる、
方法。
［150］切断可能リンカーを介して、少なくとも1つのリガンド部分をリガンド結合分子のN末端領域に接続する工程をさらに含む、［149］の方法。
［151］［101］～［141］のいずれか1つの融合タンパク質または［146］もしくは［147］の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、癌を治療する方法。
［152］［101］～［145］のいずれか1つの融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
［153］［152］のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［154］［152］のポリヌクレオチドまたは［153］のベクターを含む、宿主細胞。
［155］［154］の宿主細胞を培養する工程を含む、［101］～［145］のいずれか1つの融合タンパク質を製造する方法。
抗体とIL-12分子とが切断可能リンカーを介して融合している、IgG抗体とIL-12との融合タンパク質を示す図である。黒色三角形によって示される切断可能リンカーは、プロテアーゼにより切断され、活性を有するフリーのIL-12分子が、切断後に遊離される。 抗体とIL-12分子とが切断可能リンカーを介して融合している、IgG抗体とIL-12との融合タンパク質を示す図である。黒色三角形によって示される切断可能リンカーは、プロテアーゼにより切断され、活性を有するフリーのIL-12分子が、切断後に遊離される。 抗体とIL-12分子とが切断可能リンカーを介して融合している、IgG抗体とIL-12との融合タンパク質を示す図である。黒色三角形によって示される切断可能リンカーは、プロテアーゼにより切断され、活性を有するフリーのIL-12分子が、切断後に遊離される。 抗体FcドメインとIL-12分子とが非切断可能リンカーを介して融合している、IgG抗体とIL-12との融合タンパク質を示す図である。黒色三角形によって示される切断可能リンカーは、プロテアーゼにより切断され、活性を有するIL-12分子が、切断後に抗体融合物として遊離される。 抗体FcドメインとIL-12分子とが非切断可能リンカーを介して融合している、IgG抗体とIL-12との融合タンパク質を示す図である。黒色三角形によって示される切断可能リンカーは、プロテアーゼにより切断され、活性を有するIL-12分子が、切断後に抗体融合物として遊離される。 抗体FcドメインとIL-12分子とが非切断可能リンカーを介して融合している、IgG抗体とIL-12との融合タンパク質を示す図である。黒色三角形によって示される切断可能リンカーは、プロテアーゼにより切断され、活性を有するIL-12分子が、切断後に抗体融合物として遊離される。 抗体FcドメインとIL-12分子とが非切断可能リンカーを介して融合している、IgG抗体とIL-12との融合タンパク質を示す図である。黒色三角形によって示される切断可能リンカーは、プロテアーゼにより切断され、活性を有するIL-12分子が、切断後に抗体融合物として遊離される。 抗体FcドメインとIL-12分子とが非切断可能リンカーを介して融合している、IgG抗体とIL-12との融合タンパク質を示す図である。黒色三角形によって示される切断可能リンカーは、プロテアーゼにより切断され、活性を有するIL-12分子が、切断後に抗体融合物として遊離される。 IL-12遊離型分子のMTSP1消化後に得られた切断産物についてのSDS-PAGEを示す。 IL-12遊離型分子のMTSP1消化後に得られた切断産物についてのSDS-PAGEを示す。 IL-12遊離型分子のMTSP1消化後に得られた切断産物についてのSDS-PAGEを示す。 IL-12融合型分子のMTSP1消化後に得られた切断産物についてのSDS-PAGEを示す。 IL-12融合型分子のMTSP1消化後に得られた切断産物についてのSDS-PAGEを示す。 IL-12融合型分子のMTSP1消化後に得られた切断産物についてのSDS-PAGEを示す。 IL-12融合型分子のMTSP1消化後に得られた切断産物についてのSDS-PAGEを示す。 IL-12融合型分子のMTSP1消化後に得られた切断産物についてのSDS-PAGEを示す。 インタクトのおよびMTSP1により切断されたIL-12遊離型抗体のIL-12生理活性を示す。 インタクトのおよびMTSP1により切断されたIL-12融合型抗体のIL-12生理活性を示す。 Mab80-L1-C1-L4-IL12（F4二価IL-12融合Mab80）についての還元条件下および非還元条件下でのSDS-PAGEの結果を示す。 Mab80-L1-C2-L4-IL12（レーン4）、Mab80-L1-C3-L4-IL12（レーン5）、およびMab80-L1-C4-L4-IL12（レーン6）についての還元条件下および非還元条件下でのSDS-PAGEの結果を示す。 インタクトのおよびMTSP1により切断されたMab80-L1-C1-L4-IL12、Mab80-L1-C2-L4-IL12、およびMab80-L1-C3-L4-IL12のIL-12生理活性を示す。 IL-22が、切断可能リンカー（A）または非切断可能リンカー（B）を介してFcのC末端に融合している、IL-22融合抗体を示す図である。切断可能リンカーは、黒色三角形によって示され、プロテアーゼにより切断された場合には、活性を有するIL-22分子が遊離される。 IL-22遊離型分子のuPA消化後に得られた切断産物についてのSDS-PAGE結果を示す。 uPA消化後のIL-22遊離型分子からのIL-22遊離を実証する、ウエスタンブロッティングの結果を示す。 uPAにより切断されたおよびインタクトのIL-22遊離型分子のIL-22生理活性を示す。 改善されたホモジェニティーを有するIL-22遊離抗体についてのSDS-PAGE解析を示す。 IL-22遊離型分子087B03-L1-C2-L3-IL22および087B03-L1-C4-L3-IL22のuPA消化後に得られた切断産物についてのSDS-PAGE結果を示す。 uPA消化後のIL-22遊離型分子087B03-L1-C2-L3-IL22および087B03-L1-C4-L3-IL22からのIL-22遊離を実証する、ウエスタンブロッティングの結果を示す。 uPAにより切断されたおよびインタクトのIL-22遊離型分子087B03-L1-C2-L3-IL22および087B03-L1-C4-L3-IL22のIL-22生理活性を示す。 プロテアーゼによる切断を例証するための、プロテアーゼ切断サイトを有するおよび有さない、例示的なIL-2 N88D融合抗体の模式図を示す。 プロテアーゼ消化の結果としての、抗体Cx-L1-C5-L5-IL2.N88Dおよび16C3-L1-C5-L5-IL2.N88DからのVH遊離を示す。 IL-2融合抗体から遊離されたIL-2の生理活性を評価するための、IL-2バイオアッセイの結果を示す。
態様の詳細
本明細書で用いられる場合、用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、通常、4アミノ酸程度以上の長さを有するペプチドのことをいう。また、本明細書におけるポリペプチドまたはタンパク質は、典型的には、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであるが、それに限定されない。例えば、ポリペプチドまたはタンパク質は、生物学的起源のものであってもよい。あるいは、本明細書におけるポリペプチドまたはタンパク質は、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれかであってもよい。さらに、そのようなポリペプチドまたはタンパク質の断片もまた、本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」または「タンパク質」に含まれる。
本明細書において、例えば、Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、またはVal/Vによって表されるように、各アミノ酸は、1文字コードもしくは3文字コード、またはその両方によって示される。
本明細書において、アミノ酸の改変を述べる。アミノ酸改変とは、置換、欠失、付加、および挿入、またはそれらの組み合わせのいずれかを意味する。本開示において、アミノ酸改変は、アミノ酸変異またはアミノ酸修飾と言い換えてもよい。抗原結合分子のアミノ酸配列におけるアミノ酸改変のためには、部位特異的変異誘発法（Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)）およびオーバーラップ伸長PCR等の公知の方法が、適宜採用され得る。さらに、非天然アミノ酸への置換のためのアミノ酸改変法として、複数の公知の方法もまた採用され得る（Annu Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249；およびProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357）。例えば、終止コドンの1つであるUAGコドン（アンバーコドン）の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合したtRNAを含有する無細胞翻訳系（Clover Direct（Protein Express））を用いることが好適である。
本明細書において、アミノ酸改変部位に言及するために用いられる用語「および/または」は、「および」と「または」で適宜組み合わされたアミノ酸改変部位の組み合わせをすべて含むように意図される。具体的には、例えば、句「37位、45位、および/または47位のアミノ酸が置換されている」には、以下のアミノ酸改変のバリエーションが含まれる：
（a）37位、（b）45位、（c）47位、（d）37位および45位、（e）37位および47位、（f）45位および47位、ならびに（g）37位、45位、および47位。
本明細書において、適切である場合、アミノ酸改変は、それぞれ改変前および改変後のアミノ酸の1文字コードまたは3文字コードを前後に伴う、特定の位置を表す数字によって表示され得る。例えば、抗体可変領域に含有されるアミノ酸を置換するために用いられるF37VまたはPhe37Valという改変は、Kabatナンバリングによって定義される37位のPheをValによって置換することを表す。具体的には、数字は、Kabatナンバリングによって定義されるアミノ酸の位置を表し；数字の前のアミノ酸の1文字コードまたは3文字コードは、置換前のアミノ酸を表し；かつ数字の次のアミノ酸の1文字コードまたは3文字コードは、置換後のアミノ酸を表す。同様に、抗体定常領域に含有されるFc領域においてアミノ酸を置換するために用いられるP238AまたはPro238Alaという改変は、EUナンバリングによって定義される238位のProをAlaによって置換することを表す。具体的には、数字は、EUナンバリングによって定義されるアミノ酸の位置を表し；数字の前のアミノ酸の1文字コードまたは3文字コードは、置換前のアミノ酸を表し；かつ数字の次のアミノ酸の1文字コードまたは3文字コードは、置換後のアミノ酸を表す。
一局面において、本発明は、
（a）リガンド結合ドメインと少なくとも1つの第1のプロテアーゼ切断サイトとを含む、リガンド結合部分；
（b）少なくとも1つのリガンド部分；および
（c）少なくとも1つのリガンド部分をリガンド結合部分のC末端領域に接続する、少なくとも1つのペプチドリンカー
を含む融合タンパク質に関し、
該リガンド結合ドメインは、該少なくとも1つのリガンド部分に結合し、かつプロテアーゼの存在下で該少なくとも1つのリガンド部分を遊離させることができる。
本明細書で用いられる場合、用語「リガンド結合部分」または「リガンド結合分子」は、リガンド（例えば、本発明の融合タンパク質内のリガンド部分）に結合することができる部分または分子のことをいい、特に、部分または分子が未切断の状態である時にリガンドに結合することができる部分または分子のことをいう。この文脈において、「結合」は通常、静電力、ファンデルワールス力、または水素結合等の非共有結合に主に基づく相互作用による結合のことをいう。リガンド結合部分または分子の結合様式の好ましい例には、それを通して抗原結合ドメイン、抗原結合分子、抗体、抗体断片等が抗原に結合する抗原抗体反応が含まれるが、それに限定されない。ある特定の態様において、リガンド結合部分または分子には、多重特異性結合分子（例えば、二重特異性ダイアボディおよび二重特異性抗体）を含む、抗体断片、抗体、および抗体断片から形成された分子（例えば、ダイアボディ、キメラ抗原受容体（CAR））が含まれるが、それらに限定されない。
句「リガンドに結合することができる」は、リガンド結合部分/分子とリガンドとが、単一分子において互いに結合しているのではなく、別々の分子であっても、リガンド結合部分または分子中のリガンド結合ドメインが、リガンドに結合できることを意味する。すなわち、リガンド結合部分/分子とリガンドとは、共有結合を通して接続されてもよく、または接続されなくてもよい。例えば、句「リガンドに結合することができる」は、リガンドとリガンド結合部分/分子とが、リンカーを介した共有結合を通して接続されることを必ずしも意味し得ない。また、句「リガンド結合が減弱される」は、上記の結合の能力（すなわち、リガンド結合ドメインの結合能）が減弱されることを意味する。例えば、リガンドとリガンド結合分子とがリンカーを介した共有結合を通して接続される場合に、リンカーの切断は、リガンド結合の減弱を意味するわけではない。本発明において、リガンド結合部分/分子は、リガンド結合ドメインをリガンド部分/分子に結合させる様式で、ペプチドリンカーを介してリガンド部分/分子に接続されている。
本明細書で用いられる場合、用語「リガンド結合ドメイン」は、リガンド結合部分/分子がリガンドに結合する時にリガンドの一部分（エピトープ）のみに結合するリガンド結合部分または分子の一部分のことをいう。本発明において、リガンド結合ドメインは、リガンド結合部分/分子が未切断の状態である時にドメインがリガンドに結合するという事実によってのみ制限され、かつリガンド結合部分/分子が未切断の状態である時にドメインが目的のリガンドに結合することができる限り、いかなる構造を有してもよい。リガンド結合ドメインの例には、抗体重鎖可変領域（VH）、抗体軽鎖可変領域（VL）、抗体Fv領域、シングルドメイン抗体（sdAb）、スキャフォールドペプチド、ペプチドアプタマー（Reverdatto S. et al., Curr Top Med Chem. 2015; 15(12): 1082-1101）、IL-12受容体、インビボ細胞膜タンパク質に含有されているおよそ35アミノ酸のAドメインと呼ばれるモジュールであるavimer（WO2004/044011およびWO2005/040229）、細胞膜上に発現している糖タンパク質フィブロネクチンに由来するタンパク質結合ドメインとして働く10Fn3ドメインを含有するアドネクチン（WO2002/032925）、プロテインAの58アミノ酸からなる3つのヘリックスの束（bundle）を構成するIgG結合ドメインスキャフォールドを含有するAffibody（WO1995/001937）、各々33アミノ酸残基の構造を有する、ターン、2つの逆平行ヘリックス、およびループのサブユニットにフォールディングされたアンキリンリピート（AR）の分子表面に露出した領域であるDARPin（設計アンキリンリピートタンパク質）（WO2002/020565）、好中球ゲラチナーゼ結合性リポカリン（NGAL）等のリポカリン分子において高度に保存されている、バレル構造の一端において中央軸に向かって湾曲した8つの逆平行ストランドを接続する4つのループ領域を有するアンチカリン（WO2003/029462）、ならびに、ヤツメウナギまたはメクラウナギ等の無顎脊椎動物の獲得免疫系において見られるような免疫グロブリンの構造を有さない可変性リンパ球受容体（VLR）の反復されたロイシンリッチリピート（LRR）モジュールから構成される蹄鉄形の折り畳みの内部平行シート構造におけるくぼんだ領域（WO2008/016854）が含まれるが、それらに限定されない。
本明細書において、用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、抗体が所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含むがそれらに限定されない、種々の抗体構造を包含する。
所望の結合活性を有する抗体を調製する方法は、当業者に公知である。以下に、IL-6Rに結合する抗体（抗IL-6R抗体）を調製する方法を、例として示す。IL-6R以外の抗原に結合する抗体もまた、下記に示す例に従って適宜調製することができる。
抗IL-6R抗体は、当技術分野で公知のアプローチの使用により、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体として取得することができる。抗IL-6R抗体としては、哺乳動物由来のモノクローナル抗体を、好ましく調製することができる。哺乳動物由来のモノクローナル抗体には、例えば、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的アプローチによって抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞により産生されるものが含まれる。本願に記載される抗体には、「ヒト化抗体」および「キメラ抗体」が含まれる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、当技術分野で公知の技法の使用により、例えば、以下のように調製することができる：通常の免疫方法に従って、IL-6Rタンパク質を感作抗原として用いて、哺乳動物を免疫する。このようにして得られた免疫細胞を、通常の細胞融合法によって、当技術分野で公知の親細胞と融合させる。次に、モノクローナル抗体を産生する細胞を、通常のスクリーニング法によってスクリーニングして、抗IL-6R抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
具体的には、モノクローナル抗体は、例えば、以下のように調製する：まず、IL-6R遺伝子を発現させて、抗体取得のための感作抗原として用いられるIL-6Rタンパク質を取得することができる。具体的には、IL-6Rをコードする遺伝子配列を、当技術分野で公知の発現ベクター中に挿入し、次いで、適切な宿主細胞をそれで形質転換させる。所望のヒトIL-6Rタンパク質を、当技術分野で公知の方法によって、宿主細胞からまたはその培養上清中から精製する。培養上清から可溶型IL-6Rを取得するためには、例えば、Mullberg et al. (J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968)によって記載されているような可溶型IL-6Rを発現させる。あるいは、精製された天然のIL-6Rタンパク質もまた、感作抗原として用いることができる。
精製されたIL-6Rタンパク質を、哺乳動物の免疫における使用のための感作抗原として用いることができる。IL-6Rの部分ペプチドもまた、感作抗原として用いることができる。この部分ペプチドは、ヒトIL-6Rのアミノ酸配列から化学合成によって取得され得る。あるいは、部分ペプチドは、IL-6R遺伝子の一部分の発現ベクターへの組込み、およびそれに続くその発現によって取得され得る。さらに、部分ペプチドはまた、タンパク質分解酵素でのIL-6Rタンパク質の分解によっても取得することができる。そのような部分ペプチドとしての使用のためのIL-6Rペプチドの領域およびサイズは、具体的な態様により特に限定されない。感作抗原としてのペプチドを構成するアミノ酸の数は、好ましくは、少なくとも5個以上、例えば、6個以上または7個以上である。より具体的には、8～50、好ましくは10～30残基のペプチドを、感作抗原として用いることができる。
また、異なるポリペプチドと融合した、IL-6Rタンパク質の所望の部分ポリペプチドまたはペプチドの融合タンパク質を、感作抗原として用いることもできる。例えば、抗体Fc断片またはペプチドタグを、感作抗原としての使用のために融合タンパク質を作製するために好ましく用いることができる。融合タンパク質の発現のためのベクターは、2タイプ以上の所望のポリペプチド断片をコードする遺伝子をインフレームで融合させること、および融合遺伝子を上記のように発現ベクター中に挿入することによって、調製することができる。融合タンパク質を調製する方法は、Molecular Cloning 2nd ed.（Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58 (1989), Cold Spring Harbor Lab. Press）に記載されている。感作抗原としての使用のためのIL-6Rを取得する方法およびこの感作抗原を用いた免疫方法はまた、WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等にも具体的に記載されている。
感作抗原で免疫される哺乳動物は、特定の動物に限定されない。免疫される哺乳動物は、好ましくは、細胞融合における使用のための親細胞との適合性を考慮して選択される。一般的には、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、およびハムスター）、ウサギ、サル等が、好ましく用いられる。
これらの動物は、当技術分野で公知の方法に従って、感作抗原で免疫される。例えば、一般的な免疫方法は、腹腔内注射または皮下注射によって感作抗原を哺乳動物に投与することを含む。具体的には、PBS（リン酸緩衝食塩水）、生理食塩水等により適切な希釈率で希釈した感作抗原を、所望の場合には、通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントと混合して、乳化させる。次いで、結果として生じた感作抗原を、4から21日の間隔で数回、哺乳動物に投与する。また、感作抗原での免疫において、適切な担体を用いることができる。特に、分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質に結合した感作抗原ペプチドでの免疫が、場合によっては望ましい可能性がある。
あるいは、所望の抗体を産生するハイブリドーマはまた、DNA免疫の使用によって、下記のように調製することもできる。DNA免疫は、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子を発現させることができる形態で構築されているベクターDNAを与えた免疫動物において感作抗原をインビボで発現させることによって、免疫動物を免疫刺激することを含む、免疫方法である。DNA免疫は、以下のように、免疫される動物に対するタンパク質抗原の投与を用いた一般的な免疫方法よりも優れていると期待することができる：
－ DNA免疫は、膜タンパク質（例えば、IL-6R）の構造を維持した免疫刺激を提供することができ；かつ
－ DNA免疫は、免疫抗原を精製する必要を排除する。
DNA免疫によって本発明のモノクローナル抗体を取得するために、まず、IL-6Rタンパク質発現のためのDNAを、免疫されるべき動物に投与する。IL-6RをコードするDNAは、PCR等の当技術分野で公知の方法によって合成することができる。得られたDNAを、適切な発現ベクター中に挿入し、次いで、免疫されるべき動物に投与する。例えば、pcDNA3.1等の市販の発現ベクターを、発現ベクターとして好ましく用いることができる。ベクターは、一般的に用いられている方法によって、生物に投与することができる。例えば、発現ベクターがその上に吸着した金粒子を、遺伝子銃を用いて動物個体の細胞中に導入することによって、当該動物個体をDNA免疫する。さらに、IL-6Rを認識する抗体はまた、WO 2003/104453に記載されている方法の使用によっても調製することができる。
このようにして免疫された哺乳動物の血清において、IL-6Rに結合する抗体の力価の上昇を確認する。次いで、哺乳動物から免疫細胞を収集し、細胞融合に供する。特に、脾細胞を、好ましい免疫細胞として用いることができる。
哺乳動物ミエローマ細胞を、免疫細胞との細胞融合において用いる。ミエローマ細胞は、好ましくは、スクリーニングのための適切な選択マーカーを有する。選択マーカーとは、特定の培養条件下で生存できる（または生存できない）形質のことをいう。例えば、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下、HGPRT欠損という）またはチミジンキナーゼ欠損（以下、TK欠損という）が、選択マーカーとして当技術分野で公知である。HGPRT欠損またはTK欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジンに対して感受性である（以下、HAT感受性という）。HAT感受性細胞は、HAT選択培地において、DNAを合成できないために死滅する。対照的に、これらの細胞は、正常細胞と融合すると、融合細胞が正常細胞のサルベージ経路の使用によりDNA合成を継続することができるため、HAT選択培地においても増殖できるようになる。
HGPRT欠損またはTK欠損を有する細胞は、HGPRT欠損については6-チオグアニンもしくは8-アザグアニン（以下、8AGと省略する）、またはTK欠損については5'-ブロモデオキシウリジンを含有する培地において選択することができる。正常細胞は、これらのピリミジンアナログをそのDNA中に取り込むことによって死滅する。対照的に、これらの酵素を欠損した細胞は、ピリミジンアナログをその中に取り込めないために選択培地において生存することができる。加えて、G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオキシストレプタミン抗生物質（ゲンタマイシンアナログ）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が、当技術分野で公知である。
例えば、P3（P3x63Ag8.653）（J. Immunol. (1979)123 (4), 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7）、NS-1（C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7), 511-519）、MPC-11（Cell (1976)8 (3), 405-415）、SP2/0（Nature (1978)276 (5685), 269-270）、FO（J. Immunol. Methods (1980)35 (1-2), 1-21）、S194/5.XX0.BU.1（J. Exp. Med. (1978)148 (1), 313-323）、およびR210（Nature (1979)277 (5692), 131-133）を、好ましくは、そのようなミエローマ細胞として用いることができる。
基本的には、当技術分野で公知の方法、例えば、Kohler and Milstein et al. (Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46）の方法に従って、免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われる。
より具体的には、細胞融合は、例えば、細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培地において実施することができる。例えば、ポリエチレングリコール（PEG）またはセンダイウイルス（HVJ）が、融合促進剤として用いられる。加えて、所望の場合には、融合効率を高めるため、ジメチルスルホキシド等の補助剤が、使用のためにそれに添加される。
用いられる免疫細胞とミエローマ細胞との比率は、任意に設定することができる。例えば、免疫細胞の量は、好ましくは、ミエローマ細胞の量の1から10倍に設定される。例えば、ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培地またはMEM培地、ならびにこの種の細胞培養における使用のための通常の培地が、細胞融合において培地として用いられる。好ましくは、血清（例えば、ウシ胎児血清（FCS））を補給した溶液を、培地にさらに添加することができる。
細胞融合のためには、免疫細胞とミエローマ細胞とを、予め決められた量で培地においてよく混合する。およそ37℃に予め加温されたPEG溶液（例えば、1000から6000程度の平均分子量のPEG）を、通常、30から60％（w/v）の濃度でそれに添加する。所望の融合細胞（ハイブリドーマ）が形成されるように、混合溶液を緩やかに混合する。その後、上記に挙げた適切な培地を、細胞培養物に逐次添加し、遠心分離によってその上清を除去する。ハイブリドーマの増殖に好ましくない細胞融合剤等を除去するために、この操作を繰り返することができる。
このようにして得られたハイブリドーマを、選択のために、通常の選択培地、例えば、HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有する培地）中で培養することができる。所望のハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、十分な時間は、数日から数週間である）、HAT培地を用いた培養を継続することができる。その後、所望の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、通常の限界希釈法によってシングルセルクローニングする。
このようにして得られたハイブリドーマを、細胞融合に用いられたミエローマ細胞の選択マーカーに適切な選択培地の使用によって選択することができる。例えば、HGPRT欠損またはTK欠損を有する細胞は、HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有する培地）中での培養によって選択することができる。具体的には、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、正常細胞との融合に成功した細胞のみが、HAT培地中で選択的に増殖することができる。所望のハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、HAT培地を用いた培養を継続する。具体的には、所望のハイブリドーマを選択するために、培養を一般的に、数日から数週間行うことができる。その後、所望の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、通常の限界希釈法によってシングルセルクローニングすることができる。
所望の抗体のスクリーニングおよびシングルセルクローニングは、好ましくは、当技術分野で公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング法によって実施することができる。例えば、IL-6Rに結合するモノクローナル抗体は、細胞表面上に発現したIL-6Rに結合することができる。そのようなモノクローナル抗体は、例えば、FACS（蛍光活性化細胞選別）によってスクリーニングすることができる。FACSは、蛍光抗体と接触させた細胞を、レーザー光を用いて解析し、個々の細胞が発する蛍光を測定することによって、細胞表面に対する抗体の結合を測定することができるシステムである。
FACSによって目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングするためには、まず、IL-6R発現細胞を調製する。スクリーニングのための好ましい細胞は、IL-6Rを強制発現させた哺乳動物細胞である。形質転換されていない宿主哺乳動物細胞を対照として用いて、細胞表面上のIL-6Rに対する抗体の結合活性を選択的に検出することができる。具体的には、対照宿主細胞には結合しないが、IL-6Rを強制発現させた細胞に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択して、IL-6Rに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得する。
あるいは、ELISAの原理に基づいて、抗体を、固定化されたIL-6R発現細胞に対するその結合活性について評価することができる。IL-6R発現細胞を、例えば、ELISAプレートの各ウェル上に固定化させる。ハイブリドーマの培養上清を、ウェル中の固定化細胞と接触させて、固定化細胞に結合する抗体を検出する。モノクローナル抗体がマウス由来である場合は、細胞に結合した抗体を、抗マウス免疫グロブリン抗体を用いて検出することができる。これらのスクリーニング法によって選択された、抗原に結合することができる所望の抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈法または他の方法によってクローニングすることができる。
このようにして調製されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地中で継代培養することができる。ハイブリドーマはまた、液体窒素中で長期間にわたって保存することもできる。
ハイブリドーマを通常の方法に従って培養し、その培養上清から、所望のモノクローナル抗体を取得することができる。あるいは、ハイブリドーマを、それと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させてもよく、その腹水からモノクローナル抗体を取得することができる。前者の方法は、高純度の抗体を取得するのに好適である。
ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子によってコードされる抗体もまた、好ましく用いることができる。クローニングされた抗体遺伝子を適切なベクターに組み込み、次いでこれを、遺伝子によってコードされる抗体が発現するように宿主中にトランスフェクトする。抗体遺伝子の単離、ベクターへの組込み、および宿主細胞の形質転換のための方法は、例えば、Vandammeらによって既に確立されている（Eur.J. Biochem. (1990) 192 (3), 767-775）。下記で述べるような組換え抗体を作製する方法もまた、当技術分野で公知である。
例えば、抗IL-6R抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗IL-6R抗体の可変領域（V領域）をコードするcDNAを取得する。この目的で、通常、まずハイブリドーマから全RNAを抽出する。例えば、以下の方法のいずれかを用いて、mRNAを細胞から抽出することができる：
－ グアニジン超遠心法（Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299）、および
－ AGPC法（Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159）。
