CN117946266A - 靶向IL-6Rα蛋白的纳米抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向IL‑6Rα蛋白的纳米抗体及其用途，该纳米抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。该纳米抗体与IL‑6Rα蛋白的亲和力高，且具有稳定性高、水溶性高等特点，可用于治疗IL‑6介导的相关疾病或病症的药物组合物的开发，还可用于IL‑6Rα检测试剂或试剂盒的开发，为IL‑6介导的相关疾病研究提供潜在的高效抗体，为自身免疫性疾病或肿瘤提供新的治疗策略和靶标。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向IL-6Rα蛋白的纳米抗体及其用途。
背景技术
白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)是具有多种生物学活性的细胞因子，也是机体复杂的细胞因子网络中的关键因子，已有研究表明在发生炎症、坏死或由于肿瘤细胞抗原刺激免疫细胞分泌IL-6增高等情况下，血清中IL-6增加，过量表达IL-6往往与某些疾病相关。
现有研究已经确认IL-6可作为多效性因子，具体的说，在急性期反应时它可以刺激肝脏诱导急性期反应蛋白产生，比如C反应蛋白、纤维蛋白原。例如在NKT细胞介导的肝脏炎症过程中，IL-6充当保护性角色，可以防止肝损伤、坏死，有助于肝再生，其中的机制主要是STAT3信号。此外，脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞时会分泌一些促炎性细胞因子，如IL-6、TNF-α，而这些炎性因子又会活化典型的核因子κB(NF-κB)通路，从而形成正反馈循环，扩大炎性因子的释放(IL-1β和TNF-α)，加重炎症。不仅如此，IL-6还参与了骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)的分化，通过充当MDSC分化所需的第二种信号，可以使未成熟的髓系细胞发生病理性活化，从而促进MDSC的积累。以上均表明了IL-6在炎症发展、细胞分化过程中承担着重要性角色，因此一旦IL-6不受控制地持续释放，则会导致各种疾病发展。
目前单克隆抗体治疗依旧是靶向IL-6的一种特异性治疗方案，但是单克隆抗体存在分子量大、很难透过组织屏障等一些缺点，这促使了靶向IL-6的纳米抗体研发。尽管靶向IL-6的纳米抗体仍然处于临床前及临床开发阶段，但是纳米抗体自身所具有的诸多优势(如分子量很小、组织渗透性强)让研究者看到了更多可能，更加坚定了研发的决心。此外，目前已有的治疗性抗体(特异性靶向IL-6)价格昂贵，其受益群众占比很小，因此非常迫切更低成本的纳米抗体问世，为IL-6相关疾病患者带来更多希望。
本发明致力于阐明一种靶向IL-6Rα蛋白的纳米抗体及其用途，为肿瘤和自身免疫性疾病的治疗提供新的靶标。
发明内容
有鉴于此，本发明有必要提供一种靶向IL-6Rα蛋白的纳米抗体，该纳米抗体与IL-6Rα蛋白具有高亲和力，从而能够为IL-6相关疾病研究提供更为广泛的治疗策略，为肿瘤和自身免疫性疾病的治疗开拓了新的治疗靶标。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种靶向IL-6Rα蛋白的纳米抗体，所述纳米抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
优选地，所述IL-6Rα蛋白为人源IL-6Rα蛋白或鼠源IL-6Rα蛋白。
进一步方案，所述纳米抗体具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
进一步方案，所述纳米抗体还包括lgG的Fc结构域；
优选地，所述Fc结构域为IgG1 Fc结构域；
优选地，所述IgG1 Fc结构域为人IgG1 Fc结构域；
优选地，所述人IgG1 Fc结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的。
