DE69836729T2

DE69836729T2 - Anti-vefg antibodies

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Publication number: DE69836729T2
Application number: DE69836729T
Authority: DE
Inventors: Manuel Baca; A. James Burlingame WELLS; G. Leonard San Francisco PRESTA; B. Henry El Granada LOWMAN; Man-Yee Yvonne San Mateo CHEN
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-04-07
Filing date: 1998-04-03
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2018-04-04
Also published as: ATE349470T1; DE122005000050I1; EP1650220A2; NO2007014I1; WO1998045331A3; EP1325932B1; EP1650220B1; JP3957765B2; PT1325932E; LU91167I2; US20050112126A1; CN100480269C; NL300193I1; NO2007015I1; BR9809387A; TR199903123T2; WO1998045331A2; GEP20105118B; EP1787999A1; NZ500078A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen Anti-VEGF-Antikörper und insbesondere humanisierte Anti-VEGF-Antikörpervarianten.
Beschreibung verwandter Gebiete
Es ist heute allgemein bekannt, dass Angiogenese mit der Pathogenese bei verschiedenen Störungen zusammenhängt. Dazu gehören feste Tumoren, intraokulare Neovaskularisationssyndrome wie z.B. proliferative Retinopathien oder altersbedingte Makuladegeneration (AMD), rheumatoide Arthritis und Psoriasis (Folkman et al., J. Biol. Chem. 267, 10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53, 217-239 (1991); und Garner A., Vascular diseases, in: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach, S. 1625-1710, Garner A., Klintworth GK., Hrsg., 2. Aufl., Marcel Dekker, NY, USA (1994)). Im Falle von festen Tumoren gewinnen die Tumorzellen durch die Neovaskularisation einen Wachstumsvorteil und proliferative Autonomie gegenüber normalen Zellen. Demgemäß wurde eine Verbindung zwischen der Dichte von Mikrogefäßen in Tumorschnitten und der Überlebensrate von Patienten bei Brustkrebs sowie bei verschiedenen anderen Tumoren beobachtet (Weidner et al., N. Engl. J. Med. 324, 1-6 (1991); Horak et al., Lancet 340, 1120-1124 (1992); und Macchiarini et al., Lancet 340, 145-146 (1992)).
Die Suche nach positiven Regulatoren für Angiogenese hat viele Möglichkeiten ergeben, einschließlich aFGF, bFGF; TGF-α, TGF-β, HGF, TNF-α, Angiogenin, IL-8 usw. (Folkman et al. und Klagsbrun et al.). Die bisher identifizierten negativen Regulatoren umfassen Thrombospondin (Good et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6624-6628 (1990)), das 16 Kilodalton schwere N-terminale Fragment von Prolactin (Clapp et al., Endocrinology 133, 1292-1299 (1993)), Angiostatin (O'Reilly et al., Cell 79, 315-328 (1994)) und Endostatin (O'Reilly et al., Cell 88, 277-285 (1996)).
Die Arbeiten der letzten Jahre haben die Schlüsselrolle des Gefäßendothelwachstumsfaktors (VEGF) bei der Regulierung von normaler und anomaler Angiogenese aufgezeigt (Ferrara et al., Endocr. Rev. 18, 4-25 (1997)). Die Erkenntnis, dass der Verlust eines einzigen VEGF-Allels zu embryonaler Letalität führt, weist auf die unersetzbare Rolle dieses Faktors bei der Entwicklung und Differenzierung des Gefäßsystems hin (Ferrara et al.). Außerdem zeigte sich, dass VEGF im Zusammenhang mit Tumoren und intraokularen Störungen ein wichtiger Neovaskularisationsmediator ist (Ferrara et al.). Die VEGF-mRNA wird von den meisten menschlichen Tumoren, die untersucht wurden, überexprimiert (Berkman et al., J. Clin. Invest. 91, 153-159 (1993); Brown et al., Human Pathol. 26, 86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res. 53, 4727-4735 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer 73, 931-934 (1996); und Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146, 1029-1039 (1995)). Darüber hinaus steht die VEGF-Konzentration in Augenflüssigkeiten stark mit der Gegenwart aktiver Proliferation von Blutgefäßen bei Patienten mit Diabetes oder anderen mit Ischämie zusammenhängenden Retinopathien in Wechselbeziehung (Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331, 1480-1187 (1994)). Neuere Untersuchungen haben außerdem die Lokalisierung von VEGF in choroidalen Neovaskularisationsmembranen bei Patienten mit AMD ermöglicht (Lopez et al., Invest. Ophthalmo. Vis. Sci. 37, 855-868 (1996)). Anti-VEGF-Neutralisierungsantikörper unterdrücken in Nacktmäusen das Wachstum verschiedener menschlicher Tumorzelllinien (Kim et al., Nature 362, 841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95, 1789-1797 (1995); Borgström et al., Cancer Res. 56, 4032-4039 (1996); und Melnyk et al., Cancer Res. 56, 921-924 (1996)) und hemmen außerdem intraokulare Angiogenese in Modellen von ischämischen Netzhauterkrankungen (Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114, 66-71 (1996)). Eine Übersicht über die Humanisierung von Antikörpern findet sich in Bending, Methods: Comp. Meth. Enzy. 8,83-93 (1995). Auch die WO92/22653 betrifft die Humanisierung von Antikörpern. Daher sind monoklonale Anti-VEGF-Antikörper oder andere Inhibitoren von VEGF-Wirkung viel versprechende Kandidaten für die Behandlung von festen Tumoren und verschiedenen intraokularen Neovaskularisationsstörungen.
Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16), 10678-10684 (1997) beschreiben ein Phagendisplay-Verfahren zur Humanisierung von Anti-VEGF-Antikörpern durch Zufallsmutagenese von bestimmten Rahmenresten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung beschreibt humanisierte Anti-VEGF-Antikörpervarianten, wie sie in den Ansprüchen definiert sind, mit vom therapeutischen Standpunkt gesehen erwünschten Eigenschaften, einschließlich starker Bindungsaffinität für VEGF; der Fähigkeit, VEGF-induzierte Proliferation von Endothelzellen in vitro zu hemmen; und der Fähigkeit, VEGF-induzierte Angiogenese in vivo zu hemmen.
Der hierin bevorzugte humanisierte Anti-VEGF-Antikörpervariante bindet menschlichen VEGF mit einem K_d-Wert von nicht mehr als etwa 1 × 10^-8 M und vorzugsweise nicht mehr als etwa 5 × 10^-9 M. Außerdem kann die humanisierte Anti-VEGF-Antikörpervariante einen ED50-Wert von nicht mehr als etwa 5 nM aufweisen, um VEGF-induzierte Proliferation von Endothelzellen in vitro zu hemmen. Die humanisierte Anti-VEGF-Antikörpervariante, die hierin von speziellem Interesse sind, sind solche, die in einem A673-In-vivo-Tumormodell zumindest etwa 50 % des Tumorwachstums hemmen, und zwar bei einer Antikörperdosis von 5 mg/kg.
Wie in den Ansprüchen definiert stellt die Erfindung eine Variante eines Anti-VEGF-Stammantikörpers bereit (wobei der Stammantikörper der humanisierte Anti-VEGF-Antikörper F(ab)-12 ist), worin die Variante menschlichen VEGF bindet und zumindest im CDRH1 und/oder CDRH3 der variablen Schwerketten- oder Leichtketten-Domäne des Anti-VEGF-Stammantikörpers eine Aminosäuresubstitution umfasst. Die Variante weist vorzugsweise eine oder mehrere Substitutionen in einer oder mehreren hypervariablen Regionen des Anti-VEGF-Antikörpers auf. Vorzugsweise gibt es Substitutionen in beiden dieser hypervariablen Regionen. Wie hierin gezeigt wird, binden solche "affinitätsgereiften" Varianten menschlichen VEGF stärker als der Anti-VEGF-Stammantikörper, aus dem sie gebildet wurden, d.h. sie weisen einen K_d-Wert auf, der bedeutend niedriger ist als der des Anti-VEGF-Stammantikörpers. Vor zugsweise weist die Variante einen ED50-Wert zur Hemmung der VEGF-induzierten Proliferation von Endothelzellen in vitro auf, der zumindest 10-mal niedriger ist, vorzugsweise zumindest 20-mal niedriger ist, insbesondere zumindest etwa 50-mal niedriger als der des Anti-VEGF-Stammantikörpers. Eine besonders bevorzugte Variante ist die Y0317-Variante aus Beispiel 3, die eine CDRH1, welche die Aminosäuresequenz GYDFTHYGMN (Seq.-ID Nr. 126) aufweist, und eine CDRH3, welche die Aminosäuresequenz YPYYYGTSHWYFDV (Seq.-ID Nr. 127) aufweist, umfasst. Diese hypervariablen Regionen und CDRH2 sind im Allgemeinen in einer menschlichen Gerüstregion bereitgestellt, was beispielsweise eine variable Schwerketten-Domäne ergibt, welche die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 116 umfasst. Solche variablen Schwerketten-Domänensequenzen sind gegebenenfalls mit einer variablen Leichtketten-Domäne kombiniert, welche die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 124 umfasst, und vorzugsweise mit der Aminosäuresequenz der variablen Leichtketten-Domäne von Seq.-ID Nr. 115.
Hierin werden verschiedene Formen des Antikörpers behandelt. Der Anti-VEGF-Antikörper kann beispielsweise ein Antikörper voller Länge (z.B. mit einer intakten menschlichen Fc-Region) oder ein Antikörperfragment (z.B. Fab, Fab' oder F(ab')2) sein. Außerdem kann der Antikörper mit einer detektierbaren Markierung markiert, auf einer festen Phase immobilisiert und/oder mit einer heterologen Verbindung (wie beispielsweise einem zytotoxischen Mittel) konjugiert sein.
Auch diagnostische und therapeutische Verwendungen des Antikörpers werden untersucht. Bei einer diagnostischen Anwendung stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart eines VEGF-Proteins bereit, bei dem eine Probe, die vermutlich das VEGF-Protein enthält, dem Anti-VEGF-Antikörper ausgesetzt und die Bindung des Antikörpers an die Probe bestimmt wird. Für diese Anwendung stellt die Erfindung ein Set bereit, das den Antikörper und Anleitungen zur Verwendung des Antikörpers zur Detektion des VEGF-Proteins enthält.
Die Erfindung stellt ferner Folgendes bereit: isolierte Nucleinsäure, die für den Antikörper kodiert; einen Vektor, der diese Nucleinsäure umfasst und gegebenenfalls operabel an Kontrollsequenzen gebunden ist, die von einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erkannt werden; eine Wirtszelle, die diesen Vektor umfasst; ein Verfahren zur Produktion des Antikörpers, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle, sodass die Nucleinsäure exprimiert wird, und gegebenenfalls das Gewinnen des Antikörpers aus der Wirtszellkultur (z.B. aus dem Wirtszellkulturmedium). Die Erfindung stellt ferner eine Zusammensetzung bereit, die den Anti-VEGF-Antikörper und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünner umfasst. Die Zusammensetzung zur therapeutischen Verwendung ist steril und kann gefriergetrocknet sein. Außerdem stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Säugetiers bereit, das an einem Tumor oder einer Netzhauterkrankung leidet, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge des Anti-VEGF-Antikörpers an das Säugetier.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1A und 1B zeigen die Aminosäuresequenzen einer variablen schweren Domäne (Seq.-ID Nr. 9) und leichten Domäne (Seq.-ID Nr. 10) des muMAb-VEGF A4.6.1, einer variablen schweren Domäne (Seq.-ID Nr. 7) und leichten Domäne (Seq.-ID Nr. 8) eines humanisierten F(ab) (F(ab)-12) und menschliche Consensus-Gerüste (humIII steht für die schwere Untergruppe III (Seq.-ID Nr. 11); humκ1 für die leichte κ-Untergruppe I (Seq.-ID Nr. 12)). In 1A sind variable schwere Domänensequenzen vergleichend angeordnet, und in 1B sind variable leichte Domänensequenzen vergleichend angeordnet. Sternchen weisen auf Unterschiede zwischen dem humanisierten F(ab)-12 und dem Mäuse-MAb oder zwischen dem F(ab)-12 und dem menschlichen Gerüst hin. Komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR) sind unterstrichen.
2 ist ein Banddiagramm des Modells der humanisierten F(ab)-12-VL- und -VH-Domäne. Die VL-Domäne ist braun dargestellt, wobei die CDRs heller gehalten sind. Die Seitenkette des Rests 146 ist gelb dargestellt. Die VH-Domäne ist violett darge stellt, wobei die CDRs rosa gehalten sind. Seitenketten von VH-Resten, die von menschlich zu mäuseartig geändert wurden, sind gelb dargestellt.
3 zeigt die Hemmung von VEGF-induzierter Mitogenese durch das humanisierte Anti-VEGF-F(ab)-12 aus Beispiel 1. Kapillarendothelzellen von der Rinder-Nebennierenrinde wurden wie in Beispiel 1 beschrieben mit einer Dichte von 6 × 10³ Zellen/Well in 6-Well-Platten geimpft. Entweder muMAb-VEGF A4.6.1 oder rhuMAb-VEGF (IgG1; F(ab)-12) wurde in den angegebenen Konzentrationen zugesetzt. Nach 2-3 Stunden wurde rhVEGF165 in einer Endkonzentration von 3 ng/ml zugesetzt. Nach fünf oder sechs Tagen wurden die Zellen trypsinisiert und gezählt. Die angeführten Werte sind Mittelwerte von doppelten Bestimmungen. Die Abweichung vom Mittel überstieg 10 % nicht.
4 zeigt die Hemmung von Tumorwachstum in vivo durch den humanisierten Anti-VEGF-F(ab)-12 aus Beispiel 1. A673-Rhabdomyosarkomzellen wurden in einer Dichte von 2 × 10⁶ pro Maus in BALB/c-Nacktmäuse injiziert. Ab 24 Stunden nach der Tumorzellinokulation wurden den Tieren zweimal wöchentlich intraperitoneal ein Kontroll-MAb, der muMAb-VEGF A4.6.1 oder ein rhuVEGF-MAb (IgG1, F(ab)-12) injiziert. Die Dosis des Kontroll-MAb betrug 5 mg/kg; die Anti-VEGF-MAbs wurden, wie angegeben, entweder in einer Dosis 0,5 oder von 5 mg/kg verabreicht (n=10). Vier Wochen nach der Tumorzellinjektion wurden die Tiere getötet und die Tumoren entfernt und gewogen. *: signifikanter Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe, bestimmt durch ANOVA (p < 0,05).
Die 5A und 5B zeigen die Aminosäuresequenzen der variablen Leicht- und Schwerkettendomänen des Mäuse-Antikörpers A4.6.1 (Seq.-ID Nr. 10 für die VL und Seq.-ID Nr. 9 für die VH) und der humanisierten A4.6.1-Varianten hu2.0 (Seq.-ID Nr. 13 für die VL und Seq.-ID Nr. 14 für die VH) und hu2.10 (Seq.-ID Nr. 15 für die VL und Seq.-ID Nr. 16 für die VH) aus Beispiel 2. Die Sequenz ist gemäß Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Aufl., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA (1991), nummeriert, und Fehlpaarungen sind durch Sterne (Mäuse-A4.6.1 im Vergleich zu hu2.0) oder Punkte (hu2.0 im Vergleich zu hu2.10) gekennzeichnet. hu2.0-Varianten enthalten nur die CDR-Sequenzen (fett) des Mäuseantikörpers, die auf ein menschliches Leichtketten-κ-Untergruppen-I-Consensusgerüst (Seq.-ID Nr. 12) und Schwerketten-Untergruppen-III-Consensusgerüst (Seq.-ID Nr. 11) aufgepfropft sind. hu2.10 war der humanisierte Consensus-Klon, der in den hierin beschriebenen Phagenklassierungsversuchen erhalten wurde.
6 zeigt Gerüstreste, die in Beispiel 2 Ziel einer Randomisierung sind.
7 zeigt das Phagemidkonstrukt zur Oberflächenpräsentation von Fab-pIII-Fusionen auf einem Phagen. Das Phagemid kodiert für eine humanisierte Version des Fab-Fragments für den Antikörper A4.6.1, der an einen Abschnitt des M13-Gen-III-Hüllproteins fusioniert ist. Das Fusionsprotein besteht aus dem Fab, das am Carboxylterminus der Schwerkette an einen einzelnen Glutaminrest (erhalten durch Suppression eines Amber-Codons in supE E. coli) gebunden ist, und der C-terminalen Region des Gen-III-Proteins (Reste 249-406). Eine Transformation in F⁺ E. coli, gefolgt von einer Superinfektion mit einem M13KO17-Helferphagen ergibt Phagemidteilchen, von denen ein kleiner Teil eine einzige Kopie des Fusionsproteins aufweisen.
Die 8A-E zeigen die doppelsträngige Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 99) für den Phagendisplay-Antikörpervektor phMB4-19-1.6 aus Beispiel 3 und die dadurch kodierten Aminosäuresequenzen (Seq.-ID Nr. 100 und 130).
