CN117098777A - 一种tslp抗原结合蛋白及其应用 - Google Patents
一种tslp抗原结合蛋白及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117098777A CN117098777A CN202180076243.1A CN202180076243A CN117098777A CN 117098777 A CN117098777 A CN 117098777A CN 202180076243 A CN202180076243 A CN 202180076243A CN 117098777 A CN117098777 A CN 117098777A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- antigen binding
- binding protein
- amino acid
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 133
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 133
- 102100031294 Thymic stromal lymphopoietin Human genes 0.000 title claims abstract description 98
- 101000845170 Homo sapiens Thymic stromal lymphopoietin Proteins 0.000 title claims abstract description 29
- 108010029307 thymic stromal lymphopoietin Proteins 0.000 claims abstract description 97
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 91
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 46
- 102000045535 human TSLP Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 102100029452 T cell receptor alpha chain constant Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 101000634853 Homo sapiens T cell receptor alpha chain constant Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 191
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 43
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 43
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 43
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 39
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 34
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 34
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 34
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 30
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 27
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 25
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 22
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 21
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 101000956427 Homo sapiens Cytokine receptor-like factor 2 Proteins 0.000 claims description 8
- 102000048388 human CRLF2 Human genes 0.000 claims description 6
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 5
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 5
- 101710194733 Cytokine receptor-like factor 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100038497 Cytokine receptor-like factor 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 208000037979 autoimmune inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 abstract description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 25
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 10
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 102100023698 C-C motif chemokine 17 Human genes 0.000 description 6
- 101000978362 Homo sapiens C-C motif chemokine 17 Proteins 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 6
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 4
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 4
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 3
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- JEPNLGMEZMCFEX-QSFUFRPTSA-N Ala-His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](C)N JEPNLGMEZMCFEX-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 2
- CREYEAPXISDKSB-FQPOAREZSA-N Ala-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O CREYEAPXISDKSB-FQPOAREZSA-N 0.000 description 2
- PMGDADKJMCOXHX-BQBZGAKWSA-N Arg-Gln Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N Arg-Phe-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N Asp-Ile Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N Asp-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N 0.000 description 2
- SXLCDCZHNCLFGZ-BPUTZDHNSA-N Asp-Pro-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O SXLCDCZHNCLFGZ-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 2
- MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N Asp-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 2
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 2
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 2
- NJMYZEJORPYOTO-BQBZGAKWSA-N Gln-Pro Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O NJMYZEJORPYOTO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- MRVYVEQPNDSWLH-XPUUQOCRSA-N Gln-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O MRVYVEQPNDSWLH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N Glu-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N Gly-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 2
- XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- SBVMXEZQJVUARN-XPUUQOCRSA-N Gly-Val-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SBVMXEZQJVUARN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- HTOOKGDPMXSJSY-STQMWFEESA-N His-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 HTOOKGDPMXSJSY-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001043809 Homo sapiens Interleukin-7 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FEHQLKKBVJHSEC-SZMVWBNQSA-N Leu-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 FEHQLKKBVJHSEC-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 2
- NRFGTHFONZYFNY-MGHWNKPDSA-N Leu-Ile-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NRFGTHFONZYFNY-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 2
- LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N Leu-Thr-Gln Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- RMODQFBNDDENCP-IHRRRGAJSA-N Pro-Lys-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RMODQFBNDDENCP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N Ser-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- PPNPDKGQRFSCAC-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PPNPDKGQRFSCAC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 2
- MXDOAJQRJBMGMO-FJXKBIBVSA-N Thr-Pro-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O MXDOAJQRJBMGMO-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N Thr-Val-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- KYPMKDGKAYQCHO-RYUDHWBXSA-N Tyr-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 KYPMKDGKAYQCHO-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N Tyr-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 108010081404 acein-2 Proteins 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 208000037883 airway inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 108010069117 seryl-lysyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000884 Airway Obstruction Diseases 0.000 description 1
- IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N Arg-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(O)=O IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- VRZDJJWOFXMFRO-ZFWWWQNUSA-N Arg-Gly-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O VRZDJJWOFXMFRO-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- LGCVSPFCFXWUEY-IHPCNDPISA-N Asn-Trp-Tyr Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CC=C(C=C3)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LGCVSPFCFXWUEY-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- OZHXXYOHPLLLMI-CIUDSAMLSA-N Cys-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OZHXXYOHPLLLMI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- MADFVRSKEIEZHZ-DCAQKATOSA-N Gln-Gln-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N MADFVRSKEIEZHZ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- RBWKVOSARCFSQQ-FXQIFTODSA-N Gln-Gln-Ser Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RBWKVOSARCFSQQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- RGAOLBZBLOJUTP-GRLWGSQLSA-N Gln-Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N RGAOLBZBLOJUTP-GRLWGSQLSA-N 0.000 description 1
- XZLLTYBONVKGLO-SDDRHHMPSA-N Gln-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O XZLLTYBONVKGLO-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- UTOQQOMEJDPDMX-ACZMJKKPSA-N Gln-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O UTOQQOMEJDPDMX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101001037145 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 2-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000989056 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 2-70D Proteins 0.000 description 1
