CN101743254A - 结合par-2的抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供涉及或源自抗PAR-2抗体的组合物和方法。在特定的实施方案中，本发明提供结合PAR-2的人抗体，这些抗体的PAR-2结合片段和衍生物，以及含有这些片段的PAR-2结合多肽。其他实施方案提供编码这些抗体、抗体片段和衍生物和多肽的核酸，包含这些多核苷酸的细胞，制备这些抗体、抗体片段和衍生物和多肽的方法，和使用这些抗体、抗体片段和衍生物和多肽的方法，包括治疗或诊断患有PAR-2相关疾病或病症的患者的方法。

Description

结合PAR-2的抗原结合蛋白
相关申请的交叉参考
本申请要求享有2008年6月2日提交的U.S.临时申请系列号61/058,094和2007年6月29日提交的U.S.临时申请系列号60/947,264的权益，在此将其引入作为参考。
发明领域
本申请提供涉及PAR-2抗原结合蛋白的组合物和方法。
发明背景
蛋白酶激活受体(PAR)家族是七-跨膜G-偶联受体超家族的一部分。目前存在四种已知PAR，其中三种(PAR-1、-3和-4)是通过凝血酶激活的；第四种(PAR-2)是通过胰蛋白酶或肥大细胞类胰蛋白酶而不是通过凝血酶激活的。PAR广泛分布于各种组织中，并参与多种生理或病理生理现象，如血小板凝集，炎症和心血管、消化或呼吸功能。
PAR不同于其他受体，因为激活受到PAR N端蛋白水解切割的抑制，然后其形成与相同受体多肽的胞外区域(环2)相互作用的束缚(tethered)配体。PAR-2的切割发生在蛋白酶切割结构域的R和S残基之间，切割结构域为SKGRSLIG(SEQ ID NO：2的氨基酸33至40)，这在人、鼠和大鼠PAR-2之间是保守的。模拟束缚配体的肽已经显示出对PAR-2具有对抗作用(Saifeddine等，Br J Pharmacol 118(3)：521-30[1996]；McGuire等，J Pharmacol Exp Ther 309(3)：1124-31[2004])。
PAR-2激活G-蛋白-偶联受体-介导的共有信号转导途径，肌醇1，4，5-三磷酸盐产生和Ca(2+)的动员(mobilization)，以及多个激酶途径，包括ERK、p38MAPK、JNK和IKK。它存在于肾脏、胰腺、胃、肠、气道、皮肤、膀胱和脑的上皮和内皮细胞、肌细胞、成纤维细胞、免疫细胞、神经元和神经胶质细胞上。在炎症过程中存在激活PAR-2的蛋白酶，并且PAR-2通过炎症因子(如肿瘤坏死因子α、白细胞间介素1α和脂多糖)得到上调。此外，利用PAR-2-缺陷或-超表达小鼠的研究证实了该受体在炎症中的作用(Schmidlin等，J.Immunol.169，5315-5321[2002]；Ferrell等，J.Clin.Invest.111，35-41[2003])。因此，本领域中需要开发PAR-2激活的拮抗剂，这在治疗或改善炎症中将是有用的。
附图简述
图1提供了一组图，在佐剂诱发性关节炎模型中比较了大鼠爪组织中存在的特定促炎症细胞因子的水平。
发明概述
在一个方面中，本发明提供了特异性结合人PAR-2的分离的抗原结合蛋白。在本发明的另一个方面中，抗原结合蛋白特异性结合非人灵长类、猕猴(cynomologous monkey)、黑猩猩、非灵长类哺乳动物、啮齿动物、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猫或狗的PAR-2。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包括：a.人抗体；b.嵌合抗体；c.单克隆抗体；d.重组抗体；e.抗原结合抗体片段；f.单链抗体；g.双链抗体(diabody)；h.三链抗体(triabody)；i.四链抗体(tetrabody)；j.Fab片段；k.F(ab’)2片段；I.结构域抗体；m.IgD抗体；n.IgE抗体；o.IgM抗体；p.IgG1抗体；q.IgG2抗体；r.IgG3抗体；s.IgG4抗体；或t.IgG4抗体，这些在铰链区具有至少一个突变，以减轻形成内-H链二硫键的趋势。
在本发明的另一个方面中，本发明提供了具有重链和轻链的分离的抗原结合蛋白，重链包含与SEQ ID NO：9至少95％同一性的可变区，轻链包含与SEQ ID NO：11至少95％同一性的可变区。在另一个实施方案中，重链包含与SEQ ID NO：31至少95％同一性的可变区，轻链包含与SEQ ID NO：35至少95％同一性的可变区。在本发明的另一个方面中，轻链可变区具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ IDNO：40的氨基酸序列。在本发明的另一个实施方案中，轻链可变区具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，重链可变区包含称为CDR1、CDR2和CDR3的3个互补决定区(CDR)，轻链可变区包含称为CDR1、CDR2和CDR3的3个互补决定区(CDR)。在本发明的另一个方面中，重链可变区进一步包含称为FR1、FR2、FR3和FR4的4个框架区(FR)，轻链可变区进一步包含称为FR1、FR2、FR3和FR4的4个框架区(FR)。在本发明的一个实施方案中，重链CDR选自具有SEQ ID NO：9、13、17、23、27、31和35中所示氨基酸序列的肽的CDR，轻链CDR选自具有SEQ ID NO：11、15、19、25、29、33和37中所示氨基酸序列的肽的CDR。
在本发明的一个方面中，所有3个重链CDR选自相同的肽，例如，重链CDR1、CDR2和CDR3来自SEQ ID NO：9，轻链CDR1、CDR2和CDR3来自SEQ ID NO：11等。在本发明的另一个实施方案中，CDR选自不同的肽，例如，重链CDR1来自SEQ ID NO：9，CDR2来自SEQ IDNO：13，CDR3来自SEQ ID NO：17，轻链CDR1来自SEQ ID NO：11，CDR2来自SEQ ID NO：15和CDR3来自SEQ ID NO：19等。可选地，两个CDR选自单个肽，而第3个来自另一个肽。各种这样的组合是可能的。在另一个方面中，框架区可以选自相同的肽，或一个或多个框架区可以选自不同的肽。
在本发明的一个方面中，本发明提供编码上述多肽的核酸。在本发明的另一个方面中，核酸是载体。在本发明的另一个实施方案中，本发明提供用本发明的核酸转化或转染的宿主细胞。在本发明的另一个方面中，提供了制备多肽的方法，包括在促进多肽表达的条件下温育宿主细胞，并收获多肽。
在另一个方面中，本发明提供分泌结合PAR-2的抗原结合蛋白的分离的细胞。在另一个实施方案中，细胞是杂交瘤。在另一个实施方案中，本发明提供制备结合人PAR-2的抗原结合蛋白的方法，包括在使其表达所述抗原结合蛋白的条件下温育所述分离的细胞。
在一个方面中，本发明提供结合蛋白酶激活受体-2(PAR-2)的分离的抗原结合蛋白。在另一个实施方案中，在分离的抗原结合蛋白结合人PAR-2时，会抑制蛋白水解切割和/或随后通过所述人PAR-2的信号传导。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白抑制PAR-2的蛋白水解激活超过约80％。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白结合未切割的PAR-2，并以较低的程度结合切割的PAR-2。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白抑制PAR-2的蛋白水解激活低于约10％。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白基本上相等地结合切割的和未切割的PAR-2。
在另一个方面中，本发明提供了含有抗原结合蛋白的药物组合物。在一个实施方案中，本发明提供了治疗患者病症的方法，包括将所述药物组合物给药于所述患者，其中所述病症是可通过降低所述患者体内PAR-2活性而进行治疗的。在另一个实施方案中，所述患者是人。在另一个实施方案中，所述病症是皮肤、关节、胃肠系统和/或气道的炎症。在另一个实施方案中，该方法进一步包括给予所述患者第二种治疗。在另一个实施方案中，在将所述药物组合物给药于所述患者之前和/或同时和/或之后将所述第二种治疗给予所述患者。在另一个实施方案中，所述第二种治疗包括抗炎剂。在另一个实施方案中，所述第二种药物组合物包括选自非类固醇抗炎药、类固醇和免疫调节剂的药剂。在另一个实施方案中，所述方法包括给予所述患者第三种治疗。
在另一个方面中，本发明提供了延长患者寿命的方法，包括将所述药物组合物给药于所述患者。
在另一个实施方案中，本发明提供了降低有此需要的患者体内PAR-2活性的方法，包括将所述药物组合物给药于所述患者。
在另一个实施方案中，本发明提供了降低有此需要的患者体内PAR-2信号转导的方法，包括将所述药物组合物给药于所述患者。
在另一个方面中，本发明提供了抑制有此需要的患者体内PAR-2蛋白水解激活的方法，包括将所述药物组合物给药于所述患者。
发明详述
本发明提供组合物、试剂盒和方法，这些都涉及结合蛋白酶激活受体2(“PAR-2”)的分子，包括对抗或拮抗PAR-2的分子，如抗-PAR-2抗体，抗体片段和抗体衍生物，例如，拮抗性抗-PAR-2抗体，抗体片段或抗体衍生物。还提供了核酸，及其衍生物和片段，其包括编码结合PAR-2的多肽的全部或部分的核苷酸序列，例如，编码抗-PAR-2抗体、抗体片段或抗体衍生物的全部或部分的核酸，还提供了含有该核酸的质粒和载体，以及含有该核酸和/或载体和质粒的细胞或细胞系。所提供的方法包括，例如，制备、鉴定或分离结合PAR-2的分子(如抗-PAR-2抗体)的方法，测定分子是否结合PAR-2的方法，测定分子是否对抗或拮抗PAR-2的方法，制备含有结合PAR-2的分子的组合物(如药物组合物)的方法，以及将结合PAR-2的分子给药于患者的方法，例如，用于治疗由PAR-2介导的病症的方法，和用于在体内或在体外对抗或拮抗PAR-2生物活性的方法。
使用标准单-或三-字母缩写来表示多核苷酸和多肽序列。除非另外指出，每个多肽序列具有左侧的氨基端和右侧的羧基端；每个单链核酸序列，和每个双链核酸序列的上链，具有左侧的5’端和右侧的3’端。也可以通过说明与参照序列是如何不同的来描述特定的多肽或多核苷酸序列。
在此除非另外限定，结合本发明所用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的意思。此外，除非内容另外需要，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。通常，与在此所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关，以及其技术，所用的命名是本领域公知和常用的那些。除非另外指出，本发明的方法和技术通常根据本领域公知的以及通过本说明书引用和讨论的各种概括性和更具体性参考文献中所述的常规方法来进行。参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第2版，Cold Spring HarborLaboratoyr Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)和Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology(分子生物学通用实验方案)，GreenePublishing Associates(1992)，以及Harlow和Lane，Antibodies：ALaboratory Manual(抗体：实验室手册)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)，在此将其引入作为参考。根据制造商的说明，按照本领域常规完成的或按照在此所述的，进行酶反应和纯化技术。与在此所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学相关，及其实验室程序和技术，所用的术语是本领域公知和常用的那些。标准技术可以用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和传送，以及患者的治疗。
以下术语，除非另外指出，应当理解为具有以下意思：
术语“分离的分子”(其中分子是，例如，多肽、多核苷酸或抗体)是根据其来源或衍生来源的分子，其(1)与伴随其天然状态的天然相关成分无关，(2)基本上没有来自相同物种的其他分子，(3)通过来自不同物种的细胞来表达，或(4)在自然界中不存在，没有人干预。因此，化学合成，或在不同于天然产生细胞的细胞系统中合成的分子，将与其天然相关成分“分离”。使用本领域公知的纯化技术，还可以通过分离提供基本上无天然相关成分的分子。可以通过各种本领域公知的各种方法来测试分子的纯度或均匀性。例如，可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶的染色来测定多肽样品的纯度，以使用本领域公知的技术来观察多肽。对于特定的目的，可以通过使用HPLC或本领域公知的其他用于纯化的方法来提供较高的分辨率。
术语“PAR-2抑制剂”和“PAR-2拮抗剂”可互换使用。各自都是可检测地抑制至少一种PAR-2功能的分子。相反，“PAR-2激动剂”是可检测地提高至少一种PAR-2功能的分子。由PAR-2抑制剂引起的抑制不需要完全，只要使用测试是可检测的。可以使用任何PAR-2的功能测试，在此提供了其实例。可以通过PAR-2抑制剂抑制或通过PAR-2激动剂提高的PAR-2功能实例包括蛋白酶激活的配体结合、下游信号传导等。PAR-2抑制剂和PAR-2激动剂的类型实例包括，但不限于，PAR-2结合多肽，如抗原结合蛋白(例如，PAR-2抑制抗原结合蛋白)、抗体、抗体片段和抗体衍生物。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”各自指的是含有通过肽键相互连接的两个或多个氨基酸残基的分子。这些术语包括，例如，天然和人造的蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物(如突变蛋白质、变体和融合蛋白)，以及翻译后修饰的蛋白质，或另外共价或非共价修饰的蛋白质。肽、多肽或蛋白质可以是单体或多聚的。
如在此所用的“多肽片段”指的是与相应的全长蛋白质相比，具有氨基端和/或羧基端缺失的多肽。片段可以是，例如，长度为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、80、90、100、150或200个氨基酸。片段还可以是，例如，长度为至多1,000、750、500、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11或1O个氨基酸。片段可以在其一端或两端进一步包括一个或多个其他氨基酸，例如，来自不同天然产生蛋白质的氨基酸序列(例如，Fc或亮氨酸拉链结构域)或人造氨基酸序列(例如，人造连接物序列或标记蛋白)。
本发明的多肽包括已经以任何方式和出于任何原因修饰的多肽，这些原因例如为：(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变对形成蛋白复合物的结合亲和性，(4)改变结合亲和性和(4)给予或改变其他物化或功能特性。类似物包括多肽的突变蛋白。例如，可以在天然产生的序列中(例如，在形成分子间接触的结构域的多肽片段中)进行单个或多个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)。“保守氨基酸取代”是基本上没有改变亲本序列的结构特征的取代(例如，替代氨基酸应当不易于破坏亲本序列中产生的螺旋，或破坏表征亲本序列或是其功能性必需的其他类型二级结构)。本领域已知的多肽二级结构和三级结构的实例描述于Proteins，Structures and MolecularPrinciples(蛋白质、结构和分子原理)(Creighton编辑，W.H.Freemanand Company，纽约(1984))；Introduction to Protein Structure(蛋白结构介绍)(C.Branden and J.Tooze编辑，Garland Publishing，纽约，N.Y.(1991))；和Thornton等，Nature 354：105(1991)，在此将每篇都引入作为参考。
本发明还提供PAR-2结合多肽的非肽类似物。非肽类似物在药物工业领域中常用为具有类似于模板肽那些特性的药物。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物”(“peptide mimetics”或“peptideminetics”)。参见，例如，Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber和Freidinger，TINS，p.392(1985)；和Evans等，J.Med.Chem.30：1229(1987)，在此将其引入作为参考。在结构上与治疗有用肽类似的肽模拟物可以用于产生等效的治疗或预防作用。通常，肽模拟物在结构上与范例多肽(即，具有所需生化特性或药物活性的多肽)相似，如人抗体，但具有一个或多个任选由选自以下的键替代的肽连接：--CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH＝CH-(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CH2SO--，使用本领域公知的方法。用相同类型的D-氨基酸系统地替换共有序列的一个或多个氨基酸(例如，D-赖氨酸替代L-赖氨酸)也可以用来产生更稳定的肽。此外，可以通过本领域已知的方法产生含有共有序列或基本上相同的共有序列变体的限制性肽(Rizo和Gierasch，Ann.Rev.Biochem.61：387(1992)，在此引入作为参考)，例如，通过添加能够形成使肽环化的分子内二硫桥键的内部半胱氨酸残基。