本发明进一步提供了一种双表位抗体，其包括第一半抗体和第二半抗体，所述第一半抗体为前述的纳米抗体，所述第二半抗体与所述第一半抗体的表位不同；
优选地，所述第一半抗体和第二半抗体之间通过肽接头连接；
优选地，所述肽接头的连接片段为(GGGGS)n，其中n为正整数。
本发明进一步提供了一种前述的纳米抗体或前述的双表位抗体的核苷酸分子。
本发明进一步提供了一种表达载体，其含有前述的核苷酸分子。
本发明进一步提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞，其含有如前所述的表达载体；
优选地，所述宿主细胞为细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本发明进一步提供了如前所述的纳米抗体或前述的双表位抗体在制备治疗IL-6介导的疾病或病症的药物组合物的用途；或者，制备IL-6Rα蛋白检测试剂或试剂盒中的用途。
本发明进一步提供了一种药物组合物，其包括如前所述的纳米抗体或前述的双表位抗体，还包括任意一种以上药学上可接受的辅料。
本发明进一步提供了一种IL-6Rα蛋白检测试剂或试剂盒，其包括前述的纳米抗体或前述的双表位抗体。
本发明具有以下有益效果：
本发明中的纳米抗体能够高亲和力的结合IL-6Rα蛋白，其亲和力KD值可达6.33×10-9M；并且该纳米抗体能够不仅能够结合人源IL-6Rα，还可以结合鼠源IL-6Rα蛋白，具有跨物种活性。
该纳米抗体与IL-6Rα蛋白结合为IL-6介导的疾病或病症研究提供了更为广泛的治疗策略，也为肿瘤和自身免疫性疾病治疗开拓了新的治疗靶标。
附图说明
图1为实施例5中ELISA鉴定纳米抗体-Fc与抗原结合的结果图；
图2为实施例6中SPR鉴定不同浓度梯度的纳米抗体(2S3-3D)与抗原h-IL-6Rα的结合动力学结果图；
图3为实施例7中通过ELISA手段检测经纳米抗体(2S3-3D)处理后其细胞上清中的IL-1β水平结果图；
图4为实施例8中通过FACS手段检测经纳米抗体(2S3-3D)处理后MDSC细胞的染色结果；
图5为实施例8中通过FACS手段检测经纳米抗体(2S3-3D)处理后MDSC细胞占比情况；
图6为实施例9中通过HE染色、ALT检测来评价纳米抗体在肝炎中的作用结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明第一方面公开了一种靶向IL-6Rα蛋白的纳米抗体，具体的说，本发明提供了能以高亲和力结合IL-6Rα蛋白的羊驼源重链抗体可变区序列(VHH)，该可变区序列即称为纳米抗体，其为IL-6介导的相关疾病研究提供潜在的高效抗体，并可开发成诊断试剂或诊断试剂盒等，为自身免疫性疾病治疗提供新的靶标。
本文中所述的纳米抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。本文中所述的纳米抗体不仅能够靶向人源IL-6Rα蛋白，同样也可以靶向鼠源IL-6Rα蛋白，因而具有跨物种活性。
在本发明一典型的实施例中，将其中亲和力最高的纳米抗体命名为2S3-3D，该纳米抗体具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
进一步方案，所述纳米抗体还包括lgG的Fc结构域，具体的说，纳米抗体的C端连接到lgG的Fc结构域形成重组抗体或融合蛋白；优选地，所述Fc结构域为IgG1 Fc结构域；更优选地，所述IgG1 Fc结构域为人IgG1 Fc结构域；在本发明一典型的实施例中，所述人IgG1Fc结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的。
本发明第二方面公开了一种双表位抗体，其包括第一半抗体和第二半抗体，所述第一半抗体为本发明第一方面所述的纳米抗体，所述第二半抗体没有特别的限定，可根据实际需要进行选择，需要注意的是，所述第二半抗体与所述第一半抗体的表位不同。其中，第一半抗体和第二半抗体之间通过接头进行连接从而形成双表位抗体。可以理解的是，这样的接头可以为本领域中的常规肽接头(即柔性多肽链)，其连接片段为(GGGGS)n，其中n为正整数，具体可根据实际需要进行选择，优选地，n为2、3、4、5等。