- 101001091242 Homo sapiens Immunoglobulin kappa joining 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001138089 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1-39 Proteins 0.000 description 1
- 101001009877 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1D-43 Proteins 0.000 description 1
- 101001008257 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3D-11 Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000582254 Homo sapiens Nuclear receptor corepressor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102100040235 Immunoglobulin heavy variable 2-5 Human genes 0.000 description 1
- 102100029429 Immunoglobulin heavy variable 2-70D Human genes 0.000 description 1
- 102100034892 Immunoglobulin kappa joining 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100020910 Immunoglobulin kappa variable 1-39 Human genes 0.000 description 1
- 102100030883 Immunoglobulin kappa variable 1D-43 Human genes 0.000 description 1
- 102100027405 Immunoglobulin kappa variable 3D-11 Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100021593 Interleukin-7 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 101001043810 Macaca fascicularis Interleukin-7 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000006833 Multifunctional Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010047290 Multifunctional Enzymes Proteins 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N Phe-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000037656 Respiratory Sounds Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- YPUSXTWURJANKF-KBIXCLLPSA-N Ser-Gln-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O YPUSXTWURJANKF-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- PKZIWSHDJYIPRH-JBACZVJFSA-N Trp-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O PKZIWSHDJYIPRH-JBACZVJFSA-N 0.000 description 1
- QOIKZODVIPOPDD-AVGNSLFASA-N Tyr-Cys-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QOIKZODVIPOPDD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- BMPPMAOOKQJYIP-WMZOPIPTSA-N Tyr-Trp Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C([O-])=O)C1=CC=C(O)C=C1 BMPPMAOOKQJYIP-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- NAHUCETZGZZSEX-IHPCNDPISA-N Tyr-Trp-Asp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N NAHUCETZGZZSEX-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010047924 Wheezing Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003915 air pollution Methods 0.000 description 1
- 210000001552 airway epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005057 airway smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000002561 chemical irritant Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000013188 needle biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000008807 pathological lesion Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012557 regeneration buffer Substances 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000011125 single therapy Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Abstract
一种分离的抗原结合蛋白、制备方法和应用。其可以高特异性地结合人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)或食蟹猴TSLP;阻断TSLP胸腺基质淋巴细胞生成素受体(TSLPR)结合;抑制TSLP诱导PBMC释放T细胞受体α恒定区(TRAC);以及抑制TSLP诱导表达TSLPR‑IL7Rα复合物的细胞的增殖。
Description
本申请涉及生物医药领域,具体的涉及一种TSLP抗原结合蛋白及其应用。
哮喘是世界范围内人类最常见的慢性疾病之一,全球的患者数量约为3.34亿人。其中重症哮喘是当前哮喘治疗中的难题,近年来有精准靶向治疗哮喘的趋势。
胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)是新近被发现的一种具有IL-7样功能的细胞因子,TSLP主要由上皮细胞表达,特别是在经抗原激活的支气管上皮细胞和活化的肥大细胞。多种细胞因子参与调解TSLP的表达,例如IL-25、IL-33两种上皮细胞起源的细胞因子,能够诱导气道上皮细胞产生TSLP。
多项研究显示TSLP与哮喘的关系十分密切。TSLP在哮喘的启动与持续,以及特应性免疫应答中起着重要的作用。例如,在哮喘病人的肺上皮细胞及粘膜下层组织中可以观察到大量的高表达TSLP-mRNA的细胞,同时肺泡灌洗液(BAL)中可见有较高浓度的TSLP蛋白表达。可见目前大部分研究都提示TSLP与哮喘气道炎症及病情严重程度密切相关。
由此可见,开发TSLP抗体具有重要的临床意义。
发明内容
本申请提供了一种TSLP抗原结合蛋白及其应用。所述TSLP抗原结合蛋白可以具有下述性质中的至少一种:高特异性地结合人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)和/或食蟹猴TSLP;有效地阻断TSLP胸腺基质淋巴细胞生成素受体(TSLPR)结合;有效地抑制TSLP诱导PBMC释放T细胞受体α恒定区(TRAC);有效地抑制TSLP诱导表达TSLPR-IL7Rα复合物的细胞的增殖。本申请还提供了编码该抗原结合蛋白的核酸、载体、细胞或包含其的药物组合物,还提供了该抗原结合蛋白相关的制备方法,以及在制备药物中的应用。
本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白,其具有下述性质中的一种或多种:a)在Octet测定中,以约1.0*10
-12M以下的K
D值特异性结合人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP);b)在Octet测定中,以约4.0*10
-10M以下的K
D值特异性结合食蟹猴胸腺基质淋巴细胞生成素 (TSLP);c)在Biacore测定中,以约3.5*10
-11M以下的K
D值特异性结合人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP);d)在Biacore测定中,以约6.0*10
-10M以下的K
D值特异性结合食蟹猴胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP);e)阻断人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)和人胸腺基质淋巴细胞生成素受体(TSLPR)结合;f)抑制TSLP诱导PBMC释放T细胞受体α恒定区(TRAC);以及g)抑制TSLP诱导表达TSLPR-IL7Rα复合物的细胞的增殖;
在某些实施方式中,所述的分离的抗原结合蛋白包含轻链可变区VL中的至少一个CDR,所述VL包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。在某些实施方式中,所述VL包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述的分离的抗原结合蛋白包含重链可变区VH中的至少一个CDR,所述VH包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。在某些实施方式中,所述VH包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述的分离的抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中,所述抗原结合片段包括Fab,Fab’,F(ab)2,Fv片段,F(ab’)2,scFv,di-scFv和/或dAb。
在某些实施方式中,所述抗体为人源化抗体。
在某些实施方式中,所述VL包含LCDR1,LCDR2和LCDR3,其中所述LCDR1包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述LCDR1包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述LCDR2包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述LCDR2包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:51中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述LCDR3包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述LCDR3包含SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:46中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述VH包含HCDR1,HCDR2和HCDR3,所述HCDR1包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述HCDR1包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:47中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述HCDR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述HCDR2包含SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:48中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述HCDR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述HCDR3包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:49中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述VL包括框架区L-FR1,L-FR2,L-FR3,和L-FR4。
在某些实施方式中,所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连,且所述L-FR1包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述L-FR1包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:34中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间,且所述L-FR2包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述L-FR2包含SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:35中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间,且所述L-FR3包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述L-FR3包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:36中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连,且所述L-FR4包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述L-FR4包含SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:37中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述VL包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述的分离的抗原结合蛋白包括抗体轻链恒定区,且所述抗体轻链恒定区包括人Igκ恒定区或人Igλ恒定区。
在某些实施方式中,所述VH包括框架区H-FR1,H-FR2,H-FR3,和H-FR4。
在某些实施方式中,所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连,且所述H-FR1包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述H-FR1包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:39中任一项所示的 氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间,且所述H-FR2包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述H-FR2包含SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:40中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间,且所述H-FR3包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述H-FR3包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连,且所述H-FR4包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述H-FR4包含SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:43中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述VH包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述的分离的抗原结合蛋白包括抗体重链恒定区,且所述抗体重链恒定区包括人IgG恒定区,或包括IgY恒定区。
在某些实施方式中,所述的分离的抗原结合蛋白包括抗体重链恒定区,且所述抗体重链恒定区包括人IgG4恒定区。
另一方面,本申请提供一种分离的一种或多种核酸分子,其编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
另一方面,本申请提供一种载体,其包含本申请所述的核酸分子。
