TW202219066A - 一種ｔｓｌｐ抗原結合蛋白及其應用 - Google Patents

一種ｔｓｌｐ抗原結合蛋白及其應用 Download PDF

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鄧俗俊
曹曉丹
劉小五
顧春銀
張建建
劉培培
潘忠宗
王學萍
郭海兵
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Abstract

本申請係關於一種分離的抗原結合蛋白，其可以高特異性地結合人胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)或食蟹猴TSLP；阻斷TSLP胸腺基質淋巴細胞生成素受體(TSLPR)結合；抑制TSLP誘導PBMC釋放T細胞受體α恆定區(TRAC)；以及抑制TSLP誘導表達TSLPR-IL7Rα複合物的細胞的增殖。本申請還提供了所述分離的抗原結合蛋白相關的製備方法和應用。

Description

一種TSLP抗原結合蛋白及其應用
本申請係關於生物醫藥領域，尤係關於一種TSLP抗原結合蛋白及其應用。
哮喘是世界範圍內人類最常見的慢性疾病之一，全球的患者數量約為3.34億人。其中重症哮喘是當前哮喘治療中的難題，近年來有精准靶向治療哮喘的趨勢。
胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)是新近被發現的一種具有IL-7樣功能的細胞因子，TSLP主要由上皮細胞表達，特別是在經抗原啟動的支氣管上皮細胞和活化的肥大細胞。多種細胞因子參與調解TSLP的表達，例如IL-25、IL-33兩種上皮細胞起源的細胞因子，能夠誘導氣道上皮細胞產生TSLP。
多項研究顯示TSLP與哮喘的關係十分密切。TSLP在哮喘的啟動與持續，以及特應性免疫應答中起著重要的作用。例如，在哮喘病人的肺上皮細胞及黏膜下層組織中可以觀察到大量的高表達TSLP-mRNA的細胞，同時肺泡灌洗液(BAL)中可見有較高濃度的TSLP蛋白表達。 可見目前大部分研究都提示TSLP與哮喘氣道炎症及病情嚴重程度密切相關。
由此可見，開發TSLP抗體具有重要的臨床意義。
本申請提供了一種TSLP抗原結合蛋白及其應用。該TSLP抗原結合蛋白可以具有下述性質中的至少一種：高特異性地結合人胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)和/或食蟹猴TSLP；有效地阻斷TSLP胸腺基質淋巴細胞生成素受體(TSLPR)結合；有效地抑制TSLP誘導PBMC釋放T細胞受體α恆定區(TRAC)；有效地抑制TSLP誘導表達TSLPR-IL7Rα複合物的細胞的增殖。本申請還提供了編碼該抗原結合蛋白的核酸、載體、細胞或包含其的藥物組成物，還提供了該抗原結合蛋白相關的製備方法，以及在製備藥物中的應用。
本申請提供了一種分離的抗原結合蛋白，其具有下述性質中的一種或多種：a)在Octet測定中，以約1.0*10-12M以下的K D 值特異性結合人胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)；b)在Octet測定中，以約4.0*10-10M以下的K D 值特異性結合食蟹猴胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)；c)在Biacore測定中，以約3.5*10-11M以下的K D 值特異性結合人胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)；d)在Biacore測定中，以約6.0*10-10M以下的K D 值特異性結合食蟹猴胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)；e)阻斷人胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)和人胸腺基質淋巴細胞生成素受體(TSLPR)結合；f)抑制TSLP誘導PBMC釋放T細胞受體α恆定區 (TRAC)；以及g)抑制TSLP誘導表達TSLPR-IL7Rα複合物的細胞的增殖；
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，該VL包含SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列。在某些實施方式中，該VL包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH包含SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列。在某些實施方式中，該VH包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：54中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體或其抗原結合片段。
在某些實施方式中，該抗原結合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在某些實施方式中，該抗體為人源化抗體。
在某些實施方式中，該VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中該LCDR1包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該LCDR1包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：50中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該LCDR2包含SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該LCDR2包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：51中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該LCDR3包含SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該LCDR3包含SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：46中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該HCDR1包含SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：47中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該HCDR2包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該HCDR2包含SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：48中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該HCDR3包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該HCDR3包含SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：49中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VL包括框架區L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。
在某些實施方式中，該L-FR1的C末端與該LCDR1的N末端直接或間接相連，且該L-FR1包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該L-FR1包含SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：34中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該L-FR2位於該LCDR1與該LCDR2之間，且該L-FR2包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該L-FR2包含SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：35中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該L-FR3位於該LCDR2與該LCDR3之間，且該L-FR3包含SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該L-FR3包含SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：36中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該L-FR4的N末端與該LCDR3的C末端直接或間接相連，且該L-FR4包含SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該L-FR4包含SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：37中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VL包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體輕鏈恆定區，且該抗體輕鏈恆定區包括人Igκ恆定區或人Igλ恆定區。
在某些實施方式中，該VH包括框架區H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。
在某些實施方式中，該H-FR1的C末端與該HCDR1的N末端直接或間接相連，且該H-FR1包含SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該H-FR1包含SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：39中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該H-FR2位於該HCDR1與該HCDR2之間，且該H-FR2包含SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該H-FR2包含SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：40中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該H-FR3位於該HCDR2與該HCDR3之間，且該H-FR3包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該H-FR3包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該H-FR4的N末端與該HCDR3的C末端直接或間接相連，且該H-FR4包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該H-FR4包含SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：43中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VH包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：54中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體重鏈恆定區，且該抗體重鏈恆定區包括人IgG恆定區，或包括IgY恆定區。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體重鏈恆定區，且該抗體重鏈恆定區包括人IgG4恆定區。
另一方面，本申請提供一種分離的一種或多種核酸分子，其編碼該分離的抗原結合蛋白。
另一方面，本申請提供一種載體，其包含該核酸分子。
另一方面，本申請提供一種細胞，其包含該核酸分子或該載體。
另一方面，本申請提供一種製備該分離的抗原結合蛋白的方法，所述方法包括在使得該分離的抗原結合蛋白表達的條件下，培養該細胞。
另一方面，本申請提供一種藥物組成物，其包含該分離的抗原結合蛋白該核酸分子、該載體和/或該細胞，以及視需要地藥學上可接受的佐劑。
另一方面，本申請提供一種該分離的抗原結合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該藥物組成物在製備藥物中的用途，所述藥物用於預防、緩解和/或治療免疫系統相關疾病或腫瘤，其中所述免疫系統相關疾病包括自身免疫疾病或炎性疾病。
在某些實施方式中，所述免疫系統相關疾病包括哮喘。
在某些實施方式中，所述腫瘤包括實體瘤和非實體瘤。
另一方面，本申請提供一種檢測樣品中胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)的存在和/或含量的方法，其包括以下的步驟：施用該分離的抗原結合蛋白。
另一方面，本申請提供一種抑制胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)與TSLP受體結合的方法，其包括以下的步驟：施用該分離的抗原結合蛋白。
所屬技術領域具有通常知識者能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本申請的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本申請的示例性實施方式。如所屬技術領域具有通常知識者將認識到的，本申請的內容使得所屬技術領域具有通常知識者能夠對所公開的實施方式進行改動而不脫離本申請所涉及發明的精神和範圍。相應地，本申請的附圖和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
本申請所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和附圖能夠更好地理解本申請所涉及發明的特點和優勢。對附圖簡要說明書如下：
圖1顯示的是該融合瘤單株抗體結合人TSLP-His-FLAG ELISA結果；
圖2顯示的是該融合瘤單株抗體阻斷TSLP-His-FLAG結合功能結果；
圖3顯示的是該人源化抗體展示Fab的結合曲線；
圖4顯示的是該抗原結合蛋白阻斷人TSLP ELISA結果；
圖5顯示的是該抗原結合蛋白抑制rhTSLP誘導人PBMC釋放TARC結果；
圖6顯示的是該抗原結合蛋白抑制rhTSLP誘導BAF3-TSLPR/IL-7R增殖實驗結果；
圖7顯示的是該抗原結合蛋白在人源化FcRn小鼠模型中藥物代謝動力學(PK)研究曲線；
圖8顯示的是該抗原結合蛋白對食蟹猴哮喘模型氣道阻力的影響；
圖9顯示的是該抗原結合蛋白對食蟹猴哮喘模型動態肺順應性的影響。
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。
術語定義
在本申請中，術語“TSLP”通常是指胸腺基質淋巴細胞生成素，Thymic stromal lymphopoietin，其也可被稱為IL-7樣細胞因子，是IL-2細胞因子家族中的一員。TSLP可以在經抗原啟動的支氣管上皮細胞和活化的肥大細胞中表達。細胞因子(例如IL-25或IL-33)可以誘導起到上皮細胞產生TSLP；IL-1β、TNF-α可以誘導氣道平滑肌細胞釋放TSLP。TSLP在哮喘的啟動與持續，以及特應性免疫應答中起著重要的作用。此外，TSLP在增進纖維化病症中也存在作用。
在本申請中，術語“TSLPR”通常是指胸腺基質淋巴細胞生成素受體。該TSLPR可以與TSLP結合。該TSLPR屬於造血細胞因數受體家族，能夠藉由與TSLP的相互作用介導TSLP的活性。人TSLPR基因的Gene ID為64109。
在本申請中，術語“抗原結合蛋白”通常是指包含結合抗原的部分的蛋白質，以及視需要地允許結合抗原的部分採用促進抗原結合蛋白與抗原結合的構象的支架或骨架部分。抗原結合蛋白的實例包括但不限於抗體、抗原結合片段(Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb)、免疫綴合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物或融合蛋白等，只要它們顯示出所需的抗原結合活性即可。
在本申請中，術語“Fab”通常是指含有重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域的片段，並且還含有輕鏈的恆定結構域和重鏈的第一恆定結構域(CH1)；術語“Fab'''通常是指在重鏈CH1結構域的羧基端添加少量殘基(包括一個或多個來自抗體鉸鏈區的半胱胺酸)而不同於Fab的片段；術語“F(ab')2”通常是指Fab’的二聚體，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的抗體片段。術語“Fv”通常是指含有完整抗原識別與結合位點的最小抗體片段。在某些情形中，該片段可以由一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區以緊密非共價結合的二聚體組成；術語“dsFv”通常是指二硫鍵穩定的Fv片段，其單個輕鏈可變區與單個重鏈可變區之間的鍵是二硫鍵。術語“dAb片段”通常是指由VH結構域組成的抗體片段。在本申請中，術語“scFv”通常是指抗體的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域藉由 柔性肽連接子共價連接配對形成的單價分子；此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-連接子-VH-COOH或NH2-VH-連接子-VL-COOH。