Die 9A und 9B zeigen eine vergleichende Anordnung der Aminosäuresequenzen für die variablen Leicht- und Schwerkettendomänen von affinitätsgereiften Anti-VEGF-Varianten aus Beispiel 3 im Vergleich zu F(ab)-12 aus Beispiel 1 (Seq.-ID Nr. 8 und 7 für die leichte bzw. schwere variable Domäne). CDRs sind unterstrichen und mit L für Leichtkette und H für Schwerkette bezeichnet und mit den Zahlen 1-3 nummeriert. Reste sind, im Gegensatz zum Kabat-Nummerierungsschema, aufsteigend in den VL- und VH-Domänen nummeriert. Das Matrizenmolekül MB1.6 (Seq.-ID Nr. 101 und 102 für die leichte bzw. schwere variable Domäne) ist gemeinsam mit Varianten dargestellt: H2305.6 (Seq.-ID Nr. 103 und 104 für die leichte bzw. schwere variable Domäne), Y0101 (Seq.-ID Nr. 105 und 106 für die leichte bzw. schwere variable Domäne) und Y0192 (Seq.-ID Nr. 107 und 108 für die leichte bzw. schwere variable Domäne). Unterschiede zum F(ab)-12 sind eingerahmt.
Die 10A und 10B zeigen eine vergleichende Anordnung der Aminosäuresequenzen für die variablen Leicht- und Schwerkettendomänen von affinitätsgereiften Anti-VEGF-Varianten aus Beispiel 3 im Vergleich zu F(ab)-12 aus Beispiel 1 (Seq.-ID Nr. 8 und 7 für die leichte bzw. schwere variable Domäne). CDRs sind unterstrichen und mit L für Leichtkette und H für Schwerkette bezeichnet und mit den Zahlen 1-3 nummeriert. Die Varianten sind wie folgt bezeichnet: Y0243-1 (Seq.-ID Nr. 109 und 110 für die leichte bzw. schwere variable Domäne), Y0238-3 (Seq.-ID Nr. 111 und 112 für die leichte bzw. schwere variable Domäne), Y0313-1 (Seq.-ID Nr. 113 und 114 für die leichte bzw. schwere variable Domäne) und Y0317 (Seq.-ID Nr. 115 und 116 für die leichte bzw. schwere variable Domäne). Unterschiede zum F(ab)-12 sind eingerahmt.
11 zeigt die Ergebnisse des HuVEC-Aktivitätstests in Beispiel 3 für die Varianten Y0238-3, Y0192 und Y0313-1 sowie den F(ab)-12 voller Länge aus Beispiel 1.
12 zeigt die Hemmung von VEGF-induzierter Mitogenese durch das F(ab)-12 voller Länge aus Beispiel 1 (rhuMAb-VEGF), ein Fab-Fragment von F(ab)-12 aus Beispiel 1 (rhuFab-VEGF) und ein Fab-Fragment der affinitätsgereiften Variante Y0317 aus Beispiel 3 (rhuFab-VEGF (affinitätsgereift)).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
I. Definitionen
Der Begriff "menschlicher VEGF" bezieht sich hierin auf den 165 Aminosäuren umfassenden menschlichen Gefäßendothelzellenwachstumsfaktor und die damit verwandten 121, 189 und 206 Aminosäuren umfassenden Gefäßendothelzellenwachstumsfaktoren, wie sie von Leung et al., Science 246, 1306 (1989), und Houck et al., Mol. Endocrin. 5, 1806 (1991), neben den natürlich vorkommenden allelischen und verarbeiteten Formen dieser Wachstumsfaktoren beschrieben wurden.
Die vorliegende Erfindung stellt antagonistische Anti-VEGF-Antikörper bereit, die zur Hemmung einer oder mehrerer biologischer Aktivitäten von VEGF fähig sind, beispielsweise seiner mitogenen oder angiogenen Aktivität. Antagonisten von VEGF wirken, indem sie die Bindung von VEGF an einen zellulären Rezeptor stören, indem sie Zellen, die durch VEGF aktiviert wurden, untauglich machen oder töten oder indem sie die Gefäßendothelzellenaktivierung nach einer VEGF-Bindung an einen zellulären Rezeptor stören. All diese Eingriffe durch einen VEGF-Antagonisten sind zum Zwecke dieser Erfindung als gleichwertig zu betrachten.
Der Begriff "VEGF-Rezeptor" oder "VEGFr" bezieht sich hierin auf einen zellulären Rezeptor für VEGF, herkömmlicherweise einen Zelloberflächenrezeptor, der auf Gefäßendothelzellen vorkommt, sowie Varianten davon, welche die Fähigkeit beibehalten, hVEGF zu binden. Ein Beispiel für einen VEGF-Rezeptor ist die fms-artige Tyrosinkinase (fit), ein transmembraner Rezeptor aus der Familie der Tyrosinkinasen. DeVries et al., Science 255, 989 (1992); Shibuya et al., Oncogene 5, 519 (1990). Der flt-Rezeptor umfasst eine extrazelluläre Domäne, eine Transmembrandomäne und eine intrazelluläre Domäne mit Tyrosinkinaseaktivität. Die extrazelluläre Domäne wirkt an der Bindung von VEGF mit, während die intrazelluläre Domäne an der Signaltransduktion mitwirkt. Ein weiteres Beispiel für einen VEGF-Rezeptor ist der flk-1-Rezeptor (auch als KDR bezeichnet). Matthews et al., Proc. Nat. Acad. Sci 88, 9026 (1991); Terman et al., Oncogene 6, 1677 (1991); Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187, 1579 (1992). Die Bindung von VEGF an den fit-Rezeptor führt zur Bildung von zumindest zwei Komplexen mit hohem Molekulargewicht, wobei das scheinbare Molekulargewicht 205.000 bis 300.000 Dalton beträgt. Es wird angenommen, dass der Komplex mit 300.000 Dalton ein Dimer ist, das zwei Rezeptormoleküle umfasst, die an ein einziges Molekül von VEGF gebunden sind.
Der Begriff "Epitop A4.6.1" bezieht sich hierin, sofern nicht anders angegeben, auf die Region von menschlichem VEGF, an die der in Kim et al., Growth Factors 7, 53 (1992), und Kim et al., Nature 362, 841 (1993), offenbarte A4.6.1-Antikörper bindet.
"Behandlung" bezieht sich sowohl auf therapeutische als auch prophylaktische oder vorbeugende Maßnahmen. Behandlungsbedürftige Personen oder Tiere sind sowohl schon an der Erkrankung Leidende als auch solche, bei denen eine Erkrankung verhindert werden soll.
"Säugetier" bezieht sich für den Zweck der Behandlung auf beliebige Säugetiere, einschließlich Menschen, Zucht- und Nutztiere sowie Zoo-, Sport- oder Haustiere, wie z.B. Hunde, Pferde, Katzen, Kühe usw. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch.
"Antikörper" (Ab) und "Immunglobuline" (Ig) sind Glykoproteine mit den gleichen strukturellen Eigenschaften. Während Antikörper Bindungsspezifität gegenüber einem bestimmten Antigen aufweisen, umfassen Immunglobuline sowohl Antikörper als auch andere antikörperähnliche Moleküle ohne Antigenspezifität. Polypeptide der letzteren Art werden beispielsweise in kleinen Mengen vom Lymphsystem und in größeren Mengen von Myelomen produziert.
"Native Antikörper" und "native Immunglobuline" sind herkömmlicherweise heterotetramere Glykoproteine mit etwa 150.000 Dalton, die aus zwei identischen Leicht-(L-)Ketten und zwei identischen Schwer-(H-)Ketten bestehen. Jede Leichtkette ist über eine kovalente Disulfidbindung an eine Schwerkette gebunden, wobei die An zahl an Disulfidbindungen in Schwerketten je nach Immunglobulinisotyp variiert. Jede Schwer- und Leichtkette weist außerdem in regelmäßigen Abständen Disulfid-Brücken innerhalb der Kette auf. Jede Schwerkette hat an einem Ende eine variable Domäne (V_H), auf die eine Reihe von konstanten Domänen folgt. Jede Leichtkette weist eine variable Domäne an einem Ende (V_L) und eine konstante Domäne am anderen Ende auf; die konstante Domäne der Leichtkette ist mit der ersten konstanten Domäne der Schwerkette und die variable Domäne der Leichtkette ist mit der variablen Domäne der Schwerkette übereinstimmend angeordnet. Es wird angenommen, dass bestimmte Aminosäurereste eine Grenze zwischen den variablen Leicht- und Schwerkettendomänen bilden.
Der Begriff "variabel" bezieht sich auf die Tatsache, dass sich bei Antikörpern bestimmte Abschnitte der variablen Domänen in ihrer Sequenz stark unterscheiden und an der Bindung und Spezifität jedes einzelnen Antikörpers für ein bestimmtes Antigen mitwirken. Die Variabilität ist jedoch nicht gleichmäßig innerhalb der variablen Domänen von Antikörpern verteilt. Sie konzentriert sich in drei Segmenten, die hypervariable Regionen genannt werden, und zwar sowohl in den variablen Leichtketten- als auch Schwerkettendomänen. Die höher konservierten Abschnitte variabler Domänen werden Gerüstregionen (FR) genannt. Die variablen Domänen von nativen Schwer- und Leichtketten umfassen jeweils vier FRs (FR1, FR2, FR3 und FR4), die im Großen und Ganzen eine β-Faltblattkonfiguration annehmen und durch drei hypervariable Regionen verbunden sind, die Schleifen bilden, welche die β-Faltblattstruktur verbinden und in manchen Fällen einen Teil davon bilden. Die hypervariablen Regionen in jeder Kette werden durch die FRs eng zusammengehalten und tragen, zusammen mit den hypervariablen Regionen der anderen Kette, zur Bildung des Antigenbindungsorts von Antikörpern bei (siehe Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Aufl., S. 647-669, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA (1991)). Die konstanten Domänen wirken nicht direkt an der Bindung eines Antikörpers an ein Antigen mit, weisen jedoch einige Effektorfunktionen auf, wie beispielsweise die Mitwirkung des Antikörpers an antikörperabhängiger zellulärer Toxizität.
Der Begriff "hypervariable Region" bezieht sich hierin auf die Aminosäurereste eines Antikörpers, die für die Antigenbindung verantwortlich sind. Die hypervariable Region umfasst Aminosäurereste von einer "komplementaritätsbestimmenden Region" oder "CDR" (d.h. die Reste 24-34 (L1), 50-56 (L2) und 89-97 (L3) in der variablen Leichtkettendomäne und 31-35 (H1), 50-65 (H2) und 95-102 (H3) in der variablen Schwerkettendomäne; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Aufl., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA (1991)) und/oder solche Reste von einer "hypervariablen Schleife" (d.h. die Reste 26-32 (L1), 50-52 (L2) und 91-96 (L3) in der variablen Leichtkettendomäne und 26-32 (H1), 53-55 (H2) und 96-101 (H3) in der variablen Schwerkettendomäne; Chothia und Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)). "Gerüst-" oder "FR"-Reste sind jene Reste von variablen Domänen, die keine Reste einer hypervariablen Region sind, wie sie hierin definiert sind.
Papainverdau von Antikörpern produziert zwei identische antigenbindende Fragmente, die "Fab"-Fragmente genannt werden, wobei jedes eine einzige Antigenbindungsstelle aufweist, und ein "Fc"-Restfragment, dessen Name seine Fähigkeit widerspiegelt, leicht zu kristallisieren. Eine Pepsinbehandlung ergibt ein F(ab')₂-Fragment, das zwei Antigenbindungsstellen aufweist und immer noch zur Vernetzung von Antigenen fähig ist.
"Fv" ist das kleinste Antikörperfragment, das eine komplette Antigenerkennungs- und -bindungsstelle enthält. Diese Region besteht aus einem Dimer mit einer variablen Schwerketten- und einer variablen Leichtkettendomäne, die eng und nichtkovalent assoziiert sind. In dieser Konfiguration besteht eine Wechselwirkung zwischen den drei hypervariablen Regionen der einzelnen variablen Domänen, sodass eine Antigenbindungsstelle auf der Oberfläche des V_H-V_L-Dimers definiert wird. Zusammen verleihen die sechs hypervariablen Regionen dem Antikörper Antigenbindungsspezifität. Aber sogar eine einzige variable Domäne (oder ein halbes Fv, das nur drei hypervariable Regionen umfasst, die für ein Antigen spezifisch sind) weist die Fähigkeit auf, ein Antigen zu erkennen und zu binden, obgleich mit einer geringeren Affinität als bei der ganzen Bindungsstelle.
Das Fab-Fragment enthält außerdem die konstante Domäne der Leichtkette und die erste konstante Domäne (CH1) der Schwerkette. Fab'-Fragmente unterscheiden sich von Fab-Fragmenten durch das Hinzufügen einiger weniger Reste am Carboxylterminus der Schwerketten-CH1-Domäne, einschließlich eines oder mehrerer Cysteine von der Antikörper-Gelenksregion. Mit Fab'-SH wird hierin ein Fab' bezeichnet, in dem der/die Cysteinrest(e) der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe aufweisen. F(ab')₂-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten produziert, die Gelenks-Cysteine dazwischen aufweisen. Andere chemische Bindungen von Antikörperfragmenten sind ebenfalls bekannt.
Die "Leichtketten" von Antikörpern (Immunglobulinen) beliebiger Wirbeltiere können einer oder zwei klar abgegrenzten Arten zugeteilt werden, die aufgrund der Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen mit Kappa (κ) und Lambda (λ) bezeichnet werden.
Je nach der Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer Schwerketten können Immunglobuline unterschiedlichen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptgruppen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und einige davon können weiter in Subklassen (Isotypen) unterteilt werden, wie z.B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2. Die konstanten Schwerkettendomänen, die den unterschiedlichen Klassen von Immunglobulinen entsprechen, werden als α, δ, ε, γ bzw. μ bezeichnet. Die Struktur der Untereinheiten und die dreidimensionale Konfiguration der unterschiedlichen Klassen von Immunglobulinen sind allgemein bekannt.
Der Begriff "Antikörper" wird hierin im weitesten Sinne verwendet und umfasst insbesondere monoklonale Antikörper (einschließlich monoklonaler Antikörper voller Länge), polyklonale Antikörper, multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper) und Antikörperfragmente, solange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen.
"Antikörperfragmente" bezeichnen einen Abschnitt eines Antikörpers voller Länge, im Allgemeinen die antigenbindende oder eine variable Domäne davon. Beispiele für Antikörperfragmente umfassen Fab, Fab', F(ab')₂ und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper; Einkettenantikörpermoleküle; und aus Antikörperfragmenten gebildete multispezifische Antikörper.
Der Begriff "monoklonaler Antikörper" bezieht sich hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörper erhalten wurde, d.h. die einzelnen Antikörper der Population sind identisch, mit Ausnahme möglicher natürlich vorkommender Mutationen, die in geringerem Ausmaß vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind äußerst spezifisch und sind gegen eine einzige Antigenstelle gerichtet. Außerdem ist jeder monoklonale Antikörper, im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise unterschiedliche Antikörper umfassen, die gegen unterschiedliche Determinanten (Epitope) gerichtet sind, gegen eine einzige Determinante auf dem Antigen gerichtet. Der Modifikator "monoklonal" weist auf den Charakter des Antikörpers hin, dass er nämlich aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten wurde, und dient nicht dazu, dass der Antikörper durch ein bestimmtes Verfahren hergestellt sein muss. Die monoklonalen Antikörper zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung können beispielsweise durch das Hybridomverfahren, das zum ersten Mal von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde, oder durch DNA-Rekombinationsverfahren (siehe z.B. US-Patent Nr. 4.816.567) hergestellt werden. Die "monoklonalen Antikörper" können auch unter Verwendung der in Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), beschriebenen Verfahren aus Phagenantikörperbibliotheken isoliert werden.
Die monoklonalen Antikörper umfassen hierin insbesondere "chimäre" Antikörper (Immunglobuline), in denen ein Teil der Schwer- und/oder Leichtkette identisch mit oder homolog zu den entsprechenden Sequenzen in Antikörpern sind, die von einer bestimmten Spezies erhalten wurden oder zu einer bestimmten Antikörperklasse oder -subklasse gehören, während der Rest der Kette(n) identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die von einer anderen Spezies er halten wurden oder zu einer anderen Antikörperklasse oder -subklasse gehören, sowie Fragmente von solchen Antikörper, solange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen (US-Patent Nr. 4.816.567; und Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855 (1984)).
"Humanisierte" Formen von nichtmenschlichen (z.B. Mäuse-)Antikörpern sind chimäre Antikörper, die Minimalsequenz enthalten, die von einem nichtmenschlichen Immunglobulin stammt. Zum Großteil sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Rezipientenantikörper), worin die Reste der hypervariablen Region des Rezipienten durch Reste hypervariabler Regionen von einer nichtmenschlichen Spezies (Donorantikörper), wie beispielsweise Mäuse, Ratten, Kaninchen oder nichtmenschliche Primaten, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen sind Gerüstregion-(FR-)Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nichtmenschliche Reste ersetzt. Außerdem können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die nicht im Rezipientenantikörper oder Donorantikörper vorkommen. Diese Modifikationen werden vorgenommen, um die Antikörperleistung weiter zu verbessern. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle zumindest einer, typischerweise zweiter, variabler Domänen, worin alle oder im Wesentlichen alle hypervariablen Regionen jenen eines nichtmenschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle FRs von einer menschlichen Immunglobulinsequenz stammen. Der humanisierte Antikörper kann gegebenenfalls auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc) enthalten, typischerweise von einem menschlichen Immunglobulin. Für weitere Details siehe Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992).