多肽(例如，抗体)的“变体”包括相对于另一个多肽序列其中氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基被插入、缺失和/或取代的氨基酸序列。本发明的变体包括融合蛋白。
多肽的“衍生物”是已经化学修饰的多肽(例如，抗体)，例如，通过缀合另一个化学部分(如，例如，聚乙二醇或白蛋白，例如，人血清白蛋白)、磷酸化和糖基化。除非另外指出，除了含有两个全长重链和两个全长轻链以外，术语“抗体”包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白，以下将描述其实例。
“抗原结合蛋白”是含有结合抗原的部分和任选使抗原结合部分采用促进抗原结合蛋白结合抗原的构象的支架或框架部分的蛋白质。抗原结合蛋白的实例包括抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。抗原结合蛋白可以包括，例如，具有移植CDR或CDR衍生物的可替换蛋白支架或人造支架。这样的支架包括，但不限于，抗体衍生的支架，其包含引入例如以稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变，以及完全合成的支架，其含有例如生物相容性聚合物。参见，例如，Kordorfer等，2003，Proteins：Structure，Function andBioinformatics(蛋白质：结构、功能和生物信息)，V53，Issue 1：121-129；Roque等，2004，Biotechnol.Prog.20：639-654。此外，可以使用肽抗体模拟物(“PAM”)，以及基于抗体模拟物的支架，其使用纤维连接蛋白(fibronection)成分作为支架。
抗原结合蛋白可以具有，例如，天然产生的免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是四聚分子。在天然产生的免疫球蛋白中，每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每个对具有一个“轻”(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每个链的氨基端部分包括约100或110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。每个链的羧基端部分限定恒定区，其主要负责效应物功能。人轻链分为κ或λ轻链。重链分为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体的同种型各自限定为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。通常参见，FundamentalImmunology Ch.7(Paul，W编辑，Raven Press，N.Y.(1989))(在此将其全部引入作为参考，用于所有目的)。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。
天然产生的免疫球蛋白链的可变区呈现出通过3个超变区(也称为互补决定区或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)的相同总体结构。从N-端到C-端，轻链和重链都含有结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。对每个结构域的氨基酸指定根据Kabat等的限定，在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，US Dept.ofHealth and Human Services，PHS，NIH，NIH Publication no.91-3242，1991。其他用于免疫球蛋白链中氨基酸的编号系统包括
Figure G2008800222226D00091
(国际ImMunoGeneTics信息系统；Lefrans等，Dev.Comp.Immunol.29：185-203；2005)和AHo(Honegger和Pluckthun，J.Mol.Biol.309(3)：657-670；2001)。
抗体可以获自如含有免疫球蛋白的血清或血浆的来源，该免疫球蛋白具有改变的抗原特异性。如果这样的抗体接受亲和性纯化，可以用特定的抗原特异性将其富集。这样富集的抗体制剂通常由低于约10％的对特定抗原具有特异性结合活性的抗体制成。将这些制剂接受几轮亲和性纯化可以提高对抗原具有特异性结合活性的抗体的比例。以这种方式制得的抗体通常称为“单特异性”。单特异性抗体制剂可以由约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.9％对特定抗原具有特异性结合活性的抗体组成。
除非另外指出，“抗体”指的是完整的免疫球蛋白或其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合部分。可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶或化学切割来产生抗原结合部分。抗原结合部分包括，特别是，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、结构域抗体(dAb)和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体和含有足以给予多肽特异性抗原结合的至少一部分免疫球蛋白的多肽。
Fab片段是具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；F(ab’)2片段是具有两个通过铰链区的二硫桥键连接的Fab片段的二价片段；Fd片段具有VH和CH1结构域；Fv片段具有抗体单臂的VL和VH结构域；dAb片段具有VH结构域、VL结构域或VH或VL结构域的抗原结合片段(US专利No.6,846,634，6,696,245，US申请公开No.05/0202512，04/0202995，04/0038291，04/0009507，03/0039958，Ward等，Nature 341：544-546，1989)。
单链抗体(scFv)是其中VL和VH片段通过连接物(例如，合成的氨基酸残基序列)连接形成连续蛋白链的抗体，其中连接物足够长以使蛋白链在自身上折回并形成单价抗原结合位点(参见，例如，Bird等，1988，Science 242：423-26和Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-83)。双链抗体是含有两个多肽链的二价抗体，其中每个多肽链含有通过连接物连接的VH和VL结构域，连接物太短以致不能使相同链上的两个结构域之间成对，因此使每个结构域与另一条多肽链上的互补结构域配对(参见，例如，Holliger等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-48，和Poljak等，1994，Structure 2：1121-23)。如果双链抗体的两个多肽链相同，那么从配对形成的双链抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可以用于制备具有两个不同抗原结合位点的双链抗体。相似地，三链抗体和四链抗体是各自含有3个或4个多肽链的抗体，并且各自形成3个和4个抗原结合位点，其可以是相同或不同。
可以使用Kabat等，出处同上；Lefranc等，出处同上和/或Honegger和Pluckthun，出处同上，中所述的系统鉴定给定抗体的互补决定区(CDR)和框架区(FR)。可以通过共价或非共价将一个或多个CDR引入分子中，使其成为抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以引入CDR作为较长多肽链的一部分，可以将CDR共价连接另一个多肽链，或可以非共价地引入CDR。CDR允许抗原结合蛋白特异性地结合特定的目标抗原。
抗原结合蛋白可以具有一个或多个结合位点。如果存在多个结合位点，结合位点可以彼此相同或可以不同。例如，天然产生的人免疫球蛋白通常具有两个相同的结合位点，而“双特异性”或“双功能性”抗体具有两个不同的结合位点。
术语“人抗体”包括具有一个或多个源自人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的所有抗体。在一个实施方案中，所有可变区和恒定区源自人免疫球蛋白序列(完全人抗体)。可以以各种方式制备这些抗体，以下将描述其实例，包括通过用小鼠的目标抗原来免疫，小鼠是遗传改变来表达源自人重链和/或轻链编码基因的抗体。
人源化抗体具有不同于源自非人物种的抗体的序列一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加的序列，使得给药于人患者时，与非人物种抗体相比，人源化抗体不太可能诱导免疫应答，和/或诱导不太严重的免疫应答。在一个实施方案中，非人物种抗体的重链和/或轻链的框架区和恒定区中的特定氨基酸突变产生人源化抗体。在另一个实施方案中，将来自人抗体的恒定区与非人物种的可变结构域融合。在另一个实施方案中，改变非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基，以降低给药于人患者时非人抗体可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基对抗体对其抗原的免疫特异性结合不重要，或对氨基酸序列进行的改变是保守性变化，使得人源化抗体对抗原的结合与非人抗体对抗原的结合相比没有明显恶化。怎样制备人源化抗体的实例可以在U.S.专利No.6,054,297，5,886,152和5,887,293中找到。
术语“嵌合抗体”指的是含有一个或多个来自一个抗体的片段和一个或多个来自一个或多个其他抗体的片段的抗体。在一个实施方案中，一个或多个CDR源自人抗-PAR-2抗体。在另一个实施方案中，所有CDR源自人抗-PAR-2抗体。在另一个实施方案中，将来自多个人抗-PAR-2抗体的CDR在嵌合抗体中混合并配对。例如，嵌合抗体可以含有来自第一个人抗-PAR-2抗体轻链的CDR1，来自第二个人抗-PAR-2抗体轻链的CDR2和CDR3以及来自第3个抗-PAR-2抗体重链的CDR。其他组合是可能的，并且包括在本发明的实施方案内。
此外，框架区可以源自一个相同的抗-PAR-2抗体，来自一个或多个不同的抗体，如人抗体，或来自人源化抗体。在嵌合抗体的一个实例中，重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体相同、同源或从其产生，而链的剩余部分与来自另一个物种或术语另一个抗体类别或亚类的抗体相同、同源或产自其。还包括这样的抗体呈现出所需生物活性的片段(即，特异性结合PAR-2的能力)。参见，例如，U.S.专利No.4,816,567和Marrison，1985，Science 229：1202-07。
“中和抗体”或“抑制抗体”是使用测试如实施例中在此描述的那些，过量的抗-PAR-2抗体将激活量减少至少约20％时，抑制PAR-2的蛋白水解激活的抗体。在各种实施方案中，抗原结合蛋白将PAR-2的蛋白水解激活量减少至少约30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％和99.9％。
抗体的片段或类似物可以由本领域普通技术人员按照本说明书的教导和使用本领域公知的技术容易地制备。优选的片段或类似物的氨基-和羧基-端在接近功能性结构域的边界产生。可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公众或专有序列数据库比较来鉴定结构和功能结构域。计算机化的比较方法可以用来鉴定序列基序或预测已知结构和/或功能的其他蛋白中产生的蛋白构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。参见，例如，Bowie等，1991，Science 253：164。
“CDR移植抗体”是含有一个或多个源自特定物种的抗体或同种型的CDR和相同或不同物种的另一个抗体或同种型的框架区的抗体。
“多特异性抗体”是识别一个或多个抗原上的多个表位(epitope)的抗体。该类型抗体的亚类是“双特异性抗体”，其识别相同或不同抗原上的两个不同表位。
如果以1纳摩尔或更低的解离常数结合抗原，抗原结合蛋白“特异性结合”抗原(例如，人PAR-2)。
“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”或“抗原结合位点”是抗原结合蛋白的一部分，其含有与抗原相互作用的氨基酸残基(或其他部分)并有助于抗原结合蛋白对抗原的特异性和亲和性。对于特异性结合抗原的抗体，这将包括至少一个CDR结构域的至少一部分。
“表位”是由抗原结合蛋白(例如，由抗体)结合的分子的一部分。表位可以包含分子的非连续部分(例如，在多肽中，在多肽的初级序列中不连续的氨基酸残基，但在多肽的三级和四级结构的范围中，彼此间足够接近以由抗原结合蛋白来结合)。
使用GAP计算机程序(GCG Wisconsin Package的一部分，10.3版本(Accelrys，San Diego，CA))，使用其缺省参数，通过比较序列来测定两个多核苷酸或两个多肽序列的“同一性百分比”。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”在全文中可互换使用，并包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物(例如，肽核酸和非天然产生的核苷酸类似物)及其杂交体。核酸分子可以单链或双链。在一个实施方案中，本发明的核酸分子含有编码本发明的抗体或其片段、衍生物、突变蛋白或变体的连续开放阅读框。
如果它们的序列能够以反平行方向比对，使得一个多核苷酸中的每个核苷酸与另一个多核苷酸中的互补核苷酸相对，没有引入缺口并在每个序列的5’或3’端没有未配对的核苷酸，那么两个单链聚核苷酸是彼此“互补”的。如果两个多核苷酸可以在中等严谨条件下彼此杂交，那么核苷酸与另一个核苷酸是“互补的”。因此，多核苷酸可以与另一个不是其补体(complement)的多核苷酸是互补的。
“载体”是可以用于将与其连接的另一个核酸引入细胞中的核酸。一种类型的载体是“质粒”，其指的是向其中可以连接其他核酸片段的线性或环状双链DNA分子。另一种类型的载体是病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其中可以将另外的DNA片段引入病毒基因组中。特定的载体能够在将其引入其中的宿主细胞中自主复制(例如，含有细菌复制起点和游离基因哺乳动物载体的细菌载体)。引入宿主细胞中时，将其他载体(例如，非游离基因哺乳动物载体)整合至宿主细胞的基因组中，并由此和宿主基因组一起复制。“表达载体”是一种可以指引选定多核苷酸表达的载体。
如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达的水平、时机或位置)，那么核苷酸序列“可操作地连接”调控序列。“调控序列”是影响与其可操作连接的核酸的表达(例如，表达的水平、时机或位置)的核酸。调控序列可以，例如，直接发挥其对调控的核酸的作用，或通过一个或多个其他分子的作用(例如，结合调控序列和/或核酸的多肽)。调控序列的实例包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酰作用信号)。调控序列的更多实例描述于，例如，Goeddel，1990，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，CA和Baron等，1995，Nuclsic Acids Res.23：3605-06。