另一方面,本申请提供一种细胞,其包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。
另一方面,本申请提供一种制备本申请所述的分离的抗原结合蛋白的方法,所述方法包括在使得本申请所述的分离的抗原结合蛋白表达的条件下,培养本申请所述的细胞。
另一方面,本申请提供一种药物组合物,其包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞,以及任选地药学上可接受的佐剂。
另一方面,本申请提供一种本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物在制备药物中的用途, 所述药物用于预防、缓解和/或治疗免疫系统相关疾病或肿瘤,其中所述免疫系统相关疾病包括自身免疫疾病或炎性疾病。
在某些实施方式中,所述免疫系统相关疾病包括哮喘。
在某些实施方式中,所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤。
另一方面,本申请提供一种检测样品中胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的存在和/或含量的方法,其包括以下的步骤:施用本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
另一方面,本申请提供一种抑制胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)与TSLP受体结合的方法,其包括以下的步骤:施用本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的,本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地,本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的,而非为限制性的。
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下:
图1显示的是本申请所述杂交瘤单克隆抗体结合人TSLP-His-FLAG ELISA结果;
图2显示的是本申请所述杂交瘤单克隆抗体阻断TSLP-His-FLAG结合功能结果;
图3显示的是本申请所述人源化抗体展示Fab的结合曲线;
图4显示的是本申请所述抗原结合蛋白阻断人TSLP ELISA结果;
图5显示的是本申请所述抗原结合蛋白抑制rhTSLP诱导人PBMC释放TARC结果;
图6显示的是本申请所述抗原结合蛋白抑制rhTSLP诱导BAF3-TSLPR/IL-7R增殖实验结果;
图7显示的是本申请所述抗原结合蛋白在人源化FcRn小鼠模型中药代动力学(PK)研究曲线;
图8显示的是本申请所述抗原结合蛋白对食蟹猴哮喘模型气道阻力的影响;
图9显示的是本申请所述抗原结合蛋白对食蟹猴哮喘模型动态肺顺应性的影响。
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式,熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中,术语“TSLP”通常是指胸腺基质淋巴细胞生成素,Thymic stromal lymphopoietin,其也可被称为IL-7样细胞因子,是IL-2细胞因子家族中的一员。TSLP可以在经抗原激活的支气管上皮细胞和活化的肥大细胞中表达。细胞因子(例如IL-25或IL-33)可以诱导起到上皮细胞产生TSLP;IL-lβ、TNF-α可以诱导气道平滑肌细胞释放TSLP。TSLP在哮喘的启动与持续,以及特应性免疫应答中起着重要的作用。此外,TSLP在增进纤维化病症中也存在作用。
在本申请中,术语“TSLPR”通常是指胸腺基质淋巴细胞生成素受体。所述TSLPR可以与TSLP结合。所述TSLPR属于造血细胞因子受体家族,能够通过与TSLP的相互作用介导TSLP的活性。人TSLPR基因的Gene ID为64109。
在本申请中,术语“抗原结合蛋白”通常是指包含结合抗原的部分的蛋白质,以及任选地允许结合抗原的部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或骨架部分。抗原结合蛋白的实例包括但不限于抗体、抗原结合片段(Fab,Fab’,F(ab)
2,Fv片段,F(ab’)
2,scFv,di-scFv和/或dAb)、免疫缀合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物或融合蛋白等,只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
在本申请中,术语“Fab”通常是指含有重链可变结构域和轻链可变结构域的片段,并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1);术语“Fab’”通常是指在重链CH1结构域的羧基端添加少量残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)而不同于Fab的片段;术语“F(ab')
2”通常是指Fab’的二聚体,包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。术语“Fv”通常是指含有完整抗原识别与结合位点的最小抗体片段。在某些情形中,该片段可以由一个重链可变区和一个轻链可变区以紧密非共价结合的二聚体组成;术语“dsFv”通常是指二硫键稳定的Fv片段,其单个轻链可变区与单个重链可变区之间的键是二硫键。术语“dAb片段”通常是指由VH结构域组成的抗体片段。在本申请中,术语“scFv”通常是指抗体的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域通过柔性肽连接子共价连接配对形成的单价分子;此类scFv分子可具有一般结构:NH
2-VL-连接子-VH-COOH或NH
2-VH-连接子-VL-COOH。
在本申请中,术语“抗体”其以最广泛意义使用,且具体涵盖,但不限于,单克隆抗体(包括包含两条轻链和两条重链的全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、完全人类抗体、嵌合抗体和骆驼化单结构域抗体。“抗体”通常可以包含通过二硫键互相连接的至少两条重链(HC)和两条轻链(LC)的蛋白,或其抗原结合片段。每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区。在某些天然存在的IgG、IgD和IgA抗体中,重链恒定区包含三个结构域,CH1、CH2和CH3。在某些天然存在的抗体中,各轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域,CL。VH和VL区可进一步细分为超变的区域,称为互补决定区(CDR),其与称为框架区(FR)的较保守的区域交替。各VH和VL包含三个CDR和四个框架区(FR),从氨基端至羧基端按以下顺序排列:FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3和FR4。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(H-FR1,H-FR2,H-FR3,H-FR4,L-FR1,L-FR2,L-FR3,L-FR4),大部分采用β-折叠构型,通过三个CDRs连接,形成环连接,并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDRs通过FR区紧密靠近在一起,并与来自另一条链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)结合。
在本申请中,术语“可变”通常是指这样的事实,即抗体的可变结构域的序列的某些部分变化强烈,它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,变异性并非均匀地分布在抗体的整个可变区中。它集中在轻链和重链可变区中的三个区段,被称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)。可变域中更高度保守的部分被称为框架(FR)。在本领域中,可以通过多种方法来定义抗体的CDR,例如基于序列可变性的Kabat定义规则(参见,Kabat等人,免疫学的蛋白质序列,第五版,美国国立卫生研究院,贝塞斯达,马里兰州(1991))、基于结构环区域位置的Chothia定义规则(参见,A1-Lazikani等人,JMol Biol 273:927-48,1997)和基于IMGT本体论(IMGT-ONTOLOGY)的概念和IMGT Scientific图表规则的KABAT定义规则。IMGT指国际ImMunoGeneTics信息系统,一种免疫遗传学和免疫信息学的全球参考数据库(http://www.imgt.org)。IMGT专门研究来自人类和其他脊椎动物的免疫球蛋白(IG)或抗体、T细胞受体(TR)、主要组织相容性(MH),以及来自脊椎动物和非脊椎动物的免疫球蛋白超家族(IgSF)、MH超家族(MhSF)和免疫系统相关蛋白。
在本申请中,术语“单克隆抗体”通常是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体,即集群中的个别抗体是相同的,除了可能存在的少量的自然突变。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且,与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体) 不同,各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外,单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成,不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征,并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如,本申请使用的单克隆抗体可以在杂交瘤细胞中制备,或者可以通过重组DNA方法制备。
在本申请中,术语“嵌合抗体”通常是指其中可变区源自一个物种,而恒定区源自另一个物种的抗体。通常,可变区源自实验动物诸如啮齿动物的抗体(“亲本抗体”),且恒定区源自人类抗体,使得所得嵌合抗体与亲本(例如小鼠来源)抗体相比,在人类个体中引发不良免疫反应的可能性降低。
在本申请中,术语“人源化抗体”通常是指非人抗体(例如小鼠抗体)的CDR区以外的部分或全部有的氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中,氨基酸的小的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的,只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中,可以将人免疫球蛋白(受体抗体)中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠,大鼠,家兔或非人灵长类动物)的CDR区残基替换。在某些情形中,可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外,人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能,诸如结合亲和力。
在本申请中,术语“全人源抗体”通常是指将人类编码抗体的基因转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中,使动物表达的抗体。抗体所有部分(包括抗体的可变区和恒定区)均由人类来源的基因所编码。
在本申请中,术语“结合”、“特异性结合”或“对…特异性的”通常是指可测量且可再现的相互作用,诸如抗原和抗体之间的结合,其可以确定在存在分子(包括生物学分子)的异质群体的情况中靶物的存在。例如,抗体通过其抗原结合域与表位结合,并且该结合需要抗原结合域和表位之间的一些互补性。例如,特异性结合靶物(其可以是表位)的抗体是以比其结合其它靶物更大的亲和力、亲合力、更容易和/或以更大的持续时间结合此靶物的抗体。当抗体相比于其将结合随机的、不相关的表位而言更容易通过其抗原结合域与表位结合时,抗体被称为“特异性结合”该抗原。
在本申请中,术语“KD”、“K
D”可互换地使用,通常是指平衡解离常数,“KD”是解离速率 常数(kdis,也称为“解离率(off-rate)(koff)”或“kd”)与结合速率常数(kon,也称为“结合率(kon)”或“ka”)的比值。可使用结合速率常数(kon)、解离速率常数(kdis)和平衡解离常数(K
D)表示抗原结合蛋白(例如抗体)对抗原的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法为本领域熟知,包括但不限于生物膜干涉技术(BLI)、放射免疫法(RIA)、平衡透析法、表面等离子共振(SPR)、荧光共振能量迁移(FRET)、免疫共沉淀(Co-IP)以及蛋白质芯片技术。如果在不同的条件(例如盐浓度、pH)下测量,则所测得的某种特定蛋白-蛋白相互作用的亲和力可不同。
在本申请中,术语“在……之间”通常是指某种氨基酸片段的C端与第一氨基酸片段的N端直接或间接连接,并且其N端与第二氨基酸片段的C端直接或间接连接。在轻链中,例如,所述L-FR2的N末端与所述LCDR1的C末端直接或间接相连,且所述L-FR2的C末端与所述LCDR2的N末端直接或间接相连。又例如,所述L-FR3的N末端与所述LCDR2的C末端直接或间接相连,且所述L-FR3的C末端与所述LCDR3的N末端直接或间接相连。在重链中,例如,所述H-FR2的N末端与所述HCDR1的C末端直接或间接相连,且所述H-FR2的C末端与所述HCDR2的N末端直接或间接相连。又例如,所述H-FR3的N末端与所述HCDR2的C末端直接或间接相连,且所述H-FR3的C末端与所述HCDR3的N末端直接或间接相连。
在本申请中,术语“分离的”抗原结合蛋白通常是指已经从其产生环境(例如,天然的或重组的)的组分中识别,分离和/或回收的抗原结合蛋白。其产生环境的污染组分通常是干扰其研究、诊断或治疗用途的物质,可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。分离的抗原结合蛋白或抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
在本申请中,术语“分离的核酸分子”或“分离的多核苷酸”通产是指基因组、mRNA、cDNA或合成来源的DNA或RNA或其一定组合,其不与在自然界中发现的多核苷酸的全部或一部分缔合,或连接至其在自然界中不连接的多核苷酸。
在本申请中,术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子,其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体,以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常,通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞,所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中,术语“细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或 载体,或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞、细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的、意外的或故意的突变,子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同,但能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌),也可以是真核细胞(例如酵母细胞,例如COS细胞,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,HeLa细胞,HEK293细胞,COS-1细胞,NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在某些情形中,所述细胞可以是哺乳动物细胞。例如,所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1细胞。在本申请中,术语“重组细胞”通常是指在其中引入了重组表达载体的细胞。所述重组宿主细胞不仅包括某种特定的细胞,还包括这些细胞的后代。
在本申请中,术语“药学上可接受的佐剂”通常包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂,它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常,生理学可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子可包括缓冲剂,抗氧化剂,亲水性聚合物,氨基酸,单糖,二糖和其它碳水化合物,螯合剂,糖醇,成盐反荷离子和/或非离子表面活性剂。
在本申请中,术语“TRAC”通常是指T细胞受体α恒定区。TRAC基因编码了TRAC蛋白质,其为TCR蛋白(T细胞受体)贡献了α链。人TRAC蛋白质的Entrez登录号为6955。
在本申请中,术语“免疫系统相关疾病”通常是指由免疫系统异常导致的症状和/或疾病。
在本申请中,术语“自身免疫疾病”通常是指自身抗原免疫耐受紊乱、机体对自身抗原发生免疫反应导致机体损害的一类疾病。所述自身免疫疾病(ADs)可以包括病变局限于某一特定器官的器官特异性ADs,也包括免疫反向造成的全身多器官和组织病理损伤的系统性ADs。在本申请中,所述自身免疫疾病可以包括类风湿性关节炎、干燥综合征、重症肌无力等。
在本申请中,术语“炎性疾病”通常是指以损伤或感染部位的局部炎症为特征的任何疾病或病症。例如,所述炎性疾病可以具备在局部组织部位产生不希望的免疫细胞积蓄的特征。
在本申请中,术语“哮喘(asthma)”通常是指一种肺部疾病,通常表现为呼吸困难和喘息反复发作。哮喘可能具备以下特征的一种或多种:可逆性气道阻塞,气道炎症和对多种刺激的气道反应性增高。哮喘的风险与遗传易感性和环境因素(例如室内外过敏原、烟雾、化学刺激物和/或空气污染)等相关。目前具有持续哮喘症状的患者必须每天使用长期药物控制潜在的感染病防止症状的出现和恶化。