"Einketten-Fv-" oder "sFv-" Antikörperfragmente umfassen die V_H- und V_L-Domänen eines Antikörpers, worin diese Domänen in einer einzigen Polypeptidkette vorhanden sind. Im Allgemeinen umfasst das Fv-Polypeptid ferner einen Polypeptidlinker zwischen der V_H- und V_L-Domäne, die es dem sFv erlaubt, die gewünschte Struktur zur Antigenbindung zu bilden. Für eine Zusammenfassung über Fv siehe Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, S. 269-315, Rosenburg und Moore, Hrsg., Springer-Verlag, New York, USA (1994).
Der Begriff "Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigenbindungsstellen, wobei die Fragmente eine variable Schwerkettendomäne (V_H) umfassen, die an eine variable Leichtkettendomäne (V_L) in derselben Polypeptidkette (V_H-V_L) gebunden ist. Durch die Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um eine Paarung zwischen den beiden Domänen auf derselben Kette zu ermöglichen, werden die Domänen gezwungen, sich mit den komplementären Domänen einer anderen Kette zu verbinden und zwei Antigenbindungsorte zu schaffen. Diabodies sind beispielsweise in der EP 404.097 ; WO 93/11161; und in Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993), näher beschrieben.
Der Begriff "linearer Antikörper" bezieht sich in der vorliegenden Anmeldung auf die in Zapata et al., Protein Eng. 8(10), 1057-1062 (1995), beschriebenen Antikörper. Kurz gesagt umfassen diese Antikörper ein Paar von Tandem-Fd-Segmenten (V_H-C_H1-V_H-C_H1), die ein Antigenbindungsregionenpaar bilden. Lineare Antikörper können bispezifisch oder monospezifisch sein.
Eine Anti-VEGF-Antikörper-"Variante" bezieht sich hierin auf ein Molekül, dessen Aminosäuresequenz sich von der Aminosäuresequenz eines "Stamm"-Anti-VEGF-Antikörpers durch eine Addition, Deletion und/oder Substitution eines Aminosäurerests oder mehrerer Aminosäurereste in der Stammantikörpersequenz unterscheidet. Wie in Anspruch 1 definiert umfasst die Variante eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen in einer oder mehreren hypervariablen Regionen des Stammantikörpers. Beispielsweise kann die Variante zumindest eine, beispielsweise etwa 1 bis etwa 10, vorzugsweise etwa 2 bis etwa 5, Substitutionen in einer oder mehreren hypervariablen Regionen des Stammantikörpers umfassen. Die Variante weist eine Aminosäuresequenz mit zumindest 90 % Aminosäuresequenzidentität mit den variablen Schwer- oder Leichtkettendomänensequenzen des Stammantikörpers mit Seq.-ID Nr. 7 oder 8 auf, noch bevorzugter zumindest 95 %. Identität oder Homologie in Bezug auf diese Sequenz ist hierin als Prozentsatz an Aminosäureresten in der Kandidaten sequenz definiert, die mit den Stammantikörperresten identisch sind, wenn die Sequenzen vergleichend angeordnet und, falls erforderlich, Lücken eingeführt werden, um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erreichen. Keine N-terminalen, C-terminalen oder internen Verlängerungen, Deletionen oder Insertionen in die Antikörpersequenz sollten sich auf die Sequenzidentität oder -homologie auswirken. Die Variante behält die Fähigkeit bei, menschlichen VEGF zu binden, und weist stärkere Bindungsaffinität auf als der Stammantikörper. Die Variante kann eine erhöhte Fähigkeit, VEGF-induzierte Proliferation von Endothelzellen zu hemmen, und/oder eine erhöhte Fähigkeit, VEGF-induzierte Angiogenese in vivo zu hemmen, aufweisen. Um solche Eigenschaften zu untersuchen, sollte eine Fab-Form der Variante mit einer Fab-Form des Stammantikörpers oder eine Variantenform voller Länge mit einer Stammantikörperform voller Länge verglichen werden, da sich beispielsweise gezeigt hat, dass sich die Form des Anti-VEGF-Antikörpers auf seine Aktivität im hierin offenbarten biologischen Aktivitätstest auswirkt. Die Antikörpervariante, die hierin von besonderem Interesse ist, ist eine mit zumindest etwa 10facher, vorzugsweise zumindest etwa 20facher, insbesondere zumindest etwa 50facher, Steigerung der biologischen Aktivität im Vergleich zum Stammantikörper.
Der "Stamm"-Antikörper umfasst hierin die Aminosäuresequenzen der variablen Schwer- und Leichtkettendomäne mit Seq.-ID Nr. 7 oder 8 und weist vorzugsweise, falls vorhanden eine oder mehrere menschliche konstante Antikörperregionen auf.
Ein "isolierter" Antikörper ist ein Antikörper, der identifiziert und abgetrennt und/oder aus einer Komponente aus seiner natürlichen Umgebung gewonnen wurde. Verunreinigende Komponenten aus seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die diagnostische oder therapeutische Verwendungen des Antikörpers beeinträchtigen würden, und können Enzyme, Hormone und andere eiweißartige oder nicht eiweißartige Gelöststoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper (1) zu mehr als 95 Gew.-% des Antikörpers, bestimmt durch das Lowry-Verfahren, noch bevorzugter zu mehr als 99 Gew.-%, (2) in einem Ausmaß, das ausreicht, um unter Verwendung eines Zentrifugenröhrchen-Sequenzierers zumindest 15 Reste einer N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz zu erhalten, oder (3) unter Verwen dung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfarbe durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen bis zur Homogenität gereinigt. Isolierte Antikörper umfassen den Antikörper in situ mit rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers nicht vorhanden ist. Herkömmlicherweise wird der isolierte Antikörper jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Der Begriff "epitopmarkiert" bezieht sich hierin auf den an eine "Epitopmarkierung" fusionierten Anti-VEGF-Antikörper. Das epitopmarkierte Polypeptid weist genug Reste auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, ist aber kurz genug, das es die Aktivität des VEGF-Antikörpers nicht beeinträchtigt. Die Epitopmarkierung ist vorzugsweise ausreichend einzigartig, sodass der Antikörper dagegen im Wesentlichen nicht mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Markierungspolypeptide weisen im Allgemeinen zumindest 6 Aminosäurereste und üblicherweise zwischen etwa 8 und 50 Aminosäureresten (vorzugsweise zwischen etwa 9 und 30 Resten) auf. Beispiele umfassen das flu-HA-Markierungspolypeptid und seinen Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159-2165 (1988)); die c-myc-Markierung und die 8F9-, 3C7-, 6E10-, G4-, B7- und 9E10-Antikörper dagegen (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12), 3410-3616 (1985)); und die Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D-(-gD-)Markierung und ihre Antikörper (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547-553 (1990)). In bestimmten Ausführungsformen ist die Epitopmarkierung ein "Rettungsrezeptorbindungsepitop". Der Begriff "Rettungsrezeptorbindungsepitop" bezieht sich hierin auf ein Epitop der Fc-Region eines IgG-Moleküls (z.B. IgG₁, IgG₂, IgG₃ oder IgG₄), das für die Erhöhung der In-vivo-Serumhalbwertszeit des IgG-Moleküls verantwortlich ist.
Der Begriff "zytotoxisches Mittel" bezieht sich hierin auf eine Substanz, welche die Funktion von Zellen hemmt oder unterbindet und/oder zur Zerstörung von Zellen führt. Der Begriff umfasst radioaktive Isotope (z.B. I¹³¹, 1¹²⁵, Y⁹⁰ und Re¹⁸⁶), chemotherapeutische Wirkstoffe und Toxine, wie beispielsweise enzymatisch aktive Toxine von Bakterien, Pilzen, Pflanzen oder Tieren, oder Fragmente davon.
Ein "chemotherapeutischer Wirkstoff" ist eine chemische Verbindung, die bei der Behandlung von Krebs nützlich ist. Beispiele für chemotherapeutische Wirkstoffe umfassen Adriamycin, Doxorubicin, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid ("Ara-C"), Cyclophosphamid, Thiotepa, Taxotere (Docetaxel), Busulfan, Cytoxin, Taxol, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin, Bleomycin, Etoposid, Ifosfamid, Mitomycin C, Mitoxantron, Vincristin, Vinorelbin, Carboplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, Esperamycine (siehe US-Pat. Nr. 4.675.187), Melphalan und andere verwandte Stickstofflost-Verbindungen.
Der Begriff "Prodrug" steht in dieser Anmeldung für eine Vorläufer- oder Derivatform einer pharmazeutisch aktiven Substanz, die für Tumorzellen weniger zytotoxisch ist als das Ausgangsarzneimittel und enzymatisch aktiviert oder in eine aktivere Ausgangsform übergeführt werden kann. Siehe beispielsweise Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions 14, 375-382, 615th Meeting Belfast (1986), und Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, 247-267, Borchardt et al. (Hrsg.), Humana Press (1985). Die Prodrugs dieser Erfindung umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, phosphathältige Prodrugs, thiophosphathältige Prodrugs, sulfathältige Produgs, peptidhältige Prodrugs, D-Aminosäure-modifizierte Prodrugs, glykosylierte Prodrugs, β-Lactam-hältige Prodrugs, gegebenenfalls substituiertes Phenoxyacetamid enthaltende Prodrugs oder gegebenenfalls substituiertes Phenylacetamid enthaltende Prodrugs, 5-Fluorcytosin- und andere 5-Fluoruridin-Prodrugs, die in das aktivere zytotoxische freie Arzneimittel übergeführt werden können. Beispiele für zytotoxische Arzneimittel, die zu einer Prodrugform zur Verwendung in dieser Erfindung derivatisiert werden können, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die oben beschriebenen chemotherapeutischen Wirkstoffe.
Das Wort "Markierung" bezieht sich hierin auf eine detektierbare Verbindung oder Zusammensetzung, die direkt oder indirekt an den Antikörper konjugiert ist. Die Markierung kann selbst detektierbar sein (z.B. Radioisotopmarkierungen oder Fluoreszenzmarkierungen), oder, im Falle einer enzymatischen Markierung, eine chemische Veränderung einer Substratverbindung oder -zusammensetzung katalysieren, die detektierbar ist.
Mit "fester Phase" ist eine nichtwässrige Matrix gemeint, an die sich der Antikörper der vorliegenden Erfindung haften kann. Beispiele für feste Phasen hierin umfassen solche, die teilweise oder vollständig aus Glas bestehen (z.B. Glas mit gesteuerter Porengröße), Polysaccharide (z.B. Agarose), Polyacrylamide, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Silicone. In bestimmten Ausführungsformen kann die feste Phase, je nach Kontext, auch den Well einer Testplatte umfassen; in anderen handelt es sich um eine Reinigungssäule (z.B. eine Affinitätschromatographiesäule). Dieser Begriff umfasst auch eine diskontinuierliche feste Phase aus separaten Teilchen, wie sie beispielsweise im US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben ist.
Ein "Liposom" ist ein kleines Vesikel, das aus verschiedenen Lipidarten, Phospholipiden und/oder Tensiden besteht und zur Verabreichung eines Arzneimittels (wie beispielsweise der hierin offenbarten Anti-VEGF-Antikörper und gegebenenfalls eines chemotherapeutischen Wirkstoffs) an ein Säugetier nützlich ist. Die Komponenten des Liposoms sind auf herkömmliche Weise in einer Doppelschicht angeordnet, ähnlich wie die Lipidanordnung von biologischen Membranen. Ein "isoliertes" Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert und von zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül abgetrennt ist, mit dem es herkömmlicherweise in der natürlichen Quelle der Antikörpernucleinsäure verbunden ist. Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül weist eine andere Form oder Umgebung auf als eines, das in der Natur vorkommt. Isolierte Nucleinsäuremoleküle unterscheiden sich also vom Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen vorkommt. Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül umfasst jedoch auch Nucleinsäuremoleküle, die in Zellen enthalten sind, die herkömmlicherweise den Antikörper exprimieren, wobei das Nucleinsäuremolekül beispielsweise an einer anderen chromosomalen Stelle vorkommen kann als in natürlichen Zellen.
Der Ausdruck "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operabel gebundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten geeignet sind, umfassen beispielsweise einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, und einen Ribosomenbindungsort. Eukaryotische Zellen verwenden bekannterweise Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer.
Eine Nucleinsäure ist "operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gesetzt wird. DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader ist beispielsweise operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids mitwirkt; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er sich auf die Transkription der Sequenz auswirkt; oder ein Ribosomenbindungsstelle ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er so positioniert ist, dass er eine Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die verbundenen DNA-Sequenzen nebeneinander liegen und, im Falle eines Sekretionsleaders, nebeneinander liegen und in Lesephase vorliegen. Enhancer müssen jedoch nicht nebeneinander liegen. Die Bindung wird durch Ligation an geeigneten Restriktionsstellen erreicht. Wenn keine solchen Stellen vorhanden sind, werden die synthetischen Oligonucleotidadapter gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
Die Begriffe "Zelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" werden austauschbar verwendet, wobei alle diese Bezeichnungen Nachkommen einschließen. Somit umfassen die Worte "Transformanten" und "transformierte Zellen" die primäre Zielzelle und daraus erhaltene Kulturen, unabhängig von der Anzahl an Transfers. Außerdem versteht sich, dass aufgrund absichtlicher oder unabsichtlicher Mutationen nicht alle Nachkommen genau den gleichen DNA-Gehalt aufweisen. Mutierte Nachkommen, welche die gleiche Funktion oder biologische Aktivität aufweisen, nach der in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent wurde, sind ebenfalls eingeschlossen. Wenn unterschiedliche Bezeichnungen erwünscht sind, geht dies aus dem Kontext klar hervor.
II. Möglichkeiten der Ausführung der Erfindung
In den nachstehend beschriebenen Beispielen ist die Herstellung von humanisierten Anti-VEGF-Antikörpervarianten mit vom therapeutischen Standpunkt gesehen wünschenswerten Eigenschaften beschrieben, wie etwa: (a) starke Bindungsaffinität für das VEGF-Antigen; (b) die Fähigkeit, VEGF-induzierte Proliferation von Endothelzellen in vitro zu hemmen; und (c) die Fähigkeit, VEGF-induzierte Angiogenese in vivo zu hemmen.
Antikörperaffinitäten können wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben bestimmt werden. Bevorzugte humanisierte Antikörpervarianten sind solche, die menschlichen VEGF mit einem K_d-Wert von nicht mehr als etwa 1 × 10^-8 M; vorzugsweise nicht mehr als etwa 1 × 10^-8 M; insbesondere nicht mehr als etwa 5 × 10^-9 M, binden.
Abgesehen von Antikörpern mit starker Bindungsaffinität für menschlichen VEGF ist es auch wünschenswert, humanisierte Antikörpervarianten zu selektieren, die vom therapeutischen Standpunkt gesehen andere vorteilhafte Eigenschaften aufweisen. Beispielsweise kann der Antikörper Endothelzellenwachstum als Reaktion auf VEGF hemmen. In einer Ausführungsform kann der Antikörper fähig sein, Rinder-Kapillarendothelzellenproliferation als Reaktion auf eine fast maximale effektive Konzentration von VEGF (3 ng/ml) zu hemmen. Vorzugsweise weist der Antikörper einen effektive-Dosis-50-(ED50-)Wert von nicht mehr als etwa 5 nM, vorzugsweise von nicht als etwa 1 nM, insbesondere von nicht mehr als etwa 0,5 nM, auf, um VEGF-induzierte Proliferation von Endothelzellen in diesem "Endothelzellenwachstumstest" zu hemmen, d.h. bei diesen Konzentration ist der Antikörper fähig, 50 % des VEGF-induzierten Endothelzellenwachstums in vitro zu hemmen. Ein bevorzugter "Endothelzellenwachstumstest" umfasst das Kultivieren von Kapillarendothelzellen von der Nebennierenrinde eines Rinds in Gegenwart von Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (GIBCO) mit geringem Glucosegehalt, das mit 10 % Kälberserum, 2 mM Glutamin und Antibiotika (Wachstumsmedium) ergänzt ist, im Wesentlichen, wie es im nachstehenden Beispiel 1 beschrieben ist. Diese Endothelzellen werden mit einer Dichte von 6 × 10³ Zellen pro Well in 6-Well-Platten in einen Wachstumsmedium geimpft. Dann wird entweder ein Anti-VEGF-Stammantikörper (Kontrolle), ein humanisierter Anti-VEGF-Antikörper oder eine Anti-VEGF-Antikörpervariante zugesetzt, und zwar in Konzentrationen zwischen 1 und 5.000 ng/ml. Nach 2-3 Stunden wurde gereinigter VEGF bis zu einer Endkonzentration von 3 ng/ml zugesetzt. Zur Spezifitätskontrolle kann jeder Antikörper in einer Konzentration von 5.000 ng/ml zu Endothelzellen zugesetzt werden, entweder alleine oder in Gegenwart von 2 ng/ml bFGF. Nach fünf oder sechs Tagen werden die Zellen dissoziiert, indem sie Trypsin ausgesetzt werden, und in einem Coulter-Zähler (Coulter Electronics, Hialeah, FL, USA) gezählt. Die Daten können mithilfe eines Vierparameter-Kurvenanpassungsprogramms (KaleidaGraph) analysiert werden.
