JP7428661B2 - Il-1r1結合ドメインおよび運搬部分を含むポリペプチド - Google Patents
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Description
本発明は、抗原結合ドメインVLと、抗原結合ドメインVLの抗原結合活性を抑制する抑制ドメインを有する運搬部分とを含み、かつ単独で存在する抗原結合ドメインVLの半減期より長い半減期を有するポリペプチド、当該ポリペプチドを製造するおよびスクリーニングする方法、当該ポリペプチドを含む医薬組成物、特定のVL、VHまたはVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得る抗原結合ドメインVLを製造するおよびスクリーニングする方法、ならびに特定のVL、VHまたはVHHと会合することで融合ポリペプチド内の抗原結合ドメインVLの抗原結合活性が抑制され得る融合ポリペプチドのライブラリにも関する。
(A0)抗原結合ドメインと運搬部分とを含むポリペプチドであって、当該運搬部分は当該抗原結合ドメインの抗原結合活性を抑制する抑制ドメインを有し、当該抗原はIL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の分子である、ポリペプチド。
(A1)抗原結合ドメインと運搬部分とを含むポリペプチドであって、当該抗原結合ドメインは、当該抗原結合ドメインの抗原結合活性を抑制する抑制ドメインを有する運搬部分のものより短い血中半減期を有し、当該抗原はIL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の分子である、ポリペプチド。
(A2)前記抗原結合ドメインの分子量は、前記運搬部分のものより小さい、(A0)または(A1)に記載のポリペプチド。
(A3)前記抗原結合ドメインの前記分子量は、120 kDa、100 kDa、80 kDa、60 kDa、40 kDa、20 kDa、またはそれ以下である、(A0)から(A2)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A4)前記運搬部分はFcRn結合活性を有し、前記抗原結合ドメインはFcRn結合活性を有さないまたは前記運搬部分のFcRn結合活性よりも弱いFcRn結合活性を有する、(A0)から(A3)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A5)前記抗原結合ドメインは前記ポリペプチドから遊離可能であり、前記抗原結合ドメインは前記ポリペプチドから遊離することで、抗原結合活性が遊離前よりも高くなる、(A0)から(A4)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A6)前記抗原結合ドメインと前記運搬部分の前記抑制ドメインが会合することで前記抗原結合ドメインの抗原結合活性が抑制される、(A0)から(A5)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A7)前記ポリペプチドは切断サイトを含み、当該切断サイトが切断されることにより前記抗原結合ドメインが前記ポリペプチドから遊離可能になる、(A5)に記載のポリペプチド。
(A8)前記ポリペプチドは切断サイトを含み、当該切断サイトが切断されることにより前記抗原結合ドメインと前記運搬部分の前記抑制ドメインとの会合が解消される、(A6)に記載のポリペプチド。
(A9)前記ポリペプチドにおいて、前記運搬部分のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端は、リンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されているか、または前記ポリペプチドにおいて、前記運搬部分のC末端と前記抗原結合ドメインのN末端は、リンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されている、(A7)または(A8)に記載のポリペプチド。
(A10)前記ポリペプチドは、プロテアーゼ切断配列を更に有し、当該切断配列は、前記運搬部分のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端との間、前記運搬部分のC末端と前記抗原結合ドメインのN末端との間、前記抗原結合ドメインの配列内、または前記運搬部分の配列内に位置する、(A9)に記載のポリペプチド。
(A11)前記切断サイトはプロテアーゼ切断配列を含む、(A7)または(A8)に記載のポリペプチド。
(A12)前記プロテアーゼは、標的組織特異的なプロテアーゼである、(A10)または(A11)に記載のポリペプチド。
(A13)前記標的組織は炎症組織である、(A12)に記載のポリペプチド。
(A14)前記プロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ(uPA)、およびメタロプロテイナーゼから選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、(A10)または(A11)に記載のポリペプチド。
(A15)前記プロテアーゼは、MT-SP1、uPA、MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP13、MMP14、ADAM17、ADAMTS4、およびADAMTS5から選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、(A14)に記載のポリペプチド。
(A16)前記プロテアーゼ切断配列は、配列番号:508、509、および510から選ばれる配列を含む、(A10)または(A11)に記載のポリペプチド。
(A17)前記プロテアーゼ切断配列の一端に、第一可動リンカーが更に付加されている、(A11)から(A16)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A18)前記プロテアーゼ切断配列の他端に、第二可動リンカーが更に付加されている、(A17)に記載のポリペプチド。
(A19)前記第一可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(A17)に記載のポリペプチド。
(A20)前記第二可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(A18)に記載のポリペプチド。
(A21)前記抗原結合ドメインは、単ドメイン抗体もしくはIL-1Rアンタゴニスト(IL-1Ra)を含むかまたは単ドメイン抗体もしくはIL-1Rアンタゴニストであり、前記運搬部分の前記抑制ドメインは当該単ドメイン抗体またはIL-1Rアンタゴニストの抗原結合活性を抑制する、(A0)から(A20)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A22)前記単ドメイン抗体は、VHH、またはそれ単独で抗原結合活性を有するVH、またはそれ単独で抗原結合活性を有するVLである、(A21)に記載のポリペプチド。
(A23)前記抗原結合ドメインは単ドメイン抗体を含み、前記運搬部分の前記抑制ドメインはVHH、または抗体VH、または抗体VLであり、前記単ドメイン抗体は当該VHH、または抗体VH、または抗体VLにより抗原結合活性が抑制される、(A0)から(A22)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A24)前記抗原結合ドメインは単ドメイン抗体を含み、前記運搬部分の前記抑制ドメインはVHH、または抗体VH、または抗体VLであり、前記単ドメイン抗体は当該VHH、または抗体VH、または抗体VLと会合することにより抗原結合活性が抑制される、(A0)から(A23)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A25)前記単ドメイン抗体はVHH、またはそれ単独で抗原結合活性を有するVHであり、前記運搬部分の前記抑制ドメインは抗体VLであり、前記VHH、またはそれ単独で抗原結合活性を有するVHは、前記抗体VLと会合することで抗原結合活性が抑制される、(A21)から(A24)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A26)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHは37番、44番、45番、および47番(すべてKabatナンバリングに従う)のアミノ酸から選ばれる少なくとも一つのポジションにおいてアミノ酸置換されている、(A21)から(A25)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A27)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHは37V、44G、45L、および47W(すべてKabatナンバリングに従う)のアミノ酸から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸を含む、(A21)から(A25)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A28)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHはF37V、Y37V、E44G、Q44G、R45L、H45L、G47W、F47W、L47W、T47W、およびS47W(すべてKabatナンバリングに従う)のアミノ酸置換から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸置換を含む、(A21)から(A25)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A29)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHは37番/44番、37番/45番、37番/47番、44番/45番、44番/47番、45番/47番、37番/44番/45番、37番/44番/47番、37番/45番/47番、44番/45番/47番、および37番/44番/45番/47番(すべてKabatナンバリングに従う)から選ばれる少なくとも一組のポジションにおいてアミノ酸置換されている、(A21)から(A25)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A30)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHは37V/44G、37V/45L、37V/47W、44G/45L、44G/47W、45L/47W、37V/44G/45L、37V/44G/47W、37V/45L/47W、44G/45L/47W、および37V/44G/45L/47W(すべてKabatナンバリングに従う)から選ばれる少なくとも一組のアミノ酸を含む、(A21)から(A25)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A31)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHはF37V/R45L、F37V/G47W、R45L/G47W、およびF37V/R45L/G47W(すべてKabatナンバリングに従う)から選ばれる少なくとも一組のアミノ酸置換を含む、(A21)から(A25)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A32)前記単ドメイン抗体はそれ単独で抗原結合活性を有するVLであり、前記運搬部分の前記抑制ドメインは抗体VHであり、前記それ単独で抗原結合活性を有するVLは、前記抗体VHと会合することで抗原結合活性が抑制される、(A21)から(A24)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A33)前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLであり、かつ前記運搬部分の前記抑制ドメインは抗体VLであり、当該それ単独で抗原結合活性を有するVLは、抗体VLと会合することで抗原結合活性が抑制される、(A21)から(A24)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A34)前記それ単独で抗原結合活性を有するVLは配列番号:479または480のアミノ酸配列を含む、(A33)に記載のポリペプチド。
(A35)抗原結合ドメインと運搬部分とを含むポリペプチドであって、当該抗原結合ドメインは、当該抗原結合ドメインの抗原結合活性を抑制する抑制ドメインを有する当該運搬部分のものより短い血中半減期を有し、当該抗原結合ドメインは、IL-1R1、IL-1α、IL-1β、および/またはIL-1RAcP内のエピトープに結合し、かつ/または抗原はIL1-R1であり、かつ当該抗原結合ドメインは、当該エピトープへの結合について、下記の1)および2):
1)配列番号:479のアミノ酸配列を含む単ドメイン抗体VL、および
2)配列番号:480のアミノ酸配列を含む単ドメイン抗体VL
からなる群より選択される単ドメイン抗体VLと競合する、ポリペプチド。
(A36)IL-1R1に結合する抗原結合ドメイン(IL-1R1結合ドメイン)と運搬部分とを含むポリペプチドであって、当該抗原結合ドメインは、当該抗原結合ドメインのIL-1R1結合活性を抑制する抑制ドメインを有する当該運搬部分のものより短い血中半減期を有し、当該IL-1R1結合ドメインは、IL-1Raと競合しないか、またはIL-1Raと競合する、ポリペプチド。
(A37)前記抗原結合ドメインは、可溶性IL-1R、またはIL-1R1、IL-1α、IL-1β、および/もしくはIL-1RAcPに結合する単ドメイン抗体である、(A0)から(A34)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A38)前記抗原結合ドメインは、可溶性IL-1R1、可溶性IL-1R2、可溶性IL-1RAcP、またはIL-1αおよび/もしくはIL-1βに結合する単ドメイン抗体である、(A37)に記載のポリペプチド。
(A39)前記抗体VHは配列番号:486のアミノ酸配列を含み、かつ/または前記抗体VLは配列番号:484または485のアミノ酸配列を含む、(A23)から(A38)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A40)前記運搬部分はFcRn結合領域を有する、(A0)から(A39)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A41)前記運搬部分は抗体定常領域を含む、(A0)から(A40)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A42)前記運搬部分の抗体定常領域と前記抗原結合ドメインは、リンカーを介して、またはリンカーを介さずに融合されている、(A41)に記載のポリペプチド。
(A43)前記運搬部分は抗体重鎖定常領域を含み、当該抗体重鎖定常領域と前記抗原結合ドメインは、リンカーを介して、またはリンカーを介さずに融合されている、(A41)に記載のポリペプチド。
(A44)前記運搬部分は抗体軽鎖定常領域を含み、当該抗体軽鎖定常領域と前記抗原結合ドメインは、リンカーを介して、またはリンカーを介さずに融合されている、(A41)に記載のポリペプチド。
(A45)前記ポリペプチドにおいて、前記運搬部分の抗体重鎖定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、前記ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に有し、当該プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの配列中、または前記抗体重鎖定常領域の122番(EUナンバリング)のアミノ酸と比較して前記抗原結合ドメイン側に位置する、(A43)に記載のポリペプチド。
(A46)前記ポリペプチドにおいて、前記運搬部分の抗体軽鎖定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、前記ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に有し、当該プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの配列中、または前記抗体軽鎖定常領域の113番(EUナンバリング)(Kabatナンバリング113番)のアミノ酸と比較して前記抗原結合ドメイン側に位置する、(A44)に記載のポリペプチド。
(A47)前記ポリペプチドにおいて、前記運搬部分の抗体定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、前記抗原結合ドメインはVHから調製された単ドメイン抗体またはVHHであり、前記ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に有し、当該プロテアーゼ切断配列は、前記抗体定常領域の配列中、または前記抗原結合ドメインの単ドメイン抗体の109番(Kabatナンバリング)のアミノ酸と比較して前記抗体定常領域側に位置する、(A42)から(A44)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A48)前記ポリペプチドにおいて、前記運搬部分の抗体定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、前記ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に有し、当該プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインと前記抗体定常領域の境界付近に位置する、(A42)に記載のポリペプチド。
(A49)前記ポリペプチドにおいて、前記運搬部分の抗体重鎖定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、前記ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に有し、当該プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインと前記抗体重鎖定常領域の境界付近に位置する、(A43)に記載のポリペプチド。
(A50)前記ポリペプチドにおいて、前記運搬部分の抗体軽鎖定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、前記ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に有し、当該プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインと前記抗体軽鎖定常領域の境界付近に位置する、(A44)に記載のポリペプチド。
(A51)前記抗原結合ドメインはVHから調製された単ドメイン抗体またはVHHであり、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの単ドメイン抗体の109番(Kabatナンバリング)のアミノ酸と前記抗体重鎖定常領域の122番(EUナンバリング)のアミノ酸の間の任意のポジションに位置する、(A49)に記載のポリペプチド。
(A52)前記抗原結合ドメインはVHから調製された単ドメイン抗体またはVHHであり、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの単ドメイン抗体の109番(Kabatナンバリング)のアミノ酸と前記抗体軽鎖定常領域の113番(EUナンバリング)(Kabatナンバリング113番)のアミノ酸の間の任意のポジションに位置する、(A50)に記載のポリペプチド。
(A53)前記抗原結合ドメインはVLから調製された単ドメイン抗体であり、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの単ドメイン抗体の104番(Kabatナンバリング)のアミノ酸と前記抗体重鎖定常領域の122番(EUナンバリング)のアミノ酸の間の任意のポジションに位置する、(A49)に記載のポリペプチド。
(A54)前記抗原結合ドメインはVLから調製された単ドメイン抗体であり、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの単ドメイン抗体の109番(Kabatナンバリング)のアミノ酸と前記抗体軽鎖定常領域の113番(EUナンバリング)(Kabatナンバリング113番)のアミノ酸の間の任意のポジションに位置する、(A50)に記載のポリペプチド。
(A55)前記ポリペプチドの抗体定常領域はIgG抗体定常領域である、(A41)から(A54)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A56)前記ポリペプチドはIgG抗体様分子である、(A0)から(A55)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A57)前記抗原結合ドメインが未遊離の状態において、BLI(Bio-Layer Interferometry)法(Octet)を用いて測定を行うとき、抗原結合ドメインと抗原の結合が見られない、(A0)から(A56)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A58)前記抗原結合ドメインに第2の抗原結合ドメインが更に連結されている、(A0)から(A57)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A59)前記第2の抗原結合ドメインは、前記抗原結合ドメインの抗原結合特異性とは異なる抗原結合特異性を有する、(A58)に記載のポリペプチド。
(A60)前記第2の抗原結合ドメインは第2の単ドメイン抗体を含む、(A58)または(A59)に記載のポリペプチド。
(A61)前記抗原結合ドメインは単ドメイン抗体であり、前記第2の抗原結合ドメインは第2の単ドメイン抗体であり、前記抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインは前記ポリペプチドから遊離可能であり、前記抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインの遊離状態において、前記単ドメイン抗体と前記第2の単ドメイン抗体とが二重特異性抗原結合分子を形成している、(A60)に記載のポリペプチド。
(A62)前記第2の抗原結合ドメインは、標的抗原としてHER2またはGPC3に向けられている、(A58)から(A61)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A63)前記ポリペプチドは、前記抗原結合ドメインとは異なる別の抗原結合ドメインを更に有し、当該別の抗原結合ドメインも前記ポリペプチドの前記運搬部分と連結することにより抗原結合活性が抑制される、(A0)から(A62)のいずれかに記載のポリペプチド。
(A64)前記別の抗原結合ドメインと、前記抗原結合ドメインとは、抗原結合特異性が異なる、(A63)に記載のポリペプチド。
(A65)(A0)から(A64)のいずれかに記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。
(B1)(A1)から(A64)のいずれか1つのポリペプチドの有効量を対象に投与する工程を含む、IL-1R1介在性の疾患または障害を有する対象を治療する方法。
(B2)(A1)から(A64)のいずれか1つのポリペプチドの有効量を対象に投与する工程を含む、変形性関節症(OA)を有する対象を治療する方法。
(B3)(A1)から(A64)のいずれか1つのポリペプチドの有効量を対象に投与する工程を含む、変形性関節症(OA)において対象の軟骨分解を予防する方法。
(B4)(A1)から(A64)のいずれか1つのポリペプチドの有効量を含む、IL-1R1介在性の疾患または障害を有する対象を治療するための医薬組成物。
(B5)(A1)から(A64)のいずれか1つのポリペプチドの有効量を含む、変形性関節症(OA)を有する対象を治療するための医薬組成物。
(B6)(A1)から(A64)のいずれか1つのポリペプチドの有効量を含む、変形性関節症(OA)において対象の軟骨分解を予防するための医薬組成物。
(B7)IL-1R1介在性の疾患または障害を有する対象を治療するための医用薬剤の製造における、(A1)から(A64)のいずれか1つのポリペプチドの使用。
(B8)変形性関節症(OA)を有する対象を治療するための医用薬剤の製造における、(A1)から(A64)のいずれか1つのポリペプチドの使用。
(B9)変形性関節症(OA)において対象の軟骨分解を予防するための医用薬剤の製造における、(A1)から(A64)のいずれか1つのポリペプチドの使用。
(B10)IL-1R1介在性の疾患または障害を有する対象を治療するのに使用するための、(A1)から(A64)のいずれか1つのポリペプチド。
(B11)変形性関節症(OA)を有する対象を治療するのに使用するための、(A1)から(A64)のいずれか1つのポリペプチド。
(B12)変形性関節症(OA)において対象の軟骨分解を予防するのに使用するための、(A1)から(A64)のいずれか1つのポリペプチド。
(C1)(A1)から(A64)のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法。
(C2)以下の工程:
(a) IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の抗原に対して結合する抗原結合ドメインを取得する工程;
(b) (a)工程で取得した抗原結合ドメインの抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインによって抑制されるように、当該抗原結合ドメインと当該運搬部分を連結させてポリペプチド前駆体を形成させる工程;
(c) 前記ポリペプチド前駆体にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、(C1)に記載の製造方法。
(C3)以下の工程:
(a) IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の抗原に対して結合する抗原結合ドメインを取得する工程;
(b) (a)工程で取得した抗原結合ドメインの抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインによって抑制されるように、当該抗原結合ドメインと当該運搬部分を連結させてポリペプチド前駆体を形成させる工程;
(c) 前記抗原結合ドメインと前記運搬部分との境界付近にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、(C1)に記載の製造方法。
(C4)以下の工程:
(a) IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の抗原に対して結合する抗原結合ドメインを取得する工程;
(b) (a)工程で取得した抗原結合ドメインの抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインによって抑制されるように、当該抗原結合ドメインを、プロテアーゼ切断配列を介して当該運搬部分と連結させてポリペプチドを形成させる工程;
を含む、(C1)に記載の製造方法。
(C5)以下の工程:
(d) 前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチド前駆体中に組み込まれた前記抗原結合ドメインの前記標的抗原に対する結合活性が、弱められていることまたは失われていることを確認する工程;
を更に含む、(C2)から(C4)のいずれかに記載の製造方法。
(C6)以下の工程:
(e) 前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼで切断することによって前記抗原結合ドメインを遊離させ、遊離した抗原結合ドメインが前記抗原に結合することを確認する工程;
を更に含む、(C2)から(C5)のいずれかに記載の製造方法。
(C7)前記ポリペプチドはIgG抗体様分子である、(C1)に記載の製造方法。
(C8)以下の工程:
(a) IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の抗原に対して結合する抗原結合ドメインを取得する工程;
(b) (a)工程で取得した抗原結合ドメインの抗原結合活性が抑制されるように、当該抗原結合ドメインをIgG抗体もしくは改変IgG抗体のVHの代わりとしてVLもしくはVHと会合させ、または当該抗原結合ドメインをIgG抗体もしくは改変IgG抗体のVLの代わりとしてVHもしくはVLと会合させることによって、前記抗原結合ドメインが導入されているIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;
(c) 前記抗原結合ドメインが導入されているIgG抗体様分子前駆体にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、(C7)に記載の製造方法。
(C9)以下の工程:
(a) IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の抗原に結合する抗原結合ドメインを取得する工程;
(b) (a)工程で取得した抗原結合ドメインの抗原結合活性が抑制されるように、当該抗原結合ドメインをIgG抗体もしくは改変IgG抗体のVHの代わりとしてVLもしくはVHと会合させ、または当該抗原結合ドメインをIgG抗体もしくは改変IgG抗体のVLの代わりとしてVHもしくはVLと会合させることによって、前記抗原結合ドメインが導入されているIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;
(c) 前記抗原結合ドメインと前記IgG抗体様分子前駆体中の抗体定常領域との境界付近にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、(C7)に記載の製造方法。
(C10)以下の工程:
(a) IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の抗原に結合する抗原結合ドメインを取得する工程;
(b) (a)工程で取得した抗原結合ドメインの抗原結合活性が抑制されるように、当該抗原結合ドメインをIgG抗体VHまたはVLの代わりとして、プロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体の重鎖定常領域または軽鎖定常領域と連結させ、前記抗原結合ドメインが導入されているIgG抗体様分子を形成させる工程;
を含む、(C7)に記載の製造方法。
(C11)以下の工程:
(d) 前記IgG抗体様分子または前記IgG抗体様分子前駆体に導入された前記抗原結合ドメインの前記標的抗原に対する結合活性が、弱められていることまたは失われていることを確認する工程;
を更に含む、(C8)から(C10)のいずれかに記載の製造方法。
(C12)以下の工程:
(e) 前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼを用いて切断することによって前記抗原結合ドメインを遊離させ、遊離した抗原結合ドメインが前記標的抗原に結合することを確認する工程;
を更に含む、(C8)から(C11)のいずれかに記載の製造方法。
(C13)以下の工程:
(a) 抗原結合ドメイン中の、抗体VHとの当該抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または抗原結合ドメイン中の、抗体VLとの当該抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該抗原結合ドメインの標的抗原に対する結合活性を保持する改変抗原結合ドメインを調製する工程;
(b) (a)工程で調製した改変抗原結合ドメインの抗原結合活性を抑制するように、当該改変抗原結合ドメインを抗体VHと会合させ、または当該改変抗原結合ドメインを抗体VLと会合させることによって、当該改変抗原結合ドメインが導入されているIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;
(c) 前記改変抗原結合ドメインが導入されている前記IgG抗体様分子前駆体にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含み、当該抗原結合ドメインは、IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の抗原に結合する、(C7)に記載の製造方法。
(C14)以下の工程:
(a) 抗原結合ドメイン中の、抗体VHとの当該抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または抗原結合ドメイン中の、抗体VLとの当該抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該抗原結合ドメインの標的抗原に対する結合活性を保持する改変抗原結合ドメインを調製する工程;