在本申请中,术语“施用”通常是指向受试者(例如,患者)给予一定剂量的化合物(例如,抗癌治疗剂)或药物组合物(例如,包含抗癌治疗剂的药物组合物)的方法。施用可通 过任何合适的方式进行,包括肠胃外、肺内和鼻内,以及(如果局部治疗需要)损伤内施用。胃肠外输注包括例如肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。部分地根据施用是否为短暂的或长期的,给药可通过任何适合的途径进行,例如通过注射(诸如静脉内或皮下注射)进行。本文涵盖各种给药过程,包括但不限于单次施用或各种时间点内的多次施用、推注施用和脉冲输注。
在本申请中,术语“肿瘤”通常是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论恶性还是良性)以及所有癌前和癌性细胞和组织。
在本申请中,术语“实体瘤”通常是指可以通过临床检查(例如X线照射、CT扫描、B超或触诊等)手段检测到的有形的肿瘤。
在本申请中,术语“非实体瘤”通常是指无法通过临床检查(例如X线照射、CT扫描、B超或触诊等)手段检测到的肿瘤。例如,所述非实体瘤可以包括血液瘤。
在本申请中,术语“Germline序列”通常是指未重排的免疫球蛋白DNA序列的序列。
在本申请中,术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下,也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中,术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5%-10%的范围内变动,例如在指定数值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的范围内变动。
在本申请中,所述抗原结合蛋白每个重链或轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体中相应氨基酸序列同源,或者属于特定的类别。例如,轻链和重链的可变区及恒定部分均来自一个动物物种(如人)的抗体的可变区及恒定区。在本申请中,所述同源物可以为,与所述蛋白质和/或所述多肽(例如,特异性结合PD-L1蛋白的抗体或其片段)的氨基酸序列具有至少约85%(例如,具有至少约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。在本申请中,所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”:将两条待比对的序列在比较窗中进行比较,确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如,A、T、C、G)或相同氨基酸残基(例如,Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目,将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即,窗大小),并且将结果乘以100,以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对,可以按本领域已知的多种方式实现,例如,使用可公开获得的计算机软件如BLAST、 BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数,包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定:FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.),85:2444-2448,1988;和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”,Science,227:1435-1441,1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”,分子生物学杂志,215:403-410,1990。
发明详述
一方面,本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白,其可以具有下述性质中的一种或多种:
a)在Octet测定中,以约1.0*10
-12M以下(例如,可以为约1.0*10
-12M以下、约9.0*10
- 13M以下、约8.0*10
-13M以下、约7.0*10
-13M以下、约6.0*10
-13M以下、约5.0*10
-13M以下、约2.0*10
-13M以下、约1.0*10
-13M以下或更小)的K
D值特异性结合人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP);
b)在Octet测定中,以约4.0*10
-10M(例如,可以为约3.9*10
-10M以下、约3.8*10
-10M以下、约3.7*10
-10M以下、约3.6*10
-10M以下、约3.5*10
-10M以下、约3.4*10
-10M以下、约3.3*10
-10M以下、约1*10
-10M以下或更小)以下的K
D值特异性结合食蟹猴胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP);
c)在Biacore测定中,以约3.5*10
-11M以下(例如,可以为约3.3*10
-11M以下、约3.0*10
- 11M以下、约2.8*10
-11M以下、约2.6*10
-11M以下、约2.4*10
-11M以下、约2.2*10
-11M以下、约2.0*10
-11M以下、约1.8*10
-11M以下、约1.6*10
-11M以下、约1.4*10
-11M以下、约1.2*10
-11M以下、约1.0*10
-11M以下或更小)的K
D值特异性结合人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP);
d)在Biacore测定中,以约6.0*10
-10M以下(例如,可以为约5.8*10
-10M以下、约5.6*10
- 10M以下、约5.0*10
-10M以下、约2.0*10
-10M以下、约1.0*10
-10M以下、约8.0*10
-11M以下、约6.0*10
-11M以下、约4.0*10
-11M以下、约2.0*10
-11M以下或更小)的K
D值特异性结合食蟹猴胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP);
e)阻断人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)和人胸腺基质淋巴细胞生成素受体(TSLPR)结合;
f)抑制TSLP诱导PBMC释放T细胞受体α恒定区(TRAC);以及
g)抑制TSLP诱导表达TSLPR-IL7Rα复合物的细胞的增殖。
在本申请中,所述抗原结合蛋白(例如,抗体)是否结合人或食蟹猴胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)可使用本领域中已知的任何测定法确定。本领域中已知测定结合亲和力的分析的实例包括表面等离子共振(例如,BIACORE)或类似技术(例如,KinExa或OCTET)。
在本申请中,所述抗原结合蛋白(例如,抗体)可以阻断人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)和人胸腺基质淋巴细胞生成素受体(TSLPR)结合;或者,可以阻断食蟹猴TSLP和食蟹猴TSLPR结合。其中阻断实验可以使用竞争法进行检测,例如,将所述的抗原结合蛋白与抗原(例如TSLP)和抗原的配体(或表达配体的细胞,例如,配体可以为TSLPR)结合,根据可检测标记的强度(例如,荧光强度或浓度)反应抗原结合蛋白与抗原的配体竞争性结合抗原的能力。
在本申请中,所述的分离的抗原结合蛋白可以包含轻链可变区VL中的至少一个CDR,所述VL包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述的分离的抗原结合蛋白包含可以重链可变区VH中的至少一个CDR,所述VH包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述的分离的抗原结合蛋白可以包括抗体或其抗原结合片段。
例如,所述抗原结合片段可以包括Fab,Fab’,F(ab)2,Fv片段,F(ab’)2,scFv,di-scFv和/或dAb。
例如,所述抗体可以为人源化抗体。
在本申请中,所述VL可以包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述VL可以包含LCDR1,LCDR2和LCDR3,其中所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列:Lys Ala Ser Gln Ile Ile X
7X
8Glu Gly X
11X
12Tyr Met Asn,其中,X
7为Asp、Val或Tyr,X
8为Trp或Tyr,X
11为Asp或Glu,X
12为Ala或Ser。
例如,所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列:X
1Ala X
3X
4Leu X
6X
7,其中X
1为Ala或Gly;X
3为Arg或Ser;X
4为Asn或Tyr;X
6为Ala、Asp或Glu;X
7为Arg或Ser。
例如,所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:51中任一 项所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列:Gln Gln Ser Asp X
5Asp Pro Trp X
9。其中,X
5为Glu或Met;X
9为Asn或Thr。
例如,所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:46中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,上述CDR可以是根据Kabat定义规则确定的序列。
在本申请中,所述VL可以包括框架区L-FR1,L-FR2,L-FR3,和L-FR4。
在本申请中,所述L-FR1的C末端可以与所述LCDR1的N末端直接或间接相连,且所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列:Asp Ile X
3Leu Thr Gln Ser Pro X
9X
10Leu X
12X
13Ser X
15Gly X
17Arg X
19Thr Ile X
22Cys。其中,X
3为Gln或Val;X
9为Ala或Ser;X
10为Phe或Ser;X
12为Ala或Ser;X
13为Ala或Val;X
15为Leu或Val;X
17为Asp或Gln;X
19为Ala或Val;X
22为Ser或Thr。
例如,所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:34中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述L-FR2可以位于所述LCDR1与所述LCDR2之间,且所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列:Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly X
8X
9Pro Lys Leu Leu Ile Tyr。其中,X
8为Lys或Gln;X
9为Ala或Pro。
例如,所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:35中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述L-FR3可以位于所述LCDR2与所述LCDR3之间,且所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列:Gly X
2Pro X
4Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu X
18Ile X
20X
21X
22X
23X
24Glu Asp X
27Ala Thr Tyr Tyr Cys,其中X
2为Ile或Val,X
4为Ala或Ser,X
18为Asp或Thr,X
20为His或Ser,X
21为Pro或Arg,X
22为Leu或Val,X
23为Glu或Gln,X
24为Glu或Pro,X
27为Ala或Phe。
例如,所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:36中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述L-FR4的N末端可以与所述LCDR3的C末端直接或间接相连,且所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列:Phe Gly X
3Gly Thr Lys X
7Glu Ile Lys,其中X
3为Gly或Gln,X
7为Leu或Val。
例如,所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:37中任一项所示的氨基酸序 列。
在本申请中,所述VL可以包含SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列:Asp Ile X
3Leu Thr Gln Ser Pro X
9X
10Leu X
12X
13Ser X
15Gly X
17Arg X
19Thr Ile X
22Cys Lys Ala Ser Gln Ile Ile X
30X
31Glu Gly X
34X
35Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly X
46X
47Pro Lys Leu Leu Ile Tyr X
54Ala X
56X
57Leu X
59X
60Gly X
62Pro X
64Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu X
78Ile X
80X
81X
82X
83X
84Glu Asp X
87Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp X
97Asp Pro Trp X
101Phe Gly X
104Gly Thr Lys X
108Glu Ile Lys,
其中X
3为Gln或Val,X
9为Ala或Ser,X
10为Phe或Ser,X
12为Ala或Ser,X
13为Ala或Val,X
15为Leu或Val,X
17为Asp或Gln,X
19为Ala或Val,X
22为Ser或Thr,X
30为Asp、Val或Tyr,X
31为Trp或Tyr,X
34为Asp或Glu,X
35为Ala或Ser,X
46为Lys或Gln,X
47为Ala或Pro,X
54为Ala或Gly,X
56为Arg或Ser,X
57为Asn或Tyr,X
59为Ala、Asp或Glu,X
60为Arg或Ser,X
62为Ile或Val,X
64为Ala或Ser,X
78为Asp或Thr,X
80为His或Ser,X
81为Pro或Arg,X
82为Leu或Val,X
83为Glu或Gln,X
84为Glu或Pro,X
87为Ala或Phe,X
97为Glu或Met,X
101为Asn或Thr,X
104为Gly或Gln,X
108为Leu或Val。
例如,所述VL可以包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,例如,所述的分离的抗原结合蛋白可以包括抗体轻链恒定区,且所述抗体轻链恒定区可以包括人Igκ恒定区或人Igλ恒定区。
在本申请中,例如,所述VH可以包含HCDR1,HCDR2和HCDR3,所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列:Gly X
2Ser Leu Ser Thr Pro Gly X
9,其中X
2为Ala或Phe,X
9为Leu或Met。
例如,所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:47中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,例如,所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列:Tyr Trp Asp X
4X
5,其中X
4为Asp或Thr,X
5为Asp或Gly。
例如,所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:48中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,例如,所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列:Arg Gly Trp Tyr X
5X
6X
7X
8,其中X
5为Phe或Tyr,X
6为Phe或Tyr,X
7为Asp或Ser,X
8为His或Tyr。
例如,所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:49中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,例如,所述VH可以包括框架区H-FR1,H-FR2,H-FR3,和H-FR4。
在本申请中,所述H-FR1的C末端可以与所述HCDR1的N末端直接或间接相连,且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列:Gln Val X
3Leu X
5X
6X
7Gly X
9Gly X
11X
12Gln Pro X
15X
16X
17Leu X
19Leu X
21Cys X
23Phe Ser,其中,X
3为Gln或Thr,X
5为Lys或Val,X
6为Glu或Gly,X
7为Ala或Ser,X
9为Gly或Pro,X
11为Ile或Val,X
12为Leu或Val,X
15为Gly或Ser,X
