KR20100033523A - Ｐａｒ－２에 결합하는 항원 결합 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항-PAR-2 항체와 관련되거나, 그로부터 유래된 조성물 및 방법을 제공한다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 PAR-2에 결합하는 인간 항체, 상기 항체의 PAR-2-결합 단편 및 유도체, 및 상기 단편을 포함하는 PAR-2-결합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양은 상기 항체, 항체 단편 및 유도체 및 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포, 상기 항체, 항체 단편 및 유도체 및 폴리펩티드를 제조하는 방법, 및 PAR-2-관련 질병 또는 병태를 앓는 대상체를 치료 또는 진단하는 방법을 비롯한, 상기 항체, 항체 단편 및 유도체 및 폴리펩티드를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

ＰＡＲ－２에 결합하는 항원 결합 단백질{ANTIGEN BINDING PROTEINS THAT BIND PAR-2}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2008년 6월 2일 출원된 미국 가출원 일련 번호 제61/058,094호, 및 2007년 6월 29일 출원된 미국 가출원 일련 번호 제60/947,264호 (본원에서 참고로 인용된다)의 이점을 주장한다.

본 발명의 분야

본 출원은 PAR-2 항원 결합 단백질과 관련된 조성물 및 방법을 제공한다.

프로테이나제-활성 수용체 (PAR) 패밀리는 7-막투과 G-커플링 수용체 슈퍼패밀리의 일부이다. 현재 4개의 PAR이 알려져 있는데, 이 중 3개 (PAR-1, -3 및 -4)는 트롬빈에 의해 활성화되고; 4번째 것 (PAR-2)은 트롬빈이 아닌 트립신 또는 비만 세포 트립타제에 의해 활성화된다. PAR은 다양한 조직에 광범위하게 분포되어 있으며, 예를 들면 혈소판 응집, 염증 및 심혈관, 소화 또는 호흡 기능과 같은 다수의 생리학적 또는 병태생리학적 현상에 관여한다.

PAR은 PAR의 N 말단이 단백질 가수분해 효소에 의해 절단된 후, 동일한 수용체 폴리펩티드의 세포외 부위 (루프 2)와 상호작용하는 연결형 리간드가 형성되면 활성화된다는 점에서 다른 수용체들과 차이를 보인다. PAR-2의 절단은 프로테아제 절단 도메인, SKGRSLIG (서열 2의 아미노산 33부터 40까지)의 R과 S 사이에서 일어나는데, 상기 도메인은 인간, 뮤린 및 래트 PAR-2 사이에서 보존되는 도메인이다. 연결형 리간드를 모사하는 펩티드가 PAR-2에 대하여 작용 효과를 갖고 있는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Saifeddine et al., Br J Pharmacol 118(3):521-30 [1996]]; [McGuire et al., J Pharmacol Exp Ther 309(3): 1124-31 [2004]]).

PAR-2는 G-단백질-커플링 수용체-매개의 공통된 신호 전달 경로인 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트 생산 및 Ca(2+) 동원 뿐만 아니라, ERK, p38MAPK, JNK, 및 IKK를 포함한 다중 키나제 경로를 활성화시킨다. 이는 신장, 췌장, 위, 장, 기도, 피부, 담낭 및 뇌 중 상피 및 내피 세포, 근육 세포, 섬유아세포, 면역 세포, 뉴런 및 아교세포 상에 존재한다. PAR-2를 활성화시키는 프로테아제는 염증이 있는 동안 존재하며, PAR-2는 염증 인자, 예를 들면 종양 괴사 인자 알파, 인터루킨 1 알파 및 지질다당류에 의해 상향조절된다. 더욱이, PAR-2-결핍 또는 PAR-2-과다발현 마우스를 사용한 연구를 통해 염증에서의 상기 수용체의 역할을 확인하게 되었다 (문헌 [Schmidlin et al., J. Immunol. 169, 5315-5321 [2002]]; [Ferrell et al., J. Clin. Invest. 111, 35-41 [2003]]). 따라서, 당업계에서는 염증 병태를 치료하거나 호전시키는데 유용한, PAR-2 활성화의 길항제를 개발하는 것이 요구되고 있다.

[도면의 간단한 설명]

도 1은 애주번트-유발성 관절염 모델의 래트로부터 유래된 발 조직에 존재하는 특정 염증전 사이토카인의 수준을 비교한 그래프 세트를 제공한다.

본 발명의 요약

하나의 측면에서, 본 발명은 인간 PAR-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 제공한다. 본 발명의 또다른 측면에서, 항원 결합 단백질은 인간을 제외한 영장류, 사이노몰로거스 원숭이, 침팬지, 영장류를 제외한 포유동물, 설치류, 마우스, 래트, 햄스터, 기니아 피그, 고양이 또는 개의 PAR-2에 특이적으로 결합한다. 또다른 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 a. 인간 항체; b. 키메라 항체; c. 모노클로날 항체; d. 재조합 항체; e. 항원-결합 항체 단편; f. 단일 쇄 항체; g. 디아바디; h. 트리아바디; i. 테트라바디; j. Fab 단편; k. F(ab')₂ 단편; l. 도메인 항체; m. IgD 항체; n. IgE 항체; o. IgM 항체; p. IgG1 항체; q. IgG2 항체; r. IgG3 항체; s. IgG4 항체; 또는 t. H쇄내 이황화 결합을 형성하는 경향을 경감시키는 힌지 부위 중의 적어도 하나의 돌연변이를 보유한 IgG4 항체를 포함한다.

본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 갖는 단리된 항원 결합 단백질을 제공하는데, 중쇄는 서열 9와 95％ 이상 동일한 가변 부위를 포함하고, 경쇄는 서열 11과 95％ 이상 동일한 가변 부위를 포함하는 것이다. 또다른 실시태양에서, 중쇄 가변 부위는 서열 31과 95％ 이상 동일하고, 경쇄 가변 부위는 서열 35와 95％ 이상 동일하다. 본 발명의 또다른 측면에서, 경쇄 가변 부위는 서열 39의 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 가변 부위는 서열 40의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 경쇄 가변 부위는 서열 41의 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 가변 부위는 서열 42의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 중쇄 가변 부위는 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 명시되는 3개의 상보성 결정 부위 (CDR)를 포함하고, 경쇄 가변 부위는 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 명시되는 3개의 상보성 결정 부위 (CDR)를 포함한다. 본 발명의 또다른 측면에서, 중쇄 가변 부위는 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 명시되는 4개의 프레임워크 부위 (FR)를 더 포함하고, 경쇄 가변 부위는 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 명시되는 4개의 프레임워크 부위 (FR)를 더 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 중쇄 CDR은 서열 9, 13, 17, 23, 27, 31, 및 35에 제시한 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 CDR들 중으로부터 선택되고, 경쇄 CDR은 서열 11, 15, 19, 25, 29, 33 및 37에 제시한 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 CDR들 중으로부터 선택된다.

본 발명의 하나의 측면에서, 3개의 중쇄 CDR 모두 동일 펩티드로부터 선택되고, 예를 들어, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열 9로부터의 것이며, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열 11 등으로부터의 것이다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, CDR은 상이한 펩티드들 중으로부터 선택되고, 예를 들어, 중쇄 CDR1은 서열 9로부터, CDR2는 서열 13으로부터, 및 CDR3은 서열 17로부터의 것이며, 경쇄 CDR1은 서열 11로부터, CDR2는 서열 15로부터, 및 CDR3은 서열 19 등으로부터 선택된다. 별법으로, 2개의 CDR은 단일 펩티드로부터 선택되고, 세번째 CDR은 또다른 펩티드로부터 선택될 수 있다. 이러한 조합은 다수가 가능하다. 또다른 측면에서, 프레임워크 부위는 동일 펩티드로부터 선택될 수 있거나, 하나 이상의 프레임워크 부위가 상이한 펩티드로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 하나의 측면에서, 본 발명은 상기 언급한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 또다른 측면에서, 핵산은 벡터이다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 핵산으로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 또다른 측면에서, 폴리펩티드의 발현을 촉진시키는 조건하에서 숙주 세포를 인큐베이션시키는 단계, 및 폴리펩티드를 수거하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 PAR-2에 결합하는 항원 결합 단백질을 분비하는 단리된 세포를 제공한다. 또다른 실시태양에서, 세포는 하이브리도마이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 항원 결합 단백질이 발현될 수 있도록 하는 조건하에서 상기 단리된 세포를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는, 인간 PAR-2에 결합하는 항원 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

하나의 측면에서, 본 발명은 프로테이나제 활성 수용체-2 (PAR-2)에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 제공한다. 또다른 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질이 인간 PAR-2에 결합하게 되면, 단백질 가수분해 효소에 의한 절단 및/또는 그 후의 상기 인간 PAR-2를 통한 신호 전달이 저해된다. 또다른 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화를 약 80％보다 더 크게 저해시킨다. 또다른 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 절단되지 않은 PAR-2에 결합하고, 그보다는 적은 정도로 절단된 PAR-2에 결합한다. 또다른 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화를 약 10％보다 더 적게 저해시킨다. 또다른 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 절단된 PAR-2와 절단되지 않은 PAR-2, 둘 모두에 실질적으로는 동등하게 결합한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 항원 결합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 대상체에게 상기 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 병태는 상기 대상체에서 PAR-2의 활성을 감소시킴으로써 치료될 수 있는 것인, 상기 대상체에서 상기 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 또다른 실시태양에서, 상기 대상체는 인간이다. 또다른 실시태양에서,상기 병태는 피부, 관절, 위장계 및/또는 기도의 염증 병태이다. 또다른 실시태양에서, 본 방법은 상기 대상체에게 제2 치료법을 투여하는 단계를 더 포함한다. 또다른 실시태양에서, 상기 제2 치료법은 상기의 제약 조성물을 상기 대상체에게 투여하기 이전에, 및/또는 그와 동시에, 및/또는 그 이후에 상기 대상체에게 투여된다. 또다른 실시태양에서, 상기 제2 치료법은 소염제를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 제2 제약 조성물은 비-스테로이드성 소염 약물, 스테로이드, 및 면역 조절 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 상기 방법은 상기 대상체에게 제3 치료법을 투여하는 단계를 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 상기 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체의 수명을 연장시키는 방법을 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 PAR-2 활성 감소를 필요로 하는 대상체에게 상기 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 PAR-2 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 PAR-2 신호 전달 감소를 필요로 하는 대상체에게 상기 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 PAR-2 신호 전달을 감소시키는 방법을 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화 저해를 필요로 하는 대상체에게 상기 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화를 저해시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은 프로테이나제 활성 수용체 2 ("PAR-2")를 작용화시키거나 길항시키는 분자, 예를 들면 항-PAR-2 항체, 항체 단편, 및 항체 유도체, 예로서, 길항성 항-PAR-2 항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체를 비롯한, PAR-2에 결합하는 분자와 관련된 조성물, 키트, 및 방법을 제공한다. PAR-2에 결합하는 폴리펩티드 전체 또는 그 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예로서, 항-PAR-2 항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체 전체 또는 그 일부를 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산, 및 그의 유도체 및 단편, 상기 핵산을 포함하는 플라스미드 및 벡터, 및 상기 핵산 및/또는 벡터 및 플라스미드를 포함하는 세포 또는 세포주 또한 제공한다. 제공하는 방법으로는 예를 들어, PAR-2에 결합하는 분자, 예를 들면 항-PAR-2 항체를 제조, 동정, 또는 단리시키는 방법, 분자가 PAR-2에 결합하는지 여부를 측정하는 방법, 분자가 PAR-2를 작용화시키는지 또는 길항시키는지 여부를 측정하는 방법, PAR-2에 결합하는 분자를 포함하는 조성물, 예를 들면 제약 조성물을 제조하는 방법, 및 대상체에게 PAR-2에 결합하는 분자를 투여하는 방법, 예를 들어, 생체내 또는 시험관내에서 PAR-2에 의해 매개되는 병태를 치료하는 방법, 및 PAR-2의 생물학적 활성을 작용화시키거나 길항시키는 방법을 포함한다.

폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 표준 1문자 또는 3문자 약어로 나타낸다. 달리 명시하지 않는 한, 각각의 폴리펩티드 서열은 좌측이 아미노 말단이고, 우측이 카르복시 말단이며; 각 단일 가닥 핵산 서열 및 각 이중 가닥 핵산 서열의 상부 가닥도 좌측이 5' 말단이고, 우측이 3' 말단이다. 또한, 특별한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 서열이 참조 서열과 어떻게 다른지를 설명함으로써 기술할 수 있다.

본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어들은 당업계의 숙련인이 보통 이해하고 있는 의미를 갖는 것이다. 추가로, 문맥상 달리 필요하지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학, 및 하이브리드화의 기법 및 관련하여 사용된 용어들은 당업계에 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다. 본 발명의 방법 및 기법은 일반적으로 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 그리고, 달리 명시하지 않는 한, 본 명세서 전체에서 인용되고 논의된 각종 일반 참고문헌 및 더욱 구체적인 참고문헌에 기술된 바와 같이 실시된다. 예로서, 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)], 및 [Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)]) (이들은 본원에서 참고로 인용된다))을 참조한다. 효소 반응 및 정제 기법은 당업계에서 일반적으로 수행되거나, 본원에 기술된 바와 같이 제조자의 지침서에 따라 실시된다. 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의약 및 약제 화학과 관련하여 사용된 용어 및 실험 절차 및 기법은 당업계에 공지되고 보통 사용되는 것이다. 화학 합성, 화학 분석, 약제 제조, 제형화 및 전달 및 환자의 치료를 위해서도 표준 기법을 사용할 수 있다.

달리 명시하지 않는 한, 하기의 용어들은 하기 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다:

"단리된 분자"라는 용어 (여기서, 분자는 예컨대 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체)는 그의 유래 근원이나 기원에 의해, (1) 그의 천연 상태에서 동반되는 천연 결합 성분과 결합되어 있지 않거나, (2) 동일 종 유래의 다른 분자가 실질적으로 없거나, (3) 다른 종 유래의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 인간의 개입없이는 천연에서 발생되지 않는 분자이다. 따라서, 화학적으로 합성되거나, 천연 기원의 세포와 다른 세포 시스템에서 합성된 분자는 그의 천연 결합 성분으로부터 "단리"된 것이다. 또한, 당업계에 잘 알려져 있는 정제 기법을 사용하여 단리를 통해 분자에는 실질적으로 천연 결합 성분이 존재하지 않게 할 수 있다. 분자 순도 또는 동종성은 당업계에 잘 알려져 있는 많은 방법에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 시료의 순도는 당업계에 잘 알려져 있는 기법을 사용하여 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하고 겔을 염색하여 폴리펩티드를 시각화함으로써 분석할 수 있다. 특정 목적을 위해서는 HPLC 또는 정제 기술분야에 잘 알려져 있는 다른 수단을 사용하여 해상도를 높일 수 있다.

"PAR-2 저해제" 및 "PAR-2 길항제"란 용어는 상호교환적으로 사용된다. 모두 PAR-2의 적어도 하나의 기능을 검출가능하게 저해시키는 분자이다. 이와 반대로, "PAR-2 작용제"는 PAR-2의 적어도 하나의 기능을 검출가능하게 증가시키는 분자이다. PAR-2 저해제에 의해 일어나는 저해는 분석법을 사용하여 검출할 수 있는 한 완전하게 저해될 필요는 없다. PAR-2의 기능을 분석하는 방법으로는 임의의 분석법을 사용할 수 있고, 그 예가 본 명세서에 제시되어 있다. PAR-2 저해제에 의해 저해될 수 있거나, 또는 PAR-2 작용제에 의해 증가될 수 있는 PAR-2의 기능의 예로는 프로테아제 활성 리간드 결합, 하류 신호 전달 등을 포함한다. PAR-2 저해제 및 PAR-2 작용제의 유형의 예로는 PAR-2 결합 폴리펩티드, 예를 들면 항원 결합 단백질, (예로서, PAR-2 저해성 항원 결합 단백질), 항체, 항체 단편, 및 항체 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"펩티드," "폴리펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 각각 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 이 용어로는 예로서, 천연 및 인공 단백질, 단백질 서열의 단백질 단편 및 폴리펩티드 유사체 (예컨대, 뮤테인, 변이체 및 융합 단백질), 뿐만 아니라 번역후 변형된 단백질, 또는 다르게는 공유결합 또는 비-공유결합적으로 변형된 단백질 등을 포함된다. 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 단량체 또는 중합체일 수 있다.

본원에 사용된 "폴리펩티드 단편"이란 용어는 상응하는 전장의 단백질과 비교했을 때, 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단이 결실된 폴리펩티드를 의미한다. 단편은, 예를 들어, 아미노산 길이가 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150 또는 200일 수 있다. 또한, 단편은 아미노산 길이가 예를 들어, 최대 1,000, 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 또는 10개일 수 있다. 또한, 단편은 말단 한쪽 또는 양쪽에 하나 이상의 추가 아미노산, 예를 들어, 다른 천연적으로 발생된 단백질 유래의 아미노산 서열 (예로서, Fc 또는 류신 지퍼 도메인) 또는 인공 아미노산 서열 (예로서, 인공 링커 서열 또는 태그 단백질)을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어, 다음과 같은 임의의 방법으로, 및 임의의 이유로 변형된 폴리펩티드를 포함한다: (1) 단백 분해 작용에 대한 감수성 감소, (2) 산화에 대한 감수성 감소, (3) 단백질 복합체 형성을 위한 결합 친화성 변경, (4) 결합 친화성 변경, 및 (5) 다른 이화학적 또는 기능적 특성의 부여 또는 변형. 유사체로는 폴리펩티드의 뮤테인을 포함한다. 예를 들어, 단일 또는 복수의 아미노산 치환 (예로서, 보존적 아미노산 치환)은 천연적으로 발생된 서열 (예로서, 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외측에 존재하는 폴리펩티드의 일부)에서 이루어질 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 모체 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않는 것이다 (예로서, 치환 아미노산은 모체 서열에서 일어나는 나선 구조를 파괴하는 경향 또는 모체 서열의 특징을 이루거나 또는 기능에 필수적인 다른 형태의 2차 구조를 붕괴시키는 경향이 없어야 한다). 당업계에 공지된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌 [Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)]; [Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)]; 및 [Thornton et at. Nature 354:105 (1991)] (이들 각각이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

본 발명은 또한 PAR-2 결합 폴리펩티드의 비-펩티드 유사체를 제공한다. 비-펩티드 유사체는 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 보유한 약물로서 제약 산업에서 보통 사용되고 있다. 이러한 유형의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모사체" 또는 "펩티도미메틱"으로 불린다 (예를 들어, 문헌 [Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986)]; [Veber and Freidinger TINS p.392 (1985)]; 및 [Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)] (본원에서 참고로 인용된다) 참조). 치료학적으로 유용한 펩티드와 구조가 유사한 펩티드 모사체는 등가의 치료 또는 예방 효과를 제공하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 펩티도미메틱은 패러다임 폴리펩티드 (즉, 원하는 생화학적 특성 또는 약리학적 활성을 보유한 폴리펩티드), 예를 들면 인간 항체와 구조가 유사하지만, 임의로는 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해서 --CH₂NH--, --CH₂S--, --CH_{2 --}CH_{2 --}, --CH=CH-(시스 및 트란스), --COCH₂--, --CH(OH)CH₂--, 및 --CH₂SO--로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합에 의해 치환된 하나 이상의 펩티드 결합을 보유한다. 또한, 펩티드를 더욱 안정하게 만들기 위해 컨센서스 서열의 하나 이상의 아미노산을 동일한 유형의 D-아미노산으로 치환하는 계통적 치환 (예로서, L-리신을 대신하여 D-리신으로)을 이용할 수도 있다. 또한, 컨센서스 서열 또는 실질적으로 동일한 컨센서스 서열 변이를 포함하는 한정된 펩티드는 당업계에 공지된 방법 (문헌 [Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61 :387 (1992)] (이는 본원에서 참고로 인용된다))에 의해, 예를 들어, 펩티드를 폐환화하는 분자내 이황화 가교를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가하여 제조할 수 있다.

폴리펩티드 (예로서, 항체)의 "변이체"는 또다른 폴리펩티드 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열에 삽입, 결실 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 변이체는 융합 단백질을 포함한다.

폴리펩티드의 "유도체"는 화학적으로 변형된, 예로서, 또다른 화학적 부분 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 알부민, 예로서, 인간 혈청 알부민)에의 접합을 통해, 인산화 및 글리코실화를 통해 변형된 폴리펩티드 (예로서, 항체)이다. 달리 명시하지 않는 한, "항체"란 용어는 2개의 전장의 중쇄 및 2개의 전장의 경쇄를 포함하는 항체 이외에도, 그의 유도체, 변이체, 단편 및 뮤테인을 포함하며, 그 예는 하기에 설명한다.

"항원 결합 단백질"은 항원에 결합하는 일부 및 임의로 항원 결합부가 항원에 대한 항원 결합 단백질의 결합을 촉진하는 입체형태를 선택하게 하는 스캐폴드 또는 프레임워크 부분을 포함하는 단백질이다. 항원 결합 단백질의 예로는 항체, 항체 단편 (예로서, 항체의 항원 결합부), 항체 유도체, 및 항체 유사체를 포함한다. 항원 결합 단백질은 예를 들어, 이식된 CDR 또는 CDR 유도체를 보유한 인공 스캐폴드 또는 대체 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있다. 이러한 스캐폴드로는 항원 결합 단백질의 3차원 구조의 안정화 등을 위해 돌연변이를 도입시킨 돌연변이를 포함하는 항체 유래 스캐폴드 뿐만 아니라, 예를 들어, 생체화합성 중합체를 포함하는 완전 합성 스캐폴드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 문헌 [Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129]; [Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639- 654]를 포함한다. 또한, 펩티드 항체 모사체 ("PAM") 뿐만 아니라, 스캐폴드로서 피브로넥틴 성분을 이용하는 항체 모사체를 기본으로 하는 스캐폴드도 사용할 수 있다.