Die bevorzugte humanisierte Anti-VEGF-Antikörpervariante kann auch in vivo Tumorsuppressionsaktivität aufweisen. Beispielsweise kann der Antikörper das Wachstum von menschlichen A673-Rhabdomyosarkomzellen oder Brustkarzinom-MDA-MB-435-Zellen in Nacktmäusen unterdrücken. Für In-vivo-Tumoruntersuchungen werden menschliche A673-Rhabdomyosarkomzellen (ATCC; CRL 1598) oder MDA-MB-435-Zellen (erhältlich von der ATCC) in, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit 10 % fötalem Rinderserum, 2 mM Glutamin und Antibiotika ergänztem DMEM/F12 kultiviert. Weiblichen BALB/c-Nacktmäusen, 6-10 Wochen alt, wurden 2 × 10⁶ Tumorzellen in einem Volumen von 200 μl subkutan in den dorsalen Bereich injiziert. Dann werden die Tiere mit dem humanisierten Antikörper oder der Antikörpervariante sowie einem Kontrollantikörper ohne Aktivität in diesem Test behandelt. Der humanisierte Anti-VEGF-Mab oder die Anti-VEGF-Mab-Variante wird in einer Dosis von 0,5 und/oder 5 mg/kg verabreicht. Jeder Mab wird zweimal wöchentlich intraperitoneal in einem Volumen von 100 μl verabreicht, beginnend 24 h nach der Tumorzellinokulation. Die Tumorgröße wird wöchentlich bestimmt. Vier Wochen nach der Tumorzellinokulation werden die Tiere getötet, und die Tumoren werden entfernt und gewogen. Eine statistische Analyse kann durch ANOVA durchgeführt werden. Vorzugsweise hemmt der Antikörper in diesem "In-vivo-Tumortest" bei einer Dosis von 5 mg/kg etwa 50-100 %, vorzugsweise etwa 70-100 % und insbesondere etwa 80-100 %, des Wachstums der menschlichen A673-Tumorzellen.
In der bevorzugten Ausführungsform führt die humanisierte Antikörpervariante bei Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des Antikörpers an einen menschlichen Patienten zu keiner immunogenen Antwort. Wenn eine immunogene Antwort ausgelöst wird, sieht die Reaktion vorzugsweise so aus, dass der Antikörper dem damit behandelten Patienten immer noch therapeutischen Nutzen bringt.
Die humanisierte Antikörpervariante ist vorzugsweise fähig, bei Menschen VEGF-induzierte Angiogenese zu hemmen, d.h. menschliches Tumorwachstum zu hemmen und/oder intraokulare Angiogenese bei Netzhauterkrankungen zu hemmen.
Bevorzugte Antikörper binden das "Epitop A4.6.1" wie hierin definiert. Um auf Antikörper zu screenen, die das Epitop an menschlichen VEGF binden, der durch einen Antikörper von Interesse gebunden ist (z.B. ein solcher, der die Bindung des A4.6.1-Antikörpers an menschlichen VEGF blockiert), kann ein herkömmlicher Cross-Blocking-Test durchgeführt werden, wie er beispielsweise in Antibodies, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, Ed Harlow und David Lane (1988), beschrieben ist. Alternativ dazu kann eine Epitopkartierung durchgeführt werden, wie sie beispielsweise in Champe et al., J. Biol. Chem. 270, 1388-1394 (1995), beschrieben ist, um festzustellen, ob der Antikörper ein Epitop von Interesse bindet.
Die Antikörper der bevorzugten Ausführungsform weisen eine variable Schwerkettendomäne auf, die eine Aminosäuresequenz der folgenden Formel umfasst: FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4, worin "FR1-4" die vier Gerüstregionen darstellen und "CDRH1-3" für die drei hypervariablen Regionen der variablen Schwerkettendomäne eines Anti-VEGF-Antikörpers stehen. FR1-4 stammen gegebenenfalls von einer "Consensus-Sequenz" (d.h. die häufigsten Aminosäuren einer Klasse, Subklasse oder Untergruppe von Schwer- oder Leichtketten von menschlichen Immunglobulinen), wie das auch in den nachstehenden Beispielen der Fall ist, oder können von einer einzelnen menschlichen Antikörper-Gerüstregion oder von einer Kombination aus unterschiedlichen Gerüstregionsequenzen stammen. Viele menschliche Antikörper-Gerüstregionsequenzen sind etwa in Kabal et al., w.o., zusammengefasst. In einer bevorzugten Ausführungsform Ausführungsform stammt die variable schwere FR von einer Consensus-Sequenz einer menschlichen Immunglobulinuntergruppe, wie sie von Kabat et al., w.o., definiert wurde. Vorzugsweise ist die menschliche Immunglobulinuntergruppe die menschliche Schwerkettenuntergruppe III (wie beispielsweise in Seq.-ID Nr. 11).
Die menschliche variable schwere FR-Sequenz weist vorzugsweise Substitutionen auf, worin beispielsweise der menschliche FR-Rest durch einen entsprechenden nichtmenschlichen Rest ersetzt ist (mit "entsprechender nichtmenschlicher Rest" ist der nichtmenschliche Rest mit der gleichen Kabat-Positionsnummerierung gemeint wie der menschliche Rest, wenn die menschliche und nichtmenschliche Sequenz vergleichend angeordnet werden), aber eine Ersetzung mit dem nichtmenschlichen Rest ist nicht unbedingt notwendig. Ein anderer Ersatz-FR-Rest als der entsprechende nichtmenschliche Rest kann beispielsweise durch Phagendisplay selektiert werden (siehe Beispiel 2). Beispiele für die variablen schweren FR-Reste, die substituiert sein können, umfassen eine oder mehrere der folgenden RF-Restnummern: 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 76H, 78H, 94H (Kabat-Nummerierung der Reste). Vorzugsweise sind zumindest zwei oder zumindest drei oder zumindest vier dieser Reste substituiert. Eine insbesondere bevorzugte Kombination von FR-Substitutionen ist: 49H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H und 94H.
In Bezug auf die hypervariablen Schwerkettenregionen sehen die Aminosäuresequenzen vorzugsweise wie folgt aus:
CDRH1
GYX₁X₂X₃X₄YGX₅N (Seq.-ID Nr. 117), worin X₁ D, T oder E, vorzugsweise jedoch D oder T, ist; X₂ F, W oder Y, vorzugsweise jedoch F, ist; X₃ T, Q, G oder S, vorzugsweise jedoch T, ist; X₄ H oder N ist; und X₅ M oder I, vorzugsweise jedoch M, ist.
CDRH2
WINTX₁TGEPTYAADFKR (Seq.-ID Nr. 16), worin X₁ Y oder W, vorzugsweise jedoch Y, ist.
CDRH3
YPX₁YX₂X₃X₄X₅HWYFDV (Seq.-ID Nr. 119), worin X₁ H oder Y ist; X₂ Y, R, K, I, T, E oder W, vorzugsweise jedoch Y, ist; X₃ G, N, A, D, Q, E, T, K oder S, vorzugsweise jedoch G, ist; X₄ S, T, K, Q, N, R, A, E oder G, vorzugsweise jedoch S oder T, ist; und X₅ S oder G, vorzugsweise jedoch S, ist.
Die variable Schwerkettendomäne umfasst gegebenenfalls ein "CDR7", wie es hierin bezeichnet wird, innerhalb (d.h. es stellt einen Teil dar von) FR3 (siehe 9B und 10B), worin CDR7 die folgende Aminosäuresequenz aufweisen kann:
CDR7
X₁SX₂DX₃X₄X₅X₆TX₇ (Seq.-ID Nr. 120), worin X₁ F, I, V, L oder A, vorzugsweise jedoch F, ist; X₂ A, L, V oder I, vorzugsweise jedoch L, ist; X₃ T, V oder K, vorzugsweise jedoch T, ist; X₄ S oder W, vorzugsweise jedoch S, ist; X₅ S oder K, vorzugsweise jedoch K, ist; X₆ N oder S, vorzugsweise jedoch S, ist; und X₇ V, A, L oder I, vorzugsweise jedoch A, ist.
Die Antikörper der hierin bevorzugten Ausführungsform weisen eine variable Leichtkettendomäne auf, die eine Aminosäuresequenz der folgenden Formel aufweist:
FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4, worin "FR1-4" die vier Gerüstregionen darstellen und "CDRL1-3" für die drei hypervariablen Regionen der variablen Leichtkette eines Anti-VEGF-Antikörpers stehen. FR1-4 stammen gegebenenfalls von einer "Consensus-Sequenz" (d.h. die häufigsten Aminosäuren einer Klasse, Subklasse oder Untergruppe von Schwer- oder Leichtketten von menschlichen Immunglobulinen), wie das auch in den nachstehenden Beispielen der Fall ist, oder können von einer einzelnen menschlichen Antikörper-Gerüstregion oder von einer Kombination aus unterschiedlichen Gerüstregionsequenzen stammen. In einer bevorzugten Ausführungsform Ausführungsform stammt die variable leichte FR von einer Con sensus-Sequenz einer menschlichen Immunglobulinuntergruppe, wie sie von Kabat et al., w.o., definiert wurde. Vorzugsweise ist die menschliche Immunglobulinuntergruppe die menschliche κ-Leichtkettenuntergruppe I (wie beispielsweise in Seq.-ID Nr. 12).
Die menschliche variable leichte FR-Sequenz weist vorzugsweise Substitutionen auf, worin beispielsweise der menschliche FR-Rest durch einen entsprechenden Mäuserest ersetzt ist, aber eine Ersetzung mit dem nichtmenschlichen Rest ist nicht unbedingt notwendig. Ein anderer Ersatzrest als der entsprechende nichtmenschliche Rest kann durch Phagendisplay selektiert werden (siehe Beispiel 2). Beispiele für variable leichte FR-Reste, die gegebenenfalls substituiert sind, umfassen einen oder mehrere der FR-Reste mit den Nummern 4L, 46L und 71L (Kabat-Restenummerierung). Vorzugsweise ist nur 46L substituiert. In einer anderen Ausführungsform sind sowohl 4L als auch 46L substituiert (Kabat-Restenummerierung).
In Bezug auf die CDRs sehen die Aminosäuresequenzen vorzugsweise wie folgt aus:
CDRL1
X₁AX₂X₃X₄X₅SNYLN (Seq.-ID Nr. 121), worin X, R oder S, vorzugsweise jedoch S, ist; X₂ S oder N, vorzugsweise jedoch S, ist; X₃ Q oder E, vorzugsweise jedoch Q, ist; X₄ Q oder D, vorzugsweise jedoch D, ist; und X₅ I oder L, vorzugsweise jedoch I, ist.
CDRL2
FTSSLHS (Seq.-ID Nr. 122).
CDRL3
QQYSX₁X₂PWT (Seq.-ID Nr. 123), worin X₁ T, A oder N, vorzugsweise jedoch T, ist; und X₂ V oder T, vorzugsweise jedoch V, ist.
Die Anti-VEGF-Antikörpervarianten sind Varianten von F(ab)-12 in Beispiel 1, wie beispielsweise affinitätsgereifte Formen, einschließlich der Varianten Y0317, Y0313- 1 und Y0238-3 in Beispiel 3, wobei Y0317 die bevorzugte Variante ist. Verfahren zur Herstellung von humanisierten Anti-VEGF-Antikörpern, die hierin von Interesse sind, werden nachstehend genauer erläutert.
A. Antikörperherstellung
Verfahren zur Humanisierung von nichtmenschlichen VEGF-Antikörpern und zur Erzeugung von Varianten von Anti-VEGF-Antikörpern sind in den nachstehenden Beispielen erläutert. Um einen Anti-VEGF-Antikörper zu humanisieren, wird nichtmenschliches Antikörperausgangsmaterial vorbereitet. Soll eine Variante erzeugt werden, wird zuerst der Stammantikörper hergestellt. Beispiele für Verfahren zur Erzeugung solch eines nichtmenschlichen Antikörper-Ausgangsmaterials und solcher Stammantikörper sind in den nachstehenden Abschnitten beschrieben.
(i) Antigenherstellung
Das VEGF-Antigen, das zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden soll, kann beispielsweise ein intakter VEGF oder ein VEGF-Fragment sein (z.B. ein VEGF-Fragment, welches das "Epitop A4.6.1" umfasst). Weitere VEGF-Formen, die zur Herstellung von Antikörpern von Nutzen sind, werden für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich sein. Das zur Herstellung des Antikörpers verwendete VEGF-Antigen ist vorzugsweise ein menschlicher VEGF, wie er beispielsweise in Leung et al., Science 246, 1306 (1989), und Houck et al., Mol. Endocrin. 5, 1806 (1991), beschrieben ist.
(ii) Polyklonale Antikörper
Polyklonale Antikörper werden vorzugsweise durch multiple subkutane (Sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des relevanten Antigens und eines Adjuvans in Tieren gezüchtet. Es kann von Nutzen sein, das relevante Antigen an ein Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, beispielsweise ein Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder ein Sojabohnen-Typsininhibitor, und zwar unter Verwendung eines bifunktionellen Mittels oder Derivatisierungsmittels, wie beispielsweise Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation durch Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (durch Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R¹N=C=NR, worin R und R¹ unterschiedliche Alkylgruppen sind.
Tiere werden gegen das Antigen, gegen immunogene Konjugate oder Derivate immunisiert, indem beispielsweise 100 μg oder 5 μg des Proteins oder Konjugats (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina Komplettem Freundschem Adjuvans kombiniert werden und die Lösung an mehreren Stellen intradermal injiziert wird. Einen Monat später werden die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge Peptid oder Konjugat in Komplettem Freundschem Adjuvans durch subkutane Injektionen an mehreren Stellen geboostet. Sieben bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen, und das Serum wird auf den Antikörpertiter untersucht. Tiere werden geboostet, bis der Titer ein Plateau erreicht. Vorzugsweise wird das Tier mit dem Konjugat des gleichen Antigens geboostet, das aber an ein anderes Protein und/oder über ein anderes Vernetzungsreagens konjugiert ist. Konjugate können auch als Proteinfusionen in rekombinanten Zellkulturen hergestellt werden. Außerdem sind auch Aggregationsmittel, wie beispielsweise Alaun, zur Steigerung der Immunantwort geeignet.
(iii) Monoklonale Antikörper
Monoklonale Antikörper können unter Verwendung des Hybridomverfahrens hergestellt werden, das zum ersten Mal von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde, oder durch DNA-Rekombinationsverfahren (US-Patent Nr. 4.816.567).
Beim Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier, wie beispielsweise ein Hamster oder ein Makakenaffe wie oben beschrieben immunisiert, um Lymphozyten zu erhalten, die Antikörper produzieren oder produzieren kön nen, die spezifisch an das für die Immunisierung verwendete Protein binden. Alternativ dazu können Lymphozyten auch in vitro immunisiert werden. In diesem Fall werden die Lymphozyten dann unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie beispielsweise Polyethylenglykol, mit Myelomzellen fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103, Academic Press (1986)).
Die so erhaltenen Hybridomzellen werden in ein geeignetes Kulturmedium geimpft und darin gezüchtet, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben von unfusionierten Stammmyelomzellen hemmen. Wenn die Stammmyelomzellen beispielsweise das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) nicht aufweisen, umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium), weil diese Substanzen das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen hemmen.
Bevorzugte Myelomzellen sind solche, die effizient fusionieren, eine stabile, starke Produktion von Antikörpern durch die gewählten antikörperproduzierenden Zellen unterstützen und gegenüber einem Medium wie dem HAT-Medium empfindlich sind. Bevorzugte Myelomzelllinien davon sind Mäusemyelomlinien, wie beispielsweise die von MOP-21- und M.C.-11-Mäusetumoren, erhältlich beim Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien,. USA, und SP-2- oder X63-Ag8-653-Zellen, erhältlich von American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Die Verwendung von menschlichen Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern wurde ebenfalls beschrieben (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, USA (1987)).
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen wachsen, wird auf die Produktion von monoklonalen Antikörpern untersucht, die gegen das Antigen gerichtet sind. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von monoklonalen Antikörpern, die von Hybri domzellen produziert werden, durch Immunfällung oder einen In-vitro-Bindungstest, wie beispielsweise den Radioimmuntest (RIA) oder die enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), bestimmt.
Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse gemäß Munson et al., Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nachdem die Hybridomzellen, die Antikörper mit der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität produzieren, identifiziert wurden, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und durch Standardverfahren gezüchtet werden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103, Academic Press (1986)). Für diesen Zweck geeignete Kulturmedien umfassen beispielsweise die Medien D-MEM oder RPMI-1640. Außerdem können die Hybridomzellen auch in vivo als Ascites-Tumoren in einem Tier gezüchtet werden.
Die durch die Subklone sekretierten monoklonalen Antikörper werden am besten durch herkömmliche Immunglobulinreinigungsverfahren, wie beispielsweise Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, vom Kulturmedium, Ascites-Fluid oder Serum abgetrennt.
DNA, die für die monoklonalen Antikörper kodiert, kann leicht unter Verwendung herkömmlicher Verfahren isoliert und sequenziert werden (beispielsweise unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die zur spezifischen Bindung an Gene fähig sind, die für die Schwer- und Leichtketten der monoklonalen Antikörper kodieren). Die Hybridomzellen dienen als bevorzugte Quelle für solche DNA. Sobald sie isoliert ist, kann die DNA in Expressionsvektoren platziert werden, die dann in Wirtszellen, wie z.B. E.-coli-Zellen, Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zellen oder Myelomzellen, die sonst kein Immunglobulinprotein produzieren, transferiert wird, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszelle zur erreichen. Die rekombinante Herstellung von Antikörpern wird nachstehend genauer beschrieben.