在本申請中，術語“抗體”其以最廣泛意義使用，且具體涵蓋，但不限於，單株抗體(包括包含兩條輕鏈和兩條重鏈的全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人源化抗體、完全人類抗體、嵌合抗體和駱駝化單結構域抗體。“抗體”通常可以包含藉由二硫鍵互相連接的至少兩條重鏈(HC)和兩條輕鏈(LC)的蛋白，或其抗原結合片段。每條重鏈包含重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區。在某些天然存在的IgG、IgD和IgA抗體中，重鏈恆定區包含三個結構域，CH1、CH2和CH3。在某些天然存在的抗體中，各輕鏈包含輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域，CL。VH和VL區可進一步細分為超變的區域，稱為互補決定區(CDR)，其與稱為框架區(FR)的較保守的區域交替。各VH和VL包含三個CDR和四個框架區(FR)，從胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區(H-FR1，H-FR2，H-FR3，H-FR4，L-FR1，L-FR2，L-FR3，L-FR4)，大部分採用β-折疊構型，藉由三個CDRs連接，形成環連接，並且在一些情況下形成β-折疊結構的一部分。每條鏈中的CDRs藉由FR區緊密靠近在一起，並與來自另一條鏈的CDR一起形成抗體的抗原結合位點。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(C1q)結合。
在本申請中，術語“可變”通常是指這樣的事實，即抗體的可變結構域的序列的某些部分變化強烈，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，變異性並非均勻地分佈在抗體的整個可變區中。它集中在輕鏈和重鏈可變區中的三個區段，被稱為互補決定區(CDR)或高變區(HVR)。可變域中更高度保守的部分被稱為框架(FR)。在本領域中，可以藉由多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州(1991))、基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見，A1-Lazikani等人，JMol Biol 273：927-48,1997)和基於IMGT本體論(IMGT-ONTOLOGY)的概念和IMGT Scientific圖表規則的KABAT定義規則。IMGT指國際ImMunoGeneTics資訊系統，一種免疫遺傳學和免疫資訊學的全球參考資料庫(http：//www.imgt.org)。IMGT專門研究來自人類和其他脊椎動物的免疫球蛋白(IG)或抗體、T細胞受體(TR)、主要組織相容性(MH)，以及來自脊椎動物和非脊椎動物的免疫球蛋白超家族(IgSF)、MH超家族(MhSF)和免疫系統相關蛋白。
在本申請中，術語“單株抗體”通常是指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即集群中的個別抗體是相同的，除了可能存在的少量的自然突變。單株抗體通常針對單個抗原位點具有高度特異性。而且，與常規多株抗體製劑(通常具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性之外，單株抗體的優點在於它們可以藉由融合瘤培養合成，不受其他免疫球蛋白污染。修飾語“單株”表示從基本上同質的抗體群體獲得的抗體的特徵，並且不被解釋為需要 藉由任何特定方法產生抗體。例如，本申請使用的單株抗體可以在融合瘤細胞中製備，或者可以藉由重組DNA方法製備。
在本申請中，術語“嵌合抗體”通常是指其中可變區源自一個物種，而恆定區源自另一個物種的抗體。通常，可變區源自實驗動物諸如齧齒動物的抗體(“親本抗體”)，且恆定區源自人類抗體，使得所得嵌合抗體與親本(例如小鼠來源)抗體相比，在人類個體中引發不良免疫反應的可能性降低。
在本申請中，術語“人源化抗體”通常是指非人抗體(例如小鼠抗體)的CDR區以外的部分或全部有的胺基酸被源自人免疫球蛋白的相應的胺基酸置換的抗體。在CDR區中，胺基酸的小的添加、缺失、插入、置換或修飾也可以是允許的，只要它們仍保留抗體結合特定抗原的能力。人源化抗體可視需要地包含人類免疫球蛋白恆定區的至少一部分。“人源化抗體”保留類似於原始抗體的抗原特異性。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在某些情形中，可以將人免疫球蛋白(受體抗體)中的CDR區殘基用具有所期望性質、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)(諸如小鼠，大鼠，家兔或非人靈長類動物)的CDR區殘基替換。在某些情形中，可以將人免疫球蛋白的FR區殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有的胺基酸修飾。進行這些修飾可以是為了進一步改進抗體的性能，諸如結合親和力。
在本申請中，術語“全人源抗體”通常是指將人類編碼抗體的基因轉移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達的抗體。抗體所有部分(包括抗體的可變區和恆定區)均由人類來源的基因所編碼。
在本申請中，術語“結合”、“特異性結合”或“對...特異性的”通常是指可測量且可再現的相互作用，諸如抗原和抗體之間的結合，其可以確定在存在分子(包括生物學分子)的異質群體的情況中靶物的存在。例如，抗體藉由其抗原結合域與表位結合，並且該結合需要抗原結合域和表位之間的一些互補性。例如，特異性結合靶物(其可以是表位)的抗體是以比其結合其它靶物更大的親和力、親合力、更容易和/或以更大的持續時間結合此靶物的抗體。當抗體相比於其將結合隨機的、不相關的表位而言更容易藉由其抗原結合域與表位結合時，抗體被稱為“特異性結合”該抗原。
在本申請中，術語“KD”、“K D ”可互換地使用，通常是指平衡解離常數，“KD”是解離速率常數(kdis，也稱為“解離率(off-rate)(koff)”或“kd”)與結合速率常數(kon，也稱為“結合率(kon)”或“ka”)的比值。可使用結合速率常數(kon)、解離速率常數(kdis)和平衡解離常數(K D )表示抗原結合蛋白(例如抗體)對抗原的結合親和力。確定結合和解離速率常數的方法為本領域熟知，包括但不限於生物膜干涉技術(BLI)、放射免疫法(RIA)、平衡透析法、表面電漿共振(SPR)、螢光共振能量遷移(FRET)、免疫共沉澱(Co-IP)以及蛋白質晶片技術。如果在不同的條件(例如鹽濃度、pH)下測量，則所測得的某種特定蛋白-蛋白相互作用的親和力可不同。
在本申請中，術語“在......之間”通常是指某種胺基酸片段的C端與第一胺基酸片段的N端直接或間接連接，並且其N端與第二胺基酸片段的C端直接或間接連接。在輕鏈中，例如，該L-FR2的N末端與該LCDR1的C末端直接或間接相連，且該L-FR2的C末端與該LCDR2的N末端直接或間接相連。又例如，該L-FR3的N末端與該LCDR2的C末端直接或間接相連，且該L-FR3的C末端與該LCDR3的N末端直接或間接相連。在重鏈中，例如，該H-FR2的N末端與該HCDR1的C末端直接或間接相連，且該H-FR2的C末端與該HCDR2的N末端直接或間接相連。又例如，該H-FR3的N末端與該HCDR2的C末端直接或間接相連，且該H-FR3的C末端與該HCDR3的N末端直接或間接相連。
在本申請中，術語“分離的”抗原結合蛋白通常是指已經從其產生環境(例如，天然的或重組的)的組分中識別，分離和/或回收的抗原結合蛋白。其產生環境的污染組分通常是干擾其研究、診斷或治療用途的物質，可以包括酶、激素和其他蛋白質或非蛋白質溶質。分離的抗原結合蛋白或抗體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。
在本申請中，術語“分離的核酸分子”或“分離的多核苷酸”通產是指基因組、mRNA、cDNA或合成來源的DNA或RNA或其一定組合，其不與在自然界中發現的多核苷酸的全部或一部分締合，或連接至其在自然界中不連接的多核苷酸。
在本申請中，術語“載體”通常是指能夠在合適的宿主中自我複製的核酸分子，其將插入的核酸分子轉移到宿主細胞中和/或宿主細胞之間。該載體可包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中的載體、主要用於 複製DNA或RNA的載體，以及主要用於DNA或RNA的轉錄和/或翻譯的表達的載體。該載體還包括具有多種上述功能的載體。該載體可以是當引入合適的宿主細胞時能夠轉錄並翻譯成多肽的多核苷酸。通常，藉由培養包含該載體的合適的宿主細胞，該載體可以產生期望的表達產物。
在本申請中，術語“細胞”通常是指可以或已經含有包括該核酸分子的質粒或載體，或者能夠表達該抗體或其抗原結合片段的個體細胞、細胞系或細胞培養物。該細胞可以包括單個宿主細胞的子代。由於天然的、意外的或故意的突變，子代細胞與原始親本細胞在形態上或在基因組上可能不一定完全相同，但能夠表達該抗體或其抗原結合片段即可。該細胞可以藉由使用該載體體外轉染細胞而得到。該細胞可以是原核細胞(例如大腸桿菌)，也可以是真核細胞(例如酵母細胞，例如COS細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，HeLa細胞，HEK293細胞，COS-1細胞，NS0細胞或骨髓瘤細胞)。在某些情形中，該細胞可以是哺乳動物細胞。例如，該哺乳動物細胞可以是CHO-K1細胞。在本申請中，術語“重組細胞”通常是指在其中引入了重組表達載體的細胞。該重組宿主細胞不僅包括某種特定的細胞，還包括這些細胞的後代。
在本申請中，術語“藥學上可接受的佐劑”通常包括藥劑學可接受的載體、賦形劑或穩定劑，它們在所採用的劑量和濃度對暴露於其的細胞或哺乳動物是無毒的。通常，生理學可接受的載體是pH緩衝水溶液。生理學可接受載體的例子可包括緩衝劑，抗氧化劑，親水性聚合物，胺基酸，單糖，二糖和其它碳水化合物，螯合劑，糖醇，成鹽反荷離子和/或非離子表面活性劑。
在本申請中，術語“TRAC”通常是指T細胞受體α恆定區。TRAC基因編碼了TRAC蛋白質，其為TCR蛋白(T細胞受體)貢獻了α鏈。人TRAC蛋白質的Entrez登錄號為6955。
在本申請中，術語“免疫系統相關疾病”通常是指由免疫系統異常導致的症狀和/或疾病。
在本申請中，術語“自身免疫疾病”通常是指自身抗原免疫耐受紊亂、機體對自身抗原發生免疫反應導致機體損害的一類疾病。該自身免疫疾病(ADs)可以包括病變局限於某一特定器官的器官特異性ADs，也包括免疫反向造成的全身多器官和組織病理損傷的系統性ADs。在本申請中，該自身免疫疾病可以包括類風濕性關節炎、乾燥綜合征、重症肌無力等。
在本申請中，術語“炎性疾病”通常是指以損傷或感染部位的局部炎症為特徵的任何疾病或病症。例如，該炎性疾病可以具備在局部組織部位元產生不希望的免疫細胞積蓄的特徵。
在本申請中，術語“哮喘(asthma)”通常是指一種肺部疾病，通常表現為呼吸困難和喘息反復發作。哮喘可能具備以下特徵的一種或多種：可逆性氣道阻塞，氣道炎症和對多種刺激的氣道反應性增高。哮喘的風險與遺傳易感性和環境因素(例如室內外過敏原、煙霧、化學刺激物和/或空氣污染)等相關。目前具有持續哮喘症狀的患者必須每天使用長期藥物控制潛在的感染病防止症狀的出現和惡化。
在本申請中，術語“施用”通常是指向受試者(例如，患者)給予一定劑量的化合物(例如，抗癌治療劑)或藥物組成物(例如，包含 抗癌治療劑的藥物組成物)的方法。施用可通過任何合適的方式進行，包括腸胃外、肺內和鼻內，以及(如果局部治療需要)損傷內施用。胃腸外輸注包括例如肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。部分地根據施用是否為短暫的或長期的，給藥可藉由任何適合的途徑進行，例如藉由注射(諸如靜脈內或皮下注射)進行。本文涵蓋各種給藥過程，包括但不限於單次施用或各種時間點內的多次施用、推注施用和脈衝輸注。
在本申請中，術語“腫瘤”通常是指所有贅生性細胞生長和增殖(無論惡性還是良性)以及所有癌前和癌性細胞和組織。
在本申請中，術語“實體瘤”通常是指可以藉由臨床檢查(例如X線照射、CT掃描、B超或觸診等)手段檢測到的有形的腫瘤。
在本申請中，術語“非實體瘤”通常是指無法藉由臨床檢查(例如X線照射、CT掃描、B超或觸診等)手段檢測到的腫瘤。例如，該非實體瘤可以包括血液瘤。
在本申請中，術語“Germline序列”通常是指未重排的免疫球蛋白DNA序列的序列。
在本申請中，術語“包括”通常是指包含、總括、含有或包涵的含義。在某些情況下，也表示“為”、“由……組成”的含義。
在本申請中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。
在本申請中，該抗原結合蛋白每個重鏈或輕鏈胺基酸序列的一部分與來自特定物種的抗體中相應胺基酸序列同源，或者屬於特定的類別。例如，輕鏈和重鏈的可變區及恆定部分均來自一個動物物種(如人)的抗體的可變區及恆定區。在本申請中，該同源物可以為，與該蛋白質和/或該多肽(例如，特異性結合PD-L1蛋白的抗體或其片段)的胺基酸序列具有至少約85%(例如，具有至少約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的)序列同源性的蛋白質或多肽。在本申請中，該同源性通常是指兩個或多個序列之間的相似性、類似或關聯。可以通過以下方式計算“序列同源性百分比”：將兩條待比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同源性百分比。為了確定序列同源性百分數而進行的比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的電腦軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。所屬技術領域具有通常知識者可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何演算法。該同源性也可以藉由以下的方法測定：FASTA和BLAST。對FASTA演算法的描述可以參見W．R．Pearson和D．J．Lipman的“用於生物學序列比較的改進的工具”，美國國家科學院院刊(Proc．Natl．Acad．Sci．)， 85：2444-2448，1988；和D．J．Lipman和W．R．Pearson的“快速靈敏的蛋白質相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。對BLAST演算法的描述可參見S．Altschul、W．Gish、W．Miller、E．W．Myers和D．Lipman的“一種基本的局部對比(alignment)搜索工具”，分子生物學雜誌，215：403-410，1990。
發明詳述
一方面，本申請提供了一種分離的抗原結合蛋白，其可以具有下述性質中的一種或多種：
a)在Octet測定中，以約1.0*10-12M以下(例如，可以為約1.0*10-12M以下、約9.0*10-13M以下、約8.0*10-13M以下、約7.0*10-13M以下、約6.0*10-13M以下、約5.0*10-13M以下、約2.0*10-13M以下、約1.0*10-13M以下或更小)的K D 值特異性結合人胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)；
b)在Octet測定中，以約4.0*10-10M(例如，可以為約3.9*10-10M以下、約3.8*10-10M以下、約3.7*10-10M以下、約3.6*10-10M以下、約3.5*10-10M以下、約3.4*10-10M以下、約3.3*10-10M以下、約1*10-10M以下或更小)以下的K D 值特異性結合食蟹猴胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)；
c)在Biacore測定中，以約3.5*10-11M以下(例如，可以為約3.3*10-11M以下、約3.0*10-11M以下、約2.8*10-11M以下、約2.6*10-11M以下、約2.4*10-11M以下、約2.2*10-11M以下、約2.0*10-11M以下、約1.8*10-11M以下、約1.6*10-11M以下、約1.4*10-11M以下、約1.2* 10-11M以下、約1.0*10-11M以下或更小)的K D 值特異性結合人胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)；
d)在Biacore測定中，以約6.0*10-10M以下(例如，可以為約5.8*10-10M以下、約5.6*10-10M以下、約5.0*10-10M以下、約2.0*10-10M以下、約1.0*10-10M以下、約8.0*10-11M以下、約6.0*10-11M以下、約4.0*10-11M以下、約2.0*10-11M以下或更小)的K D 值特異性結合食蟹猴胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)；
e)阻斷人胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)和人胸腺基質淋巴細胞生成素受體(TSLPR)結合；
f)抑制TSLP誘導PBMC釋放T細胞受體α恆定區(TRAC)；以及
g)抑制TSLP誘導表達TSLPR-IL7Rα複合物的細胞的增殖。
在本申請中，該抗原結合蛋白(例如，抗體)是否結合人或食蟹猴胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)可使用本領域中已知的任何測定法確定。本領域中已知測定結合親和力的分析的實例包括表面電漿共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如，KinExa或OCTET)。
在本申請中，該抗原結合蛋白(例如，抗體)可以阻斷人胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)和人胸腺基質淋巴細胞生成素受體(TSLPR)結合；或者，可以阻斷食蟹猴TSLP和食蟹猴TSLPR結合。其中阻斷實驗可以使用競爭法進行檢測，例如，將該抗原結合蛋白與抗原(例如TSLP)和抗原的配體(或表達配體的細胞，例如，配體可以為TSLPR)結合，根據可檢測標記的強度(例如，螢光強度或濃度)反應抗原結合蛋白與抗原的配體競爭性結合抗原的能力。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可以包含輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，該VL包含SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白包含可以重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH包含SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可以包括抗體或其抗原結合片段。