항원 결합 단백질은 예를 들어, 천연적으로 발생된 면역글로불린의 구조를 보유할 수 있다. "면역글로불린"은 사량체 분자이다. 천연적으로 발생된 면역글로불린에서, 각 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄 쌍으로 구성되고, 각 쌍은 하나의 "경쇄 "(약 25kDa)와 하나의 "중쇄 " (약 50 내지 70kDa)를 보유한다. 각 쇄의 아미노-말단부는 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산으로 이루어진 가변 부위를 포함한다. 각 쇄의 카르복시-말단부는 주로 효과기 기능을 담당하는 불변 부위이다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 입실론으로 분류되며, 항체의 이소형은 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 각각 정의된다. 경쇄 및 중쇄 내에서 가변 부위와 불변 부위는 약 12개 이상의 아미노산으로 이루어진 "J" 부위에 의해 결합되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산으로 이루어진 "D" 부위를 포함한다. 일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)] (모든 목적을 위해서 상기 문헌의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)을 참조한다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합부를 형성하여, 온전한 면역글로불린은 2개의 결합부를 갖는다.

천연적으로 발생된 면역글로불린 쇄의 가변 부위는 비교적 보존적인 프레임워크 부위 (FR)가 상보성 결정 부위 또는 CDR이라고도 불리는 3개의 초가변 부위에 의해 결합되어 있는 동일한 일반 구조를 나타낸다. N-말단에서부터 C-말단까지 경쇄와 중쇄, 둘 모두 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 아미노산을 배정하는 것은 문헌 [Kabat et al. in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991]의 정의에 따라 이루어진다. 면역글로불린 쇄에서 아미노산에 대한 기타 다른 번호화 체계로는 IMGT® (국제 면역유전학 정보 체계(international ImMunoGeneTics information system); 문헌 [Lefranc et al., Dev . Comp . Immunol. 29:185-203; 2005]) 및 AHo (문헌 [Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol . 309(3):657-670; 2001])을 포함한다.

항체는 예를 들면, 항원 특이성이 다양한 면역글로불린을 함유하는 혈청 또는 혈장과 같은 공급원으로부터 수득할 수 있다. 그러한 항체를 친화성 정제시키면, 특별한 항원 특이성에 대해 강화될 수 있다. 그렇게 강화된 항체 시료는 일반적으로 특정 항원에 대해 특이적인 결합 활성을 갖는 약 10％ 미만의 항체로 제조된다. 이들 시료를 수회에 걸쳐 친화성 정제시키면 항원에 대해 특이적인 결합 활성을 갖는 항체의 비율을 증가시킬 수 있다. 이러한 방식으로 제조된 항체를 대개는 "단일특이성"이라 지칭한다. 단일특이성 항체 시료는 특정 항원에 대해 특이적인 결합 활성을 갖는 약 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 97％, 99％, 또는 99.9％ 항체로 구성될 수 있다.

"항체"는 달리 언급하지 않는 한, 온전한 면역글로불린 또는 특이적 결합에 대해 온전한 항체와 경쟁하는 항원 결합부를 의미한다. 항원 결합부는 온전한 항체의 효소 또는 화학적 절단에 의해 또는 재조합 DNA 기법에 의해 생산될 수 있다. 항원 결합부는 특히 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 도메인 항체 (dAb) 및 상보성 결정 부위 (CDR) 단편, 단일 쇄 항체 (scFv), 키메라 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 폴리펩티드에 대한 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩티드를 포함한다.

Fab 단편은 V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인을 보유하는 1가 단편이다; F(ab')₂ 단편은 2개의 Fab 단편이 힌지 부위에서 이황화 가교에 의해 결합된 2가 단편이다; Fd 단편은 V_H 및 C_H1 도메인을 보유한다; Fv 단편은 항체 단일 아암의 V_L 및 V_H 도메인을 보유한다; 그리고, dAb 단편은 V_H 도메인, V_L 도메인 또는 V_H 또는 V_L 도메인의 항원-결합 단편을 보유한다 (미국 특허 번호 제6,846,634호, 제6,696,245호, 미국 출원 공개번호 제05/0202512호, 제04/0202995호, 제04/0038291호, 제04/0009507호, 제03/0039958호, 문헌 [Ward et al., Nature 341 :544-546, 1989]).

단일 쇄 항체 (scFv)는 V_L 및 V_H 부위가 링커 (예로서, 합성 아미노산 잔기 서열)를 통해 결합되어 연속 단백질 쇄를 형성하는 항체로서, 상기 링커는 단백질 쇄가 그 자체를 폴딩하여 1가 항원 결합부를 형성할 수 있을 정도로 충분히 길다 (예로서, 문헌 [Bird et al., 1988, Science 242:423-26] 및 [Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83] 참조). 디아바디는 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 2가 항체로서, 각 폴리펩티드 쇄는 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍을 형성할 정도로 매우 짧은 링커에 의해 결합된 V_H 및 V_L 도메인을 함유하며, 이에 따라 각 도메인은 또다른 폴리펩티드 쇄 상의 상보성 도메인과 쌍을 형성할 수 있게 한다 (예로서, 문헌 [Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48] 및 [Poljak et al., 1994, Structure 2: 1121-23] 참조). 디아바디의 2개의 폴리펩티드 쇄가 동일하다면, 이들의 쌍 형성으로부터 수득한 디아바디는 2개의 동일한 항원 결합부를 갖게 될 것이다. 서열이 다른 폴리펩티드 쇄는 다른 항원 결합부를 2개 보유한 디아바디를 제조하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 트리아바디 및 테트라바디는 각각 3개 및 4개의 폴리펩티드 쇄를 함유하고, 동일하거나 상이할 수 있는 항원 결합 부위를 각각 3개 및 4개 형성하는 항체이다.

소정 항체의 상보성 결정 부위 (CDR) 및 프레임워크 부위 (FR)은 문헌 ([Kabat et al. 상기 문헌 동일]; [Lefranc et al., 상기 문헌 동일] 및/또는 [Honegger and Pluckthun, 상기 문헌 동일])에 의해 기재된 시스템을 사용함으로써 동정될 수 있다. 하나 이상의 CDR은 공유 또는 비공유결합을 통해 분자에 혼입되어 항원 결합 단백질을 형성할 수 있다. 항원 결합 단백질은 더 큰 폴리펩티드 쇄의 일부로서 CDR(들)을 혼입할 수 있거나, 또다른 폴리펩티드 쇄에 CDR(들)을 공유 결합시킬 수 있거나, 또는 CDR(들)을 비공유결합을 통해 혼입할 수 있다. CDR은 항원 결합 단백질이 관심의 대상이 되는 특정 항원에 특이적으로 결합할 수 있게 한다.

항원 결합 단백질은 하나 이상의 결합부를 가질 수 있다. 1 초과의 결합부가 존재할 경우, 결합부는 서로 동일할 수 있거나, 상이할 수 있다. 예를 들어, 천연적으로 발생된 인간 면역글로불린은 전형적으로 2개의 동일한 결합부를 갖는 반면, "이중특이성" 또는 "이관능성" 항체는 2개의 상이한 결합부를 갖는다.

"인간 항체"란 용어는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 부위 및 불변 부위를 하나 이상 갖는 모든 항체를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 모든 가변 도메인과 불변 도메인은 인간 면역글로불린 서열 (완전 인간 항체)로부터 유래된다. 이러한 항체는 인간 중쇄 및/또는 경쇄-코딩 유전자 유래의 항체를 발현하도록 유전자 변형된 마우스를 관심의 대상이 되는 항원으로 면역화시키는 방법을 비롯한, 다양한 방법으로 제조할 수 있으며, 그 실례는 하기에서 설명된다.

인간화된 항체는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 인간을 제외한 종으로부터 유래된 항체 서열과 차이가 나는 서열을 가짐으로써, 인간화된 항체는 인간 대상체에게 투여되었을 때에 인간을 제외한 종의 항체에 비해 면역 반응을 유도할 가능성이 적고/거나, 덜 격렬한 면역 반응을 유도하게 된다. 하나의 실시태양에서, 인간을 제외한 종의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인 및 프레임워크에 존재하는 특정 아미노산이 돌연변이화됨으로써 인간화된 항체가 생산된다. 또다른 실시태양에서, 인간 항체 유래의 불변 도메인(들)은 인간을 제외한 종의 가변 도메인(들)에 융합된다. 또다른 실시태양에서, 비-인간 항체의 하나 이상의 CDR 서열에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기는 인간 대상체에게 투여될 때 비-인간 항체의 가능한 면역원성을 감소시키도록 변화되며, 여기서, 변화된 아미노산 잔기는 항체의 그 항원에의 면역특이적 결합에 중요하지 않거나, 실시된 아미노산 서열의 변화가 보존적 변화이기 때문에 인간화된 항체의 항원에의 결합은 비-인간 항체의 항원에의 결합보다 유의적으로 저하되지는 않는다. 인간화된 항체를 제조하는 방법의 예는 미국 특허 번호 제6,054,297호, 제5,886,152호, 및 제5,877,293호에서 살펴볼 수 있다.

"키메라 항체"란 용어는 한 항체 유래의 하나 이상의 부위와, 하나 이상의 다른 항체 유래의 하나 이상의 부위를 함유하는 항체를 의미한다. 하나의 실시태양에서, 하나 이상의 CDR은 인간 항-PAR-2 항체로부터 유래된다. 다른 실시태양에서, 모든 CDR은 인간 항-PAR-2 항체로부터 유래된다. 또다른 실시태양에서, 1 초과의 인간 항-PAR-2 항체 유래의 CDR은 키메라 항체 내에서 혼합되고 매치된다. 예를 들어, 키메라 항체는 제1 인간 항-PAR-2 항체의 경쇄 유래의 CDR1, 제2 인간 항-PAR-2 항체의 경쇄 유래의 CDR2 및 CDR3, 및 제3 항-PAR-2 항체의 중쇄 유래의 CDR을 포함할 수 있다. 다른 조합도 가능하며, 이는 본 발명의 실시태양에 포함된다.

또한, 프레임워크 부위는 동일한 항-PAR-2 항체 중의 하나로부터, 예를 들면 인간 항체와 같은 하나 이상의 상이한 항체로부터, 또는 인간화된 항체로부터 유도될 수 있다. 키메라 항체의 일례에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종 유래의 항체 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체와 동일하거나, 상동성이거나, 또는 그 항체에서 유래되는 것인 반면, 상기 쇄(들)의 나머지는 또다른 종 유래의 항체(들) 또는 또다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체와 동일하거나 상동성이거나, 또는 그 항체에서 유래되는 것이다. 또한, 원하는 생물학적 활성 (즉, PAR-2에 특이적으로 결합하는 능력)을 나타내는 상기 항체의 단편도 포함된다. 예로서, 미국 특허 번호 제4,816,567호 및 문헌 [Morrison, 1985, Science 229:1202-07]을 참조한다.

"중화 항체 " 또는 "저해성 항체"란, 예를 들면 본원 실시예에 기술된 것과 같은 분석을 사용하였을 때 과량의 항-PAR-2 항체가 활성화 양을 적어도 약 20％ 만큼 감소시키는 경우, PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화를 저해시키는 항체이다. 다양한 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화 양을 적어도 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 97％, 99％, 및 99.9％ 만큼 감소시킨다.

항체의 단편 또는 유사체는 당업계의 숙련인이라면 본 명세서의 교시에 따라 당업계에 잘 공지되어 있는 기법을 사용하여 쉽게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노-말단 및 카르복시-말단은 기능성 도메인의 경계 부근에 존재한다. 구조 및 기능성 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이타를 공공 또는 전용 서열 데이터베이스와 비교하여 동정할 수 있다. 전산화된 비교 방법을 사용하여 공지된 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에 존재하는 서열 모티프 또는 예측 단백질 입체형태 도메인을 동정할 수 있다. 공지된 3차원 구조로 폴딩된 단백질 서열을 동정하는 방법이 공지되어 있다. 예로서, 문헌 [Bowie et al., 1991, Science 253:164]를 참조한다.

"CDR 이식된 항체"는 특정 종의 항체 또는 이소형 유래의 하나 이상의 CDR 및 동일한 종 또는 다른 종의 또다른 항체 또는 이소형의 프레임워크를 포함하는 항체이다.

"다중특이적 항체"는 하나 이상의 항원에 존재하는 1 초과의 에피토프를 인식하는 항체이다. 이러한 항체 유형의 하위부류는 동일하거나 다른 항원에 존재하는 2개의 상이한 에피토프를 인식하는 "이중특이성 항체"이다.

항원 결합 단백질이 1 nM 이하의 해리 상수하에 항원에 결합한다면, 항원 결합 단백질은 항원 (예로서, 인간 PAR-2)에 "특이적으로 결합"하는 것이다.

"항원 결합 도메인," "항원 결합 부위," 또는 "항원 결합부"는 항원과 상호작용하고, 항원에 대한 항원 결합 단백질의 특이성 및 친화성에 기여하는 아미노산 잔기 (또는 다른 부분)를 함유하는 항원 결합 단백질의 일부이다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체인 경우, 이 항체는 적어도 하나의 CDR 도메인의 적어도 일부를 포함할 것이다.

"에피토프"는 항원 결합 단백질이 (예로서, 항체가) 결합하는 분자의 일부이다. 에피토프는 분자의 비-인접 부분 (예로서, 폴리펩티드에서 폴리펩티드 1차 서열에서는 인접해 있지 않지만, 폴리펩티드의 3차 및 4차 구조 환경에서는 항원 결합 단백질이 결합하기에 충분하게 서로 가까운 아미노산 잔기)을 포함할 수 있다.

두 폴리뉴클레오티드 또는 두 폴리펩티드 서열의 "동일성(％)"은 디폴트 파라미터를 사용하는 GAP 컴퓨터 프로그램 (GCG 위스콘신 패키지(GCG Wisconsin Package) 버전 10.3 (캘리포니아주 샌디에고 소재의 엑설리스(Accelrys)))으로 서열을 비교하여 측정한다.

"폴리뉴클레오티드," "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"이란 용어는 본 명세서 전반에서 상호교환적으로 사용되며, DNA 분자 (예로서, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자 (예로서, mRNA), 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체 (예로서, 펩티드 핵산 및 비-천연적으로 발생된 뉴클레오티드 유사체) 및 그의 하이브리드를 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 항체, 그의 단편, 유도체, 뮤테인 또는 변이체를 코딩하는 인접 오픈 리딩 프레임을 포함한다.

2개의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 한 뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드가 도입된 갭 없이, 그리고 각 서열의 5' 또는 3' 말단에 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드는 없이, 나머지 한 폴리뉴클레오티드의 상보성 뉴클레오티드와 대향하도록 역평행 배향으로 정렬될 수 있다면 서로의 "상보체"이다. 폴리뉴클레오티드는 2개의 폴리뉴클레오티드가 중간 정도의 엄격도 조건하에서 서로 하이브리드화할 수 있다면 또다른 폴리뉴클레오티드에 "상보성"이다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 그의 상보체가 아니어도 다른 폴리뉴클레오티드에 상보성일 수 있다.

"벡터"는 여기에 결합된 또다른 핵산을 세포 내로 도입시키는데 사용될 수 있는 핵산이다. 벡터 중 한가지 유형은, 추가 핵산 분절이 결찰될 수 있는 선형 또는 환형 이중 가닥 DNA 분자를 의미하는 "플라스미드"이다. 또다른 유형의 벡터는 추가 DNA 분절이 바이러스 게놈 내로 도입될 수 있는 바이러스 벡터 (예로서, 복제 결손형 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)이다. 특정 벡터는 이것이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다 (예로서, 세균의 복제 기원을 포함하는 세균 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예로서, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입되는 즉시 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 숙주 게놈을 따라 복제된다. "발현 벡터"는 선택된 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도할 수 있는 벡터 유형이다.

뉴클레오티드 서열은 조절 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현 (예로서, 발현 수준, 발현 시기 또는 발현 위치)에 영향을 미친다면, 그 조절 서열에 "작동가능하게 연결된" 것이다. "조절 서열"은 작동가능하게 연결된 핵산의 발현 (예로서, 발현 수준, 시기 또는 위치)에 영향을 미치는 핵산이다. 조절 서열은 예를 들어, 그 효과를 조절된 핵산에 직접 발휘하거나, 또는 하나 이상의 다른 분자 (예로서, 조절 서열 및/또는 핵산에 결합하는 폴리펩티드)의 작용을 통해서 발휘할 수 있다. 조절 서열의 예에는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소 (예로서, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 조절 서열의 추가 예는 예를 들어, 문헌 ([Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA] 및 [Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06])에 기재되어 있다.

"숙주 세포"는 핵산, 예로서, 본 발명의 핵산을 발현하는데 사용될 수 있는 세포이다. 숙주 세포는 E. 콜라이(E. coli)와 같은 원핵생물이거나, 또는 단세포 진핵생물 (예로서, 효모 또는 다른 진균류), 식물 세포 (예로서, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포 (예로서, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포, 래트 세포, 마우스 세포 또는 곤충 세포) 또는 하이브리도마와 같은 진핵세포일 수 있다. 숙주 세포의 예로는 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주 (ATCC CRL 1651) (문헌 [Gluzman et al., 1981, Cell 23:175] 참조), L 세포, C127 세포, 3T3 세포 (ATCC CCL 163), 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 그의 유도체, 예를 들면 무혈청 배지에서 성장하는 베지(Veggie) CHO 및 관련 세포주 (문헌 [Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28; 31] 참조) 또는 DHFR 결손성인 CHO 균주 DX-B11 (문헌 [Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20] 참조), HeLa 세포, BHK(ATCC CRL 10) 세포주, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 CV1 유래의 CV1/EBNA 세포주 (ATCC CCL 70) (문헌 [McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821] 참조), 인간 배아 신장 세포, 예를 들면 293, 293 EBNA 또는 MSR 293, 인간 상피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 다른 형질전환된 영장류 세포주, 정상 배수염색체 세포, 일차 조직의 시험관내 배양 유래의 세포 계통, 일차 체외이식편, HL-60, U937, HaK 및 Jurkat 세포를 포함한다. 전형적으로, 숙주 세포는 이후에 숙주 세포에서 발현될 수 있는 폴리펩티드 코딩 핵산에 의해 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 배양된 세포이다. "재조합 숙주 세포"란 표현은 발현될 핵산으로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 나타내는데 사용될 수 있다. 숙주 세포는 또한 핵산을 포함하지만, 조절 서열이 숙주 세포에 도입되어 그 핵산에 작동가능하게 연결되지 않는 한 바람직한 수준으로 발현되지 않는 핵산을 포함하는 세포일 수 있다. 숙주 세포란 용어는 특별한 대상체 세포를 의미할 뿐만 아니라, 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손도 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 후속 세대에서는 돌연변이 또는 환경의 영향으로 인해 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 그러한 자손은 사실상 모체 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용되는 용어의 범주 내에 여전히 포함된다.

PAR -2

앞서 논의된 바와 같이, PAR-2는 7-막투과 G-커플링 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이며; N 말단의 단백질 가수분해 효소에 의해 절단에 의해 연결형 리간드를 형성함으로써 활성화가 개시된다. 인간 PAR-2의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 서열 1 및 2에 제시하고; 마우스 PAR-2의 아미노산 서열은 서열 3에 제시하고, 래트 PAR-2의 아미노산 서열은 서열 4에 제시한다. 단백질 가수분해 효소에 의해 절단에 의해 상기 수용체의 활성 형태가 생성되는데, 이는 본원에서는 "절단된" 또는 "잘린(clipped)" PAR-2로서 상호교환적으로 지칭된다.

항원 결합 단백질

하나의 측면에서, 본 발명은 PAR-2, 예로서, 인간 PAR-2에 결합하는 항원 결합 단백질 (예로서, 항체, 항체 단편, 항체 유도체, 항체 뮤테인 및 항체 변이체)를 제공한다.

본 발명에 따른 항원 결합 단백질로는 PAR-2의 생물학적 활성을 저해시키는 항원 결합 단백질을 포함한다. 이러한 생물학적 활성의 예로는 G-단백질-커플링 수용체-매개 공통 신호 전달 경로의 활성화, 예를 들면 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트 생산 및 Ca(2+) 동원, 및 ERK, p38MAPK, JNK, 및 IKK를 포함한, 다중 키나제 경로의 활성화를 포함한다. 다른 생물학적 활성으로는 생체내에서 PAR-2에 의해 매개되는 것, 예를 들면 외상 및 염증에 대한 반응을 포함하고; 특히, PAR-2는 심혈관, 폐 및 위장계에 관여하는데, 여기서, PAR-2가 염증과 통증 (통각)을 조정하는 것이다. PAR-2 활성화는 또한 염증 반응에서도 중요한 역할을 하는데, 상기 염증 반응이 만성적으로 활성화되면 질환 병태를 유발할 수 있다.