16为Gln或Arg,X
17为Ser或Thr,X
19为Arg或Ser,X
21为Ser或Thr,X
23为Ala或Ser。
例如,所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:39中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,例如,所述H-FR2可以位于所述HCDR1与所述HCDR2之间,且所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列:Gly Val Ser Trp X
5Arg Gln X
8X
9Gly Lys Gly Leu Glu Trp X
16Ala His Ile,其中X
5为Ile或Val,X
8为Ala或Pro,X
9为Pro或Ser,X
16为Leu或Val。
例如,所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:40中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述H-FR3可以位于所述HCDR2与所述HCDR3之间,且所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列:X
1His Tyr X
4X
5Ser X
7Lys X
9Arg X
11Thr X
13Ser Lys Asp Ser Ser X
19Asn X
21Val X
23Leu X
25X
26X
27X
28X
29X
30X
31X
32Asp Thr Ala X
36Tyr Tyr Cys Ala Arg,其中X
1为Met或Arg,X
4为Ala或Asn,X
5为Asp或Pro,X
7为Ala或Leu,X
9为Gly或Ser,X
11为Phe或Leu,X
13为Ile或Leu,X
19为Ser或Thr,X
21为Gln或Thr,X
23为Phe或Leu,X
25为Lys或Gln,X
26为Ile或Met,X
27为Asn或Thr,X
28为Asn或Ser,X
29为Leu或Val,X
30为Asp或Arg,X
31为Ala或Thr,X
32为Glu或Thr,X
36为Thr或Val。
例如,所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述H-FR4的N末端可以与所述HCDR3的C末端直接或间接相连,且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列:Trp Gly X
3Gly Thr X
6X
7Thr Val Ser Ser,其中X
3为Gln或Arg,X
6为Leu或Thr,X
7为Leu或Val。
例如,所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:43中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述VH可以包含SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列:Gln Val X
3Leu X
5X
6X
7Gly X
9Gly X
11X
12Gln Pro X
15X
16X
17Leu X
19Leu X
21Cys X
23Phe Ser Gly X
27Ser Leu Ser Thr Pro Gly X
34Gly Val Ser Trp X
39Arg Gln X
42X
43Gly Lys Gly Leu Glu Trp X
50Ala His Ile Tyr Trp Asp X
57X
58X
59His Tyr X
62X
63Ser X
65Lys X
67Arg X
69Thr X
71Ser Lys Asp Ser Ser X
77Asn X
79Val X
81Leu X
83X
84X
85X
86X
87X
88X
89X
90Asp Thr Ala X
94Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Trp Tyr X
104X
105X
106X
107Trp Gly X
110Gly Thr X
113X
114Thr Val Ser Ser,
其中X
3为Gln或Thr,X
5为Lys或Val,X
6为Glu或Gly,X
7为Ala或Ser,X
9为Gly或Pro,X
11为Ile或Val,X
12为Leu或Val,X
15为Gly或Ser,X
16为Gln或Arg,X
17为Ser或Thr,X
19为Arg或Ser,X
21为Ser或Thr,X
23为Ala或Ser,X
27为Ala或Phe,X
34为Leu或Met,X
39为Ile或Val,X
42为Ala或Pro,X
43为Pro或Ser,X
50为Leu或Val,X
57为Asp或Thr,X
58为Asp或Gly,X
59为Met或Arg,X
62为Ala或Asn,X
63为Asp或Pro,X
65为Ala或Leu,X
67为Gly或Ser,X
69为Phe或Leu,X
71为Ile或Leu,X
77为Ser或Thr,X
79为Gln或Thr,X
81为Phe或Leu,X
83为Lys或Gln,X
84为Ile或Met,X
85为Asn或Thr,X
86为Asn或Ser,X
87为Leu或Val,X
88为Asp或Arg,X
89为Ala或Thr,X
90为Glu或Thr,X
94为Thr或Val,X
104为Phe或Tyr,X
105为Phe或Tyr,X
106为Asp或Ser,X
107为His或Tyr,X
110为Gln或Arg,X
113为Leu或Thr,X
114为Leu或Val。
例如,所述VH可以包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,例如,所述的分离的抗原结合蛋白可以包括抗体重链恒定区,且所述抗体重链恒定区可以包括人IgG恒定区,或可以包括IgY恒定区。
在本申请中,例如,所述的分离的抗原结合蛋白可以包括抗体重链恒定区,且所述抗体重链恒定区可以包括人IgG4恒定区。在本申请中,编码所述人IgG4恒定区的基因可以如NCBI数据库的Gene ID:3503所示。在本申请中,所述人IgG4恒定区可以进一步包含氨基酸突变(例如,可以包含S228P突变,即第228位的氨基酸S突变为P)。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区CDR——LCDR1、LCDR2和LCDR3,所述LCDR1可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列,所述LCDR2可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列,且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区CDR——LCDR1、LCDR2和LCDR3,所述LCDR1可包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列,所述LCDR2可包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列,且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区CDR——LCDR1、LCDR2和LCDR3,所述LCDR1可包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列,所述LCDR2可包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列,且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区CDR——HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述HCDR1可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,所述HCDR2可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列,且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区CDR——HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述HCDR1可包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列,所述HCDR2可包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列,且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3,所述HCDR1可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,所述HCDR2可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列,且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列,所述LCDR1可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列,所述LCDR2可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列,且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3,所述HCDR1可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,所述HCDR2可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列,且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列,所述LCDR1可包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列,所述LCDR2可包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列,且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3,所述HCDR1可包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列,所述HCDR2 可包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列,且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列,所述LCDR1可包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列,所述LCDR2可包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列,且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
例如,所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL,所述VH可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列,且所述VL可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。该分离的抗原结合蛋白可称为29G2-2H5。
例如,所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL,所述VH可包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列,且所述VL可包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。该分离的抗原结合蛋白可称为JYB1909Am09。
例如,所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL,所述VH可包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列,且所述VL可包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。该分离的抗原结合蛋白可称为JYB1909Am34。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白还可以与参比抗体竞争结合人TSLP,其中所述参比抗体可包含重链可变区和轻链可变区,所述参比抗体的重链可变区可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述HCDR1可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,所述HCDR2可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列,且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列,所述LCDR1可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列,所述LCDR2可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列,且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白还可以与参比抗体竞争结合人TSLP,其中所述参比抗体可包含重链可变区和轻链可变区,所述参比抗体的重链可变区可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述HCDR1可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,所述HCDR2可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列,且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列,所述LCDR1可包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列,所述LCDR2可包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列,且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白还可以与参比抗体竞争结合人TSLP,其中所述参比抗体可包含重链可变区和轻链可变区,所述参比抗体的重链可变区可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述HCDR1可包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列,所述HCDR2 可包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列,且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列,所述LCDR1可包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列,所述LCDR2可包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列,且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
核酸、载体、宿主细胞和制备方法
另一个方面,本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子。
所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述的抗原结合蛋白。例如,所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述抗原结合蛋白,也可以编码其中的一部分(例如,HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、轻链或重链中的一种或多种)。本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如,其可以是通过以下方法产生或合成的:(i)在体外扩增的,例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的,(ii)通过克隆重组产生的,(iii)纯化的,例如通过酶切和凝胶电泳分级分离,或者(iv)合成的,例如通过化学合成。在某些实施方式中,所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。在本申请中,可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述抗体、其抗原结合片段的核酸,这些方法包括但不限于,采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR,具体操作可参见Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989;和Ausube等人Current Protocol sin Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York N.Y.,1993。