“宿主细胞”是可以用于表达核酸例如本发明核酸的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如，大肠杆菌(E.coli)，或可以是真核生物，例如，单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)，植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)，动物细胞(例如，人细胞，猴细胞，仓鼠细胞，大鼠细胞，小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的实例包括猴肾脏细胞的COS-7系(ATCC CRL 1651)(参见Gluzman等，1981，Cell23：175)，L细胞，C127细胞，3T3细胞(ATCC CCL 163)，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物，如Veggie CHO和相关的细胞系，其在无血清培养基中生长(参见Rasmussen等，1998，Cytotechnology 28：31)或CHO株DX-B11，其是DHFR缺陷的(参见，Urlaub等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-20)，Hela细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系，源自非洲绿猴肾脏细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCCCCL 70)(参见McMahan等，1991，EMBO J.10：2821)，人胚胎肾脏细胞，如293，293EBNA或MSR293，人表皮A431细胞，人Colo205细胞，其他转化的灵长类细胞系，正常的二倍体细胞，源自初生组织体外培养的细胞株，初级外植体，HL-60，U937，HaK或Jurkat细胞。通常，宿主细胞是可以用多肽编码核酸转化或转染的培养细胞，然后其可以在宿主细胞中表达。短语“重组宿主细胞”可以用来表示已经用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞还可以是含有核酸但不以所需的水平表达的细胞，除非将调控序列引入宿主细胞中，使其变成与核酸可操作连接的。理解术语宿主细胞不仅指的是特定的主体细胞，而且还指这些细胞的后代或潜在的后代。因为在随后的传代中由于例如突变或环境影响可能发生特定的改变，实际上这样的后代与亲本细胞不相同，但仍然包括在在此所用的术语范围内。
PAR-2
如之前所讨论的，PAR-2是七-跨膜G-偶联的受体超家族的成员；激活受到N端的蛋白水解切割的抑制，形成束缚配体。人PAR-2的核苷酸和氨基酸序列显示于SEQ ID NO：1和2中；小鼠PAR-2的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：3中，大鼠PAR-2的显示于SEQ ID NO：4中。蛋白水解切割产生该受体的活化形式，在此可将其互换地称为“切割的”或“截短的”PAR-2。
抗原结合蛋白
在一个方面中，本发明提供了结合PAR-2(例如，人PAR-2)的抗原结合蛋白(例如，抗体、抗体片段、抗体衍生物、抗体突变蛋白和抗体变体)。
根据本发明的抗原结合蛋白包括抑制PAR-2生物活性的抗原结合蛋白。这样的生物活性实例包括G-蛋白-偶联的受体-介导的通用信号转导途径的激活，如肌醇1，4，5-三磷酸盐生产和Ca(2+)动员，和多重激酶途径的激活，包括ERK、p38MAPK、JNK和IKK。其他生物活性包括在体内通过PAR-2介导的那些，如对创伤和炎症的应答；特别地，PAR-2涉及心血管、肺和胃肠系统，它在其中控制炎症和伤害感受(疼痛的)。PAR-2激活在炎症应答中也起着作用，其慢性激活可以导致病症。
不同的抗原结合蛋白可以结合PAR-2不同的结构域或表位或通过不同的作用机制来起作用。实例包括但不限于干扰PAR-2的蛋白水解激活或抑制信号转导的抗原结合蛋白。作用的位点可以是，例如，胞内(例如，通过影响胞内信号传导级联)或胞外。抗原结合蛋白不需要完全抑制PAR-2诱导的活性来发现本发明中的用途；相反，也可以考虑降低PAR-2特定活性的抗原结合蛋白用于使用。(在此对于PAR-2-结合抗原结合蛋白在治疗特定疾病中的特定作用机制的讨论只是说明性的，并且在此呈现的方法不受理论的束缚)。
本发明范围内的抗-PAR-2抗体的其他衍生物包括抗-PAR-2抗体或其片段与其他蛋白或多肽一起的共价或聚集缀合物，如通过含有与抗-PAR-2抗体多肽的N-端或C-端融合的异种多肽的重组融合蛋白的表达。例如，缀合的肽可以是一种异种的信号(或前导)多肽，例如，酵母α-因子前导序列，或如表位标记物的肽。含有抗原结合蛋白的融合蛋白可以含有添加来促进抗原结合蛋白纯化或鉴定的肽(例如，多-His)。抗原结合蛋白还可以连接
Figure G2008800222226D00151
肽Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)(SEQ ID NO：7)，如Hopp等，Bio/Technology 6：1204，1988，和U.S.专利5,011,912中所述的。
Figure G2008800222226D00152
肽是高度抗原性的并且提供由特异性单克隆抗体(mAb)可逆性结合的表位，能够使表达的重组蛋白快速测试和容易纯化。用于制备其中
Figure G2008800222226D00153
肽融合给定多肽的试剂是可购得的(Sigma-Aldrich，St.Louis MO)。
含有一种或多种抗原结合蛋白的寡聚物可以用作PAR-2拮抗剂。寡聚物可以是共价连接或非共价连接的二聚物、三聚物或更高级别寡聚物的形式。打算将含有两个或多个抗原结合蛋白的寡聚物用于使用，一个实例是同型二聚物。其他寡聚物包括杂二聚物、同型三聚物、杂三聚物、同型四聚物、杂四聚物等。
一个实施方案涉及含有通过融合抗原结合蛋白的肽部分之间的共价或非共价相互作用连接的多个抗原结合蛋白的寡聚物。这样的肽可以是肽连接物(间隔物)或具有促进寡聚作用特性的肽。亮氨酸拉链和源自抗体的特定多肽在可以促进与其连接的抗原结合蛋白寡聚的肽中，如以下更详细地所述的。
在特定的实施方案中，寡聚物包括2个至4个抗原结合蛋白。寡聚物的抗原结合蛋白可以是任何形式的，如上述的任何形式，例如，变体或片段。优选，寡聚物包括具有PAR-2结合活性的抗原结合蛋白。
在一个实施方案中，使用源自免疫球蛋白的多肽制备了寡聚物。含有融合抗体衍生多肽的各个片段(包括Fc结构域)的特定异种多肽的融合蛋白的制备已经得到了描述，例如，Ashkenazi等，1991，PNAS USA88：10535；Byrn等，1990，Nature 344：677；和Hollenbaugh等，1992“Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”(免疫球蛋白融合蛋白的构建)，见Current Protocols in Immunology，增补4，p10.19.1-10.19.11)
本发明的一个实施方案涉及含有两个融合蛋白的二聚物，该融合蛋白通过将抗-PAR-2抗体的PAR-2结合片段与抗体的Fc片段融合来形成。例如，可以通过以下方法来制得二聚物：将编码融合蛋白的基因融合体插入合适的表达载体中，在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达基因融合体，使表达的融合蛋白很像抗体分子那样装配，在其上在Fc部分之间形成链内二硫键，以产生二聚物。
如在此所用的术语“Fc多肽”包括源自抗体Fc片段的多肽的天然和突变蛋白形式。还包括含有促进二聚化的铰链区的该多肽的截断形式。含有Fc部分的融合蛋白(和从其形成的寡聚物)给予了超过蛋白A或蛋白G柱的通过亲和性色谱容易纯化的优势。
一种合适的Fc多肽，在PCT申请WO93/10151中有描述(在此引入作为参考)，是从N-端铰链区延伸至人IgG1抗体的Fc片段的天然C-端的单链多肽。另一种有用的Fc多肽是U.S.专利5,457,035和Baum等，1994，EMBO J.13：3992-4001中所述的Fc突变蛋白。该突变蛋白的氨基酸序列与WO93/10151中呈现的天然Fc序列的相同，除了氨基酸19已经从Leu变成Ala，氨基酸20已经从Leu变成Glu，并且氨基酸22已经从Gly变成Ala。突变蛋白呈现出降低的Fc受体亲和性。
在其他实施方案中，抗-PAR-2抗体的重链和/或轻链可变区可以代替抗体重链和/或轻链的可变区。
可选的，寡聚物是含有多个抗原结合蛋白的融合蛋白，含有或不含肽连接物(间隔物肽)。其中，合适的肽连接物是U.S.专利4,751,180和4,935,233中所述的那些。
制备寡聚抗原结合蛋白的另一种方法涉及使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链结构域是促进蛋白质的寡聚的肽，其中在所述蛋白质中发现所述亮氨酸拉链结构域。亮氨酸拉链最初在几种DNA-结合蛋白中鉴定得到(Landschulz等，1988，Science 240：1759)，并且已经在各种不同的蛋白质中发现。其中，已知的亮氨酸拉链是天然产生的肽及其二聚化或三聚化的衍生物。适用于产生可溶性寡聚蛋白质的亮氨酸拉链结构域的实例描述于PCT申请WO94/10308中，和Hoppe等，1994，FEBS Letters344：191中描述的源自肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链，在此引入作为参考。允许与其融合的异种蛋白稳定三聚的改良亮氨酸拉链的使用描述于Fanslow等，1994，Semin.Immunol.6：267-78中。在一种方法中，在合适的宿主细胞中表达含有融合亮氨酸拉链肽的抗-PAR-2抗体片段或衍生物的重组融合蛋白，并且从培养物上清液中回收可溶性寡聚抗-PAR-2抗体片段或衍生物。
在一个方面中，本发明提供了干扰PAR-2蛋白水解激活的抗原结合蛋白。可以制得这样的抗原结合蛋白来对抗PAR-2，或其片段、变体或衍生物，并且在常规测试中筛选其干扰PAR-2蛋白水解激活的能力。合适的测试实例是测试抗原结合蛋白抑制表达PAR-2细胞的蛋白水解激活能力的测试，或测试抗原结合蛋白降低由细胞表面PAR-2受体的蛋白水解激活引起的生物或细胞应答能力的测试。测试抗原结合蛋白的其他测试包括定性或定量比较抗原结合蛋白与全长、未分离的PAR-2多肽的结合和蛋白水解切割的PAR-2多肽的结合的那些，在此公开了其中的几个实例。
在另一个实施方案中，本发明提供了结合切割PAR-2和未切割PAR-2的抗原结合蛋白。可以在如以上所述那些的常规测试中制得和筛选这样的抗原结合蛋白。
在另一个方面中，本发明提供了证明物种选择性的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，抗原结合蛋白结合一种或多种哺乳动物PAR-2，例如，人PAR-2，和一种或多种小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、奶牛、马、骆驼和非人灵长类PAR-2。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白结合一种或多种灵长类PAR-2，例如，人PAR-2，和一种或多种猕猴、绒猴、恒河猴和黑猩猩PAR-2。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白特异性地结合人、猕猴、绒猴、恒河猴或黑猩猩PAR-2。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白没有结合一种或多种小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、奶牛、马、骆驼和非人灵长类PAR-2。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白没有结合新大陆猴物种，如绒猴。
在另一个实施方案中，除了PAR-2，抗原结合蛋白没有呈现出对任何天然产生蛋白质的特异性结合。在另一个实施方案中，除了哺乳动物PAR-2，抗原结合蛋白没有呈现出对任何天然产生蛋白质的特异性结合。在另一个实施方案中，除了灵长类PAR-2，抗原结合蛋白没有呈现出对任何天然产生蛋白质的特异性结合。在另一个实施方案中，除了人PAR-2，抗原结合蛋白没有呈现出对任何天然产生蛋白质的特异性结合。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白特异性地结合小鼠、大鼠、猕猴和人PAR-2。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白以相似的结合亲和性特异性地结合小鼠、大鼠、猕猴和人PAR-2。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白阻断小鼠、大鼠、猕猴和人PAR-2的蛋白水解激活的结合。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白在Ca2+动员测试中针对小鼠、大鼠、猕猴和人PAR-2具有相似的IC50。
可以使用本领域公知的方法和按照本说明书的教导来测定抗原结合蛋白对PAR-2的选择性。例如，可以使用Western印迹、FACS、ELISA或RIA测定选择性。
在另一个方面中，本发明提供PAR-2结合抗原结合蛋白(例如，抗-PAR-2抗体)，其具有一个或多个以下的特征：结合人和鼠PAR-2，抑制人PAR-2的蛋白水解激活，抑制鼠PAR-2的蛋白水解激活，结合或接近PAR-2的蛋白水解切割位点，引起细胞表面表达的PAR-2相对小的下调。
可以通过常规技术来产生本发明抗原结合蛋白的抗原结合片段。这样的片段实例包括，但不限于，Fab和F(ab’)2片段。考虑了通过遗传工程化技术产生的抗体片段和衍生物。
其他实施方案包括嵌合抗体，例如，非人(例如，鼠)单克隆抗体的人源化形式。可以通过已知技术制备这样的人源化抗体，并在将抗体给药于人时，提供降低的免疫原性的优势。在一个实施方案中，人源化单克隆抗体包含鼠抗体的可变域(或其抗原结合部位的全部或一部分)和源自人抗体的恒定域。可选的，人源化抗体片段可以包含鼠单克隆抗体的抗原结合位点和源自人抗体的可变域片段(缺乏抗原结合位点)。用于生产嵌合和更多工程化单克隆抗体的程序包括以下参考文献中所述的那些：Riechmann等，1988，Nature 332：323，Liu等，1987，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 84：3439，Larrick等，1989，Bio/Technology 7：934和Winter等，1993，TIPS，14：139。在一个实施方案中，嵌合抗体是CDR移植抗体。用于将抗体人源化的技术在例如U.S.专利申请No.10/194,975(2003年2月27日公开)，U.S.专利No.5,869,619，5,225,539，5,821,337，5,859,205，Padlan等，1995，FASEB J.9：133-39和Tamura等，2000，J.Immunol.164：1432-41中有讨论。
已经开发了用于在非人动物中产生人或部分人抗体的程序。例如，已经制备了其中一个或多个内源免疫球蛋白基因已经失活的小鼠。将人免疫球蛋白基因引入小鼠中来替代灭活的小鼠基因。动物中产生的抗体结合通过引入动物中的人遗传物质编码的人免疫球蛋白多肽链。在一个实施方案中，用PAR-2多肽免疫非人动物，如转基因小鼠，使得在动物中产生针对PAR-2多肽的抗体。合适免疫原的一个实例是可溶性人PAR-2，如含有PAR-2的蛋白水解切割位点的多肽，或其他免疫原性片段PAR-2。合适免疫原的另一个实例是表达高水平PAR-2的细胞，或从其获得的细胞膜制剂。
用于生产人或部分人抗体的转基因动物的生产和使用技术的实例描述于U.S.专利5,814,318、5,569,825和5,545,806，Davis等，2003，Production of human antibodies from transgenic mice(从转基因小鼠生产人抗体)，见Lo编辑的，Antibody Engineering：Methods and Protocols(抗体工程化：方法和实验方案)，Humana Press，NJ：191-200，Kellermann等，2002，Curr Opin Biotechnol.13：593-97，Russel等，2000，Infect Immun.68：1820-26，Gallo等，2000，Eur J Immun.30：534-40，Davis等，1999，Cancer Metastasis Rev.18：421-25，Green，1999，J ImmunolMethods.231：11-23，Jakobovits，1998，Adv Drug Deliv Rev 31：33-42，Green等，1998，J Exp Med.188：483-95，Jakobovits A，1998，Exp.Opin.Invest.Drugs.7：607-14，Tsuda等，1997，Genomics 42：413-21，Mendez等，1997，Nat Genet.15：146-56，Jakobovits，1994，Curr Biol.4：761-63，Arbones等，1994，Immunity.1：247-60，Green等，1994，Nat Genet.7：13-21，Jakobovits等，1993，Nature 362：255-58，Jakobovits等，1993，Proc Natl Acad Sci U S A.90：2551-55.Chen，J.等，1993，lnt Immunol 5：647-656，Choi等，1993，Nature Genetics 4：117-23，Fishwild等，1996，Nat Biotechnol 14：845-51，Harding等，1995，Ann NY Acad Sci，Lonberg等，1994，Nature 368：856-59，Lonberg，1994，Transgenic Approaches toHuman Monoclonal Antibodies in Handbook of ExperimentalPharmacology(实验药理学手册中人单克隆抗体的转基因方法)113：49-101，Lonberg等，1995，Int Rev Immunol 13：65-93，Neuberger，1996，Nat Biotechnol 14：826，Taylor等，1992，Nucleic Acids Research 20：6287-95，Taylor等，1994，Int Immunol 6：579-91，Tomizuka等，1997，Nat Gen 16：133-43，Tomizuka等，2000，Proc Natl Acad Sci USA.97：722-27，Tuaillon等，1993，Proc Natl Acad Sci USA.90：3720-24和Tuaillon等，1994，J Immunol 152：2912-20。这些和其他实施例还在2007年5月3日公开的U.S.专利申请2007-0098715中进行了讨论。