다른 항원 결합 단백질은 PAR-2의 다른 도메인이나 에피토프에 결합하거나, 다른 작용 기작에 의해 작용할 수 있다. 그 예로는 PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화를 방해하거나, 신호 전달을 저해하는 항원 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 작용 부위는 예를 들어, 세포내 (예로서, 세포내 신호 전달 캐스캐이드를 방해하여) 또는 세포외일 수 있다. 항원 결합 단백질은 본 발명에서 사용되는 용도를 찾기 위해 PAR-2 유도 활성을 완전히 저해시킬 필요는 없고; 오히려 PAR-2의 특별한 활성을 감소시키는 항원 결합 단백질이면 마찬가지로 사용이 고려될 수 있다 (특별한 질환을 치료하는데 있어서 PAR-2-결합 항원 결합 단백질의 특별한 작용 기작에 대한 본원의 논의는 단지 예시적인 것이며, 이에 따라 본원에 제시된 방법들이 제한되는 것은 아니다).

본 발명의 범주에 속하는 항-PAR-2 항체의 다른 유도체로는 예를 들면, 항-PAR-2 항체 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 이종 폴리펩티드가 융합되어 있는 재조합 융합 단백질의 발현 등에 의한, 항-PAR-2 항체 또는 그의 단편과 다른 단백질 또는 폴리펩티드의 공유 또는 응집 접합체가 포함한다. 예를 들어, 접합된 펩티드는 이종 신호 (또는 리더) 폴리펩티드, 예로서, 효모 알파-인자 리더, 또는 예를 들면, 에피토프 태그와 같은 펩티드일 수 있다. 항원 결합 단백질-함유 융합 단백질은 항원 결합 단백질의 정제 또는 동정을 용이하게 하기 위해 첨가된 펩티드를 포함할 수 있다(예로서, 폴리-His). 항원 결합 단백질은 또한 문헌 [Hopp et al., Bio / Technology 6: 1204, 1988] 및 미국 특허 5,011,912에 기술된 FLAG® 펩티드 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (서열 7)에 연결될 수 있다. FLAG® 펩티드는 항원성이 크고, 발현된 재조합 단백질의 신속한 분석 및 용이한 정제를 가능하게 하는 특이 모노클로날 항체 (mAb)가 가역적으로 결합하는 에피토프를 제공한다. FLAG® 펩티드가 소정 폴리펩티드에 융합된 융합 단백질을 제조하는데 유용한 시약은 상업적으로 이용가능하다 (미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)).

하나 이상의 항원 결합 단백질을 함유하는 올리고머는 PAR-2 길항제로서 이용될 수 있다. 올리고머는 공유적으로 연결되거나, 비-공유적으로 연결된 이량체, 삼량체 또는 그 이상의 올리고머 형태일 수 있다. 2 이상의 항원 결합 단백질을 포함하는 올리고머도 사용될 수 있다고 보여지면, 그 일례는 동종이량체이다. 다른 올리고머로는 이종이량체, 동종삼량체, 이종삼량체, 동종사량체, 이종사량체 등을 포함한다.

하나의 실시태양은 항원 결합 단백질에 융합된 펩티드 부분들 사이의 공유 또는 비-공유 상호작용을 통해 결합된 다중 항원 결합 단백질을 포함하는 올리고머에 관한 것이다. 상기 펩티드는 펩티드 링커 (스페이서)이거나, 또는 올리고머화를 촉진하는 특성이 있는 펩티드일 수 있다. 류신 지퍼 및 항체로부터 유래된 특정 폴리펩티드는 여기에 부착된 항원 결합 단백질의 올리고머화를 촉진할 수 있는 펩티드 중의 하나로서, 하기에서 더 상세히 설명된다.

특정 실시태양에서, 올리고머는 2 내지 4개의 항원 결합 단백질을 포함한다. 이러한 올리고머의 항원 결합 단백질은 임의 형태, 예를 들면 상기 설명한 형태들 중 임의의 것, 예로서, 변이체 또는 단편일 수 있다. 이러한 올리고머는 PAR-2 결합 활성을 보유한 항원 결합 단백질을 포함하는 것이 바람직하다.

하나의 실시태양에서, 올리고머는 면역글로불린 유래의 폴리펩티드를 사용하여 제조된다. 항체 유래의 폴리펩티드의 다양한 부분 (Fc 도메인 포함)에 융합된 특정 이종 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 제조에 대해서는 예로서, 문헌 ([Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88: 10535]; [Byrn et al., 1990, Nature 344:677]; 및 [Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11])에 기재되어 있다.

본 발명의 하나의 실시태양은 항-PAR-2 항체의 PAR-2 결합 단편을 항체의 Fc 영역에 융합시킴으로써 생성된 2개의 융합 단백질을 포함하는 이량체에 관한 것이다. 이러한 이량체는 예를 들어, 융합 단백질을 코딩하는 유전자 융합체를 적절한 발현 벡터에 삽입하는 단계, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에서 상기 유전자 융합체를 발현시키는 단계, 및 발현된 융합 단백질을 항체 분자와 더욱 유사하게 조립하여, Fc 부분들 사이의 쇄간 이황화 결합을 형성시켜 이량체를 수득하는 단계를 통해 제조할 수 있다.

본원에서 사용된 "Fc 폴리펩티드"란 용어는 항체의 Fc 부위로부터 유래된 폴리펩티드의 천연 형태 및 뮤테인 형태를 포함한다. 또한, 이량체화를 촉진하는 힌지 부위를 함유하는 상기 폴리펩티드의 절단된 형태도 포함한다. Fc 부분을 포함하는 융합 단백질 (및 그로부터 형성된 올리고머)은 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 상에서의 친화성 크로마토그래피를 통해 용이하게 정제되는 장점을 제공한다.

PCT 출원 WO 93/10151 (본원에 참고로 인용된다)에 기술된 바와 같이, 적합한 Fc 폴리펩티드는 인간 IgG1 항체의 Fc 부위의 N 말단 힌지 부위에서부터 천연 C 말단까지의 단일 쇄 폴리펩티드이다. 또다른 유용한 Fc 폴리펩티드는 미국 특허 5,457,035 및 문헌 [Baum et al., 1994, EMBO J. 13: 3992-4001]에 기술된 Fc 뮤테인이다. 이러한 뮤테인의 아미노산 서열은 19번 아미노산이 Leu에서 Ala로, 20번 아미노산이 Leu에서 Glu로, 22번 아미노산이 Gly에서 Ala로 변화된 것을 제외하고는 WO 93/10151에 제시된 천연 Fc 서열의 아미노산 서열과 동일하다. 이러한 뮤테인은 Fc 수용체에 대한 친화성 감소를 나타낸다.

다른 실시태양에서, 항-PAR-2 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변부가 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 가변부를 대신하여 치환될 수 있다.

별법으로, 올리고머는 펩티드 링커 (스페이서 펩티드)를 사용하거나 사용하지 않은, 다수의 항원 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질이다. 적합한 펩티드 링커 중에는 미국 특허 4,751,180 및 4,935,233에 기술된 것이 있다.

올리고머 항원 결합 단백질을 제조하는 또다른 방법은 류신 지퍼를 사용하는 것을 포함한다. 류신 지퍼 도메인은 이것이 발견되는 단백질의 올리고머를 촉진하는 펩티드이다. 류신 지퍼는 맨 처음 수개의 DNA-결합 단백질에서 동정되었고 (문헌 [Landschulz et al., 1988, Science: 240-1759]), 이후 다른 각종 단백질에서 발견되었다. 공지된 류신 지퍼 중에는 이량체화 또는 삼량체화된 천연적으로 발생된 펩티드 및 그의 유도체가 있다. 가용성 올리고머 단백질의 생산에 적합한 류신 지퍼 도메인의 예는 PCT 출원 WO 94/10308에 기재되어 있고, 폐 계면활성 단백질 D (SPD) 유래의 류신 지퍼는 문헌 [Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191] (본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 변형된 류신 지퍼는 여기에 융합된 이종 단백질의 삼량체화를 안정화시키는 용도가 문헌 [Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78]에 기재되어 있다. 한 접근법에 따르면, 류신 지퍼 펩티드에 융합된 항-PAR-2 항체 단편 또는 그의 유도체를 포함하는 재조합 융합 단백질을 적합한 숙주 세포에서 발현시키고, 형성된 가용성 올리고머 항-PAR-2 항체 단편 또는 유도체를 배양 상등액으로부터 회수한다.

하나의 측면에서, 본 발명은 PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화를 방해하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 이러한 항원 결합 단백질은 PAR-2 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체에 대하여 제조될 수 있고, PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화를 방해할 수 있는 능력에 대해 통상의 분석법으로 스크리닝될 수 있다. 적합한 분석법의 예에는 PAR-2를 발현하는 세포의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화를 저해시킬 수 있는 능력에 대해 항원 결합 단백질을 시험하거나, 또는 세포 표면 PAR-2 수용체의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화로 인해 일어나는 생물학적 또는 세포 반응을 감소시키는 능력에 대해 항원 결합 단백질을 시험하는 분석법이 있다. 항원 결합 단백질을 시험하는 추가 분석법으로는 항원 결합 단백질의 전장의 절단되지 않은 PAR-2 폴리펩티드에의 결합을, 단백질 가수분해 효소에 의해 절단된 PAR-2 폴리펩티드에의 결합과 정성적으로 또는 정량적으로 비교하는 분석법을 포함하며, 이에 관한 수개의 일례는 본원에 개시되어 있다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 절단된 PAR-2와 절단되지 않은 PAR-2, 둘 모두에 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 이러한 항원 결합 단백질은 예를 들면, 상기 기술된 것과 같이 제조되고, 통상적인 분석법으로 스크리닝될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 종 특이성을 입증하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 하나 이상의 포유동물 PAR-2, 예를 들어, 인간 PAR-2 및 마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 게르빌루스쥐, 고양이, 토끼, 개, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 및 인간을 제외한 영장류 PAR-2 중 하나 이상에 결합한다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 하나 이상의 영장류 PAR-2, 예를 들어, 인간 PAR-2 및 사이노몰로거스, 명주원숭이, 붉은털원숭이 및 침팬지 PAR-2 중 하나 이상에 결합한다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 인간, 사이노몰로거스, 명주원숭이, 붉은털원숭이, 또는 침팬지 PAR-2에 특이적으로 결합한다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 게르빌루스쥐, 고양이, 토끼, 개, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 및 인간을 제외한 영장류 PAR-2 중 하나 이상에 결합하지 않는다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 예를 들면, 명주원숭이와 같은 신세계 원숭이 종에 결합하지 않는다.

또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 PAR-2 이외의 임의의 천연적으로 발생된 단백질에 특이적인 결합을 나타내지 않는다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 포유동물 PAR-2 이외의 임의의 천연적으로 발생된 단백질에 특이적인 결합을 나타내지 않는다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 영장류 PAR-2 이외의 임의의 천연적으로 발생된 단백질에 특이적인 결합을 나타내지 않는다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 인간 PAR-2 이외의 임의의 천연적으로 발생된 단백질에 특이적인 결합을 나타내지 않는다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 마우스, 래트, 사이노몰로거스 원숭이, 및 인간 PAR-2에 특이적으로 결합한다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 유사한 결합 친화성으로 마우스, 래트, 사이노몰로거스 원숭이, 및 인간 PAR-2에 특이적으로 결합한다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 마우스, 래트, 사이노몰로거스 원숭이, 및 인간 PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화 결합을 차단한다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 Ca2+ 동원 분석법에서 마우스, 래트, 사이노몰로거스 원숭이, 및 인간 PAR-2에 대해 유사한 IC₅₀을 갖는다.

PAR-2에 대한 항원 결합 단백질의 선택성은 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 본 명세서의 교시에 따라서 측정할 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯, FACS, ELISA 또는 RIA를 사용하여 선택성을 측정할 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 하기 특징들 중 하나 이상의 특징을 갖는 PAR-2 결합 항원 결합 단백질 (예를 들어, 항-PAR-2 항체)을 제공한다: 인간 및 뮤린 PAR-2, 둘 모두에의 결합, 인간 PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화 저해, 뮤린 PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화 저해, PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 절단 부위에, 또는 그 부근에의 결합, 세포 표면에서 발현되는 PAR-2를 상대적으로 거의 하향 조절시키지 않음.

본 발명의 항원 결합 단백질의 항원-결합 단편은 통상의 기법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 단편의 예로는 Fab 및 F(ab')₂ 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 유전공학 기술로 제조된 항체 단편 및 유도체도 주시된다.

추가의 실시태양은 키메라 항체, 예로서, 인간을 제외한 (예로서, 뮤린) 모노클로날 항체의 인간화된 형태를 제공한다. 이러한 인간화된 항체는 공지 기법으로 제조할 수 있고, 이 항체가 인간에게 투여될 때 감소된 면역원성의 장점을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 인간화된 모노클로날 항체는 뮤린 항체의 가변 도메인 (또는 그의 항원 결합부 전체 또는 그 일부) 및 인간 항체 유래의 불변 도메인을 포함한다. 별법으로, 인간화된 항체 단편은 뮤린 모노클로날 항체의 항원 결합부와 인간 항체 유래의 가변 도메인 단편 (항원 결합부 제외)을 포함할 수 있다. 키메라성 및 추가 조작된 모노클로날 항체를 생산하는 방법은 문헌 ([Riechmann et al., 1988, Nature 332:323], [Liu et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3439], [Larrick et al., 1989, Bio/Technology 7:934], 및 [Winter et al., 1993, TIPS 14: 139])에 기재되어 있는 것을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 키메라 항체는 CDR 이식된 항체이다. 항체의 인간화 기법은 예로서, 미국 특허 출원 번호 제10/194,975호 (2003년 2월 27일 공개), 미국 특허 번호 제5,869,619호, 제5,225,539호, 제5,821,337호, 제5,859,205호, 문헌 [Padlan et al., 1995, FASEB J. 9: 133-39], 및 [Tamura et al., 2000, J. Immunol. 164: 1432-41]에서 논의된 바 있다.

인간을 제외한 동물에서 인간 항체 또는 부분 인간 항체를 생산하기 위한 방법은 개발되어 있다. 예를 들어, 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자가 다양한 수단에 의해 불활성화되어 있는 마우스를 제조하였다. 이와 같이 불활성화된 마우스 유전자 대신에 인간 면역글로불린 유전자를 마우스 내로 도입시킨다. 이 동물에서 생산되는 항체는 동물 내로 도입된 인간 유전자 물질에 의해 코딩된 인간 면역글로불린 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 예를 들면 트랜스제닉 마우스와 같은, 인간을 제외한 동물을 PAR-2 폴리펩티드로 면역화시켜, PAR-2 폴리펩티드에 대한 항체가 상기 동물에서 생산될 수 있도록 한다. 적합한 면역원의 일례로 가용성 인간 PAR-2, 예를 들면 PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의해 절단 부위를 포함하는 폴리펩티드, 또는 다른 면역원성 단편 PAR-2가 있다. 적합한 면역원의 또다른 일례로는 PAR-2를 고수준으로 발현하는 세포, 또는 그로부터 유래된 세포막 시료가 있다.

인간 또는 부분 인간 항체의 생산을 위한 트랜스제닉 동물의 생산 및 사용 기법에 대한 예는 미국 특허 5,814,318, 5,569,825, 및 5,545,806, [Davis et al., 2003, Production of human antibodies from transgenic mice in Lo, ed. Antibody Engineering: Methods and Protocols, Humana Press, NJ:191-200], [Kellermann et al., 2002, Curr Opin Biotechnol. 13:593-97], [Russel et al., 2000, Infect Immun. 68:1820-26], [Gallo et al., 2000, Eur J Immun. 30:534-40], [Davis et al., 1999, Cancer Metastasis Rev. 18:421-25], [Green, 1999, J Immunol Methods. 231:11-23], [Jakobovits, 1998, Adv Drug Deliv Rev 31:33-42], [Green et al., 1998, J Exp Med. 188:483-95], [Jakobovits A, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs. 7:607-14], [Tsuda et al., 1997, Genomics. 42:413-21], [Mendez et al., 1997, Nat Genet. 15:146-56], [Jakobovits, 1994, Curr Biol. 4:761-63], [Arbones et al., 1994, Immunity. 1:247-60], [Green et al., 1994, Nat Genet. 7:13-21], [Jakobovits et al., 1993, Nature. 362:255-58], [Jakobovits et al., 1993, Proc Natl Acad Sci U S A. 90:2551-55], [Chen, J. et al., 1993, Int Immunol 5:647-656], [Choi et al., 1993, Nature Genetics 4: 117-23], [Fishwild et al., 1996, Nat Biotechnol 14: 845-51], [Harding et al., 1995, Ann NY Acad Sci], [Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-59], [Lonberg, 1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies in Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101], [Lonberg et al., 1995, Int Rev Immunol 13: 65-93], [Neuberger, 1996, Nat Biotechnol 14: 826], [Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20: 6287-95], [Taylor et al., 1994, Int Immunol 6: 579-91], [Tomizuka et al., 1997, Nat Gen 16: 133-43], [Tomizuka et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97: 722-27], [Tuaillon et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90: 3720-24], 및 [Tuaillon et al., 1994, J Immunol 152: 2912-20]에 기재되어 있다. 이들 및 기타 다른 예 또한 2007년 3월 3일 공개된 미국 특허 출원 공보 2007-0098715에서 논의된 바 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 PAR-2에 결합하는 모노클로날 항체를 제공한다. 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 임의의 기법을 사용하여, 예로서, 면역화 스케줄을 완료한 후 트랜스제닉 동물로부터 수거한 비장 세포를 불멸화시켜 생산할 수 있다. 비장 세포의 불멸화는 당업계에 공지된 임의의 기법을 사용하여, 예로서, 이 비장 세포를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생산함으로써 수행될 수 있다. 하이브리도마를 생산하는 융합 방법에 사용하기 위한 골수종 세포는 항체생산성이 아니고, 융합율이 높고, 원하는 융합 세포 (하이브리도마)만의 성장을 지지하는 특정 선택 배지에서는 성장을 할 수 없게 하는 효소 결핍성인 것이 바람직하다. 마우스 융합체에 사용하기 위한 적합한 세포주의 예로는 Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XX0 Bul을 포함하고; 래트 융합체에 사용되는 세포주의 예로는 R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 4B210을 포함한다. 세포 융합체에 유용한 다른 세포주는 U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6이다.

하나의 실시태양에서, PAR-2 면역원으로 동물 (예로서, 인간 면역글로불린 서열을 보유한 트랜스제닉 동물)을 면역화하고; 면역화된 동물로부터 비장 세포를 수거한 뒤; 수거한 비장 세포를 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 생산하고; 이 하이브리도마 세포로부터 하이브리도마 세포주를 확립시킨 뒤, PAR-2 폴리펩티드에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 동정함으로써 하이브리도마 세포주를 생산한다. 이러한 하이브리도마 세포주 및 이에 의해 생산된 항-PAR-2 모노클로날 항체는 본 발명에 포함된다.

하이브리도마 세포주에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 임의의 기법을 사용하여 정제할 수 있다. 하이브리도마 또는 mAb는 예를 들면, PAR-2 유도 활성을 차단할 수 있는 능력과 같은 특별한 특성을 보유한 mAb를 동정하기 위해 추가로 스크리닝할 수 있다. 이러한 스크린의 예는 하기 실시예를 통해 제시한다.

모노클로날 항체는 또한 유전자 면역법이라 지칭되는 공정을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 관심의 대상이 되는 항원을 코딩하는 핵산을 바이러스 벡터 (예를 들면, 아데노바이러스 벡터)로 혼입시킬 수 있다. 이어서, 생성된 벡터를 사용하여 적합한 숙주 동물 (예를 들면, 비-비만 당뇨, 또는 NOD 마우스)에서 관심의 대상이 되는 항원에 대한 면역 반응을 발생시킨다. 이러한 기법은 대체로 문헌 [Ritter et al., Biodrugs16(1): 3-10 (2002)] (상기 개시 내용이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

또한, 항체 결합부의 중심에 존재하는 상보성 결정 부위 (CDR)의 분자 진화는 친화성이 증가된 항체, 예를 들어, 문헌 [Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551]에 기재된 바와 같은 c-erbB-2에 대한 친화성이 증가된 항체 등을 단리시키는데 사용되었다. 따라서, 이러한 기법은 PAR-2에 대한 항체를 제조하는데 유용하다.

PAR-2에 대한 항원 결합 단백질은 예를 들어, 시험관내 또는 생체내에서 PAR-2 폴리펩티드의 존재를 검출하는 분석법 등에도 사용될 수 있다. 또한, 항원 결합 단백질은 면역친화성 크로마토그래피에 의해 PAR-2 단백질을 정제하는데에도 사용될 수 있다. 추가로 PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화를 차단할 수 있는 상기 항원 결합 단백질은 그 결합에 기인한 생물학적 활성을 저해시키는데 사용될 수 있다. 차단성 항원 결합 단백질은 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. PAR-2 길항제로서 작용하는 상기 항원 결합 단백질은 염증 병태를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 PAR-2-유도성 병태를 치료하는데 사용될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 트랜스제닉 마우스의 면역화를 포함하는 방법에 의해 생산되는 인간 항-PAR-2 모노클로날 항체는 상기 병태 치료에 사용된다.

항원 결합 단백질은 PAR-2-유도 생물학적 활성을 저해시키기 위해 생체내 투여되거나 시험관내 방법에 사용될 수 있다. 따라서, PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화에 의해 (직접 또는 간접적으로) 유발되거나 악화된 질병 (그 예는 본원에 제공되어 있다)은 치료될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 PAR-2-유도 생물학적 활성을 저하시키는데 유효한 양으로 PAR-2 차단성 항원 결합 단백질을 그를 필요로 하는 포유동물에게 생체내 투여하는 것을 포함하는 치료학적 방법을 제공한다.