(b) (a)工程で調製した改変抗原結合ドメインの抗原結合活性を抑制するように、当該改変抗原結合ドメインを抗体VHと会合させ、または当該改変抗原結合ドメインを抗体VLと会合させることによって、当該改変抗原結合ドメインが導入されているIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;
(c) 前記改変抗原結合ドメインと前記IgG抗体様分子前駆体の定常領域との境界付近にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含み、当該抗原結合ドメインは、IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の抗原に結合する、(C7)に記載の製造方法。
(C15)以下の工程:
(a) 抗原結合ドメイン中の、抗体VHとの当該抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または抗原結合ドメイン中の、抗体VLとの当該抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該抗原結合ドメインの標的抗原に対する結合活性を保持する改変抗原結合ドメインを調製する工程;
(b) (a)工程で調製した改変抗原結合ドメインの抗原結合活性を抑制するように、当該改変抗原結合ドメインをプロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体の重鎖定常領域と連結させ、または当該改変抗原結合ドメインをプロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体の軽鎖定常領域と連結させ、当該改変抗原結合ドメインが導入されているIgG抗体様分子を形成させる工程;
を含み、当該抗原結合ドメインは、IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の抗原に結合する、(C7)に記載の製造方法。
(C16)以下の工程:
(d) 前記IgG抗体様分子に導入されている前記改変抗原結合ドメインまたは前記IgG抗体様分子前駆体に導入されている前記改変抗原結合ドメインの、前記標的抗原に対する結合活性が、弱められていることまたは失われていることを確認する工程;
を更に含む、(C13)から(C15)のいずれかに記載の製造方法。
(C17)以下の工程:
(e) 前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼで切断することによって前記改変抗原結合ドメインを遊離させ、遊離した改変抗原結合ドメインが前記標的抗原に結合することを確認する工程;
を更に含む、(C13)から(C16)のいずれかに記載の製造方法。
(C18)前記抗原結合ドメインは、IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の抗原内のエピトープに結合する、(C2)から(C17)のいずれかに記載の製造方法。
(C19)IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の抗原は、IL-1R1、IL-1α、IL-1β、および/またはIL-1RAcPである、(C1)から(C18)のいずれかに記載の製造方法。
(C20)前記抗原結合ドメインは、前記エピトープへの結合について、下記の1)および2):
1)配列番号:479のアミノ酸配列を含む単ドメイン抗体VL、および
2)配列番号:480のアミノ酸配列を含む単ドメイン抗体VL
からなる群より選択される単ドメイン抗体VLと競合する、(C2)から(C18)のいずれかに記載の製造方法。
(C21)前記抗原結合ドメインは、単ドメイン抗体もしくはアンタゴニストを含むか、または単ドメイン抗体もしくはアンタゴニストである、(C2)から(C20)のいずれかに記載の製造方法。
(C22)前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、(C21)に記載の製造方法。
(C23)前記それ単独で抗原結合活性を有するVLは、配列番号:479または480のアミノ酸配列を含む、(C22)に記載の製造方法。
(C24)前記(b)工程におけるIgGのVHおよび/または前記(b)工程におけるIgG抗体様分子前駆体は、配列番号:486のアミノ酸配列を含む、(C8)から(C23)のいずれか1つに記載の製造方法。
(C25)前記(b)工程におけるIgGのVLおよび/または前記(b)工程におけるIgG抗体様分子前駆体は、配列番号:484または485のアミノ酸配列を含む、(C8)から(C23)のいずれかに記載の製造方法。
(C26)(A1)から(A64)のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
(C27)(C26)に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
(C28)(C26)に記載のポリヌクレオチドまたは(C26)に記載のベクターを含む、宿主細胞。
(C29)(C28)に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、(A1)から(A64)のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法。
(C30)(C1)から(C25)および(C29)のいずれかに記載の方法によって製造されるポリペプチド。
(D1)特定のVLと会合することで、もしくは特定のVHと会合することで、もしくは特定のVHHと会合することで、その抗原結合活性が抑制され得る抗原結合ドメインをスクリーニングする方法であって、当該抗原は、IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の分子である、方法。
(D2)特定のVLと会合することで、その抗原結合活性が抑制され得る抗原結合ドメインをスクリーニングする方法である、(D1)に記載のスクリーニング方法。
(D3)以下の工程:
(a)標的抗原結合活性を有する抗原結合ドメインを取得する工程;
(b)(a)工程で取得した抗原結合ドメインを特定のVLと会合させる工程;および
(c)(b)工程で特定のVLと会合させた前記抗原結合ドメインの、抗原に対する前記結合活性が、会合前のものと比較して、弱められていることまたは失われていることを確認する工程
を含む、(D2)に記載のスクリーニング方法。
(D4)以下の工程:
(a)抗原結合ドメインを特定のVLと会合させる工程;
(b)(a)工程で特定のVLと会合させた前記抗原結合ドメインが、前記抗原に対する結合活性を有さないかまたは予め決定した値以下の結合活性を有することに基づいて、VLと抗原結合ドメインとの会合体を選択する工程;および
(c)(b)工程で選択した会合体中の前記抗原結合ドメインが、特定のVLと会合した状態でのものより、特定のVLと会合していない状態で前記抗原に対してより強い結合活性を有することを確認する工程
を含む、(D2)に記載のスクリーニング方法。
(D5)特定のVHと会合させることでその抗原結合活性を抑制することができる抗原結合ドメインをスクリーニングする方法である、(D1)に記載のスクリーニング方法。
(D6)以下の工程:
(a)標的抗原結合活性を有する抗原結合ドメインを取得する工程;
(b)(a)工程で取得した抗原結合ドメインを特定のVHと会合させる工程;および
(c)(b)工程で特定のVHと会合させた前記抗原結合ドメインの、抗原に対する前記結合活性が、会合前のものと比較して、弱められていることまたは失われていることを確認する工程
を含む、(D5)に記載のスクリーニング方法。
(D7)以下の工程:
(a)抗原結合ドメインを特定のVHと会合させる工程;
(b)(a)工程で特定のVHと会合させた前記抗原結合ドメインが、前記抗原に対する結合活性を有さないかまたは予め決定した値以下の結合活性を有することに基づいて、VHと抗原結合ドメインとの会合体を選択する工程;および
(c)(b)工程で選択した会合体中の前記抗原結合ドメインが、特定のVHと会合した状態でのものより、特定のVHと会合していない状態で前記抗原に対してより強い結合活性を有することを確認する工程
を含む、(D5)に記載のスクリーニング方法。
(D8)特定のVHHと会合させることでその抗原結合活性を抑制することができる抗原結合ドメインをスクリーニングする方法である、(D1)に記載のスクリーニング方法。
(D9)以下の工程:
(a)標的抗原結合活性を有する抗原結合ドメインを取得する工程;
(b)(a)工程で取得した抗原結合ドメインを特定のVHHと会合させる工程;および
(c)(b)工程で特定のVHHと会合させた前記抗原結合ドメインの、抗原に対する前記結合活性が、会合前のものと比較して、弱められていることまたは失われていることを確認する工程
を含む、(D8)に記載のスクリーニング方法。
(D10)以下の工程:
(a)抗原結合ドメインを特定のVHHと会合させる工程;
(b)(a)工程で特定のVHHと会合させた前記抗原結合ドメインが、前記抗原に対する結合活性を有さないかまたは予め決定した値以下の結合活性を有することに基づいて、VHHと抗原結合ドメインとの会合体を選択する工程;
(c)(b)工程で選択した会合体中の前記抗原結合ドメインが、特定のVHHと会合した状態でのものより、特定のVHHと会合していない状態で前記抗原に対してより強い結合活性を有することを確認する工程
を含む、(D8)に記載のスクリーニング方法。
(D11)前記抗原結合ドメインは、単ドメイン抗体またはアンタゴニストを含むか、または単ドメイン抗体またはアンタゴニストである、(D1)から(D10)のいずれか1つに記載のスクリーニング方法。
(D12)前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、(D11)に記載のスクリーニング方法。
(D13)IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の分子は、IL-1R1、IL-1α、IL-1β、およびIL-1RAcPからなる群より選択される、(D1)から(D12)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(D14)以下のための候補を取得するのに使用するための、(D1)から(D13)のいずれかに記載のスクリーニング方法:
(i)IL-1R1介在性の疾患または障害を有する対象を治療するため、
(ii)変形性関節症(OA)を有する対象を治療するため、および/または
(iii)変形性関節症(OA)において対象の軟骨分解を予防するため。
(E1)特定のVLと会合すること、特定のVHと会合すること、または特定のVHHと会合することでその抗原結合活性を抑制することができる抗原結合ドメインを製造する方法であって、当該抗原は、IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の分子である、方法。
(E2)特定のVLと会合することでその抗原結合活性を抑制することができる抗原結合ドメインを製造する方法である、(E1)に記載の製造方法。
(E3)以下の工程:
(a)抗原結合ドメイン中の、抗体VLとの当該抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、標的抗原に対する当該抗原結合ドメインの結合活性を保持する改変抗原結合ドメインを調製する工程
を含む、(E2)に記載の製造方法。
(E4)以下の工程:
(b)(a)工程で調製した前記改変抗原結合ドメインをVLと会合させる工程;および
(c)VLと会合させた前記改変抗原結合ドメインの抗原結合活性が、会合前のものと比較して、弱められていることまたは失われていることを確認する工程
を更に含む、(E3)に記載の製造方法。
(E5)特定のVHと会合させることでその抗原結合活性を抑制することができる抗原結合ドメインを製造する方法である、(E1)に記載の製造方法。
(E6)以下の工程:
(a)抗原結合ドメイン中の、抗体VHとの当該抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、標的抗原に対する当該抗原結合ドメインの結合活性を保持する改変抗原結合ドメインを調製する工程
を含む、(E5)に記載の製造方法。
(E7)以下の工程:
(b)(a)工程で調製した前記改変抗原結合ドメインをVHと会合させる工程;および
(c)VHと会合させた前記改変抗原結合ドメインの抗原結合活性が、会合前のものと比較して、弱められていることまたは失われていることを確認する工程
を更に含む、(E6)に記載の製造方法。
(E8)特定のVHHと会合させることでその抗原結合活性を抑制することができる抗原結合ドメインを製造する方法である、(E1)に記載の製造方法。
(E9)以下の工程:
(a)抗原結合ドメイン中の、VHHとの当該抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、標的抗原に対する当該抗原結合ドメインの結合活性を保持する改変抗原結合ドメインを調製する工程
を含む、(E8)に記載の製造方法。
(E10)以下の工程:
(b)(a)工程で調製した前記改変抗原結合ドメインをVHHと会合させる工程;および
(c)VHHと会合させた前記改変抗原結合ドメインの抗原結合活性が、会合前のものと比較して、弱められていることまたは失われていることを確認する工程
を更に含む、(E9)に記載の製造方法。
(E11)前記抗原結合ドメインは、単ドメイン抗体またはアンタゴニストを含むか、または単ドメイン抗体またはアンタゴニストである、(E1)から(E10)のいずれかに記載の製造方法。
(E12)前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、(E11)に記載の製造方法。
(E13)IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の分子は、IL-1R1、IL-1α、IL-1β、およびIL-1RAcPからなる群より選択される、(E1)から(E12)のいずれかに記載の製造方法。
(F1)抗原結合ドメインをそれぞれ第1会合支持ドメインと連結させた融合ポリペプチドを複数含むライブラリであって、前記抗原結合ドメインは、特定のVLと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るもしくは失われ得る抗原結合ドメイン、または特定のVHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るもしくは失われ得る抗原結合ドメイン、または特定のVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るもしくは失われ得る抗原結合ドメインを含み、当該抗原は、IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の分子である、ライブラリ。
(F2)前記抗原結合ドメインは、単ドメイン抗体を含むかまたは単ドメイン抗体であり、前記ライブラリ中の融合ポリペプチドの単ドメイン抗体部分は、ラクダ科動物もしくは単ドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入されている遺伝子導入動物から取得した単ドメイン抗体もしくはそのヒト化抗体、またはラクダ科動物もしくは単ドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入されている遺伝子導入動物を免疫させることで取得した単ドメイン抗体もしくはそのヒト化抗体、またはヒト抗体VHもしくはVLから出発して人工的に調製された単ドメイン抗体を含む、(F1)に記載のライブラリ。
(F3)抗原結合ドメインをそれぞれ第1会合支持ドメインと連結させた融合ポリペプチドを複数含むライブラリであって、前記抗原結合ドメインは、特定のVLと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るもしくは失われ得る抗原結合ドメインを含む、(F1)または(F2)に記載のライブラリ。
(F4)抗原結合ドメインをそれぞれ第1会合支持ドメインと連結させた融合ポリペプチドを複数含むライブラリであって、前記抗原結合ドメインは、特定のVHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るもしくは失われ得る抗原結合ドメインを含むライブラリである、(F1)または(F2)に記載のライブラリ。
(F5)抗原結合ドメインをそれぞれ第1会合支持ドメインと連結させた融合ポリペプチドを複数含むライブラリであって、前記抗原結合ドメインは、特定のVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るもしくは失われ得る抗原結合ドメインを含むライブラリである、(F1)または(F2)に記載のライブラリ。
(F6)前記第1会合支持ドメインは、IgG抗体CH1ドメインまたは抗体軽鎖定常領域を含む、(F1)から(F5)のいずれか1つに記載のライブラリ。
(F7)前記抗原結合ドメインは、単ドメイン抗体またはアンタゴニストを含むか、または単ドメイン抗体またはアンタゴニストである、(F1)から(F6)のいずれか1つに記載のライブラリ。
(F8)前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、(F7)に記載のライブラリ。
(F9)IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の分子は、IL-1R1、IL-1α、IL-1β、およびIL-1RAcPからなる群より選択される、(F1)から(F8)のいずれかに記載のライブラリ。
(F10)前記それ単独で抗原結合活性を有するVLは、配列番号:479または480のアミノ酸配列を含む、(F1)から(F9)のいずれかに記載のライブラリ。
(G1)(F1)または(F2)に記載のライブラリから、特定のVLと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るもしくは失われ得る抗原結合ドメイン、または特定のVHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るもしくは失われ得る抗原結合ドメイン、または特定のVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るもしくは失われ得る抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドをスクリーニングする方法であって、当該抗原は、IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の分子である、方法。
(G2)(F3)に記載のライブラリから、特定のVLと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るもしくは失われ得る抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドをスクリーニングする方法であって、当該抗原は、IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の分子である、方法。
(G3)以下の工程:
(a) 前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b) 特定のVLと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c) (a)工程でディスプレイされた融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、抗原結合ドメインと前記VLが会合する状態で、抗原と結合しないもしくは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;
(d) (c)工程に従って選択された融合ポリペプチドから、含まれる抗原結合ドメインと前記VLが会合しない状態で、抗原と結合するもしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する工程;
を含む、(G2)に記載のスクリーニング方法。
(G4)前記(b)工程で用意された会合パートナーはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程は、プロテアーゼ処理により前記会合パートナーを切断し、前記抗原結合ドメインと前記VLとの会合を解消させることを含む、(G3)に記載のスクリーニング方法。
(G5)前記(b)工程で用意された会合パートナーの前記プロテアーゼ切断配列は、前記特定のVLと前記第2会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(G4)に記載のスクリーニング方法。
(G6)前記ライブラリの融合ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程は、プロテアーゼ処理により前記融合ポリペプチドを切断し、前記抗原結合ドメインと前記VLとの会合を解消させることを含む、(G3)に記載のスクリーニング方法。
(G7)前記融合ポリペプチドは第1会合支持ドメインを含み、各融合ポリペプチドに含まれるプロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインと前記第1会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(G6)に記載のスクリーニング方法。
(G8)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長もしくは抗原結合ドメインを含む部分を再度インビトロディスプレイさせることを含む、(G3)に記載のスクリーニング方法。
(G9)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長を再度インビトロディスプレイさせ、第2会合支持ドメインのみと会合させた状態で、抗原と結合するもしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択することを含む、(G3)に記載のスクリーニング方法。
(G10)(F4)に記載のライブラリから、特定のVHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るもしくは失われ得る抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドをスクリーニングする方法であって、当該抗原は、IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の分子である、方法。
(G11)以下の工程:
(a) 前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b) 特定のVHと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c) (a)工程でディスプレイした融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、抗原結合ドメインと前記VHが会合する状態で、抗原と結合しないもしくは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;
(d) (c)工程に従って選択された融合ポリペプチドから、含まれる抗原結合ドメインと前記VHが会合しない状態で、抗原と結合するもしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する工程;
を含む、(G10)に記載のスクリーニング方法。
(G12)前記(b)工程で用意された会合パートナーはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程は、プロテアーゼ処理により前記会合パートナーを切断し、前記抗原結合ドメインと前記VHとの会合を解消させることを含む、(G11)に記載のスクリーニング方法。
(G13)前記(b)工程で用意された会合パートナーの前記プロテアーゼ切断配列は、前記特定のVHと前記第2会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(G12)に記載のスクリーニング方法。
(G14)前記ライブラリの融合ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程は、プロテアーゼ処理により前記融合ポリペプチドを切断し、前記抗原結合ドメインと前記VHとの会合を解消させることを含む、(G11)に記載のスクリーニング方法。
(G15)前記融合ポリペプチドは第1会合支持ドメインを含み、各融合ポリペプチドに含まれるプロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインと前記第1会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(G14)に記載のスクリーニング方法。
(G16)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長もしくは抗原結合ドメインを含む部分を再度インビトロディスプレイさせることを含む、(G11)に記載のスクリーニング方法。
(G17)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長を再度インビトロディスプレイさせ、第2会合支持ドメインのみと会合させた状態で、抗原と結合するもしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択することを含む、(G11)に記載のスクリーニング方法。
(G18)(F5)に記載のライブラリから、特定のVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るもしくは失われ得る抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドをスクリーニングする方法であって、当該抗原は、IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の分子である、方法。
(G19)以下の工程:
(a) 前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b) 特定のVHHと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c) (a)工程でディスプレイした融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、抗原結合ドメインと前記特定のVHHが会合する状態で、抗原と結合しないもしくは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;
(d) (c)工程に従って選択された融合ポリペプチドから、含まれる抗原結合ドメインと前記VHHが会合しない状態で、抗原と結合するもしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する工程;
を含む、(G18)に記載のスクリーニング方法。
(G20)前記(b)工程で用意された会合パートナーはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程は、プロテアーゼ処理により前記会合パートナーを切断し、前記抗原結合ドメインと前記VHHとの会合を解消させることを含む、(G19)に記載のスクリーニング方法。
(G21)前記(b)工程で用意された会合パートナーの前記プロテアーゼ切断配列は、前記特定のVHHと前記第2会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(G20)に記載のスクリーニング方法。
(G22)前記ライブラリの融合ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程は、プロテアーゼ処理により前記融合ポリペプチドを切断し、前記抗原結合ドメインと前記VHHとの会合を解消させることを含む、(G19)に記載のスクリーニング方法。
(G23)前記融合ポリペプチドは第1会合支持ドメインを含み、各融合ポリペプチドに含まれるプロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインと前記第1会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(G22)に記載のスクリーニング方法。
(G24)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長もしくは抗原結合ドメインを含む部分を再度インビトロディスプレイさせることを含む、(G19)に記載のスクリーニング方法。
(G25)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長を再度インビトロディスプレイさせ、第2会合支持ドメインのみと会合させた状態で、抗原と結合するもしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択することを含む、(G19)に記載のスクリーニング方法。
(G26)前記(b)工程中の会合パートナーを用意する工程は、会合パートナーと融合ポリペプチドを同時にディスプレイさせる工程である、(G3)から(G9)、(G11)から(G17)、(G19)から(G25)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(G27)前記第1会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインまたは抗体軽鎖定常領域を含む、(G7)から(G9)、(G15)から(G17)、(G23)から(G25)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(G28)前記第2会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインまたは抗体軽鎖定常領域を含む、(G3)から(G9)、(G11)から(G17)、(G19)から(G25)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(G29)前記第1会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインを含み、前記第2会合支持ドメインは抗体軽鎖定常領域を含む、(G27)または(G28)に記載のスクリーニング方法。
(G30)前記第1会合支持ドメインは抗体軽鎖定常領域を含み、前記第2会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインを含む、(G27)または(G28)に記載のスクリーニング方法。
(G31)以下の工程:
(a) 前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b) 特定のVLと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c) 抗原と結合するもしくは抗原結合活性が一定値以上である抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドを選択する工程;
(d) (c)工程に従って選択された融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、抗原結合ドメインと前記VLが会合する状態で、抗原と結合しないもしくは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;
を含む、(G2)に記載のスクリーニング方法。
(G32)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドを再度インビトロディスプレイさせることを含む、(G31)に記載のスクリーニング方法。
(G33)前記(c)工程は、前記融合ポリペプチドを第2会合支持ドメインのみと会合させることを含む、または第2会合支持ドメインのみと会合させた融合ポリペプチドに含まれる抗原結合ドメインの抗原結合を確認することを含む、(G31)に記載のスクリーニング方法。
(G34)以下の工程:
(a) 前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b) 特定のVHと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c) 抗原と結合するもしくは抗原結合活性が一定値以上である抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドを選択する工程;
(d) (c)工程に従って選択された融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、抗原結合ドメインと前記VHが会合する状態で、抗原と結合しないもしくは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;
を含む、(G10)に記載のスクリーニング方法。