(iv) Humanisierung und Aminosäuresequenzvarianten
In den nachstehenden Beispielen 1 und 2 sind Verfahren zur Humanisierung eines Anti-VEGF-Antikörpers beschrieben. In bestimmten Ausführungsformen kann es von Vorteil sein, Aminosäuresequenzvarianten dieser humanisierten Antikörper herzustellen, vor allem wenn dadurch die Bindungsaffinität oder andere biologische Eigenschaften des humanisierten Antikörpers verbessert werden. In Beispiel 3 sind Verfahren zur Herstellung von Aminosäuresequenzvarianten eines Anti-VEGF-Antikörpers mit höherer Affinität als der Stammantikörper beschrieben.
Aminosäuresequenzvarianten des Anti-VEGF-Antikörpers werden hergestellt, indem geeignete Nucleotidveränderungen in die Anti-VEGF-Antikörper-DNA eingebracht werden, oder durch Peptidsynthese. Solche Varianten umfassen beispielsweise Deletionen und/oder Insertionen und/oder Substitutionen von Resten innerhalb der Aminosäuresequenz der Anti-VEGF-Antikörper des hierin beschriebenen Beispiels. Jede beliebige Kombination von Deletion, Insertion und Substitution kann verwendet werden, um das Endkonstrukt zu erhalten, solange das Endkonstrukt die gewünschten Eigenschaften aufweist. Die Aminosäureveränderungen können auch posttranslationale Prozesse des humanisierten Anti-VEGF-Antikörpers oder der Anti-VEGF-Antikörpervariante verändern, wie beispielsweise die Veränderung der Anzahl oder Positionen von Glykosylierungsstellen.
Ein nützliches Verfahren zur Identifizierung von bestimmten Resten oder Regionen des Anti-VEGF-Antikörpers, die bevorzugte Mutagenesestellen sind, wird "Alanin-Scanning-Mutagenese" genannt und wurde von Cunningham und Wells, Science 244, 1081-1085 (1989), beschrieben. Hier wird ein Rest oder eine Gruppe von Zielresten identifiziert (beispielsweise geladene Reste, wie z.B. arg, asp, his, lys und glu) und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure (insbesondere Alanin oder Polyalanin) ersetzt, um die Wechselwirkung zwischen den Aminosäuren und dem VEGF-Antigen zu beeinflussen. Diese Aminosäurestellen, die funktionelle Empfindlichkeit gegenüber den Substitutionen aufweisen, werden dann verfeinert, indem weitere oder andere Varianten an den oder für die Substitutionsstelle(n) einge bracht werden. Somit muss die Art der Mutation an sich nicht vorbestimmt sein, während der Ort zu Einbringung einer Aminosäuresequenzvariation vorbestimmt ist. Um beispielsweise die Wirkungsweise einer Mutation an einem vorgegebenen Ort zu analysieren, wird ala-Scanning oder eine zufallsbestimmte Mutagenese am Zielcodon oder an der Zielregion durchgeführt, und die exprimierte Anti-VEGF-Antikörpervariante wird auf die gewünschte Aktivität gescreent. Alanin-Scanning-Mutagenese ist in Beispiel 3 beschrieben.
Aminosäuresequenzinsertionen umfassen amino- und/oder carboxyterminale Fusionen, deren Länge von einem Rest bis zu Polypeptiden aus hundert oder mehr Resten reicht, sowie Intrasequenzinsertionen einzelner oder mehrerer Aminosäurereste. Beispiele für terminale Insertionen umfassen einen Anti-VEGF-Antikörper mit einem N-terminalen Methionylrest oder den an eine Epitopmarkierung fusionierten Antikörper. Andere Insertionsvarianten des Anti-VEGF-Antikörpermoleküls umfassen die Fusion an den N- oder C-Terminus des Anti-VEGF-Antikörpers eines Enzyms oder eines Polypeptids, was die Serum-Halbwertszeit des Antikörpers erhöht (siehe unten).
Ein weiterer Variantentyp ist eine Aminosäuresubstitutionsvariante. Bei diesen Varianten ist zumindest ein Aminosäurerest im Anti-VEGF-Antikörpermolekül entfernt, und stattdessen ist ein anderer Rest eingebracht. Die Stellen von größtem Interesse für eine Substitutionsmutagenese umfassen die hypervariablen Regionen, aber auch FR-Veränderung werden ins Auge gefasst. Konservative Substitutionen sind in Tabelle 1 unter "bevorzugte Substitutionen" angeführt. Wenn solche Substitutionen zu einer Veränderung der biologischen Aktivität führen, dann können wesentlichere Veränderungen, die in Tabelle 1 als "beispielhafte Substitutionen bezeichnet sind" und weiter unten unter Bezugnahme auf Aminosäureklassen erläutert sind, eingebracht und die Produkte gescreent werden.
Tabelle 1
Wesentliche Modifikationen der biologischen Eigenschaften des Antikörpers werden erreicht, indem Substitutionen selektiert werden, die sich in ihrer Wirkung deutlich dadurch unterscheiden, dass sie (a) die Struktur des Polypeptid-Rückgrats im Bereich der Substitution, beispielsweise als Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) die Ladung oder Hydrophobie des Moleküls am Zielort oder (c) die Sperrigkeit der Seitenkette erhalten. Natürlich vorkommende Reste werden aufgrund der folgenden Seitenketteneigenschaften in Gruppen unterteilt:

(1) hydrophob: Norleucin, met, ala, val, leu, ile;
(2) neutral hydrophil: cys, ser, thr;
(3) sauer: asp, glu;
(4) basisch: asn, glu, his, lys, arg;
(5) Reste, die sich auf die Kettenausrichtung auswirken: gly, pro; und
(6) aromatisch: trp, tyr, phe.

Nichtkonservative Substitutionen führen zum Austausch eines Elements einer Klasse durch eine andere Klasse.
Jeder Cysteinrest, der nicht an der Beibehaltung der geeigneten Konformation des humanisierten Anti-VEGF-Antikörpers oder der Anti-VEGF-Antikörpervariante mitwirkt, kann ebenfalls substituiert werden, im Allgemeinen mit Serin, um die Oxidationsbeständigkeit des Moleküls zu verbessern und anomale Vernetzung zu verhindern. Umgekehrt können eine oder mehrere Cysteinbindungen zum Antikörper hinzugefügt werden, um seine Stabilität zu erhöhen (insbesondere wenn der Antikörper ein Antikörperfragment, wie z.B. ein Fv-Fragment, ist.
Ein insbesondere bevorzugter Substitutionsvariantentyp umfasst die Substitution einer oder mehrerer Reste hypervariabler Regionen eines Stammantikörpers (z.B. eines humanisierten oder menschlichen Antikörpers). Im Allgemeinen weist/weisen die resultierende(n) Variante(n), die für eine Weiterbearbeitung ausgewählt wird/werden, bessere biologische Eigenschaften als der Stammantikörper auf, aus dem sie gebildet wurden. Ein geeigneter Weg, solche Substitutionsvarianten herzustellen, ist Affinitätsreifung unter Verwendung von Phagendisplay (siehe Beispiel 3). Kurz gesagt werden hier mehrere Stellen hypervariabler Regionen (z.B. 6-7 Stellen) mutiert, um alle möglichen Aminosubstitutionen an jedem Ort zu bilden. Die so erhaltenen Antikörpervarianten werden von filamentösen Phagenteilchen auf einwertige Weise als Fusionen an das Gen-III-Produkt von M13, verpackt in jedem Teilchen, präsen tiert. Die Phagendisplayvarianten werden dann wie hierin offenbart auf ihre biologische Aktivität (z.B. Bindungsaffinität) gescreent. Um mögliche Modifikationsstellen hypervariabler Regionen zu identifizieren, kann eine Alanin-Scanning-Mutagenese (siehe Beispiel 3) durchgeführt werden, um Reste hypervariabler Regionen zu identifizieren, die bedeutend zur Antigenbindung beitragen. Alternativ dazu oder zusätzlich kann es von Vorteil sein, die Kristallstruktur des Antigen-Antikörper-Komplexes zu analysieren, um Kontaktpunkte zwischen dem Antikörper und menschlichem VEGF zu identifizieren. Solche Kontaktreste und benachbarten Reste sind Kandidaten für Substitutionen gemäß den hierin angeführten Verfahren. Sobald solche Varianten erzeugt wurden, wird die gesamte Variantengruppe wie hierin beschrieben gescreent, und Antikörper, die in einem oder mehreren relevanten Tests bessere Eigenschaften aufweisen, können für eine weitere Bearbeitung ausgewählt werden.
Ein weiterer Typ von Aminosäurevarianten des Antikörpers verändert das ursprüngliche Glykosylierungsmuster des Antikörpers. Mit Veränderung ist gemeint, dass eine oder mehrerer Kohlenhydratgruppierungen, die im Antikörper vorkommen, deletiert und/oder ein oder mehrere Glykosylierungsstellen, die nicht im Antikörper vorhanden sind, hinzugefügt werden.
Die Glykosylierung von Antikörpern ist entweder N-gebunden oder O-gebunden. N-gebunden bezieht sich auf die Bindung der Kohlenhydratgruppierung an die Seitenkette eines Asparaginrests. Die Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, worin X eine Aminosäure außer Prolin ist, sind die Erkennungssequenzen für die enzymatische Anbindung der Kohlenhydratgruppierung an die Asparaginseitenkette. Somit ergibt die Gegenwart einer beliebigen dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypeptid einen möglichen Glykosylierungsort. O-gebundene Glykosylierung bezieht sich auf die Anbindung eines aus N-Aceylgalactosamin, Galactose oder Xylose ausgewählten Zuckers an eine Hydroxyaminosäure, meist Serin oder Threonin, obwohl auch 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin verwendet werden können.
Die Addition von Glykosylierungsstellen zum Antikörper wird herkömmlicherweise durch eine Veränderung der Aminosäuresequenz erreicht, sodass sie eine oder mehrere der oben beschriebenen Tripeptidsequenzen enthält (für N-gebundene Glykosylierungsstellen). Die Veränderung kann auch durch die Addition von einem oder mehreren Serin- oder Threoninresten an die Sequenz des ursprünglichen Antikörpers oder Substitution durch einen oder mehrere Serin- oder Threoninreste erreicht werden (für O-gebundene Glykosylierungsstellen).
Nucleinsäuremoleküle, die für Aminosäuresequenzvarianten des Anti-VEGF-Antikörpers kodieren, können durch zahlreiche auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren hergestellt werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die Isolation aus einer neutralen Quelle (im Falle von natürlich vorkommenden Aminosäuresequenzvarianten) und die Herstellung durch Oligonucleotidvermittelte (oder ortsgerichtete) Mutagenese, PCR-Mutagenese und Kassettenmutagenese einer früher hergestellten Variante oder eine Nichtvariante des Anti-VEGF-Antikörpers.
(v) Menschliche Antikörper
Als Alternative zur Humanisierung können auch menschliche Antikörper hergestellt werden. Es ist nun beispielsweise möglich, transgene Tiere (z.B. Mäuse) zu schaffen, die bei einer Immunisierung fähig sind, in Abwesenheit endogener Immunglobulinproduktion das volle Repertoire an menschlichen Antikörpern zu produzieren. So wurde beispielsweise beschrieben, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerkettenverbindungsregions-(J_H-)Gens in chimären und keimbahnmutierten Mäusen zur vollständigen Inhibition von endogener Antikörperproduktion führt. Der Transfer des menschlichen Keimbahn-Immunglobulingenanordnung in solche keimbahnmutierte Mäuse führt bei Provokation durch Antigene zur Produktion von menschlichen Antikörpern. Siehe beispielsweise Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 225-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7, 33 (1993); und die US-Patente 5.591.669, 5.589.369 und 5.545.807. Menschliche Antikörper können auch aus Phagendisplaybibliotheken erhalten werden (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991); und die US-Patente 5.565.332 und 5.573.905). Wie oben beschrieben können menschliche Antikörper auch durch in-vitro-aktivierte B-Zellen erzeugt werden (siehe US-Patente 5.567.610 und 5.229.275).
(vi) Antikörperfragmente
In bestimmten Ausführungsformen ist der humanisierte Anti-VEGF-Antikörper oder die Anti-VEGF-Antikörpervariante ein Antikörperfragment. Für die Herstellung von Antikörperfragmenten wurden verschiedene Verfahren entwickelt. Traditionellerweise wurden diese Fragmente durch proteolytische Verdauung von intakten Antikörpern erhalten (siehe beispielsweise Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24, 107-117 (1992), und Brennan et al., Science 229, 81 (1985)). Diese Fragmente können nun jedoch direkt durch rekombinante Wirtszellen hergestellt werden. Fab'-SH-Fragmente können beispielsweise direkt aus E. coli gewonnen und chemisch verbunden werden, um F(ab')₂-Fragmente zu bilden (Carter et al., Bio/Technology 10, 163-167 (1992)). In einer weiteren Ausführungsform wird das F(ab')2 unter Verwendung des Leucin-Zippers GCN4 gebildet, um die Assemblierung des F(ab')₂-Moleküls zu fördern. Gemäß einem weiteren Ansatz können Fv-, Fab- oder F(ab')₂-Fragmente auch direkt aus einer rekombinanten Wirtszellkultur isoliert werden. Andere Verfahren zur Herstellung von Antikörperfragmenten werden für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich sein.
(vii) Multispezifische Antikörper
In manchen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, multispezifische (z.B. bispezifische) humanisierte Anti-VEGF-Antikörper oder Anti-VEGF-Antikörper-Varianten zu bilden, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei unterschiedliche Epitope aufweisen. Beispielhafte bispezifische Antikörper können sich an zwei unterschiedliche Epitope des VEGF-Proteins binden. Alternativ dazu kann ein Anti-VEGF-Arm mit einem Arm kombiniert werden, der sich an ein Trigger-Molekül an einem Leukozyten wie beispielsweise T-Zellrezeptormolekül (z.B. CD2 oder CD3) oder Fc- Rezeptoren für IgG (FcγR), wie beispielsweise FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) und FcγRIII (CD16), bindet, wodurch zelluläre Abwehrmechanismen auf die VEGF-exprimierende Zelle fokussiert werden. Bispezifische Antikörper können auch verwendet werden, um Mittel, die für VEGF-exprimierende Zellen zytotoxisch sind, zu lokalisieren. Diese Antikörper verfügen über einen VEGF-Bindungsarm und einen Arm, der das zytotoxische Mittel (z.B. Saporin, Anti-Interferon-α, Vincaalkaloid, Ricin-A-Kette, Methotrexat oder Hapten mit radioaktivem Isotop) bindet. Bispezifische Antikörper können als Volllängen-Antikörper oder als Antikörperfragmente (z.B. bispezifische F(ab')₂-Antikörper) hergestellt werden.
Gemäß einem anderen Ansatz zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern kann die Grenzfläche zwischen einem Paar von Antikörpermolekülen so bearbeitet werden, dass der Prozentsatz an Heterodimeren, die aus rekombinanter Zellkultur gewonnen werden, maximiert wird. Die bevorzugte Grenzfläche umfasst zumindest einen Teil der C_H3-Domäne einer konstanten Antikörper-Domäne. Bei diesem Verfahren werden eine oder mehrere Aminosäure-Seitenketten von der Grenzfläche des ersten Antikörpermoleküls durch größere Seitenketten (z.B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt. Kompensations-"Hohlräume" von identischer oder ähnlicher Größe wie die große(n) Seitenkette(n) werden an der Grenzfläche des zweiten Antikörpermoleküls durch Ersetzen großer Aminosäure-Seitenketten durch kleinere (z.B. Alanin oder Threonin) geschaffen. Dies sorgt für einen Mechanismus der Steigerung der Ausbeute an Heterodimeren im Vergleich zu anderen, nicht erwünschten Endprodukten wie beispielsweise Homodimeren. Siehe die WO 96/27011, veröffentlicht am 6. September 1996.
Eispezifische Antikörper umfassen vernetzte oder "heterokonjugierte" Antikörper. Beispielsweise kann einer der Antikörper im Heterokonjugat an Avidin gebunden sein, der andere an Biotin. Heterokonjugierte Antikörper können unter Verwendung jedes beliebigen passenden Vernetzungsverfahrens hergestellt werden. Geeignete Vernetzungsmittel sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und sind im US-Patent Nr. 4.676.980 zusammen mit zahlreichen Vernetzungsverfahren offenbart.
Verfahren zur Bildung von bispezifischen Antikörpern aus Antikörperfragmenten wurden ebenfalls bereits in der Literatur beschrieben. Beispielsweise können bispezifische Antikörper unter Einsatz von chemischer Kupplung hergestellt werden. Brennan et al., Science 229, 81 (1985), beschreiben ein Verfahren, worin intakte Antikörper proteolytisch gespaltet werden, um F(ab')₂-Fragmente zu bilden. Diese Fragmente werden in Gegenwart des Dithiol-Komplexbildners Natriumarsenit reduziert, um benachbarte Dithiole zu stabilisieren und intermolekulare Disulfidbindung zu verhindern. Die gebildeten Fab'-Fragmente werden dann zu Thionitrobenzoat-(TNB-)Derivaten umgesetzt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird anschließend durch Reduktion mit Mercaptoethylamin wieder zu Fab'-Thiol umgesetzt und mit einer äquimolaren Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats vermischt, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Die hergestellten bispezifischen Antikörper können als Mittel zur selektiven Immobilisierung von Enzymen verwendet werden. Wiederum in einer anderen Ausführungsform werden Fab'-SH-Fragmente, die direkt aus E. coli gewonnen wurden, in vitro chemisch gekuppelt, um bispezifische Antikörper zu bilden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217-225 (1992).