本发明第三方面提供了一种编码本发明第一方面所述的纳米抗体或本发明第二方面所述的双表位抗体的核苷酸分子。可以理解的是，该核苷酸分子的制备可以采用本领域中常规的制备方法，比如PCR方法或者人工序列合成等，这里不再具体阐述。
本发明第四方面提供了一种表达载体，其含有如本发明第三方面所述的核苷酸分子。所述的表达载体是指含有适当的调控序列(如启动子序列、终止子序列、标记基因和/或序列等)的表达载体，可以采用本领域中常规的载体种类，如病毒或质粒，这里不再具体阐述，优选的，所述的表达载体为质粒。
本发明第五方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述的表达载体，本文中所述的宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞，只要能够使得上述表达载体稳定地进行复制，且所携带的核苷酸可被有效表达即可。优选地，所述宿主细胞为细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本发明第六方面提供了如本发明第一方面所述的纳米抗体或第二方面所述的双表位抗体在制备治疗IL-6介导的疾病或病症的药物组合物的用途；或者，制备IL-6Rα蛋白检测试剂或试剂盒中的用途。举例来说，所述的药物组合物可以是炎性因子IL-1β抑制剂、鼠源性MDSC分化抑制剂或T细胞介导的肝炎治疗药物。
本发明第七方面提供了一种药物组合物，其包括如本发明第一方面所述的纳米抗体或第二方面所述的双表位抗体，还包括任意一种以上药学上可接受的辅料。可以理解的是，该药物组合物中纳米抗体或双表位抗体以治疗有效量为基准，具体的说，这里的有效量指的是包含足以预防或治疗医学病症的症状或疾病的量。在用于特定患者或医学受试者以后，可以产生以下变化：治疗的病症、患者/受试者的总体健康情况得到改善。有效量还可以是至避免显著副作用或毒性作用的最大剂量以下的剂量方案。所述的药学上可接受的辅料包括载体、赋形剂、稀释剂等，具体的种类可根据药物组合物的制剂种类进行调整，故这里不再具体阐述。
本发明第八方面提供了一种IL-6Rα蛋白检测试剂或试剂盒，其包括本发明第一方面所述的纳米抗体或第二方面所述的双表位抗体。具体的检测试剂或试剂盒的设计可根据具体需要进行调整，但可以理解的是，该检测试剂或试剂盒中至少包括本发明中的纳米抗体或双表位抗体，从而其能够与IL-6Rα蛋白进行特异性结合，对待测样中的IL-6Rα蛋白进行分析，以获取IL-6介导的疾病或病症的相关信息，为IL-6相关疾病研究提供更为广泛的治疗策略，也为肿瘤和自身免疫性疾病治疗开拓了新的治疗靶标。
下面通过具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，下面的具体实施例仅仅是用于说明的目的，而不以任何方式限制本发明的范围，另外，如无特别说明，未具体记载条件或者步骤的方法均为常规方法，所采用的试剂和材料均可从商业途径获得。
本文中采用体外重组表达的人源IL-6Rα蛋白对羊驼进行免疫，然后分离出外周血淋巴细胞并抽提细胞的总RNA，随后反转录为cDNA；再以此cDNA为模板，用特异引物扩增出纳米抗体序列并构建噬菌体展示文库；随后采用人源IL-6Rα对文库进行筛选，从而获得多个具备特异性结合IL-6Rα的纳米抗体，并从中筛选出亲和力较高的纳米抗体。
实施例1免疫原h-IL-6Rα(人源IL-6Rα)的制备
本实施例中免疫原h-IL-6Rα的制备采用现有技术，其详细的制备步骤参照申请号202111337977.9的中国专利申请，获得可溶性人源IL-6Rα蛋白。
实施例2羊驼免疫
取实施例1中制备得到的纯度高的可溶性人源IL-6Rα蛋白作为抗原，取此抗原0.2mg与500μL完全弗氏佐剂的乳化混合物对1头2-4周龄羊驼进行初次静脉注射；随后间隔三周用此蛋白与500μL不完全弗氏佐剂加强免疫3次。
实施例3噬菌体展示文库构建与筛选
采用静脉取血的方式收集20mL羊驼外周血，利用淋巴细胞分离液Ficol 1.077分离得到PBMC，并通过Trizol操作手册提取RNA，利用Oligo(dT)反转成cDNA，通过引物扩增以及分子克隆技术将羊驼的VHH基因克隆至pR2噬菌粒，转化TG1可得到VHH噬菌体文库。