(G35)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドを再度インビトロディスプレイさせることを含む、(G34)に記載のスクリーニング方法。
(G36)前記(c)工程は、前記融合ポリペプチドを第2会合支持ドメインのみと会合させることを含む、または第2会合支持ドメインのみと会合させた融合ポリペプチドに含まれる抗原結合ドメインの抗原結合を確認することを含む、(G34)に記載のスクリーニング方法。
(G37)以下の工程:
(a) 前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b) 特定のVHHと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c)抗原と結合するもしくは抗原結合活性が一定値以上である抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドを選択する工程;
(d) (c)工程に従って選択された融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、抗原結合ドメインと前記VHHが会合する状態で、抗原と結合しないもしくは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;
を含む、(G18)に記載のスクリーニング方法。
(G38)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドを再度インビトロディスプレイさせることを含む、(G37)に記載のスクリーニング方法。
(G39)前記(c)工程は、前記融合ポリペプチドを第2会合支持ドメインのみと会合させることを含む、または第2会合支持ドメインのみと会合させた融合ポリペプチドに含まれる抗原結合ドメインの抗原結合を確認することを含む、(G37)に記載のスクリーニング方法。
(G40)前記融合ポリペプチドは第1会合支持ドメインを含み、当該第1会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインまたは抗体軽鎖定常領域を含む、(G31)から(G39)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(G41)前記第2会合支持ドメインは、IgG抗体CH1ドメインまたは抗体軽鎖定常領域を含む、(G31)から(G40)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(G42)前記(d)工程における融合ポリペプチドと会合パートナーとを会合させる工程は、会合パートナーと融合ポリペプチドを同時にディスプレイさせる工程である、(G31)から(G41)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(G43)前記融合ポリペプチドは第1会合支持ドメインを含み、当該第1会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインを含み、前記第2会合支持ドメインは抗体軽鎖定常領域を含む、(G31)から(G42)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(G44)前記融合ポリペプチドは第1会合支持ドメインを含み、当該第1会合支持ドメインは抗体軽鎖定常領域を含み、前記第2会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインを含む、(G31)から(G42)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(G45)前記抗原結合ドメインは、単ドメイン抗体またはアンタゴニストを含むか、または単ドメイン抗体またはアンタゴニストである、(G31)から(G44)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(G46)前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、(G45)に記載のスクリーニング方法。
(G47)IL-1により媒介されるシグナル伝達に関与する1つまたは複数の分子は、IL-1R1、IL-1α、IL-1β、およびIL-1RAcPからなる群より選択される、(G1)から(G46)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(H1)抗原結合ドメインVLと運搬部分とを含むポリペプチドであって、当該抗原結合ドメインVLは、当該抗原結合ドメインVLの抗原結合活性を抑制する抑制ドメインを有する当該運搬部分のものより短い血中半減期を有する、ポリペプチド。
(H2)前記抗原結合ドメインVLは、それ単独で抗原結合活性を有するVLを含むか、またはそれ単独で抗原結合活性を有するVLである、(H1)に記載のポリペプチド。
(H3)前記運搬部分の前記抑制ドメインはVHH、抗体VH、または抗体VLである、(H1)または(H2)に記載のポリペプチド。
(H4)抗原結合ドメインVLと運搬部分とを含むポリペプチドであって、当該抗原結合ドメインVLは、当該抗原結合ドメインVLの抗原結合活性を抑制する抑制ドメインVLを有する当該運搬部分のものより短い血中半減期を有する、ポリペプチド。
(H5)前記抗原結合ドメインVLは、それ単独で抗原結合活性を有するVLを含むか、またはそれ単独で抗原結合活性を有するVLである、(H4)に記載のポリペプチド。
(H6)前記抑制ドメインVLは抗体VLである、(H4)または(H5)に記載のポリペプチド。
(H7)前記抗原結合ドメインVLの分子量は前記運搬部分のものより小さい、(H1)から(H6)のいずれか1つに記載のポリペプチド。
(H8)前記抗原結合ドメインVLの分子量は、120 kDa、100 kDa、80 kDa、60 kDa、40 kDa、20 kDa、またはそれ以下である、(H1)から(H7)のいずれか1つに記載のポリペプチド。
(H9)前記運搬部分はFcRn結合活性を有し、かつ前記抗原結合ドメインVLはFcRn結合活性を有さないか、または前記運搬部分のものより弱いFcRn結合活性を有する、(H1)から(H8)のいずれかに記載のポリペプチド。
(H10)前記抗原結合ドメインVLは、前記ポリペプチドから遊離可能であり、かつ前記ポリペプチドから遊離された前記抗原結合ドメインVLは、遊離前のものより高い抗原結合活性を有する、(H1)から(H9)のいずれかに記載のポリペプチド。
(H11)前記運搬部分の前記抑制ドメインは、前記抗原結合ドメインVLと会合し、それによって抗原結合ドメインVLの抗原結合活性を抑制する、(H1)から(H10)のいずれかに記載のポリペプチド。
(H12)前記ポリペプチドは切断サイトを含み、当該切断サイトが切断されることにより、前記抗原結合ドメインVLが前記ポリペプチドから遊離可能になる、(H10)に記載のポリペプチド。
(H13)前記ポリペプチドは切断サイトを含み、当該切断サイトが切断されることにより、前記運搬部分の抑制ドメインと前記抗原結合ドメインVLとの会合が解消される、(H11)に記載のポリペプチド。
(H14)前記切断サイトはプロテアーゼ切断配列を含む、(H12)または(H13)に記載のポリペプチド。
(H15)前記プロテアーゼは標的組織特異的プロテアーゼである、(H14)に記載のポリペプチド。
(H16)前記標的組織は癌組織または炎症組織である、(H15)に記載のポリペプチド。
(H17)前記プロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ(uPA)、およびメタロプロテイナーゼから選択される少なくとも1つのプロテアーゼである、(H14)に記載のポリペプチド。
(H18)前記プロテアーゼは、MT-SP1、uPA、MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP13、MMP14、ADAM17、ADAMTS4、およびADAMTS5から選択される少なくとも1つのプロテアーゼである、(H17)に記載のポリペプチド。
(H19)前記プロテアーゼ切断配列は、配列番号:12、25、34、35、70~73、75、76、91、178、193~195、および508~510から選択される配列を含む、(H14)に記載のポリペプチド。
(H20)前記プロテアーゼ切断配列の一端に、第一可動リンカーが更に付加されている、(H14)から(H19)のいずれかに記載のポリペプチド。
(H21)前記プロテアーゼ切断配列の他端に、第二可動リンカーが更に付加されている、(H20)に記載のポリペプチド。
(H22)前記第一可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(H20)に記載のポリペプチド。
(H23)前記第二可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(H21)に記載のポリペプチド。
(H24)前記抗原結合ドメインVLは、VHH、抗体VH、または抗体VLと会合することで抗原結合活性が抑制される、(H1)から(H23)のいずれかに記載のポリペプチド。
(H25)前記運搬部分はFcRn結合領域を有する、(H1)から(H24)のいずれかに記載のポリペプチド。
(H26)前記運搬部分は抗体定常領域を含む、(H1)から(H25)のいずれかに記載のポリペプチド。
(H27)前記運搬部分の前記抗体定常領域および前記抗原結合ドメインVLは、リンカーを介してまたはリンカーなしで融合されている、(H26)に記載のポリペプチド。
(H28)前記運搬部分は抗体重鎖定常領域を含み、当該抗体重鎖定常領域と前記抗原結合ドメインVLは、リンカーを介してまたはリンカーなしで融合されている、(H26)に記載のポリペプチド。
(H29)前記運搬部分は抗体軽鎖定常領域を含み、当該抗体軽鎖定常領域と前記抗原結合ドメインVLは、リンカーを介してまたはリンカーなしで融合されている、(H26)に記載のポリペプチド。
(H30)前記ポリペプチドにおいて、前記運搬部分の前記抗体重鎖定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインVLのC末端は、リンカーを介してまたはリンカーなしで融合されており、かつ前記ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に有し、当該プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインVLの配列内に、または前記抗体重鎖定常領域の122番(EUナンバリング)のアミノ酸と比べて前記抗原結合ドメインVL側に位置する、(H28)に記載のポリペプチド。
(H31)前記ポリペプチドにおいて、前記運搬部分の前記抗体軽鎖定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインVLのC末端は、リンカーを介してまたはリンカーなしで融合されており、かつ前記ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に有し、当該プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインVLの配列内に、または前記抗体軽鎖定常領域の113番(EUナンバリング)(Kabatナンバリング113番)のアミノ酸と比べて前記抗原結合ドメインVL側に位置する、(H29)に記載のポリペプチド。
(H32)前記ポリペプチドにおいて、前記運搬部分の前記抗体定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインVLのC末端は、リンカーを介してまたはリンカーなしで融合されており、かつ前記ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に有し、当該プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインVLと前記抗体定常領域との境界付近に位置する、(H27)に記載のポリペプチド。
(H33)前記ポリペプチドにおいて、前記運搬部分の前記抗体重鎖定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインVLのC末端は、リンカーを介してまたはリンカーなしで融合されており、かつ前記ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に有し、当該プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインVLと前記抗体重鎖定常領域との境界付近に位置する、(H28)に記載のポリペプチド。
(H34)前記ポリペプチドにおいて、前記運搬部分の前記抗体軽鎖定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインVLのC末端は、リンカーを介してまたはリンカーなしで融合されており、かつ前記ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に有し、当該プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインVLと前記抗体軽鎖定常領域との境界付近に位置する、(H29)に記載のポリペプチド。
(H35)前記抗原結合ドメインVLは、VLから作製された単ドメイン抗体であり、かつ前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインVLの単ドメイン抗体の104番(Kabatナンバリング)のアミノ酸と前記抗体重鎖定常領域の122番(EUナンバリング)のアミノ酸との間の任意の位置に位置する、(H33)に記載のポリペプチド。
(H36)前記抗原結合ドメインVLは、VLから作製された単ドメイン抗体であり、かつ前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインVLの単ドメイン抗体の109番(Kabatナンバリング)のアミノ酸と前記抗体軽鎖定常領域の113番(EUナンバリング)(Kabatナンバリング113番)のアミノ酸との間の任意の位置に位置する、(H34)に記載のポリペプチド。
(H37)前記ポリペプチドの前記抗体定常領域はIgG抗体定常領域である、(H26)から(H36)のいずれかに記載のポリペプチド。
(H38)前記ポリペプチドはIgG抗体様分子である、(H1)から(H37)のいずれかに記載のポリペプチド。
(H39)前記抗原結合ドメインVLが未遊離の状態において、BLI(bio-layer interferometry)法(Octet)を用いることにより測定されるとき、抗原への前記抗原結合ドメインVLの結合が見られない、(H1)から(H38)のいずれかに記載のポリペプチド。
(H40)前記抗原結合ドメインVLに第2の抗原結合ドメインが更に連結されている、(H1)から(H39)のいずれかに記載のポリペプチド。
(H41)前記第2の抗原結合ドメインは、前記抗原結合ドメインVLのものと異なる抗原結合特異性を有する、(H40)に記載のポリペプチド。
(H42)前記第2の抗原結合ドメインは第2の単ドメイン抗体を含む、(H40)または(H41)に記載のポリペプチド。
(H43)前記第2の抗原結合ドメインは第2の単ドメイン抗体であり、かつ前記抗原結合ドメインVLおよび前記第2の抗原結合ドメインは前記ポリペプチドから遊離可能であり、前記抗原結合ドメインVLおよび前記第2の抗原結合ドメインの遊離状態において、前記抗原結合ドメインVLと前記第2の単ドメイン抗体とが二重特異性抗原結合分子を形成している、(H42)に記載のポリペプチド。
(H44)前記第2の抗原結合ドメインは、HER2またはGPC3を標的抗原とする、(H40)から(H43)のいずれかに記載のポリペプチド。
(H45)前記ポリペプチドは、前記抗原結合ドメインVLとは異なる別の抗原結合ドメインを更に有し、前記別の抗原結合ドメインの抗原結合活性もまた、前記ポリペプチドの前記運搬部分に連結することによって抑制される、(H1)から(H44)のいずれかに記載のポリペプチド。
(H46)前記別の抗原結合ドメインと前記抗原結合ドメインVLは抗原結合特異性が異なっている、(H45)に記載のポリペプチド。
(H47)前記別の抗原結合ドメインは、plexin A1、IL6R、またはCD3を標的抗原とする抗原結合ドメインである、(H1)から(H46)のいずれかに記載のポリペプチド。
(H48)(H1)から(H47)のいずれかのポリペプチドを含む、医薬組成物。
(I1)(H1)から(H47)のいずれかのポリペプチドを製造する方法。
(I2)以下の工程:
(a)標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b)(a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインによって抑制されるように、当該単ドメイン抗体を当該運搬部分に連結させて、ポリペプチド前駆体を形成させる工程;および
(c)前記ポリペプチド前駆体にプロテアーゼ切断配列を導入する工程
を含み、前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、(I1)に記載の製造方法。
(I3)以下の工程:
(a)標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b)(a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインによって抑制されるように、当該単ドメイン抗体を当該運搬部分に連結させて、ポリペプチド前駆体を形成させる工程;および
(c)前記単ドメイン抗体と前記運搬部分との境界付近にプロテアーゼ切断配列を導入する工程
を含み、前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、(I1)に記載の製造方法。
(I4)以下の工程:
(a)標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;および
(b)(a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインによって抑制されるように、当該単ドメイン抗体を、プロテアーゼ切断配列を介して当該運搬部分に連結させて、ポリペプチドを形成させる工程
を含み、前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、(I1)に記載の製造方法。
(I5)更に以下の工程:
(d)前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチド前駆体に組み込まれた前記単ドメイン抗体の前記標的抗原に対する結合活性が弱められていることまたは失われていることを確認する工程
を含む、(I2)から(I4)のいずれかに記載の製造方法。
(I6)更に以下の工程:
(e)前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼで切断することによって前記単ドメイン抗体を遊離させ、遊離した単ドメイン抗体が抗原に結合することを確認する工程
を含む、(I2)から(I5)のいずれかに記載の製造方法。
(I7)前記ポリペプチドはIgG抗体様分子である、(I1)に記載の製造方法。
(I8)以下の工程:
(a)標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b)(a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が抑制されるように、当該単ドメイン抗体をIgG抗体もしくは改変IgG抗体のVHの代わりとしてVLもしくはVHと会合させ、または当該単ドメイン抗体をIgG抗体もしくは改変IgG抗体のVLの代わりとしてVHもしくはVLと会合させることによって、前記単ドメイン抗体が導入されているIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;および
(c)前記単ドメイン抗体が導入されている前記IgG抗体様分子前駆体にプロテアーゼ切断配列を導入する工程
を含み、前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、(I7)に記載の製造方法。
(I9)以下の工程:
(a)標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b)(a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が抑制されるように、当該単ドメイン抗体をIgG抗体もしくは改変IgG抗体のVHの代わりとしてVLもしくはVHと会合させ、または当該単ドメイン抗体をIgG抗体もしくは改変IgG抗体のVLの代わりとしてVHもしくはVLと会合させることによって、前記単ドメイン抗体が導入されているIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;および
(c)前記単ドメイン抗体と前記IgG抗体様分子前駆体中の抗体定常領域との境界付近にプロテアーゼ切断配列を導入する工程
を含み、前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、(I7)に記載の製造方法。
(I10)以下の工程:
(a)標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;および
(b)(a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が抑制されるように、当該単ドメイン抗体をIgG抗体VHまたはVLの代わりとして、プロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体重鎖定常領域または軽鎖定常領域に連結させ、前記単ドメイン抗体が導入されているIgG抗体様分子を形成させる工程
を含み、前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、(I7)に記載の製造方法。
(I11)更に以下の工程:
(d)前記IgG抗体様分子または前記IgG抗体様分子前駆体に導入された前記単ドメイン抗体の前記標的抗原に対する結合活性が弱められていることまたは失われていることを確認する工程
を含む、(I8)から(I10)のいずれかに記載の製造方法。
(I12)更に以下の工程:
(e)前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼで切断することによって前記単ドメイン抗体を遊離させ、遊離した単ドメイン抗体が前記標的抗原に結合することを確認する工程
を含む、(I8)から(I11)のいずれかに記載の製造方法。
(I13)以下の工程:
(a)単ドメイン抗体中の、当該単ドメイン抗体と抗体VHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または単ドメイン抗体中の、当該単ドメイン抗体と抗体VLとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する単ドメイン抗体バリアントを調製する工程;
(b)(a)工程で調製した単ドメイン抗体バリアントの抗原結合活性が抑制されるように、当該単ドメイン抗体バリアントを抗体VHと会合させ、または当該単ドメイン抗体バリアントを抗体VLと会合させることによって、前記単ドメイン抗体バリアントが導入されているIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;および
(c)前記単ドメイン抗体バリアントが導入されている前記IgG抗体様分子前駆体にプロテアーゼ切断配列を導入する工程
を含み、前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、(I7)に記載の製造方法。
(I14)以下の工程:
(a)単ドメイン抗体中の、当該単ドメイン抗体と抗体VHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または単ドメイン抗体中の、当該単ドメイン抗体と抗体VLとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する単ドメイン抗体バリアントを調製する工程;
(b)(a)工程で調製した単ドメイン抗体バリアントの抗原結合活性が抑制されるように、当該単ドメイン抗体バリアントを抗体VHと会合させ、または当該単ドメイン抗体バリアントを抗体VLと会合させることによって、前記単ドメイン抗体バリアントが導入されているIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;および
(c)前記単ドメイン抗体バリアントと前記IgG抗体様分子前駆体中の定常領域との境界付近にプロテアーゼ切断配列を導入する工程
を含み、前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、(I7)に記載の製造方法。
(I15)以下の工程:
(a)単ドメイン抗体中の、当該単ドメイン抗体と抗体VHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または単ドメイン抗体中の、当該単ドメイン抗体と抗体VLとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する単ドメイン抗体バリアントを調製する工程;および
(b)(a)工程で調製した単ドメイン抗体バリアントの抗原結合活性が抑制されるように、当該単ドメイン抗体バリアントをプロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体重鎖定常領域に連結させ、または当該単ドメイン抗体バリアントをプロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体軽鎖定常領域に連結させ、前記単ドメイン抗体バリアントが導入されているIgG抗体様分子を形成させる工程
を含み、前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、(I7)に記載の製造方法。
(I16)更に以下の工程:
(d)前記標的抗原に対する前記IgG抗体様分子または前記IgG抗体様分子前駆体に導入されている前記単ドメイン抗体バリアントの結合活性が弱められていることまたは失われていることを確認する工程
を含む、(I13)から(I15)のいずれかに記載の製造方法。
(I17)更に以下の工程:
(e)前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼで切断することによって前記単ドメイン抗体バリアントを遊離させ、遊離した単ドメイン抗体バリアントが前記標的抗原に結合することを確認する工程
を含む、(I13)から(I16)のいずれかに記載の製造方法。
(I18)(H1)から(H47)のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(I19)(I18)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(I20)(I18)に記載のポリヌクレオチドまたは(I19)に記載のベクターを含む、宿主細胞。
(I21)(I20)に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、(H1)から(H47)のいずれかのポリペプチドを製造する方法。
(I22)(I1)から(I17)および(I21)のいずれかに記載の方法によって製造されるポリペプチド。
(J1)特定のVLと会合することで、特定のVHと会合することで、または特定のVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得る単ドメイン抗体をスクリーニングする方法であって、前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、スクリーニング方法。
(J2)特定のVLと会合することでその抗原結合活性が抑制され得る単ドメイン抗体をスクリーニングする方法である、(J1)に記載のスクリーニング方法。
(J3)以下の工程:
(a)標的抗原結合活性を有する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b)(a)工程で取得した単ドメイン抗体を特定のVLと会合させる工程;および
(c)(b)工程で特定のVLと会合させた前記単ドメイン抗体の、抗原に対する結合活性が、会合前のものと比較して、弱められていることまたは失われていることを確認する工程
を含む、(J2)に記載のスクリーニング方法。
(J4)以下の工程:
(a)単ドメイン抗体を特定のVLと会合させる工程;
(b)(a)工程で特定のVLと会合させた前記単ドメイン抗体が、前記抗原に対して結合活性を有さないかまたは一定値以下の結合活性を有することに基づいて、VLと単ドメイン抗体との会合体を選択する工程;および
(c)(b)工程で選択した会合体中の単ドメイン抗体の、前記特定のVLと会合していない状態での前記抗原に対する結合活性が、前記特定のVLと会合した状態でのものより強くなっていることを確認する工程
を含む、(J2)に記載のスクリーニング方法。
(J5)特定のVHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得る単ドメイン抗体をスクリーニングする方法である、(J1)に記載のスクリーニング方法。
(J6)以下の工程:
(a)標的抗原結合活性を有する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b)(a)工程で取得した単ドメイン抗体を特定のVHと会合させる工程;および
(c)(b)工程で特定のVHと会合させた前記単ドメイン抗体の、抗原に対する結合活性が、会合前のものと比較して、弱められていることまたは失われていることを確認する工程
を含む、(J5)に記載のスクリーニング方法。
(J7)以下の工程:
(a)単ドメイン抗体を特定のVHと会合させる工程;
(b)(a)工程で特定のVHと会合させた前記単ドメイン抗体が、前記抗原に対して結合活性を有さないかまたは一定値以下の結合活性を有することに基づいて、VHと単ドメイン抗体との会合体を選択する工程;および
(c)(b)工程で選択した会合体中の単ドメイン抗体の、前記特定のVHと会合していない状態での前記抗原に対する結合活性が、前記特定のVHと会合している状態でのものより強くなっていることを確認する工程
を含む、(J5)に記載のスクリーニング方法。
(J8)特定のVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得る単ドメイン抗体をスクリーニングする方法である、(J1)に記載のスクリーニング方法。
(J9)以下の工程:
(a)標的抗原結合活性を有する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b)(a)工程で取得した単ドメイン抗体を特定のVHHと会合させる工程;および
(c)(b)工程で特定のVHHと会合させた前記単ドメイン抗体の、抗原に対する結合活性が、会合前のものと比較して、弱められていることまたは失われていることを確認する工程
を含む、(J8)に記載のスクリーニング方法。
(J10)以下の工程:
(a)単ドメイン抗体を特定のVHHと会合させる工程;
(b)(a)工程で特定のVHHと会合させた前記単ドメイン抗体が、前記抗原に対して結合活性を有さないかまたは一定値以下の結合活性を有することに基づいて、VHHと単ドメイン抗体との会合体を選択する工程;および
(c)(b)工程で選択した会合体中の単ドメイン抗体の、前記特定のVHHと会合していない状態での前記抗原に対する結合活性が、特定のVHHと会合している状態でのものより強くなっていることを確認する工程
を含む、(J8)に記載のスクリーニング方法。
(K1)特定のVLと会合することで、特定のVHと会合することで、または特定のVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得る単ドメイン抗体を製造する方法であって、前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、製造方法。
(K2)特定のVLと会合することでその抗原結合活性が抑制され得る単ドメイン抗体を製造する方法である、(K1)に記載の製造方法。
(K3)以下の工程:
(a)単ドメイン抗体中の、当該単ドメイン抗体と抗体VLとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する単ドメイン抗体バリアントを調製する工程
を含む、(K2)に記載の製造方法。
(K4)更に以下の工程:
(b)(a)工程で調製した単ドメイン抗体バリアントを前記VLと会合させる工程;および
(c)前記VLと会合させた前記単ドメイン抗体バリアントの抗原結合活性が、会合前のものと比較して、弱められていることまたは失われていることを確認する工程
を含む、(K3)に記載の製造方法。
(K5)特定のVHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得る単ドメイン抗体を製造する方法である、(K1)に記載の製造方法。
(K6)以下の工程:
(a)単ドメイン抗体中の、当該単ドメイン抗体と抗体VHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する単ドメイン抗体バリアントを調製する工程