另一个方面,本申请提供了一种或多种载体,其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外,所述载体中还可包含其他基因,例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外,所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的,例如,可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中,所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化,但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列,例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如,5’非转录表达控制序列可包含启动子区,启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。所述表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。所述载体可以包括,例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如,所述载体为表达载体。
另一个方面,本申请提供了一种细胞,所述细胞可包含本申请所述的一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种载体。在某些实施方式中,每种或每个细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中,每种或每个细胞可包含多个(例如,2个或以上)或多种(例如,2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如,可将本申请所述的载体引入所述细胞中,例如真核细胞,如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述细胞中,例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。
另一方面,本申请提供一种制备本申请所述的分离的抗原结合蛋白的方法,所述方法包括在使得本申请所述的分离的抗原结合蛋白表达的条件下,培养本申请所述的细胞。
例如,可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等,这些方法是本领域普通技术人员所了解的。在某些情形中,所述方法还可包括分离和/或纯化所述抗体或其抗原结合片段的步骤。例如,可以采用蛋白G-琼脂糖或蛋白A-琼脂糖进行亲和层析,还可通过凝胶电泳和/或高效液相色谱等来纯化和分离本申请所述的抗体或其抗原结合片段。例如所述纯化的方法可以包括以下的步骤:采用蛋白质A柱上的亲和力捕获,然后滴定。又例如,所述纯化可以采用蛋白质G柱上的亲和力捕获,然后HPLC滴定。又例如例如,所述纯化可以采用IgE柱上的亲和力捕获,然后滴定。所述纯化还可以包括一个或多个过滤步骤,所述过滤可以包括透滤和/或HPLC过滤。
药物组合物、方法、用途
另一方面,本申请提供一种药物组合物,其包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞,以及任选地药学上可接受的佐剂。
本申请所述的药物组合物可以用于治疗预防、缓解和/或治疗免疫系统相关疾病或肿瘤,其中所述免疫系统相关疾病包括自身免疫疾病或炎性疾病。
本申请的药物组合物可以含有安全有效量(如0.001-99wt%,0.01-90wt%,或0.1-80wt%)的本申请所述的抗原结合蛋白以及药学上可接受的佐剂(可包括载体或赋形剂)。这类载体可以包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本申请所述的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。此外,本申请所述的抗原结合蛋白还可与其他治疗剂一起使用。本文所述的抗原结合蛋白或药物组合物可以符合良好医疗实践的方式配制、给 药和施用。在此情形下的考虑因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、单个患者的临床病状、病症的病因、药剂递送部位、施用方法和医学从业者已知的其他因素。治疗剂(例如,本申请所述的分离的抗原结合蛋白)无需但任选地与一种或多种当前用来预防或治疗所考虑的病症的药剂一起配制和/或同时施用。此类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的治疗剂(例如,本申请所述的分离的抗原结合蛋白)的量、病症或治疗的类型以及以上论述的其他因素。这些药剂通常可以凭经验/临床上确定为适当的任何剂量且通过凭经验/临床上确定为适当的任何途径加以使用。与单个治疗相比,可减少组合治疗中施用的抗体的剂量。通过常规技术易于监测此疗法的进展。
另一方面,本申请提供一种本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物在制备药物中的用途,所述药物用于预防、缓解和/或治疗免疫系统相关疾病或肿瘤,其中所述免疫系统相关疾病包括自身免疫疾病或炎性疾病。例如,所述免疫系统相关疾病可以包括哮喘。例如,所述肿瘤可以包括实体瘤和非实体瘤。
另一方面,本申请提供了一种预防、缓解和/或治疗免疫系统相关疾病或肿瘤的方法,其包括以下的步骤:向有需要的受试者施用有效剂量的本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物,其中所述免疫系统相关疾病包括自身免疫疾病或炎性疾病。例如,所述免疫系统相关疾病可以包括哮喘。例如,所述肿瘤可以包括实体瘤和非实体瘤。
另一方面,本申请提供了所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物,其可以用于预防、缓解和/或治疗免疫系统相关疾病或肿瘤,其中所述免疫系统相关疾病包括自身免疫疾病或炎性疾病。例如,所述免疫系统相关疾病可以包括哮喘。例如,所述肿瘤可以包括实体瘤和非实体瘤。
另一方面,本申请提供一种检测样品中胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的存在和/或含量的方法,其包括以下的步骤:施用本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
另一方面,本申请提供一种抑制胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)与TSLP受体结合的方法,其包括以下的步骤:施用本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
本申请的抗原结合蛋白可用于检测应用,例如用于针对样本中TSLP的定性和/或定量分析,从而可能可以提供诊断信息。例如,本申请所述的分离的抗原结合蛋白和/或方法,可以用于对受试者(例如哮喘患者)的标本(例如,咽拭子检测样品,例如血清、全血、痰液、口腔/鼻咽分泌物或洗液和组织标本)进行检测,作为疗效观察的指标。例如,本申请所述的分离的抗原结合蛋白和/或方法,可以为治疗性干预提供监测方案。在本申请中,所采用的样本 (样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本申请使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本申请中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。例如,所述样本可以包括固定的或保存的细胞或组织样本。
另一方面,本申请还提供了一种指含有本申请的抗原结合蛋白的试剂盒。在某些情形中,所述的试剂盒还可以包括容器、使用说明书、缓冲剂等。例如,本申请的抗原结合蛋白可以固定于检测板。
不欲被任何理论所限,下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的抗原结合蛋白、制备方法和用途等,而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1 重组蛋白制备及抗体鉴定细胞株构建
1.重组蛋白制备
人TSLP-mFc蛋白:在人293细胞(HEK293)中表达重组人TSLP-mFc融合蛋白。为避免弗林蛋白酶对TSLP蛋白的切割,分别构建弗林蛋白酶识别位点突变或/和删除的人TSLP-Linker-V1(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)、人TSLP-Linker-V2(其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)以及食蟹猴TSLP-Linker-V4(其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)。同时,在这些重组蛋白的C末端带有鼠抗体IgG2a的Fc片段(其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)或His-FLAG标签(其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)。
为了鉴定杂交瘤上清和制备抗体具有中和TSLP的活性,构建了TSLPR+(GGS)20+IL7R重组蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示),在该重组蛋白的C末端带有鼠抗体IgG2a的Fc片段(其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)。
上述重组蛋白委托南京金斯瑞生物科技有限公司构建、表达及纯化。
重组全长人TSLP蛋白购自北京义翘神州科技股份有限公司(货号:51005-M08H)。
同型对照抗体:anti-HEL-Human IgG4(S228P)Isotype-control购自泰州市百英生物科技有限公司(货号:B107804)。
2.抗体鉴定细胞株BAF3-TSLPR/IL-7R的构建
将人TSLPR基因(Gene ID:64109)及人IL-7Rα基因(Gene ID:23765)共转染BAF3细胞系,构建稳定表达人类TSLPR-IL7Rα复合物的单克隆细胞株。该稳定细胞株委托上海吉凯基因科技有限公司完成。
实施例2 杂交瘤单克隆抗体的制备
1.小鼠免疫
初次免疫时,使用完全弗氏佐剂依照1:1的比例将实施例1制备的人TSLP-Linker-V1进行乳化,然后通过皮下及腹腔注射至6~8周龄雌性Balb/c小鼠,50μg/只;之后间隔两周进行加强免疫,每只小鼠皮下及腹腔注射50μg蛋白加弗氏不完全佐剂。共计免疫4次,最后一次免疫一周后取小鼠尾血,测定血清抗人TSLP抗体滴度。经小鼠腹腔注射不加弗氏佐剂的50μg蛋白冲击免疫后,第三天取小鼠脾脏细胞。
2.脾细胞融合
小鼠安乐死后,解剖、取脾、研磨并收集细胞,1500rpm,5min离心,收集细胞,用5毫升红细胞裂解液悬浮细胞,4℃放置5分钟,用DMEM+10%FBS终止反应,计数。离心后用40mL DMEM悬浮细胞,静置2~3min后转移上清到另外一个50毫升离心管中。收集SP2/0细胞,按SP2/0:脾细胞=1:5的细胞数比例混合,离心,充分吸取上清后,拍松,混合细胞沉淀,用DMEM洗涤混合细胞两次,依照常规方法进行PEG融合。融合后,用DMEM培养基洗涤细胞并将其重悬于DMEM+10%FBS+1×HAT的筛选培养基中。将融合后的细胞加入96孔细胞培养板内,置37℃、湿度75%、5%CO
2培养箱内培养9~10天。
3.杂交瘤单克隆抗体的筛选
用PBS稀释重组全长人TSLP蛋白(北京义翘神州科技股份有限公司,货号:51005-M08H)至1.0μg/mL,加入高结合透明聚苯乙烯96孔板(Nunc)内,100μL/孔,置4℃包被过夜。第二天将ELISA板在自动洗板机上用洗涤缓冲液(PBS+0.05%吐温20(sigma))洗涤二次。每孔加入300μL封闭缓冲液(PBS+0.05%吐温20(sigma)+1%BSA),置室温封闭1小时。然后在自动洗板机上用洗涤缓冲液洗涤二次,将100μL杂交瘤上清转移至ELISA板各孔内,置室温孵育1小时,然后依照上述方法洗板3次。每孔加入100μL在封闭缓冲液中1:5000稀释的Goat Anti-mouse-HRP(Sigma,货号:M4280)。置室温孵育1小时,然后依照上述方法洗板3次。加入TMB底物液,100μL/孔,然后每孔加入100μL1.0M盐酸终止液终止反应。在Thermo Multiscan FC上在450nm处读板。
通过结合实验,筛选到杂交瘤克隆抗体29G2-2-H5、83B1-G2和104G11-H5,采用无血清培养及常规抗体纯化的方法制备杂交瘤单克隆抗体进行抗体功能确认。
实施例3 杂交瘤单克隆抗体的鉴定
1.ELISA鉴定杂交瘤单克隆抗体结合人TSLP功能
用PBS稀释重组全长人TSLP蛋白(北京义翘神州科技股份有限公司,货号:51005-M08H)至1.0μg/mL,加入高结合透明聚苯乙烯96孔板(Nunc)内,100μL/孔,置4℃包被过夜。第二天将ELISA板在自动洗板机上用洗涤缓冲液(PBS+0.05%吐温20(sigma))洗涤二次。每孔加入300μL封闭缓冲液(PBS+0.05%吐温20(sigma)+1%BSA),置室温封闭1小时。然后在自动洗板机上用洗涤缓冲液洗涤二次,将1000μL杂交瘤上清转移至ELISA板各孔内,置室温孵育1小时,然后依照上述方法洗板3次。每孔加入100μL在封闭缓冲液中1:5000稀释的Goat Anti-mouse-HRP(Sigma,货号:M4280)。置室温孵育1小时,然后依照上述方法洗板3次。加入TMB底物液,100μL/孔,然后每孔加入100μL1.0M盐酸终止液终止反应。在Thermo Multiscan FC上在450nm处读板。利用软件作图并计算EC50。结果如图1所示。
图1中,A-C分别代表杂交瘤单克隆抗体29G2-2-H5、83B1-G2和104G11-H5的试验结果。其中杂交瘤单克隆抗体29G2-2-H5、83B1-G2和104G11-H5的EC50值依次为0.4654、0.3765和0.4445。
2.ELISA鉴定杂交瘤单克隆抗体阻断人TSLP与TSLPR+(GGS)20+IL7R-Fc结合功能
用PBS稀释重组全长人TSLP蛋白与实施例1制备的TSLPR+(GGS)20+IL7R-Fc至1.0μg/mL,加入高结合透明聚苯乙烯96孔板(Nunc)内,100μL/孔,置4℃包被过夜。第二天将ELISA板在自动洗板机上用洗涤缓冲液(PBS+0.05%吐温20(sigma))洗涤二次。每孔加入300μL封闭缓冲液(PBS+0.05%吐温20(sigma)+1%BSA),置室温封闭1小时。然后在自动洗板机上用洗涤缓冲液洗涤二次。用封闭缓冲液将待选的杂交瘤克隆进行系列稀释后等体积加入已稀释至0.2μg/mL的实施例1制备的人TSLP-His-FLAG中,使抗体终浓度分别为2000ng/mL、400ng/mL、80ng/mL。混匀后加入上述包被ELISA板内,100μL/孔。置室温孵育1小时,然后依照上述方法洗板3次。每孔加入100μL在封闭缓冲液中1:5000稀释的Mouse Anti-FLAG-HRP(Sigma,货号:A8592)。置室温孵育1小时,然后依照上述方法洗板3次。加入TMB底物液,100μL/孔,然后每孔加入100μL1.0M盐酸终止液终止反应。在Thermo Multiscan FC上在450nm处读板。利用软件作图并计算EC50。图2所示,其中A-C分别代表杂交瘤单克隆抗体29G2-2-H5、83B1-G2和104G11-H5的试验结果。
3.Octet Red测定纯化后TSLP杂交瘤单克隆抗体与生物素化的人或食蟹猴TSLP的亲和力
1)采用Octet Red(Fortebio)分别测定杂交瘤单克隆抗体29G2-2-H5、83B1-G2和104G11-H5与抗原生物素化的人TSLP(biotin-hTSLP,厂家:Acro,货号:TSP-H82Eb)和生物化的食蟹猴TSLP(biotin-Cyno TSLP)的亲和力,利用解离速率进行排序;
2)抗原和抗体的稀释:使用PBST缓冲液(1xPBS,0.02%吐温20)稀释,抗原和抗体的使 用浓度分别为66.7nM和50nM;
3)样品上机检测(Octet Data Acquisition 11.1.0.11),首先,将样品加入96孔板(Greiner bio-one,655209),体系为200μL/孔。然后设置软件参数,板温设定为30℃,收集标准动力学信号的频率为5.0HZ。接着用PBST缓冲液预湿SA sensor(Fortébio,18-0009)10分钟,然后上机检测。每个循环包含以下步骤:(1)浸入缓冲液60s;(2)抗原固化在SA传感器上,时间为75s;(3)传感器浸入缓冲液180s;(4)抗原与50nM的抗体结合,时间180s;(6)抗原抗体的解离,时间10分钟;
4)数据分析采用Fortebio的Data Analysis 11.1软件,对抗原-抗体以1:1的结合方式,测定结合速率(Ka)和解离速率(Kd),以此计算单克隆Anti-TSLP的平衡解离常数(KD)。结果见表1所示。
表1 杂交瘤单克隆抗体与生物素化的人或食蟹猴TSLP的亲和力
4.纯化后杂交瘤单克隆抗体抑制人TSLP诱导PBMC释放TARC的实验
新鲜的人PBMC购自ALLCELLS公司。先将PBMC 400g离心10min,然后用含有10%FBS(Thermo Fisher,10099-141)和1×Pen Strep(Thermo Fisher,15140-122)的新鲜RPMI 1640培养基(Thermo Fisher,A10491-01)重悬,按每孔1×10
6个细胞(每孔100μL)铺至96孔板中(Corning,3599)。每孔加入50μL梯度稀释的杂交瘤单克隆抗体29G2-2-H5、83B1-G2或104G11-H5(终浓度10μg/mL起始,5倍梯度稀释,最后一个孔抗体浓度为0,共8个点),与PBMC在37℃共孵育30min。
随后加入50μL工作浓度为1ng/mL的rhTSLP蛋白(Biolegend,582408),37℃,5%CO
2,孵育24小时后,300g离心5min收集细胞上清。最后用Human TARC的ELISA试剂盒(R&D,SDN00)检测细胞上清中TARC的浓度。结果见表2所示。
表2 纯化后杂交瘤单克隆抗体抑制人TSLP诱导PBMC释放TARC
抗体编号 | IC50(nM) |
29G2-2 H5 | 0.0699 |
83B1 G2 | 0.3360 |
104G11 H5 | 0.1033 |
通过实施例3的上述功能鉴定,选择29G2-2 H5作为鼠源候选抗体进行人源化改造。
其中,29G2-2 H5的氨基酸序列如表3所示。
表3 29G2-2 H5的氨基酸序列
序列名称 | 序列编号 | 序列名称 | 序列编号 |
