ES2273452T3 - Anticuerpos monoclonales antagonistas contra la molecula humana cd40. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UN ANTICUERPO MONOCLONAL O FRAGMENTO DEL MISMO, CAPAZ DE FIJARSE A UN ANTIGENO CD40 HUMANO SITUADO EN LA SUPERFICIE DE UNA CELULA B HUMANA, CARACTERIZADO PORQUE LA FIJACION DEL ANTICUERPO O DE UN FRAGMENTO DEL MISMO AL ANTIGENO CD40 IMPIDE EL CRECIMIENTO O DIFERENCIACION DE LA CELULA B.

Description

Anticuerpos monoclonales antagonistas contra la molécula humana CD40.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos dirigidos contra moléculas de antígenos asociados a membrana. Más específicamente, la presente invención describe procedimientos para usar estos antígenos asociados a membrana para la inmunización de un animal huésped y para explorar anticuerpos aislados del animal huésped. La invención se refiere también a nuevos procedimientos para tratar enfermedades del sistema inmune. En particular, la invención se refiere a procedimientos para prevenir o tratar enfermedades mediadas por anticuerpos, tales como la enfermedad mediada por IgE (alergias) y enfermedades autoinmunes, incluidas lupus erythomatosus (SLE), cirrosis biliar primaria (PBC) y púrpura trombocitopénica idiopática (ITP).

Antecedentes de la invención I. Producción de anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales han demostrado ser herramientas poderosas en la investigación inmunológica. En general, los anticuerpos monoclonales se pueden producir usando antígenos impuros como inmunógenos, con tal de que haya disponible un ensayo de exploración que distinga anticuerpos dirigidos contra el antígeno de interés, de anticuerpos dirigidos contra otros otros antígenos presentes en la composición inmunogénica. Cuando el antígeno de interés es una molécula de superficie de una célula, es deseable usar células o fracciones de membrana que contienen la molécula de interés como inmunógenos con el fin de preservar las limitaciones conformacionales proporcionadas por un medio de membrana.

La inmunización de ratones con células enteras usualmente da una respuesta inmune fuerte que genera anticuerpos a un gran número de moléculas diferentes. Esta amplia respuesta inmune imposibilita el uso de células de inmunógeno en una posterior exploración para la producción de anticuerpos específicos por clones de hibridoma derivados de bazo de ratón o células de linfocitos.

Además, cuando el antígeno de interés se expresa a densidad baja, es probable que la frecuencia de células B de ratón específicas para el antigeno sea relativamente baja. Esta baja frecuencia necesita la exploración de un número grande de clones de hibridoma para identificar un clon que produzca anticuerpos dirigidos contra el antígeno de interés.

Se han usado fibroblastos de murino singeneicos que expresan antígenos de superficie de células humanas para inmunizar ratones para la producción de anticuerpos específicos (DiSanto y otros, 1991). Cuando se inyectan en la cepa de ratón apropiada, las proteínas de antígeno de fondo presentes en los fibroblastos no han de ser inmunogeneicas, por lo que la respuesta inmune no debe concentrarse en la proteína recombinante xenogeneica. Sin embargo, este enfoque requiere la construcción de células recombinantes específicas para cada especie o cepa en la que se desea la producción de anticuerpo.

II. Activación de células B y sistema de antígeno CD40-ligando

Las células B desempeñan un papel importante durante la respuesta inmune normal in vivo. Un antígeno foráneo se unirá a inmunoglobulinas de superficie en células B específicas, desencadenando una cadena de fenómenos en los que están incluidos endocitosis, tratamiento, presentación de péptidos tratados en moléculas de MHC de clase II y regulación por hiperproducción del antígeno B7 en la superficie de células B. Luego, una célula T específica se une a la célula B por vía de reconocimiento por el receptor de célula T (TCR) del antígeno tratado presentado en la molécula de MHC de clase II. La estimulación por TCR comienza a activar la célula T e inicia la producción de citoquinas de célula T. La interacción entre el antígeno CD28 en células T y el antígeno B7 en células B puede proporcionar una segunda señal que activa la célula T, de lo que resulta un alto nivel de secreción de citoquinas. Adicionalmente, el ligando CD40, que no se expresa en las restantes células T humanas, es hiperregulado en la superficie de la célula T cuando se reciben las señales antes mencionadas. La célula B es estimulada luego por el ligando de CD40 a través del antígeno CD40 sobre la superficie de la célula B, y también por citoquinas solubles, causando que madure la célula B en una célula de plasma que secreta niveles altos de inmunoglobulina soluble.

Hace unos pocos años, Zubler y otros, J. Immunol. (1985) 134:3662, observaron que un subclón mutante de la línea EL-4 de timoma de ratón, conocido como EL4B5, podía estimular fuertemente células B tanto de origen humano como de origen de murino para proliferar y diferenciar in vitro en células de plasma que secretan inmunoglobulina. Se encontró que esta activación era antígeno-independiente y no restringida por MHC. Para una estimulación óptima de células B humanas, era necesaria la presencia de material sobrenadante de células T humanas activadas; pero también se producía una respuesta de las células B cuando las células EL4B5 se preactivaron con 12-miristato 13-acetato de forbal (PMA) o IL-1. Zubler y otros. Immunological Reviews (1987) 99:281; y Zhang y otros, J. Immunol. (1990) 144:2955. La activación de células B en este sistema de cultivo es eficiente; experimentos de dilución límitativa han revelado que la mayoría de células B humanas se pueden activar para proliferar y diferenciar en células que secretan anticuerpo. Wen y otros, Eur. J. Immunol. (1987) 17:887.

No se ha elucidado antes el mecanismo por el que estas células EL-4 mutantes activan células B humanas y de murino. Sin embargo, está claro que se requiere el contacto de célula-célula para la activación de las células B inducida por EL4B5. Primero, las células B no proliferan en presencia de material sobrenadante de células EL4B5 estimuladas con PMA. Zubler y otros (1985) cita anterior. Segundo, las células B no proliferan cuando se separan de células EL4B5 pretratadas con PMA por una membrana de filtro semipermeable. Zhang y otros, cita anterior. Los anticuerpos contra LFA-1 de ratón, LFA-1 humano o LFA-3 humano, y los anticuerpos contra moléculas de clase II de MHC de ratón o humanos no inhiben la proliferación inducida por EL4B5 de células B humanas o de murino. Zubler y otros (1987) y Zang y otros, cita anterior.

El antígeno CD40 es una glicoproteína expresada en la superficie celular de células B. Durante la diferenciación de células B, la molécula se expresa primeramente en células pre-B y luego desaparece de la superficie de la célula cuando la célula B se convierte en una célula de plasma. La reticulación de las moléculas de CD40 con anticuerpos anti-CD40 media una variedad de efectos sobre células B. Es conocido que el antígeno CD40 está relacionado con el receptor del factor de crecimiento de nervios humano (NGF) y el receptor del factor \alpha de necrosis tumoral (TNF-\alpha), lo que sugiere que CD40 es receptor de un ligando con funciones importantes en la activación de células B.

Sobre la superficie celular de células T activadas se ha encontrado un ligando para CD40. Fenslow y otros, J. Immunol. (1992) 149:655; Lane y otros, Eur. J. Immunol. (1992) 22:2573; Noelle y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1992) 89:6550. La clonación de cDNA del ligando de CD40 reveló una molécula con características de una glicoproteína de transmembrana de tipo II con homología con TNF-\alpha. Armitage y otros, Nature (1992) 357:80 y Springs y otros, J. Exp. Med. (1992) 176:1543. El dominio extracelular del ligando de CD40 contiene dos restos de arginina proximales a la región de transmembrana, que proporcionan un potencial sitio de escisión proteolítica que podría dar origen a una forma soluble del ligando. La expresión del ligando de CD40 recombinante ha demostrado que esta molécula puede estimular la purificación de células B purificadas y, en combinación con IL-4, mediar la secreción de IgE. Armitage y otros y Spring y otros, citas anteriores. Se ha dado cuenta de que las anormalidades en el gen para el ligando DC40, que resultan de la ausencia de una molécula funcional sobre células T activadas, son responsables de la presencia del síndrome de hiper-IgM X-ligado, un trastorno raro caracterizado por la incapacidad de estos pacientes para producir niveles normales de isotipos de anticuerpo que no sean IgM. Allen y otros, Science (1993) 259:990, y Korthäuer y otros, Nature (1993) 361:539.

Todos los anticuerpos anti CD40 conocidos en la técnica tienen un efecto estimulador sobre células B humanas. La reticulación de la molécula de CD40 sobre la superficie de células B usando anticuerpos anti CD40 conocidos media una variedad de efectos sobre células B. Los anticuerpos monoclonales (mAbs) anti CD40 pueden inducir adherencia intercelular, proliferación y, en combinación con ciertas citoquinas, la maduración de células que secretan anticuerpo. Por ejemplo, los mAbs anti CD40 conocidos han demostrado imitar los efectos de células cooperadoras T en la activación de células B. Estos anticuerpos, cuando están presentes en células adherentes que expresan Fc\gammaRII, inducen la proliferación de células B. J. Banchereau y otros, Science (1989) 251:70. Además, los mAbs anti CD40 pueden reemplazar la señal cooperadora de T para la secreción de IgM, IgG e IgE en presencia de IL-4. H. Gascan y otros, J. Immunol. (1991) 147:8. A mayor abundamiento, los mAbs anti CD40 conocidos pueden prevenir la muerte celular programada (apoptosis) de células B aisladas de nodos de linfa.

La presente invención proporciona un procedimiento para generar células que producen anticuerpos monoclonales anti CD40, en el que los anticuerpos tienen una especifidad de unión para una molécula de superficie celular especifica; procedimiento que elude las limitaciones de los procedimientos antes mencionados. Esta invención también proporciona el uso de anticuerpos anti DC 40 que (a) son capaces de inhibir la respuesta de células B y (b) se pueden usar para prevenir o tratar la enfermedad mediada por anticuerpos.

Sumario de la invención

La invención está basada en el descubrimiento de anticuerpos anti CD40 que no estimulan el crecimiento y diferenciación de células B humanas. A diferencia, estos anticuerpos pueden inhibir las respuestas de células B humanas a concentraciones relativamente bajas. Consecuentemente, estos anticuerpos se pueden usar para prevenir o tratar enfermedades o afecciones que están mediadas por anticuerpos producidos por la respuesta de células B humanas. Estos anticuerpos también reconocen nuevos epitopos sobre el antígeno CD 40 útiles en la modulación de la respuesta de células B.

Consecuentemente, esta invención proporciona un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a un antígeno CD 40 humano localizado en la superficie de una célula B humana, en el que la unión del anticuerpo al antígeno CD40 previene el crecimiento o diferenciación de la célula B.

Además, los anticuerpos se pueden usar en un procedimiento para prevenir o tratar en un paciente una enfermedad mediada por un anticuerpo, procedimiento que comprende administrar a un paciente que necesita tal tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a un antígeno CD40 situado sobre la superficie de una célula B humana, en el que la unión del anticuerpo al antígeno CD40 previene el crecimiento o diferenciación de la célula B, en un excipiente farmacéuticamente aceptable.

También, los anticuerpos se pueden usar en un procedimiento para prevenir o tratar en un paciente una enfermedad mediada por IgE, tal como una alergia, procedimiento que comprende administrar a un paciente que necesita tal tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a un antígeno CD40 humano situado en la superficie de una célula B humana, en el que la unión del anticuerpo al antígeno CD40 previene el crecimiento o diferenciación de la célula B, en un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Además, los anticuerpos se pueden usar en un procedimiento para prevenir o tratar en un paciente una enfermedad autoinmune mediada por un anticuerpo, procedimiento que comprende administrar a un paciente que necesita tal tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a un antígeno CD40 humano situado sobre la superficie de una célula B humana, en el que la unión del anticuerpo al antígeno CD40 previene el crecimiento o diferenciación de la célula B, en un excipiente farmacéuticamente aceptable. Entre las enfermedades autoinmunes particulares contempladas para tratamiento por este procedimiento están incluidas lupus erythematosus sistémico (SLE), cirrosis biliar primaria (PBC) y púrpura trombocitopénica idiopática (ITP).

En realizaciones más preferentes de los objetivos anteriores, el anticuerpo monoclonal anti CD40 es 5D12 (ATCC HB 11399) o 3C6 (ATCC HB 11340).

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación esquemática del vector de transferencia baculoviral pAcC8 y la secuencia del sitio de clonación múltiple. La Fig. 1B es una representación esquemática de la generación de células Sf9 que expresan el antígeno CD40 humano de acuerdo con el procedimiento de la presente invención.

La Fig. 2 representa las secuencias de cebadores de la reacción en cadena de polimerasa usados en la preparación de regiones de codificación para antígenos CD40 humanos. Estos cebadores se construyeron sobre la base de secuencias publicadas que codifican DNA completo para CD40. Stamenkovic y otros, (1989).

La Fig. 3 representa los resultados de los ensayos ELISA que examinan la reacción del anticuerpo monoclonal S2C6 anti-(CD40) con células Sf9 que expresan CD40 y células Sf9 que expresan B7.

Las Figuras 5A-C presentan los resultados de la tinción fluorescente de células de las células ARC de la línea de células B EBV-transformadas que expresan CD40 o B7.

Las Figuras 6A-F presentan los resultados de los ensayos de competición en los que se usa tinción fluorescente de células de las células ARC de la línea de células B EBV-transformadas que expresan CD40 y B7, así como antígenos CD40 y B7 solubles.

En la Fig. 7A se compara la capacidad de tres mAbs anti CD40 nuevos y uno viejo de coestimular la proliferación inducida de células B humanas anti-IgM. La Fig. 7B repite el experimento de la Fig. 5A en presencia de interleuquina-2 recombinante (rIL-2).

La Fig. 8 representa la capacidad de tres nuevos mAbs anti CD40 para inhibir la proliferación inducida de células B humanas por coestimulación con mAb 52C6 inmovilizado anti IgM y anti CD40.

La Fig. 9 representa el efecto de tres nuevos mAbs anti CD40 para inhibir la proliferación de células B humanas inducida por EL4B5.

La Fig. 10 presenta el efecto de CD40 soluble (hCD40\mu) sobre la proliferación de células B humanas inducida por EL4B5.

Las Figuras 4A y 4B demuestran el efecto de un nuevo mAb 5D12 anti CD40 sobre la producción de inmunoglobulina, inducida por células T humanas, por células B humanas.

Descripción detallada de la invención

La invención aquí descrita se basa en trabajo previamente publicado y solicitudes de patentes en tramitación. A modo de ejemplo, tal trabajo está constuido por publicaciones científicas, patentes o solicitudes de patentes en tramitación.

I. Definiciones

Tal como se usa aquí, los términos "antígeno asociado a membrana", "molécula de superficie de célula" o "antígeno de superficie de célula" se refieren a una proteína, un polipéptido o un péptido en el que al menos una porción antigénica de la proteína, polipéptido o péptido está expuesta sobre una superficie de una membrana biológica y que puede tener uno o más de los restos siguientes unidos por covalencia: uno o más restos simples o complejos de azúcar (como en una glicoproteína), restos lipídicos (como en una lipoproteína), una combinación de restos lipídicos o de azúcar, u otras modificaciones postransacionales.

Las "proteínas" típicamente son polímeros de cadena larga basados en aminoácidos ("polipéptidos"). Las proteínas pueden estar compuestas por una, dos o más cadenas de polipéptido y además pueden contener algún otro tipo de sustancia en asociación con la(s) cadena(s) de polipéptido, tal como carbohidratos. El tamaño de las proteínas cubre un amplio intervalo desde (una cifra arbitraria) 5.000 a varios cientos de miles de g/mol. La cifra de 5.000 corresponde a la presencia de aproximadamente 40-45 aminoácidos. Típicamente, las proteínas menores que aproximadamente 5.000 g/mol se denominan polipéptidos o simplemente péptidos (Bohinsk).

Tal como se usa aquí, el término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos policlonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena individual y fragmentos de ellos tales como F_{ab}, F_{(ab)2}', F_{v} y otros fragmentos que retienen la función de unión del antígeno del anticuerpo madre.

Tal como se usa aquí, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de anticuerpo que tiene una población homogénea de anticuerpos. El término no está limitado en consideración de la especie o fuente del anticuerpo ni está limitado por la manera en que se ha hecho. El término abarca inmunoglobulinas enteras así como fragmentos tales como F_{ab}, F_{(ab)2}', F_{v} y otros fragmentos que retienen la función de unión del antígeno del anticuerpo. En esta invención se pueden usar anticuerpos monoclonales de cualquier especie mamífera. En la práctica, sin embargo, típicamente serán de origen de rata o murino, a causa de la disponibilidad de células de rata o murino para hacer las líneas de células híbridas o hibridomas requeridos para producir anticuerpos monoclonales.

Tal como se usa aquí, el término "anticuerpos humanizados" significa que al menos una porción de las regiones de armazón de una inmunoglobulina deriva de secuencias de inmunoglobulina humana.

Tal como se usa aquí, el término "anticuerpos de cadena individual" se refiere a anticuerpos preparados por determinación de los dominios de unión (en cadenas pesadas y ligeras) de un anticuerpo de unión, y suministro de un resto de unión que permite conservar la función de unión. Esto forma, en esencia, un anticuerpo abreviado radicalmente, que tiene sólo la parte del dominio variable necesaria para la unión al antígeno. La determinación y construcción de anticuerpos de cadena individual se describen en la patente U.S. nº. 4.946.778, expedida a Ladner y otros.

Tal como se usa aquí, el término "molécula que se une al antígeno B7" significa una molécula que es capaz de formar un complejo con el antígeno B7 en un medio en el que otras sustancias del mismo medio no están complejadas al antígeno B7. El complejo se forma de manera que bloquea la ruta normal de transducción de señal de B7 a través del antígeno CD28 o CTLA4. Entre las moléculas que se unen al antígeno B7 están incluidas CD28, CTLA4, CTLA4Ig y anticuerpos anti B7.

El término "epitopo del antígeno CD40", tal como se usa aquí, se refiere a una molécula que es capaz de inmunorreactividad con los cuerpos monoclonales anti CD40 de esta invención, excluido el propio antígeno CD 40. Los epitopos del antígeno CD40 pueden comprender proteínas, fragmentos de proteínas, hidratos de carbono, lípidos y otras moléculas; pero, a los fines de la presente invención, muy comúnmente son proteínas, oligopéptidos cortos, imitadores de oligopéptidos (esto es, compuestos orgánicos que imitan las propiedades de unión al anticuerpo del antígeno CD40), o combinaciones de ellos. Se describen imitadores de oligopéptidos adecuados en, por ejemplo, la solicitud de PCT US91/04282.

II. Generación de anticuerpos para moléculas de antígeno asociado a membrana

Esta sección describe un procedimiento para generar y seleccionar anticuerpos para una molécula de superficie celular, usando como inmunógeno células de insecto transfectadas. Las células de insecto transfectadas de la presente invención se pueden usar también en ensayos de exploración.

De acuerdo con una realización, la invención incluye un procedimiento para producir anticuerpos monoclonales para un antígeno de superficie celular. El procedimiento implica las etapas siguientes: la etapa de inmunización, que incluye (i) seleccionar y aislar una secuencia codificadora de ácido nucleico que codifica el antígeno de interés; (ii) insertar la secuencia codificadora en un vector de expresión baculoviral de manera que se obtenga una expresión eficiente de la secuencia codificadora, (iii) transfectar el vector de expresión en una línea de células de insecto para obtener células recombinantes de insecto que expresan el antígeno seleccionado, y (iv) inmunizar un animál huésped con las células de insecto que expresan el antígeno asociado a membrana.

Después de la inmunización, se explora el suero del animal huésped contra células, que no son las células de insecto, que expresan el antígeno de interés. Alternativamente, para explorar el suero se pueden emplear fracciones de membrana que contienen el antígeno de interés o, en algunos casos, los propios antígenos producidos recombinantemente, purificados. Típicamente, se exploran (a) suero presangrado, (b) el suero de un animal huésped inmunizado con las células de insecto que no expresan al antígeno de interés, y (c) el suero del animal huésped inmunizado con las células recombinantes de insecto. La presencia de anticuerpos dirigidos específicamente contra el antígeno de interés la revelan las reacciones negativas con los sueros (a) y (b) y las reacciones positivas con el
suero (c).

De acuerdo con otra realización, la invención incluye un procedimiento para la producción de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales para una proteína de superficie de célula. El procedimiento implica la etapas (i) a (iv) descritas antes. Después de la inmunización del animal huésped con las células de insecto recombinantes, se aislan las células del animal que producen anticuerpo. En una realización preferente de la invención, tales células que producen anticuerpo se usan para generar células de hibridoma, que se clonan y usan para la producción de anticuerpos monoclonales. Para la producción de un anticuerpo específico se exploran las sustancias sobrenadantes de tales células de hibridoma, por ejemplo, usando un ensayo de exploración basado en células que se describe más adelante.

A. Aislamiento de secuencias codificadoras para moléculas de membrana

La secuencia codificadora de ácido nucleico para un antígeno asociado a membrana seleccionado se puede aislar basándose en secuencias de codificación conocidas de aminoácidos y/o DNA para el componente proteínico del antígeno. La secuencia de codificación se puede aislar de fuentes biológicas por procedimientois estándar (Ausubel y otros; Maniatis y otros; Sambrook y otros) (por ejemplo, hibridación, hibridación diferencial, clonación y exploración de placa, etc.). Alternativamente, se pueden preparar secuencias de oligonucleótidos sintéticos que codifican el antígeno de interés usando sintetizadores automatizados de oligonucleótidos, asequibles comercialmente, o se pueden comprar, por ejemplo, de Synthetic Genetics (San Diego, CA). En el caso de secuencias de codificación grandes, la secuencia codificadora de oligonucleótidos se puede sintetizar a través de una serie de etapas de exploración que implican una serie en tándem de fragmentos múltiples de oligonucleótido que corresponden a la secuencia de codificación. (Crea; Yoshio y otros; Eaton y otros). Las secuencias codificadoras de oligonucleótidos se pueden amplificar y aislar por procedimientos recombinantes estándar (Maniatis y otros; Ausubel y otros) o por reacción en cadena de polimerasa (Mullis). Cuando se conoce la secuencia del antígeno asociado a membrana, o se conoce en parte, se puede aislar una secuencia específica que codifica el antígeno. Típicamente, la secuencia que codifica el antígeno se aisla de una biblioteca de cDNA generada por inserción en un vector de fragmentos de DNA de una fuente seleccionada. La biblioteca de cDNA que contiene fragmentos de DNA de una fuente que contiene antígeno de membrana se puede construir usando fragmentos al azar de moléculas de cDNA generadas a partir de moléculas diana de RNA. Tal biblioteca de cDNA se construye generalmente usando un sistema bacteriano (tal como lambda gt10) (Promega, Madison WI), pero también se puede construir en una levadura o sistema de expresión eucariótico usando técnicas convencionales (Ausubel).

La biblioteca se explora (usualmente por hibridación; Ausubel y otros; Maniatis y otros) en cuanto a la presencia de la secuencia de DNA de antígeno asociado a membrana, típicamente usando como sonda un oligonucleótido que tiene una secuencia conocida o de consenso hibridizable con la región de codificación del antígeno. La sonda puede presentar varios restos de detección que incluyen radioisótopos, biotina y digoxigenina. Alternativamente, cuando no se dispone de una secuencia de sonda de ácido nucleico, se puede realizar la exploración de clones que presentan la región codificadora de interés usando, por ejemplo, inmunoexploración (usando el sistema lambda gf11 de "PROTOCLONE", Promega: Young y otros; Huynh y otros).

Las regiones codificadoras se aislan de aislados recombinantes que dan señales positivas (bien por hibridación o bien por exploración inmunológica). Típicamente, se aíslan fragmentos de DNA que contienen las regiones codificadoras por digestión de restricción seguida de fraccionamiento por tamaños y purificación de fragmentos. Tales regiones codificadoras de ácidos nucleicos se pueden tratar luego para inserción en un vector de transferencia baculoviral, tal como el vector pAcC8 (Figura 1A), como se describe más adelante en la parte B. Hay disponibles vectores baculovirales alternativos, incluidos los vectores pVL1393 (Luckow y otros) y pAC3T3 (Summers y otros).

Alternativamente, se pueden aislar también secuencias codificadoras usando amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) (Mullis; Mullis y otros). Las sondas útiles para la PCR pueden derivar de cualquier secuencia de ácido nucleico conocida. Si no se conoce la secuencia exacta, se pueden usar sondas degenerativas (Mullis; Mullis y otros). Típicamente, estas sondas son dos secuencias de ácidos nucleicos constituidas por 8 o más nucleótidos colineales, estando separadas las dos secuencias por una distancia definida con el fin de generar una secuencia diana (Ejemplo 1), y son complementarias de cadenas opuestas.

Un ciclo típico de PCR implica las siguientes etapas: fusión a elevada temperatura, seguida de anillamiento y extensión. Las reacciones se repiten durante 25-30 ciclos. Los productos de la PCR se pueden someter a digestión con enzimas de restricción y resolver electroforéticamnete usando un gel preparativo de agarosa al 1%. Típicamente, los fragmentos amplificados clon-específicos se identifican por fraccionamiento electoforético por tamaños en gel. Los fragmentos de DNA clon-específicos se recuperan luego del gel, por ejemplo, usando el sistema "GENE CLEAN" (BIO 101m, La Jolla CA). Si es necesario, se puede extraer el DNA con fenol y/o fenol:cloroformo (1:1). El DNA aislado se precipita en etanol. Después de la precipitación, el DNA se usa para inserción en vectores de expresión de baculovirus.

La generación de células Sf9 que expresan CD40 humano se presenta esquemáticamente en la Figura 1B. Como se ve, el RNA se aisla de una población de células de bazo humano transformadas con virus de Epstein-Barr (EBV) usando procedimientos estándar (Chirgwin y otros). El RNA total se convierte en cDNA usando cebado de hexámero al azar de acuerdo con procedimientos establecidos, como se detalla en el Ejemplo 1. La molécula de DNA que codifica las moléculas de antígeno asociado a membrana de interés se genera por amplificación por PCR, usando cebadores de avance e inversos que tienen sitios de restricción para clonación en sus terminales 5'. Tales cebadores de cDNA, usados en la preparación de regiones codificadoras para CD40 humano, se representan en la Figura 2. Estos cebadores se construyeron sobre la base de secuencias codificadoras de DNA completo para CD40 (Stamenkovic y otros, 1989).

Continuando con la referencia a la Figura 1B, el cDNA se mezcla con un cebador de avance y un cebador inverso en presencia de una polimerasa termoestable, tal como polimerasa obtenida de Thermus aquaticus, una mezcla de desoxinucleótidos equimolares, y un sistema tampón (Ejemplo 1). La mezcla se somete a amplificación en un termociclador y los productos de PCR obtenidos se subclonan en el policonector de un vector de transferencia de baculovirus. En la Figura 1A se representa como diagrama uno de estos vectores, el pAcC8. En la práctica de la presente invención se puede usar cualquier vector entre tales vectores de transferencia baculoviral que contienen sitios singulares de endonucleasa de restricción corriente abajo del promotor de polihedrina (Miller): para virus de polihidrosis nuclear de Autographica californica (AcNPV) (Wu y otros; Matsuura y otros; Takehara y otros) o mRNA de polihidrina de virus de polihidrosis nuclear de Bombyx mori (pBmNPV) (Nyunoya y otros; Sekine y otros).

Típicamente, antes de la expresión en baculovirus, los insertos de DNA se comprueban en cuanto a las mutaciones inducidas por PCR mediante análisis de secuenciación.

B. Inserción de una secuencia que codifica un antígeno en un vector baculoviral

La inserción de una región codificadora de antígeno asociado a membrana en un vector de baculovirus se realiza de acuerdo con procedimientos establecidos (Ausubel y otros; Maniatis y otros; Sambrook y otros). Se generaron por PCR cDNAs de longitud entera que codifican B7 humano y CD40 humano usando cebadores con sitios de restricción para clonación. El molde para amplificación por PCR era cDNA generado a partir de RNA de células B de bazo humano transformadas con EBV. En resumen, se liga el molde para amplificación por PCR en un vector de transferencia baculoviral o un plásmido, tal como un plásmido pAcC8, de manera que la región codificadora asociada a membrana esté corriente abajo de un promotor polihedrónico. El gen de polihedrón ATG se ha mutado a ATT (Figura1A) para impedir una iniciación translacional en clones recombinantes que no contienen una secuencia codificadora con un ATG funcional. El DNA de plásmido resultante se cotransfecta con baculovirus de tipo salvaje (AcNPV) en células de insecto de Spodoptera frugiperda (células Sf9) para crear partículas de virus recombinante, por vía de la recombinación in vivo entre el virus de tipo salvaje y el vector recombinante, que portan el gen de antígeno asociado a membrana.

Los Ejemplos 1-2 describen el aislamiento de vectores de baculovirus recombinantes que contienen segmentos heterólogos de DNA: pAcCD40 (que codifica una molécula de CD40 de longitud entera), pAcCD40-ED/Glu (que codifica el dominio extracelular de CD40), pAcB7 (que codifica una molécula de B7 de longitud entera) y pCcB7.ED/Glu (que codifica el dominio celular de la molécula de B7).

C. Infección de células de insecto con vectores baculovirales

Los virus recombinantes descritos antes se usaron luego para coinfectar células de insecto (Ejemplo 2). Estas células expresaron luego los antígenos codificados por los insertos de DNA heterólogo.

Se infecaron con virus recombinante células Sf9 (Spodoptera frugiperda, Summers y otros) a una densidad de 10^{8} células/ml. Se identificaron las células Sf9 infectadas con baculovirus recombinante y se purificaron por clonación. (Summers y otros).

Se cosecharon después de 48 horas células que expresan el antígeno de superficie de la célula y se usaron para inmunizar los animales huésped. Para la producción de proteínas recombinantes secretadas, las células se cosecharon después de 72 horas de cultivo.

Se ensayó usando un sistema ELISA la expresión de las moléculas recombinantes sobre la superficie celular de las células Sf9 (Ejemplo 3) (Harlow y otros). La Figura 3 demuestra que el anticuerpo monoclonal BB-1 anti-(B7) reaccionó sólo con células Sf9 infectadas con virus AcB7, pero no con células Sf9 que expresan CD26 humano. A diferencia, el anticuerpo monoclonal Ta-1 anti-(CD26) reaccionó sólo con las células Sf9 que expresan CD40. La Figura 4 demuestra que el anticuerpo monoclonal S2C6 anti-(CD40) reaccionó sólo con células Sf9 que expresan CD40, pero no con células Sf9 que expresan B7. Estos resultados demuestran la especifidad del procedimiento de la presente invención para la producción de antígenos asociados a membrana seleccionados. Además, estos resultados sugieren que las células Sf9 que expresan antígenos asociados a membrana seleccionados se pueden usar para explorar sueros y sustancias sobrenadantes de hibridomas en cuanto a la presencia de anticuerpos reactivos contra el antígeno seleccionado.

D. Inyección de células de insecto que expresan el antígeno asociado a membrana en un animal huésped

Entre los animales huésped adecuados para la producción de anticuerpos policlonales están incluidos, por ejemplo, conejos, cabras, ovejas, cobayas, chimpancés y perros. Una ventaja de la presente invención es que, generalmente, no se requieren coadyuvantes de inmunización.

Entre los animales huésped adecuados para uso en la producción de anticuerpos monoclonales adecuados comúnmente están incluidos ratas, hamsters y ratones. Sin embargo, en los casos en los que sea deseable producir anticuerpos que inmunológicamente son más próximos al hombre, entre las fuentes de tales anticuerpos se pueden incluir primates superiores tales como chimpancés. Se puede usar la fusión con un partícipe de fusión de heteromieloma para generar anticuerpos monoclonales (Carroll; Perkins, 1991). Tales fusiones se pueden lograr por varios procedimientos conocidos en la técnica (Harlow y otros), entre los que están incluidas la exposición de células mixtas a polietilenglicol y la exposión de las células a un campo eléctrico fuerte (electrofusión). Los hibridomas se seleccionan por crecimiento en un medio selectivo; luego se ensayan en cuanto a la especifidad del antígeno como se describe más adelante.

\newpage

Para la generación de anticuerpos monoclonales para CD40 y B7, se inmunizaron los ratones (Ejemplo 5) con células Sf9 que expresan estas moléculas sobre la superficie de la célula. Una semana después de la primera inmunización, se sangraron los ratones y se analizaron los sueros en cuanto a la presencia de anticuerpos específicos usando tinción fluorescente de células de células B transformadas con EBV (Ejemplo 3). La Figura 5 presenta los resultados de la tinción de células, que indican que los ratones inmunizados con células Sf9 que expresan CD40 o B7 tenían un título de antisuero contra la línea ARC de células B transformadas con EBV (American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Rockville MD 20852) que es positivo tanto para CD40 como para B7. A diferencia, los ratones que fueron inmunizados con células Sf9 de control no presentaban reactividad con las células ARC. Los resultados indican que se pueden inmunizar los animales huésped con células que expresan un antígeno asociado a membrana de elección y que la inmunización da por resultado una respuesta inmune que incluye anticuerpos contra el antígeno recombinante. La inmunización no da por resultado anticuerpos reactivos por cruce con proteínas humanas que no son la proteína recombinante humana clonada en las células de insecto Sf9.

A un ratón se administró una inyección final de recuerdo con células Sf9 que expresan CD40 y a un ratón una de células Sf9 que expresan B7. Tres días después de la inyección de recuerdo, se extrajeron los bazos y se fusionaron los esplenocitos con células de mieloma de murino SP2/0.

E. Aislamiento e inmortalización de linfocitos que producen anticuerpos específicos

Preferiblemente, los linfocitos que producen anticuerpos para la producción de anticuerpos monoclonales son linfocitos B, tales como los que se pueden aislar de médula ósea, bazo o nodos de linfa de un animal huésped inumune (Harlow y otros).

Alternativamente, se pueden aislar linfocitos B de la circulación periférica. En este caso, se centrifugan muestras de sangre y se someten a técnicas de separación en gradiente para producir una mezcla de linfocitos de sangre periférica en bruto (PBL). Se disminuyen selectivamente los monocitos y linfocitos T de esta mezcla de células de acuerdo con procedimientos establecidos (Mishell). Tales células remanentes se pueden someter a un proceso de selección, tal como el proceso "separador", en el que las células que tienen afinidad por el antígeno se concentran mediante captura selectiva por una matriz de afinidad que contiene el antígeno. En el contexto de la presente invención, tal matriz puede comprender una célula que comprende el antígeno asociado a membrana.

Cuando se aislan linfocitos B de la circulación como se ha descrito, puede ser ventajosa la transformación con un virus transformante tal como el virus de Epstein-Barr. Las células transformadas (linfoblastoides) se distribuyen en pocillos de subcultivo y se mantienen en cultivo durante varias semanas antes de ensayarlas en cuanto a la producción de anticuerpos específicos. Los cultivos que presentan esta producción de anticuerpos específicos se expanden y fusionan con células partícipes de mieloma apropiadas para especie usando uno o varios protocolos estándar de fusión, incluido el polietilenglicol o la electrofusión, descritos antes. Los procedimientos para aislar e inmortalizar linfocitos B de varias fuentes son conocidos en la técnica.

En experimentos realizados en soporte de la presente invención, se fusionaron esplenocitos de ratones inmunizados con polietilenglicol-células de mieloma de murino SP2/0 como han descrito antes Boer y otros (1988). Los clones de hibridoma se trataron como se describe en el Ejemplo 6.

La Tabla 1 (Ejemplo 6) da un sumario de los datos de fusión. Después de la fusión de CD40, sólo se sembró la mitad de las células en 480 pocillos. Esto dio por resultado 351 pocillos con crecimiento de hibridoma. 14 días después de la fusión, se combinaron las sustancias sobrenadantes de 12 pocillos y la combinación se ensayó en cuanto a la presencia de anticuerpos reactivos con células ARC. El análisis FACS reveló que 4 pocillos de la fusión de CD40 y 1 combinación de la fusión de B7 eran reactivos con células ARC. Cuando se volvieron a ensayar sustancias individuales sobrenadantes de las combinaciones positivas, se identificaron 4 pocillos reactivos con CD40 y 1 pocillo reactivo con B7. Las células de estos pocillos positivos se clonaron por dilución límite y, después de 3 tandas de crecimiento celular, se establecieron 4 clones de hibridoma anti-(CD40) estables (CD40-3A8, CD40-3C6, CD40-5D12 y CD40-5) y 1 clon de hibridoma anti(B7) estable (B7-24). Estos resultados indican la capacidad de lograr clones de hibridoma estables que secretan anticuerpos monoclonales dirigidos contra un antígeno asociado a membrana seleccionado.

Hay disponibles varios procedimientos para explorar fusiones (Harlow y otros), incluida la captura de anticuerpos, (i) usando antígeno marcado, por ejemplo, antígeno marcado radiactivamente, purificado o no purificado, (ii) células enteras o permeabilizadas, por ejemplo células Sf9 que expresan el antígeno recombinante; y captura de antígeno, (i) anticuerpo/antígeno en solución; (ii) anticuerpo/antígeno en fase sólida.

F. Ensayo de la especifidad de anticuerpos monoclonales

Se usaron células transformadas con EBV para la exploración de las sustancias sobrenadantes de hibridomas primarios y para exploración de los subsiguientes productos de la clonación por dilución limitativa. Varias líneas de evidencia que se presentan posteriormente sugieren que se habían generado 4 anticuerpos monoclonales anti-(CD40) y 1 anti-(B7).

Primero, las sustancias sobrenadantes de 5 clones de hibridoma eran reactivas con células ARC y otras líneas de células B transformadas con EBV, pero no con líneas HSB de células T (A.T.C.C.) y CEMM (A.T.C.C.).

Segundo, se realizaron experimentos de unión con competición usando los anticuerpos monoclonales de la presente invención y formas solubles de los antígenos diana (Ejemplo 7). Las sustancias sobrenadantes de hibridoma se preincubaron con formas solubles de CD40 y B7 (Ejemplo 7). Luego se añadieron las mezclas a células ARC para tinción fluorescente de las células. Los resultados del experimento de competición se presentan en la Figura 6. Los datos revelan que el B7 soluble, pero no el CD40 soluble, podía bloquear la unión del anticuerpo monoclonal anti-(B7) CD40-3A8 a células ARC. Inversamente, el CD40 soluble, pero no el B7 soluble, podía bloquear la unión del anticuerpo monoclonal anti-(CD40) CD40-3A8 a células ARC. Se obtuvieron resultados similares con los otros 3 anticuerpos monoclonales anti-(CD40). Además, los efectos de CD40 soluble sobre los anticuerpos monoclonales anti-(CD40) y el efecto de B7 soluble sobre el anticuerpo monoclonal anti-(B7) dependian de la concentración. La disminución de la cantidad de proteína soluble dio por resultado el bloqueo de la unión de los anticuerpos a las células ARC.

Como análisis adicional, se ensayaron los anticuerpos monoclonales anti-(CD40) y anti-(B7) en cuanto a su capacidad de unirse a células B tonsilares (Ejemplo 8). La Tabla 8 revela que el 89-95% de células B tonsilares aisladas recientemente se teñía positivamente con los 4 anticuerpos monoclonales anti-(CD40). Aproximadamente el mismo porcentaje de células era positivo con el anticuerpo monoclonal G 28.5 anti-(CD40) (Clark y otros). La Tabla 3 revela que el 12-17% de células B tonsilares aisladas recientemente se teñía positivamente con el anticuerpo monoclonal B7-24 anti-(B7). Sin embargo, cuando las células B tonsilares se cultivaron durante 5 días en presencia de anticuerpos anti-(IgM) inmovilizados e IL-2, el porcentaje de células positivas para B7-24 aumento hásta aproximadamente 25%.

Además, cuando las células B tonsilares se estimularon con anticuerpos anti-(IgM) e IL-2, no sólo aumentó el número de células B positivas para B7-24, sino que también había un aumento significativo de la cantidad de tinción fluorescente por célula, lo que indicaba que la expresión de B7 aumentó después de la estimulación.

Los datos anteriores indican que el procedimiento de la presente invención proporciona una vía para aislar anticuerpos monoclonales que son específicamente reactivos con antígenos asociados a membrana. Los anticuerpos monoclonales obtenidos por el procedimiento de la presente invención se pueden tipificar como se ha descrito previamente (Harlow y otros).

G. Utilidad

Para la producción de anticuerpos monoclonales es óptimo inmunizar ratones con material purificado. Sin embargo, la purificación de antígenos de membrana requiere técnicas especializadas y complejas y, además, la extracción de la membrana puede alterar la estructura de la molécula. Además, con frecuencia, la solubilización de proteínas disminuye su inmunogenia. Por tanto, la mayoría de anticuerpos monoclonales para antígenos de superficie se ha obtenido después de inmunizar ratones con células enteras o fracciones de membrana. En muchos casos, los subconjuntos de linfocitos específicos se han inyectado en ratones dando por resultado paneles de anticuerpos monoclonales. Estos anticuerpos se han usado para aislar y caracterizar el antígeno al que se pueden unir. Cuando los ratones se inmunizan con células enteras, se generan anticuerpos para un gran número de moléculas diferentes. Por tanto, es difícil usar las mismas células para explorar la producción de anticuerpos específicos por los clones de hibridoma.

Para eludir el problema antes mencionado, el procedimiento de la presente invención implica la expresión de antígenos asociados a membrana en células de insecto y el uso de estas células de insecto para inmunizar animales huésped. Desde que la introducción de la tecnología de PCR (Saiki y otros, 1985; Saiki y otros, 1988; Mullis; Mullis y otros) se ha hecho relativamente directa la clonación de cDNAs para proteínas cuya secuencia de codificación de ácido nucleico codificador se ha publicado. Se pueden usar cebadores de PCR que se extienden sólo por la región de codificación entera e incorporar sitios de restricción en estos cebadores para facilitar la clonación en vectores de expresión.

Se ha visto que las proteínas intracelulares humanas, secretadas y de transmembrana, se pueden expresar a niveles altos en células de insecto cuando se expresan en las células bajo la regulación de los genes de baculovirius no esenciales para la proteína de polihedrina (Webb y otros, 1989; revisión por Luckow, 1990). Experimentos realizados en soporte de la presente invención han demostrado que sólo 2 inyecciones con 5 x 10^{6} células Sf9 que expresan CD40 humano o B7 humano dieron buenos títulos de suero contra estos antígenos. Además, las propias células de insecto no indujeron una reactividad de cruce de respuesta inmune con células humanas. Esto permite el uso de células B transformadas con EBV para la exploración de la producción de anticuerpos específicos por los clones de hibridoma, con un riesgo mínimo de obtener positivos falsos. De hecho, todos los pocillos primarios positivos obtenidos por el procedimiento de la invención fueron específicos para el antígeno que se usó para inmunización.

Los anticuerpos obtenidos por el procedimiento de la presente invención, dirigidos contra antígenos asociados a membrana, son ventajosos para uso como agentes diagnósticos para la detección del antígeno asociado a membrana. Por ejemplo, anticuerpos dirigidos contra proteínas marcadoras de la superficie celular o proteínas virales que sobresalen de la superficie de la célula.

Una configuración diagnóstica implica el uso de anticuerpos antivirales capaces de detectar antígenos virales específicos. Los antígenos se pueden detectar, por ejemplo, usando un ensayo de captura de un antígeno en el que los antígenos presentes en muestras de suero candidato se hacen reaccionar con un antícuerpo monoclonal o policlonal específico para el antígeno. El anticuerpo se une a un sustrato sólido y el antígeno es detectado luego por un segundo anticuerpo diferente marcado, dirigido contra el anticuerpo antiviral.

Los anticuerpos antivirales obtenidos por el procedimiento de la invención se pueden usar como un medio para intensificar la respuesta inmune antiviral, puesto que los complejos anticuerpo-virus típicamente son reconocidos por macrófagos y otras células activas. Los anticuerpos se pueden administrar en cantidades similares a las usadas para administración terapéutica de anticuerpos. Por ejemplo, se administra gammaglobulina combinada a 0,044-0,22 ml/kg de peso corporal durante la incubación temprana de enfermedades virales tales como rabia, sarampión y hepatitis B para interferir con la entrada viral en las células. Así, los anticuerpos reactivos con un antígeno viral asociado a membrana se pueden administrar pasivamente solos, en una mezcla con otros anticuerpos o junto con otro agente antiviral para intensificar la respuesta inmune y/o la eficacia de un fármaco antiviral.

III. Composiciones en que se usan anticuerpos

Esta invención contempla el uso de anticuerpos monoclonales tales como los hechos por el procedimiento antes descrito. Los anticuerpos de la presente invención se unen al antígeno CD40 humano sobre la superficie de células B humanas y no estimulan el crecimiento o la diferenciación de la célula B. Estos anticuerpos monoclonales pueden ser anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena simple y fragentos de ellos.

A. Preparación del anticuerpo

Los anticuerpos monoclonales 5D12,3A8 y 3C6 se preparan como en la sección II de la descripción detallada y en los Ejemplos 1-7. Se pueden preparar similarmente, como se indica seguidamente, otros anticuerpos monoclonales. Primero, se preparan anticuerpos policlonales contra el antígeno CD40. Segundo, se seleccionan anticuerpos monoclonales específicos para CD40.

1. Suero policlonal

Se puede preparar suero policlonal por procedimientos convencionales. En general, primeramente se usa una solución que contiene el antígeno CD40 o B7 para inmunizar un animal adecuado, preferiblemente un ratón, una rata, un conejo o una cabra. Para la preparación de sueros policlonales se prefieren conejos y cabras debido al volumen de suero obtenible y la disponibilidad de anticuerpos anticonejo y anticabra marcados. Generalmente, la inmunización se realiza mezclando o emulsionando en solución salina la solución que contiene el antígeno, preferiblemente en un coadyuvante tal como coadyuvante de Freund completo, e inyectando la mezcla o emulsión parenteralmente (por lo general subcutánea o intramuscularmente). Típicamente es suficiente una dosis de 50-200 \mug/inyección. La inmunización generalmente se realiza con una o más inyecciones de recuerdo de la proteína en solución salina, de 2 a 6 semanas después, preferiblemente usando coadyuvante de Freund incompleto. Alternativamente, se pueden generar anticuerpos por inmunización in vitro usando procedimientos conocidos en la técnica que, a los fines de esta invención, se consideran equivalentes a inmunización in vivo.

Los antisueros policlonales se producen sangrando el animal y poniendo la sangre en un recipiente de vidrio o plástico, incubando la sangre a 25ºC durante 1 hora y seguidamente a 40ºC durante 2-18 horas. El suero se recupera por centrifugación (por ejemplo, a 1.000 x g durante 10 min). Se pueden obtener de conejos aproximadamente 20-25 ml por sangado.

2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales se preparan usando el procedimiento de Kohler y Milstein, Nature (1975) 256:495-96, o una modificación de él. Típicamente, se inmuniza un ratón como se ha descrito antes. Sin embargo, en vez de sangrar el animal para extraer suero, se extrae el bazo (u opcionalmente, varios nodos grandes de linfa) y se disocia en células individuales. Si se desea, las células del bazo se pueden explorar (después de eliminar células adherentes no específicamente) aplicando una suspensión de células a una placa o pocillo revestido con el antígeno de proteína. Las células B que expresan inmunoglobulina unida a membrana específica para el antígeno se unen a la placa, y no se eliminan por enjuagadura con el resto de la suspensión. Las células B resultantes, o todas las células de bazo disociadas, son inducidas luego a fusionarse con las células de mieloma para formar hibridomas, y se cultivan en un medio selectivo (por ejemplo, medio de hipoxantina, aminopterina, timidina, "HAT"). Los hibridomas resultantes se cultivan en un medio de dilución limitativo y se ensayan en cuanto a la producción de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno de superficie celular de inmunización deseado (y que no se unen a antígenos no afines). Los hibridomas seleccionados que secretan mAb se cultivan luego in vitro (por ejemplo, en botellas de cultivo de tejidos o reactores huecos de fibra) o in vivo (como ascites en ratones).

Si se desea, los anticuerpos (sean policlonales o monoclonales) se pueden marcar usando técnicas convencionales. Entre los marcadores adecuados están incluidos fluoróforos, cromóforos, átomos radiactivos (en particular ^{32}P y ^{125}I), reactivos densos en electrones, enzimas y ligandos que tienen partícipes de unión específicos. Típicamente, las enzimas se detectan por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano amargo usualmente se detecta por su capacidad para convertir 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) en un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. "Partícipe de unión específico" se refiere a una proteína capaz de unirse a una molécula ligando con una alta especifidad, como, por ejemplo, en el caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico para el primero. Entre otros partícipes de unión específica están incluidos biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, y los numerosos pares de receptor-ligando conocidos en la técnica. Debe tenerse en cuenta que la descripción anterior no significa categorizar en distintas clases los varios marcadores, ya que el mismo marcador puede actuar de distintos modos. Por ejemplo, el ^{125}I puede actuar como marcador radiactivo o como reactivo denso en electrones. HRP puede actuar como enzima o como antígeno para mAb. Además, se pueden combinar varios marcadores para el efecto deseado. Por ejemplo, los mAbs y la avidina también requieren marcadores en la práctica de esta invención; así, se puede marcar mAb con biotina y detectar su presencia con avidina marcada con ^{125}I, o con mAb antibiotina marcado con HRP. Los expertos corrientes en la técnica identificarán fácilmente otras permutaciones y posibilidades, que se consideran equivalentes en el ámbito de la presente invención.

IV. Epitopos del antígeno CD40

Los epitopos del antígeno CD40 de esta invención son moléculas que son inmunorreactivas con anticuerpos monoclonales anti-CD40 cuya unión al antígeno CD40 humano localizado sobre la superficie de una célula B humana previene el crecimiento o la diferenciación de la célula B. Esto es, tales epitopos compiten con la unión de los mencionados anticuerpos al antígeno CD40. En la técnica son conocidas técnicas sistemáticas para identificar estos epitopos, según lo describe H.M. Geysen en la patente U.S. nº. 4.708.871. Típicamente, estos epitopos son secuencias de aminoácidos cortos. Estas secuencias se pueden embeber en la secuencia de péptidos o proteínas más largos, tan largos como sea accesible.

Los epitopos de la invención se pueden preparar por técnicas estándar de síntesis de péptidos, tales como la síntesis en fase sólida. Alternativamente, las secuencias de la invención se pueden incorporar a proteínas o péptidos largos por procedimientos recombinantes. Esto se puede realizar muy fácilmente preparando un casete de DNA que codifica la secuencia de interés y ligando el casete a DNA que codifica la proteína a modificar en el sitio apropiado. El DNA de la secuencia puede sintetizarse por técnicas estándar de síntesis, o se puede escindir del gen pIII de fago usando las enzimas de restricción adecuadas.

Los epitopos identificados aquí se pueden preparar por técnicas simples en estado sólido. La secuencia mínima de unión se puede determinar sistemáticamente para cada epitipo por técnicas estándar, por ejemplo, empleando el procedimiento descrito por H.M. Geysen en la patente U.S. nº. 4.708.871. En resumen, se puede sintetizar una serie de oligopéptidos que se solapan derivados del antígeno CD40 unidos a una fila de alfileres en fase sólida, con un único oligopéptido en cada alfiler. Los alfileres están colocados para tener el formato de una placa de microtitulación de 96 pocillos, lo que permite ensayar simultáneamente todos los alfileres, por ejemplo, para unirse a un anticuerpo monoclonal anti CD40. Usando este procedimiento, se puede determinar fácilmente la afinidad de unión para cualquier posible subconjunto de aminoácidos consecutivos.

Los análogos de la invención se preparan también por procedimientos estándar en fase sólida, y tales procedimientos se describen la solicitud de PCT US 91/04282.

VI. Formulaciones y procedimientos de administración

Los anticuerpos y las composiciones de esta invención se administran a una concentración que es terapéuticamente efectiva para prevenir o tyratar enfermedades mediadas por anticuerpos, tales como alergias, SLE, PBC e ITP. Para alcanzar este objetivo, los anticurpos o composiciones se pueden formular usando una variedad de excipientes aceptables conocidos en la técnica. Típicamente, los anticuerpos o las composiciones se administran por inyección, inravenosamente o peritonealmente. Los procedimientos de administración son conocidos por los expertos corrientes en la técnica. También se posible obtener composiciones que se pueden administrar tópica u oralmente, o que son capaces de transmitirse a través de membranas mucosas.

Antes de la administración a los pacientes, se pueden añadir a los anticuerpos ingredientes de formulación. Se prefiere una formulación líquida. Por ejemplo, los ingredientes a añadir pueden ser aceites, polímeros, vitaminas, hidratos de carbono, aminoácidos, sales, tampones, albúmina, tensoactivos o agentes para hacer masa. Preferiblemente, entre los hidratos de arbono están incluidos azúcar o alcoholes de azúcar tales como monosacáridos, disacáridos o polisacáridos, o glucanos solubles en agua. Los sacáridos o glucanos pueden incluir fructosa, dextrosa, lactosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, sacarosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina alfa y beta, almidón soluble, hidroxietilalmidón y carboximetilcelulosa, y mezclas de ellos. Es muy preferida la sacarosa. "Alcohol de azúcar" se define como un hidrocarburo C_{4} a C_{8} que tiene un grupo -OH e incluye galactitol, inositol, manitol, xilitol, sorbitol, glicerol y una combinación de ellos. Es muy preferido el manitol. Estos azúcares o alcoholes de azúcar se pueden usar individualmente o en combinación. No hay limitación de la cantidad a usar siempre que el azúcar o el alcohol de azúcar sea soluble en el preparado acuoso. Preferiblemente, la concentración de azúcar o alcohol de azúcar es de entre 1,0% p/v y 7% p/v, más preferiblemente de entre 2,0 y 6,0% p/v. Preferiblemente, los aminoácidods incluyen las formas levógiras (L) de carnitina, arginina y betaína; sin embargo, se pueden añadir otros aminoácidos. Entre los polímeros preferidos están incluidos polivinilpirrolidona (PVP) con un peso molecular medio entre 2.000 y 3.000, o polietilenglicol (PEG) con un peso molecular medio entre 3.000 y 5.000. También se prefiere usar en la composición un tampón para minimizar cambios del pH de la solución antes de la liofilización o después de la reconstitución. Se puede usar casi cualquier tampón fisiológico, aunque son preferidos los tampones de citratos, fosfatos, succionatos y glutamatos, o mezclas de ellos. El más preferido es un tampón de citrato. Preferiblemente, la concentración es de 0,01 a 0,3 molar. Los tensoactivos que se pueden añadir a la formulación se indican en las patentes EP n^{os}. 270.799 y 268.110.

\newpage

Adicionalmente, los anticuerpos se pueden modificar por conjugación covalente con un polímero para aumentar su semivida circulante, por ejemplo. En las patentes U.S. n^{os}. 4.766.106, 4.179.337, 4.495.285 y 4.609.546 se dan polímeros preferidos y procedimientos para anexionarlos a péptidos. Los polímeros preferidos son polioles polietoxilados y polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua a temperatura ambiente y tiene la fórmula general R(O-CH_{2}-
CH_{2})_{n}O-R, en la que R puede ser hidrógeno o un grupo protector tal como un grupo alquilo o alcanol. Preferiblemente, el grupo protector tiene entre 1 y 8 átomos de carbono, más preferiblemente es metilo. El símbolo n es un número entero positivo, preferiblemente entre 1 y 1.000, más preferiblemente entre 2 y 500. El peso molecular medio preferido del PEG es de entre 1.000 y 40.000, siendo más preferido de entre 2.000 y 20.000 y, muy preferido, de entre 3.000 y 12.000. Preferiblemente, el PEG tiene al menos un grupo hidroxí, más preferiblemente es un grupo hidroxi terminal. Es este grupo hidroxi el que preferiblemente se activa para reaccionar con un grupo amino libre en el inhibidor. Sin embargo, se entenderá que el tipo y la cantidad del grupo reactivo puede variar para lograr un PEG/anticuerpo conjugado covalentemente de la presente invención.

En la presente invención son también útiles polioles polietoxilados solubles en agua. Entre ellos están incluidos sorbitol polietoxilado, glucosa polietoxilada, glicerol polietoxilado (POG), etc. Es preferido el POG. Una razón de ello es que el espinazo del glicerol del glicerol polietoxilado es el mismo que se presenta en la naturaleza en, por ejemplo, monoglicéridos y triglicéridos de animales y seres humanos. Por tanto, esta ramificación no se vería necesariamente como un agente foráneo en el cuerpo. El POG tiene un peso molecular preferido en el mismo intervalo que el PEG. La estructura del POG la presentan Knauf y otros, 1988, en J. Bio. Chem. 263:15064-15070, y se encuentra una discusión de los conjugados de POG/IL-2 en la patente U.S. nº. 4.766.106. Otro sistema de suministro de fármacos para aumentar la semivida en el sistema circulatorio es el liposoma. Se discuten procedimientos para preparar sistemas de suministro de liposomas por Gabizon y otros, Cancer Research (1982) 42:4734; Cafiso, Biochem. Biophys. Acta (1981) 649:129, y Szoka, Ann. Rev. Biophys. Eng. (1980) 9:467. Se conocen en la técnica otros sistemas de suministro de fármacos que se describen, por ejemplo, por M.L. Poznansky y otros, Drug Delivery Systems (R.L. Juliano, ed., Oxford, N.Y. (1980) págs. 253-315; M.L. Poznansky, Pharma. Revs (1984) 36.277.

Después de haber sido preparada la composición farmacéutica líquida, es preferible liofilizarla para evitar la degradación y conservar la esterilidad. Los expertos corrientes en la técnica conocen los procedimientos de liofilización de composiciones líquidas. Justo antes del uso, la composición se puede reconstituir con un diluyente estéril (solución de Ringer, agua destilada o solución salina esterilizada, por ejemplo) que puede incluir ingredientes adicionales. Preferiblemente, después de reconstituida, la composición se administra a los pacientes usando procedimientos conocidos por los expertos.

Como se ha señalado antes, los anticuerpo anti CD40 y las composiciones de esta invención se usan para tratar pacientes humanos con el fin de prevenir o tratar enfermedades mediadas por anticuerpos, tales como alergias, SLE, PBC e ITP. La vía de administración preferida para estos anticuerpos es la parenteral. En la administración parenteral, las composiciones de esta invención se formularán en forma de unidosis inyectable, tal como una solución, suspensión o emulsión, en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos son inherentemente no tóxicos y no terapéuticos. Son ejemplos de tales vehículos, solución fisiológica salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. También se pueden usar vehículos no acuosos tales como aceites fijados y oleato de etilo. Un vehículo preferido es dextrosa al 5% en solución salina. El vehículo puede contener cantidades minoritarias de aditivos tales como sustancias que intensifican la isotonicidad y la estabilidad química, incluidos tampones y conservantes.

La dosificación y el modo de administración dependerán del individuo. Por lo general, las composiciones se administran de modo que los anticuerpos se aportan a una dosis entre 1 \mug/kg y 20 mg/kg, más preferiblemente entre 20 \mug/kg y 10 mg/kg, muy preferiblemente, entre 1 y 7 mg/kg. Preferiblemente se da como dosis de bolus para aumentar los niveles circulatorios en 10-20 veces y durante 4-6 horas. También se puede usar la infusión continua después de la dosis de bolus. Si se hace así, los anticuerpos se pueden infundir a una dosis entre 5 y 20 \mug/kg/min, más preferiblemente entre 7 y 15 \mug/kg/min.

Los ejemplos siguientes ilustran la presente invención, pero no la limitan de forma alguna.

Materiales y procedimientos

La modificación de Isocove del medio Eagle de Dulbecco (IMDM) y el suero fetal de bovino se obtuvieron de JR Biosciences (Lenexa, KS); la penicilina y la estreptomicina se obtuvieron de Irvine (Santa Ana, CA); y el polietilenglicol (peso molecular 1.500) se obtuvo de Boehringer Mannheim (Indianopolis, IN).

Medio de cultivo. Se cultivaron células de hibridoma de SP2/0 de murino, células de hibridoma, células T purificadas, células T transformadas con EBV y líneas de células en IMDM suplementado con estreptomicina (200 \mug/ml), penicilina (200 U/ml) y suero fetal bovino inactivado por calor, al 10% (IMDM completo). Se cultivaron células Sf9 de insecto en matraces de sacudidas agitados (125-150 rpm) en el medio descrito por Maiorella y otros (1989) suplemantado con suero fetal bovino al 0,5%. Se cultivaron células 3T6-Fc\gammaRII en un medio constituido por medio Eagle de Dulbecco modificado y medio HAM-F10 al 50%, suplementado con aminopterina (0,2 \mug/ml), timidina (5 \mug/ml), xantina (10 \mug/ml), hipoxantina (15 \mug/ml), ácido micofenólico (20 \mug/ml), desoxicitidina (2,3 \mug/ml) y suero fetal bovino inactivado por calor al 10% (DME/HAM-F10). Se cultivaron células 3T6-Fc\gammaRII/B7 en medio DME/HAM-F10 completo que contenía 400 \mug/ml de G418 (Gibco).

Células y lineas de células. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica heparinizada (obtenida de voluntarios sanos) por centrifugación de densidad de Ficoll-Hypaque. Las células T se enriquecieron por empobrecimiento de monocitos y células B usando Lymphokwik (Lambda, California) (1X). La linea ARC de células B transformadas con EBV y la linea de células P815, una linea de células de mastocitoma de murino resistente a NK que expresa Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII (Ra, C. y otros, Nature (1989) 341:752) se obtuvieron de ATCC (Rockville, MD). 3T6-Fc\gammaRII, la linea de células de fibroblasto de ratón que expresa CD32, los alelos de alta respuesta de Fc\gammaRII humana, descrita por Warmerdam, P.A.M. y otros, J. Exp. Med. (1990) 172:19 fueron proporcionados amablemente por el Dr. J. van der Winkel (University Hospital, Utrecht, Países Bajos). El subclón EL4B5 de EL-4 mutante de timoma de ratón fue un regalo del Dr. R.H. Zubler, Hôpital Cantonal Universitaire, Ginebra. Las células transfectantes 3T6 de ratón que expresan moléculas híbridas de la forma alélica de HR (alta respuesta) de Fc\gammaRIIa fueron un regalo del Dr. P.A.M. Warmerdam, Departamento de Inmunología Experimental, University Hospital Utrrecht, Utrecht, Países Bajos. Warmerdan y otros, J. Immunol. (1991) 147:1338. Ambas líneas de células se cultivaron en medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), suplementado con gentamicina (80 \gammag/ml) y 10% de suero fetal de ternera inactivado por calor (TCS) (Hyclone, Logan, Utah). Para evitar una posible pérdida de la capacidad de activar células B, cada 4 a 8 semanas se descongeló un lote nuevo de células EL4B5. Las lineas de células se ensayaron periódicamente en cuanto a contaminación de micoplasma usando una sonda de DNA marcada con ^{3}H para RNA ribosomal de micoplasma (GenProbe, San Diego, CA) y estaban libres de micoplasma en el transcurso de los experimentos.

Linfocitos B humanos. Se aislaron linfocitos B de amígdalas obtenidas de niños a los que se les fueron extirpadas, esencialmente como describieron De Groot y otros, Lymphokine Research (1990) 9:321. En resumen, el tejido se dispersó con cuchilla de escalpelo, las células fagocíticas y NK se redujeron por tratamiento con éster metílico de L-leucina 5 mM y las células T se eliminaron por un ciclo de formación de rosetas con eritrocitos de oveja (SRBC) tratados con bromuro de 2-aminoetilisotiouronio. La pureza de las preparaciones del linfocito B resultante se comprobó por marcación inmunofluorescente indirecta con mAb B1 anti-(CD20) (Coulter Clone, Hialeah, FA) o mAb OKT3 anti-(CD3) (Ortho, Raritan, NJ) y un fragmento F(ab')_{2} conjugado a FITC de anti(Ig de ratón) de conejo (Zymed, San Francisco, CA) y análisis de FACS. Las preparaciones de células B contenían (media \pm d.e. de 6 aislamientos): 95 \pm 4% de células CD20 positivas y 2 \pm 1% de células CD3 positivas.

Anticuerpos. Se obtuvo anticuerpo monoclonal BB-1 anti (B7 humano) del Dr. E.A. Clark (University of Washington, Seattle, WA) y se usó como anticuerpo purificado. Se obtuvo del Dr. J.A. Ledbetter (Oncogen Corporation, Seattle, WA) anticuerpo monoclonal G27.5 anti(CD40 humano) (Clark y otros, 1986) y se usó como anticuerpo purificado. Se obtuvo del Dr. S. Paulie (University of Stockholm, Estocolmo, Suecia) anticuerpo monoclonal S2C6 anti CD40 (Paulie y otros, 1985) y se usó como anticuerpo purificado. Se obtuvieron de Coulter (Hialeah, FL) anticuerpo monoclonal Ta-1 anti(CD26 humano) y anticuerpo monoclonal B1 anti (CD20). Se obtuvo anticuerpo monoclonal OKT3 anti (CD3) de Ortho (Raritan, NJ) y el anticuerpo monoclonal anti(LeuM3) se obtuvo de Becton-Dickinson (San Jose, CA). Los anticuerpos anti(IgM) acoplados a perlas (inmunoperlas) se obtuvieron de Bio-Rad (Richmond, CA).

Los Mab B7-24 anti B7 (IgG2a x) y mAbs 5D12 anti CD40, 3C6 y 3A8 se obtuvieron como se ha descrito en la Sección II anterior y se usaron como anticuerpos purificados. Se usó Mab CLB-T3/4.1 (IgG.x) anti CD3 como material sobrenadante de cultivo de cálulas diluido, y fue suministrado amablemente por el Dr. L. Aarden (Laboratorio Central del Servicio de Transfusión de Sangre de la Cruz Roja, Amsterdam, Países Bajpos). Se usó Mab UCHT1 anti-CD3 (IgG, x) como anticuerpo purificado, y fue un regalo del Dr. P. Beverley (Imperial Research Cancer Foundation, Londres, RU). Se usó Mab WL225 anti-CD72 (IgG2a.x) como anticuerpo purificado, y fue regalado por el Dr. K. Thielemans (Vrije Universiteit Brussel, Bélgica). El Mab 84H10 anti-ICAM-1 se usó como fluido de ascites diluido. El mAb G28.5 anti CD40 fue donado por el Dr. J.A. Ledbetter (Oncogen Corporation, Seattle, WA, USA). Clark y otros, PNAS (USA) (1986) 83:4494. Los anticuerpos de control eran: mAb 8E4 anti(\beta-glucocerebrosidasa) (IgG1), Barneveld y otros, Eur. J. Biochem. (1983) 134:585, e inmunoglobulinas MOPC-21 de mieloma (IgG1) y MOPC-141 (IgG2b) (Sigma, St. Louis, MO). Todos los mAb se usaron como preparaciones de anticuerpos purificados. La sustancia sobrenadante de la proteína de fusión hCD40.H\mu fue tegalo del Dr. P. Lane (Basel Institute for Immnulogy, Basilea, Suiza) y se usó como material sobrenadante concentrado 5x de células J558L transfectadas. Lane y otros, Eur. J. Immunol. (1992) 22:2573.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención se pueden marcar por procedimientos convencionales usando varios restos informadores, incluidos los siguierntes: marcadores fluorescentes (fluoresceína (FITC), R-ficoeritrina, rodamina (TMRITC), rodamina 600 (XRITC), "TEXAS RED", etc., comúnmente unidos a avidina); restos radiactivos (^{125}I, etc.); emisores de luz (luciferasa y otros); sustancias enzimáticas (peroxidasa de rábano amargo, fosfatasa alcalina, oxidasa de glucosa, \beta-galactosidasa, etc). Además, también los anticuerpos informadores (anticuerpos que tienen especifidad de unión para los anticuerpos monoclonales de la presente invención, por ejemplo, IgG antirratón de cabra) pueden usar os restos marcadores antes mencionados.

Enzimas y oligonucleótidos. Se obtuvo DNA polimerasa de E. coli (fragmento de Klenow) de Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB) (Indianopolis, IN). La DNA ligasa de T4 y la DNA polimerasa de T4 se obtuvieron de New England Biolabs (Beverly, MA); los filtros de nitrocelulosa se obtuvieron de Schleicher and Schuell (Keene, NH). Los conectores y cebadores sintéticos se prepararon usando sintetizadores automatizados de oligonucleótidos comercialmente disponibles. Alternativamente, se pueden comprar oligonucleótidos sintéticos diseñados especialmente, por ejemplo, a Synthetic Genetics (San Diego, CA). Los kits para síntesis de cDNA y los kits para marcar cebadores al azar se obtuvieron de Boehringer-Mannheim Biochemical (BMB, Indianopolis, IN). Las secuencias de oligonucleótidos que codifican péptidos se pueden sintetizar como se ha descrito antes. Alternativamente, los péptidos se pueden sintetizar directamente por técnicas estándar in vitro (Applied Biosystems, Foster City CA).

Las manipulaciones comunes implicadas en el trabajo con anticuerpos policlonales y monoclonales, incluida la purificación de anticuerpos, se realizaron por procedimientos estándar (Harlow y otros).

Ensayo de tinción fluorescente de células (FACS)

Se incubaron células (10^{6}/muestra) en 10 \mul de anticuerpo primario (10 \mul/ml en PBS-BSA o HBSS (solución equilibrada de Hank, Gibco/BRL) suplementada con 1% de BSA y 0,05% de azida sódica) durante 20 min a 4ºC. Después de lavar tres veces con PBS-BSA o HBSS-BSA, las células se incubaron en 100 \mul de fragmentos T_{ab2}, marcados con FITC, de anticuerpos de cabra anti(IgG de ratón) (Jackson, West Grove, PA) durante 20 min a 4ºC. Después de tres lavados con PBS-BSA o HBSS-BSA y un lavado con PBS, las células se pusieron nuevamente en suspensión en 0,5 ml de PBS. Los análisis se realizaron en un aparato FACSSCAN V (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Ensayo de proliferación de células T mediada por B7

Se cultivaron células T purificadas con fibroblastos 3T6 transfectados con el alelo de alta respuesta de Fc\gammaRIIa y la molécula de B7 (de Boer, M. y otros, Eur. J. Immunol. (1992) 22:3071-3075). La proliferación se midió por incorporación de ^{3}H-timidina. Resumidamente, se cultivaron 4 x 10^{4} células T con células 3T6-Fc\gammaRII/B7 irradiadas (2500 rads) en placas de cultivo de células, de fondo plano, de 96 pocillos, en 200 \mul/pocillo de IMDM completo con o sin Mab CLB-T3/4.1 anti CD3. Durante las últimas 16 horas de un período de cultivo de 72 horas, las células se pulsaron con 1 \muCi/pocillo de ^{3}H-timidina. La proliferación de células T se expresa como cpm media de pocilos triplicados.

Ensayo citotóxico de células T. Se cultivaron células T purificadas con fibroblastos 3T6 transfectados con el alelo de alta respuesta de Fc\gammaRIIa y la molécula de B7. En resumen, se cultivaron 10^{6} células T con 0,2 x 10^{6} células 3T6-Fc\gammaRII/B7 en placas de cultivo de tejidos, de fondo plano, de 24 pocillos, en 1 ml/pocillo de IMDM completo en presencia de Mab UCHT1 anti CD3 durante 3-4 días. La actividad citotóxica de los linfocitos se analizó en un ensayo de citotoxicidad redirigido anti CD3 que se describe más adelante.

Ensayo de cultivo de linfocitos mixtos (MLC)

La proliferación de células T purificadas se midió en cultivos de linfocitos mixtos (MLC) usando la línea ARC de células B transformadas con EBV como células estimuladoras. Se cultivaron 5 x 10^{4} células T con 5 x 10^{4} células estimuladoras irradiadas (5000 rads) en placas de cultivo de células, de fondo redondo (Corning), en 200 \mul/pocillo de medio IMDM completo. Durante las últimas 16 horas de un período de cultivo de 72 horas, las células se pulsaron con 1 \muCi/pocillo de ^{3}H-timidina. La proliferación de células T se expresa como cpm media de pocillos triplicados. Para MLCs secundarios, las células se estimularon como se ha descrito antes para MLC primario. Los blastos de células T para MLC secundario se generaron en MLC primario de 5 a 7 días, con posterior cultivo en ausencia de las células estimuladoras durante 2-4 días. La actividad citotóxica de células T generadas en MLC primario o secundario se analizó en un ensayo de citotoxicidad redirigido anti CD3 usando las células de ratón P815 como se describe más adelante. Alternativamente, las células B transformadas con EBV usadas para inducir la actividad de CTL actuaron como células diana.

Ensayo de citotoxicidad. La actividad de CTL se determinó en un ensayo de lisis de células diana de 4 horas usando como diana células de mastocitoma de murino P815 o células B transformadas con EBV como diana. En el caso de células diana P815, los CTLs se puentearon no específicamente a las células diana usando el Mab OKT3 anti CD3 a 2 \mug/ml. Cuando las células ARC se usaron como células diana, sólo los CTLs específicos para el aloantígeno participan en el proceso mortal. Se incubaron 10^{6} células diana con 200 \muCi de ^{51}Cr-cromato sódico (Amersham International) durante 1 hora y luego se lavaron. Los ensayos de CTL se realizaron en placas de microtitulación de fondo en V, de 96 pocillos, usando 5000 células diana marcadas con ^{51}Cr en diferentes cantidades de pocillos efectores en un volumen total de 200 \mul/pocillo. Cuatro pocillos se llenaron con 5 x 10^{3} células diana en 200 \mul de medio solo, y cuatro pocillos se llenaron con 5 x 10^{3} células diana en 100 \mul de medio y 100 \mul de saponina (para evaluación de la liberación espontánea y la máxima, respectivamente). En el caso de células P815, tres pocillos se llenaron con células efectoras y células diana en ausencia de Mab anti CD3 (para determinar la lisis experimental de fondo). Otros tres pocillos contenían también el Mab anti CD3 a 2 \mug/ml con el fin de determinar la lisis total en presencia de anti CD3. Las placas se centrifugaron a 200 x g y se incubaron durante 4 horas a 37ºC. Luego se sometieron a recuento en un contador de radiación gamma 100 \mul de material sobrenadante. Los resultados se expresan como porcentaje de liberación específica dependiente de CD3 con las células diana P815, o como porcentaje de liberación específica para el aloantígeno con las células diana ARC.

Ensayo de proliferación de células B. Se cultivaron células B (4 x 10^{4} por pocillo) en 200 \mul de IMDM suplementado con 10% de suero fetal de bovino en placas de microtitulación de fondo plano, de 96 pocillos. Las células B se estimularon añadiendo anticuerpos anti-(IgM) inmovilizados (inmunoperlas; 5 \mug/ml; BioRad, Richmond, CA). Cuando era conveniente, se añadieron 100 U/ml de IL-2 recombinante. Al comienzo de los microcultivos se añadieron concentraciones variables de mAbs y la proliferación se estimó el día 3 midiendo la incorporación de [^{3}H]-timidina después de pulsar durante 18 horas.

Ensayo de tipo Bancherau de la proliferación de células B

Para ensayar la capacidad de mAbs anti CD40 de estimular la proliferación de células B en un sistema de cultivo análogo al descrito por Banchereu y otros, Science(1989) 251:70, se usaron células 3T6 de ratón transfectadas que expresan la forma alélica HR de Fc\gammaRII humano. Se cultivaron células B (2 x 10^{4} por pocillo) en micropocillos de fondo plano en presencia de 1 x 10^{4} células transfectantes (irradiadas con 5000 rads) en 200 \mul de IMDM suplementado con 10% de suero fetal de ternera y 100 U/ml de IL-4 recombinante. Antes de añadir las células B, se dejó que las células 3T6 se adhirieran al plástico de cultivo durante como mínimo 5 horas. Se añadieron mAbs anti CD40 a concentraciones variables de 15 ng/ml a 2000 ng/ml y la proliferación de células B se estimó por medición de la incorporación de timidina el día 7, después de pulsación durante 18 horas con [^{3}H]-timidina.

Ensayo de activación de células B con células EL4B5. Se cultivaron células B (1000 por pocillo) junto con células EL4B5 (5 x 10^{4} por pocillo) irradiadas (5000 rads) en placas de microtitulación de fondo plano en 200 \mul de IMDM suplementado con 10% de suero fetal de ternera inactivado por calor, 5 ng/ml de 12-miristato 13-acetato de forbol (Sigma) y 5% de material sobrenadante de células T humanas. Los mAbs se añadieron a concentraciones variables al comienzo de los cultivos y la incorporación de timidina se estimó el día 6 después de pulsar con [^{3}H]-timidina durante 18 horas. Para la preparación del material sobrenadante de células T, se cultivaron células T purificadas a una densidad de 10^{6}/ml durante 36 horas en presencia de 1 \mug/ml de PHA y 10 ng/ml de PMA. Wen y otros, cita anterior. El material sobrenadante de células T se obtuvo por centrifugación de las células y se almacenó a -20ºC. Se ensayó la eficacia del material sobrenadante de células T en la intensificación de la proliferación de células B humanas en cultivos de células EL4B5-B y se combinaron los materiales sobrenadantes más efectivos que se usaron en los experimentos.

Ensayo de células T cooperadoras humanas para anticuerpo

Producción por células B. Se revistieron placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos con una dilución 1:500 de fluido de ascites de mAb CLB-T3/3 anti CD30 (CLB, Amsterdam, Países Bajos). Como se ha indicado, se añadieron mAbs coestimuladores: mAbs CLB-T11.1/1 y CLB-T11.2/1 anti CD2 (CLB, Amsterdam, Países Bajos), ambos ascites 1:1000, y mAb CLB-28/1 anti CD28 (CLB, Amsterdam, Países Bajos). Luego se añadieron células T tonsilares (irradiadas con 3000 rads; 10^{5} por pocillo), células B tonsilares (10^{4} por pocillo) y rIL-2 (20 U/ml). El volumen final de cada cultivo era de 200 \mul. Después de 8 días, se eliminaron las células por centrifugación y se cosechó el material sobrenadante. Las concentraciones de muestras de IgM e IgG (diluidas) humana se estimaron por ELISA según se ha descrito antes.

Ensayo ELISA para cuantificación de inmunoglobulina

Las concentraciones de IgM e IgG humanas se estimaron por ELISA. Se revistieron placas de ELISA con 4 \mug/ml de IgG mAb MH 16-01 antihumano de ratón (CLB, Amsterdam, Países Bajos) o con 1,2 \mug/ml de IgG mAb 4102 antihumano de ratón (Tago, Burlingame, CA) en tampón de carbonato 0,05 M (pH = 9,6) por incubación durante 16 horas a 4ºC. Las placas se lavaron 3 veces con PBS-0,05% de Tween-20 (PBS-Tween) y se saturaron con BSA durante 1 hora. Después de 2 lavados, las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC con diferentes diluciones de las muestras de ensayo. Después de 3 lavados, la Ig unida se detectó por incubación durante 1 hora a 37ºC con IgG mAb MH 16-01 antihumano de ratón (CLB) marcado con peroxidasa o IgM mAb MH 15-01 antihumano de ratón (CLB). Las placas se lavaron 4 veces y la actividad de la peroxidasa unida se reveló añadiendo como sustrato o-fenilendiamina. Se usó suero humano estándar (H00, CLB) para establecer una curva patrón para cada ensayo.

Ensayo citofluorimétrico de flujo. Se incubaron células ARC (10^{5} células/muestra) en 100 \mul de anticuerpo primario (10 \mug/ml en PBS-BA o solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) suplementada con 1% de BSA y 0,05% de azida sódica) durante 20 min a 4ºC. Después de lavar tres veces con PBS-BSA o HBSS-BSA, las células se incubaron en 100 \mul de fragmentos de F(ab)_{2} marcados con FITC de anticuerpos de cabra anti(IgG de ratón) (Jackson, West Grove, PA) durante 20 min a 4ºC. Después de 3 lavados con PBS-BSA o HBSS-BSA y un lavado con PBS, las células se pusieron en suspensión en 0,5 ml de PBS. Los análisis se realizaron con un aparato FACSCAN V (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Alternativamente, se cosecharon células EL4B5 antes del cultivo y en diferentes momentos durante el cultivo en un medio que contenía PMA (5 ng/ml) y material sobrenadante de células T humanas (5%). Las células se incubaron durante 30 min con 10 \mul de material sobrenadante de células transfectadas que contenía hCD40-H\mu diluido en 100 \mul de solución salina equilibrada de Hank suplementada con 0,05% de azida sódica (4ºC). Seguidamente se incubó con fragmentos de F(ab)_{2} conjugado con FITC de conejo anti(IgM humano) (Central Laboratory of the Blood Transfusion Service, Amsterdam, Países Bajos). Como control, las células se incubaron con conjugado de FITC solo. Para el análisis se usó un citofluorímetro FACScan-4 (Becton and Dickinson). Del análsis se excluyeron células no vitales usando yoduro de propidio.

Ejemplo 1 Clonación por PCR de CD40

Se aisló RNA de una población de células de bazo humano transformadas con EBV, esencialmente como lo describen Chirgwin y otros (1979). En resumen, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se lisaron en tiocianato de guanidinio 5M en presencia de 2-mercaptoetanol 0,7 M. El lisado de células se estratificó en un gradiente de CsCl discontinuo (Chirgwin y otros) y se centrifugó durante 16 horas a 26.000 rpm en una centrifugadora Beckman SW28. El RNA se recuperó disolviendo el pélet en H_{2}O tratado con DEPC. El RNA se precipitó una vez con etanol, se puso nuevamente en suspensión en H_{2}O tratada con DEPC y se almacenó a
-70ºC.

El RNA total se convirtió en cDNA usando cebado al azar con hexámero en 50 \mul de tampón de reacción que contenía 500 unidades de LMV RT (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD), hexámeros al azar 5 \muM (Pharmacia, Piscataway, NJ), DTT 1 mM, mezcla de dNTP (0,05 mM de cada uno), Tris-HCl 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 2,5 mM y 0,1 mg/ml de BSA (albúmina de suero bovino). Después de incubación a 37ºC durante 1 hora, las muestras se sometieron a ebullición durante 3 min y se almacenaron a -70ºC. El DNA que codifica CD40 se generó por PCR usando cebadores que contenían secuencias que tenían homología con una secuencia de CD40 conocida, cebadores que codificaban también sitios de restricción útiles para clonación (Figura 2). Estos cebadores estaban basados en las secuencias de codificación de cDNA conocidas para CD40 (Stamenkovic y otros, 1989). Todos los cebadores comienzan con una pinza C-G en el extremo 5' seguida de un sitio de restricción para clonación (representado en negrita, Fig. 2). Las secuencias subrayadas en los cebadores de retroceso, para la clonación de la forma soluble de CD40, representan un epitopo reconocido por un anticuerpo monoclonal usado para purificación por afinidad. Los números en paréntesis representan la situación de los cebadores respecto al cDNA publicado para
CD40.

Para amplificación por PCR, se mezcló 1 \mul de cDNA con 1 \mul (10 picomoles) de un cebador de avance, 1 \mul (10 picomoles) de un cebador de retroceso y 47 \mul de mezcla de PCR. La mezcla de PCR estaba constituida por 1,25 unidades de Taq polimerasa (Perkin-Elmer/Cetus, Norwalk, CT), mezcla de dNTP (0,2 mM de cada uno), Tris-HCl 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 2,5 mM y 0,1 mg/ml de BSA. Los 50 \mul de la mezcla de PCR estaban recubiertos con 70 \mul de aceite mineral y se sometieron a 25 ciclos de amplificación en un termociclador Perkin-Elmer/Cetus (desnaturalización a 95ºC durante 30 s, anillamiento del cebador a 55ºC durante 30 s y extensión a 72ºC durante 1,5 min). Los productos de PCR se obtuvieron después de 25 ciclos de amplificación.

Los productos de amplificación se sometieron a digestión con BgIII y Kpnl (Fig. 1B) y se aislaron mediante fraccionamiento por tamaños. Antes de expresión en baculovirus, la secuencia de DNA de cada fragmento se confirmó por análisis de secuenciación para impedir la introducción de mutaciones inducidas por PCR. El vector pAcC8 de transferencia de baculovirus se sometió también a digestión con BgIII y KpnI (Fig. 1B).

Los fragmentos amplificados se ligaron al vector lineal pAcC8 (la relación de inserción en el vector era de 3:1). Los productos de ligación se transformaron en la cepa bacteriana DH5\alpha (Gibco/BRL, Gaithersburg MD) y se seleccionaron vectores pAcC8 recombinantes sobre la base de resistencia a la penicilina. Se aislaron plásmidos recombinantes de clones bacterianos (Maniatis y otros; Ausubel y otros) y se verificó la presencia del inserto de interés verificado usando reacción en cadena de polimerasa (véase antes). La preparación de plásmidos a gran escala se realizó por procedimientos estándar (Ausubel y otros; Maniatis y otros; Sambrook y otros).

Ejemplo 2 Expresión de baculovirus de CD40 humano

Las secuencias que codifican CD40 humano y B7 humano se recombinaron en el baculovirus Autographa californica (AcNPV) usando los vectores de transferencia pAcCD40 (que codifica la molécula de CD40 de longitud entera) y pAcCD40-ED/Glu (que codifica el dominio extracelular de CD40).

Los plásmidos se cotransfectaron con DNA baculoviral de tipo salvaje (2-10 pfu) (AcNPV; Sumers y otros) en células SF9 (Spodoptera frugiperda) a una densidad de 10^{6} células/ml (Summers y otros). Las células Sf9 recombinantes infectadas con baculovirus se identificaron y purificaron clonalmente (Summers y otros).

Para la expresión en la superficie de células de proteínas recombinantes se cosecharon las células después de 48 horas de cultivo; para la producción de proteínas recombinantes secretadas, las células se cosecharon después de 72 horas de cultivo.

\newpage

Ejemplo 3 ELISA de células Sf9

Se cultivaron durante 48 horas en placas de 24 pocillos células Sf9 de insecto con virus recombinante. Después de eliminar el medio de cultivo de células, las placas se incubaron durante 45 min a temperatura ambiente con 0,25 ml de anticuerpo con 1% de BSA (PBS-BSA). Después de tres lavados con PBS-BSA, las placas se incubaron durante 35 min a temperatura ambiente con 250 \mul de una dilución 1/250 de inmunoglobulinas de cabra anti(Ig total de ratón) conjugadas con peroxidasa de rábano amargo (Zymed, South San Francisco, CA) en PBS-BSA. La actividad de la peroxidasa no unida se eliminó lavando cinco veces con PBS-BSA. La actividad de la peroxidasa unida se reveló añadiendo una mezcla de ensayo preparada diluyendo 0,5 ml de 2 mg/ml de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina en etanol a 10 ml con acetato sódico 10 mM, tampón de EDTA 10 mM (pH 5,0) y añadiendo 0,03% (v/v) de H_{2}O_{2}. La reacción se paró después de 10 min añadiendo 100 \mul de H_{2}SO_{4} 1M.

Los ensayos ELISA descritos, realizados en células Sf9 vivas, dieron los resultados siguientes. La Figura 3 representa los datos para células Sf9 infectadas con pAcB7 y pAcCd40 que se cultivaron durante 48 horas en placas de 24 pocillos. Los anticurpos usados en el ELISA fueron: S2C6, anti(CD40) (barras en blanco) y ningún anticuerpo primario (barras con rayas).

Ejemplo 4 Tinción fluorescente de células A. Tinción fluorescente de células

Se incubaron células (10^{6}/muestra) en 10 \mul de anticuerpo primario (10 \mug/ml en PBS-BSA o HBSS (solución salina equilibrada de Hank, Gibco/BRL) suplementado con 1% de BSA y 0,05% de azida sódica) durante 20 min a 4ºC. Después de tres lavados con PBS-BSA o HBSS-BSA, las células se incubaron en 100 \mul de fragmentos de Fab 2 marcados con FITC de anticuerpos de cabra anti(IgG de ratón) (Jackson, West Grove, PA) durante 20 min a 4ºC. Después de tres lavados con PBS-BSA o HBSS-BSA y un lavado con PBS, las células se pusieron en suspensión en 0,5 ml de PBS. Los análisis se realizaron con un aparato FACSSCAN V (Becton Dickinson, San Jose,
CA).

Los protocolos generales para análisis citométrico de flujo y el análisis de datos clínicos para citometría de flujo los detallan Keren y otros y Coon y otros. Las técnicas generales para recuento de células de sangre y cuantificación de DNA se describen por Powers, Keren y otros, y Coon y otros.

Los datos para la tinción fluorescente de células para células B ARC transformadas con EBV se presenta en la Figura 5. En la Fig. 5A se presentan los resultados de tinción a una dilución de 1:100 de suero de un ratón inmunizado con células Sf9 que expresan B7 (línea continua) o una dilución de 1:100 de suero normal de ratón (línea a
puntos).

En la Figura 5B se presentan los resultados de tinción a una dilución de 1:100 de suero de un ratón inmunizado con células Sf9 que expresan CD40 (línea continua) o una dilución de 1:100 de suero normal de ratón (línea a
puntos).

En la Fig. 5C se representan los resultados de tinción con una dilución de 1:100 de un ratón inmunizado con células Sf9 de control (línea continua) o una dilución de 1:100 de suero normal de ratón (línea a puntos).

B. Ensayos de competición de antígenos solubles

Células B ARC transformadas con EBV se tiñeron con anticuerpos monoclonales anti-(B7) y anti-(CD40) en presencia y ausencia de B7 soluble y CD40 soluble. Los anticuerpos y B7 soluble, CD40 soluble o los controles se preincubaron a temperatura ambiente durante 20 min antes de añadirlos a las células ARC.

La Fig. 6A presenta los resultados de la tinción con B7-24 (línea punteada) o anticuerpo secundario solo (línea continua). La Fig. 6B presenta los resultados de tinción con B7-24 solo (línea punteada) o B7-24 preincubado con B7 soluble (línea continua). La Fig. 6C presenta los resultados de la tinción con B7-24 solo (línea punteada) o B7-24 preincubado con CD40 soluble. La Fig. 6D presenta los resultados de la tinción con CD40-3A8 (línea punteada) o anticuerpo secundario solo (línea continua). La Fig. 6E presenta los resultados de la tinción con CD407A8 solo (línea punteada) o CD403A8 preincubado con B7 soluble (línea continua). La Fig. 6F presenta los resultados de la tinción con CD403A8 (línea punteada) o preincubado con CD40 soluble solo (línea continua).

\newpage

Ejemplo 5 Inmunización del animal huésped

Se inyectaron intraperitonealmente ratones BALB/c hembra el día 0 y el día 14 con 5 x 10^{6} células Sf9 infectadas con el virus AcCD40, el virus AcB7 o el virus AcCd3 (virus de control). El día 21, se obtuvieron 100 \mul de suero para ensayar la presencia de anticuerpos específicos. Después de un período de descanso de como mínimo dos semanas, los ratones recibieron una inyección final de 2 x 10^{6} células infectadas con virus AcCD40 o AcB7. Tres días después de esta inyección, se usaron las células de bazo para fusión de células.

Ejemplo 6 Generación de clones de hibridoma

Esplenocitos de ratones BALB/c inmunizados se fusionaron con células SP2/0 de mieloma de murino en una proporción de 10:1 usando polietilenglicol al 50% como ha sido descrito por de Boer y otros (1988). Las células fusionadas se pusieron en suspensión en medio IMDM completo suplementado con hipoxantina (0,1 mM), timidina (0,016 mM) y 0,5 ng/ml de hIL-6 (Genzyme, Cambridge, MA). Las células fusionadas se distribuyeron luego entre los pocillos de placas de cultivo de 96 pocillos de manera que cada pocillo contuviera de media un híbrido en crecimiento.

Después de 10-14 días, se exploraron las sustancias sobrenadantes de las poblaciones de hibridomas en cuanto a la producción de anticuerpos específicos. Para la exploración de la producción de anticuerpos específicos, se combinaron las sustancias sobrenadantes de 12 pocillos y se usaron para tinción fluorescente de células, de células B transformadas con EBV como se ha descrito en el Ejemplo 4. Seguidamente, se ensayaron individualmente las sustancias sobrenadantes de las combinaciones positivas. Las células de hibridoma positivas se clonaron tres veces por dilución limitativa en IMDM/FBS que contenía 0,5 ng/ml de hIL-6. Los resultados del ensayo se presentan en la Tabla 1.

TABLA 1 Resumen de datos de fusión para la generación de anticuerpos monoclonales a la fusión de CD40 humano y B7 humano

	Anti CD40	Anti B7
Número de pocillos sembrados después de la fusión	480ª	960
Número de pocillos con crecimiento de hibridoma	351	312
Número de pocillos positivos^{b}	4	1
Frecuencia de pocillos positivos^{c}	1,15	0,31
^{a}. Sólo se analizó la mitad de las células obtenidas después de la fusión.
^{b}. Determinado por análisis FACS descrito en el Ejemplo 4.
^{c}. \begin{minipage}[t]{150mm} La frecuencia de pocillos positivos se define como número de pocillos positivos dividido por número total de pocillos con crecimiento de hibridoma multiplicado por 100. \end{minipage}

Ejemplo 7 Ensayo de células B tonsilares

Se aislaron linfocitos B tonsilares de amígdalas obtenidas de niños a los que se practicó amigdalotomía, según lo descrito por deGroot y otros (1990). En resumen, el tejido se dispersó con cuchillas de escalpelo, se redujeron las células fagocíticas y las células NK por tratamiento con éster metílico de L-leucina 5 mM y las células T se eliminaron por un ciclo de formación de rosetas con eritrocitos de oveja tratados con bromuro de 2-aminoetilisotiouronio.

Los anticuerpos monoclonales anti CD40 y anti B7 se ensayaron en cuanto a su capacidad de unirse a células B tonsilares usando la tinción fluorescente de células descrito antes en el Ejemplo 4. Para el análisis por tinción fluorescente de células B tonsilares cultivadas se usó yoduro de propidio para excluir células muertas.

La Tabla 2 presenta los resultados de los análisis anteriores para la unión de anticuerpos monoclonales anti CD40 a células B tonsilares muy enriquecidas.

TABLA 2 Unión de anticuerpos monoclonales anti CD40 a células B tonsilares muy enriquecidas

Anticuerpo	Especifidad	% de células positivas^{a}
OKT3	CD3	2,1
LeuM3	LeuM3	2,5
B1	CD20	88,0
G28,5	CD40	92,1
CD40-5H7	CD40	93,7
CD40-5D12	CD40	95,0
CD40-3C6	CD40	88,9
CD40-3A8	CD40	93,3
^{a}. \begin{minipage}[t]{150mm} El porcentaje de células tonsilares positivas se midió por tinción fluorescente de células como se ha descrito en el Ejemplo 4. \end{minipage}

Estos datos revelan que el 89-95 por ciento de las células tonsilares aisladas recientemente se tiñó positivamente con los cuatro anticuerpos monoclonales anti CD40.

La reacción de las células B tonsilares con el anticuerpo monoclonal G28.5 (Clark y otros) se ensayó de manera esencialmente igual: aproximadamente el porcentaje de células que fue positivo con G28.5 era esencialmente igual al de células con los anticuerpos monoclonales anti CD40 de la presente invención.

Ejemplo 8 Coestimulación de la proliferación de células B usando mAbs anti CD40

Se generaron como se describe en los Ejemplos 1-7 cuatro hibridomas que producen anticuerpos monoclonales contra CD40 humano. Se vió que estos mAbs se unen en una proporción similar a células B tonsilares como lo hace mAb28.5 anti CD40. deBoer y otros, J. Immunol. Methods (1992) 152:15. Tres de estos anticuerpos monoclonales (5D12, 3A8 y 3C6) que eran de la subclase de IgG2b, se ensayaron en cuanto a su capacidad para suministrar señales de activación a células B humanas en el ensayo de proliferación que se ha descrito antes.

Se cultivaron células B tonsilares humanas (4 x 10^{4} por pocillo) en 200 \mul en micropocillos en presencia de anti-IgM acoplado a perlas de sefarosa (5 \mul/ml) (Figura 7A) o en presencia de anti IgM más rIL-2 (100 U/ml) (Fig. 7B). Se añadieron concentraciones variables del antígeno mAbs S2C6 de CD40, 5D12, 3C6 o 3A8 y la incorporación de [^{3}H]timidina se midió el día 3 después de pulsación durante 18 h. Los datos presentados en la Fig. 7A son valores medios derivados de experimentos con preparaciones de células B de tres donantes diferentes con inoculaciones duplicadas. Los datos de la Fig. 7B son valores medios de incubaciones duplicadas de un experimento fuera de dos con resultados comparables.

Ninguno de los nuevos mAbs anti CD40 era capaz de coestimular significativamente la proliferación de células B humanas en presencia de anti IgM inmovilizado o en presencia de anti IgM inmovilizado e IL-2. A diferencia, mAb S2C6 anti CD40 coestimulaba la proliferación de células B humanasb de modo dependiente de la concentración.

Ejemplo 9 Inducción de la proliferación de células B usando mAbs anti CD40

Los mAbs ensayados en el Ejemplo 8 se ensayaron en cuanto a su capacidad para inducir la proliferación de células B humanas en un ensayo del tipo de Bancherau descrito antes, esto es, presentando el mAb anti CD40 sobre células adherentes que expresan Fc\gammaRII. Como células que presentan anticuerpo, se usaron células 3T6 de ratón que expresan la forma alélica HR de Fc\gammaRII humano. Se observó que mAb S2C6 anti CD40 junto con IL-4 inducían una proliferación sustancial de células B humanas en este sistema, según se estimó por medición de la incorporación de [^{3}H]timidina. Sin embargo, mAbs 5D12 anti CD40, 3C6 o 3A8 no indujeron la proliferación de células B humanas en este sistema de cultivo (datos no presentados).

\newpage

Ejemplo 10 Inhibición de la proliferación de células B estimulada por S2C6 usando mAbs anti CD40

También se ensayaron los mAbs anti CD40 en cuanto a su capacidad de inhibir la coestimulación de la proliferación de células B humanas por mAb S2C6 anti CD40 usando el ensayo de proliferación de células B descrito antes. Se cultivaron células B tonsilares humanas (4 x 10^{4} por pocillo) en 200 \mul en micropocillos en presencia de anti-IgM acoplado a perlas de sefarosa (5 \mug/ml) y mAb S2C6 anti CD40 (1,25 \mug/ml). Se añadieron cantidades variables de mAbs 5D12, 3C6 o 3AB anti CD40 y la incorporación de [^{3}H]timidina evaluó después de 3 días. Como control se añadió mAb 8E4 anti-(glucocerebrosidasa) en concentraciones similares. Barneveld y otros, Eur. J. Biochem. (1983) 134:585. Los datos son las medias \pm d.e. derivadas de experimentos con células B de dos diferentes donantes con incubaciones por duplicado.

Se encontró que cada uno de los mAbs 5D12, 3A8 y 3C6 anti CD40 podía inhibir la coestimulación de la proliferación de células B humanas inducida por anti-IgM por mAb S2C6 (Figura 8). A diferencia, no se vió inhibición significativa alguna con cantidades equivalentes de mAb 8E4 no relevante dirigido a \beta-glucocerebrosidasa. Barneveld y otros, cita anterior. Así, se concluyó que estos mAbs anti CD40 no suministran señales estimuladoras para la proliferación de células B humanas, pero, a la inversa, pueden inhibir señales estimuladoras ejercidas por desescadenar anti CD40 con otro mAb. Por tanto, se consideró que estos mAbs son excelentes herramientas para investigar si la señalización a través de CD40 juega un papel en la estimulación de la proliferación de células B humanas por células EL4B5.

Ejemplo 11 Efectos de mAbs anti-CD40 sobre la proliferación de células B humanas inducida por EL4B5

El efecto de mAbs anti CD40 sobre la proliferación de células B humanas inducido por EL4B5 se ensayó usando el ensayo de activación de células B descrito antes. Se cultivaron células B tonsilares humanas (100 por pocillo) junto con células EL4B5 irradiadas (50.000 por pocillo) en presencia de 5% de sustancias sobrenadantes de células T humanas activadas y 5 ng/ml de PMA. Se añadieron en cantidades variables mAbs 5D12, 3C6 o 3A8 anti CD40. Como control, se añadió mAb MOPC-141 (IgG2b). Después de 6 días de cultivo, se evaluó la incorporación de [^{3}H]-timidina.

La Figura 9 revela que la adición de mAbs 5D12, 3C6 o 3A8 anti CD40 dio por resultado una inhibición dependiente de la concentración de la proliferación de células B humanas. Los datos son medias \pm d.e. derivadas de experimentos con células B de cuatro donantes diferentes con incubaciones por duplicado. Los valores de la incorporación de [^{3}H]timidina encontrados para incubaciones sin mAb fueron (valores medios \pm d.e.) 10460 \pm 1843 cpm; 6982 \pm 1729 cpm; 4362 \pm 1020 cpm y 1543 \pm 3190 en los cuatro experimentos diferentes, respectivamente. La incorporación de [^{3}H]-timidina en células B solas era de 40 \pm 5 cpm, y en células EL4B5 irradiadas solas era de 31 \pm 15 cpm.

Se produjo una inhibición muy potente. A concentraciones tan bajas como de 10 ng/ml de cada uno de los tres mAbs anti CD40, mAbs 5D12, 3C6 y 3A8, se inhibía completamente la proliferación de células B humanas. La inhibición semimáxima se encontró a aproximadamente 1 ng/ml. A diferencia, la proteína MOPC-141 de mieloma de ratón del isotipo emparejado a IgG2b no tenía efecto significativo sobre la incorporación de [^{3}H]timidina. Se observó una inhibición similar cuando la incorporación de [^{3}H]timidina se evaluó el día 4 de cultivo en vez del día 6, lo que excluye la posibilidad de que el efecto observado fuera debido a un cambio en la cinética de la proliferación por influencia del mAb anti CD40 (datos no representados).

A fines comparativos, se investigó la influencia de unos pocos mAb dirigidos contra las estructuras de superficie de otras células B. Ni el mAb B1 anti CD20 o el mAb B7-24 anti B7 (este último se generó por un procedimiento similar al usado para generar el mAb anti CD40 usado en la Fig. 9), en concentraciones similares a las usadas en los experimentos con mAb anti CD40, tenía efecto alguno sobre la proliferación de células B humanas inducida por EL-4B5 (datos no representados). Por tanto, se puede concluir que el efecto inhibidor de mAb anti DC40 sobre la proliferación de células B inducida por EL 4B5 no es debido a enmascaramiento de la superficie de las células B.

Ejemplo 12 Efectos de hCD40.H\mu sobre la proliferación de células B humanas inducida por EL4B5

Con el fin de investigar si las células EL4B5 expresaban una estructura de membrana que se une a CD40, se usó para análisis fluorimétrico de flujo una proteína de fusión constituida por el dominio extracelular de los dominios constantes CH2, CH3 y CH4 (hCD40.H\mu) de CD40 humano e IgM humano. Lane y otros, cita anterior. Las células EL4B5 no activadas no se unieron a la proteína de fusión. Sin embargo, después de cultivar células EL4B5 junto con PMA (5 ng/ml) y 5% de sustancias sobrenadantes de células T humanas, que son las condiciones necesarias para activación de células B humanas, se encontró una unión baja de hCD40.H\mu (datos no representados). Este pequeño desplazamiento de la flurescencia se encontró consistentemente en tres experimentos diferentes. El período mínimo de activación necesario para la inducción de la unión de CD40 era de 24 horas. Para determinar si la unión de hCD40.H\mu a las células EL4B5 inhibiría la proliferación de células B humanas inducida por EL4B5 como lo hacía mAb anti CD40, se valoró la proteína de fusión en cocultivos de células EL4B5 con células B humanas usando el ensayo de activación de células B descrito antes. La Figura 10 revela que la proteína de fusión inhibió ciertamente la incorporación de [^{3}H]timidina de modo dependiente de la concentración y que, como el mAb anti CD40 usado en los experimentos representados en la Fig. 9, era capaz de inhibir completamente la proliferación de células B inducida por células EL4B5.

Ejemplo 13 Efectos de mAbs anti CD40 sobre la producción de anticuerpos, inducida por células T humanas, por células B humanas

Los anticuerpos se ensayaron tambien en cuanto a su capacidad para inhibir la producción de inmunoglobulinas por células B, estimulada de modo dependiente de la concentración con células T activadas, usando el ensayo de células T cooperadoras descrito antes. Se cultivaron células B tonsilares humanas (10^{4}/pocillo) junto con células T purificadas iradiadas (3.000 rads, 10^{5}/pocillo) en placas de 96 pocillos revestidas con mAb anti CD40 y con o sin mAbs diferentes para coestimular las células T. Después de 8 días de cultivo, se cosecharon las sustancias sobrenadantes para la determinación de la producción de inmunoglobulina por las células B. La producción de inmunoglobulina por las células B se estimó por el ensayo ELISA descrito antes. Se añadió en concentraciones variables mAb 5D12 anti CD40 a partir del comienzo de los cultivos. Como control se añadió mAb MOPC-141. La Figura 4A demuestra que, cuando las células T se estimularon con mAb anti CD3 y coestimularon con mAbs anti DE2 y anti CD28 solubles, la adición de mAb 5D12 anti CD40 dio por resultado una inhibición, dependiente de la concentración, de la producción de IgG por células B humanas. En la misma cuantía se inhibió la producción de IgM por las células B. Se obtuvieron resultados similares con los Abs 3C6 y 3A8 anti CD40 con la proteína de fusión hCD40.H\mu.

Los mAbs anti CD40 de esta invención exhibían una inhibición muy potente. A concentraciones tan bajas como de aproximadamente 30 ng/ml, cada uno de los tres mAbs anti CD40 dio 50% de inhibición máxima. A diferencia, la proteína MOPC-141 de mieloma de ratón de IgG2b emparejada con isotipo no tenía efecto sobre la producción de inmunoglobulina.

El efecto inhibidor de los tres mAbs anti CD40 no era específico para la manera de activación de las células T que proporcionan la actividad cooperadora del ligando de CD40. La Fig. 4B revela que, para todas las condiciones de estimulación de células T (anti CD3 solo; anti CD3 \pm anti CD2; anti CD3 \pm anti CD28, y anti CD2 \pm qnti CD3 \pm anti CD28), la adición de mAb 5D12 anti CD40 da por resultado una fuerte inhibición de la producción de inmunoglobulina por células B humanas. La inhibición es comparable con la cuantía de inhibición con la proteína de fusión hCD40.H\mu, que es conocido que bloquea completamente la interacción de CD40-ligando de CD40. El porcentaje de inhibición variaba de 40 a 70%, dependiendo de las condiciones de inhibición. A diferencia, la proteína MOPC-141 de mieloma de ratón de IgG2b emparejada con isotipo, o IgM humana (como control para la proteína de fusión hCD40.H\mu) no tenía efecto sobre la producción de inmunoglobulina por células B humanas.

Depósito de cultivos

Los hibridomas usados en los ejemplos anteriores se depositaron y fueron aceptados en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, bajo los términos del Tratado de Budapest. Este depósito no indica que estos hibridomas son necesarios para la práctica de la invención descrita en lo anterior o reivindicada seguidamente.

Hibridoma	Fecha de depósito	Número de acceso
3C6	6 de mayo de 1993	HB 11340
5D12	6 de mayo de 1993	HB 11339

La presente invención se ha descrito haciendo referencia a realizaciones específicas. Sin embargo, esta solicitud cubre los cambios y sustituciones que pueden realizar los expertos en la técnica sin desviarse del espíritu y el ámbito de las reivindicaciones anexas.

Referencias bibliográficas

Ausubel, F.M. y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Son, Media, PA.

Bohinski, R.C., Modern Concepts in Biochemistry, 2ª edición, Allyn and Bacon, inc.

Carroll, W.P., Thielemans, K., Dilley, J. y Levy, R. (1986), J. Immunol. Methods, 89:61.

Chirgwin, J.M. y otros, Biochemistry 17:5294 (1979);

Clark, E.A. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:4494 (1986).

Coon, J.S. y otros (editores), Diagnostic Flow Cytometry, Academy of Pathology Inc (1991).

Crea, R. patente U.S. nº. 4.888.286, expedida el 19 de diciembre de 1989.

De Boer, M. y otros, J. Immunol. Methods 113:143 (1988).

DeGroot, C. y otros, Lymphokine Researach 9:321 (1990).

DiSanto, J.P. y otros, J. Immunol. Methods 141:123 (1991).

Eaton, M.A.W. y otros, patente U.S. nº. 4.719.180, expedida el 12 de enero de 1988.

Freedman, A.S. y otros, J. Immunol. 139:3260 (1987).

Freedman, G.F. y otros, J. Immunol. 143:2714 (1989).

Harlow, E. y otros, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988).

Huynh, T.V. y otros, en DNA cloning. Volumen 1, ed. D.M. Glover, Washington D.C: IRL Press, 1985 (capítulo 2)

Keren, D.F., (editor), Flow Cytometry in Clinical Diagnosis, American Society of Clinical Pathologists (1989).

Lackuow, V.A. y otros, Cloning and express ion of heterologous genes in insect cells with baculovirus vectors, en Recombinant DNA Technology and Applications (C. Ho, A. Prokop y R. Bajpal, eds.). McGraw-Hill, NY (1991).

Luckow, V.A. y otros, Virology 170:31 (1989).

Maiorella, B. y otros, Biotechnology 6:1406 (1988).

Maniatis, T. y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982).

Matsuura, Y. y otros, J. Gen. Vir. 68(pt5): 1233-1250 (1987).

Miller, L.K. (1988) en Vectors: A Survey of Molecular Clonong Vectors and Their Uses, Rodriguez, R.L. y Denhardt D.T., eds., Butterworths, Boston.

Mishell, B.B. y Shiigi, S.M., eds. (1980), Selected Methods in Cellular Immnunology, W.H. Freeman and Co., San Francisco.

Mullis, K.B., patente U.S. nº. 4.683.202, expedida el 28 de julio de 1987.

Mullis, K.B. y otros, patente U.S. nº. 4.683.195, expedida el 28 de julio de 1987.

Nyunoya, H. y otros, AIDS Res. Hum. Retrovir. 6(11):1311-1321 (1990).

Paulie, S. y otros, Cancer Immunol. Immunother. 20:23 (1985).

Perkins, S. y otros (1989) en Electromanipulation in Hybridoma Technology. A Laboratory Manual, Borrebaeck, C.A.K., Hagen, I. (eds), Stockton Press, New York.

Perkins, S., Zimmerman, U., Foung, S.K.H. (1991) Hum. Antibod. Hybridomas 2:155-159.

Powers, L.W., Diagnostic Hematology: Clinical and Technical Principles, C.V. Mosby Company (1989).

Sambrook, J. y otros, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, vol. 2 (1989).

Saiki, R.K. y otros, Science 230:1350 (1985).

Saiki, R.K. y otros, Science, 239:487 (1988).

Sakine, H. y otros, Gene 65(2): 187-193 (1988).

Stamenkovic, I. Y otros, EMBO J. 8:1403 (1989).

Summers, M.D. y otros, A manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin nº. 1555 (1987).

Takehara, K. y otros, J. Gen. Virol. 69(pt. 11): 2763-2777 (1988).

Valle, A. y otros, Imunol. 69:531 (1990).

Webb, N.R. y otros, Technique 2:173 (1990).

Webb, N.R. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:7731 (1989).

Wu, A.Z. y otros, Chin. J. Biotech. 6(4): 237-242 (1990).

Yokochi, T. y otros, J. Immunol. 128:823 (1982).

Yoshio, T. y otros, patente U.S. nº. 4.849.350, expedida el 18 de julio de 1989.

Claims (12)

1. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de él capaz de unirse a un antígeno humano CD40 situado sobre la superficie de una célula B humana, en el que la unión del anticuerpo o fragmento de él al antígeno CD40 impide el crecimiento o la diferenciación de la célula B.

2. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionado entre 5D12 producido por el hibridoma ATCC HB 11339 y 3C6 producido por el hibridoma ATCC HB 11340.

3. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que está humanizado.

4. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el mencionado fragmento es un fragmento Fab', F(ab')_{2} o F_{v}.

5. Un hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal que tiene especifidad para el antígeno CD40 de una célula B humana, en el que la unión del mencionado anticuerpo monoclonal a un antígeno CD40 humano expresado sobre la superficie de una célula B humana inhibe el crecimiento o la diferenciación de la célula B.

6. Un hibridoma de acuerdo con la reivindicación 5, con el número de depósito ATCC HB 11339, que produce el anticuerpo monoclonal 5D12.

7. Un hibridoma de acuerdo con la reivindicación 5, con el número de depósito ATCC HB 11340, que produce el anticuerpo monoclonal 3C6.

8. Uso de un anticuerpo monoclonal anti CD40 o fragmento de él, capaz de unirse a un antigeno CD40 humano situado sobre la superficie de una célula B humana, para la manufactura de un medicamento para prevenir o tratar una enfermedad mediada por anticuerpos en un paciente, en el que la unión del anticuerpo o el fragmento de él al antígeno CD40 impide el crecimiento o la diferenciación de la célula B.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la enfermedad mediada por anticuerpos se selecciona entre el grupo constituido por una enfermedad mediada por IgG, lupus eritomatoso sistémico, (SLE), cirrosis biliar primaria (PBC) y púrpura trombocitopénica idiopática (ITP).

10. Uso de un anticuerpo monoclonal anti CD40 o fragmento de él, capaz de unirse a un antigeno CD40 humano situado sobre la superficie de una célula B humana, para la manufactura de un medicamento para inhibir la proliferación de células B humanas, proliferación de las mencionadas células B que aumenta por la interacción de un ligando CD40 con un antígeno CD40 expresado sobre la superficie de las mencionadas células B, en el que la unión del anticuerpo o el fragmento de él al mencionado antígeno CD40 impide el crecimiento o la diferenciación de la célula B.

11. Una composición farmacéutica que comprende:

(a)

un anticuerpo monoclonal o fragmento de él que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado sobre la superficie de una célula B humana, en el que la unión del anticuerpo o fragmento de él al antígeno CD40 impide el crecimiento o la diferenciación de la célula B; y

(b)

un excipiente farmacéutico.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 11, en la que el anticuerpo monoclonal es como se ha definido en la reivindicación 2, la reivindicación 3 o la reivindicación 4.