を含む、(K5)に記載の製造方法。
(K7)更に以下の工程:
(b)(a)工程で調製した単ドメイン抗体バリアントを前記VHと会合させる工程;および
(c)前記VHと会合させた前記単ドメイン抗体バリアントの抗原結合活性が、会合前のものと比較して、弱められていることまたは失われていることを確認する工程
を含む、(K6)に記載の製造方法。
(K8)特定のVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得る単ドメイン抗体を製造する方法である、(K1)に記載の製造方法。
(K9)以下の工程:
(a)単ドメイン抗体中の、当該単ドメイン抗体とVHHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する単ドメイン抗体バリアントを調製する工程
を含む、(K8)に記載の製造方法。
(K10)更に以下の工程:
(b)(a)工程で調製した単ドメイン抗体バリアントを前記VHHと会合させる工程;および
(c)前記VHHと会合させた前記単ドメイン抗体バリアントの抗原結合活性が、会合前のものと比較して、弱められていることまたは失われていることを確認する工程
を含む、(K9)に記載の製造方法。
(L1)単ドメイン抗体をそれぞれ第1会合支持ドメインと連結させた融合ポリペプチドを複数含むライブラリであって、前記単ドメイン抗体は、特定のVLと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るもしくは失われ得る単ドメイン抗体、特定のVHと会合することでその抗原結合活性が抑制されるもしくは失われ得る単ドメイン抗体、または特定のVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るもしくは失われ得る単ドメイン抗体を含み、前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、ライブラリ。
(L2)前記ライブラリ中の融合ポリペプチドの単ドメイン抗体部分は、ラクダ科動物もしくは単ドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入されている遺伝子導入動物から取得した単ドメイン抗体もしくはそのヒト化抗体、ラクダ科動物もしくは単ドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入されている遺伝子導入動物を免疫させることで取得した単ドメイン抗体もしくはそのヒト化抗体、またはヒト抗体VHもしくはVLから出発して人工的に調製された単ドメイン抗体を含む、(L1)に記載のライブラリ。
(L3)単ドメイン抗体をそれぞれ第1会合支持ドメインと連結させた融合ポリペプチドを複数含むライブラリであって、前記単ドメイン抗体は、特定のVLと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るまたは失われ得る単ドメイン抗体を含む、(L1)または(L2)に記載のライブラリ。
(L4)単ドメイン抗体をそれぞれ第1会合支持ドメインと連結させた融合ポリペプチドを複数含むライブラリであって、前記単ドメイン抗体は、特定のVHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るかまたは失われ得る単ドメイン抗体を含む、(L1)または(L2)に記載のライブラリ。
(L5)単ドメイン抗体をそれぞれ第1会合支持ドメインと連結させた融合ポリペプチドを複数含むライブラリであって、前記単ドメイン抗体は、特定のVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るかまたは失われ得る単ドメイン抗体を含む、(L1)または(L2)に記載のライブラリ。
(L6)前記第1会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインまたは抗体軽鎖定常領域を含む、(L1)から(L5)のいずれかに記載のライブラリ。
(M1)特定のVLと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るもしくは失われ得る単ドメイン抗体、特定のVHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るもしくは失われ得る単ドメイン抗体、または特定のVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るもしくは失われ得る単ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドについて、(L1)または(L2)に記載のライブラリをスクリーニングする方法であって、前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、スクリーニング方法。
(M2)特定のVLと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るまたは失われ得る単ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドについて、(L3)に記載のライブラリをスクリーニングする方法であって、前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、スクリーニング方法。
(M3)以下の工程:
(a)前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b)特定のVLと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c)(a)工程でディスプレイされた融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーと会合させ、単ドメイン抗体と前記VLが会合する状態で、抗原に結合しないまたは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;および
(d)(c)工程に従って選択された融合ポリペプチドから、含まれる単ドメイン抗体と前記VLが会合しない状態で、抗原に結合するまたは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する工程
を含む、(M2)に記載のスクリーニング方法。
(M4)前記(b)工程で用意された会合パートナーはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程は、プロテアーゼ処理により前記会合パートナーを切断し、前記単ドメイン抗体と前記VLとの会合を解消させることを含む、(M3)に記載のスクリーニング方法。
(M5)前記(b)工程で用意された会合パートナーの前記プロテアーゼ切断配列は、前記特定のVLと前記第2会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(M4)に記載のスクリーニング方法。
(M6)前記ライブラリの融合ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程は、プロテアーゼ処理により前記融合ポリペプチドを切断し、前記単ドメイン抗体と前記VLとの会合を解消させることを含む、(M3)に記載のスクリーニング方法。
(M7)前記融合ポリペプチドは第1会合支持ドメインを含み、各融合ポリペプチドに含まれるプロテアーゼ切断配列は、前記単ドメイン抗体と前記第1会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(M6)に記載のスクリーニング方法。
(M8)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長または単ドメイン抗体を含む部分を再度インビトロディスプレイさせることを含む、(M3)に記載のスクリーニング方法。
(M9)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長を再度インビトロディスプレイさせ、第2会合支持ドメインのみと会合させた状態で、抗原と結合するまたは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択することを含む、(M3)に記載のスクリーニング方法。
(M10)特定のVHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るまたは失われ得る単ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドについて、(L4)に記載のライブラリをスクリーニングする方法であって、前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、スクリーニング方法。
(M11)以下の工程:
(a)前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b)特定のVHと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c)(a)工程でディスプレイされた融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーと会合させ、単ドメイン抗体と前記VHが会合する状態で、抗原と結合しないまたは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;および
(d)(c)工程に従って選択された融合ポリペプチドから、含まれる単ドメイン抗体と前記VHが会合しない状態で抗原と結合するまたは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する工程
を含む、(M10)に記載のスクリーニング方法。
(M12)前記(b)工程で用意された会合パートナーはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程は、プロテアーゼ処理により前記会合パートナーを切断し、前記単ドメイン抗体と前記VHとの会合を解消させることを含む、(M11)に記載のスクリーニング方法。
(M13)前記(b)工程で用意された会合パートナーの前記プロテアーゼ切断配列は、前記特定のVHと前記第2会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(M12)に記載のスクリーニング方法。
(M14)前記ライブラリの融合ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程は、プロテアーゼ処理により前記融合ポリペプチドを切断し、前記単ドメイン抗体と前記VHとの会合を解消させることを含む、(M11)に記載のスクリーニング方法。
(M15)前記融合ポリペプチドは第1会合支持ドメインを含み、各融合ポリペプチドに含まれるプロテアーゼ切断配列は、前記単ドメイン抗体と前記第1会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(M14)に記載のスクリーニング方法。
(M16)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長または単ドメイン抗体を含む部分を再度インビトロディスプレイさせることを含む、(M11)に記載のスクリーニング方法。
(M17)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長を再度インビトロディスプレイさせ、第2会合支持ドメインのみと会合させた状態で、抗原と結合するまたは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択することを含む、(M11)に記載のスクリーニング方法。
(M18)特定のVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得るまたは失われ得る単ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドについて、(L5)に記載のライブラリをスクリーニングする方法であって、前記単ドメイン抗体は、それ単独で抗原結合活性を有するVLである、スクリーニング方法。
(M19)以下の工程:
(a)前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b)特定のVHHと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c)(a)工程でディスプレイされた融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーと会合させ、単ドメイン抗体と前記特定のVHHが会合する状態で、抗原と結合しないまたは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;および
(d)(c)工程で選択された融合ポリペプチドから、含まれる単ドメイン抗体と前記VHHが会合しない状態で、抗原に結合するまたは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する工程
を含む、(M18)に記載のスクリーニング方法。
(M20)前記(b)工程で用意された会合パートナーはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程は、プロテアーゼ処理により前記会合パートナーを切断し、前記単ドメイン抗体と前記VHHとの会合を解消させることを含む、(M19)に記載のスクリーニング方法。
(M21)前記(b)工程で用意された会合パートナーの前記プロテアーゼ切断配列は、前記特定のVHHと前記第2会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(M20)に記載のスクリーニング方法。
(M22)前記ライブラリの融合ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程は、プロテアーゼ処理により前記融合ポリペプチドを切断し、前記単ドメイン抗体と前記VHHとの会合を解消させることを含む、(M19)に記載のスクリーニング方法。
(M23)前記融合ポリペプチドは第1会合支持ドメインを含み、各融合ポリペプチドに含まれるプロテアーゼ切断配列は、前記単ドメイン抗体と前記第1会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(M22)に記載のスクリーニング方法。
(M24)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長または単ドメイン抗体を含む部分を再度インビトロディスプレイさせることを含む、(M19)に記載のスクリーニング方法。
(M25)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長を再度インビトロディスプレイさせ、第2会合支持ドメインのみと会合させた状態で、抗原と結合するまたは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択することを含む、(M19)に記載のスクリーニング方法。
(M26)前記(b)工程中の会合パートナーを用意する工程は、会合パートナーと融合ポリペプチドを同時にディスプレイさせる工程である、(M3)から(M9)、(M11)から(M17)、および(M19)から(M25)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(M27)前記第1会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインまたは抗体軽鎖定常領域を含む、(M7)から(M9)、(M15)から(M17)、および(M23)から(M25)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(M28)前記第2会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインまたは抗体軽鎖定常領域を含む、(M3)から(M9)、(M11)から(M17)、および(M19)から(M25)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(M29)前記第1会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインを含み、前記第2会合支持ドメインは抗体軽鎖定常領域を含む、(M27)または(M28)に記載のスクリーニング方法。
(M30)前記第1会合支持ドメインは抗体軽鎖定常領域を含み、前記第2会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインを含む、(M27)または(M28)に記載のスクリーニング方法。
(M31)以下の工程:
(a)前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b)特定のVLと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c)抗原に結合するまたは抗原結合活性が一定値以上である単ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドを選択する工程;および
(d)(c)工程に従って選択した融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、単ドメイン抗体と前記VLが会合する状態で、抗原に結合しないまたは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程
を含む、(M2)に記載のスクリーニング方法。
(M32)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択した融合ポリペプチドを再度インビトロディスプレイさせることを含む、(M26)に記載のスクリーニング方法。
(M33)前記(c)工程は、前記融合ポリペプチドを第2会合支持ドメインのみと会合させることを含む、または第2会合支持ドメインのみと会合させた融合ポリペプチドに含まれる単ドメイン抗体の抗原結合を確認することを含む、(M31)に記載のスクリーニング方法。
(M34)以下の工程:
(a)前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b)特定のVHと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c)抗原に結合するまたは抗原結合活性が一定値以上である単ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドを選択する工程;および
(d)(c)工程に従って選択した融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、単ドメイン抗体と前記VHが会合する状態で、抗原に結合しないまたは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程
を含む、(M10)に記載のスクリーニング方法。
(M35)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択した融合ポリペプチドを再度インビトロディスプレイさせることを含む、(M34)に記載のスクリーニング方法。
(M36)前記(c)工程は、前記融合ポリペプチドを第2会合支持ドメインのみと会合させることを含む、または第2会合支持ドメインのみと会合させた融合ポリペプチドに含まれる単ドメイン抗体の抗原結合を確認することを含む、(M34)に記載のスクリーニング方法。
(M37)以下の工程:
(a)前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b)特定のVHHと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c)抗原に結合するまたは抗原結合活性が一定値以上である単ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドを選択する工程;および
(d)(c)工程に従って選択された融合ポリペプチドを(b)工程で用意した会合パートナーと会合させ、単ドメイン抗体と前記VHHが会合する状態で、抗原と結合しないまたは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程
を含む、(M18)に記載のスクリーニング方法。
(M38)前記(d)工程は、前記(c)工程で選択した融合ポリペプチドを再度インビトロディスプレイさせることを含む、(M37)に記載のスクリーニング方法。
(M39)前記(c)工程は、前記融合ポリペプチドを第2会合支持ドメインのみと会合させることを含む、または第2会合支持ドメインのみと会合させた融合ポリペプチドに含まれる単ドメイン抗体の抗原結合を確認することを含む、(M37)に記載のスクリーニング方法。
(M40)前記(d)工程中の融合ポリペプチドを会合パートナーと会合させる工程は、会合パートナーと融合ポリペプチドを同時にディスプレイさせる工程である、(M31)から(M39)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(M41)前記融合ポリペプチドは第1会合支持ドメインを含み、当該第1会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインまたは抗体軽鎖定常領域を含む、(M31)から(M40)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(M42)前記第2会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインまたは抗体軽鎖定常領域を含む、(M31)から(G41)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(M43)前記第1会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインを含み、前記第2会合支持ドメインは抗体軽鎖定常領域を含む、(M41)または(M42)に記載のスクリーニング方法。
(M44)前記第1会合支持ドメインは抗体軽鎖定常領域を含み、前記第2会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインを含む、(M41)または(M42)に記載のスクリーニング方法。
本発明は、抗原結合ドメインと運搬部分とを含むポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドにおいて、運搬部分は、抗原結合ドメインの抗原結合活性を抑制する抑制ドメインを有する。一実施態様において、抗原結合ドメインは、運搬部分の半減期より短い血中半減期を有する。
ざ瘡、急性冠症候群、成人スチル病、アレルギー、アルツハイマー病、貧血、動脈瘤、痛風性関節炎、若年性関節炎、変形性関節症、関節リウマチ、関節炎、喘息、アテローム動脈硬化症、自己免疫疾患、ベーチェット病、悪液質、白血病、固形癌、肺癌、胆道癌、結腸直腸癌、リンパ腫、骨髄腫、神経内分泌癌、卵巣癌、キャッスルマン病、慢性閉塞性肺疾患、結膜炎、皮膚筋炎、「1型糖尿病、1型」、2型糖尿病、「糖尿病、非顕在型」、家族性寒冷自己炎症性症候群、家族性地中海熱、移植片対宿主病、脳出血、心不全、化膿性汗腺炎、高コレステロール血症、高IgD症候群、高尿酸血症、免疫疾患、心筋梗塞、バークホルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)感染、川崎病、血管炎、炎症性腸疾患、炎症性疾患、間欠性跛行、脳虚血、加齢黄斑変性、マックル・ウエルズ症候群、粘膜炎、多発性硬化症、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、新生児期発症多臓器性炎症性疾患、「腎症、糖尿病性」、筋骨格痛、神経障害性疼痛、末梢血管疾患、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、乾癬、壊疽性膿皮症、再灌流傷害、再狭窄、酒さ、サルコイドーシス、シュニッツラー症候群、強膜炎、敗血症、皮膚障害、椎間板ヘルニア、血栓性静脈炎、血栓症、TNF受容体関連周期性症候群、外傷性脳損傷、糖尿病性潰瘍、ぶどう膜炎、前庭傷害、および眼球乾燥症。
(a) 37番、(b)45番、(c)47番、(d) 37番および45番、(e) 37番および47番、(f) 45番および47番、ならびに(g) 37番および45番および47番。
(a) アミノ酸残基26~32 (L1)、50~52 (L2)、91~96 (L3)、26~32 (H1)、53~55 (H2)、および96~101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) アミノ酸残基24~34 (L1)、50~56 (L2)、89~97 (L3)、31~35b (H1)、50~65 (H2)、 および95~102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) アミノ酸残基27c~36 (L1)、46~55 (L2)、89~96 (L3)、30~35b (H1)、47~58 (H2)、および93~101 (H3) のところで生じる抗原接触部(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46~56 (L2)、47~56 (L2)、48~56 (L2)、49~56 (L2)、26~35 (H1)、26~35b (H1)、49~65 (H2)、93~102 (H3)、および94~102 (H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
別段示さない限り、CDR残基および可変ドメイン中の他の残基(例えば、FR残基)は、本明細書では上記のKabatらにしたがって番号付けされる。
別の面から見て、本発明の抗原結合ドメインの好適な例の一つとして、血中半減期が12時間以下の抗原結合ドメインが挙げられる。そのような抗原結合ドメインの例として、それだけに限定されないが、単ドメイン抗体、scFv、Fab、Fab'、およびアンタゴニストが挙げられる。
a)(Kabatナンバリングによる11番のアミノ酸残基がL、M、S、V、およびWからなる群より選択され、好ましくはLである)3つの相補性決定領域/配列によって遮られる4つのフレームワーク領域/配列で構成されるアミノ酸配列;および/または
b)(Kabatナンバリングによる37番のアミノ酸残基がF、Y、H、I、L、およびVからなる群より選択され、好ましくはFまたはYである)3つの相補性決定領域/配列によって遮られる4つのフレームワーク領域/配列で構成されるアミノ酸配列;および/または
c)(Kabatナンバリングによる44番のアミノ酸残基がG、E、A、D、Q、R、S、およびLからなる群より選択され、好ましくはG、E、またはQである)3つの相補性決定領域/配列によって遮られる4つのフレームワーク領域/配列で構成されるアミノ酸配列;および/または
d)(Kabatナンバリングによる45番のアミノ酸残基がL、R、C、I、L、P、Q、およびVからなる群より選択され、好ましくはLまたはRである)3つの相補性決定領域/配列によって遮られる4つのフレームワーク領域/配列で構成されるアミノ酸配列;および/または
e)(Kabatナンバリングによる47番のアミノ酸残基がW、L、F、A、G、I、M、R、S、V、およびYからなる群より選択され、好ましくはW、L、F、またはRである)3つの相補性決定領域/配列によって遮られる4つのフレームワーク領域/配列で構成されるアミノ酸配列;および/または
f)(Kabatナンバリングによる83番のアミノ酸残基がR、K、N、E、G、I、M、Q、およびTからなる群より選択され、好ましくはKまたはR、より好ましくはKである)3つの相補性決定領域/配列によって遮られる4つのフレームワーク領域/配列で構成されるアミノ酸配列;および/または
g)(Kabatナンバリングによる84番のアミノ酸残基がP、A、L、R、S、T、D、およびVからなる群より選択され、好ましくはPである)3つの相補性決定領域/配列によって遮られる4つのフレームワーク領域/配列で構成されるアミノ酸配列;および/または
h)(Kabatナンバリングによる103番のアミノ酸残基がW、P、R、およびSからなる群より選択され、好ましくはWである)3つの相補性決定領域/配列によって遮られる4つのフレームワーク領域/配列で構成されるアミノ酸配列;および/または
i)(Kabatナンバリングによる104番のアミノ酸残基がGまたはDであり、好ましくはGである)3つの相補性決定領域/配列によって遮られる4つのフレームワーク領域/配列で構成されるアミノ酸配列;および/または
j)(Kabatナンバリングによる108番のアミノ酸残基がQ、L、およびRからなる群より選択され、好ましくはQまたはLである)3つの相補性決定領域/配列によって遮られる4つのフレームワーク領域/配列で構成されるアミノ酸配列。
k)Kabatナンバリングによる43番~46番のアミノ酸残基がKERE(配列番号:620)またはKQRE(配列番号:621)である、
l)Kabatナンバリングによる44番~47番のアミノ酸残基がGLEW(配列番号:622)である、および
m)Kabatナンバリングによる83番~84番のアミノ酸残基がKPまたはEPである。
- IL-1R1に結合する、それ単独で抗原結合活性を有するVL:配列番号:479のアミノ酸配列を有するDOM4-122-23および配列番号:480のアミノ酸配列を有するDOM4-130-202、
- IL-1R1に結合する、それ単独で抗原結合活性を有するVH:
- IL-1R1に結合する、それ単独で抗原結合活性を有するVHH:
- IL-1R(IL-1Ra)に対するアンタゴニスト:インターロイキン1受容体アンタゴニストタンパク質(タンパク質のアクセッション番号:NP_776214(配列番号:527)、mRNAのアクセッション番号:NM_173842.2)、AMG108(Amgen、配列番号:515、516、または517のH鎖、配列番号:522、523、または524のL鎖)、アナキンラ(Anakinra)(Amgen、配列番号:526)、ABT-981(AbbVie、配列番号:512のH鎖、配列番号:519のL鎖)、カナキヌマブ(Novartis、配列番号:513のH鎖、配列番号:520のL鎖)、ゲボキズマブ(Xoma、配列番号:514のH鎖、配列番号:521のL鎖)、MABp1(XBiotech、配列番号:518のH鎖、配列番号:525のL鎖)。
本発明において、上記抗体の抗体断片もまた、IL-1Rに対するアンタゴニスト性活性を示す限り、抗原結合ドメインとして用いることができる。抗体断片の例としては、これらに限定されないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;ダイアボディ;線状抗体;単鎖抗体分子(例えば、scFv)が挙げられる。
- IL-1αに結合する、それ単独で抗原結合活性を有するVL:
- IL-1αに結合する、それ単独で抗原結合活性を有するVH:
- IL-1αに結合する、それ単独で抗原結合活性を有するVHH:
- IL-1βに結合する、それ単独で抗原結合活性を有するVL
- IL-1βに結合する、それ単独で抗原結合活性を有するVH:
- IL-1βに結合する、それ単独で抗原結合活性を有するVHH:
- IL-1RAcPに結合する、それ単独で抗原結合活性を有するVL:
- IL-1RAcPに結合する、それ単独で抗原結合活性を有するVH:
- IL-1RAcPに結合する、それ単独で抗原結合活性を有するVHH:
そのような実施態様は、本明細書を参照することで当業者に明らかであるはずであり、本発明の範囲内に含まれる。
- IL-1R1:核酸配列NM_001320982.1、アミノ酸配列 NP_001307911(配列番号:528)
- IL-1R2トランスクリプトバリアント 1:核酸配列NM_004633.3、アミノ酸配列 NP_004624.1(配列番号:529)
- IL-1α:核酸配列NM_000575.4、アミノ酸配列 NP_000566(配列番号:530)
- IL-1β:核酸配列NM_000576.2、アミノ酸配列 NP_000567(配列番号:531)
- IL-1RAcP:核酸配列NM_001167929.1、アミノ酸配列 NP_001161401(配列番号:532)
本発明において、IL1-R1、IL1-R2、IL-1α、IL-1β、およびIL-1RAcPには、IL1-R1、IL1-R2、IL-1α、IL-1β、およびIL-1RAcPの任意のアイソフォーム、多型、およびバリアント(アレルバリアントおよびスプライシングバリアントを含む)が含まれる。
1)配列番号:479のアミノ酸配列を含む単ドメイン抗体VL、および
2)配列番号:480のアミノ酸配列を含む単ドメイン抗体VL
からなる群より選択される単ドメイン抗体VLと競合し得る。
1)インターロイキン1受容体アンタゴニストタンパク質(タンパク質のアクセッション番号: NP_776214(配列番号:527)、アナキンラ(Amgen、配列番号:526)、およびAMG108(Amgen、配列番号:515、516、または517のH鎖、配列番号:522、523、または524のL鎖、WO2004/022718)、および