Ebenfalls wurden bereits verschiedene Verfahren zur Herstellung und Isolierung bispezifischer Antikörperfragmente direkt aus rekombinanter Zellkultur beschrieben. Beispielsweise wurden bispezifische Antikörper unter Verwendung von Leucin-Zipper hergestellt. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547-1553 (1992). Die Leucin-Zipper-Peptide aus den Fos- und Jun-Proteinen wurden durch Genfusion an die Fab'-Abschnitte zwei verschiedener Antikörper gebunden. Die Antikörper-Homodimere wurden an der Gelenk-Region reduziert, um Monomere zu bilden, und anschließend reoxidiert, um die Antikörper-Heterodimere zu bilden. Dieses Verfahren kann auch zur Herstellung von Antikörper-Homodimeren verwendet werden. Die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993), beschriebene "Diakörper"-Technologie lieferte einen alternativen Mechanismus zur Herstellung von bispezifischen Antikörperfragmenten. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerkettendomäne (V_H), die über einen Linker, der zu kurz ist, um eine Paarung zwischen den zwei Domänen an derselben Kette zu ermöglichen, an eine variable Leichtkettendomäne (V_L) gebunden ist. Demgemäß sind die V_H- und V_L-Domänen eines Frag ments dazu gezwungen, mit den komplementären V_L- und V_H-Domänen eines anderen Fragments ein Paar zu bilden, wodurch zwei Antigen-Bindungsstellen gebildet werden. Über eine andere Strategie zur Bildung bispezifischer Antikörperfragmente durch die Verwendung von einkettigen Fv-(sFv-)Dimeren wurde ebenfalls berichtet. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994). Alternativ dazu kann der bispezifische Antikörper ein "linearer Antikörper" sein, der wie von Zapata et al., Protein Eng. 8(10), 1057-1062 (1995), beschrieben hergestellt wird.
Es werden Antikörper mit mehr als zwei Wertigkeiten erwogen. Beispielsweise können trispezifische Antikörper hergestellt werden. Tutt et al., J. Immunol. 147, 60 (1991).
(viii) Andere Modifikationen
Andere Modifikationen des humanisierten Anti-VEGF-Antikörpers oder der Anti-VEGF-Antikörpervariante werden erwogen. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, den Antikörper der Erfindung hinsichtlich der Effektorfunktion zu modifizieren, um die Wirksamkeit des Antikörpers z.B. bei der Behandlung von Krebs zu verbessern. Beispielsweise können Cysteinrest(e) in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch Disulfidbindung-Bildung zwischen den Ketten in dieser Region ermöglicht wird. Der so gebildete homodimere Antikörper kann verbesserte Internalisierungsfähigkeit und/oder verstärktes Komplement-vermitteltes Zelltöten und antikörpervermittelte zelluläre Zytotoxizität (ADCC) aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191-1195 (1992), und B. Shopes, J. Immunol. 148, 2918-2922 (1992). Homodimere Antikörper mit verstärkter Antitumor-Aktivität können auch unter Verwendung von heterobifunktionellen Vernetzern, wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560-2565 (1993), beschrieben wird, hergestellt werden. Alternativ dazu kann ein Antikörper hergestellt werden, der duale Fc-Regionen aufweist und dadurch über verstärkte Komplementlyse- und ADCC-Fähigkeiten verfügt. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3, 219-230 (1989).
Die Erfindung betrifft auch Immunkonjugate umfassend den hierin beschriebenen Antikörper, der an ein zytotoxisches Mittel wie beispielsweise ein chemotherapeutisches Mittel, Toxin (z.B. ein enzymatisch aktives Toxin bakteriellen, pflanzlichen, tierischen Ursprungs oder von Pilzen abstammend oder Fragmente davon) oder ein radioaktives Isotop (z.B. ein Radiokonjugat) konjugiert ist.
Chemotherapeutische Mittel, die zur Herstellung solcher Immunkonjugate nützlich sind, wurden oben bereits beschrieben. Enzymatisch aktive Toxine und Fragmente davon, die verwendet werden können, umfassen Diphtherie-A-Kette, nichtbindende aktive Fragmente von Diphtherietoxin, Exotoxin-A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa), Ricin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modecin-A-Kette, Alpha-Sarcin, Aleurites-fordii-Proteine, Dianthin-Proteine, Phytolaca-americana-Proteine (PAPI, PAPII und PAP-S), Momordica-charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Sapaonaria-officinalis-Inhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene. Zahlreiche Radionuclide sind zur Herstellung von radiokonjugierten Anti-VEGF-Antikörpern erhältlich. Beispiele umfassen ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y und ¹⁸⁶Re.
Konjugate des Antikörpers und zytotoxischen Mittels werden unter Verwendung von zahlreichen bifunktionellen Proteinkupplungsmitteln wie beispielsweise N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionellen Derivaten von Imidoestern (wie beispielsweise Dimethyladipimidat-HCl), aktiven Estern (wie beispielsweise Disuccinimidylsuberat), Aldehyden (wie beispielsweise Glutaraldehyd), Bisazido-Verbindungen (wie beispielsweise Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bisdiazonium-Derivaten (wie beispielsweise Bis(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanaten (wie beispielsweise Tolyen-2,6-diisocyanat) und bis-aktiven Fluorverbindungen (wie beispielsweise 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol) hergestellt. Beispielsweise kann ein Ricin-Immuntoxin wie von Vitetta et al. in Science 238, 1098 (1987), beschrieben hergestellt werden. C14-markiertes 1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein beispielhafter Chelatbildner zur Konjugation von Radionucleotid an den Antikörper. Siehe die WO 94/11026.
In einer anderen Ausführungsform kann der Antikörper an einen "Rezeptor" (wie beispielsweise Streptavidin) gebunden werden, um zum Tumor-Pretargeting verwendet zu werden, worin dem Patienten das Antikörper-Rezeptor-Konjugat verabreicht wird, woraufhin das Entfernen nicht gebundenen Konjugats aus dem Blutkreislauf unter Verwendung eines Klärungsmittels und anschließend die Verabreichung eines "Liganden" (z.B. Avidin), der an ein zytotoxisches Mittel (z.B. ein Radionuclid) gebunden ist, folgen.
Die hierin offenbarten Anti-VEGF-Antikörper können auch als Immunoliposomen formuliert werden. Liposomen, die den Antikörper enthalten, werden mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren hergestellt, die beispielsweise in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); und in den US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben werden. Liposomen mit erhöhter Zirkulationsdauer sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
Besonders nützliche Liposome können durch das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) umfasst, gebildet werden. Liposome werden durch Filter mit definierter Porengröße extrudiert, um Liposome mit dem erwünschten Durchmesser zu erhalten. Fab'-Fragmente des Antikörpers der vorliegenden Erfindung können wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286-288 (1982), beschrieben über Disulfid-Austauschreaktion an die Liposomen konjugiert werden. Ein chemotherapeutisches Mittel (wie beispielsweise Doxorubicin) ist gegebenenfalls innerhalb des Liposoms enthalten. Siehe Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989).
Der Antikörper der vorliegenden Erfindung kann durch Konjugieren des Antikörpers an ein Prodrug aktivierendes Enzym, das ein Prodrug (z.B. ein Peptidyl-chemotherapeutisches Mittel, siehe WO 81/01145) zu einem aktiven Antikrebs-Arzneimittel umsetzt, auch in ADEPT verwendet werden. Siehe beispielsweise die WO 88/07378 und das US-Patent Nr. 4.975.278.
Die Enzymkomponente des Immunkonjugats, das für ADEPT nützlich ist, schließt jedes beliebige Enzym ein, das in der Lage ist, auf ein Prodrug auf solche Weise zu wirken, dass es dieses zu einer aktiveren zytotoxischen Form umsetzt.
Enzyme, die im Verfahren dieser Erfindung nützlich sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, alkalische Phosphatase, die zur Umsetzung von Phosphat-hältigen Prodrugs zu freien Arzneimitteln nützlich ist; Arylsulfatase, die zur Umsetzung von Sulfat-hältigen Prodrugs zu freien Arzneimitteln nützlich ist; Cytosindeaminase, die zur Umsetzung von nichttoxischem 5-Fluorcytosin zum Antikrebs-Arzneimittel 5-Fluoruracil nützlich ist; Proteasen, wie beispielsweise Serratia-Protease, Thermolysin, Subtilisin, Carboxypeptidasen und Cathepsine (wie beispielsweise Cathepsine B und L), die zur Umsetzung von Peptid-hältigen Prodrugs zu freien Arzneimitteln nützlich sind; D-Alanylcarboxypeptidasen, die zur Umsetzung von Prodrugs nützlich sind, die D-Aminosäure-Substituenten enthalten; Kohlenhydrat-spaltende Enzyme wie beispielsweise β-Galactosidase und Neuraminidase, die zur Umsetzung von glykosylierten Prodrugs zu freien Arzneimitteln nützlich sind; β-Lactamase, die zur Umsetzung von Wirkstoffen, die mit β-Lactamen derivatisiert sind, zu freien Arzneimitteln nützlich ist; und Penicillin-Amidasen, wie beispielsweise Penicillin-V-Amidase oder Penicillin-G-Amidase, die zur Umsetzung von Wirkstoffen, die an ihren Aminstickstoffen mit Phenoxyacetyl- bzw. Phenylacetylgruppen derivatisiert sind, zu freien Arzneimitteln nützlich sind. Alternativ dazu können auch Antikörper mit enzymatischer Aktivität, die auf dem Gebiet der Erfindung auch als "Abzyme" bekannt sind, verwendet werden, um die Prodrugs der Erfindung zu freien aktiven Arzneimitteln umzusetzen (siehe z.B. Massey, Nature 328, 457-458 (1987)). Antikörper-Abzym-Konjugate können wie hierin beschrieben zur Zufuhr des Abzyms zu einer Tumorzellpopulation hergestellt werden.
Die Enzyme dieser Erfindung können durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren wie beispielsweise die Verwendung der heterobifunktionellen Vernetzer, die zuvor erläutert wurden, kovalent an die Anti-VEGF-Antikörper gebunden werden. Alternativ dazu können Fusionsproteine, die zumindest die Antigen-Bindungsregion eines Antikörpers der Erfindung umfassen, die an zumindest einen funktionell aktiven Abschnitt eines Enzyms der Erfindung gebunden ist, unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, konstruiert werden (siehe z.B. Neuberger et al., Nature 312, 604-608 (1984)).
In manchen Ausführungsformen der Erfindung kann es wünschenswert sein, ein Antikörperfragment zu verwenden und nicht einen intakten Antikörper, um beispielsweise das Eindringen in den Tumor zu verstärken. In diesem Fall kann es wünschenswert sein, das Antikörperfragment zu modifizieren, um seine Serum-Halbwertszeit zu verlängern. Dies kann beispielsweise durch Einbindung eines Salvagerezeptor-Bindungsepitops in das Antikörperfragment (z.B. durch Mutation der geeigneten Region im Antikörperfragment oder durch Einbindung des Epitops in eine Peptidmarkierung, die anschließend an das Antikörperfragment an beiden Enden oder in der Mitte, z.B. durch DNA- oder Peptidsynthese, fusioniert wird) erreicht werden. Siehe die WO 96/32478, veröffentlicht am 17. Oktober 1996.
Das Salvagerezeptor-Bindungsepitop stellt im Allgemeinen eine Region dar, in der jeder oder zumindest mehrere Aminosäurereste aus einer oder zwei Schleifen einer Fc-Domäne zu einer analogen Position des Antikörperfragments transferiert werden. Noch bevorzugter werden drei oder mehr Reste von einer oder zwei Schleifen der Fc-Domäne transferiert. Noch stärker bevorzugt wird das Epitop aus der CH2-Domäne der Fc-Region (z.B. eines IgG) entnommen und in die CH1-, CH3- oder V_H-Region oder in mehr als eine solche Region des Antikörpers transferiert. Alternativ dazu wird das Epitop der CH2-Domäne der Fc-Region entnommen und in die C_L-Region oder V_L-Region oder beide des Antikörperfragments transferiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Salvagerezeptor-Bindungsepitop die Sequenz: PKNSSMISNTP (Seq.-ID Nr. 17) und umfasst gegebenenfalls eine Sequenz, die aus der aus HQSLGTQ (Seq.-ID Nr. 18), HQNLSDGK (Seq.-ID Nr. 19), HQNISDGK (Seq.-ID Nr. 20) oder VISSHLGQ (Seq.-ID Nr. 21) bestehenden Gruppe ausgewählt ist, insbesondere, wenn das Antikörperfragment Fab oder F(ab')₂ ist. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform Ausfüh rungsform ist das Salvagerezeptor-Bindungsepitop ein Polypeptid, das die Sequenz(en): HQNLSDGK (Seq.-ID Nr. 19), HQNISDGK (Seq.-ID Nr. 20) oder VISSHLGQ (Seq.-ID Nr. 21) und die Sequenz: PKNSSMISNTP (Seq.-ID Nr. 17) enthält.
Kovalente Modifikationen des humanisierten Anti-VEGF-Antikörpers oder der Anti-VEGF-Antikörpervariante sind ebenfalls im Schutzumfang der Erfindung eingebunden. Sie können durch chemische Synthese oder durch enzymatische oder chemische Spaltung des Antikörpers, sofern dies geeignet ist, hergestellt werden. Andere Arten kovalenter Modifikationen des Antikörpers werden in das Molekül durch Umsetzen von Target-Aminosäureresten des Antikörpers mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten zu reagieren, eingeführt. Beispielhafte kovalente Modifikationen von Polypeptiden werden im US-Patent 5.534.615 beschrieben. Eine bevorzugte Art kovalenter Modifikation des Antikörpers umfasst das Binden des Antikörpers an ein aus zahlreichen verschiedenen, nichtproteinischen Polymeren ausgewähltes Polymer, z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, gemäß der in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 beschriebenen Art und Weise.
B. Vektoren, Wirtszellen und Rekombinationsverfahren
Die Erfindung stellt auch isolierte Nucleinsäure, die für den humanisierten Anti-VEGF-Antikörper oder die Anti-VEGF-Antikörpervariante kodiert, Vektoren und Wirtszellen, die die Nucleinsäure umfassen, sowie Rekombinationsverfahren zur Herstellung des Antikörpers bereit.
Zur rekombinanten Herstellung des Antikörpers kann die für ihn kodierende Nucleinsäure isoliert und in einen replizierbaren Vektor zum weiteren Klonieren (Amplifikation der DNA) oder zur Expression eingeführt werden. In einer anderen Ausführungsform kann der Antikörper durch homologe Rekombination hergestellt werden, wie z.B. im US-Patent 5.204.244 beschrieben wird. DNA, die für den monoklonalen Antikörper kodiert, kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (z.B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, sich spezifisch an Gene zu binden, die für die Schwer- und Leichtketten des Antikörpers kodieren) leicht isoliert und sequenziert werden. Zahlreiche Vektoren sind erhältlich. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, ein oder mehrere der folgenden Elemente: eine Signalsequenz, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, einen Promotor, eine Transkriptionsterminationssequenz, z.B. wie im US-Patent Nr. 5.534.615, das am 9. Juli 1996 ausgegeben wurde, beschrieben wird.
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in den hierin beschriebenen Vektoren sind Prokaryoten-, Hefe- oder höhere eukaryotische Zellen, die zuvor beschrieben wurden. Für diesen Zweck geeignete Prokaryoten umfassen Eubakterien, wie beispielsweise Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae wie beispielsweise Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli wie beispielsweise B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710, veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas wie beispielsweise P. aeruginosa und Streptomyces. Ein bevorzugter E.-coli-Klonierwirt ist E. coli 294 (ATCC 31.446), wobei auch andere Stämme wie beispielsweise E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) und E. coli W3110 (ATCC 27.325) geeignet sind. Diese Beispiele dienen zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie beispielsweise Fadenpilze oder Hefe geeignete Klonier- oder Expressionswirte für für Anti-VEGF-Antikörper kodierende Vektoren.
Saccharomyces cerevisiae, oder gemeine Bäckerhefe, ist unter den niedrigeren eukaryotischen Wirtmikroorganismen am häufigsten verwendet. Dennoch sind zahlreiche andere Gattungen, Spezies und Stämme üblicherweise erhältlich und hierin nützlich, wie beispielsweise Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces-Wirte wie Z.B. K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans und K. marxiamis; Yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa; Schwanniomyces wie beispielsweise Schwanniomyces occidentalis; und Fadenpilze wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium und Aspergillus-Wirte wie beispielsweise A. nidulans und A. niger.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykosylierten Anti-VEGF-Antikörpern sind von mehrzelligen Organismen abgeleitet. Beispiele für Zellen von Wirbellosen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche Baculovirus-Stämme und -Varianten und entsprechende permissive Insekten-Wirtszellen von Wirten wie beispielsweise Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Moskito), Aedes albopictus (Moskito), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori wurden bereits identifziert. Zahlreiche Virusstämme zur Transfektion sind öffentlich erhältlich, Z.B. die L-1-Variante von Autographs californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV, und solche Viren können als die Viren hierin gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen. Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Mais, Kartoffel, Sojabohne, Petunie, Tomate und Tabak können auch als Wirte verwendet werden.
Das Interesse war jedoch stets für Wirbeltierzellen am größten, und die Vermehrung von Wirbeltierzellen (Gewebekultur) wurde zu einem Routineverfahren. Beispiele für nützliche Säugetierwirt-Zelllinien sind Affennieren-CV1-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293 oder 293-Zellen, subkloniert für Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)); Affen-Nierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Grüne-Meerkatzennierenzellen (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hunde-Nieren zellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäuse-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TR1-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-68 (1982)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen; und eine menschliche Hepatomlinie (Hep G2).