例如，該抗原結合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
例如，該抗體可以為人源化抗體。
在本申請中，該VL可以包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該VL可以包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中該LCDR1可以包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列：Lys Ala Ser Gln Ile Ile X7 X8 Glu Gly X11 X12 Tyr Met Asn，其中，X7為Asp、Val或Tyr，X8為Trp或Tyr，X11為Asp或Glu，X12為Ala或Ser。
例如，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：50中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該LCDR2可以包含SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列：X1 Ala X3 X4 Leu X6 X7，其中X1為Ala或Gly；X3為Arg或Ser；X4為Asn或Tyr；X6為Ala、Asp或Glu；X7為Arg或Ser。
例如，該LCDR2可以包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：51中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該LCDR3可以包含SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列：Gln Gln Ser Asp X5 Asp Pro Trp X9。其中，X5為Glu或Met；X9為Asn或Thr。
例如，該LCDR3可以包含SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：46中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，上述CDR可以是根據Kabat定義規則確定的序列。
在本申請中，該VL可以包括框架區L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。
在本申請中，該L-FR1的C末端可以與該LCDR1的N末端直接或間接相連，且該L-FR1可以包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列：Asp Ile X3 Leu Thr Gln Ser Pro X9 X10 Leu X12 X13 Ser X15 Gly X17 Arg X19 Thr Ile X22 Cys。其中，X3為Gln或Val；X9為Ala或Ser；X10為Phe或Ser；X12為Ala或Ser；X13為Ala或Val；X15為Leu或Val；X17為Asp或Gln；X19為Ala或Val；X22為Ser或Thr。
例如，該L-FR1可以包含SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：34中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該L-FR2可以位於該LCDR1與該LCDR2之間，且該L-FR2可以包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列：Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly X8 X9 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr。其中，X8為Lys或Gln；X9為Ala或Pro。
例如，該L-FR2可以包含SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：35中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該L-FR3可以位於該LCDR2與該LCDR3之間，且該L-FR3可以包含SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列：Gly X2 Pro X4 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu X18 Ile X20 X21 X22 X23 X24 Glu Asp X27 Ala Thr Tyr Tyr Cys，其中X2為Ile或Val，X4為Ala或Ser，X18為Asp或Thr，X20為His或Ser，X21為Pro或Arg，X22為Leu或Val，X23為Glu或Gln，X24為Glu或Pro，X27為Ala或Phe。
例如，該L-FR3可以包含SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：36中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該L-FR4的N末端可以與該LCDR3的C末端直接或間接相連，且該L-FR4可以包含SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列：Phe Gly X3 Gly Thr Lys X7 Glu Ile Lys，其中X3為Gly或Gln，X7為Leu或Val。
例如，該L-FR4可以包含SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：37中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該VL可以包含SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列：Asp Ile X3 Leu Thr Gln Ser Pro X9 X10 Leu X12 X13 Ser X15 Gly X17 Arg X19 Thr Ile X22 Cys Lys Ala Ser Gln Ile Ile X30 X31 Glu Gly X34 X35 Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly X46 X47 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr X54 Ala X56 X57 Leu X59 X60 Gly X62 Pro X64 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu X78 Ile X80 X81 X82 X83 X84 Glu Asp X87 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp X97 Asp Pro Trp X101 Phe Gly X104 Gly Thr Lys X108 Glu Ile Lys，
其中X3為Gln或Val，X9為Ala或Ser，X10為Phe或Ser，X12為Ala或Ser，X13為Ala或Val，X15為Leu或Val，X17為Asp或Gln，X19為Ala或Val，X22為Ser或Thr，X30為Asp、Val或Tyr，X31為Trp或Tyr，X34為Asp或Glu，X35為Ala或Ser，X46為Lys或Gln，X47為Ala或Pro，X54為Ala或Gly，X56為Arg或Ser，X57為Asn或Tyr，X59為Ala、Asp或Glu，X60為Arg或Ser，X62為Ile或Val，X64為Ala或Ser，X78為Asp或Thr，X80為His或Ser，X81為Pro或Arg，X82為Leu或Val，X83為Glu或Gln，X84為Glu或Pro，X87為Ala或Phe，X97為Glu或Met，X101為Asn或Thr，X104為Gly或Gln，X108為Leu或Val。
例如，該VL可以包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，例如，該分離的抗原結合蛋白可以包括抗體輕鏈恆定區，且該抗體輕鏈恆定區可以包括人Igκ恆定區或人Igλ恆定區。
在本申請中，例如，該VH可以包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列：Gly X2 Ser Leu Ser Thr Pro Gly X9，其中X2為Ala或Phe，X9為Leu或Met。
例如，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：47中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，例如，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列：Tyr Trp Asp X4 X5，其中X4為Asp或Thr，X5為Asp或Gly。
例如，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：48中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，例如，該HCDR3可以包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列：Arg Gly Trp Tyr X5 X6 X7 X8，其中X5為Phe或Tyr，X6為Phe或Tyr，X7為Asp或Ser，X8為His或Tyr。
例如，該HCDR3可以包含SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：49中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，例如，該VH可以包括框架區H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。
在本申請中，該H-FR1的C末端可以與該HCDR1的N末端直接或間接相連，且該H-FR1可以包含SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列：Gln Val X3 Leu X5 X6 X7 Gly X9 Gly X11 X12 Gln Pro X15 X16 X17 Leu X19 Leu X21 Cys X23 Phe Ser，其中，X3為Gln或Thr，X5為Lys或Val，X6為Glu或Gly，X7為Ala或Ser，X9為Gly或Pro，X11為Ile或Val，X12為Leu或Val，X15為Gly或Ser，X16為Gln或Arg，X17為Ser或Thr，X19為Arg或Ser，X21為Ser或Thr，X23為Ala或Ser。
例如，該H-FR1可以包含SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：39中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，例如，該H-FR2可以位於該HCDR1與該HCDR2之間，且該H-FR2可以包含SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列：Gly Val Ser Trp X5 Arg Gln X8 X9 Gly Lys Gly Leu Glu Trp X16 Ala His Ile，其中X5為Ile或Val，X8為Ala或Pro，X9為Pro或Ser，X16為Leu或Val。
例如，該H-FR2可以包含SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：40中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該H-FR3可以位於該HCDR2與該HCDR3之間，且該H-FR3可以包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列：X1 His Tyr X4 X5 Ser X7 Lys X9 Arg X11 Thr X13 Ser Lys Asp Ser Ser X19 Asn X21 Val X23 Leu X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 Asp Thr Ala X36 Tyr Tyr Cys Ala Arg，其中X1為Met或Arg，X4為Ala或Asn，X5為Asp或Pro，X7為Ala或Leu，X9為Gly或Ser，X11為Phe或Leu，X13為Ile或Leu，X19為Ser或Thr，X21為Gln或Thr，X23為Phe或Leu，X25為Lys或Gln，X26為Ile或Met，X27為Asn或Thr，X28為Asn或Ser，X29為Leu或Val，X30為Asp或Arg，X31為Ala或Thr，X32為Glu或Thr，X36為Thr或Val。
例如，該H-FR3可以包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該H-FR4的N末端可以與該HCDR3的C末端直接或間接相連，且該H-FR4可以包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸 序列：Trp Gly X3 Gly Thr X6 X7 Thr Val Ser Ser，其中X3為Gln或Arg，X6為Leu或Thr，X7為Leu或Val。
例如，該H-FR4可以包含SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：43中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該VH可以包含SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列：Gln Val X3 Leu X5 X6 X7 Gly X9 Gly X11 X12 Gln Pro X15 X16 X17 Leu X19 Leu X21 Cys X23 Phe Ser Gly X27 Ser Leu Ser Thr Pro Gly X34 Gly Val Ser Trp X39 Arg Gln X42 X43 Gly Lys Gly Leu Glu Trp X50 Ala His Ile Tyr Trp Asp X57 X58 X59 His Tyr X62 X63 Ser X65 Lys X67 Arg X69 Thr X71 Ser Lys Asp Ser Ser X77 Asn X79 Val X81 Leu X83 X84 X85 X86 X87 X88 X89 X90 Asp Thr Ala X94 Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Trp Tyr X104 X105 X106 X107 Trp Gly X110 Gly Thr X113 X114 Thr Val Ser Ser，
其中X3為Gln或Thr，X5為Lys或Val，X6為Glu或Gly，X7為Ala或Ser，X9為Gly或Pro，X11為Ile或Val，X12為Leu或Val，X15為Gly或Ser，X16為Gln或Arg，X17為Ser或Thr，X19為Arg或Ser，X21為Ser或Thr，X23為Ala或Ser，X27為Ala或Phe，X34為Leu或Met，X39為Ile或Val，X42為Ala或Pro，X43為Pro或Ser，X50為Leu或Val，X57為Asp或Thr，X58為Asp或Gly，X59為Met或Arg，X62為Ala或Asn，X63為Asp或Pro，X65為Ala或Leu，X67為Gly或Ser，X69為Phe或Leu，X71為Ile或Leu，X77為Ser或Thr，X79為Gln或Thr，X81為Phe或Leu，X83為Lys或Gln，X84為Ile或Met，X85為Asn或Thr，X86為Asn或Ser，X87為Leu或Val，X88為Asp或Arg，X89為Ala 或Thr，X90為Glu或Thr，X94為Thr或Val，X104為Phe或Tyr，X105為Phe或Tyr，X106為Asp或Ser，X107為His或Tyr，X110為Gln或Arg，X113為Leu或Thr，X114為Leu或Val。
例如，該VH可以包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：54中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，例如，該分離的抗原結合蛋白可以包括抗體重鏈恆定區，且該抗體重鏈恆定區可以包括人IgG恆定區，或可以包括IgY恆定區。
在本申請中，例如，該分離的抗原結合蛋白可以包括抗體重鏈恆定區，且該抗體重鏈恆定區可以包括人IgG4恆定區。在本申請中，編碼該人IgG4恆定區的基因可以如NCBI資料庫Gene ID：3503所示。在本申請中，該人IgG4恆定區可以進一步包含胺基酸突變(例如，可以包含S228P突變，即第228位的胺基酸S突變為P)。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈可變區CDR──LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈可變區CDR──LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈可變區CDR──LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區CDR──HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區CDR──HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：12所示 的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。該分離的抗原結合蛋白可稱為29G2-2 H5。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：52所示的胺基酸序列。該分離的抗原結合蛋白可稱為JYB1909Am09。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：54所示的胺基酸序列，且該VL 可包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列。該分離的抗原結合蛋白可稱為JYB1909Am34。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白還可以與參比抗體競爭結合人TSLP，其中該參比抗體可包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該參比抗體的重鏈可變區可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白還可以與參比抗體競爭結合人TSLP，其中該參比抗體可包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該參比抗體的重鏈可變區可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白還可以與參比抗體競爭結合人TSLP，其中該參比抗體可包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該參比抗體的重鏈可變區可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO： 48所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列。
核酸、載體、宿主細胞和製備方法
另一個方面，本申請還提供了分離的一種或多種核酸分子。
該一種或多種核酸分子可編碼該抗原結合蛋白。例如，該一種或多種核酸分子中的每一個核酸分子可以編碼完整的該抗原結合蛋白，也可以編碼其中的一部分(例如，HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、輕鏈或重鏈中的一種或多種)。該核酸分子可以為分離的。例如，其可以是藉由以下方法產生或合成的：(i)在體外擴增的，例如藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產生的，(ii)藉由選殖重組產生的，(iii)純化的，例如藉由酶切和凝膠電泳分級分離，或者(iv)合成的，例如藉由化學合成。在某些實施方式中，該分離的核酸是藉由重組DNA技術製備的核酸分子。在本申請中，可以藉由本領域已知的多種方法來製備編碼該抗體、其抗原結合片段的核酸，這些方法包括但不限於，採用限制性片段操作或採用合成性寡核苷酸的重疊延伸PCR，具體操作可參見Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocol sin Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York N.Y.，1993。
另一個方面，本申請提供了一種或多種載體，其包含該一種或多種核酸分子。每種載體中可包含一種或多種該核酸分子。此外，該載體中還可包含其他基因，例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外，該載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。這樣的控制元件為所屬技術領域具有通常知識者所熟知的，例如，可包括啟動子、核糖體結合位點、增強子和調節基因轉錄或mRNA翻譯的其他控制元件等。在某些實施方式中，該表達控制序列為可調的元件。該表達控制序列的具體結構可根據物種或細胞類型的功能而變化，但通常包含分別參與轉錄和翻譯起始的5’非轉錄序列和5’及3’非翻譯序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非轉錄表達控制序列可包含啟動子區，啟動子區可包含用於轉錄控制功能性連接核酸的啟動子序列。該表達控制序列還可包括增強子序列或上游活化子序列。該一種或多種核酸分子可以與該表達控制元件可操作地連接。該載體可以包括，例如質粒、黏粒、病毒、噬菌體或者在例如遺傳工程中通常使用的其他載體。例如，該載體為表達載體。
另一個方面，本申請提供了一種細胞，該細胞可包含該一種或多種核酸分子和/或該一種或多種載體。在某些實施方式中，每種或每個細胞可包含一個或一種該核酸分子或載體。在某些實施方式中，每種或每個細胞可包含多個(例如，2個或以上)或多種(例如，2種或以上)該核酸分子或載體。例如，可將該載體引入該細胞中，例如真核細胞，如來自植物的細胞、真菌或酵母細胞等。可藉由本領域已知的方法將該載體引入該細胞中，例如電穿孔、lipofectine轉染、lipofectamin轉染等。
另一方面，本申請提供一種製備該分離的抗原結合蛋白的方法，該方法包括在使得該分離的抗原結合蛋白表達的條件下，培養該細胞。
例如，可藉由使用適當的培養基、適當的溫度和培養時間等，這些方法是所屬技術領域具有通常知識者所瞭解的。在某些情形中，該方法還可包括分離和/或純化該抗體或其抗原結合片段的步驟。例如，可以採用蛋白G-瓊脂糖或蛋白A-瓊脂糖進行親和層析，還可藉由凝膠電泳和/或高效液相色譜等來純化和分離該抗體或其抗原結合片段。例如該純化的方法可以包括以下的步驟：採用蛋白質A管柱上的親和力捕獲，然後滴定。又例如，該純化可以採用蛋白質G管柱上的親和力捕獲，然後HPLC滴定。又例如例如，該純化可以採用IgE管柱上的親和力捕獲，然後滴定。該純化還可以包括一個或多個過濾步驟，該過濾可以包括透濾和/或HPLC過濾。
藥物組成物、方法、用途
另一方面，本申請提供一種藥物組成物，其包含該分離的抗原結合蛋白該核酸分子、該載體和/或該細胞，以及視需要地藥學上可接受的佐劑。
該藥物組成物可以用於治療預防、緩解和/或治療免疫系統相關疾病或腫瘤，其中該免疫系統相關疾病包括自身免疫疾病或炎性疾病。
本申請的藥物組成物可以含有安全有效量(如0.001-99wt%，0.01-90wt%，或0.1-80wt%)的該抗原結合蛋白以及藥學上可接受的佐劑(可包括載體或賦形劑)。這類載體可以包括(但並不限於)：鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方 式相匹配。該藥物組成物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液藉由常規方法進行製備。藥物組成物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量。此外，該抗原結合蛋白還可與其他治療劑一起使用。本文該抗原結合蛋白或藥物組成物可以符合良好醫療實踐的方式配製、給藥和施用。在此情形下的考慮因素包括所治療的特定病症、所治療的特定哺乳動物、單個患者的臨床病狀、病症的病因、藥劑遞送部位、施用方法和醫學從業者已知的其他因素。治療劑(例如，該分離的抗原結合蛋白)無需但視需要地與一種或多種當前用來預防或治療所考慮的病症的藥劑一起配製和/或同時施用。此類其他藥劑的有效量取決於製劑中存在的治療劑(例如，該分離的抗原結合蛋白)的量、病症或治療的類型以及以上論述的其他因素。這些藥劑通常可以憑經驗/臨床上確定為適當的任何劑量且藉由憑經驗/臨床上確定為適當的任何途徑加以使用。與單個治療相比，可減少組合治療中施用的抗體的劑量。藉由常規技術易於監測此療法的進展。
另一方面，本申請提供一種該分離的抗原結合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該藥物組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防、緩解和/或治療免疫系統相關疾病或腫瘤，其中該免疫系統相關疾病包括自身免疫疾病或炎性疾病。例如，該免疫系統相關疾病可以包括哮喘。例如，該腫瘤可以包括實體瘤和非實體瘤。
另一方面，本申請提供了一種預防、緩解和/或治療免疫系統相關疾病或腫瘤的方法，其包括以下的步驟：向有需要的受試者施用有效劑量的該分離的抗原結合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該藥物 組成物，其中該免疫系統相關疾病包括自身免疫疾病或炎性疾病。例如，該免疫系統相關疾病可以包括哮喘。例如，該腫瘤可以包括實體瘤和非實體瘤。
另一方面，本申請提供了該分離的抗原結合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該藥物組成物，其可以用於預防、緩解和/或治療免疫系統相關疾病或腫瘤，其中該免疫系統相關疾病包括自身免疫疾病或炎性疾病。例如，該免疫系統相關疾病可以包括哮喘。例如，該腫瘤可以包括實體瘤和非實體瘤。
另一方面，本申請提供一種檢測樣品中胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)的存在和/或含量的方法，其包括以下的步驟：施用該分離的抗原結合蛋白。
另一方面，本申請提供一種抑制胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)與TSLP受體結合的方法，其包括以下的步驟：施用該分離的抗原結合蛋白。
本申請的抗原結合蛋白可用於檢測應用，例如用於針對樣本中TSLP的定性和/或定量分析，從而可能可以提供診斷資訊。例如，該分離的抗原結合蛋白和/或方法，可以用於對受試者(例如哮喘患者)的標本(例如，咽拭子檢測樣品，例如血清、全血、痰液、口腔/鼻咽分泌物或洗液和組織標本)進行檢測，作為療效觀察的指標。例如，該分離的抗原結合蛋白和/或方法，可以為治療性干預提供監測方案。在本申請中，所採用的樣本(樣品)包括細胞、組織樣本和活檢標本。本申請使用的術語“活檢”應包括所屬技術領域具有通常知識者已知的所有種類的活檢。因此本申請中 使用的活檢可以包括例如藉由內窺鏡方法或器官的穿刺或針刺活檢製備的組織樣本。例如，該樣本可以包括固定的或保存的細胞或組織樣本。
另一方面，本申請還提供了一種指含有本申請的抗原結合蛋白的試劑盒。在某些情形中，該試劑盒還可以包括容器、使用說明書、緩衝劑等。例如，本申請的抗原結合蛋白可以固定於檢測板。
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請的抗原結合蛋白、製備方法和用途等，而不用於限制本申請發明的範圍。
實施例
實施例1 重組蛋白製備及抗體鑑定細胞株構建
1.重組蛋白製備
人TSLP-mFc蛋白：在人293細胞(HEK293)中表達重組人TSLP-mFc融合蛋白。為避免弗林蛋白酶對TSLP蛋白的切割，分別構建弗林蛋白酶識別位點突變或/和刪除的人TSLP-Linker-V1(其胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示)、人TSLP-Linker-V2(其胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示)以及食蟹猴TSLP-Linker-V4(其胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示)。同時，在這些重組蛋白的C末端帶有鼠抗體IgG2a的Fc片段(其胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示)或His-FLAG標籤(其胺基酸序列如SEQ ID NO：5所示)。
為了鑑定融合瘤上清和製備抗體具有中和TSLP的活性，構建了TSLPR+(GGS)20+IL7R重組蛋白(其胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示)，在該重組蛋白的C末端帶有鼠抗體IgG2a的Fc片段(其胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示)。
上述重組蛋白委託南京金斯瑞生物科技有限公司構建、表達及純化。
重組全長人TSLP蛋白購自北京義翹神州科技股份有限公司(貨號：51005-M08H)。
同型對照抗體：anti-HEL-Human IgG4(S228P)Isotype-control購自泰州市百英生物科技有限公司(貨號：B107804)。
2.抗體鑑定細胞株BAF3-TSLPR/IL-7R的構建
將人TSLPR基因(Gene ID：64109)及人IL-7Rα基因(Gene ID：23765)共轉染BAF3細胞系，構建穩定表達人類TSLPR-IL7Rα複合物的單株細胞株。該穩定細胞株委託上海吉凱基因科技有限公司完成。
實施例2 融合瘤單株抗體的製備
1.小鼠免疫
初次免疫時，使用完全弗氏佐劑依照1：1的比例將實施例1製備的人TSLP-Linker-V1進行乳化，然後藉由皮下及腹腔注射至6~8週齡雌性Balb/c小鼠，50μg/隻；之後間隔兩週進行加強免疫，每隻小鼠皮下及腹腔注射50μg蛋白加弗氏不完全佐劑。共計免疫4次，最後一次免疫一週後取小鼠尾血，測定血清抗人TSLP抗體滴度。經小鼠腹腔注射不加弗氏佐劑的50μg蛋白衝擊免疫後，第三天取小鼠脾臟細胞。
2.脾細胞融合
小鼠安樂死後，解剖、取脾、研磨並收集細胞，1500rpm，5min離心，收集細胞，用5毫升紅細胞裂解液懸浮細胞，4℃放置5分鐘，用DMEM+10%FBS終止反應，計數。離心後用40mL DMEM懸浮細胞，靜置2~3min 後轉移上清到另外一個50毫升離心管中。收集SP2/0細胞，按SP2/0：脾細胞=1：5的細胞數比例混合，離心，充分吸取上清後，拍松，混合細胞沉澱，用DMEM洗滌混合細胞兩次，依照常規方法進行PEG融合。融合後，用DMEM培養基洗滌細胞並將其重新懸浮於DMEM+10%FBS+1×HAT的篩選培養基中。將融合後的細胞加入96孔細胞培養板內，置37℃、濕度75%、5%CO2培養箱內培養9~10天。
3.融合瘤單株抗體的篩選
用PBS稀釋重組全長人TSLP蛋白(北京義翹神州科技股份有限公司，貨號：51005-M08H)至1.0μg/mL，加入高結合透明聚苯乙烯96孔板(Nunc)內，100μL/孔，置4℃包被過夜。第二天將ELISA板在自動洗板機上用洗滌緩衝液(PBS+0.05%吐溫20(sigma))洗滌二次。每孔加入300μL封閉緩衝液(PBS+0.05%吐溫20(sigma)+1%BSA)，置室溫封閉1小時。然後在自動洗板機上用洗滌緩衝液洗滌二次，將100μL融合瘤上清轉移至ELISA板各孔內，置室溫孵育1小時，然後依照上述方法洗板3次。每孔加入100μL在封閉緩衝液中1：5000稀釋的Goat Anti-mouse-HRP(Sigma，貨號：M4280)。置室溫孵育1小時，然後依照上述方法洗板3次。加入TMB受質液，100μL/孔，然後每孔加入100μL 1.0M鹽酸終止液終止反應。在Thermo Multiscan FC上在450nm處讀板。
藉由結合實驗，篩選到融合瘤選殖抗體29G2-2-H5、83B1-G2和104G11-H5，採用無血清培養及常規抗體純化的方法製備融合瘤單株抗體進行抗體功能確認。
實施例3 融合瘤單株抗體的鑑定
1.ELISA鑑定融合瘤單株抗體結合人TSLP功能
用PBS稀釋重組全長人TSLP蛋白(北京義翹神州科技股份有限公司，貨號：51005-M08H)至1.0μg/mL，加入高結合透明聚苯乙烯96孔板(Nunc)內，100μL/孔，置4℃包被過夜。第二天將ELISA板在自動洗板機上用洗滌緩衝液(PBS+0.05%吐溫20(sigma))洗滌二次。每孔加入300μL封閉緩衝液(PBS+0.05%吐溫20(sigma)+1%BSA)，置室溫封閉1小時。然後在自動洗板機上用洗滌緩衝液洗滌二次，將1000μL融合瘤上清轉移至ELISA板各孔內，置室溫孵育1小時，然後依照上述方法洗板3次。每孔加入100μL在封閉緩衝液中1：5000稀釋的Goat Anti-mouse-HRP(Sigma，貨號：M4280)。置室溫孵育1小時，然後依照上述方法洗板3次。加入TMB受質液，100μL/孔，然後每孔加入100μL 1.0M鹽酸終止液終止反應。在Thermo Multiscan FC上在450nm處讀板。利用軟體作圖並計算EC50。結果如圖1所示。
圖1中，A-C分別代表融合瘤單株抗體29G2-2-H5、83B1-G2和104G11-H5的試驗結果。其中融合瘤單株抗體29G2-2-H5、83B1-G2和104G11-H5的EC50值依次為0.4654、0.3765和0.4445。
2.ELISA鑑定融合瘤單株抗體阻斷人TSLP與TSLPR+(GGS)20+IL7R-Fc結合功能
用PBS稀釋重組全長人TSLP蛋白與實施例1製備的TSLPR+(GGS)20+IL7R-Fc至1.0μg/mL，加入高結合透明聚苯乙烯96孔板(Nunc)內，100μL/孔，置4℃包被過夜。第二天將ELISA板在自動洗板機上用洗滌緩衝液(PBS+0.05%吐溫20(sigma))洗滌二次。每孔加入 300μL封閉緩衝液(PBS+0.05%吐溫20(sigma)+1%BSA)，置室溫封閉1小時。然後在自動洗板機上用洗滌緩衝液洗滌二次。用封閉緩衝液將待選的融合瘤選殖進行系列稀釋後等體積加入已稀釋至0.2μg/mL的實施例1製備的人TSLP-His-FLAG中，使抗體終濃度分別為2000ng/mL、400ng/mL、80ng/mL。混勻後加入上述包被ELISA板內，100μL/孔。置室溫孵育1小時，然後依照上述方法洗板3次。每孔加入100μL在封閉緩衝液中1：5000稀釋的Mouse Anti-FLAG-HRP(Sigma，貨號：A8592)。置室溫孵育1小時，然後依照上述方法洗板3次。加入TMB受質液，100μL/孔，然後每孔加入100μL 1.0M鹽酸終止液終止反應。在Thermo Multiscan FC上在450nm處讀板。利用軟體作圖並計算EC50。圖2所示，其中A-C分別代表融合瘤單株抗體29G2-2-H5、83B1-G2和104G11-H5的試驗結果。
3.Octet Red測定純化後TSLP融合瘤單株抗體與生物素化的人或食蟹猴TSLP的親和力
1)採用Octet Red(Fortebio)分別測定融合瘤單株抗體29G2-2-H5、83B1-G2和104G11-H5與抗原生物素化的人TSLP(biotin-hTSLP，廠家：Acro，貨號：TSP-H82Eb)和生物化的食蟹猴TSLP(biotin-Cyno TSLP)的親和力，利用解離速率進行排序；
2)抗原和抗體的稀釋：使用PBST緩衝液(1xPBS,0.02%吐溫20)稀釋，抗原和抗體的使用濃度分別為66.7nM和50nM；
3)樣品上機檢測(Octet Data Acquisition 11.1.0.11)，首先，將樣品加入96孔板(Greiner bio-one，655209)，體系為200μL/孔。然後設置 軟體參數，板溫設定為30℃，收集標準動力學信號的頻率為5.0HZ。接著用PBST緩衝液預濕SA sensor(Fortébio,18-0009)10分鐘，然後上機檢測。每個迴圈包含以下步驟：(1)浸入緩衝液60s；(2)抗原固化在SA感測器上，時間為75s；(3)感測器浸入緩衝液180s；(4)抗原與50nM的抗體結合，時間180s；(6)抗原抗體的解離，時間10分鐘；
4)資料分析採用Fortebio的Data Analysis 11.1軟體，對抗原-抗體以1：1的結合方式，測定結合速率(Ka)和解離速率(Kd)，以此計算單株Anti-TSLP的平衡解離常數(KD)。結果見表1所示。
Figure 110142037-A0101-12-0043-1
4.純化後融合瘤單株抗體抑制人TSLP誘導PBMC釋放TARC的實驗
新鮮的人PBMC購自ALLCELLS公司。先將PBMC 400g離心10min，然後用含有10% FBS(Thermo Fisher，10099-141)和1×Pen Strep(Thermo Fisher，15140-122)的新鮮RPMI 1640培養基(Thermo Fisher， A10491-01)重新懸浮，按每孔1×106個細胞(每孔100μL)鋪至96孔板中(Corning，3599)。每孔加入50μL梯度稀釋的融合瘤單株抗體29G2-2-H5、83B1-G2或104G11-H5(終濃度10μg/mL起始，5倍梯度稀釋，最後一個孔抗體濃度為0，共8個點)，與PBMC在37℃共孵育30min。
隨後加入50μL工作濃度為1ng/mL的rhTSLP蛋白(Biolegend，582408)，37℃，5%CO2，孵育24小時後，300g離心5min收集細胞上清。最後用Human TARC的ELISA試劑盒(R&D，SDN00)檢測細胞上清中TARC的濃度。結果見表2所示。
Figure 110142037-A0101-12-0044-2
藉由實施例3的上述功能鑑定，選擇29G2-2 H5作為鼠源候選抗體進行人源化改造。
其中，29G2-2 H5的胺基酸序列如表3所示。
Figure 110142037-A0101-12-0045-4
實施例4 融合瘤單株抗體的人源化
1.藉由序列比對挑選最同源的人Germline序列(資料來源：IMGT)作為人源化設計框架(輕鏈以IGKV3D-11*02(其胺基酸序列如SEQ ID NO：17所示)或IGKV1-39*02(其胺基酸序列如SEQ ID NO：18所示)或IGKV1D-43*01(其胺基酸序列如SEQ ID NO：19所示)，IGKJ1*01(其胺基酸序列如SEQ ID NO：20所示)或IGKJ4*02(其胺基酸序列如SEQ ID NO：21所示)為框架；重鏈以IGHV2-5*08(其胺基酸序列如SEQ ID NO：22所示)，IGHV2-70D*14(其胺基酸序列如SEQ ID NO：23所示)或IGHJ2*01(其胺基酸序列如SEQ ID NO：24所示)為框架)，對抗體輕重鏈可變區進行Chothia編號(參見Chothia & Lesk,1987)定義抗體CDR區：CDRL1(L24-L34，即表示VL的第24-34位胺基酸)，CDRL2(L50-L56)，CDRL3(L89-L97)，CDRH1(H26-H32，即表示VH的第26-32位胺基酸)，CDRH2(H52-H56)，CDRH3(H95-H97)，根據序列比對和可變區結構資訊對抗體輕重鏈可變區胺基酸進行人源化突變。
2.設計表達載體，基因合成，哺乳細胞表達純化重組抗體，比較人源化改造後抗體活性，理化性質的差異，進行1-2輪人源化優化；
3.以上述Germline抗體為框架進行CDR移植，獲得以下的嵌合抗體的可變區胺基酸序列：
輕鏈可變區序列1909M2hzL14(其胺基酸序列如SEQ ID NO：33所示)，其中的FR1-FR4的胺基酸序列依次如SEQ ID NO：34-37所示。
重鏈可變區序列1909V3hzH18(其胺基酸序列如SEQ ID NO：38所示)，其中的FR1-FR4的胺基酸序列依次如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：43所示。
4.重組抗體表達和純化
設計上述人源化優化胺基酸序列後，將其分別進行密碼子優化，並合成對應的DNA基因片段(Genscript)，擴增合成的該基因片段到表達載體pcDNA3.4(Life Technologies)。表達質粒擴增和質粒抽提後雙質粒共轉ExpiCHO細胞(ThermoFisher Scientific，A29133)，根據供應商ExpiCHO表達系統方法進行抗體瞬轉表達，過程如下：在培養總體積25mL培養基中，36.5℃，8%二氧化碳濃度下培養ExpiCHO細胞至密度為6×106/mL，使用ExpiFectamine轉染試劑化轉各10μg抗體輕重鏈表達質粒到細胞；轉染一天後，各取150μL和4mL ExpiCHO增強劑和ExpiCHO輔料添加到培養細胞中，繼續培養至9天，4℃，3500轉離心取上清。混合AmMagTM Protein A磁珠(Genscript，L00695)和抗體表達上清，室溫孵育2小時，PBS洗滌兩次棄上清，加入適量沖提緩衝液Protein G or A SefinoseTMElution buffer(Sangon,C600481)，充分混勻後置於試管架上 靜止孵育5分鐘，孵育期間重新懸浮磁珠2~3次，重複沖提2次，沖提後，立即加入適量中和液1M Tris-HCl，pH7.5(Sangon,B548124)中和備用。
藉由阻斷實驗和結合實驗，選擇將上述輕鏈可變區序列1909M2hzL14和重鏈可變區序列1909V3hzH18組合為人源化抗體AB1909L14H18。
實施例5 人源化抗體的親和力成熟
5.1 人源化抗體的親和力成熟
將人源化抗體AB1909L14H18繼續進行親和力成熟改造。
首先將表達該抗體輕鏈可變區和重鏈可變區的基因分別進行密碼子優化，將優化後的合成基因插入酵母展示載體中，並在轉入酵母表達(例如在酵母表面展示1909M2hzL14、1909V3hzH18的Fab區)。對表達抗體的酵母細胞與人或食蟹猴TSLP結合水準的微毛細管細胞分析平臺的進行流式分析。流式分析驗證了人源化抗體AB1909L14H18能夠在酵母細胞表面展示其Fab區，且與人或食蟹猴TSLP有效結合(結果如圖3所示)。
在此基礎上，對人源化抗體AB1909L14H18的CDR區的胺基酸進行突變，設計突變文庫經過篩選，以獲得更高親和力的突變體。按Chothia編碼規則對人源化抗體AB1909L14H18的輕、重鏈可變區胺基酸進行編碼，CDR區按Chothia定義，突變各CDR內標胺基酸，構建NNK突變文庫。
以獲得的各CDR突變的質粒為範本，藉由PCR將重鏈或輕鏈不同CDR的突變組合，構建組合突變文庫。對所有突變序列的選殖進行 流式染色，經過流式分析後，根據各選殖的結合力係數，挑選與人和食蟹猴猴TSLP結合能力強的親和力成熟抗體進行表達。
獲得的親和力成熟抗體JYB1909Am09、JYB1909Am34的胺基酸序列表4-表5所示。
Figure 110142037-A0101-12-0048-5
Figure 110142037-A0101-12-0048-6
5.2 親和力成熟抗體的親和力檢測
1)根據His捕獲試劑盒2(GE Healthcare，貨號：29-2346-02)的操作說明將anti-his抗體偶聯到CM5晶片上(GE Healthcare，貨號：BR-1005-30)上；
2)抗體與抗原的親和力測定。使用HBS-EP+作為實驗緩衝液。每個進樣迴圈測定一種濃度的該親和力成熟抗體JYB1909Am09、JYB1909Am34與被捕獲抗原間的結合，每個迴圈包括捕獲抗原、不同濃度抗體的進樣及再生。以10μL/min的流速，將人TSLP(ACRO，貨號：TSP-H52Ha)或者食蟹猴TSLP(ACRO，貨號：TSP-C52H4)捕獲在2通道上，捕獲時間60s,1通道作為空白參考通道。以30μL/min的流速，將逐級稀釋的抗體(10nM，5nM，2.5nM，1.25nM，0.625nM，0.3125nM，0.15625nM，0nM)依次進樣於1，2通道，測定結合及解離。以10μL/min的流速，用再生緩衝液(10mM甘胺酸緩衝液，pH1.5)進行晶片再生以去除被捕獲的抗原及抗體。
3)資料分析：使用Biacore 8K分析軟體對資料進行分析。軟體分析所用的模型為1：1 binding。結果如表6所示。
其中Tezepelumap作為對照抗體，其重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示；輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
Figure 110142037-A0101-12-0050-7
5.3 親和力成熟抗體阻斷人TSLP與TSLPR+(GGS)20+IL7R-Fc結合功能
利用實施例3.2的方法檢測親和力成熟抗體JYB1909Am09、JYB1909Am34阻斷人TSLP與TSLPR+(GGS)20+IL7R-Fc結合功能，結果如圖4所示。在圖4中，不同圖示表示不同的施用劑量(2000ng/mL、400ng/mL和80ng/mL)，A-D分別表示親和力成熟抗體JYB1909Am09、JYB1909Am34、對照抗體Tezepelumap和同型對照抗體anti-HEL-Human IgG4(S228P)的結果。
5.4 親和力成熟抗體抑制rhTSLP誘導人PBMC釋放TARC
利用實施例3.4的方法檢測親和力成熟抗體JYB1909Am09、JYB1909Am34抑制rhTSLP誘導人PBMC釋放TARC功能，結果如圖5所示。在圖5中，A-D分別表示親和力成熟抗體JYB1909Am09、JYB1909Am34、對照抗體Tezepelumap和同型對照抗體anti-HEL-Human IgG4(S228P)的結果，即其IC50值分別依次為0.02933、0.01261、1.932和3.5 E+12。
5.5 親和力成熟抗體抑制rhTSLP誘導BAF3-TSLPR/IL-7R增殖實驗
高表達穩轉人TSLPR及人IL7Ra並外源施加TSLP後，TSLP蛋白與Baf3-TSLPR/IL-7R細胞上的受體複合物結合，從而促進細胞增殖，加入CellTiter反應受質時螢光信號值增加；當TSLP抗體(即親和力成熟抗體JYB1909Am09、JYB1909Am34)存在時，其與TSLP結合，導致細胞增殖被抑制，此時加入celltiter反應受質的螢光信號值降低。
細胞準備：將BAF3-TSLPR/IL-7R細胞轉移至50ml離心管中，300g離心5min，棄上清，加入20mL 1640空白培養基進行重新懸浮，300g離心5min，棄上清(洗掉殘餘的IL-3蛋白)。最後使用1640分析培養基重新懸浮細胞，根據細胞計數結果使用分析培養基調整細胞密度1×105/mL，將細胞懸液轉移至加樣槽中，使用多道移液器按照50μL/孔加入到96孔板中(鋪96孔整板可配製7mL的細胞懸液)。
樣品製備：根據樣品的濃度，使用分析培養基預稀釋至400μg/mL，2.5倍梯度稀釋，終濃度分別為400μg/mL，160μg/mL，64μg/mL，25.6μg/mL，10.24μg/mL，4.096μg/mL，1.638μg/mL，0.655μg/mL，0.262μg/mL，0.105μg/mL和0.042μg/mL共10個濃度點，同時設置只加分析培養基的Blank孔，每個濃度設置2複孔。
在抗體孵育期間，將Cell Titer-Glo® Assay System(提前配製反應液，將受質A和受質溶解液B解凍後進行混合)取出使其溫度恢 復至室溫。取出細胞培養板，置於室溫放置5~10min，然後每孔加入100μL Bio-GloTM Reagent，避光孵育5~10min，使用多功能酶標儀讀取化學發光信號值。
實驗結果如圖6所示，其中A-C分別表示對照抗體Tezepelumap、親和力成熟抗體JYB1909Am09和JYB1909Am34。由圖6的結果可知親和力成熟抗體JYB1909Am09、JYB1909Am34能夠抑制rhTSLP誘導BAF3-TSLPR/IL-7R增殖作用。
實施例6 在人源化FcRn小鼠模型中藥物代謝動力學(PK)研究
以人源化FcRn小鼠為受試動物，分別研究親和力成熟抗體JYB1909Am09、JYB1909Am34和對照抗體Tezepelumap單次皮下給藥後的藥物代謝動力學指標。
所有動物實驗方案獲得了IACUC審閱和批准。hFcRn小鼠採購自北京百奧賽圖，雄性，6~8週齡，體重23~26g，飼養於SPF級動物房，標準顆粒飼料餵養，自由進食及飲水，室溫18~24℃，相對濕度40%~50%，每日12小時晝夜交替。實驗動物共12隻，隨機分為主組，每組四隻動物，皮下單次給藥，給藥劑量為10mg/kg，給藥體積為10mL/kg。採血時間點為給藥前，給藥後2小時，6小時，24小時(第1天)，第2天，第3天，第4天，第7天，第10天，第14天，第21天，第28天，第35天和第42天。藉由臉頰穿刺採集全血60μL/隻至EP管中，室溫靜置30min，然後離心(2000g，4℃，5min)分離血清，每個樣品分裝為2份(檢測管和備份管)，10μL/管，置於-80℃保存。
利用Elisa間接法檢測，分析三種抗體不同時間點藥物代謝動力學。包被抗原為抗人TSLP-His-FLAG，2μg/ml，100μl/孔，37℃，2h。洗板後用200μl/孔封閉液4℃過夜。血清樣本加樣，50μl/孔，37℃，1小時。檢測抗體為鼠抗人Fab HRP(1：10000)(Abcam，貨號：ab87422)，100μl/孔，37℃，0.5小時。TMB顯色液(KPL，貨號：52-00-03)顯色，酶標儀(Molecular Devices，SpectraMax M3)讀值OD450。根據標曲獲得藥物濃度，PK Solver非房室進行資料處理獲得PK參數。
結果如圖7所示，其中A-C分別表示Tezepelumap、JYB1909Am09和JYB1909Am34。給藥Tezepelumap後，半衰期(t1/2)=8.9天，最高濃度(Cmax)為93499.79ng/ml；給藥JYB1909Am09後，半衰期(t1/2)=9.6天，最高濃度(Cmax)為54240.86ng/ml；給藥JYB1909Am34後半衰期(t1/2)=2.8天，最高濃度(Cmax)為21884.6ng/ml。
實施例7 食蟹猴哮喘疾病模型中的藥效學研究
以食蟹猴(Cynomolgus monkey)為受試動物，研究了親和力成熟抗體JYB1909Am09和對照抗體Tezepelumap在食蟹猴哮喘疾病模型中的藥效，動物實驗方案獲得了IACUC批准。動物採購自海南靈長實驗動物開發有限公司，雄性，體重3~7kg，年齡3~7周歲，動物單隻飼養於動物籠中，可自由進水，每天給動物提供兩次飼料。動物經過敏原皮試後選定16隻，每組4隻，分別給與同型對照抗體anti-HEL-Human IgG4(S228P)、Tezepelumap及JYB1909Am09。食蟹猴哮喘模型採用豬蛔蟲過敏原造模，具體方法可參考(Iwashita K et al.2008,J Pharmacol Sci 106：92-99)。
造模成功後，動物給與藥物處理，皮下給藥，10mg/kg每週一次。
圖8是給藥第1次、第3次和第6次的氣道阻力RL藥效資料；圖9是給藥第1次、第3次和第6次的動態肺順應性藥效資料CDYN(Mean+-SEM)。圖8中，A-C分別表示同型對照抗體anti-HEL-Human IgG4(S228P)、Tezepelumap及JYB1909Am09的氣道阻力RL藥效資料；圖9中，A-C分別表示Tezepelumap、JYB1909Am09及同型對照抗體anti-HEL-Human IgG4(S228P)的動態肺順應性藥效資料CDYN。
上述結果說明，JYB1909Am09能夠有效治療和/或緩解食蟹猴的哮喘症狀。
前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附請求項的範圍。目前本文所列舉的實施方式的多種變化對所屬技術領域具有通常知識者來說是顯而易見的，且保留在所附的請求項和其等同方案的範圍內。
<110> 大陸商上海濟煜醫藥科技有限公司(Shanghai Jemincare Pharmaceutical Co.,Ltd)；江西濟民可信集團有限公司(Jiangxi Jemincare Group Co.,Ltd)
<120> 一種TSLP抗原結合蛋白及其應用
<130> 0134-PA-021TW
<160> 70
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人TSLP-Linker-V1
<400> 1
Figure 110142037-A0101-12-0055-8
Figure 110142037-A0101-12-0056-9
<210> 2
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人TSLP-Linker-V2
<400> 2
Figure 110142037-A0101-12-0056-10
<210> 3
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 食蟹猴TSLP-Linker-V4
<400> 3
Figure 110142037-A0101-12-0057-11
<210> 4
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 鼠抗體IgG2a的Fc片段
<400> 4
Figure 110142037-A0101-12-0057-12
Figure 110142037-A0101-12-0058-13
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> His-FLAG標簽
<400> 5
Figure 110142037-A0101-12-0059-14
<210> 6
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TSLPR+(GGS)20+IL7R重組蛋白
<400> 6
Figure 110142037-A0101-12-0059-15
Figure 110142037-A0101-12-0060-16
Figure 110142037-A0101-12-0061-17
<210> 7
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人TSLP單株抗體Tezepelumab輕鏈
<400> 7
Figure 110142037-A0101-12-0061-18
Figure 110142037-A0101-12-0062-19
<210> 8
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人TSLP單株抗體Tezepelumab重鏈
<400> 8
Figure 110142037-A0101-12-0062-20
<210> 9
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 29G2-2H5VH
<400> 9
Figure 110142037-A0101-12-0063-21
<210> 10
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 29G2-2H5VL；AB1909wtKVL
<400> 10
Figure 110142037-A0101-12-0063-22
Figure 110142037-A0101-12-0064-23
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 29G2-2H5HCDR1
<400> 11
Figure 110142037-A0101-12-0064-24
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 29G2-2H5HCDR2
<400> 12
Figure 110142037-A0101-12-0064-25
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 29G2-2H5HCDR3
<400> 13
Figure 110142037-A0101-12-0064-26
Figure 110142037-A0101-12-0065-27
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 29G2-2H5LCDR1
<400> 14
Figure 110142037-A0101-12-0065-28
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 29G2-2H5LCDR2
<400> 15
Figure 110142037-A0101-12-0065-29
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 29G2-2H5LCDR3
<400> 16
Figure 110142037-A0101-12-0065-30
<210> 17
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGKV3D-11*02
<400> 17
Figure 110142037-A0101-12-0065-31
Figure 110142037-A0101-12-0066-32
<210> 18
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGKV1-39*02
<400> 18
Figure 110142037-A0101-12-0066-33
<210> 19
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGKV1D-43*01
<400> 19
Figure 110142037-A0101-12-0067-34
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGKJ1*01
<400> 20
Figure 110142037-A0101-12-0067-36
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGKJ4*02
<400> 21
Figure 110142037-A0101-12-0068-37
<210> 22
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGHV2-5*08
<400> 22
Figure 110142037-A0101-12-0068-38
<210> 23
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGHV2-70D*14
<400> 23
Figure 110142037-A0101-12-0068-39
Figure 110142037-A0101-12-0069-40
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGHJ2*01
<400> 24
Figure 110142037-A0101-12-0069-41
<210> 25
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AB1909wtKVLFR1
<400> 25
Figure 110142037-A0101-12-0069-42
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AB1909wtKVLFR2
<400> 26
Figure 110142037-A0101-12-0070-43
<210> 27
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AB1909wtKVLFR3
<400> 27
Figure 110142037-A0101-12-0070-44
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AB1909wtKVLFR4
<400> 28
Figure 110142037-A0101-12-0070-45
<210> 29
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AB1909wtHVHFR1
<400> 29
Figure 110142037-A0101-12-0071-46
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AB1909wtHVHFR2
<400> 30
Figure 110142037-A0101-12-0071-47
<210> 31
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AB1909wtHVHFR3
<400> 31
Figure 110142037-A0101-12-0071-48
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AB1909wtHVHFR4
<400> 32
Figure 110142037-A0101-12-0072-49
<210> 33
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1909M2hzL14VL
<400> 33
Figure 110142037-A0101-12-0072-50
<210> 34
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1909M2hzL14VLFR1
<400> 34
Figure 110142037-A0101-12-0072-51
Figure 110142037-A0101-12-0073-52
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1909M2hzL14VLFR2
<400> 35
Figure 110142037-A0101-12-0073-53
<210> 36
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1909M2hzL14VLFR3
<400> 36
Figure 110142037-A0101-12-0073-54
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1909M2hzL14VLFR4
<400> 37
Figure 110142037-A0101-12-0073-55
<210> 38
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1909FIThzH18VH
<400> 38
Figure 110142037-A0101-12-0074-56
<210> 39
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1909FIThzH18VHFR1
<400> 39
Figure 110142037-A0101-12-0074-57
<210> 40
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1909FIThzH18VHFR2
<400> 40
Figure 110142037-A0101-12-0075-58
<210> 41
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1909FIThzH18VHFR3
<400> 41
Figure 110142037-A0101-12-0075-59
<210> 42
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JYB1909Am34VHFR3
<400> 42
Figure 110142037-A0101-12-0075-60
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1909FIThzH18VHFR4
<400> 43
Figure 110142037-A0101-12-0076-61
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JYB1909Am09LCDR1
<400> 44
Figure 110142037-A0101-12-0076-62
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JYB1909Am09LCDR2
<400> 45
Figure 110142037-A0101-12-0076-63
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JYB1909Am09LCDR3；JYB1909Am34LCDR3
<400> 46
Figure 110142037-A0101-12-0076-64
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JYB1909Am34HCDR1
<400> 47
Figure 110142037-A0101-12-0077-65
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JYB1909Am34HCDR2
<400> 48
Figure 110142037-A0101-12-0077-66
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JYB1909Am34HCDR3
<400> 49
Figure 110142037-A0101-12-0077-67
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JYB1909Am34LCDR1
<400> 50
Figure 110142037-A0101-12-0077-68
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JYB1909Am34LCDR2
<400> 51
Figure 110142037-A0101-12-0078-69
<210> 52
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JYB1909Am09VL
<400> 52
Figure 110142037-A0101-12-0078-70
<210> 53
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JYB1909Am34VL
<400> 53
Figure 110142037-A0101-12-0079-71
<210> 54
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JYB1909Am34VH
<400> 54
Figure 110142037-A0101-12-0079-72
Figure 110142037-A0101-12-0080-73
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HCDR1通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=Ala或Phe
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa=Leu或Met
<400> 55
Figure 110142037-A0101-12-0080-74
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HCDR2通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa=Asp或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa=Asp或Gly
<400> 56
Figure 110142037-A0101-12-0081-75
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HCDR3通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa=Phe或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa=Phe或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa=Asp或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa=His或Tyr
<400> 57
Figure 110142037-A0101-12-0081-76
<210> 58
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR1通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa=Asp、Val或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa=Trp或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa=Ala或Ser
<400> 58
Figure 110142037-A0101-12-0082-77
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR2通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa=Ala或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Arg或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa=Ala、Asp或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa=Arg或Ser
<400> 59
Figure 110142037-A0101-12-0082-78
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR3通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa=Glu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa=Asn或Thr
<400> 60
Figure 110142037-A0101-12-0083-79
<210> 61
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HFR1通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Gln或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa=Lys或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa=Glu或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa=Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa=Gly或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa=Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa=Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa=Gly或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa=Gln或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa=Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa=Arg或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> Xaa=Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Xaa=Ala或Ser
<400> 61
Figure 110142037-A0101-12-0084-80
<210> 62
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HFR2通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa=Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa=Ala或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa=Pro或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa=Leu或Val
<400> 62
Figure 110142037-A0101-12-0085-81
<210> 63
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HFR3通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa=Met或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa=Ala或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa=Asp或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa=Ala或Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa=Gly或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa=Phe或Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa=Ile或Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa=Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> Xaa=Gln或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Xaa=Phe或Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Xaa=Lys或Gln
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa=Ile或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa=Asn或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> Xaa=Asn或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa=Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Xaa=Asp或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Xaa=Ala或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> Xaa=Glu或Thr
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa=Thr或Val
<400> 63
Figure 110142037-A0101-12-0087-82
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HFR4通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Gln或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa=Leu或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa=Leu或Val
<400> 64
Figure 110142037-A0101-12-0088-83
<210> 65
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LFR1通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Gln或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa=Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa=Phe或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa=Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa=Ala或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa=Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa=Asp或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa=Ala或Val
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa=Ser或Thr
<400> 65
Figure 110142037-A0101-12-0089-84
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LFR2通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa=Lys或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa=Ala或Pro
<400> 66
Figure 110142037-A0101-12-0089-85
<210> 67
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LFR3通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa=Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> Xaa=Asp或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Xaa=His或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> Xaa=Pro或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa=Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Xaa=Glu或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> Xaa=Glu或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa=Ala或Phe
<400> 67
Figure 110142037-A0101-12-0090-86
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LFR4通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Gly或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa=Leu或Val
<400> 68
Figure 110142037-A0101-12-0091-87
<210> 69
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Gln或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa=Lys或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa=Glu或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa=Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa=Gly或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa=Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa=Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa=Gly或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa=Gln或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa=Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa=Arg或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> Xaa=Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Xaa=Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa=Ala或Phe
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> Xaa=Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> Xaa=Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> Xaa=Ala或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> Xaa=Pro或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(50)
<223> Xaa=Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> Xaa=Asp或Thr
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa=Asp或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(59)
<223> Xaa=Met或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(62)
<223> Xaa=Ala或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> Xaa=Asp或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(65)
<223> Xaa=Ala或Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (67)..(67)
<223> Xaa=Gly或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> Xaa=Phe或Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> Xaa=Ile或Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (77)..(77)
<223> Xaa=Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (79)..(79)
<223> Xaa=Gln或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> Xaa=Phe或Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> Xaa=Lys或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> Xaa=Ile或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(85)
<223> Xaa=Asn或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (86)..(86)
<223> Xaa=Asn或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> Xaa=Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (88)..(88)
<223> Xaa=Asp或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (89)..(89)
<223> Xaa=Ala或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (90)..(90)
<223> Xaa=Glu或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (94)..(94)
<223> Xaa=Thr或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (104)..(104)
<223> Xaa=Phe或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (105)..(105)
<223> Xaa=Phe或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (106)..(106)
<223> Xaa=Asp或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (107)..(107)
<223> Xaa=His或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (110)..(110)
<223> Xaa=Gln或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(113)
<223> Xaa=Leu或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (114)..(114)
<223> Xaa=Leu或Val
<400> 69
Figure 110142037-A0101-12-0095-88
Figure 110142037-A0101-12-0096-89
<210> 70
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Gln或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa=Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa=Phe或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa=Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa=Ala或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa=Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa=Asp或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa=Ala或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa=Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Xaa=Asp、Val或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Xaa=Trp或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> Xaa=Asp或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> Xaa=Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)..(46)
<223> Xaa=Lys或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(47)
<223> Xaa=Ala或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(54)
<223> Xaa=Ala或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(56)
<223> Xaa=Arg或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> Xaa=Asn或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(59)
<223> Xaa=Ala、Asp或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(60)
<223> Xaa=Arg或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(62)
<223> Xaa=Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (64)..(64)
<223> Xaa=Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (78)..(78)
<223> Xaa=Asp或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> Xaa=His或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> Xaa=Pro或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (82)..(82)
<223> Xaa=Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> Xaa=Glu或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> Xaa=Glu或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> Xaa=Ala或Phe
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(97)
<223> Xaa=Glu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (101)..(101)
<223> Xaa=Asn或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (104)..(104)
<223> Xaa=Gly或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (108)..(108)
<223> Xaa.=Leu或Val
<400> 70
Figure 110142037-A0101-12-0099-90

Claims (51)

  1. 一種分離的抗原結合蛋白，其具有下述性質中的一種或多種：
    a)在Octet測定中，以約1.0*10-12M以下的K D 值特異性結合人胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)；
    b)在Octet測定中，以約4.0*10-10M以下的K D 值特異性結合食蟹猴胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)；
    c)在Biacore測定中，以約3.5*10-11M以下的K D 值特異性結合人胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)；
    d)在Biacore測定中，以約6.0*10-10M以下的K D 值特異性結合食蟹猴胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)；
    e)阻斷人胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)和人胸腺基質淋巴細胞生成素受體(TSLPR)結合；
    f)抑制TSLP誘導PBMC釋放T細胞受體α恆定區(TRAC)；以及
    g)抑制TSLP誘導表達TSLPR-IL7Rα複合物的細胞的增殖。
  2. 如請求項1所述的分離的抗原結合蛋白，其包含輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，所述VL包含SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列。
  3. 如請求項1至2中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區VH中的至少一個CDR，所述VH包含SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體或其抗原結合片段。
  5. 如請求項4所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
  6. 如請求項4至5中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗體為人源化抗體。
  7. 如請求項2至6中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列。
  8. 如請求項7所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述LCDR1包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：50中任一項所示的胺基酸序列。
  9. 如請求項7至8中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述LCDR2包含SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列。
  10. 如請求項9所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述LCDR2包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：51中任一項所示的胺基酸序列。
  11. 如請求項7至10中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述LCDR3包含SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列。
  12. 如請求項11所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述LCDR3包含SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：46中任一項所示的胺基酸序列。
  13. 如請求項3至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列。
  14. 如請求項13所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：47中任一項所示的胺基酸序列。
  15. 如請求項13至14中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述HCDR2包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列。
  16. 如請求項15所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述HCDR2包含SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：48中任一項所示的胺基酸序列。
  17. 如請求項13至16中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列。
  18. 如請求項17所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：49中任一項所示的胺基酸序列。
  19. 如請求項2至18中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述VL包括框架區L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。
  20. 如請求項19所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述L-FR1的C末端與所述LCDR1的N末端直接或間接相連，且所述L-FR1包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列。
  21. 如請求項20所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述L-FR1包含SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：34中任一項所示的胺基酸序列。
  22. 如請求項19至21中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述L-FR2位於所述LCDR1與所述LCDR2之間，且所述L-FR2包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列。
  23. 如請求項22所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述L-FR2包含SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：35中任一項所示的胺基酸序列。
  24. 如請求項19至23中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述L-FR3位於所述LCDR2與所述LCDR3之間，且所述L-FR3包含SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列。
  25. 如請求項24所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述L-FR3包含SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：36中任一項所示的胺基酸序列。
  26. 如請求項19至25中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述L-FR4的N末端與所述LCDR3的C末端直接或間接相連，且所述L-FR4包含SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列。
  27. 如請求項26所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述L-FR4包含SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：37中任一項所示的胺基酸序列。
  28. 如請求項2至27中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述VL包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53中任一項所示的胺基酸序列。
  29. 如請求項1至28中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體輕鏈恆定區，且所述抗體輕鏈恆定區包括人Igκ恆定區或人Igλ恆定區。
  30. 如請求項3至29中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述VH包括框架區H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。
  31. 如請求項30所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述H-FR1的C末端與所述HCDR1的N末端直接或間接相連，且所述H-FR1包含SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列。
  32. 如請求項31所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述H-FR1包含SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：39中任一項所示的胺基酸序列。
  33. 如請求項30至32中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述H-FR2位於所述HCDR1與所述HCDR2之間，且所述H-FR2包含SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列。
  34. 如請求項33所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述H-FR2包含SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：40中任一項所示的胺基酸序列。
  35. 如請求項30至34中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述H-FR3位於所述HCDR2與所述HCDR3之間，且所述H-FR3包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列。
  36. 如請求項35所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述H-FR3包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42中任一項所示的胺基酸序列。
  37. 如請求項30至36中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述H-FR4的N末端與所述HCDR3的C末端直接或間接相連，且所述H-FR4包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列。
  38. 如請求項37所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述H-FR4包含SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：43中任一項所示的胺基酸序列。
  39. 如請求項3至38中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中所述VH包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：54中任一項所示的胺基酸序列。
  40. 如請求項1至39中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體重鏈恆定區，且所述抗體重鏈恆定區包括人IgG恆定區，或包括IgY恆定區。
  41. 如請求項1至40中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體重鏈恆定區，且所述抗體重鏈恆定區包括人IgG4恆定區。
  42. 一種分離的一種或多種核酸分子，其編碼請求項1至41中任一項所述的分離的抗原結合蛋白。
  43. 一種載體，其包含如請求項42所述的核酸分子。
  44. 一種細胞，其包含如請求項42所述的核酸分子或如請求項43所述的載體。
  45. 一種製備請求項1至41中任一項所述的分離的抗原結合蛋白的方法，所述方法包括在使得請求項1至41中任一項所述的分離的抗原結合蛋白表達的條件下，培養如請求項44所述的細胞。
  46. 一種藥物組成物，其包含請求項1至41中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、請求項42所述的核酸分子、請求項43所述的載體和/或請求項44所述的細胞，以及視需要地藥學上可接受的佐劑。
  47. 一種請求項1至41中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、請求項42所述的核酸分子、請求項43所述的載體、請求項44所述的細胞和/或請求項46所述的藥物組成物在製備藥物中的用途，所述藥物用於預防、緩解和/或治療免疫系統相關疾病或腫瘤，其中所述免疫系統相關疾病包括自身免疫疾病或炎性疾病。
  48. 如請求項47所述的用途，其中所述免疫系統相關疾病包括哮喘。
  49. 如請求項47至48中任一項所述的用途，其中所述腫瘤包括實體瘤和非實體瘤。
  50. 一種檢測樣品中胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)的存在和/或含量的方法，其包括以下的步驟：施用請求項1至41中任一項所述的分離的抗原結合蛋白。
  51. 一種抑制胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)與TSLP受體結合的方法，其包括以下的步驟：施用請求項1至41中任一項所述的分離的抗原結合蛋白。
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