2)配列番号:540~617
からなる群より選択されるインターロイキン1受容体アンタゴニストタンパク質または抗体と競合し得る。
ABT-981(AbbVie、配列番号:512のH鎖、配列番号:519のL鎖)、カナキヌマブ(Novartis、配列番号:513のH鎖、配列番号:520のL鎖、WO2013/082282)、ゲボキズマブ(Xoma、配列番号:514のH鎖、配列番号:521のL鎖、US8,551,487)、およびMABp1(XBiotech、配列番号:518のH鎖、配列番号:525のL鎖、US8,034,337)
からなる群より選択される抗体と競合し得る。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM (いずれもBD Biosciencesの商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC(いずれもBeckman Coulter Inc.の商品名)
ΔGeo-Mean=Geo-Mean(ポリペプチド会合体存在下)/Geo-Mean(ポリペプチド会合体非存在下)
FcRn結合領域を含む運搬部分は、FcRnのサルベージ経路により細胞内に取り込まれた後に再び血漿中に戻ることが可能である。例えば、IgG分子の血漿中滞留性が比較的長い(消失が遅い)のは、IgG分子のサルベージレセプターとして知られているFcRnが機能しているためである。ピノサイトーシスによってエンドソームに取り込まれたIgG分子は、エンドソーム内の酸性条件下においてエンドソーム内に発現しているFcRnに結合する。FcRnに結合できなかったIgG分子はライソソームへと進みそこで分解されるが、FcRnへ結合したIgG分子は細胞表面へ移行し血漿中の中性条件下においてFcRnから解離することで再び血漿中に戻る。
FcRn結合領域は、直接FcRnと結合する領域であることが好ましい。FcRn結合領域の好ましい例として、抗体のFc領域を挙げることができる。しかしながら、アルブミンまたはIgGなどのFcRnとの結合能を有するポリペプチドに結合可能な領域は、アルブミンまたはIgGなどを介して間接的にFcRnと結合することが可能であるので、本発明におけるFcRn結合領域はそのようなFcRnとの結合能を有するポリペプチドに結合する領域であってもよい。
例えば、IgG抗体Fc領域におけるEUナンバリング237番目、238番目、239番目、248番目、250番目、252番目、254番目、255番目、256番目、257番目、258番目、265番目、270番目、286番目、289番目、297番目、298番目、303番目、305番目、307番目、308番目、309番目、311番目、312番目、314番目、315番目、317番目、325番目、332番目、334番目、360番目、376番目、380番目、382番目、384番目、385番目、386番目、387番目、389番目、424番目、428番目、433番目、434番目および436番目から選択される少なくとも1つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を含む改変Fc領域を用いることが可能である。
237番目のGlyをMetに置換するアミノ酸置換、
238番目のProをAlaに置換するアミノ酸置換、
239番目のSerをLysに置換するアミノ酸置換、
248番目のLysをIleに置換するアミノ酸置換、
250番目のThrをAla、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
252番目のMetをPhe、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
254番目のSerをThrに置換するアミノ酸置換、
255番目のArgをGluに置換するアミノ酸置換、
256番目のThrをAsp、Glu、またはGlnに置換するアミノ酸置換、
257番目のProをAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、またはValに置換するアミノ酸置換、
258番目のGluをHisに置換するアミノ酸置換、
265番目のAspをAlaに置換するアミノ酸置換、
270番目のAspをPheに置換するアミノ酸置換、
286番目のAsnをAlaまたはGluに置換するアミノ酸置換、
289番目のThrをHisに置換するアミノ酸置換、
297番目のAsnをAlaに置換するアミノ酸置換、
298番目のSerをGlyに置換するアミノ酸置換、
303番目のValをAlaに置換するアミノ酸置換、
305番目のValをAlaに置換するアミノ酸置換、
307番目のThrをAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
308番目のValをAla、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、またはThrに置換するアミノ酸置換、
309番目のLeuまたはValをAla、Asp、Glu、Pro、またはArgに置換するアミノ酸置換、
311番目のGlnをAla、His、またはIleに置換するアミノ酸置換、
312番目のAspをAlaまたはHisに置換するアミノ酸置換、
314番目のLeuをLysまたはArgに置換するアミノ酸置換、
315番目のAsnをAlaまたはHisに置換するアミノ酸置換、
317番目のLysをAlaに置換するアミノ酸置換、
325番目のAsnをGlyに置換するアミノ酸置換、
332番目のIleをValに置換するアミノ酸置換、
334番目のLysをLeuに置換するアミノ酸置換、
360番目のLysをHisに置換するアミノ酸置換、
376番目のAspをAlaに置換するアミノ酸置換、
380番目のGluをAlaに置換するアミノ酸置換、
382番目のGluをAlaに置換するアミノ酸置換、
384番目のAsnまたはSerをAlaに置換するアミノ酸置換、
385番目のGlyをAspまたはHisに置換するアミノ酸置換、
386番目のGlnをProに置換するアミノ酸置換、
387番目のProをGluに置換するアミノ酸置換、
389番目のAsnをAlaまたはSerに置換するアミノ酸置換、
424番目のSerをAlaに置換するアミノ酸置換、
428番目のMetをAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
433番目のHisをLysに置換するアミノ酸置換、
434番目のAsnをAla、Phe、His、Ser、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、および
436番目のTyrまたはPheをHisに置換するアミノ酸置換
から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、改変Fc領域を使用することが可能である。
237番目のアミノ酸におけるMet、
238番目のアミノ酸におけるAla、
239番目のアミノ酸におけるLys、
248番目のアミノ酸におけるIle、
250番目のアミノ酸におけるAla、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、またはTyr、
252番目のアミノ酸におけるPhe、Trp、またはTyr、
254番目のアミノ酸におけるThr、
255番目のアミノ酸におけるGlu、
256番目のアミノ酸におけるAsp、Glu、またはGln、
257番目のアミノ酸におけるAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、またはVal、
258番目のアミノ酸におけるHis、
265番目のアミノ酸におけるAla、
270番目のアミノ酸におけるPhe、
286番目のアミノ酸におけるAlaまたはGlu、
289番目のアミノ酸におけるHis、
297番目のアミノ酸におけるAla、
298番目のアミノ酸におけるGly、
303番目のアミノ酸におけるAla、
305番目のアミノ酸におけるAla、
307番目のアミノ酸におけるAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、またはTyr、
308番目のアミノ酸におけるAla、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、またはThr、
309番目のアミノ酸におけるAla、Asp、Glu、Pro、またはArg、
311番目のアミノ酸におけるAla、His、またはIle、
312番目のアミノ酸におけるAlaまたはHis、
314番目のアミノ酸におけるLysまたはArg、
315番目のアミノ酸におけるAlaまたはHis、
317番目のアミノ酸におけるAla、
325番目のアミノ酸におけるGly、
332番目のアミノ酸におけるVal、
334番目のアミノ酸におけるLeu、
360番目のアミノ酸におけるHis、
376番目のアミノ酸におけるAla、
380番目のアミノ酸におけるAla、
382番目のアミノ酸におけるAla、
384番目のアミノ酸におけるAla、
385番目のアミノ酸におけるAspまたはHis、
386番目のアミノ酸におけるPro、
387番目のアミノ酸におけるGlu、
389番目のアミノ酸におけるAlaまたはSer、
424番目のアミノ酸におけるAla、
428番目のアミノ酸におけるAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyr、
433番目のアミノ酸におけるLys、
434番目のアミノ酸におけるAla、Phe、His、Ser、Trp、またはTyr、および
436番目のアミノ酸におけるHis
から選択される少なくとも1つのアミノ酸を含むFc領域を使用することは可能である。
(1)標的組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(2)標的組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
(3)標的細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(4)標的細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかを指すことができる。
より具体的な実施態様において、癌組織特異的プロテアーゼまたは炎症組織特異的プロテアーゼが使用される。
・関節リウマチ、または変形性関節症における、関節組織
・気管支喘息、またはCOPDにおける、肺(肺胞)組織
・炎症性腸疾患、クローン病、または潰瘍性大腸炎における、消化器官組織
・肝臓、腎臓、または肺における線維化症における、線維化組織
・臓器移植における拒絶反応が起こっている、組織
・動脈硬化、または心不全における、血管または心臓(心筋)組織
・メタボリック症候群における、内臓脂肪組織
・アトピー性皮膚炎、およびその他皮膚炎における、皮膚組織
・椎間板ヘルニア、または慢性腰痛における、脊髄神経組織
(i) 標的組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(ii) 標的組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
(iii) 標的細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(iv) 標的細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかを指すことができる。
癌組織特異的プロテアーゼとしては、例えば、国際公開WO2013/128194号、国際公開WO2010/081173号、および国際公開WO2009/025846号等で開示される癌組織に特異的に発現するプロテアーゼが挙げられる。
(i) 癌組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(ii) 癌組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
(iii) 癌細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(iv) 癌細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかである。
(i) 炎症組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(ii) 炎症組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
(iii) 炎症細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(iv) 炎症細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかである。
LSGRSDNH(配列番号:12、MT-SP1、またはuPAにより切断可能)
PLALAG(配列番号:25、MMP2、またはMMP9により切断可能)
VPLSLTMG(配列番号:26、MMP7により切断可能)
プロテアーゼ切断配列として、以下の配列のいずれかを用いることもできる。
TSTSGRSANPRG(配列番号:74、MT-SP1、またはuPAにより切断可能)
ISSGLLSGRSDNH(配列番号:75、MT-SP1、またはuPAにより切断可能)
AVGLLAPPGGLSGRSDNH(配列番号:76、MT-SP1、またはuPAにより切断可能)
GAGVPMSMRGGAG(配列番号:77、MMP1により切断可能)
GAGIPVSLRSGAG(配列番号:78、MMP2により切断可能)
GPLGIAGQ(配列番号:79、MMP2により切断可能)
GGPLGMLSQS(配列番号:80、MMP2により切断可能)
PLGLWA(配列番号:81、MMP2により切断可能)
GAGRPFSMIMGAG(配列番号:82、MMP3により切断可能)
GAGVPLSLTMGAG(配列番号:83、MMP7により切断可能)
GAGVPLSLYSGAG(配列番号:84、MMP9により切断可能)
AANLRN(配列番号:85、MMP11により切断可能)
AQAYVK(配列番号:86、MMP11により切断可能)
AANYMR(配列番号:87、MMP11により切断可能)
AAALTR(配列番号:88、MMP11により切断可能)
AQNLMR(配列番号:89、MMP11により切断可能)
AANYTK(配列番号:90、MMP11により切断可能)
GAGPQGLAGQRGIVAG(配列番号:91、MMP13により切断可能)
PRFKIIGG(配列番号:92、proウロキナーゼにより切断可能)
PRFRIIGG(配列番号:93、proウロキナーゼにより切断可能)
GAGSGRSAG(配列番号:94、uPAにより切断可能)
SGRSA(配列番号:95、uPAにより切断可能)
GSGRSA(配列番号:96、uPAにより切断可能)
SGKSA(配列番号:97、uPAにより切断可能)
SGRSS(配列番号:98、uPAにより切断可能)
SGRRA(配列番号:99、uPAにより切断可能)
SGRNA(配列番号:100、uPAにより切断可能)
SGRKA(配列番号:101、uPAにより切断可能)
QRGRSA(配列番号:102、tPAにより切断可能)
GAGSLLKSRMVPNFNAG(配列番号:103、カテプシンBにより切断可能)
TQGAAA(配列番号:104、カテプシンBにより切断可能)
GAAAAA(配列番号:105、カテプシンBにより切断可能)
GAGAAG(配列番号:106、カテプシンBにより切断可能)
AAAAAG(配列番号:107、カテプシンBにより切断可能)
LCGAAI(配列番号:108、カテプシンBにより切断可能)
FAQALG(配列番号:109、カテプシンBにより切断可能)
LLQANP(配列番号:110、カテプシンBにより切断可能)
LAAANP(配列番号:111、カテプシンBにより切断可能)
LYGAQF(配列番号:112、カテプシンBにより切断可能)
LSQAQG(配列番号:113、カテプシンBにより切断可能)
ASAASG(配列番号:114、カテプシンBにより切断可能)
FLGASL(配列番号:115、カテプシンBにより切断可能)
AYGATG(配列番号:116、カテプシンBにより切断可能)
LAQATG(配列番号:117、カテプシンBにより切断可能)
GAGSGVVIATVIVITAG(配列番号:118、カテプシンLにより切断可能)
APMAEGGG(配列番号:119、メプリンα、またはメプリンβにより切断可能)
EAQGDKII(配列番号:120、メプリンα、またはメプリンβにより切断可能)
LAFSDAGP(配列番号:121、メプリンα、またはメプリンβにより切断可能)
YVADAPK(配列番号:122、メプリンα、またはメプリンβにより切断可能)
RRRRR(配列番号:123、フーリンにより切断可能)
RRRRRR(配列番号:124、フーリンにより切断可能)
GQSSRHRRAL(配列番号:125、フーリンにより切断可能)
SSRHRRALD(配列番号:126)
RKSSIIIRMRDVVL(配列番号:127、プラスミノーゲン(Plasminogen)により切断可能)
SSSFDKGKYKKGDDA(配列番号:128、スタフィロキナーゼ(Staphylokinase)により切断可能)
SSSFDKGKYKRGDDA(配列番号:129、スタフィロキナーゼにより切断可能)
IEGR(配列番号:130、第Xa因子(Factor Xa)により切断可能)
IDGR(配列番号:131、第Xa因子により切断可能)
GGSIDGR(配列番号:132、第Xa因子により切断可能)
GPQGIAGQ(配列番号:133、コラゲナーゼ(Collagenase)により切断可能)
GPQGLLGA(配列番号:134、コラゲナーゼにより切断可能)
GIAGQ(配列番号:135、コラゲナーゼにより切断可能)
GPLGIAG(配列番号:136、コラゲナーゼにより切断可能)
GPEGLRVG(配列番号:137、コラゲナーゼにより切断可能)
YGAGLGVV(配列番号:138、コラゲナーゼにより切断可能)
AGLGVVER(配列番号:139、コラゲナーゼにより切断可能)
AGLGISST(配列番号:140、コラゲナーゼにより切断可能)
EPQALAMS(配列番号:141、コラゲナーゼにより切断可能)
QALAMSAI(配列番号:142、コラゲナーゼにより切断可能)
AAYHLVSQ(配列番号:143、コラゲナーゼにより切断可能)
MDAFLESS(配列番号:144、コラゲナーゼにより切断可能)
ESLPVVAV(配列番号:145、コラゲナーゼにより切断可能)
SAPAVESE(配列番号:146、コラゲナーゼにより切断可能)
DVAQFVLT(配列番号:147、コラゲナーゼにより切断可能)
VAQFVLTE(配列番号:148、コラゲナーゼにより切断可能)
AQFVLTEG(配列番号:149、コラゲナーゼにより切断可能)
PVQPIGPQ(配列番号:150、コラゲナーゼにより切断可能)
LVPRGS(配列番号:151、トロンビン(Thrombin)により切断可能)
TSTSGRSANPRG(配列番号:178、uPA、またはMT-SP1により切断可能)および
GPPGPQGLAGQRGIVGL(配列番号:509、MMP13により切断可能)。
(プロテアーゼ切断配列)
(第一可動リンカー)-(プロテアーゼ切断配列)
(プロテアーゼ切断配列)-(第二可動リンカー)
(第一可動リンカー)-(プロテアーゼ切断配列)-(第二可動リンカー)
Ser(S)
Gly Ser(GS)
Ser Gly(SG)
Gly Gly Ser(GGS)
Gly Ser Gly(GSG)
Ser Gly Gly(SGG)
Gly Ser Ser(GSS)
Ser Ser Gly(SSG)
Ser Gly Ser(SGS)
Gly Gly Gly Ser(GGGS、配列番号:28)
Gly Gly Ser Gly(GGSG、配列番号:29)
Gly Ser Gly Gly(GSGG、配列番号:46)
Ser Gly Gly Gly(SGGG、配列番号:47)
Gly Ser Ser Gly(GSSG、配列番号:48)
Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGS、配列番号:49)
Gly Gly Gly Ser Gly(GGGSG、配列番号:33)
Gly Gly Ser Gly Gly(GGSGG、配列番号:30)
Gly Ser Gly Gly Gly(GSGGG、配列番号:32)
Gly Ser Gly Gly Ser(GSGGS、配列番号:27)
Ser Gly Gly Gly Gly(SGGGG、配列番号:51)
Gly Ser Ser Gly Gly(GSSGG、配列番号:52)
Gly Ser Gly Ser Gly(GSGSG、配列番号:31)
Ser Gly Gly Ser Gly(SGGSG、配列番号:53)
Gly Ser Ser Ser Gly(GSSSG、配列番号:34)
Gly Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGGS、配列番号:50)
Ser Gly Gly Gly Gly Gly(SGGGGG、配列番号:54)
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGGGS、配列番号:55)
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(SGGGGGG、配列番号:56)
(Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGS、配列番号:49))n
(Ser Gly Gly Gly Gly(SGGGG、配列番号:51))n
が挙げられる。
VHHとVLの会合を促進する目的が達成できる限り、VHHのアミノ酸ではなく、VL中の、VHHとの会合に関与するアミノ酸残基を改変することが可能であり、VHHとVLの両方にアミノ酸改変を導入することも可能である。
VHとVLとの間の会合の増強に関して、複数の変異が、Nature Biotechnology volume32, pages191-198 (2014)、Biophys. J. 75, 1473-1482 (1998)、Protein Eng. Des. Sel. 23, 667-677 (2010)、MAbs. 2017 Feb-Mar; 9(2): 182-212、およびWO2013065708において報告されている。VHHまたはVLの活性は、VHHまたはVHとVLとの間の会合を促進することによって抑制される。
(i)IgG抗体にあるようなH鎖可変ドメインまたはH鎖可変領域が、L鎖可変ドメインまたはL鎖可変領域に置換されている「改変IgG抗体」、
(ii)IgG抗体にあるようなL鎖可変ドメインまたはL鎖可変領域が、H鎖可変ドメインまたはH鎖可変領域に置換されている「改変IgG抗体」、
(iii)IgG抗体にあるようなH鎖定常ドメインまたはH鎖定常領域が、L鎖定常ドメインまたはL鎖定常領域に置換されている「改変IgG抗体」、
(iv)IgG抗体にあるようなL鎖定常ドメインまたはL鎖定常領域が、H鎖定常ドメインまたはH鎖定常領域に置換されている「改変IgG抗体」、
(v)上記(i)および(ii)で定義される特徴を有する「改変IgG抗体」、
(vi)上記(i)および(iii)で定義される特徴を有する「改変IgG抗体」、
(vii)上記(i)および(iv)で定義される特徴を有する「改変IgG抗体」、
(viii)上記(ii)および(iii)で定義される特徴を有する「改変IgG抗体」、
(ix)上記(ii)および(iv)で定義される特徴を有する「改変IgG抗体」、
(x)上記(iii)および(iv)で定義される特徴を有する「改変IgG抗体」、
(xi)上記(i)、(ii)および(iii)で定義される特徴を有する「改変IgG抗体」、
(xii)上記(i)、(ii)および(iv)で定義される特徴を有する「改変IgG抗体」、
(xiii)上記(i)、(iii)および(iv)で定義される特徴を有する「改変IgG抗体」、および
(xiv)上記(ii)、(iii)および(iv)で定義される特徴を有する「改変IgG抗体」。
(a) 標的抗原に結合する抗原結合ドメインを取得する工程;
(b) (a)工程で取得した抗原結合ドメインの抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインに抑制されるように、当該抗原結合ドメインと当該運搬部分を連結させてポリペプチド前駆体を形成させる工程;および
(c) 前記ポリペプチド前駆体中にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、製造方法である。
(a) 標的抗原に結合する抗原結合ドメインを取得する工程;
(b) (a)工程で取得した抗原結合ドメインの抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインに抑制されるように、当該抗原結合ドメインと当該運搬部分を連結させてポリペプチド前駆体を形成させる工程;および
(c) 前記抗原結合ドメインと前記運搬部分との境界付近にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、製造方法である。
(a) 標的抗原に結合する抗原結合ドメインを取得する工程;および
(b) (a)工程で取得した抗原結合ドメインの抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインに抑制されるように、当該抗原結合ドメインを、プロテアーゼ切断配列を介して当該運搬部分と連結させてポリペプチドを形成させる工程;
を含む、製造方法である。
(d) 前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチド前駆体中に組み込まれた前記抗原結合ドメインの前記標的抗原に対する結合活性が、弱められていることまたは失われていることを確認する工程;
を更に含む、製造方法である。
本発明において、語句「結合活性が弱められ」ているとは、連結前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、この減少の程度は問わない。
(e) 前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼで切断することによって前記抗原結合ドメインを遊離させ、遊離した抗原結合ドメインが抗原に結合することを確認する工程;
を更に含む、製造方法である。
(a) 標的抗原に結合する抗原結合ドメインを取得する工程;
(b) (a)工程で取得した抗原結合ドメインの抗原結合活性が抑制されるように、当該抗原結合ドメインをIgG抗体または改変IgG抗体のVHの代わりとしてVLまたはVHと会合させ、または当該抗原結合ドメインをIgG抗体または改変IgG抗体のVLの代わりとしてVHまたはVLと会合させることによって、前記抗原結合ドメインが導入されているIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;および
(c) 前記抗原結合ドメインが導入されているIgG抗体様分子前駆体中にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、製造方法である。
(a) 標的抗原に結合する抗原結合ドメインを取得する工程;
(b) (a)工程で取得した抗原結合ドメインの抗原結合活性が抑制されるように、当該抗原結合ドメインをIgG抗体または改変IgG抗体のVHの代わりとしてVLまたはVHと会合させ、または当該抗原結合ドメインをIgG抗体または改変IgG抗体のVLの代わりとしてVHまたはVLと会合させることによって、前記抗原結合ドメインが導入されているIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;および
(c) 前記抗原結合ドメインと前記IgG抗体様分子前駆体中の抗体定常領域との境界付近にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、製造方法である。
(a) 標的抗原に結合する抗原結合ドメインを取得する工程;および
(b) (a)工程で取得した抗原結合ドメインの抗原結合活性が抑制されるように、当該抗原結合ドメインをIgG抗体VHまたはVLの代わりとして、プロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体の重鎖定常領域または軽鎖定常領域と連結させ、前記抗原結合ドメインが導入されているIgG抗体様分子を形成させる工程;
を含む、製造方法である。
(d) 前記IgG抗体様分子または前記IgG抗体様分子前駆体に導入されている抗原結合ドメインの前記標的抗原に対する結合活性が、弱められていることまたは失われていることを確認する工程;
を更に含む、製造方法である。
本発明において、語句「結合活性が弱められ」ているとは、会合前または連結前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、この減少の程度は問わない。
(e) 前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼで切断することによって前記抗原結合ドメインを遊離させ、遊離した抗原結合ドメインが前記標的抗原に結合することを確認する工程;
を更に含む、製造方法である。
(a) 抗原結合ドメイン中の、抗体VHとの抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または抗原結合ドメイン中の、抗体VLとの抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該抗原結合ドメインの標的抗原に対する結合活性を保持する改変抗原結合ドメインを調製する工程;
(b) (a)工程で調製した改変抗原結合ドメインの抗原結合活性を抑制するように、当該改変抗原結合ドメインを抗体VHと会合させ、または当該改変抗原結合ドメインを抗体VLと会合させることによって、当該改変抗原結合ドメインが導入されているIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;および
(c) 前記改変抗原結合ドメインが導入されているIgG抗体様分子前駆体中にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、製造方法である。
(a)抗原結合ドメイン中の、抗体VHとの抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または抗原結合ドメイン中の、抗体VLとの抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該抗原結合ドメインの標的抗原に対する結合活性を保持する改変抗原結合ドメインを調製する工程;
(b) (a)工程で調製した改変抗原結合ドメインの抗原結合活性を抑制するように、当該改変抗原結合ドメインを抗体VHと会合させ、または当該改変抗原結合ドメインを抗体VLと会合させることによって、当該改変抗原結合ドメインが導入されているIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;および
(c) 前記改変抗原結合ドメインと前記IgG抗体様分子前駆体の定常領域との境界付近にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、製造方法である。
(a)抗原結合ドメイン中の、抗体VHとの抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または抗原結合ドメイン中の、抗体VLとの抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該抗原結合ドメインの標的抗原に対する結合活性を保持する改変抗原結合ドメインを調製する工程;および
(b) (a)工程で調製した改変抗原結合ドメインの抗原結合活性を抑制するように、当該改変抗原結合ドメインをプロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体の重鎖定常領域と連結させ、または当該改変抗原結合ドメインをプロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体の軽鎖定常領域と連結させ、当該改変抗原結合ドメインが導入されているIgG抗体様分子を形成させる工程;
を含む、製造方法である。
(d) 前記IgG抗体様分子または前記IgG抗体様分子前駆体に導入されている前記改変抗原結合ドメインの前記標的抗原に対する結合活性が、弱められていることまたは失われていることを確認する工程;
を更に含む、製造方法である。
本発明において、語句「結合活性が弱められ」ているとは、会合前または連結前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、この減少の程度は問わない。
(e) 前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼで切断することによって前記改変抗原結合ドメインを遊離させ、遊離した改変抗原結合ドメインが前記標的抗原に結合することを確認する工程;
を更に含む、製造方法である。
(a) 標的抗原結合活性を有する抗原結合ドメインを取得する工程;