Wirtszellen werden mit den zuvor beschriebenen Expressions- oder Kloniervektoren zur Anti-VEGF-Antikörperherstellung transformiert und in herkömmlichem Nährmedium, das je nach Bedarf zum Induzieren von Promotoren, Selektieren von Transformanten oder Amplifizieren der Gene, die für die erwünschten Sequenzen kodieren, modifiziert ist, kultiviert.
Die Wirtszellen, die für die Herstellung der Anti-VEGF-Antikörpers dieser Erfindung verwendet werden, können in zahlreichen verschiedenen Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien wie beispielsweise Ham's F10 (Sigma), Minimalmedium (MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Sigma) sind zum Kultivieren der Wirtszellen geeignet. Zusätzlich kann jedes beliebige der in Ham et al., Meth. Enz. 58, 44 (1979); Barnes et al., Anal. Biochem. 102, 255 (1980); US-Patente Nr. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; oder 5.122.469; der WO 90/03430; WO 87/00195; oder der Patentanmeldung mit der Anmeldenummer 30.985 beschriebenen Medien als Kulturmedium für die Wirtszellen verwendet werden. Jedes dieser Medien kann, sofern erforderlich, mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie beispielsweise Insulin, Transferrin oder Epidermiswachstumsfaktor), Salzen (wie beispielsweise Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie HEPES), Nucleotiden (wie beispielsweise Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie beispielsweise GENTAMYCIN^TM-Wirkstoff), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise bei Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden sind) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequellen ergänzt sein. Jede andere notwendige Ergänzung kann in geeigneten Konzentrationen, die Fachleuten bekannt sind, ebenfalls eingebunden werden. Die Kulturbedingungen, wie beispielsweise Temperatur, pH und dergleichen, entsprechen jenen, die bisher für die zur Expression ausgewählte Wirtszelle verwendet wurden, und sind durchschnittlichen Fachleuten bekannt.
Bei der Verwendung von Rekombinationsverfahren kann der Antikörper intrazellulär, im periplasmatischen Raum, hergestellt oder direkt ins Medium sekretiert werden. Wird der Antikörper intrazellulär hergestellt, so werden in einem ersten Schritt die partikulären Zelltrümmer, entweder Wirtszellen oder lysierte Fragmente, beispielsweise durch Zentrifugation oder Ultrafiltration entfernt. Carter et al., Bio/Technology 10, 163-167 (1992), beschreiben ein Verfahren zum Isolieren von Antikörpern, die zum periplasmatischen Raum von E. coli hin sekretiert werden. Kurz zusammengefasst wird Zellpaste in Gegenwart von Natriumacetat (pH 3,5), EDTA und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) etwa 30 Minuten lang aufgetaut. Zelltrümmer können durch Zentrifugation entfernt werden. Wird der Antikörper zuerst in das Medium sekretiert, so werden Überstände aus solchen Expressionssystemen im Allgemeinen zuerst unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Proteinkonzentrationsfilter, beispielsweise einer Amicon- oder Millipore-Pellicon-Ultrafiltrationseinheit, konzentriert. Ein Protease-Inhibitor wie beispielsweise PMSF kann in jedem der vorangehenden Schritte eingebunden werden, um Proteolyse zu hemmen, und Antibiotika können eingebunden werden, um das Wachstum von hinzukommenden Verunreinigungen zu unterbinden.
Die aus den Zellen hergestellte Antikörper-Zusammensetzung kann unter Verwendung von beispielsweise Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse und Affinitätschromatographie gereinigt werden, wobei Affinitätschromatographie das bevorzugte Reinigungsverfahren darstellt. Die Eignung von Protein A als Affinitätsligand hängt von der Spezies und dem Isotyp jeder einzelnen Immunglobulin-Fc-Domäne ab, die im Antikörper vorhanden ist. Protein A kann verwendet werden, um Antikörper zu reinigen, die auf menschlichen γ1-, γ2- oder γ4-Schwerketten basieren (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62, 1-12 (1983)). Protein G wird für alle Maus-Isotypen und für menschliches γ3 empfohlen (Guss et al., EMBO J. 5, 1567-1575 (1986)). Die Matrize, an die der Affinitätsligand gebunden ist, ist in den meisten Fäl len Agarose, wobei jedoch auch andere Matrizen erhältlich sind. Mechanisch stabile Matrizen wie beispielsweise Controlled Pore Glass oder Poly(styroldivinyl)benzol ermöglichen höhere Durchflussgeschwindigkeiten und kürzere Verarbeitungszeiten als mit Agarose erreicht werden können. Umfasst der Antikörper eine C_H3-Domäne, so ist das Bakerbond-ABX^TM-Harz (J. T. Baker, Philipsburg, NJ) zur Reinigung nützlich. Andere Verfahren zur Proteinreinigung wie beispielsweise Fraktionierung an einer Ionenaustauschsäule, Ethanolfällung, Umkehrphasen-HPLC, Chromatographie auf Siliciumdioxid, Chromatographie auf Heparin, SEPHAROSE^TM-Chromatographie auf einem Anionen- oder Kationen-Austauschharz (wie beispielsweise einer Polyasparaginsäure), Chromatofokussierung, SDS-PAGE und Ammoniumsulfatfällung sind je nach dem zu gewinnenden Antikörper auch geeignet.
Nach jedem dieser vorläufigen Reinigungsschritte kann das Gemisch, das den Antikörper von Interesse und Verunreinigungen umfasst, einer Hydrophobchromatographie bei niedrigem pH unter Verwendung eines Elutionspuffers bei einem pH zwischen etwa 2,5-4,5, die vorzugsweise bei geringen Salzkonzentrationen (z.B. von etwa 0 bis 0,25 M Salz) durchgeführt wird, unterzogen werden.
C. Pharmazeutische Formulierungen
Therapeutische Formulierungen des Antikörpers werden zur Lagerung durch Vermischen des Antikörpers, der den erwünschten Grad an Reinheit aufweist, mit gegebenenfalls physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980)) in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen hergestellt. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind gegenüber Rezipienten bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nichttoxisch und umfassen Puffer wie beispielsweise Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien, einschließlich Ascorbinsäure und Methionin; Konservierungsmittel (wie beispielsweise Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid; Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid; Benzethoniumchlorid; Phenol, Butyl- oder Benzylalkohol; Alkylparabene wie beispielsweise wie beispielsweise Methyl- oder Propylparaben; Catechin; Resorcin; Cyclohexanol; 3-Pentanol; und m-Kresol); niedermolekulare Polypeptide (mit weniger als 10 Resten); Proteine, wie beispielsweise Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie beispielsweise Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie beispielsweise Glycin, Glutamin, Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie beispielsweise EDTA; Zucker wie beispielsweise Saccharose, Mannit, Trehalose oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie Natrium; Metallkomplexe (z.B. Zn-Proteinkomplexe); und/oder nichtionische Tenside wie beispielsweise TWEEN^TM, PLURONICS^TM oder Polyethylenglykol (PEG).
Die Formulierung hierin kann auch mehr als eine aktive Verbindung enthalten, sofern dies für die bestimmte zu behandelnde Indikation erforderlich ist, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, die sich gegenseitig nicht negativ beeinflussen (siehe unten Abschnitt F). Solche Moleküle sind geeigneterweise in Kombination in solchen Mengen vorhanden, dass sie für den beabsichtigten Zweck wirksam sind.
Die aktiven Bestandteile können auch in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervationsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt wurden, beispielsweise in Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly-(methylmethacrylat)mikrokapseln, in kolloidalen Arzneimittel freisetzenden Systemen (beispielsweise Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln), oder in Makroemulsionen eingeschlossen sein. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.) (1980), offenbart.
Die für die In-vivo-Verabreichung verwendeten Formulierungen müssen steril sein. Dies kann leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen sichergestellt werden.
Es können auch Retard-Präparate hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Retard-Präparate umfassen semipermeable Matrizen aus hydrophoben Polymeren, die den Antikörper enthalten, wobei die Matrizen in Form von geformten Artikeln, z.B. Filmen oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele für Retard-Matrizen umfassen Polyester, Hydrogele (beispielsweise Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 4.773.919), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-Glutamat, nicht abbaubares Ethylen-Vinyl-Acetat, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere wie beispielsweise Lupron Depot^TM (injizierbare Mikrokügelchen, zusammengesetzt aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere wie beispielsweise Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen über 100 Tage hinweg ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine über kürzere Zeitspannen hinweg frei. Verbleiben eingekapselte Antikörper über eine längere Zeit im Körper, so können sie denaturieren oder als ein Resultat von Aussetzung gegenüber Feuchtigkeit bei 37 °C aggregieren, was zu einem Verlust von biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität führt. Je nach eingebundenem Mechanismus können rationale Strategien zur Stabilisierung entwickelt werden. Wird beispielsweise entdeckt, dass der Aggregationsmechanismus eine intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thiodisulfidaustausch ist, kann Stabilisierung durch Modifizieren von Sulfhydrylresten, Lyophilisieren von sauren Lösungen, Steuern des Feuchtigkeitsgehalts, Einsatz von geeigneten Additiven und Entwickeln spezifischer Polymermatrizen-Zusammensetzungen erreicht werden.
D. Nichttherapeutische Verwendungen von Antikörpern
Die Antikörper der Erfindung können als Affinitätsreinigungsmittel verwendet werden. In diesem Verfahren werden die Antikörper an einer Festphase wie beispielsweise Sephadexharz oder Filterpapier unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren immobilisiert. Der immobilisierte Antikörper wird mit einer Probe kontaktiert, die das VEGF-Protein (oder ein Fragment davon), das es zu reinigen gilt, enthält, und hiernach wird der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das im Wesentlichen das gesamte Material in der Probe unter Ausnahme des VEGF-Proteins entfernt, das an den immobilisierten Antikörper gebunden ist.
Schließlich wird der Träger mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise Glycinpuffer, pH 5,0, gewaschen, der das VEGF-Protein aus dem Antikörper freisetzt.
Anti-VEGF-Antikorper können auch bei Diagnosetests auf VEGF-Protein nützlich sein, z.B. zur Detektion seiner Expression in spezifischen Zellen, Geweben oder Serum. Solche Diagnoseverfahren können zur Krebsdiagnose nützlich sein.
Für diagnostische Anwendungen wird der Antikörper typischerweise mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert. Zahlreiche Markierungen sind erhältlich, die im Allgemeinen den folgenden Kategorien zugeteilt werden können:

(a) Radioisotope, wie beispielsweise ³⁵S ¹⁴C ¹²⁵I, ³H und ¹³¹I. Der Antikörper kann mit dem Radioisotop unter Verwendung der beispielsweise in Current Protocols in Immunology, Bd. 1 und 2, Coligen et al. (Hrsg.), Wiley-Interscience, New York (1991), beschriebenen Verfahren markiert werden, und Radioaktivität kann unter Verwendung von Szintillationszählung gemessen werden.
(b) Fluoreszierende Markierungen wie beispielsweise Seltenerdchelate (Europiumchelate) oder Fluorescein und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl, Lissamin, Phycoerythrin und Texas-Rot, sind erhältlich. Die fluoreszierenden Markierungen können mit dem Antikörper unter Verwendung der beispielsweise in Current Protocols in Immunology, s.o., offenbarten Verfahren konjugiert werden. Fluoreszenz kann unter Verwendung eines Flourimeters quantifiziert werden.
(c) Verschiedene Enzym-Substrat-Markierungen sind erhältlich, und das US-Patent Nr. 4.275.149 stellt einen Bericht über manche von diesen bereit. Das Enzym katalysiert normalerweise eine chemische Veränderung des chromogenen Substrats, was unter Verwendung verschiedener Verfahren gemessen werden kann. Beispielsweise kann das Enzym eine Farbveränderung in einem Substrat katalysieren, die spektralphotometrisch gemessen werden kann. Alternativ dazu kann das Enzym die Fluoreszenz oder Chemolumineszenz des Substrats ändern. Verfahren zur Quantifizierung einer Änderung der Fluoreszenz wurden vorangehend beschrieben. Das chemolumineszierende Substrat wird durch eine chemische Reaktion elektronisch angeregt und kann dann Licht emitieren, das gemessen werden kann (unter Verwendung eines Chemoluminometers beispielsweise), oder spendet Energie an einen fluoreszierenden Akzeptor. Beispielsweise für enzymatische Markierungen umfassen Luciferasen (z.B. Glühwürmchen-Luciferase und bakterielle Luciferase; US-Patent Nr. 4.737.456), Luciferin, 2,3-Dihydrophthalazindione, Maleatdehydrogenase, Urease, Peroxidase wie beispielsweise Meerrettichperoxidase (HRPO), alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Glucoamylase, Lysozym, Saccharidoxidasen (z.B. Glucoseoxidase, Galactoseoxidase und Glucose-6-phosphatdehydrogenase), heterozyklische Oxidasen (wie beispielsweise Uricase und Xanthinoxidase), Lactoperoxidase, Mikroperoxidase und dergleichen. Verfahren zum Konjugieren von Enzymen an Antikörper sind in O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in: Methods in Enzym. (hrsg. von J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73, 147-166 (1981), beschrieben.

Beispiele für Enzym-Substrat-Kombinationen umfassen beispielsweise:

(i) Meerrettichperoxidase (HRPO) mit Wasserstoffperoxidase als Substrat, worin die Wasserstoffperoxidase einen Farbstoffvorläufer (z.B. o-Phenylendiamin (OPD) oder 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidinhydrochlorid (TMB)) oxidiert;
(ii) alkalische Phosphatase (AP) mit p-Nitrophenylphosphat als chromogenes Substrat; und
(iii) β-D-Galactosidase (β-D-Gal) mit einem chromogenen Substrat (z.B. p-Nitrophenyl-β-D-Galactosidase) oder einem fluorogenen Substrat 4-Methylumbelliferyl-β-D-Galactosidase.

Zahlreiche andere Enzym-Substrat-Kombinationen sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung zugänglich. Ein allgemeiner Bericht hierzu ist in den US-Patenten Nr. 4.275.149 und 4.318.980 zu finden.
Manchmal wird die Markierung indirekt mit dem Antikörper konjugiert. Fachleuten werden verschiedene Verfahren zur Umsetzung solcher Markierungen bekannt sein. Beispielsweise kann der Antikörper mit Biotin und jede beliebige der drei umfassenden Markierungskategorien, die zuvor erwähnt wurden, mit Avidin konjugiert werden oder umgekehrt. Biotin bindet sich selektiv an Avidin, wodurch die Markierung mit dem Antikörper auf diese indirekte Weise konjugiert werden kann. Alternativ dazu wird der Antikörper, um indirekte Konjugation der Markierung mit dem Antikörper zu erreichen, mit einem kleinen Hapten (z.B. Digoxin) und eine der verschiedenen Arten von Markierungen, die zuvor erwähnt wurden, mit einem Anti-Hapten-Antikörper (z.B. Anti-Digoxin-Antikörper) konjugiert. Somit kann indirekte Konjugation der Markierung mit dem Antikörper erreicht werden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung muss der Anti-VEGF-Antikörper nicht markiert werden, und die Gegenwart davon kann unter Verwendung eines markierten Antikörpers nachgewiesen werden, der sich an den VEGF-Antikörper bindet.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können in jedem bekannten Testverfahren wie beispielsweise in Konkurrenzbindungstests, direkten und indirekten Sandwichtests und Immunfällungstests verwendet werden. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
Konkurrenzbindungstests beruhen auf der Fähigkeit eines markierten Standards, mit dem Testprobenanalyt um Bindung mit einer limitierten Menge an Antikörper zu konkurrieren. Die Menge an VEGF-Protein in der Testprobe ist umgekehrt proportional zur Menge des Standards, der an die Antikörper gebunden wird. Um das Bestimmen der Menge des Standards, der gebunden wird, zu erleichtern, werden die Antikörper im Allgemeinen vor oder nach der Kompetition unlöslich gemacht, sodass der Standard und der Analyt, die an die Antikörper gebunden sind, leicht vom Standard und Analyt getrennt werden können, die ungebunden verbleiben.
Sandwichtests binden die Verwendung von zwei Antikörpern ein, wobei jeder in der Lage ist, sich an einen anderen immunogenen Abschnitt, oder ein Epitop, des nach zuweisenden Proteins zu binden. In einem Sandwichtest ist der Testprobenanalyt durch einen ersten Antikörper gebunden, der an einem festen Träger immobilisiert ist, und hiernach bindet sich ein zweiter Antikörper an den Analyt, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex gebildet wird. Siehe z.B. das US-Patent Nr. 4.376.110. Der zweite Antikörper kann selbst mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert sein (direkte Sandwichtests) oder kann unter Verwendung eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers, der mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert ist, gemessen werden (indirekter Sandwichtest). Eine Art von Sandwichtest ist beispielsweise ein ELISA-Test, wobei die nachweisbare Gruppierung hier ein Enzym ist.
Für Immunhistochemie kann die Tumorprobe frisch oder gefroren sein oder kann in Paraffin eingebettet und mit einem Konservierungsmittel wie beispielsweise Formalin fixiert sein.
Die Antikörper können auch für In-vivo-Diagnosetests verwendet werden. Im Allgemeinen wird der Antikörper mit einem Radionuclid (wie beispielsweise ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ¹²⁵I, ³²H, ³²P oder ³⁵S) markiert, sodass der Tumor unter Verwendung von Immunszintigraphie lokalisiert werden kann.