在另一个方面中，本发明提供结合PAR-2的单克隆抗体。可以使用本领域已知的任何技术生产单克隆抗体，例如，通过将从完成免疫时间表后的小鼠收集的脾细胞永生化(immortalized)。可以使用本领域已知的任何技术使脾细胞永生化，例如，通过将它们与骨髓瘤融合来产生杂交瘤。用于杂交瘤生产融合程序的骨髓瘤细胞优选是非抗体产生，具有高融合效率，并且酶缺陷使得它们不能在特定选择性培养基中生长，选择性培养基只支持所需的融合细胞(杂交瘤)的生长。用于小鼠融合的合适细胞系的实例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul；用于大鼠融合中的细胞系实例包括R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和4B210。用于细胞融合的其他细胞系是U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
在一个实施方案中，通过用PAR-2免疫原使动物(例如，具有人免疫球蛋白序列的转基因动物)免疫来产生杂交瘤细胞系；从免疫的动物收集脾细胞；将收集的脾细胞与骨髓瘤细胞系融合，由此产生杂交瘤细胞；从杂交瘤细胞建立杂交瘤细胞系，并鉴定产生结合PAR-2多肽的抗体的杂交瘤细胞系。本发明包括这样的杂交瘤细胞系，以及通过它们产生的抗PAR-2单克隆抗体。
可以使用本领域已知的任何技术来纯化杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体。可以进一步筛选杂交瘤或mAb来鉴定具有特定特性的mAb，如阻断PAR-2诱导的活性的能力。以下实施例中提供了这种筛选实例。
还可以使用称为遗传免疫的方法来产生单克隆抗体。例如，将编码目标抗原的核酸引入病毒载体中(如，腺病毒载体)。然后将所得到的载体用于在合适宿主动物(例如，非肥胖性糖尿病或NOD小鼠)中产生对抗目标抗原的免疫应答。该技术得到了Ritter等的充分描述，Biodrugs 16(1)：3-10(2002)，在此将其公开内容引入作为参考。
抗体结合位点中心的互补决定区(CDR)的分子进化也已经用于分离具有提高亲和性的抗体，例如，对c-erbB-2具有提高亲和性的抗体，如Schier等，1996，J.Mol.Biol.263：551所述的。因此，这样的技术在制备PAR-2抗体中是有用的。
针对PAR-2的抗原结合蛋白，例如，可以用于在体外或体内测定PAR-2多肽存在的测试中。抗原结合蛋白还可以用于通过免疫亲和性色谱纯化PAR-2蛋白中。另外可以阻断PAR-2蛋白水解激活的那些抗原结合蛋白可以用来抑制由这样的结合引起的生物活性。阻断抗原结合蛋白可以用于本发明的方法中。这样作为PAR-2拮抗剂起作用的抗原结合蛋白可以用于治疗包括但不限于炎症的任何PAR-2诱导的病症中。在一个实施方案中，通过涉及转基因小鼠免疫的程序产生的人抗-PAR-2单克隆抗体用于治疗这样的病症中。
抗原结合蛋白可以用于体外程序中，或体内给药，以抑制PAR-2诱导的生物活性。因此可以治疗由PAR-2的蛋白水解激活引起或加剧(直接或间接)的失调，在此提供了其实例。在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其包括将降低PAR-2诱导的生物活性有效量的PAR-2阻断抗原结合蛋白体内给药于有此有此需要的哺乳动物。
本发明的抗原结合蛋白包括抑制PAR-2生物活性的部分人或全部人单克隆抗体。一个实施方案涉及至少部分阻断人PAR-2蛋白水解激活的人单克隆抗体。在一个实施方案中，通过用PAR-2免疫原免疫转基因小鼠来产生抗体。在另一个实施方案中，免疫原是人PAR-2多肽(例如，含有全部或部分PAR-2切割位点的可溶性片段)。在此还提供了源自该免疫小鼠的杂交瘤细胞系，其中杂交瘤分泌结合PAR-2的单克隆抗体。
尽管人、部分人或人源化抗体将适用于许多应用，特别是涉及将抗体给药于人患者的那些，但其他类型的抗原结合蛋白也适用于特定的应用。本发明的非人抗体可以是，例如，源自任何产生抗体的动物，如小鼠、大鼠、兔、山羊、驴或非人灵长类(如猴(例如，猕猴或恒河猴)或猿(例如，黑猩猩))。本发明的非人抗体可以用于，例如，体外或基于细胞培养物的应用中，或任何其他应用，其中在这些应用中对于本发明抗体的免疫应答没有发生、不明显、可以防止、不是关注的问题或是所期望的。在一个实施方案中，将本发明的非人抗体给药于非人患者。在另一个实施方案中，非人抗体在非人患者中没有引发免疫应答。在另一个实施方案中，非人抗体来自与非人患者相同的物种，例如，将本发明的小鼠抗体给药于小鼠。可以通过以下方法制得来自特定物种的抗体，例如，用所需的免疫原(例如，可溶性PAR-2多肽)免疫该物种的动物，或使用产生该物种抗体的人造系统(例如，用于产生特定物种抗体的基于细菌或噬菌体展示的系统)，或通过用另一个物种的恒定区替代例如抗体的恒定区，或通过替代抗体的一个或多个氨基酸残基，将来自一个物种的抗体转化成另一个物种的抗体，使得更接近地类似来自另一个物种的抗体的序列。在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体，其含有源自两个或多个不同物种的抗体的氨基酸序列。
可以通过各种常规技术中的任何一种来制备抗原结合蛋白。例如，可以从天然表达它们的细胞中纯化(例如，可以从产生该抗体的杂交瘤纯化抗体)，或在重组表达系统中产生，使用本领域公知的任何技术。参见，例如，Monoclonal Antibodies，Hybridomas：A New Dimension inBiological Analyses(单克隆抗体、杂交瘤：生物分析中的新因素)，Kennet等编辑，Plenum Press，New York(1980)；和Antibodies：A LaboratoryManual(抗体：实验室手册)，Harlow和Land编辑，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1988)。
本领域已知的任何表达系统都可以用来制备本发明的重组多肽。通常，用含有编码所需多肽的DNA的重组表达载体转化宿主细胞。其中，可以使用的宿主细胞是原核生物细胞、酵母或高等真核生物细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性微生物，例如，大肠杆菌或杆状菌。高等真核生物细胞包括昆虫细胞和建立的哺乳动物来源的细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾脏细胞的COS-7(ATCC CRL1651)(Gluzman等，1981，Cell 23：175)、L细胞、293细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Hela细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系，和源自非洲绿猴肾脏细胞系CVI的CVI/EBNA细胞系(ATCC CCL 70)，如通过Mchahan等，1991，EMBO J.10：2821所述的。Pouwels等描述了与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的合适克隆和表达载体(Cloning Vectors：ALaboratory Manual(克隆载体：实验室手册)，Elsevier，New York，1985)。
可以在促进多肽表达的条件下温育转化的细胞，并通过常规的蛋白质纯化程序来回收多肽。一种这样的纯化程序包括使用亲和层析，例如，在具有与其结合的全部或部分(例如，胞外结构域)PAR-2的基质上。在此考虑使用的多肽包括基本上同源的重组哺乳动物抗-PAR-2抗体多肽，其基本上没有内源杂质物质。
可以通过各种已知技术中的任何一种为所需的特性来制备和筛选抗原结合蛋白。特定的技术涉及分离编码目标抗原结合蛋白的多肽链(或其部分)的核酸，并通过重组DNA技术操纵核酸。例如，核酸可以与另一种目标核酸融合，或将其改变(例如，通过突变或其他常规技术)来添加、缺失或取代一个或多个氨基酸残基。
在一个方面中，本发明提供了本发明抗-PAR-2抗体的抗原结合片段。这样的片段完全由抗体衍生的序列构成，并可以含有其他序列。抗原结合片段的实例包括Fab、F(ab’)2、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体和结构域抗体。Lunde等，2002，Biochem.Soc.Trans.30：500-06中提供了其他实例。
可以通过氨基酸桥(短肽连接物)连接重链和轻链可变域(Fv区)片段来形成单链抗体，形成单多肽链。已经通过融合编码两个可变域多肽(VL和VH)之间的肽连接物的DNA来制备这样的单链Fv(scFv)。所得到的多肽在其自身上折回，形成抗原结合单体，或它们可以形成多聚体(例如，二聚体、三聚体或四聚体)，这取决于两个可变域之间柔性连接物的长度(Kortt等，1997，Prot.Eng.10：423；Kortt等，2001，Biomol.Eng.18：95-108)。通过结合含有不同VL和VH的多肽，可以形成结合不同表位的多聚scFv(Kriangkum等，2001，Biomol.Eng.18：31-40)。为生产单链抗体开发的技术包括U.S.专利No.4,946,778；Bird，1988，Science 242：423；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879；Ward等，1989，Nautre 334：544，de Graaf等，2002，MethodsMol Biol.178：379-87中所述的那些。
本发明的抗原结合蛋白(例如，抗体、抗体片段和抗体衍生物)可以含有本领域已知的任何恒定区。轻链恒定区可以是，例如，κ-或λ-型轻链恒定区，例如，人κ-或λ-型轻链恒定区。重链恒定区可以是，例如，α-、δ-、ε-、γ-或μ-型重链恒定区，例如，人α-、δ-、ε-、γ-或μ-型重链恒定区。在一个实施方案中，轻链或重链恒定区是天然产生的恒定区的片段、衍生物、变体或突变蛋白。
从目标抗体衍生不同亚类或同种型抗体(即，亚类转换)的技术是已知的。因此，例如，可以从IgM抗体衍生IgG抗体，反之亦然。这样的技术使新抗体的制剂具有给定抗体(亲本抗体)的抗原结合特性，而且还呈现出与不同于亲本抗体的抗体同种型或亚类相关的生物特性。可以使用重组DNA技术。克隆的编码特定抗体多肽的DNA可以用于这样的程序中，例如，编码所需同种型抗体的恒定域的DNA。请参阅Lantto等，2002，Methods Mol.Biol.178：303-16。此外，如果需要IgG4，还期望在铰链区中引入点突变(CPSCP-＞CPPCP)，如Bloom等，1997，ProteinScience 6：407中所述的，在此引入作为参考)，以减轻形成H链内二硫键的趋势，其可能导致IgG4抗体中的异质性。
此外，衍生具有不同特性(即，改变对与其结合的抗原的亲和性)的抗原结合蛋白的技术也是已知的。一种这样的技术，称为链替换(chainshuffling)，涉及在丝状噬菌体的表面上展示免疫球蛋白可变域基因库，通常称为噬菌体展示。链替换已经用于制备对半抗原2-苯基噁唑-5-酮高亲和性的抗体，如Marks等，1992，BioTechnology，10：779中所述的。
在特定的实施方案中，本发明的抗原结合蛋白对PAR-2具有至少106的结合亲和性(Ka)。在其他实施方案中，抗原结合蛋白呈现出至少106、至少107、至少108、至少109或至少1010的Ka。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白呈现出与实施例中所述抗体基本上相同的Ka。
在另一个实施方案中，本发明提供从PAR-2的离解速率低的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，抗原结合蛋白具有1x10-4s-1或更低Koff的抗原结合蛋白。在另一个实施方案中，Koff为5x10-5s-1或更低。在另一个实施方案中，Koff与实施例中所述抗体的基本相同。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白以与实施例中所述抗体基本相同的Koff结合PAR-2。
在另一个方面中，本发明提供抑制PAR-2活性的抗原结合蛋白，例如Ca2+动员。在一个实施方案中，抗原结合蛋白具有1000nM或更低的IC50。在另一个实施方案中，IC50是100nM或更低；在另一个实施方案中，IC50是10nM或更低。在另一个实施方案中，IC50与实施例中所述抗体的基本相同。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白以与实施例中所述抗体基本相同的IC50来抑制PAR-2的活性。
在另一个实施方案中，本发明提供结合全长PAR-2和以较低程度结合切割的PAR-2的抗原结合蛋白。在各种实施方案中，抗原结合蛋白以高于其结合切割的PAR-2至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％和99.9％来结合全长PAR-2。
在另一个方面中，本发明提供在人PAR-2的蛋白切割位点或其附近结合的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，抗原结合蛋白结合切割位点的下游(即，结合全长和截短的氨基端PAR-2-Fc；在另一个实施方案中，则是抗原结合蛋白结合切割位点的上游(即，只结合全长PAR-2/Fc)。可以使用本领域已知的任何技术来制得结合蛋白酶切割位点的抗原结合蛋白。例如，可以使用全长PAR-2多肽(例如，在膜结合的制备中)、PAR-2的可溶性胞外结构域片段，或含有蛋白酶切割位点或由蛋白酶切割位点组成的PAR-2胞外结构域的较小片段(在此提供了其实例)来分离这样的抗原结合蛋白。使用本领域已知的任何方法(在此提供了其实例)来筛选因此分离的抗原结合蛋白，以测定其结合特异性。
在另一个实施方案中，本发明提供与在此公开的抗体竞争与PAR-2结合的抗原结合蛋白。可以通过本领域公知的方法来测定这样的竞争能力，例如，通过Western印迹(或另一种基于肽的测试)中与PAR-2/Fc结合的竞争，或通过在此所述的Ca2+溢出(flux)测试中的竞争。在一个方面中，与在此公开的抗体竞争与PAR-2结合的抗原结合蛋白结合与抗体相同的抗原结合部位。在另一个方面中，与在此公开的抗体竞争与PAR-2结合的抗原结合蛋白抑制PAR-2的蛋白水解激活。
在另一个方面中，本发明提供结合在细胞表面上表达的人PAR-2的抗原结合蛋白，并且这样结合时，抑制细胞中的PAR-2信号传导活性，而没有引起细胞表面上PAR-2含量的明显下降，可以使用测定或估算细胞表面上/或内部的PAR-2含量的任何方法。在一个实施方案中，本发明提供在细胞表面上表达的人PAR-2的蛋白酶切割位点或其附近结合的抗原结合蛋白，并且这样结合时，抑制细胞中的PAR-2信号传导活性，而没有显著提高来自细胞表面的PAR-2的内在化速率。在其他实施方案中，抗原结合蛋白与PAR-2表达细胞的结合引起低于约75％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、1％或0.1％细胞表面PAR-2被内在化(internalized)。
在另一个方面中，本发明提供具有至少一天体外或体内半衰期的抗原结合蛋白(例如，给药于人患者时)。在一个实施方案中，抗原结合蛋白具有至少三天的半衰期。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白具有四天或更长的半衰期。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白具有八天或更长的半衰期。在另一个实施方案中，将抗原结合蛋白衍生或修饰，使其与未衍生或未修饰的抗原结合蛋白相比，具有更长的半衰期。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白含有一个或多个点突变，以提高血清半衰期，如WO00/09560中所述的，2000年2月24日公开，引入作为参考。
本发明进一步提供多特异性抗原结合蛋白，例如，双特异性抗原结合蛋白，例如，通过两个不同的抗原结合位点或区域，结合PAR-2两个不同表位或结合PAR-2的表位和另一个分子的表位的抗原结合蛋白。此外，在此公开的双特异性抗原结合蛋白可以含有来自在此所述抗体之一的PAR-2结合位点和来自另一个在此所述抗体的第二个PAR-2结合区域，包括通过参考其他出版物在此所述的那些抗体。或者，双特异性抗原结合蛋白可以含有来自在此所述抗体之一的抗原结合位点和来自另一个本领域已知的PAR-2抗体或来自通过已知方法或在此所述的方法制备的抗体的第二个抗原结合位点。
制备双特异性抗体的各种方法是本领域已知的，并且公开于US专利申请09/839,632中，2001年4月20日提交(在此引入作为参考)。这样的方法包括使用杂交-杂交瘤，如Milstein等所述的，1983，Nature305：537，以及其他(U.S.专利4,474,893，U.S.专利6,106,833)，和抗体片段的化学偶合(Brennan等，1985，Science 229：81；Glennie等，1987，J.Immunol.139：2367；U.S.专利6,010,902)。此外，可以通过重组方法来产生双特异性抗体，例如，通过使用亮氨酸拉链部分(即，来自Fos和Jun蛋白，其优选来自杂二聚体；Kostelny等，1992，J.Immunol.148：1547)或其他锁匙交互结构域结构，如U.S.专利5,582.996中所述的。其他有用的技术包括Kortt等，1997，出处同上；U.S.专利5,959,083和U.S.专利5,807,706中所述的那些。
在另一个方面中，本发明的抗原结合蛋白包括抗体的衍生物。衍生的抗体可以包括给予抗体所需特征的任何分子或物质，如特定用途中提高的半衰期。衍生的抗体可以包括，例如，可检测(或标记)部分(例如，放射性、比色、抗原或酶分子、可检测的珠子(如磁性或电密集(例如，金)珠子)，或结合另一个分子的分子(例如，生物素或抗生物素蛋白链菌素))，治疗或诊断部分(例如，放射性、细胞毒性或药物活性部分)，或提高抗体对特定用途的适用性的分子(例如，给药于患者，如人患者，或其他体内或体外用途)。可以用于衍生抗体的分子实例包括白蛋白(例如，人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。可以使用本领域公知技术来制备抗体的白蛋白样和PEG化衍生物。在一个实施方案中，将抗体缀合或以其他方式连接转甲状腺素蛋白(TTR)或TTR变体。例如，可以用选自葡聚糖、聚(n-乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇和聚乙烯醇的化学物质在化学上修饰TTR或TTR变体。U.S.专利申请No.20030195154。
在另一个方面中，本发明提供了使用本发明的抗原结合蛋白来筛选结合PAR-2的分子的方法。可以使用任何合适的筛选技术。在一个实施方案中，将本发明的抗原结合蛋白结合的PAR-2分子或其片段接触本发明的抗原结合蛋白和另一个分子，其中如果其他分子降低抗原结合蛋白与PAR-2的结合，其结合PAR-2。可以使用任何合适的方法，例如，ELISA，来检测抗原结合蛋白的结合。如上所述，可以通过可检测地标记抗原结合蛋白，来简单地测定抗原结合蛋白与PAR-2的结合。在另一个实施方案中，进一步分析PAR-2结合分子，来测定其是否抑制PAR-2激活和/或信号传导。
核酸
在一个方面中，本发明提供分离的核酸分子。核酸分子包括，例如，编码全部或部分抗原结合蛋白(例如，本发明抗体的一条或两条链，或其片段、衍生物、突变蛋白或变体)的多核苷酸，足以用作杂交探针的多核苷酸，用于鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的PCR引物或测序引物，用于抑制多核苷酸表达的反义核酸和上述的互补序列。核酸可以是任何长度。它们可以是，长度为例如，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000或更多个核苷酸，和/或可以包含一个或多个其他序列，例如，调控序列，和/或是较大核酸的一部分，例如，载体。核酸可以是单链或双链，并可以包含RNA和/或DNA核苷酸，及其人造变体(例如，肽核酸)。
可以从已经用PAR-2免疫的小鼠的B-细胞分离编码抗体多肽(例如，重链或轻链、仅仅可变域或全长)的核酸。可以通过常规程序如聚合酶链式反应(PCR)来分离核酸。
本发明进一步提供在特定杂交条件下与其他核酸杂交的核酸。用于杂交核酸的方法是本领域公知的。参见，例如，Current Protocols inMolecular Biology(分子生物学通用实验方案)，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。如在此限定的，中等严谨杂交条件使用含有5X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的预洗溶液，约50％甲酰胺醛、6XSSC的杂交缓冲液和55℃的杂交温度(或其他相似的杂交溶液，如含有约50％甲酰胺的一种，使用42℃的杂交温度)，和60℃的洗涤条件，在0.5XSSC，0.1％SDS中。严谨杂交条件在45℃下在6XSSC中杂交，接着在68℃下在0.1XSSC，0.2％SDS中洗涤一次或多次。此外，本领域技术人员可以操纵杂交和/或洗涤条件来提高或降低杂交的严谨性，使得含有相互为至少65、70、75、80、85、90、95、98或99％同一性的核苷酸序列的核酸通常仍然能彼此杂交。影响杂交条件选择的基础参数和设计合适条件的指导列于例如Sambrook，Fritsch和Maniatis(1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，第9章和第11章；和Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学通用实验方案)，1995，Ausubel等，编辑，John Wiley&Sons，Inc.，2.10和6.3-6.4部分)，并可以由本领域普通技术人员基于例如DNA的长度和/或碱基组成来容易地确定。
可以通过突变将变化引入核酸中，由此导致其编码的多肽的氨基酸序列的变化(例如，抗原结合蛋白)。可以使用本领域已知的任何技术来引入突变。在一个实施方案中，例如，使用定点突变实验方案来改变一个或多个特定的氨基酸残基。在另一个实施方案中，例如，使用随机突变实验方案来改变一个或多个随机选择的残基。然而，制得后，可以表达突变多肽并筛选所需的特性(例如，结合PAR-2或阻断PAR-2的蛋白水解激活)。
可以将突变引入核酸中，而没有明显改变其编码的多肽的生物活性。例如，可以制得导致在非必需氨基酸残基处的氨基酸取代的核苷酸取代。在一个实施方案中，将核苷酸序列，或其所需片段、变体或衍生物突变，使得其编码含有一个或多个氨基酸残基的缺失或取代的氨基酸序列。在另一个实施方案中，突变在一个或多个氨基酸残基邻近处插入氨基酸。或者，可以将一个或多个选择性改变其编码的多肽的生物活性(例如，PAR-2的结合，抑制PAR-2的蛋白水解激活等)的突变引入核酸中。例如，突变可以定量或定性地改变生物活性。定量变化的实例包括提高、降低或消除活性。定性变化的实例包括改变抗原结合蛋白的抗原特异性。
在另一个方面中，本发明提供适于用作引物或杂交探针的核酸分子，用于检测本发明的核酸序列。本发明的核酸分子可以只包括编码本发明全长多肽的核酸序列的一部分，例如，可以用作探针或引物的片段或编码本发明多肽活性部分(例如，PAR-2结合片段)的片段。
基于本发明核酸序列的探针可以用于检测核酸或相似核酸，例如，编码本发明多肽的转录产物。探针可以包含标记基团，例如，放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。合适的探针可以用于鉴定表达多肽的细胞。
在另一个方面中，本发明提供了含有编码本发明多肽或其部分的核酸的载体。载体的实例包括，但不限于，质粒、病毒载体、非游离基因哺乳动物载体和表达载体，例如，重组表达载体。
本发明的重组表达载体可以包含以适于核酸在宿主细胞中表达的形式的本发明的核酸。重组表达载体包括一个或多个调控序列，基于用于表达的宿主细胞来选择，其可操作地连接待表达的核酸序列。调控序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的那些(例如，SV40早期基因增强子、劳氏肉瘤病毒启动子和巨细胞病毒启动子)，指导核苷酸序列仅在特定宿主细胞中表达的那些(例如，组织特异性调控序列，参见Voss等，1986，Trends Biochem.Sci.11：287，Maniatis等，1987，Science 236：1237，在此以其整体引入作为参考)，和指导核苷酸序列应答特定处理或条件的诱导型表达的那些(例如，哺乳动物细胞中金属硫蛋白启动子以及原核和真核系统中tet-应答性和/或链霉素应答性启动子(参见同上)。本领域技术人员将认识到表达载体的设计可以取决于这些因素，如待转化的宿主细胞的选择，所需的蛋白表达水平等。本发明的表达载体可以引入宿主细胞中，由此产生蛋白或肽，包括融合蛋白或肽，由在此所述的核酸编码。
在另一个方面中，本发明提供其中引入了本发明重组表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任何原核生物细胞(例如，大肠杆菌)或真核生物细胞(例如，酵母、昆虫或哺乳动物细胞(例如，CHO细胞))。可以通过常规转化或转染技术将载体DNA引入原核生物或真核生物细胞中。对于哺乳动物细胞的稳定转染，根据所用的表达载体和转染技术，已知只有小部分细胞可以将外源DNA整合至它们的基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，通常将编码选择标记(例如，抗生素抗性)的基因连同目标基因一起引入宿主细胞中。优选的选择标记包括给予抗药性的那些，药物如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。在这些方法中，可以通过药物选择鉴定用引入的核酸稳定转染的细胞(例如，具有整合的选择标记基因的细胞将存活，而其他细胞将死亡)。
适应症
在一个方面中，本发明提供治疗患者的方法。例如，该方法通常对患者具有有益健康的作用，例如，可以提高患者预期的寿命。或者，例如，该方法可以治疗、预防、治愈、减轻或改善(“治疗”)疾病、失调、病症或病(“病症”)。待治疗的病症中，根据本发明的是特征在于PAR-2的不适表达或活性的病症。在一些这样的病症中，表达或活性水平太高，并且治疗包括给药在此所述的PAR-2拮抗剂。
用本发明的抗原结合蛋白可治疗或可预防的特定医学病症和疾病包括胃肠道系统的炎症，包括乳糜泄、节段性回肠炎；溃疡性结肠炎；突发性胃轻瘫；胰腺炎，包括慢性胰腺炎；炎性肠病和溃疡，包括胃和十二指肠溃疡。本发明的抗原结合蛋白还可用于治疗或改善气道的炎症，如哮喘(包括外源性和内源性哮喘以及气道的相关慢性炎症，或超反应)，慢性梗阻性肺病(COPD，即，慢性支气管炎，肺气肿)，急性呼吸障碍综合症(ARDS)，呼吸窘迫综合症，囊性纤维化，肺动脉高压，肺血管收缩，急性肺损伤，过敏性支气管肺曲霉病，超过敏性肺炎，嗜酸细胞性肺炎，支气管炎，过敏性支气管炎性支气管扩张，肺结核，超过敏性肺炎，职业性哮喘，哮喘样失调，肉瘤，反应性气道疾病(或机能障碍)综合症，棉尘肺，间质性肺炎，高-嗜曙红粒细胞增多综合症，鼻炎，鼻窦炎和寄生虫肺病，与病毒诱导的病症相关的气道超反应性(例如，呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、鼻病毒(RV)和腺病毒)。
可用本发明的抗原结合蛋白治疗的风湿性疾病包括成年和青年类风湿性关节炎；硬皮病；全身性红斑狼疮；狼疮-样综合症；未分化结缔组织病；痛风；骨关节炎；风湿性多肌痛；血清反应阴性脊柱关节病，包括强直性脊柱炎和Reiter病，银屑病关节炎和慢性莱姆关节炎。用这些多肽也可以治疗或预防的是Still病以及与类风湿性关节炎相关的葡萄膜炎。此外，本发明的多肽治疗剂用于治疗导致随意肌和其他肌肉炎症的疾病，包括皮肌炎，包涵体肌炎，多肌炎和肺淋巴管平滑肌瘤病。用本发明也可治疗的其他失调包括Guillain-Barre疾病、I型糖尿病、甲状腺功能亢进、爱迪生氏病、雷诺氏现象(包括雷诺氏病和雷诺氏综合症)、自体免疫肝炎、GVHD(移植物对抗宿主疾病)等。
用本发明的抗原结合蛋白结合其他细胞因子、细胞因子抑制剂和试剂(在此也称为免疫调节剂)来治疗在此所述的疾病。例如，免疫包括IL-18拮抗剂，如可溶性IL-18受体，IL-18的抗体或IL-18受体，IL-18结合蛋白；TNF抑制剂，包括
Figure G2008800222226D00311
IL-1抑制剂，包括I型IL-1R，II型IL-1R的可溶性形式，IL-1的抗体，I型IL-1R的抗体；和或在治疗公开的医学病症和疾病中有效的其他活性剂。
本发明的组合物和/或方法还可以用于，例如，美容治疗、兽医治疗、提高寿命、治疗生殖缺陷和治疗各种PAR-2相关的失调。此外，在特定的这样的病症中，PAR-2的表达或活性水平太低，因此治疗包括给药PAR-2激动剂；在此也包括这样的治疗。
抗原结合蛋白的治疗方法和给药
在此提供的特定方法包括将PAR-2结合抗原结合蛋白给药于患者，由此降低在特定病症中起作用的PAR-2诱导的生物应答。在特定的实施方案中，本发明的方法涉及将内源PAR-2接触PAR-2结合抗原结合蛋白，例如，通过给药于患者或以离体(ex vivo)程序。
术语“治疗”包括至少一种症状或疾病其他方面的缓解或预防，或疾病严重程度的减轻等。抗原结合蛋白不需要实现完全的治愈，或根除疾病的每个症状或表现，以构成可行的治疗剂。如相关领域所知的，用作治疗剂的药物可以降低给定疾病状态的严重程度，但不需要根除疾病的每个表现，认为是有用的治疗剂。相似地，预防性给予的治疗不需要完全有效预防疾病的发作，以构成抗性的预防剂。仅仅降低疾病的影响(例如，通过降低症状的数量或严重程度，或通过提高另一种治疗的有效性，或通过产生另一种有效作用)，或降低患者体内疾病将发生或恶化的可能性就足以。本发明的一个实施方案涉及一种方法，其包括以足以诱导超过指示基线的提高的量和时间将PAR-2拮抗剂给药于患者，该指示反映出特定疾病的严重程度。
如相关领域所理解的，将含有本发明分子的药物组合物以适于适应症的方式给药于患者。可以通过任何合适的技术来给药药物组合物，包括但不限于，非肠道、局部或通过吸入。如果注射，例如，可以通过关节内、静脉内、肌内、病灶内、腹膜内或皮下途径，通过弹丸注射或连续灌输来给药药物组合物。考虑了在疾病或受伤部位定位给药，因为是经皮传送和从植入物的持续释放。通过吸入的传送包括，例如，鼻或口腔吸入，使用喷雾器，气溶胶形式的拮抗剂的吸入等。其他可替换的包括滴眼液；口服制剂，包括丸剂，糖浆，锭剂或口香糖；和局部制剂，如洗液，凝胶，喷雾和膏剂。
还考虑了以离体程序的抗原结合蛋白的使用。例如，可以将患者的血液或其他体液离体接触结合PAR-2的抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以结合合适的不溶性基质或固体支持材料。
有利地，以含有一种或多种其他成分如生理学上可接受载体、赋形剂或稀释剂的组合物形式来给药抗原结合蛋白。任选地，组合物另外含有一种或多种生理学活性剂，例如，第二种炎症-或免疫-抑制物质、抗血管生成物质、止痛物质等，在此提供了其非穷尽实例。在各种特定的实施方案中，除了PAR-2结合抗原结合蛋白外，组合物含有一种、两种、三种、四种、五种或六种生理学活性剂。
在一个实施方案中，药物组合物含有本发明的抗原结合蛋白，连同一种或多种选自以下的物质：缓冲剂，抗氧化剂，如抗坏血酸，低分子量多肽(如具有低于10个氨基酸的那些)，蛋白质，氨基酸，碳水化合物，如葡萄糖，蔗糖或糊精，螯合剂，如EDTA，谷胱甘肽，稳定剂和赋形剂。根据合适的工业标准，还可以加入防腐剂，如苯甲醇。可以使用合适的赋形剂溶液(例如，蔗糖)作为稀释剂，将组合物配制成冷冻干产物。在所用的剂量和浓度，合适的成分对于接受者是无毒的。可以用于药物制剂中的成分的更多实例列于Remington’s PharmaceuticalScience中，第16版(1980)和第20版(2000)，Mack Publishing Company，Easton，PA。
由开业医生使用的试剂盒包括本发明的PAR-2抑制物质和用于治疗在此所述的任一种病症的标签或其他说明。在一个实施方案中，试剂盒包括一种或多种PAR-2结合抗原结合蛋白的无菌制剂，其可以以如上所述的组合物形式来使用，并且可以在一个或多个小瓶中。
给药的剂量和频率可以根据如给药途径、所用的特定抗原结合蛋白、待治疗疾病的性质和严重程度(不管病症是急性或慢性)以及患者的大小和一般状况这样的因素而改变。可以通过相关领域已知的程序，例如，在涉及剂量估算研究的临床试验中，来测定合适的剂量。
可以将本发明的PAR-2抑制物质给药，例如，一次或多次，例如，在一定的时间段内以规则的时间间隔。在特定的实施方案中，在至少一个月或更长时间段内(例如，1个、2个或3个月或更长时间的)给药抗原结合蛋白。对于治疗慢性病症，长期治疗通常是最有效的。然而，对于治疗急性病症，给药持续较短的时间段，例如，从一周至六周，足以。通常，给药抗原结合蛋白，直至对于选定的一种或几种指示，患者呈现出医学上相关的超过基线的提高程度。
本发明的特定实施方案涉及将约1ng抗原结合蛋白/kg患者体重/天(“1ng/kg/天”)至约10mg/kg/天剂量的抗原结合蛋白给药于患者，更优选约500ng/kg/天至约5mg/kg/天，最优选约5μg/kg/天至约2mg/kg/天。在其他的实施方案中，将抗原结合蛋白给药于成人，一周一次，一周两次或一周三次或更多次，来治疗PAR-2介导的疾病、病症或失调，例如，在此公开的医学失调。如果注射，每个成人剂量的抗原结合蛋白的有效量为1-20mg/m2，优选约5-12mg/m2。或者，可以给药固定剂量(flat dose)；剂量为5-100mg/剂。固定剂量的一个范围是约20-30mg/剂。在本发明的一个实施方案中，通过注射重复给药25mg/剂的固定剂量。如果使用了非注射的给药途径，根据标准医学实践来适当地调节剂量。治疗方案的一个实例包括在至少三周的时间段内注射约20-30mg剂量的抗原结合蛋白，一周一次至三次，尽管可能需要较长时间段的治疗来诱导所需程度的提高。对于儿科患者(年龄4-17)，一个示例性的合适方案涉及皮下注射0.4mg/kg，直至给药最大剂量25mg的抗原结合蛋白，一周两次或三次。