본 발명의 항원 결합 단백질은 PAR-2의 생물학적 활성을 저해시키는 부분 인간 및 완전 인간 모노클로날 항체를 포함한다. 하나의 실시태양은 인간 PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화를 적어도 부분적으로 차단하는 인간 모노클로날 항체에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서, 이러한 항체는 트랜스제닉 마우스를 PAR-2 면역원으로 면역화시킴으로써 생산된다. 또다른 실시태양에서, 면역원은 인간 PAR-2 폴리펩티드 (예로서, PAR-2 절단 부위의 전체 또는 그 일부를 포함하는 가용성 단편)이다. 본원에서는 이와 같이 면역화된 마우스에서 유래되고, PAR-2에 결합하는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주 또한 제공한다.

인간, 부분 인간 또는 인간화된 항체가 다수의 적용들, 특히 인간 대상체에게 항체를 투여하는 것을 포함하는 적용들에 적합할지라도, 특정 유형의 항원 결합 단백질이 특정 적용에 적합할 것이다. 본 발명의 비-인간 항체는 예를 들어, 임의의 항체 생산 동물, 예를 들면 마우스, 래트, 토끼, 염소, 당나귀 또는 인간을 제외한 영장류 (예를 들면, 원숭이 (예로서, 사이노몰로거스 또는 붉은털원숭이) 또는 꼬리없는 원숭이 (예로서, 침팬지))로부터 유래되는 것일 수 있다. 본 발명의 비-인간 항체는 예를 들어, 시험관내 및 세포 배양을 기반으로 한 적용 또는 본 발명의 항체에 대한 면역반응이 일어나지 않거나, 무시할 정도이거나, 방지될 수 있거나, 중요하지 않거나 또는 바람직한 임의의 다른 적용에 사용될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 비-인간 항체는 인간을 제외한 대상체에게 투여된다. 또다른 실시태양에서, 비-인간 항체는 인간을 제외한 대상체에서 면역반응을 유발하지 않는다. 또다른 실시태양에서, 비-인간 항체는 인간을 제외한 대상체와 동일한 종 유래인 것으로서, 예로서, 본 발명의 마우스 항체는 마우스에게 투여된다. 특정 종으로부터의 항체는 예를 들어, 그 종의 동물을 바람직한 면역원 (예로서, 가용성 PAR-2 폴리펩티드)으로 면역화하거나, 그 종의 항체 생산을 위해 인공 시스템 (예로서, 특정 종의 항체 생산용 세균 또는 파아지 디스플레이-기반 시스템)을 이용하거나, 또는 예로서, 항체의 불변 부위를 다른 종 유래의 불변 부위로 치환시키거나 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기를 다른 종 유래의 항체의 서열과 매우 유사하도록 치환시켜, 한 종 유래의 항체를 또다른 종 유래의 항체로 변환시켜 제조할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 항체는 2 이상의 다른 종의 항체로부터 유래되는 아미노산 서열을 함유하는 키메라 항체이다.

항원 결합 단백질은 임의의 다수의 통상적인 기법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 단백질은 천연적으로 이 단백질을 발현하는 세포로부터 정제될 수 있거나 (예로서, 항체는 이를 생산하는 하이브리도마로부터 정제될 수 있다), 또는 당업계에 공지된 임의의 기법을 사용하여 재조합 발현 시스템에서 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Monoclonal Antibodies , Hybridomas : A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980)]; 및 [Antibodies : A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988)]을 참조한다.

당업계에 공지된 임의의 발현 시스템을 사용하여 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 일반적으로, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시킨다. 사용될 수 있는 숙주 세포 중에는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포가 있다. 원핵생물에는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, E. 콜라이 또는 바실러스가 있다. 고등 진핵생물 세포에는 곤충 세포 및 포유동물 기원의 확립세포주가 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주 (ATCC CRL 1651) (문헌 [Gluzman et al., 1981, Cell 23:175]), L 세포, 293 세포, C127 세포, 3T3 세포 (ATCC CCL 163), 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, BHK (ATCC CRL 10) 세포주, 및 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 CVI 유래의 CVI/EBNA 세포주 (ATCC CCL 70) (문헌 [McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821]에 기재)를 포함한다. 세균, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주에 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터에 대해서는 문헌 [Pouwels et al. (Cloning Vectors : Laboratory Manual , Elsevier, New York, 1985]에 기재되어 있다.

형질전환된 세포를, 폴리펩티드의 발현을 촉진시키는 조건하에서 배양할 수 있고, 폴리펩티드는 통상의 단백질 정제 방법에 따라 회수한다. 이러한 정제 방법 중 하나로는 예로서, PAR-2 전체 또는 그 일부 (예로서, 세포외 도메인)가 결합되어 있는 매트릭스 상에서 친화성 크로마토그래피를 사용하는 것을 포함한다. 본원에서 사용을 위해 주시된 폴리펩티드로는 실질적으로 내인성 불순물이 없는 실질적으로 균질성인 재조합 포유동물 항-PAR-2 항체 폴리펩티드를 포함한다.

항원 결합 단백질은 공지된 많은 임의의 기법에 의해 제조되고 바람직한 특성질에 대해 스크리닝될 수 있다. 특정 기법은 관심의 대상이 되는 항원 결합 단백질 (예로서, 항-PAR-2 항체)의 폴리펩티드 쇄 (또는 그의 일부)를 코딩하는 핵산을 단리시키는 단계 및 이러한 핵산을 재조합 DNA 기술을 통해 조작하는 단계를 포함한다. 핵산은 관심의 대상이 되는 또다른 핵산에 융합될 수 있거나, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기를 첨가, 결실 또는 치환하기 위해 (예로서, 돌연변이유발 또는 다른 통상의 기술에 의해) 변경될 수 있다.

하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-PAR-2 항체의 항원-결합 단편을 제공한다. 이러한 단편은 전적으로 항체-유래 서열로 구성되거나, 추가 서열을 포함할 수 있다. 항원-결합 단편의 예로는 Fab, F(ab')₂, 단일 쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 및 도메인 항체를 포함한다. 다른 예는 문헌 [Lunde et al., 2002, Biochem. Soc. Trans. 30:500-06]에 제시되어 있다.

아미노산 가교 (짧은 펩티드 링커)를 통해 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (Fv 영역) 단편을 연결시켜 단일 폴리펩티드 쇄를 만들어냄으로써 단일 쇄 항체를 형성할 수 있다. 이러한 단일 쇄 Fv (scFv)는 2개의 가변 도메인 폴리펩티드 (V_L 및 V_H)를 코딩하는 DNA 사이에 펩티드 링커를 코딩하는 DNA를 융합시켜 제조하였다. 생성된 폴리펩티드는 그 자체를 폴딩하여 항원-결합 단량체를 형성하거나, 두 가변 도메인 사이의 가요성 링커의 길이에 따라서 다량체 (예로서, 이량체, 삼량체 또는 사량체)를 형성할 수 있다 (문헌 ([Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423]; [Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108])). 다른 V_L 및 V_H를 포함하는 폴리펩티드를 조합함으로써 다른 에피토프에 결합하는 다량체 scFv를 형성할 수 있다 (문헌 [Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18: 31-40]). 단일 쇄 항체 생산을 위해 개발된 기법으로는 미국 특허 번호 제4,946,778호; 문헌 ([Bird, 1988, Science 242:423]; [Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879]; [Ward et al., 1989, Nature 334:544], [de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87])에 기재되어 있는 것을 포함한다.

본 발명의 항원 결합 단백질 (예로서, 항체, 항체 단편, 및 항체 유도체)은 당업계에 공지된 임의의 불변 부위를 포함할 수 있다. 경쇄 불변 부위는 예를 들어, 카파형 또는 람다형 경쇄 불변 부위, 예로서, 인간 카파형 또는 람다형 경쇄 불변 부위일 수 있다. 중쇄 불변 부위는 예를 들어, 알파형, 델타형, 입실론형, 감마형 또는 뮤형 중쇄 불변 부위, 예로서, 인간 알파형, 델타형, 입실론형, 감마형 또는 뮤형 중쇄 불변 부위일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 경쇄 또는 중쇄 불변 부위는 천연적으로 발생된 불변 부위의 단편, 유도체, 변이체 또는 뮤테인이다.

관심의 대상이 되는 항체로부터 다른 하위부류 또는 이소형의 항체를 유도하는 기법, 즉, 하위부류 변환법은 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어, IgG 항체는 IgM 항체로부터 유도될 수 있고, 그 반대일 수도 있다. 이러한 기법에 따르면 소정 항체 (모체 항체)의 항원-결합 특성을 갖지만, 모체 항체와는 다른 항체 이소형 또는 하위부류와 관련된 생물학적 특성을 나타내는 새로운 항체를 제조할 수 있다. 재조합 DNA 기법이 이용될 수 있다. 특정 항체 폴리펩티드를 코딩하는 클로닝된 DNA, 예로서, 원하는 이소형 항체의 불변 도메인을 코딩하는 DNA가 이러한 방법에 사용될 수 있다. 또한, 문헌 [Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol.178:303-16]을 참조한다. 더욱이, IgG4를 원한다면, 문헌 [Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407] (본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 바와 같이, 힌지 부위에 점 돌연변이(CPSCP → CPPCP)를 도입하여 IgG4 항체에 이종원성을 유도할 수 있는 H쇄내 이황화 결합을 형성하는 경향을 경감시키는 것이 바람직할 수 있다.

더욱이, 특성이 다른 (즉, 그가 결합하는 항원에 대한 친화성이 다른) 항원 결합 단백질을 유도하는 기법 또한 공지되어 있다. 쇄 셔플링(shuffling)으로 불리는 이 기법 중 하나는 파지 디스플레이로 종종 불리는, 섬유상 박테리오파지의 표면 상에서 면역글로불린 가변 도메인 유전자 레파토리를 디스플레이하는 단계를 포함한다. 쇄 셔플링은 문헌 [Marks et al., 1992, BioTechnology, 10:779]에 기재되어 있는 바와 같이, 합텐 2-페닐옥사졸-5-온에 대해 고도의 친화성을 나타내는 항체를 제조하는데 사용되었다.

특정 실시태양에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 적어도 10⁶의 PAR-2에 대한 결합 친화성 (K_a)을 갖는다. 다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 적어도 10⁷, 적어도 10⁸, 적어도 10⁹, 또는 적어도 10¹⁰의 K_a를 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 본원 실시예에 기술된 항체의 것과 실질적으로 동일한 K_a를 나타낸다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 PAR-2로부터의 해리 속도가 느린 항원 결합 단백질을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 1x10^-4s^-1 이하의 K_{오 프}를 갖는다. 또다른 실시태양에서, K_오프는 5x10^-5s^-1 이하이다. 또다른 실시태양에서, K_오프는 본원 실시예에 기술된 항체의 것과 실질적으로 동일하다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 본원 실시예에 기술된 항체의 것과 실질적으로 동일한 K_오프로 PAR-2에 결합한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 PAR-2의 활성, 예를 들어, Ca2+ 동원을 저해시키는 항원 결합 단백질을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 1000 nM 이하의 IC₅₀을 갖는다. 또다른 실시태양에서, IC₅₀은 100 nM 이하이고; 또다른 실시태양에서, IC₅₀은 10 nM이하이다. 또다른 실시태양에서, IC₅₀은 본원 실시예에 기술된 항체의 것과 실질적으로 동일하다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 본원 실시예에 기술된 항체의 것과 실질적으로 동일한 IC₅₀으로 PAR-2 활성을 저해시킨다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 전장의 PAR-2에는 결합하고, 그보다는 적은 정도로 절단된 PAR-2에 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 다양한 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 절단된 PAR-2에 결합하는 것보다 적어도 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 97％, 99％, 및 99.9％ 초과 만큼 전장의 PAR-2 에 결합한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 인간 PAR-2의 프로테아제 절단 부위에, 또는 그 부근에 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 절단 부위의 하류에 결합하는 반면 (즉, 전장 및 절단된 아미노-말단 PAR-2-Fc, 둘 모두에 결합하는 반면); 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 절단 부위의 상류에 결합한다 (즉, 전장의 PAR-2/Fc에만 결합한다). 프로테아제 절단 부위에 결합하는 항원 결합 단백질은 당업계에 공지되어 있는 임의의 기법을 사용함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 이러한 항원 결합 단백질은 (예로서, 막-결합 시료 중의) 전장의 PAR-2 폴리펩티드, PAR-2의 가용성 세포외 도메인 단편, 또는 프로테아제 절단 부위 (그 예는 본원에서 제공한다)를 포함하거나, 그로 구성된 PAR-2의 세포외 도메인의 더 작은 단편의 사용으로 단리될 수 있다. 그렇게 단리된 항원 결합 단백질을 스크리닝하여 당업계에 공지된 임의의 방법 (그 예는 본원에서 제공한다)을 사용함으로써 결합 특이성을 측정할 수 있다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 PAR-2에의 결합에 대하여 본원에 개시된 항체와 경쟁하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 이러한 경쟁 능력은 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해, 예를 들어, 웨스턴 블롯 (또는 또다른 펩티드-기반 분석법)에서 PAR-2/Fc에의 결합 경쟁에 의해, 또는 본원에 기술된 Ca2+ 유량 분석에서의 경쟁에 의해 측정될 수 있다. 하나의 측면에서, PAR-2에의 결합에 대하여 본원에 개시된 항체와 경쟁하는 항원 결합 단백질은 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 또다른 측면에서, PAR-2에의 결합에 대하여 본원에 개시된 항체와 경쟁하는 항원 결합 단백질은 PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화를 저해시킨다.

또다른 측면에서, 본 발명은 세포 표면 상에서 발현된 인간 PAR-2에 결합하고, 그렇게 결합한 경우, 세포 표면 상의 PAR-2의 양은 유의적으로 감소시키지 않으면서 세포에서의 PAR-2 신호 전달 활성을 저해시키는 항원 결합 단백질을 제공한다. 표면상의 PAR-2, 및/또는 세포 내부에 존재하는 PAR-2의 양을 측정하거나 예측하는데 임의의 방법을 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 세포 표면 상에서 발현된 인간 PAR-2의 프로테아제 절단 부위에, 또는 그 부근에 결합하고, 그렇게 결합한 경우, PAR-2를 세포 표면으로부터 내재화시키는 속도를 유의적으로 증가시키지 않으면서 세포에서의 PAR-2 신호 전달 활성을 저해시키는 항원 결합 단백질을 제공한다. 다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질이 PAR-2-발현 세포에 결합하게 되면 약 75％, 50％, 40％, 30％, 20％, 15％, 10％, 5％, 1％, 또는 0.1％ 미만의 세포-표면 PAR-2가 내재화된다.

또다른 측면에서, 본 발명은 반감기가 시험관내 또는 생체내 (예로서, 인간 대상체에게 투여했을 때)에서 적어도 1일인 항원 결합 단백질을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 반감기가 적어도 3일이다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질의 반감기는 4일 이상이다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질의 반감기는 8일 이상이다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 유도체화되지 않거나, 변형되지 않은 항원 결합 단백질과 비교했을 때 더욱 긴 반감기를 갖도록 유도체화되거나 변형된다. 또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 예로서, WO 00/09560 (2000년 2월 24일 공개) (이는 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같이, 혈청 반감기를 증가시키기 위해 하나 이상의 점돌연변이를 포함한다.

본 발명은 추가로 2개의 다른 항원 결합부 또는 항원 결합 부위를 통해 2개의 다른 PAR-2 에피토프에 결합하거나, 또는 PAR-2의 에피토프와 또다른 분자의 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질과 같은, 예를 들어, 이중특이성 항원 결합 단백질과 같은 다중특이성 항원 결합 단백질을 제공한다. 더욱이, 본원에 개시된 이중특이성 항원 결합 단백질은 본원에 기술된 항체들 중 한 항체 유래의 PAR-2 결합부 및 본원에 기술된 또다른 항체 유래의 제2 PAR-2 결합 부위 (예컨대, 다른 공개 문헌을 참고로 하여 본원에 기술된 것 포함)을 포함할 수 있다. 별법으로, 이중특이성 항원 결합 단백질은 본원에 기술된 항체들 중 한 항체 유래의 항원 결합부, 및 당업계에 공지된 또다른 PAR-2 항체, 또는 공지 방법 또는 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 항체 유래의 제2 항원 결합부를 포함할 수 있다.

이중특이성 항체를 제조하는 수많은 방법이 당업계에 공지되어 있고, 2001년 4월 20일에 출원된 미국 특허 출원 09/839,632 (본원에서 참고로 인용된다)에서 논의되고 있다. 이러한 방법으로는 문헌 [Milstein et al., 1983, Nature 305:537] 및 다른 문헌 (미국 특허 4,474,893, 미국 특허 6,106,833)에 기술된 바와 같은 하이브리드-하이브리도마의 사용, 및 항체 단편의 화학적 커플링법 (문헌 [Brennan et al., 1985, Science 229:81]; [Glennie et al., 1987, J. Immunol. 139:2367]; 미국 특허 6,010,902)을 포함한다. 더욱이, 이중특이성 항체는 재조합 수단을 통해, 예를 들어, 류신 지퍼 부분 (즉, 이종이량체를 우선적으로 형성하는 Fos 및 Jun 단백질 유래; 문헌 [Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547]) 또는 미국 특허 5,582,996에 기술된 바와 같은 다른 자물쇠와 열쇠 상호작용 도메인 구조를 사용하여 제조할 수 있다. 추가의 유용한 기법은 문헌 ([Kortt et al., 1997, 상기 문헌 동일]; 미국 특허 5,959,083; 및 미국 특허 5,807,706)에 기재되어 있는 것을 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 항체의 유도체를 포함한다. 유도체화된 항체는 항체에 원하는 특성, 예로서, 특정 용도의 증가된 반감기 등을 부여하는 임의의 분자 또는 물질을 포함할 수 있다. 유도체화된 항체는 예를 들어, 검출가능한 (또는 표지화) 부분 (예로서, 방사성, 비색성, 항원성 또는 효소적 분자, 검출가능한 비드 (예로서, 자성 또는 전자고밀도 (예로서, 금) 비드) 또는 다른 분자에 결합하는 분자 (예로서, 비오틴 또는 스트렙트아비딘)), 치료용 또는 진단용 부분 (예로서, 방사성, 세포독성 또는 제약상 활성인 부분), 또는 특정 용도 (예로서, 인간 대상체와 같은 대상체에 대한 투여, 또는 다른 생체내 또는 시험관내 용도)를 위해 항체의 적합성을 증가시키는 분자를 포함할 수 있다. 항체를 유도체화시키는데 사용될 수 있는 분자의 예로는 알부민 (예로서, 인간 혈청 알부민) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 알부민-결합 및 PEG화된 항체 유도체는 당업계에 잘 알려져 있는 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 이 항체는 트랜스티레틴 (TTR) 또는 TTR 변이체에 접합 또는 다른 방식으로 결합된다. 이러한 TTR 또는 TTR 변이체는 예를 들어, 덱스트란, 폴리(n-비닐 피롤리돈), 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 및 폴리비닐 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학물질로 화학적으로 변형될 수 있다 (미국 특허 출원 번호 제20030195154호).

또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원 결합 단백질을 사용하여 PAR-2에 결합하는 분자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 임의의 적합한 스크리닝 기법이 사용될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 항원 결합 단백질이 결합하는 PAR-2 분자 또는 그의 단편을 본 발명의 항원 결합 단백질 및 다른 분자와 접촉시키는데, 여기서, 다른 분자가 PAR-2에의 항원 결합 단백질의 결합을 감소시킨다면 그 다른 분자가 PAR-2에 결합하는 것이다. 항원 결합 단백질의 결합은 예로서, ELISA와 같은 임의의 적합한 방법을 사용하여 검출할 수 있다. PAR-2에의 항원 결합 단백질의 결합을 검출하는 것은 상기 논의된 바와 같이, 항원 결합 단백질을 검출가능하게 표지화함으로써 간소화시킬 수 있다. 또다른 실시태양에서, PAR-2 결합 분자는 이 분자가 PAR-2 활성화 및/또는 신호 전달을 저해시키는지 여부를 측정하기 위해 추가 분석된다.

핵산

하나의 측면에서, 본 발명은 단리된 핵산 분자를 제공한다. 핵산은 예를 들어, 항원 결합 단백질 전체 또는 그 일부, 예를 들어, 본 발명에 따른 항체의 한쪽 쇄 또는 양쪽 쇄, 그의 단편, 유도체, 뮤테인 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 동정, 분석, 돌연변이화 또는 증폭을 위한 하이브리드화 프로브, PCR 프라이머 또는 서열분석 프라이머로서 사용하기에 충분한 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드의 발현을 저해시키기 위한 안티센스 핵산 및 상기 것들의 상보성 서열을 포함한다. 핵산은 임의의 길이일 수 있다. 그의 길이는 예를 들어, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1,000, 1,500, 3,000, 5,000개 이상의 뉴클레오티드일 수 있고/거나, 하나 이상의 추가 서열, 예를 들어, 조절 서열을 포함할 수 있고/거나, 예를 들면 벡터와 같은 더 큰 핵산의 일부일 수 있다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, RNA 및/또는 DNA 뉴클레오티드 및 그의 인공 변이체 (예로서, 펩티드 핵산)를 포함할 수 있다.

항체 폴리펩티드 (예로서, 중쇄 또는 경쇄, 오로지 가변 도메인만 또는 전장)를 코딩하는 핵산은 PAR-2로 면역화된 마우스의 B-세포로부터 단리될 수 있다. 핵산은 예로서, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)과 같은 통상의 방법에 따라 단리될 수 있다.

본 발명은 추가로 특별한 하이브리드화 조건하에서 다른 핵산에 하이브리드화하는 핵산을 제공한다. 핵산의 하이브리드화 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예로서, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]을 참조한다. 본원에 정의되어 있는 바와 같이, 중간 정도로 엄격한 하이브리드화 조건은 5X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC), 0.5％ SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)를 함유하는 예비세척 용액, 약 50％ 포름아미드, 6X SSC의 하이브리드화 완충액, 및 55℃의 하이브리드화 온도 (또는 예로서, 약 50％ 포름아미드를 함유하는 것과 42℃의 하이브리드화 온도와 같은 다른 유사 하이브리드화 조건) 및 0.5X SSC, 0.1％ SDS 중 60℃에서의 세척 조건을 이용한다. 엄격한 하이브리드화 조건은 6X SSC, 45℃에서 하이브리드화한 후, 0.1X SSC, 0.2％ SDS, 68℃에서 1회 이상 세척하는 것이다. 더욱이, 당업자는 서로 적어도 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99％ 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 전형적으로 서로 하이브리드화된 상태를 유지하도록 하이브리드화의 엄격도를 증가 또는 감소시키는 하이브리드화 및/또는 세척 조건을 조작할 수 있다. 하이브리드화 조건의 선택에 영향을 미치는 기본 파라미터와 적합한 조건을 고안하기 위한 가이던스에 대해서는 예를 들어, 문헌 ([Sambrook, Fritsch, and Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4])에 설명되어 있고, 당업계의 숙련인이라면 DNA의 길이 및/또는 염기 조성 등을 기초로 하여 쉽게 결정할 수 있다.

핵산에 돌연변이에 의한 변화를 일으켜 코딩된 폴리펩티드 (예로서, 항원 결합 단백질)의 아미노산 서열에 변화를 유도할 수 있다. 돌연변이는 당업계에 공지된 임의의 기법을 사용하여 도입시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 하나 이상의 특별한 아미노산 잔기는 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발 프로토콜 등을 사용하여 변화시킨다. 또다른 실시태양에서, 하나 이상의 무작위로 선택된 잔기는 예를 들어, 무작위 돌연변이유발 프로토콜을 사용하여 변화시킨다. 그러나, 제조 후, 돌연변이체 폴리펩티드를 발현시키고 원하는 특성 (예컨대, PAR-2에의 결합 또는 PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화 차단)에 대해 스크리닝할 수 있다.

돌연변이는 코딩된 폴리펩티드의 생물학적 활성을 현저하게 변경시키지 않고 핵산에 도입될 수 있다. 예를 들어, 비-필수아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 유도하는 뉴클레오티드 치환을 만들 수 있다. 하나의 실시태양에서, 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 바람직한 단편, 변이체 또는 유도체는 아미노산 잔기의 하나 이상의 결실 또는 치환을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하도록 돌연변이화된다. 또다른 실시태양에서, 돌연변이유발은 하나 이상의 아미노산 잔기에 인접하게 아미노산을 삽입한다. 별법으로, 하나 이상의 돌연변이는 코딩된 폴리펩티드의 생물학적 활성 (예로서, PAR-2의 결합, PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화 저해 등)을 선택적으로 변화시키는 핵산 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 생물학적 활성을 정량적 또는 정성적으로 변화시킬 수 있다. 정량적 변화의 예로는 활성 증가, 감소 또는 제거를 포함한다. 정성적 변화의 예로는 항원 결합 단백질의 항원 특이성 변화를 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열을 검출하기 위한 하이브리드화 프로브 또는 프라이머로서 사용하기에 적합한 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 전장 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 일부만을 포함할 수 있고, 예를 들어, 프로브 또는 프라이머로 사용될 수 있는 단편 또는 본 발명의 폴리펩티드의 활성부 (예로서, PAR-2 결합부)를 코딩하는 단편을 포함할 수 있다.

본 발명의 핵산 서열을 기초로 한 프로브는 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 전사체와 같은 핵산 또는 유사 핵산을 검출하는데 사용될 수 있다. 프로브는 표지 기, 예로서, 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자를 포함할 수 있다. 이러한 프로브는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 동정하는데 사용될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 일부를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터의 예로는 플라스미드, 바이러스 벡터, 비-에피솜 포유동물 벡터 및 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산을 발현시키는데 적합한 형태로 본 발명의 핵산을 포함한다. 재조합 발현 벡터는 재조합 발현 벡터는 발현에 사용될 숙주 세포에 기초하여 선택된 하나 이상의 조절 서열을 포함하는데, 이는 발현되는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 조절 서열은 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것 (예로서, SV40 조기 유전자 인핸서, 라우스 육종 바이러스 프로모터 및 사이토메갈로바이러스 프로모터), 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것 (예로서, 조직-특이 조절 서열, 문헌 ([Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287], [Maniatis et al., 1987, Science 236: 1237]) (이는 그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다) 참조), 및 특정 처리 또는 조건에 대한 반응으로 뉴클레오티드 서열의 유도성 발현을 지시하는 것 (예로서, 포유동물 세포의 메탈로티오닌 프로모터 및 원핵생물계 및 진핵생물계, 둘 모두에서의 tet-반응성 및/또는 스트렙토마이신-반응성 프로모터 (상기 동일 문헌 참조))을 포함한다. 발현 벡터의 디자인은 형질전환될 숙주 벡터의 선택, 원하는 단백질 발현 수준 등과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다는 것을 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포내로 도입되어 본원에 기술된 핵산에 의해 코딩된 융합 단백질 또는 펩티드를 비롯한 단백질 또는 펩티드를 생산할 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 임의의 원핵생물 세포 (예를 들어, E. 콜라이) 또는 진핵생물 세포 (예를 들어, 효모, 곤충 또는 포유동물 세포 (예로서, CHO 세포))일 수 있다. 벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기법을 통해 원핵생물 또는 진핵생물 세포로 도입될 수 있다. 포유동물 세포의 안정한 형질감염을 위해, 사용되는 발현 벡터와 형질감염 기법에 따라 단지 소량의 세포만이 자신의 게놈에 외래 DNA를 통합시킬 수 있다는 것이 알려져 있다. 이러한 통합체를 동정 및 선별하기 위해, 일반적으로 관심의 대상이 되는 유전자와 함께 선별가능 마커 (예로서, 항생제에 대해 내성을 띠는 것)를 코딩하는 유전자를 숙주 세포 내로 도입시킨다. 바람직한 선별가능 마커로는 약물에 대한 내성을 부여하는 것, 예로서, G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트를 포함한다. 도입된 핵산으로 안정하게 형질감염된 세포는 많은 방법 중에서 약물 선별을 통해 동정될 수 있다 (예로서, 선별가능 마커 유전자가 통합된 세포는 생존하는 반면, 그렇지 않은 세포는 사멸할 것이다).

징후

하나의 측면에서, 본 발명은 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 예를 들어, 일반적으로 대상체의 건강에 좋은 영향을 미칠 수 있고, 예로서, 대상체의 예상 수명을 연장시킬 수 있다. 별법으로, 본 방법은 예를 들어, 질환, 질병, 병태 또는 병 ("병태")을 치료, 예방, 치유, 경감 또는 호전 ("치료 ")할 수 있다. 본 발명에 따라 치료되는 병태 중에는 PAR-2의 부적절한 발현 또는 활성을 특징으로 하는 병태가 있다. 이러한 몇몇 병태에서는 발현 또는 활성 수준이 매우 높고, 치료는 본원에 기술된 바와 같은 PAR-2 길항제를 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 항원 결합 단백질을 사용하여 치료할 수 있거나, 예방할 수 있는 특정 의학적 병태 및 질환으로는 복강 질환, 크론병; 궤양 대장염; 특발성 위마비를 비롯한 위장계의 염증성 병태; 만성 췌장염을 비롯한 췌장염; 염증성 장 질환, 및 위궤양 및 십이지장 궤양을 비롯한 궤양을 포함한다. 본 발명의 항원 결합 단백질은 또한 기도의 염증성 병태, 예로서, 천식 (외인성 천식 및 내인성 천식 뿐만 아니라, 기도의 관련된 만성 염증성 병태, 또는 기도 과민성 포함), 만성 폐쇄 폐 질환 (COPD, 즉, 만성 기관지염, 폐기종), 급성 호흡기 장애 증후군 (ARDS), 호흡 곤란 증후군, 낭성 섬유증, 폐 고혈압증, 폐 혈관수축, 급성 폐 손상, 알레르기성 기관지 폐 아스페르길루스증, 과민성 폐렴, 호산구성 폐렴, 기관지염, 알레르기성 기관지염, 기관지확장증, 결핵, 과민성 폐장염, 직업성 천식, 천식양 질병, 사르코이드증, 반응성 기도 질환 (또는 기능장애) 증후군, 면폐증, 간질성 폐 질환, 과호산구성 증후군, 비염, 부비동염, 및 기생충성 폐 질환, 바이러스-유도성 병태 (예를 들어, 호흡기 신시티움 바이러스 (RSV), 파라인플루엔자 바이러스 (PIV), 리노바이러스 (RV) 및 아데노바이러스)와 관련된 기도 과민증을 치료 또는 호전시키는데 유용하다.

본 발명의 항원 결합 단백질로 치료가능한 류마티스 질병으로는 성인성 및 연소성 류마티스 관절염; 공피증; 전신 홍반 루푸스; 루푸스양 증후군; 미분화 결합 조직 질병; 통풍; 골관절염; 류마티스성 다발성 근육통; 강직성 척추염 및 라이터병을 비롯한 혈청검사 음성인 척추 병변, 건선성 관절염 및 만성 라임병에서의 관절염을 포함한다. 스틸병 및 류마티스 관절염에 동반된 포도막염 또한 이들 폴리펩티드로 치료가능하거나 예방가능하다. 추가로, 본 발명의 폴리펩티드 요법은 피부근육염, 봉입체 근염, 다발성 근염, 및 폐림프관평활근종증을 비롯한, 수의근 및 기타 다른 근육에 염증을 일으키는 질병들을 치료하는데 사용된다. 길랑-바레병, I형 당뇨병, 그레이브스병, 애디슨병, 레이노 현상 (레이노병 및 레이노 증후군 포함), 자가면역성 간염, GVHD (이식편대 숙주병) 등을 비롯한, 추가의 질병 또한 본 발명으로 치료가능하다.

본원에 기술된 질병은 기타 사이토카인, 사이토카인 저해제 및 시약 (본원에서는 면역 조절 인자로도 지칭된다)과 함께 조합된, 본 발명의 항원 결합 단백질로 치료될 수 있다. 예를 들어, 면역 조절 인자로는 IL-18 길항제, 예로서, 가용성 IL-18 수용체, IL-18 또는 IL-18 수용체에 대한 항체, IL-18 결합 단백질; TNF 저해제 (ENBREL® 포함); IL-1 저해제 (가용성 형태의 I형 IL-1R, II형 IL-1R, IL-1에 대한 항체, I형 IL-1R에 대한 항체 포함); 및/또는 개시된 의학적 병태 및 질환을 치료하는데 효과적인 기타 다른 활성제를 포함한다.

본 발명의 조성물 및/또는 방법 또한 예를 들어, 미용적 치료에서, 수의적 치료에서, 수명을 연장시키는데, 생식계 장애를 치료하는데, 및 각종 PAR-2 관련 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 추가로, 상기와 같은 특정 병태에서, PAR-2의 발현 또는 활성 수준은 매우 낮은 바, 치료법은 PAR-2 작용제를 투여하는 것을 포함하며; 그러한 치료법 또한 본원에 이해된다.

치료학적 방법 및 항원 결합 단백질의 투여

본원에서 제공하는 특정 방법은 PAR-2 결합 항원 결합 단백질을 대상체에 투여함으로써 특정 병태에서 중요한 역할을 하는 PAR-2-유도성 생물학적 반응을 감소시키는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 방법은 예로서, 대상체에게 투여하는 것을 통해, 또는 생체외 방법으로 내인성 PAR-2를 PAR-2 결합 항원 결합 단백질과 접촉시키는 것을 포함한다.

"치료"란 용어는 질병의 적어도 하나의 증상 또는 다른 측면의 경감 또는 예방, 또는 중증도의 감소 등을 포함한다. 항원 결합 단백질은 실행가능한 치료제를 구성하기 위해 완전하게 치유하거나, 질병의 모든 증상 또는 징후를 근절시킬 필요는 없다. 당업계에 공지된 바와 같이, 치료제로서 사용되는 약물은 소정의 질환 상태의 중증도를 감소시킬 수 있지만, 유용한 치료제로서 간주되기 위해서 질환의 모든 징후를 제거할 필요는 없다. 유사하게, 예방학적으로 투여되는 치료는 실행가능한 예방제를 구성하기 위해 병태의 발병 개시를 방지하는데 있어서 완전한 효과를 나타낼 필요는 없다. 단지, (예를 들어, 질환 증상의 수 또는 중증도를 감소시키거나, 또다른 치료의 효능을 증가시키거나, 또다른 유익한 효과는 나타냄으로써) 질환이 미치는 영향을 감소시키거나, 또는 대상체에서 질환이 발병되거나, 악화될 가능성을 감소시키는 것이면 충분하다. 본 발명의 하나의 실시태양은 특정 질병의 중증도를 반영하는 지표인자의 기준값에 비해 더 나은 개선을 지속적으로 유도하기에 충분한 시간 동안, 그리고 그러한 용량으로 PAR-2 길항제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

당업계에 알려진 바와 같이, 본 발명의 분자를 포함하는 제약 조성물은 징후에 적절한 방식으로 대상체에게 투여된다. 제약 조성물은 비경구적으로, 국소적으로, 또는 흡입에 의한 투여를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 기법에 의해 투여될 수 있다. 주사되는 경우에, 제약 조성물은 예를 들어, 동맥내, 정맥내, 근육내, 병변내, 복강내 또는 피하 경로를 통해 투여되거나, 볼루스 주사 또는 연속 주입을 통해 투여될 수 있다. 임플란트로부터의 경피 전달 및 지효성 방출과 같이 국소 투여, 예로서, 질환 또는 상해 부위로의 투여도 고려될 수 있다. 흡입 전달, 예를 들어, 비측 흡입 또는 경구 흡입, 분무기 이용, 에어로졸 형태의 길항제의 흡입 등을 포함한다. 다른 대체안으로는 점안제; 환제, 시럽제, 로젠지 또는 츄잉검을 비롯한 경구 제제; 및 예로서, 로션, 젤, 스프레이 및 연고와 같은 국소 제제를 포함한다.

생체외 방법에서 항원 결합 단백질의 사용 또한 고려되어야 한다. 예를 들어, 환자의 혈액이나 다른 체액을, 생체외에서 PAR-2와 결합하는 항원 결합 단백질과 접촉시킬 수 있다. 항원 결합 단백질을 적합한 불용성 매트릭스 또는 고체 지지체 물질에 결합시킬 수 있다.

유리하게, 항원 결합 단백질은 예로서, 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 조성물 형태로 투여된다. 임의로, 본 조성물은 추가로 하나 이상의 생리학적 활성제, 예를 들어, 제2 염증- 또는 면역-저해 물질, 항-혈관형성 물질, 진통제 물질 등을 포함하며, 그 예는 본원에 제시한 바와 같지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 특정 실시태양에서, 조성물은 PAR-2 결합 항원 결합 단백질 이외에도 1종, 2종, 3종, 4종, 5 종 또는 6종의 생리학적 활성제를 포함한다.

하나의 실시태양에서, 제약 조성물은 완충제, 아스코르브산과 같은 항산화제, 저분자량 폴리펩티드 (예로서, 아미노산 수가 10개보다 적은 것), 단백질, 아미노산, 예로서, 글루코스, 수크로스 또는 덱스트린과 같은 당질, 예로서, EDTA와 같은 킬레이트제, 글루타티온, 안정제 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질과 함께 본 발명의 항원 결합 단백질을 포함한다. 중성의 완충처리된 염수 또는 동종 혈청 알부민과 혼합된 염수가 적절한 희석제의 예이다. 적절한 산업 기준에 따라, 예로서, 벤질 알코올과 같은 보존제도 첨가할 수 있다. 조성물은 희석제로서 적절한 부형제 용액 (예로서, 수크로스)을 사용하여 동결건조물로서 제조될 수 있다. 적합한 성분은 사용된 투약량 및 농도에서 수용체에게 비독성이다. 제약 제제에 사용될 수 있는 추가 성분의 예는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th Ed. (1980) and 20^th Ed. (2000), Mack Publishing Company, Easton, PA]에 제시되어 있다.

의사가 사용하는 키트는 본 발명의 PAR-2-저해 물질과 본원에서 논의된 병태들 중 임의의 것을 치료하는데 사용되는 라벨 또는 다른 설명서를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 키트는 하나 이상의 PAR-2 결합 항원 결합 단백질의 멸균 제제를 포함하는데, 이는 상기 개시된 바와 같은 조성물 형태일 수 있고, 하나 이상의 바이알로 존재할 수 있다.

투약량 및 투여 빈도는 투여 경로, 사용된 특정 항원 결합 단백질, 치료하고자 하는 질환의 성질 및 중증도, 병태가 급성인지 또는 만성인지의 여부, 대상체의 크기 및 일반적인 건강 상태와 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 적절한 투약량은 예로서, 용량 단계적 확대 연구를 수반할 수 있는 임상 시험에서 당업계에 공지된 방법을 통해 측정될 수 있다.

본 발명의 PAR-2 저해 물질은 예로서, 일정 시간 동안 일정한 간격을 두고, 예를 들어, 1회 이상 투여될 수 있다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 적어도 1개월 이상의 기간에 걸쳐, 예로서, 1개월, 2개월 또는 3개월 동안 또는 심지어 무기한 동안 투여된다. 만성 병태 치료시에는, 장기 치료가 일반적으로 가장 효과적이다. 하지만, 급성 병태 치료시에는 단기간 동안, 예로서, 1주 내지 6주 동안의 투여가 충분할 수 있다. 일반적으로, 항원 결합 단백질은, 환자가 선정된 지표인자 또는 지표인자들에 대한 기준값에 비해 의학적 관련 개선도를 보일 때까지 투여된다.

본 발명의 특정 실시태양은 항원 결합 단백질을 대상체에게 1일당 대상체 체중 kg당 약 1 ng의 항원 결합 단백질 ("1 ng/kg/일") 내지 약 10 mg/kg/일, 더욱 바람직하게는 약 500 ng/kg/일 내지 약 5 mg/kg/일, 및 가장 바람직하게는 약 5 ㎍/kg/일 내지 약 2 mg/kg/일의 투약량으로 투여하는 것을 포함한다. 추가 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 PAR-2 매개 질환, 병태 또는 질병, 예로서, 본원에 개시된 의학적 질병을 치료하기 위해 1주에 1회, 1주에 2회, 1주에 3회 이상 성인에게 투여된다. 주사되는 경우에, 항원 결합 단백질의 성인 용량당 유효량은 1-20 mg/㎡ 범위, 바람직하게는 약 5-12 mg/㎡ 범위일 수 있다. 별법으로, 균일한 용량이 투여될 수 있고; 그 양은 용량당 5-100 mg 범위일 수 있다. 균일 용량 범위의 일례는 용량당 약 20-30 mg이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 용량당 25 mg의 균일 용량이 주사에 의해 반복 투여된다. 주사 이외의 다른 투여 경로가 사용된다면, 그 용량은 표준 의료 관행에 따라 적절히 조정된다. 치료 요법의 일례는 항원 결합 단백질 약 20-30 mg의 용량을 1주에 1회 내지 3회로 적어도 3주 기간 동안 주사 투여하는 것을 포함하며, 물론 더 장기간의 치료가 바람직한 개선도를 유도하는데 필요할 수도 있다. 소아 대상체 (4-17세)의 경우, 1가지 적합한 요법의 예는 0.4mg/kg, 최대 25 mg 용량의 항원 결합 단백질을 1주에 2회 또는 3회로 피하 주사로 투여하는 것을 포함한다.

본원에 제시된 방법의 특정 실시태양은 항원 결합 단백질 0.5 mg 내지 10 mg, 바람직하게는 3 내지 5 mg을 1주에 1회 또는 2회에 걸쳐 피하 주사하는 것을 포함한다. 또다른 실시태양은 항원 결합 단백질 3 mg 이상을 1주에 1회 폐로 투여 (예컨대, 분무기를 사용하여)하는 것에 관한 것이다.

본원에 제시된 치료학적 요법의 예는 PAR-2 신호 전달이 중요한 역할을 하는 병태를 치료하기 위해 항원 결합 단백질을 1.5 내지 3 mg의 용량으로 1주에 1회 피하 주사하는 것을 포함한다. 이러한 병태의 예를 본원에서 제시하고, 그 예로는 예를 들어, 앞서 기술된 류마티스성 병태, 및 과도한 염증이 중요한 역할을 하는 기타 다른 병태 (본원에 기술되어 있음; 예를 들어, 염증성 장 질환, 췌장염 등)를 포함한다. 항원 결합 단백질의 매주 투여는 바람직한 결과가 수득될 때까지, 예로서, 대상체의 증후군이 감소될 때까지 지속한다. 치료는 필요한 경우 재개하거나, 또는 별법으로, 유지 용량을 투여할 수도 있다.

본원에서 제공하는 치료 요법의 다른 예에는 대상체의 체질량 1 kg당 본 발명의 PAR-2 저해제 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 또는 20 mg (mg/kg)의 용량을 피하 또는 정맥내 투여하는 것을 포함한다. 이러한 용량은 대상체에게 1회로, 또는 특정 간격으로 1회 초과 횟수로 투여할 수 있으며, 예컨대 1일 1회, 1주에 3회, 1주에 2회, 1주에 1회, 1개월에 3회, 1개월에 2회, 1개월에 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회, 6개월에 1회 또는 1년에 1회 투여할 수 있다. 치료 기간 및 치료 용량 및/빈도에 대한 임의의 변화는 대상체의 특별한 요구를 충족시키기 위해 치료 과정 동안에 변경 또는 변동될 수 있다.

또다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 치료 중인 질병의 중증도를 반영하는 적어도 하나의 지표인자에 개선, 바람직하게는 지속적인 개선을 유도하기에 충분한 양으로, 그러한 시간 동안 대상체에게 투여된다. 대상체의 병, 질환 또는 병태의 정도를 반영하는 각종 지표인자는 치료 시간 및 양이 충분한지의 여부를 측정하기 위해 평가될 수 있다. 이러한 지표인자로는 예를 들어, 임상적으로 공지된 질환 중증도의 지표인자, 증상 또는 당해 질병의 징후를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 대상체가 2주 내지 4주 간격을 두고 수행되는 적어도 2회의 검사시 대상체가 개선을 나타낸다면 그 개선은 지속적인 것으로 간주한다. 개선도는 일반적으로 징후, 증상, 생검 또는 다른 검사 결과를 기초로 하여 이러한 결정을 할 수 있고, 대상체에게 시행된 질문지, 예로서, 소정 질환에 대해 진행된 삶의 질 질문지를 이용할 수 있는 의사가 결정한다.

PAR-2의 수준 및/또는 PAR-2의 활성화 증가는 예를 들어, 피부, 관절, 위장계 및/또는 기도의 염증성 병태를 비롯한, 다수의 질병과 관련이 있다. 소정의 질병을 앓는 대상체는 PAR-2 활성화가 증가된 개체를 확인하여 PAR-2 결합 항원 결합 단백질 치료로 가장 큰 이익을 얻을 수 있는 대상체를 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다. 따라서, 본원에서 제공하는 치료 방법은 임의로 대상체의 PAR-2 활성화 수준을 측정하는 제1 단계를 포함한다. 항원 결합 단백질은 PAR-2 활성화가 정상보다 증가된 대상체에게 투여될 수 있다.

대상체의 PAR-2 활성 수준은 항원 결합 단백질로의 치료 이전, 치료 동안 및/또는 치료 이후에 존재할 경우, PAR-2 활성의 변화를 검출하기 위해 모니터할 수 있다. 일부 질병의 경우, PAR-2 활성이 증가될 수 있는 발생률은 질환 단계 또는 질환의 특정 형태와 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 예로서, 대상체의 혈청, 혈액, 또는 조직 시료 중에서 PAR-2 활성을 측정하는데 공지 기술이 이용될 수 있다. 적합한 기법을 사용하여 PAR-2 활성을 측정할 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물의 특정 실시태양은 항원 결합 단백질과 1종 이상의 추가 PAR-2 길항제, 예를 들어, 본 발명의 2종 이상의 항원 결합 단백질, 또는 본 발명의 항원 결합 단백질과 1종 이상의 다른 PAR-2 길항제의 사용을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 단독으로 투여되거나, 환자가 앓고 있는 병태를 치료하는데 유용한 다른 제제와 함께 투여된다. 이러한 제제의 예로는 단백질성 및 비-단백질성 약물, 둘 모두를 포함한다. 다수의 치료제가 공동투여되는 경우에, 투약량은 당업계에 공지된 바와 같이 적절히 조정될 수 있다. "공동 투여" 및 병용 요법은 동시 투여로만 제한되지 않고, 적어도 1종의 다른 치료제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 치료 과정 동안 항원 결합 단백질을 적어도 1회 투여하는 치료 요법도 포함한다.

항원 결합 단백질과 공동투여될 수 있는 다른 제제의 예는 치료하고자 하는 특정 병태에 따라 선정되는 다른 항원 결합 단백질 또는 치료용 폴리펩티드이다. 별법으로, 상기에서 논의된 특정 병태들 중 하나를 치료하는데 유용한 비-단백질성 약물은 PAR-2 길항제와 함께 공동투여될 수 있다.

병용 요법

또다른 측면에서, 본 발명은 PAR-2 저해 항원 결합 단백질과 1종 이상의 다른 치료로 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 이러한 병용 요법은 예를 들어, 종양의 다수 부위 또는 분자 표적을 공격하여, 상승 또는 부가 효과를 달성한다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 병용 요법의 유형으로는 단일 질환-관련 경로의 다수 분기점, 표적 세포 내의 다수 경로 및 표적 조직 내의 다수 세포 유형을 저해시키거나, 활성화 (적당한 경우)시키는 것을 포함한다.

또다른 실시태양에서, 병용 요법 방법은 본원에 기술된 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 이상의 PAR-2 작용제 또는 길항제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 방법은 PAR-2 매개의 신호 전달을 함께 저해시키거나 활성화 (직접 또는 간접적으로)시키는 2 이상의 치료를 대상체에게 실시하는 것을 포함한다. 이러한 방법의 예로는 2종 이상의 PAR-2 저해 항원 결합 단백질의 조합, PAR-2 저해 항원 결합 단백질과 항-염증성 특성을 갖는 1종 이상의 다른 치료제 부분 (예를 들어, 비-스테로이드성 소염제, 스테로이드, 및/또는 면역 조절 인자)의 조합, 또는 PAR-2 저해 항원 결합 단백질과 1종 이상의 다른 치료법 (예로서, 수술, 초음파, 또는 염증을 감소시키는데 효과적인 치료법)의 조합을 이용하는 것을 포함한다. 더욱이, 1종 이상의 항PAR-2 항체 또는 항체 유도체는 1종 이상의 분자 또는 다른 치료법과 함께 사용될 수 있고, 여기서, 다른 분자(들) 및/또는 치료법(들)은 PAR-2에 직접 결합하거나 영향을 미치지 않지만, 조합이 치료되는 병태의 치료 또는 예방에 효과적이다. 하나의 실시태양에서, 1종 이상의 분자(들) 및/또는 치료법(들)은 치료 과정에서 1종 이상의 다른 분자(들) 및/또는 치료법(들)에 의해 유발되는 병태, 예로서, 구토, 피로감, 탈모, 악액질, 불면증 등을 치료하거나 예방한다. 분자 및/또는 다른 치료법의 조합이 사용되는 모든 경우에서 각 분자(들) 및/또는 치료법(들)은 효과적인 임의의 순서로 임의의 시간 기간 동안, 예로서, 동시에, 연속적으로 또는 교대로 투여될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 치료 방법은 1 분자를 이용한 치료 또는 다른 치료의 제1 과정을 완료한 다음 제2 치료 과정을 개시하는 것을 포함한다. 제1 치료 과정의 종결점과 제2 치료 과정 개시점 사이의 시간 기간은 총 치료 과정이 효과를 얻게 하는 임의의 시간 길이, 예로서, 수초, 수분, 수시간, 수일, 수주, 수개월 또는 수년일 수 있다.

또다른 실시태양에서, 본 방법은 본원에 기술된 1종 이상의 PAR-2 길항제의 투여 및 1가지 이상의 다른 치료법 (예로서, 치료적 또는 고식적 치료)를 포함한다. 대상체에게 1가지보다 많은 치료법을 실시하는 방법인 경우에, 그 실시 순서, 시기, 횟수, 투여 농도 및 부피는 치료의 의학적 요건 및 제약에 의해서만 제한되는 것으로 이해되어야 하며, 즉, 2가지 치료법은 예로서, 동시에, 연속적으로, 교대로 또는 임의의 다른 요법에 따라 대상체에게 실시될 수 있다.

<실시예>

하기 실시예는 실제 실시예 및 가상 실시예로서, 본 발명의 구체적인 실시태양 또는 특징을 예시하기 위한 목적으로 제시된 것이며, 범 발명의 범주를 제한하지 않는다.

실시예 1: 모노클로날 항체 제조

가용성 PAR-2 펩티드 (접합을 촉진시키기 위한 목적으로 추가의 C-말단 시스테인 잔기를 보유하며, 말레이미드-활성 키홀 림펫 헤모시아닌 [KLH; 예로서, 일리노이주 록퍼드 소재의 피어스 바이오테크놀러지스, 인코포레이티드(Pierce Biotechnology Inc.)로부터 입수가능함]에 접합되어 있는 PAR-2의 루프 1 펩티드 [TNRSSKGRSLIGKVDGTS; 서열 2의 아미노산 29부터 46까지]), PAR-2/Fc 융합 단백질, 및 세포-결합 PAR-2 (예를 들어, 서열 2의 폴리펩티드를 코딩하는 인간의 전장 PAR-2 cDNA로 CHO 세포를 형질감염시킴으로써 수득가능한, 세포 표면에서 인간 PAR-2를 발현하는 CHO 형질감염체), 또는 그의 조합을 비롯한, 하나 이상의 적합한 형태의 PAR-2 항원을 사용하여 면역화를 수행한다.

1996년 12월 3월 출원된 미국 특허 출원 시리얼 번호 제08/759,620호 및 1998년 6월 11일 공개된 국제 특허 출원 공개 번호 WO 98/24893 및 2000년 12월 21일 공개된 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/76310 (그의 내용이 본원에서 참고로 인용된다)에 개시된 방법에 따라 제노마우스(XenoMouse)™에서의 최초 면역화를 위해 적합한 양의 면역원 (즉, 마우스 1마리당 10 ㎍의 가용성 PAR-2 또는 마우스 1마리당 3 x 10⁶개의 형질감염된 CHO 세포)을 사용한다. 최초 면역화 이후에 이어서 면역화를 증대시키기 위해 마우스에서 임의의 적합한 역가의 항-PAR-2 항체를 유도하는데 필요한 스케줄로 필요한 기간 동안 면역원 (마우스 1마리당 5 ㎍의 가용성 PAR-2 또는 마우스 1마리당 1.5 x 10⁶개의 PAR-2 형질감염된 세포)을 투여한다. 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 효소 면역분석법 또는 형광 활성 세포 분류에 의해, 또는 기타 다른 방법 (그의 조합 포함)에 의해 역가를 측정한다.

적합한 역가를 보이는 동물을 확인하고, 림프절을 배출시켜 림프구를 수득하고, 필요한 경우에는 각 코호트마다 풀링시킨다. 림프구는, 적합한 배지 (예를 들어, 둘베코스 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium); DMEM; 캘리포니아주 칼스베드 소재의 인비트로겐(Invitrogen)) 중에서 분쇄시켜 림프구를 림프계 조직으로부터 유리시킴으로써 상기 조직으로부터 해리시킬 수 있고, DMEM 중에 현탁시킬 수 있다. B 세포는 적합한 방법을 사용하여 선별 및/또는 확장시킬 수 있고, 당업계에 공지된 기법을 사용하여 적합한 융합 파트너, 예를 들어, 비분비성 골수종 P3X63Ag8.653 세포 (American Type Culture Collection CRL 1580; 문헌 [Kearney et al., J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550])에 융합시킬 수 있다.

하나의 적합한 융합 방법에서는 림프구를 융합 파트너 세포와 1:4의 비율로 혼합한다. 400 x g로 4분 동안 원심분리하여 세포 혼합물을 완만하게 펠릿화시키고, 상등액을 버리고, 세포 혼합물을 (예를 들어, 1 ml 피펫 사용하여) 완만하게 혼합한다. PEG/DMSO (폴리에틸렌 글리콜/디메틸 설폭시드; 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치로부터 입수가능; 림프구 100만개당 1 ml)를 사용하여 융합을 유도한다. 1분간에 걸쳐 완만하게 교반시키면서 PEG/DMSO를 천천히 첨가한 후, 1분간 혼합한다. 이어서, 2분간에 걸쳐 완만하게 교반시키면서 IDMEM (글루타민을 함유하지 않는 DMEM; B 세포 100만개당 2 ml)을 첨가한 후, 3분간에 걸쳐 추가의 IDMEM (B 세포 100만개당 8 ml)을 첨가한다.

융합된 세포를 완만하게 펠릿화하고 (400 x g로 6분), B 세포 100만개당 20 ml의 선별 배지 (예를 들어, 아자세린 및 히포크산틴 [HA], 및 필요에 따라, 기타 다른 보충 물질을 함유하는 DMEM) 중에 재현탁시킨다. 세포를 37℃에서 20-30분 동안 인큐베이션시킨 후, 200 ml 선별 배지 중에 재현탁시키고, 96웰에 플레이팅하기 전에 3 내지 4일 동안 T175 플라스크에서 배양한다.

생성된 클로니의 클론형성능이 최대에 도달하도록 표준 기법을 사용하여 세포를 96웰 플레이트로 분배한다. 수일간에 걸쳐 배양한 후, 상등액을 수집하고, 인간 PAR-2에의 결합 확인, 다른 종 PAR-2 (예를 들어, 사이노몰로거스 원숭이 및/또는 뮤린 PAR-2)와의 교차-반응성 평가, 절단된 PAR-2 대 절단되지 않은 PAR-2에의 결합, 및 PAR-2의 단백질 가수분해 효소에 의한 활성화를 저해시키는 능력을 비롯한, 하기의 실시예에서 상세히 설명되는 스크리닝 분석법으로 분석한다. 양성 세포를 추가로 선별하고, 표준 클로닝 및 서브클로닝 기법으로 클로닝하다. 클론주를 시험관내 또는 생체내에서 확장시킬 수 있고, 분비된 인간 항체를 분석을 위해 수득할 수 있다.

그렇게 생성된 하이브리도마 클론을 PAR-2와의 반응성에 대해 스크리닝한다. 하이브리도마 상등액을 초기 스크리닝하기 위해서는 고효율 스크리닝 (형광측정 미소부피 분석 기술 또는 FMAT (이는 대체로 문헌 [Fiscella, et al., Nature Biotechnology 21 :302-307; 2003]에 기재되어 있다)에 적합한 펩티드 ELISA, 전체 세포 ELISA 및/또는 세포 기반 분석법을 사용할 수 있다. 상기 스크리닝 방법에서 양성인 하이브리도마를 추가로 배양함으로써 더 많은 양의 항체를 제공할 수 있고, 이어서, 하기 기술되는 바와 같이 정제할 수 있고, 추가의 세포 기반 분석법(들) (예를 들어, Ca2+-감수성 광단백질인 아포아에쿠오린(apoaequorin) (이는 대체로 문헌 [Le Poul et al., J. Biomol. Screen. 7(1):57-65; 2002]에 기재되어 있다), 및 PAR-2를 공-발현하는 세포를 사용하는 플래쉬 플레이트 분석법), 또는 세포내 Ca2+ 수준 변화를 측정하는데 사용되는 형광측정 영상 플레이트 판독기 (FLIPR) 분석법 (이는 대체로 문헌 ([S. Pitchford, Genetic Engineering News vol. 18, Number 15 (1998)) 및/또는 [Sullivan et al., Methods in Molecular Biology vol. 114, pp125-133 (1999)])에 기재되어 있다) (상기 문헌들은 본원에서 참고로 인용된다)에 의해 스크리닝된다.

이러한 방식으로 대략 2개월 내지 2개월 반 동안의 기간에 걸친 총 19회 또는 20회의 면역화를 위해 마우스를 가용성 PAR-2, PAR-2 발현 세포 또는 PAR-2/Fc 단백질로 면역화시키고; PAR-2-특이 항체를 분비하는 수개의 세포를 수득하고, 추가로 항체의 특징을 규명하였다. 그의 서열은 서열 목록에 제시하고, 하기 표 1에 요약하며, 이들 항체를 사용한 각종 시험 결과를 본원에서 제공한다. 프레임워크와 상보성 결정 부위 사이의 경계는 달라질 수 있다는 것; 예를 들어, 몇몇 경우에서는 경쇄 FR1의 아미노산 22가 CDR1의 일부로서 간주될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 또한, 몇몇 번호화 체계는 중쇄의 CDR3 및 FR4를 J 부위로 지정하고, FR3과 CDR3 사이의 D 부위를 포함할 수 있다. 따라서, 하기 기술하는 부위에 대한 번호화는 1 내지 5개의 아미노산에 의해 달라질 수 있다.

실시예 2: 스크리닝하기 위한 항- PAR2 하이브리도마 항체의 정제

약 35 ml의 하이브리도마 상등액 유체 시료를 수득할 수 있는 시간 동안 및 그러한 조건하에서 하이브리도마 세포를 배양한다. 적합한 방법을 사용하여, 예를 들면 단백질 A를 사용하여 모노클로날 항체를 정제한다. 각 시료에 12 ml의 4X-단백질 A 결합 완충액 (1.6 M 시트르산, 100 mM 트리스 (pH 9.15)) 및 약 300 ㎕의, 마브셀렉트(MabSelect)™ 배지(뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 GE 헬쓰케어(GE Healthcare) 67％ 슬러리를 첨가한다. 생성된 슬러리를 4℃에서 밤새도록 완만하게 회전시킨다.

밤새도록 인큐베이션시킨 후, 예를 들면 브레이크 없이 4℃에서 5분 동안 G3.8 원심분리기 (캘리포니아주 풀러턴 소재의 베크만 쿨터(Beckman Coulter))에서 2,000 RPM으로 시료를 원심분리하여 수지 및 그에 결합되어 있는 모노클로날 항체를 침전시킨다. 거의 약 300 ㎕의 상등액 유체를 제거하고, 수지를 재현탁시켜 농축 슬러리를 형성한다.

농축 슬러리를 미세원심분리관으로 옮기고, 1X-단백질 A 결합 완충액 (400 mM 시트르산, 25 mM 트리스 (pH 8.9))을 충분히 첨가하여 총 부피가 약 1 ml까지 되도록 첨가한다. 슬러리를 재현탁시킨 후, 약 14,000 g로 5초 동안 원심분리한다. 상등액 유체를 생성된 펠렛으로부터 제거하고, 유사한 방식으로 (약 1 ml의 1X-단백질 A 결합 완충액 중에 재현탁시키고, 원심분리하고, 상등액을 제거하고, 새로운 완충액 중에 재현탁시켜) 총 3회에 걸쳐 세척한다.

3회에 걸쳐 세척한 후, 펠릿을 400 ㎕ 용리 완충액 (200 mM 포름산) 중에 재현탁시키고, 실온에서 10분 동안 교반한 후, 14,000 g로 5초 동안 원심분리한다. 상등액을 용리액으로서 주의하여 제거하고, 총 3회의 용리 주기에 대해 상기 기술된 방식과 유사한 방식으로 펠릿을 다시 용리시킨다. 3회의 용리 주기로부터 수득한 용리액을 조합하고, 실온에서 14,000 g로 5분 동안 원심분리하고, 새로운 관으로 옮긴다. 2 M 트리스 염기 (235 mM_f)를 첨가하고, 신속하게 혼합하여 pH를 pH 7.8-8.2로 조정한다. 시료를 실온에서 14,000 g로 5분 동안 다시 원심분리하고, pH 쉬프트 가용성(pH Shift Soluble)이라고 표시한다. 250 내지 350 nm에서 (20 ㎕의 시료를 700 ㎕에 첨가하여 희석시킨) 각 시료에 대해 스펙트럼 스캔을 실시하고, 0.5 ㎍의, 각 항체-함유 시료를 적절한 항체 표준과 함께 환원성 4 - 20％ SDS-PAGE 겔 상에 로딩하여 단백질 농도를 확인한다.

실시예 3: PAR -2/ Fc 폴리펩티드 정제

N-말단 PAR-2/Fc 폴리펩티드(서열 번호:6)를 적합한 포유동물 세포, 예로서, CHO 세포에서 발현시킨다. 무혈청 배지 중에서 배양된 CHO 발현 세포로부터의 발현 상등액은 활성화 Arg-Ser 결합에서 PAR-2/Fc를 절단하는 CHO 세포 트립신-유사 세린 프로테아제를 함유하며, 이를 통해 "잘린" 버전의 PAR-2/Fc 폴리펩티드를 생성한다. (CHO 세포 트립신-유사 세린 프로테아제의 농도를 훨씬 넘는 농도로 정산 수준의 혈장 프로테이나제 저해제를 함유하는) 10％ 소 태아 혈청 중에서 배양된 CHO 발현 세포는 배양 상등액 중 절단되지 않은 N-말단 PAR-2/Fc를 발현한다. Fc 부위를 포함하는 단백질을 단리 및 정제시키는데 적합한 방법을 사용하여 (예를 들면, 뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 GE 헬쓰케어로부터 입수한 마브셀렉트™ 수지 시스템을 사용하여) 잘린 단백질 및 절단되지 않은 단백질, 둘 모두를 정제한다. 필요에 따라 아미노 말단 서열 분석법 (에드만 분해법(Edman degradation)), 크기 배제 크로마토그래피, 흡광 스펙트럼 스캔, 및 질량 분광분석법에 의해 생성된 정제 Fc-작제물을 분석한다.

적합한 정제 시스템의 일례로 PAR-2/Fc를 함유하는 조절된 배지를 6 ml/분으로 7℃에서 GE 헬쓰케어의 10 ml 단백질 A 세파로스(Sepharose)™ 하이트랩(HiTrap) 칼럼 상에 로딩한다. 칼럼을 수개의 칼럼 부피의, 2가 양이온을 함유하지 않는 둘베코스 포스페이트 완충처리된 염수로 세척한 후, 100 mM 글리신 (pH 3.0)을 사용하여 용리시킨다. 용리된 단백질을 트리스 완충액에 희석시키고, 1 M H₃PO₄를 사용하여 pH 7.0으로 조정한다. 이어서, 용리액을 5 ml/분으로 7℃에서 S-완충액 A (20 mM NaH₂PO₄ (pH 7.0)) 중 5 ml GE 헬쓰케어 SP-HP 하이트랩 칼럼 상에 로딩한다. 칼럼을 수개의 칼럼 부피의 S-완충액 A로 세척한 후, 20 칼럼 부피의 40％ S-완충액 B (20 mM NaH₂PO₄, 1 M NaCl (pH 7.0))의 선형 구배로, 이어서, 100％ S-완충액 B에 대한 단계로 5 ml/분으로 7℃에서 용리시킨다. 분획을 쿠마시(Coomassie) 염색 SDS-PAGE로 분석하고, 풀링시킬 수 있다. 풀링된 분획은 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 여과할 수 있고; 30,226의 계산된 분자량 및 35,410 M^-1 cm^-1의 계산된 흡광 계수를 사용하여 시료에 대한 스펙트럼 스캔을 수행할 수 있다. (예를 들어, 실온에서 팔 마크로셉(Pall Macrosep)^® 10 kDa 막을 사용한 후, 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 여과시킴으로써) 풀링된 물질을 농축시키고; 추가의 스펙트럼 스캔을 수행하여 농도를 확인할 수 있다. 이어서, 최종 생성물을 쿠마시 염색 SDS-PAGE (4-20％ 1.0 mm 트리스-글리신 겔)과, 50 mM NaH₂PO₄, 250 mM NaCl (pH 6.9) 중 페노멘스 바이오셉 3000 칼럼(Phenomenx BioSep 3000 column) (7.8 x 300 mm)을 사용하여 SE-HPLC를 사용하여 분석할 수 있다.

실시예 4: PAR -2/ Fc : FLAG ®/ Fc 이종이량체의 발현 및 정제

이종이량체 PAR-2/Fc:FLAG®/Fc 단백질을 발현시키고, PAR-2에 대한 항체의 결합성 및 친화성의 분석을 가속화하기 위해서 정제한다. 적합한 세포, 예를 들어, 포유동물 세포 또는 인간 세포, 예로서, HEK293 세포를, PAR-2/Fc를 코딩하는 핵산 (서열 번호:5)과, FLAG®/Fc를 코딩하는 핵산 (서열 번호:43)으로 공-형질감염시킨다. 적절한 조건 (예를 들어, 저-IgG 혈청을 함유하는 배지 중에서) 형질감염된 세포를 배양하면 동종이량체 PAR-2/Fc, 동종이량체 FLAG®/Fc 및 이종이량체 PAR-2/Fc:FLAG®/Fc 단백질이 발현된다. 후자의 것은 순차적인 정제 단계 (이는 대체로 하기에 기술되어 있다)를 통해 수득한다.

적합한 정제 시스템의 일례로, 앞서 PAR-2/Fc에 대해 기술된 방법과 유사하게, Fc 단백질의 정제를 가속화시키는 정제 방법으로 PAR-2/Fc:FLAG®/Fc를 함유하는 조절된 배지를 정제한다. 간략하며, 조절된 배지를 Fc가 단백질 A에 결합할 수 있도록 하는 조건하에서 단백질 A 칼럼 상에 로딩한다. 칼럼을 수개의 칼럼 부피의 PBS로 세척한 후, 낮은 pH에서 용리시킨다. 용리된 단백질을 희석시키고, (예를 들어, S-완충액 A (20 mM NaH₂PO₄ (pH 7.0) 중 GE 헬쓰케어 SP 세파로스™-고성능 칼럼을 사용하여) 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하고, 수개의 칼럼 부피의 S-완충액으로 세척하고, 20 칼럼 부피의 1 내지 20％ 및 20 칼럼 부피의 20 내지 50％ S-완충액 B (20 mM NaH₂PO₄, 1 M NaCl (pH 7.0))의 선형 구배로, 이어서, 100％ S-완충액 B의 단계로 5 ml/분으로 용리시킨다.

분획을 쿠마시 염색 SDS-PAGE로 분석하고, 원하는 벌크 생성물을 함유하는 분획을 풀링시킨다. 이어서, 풀링된 물질을 항-플래그(anti-FLAG)® M2 친화성 겔 (시그마(Sigma) A2220; 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치)와 함께 밤새도록 인큐베이션시킨다. 이어서, 수지를 트리스-완충처리된 염수로 세척하고, 100 mM HOAC (pH 3.5)로 용리시킨다. 1 M 트리스 HCl (pH 8.0)을 사용하여 최종 풀을 pH 7.0으로 중화시킨다.

임의의 원하는 시점에 물질을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 여과시킬 수 있고; 30,226의 계산된 분자량 및 35,410 M^-1cm^-1의 계산된 흡광 계수를 사용하여 시료에 대한 스펙트럼 스캔을 수행할 수 있다. 필요한 경우, (예를 들어, 실온에서 팔 마크로셉^® 10 kDa 막을 사용한 후, 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 여과시킴으로써) 풀링된 물질을 농축시킬 수 있고; 추가의 스펙트럼 스캔을 수행하여 농도를 확인할 수 있다. 이어서, 최종 생성물을 쿠마시 염색 SDS-PAGE (4-20％ 1.0 mm 트리스-글리신 겔)과, 50 mM NaH₂PO₄, 250 mM NaCl (pH 6.9) 중 페노멘스 바이오셉 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm)을 사용하여 SE-HPLC를 사용하여 분석할 수 있다.

N-말단 아미노산 서열 분석을 사용하여 상기 방식으로 정제된 물질이 PAR-2/Fc:FLAG®/Fc 이종이량체를 함유하고 있었음을 확인하였다. 2개의 서열: TIQGTNRSSKG (서열 번호:2의 아미노산 25 내지 35에 상응하는 것), 및 DDYKDDDD (서열 7에 상응하는 것)을 검출하였다. 두 펩티드의 비율은 1에 가까웠다. 쿠마시 염색 및 SEC 분석을 통해 상기 물질은 PAR-2/Fc:FLAG®/Fc 이종이량체 단백질이라는 것을 확인하였고, 검출불가능한 수준의 동종이량체 단백질도 확인하였다.

실시예 5: 웨스턴 블롯에 의한 PAR -2 항체 분석

절단되지 않은 PAR-2 대 절단된 PAR-2에의 결합을 분석하기 위해 정제된, 절단되지 않은 N-말단 PAR2-Fc 및 잘린 N-말단 PAR2-Fc의 양을 다양하게 하여 트리스-글리신 완충 시스템 중 8-16％ 폴리아크릴아미드 구배 겔 (노벡스(Novex) 겔, 인비트로젠 라이프 테크놀러지스(Invitrogen Life Technologies))을 사용하여 SDS-PAGE한다. 분자량 확인을 위해 씨 블루(See Blue) 표준 (노벡스, 인비트로젠 라이프 테크놀러지스)를 함유하는 겔 래인 또한 포함한다. 전기영동 이후, 노벡스 XCell II 블롯 모듈(Novex XCell II Blot Module) (인비트로젠 라이프 테크놀러지스)을 사용하여 겔로부터 니트로셀룰로스 막으로 단백질을 옮긴다. 진탕시키면서 4℃에서 밤새도록 1:1, 오딧세이(Odyssey) 차단 완충액, OBB, (LI-COR 바이오사이언스(LI-COR Biosciences)):TBS (트리스 완충 염수)를 사용하여 막을 차단시킨다. 분석하고자 하는 항체를 실온에서 1시간 동안 원하는 최종 농도로 1:1 OBB:TBS 중에 희석시킨다. TBS 중 0.1％ 트윈 20을 사용하여 막을 철저히 (약 1시간에 걸쳐 100 ml로 3-4회 교체하여) 세척한다. 이어서, 실온에서 1시간 동안, 1:1 (OBB:TBS) 중 1:5000로 희석된 적절한 2차 항체-알렉사680(anti-Alexa680) (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 인비트로젠 라이프 테크놀러지스) 접합체 (염소 항-토끼 IgG, 또는 염소 항-마우스 IgG)에 노출시킨다. 막을 상기와 같이 세척하고, 원하는 경우, LI-COR 오딧세이 적외선 영상 시스템(LI-COR Odyssey Infrared Imaging System) (LI-COR 바이오사이언스)를 사용하여 분석한다.

실시예 6: PAR -2 항체의 결합 활성

본 실시예는 비아코어(BIAcore)® 바이오센서 (스웨덴 웁살라 소재의 비아코어 인터내셔날 AB(BIAcore International AB))를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 평가된 결합 활성을 설명한다. 간략하면, 제조사의 설명서에 따라 표준 아민 커플링 방법 및 시약을 사용하여 항-인간 Fc (또는 항-뮤린 Fc)를 바이오센서 칩 (즉, CM5 칩)에 공유적으로 커플링시킨다. PAR-2 항체 (인간 또는 뮤린, 또는 키메라, 예를 들어, 서열 38) 또는 대조군 항체를 고정된 항-Fc 상에 주사하고, 다양한 양의 PAR-2 (동종이량체 PAR-2-huFc 또는 이종이량체 PAR-2-huFc/FLAG-huFc)를 무관한 항체-커플링 칩 (음성 대조군) 뿐만 아니라, 항-PAR-2-코팅 칩에 독립적으로 통과시킨다. 10 ㎕/분으로 1회의 10-㎕ 100 mM 인산 펄스를 사용하여 칩을 재생시킬 수 있다. 모든 결합은 HBS (10 mM HEPES, 0.15 M NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.02％ NaN₃, 0.005％ 계면활성제 P2O (pH 7.4)) 또는 등가물 중에서 실시한다.

실시예 7: PAR -2 항체 비교

수개의 PAR-2 항체를 상이한 분석 포맷으로 시험하였다; 표 2는 그 결과를 요약한다. 앞서 기술된 Ca2+ 동원에 관한 FLIPR 분석법으로 IC₅₀ 값을 측정하고; 절단 부위의 상류 부위에의 결합 대 절단 부위의 하류 부위에의 결합을 앞서 기술된 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 측정한다.

실시예 8: 애주번트 - 유발성 관절염 ( AIA ) 모델

본 실시예는 급성 및 만성 관절염 모델을 설명한다. 양쪽 모델 모두의 동물을 예를 들어, 모두 관절내 (IA), 관절 주위 (PA) 주사용의, 또는 진피내 (ID) 주사용의 케타민/자일라진 혼합물 (각각 마우스 믹스 또는 래트 믹스) 또는 이소푸란에 의해 마취시킨다.

관절 주사인 IA 또는 PA는 무릎 또는 뒷다리 발을 표적으로 한다. PA 주사는 관심의 대상이 되는 관절 주변의 사방으로 동등하게 나뉘어진다. 발 주사는 뒷발바닥 부위로 ID 투여된다. 한쪽 무릎 또는 뒷다리 발에는 비히클만 단독으로 또는 멸균 PBS를 주사하여 이를 내부 대조군으로서 사용한다. 주사 부위를 제조하는 것은 동물을 마취시킨 후, 관절 부위를 면도시키고, 요오드 용액을 사용하여 문질러 씻어낸 후에 알코올로 소독하는 것을 포함한다. 소량의 주사량 (즉, 10 ㎕)을 위해 관절 주사 모두 30-게이지 바늘 또는 등가물을 사용하여 제공하고, 필요시에는 기밀(gastight) (즉, 해밀턴(Hamilton)) 주사기에 의해 제공한다.

급성 AIA (aAIA)를 유도하기 위해서 0일째 (D0) 염수 중 1-4％ 람다-카라기난 및 1-4％ 카올린 (C/K)를 IA 주사에 의해 동물에게 주사한다. 두 화합물 모두의 농도는 대상으로 하는 질병의 중증도에 따라 달라진다. 유도제의 총 주사량은 마우스의 경우, 10-20 ㎕ 사이, 래트의 경우, 60-80 ㎕ 사이이다. 농도와 주사량, 둘 모두 공개된 방법과 일치한다 (문헌 ([J Clin Invest. 2003; 111(1):35-41] 및 [J Pharmacol Exp Ther. 2006; 316(3): 1017-24])). 별법으로, 특이적 PAR-2 펩티드작용제, 또는 기타 다른 염증 활성 인자 (예로서, 트립신, 또는 인간 베타-트립타제 (문헌 ([J Clin Invest. 2003; 111(1):35-41], [J Pharmacol Exp Ther. 2006; 316(3): 1017-24], [J Pharmacol Sci . 2005 97(1):38-42], 및 [Br J Pharmacol. 1999 127(5): 1083-90])) 또는 등가물을 사용할 수 있다. 사용되는 농도는 대상으로 하는 질병의 중증도에 따라 선택되고, 총 주사량은 주사맞는 동물에 적절하다.

만성 AIA (cAIA)를 유도하기 위해서 0일째 (D0) 동물에게, 10 mg/mL H37Ra 미코박테리엄 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) (M. tb .)로 보충된 프로인트 애주번트 [완전 프로인트 애주번트; CFA] 10-20 ㎕ (마우스) 및 60-80 ㎕ (래트)를 IA 주사에 의해 주사한 후, 40-80 ㎕ (마우스) 및 120-200 ㎕ (래트)를 PA 주사에 의해 주사한다. 농도, 주사량, 및 주사 요법은 공개된 방법과 일치한다 (문헌 ([J Clin Invest. 2003; 111(1):35-41]). 애주번트 사용은 내부 IACUC 글로벌 애주번트 용법 표준안(internal IACUC Global Adjuvant Usage Standards)을 따르되, 마우스의 경우, 총 0.4 mL 및 래트의 경우, 총 1 mL를 넘지 않도록 한다. 모든 주사는 내부 동물 실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC))의 투여량에 관한 관리 기관의 표준안에 따라 마우스의 경우, 20 mL/kg IP, 1 mL/kg IA, 및 5 mL/kg IV 이하, 및 래트의 경우, 10 mL/kg IP, 0.5 mL/kg IA, 및 5 mL/g IV 이하를 포함한다.

치료 개입은 복강내 (IP), 관절내 (IA), 또는 정맥내 (IV) 투여 경로를 포함하고; 다른 적합한 투여 경로도 상기 투여 경로 대신에 또는 그 이외의 것으로서 사용될 수 있다. IA 주사에 의한 임의의 치료 요법은 D0일째를 제외한 시점에 제공하거나, D0일째 순차적으로 같은 관절내 다른 주사 부위에 제공한다 (예를 들면, 먼저 무릎 내측에 주사한 후, 그 다음에는 외측에 주사한다.

급성 및 만성 AIA 연구를 위해서 임의로 주사하기 이전에 관심의 대상이 되는 관절 모두의 관절 직경 치수를 캘리퍼로 잰다. 질환을 추적하는 것은 관절 직경 치수를 캘리퍼로 재는 것 뿐만 아니라, 관절 둘레 치수를 가용성 테이프로 재는 것, 및 시각적으로 점수화하는 것을 포함할 수 있다. 대체 방법 (즉, 체적변동유량계 사용) 또한 사용할 수 있다. cAIA의 중증도는 하기 제시하는 기준들 중 하나 또는 둘 모두에 의해 점수화된다:

cAIA 관절 사용 기준 cAIA 관절 외양 기준

0 - 정상적인 관절 사용 0 - 정상적인 관절

1 - 발가락 말림 1 - 발가락 1 내지 3개에서의 발적/종창

2 - 관절 또는 발 혐기 2 - 3개보다 많은 발가락에서의

발적/종창,

발로 확장된 경미한 종창,

종창성/붉거진 발복, 또는

앞발의 경미한 발적/종창

3 - 부분적인 체중 부하 3 - 종창성 발목,

경미한 것부터 중간 정도까지의 발적

4 - 비-체중 부하 및 4 - 발 전체의 극심한 발적과 극심한 종창

보호(guarding)

이러한 방식으로, 급성 모델의 경우, 6-8주령된 루이스(Lewis) 래트의 왼쪽 무릎에는 C/K 플러스 치료 (또는 대조군)을 주사하고, 각 오른쪽 무릎에는 음성 대조군을 주사하였다. 치료 후 설정된 시점에 3개의 캘리퍼 판독값 평균을 사용하여 관절 두께를 측정하였다. 오른쪽 무릎과 비교하여 왼쪽 무릎의 두께 변화를 변화율 (％)로 표시하였고, 하기 표 3에 나타낸다.

이러한 결과는 길항성 항-PAR-2 항체가 애주번트-유발성 관절염 모델에서 관찰되는 염증을 감소시킨다는 것을 입증한다.

실시예 9: 애주번트 - 유발성 관절염 ( AIA ) 모델

본 실시예는 대체로 앞서 기술된 바 있는, 급성 AIA 모델에서 PAR-2 항체가 발 부종에 미치는 효과를 기술한다. 간략하면, 6-8주령된 스프래그 다우리(Sprague Dawley) 또는 루이스 래트 (매사추세츠주 윌밍턴 소재의 찰스 리버 레보레토리스(Charles River Laboratories) 뒷발 발바닥 부위 중 한쪽 뒷발에는 1％ 람다 카라기난을, 그리고 나머지 한쪽에는 대조군 (염수)를 피하 (SC) 주사하였다. 애주번트를 주사하기 18시간 전에 차단성 PAR-2 모노클로날 항체 (1A1) 또는 대조군 (양성 또는 음성 대조군; 표 4의 주석 참조)을 래트 1마리당 1.5 mg으로 (대략 8-10 mg/kg) 복강내로 (IP) 투여한 후, 선택된 시점에 체적변동기록법에 의해 종창을 측정하였다. 데이타는 발 하나당의 배수량 (mL) 대 상기 발에 대한 기준 측정치로 표시하였다. 대표적인 실험 결과를 하기 표 4-5에 나타낸다.

추가 실험에서, 차단성 PAR-2 항체 (1A1)는 IP로 투여되었을 때에는 발 종창을 현저히 감소시켰지만, SC로 투여되었을 때에는 그렇지 못했고; SC로 투여된 1A1의 생체이용성은 발 부종 연구에서 차선적이었다는 것이 추후의 약동학적 분석을 통해 밝혀졌다. 추가로, IP로 투여된 차단성 PAR-2 항체에 의한 종창 저해는 용량에 의존하는 방식으로 일어났다. 이러한 결과는, 길항성 항-PAR-2 항체가 애주번트-유발성 관절염 모델에서 관찰되는 염증을 감소시킨다는 이전 관찰결과를 확인시켜 준다.

실시예 10: 염증전 사이토카인 변경

본 실시예는 PAR-2 항체 또는 벤치마크 양성 대조군 항체 (즉, 항-PGE2 2B5 (케이만 케미칼로부터 입수))가 염증전 사이토카인 유도에 미치는 효과를 설명한다. 간략하면, 용해 완충액 중에 민싱(mincing)하고, 퀴아젠(Qiagen) 조직 용해기 상에 놓고 염증성 래트 발 또는 대조군 (순수한(naive)) 발로부터 유래된 조직 용해물을 제조하였다. 분취량의 시료를 풀링하고, 미소부피 분광분석법 시스템 (나노드롭(NanoDrop)™, 매사추세츠주 월섬 소재의 써모 사이언티픽(Thermo Scientific))을 사용하여 흡광도 (A₂₈₀)에 의해 총 단백질에 대해 평가하고, 로덴츠 패널 v2.0(Rodent Panel v2.0) 상에서의 다중-분석물 프로파일 (MAP) 분석을 위해 룰스-베이스드 메디슨, 인크.(Rules-Based Medicine, Inc.) (텍사스주 오스틴 소재)에 제출하였다. 분석물 다수의 질환 활성이 변경되었고, 제시한 비교는 1A1 및 2B5 처리에 의해 차별화된 것을 포함하였다. 분석물을 총 단백질에 대해 정규화하고 (즉, (pg, ng, ㎍)/mg 총 단백질); 데이타를 도 1에 나타낸다. 이들 결과는, 예로서, 사이토카인 및 프로스타글란딘과 같은 염증전 매개 인자의 방출 증가가 카라기난-유도성 부종의 특징이 된다는 문헌상의 관찰결과를 확인시켜 준다. 항-PAR-2 길항성 항체로 처리된 동물의 발 용해물 중 이들 인자가 더 낮은 수준으로 관찰되었다는 것은 이들 항체가 PAR-2에 결합하고, 이어서 염증전 매개 인자의 생산을 현저히 감소시킨다는 것을 제안한다. 이들 분석물 생산의 감소가 PAR-2 중화 항체의 항-염증성 활성을 확인시켜 준다.

실시예 11: 항원-결합 단백질의 결합 특성

본 실시예는, 용액상에서의 결합 이벤트를 측정하고, K_D, K_온, 및 K_오프를 계산하기 위해 사용될 수 있는 키네틱 익스클루전 어세이(Kinetic Exclusion Assay) (KinExA®; 아이다호주 보이시 소재의 사피다인 인스트루먼츠(Sapidyne Instruments)) (이는 대체로 앞서 문헌 ([Xie et. al. J. Imm , Methods 304: 1 (2005)] 및 [Rathanaswami et. al. Anal . Biochem. 373:52 (2008)])에 기재되어 있다)를 사용하여 세포 표면에서 발현된 PAR-2에 결합하는 PAR-2 항원-결합 단백질의 결합 특성을 분석하는 것을 설명한다. 간략하면, 변형 DMEM 배지 (페놀 레드 무함유의 10％ 열 활성화된 FBS, 0.1 mM MEM 비-필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨, 페니실린-스트렙토마이신-글루타민, 및 0.025％ (w/w) 아지화나트륨) 중 인간 PAR-2를 발현하는 세포 (예를 들어, 서열 2의 폴리펩티드를 코딩하는 인간 전장의 PAR-2 cDNA로 CHO 세포를 형질감염시켜 수득할 수 있는 것인, 세포 표면에서 인간 PAR-2를 발현하는 CHO 형질감염체), 및 대조군 세포 (즉, 형질감염되지 않은 CHO 세포)의 일련의 희석액을 회전시키면서 4℃에서 24 내지 36시간 동안 설정량의 항체와 함께 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 종결시, 원심분리하여 (즉, 2000 rpm으로 4분 동안) 세포를 펠릿화시키고, 비결합 (유리) 항체를 함유하는 상등액을 제거한다. 문헌 [Rathanaswami et al. Biochem Biophys Research Commun : 1004 (2005)]에 기재되어 있는 바와 같이, 적절한 포획 비드 및 Cy5-접합된 항-인간 2차 항체를 사용하여 KinExA®에 의해 유리 mAb를 측정한다. KinExA® 소프트웨어를 사용하여, 주어진 곡선들 모두를 동시에 단일 K_D 값으로 피팅하는 "n-곡선 분석"에 의해 평형 해리 상수 (K_D)를 수득한다 (문헌 ([Rathanswami et al. 2005] 및 [Xie et al., 상기 문헌 동일])).

특정 PAR-2 항체의 K_D는 이러한 방식으로 측정하였다. KinExA®에 의해 측정된 바, 세포 표면에서 발현되는 인간 PAR-2에의 항-PAR-2 항체 1A1의 상호작용에 대한 K_D는 62.8 pM이며, 24.8 내지 134.7 pM으로 95％ 신뢰 구간을 갖는다 (N=5의 실험에 대한 평균값). 본 시스템에서 항체 1B5의 초기 분석시에는 K_D가 3.39 nM으로 나타났고, 1.36 내지 5.47 pM으로 95％ 신뢰 구간을 가졌다 (N=2의 실험).

실시예 12: 콜라겐- 유발성 관절염 유도

본 실시예는 래트를 사용한 콜라겐-유발성 관절염 모델을 설명한다. 사용 이틀전 2-4℃에서 돼지 II형 콜라겐 (10 mg; 워싱턴주 레드몬드 소재의 콘드렉스(Chondrex))를 회전식 플레이트 상에서 0.1N 아세트산 (5 mL)에 용해시킨다. 이어서, 유화 바늘 및 유리 시린지를 사용하여 콜라겐을 프로인트 불완전 애주번트 (IFA: 미시간주 디트로이트 디프코(Difco))로 1:1로 유화시켜, 최종 농도가 1 mg/mL가 되게 한다. 8주령된 암컷 루이스 래트 (매사추세츠주 윌밍턴 소재의 찰스 리버 레보레토리스) 등의 10군데의 다른 부위 (한 부위당 100 ㎕)에 IFA 중 유화된 콜라겐을 진피내 주사하여 상기 래트에서 질환을 유도한다. 뒷발 종창 및 보행상의 어려움으로 나타낸 바, 관절염의 임상적 발병 시점은 보통 10 내지 12일 사이로 다르게 나타난다. 콜라겐으로 면역화시키기 이전에 래트를 처리군으로 무작위 임의 추출하고, PAR-2 중화 항체, 대조군 항체 (즉, PAR-2 비-차단성 항체) 또는 비히클 대조군 (A5Su)을 i.p. 투여하여 요법을 개시한다. 개시 전날인 9일째 2차 투여량의 항체 및 비히클을 투여한다.

캘리퍼를 사용하여 뒷발의 직경을 간헐적으로 측정함으로써 연구하는 동안 염증의 진행 상태를 임상적으로 평가한다. 관절 유도 전, 개시 당일 (10일째), 11-17일째, 및 부검일 (18일째)날 경골뒷발목 (발목) 관절에서 판독하여 값을 얻는다. 하기 식에 따라 곡선하 면적 (AUC)에 기초하여 발 염증 저해율을 계산한다:

[(비히클 처리된 CIA - 처리된 CIA) / (비히클 처리된 CIA)] x 100

추가로, 이러한 관절염 모델에서는 체중 손실이 관절 염증의 진행 상태와 유사하기 때문에 치료 요법 동안 매일 전체 체중을 보충적 종점으로서 측정한다.

연구 종료시, 골밀도 (BMD) 손실 뿐만 아니라, 미노겐-활성화 단백질 키나제-활성화 키나제-2 (MAPKAPK-2 또는 MK-2)의 인산화 상의 변화에 대하여 발목 관절을 평가할 수 있다. 부검 후 적합한 시점에 이중-에너지 x선 흡광분석법 (DEXA)를 사용하여 BMD를 측정한다. (발목 [무릎 관절])에 가장 인접해 있는) 퍼 라인(fur line)에서 뒷발을 제거하고, 70％ 에탄올 중에 침지시키고, BMD 측정시까지 실온에서 보관한다. 이어서, 팬 빔 X선 농도계 (모델 QDR-4500A; 매사추세츠주 월섬 소재의 홀로직(Hologic))을 사용하여 수평 배향으로 관절을 스캐닝한다 (이는 대체로 문헌 [Feige et al., Cell Mol Life Sci 57: 1457; 2000]에 기재되어 있다). 스캐닝한 후, 분석하고자 하는 부위를 설명하기 위해 발뒤꿈치 중심부에 직사각형 모양의 박스 (29 x 25 mm)를 배치하고, 사용된 기기 조작법에 대해 승인받은 알고리즘 (예를 들어, 홀로직 소프트웨어)을 사용하여 골면적, 골 무기질 함량, 골밀도를 계산한다. 인광물 분석을 위해서는 한쪽 발목을 액상 N2 중에서 냉동시켜 단백질 분말로 분쇄시키고, 상업적으로 이용가능한 MK-2 분석을 사용하여 웨스턴 블롯 상에서 전개시킨다.

본원에서 인용된 각 참고문헌은 그가 교시하는 모든 것에 대해, 그리고, 모든 목적을 위해 그의 전문이 참고로 인용된다.

SEQUENCE LISTING <110> VIRCA, G. Duke HU, Shaw-Fen Sylvia ARORA KHARE, Taruna <120> ANTIGEN BINDING PROTEINS THAT BIND PAR-2 <130> A-1290-WO-PCT <140> to be assigned <141> 2008-06-20 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1194 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1191) <400> 1 atg cgg agc ccc agc gcg gcg tgg ctg ctg ggg gcc gcc atc ctg cta 48 Met Arg Ser Pro Ser Ala Ala Trp Leu Leu Gly Ala Ala Ile Leu Leu 1 5 10 15 gca gcc tct ctc tcc tgc agt ggc acc atc caa gga acc aat aga tcc 96 Ala Ala Ser Leu Ser Cys Ser Gly Thr Ile Gln Gly Thr Asn Arg Ser 20 25 30 tct aaa gga aga agc ctt att ggt aag gtt gat ggc aca tcc cac gtc 144 Ser Lys Gly Arg Ser Leu Ile Gly Lys Val Asp Gly Thr Ser His Val 35 40 45 act gga aaa gga gtt aca gtt gaa aca gtc ttt tct gtg gat gag ttt 192 Thr Gly Lys Gly Val Thr Val Glu Thr Val Phe Ser Val Asp Glu Phe 50 55 60 tct gca tct gtc ctc act gga aaa ctg acc act gtc ttc ctt cca att 240 Ser Ala Ser Val Leu Thr Gly Lys Leu Thr Thr Val Phe Leu Pro Ile 65 70 75 80 gtc tac aca att 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300 ctt ctg ctt gtg gtg cat tat ttt ctg att aag agc cag ggc cag agc 960 Leu Leu Leu Val Val His Tyr Phe Leu Ile Lys Ser Gln Gly Gln Ser 305 310 315 320 cat gtc tat gcc ctg tac att gta gcc ctc tgc ctc tct acc ctt aac 1008 His Val Tyr Ala Leu Tyr Ile Val Ala Leu Cys Leu Ser Thr Leu Asn 325 330 335 agc tgc atc gac ccc ttt gtc tat tac ttt gtt tca cat gat ttc agg 1056 Ser Cys Ile Asp Pro Phe Val Tyr Tyr Phe Val Ser His Asp Phe Arg 340 345 350 gat cat gca aag aac gct ctc ctt tgc cga agt gtc cgc act gta aag 1104 Asp His Ala Lys Asn Ala Leu Leu Cys Arg Ser Val Arg Thr Val Lys 355 360 365 cag atg caa gta tcc ctc acc tca aag aaa cac tcc agg aaa tcc agc 1152 Gln Met Gln Val Ser Leu Thr Ser Lys Lys His Ser Arg Lys Ser Ser 370 375 380 tct tac tct tca agt tca acc act gtt aag acc tcc tat tga 1194 Ser Tyr Ser Ser Ser Ser Thr Thr Val Lys Thr Ser Tyr 385 390 395 <210> 2 <211> 397 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Ser Pro Ser Ala Ala Trp Leu Leu Gly Ala Ala Ile Leu Leu 1 5 10 15 Ala Ala Ser Leu Ser Cys Ser Gly Thr Ile Gln Gly Thr Asn Arg Ser 20 25 30 Ser Lys Gly Arg Ser Leu Ile Gly Lys Val Asp Gly Thr Ser His Val 35 40 45 Thr Gly Lys Gly Val Thr Val Glu Thr Val Phe Ser Val Asp Glu Phe 50 55 60 Ser Ala Ser Val Leu Thr Gly Lys Leu Thr Thr Val Phe Leu Pro Ile 65 70 75 80 Val Tyr Thr Ile Val Phe Val Val Gly Leu Pro Ser Asn Gly Met Ala 85 90 95 Leu Trp Val Phe Leu Phe Arg Thr Lys Lys Lys His Pro Ala Val Ile 100 105 110 Tyr Met Ala Asn Leu Ala Leu Ala Asp Leu Leu Ser Val Ile Trp Phe 115 120 125 Pro Leu Lys Ile Ala Tyr His Ile His Gly Asn Asn Trp Ile Tyr Gly 130 135 140 Glu Ala Leu Cys Asn Val Leu Ile Gly Phe Phe Tyr Gly Asn Met Tyr 145 150 155 160 Cys Ser Ile Leu Phe Met Thr Cys Leu Ser Val Gln Arg Tyr Trp Val 165 170 175 Ile Val Asn Pro Met Gly His Ser Arg Lys Lys Ala Asn Ile Ala Ile 180 185 190 Gly Ile Ser Leu Ala Ile Trp Leu Leu Ile Leu Leu Val Thr Ile Pro 195 200 205 Leu Tyr Val Val Lys Gln Thr Ile Phe Ile Pro Ala Leu Asn Ile Thr 210 215 220 Thr Cys His Asp Val Leu Pro Glu 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<211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Asn 20 25 30 His Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Ile Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 26 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatctg 300 ggagcagcag ctggtactgg ttttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 27 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Gly Ala Ala Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 28 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgctggtgtg 300 gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333 <210> 29 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 30 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagag ctgcttggaa ctggatcagg 120 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180 aatgattttg cagtatctgt gagaagtcga ataaccatca ccccagacac atccaagaac 240 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agagatagga acagtggcta ctactactac ggtttggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 31 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Arg Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Phe Ala 50 55 60 Val Ser Val Arg Ser Arg Ile Thr Ile Thr Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Asn Ser Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 32 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 aaaatagtga tgacgcagtc tccagctacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt aacaacttag cctggtatca gcagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcaccag cctacagtct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggcctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 33 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Lys Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 34 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagag ctgcttggaa ctggatcagg 120 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180 aatgatcatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca ccccagacac atccaagaac 240 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca aagctgtgta ttactgtgca 300 agagatagga acagtggcta ctactactac ggtttggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 35 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Arg Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp His Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Thr Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Lys Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Asn Ser Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 36 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt aacaacttag cctggtacca gcagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcaccag cctacagtct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggcctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 38 <211> 473 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 1A1 human-mouse chimera <400> 38 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 20 25 30 Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly 35 40 45 Tyr Asn Phe Ile Ser His Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly 50 55 60 Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Met Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr 65 70 75 80 Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys 85 90 95 Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Arg Ser Leu Lys Ala Ser Asp 100 105 110 Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala Arg His Gly Gly Ile Thr Gly Thr Thr 115 120 125 Phe Tyr Tyr Asp Phe Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 130 135 140 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 145 150 155 160 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 165 170 175 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 180 185 190 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 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Ser <220> <221> misc_feature <222> (96)..(96) <223> Xaa can be Tyr or none <220> <221> misc_feature <222> (104)..(104) <223> Xaa can be Arg or Lys <400> 39 Ser Tyr Glu Leu Xaa Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Xaa Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala 20 25 30 Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Xaa Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Xaa Asp Xaa Glu Arg Pro Ser Gly Xaa Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Xaa Gly Xaa Xaa 85 90 95 Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Xaa Val Thr Val Leu 100 105 <210> 40 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain consensus <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa can be Pro or Ser <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> Xaa can be Ser or Asn <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> Xaa can be Ser or Ile or Thr <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> 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Claims (19)

1. 서열 9와 95％ 이상 동일한 가변 부위를 포함하는 중쇄, 및 서열 11과 95％ 이상 동일한 가변 부위를 포함하는 경쇄를 갖는 단리된 항원 결합 단백질.
2. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 부위가 서열 39의 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 가변 부위가 서열 40의 아미노산 서열을 갖는 것인 항원 결합 단백질.
3. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 부위가 서열 11, 서열 15 및 서열 19로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 가변 부위가 서열 9, 서열 13 및 서열 17로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 항원 결합 단백질.
4. 제1항에 있어서,
   a) 경쇄 가변 부위가 서열 11의 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 가변 부위가 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 것인 항원 결합 단백질;
   b) 경쇄 가변 부위가 서열 15의 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 가변 부위가 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 것인 항원 결합 단백질; 및
   c) 경쇄 가변 부위가 서열 19의 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 가변 부위가 서열 17의 아미노산 서열을 갖는 것인 항원 결합 단백질
   로 이루어진 군으로부터 선택된 항원 결합 단백질.
5. CDR1, CDR2 및 CDR3으로 명시되는 3개의 상보성 결정 부위 (CDR)를 포함하는 중쇄, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 명시되는 3개의 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄를 가지며, 여기서
   a) 중쇄 CDR1은 서열 9의 아미노산 31 내지 35, 서열 13의 아미노산 31 내지 35 및 서열 17의 아미노산 31 내지 35로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
   b) 중쇄 CDR2는 서열 9의 아미노산 50 내지 66, 서열 13의 아미노산 50 내지 66 및 서열 17의 아미노산 50 내지 66으로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
   c) 중쇄 CDR3은 서열 9의 아미노산 99 내지 115, 서열 13의 아미노산 99 내지 115 및 서열 17의 아미노산 99 내지 115로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
   a') 경쇄 CDR1은 서열 11의 아미노산 23 내지 33, 서열 15의 아미노산 23 내지 33 및 서열 19의 아미노산 23 내지 33으로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
   b') 경쇄 CDR2는 서열 11의 아미노산 49 내지 55, 서열 15의 아미노산 49 내지 55 및 서열 19의 아미노산 49 내지 55로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
   c') 경쇄 CDR3은 서열 11의 아미노산 88 내지 97, 서열 15의 아미노산 88 내지 97 및 서열 19의 아미노산 88 내지 97로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인
   단리된 항원 결합 단백질.
6. 제5항에 있어서, 중쇄가 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 명시되는 1 내지 4개의 프레임워크 부위 (FR)를 더 포함하고, 경쇄가 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 명시되는 1 내지 4개의 프레임워크 부위를 더 포함하며, 여기서
   a) 중쇄 FR1은 서열 9의 아미노산 1 내지 30, 서열 13의 아미노산 1 내지 30 및 서열 17의 아미노산 1 내지 25로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
   b) 중쇄 FR2는 서열 9의 아미노산 36 내지 49, 서열 13의 아미노산 36 내지 49 및 서열 17의 아미노산 36 내지 49로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
   c) 중쇄 FR3은 서열 9의 아미노산 67 내지 98, 서열 13의 아미노산 67 내지 98 및 서열 17의 아미노산 67 내지 98로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
   d) 중쇄 FR4는 서열 9의 아미노산 116 내지 126, 서열 13의 아미노산 116 내지 126 및 서열 17의 아미노산 116 내지 126으로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
   a') 경쇄 FR1은 서열 11의 아미노산 1 내지 22, 서열 15의 아미노산 1 내지 22 및 서열 19의 아미노산 1 내지 22로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
   b') 경쇄 FR2는 서열 11의 아미노산 34 내지 48, 서열 15의 아미노산 34 내지 48 및 서열 19의 아미노산 34 내지 48로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
   c') 경쇄 FR3은 서열 11의 아미노산 56 내지 87, 서열 15의 아미노산 56 내지 87 및 서열 19의 아미노산 56 내지 87로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
   d') 경쇄 FR4는 서열 11의 아미노산 98 내지 107, 서열 15의 아미노산 98 내지 107 및 서열 19의 아미노산 98 내지 107로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인
   항원 결합 단백질.
7. 서열 31과 95％ 이상 동일한 가변 부위를 포함하는 중쇄, 및 서열 35와 95％ 이상 동일한 가변 부위를 포함하는 경쇄를 갖는 항원 결합 단백질.
8. 제7항에 있어서, 경쇄 가변 부위가 서열 41의 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 가변 부위가 서열 42의 아미노산 서열을 갖는 것인 항원 결합 단백질.
9. 제7항에 있어서, 경쇄 가변 부위가 서열 33 및 서열 37로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 가변 부위가 서열 31 및 서열 35로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 항원 결합 단백질.
10. 제7항에 있어서,
    a) 경쇄 가변 부위가 서열 33의 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 가변 부위가 서열 31의 아미노산 서열을 갖는 것인 항원 결합 단백질; 및
    b) 경쇄 가변 부위가 서열 37의 아미노산 서열을 갖고, 중쇄 가변 부위가 서열 35의 아미노산 서열을 갖는 것인 항원 결합 단백질
    로 이루어진 군으로부터 선택된 항원 결합 단백질.
11. CDR1, CDR2 및 CDR3으로 명시되는 3개의 상보성 결정 부위 (CDR)를 포함하는 중쇄, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 명시되는 3개의 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄를 가지며, 여기서
    a) 중쇄 CDR1은 서열 31의 아미노산 31 내지 37 및 서열 35의 아미노산 31 내지 37로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
    b) 중쇄 CDR2는 서열 31의 아미노산 52 내지 69 및 서열 35의 아미노산 52 내지 69로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
    c) 중쇄 CDR3은 서열 31의 아미노산 102 내지 114 및 서열 35의 아미노산 102 내지 114로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
    a') 경쇄 CDR1은 서열 33의 아미노산 24 내지 34 및 서열 37의 아미노산 24 내지 34로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
    b') 경쇄 CDR2는 서열 33의 아미노산 50 내지 56 및 서열 37의 아미노산 50 내지 56으로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
    c') 경쇄 CDR3은 서열 33의 아미노산 89 내지 97 및 서열 37의 아미노산 89 내지 97로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인
    단리된 항원 결합 단백질.
12. 제11항에 있어서, 중쇄가 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 명시되는 1 내지 4개의 프레임워크 부위 (FR)를 더 포함하고, 경쇄가 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 명시되는 1 내지 4개의 프레임워크 부위를 더 포함하며, 여기서
    a) 중쇄 FR1은 서열 31의 아미노산 1 내지 30 및 서열 35의 아미노산 1 내지 30으로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
    b) 중쇄 FR2는 서열 31의 아미노산 38 내지 51 및 서열 35의 아미노산 38 내지 51로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
    c) 중쇄 FR3은 서열 31의 아미노산 70 내지 101 및 서열 35의 아미노산 70 내지 101로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
    d) 중쇄 FR4는 서열 31의 아미노산 115 내지 125 및 서열 35의 아미노산 115 내지 125로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
    a') 경쇄 FR1은 서열 33의 아미노산 1 내지 23 및 서열 37의 아미노산 1 내지 23으로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
    b') 경쇄 FR2는 서열 33의 아미노산 35 내지 49 및 서열 37의 아미노산 35 내지 49로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
    c') 경쇄 FR3은 서열 33의 아미노산 57 내지 88 및 서열 37의 아미노산 57 내지 88로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
    d') 경쇄 FR4는 서열 33의 아미노산 98 내지 107 및 서열 37의 아미노산 98 내지 107로 이루어진 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인
    항원 결합 단백질.
13. a) 서열 11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 부위, 및 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 부위를 포함하는 항원 결합 단백질;
    b) 서열 15의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 부위, 및 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 부위를 포함하는 항원 결합 단백질;
    c) 서열 19의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 부위, 및 서열 17의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 부위를 포함하는 항원 결합 단백질;
    d) 서열 25의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 부위, 및 서열 23의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 부위를 포함하는 항원 결합 단백질;
    e) 서열 29의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 부위, 및 서열 27의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 부위를 포함하는 항원 결합 단백질;
    f) 서열 33의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 부위, 및 서열 31의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 부위를 포함하는 항원 결합 단백질; 및
    g) 서열 37의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 부위, 및 서열 35의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 부위를 포함하는 항원 결합 단백질
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 항원 결합 단백질.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
15. 제14항에 있어서,
    a) 서열 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산, 및 서열 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 핵산;
    b) 서열 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산, 및 서열 14의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 핵산;
    c) 서열 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산, 및 서열 18의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 핵산;
    d) 서열 24의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산, 및 서열 22의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 핵산;
    e) 서열 28의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산, 및 서열 26의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 핵산;
    f) 서열 30의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산, 및 서열 32의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 핵산; 및
    g) 서열 34의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산, 및 서열 36의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 핵산
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산.
16. 제14항 또는 제15항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
17. 제16항의 벡터로 형질감염되거나, 형질전환된 단리된 숙주 세포.
18. 발현을 촉진시키는 조건하에서 제17항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 항원 결합 단백질을 생산하는 방법.
19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 및 생리학상 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물.

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