在辅助噬菌体的帮助下，进行噬菌体展示筛选，将包被免疫原h-IL-6Rα进行两轮生物淘洗。将富集的噬菌体洗脱、转化、涂板、挑取单克隆进行噬菌体与蛋白h-IL-6Rα结合的ELISA实验，将结合读值>1的克隆送去测序，并克隆至表达载体pTT5，转染293F细胞表达纳米抗体。经两轮生物淘洗得到的纳米抗体氨基酸序列如SEQ ID NO.1-4所示。
实施例4抗h-IL-6Rα纳米抗体的制备
利用分子克隆技术将纳米抗体的VHH基因克隆至表达载体pTT5，转染293F细胞表达纳米抗体。其具体制备方式参照申请号为202111337977.9的中国专利申请。
实施例5ELISA鉴定抗原抗体的结合
将抗原h-IL-6Rα包被免疫板，进行封闭、孵育一抗、孵育二抗等操作，最终经TMB显色、浓硫酸终止显色后用酶标仪检测OD450值，从而判断抗原是否与抗体结合。
检测抗体与鼠源抗原m-IL-6Rα的方式与上述操作相同。
测试结果如图1所示的，其中，图1A为携带Fc的纳米抗体结合人源抗原h-IL-6Rα的ELISA、EC50结果图；图1B为携带Fc的纳米抗体结合鼠源抗原m-IL-6Rα的ELISA、EC50结果图；图1C为对上述结果的柱状示意图。可以看出，不论人源抗原或者鼠源抗原，都能够很好地与纳米抗体结合，其中以2S3-3D-Fc结合能力最好，说明本文中得到的纳米抗体具有跨物种活性。
实施例6SPR鉴定抗原抗体的结合
通过Biocare分子生物相互作用平台进行检测抗原抗体的结合动力学实验，将抗原h-IL-6Rα固定在CM5芯片(美国Cytiva)上，设置空白通道为阴性对照，再结合不同浓度梯度(250nM、125nM、62.5nM、31.2nM、15.6nM)的纳米抗体(2S3-3D)，设置结合时间180s/解离时间200s，观察抗原抗体的结合解离情况，并用相应分析软件分析数据。
结果如图2所示，发现纳米抗体2S3-3D都可以与抗原结合，且亲和力达到纳摩尔级别。由此可见，该纳米抗体与抗原具有高亲和力，可用于IL-6Rα的检测。
实施例7纳米抗体阻断炎性因子的分泌
将THP-1细胞(人白血病单核细胞系，TIB-202，美国ATCC公司)用PMA(佛波酯)诱导成巨噬细胞，紧接着加入1μg/mL LPS和100μg/mL抗体(2S3-3D)同时对此巨噬细胞进行刺激，然后使用ELISA试剂盒说明书检测细胞上清中IL-1β的水平来评价抗体的作用。
结果如图3所示，可以看出该纳米抗体可以抑制炎性因子分泌。
实施例8纳米抗体阻止MDSC分化
髓系前体细胞在体外发育分化为MDSC细胞需要必不可少的两种细胞因子GM-CSF和IL-6，由于本文中的抗体具有跨物种活性，因此本实施例在体外构建MDSC的分化模型中，通过添加抗h-IL-6Rα的纳米抗体来确定此纳米抗体是否通过抑制其分化所必须的IL-6信号转导通路，从而证实其生物学效果，具体步骤如下：
利用GM-CSF(40ng/mL，315-03-20，Peprotech)、IL-6(40ng/mL，575702，Biolegend)诱导新鲜分离的小鼠骨髓细胞顺利分化成MDSC细胞，并在体系加入IL-6刺激的同时加入100μg/mL纳米抗体(2S3-3D)孵育4天对细胞进行处理，主要将细胞与相应流式抗体进行孵育30min，并通过洗涤来去除未结合的流式抗体，最终用200μL PBS缓冲液重悬，通过BD公司的流式细胞仪来分析细胞比例情况，观察是否对鼠源MDSC的分化产生影响。
结果如图4和图5所示的，可以看到细胞染色情况，发现经纳米抗体处理后MDSC的细胞比例显著降低，说明该纳米抗体可以阻止MDSC的分化进程。
实施例9纳米抗体在肝炎中作用
为进一步研究纳米抗体的生物学功能，本实施例中运用小鼠中ConA诱导的肝炎模型进行验证。刀豆蛋白(Concanavalin A，ConA)尾静脉注射会促使小鼠在12-24小时内产生爆发性肝炎。这一自身免疫性肝炎模型是NKT细胞介导的，同时伴随着大量炎性细胞因子的产生，包括IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-12等等。值得特别指出的是，IL-6在这一模型中并不诱发肝脏损伤，反而起到很好的保护作用。前期实验运用IL-6或者IL-6R缺陷鼠均证实了这一现象(H Mizuhara et al.J Exp Med 1994；Christian Klein，et al.JCI 2005；WeiciZhang,et al.Hepatology2010)，IL-6-/-小鼠较WT小鼠显示较低的ALT和AST水平，其主要机理在于IL-6通过gp130-STAT3信号转导通路可以刺激肝脏细胞迅速再生，从而保护肝脏细胞。
为探究抗h-IL-6Rα的纳米抗体是否能通过结合IL-6Rα而抑制IL-6信号转导通路，本实施例中在上述肝炎模型中给C57BL/6小鼠腹腔注射500μg/只的纳米抗体(2S3-3D)，6小时后尾静脉注射低剂量Con A，12小时后处死小鼠并获取小鼠血清，使用ELISA方法检测血清中ALT的水平。
结果如图6中所示的，其图6A为Con A组(只进行尾静脉注射Con A)、2S3-3D+Con A组(先腹腔注射2S3-3D再间隔12h尾静脉注射Con A)小鼠肝脏组织经HE染色后的结果图，比例尺50μm，放大倍数200倍；图6B为通过ALT试剂盒检测Con A组、2S3-3D+Con A组血清中ALT水平结果图。结果发现WT小鼠存在较级的肝脏损伤，而纳米抗体处理后的小鼠其血清ALT水平显著上升，这说明本发明中的纳米抗体2S3-3D在此肝炎模型中具有抑制IL-6信号通路的功能。
通过上述实施例证实了本发明中的抗可溶性人源IL-6Rα纳米抗体具有与抗原结合的能力，并且具有生物学功能，比如可以阻止炎性因子分泌、阻止MDSC分化等表现，因此可以应用于抗炎剂和MDSC抑制剂开发；同时该纳米抗体与IL-6Rα具有高亲和力，可应用于IL-6Rα检测试剂或试剂盒的开发，为IL-6介导的相关疾病治疗提供可行的策略。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种靶向IL-6Rα蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
优选地，所述IL-6Rα蛋白为人源IL-6Rα蛋白或鼠源IL-6Rα蛋白。
2.如权利要求1所述的靶向IL-6Rα蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的靶向IL-6Rα蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括lgG的Fc结构域；
优选地，所述Fc结构域为IgG1 Fc结构域；
优选地，所述IgG1 Fc结构域为人IgG1 Fc结构域；
优选地，所述人IgG1 Fc结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的。
4.一种双表位抗体，其包括第一半抗体和第二半抗体，其特征在于，所述第一半抗体为权利要求1-3任一项所述的纳米抗体，所述第二半抗体与所述第一半抗体的表位不同；
优选地，所述第一半抗体和第二半抗体之间通过肽接头连接；
优选地，所述肽接头的连接片段为(GGGGS)n，其中n为正整数。
5.一种编码权利要求1-3任一项所述的纳米抗体或权利要求4所述的双表位抗体的核苷酸分子。
6.一种表达载体，其特征在于，其含有如权利要求5所述的核苷酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞，其含有如权利要求6所述的表达载体；
优选地，所述宿主细胞为细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
8.如权利要求1-3任一项所述的纳米抗体或权利要求4所述的双表位抗体在制备治疗IL-6介导的疾病或病症的药物组合物的用途；或者，制备IL-6Rα蛋白检测试剂或试剂盒中的用途。
9.一种药物组合物，其特征在于，其包括如权利要求1-3任一项所述的纳米抗体或权利要求4所述的双表位抗体，还包括任意一种以上药学上可接受的辅料。
10.一种IL-6Rα蛋白检测试剂或试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-3任一项所述的纳米抗体或权利要求4所述的双表位抗体。
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