DE69826496T2

DE69826496T2 - RECOMBINANTES IgA

Info

Publication number: DE69826496T2
Application number: DE69826496T
Authority: DE
Inventors: Donald J. CAPRA; M. Jonathan HEXHAM; N. Leon CARAYANNOPOULOS; E. Edward MAX
Original assignee: US Department of Health and Human Services; University of Texas System
Current assignee: US Department of Health and Human Services; University of Texas System
Priority date: 1997-01-07
Filing date: 1998-01-07
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2018-01-08
Also published as: AU728748B2; ATE277082T1; US6673342B1; EP1009756A1; US6063905A; EP1009756A4; AU5915498A; EP1009756B1; WO1998030577A1; DE69826496D1; CA2278344A1

Description

GRUNDLAGEN DER ERFINDUNG
Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der humoralen Immunabwehr gegen Pathogene, die in den Körper über Schleimhautoberflächen eindringen. Ganz besonders betrifft sie das Gebiet rekombinant gebildeter dimerer IgA-Antikörper und die Sekretion derartiger Antikörper in die Schleimhautsekrete für eine schützende Immunität gegen externe Pathogene, einschließlich Viren, Bakterien, bakterieller Toxine und makroskopischer Parasiten.
Beschreibung der verwandten Technik
Die Schleimhautoberflächen des Körpers stellen die größte Expositionsfläche des Körpers für externe Pathogene dar. 400 m² im Vergleich zu nur 1,8 m² Hautfläche (Childers et al., 1989). IgA ist die Immunglobulin-Unterklasse, die hauptsächlich für den humoralen Immunschutz auf dieser großen exponierten Fläche verantwortlich ist. IgA kann intrazellulär mit der J-Kette über ein Cystein in dem C-terminalen „Schwanz" verknüpft sein, um dimeres IgA (dIgA, Koshland, 1985) zu bilden, das von dem polymeren Immunglobulinrezeptor (pIgR) gebunden und durch die Schleimhautepithelien transportiert werden kann (Mostov und Blobel, 1982; Underdown, 1990; Mostov, 1994), um als sekretorisches IgA (sIgA) freigesetzt zu werden. Deshalb dient sIgA als die erste Front der humoralen Immunabwehr auf den Schleimhautoberflächen (Underdown und Schiff, 1986).
IgA ist ein tetramers Protein, umfassend zwei identische leichte Ketten (κ oder λ) und zwei identische schwere Ketten (a), die IgA mit seinen biologisch spezifischen Eigenschaften ausstatten. Im Menschen liegen zwei IgA-Isotypen, IgA1 und IgA2, vor, als Folge der Duplikation und anschließenden Diversifikation eines großen Segmentes des Locus der humanen schweren Kette (Torano und Putnam, 1978, Putnam et al., 1979, Tsuzukida et al., 1979). Die gesamte Domänenstruktur von IgA scheint dem IgG zu ähneln, da es drei konstante Domänen (Cα1–Cα3) mit einer Gelenkregion zwischen den Cα1 und Cα2-Domänen enthält. Alle IgA-Isotypen (wie auch IgMs) besitzen ein 18-Aminosäure „Schwanzstück" C-terminal zu der CH3-Domäne, das nicht auf IgG vorhanden ist und eine Ig-Polymerbildung ermöglicht (Garcia-Pardo et al., 1981, Davis et al., 1988).
Serum IgA liegt in monomeren oder polymeren Formen vor, wobei die Dimere am häufigstens sind, obwohl Tetramere und höhere Polymere beobachtet worden sind. Polymerisierung ist für Antikörper der IgA und IgM Isotypen einzigartig und ist durch das Schwanzstück zusammen mit der J-Kette vermittelt, wobei ein Molekül davon pro IgA-Dimer vorhanden ist (Zikan et al., 1986). Die J-Kette ist eine kleine Glycoprotein-(15 kD)-Komponente des polymeren IgA und IgM (Koshland, 1985). Die J-Kette enthält sechs Disulfidbindungen zwischen den Ketten und zwei zusätzliche Cystein-Reste an Position 15 und 79, die Disulfidbindungen mit dem vorletzten Cystein von einer schweren Kette in jeder IgA monomeren Untereinheit bilden (Bastian et al., 1992). Folglich überbrückt die J-Kette zwei IgA-Monomere, während die anderen Cystein-Reste des Schwanzstückes miteinander direkt binden und das dimere Molekül weiter stabilisieren.
Dimeres IgA (wie auch polymeres IgM) wird von dem pIgR spezifisch gebunden, der auf der basolateralen Oberfläche von Schleimhautepithelzellen exprimiert ist, und durch diese Zellen transportiert, um auf der Schleimhautoberfläche sezerniert zu werden. Sekretorisches IgA (sIgA) behält meistens die extrazelluläre Region des pIgR, als sekretorische Komponente (SC) bezeichnet, an eines der IgA-Monomere gebunden (Underdown et al., 1977).
Untersuchungen bei J-Ketten Knockout-Mäusen zeigen, dass die J-Kette nicht unbedingt für eine IgA-Polymerisierung erforderlich ist, obwohl diese bei Fehlen der J-Kette viel weniger effizient ist (Hendrickson, et al., 1995). In diesen Mäusen waren die IgA-Levels in Galle und Fäzes sehr verringert, so wie es der Level von dimerem IgA im Serum war. Weitere Untersuchungen ergaben, dass Darm-, Brust- und Atemwegssekrete IgA überwiegend in monomerer Form enthielten (Hendrickson et al., 1996), deshalb ist die J-Kette für eine IgA-Sekretion nicht erforderlich, scheint aber die Wechselwirkung zwischen sezerniertem IgA und sekretorischer Komponente zu stabilisieren.
Die Strukturen auf dem pIgR, die die Wechselwirkung mit IgA vermitteln, sind zum Teil wie auch der Assoziationsmechanismus zwischen IgA und pIgR identifiziert worden. Der pIgR ist ein 110 kD Transmembran-Glycoprotein mit fünf Homologie-Domänen (I–V) der Immunglobulin-Superfamilie in der extrazellulären Region (Mostov et al., 1984, Eiffert et al., 1984). Die primäre Stelle der Wechselwirkung von pIgR mit dem IgA ist in Domäne I (Frutiger et al., 1986), die an einer hoch affinen (10⁸ M^–1), nicht kovalenten Wechselwirkung beteiligt ist (Kuhn und Kraehenbuhl, 1979). Eine weitere Kartierung der Bindungsstelle des dimeren IgA innerhalb von Domäne I des pIgR identifizierte ein Peptid, umfassend Reste 15–37 von humanem pIgR, der dIgA bindet (Bakos et al., 1991a). Ein Versuchsansatz mit einer Mutation, der auf der Modellierung der Domäne I Sequenz auf bekannten Strukturen von Ig variablen Domänen basierte, zeigte, dass die Schleifen in analogen Positionen zu den drei V-Region CDRs die dIgA-Bindungsstelle bildeten (Coyne et al., 1994). Dies legt die Vermutung nahe, dass die Wechselwirkung des pIgR mit dIgA zu der Wechselwirkung von Antikörper mit Antigen ähnlich ist, oder um genauer zu sein, der Wechselwirkung einer einzelnen V-Domäne mit Antigen ähnelt.
Das zweite Stadium der Wechselwirkung zwischen pIgR und IgA involviert kovalentes Binden von Domäne V an das Fc einer der Untereinheiten in dIgA (Lindh und Bjork, 1974, Cunningham-Rundles und Lamm, 1975). Dieses einzige Disulfid ist zwischen cys467 in Domäne V der sekretorischen Komponente und cys311 gebildet, das sich in der Cα1-Domäne einer schweren Kette in einer IgA-Untereinheit befindet. Disulfid-Bildung scheint ein spätes Ereignis im Sekretionsweg zu sein und ist nicht unbedingt für Transcytose erforderlich (Chintalacharuvu et al., 1994, Tamer et al., 1995).
Schützende Antikörper vom IgA-Isotyp sind gegen ein großes Spektrum humaner Pathogene, einschließlich Viren wie HIV (Burnett et al., 1994) und Influenza A (Liew et al., 1984), Bakterien (Tarkowski et al., 1990, Hajishengallis et al., 1992), bakterieller Toxine und makroskopischer Parasiten (Grzych, et al., 1993) dokumentiert worden. Es bestehen mehrere Mechanismen, mit denen IgA seine antimikrobielle Wirkung ausübt und sie können in aktive (z. B. Fc-Rezeptor bindende oder Komplementaktivierung) und passive (z. B. Blockieren viraler Rezeptoren für Wirtszellen oder Hemmung der Bewegung von Bakterien) Mechanismen unterteilt sein.
Zahlreiche Untersuchungen haben die Verbindung von starken mukösen IgA-Antworten und Schutz gegen virale Infektion mit Rotavirus gezeigt (Underdown und Schiff, 1986, Feng et al., 1994), Influenzavirus (Taylor und Dimmock, 1985, Liew et al., 1994), Poliovirus (Ogra und Karzon, 1970), Respiratory Syncytial Virus (Kaul et al., 1981), Cytomegalovirus (Tamura et al., 1980) und Epstein-Barr-Virus (Yao et al., 1991) demonstriert. Sekretorisches IgA verhindert deshalb erfolgreich, dass diese Viren sich einen Zutritt in den Körper verschaffen, indem sie die Infektion an der Eintrittstelle, nämlich der Schleimhautoberfläche, blockieren. Passive Immuntherapie mit intranasalen IgG Fabs war gegen Respiratory Syncytial Virus schützend (Crowe et al., 1994), was zeigt, dass die schiere Präsenz von neutralisierenden antiviralen Antikörpern, ohne irgendeine Effektorfunktion, auf der Schleimhautoberfläche eine virale Infektion verhindern kann.
Aufgrund seiner komplexen Wechselwirkungen mit dem Immunsystem des Wirts, hat sich die Eindämmung des HIV-Virus als sehr schwierig erwiesen, sobald es in den Körper eingedrungen ist. Eindeutig wäre eine Strategie ideal, die das Virus vom Körper ausschließt. Muköse IgA-Antikörper bieten diese Möglichkeit und besitzen eine Schlüsselrolle bei vielen viralen Infektionen. Da die Schleimhautoberflächen gewöhnlich die Eintrittstelle des Virus in den Körper sind, erscheint es logisch, einige Anstrengungen für die Entwicklung dieser ersten antiviralen Verteidigungslinie aufzuwenden. Viele Berichte lassen die eine schützende Rolle für eine passive Immunisierung in Patienten mit AIDS vermuten.
Es ist beobachtet worden, dass HIV-1 infizierte Individuen neutralisierende Antikörper und hohe Titer antivraler Antikörper im Gegensatz zu AIDS-Patienten besaßen, die geringe Levels antivraler Antikörper besaßen (Karpas et al., 1988). Passive Immunisierung von sowohl ARC als auch AIDS-Patienten hatte vorteilhafte Wirkungen. Neutralisierende anti-HIV Antikörper sind unter Verwendung kombinatorischer Bibliotheken, die von langzeitasymptomatischen HIV-infizierten Spendern stammten, hergestellt worden (Barbas et al., 1992 und 1993), was eine Rolle für eine humorale Immunität bei der Limitierung der Progression der HIV-Infektion vermuten lässt. Es ist gezeigt worden, dass eine passive Immuntherapie unter Verwendung von humanen anti-HIV Seren die Progression einer Erkrankung in HIV-infizierten Patienten verzögert (Vittecoq et al., 1995). Impfstudien bei Makaken haben vermuten lassen, dass sekretorisches IgA eine wichtige Rolle bei der Neutralisierung von HIV-1 spielen kann (Bukawa et al., 1995). Die relative Rolle von systemischem und mukösen IgA in der anti-HIV Antwort bleibt noch zu klären, obwohl neutralisierende IgA-Antikörper im Serum HIV-infizierter Patienten vorkommen (Burnett et al., 1994). Das Vorhandensein von sIgA-Antikörper im Speichel HIV-infizierter Individuen stimmte mit einer asymptomatischen HIV-Infektion gut überein, wohingegen Patienten mit AIDS verminderte sIgA-Levels im Speichel zeigten (Matsuda et al., 1994). Im Gegensatz hierzu war keine derartige Korrelation mit dem Serum-IgG in diesen Individuen zu beobachten.
Das Vorliegen von mütterlichem Serum-IgA gegen HIV hat sich von prognostischem Wert bei Bestimmung der maternofetalen Transmission erwiesen (Re et al., 1992). In dieser Studie hatten Mütter, die nichtinfizierte Kinder gebaren, IgA gegen HIV, besonders gegen das gp24-Protein gerichtet. Allerdings besaßen die Mütter von infizierten Kindern diese Reaktivität nicht. Es ist vermutet worden, dass eine gewisse maternofetale Übertragung des HIV-Virus während des Geburtsvorgangs erfolgt (Livingston et al., 1995). Deshalb lässt das Vorhandensein dieser Serumreaktivität vermuten, dass sekretorisches IgA (sIgA) mit dieser Spezifität einen Schutz während des Geburtsvorgangs durch Neutralisieren der im Geburtskanal vorhandenen HIV verleihen kann. Die Art der IgA-Antwort auf das Virus scheint spezifisch zu sein, da IgA1 bevorzugt exprimiert wird (Kozlowski et al., 1992) und vielleicht ist diese IgA-Subklasse wirksamer bei der Bekämpfung des Virus. Diese Studien demonstrieren das Potenzial der Antikörper bei der Bekämpfung der Krankheit und gibt zur Hoffnung Anlass, dass Impfung in nicht immunbeeinträchtigten Individuen eine schützende Antikörper-vermittelte Immunität hervorrufen kann. Unglücklicherweise ist keine Immuntherapie zur Behandlung des HIV auf der Schleimhautoberfläche verfügbar, bevor es in den Körper eindringt.
Michetti, P. et al., 1991 legt kovalent verbundene IgA-Dimere und sekretorische Ketten offen, die für ein einziges bakterielles Oberflächen-Epitop spezifisch sind. Rindisbacher et al., 1995 legt die Produktion rekombinanten MMTV spezifischen dimeren IgA offen. Lullau et al., 1996, legt die Produktion von rekombinanten sekretorischen IgA-Molekülen für passiven Schutz offen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung umgeht diese Nachteile des Standes der Technik, indem sie Zusammensetzungen bereitstellt, die eine schützende Immuntherapie auf den Schleimhautoberflächen des Körpers bereitstellen und die gleichzeitig einen passiven Immunschutz im Serum bereitstellen. Die dimeren IgA-Antikörper können mit rekombinanten Verfahren hergestellt sein, zum Beispiel in Insektenzellen, und zur Verabreichung an ein Tier oder einen Menschen formuliert sein. Als ein weiterer Aspekt der Erfindung ist hier der minimale IgA- Antikörper zum Binden an den pIgA-Rezeptor definiert und stellt ein Verfahren zu einer effizienteren Überbringung der Pathogen-neutralisierenden Immuntherapie oder des antipathogenen Arzneimittels bereit.
Die vorliegende Erfindung kann in weitestem Sinne als eine pharmakologische Zusammensetzung beschrieben sein, die einen rekombinanten dimeren IgA-Antikörper umfasst, wobei der Antikörper mit einem infektiösen Agens immunreaktiv ist. Das infektiöse Agens kann ein Virus, ein Bakterium oder ein eukaryotisches Pathogen sein wie beispielsweise ein Protozoon oder ein Helminth. Die Antigenerkennungsfunktion der hier offengelegten Zusammensetzungen sind derart, dass sie ein Antigen eines infektiösen Agens oder ein Toxin, das von einem fremden Agens produziert ist, wie beispielsweise ein bakterielles Toxin erkennen. Die Antigene sind typischerweise Oberflächenantigene, die verfügbar sind, wenn das Pathogen intakt oder in seiner infektiösen Form ist. Derartige Antigene können ebenfalls eukaryotische Adhäsine umfassen, deren Bindung eine Adhäsion auf Schleimhautoberflächen verhindern würde.
Pathogene, gegen die die Antikörper der Zusammensetzungen hier offengelegt sind, können virale Pathogene sein und können umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Influenza A, B oder C, Parainfluenza, Paramyxovirus, Newcastle-Disease-Virus, Respiratory Syncytial Virus, Masern, Mumps, Adenovirus, adeno-assoziiertes Virus, Parvovirus, Epstein-Barr-Virus, Rhinovirus, Coxsackievirus, Echovirus, Reovirus, Rhabdovirus, lymphozytisches Choriomeningitisvirus, Coronavirus, Poliovirus, Herpes simplex, das humane Immundefizienzvirus, Cytomegalovirus, Papillomavirus, das Virus B, Varicella zoster, das Pockenvirus, Röteln, Tollwut, Picornavirus oder Rotavirus. Bestimmte bevorzugte Zusammensetzungen sind mit einem humanem Immundefizienzvirus immunreaktiv und können mit gp120 von HIV immunreaktiv sein.