HCDR1 | SEQ ID NO:11 | LCDR1 | SEQ ID NO:14 |
HCDR2 | SEQ ID NO:12 | LCDR2 | SEQ ID NO:15 |
HCDR3 | SEQ ID NO:13 | LCDR3 | SEQ ID NO:16 |
重链可变区 | SEQ ID NO:9 | 轻链可变区 | SEQ ID NO:10 |
实施例4 杂交瘤单克隆抗体的人源化
1.通过序列比对挑选最同源的人Germline序列(数据来源:IMGT)作为人源化设计框架(轻链以IGKV3D-11*02(其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示)或IGKV1-39*02(其氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示)或IGKV1D-43*01(其氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示),IGKJ1*01(其氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示)或IGKJ4*02(其氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示)为框架;重链以IGHV2-5*08(其氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示),IGHV2-70D*14(其氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示)或IGHJ2*01(其氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示)为框架),对抗体轻重链可变区进行Chothia编号(参见Chothia&Lesk,1987)定义抗体CDR区:CDRL1(L24-L34,即表示VL的第24-34位氨基酸),CDRL2(L50-L56),CDRL3(L89-L97),CDRH1(H26-H32,即表示VH的第26-32位氨基酸),CDRH2(H52-H56),CDRH3(H95-H97),根据序列比对和可变区结构信息对抗体轻重链可变区氨基酸进行人源化突变。
2.设计表达载体,基因合成,哺乳细胞表达纯化重组抗体,比较人源化改造后抗体活性,理化性质的差异,进行1-2轮人源化优化;
3.以上述Germline抗体为框架进行CDR移植,获得以下的嵌合抗体的可变区氨基酸序列:
轻链可变区序列1909M2hzL14(其氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示),其中的FR1-FR4的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:34-37所示。
重链可变区序列1909V3hzH18(其氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示),其中的FR1-FR4的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:43所示。
4.重组抗体表达和纯化
设计上述人源化优化氨基酸序列后,将其分别进行密码子优化,并合成对应的DNA基因片段(Genscript),扩增合成的所述基因片段到表达载体pcDNA3.4(Life Technologies)。表达质粒扩增和质粒抽提后双质粒共转ExpiCHO细胞(ThermoFisher Scientific,A29133),根据 供应商ExpiCHO表达系统方法进行抗体瞬转表达,过程如下:在培养总体积25mL培养基中,36.5℃,8%二氧化碳浓度下培养ExpiCHO细胞至密度为6×10
6/mL,使用ExpiFectamine转染试剂化转各10μg抗体轻重链表达质粒到细胞;转染一天后,各取150μL和4mL ExpiCHO增强剂和ExpiCHO辅料添加到培养细胞中,继续培养至9天,4℃,3500转离心取上清。混合AmMagTM Protein A磁珠(Genscript,L00695)和抗体表达上清,室温孵育2小时,PBS洗涤两次弃上清,加入适量洗脱缓冲液Protein G or A SefinoseTMElution buffer(Sangon,C600481),充分混匀后置于试管架上静止孵育5分钟,孵育期间重悬磁珠2~3次,重复洗脱2次,洗脱后,立即加入适量中和液1M Tris-HCl,pH7.5(Sangon,B548124)中和备用。
通过阻断实验和结合实验,选择将上述轻链可变区序列1909M2hzL14和重链可变区序列1909V3hzH18组合为人源化抗体AB1909L14H18。
实施例5 人源化抗体的亲和力成熟
5.1人源化抗体的亲和力成熟
将人源化抗体AB1909L14H18继续进行亲和力成熟改造。
首先将表达该抗体轻链可变区和重链可变区的基因分别进行密码子优化,将优化后的合成基因插入酵母展示载体中,并在转入酵母表达(例如在酵母表面展示1909M2hzL14、1909V3hzH18的Fab区)。对表达抗体的酵母细胞与人或食蟹猴TSLP结合水平的微毛细管细胞分析平台的进行流式分析。流式分析验证了人源化抗体AB1909L14H18能够在酵母细胞表面展示其Fab区,且与人或食蟹猴TSLP有效结合(结果如图3所示)。
在此基础上,对人源化抗体AB1909L14H18的CDR区的氨基酸进行突变,设计突变文库经过筛选,以获得更高亲和力的突变体。按Chothia编码规则对人源化抗体AB1909L14H18的轻、重链可变区氨基酸进行编码,CDR区按Chothia定义,突变各CDR内标氨基酸,构建NNK突变文库。
以获得的各CDR突变的质粒为模板,通过PCR将重链或轻链不同CDR的突变组合,构建组合突变文库。对所有突变序列的克隆进行流式染色,经过流式分析后,根据各克隆的结合力系数,挑选与人和食蟹猴猴TSLP结合能力强的亲和力成熟抗体进行表达。
获得的亲和力成熟抗体JYB1909Am09、JYB1909Am34的氨基酸序列表4-表5所示。
表4 JYB1909Am09的氨基酸序列
序列名称 | 序列编号 | 序列名称 | 序列编号 |
HCDR1 | SEQ ID NO:11 | LCDR1 | SEQ ID NO:44 |
HCDR2 | SEQ ID NO:12 | LCDR2 | SEQ ID NO:45 |
HCDR3 | SEQ ID NO:13 | LCDR3 | SEQ ID NO:46 |
重链可变区 | SEQ ID NO:38 | 轻链可变区 | SEQ ID NO:52 |
表5 JYB1909Am34的氨基酸序列
序列名称 | 序列编号 | 序列名称 | 序列编号 |
HCDR1 | SEQ ID NO:47 | LCDR1 | SEQ ID NO:50 |
HCDR2 | SEQ ID NO:48 | LCDR2 | SEQ ID NO:51 |
HCDR3 | SEQ ID NO:49 | LCDR3 | SEQ ID NO:46 |
重链可变区 | SEQ ID NO:54 | 轻链可变区 | SEQ ID NO:53 |
5.2亲和力成熟抗体的亲和力检测
1)根据His捕获试剂盒2(GE Healthcare,货号:29-2346-02)的操作说明将anti-his抗体偶联到CM5芯片上(GE Healthcare,货号:BR-1005-30)上;
2)抗体与抗原的亲和力测定。使用HBS-EP+作为实验缓冲液。每个进样循环测定一种浓度的所述亲和力成熟抗体JYB1909Am09、JYB1909Am34与被捕获抗原间的结合,每个循环包括捕获抗原、不同浓度抗体的进样及再生。以10μL/min的流速,将人TSLP(ACRO,货号:TSP-H52Ha)或者食蟹猴TSLP(ACRO,货号:TSP-C52H4)捕获在2通道上,捕获时间60s,1通道作为空白参考通道。以30μL/min的流速,将逐级稀释的抗体(10nM,5nM,2.5nM,1.25nM,0.625nM,0.3125nM,0.15625nM,0nM)依次进样于1,2通道,测定结合及解离。以10μL/min的流速,用再生缓冲液(10mM甘氨酸缓冲液,pH1.5)进行芯片再生以去除被捕获的抗原及抗体。
3)数据分析:使用Biacore 8K分析软件对数据进行分析。软件分析所用的模型为1:1binding。结果如表6所示。
其中Tezepelumap作为对照抗体,其重链氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示;轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
表6 亲和力成熟抗体与人及食蟹猴TSLP的结合
5.3亲和力成熟抗体阻断人TSLP与TSLPR+(GGS)20+IL7R-Fc结合功能
利用实施例3.2的方法检测亲和力成熟抗体JYB1909Am09、JYB1909Am34阻断人TSLP与TSLPR+(GGS)20+IL7R-Fc结合功能,结果如图4所示。在图4中,不同图标表示不同的施用剂量(2000ng/mL、400ng/mL和80ng/mL),A-D分别表示亲和力成熟抗体JYB1909Am09、JYB1909Am34、对照抗体Tezepelumap和同型对照抗体anti-HEL-Human IgG4(S228P)的结果。
5.4亲和力成熟抗体抑制rhTSLP诱导人PBMC释放TARC
利用实施例3.4的方法检测亲和力成熟抗体JYB1909Am09、JYB1909Am34抑制rhTSLP诱导人PBMC释放TARC功能,结果如图5所示。在图5中,A-D分别表示亲和力成熟抗体JYB1909Am09、JYB1909Am34、对照抗体Tezepelumap和同型对照抗体anti-HEL-Human IgG4(S228P)的结果,即其IC50值分别依次为0.02933、0.01261、1.932和3.5E+12。
5.5亲和力成熟抗体抑制rhTSLP诱导BAF3-TSLPR/IL-7R增殖实验
高表达稳转人TSLPR及人IL7Ra并外源施加TSLP后,TSLP蛋白与Baf3-TSLPR/IL-7R细胞上的受体复合物结合,从而促进细胞增殖,加入CellTiter反应底物时荧光信号值增加;当TSLP抗体(即亲和力成熟抗体JYB1909Am09、JYB1909Am34)存在时,其与TSLP结合,导致细胞增殖被抑制,此时加入celltiter反应底物的荧光信号值降低。
细胞准备:将BAF3-TSLPR/IL-7R细胞转移至50ml离心管中,300g离心5min,弃上清,加入20mL 1640空白培养基进行重悬,300g离心5min,弃上清(洗掉残余的IL-3蛋白)。最后使用1640分析培养基重悬细胞,根据细胞计数结果使用分析培养基调整细胞密度1×10
5/mL,将细胞悬液转移至加样槽中,使用多道移液器按照50μL/孔加入到96孔板中(铺96孔整板可配制7mL的细胞悬液)。
样品制备:根据样品的浓度,使用分析培养基预稀释至400μg/mL,2.5倍梯度稀释,终浓度分别为400μg/mL,160μg/mL,64μg/mL,25.6μg/mL,10.24μg/mL,4.096μg/mL,1.638μg/mL,0.655μg/mL,0.262μg/mL,0.105μg/mL和0.042μg/mL共10个浓度点,同时设置只加分析培养基的Blank孔,每个浓度设置2复孔。
在抗体孵育期间,将Cell
Assay System(提前配制反应液,将底物A和底物溶解液B解冻后进行混合)取出使其温度恢复至室温。取出细胞培养板,置于室温放置5~10min,然后每孔加入100μL Bio-Glo
TM Reagent,避光孵育5~10min,使用多功能酶标仪 读取化学发光信号值。
实验结果如图6所示,其中A-C分别表示对照抗体Tezepelumap、亲和力成熟抗体JYB1909Am09和JYB1909Am34。由图6的结果可知亲和力成熟抗体JYB1909Am09、JYB1909Am34能够抑制rhTSLP诱导BAF3-TSLPR/IL-7R增殖作用。
实施例6 在人源化FcRn小鼠模型中药代动力学(PK)研究
以人源化FcRn小鼠为受试动物,分别研究亲和力成熟抗体JYB1909Am09、JYB1909Am34和对照抗体Tezepelumap单次皮下给药后的药代动力学指标。
所有动物实验方案获得了IACUC审阅和批准。hFcRn小鼠采购自北京百奥赛图,雄性,6~8周龄,体重23~26g,饲养于SPF级动物房,标准颗粒饲料喂养,自由进食及饮水,室温18~24℃,相对湿度40%~50%,每日12小时昼夜交替。实验动物共12只,随机分为三组,每组四只动物,皮下单次给药,给药剂量为10mg/kg,给药体积为10mL/kg。采血时间点为给药前,给药后2小时,6小时,24小时(第1天),第2天,第3天,第4天,第7天,第10天,第14天,第21天,第28天,第35天和第42天。通过脸颊穿刺采集全血60μL/只至EP管中,室温静置30min,然后离心(2000g,4℃,5min)分离血清,每个样品分装为2份(检测管和备份管),10μL/管,置于-80℃保存。
利用Elisa间接法检测,分析三种抗体不同时间点药代动力学。包被抗原为抗人TSLP-His-FLAG,2μg/ml,100μl/孔,37℃,2h。洗板后用200μl/孔封闭液4℃过夜。血清样本加样,50μl/孔,37℃,1小时。检测抗体为鼠抗人Fab HRP(1:10000)(Abcam,货号:ab87422),100μl/孔,37℃,0.5小时。TMB显色液(KPL,货号:52-00-03)显色,酶标仪(Molecular Devices,SpectraMax M3)读值OD450。根据标曲获得药物浓度,PK Solver非房室进行数据处理获得PK参数。
结果如图7所示,其中A-C分别表示Tezepelumap、JYB1909Am09和JYB1909Am34。给药Tezepelumap后,半衰期(t1/2)=8.9天,最高浓度(Cmax)为93499.79ng/ml;给药JYB1909Am09后,半衰期(t1/2)=9.6天,最高浓度(Cmax)为54240.86ng/ml;给药JYB1909Am34后半衰期(t1/2)=2.8天,最高浓度(Cmax)为21884.6ng/ml。
实施例7 食蟹猴哮喘疾病模型中的药效学研究
以食蟹猴(Cynomolgus monkey)为受试动物,研究了亲和力成熟抗体JYB1909Am09和对照抗体Tezepelumap在食蟹猴哮喘疾病模型中的药效,动物实验方案获得了IACUC批准。动物采购自海南灵长实验动物开发有限公司,雄性,体重3~7kg,年龄3~7周岁,动物单只 饲养于动物笼中,可自由进水,每天给动物提供两次饲料。动物经过敏原皮试后选定16只,每组4只,分别给与同型对照抗体anti-HEL-Human IgG4(S228P)、Tezepelumap及JYB1909Am09。食蟹猴哮喘模型采用猪蛔虫过敏原造模,具体方法可参考(Iwashita K et al.2008,J Pharmacol Sci 106:92-99)。
造模成功后,动物给与药物处理,皮下给药,10mg/kg每周一次。
图8是给药第1次、第3次和第6次的气道阻力RL药效数据;图9是给药第1次、第3次和第6次的动态肺顺应性药效数据C
DYN(Mean+-SEM)。图8中,A-C分别表示同型对照抗体anti-HEL-Human IgG4(S228P)、Tezepelumap及JYB1909Am09的气道阻力RL药效数据;图9中,A-C分别表示Tezepelumap、JYB1909Am09及同型对照抗体anti-HEL-Human IgG4(S228P)的动态肺顺应性药效数据C
DYN。
上述结果说明,JYB1909Am09能够有效治疗和/或缓解食蟹猴的哮喘症状。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的,并非要限制所附权利要求的范围。目前本文所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的,且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
Claims (51)
- 分离的抗原结合蛋白,其具有下述性质中的一种或多种:a)在Octet测定中,以约1.0*10 -12M以下的K D值特异性结合人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP);b)在Octet测定中,以约4.0*10 -10M以下的K D值特异性结合食蟹猴胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP);c)在Biacore测定中,以约3.5*10 -11M以下的K D值特异性结合人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP);d)在Biacore测定中,以约6.0*10 -10M以下的K D值特异性结合食蟹猴胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP);e)阻断人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)和人胸腺基质淋巴细胞生成素受体(TSLPR)结合;f)抑制TSLP诱导PBMC释放T细胞受体α恒定区(TRAC);以及g)抑制TSLP诱导表达TSLPR-IL7Rα复合物的细胞的增殖。
- 根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白,其包含轻链可变区VL中的至少一个CDR,所述VL包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包含重链可变区VH中的至少一个CDR,所述VH包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包括抗体或其抗原结合片段。
- 根据权利要求4所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述抗原结合片段包括Fab,Fab’,F(ab)2,Fv片段,F(ab’)2,scFv,di-scFv和/或dAb。
- 根据权利要求4-5中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述抗体为人源化抗体。