抽出されたmRNAを、mRNA Purification Kit（GE Healthcare Bio-Sciences Corp.製）等を用いて精製することができる。あるいは、QuickPrep mRNA Purification Kit（GE Healthcare Bio-Sciences Corp.製）等の、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットもまた市販されている。そのようなキットを用いて、mRNAをハイブリドーマから取得することができる。得られたmRNAから、抗体V領域をコードするcDNAを、逆転写酵素を用いて合成することができる。cDNAは、例えば、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（Seikagaku Corp.製）を用いて合成することができる。あるいは、cDNAの合成および増幅のために、SMART RACE cDNA増幅キット（Clontech Laboratories, Inc.製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002；およびNucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932）を適宜用いることができる。そのようなcDNA合成の過程において、後述する適切な制限酵素サイトを、cDNAの両端にさらに導入することができる。
得られたPCR産物から目的のcDNA断片を精製し、その後、ベクターDNAとライゲーションする。このようにして調製された組換えベクターを、大腸菌（E.coli）等にトランスフェクトする。コロニー選択の後に、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターを調製することができる。次いで、組換えベクターが目的のcDNAのヌクレオチド配列を有しているか否かを、当技術分野で公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法によって確認する。
可変領域をコードする遺伝子を取得するためには、可変領域遺伝子増幅用のプライマーを用いた5'-RACE法が便利に用いられる。まず、5'-RACE cDNAライブラリを、ハイブリドーマ細胞から抽出されたRNAを鋳型としたcDNA合成によって取得する。SMART RACE cDNA増幅キット等の市販のキットを、5'-RACE cDNAライブラリの合成に適宜用いる。
得られた5'-RACE cDNAライブラリを鋳型としたPCRによって、抗体遺伝子を増幅させる。マウス抗体遺伝子増幅用のプライマーは、当技術分野で公知の抗体遺伝子配列を元に設計することができる。これらのプライマーは、免疫グロブリンのサブクラスに応じて異なるヌクレオチド配列を有する。したがって、サブクラスを、望ましくは、Iso Stripマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Roche Diagnostics K.K.）等の市販のキットを用いて予め決定する。
具体的には、例えば、マウスIgGをコードする遺伝子を取得する目的で、γ１、γ2a、γ2b、およびγ3重鎖、ならびにκおよびλ軽鎖をコードする遺伝子を増幅することができるプライマーを、用いることができる。IgG可変領域遺伝子を増幅するためには、可変領域に近い定常領域に対応する部分にアニールするプライマーを、3'プライマーとして一般的に用いる。他方、5' RACE cDNAライブラリ調製キットに付属するプライマーを、5'プライマーとして用いる。
このようにして増幅により得られたPCR産物を用いて、重鎖と軽鎖との組み合せからなる免疫グロブリンを再構築することができる。所望の抗体を取得するために、再構築された免疫グロブリンを、IL-6Rに対する結合活性についてスクリーニングすることができる。より好ましくは、例えば、IL-6Rに対する抗体を取得する目的で、IL-6Rに対する抗体の結合は特異的である。IL-6Rに結合する抗体は、例えば、以下の工程によってスクリーニングすることができる：
（1）ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含有する抗体を、IL-6R発現細胞と接触させる工程；
（2）IL-6R発現細胞に対する抗体の結合を検出する工程；および
（3）IL-6R発現細胞に結合する抗体を選択する工程。
IL-6R発現細胞に対する抗体の結合を検出する方法は、当技術分野で公知である。具体的には、IL-6R発現細胞に対する抗体の結合を、上記で述べたFACS等のアプローチによって検出することができる。抗体の結合活性を評価するために、IL-6R発現細胞の固定標本を適宜用いることができる。
ファージベクターを用いるパニング法もまた、結合活性を指標とした抗体のスクリーニングのための方法として好ましく用いられる。抗体遺伝子を、ポリクローナル抗体を発現する細胞集団から重鎖および軽鎖のサブクラスのライブラリとして取得した場合には、ファージベクターを用いるスクリーニング法が有利である。重鎖および軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、一本鎖Fv（scFv）をコードする遺伝子を形成するように、適切なリンカー配列を介して連結させることができる。scFvをコードする遺伝子をファージベクター中に挿入して、scFvをその表面上に発現するファージを取得することができる。ファージと所望の抗原との接触の後に、抗原に結合したファージを回収して、目的の結合活性を有するscFvをコードするDNAを回収することができる。所望の結合活性を有するscFvを濃縮するために、必要な場合には、この操作を繰り返すことができる。
目的の抗IL-6R抗体のV領域をコードするcDNAの取得後に、このcDNAを、cDNAの両端に挿入された制限酵素サイトを認識する制限酵素で消化する。制限酵素は、好ましくは、抗体遺伝子を構成するヌクレオチド配列に低頻度で出現するヌクレオチド配列を認識して消化する。付着末端を提供する制限酵素のサイトの挿入が、1コピーの消化断片をベクター中に正しい方向で挿入するために好ましい。このようにして消化された抗IL-6R抗体のV領域をコードするcDNAを、適切な発現ベクター中に挿入して、抗体発現ベクターを取得することができる。この場合に、キメラ抗体を取得するためには、抗体定常領域（C領域）をコードする遺伝子とV領域をコードする遺伝子とをインフレームで融合させる。この文脈において、「キメラ抗体」は、異なる起源の定常領域および可変領域を有する抗体のことをいう。したがって、異種（例えば、マウス-ヒト）キメラ抗体に加えてヒト-ヒト同種キメラ抗体もまた、本発明によるキメラ抗体に含まれる。キメラ抗体発現ベクターを構築するために、V領域遺伝子を、予め定常領域遺伝子を有する発現ベクター中に挿入することができる。具体的には、例えば、V領域遺伝子を消化する制限酵素の認識配列を、所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAを保有する発現ベクターの5'側に適宜配置することができる。C領域遺伝子およびV領域遺伝子を有するこの発現ベクターを、同じ組み合わせの制限酵素で消化し、インフレームで融合させて、キメラ抗体発現ベクターを構築する。
抗IL-6Rモノクローナル抗体を作製するために、抗体遺伝子が発現制御領域の制御の下で発現するように、該抗体遺伝子を発現ベクターに組み込む。抗体発現のための発現制御領域には、例えば、エンハンサーおよびプロモーターが含まれる。また、発現した抗体が細胞外に分泌されるように、適切なシグナル配列をアミノ末端に付加することができる。例えば、アミノ酸配列MGWSCIILFLVATATGVHS（配列番号：1）を有するペプチドを、シグナル配列として用いることができる。他の好適なシグナル配列のいずれかを、それに付加してもよい。発現したポリペプチドは、この配列のカルボキシル末端部分で切断される。切断されたポリペプチドは、成熟ポリペプチドとして細胞外に分泌され得る。その後、適切な宿主細胞をこの発現ベクターで形質転換して、抗IL-6R抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞を取得することができる。
「抗体断片」は、全長抗体の一部分を含有し、かつ該全長抗体が結合する抗原に結合する、全長抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、scFv）、および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、それらに限定されない。
用語「全長抗体」、「完全抗体」、および「全部抗体」は、本明細書では相互に交換可能に用いられ、天然抗体構造に実質的に類似した構造を有するか、または本明細書で定義されるFc領域を含有する重鎖を有する抗体のことをいう。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体のその抗原に対する結合に関与する、抗体の重鎖または軽鎖の領域またはドメインのことをいう。通常、抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、構造的に類似しており、各々は、4つの保存されたフレームワーク領域（FR）および3つの相補性決定領域（CDR）を含有する（例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照）。1つのVHまたはVLドメインが、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。
本明細書で用いられる用語「相補性決定領域」または「CDR」は、配列において超可変であり、かつ/または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ/または抗原接触残基（「抗原接触部」）、もしくは抗体可変ドメインの各領域のことをいう。通常、抗体は、6つのCDR：VHにおける3つ（H1、H2、およびH3）、ならびにVLにおける3つ（L1、L2、およびL3）を含有する。本明細書において、例示的なCDRには、以下が含まれる：
（a）アミノ酸残基26～32（L1）、50～52（L2）、91～96（L3）、26～32（H1）、53～55（H2）、および96～101（H3）で形成される超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（b）アミノ酸残基24～34（L1）、50～56（L2）、89～97（L3）、31～35b（H1）、50～65（H2）、 および95～102（H3）で形成されるCDR（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（c）アミノ酸残基27c～36（L1）、46～55（L2）、89～96（L3）、30～35b（H1）、47～58（H2）、および93～101（H3）で形成される抗原接触部（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；ならびに
(d）HVRアミノ酸残基46～56（L2）、47～56（L2）、48～56（L2）、49～56 （L2）、26～35（H1）、26～35b（H1）、49～65（H2）、93～102（H3）、および94～102（H3）を含有する、（a）、（b）、および/または（c）の組み合わせ。
本明細書において、別段特定しない限り、可変ドメイン中のCDR残基および他の残基（例えば、FR残基）は、Kabatら（上記）に従って番号付けされる。
用語「フレームワーク」または「FR」は、相補性決定領域 (CDR) 残基以外の、可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメイン中のFRは、4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、CDRおよびFRの配列は、通常、以下の順序でVH（またはVL）に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
本明細書において、用語「定常領域」または「定常ドメイン」は、抗体中の可変領域以外の領域またはドメインのことをいう。例えば、IgG抗体は、ジスルフィド結合で接続されている2本の同一の軽鎖および2本の同一の重鎖により構成される、およそ150,000 Daのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、N末端からC末端に向かって、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VH）を有し、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む重鎖定常領域（CH）がそれに続く。同様に、各軽鎖は、N末端からC末端に向かって、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VL）を有し、定常軽鎖（CL）ドメインがそれに続く。天然型抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる2タイプのうちの1つに帰属し得る。
抗体の「クラス」は、抗体の重鎖が保有する定常ドメインまたは定常領域のタイプのことをいう。抗体は、5つの主要なクラス：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMを有する。これらのクラスのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分けられてもよい。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。
本明細書において、用語「Fc領域」は、定常領域の少なくとも一部分を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列を有するFc領域および変異体Fc領域を含む。一局面において、ヒトIgG1の重鎖Fc領域は、Cys226またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかし、Fc領域のC末端のリジン（Lys447）またはグリシン-リジン（Gly446-Lys447）は、存在していてもよく、または存在していなくてもよい。本明細書において、別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991に記載されるEUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）に従って番号付けされる。
本発明において、リガンド結合部分または分子は、少なくとも1つのプロテアーゼ切断サイトを含む。リガンド結合部分/分子のリガンド結合ドメインが、プロテアーゼの存在下でリガンド部分/分子を遊離させることができる限り、プロテアーゼ切断サイトは、リガンド結合部分/分子内のどこに配置されてもよい。例えば、プロテアーゼ切断サイトは、リガンド結合部分/分子中のリガンド結合ドメイン内にでも配置されてもよい。本明細書において、句「リガンド部分/分子を遊離させる/遊離させること」または「リガンド部分/分子が遊離される」は、リガンド部分/分子が、未切断のリガンド結合部分/分子に結合したリガンド部分/分子の生物活性と比較して、その結合パートナーとの相互作用を通してその生物活性を発揮および/または増加できるようになることを意味するが、いずれかの特定の遊離レベルまたはリガンド部分/分子が遊離されるいずれかの特定の作用様式のことはいわない。いくつかの態様において、プロテアーゼの存在下で、リガンド部分/分子は、リガンド結合部分/分子中のリガンド結合ドメイン内またはその付近に配置されたプロテアーゼ切断サイトでの切断のために、リガンド結合部分/分子中のリガンド結合ドメインから遊離され得る。この場合に、切断後であっても、リガンド部分/分子は、リガンド結合部分/分子のC末端領域（例えば、Fc領域/ドメイン）に依然として連結されていてもよい。いくつかの態様において、プロテアーゼの存在下で、リガンド部分/分子は、リガンド部分/分子とリガンド結合部分/分子のC末端領域（例えば、Fc領域/ドメイン）との間に配置されたプロテアーゼ切断サイトでの切断のために、リガンド結合部分/分子（全体）から遊離され得る。この場合に、切断後、リガンド部分/分子は、リガンド結合部分/分子のC末端領域（例えば、Fc領域/ドメイン）にもはや連結されていない。
一態様において、リガンド結合部分または分子は、切断された状態で、未切断の状態と比較してより弱くリガンドまたはリガンド部分に結合する（すなわち、リガンド結合が減弱される）。抗原抗体反応によってリガンド結合部分/分子がリガンドまたはリガンド部分に結合する態様において、リガンド結合の減弱は、リガンド結合部分/分子のリガンド結合活性に基づいて評価することができる。
リガンド結合部分/分子のリガンド結合活性は、FACS、ELISAフォーマット、ALPHA（増幅発光近接ホモジニアスアッセイ）スクリーンもしくは表面プラズモン共鳴（SPR）現象を用いたBIACORE法、またはBLI（バイオレイヤー干渉法）（Octet）等の周知の方法によって確認することができる（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010）。
ALPHAスクリーンは、ドナーおよびアクセプターの2つのビーズを用いてALPHAテクノロジーに従って、以下の原理に基づいて実施される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の相互作用を通して、これらの2つのビーズが近接して位置する時にのみ、発光シグナルが検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ中のフォトセンシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素が、ドナービーズ周囲に拡散し、近接して位置するアクセプタービーズに到達して、それによりビーズにおける化学発光反応を引き起こし、これが最終的に光を放出する。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の相互作用の非存在下では、ドナービーズによって産生される一重項酸素がアクセプタービーズに到達しないため、化学発光反応は起きない。
例えば、ビオチン標識されたリガンド結合分子を、ドナービーズに結合させ、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）でタグ付けされたリガンドを、アクセプタービーズに結合させる。タグ付けされていない競合リガンド結合分子の非存在下では、リガンド結合分子はリガンドと相互作用して、520～620 nmのシグナルを生成する。タグ付けされていないリガンド結合分子は、リガンドとの相互作用について、タグ付けされたリガンド結合分子と競合する。競合から結果として生じる蛍光の減少を定量して、相対的な結合アフィニティを決定することができる。スルホ-NHS-ビオチン等を用いた抗体等のリガンド結合分子のビオチン化は、当技術分野で公知である。リガンドにGSTをタグ付けする方法として、例えば、リガンドをコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドとをインフレームで融合させる工程；結果として生じた融合遺伝子の発現を可能にするベクターを保有する細胞等から、GST融合リガンドを発現させる工程；およびグルタチオンカラムを用いてGST融合リガンドを精製する工程を含む方法を、適宜採用することができる。得られたシグナルは、好ましくは、例えば、ソフトウェアGRAPHPAD PRISM（GraphPad Software, Inc., San Diego）を用いて、非線形回帰解析に基づく一部位競合（one-site competition）モデルに適合させて解析される。
その間の相互作用を観察することになる物質の一方（リガンド）を、センサーチップの金薄膜上に固定化する。金薄膜とガラスとの境界面で全反射が起こるように、センサーチップの裏側から光を当てる。結果として、反射強度が低下した部位（SPRシグナル）が、反射光の一部分に形成される。その間の相互作用を観察することになる物質の他方（アナライト）を、センサーチップの表面に流して、リガンドに結合させると、固定化されているリガンド分子の質量が増加して、センサーチップ表面上の溶媒の屈折率が変化する。この屈折率の変化により、SPRシグナルの位置がシフトする（逆に、結合した分子の解離により、シグナルは元の位置に戻る）。Biacoreシステムは、シフトの量、すなわち、センサーチップ表面上の質量の変化を縦軸にプロットし、質量の経時変化をアッセイデータとして表示する（センサーグラム）。カイネティクス：結合速度定数（ka）および解離速度定数(kd）は、センサーグラムのカーブから決定され、解離定数（KD）は、これらの定数間の比から決定される。阻害アッセイまたは平衡解析もまた、BIACORE法において好ましく用いられる。阻害アッセイの例は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010に記載され、平衡解析の例は、Methods Enzymol. 2000; 323: 325-40に記載されている。
句「リガンド結合分子のリガンド結合機能が減弱される」は、リガンドに結合した被験リガンド結合分子の量が、上記の測定法に基づいて、リガンドに結合した対照リガンド結合分子の量の、例えば、90％以下、80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、好ましくは45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、20％以下、または15％以下、特に好ましくは10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、または1％以下であることを意味する。結合活性についての指標として、所望の指標が適宜用いられてもよい。例えば、解離定数（KD）が用いられてもよい。結合活性を評価するための指標として解離定数（KD）を用いる場合、対照リガンド結合分子のリガンドに対するものよりも大きい、被験リガンド結合分子のリガンドに対する解離定数（KD）は、被験リガンド結合分子が、対照リガンド結合分子のものよりも弱い、リガンドに対する結合活性を有することを意味する。句「リガンド結合機能が減弱される」は、被験リガンド結合分子のリガンドに対する解離定数（KD）が、対照リガンド結合分子のリガンドに対する解離定数（KD）の、例えば、少なくとも2倍、好ましくは少なくとも5倍または少なくとも10倍、特に好ましくは少なくとも100倍であることを意味する。
対照リガンド結合分子の例には、未切断型のリガンド結合分子が含まれる。
本発明の融合タンパク質において、リガンド部分または分子は、ペプチドリンカーを介してリガンド結合部分または分子のC末端領域に接続されている。本明細書で用いられる場合、用語「C末端領域」は、ポリペプチド中の内部アミノ酸残基からポリペプチドのC末端アミノ酸残基まで延びる、ポリペプチドの領域のことをいう。リガンド結合部分/分子が、例えば、抗体の形態にあるかまたはFc領域を含有する抗体断片の形態にある、ある特定の態様において、リガンド結合部分/分子のC末端領域は、典型的には、該リガンド結合部分/分子のC末端から1～250番目のアミノ酸残基の領域のことをいう。好ましい態様において、リガンド結合部分/分子は、ペプチドリンカーを介して、抗体Fc領域のCH3領域の表面上に露出したアミノ酸残基と連結されている。別の好ましい態様において、リガンド部分/分子は、ペプチドリンカーを介してリガンド結合部分/分子のC末端アミノ酸残基に接続されている。ペプチドリンカーは、ペプチド結合等の任意の共有結合によって、リガンド部分/分子に、およびリガンド結合部分/分子のC末端領域に付加されていてもよい。ペプチドリンカーの長さは、リガンド部分/分子をリガンド結合部分/分子中のリガンド結合ドメインに結合させる限り、特に限定されない。上述のペプチドリンカーは、プロテアーゼ切断サイトを含有してもよく、または含有しなくてもよい。
一態様において、本発明のリガンド部分/分子はIL-12であり、該IL-12は、IL-12のp35サブユニットまたはIL-12のp40サブユニットに付加されたペプチドリンカーを介して、リガンド結合部分/分子のC末端アミノ酸残基に接続されている。
一態様において、本発明のリガンド部分/分子はIL-12であり、該IL-12は、IL-12のp35サブユニットまたはIL-12のp40サブユニットのN末端に付加されたペプチドリンカーを介して、リガンド結合部分/分子のC末端アミノ酸残基に接続されている。
一態様において、本発明のリガンド結合ドメインは、ペプチドリンカーを介して、リガンド結合部分に含まれるヒンジ領域に接続されている。好ましい態様において、本発明のリガンド結合部分は、ペプチドリンカーを介してヒンジ領域に接続されているCH1領域をさらに含んでもよい。ペプチドリンカーは、リンカーの両側でCH1とヒンジとの間に挿入することができる。
いくつかの態様において、本発明の融合タンパク質（またはリガンド結合部分）は、ペプチドリンカーを含む定常領域を含む。いくつかの態様において、定常領域は、ペプチドリンカーを含むヒンジ領域を含む。ペプチドリンカーは、ヒンジ領域前/内の任意の位置に含まれてもよい。ペプチドリンカーは、CH1とヒンジ領域との間、すなわち、ヒンジ領域中のアミノ酸配列EPKSC（配列番号：936）の前に含まれてもよい（注記：最初の残基（E）は216位（EUナンバリング）である）。ペプチドリンカーは、ヒンジ領域中のアミノ酸配列EPKSC（配列番号：936）の後に含まれてもよい。ペプチドリンカーの位置の例には、以下が含まれるが、それらに限定されない：
[ペプチドリンカー]EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号：901参照；例は「C1」タイプを含む）；
EPKSC[ペプチドリンカー]DKTHTCPPCP（配列番号：905参照；例は「C2」タイプを含む）；ならびに
[ペプチドリンカー]EPKSSDKTHTCPPCP（配列番号：908および910参照；例は「C3」および「C4」タイプを含む）；ならびに
EPKSCDKTHT[ペプチドリンカー]CPPCP（配列番号：932参照；例は「C5」タイプを含む）。
いくつかの態様において、ペプチドリンカー（上記で示される[ペプチドリンカー]）は、本明細書で述べられるGSリンカー、例えば、(GS)2、(GGGGS：配列番号：141)2である。
上記の好適なペプチドリンカーは、容易に選択され得、好ましくは、1アミノ酸（Gly等）～300アミノ酸、2アミノ酸～200アミノ酸、または、4アミノ酸～100アミノ酸、5アミノ酸～100アミノ酸、5アミノ酸～50アミノ酸、5アミノ酸～30アミノ酸、5アミノ酸～25アミノ酸、もしくは5アミノ酸～20アミノ酸を含む3アミノ酸～100アミノ酸等の様々な長さの中から選択することができる。
ペプチドリンカーの例には、グリシンポリマー(G)n、グリシン-セリンポリマー（例えば、(GS)n、(GGGGS：配列番号：141)n、および(GGGS：配列番号：136)nを含み、nは少なくとも1の整数である）、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、および従来の技法において周知の他の可動リンカーが含まれるが、それらに限定されない。
構成するペプチドリンカーの例には、
Gly Gly Gly Gly Ser（GGGGS、配列番号：141）
(Gly Gly Gly Gly Ser（GGGGS、配列番号：141）)n
Gly Gly Gly Gly Ala（GGGGA、配列番号：893）
Gly Gly Gly Gly Glu（GGGGE、配列番号：894）
Gly Gly Gly Ser（GGGS、配列番号：136）
(Gly Gly Gly Ser（GGGS、配列番号：136）)n
Gly Gly Gly Ala（GGGA、配列番号：895）
Gly Gly Gly Glu（GGGE、配列番号：896）
Gln Gln Gln Gly（QQQG、配列番号：897）
Gln Gln Gln Gln Gly（QQQQG、配列番号：898）
Ser Ser Ser Gly（SSSG、配列番号：899）
Ser Ser Ser Ser Gly（SSSSG、配列番号：900）
（nは1以上の整数である）
が含まれ得るが、それらに限定されない。
しかし、ペプチドリンカーの長さおよび配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
FabとFcとの間のヒンジ領域中のリンカー（GSリンカー等）の存在は、HC（重鎖定常領域）とLC（軽鎖定常領域）との間のジスルフィド結合形成においてヘテロジェニティーを結果としてもたらし得る。いくつかの態様において、本発明の融合タンパク質は、軽鎖と重鎖とのホモ二量体である。重鎖は、重鎖可変領域と定常領域1（「C1」、例えば、配列番号：901）との間のエルボーヒンジ領域中に導入された、切断可能リンカー等のリンカー（「L1」、例えば、配列番号：873）を含む。一本鎖リガンド（IL-12およびIL-22等）が、GSリンカー等のリンカー（「L4」、例えば、配列番号：903）を介して、FcドメインのC末端に付加されてもよい；あるいは、リンカーは、切断可能リンカー（「L3」、例えば、配列番号：879）であってもよい。
このタイプの融合タンパク質は、「C1」改変体と呼ばれ得る。いくつかの態様において、改変体は、配列番号：876の軽鎖および配列番号：885の重鎖を含むホモ二量体である、Mab80-L1-C1-L4-IL12（F4二価IL-12融合Mab80）である。いくつかの態様において、改変体は、配列番号：912の軽鎖および配列番号：913の重鎖を含むホモ二量体である、087B03-L1-C1-L3-IL22である。いくつかの態様において、改変体は、配列番号：912の軽鎖および配列番号：917の重鎖を含むホモ二量体である、087B03-C1-L4-IL22である。
ホモジェニティーを促進するために、改善された形態（さらなる改変体）が、以下のように生成され得る。
いくつかの態様において、「C2」改変体が用いられる。この改変体の重鎖は、重鎖可変領域と定常領域2（「C2」、例えば、配列番号：905）との間のエルボーヒンジ領域中に導入された、切断可能リンカー等のリンカー（「L1」、例えば、配列番号：873）を含んでもよい。定常領域2において、リンカー（例えば、ヒンジ領域中に存在するGSリンカー（GGGGSGGGGS(配列番号：141)2））の位置シフトの非限定的な例を、以下に示す：
[GGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP]（配列番号：937）から
[EPKSCGGGGSGGGGSDKTHTCPPCP]（配列番号：935）へ（最初の残基（E）は216位（EUナンバリング）である）。
リンカーのシフトした位置は、目的に応じて、すなわち、ホモジェニティーを促進するために、当業者が適宜選択または設計することができる。リンカーの位置シフトは、重鎖の220位のCys（C220）（EUナンバリング）と軽鎖の214位のCys（C214）（EUナンバリング）との間のジスルフィド（システイン-システイン（Cys-Cys））結合形成を促進または助長することができる。一本鎖リガンド（IL-12およびIL-22等）が、GSリンカー等のリンカー（「L4」、例えば、配列番号：903）を介して、FcドメインのC末端に付加されてもよい；あるいは、リンカーは、切断可能リンカー（「L3」、例えば、配列番号：879）であってもよい。
いくつかの態様において、改変体は、配列番号：876の軽鎖および配列番号：904の重鎖を含むホモ二量体である、Mab80-L1-C2-L4-IL12である。
いくつかの態様において、改変体は、軽鎖（配列番号：912）と重鎖（配列番号：929）とのホモ二量体である、087B03-L1-C2-L3-IL22である。
いくつかの態様において、「C3」改変体が用いられる。この改変体において、軽鎖はC214S（EUナンバリング）改変を含んでもよく、重鎖はC220S（EUナンバリング）改変を含んでもよく、これは、重鎖と軽鎖との間、すなわち、重鎖の220位（EUナンバリング）と軽鎖の214位（EUナンバリング）との間にいかなるジスルフィド結合形成も結果としてもたらさない。この改変体の重鎖は、重鎖可変領域と定常領域3（「C3」、例えば、配列番号：908）との間のエルボーヒンジ領域中に導入された、切断可能リンカー等のリンカー（「L1」、例えば、配列番号：873）を含んでもよい。一本鎖リガンド（IL-12およびIL-22等）が、GSリンカー等のリンカー（「L4」、例えば、配列番号：903）を介して、FcドメインのC末端に付加されてもよい；あるいは、リンカーは、切断可能リンカー（「L3」、例えば、配列番号：879）であってもよい。
いくつかの態様において、改変体は、配列番号：906の軽鎖および配列番号：907の重鎖を含むホモ二量体である、Mab80-L1-C3-L4-IL12である。いくつかの態様において、改変体は、配列番号：915の軽鎖および配列番号：916の重鎖を含むホモ二量体である、087B03-L1-C3-L3-IL22である。
いくつかの態様において、「C4」改変体が用いられる。この改変体において、軽鎖は上述の改変を含まなくてもよく、他方、重鎖はS131C（EUナンバリング）およびC220S（EUナンバリング）改変を含んでもよく、これは、重鎖と軽鎖との間、すなわち、重鎖の131位のCys（C131）（EUナンバリング）と軽鎖の214位のCys（C214）（EUナンバリング）との間のジスルフィド結合形成を結果としてもたらす。この改変体の重鎖は、重鎖可変領域と定常領域4（「C4」、例えば、配列番号：910）との間のエルボーヒンジ領域中に導入された、切断可能リンカー等のリンカー（「L1」、例えば、配列番号：873）を含んでもよい。一本鎖リガンド（IL-12およびIL-22等）が、GSリンカー等のリンカー（L4、例えば、配列番号：903）を介して、FcドメインのC末端に付加されてもよい；あるいは、リンカーは、切断可能リンカー（「L3」、例えば、配列番号：879）であってもよい。
いくつかの態様において、改変体は、配列番号：876の軽鎖および配列番号：909の重鎖を含むホモ二量体である、Mab80-L1-C4-L4-IL12である。
いくつかの態様において、改変体は、軽鎖（配列番号：912）と重鎖（配列番号：930）とのホモ二量体である、087B03-L1-C4-L3-IL22である。
いくつかの態様において、「C5」改変体が用いられる。この改変体の重鎖は、重鎖可変領域と定常領域5（「C5」、例えば、配列番号：932）との間のエルボーヒンジ領域中に導入された、切断可能リンカー等のリンカー（「L1」、例えば、配列番号：873）を含んでもよい。定常領域5において、リンカー（例えば、ヒンジ領域中に存在するGSリンカー（GGGGSGGGGS(配列番号：141)2））の位置シフトの非限定的な例を、以下に示す：
[GGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP]（配列番号：937）から
[EPKSCDKTHTGGGGSGGGGSCPPCP]（配列番号：938）へ（最初の残基（E）は216位（EUナンバリング）である）。
リンカーのシフトした位置は、目的に応じて、すなわち、ホモジェニティーを促進するために、当業者が適宜選択または設計することができる。リンカーの位置シフトは、重鎖の220位のCys（C220）（EUナンバリング）と軽鎖の214位のCys（C214）（EUナンバリング）との間のジスルフィド（システイン-システイン（Cys-Cys））結合形成を促進または助長することができる。一本鎖リガンド（IL-2等）が、GSリンカー等のリンカー（「L5」、例えば、配列番号：927）を介して、FcドメインのC末端に付加されてもよい。
いくつかの態様において、改変体は、重鎖（配列番号：919）と軽鎖（配列番号：920）とのホモ二量体である、Cx-L1-C5-L5-IL2.N88Dである。いくつかの態様において、改変体は、重鎖（配列番号：922）と軽鎖（配列番号：923）とのホモ二量体である、16C3-L1-C5-L5-IL2.N88Dである。
いくつかの局面において、本発明の融合タンパク質は、（i）リガンド結合ドメイン、（ii）第1のペプチドリンカー、および（iii）第2のペプチドリンカーを含む定常領域を含むリガンド結合部分と、第3のペプチドリンカーと、リガンド部分とを含む。融合タンパク質は、以下の一般式（I）：
[リガンド結合ドメイン]-[Lx]-[Cx]-[Ly]-[リガンド部分]（I）
によって表され、
式中、
Lxは、プロテアーゼ切断サイトを任意で含む第1のペプチドリンカーを表すか、またはLxは存在せず；
Cxは、第2のペプチドリンカー、および任意でシステインからまたはシステインに改変されている1個または複数個のアミノ酸残基を含む定常領域を表し；
Lyは、第3のペプチドリンカーを表し、
該リガンド結合ドメインは、該リガンド部分に結合し、かつプロテアーゼの存在下で該リガンド結合ドメインから該リガンド部分を遊離させることができる。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、2セット（例えば、2つの同一のセット）のリガンド結合ドメイン、リガンド部分、第1のペプチドリンカー、（第2のペプチドリンカーを含む）定常（またはFc）領域、および第3のペプチドリンカーを含む、二価リガンド結合融合タンパク質である。融合タンパク質が2つのFc領域を含む場合、領域は互いと二量体化してリガンド結合部分を形成する。この場合に、いくつかの態様において、融合タンパク質は、IgG型タンパク質、例えば、二量体化する2つのFc領域を含むIgG型抗体であってもよい。
いくつかの態様において、融合タンパク質はFc領域を含み、例えば、タンパク質は、少なくとも1つ（すなわち、1つ、2つ、または2つよりも多い）Fc領域を含む。
第1のペプチドリンカー、第2のペプチドリンカー、および第3のペプチドリンカーの各々は、本明細書に開示される任意のリンカーであってもよい。いくつかの態様において、各リンカーは、任意のプロテアーゼによって切断することができるかまたは切断することができない、切断可能リンカーまたは非切断可能リンカーであってもよい。
あるいは、いくつかの局面において、本発明の融合タンパク質は、（i）リガンド結合ドメイン、（ii）第1のペプチドリンカー、および（iii）第2のペプチドリンカーを含む第1の定常領域を含むリガンド結合部分と、第3のペプチドリンカーと、リガンド部分；ならびに、非リガンド結合ドメイン、第4のペプチド、および第5のペプチドリンカーを含む第2の定常領域を含む。融合タンパク質は、以下の一般式（II）：
[リガンド結合ドメイン]-[Lx]-[Cx]-[Ly]-[リガンド部分]//[非リガンド結合ドメイン]-[Lz]-[Cz]（II）
によって表され、
式中、
Lx、Cx、およびLyは、上記の式（I）に定義されている通りであり；
Lzは、プロテアーゼ切断サイトを任意で含む第4のペプチドリンカーを表すか、またはLzは存在せず；
Czは、任意で第5のペプチドリンカー、および任意でシステインからまたはシステインに改変されている1個または複数個のアミノ酸残基を含む第2の定常領域を表す。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、1セットのリガンド結合ドメイン、リガンド部分、第1のペプチドリンカー、（第2のペプチドリンカーを含む）第1の定常領域、および第3のペプチドリンカー；ならびに1セットの非リガンド結合ドメイン、第4のペプチドリンカー、（第5のペプチドリンカーを含む）第2の定常領域を含む、一価リガンド結合融合タンパク質である。
第1のペプチドリンカー、第2のペプチドリンカー、第3のペプチドリンカー、第4のペプチドリンカー、および第5のペプチドリンカーの各々は、本明細書に開示される任意のリンカーであってもよい。いくつかの態様において、各リンカーは、任意のプロテアーゼによって切断することができるかまたは切断することができない、切断可能リンカーまたは非切断可能リンカーであってもよい。
本発明の融合タンパク質の可能なバリエーションには、リガンド結合分子を2つのパートに分割するために、ペプチドリンカーに付加されたリガンド部分がリガンド結合分子のC末端領域中に挿入されている構造を有する、融合タンパク質が含まれ得る。そのような融合タンパク質もまた、リガンド部分がペプチドリンカーを介して（本発明においてリガンド結合部分として働く）リガンド結合ドメインを含有するパートのC末端アミノ酸残基に連結されている限り、本発明の範囲に含まれることが理解される。
本発明のさらなる態様において、リガンド部分または分子は、さらに、切断可能リンカーを介してリガンド結合部分または分子のN末端領域に接続されている。本明細書で用いられる場合、用語「N末端領域」は、ポリペプチドのN末端からポリペプチド中の内部アミノ酸残基まで延びる、ポリペプチドの領域のことをいう。リガンド結合部分/分子が、例えば、抗体の形態にあるかまたは抗体断片の形態にある、ある特定の態様において、リガンド結合部分/分子のN末端領域は、典型的には、該リガンド結合部分/分子のN末端から1～230番目のアミノ酸残基の領域のことをいう。好ましい態様において、リガンド部分/分子は、切断可能リンカーを介してリガンド結合部分/分子のN末端アミノ酸残基に接続されている。切断可能リンカーは、ペプチド結合等の任意の共有結合によって、リガンド部分/分子に、およびリガンド結合部分/分子のN末端領域に付加されていてもよい。切断可能リンカーの長さは、リガンド部分/分子をリガンド結合部分/分子中のリガンド結合ドメインに結合させる限り、特に限定されない。上述の切断可能リンカーは、プロテアーゼ切断サイトを含有してもよく、プロテアーゼによって切断することができる。
本発明の可能なバリエーションには、リガンド結合分子を2つのパートに分割するために、切断可能リンカーに付加されたリガンド部分がリガンド結合分子のN末端領域中に挿入されている構造を有する、融合タンパク質が含まれ得る。そのような融合タンパク質もまた、リガンド部分が、切断可能リンカーを介して（本発明においてリガンド結合部分として働く）リガンド結合ドメインを含有するパートのN末端アミノ酸残基に連結されている限り、本発明の範囲に含まれることが理解される。
本発明の一態様において、リガンド部分は、融合タンパク質のプロテアーゼ切断によって、リガンド結合部分のリガンド結合ドメインから遊離される。この文脈において、リガンド部分が、プロテアーゼ切断サイトを有するペプチドリンカーを介して、リガンド結合部分のC末端領域に接続されている場合、リガンド部分は、融合タンパク質から完全に遊離され得る（例えば、図1A～1C参照）。本明細書において、このタイプの融合タンパク質を「遊離型」という。他方、リガンド部分が、いかなるプロテアーゼ切断サイトも有さないペプチドリンカーを介して、リガンド結合部分のC末端領域に接続されている場合、リガンド部分は、ペプチドリンカーを介してリガンド結合部分のC末端領域に融合したままでありながら、リガンド結合ドメインから遊離され得る（例えば、図2A～2E参照）。本明細書において、このタイプの融合タンパク質を「融合型」という。
プロテアーゼ切断サイトの切断によるリガンド結合ドメインからのリガンド部分または分子の遊離を検出する方法には、例えば、リガンドを認識するリガンド検出用抗体を用いて、リガンドを検出する方法が含まれる。リガンド結合部分/分子が抗体断片である場合、リガンド検出用抗体は、好ましくは、リガンド結合ドメイン用と同じエピトープに結合する。リガンド検出用抗体を用いて検出されるリガンドは、FACS、ELISAフォーマット、ALPHA（増幅発光近接ホモジニアスアッセイ）スクリーンもしくは表面プラズモン共鳴（SPR）現象を用いたBIACORE法、またはBLI（バイオレイヤー干渉法）（Octet）等の周知の方法によって確認することができる（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010）。
例えば、Octetを用いてリガンドの遊離を検出する場合には、リガンドを認識するリガンド検出用抗体をビオチン化し、バイオセンサーと接触させる。次いで、サンプル中のリガンドに対する結合を測定して、リガンドの遊離を検出することができる。具体的には、リガンドの量を、プロテアーゼ処理前またはプロテアーゼ処理後のリガンド結合分子とリガンドとを含有するサンプルにおいて、リガンド検出用抗体を用いて測定する。サンプル中に検出されたリガンドの量を、プロテアーゼ処理前とプロテアーゼ処理後の間で比較して、リガンドの遊離を検出することができる。あるいは、リガンドの量を、プロテアーゼとリガンド結合分子とリガンドとを含有するサンプル、およびプロテアーゼを含有せずにリガンド結合分子とリガンドとを含有するサンプルにおいて、リガンド検出用抗体を用いて測定する。サンプル中に検出されたリガンドの量を、プロテアーゼの有無の間で比較して、リガンドの遊離を検出することができる。より具体的には、本願の実施例に記載される方法によって、リガンドの遊離を検出することができる。リガンド結合分子がリガンドと融合して融合タンパク質を形成している場合は、リガンドの量を、プロテアーゼ処理前またはプロテアーゼ処理後の融合タンパク質を含有するサンプルにおいて、リガンド検出用抗体を用いて測定する。サンプル中に検出されたリガンドの量を、プロテアーゼ処理前とプロテアーゼ処理後の間で比較して、リガンドの遊離を検出することができる。あるいは、リガンドの量を、プロテアーゼと融合タンパク質とを含有するサンプル、およびプロテアーゼを含有せずに融合タンパク質を含有するサンプルにおいて、リガンド検出用抗体を用いて測定する。サンプル中に検出されたリガンドの量を、プロテアーゼの有無の間で比較して、リガンドの遊離を検出することができる。より具体的には、本願の実施例に記載される方法によって、リガンドの遊離を検出することができる。
リガンド結合ドメインに対する結合時にリガンドの生理活性が阻害される態様において、リガンド結合分子からの遊離は、サンプル中のリガンドの生理活性を測定する方法によって検出することができる。具体的には、リガンドの生理活性を、プロテアーゼ処理前またはプロテアーゼ処理後のリガンド結合分子とリガンドとを含有するサンプルにおいて測定し、プロテアーゼ処理前とプロテアーゼ処理後の間で比較して、リガンドの遊離を検出することができる。あるいは、リガンドの生理活性を、プロテアーゼとリガンド結合分子とリガンドとを含有するサンプル、およびプロテアーゼを含有せずにリガンド結合分子とリガンドとを含有するサンプルにおいて測定し、これらのサンプルの間で比較して、リガンドの遊離を検出することができる。リガンド結合分子がリガンドと融合して融合タンパク質を形成している場合は、リガンドの生理活性を、プロテアーゼ処理前またはプロテアーゼ処理後の融合タンパク質を含有するサンプルにおいて測定し、プロテアーゼ処理前とプロテアーゼ処理後の間で比較して、リガンドの遊離を検出することができる。あるいは、リガンドの生理活性を、プロテアーゼと融合タンパク質とを含有するサンプル、およびプロテアーゼを含有せずに融合タンパク質を含有するサンプルにおいて測定し、これらのサンプルの間で比較して、リガンドの遊離を検出することができる。
本発明において、プロテアーゼ切断サイトは、プロテアーゼ切断配列を含み、プロテアーゼによって切断される。本発明の融合タンパク質が複数のプロテアーゼ切断サイトを有するある特定の態様において、それらのプロテアーゼ切断サイトは、同じプロテアーゼ切断配列を有してもよく、または異なるプロテアーゼ切断配列を有してもよい。プロテアーゼ切断サイトが異なるプロテアーゼ切断配列を有する場合、それらの異なるプロテアーゼ配列は、同じプロテアーゼによって切断されてもよく、または異なるプロテアーゼによって切断されてもよい。本発明のいくつかの態様において、プロテアーゼ切断サイトはまた、プロテアーゼ切断配列の一端または両端に1個または複数個のアミノ酸残基を、それらの残基がプロテアーゼによるプロテアーゼ切断配列の認識および切断を阻害しない限り含んでもよい。
本明細書において、用語「プロテアーゼ」は、ペプチド結合を加水分解するエンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼ等の酵素のことをいい、典型的には、エンドペプチダーゼのことをいう。本発明に用いられるプロテアーゼは、プロテアーゼ切断配列を切断できることのみによって制限され、任意の特定のタイプのプロテアーゼに限定されない。いくつかの態様において、標的組織特異的プロテアーゼが用いられる。標的組織特異的プロテアーゼは、例えば、
（1）標的組織において正常組織よりも高いレベルで発現しているプロテアーゼ、
（2）標的組織において正常組織よりも高い活性を有するプロテアーゼ、
（3）標的細胞において正常細胞よりも高いレベルで発現しているプロテアーゼ、
（4）標的細胞において正常細胞よりも高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかを指すことができる。
より具体的な態様において、癌組織特異的プロテアーゼまたは炎症組織特異的プロテアーゼが用いられる。
本明細書において、用語「標的組織」は、少なくとも1つの標的細胞を含有する組織を意味する。本発明のいくつかの態様において、標的組織は癌組織である。本発明のいくつかの態様において、標的組織は炎症組織である。
用語「癌組織」は、少なくとも1つの癌細胞を含有する組織を意味する。したがって、例えば、癌組織が癌細胞および血管を含有していることを考慮すると、癌細胞および内皮細胞を含有する腫瘤（tumor mass）の形成に寄与するすべての細胞型が、本発明の範囲に含まれる。本明細書において、腫瘤とは、腫瘍組織巣（foci of tumor tissue）のことをいう。用語「腫瘍」は、一般的に、良性新生物または悪性新生物を意味するために用いられる。
本明細書において、「炎症組織」の例には、以下が含まれる：
関節リウマチまたは変形性関節症における関節組織、
気管支喘息またはCOPDにおける肺（肺胞）組織、
炎症性腸疾患、クローン病、または潰瘍性大腸炎における消化器官組織、
肝臓、腎臓、または肺における線維症の線維性組織、
臓器移植の拒絶反応が起こっている組織、
動脈硬化または心不全における血管または心臓（心筋）組織、
メタボリック症候群における内臓脂肪組織、
アトピー性皮膚炎および他の皮膚炎における皮膚組織、および
椎間板ヘルニアまたは慢性腰痛における脊髄神経組織、
免疫細胞が浸潤している任意の組織。
特異的に発現するかもしくは特異的に活性化されるプロテアーゼ、または標的組織の疾患状態に関連すると考えられるプロテアーゼ（標的組織特異的プロテアーゼ）が、いくつかのタイプの標的組織について公知である。例えば、国際公開番号WO2013/128194、WO2010/081173、およびWO2009/025846は、癌組織において特異的に発現するプロテアーゼを開示している。また、J Inflamm (Lond). 2010; 7: 45、Nat Rev Immunol. 2006 Jul; 6 (7): 541-50、Nat Rev Drug Discov. 2014 Dec; 13 (12): 904-27、Respir Res. 2016 Mar 4; 17: 23、Dis Model Mech. 2014 Feb; 7 (2): 193-203、およびBiochim Biophys Acta. 2012 Jan; 1824 (1): 133-45は、炎症に関連すると考えられるプロテアーゼを開示している。
標的組織において特異的に発現するプロテアーゼに加えて、標的組織において特異的に活性化されるプロテアーゼも存在する。例えば、プロテアーゼは、不活性型で発現し、次いで活性型に変換されることがある。多くの組織は、活性プロテアーゼを阻害する物質を含有し、活性化のプロセスおよび阻害剤の存在によって活性を制御する（Nat Rev Cancer. 2003 Jul; 3 (7): 489-501）。標的組織において、活性プロテアーゼは、阻害から逃れることによって特異的に活性化され得る。
活性プロテアーゼは、活性プロテアーゼを認識する抗体を用いる方法（PNAS 2013 Jan 2; 110 (1): 93-98）、またはプロテアーゼが認識可能なペプチドを蛍光標識し、蛍光が切断前は消光しているが、切断後に放出されるようにする方法（Nat Rev Drug Discov. 2010 Sep; 9 (9): 690-701. doi: 10.1038/nrd3053）の使用によって測定することができる。
1つの視点から、用語「標的組織特異的プロテアーゼ」は、
（i）標的組織において正常組織よりも高いレベルで発現しているプロテアーゼ、
（ii）標的組織において正常組織よりも高い活性を有するプロテアーゼ、
（iii）標的細胞において正常細胞よりも高いレベルで発現しているプロテアーゼ、および
（iv）標的細胞において正常細胞よりも高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかを指すことができる。
プロテアーゼの具体例には、システインプロテアーゼ（カテプシンファミリーB、L、S等を含む）、アスパルチルプロテアーゼ（カテプシンD、E、K、O等）、セリンプロテアーゼ（マトリプターゼ（MT-SP1を含む）、カテプシンAおよびG、トロンビン、プラスミン、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（uPA）、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）、エラスターゼ、プロテイナーゼ3、トロンビン、カリクレイン、トリプターゼ、およびキマーゼを含む）、メタロプロテアーゼ（膜結合型（MMP14-17およびMMP24-25）ならびに分泌型（MMP1-13、MMP18-23、およびMMP26-28）の両方を含むメタロプロテアーゼ（MMP1-28）、ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（A disintegrin and metalloproteinase）（ADAM）、トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ADAMTS）、メプリン（メプリンαおよびメプリンβ）、CD10（CALLA）、前立腺特異的抗原（PSA）、レグマイン、TMPRSS3、TMPRSS4、ヒト好中球エラスターゼ（HNE）、ベータセクレターゼ（BACE）、線維芽細胞活性化蛋白質アルファ（FAP）、グランザイムB、 グアニジノベンゾアターゼ（GB）、ヘプシン、ネプリライシン、NS3/4A、HCV-NS3/4、カルパイン、ADAMDEC1、レニン、カテプシンC、カテプシンV/L2、カテプシン X/Z/P、クルジパイン、オツバイン2、カリクレイン関連ペプチダーゼ（KLKs（KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、およびKLK14））、骨形成タンパク質1（BMP-1）、活性化プロテインC、血液凝固関連プロテアーゼ（第VIIa因子、第IXa因子、第Xa因子、第XIa因子、および第XIIa因子）、HtrA1、ラクトフェリン、マラプシン、PACE4、DESC1、ジペプチジルペプチダーゼ4（DPP-4）、TMPRSS2、カテプシンF、カテプシンH、カテプシンL2、カテプシンO、カテプシンS、グランザイムA、Gepsinカルパイン2、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ2、AMSH様プロテアーゼ、AMSH、ガンマセクレターゼ、抗プラスミン切断酵素（APCE）、decysin 1、N-アセチル化α結合酸性ジペプチダーゼ様1（NAALADL1）、ならびにフーリン（furin）が含まれるが、それらに限定されない。
別の視点から、標的組織特異的プロテアーゼは、癌組織特異的プロテアーゼまたは炎症組織特異的プロテアーゼを指すことができる。
癌組織特異的プロテアーゼの例には、国際公開番号WO2013/128194、WO2010/081173、およびWO2009/025846に開示されている、癌組織において特異的に発現するプロテアーゼが含まれる。
癌組織特異的プロテアーゼのタイプについて、治療されるべき癌組織においてより高い発現特異性を有するプロテアーゼは、有害反応を低減させるのにより有効である。好ましい癌組織特異的プロテアーゼは、正常組織におけるその濃度よりも少なくとも5倍、より好ましくは少なくとも10倍、さらに好ましくは少なくとも100倍、特に好ましくは少なくとも500倍、最も好ましくは少なくとも1000倍高い、癌組織における濃度を有する。また、好ましい癌組織特異的プロテアーゼは、正常組織におけるその活性よりも少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍、さらに好ましくは少なくとも100倍、特に好ましくは少なくとも500倍、最も好ましくは少なくとも1000倍高い、癌組織における活性を有する。
癌組織特異的プロテアーゼは、癌細胞膜に結合した形態であってもよく、または細胞膜に結合することなく細胞外に分泌される形態であってもよい。癌組織特異的プロテアーゼが癌細胞膜に結合していない場合、癌組織特異的プロテアーゼは、癌組織内または癌組織の近傍に存在するものであることが好ましい。本明細書において、「癌組織の近傍」とは、リガンド結合活性を低減させる効果が発揮されるように、癌組織に特異的なプロテアーゼ切断配列が切断される場所の範囲内であることを意味する。
代替的な視点から、癌組織特異的プロテアーゼは、
（i）癌組織において正常組織よりも高いレベルで発現しているプロテアーゼ、
（ii）癌組織において正常組織よりも高い活性を有するプロテアーゼ、
（iii）癌細胞において正常細胞よりも高いレベルで発現しているプロテアーゼ、および
（iv）癌細胞において正常細胞よりも高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかである。
1タイプの癌組織特異的プロテアーゼが単独で用いられてもよく、または2タイプ以上の癌組織特異的プロテアーゼが組み合わせられてもよい。癌組織特異的プロテアーゼのタイプ数は、治療されるべき癌のタイプを考慮して、当業者が適宜設定することができる。
これらの視点から、癌組織特異的プロテアーゼは、好ましくは、セリンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼ、より好ましくは、マトリプターゼ（MT-SP1を含む）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（uPA）、またはメタロプロテアーゼ、さらに好ましくは、上に列記したプロテアーゼの中でもMT-SP1、uPA、MMP-2、またはMMP-9、特に好ましくは、上に列記したプロテアーゼの中でもMMP-2またはMMP-9である。
炎症組織特異的プロテアーゼのタイプについて、治療されるべき炎症組織においてより高い発現特異性を有するプロテアーゼは、有害反応を低減させるのにより有効である。好ましい炎症組織特異的プロテアーゼは、正常組織におけるその濃度よりも少なくとも5倍、より好ましくは少なくとも10倍、さらに好ましくは少なくとも100倍、特に好ましくは少なくとも500倍、最も好ましくは少なくとも1000倍高い、炎症組織における濃度を有する。また、好ましい炎症組織特異的プロテアーゼは、正常組織におけるその活性よりも少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍、さらに好ましくは少なくとも100倍、特に好ましくは少なくとも500倍、最も好ましくは少なくとも1000倍高い、炎症組織における活性を有する。
炎症組織特異的プロテアーゼは、炎症細胞膜に結合した形態であってもよく、または細胞膜に結合することなく細胞外に分泌される形態であってもよい。炎症組織特異的プロテアーゼが炎症細胞膜に結合していない場合、炎症組織特異的プロテアーゼは、炎症組織内または炎症組織の近傍に存在するものであることが好ましい。本明細書において、「炎症組織の近傍」とは、リガンド結合活性を低減させる効果が発揮されるように、炎症組織に特異的なプロテアーゼ切断配列が切断される場所の範囲内であることを意味する。
代替的な視点から、炎症組織特異的プロテアーゼは、
（i）炎症組織において正常組織よりも高いレベルで発現しているプロテアーゼ、
（ii）炎症組織において正常組織よりも高い活性を有するプロテアーゼ、
（iii）炎症細胞において正常細胞よりも高いレベルで発現しているプロテアーゼ、および
（iv）炎症細胞において正常細胞よりも高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかである。
1タイプの炎症組織特異的プロテアーゼが単独で用いられてもよく、または2タイプ以上の炎症組織特異的プロテアーゼが組み合わせられてもよい。炎症組織特異的プロテアーゼのタイプ数は、治療されるべき病態を考慮して、当業者が適宜設定することができる。
これらの視点から、炎症組織特異的プロテアーゼは、好ましくは、上に列記したプロテアーゼの中でもメタロプロテアーゼである。メタロプロテアーゼは、より好ましくは、ADAMTS5、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP11、またはMMP-13である。
プロテアーゼ切断配列は、ポリペプチドが水溶液中で標的組織特異的プロテアーゼによって加水分解される時に、標的組織特異的プロテアーゼによって特異的に認識される特定のアミノ酸配列である。
プロテアーゼ切断配列は、有害反応の低減の視点から、好ましくは、治療されるべき標的組織もしくは細胞においてより特異的に発現する、または治療されるべき標的組織/細胞においてより特異的に活性化される標的組織特異的プロテアーゼによって、高い特異性で加水分解されるアミノ酸配列である。
プロテアーゼ切断配列の具体例には、国際公開番号WO2013/128194、WO2010/081173、およびWO2009/025846に開示されている、癌組織において特異的に発現する上に列記したプロテアーゼ、炎症組織特異的プロテアーゼ等によって特異的に加水分解される標的配列が含まれる。例えば、公知のプロテアーゼによって特異的に加水分解される標的配列にアミノ酸変異を適宜導入することによって人工的に改変された配列もまた、用いることができる。あるいは、Nature Biotechnology 19, 661-667 (2001)に記載されているような当業者に公知の方法によって特定されたプロテアーゼ切断配列が、用いられてもよい。
さらに、天然に存在するプロテアーゼ切断配列が用いられてもよい。例えば、TGFβは、プロテアーゼ切断によって潜在型に変換される。同様に、プロテアーゼ切断によってその分子形態を変化させるタンパク質中のプロテアーゼ切断配列もまた、用いることができる。
用いることができるプロテアーゼ切断配列の例には、WO2015/116933、WO2015/048329、WO2016/118629、WO2016/179257、WO2016/179285、WO2016/179335、WO2016/179003、WO2016/046778、WO2016/014974、米国特許出願公開第2016/0289324号、米国特許出願公開第2016/0311903号、PNAS (2000) 97: 7754-7759、Biochemical Journal (2010) 426: 219-228、およびBeilstein J Nanotechnol. (2016) 7: 364-373に開示されている配列が含まれるが、それらに限定されない。
プロテアーゼ切断配列は、より好ましくは、上述のような好適な標的組織特異的プロテアーゼによって特異的に加水分解されるアミノ酸配列である。標的組織特異的プロテアーゼによって特異的に加水分解されるアミノ酸配列は、好ましくは、以下のアミノ酸配列のいずれかである：
LSGRSDNH（配列番号：2、MT-SP1またはuPAにより切断可能）、
PLGLAG（配列番号：3、MMP-2またはMMP-9により切断可能）、および
VPLSLTMG（配列番号：4、MMP-7により切断可能）。
以下の配列のいずれかもまた、プロテアーゼ切断配列として用いることができる。
TSTSGRSANPRG（配列番号：5、MT-SP1またはuPAにより切断可能）、
ISSGLLSGRSDNH（配列番号：6、MT-SP1またはuPAにより切断可能）、
AVGLLAPPGGLSGRSDNH（配列番号：7、MT-SP1またはuPAにより切断可能）、
GAGVPMSMRGGAG（配列番号：8、MMP-1により切断可能）、
GAGIPVSLRSGAG（配列番号：9、MMP-2により切断可能）、
GPLGIAGQ（配列番号：10、MMP-2により切断可能）、
GGPLGMLSQS（配列番号：11、MMP-2により切断可能）、
PLGLWA（配列番号：12、MMP-2により切断可能）、
GAGRPFSMIMGAG（配列番号：13、MMP-3により切断可能）、
GAGVPLSLTMGAG（配列番号：14、MMP-7により切断可能）、
GAGVPLSLYSGAG（配列番号：15、MMP-9により切断可能）、
AANLRN（配列番号：16、MMP-11により切断可能）、
AQAYVK（配列番号：17、MMP-11により切断可能）、
AANYMR（配列番号：18、MMP-11により切断可能）、
AAALTR（配列番号：19、MMP-11により切断可能）、
AQNLMR（配列番号：20、MMP-11により切断可能）、
AANYTK（配列番号：21、MMP-11により切断可能）、
GAGPQGLAGQRGIVAG（配列番号：22、MMP-13により切断可能）、
PRFKIIGG（配列番号：23、プロウロキナーゼにより切断可能）、
PRFRIIGG（配列番号：24、プロウロキナーゼにより切断可能）、
GAGSGRSAG（配列番号：25、uPAにより切断可能）、
SGRSA（配列番号：26、uPAにより切断可能）、
GSGRSA（配列番号：27、uPAにより切断可能）、
SGKSA（配列番号：28、uPAにより切断可能）、
SGRSS（配列番号：29、uPAにより切断可能）、
SGRRA（配列番号：30、uPAにより切断可能）、
SGRNA（配列番号：31、uPAにより切断可能）、
SGRKA（配列番号：32、uPAにより切断可能）、
QRGRSA（配列番号：33、tPAにより切断可能）、
GAGSLLKSRMVPNFNAG（配列番号：34、カテプシンBにより切断可能）、
TQGAAA（配列番号：35、カテプシンBにより切断可能）、,
GAAAAA（配列番号：36、カテプシンBにより切断可能）、,
GAGAAG（配列番号：37、カテプシンBにより切断可能）、,
AAAAAG（配列番号：38、カテプシンBにより切断可能）、,
LCGAAI（配列番号：39、カテプシンBにより切断可能）、,
FAQALG（配列番号：40、カテプシンBにより切断可能）、,
LLQANP（配列番号：41、カテプシンBにより切断可能）、,
LAAANP（配列番号：42、カテプシンBにより切断可能）、,
LYGAQF（配列番号：43、カテプシンBにより切断可能）、,
LSQAQG（配列番号：44、カテプシンBにより切断可能）、,
ASAASG（配列番号：45、カテプシンBにより切断可能）、,
FLGASL（配列番号：46、カテプシンBにより切断可能）、,
AYGATG（配列番号：47、カテプシンBにより切断可能）、,
LAQATG（配列番号：48、カテプシンBにより切断可能）、,
GAGSGVVIATVIVITAG（配列番号：49、カテプシンLにより切断可能）、
APMAEGGG（配列番号：50、メプリンαまたはメプリンβにより切断可能）、
EAQGDKII（配列番号：51、メプリンαまたはメプリンβにより切断可能）、
LAFSDAGP（配列番号：52、メプリンαまたはメプリンβにより切断可能）、
YVADAPK（配列番号：53、メプリンαまたはメプリンβにより切断可能）、
RRRRR（配列番号：54、フリンにより切断可能）、
RRRRRR（配列番号：55、フリンにより切断可能）、
GQSSRHRRAL（配列番号：56、フリンにより切断可能）、
SSRHRRALD（配列番号：57）、
RKSSIIIRMRDVVL（配列番号：58、プラスミノゲンにより切断可能）、
SSSFDKGKYKKGDDA（配列番号：59、スタフィロキナーゼにより切断可能）、
SSSFDKGKYKRGDDA（配列番号：60、スタフィロキナーゼにより切断可能）、
IEGR（配列番号：61、第IXa因子により切断可能）、
IDGR（配列番号：62、第IXa因子により切断可能）、
GGSIDGR（配列番号：63、第IXa因子により切断可能）、
GPQGIAGQ（配列番号：64、コラーゲンにより切断可能）、
GPQGLLGA（配列番号：65、コラーゲンにより切断可能）、
GIAGQ（配列番号：66、コラーゲンにより切断可能）、
GPLGIAG（配列番号：67、コラーゲンにより切断可能）、
GPEGLRVG（配列番号：68、コラーゲンにより切断可能）、
YGAGLGVV（配列番号：69、コラーゲンにより切断可能）、
AGLGVVER（配列番号：70、コラーゲンにより切断可能）、
AGLGISST（配列番号：71、コラーゲンにより切断可能）、
EPQALAMS（配列番号：72、コラーゲンにより切断可能）、
QALAMSAI（配列番号：73、コラーゲンにより切断可能）、
AAYHLVSQ（配列番号：74、コラーゲンにより切断可能）、
MDAFLESS（配列番号：75、コラーゲンにより切断可能）、
ESLPVVAV（配列番号：76、コラーゲンにより切断可能）、
SAPAVESE（配列番号：77、コラーゲンにより切断可能）、
DVAQFVLT（配列番号：78、コラーゲンにより切断可能）、
VAQFVLTE（配列番号：79、コラーゲンにより切断可能）、
AQFVLTEG（配列番号：80、コラーゲンにより切断可能）、
PVQPIGPQ（配列番号：81、コラーゲンにより切断可能）、
LVPRGS（配列番号：82、トロンビンにより切断可能）、
TSTSGRSANPRG（配列番号：83）、
TSTSGRSANPRG（配列番号：84）、
TSGSGRSANARG（配列番号：85）、
TSQSGRSANQRG（配列番号：86）、
TSPSGRSAYPRG（配列番号：87）、
TSGSGRSATPRG（配列番号：88）、
TSQSGRSATPRG（配列番号：89）、
TSASGRSATPRG（配列番号：90）、
TSYSGRSAVPRG（配列番号：91）、
TSYSGRSANFRG（配列番号：92）、
TSSSGRSATPRG（配列番号：93）、
TSTTGRSASPRG（配列番号：94）、
TSTSGRSANPRG（配列番号：95）。
表1に示す配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい。
（表１）プロテアーゼ切断配列（uPAおよびMT-SP1により切断可能）
Figure 2023510994000002
Figure 2023510994000003
Figure 2023510994000004
Figure 2023510994000005
Figure 2023510994000006
Figure 2023510994000007
Figure 2023510994000008
Figure 2023510994000009
Figure 2023510994000010
Figure 2023510994000011
Figure 2023510994000012
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：96）
配列中、X1からX8は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；かつX8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：97）
配列中、X1からX8は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：98）
配列中、X1からX8は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、F、L、M、P、Q、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：99）
配列中、X1からX8は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：100）
配列中、X1からX8は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：101）
配列中、X1からX8は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、E、F、K、M、N、P、Q、R、S、およびWから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：102）
配列中、X1からX8は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、F、G、L、M、P、Q、V、およびWから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：103）
配列中、X1からX8は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、I、K、N、T、およびWから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：104）
配列中、X1からX8は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、G、I、P、Q、S、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、KまたはTから選択されるアミノ酸であり；X3はGであり；X4はRであり；X5はSであり；X6はAであり；X7は、H、I、およびVから選択されるアミノ酸であり；X8は、H、V、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：105）
配列中、X1からX8は各々、単一のアミノ酸を表し、X1はYであり；X2は、SおよびTから選択されるアミノ酸であり；X3はGであり；X4はRであり；X5はSであり；X6は、AおよびEから選択されるアミノ酸であり；X7は、NおよびVから選択されるアミノ酸であり；X8は、H、P、V、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：106）
配列中、X1からX9は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：107）
配列中、X1からX9は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：108）
配列中、X1からX9は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、F、L、M、P、Q、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：109）
配列中、X1からX9は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：110）
配列中、X1からX9は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：111）
配列中、X1からX9は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、E、F、K、M、N、P、Q、R、S、およびWから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：112）
配列中、X1からX9は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、F、G、L、M、P、Q、V、およびWから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：113）
配列中、X1からX9は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、I、K、N、T、およびWから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：114）
配列中、X1からX9は各々、単一のアミノ酸を表し、X1は、A、G、I、P、Q、S、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、KまたはTから選択されるアミノ酸であり；X3はGであり；X4はRであり；X5はSであり；X6はAであり；X7は、H、I、およびVから選択されるアミノ酸であり；X8は、H、V、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：115）
配列中、X1からX9は各々、単一のアミノ酸を表し、X1はYであり；X2は、SおよびTから選択されるアミノ酸であり；X3はGであり；X4はRであり；X5はSであり；X6は、AおよびEから選択されるアミノ酸であり；X7は、NおよびVから選択されるアミノ酸であり；X8は、H、P、V、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：116）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：117）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：118）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、F、L、M、P、Q、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：119）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：120）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：121）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、E、F、K、M、N、P、Q、R、S、およびWから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：122）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、F、G、L、M、P、Q、V、およびWから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：123）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、I、K、N、T、およびWから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：124）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、G、I、P、Q、S、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、KまたはTから選択されるアミノ酸であり；X3はGであり；X4はRであり；X5はSであり；X6はAであり；X7は、H、I、およびVから選択されるアミノ酸であり；X8は、H、V、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：125）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1はYであり；X2は、SおよびTから選択されるアミノ酸であり；X3はGであり；X4はRであり；X5はSであり；X6は、AおよびEから選択されるアミノ酸であり；X7は、NおよびVから選択されるアミノ酸であり；X8は、H、P、V、およびYから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：126）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：127）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：128）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、F、L、M、P、Q、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：129）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：130）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：131）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、E、F、K、M、N、P、Q、R、S、およびWから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：132）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、F、G、L、M、P、Q、V、およびWから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：133）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X4はRであり；X5は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X6は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、およびYから選択されるアミノ酸であり；X8は、A、D、E、F、G、I、K、N、T、およびWから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：134）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1は、A、G、I、P、Q、S、およびYから選択されるアミノ酸であり；X2は、KまたはTから選択されるアミノ酸であり；X3はGであり；X4はRであり；X5はSであり；X6はAであり；X7は、H、I、およびVから選択されるアミノ酸であり；X8は、H、V、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
以下の配列もまた、プロテアーゼ切断配列として用いられてもよい：
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：135）
配列中、X1からX11は各々、単一のアミノ酸を表し、X10は、I、T、およびYから選択されるアミノ酸であり；X11はSであり；X1はYであり；X2は、SおよびTから選択されるアミノ酸であり；X3はGであり；X4はRであり；X5はSであり；X6は、AおよびEから選択されるアミノ酸であり；X7は、NおよびVから選択されるアミノ酸であり；X8は、H、P、V、およびYから選択されるアミノ酸であり；X9は、A、G、H、I、L、およびRから選択されるアミノ酸である。
上述のプロテアーゼ切断配列を用いることに加えて、スクリーニングによって新規のプロテアーゼ切断配列もまた取得してもよい。例えば、公知のプロテアーゼ切断配列の結晶構造解析の結果に基づいて、切断配列と酵素の活性残基/認識残基の相互作用を変化させることによって、新規のプロテアーゼ切断配列を探索することができる。新規のプロテアーゼ切断解列はまた、公知のプロテアーゼ切断配列中のアミノ酸を改変すること、および改変された配列とプロテアーゼとの間の相互作用を調べることによっても探索することができる。別の例として、プロテアーゼと、ファージディスプレイおよびリボソームディスプレイ等のインビトロディスプレイ法を用いてディスプレイされたペプチドのライブラリ、またはチップもしくはビーズ上に固定化されたペプチドのアレイとの相互作用を調べることによって、プロテアーゼ切断配列を探索することができる。
プロテアーゼ切断配列とプロテアーゼとの間の相互作用は、インビトロまたはインビボでプロテアーゼによる配列の切断を試験することによって調べることができる。
プロテアーゼ切断配列、プロテアーゼの活性、およびプロテアーゼ切断配列が導入されている分子の切断率を評価するために、プロテアーゼ処理後の切断断片を、SDS-PAGE等の電気泳動によって分離し、定量することができる。プロテアーゼ切断配列が導入されている分子の切断率を評価する方法の非限定的な態様には、以下の方法が含まれる。例えば、プロテアーゼ切断配列が導入されている抗体改変体の切断率を、組換えヒトu-プラスミノーゲン活性化因子/ウロキナーゼ（ヒトuPA、huPA）（R&D Systems;1310-SE-010）または組換えヒトマトリプターゼ/ST14触媒ドメイン（ヒトMT-SP1、hMT-SP1）（R&D Systems; 3946-SE-010）を用いて評価する場合は、100マイクログラム/mLの抗体改変体を、40 nMのhuPAまたは3 nMのhMT-SP1と、PBSにおいて37℃で1時間反応させ、次いで、キャピラリー電気泳動イムノアッセイに供する。キャピラリー電気泳動イムノアッセイは、Wes（Protein Simple）を用いて行うことができるが、本方法は、それに限定されない。キャピラリー電気泳動イムノアッセイに対する代替として、分離のためにSDS-PAGE等を行い、続いてウエスタンブロッティングでの検出を行ってもよい。本方法は、これらの方法に限定されない。切断の前後に、抗ヒトλ鎖HRP標識抗体（abcam; ab9007）を用いて軽鎖を検出することができるが、切断断片を検出することができる任意の抗体を用いてもよい。プロテアーゼ処理後に得られた各ピークの面積を、Wes用のソフトウェア（Compass for SW; Protein Simple）を用いて出力し、抗体改変体の切断率（％）を、以下の式で決定することができる。
（切断された軽鎖のピーク面積）×100／（切断された軽鎖のピーク面積＋未切断の軽鎖のピーク面積）
切断率は、プロテアーゼ処理の前後にタンパク質断片が検出可能であれば、決定することができる。切断率は、抗体改変体についてだけではなく、プロテアーゼ切断配列が導入されている種々のタンパク質分子についても決定することができる。
プロテアーゼ切断配列が導入されている分子のインビボ切断率は、分子を動物に投与すること、および血液サンプル中の投与された分子を検出することによって決定することができる。例えば、プロテアーゼ切断配列が導入されている抗体改変体を、マウスに投与し、それらの血液サンプルから血漿を収集する。Dynabeads Protein A（Thermo; 10001D）を用いて当業者に公知の方法により血漿から抗体を精製し、次いで、キャピラリー電気泳動イムノアッセイに供して、抗体改変体のプロテアーゼ切断率を評価する。キャピラリー電気泳動イムノアッセイは、Wes（Protein Simple）を用いて行うことができるが、本方法は、それに限定されない。キャピラリー電気泳動イムノアッセイに対する代替として、分離のためにSDS-PAGE等を行い、続いてウエスタンブロッティングでの検出を行ってもよい。本方法は、これらの方法に限定されない。抗ヒトλ鎖HRP標識抗体（abcam; ab9007）を用いて、マウスから収集された抗体改変体の軽鎖を検出することができるが、切断断片を検出することができる任意の抗体を用いてもよい。キャピラリー電気泳動イムノアッセイによって得られた各ピークの面積を、ひとたびWes用のソフトウェア（Compass for SW; Protein Simple）を用いて出力すると、残った軽鎖の比率を［軽鎖のピーク面積］／［重鎖のピーク面積］として算出して、マウスの体において切断されないままである全長軽鎖の比率を決定することができる。インビボ切断効率は、生体から収集されたタンパク質断片が検出可能であれば、決定することができる。切断率は、抗体改変体についてだけではなく、プロテアーゼ切断配列が導入されている種々のタンパク質分子についても決定することができる。上述の方法による切断率の算出によって、例えば、異なる切断配列が導入されている抗体改変体のインビボ切断率の比較、および正常マウスモデルと腫瘍移植マウスモデル等の異なる動物モデル間での単一抗体改変体の切断率の比較が可能である。
例えば、表1に示すプロテアーゼ切断配列はすべて、WO2019/107384に開示されている。これらのプロテアーゼ切断配列を含有するポリペプチドはすべて、プロテアーゼの作用によって加水分解されるプロテアーゼ基質として有用である。したがって、本発明は、配列番号：96～135から選択される配列、および表1に列記する配列を含むプロテアーゼ基質を提供する。本発明のプロテアーゼ基質は、例えば、リガンド結合部分または分子中に組み込むために、目的に適した性状を有するものをそれから選択することができるライブラリとして活用することができる。具体的には、病巣に局在するプロテアーゼによってリガンド結合部分/分子を選択的に切断するために、そのプロテアーゼに対する感受性について基質を評価することができる。リガンド部分/分子に接続されたリガンド結合部分/分子がインビボ投与された時に、分子は、病巣に到達する前に種々のプロテアーゼと接触することがある。したがって、分子は、好ましくは、病巣に局在するプロテアーゼに対して感受性を有し、かつまた他のプロテアーゼ対してはできるだけ高い耐性を有する。目的に応じて望ましいプロテアーゼ切断配列を選択するために、予め種々のプロテアーゼに対する感受性について網羅的に各プロテアーゼ基質を解析して、そのプロテアーゼ耐性を見出すことができる。得られたプロテアーゼ耐性スペクトルに基づいて、必要な感受性および耐性を有するプロテアーゼ切断配列を見出すことが可能である。
あるいは、プロテアーゼ切断配列が組み込まれているリガンド結合分子は、病巣に送達する前に、プロテアーゼによる酵素作用だけではなく、pHの変化、温度、および酸化/還元ストレス等の種々の環境ストレスを受ける。これらの外部要因に対する耐性もまた、プロテアーゼ基質の間で比較することができ、この比較情報を用いて、目的に応じた望ましい性状を有するプロテアーゼ切断配列を選択することができる。
本発明の一態様において、各プロテアーゼ切断サイトの一端または両端に、可動リンカーがさらに付加されている。第1のプロテアーゼ切断サイトの一端に付加された可動リンカーを、「第1の可動リンカー」といい、他端に付加された可動リンカーを、「第2の可動リンカー」という。本発明の融合タンパク質が、2つ以上のプロテアーゼ切断サイトを含有する場合は、同様に、第2のプロテアーゼ切断サイトに付加された可動リンカーを、「第3の可動リンカー」および「第4の可動リンカー」といい、第3のプロテアーゼ切断サイトに付加された可動リンカーを、「第5の可動リンカー」および「第6の可動リンカー」という、等々である。下記の説明は、第1のプロテアーゼ切断サイトに付加された第1のおよび第2の可動リンカーを説明するために提供されるが、また同様に、第2のおよび後続のプロテアーゼ切断サイトに付加された第3のおよび後続の可動リンカーにも当てはまる。
特定の態様において、プロテアーゼ切断サイトおよび可動リンカーは、以下の式のいずれかを含む：
（プロテアーゼ切断配列）、
（第1の可動リンカー）-（プロテアーゼ切断サイト）、
（プロテアーゼ切断サイト）-（第2の可動リンカー）、および
（第1の可動リンカー）-（プロテアーゼ切断サイト）-（第2の可動リンカー）。
本態様による可動リンカーは、好ましくはペプチドリンカーである。第1の可動リンカーおよび第2の可動リンカーは各々、独立的かつ任意的に存在し、少なくとも1つのフレキシブルアミノ酸（Gly等）を各々が含有する同一のまたは異なる可動リンカーである。可動リンカーは、例えば、プロテアーゼ切断配列が所望のプロテアーゼアクセス性を得るのに十分な数の残基（Arg、Ile、Gln、Glu、Cys、Tyr、Trp、Thr、Val、His、Phe、Pro、Met、Lys、Gly、Ser、Asp、Asn、Ala等から任意に選択されるアミノ酸、特にGly、Ser、Asp、Asn、およびAla、とりわけGlyおよびSer、特にGly等）を含有する。
プロテアーゼ切断配列の両端での使用に好適な可動リンカーは、通常、プロテアーゼ切断配列に対するプロテアーゼのアクセスを改善し、プロテアーゼの切断効率を上昇させる可動リンカーである。好適な可動リンカーは、容易に選択され得、好ましくは、1アミノ酸（Gly等）～20アミノ酸、2アミノ酸～15アミノ酸、または、4アミノ酸～10アミノ酸、5アミノ酸～9アミノ酸、6アミノ酸～8アミノ酸、もしくは7アミノ酸～8アミノ酸を含む3アミノ酸～12アミノ酸等の様々な長さの中から選択することができる。本発明のいくつかの態様において、可動リンカーは、1～7アミノ酸のペプチドリンカーである。
可動リンカーの例には、グリシンポリマー(G)n、グリシン-セリンポリマー（例えば、(GS)n、(GSGGS：配列番号：145)n、および(GGGS：配列番号：136)nを含み、nは少なくとも1の整数である）、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、および従来の技法において周知の他の可動リンカーが含まれるが、それらに限定されない。
それらの中で、グリシンポリマーおよびグリシン-セリンポリマーが注目されており、それは、これらのアミノ酸が、比較的構造化されておらず、成分間の中性テザーとして容易に機能するためである。
グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーの例には、
Ser
Gly Ser（GS）
Ser Gly（SG）
Gly Ser（GGS）
Gly Ser Gly（GSG）
Ser Gly Gly（SGG）
Gly Ser Ser（GSS）
Ser Ser Gly（SSG）
Ser Gly Ser（SGS）
Gly Gly Gly Ser（GGGS、配列番号：136）
Gly Gly Ser Gly（GGSG、配列番号：137）
Gly Ser Gly Gly（GSGG、配列番号：138）
Ser Gly Gly Gly（SGGG、配列番号：139）
Gly Ser Ser Gly（GSSG、配列番号：140）
Gly Gly Gly Gly Ser（GGGGS、配列番号：141）
Gly Gly Gly Ser Gly（GGGSG、配列番号：142）
Gly Gly Ser Gly Gly（GGSGG、配列番号：143）
Gly Ser Gly Gly Gly（GSGGG、配列番号：144）
Gly Ser Gly Gly Ser（GSGGS、配列番号：145）
Ser Gly Gly Gly Gly（SGGGG、配列番号：146）
Gly Ser Ser Gly Gly（GSSGG、配列番号：147）
Gly Ser Gly Ser Gly（GSGSG、配列番号：148）
Ser Gly Gly Ser Gly（SGGSG、配列番号：149）
Gly Ser Ser Ser Gly（GSSSG、配列番号：150）
Gly Gly Gly Gly Gly Ser（GGGGGS、配列番号：151）
Ser Gly Gly Gly Gly Gly（SGGGGG、配列番号：152）
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser（GGGGGGS、配列番号：153）
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly（SGGGGGG、配列番号：154）
（Gly Gly Gly Gly Ser（GGGGS、配列番号：141）)n
（Ser Gly Gly Gly Gly（SGGGG、配列番号：146）)n
（nは1以上の整数である）
が含まれ得るが、それらに限定されない。
しかし、ペプチドリンカーの長さおよび配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
本発明のいくつかの態様において、リガンド結合部分または分子は、抗体VHおよび抗体VLを含むリガンド結合ドメイン含む。VHおよびVLを含むリガンド結合部分/分子の例には、Fv、scFv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、および全長抗体が含まれるが、それらに限定されない。
本発明のいくつかの態様において、リガンド結合部分または分子は、Fc領域を含有する。IgG抗体のFc領域を用いる場合、そのタイプは限定されず、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域を用いてもよい。IgG抗体のFc領域を用いる場合、そのタイプは限定されず、例えば、IgG1、IgG2、またはIgG4のFc領域を用いてもよい。例えば、配列番号：155、156、157、および158によって表されるアミノ酸配列から選択される1つの配列を含有するFc領域、またはFc領域に改変を加えることによって調製されたFc領域変異体を用いてもよい。本発明のいくつかの態様において、リガンド結合部分/分子は、抗体定常領域を含む。
例として、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、およびヒトIgG4の重鎖定常領域は、それぞれ、配列番号：153～158に示される。例として、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、およびヒトIgG4のFc領域は、配列番号：153～158の部分配列として示される。
本発明のいくつかのより具体的な態様において、リガンド結合部分または分子は、抗体である。リガンド結合部分/分子として抗体を用いる場合、リガンドに対する結合は、可変領域によって達成される。いくつかのさらに具体的な態様において、リガンド結合部分/分子は、IgG抗体である。リガンド結合部分/分子としてIgG抗体を用いる場合、そのタイプは限定されず、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等を用いることができる。リガンド結合部分/分子としてIgG抗体を用いる場合、そのタイプは限定されず、IgG1、IgG2、IgG4等を用いることができる。リガンド結合部分/分子としてIgG抗体を用いる場合、リガンドに対する結合はまた、可変領域によって達成される。IgG抗体の2つの可変領域の一方または両方が、リガンドに対する結合を達成することができる。上述の態様において、本発明の融合タンパク質は、好ましくは、1つまたは2つのペプチドリンカーを介して抗体部分のC末端領域に接続されている、1つのリガンド部分（一価）または2つのリガンド部分（二価）を含む。抗体が、2つの可変領域のうちの1つのみが目的のリガンドに結合する二重特異性抗体であるいくつかの態様において、融合タンパク質は、好ましくは、1つのリガンド部分のみを含む。
本発明のいくつかの態様において、リガンド結合部分/分子中のプロテアーゼ切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列の切断によって、リガンド結合活性を有するドメインがリガンド結合部分/分子から分離され、そのためリガンドに対する結合が減弱される。リガンド結合部分/分子としてIgG抗体を用いる態様において、例えば、抗体の可変領域のうちの1つは、プロテアーゼ切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列を伴って提供され、そのため切断状態では抗体が全長抗体可変領域を形成することができず、それによりリガンドに対する結合が減弱される。
本明細書において、「会合」とは、例えば、2つ以上のポリペプチド領域が互いに相互作用する状態を指すことができる。一般的に、疎水結合、水素結合、イオン結合等が、意図されたポリペプチド領域の間に形成されて、会合体を形成する。一般的な会合の一例として、天然型抗体に代表される抗体は、重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）とのペア構造を、それらの間の非共有結合等を通して保持していることが公知である。
本発明のいくつかの態様において、リガンド結合ドメインに含有されるVHとVLとは、互いに会合する。抗体VHと抗体VLとの間の会合は、例えば、切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列の切断によって解消され得る。会合の解消は、例えば、2つ以上のポリペプチド領域が互いに相互作用する状態の全部または一部の解消と、互換的に用いることができる。VHとVLとの間の会合の解消については、VHとVLとの間の相互作用が完全に解消されてもよく、またはVHとVLとの間の相互作用が部分的に解消されてもよい。
本発明におけるリガンド結合ドメインは、抗体VLまたはその一部分と抗体VHまたはその一部分との間の会合が、プロテアーゼ切断サイトの切断によって解消されるかまたはプロテアーゼ切断配列の切断によって解消される、リガンド結合部分または分子を包含する。
本発明のいくつかの態様において、リガンド結合部分または分子は、抗体VHおよび抗体VLを含むリガンド結合ドメインを含み、リガンド結合部分/分子中の抗体VHと抗体VLとは、リガンド結合部分/分子のプロテアーゼ切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列が未切断である状態では、互いに会合しているが、リガンド結合部分/分子中の抗体VHと抗体VLとの間の会合は、切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列の切断によって解消される。リガンド結合部分/分子中の切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列は、該切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列の切断によってリガンド結合部分/分子のリガンド結合が減弱され得る限り、リガンド結合部分/分子中の任意の位置に配置されてもよい。
本発明のいくつかの態様において、リガンド結合部分または分子は、抗体VH、抗体VL、および抗体定常領域を含むリガンド結合ドメインを含む。
Rothlisbergerら（J Mol Biol. 2005 Apr 8; 347 (4): 773-89）によって述べられているように、抗体のVHドメインとVLドメイン、またはCHドメインとCLドメインは、多くのアミノ酸側鎖を介して互いに相互作用していることが公知である。VH-CH1とVL-CLとは、Fabドメインとして安定な構造を形成できることが公知である。以前に報告されているように、VHとVLとの間で、アミノ酸側鎖は一般的に相互作用し、解離定数は10-5 M～10-8 Mの範囲である。VHドメインとVLドメインのみが存在する場合には、少ない割合しか会合状態を形成し得ない。
本発明のいくつかの態様において、プロテアーゼ切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列が、抗体VHおよび抗体VLを含むリガンド結合ドメインを含むリガンド結合部分または分子中に提供され、Fab構造中の2つのペプチドが、切断前には、互いとの全体的な重鎖-軽鎖の相互作用を有するが、プロテアーゼ切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列の切断が、VH（またはVHの一部分）を含有するペプチドとVL（またはVLの一部分）を含有するペプチドとの間の相互作用の減弱を結果としてもたらし、VHとVLとの間の会合を排除するように、融合タンパク質が設計される。
本発明の一態様において、プロテアーゼ切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列は、抗体定常領域内に位置する。より具体的な態様において、プロテアーゼ切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列は、抗体重鎖定常領域中のアミノ酸140位（EUナンバリング）に対して可変領域側に、好ましくは、抗体重鎖定常領域中のアミノ酸122位（EUナンバリング）に対して可変領域側に位置する。いくつかの具体的な態様において、切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列は、抗体重鎖定常領域のアミノ酸118位（EUナンバリング）から抗体重鎖定常領域のアミノ酸140位（EUナンバリング）までの配列中の任意の位置に導入される。別のより具体的な態様において、切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列は、抗体軽鎖定常領域中のアミノ酸130位（EUナンバリング）（Kabatナンバリング130位）に対して可変領域側に、好ましくは、抗体軽鎖定常領域中のアミノ酸113位（EUナンバリング）（Kabatナンバリング113位）に対して可変領域側に、または抗体軽鎖定常領域中のアミノ酸112位（EUナンバリング）（Kabatナンバリング112位）に対して可変領域側に位置する。いくつかの具体的な態様において、切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列は、抗体軽鎖定常領域のアミノ酸108位（EUナンバリング）（Kabatナンバリング108位）から抗体軽鎖定常領域のアミノ酸131位（EUナンバリング）（Kabatナンバリング131位）までの配列中の任意の位置に導入される。
本発明の一態様において、プロテアーゼ切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列は、抗体VH内または抗体VL内に位置する。より具体的な態様において、切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列は、抗体VHのアミノ酸7位（Kabatナンバリング）に対して抗体定常領域側に、好ましくは、抗体VHのアミノ酸40位（Kabatナンバリング）に対して抗体定常領域側に、より好ましくは、抗体VHのアミノ酸101位（Kabatナンバリング）に対して抗体定常領域側に、さらに好ましくは、抗体VHのアミノ酸109位（Kabatナンバリング）に対して抗体定常領域側に、または抗体VHのアミノ酸111位（Kabatナンバリング）に対して抗体定常領域側に位置する。より具体的な態様において、切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列は、抗体VLのアミノ酸7位（Kabatナンバリング）に対して抗体定常領域側に、好ましくは、抗体VLのアミノ酸39位（Kabatナンバリング）に対して抗体定常領域側に、より好ましくは、抗体VLのアミノ酸96位（Kabatナンバリング）に対して抗体定常領域側に、さらに好ましくは、抗体VLのアミノ酸104位（Kabatナンバリング）に対して抗体定常領域側に、または抗体VLのアミノ酸105位（Kabatナンバリング）に対して抗体定常領域側に位置する。
いくつかのより具体的な態様において、プロテアーゼ切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列は、抗体VHまたは抗体VL中のループ構造を構成する残基、およびループ構造に近い残基の位置に導入される。抗体VHまたは抗体VL中のループ構造とは、抗体VHまたは抗体VLにおける、α-へリックスまたはβ-シート等の二次構造を形成しない部分のことをいう。具体的には、ループ構造を構成する残基およびループ構造に近い残基の位置とは、抗体VHのアミノ酸7位（Kabatナンバリング）～アミノ酸16位（Kabatナンバリング）、アミノ酸40位（Kabatナンバリング）～アミノ酸47位（Kabatナンバリング）、アミノ酸55位（Kabatナンバリング）～アミノ酸69位（Kabatナンバリング）、アミノ酸73位（Kabatナンバリング）～アミノ酸79位（Kabatナンバリング）、アミノ酸83位（Kabatナンバリング）～アミノ酸89位（Kabatナンバリング）、アミノ酸95位（Kabatナンバリング）～アミノ酸99位（Kabatナンバリング）、もしくはアミノ酸101位（Kabatナンバリング）～アミノ酸113位（Kabatナンバリング）、または抗体VLのアミノ酸7位（Kabatナンバリング）～アミノ酸19位（Kabatナンバリング）、アミノ酸39位（Kabatナンバリング）～アミノ酸46位（Kabatナンバリング）、アミノ酸49位（Kabatナンバリング）～アミノ酸62位（Kabatナンバリング）、もしくはアミノ酸96位（Kabatナンバリング）～アミノ酸107位（Kabatナンバリング）の範囲を指すことができる。
いくつかのより具体的な態様において、切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列は、抗体VHのアミノ酸7位（Kabatナンバリング）～アミノ酸16位（Kabatナンバリング）、アミノ酸40位（Kabatナンバリング）～アミノ酸47位（Kabatナンバリング）、アミノ酸55位（Kabatナンバリング）～アミノ酸69位（Kabatナンバリング）、アミノ酸73位（Kabatナンバリング）～アミノ酸79位（Kabatナンバリング）、アミノ酸83位（Kabatナンバリング）～アミノ酸89位（Kabatナンバリング）、アミノ酸95位（Kabatナンバリング）～アミノ酸99位（Kabatナンバリング）、またはアミノ酸101位（Kabatナンバリング）～アミノ酸113位（Kabatナンバリング）の配列中の任意の位置に導入される。
いくつかのより具体的な態様において、切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列は、抗体VLのアミノ酸7位（Kabatナンバリング）～アミノ酸19位（Kabatナンバリング）、アミノ酸39位（Kabatナンバリング）～アミノ酸46位（Kabatナンバリング）、アミノ酸49位（Kabatナンバリング）～アミノ酸62位（Kabatナンバリング）、またはアミノ酸96位（Kabatナンバリング）～アミノ酸107位（Kabatナンバリング）の配列中の任意の位置に導入される。
本発明の一態様において、プロテアーゼ切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列は、抗体VHと抗体定常領域との境界付近に位置する。句「抗体VHと抗体重鎖定常領域との境界付近」は、抗体VHのアミノ酸101位（Kabatナンバリング）と抗体重鎖定常領域のアミノ酸140位（EUナンバリング）との間を指すことができ、好ましくは、抗体VHのアミノ酸109位（Kabatナンバリング）と抗体重鎖定常領域のアミノ酸122位（EUナンバリング）との間、または抗体VHのアミノ酸111位（Kabatナンバリング）と抗体重鎖定常領域のアミノ酸122位（EUナンバリング）との間を指すことができる。抗体VHが抗体軽鎖定常領域と融合している場合、句「抗体VHと抗体軽鎖定常領域との境界付近」は、抗体VHのアミノ酸101位（Kabatナンバリング）と抗体軽鎖定常領域のアミノ酸130位（EUナンバリング）（Kabatナンバリング130位）との間を指すことができ、好ましくは、抗体VHのアミノ酸109位（Kabatナンバリング）と抗体軽鎖定常領域のアミノ酸113位（EUナンバリング）（Kabatナンバリング113位）との間、または抗体VHのアミノ酸111位（Kabatナンバリング）と抗体軽鎖定常領域のアミノ酸112位（EUナンバリング）（Kabatナンバリング112位）との間を指すことができる。
一態様において、切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列は、抗体VLと抗体定常領域との境界付近に位置する。句「抗体VLと抗体軽鎖定常領域との境界付近」は、抗体VLのアミノ酸96位（Kabatナンバリング）と抗体軽鎖定常領域のアミノ酸130位（EUナンバリング）（Kabatナンバリング130位）との間を指すことができ、好ましくは、抗体VLのアミノ酸104位（Kabatナンバリング）と抗体軽鎖定常領域のアミノ酸113位（EUナンバリング）（Kabatナンバリング113位）との間、または抗体VLのアミノ酸105位（Kabatナンバリング）と抗体軽鎖定常領域のアミノ酸112位（EUナンバリング）（Kabatナンバリング112位）との間を指すことができる。抗体VLが抗体重鎖定常領域と融合している場合、句「抗体VLと抗体重鎖定常領域との境界付近」は、抗体VLのアミノ酸96位（Kabatナンバリング）と抗体重鎖定常領域のアミノ酸140位（EUナンバリング）との間を指すことができ、好ましくは、抗体VLのアミノ酸104位（Kabatナンバリング）と抗体重鎖定常領域のアミノ酸122位（EUナンバリング）との間、または抗体VLのアミノ酸105位（Kabatナンバリング）と抗体重鎖定常領域のアミノ酸122位（EUナンバリング）との間を指すことができる。
リガンド結合部分/分子は、例えば、抗体定常領域内、抗体VH内、抗体VL内、抗体VHと抗体定常領域との境界付近、および抗体VLと抗体定常領域との境界付近から選択される複数の位置に、プロテアーゼ切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列を伴って提供され得る。本発明に関連する当業者は、例えば、抗体VHと抗体VLとを入れ替えることによって、抗体VH、抗体VL、および抗体定常領域を含む分子の形態を変更することができる。そのような分子形態は、本発明の範囲に含まれる。
本明細書において、用語「リガンド部分」または「リガンド分子」は、生物活性を有する部分または分子のことをいう。本明細書において、「リガンド部分」および「リガンド分子」は、単に「リガンド」といってもよい。生物活性を有する分子は、通常、細胞表面上の受容体と相互作用し、それにより生物学的な刺激、阻害、または他の様式での調節を行うことによって機能する。これらの機能は、通常、受容体を保有する細胞の細胞内シグナル伝達経路に関与すると考えられる。
本明細書において、リガンドには、生体分子との相互作用を通して生物活性を発揮する所望の分子が包含される。例えば、リガンドは、受容体と相互作用する分子を意味するだけではなく、分子との相互作用を通して生物活性を発揮する分子、例えば、分子と相互作用する受容体、またはその結合断片も含む。例えば、受容体として公知のタンパク質のリガンド結合部位、および受容体の別の分子との相互作用部位を含有するタンパク質は、本発明によるリガンドに含まれる。具体的には、例えば、可溶性受容体、受容体の可溶性断片、膜貫通受容体の細胞外ドメイン、およびそれらを含有するポリペプチドは、本発明によるリガンドに含まれる。
本発明のリガンドは、通常、1つまたは複数の結合パートナーに対する結合によって、望ましい生物活性を発揮することができる。リガンドの結合パートナーは、細胞外、細胞内、または膜貫通タンパク質であることができる。一態様において、リガンドの結合パートナーは、細胞外タンパク質、例えば、可溶性受容体である。別の態様において、リガンドの結合パートナーは、膜結合型受容体である。
本発明のリガンドは、10マイクロモル濃度（μM）、1マイクロモル濃度、100 nM、50 nM、10 nM、5 nM、1 nM、500 pM、400 pM、350 pM、300 pM、250 pM、200 pM、150 pM、100 pM、50 pM、25 pM、10 pM、5 pM、1 pM、0.5 pM、もしくは0.1 pM、またはそれよりも小さい解離定数（KD）で、結合パートナーに特異的に結合することができる。
生物活性を有する分子の例には、サイトカイン、ケモカイン、ポリペプチドホルモン、成長因子、アポトーシス誘導因子、PAMPs、DAMPs、核酸、およびその断片が含まれるが、それらに限定されない。具体的な態様において、インターロイキン、インターフェロン、造血因子、TNFスーパーファミリーのメンバー、ケモカイン、細胞増殖因子、TGF-βファミリーのメンバー、マイオカイン、アディポカイン、または神経栄養因子を、リガンドとして用いることができる。より具体的な態様において、CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-22、IFN-α、IFN-β、IFN-g、MIG、I-TAC、RANTES、MIP-1a、MIP-1b、IL-1R1（インターロイキン-1受容体、I型）、IL-1R2（インターロイキン-1受容体、II型）、IL-1RAcP（インターロイキン-1受容体アクセサリータンパク質）、またはIL-1Ra（タンパク質アクセッション番号NP_776214、mRNAアクセッション番号NM_173842.2）を、リガンドとして用いることができる。本開示において用いられるリガンドについて、制限はない。いくつかの態様において、リガンドは、野生型（または天然に存在する）リガンドであってもよく、または任意の変異を有する変異体リガンドであってもよい。ヘテロ二量体サイトカインであるIL-12の場合には、いくつかの態様において、リガンドIL-12は、野生型（または天然に存在する）IL-12であってもよく、または任意の変異を有する変異体IL-12であってもよい。いくつかの態様において、IL-12は、p35とp40とが連結されて一本鎖に含まれている、一本鎖IL-12であってもよい。
本発明のいくつかの態様において、リガンドは、サイトカインである。
サイトカインは、免疫調節プロセスおよび炎症プロセスに関与する分泌型細胞シグナル伝達タンパク質のファミリーである。これらのサイトカインは、神経系のグリア細胞によって、および免疫系の多くの細胞によって分泌される。サイトカインは、タンパク質、ペプチド、および糖タンパク質に分類することができ、大きな多様な調節因子ファミリーを包含する。サイトカインは、その細胞表面受容体に対する結合を通して細胞内シグナル伝達を誘導し、それにより、酵素活性の調節、いくつかの遺伝子およびその転写因子の上方制御もしくは下方制御、またはフィードバック阻害等を引き起こすことができる。
いくつかの態様において、本発明のサイトカインには、インターロイキン（IL）およびインターフェロン（IFN）等の免疫調節因子が含まれる。好適なサイトカインには、以下のタイプの1つまたは複数に由来するタンパク質が含有され得る：4つのα-ヘリックスバンドルファミリー（IL-2サブファミリー、IFNサブファミリー、およびIL-10サブファミリーを含む）；IL-1ファミリー（IL-1およびIL-8を含む）；ならびにIL-17ファミリー。サイトカインにはまた、細胞性免疫応答を増強する1型サイトカイン（例えば、IFN-γおよびTGF-β）、または抗体反応に有利に働く2型サイトカイン（例えば、IL-4、IL-10、およびIL-13）に分類されるものが含まれ得る。
インターロイキン12（IL-12）は、ジスルフィド結合された30 kDと40 kDのグリコシル化ポリペプチド鎖からなるヘテロ二量体のサイトカインである。サイトカインは、樹状細胞、単球、マクロファージ、B細胞、ランゲルハンス細胞、および角化細胞、ならびにナチュラルキラー（NK）細胞を含む抗原提示細胞によって合成され、次いで分泌される。IL-12は、種々の生物学的プロセスを媒介し、NK細胞刺激因子（NKSF）、T細胞刺激因子、細胞傷害性Tリンパ球成熟因子、およびEBVにより形質転換されたB細胞株因子として述べられている。
インターロイキン12は、細胞（例えば、T細胞およびNK細胞）の細胞質膜上に発現したIL-12受容体に結合し、それにより生物学的プロセスを変更する（例えば、開始するかまたは遮断する）ことができる。例えば、IL-12受容体に対するIL-12の結合は、予め活性化されたT細胞およびNK細胞の増殖を刺激し、細胞傷害性T細胞（CTL）、NK細胞、およびLAK（リンホカイン活性化キラー）細胞の細胞溶解活性を促進し、T細胞およびNK細胞によるγインターフェロン（IFNγ）の産生を誘導し、かつナイーブなTh0細胞のIFNγおよびIL-2を産生すTh1細胞への分化を誘導する。特に、IL-12は、細胞溶解細胞（例えば、NKおよびCTL）の産生および細胞性免疫応答（例えば、Th1細胞媒介性免疫応答）を設定するのに絶対に必要である。したがって、IL-12は、防御免疫（例えば、感染症の根絶）および病理学的免疫応答（例えば、自己免疫）の両方を生成する、および調節するのに絶対に必要である。
IL-12の生理活性を測定する方法の例には、IL-12の細胞増殖活性を測定する方法、STAT4 レポーターアッセイ、IL-12による細胞活性化（細胞表面マーカー発現、サイトカイン産生等）を測定する方法、およびIL-12による細胞分化の促進を測定する方法が含まれる。
インターロイキン22（IL-22）は、サイトカインのIL-10ファミリーのメンバーである。これは、T細胞、NKT細胞、3型自然リンパ球（ILC3）等の免疫細胞によって、ならびにより少ない程度であるが好中球およびマクロファージによって分泌される。IL-22は、IL-22R1およびIL-10R2から構成されるヘテロ二量体である、その受容体IL-22Rに結合する。IL-22Rは主に、上皮細胞および間質細胞等の非造血細胞上に発現している。IL-22活性は、IL-22R1に対して高い構造的相同性を有する分泌タンパク質であるIL-22結合タンパク質（IL-22BP；IL-22RA2としても知られる）によって調節される。IL-22BPは、高いアフィニティでIL-22に結合し、IL-22がIL-22R1と相互作用するのを遮断する。
IL-22受容体に対するIL-22の結合は、JAK1およびTYK2キナーゼの活性化をもたらし、これは次に、STAT3シグナル伝達の活性化をもたらす。IL-22は、上皮細胞機能において重要な役割を果たす。例えば、腸管において、IL-22は、腸管上皮細胞の増殖、粘液分泌、および抗微生物ペプチド分泌を刺激することによって、腸のバリアの完全性を促進する。肝臓において、IL-22は、肝損傷中の肝細胞に対して生存因子として作用し、かつまた、肝再生のために増殖するように肝細胞を刺激する。
IL-22の生理活性を測定する方法の例には、IL-22の細胞増殖活性を測定する方法、STAT3 レポーターアッセイ、およびIL-22による細胞活性化（細胞表面マーカー発現、サイトカイン産生等）を測定する方法が含まれる。
インターロイキン2（IL-2）は、単量体サイトカインであり、主に、活性化されたCD4 T細胞およびCD8 T細胞によって分泌される。IL-2は、α、β、およびγの3つのサブユニットからなる、その受容体（IL-2R）に結合する。IL-2Rβおよびγは、シグナル伝達に関与し、IL-2Rαおよびβは、結合に関与する。3つのサブユニットすべてが、高アフィニティのサイトカイン-受容体複合体に重要である。IL-2は、エフェクターT細胞および制御性T細胞の両方に結合して活性化するため、免疫応答の促進および調節の両方のために不可欠である。
IL-2の生理活性を測定する方法の例には、IL-2の細胞増殖活性を測定する方法、IL-2による細胞活性化（細胞表面マーカー発現、サイトカイン産生等）を測定する方法、およびIL-2による細胞分化の促進を測定する方法が含まれる。
本発明のいくつかの態様において、リガンドは、ケモカインである。ケモカインは一般的に、免疫エフェクター細胞をケモカイン発現部位に動員する化学誘引物質として作用する。これは、他の免疫系成分を治療部位に動員する目的で、特定のケモカイン遺伝子を、例えば、サイトカイン遺伝子と共に発現させるために有益と考えられる。そのようなケモカインには、CXCL10、RANTES、MCAF、MIP1-α、およびMIP1-βが含まれる。当業者は、ある特定のサイトカインもまた、化学誘引作用を有することを承知しており、そのようなサイトカインが、「ケモカイン」という用語によって分類され得ることを認めるはずである。
ケモカインは、白血球の遊走を誘導するその能力を元々特徴とする、7～16 kDaの均質な血清タンパク質のファミリーである。ケモカインの大部分は、4つの特徴的なシステイン（Cys）を有し、最初の2つのシステインによって形成されるモチーフに従って、CXCまたはアルファ、CCまたはベータ、Cまたはガンマ、およびCX3Cまたはデルタのケモカインクラスに分類される。2つのジスルフィド結合が、第1と第3のシステインの間、および第2と第4のシステインの間に形成される。一般的に、ジスルフィド架橋は、必要であると考えられている。Clark-Lewisおよび共同研究者らは、少なくともCXCL10のケモカイン活性について、ジスルフィド結合が非常に重要であることを報告している（Clark-Lewis et al., J. Biol. Chem. 269: 16075-16081, 1994）。4つのシステインを有することに対する唯一の例外は、2つのシステイン残基のみを有するリンホタクチンである。したがって、リンホタクチンは、唯一のジスルフィド結合によって、その機能的構造をなんとか維持している。
CXCまたはアルファのサブファミリーは、第1のシステインに先行するELRモチーフ（Glu-Leu-Arg）の存在に従って、2つの群：ELR-CXCケモカインおよび非ELR-CXCケモカインにさらに分類される（例えば、Clark-Lewis、上記；およびBelperio et al., "CXC Chemokines in Angiogenesis", J. Leukoc. Biol. 68: 1-8, 2000参照）。
インターフェロン誘導性タンパク質-10（IP-10またはCXCL10）は、インターフェロン-γおよびTNF-αによって誘導され、角化細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および単球によって産生される。IP-10は、組織の炎症部位への活性化T細胞の動員において役割を果たすと考えられている（Dufour, et al., "IFN-gamma-inducible protein 10 (IP-10; CXCL10)-deficient mice reveal a role for IP-10 in effector T cell generation and trafficking", J Immunol., 168: 3195-204, 2002）。さらに、IP-10は、過敏反応において役割を果たす可能性がある。IP-10はまた、炎症性脱髄性ニューロパチーの発生においても役割を果たす可能性がある（Kieseier, et al., "Chemokines and chemokine receptors in inflammatory demyelinating neuropathies: a central role for IP-10", Brain 125: 823-34, 2002）。
研究により、IP-10が、移植に続く幹細胞の生着（Nagasawa, T., Int. J. Hematol. 72: 408-11, 2000）、幹細胞の動員（Gazitt, Y., J. Hematother Stem Cell Res 10: 229-36, 2001；およびHattori et al., Blood 97: 3354-59, 2001）ならびに抗腫瘍超免疫性（hyperimmunity）（Nomura et al., Int. J. Cancer 91: 597-606, 2001；およびMach and Dranoff, Curr. Opin. Immunol. 12:571-75, 2000）において有用である可能性が示されている。例えば、当業者に公知の以前の報告では、ケモカインの生物活性が議論されている（Bruce, L. et al., "Radiolabeled Chemokine binding assays", Methods in Molecular Biology (2000) vol. 138, pp. 129-134；Raphaele, B. et al. "Calcium Mobilization", Methods in Molecular Biology (2000) vol. 138, pp. 143-148；およびPaul D. Ponath et al., "Transwell Chemotaxis", Methods in Molecular Biology (2000) vol. 138, pp. 113-120 Humana Press. Totowa, New Jersey）。
CXCL10の生物活性の例には、CXCL10受容体（CXCR3）に対する結合、CXCL10により誘導されるカルシウム流、CXCL10により誘導される細胞走化性、グリコサミノグリカンに対するCXCL10の結合、およびCXCL10オリゴマー化が含まれる。
CXCL10の生理活性を測定する方法の例には、CXCL10の細胞走化活性を測定する方法、CXCR3を安定に発現する細胞株を用いたレポーターアッセイ（PLoS One. 2010 Sep 13; 5(9): e12700参照）、およびGPCRシグナル伝達の初期に誘導されるB-アレスチン漸増を用いたPathHunter（商標） β-アレスチン漸増アッセイが含まれる。
プログラム細胞死1（PD-1）タンパク質は、CD28ファミリーの受容体の抑制性メンバーである。CD28ファミリーには、CD28、CTLA-4、ICOS、およびBTLAもまた含まれる。PD-1は、活性化されたB細胞、T細胞、および骨髄細胞上で発現する（Okazaki et al., (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82；およびBennett et al., (2003) J Immunol 170: 711-8）。ファミリーの最初のメンバーであるCD28およびICOSは、モノクローナル抗体添加後のT細胞増殖の上昇に対する機能的影響に基づいて発見された（Hutloff et al., (1999) Nature 397: 263-266；およびHansen et al., (1980) Immunogenics 10: 247-260）。PD-1は、アポトーシス細胞における差次的発現のスクリーニングによって発見された（Ishida et al., (1992) EMBO J 11: 3887-95）。ファミリーの他のメンバーであるCTLA-4およびBTLAは、それぞれ、細胞傷害性Tリンパ球およびTH1細胞における差次的発現のスクリーニングによって発見された。CD28、ICOS、およびCTLA-4はすべて、ホモ二量体化を可能にする、対になっていないシステイン残基を有する。対照的に、PD-1は、単量体として存在すると考えられており、CD28ファミリーの他のメンバーに特徴的な対になっていないシステイン残基が欠如している。
PD-1遺伝子は、Igスーパーファミリーの一部である55 kDaのI型膜貫通タンパク質をコードする。PD-1は、膜近位免疫受容体チロシン抑制モチーフ（ITIM）および膜遠位チロシンベーススイッチモチーフ（ITSM）を含有する。PD-1は、構造的にCTLA-4に類似しているが、B7-1およびB7-2結合に重要なMYPPPYモチーフ（配列番号：159）が欠如している。PD-1に対する2つのリガンド、PD-L1およびPD-L2が同定されており、PD-1に対する結合時にT細胞活性化を負に調節することが示されている（Freeman et al., (2000) J Exp Med 192: 1027-34；Latchman et al., (2001) Nat Immunol 2: 261-8；およびCarter et al., (2002) Eur J Immunol 32: 634-43）。PD-L1およびPD-L2は両方とも、PD-1に結合するが、CD28ファミリーの他のメンバーには結合しないB7ホモログである。PD-1リガンドの1つであるPD-L1は、種々のヒト癌において豊富である（Dong et al., (2002) Nat. Med. 8: 787-9）。PD-1とPD-L1との間の相互作用は、腫瘍浸潤リンパ球の減少、T細胞受容体媒介性増殖の低減、および癌性細胞による免疫回避を結果としてもたらす（Dong et al., (2003) J. Mol. Med. 81: 281-7；Blank et al., (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54: 307-314；およびKonishi et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10: 5094-100）。免疫抑制は、PD-1とPD-L1との局所的相互作用の阻害によって逆転させることができ、この効果は、PD-2とPD-L2との相互作用もまた阻害される時に相加的である（Iwai et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 12293-7；およびBrown et al., (2003) J. Immunol. 170: 1257-66）。
PD-1は、活性化されたB細胞、T細胞、および骨髄細胞上で発現するCD28ファミリーの抑制性メンバーである。PD-1が欠損した動物は、自己免疫性心筋症、ならびに関節炎および腎炎を伴うループス様症候群を含む、種々の自己免疫性表現型を発症する（Nishimura et al., (1999) Immunity 11: 141-51；およびNishimura et al., (2001) Science 291: 319-22）。PD-1は、さらに、自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病（GVHD）、I型真性糖尿病、および関節リウマチにおいて重要な役割を果たすことが見出されている（Salama et al., (2003) J Exp Med 198: 71-78；Prokunia and Alarcon-Riquelme (2004) Hum Mol Genet 13: R143；およびNielsen et al., (2004) Lupus 13: 510）。マウスB細胞腫瘍株において、PD-1のITSMは、BCR媒介性のCa2+流および下流エフェクター分子のチロシンリン酸化を阻害するのに不可欠であることが示されている（Okazaki et al., (2001) PNAS 98: 13866-71）。
本発明のいくつかの態様において、サイトカイン改変体、ケモカイン改変体等（例えば、Annu Rev Immunol. 2015; 33: 139-67）、または改変体を含有する融合タンパク質（例えば、Stem Cells Transl Med. 2015 Jan; 4 (1): 66-73）を、リガンドとして用いることができる。
本発明のいくつかの態様において、リガンドは、CXCL9、CXCL10、CXCL11、PD-1、IL-2、IL-12、IL-22、IL-6R、IL-1R1、IL-1R2、IL-1RAcP、およびIL-1Raから選択される。CXCL10、PD-1、IL-2、IL-12、IL-22、IL-6R、IL-1R1、IL-1R2、IL-1RAcP、およびIL-1Raは、それぞれ、天然に存在するCXCL10、PD-1、IL-2、IL-12、IL-22、IL-6R、IL-1R1、IL-1R2、IL-1RAcP、およびIL-1Raと同じ配列を有していてもよく、または、天然に存在するCXCL9、CXCL10、CXCL11、PD-1、IL-2、IL-12、IL-22、IL-6R、IL-1R1、IL-1R2、IL-1RAcP、およびIL-1Raとは配列が異なるが、対応する天然リガンドの生理活性を保持しているリガンド改変体であってもよい。リガンド改変体を得るために、種々の目的でリガンド配列に改変を人工的に加えてもよい。好ましくは、リガンド改変体を得るために、プロテアーゼ切断に耐性を示す改変（プロテアーゼ耐性改変）を加える。
本発明のいくつかの態様において、リガンド部分または分子の生物活性は、未切断のリガンド結合部分または分子のリガンド結合ドメインに対する結合によって阻害される。リガンドの生物活性が阻害される態様の例には、未切断のリガンド結合部分/分子のリガンド結合ドメインに対するリガンド部分/分子の結合が、リガンドのその結合パートナーに対する結合を実質的にまたは有意に妨害するかまたは競合する態様が含まれるが、それらに限定されない。リガンド結合部分/分子としてリガンド中和活性を有する抗体またはその断片を用いる場合、リガンドに結合したリガンド結合部分/分子は、その中和活性を発揮することによって、リガンドの生物活性を阻害することができる。
本発明の一態様において、好ましくは、未切断のリガンド結合部分または分子は、リガンド部分/分子に対する結合によって、リガンド部分または分子の生物活性を十分に中和することができる。具体的には、未切断のリガンド結合部分/分子に結合したリガンド部分/分子の生物活性は、好ましくは、未切断のリガンド結合部分/分子に結合していないリガンド部分/分子の生物活性よりも低い。未切断のリガンド結合分子に結合したリガンドの生物活性は、これに限定されないが、未切断のリガンド結合分子に結合していないリガンドの生物活性の、例えば、90％以下、好ましくは80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、または30％以下、特に好ましくは20％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、または1％以下であることができる。リガンドの生物活性を十分に中和する、リガンド結合分子の投与により、リガンドが標的組織に到着する前にその生物活性を発揮することが阻止されることが期待できる。
あるいは、本発明は、リガンドの生物活性を中和する方法を提供する。本発明の方法は、本発明のリガンド結合分子を、その生物活性が中和されるべきリガンドと接触させる工程、および2つの分子の結合の産物を収集する工程を含む。収集された結合産物におけるリガンド結合分子の切断により、中和されたリガンドの生物活性を復元することができる。したがって、本発明によるリガンドの生物活性を中和する方法は、リガンドおよびリガンド結合分子からなる結合産物におけるリガンド結合分子を切断すること（換言すると、リガンド結合分子の中和活性を解消すること）によって、リガンドの生物活性を復元する工程をさらに含んでもよい。
本発明の一態様において、切断されたリガンド結合部分または分子のリガンド部分または分子に対する結合活性は、好ましくは、インビボでの天然のリガンド結合パートナー（例えば、リガンドに対する天然の受容体）のリガンドに対する結合活性よりも低い。切断されたリガンド結合部分/分子のリガンド部分/分子に対する結合活性は、これに限定されないが、インビボでの天然の結合パートナーに結合したリガンドの量（単位結合パートナーあたり）の、例えば、90％以下、好ましくは80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、または30％以下、特に好ましくは20％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、または1％以下を示す。結合活性についての指標として、所望の指標が適宜用いられてもよい。例えば、解離定数（KD）が用いられてもよい。結合活性を評価するための指標として解離定数（KD）を用いる場合、インビボでの天然のリガンド結合パートナーのリガンドに対するものよりも大きい、切断されたリガンド結合部分/分子のリガンドに対する解離定数（KD）は、切断されたリガンド結合分子が、インビボでの天然の結合パートナーのものよりも弱い、リガンドに対する結合活性を有することを意味する。切断されたリガンド結合分子のリガンドに対する解離定数（KD）は、インビボでの天然のリガンド結合パートナーのリガンドに対する解離定数（KD）の、例えば、少なくとも1.1倍、好ましくは少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍、特に好ましくは少なくとも100倍である。切断後にリガンドに対して低い結合活性しか有さない、またはリガンドに対して結合活性をほとんど有さないリガンド結合分子により、リガンド結合分子の切断によってリガンドが遊離されることが保証され、かつ別のリガンド分子に再び結合するのが阻止されることが期待され得る。
リガンドは、望ましくは、リガンド結合分子の切断後に、抑制された生物活性を復元する。望ましくは、切断されたリガンド結合分子のリガンド結合は、リガンド結合分子のリガンド生物活性阻害機能も減弱されるように、減弱される。当業者は、公知の方法、例えば、リガンドのその結合パートナーに対する結合を検出する方法によって、リガンドの生物活性を確認することができる。
本発明のいくつかの態様において、未切断のリガンド結合分子は、抗原抗体結合を通してリガンドとの複合体を形成する。より具体的な態様において、リガンド結合分子とリガンドとの複合体は、リガンド結合分子とリガンドとの間の非共有結合、例えば、抗原抗体結合を通して形成される。
本発明において、融合タンパク質を形成するように、未切断のリガンド結合分子をリガンド分子と融合させる。融合タンパク質中のリガンド結合部分のリガンド結合ドメインとリガンド部分とは、抗原抗体結合を通してさらに互いに相互作用する。リガンド結合分子とリガンドとは、ペプチドリンカーを介して融合させることができる。融合タンパク質中のリガンド結合分子とリガンドとが、ペプチドリンカーを介して融合している場合であっても、リガンド結合部分のリガンド結合ドメインとリガンド部分との間には、非共有結合が依然として存在する。換言すると、リガンド結合分子がリガンドと融合している態様においても、リガンド結合部分のリガンド結合ドメインとリガンド部分との間の非共有結合は、リガンド結合分子がリガンドと融合していない場合と類似している。非共有結合は、リガンド結合部分/分子の切断によって減弱される。要するに、リガンド結合部分/分子のリガンド結合が減弱される。
本発明において、リガンド結合部分または分子とリガンド部分または分子とを、ペプチドリンカーを介して融合させる。例えば、遺伝子工学によって導入することができる任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカーとして開示されるリンカー（例えば、Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996参照）を、リガンド結合分子とリガンドとの融合におけるリンカーとして用いることができる。ペプチドリンカーの長さは、特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択してもよい。ペプチドリンカーの例には、
Ser
Gly Ser（GS）
Ser Gly（SG）
Gly Gly Ser（GGS）
Gly Ser Gly（GSG）
Ser Gly Gly（SGG）
Gly Ser Ser（GSS）
Ser Ser Gly（SSG）
Ser Gly Ser（SGS）
Gly Gly Gly Ser（GGGS、配列番号：136）
Gly Gly Ser Gly（GGSG、配列番号：137）
Gly Ser Gly Gly（GSGG、配列番号：138）
Ser Gly Gly Gly（SGGG、配列番号：139）
Gly Ser Ser Gly（GSSG、配列番号：140）
Gly Gly Gly Gly Ser（GGGGS、配列番号：141）
Gly Gly Gly Ser Gly（GGGSG、配列番号：142）
Gly Gly Ser Gly Gly（GGSGG、配列番号：143）
Gly Ser Gly Gly Gly（GSGGG、配列番号：144）
Gly Ser Gly Gly Ser（GSGGS、配列番号：145）
Ser Gly Gly Gly Gly（SGGGG、配列番号：146）
Gly Ser Ser Gly Gly（GSSGG、配列番号：147）
Gly Ser Gly Ser Gly（GSGSG、配列番号：148）
Ser Gly Gly Ser Gly（SGGSG、配列番号：149）
Gly Ser Ser Ser Gly（GSSSG、配列番号：150）
Gly Gly Gly Gly Gly Ser（GGGGGS、配列番号：151）
Ser Gly Gly Gly Gly Gly（SGGGGG、配列番号：152）
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser（GGGGGGS、配列番号：153）
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly（SGGGGGG、配列番号：154）
（Gly Gly Gly Gly Ser（GGGGS、配列番号：141）)n
（Ser Gly Gly Gly Gly（SGGGG、配列番号：146）)n
（nは1以上の整数である）
が含まれ得るが、それらに限定されない。
しかし、ペプチドリンカーの長さおよび配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
合成化合物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチド架橋に通常用いられる架橋剤、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジスクシンイミジルスベラート（DSS）、ビス(スルホスクシンイミジル)スベラート（BS3）、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)（DSP）、ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオナート)（DTSSP）、エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシナート)（EGS）、エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシナート)（スルホ-EGS）、ジスクシンイミジルタルトラート（DST）、ジスルホスクシンイミジルタルトラート（スルホ-DST）、ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン（BSOCOES）、またはビス[2-(スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン（スルホ-BSOCOES）である。
これらの架橋剤は、市販されている。
本願のいくつかの態様において、リガンド部分は、IL-12を含み、かつリガンド結合部分（または融合タンパク質）は、以下からなる群より選択される抗体重鎖および軽鎖を含む：
（a）配列番号：874のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：875のアミノ酸配列を含む重鎖；
（b）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：880のアミノ酸配列を含む重鎖；
（c）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：881のアミノ酸配列を含む重鎖；
（d）配列番号：874のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：884のアミノ酸配列を含む重鎖；
（e）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：885のアミノ酸配列を含む重鎖；
（f）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：886のアミノ酸配列を含む重鎖；
（g）配列番号：887のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：888のアミノ酸配列を含む重鎖；
（h）配列番号：890のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：891のアミノ酸配列を含む重鎖；
（i）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：904のアミノ酸配列を含む重鎖；
（j）配列番号：906のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：907のアミノ酸配列を含む重鎖；
（k）配列番号：876のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：909のアミノ酸配列を含む重鎖；ならびに
（l）（a）～（k）に記載される抗体重鎖および抗体軽鎖と競合する、抗体重鎖および軽鎖。
本願のいくつかの態様において、リガンド部分は、IL-12を含み、かつリガンド結合部分は、以下の（a）～（l）から選択されるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域、またはそれに対して機能的に等価の抗体可変領域のH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域を含む：
（a）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：875に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：874に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（b）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：880に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（c）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：881に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（d）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：884に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：874に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（e）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：885に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（f）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：886に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（g）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：888に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：887に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（h）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：891に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：890に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（i）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：904に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（j）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：907に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：906に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（k）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：909に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：876に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；ならびに
（l）（a）～（k）に記載される抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域と競合する抗体可変領域に含まれる、H鎖およびL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3。
本願のいくつかの態様において、リガンド部分は、IL-12を含み、かつリガンド結合部分は、以下の（a）～（l）から選択される重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）の組み合わせのいずれか1つを含む：
（a）配列番号：875に含まれるVH；および配列番号：874に含まれるVL；
（b）配列番号：880に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；
（c）配列番号：881に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；
（d）配列番号：884に含まれるVH；および配列番号：874に含まれるVL；
（e）配列番号：885に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；
（f）配列番号：886に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；
（g）配列番号：888に含まれるVH；および配列番号：887に含まれるVL；
（h）配列番号：891に含まれるVH；および配列番号：890に含まれるVL；
（i）配列番号：904に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；
（j）配列番号：907に含まれるVH；および配列番号：906に含まれるVL；
（k）配列番号：909に含まれるVH；および配列番号：876に含まれるVL；ならびに
（l）（a）～（k）に記載されるVHおよびVLと競合する、VHおよびVL。
いくつかの態様において、本明細書における表2および3に示すように、リガンド部分は、IL-12を含み、かつ融合タンパク質は、以下の（a）～（d）から選択される組み合わせのいずれか1つを含む：
（a）配列番号：876の配列を含む第1の軽鎖、配列番号：881の配列を含む第1の重鎖、配列番号：882の配列を含む第2の軽鎖、および配列番号：883の配列を含む第2の重鎖；
（b）配列番号：876の配列を含む第1の軽鎖、配列番号：886の配列を含む第1の重鎖、配列番号：882の配列を含む第2の軽鎖、および配列番号：883の配列を含む第2の重鎖；
（c）配列番号：887の配列を含む第1の軽鎖、配列番号：888の配列を含む第1の重鎖、配列番号：882の配列を含む第2の軽鎖、および配列番号：883の配列を含む第2の重鎖；ならびに
（d）配列番号：890の配列を含む第1の軽鎖、配列番号：891の配列を含む第1の重鎖、配列番号：882の配列を含む第2の軽鎖、および配列番号：883の配列を含む第2の重鎖。
本願のいくつかの態様において、リガンド部分は、IL-22を含み、かつリガンド結合部分（または融合タンパク質）は、以下からなる群より選択される抗体重鎖および軽鎖を含む：
（a）配列番号：912のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：913のアミノ酸配列を含む重鎖；
（b）配列番号：915のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：916のアミノ酸配列を含む重鎖；ならびに
（c）配列番号：912のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：929のアミノ酸配列を含む重鎖；
（d）配列番号：912のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：930のアミノ酸配列を含む重鎖；ならびに
（e）（a）～（d）に記載される抗体重鎖および抗体軽鎖と競合する、抗体重鎖および軽鎖。
本願のいくつかの態様において、リガンド部分は、IL-22を含み、かつリガンド結合部分は、以下の（a）～（e）から選択されるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域、またはそれに対して機能的に等価の抗体可変領域のH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域を含む：
（a）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：913に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：912に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（b）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：916に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：915に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（c）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：929に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：912に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（d）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：930に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：912に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；ならびに
（e）（a）～（d）に記載される抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域と競合する抗体可変領域に含まれる、H鎖およびL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3。
本願のいくつかの態様において、リガンド部分は、IL-22を含み、かつリガンド結合部分は、以下の（a）～（e）から選択される重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）の組み合わせのいずれか1つを含む：
（a）配列番号：913に含まれるVH；および配列番号：912に含まれるVL；
（b）配列番号：916に含まれるVH；および配列番号：915に含まれるVL；
（c）配列番号：929に含まれるVH；および配列番号：912に含まれるVL；
（d）配列番号：930に含まれるVH；および配列番号：912に含まれるVL；ならびに
（e）（a）～（d）に記載されるVHおよびVLと競合する、VHおよびVL。
本願のいくつかの態様において、リガンド部分は、IL-2を含み、かつリガンド結合部分（または融合タンパク質）は、以下からなる群より選択される抗体重鎖および軽鎖を含む：
（a）配列番号：920のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：919のアミノ酸配列を含む重鎖；
（b）配列番号：923のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号：922のアミノ酸配列を含む重鎖；ならびに
（c）（a）～（b）に記載される抗体重鎖および抗体軽鎖と競合する、抗体重鎖および軽鎖。
本願のいくつかの態様において、リガンド部分は、IL-2を含み、かつリガンド結合部分は、以下の（a）～（c）から選択されるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域、またはそれに対して機能的に等価の抗体可変領域のH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の組み合わせのいずれか1つを含む抗体可変領域を含む：
（a）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：919に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：920に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；
（b）抗体可変領域に含まれるH鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：922に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一であり；かつ抗体可変領域に含まれるL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3が、配列番号：923に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3領域のアミノ酸配列と同一である；ならびに
（c）（a）～（b）に記載される抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域と競合する抗体可変領域に含まれる、H鎖およびL鎖CDR1、CDR2、およびCDR3。
本願のいくつかの態様において、リガンド部分は、IL-2を含み、かつリガンド結合部分は、以下の（a）～（c）から選択される重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）の組み合わせのいずれか1つを含む：
（a）配列番号：919に含まれるVH；および配列番号：920に含まれるVL；
（b）配列番号：922に含まれるVH；および配列番号：923に含まれるVL；ならびに
（c）（a）～（b）に記載されるVHおよびVLと競合する、VHおよびVL。
本発明はまた、本発明の融合タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物（医薬品）にも関する。
ある特定の態様において、本開示の医薬組成物は、細胞増殖抑制剤である。ある特定の態様において、本開示の医薬組成物は、癌または悪性腫瘍の治療および/または予防のために使用される医薬組成物である。
ある特定の態様において、本開示の医薬組成物は、炎症性疾患の治療および/または予防のために使用される医薬組成物である。ある特定の態様において、本開示の医薬組成物は、腸および肝臓の炎症性疾患の治療および/または予防のために使用される医薬組成物である。ある特定の態様において、本開示の医薬組成物は、炎症性腸疾患、アルコール性脂肪肝疾患、または非アルコール性脂肪肝疾患の治療および/または予防のために使用される医薬組成物である。ある特定の態様において、本開示の医薬組成物は、潰瘍性大腸炎またはクローン病の治療および/または予防のために使用される医薬組成物である。
ある特定の態様において、本開示の医薬組成物は、自己免疫疾患の治療および/または予防のために使用される医薬組成物である。ある特定の態様において、本開示の医薬組成物は、関節リウマチ、1型糖尿病、およびSLEの治療および/または予防のために使用される医薬組成物である。
本明細書で用いられる「治療」（およびその文法上の派生語、例えば、「治療する」および「治療すること」）は、治療される個体の自然経過を改変することを企図した臨床的介入を意味し、予防のためおよび臨床的病態の経過の間の両方に実施され得る。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の防止、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的影響の減弱、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態からの回復またはその緩和、および寛解または改善された予後が含まれるが、それらに限定されない。いくつかの態様において、本発明のリガンド結合分子は、リガンドの生物活性を制御することができ、疾患の発症を遅らせる、または疾患の進行を遅らせるために用いられる。
本発明において、医薬組成物とは、通常、疾患の治療もしくは予防のため、または検査もしくは診断のための医薬品のことをいう。
本発明において、用語「融合タンパク質を含む医薬組成物」は、「治療されるべき対象に融合タンパク質を投与する工程を含む、疾患を治療する方法」と互換的に用いられてもよく、かつ「疾患の治療用の医薬品の製造のための融合タンパク質の使用」と互換的に用いられてもよい。また、用語「融合タンパク質を含む医薬組成物」は、「疾患を治療するための融合タンパク質の使用」と互換的に用いられてもよい。
本発明のいくつかの態様において、本発明の融合タンパク質を、個体に投与することができる。リガンド結合部分のリガンド結合ドメインとリガンド部分との間には、非共有結合が依然として存在する。本発明の融合タンパク質を個体に投与した場合、融合タンパク質は、インビボで運搬される。融合タンパク質中のリガンド結合部分は、標的組織において切断され、そのためにリガンドに対するリガンド結合分子部分のリガンド結合ドメインの非共有結合が減弱されて、リガンドおよびリガンド結合分子の一部分を融合タンパク質から遊離させる。遊離されたリガンドおよび遊離されたリガンド結合分子の一部分は、標的組織においてリガンドの生物活性を発揮し、標的組織によって引き起こされる疾患を治療することができる。リガンド結合ドメインがリガンドに結合している場合には、リガンド結合部分がリガンド部分の生物活性を抑制し、リガンド結合部分が標的組織において特異的に切断される態様において、融合タンパク質中のリガンドは、運搬中には生物活性を発揮せず、融合タンパク質が標的組織において切断された時のみに生物活性を発揮する。結果として、全身有害反応がより少ない状態で、疾患を治療することができる。
本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法の使用によって製剤化することができる。例えば、医薬組成物は、水または他の薬学的に許容される液体の任意を伴う無菌の溶液または懸濁液の注射形態で、非経口的に使用することができる。医薬組成物は、例えば、ペプチドを、薬理学的に許容される担体または媒体、具体的には、滅菌水または生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせること、およびそれらを混合して、一般的に認められた製薬実施に要求される単位剤形にすることによって、製剤化することができる。これらの製剤における有効成分の量は、処方された範囲で適切な体積をもたらすように設定される。
注射のための無菌組成物は、注射用蒸留水等のビヒクルを用いて、通常の製剤実施に従って製剤化することができる。注射用の水溶液の例には、生理食塩水、ブドウ糖、または他の補助薬（例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、および塩化ナトリウム）を含有する等張液が含まれる。水溶液は、適切な溶解補助剤、例えば、アルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、または非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80（商標）、HCO-50等）と組み合わせて用いることができる。
油剤の例には、ゴマ油および大豆油が含まれる。油剤はまた、溶解補助剤としての安息香酸ベンジルおよび/またはベンジルアルコールと組み合わせて用いることもできる。油剤には、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコールおよびフェノール）、ならびに酸化防止剤を補給することができる。調製された注射液は、通常、適切なアンプルに充填される。
本発明の医薬組成物は、好ましくは、非経口経路を通して投与される。例えば、注射剤形、経鼻剤形、経肺剤形、または経皮剤形を有する組成物が投与される。医薬組成物は、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、または皮下注射によって、全身にまたは局部的に投与され得る。
投与方法は、患者の年齢および症状に従って適宜選択することができる。リガンド結合分子を含有する医薬組成物の投与量は、例えば、1投与量につき体重1 kgあたり0.0001 mg～1000 mgの範囲に設定することができる。あるいは、ポリペプチドを含有する医薬組成物の投与量は、例えば、患者あたり0.001～100000 mgの投与量に設定することができる。しかし、本発明は、これらの数値によって必ずしも制限されない。投与量および投与方法は、患者の体重、年齢、症状等に応じて変動するが、当業者は、これらの条件を考慮して適切な投与量および投与方法を設定することができる。
本発明はまた、本発明の融合タンパク質を製造する方法にも関する。一態様において、本発明は、
（a）リガンド結合ドメインと少なくとも1つの第1のプロテアーゼ切断サイトとを含む、リガンド結合分子、
（b）少なくとも1つのリガンド分子、および
（c）少なくとも1つのペプチドリンカー
を提供する工程；ならびに
少なくとも1つのペプチドリンカーを介して、少なくとも1つのリガンド分子をリガンド結合分子のC末端領域に接続する工程；
を含む、融合タンパク質を製造する方法を提供する。
リガンドに結合することができる分子中にプロテアーゼ切断配列を導入する方法の例には、リガンドに結合することができるポリペプチドのアミノ酸配列中にプロテアーゼ切断配列を挿入する方法、およびリガンドに結合することができるポリペプチドのアミノ酸配列の一部分をプロテアーゼ切断配列で置き換える方法が含まれる。
アミノ酸配列Aをアミノ酸配列B中に「挿入する」ことは、アミノ酸配列Bを、欠失を伴わない2つのパートに分割すること、および該2つのパートをアミノ酸配列Aで連結すること（すなわち、「アミノ酸配列Bの前半-アミノ酸配列A-アミノ酸配列Bの後半」のようなアミノ酸配列を製造すること）をいう。アミノ酸配列Aをアミノ酸配列B中に「導入する」ことは、アミノ酸配列Bを2つのパートに分割すること、および該2つのパートの間をアミノ酸配列Aで連結することをいう。これは、上述のようにアミノ酸配列Aをアミノ酸配列B中に「挿入すること」だけではなく、アミノ酸配列Aに隣接するアミノ酸残基を含むアミノ酸配列Bの1個または複数個のアミノ酸残基を欠失させた後に、アミノ酸配列Aで2つのパートを連結すること（すなわち、アミノ酸配列Bの一部分をアミノ酸配列Aで置き換えること）も包含する。
リガンドに結合することができる分子を取得する方法の例には、リガンドに結合する能力を有するリガンド結合領域を取得する方法が含まれる。リガンド結合領域は、例えば、当技術分野で公知の抗体調製法を用いた方法によって取得される。
調製法によって得られた抗体は、融合タンパク質において直接用いられてもよく、または得られた抗体におけるFv領域のみが用いられてもよい。一本鎖（「sc」ともいう）形態のFv領域が、抗原を認識することができる場合には、該一本鎖のみが用いられてもよい。あるいは、Fv領域を含有するFab領域が用いられてもよい。
具体的な抗体調製法は、当業者に周知である。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)）または組換え法（米国特許第4,816,567号）によって製造されてもよい。あるいは、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイ抗体ライブラリから単離されてもよい（Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)；およびMarks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)）。また、モノクローナル抗体は、単一B細胞クローンから単離されてもよい（N. Biotechnol. 28(5): 253-457 (2011)）。
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも呼ばれる。具体的には、例えば、非ヒト動物（例えば、マウス）抗体のCDRが移植されたヒト抗体からなるヒト化抗体が、当技術分野で公知である。ヒト化抗体を取得するための一般的な遺伝子組換えアプローチもまた、公知である。具体的には、マウス抗体のCDRをヒトFRに移植するための方法として、例えば、オーバーラップ伸長PCRが公知である。
連結された3つのCDRおよび4つのFRを含有する抗体可変領域をコードするDNAと、ヒト抗体定常領域をコードするDNAとを、これらのDNAがインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入して、ヒト化抗体発現用ベクターを調製することができる。挿入物を有するベクターを、宿主中にトランスフェクトして、組換え細胞を樹立する。次いで、ヒト化抗体をコードするDNAの発現のために組換え細胞を培養して、ヒト化抗体を培養細胞の培養物中に産生させる（欧州特許公開第239400号および国際公開番号WO1996/002576参照）。
必要な場合には、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するように、FRのアミノ酸残基が置換されてもよい。例えば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いられるPCR法の応用によって、FRのアミノ酸配列に変異を導入することができる。
ヒト抗体遺伝子のすべてのレパートリーを有するトランスジェニック動物（国際公開番号WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、およびWO1996/033735参照）を免疫動物として用いたDNA免疫によって、所望のヒト抗体を取得することができる。
加えて、ヒト抗体ライブラリを用いたパニングによってヒト抗体を取得する技法もまた、公知である。例えば、ヒト抗体Fv領域を、一本鎖抗体（「scFv」ともいう）として、ファージディスプレイ法によってファージの表面上に発現させる。抗原結合scFvを発現するファージを、選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析して、抗原結合ヒト抗体のFv領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原結合scFvのDNA配列の決定後に、Fv領域配列を、所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させ、次いで、適切な発現ベクター中に挿入して、発現ベクターを調製することができる。ヒト抗体をコードする遺伝子の発現のために、発現ベクターを上に列記した好ましい発現細胞中にトランスフェクトして、ヒト抗体を取得する。これらの方法は、当技術分野で既知である（国際公開番号WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、およびWO1995/015388参照）。
リガンドに結合することができる分子中にプロテアーゼ切断配列を持つ分子は、本発明におけるリガンド結合部分または分子として働く。リガンド結合部分/分子が、プロテアーゼ切断配列に適切なプロテアーゼでの処理によって切断されるかどうかを、任意で確認することができる。例えば、プロテアーゼを、リガンドに結合することができる分子中にプロテアーゼ切断配列を持つ分子と接触させること、およびプロテアーゼ処理産物の分子量を、SDS-PAGE等の電気泳動法により確認することによって、プロテアーゼ切断配列の切断の有無を確認することができる。
さらに、プロテアーゼの活性、およびプロテアーゼ切断配列が導入されている分子の切断率を評価するために、プロテアーゼ処理後の切断断片を、SDS-PAGE等の電気泳動によって分離し、定量することができる。プロテアーゼ切断配列が導入されている分子の切断率を評価する方法の非限定的な態様には、以下の方法が含まれる。例えば、プロテアーゼ切断配列が導入されている抗体改変体の切断率を、組換えヒトu-プラスミノーゲン活性化因子/ウロキナーゼ（ヒトuPA、huPA）（R&D Systems;1310-SE-010）または組換えヒトマトリプターゼ/ST14触媒ドメイン（ヒトMT-SP1、hMT-SP1）（R&D Systems; 3946-SE-010）を用いて評価する場合は、100マイクログラム/mLの抗体改変体を、40 nMのhuPAまたは3 nMのhMT-SP1と、PBSにおいて37℃で1時間反応させ、次いで、キャピラリー電気泳動イムノアッセイに供する。キャピラリー電気泳動イムノアッセイは、Wes（Protein Simple）を用いて行うことができるが、本方法は、それに限定されない。キャピラリー電気泳動イムノアッセイに対する代替として、分離のためにSDS-PAGE等を行い、続いてウエスタンブロッティングでの検出を行ってもよい。本方法は、これらの方法に限定されない。切断の前後に、抗ヒトλ鎖HRP標識抗体（abcam; ab9007）を用いて軽鎖を検出することができるが、切断断片を検出することができる任意の抗体を用いてもよい。プロテアーゼ処理後に得られた各ピークの面積を、Wes用のソフトウェア（Compass for SW; Protein Simple）を用いて出力し、抗体改変体の切断率（％）を、以下の式で決定することができる。
（切断された軽鎖のピーク面積）×100／（切断された軽鎖のピーク面積＋未切断の軽鎖のピーク面積）
切断率は、プロテアーゼ処理の前後にタンパク質断片を検出することができれば、決定することができる。したがって、切断率は、抗体改変体についてだけではなく、プロテアーゼ切断配列が導入されている種々のタンパク質分子についても決定することができる。
プロテアーゼ切断配列が導入されている分子のインビボ切断率は、分子を動物に投与すること、および血液サンプル中の投与された分子を検出することによって決定することができる。例えば、プロテアーゼ切断配列が導入されている抗体改変体を、マウスに投与し、それらの血液サンプルから血漿を収集する。Dynabeads Protein A（Thermo; 10001D）を用いて当業者に公知の方法により血漿から抗体を精製し、次いで、キャピラリー電気泳動イムノアッセイに供して、抗体改変体のプロテアーゼ切断率を評価する。キャピラリー電気泳動イムノアッセイは、Wes（Protein Simple）を用いて行うことができるが、本方法は、それに限定されない。キャピラリー電気泳動イムノアッセイに対する代替として、分離のためにSDS-PAGE等を行い、続いてウエスタンブロッティングでの検出を行ってもよい。本方法は、これらの方法に限定されない。抗ヒトλ鎖HRP標識抗体（abcam; ab9007）を用いて、マウスから収集された抗体改変体の軽鎖を検出することができるが、切断断片を検出することができる任意の抗体を用いてもよい。キャピラリー電気泳動イムノアッセイによって得られた各ピークの面積を、ひとたびWes用のソフトウェア（Compass for SW; Protein Simple）を用いて出力すると、残った軽鎖の比率を［軽鎖のピーク面積］／［重鎖のピーク面積］として算出して、マウスの体において切断されないままである全長軽鎖の比率を決定することができる。インビボ切断効率は、生体から収集されたタンパク質断片が検出可能であれば、決定することができる。したがって、切断率は、抗体改変体についてだけではなく、プロテアーゼ切断配列が導入されている種々のタンパク質分子についても決定することができる。上述の方法による切断率の算出によって、例えば、異なる切断配列が導入されている抗体改変体のインビボ切断率の比較、および正常マウスモデルと腫瘍移植マウスモデル等の異なる動物モデル間での単一抗体改変体の切断率の比較が可能である。
本発明はまた、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにも関する。
本発明によるポリヌクレオチドは、通常、適切なベクターによって保有され（それに挿入され）、宿主細胞中にトランスフェクトされる。ベクターは、該ベクターが挿入された核酸を安定に保持することができる限り、特に限定されない。例えば、宿主として大腸菌が用いられる場合、pBluescriptベクター（Stratagene Corp.製）等が、クローニング用ベクターとして好ましい。種々の市販されているベクターを、用いることができる。本発明の融合タンパク質を製造する目的でベクターを用いる場合には、発現ベクターが特に有用である。発現ベクターは、インビトロでの、大腸菌における、培養細胞における、または生物個体における融合タンパク質の発現を該ベクターが可能にする限り、特に限定されない。発現ベクターは、好ましくは、例えば、インビトロ発現用のpBESTベクター（Promega Corp.製）、大腸菌用のpETベクター（Invitrogen Corp.製）、培養細胞用のpME18S-FL3ベクター（GenBankアクセッション番号AB009864）、および生物個体用のpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8: 466-472 (1988)）である。本発明のDNAのベクター中への挿入は、常法、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応によって行うことができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4-11.11）。
宿主細胞は、特に限定されず、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。融合タンパク質を発現させるための細胞の例には、細菌細胞（例えば、連鎖球菌属（Streptococcus）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、大腸菌、ストレプトマイセス属（Streptmyces）、および枯草菌（Bacillus subtilis））、真菌細胞（例えば、酵母およびアスペルギルス属（Aspergillus））、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ属（Drosophila）S2およびスポドプテラ属（Spodoptera）SF9）、動物細胞（例えば、CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、およびBowes メラノーマ細胞）、ならびに植物細胞が含まれ得る。宿主細胞へのベクターのトランスフェクションは、当技術分野で公知の方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、エレクトロポレーション法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、Lipofectamine法（GIBCO-BRL/Thermo Fisher Scientific Inc.製）、またはマイクロインジェクション法によって行われてもよい。
宿主細胞において発現した融合タンパク質を、小胞体の内腔、細胞周辺腔、または細胞外環境に分泌させるために、適切な分泌シグナルを、目的の融合タンパク質中に組み込むことができる。シグナルは、目的の融合タンパク質に対して内因性であってもよく、または異種シグナルであってもよい。
本発明の融合タンパク質が培地中に分泌される場合、製造方法における融合タンパク質の回収は、培地の回収によって行われる。本発明の融合タンパク質が細胞中に産生される場合は、細胞をまず溶解し、続いて融合タンパク質を回収する。
本発明の融合タンパク質を組換え細胞培養物から回収し、精製するために、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む当技術分野で公知の方法を用いることができる。
本明細書に記載される1つまたは複数の態様の任意の組み合わせもまた、当業者の技術常識に基づいて技術的矛盾がない限り、本発明に含まれることが、当業者によって理解されるべきである。また、本明細書に記載される1つまたは複数の態様の任意の組み合わせを除外した本発明も、当業者の技術常識に基づいて技術的矛盾がない限り、本明細書において意図され、記載される発明とみなされるべきである。
実施例1. プロテアーゼにより切断可能なリンカーを有するIL-12融合抗体の調製
IL-12は、T、NK、およびB細胞等の種々の細胞を活性化する炎症誘発性サイトカインである。IL-12は、抗腫瘍効力を示すことが知られているが、その全身曝露は重度の毒性を引き起こし、これが、効力を示すのに十分な投薬を妨げている。この限界を克服するために、腫瘍特異的プロテアーゼを活用することによって腫瘍の周囲でのみIL-12を遊離させることができる、IL-12遊離抗体を開発した。
1-1. IL-12遊離型の調製
p40（配列番号：871）およびp35（配列番号：872）から構成されるIL-12分子を、様々な様式でプロテアーゼにより切断可能なリンカー（配列番号：873）を通して抗IL-12抗体と融合させることによって、種々のIL-12遊離型抗体を構築した。抗IL-12抗体である、Mab80（WO2010017598）を使用した。別段言及しない限り、Fc領域は、FcγR結合を廃するための変異（EUナンバリングでL235R/G236R）を含有する改変されたIgG1 Fc領域である。
F2二価IL-12遊離Mab80は、軽鎖（配列番号：874）と重鎖（配列番号：875）とのペアのホモ二量体である。軽鎖において、p40サブユニットを、切断可能リンカー（配列番号：877）を介してMab80VL-k0（配列番号：876）のN末端に付加した。重鎖において、切断可能リンカー（配列番号：873）を、Mab80VH（配列番号：878）とCH1ドメインとの間のエルボーヒンジ領域中に導入した。GSリンカーをヒンジ領域に挿入し、p35サブユニットを、切断可能リンカー（配列番号：879）を介してFcドメインのC末端に付加した。ひとたびこれらの切断可能リンカーがプロテアーゼによって消化されると、活性を有するIL-12分子が遊離される（図1A）。
F4二価IL-12遊離Mab80（図1B）は、軽鎖（配列番号：876）と重鎖（配列番号：880）とのホモ二量体である。Mab80VL-k0（配列番号：876）を、改変を伴わない軽鎖として使用した。重鎖において、切断可能リンカーを、Mab80VH（配列番号：878）とCH1ドメインとの間のエルボーヒンジ領域中に導入した。GSリンカーをヒンジ領域に挿入し、一本鎖IL-12を、切断可能リンカー（配列番号：879）を介してFcドメインのC末端に付加した。ひとたびこれらの切断可能リンカーがプロテアーゼによって消化されると、活性を有するIL-12分子が遊離される（図1B）。
F4一価IL-12遊離Mab80（図1C）は、軽鎖1（配列番号：876）/重鎖1（配列番号：881）および軽鎖2（配列番号：882）/重鎖2（配列番号：883）のペアのヘテロ二量体である。重鎖1（配列番号：881）において、切断可能リンカーを、Mab80VH（配列番号：878）とCH1ドメインとの間のエルボーヒンジ領域中に導入した。抗KLH抗体を、重鎖2および軽鎖2において可変領域として用いた。ヘテロ二量体化および重鎖と軽鎖との正確な会合を促進するために、重鎖CH3ドメインにノブ-イントゥ-ホール（knobs-into-holes）変異（Nat. Biotechnol, 1998, 16, 677-681）を導入し、重鎖2および軽鎖2においてCrossMab技術（PNAS, 2011, 108, 11187-11192）を使用した。Mab80VL-k0（配列番号：876）を、改変を伴わない軽鎖1として使用した。重鎖1および重鎖2は、それぞれ、ノブ変異（Y349C/T366W）およびホール変異（E356C/T366S/L368A/Y407V）を含有する。軽鎖2は、抗KLHのVHドメインとヒトκ定常領域とから構成されていた。重鎖2は、抗KLHのVLドメインおよび改変されたIgG1 Fc領域から構成されていた。
各鎖の発現ベクターを、当業者に公知の方法によって調製し、表2に示すように各鎖を組み合わせることによって、Expi293（Life Technologies Corp.）を用いて発現させた。抗体の精製は、MabSelect SuRe（カタログ番号：17-5438-01、GE Healthcare）によるアフィニティ精製、およびそれに続くSuperdex 200ゲル濾過カラム（カタログ番号：28-9893-35、GE Healthcare）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて行った。アフィニティクロマトグラフィーからの溶出液中に存在する凝集物はいずれも、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて除去した。
（表２）IL-12遊離抗体および各鎖の配列ID
Figure 2023510994000013
1-2. IL-12融合型の調製
p40（配列番号：871）およびp35（配列番号：872）から構成されるIL-12分子を、GSリンカーを通して抗IL-12抗体と融合させることによって、IL-12融合型抗体を構築した。抗IL-12抗体として、Mab80（WO2010017598）、ウステキヌマブ（WO2002012500）、およびJ695（WO2000056772）を使用した。別段言及しない限り、Fc領域は、FcγR結合を廃するための変異（EUナンバリングでL235R/G236R）を含有する改変されたIgG1 Fc領域である。
F2二価IL-12融合Mab80は、軽鎖（配列番号：874）と重鎖（配列番号：884）とのペアのホモ二量体である。軽鎖において、p40サブユニットを、切断可能リンカー（配列番号：877）を介してMab80VL-k0（配列番号：876）のN末端に付加した。重鎖において、切断可能リンカーを、Mab80VH（配列番号：878）とCH1ドメインとの間のエルボーヒンジ領域中に導入した。GSリンカーをヒンジ領域に挿入し、p35サブユニットを、GSリンカーを介してFcドメインのC末端に付加した。ひとたびこれらの切断可能リンカーがプロテアーゼによって消化されると、活性を有するIL-12分子融合Fcが遊離される（図2A）。
F4二価IL-12融合Mab80（図2B）は、軽鎖（配列番号：876）と重鎖（配列番号：885）とのホモ二量体である。Mab80VL-k0（配列番号：876）を、改変を伴わない軽鎖として使用した。重鎖において、切断可能リンカーを、Mab80VH（配列番号：878）とCH1ドメインとの間のエルボーヒンジ領域中に導入した。GSリンカーをヒンジ領域に挿入し、一本鎖IL-12を、GSリンカーを介してFcドメインのC末端に付加した。ひとたびこれらの切断可能リンカーがプロテアーゼによって消化されると、活性を有するIL-12分子融合Fcが遊離される（図2B）。
F4一価IL-12融合Mab80（図2C）は、軽鎖1（配列番号：876）/重鎖1（配列番号：886）および軽鎖2（配列番号：882）/重鎖2（配列番号：883）のペアのヘテロ二量体である。重鎖1（配列番号：886）において、切断可能リンカーを、Mab80VH（配列番号：878）とCH1ドメインとの間のエルボーヒンジ領域中に導入した。抗KLH抗体を、重鎖2および軽鎖2において可変領域として用いた。ヘテロ二量体化および重鎖と軽鎖との正確な会合を促進するために、重鎖CH3ドメインにノブ-イントゥ-ホール変異を導入し、重鎖2および軽鎖2においてCrossMab技術を使用した。Mab80VL-k0（配列番号：876）を、改変を伴わない軽鎖1として使用した。
重鎖1および重鎖2は、それぞれ、ノブ変異（Y349C/T366W）およびホール変異（E356C/T366S/L368A/Y407V）を含有する。軽鎖2は、抗KLHのVHドメインとヒトκ定常領域とから構成されていた。重鎖2は、抗KLHのVLドメインおよび改変されたIgG1 Fc領域から構成されていた。
F4一価IL-12融合UstK（図2D）は、軽鎖1（配列番号：887）/重鎖1（配列番号：888）および軽鎖2（配列番号：882）/重鎖2（配列番号：883）のペアのヘテロ二量体である。重鎖1（配列番号：888）において、切断可能リンカーを、UstKVH（配列番号：889）とCH1ドメインとの間のエルボーヒンジ領域中に導入した。抗KLH抗体を、重鎖2および軽鎖2において可変領域として用いた。ヘテロ二量体化および重鎖と軽鎖との正確な会合を促進するために、重鎖CH3ドメインにノブ-イントゥ-ホール変異を導入し、重鎖2および軽鎖2においてCrossMab技術を使用した。UstkVL（配列番号：887）を、改変を伴わない軽鎖1として使用した。
重鎖1および重鎖2は、それぞれ、ノブ変異（Y349C/T366W）およびホール変異（E356C/T366S/L368A/Y407V）を含有する。軽鎖2は、抗KLHのVHドメインとヒトκ定常領域とから構成されていた。重鎖2は、抗KLHのVLドメインおよび改変されたIgG1 Fc領域から構成されていた。
F4一価IL-12融合J695（図2E）は、軽鎖1（配列番号：890）/重鎖1（配列番号：891）および軽鎖2（配列番号：882）/重鎖2（配列番号：883）のペアのヘテロ二量体である。重鎖1（配列番号：891）において、切断可能リンカーを、J695VH（配列番号：892）とCH1ドメインとの間のエルボーヒンジ領域中に導入した。抗KLH抗体を、重鎖2および軽鎖2において可変領域として用いた。ヘテロ二量体化および重鎖と軽鎖との正確な会合を促進するために、重鎖CH3ドメインにノブ-イントゥ-ホール変異を導入し、重鎖2および軽鎖2においてCrossMab技術を使用した。J695VL（配列番号：890）を、改変を伴わない軽鎖1として使用した。
重鎖1および重鎖2は、それぞれ、ノブ変異（Y349C/T366W）およびホール変異（E356C/T366S/L368A/Y407V）を含有する。軽鎖2は、抗KLHのVHドメインとヒトκ定常領域とから構成されていた。重鎖2は、抗KLHのVLドメインおよび改変されたIgG1 Fc領域から構成されていた。
各鎖の発現ベクターを、当業者に公知の方法によって調製し、表3に示すように各鎖を組み合わせることによって、Expi293（Life Technologies Corp.）を用いて発現させた。抗体の精製は、MabSelect SuRe（カタログ番号：17-5438-01、GE Healthcare）によるアフィニティ精製、およびそれに続くSuperdex 200ゲル濾過カラム（カタログ番号：28-9893-35、GE Healthcare）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて行った。アフィニティクロマトグラフィーからの溶出液中に存在する凝集物はいずれも、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて除去した。
（表３）Fc融合物を伴うIL-12遊離抗体および各鎖の配列ID
Figure 2023510994000014
実施例2. プロテアーゼ切断配列および可動リンカー配列を持つIL-12遊離抗体のプロテアーゼ切断の評価
実施例1において調製された抗体が、プロテアーゼによって切断されるかどうかを検証した。組換えヒトマトリプターゼ/ST14触媒ドメイン（MT-SP1）（R&D Systems, Inc., 3946-SE-010）を、プロテアーゼとして用いた。500 nMのプロテアーゼと500 nMの各抗体とを、PBSにおいて37℃の条件下で1または2または4時間反応させた。次いで、プロテアーゼによる切断を、還元SDS-PAGEによって評価した。結果を、図3および4に示す。IL-12遊離型F2およびF4のプロテアーゼ消化の結果として（図3）、VHおよびIL-12は抗体から切断される。IL-12融合型F2およびF4のプロテアーゼ消化の結果として（図4）、VHは抗体から切断され、IL-12は、VHのない抗体に融合している。プロテアーゼサイトで観察された消化とは別に、IL12の非特異的消化もまた観察された（図3B～C；図4B～D）。これは、p40のC末端に、MTSP1によって認識される配列が存在するためであった。したがって、p40とp35とはGSリンカーで融合しているが、切断されたp40は遊離されるかまたはFcに融合して、プロテアーゼ消化後に観察された（図3B～C；図4B～C）。しかし、p35はTrpが欠如しているため、stain-freeゲルは、p35に対応する正確なバンドを示すことができなかった。
実施例3. インビトロ活性の評価
3-1. 遊離型改変体のインビトロ活性の評価
IL12を、C末端に融合したTEVサイトおよびそれに続く(His)6タグを有するp40（配列番号：871）およびp35（配列番号：872）を発現する、ベクターの同時発現によって精製した。各鎖の発現ベクターを、当業者に公知の方法によって調製し、各鎖を組み合わせることによって、Expi293（Life Technologies Corp.）を用いて発現させた。抗体の精製は、Ni Sepharose excel（カタログ番号：17-3712-02、GE Healthcare）によるアフィニティ精製、およびそれに続くSuperdex 200ゲル濾過カラム（カタログ番号：28-9893-35、GE Healthcare）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて行った。アフィニティクロマトグラフィーからの溶出液中に存在する凝集物はいずれも、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて除去した。
プロテアーゼ処理を伴うかまたは伴わない、IL-12遊離型抗体のIL-12生物活性を評価するために、IL-12ルシフェラーゼアッセイを実施した。簡潔に述べると、ヒトIL-12Rb1、IL-12Rb2、およびSTAT4を発現する2.5×104細胞/ウェルのIL-12 bioassay cell（Promega、カタログ番号CS2018A02A）を、96ウェルプレートにプレーティングし、一晩インキュベートした。次いで、IL-12またはIL-12遊離抗体を培養プレートに添加して、18時間インキュベートした。プロテアーゼ処理するサンプルについては、IL-12またはIL-12遊離抗体を、等モル濃度のMTSP1で4時間処理し、段階希釈物を調製した。ルシフェラーゼ活性を、Bio-Glo Luciferase Assay System（Promega、G7940）により製造業者の指示に従って検出した。発光は、GloMax（登録商標） Explorer System（Promega #GM3500）を用いて検出した。データ解析を、Microsoft（登録商標） Excel（登録商標） 2013によって行い、GraphPad Prism 7を用いて解析データをプロットした。
F4一価IL-12遊離Mab80、F4二価IL-12遊離Mab80、およびF2二価IL-12遊離Mab80を、IL-12ルシフェラーゼアッセイに供した。3つの改変体はすべて、MTSP1の非存在下ではhIL-12_Hisタグよりも低いIL-12生物活性を示し、MTSP1処理時に、IL-12生物活性が、hIL-12_Hisタグと同じレベルまで回復された（図5A～C）。
3-2. 融合改変体のインビトロ活性の評価
IL-12融合型抗体のIL-12生物活性を評価するために、上述のIL-12ルシフェラーゼアッセイを使用した。
F4一価IL-12融合Mab80、F4一価IL-12融合Ustk、F4一価IL-12融合J695、F2二価IL-12融合Mab80、およびF4二価IL-12融合Mab80を、IL-12ルシフェラーゼアッセイに供した。5つの改変体はすべて、MTSP1の非存在下ではhIL-12_Hisタグよりも低いIL-12生物活性を示し、MTSP1処理時に、IL-12生物活性が回復された（図6A～E）。F4二価IL-12融合Mab80とF2二価IL-12融合Mab80とを比較すると、F4一価IL-12融合Mab80は、MTSP1の非存在下でF2二価IL-12融合Mab80よりも低いIL-12生物活性を示し、これは、Mab80の場合に、F4がF2よりも強いIL-12中和活性を有することを意味していた（図6D）。
実施例4: 改善されたホモジェニティーを有するIL-12融合型抗体の調製
FabとFcとの間のヒンジ領域におけるGSリンカーの存在は、Mab80-L1-C1-L4-IL12（F4二価IL-12融合Mab80）の重鎖定常領域（HC）と軽鎖定常領域（LC）との間のジスルフィド結合形成においてヘテロジェニティーを結果としてもたらした。Mab80-L1-C1-L4-IL12は、軽鎖（配列番号：876）と重鎖（配列番号：885）とのホモ二量体である。配列番号：876を、改変を伴わない軽鎖として使用した。重鎖において、切断可能リンカー（L1、配列番号：873）を、Mab80VH（配列番号：878）と定常領域1（C1、配列番号：901）との間のエルボーヒンジ領域中に導入した。一本鎖IL-12（配列番号：902）を、GSリンカー（L4、配列番号：903）を介してFcドメインのC末端に付加した（図2B）。ホモジェニティーを促進するために、IL-12融合型抗体の3つの改変体を生成した。
Mab80-L1-C2-L4-IL12は、軽鎖（配列番号：876）と重鎖（配列番号：904）とのホモ二量体である。配列番号：876を、改変を伴わない軽鎖として使用した。重鎖において、切断可能リンカー（配列番号：873）を、Mab80VH（配列番号：878）と定常領域2（C2、配列番号：905）との間のエルボーヒンジ領域中に導入した。定常領域2において、重鎖（配列番号：904）のC220と軽鎖（配列番号：876）のC214との間のシステイン（cys）結合形成を促進するために、ヒンジ領域中に存在するGSリンカー（GGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP）（配列番号：937）を、（EPKSCGGGGSGGGGSDKTHTCPPCP）（配列番号：935）にシフトさせた。一本鎖IL-12（配列番号：902）を、GSリンカー（L4、配列番号：903）を介してFcドメインのC末端に付加した。
Mab80-L1-C3-L4-IL12は、軽鎖（配列番号：906）と重鎖（配列番号：907）とのホモ二量体である。配列番号：906を、C214S改変を伴う軽鎖として使用し、配列番号：907を、C220S改変を伴う重鎖として使用し、これは、重鎖と軽鎖との間にいかなるジスルフィド結合形成も結果としてもたらさなかった。重鎖において、切断可能リンカー（配列番号：873）を、Mab80VH（配列番号：878）と定常領域3（C3、配列番号：908）との間のエルボーヒンジ領域中に導入した。一本鎖IL-12（配列番号：902）を、GSリンカー（L4、配列番号：903）を介してFcドメインのC末端に付加した。
Mab80-L1-C4-L4-IL12は、軽鎖（配列番号：876）と重鎖（配列番号：909）とのホモ二量体である。配列番号：876を、改変を伴わない軽鎖として使用した。配列番号：909を、S131CおよびC220S改変を伴う重鎖として使用し、これは、重鎖と軽鎖との間にジスルフィド結合形成を結果としてもたらした。重鎖において、切断可能リンカー（配列番号：873）を、Mab80VH（配列番号：878）と定常領域4（C4、配列番号：910）との間のエルボーヒンジ領域中に導入した。一本鎖IL-12（配列番号：902）を、GSリンカー（L4、配列番号：903）を介してFcドメインのC末端に付加した。
各鎖の発現ベクターを、当業者に公知の方法によって調製し、表4に示すように各鎖を組み合わせることによって、Expi293（Life Technologies Corp.）を用いて発現させた。抗体の精製は、MabSelect SuRe（カタログ番号：17-5438-01、GE Healthcare）によるアフィニティ精製、およびそれに続くSuperdex 200ゲル濾過カラム（カタログ番号：28-9893-35、GE Healthcare）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて行った。アフィニティクロマトグラフィーからの溶出液中に存在する凝集物はいずれも、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて除去した。
（表４）改善されたホモジェニティーを有するIL-12融合型抗体および各鎖の配列ID
Figure 2023510994000015
実施例5: 改善されたホモジェニティーを有するIL12融合型抗体のSDS-PAGE解析
SDS-PAGEを、還元条件下および非還元条件下で行った。図7Aは、Mab80-L1-C1-L4-IL12（F4二価IL-12融合Mab80）のSDS-PAGE結果を示す。非還元条件下で、Mab80-L1-C1-L4-IL12は、LCがHCとcys結合を形成しているMab80-L1-C1-L4-IL12およびLCがHCから解離しているMab80-L1-C1-L4-IL12に対応する複数の上のバンドを示し、対応するLCは、非還元条件下で20 kDa近くに見られる（下のバンド）。非還元条件下での複数のバンドの存在は、HCとLCとの間にcys結合によるヘテロジェニティーが実在することを示し、これはヘテロジェニティーの存在を表す。図7Bは、改善されたホモジェニティーを示す、Mab80-L1-C2-L4-IL12、Mab80-L1-C3-L4-IL12、およびMab80-L1-C4-L4-IL12のSDS-PAGE結果を示す。Mab80-L1-C2-L4-IL12およびMab80-L1-C4-L4-IL12（レーン4および6）は、非還元条件において単一のバンドを示し、これは、重鎖と軽鎖との間のcys結合の存在を表す。これに対して、Mab80-L1-C3-L4-IL12（レーン5）は、非還元条件において重鎖および軽鎖の存在を示し、これは、変異により重鎖と軽鎖との間にcys結合がないことを示す。
実施例6: 改善されたホモジェニティーを有するIL12融合型抗体のインビトロ活性の評価
プロテアーゼ処理を伴うかまたは伴わない、IL-12融合型抗体のIL-12生物活性を評価するために、IL-12ルシフェラーゼアッセイを実施した。簡潔に述べると、ヒトIL-12Rb1、IL-12Rb2、およびSTAT4を発現する2.5×104細胞/ウェルのIL-12 bioassay cell（Promega、カタログ番号CS2018A02A）を、96ウェルプレートにプレーティングし、一晩インキュベートした。次いで、IL-12またはIL-12遊離抗体を培養プレートに添加して、18時間インキュベートした。プロテアーゼ処理するサンプルについては、IL-12またはIL-12遊離抗体を、等モル濃度のMTSP1で4時間処理し、段階希釈物を調製した。ルシフェラーゼ活性を、Bio-Glo Luciferase Assay System（Promega、G7940）により製造業者の指示に従って検出した。発光は、GloMax（登録商標）Explorer System（Promega #GM3500）を用いて検出した。野生型IL-12に対する有効濃度のパーセンテージを算出し、GraphPad Prism 7を用いて捕捉値をプロットした。
Mab80-L1-C1-L4-IL12、Mab80-L1-C2-L4-IL12、Mab80-L1-C3-L4-IL12、およびMab80-L1-C4-L4-IL12を、IL-12ルシフェラーゼアッセイに供した。4つの改変体はすべて、MTSP1の非存在下ではhIL-12_Hisタグよりも低いIL-12生物活性を示し、MTSP1処理時に、IL-12生物活性が回復された（図8Aおよび8B）。すべての改変体のうち、Mab80-L1-C4-L4-IL12は、MTSP1の非存在下ですべての改変体のうちで最低の活性を示し、Mab80-L1-C1-L4-IL12およびMab80-L1-C2-L4-IL12がそれに続いた。
実施例7: プロテアーゼにより切断可能なリンカーを有するIL-22融合抗体の調製
7-1. IL-22遊離型の調製
IL-22分子（配列番号：911）を、プロテアーゼにより切断可能なリンカー（配列番号：873および879）を通して抗IL-22抗体と融合させることによって、種々のIL-22融合抗体を構築した。抗IL-22抗体である、087B03（Gill et. al., US20070243589A1）を使用した。別段言及しない限り、Fc領域は、FcγR結合を廃するための変異（EUナンバリングでL235R/G236R）を含有する改変されたIgG1 Fc領域である。
087B03-L1-C1-L3-IL22は、軽鎖（配列番号：912）と重鎖（配列番号：913）とのホモ二量体である。配列番号：912を、改変を伴わない軽鎖として使用した。重鎖において、切断可能リンカー（L1、配列番号：873）を、087B03VH（配列番号：914）と定常領域1（C1、配列番号：901）との間のエルボーヒンジ領域中に導入した。図9Aに示すように、IL-22を、切断可能リンカー（L3、配列番号：879）を介してFcドメインのC末端に付加した。
087B03-L1-C3-L3-IL22は、軽鎖（配列番号：915）と重鎖（配列番号：916）とのホモ二量体である。配列番号：915を、C214S改変を伴う軽鎖として使用し、配列番号：916を、C220S改変を伴う重鎖として使用し、これは、重鎖と軽鎖との間にいかなるジスルフィド結合形成も結果としてもたらさなかった。重鎖において、切断可能リンカー（L1、配列番号：873）を、087B03VH（配列番号：914）と定常領域3（C3、配列番号：908）との間のエルボーヒンジ領域中に導入した。IL-22を、切断可能リンカー（L3、配列番号：879）を介してFcドメインのC末端に付加した。
7-2. IL-22非遊離型の調製
087B03-C1-L4-IL22は、軽鎖（配列番号：912）と重鎖（配列番号：917）とのホモ二量体である。配列番号：912を、改変を伴わない軽鎖として使用した。重鎖において、087B03VH（配列番号：914）と定常領域1（C1、配列番号：901）との間のエルボーヒンジ領域中に導入された切断可能リンカーはなかった。図9Bに示すように、IL-22を、GSリンカー（L4、配列番号：903）を介してFcドメインのC末端に付加した。087B03-C1-L4-IL22は、IL22融合抗体の非切断可能形態を表す。