(b) (a)工程で取得した抗原結合ドメインを特定のVLと会合させる工程;および
(c) (b)工程で特定のVLと会合させた前記抗原結合ドメインの前記抗原に対する結合活性が、弱められていることまたは失われていることを確認する工程;
を含む、特定のVLと会合することでその抗原結合活性が抑制され得る抗原結合ドメインをスクリーニングする方法を提供する。
本発明において、語句「結合活性が弱められ」ているとは、会合前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、この減少の程度は問わない。
(a) 標的抗原結合活性を有する抗原結合ドメインを取得する工程;
(b) (a)工程で取得した抗原結合ドメインを特定のVHと会合させる工程;および
(c) (b)工程で特定のVHと会合させた前記抗原結合ドメインの前記抗原に対する結合活性が、弱められていることまたは失われていることを確認する工程;
を含む、特定のVHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得る抗原結合ドメインをスクリーニングする方法を提供する。
本発明において、語句「結合活性が弱められ」ているとは、会合前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、この減少の程度は問わない。
(a) 標的抗原結合活性を有する抗原結合ドメインを取得する工程;
(b) (a)工程で取得した抗原結合ドメインを特定のVHHと会合させる工程;および
(c) (b)工程で特定のVHHと会合させた前記抗原結合ドメインの前記抗原に対する結合活性が、弱められていることまたは失われていることを確認する工程;
を含む、特定のVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制され得る抗原結合ドメインをスクリーニングする方法を提供する。
本発明において、語句「結合活性が弱められ」ているとは、会合前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、この減少の程度は問わない。
(a)抗原結合ドメイン中の、抗体VLとの抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該抗原結合ドメインの標的抗原に対する結合活性を保持する改変抗原結合ドメインを調製する工程;
を含む、特定のVLと会合することでその抗原結合活性が抑制される抗原結合ドメインを製造する方法を提供する。
(b) (a)工程で調製された改変抗原結合ドメインを特定のVLと会合させる工程;および
(c) 当該VLと会合させた前記改変抗原結合ドメインの抗原結合活性が、弱められていることまたは失われていることを確認する工程;
を更に含む、特定のVLと会合することでその抗原結合活性が抑制される抗原結合ドメインを製造する方法を提供する。
本発明において、語句「結合活性が弱められ」ているとは、会合前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、この減少の程度は問わない。
(a)抗原結合ドメイン中の、抗体VHとの抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該抗原結合ドメインの標的抗原に対する結合活性を保持する改変抗原結合ドメインを調製する工程;
を含む、特定のVHと会合することでその抗原結合活性が抑制される抗原結合ドメインを製造する方法を提供する。
(b) (a)工程で調製された改変抗原結合ドメインを特定のVHと会合させる工程;および
(c) 当該VHと会合させた前記改変抗原結合ドメインの抗原結合活性が、弱められていることまたは失われていることを確認する工程;
を更に含む、特定のVHと会合することでその抗原結合活性が抑制される抗原結合ドメインを製造する方法を提供する。
本発明において、語句「結合活性が弱められ」ているとは、会合前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、この減少の程度は問わない。
(a)抗原結合ドメイン中の、VHHとの抗原結合ドメインの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該抗原結合ドメインの標的抗原に対する結合活性を保持する改変抗原結合ドメインを調製する工程;
を含む、特定のVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制される抗原結合ドメインを製造する方法を提供する。
(b) (a)工程で調製された改変抗原結合ドメインを特定のVHHと会合させる工程;および
(c) 当該VHHと会合させた前記改変抗原結合ドメインの抗原結合活性が、弱められていることまたは失われていることを確認する工程;
を更に含む、特定のVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制される抗原結合ドメインを製造する方法を提供する。
本発明において、語句「結合活性が弱められ」ているとは、会合前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、この減少の程度は問わない。
(1)抗原結合ドメインと第1会合支持ドメインとをそれぞれ連結させた融合ポリペプチドを、ファージディスプレイ等のディスプレイ法でファージ等の表面にディスプレイさせる;
(2)抑制ドメインと第2会合支持ドメインとを連結させた会合パートナーを用意し、融合ポリペプチドと会合パートナーを会合させる。この融合ポリペプチドと会合パートナーとが会合している状態において、標的抗原に結合しないもしくは抗原結合活性が一定値以下の融合ポリペプチドを選択する;
(3)(2)で選択した融合ポリペプチド中の抗原結合ドメインと、会合パートナー中の抑制ドメインとの会合を解消させ、抗原結合ドメインが抑制ドメインと会合しない状態で、標的抗原と結合するもしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する。
(a) 本発明のライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b) 特定のVLとIgG抗体軽鎖定常領域とを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c) (a)工程でディスプレイされた融合ポリペプチドと、(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、抗原結合ドメインと前記VLが会合する状態で、抗原と結合しないもしくは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;および
(d) (c)工程で選択された融合ポリペプチドに含まれる抗原結合ドメインが前記VLと会合しない状態で抗原と結合する、もしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する工程;
を含む、抗原結合ドメインをスクリーニングする方法を提供する。
(a) 本発明のライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b) 特定のVHとIgG抗体CH1ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c) (a)工程でディスプレイされた融合ポリペプチドと、(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、抗原結合ドメインと前記VHが会合する状態で、抗原と結合しないもしくは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;および
(d) (c)工程で選択された融合ポリペプチドに含まれる抗原結合ドメインが前記VHと会合しない状態で、抗原と結合するもしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する工程;
を含む、抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドをスクリーニングする方法を提供する。
癌組織または炎症性組織などの病変部位で発現するプロテアーゼで切断されることによって、初めて抗原結合活性を発揮する抗体を作製する方法が報告されている。Probodyと呼ばれる同抗体は、図1に示すように抗体の抗原結合部位をマスクするペプチドを、病変部位で発現するプロテアーゼで切断されるリンカーで抗体とつなぐことで、その抗原結合活性を阻害した抗体分子である(非特許文献18)。構成要素であるリンカーが標的の病態部位において発現するプロテアーゼによって切断されることでProbodyからマスクペプチドが解離し、その抗原結合活性が回復した抗体分子が生成され、標的の病態組織において抗原に結合することが可能となる。
Probodyは上述のようなメカニズムにより標的の病態部位で選択的に抗原に結合することで治療可能域(therapeutic window)を拡大することが出来ると考えられる。しかしながら、Probodyに関して、プロテアーゼによる抗体の切断は不可逆的であるため、病態部位で切断された抗体は、病態部位から再び血中に戻ることが可能であり、抗体が血流に乗って正常組織に分布し、正常組織に発現する抗原に結合する可能性があると考えられる。プロテアーゼで活性化されたProbodyは、活性化前のProbodyのようにFc領域を保有するため長い血中滞留性を保有する。そのため、病態部位に発現するプロテアーゼで活性化された抗体は長く血中に滞留する可能性がある。病態部位で発現が上昇しているプロテアーゼであっても、正常組織にも低いレベルでは発現しており、病態部位で産生された遊離型プロテアーゼが血中に漏出していることもあるため(The Chinese-German Journal of Clinical Oncology Jun. 2004, Vol. 3, No. 2 P78-P80)、そのような遊離型プロテアーゼでProbodyは活性化されうる。そのため、Probodyは病態部位以外でも活性化される可能性が考えられ、そのように活性化されたProbodyも同様に長く血中に滞留する。このように病態部位、正常組織、血中において継続的にProbodyは活性化され、活性化されたProbodyは長い血中滞留性を有すると、血中に蓄積する可能性がある。血中に蓄積した活性化されたProbodyは正常組織に発現する抗原に結合することで有害反応を発揮する可能性がある(図2)。
Probodyはリンカーによって抗体と連結されたマスクペプチドによってその抗原結合活性が阻害されてはいるが、完全に阻害されているわけではない。Probodyは、リンカーによって連結されたマスクペプチドが抗原結合部位に結合した状態とマスクペプチドが解離した状態の平衡状態にあり、解離した状態の分子は抗原に結合することができる(図3)。実際、非特許文献17に記載されている抗EGFR Probodyは、プロテアーゼによるリンカーの切断の前でもEGFRに対する結合活性を有する。プロテアーゼによるリンカーの切断により結合活性において30~100倍の上昇がみられるが、活性化される前のProbodyが、活性化されたProbodyの1/30~1/100の結合活性を有することから、活性化される前のProbodyが高い濃度で存在すると、正常組織に発現する抗原に結合することで有害反応を発揮する可能性がある。
Probodyは抗体の抗原結合部位をマスクするために人工的なペプチドを使用する。この人工的なペプチドは天然ヒト蛋白質に存在しない配列を有するため、ヒトにおいて免疫原性を有する可能性がある。そのような免疫原性は抗薬物抗体を誘導することで、抗体医薬の作用を減じることが知られている(Blood. 2016 Mar 31;127(13):1633-41.)。
Probodyに対する抗薬物抗体として、抗体とマスクペプチドの複合体(活性化される前のProbody)に対する抗薬物抗体、マスクペプチドが解離した抗体(活性化されたProbody)に対する抗薬物抗体、マスクペプチド(活性化されたProbodyから解離したマスクペプチド)に対する抗薬物抗体などが考えられる。このうち、マスクペプチドに対する抗薬物抗体(抗マスクペプチド抗体)は、活性化される前のProbodyのマスクペプチドに結合することで、プロテアーゼによる切断が起こらなくてもProbodyを活性化する可能性がある(図4)。抗マスクペプチド抗体によって活性化されたProbodyは正常組織に発現する抗原に結合することで有害反応を発揮する可能性がある。
実施例1に示したようにProbody技術には以下の課題がある。
1. プロテアーゼによる切断で活性化されたProbodyが長い血中滞留性を有する
2. プロテアーゼによる切断前のProbodyであっても抗原に対する結合活性を有する
3. マスクペプチドが人工的な非ヒト配列であり、抗マスクペプチド抗体を誘導しうる
本発明者らは、これらの課題を解決した、病態部位で活性を発揮する抗体医薬を提供するためには以下の条件を満たすことが有用であると考えた。
1. プロテアーゼによる切断で活性化された抗原結合ドメインが短い血中半減期を有する
2. プロテアーゼによる切断前の分子の抗原結合活性を最少化する
3. 人工的な非ヒト配列を有するマスクペプチドを使用しない
本発明者らは、上記条件を満たすポリペプチドの一例として図5に示す分子を考案した。抗原結合ドメインと運搬部分とが連結されたポリペプチドは長い半減期を有し、抗原結合ドメインの抗原結合活性が抑制されているため抗原に結合しない(A)。抗原結合ドメインが遊離すると、このように遊離した抗原結合ドメインはその抗原結合活性が回復し、半減期も短い(B)。
図5に示すポリペプチドは様々なバリエーションを有するが、IgG抗体様分子を使用する場合、図6に例示されるような製造方法でポリペプチドを製造することが可能である。まず標的の抗原に結合する単ドメイン抗体(例:VHあるいはVHH)を取得する(A)。得られた単ドメイン抗体を、ジャームライン配列を有するIgG抗体のVHとVLのうちの一方と入れ替えて、VHとVLのうちの他方と会合させ、IgG抗体様分子を形成させる(B)。IgG抗体様分子中にプロテアーゼ切断配列を導入する(C)。導入位置の例として、導入した単ドメイン抗体(VHあるいはVHH)と定常領域(CH1またはCL)との境界付近の位置が挙げられる。
単ドメイン抗体は単独で存在する場合には抗原結合活性を有するが、VL、VH、またはVHH等と可変領域を形成するとその抗原結合活性を失う。VLまたはVHはジャームライン配列を有する天然のヒト抗体配列であることから免疫原性のリスクは低く、同VL、またはVHを認識する抗薬物抗体が誘導される可能性は極めて低い。VHHを使用して単ドメイン抗体と可変領域を形成する場合、VHHをヒト化することによって、免疫原性のリスクを低減し、同ヒト化VHHを認識する抗薬物抗体が誘導される可能性を低下させられる。IgG抗体様分子に挿入されたプロテアーゼ切断配列がプロテアーゼで切断されることによって、単ドメイン抗体が遊離する。遊離した単ドメイン抗体は抗原結合活性を有する。プロテアーゼによる切断前のIgG抗体様分子は一般的なIgG分子と類似する構造であることから長い血中滞留性を有するのに対して、プロテアーゼによる切断で遊離した単ドメイン抗体は、Fc領域を保有せず、分子量が約13kDa程度であることから腎排泄により速やかに消失する。実際、全長IgGの半減期は2~3週間程度であるのに対して(Blood. 2016 Mar 31;127(13):1633-41.)、単ドメイン抗体の半減期は約2時間である(Antibodies 2015, 4(3), 141-156)。そのため、プロテアーゼにより活性化された抗原結合分子は血中半減期が短く、正常組織の抗原に結合する可能性は低くなる。
単ドメイン抗体がVLの場合は、プロテアーゼ切断配列を、例えばVLとCLの境界付近に導入することで、上記のような同様のコンセプトを達成可能である。
3-1 IL6Rに結合するVHHを組み込んだポリペプチドの調製
国際公開WO2010/115998号に記載されている、ヒトIL6Rに対して結合および中和活性を有するVHHであるIL6R90(配列番号:1)をヒトIgG1の定常領域(CH1-ヒンジ-CH2-CH3)に融合したものを含む、IL6R90-G1m(配列番号:2)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で調製した。
ヒトジャームライン配列を有する様々なサブクラスの軽鎖(可変領域-定常領域)としてVK1-39-k0MT(配列番号:3)、VK2-28-k0MT(配列番号:4)、VK3-20-k0MT(配列番号:5)、VL1-40-lamL(配列番号:6)、VL1-44-lamL(配列番号:7)、VL2-14-lamL(配列番号:8)、VL3-21-lamL(配列番号:9)、k0(配列番号:10)、およびlamL(配列番号:11)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で調製した。
IgG抗体様分子であるIL6R90-G1m/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:3)、IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:4)、IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT(重鎖配列番号;2、軽鎖配列番号:5)、IL6R90-G1m/VL1-40-lamL(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:6)、IL6R90-G1m/VL1-44-lamL(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:7)、IL6R90-G1m/VL2-14-lamL(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:8)、IL6R90-G1m/VL3-21-lamL(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:9)、IL6R90-G1m/k0(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:10)、およびIL6R90-G1m/lamL(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:11)を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen社)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT、IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT、IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT、IL6R90-G1m/VL1-40-lamL、IL6R90-G1m/VL1-44-lamL、IL6R90-G1m/VL2-14-lamL、IL6R90-G1m/VL3-21-lamL、IL6R90-G1m/k0、およびIL6R90-G1m/lamLの、ヒトIL6Rに対する結合活性を以下の方法で評価した。
抗原として用いた組み換えヒトIL6Rは以下のように調製した。J. Immunol. 152, 4958-4968 (1994)で報告されているN末端側1番目から357番目のアミノ酸配列からなる可溶型ヒトIL-6R(以下、hsIL-6R、IL6RあるいはIL-6Rとも呼ぶ)のCHO定常発現株を当業者公知の方法で構築し、培養し、hsIL-6Rを発現させた。得られた培養上清から、Blue Sepharose 6 FFカラムクロマトグラフィー、およびゲルろ過カラムクロマトグラフィーの2工程によりhsIL-6Rを精製した。最終工程においてメインピークとして溶出した画分を最終精製品として用いた。
各分子とhsIL6Rの結合評価を、OctetHTX (Pall ForteBio社) を用いて行った。具体的には、Biosensor / Protein A (ProA) (Pall ForteBio社, 18-5013 ) に各分子を結合させ、hsIL-6Rを作用させたのちに、30℃における結合を評価した。OctetHTXを用いて測定した継時的な結合量を表すセンサーグラムを図10に示した。VLが欠損したIL6R90-G1m/k0およびIL6R90-G1m/lamLは、hsIL-6Rに結合したが、VLと可変領域を形成したIL6R90-G1m/VK1-39-k0MT、IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT、IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT、IL6R90-G1m/VL1-40-lamL、IL6R90-G1m/VL1-44-lamL、およびIL6R90-G1m/VL2-14-lamLは、hsIL-6Rと結合することができないことが示された。このことから、ヒトIL6Rに対して結合活性を有するVHHをVLと会合させて可変領域を形成することで、そのIL6R結合活性を失わせることが出来ることが見いだされた。
抗ヒトIL6R VHHであるIL6R90とCH1の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入した。癌特異的に発現しているウロキナーゼ(uPA)およびMT-SP1で切断されることが報告されている配列であるペプチド配列A(配列番号:12)を、IL6R90とCH1の境界付近の3か所にグリシン-セリンリンカーの有りまたは無しで挿入した、図11に示す6種類の重鎖を設計した。IL6R90H1001(配列番号:13)、IL6R90H1002(配列番号:14)、IL6R90H1003(配列番号:15)、IL6R90H1004(配列番号:16)、IL6R90H1005(配列番号:17)、およびIL6R90H1006(配列番号:18)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で調製した。
これらの重鎖と、軽鎖としてVK1-39-k0MT(配列番号:3)を用いて、IgG抗体様分子であるIL6R90H1001/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:13、軽鎖配列番号:3)、IL6R90H1002/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:14、軽鎖配列番号:3)、IL6R90H1003/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:15、軽鎖配列番号:3)、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:16、軽鎖配列番号:3)、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:17、軽鎖配列番号:3)、およびIL6R90H1006/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:18、軽鎖配列番号:3)を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen社)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
IL6R90H1001/VK1-39-k0MT、IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1003/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT、およびIL6R90H1006/VK1-39-k0MTをプロテアーゼにより切断し、IL6Rへの結合活性を有するVHHが遊離するかどうかを検証した。
可溶型ヒトIL6Rは当業者公知の方法で調製した。調製した可溶型ヒトIL6Rを当業者公知の方法でビオチン化した。
可溶型ヒトIL-6R(hsIL-6Rあるいは可溶型ヒトIL6Rとも呼ぶ、配列番号:35)のC末端にビオチンを付加する目的で、hsIL-6Rをコードする遺伝子断片の下流に、ビオチンリガーゼによってビオチンが付加される特異的な配列(AviTag配列、配列番号:36)をコードする遺伝子断片を、リンカーをコードする遺伝子断片を介して、連結させた。AviTag配列と連結されたhsIL-6Rを含むタンパク質(hsIL6R-Avitag、配列番号:37)をコードする遺伝子断片を動物細胞発現用ベクターに組み込み、構築されたプラスミドベクターを293Fectin (Invitrogen社)を用いてFreeStyle293細胞 (Invitrogen社)へ導入した。このとき、細胞に、EBNA1(配列番号:57)発現のための遺伝子およびビオチンリガーゼ(BirA、配列番号:58)発現のための遺伝子を同時に導入し、hsIL-6R-Avitagをビオチン標識する目的でビオチンをさらに添加した。前述の手順に従って遺伝子が導入された細胞を、37℃、8% CO2で培養し、目的のタンパク質( hsIL-6R-BAP1 )を培養上清中に分泌させた。この細胞培養液を0.22μmボトルトップフィルターでろ過し、培養上清を得た。
メーカーのプロトコルに従いHiTrap NHS-activated HP (GEヘルスケアジャパン社)に、抗ヒトIL-6R抗体を固定化したカラム(抗ヒトIL-6R抗体カラム)を調製した。TBSで平衡化した抗ヒトIL-6R抗体カラムに培養上清をアプライし、吸着したhsIL-6Rを2 M Arginine (pH4.0)で溶出させた。次に、TBSで平衡化されたSoftLink Avidin カラム(Promega社)に、同緩衝液で希釈した抗ヒトIL-6R抗体カラムからの溶出液をアプライし、5 mM ビオチン, 50 mM Tris-HCl(pH8.0)および2 M Arginine(pH4.0)でhsIL-6R-BAP1を溶出した。この溶出液を、Superdex200(GEヘルスケアジャパン社)を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって、hsIL-6R-BAP1の会合体を除去し、バッファーがD-PBSおよび0.05% CHAPSに交換された精製hsIL-6R-BAP1を得た。
プロテアーゼとしてリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン (R&D Systems, Inc., 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ12.5nM、各IgG抗体様分子 100ug/mLを、PBS中、37℃の条件下で20時間反応させたのちに、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図12に示す。その結果、IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT、およびIL6R90H1006/VK1-39-k0MTにおいて、プロテアーゼ切断配列がVHHと重鎖定常領域の境界付近でプロテアーゼによって切断されることが確認された。
次に、プロテアーゼ処理によって遊離したVHHとIL6Rの結合評価を、OctetHTX (Pall ForteBio社) を用いて行った。具体的には、ストレプトアビジンセンサー(Pall ForteBio社, 18-5021 ) に hsIL-6R-BAP1 を結合させ、切断した各IgG抗体様分子を作用させて、30℃における結合を評価した。OctetHTXで測定した継時的な結合量を表すセンサーグラムを図13に示す。その結果、IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT、およびIL6R90H1006/VK1-39-k0MTにおいて結合が確認された。IL6R90-G1m/k0、およびIL6R90-G1m/lamLは2価で、avidityで結合するのに対して、遊離したVHHはaffinityで結合するため、プロテアーゼ処理したIL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT、およびIL6R90H1006/VK1-39-k0MTは、IL6R90-G1m/k0、およびIL6R90-G1m/lamLと比較して、IL6Rからの早い解離速度を示した。また、VHHは、IL6R90-G1m/k0、およびIL6R90-G1m/lamLと比較して分子量が小さいため、その結合量が低かった。
これらの結果から、IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT、またはIL6R90H1006/VK1-39-k0MTは、そのままではIL6Rに対して結合活性を示さないが、プロテアーゼ処理によりVHHと重鎖定常領域の境界付近に挿入したペプチド配列Aが切断され、その結果としてVHHドメインが遊離し、遊離したVHHはIL6Rに対して結合することができることが確認された。このことから実施例2に記載されたコンセプトの分子を実際に調製することが出来たと言える。
4-1 IL6Rに結合するVHHを組み込んだポリペプチドのIL6R結合評価
国際公開WO2010/115998号に記載されている、IL6Rに対して結合および中和活性を有するVHHである20A11(配列番号:19)を、実施例3と同様の方法でヒトIgG1の定常領域(CH1- ヒンジ-CH2-CH3)に融合したものを含む、20A11-G1m(配列番号:38)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で調製した。
この重鎖と、軽鎖としてVK1-39-k0MT(配列番号:3)、VK2-28-k0MT(配列番号:4)、VK3-20-k0MT(配列番号:5)、VL1-40-lamL(配列番号:6)、VL1-44-lamL(配列番号:7)、VL2-14-lamL(配列番号:8)、およびVL3-21-lamL(配列番号:9)とを用いて、実施例3と同様の方法でポリペプチド20A11-G1m/VK1-39-k0MT、20A11-G1m/VK2-28-k0MT、20A11-G1m/VK3-20-k0MT、20A11-G1m/VL1-40-lamL、20A11-G1m/VL1-44-lamL、20A11-G1m/VL2-14-lamL、および20A11-G1m/VL3-21-lamLの発現および精製を行った。
実施例3と同様の方法で、得られた20A11-G1m/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:38、軽鎖配列番号:3)、20A11-G1m/VK2-28-k0MT(重鎖配列番号:38、軽鎖配列番号:4)、20A11-G1m/VK3-20-k0MT(重鎖配列番号:38、軽鎖配列番号:5)、20A11-G1m/VL1-40-lamL(重鎖配列番号:38、軽鎖配列番号:6)、20A11-G1m/VL1-44-lamL(重鎖配列番号:38、軽鎖配列番号:7)、20A11-G1m/VL2-14-lamL(重鎖配列番号:38、軽鎖配列番号:8)、および20A11-G1m/VL3-21-lamL(重鎖配列番号:38、軽鎖配列番号:9)のIL6Rに対する結合を評価した結果を図14に示す。その結果、本実施例で使用した軽鎖の中で、ヒトジャームラインIgG1の定常領域(CH1- ヒンジ-CH2-CH3)と融合させた20A11を含む重鎖と会合することで、20A11のIL6R結合活性を抑制するものはなかった。
この理由として、20A11と本実施例で使用したVLが安定な可変領域を形成しなかったことが考えられた。
20A11とVLとの安定な可変領域を形成させるために、20A11とVLとの界面に存在するアミノ酸に変異を導入した。20A11に対して37番目のFをVに(F37V)、45番目のRをLに、および47番目のGをWに(すべてKabatナンバリングによる)置換する変異を導入した20A11hu(配列番号:20)を、実施例3と同様の方法でヒトIgG1の定常領域(CH1- ヒンジ-CH2-CH3)に融合したものを含む、20A11hu-G1m(配列番号:39)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で調製した。
この重鎖と、軽鎖としてVK1-39-k0MT(配列番号:3)、VK2-28-k0MT(配列番号:4)、VK3-20-k0MT(配列番号:5)、VL1-40-lamL(配列番号:6)、VL1-44-lamL(配列番号:7)、VL2-14-lamL(配列番号:8)、およびVL3-21-lamL(配列番号:9)とを用いて、ポリペプチド20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:39、軽鎖配列番号:3)、20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT(重鎖配列番号:39、軽鎖配列番号:4)、20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT(重鎖配列番号:39、軽鎖配列番号:5)、20A11hu-G1m/VL1-40-lamL(重鎖配列番号:39、軽鎖配列番号:6)、20A11hu-G1m/VL1-44-lamL(重鎖配列番号:39、軽鎖配列番号:7)、20A11hu-G1m/VL2-14-lamL(重鎖配列番号:39、軽鎖配列番号:8)、および20A11hu-G1m/VL3-21-lamL(重鎖配列番号:39、軽鎖配列番号:9)の発現および精製を実施例3と同様の方法で行った。