- 根据权利要求2-6中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述VL包含LCDR1,LCDR2和LCDR3,其中所述LCDR1包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求7所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述LCDR1包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求7-8中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述LCDR2包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求9所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述LCDR2包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:51中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求7-10中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述LCDR3包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求11所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述LCDR3包含SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:46中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求3-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述VH包含HCDR1,HCDR2和HCDR3,所述HCDR1包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求13所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:47中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求13-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述HCDR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求15所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述HCDR2包含SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:48中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求13-16中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求17所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:49中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求2-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述VL包括框架区L-FR1,L-FR2,L-FR3,和L-FR4。
- 根据权利要求19所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连,且所述L-FR1包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求20所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述L-FR1包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:34中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求19-21中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间,且所述L-FR2包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求22所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述L-FR2包含SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:35中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求19-23中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间,且所述L-FR3包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求24所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述L-FR3包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:36中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求19-25中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述L-FR4的N末端与 所述LCDR3的C末端直接或间接相连,且所述L-FR4包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求26所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述L-FR4包含SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:37中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求2-27中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述VL包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包括抗体轻链恒定区,且所述抗体轻链恒定区包括人Igκ恒定区或人Igλ恒定区。
- 根据权利要求3-29中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述VH包括框架区H-FR1,H-FR2,H-FR3,和H-FR4。
- 根据权利要求30所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连,且所述H-FR1包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求31所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述H-FR1包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:39中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求30-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间,且所述H-FR2包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求33所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述H-FR2包含SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:40中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求30-34中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间,且所述H-FR3包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求35所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述H-FR3包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求30-36中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连,且所述H-FR4包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求37所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述H-FR4包含SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:43中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求3-38中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述VH包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-39中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包括抗体重链恒定区,且所 述抗体重链恒定区包括人IgG恒定区,或包括IgY恒定区。
- 根据权利要求1-40中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包括抗体重链恒定区,且所述抗体重链恒定区包括人IgG4恒定区。
- 分离的一种或多种核酸分子,其编码权利要求1-41中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
- 载体,其包含根据权利要求42所述的核酸分子。
- 细胞,其包含根据权利要求42所述的核酸分子或根据权利要求43所述的载体。
- 制备权利要求1-41中任一项所述的分离的抗原结合蛋白的方法,所述方法包括在使得权利要求1-41中任一项所述的分离的抗原结合蛋白表达的条件下,培养根据权利要求44所述的细胞。
- 药物组合物,其包含权利要求1-41中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求42所述的核酸分子、权利要求43所述的载体和/或权利要求44所述的细胞,以及任选地药学上可接受的佐剂。
- 权利要求1-41中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求42所述的核酸分子、权利要求43所述的载体、权利要求44所述的细胞和/或权利要求46所述的药物组合物在制备药物中的用途,所述药物用于预防、缓解和/或治疗免疫系统相关疾病或肿瘤,其中所述免疫系统相关疾病包括自身免疫疾病或炎性疾病。
- 根据权利要求47所述的用途,其中所述免疫系统相关疾病包括哮喘。
- 根据权利要求47-48中任一项所述的用途,其中所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤。
- 一种检测样品中胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的存在和/或含量的方法,其包括以下的步骤:施用权利要求1-41中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
- 一种抑制胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)与TSLP受体结合的方法,其包括以下的步骤:施用权利要求1-41中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2020112597678 | 2020-11-12 | ||
CN202011259767 | 2020-11-12 | ||
PCT/CN2021/130073 WO2022100664A1 (zh) | 2020-11-12 | 2021-11-11 | 一种tslp抗原结合蛋白及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117098777A true CN117098777A (zh) | 2023-11-21 |
Family
ID=81602137
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202180076243.1A Pending CN117098777A (zh) | 2020-11-12 | 2021-11-11 | 一种tslp抗原结合蛋白及其应用 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117098777A (zh) |
TW (1) | TW202219066A (zh) |
WO (1) | WO2022100664A1 (zh) |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0603683D0 (en) * | 2006-02-23 | 2006-04-05 | Novartis Ag | Organic compounds |
US10647756B2 (en) * | 2015-05-18 | 2020-05-12 | Pfizer Inc. | Humanized antibodies |
LT3347377T (lt) * | 2015-09-09 | 2021-05-25 | Novartis Ag | Užkrūčio liaukos stromos limfopoetiną (tslp) rišantys antikūnai ir antikūnų panaudojimo būdai |
AU2020400221A1 (en) * | 2019-12-13 | 2022-05-19 | Nona Biosciences (Suzhou) Co., Ltd. | Anti-TSLP antibody and uses thereof |
CN111196850B (zh) * | 2020-02-07 | 2020-10-30 | 北京汇智和源生物技术有限公司 | 人胸腺基质淋巴细胞生成素单克隆抗体及其应用 |
-
2021
- 2021-11-11 WO PCT/CN2021/130073 patent/WO2022100664A1/zh active Application Filing
- 2021-11-11 TW TW110142037A patent/TW202219066A/zh unknown
- 2021-11-11 CN CN202180076243.1A patent/CN117098777A/zh active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2022100664A1 (zh) | 2022-05-19 |
TW202219066A (zh) | 2022-05-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TWI679211B (zh) | 抗il-33抗體和彼之組成物、方法及用途 | |
US20210040223A1 (en) | Antibodies to Canine Interleukin-4 Receptor Alpha | |
KR102662387B1 (ko) | B7-h3 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도 | |
CN111171150B (zh) | 抗人tslp抗体及其用途 | |
DK2470671T3 (en) | ANTIKIN- ANTIBODIES BINDING TO MULTIPLE CC chemokines | |
CN112513090B (zh) | 结合人il-4r的抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
JP2012507294A (ja) | ヒトil−4受容体に対する高親和性ヒト抗体 | |
US20220340654A1 (en) | Antibody capable of binding to thymic stromal lymphopoietin and use thereof | |
EP4289861A1 (en) | Antibodies against human tslp and use thereof | |
AU2014253090B2 (en) | Antibodies targeting M-CSF | |
WO2022100664A1 (zh) | 一种tslp抗原结合蛋白及其应用 | |
TWI801425B (zh) | Il-5 抗體、其抗原結合片段及醫藥用途 | |
WO2024093652A1 (en) | APPLICATION OF NANOBODY TARGETING ON IL-6Rα | |
TWI840399B (zh) | 結合人il-4r的抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 | |
WO2021190437A1 (en) | Antibodies against areg and its use | |
TW202214703A (zh) | 一種抗IgE的工程化抗體及其應用 | |
TW202413405A (zh) | 抗體、其抗原結合片段及其藥物用途 | |
CN116419972A (zh) | 抗SARS-CoV-2抗体及其应用 | |
CN117886935A (zh) | 抗csf-1r抗体及其应用 | |
KR20240063177A (ko) | B7-h3 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |