TW200909447A - Antigen binding proteins that bind PAR-2 - Google Patents

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200909447 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本申請案提供有關結合PAR-2抗原之蛋白質之組成物 及方法。 【先前技術】 蛋白酶活化受體（PAR)家族是七跨膜 G -偶合受體 (seven-transmembrane G-coupled receptor)超級家族的一部 分。目前已知有四種PARs，其中3者（PARs-1，-3及-4)是由 凝血酶（thrombin)活化；第4種（PAR-2)是由胰蛋白酶或肥大 細胞類胰蛋白酶活化，但不由凝血酶活化。PARs廣泛分佈 於各種組織且特別在一些生理或病理生理現象，例如血小板 凝集，發炎以及心血管、消化或呼吸功能。 PARS不同於其他受體，因爲活化是由PAR之N終端的 蛋白酵素切割開始，然後形成與相同受體多胜肽的細胞外區 域（環2)作用之束縛配體（tethered ligand)。PAR-2的切割發 生在蛋白酶切割功能部位（domain) : SKGRSLIG(SEQ ID N 0 : 2的胺基酸3 3至4 0)之R及S殘基間，該功能部位在人 類' 小鼠以及大鼠PAR-2間是保守的。已顯示模擬束縛配體 之胜肽具有作用於 PAR-2(Saifeddine et al.，Br J Pharmacol 118(3):521-30 [ 1 9 9 6]; McGuire e t al., J Pharmacol Exp

Ther 3 09(3): 1 124-31 [2004])。 PAR-2活化G-蛋白偶合受體仲介的共同訊息傳遞路 徑，肌醇1,4,5-三磷酸製造以及Ca(2 + )的移動’以及多種激 酶路徑，包括ERK、p38MAPK、JNK以及IKK。其呈現在腎 200909447 臟、胰臟、胃、腸、氣道、皮膚、膀胱以及腦的上皮以及內 皮細胞、肌細胞、纖維母細胞、免疫細胞、神經元以及神經 膠質細胞。活化PAR-2之蛋白酶出現於發炎期間，且PAR-2 經由發炎因子如腫瘤壞死因子α、介白素1 α以及脂多醣類 被向上調節。再者，利用PAR-2-缺乏或過度表現小鼠之硏究 確認此受體於發炎的角色（Schmidlin et al.，J. Immunol. 169, 5 3 1 5 - 5 3 2 1 [2002]; Ferrell et al., J. Clin. Invest. Ill, 35 - 41 [2 00 3 ])。因此，本技藝有需要發展PAR-2活化之拮 抗劑，其可用於治療或改善發炎情形。 【發明內容】 發明槪述 本發明之一方面提供一種專一結合人類PAR-2之經單 離之抗原結合蛋白。在本發明之另一方面，該抗原結合蛋白 專一結合非人類之靈長類、食蟹獼猴（cynomologous monkey)、黑猩猩、非靈長類哺乳動物、齧齒動物、小鼠、 大鼠、倉鼠、天竺鼠、猫或狗的PAR-2。在另一具體例中， 經單離之抗原結合蛋白包括：a ·人類抗體；b .嵌合型抗體； c.單株抗體；d.重組抗體；e.結合抗原之抗體片段；f.單鏈抗 體；g·雙鏈抗體（diabody); h.三鏈抗體（triab〇dy); i.四鏈抗 體（tetrabody); j.Fab片段；k.F(ab’）2片段；1.功能部位抗體； m.IgD 抗體；n.IgE 抗體；o.IgM 抗體；p.igGl 抗體；q.IgG2 抗體；r.IgG3抗體；s.IgG4抗體；或t.具有至少一突變於樞 紐區（h i n g e r e g i ο η)以緩和形成內部-Η鏈二硫鍵傾向之I g G 4 抗體。 200909447 在本發明之另一方面，本發明提供一種具有重鏈及輕鏈 之經單離之抗原結合蛋白’該重鏈含有至少95 %相同於SEQ ID NO:9之可變區域（variable region)，以及該輕鏈含有至少 9 5%相同於3£(^101^0:11之可變區域。在另一具體例中， 重鏈可變區域爲至少95%相同於SEQIDNO:31，以及輕鏈 可變區域爲至少95%相同於SEQIDNO:35。在本發明之另 一方面，輕鏈可變區域具有SEQ ID NO:39之胺基酸序列， 以及重鏈可變區域具有SEQ ID NO: 40之胺基酸序列。在本 發明之另一具體例中，輕鏈可變區域具有SEQ ID N0:41之 胺基酸序列，以及重鏈可變區域具有SEQ ID NO :42之胺基 酸序列。 在本發明之一具體例中，重鏈可變區域含有三個互補決 定區域（complementarity determining regions(CDRs))，命名 爲CDR1、CDR2以及CDR3，以及輕鏈可變區域含有三個互 補決定區域（CDRs)，命名爲CDR1、CDR2以及CDR3。在本 發明之另一方面，重鏈可變區域進一步含有四個骨架區域 (FRs)，命名爲FR1、FR2、FR3以及FR4，以及輕鏈可變區 域進一步含有四個骨架區域（FRs)，命名爲FR1、FR2、FR3 以及FR4。在本發明之一具體例中，重鏈CDRs是選自具有 示於 SEQ ID NOs:9、13、17、23、27、31 以及 35 胺基酸序 列之胜肽的CDRs，以及輕鏈CDRs是選自具有示於SEQ ID N0s:ll、15、19、25、29、33以及37胺基酸序歹[]之胜肽的 CDRs。 在本發明之一方面，全部三個重鏈CDRs是選自相同胜 200909447 肽’例如重鏈CDRl、CDR2以及CDR3是來自SEQ IDNO:9 以及輕鏈CDR1、CDR2以及CDR3是來自SEQ ID ΝΟ:11等 等。在本發明之另一具體例中，CDRs是選自於不同胜肽， 例如重鏈CDR1是來自SEQ ID NO:9，CDR2是來自SEQ ID NO:13以及CDR3是來自SEQ ID NO:17，以及輕鏈CDR1是 來自 SEQ ID NO:ll，CDR2 是來自 SEQ ID NO:15 以及 CDR3 是來自SEQ ID NO:19等等。另外，兩個CDRs能選自單一 胜肽以及第3個來自另一胜肽。諸多此等組合是可能的。在 另一方面’骨架區域能選自相同胜肽，或一個或以上骨架區 域能選自不同胜肽。 在本發明之一方面，本發明提供編碼上述多胜肽之核 酸。在本發明之另一方面，該核酸是一載體。在本發明之另 一具體例中，本發明提供經本發明核酸轉形或轉染之宿主細 胞。在本發明之另一方面，有提供製備多胜肽之方法，包含 在促進多胜肽表現之條件下培育宿主細以及收取該多胜肽。 在另一方面，本發明提供一種經單離細胞，其分泌結合 PAR-2之抗原結合蛋白。在另一具體例中，該細胞是融合瘤。 在另一具體例中，本發明提供一種製造結合人類PAR-2之抗 原結合蛋白之方法，包含在使該細胞表現該抗原結合蛋白的 條件下培育該經單離細胞。 在一方面，本發明提供一種結合至蛋白酶活化受體 -2 (PAR-2)之經單離之抗原結合蛋白。在另一具體例中，該 經單離之抗原結合蛋白結合至人類PAR-2時，透過該人類 PAR-2抑制蛋白酵素切割及/或隨後的發訊息。在另一具體例 200909447 中，經單離之抗原結合蛋白抑制PAR-2的蛋白酵素分解活化 大於約80%。在另一具體例中，經單離之抗原結合蛋白結合 至未切割的PAR-2以及程度上較少結合至切割的PAR-2。在 另一具體例中，經單離之抗原結合蛋白抑制PAR-2的蛋白酵 素分解活化少於約1 0%。在另一具體例中，經單離之抗原結 合蛋白實質上平均結合至切割及未切割的PAR-2。 在另一方面，本發明提供一種含有抗原結合蛋白之醫藥 組成物。在一具體例中，本發明提供一種治療患者症狀之方 法，包括對該患者投與該醫藥組成物，其中該症狀是在該患 者經由降低PAR-2活性可治療的。在另一真體例中，該患者 是人類。在另一具體例中，該症狀是皮膚、關節、胃腸系統 及/或氣道的發炎情形。在另一具體例中，該方法進一步包 括對該患者投與第二種治療。在另一具體例中，該第二種治 療是投與該醫藥組成物至該患者之前及/或同時及/或之後投 與至該患者。在另一具體例中，該第二種治療含有抗發炎 劑。在另一具體例中，該第二種醫藥組成物含有選自由非固 醇類抗發炎藥、類固醇以及免疫調節劑所組成群組之藥劑。 在另一具體例中，該方法包含對該患者投與第三種治療。 在另一方面，本發明提供一種增加患者壽命之方法，包 括對該患者投與該醫藥組成物。 在另一方面，本發明提供一種於有其需要之患者減小 P A R - 2活性之方法，包括對該患者投與該醫藥組成物。 在另一方面’本發明提供一種於有其需要之患者減小 PAR-2發訊息之方法，包括對該患者投與該醫藥組成物。 200909447 在另一方面，本發明提供於有其需要之患 之蛋白酵素分解活化之方法，包括對該患者投 物。 【實施方式】 發明之詳細說明 本發明提供有關結合至蛋白酶活化受體 分子之組成物、套組及方法，包括促進或拮挤 子’例如抗-PAR-2抗體、抗體片段以及抗體衍 抗性抗-PAR-2抗體、抗體片段或抗體衍生物。 酸及其衍生物及片段，含有編碼結合至PAR-2 部或一部分的核苷酸序列，例如編碼全部或 抗體的核酸、抗體片段、或抗體衍生物，含有 體以及載體，以及含有此等核酸及/或載體及 細胞株。所提供之方法包括，例如製造、鑑定 PAR-2之分子（例如抗-PAR-2抗體）之方法，測 合至PAR-2之方法，測定分子是否促進或掊ί 法，製造組成物（例如含有結合至PAR-2之分 物）之方法，以及對患者投與結合PAR-2之分 如治療PAR-2仲介之症狀之方法，以及活體內 體外（/« v/iro)促進或拮抗PAR-2之生物活性免 使用標準一字母或三字母縮寫表示多核 序列。除非其他指示，每一多胜肽序列具有胺 及羧基末端在右；每一單股核酸序列，以及每 列的上方股具有5 ’末端在左以及3 ’末端在右 者抑制PAR-2 與該醫藥組成 2(“PAR-2”）之 〔PAR-2之分 生物，例如拮 也提供者爲核 之多胜肽的全 部分抗-PAR-2 此等核酸之質 質體之細胞或 或單離結合至 定分子是否結 充PAR-2之方 子之醫藥組成 子的方法，例 丨（z’《 Wvoj或活 ]方法。 苷酸及多胜肽 基末端在左以 一雙股核酸序 。一特殊的多 -10- 200909447 胜肽或多核苷酸序列也能以其如何異於一參考序列說明敘 述。 除非其他定義，文中有關本發明所用之科學及技術用語 之意義將爲所屬技術領域具有一般知識者通常可瞭解者。再 者，除非上下文中需要，單數用語將包括複數以及複數用語 將包括單數。通常文中所述細胞及組織培養，分子生物學， 免疫學，微生物學，遺傳學及蛋白質及核酸化學與雜化作用 (hybridization)有關聯及技術之命名爲所屬技術領域熟知且 常用者。除非其他指示，本發明之方法及技術通常根據所屬 技術領域熟知的慣周方法，以及敘述於本說明書從頭到尾所 引用及討論的各種一般的及更專一的參考資料來實施。例如 參閱 Sambrook ei a/·，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，2d ed·, Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. (1989)以及 Ausubel et al_，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates (1992)，以及 Harlow and Lane Antibodies : A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. (1990)，其 倂入本文參考。酵素反應及純化技術是根據製造商的說明書 實施，就如平常完成於技藝或如文中所述一樣。所用與技術 有關之術語以及文中所述分析化學、合成有機化學、及藥學 和醫藥化學之實驗室常規及技術爲所屬技術領域熟知且常 用者。標準技術能用於化學合成，化學分析，醫藥製備，配 方，及傳送，以及病患的治療。 除非其他指示，將理解以下用語具有下列意義： 用語“經單離之分子”（其中該分子例如是一多胜肽，多 200909447 核昔酸或抗體）是一分子憑藉其起源（origin)或根源（source) 的衍生而爲：（1 )與附有其天然狀態之天然相關的成分無牽 連’（2)實質上不含來自相同物種之其他分子，（3)經由不同 物種的細胞表現，或（4)沒有人類介入不出現於自然。因此， 化學合成或在不同於其自然產生之細胞的細胞系統中合成 之分子，將是“經單離”自其天然相關的成分。分子亦可使用 技藝熟知的純化技術單離成爲實質上無天然相關的成分。分 子純度或同質性可以許多技藝熟知的方法分析。舉例而言， 多胜肽樣品的純度可使用技藝熟知的技術使用聚丙烯醯胺 凝膠電泳分析並染色凝膠以看見多胜肽。爲此目的，使周 Η P L C或技藝熟知用於純化的其他方法可得到較高解析度。 用語“PAR-2抑制劑”及“PAR-2拮抗劑”可交互使用。每 一分子爲可察覺地抑制PAR-2至少一功能。因此，“PAR_2 激動劑”是一分子可察覺地增加PAR-2至少一功能。pAR_ 2 抑制劑引起之抑制不需完全’只要使用分析可偵測即可。能 使用PAR-2功能的任何分析，本文中提供其實例。能由par-2 抑制劑抑制，或由PAR-2激動劑增加PAR-2功能的實例包括 經蛋白酶活化之配體結合、下游傳訊息等等。PAR-2抑制劑 及PAR-2激動劑之類型實例，包括但不限爲結合PAR-2之多 胜肽，例如抗原結合蛋白（例如抑制PAR-2抗原結合之蛋白 質），抗體，抗體片段以及抗體衍生物。 用語“胜肽”、“多胜肽”及“蛋白質”各指含有兩個或兩個 以上胺基酸殘基以胜肽鍵彼此連結之分子。這些用語包含例 如天然及人造蛋白質，蛋白質片段及蛋白質序列的多胜肽類 200909447 似物（例如突變蛋白，變異體，以及接合蛋白（fusion protein))，以及轉譯後或其他共價或非共價、經修飾蛋白 質。胜肽、多胜肽或蛋白質可爲單體或多體。 文中使用之用語“多胜肽片段”是指相較於對應之全長 蛋白質，具有胺基末端及/或羧基末端刪除之多胜肽。片段 例如能爲至少 5、6、7、8、9、1 0、1 1、1 2、1 3、1 4、1 5、 20、50、70、80、90、100、150或200個胺基酸長度。片段 也能爲例如至多 1，〇〇〇、 750、 500、 250、 200、 175、 150、 125、 100、 90、 80、 70、 60、 50、 40、 30、 20、 15、 14、 13、 12、11、或10個胺基酸長度。片段能進一步在其一或兩末 端含有一個或一個以上額外的胺基酸，例如來自不同天然存 在之蛋白質（例如Fc或白胺酸拉錬結構（leucine zipper)功能 部位）或人造胺基酸序列（例如人造連接體序列（artificial linker sequence)或標鐵蛋白）之胺基酸序列。 本發明之多胜肽包括已於任何方式及爲任何理由經修 飾之多胜肽，例如爲使其：（1 )降低對蛋白水解的感受性，（2) 降低對氧化的感受性，（3)改變對形成之蛋白質複合體的結 合親和力，（4 )改變結合親和力，以及（4 )給予或修飾其他物 理化學或功能性特性。類似物包括多胜肽的突變蛋白。舉例 而言，單一或多胺基酸取代（例如，保留性胺基酸取代）可製 作於天然存在之序列（例如，在形成分子間接觸之功能部位 外側之部分多胜肽）。“保留性胺基酸取代，，是沒有實質改變 親代序列的結構特徵（例如，置換的胺基酸應不易毀壞存在 於親代序列的螺旋’或瓦解親代序列特徵或其功能性所需之 200909447 其他種二級結構）。技藝辯認多胜肽二級及三級結構之實例 敘述於 Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed.，W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. To.oze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); 以及 Thornton ei Nature 354:105 (1991)，這些皆倂入本文參考。 本發明也提供結合PAR-2多胜肽之非胜肽類似物。由 於藥物具有特性類似於那些模板胜肽，因此非胜肽類似物常 用於醫藥工業。此類非胜肽化合物稱爲“胜肽擬物（peptide mimetics)”或“擬肽（peptidomimetics)”。例如參閱 Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS ρ·392 (1985);以及 Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)，其倂入本文參考。結構類 似於治療用胜肽之胜肽擬物可用於產生相當的治療或預防 效果。一般而言，擬肽（peptidomimetics)的結構類似於範例 多胜肽（paradigm polypeptide)(亦即具有所欲生化特性或藥 理活性之多胜肽），例如人類抗體，但具有一個或一個以上 的胜肽連接，可以技藝熟知的方法經由選自下列所組群組組 成之連接置換：--CH2NH--，--CH2S--，--CH2--CH2--， --CH = CH-(順式及反式），--COCH2--，--CH(0H)CH2--以及 --CH2SO--。以相同種類 D-胺基酸之共有序列（consensus sequence)—個或一個以上胺基酸的系統性取代（例如D-離胺 酸代替L-離胺酸），亦可用於產生更穩定的胜肽。此外，含 有共有序列或實質相同的共有序列變異之受限胜肽，可由技 藝已知方法製造（Rizo and Gierasch Ann. Rev· Biochem. 61 : 387 (1992)，其倂入本文參考），例如經由添加內部半胱胺酸殘基， 200909447 其能形成環化胜肽之分子內二硫橋（disulfide bridges)。 多胜肽之“變異體”（例如抗體）含有胺基酸序列中一個 或一個以上胺基酸殘基是插入、刪除自及/或取代進入相對 於另一多胜肽序列的胺基酸序列。本發明之變異體包括接合 蛋白。 多胜肽之“衍生物”是已經過化學修飾，例如經由接合到 另一化學部分（moiety)如聚乙二醇或白蛋白（例如人類血清 白蛋白）、磷酸化及糖化之多胜肽（例如抗體）。除非其他指 示，用語“抗體”除含有兩全長重鏈及兩全長輕鏈之抗體以 外，包括其衍生物、變異體、片段及突變蛋白，其實洌敘述 於下。 “抗原結合蛋白”是一種蛋白質，含有結合至抗原的一部 分以及可有一支架（scaffold)或骨架（framework)部分能使結 合抗原之部分採取促進該抗原結合蛋白結合至抗原之構 形。抗原結合蛋白的實例包括抗體、抗體片段（例如，抗體 之結合抗原部分）、抗體衍生物及抗體類似物。該抗原結合 蛋白能含有，例如另一蛋白質支架或具有移植之CDRs或 CDR衍生物之人造支架。此等支架包括但不限爲衍生自抗體 之支架（例如含有突變導入以穩定該抗原結合蛋白三維結構） 以及完全合成之支架（例如含有一生物可容性聚合物）。例如 參閱 Korndorfer et al·，2003, Proteins : Structure, Function, and

Bioinformatics, Volume 53, Issue 1 ： 121-129 ； Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20 : 639-654。此外，能使用胜肽抗體擬態物（“PAMs”），以 及依據抗體擬態物利用纖維網蛋白成分作爲支架之支架。 200909447 抗原結合蛋白能具有，例如天然存在之免疫球蛋白的結 構。“免疫球蛋白”是四聚體分子。天然存在之免疫球蛋白 中，每一四聚體由相同兩對多肽鏈所組成，每對具有一 “輕” 鏈（約2 5 kDa)及一“重”鏈（約5 0-70 kDa)。每一鏈的胺基末端 部分包括一個主要負責抗原辨認之約1 〇 〇至11 〇或以上胺基 酸的可變區域（variable region)。每一鏈之羧基末端部分定 義爲主要負責效應功能之恆定區域（constant region)。人類 輕鏈分類爲κ及λ輕鏈。重鏈分類爲μ、δ、γ、α、或ε，並 分別定義爲抗體之同型物IgM、IgD、IgG ' IgA及IgE。輕 鏈及重鏈中，可變及恆定區域是經由約1 2個或以上之胺基 酸的“Γ’區域連結，以及重鏈也包括約1 0個或以上之胺基酸 之 “D”區域。槪括而言參閱 Fundamental Immunology Ch· 7 (Paul, W·， ed_，2nd ed_ Raven Press，N.Y. (1989))(不限目前其完全倂入參考）。 每一輕鏈/重鏈對之可變區域形成抗體結合位置，以至一完 整的免疫球蛋白具有兩個結合位置。 天然存在之免疫球蛋白鏈之可變區域展現以三個高可 變區域（也稱爲互補決定區域或CDR)連結之相當保留的骨 架區域（FR)相同的一般構造。從N-末端至C-末端，輕鏈及 重鏈二者皆含有功能部位FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3, CDR3及FR4。胺基酸對每一功能部位之分配是依據Kabat 等人之定義，於 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.， US Dept, of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242，1991。免疫球蛋白鏈中胺基酸的其他編號系統包括 IMGT®(the international ImMunoGeneTics information 200909447 system; Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 29:1 8 5-203; 2005)以及 AHo(Honegger and Pluckthun， J. Λ/ο/. 309(3):657-670; 2001) ° 抗體能從例如含有具各種抗原專一性之免疫球蛋白之 血清或血漿來源取得。若此等抗體進行親和性純化，他們能 被強化特殊抗原專一性。此等抗體之強化製備物通常製造爲 少於約1 0 %抗體對於特殊抗原具有專一結合活性。這些製備 物進行數回親和性純化能增加抗體對於抗原具有專一結合 活性之特性。此方法製備之抗體通常稱爲“單專一性”。單 專一性抗體製備物能甶約1 0 %、2 0 %、3 0 %、4 0 %、5 0 %、6 0 %、 70% ' 75% > 8 0%、85% ' 90%、95%、9 7%、9 9 %或 99.9% 對 於特殊抗原具有專一結合活性之抗體所組成。 除非其他具體指定，“抗體”是指一完整的免疫球蛋白或 其抗原結合部分可與完整抗體競爭專一結合。抗原結合部分 可由重組DNA技術或酵素或化學切割完整抗體來製造。抗 原結合部分包括，特別是Fab，Fab’，F(ab’）2，Fv，功能部 位抗體（dAbs)，以及互補決定區域（CDR)片段，單鏈抗體 (scFv)，嵌合型抗體，雙鏈抗體（diabodies)，三鏈抗體 (triabodies)，四鏈抗體（tetrabodies)以及多胜肽，其至少含 有足以賦予專一抗原結合至多胜肽之一部分免疫球蛋白。

Fab片段是具有VL，VH，Cl及CH1功能部位之單價片 段；F(ab’）2片段是具有兩Fab片段在樞紐區以二硫橋連接之 二價片段；Fd片段具有VH及CH1功能部位；Fv片段具有抗 體單臂之Vl及VH功能部位；以及dAb片段具有VH功能部 200909447 位，VL功能部位，或VH或vL功能部位之抗原結合片段（美 國專利第6,846,634，6,696,245號，美國專利申請案公開號 05/0202512 > 04/0202995 > 04/0038291 > 04/0009507 - 03/003 995 8 > Ward et al. > Nature 34 1 ： 544-546 > 1 989) ° 單鏈抗體（scFv)是抗體中 Vl及Vh區域透過連接體 (linker)(例如，胺基酸殘基之合成序列）連結以形成連續蛋白 質鏈，其中連接體是長度足夠使蛋白質鏈在其本身摺疊返回 並形成單價抗原結合位置（參閱例如 Bird以β/·，198S， 242 · 423-26 and Huston et al·, 1988 * Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 5879-83)。雙鏈抗體（diabodies)是含有兩多胜肽鏈之二價抗 體，其中每一多胜肽鏈含有連接體連結之VH及Vl功能部 位，由於連接體太短以致兩功能部位之間無法在相同鏈上配 對，如此使每一功能部位與另一多肽胜鏈上互補的功能部位 配對（參閱，例如 Holliger ei β/.，1993，_Proc. iVar/. Jcai/. 5W. USA 90:6444-48, and Poljak ei a/·，1994, Sewciwre 2:1121-23)。如果雙鏈抗體 (diabody)的兩多胜肽鏈是一樣的，則其配對產生之雙鏈抗體 (diabody)將具有兩個相同抗原結合位置。具有不同序列之多 胜肽鏈能用於製造具有兩不同抗原結合位置之雙鏈抗體 (diabody)。同樣地’三鏈抗體（tribodies)及四鏈抗體 (tetrabodies)分別爲含有三個及四個多胜肽鏈之抗體，且分 別形成三個及四個抗原結合位置，其能爲相同或不同。 所提供抗體之互補決定區域（CDR)及骨架區域（Fr)可使 用前述 Kabat 等人、Lefranc 等人及 / 或 Honegger 及 Pluckthun 所述之系統鑑定。一個或一個以上CDR可共價或非共價倂 200909447 入分子中以製造一抗原結合蛋白。抗原結合蛋白可倂入 CDR(s)作爲較大多胜肽鏈的一部分，可共價連接CDR(S)到 另一多胜肽鏈，或可非共價倂入CDR(s)。CDRs容許該抗原 結合蛋白專一結合感興趣的特殊抗原。 抗原結合蛋白可具有一個或一個以上結合位置。若有一 個以上結合位置，則結合位置可彼此一樣或可不同。舉例而 言’天然存在之人類免疫球蛋白典型具有兩個一樣的結合位 置，然而“雙專一性（bispecific)”或“雙功能（bifunctional)”抗 體具有兩個不同的結合位置。 用語“人類抗體”包括具有一個或一個以上衍生自人類 免疫球蛋白序列之可變及恆定區域之全部抗體。在一具體例 中，全部的可變及®定功能部位（c ο n s t a n t d 〇 m a i η)是衍生自 人類免疫球蛋白序列（完全人類抗體）。這些抗體可以各種方 法製備，其實例敘述如下，包括透過以感興趣的抗原免疫小 鼠，該小鼠經基因修飾以表現衍生自編碼人類重鏈及/或輕 鏈基因之抗體。 人類化抗體具有序列以一個或一個以上胺基酸取代、刪 除及/或添加而不同於衍生自非人類物種之抗體的序列，以 至當將其投與人類患者時，相較於非人類物種抗體，該人類 化抗體較不可能引起免疫反應及/或引起較不嚴重的免疫反 應。在一具體例中，非人類物種抗體之重鏈及/或輕鏈骨架 及恆定功能部位中某些胺基酸經突變以產生人類化抗體。在 另一具體例中，來自人類抗體的恆定功能部位是接合到非人 類物種的可變功能部位。在另一具體例中，非人類抗體之一 -19- 200909447 個或一個以上C D R序列中一個或一個以上胺基酸殘基是經 改變，當將其投與人類患者時以降低可能的非人類抗體免疫 原性，其中經改變胺基酸殘基並非抗體免疫專一結合至其抗 原之關鍵者，或對該胺基酸序列所做的改變是保留性改變’ 以至人類化抗體結合至抗原沒有比非人類抗體結合至該抗 原顯著惡化。如何製作人類化抗體之實例可見於美國專利第 6,054,297 ， 5,886，152 及 5,877,293 號。 用語“嵌合型抗體”是指含有一個或一個以上區域來自 一抗體以及一個或一個以上區域來自一個或一個以上其他 抗體之抗體。在一具體例中，一個或一個以上CDR是衍生 自人類抗-PAR-2抗體。在另一具體例中，全部CDR是衍生 自人類抗-PAR-2抗體。在另一具體例中，來自一個以上人類 抗-PAR-2抗體之CDR是混合及相配於嵌合型抗體。例如， 嵌合型抗體可含有來自第一人類抗-PAR-2抗體輕鏈之 CDIM，來白第二人類抗-PAR-2抗體輕鏈之CDR2及CDR3, 以及來自第三抗-PAR-2抗體重鏈之CDR。其他組合是可行 且包括在本發明具體例中。 再者，骨架區域可衍生自相同抗-PAR-2抗體、一種或 一種以上不同抗體，例如人類抗體，或人類化抗體之一。在 嵌合型抗體之一實例中，重鏈及/或輕鏈之一部分是一樣 於、同源於（homologous)、或衍生自來自特殊物種之抗體或 屬於特殊物種之抗體類型或亞型，而剩餘鏈是一樣於、同源 於、或衍生自來自另一物種之抗體或屬於另一抗體類型或亞 型。所包括亦爲展現所欲生物活性之此等抗體的片段（亦即 -20 - 200909447 能專一結合PAR-2)。例如參閱美國專利第4,8 1 6,5 67號以及 Morrison, 1 985，Science 229:1 202-07 〇 “中和性抗體”或“抑制性抗體”是指會抑制PAR-2的蛋 白酵素分解活化的抗體，當抗-PAR-2抗體過量，使用如本文 實施例所述那些分析會降低活化量至少約20%。又在許多具 體例中，抗原結合蛋白降低PAR-2的蛋白酵素分解活化量至 少 3 0%、40%、5 0% ' 6 0% > 7 0%、8 0%、85%、90%、95%、 9 7%、9 9 % 及 9 9.9% ° 抗體之片段或類似物能經由所屬領域具有通常知識者 依照本説明書之教不及使用技藝熟知之技術輕易製備。片段 或類似物之較佳胺基-及羧基-末端出現在靠近功能性功能 部位的邊界。結構性及功能性功能部位能經由比對核苷酸及 /或胺基酸序列數據與公用或私有之序列資料庫來鑑定之。 電腦化之比對方法能用於鑑定出現在其他蛋白質已知結構 及/或功能之序列模體（motif)或預料之蛋白質構形功能部 位。摺疊爲已知三維結構之蛋白質序列的鑑定方法是已知 的。參閱，例如 Bowie ei α/·，1991，《Science 253 : 164。 “CDR移植之抗體”是一抗體含有一個或一個以上衍生 自特殊物種或同型物抗體之CDR以及相同或不同物種或同 型物之另一抗體的骨架。 “多專一性抗體”是一抗體可辨認一個或一個以上的抗 原上之一個以上的抗原決定基（epitope)。此型抗體之亞型是 一“雙專一性抗體”，可辨認相同或不同抗原上之兩不同的抗 原決定基。 -21- 200909447 若其結合至該抗原是以1 nM或更少之解離常數，則抗 原結合蛋白“專一結合”至一抗原（例如人類PAR-2)。 “抗原結合功能部位”、“抗原結合區域，，或“抗原結合位 置”是抗原結合蛋白的一部分，含有與抗原交互作用及提供 該抗原結合蛋白專一性與對抗原之親和力的胺基酸殘基（或 其他部分）。對於專一結合至其抗原之抗體，此將包括至少 其CDR功能部位之一的至少一部分。 “抗原決定基”是一分子經由抗原結合蛋白（例如經由抗 體）結合之部分。抗原決定基能含有分子之非連續部分（例如 在一多胜肽中，胺基酸殘基在多胜肽一級序列中不連續，但 在整個多胜肽的三級和四級結構中接近到足以彼此經由抗 原結合蛋白結合）。 兩多核苷酸或兩多胜肽序列之“同一性百分比”是使用 GAP 電腦程式（GCG Wisconsin Package，version 10.3 (Accelrys，San Diego，CA)之一部分），使用其預設參數經 由比對序列來決定。 用語“多核苷酸”、“寡核苷酸”及“核酸”在全文可交互使 用且包括DNA分子（例如cDNA或基因體DNA)，RNA分子 (例如mRNA)，使用核苷酸類似物（例如，胜肽核酸及非天然 存在之核苷酸類似物）所產生之DNA或RNA的類似物，及其 雜化物（hybrids)。核酸分子能爲單股或雙股。在一具體例 中，本發明之核酸分子含有編碼本發明抗體或其片段、衍生 物、突變蛋白或變異體之連續的開放譯讀架（open reading f r am e ) ° -22 - 200909447 如果兩單股多核苷酸的序列在平行反方向能對齊 (aligned)以至一多核苷酸中每一核苷酸在其互補核苷酸位 於另一多核苷酸之對面，無間隔導入且在任一序列的5 ’或3 ’ 末端無未配對核苷酸’則兩單股多核苷酸是彼此“互補”。若 兩多核苷酸在中度嚴格條件下（moderately stringent conditions)能雜化到另一者’則—多核苷酸是“互補”於另一 多核苷酸。因此，一多核苷酸能互補於非其互補體之另一多 核苷酸。 “載體”是一核酸能用於將其連接的另一核酸導入細 胞。載體之一類型是“質體”，其是指一線型或環型雙股DN A 分子，額外的核酸節段能連接（ligate)於其中。載體的另一類 型是病毒載體（例如複製缺陷反轉錄病毒（rePlication defective retroviruses)，腺病毒以及腺相關病毒 (adeno-associated viruses))，其中額外的DNA節段能導入病 毒基因體中。某些載體能於其所導入之宿主細胞中自主的複 製（例如，含有細菌的複製起點之細菌載體以及附加型哺乳 動物細胞載體（episomal mammalian vectors))。其他載體（例 如非附加型哺乳動物細胞載體）隨導入宿主細胞時整合到宿 主細胞的基因體，並藉此隨宿主基因體複製。“表現載體”是 載體的一種，能指揮所選多核苷酸的表現。 核苷酸序列是“可操作地連接（operably linked)”到一調 節序列，若該調節序列影響該核苷酸序列的表現（例如表現 的程度、時點或位置）。“調節序列”是一核酸能影響對其可 操作地連接之核酸的表現（例如表現的程度、時點或位置）。 -23 - 200909447 調節序列，例如能直接在所調節之核酸發揮其作用，或透過 一個或一個以上其他分子的作用（例如，結合至調節序列及/ 或核酸之多胜肽）。調節序列之實例包括啓動子（promoter)， 增強子（e n h a n c e r)及其他表現控制要素（例如，聚腺苷酸化作 用訊息）。進一步之調節序列實例敘述於例如Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press,

San Diego, CA and Baron ei a/., 1995, jVwc/eic dcz·^ Λα. 23:3605 - 06。 “宿主細胞”是能用於表現核酸（例如本發明之核酸）之 細胞。宿主細胞能爲原核細胞’例如大腸桿菌（£. co/〇，或 能爲真核細胞，例如單細胞真核細胞（例如酵母菌或其他真 菌），植物細胞（例如菸草或蕃茄植物細胞），動物細胞（例如 人類細胞，猴子細胞，倉鼠細胞，大鼠細胞，小鼠細胞或昆 蟲細胞）或融合瘤。宿主細胞的實例包括猴腎細胞COS-7細 胞系（ATCC CRL 1 65 1)(參閱 Gluzman e，W.，1981，CW/ 23 : 175)，L 細胞，C127細胞，3T3細胞（ATCC CCL 163)，中國倉鼠卵 巢（CH0)細胞或其衍生物’例如Veggie CHO及相關之細胞 系，其生長於無血清培養基（參閱 Rasmussen et al·，1998, Cytotechnology 28:31)或 CHO 細胞株 DX-B 1 1，其爲 DHFR 缺乏（參 閱 Urlaub et al·，1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 ·· 4216-20)，HeLa 細 胞，BHK(ATCC CRL 10)細胞系，衍生自非洲綠猴腎細胞系 CV1( ATCC CCL 70)之 CV1/EBNA 細胞系（參閱 McMahan “以·， 1991，J. 10 : 2821)，人類胚胎腎細胞例如 293，293 ΕΒΝΑ 或MSR 293，人類表皮Α431細胞，人類C〇1〇205細胞’其 他轉形之靈長類細胞系’正常二倍體細胞’衍生自原始組織 -24 - 200909447 活體外培養之細胞株，原始移植體（Primary exPlants)， HL-60，U937，HaK或Jurkat細胞。典型的宿主細胞是經培 養細胞，能經編碼多胜肽之核酸轉形或轉染，然後該核酸能 表現於宿主細胞。“重組宿主細胞”一詞能用於表示一宿主細 胞已經由將表現之核酸轉形或轉染。宿主細胞也能是含有核 酸之細胞，該核酸不以所欲程度表現，除非調節序列導入宿 主細胞以至其變得可操作地連接該核酸。須知用語宿主細胞 不僅指特定對象細胞，也指如此細胞之後代或可能的後代。 因某些修飾由於例如突變或環境影響可出現於後繼世代，如 此後代實際上可能不相同於親代細胞，但仍包括在本文使用 之用語範圍內。 PAR-2 如前所討論，PAR-2是七跨膜G-偶合受體超級家族的 成員；最初由N終端的蛋白酵素切割形成束縛配體（tethered ligand)活化。人類PAR-2的核苷酸及胺基酸序列示於SEQ ID NO S:1以及2 ;小鼠PAR-2的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 3 以及大鼠PAR-2的胺基酸序列示於SEQ ID NO :4。蛋白酵素 切割產生此受體的活化型，其於本文中可交互稱爲“經切割 (cleaved)” 或“經修剪（clipped)” PAR-2。 抗原結合蛋白 在一方面，本發明提供結合至PAR-2之抗原結合蛋白 (例如抗體，抗體片段，抗體衍生物，抗體突變蛋白，以及 抗體變異體），例如人類PAR-2。 根據本發明之抗原結合蛋白包括抑制p A R - 2生物活性 -25 - 200909447 之抗原結合蛋白。此等生物活性之實例包括G -蛋白偶合受 體仲介的共同訊息傳遞路徑之活化，例如肌醇1,4,5-三磷酸 製造以及Ca(2 + )的移動，以及多種激酶路徑，包括ERK、 P38MAPK、JNK以及IKK。其他生物活性包括活體內PAR-2 仲介者，例如創傷以及發炎反應；特別是PAR-2涉及心血 管、肺以及胃腸系統，此處其控制發炎及傷害感受覺 (nociception)(疼痛的感覺）。PAR-2活化也在發炎反應扮演 角色，其慢性活化能導致疾病症狀。 不同的抗原結合蛋白可結合至P A R - 2的不同功能部位 或抗原決定基或由不同的作周機制作周=實例包括但不限爲 妨礙PAR-2的蛋白酵素分解活化或抑制訊息傳遞之抗原結 合蛋白。作用位置可能爲例如細胞內（例如經由妨礙細胞內 傳訊息一連串系列）或細胞外。抗原結合蛋白不需完全抑制 PAR-2誘發的活性以提供本發明之用途；的確，降低PAR-2 特定活性之抗原結合蛋白也被考慮使用。（本文中討論之結 合PAR-2之抗原結合蛋白於治療特定疾病之作用的特定機 制，僅爲舉例說明，且文中描述之方法不因此受約束）。 在本發明範圍內之抗-PAR-2抗體的其他衍生物包括 抗-PAR-2抗體或其片段與其他蛋白質或多胜狀之共價或聚 集共軛物’例如經由表現含有異質多胜肽接合至抗-PAR-2 抗體多胜肽N-末端或C-末端之重組的接合蛋白。舉例而 言，共軛之胜肽可爲異質訊息（或前導（leader))多胜肽’例 如酵母菌α -因子前導（a-fact〇rleader)，或胜狀例如抗原決 定基標籤。含抗原結合蛋白之接合蛋白能含有添加以促進 -26 - 200909447 抗原結合蛋白純化或鑑定之胜肽（例如聚-組胺酸）。抗原結 合蛋白也能連接到如欽述於Ηορρ βί α/., 6:1204，1988以及美國專利第5,011,912號之FLAG®胜肽 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)(SEQ ID NO : 7)。 FLAG®胜肽具高度抗原性且提供經專一單株抗體（mAb)可逆 地結合之抗原決定基，能快速分析及易於純化所表現之重組 蛋白質。可用於製備接合蛋白（其中FLAG®胜肽接合到所給 多胜肽）之試劑可獲自市售商品（Sigma-Aldrich, St. Louis MO)。 含一個或一個以上抗原結合蛋白之寡聚物可運用於作 爲PAR-2拮抗劑。寡聚物可爲共價連接或非共價連接之二聚 體，三聚體，或更高的寡聚物之形式。含有兩個或兩個以上 抗原結合蛋白之寡聚物的一實例是計畫以同質二聚體使 用。其他寡聚物包括異質二聚體，同質三聚體，雜質三聚體， 同質四聚體，雜質四聚體等等。 一具體例是針對寡聚物，其含有透過接合到該抗原結合 蛋白之胜肽部分間共價或非共價交互作用連結之多抗原結 合蛋白。此等胜肽可爲胜肽連接體（spacers)或具有促進寡聚 物化作用之胜肽。白胺酸拉鍊結構及衍生自抗體的某些多胜 肽是在能促進附著於抗原結合蛋白的寡聚物化作用之胜肽 中，詳細如下所述。 在特定具體例中，寡聚物含有二到四個抗原結合蛋白。 該寡聚物之抗原結合蛋白可爲任何形式，例如上述之任何形 式，例如變異體或片段。較佳爲寡聚物含有具有PAR-2結合 活性之抗原結合蛋白。 -27 - 200909447 在一具體例中，寡聚物是使用衍生自免疫球蛋白之多胜 肽製備。含有某些異質多胜肽接合到抗體衍生之多胜肽各種 部分（包括Fc功能部位）之接合蛋白的製備，已敘述於例如 Ashkenazi et al., 1991 - PNAS USA 88 ： 10535 ； Byrn et al., 1990 - Nature 344 ： 677 ； 以及 Hollenbaugh et al.，1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins"，in Current Protocols in Immunology，Suppl. 4，pages 10.19.1 - 10.19.11。 本發明之一具體例是針對經由接合抗-PAR-2抗體之 PAR-2結合片段至抗體Fc區域所產生之含有兩接合蛋白之 二聚體。該二聚體之製造能經由例如插入一編碼該接合蛋白 之基因接合體至適當的表現載體，在以重組表現載體轉形之 宿主細胞中表現該基因接合體，並使所表現之接合蛋白裝配 更像抗體分子，於是F c部分間形成鏈間二硫鍵以產生二聚 體。 文中使用之用語“Fc多胜肽”包括衍生自抗體Fc區域之 多胜肽之天然及突變蛋白形式。也包括含有促進二聚體化之 樞紐區之此等多肽的截頭形式（truncated forms)。含有Fc部 分（以及從其形成之寡聚物）之接合蛋白提供以親和力色層 分析經蛋白質A或蛋白質G管柱易於純化之優點。 敘述於PCT申請案WO 93/10151(特此倂入參考）之一適 當的Fc多胜肽，是單鏈多胜肽從人類IgGl抗體Fc區域之 N-末端樞紐區延伸至天然C-末端。另一可用Fc多胜肽是Fc 突變蛋白，敘述於美國專利第5,45 7,03 5號及Baum Η α/.， 1994，EMBO J. 13: 3992-4001。此突變蛋白之胺基酸序列 相同於WO 93/10151所示之天然Fc序列，除胺基酸19已從 -28 - 200909447

Leu改爲Ala ’胺基酸20已從Leu改爲Glu ’以及胺基酸22 已從Gly改爲Ala除外。突變蛋白對Fc受器展現降低的親 和力。 在其他具體例中，抗-PAR-2抗體之重鏈及/或輕鏈的可 變部分可替換抗體重鏈及/或輕鏈的可變部分。 此外，寡聚物是含有多抗原結合蛋白及含或不含胜肽連 接體（spacer peptides)之接合蛋白。適宜之胜肽連接體爲美 國專利第4,751，180及4,935,233號所述者。 寡聚物抗原結合蛋白之另一製備方法包括使用白胺酸 拉鍊結構。白胺酸拉錬結構功能部位是促進該結搆所存在之 蛋白質寡聚物化之胜肽。白胺酸拉鍊結構原始於數種DN A-結合蛋白中被識別（Landschulz ei α/., 1988，Science 240: 1759)，並自此於各種不同的蛋白質中被發現。已知的白胺 酸拉鍊結構爲天然存在之二聚體化或三聚體化之胜肽及其 衍生物。適合用於製造可溶寡聚物蛋白之白胺酸拉鍊結構功 能部位的實例敘述於PCT申請案WO 94/ 1 03 08，以及衍生自 肺表面張力蛋白質D(SPD)之白胺酸拉鍊敘述於Hoppe^a/., 1 994，FEB S Letters 3 44 : 1 9 1，特此倂入參考。使用經修飾 白胺酸拉鍊結構，使接合至它的異質蛋白質能穩定三聚體化 者’欽述於 Fanslow ei α/., 1994，Semin. Immunol. 6: 267-7 8。在一方法中，含有抗-PAR-2抗體片段或接合到白胺 酸拉鍊結構胜肽之衍生物的重組接合蛋白，表現於適當宿主 細胞中，且從培養的上清液回收可溶性寡聚物抗-PAR-2抗體 片段或形成之衍生物。 -29 - 200909447 在一方面，本發明提供抗原結合蛋白質，能妨礙PAR-2 的蛋白酵素分解活化。能製作此等抗原結合蛋白對抗 PAR-2 ’或其片段、變異體或衍生物，並於慣用分析法中篩 選能妨礙P A R - 2的蛋白酵素分解活化者。適合的分析實例爲 測試該抗原結合蛋白抑制細胞表現PAR-2的蛋白酵素分解 活化能力之分析，或測試抗原結合蛋白降低因細胞表面 PAR-2受體的蛋白酵素分解活化所產生之生物或細胞反應的 能力。測試抗原結合蛋白之額外分析，包括定性或定量比較 抗原結合蛋白對全長、未切割之PAR-2多胜肽的結合與對經 蛋白酵素分解切割之PAR- 2多胜肽的結合，其數個實例揭示 於本文中。 在另一具體例中，本發明提供結合至經切割之PAR-2 以及未切割之PAR-2二者之抗原結合蛋白。此等抗原結合蛋 白能以慣用分析法，例如以上所述者製作及篩選。 在另一方面’本發明提供一種抗原結合蛋白，證實有物 種選擇性。在一具體例中，抗原結合蛋白結合至一種或一種 以上哺乳動物PAR-2，例如結合至人類PAR-2以及一種或一 種以上小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、貓、兔子、狗、 山羊、綿羊、牛、馬、駱駝以及非人類之靈長類PAR-2。在 另一具體例中’抗原結合蛋白結合至一種或一種以上靈長類 動物PAR-2 ’例如結合至人類pAR_2以及一種或一種以上食 蟹獼猴、滅猴（marmoset)、恒河猴（rhesus)以及黑獲猩 PAR-2。在另一具體例中’抗原結合蛋白專一結合至人類、 食蟹獼猴、狨猴、恆河猴或黑猩猩PAR- 2。在另一具體例中， -30- 200909447 抗原結合蛋白不結合至一種或一種以上小鼠、大鼠、天竺 鼠、倉鼠、沙鼠、貓、兔子、狗、山羊、綿羊、牛、馬、駱 駝以及非人類之靈長類PAR-2。在另一具體例中，抗原結合 蛋白不結合至新世界猴種，例如狨猴。 在另一具體例中，抗原結合蛋白不展現專一結合至 PAR_2以外的任何天然存在之蛋白質。在另一具體例中，抗 原結合蛋白不展現專一結合至哺乳動物PAR_2以外的任何 天然存在之蛋白質。在另一具體例中，抗原結合蛋白不展現 專一結合至靈長類動物PAR-2以外的任何天然存在之蛋白 質。在另一具體例中，抗原結合蛋白不展現專一結合至人類 PAR-2以外的任何天然存在之蛋白質。在另一具體例中，抗 原結合蛋白專一結合小鼠、大鼠、食蟹獼猴以及人類PAR-2。 在另一具體例中，抗原結合蛋白以類似的結合親和力專一結 合小鼠、大鼠、食蟹獼猴以及人類PAR-2。在另一具體例中， 抗原結合蛋白阻斷蛋白酵素分解活化之小鼠、大鼠、食蟹獼 猴以及人類PAR-2的結合。在另一具體例中，抗原結合蛋白 在Ca2 +移動分析中具有類似IC5Q對抗小鼠、大鼠、食蟹獼 猴以及人類PAR-2。 測定抗原結合蛋白對PAR_2之選擇性，可使用技藝熟 知的方法以及依照本說明書之教示。例如，可使用西方點墨 法（Western blot)、FACS、ELIS A 或 RIA 測定選擇性。 在另一方面，本發明提供一種結合PAR-2之抗原結合 蛋白（例如抗- PAR-2抗體），其具有一種或一種以上下列特 徵：皆可結合至人類以及小鼠PAR-2，抑制人類PAR-2的蛋 200909447 白酵素分解活化，抑制小鼠PAR-2的蛋白酵素分解活化，結 合至或接近PAR-2的蛋白酵素切割位置，引起相當小之細胞 表面所表現PAR-2的下降調節（down-regulation)。 本發明抗原結合蛋白之抗原結合片段可由慣用技術產 生。此等片段之實例包括但不限爲Fab及F(ab’）2片段。以 遺傳工程技術製造之抗體片段及衍生物也考慮其中。 額外的具體例包括嵌合型抗體，例如非人類（例如鼠科 動物）單株抗體之人類化形式。此等人類化抗體可由已知技 術製備，並當投與抗體到人類時給予降低免疫原性之優點。 在一具體例中，人類化單株抗體含有鼠科動物抗體的可變功 能部位（或其抗原結合位置全部或部分）以及衍生自人類抗 體之恆定功能部位。另外，人類化抗體片段可含有鼠科動物 單株抗體之抗原結合位置以及衍生自人類抗體之可變功能 部位片段（缺乏抗原結合位置）。製造嵌合型之程序及進一步 加工之單株抗體包括那些敘述於Riechmann ei α/., 1988, Nature 332:323, Liu et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3439, Larrick et al., 1989, Bio/Technology 7:934，以及 Winter a/·，1993，TIPS 14 : 139。在 一具體例中，該嵌合型抗體是CDR移植之抗體。人類化抗 體之技術討論於，例如美國專利申請案第1 0/1 94,975號（公 開於2003年2月27日），美國專利第5,869,619, 5,225,539, 5,82 1,3 3 7 > 5,8 59,205 > Padlan et al., 1 995 * FASEB J. 9 ： 1 3 3 -3 9 ’ 以及 Tamura ei a/·, 2000，J. Immunol. 164 : 1432-41 ° 於非人類動物中已硏發產生人類或部分人類抗體之程 -32 - 200909447 序。例如經由各種方法已製備具一個或一個以上內生性免疫 球蛋白基因之小鼠。人類免疫球蛋白基因已被導入小鼠中取 代去活性小鼠基因。動物中製造之抗體倂入由導入動物之人 類基因材料編碼之人類免疫球蛋白多胜肽鏈。在一具體例 中，以PAR-2多胜肽免疫非人類動物（例如基因轉殖老鼠）， 以致於動物中產生指向對抗PAR-2多胜肽之抗體。適宜的免 疫原之一實例爲可溶性人類PAR_2，例如含有PAR-2之蛋白 酵素切割位置之多胜肽或PAR-2的其他免疫原性片段。適宜 的免疫原之另一實例爲表現高程度PAR- 2的細胞，或其細胞 膜製備物。 製造技術及使用基因轉殖動物製造人類或部分人類抗 體之實例敘述於美國專利第 5,814,318，5,5 69,825及 5,545,806 號'Davis et al., 2003, Production of Human antibodies from transgenic mice in Lo, ed. Antibody Engineering: Methods and Protocols, Human a Press, NJ:191-200 ； Kellermann et aL, 2002, Curr Opin Biotechnol. 13:593-97 ； Russel et al., 2000, Infect Immun. 68:1820-26 ； Gallo et aL, 2000, Eur J Immun. 30:534-40 ； Davis et al., 1999, Cancer Metastasis Rev. 18:421-25 ； Green, 1999, J Immunol Methods. 231:11-23 ； Jakobovits, 1998, Adv Drug Deliv Rev 31:33-42 ； Green et aL, 1998, J Exp Med. 188:483-95 ； Jakobovits A, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs. 7:607-14 ； Tsuda et al., 1997, Genomics 42:413-21 I Mendez et al., 1997, Nat Genet. 15:146-56 ； Jakobovits, 1994? Curr Biol. 4:761-63 ； Arbones et aL, 1994, Immunity. 1:247-60: Green et aL, 1994, Nat Genet. 7:13-21 ； Jakobovits et aL, 1993, Nature 362:255-58 ； Jakobovits et aL, 1993, Proc Natl Acad Sci U S A. 90:2551-55； Chen, J. et al.5 200909447 1993? lnt Immunol 5: 647-656 i Choi et al., 1993, Nature Genetics 4: 117-23 i Fishwild et al., 1996? 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Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988)。 技藝已知的任何表現系統能用於製造本發明之重組多 胜肽。一般言之，宿主細胞是經含有編碼所欲多胜肽之DN A 的重組表現載體轉形。宿主細胞中可利用者爲原核細胞，酵 母菌或更高等的真核細胞。原核細胞包括格蘭氏陰性或格蘭 氏陽性微生物，例如大腸桿菌（£. c〇//)或桿菌（Bad///)。更 高等的真核細胞包括昆蟲細胞及哺乳動物來源建立之細胞 系。適當哺乳動物宿主細胞系之實例包括猴腎細胞COS-7 ^ (ATCC CRL 1 65 1 )(Gluzman et al., 1981 - Cell 23 ： 175)，

L 細胞，293 細胞，C127 細胞，3T3 細胞（ATCC CCL 163)， 中國倉鼠卵巢（CHO)細胞，HeLa細胞，BHK(ATCC CRL 10) 細胞系，以及衍生自非洲綠猴腎細胞系CVI之CVI/EBNA 細胞系（ATCC CCL 70)，敘述如 McMahan ei α/., 1991，EMBO J. 1 0 : 282 1。用於細菌，真菌，酵母菌及哺乳動物細胞宿主 之合適的選殖及表現載體敘述於Pouwels以a/. Feciorr J

Elsevier，New York, 1985)。 經轉形細胞能於促進多胜肽表現之條件下培養，並以慣 用蛋白質純化程序回收多胜肽。此等純化程序之一包括使用 親和性色層分析，例如通過具有全部或部分（例如細胞外功 能部位）之PAR-2結合於其上之基質。本文中考慮使用之多 胜肽包括實質均一的重組哺乳動物抗-PAR-2抗體多胜肽，其 -38 - 200909447 實質不含污染之內生性物質。 可爲所欲特性經由數種已知技術製備及篩選抗原結合 蛋白。某些技術涉及單離編碼感興趣抗原結合蛋白（例如抗 -PAR-2抗體）之多胜肽鏈（或其部分）的核酸，並透過重組 DNA技術操作該核酸。舉例而言，該核酸可被接合到另一感 興趣的核酸，或經改變（例如，經由突變作用或其他慣用技 術）以添加、刪除或取代一個或一個以上胺基酸殘基。 在一方面，本發明提供本發明抗-PAR-2抗體之抗原結 合片段。此等片段能完全由抗體衍生之序列組成或能含有額 外序列。抗原結合片段之實例包括F a b，F (a b ’）2，單鍵抗體， 雙鏈抗體，三鏈抗體，四鏈抗體，以及功能部位抗體。其他 實例提供於 Lunde ei α/.，2002，Biochem. Soc. Trans. 30 : 500-06。 單鏈抗體可透過胺基酸橋（短胜肽連接體）經由連接重 鏈及輕鏈可變功能部位（Fv區域）片段而形成，導致單一多胜 肽鏈。此等單鏈Fvs(SCFVS)已於編碼兩可變功能部位多胜肽 (VL及VH)之DNA間經由接合編碼胜肽連接體之DNA來製 造。所得多胜肽能自行摺疊回去以形成抗原結合單體，或他 們能形成多聚物（例如，二聚體，三聚體，或四聚體），視兩 可變功能部位間之可彎曲連接體的長度而異（Kom et al.，1997,

Prot. Eng. 10 : 423 ; Kortt et al.，2001，Biomol. Eng. 18 : 95-108)。經由組 合不同之含v L及V H的多胜肽，有一者能形成結合不同抗原 決定基之多聚物型 scFvs(Kriangkum ei αΛ, 2001，18 : 31-40)。製造單鏈抗體已硏發之技術包括那些敘述於美國專利 第 4,946,778 號；Bird, 1988, Science 242:423; Huston 1988, Proc. -39 - 200909447

Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et a/., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87。 本發明之抗原結合蛋白（例如抗體，抗體片段及抗體衍 生物）能含有技藝已知的任何恆定區域。輕鏈恆定區域能 爲，例如κ-或λ-型輕鏈恆定區域，例如，人類κ-或λ-型輕 鍵恒疋區域。重鍵恒定區域能爲，例如α -、δ -、ε -、γ -或μ -型重鏈恆定區域，例如人類α-、δ-、ε-、γ-或μ-型重鏈恆定 區域。在一具體例中，該輕鏈或重鏈恆定區域是天然存在之 恆定區域的片段，衍生物，變異體，或突變蛋白。 從感興趣抗體衍生不同亞型或同型物抗體的技術是已 知的’亦即，亞型交換（subclass switching)。因此例如IgG 抗體可衍生自IgM抗體，反之亦然。此等技術使新抗體的製 備具有所給抗體（親代抗體）之抗原結合特性，但也展現與抗 體同型物或不同於親代抗體之亞型有關之生物特性。可運用 重組DNA技術。編碼特殊抗體多胜肽之經選殖DNA可用於 此等程序中，例如，編碼所欲同型物抗體恆定功能部位之 DNA。亦參閱 Lantto e，α/_, 2002, Methods Mol_ Biol. 178:303-16。再 者’若IgG4爲所欲，其亦可視需要導入點突變（CPSCP -> CPPCP)於樞紐區，如 Bloom ei <3厂，1997, Pro fez· n 5c iewce 6:407所述’倂入本文參考）以減輕能導致IgG4抗體異源性 之內部-Η鏈二硫鍵形成的傾向。 再者’用於衍生具有不同性質（亦即改變對他們要結合 之抗原的親和力）之抗原結合蛋白的技術也已知悉。此等技 術之一稱爲鏈改組（chain shuffling)，涉及展現免疫球蛋白可 -40 - 200909447 變功能部位基因庫於絲狀細菌噬菌體的表面，通常稱爲噬菌 體展現（phage display)。鏈改組已被用於製備對半抗原2-苯 基曙哩-5-酮（hapten 2-phenyloxazol-5-one)具高親和力之抗 體，敘述如 Marks et al·, 1992，BioTechnology，10:779。 在特別之具體例中，本發明之抗原結合蛋白具有對 PAR-2之結合親和力（Ka)至少106。在其他具體例中，抗原 結合蛋白展現至少1〇7、至少1〇8、至少109、至少1〇1()之 Ka。在另一具體例中，抗原結合蛋白展現之Ka實質相同於 文中實施例所述抗體之Ka。 在另一具體例中，本發明提供一種抗原結合蛋白，具有 低解離速率自PAR-2。在一具體例中，抗原結合蛋白具有 lxl 0 — 4 s — 1或更低之K。^。在另一具體例中，κ。^是5Xl〇-5 s —1 或更低。在另一具體例中，Κ。^實質相同於文中實施例所述 抗體之Κ。^。在另一具體例中，抗原結合蛋白以實質相同於 文中實施例所述抗體之K。^結合至PAR-2。 在另一方面’本發明提供一種抑制PAR-2活性（例如 Ca2 +移動）之抗原結合蛋白。在一具體例中，抗原結合蛋白 具有ΙΟΟΟηΜ或更低之IC5〇。在另一具體例中，ic5〇爲ΙΟΟηΜ 或更低：在另一具體例中，IC5G爲10nM或更低。在另一具 體例中’ 1C5 〇實質相同於文中實施例所述抗體之IC5Q。在另 一具體例中，抗原結合蛋白以實質相同於文中實施例所述抗 體之IC5Q抑制PAR-2的活性。 在另一具體例中’本發明提供一種結合至全長par-2 以及較小程度結合至經切割PAR-2之抗原結合蛋白。在各種 200909447 具體例中，該抗原結合蛋白結合至全長PAR- 2比其結合至經 切割 PAR-2 超過至少 30%、40%、50%、60%、70%、75%、 8 0% ' 8 5%、9 0% > 95%、9 7%、99%及 9 9.9% ° 在另一方面，本發明提供一種結合在或接近人類PAR-2 之蛋白酶切割位置之抗原結合蛋白。在一具體例中，抗原結 合蛋白結合切割位置的下游（亦即結合全長及截頭胺基終端 PAR-2-Fc二者）；反之在另一具體例中，抗原結合蛋白結合 切割位置的上游（亦即只結合全長PAR-2/Fc)。結合至蛋白酶 切割位置之抗原結合蛋白，能使用技藝已知的任何技術產 生。舉例而言，此等抗原結合蛋白能使用全長PAR-2多胜肽 (例如於結合膜之製備物）、PAR-2之可溶性細胞外功能部位 片段、或含有或由蛋白酶切割位置所組成PAR-2細胞外功能 部位之較小片段（其實例提供於本文中）來單離。如此單離之 抗原結合蛋白能使用任何技藝已知方法，經篩選以決定他們 的結合專一性（其實例提供於本文中）。 在另一具體例中’本發明提供一種抗原結合蛋白，與文 中揭示之抗體競爭結合至PAR-2。此等競爭力能以技藝已熟 知的方法決定，例如在西方點墨法（或另一基於胜肽之分析） 中經由競爭結合至PAR-2/Fc，或於文中敘述之Ca2+流動分 析中經由競爭作用。在一方面，與文中揭示之抗體競爭結合 至PAR-2之抗原結合蛋白’與該抗體結合相同的抗原決定 基。在另一方面’與文中揭示之抗體競爭結合至PAR-2之抗 原結合蛋白’抑制PAR-2的蛋白酵素分解活化。 在另一方面’本發明提供一種結合至表現於細胞表面的 -42- 200909447 人類PAR-2之抗原結合蛋白，且當其結合時抑制細胞中 PAR-2傳訊號活性而未造成細胞表面的PAR-2含量顯著降 低。可使用決定或估計細胞表面及/或內部之PAR-2含量的 任何方法。在一具體例中，本發明提供一種抗原結合蛋白， 其結合至或接近表現於細胞表面的人類PAR-2之蛋白酶切 割位置，且當其結合時抑制細胞中PAR-2傳訊號活性而未造 成來自細胞表面的PAR-2內化率顯著增加。在另一具體例 中’抗原結合蛋白結合至表現PAR-2的細胞，造成少於約 / - 7 5%、50%、40%、30% ' 20%、15%、10%、5% ' 1 % 或 0.1% 的細胞表面PAR-2將被內化。 在另一方面，本發明提供一種在活體外或活體內（例如 投與至人類患者時）具有至少一天半衰期之抗原結合蛋白。 在一具體例中，抗原結合蛋白具有至少三天半衰期。在另一 具體例中’抗原結合蛋白具有四天或更長的半衰期。在另一 具體例中’抗原結合蛋白具有八天或更長的半衰期。在另一 具體例中’抗原結合蛋白經衍生或修飾，使其相較於未經衍 生或未經修飾的抗原結合蛋白具有更長的半衰期。在另一具 體例中，抗原結合蛋白含有一個或一個以上點突變來增加血 清半衰期，例如敘述於公開在2000年2月24日之WO 00/09560，其倂入本文參考。 本發明進一步提供多專一性抗原結合蛋白，例如雙專一 性抗原結合蛋白’例如透過兩個不同抗原結合位置或區域結 合至兩個不同PAR-2抗原決定基’或結合至一paR-2抗原決 定基及另一分子之抗原決定基抗原結合蛋白。再者，如文中 -43 - 200909447 所述之雙專一性抗原結合蛋白能含有一來自文中所述抗體 之一的PAR - 2結合位置以及一來自另—文中所述抗體之第 一 PAR-2結合區域’包括文中所述那些渉及其他公開者。另 外，雙專一性抗原結合蛋白可含有一來自文中所述抗體之一 的抗原結合位置以及一來自另一習知PAR_2抗體之第二抗 原結合位置、或來自經由已知方法或文中所述方法製備之抗 體。 該技藝已知許多製備抗體的方法並討論於2001年4月 20日申請之美國專利申請案第09/83 9,63 2號（倂入本文參 考）。此等方法包括使用雜種-融合瘤，敘述於M i 1 s t e i n e i a /.， 1 9 8 3，Nature 3 05:5 3 7以及其他（美國專利第4,474,8 93號， 美國專利第6，1 06,83 3號）；以及抗體片段的化學偶合 (Brennan et α/.,1 9 8 5, Science 229:8 1; Glennie et a/.,1 987, J. Immunol. 139:2367;美國專利第 6,010,902 號）。再者，可 透過重組方法製造抗體，例如經由使用白胺酸拉錬結構部分 Γ亦即來自Fos及Jun蛋白質，其較佳形成異二聚體；Kostelny eia/·，1992，J. Immnol. 148:1547)，或其他鎖及鑰匙相互作 用功能部位結構，敘述於美國專利第5,5 82,996號。額外可 用技術包括那些敘述於Kortt d a/., 1 997,同前，美國專利第 5,959,083號，美國專利第5,807,706號。 在另一方面，本發明之抗原結合蛋白包含抗體的衍生 物。該衍生之抗體可含有任何分子或物質給予抗體所欲性 質，例如於特定用途時增加半衰期。該衍生之抗體能含有’ 例如可偵測（或標記）部分（例如放射性、比色性、抗原性或酵 -44- 200909447 素性分子，可偵測珠（例如磁性或電密集（例如金）珠），或結 合至另一分子之分子（例如生物素或卵白素 (s t r e p t a v i d i η)))，治療或診斷部分（例如放射性、細胞毒性或 醫藥活性部分），或增加特定用途時抗體適合性的分子（例如 投與至患者，例如人類病患或其他活體內或活體外用途）。 能用於衍生抗體之分子的實例包括白蛋白（例如人類血清 白蛋白）以及聚乙二醇（PEG)。能使用技藝已熟知技術製備抗 體之白蛋白-連接及PEG化衍生物。在一具體例中，抗體共 軛或另外連接至甲狀腺運送蛋白（TTR)或TTR變異體。TTR 或TTR變異體能以例如選自葡聚糖、聚（η-乙烯基-2-吡咯 酮）、聚乙二醇、聚丙二醇同質聚合物、聚環氧丙烷/環氧乙 烷共聚物、聚氧乙基化多元醇類以及聚乙烯醇類所組群組之 化學劑經化學修飾。美國專利申請第20030 1 95 1 54號。 在另一方面，本發明提供使用本發明之抗原結合蛋白篩 選結合至PAR-2之分子的方法。可使用任何適合的篩選技 術。在一具體例中，本發明之抗原結合蛋白所結合之PAR-2 分子或其片段，是接觸本發明之抗原結合蛋白及另一分子， 其中結合至PAR-2之其他分子若可降低該抗原結合蛋白結 至PAR-2。能使用任何適宜的方法，例如ELISA偵測抗原結 合蛋白的結合。抗原結合蛋白結合至PAR-2的偵測能如上所 述經由可偵測性標記抗原結合蛋白而簡化。在另一具體例 中，結合PAR-2之分子進一步經分析以決定其是否抑制 PAR-2活化及/或傳訊號。 -45- 200909447 在一方面，本發明提供經單離之核酸分子。該核酸含有 例如編碼全部或部分抗原結合蛋白（例如本發明抗體之一或 兩鏈’或其片段、衍生物、突變蛋白或變異體）之多核苷酸， 足以用於作爲雜化探針之多核苷酸，用於鑑定、分析、突變 或增幅編碼多胜肽之多核苷酸之PCR引子或定序引子，抑制 多核苷酸表現之抗有意義核酸，以及前述的互補序列。該核 酸能爲任何長度。他們能爲例如5，10，1 5，20，25 ’ 30 ’ 35，40，45，50，75，100，125，150，175，200，250，300, 350， 400， 450， 500， 750， 1,000 1 1,500， 3,000， 5,000 或 以上之核苷酸長度，及/或能含有一個或一個以上額外序 列，例如調節序列，及/或爲較大核酸的部分，例如載體。 該核酸能爲單股或雙股，以及能含有RNA及/或DNA核苷 酸，及其人造變異體（例如胜肽核酸）。 編碼抗體多胜肽（例如’重鏈或輕鏈，僅可變功能部位’ 或全長）之核酸可單離自已被PAR-2免疫的小鼠B-細胞。該 核酸可經由慣用程序例如聚合酶鏈鎖反應（PCR)單離。 本發明進一步提供在特定雜化條件下雜化到其他核酸 之核酸。雜化核酸的方法爲技藝熟知。例如參閱Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6。如文中定義’中度嚴格雜化條件是使用

含 5X 氯化鈉 /檸檬酸鈉（ssc)、〇·5% SDS、U mM EDTA(pH 8.0 )之預洗液，約5 0 %甲醯胺、6X S S C之雜化緩衝液’以及 55。(：（或其他類似雜化液，例如含有約50%甲醯胺、具42°C 的雜化溫度）的雜化溫度，以及60乞於〇·5Χ ssc、o·1% SDS -46 - 200909447 之清洗條件。嚴格雜化條件是於6X SSC在45 °C雜化’隨後 在68°C於0.1X SSC、0.2% SDS清洗一次或一次以上。再者’ 熟習該項技藝者能操作雜化及/或清洗條件以增加或減少雜 化的嚴格度，以致含有核苷酸序列彼此至少65、70、75、80、 8 5、9 0、9 5、9 8或9 9 %相同的核酸通常仍雜化到彼此。影響 雜化條件選擇的基本參數及設計適宜條件的指南提出於’例 如 Sambrook，Fritsch，and Maniatis (1989，Molecular Cloning : A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，Ν·Υ.，chapters 9 and 11 ;以及 ί : 、 Current Protocols in Molecular Biology. 1995 ' Ausubel et ai9 eds. > John Wiley & Sons > Inc_ ’ sections 2.10 and 6.3-6.4)，且能輕易由所屬領域具有通常知識者 依據例如，DNA的長度及/或鹼基組成物來決定。 經由突變作用能將變化導入核酸，藉此導致其編碼的多 胜肽（例如抗原結合蛋白）胺基酸序列改變。使用技藝已知技 術能將突變導入。在一具體例中，一個或一個以上特定胺基 酸殘基是使用，例如指定位置之突變法來改變。在另一具體 例中，一個或一個以上隨機選擇之殘基是使用，例如隨機突 i V 變法來改變。然而其經製作，對於所欲性質（例如，結合至 PAR-2或阻斷PAR-2的蛋白酵素分解活化）之突變多胜肽能 被表現及篩選。 突變能導入核酸中而無需顯著改變其編碼之多胜肽的 生物活性。例如，能製造核苷酸取代造成胺基酸取代在非必 需胺基酸殘基。在一具體例中’一核苷酸序列或其所欲片 段、變異體或衍生物，經突變以至於其編碼的胺基酸序列含 有一個或一個以上胺基酸殘基的刪除或取代。在另一具體例 -47 - 200909447 中’突變作用插入胺基酸鄰接於一或一以上胺基酸殘基。另 外’ 一個或一個以上突變能導入核酸以選擇性改變其編碼之 多胜肽的生物活性（例如，PAR-2的結合、抑制PAR-2的蛋 白酵素分解活化等等）。例如，突變能定量或定性改變生物 活性。定量改變的實例包括增加、降低或消除活性。定性改 變的實例包括改變抗原結合蛋白的抗原專一性。 在另一方面’本發明提供核酸分子，其適用於作爲偵測 本發明核酸序列用之引子或雜化探針。本發明之核酸分子能 僅含有編碼本發明全長多胜肽之一部分的核酸序列，例如， 能用於作爲探針或引子之片段或編碼本發明多肽活性部分 (例如，PAR-2結合部分）之片段。 根據本發明之核酸序列的探針能用於偵測核酸或類似 核酸，例如編碼本發明多胜肽之轉錄體。該探針能含有一標 記基，例如放射性同位素、螢光化合物、酵素或酵素輔因子。 此等探針能用於鑑定表現該多胜肽之細胞。 在另一方面，本發明提供載體，含有編碼本發明多胜肽 或其一部分之核酸。載體之實例包括但不限爲質體，病毒載 體，非附加型哺乳動物載體及表現載體，例如重組表現載體。 本發明之重組表現載體能含有本發明之核酸以適於宿 主細胞中表現核酸之形式。重組表現載體包括一個或一個以 上基於宿主細胞可用於表現而選擇之調節序列，其爲可操作 地連接到欲表現之核酸序列。調節序列包括在許多種類宿主 細胞（例如，SV40早期基因增強子，勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus)啓動子以及巨細胞病毒啓動子）中主導核苷酸 -48 - 200909447 序列之組成型表現（constitutive expression)者，只於某些宿 主細胞主導核苷酸序列表現者（例如，組織專一調節序列， 參閱 Voss eί a /.，1 986，Trends Bi〇che m . Sci · 1 1 : 287， Maniatis et al ·，1987，Science 23 6 ： 1237，彼等以全文倂入 本文參考），以及對特別處理或條件反應主導核苷酸序列之 誘發表現者（例如，哺乳動物細胞之金屬硫蛋白 (metallothionin)啓動子以及原核及真核系統中之四環黴素 反應性及/或鏈黴素反應性啓動子）（參閱同前）。熟習該項技 藝者應知表現載體的設計能依此等因子決定作爲欲轉形之 宿主細胞、所欲蛋白質表現程度的選擇等等。本發明之表現 載體能導入宿主細胞藉此製造蛋白質或胜肽，包括由文中所 述核酸編碼之接合蛋白或胜肽。 在另一方面，本發明提供已導入本發明重組表現載體之 宿主細胞。宿主細胞能爲任何原核細胞（例如大腸桿菌（五. C〇//))或真核細胞（例如，酵母菌，昆蟲，或哺乳動物細胞（例 如，CHO細胞））。載體DNA能經由慣用轉形或轉染技術導 入原核或真核細胞。對於哺乳動物細胞的穩定轉染，已知隨 所用的表現載體及轉染技術，只有小部分的細胞可整合外來 DNA到其基因體中。爲鑑定及選擇這些整合體，通常與感興 趣基因一起導入編碼可篩選記號之基因（例如，抗生素之抗 性）至宿主細胞。較佳的可篩選記號包括那些對藥物具抗性 者，例如 G418，效高黴素（hygromycin)及甲氛蝶哈 (methotrexate)。在其他方法中，以導入的核酸穩定轉染之細 胞能經由藥物篩選來鑑定（例如，已倂入可篩選記號基因之 -49 - 200909447 細胞將存活，而其他細胞死亡）。 適應症 在一方面，本發明提供治療患者之方法。該方法能爲例 如對患者健康具有廣泛利益，例如能增加患者的預期壽命。 另外’該方法能爲例如治療、預防、治癒、減輕或改善（“治 療”）疾病，病症，疾病狀況或患病狀態（“症狀”）。根據本發 明欲治療的疾病狀況具有PAR-2不當表現或活性之特徵。在 某些此等疾病狀況中，該表現或活性程度太高，以及治療包 括投與文中所述之PAR_2拮抗劑。 以本發明之抗原結合蛋白可治療或可預防的專一醫學 症狀及疾病’包括胃腸系統的發炎情形，包括腹腔疾病， 克隆氏疾病（C r 〇 h η ’ s d i s e a s e);潰瘍性大腸炎；原發性胃輕 癱（idiopathic gastroparesis);胰臟炎，包括慢性胰臟炎； 發炎性腸道疾病及潰瘍’包括胃以及十二指腸潰瘍。本發 明之抗原結合蛋白也可用於治療或改善氣道的發炎情形， 例如氣喘（包括外因性及內因性氣喘以及氣道的相關慢性發 炎情形或過度反應）’慢性阻塞性肺部疾病（c〇PD，亦即慢 性支氣管炎’肺氣腫）’急性呼吸窘迫症候群（A R D s )，呼吸 窘迫症候群’囊腫纖維症’肺高血壓，肺血管收縮，急性 肺損傷’過敏性支氣管肺麹菌症（allergic brQnehQpuimQnafy aspergillosis)，過敏性肺炎，嗜伊紅性肺炎（e〇sin〇phiUc pneumonia) ’支氣管炎，過敏性支氣管炎支氣管擴張症，結 核病’過敏性肺發炎，職業性氣喘，類氣喘病症，肉狀瘤， 反應性呼吸道失能症候群’棉屑沈著病，間質性肺病，高嗜 -50 - 200909447 伊紅性症候群’鼻炎’竇炎以及寄生蟲性肺疾，病毒誘發有 關之氣道過度反應病症（例如，呼吸道融合病毒（RSV)，副流 行性感冒病毒（PIV)，鼻病毒（RV)以及腺病毒）。 可以本發明之抗原結合蛋白治療之風濕病，包括成人及 幼年型類風濕性關節炎；硬皮症；全身紅斑性狼瘡；類狼瘡 症候群；未分化型結締組織病；痛風；骨關節炎；風濕性多 發性肌痛症（polymyalgia rheumatica);血清陰性脊柱關節病 (seronegative spondylarthropathies)，包括僵直性脊椎炎， 以及賴特氏病（R e i t e r ’ s d i s e a s e ) ’牛皮廯性關節炎以及慢性 萊姆病關節炎（chronic Lyme arthritis)。以這些多胜肽佐可 治療或預防者爲史迪爾氏症候群（Still’s disease)以及類風 濕性關節炎有關之葡萄膜炎（uveitis associated with rheumatoid arthritis)。此外’本發明之多胜肽治療是用於治 療隨意肌及其他肌肉發炎導致的失調，包括皮肌炎，包涵體 肌炎（inclusion body myositis)，多發性肌炎，以及肺淋巴管 肌瘤病（lymphangioleimyomatosis)。本發明也可治療的其他 ( 〆、 失調，包括吉-巴氏症候群（Guillain-Barre disease)，第I型 糖尿病，葛瑞夫兹氏病（Graves’disease)，愛迪生氏症 (Addison’s disease)，雷諾氏現象（Raynaud’s phenomenon) (包括雷諾氏症以及雷諾氏症候群Raynaud’s syndrome)，自 體免疫性肝炎，GVHD(移植體對抗宿主疾病graft versus host disease)之類。 文中所述失調能以本發明之抗原結合蛋白組合其他細 胞激素、細胞激素抑制劑及試劑（本文中也稱爲免疫調節劑） -51- 200909447 來治療。舉例而言，免疫調節劑包括IL -1 8拮抗劑，例如可 溶性IL-18受體、對IL-18之抗體或IL-18受體、IL-18結合 蛋白；TNF抑制劑，包括ENBREL® ; IL-1抑制劑，包括第 I型IL -1 R之可溶性型、第11型IL - 1 R、對IL -1之抗體、對 第I型IL-1R之抗體；以及有效於治療所揭示之醫學症狀及 疾病之其他活性劑。 本發明之組成物及/或方法亦能用於，例如美容性治 療、獸醫的治療以增加壽命，治療生殖缺陷，以及治療各種 PAR-2有關的失調。此外，在某些此等症狀中，PAR-2的表 現或活性程度太低，則治療包括投與PAR-2激動劑（PAR-2 agonist);此等治療也包含於本文中。 治療方法及抗原結合蛋白的投與 文中提供之某些方法包括投與結合PAR-2之抗原結合 蛋白至患者，藉此降低PAR-2誘發之在特殊情況扮演角色的 生物反應。在特定具體例中，本發明之方法包括將內生性 PAR-2接觸結合PAR-2之抗原結合蛋白質，例如經由投與至 患者或以生體外（ex Wvo)程序。 用語“治療”包括減輕或預防至少一症狀或其他方面的 失調，或降低疾病嚴重性等等。抗原結合蛋白不需達到完全 的治癒或根絕每一症狀或疾病的表現以構成可行之治療 劑。如有關領域所認定’使用作爲治療劑之藥物可降低所給 疾病狀態之嚴重度，但不需徹底破壞疾病的每一表現則視爲 有用之治療劑。同樣的，預防性投與之治療不需完全有效預 防開始的症狀以構成可行的預防劑。純粹降低疾病的影響 -52- 200909447 (例如，經由降低症狀量或嚴重度，或經由增加另一治療的 有效性，或經由產生另一有利效果），或降低疾病發生或使 患者惡化的可能性就足夠。本發明之一具體例是針對一方 法，包括對病患投與一定量之PAR_2拮抗劑一段時間足以誘 發持續的改善超過反映特定疾病嚴重度之指標基線。 如有關領域所瞭解，含有本發明分子之醫藥組成物是以 適於該適應症之方式投與至患者。醫藥組成物可以任何適合 的技術投與，包括但不限爲非經腸地，局部地，或經由吸入。 若爲注射，醫藥組成物之投能透過，例如關節內，靜脈內’ 肌肉內，病灶內，腹腔內或皮下路徑，經由快速注射（bolus i n j e c t i ο η)，或連續式輸注。局部投與，例如考慮在疾病或受 傷位置，以經皮傳送及從植入物持續釋放。經由吸入傳送包 括，例如鼻或口吸入，使用噴霧器、氣溶膠形式吸入之拮抗 劑等等。其他變化包括眼藥水；口服製備物包括藥九，糖漿， 錠或口香糖；以及局部製備物例如外用藥水，凝膠，噴霧及 軟膏。 也考慮生體外（ex Wvo)使用抗原結合蛋白之方法。例 如，可將病患的血液或其他體液接觸抗原結合蛋白質，其在 生體外（ex Wvo)結合PAR-2。該抗原結合蛋白可結合至適當 不溶性基質或固體撐體材料。 有利地，抗原結合蛋白是以組成物之形式投與，該組成 物含有一個或一個以上額外成分，例如生理上可接受載劑 (carrier)，賦形劑或稀釋劑。該組成物可額外含有一種或一 種以上生理活性劑，例如第二發炎-或免疫-抑制物質、抗血 -53 - 200909447 管新生物質、止痛的物質等等，其非限制實例提供於文中。 在各種特殊具體例中，該組成物除結合PAR-2之抗原結合蛋 白之外，含有一、二、三、四、五或六種生理活性劑。 在一具體例中，醫藥組成物含有本發明之抗原結合蛋白 與一個或一個以上物質’該物質係選自由緩衝劑、抗氧化劑 (例如抗壞血酸）、低分子量多胜肽（例如具有少於1 0胺基酸 者）、蛋白質、胺基酸、碳水化合物（例如葡萄糖，蔗糖或糊 精）、螯合劑（例如EDTA，榖胱甘肽（glutathione))、穩定劑、 ' 以及賦形劑所組成之群組。中和緩衝鹽液或混與同種血清白 蛋白之鹽液爲適當稀釋劑之例。依照適宜之工業標準，亦可 添加防腐劑，例如苄基醇。可使用適當賦形劑溶液（例如蔗 糖）爲稀釋劑將組成物調配爲凍乾物。適合的成分爲所用劑 量及濃度對接受者無毒性。可運用於醫藥調配物之成分的進 —步實例描述於 Remington’s Pharmaceutical Sciences，16th Ed. ( 1 9 8 0) and 20th Ed. (20 00)' Mack Publishing Company， Easton，P A。 ,ι· 、 給開業醫生用之套組包括本發明之抑制PAR-2之物質 以及一標示或其他用於治療文中所討論任何狀況之指示。在 一具體例中，該套組包括一種或一種以上抗原結合蛋白之無 菌製備物，其可爲如上揭示之組成物形式，以及可於一個或 一個以上小瓶中。 投與的劑量及頻率可根據投與路徑因子、使用特殊抗原 結合蛋白、欲治療的疾病本質及嚴重度而異，疾病情況是否 爲急性或慢性，以及隨患者的大小及一般情況而異。適宜之 -54- 200909447 劑量能由有關領域已知程序決定，例如可包括劑量逐 硏究之臨床試驗。 本發明之P A R - 2抑制物質的投與可例如一次或 次，例如在一段期間內以規則的間隔投與。在特定 中，抗原結合蛋白經至少一個月或以上的期間投與， 一個月、兩個月、或三個月、或甚至無限期。對於治 疾病情況，長期治療通常是最有效的。然而，對於治 疾病情況，較短期間之投與，例如從一至六週可能 的。一般而言，投與抗原結合蛋白直到病患顯示超過 標或指不的基線之醫學上有意義程度的改善。 本發明之特殊具體例包括投與抗原結合蛋白至 劑量從每天患者每公斤體重約1 ng抗原結合蛋白（“ 1 天”）至約1 〇 m g / k g /天，更佳從約5 0 0 n g / k g /天至約5 天’以及最佳從約5 pg/kg/天至約2 mg/kg/天。在額 例中，抗原結合蛋白投與至成人爲每週一次、每週兩 週三或更多次，以治療PAR-2仲介之疾病、狀況或症 如文中揭示之醫學症狀。若爲注射，每位成人給與抗 蛋白之有效量$B圍可爲1-20 mg/m2，以及較佳爲糸 mg/m2。另外，可均一劑（flat dose)投與；量之範圍可役 m g /劑。用於均一劑之範圍爲每劑約2 0 - 3 0 m g。本發 體例中’以2 5 mg/劑之均—劑經由注射反覆投與。若 射以外的投與路徑，依據標準醫學慣例適當調整劑量 療程之一實例包括每週一至三次且經歷至少三週期 一劑約20-30 mg之抗原結合蛋白質，儘管可能需要 步上升 超過一 具體例 例如於 療慢性 療急性 是足夠 所選指 患者的 ng/kg/ mg/kg/ 外具體 次或每 狀，例 原結合 ^ 5-12 ^ 5-100 明一具 使用注 。治療 間注射 更長期 200909447 間的治療以誘發所欲程度的改善。對於兒童患者（年齡 4-17)，一示範性適合的療程包括每週投與兩或三次之皮下 注射0.4 mg/kg，至多最大劑量25 mg的抗原結合蛋白。 文中提供之方法的特殊具體例包括每週一或兩次皮下 注射0.5 mg至10 mg，較佳3至5 mg的抗原結合蛋白。另 一具體例是針對肺的投與（例如經由噴霧器），每週一次3 m g 或以上的抗原結合蛋白。 文中提供之治療療程之實施例，包括每週一次每劑1 . 5 至3 m g皮下注射抗原結合蛋白來治療以p a R - 2傳訊息扮演 角色之疾病狀況。此等疾病狀況之例提悮於文中以及包括， 例如前述之風濕疾病，以及因過度發炎作用之其他疾病（文 中所述，例如發炎性腸道疾病，胰臟炎等等）。持續每週投 與抗原結合蛋白直到達到所欲結果，例如患者的症狀消退。 若需要’治療可重新開始，或另可投與保養劑。 文中提供之治療療程的其他實例包括皮下或靜脈內投 與一劑爲每公斤患者體質量（mg/kg)之1，3，5，6，7，8，9, 10，11 ’ 12 ’ 15 ’或20 mg之本發明之PAR-2抑制劑。該劑 能一次投與至患者’或在特定間隔超過一次的投與，例如一 天一次，一週三次，一週兩次’一週一次，一個月三次，一 個月兩次，一個月一次，每兩個月一次，每三個月一次，每 六個月一次’或一年一次。治療的期間及對治療的劑及/或 頻率之任何變化，能於治療過程中改變或修改以符合患者的 特殊需求。 在另一具體例中’抗原結合蛋白是以足以引起改善之一 -56 - 200909447 定量及經一段時間投與至患者，較佳爲持續的改善至少一項 指標，該指標反映所欲治療之疾病的嚴重度。反映患者疾病 狀態、疾病或病症程度之各種指標，可用於評估決定該治療 的量及時間是否足夠。此等指標包括，例如疾病嚴重度、症 狀之臨床辯認的指標，或討論之症狀的表現。在一具體例 中，若患者於二到四週對至少兩起因分開展現改善，則視爲 改善是持續的。改善的程度通常由醫師決定，其可根據症 候、症狀、切片檢體或其他測試結果決定，以及亦可運用提 供給患者之問卷，例如對所治療疾病進展之生活品質問卷調 查。 PAR-2的含量提高及/或PAR-2的活化與一些失調有 關，包括例如皮膚、關節、胃腸系統及/或氣道的發炎情形。 可篩選具有已知失調之患者以鑑定那些具有PAR-2活化已 提高的人，藉此鑑定可使用結合P A R - 2之抗原結合蛋白治療 而受益的患者。如此文中提供之治療方法可包含測量患者 PAR-2活化程度之第一步驟。可投與抗原結合蛋白至患者， 而該患者的PAR-2活化高於正常。 患者的PAR-2活性程度可於以抗原結合蛋白治療之 前、期間及/或之後監測，若有的話偵測PAR-2活性的變化。 對於某些失調，PAR-2活性經提高之影響可依據作爲疾病的 階段或疾病的特殊形式之此等因子變化。可運用已知技術測 量PAR-2活性，例如在患者血清、血液或組織樣品。可使用 任何適合的技術測量PAR-2活性。 本發明方法及組成物的特殊具體例，包括使用抗原結合 -57 - 200909447 蛋白及一種或一種以上額外PAR-2拮抗劑，例如兩種或兩種 以上本發明之抗原結合蛋白質，或本發明之抗原結合蛋白以 及一種或一種以上其他PAR-2拮抗劑。在進一步具體例中， 抗原結合蛋白是單獨投與或與其他可用於治療使病患痛苦 的疾病狀況之試劑組合。此等試劑之實例包括蛋白質性及非 蛋白質試劑兩種。當多樣治療劑是共投與時，於是可如有關 領域認知調整劑量。“共投與，，及組合治療不限於同時投與， 但也包括治療療程是在治療過程中對病患至少投與一次抗 原結合蛋白及包括投與至少一其他治療劑。 可與抗原結合蛋白共投與之其他試劑之實例，爲根據欲 治療的特殊情況選擇之其他抗原結合蛋白或治療性多胜 肽。另外，可用於治療以上討論之特殊情況之非蛋白質性藥 劑可與PAR-2拮抗劑共投與。 組合治療 在另一方面，本發明提供一種以PAR-2抑制抗原結合 蛋白與一種或一種以上其他治療之治療患者之方法。在一具 體例中，此等組合治療經由例如在腫瘤中攻擊多位置或分子 靶，達到協同作用或加成效果。能用於連結本發明之組合治 療類型包括抑制或活化（依適合情形）單一疾病有關途徑之 多節點、靶細胞之多途徑、以及靶組織中多細胞類型。 在另一具體例中，組合治療之方法包括對患者投與兩 種、三種、四種、五種、六種或以上文中所述之PAR-2激動 劑或拮抗劑。在另一具體例中，該方法包括對患者投與兩種 或兩種以上治療，一起抑制或活化（直接或間接）PAR-2仲介 -58 - 200909447 之訊息傳遞。此等方法之實例包括使用兩種或兩種以上抑制 PAR-2之抗原結合蛋白的組合、抑制PAR-2之抗原結合蛋白 與一種或一種以上具有抗炎特性（例如非類固醇性抗發炎 劑，類固醇及/或免疫調節劑）之其他治療性部分的組合、或 抑制PAR-2之抗原結合蛋白與一種或一種以上其他治療（例 如手術，超音波或有效降低發炎的治療）的組合。再者，一 種或一種以上抗-PAR-2抗體或抗體衍生物能用於組合一種 或一種以上分子或其他治療，其中該其他分子及/或治療不 直接結合至或影響PAR-2，但其組合有效於治療或預防所欲 處理之狀況。在一具體例中，一種或一種以上分子及/或治 療，可治療或預防療程中因一種或一種以上其他分子或治療 造成之情況，例如噁心、疲勞、禿頭症、惡病質、不眠症等 等。在每一案例中使用分子及/或其他治療的組合，該個別 分子及/或治療能以任何順序投與，例如同時、連續或變化 地，且經歷任何期間是有效的。在一具體例中，該治療方法 包括在開始第二療程之前，完成以一種分子或其他治療之第 一療程。第一療程結束與開始第二療程間的時間長短，是能 使總療程有效的任何時間長度，例如數秒、數分、數小時、 數天、數週、數月、或甚至數年。 在另一具體例中，該方法包括投與一種或一種以上文中 所述之PAR-2拮抗劑以及一種或一種以上其他治療（例如治 療性或緩和性處理）。其中一方法包括對患者投與超過一種 治療’須瞭解投與的順序 '時間、次數、濃度以及體積只受 醫療規定及治療限度（亦即能對患者投與兩種治療，例如同 -59 - 200909447 時、連續、變化’或根據任何其他療法）所限。 下列實際及預知之實施例僅提供用於舉例說明本發明 之專一具體例或特徵，故不因此限制其範圍。 實施例1:單株抗體夕軔^ 使用一種或一種以上適宜形式的PAR-2抗原進行免疫 作用，包括共軛至經馬來醯亞胺活化的血藍質 (maleiimide-acti vated keyhole limpet h e m o c y an i η) [ K L Η ；例 如可獲自 Pierce Biotechnology Inc.，Rockford, IL]之具有額 外C-末端半胱胺酸殘基促進共軛之可溶性PAR-2胜肽 (PAR-2 之環 1胜肽[TNRSSKGRSLIGKVDGTS;SEQIDN0:2 的胺基酸29至46])、PAR-2/Fc接合蛋白以及結合於細胞之 PAR-2(例如在細胞表面表現人類PAR-2之CH0轉染體，可 經由以編碼S E Q I D Ν Ο : 2多胜肽之人類全長p A R - 2 c DN A轉 染C HO細胞而獲得）、或其組合。 使用適當量之免疫原（亦即可溶性PAR-2 1 0 // g/小鼠或 轉染C Η Ο細胞3 X 1 06細胞/小鼠），根據揭示於1 9 9 6年1 2月 3曰申請之美國專利申請序號案〇 8 / 7 5 9，6 2 0以及公開於1 9 9 8 年6月11日之國際專利申請案WO 9 8/24 8 93以及公開於 2 000年12月21日之WO 00/763 1 0之方法於Xeno小鼠τμ初 次免疫。初次免疫之後，按照預定時間給予隨後的免疫原追 加免疫（可溶性PAR-2 5pg/小鼠或PAR-2轉染細胞1.5x106/ 小鼠），以於所需期間在該小鼠誘發適當力價之抗-P A R - 2抗 體。以任何適宜的方法決定力價’例如酵素免疫分析法或蟹 光激活細胞分選（flu〇rescent activated cell sorting)，或經由 -60 - 200909447 其他方法決定力價（包括上述組合）。 確認展現適當力價的動物，並從排出的淋巴結獲取淋巴 細胞，視需要將每一世代集合在一起。以適合的培養基（例 如 Dulbecco’s Modified Eagle Medium ; DMEM ;可獲自 I n v i t r o g e η，C a r 1 s b a d, C A)經由磨碎將淋巴細胞從淋巴組織 分離以從該組織釋放細胞，並懸浮於DMEM。使用適合的方 法可篩選及/或擴充B細胞，以及使用技藝已知之技術與適 宜的融合夥伴，例如非分泌性骨髓細胞瘤P 3 X 6 3 A g 8.6 5 3細 胞（美國菌種中心 CRL 1580; Kearney et al_, J. /wwmwo/· 123, 1979，1548-1550)接合= 在一適合之融合方法中，淋巴細胞以1 : 4的比例與融合 夥伴細胞混合。細胞混合物經由40 Oxg離心4分鐘緩慢形成 九狀，輕輕倒出上清液，然後輕輕地混合細胞混合物（例如 使用1 ml移液管）。以PEG/DMSO(聚乙二醇/二甲基亞颯； 獲自Sigma-Aldrich，St. Louis MO ;每一百萬個淋巴細胞1 ml)誘發融合作用。輕輕攪動下緩慢添加PEG/DMSO歷經1 分鐘，隨後混合1分鐘。然後輕輕攪動下添加IDMEM(無麩 醯胺酸之DMEM;毎一百萬個B細胞2ml)歷經2分鐘，隨 後添加I D Μ E Μ (每一百萬個B細胞8 m 1) 3分鐘。 已融合細胞緩慢形成九狀（400xg 6分鐘）並再懸浮於20 ml篩選用培養基/每一百萬個B細胞（例如含有偶氮絲胺酸 (Azaserine)及次黃嘌呤[HA]以及其他必要補充性物質之 DMEM)。在37°C培育細胞20-3 0分鐘，然後再懸浮於200 ml 篩選用培養基，並於置入96井之前在T1 75燒瓶中培養三至 -61 - 200909447 四天。 使用標準技術將細胞分配到96井平板使所得群落的單 株性（clonality)最大化。培養數天之後，收集上清液並如下 實施例詳述進行篩選分析，包括結合至人類PAR-2之確認、 與其他物種PAR-2(例如食蟹獼猴（cynomologous monkey)及/ 或小鼠PAR-2)的交叉反應評估、對於經切割與未切割PAR-2 之結合、以及抑制PAR-2之蛋白酵素分解活化的能力。進一 步篩選陽性細胞並進行標準選殖及次選殖技術。選殖株可於 活體外或活體內擴充，並獲得分泌之人類抗體用於分析。 如此產生之融合瘤選殖株，篩選其與PAR-2之反應性。 融合瘤上清液的初步篩選可運用適用於高生產量篩選之胜 肽ELISA、完整細胞ELISA及/或基於細胞之分析（螢光測定 微體積分析技術或FMAT，大體敘述如Fiscella, et al., iVa me 5 ioiec/zno/ogy 21:302-307; 2003)。在此舖選方法中 爲陽性的融合瘤，可進一步培養以提供更大量的抗體，然後 如下所述純化並如下篩選，以額外基於細胞之分析[例如使 用細胞共表現一種Ca2 + -敏感性光蛋白之水母發光蛋白 (apoaequorin)(大體敘述於 Le Poul et al., «/. 5/omo/. Screen. 7(l):57-65; 2002)以及 PAR-2 之閃爍平板分析（fiash plate assay)]，或用於決定細胞內Ca2 +含量變化之螢光成像平板 曰賣取益（FLIPR)分析’大體欽述於 s. pitchf〇rd, Genei/c vol. 18, Number 15 (1998)及 /或 Sullivan et 也 in Mo—r 5z_o/ogjvol_114，ppl25_133(1999)，其倂入本文參考。 於此方法中’以可溶性PAR-2、PAR-2表現細胞或 200909447 PAR-2/Fc蛋白免疫小鼠，總計1 9或20免疫作用歷經約二至 一又一分之一個月期間；得到分泌P A R - 2專一性抗體之數種 細胞株’並進一步特性分析該抗體。其序列描述於序列表並 槪述於下表1 ’以及使用這些抗體之各種測試結果示於文 中。熟悉該項技藝者可辨別骨架（framework)及互補決定區域 之間可變化；例如在某些情況輕鏈FR1的胺基酸22可視爲 CDR1的一部分等等。再者，某些編號系統命名重鏈的CDR3 以及FR4爲J區域以及可包括D區域於FR3及CDR3之間。 ? 因此，以下提出之區域編號可有一至五個胺基酸變化。 -63 - 200909447 表1 VR FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 1A1，重鏈，SEQ ID NO:9 1-126 1—30 31-35 36-49 50—66 67—98 99-115 116-126 1A1 輕鏈，SEQ ID NO: 11 1-107 1-22 23-33 34-48 49-55 56-87 88-97 98-107 1B5,重鏈，SEQ ID NO:13 1-126 1-30 31-35 36-49 50-66 67-98 99-115 116-126 1B5 輕鏈，SEQ ID NO: 15 1-107 1-22 23-33 34-8 49-55 56-87 88-97 98-107 1C7,重鏈，SEQ ID NO: 17 1-126 1—30 31-35 36-49 50-66 67-98 99-115 116-126 1C7 輕鏈，SEQ ID NO: 19 1-107 1-22 23-33 34-48 49-55 56-87 88-97 98-107 2A5,輕鏈，SEQ ID NO:21 1-106 1-22 23-33 34-48 49-55 56-87 88-96 97-106 2C6,重鏈，SEQ ID NO:23 1-122 1-30 31-35 36-49 50-66 67-98 99-110 111-122 2C6,輕鏈，SEQ ID NO:25 Mil 1-22 23-35 35-50 51-57 58-89 90-100 101-111 9B12，重鏈， SEQ ID NO:27 1-121 1-30 31-35 36-49 50-66 67-98 99-110 111-121 9B12，輕鏈， SEQ ID NO:29 1-111 1-22 23-35 36-50 51-57 58-89 90-101 102-111 12D5，重鏈， SEQ ID NO:31 1-125 1-30 31-37 38-51 52-69 70-101 102-114 115-125 12D5，輕鏈， SEQ ID NO:33 1-107 1-23 24-34 35-49 50-56 57-88 89-97 98-107 13F2，重鏈， SEQ ID NO:35 1-125 1-30 31-37 38-51 52-69 70-101 102-114 115-125 13F2，輕鏈， SEQ ID NO:37 1-107 1-23 24-34 35-49 50-56 57-88 89-97 98-107 實施例2 :純化抗-PAR2融合瘤抗體用於篩選 培養融合瘤細胞一段時間，並在條件下產生約3 5 ml融 合瘤上清液之樣品。使用適合的方法，例如使用蛋白A純化 單株抗體。對每一樣品添加1 2 ml之4X-蛋白A結合緩衝液 (1.6 Μ 檸檬酸，100 mM tris，pH 9.15)以及約 300 μΐ 的 67% MabSelect™ 培養基（GE Healthcare, Piscataway，NJ)泥獎 液。在4 °C輕輕旋轉所得泥漿液隔夜。 -64- 200909447 隔夜培育之後，離心樣品爲沉澱樹脂及其結合之單株抗 體，例如於 G3.8 離心旋轉機（Beckman Coulter，Fullerton, CA)以2,0 00 RPM在4°C不間斷5分鐘。移除幾乎約3 00 μΐ 的上清液並再懸浮樹脂形成濃縮之泥漿液。 將濃縮之泥漿液轉移到微離心管並添加足量1 X-蛋白A 結合緩衝液（40〇1«]\/1檸檬酸，25 111]^1；1^，卩118.9)使產生總 體積至多約1 ml。再懸浮泥漿液，然後以約1 4,000 g離心5 秒。從所得九狀物移除上清液，以類似方式清洗九狀物共3 次（亦即再懸浮於約1 ml的1X-蛋白A結合緩衝液，離心， 移除上清液並再懸浮於新的緩衝液）。 清洗3次後，將丸狀物再懸浮於4 0 0 μ 1溶析緩衝液 (Elution Buffer)(200 mM甲酸）並在室溫攪動1〇分鐘，然後 以1 4，0 0 0 g離心5秒。小心移除上清液作爲溶析液，並以類 似上述方法再次溶析該九狀物共3次溶析循環。合倂3次溶 析循環之溶析液，在室溫以1 4,000 g離心5分鐘並轉移到新 試管。經由添加2 M tris鹽（235 mMf)並迅速混合來調整pH 至7.8-8.2。在室溫以I4, 〇〇〇 g再次離心樣品5分鐘，並標 示爲pH變動可溶性（pH Shift Soluble)。從250至350 nm進 丫了母一樣πΐ3(經由添加20 μΐ樣品至700 μΐ水來稀釋）的光譜 掃描’以及經由載入〇_5 pg含每一抗體之樣品於具適當抗體 標準物之還原性4 - 20% SDS-PAGE凝膠來決定蛋白質濃度。 亶施例3:PAR-2/Fc多胖狀夕純化 將N-終端PAR-2/Fc多胜肽（SEQ ID N0:6)表現於適合 的哺乳動物細胞，例如C Η Ο細胞。來自培養於無血清培養 200909447 基之CHO表現細胞的表現上清液，含有類似CHO細胞胰蛋 白酶之絲胺酸蛋白酶，可在活化Arg-Ser鍵切割PAR-2/Fc 而產生PAR-2/Fc多胜肽的“經修剪”形式變體。培養於10% 胎牛血清（其含有正常水平的血漿蛋白酶抑制劑，濃度遠超 過類似CHO細胞胰蛋白酶之絲胺酸蛋白酶的濃度）之CHO 表現細胞，表現未切割的N-終端PAR-2/Fc於培養的上清 液。經修剪以及未切割的蛋白質二者，使用適於單離及純化 含Fc區域之蛋白質的方法純化之（例如使用Mab Select™樹 脂系統，來自GE Healthcare, Piscataway, NJ)。所得純化之 Fc-構築體經由胺基終端序列分析法（Edman降解）、大小排除 層析（size exclusion chromatrography)、吸收光譜掃描分析、 以及視需要之質譜分析法來分析。 在一適當純化系統之實施例中，以6 ml/min及在7°C將 含有PAR-2/Fc之條件培養基載入GE Healthcare 10 ml蛋白A SePhar〇SeTM HiTrap管柱。以數管柱體積之不含二價陽離子的杜 氏（Dulbecco’s)磷酸緩衝鹽液清洗管柱，然後以100 mM甘胺 酸在PH3.0溶析。溶析之蛋白質稀釋於Tris緩衝液並以1 Μ 113?〇4調整？11爲7.0。然後以5 1111/111丨11及在7°(：將溶析液載 入於 S-緩衝液 Α(ρΗ 7.0 之 20 mM NaH2P04)之 5 ml GE Healthcare SP-HP HiTrap管柱。以數管柱體積之S -緩衝液A清洗 管柱，隨後以5 ml/min及在7°C以20管柱體積之線性梯度 至 40% S-緩衝液 B(20 mM NaH2P04，1 M NaCl，pH 7.0)， 隨後一步至100% s-緩衝液B溶析。分劃（fractions)可經由 考馬斯（Coomassie)染色的SDS-PAGE分析並集合一起。集合 -66 - 200909447 之分劃可透過0.2 2 μ m醋酸纖維素濾器過濾；並使用經計算 之分子質量3 0,226及經計算之消光係數35,410 M^cnT1可 於樣品進行光譜掃描。濃縮集合之物質（例如經由在室溫使 用Pall Macrosep® 10 kDa膜，隨後透過0.22 μπι醋酸纖維 素濾器過濾）；可進行另一光譜掃描來證實濃度。然後最終 產物可經由考馬斯（Coomassie)染色的SDS-PAGE(4-20% 1_0 mm tris-甘胺酸凝膠）以及使用Phenomenx BioSep 3000管柱 (7.8x3 00 mm)於 50 mM NaH2P〇4、250 mM NaCl、pH 6.9 之 /'. SE-HPLC 分析之。 實施例4: PAR-2/Fc:FLAG®/Fc異二聚體之表現及純化 表現異二聚體PAR-2/Fc:FLAG®/Fc蛋白質，並純化以 促進分析抗體對PAR-2之抗體親抗原性以及親和性。以編碼 PAR-2/Fc(SEQ ID Ν Ο : 5 )之核酸及編碼 FLAG®/Fc(SEQ ID NO :43)之核酸共轉染適合的細胞，例如哺乳動物細胞或人類 細胞如HEK2 93細胞。轉染細胞在適當條件下培養（例如在含 有低-IgG血清之培養基）造成同質二聚體PAR-2/Fc、同質二 ' 聚體FLAG®/Fc以及異二聚體PAR-2/Fc:FLAG®/Fc蛋白質的 表現。後者經由連續純化步驟取得，大體如下所述。

在一適當純化系統之實施例中，將含有 PAR_2/Fc: FLAG®/Fc之條件培養基經促進Fc蛋白質純化之純化方 法，類似前述用於PAR-2/Fc之方法。簡言之，在使Fc結合 蛋白A之條件下將條件培養基載入蛋白A管柱。以數管柱 體積之PBS清洗管柱，然後在低pH溶析。稀釋溶析之蛋白 質並進一步經由離子交換色層分析（例如使用GE Healthcare SP -67 - 200909447

SepharoseTM -高效管柱於 S-緩衝液 A(20 mM NaH2P04 於 pH 7.0) 純化，其經數管柱體積之S-緩衝液清洗，並以5 ml/min以 20管柱體積線性梯度從1至20%及20管柱線性梯度從20 至 50%之 S-緩衝液 B(20 mM NaH2P04，1 M NaC卜 pH 7_0)、 隨後單一步驟至100% S-緩衝液B溶析。 經由考馬斯染色的SDS-PAGE分析分劃，並將含大部分 所欲產物之分劃集合一起。然後將集合一起之物質與抗 -FLAG® M2 親和性凝膠（Sigma A2220 ; Sigma-Aldrich, St _ Louis MO) 培育隔夜。然後以T r i s -緩衝之鹽液清洗樹脂並以1 0 0 m Μ HOAC、pH 3.5 溶析。以 1 Μ Tris HC1、pH 8.0 中和最終集 合物至pH 7_0。 在任何所欲點，該物質可透過0.22 μιη醋酸纖維素濾器 過濾；並使用經計算之分子質量3 0,226及經計算之消光係 數35,4 10 NT1 cnT1可於樣品進行光譜掃描。視需要可濃縮最 終集合物質（例如在室溫使用Pall Macrosep® 1 0 kDa膜，隨 後透過0.22 μιη醋酸纖維素濾器過濾）；可進行另一光譜掃 描來證實濃度。然後最終產物可經由考馬斯染色的SDS-PAGE (4-20% 1.0 mm tris-甘胺酸凝膠）以及使用Phenomenx

BioSep 3 000 管柱（7.8 X 3 00 mm)於 50 mM NaH2P04、250 mM NaCl、pH 6.9 之 SE-HPLC 分析之。 使用N-終端胺基酸定序來證實此方式純化之物質含有 PAR-2/Fc:FLAG®/fC 異二聚體。偵測到兩序列：TIQGTNRSSKG (對應於SEQ ID N0:2之胺基酸25至35)以及DDYKDDDD(對 應於SEQ ID NO: 7)。兩胜肽的比例接近於1。考馬斯染色及 -68 - 200909447 SEC分析確認該物質是PAR-2/Fc:FLAG®/Fc異二聚體蛋白 質與未偵測到程度的同質二聚體蛋白質。 實施例5:經由西方點墨法之PAR-2抗體分析 爲分析未切割相對於經切割PAR-2之結合，使用8-16% 聚丙稀酿胺梯度凝膠（Novex 凝膠，Invitrogen Life Technologies) 於Tris-甘胺酸緩衝系統將各種含量經純化之未經切割以及 經修剪N-終端PAR2-FC進行SDS-PAGE。也包括含有可見藍 色標準用以識別分子量之凝膠跑道（Novex, Invitrogen Life Technologies)。電泳之後，使用 Novex XCell II Blot Module (Invitrogen Life Technologies)將蛋白質從凝膠轉移到硝基纖維膜上=以1 : 1 之 Odyssey 封阻緩衝液 OBB(LI-COR Biosciences): TBS(Tris 緩衝鹽液），在4°C搖動下封阻該膜隔夜。在室溫以1 : 1之 〇BB:TBS稀釋欲分析之抗體於所欲終濃度1小時。以0.1% Tween 20於TBS大量清洗該膜（以1 00ml歷經約1小時更換 3-4次）。然後在室溫將膜曝露到適當之以l:l(OBB:TBS)稀 釋爲 1:5000 的二級抗體-Alexa680(分子探針，Invitrogen Life Technologies)共轭體（山羊抗-兔子IgG或山羊抗-小鼠IgG)達1 小時。如上所述清洗膜，並視需要使用LI-COR Odyssey紅 外線影像系統（L I - C Ο R B i 〇 s c i e n c e s )分析。 實施例6 : PAR-2抗體的結合活性 此實施例說明結合活性，其係使用BIAcore®生物感應 器（BIAcore International AB, Uppsala, Sweden)經由表面電獎子共振 來評價。簡言之，使用標準胺偶合步驟及根據廠商說明書指 示之試劑將抗-人類F c (或抗-小鼠F c )共價偶合至生物感應 -69 - 200909447 晶片（亦即CM5晶片）。注射PAR-2抗體（人類或小鼠，或嵌 合體例如SEQIDNO:38)或對照組抗體於固定之抗-Fc，並獨 立地將不同含量PAR-2(同質二聚體PAR-2-huFc或異二聚體 PAR-2-huFc/FLAG-huFc)通過已偶合無關係抗體之晶片（負 對照組）以及已塗覆抗-PAR-2之晶片。晶片的再生可以 l〇/zl/min加上 100 mM磷酸 10-//1來達成。全部結合在 HBS( 10 mM HEPES > 0.15 M NaCl > 3.4 mM EDTA > 0.02% NaN3 > 0.005% 界面活性劑P20，pH 7.4)或等效物中進行。 f . 實施例7 : PAR-2抗體之[±較 於不同分析形式中測試數種PAR-2抗體；表2總結此 結果。於如前所述Ca2 +移動之FLIPR分析決定IC5Q値；使 用前述之西方點墨法分析決定結合至切割位置的上游區域 與切割位置的下游區域。 表2

ic5〇 尔口 σ王 切割位置* 抗體 上游 下游 1A1 2nM XXX 1B5 3nM XXX 1C7 3nM XXX 2C6 >1μΜ - XX 9B12 >1μΜ XX 12D5 >1μΜ . XX 13F2 >1μΜ _ XX 在此西方點墨法中，結合切割位置下游之抗體將結合全長 及截頭胺基終端PAR-2-Fc二者，反之結合切割位置上游之 抗體將只結合全長PAR-2/Fc。 -70 - 200909447 實施例8 :佐劑誘發關節炎f AIA)樽甘， 此實施例說明關節炎之急性及慢性模式。在此二模式 中’例如經由Ketamine/Xylazine混合物（分別爲小鼠混合或 大鼠混合）或麻醉劑Isoflurane用於全部關節內（I a)、關節周 圍（PA)注射或皮膚內（ID)注射麻醉動物。 關節注射IA或PA的目標對象在膝部或後肢爪。pa注 射是平均分配遍及圍繞感興趣關節的四個位置。爪子注射是 I D投與到後爪的腳底區域。爲提供內部對照組，單獨以運 載劑（vehicle)或無菌PBS注射一膝部或後肢爪。注射區域的 製備包括動物麻醉後刮除的關節區域，以及以碘酒溶液及隨 後酒精消毒劑擦洗者。全部關節注射是以30_規格徑注射針 或同等物實施’且當需要時經由氣密式注射針（亦即 H a m i 11 ο η)用於小注射體積（亦即1 〇 # l )。 爲誘發急性AIA(aAIA) ’在第〇天（D0)以1-4%的λ -鹿 角菜膠（又-carrageenan)及 1-4%的高嶺土（kaolin)(C/K)經由 I A注射液於鹽水注射動物。兩化合物之濃度視預定的疾病 嚴重度而異。誘發劑之總注射體積界於1 0-20 // L於小鼠以及 6 0 - 8 0 # L於大鼠。濃度及注射體積二者符合發表之方法論（J Clin Invest. 2003; 111(1):35-41,以及 p/iarwaco/ 五；φ 77^. 2006; 316(3):1017-24)。另外’可使用專一性par-2胜肽激動劑或其 他發炎活化劑（例如胰蛋白酶或人類/3 -類胰蛋白酶[J C/h Invest. 2003; 111(1):35-41, J Pharmacol Exp Ther. 2006; 316(3):1017-24, J 2005 97(1):38-42,以及 1999 127(5):1083-90]) 或等效物。所用濃度是用於篩選預定疾病嚴重度，以及總注 射體積對將注射動物是適當的。 200909447 對於慢性AIA(CAIA)的誘發，在第0天（DO)以10-20 //L (小鼠）與60-80//L(大鼠）補充以10 mg/mL H37Ra結核分支 桿菌（M_yrwZjercw/oj'/j'MM.tb.)[完全佛氏佐劑 (complete Freund’s adjuvant); CFA]的佛氏佐劑經由 IA 注射 液，隨後以40- 80 /zL(小鼠）與1 2 0 -200 /zL(大鼠）經由PA注 射液注射動物。濃度、注射體積以及注射療程符合發表之方 法論（·/ C/Ζ» 20 03; 1 1 1(1):35-41)。佐劑使用依照國際 IACUC全球佐劑使用標準，不超過總計0.4 mL於小鼠以及 總計1 mL於大鼠。全部注射符合國際動物實驗管理及使用 委員會（Institutional Animal Care and Use Committee ; IACUC) 劑量投與標準，包括不超過20 mL/kg IP、1 mL/kg IA以及5 mL/kg IV 於小鼠以及 10 mL/kg ΙΡ、0·5 mL/kg IA以及 5 mL/g IV於大鼠。 治療介入包括腹膜內（IP)、關節內（IA)或靜脈內（iv)投 與路徑；除此之外，其他適當的投與路徑可用於取代這些。 透過IΑ注射之任何治療法，是在D 0以外的時間給予或在 D0給予但相繼於同一關節在不同注射位置（例如第一次注射 到膝部的內部方位以及第二次注射到外部方位）。 對於急性與慢性AIA二者之硏究，在任何注射前對感 興趣之全部關節進行關節直徑的卡尺測量。疾病的追蹤可包 括關節直徑的卡尺測量及關節周長的彈性膠帶測量，以及視 覺計分。亦可使用另外的方法（亦即使用足趾容積測量儀 (plethysmometer)VcAIA的嚴重度是以如下所示—種或兩種 標準計分： -72 - 200909447 CAIA關節使用標進 〇-正常的關節使用 1-腳趾捲縮 2-關節或爪子轉向 3- 部分承重 4- 未承重以及防衛 gAIA關節外觀標進 0-正常的關節 1 - 1至3個足趾紅腫/膨脹 2- 超過3個足趾紅腫/膨脹，微紅腫/膨脹擴大 到爪子，踝關節膨脹/紅腫，或前爪子微膨脹/ 紅腫 3- 膨脹的爪子，輕微至中度紅腫 4- 整個爪子極度紅腫以及極度膨脹 於此方法中，以C/K+處理（或對照組）注射6-8週齡 ( Lewis大鼠左膝部，以及負對照組於各右膝部作爲急性模 式。處理之後在設定時間點測量關節厚度，使用3次卡尺讀 數的平均。左膝部的厚度變化與右膝部比較是以百分比變化 表不，並不於下表3。 表3 0小時 2小時 6小時 24小時 48小時 72小時 PBS 0.00 ±0.00 -0.26 ±0.71 0.26 ±0.65 -0.84 ±0.53 -0.84 ±0.55 -0.48 ±0.50 C/K 0.00 ±0.00 3.88 ±2.88 15.76 ±1.74 17.51 ±2.45 16.41 ± 1_39 8.07 ±1.02 SLIGRL 0.00 ±0.00 4.84** ±0.87 8.02*** ±1.17 5.68*** ±1.07 3.47* ±0.95 3.55* ±0.81 1A1 0.00 ±0.00 1.10 ±1.13 4.12*** ± 1_29 3.57*** ±1.20 4.70** ±1.39 3.48 ±0.66 hlgG 0.00 ±0.00 4.80 + 0.88 15.20 ±2.91 13.77 ±2.29 10.89 ±1.30 5.95 ±1.32 數値爲組平均± SEM。經由雙因子變異數分析(2_Way ANOVA)與Bonferroni 進行統計計算。單株抗體1A1與hlgG相比；SLIGRL與PBS相比 * p < 0.05 ** p<0.01 *** p < 0.001 200909447 這些結果證明在佐劑誘發關節炎模式中觀察到拮抗性 抗-PAR-2抗體降低發炎作用。 實施例9 :佐劑誘發關節炎（AIA)樽忒 此實施例說明在急性AIA模式中PAR-2抗體對爪子水 腫的效力，大體如前所述。簡言之，在6-8週齡Sprague Dawley 或 Lewis 大鼠(Charles River Laboratories, Wilmington，MA)後爪腳底區域皮下（SC)注射1% λ-鹿角菜 膠於一後爪以及對照組（鹽水）於另一者。注射佐劑之前1 8 小時’以1 .5 mg/大鼠（約8-10 mg/kg)腹膜內（IP)投與阻斷性 PAR-2單株抗體（1 A 1)或對照組（正或負對照組：請參閱表4 腳註），然後在選擇之時間點經由足趾容積測量儀測量腫 脹。數據是以毫升表示每爪子相對於該爪子基線測量値所移 除之水的體積（mL)。代表性實驗結果示於以下表4-5。 表4: Lewis大鼠之爪子水腫 0小時 2小時 4小時 6小時 8小時 鹽水 0.00 0.09 0.03 0.01 0.01 ±0.00 土 0.05 ±0.05 ±0.04 ±0.04 鹿角菜膠 0.00 0.21 0.24 0.31 0.46 ±0.00 ±0.05 ±0.07 ±0_04 ±0.05 2B51 0.00 0.13 0.10 0.06 0.17 ±0.00 ±0.04 ±0.02 土 0.05 ±0.09 1A1 0.00 0.15 0.09*** 0.14*** 0.30*** ±0.00 ±0.06 ±0.04 ±0.07 土 0.06 2C62 0.00 0.22 0.22 0.32 0.51 ±0.00 ±0.02 ±0.05 ±0.06 ±0.11 2B5:正 k寸照組抗-PGE2，Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan 22C6:負對照組結合無阻斷性抗_PAR2mAb * ρ<0·05，** p<〇.〇i，p<0 001經由雙因子變異數分析與 Bonferroni/正測試相對於對照組 74- 200909447 表5 : Sprague Dawley大鼠之爪子水腫 0小時 2小時 4小時 6小時 鹽水 0.00 0.01 -0.01 -0.01 ±0.00 ±0.08 ±0.06 ±0.04 鹿角菜膠 0.00 0.61 1.16 1.36 ±0.00 ±0.12 ±0.13 ±0.19 吲哚曼他辛1 0.00 0.26 0.28 0.49 ±0.00 ±0.22 ±0.08 ±0_16 1A1 0.00 0.15*** 0.45*** 0.49*** ±0.00 ±0.05 ±0.08 ±0.08 2C62 0.00 0.57 1.06 1.13 ±0.00 ±0.08 ±0.16 ±0.08 吲哚曼他辛（Indomethacin)以5 mg/kg之正對照組 22C6:負對照組結合無阻斷性抗-PAR2mAb * ρ<0·05，** ρ<0.01, *** ρ<0.001經由雙因子變異數分析與 Bonferroni/正測試相對於對照組。 在進一步實驗中，當IP投與時阻斷性PAR-2抗體（1A1) 顯著減少爪子腫脹，但S C投與時則否；之後的藥物動力學 分析顯示S C投與1 A 1之生物利用率於爪子水腫硏究是次理 想的。此外，經由IP投與阻斷性PAR-2抗體之腫脹抑制， 出現劑量依存性方式。這些結果確認先前之發現，亦即在佐 劑誘發關節炎模式中觀察到拮抗性抗-PAR-2抗體降低發炎 作用。 實施例1 〇 :促發炎細胞激素之5々戀 此實施例説明PAR-2抗體或基準正對照組抗體（亦即抗 -PGE2 2B5 ’來自Cayman Chemical)對於誘發促發炎細胞激 素的效力。簡言之’經由在細胞溶解緩衝液中切碎並置於 200909447

Qiagen Tissue Lyser製備來自發炎大鼠爪子或對照組（自然 的）爪子之組織細胞溶解物。將小份量樣品集合一起，使用 微體積光譜儀系統（NanoDr〇PTM， Thermo Scientific, Waltham ΜΑ)經由吸光（A28〇)評估總蛋白質，並送交 Rules-Based Medicine, Inc.(Austin, TX)於 Rodent Panel v2.0進行多待測物槪廓（MAP)分析。眾多待測物因疾病活性 變化，所示比較包括因1 A 1及2B5處理所構成之差異。使待 測物對總蛋白質標準化（亦即（Pg、ng、# g)/mg總蛋白質）； 數據示於第1圖。這些結果確認文獻報告之促發炎調節劑（例 如細胞激素以及前列腺素）的釋放提高是鹿角菜膠誘發水腫 的特徵標誌。處以抗-PAR-2拮抗性抗體之動物爪子細胞溶解 物中觀察到這些因子的水平較低，而提議這些抗體結合 PAR-2並顯著降低後續促發炎調節劑的產生。減少這些待測 物的產生，確認PAR-2中和性抗體之抗發炎活性。 眚施例11 :抗原結合蛋白質之結合特性

此實施例說明PAR-2抗原結合蛋白對細胞表面所表現 PAR-2的結合特性之分析，其係利用溶液相中測量結合情形 及能用於計算 KD 、 Kon 及 Koff(KinExA®;Sapidyne Instruments, Boise, ID)之動力排除分析（Kinetic Exclusion Assay)，大體如前說明於 Xie et. al. ·/. /ww, Afei/jo心 304:1 (2005)以及 Rathanaswami et. al. τίηα/. 5z’oc/zew. 373:52 (2008)。簡言之，表現人類 PAR-2之細胞（例如在細胞表面表現人類PAR-2之CHO轉染 體，可獲自以編碼SEQ ID NO:2多胜肽之人類全長PAR-2 cDNA轉染之CHO細胞）及對照組細胞（亦即未轉染之CHO 200909447 細胞）於經修飾DMEM培養基（不含酚紅，含有10 %加熱去活 性F B S、〇 . 1 m Μ Μ E Μ非必需胺基酸、1 m Μ丙酮酸鈉、青 黴素-鏈黴素-麩醯胺酸以及0.025 % (w/w)疊氮化鈉）的一連串 稀釋，是在4°C旋轉下與設定量抗體培育24至36小時。培 育時間終了，經由離心（亦即以2000 rpm達4分鐘）將細胞製 成九狀，並移除含有未被結合的（游離）抗體之上清液。使用 適當捕獲珠及共軛Cy5之抗-人類二級抗體，經由Kin ExA® 測量游離 mAb，欽述如 Rathanaswami et al.

Cowaww«:1004(2005)。使用KinExA®軟體並經由“ η-曲線分析” 得到平衡解離常數（KD)，其同時適用全部所給曲線於單一 Kd 値（Rathanswami et al. 2005 以及 Xie et al.同上）。 某些PAR-2抗體的KD是以此方法決定。如以KinExA® 測量，抗-PAR-2抗體1A1至細胞表面所表現之人類PAR-2 的交互作用KD爲62.8 pM，以及24.8至134.7 pM之95 %信 賴區間（N = 5實驗之平均）。抗體1 B5於此系統之初次分析指 出3.3 9 nM的KD，以及1 .3 6至5.47 pM之95%信賴區間（N = 2 實驗）。 實施例1 2 :膠原誘發關節炎之誘發作用 此實施例說明利用大鼠之膠原誘發關節炎模式。使用之 前，在2-4 °C於旋轉平板上將豬第II型膠原（10 mg; Chond rex, Redmond, WA)溶解於0.1N醋酸（5 mL)兩天。隨後，使用乳 化針及玻璃注射器以佛氏不完全佐劑（IFA; Difco，Detroit， MI)1:1乳化膠原，產生1 mg/mL之最終濃度。對8週齡雌 Lewis 大鼠（Charles River, Wilmington，MA)在背上 10 個不 -77 - 200909447 同位置（每一位置1 00 y L)經由皮膚內注射乳化之膠原於 IFA誘發疾病。關節炎的臨床開始各異’通常在10至12天 之間，顯現後爪腫脹及活動困難（ambulatory difficulties)。 膠原免疫大鼠之前隨機分配處理組別’以及經由i · P ·投與 PAR-2中和性抗體、對照組抗體（亦即PAR-2無阻斷性抗體） 或運載劑對照組（A5Su)開始治療。第二劑抗體及運載劑是在 開始之前（第9天）投與。 硏究期間發炎的進展是使用卡尺經由時斷時續的後爪 直徑測量作臨床評估。誘發關節炎之前 '在開始當天（第1 〇 天）、第1 1 - 1 7天以及在驗屍日（第1 8天）量取脛踱（踝關節） 關節的讀數。根據下式基於曲線下面積（AUC)計算爪子發炎 的抑制作用： [(處以運載劑之CIA-經處理CIA) / (處以運載劑之CIA)]Xl〇〇 此外，療程處理期間每天測定總體重作爲追加終點，因 爲體重減少在此關節炎模式中與關節發炎的進展平行。 硏究結束時，可鑑定踝關節的骨礦物質密度（BMD) 減少及有絲分裂原活化之蛋白激酶激活蛋白激酶 -2 (mitogen-activated protein kinase-activated kinase-2 ； MAPKAPK-2 或 Μ Κ - 2 )的磷酸化變化。驗屍後在一適當時間點使用雙能量χ _ 射線吸收儀（D E X A)檢查B M D。在軟毛線（恰接近踝關節[跗 關節])移除後爪，浸泡於7 0 %酒精並保存在室溫直到測定 BMD。然後使用扇形狀X -射線光密度計（Model QDR-4500A; Hologic，Waltham，ΜΑ)在水平方向掃描關節，大體敘述於 (Feige et al.，Ce" Mo/ ZW/e 5c ζ· 57:1457; 2000)。掃描之後， 200909447 放置一長方形盒（29X25 mm)在跟骨中心以畫出欲分析之輪 廓，以及使用對儀器有效之演算法（例如Hoi ogic軟體）計算 骨面積、骨礦物質含量以及骨礦物質密度。至於磷分析，使 用市售MK-2分析法，將一踝關節冷凍於液態氮以壓碎爲蛋 白質粉末用於進行西方點墨法。 文中引用之每一參考資料以其全文教示及意圖倂入本 文參考。 【圖式簡單說明】 .f ： " 第1圖提供一組圖比較佐劑誘發關節炎模式中來自大鼠 爪子組織所存在之某些浞發炎細胞激素的水$。 【元件符號說明】 無0 -79 - 200909447 序列表 <11〇> G.度克弗卡（VIRCA, G. Duke) 胡蕭芬西維亞（HU, Shaw-Fen Sylvia)

<120> 糸吉合 PAR-2 之糸吉合抗原之蛋白質（ANTIGEN BINDING PROTEINS THAT BIND PAR-2) <130> A-1290- -NP <140〉 97124011 <141> 2008-06-27 <150> 60/947,264 <151> 2007-06-29 <150> 61/058,094 <151> 2008-06-02 <160> 43 <170> Patentln version 3.4 <210> 1 <211> 1194

<212> DNA <213> 人類（Homo sapiens ) <220> <221> CDS <222> (1) . . (1191) <400> 1 atg egg age ccc age geg geg tgg ctg ctg ggg gee gee ate ctg eta 48

Met Arg Ser Pro Ser Ala Ala Trp Leu Leu Gly Ala Ala lie Leu Leu 15 10 15 gca gee tet etc tee tgc agt ggc acc ate caa gga acc aat aga tee 96

Ala Ala Ser Leu Ser Cys Ser Gly Thr 工le Gin Gly Thr Asn Arg Ser 20 25 30 tet aaa gga aga age ett att ggt aag gtt gat ggc aca tee cac gtc 144

Ser Lys Gly Arg Ser Leu lie Gly Lys Val Asp Gly Thr Ser His Val 35 40 45 act gga aaa gga gtt aca gtt gaa aca gtc ttt tet gtg gat gag ttt 192

Thr Gly Lys Gly Val Thr Val Glu Thr Val Phe Ser Val Asp Glu Phe 50 55 60 tet gca tet gtc etc act gga aaa ctg acc act gtc ttc ett cca att 240

Ser Ala Ser Val Leu Thr Gly Lys Leu Thr Thr Val Phe Leu Pro lie 65 70 75 80 gtc tac aca att gtg ttt gtg gtg ggt ttg cca agt aac ggc atg gee 288

Val Tyr Thr lie Val Phe Val Val Gly Leu Pro Ser Asn Gly Met Ala 85 90 95 ctg tgg gtc ttt ett ttc ega act aag aag aag cac cct get gtg att 336

Leu Trp Val Phe Leu Phe Arg Thr Lys Lys Lys His Pro Ala Val lie 100 105 110 384200909447 tac atg gcc aat ctg gcc ttg get gac etc etc tet gtc ate tgg ttc Tyr Met Ala Asn Leu Ala Leu Ala Asp Leu Leu Ser Val lie Trp Phe 115 120 125 ccc ttg aag att gcc tat cac ata cat ggc aac aac tgg att tat ggg Pro Leu Lys lie Ala Tyr His lie His Gly Asn Asn Trp lie Tyr Gly 130 135 140 gaa get ett tgt aat gtg ett att ggc ttt ttc tat ggc aac atg tac Glu Ala Leu Cys Asn Val Leu lie Gly Phe Phe Tyr Gly Asn Met Tyr 145 150 155 160 tgt tcc att etc ttc atg acc tgc etc agt gtg cag agg tat tgg gtc Cys Ser lie Leu Phe Met Thr Cys Leu Ser Val Gin Arg Tyr Trp Val 165 170 175 ate gtg aac ccc atg ggg cac tcc agg aag aag gca aac att gcc att 工le Val Asn Pro Met Gly His Ser Arg Lys Lys Ala Asn lie Ala lie 180 185 190 ggc ate tcc ctg gca ata tgg ctg ctg att ctg ctg gtc acc ate cct Gly lie Ser Leu Ala lie Trp Leu Leu lie Leu Leu Val Thr lie Pro 195 200 205 ttg tat gtc gtg aag cag acc ate ttc att cct gcc ctg aac ate aeg Leu Tyr Val Val Lys Gin Thr lie Phe lie Pro Ala Leu Asn lie Thr 210 215 220 acc tgt cat gat gtt ttg cct gag cag etc ttg gtg gga gac atg ttc Thr Cys His Asp Val Leu Pro Glu Gin Leu Leu Val Gly Asp Met Phe 225 230 235 240 aat tac ttc etc tet ctg gcc att ggg gtc ttt ctg ttc cca gcc ttc Asn Tyr Phe Leu Ser Leu Ala lie Gly Val Phe Leu Phe Pro Ala Phe 245 250 255 etc aca gcc tet gcc tat gtg ctg atg ate aga atg ctg ega tet tet Leu Thr Ala Ser Ala Tyr Val Leu Met lie Arg Met Leu Arg Ser Ser 260 265 270 gcc atg gat gaa aac tea gag aag aaa agg aag agg gcc ate aaa etc Ala Met Asp Glu Asn Ser Glu Lys Lys Arg Lys Arg Ala lie Lys Leu 275 280 285 att gtc act gtc ctg gcc atg tac ctg ate tgc ttc act cct agt aac lie Val Thr Val Leu Ala Met Tyr Leu lie Cys Phe Thr Pro Ser Asn 290 295 300 ett ctg ett gtg gtg cat tat ttt ctg att aag age cag ggc cag age Leu Leu Leu Val Val His Tyr Phe Leu lie Lys Ser Gin Gly Gin Ser 305 310 315 320 cat gtc tat gcc ctg tac att gta gcc etc tgc etc tet acc ett aac His Val Tyr Ala Leu Tyr lie Val Ala Leu Cys Leu Ser Thr Leu Asn 325 330 335 age tgc ate gac ccc ttt gtc tat tac ttt gtt tea cat gat ttc agg Ser Cys lie Asp Pro Phe Val Tyr Tyr Phe Val Ser His Asp Phe Arg 340 345 350 432 480 528 624 672 720 768 816 864 912 960 1008 1056 1104 200909447 gat cat gca aag aac get etc ett tgc ega agt gtc ege act gta aag

Asp His Ala Lys Asn Ala Leu Leu Cys Arg Ser Val Arg Thr Val Lys 355 360 365 cag atg caa gta tee etc acc tea aag aaa cac tee agg aaa tee age

Gin Met Gin Val Ser Leu Thr Ser Lys Lys His Ser Arg Lys Ser Ser 370 375 380 tet tac tet tea agt tea acc act gtt aag acc tee tat tga

Ser Tyr Ser Ser Ser Ser Thr Thr Val Lys Thr Ser Tyr 385 390 395 <210〉 2 <211> 397

<212> PRT <213> 人類（Homo sapiens) <400〉 2

Met Arg Ser Pro Ser Ala Ala Trp Leu Leu Gly Ala Ala lie Leu Leu 15 10 15

Ala Ala Ser Leu Ser Cys Ser Gly Thr lie Gin Gly Thr Asn Arg Ser 20 25 30

Ser Lys Gly Arg Ser Leu lie Gly Lys Val Asp Gly Thr Ser His Val 35 40 45

Thr Gly Lys Gly Val Thr Val Glu Thr Val Phe Ser Val Asp Glu Phe 50 55 60

Ser Ala Ser Val Leu Thr Gly Lys Leu Thr Thr Val Phe Leu Pro lie 65 70 75 80

Val Tyr Thr lie Val Phe Val Val Gly Leu Pro Ser Asn Gly Met Ala 85 90 95

Leu Trp Val Phe Leu Phe Arg Thr Lys Lys Lys His Pro Ala Val lie 100 105 110

Tyr Met Ala Asn Leu Ala Leu Ala Asp Leu Leu Ser Val lie Trp Phe 115 120 125

Pro Leu Lys lie Ala Tyr His lie His Gly Asn Asn Trp lie Tyr Gly 130 135 140

Glu Ala Leu Cys Asn Val Leu lie Gly Phe Phe Tyr Gly Asn Met Tyr 145 150 155 160

Cys Ser lie Leu Phe Met Thr Cys Leu Ser Val Gin Arg Tyr Trp Val 1152 1194 200909447 165 170 175 lie Val Asn Pro Met Gly His Ser Arg Lys Lys Ala Asn He Ala lie 180 185 190

Gly lie Ser Leu Ala lie Trp Leu Leu lie Leu Leu Val Thr lie Pro 195 200 205

Leu Tyr Val Val Lys Gin Thr lie Phe lie Pro Ala Leu Asn lie Thr 210 215 220

Thr Cys His Asp Val Leu Pro Glu Gin Leu Leu Val Gly Asp Met Phe 225 230 235 240

Asn Tyr Phe Leu Ser Leu Ala lie Gly Val Phe Leu Phe Pro Ala Phe 245 250 255

Leu Thr Ala Ser Ala Tyr Val Leu Met lie Arg Met Leu Arg Ser Ser 260 265 270

Ala Met Asp Glu Asn Ser Glu Lys Lys Arg Lys Arg Ala lie Lys Leu 275 280 285 工le Val Thr Val Leu Ala Met Tyr Leu lie Cys Phe Thr Pro Ser Asn 290 295 300

Leu Leu Leu Val Val His Tyr Phe Leu lie Lys Ser Gin Gly Gin Ser 305 310 315 320

His Val Tyr Ala Leu Tyr lie Val Ala Leu Cys Leu Ser Thr Leu Asn 325 330 335

Ser Cys lie Asp Pro Phe Val Tyr Tyr Phe Val Ser His Asp Phe Arg 340 345 350

Asp His Ala Lys Asn Ala Leu Leu Cys Arg Ser Val Arg Thr Val Lys 355 360 365

Gin Met Gin Val Ser Leu Thr Ser Lys Lys His Ser Arg Lys Ser Ser 370 375 380

Ser Tyr Ser Ser Ser Ser Thr Thr Val Lys Thr Ser Tyr 385 390 395 <210> 3 <211> 399 200909447

<212> PRT <213> 小鼠（Mus musculus) <400> 3

Met Arg Ser Leu Ser Leu Ala Trp Leu Leu Gly Gly lie Thr Leu Leu 1 5 10 15

Ala Ala Ser Val Ser Cys Ser Arg Thr Glu Asn Leu Ala Pro Gly Arg 20 25 30

Asn Asn Ser Lys Gly Arg Ser Leu lie Gly Arg Leu Glu Thr Gin Pro 35 40 45

Pro lie Thr Gly Lys Gly Val Pro Val Glu Pro Gly Phe Ser lie Asp 50 55 60

Glu Phe Ser Ala Ser lie Leu Thr Gly Lys Leu Thr Thr Val Phe Leu 65 70 75 80

Pro Val Val Tyr lie lie Val Phe Val lie Gly Leu Pro Ser Asn Gly 85 90 95

Met Ala Leu Trp lie Phe Leu Phe Arg Thr Lys Lys Lys His Pro Ala 100 105 110

Val lie Tyr Met Ala Asn Leu Ala Leu Ala Asp Leu Leu Ser Val lie 115 120 125

Trp Phe Pro Leu Ala lie Ala Tyr His Leu His Gly Asn Asn Trp Val 130 135 140

Tyr Gly Glu Ala Leu Cys Lys Val Leu lie Gly Phe Phe Tyr Gly Asn 145 150 155 160

Met Tyr Cys Ser lie Leu Phe Met Thr Cys Leu Ser Val Gin Arg Tyr 165 170 175

Trp Val lie Val Asn Pro Met Gly His Pro Arg Lys Lys Ala Asn lie 180 185 190

Ala Val Gly Val Ser Leu Ala lie Trp Leu Leu lie Phe Leu Val Thr 195 200 205 lie Pro Leu Tyr Val Met Lys Gin Thr lie Tyr lie Pro Ala Leu Asn 210 215 220 200909447 lie Thr Thr Cys His Asp Val Leu Pro Glu Glu Val Leu Val Gly 225 230 235

Met Phe Asn Tyr Phe Leu Ser Leu Ala lie Gly Val Phe Leu Phe 245 250 255

Ala lie Leu Thr Ala Ser Ala Tyr Val Leu Met lie Lys Thr Leu 260 265 270

Ser Ser Ala Met Asp Glu His Ser Glu Lys Lys Arg Gin Arg Ala 275 280 285

Arg Leu lie lie Thr Val Leu Ala Met Tyr Phe lie Cys Phe Ala 290 295 300

Ser Asn Leu Leu Leu Val Val His Tyr Phe Leu lie Lys Thr Gin 305 310 315

Gin Ser His Val Tyr Ala Leu Tyr Leu Val Ala Leu Cys Leu Ser 325 330 335

Leu Asn Ser Cys lie Asp Pro Phe Val Tyr Tyr Phe Val Ser Lys 340 345 350

Phe Arg Asp His Ala Arg Asn Ala Leu Leu Cys Arg Ser Val Arg 355 360 365

Val Asn Arg Met Gin lie Ser Leu Ser Ser Asn Lys Phe Ser Arg 370 375 380

Asp 240 Pro Arg lie Pro Arg 320 Thr Asp Thr Lys

Ser Gly Ser Tyr Ser Ser Ser Ser Thr Ser Val Lys Thr Ser Tyr 385 390 395 <210> 4 <211> 397

<212> PRT <213> 大鼠（Rattus rattus) <400> 4

Met Arg Ser Leu Ser Leu Ala Trp Leu Leu Gly Gly lie Thr Leu 15 10 15

Ala Ala Ser Ala Ser Cys Asn Arg Thr Val Asn Ala Pro Gly Pro 20 25 30

Ser Lys Gly Arg Ser Leu lie Gly Arg Leu Asp Thr Pro Pro Pro 35 40 45

Leu Asn lie 200909447

Thr Gly Lys Gly Ala Pro Val 50 55 Glu Pro Gly Phe Ser Val Asp Glu Phe 60 Ser Ala Ser Val Leu Thr Gly 65 70 Lys Leu Thr Thr Val Phe Leu Pro Val 7 5 80 lie Tyr lie lie Val Phe Val 85 lie Gly Leu Pro Ser Asn Gly Met Ala 90 95 Leu Trp Val Phe Phe Phe Arg 100 Thr Lys Lys Lys His Pro Ala Val lie 105 110 Tyr Met Ala Asn Leu Ala Leu 115 Ala Asp Leu Leu Ser Val lie Trp Phe 120 125 Pro Leu Lys lie Ser Tyr His 130 135 Leu His Gly Asn Asp Trp Thr Tyr Gly 140 Asp Ala Leu Cys Lys Val Leu 145 150 lie Gly Phe Phe Tyr Gly Asn Met Tyr 155 160 Cys Ser lie Leu Phe Met Thr 165 Cys Leu Ser Val Gin Arg Tyr Trp Val 170 175 lie Val Asn Pro Met Gly His 180 Ser Arg Lys Arg Ala Asn lie Ala Val 185 190 Gly Val Ser Leu Ala lie Trp 195 Leu Leu lie Phe Leu Val Thr lie Pro 200 205 Leu Tyr Val Met Arg Gin Thr 210 215 lie Tyr lie Pro Ala Leu Asn lie Thr 220 Thr Cys His Asp Val Leu Pro 225 230 Glu Glu Val Leu Val Gly Asp Met Phe 235 240 Ser Tyr Phe Leu Ser Leu Ala 245 lie Gly Val Phe Leu Phe Pro Ala Leu 250 255 Leu Thr Ala Ser Ala Tyr Val 260 Leu Met lie Lys Thr Leu Arg Ser Ser 265 270

Ala Met Asp Glu His Ser Glu Lys Lys Arg Arg Arg Ala lie Arg Leu 275 280 285 200909447 lie lie Thr Val Leu Ser Met Tyr Phe lie Cys Phe Ala Pro Ser Asn 290 295 300

Val Leu Leu Val Val His Tyr Phe Leu lie Lys Ser Gin Arg Gin Ser 305 310 315 320

His Val Tyr Ala Leu Tyr Leu Val Ala Leu Cys Leu Ser Thr Leu Asn 325 330 335

Ser Cys lie Asp Pro Phe Val Tyr Tyr Phe Val Ser Lys Asp Phe Arg 340 345 350

Asp Gin Ala Arg Asn Ala Leu Leu Cys Arg Ser Val Arg Thr Val Lys 355 360 365 f \ , Arg Met Gin lie Ser Leu Thr Ser Asn Lys Phe Ser Arg Lys Ser Ser 370 375 380

Ser Tyr Ser Ser Ser Ser Thr Ser Val Lys Thr Ser Tyr 385 390 395 <210> 5 <211〉 903

<212> DNA <213> 人類（Homo sapiens) <220> <221> CDS <222> (1)..(900) <400> 5 atg egg age ccc age geg geg tgg ctg ctg ggg gcc gcc ate ctg eta Met Arg Ser Pro Ser Ala Ala Trp Leu Leu Gly Ala Ala lie Leu Leu 15 10 15 gca gcc tet etc tcc tgc agt ggc acc ate caa gga acc aat aga tcc Ala Ala Ser Leu Ser Cys Ser Gly Thr lie Gin Gly Thr Asn Arg Ser 20 25 30 tet aaa gga aga age ett att ggt aag gtt gat ggc aca tcc cac gtc Ser Lys Gly Arg Ser Leu lie Gly Lys Val Asp Gly Thr Ser His Val 35 40 45 act gga aaa gga gtt aca gtt gaa aca gtc ttt tet gtg gat gag ttt Thr Gly Lys Gly Val Thr Val Glu Thr Val Phe Ser Val Asp Glu Phe 50 55 60 tet gca tet gtc etc act gga aaa gtc gac aaa act cac aca tgc cca Ser Ala Ser Val Leu Thr Gly Lys Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 65 70 75 80 48 96 144 192 240 ccg tgc cca gca cct gaa etc ctg ggg gga ccg tea gtc ttc etc ttc 288 336200909447

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 85 90 95 ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tcc egg acc cct gag gtc Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val 100 105 110 aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 115 120 125 aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 130 135 140 egg gag gag cag tac aac age aeg tac cgt gtg gtc age gtc etc acc Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 145 150 155 160 gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 165 170 175 tec aac aaa gcc etc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate tec aaa gcc Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Fro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala 180 185 190 aaa ggg cag ccc ega gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tec egg Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 195 200 205 gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 210 215 220 ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 225 230 235 240 gag aac aac tac aag acc aeg cct ccc gtg ctg gac tec gac ggc tec Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 245 250 255 ttc ttc etc tac age aag etc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 260 265 270 ggg aac gtc ttc tea tgc tec gtg atg cat gag get ctg cac aac cac Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 275 280 285 tac aeg cag aag age etc tec ctg tet ccg ggt aaa tga Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 290 295 300 384 432 480 528 576 624 672 720 768 816 864 <210> 6 <211> 300 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) 903 200909447 <400> 6

Met Arg Ser Pro Ser Ala Ala Trp Leu Leu Gly Ala Ala lie Leu Leu 15 10 15

Ala Ala Ser Leu Ser Cys Ser Gly Thr lie Gin Gly Thr Asn Arg Ser 20 25 30

Ser Lys Gly Arg Ser Leu lie Gly Lys Val Asp Gly Thr Ser His Val 35 40 45

Thr Gly Lys Gly Val Thr Val Glu Thr Val Phe Ser Val Asp Glu Phe 50 55 60

Ser Ala Ser Val Leu Thr Gly Lys Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 65 70 75 80 /·

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 85 90 95

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val 100 105 110

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 115 120 125

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 130 135 140

Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 145 150 155 160

Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 165 170 175

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala 180 185 190

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 195 200 205

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 210 215 220

Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 225 230 235 240 200909447

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 245 250 255

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 260 265 270

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 275 280 285

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 290 295 300 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213〉人造 <220> <223>胜肽 <400> 7

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 8 <211> 378

<212> DNA <213> 人類（Homo sapiens) <400> 8 60 120 180 240 300 360 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc tcctgtaagg gttctggata caactttatc agccactgga tcggctgggt gcgccagatg cccgggaaag gcctggagtg gatggggatg atctatcctg gtgactctga taccagatac agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcaa taccgcctac ctgcagtgga gaagcctgaa ggcctcggac accgccatgt atttctgtgc gagacatgga ggtataactg gaactacctt ctactacgac ttcggtatgg acgtctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctca <210> 9

<211> 126 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens) <400> 9

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 378 200909447 1 5 10 15 Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe lie Ser His 20 25 30

Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Met lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Trp Arg Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg His Gly Gly lie Thr Gly Thr Thr Phe Tyr Tyr Asp Phe Gly 100 105 110

Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 10 <211> 321

<212> DNA <213> 人類（Homo sapiens) <400> 10 60 120 180 240 300 tcctatgagc tgacacagcc accctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc acctgctctg gagatgcatt gccaaagcaa tatgcttctt ggtaccagca gaagccaggc caggcccctc tattggtgat atatagagac agtgagaggc cctcagggct ccctgagcga ttctctggct ccagctcagg gacaacagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa gacgaggctg actattactg tcaatcggca gacagcggtg gttcttatgt cttcggcact gggaccaagg tcaccgtcct a <210> 11 <211> 107

<212> PRT <213> 人類（Homo sapiens) <400> 11

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 1 5 10 15 321 200909447

Thr Ala Arg lie Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gin Tyr Ala 20 25 30

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Leu Leu Val lie Tyr 35 40 45

Arg Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Leu Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr lie Ser Gly Val Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Ala Asp Ser Gly Gly Ser Tyr 85 90 95

Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 12 <211〉 378

<212> DNA <213> 人類（Homo sapiens) <400> 12 60 120 180 240 300 360 378 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagt ccggggagtc tctgaagatc tcctgtaagg gttctggata cagcttttcc aactactgga tcggctgggt gcgccagatg cccgggaaag gcctggagtg gatgggaatc atctatcctg gtgactctga taccagatac agcccgtcct tccagggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag aaccgcctac ctacagtgga gcagtttgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacataaa ggtataactg gaactacctt ctactacgac tacggcatgg acgtctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctca <210> 13

<211〉 126 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens) <400> 13

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Glu 1 5 10 15

Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 200909447 35 40 45

Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg His Lys Gly He Thr Gly Thr Thr Phe Tyr Tyr Asp Tyr Gly 100 105 110

Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 14 <2ii> 321

<212> DNA <213> 人類（Homo sapiens ) <40〇> 14 60 120 180 240 300 321 tcctatgagt tgacacagcc accctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc acctgctctg gagaagcttt gccaaaacaa tatgcttctt ggtaccagca gaagccaggc caggcccctg tcttggtgat atatagagac actgagaggc cctcagggat ccctgagcga ttctctggct ccagctcagg gacaacagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa gacgaggctg actattactg tcaatcagca gacagcaatg gtgcttatgt cttcggaact gggaccaggg tcaccgtcct a <210> 15 <211> 107

<212> PRT <213> 人類（Homo sapiens) <40〇> 15

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 1 5 10 15

Thr Ala Arg lie Thr Cys Ser Gly Glu Ala Leu Pro Lys Gin Tyr Ala 20 25 30

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45 -14- 200909447

Arg Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr lie Ser Gly Val Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Ala Asp Ser Asn Gly Ala Tyr 85 90 95

Val Phe Gly Thr Gly Thr Arg Val Thr Val Leu 100 105 <210> 16 <211> 378

<212> DNA <213> 人類（Homo sapiens) <400> 16 60 120 180 240 300 360 378 gaggtgcagt tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg cccgggaaag gcctggagtg gatgggaatc atctatcctg gtgactctga taccagatac agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag aaccgcctac ctacagtgga gcagtttgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacataaa ggtataactg gaactacctt ctactacgac tacggcatgg acgtctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctca <210> 17

<211> 126 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens) <400> 17

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Arg Thr Ala Tyr 200909447 65 70 75 80

Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg His Lys Gly lie Thr Gly Thr Thr Phe Tyr Tyr Asp Tyr Gly 100 105 110

Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 18 <211> 321 <212> DNA <213> 人類（Homo sapiens) <400> 18 tcctatgagt tgacacagcc accctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60 acctgctctg gagaagcttt gccaaagcaa tatgcttctt ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tcttggtgat atataaagac agtgagaggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccagctcagg gacaacagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa 240 gacgaggctg actattactg tcaatcagca gacagcaatg gtgcttatgt cttcggaact 300 ggaaccaagg tcaccgtcct a 321 <210> 19 <211> 107

<212> PRT <213> 人類（Homo sapiens) <400> 19

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg lie Thr Cys Ser Gly Glu Ala Leu Pro Lys Gin Tyr Ala 20 25 30

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr He Ser Gly Val Gin Ala Glu 65 70 75 80 -16- 200909447

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Ala Asp Ser Asn Gly Ala Tyr 85 90 95

Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 <210> 20 <211> 318 <212> DNA <213> 人類（Homo sapiens) <40〇> 20 tcctatgagc tgactcagcc actctcagtg tcagtggccc tgggacagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa aatgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctatagggat agcaaccggc cctctgggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcagagc ccaagccggg 240 gatgaggctg actattactg tcaggtgtgg gacagcagca ctgcggtatt cggcggaggg 300 accaagctga ccgtccta 318

<210> 21 <211〉 106 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens) <4〇0> 21

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gin 1 5 10 15

Thr Ala Arg lie Thr Cys Gly Gly Asn Asn lie Gly Ser Lys Asn Val 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Arg Ala Gin Ala Gly 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Val Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 60 200909447 <210> 22 <211〉 366 <212〉 DNA <213〉 人類（Homo sapiens) <400> 22 120 180 240 300 360 366 caggtgcaac tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactttt ttcactgggt gcgacaggcc cctggacaag ggcttgagtg ggtgggatgg atcaacccta acagtggtgc cacacacttt gcacagaaat ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag tacagcctac atggaactga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatggc tccaactgga accgcgacta cggtatggac gtctggggcc aggggaccac ggtcaccgtc tcctca <210> 23

<211> 122 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens) <4〇〇> 23

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30

Phe Phe His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Ala Thr His Phe Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Gly Ser Asn Trp Asn Arg Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 -18- 200909447 <210> 24 <211> 330 <212> DNA <213> 人類（Homo sapiens) <400> 24 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga attaatcatg tatattggta ccagcaactc 120 ccaggaacgg cccccaaaat cttcatctat aggaataatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gtatgggatg acagtctgag tggtgtggta 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 25

<211> 111 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens) <4〇〇> 25

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin 15 10 15

Arq Val Thr lie Ser Cvs Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly lie Asn 20 25 30

His Val Tyr Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys lie Phe 35 40 45 lie Tyr Arg Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95

Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 26 <211> 363 <212> DNA <213> 人類（Homo sapiens) <400> 26 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 -19- 200909447 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agetatggea tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag ageegaggae acggctgtgt attactgtgc gagagatetg 300 ggagcagcag ctggtactgg ttttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tea 363 <210> 27

<211> 121 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens) <400> 27

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Leu Gly Ala Ala Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <21〇> 28 <211> 333

<212> DNA <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 28 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 -20 - 120200909447 tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgctggtgtg gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc eta 180 240 300 333 <210> 29 <211> 111 <212> PRT <213> 人類（Horao sapiens) <400> 29 Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gin 15 10 15 f Lys Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asn Asn 20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly lie Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95

Ser Ala Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 30 <211> 375 <212> DNA <213> 人類（Homo sapiens) <400> 30 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagag ctgcttggaa ctggatcagg cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat aatgattttg cagtatctgt gagaagtega ataaccatca ccccagacac atccaagaac 60 120 180 240 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 360 200909447 375 agagatagga acagtggcta ctactactac ggtttggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca <210> 31 <211> 125

<212> PRT <213> (Homo sapiens ) <400〉 31

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala lie Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30

Arg Ala Ala Trp Asn Trp 工le Arg Gin Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Phe Ala 50 55 60

Val Ser Val Arg Ser Arg lie Thr lie Thr Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80

Gin Phe Ser Leu Gin Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Asn Ser Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 32 <211> 321

<212> DNA <213> 人類（Homo sapiens) <400〉 32 60 120 180 240 aaaatagtga tgacgcagtc tccagctacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt aacaacttag cctggtatca gcagaaacct ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcaccag cctacagtct gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggcctctcac tttcggcgga -22 - 300 200909447 321 gggaccaagg tggagatcaa a <210> 33 <211> 107

<212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <40〇> 33

Lys lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Asn Asn 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Thr Ser Leu Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Asn Trp Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 34 <211> 375

<212> DNA <213> 人類（Homo sapiens) <400> 34 60 120 180 240 300 360 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagag ctgcttggaa ctggatcagg cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat aatgatcatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca ccccagacac atccaagaac cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca aagctgtgta ttactgtgca agagatagga acagtggcta ctactactac ggtttggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca <210> 35 <211> 125 375 -23 - 200909447

<212> PRT <213> (Homo sapiens) <400> 35

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala lie Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30

Arg Ala Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp His Ala 50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg lie Thr lie Thr Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80

Gin Phe Ser Leu Gin Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Lys Ala Val 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Asn Ser Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 36 <211〉 321

<212> DNA <213> 人類（Homo sapiens) <400> 36 60 120 180 240 300 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt aacaacttag cctggtacca gcagaaacct ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcaccag cctacagtct gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggcctctcac tttcggcgga gggaccaagg tggagatcaa a <210> 3Ί <211> 107

<212> PRT <213> 人類（Homo sapiens) -24 - 321 200909447 <400> 37

Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Asn Asn 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Thr Ser Leu Gin Ser 65 70 7 5 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Asn Trp Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 38 <211> 473 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> 1A1人類-小鼠嵌合體 <4〇〇> 38

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu 20 25 30

Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly 35 40 45

Tyr Asn Phe lie Ser His Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly 50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Met lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr 65 70 75 80

Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys 200909447 85 90 95

Ser lie Asn Thr Ala 100 Tyr Leu Gin Trp Arg Ser Leu Lys Ala Ser Asp 105 110 Thr Ala Met Tyr Phe 115 Cys Ala Arg His Gly Gly lie Thr Gly Thr Thr 120 125 Phe Tyr Tyr Asp Phe 130 Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 135 140 Thr Val Ser Ser Ala 145 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 150 155 160 Pro Cys Ser Arg Ser 165 Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 170 175 Val Lys Asp Tyr Phe 180 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 165 190 Ala Leu Thr Ser Gly 195 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser 200 205 Gly Leu Tyr Ser Leu 210 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe 215 220 Gly Thr Gin Thr Tyr 225 Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr 230 235 240 Lys Val Asp Lys Thr 245 Val Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys 250 255 lie Cys Thr Val Pro 260 Glu Val Ser Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Lys 265 270 Pro Lys Asp Val Leu 275 Thr lie Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val 280 285 Val Val Asp lie Ser 290 Lys Asp Asp Pro Glu Val Gin Phe Ser Trp Phe 295 300 Val Asp Asp Val Glu 305 Val His Thr Ala Gin Thr Gin Pro Arg Glu Glu 310 315 320 Gin Phe Asn Ser Thr 325 Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro 工le Met His 330 335 -26 - 200909447

Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala 340 345 350

Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Arg 355 360 365

Pro Lys Ala Pro Gin Val Tyr Thr lie Pro Pro Pro Lys Glu Gin Met 370 375 380

Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met lie Thr Asp Phe Phe Pro 385 390 395 400

Glu Asp lie Thr Val Glu Trp Gin Trp Asn Gly Gin Pro Ala Glu Asn 405 410 415

Tyr Lys Asn Thr Gin Pro lie Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val 420 425 430

Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr 435 440 445

Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu 450 455 460

Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 39 <211> 108 <212> PRT <213> 人造 <220> <223> 輕鏈共有序列 <220> <221> raise feature <222> (5) 7(5) <223> Xaa可爲Thr或Met <220> <221> misc 一feature <222> (25)' 7.(25) <223> Xaa可爲Glu或Asp <220> <221> misc feature <222> (33)' 7.(33) 200909447 <223> Xaa 可爲 Ser 或 Tyr <220> <221> misc—feature <222> (44)7. (44) <223> Xaa 可爲 Leu 或 Val <220> <22X> mi s c—feature <222> (49)7. (49) <223> Xaa 可爲 Arg 或 Lys <220> <221> misc_feature <222> (51)7.(51) <223> Xaa 可爲 Thr 或 Ser <220> <221> misc一feature <222> (57)T. (57) <223> Xaa 可爲工le 或 Leu <220> <221> misc—feature <222> (93)7. (93) <223> Xaa 可爲 Asn 或 Gly <220> <221> misc一feature <222> (95)7.(95) <223> Xaa 可爲 Ala 或 Ser <220> <221> misc一feature <222> (96)7.(96) <223> Xaa可爲Tyr或無 <220> <221> misc—feature <222> (1047.-(104) <223 > Xaa 可爲 Arg 或 Lys <400> 39

Ser Tyr Glu Leu Xaa Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 1 5 10 15 Thr Ala Arg lie Thr Cys Ser Gly Xaa Ala Leu Pro Lys Gin Tyr Ala 20 25 30

Xaa Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Xaa Leu Val lie Tyr 35 40 45

Xaa Asp Xaa Glu Arg Pro Ser Gly Xaa Pro Glu Arg phe Ser Gly Ser 50 55 60 2 00909447

Ser Ser Gly Thr Thr Val T 65 70

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr C 85

Tvr Val y o 1 o

Thr Gly

Leu Thr lie Ser Gly Val Gin Ala Glu 75 80 Gin Ser Ala Asp Ser Xaa Gly Xaa Xaa 90 95 Xaa Val Thr Val Leu 105 <210> 40 <211〉 126 <212> PRT <213> 人造 <22〇> <223> 重鏈共有序列 <22〇> <221> misc feature <222> (14)7.(14) <223> Xaa可爲Pro或 Ser <220> <221> misc feature <222> (28)7.(28) <223> Xaa可爲Ser或 Asn <220> <221> misc feature <222> (30)7.(30) <223> Xaa可爲Ser或 lie <220> <221> misc feature <222> (31)7.(31) <223> Xaa可爲As π或 Ser <22〇> <221> misc feature <222> (32)7.(32) <223> Xaa可爲Tyr或 His <220> <221> misc feature <222> (50) . . (50) <223> Xaa可爲lie或 Met <220> <221〉 misc feature <222> (77)7.(77) <223> Xaa可爲Arg或 Asn <220〉 <221> misc feature <222> (84)7.(84) <223> X33可爲Ser或 Arg 或Thr -29 - 200909447 <220> <221> misc_feature <222> (95)7.(95) <223> Xaa 可爲 Tyr 或 Phe <220〉 <221> misc_feature <222> (1〇〇Τ·.(100) <223> Xaa 可爲 Lys 或 Gly <220> <221> misc_feature <222> (lllT..(111) <223〉Xaa 可爲 Tyr 或 Phe <400> 40 Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Xaa Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Xaa Phe Xaa Xaa Xaa 20 25 30

Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Xaa lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Xaa Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Trp Xaa Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Xaa Cys 85 90 95

Ala Arg His Xaa Gly lie Thr Gly Thr Thr Phe Tyr Tyr Asp Xaa Gly 100 105 110

Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> 人造 <220> <223> 鏈共有序列 -30 - <220> 200909447 <221> misc—feature <222〉 (1).7(1) <223〉Xaa 可爲 Lys 或 Glu <400> 41

Xaa lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Asn Asn 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Thr Ser Leu Gin Ser 65 7 0 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Asn Trp Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 42 <211〉 125 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223〉 重鏈共有序列 <220> <221> misc feature <222> (63)7.(63) <223> Xaa可爲Phe或 His <220> <221〉 misc feature <222> (68)7.(68) <223> Xaa可爲Arg或 Lys <220〉 <221> misc feature <222> (94)7.(94) <223> Xaa可爲Thr或 Lys <400> 42 200909447

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala lie Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30

Arg Ala Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Xaa Ala 50 55 60

Val Ser Val Xaa Ser Arg lie Thr lie Thr Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80

Gin Phe Ser Leu Gin Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Xaa Ala Val 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Asn Ser Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 43 <211> 256 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> Flag/Fc 構築 <400> 43

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Lys Thr 20 25 30

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 35 40 45

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 50 55 60

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 65 70 75 80 200909447

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 85 90 95

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 100 105 110

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 115 120 125

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr 130 135 140 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 145 150 155 160

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 165 170 175

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser 180 185 190

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 195 200 205

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 210 215 220

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 225 230 235 240

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 250 255 -33 -

Claims (1)

1. 200909447 十、申請專利範圍： 1. 一種經單離之抗原結合蛋白，具有重鏈及輕鏈，該重鏈含 有至少95 %相同於SEQ ID NO:9之可變區域，以及該輕鏈 含有至少95%相同於5已(^10 1^0:11之可變區域。 2 .如申請專利範圍第1項之抗原結合蛋白，其中輕鏈可變區 域具有SEQ ID NO:39之胺基酸序列，以及重鏈可變區域 具有SEQ ID NO:40之胺基酸序列。 3 .如申請專利範圍第1項之抗原結合蛋白，其中輕鏈可變區 域具有選自由 SEQ ID NO:ll、SEQ ID NO:15 以及 SEQ ID NO : 1 9所組胺基酸序列群組之胺基酸序列，以及重鏈可變 區域具有選自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13以及SEQ ID NO: 1 7所組胺基酸序列群組之胺基酸序列。 4. 如申請專利範圍第1項之抗原結合蛋白，其係選自由下所 組群組： a) —種抗原結合蛋白，其中輕鏈可變區域具有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列，以及重鏈可變區域具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列； b) —種抗原結合蛋白，其中輕鏈可變區域具有SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，以及重鏈可變區域具有SEQ ID NO: 13之胺基酸序列；以及 c) 一種抗原結合蛋白，其中輕鏈可變區域具有SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，以及重鏈可變區域具有SEQ ID NO: 17之胺基酸序列。 5. —種經單離之抗原結合蛋白，具有重鏈以及輕鏈，重鏈含 200909447 有三個互補決定區域（CDRs)命名爲 CDRl、CDR2以及 CDR3，以及輕鏈含有三個互補決定區域命名爲CDR1、 CDR2以及CDR3，其中 a) 重鏈CDR1具有選自由SEQ ID NO:9之胺基酸31至35、 SEQ ID NO:13之胺基酸31至35以及SEQ ID NO:17之 胺基酸3 1至3 5所組胺基酸序列群組之胺基酸序列； b) 重鏈CDR2具有選自由SEQ IDNO:9之胺基酸50至66、 SEQ ID NO:13之胺基酸50至66以及SEQ ID NO:17之 ( 胺基酸50至66所組胺基酸序列群組之胺基酸序列；以 及 c) 重鏈CDR3具有選自由SEQ ID NO:9之胺基酸99至 115、SEQ ID NO:13 之胺基酸 99 至 115 以及 SEQ ID NO: 1 7之胺基酸99至1 1 5所組胺基酸序列群組之胺基酸 序列； 以及 a’）輕鏈CDR1具有選自由SEQ ID ΝΟ:11之胺基酸23至 % 33、SEQIDNO:15 之胺基酸 23 至 33 以及 SEQIDNO:19 之胺基酸2 3至3 3所組胺基酸序列群組之胺基酸序列； b’）輕鏈CDR2具有選自由SEQ ID ΝΟ:11之胺基酸49至 55、SEQ ID NO:15 之胺基酸 49 至 55 以及 SEQ ID NO:19 之胺基酸49至55所組胺基酸序列群組之胺基酸序列； 以及 c’）輕鏈CDR3具有選自由SEQ ID ΝΟ:11之胺基酸88至 97、SEQ ID NO:15 之胺基酸 88 至 97 以及 SEQ ID NO:19 200909447 之胺基酸8 8至97所組胺基酸序列群組之胺基酸序列。 6.如申請專利範圍第5項之抗原結合蛋白，該重鏈進一步含 有一至四個骨架區域（FRs)，命名爲FR1、FR2、FR3以及 FR4，以及輕鏈進一步含有一至四個骨架區域，命名爲 FR1、FR2、FR3 以及 FR4，其中 a) 重鏈FR1具有選自由SEQ ID NO:9之胺基酸1至30、SEQ IDNO:13之胺基酸1至30以及SEQ ID NO:17之胺基酸 1至2 5所組胺基酸序列群組之胺基酸序列； b) 重鏈FR2具有選自由SEQ IDNO:9之胺基酸36至49、 SEQ ID NO:13之胺基酸36至49以及SEQ ID NO:17之 胺基酸3 6至4 9所組胺基酸序列群組之胺基酸序列； c) 重鏈FR3具有選自由SEQIDNO:9之胺基酸67至98、 SEQ ID NO:13之胺基酸67至98以及SEQ ID NO:17之 胺基酸67至98所組胺基酸序列群組之胺基酸序列；以 及 d) 重鏈FR4具有選自由SEQ ID NO:9之胺基酸116至 126、SEQ ID NO:13 之胺基酸 116 至 126 以及 SEQ ID NO: 17之胺基酸1 16至126所組胺基酸序列群組之胺基 酸序列； 以及 a’）輕鏈FR1具有選自由SEQIDNO:ll之胺基酸1至22、 SEQ ID NO:15之胺基酸1至22以及SEQ ID NO:19之 胺基酸1至22所組胺基酸序列群組之胺基酸序列； b’）輕鏈FR2具有選自由SEQ ID ΝΟ:11之胺基酸34至48、 200909447 SEQ ID NO:15之胺基酸34至48以及SEQ ID NO:19之 胺基酸34至48所組胺基酸序列群組之胺基酸序列； c’）輕鏈FR3具有選自由SEQ ID ΝΟ:11之胺基酸56至87、 SEQ ID NO:15之胺基酸56至87以及SEQ ID NO:19之 胺基酸56至87所組胺基酸序列群組之胺基酸序列；以 及 d’）輕鏈FR4具有選自由SEQ ID N〇:ll之胺基酸98至 107、SEQ ID NO:15 之胺基酸 98 至 107 以及 SEQ ID NO: 1 9之胺基酸98至1 07所組胺基酸序列群組之胺基 酸序列。 7·—種抗原結合蛋白，具有重鏈及輕鏈，該重鏈含有至少95% 相同於SEQ ID NO :31之可變區域，以及該輕鏈含有至少 95%相同於8£卩1〇]^0:35之可變區域。 8 .如申請專利範圍第7項之抗原結合蛋白，其中輕鏈可變區 域具有SEQ ID NO :41之胺基酸序列，以及重鏈可變區域 具有SEQ ID NO:42之胺基酸序列。 9.如申請專利範圍第7項之抗原結合蛋白，其中輕鏈可變區 域具有選自由SEQ ID NO:33以及SEQ ID NO:37所組胺基 酸序列群組之胺基酸序列，以及重鏈可變區域具有選自由 SEQ ID NO:3 1以及SEQ ID NO:35所組胺基酸序列群組之 胺基酸序列。 1 0•如申請專利範圍第7項之抗原結合蛋白，其係選自由下所 組群組： a) —種抗原結合蛋白，其中輕鏈可變區域具有SEQ ID 200909447 NO:33之胺基酸序列，以及重鏈可變區域具有SEQ ID NO:31之胺基酸序列；以及 b)—種抗原結合蛋白，其中輕鏈可變區域具有SEQ ID NO:37之胺基酸序列，以及重鏈可變區域具有SEQ ID NO:35之胺基酸序列。 11.一種經單離之抗原結合蛋白，具有重鏈以及輕鏈，重鏈含 有三個互補決定區域（CDRS)命名爲 CDR1、CDR2以及 CDR3，以及輕鏈含有三個互補決定區域命名爲CDR1、 CDR2以及CDR3，其中 a) 重鏈CDR1具有選自由SEQ ID NO:31之胺基酸31至37 以及S E Q ID Ν Ο : 3 5之胺基酸3 1至3 7所組胺基酸序列 群組之胺基酸序列； b) 重鏈CDR2具有選自由SEQ ID NO:31之胺基酸52至69 以及SEQ ID NO:35之胺基酸52至69所組胺基酸序列 群組之胺基酸序列；以及 c) 重鏈CDR3具有選自由SEQ ID NO:31之胺基酸102至 114以及SEQ IDNO:35之胺基酸102至114所組胺基酸 序列群組之胺基酸序列； 以及 a，）輕鏈CDR1具有選自由SEQ ID NO:33之胺基酸24至34 以及S E Q I D Ν Ο : 3 7之胺基酸2 4至3 4所組胺基酸序列 群組之胺基酸序列； b，）輕鏈CDR2具有選自由SEQ ID NO:33之胺基酸50至56 以及S E Q ID Ν Ο : 3 7之胺基酸5 0至5 6所組胺基酸序列 97 200909447 群組之胺基酸序列；以及 C’）輕鏈CDR3具有選自由SEQIDNO:33之胺基酸89至 以及SEQ ID NO:37之胺基酸89至97所組胺基酸序 群組之胺基酸序列。 12.如申請專利範圍第11項之抗原結合蛋白，該重鏈進一 含有一至四個骨架區域（FRs)，命名爲FR1、FR2、FR3 及FR4，以及輕鏈進一步含有一至四個骨架區域，命名 FR1、FR2、FR3 以及 FR4，其中 a) 重鏈FR1具有選自由SEQ ID NO:31之胺基酸1至30 及SEQ ID NO:35之胺基酸1至30所組胺基酸序列群 之胺基酸序列； b) 重鏈FR2具有選自由SEQ ID NO:31之胺基酸38至 以及S E Q ID Ν Ο : 3 5之胺基酸3 8至5 1所組胺基酸序 群組之胺基酸序列； c) 重鏈FR3具有選自由SEQ ID NO:31之胺基酸70至1 以及S E Q I D Ν Ο : 3 5之胺基酸7 0至1 0 1所組胺基酸序 群組之胺基酸序列；以及 d) 重鏈FR4具有選自由SEQIDNO:31之胺基酸115至1 以及SEQ IDNO:35之胺基酸115至125所組胺基酸序 群組之胺基酸序列： 以及 a’）輕鏈FR1具有選自由SEQIDNO:33之胺基酸1至23 及S E Q ID Ν Ο : 3 7之胺基酸1至2 3所組胺基酸序列群 之胺基酸序列； 列 步 以 爲 以 組 5 1 列 0 1 列 25 列 以 組 200909447 b’）輕鏈FR2具有選自由SEQ ID NO:33之胺基酸35至49 以及S E Q ID Ν Ο : 3 7之胺基酸3 5至4 9所組胺基酸序列 群組之胺基酸序列； c’）輕鏈FR3具有選自由SEQ ID NO:33之胺基酸57至88 以及S E Q I D Ν Ο : 3 7之胺基酸5 7至8 8所組胺基酸序列 群組之胺基酸序列；以及 d’）輕鏈FR4具有選自由SEQIDNO:33之胺基酸98至107 以及S E Q ID N 0 : 3 7之胺基酸9 8至1 0 7所組胺基酸序列 群組之胺基酸序列。 1 3 . —種經單離之抗原結合蛋白，其係選自由下所組群組： a) —種抗原結合蛋白，含有輕鏈可變區域具有SEQ ID ΝΟ:11之胺基酸序列，以及重鏈可變區域具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列； b) —種抗原結合蛋白，含有輕鏈可變區域具有SEQ ID NO:15之胺基酸序列，以及重鏈可變區域具有SEQ ID NO: 13之胺基酸序列； c) 一種抗原結合蛋白，含有輕鏈可變區域具有SEQ ID NO:19之胺基酸序列，以及重鏈可變區域具有SEQ ID NO: 17之胺基酸序列； d) —種抗原結合蛋白，含有輕鏈可變區域具有SEQ ID NO:25之胺基酸序列，以及重鏈可變區域具有SEQ ID NO:23之胺基酸序列； e) —種抗原結合蛋白，含有輕鏈可變區域具有 SEQ ID NO:29之胺基酸序列，以及重鏈可變區域具有SEQ ID 200909447 Ν Ο : 2 7之胺基酸序列； f) —種抗原結合蛋白’含有輕鏈可變區域具有SEQ ID NO:33之胺基酸序列，以及重鏈可變區域具有SEQ ID Ν Ο : 3 1之胺基酸序列；以及 g) —種抗原結合蛋白，含有輕鏈可變區域具有 SEQ ID NO:37之胺基酸序列，及重鏈可變區域具有 SEQ ID Ν Ο : 3 5之胺基酸序列。 1 4 · 一種經單離之核酸’其編碼如申請專利範圍第1至1 3項 中任一項之抗原結合蛋白。 1 5 _如申請專利範圍第1 4項之核酸，其係選自由下所組群組： a) —種核酸，含有具有SEQIDNO:10核苷酸序列之核酸， 以及具有SEQ ID NO:8核苷酸序列之核酸； b) —種核酸，含有具有SEQIDNO:12核苷酸序列之核酸， 以及具有S E Q I D Ν Ο : 1 4核苷酸序列之核酸； c) 一種核酸，含有具有SEQIDNO:16核苷酸序列之核酸， 以及具有SEQIDN0:18核苷酸序列之核酸； d) —種核酸，含有具有SEQIDNO:24核苷酸序列之核酸， 以及具有SEQIDNO:22核苷酸序列之核酸； e) —種核酸，含有具有SEQIDNO:28核苷酸序列之核酸， 以及具有SEQ ID NO:26核苷酸序列之核酸： f) 一種核酸，含有具有S E Q ID Ν Ο : 3 0核苷酸序列之核酸， 以及具有SEQ ID NO:32核苷酸序列之核酸；以及 g) —種核酸，含有具有SEQIDNO:34核苷酸序列之核酸， 以及具有SEQ ID NO: 36核苷酸序列之核酸。 200909447 1 6 . —種載體，含有如申請專利範圍第1 4或1 5項之核酸。 1 7 . —種經單離之宿主細胞，其係經申請專利範圍第1 6項之 載體轉染或轉形。 1 8 .—種製造抗原結合蛋白之方法，其包括在促進表現的條件 下培養申請專利範圍第1 7項之宿主細胞，並從培養基收 取該蛋白質。 1 9 . 一種組成物，含有申請專利範圍第1至1 3項中任一項之 之多胜肽以及生理上可接受稀釋劑、賦形劑或載劑。