各鎖の発現ベクターを、当業者に公知の方法によって調製し、表1に示すように各鎖を組み合わせることによって、Expi293（Life Technologies Corp.）を用いて発現させた。抗体の精製は、MabSelect SuRe（カタログ番号：17-5438-01、GE Healthcare）によるアフィニティ精製、およびそれに続くSuperdex 200ゲル濾過カラム（カタログ番号：28-9893-35、GE Healthcare）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて行った。アフィニティクロマトグラフィーからの溶出液中に存在する凝集物はいずれも、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて除去した。
（表５）改善されたホモジェニティーを有するIL-22融合型Abおよび各鎖の配列ID
Figure 2023510994000016
実施例8. プロテアーゼ切断配列および可動リンカー配列を持つIL-22遊離抗体のプロテアーゼ切断の評価
図9AおよびBは、プロテアーゼによる切断を例証するための、プロテアーゼ切断サイトを有するおよび有さない、例示的なIL-22融合抗体の模式図を示す。087B03-L1-C1-L3-IL22等の切断可能リンカーを有するIL-22融合抗体について、プロテアーゼ処理は、重鎖領域の可変領域とCH1領域との間のリンカーの切断を結果としてもたらすであろう。これは、抗体の抗原結合断片（Fab）領域を不安定化すると考えられ、IL-22がFab領域から遊離され得る。加えて、IL-22と抗体重鎖のC末端との間のリンカーのタンパク質分解的消化により、IL-22が抗体の断片結晶化可能領域（Fc領域）から遊離されることが可能になるであろう。対照的に、087B03-C1-L4-IL22等の非切断可能リンカーを有するIL-22融合抗体は、リンカーがプロテアーゼによって切断され得ないため、IL-22の遊離を結果としてもたらさないであろう。そのように、IL-22は、抗体の抗原結合断片（Fab）領域によって中和されたままであろう。
リンカーのタンパク質分解的消化がIL-22を遊離できるかどうかを検証するために、組換えヒトu-プラスミノーゲン活性化因子/ウロキナーゼ（uPA）（カタログ番号：1310-SE、R&D Systems）および表5に列記する抗体を用いて、タンパク質分解反応を設定した。IL-22融合抗体およびuPAプロテアーゼを、PBS（Gibco）で希釈し、2000 nMの抗体および2000 nMのuPAプロテアーゼの最終濃度で混合して、Thermocycler（2720 Applied Biosystems）において37℃で一晩インキュベートした。蒸発を最小限にするために、反応液をPCRプレート（Axygen）中で調製した。対照として、HEK293由来の組換えヒトIL-22（カタログ番号：Z03081-50、Genscript）またはPBSを、IL-22融合抗体の代わりに添加した。プロテアーゼによる抗体の切断を、4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels（Bio-Rad）を用いた還元ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって評価した。ChemiDoc Imaging system（Bio-Rad）を用いてゲルを紫外線で45秒間活性化し、ゲルのイメージを取得した。
図10Aに示すように、VHおよびIL-22は、プロテアーゼ消化の結果として、抗体087B03-L1-C1-L3-IL22および087B03-L1-C3-L3-IL22から遊離された。これは、75 kDaのバンドが存在していないレーン1および2を、バンドが存在しているレーン6および7と比較することによって見ることができる。087B03-C1-L4-IL22は、非切断可能リンカーを有するため、プロテアーゼ消化は、レーン3および8においてVHおよびIL-22の遊離を結果としてもたらさなかった。遊離されたVHは、およそ15 kDaに現れる。
IL-22は、stain-freeゲル上での可視化のためのトリプトファン残基が欠如しているため、かつまた、はっきりとしたバンドの代わりに広がったスメアとして現れるグリコシル化されたタンパク質であるため、遊離されたIL-22を、図10Aにおいてはっきり可視化することはできなかった。そのため、ウエスタンブロッティングを用いて、uPAプロテアーゼによるIL-22遊離を実証した。
これを行うために、サンプルを、図10Aと同じ様式で調製し、還元SDS-PAGEに供して、Trans-Blot Turbo Transfer System（Bio-Rad）を用いてPVDF膜（Bio-Rad）に転写した。iBind Western Device（Invitrogen）によって、免疫検出を行った。ヤギ抗ヒトIL-22抗体（カタログ番号：AF782、R&D Systems）およびロバ抗ヤギIgG HRP（カタログ番号：ab98519、Abcam）を、検出のために用いた。化学発光検出は、SuperSignal（商標） West Femto substrate（ThermoFisher）およびChemiDoc Imaging system（Bio-Rad）を用いて行った。手順は、各製造業者の推奨に従って行った。
図10Bに示すように、uPAタンパク質分解的切断によって遊離されたIL-22は、レーン1～2において検出されたが、レーン3、6、7、および8においては検出されず、これは、図10AにおけるVHの遊離と一貫していた。合わせると、これらのデータは、IL-22融合抗体中のリンカーのタンパク質分解的消化が、IL-22を遊離できたことを実証する。
実施例9. インビトロ活性の評価
IL-22融合抗体の切断後に遊離されたIL-22の生物活性をアッセイするために、以下のアッセイを設定した。最初に、IL-22融合抗体および組換えヒトuPAプロテアーゼを、PBS（Gibco）で希釈し、2000 nMの抗体および2000 nMのuPAプロテアーゼの最終濃度で混合し、Thermocycler（2720 Applied Biosystems）において37℃で一晩インキュベートして、リンカーの切断およびIL-22の遊離を可能にした。対照のために、HEK293由来の組換えヒトIL-22（カタログ番号：Z03081-50、Genscript）またはPBS（Gibco）を、uPAとインキュベートした。
次に、遊離されたIL-22の生物活性を、IL-10を分泌することによってIL-22に応答するCOLO205結腸癌細胞（カタログ番号：CCL-222、ATCC）を用いてアッセイした（Int Immunopharmacol. 2004 May;4(5):679-91）。0.25％トリプシン（Gibco）でのトリプシン処理後に、COLO205細胞を70マイクロメートルセルストレーナー（Corning）で濾過して、細胞塊を除去した。Luna Dual Fluorescence Cell Counter（Logos Biosystem）を用いて細胞計数を行い、50マイクロリットル中の3E4細胞を、平底96ウェルプレートの各ウェル中に播種した。細胞を、最短でも4時間、37℃で5％ CO2インキュベーターにおいてインキュベートして、細胞をプレートに付着させた。事前にuPAとインキュベートした切断されたIL-22融合抗体を、所望の最終濃度の6倍まで段階希釈し、60マイクロリットルの最終アッセイ体積に向けて、10マイクロリットルを細胞に添加した。アッセイプレートを、一晩37℃で5％ CO2インキュベーターにおいてさらにインキュベートした。一晩のインキュベーション後に、アッセイプレートを、300 gで3分間、25℃で遠心分離した。細胞上清サンプルを収集して、Human IL-10 DuoSet ELISA（R&D Systems）を用いてCOLO205細胞により産生されたIL-10の量を定量した。Human IL-10 ELISAのための手順は、IL-10標準およびサンプルの調製を除いて、製造業者の推奨に従って行った。より感度の高いIL-10検出のために細胞上清サンプルを希釈せずにアッセイできるように、IL-10標準は、COLO205培養培地である、10％胎児ウシ血清（Sigma）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco）を含有するRPMI 1640培地（Gibco）において希釈した。サンプルの希釈が必要である場合には、サンプルをELISA用のCOLO205培養培地において希釈した。サンプルの吸光度は、MultiSkan GOプレートリーダー（Thermo Scientific）を用いて450 nmおよび595 nmで測定した。
実施例10. プロテアーゼにより切断されたIL-22融合抗体は、プロテアーゼで処理されていない抗体と比較してより強い生物活性を示した
図11Aに示すように、切断可能リンカーを有する087B03-L1-C1-L3-IL22および087B03-L1-C3-L3-IL22のプロテアーゼ消化後に遊離されたIL-22は、COLO205細胞上のIL-22受容体に結合して、IL-10分泌を誘発することができた。対照的に、非切断可能リンカーを有する087B03-C1-L4-IL22は、極度に高いIL-22の用量で、弱いIL-10応答を示しただけであり、これは、IL-22が遊離されず、中和されたままであったことを示している。同様に、IL-22融合抗体にいかなるプロテアーゼも添加しなかった図11Bでは、IL-22生物活性は、組換えヒトIL-22単独と比較してより弱く、これは、融合抗体中のIL-22が、COLO205細胞上のIL-22Rに対する結合にあまり利用可能ではなかったことを示している。
実施例11: 改善されたホモジェニティーを有するIL-22融合抗体の調製
FabとFcとの間のヒンジ領域におけるGSリンカーの存在は、087B03-L1-C1-L3-IL22の重鎖定常領域（HC）と軽鎖定常領域（LC）との間のジスルフィド結合形成においてヘテロジェニティーを結果としてもたらした。ホモジェニティーを促進するために、実施例4に記載される改善されたホモジェニティーを有するIL-12融合型抗体の設計に従って、IL-22融合抗体の2つの改変体を生成した。
087B03-L1-C2-L3-IL22は、軽鎖（配列番号：912）と重鎖（配列番号：929）とのホモ二量体である。配列番号：912を、改変を伴わない軽鎖として使用した。重鎖において、切断可能リンカー（L1、配列番号：873）を、087B03VH（配列番号：914）と定常領域2（C2、配列番号：905）との間のエルボーヒンジ領域中に導入した。定常領域2において、重鎖（配列番号：929）のC220と軽鎖（配列番号：912）のC214との間のシステイン（cys）結合形成を促進するために、ヒンジ領域中に存在するGSリンカー（GGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP）（配列番号：937）を、（EPKSCGGGGSGGGGSDKTHTCPPCP）（配列番号：935）にシフトさせた。IL-22（配列番号：911）を、切断可能リンカー（L3、配列番号：879）を介してFcドメインのC末端に付加した。
087B03-L1-C4-L3-IL22は、軽鎖（配列番号：912）と重鎖（配列番号：930）とのホモ二量体である。配列番号：912を、改変を伴わない軽鎖として使用した。配列番号：930を、S131CおよびC220S改変を伴う重鎖として使用し、これは、重鎖と軽鎖との間にジスルフィド結合形成を結果としてもたらした。重鎖において、切断可能リンカー（L1、配列番号：873）を、087B03VH（配列番号：914）と定常領域4（C4、配列番号：910）との間のエルボーヒンジ領域中に導入した。IL-22（配列番号：911）を、切断可能リンカー（L3、配列番号：879）を介してFcドメインのC末端に付加した。
各鎖の発現ベクターを、当業者に公知の方法によって調製し、表6に示すように各鎖を組み合わせることによって、Expi293（Life Technologies Corp.）を用いて発現させた。抗体の精製は、MabSelect SuRe（カタログ番号：17-5438-01、GE Healthcare）によるアフィニティ精製、およびそれに続くSuperdex 200ゲル濾過カラム（カタログ番号：28-9893-35、GE Healthcare）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて行った。アフィニティクロマトグラフィーからの溶出液中に存在する凝集物はいずれも、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて除去した。
（表６）改善されたホモジェニティーを有するIL-22融合型抗体および各鎖の配列ID
Figure 2023510994000017
実施例12: 改善されたホモジェニティーを有するIL-22遊離抗体のSDS-PAGE解析
図12は、還元条件および非還元条件下での、改善されたホモジェニティーを有するおよび有さない切断可能なIL-22遊離抗体のSDS-PAGE結果を示す。非還元条件下で、087B03-L1-C1-L3-IL22（レーン1）は、複数のバンドを示し、これは、HCとLCとの間にcys結合のヘテロジェニティーが実在することを示す。最も上のバンドは、LCとHCとの間にcys結合を有する087B03-L1-C1-L3-IL22に対応する。より下のバンドは、LCがHCとcys結合を形成していない時の087B03-L1-C1-L3-IL22に対応する。HCとのCys結合の非存在下で、LCは、非還元条件下でおよそ20 kDaに見られる。レーン2において、LCは非還元条件下でも見られ、これは、087B03-L1-C3-L3-IL22が、HC中のC220S改変およびLC中のC214S改変の導入により、LCとHCとの間にいかなるジスルフィド結合も有さないためである。
対照的に、改善されたホモジェニティーを有するIL-22遊離抗体である087B03-L1-C2-L3-IL22（レーン3）および087B03-L1-C4-L3-IL22（レーン4）は、非還元条件下で単一のバンドを示し、これは、重鎖と軽鎖との間のcys結合の存在を表す。
実施例13. 改善されたホモジェニティーを有する、プロテアーゼ切断配列および可動リンカー配列を持つIL-22遊離抗体のプロテアーゼ切断の評価
リンカーのタンパク質分解的消化が、改善されたホモジェニティーを有する抗体からIL-22を遊離できるかどうかを検証するために、実施例8に記載される方法を用い、組換えヒトu-プラスミノーゲン活性化因子/ウロキナーゼ（uPA）（カタログ番号：1310-SE、R&D Systems）を用いて、タンパク質分解反応を設定した。図13に示すように、VHおよびIL-22は、uPAプロテアーゼ消化の結果として、抗体087B03-L1-C2-L3-IL22および087B03-L1-C4-L3-IL22から遊離された。これは、75 kDaのバンドが存在していないレーン1および2を、バンドが存在しているレーン5および6と比較することによって見ることができる。遊離されたVHは、およそ15 kDaに現れる。実施例8に記載される方法を用いて、uPAプロテアーゼによって遊離されたIL-22を検出するウエスタンブロッティングもまた行った。図14に示すように、uPAタンパク質分解的切断によって遊離されたIL-22は、レーン1および2において検出されたが、レーン5および6においては検出されず、これは、図13におけるVHの遊離と一貫していた。
実施例14: 改善されたホモジェニティーを有するIL22融合抗体のインビトロ活性の評価
改善されたホモジェニティーを有するIL-22融合抗体の切断後に遊離されたIL-22の生物活性を、実施例9に記載される方法を用いて評価した。図15Aに示すように、プロテアーゼの存在下で、087B03-L1-C2-L3-IL22および087B03-L1-C4-L3-IL22から遊離されたIL-22は、COLO205細胞上のIL-22受容体に結合して、IL-10分泌を誘発することができた。対照的に、図15Bに示すように、IL-22融合抗体にいかなるプロテアーゼも添加しなかった場合、IL-22生物活性は、組換えヒトIL-22単独と比較してより弱く、これは、融合抗体中のIL-22が、COLO205細胞上のIL-22Rに対する結合にあまり利用可能ではなかったことを示している。
実施例15: プロテアーゼにより切断可能なリンカーを有するIL-2融合抗体の調製
IL-2は、T細胞依存性免疫応答を促進すると同時に、免疫応答を調節するように機能的なTregを維持するためにも不可欠である。免疫応答の促進または調節のいずれかにおけるその機能を制御するために、IL-2の工学が研究されてきた。例えば、IL-2 N88Dムテインは、IL-2Rβγに対して低減した結合を示し、したがって、Treg選択的IL-2分子として働くことが報告されている（J. Autoimmun., 2018, 95, 1）。他方、Tregの優先的活性化を回避するためにIL-2Rαに対する結合が低減している別のIL-2ムテインもまた、報告されている（Oncoimmunology, 2017, 6, e1277306）。これらのサイトカイン工学アプローチを疾患特異的プロテアーゼ活性化と組み合わせることによって、治療指標の拡大を期待することができる。疾患特異的プロテアーゼによるサイト特異的活性化を有するIL-2ムテインの感受性を実証するために、プロテアーゼにより切断可能なリンカーを有するIL-2融合抗体を試験した。
IL-2ムテインを、GSリンカー（配列番号：927）を通して抗IL-2抗体または対照抗体と融合させることによって、種々のIL-2融合抗体を構築した。IL2.N88D（配列番号：918）を、2つの変異（IL-2Rβγに対する結合を低減させるN88D、他の分子に対する予想外の結合を低減させるC145A）および精製タグ（そのC末端のHisタグ）を含有する改変されたIL-2である、IL-2ムテインの例として使用した。抗IL-2抗体である、Cx（Onur et. al., WO2017121758A1）および16C3（Isaac et. al., WO2015/109212A1）を使用した。抗KLH抗体を、IL-2に結合しない対照抗体として使用し、したがって、IL-2は、プロテアーゼ切断にかかわらず中和されない。別段言及しない限り、Fc領域は、FcγR結合を廃するための変異（EUナンバリングでL235R/G236R/A327G/A330S/P331S）を含有する改変されたIgG1 Fc領域である。
Cx-L1-C5-L5-IL2.N88Dは、重鎖（配列番号：919）と軽鎖（配列番号：920）とのホモ二量体である。重鎖において、切断可能リンカー（L1、配列番号：873）を、CxH（配列番号：931）と定常領域5（C5、配列番号：932）との間のエルボーヒンジ領域中に導入した。配列番号：920を、改変を伴わない軽鎖として使用した。図16Aに示すように、IL-2 N88Dを、可動リンカー（配列番号：927）を介してFcドメインのC末端に付加した。
Cx-L6-C5-L5-IL2.N88Dは、重鎖（配列番号：921）と軽鎖（配列番号：920）とのホモ二量体である。重鎖において、GSリンカー（配列番号：928）を、CxH（配列番号：931）と定常領域5（C5、配列番号：932）との間のエルボーヒンジ領域中に導入した。配列番号：920を、改変を伴わない軽鎖として使用した。図16Bに示すように、IL-2 N88Dを、可動リンカー（配列番号：927）を介してFcドメインのC末端に付加した。
16C3-L1-C5-L5-IL2.N88Dは、重鎖（配列番号：922）と軽鎖（配列番号：923）とのホモ二量体である。重鎖において、切断可能リンカー（L1、配列番号：873）を、16C3VH（配列番号：933）と定常領域5（C5、配列番号：932）との間のエルボーヒンジ領域中に導入した。配列番号：923を、改変を伴わない軽鎖として使用した。IL-2 N88Dを、可動リンカー（配列番号：927）を介してFcドメインのC末端に付加した。
16C3-L6-C5-L5-IL2.N88Dは、重鎖（配列番号：924）と軽鎖（配列番号：923）とのホモ二量体である。重鎖において、GSリンカー（配列番号：928）を、16C3VH（配列番号：933）と定常領域5（C5、配列番号：932）との間のエルボーヒンジ領域中に導入した。配列番号：923を、改変を伴わない軽鎖として使用した。IL-2 N88Dを、可動リンカー（配列番号：927）を介してFcドメインのC末端に付加した。
KLH-L6-C5-L5-IL2.N88Dは、重鎖（配列番号：925）と軽鎖（配列番号：926）とのホモ二量体である。重鎖において、GSリンカー（配列番号：928）を、KLH VH（配列番号：934）と定常領域5（C5、配列番号：932）との間のエルボーヒンジ領域中に導入した。配列番号：926を、改変を伴わない軽鎖として使用した。図16Cに示すように、IL-2 N88Dを、可動リンカー（配列番号：927）を介してFcドメインのC末端に付加した。
各鎖の発現ベクターを、当業者に公知の方法によって調製し、表7に示すように各鎖を組み合わせることによって、Expi293（Life Technologies Corp.）を用いて発現させた。抗体分子を伴わないIL-2 N88Dの精製は、HisTrap excel（カタログ番号：17371206、GE Healthcare）によるアフィニティ精製、およびそれに続くSuperdex 75 increaseゲル濾過カラム（カタログ番号：29148721、GE Healthcare）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて行った。IL-2融合抗体の精製は、HisTrap excel（カタログ番号：17371206、GE Healthcare）によるアフィニティ精製、およびそれに続くSuperdex 200 increaseゲル濾過カラム（カタログ番号：28990944、GE Healthcare）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて行った。アフィニティクロマトグラフィーからの溶出液中に存在する凝集物はいずれも、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて除去した。
（表７）IL-2融合抗体および各鎖の配列IDのリスト
Figure 2023510994000018
実施例16: IL-2融合抗体のプロテアーゼ切断の評価
図16は、プロテアーゼによる切断を例証するための、プロテアーゼ切断サイトを有するおよび有さない、例示的なIL-2 N88D融合抗体の模式図を示す。Cx-L1-C5-L5-IL2.N88Dおよび16C3-L1-C5-L5-IL2.N88D等の切断可能リンカーを有するIL-2 N88D融合抗体について、プロテアーゼ処理は、重鎖においてVH領域とCH1領域との間のリンカーの切断を結果としてもたらすであろう（A）。これは、抗体のFab領域を不安定化すると考えられ、IL-2 N88Dが中和状態から遊離され得る。対照的に、Cx-L6-C5-L5-IL2.N88Dおよび16C3-L6-C5-L5-IL2.N88D等の非切断可能リンカーを有するIL-2 N88D融合抗体は、リンカーがプロテアーゼによって切断され得ないため、IL-2 N88Dの遊離を結果としてもたらさないであろう（B）。そのように、IL-2 N88Dは、中和されたままであろう。KLH-L6-C5-L5-IL2.N88D等の非切断可能リンカーを有するIL-2 N88D融合対照抗体は、プロテアーゼ処理にかからわず活性を有するままであろう（C）。
リンカーのタンパク質分解的消化がIL-2 N88Dを遊離できるかどうかを検証するために、組換えヒトu-プラスミノーゲン活性化因子/ウロキナーゼ（uPA）（カタログ番号：755304、Biolegend）および表7に列記する抗体を用いて、タンパク質分解反応を設定した。IL-2 N88D融合抗体およびuPAプロテアーゼを、PBS（Wako）で希釈し、0.1 mg/mLの抗体および100 nMのuPAプロテアーゼの最終濃度で混合して、Thermocycler（2720 Applied Biosystems）において37℃で2時間インキュベートした。蒸発を最小限にするために、反応をPCRチューブ（Applied Biosystems）中で行った。対照として、大腸菌由来の組換えヒトIL-2（カタログ番号：AF-200-02、PEPROTECH）または精製されたIL-2 N88Dを、IL-2融合抗体の代わりに添加した。プロテアーゼによる抗体の切断を、4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels（Bio-Rad）を用いた還元ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって評価した。ゲルをQuick CBB（カタログ番号：299-50101、FUJIFILM）で染色し、ChemiDoc Imaging system（Bio-Rad）によって、ゲルのイメージを取得した。
図17に示すように、プロテアーゼ消化の結果として、抗体Cx-L1-C5-L5-IL2.N88Dおよび16C3-L1-C5-L5-IL2.N88Dから、VHが遊離された。これは、75 kDaのバンドが存在していないレーン8および9を、バンドが存在しているレーン1および2と比較することによって確認できる。遊離されたVHは、レーン8および9においておよそ15 kDaに現れた。KLH-L6-C5-L5-IL2.N88D、Cx-L6-C5-L5-IL2.N88D、および16C3-L6-C5-L5-IL2.N88Dは、非切断可能リンカーを有するため、プロテアーゼ消化は、レーン10、11、および12においてVHの遊離を結果としてもたらさなかった。
実施例17: IL-2融合抗体のインビトロ活性の評価
IL-2融合抗体から遊離されたIL-2の生物活性を評価するために、以下の手順でIL-2 bioassay（Promega、JA2205）を用いた。20マイクロリットルのRPMI中の2.4×104個のエフェクター細胞を、384ウェルプレートの各ウェルにプレーティングし、100 nMの最終濃度のuPAプロテアーゼ（Biolegend）を伴ってまたは伴わずに、10マイクロリットルのRPMI中のIL-2融合抗体を1000 nM～1.4 nMの最終濃度で添加した。プレートを、37℃、5％ CO2で18時間インキュベートし、30マイクロリットルのBio-Gloルシフェラーゼアッセイ試薬を各ウェルにアプライした。2104 EnVision（Perkin Elmer）で発光を測定することによって、IL-2の活性を評価した。このアッセイの結果を、図18に示した。
組換えIL2.N88D（a）およびKLH-L6-C5-L5-IL2.N88D（d）は、それらの中和されていない形態のために、uPA処理にかかわらず活性を示した。他方、両方ともプロテアーゼにより切断可能なリンカーを有するIL-2融合抗体であるCx-L1-C5-L5-IL2.N88D（b）および16C3-L1-C5-L5-IL2.N88D（c）は、uPA処理時に活性の回復を示したが、uPA処理なしでは、活性は抑制されていた。非切断可能リンカーを有するこれらの分子（eおよびf）の活性は、uPA処理時であっても抑制され続けた。これらの結果は、プロテアーゼにより切断可能なリンカーを有するIL-2融合抗体が、プロテアーゼ活性なしでは中和され続け、プロテアーゼにより切断可能なリンカーのプロテアーゼ媒介性切断時には活性化され得ることを示す。

Claims (29)

  1. （a）リガンド結合ドメインと少なくとも1つの第1のプロテアーゼ切断サイトとを含む、リガンド結合部分；
    （b）少なくとも1つのリガンド部分；および
    （c）少なくとも1つのリガンド部分をリガンド結合部分のC末端領域に接続する、少なくとも1つのペプチドリンカー
    を含む融合タンパク質であって、
    該リガンド結合ドメインが、該少なくとも1つのリガンド部分に結合し、かつプロテアーゼの存在下で該少なくとも1つのリガンド部分を遊離させることができる、
    融合タンパク質。
  2. 前記少なくとも1つのペプチドリンカーが、いかなるプロテアーゼ切断サイトも含まない、請求項1に記載の融合タンパク質。
  3. 前記少なくとも1つのペプチドリンカーが、第2のプロテアーゼ切断サイトを含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
  4. 前記リガンド結合ドメインが、抗体可変領域を含む、請求項1～3のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  5. 前記リガンド結合ドメインが、互いに会合するVH領域およびVL領域を含む、請求項4に記載の融合タンパク質。
  6. 前記リガンド結合部分が、CH1領域およびCL領域をさらに含む、請求項4または5に記載の融合タンパク質。
  7. 前記少なくとも1つの第1のプロテアーゼ切断サイトのうちの少なくとも1つが、VHまたはVL領域とCH1またはCL領域との間の境界付近に位置している、請求項6に記載の融合タンパク質。
  8. 前記リガンド結合部分が、Fc領域をさらに含む、請求項4～7のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  9. 前記リガンド結合部分が、全長抗体を含む、請求項8に記載の融合タンパク質。
  10. 前記全長抗体が、IgG抗体である、請求項9に記載の融合タンパク質。
  11. 前記少なくとも1つのリガンド部分が、2つのリガンド部分を含み、かつ前記少なくとも1つのペプチドリンカーが、2つのペプチドリンカーを含み、各リガンド部分が、各ペプチドリンカーを介してリガンド結合部分のC末端領域に接続されている、請求項9または10に記載の融合タンパク質。
  12. 前記少なくとも1つのリガンド部分が、前記少なくとも1つのペプチドリンカーを介して、Fc領域のCH3領域の表面上に露出したアミノ酸残基に接続されている、請求項8～11のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  13. 前記少なくとも1つのリガンド部分が、前記少なくとも1つのペプチドリンカーを介してリガンド結合部分のC末端アミノ酸残基に接続されている、請求項1～12のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  14. 第3のプロテアーゼ切断サイトを含む切断可能リンカーをさらに含み、
    前記少なくとも1つのリガンド部分が、該切断可能リンカーを介してリガンド結合部分のN末端領域に接続されている、
    請求項1～13のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  15. 第3のプロテアーゼ切断サイトを含む切断可能リンカーをさらに含み、
    前記少なくとも1つのリガンド部分が、該切断可能リンカーを介して、リガンド結合部分のN末端から1～230番目のアミノ酸残基のうちの1つに接続されている、
    請求項8～13のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  16. 前記少なくとも1つのリガンド部分が、前記切断可能リンカーを介してリガンド結合部分のN末端アミノ酸残基に接続されている、請求項14または15に記載の融合タンパク質。
  17. 前記少なくとも1つのリガンド部分が、生物活性を有し、リガンド部分に対するリガンド結合ドメインの結合が、該リガンド部分の生物活性を阻害する、請求項1～16のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  18. 前記少なくとも1つのリガンド部分が、生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドを含む、請求項17に記載の融合タンパク質。
  19. 前記少なくとも1つのリガンド部分が、サイトカインまたはケモカインを含む、請求項18に記載の融合タンパク質。
  20. 前記少なくとも1つのリガンド部分が、CXCL10、IL-2、IL-12、IL-22、PD-1、またはIL-6Rからなる群より選択されるリガンドタンパク質またはポリペプチドを含む、請求項18に記載の融合タンパク質。
  21. 請求項1～20のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
  22. （a）リガンド結合ドメインと少なくとも1つの第1のプロテアーゼ切断サイトとを含む、リガンド結合分子、
    （b）少なくとも1つのリガンド分子、および
    （c）少なくとも1つのペプチドリンカー
    を提供する工程；ならびに
    少なくとも1つのペプチドリンカーを介して、少なくとも1つのリガンド分子をリガンド結合分子のC末端領域に接続する工程；
    を含む、請求項1～20のいずれか一項に記載の融合タンパク質を製造するための方法であって、
    該リガンド結合ドメインが、該リガンド分子に結合し、
    該リガンド結合ドメインが、プロテアーゼの存在下で該リガンド分子を遊離させることができる、
    方法。
  23. 請求項1～20のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
  24. 請求項23に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  25. 請求項23に記載のポリヌクレオチドまたは請求項24に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  26. 請求項25に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、請求項1～20のいずれか一項に記載の融合タンパク質を製造する方法。
  27. リガンド結合部分を含み、かつ一般式（I）：
    [リガンド結合ドメイン]-[Lx]-[Cx]-[Ly]-[リガンド部分]（I）
    によって表される、融合タンパク質であって、
    式中、
    Lxは、第1のプロテアーゼ切断サイトを任意で含む第1のペプチドリンカーを表すか、またはLxは存在せず、
    Cxは、第2のペプチドリンカーと、任意でシステインからまたはシステインに改変されている1個または複数個のアミノ酸残基とを含む定常領域を表し、
    Lyは、第3のペプチドリンカーを表し；
    該リガンド結合ドメインが、該リガンド部分に結合し、かつプロテアーゼの存在下で該リガンド部分を遊離させることができる、
    融合タンパク質。
  28. 2セットのリガンド結合ドメイン、リガンド部分、第1のペプチドリンカー、定常領域、および第3のペプチドリンカーを含む、請求項27に記載の融合タンパク質。
  29. 一般式（II）：
    [リガンド結合ドメイン]-[Lx]-[Cx]-[Ly]-[リガンド部分]//[非リガンド結合ドメイン]-[Lz]-[Cz]（II）
    によって表され、
    式中、
    Lx、Cx、およびLyは、請求項1に定義されている通りであり、
    Lzは、第1のプロテアーゼ切断サイトを任意で含む第4のペプチドリンカーを表すか、またはLzは存在せず、
    Czは、任意で第5のペプチドリンカーと、任意でシステインからまたはシステインに改変されている1個または複数個のアミノ酸残基とを含む第2の定常領域を表す、
    請求項27に記載の融合タンパク質。
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