Zusätzlich zu den antiviralen Zusammensetzungen können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung antibakteriell sein oder gegen ein bakterielles pathogenes Agens oder Toxin gerichtet sein. Repräsentative Bakterien könnten umfassen, sind aber nicht auf Spezies von Pneumococci beschränkt, Spezies von Streptococci, einschließlich aber nicht beschränkt auf Streptococcus pyogenes. Streptococcus agalactiae, Streptococcus equi, Streptococcus canis, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Streptococcus anginosus, Streptococcus sanguis, Streptococcus salivarius, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, ebenfalls viridans streptococci, Peptostreptococci, verschiedene Spezies von Enterococci, wie Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Spezies von Staphylococci wie Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, ebenfalls Hemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas pseudomallei, Pseudomonas mallei und andere pathogene Pseudomonaden, Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella abortus und verwandte Spezies, Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Corynebakterien wie Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium hemolyticum, Corynebacterium equi, Listeria monocytogenes, Nocordia asteroides, verschiedene Spezies von Actinomycetes, Treponema pallidum, verschiedene Leptospirosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Spezies von Proteus, Serratia marscesens und verwandte Spezies, Spezies von Acinetobacter, Yersinia pestis, Francisella tularensis, Spezies von Enterobacter, Spezies von Bacteriodes und von Legionella.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls gegen einen eukaryotischen Organismus wie ein Protozoon oder ein Helminth gerichtet sein. Beispielgebende Eukaryoten umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, verschiedene Spezies von Cryptosporidium, Isospora belli, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis, verschiedene Spezies von Cyclospora, Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci oder Chlamydia pneumoniae zum Beispiel.
Ein Verfahren zur Hemmung einer Infektion in einer Person mit einem infektiösen Agens, umfassend Verabreichen an besagte Person eines dimeren IgA-Antikörpers, der mit besagtem Agens immunreaktiv ist, in einer zur Hemmung besagter Infektion wirksamen Menge, ist ebenfalls offengelegt. Die hier beschriebenen Verfahren finden Anwendungen in der Humanmedizin ebenso wie auch in der Veterinärmedizin. In der praktischen Umsetzung der Erfindung ist es bevorzugt, dass die Cα3-Domänen der Antikörper-Zusammensetzungen von der Wirtsspezies abstammen. Diese Verfahren können außerdem definiert sein, als umfassend Schritte zur Gewinnung von genetischen Sequenzen, die Ig schwere Kette und leichte Kette Erkennungssequenzen codieren, die mit einem infektiösen Agens immunreaktiv sind und an die Cα3-Domänen, einschließlich des Schwanzstückes, fusioniert sind, Gewinnen einer genetischen Sequenz, die eine Ig J-Kette codiert, Co-Expression der genetischen Sequenzen in einer Zelle, vorzugsweise in einer Insektenzelle, um einen dimeren IgA- Antikörper zu erhalten, der mit dem Agens immunreaktiv ist; und Verabreichen des IgA-Moleküls an die Person. Das zu hemmende infektiöse Agens kann ein Bakterium, ein Virus oder ein eukaryotisches Agens sein, einschließlich eines Protozoons oder Helminth. Repräsentative Spezies sind in den vorhergehenden Absätzen definiert.
Im weitesten Sinne der Erfindung besteht ein IgA-Antikörper im Wesentlichen aus einer VH-Domäne, fusioniert an eine erste IgA1 Cα3-Domäne, einschließlich eines Schwanzstückes, einer VL-Domäne, fusioniert an eine zweite IgA1Cα3-Domäne einschließlich eines Schwanzstückes, und einer J-Kette, wobei die VL- und VH-Domänen eine Antigen- oder Haptenerkennungsstelle konstituieren. Diese Antikörper sind hier ebenfalls als „mini IgA" Antikörper bezeichnet. Im Wesentlichen bestehen aus bedeutet, dass die Antikörper nur die Antikörper-Domänen umfassen, die sich als essenziell für die Dimerisierung und für das Binden der Dimere an den pIgA-Rezeptor gezeigt haben. Die Erfindung kann außerdem definiert sein als die Dimere der beschriebenen minimalen IgA-Antikörper, die durch Disulfid-Bindungen zwischen den Monomeren und den J-Ketten und über die Schwanzstücke gebildet sind, wie es in 3B gezeigt ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind die mini IgA-Antikörper, wie im vorhergehenden Absatz beschrieben, und bevorzugt die dimeren Antikörper in einer pharmazeutisch verträglichen Lösung dispergiert. Bevorzugte Antikörper können die Cα3-Domänen der Wirtsspezies besitzen und besonders bevorzugt für die Verabreichung an Menschen sind Antikörper mit den humanen Cα3-Domänen. Ebenfalls bevorzugt sind Antigenerkennungsstellen, wo das Antigen ein virales, bakterielles oder protozoisches Antigen ist. Beispielhafte Spezies sind oben definiert.
In weitestem Sinne umfasst die Erfindung deshalb die rekombinante Herstellung von dimeren oder polymeren IgA-Antikörpern, die in die Schleimhautoberflächen einer Person sezerniert werden, wenn sie in das Serum der Person verabreicht sind. Die Antikörper können mit in der Technik bekannten Mitteln hergestellt oder identifiziert sein. Insbesondere kann ein intakter pathogener Organismus oder eine gereinigte antigene Verbindung, die aus einem beliebigen pathogenen Organismus isoliert ist oder abstammt, verwendet sein, um einen Antikörper oder einen wie hier beschriebenen „mini" Antikörper herzustellen oder zu identifizieren. Der Antikörper wird dann in seiner dimeren Form hergestellt, in einer pharmazeutischen Zusammensetzung dispergiert und dann an die Person verabreicht, um einen Schutz an der Schleimhaut-Barriere gegen das Antigen präsentierende Pathogen zu bieten. Im Lichte der vorliegenden Offenlegung könnte der Fachmann, ohne Versuche anzustellen, die Erfindung bei Behandlung oder Hemmung einer Ínfektion von einem beliebigen hier genannten oder anderen Pathogen anwenden, gegen die die offengelegten und hier beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren wirksam wären.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die folgenden Zeichnungen sind Teil der vorliegenden Patentbeschreibung und sind zur weiteren Demonstration bestimmter Aspekte der vorliegenden Erfindung enthalten. Die Erfindung kann mit Bezug auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen zusammen mit der detaillierten Beschreibung der hier angeführten spezifischen Anwendungsformen besser verstanden werden.
1. Eine α-Kohlenstoffband-Darstellung einer dreidimensionalen Struktur der Fc-Region von humanem IgG1 (von Deisenhofer, 1981). Auf der linken Seite zeigt die schwere Kette die mutmaßlichen Positionen derjenigen IgA-Aminosäuren, die für eine Mutationsanalyse anvisiert worden sind. Mutationen, einschließlich ESK346, R280H, KLE, SSGKS295 und VEGHT besaßen keine Wirkung, E330R, N271Q, L266R und L465R hoben die Bindung an den Fcα-Rezeptor vollständig auf (Carayannopoulos, et al., 1996). Die Kreise zwischen den gepaarten CH2-Domänen kennzeichnen N-verknüpfte Glycosylierungsstellen. Nummerierung erfolgt nach Kabat und Mitarbeiter (Kabat, et al., 1991).
2. MDCK-Zellsystem zur Transcytose von dimerem IgA (dIgA) (Mostov und Deitscher, 1986). Die Poly-Ig-Rezeptor exprimierenden MDCK-Zellen bilden eine polarisierte Monolayer mit tight junctions, wenn sie auf einer semipermeablen Polycarbonat-Membran in einem Zellkulturbehälter angezogen sind. Wenn dIgA in die untere (basolaterale) Kammer gegeben wird, wird es von dem pIgR gebunden und gelangt mittels Transcytose zu der oberen (apikalen) Oberfläche. Pfeile geben die Bewegung des aktiven Transports von dIgA an.
3A und 3B. Konstruktion von Arsonat-spezifischen "mini-IgA" monomeren (3A) und dimeren (3B) Molekülen. Jedes „mini-IgA" Monomer enthält zwei Polypeptid-Ketten, eine Arsonat-spezifische VH-Domäne, fusioniert an die IgA1 Cα3- Domäne, und ähnlicherweise eine Arsonat-spezifische VL-Domäne, fusioniert an eine humane IgA1 Cα3-Domäne. Dimerisierung wird erreicht, wenn in dem nativen Molekül mit den Schwanzstücken sich Disulfid-Bindungen untereinander mit der J-Kette bilden (Bastian et al., 1992).
4. Bindung von „mini-IgA" Molekülen an Arsonat-Hapten in ELISA nach Expression in Baculovirus. Die VH-Cα3 und VL-Cα3 Fusionsproteine waren einzeln, gemeinsam oder in Kombination mit J-Kette exprimiert. Nur mit Co-Expression von J-Kette war ein signifikantes Binden beobachtet.
5. Analyse von Makaken-Vaginalsekreten auf anti-Arsonat Antikörperaktivität nach intravenöser Verabreichung von anti-Arsonat IgA1-Dimeren.
6. Analyse von Makaken-Vaginalsekreten auf anti-Arsonat Antikörperaktivität nach intravenöser Verabreichung von humanem anti-Arsonat IgA1-Dimeren. Analyse wurde nach Vorinkubation entweder mit Arsonat-BSA konjugiert (weiße Kreise) oder nur BSA (weiße Quadrate) durchgeführt.
BESCHREIBUNG DER ERLÄUTERNDEN ANWENDUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung und Verabreichung dimerer oder polymerer IgA-Antikörper bereit, die für eine Prävention oder Hemmung einer Infektion mit Pathogenen und insbesondere mit einem beliebigen Pathogen, das in den Körper über eine Schleimhaut-Barriere eindringt oder diesen verlässt, zweckdienlich sind. Die Zusammensetzungen der Erfindung werden an einen Probanden, wie Tier oder Menschen, verabreicht und werden anschließend, nach einer Latenzzeit von bis zu 24 Stunden, durch eine Schleimhaut-Barriere transportiert. Nach aktiver oder passiver Beförderung in die Schleimhaut sind die Antikörper der Erfindung zur Hemmung einer Infektion an diesem Ort verfügbar. Weil dies ein Verfahren der passiven Immunität ist, ist es aufgrund der Halbwertzeit der Antikörper im Serum zu verstehen, dass der Schutz über einen Zeitraum von mehreren Wochen bestehen kann und dass die Zusammensetzungen dann wiederholt verabreicht sein können, falls der Bedarf weiterhin besteht. Die Erfindung stellt deshalb ein Verfahren zur Hemmung einer Infektion vor dem Eindringen in den Körper bereit, was eine erste Verteidigungslinie vor Exposition dem bestimmten Pathogen bietet. Pathogene, die an einer Infektion einer Person gehemmt werden können, umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Viren, Bakterien und makroskopische Parasiten wie Protozoen.
Die Schleimhautoberflächen des Körpers bieten einen bedeutenden Vorteil gegenüber Serum als Ort einer Immunprävention oder Hemmung einer Krankheit, weil eher als eine Antwort auf eine bereits erfolgte Infektion eine immunologische Antwort auf der Schleimhautoberfläche das infektiöse Agens daran hindert, in den Körper einzudringen. Ein derartiges präventives Verfahren, wie es mit der vorliegenden Offenlegung bereitgestellt ist, besäße einen drastischen Vorteil, nicht nur bei der Prävention sexuell übertragener Infektionen und mütterlicher Übertragungen solcher Krankheiten während der Geburt, sondern ebenfalls bei Prävention anderer Infektionen, die über Schleimhautoberflächen wie Urogenitaltrakt, Mund, Nasenpassage, Lungen, Augen, etc. in den Körper eindringen.
Die vorliegende Erfindung würde deshalb Anwendung bei der Prävention von Viruserkrankungen finden, die in den Körper über Schleimhautoberflächen eindringen oder verlassen können, wie die folgenden pathogenen Viren, die als Beispiele erwähnt sind, wie Influenza A, B und C, Parainfluenza, Paramyxoviren, Newcastle-Disease-Virus, Respiratory Syncytial Virus, Masern, Mumps, Adenoviren, adeno-assoziierte Viren, Parvoviren, Epstein-Barr-Virus, Rhinoviren, Coxsackieviren, Echoviren, Reoviren, Rhabdoviren, lymphozytisches Choriomeningitisvirus, Coronavirus, Polioviren, Herpes simplex, humane Immundefizienzviren, Cytomegaloviren, Papillomaviren, Virus B, Varicella zoster, Pockenviren, Röteln, Tollwut, Picornaviren, Rotavirus und Kaposi-assoziiertes Herpes Virus.
Zusätzlich zu den oben erwähnten Viruserkrankungen ist die vorliegende Erfindung ebenfalls bei Prävention oder Hemmung bakterieller Infektionen zweckdienlich, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, der 83 oder mehr unterschiedlichen Serotypen von Pneumococci, Streprococci wie S. pyogenes S. agalactiae, S. equi, S. canis, S. bovis, S. equinus, S. anginosus, S. sanguis, S. salivarius, S. mitis, S. mutans, weitere Streptococci viridans, Peptostreptococci, weitere verwandte Spezies von Streptococci, Enterococci wie Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Staphylococci wie Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, besonders in der Nasopharynx, Hemophilus influenzae, Pseudomonas-Spezies wie Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas pseudomallei, Pseudomonas mallei und Brucellen wie Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella abortus, Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium hemolyticum, Corynebacterium equi etc., Listeria monocytogenes, Nocordia asteroides, Bacteroides Spezies von Actinomycetes Spezies, Treponema pallidum. Leptospirosa Spezies und verwandte Organismen. Die Erfindung ist ebenfalls gegen Gramnegative Bakterien zweckdienlich wie Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus, Serratia Spezies, Acinetobacter, Yersinia pestis, Francisella tulrensis, Enterobacter Spezies, Bacteriodes und Legionella Spezies und ähnliche. Zusätzlich kann sich die Erfindung bei der Kontrolle protozoischer oder makroskopischer Infektionen mit Organismen wie Cryptosporidium, Isospora belli, Toxoplasma gondii, Trichomas vaginalis, Cyclospora Spezies zum Beispiel und für Chlamydia trachomatis und andere Chlamydia-Infektionen wie Chlamydia psittaci oder Chlamydia pneumoniae zum Beispiel als zweckdienlich erweisen. Es ist selbstverständlich zu verstehen, dass die Erfindung gegen jedes beliebige Pathogen angewandt sein kann, gegen das ein Antikörper gebildet werden kann. Im Lichte der vorliegenden Erfindung wäre ein Fachmann in der Lage, eine Zusammensetzung aus dimeren IgA-Antikörpern herzustellen, die mit irgendeinem derartigen Pathogen immunreaktiv wären, und wäre außerdem in der Lage, eine derartige Zusammensetzung an eine Person zu verabreichen.
Von besonderem Interesse wäre ein Mittel zur Prävention einer Infektion mit dem HIV-Virus durch einen von sekretorischem IgA an der Schleimhautoberfläche vermittelten Immunausschluss. Die vorliegende Erfindung demonstriert die Fähigkeit, dimeres IgA in die Vaginalflüssigkeit zu sezernieren und folglich zum Beispiel eine heterosexuelle Übertragung von HIV potenziell zu hemmen. Diese Anwendungsform bietet den Vorteil einer passiven Immuntherapie zur Verhinderung einer perinatalen Übertragung des Virus wie auch ein Verfahren zur Hemmung der sexuellen Übertragung dieser Krankheit in der Allgemeinbevölkerung.
Wie es hier offengelegt ist, führte die intravenöse Verabreichung von dimeren IgA-Antikörpern an Makaken zur Präsenz von sezernierten Antikörpern in der Vaginalflüssigkeit. Während das hier beschriebene Tiermodell ursprünglich entwickelt war, um die sexuelle Übertragung von HIV zu erforschen (Miller et al., 1989), ist dieses Modell ebenfalls auf die maternofetale Situation direkt anwendbar. In der Tat passt die maternofetale Situation bei Geburt zu diesem Versuchsansatz einzigartig, da ein Schutz nur für kurze Zeit (d. h. den Zeitraum der Entbindung) benötigt wird. Der beobachtete zeitliche Verlauf der IgA-Sekretion in die Vaginalflüssigkeit von Makaken würde gut zu einer Entbindungssituation passen, besonders wenn die Wehen durch genaue zeitliche Auslösung der Geburt gesteuert waren. In diesem Fall konnte die maternofetale Übertragung von HIV durch Verbreichung eines schützenden anti-HIV dimeren Antikörpers 24 h vor der Entbindung verhindert werden.
Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass die Präsenz von maternalem Serum IgA gegen HIV ein prognostischer Wert bei Bestimmung der maternofetalen Übertragung darstellt (Re et al., 1992). In dieser Studie hatten 72% der Mütter (n = 22), die nichtinfizierte Kinder gebaren, Serum IgA gegen HIV, besonders gegen das gp24-Protein gerichtet. Jedoch besaßen die Mütter von infizierten Kindern nicht diese Reaktivität. Das Vorhandensein dieser Serumreaktivität lässt vermuten, dass ein sekretorisches IgA (sIgA) mit dieser Spezifität einen Schutz während des Geburtsvorgangs durch Neutralisierung der im Geburtskanal vorhandenen HIV verleihen kann. Die Art der IgA-Antwort auf das Virus scheint spezifisch zu sein, weil IgA bevorzugt exprimiert ist (Kozlowski et al., 1992) und diese IgA-Unterklasse bei der Bekämpfung des Virus wirksamer sein kann. Diese Studien zeigen das Potenzial der Antikörper bei Bekämpfung der Krankheit und geben zur Hoffnung Anlass, dass Impfung in nicht immunbeeinträchtigten Individuen eine schützende Antikörper-vermittelte Immunität hervorrufen kann.
Es ist ebenfalls zu verstehen, dass jegliche Verringerung der Virus-Ladung ein vorteilhaftes Ergebnis wäre, da dieses die Wirksamkeit von antiviralen Arzneimitteln oder sogar anderer Antikörper wie IgG-Antikörper erhöhen würde, die in Verbindung mit dieser Therapie eingesetzt sein könnten. Obwohl signifikante Fortschritte bei der Verringerung der perinatalen HIV-Übertragungsrate mittels Behandlung mit antiviralen Arzneimitteln vor kurzem gemacht worden sind, besteht die Möglichkeit, diese Übertragungsraten durch Verwendung der hier offengelegten Zusammensetzungen und Verfahren noch weiter zu verringern.
PASSIVE IMMUNTHERAPIE
In der Zeit vor den Antibiotika wurde eine passive Immunisierung gegen einige bakterielle Infektionen, einschließlich Pneumokokkenpneumonie und H. influenza Pneumonie, verabreicht. Bei Pneumokokkenerkrankungen war es wichtig, den infizierenden Serotyp zu identifizieren und das geeignete Typ-spezifische Antiserum zu gewinnen. Eindeutig war diese Therapie wirksam. Die Probleme, die durch die Verwendung von Pferdeserum entstanden, und die Schwierigkeit bei der genauen Bestimmung des Serotyps führten dazu, dass dieses Verfahren aufgegeben wurde, sobald die Antibiotika-Therapie in der klinischen Medizin eingeführt war.
In den letzten Jahren ist die passive Immunisierung bei einigen viralen Erkrankungen wie Hepatitis A, Hepatitis B, Polio etc angewandt worden und die Verwendung intravenösen Gammaglobins hat zugenommen wie seine Anwendungen mehr wurden. Es hat einige klinische Versuche mit humanen monoklonalen Antikörpern bei verschiedenen Infektionskrankheiten gegeben, die nicht nur die Wirksamkeit sondern auch die Sicherheit belegen. Es wird deshalb überlegt, dass große Mengen humaner monoklonaler Antikörper mit hoher Affinität für entscheidende Epitope eines infektiösen Pathogens wie das humane Immundefizienzvirus zum Beispiel entweder bei Prävention von Infektionen oder in der eigentlichen Therapie wirksam sein können. Obwohl die heute vorherrschende Meinung in der Virologie und Immunologie das Paradigma stützt, dass Immunität gegen den humanen Immundefizienzvirus überwiegend zellulärer Natur ist, gibt es signifikante Ergebnisse aus Impfstudien bei Tieren (Kamani et al., 1989, Sawyer et al., 1990, Moore et al., 1991), die für eine zentrale Rolle für das humorale Immunsystem sprechen. Bei chronischen Virusinfektionen können Antikörper zu bestimmten Stadien entscheidend sein und als solche können Antikörper eine wichtige Rolle bei der anfänglichen Kontrolle von HIV-1 Infektionen spielen. Am wichtigsten ist, dass durch die Anwendung der vorliegenden Erfindung das Virus vollständig vom Körper ferngehalten werden kann oder wenigstens der Infektionslevel signifikant vermindert sein kann.
MUKÖSE IMMUNITÄT
Immunglobuline vermitteln humorale Immunität mittels Anheften an fremde Antigene und Aktivierung Effektor-Modalitäten (z. B. Komplement, Granulocyten, cytotoxische T-Zellen etc.), um die Antigene zu zerstören und zu entfernen, und ebenfalls durch passive Inaktivierung, Ausschluss oder Immobilisierung von Pathogenen. Der Antikörper ist folglich ein flexibler Adaptor, der die variable, Antigen-bindende Domäne mit der konstanten Region, die die Fc-Region (Fragment kristallisierbar) enthält, verbindet. Jeder der fünf Ig-Isotypen besitzt sein eigenes Spektrum von Effektor-Systemen mit denen er über seine Fc-Domäne interagiert. Der Isotyp der konstanten Region des Antikörpers wird nach einem T-Zellvermittelten Ig-Klassenwechsel bestimmt, der einen gegebenen Antikörper mit den spezi fischen Effektor-Modalitäten des neuen Isotyps ausstattet. Aufgrund der immunologischen und klinischen Bedeutung von Immunglobulin-Effektor-Wechselwirkungen ist die Antikörper-Struktur/Funktion Gegenstand intensiver Forschungen (Überblick in Burton und Woof, 1992).
Die Schleimhautoberflächen des Körpers stellen die größte Expositionsfläche des Körpers für externe Pathogene dar und sind als solche die primäre Eintrittstelle von pathogenen Organismen (Childers et al., 1989). Die polymeren Antikörper (IgA und IgM) sind an der Schleimhautoberfläche des Körpers sezerniert, wo sie die erste Verteidigungslinie der humoralen Abwehr gegen externe Pathogene bilden. IgA ist die Immunglobulin-Unterklasse, die primär für den humoralen Immunschutz an dieser großen exponierten Oberfläche verantwortlich ist (Underdown und Schiff, 1986). Sekretion von IgA und IgM erfolgt durch einen einzigartigen Vorgang, der als Transcytose bezeichnet ist und von dem auf der basolateralen Seite der Mukosaepithelzellen exprimierten polymeren Immunglobulinrezeptor (pIgR) vermittelt ist. Da viele Pathogene, einschließlich HIV, in den Körper über die exponierte Schleimhautoberfläche eindringen, hat der an diesen Ort übertragene spezifische Antikörper das Potenzial, ein Eindringen des Pathogens in den Körper zu verhindern.
IgA verbindet sich mit der J-Kette über ein Cystein in dem C-terminalen „Schwanz", um sezernierte Dimere zu bilden (Koshland et al., 1982), die dann spezifisch von dem polymeren Ig-Rezeptor (pIgR) erkannt und durch das Mukosaepithel transportiert werden (Mostov und Blobel, 1982; Underdown, 1990). Das so transportierte IgA dient als die erste humorale Verteidigungslinie auf den Schleimhautoberflächen (Überblick von Underdown und Schiff, 1986). IgA ist ebenfalls das Ziel von spezifischen Rezeptoren und Proteasen, die von vielen pathogenen Bakterien beim Versuch, die IgA-vermittelte Immunität zu umgehen, gebildet werden (Kilian et al., 1988). Zusätzlich zu Mukosa-IgA enthält Blut ebenfalls eine große Menge (durchschnittlich 2 mg/ml, Mestecky und McGhee, 1987) von überwiegend monomerem IgA; dieser zirkulierende Pool ist im Menschen vom Mukosa-Pool weitgehend unabhängig (Jonard et al., 1984).
IgA bindet bekanntermaßen an einen vor kurzem klonierten (Shen et al., 1989; Monteiro et al., 1990; Maliszewski et al., 1990) Fcα-Rezeptor (mFcαR) auf der Oberfläche von Eosinophilen (Monteiro et al., 1993), Neutrophilen (Weisbart et al., 1988) und Monocyten/Makrophagen (Monteiro et al., 1990), was folglich Effektor-Antworten auslöst. B-Lymphocyten und T-Lymphocyten besitzen Oberflächenrezeptoren für Fcα, über die immunregulatorische Signale vermutlich übermittelt werden (Kurita et al., 1986). Ein für sIgA spezifischer Rezeptor, der sich von FcαR unterscheidet, ist auf Eosinophilen identifiziert worden, der eine Rolle bei der Aktivierung und Degranulation von Eosinophilen während der Entzündungsreaktion spielen kann (Lamkhioued et al., 1995). Es wird ebenfalls vermutet, dass IgA über alternative Wege Komplement aktivieren kann (Lucisano-Valim und Lachmann, 1991).
Aufgrund dieser funktionalen Eigenschaften spielt IgA nicht nur eine Rolle bei der Wirtsabwehr gegen extrazelluläre Viren und Bakterien sondern ist ebenfalls potenziell entscheidend für die Neutralisation von intrazellulären Viren in pIgR exprimierenden Geweben (Mazanec et al., 1992) und Zerstörung von Helminthen, Protozoen und anderen eukaryotischen Parasiten (Grzych et al., 1993). Mehrere immunologische Krankheitsprozesse sind ebenfalls von IgA vermittelt, einschließlich IgA-Glomerulonephritis (Clarkson et al., 1984) und möglicherweise die Exazerbation von allergischem Asthma (Popper et al., 1982; Kitani et al., 1985). Jede dieser oben erwähnten Eigenschaften von IgA hängt von der Fähigkeit der Effektor-Moleküle wie pIgR, C3 und dem FcαR ab, spezifische Stellen auf der Oberfläche des Fcα-Proteins zu erkennen.
Einige Strukturen auf dem pIgR, die die Wechselwirkung mit IgA vermitteln, sind identifiziert worden, soweit sie den Assoziationsmechanismus betreffen. Der pIgR ist ein transmembranständiges Glycoprotein mit fünf homologen Domänen (I–V) der Immunglobulin-Superfamilie in der extrazellulären Region (Mostov et al., 1984, Eiffert et al., 1984). Die primäre Stelle der Wechselwirkung mit dIgA ist das nichtkovalente Binden der pIgR-Domäne I (Frutiger et al., 1986), die eine hochaffine (10⁸ M^–1) nichtkovalente Bindungsstelle für sIgA ist (Kuhn und Kraehenbuhl, 1979). Weitere Kartierung der dimeres IgA bindenden Stelle innerhalb der Domäne I des pIgR führte zur Identifizierung eines Peptids, umfassend Reste 15–37 vom humanen pIgR, das dIgA bindet (Bakos et al., 1991a). Dieses Peptid zeigte eine hohe Konservierung zwischen den Spezies und wurde ebenfalls von einem monoklonalen Antikörper identifiziert, der in der Lage war, Binden von dIgA an pIgR zu hemmen (Bakos et al., 1991a und b). In diesen Untersuchungen war die Affinität der Wechselwirkung des Peptids mit IgA etwa 100fach geringer als mit dem intakten Molekül. Ähnlicherweise war die Spezifität der Wechselwirkung verringert, so dass ein Binden von monomerem IgG an das Peptid nun detektierbar war, obwohl mit geringerer Affinität als dIgA und pIgM-Bindung. Eine deglycosylierte Form des pIgR-Moleküls war ebenfalls noch in der Lage, dIgA zu binden. Diese Beobachtungen zeigen, dass während dieses Peptid einen zentralen Teil der Bindungsstelle darstellt, es andere Regionen von Domäne I gibt, die wichtige Beiträge zum Binden von dIgA leisten.
Die Assoziation von IgA mit dem pIgR scheint ein zweistufiger Prozess zu sein (Mestecky und McGhee, 1987), wobei die erste Stufe das Binden von IgA an Domäne I ist, wie oben diskutiert. Die zweite Stufe der Wechselwirkung zwischen pIgR und dIgA involviert ein kovalentes Binden von Domäne V an das Fc einer der Untereinheiten in dIgA (Lindh und Bjork, 1974, Cunningham-Rundles und Lamm, 1975). Dieses einzige Disulfid wird zwischen cys467 in Domäne V der sekretorischen Komponente und cys311 gebildet, das sich in der Cα2-Domäne einer schweren Kette in einer IgA-Untereinheit befindet (Fallgreen-Gebauer et al., 1993). Diese Disulfid-Bildung scheint ein spätes Ereignis im Sekretionsweg zu sein und ist nicht unbedingt für eine Transcytose erforderlich (Chintalacharuvu et al., 1994).
Entscheidend für den Fortschritt auf dem Gebiet von Fc-Struktur/Funktion sind die verschiedenen in vitro Expressionssysteme gewesen, die die Produktion von Immunglobulinen erlauben, die experimentelle Sequenzänderungen eingebaut haben. Diese Systeme haben die Aufklärung von Komplement- und/oder Fc-Rezeptor-Bindungsstellen auf IgM, IgG und IgE erleichtert (Burton und Woof 1992). Das Baculovirus-System (wie von Summers und Smith, 1987, beschrieben) erlaubt die Herstellung mutierter Antikörper (wie von Hasemann und Capra, 1990; 1991, beschrieben) wie auch die kombinatorische Expression von Immunglobulin mit anderen Polypeptiden (z. B. J-Kette, Chaperonine, etc.) sehr viel schneller als mit stabil transfizierten Säuger-Zelllinien. Ein Baculovirus-System ist zur Herstellung von immunologisch und funktional authentischen humanen IgA-Spezifität für das Arsonat-Hapten entwickelt worden (Carayannopoulos et al., 1994). Das erzeugte chimäre IgA wurde in schwere Kette : leichte Kette Heterodimere korrekt zusammengesetzt, N-glycosyliert und von Insektenzellen sezerniert; darüber hinaus, wenn mit einer humanen J-Kette coexprimiert, waren die Antikörper in der Lage, sich zu Dimeren zusammenzusetzen. Das rekombinante Protein war authentisch, wie mittels Antigen-Bindung, Erkennung durch monoklonale Antikörper und Komplement-Fixierung über den alternativen Weg beurteilt wurde. Das Molekül bindet ebenfalls an den Fcα-Rezeptor und pIgR und eine Expression von verschiedenen mutierten IgA-Molekülen in diesem System hat vor kurzem die Kartierung der Bindungsstellen dieser beiden Moleküle auf IgA ermöglicht (Carayannopoulos et al., 1996; Hexham et al., 1996). Folglich sind die wichtigen Effektor-Funktionen des Moleküls, nämlich Fcα-Bindung, was zu einer Entfernung von IgA-Immunkomplexen und pIgR-Rezeptor-Bindung führte, was zu Transport durch die Schleimhaut führt, bei diesen rekombinanten Antikörpern konserviert.
ANTI-VIRALE IMMUNITÄT
Die Hauptfunktion von IgA ist die Vermittling der humoralen Immunität (Underdown und Schiff, 1986). Allerdings spielt Serum IgA ebenfalls eine Rolle in der systemischen Immunität. Wie oben dargelegt, haben mehrere Studien die Beziehung zwischen starken mukösen IgA-Antworten und Schutz gegen virale Infektion mit Rotavirus (Feng et al., 1994), Influenzavirus (Liew et al., 1994), Poliovirus (Orga und Karzon, 1970), Respiratory Syncytial Virus (Kaul et al., 1981), Cytomegalovirus (Tamura et al., 1980) und Epstein-Barr-Virus (Yao et al., 1991) demonstriert. Murine Rotavirus-Infektion wird folglich von antiviralen IgA-Antikörpern verhindert, die in den Schleimhäuten nach einer primären Inokulation vorhanden sind (Underdown und Schiff, 1986). Zusätzlich war die passive Immuntherapie mit intranasalen IgG-Fabs gegen eine Challenge mit Respiratory Syncytial Virus schützend (Crowe et al., 1994), was eine Funktion für auf der Schleimhautoberfläche vorhandene antivirale Antikörper bei Prävention von viraler Infektion unterstützt. Im Gegensatz hierzu scheint es, wenn überhaupt, nur eine geringe Korrelation zwischen den antiviralen IgG-Levels im Serum und viralen Schutz zu geben. Ähnlicherweise wurde festgestellt, dass der Schutz von Mäusen gegen Influenzavirus-Infektion mit dem Vorhandensein von sIgA in den Lungenschleimhäuten korrelierte und nicht mit der Serum-Antikörper- oder cytotoxischen T-Zellaktivität (Liew et al., 1994). Eindeutig ist IgA bei Verhinderung des Eindringens dieser Viren in den Körper erfolgreich, indem die Infektion an der Eintrittstelle, nämlich an der Schleimhautoberfläche, blockiert wird. Serum IgA-Dimere besitzen ebenfalls das Potenzial, immunkomplexiertes Antigen von dem submukösen Bereich zu eliminieren und können folglich eine zweite antivirale Verteidigungslinie bereitstellen, selbst wenn die Schleimhautoberfläche durchdrungen worden ist (Kaetzel et al., 1991 und 1994).
ANTIKÖRPER
Mittel zur Herstellung und Charakterisierung sind in der Technik gut bekannt (siehe z. B. Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
Die Verfahren zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern (mAk) erfolgen nach den gleichen Prinzipien wie auch die Herstellung von polyklonalen Antikörpern. Kurz: ein polyklonaler Antikörper wird hergestellt durch Immunisieren eines Tieres mit einer immunogenen Zusammensetzung, die ein Pathogen oder ein Antigen enthält, das vom gewählten Pathogen abstammt (entweder mit oder ohne vorherige Immuntolerisierung, abhängig von der eingesetzten Antigen-Zusammensetzung und Protokoll), und Sammeln der Antisera von diesem immunisierten Tier. Ein großes Spektrum von Tierspezies können zur Produktion von Antisera eingesetzt sein. Das für die Produktion von Antisera typischerweise eingesetzten Tiere sind Kaninchen, Maus, Ratte, Hamster, Meerschweinchen oder Ziege. Aufgrund des relativ großen Blutvolumens von Kaninchen sind diese Tiere bevorzugt für die Produktion von polyklonalen Antikörpern gewählt.
Es ist in der Technik gut bekannt, dass eine gegebene Zusammensetzung in ihrer Immunogenität variieren kann. Es ist deshalb häufig erforderlich, das Immunsysten des Wirts zu boosten, wie es durch Koppeln des immunogenen Peptids oder Polypeptids an einen Träger erreicht werden kann. Beispielhafte und bevorzugte Träger sind Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) und bovines Serumalbumin (BSA). Andere Albumine wie Ovalbumin, Maus Serumalbumin oder Kaninchen Serumalbumin können ebenfalls als Träger verwendet sein. Mittel zur Konjugation eines Polypeptids an ein Trägerprotein sind in der Technik gut bekannt und umfassen Glutaraldehyd, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, Carbodiimid und bis-diazotiertes Benzidin.
Es ist ebenfalls in der Technik gut bekannt, dass die Immunogenität einer bestimmten Immunogen-Zusammensetzung durch die Verwendung von nichtspezifischen Stimulatoren der Immunantwort, auch als Adjuvanzien bekannt, verstärkt werden kann. Beispielhafte und bevorzugte Adjuvanzien umfassen komplettes Freund Adjuvans (ein nichtspezifischer Stimulator der Immunantwort, der abgetötetes Mycobacterium tuberculosis enthält), inkomplettes Freund Adjuvans und Aluminiumhydroxid als Adjuvans.
Die Menge an Immunogen-Zusammensetzung, die zur Produktion von polyklonalen Antikörpern verwendet wird, hängt von der Natur des Immunogens wie auch von dem zur Immunisierung eingesetzten Tier ab. Verschiedene Wege können zur Verabreichung des Immunogens genutzt sein (subkutan, intramuskulär, intradermal, intravenös und intraperitoneal). Die Produktion von polyklonalen Antikörpern kann durch Bluttests des immunisierten Tieres zu verschiedenen Zeitpunkten nach Immunisierung kontrolliert sein. Eine zweite Booster-Injektion kann ebenfalls gegeben werden. Das Booster- und Titrierverfahren wird solange wiederholt, bis ein geeigneter Titer erreicht ist. Wenn ein gewünschtes Immunogentitätsniveau erreicht ist, kann dem immunisierten Tier Blut entnommen und das Serum isoliert und aufbewahrt werden und/oder das Tier kann zur Bildung von mAk eingesetzt werden.
mAk können ohne weiteres durch die Anwendung bekannter Techniken produziert sein, wie beispielhaft beschrieben in U.S. Patent 4.196.265, das hier durch Quellenangabe eingefügt ist. Typischerweise umfasst diese Technik die Immunisierung eines geeigneten Tieres mit einer ausgewählten Immunogen-Zusammensetzung, z. B. ein gereingtes oder teilgereinigtes Protein, Polypeptid oder Peptid. Die immunisierende Zusammensetzung ist in einer Weise verabreicht, die zur Stimulierung von Antikörper produzierenden Zellen wirksam ist. Nagetiere wie Mäuse und Ratten sind bevorzugte Tiere, allerdings ist die Verwendung von Kaninchen und Schaf ebenfalls möglich. Die Verwendung von Ratten kann bestimmte Vorteile aufweisen (Goding, 1986, Seiten 60–61), aber Mäuse sind bevorzugt, wobei die BALB/c Mäuse am bevorzugtesten verwendet sind, da dies am üblichsten ist und im Allgemeinen einen höheren Prozentsatz stabiler Fusionen liefert.
Verfahren zur Erzeugung von Hybriden von Antikörper-produzierenden Milz- oder Lymphknotenzellen und Myelomzellen umfassen gewöhnlich Mischen somatischer Zellen mit Myelomzellen in einem 2 : 1 Verhältnis, obwohl das Verhältnis von etwa 20 : 1 bis etwa 1 : 1 schwanken kann, jeweils in Anwesenheit von Agens oder Agenzien (chemische oder elektrische), die die Fusion von Zellmembranen fördern. Fusionsverfahren unter Verwendung von Sendai Virus sind von Köhler und Milstein (1975; 1976) und auch Verfahren, die Polyethylenglycol (PEG) wie 37% (v/v) PEG verwenden, von Gefter et al. (1977) beschrieben worden. Die Anwendung elektrisch induzierter Fusionsverfahren ist ebenfalls geeignet (Goding, Seiten 71–74, 1986).
Mit Fusionsprozeduren werden normalerweise lebende Hybride mit einer geringer Häufigkeit gebildet, etwa 1 × 10^–6 bis 1 × 10^–8. Allerdings stellt dies kein Problem dar, da die lebenden fusionierten Hybride von den elterlichen, nichtfusionierten Zellen (besonders die nichtfusionierten Myelomzellen, die sich normalerweise unaufhörlich unbegrenzt teilen würden) durch Kultivieren in einem Selektivmedium sich unterscheiden. Das Selektivmedium enthält im Allgemeinen ein Agens, das die de novo Synthese von Nucleotiden in dem Gewebekulturmedium blockiert. Beispielhafte und bevorzugte Agenzien sind Aminopterin. Methotrexat und Azaserin. Aminopterin und Methotrexat blockieren die de novo Synthese sowohl von Purinen als auch Pyrimidinen, wohingegen Azaserin nur die Purinsynthese blockiert. Wo Aminopterin oder Methotrexat verwendet ist, ist das Medium mit Hypoxanthin und Thymidin als eine Nucleotid-Quelle supplementiert (HAT-Medium). Wo Azaserin verwendet ist, ist das Medium mit Hypoxanthin supplementiert.
Ein bevorzugtes Selektionsmedium ist HAT. Nur Zellen, die in der Lage sind, Nucleotid-Wiederverwertungsstoffwechselwege zu betreiben, können im HAT-Medium überleben. Die Myelomzellen besitzen defekte Schlüsselenzyme z. B. Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT) und können nicht überleben. Bei den B-Zellen funktioniert dieser Syntheseweg, aber sie haben eine begrenzte Lebensspanne in Kultur und sterben normalerweise innerhalb von zwei Wochen ab. Deshalb können nur Zellen in Selektivmedium überleben, die Hybride aus Myelomzelle und B-Zelle sind.
Die Kultivierung liefert eine Population von Hybridomen, von denen spezifische Hybridome selektiert werden. Typischerweise wird die Selektion von Hybridomen mittels Kultivieren der Zellen in einer Einzel-Klon-Verdünnung in Mikrotiterplatten und anschließendem Testen der einzelnen Klonüberstände (nach etwa zwei bis drei Wochen) auf die gewünschte Reaktivität durchgeführt. Der Test sollte empfindlich, einfach und schnell sein, wie Radioimmunoassays, Enzyimmunoassays, cytotoxische Assays, Plaque-Assays, Dot-Immunobindungsassays und ähnliche.
Die ausgewählten Hybridome werden dann in einer Verdünnungsreihe verdünnt und in einzelne Antikörper produzierende Zelllinien kloniert, diese Klone können dann unbegrenzt vermehrt werden, um mAk zu liefern. Die Zelllinien können für die mAk-Produktion auf zwei grundlegende Weisen verwendet sein. Eine Hybridom-Probe kann in ein histkompatibles Tier von der Art injiziert sein (oftmals in die Peritonealhöhle), von dem die somatische Zellen und Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion stammen. Das die Injektion erhaltene Tier entwickelt Tumoren, die die von dem fusionierten Zellhybrid gebildeten spezifischen monoklonalen Antikörper sezernieren. Die Körperflüssigkeiten des Tieres wie Serum oder Aszitesflüssigkeit können dann gesammelt werden, um mAk in hoher Konzentration zu liefern. Die einzelnen Zelllinien könnten ebenfalls in vitro kultiviert sein, wo die mAk natürlicherweise ins Zellkulturmedium sezerniert werden, von dem sie ohne weiteres in hohen Konzentrationen gewonnen werden können. Die mit jedem Mittel produzierten mAk können, falls erwünscht, unter Zuhilfenahme von Filtration, Zentrifugation und verschiedenen Chromatographieverfahren wie HPLC oder Affinitätschromatographie noch weiter gereinigt werden.
MOLEKULARE KLONIERUNG VON ANTIKÖRPERN
Eine alternative Strategie, d. h. ein Versuchsansatz der molekularen Klonierung, kann zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern angewandt sein. Bei der praktischen Umsetzung dieses Verfahrens können kombinatorische Immunglobulin-Phagemid-Bibliotheken von RNA, die von der Milz, Hybridom oder sogar B-Zellen isoliert ist, unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion oder mit Hilfe eines beliebig anderen in der Technik bekannten Verfahrens hergestellt sein. Die isolierte RNA wird dann in Expressionsvektoren für die Durchmusterung kloniert. Der Vektor kann Antikörper-Fragmente auf der Oberfläche von Bakterien exprimieren oder bevorzugter, das Antikörper-Fragment kann auf der Oberfläche eines Bakteriophagens exprimiert sein. Derartige Systeme sind von McCafferty et al., (1990) und Chester et al., (1994) beschrieben, in denen Antikörper-Gene in einen fd-Phagenvektor an der N-terminalen Region des Gens III Protein zum Beispiel kloniert sind. Die Autoren zeigten, dass ein funktionaler Antikörper auf der Oberfläche des Bakteriophagens exprimiert ist. Der Phage wird dann mit einem Immunoassay gegen Antigen oder gegen das erwünschte Pathogen durchmustert und kann mittels Immunpräzipitation oder Affinitätschromatographie isoliert werden.
VH und VL-Gen-Repertoires können, wie von Winter et al. (1994) (hier durch Quellenangabe eingefügt) beschrieben, hergestellt sein und bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung Verwendung finden. In diesem Versuchsansatz ist die Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifizierung von VH und VL-Genen von Lymphocyten unter Verwendung von Primern verwendet, die mit den 5' und 3'-Enden von rearrangierten VH und VL-Genen paaren. V-Gene können sowohl von cDNA als auch genomischer DNA amplifiziert werden, mit Rückwärtsprimer am 5'-Ende des die reife V-Domäne codierenden Exons und Vorwärtsprimer mit dem J-Segment. Zusätzlich sind Primer zur Amplifizierung von cDNA konstruiert, die an das Leader-Exon hybridisieren und mit Primer paaren, die so gestaltet sind, dass sie in der konstanten Region starten. Eine gesteigerte Diversität kann in den Bibliotheken mittels Verwendung degenerierter Primer oder durch Verwendung verschiedener Primer für verschiedene V-Genfamilien erhalten sein. Zusätzlich können einmal vorkommende Restriktionsstellen in den Primern enthalten sein, um die Klonierung zu unterstützen. Die Anwendung dieser Techniken kann mit der Immunisierung kombiniert sein, so dass Gene von Lymphocyten oder Milzzellen eines immunisierten Tieres amplifiziert werden, die Levels von Antikörper-Genen erhöhen, die erhalten werden können.
In alternativen Anwendungsformen können rearrangierte V-Gene von humanen peripheren Blutlymphocyten unter Verwendung Familien-basierten Primer isoliert sein, um die VH Vκ und Vλ Familien zu amplifizieren (Winter et al., 1994). Die Kombination dieser Gene liefert eine große Zahl an Antikörpern mit neuartigen Spezifitäten, die gegen verschiedene Pathogene durchmustert werden können, um die sekretorischen Antikörper der vorliegenden Erfindung zu gewinnen. Ebenfalls können synthetische Bibliotheken mittels Randomisierung der H3-Schleife in Kombination mit einer feststehenden leichten Kette konstruiert sein.
Von besonderem Nutzen in einer Anwendungsform der vorliegenden Erfindung ist S1-1, ein humaner monoklonaler Antikörper, produziert von einem Hybridom, das von der Milz eines HIV seropositiven Patienten stammt. Dieser Antikörper kann als Teil eines Arzneimittel/Antikörper-Überbringungssystem für eine passive Immuntherapie für HIV verwendet sein. Es ist gezeigt worden, dass dieses IgG1/γ Immunglobulin an die CD4-Stelle auf dem Oberflächenglycoprotein, gp120, bindet und dass es mehrere Virusstämme, einschließlich HIV/IIIB, MN, SF2 und RF, neutralisiert (Lake et al., 1992). Es ist ebenfalls gegen die meisten primären Isolate aktiv, die von den Erfindern untersucht worden sind.
Es ebenfalls ein Aspekt der Erfindung ist, dass geklonte Antikörper durch eine ortsgerichtete oder Zufallsmutation mutiert und auf Bindungsaffinität durchmustert sein können, um neuartige Antikörper mit einem verstärkten Binden an ein beliebiges der hier beschriebenen Pathogene zu erhalten. Zusätzlich kann eine Mischung aus Antikörpern mit verschiedenen Bindungsaffinitäten für die gleichen oder verschiedenen Antigene, die von einem bestimmten Pathogen präsentiert sind, in bestimmten spezifischen Anwendungsformen zweckdienlich sein.
Folglich kann man im Lichte der vorliegenden Offenlegung IgA-Moleküle mit anti-HIV Spezifität konstruieren. Die Gene der variablen Region für mehrere anti-HIV Antikörper sind kloniert und sequenziert und ein Vektor ist konstruiert worden, um einen dieser Antikörper (S1-1) als ein IgA1-Dimer in Komplex mit einer J-Kette in dem hier beschriebenen Baculovirus-System zu exprimieren. Eine weitere Anwendung dieser geklonten Antikörper ist die Anwendung der Antikörper-Herstellung, um Antikörper mit IgA Fc-Regionen mit verbesserten Effektor-Funktionen zur Expression im Baculovirus-System zu erzeugen. Ein ähnlicher Versuchsansatz ist bei der Anti-Tumor-Behandlung eingesetzt worden, wo dimeres IgA gegen carcinoembryonales Antigen evaluiert wird für eine in vivo Carcinom-Lokalisierung und mögliche Therapie (Tersikh et al., 1994).
BACULOVIRALE EXPRESSION VON REKOMBINANTEM DIMEREN IgA
Ein Vorteil der Verwendung von Insektenzellen, die rekombinante Baculoviren für die Produktion der Antikörper der vorliegenden Erfindung verwenden, ist derjenige, dass unter anderem das Baculovirus-System die Produktion rekombinanter Antikörper wie auch eine kombinatorische Expression von Immunglobulin mit anderen Polypeptiden zum Beispiel J-Kette und unter anderem Chaperoninen viel rascher erlaubt als stabil transfizierte Säugerzelllinien. Zusätzlich ist gezeigt worden, dass Insektenzellen eukoryotische Proteine korrekt prozessieren und glycosylieren, was prokaryotische Zellen nicht können. Schließlich ist gezeigt worden, dass die Baculovirus-Expression von fremden Protein in etwa 50–75% des gesamten zellulären Proteins spät in der viralen Infektion bildet, was dieses System zu einem hervorragenden Mittel zur Produktion von Milligrammmengen der rekombinanten dimeren IgA-Antikörper macht.
Die Verwendung des Baculovirus Autographia california nuclear polyhedrosis-Virus (AcNPV) und rekombinanter viraler Vorratsstämme in Spodoptera frugiperda (Sf9) Zellen zur Herstellung großer Mengen an Protein ist von Smith et al. (1985), Summers und Smith (1987) beschrieben worden. Eine bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von rekombinantem dimeren IgA erfolgt durch die Expression von cDNA, die rekombinantes dimers IgA codiert, über das Baculovirus-Expressionssystem in Sf9-Insektenzellen.
Allgemein können rekombinante IgA-Antikörper hergestellt sein mittels Isolieren von DNA-Fragmenten, die den variablen (V) Regionen der schweren und leichten Kette von mAk entsprechen, und Verknüpfen dieser miteinander mit Hilfe beliebiger Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind und von Sambrook et al. (1989) und O'Reilly et al. (1992) beschrieben sind. Diese rekombinanten DNA-Fragmente können dann in baculovirale Transfervektoren inseriert werden, so dass die Gene von Interesse in das virale Genom anstatt des baculoviralen Polyhedron-Gens inseriert sind.
In einer bevorzugten Anwendungsform der vorliegenden Erfindung waren die DNA-Fragmente, die den V-Regionen der schweren und leichten Kette von mAk93G7 entsprechen, mittels PCR von Plasmiden pHγ1-360E beziehungsweise pHκ-360E amplifiziert. Die Oligonucleotid-Primer für diese Amplifikationen enthielten eine 5' Nco I Stelle am Initiatonscodon und eine 12 Nucleotid Antisense-Überlappung mit C_α am 3'-Ende. Die codierenden Regionen von humanem Cα1 und Cκ waren von RNA von humanen peripheren Blutleukocyten mittels RT-PCR^TM erhalten; in diesem Falle enthielten die Primer eine 12 Nucleotid Sense-Überlappung mit der geeigneten V-Region am 5'-Ende und eine Xba I Stelle am 3'-Ende. Die geeigneten V und C-Regionen waren mittels PCR^TM Überlappungsextension verknüpft.
In einer weiteren Anwendungsform der vorliegenden Erfindung war ebenfalls ein DNA-Segment, umfassend eine J-Kette codierende Region, isoliert. Eine cDNA-Bibliothek von einer humanen B-Zelllinie wurde mit einem 1,6 kb Xba I Fragment, das Exons 3 und 4 von dem Gen der humanen genomischen J-Kette enthielt, durchmustert (Max und Korsmeyer, 1985). Ein Klon, der das reife Protein mit 137 Aminosäuren codiert, das von dem zuvor charakterisierten genomischen Klon vorhergesagt war (Max und Korsmeyer, 1985) wie auch ein 22 Aminosäure N-terminales Signalpeptid wurde erhalten.
Die isolierten DNA-Fragmente, die die bevorzugten Gene codieren, wurden dann in die Baculovirus-Transfervektoren inseriert. Ein bevorzugter Transfervektor der vorliegenden Erfindung basiert auf pAc360. Die DNA-Fragmente wurden verdaut, gereinigt und in die einzige Nco I und Xba I Stelle in pH-360EX (Haseman und Capra, 1990) unter Anwendung von Standardtechniken ligiert, die dem Fachmann bekannt und von Sambrook et al. (1989) beschrieben sind.
Rekombinante Plasmid-Vektoren (2–20 μg) wurden dann mit linearem Wildtyp AcNPV (etwa 4 μg) in Sf9-Zellen cotransifiziert. Cotransfektion erfolgt bevorzugt unter Verwendung kationischer Liposomen, die im Handel erhältlich sind, z. B. Invitrogen, nach der Herstelleranleitung, außer dass 0,25 μg lineare DNA bevorzugt verwendet wird. Falls erwünscht, kann die rekombinante Plasmid-DNA vor Transfektion unter Verwendung eines Cäsiumchlorid-Gradienten oder anderer dem Fachmann bekannter Verfahren gereinigt werden. Es ist eine bevorzugte Anwendungsform der vorliegenden Erfindung, dass Wachstum, Plaque-Reinigung und Virus-Titration nach Standardverfahren erfolgen, die von Summers und Smith (1987) beschrieben sind. Zum Beispiel werden nach Transfektion die resultierenden Viren visuell durchmustert, um okklusionsnegative, rekombinante Viren enthaltende Insektenzellen zu isolieren. Mit okklusionsnegativen Viren infizierte Sf9-Zellen können zu der gewünschten Menge und unter geeigneten Bedingungen angezogen werden, so dass große Mengen an dimeren IgA-Antikörper produziert werden. Zur Proteinproduktion sind die infizierten Zellen in Spinner-Kolben in einer Dichte von 2 × 10⁶ pro ml gehalten.
Rekombinante IgA-Antikörper der vorliegenden Erfindung wurden folgendermaßen isoliert: Zellüberstände wurden auf 20 mM Tris-Cl, pH 7,5/10 mM EGTA/10 mM EDTA/1 mM Phenylmethansulfonylfluorid eingestellt und mit 90.000 × g 40 Minuten zentrifugiert. Antikörper wurden aus dem reultierenden Überstand mittels Fällung mit Ammoniumsulfat bei 40% Sättigung isoliert. Diese Fraktion wurde entweder direkt in weiteren Protokollen und Analysen verwendet oder auf p-Azophenylarsonat(Ars)-Sepharose vor Weiterverwendung weiter aufgereinigt.
Um ein intaktes Immunglobulin herzustellen, müssen sowohl schwere als auch leichte Kette exprimiert sein. Um dimeres IgA herzustellen, muss eine humane J-Kette ebenfalls mit der schweren und leichten Kette exprimiert sein. Drei allgemeine Strategien können angewandt sein, um diese dreifache Expression zu erreichen. Eine derartige Strategie ist die Infektion einer Insektenzelle mit drei rekombinanten Viren, die das Gen von schwerer, leichter beziehungsweise J-Kette enthalten. Eine andere Strategie ist die bi- oder tricistronische Expression von zwei oder möglicherweise von allen drei Polypeptiden von einer einzigen Transcriptionseinheit. Allerdings haben Hasemann und Capra (1990) herausgefunden, dass eine bicistronische Expression der Gene von leichter und schwerer Kette nicht zur Bildung eines authentischen heterodimeren Immunglobulins führte. Eine dritte Strategie ist die Bildung eines rekombinanten Virus mit zwei Polyhedrin-Promotoren, wobei jeder die Transcription von beispielsweise entweder der cDNA der leichten oder schweren Kette initiiert. Dies würde mit der Coinfektion eines weiteren rekombinanten Virus, der in diesem Fall das Gen der J-Kette enthält, kombiniert werden. Ein tatsächlich doppelt rekombinanter Transfervektor wurde hergestellt, so dass zwei Fremdgene in einem Plasmid in gegensätzlicher Orientierung enthalten waren, um ein funktionales heterodimeres Immunglobulin zu produzieren (Hasemann und Capra, 1990). Diese letzte Strategie produzierte erfolgreich dimeres IgA, wenn die schwere und leichte Kette mit der humanen J-Kette coexprimiert wurden (Carayannopoulos, 1994). Der doppelt rekombinante Transfervektor wurde hergestellt, so dass zwei Fremdgene in einem Plasmid in gegensätzlicher Orientierung enthalten waren, um ein funktionales heterodimeres Immunglobulin, das dem von Hasemann und Capra (1990) beschriebenen ähnlich war, zu produzieren.
Um zu bestimmen, ob die rekombinanten Viren das korrekte Gen für die Herstellung von dimerem IgA der vorliegenden Erfindung mit der schweren und/oder leichten Kette an der korrekten Stelle und in der korrekten Orientierung enthalten, kann eine DNA-Sequenzierung von PCR-amplifizierten Genen durchgeführt werden. Um zu überprüfen, ob die Proteinprodukte der viral infizierten Sf9-Zellen die erwünschten Antikörper der vorliegenden Erfindung sind, werden SDS-PAGE, Western-Blot, Glycosylierung und ELISA Analysen durchgeführt. Dem Fachmann sind diese Techniken vertraut, die in Sambrook et al. (1989) beschrieben sind. Um weiter zu überprüfen, ob die Antikörper der vorliegenden Erfindung authentisch sind, werden sie auf ihre Reaktivität mit mehreren IgA1-spezifischen mAk, M4C11, M4D8, 2D7 und N1F2 zum Beispiel, in ELISA Analysen wie auch ihre Empfindlichkeit auf ein Schneiden mit H. influenza IgA1-Protease geprüft. Geschnittene Fc-Regionen werden mit Western-Blotting untersucht. Zum Schluss werden die Proben einer nichtreduzierenden SDS-PAGE auf 40% Gelen und anschließendem Western-Blotting unterzogen, um das Vorhandensein von dimerem Ig zu demonstrieren.
Die Fähigkeit der Antikörper der vorliegenden Erfindung, die Komplement-Komponente C3 zu fixieren, ist im Wesentlichen, wie von Schneiderman et al. (1990) beschrieben, mit den folgenden Änderungen beurteilt worden. Ars-BSA oder Ars-Gelatine ist zum Einfangen eines Hapten-spezifischen Antikörpers verwendet worden und normales humanes Serum ist als Komplementquelle verwendet worden. Angelagertes C3 wird mit Schaf anti-humanem C3 (The Binding Site, San Diego, CA) gefolgt von Ziege anti-Schaf IgG, das mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist (Sigma, St. Louis, MO), detektiert.
Um die Fähigkeit von rekombinantem IgA zu beurteilen, den mFcαR zu erkennen, wird die Rosettenbildung von Ars-derivatisiertem IgA-beschichteten Erythrocyten mit mFcαR⁺-Zellen geprüft. HL-60 promyelocytische Leukämiezellen exprimieren mFcαR nach einer 5–7 Tagen dauernden Behandlung mit 0,5 μM Calcitriol und sind folglich in diesen Analysen verwendet. Schaf-Erythrocyten (Colorado Serum, Denver, CO) werden mit Ars, genau wie von Henry (1980) beschrieben, derivatisiert und dann mit Hank isotonischer Salzlösung (HBSS) gewaschen. Die Hapten behafteten Erythrocyten werden dann mit sensitiviertem Antikörper oder Zufallsserum-Ig (in HBSS) beschichtet. Die Rosettenbildung wird bewertet, wie von Shen et al. (1989) beschrieben. Induktion von mFcαR auf HL-60 Zellen wird mittels Durchflusscytometrie unter Zuhilfenahme von My43 (IgM) anti-mFcαR mAk und mittels Immunoblotting unter Verwendung eines mAk einer anderen IgG-Klasse (Monteiro et al., 1992) geprüft. Das dimere IgA der vorliegenden Erfindung vermittelte spezifisch eine Rosettenbildung zwischen HL-60 Zellen und Ars-beschichteten Erythrocyten.
HERSTELLUNG VON REKOMBINANTEM DIMEREN IgA
Ein großes Hindernis beim Verstehen des IgA-Systems sind die Schwierigkeiten gewesen, auf die mehrere Forscher bei Definition der von dem Fc-Teil des Moleküls vermittelten Effektor-Funktionen gestoßen sind (Clackson et al., 1984). Allerdings haben jüngste Fortschritte im Labor des Erfinders (Carayannopoulos, 1994) ein Mittel zur Beantwortung einiger fundamentaler molekularer Fragen hinsichtlich IgA geliefert. Die variablen Regionen der schweren und leichten Kette des Moleküls mit Spezifität für Arsonat-Hapten wurden von einem murinen Hybridom kloniert, wie bereits beschrieben (Hasemann und Capra, 1990). Die codierenden Regionen von humanem Cα1 und Cκ wurden aus RNA von humanen Leukocyten des peripheren Bluts mittels reverser Transcription und nachfolgender PCR erhalten, wie bereits beschrieben (Tuaillon et al., 1993). Die geeignete variable und konstante Region wurden dann mittels PCR-Überlappungsextension verknüpft (Horton et al., 1990). Der Klon der humanen J-Kette wurde aus einer humanen B-Zelllinie mittels Durchmusterung mit einer genomischen J-Ketten-Sequenz erhalten (Max und Korsmeyer, 1985). Diese Gene wurden zunächst in Baculovirus Transfervektoren kloniert, von denen rekombinante Baculoviren unter Anwendung von Standardverfahren (Sambrook et al., 1989; O'Reilly et al., 1992) hergestellt wurden. Coinfektion von Sf9-Zellen (Spodoptera frugiperda) mit rekombinanten Baculoviren erleichtert die Expression von Proteinkomplexen mit mehreren Untereinheiten in Milligramm-Mengen. Die Leistung des Systems ist, dass IgA schwere Kette, leichte Kette und J-Kette einzeln oder gemeinsam exprimiert sein können, was folglich die Produktion vieler verschiedener Versionen von Proteinen mit mehreren Untereinheiten erlaubt (Potter, et al., 1993a; Potter, et al., 1993b). Mutationsanalyse ist schnell durchgeführt, da nur das Konstrukt der schweren Kette verändert werden muss, die Konstrukte der leichten Kette und J-Kette bleiben gleich.
Bindung von rekombinantem baculoviralen IgA an den auf Calcitriol-behandelten HL-60 Zellen (eine humane promyelocytische Zelllinie) exprimierten FcαR ist schon unter Verwendung eines Rosettenbildungsassays demonstriert worden (Carayannopoulos et al., 1994). Kurz, Hapten-beschichtete Erythrocyten werden in Gegenwart von rekombinantem IgA oder nichtantigen-spezifischem IgA und HL-60 Zellen inkubiert. Im Falle von anti-Arsonat IgA bilden sich Cluster oder Rosetten von Erythrocyten um die HL-60 Zellen herum, wohingegen bei Bindung an HL60 FcαR, das Kontroll-IgA oder nichtderivatisierte Erythrocyten keine Rosetten bilden. Eine Mutante, aglycosyliertes IgA interagiert nicht mit dem Fcα-Rezeptor in diesem Assay (Carayannopoulos et al., 1994). Diese Untersuchungen sind durch Konstruktion weiterer mutierter IgA-Moleküle erweitert worden, in denen die humanen IgA konstanten Domänen mit den entsprechenden Domänen von humanem IgG vertauscht worden sind (Carayannopoulos et al., 1996). Unter Anwendung dieses Versuchsansatzes ist gezeigt worden, dass die Cα2 und die Cα3 (VGAA Mutante) Domänen für eine FcαR-Bindung erforderlich sind (siehe Tabelle 1). Eine aglycosylierte Mutante, in der N271 zu Glutamin mutiert war, band nicht den FcαR (1). Ein Vergleich der IgA1 Fc-Sequenz mit der homologen IgG1 Fc-Sequenz, deren Struktur bekannt ist (Deisenhofer, 1981), legt die Vermutung nahe, dass eine Lösemittel exponierte Schleife in der Cα2-Domäne, enthaltend N271, an der FcαR-Bindung beteiligt war. Dies wurde durch gezielte Punktmutationen in verschiedenen Resten, wie in 1 gezeigt, bestätigt. Mutation des exponierten L266, in dieser Schleife vier Aminosäuren N-terminal zu der Glycosylierungsstelle vorliegend, zu Arginin, verhinderte ebenfalls ein Binden. Mutation von E320, analog zu der katabolischen Stelle von IgG, in einer Schleife über der L266-enthaltenden Schleife vorliegend, zu Arginin hatte keine Auswirkung. Darüber hinaus war die vom Gelenk proximal gelegene Region der Cα2-Domäne, analog zu der Fc-Bindungsstelle in IgG, nicht beim Binden des FcαR beteiligt, wie es durch die fehlende Auswirkung, die mit Mutation von R280 zu Histidin beobachtet wurde, und durch Entfernen des Gelenks, das ebenfalls keine Auswirkung hatte, beurteilt wurde. Es wurde gezeigt, dass die Region von der CH3-Domäne, die an der FcαR-Bindung beteiligt ist, die L465 enthaltende Schleife ist, die ein Binden verhinderte, wenn zu Arginin mutiert (siehe 1).
Um die an der FcαR-Bindung beteiligte minimale Struktureinheit zu identifizieren, werden die Schleifen, die an Cα2 und Cα3 Domänen beteiligt sind, auf die VAGA beziehungsweise VAAG Mutanten verpflanzt (Tabelle 1). 93G7 stellt die murine VH-Region mit einer Spezifität für Arsonat dar (Hasemann und Capra, 1990). Die Bindung an den FcαR wurde mittels Rosettenbildung, wie in Carayannopoulos et al. (1996) beschrieben, beurteilt. Die Konstruktion kleiner Moleküle mit Fcα-Rezeptor bindenden Aktivitäten kann ein zweckdienlicher zusätzlicher Versuchsansatz zu bestehenden Antikörper- und Arzneimittel-Versuchsansätzen sein.
Tabelle 1 Effekt des Austausches der konstanten Domäne von IgA/IgG auf die Bindung von IgA an den polymeren Immunglobulinrezeptor
BINDUNGSSTELLE VON DIMEREM IgA
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Entdeckung des minimalen IgA-Dimers, das für einen Transport mit dem pIgR wirksam ist, durch Kartierung der Bindungsstelle für den pIgR auf dimerem IgA. Die MDCK-(Madin-Darby Kaninchennieren)-Zelllinie, mit dem pIgR transfiziert, kann für einen in vitro Transcytose-Assay verwendet werden (Mostov und Deitscher, 1986) und ist zur Bewertung der Bindung und Transcytose von dIgA verwendet worden (2). Dies ist eine polarisierte Zelllinie, die in der Lage ist, Monolayer mit tight junctions zu bilden, die, wenn auf einem semipermeablen Träger gewachsen, dIgA von der unteren (basolateralen) zu der oberen (apikalen) Kammer eines Gewebekulturbehälters transportiert.
Domänenaustausch-Mutanten sind als dIgA mit J-Kette exprimiert und auf pIgR-Bindung und Transcytose mit dieser Zelllinie geprüft worden. FACS-Analyse ist verwendet worden, um zu bestimmen, ob oder ob nicht eine gegebene Mutante an den auf diesen Zellen exprimierten pIgR bindet. Zellen werden mit 10 mM EDTA in PBS geerntet und gebundenes IgA wird mit einem anti-humanen kappa Kette FITC-Konjugat detektiert. Nur dIgA, wie operational von IgA mit J-Kette coexprimiert definiert, bindet an den Rezeptor, Binden von jeglichem monomeren IgA mit irgendeiner Mutante wurde nicht beobachtet. Wenn das Panel von Domänenaustausch-Mutanten als dIgA exprimiert wurde und auf pIgR-Bindung getestet wurde, waren nur diejenigen mit der von IgA stammenden CH3-Domäne in der Lage, an den pIgR zu binden (Tabelle 1). Die Fähigkeit einer Mutante von pIgR im Transcytose-Assay transportiert zu werden, korrelierte ebenfalls mit der Expression von dimerem Ig, das CH3 von IgA besitzt. Die CH3-Domäne, wie in diesem System exprimiert, umfasst das IgA-Schwanzstück, das für eine Dimerisierung essenziell ist. Die entscheidenden Determinanten für pIgR-Bindung sind folglich auf der Domäne lokalisiert worden, die den CH3-Schwanzstück-J-Kette-Komplex umfasst. Dieser kann bis zu fünf Polypeptidketten (d. h. vier IgA schwere Kette CH3-Domänen und eine J-Kette) oder eine Kombination dieser Ketten enthalten.
KOMPONENTEN DER PASSIVEN IMMUNTHERAPIE UND IHRE DARSTELLUNG
Pharmazeutische Zusammensetzungen und die Immunglobuline, die sie für eine passive Immuntherapie liefern, sind auf eine vorübergehende Prophylaxe empfindlicher Individuen und auf die unmittelbare Behandlung von Infektionen und Toxizitäten begrenzt. Eine Abhandlung über passive Immunität und immunisierende Agenzien können Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Seiten 1389–1404, 1990, entnommen werden. Die von diesen Mitteln gelieferte Immunität ist nicht langandauernd und die von den Impfstoffen gelieferten Immunglobuline verschwinden aus den Körpergeweben und -flüssigkeiten des Wirts innerhalb eines vergleichsweise kurzen Zeitraums, normalerweise nach ein oder zwei Wochen, entweder durch Verbrauch, durch Binden des Pathogens oder durch den Stoffwechsel des Körpers des Wirts. Folglich sollte die Verabreichung eines Antikörpers für eine passive Immunität während des entscheidenden Zeitraums unmittelbar nach oder genau vor der erwarteten Pathogen oder Toxin-Exposition erfolgen, so dass die Immunglobuline vorhanden sind, wenn die Immunität am dringendsten erforderlich ist.
Der Prozentgehalt der aktiven Komponente in einem beliebigen pharmazeutischen Präparat ist abhängig sowohl von der Aktivität der Verbindung, im diesem Fall von Antikörper(n), als auch seiner Konzentration im Präparat. Typischerweise sollten derartige Zusammensetzungen wenigstens 0,1% aktive Verbindung enthalten. Der Prozentgehalt der Zusammensetzungen und Präparate kann selbstverständlich variiert sein und kann bequem zwischen etwa 2 bis etwa 60% des spezifischen Gewichts betragen. Die Menge an aktiven Verbindungen in derart therapeutisch zweckdienlichen Zusammensetzungen ist entsprechend, um eine geeignete Dosierung zu erhalten.
Die pharmazeutischen Formen, die für einen injizierbaren Gebrauch geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die unmittelbar vor Gebrauch erfolgende Zubereitung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. In allen Fällen muss die Form steril sein und muss in einem Ausmaß flüssig sein, dass sie sich leicht injizieren lässt. Sie muss unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein und muss gegen die Wirkung kontaminierender Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze konserviert sein. Der Träger kann ein Lösemittel oder Dispersionsmedium sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerin, Propylenglycol und flüssiger Polyethylenglycol und ähnliches), geeignete Mischungen davon und Pflanzenöle enthält. Die passende Fließfähigkeit kann erhalten sein zum Beispiel durch die Verwendung einer Beschichtung wie Lecithin, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Falle einer Dispersion und durch die Verwendung oberflächenaktiver Substanzen. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann mit verschiedenen antibakteriellen und fungiziden Agenzien bewerkstelligt sein, zum Beispiel Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal, Phenylquecksilbernitrat, m-Kresol und ähnliche. In vielen Fällen ist die Verwendung isotonischer Lösungen bevorzugt, zum Beispiel Zucker oder Natriumchlorid. Verzögerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen können durch Verwendung von Absorption verzögernden Agenzien in den Zusammensetzungen zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine bewerkstelligt sein.
Sterile injizierbare Lösungen sind durch Einbau der aktiven Verbindungen in der erforderlichen Menge in dem geeigneten Lösemittel mit verschiedenen anderen, oben angeführten Bestandteilen, wie erforderlich, und anschließender Sterilfiltration zubereitet. Allgemein sind Dispersionen durch Einbau der verschiedenen sterilisierten aktiven Bestandteile in einem sterilen Träger zubereitet, der das Basisdispersionsmedium und die erforderlichen anderen Bestandteile, die oben aufgeführt sind, enthält. Im Falle steriler Pulver für die Zubereitung steriler injizierbarer Lösungen sind die bevorzugten Verfahren zur Zubereitung Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungstechniken, die ein Pulver des aktiven Bestandteils plus jeden zusätzlichen erwünschten Bestandteil von einer davon zuvor sterilfiltrierten Lösung ergeben.
Wie hier verwendet, beinhaltet der Ausdruck „pharmazeutisch verträglicher Träger" jedes und alle Lösemittel, Dispersionsmittel, Beschichtungen, antibakterielle und fungizide Agenzien, isotonische und absorptionsverzögernde Agenzien und ähnliche. Der Ausdruck unterstreicht, dass die Zusammensetzungen und Additive keine allergische oder andere unerwünschte Reaktion hervorrufen, wenn sie einer Person verabreicht sind. Die Verwendung derartiger Medien und Agenzien für pharmazeutische aktive Substanzen ist in der Technik bekannt. Außer soweit ein beliebiges herkömmliches Medium oder Agens mit dem aktiven Bestandteil nicht verträglich ist, kann seine Verwendung in therapeutischen Zusammensetzungen erwogen werden. Ergänzende aktive Bestandteilekönnen ebenfalls zu den Zusammensetzungen zugefügt werden.
ÜBERBRINGUNG VON FORMULIERUNGEN
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung können herkömmlicherweise parenteral, entweder mittels subkutaner oder intramuskulärer Injektion zum Beispiel verabreicht sein. Zusätzliche Formulierungen, die für andere Verabreichungsarten geeignet sind, umfassen Suppositorien und, in manchen Fällen, orale Formulierungen und Aerosol-Formulierungen. In Suppositorien können traditionelle Bindemittel und Träger enthalten sein, zum Beispiel Polyalkalenglycole oder Triglyceride: derartige Suppositorien können aus Mischungen gebildet sein, die den aktiven Bestandteil mit 0,5% bis 10%, vorzugsweise 1–2% enthalten. Orale Formulierungen enthalten gewöhnlich eingesetzte Arzneimittelträger wie zum Beispiel Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat und ähnliches in pharmazeutischer Reinheit. Diese Zusammensetzungen sind in Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Depotformulierungen oder Pulvern und enthalten 10–95% aktiven Bestandteil, vorzugsweise 25–70%.
Die Antikörper können neutral oder als Salze formuliert sein. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen Säuresalze und diejenigen, die mit anorganischen Säuren wie zum Beispiel Salzsäure oder Phosphorsäure oder organischen Säuren wie Essig-, Oxal-, Wein-, Mandelsäure und ähnlichen gebildet sind. Mit freien Carboxylgruppen gebildete Salze können auch von anorganischen Basen abstammen wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisenhydroxiden und organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und ähnlichen.
In vielen Fällen wird es erwünscht sein, eine mehrfache Verabreichung der Antikörper zu haben, gewöhnlich nicht sechs überschreitend, gewöhnlicher nicht vier überschreitend und vorzugsweise eine oder mehrere, gewöhnlich wenigstens etwa drei Verabreichungen. Die Verabreichungen erfolgen gewöhnlich in ein- bis zu zwölfwöchigen Intervallen, gewöhnlicher in ein- bis zu vierwöchigen Intervallen. Periodische wiederholte Verabreichung ist bei einer wiederkehrenden Pathogen- oder Toxin-Exposition erwünscht. Zum Beispiel eine HIV-positive Mutter würde vor Entbindung von einer zweiten Schwangerschaft wieder geimpft werden.
Für Formulierungen, die eine passive Immunität verleihen, liegen die normalerweise eingesetzten Dosierungen im Bereich von 0,5 ml bis 10 ml pro Dosis, vorzugsweise im Bereich von 2 ml bis 5 ml pro Dosis. Wiederholte Dosen zum Überbringen der geeigneten Menge an aktiver Verbindung sind normal. Sowohl Alter als auch Menge pro Gewicht des Empfängers müssen bei Bestimmung der geeigneten Dosierung des aktiven Bestandteils und Verabreichungsvolumens berücksichtigt sein.
Der Behandlungsverlauf kann mit Assays auf Antikörper für die Antigene im Überstand verfolgt werden. Diese Assays können mittels Markierung mit herkömmlichen Markern wie Radionuklide, Enzyme, fluoreszierende Marker und ähnlichen durchgeführt sein. Proben zum Testen können Serumproben sein oder sie können von einer beliebigen Schleimhautoberfläche oder Körperflüssigkeit wie Speichel, Sputum, Vaginalspülung oder Expektoration erhalten sein. Diese Assay-Techniken sind gut bekannt und können in einem großen Spektrum von Patenten, wie U.S. Patent, Nr. 3.791.932; 4.174.384 und 3.949.064, zur Veranschaulichung dieser Assay-Typen, gefunden werden.
ANTIKÖRPER MIT MINIMALEN pIgR ERKENNUNGSSTELLEN
In einem Versuch, um die Cα3-Domäne, Schwanzstück und J-Kette als die minimale bindende Einheit für den pIgR schlüssig zu identifizieren, wurde ein „mini-IgA" dimeres Molekül konstruiert und unter Verwendung des Baculovirus-Systems exprimiert (3B). Das Molekül umfasst die Arsonat-spezifischen VH und VL-Domänen, jede an eine humane IgA1 Cα3-Domäne (einschließlich Schwanzstück) fusioniert. Diese beiden Polypepid-Ketten sind im Baculovirus erfolgreich exprimiert worden, wie es mit Western-Blot gezeigt wurde. Wenn sie mit der J-Kette coexprimiert sind, um das „mini-IgA2 dimere Molekül herzustellen, ist die Hapten-bindende Spezifität beibehalten. (4).
IMMUNOASSAYS
Bestimmte Immunoassays können bei der praktischen Anwendung der vorliegenden Erfindung angewandt sein und diese umfassen, sind aber nicht auf die in U.S. Patent, Nr. 4.367.110, (doppelter monoklonaler Antikörper Sandwich-Assay) und U.S. Patent, Nr. 4.452.901, (Western-Blot) beschriebenen Assays beschränkt. Andere Assays umfassen Immunpräzipitation von markierten Liganden und Immuncytochemie, sowohl in vitro als auch in vivo.
Immunoassays sind im einfachsten und direktesten Sinne Bindungsassays. Bestimmte bevorzugte Immunoassays sind die verschiedenen Arten Enzym-gebundener Festphasen-Immunoassays (ELISAs) und andere Festphasen-Immunoassays, die in der Technik bekannt sind. Immunhistochemische Detektion unter Verwendung von Gewebeschnitten und Radioimmunoassays (RIA) sind ebenfalls besonders zweckdienlich. Allerdings ist es ohne weiteres einzusehen, dass Detektion nicht auf derartige Techniken beschränkt ist und Western-Blotting, Dot-Blotting, FACS-Analysen und ähnliches ebenfalls Verwendung finden können.
Die folgenden Beispiele sind enthalten, um bevorzugte Anwendungsformen der Erfindung zu demonstrieren. Es sollte dem Fachmann bewusst sein, dass die in den Beispielen offengelegten Techniken, die vom Erfinder entdeckten Techniken darstellen, bei der praktischen Anwendung der Erfindung gut funktionieren, und folglich als bevorzugte Ausführungsformen für die praktische Umsetzung betrachtet sein können. Allerdings sollte der Fachmann im Lichte der vorliegenden Offenlegung erkennen, dass viele Änderungen in den hier offengelegten spezifischen Anwendungsformen gemacht werden können und immer noch ein gleiches oder ähnliches Resultat erhalten wird.
BEISPIEL 1
Vaginale Sekretion der dIgA-Antikörper
Eine große Menge (1 mg) J-Kette enthaltendes, für das Arsonat-Hapten spezifisches IgA1-Dimer wurde unter Verwendung eines Baculovirus-Systems gereinigt. Antikörper von 0,5–1 l Kulturen von IgA exprimierenden High Five Insektenzellen, in serumfreiem (Ex-cell 405) Medium gewachsen, wurde einer Affinitätsreinigung auf Arsonat-derivatisiertem Cyanbromid SEPHAROSE 6B unterzogen. Das Material wurde von der Säule mit 0,5 M Arsanilsäure eluiert und ausgiebig (10–12maliges Wechseln über mehrere Tage) gegen Phosphat gepufferte Saline dialysiert, um das Antigen zu entfernen. Das dialysierte Material wurde mittels Druckfiltration auf einer Amicon YM 30 Membran aufkonzentriert. Der Antikörper wurde auf Reinheit und Aktivität mit SDS-PAGE und ELISA geprüft und pIgR-Bindung wurde mittels FACS auf MDCK-Zellen bestätigt. Gereinigte Antikörper wurde sterilfiltriert und auf Endotxin getestet. Der Antikörper (500 mg in 3 ml) wurde einem Rhesus-Makaken intravenös injiziert. Proben von Serum und Vaginalspülungen wurden 20 Minuten vor der Injektion und dann hinterher in Zeitintervallen genommen. Dieses Material wurde dann Arsonat-spezifischem ELISA (5) und kompetitivem ELISA unterzogen, wo lösliches Arsonat-BSA eingesetzt war, um die Bindung des Antikörpers an Arsonat-beschichtete Platte zu hemmen (6).
Die Daten zeigen, dass Antigen-spezifisches IgA zu den Vaginalsekreten 24 bis 48 Stunden nach Injektion transprotiert ist. Der eine Tag Verzögerung zwischen Injektion und Erscheinen des Antikörpers auf der Schleimhautoberfläche liegt vermutlich an der Zeit, die der Antikörper braucht, um den Kreislauf zu verlassen und im submukösen Raum sich anzusammeln, wo er dann über den pIgR-Transcytoseweg transportiert werden kann.
Tabelle 1 zeigt das Binden von dimeren IgA/IgG konstante Domänenaustausch-Mutanten an pIgR auf MDCK-Zellen, wie es mit FACS Analyse gemessen ist. 93G7 codiert die murine VH-Region mit einer Spezifität für Arsonat.
BEISPIEL 2
Vaginales Überbringen von schützenden anti-HIV Antikörpern in einem SHIV/Rhesus-Makaken-Modell
Es ist ein Primaten-Modell einer heterosexuellen AIDS-Übertragung, das auf der Inokulation der genitalen Mukosa von Tieren mit SIV basiert, entwickelt worden (Miller et al., 1989). Dieses Modell hat die Entwicklung und das Testen von schützenden Impfstoffen gegen SIV auf Wirksamkeit gegen eine genitale Inokulation des SIV-Virus ermöglicht (Marx et al., 1993). Das erst kürzlich entwickelte SHIV-Krankheitsmodell in Rhesus-Makaken (Luciw et al., 1995), wo das Virus ein Hybrid aus SIV und HIV ist, das das HIV gp120 Molekül trägt, bietet die Möglichkeit, die Wirksamkeit von anti-HIV Antikörpern der IgA- Unterklasse bei der Bekämpfung der Ausbreitung von AIDS zu testen. Dies besitzt erhebliche Auswirkungen nicht nur für ein begrenztes Programm einer passiven Immunisierung sondern auch für die muköse Impfung, falls die IgA-Antikörper sich als wirksam bei der Prävention einer Infektion erweisen würden.
Das SIV/Makaken-Modell der heterosexuellen Übertragung ist kürzlich um die SHIV rekombinanten Viren erweitert worden (Luciw, et al., 1995). SHIV hat einen Vorteil gegenüber SIVmac, weil dieses rekombinante Virus das HIV-1 env anstatt des analogen SIVmac env besitzt. Es ist deshalb möglich, HIV-1 env Reagenzien auf die SIV infizierten Makaken anzuwenden. Das SIV/Makaken-Modell der genitalen mukösen Übertragung von SIV ist gut bekannt und wurde im Laboratorium von Dr. Marx entwickelt (Miller, et al., 1989). In der Tat ist es eingesetzt worden, um den Schutz gegen vaginale SIV-Übertragung mit einem mikroverkapselten Impfstoff zu demonstrieren (Marx, et al., 1995).
Der humane monoklonale Antikörper S1-1 (Lake et al., 1992), der in dem Baculovirus-Expressionssystem als ein IgA exprimiert ist, erkennt gp120 in ELISA. Die diesen Antikörper codierenden Gene der schweren und leichten Kette sind in die Baculovirus-Expressionsvektoren mit einer IgA konstanten Region geklont worden und der exprimierte Antikörper ist gegen gp120 in ELISA aktiv. Der Antikörper ist als dimeres IgA in großem Maßstab unter Verwendung eines Serum freien Mediums exprimiert und unter Verwendung von Affinitätschromatographie auf dem Lectin-Jacalin gereinigt, das für den O-gebundenen Zucker in dem IgA1-Gelenk spezifisch ist (Roque-Barriera und Campos-Neto, 1985).
Als ein Aspekt der vorliegenden Erfindung wird dieser Antikörper als ein an vitro Beispiel für die Neutralisierung des Stammes SHIV33 verwendet, der das HIV gp120 env Protein trägt. Der Assay ist 100 TCID50 Virus in Rhesus PBMCS mit irrelevantem IgA und mit HIV-spezifischem IgA als Kontrollen. SIVP22 Antigenproduktion wird an Tag 0, 7, 10 und 14 gemessen, wie beschrieben (Marx et al., 1993). Nach Feststellen der neutralisierenden Aktivität wird das IgA intravenös verabreicht, um den Schutz der Makaken gegen vaginale SHIV-Inokulation zu kontrollieren. Vierundzwanzig Tage nach Verabreichung des dIgA werden die Makaken mit SHIV33 vaginal inokuliert und Infektionslevels werden zeitlich mittels Serokonversion, SHIV-Kultur von dem peripheren Blut und SHIV-spezifischer PCR kontrolliert (Luciw et al., 1995).
Um ein höheres Schutzniveau zu erhalten, können andere Antikörper als IgA-Dimere zu dem Inokulum zugegeben sein, um einen Antikörper-Cocktail zur Hemmung der Virus-Übertragung herzustellen. Alternativ können mini-IgA-Moleküle, die nur ein minimales Motiv für den Transport tragen, wie hier beschrieben, die Möglichkeit einer effizienteren Überbringung von anti-HIV Antikörpern mit einem hohen Level an die Schleimhautoberfläche bieten.
Tabelle 2 zeigt die vorläufigen Studien. Drei von 3 weiblichen Makaken wurden mit einer nichttraumatischen Verabreichung von 2,7 × 10⁴ TCID50 SHIV33 in das intakte Vaginaepithel infiziert. SHIV war aus dem peripheren Blut von Rh 1412, 1414 und 1418 erhalten. Zwei Rhesusaffen wurden bis zu 140 Tage nach vaginaler Inokulation beständig infiziert, der kürzeste zurückliegende getestete Zeitpunkt. Das dritte Weibchen, das mit SHIV33 inokuliert war, wurde an Tag 28 infiziert, gab aber ein leicht positives Signal an Tag 42. Mit Hilfe wiederholten Kultivierens von Proben von den Tieren während der ersten 60 Tage nach Inokulation wird die Dauer des Schutzes durch Vorbehandlung mit spezifischen IgA gemessen.
Tabelle 2
Tabelle 2 zeigt die Isolierung von SHIV von dem Blut von vaginal inokulierten Rhesus-Makaken. Virusinfektion wurde durch Co-Kultivierung von Rh PBMCs mit CBMx174 Zellen detektiert, wie berichtet (Marx et al., 1993). a – 3 von SHIV₁₆₂ inokulierten waren PCR-positiv an Tag 142. b – Serokonvertiert durch SIVmac Western-Blot. Vaginale Dosis – SHIV₁₆₂ = 4,5 × 10⁴ TCID50 und SHIV33 = 2,7 × 10⁴ TCID50. PBMC – Mononukleäre zellen des peripheren Bluts. LN – Lymphknoten der Leiste.
Nachdem die Kinetiken der Neutralisierung bekannt sind, werden 4 Makaken mit HIV env spezifischem IgA vorbehandelt und mit 10⁴ TCID50 von SHIV33 über den vaginalen Pfad einer Challenge unterzogen. Dies ist für eine Infektion eine hinreichend Virus-Menge. Vier Kontrollen werden mit einem Kontroll-IgA behandelt. Alle 8 Makaken sind mit 1 ml SHIV33 titrierter Stammlösung einer Challenge unterzogen worden. Sollte irgendein Tier der Infektion widerstehen, werden die Kontrollen und die behandelten Tiere ein zweites Mal reimmunisiert und vaginal inokuliert. Wiederholte Expositionen von immunsisierten Tieren und Kontrollen sind erfolgreich angewandt worden, um einen Schutz zu zeigen (Marx et al., 1993).
Alle hier offengelegten und beanspruchten Zusammensetzungen und Verfahren können ohne übermäßiges Experimentieren im Lichte der vorliegenden Offenlegung hergestellt und ausgeführt werden. Während die Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung mit Bezug auf die bevorzugten Anwendungsformen beschrieben worden sind, ist es dem Fachmann klar, dass Änderungen der Zusammensetzungen und Verfahren und in den Schritten oder in einer Reihe von Schritten des hier beschriebenen Verfahrens erfolgen können. Spezifischer, es ist klar, dass bestimmte Agenzien, die sowohl chemisch als auch physiologisch verwandt sind, hier beschriebene Agenzien ersetzen können, während die gleichen oder ähnliche Ergebnisse erhalten werden würden.
LITERATURHINWEISE
The following references, to the extent that they provide exemplary procedural or other details supplementary to those set forth herein, are specifically incorporated herein by reference.

Bakos, M., Kurowsky, A. and Goldblum, R. M. (1991) Characterization of a critical binding site for human polymeric Ig on secretory component. J. Immunol. 147, 3419–3426
Bakos, M., Kurowsky, A., Woodward, C. S., Denney, R. M. and Goldblum, R. M. (1991b) Probing the topography of free and polymeric Ig-bound human secretory component with monoclonal antibodies. J. Immunol. 146, 162–168
Barbas, C. F., Bjorling, E., Chiodi, F., Dunlop, N., Cababa, D., Jones, T. M., Zebedee, S. L., Persson, M. A. A., Nara, P. L., Norrby, E. and Burton, D. R. (1992) Recombinant human Fabs neutralise human type 1 immunodeficiency virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9339–9343
Barbas, C. F., Collett, T. A., Amberg, W., Roben, P., Binley, J. M., Hoekstra, D., Cababa, D., Jones, T. M., Williamson, R. A., Pilkington, G. R., Haigwood, N. L., Satterthwait, A. C., Sanz, I. and Burton, D. R. (1993) Molecular profile of an antibody response to HIV-1 as probed by combinatorial libraries. J. Mol. Biol. 230, 812–823
Bastian, A., Kratzin, H., Eckart, K. and Hilschmann, N. (1992) Intra and Interchain disulfide bridges of the human J chain in secretory Immunonglobulin A. Biol. Chem. Hoppe-Seylers 373, 1255–1263
Bukawa, H., Sekigawa, K. I., Hamajima, K., Fukushima, J., Yamada, Y., Kiyono, H. and Okuda, K. Neutralisation of HIV-1 by secretory IgA induced with a new macromolecular multicomgonet peptide vaccine candidate. (1995) Nature Mediceine: 1, 681–685
Burnett, P. R., VanCott. T. C., Polonis, V. R., Redfield, R. R. and Birx, D. L. (1994) Serum IgA-mediated neutralization of HIV type 1. J. Immunol. 152, 4642–4648
Burton, D. R. and Woof, J. M. (1992) Human antibody effector functions. Adv. Immunol. 51, 1–84
Campbell, in Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Vol. 13, Burden and Von Knippenberg, Eds. pp. 75–83, Amsterdam, Elseview, 1984
Carayannopoulos, L. N., Hexham, J. M. and Capra, J. D. (1996) Localization of the binding site for the monocyte IgA-Fc receptor (CD89) to the domain boundary between Ca2 and Ca3 in human IgA1. J. Exp. Med. 183, 1579–1586
Carayannopoulos, L. N., Max, E. E. and Capra, J. D. (1994) Recombinant human IgA expressed in insect cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91. 8348–8352
Chester, K. A. et al. (1994) Phage libraries for generation of clinically useful antibodies. Lancet 343: 455–56
Childers, N. K., Bruce, M. G. and McGhee, J. R. (1989) Molecular mechanisms of immunoglobulin A defense. Ann. Rev. Microbiol. 43, 503–536
Chintalacharuvu, K. R., Tavill, A. S., Loui, L. N., Vaerman, J. P., Lamm, M. E. and Kaetzel, C. S. (1994) Disulphide bond formation between dimeric IgA and the polymeric immunoglobulin receptor during hepatic transcytosis. Heparology 19, 162–173
Clarkson, A. R., Woodroffe, A. J. Bannister, K. M., Lomax-Smith, J. D. and I, A. (1984) The syndrome of IgA nephropathy. Clin. Nephrol. 21, 7–15,
Coyne, R. S., Siebrecht, M., Pietsch, M. C. and Casanova, J. E. (1994) Mutational analysis of polymeric immunoglobulin receptor/ligand interactions. J. Biol. Chem. 269, 31620–31625
Crowe, J. E., Murphy, B. R., Chanock, R. M., Williamson, R. A., Barbas, C. F. and Burton, D. R. Recombinant human respiratory syncitial virus monoclonal antibody Fab is effective therapeutically when administered directly into the lungs of RSV-infected mice. (1994) Proc. Natl Acad. Sci. USA: 91, 1386–1390
Cunningham-Rundles, C. and Lamm, M. F. (1975) Reactive half cystine peptides of the secretory component of human exocrine Immunoglobulin A. J. Biol. Chem. 250, 1987–1991
Davis, A. C., Roux, K. H. and Schulman, M. J. (1988) On the structure of polymeric IgM. Eur. J. Immunol. 18, 1001–1008
Eiffert, H., Quentin, E., Decker, J., Hillemeir, S., Hufschmidt, M., Klingmuller, D., Weber, M. H. and Hilschmann, N. (1984) Die Primastruktur der menschlichen freien Sekretkomponente und die Anordnung der Disulfidbrucken. Hoppe-Seylers Z. Physiol Chem. 365, 1489–1495
Fallgreen-Gebauer, E., Gebauer, W., Bastian, A., Kratzin, H. D., Eiffert, H., Zimmermann, B., Karas, M. and Hilschman, N. (1993) The covalent linkage of secretory component to IgA. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374, 1023–1028
Feng, N., Burns, J. W., Bracy, L. and Greenberg, H. B. Comparison of mucosal and systemic humoral immune responses and subsequent protection in mice orally inoculated with a homologous or a heterologous rotavirus. (1994) J. Virol.: 68, 7766–7773
Frutiger, S., Hughes, G. J., Hanly, W. C., Kingzette, M. and Jaron, J. C. (1986) The amino terminal domain of rabbit secretory component is responsible for noncovalent binding to immunoglobulin A dimers. J. Biol. Chem. 261, 16673–16681
Garcia-Pardo, A., Lamm, M. F., Plaut, A. G. and Frangione, B. (1981) J chain is covalently bound to both monomer subunits in human secretory IgA. J. Biol. Chem. 256, 11734–11738
Gefter et al., Somatic Cell Genet. 3: 231–236 (1977)
Goding, 1986, in Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2d ed., Orlando, Fla., Academic Press, 1986, pp. 60–61, 65–66, 71–74.
Grzych, J. M., Grezel, D., Xu, C., Neyrinck, J. L., Capron, M., Ouma, J. H., Butterworth, A. E. and Capron, A. (1993) IgA antibodies to a protective antigen in human Schistosoma mansoni. J. Immunol. 150, 527–535.
Hajishengallis, G., Nikolova, E. and Russell, M. W. (1992) Inhibition of Streptococcus mutans adherence to saliva coated hydroxy-apatite by human secretory antibodies to cell surface protein antigen I/II: reversal by IgA protease cleavage. Infect. Immunol. 60, 5057–5064
Haseman, C. and Capra, J. D. High-level production of a functional immunoglobulin heterodimer in a baculovirus expression system. (1990) Proc. Natl. Acad Sci. USA: 87, 3942–3946
Hendrickson, B. A., Conner, D. A., Ladd, D. J., Kendall, D., Casanova, J. E., Corthesy, B., Max, E. E., Neutra, M. R., Seidman, C. E. and Seidman, J. G. (1995) Altered hepatic transport of immunoglobulin A in mice lacking the J chain. J. Exp. Med. 182, 1905–1911
Hendrickson, B. A., Rindisbacher, L., Corthesy, B., Kendall, D., Waltz, D. A., Neutra, M. R., and Seidman, J. G. (1996) Lack of association of secretory component with IgA in J chain-deficient mice. J. Immunol. 157, 750–754
Jewett, A., Giorgi, J. V. and Bonavida, B. (1990) Antibody-dependent cellular cytotoxicity against HIV-coated target cells by peripheral blood monocytes from HIV seropositive asymptomatic patients. J. Immunol. 145, 4065–4071
Jonard, P. P., Rambaud, J. C., Dive, C., Vaerman, J. P., Galian, A. and Delacroix, D. (1984) Secretion of immunoglobulins and plasma proteins from the jejunal mucosa. Transport rate and orgin of polymeric imunoglobulin A. J. Clin. Inv. 74, 525–35
Kaetzel, C. S., Robinson, J. K. and Lamm, M. E. (1994) Epithelial transcytosis of monomeric IgA and IgG cross linked through antigen to polymeric IgA. J. Immunol. 152, 72–78
Kaetzel, C. S., Robinson, J. K., Chintalacharvuvu, K. R., Vaerman, J. P. and Lamm, M. E. (1991) The polymeric immunoglobulin receptor (secretory component) mediates transport of immune complexes across epithelial cells: A local defense function for IgA. Pro. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8796–8800
Kamani, N., Krilov, L. R., Wittek, A. E. and Hendry, R. M. (1989) Characterization of the serologic profile of children with human immunodeficiency virus infection: correlation with clinical status. Clin. Immunol. and Immunopath. 53. 233–242
Karpas, A., Hill, F., Youle, M., Cullen, V., Gray, J., Byron, N., Hayhoe, F., Tenant-Flowers, M., Howard, L., Gilgen, D., Oates, J. K., Hawkins, D. and Gazzard, B. Effects of passive immunization in patients with the acquired immunodeficiency syndrome-related complex and acquired immunodeficiency syndrome. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 85, 9234–9237
Kaul, T. N., Welliver, R. C. and Ogra, P. L. (1981) Comparison of fluorescent-antibody, neutralizing-antibody, and complement-enhanced neutralizing-antibody assays for detection of serum antibody to respiratory syncytial virus. J. Clin. Microbiol. 13: 957–962
Kilian, M., Mestecky, J. and Russell, M. W. (1988) Defense mechanisms involving Fc-dependent functions of immunoglobulin A and their subversion by bacterial immunoglobulin A proteases. Microbiol. Rev. 52, 296–303
Kitani, S., Ito, K. and Miyamoto, T. (1985) IgG, IgA, and IgM antibodies to mite in sera and sputa from asthmatic patients. Ann. Allergy 55, 612–620
Kohler and Milstein, Nature 256: 495–497 (1975)
Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511–519 (1976)
Koshland, M. F. (1985) The coming of age of the immunoglobulin J chain. Ann. Rev. Immunol. 3, 425–453
Kozlowski, P. A. and Jackson, S. Serum IgA subclasses and molecular forms in HIV infection: Selective increases in monomer and apparent restriction of the antibody response to IgA1 antibodies mainly directed at env glycoproteins. (1992) AIDS Res. & Hum. Retrovir.: 8, 1773–1780
Kuhn, L. C. and Kraehenbuhl, J. P. (1979) Interaction of rabbit secretory component with rabbit IgA dimer. J. Biol. Chem. 254, 11066–11071
Kurita, T., Kiyono, H., Komiyama, K., Grossi, C. E., Mestecky, J. and McGhee, J. R. (1986) Isotype-specific immunoregulation; characterization and function of Fc receptors on T-T hybridomas which produce murine IgA-binding factor. J. Immunol. 136, 3953–3960
Lake, D. F., Kawamura, T., Tomiyama, T., Robinson, W. E., Matsumoto, Y. and M. H. E. (1992) Generation and characterization of a human monoclonal antibody that neutralizes diverse HIV-1 isolates in vitro. AIDS 6, 17–24
Lamkhioued, B., Gounni, A. S., Gruart, V., Pierce, A., Capron, A. and Capron, M. (1995) Human eosinophils express a receptor for secretory component. Role in secretory IgA-dependent activation. Eur. J. Immunol. 25, 117–125
Liew, T. N., Russell, S. M., Appleyard, G., Brand, C. M. and Beale, J. (1984) Cross protection in mice infected with influenza virus is correlated with local IgA activity rather than serum antibody or cytotoxic T cell reactivity. Eur. J. Immunol. 14, 350
Lindh, E. and Bjork, I. (1974) Binding of secretory component to dimers of immunoglobulin A in vitro. Eur. J. Biochem. 45, 261–268
Livingston, R. A., Hutton, N., Halsey, N. A., Kline, R. L., Joyner, M. and Quinn, T. C. Human immunodeficiency virus-specific IgA in infants born to human immunodeficiency virus-seropositive women. (1995) Arch. Ped. Adoles. Med.: 149, 503–507
Lucisano-Valim, Y. M. and Lachmann, P. J. (1991) The effect of antibody isotype and antigenic epitope density on the complement-fixing activity of immune complexes: a systematic study using chimaeric anti-NIP antibodies with human Fc regions. Clin. Exp. Immunol. 84, 1–8
Luciw, P. A., Pratt-Lowe, E., Shaw, K. E. S., Levy, J. A. and Cheng-Mayer, C. (1995) Persistent infection of rhesus macaques with T-cell-line-tropic and macrophage-tropic clones of simian/human immunodeficiency viruses (SHIV). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,
Maliezewski, C. R., March, C. J., Schoenborn, M. A., Gimpel, S. and Shen, L. (1990) Expression cloning of a human Fc receptor for IgA. J. Exp. Med. 172., 1665–1672
Marx, P. A., Compans, R. W., Gettie, A., Staas, J. K., Gilley, R. M., Mulligan, M. J., Yamshcikov, G. V., Chen, D. and Eldridge, J. H. (1993) Protection against vaginal SIV transmission with microencapsulated vaccine. Science 260, 1323–1327
Matsuda, S., Oka, S., Honda, M., Takebe, Y. and Takemori, T. Characteristics of IgA antibodies against HIV-1 in sera and saliva from HIV seropositive individulas in different clinical stages. (1993) Scand. J. Immunol.: 38, 428–434
Max, E. E. and Korsmeyer, S. J. (1985) Immunoglobulin J chain gene. Structure and expression in B lymphoid cells. J. Exp. Med. 161, 832–849
Mazanec, M. B., Kaetzel, C. S., Lamm, M. E., Fletcher, D. and Nedrud, J. G. (1992) Intracellular neutralization of virus by IgA antibodies. Pro. Natl. Acad Sci USA 89, 7252–7256
McCafferty J., Griffiths, A. D., Winter, G. and Chiswell D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature 348: 552–554
Mestecky, J. and McGhee. J. R. (1987) Immunoglobulin A (IgA): molecular and cellular interactions involved in IgA biosynthesis and immune response. Adv. Immunol. 40, 153–245
Miller, C. J., Alexander, N. J., Sutjipto, S., Lackner, A. A., Gettie, A., Hendrikx, A. G., Lowenstein, L. J., Jennings, M. and Marx, P. A. (1989) Genital mucosal transmission of simian immunodeficiency virus: Animal model for heterosexual transmission of human immunodeficiency virus. J. Virol. 63, 4277–4284
Moore, J. P., McKeating, J. A., Norton, W. A. and Sattentau, Q. J. (1991) Direct measurement of soluble CD4 binding to human immunodeficiency virus type 1 virions: gp120 dissociation and its implications for virus-cell binding and fusion reactions and their neutralization by soluble CD4. J. Virol. 65, 1133–1140
Monteiro, R. C., Hostoffer, R. W., Cooper, M. D., Bonner, J. R., Gartland, G. L. and Kubagawa, H. (1993) Definition of immunoglobulin A receptors on eosinophils and their enhanced expression in allergic individuals. J. Clin. Inv. 92, 1681–1685
Monteiro, R. C., Kubagawa, H. and Cooper, M. D. (1990) Cellular distribution, regulation and biochemical nature of an Fcα receptor in humans. J. Exp. Med. 148, 597–613
Moran, M., Andris, J., Matsumato, Y. I., Capra, J. D. and Hersh, E. (1993) Variable region genes of anti HIV human monclonal antibodies: Non-restricted use of the V gene repertoire and extensive somatic mutation. Mol. Immunol. 30, 1543–1551
Mostov, K. E. (1994) Transepithelial transport of immunoglobulins. Ann. Rev. Immunol. 12, 63–84
Mostov, K. E. and Blobel, G. (1982) A transmembrane precursor of secretroy component. The receptor for transcellular transport of polymeric immunoglobulins. J. Biol. Chem. 257, 11816–11821
Mostov, K. E. and Deitcher, D. L. (1986) Polymeric immunoglobulin receptor expressed in MDCK cells transcytoses IgA. Cell 46, 613–621
Mostov, K. E., Freidlander, M. and Blobel, G. (1984) The receptor for transepithelial transport of IgA and IgM contains multiple immunoglobulin-like domains. Nature 308, 37–43
O'Reilly, D. R., Miller, L. K. and Luckow, V. A. (1992) Baculovirus expression vectors. A laboratory Manual. W. H. Freeman and Co., New York.
Ogra, P. L., and Karzon, D. T. (1970) The role of immunoglobulins in the mechanism of mucosal immunity to virus infection. Pediatr. Clin. North. Amer. 17: 385–388
Palca, J. (1991) Is the AIDS epidemic slowing? Science 246, 1560
Popper, H., Pongratz, M. and Lanzer, G. (1982) IgA2-alveolitis and eosinophilic pneumonia-a possibly virus-triggered allergy. Allergologia et Immunopathologia. 10, 177–84
Potter, K. N., Li, Y., Pascual, V., Williams, R. C., Byres, L. C., Spellerberg, M., Stevenson, F. K. and Capra, J. D. (1993a) Molecular characterization of a cross-reactive idiotope on human immunoglobulins utilizing the VH4-21 gene segment. J. Exp. Med., 178: 1419–1428
Patter, K. N., Li, Y. and Capra, J. D. (1993b) Antibody production in the baculovirus expression system. Int. Rev. Immunol. 10: 103–112
Putnam, F. W., Liu, Y. S. V. and Low, T. L. K. (1979) Primary structure of a human IgA1 immunoglobulin. J. Biol. Chem. 254, 2865–2874
Re, M., Furlini, G., Vignoli, M., Ricchi, E., Ramazzotti, E., Bianchi, S., Guerra, B., Costigliola, P. and LaPlaca, M. (1992) Vertical transmission of human immunodeficiency virus type 1: Prognostic value of IgA antibody to HIV1 polypeptides during pregnancy. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 15, 553–556
Roque-Barriera, M. C. and Campos-Neto, A. (1985) Jacalin: an IgA-binding lectin. J. Immunol. 134, 1740–1743
Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sawyer, L. A., Katzenstein, D. A., Hendry, R. M., Boone, E. J., Vujcic, L. K., Williams, C. C., Zeger, S. L., Saah, A. J., Rinaldo, C. R., Phair, J. P., Giorgi, J. V. and Quinnan, G. V. (1990) Possible beneficial effects of neutralizing antibodies and antibody-dependent, cell-mediated cytotoxicity in human immunodeficiency virus infection. AIDS Res. and Human Retroviruses 6, 341–356
Shen, L., Lasser, R. and Fanger, M. W. (1989) My 43, a monoclonal antibody that reacts with human myeloid celis inhibits monocyte IgA binding and triggers function. J. Immunol. 143, 4117–4122
Summers, M. D. and Smith, G. E. (1987) Baculovirus as an expression system, Tex. Agric Exp. St. Bull. 1555, 1–56
Tamer, C. S., Lamm, M. F., Robinson, J. K., Piskurich, J. F. and Kaetzel, C. S. (1995) Comparative studies of transcytosis and assembly of secretory IgA in Madin-Darby canine kidney cell expressing human polymeric Ig receptor. J. Immunol. 155, 707–714
Tamura, T., Chiba, Y., Chiba, S. and Nakao, T. (1980) Virus excretion and neutralizing antibody response in saliva in human cytomegalovirus infection. Infect. Immun. 29: 427
Tarkowski, A., Lue, C., Moldoveneau, Z., Kiyono, H., McGhee, J. R. and and Mestecky, J. (1990) Immunization of humans with polysaccharide vaccines induces systemic predominantly IgA2-subclass antibody responses. J. Immunol. 144, 3770–3778
Taylor, H. P. and Dimmock, N. J. (1985) Mechanism of neutralization of influenza virus by secretory IgA is different from that of monomeric IgA or IgG. J. Exp. Med. 161: 198–205
Torano, A. and Putnam, F. W. (1978) Complete amino acid sequence of the a2 heavy chain of a human IgA2 immunoglobulin of the A2 in (2) allotype. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 966–969
Tsuzukida, Y., Wang, C. C. and Putnam, F. W. (1979) Structure of the A2m(1) allotype of human IgA-A recombinant molecule. Proc. Natl. Acad Sci. USA 76, 1104–1108
Underdown, B. J. (1990) In Fc Receptors and the Action of Antibodies, ed. Metzger, H. (American Society for Microbiology, Washington D.C.), pp. 74–93
Underdown, B. J. and Schiff, J. M. (1986) Immunoglobulin A: strategic defense initiative at the mucosal surface. Ann. Rev. Immunol. 4, 389–417
Underdown, B. J., De Rose, J. and Plaut, A. (1977) Disulfide bonding of secretory component to a single monomer subunit in human secretory IgA. J. Immunol 118, 1816–1821
Vittecoq, D., Chevret, S., Morand-Joubert, L., Heshmati, F., Audat, F., Bary, M., Dusautior, T., Bismuth, A., Viard, J. P., Barre-Sinoussi, F., Bach, J. F. and Lefrere, J. J. (1995) Passive immunotherapy in AIDS: A double-blind study based on transfusions of plasma rich in anti-human immunodeficiency virus 1 antibodies vs. transfusions of seronegative plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1195–1199
Vittecoq, D., Chevret, S., Morand-Joubert, L., Heshmati, F., Audat, F., Bary, M., Dusautior, T., Bismuth, A., Viard, J. P., Barre-Sinoussi, F., Bach, J. F. and Lefrere, J. J. Passive immunotherapy in AIDS: A double-blind study based on transfusions of plasma rich in anti-human immunodeficiency virus 1 antibodies vs. transfusions of seronegative plasma. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 92, 1195–1199
Wang, Y., Ben, K., Cao, X. and Wang, Y. (1996) Transport of anti-sperm monoclonal IgA and IgG into murine male and female genital tracts from blood. Effect of sex hormones. J. Immunol. 156, 1014–1019
Weisbart, R. H., Kacena, A., Schuh, A. and Golde, D. W. (1988) GM-CSF induces human neutrophil IgA-mediated phagocytosis by an IgA Fc receptor activation mechanism. Nature 332, 647–648
Winter, G., Griffiths, A. D., Hawkins, R. E. and Hoogenboom, H. R. (1994) Making Antibodies by Phage Display Technology. Ann Rev Immunol. 12: 433–55
Yao, Q. Y., Rowe, M., Morgan, A. J., Sam, C. K., Prasad, U., Dang, Y. and Rickinson, A. J. (1991) The Epstein-Barr virus carrier state: dominance of a single growth-transforming isolate in the blood and in the oropharynx of healthy virus carriers. Int. J. Cancer 48: 45–49
Zikan, J., Mestecky, J., Kulhavy, R. and Bennet, J. C. (1986) The stochiometry of J chain in human dimeric IgA. Mol. Immunol. 23, 541–544

Claims

Antikörper, umfassend eine VH-Domäne, fusioniert an eine erste IgA1 C.alpha.3-Domäne einschließlich eines Schwanzstückes, und umfassend eine VL-Domäne, fusioniert an eine zweite IgA1 C.alpha.3-Domäne einschließlich eines Schwanzstückes, wobei die VL- und VH-Domänen eine Antigen- oder Haptenerkennungsstelle konstituieren, und wobei der Antikörper keine andere Antikörperdomäne umfasst, die für eine Dimerisierung essenziell ist.
Dimerer IgA-Antikörper, umfassend zwei Antikörper gemäß Anspruch 1, die durch eine J-Kette verbunden sind.
Antikörper gemäß Anspruch 2, dispergiert in einer pharmazeutisch verträglichen Lösung.
Antikörper gemäß Anspruch 1, wobei die C.alpha.3-Domäne humane C.alpha.3-Domänen sind.
Antikörper gemäß Anspruch 1, wobei das Antigen ein virales, bakterielles oder protozoisches Antigen ist.
Antikörper gemäß Anspruch 5, wobei das Antigen ein Virus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 6, wobei das Virus Influenza A, B oder C, Parainfluenza, Paramyxovirus, das Newcastle-Disease-Virus, das Respiratory Syncytial Virus, Masern, Mumps, Adenovirus, adeno-assoziiertes Virus, Parvovirus, Epstein-Barr-Virus, Rhinovirus, Coxsackievirus, Echovirus, Reovirus, Rhabdovirus, lymphozytisches Choriomeningitisvirus, Coronavirus, Poliovirus, Herpes simplex, das humane Immundefizienzvirus, Cytomegalovirus, Papillomavirus, das Virus B, Varicella zoster, das Pockenvirus, Röteln, Tollwut, Picornavirus oder Rotavirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein humanes Immundefizienzvirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 8, wobei der Antikörper immunreaktiv mit gp120 von HIV ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Influenza A Virus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Influenza B Virus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Influenza C Virus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Parainfluenzavirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Paramyxovirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Newcastle-Disease-Virus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Respiratory Syncytial Virus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Masernvirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Mumpsvirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Adenovirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein adeno-assoziiertes Virus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Parvovirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Epstein-Barr-Virus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Rhinovirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Coxsackievirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Echovirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Reovirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Rhabdovirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein lymphozytisches Choriomeningitisvirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Coronavirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Poliovirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Herpes simplex Virus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Cytomeglovirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Papillomavirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Virus B ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Varicella zoster Virus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Pockenvirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Rötelnvirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Tollwutvirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Picornavirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei das Virus ein Rotavirus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 5, wobei das Antigen ein Bakterium ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien Pneumokokken, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus equi, Streptococcus canis, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Streptococcus anginosus, Streptococcus sanguis, Streptococcus salivarius, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, viridans streptococci, peptostreptococci, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Staphylococcus epidennidis, Staphylococcus aureus, Hemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas pseudomallei, Pseudomonas mallei, Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella abortus, Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium hemolyticum, Corynebacterium equi, Listeria monocytogenes, Nocordia asteroides, Actinomycetes, Treponema pallidum, Leptospirosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus, Serratia, Acinetobacter, Yersinia pestis, Francisella tulrensis, Enterobacter, Bacteriodes oder Legionella sind.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien Pneumokokken sind.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Streptococcus pyogenes ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Streptococcus agalactiae ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Streptococcus equi ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Streptococcus canis ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Streptococcus bovis ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Streptococcus equinus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Streptococcus anginosus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Streptococcus sanguis ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Streptococcus salivarius ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Streptococcus mitis ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Streptococcus mutans ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein viridans streptococci ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein peptostreptococci ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Enterococcus faecalis ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Enterococcus faecium ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Staphylococcus epidermidis ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Staphylococcus aureus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Hemophilus influenzae ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Pseudomonas aeruginosa ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Pseudomonas pseudomallei ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Pseudomonas mallei ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Brucella melitensis ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Brucella suis ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Brucella abortus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Bordetella pertussis ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Neisseria meningitidis ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Neisseria gonorrhoeae ist
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Moraxella catarrhalis ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Corynebacterium diphtheriae ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Corynebacterium ulcerans ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Corynebacterium pseudotuberculosis ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Corynebacterium pseudodiphtheriticum ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Corynebacterium urealyticum ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Corynebacterium hemolyticum ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Corynebacterium equi ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Listeria monocytogenes ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Nocordia asteroides ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Actinomycetes ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Treponema pallidum ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Leptospirosa ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Klebsiella pneumoniae ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Escherichia coli ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Proteus ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Serratia ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Acinetobacter ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Yersinia pestis ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Francisella tularensis ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Enterobacter ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Bacteriodes ist.
Antikörper gemäß Anspruch 41, wobei die Bakterien ein Legionella ist.
Antikörper gemäß Anspruch 5, wobei das Antigen ein ein Protozoon ist.
Antikörper gemäß Anspruch 94, wobei das Protozoon ein Cryptosporidium ist.
Antikörper gemäß Anspruch 94, wobei das Protozoon ein Isospora belli ist.
Antikörper gemäß Anspruch 94, wobei das Protozoon ein Toxoplasma gondii ist.
Antikörper gemäß Anspruch 94, wobei das Protozoon ein Trichomonas vaginalis ist.
Antikörper gemäß Anspruch 94, wobei das Protozoon ein Cyclospora ist.
Antikörper gemäß Anspruch 94, wobei das Protozoon ein Chlamydia trachomatis ist.
Antikörper gemäß Anspruch 94, wobei das Protozoon ein Chlamydia psittaci ist.
Antikörper gemäß Anspruch 94, wobei das Protozoon ein Chlamydia pneumoniae ist.