得られた20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT、20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT、20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT、20A11hu-G1m/VL1-40-lamL、20A11hu-G1m/VL1-44-lamL、20A11hu-G1m/VL2-14-lamL、および20A11hu-G1m/VL3-21-lamLの、30℃または25℃におけるIL6Rに対する結合を実施例3と同様の方法で評価した結果を図15に示す。
その結果、20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT、20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT、20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT、20A11hu-G1m/VL1-40-lamL、20A11hu-G1m/VL1-44-lamL、および20A11hu-G1m/VL2-14-lamLは、IL6Rと結合することができないことが示された。
これらの結果から、VHHとVLの界面部位に存在するアミノ酸を、37V、45L、および47W(Kabatナンバリング)にして20A11を20A11huに改変することで、実施例3で使用したVLと会合させてもIL6R結合活性を失わなかったVHH20A11に、VLと安定な可変領域を形成させることができ、かつIL6R結合活性を失わせることができることが示された。
20A11huとCH1との境界付近に、プロテアーゼ切断配列(配列番号:12)、または可動リンカーと連結されたプロテアーゼ切断配列(配列番号:44)が挿入されるように、重鎖20A11huH1001(配列番号:40)、20A11huH1002(配列番号:41)、20A11huH1004(配列番号:42)、および20A11huH1006(配列番号:43)を実施例3と同様の方法で調製した。
これらの重鎖と、軽鎖としてVK1-39-k0MT(配列番号:3)とを用いて、ポリペプチド20A11huH1001/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:40、軽鎖配列番号:3)、20A11huH1002/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:41、軽鎖配列番号:3)、20A11huH1004/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:42、軽鎖配列番号:3)、および20A11huH1006/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:43、軽鎖配列番号:3)の発現および精製を実施例3と同様の方法で行った。
20A11huH1001/VK1-39-k0MT、20A11huH1002/VK1-39-k0MT、20A11huH1004/VK1-39-k0MT、および20A11huH1006/VK1-39-k0MTを、実施例3と同様の方法でプロテアーゼにより切断し、切断の程度を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図16に示す。
その結果、20A11huH1002/VK1-39-k0MT、20A11huH1004/VK1-39-k0MT、および20A11huH1006/VK1-39-k0MTにおいて、VHHとCH1の境界付近がプロテアーゼによる切断を受けることが確認された。
次に、プロテアーゼ処理によって遊離したVHHとIL6Rの、30℃または25℃における結合評価を実施例3と同様の方法で行った。Octetのセンサーグラムを図17に示す。
その結果、プロテアーゼ処理によってVHHとCH1の境界付近が切断を受けることが確認された20A11huH1002/VK1-39-k0MT、20A11huH1004/VK1-39-k0MT、および20A11huH1006/VK1-39-k0MTにおいて、IL6Rへの結合が確認された。
これらの結果から、VHHを組み込んだポリペプチドにおいて、特定のVLと会合させる際に直ちに抗原結合活性が失われない場合でも、VHHとVLとの界面に存在するアミノ酸に会合促進の変異を導入することで抗原結合活性を失わせることができることが確認された。
この結果から、実施例3のようにあらかじめ得られているVHHを軽鎖と組み合わせる方法以外に、軽鎖との会合に関与する置換アミノ酸を含むVHHを軽鎖と組み合わせる方法によっても、実施例2に記載されたコンセプトの分子を調製できることが結論づけられた。
5-1 免疫アルパカ由来VHHの取得
当業者公知の方法でIL6R、CD3、またはPlexinA1をアルパカに免疫し、4及び8週後にPBMCを回収した。回収したPBMCからJ. Immunol. Methods (2007) 324, 13に記載の方法を参考にVHH遺伝子を増幅した。増幅したVHH遺伝子断片は、gene3遺伝子と接続してファージミドベクターに挿入した。VHH断片が挿入されたファージミドベクターを大腸菌にエレクトロポレーション法で移入し、当業者既知の方法でVHHをディスプレイするファージを得た。得られたファージは、ELISA法で、IL6R、CD3、またはPlexinA1に対する結合を評価し、結合するクローンの配列を当業者公知の方法で解析して、抗原に結合するVHHを同定した。
実施例5-1で構築されたVHHライブラリからヒトCD3に結合するVHHを同定した。抗原として、ヒトCD3ε及びヒトCD3δをヒト抗体定常領域に連結したものを含むビオチン標識されたタンパク質(ヒトCD3ed-Fc)を用いて、ヒトCD3に対して結合能をもつVHHクローンの濃縮を行った。ヒトCD3ed-Fcは以下のように調製された。配列番号:59で示すアミノ酸配列をコードする遺伝子と、配列番号:60で示すアミノ酸配列をコードする遺伝子と、BirA(配列番号:58)をコードする遺伝子とを有する動物細胞発現ベクターをFreeStyle293細胞(Invitrogen社)に移入した。移入後L-ビオチンを加えてビオチン化を培養液中で実施し、細胞培養はプロトコルに従って37℃で振とう培養によって実施した。4~5日後に上清を回収した。上清からProteinAカラム(Eshmuno A (Merck KGaA))を用いて、抗体の定常領域が融合しているタンパク質を得た。さらにCD3εδヘテロダイマーのみを取得する目的で、Anti-FLAG M2カラムを用いて、抗体の定常領域が融合しているCD3εδヘテロダイマー(ヒトCD3ed-Fcと呼ぶ)の分画を分離した。引き続き、ゲル濾過クロマトグラフィー(Superdex200、GEヘルスケアジャパン社)を実施して、目的のCD3εδヘテロダイマー(ヒトCD3ed-Fcと呼ぶ)の分画を得た。
構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保持した大腸菌からファージ産生が行われた。ファージ産生が行われた大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10%PEGを添加することによって沈殿させたファージの集団を、その後TBSにて希釈することによってファージライブラリ液が得られた。次に、ファージライブラリ液に、BSAの終濃度が4%となるようにBSAが添加された。パニングは、磁気ビーズに固定化した抗原を用いる、一般的なパニング方法を参照して実施された(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20、およびMol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads(FG beads NeutrAvidin)もしくはStreptavidin coated beads(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)が用いられた。
具体的には、調製されたファージライブラリ液に100 pmolのビオチン標識抗原を加え、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原と接触させた。BSAでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を、磁気ビーズと、室温にて15分間結合させた。ビーズは0.5 mLのTBST(0.1%Tween20を含有するTBS, TBSはTaKaRa Bio Inc.製)にて2回洗浄された後、0.5 mLのTBSでさらに1回洗浄された。その後、0.5 mLの1 mg/mLのトリプシンが加えられ、ビーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4~0.5)にある20 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間、緩やかに攪拌しながら上記大腸菌の培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養上清からファージを回収することによって、ファージライブラリ液が調製された。このサイクルをパニングと呼び、全部で2回繰り返した。2回目のパニングでは、ビーズの洗浄はTBSTで3回、続けてTBSで2回行われた。また、ヒトCD3ed-Fcをファージを接触させる時には、4 nmolのヒトFcが加えられた。
実施例5-1または5-2で得られた、ヒトCD3に対する各結合クローンのVHH配列(表1)をコードするヌクレオチド配列を、実施例3に記載の方法で、プロテアーゼ切断サイトおよび定常領域をコードするヌクレオチド配列に接続し、得られたものを動物細胞発現ベクターに挿入し、IgG抗体様分子の重鎖として使用した。
実施例5-3で調製したIgG抗体様分子を実施例3と同様の方法でプロテアーゼにより切断し、切断の程度を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図18に示す。プロテアーゼ濃度は25 nMで実施し、測定にはOctetRED (Pall ForteBio社)を用いた。
その結果、IgG抗体様分子は、プロテアーゼ切断配列において、プロテアーゼによる切断を受けることが確認された。
次に、プロテアーゼ処理によって遊離したVHHとCD3の結合評価を実施例3と同様の方法で行った。Octetのセンサーグラムを図19に示す。
その結果、IgG抗体様分子bC3edL1R1N160H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT、bC3edL1R1N161H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT、およびbC3edL1R1N164H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MTは、プロテアーゼ処理前には抗原結合を示さないのに対し、プロテアーゼ処理後には抗原結合が確認された。表1に記載されたVHHと同様な方法で得られた、CD3分子に対して結合する複数のVHH分子もまた用いて、表2に記載されたIgG抗体様分子と同様なプロテアーゼ切断サイトを含むIgG様分子を調製した結果、プロテアーゼ処理によって抗原結合が確認された。これらの結果から、実施例3および4で示されたポリペプチド以外にも、プロテアーゼ処理によってプロテアーゼ切断配列が切断され、抗原結合ドメインが遊離し、遊離した抗原結合ドメインが抗原に結合することができる、プロテアーゼ切断配列が導入されているIgG抗体様分子が示された。
実施例3と同様の方法で、各位置にプロテアーゼ切断配列が導入されている軽鎖VK1-39P-2-Pk0MT(配列番号:67)、VK1-39P-1-Pk0MT(配列番号:68)、VK1-39P-Pk0MT(配列番号:69)、VK1-39P+2-Pk0MT(配列番号:70)、VK1-39P+3-Pk0MT(配列番号:71)、VK1-39P+4-Pk0MT(配列番号:72)、及びVK1-39P+5-Pk0MT(配列番号:73)を調製した。
これらの軽鎖と、重鎖としてIL6R90-G1m(配列番号:2)とを用いたIgG抗体様分子の発現および精製を実施例3と同様の方法で行った。プロテアーゼ濃度は25 nMで実施した。切断配列を導入されていないIgG抗体様分子としてIL6R90-G1m/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:3)を用いた。
続いて、調製したIgG抗体様分子を実施例3と同様の方法でプロテアーゼにより切断し、切断の程度を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図20に示す。その結果、VK1-39P+2-Pk0MT(配列番号:70)、VK1-39P+3-Pk0MT(配列番号:71)、VK1-39P+4-Pk0MT(配列番号:72)、及びVK1-39P+5-Pk0MT(配列番号:73)は、プロテアーゼ切断配列においてプロテアーゼによる切断を受けることが確認された。プロテアーゼ処理によって露出したVHHとIL6Rの結合評価を、実施例3と同様の方法でさらに行った。Octetのセンサーグラムを図21に示す。その結果、軽鎖に切断配列を導入した場合にも、プロテアーゼ処理によって結合が認められ、軽鎖をプロテアーゼで切断することによって抗原結合ドメインが露出し抗原結合能を示すように軽鎖にプロテアーゼ切断配列が導入されている、プロテアーゼ活性化ポリペプチドを取得可能なことが示された。
実施例6で確認されたように、プロテアーゼ活性化ポリペプチドの軽鎖にプロテアーゼ切断配列を導入した場合であっても、軽鎖切断後に抗原結合ドメインが露出し、抗原に結合する。
そこで、単ドメイン抗体等の抗原結合ドメインを含む重鎖と、プロテアーゼ切断配列を導入されている軽鎖とをファージミドに組み込み、ファージによって提示させる。異なる種類の抗原結合ドメインを含む複数のファージディスプレイ用ファージミドが構築され、それらのファージミドを保持した大腸菌からファージ産生が行われる。ファージ産生の後に、大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10%PEGを添加することによってファージの集団を沈殿させ、次いでTBSで希釈することによってファージライブラリ液が得られる。ファージライブラリ液に、BSAの終濃度が4%となるようにBSAが添加される。
上記のように調製されたファージライブラリからプロテアーゼ活性化ポリペプチドをパニングにより取得する。パニングは、磁気ビーズに固定化した抗原を用いる、一般的なパニング方法を参照して実施される(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20、およびMol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。プロテアーゼ添加前は、抗原が固定されている磁気ビーズに結合しなかったファージを回収し、プロテアーゼ添加後は、抗原が固定されている磁気ビーズに結合したファージを回収する。使用磁気ビーズは、NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated、FG beads NeutrAvidin)もしくはStreptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)である。回収したファージから、前項に記載されたファージELISAで、抗原と結合するクローンを選定しても良く、あるいは抗体遺伝子を動物発現用ベクターへサブクローニングを行って動物細胞を用いて発現し、プロテアーゼ処理前後の結合活性を比較して、結合クローンを選定する。
実施例3で確認されたように、軽鎖の会合によって抗原結合ドメインを含む重鎖の抗原結合能が制御される。そこで、軽鎖と会合した時に抗原結合能を失い、重鎖のみを、または重鎖と軽鎖定常領域とを組み合わせて提示した時に抗原結合能を示す重鎖を、ファージディスプレイ法により取得する。
単ドメイン抗体等の抗原結合ドメインを含む重鎖をファージミドに組み込み、ファージによって提示させる。異なる種類の抗原結合ドメインを含む複数のファージディスプレイ用ファージミドが構築され、それらのファージミドを保持した大腸菌からファージ産生が行われる。ファージ産生の後に、大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10%PEGを添加することによって、ファージの集団を沈殿させ、次いで、TBSで希釈することによってファージライブラリ液が得られる。ファージライブラリ液に、BSAの終濃度が4%となるようにBSAが添加される。
上記のように調製されたファージライブラリから、重鎖のみまたは重鎖と軽鎖定常領域とを組み合わせて提示しているときに抗原結合能を示し、重鎖が軽鎖可変領域と会合した時に抗原結合能が失われる重鎖をパニングにより取得する。パニングは、実施例5に記載された、磁気ビーズに固定化した抗原を用いるパニング方法を参照して実施する。重鎖をまたは重鎖と軽鎖定常領域とをディスプレイしたファージライブラリから、抗原が固定されている磁気ビーズに結合したファージを回収する。回収したファージを大腸菌に感染させ、軽鎖を発現するヘルパーファージを用いて重鎖と軽鎖とをディスプレイするファージを産生する。ファージ産生の後に、大腸菌の培養液から、上述の方法で抗原結合ドメインを含む重鎖と軽鎖をディスプレイしたファージが得られる。重鎖と軽鎖とをディスプレイしたファージの集団から、抗原が固定されている磁気ビーズに結合しないファージを回収する。
図9Dに示されたようにパニングは、抗原が固定されている磁気ビーズに結合する、重鎖のみをまたは重鎖と軽鎖定常領域とを組み合わせてディスプレイしたファージ集団の回収、および抗原が固定されている磁気ビーズに結合しない、重鎖と軽鎖とをディスプレイしたファージ集団の回収の順序を入れ替えて実施することもある。ヘルパーファージを用いて軽鎖を発現する方法以外に、通常通り、同じファージミドに、軽鎖をコードする領域と重鎖をコードする領域とを組み込み、パニングごとに軽鎖定常領域のみあるいは軽鎖全長をコードする遺伝子を組み込んで用いることもある。
回収したファージから、前項に記載されたファージELISAで、抗原と結合するクローンを選定しても良く、あるいは抗体遺伝子を動物発現用ベクターへサブクローニングを行って動物細胞を用いて発現し、プロテアーゼ処理前後の結合活性を比較して、結合クローンを選定する。
実施例3で、重鎖にVHの代わりとして含まれるVHHの抗原結合能が、軽鎖との会合によって制御されることが確認された。そこで、特定の軽鎖と会合した時にはその抗原結合能を失い、重鎖のみをまたは重鎖と軽鎖定常領域とを組み合わせて提示した時、即ち軽鎖可変領域と会合していない時には抗原結合能を示すVHHを、免疫アルパカPBMC由来のVHHとCH1を連結したものをディスプレイさせたファージライブラリから取得し、当該VHHを含むIgG抗体様分子を調製した。
国際公開公報WO2015/046554号に記載の方法に基づき、ヘルパーファージのゲノムに、プロモーター、シグナル配列、抗体軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域の遺伝子、または軽鎖定常領域の遺伝子などを組み込むことにより、軽鎖発現ヘルパーファージの構築を行った。本ヘルパーファージが感染した大腸菌は、抗体軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域、または軽鎖定常領域のみの発現が可能となる。
具体的には国際公開公報WO2015/046554号に記載の方法で構築したヘルパーファージM13KO7TCからゲノムを抽出し、軽鎖発現ユニットをこのゲノムに導入した。導入する軽鎖遺伝子として、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域(VK1-39-k0MTdC、配列番号:152)をコードする遺伝子、または軽鎖定常領域(k0MTdC、配列番号: 153)をコードする遺伝子を用いた。lacプロモーター - pelBシグナル配列 - 軽鎖遺伝子を上記方法でM13KO7TC/SacIへ挿入し、大腸菌株ER2738へエレクトロポレーション法により移入した。
得られた大腸菌を培養し、培養上清に2.5 M NaCl/10%PEGを添加してPEG沈殿法によりヘルパーファージを精製した。得られたヘルパーファージM13KO7TC-Vk1-39-k0MTdC及びM13KO7TC-k0MTdCのタイターを一般的なプラーク形成法にて確認した。
当業者公知の方法で、ヒトIL6Rの細胞外ドメイン、ヒトCD3εγヘテロダイマー、サルCD3εγヘテロダイマー及びヒトPlexinA1の細胞ドメインの4種類の免疫原を用いて、アルパカに免疫し、4週間後にPBMCを回収した。CD3εγヘテロダイマーはJournal of Molecular Biology (2000) 302:899-916.を参考に調製した。回収したPBMCからJ. Immunol. Methods (2007) 324, 13に記載の方法を参考にVHH遺伝子を増幅した。増幅したVHH遺伝子断片は、CH1-gene3遺伝子と接続してファージミドベクターに挿入し、VHHとCH1を連結させたVHH-CH1分子を複数含むライブラリを調製した。
VHH-CH1をコードする遺伝子が挿入されたファージミドベクターを大腸菌にエレクトロポレーション法で移入し、得られた大腸菌を培養し、実施例9-1で調製したヘルパーファージM13KO7TC-Vk1-39-k0MTdCを感染させることで、ファージミドベクターから発現するVHH-CH1とヘルパーファージから発現する全長軽鎖がFab構造を形成し、VHH-CH1をコードする遺伝子が含まれるファージミドの表面に、VHH-CH1/全長軽鎖(VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC)をディスプレイするファージ集団を調製できる。また、VHH-CH1をコードする遺伝子が挿入されたファージミドベクターが導入されている大腸菌を培養し、実施例9-1で調製したヘルパーファージM13KO7TC-k0MTdCを感染させることで、ファージミドベクターから発現するVHH-CH1とヘルパーファージから発現する軽鎖定常領域がVHH-CH1とCLが会合した構造を形成し、VHH-CH1/軽鎖定常領域(VHH-CH1/k0MTdC)をディスプレイするファージ集団を調製できる。培養上清に2.5 M NaCl/10% PEGを添加してPEG沈殿法によりファージを精製できる。得られたファージのタイターを一般的なプラーク形成法にて確認できる。
実施例9-2で調製されたVHH-CH1ライブラリから、軽鎖可変領域との会合でその抗原結合が阻害され、軽鎖可変領域がないときに抗原結合能を示すVHHを含むVHH-CH1をパニングにより取得した。
使用した抗原は、参考実施例で作製した、ビオチン標識されたヒトPlexinA1であった。
パニング方法として、以下のステップ:
(1)実施例9-2で調製されたVHH-CH1ファージライブラリに対し、実施例9-3の方法でVHH-CH1/軽鎖定常領域(VHH-CH1/k0MTdC)をディスプレイするファージ集団を産生し、この集団から、抗原が固定されている磁気ビーズに結合したファージを回収する
(2)回収したファージから、実施例9-3の方法で、VHH-CH1/全長軽鎖(VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC)をディスプレイするファージ集団を産生し、この集団から、抗原が固定されている磁気ビーズに結合しないファージを回収する;
(3)回収したファージは、ステップ(1)と(2)に繰り返し供し、所望のファージを回収する;
に沿って行った。
パニングの結果、軽鎖Vk1-39-k0MTdCとの会合によってそのPlexinA1に対する結合が阻害され、軽鎖可変領域がないときにPlexinA1に対する結合能を示すVHH-CH1分子を複数個選択できた。
別のパニング方法として、以下のステップ:
(1)実施例9-2で調製されたVHH-CH1ファージライブラリから、実施例9-3の方法で、VHH-CH1/軽鎖定常領域(VHH-CH1/k0MTdC)をディスプレイするファージ集団を産生し、このファージ集団から、抗原が固定されている磁気ビーズに結合したファージを回収する;
(2)回収したファージから、実施例9-3の方法で、VHH-CH1/全長軽鎖(VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC)をディスプレイするファージ集団を産生し、このファージ集団から、抗原が固定されている磁気ビーズに結合しないファージを回収し、回収したファージから、抗軽鎖抗体 (EY Laboratories, Inc., Cat. BAT-2107-2)が固定された磁気ビーズに結合するファージを更に回収する;
(3)回収したファージは、ステップ(1)と(2)に繰り返し供し、所望のファージを回収する;
に沿って行った。
パニングの結果、軽鎖Vk1-39-k0MTdCとの会合によってそのPlexinA1に対する結合が阻害され、軽鎖可変領域がないときにPlexinA1に対する結合能を示すVHH-CH1分子を複数個選択できた。
こうしてパニングにより選択されたVHH-CH1中のVHHは、IgG抗体様分子の調製に使用できる。
実施例9-4で選択された各VHH-CH1分子に含まれるVHHをコードするヌクレオチド配列を実施例3に記載の方法で、プロテアーゼ切断サイトおよび重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列に接続して得られたものをIgG抗体様分子の重鎖として使用し、全長軽鎖VK1-39-k0MT(配列番号:3)と組み合わせた。このIgG抗体様分子を、当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen社)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
調製されたIgG抗体様分子は表3に示す。
実施例9-4で調製したIgG抗体様分子を実施例3と同様の方法でプロテアーゼにより切断し、切断の程度を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図22に示す。プロテアーゼ濃度は25 nMで実施した。
その結果、調製した各IgG抗体様分子は、プロテアーゼ切断配列において、プロテアーゼによる切断を受けることが確認された。
次に、プロテアーゼ処理によって遊離したVHHとヒトPlexinA1の結合評価を実施例3と同様の方法で行った。Octetのセンサーグラムを図23に示す。
その結果、調製した各IgG抗体様分子は、プロテアーゼ処理前には抗原結合を示さなかったのに対し、プロテアーゼ処理後には遊離VHHの抗原結合が確認された。
10-1 癌抗原とCD3とに結合する二重特異性VHH-VHH、及び二重特異性VHH-VHH含有ポリペプチドの調製
図8に示されたように、プロテアーゼによって活性化される抗原結合ドメインは第2の抗原結合ドメインと二重特異性抗原結合分子を形成してもよい。
ヒトグリピカン3を認識するVHH HN3(配列番号:159)と、CD3を認識するVHH G03(配列番号:160)とを、グリシンとセリンで構成されるリンカーを介して接続し、二重特異性VHH-VHH HN3G03を調製した。プロテアーゼ切断配列を介して、配列番号:161に示す抗体重鎖定常領域をさらに接続し、得られた二重特異性VHH-VHH含有重鎖HN3G03-cF760mnHIF(配列番号:162)を動物発現用ベクターに挿入した。
Her2を認識するVHH HerF07(配列番号:163)と、CD3を認識するVHH G03(配列番号:160)とを、グリシンとセリンで構成されるリンカーを介して接続し、二重特異性VHH-VHH HerF07G03を調製した。プロテアーゼ切断配列を介して、配列番号:161に示す抗体重鎖定常領域をさらに接続し、得られた二重特異性VHH-VHH含有重鎖HerF07G03-cF760mnHIF(配列番号:164)を動物発現用ベクターに挿入した。
それぞれの二重特異性VHH-VHH含有重鎖を、軽鎖VK1.39-k0MT(配列番号:3)と、ヒンジ領域からC末端までのヒト定常領域配列VHn-Kn010dGK(配列番号:166)の挿入をそれぞれ有する動物発現用ベクターと共にExpi293細胞(Life technologies社)に導入し、二重特異性VHH-VHH含有ポリペプチドを発現した。その後、当業者公知の方法でMonoSpin ProA 96ウェルプレートタイプ (GL sciences Inc., Cat No.:7510-11312)を用いて二重特異性VHH-VHH含有ポリペプチドを精製した。二重特異性VHH-VHH HN3G03を含むポリペプチドはHN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MTであり、二重特異性VHH-VHH HerF07G03を含むポリペプチドはHerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MTである。
プロテアーゼ処理として、精製した各二重特異性VHH-VHH含有ポリペプチド 40μgに(終濃度25nMとなるように)uPA(Recombinant Human u-Plasminogen Activator、R&D systems, Inc.)を加え20時間以上37℃で保温した。プロテアーゼを処理しないサンプルは、プロテアーゼの代わりにPBSをプロテーゼの量と同じ量加えたのち、保温した。プロテアーゼ切断を実施した二重特異性VHH-VHH含有ポリペプチドが目的通り切断を受けているかを還元SDS-PAGEで確認した結果を図24に示す。図24に示す通り、プロテアーゼ切断によって二重特異性VHH-VHHが分子全体から切り離されたことが示唆された。
CD3へのアゴニスト活性はJurkat-NFAT レポーター細胞(NFAT luc2_jurkat cell)を用いて評価された。Jurkat-NFATレポーター細胞は、CD3を発現しているヒト急性T細胞性白血病由来細胞にNFAT応答エレメントとルシフェラーゼ (luc2P) が融合している細胞株であり、CD3の下流のシグナルが活性化するとルシフェラーゼが発現する。GPC3に基づく抗体のために用いた標的細胞は、ヒト肝がん由来細胞株のSK-HEP-1にヒトGPC3を強制発現させて樹立したSK-pca60細胞株であった。White-bottomed, 96-well assay plate (Costar, 3917)の各ウェルに、標的細胞とエフェクター細胞をそれぞれ1.25E+04 細胞/ウェル、7.50E+04細胞/ウェル加え、当該ウェルに、プロテアーゼ処理有りもしくはプロテアーゼ処理無しのHN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MTを、終濃度1, 10, 100nMで添加した。5% CO2存在下で37℃、 24時間インキュベートしたのち、ルシフェラーゼ酵素活性をBio-Glo luciferase assay system (Promega社、G7940) を使用して添付のプロトコルに従って発光強度として測定した。検出には2104 EnVisionを使用した。その結果を図25に示す。プロテアーゼ処理無しのサンプルの場合ルシフェラーゼ活性の上昇がみられなかったのに対して、プロテアーゼ処理有りのHN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MTではルシフェラーゼ活性の上昇が示された。すなわち、プロテアーゼ処理有りのHN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT の場合、CD3に対するアゴニスト活性を有することが確認でき、プロテアーゼ切断によってHN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MTから、GPC3およびCD3に対する二重特異性VHH-VHHが遊離され、未切断時には阻害されていたCD3結合活性を発揮した。