在此提供的方法的特定实施方案涉及皮下注射0.5mg至10mg的抗原结合蛋白，优选3至5mg，一周一次或两次。另一个实施方案涉及肺部给药(例如，通过喷雾器)3mg或更多的抗原结合蛋白，一周一次。
在此提供的治疗方案的实例包括皮下注射抗原结合蛋白，一周一次，以1.5至3mg的剂量，以治疗其中PAR-2信号传导起作用的病症。在此提供了这样病症的实例，并包括，例如，之前所述的风湿性病症，和其中过度炎症起作用的其他病症(例如，在此所述的，炎性肠病，胰腺炎等)。持续每周给药抗原结合蛋白，直至获得所需的结果，例如，患者症状消退。治疗可以按需要继续，或者可替换地，可以给药维持剂量。
在此提供的治疗方案的其他实例包括皮下或静脉内给药1、3、5、7、8、9、10、11、12、15或20微克本发明的PAR-2抑制剂/公斤患者体重(mg/kg)的剂量。可以将该剂量给予患者一次，或以特定的时间间隔给予多次，例如，一天一次，一周三次，一周两次，一周一次，一个月三次，一个月两次，一个月一次，每两个月一次，每三个月一次，每六个月一次，或一年一次。可以在治疗过程中，改变或变化治疗的持续时间和剂量和/或治疗频率的任何改变，以满足患者的特定需求。
在另一个实施方案中，以足以诱导至少一个反映待治疗疾病严重程度的指示的提高(优选持续提高)的含量和时间，将抗原结合蛋白给药于患者。可以测定反映患者病、疾病或病症程度的各种指示，用于确定治疗的含量和时间是否足够。这样的指示包括，例如，临床上认知的考虑中的疾病严重程度、症状或疾病表现的指示。在一个实施方案中，如果患者在分开两周至四周的至少两个情况中呈现出提高，则认为提高是持续的。通常通过医师来判定提高的程度，医师基于信号、症状、活组织检查或其他测试结果来进行该判定，并且他还可以使用给予患者的调查问卷，如对于给定的疾病开发的生活质量调查问卷。
升高的PAR-2水平和/或PAR-2的激活与各种疾病相关，包括，例如，皮肤、关节、胃肠系统和/或气道的炎症。可以筛选患有给定疾病的患者，以鉴定具有升高的PAR-2激活的那些个体，由此鉴定从使用PAR-2结合抗原结合蛋白治疗得益最大的患者。因此，在此提供的治疗方法任选包括测量患者PAR-2激活水平的第一个步骤。可以将抗原结合蛋白给药于其PAR-2激活升高超过正常的患者。
用抗原结合蛋白治疗之前、之中和/或之后，可以监控患者的PAR-2活性水平，以检测PAR-2活性的变化(如果存在)。对于一些疾病，升高的PAR-2活性的发生可能根据如疾病的阶段或疾病的特定形式这样的因素而改变。可以使用已知的技术来测量PAR-2活性，例如，在患者血清、血液或组织样品中的PAR-2活性。可以使用任何合适的技术来测量PAR-2活性。
本发明方法和组合物的特定实施方案涉及使用抗原结合蛋白和一种或多种其他的PAR-2拮抗剂，例如，两种或多种本发明的抗原结合蛋白，或本发明的抗原结合蛋白和一种或多种其他的PAR-2拮抗剂。在进一步的实施方案中，将抗原结合蛋白单独给药或结合用于治疗患者患有病症的其他药剂一起给药。这样的药剂的实例包括蛋白质和非蛋白质药物两者。共同给药多种治疗剂时，可以按照相关领域所知的来调节剂量。“共同给药”和联合治疗不限于同时给药，还包括以下的治疗方案：其中在涉及将至少一种其他治疗剂给药于患者的治疗过程中至少给药一次抗原结合蛋白。
可以与抗原结合蛋白共同给药的其他药剂的实例是根据待治疗的特定病症选择的其他抗原结合蛋白或治疗性多肽。或者，上述用于治疗一种特定病症的非蛋白质药物可以与PAR-2拮抗剂共同给药。
联合治疗
在一个方面中，本发明提供用PAR-2抑制抗原结合蛋白和一种或多种其他治疗来治疗患者的方法。在一个实施方案中，这样的联合治疗或者协同或相加效应，例如，通过攻击肿瘤中的多个位点或分子目标。可以结合本发明使用的联合治疗的类型包括抑制或激活(如果合适)单个疾病相关途径中的多个节点，目标细胞中的多个途径和目标组织内的多个细胞类型。
在另一个实施方案中，联合治疗方法包括给药于患者两种、三种、四种、五种、六种或更多种在此所述的PAR-2激动剂或拮抗剂。在另一个实施方案中，该方法包括给予患者两种或多种能一起抑制或激活(直接或间接)PAR-2介导的信号传导的治疗。这样的方法的实例包括使用两种或多种PAR-2抑制抗原结合蛋白的结合，PAR-2抑制抗原结合蛋白和一种或多种具有抗炎特性的治疗部分(例如，非类固醇抗炎药，类固醇和/或免疫调节剂)的结合或PAR-2抑制抗原结合蛋白和一种或多种其他治疗(例如，外科手术、超声波或有效降低炎症的治疗)的结合。此外，一种或多种抗-PAR-2抗体或抗体衍生物可以结合一种或多种分子或其他治疗使用，其中其他分子和/或治疗没有直接结合PAR-2或干扰PAR-2，但该结合能有效治疗或预防待治疗的病症。在一个实施方案中，一种或多种分子和/或治疗治疗或预防由治疗过程中的一种或多种其他分子或治疗引起的病症，例如，恶心、疲劳、脱发、恶病质、失眠等。在其中使用分子和/或其他治疗结合的每种情况中，可以以任何次序，在任何时间长度中，给予有效的单独的分子和/或治疗，例如，同时、连续或交替给予。在一个实施方案中，治疗方法包括在开始第二个治疗过程之前，完成使用一种分子或其他治疗的第一个治疗过程。第一个治疗过程结束和第二个治疗过程开始之间的时间长度可以是使总的治疗过程有效的任何时间长度，例如，几秒，几分钟，几小时，几天，几周，几个月乃至几年。
在另一个实施方案中，该方法包括给予在此所述的一种或多种PAR-2拮抗剂和一种或多种其他治疗(例如，治疗性或缓解性的处理)。在方法包括给予患者多种治疗的情况中，将理解给药的次序、计时、数量、浓度和体积仅受到医学需求和治疗限制的限制，即，例如，可以同时、连续、交替或根据任何其他方案，将两种治疗给予患者。
提供以下实际性和预测性的实施例，用于说明本发明的特定实施方案和特征的目的，而非限制其范围。
实施例1：单克隆抗体的制备
使用一种或多种合适形式的PAR-2抗原进行免疫，包括可溶性PAR-2肽(PAR-2的环1肽[TNRSSKGRSLIGKVDGTS；SEQ ID NO：2的氨基酸29至46]，具有另外的C-端半胱氨酸残基来促进缀合，缀合马来酰亚胺-激活的匙孔血蓝蛋白[KLH；例如，可获自PierceBiotechnology Inc.，Rockford，IL])，PAR-2/Fc融合蛋白和细胞结合的PAR-2(例如，在细胞表面表达人PAR-2的CHO转染子，通过用编码SEQ ID NO：2多肽的人全长PAR-2cDNA转染CHO细胞来获得)，或其组合。
将合适含量的免疫原(即，10微克可溶性PAR-2/小鼠或3x106转染的CHO细胞/小鼠)用于XenoMouseTM中的首次免疫，根据1996年12月3日提交的U.S.专利申请系列No.08/759,620和1998年6月11日公开的国际专利申请No.WO98/24893和2000年12月21日公开的WO00/76310中公开的方法，在此将其公开内容引入作为参考。首次免疫后，按照时间表给予随后的免疫原加强免疫(5μg可溶性PAR-2/小鼠或1.5x106PAR-2转染的细胞/小鼠，并持续在小鼠中诱发合适的抗PAR-2抗体滴定度需要的时间。通过任何合适的方法来测定滴定度，例如，酶免疫测试或荧光激活的细胞分选，或通过其他方法(包括其组合)。
鉴定呈现出合适滴定度的动物，并从引流淋巴结获得淋巴细胞，并且如果需要，对每个组的进行合并。可以通过在合适的介质中(例如，Dulbecco’s改良Eagle培养基；DMEM；可从Invetrogen，Carlsbad，CA获得)研磨淋巴组织以从组织中释放细胞来解离淋巴细胞，并使用本领域已知的技术，与合适的融合伴侣融合，例如，非分泌型骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞(美国典型培养物中心CRL1580；Kearney等，J.Immunol.123，1979，1548-1550)。
在一种合适的融合方法，将淋巴细胞与融合伴侣细胞以1∶4的比例混合。通过在400xg离心4分钟，将细胞混合物温和地沉淀，滗去上清液，并温和地混合细胞混合物(例如，使用1ml移液管)。用PEG/DMSO(聚乙二醇/二甲基亚砜；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO获得；1ml/百万淋巴细胞)。伴随温和的搅拌在1分钟内缓慢加入PEG/DMSO，接着混合1分钟。然后伴随温和的搅拌在2分钟内加入IDMEM(不含谷氨酰胺的DMEM；2ml/百万B-细胞)，接着在3分钟内加入另外的IDMEM(8ml/百万B-细胞)。
温和地沉淀(400xg 6分钟)融合的细胞，并以每百万B-细胞重悬浮于20ml选择培养基中(例如，含有偶氮丝氨酸和次黄嘌呤[HA]以及按照需要的其他补充材料的DMEM)。将细胞在37℃下温育20-30分钟，然后重悬浮于200ml选择培养基中，并在96孔涂布之前，在T175烧瓶中培养三至四天。
使用标准技术将细胞分配在96-孔平板中，以最大化所得到菌落的克隆性。培养几天后，收集上清液并接受以下实施例中所述的筛选测试，包括证实与人PAR-2的结合，与其他物种PAR-2(例如，猕猴和/或鼠PAR-2)的交叉反应性的评价，与切割的vs.未切割的PAR-2的结合，以及抑制PAR-2的蛋白水解激活的能力。进一步选择阳性细胞，并接受标准克隆和亚克隆技术。可以在体外或在体内扩大营养繁殖系，并且将获得的分泌的人抗体用于分析。
筛选由此产生的杂交瘤克隆与PAR-2的反应性。杂交瘤上清液的最初筛选可以使用肽ELISA，全细胞ELISA和/或适用于高通量筛选的基于细胞的测试(荧光微体积测试技术或FMAT，基本上按照Fiscella等，Nature Biotechnology 21：302-307；2003所述的)。可以将该筛选方法中阳性的杂交瘤进一步培养来提供更大量的抗体，然后按照以下所述的将其纯化，并通过其他的基于细胞的测试来筛选(例如，使用共同表达脱辅基水母发光蛋白(apoaequorin)、Ca2+-敏感性发光蛋白和PAR-2的细胞的闪光板(flash plate)测试，基本上按照Le Poul等所述的，J.Biomol.Screen.7(1)：57-65；2002)，或荧光成像平板阅读仪(FLIPR)测试，将其用来测定胞内Ca2+水平的变化，基本上按照S.Pitchford，GeneticEngineering News vol.18，No.15(1998)和/或Sullivan等，Methods inMolecular Biology vol.144，pp125-133(1999)中所述的，在此将其引入作为参考。
以这种方式，用可溶性PAR-2、表达PAR-2的细胞或PAR-2/Fc蛋白将小鼠免疫，在大约两个-两个和一个半月的时间段内总的免疫19或20次；获得几个分泌PAR-2特异性抗体的细胞系，并进一步表征抗体。序列表中呈现了其序列并概括于以下的表1中，并且其中显示了使用这些抗体的各种测试的结果。本领域技术人员认识到框架区和互补决定区之间的界限可以改变；例如，在一些情况中，轻链FR1的氨基酸22可以认为是CDR1的一部分等。此外，一些编号系统将重链的CDR3和FR4指定为J区，并且可以在FR3和CDR3之间包括D区。因此，以下列出的区域的编号可以有1个至5个氨基酸的变化。
表1
  VR   FR1   CDR1   FR2   CDR2   FR3   CDR3   FR4
  1A1，重链，SEQ ID NO：9   1-126   1-30   31-35   36-49   50-66   67-98   99-115   116-126
  VR   FR1   CDR1   FR2   CDR2   FR3   CDR3   FR4
  1A1轻链，SEQID NO：11   1-107   1-22   23-33   34-48   49-55   56-87   88-97   98-107
  1B5，重链，SEQ ID NO：13   1-126   1-30   31-35   36-49   50-66   67-98   99-115   116-126
  1B5轻链，SEQID NO：15   1-107   1-22   23-33   34-48   49-55   56-87   88-97   98-107
  1C7，重链，SEQ ID NO：17   1-126   1-30   31-35   36-49   50-66   67-98   99-115   116-126
  1C7轻链，SEQID NO：19   1-107   1-22   23-33   34-48   49-55   56-87   88-97   98-107
  2A5，轻链，SEQID NO：21   1-106   1-22   23-33   34-48   49-55   56-87   88-96   97-106
  2C6，重链，SEQ ID NO：23   1-122   1-30   31-35   36-49   50-66   67-98   99-110   111-122
  2C6，轻链，SEQID NO：25   1-111   1-22   23-35   35-50   51-57   58-89   90-100   101-111
  9B12，重链，SEQ ID NO：27   1-121   1-30   31-35   36-49   50-66   67-98   99-110   111-121
  9B12，轻链，SEQ ID NO：29   1-111   1-22   23-35   36-50   51-57   58-89   90-101   102-111
  12D5，重链，SEQ ID NO：31   1-125   1-30   31-37   38-51   52-69   70-101   102-114   115-125
  12D5，轻链，SEQ ID NO：33   1-107   1-23   24-34   35-49   50-56   57-88   89-97   98-107
  13F2，重链，SEQ ID NO：35   1-125   1-30   31-37   38-51   52-69   70-101   102-114   115-125
  VR   FR1   CDR1   FR2   CDR2   FR3   CDR3   FR4
  13F2，轻链，SEQ ID NO：37   1-107   1-23   24-34   35-49   50-56   57-88   89-97   98-107
实施例2：用于筛选的抗-PAR2杂交瘤抗体的纯化
在产生约35ml杂交瘤上清液流体样品的时间和条件下培养杂交瘤。使用合适的方法，例如使用蛋白A，来纯化单克隆抗体。给每个样品中加入12ml 4X-蛋白A结合缓冲液(1.6M柠檬酸，100mM tris，pH9.15)和约300μl 67％MabSelectTM培养基浆液(GE Healthcare，Piscataway，NJ)。将所得到的浆液在4℃下温和旋转过夜。
过夜培养后，将样品离心来沉淀树脂和与其结合的单克隆抗体，例如，在G3.8离心机转子(Beckman Coulter，Fullerton，CA)中在2,000RPM下4℃离心5分钟，没有间断。取出所有大约300μl上清液流体，并将树脂重悬浮来形成浓缩的浆液。
将浓缩的浆液转移至微离心管中，并加入足量的1X-蛋白A结合缓冲液(400mM柠檬酸，25mM tris，pH8.9)，使总体积达到约1ml。将浆液重悬浮，然后在约14,000g下离心5秒钟。从所得到的沉淀中取出上清液流体，以相似的方式将其洗涤总共三次(即，重悬浮于约1ml 1X-蛋白A结合缓冲液中，离心，取出上清液并重悬浮于新鲜缓冲液中)。
三次洗涤后，将沉淀重悬浮于400μl洗脱缓冲液中(200mM甲酸)并在室温下搅拌10min，然后在14,000g离心5秒钟。将上清液小心取出，作为洗脱液，并以上述相似的方式将沉淀再次洗脱，总共三次洗脱循环。将来自三次洗脱循环的洗脱液合并，在室温下在14,000g离心5min，并转移至新鲜的试管中。通过加入2M tris碱(235mMf)将pH调节至7.8-8.2，并快速混合。将样品在室温下在14,000g再次离心5min，并指定为pH Shift Soluble。每个样品(通过将20μl的样品加入700μl水中来稀释)的光谱扫描从250运行至350nm，并通过将0.5μg含有每种抗体的样品装载于含有合适标准品的递减4-20％SDS-PAGE凝胶上来证实蛋白质浓度。
实施例3：PAR-2/Fc多肽的纯化
在合适的哺乳动物细胞如CHO细胞中表达N-端PAR-2/Fc多肽(SEQ ID NO：6)。在无血清培养基中培养的CHO表达细胞的表达上清液含有在激活Arg-Ser键切割PAR-2/Fc的CHO细胞胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，产生“截短”形式的PAR-2/Fc多肽。在10％胎牛血清中(其含有正常水平的血浆蛋白酶抑制剂，其浓度远超过CHO细胞胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的浓度)培养的CHO表达细胞在培养物上清液中表达未分离的N-端PAR-2/Fc。使用适用于分离和纯化含有Fc片段的蛋白质的方法(例如，使用MabSelectTM树脂系统，来自GE Healthcare，Piscataway，NJ)来纯化截短的和未切割的蛋白质。按照需要，通过氨基端序列分析(埃德曼降解)、尺寸排阻色谱、吸收光谱扫描和质谱来分析所得到的纯化FC-构建体。
在合适纯化系统的一个实例中，将含有PAR-2/Fc的调节培养基以6ml/min和在7℃下装载于GE Healthcare 10ml蛋白A SepharoseTMHiTrap柱上。用几个柱体积的不含二价阳离子的Dulbecco’s磷酸盐缓冲的盐水洗涤柱子，然后用pH3.0的100mM甘氨酸洗脱。将洗脱的蛋白质稀释至Tris缓冲液中，并用1M H3PO4将pH调节至7.0。然后将洗脱液在S-缓冲液A中(pH7.0的20mM NaH2PO4)以5ml/min和在7℃下装载于5ml GE Healthcare SP-HP HiTrap柱子上。以5ml/min和在7℃下，用几个柱体积的S-缓冲液A洗涤柱子，接着用20个柱体积线性梯度至40％S-缓冲液B(20mM NaH2PO4，1M NaCl，pH7.0)洗脱，接着步骤至100％S-缓冲液B。通过考马斯染色的SDS-PAGE分析级分并集合。将集合的积分通过0.22μm纤维素醋酸酯滤器来过滤，并使用30,226的计算分子量和35,410M-1cm-1的计算消光系数，对样品进行光谱扫描。将集合的材料浓缩(例如，通过在室温下使用Pall
Figure G2008800222226D00411
10kDa膜，接着通过0.22μm纤维素醋酸酯滤器来过滤)；可以进行另一个光谱扫描来证实浓度。然后通过考马斯染色的SDS-PAGE(4-20％1.0mm tris-甘氨酸凝胶)和在50mM NaH2PO4，250mM NaCl，pH6.9中使用Phenomenx BioSep 3000柱(7.8x300mm)的SE-HPLC来分析终产品。
实施例4：PAR-2/Fc：
Figure G2008800222226D00412
杂二聚体的表达和纯化
将杂二聚的PAR-2/Fc：
Figure G2008800222226D00413
蛋白表达和纯化，以促进PAR-2抗体的亲和力和亲和性的分析。用编码PAR-2/Fc(SEQ ID NO：5)的核酸和编码
Figure G2008800222226D00414
的核酸(SEQ ID NO：43)共同转染合适的细胞，例如，哺乳动物或人细胞，如HEK293细胞。合适条件下转染细胞的培养(例如，在含有低IgG血清的培养基中)导致同型二聚PAR-2/Fc、同型二聚
Figure G2008800222226D00415
和杂二聚PAR-2/Fc：
Figure G2008800222226D00416
蛋白的表达。基本上按照以下所述的，通过顺次的纯化步骤获得后者。
在合适纯化系统的一个实例中，将含有PAR-2/Fc：
Figure G2008800222226D00417
的调节培养基接受促进Fc蛋白纯化的方法，与之前对于PAR-2/Fc所述的方法相似。简而言之，在使Fc结合蛋白A的条件下，将调节的培养基装载于蛋白A柱上。用几个柱体积的PBS洗涤柱子，然后在低pH下洗脱。将洗脱的蛋白质稀释，并进一步通过离子交换色谱纯化(例如，使用S-缓冲液A(pH7.0的20mM NaH2PO4)中的GE Healthcare SP SepharoseTM-高性能柱，用几个柱体积的S-缓冲液洗涤，并以5ml/min用20个柱体积的1至20％的线性梯度和20个柱体积的20至50％S-缓冲液B(20mM NaH2PO4，1M NaCl，pH7.0)线性梯度，接着一个步骤至100％S-缓冲液B来洗脱)。
通过考马斯染色的SAS-PAGE分析级分，并集合含有大量所需产品的级分。然后用抗-
Figure G2008800222226D00418
亲和性凝胶(Sigma A2220；Sigma-Aldrich，St.Louis MO)温育集合的材料过夜。然后用Tris缓冲的盐水洗涤树脂，并用100mM HOAC，pH3.5洗脱。用1M TrisHCl，pH8.0将最终的集合中和至pH7.0。
在任何所需的点，将材料通过0.22μm纤维素醋酸酯滤器来过滤；使用30,226的计算分子量和35,410M-1cm-1的计算消光系数，对样品进行光谱扫描。如果需要，将集合的材料浓缩(例如，通过在室温下使用Pall10kDa膜，接着通过0.22μm纤维素醋酸酯滤器来过滤)；可以进行另一个光谱扫描来证实浓度。然后通过考马斯染色的SDS-PAGE(4-20％1.0mm tris-甘氨酸凝胶)和在50mM NaH2PO4，250mMNaCl，pH6.9中使用Phenomenx BioSep 3000柱(7.8x300mm)的SE-HPLC来分析终产品。
使用N-端氨基酸测序来证实以该方式纯化的材料含有PAR-2/Fc：
Figure G2008800222226D00422
杂二聚体。检测到两个序列：TIQGTNRSSKG(对应于SEQ ID NO：2的氨基酸25至35)，和DDYKDDDD(对应于SEQ IDNO：7)。两个肽的比例接近1。考马斯染色和SEC分析证实了材料是PAR-2/Fc：
Figure G2008800222226D00423
杂二聚蛋白，具有不可检测水平的同型二聚蛋白。
实施例5：通过Western印迹分析PAR-2抗体
为了分析对未切割vs.切割PAR-2的结合，将各种含量的纯化未切割的和截短的N-端PAR-2-Fc接受SDS-PAGE，使用Tris-甘氨酸缓冲系统中8-16％聚丙烯酰胺梯度凝胶(Novex凝胶，Invitrogen LifeTechnologies)。还包括了用于分子量鉴定的含有See Blue标准品(Novex，Invitrogen Life Technologies)的凝胶泳道。电泳后，将蛋白质从凝胶转移至硝基纤维素膜上，使用Novex XCell II Blot Module(Invitrogen Life Technologies)。用1∶1的Odyssey阻断缓冲液，OBB(LI-COR Biosciences)：TBS(Tris缓冲盐水)在4℃下将膜振荡阻断过夜。将待分析的抗体以所需的终浓度稀释于1∶1的OBB∶TBS中，在室温下持续1hr。用TBS中0.1％的吐温20将膜彻底清洗(在～1hr中，改换3-4次100ml)。然后将膜暴露于合适的双链抗体-Alexa680(MolecularProbes，Invitrogen Life Technologies)缀合物(山羊抗-兔IgG，或山羊抗-小鼠IgG)，缀合物以1∶5000稀释于1∶1(OBB∶TBS)中，在室温下持续1hr。如上所述将膜清洗，并且如果需要，使用LI-COR Odyssey红外线成像系统(LI-COR Biosciences)分析。
实施例6：PAR-2抗体的结合活性
该实施例描述了通过表面等离子共振使用
Figure G2008800222226D00431
生物传感器(BIAcore International AB，Uppsala，瑞典)测定的结合活性。简而言之，根据制造商的说明，使用标准的胺结合程序和试剂，将抗人Fc(或抗鼠Fc)共价结合生物传感器芯片(即，CM5芯片)。将PAR-2抗体(人或鼠，或嵌合体，例如，SEQ ID NO：38)或对照抗体注射在固定的抗Fc上，并将不同含量的PAR-2(同型二聚的PAR-2-huFc或杂二聚的PAR-2-huFc/FLAG-huFc)独立地在结合无关抗体的芯片(阴性对照)以及抗PAR-2覆盖的芯片上通过。用10微升/分钟的100mM磷酸的一个10微升脉冲来完成芯片的再生。所有结合在HBS(10mM HEPES，0.15MNaCl，3.4mM EDTA，0.02％NaN3，0.005％表面活性剂P2O，pH7.4)或等价物中进行。
实施例7：PAR-2抗体的比较
在不同的测试形式中测试了七个PAR-2抗体；表2概括了结果。对于之前所述的Ca2+动员，在FLIPR测试中测定了IC50值；使用之前所述的Western印迹测试测定与切割位点的上游片段的结合vs.与切割位点的下游片段的结合。
表2
Figure G2008800222226D00441
*在该Western印迹中，结合切割位点下游的抗体将结合全长和截短的氨基端PAR-2-Fc，而结合切割位点上游的抗体将只结合全长PAR-2/Fc。
实施例8：佐剂诱发性关节炎(AIA)模型
该实施例描述了关节炎的急性和慢性模型。在两种模型中，将动物麻醉，例如通过氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(各自为小鼠混合物或大鼠混合物)或异氟烷，用于所有的关节内(IA)、关节周围(PA)注射或皮层内(ID)注射。
关节注射，IA或PA，针对膝盖或后爪。PA注射跨过围绕目标关节的四个点相等分布。爪注射将ID给药至后爪的足底区域。为了作为内部对照，给一个膝盖或后爪仅注射载体或无菌PBS。注射区域的准备包括将动物麻醉后将关节区域脱毛，并用碘溶液擦拭，接着用醇消毒剂擦拭。用30-规格的针或等价物来给予所有的关节注射，并且对于小注射体积(即，10微升)时，需要气密注射器(即，Hamilton)。
为了诱导急性AIA(aAIA)，在第0天(D0)通过IA注射给动物注射盐水中的1-4％λ卡拉胶和1-4％高岭土(C/K)。两种化合物的浓度取决于打算的疾病严重程度。对于小鼠，诱导剂的总注射体积为10-20微升，对于大鼠为60-80微升。浓度和注射体积都与公开的方法相一致(J Clin Invest.2003；111(1)：35-41和J Pharmacol Exp Ther.2006；316(3)：1017-24)。可选地，可以使用特定PAR-2肽激动剂，或其他炎症激活剂(如，胰蛋白酶，或人β-类胰蛋白酶[J Clin Invest.2003；111(1)：35-41，J Pharmacol Exp Ther.2006；316(3)：1017-24，J PharmacolSci.2005 97(1)：38-42和Br J Pharmacol.1999 127(5)：1083-90]或等价物。对于打算的疾病严重程度来选择所用的浓度，并且总注射体积适于待注射的动物。
为了诱导慢性AIA(cAIA)，在第0天(D0)通过IA注射给动物注射10-20微升(小鼠)和60-80微升(大鼠)补充10mg/mL H37Ra结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(M.tb.)的Freund’s佐剂[完全Freund’s佐剂；CFA]，接着通过PA注射40-80微升(小鼠)和120-200微升(大鼠)。浓度、注射体积和注射方案与公开的方法相一致(J ClinInvest.2003；111(1)：35-41)。佐剂使用按照内部IACUC全球佐剂使用标准，对于小鼠，总的不超过0.4mL，对于大鼠，总的不超过1mL。所有注射按照内部动物管理和使用委员会(IACUC)剂量给药标准，对于小鼠，包括不超过20Ml/kg IP，1mL/kg IA和5mL/kg IV，对于大鼠，包括不超过10Ml/kg IP，0.5mL/kg IA和5mL/kg IV。
治疗干预包括腹膜内(IP)、关节内(IA)或静脉内(IV)给药途径；其他合适的给药途径可以替代这些或附加使用。在D0以外的时间给予通过IA注射的任何治疗方案，或在D0，但在相同关节的不同注射部位继续通过IA注射的任何治疗方案(例如，第一次注射至膝盖的内面中，第二次注射至外面中)。
对于急性和慢性AIA的两种研究，在任何注射之前对所有目标关节进行关节直径的卡尺测量。疾病的追踪可以包括关节直径的卡尺测量以及关节周长的卷尺测量和视觉评分。还可以使用可替换的方法(即，使用器官充满度测量器)。通过以下所示标准中的一个或两个来评价cAIA的严重程度。
cAIA关节使用标准        cAIA关节外观标准
0-正常的关节使用        0-正常关节
1-脚趾卷曲              1-1至3个脚趾发红/肿胀
2-关节或爪的移位        2-超过3个脚趾发红/肿胀，轻度
                        肿胀延伸至爪，肿胀/发红的脚踝，
                        或前爪的轻度肿胀/发红
3-部分荷重              3-肿胀的爪子，轻度至中度发红
4-未荷重和保护          4-整个爪子非常红和非常肿
以这种方式，给6-8周大的Lewis大鼠在左膝注射C/K加上治疗(或对照)，每个右膝为阴性对照，急性模型也是如此。在治疗后的设定时间点测量关节厚度，使用3个卡尺读数的平均值。将左膝与右膝相比的厚度变化表示为百分比变化，并且显示于以下的表3中。
表3
  0Hr   2Hr   6Hr   24Hr   48Hr   72Hr
  PBS   0.00±0.00   -0.26±0.71   0.26±0.65   -0.84±0.53   -0.84±0.55   -0.48±0.50
  C/K   0.00±0.00   3.88±2.88   15.76±1.74   17.51±2.45   16.41±1.39   8.07±1.02
  SLIGRL   0.00±0.00   4.84**±0.87   8.02***±1.17   5.68***±1.07   3.47*±0.95   3.55*±0.81
  1A1   0.00±0.00   1.10±1.13   4.12***±1.29   3.57***±1.20   4.70**±1.39   3.48±0.66
  hIgG   0.00±0.00   4.80±0.88   15.20±2.91   13.77±2.29   10.89±1.30   5.95±1.32
值表示组平均±SEM。使用Bonferroni，通过2-Way ANOVA计算统计学。将单克隆抗体1A1与hIgG相比较；将SLIGRL与PBS相比较。
*p＜0.05
**p＜0.01
***p＜0.001
这些结果证明拮抗性抗PAR-2抗体降低了佐剂诱发性关节炎模型中观察到的炎症。
实施例9：佐剂诱发性关节炎(AIA)模型
该实施例描述了基本上如之前所述的急性AIA模型中PAR-2抗体对爪水肿的作用。简而言之，给6-8周大的Sprague Dawley或Lewis大鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)在后爪足底区域皮下注射(SC)，一个后爪中注射1％λ卡拉胶，另一个为对照(盐水)。在注射佐剂之前，以1.5mg/大鼠(大约8-10mg/kg)腹膜内注射(IP)阻断PAR-2单克隆抗体(1A1)或对照(阳性或阴性对照；参见表4的脚注)，然后在选定的时间点通过器官充满度测量器来测量肿胀。数据表示为以毫升(mL)计每个爪置换出的水体积，vs.对于该爪的基线测量。代表性实验的结果显示于以下的表4-5中。
表4：Lewis大鼠中的爪水肿
  0Hr   2Hr   4Hr   6Hr   8Hr
盐水   0.00±0.00   0.09±0.05   0.03±0.05   0.01±0.04   0.01±0.04
  卡拉胶   0.00±0.00   0.21±0.05   0.24±0.07   0.31±0.04   0.46±0.05
  2B51   0.00±0.00   0.13±0.04   0.10±0.02   0.06±0.05   0.17±0.09
1A1   0.00±0.00   0.15±0.06   0.09***±0.04   0.14***±0.07   0.30***±0.06
  2C62   0.00±0.00   0.22±0.02   0.22±0.05   0.32±0.06   0.51±0.11
12B5：阳性对照抗-PEG2，Cayman Chemical，Ann Arbor，Michigan
22C6：阴性对照结合非阻断抗-PAR2 mAb
*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，通过2-Way ANOVA，使用BonferroniPost测试，vs.对照
表5：Sprague Dawley大鼠中的爪水肿
  0Hr   2Hr   4Hr   6Hr
  盐水   0.00±0.00   0.01±0.08   -0.01±0.06   -0.01±0.04
卡拉胶   0.00±0.00   0.61±0.12   1.16±0.13   1.36±0.19
消炎痛1   0.00±0.00   0.26±0.22   0.28±0.08   0.49±0.16
  0Hr   2Hr   4Hr   6Hr
1A1   0.00±0.00   0.15***±0.05   0.45***±0.08   0.49***±0.08
  2C62   0.00±0.00   0.57±0.08   1.06±0.16   1.13±0.08
15mg/kg的消炎痛阳性对照
22C6：阴性对照结合非阻断抗-PAR2 mAb
*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，通过2-Way ANOVA，使用Bonferroni Post测试，vs.对照
在进一步的实验中，IP给药时，阻断PAR-2抗体(1A1)明显减轻了爪肿胀，但SC给药时没有；随后的药物动力学分析表明SC给药的1A1的生物利用率在爪水肿研究中是次佳的。此外，通过IP给药的阻断PAR-2抗体对肿胀的抑制以剂量依赖性方式发生。这些结果证实之前的发现：拮抗性抗-PAR-2抗体减轻了佐剂诱发性关节炎模型中观察到的炎症。
实施例10：促炎症细胞因子的改变
该实施例描述了PAR-2抗体或基准阳性对照抗体(即，抗-PEG22B5，来自Cayman Chemical)对诱导促炎症细胞因子的作用。简而言之，通过在裂解缓冲液中切碎并置于Qiagen组织裂解仪上来制备来自发炎的大鼠爪或对照(幼稚)爪的组织裂解物。合并等份的样品，使用微体积分光镜系统(NanoDropTM，Thermo Scientific，Waltham MA)通过吸光值(A280)测定总蛋白，并提交给Rules-Based Medicine，Inc.(Austin，TX)，用于在Rodent Panel v2.0上的多分析物特征(MAP)分析。各种分析物发生了变化，具有了疾病活性，所示比较包括通过1A1和2B5治疗分化的那些。将分析物标准化至总蛋白(即(pg，ng，mg)/mg总蛋白)；数据显示于图1中。这些结果证实了文献中的发现：促炎症介质(如细胞因子和前列腺素)提高的释放是卡拉胶诱发水肿的特点。在抗PAR-2拮抗性抗体治疗的动物的爪裂解物中观察到的这些因子的较低水平表明这些抗体结合PAR-2并显著降低了随后的促炎症介质产生。这些分析物产生的降低证实了PAR-2中和抗体的抗炎活性。
实施例11：抗原结合蛋白的结合特性
该实施例描述了PAR-2抗原结合蛋白与细胞表面表达的PAR-2的结合特性的分析，利用了动力学排除测试，其测量了溶液相中的结合事件并可以用来计算KD、Kon和Koff(Sapidyne Instruments，Boise，ID)，基本上按照之前所述的，Xie等，J.Imm.Methods 3041：1(2005)和Rathanaswami等，Anal.Biochem.373：52(2008)。简而言之，用设定含量的抗体将连续稀释的表达人PAR-2的细胞(例如，在细胞表面表达人PAR-2的CHO转染子，通过用编码SEQ ID NO：2多肽的人全长PAR-2 cDNA转染CHO细胞获得)和对照细胞(即，未转染的CHO细胞)在改良的DMEM培养基中(无酚红，含有10％热灭活FBS，0.1mM MEM非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，青霉素-链霉素-谷氨酰胺和0.025％(w/w)叠氮化钠)4℃旋转培养24至36小时。在培养时间结束时，通过离心将细胞沉淀，(即，在2000rpm 4分钟)，并除去含有未结合(游离)抗体的上清液。按照Rathanaswami等，Biochem BiophysResearch Commun：1004(2005)中所述的，使用合适的捕获珠子和Cy5-缀合的抗人双链抗体，通过测量游离mAb。使用
Figure G2008800222226D00493
软件和通过“n-曲线分析”(其同时适合对单个KD值给定的所有曲线)，获得平衡解离常数(KD)(Rathanswami等，2005和Xie等，同上)。以这种方式测定特定PAR-2抗体的KD。如通过
Figure G2008800222226D00494
所测量的，抗PAR-2抗体1A1与细胞表面表达的人PAR-2相互作用的KD为62.8pM，具有24.8至134.7pM的95％置信区间(对于N＝5实验的平均)。该系统中抗体1B5的最初分析表示了3.39的KD，具有1.36至5.47pM的95％置信区间(N＝2实验)。
实施例12：胶原诱导性关节炎的诱发
该实例描述了利用大鼠的胶原诱导性关节炎模型。在使用前两天，在2-4℃的转盘上，将猪II型胶原蛋白(10mg；Chondrex，Redmond，WA)溶解于0.1N醋酸中(5mL)。随后，使用乳化针和玻璃注射器，用Freund’s不完全佐剂(IFA；Difco，Detroit，MI)将胶原蛋白1∶1乳化，产生1mg/mL的终浓度。通过在背上的10个不同部位(100微升/部位)皮层内注射IFA中乳化的胶原蛋白在8-周大雌性Lewis大鼠中(Charles River，Wilmington，MA)诱发疾病。关节炎的临床发作通常在10至12天发生，如通过后爪肿胀和走动困难所示。在胶原蛋白免疫之前，将大鼠随机分成处理组，并用i.p.给药PAR-2中和抗体、对照抗体(即，PAR-2非阻断抗体)或载体对照(A5Su)来开始治疗。在发作开始前一天，第9天，给予第二次剂量的抗体和载体。
通过使用卡尺间歇性地测量后爪直径在临床上测定研究过程中的炎症进展。在诱发关节炎之前、发作那天(第10天)、第11-17天和尸检时(第18天)，在胫附(踝)关节处获取读数。根据以下的公式，基于曲线下面积(AUC)来计算爪炎症的抑制：
[(载体处理的CIA-处理的CIA)/(载体处理的CIA)]x100
此外，在处理方案的过程中，每日测定总体重，作为增补的终点，因为在该关节炎模型中，体重损耗与关节炎症的进展平行。
在研究结束时，可以评价踝关节的骨矿物质密度(BMD)的损耗以及有丝切割原激活的蛋白激酶激活的激酶-2(MAPKAPK-2或MK-2)的磷酸化中的变化。在尸检后的合适时间点使用双重能量X-射线吸光测定法(DEXA)来检测BMD。在毛发线处取出后爪(就在踝[跗关节]附近)，浸入70％乙醇中，并在室温下存储直至测定BMD。然后基本上按照所述的(Feige等，Cell Mol Life Sci 57：1457；2000)，使用扇形射束X-射线密度计(Model QRD-4500A；Hologic，Waltham，MA)在水平方向上扫描关节。扫描后，在跟骨中心放置矩形框(29x25mm)来描绘待分析的部位，并且将对所用仪器确认的算法(例如，Hologic软件)用来计算骨面积、骨矿物质含量和骨矿物质密度。对于磷分析，将一个脚踝在液氮中冷冻，用于研磨成蛋白粉，使用可购得的MK-2测试将其在Western印迹上运行。
对于其所有的教导和用于所有目的，将在此引用的每篇参考文献以其整体引入作为参考。

Claims (19)

1.具有重链和轻链的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链包含与SEQ ID NO：9至少95％同一性的可变区，和所述轻链包含与SEQ IDNO：11至少95％同一性的可变区。
2.权利要求1的抗原结合蛋白，其中所述轻链可变区具有SEQ IDNO：39的氨基酸序列，和所述重链可变区具有SEQ ID NO：40的氨基酸序列。
3.权利要求1的抗原结合蛋白，其中所述轻链可变区具有选自SEQID NO：11、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：19的氨基酸序列，和所述重链可变区具有选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：17的氨基酸序列。
4.权利要求1的抗原结合蛋白，其选自：
a)其中轻链可变区具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列和重链可变区具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的抗原结合蛋白；
b)其中轻链可变区具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列和重链可变区具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的抗原结合蛋白；
和
c)其中轻链可变区具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列和重链可变区具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的抗原结合蛋白。
5.具有重链和轻链的分离的抗原结合蛋白，所述重链包含称为CDR1、CDR2和CDR3的3个互补决定区(CDR)，和所述轻链包含称为CDR1、CDR2和CDR3的3个互补决定区，其中
a)重链CDR1具有选自SEQ ID NO：9的氨基酸31至35，SEQ IDNO：13的氨基酸31至35和SEQ ID NO：17的氨基酸31至35的氨基酸序列；
b)重链CDR2具有选自SEQ ID NO：9的氨基酸50至66，SEQ IDNO：13的氨基酸50至66和SEQ ID NO：17的氨基酸50至66的氨基酸序列；
c)重链CDR3具有选自SEQ ID NO：9的氨基酸99至115，SEQ IDNO：13的氨基酸99至115和SEQ ID NO：17的氨基酸99至115的氨基酸序列；
和
a′)轻链CDR1具有选自SEQ ID NO：11的氨基酸23至33，SEQ IDNO：15的氨基酸23至33和SEQ ID NO：19的氨基酸23至33的氨基酸序列；
b′)轻链CDR2具有选自SEQ ID NO：11的氨基酸49至55，SEQ IDNO：15的氨基酸49至55和SEQ ID NO：19的氨基酸49至55的氨基酸序列；和
c′)轻链CDR3具有选自SEQ ID NO：11的氨基酸88至97，SEQ IDNO：15的氨基酸88至97和SEQ ID NO：19的氨基酸88至97的氨基酸序列。
6.权利要求5的抗原结合蛋白，所述重链进一步包含1至4个称为FR1、FR2、FR3和FR4的框架区(FR)，和所述轻链进一步包含1至4个称为FR1、FR2、FR3和FR4的框架区，其中
a)重链FR1具有选自SEQ ID NO：9的氨基酸1至30、SEQ ID NO：13的氨基酸1至30和SEQ ID NO：17的氨基酸1至25的氨基酸序列；
b)重链FR2具有选自SEQ ID NO：9的氨基酸36至49、SEQ ID NO：13的氨基酸36至49和SEQ ID NO：17的氨基酸36至49的氨基酸序列；
c)重链FR3具有选自SEQ ID NO：9的氨基酸67至98、SEQ ID NO：13的氨基酸67至98和SEQ ID NO：17的氨基酸67至98的氨基酸序列；和
d)重链FR4具有选自SEQ ID NO：9的氨基酸116至126、SEQ IDNO：13的氨基酸116至126和SEQ ID NO：17的氨基酸116至126的氨基酸序列；
和
a′)轻链FR1具有选自SEQ ID NO：11的氨基酸1至22、SEQ IDNO：15的氨基酸1至22和SEQ ID NO：19的氨基酸1至22的氨基酸序列；
b′)轻链FR2具有选自SEQ ID NO：11的氨基酸34至48、SEQ IDNO：15的氨基酸34至48和SEQ ID NO：19的氨基酸34至48的氨基酸序列；
c′)轻链FR3具有选自SEQ ID NO：11的氨基酸56至87、SEQ IDNO：15的氨基酸56至87和SEQ ID NO：19的氨基酸56至87的氨基酸序列；
d′)轻链FR4具有选自SEQ ID NO：11的氨基酸98至107、SEQ IDNO：15的氨基酸98至107和SEQ ID NO：19的氨基酸98至107的氨基酸序列。
7.具有重链和轻链的抗原结合蛋白，所述重链包含与SEQ ID NO：31至少95％同一性的可变区，和轻链包含与SEQ ID NO：35至少95％同一性的可变区。
8.权利要求7的抗原结合蛋白，其中所述轻链可变区具有SEQ IDNO：41的氨基酸序列，和所述重链可变区具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列。
9.权利要求7的抗原结合蛋白，其中所述轻链可变区具有选自SEQID NO：33和SEQ ID NO：37的氨基酸序列，和所述重链可变区具有选自SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：35的氨基酸序列。
10.权利要求7的抗原结合蛋白，其选自：
a)其中轻链可变区具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列和重链可变区具有SEQ ID NO：31的氨基酸序列的抗原结合蛋白；
和
b)其中轻链可变区具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列和重链可变区具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的抗原结合蛋白。
11.具有重链和轻链的分离的抗原结合蛋白，所述重链包含称为CDR1、CDR2和CDR3的3个互补决定区(CDR)，和所述轻链包含称为CDR 1、CDR2和CDR3的3个互补决定区，
其中
a)重链CDR1具有选自SEQ ID NO：31的氨基酸31至37和SEQ IDNO：35的氨基酸31至37的氨基酸序列；
b)重链CDR2具有选自SEQ ID NO：31的氨基酸52至69和SEQ IDNO：35的氨基酸52至69的氨基酸序列；和
c)重链CDR3具有选自SEQ ID NO：31的氨基酸102至114和SEQID NO：35的氨基酸102至114的氨基酸序列；
和
a′)轻链CDR1具有选自SEQ ID NO：33的氨基酸24至34和SEQ IDNO：37的氨基酸24至34的氨基酸序列；
b′)轻链CDR2具有选自SEQ ID NO：33的氨基酸50至56和SEQ IDNO：37的氨基酸50至56的氨基酸序列；和
c′)轻链CDR3具有选自SEQ ID NO：33的氨基酸89至97和SEQ IDNO：37的氨基酸89至97的氨基酸序列。
12.权利要求11的抗原结合蛋白，所述重链进一步包含1至4个称为FR1、FR2、FR3和FR4的框架区(FR)，和所述轻链进一步包含1至4个称为FR1、FR2、FR3和FR4的框架区，其中
a)重链FR1具有选自SEQ ID NO：31的氨基酸1至30和SEQ IDNO：35的氨基酸1至30的氨基酸序列；
b)重链FR2具有选自SEQ ID NO：31的氨基酸38至51和SEQ IDNO：35的氨基酸38至51的氨基酸序列；
c)重链FR3具有选自SEQ ID NO：31的氨基酸70至101和SEQ IDNO：35的氨基酸70至101的氨基酸序列；和
d)重链FR4具有选自SEQ ID NO：31的氨基酸115至125和SEQ IDNO：35的氨基酸115至125的氨基酸序列；
和
a′)轻链FR1具有选自SEQ ID NO：33的氨基酸1至23和SEQ IDNO：37的氨基酸1至23的氨基酸序列；
b′)轻链FR2具有选自SEQ ID NO：33的氨基酸35至49和SEQ IDNO：37的氨基酸35至49的氨基酸序列；
c′)轻链FR3具有选自SEQ ID NO：33的氨基酸57至88和SEQ IDNO：37的氨基酸57至88的氨基酸序列；和
d′)轻链FR4具有选自SEQ ID NO：33的氨基酸98至107和SEQ IDNO：37的氨基酸98至107的氨基酸序列。
13.分离的抗原结合蛋白，其选自：
a)包含具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQID NO：9的氨基酸序列的重链可变区的抗原结合蛋白；
b)包含具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQID NO：13的氨基酸序列的重链可变区的抗原结合蛋白；
c)包含具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQID NO：17的氨基酸序列的重链可变区的抗原结合蛋白；
d)包含具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQID NO：23的氨基酸序列的重链可变区的抗原结合蛋白；
e)包含具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQID NO：27的氨基酸序列的重链可变区的抗原结合蛋白；
f)包含具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQID NO：31的氨基酸序列的重链可变区的抗原结合蛋白；和
g)包含具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQID NO：35的氨基酸序列的重链可变区的抗原结合蛋白。
14.分离的核酸，其编码权利要求1至13任一项的抗原结合蛋白。
15.权利要求14的核酸，其选自：
a)包含具有SEQ ID NO：10的核苷酸序列和具有SEQ ID NO：8的核苷酸序列的核酸；
b)包含具有SEQ ID NO：12的核苷酸序列和具有SEQ ID NO：14的核苷酸序列的核酸；
c)包含具有SEQ ID NO：16的核苷酸序列和具有SEQ ID NO：18的核苷酸序列的核酸；
d)包含具有SEQ ID NO：24的核苷酸序列和具有SEQ ID NO：22的核苷酸序列的核酸；
e)包含具有SEQ ID NO：28的核苷酸序列和具有SEQ ID NO：26的核苷酸序列的核酸；
f)包含具有SEQ ID NO：30的核苷酸序列和具有SEQ ID NO：32的核苷酸序列的核酸；和
g)包含具有SEQ ID NO：34的核苷酸序列和具有SEQ ID NO：36的核苷酸序列的核酸。
16.载体，其含有根据权利要求14或15的核酸。
17.分离的宿主细胞，其被权利要求16的载体转染或转化。
18.生产抗原结合蛋白的方法，其包括在促进表达的条件下培养权利要求17的宿主细胞，以及从培养基回收蛋白质。
19.组合物，其含有权利要求1至13任一项的多肽和生理学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
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