CD3に対するアゴニスト活性はJurkat-NFAT レポーター細胞(NFAT luc2_jurkat cell)を用いて評価された。Jurkat-NFATレポーター細胞(エフェクター細胞)は、CD3を発現しているヒト急性T細胞性白血病由来細胞にNFAT応答エレメントとルシフェラーゼ (luc2P) が融合している細胞株であり、CD3の下流のシグナルが活性化するとルシフェラーゼが発現する。使用した標的細胞は、LS1034細胞株であった。White-bottomed, 96-well assay plate (Costar, 3917)の各ウェルに、標的細胞とエフェクター細胞をそれぞれ2.50E+04細胞/ウェル、7.50E+04細胞/ウェル加え、当該ウェルに、プロテアーゼ処理有りもしくはプロテアーゼ処理無しのHerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MTを、終濃度0.01, 0.1, 1nMで添加した。5% CO2存在下で37℃、24時間インキュベートしたのち、ルシフェラーゼ酵素活性をBio-Glo luciferase assay system (Promega社、G7940) を使用して添付のプロトコルに従って発光強度として測定した。検出には2104 EnVisionを使用した。その結果を図26に示す。プロテアーゼ処理無しのサンプルの場合ルシフェラーゼ活性の上昇がみられなかったのに対して、プロテアーゼ処理有りのHerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MTではルシフェラーゼ活性の上昇が示された。すなわち、プロテアーゼ処理有りのHerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MTの場合、CD3に対するアゴニスト活性を有することが確認でき、プロテアーゼ切断によってHerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MTから、Her2およびCD3に対する二重特異性VHH-VHHが遊離し、未切断時には阻害されていたCD3結合活性を発揮した。
11-1 IL6Rに結合するVHHを組み込んだポリペプチドへのプロテアーゼ切断配列の導入
国際公開WO2010/115998号に記載されている、ヒトIL6Rに対して結合および中和活性を有するVHHであるIL6R90(配列番号:1)をヒトIgG1の定常領域(CH1- ヒンジ-CH2-CH3)に融合したものを含む、IL6R90-G1T4(配列番号:167)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で調製した。IgG抗体様分子であるIL6R90-G1T4/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:167、軽鎖配列番号:3)を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen社) もしくはExpi293細胞 (Life technologies社) を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
IL6R90-G1T4/VK1-39-k0MTの重鎖のVHHとCH1の境界付近に、配列番号:178で示すプロテアーゼ切断配列を挿入し、プロテアーゼ切断配列が導入されているVHH含有重鎖IL6R90.12aa-G1T4(配列番号:189)を調製した。IL6R90.12aa-G1T4発現ベクターを、当業者公知の方法で調製した。
IL6R90.12aa-G1T4と配列番号:3で示す軽鎖を組み合わせて、VHHとCH1の境界付近にプロテアーゼ切断配列を導入されているIgG1抗体様分子IL6R90.12aa-G1T4/VK1-39-k0MTを当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen社) もしくはExpi293細胞 (Life technologies社)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
実施例11-1で調製したIgG抗体様分子がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン( MT-SP1 ) ( R&D Systems,Inc., 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ 10nM、抗体 50μg/mLを、PBS中、37℃の条件下で20時間反応させたのちに、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図27に示す。その結果、IgG抗体様分子IL6R90.12aaは、プロテアーゼ処理によって37kDa付近に新たなバンドが生じた。即ち、IgG抗体様分子は、VHHとCH1の境界付近に挿入された、プロテアーゼ切断配列(配列番号:178)でプロテアーゼによる切断を受けることが確認された。また、配列番号:178で示すプロテアーゼ切断配列がIgG抗体に組み込まれているときに、類似する方法でヒトuPAおよびマウスuPAによって切断されることも確認された。
国際公開WO2010/115998号に記載されている、ヒトIL6Rに対して結合および中和活性を有するVHHであるIL6R75(配列番号:190)をヒトIgG1の定常領域(CH1-ヒンジ-CH2-CH3)に融合したものを含む、IL6R75-G1m(配列番号:191)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で調製した。実施例4-2と同様の方法でVHHとVLの界面部位へアミノ酸改変を導入したIL6R75hu-G1m(配列番号:192)を調製した。プロテアーゼ切断配列を組み込んだ軽鎖VK1-39P+4-Pk0MT(配列番号:72)と、重鎖としてIL6R90-G1m(配列番号:2)、20A11hu-G1m(配列番号:39)、およびIL6R75hu-G1m(配列番号:192)を用いたIgG抗体様分子IL6R90-G1m/ VK1-39P+4-Pk0MT(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:72)、20A11hu-G1m/ K1-39P+4-Pk0MT(重鎖配列番号:39、軽鎖配列番号:72)、およびIL6R75hu-G1m/ VK1-39P+4-Pk0MT(重鎖配列番号:192、軽鎖配列番号:72)の発現および精製を実施例3と同様の方法により行った。
IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT、20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT、およびIL6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MTを実施例3と同様の方法でプロテアーゼにより切断し、切断の程度を評価した結果を図28に示す。具体的には、プロテアーゼとしてリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン ( R&D Systems, Inc., 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ50nM、および各IgG抗体様分子 50μg/mLを、PBS中、37℃の条件下で20時間反応させたのちに、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した。その結果、IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT、20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT、およびIL6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MTは、VLとCLの境界付近がプロテアーゼによる切断を受けることが確認された。
次に、プロテアーゼ処理によって露出したVHHとIL6Rの結合をELISAで評価した。具体的には、ストレプトアビジン・コート384ウェルプレート ( Greiner Bio-One GmBH, 781990 ) に実施例3で使用した hsIL-6R-BAP1 を固定し、切断した各IgG抗体様分子を室温で結合させた。30分間の反応後、HRP標識抗ヒトIgG抗体 ( Sigma-Aldrich Co. LLC, SAB3701362-2MG ) を室温で10分間作用させ、それをTMB Chromogen Solution ( Life Technologies社, 002023 ) と反応させた。室温で30分反応させた後、硫酸で反応を停止させ、Synergy HTX マルチモードリーダー(BioTek Instruments, Inc.)を用いて450nmでの吸光度を測定した。抗原を固定したウェルとしなかったウェルの吸光度の比を算出し、S/N比として使用した。ELISAのS/N比(平均値)を縦軸、各IgG抗体様分子の濃度を横軸にプロットし、結果を図29に示す。この結果から、プロテアーゼ処理された、その軽鎖に切断配列が導入されているIgG抗体様分子20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MTは、プロテアーゼ未処理のIgG抗体様分子と比べてIL6Rへの結合活性が10倍以上になり、プロテアーゼ処理されたIgG抗体様分子IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MTは、プロテアーゼ未処理のもののIL6Rへの結合活性の1000倍以上となったことが示された。
13-1 多様なプロテアーゼ切断配列が導入されているポリペプチドの調製
ウロキナーゼまたはマトリプターゼ以外のプロテアーゼのための認識配列を用いて、実施例3と同様の方法でIgG抗体様分子を調製した。IL6R90-G1mの可変領域と定常領域の境界付近に、MMP-2、MMP-7、MMP-9、またはMMP-13で切断されることが知られている各種ペプチド配列をそれぞれ挿入し、かつそれらの切断配列の近傍に、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーを含むペプチド配列を挿入した。挿入した配列は表4に示す。
これらの重鎖改変体と軽鎖を組み合わせて、重鎖の可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列が導入されているIgG抗体様分子を表5に示す。これらのIgG抗体様分子を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen社) もしくはExpi293細胞 (Life technologies社)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
実施例13-1で調製したIgG抗体様分子がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトMMP-2(R&D Systems, Inc., 902-MP-010 )、リコンビナントヒトMMP-7( R&D Systems, Inc., 907-MP-010)、リコンビナントヒトMMP-9(R&D Systems, Inc., 911-MP-010 )、またはリコンビナントヒトMMP-13(R&D Systems, Inc., 511-MM-010)を用いた。MMP-2、MMP-7、MMP-9、およびMMP-13は、それぞれ1 MMP-アミノフェニル水銀アセタート(APMA; Abcam PLC, ab112146 ) と混ぜ、37℃で1または24時間活性化させてから使用した。プロテアーゼ 50 nM、100 nM、または 500 nM、およびIgG抗体様分子50μg/mLまたは100μg/mLは、PBS中、または 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2(pH 7.2)(以下、Trisと呼ぶ)中、37℃の条件下で20時間反応させた後に、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図30Aおよび図30Bに示す。図30Bではプロテアーゼによる切断をassay buffer(MMP Activity Assay Kit (Fluorometric - Green) (ab112146), Component C: Assay Buffer)を用いて実施した。
その結果、MMP-2では6R90EIVHEMP2.1-6R90EICHEMP2.1G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.2-6R90EICHEMP2.2G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.3-6R90EICHEMP2.3G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.4-6R90EICHEMP2.4G1m/VK1-39-k0MT,6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m/VK1-39-k0MT、および6R90EIVHEG4SMP2.2G4S-6R90EICHEG4SMP2.2G4SG1m/VK1-39-k0MTが、MMP-7では6R90EIVHEMP7.1-6R90EICHEMP7.1G1m/VK1-39-k0MT、および6R90EIVHEMP7.2-6R90EICHEMP7.2G1m/VK1-39-k0MTが、MMP-9では6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m/VK1-39-k0MT、および6R90EIVHEG4SMP9G4S-6R90EICHEG4SMP9G4SG1m/VK1-39-k0MTが、MMP-13では6R90EIVHEMP13-6R90EICHEMP13G1m/VK1-39-k0MTが、切断されることが確認された。
14-1 重鎖の多様な位置にプロテアーゼ切断配列が導入されている抗体の調製
ウロキナーゼ(uPA)およびマトリプターゼ(MT-SP1)によって切断可能と報告されているペプチド配列B(配列番号:210)を、MRA重鎖可変領域(MRAH; 配列番号:211)内のさまざまな位置のそれぞれに挿入し、表6に示される操作されたMRA重鎖可変領域を調製した。これらの操作されたMRA重鎖可変領域をそれぞれMRA重鎖定常領域(G1T4; 配列番号:212)に連結し、操作されたMRA重鎖を調製した。当業者に公知の方法によって、対応する遺伝子発現ベクターを調製した。さらに、ペプチド配列B(配列番号:210)を、MRA重鎖定常領域(G1T4; 配列番号:212)内のさまざまな位置のそれぞれに挿入し、表7に示される操作されたMRA重鎖定常領域を調製した。これらの操作されたMRA重鎖定常領域をそれぞれMRA重鎖可変領域(MRAH; 配列番号:211)に連結し、操作されたMRA重鎖を調製した。当業者に公知の方法によって、対応する遺伝子発現ベクターを調製した。表6および7はまた、調製した操作されたMRA重鎖可変領域および操作されたMRA重鎖定常領域におけるプロテアーゼ切断配列挿入位置も示す。表6では、挿入配列は、抗体重鎖可変領域における記載位置(Kabatナンバリング)に隣接する定常領域側に位置した。表7では、挿入配列は、抗体重鎖定常領域における記載位置(EUナンバリング)に隣接する可変領域側に位置した。
実施例14-1で調製した操作されたMRA抗体がプロテアーゼにより切断されるかどうかを検証した。プロテアーゼとして、組換えヒトマトリプターゼ/ST14触媒ドメイン(ヒトMT-SP1、hMT-SP1)(R&D Systems, Inc.、3946-SE-010)を用いた。10 nMプロテアーゼおよび50 μg/mLの各抗体を、PBS中で37℃の条件下で20時間反応させ、その後、還元SDS-PAGEを行った。結果を図31A、31B、31C、31D、31E、31F、31G、31H、31I、32A、32B、および32Cに示す。プロテアーゼ処理した操作されたMRA抗体は、その重鎖で切断を受け、プロテアーゼで処理しなかった操作されたMRA抗体の重鎖のものより小さな分子量の位置で重鎖のバンドを生じた(図中、バンドはMT-SP1(-)レーンの50 kDa付近に現れている)。この結果から、実施例14-1において調製された操作されたMRA抗体がhMT-SP1によって切断されていることが確認された。
15-1 軽鎖の多様な位置にプロテアーゼ切断配列が導入されている抗体の調製
ウロキナーゼ(uPA)およびマトリプターゼ(MT-SP1)によって切断可能と報告されているペプチド配列B(配列番号:210)を、MRA軽鎖可変領域(MRAL; 配列番号:280)内のさまざまな位置のそれぞれに挿入し、表9に示される操作されたMRA軽鎖可変領域を調製した。これらの操作されたMRA軽鎖可変領域をそれぞれMRA軽鎖定常領域(k0; 配列番号:281)に連結し、操作されたMRA軽鎖を調製した。当業者に公知の方法によって、対応する遺伝子発現ベクターを調製した。さらに、ペプチド配列B(配列番号:210)をMRA軽鎖定常領域(k0; 配列番号:281)内のさまざまな位置のそれぞれに挿入し、表10に示される操作されたMRA軽鎖定常領域を調製した。これらの操作されたMRA軽鎖定常領域をそれぞれMRA軽鎖可変領域(MRAL; 配列番号:280)に連結し、操作されたMRA軽鎖を調製した。当業者に公知の方法によって、対応する遺伝子発現ベクターを調製した。表9および10はまた、調製した操作されたMRA軽鎖可変領域および操作されたMRA軽鎖定常領域におけるプロテアーゼ切断配列挿入位置も示す。表9では、挿入配列は、抗体軽鎖可変領域における記載されたアミノ酸位置(Kabatナンバリング)に隣接する定常領域側に位置した。表10では、挿入配列は、抗体軽鎖定常領域における記載されたアミノ酸位置(EUナンバリング)に隣接する可変領域側に位置した。
実施例15-1で調製した操作されたMRA抗体がプロテアーゼにより切断されるかどうかを検証した。プロテアーゼとして、組換えヒトマトリプターゼ/ST14触媒ドメイン(MT-SP1)(R&D Systems, Inc.、3946-SE-010)を用いた。10 nMプロテアーゼおよび50 μg/mLの各抗体を、PBS中で37℃の条件下で20時間反応させ、その後、還元SDS-PAGEを行った。結果を図33A、33B、33C、33D、33E、34A、および34Bに示す。プロテアーゼ処理した操作されたMRA抗体は、その軽鎖で切断を受け、プロテアーゼで処理しなかった操作されたMRA抗体の軽鎖のものより小さな分子量を有する位置で軽鎖のバンドを生じた(図中、バンドはMT-SP1(-)レーンの25 kDa付近に現れている)。
16-1 IL-1Rに結合するVLが組み込まれているポリペプチドへのプロテアーゼ切断配列の導入
前記実施例に示されるように、VHHは、プロテアーゼ活性化ポリペプチドにおいて抗原結合単ドメイン抗体として用いられ得る。単独で抗原に結合するVL単ドメイン抗体は、VL単ドメインが、VHHまたはVH単ドメインと比較して更により優れた物理化学的な性質を有することが報告されている(J. Mol. Biol., 342 (2004), pp. 901-912, J. Mol. Biol. (2003) 325, 531-553)。したがって、本発明者らは、VL単ドメインを、図35に示すようにIgG抗体様分子において抗原結合ドメインに使用でき得ると予測した。
プロテアーゼ活性化IgG抗体様分子を構築するために、図35に示す3種類のIgG抗体様分子フォーマットに応じて、抗IL-1R1-VL(DOM4.122.23(配列番号:479)または DOM4.130.202(配列番号:480))とCH1またはIgκのいずれかとの境界付近に、プロテアーゼ切断配列を挿入した。
VL二量体タイプおよびVL×VHタイプ1フォーマットにおいて、ペプチド配列i(配列番号:508)、k(配列番号:509)、またはuPA(配列番号:510)がVL DOM4.122.23またはDOM4.130.202とCH1との境界付近の部位に挿入されるように、表13に示す3種類の重鎖定常領域(iSG1、kSG1、uPASG1)を設計した。iおよびkはMMP13によって切断可能な配列として報告されており、uPAはウロキナーゼ(uPA)によって切断可能である。
VL×VHタイプ2フォーマットにおいて、ペプチド配列i(配列番号:508)、k(配列番号:509)、またはuPA(配列番号:510)がVL DOM4.122.23またはDOM4.130.202とIgκとの境界付近の部位に挿入されるように、図CK1Bに示す3種類の軽鎖定常領域(iSK1、kSK1、uPASK1)を設計した。
DOM4.122.23-iSG1(配列番号:492)、DOM4.122.23-kSG1(配列番号:493)、DOM4.122.23-uPASG1(配列番号:494)、DOM4.130.202-iSG1(配列番号:495)、DOM4.130.202-kSG1(配列番号:496)、DOM4.130.202-uPASG1(配列番号:497)、DOM4.122.23-iSK1(配列番号:502)、DOM4.122.23-kSK1(配列番号:503)、DOM4.122.23-uPASK1(配列番号:504)、DOM4.130.202-iSK1(配列番号:505)、DOM4.130.202-kSK1(配列番号:506)、およびDOM4.130.202-uPASK1(配列番号:507)をコードする発現ベクターを、当業者に公知の方法によって調製した。
ヒト生殖細胞系列配列を有する重鎖(可変領域-定常領域)としてVH3.23-SG1(配列番号:498)をコードする発現ベクターを、当業者に公知の方法によって調製した。
ヒト生殖細胞系列配列を有する種々のサブクラスの軽鎖(可変領域-定常領域)としてVK1.39-SK1(配列番号:499)、VL1.40-lam1(配列番号:500)、VH3.23-SK1(配列番号:501)をコードする発現ベクターを調製した(当業者に公知の方法によりVK1.39(配列番号:484)、VL1.40(配列番号:485)、VH3.23(配列番号:486)、lam1(配列番号:488))。
当業者に公知の方法によって、下記表12に示すプロテアーゼ活性化IgG抗体様分子を、Expi 293細胞(Invitrogen Corp.)を用いる一過性発現によって発現させ、プロテインAを用いる当業者に公知の方法によって精製した。表13は各調製した抗体定常領域の名前、アミノ酸配列の挿入部位、および挿入したアミノ酸配列を示す。挿入部位を[insert]で示す。
MMP13(R&D systems、511-MM-010)を1マイクロモルの4-アミノフェニル水銀アセタート(APMA、Sigma、A9563)で活性化した。活性化したMMP13またはuPA(R&D systems、1310-SE-010)を、実施例16に記載される抗IL-1R1結合ドメインを有するIgG抗体様分子に加えた。IgG抗体様分子の最終濃度は800 nMであり、プロテアーゼの最終濃度は25 nMであった。反応混合物を37℃で20時間インキュベートした。還元SDS-PAGEおよび非還元SDS-PAGEによって切断の程度を評価した。IgG抗体様分子のプロテアーゼ切断が確認され、抗IL-1R1ドメイン抗体の対応するバンドが15 kDaから10 kDaの間に認められた(図36、37、および38)。
10%ウシ胎仔血清、50 U/mLストレプトマイシン、50 μg/mLペニシリン、100 μg/mL Normocin(商標)、200 μg/mLのハイグロマイシンB Gold、および100 μg/mLのZeocin(商標)を補充したDMEM培地(Gibco)中で、HEK-Blue(商標) IL-1β細胞を維持した。機能アッセイの間、細胞用の培地をアッセイ培地(10% FBS、50 U/mLストレプトマイシン、50 μg/mLペニシリン、および100 μg/mL Normocin(商標)を含むDMEM)に変更し、1ウェルあたり5×104個の細胞の播種密度で96ウェルプレートに播種した。次いで、実施例17に記載されるようなIgG抗体様分子反応混合物をアッセイ培地で100倍に希釈し、5% CO2を供給される37℃のインキュベーターでHEK-Blue(商標) IL-1β細胞と一緒に1時間インキュベートした。次いで、5% CO2を供給される37℃のインキュベーターにて一晩の細胞刺激のために、ヒト組換えIL-1βを1 ng/mLの最終濃度までウェルに加えた。細胞上清をQUANTI-Blue(商標)と混合し、37℃にて30分間インキュベートし、その後、620 nmでの光学密度を比色プレートリーダーで測定した。抗IL-1R1結合ドメインを有するIgG抗体様分子でのプロテアーゼ処理後に、中和活性が増強した(図39および40)。
プロテアーゼ活性化IgG抗体様分子を構築するために、プロテアーゼ切断配列を抗CD154 VL(DOM8.8(配列番号:533)とIgκとの境界付近に挿入した。重鎖 MORH-wtG4d(配列番号:534)、重鎖 MORH-G1d(配列番号:535)、MORH-IgG2dGK(配列番号:536)、および MDXH-mFa55(配列番号:537)をコードする発現ベクターを、当業者に公知の方法によって調製した。当業者に公知の方法によって、重鎖およびプロテアーゼ切断配列含有軽鎖 DOM8.8-Pk0MT(配列番号:538)を、Expi 293細胞(Invitrogen Corp.)を用いる一過性発現によって同時発現させ、プロテインAを用いる当業者の公知の方法によって精製した。
実施例3と同じ方法で、実施例19で調製したIgG抗体様分子をプロテアーゼによって切断し、切断を還元SDS-PAGEによって評価した。プロテアーゼ濃度を25 nMに設定し、Octet RED(Pall ForteBio Corp.)をこのアッセイで用いた。還元SDS-PAGEによる評価の結果を図41に示し、プロテアーゼ切断を各IgG抗体様分子において確認した。
次に、プロテアーゼ処理によって遊離したVLのCD154結合の評価を、実施例3と同じ方法で行った。N末端Flagタグ付きCD154(配列番号:539)を当業者に公知の方法によって調製した。次いで、CD154のビオチン化を製造者のプロトコールしたがって行った。具体的には、ビオチン化CD154をストレプトアビジンセンサー(Pall ForteBio Corp.、18-5021)に結合させ、各切断したIgG抗体様分子「プロテアーゼ処理IgG抗体様分子」または「プロテアーゼ未処理IgG抗体様分子」をその上に作用させ、続いて27℃で結合評価を行った。Octet REDを用いて測定した連続反応を示すセンサーグラムを図42-1および図42-2に示す。
結果として、IgG抗体様分子は、プロテアーゼ切断配列でプロテアーゼ切断を受けることが確認され、プロテアーゼ切断後の抗原結合が想起された。
実施例4に示すように、たとえ、ポリペプチドに組み込まれたVHHが、特定のVLとの会合後直ちにその抗原結合活性を失わないとしても、抗原結合活性は、VHHとVLとの間の界面に存在するアミノ酸に会合促進変異を導入することによって失わせることができる。VLの場合には、単ドメインはVH/VL会合を改善するように変異を導入することもできる。VHとVLとの会合の増強に関して、複数の変異が、Nature Biotechnology volume 32, pages 191-198 (2014)、Biophys. J. 75, 1473-1482 (1998)、Protein Eng. Des. Sel. 23, 667-677 (2010)、MAbs. 2017 Feb-Mar; 9(2): 182-212、およびWO2013065708に報告されている。具体的には、変異の組み合わせを表15に示した。
ビオチン化プレキシンA1(ビオチン標識されたヒトPlexinA1とも呼ぶ)は当業者公知の方法で調製した。具体的には、プレキシンA1の細胞外領域をコードする遺伝子断片の下流に、ビオチンリガーゼによってビオチン化される特異的な配列(AviTag配列、配列番号:36)をコードする遺伝子断片と、FLAGタグ配列(配列番号:199、DYKDDDDK)をコードする遺伝子断片とを、グリシンとセリンで構成されるリンカーをコードする遺伝子断片を介して連結した。プレキシンA1とAviTag配列およびFLAGタグ配列が連結されたものを含むタンパク質(配列番号:200)をコードする遺伝子断片を動物細胞発現用ベクターに組み込み、構築されたプラスミドベクターを、293フェクチン(Invitrogen社)を用いてFreeStyle293細胞 (Invitrogen社)に移入した。このときEBNA1(配列番号:57)を発現するための遺伝子およびビオチンリガーゼ(BirA、配列番号:201)を発現するための遺伝子を同時に細胞に導入し、プレキシンA1をビオチン標識する目的で、ビオチンをさらに添加した。前述の手順に従って遺伝子が導入された細胞を37℃、8% CO2で培養し、目的のタンパク質(ビオチン化プレキシンA1)を培養上清中に分泌させた。この細胞培養液を0.22μmボトルトップフィルターでろ過し、培養上清を得た。
Anti FLAG M2 agarose (Sigma-Aldrich Co. LLC, #A2220)をカラムに詰めて、FLAGカラムを調製した。FLAGカラムをあらかじめD-PBS(-)で平衡化し、培養上清をそこにアプライして、ビオチン化プレキシンA1をカラムに結合させた。続いて、D-PBS(-)に溶解したFLAG ペプチドを用いて、ビオチン化プレキシンA1を溶出した。この溶出液を、HiLoad 26/600 Superdex 200 pg, 320mL (GEヘルスケアジャパン社, 28-9893-36)を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって、会合体を除去して、精製ビオチン化プレキシンA1を得た。
抗原結合ドメインの一例として、特定のVL、VH、またはVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体をスクリーニングまたは製造することで、本発明のポリペプチドを効率よく製造することが可能である。さらに、本発明のポリペプチドに使用できる抗原結合ドメインの一例として、特定のVL、VH、またはVHHと会合することでその抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体を含むライブラリを用いれば、本発明のポリペプチドを調製するときに必要とする抗原結合ドメインを、効率よく取得することが可能である。
Claims (13)
- IL-1R1に結合する抗原結合ドメイン(IL-1R1結合ドメイン)と切断サイトと運搬部分とを含むポリペプチドであって、該IL-1R1結合ドメインが、該IL-1R1結合ドメインのIL-1R1結合活性を抑制する抑制ドメインを有する該運搬部分のものより短い血中半減期を有し、該IL-1R1結合ドメインが単ドメイン抗体を含み、かつ該運搬部分の抑制ドメインがVHH、抗体VH、または抗体VLを含む、前記ポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、前記ポリペプチドから遊離可能であり、かつ該ポリペプチドから遊離した抗原結合ドメインが、遊離前のものより高い抗原結合活性を有する、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記運搬部分の抑制ドメインが、前記抗原結合ドメインと会合し、それによって前記抗原結合ドメインの抗原結合活性を抑制する、請求項1または2に記載のポリペプチド。
- 前記切断サイトが切断されることにより、前記抗原結合ドメインが前記ポリペプチドから遊離可能になる、または/かつ前記運搬部分の抑制ドメインと前記抗原結合ドメインとの会合が解消される、請求項2または3に記載のポリペプチド。
- 前記切断サイトがプロテアーゼ切断配列を含む、請求項4に記載のポリペプチド。
- 前記運搬部分が抗体定常領域を含む、請求項1~5のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドがプロテアーゼ切断配列を有し、該プロテアーゼ切断配列が、前記抗原結合ドメインと前記抗体定常領域との境界付近に位置する、請求項6に記載のポリペプチド。
- 切断サイトと運搬部分とIL-1R1結合ドメインのIL-1R1結合活性を抑制する抑制ドメインを有する運搬部分のものより短い血中半減期を有するIL-1R1結合ドメインとを含む、ポリペプチドであって、該IL-1R1結合ドメインが、下記の1)および2):
1)配列番号:479のアミノ酸配列を含む単ドメイン抗体VL、および
2)配列番号:480のアミノ酸配列を含む単ドメイン抗体VL
からなる群より選択される単ドメイン抗体VLを含み、かつ該抑制ドメインがVHH、抗体VH、または抗体VLを含む、前記ポリペプチド。 - 抗原結合ドメインと切断サイトと運搬部分とを含むポリペプチドであって、該抗原結合ドメインが、該抗原結合ドメインの抗原結合活性を抑制する抑制ドメインを有する該運搬部分のものより短い血中半減期を有し、該抗原結合ドメインが単ドメイン抗体を含み、かつ該運搬部分の抑制ドメインがVHH、抗体VH、または抗体VLを含み、該抗原が、IL-1α、IL-1β、およびIL-1RAcPからなる群より選択される、前記ポリペプチド。
- 請求項1~9のいずれかに記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載のポリペプチドの有効量を含む、IL-1R1により媒介される疾患または障害を有する対象を治療するための医薬組成物。
- 抗原結合ドメインと切断サイトと運搬部分とを含むポリペプチドであって、該抗原結合ドメインが、該抗原結合ドメインの抗原結合活性を抑制する抑制ドメインを有する該運搬部分のものより短い血中半減期を有し、該抗原結合ドメインが抗体VLを含み、かつ該運搬部分の抑制ドメインがVHH、抗体VH、または抗体VLを含む、前記ポリペプチド。
- 抗原結合ドメインと切断サイトと運搬部分とを含むポリペプチドであって、該抗原結合ドメインが、該抗原結合ドメインの抗原結合活性を抑制する抑制ドメインを有する該運搬部分のものより短い血中半減期を有し、該抗原結合ドメインがVHHまたは抗体VHを含み、かつ該運搬部分の抑制ドメインがVHH、抗体VH、または抗体VLを含む、前記ポリペプチド。
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