E. Diagnosesets
Aus praktischen Gründen kann der Antikörper der vorliegenden Erfindung in einem Set bereitgestellt werden, d.h. in Form einer abgepackten Kombination von Reagenzien in vorbestimmten Mengen mit Anweisungen zur Durchführung des Diagnosetests. Ist der Antikörper mit einem Enzym markiert, so umfasst das Set Substrate und Cofaktoren, die das Enzym erfordert (z.B. ein Substratvorläufer, der das nachweisbare Chromophor oder Fluorophor bereitstellt). Zusätzlich können andere Additive eingebunden werden, wie beispielsweise Stabilisatoren, Puffer (z.B. ein Blockpuffer oder ein Lysepuffer) und dergleichen. Die relativen Mengen der verschiedenen Reagenzien können in einem weiten Bereich variiert werden, um Konzentrationen in Lösung der Reagenzien bereitzustellen, die die Empfindlichkeit des Tests wesentlich optimieren. Insbesondere können die Reagenzien in Form von trockenen Pulvern, üblicherweise lyophilisiert, bereitgestellt werden, einschließlich Exzipienten, die unter Auflösung eine Reagenzlösung mit der geeigneten Konzentration bereitstellen.
F. Therapeutische Verwendungen des Antikörpers
Für therapeutische Anwendungszwecke werden die Anti-VEGF-Antikörper der Erfindung einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, in einer pharmazeutisch annehmbaren Dosierungsform wie beispielsweise jene, die zuvor erläutert wurden, verabreicht, einschließlich jenen Dosierungsformen, die einem Menschen intravenös in Form eines Bolus oder mittels kontinuierlicher Infusion über eine bestimmte Zeitspanne hinweg, intramuskulär, intraperitoneal, intra-zerebrospinal, subkutan, intraartikular, intrasynovial, intrathekal, oral, tropisch oder über Inhalation verabreicht werden. Die Antikörper können auch intra-tumoral, peritumoral, intraläsional oder periläsional geeignet verabreicht werden, um lokale sowie systemische therapeutische Wirkungen zu erzielen. Intraperitoneale Verabreichung wird als besonders nützlich erachtet, beispielsweise in der Behandlung von Eierstocktumoren.
Zur Prävention oder Behandlung einer Erkrankung hängt die geeignete Dosierung an Antikörper vom zu behandelnden Erkrankungstyp, wie zuvor definiert, von Ausmaß und Verlauf der Erkrankung, von der Tatsache, ob der Antikörper zu präventiven oder therapeutischen Zwecken verabreicht wird, von vorangehenden Therapien, von der Anamnese des Patienten und der Reaktion auf den Antikörper sowie dem Ermessen des behandelnden Arztes ab. Der Antikörper wird geeigneterweise dem Patienten einmalig oder mehrmalig im Rahmen einer Reihe von Behandlungen verabreicht.
Die Anti-VEGF-Antikörper sind zur Behandlung verschiedener neoplastischer und nicht-neoplastischer Erkrankungen und Störungen nützlich. Neoplasmen und damit verbundene Erkrankungszustände, die auf eine Behandlung ansprechen könnten, umfassen Brustkarzinome, Lungenkarzinome, Magenkarzinome, Speiseröhrenkarzi nome, Kolorektalkarzinome, Leberkarzinome, Eierstockkarzinome, Thekazelltumoren, Arrhenoblastome, Zervixkarzinome, Korpuskarzinome, endometriale Hyperplasie, Endometriose, Fibrosarkomen, Chorionkarzinom, Kopf- und Halskrebs, Nasopharynxkarzinom, Kehlkopfkarzinom, Hepatoblastom, Kaposi-Sarkom, Melanom, Hautkarzinome, Hämangiom, Kavernom, Hämangioblastom, Bauchspeicheldrüsenkarzinome, Retinoblastom, Astrozytom, Glioblastom, Schwannom, Oligodendrogliom, Medulloblastom, Neuroblastome, Rhabdomyosarkom, osteogenes Sarkom, Leiomyosarkom, Harnwegskarzinome, Schilddrüsenkarzinome, Wilm-Tumor, Nierenzellkarzinom, Prostatakarzinom, anomale vaskuläre Vermehrung, assoziiert mit Phakomatosen, Ödem (wie beispielsweise jenes, das mit Hirntumoren in Verbindung steht) und Meigs-Syndrom.
Nicht-neoplastische Erkrankungszustände, die auf eine Behandlung ansprechen könnten, umfassen rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Arteriosklerose, Retinopathia diabetica und andere wuchernde Retinopathien, einschließlich retrokristalline Retinopathie, retrokristalline Fibroplasie, Neovaskularisationsglaukom, altersbedingte Makuladegeneration, Schilddrüsenhyperplasien (einschließlich Graves-Krankheit), Korneal- und andere Gewebetransplantationen, chronische Entzündung, Lungenentzündung, nephrotisches Syndrom, Präeklampsie, Aszites, Perikarderguss (wie beispielsweise jener, der mit Pericarditis einhergeht) und Pleuraerguss.
Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine der Hauptursachen für gravierenden Sichtverlust unter der alternden Bevölkerung. Die exsudative Form von AMD ist durch choroidale Neovaskularisierung und Ablösung von Netzhaut-Pigmentepithelzellen charakterisiert. Da choroidale Neovaskularisierung mit einer drastischen Prognoseverschlechterung einhergeht, wird erwartet, dass die VEGF-Antikörper der vorliegenden Erfindung zur Reduktion des Ausmaßes von AMD besonders nützlich sind.
Je nach Art und Ausmaß der Erkrankung ist etwa 1 μg/kg bis etwa 50 mg/kg (z.B. 0,1-20 mg/kg) Antikörper eine anfängliche mögliche Dosierung zur Verabreichung an den Patienten, entweder beispielsweise mittels einer oder mehrerer getrennter Verabreichungen oder mittels kontinuierlicher Infusion. Eine typische tägliche oder wö chentliche Dosierung kann im Bereich von etwa 1 μg/kg bis etwa 20 mg/kg oder mehr liegen, je nach den bereits zuvor erwähnten Faktoren. Für wiederholte Verabreichungen über mehrere Tage oder länger hinweg, je nach Leiden des Patienten, wird die Behandlung wiederholt, bis eine erwünschte Unterdrückung der Erkrankungssymptome eintritt. Es können jedoch auch andere Dosierungspläne nützlich sein. Der Fortschritt dieser Therapie kann durch herkömmliche Verfahren und Tests, einschließlich beispielsweise radiographischer Tumorabbildung, beobachtet werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Wirksamkeit des Antikörpers in der Prävention oder Behandlung von Erkrankungen durch Verabreichung des Antikörpers in Serie oder in Kombination mit einem anderen Mittel, das für diese Zwecke wirksam ist, wie beispielsweise Tumornekrosefaktor (TNF), mit einem Antikörper, der in der Lage ist, die angiogene Aktivität von saurem oder basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) oder Hepatozytwachstumsfaktor (HGF) zu hemmen oder zu neutralisieren, mit einem Antikörper, der in der Lage ist, die Koagulationsaktivitäten von Gewebefaktor, Protein C oder Protein S zu hemmen oder zu neutralisieren (siehe Esmon et al., PCT-Patentveröffentlichungs-Nr. WO 91/01753, veröffentlicht am 21. Februar 1991), mit einem Antikörper, der in der Lage ist, sich an HER2-Rezeptor zu binden (siehe Hudziak et al., PCT-Patentveröffentlichungs-Nr. WO 89/06692, veröffentlicht am 27. Juli 1989) oder mit einem oder mehreren herkömmlichen therapeutischen Mittel(n) wie beispielsweise Alkylierungsmitteln, Folsäureantagonisten, Anti-Metaboliten des Nucleinsäure-Metabolismus, Antibiotika, Pyrimidin-Analoga, 5-Fluoruracil, Cisplatin, Purinnucleosiden, Aminen, Aminosäuren, Triazolnucleosiden oder Corticosteroiden verbessert werden. Solche anderen Mittel können in der zu verabreichenden Zusammensetzung vorhanden sein oder können separat verabreicht werden. Auch wird der Antikörper geeigneterweise in Serie oder in Kombination mit radiologischen Behandlungen verabreicht, unabhängig davon, ob diese Bestrahlung oder Verabreichung von radioaktiven Substanzen einbinden.
In einer Ausführungsform wird die Vaskularisierung von Tumoren mittels Kombinationstherapie bekämpft. Der Antikörper und ein oder mehrere andere Anti-VEGF-Antagonisten werden dem an einem Tumor erkrankten Patienten bei therapeutisch wirksamer Dosierung, wie beispielsweise durch Beobachten der Nekrose des Tumors oder seiner Metastasenherde, sofern welche vorhanden sind, bestimmt, verabreicht. Diese Therapie wird fortgesetzt, bis keine weitere zusätzliche positive Wirkung mehr zu beobachten ist oder bis klinische Untersuchungen keine Spur des Tumors oder keine Metastasenherde mehr zeigen. Dann wird TNF verabreicht, alleine oder in Kombination mit einem Hilfsmittel wie beispielsweise α-, β- oder γ-Interferon, Anti-HER2-Antikörper, Heregulin, Anti-Heregulin-Antikörper, D-Faktor, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierender Faktor (GMCSF) oder mit Mitteln, die mikrovaskuläre Koagulation in Tumoren fördern, wie beispielsweise Anti-Protein-C-Antikörper, Anti-Protein-S-Antikörper oder C4b-Bindungsprotein (siehe Esmon et al., PCT-Patentveröffentlichungs-Nr. WO 91/101753, veröffentlicht am 21. Februar 1991) oder mit Wärme oder Bestrahlung.
Da sich die Hilfsmittel bezüglich ihrer Wirksamkeit unterscheiden, ist es wünschenswert, ihre Auswirkung auf den Tumor mittels Matrizen-Screening auf herkömmliche Weise zu vergleichen. Die Verabreichung von Anti-VEGF-Antikörper und TNF wird wiederholt, bis die erwünschte klinische Wirkung erzielt wird. Alternativ dazu wird der Anti-VEGF-Antikörper zusammen mit TNF und gegebenenfalls mit Hilfsmittel(n) verabreicht. In Fällen, in denen feste Tumoren in den Gliedern oder an anderen Stellen, die möglicherweise vom allgemeinen Blutkreislauf isoliert sind, gefunden werden, werden die hierin beschriebenen therapeutischen Mittel dem isolierten Tumor oder Organ verabreicht. In weiteren Ausführungsformen wird ein FGF- oder von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor-(PDGF-)Antagonist, wie beispielsweise ein Anti-FGF- oder ein neutralisierender Anti-PDGF-Antikörper, dem Patienten in Verbindung mit dem Anti-VEGF-Antikörper verabreicht. Die Behandlung mit Anti-VEGF-Antikörpern kann gegebenenfalls während Phasen der Wundheilung oder während wünschenswerter Neovaskularisierung ausgesetzt werden.
G. Fertigartikel
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Herstellungsartikel, der für die Behandlung von den zuvor beschriebenen Erkrankungen nützliche Materialien enthält, bereitgestellt. Der Herstellungsartikel umfasst einen Behälter und eine Markierung. Geeignete Behälter umfassen beispielsweise Flaschen, Phiolen, Spritzen und Teströhrchen. Die Behälter können aus zahlreichen verschiedenen Materialien wie beispielsweise Glas oder Kunststoff hergestellt sein. Der Behälter enthält eine Zusammensetzung, die zur Behandlung des Leidens nützlich ist, und kann über einen sterilen Eingang verfügen (beispielsweise kann der Behälter ein Beutel mit intravenöser Lösung oder eine Phiole mit einem Septum sein, das man mit einer Nadel zur subkutanen Injektion durchstechen kann). Der Wirkstoff in der Zusammensetzung ist der Anti-VEGF-Antikörper. Die Markierung, die am Behälter angebracht oder mit ihm verbunden ist, weist darauf hin, dass die Zusammensetzung zur Behandlung der jeweiligen Erkrankung verwendet wird. Der Herstellungsartikel kann weiters einen zweiten Behälter umfassen, der einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer, wie beispielsweise Phosphat-gepufferte Salzlösung, Ringer-Lösung und Dextroselösung, enthält. Weiters können andere Materialien enthalten sein, die aus kommerzieller Hinsicht und aus Sicht des Benutzers wünschenswert sind, einschließlich weiterer Puffer, Verdünner, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Gebrauchsanweisungen.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von humanisierten Anti-VEGF-Antikörpern mit erwünschten Eigenschaften für therapeutische Zwecke.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Klonieren von Maus-A4.6.1-MAb und Konstruktion von chimärem Maus-Mensch-Fab: Der Maus-Anti-VEGF-MAb A4.6.1 wurde bereits von Kim et al., Growth Factors 7, 53 (1992), und Kim et al., Nature 362, 841 (1993), beschrieben. Gesamt-RNA wurde aus Hybridomzellen, die den Anti-VEGF-MAb A.4.6.1 produzieren, unter Verwendung von RNAsol (TEL-TEST) isoliert und revers zu cDNA unter Verwendung von Oligo-dT-Primer und dem SuperScript-II-System (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) transkribiert. Degenerierte Oligonucleotid-Primerpools, basierend auf den N-terminalen Aminosäuresequenzen der leichten und schweren Ketten des Antikörpers, wurden synthetisiert und als Vorwärts-Primer verwendet. Rückwärts-Primer basierten auf 4 Gerüstsequenzen, die aus Maus-Leichtketten-Untergruppe kV und -Schwerketten-Untergruppe II erhalten wurden (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Aufl., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Nach Polymerasekettenreaktion-(PCR-)Amplifikation wurden DNA-Fragmente an einen TA-Kloniervektor (Invitrogen, San Diega, CA) ligiert. Acht Klone von jeweils den schweren und den leichten Ketten wurden sequenziert. Ein Klon mit einer Consensus-Sequenz für die Leichtketten-VL-Domäne und einer mit einer Consensus-Sequenz für die Schwerketten-VH-Domäne wurden jeweils in den pEMX1-Vektor subkloniert, der die menschlichen CL- und CH1-Domänen enthielt (Werther et al., J. Immunol. 157, 4986-4995 (1996)), wodurch eine Maus-Mensch-Chimäre gebildet wurde. Dieses chimäre F(ab) bestand aus der gesamten Maus-A4.6.1-VH-Domäne, die an eine menschliche CH1-Domäne bei Aminosäure SerH113 fusioniert war, und der gesamten Maus-A4.6.1.-VL-Domäne, die an eine menschliche CL-Domäne bei Aminosäure LysL107 fusioniert war. Expression und Reinigung des chimären F(ab) erfolgten wie im Fall der humanisierten F(ab)s. Das chimäre F(ab) wurde in Bindungstests als Standard verwendet.
Computergraphikmodelle von Maus-F(ab) und humanisiertem F(ab): Sequenzen der VL- und VH-Domänen (1A und 1B) wurden verwendet, um ein Computergraphikmodell der Maus-A4.6.1-VL-VH-Domänen zu konstruieren. Dieses Modell wurde verwendet, um zu bestimmen, welche Gerüst-Reste in den humanisierten Antikörper eingebunden werden sollten. Auch wurde ein Modell des humanisierten F(ab) konstruiert, um die korrekte Selektion von Maus-Gerüst-Resten zu überprüfen. Die Konstruktion von Modellen erfolgte gemäß bereits vorhandener Beschreibungen (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285-4289 (1992), und Eigenbrot et al., J. Mol. Biol. 229, 969-995 (1993)).
Konstruktion von humanisierten F(ab)s: Das Plasmid pEMX1, das für Mutagenese und Expression von F(ab)s in E. coli verwendet wurde, wurde bereits beschrieben (Werther et al., s.o.). Kurz zusammengefasst enthält das Plasmid ein DNA-Fragment, das für eine menschliche Consensus-κ-Untergruppe-I-Leichtkette (VLκI-CL) kodiert, und eine menschliche Consensus-Untergruppe-III-Schwerkette (VHIII-CH1) und einen alkalische-Phosphatase-Promotor. Die Verwendung der Consensussequenzen für VL und VH wurde bereits beschrieben (Carter et al., s.o.).
Um die erste F(ab)-Variante von humanisiertem A4.6.1, F(ab)-1, zu konstruieren, wurde ortsgerichtete Mutagenese (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492 (1985)) an einer Desoxyuridin-hältigen Matrize von pEMX1 durchgeführt. Die sechs CDR gemäß Kabat et al., s.o., wurden zu Maus-A4.6.1-Sequenz geändert. F(ab)-1 bestand daher aus einem vollständigen menschlichem Gerüst (VL-κ-Untergruppe I und VH-Untergruppe III) mit den sechs vollständigen Maus-CDR-Sequenzen. Plasmide für alle anderen F(ab)-Varianten wurden aus der Plasmid-Matrize von F(ab)-1 konstruiert. Plasmide zur Herstellung von doppel- und einzelsträngiger DNA wurden in E.-coli-Stamm XL-1 Blue transformiert (Stratagene, San Diego, CA). Für jede Variante wurde DNA, die für Leicht- und Schwerketten kodierte, unter Verwendung des Didesoxynucleotidverfahrens vollständig sequenziert (Sequenase, U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH). Plasmide wurden in E.-coli-Stamm 16C9, einem Derivat von MM294, transformiert, auf Luria-Nährmedium-Platten, die 50 μg/ml Carbenicillin enthielten, ausplattiert, und eine einzelne Kolonie wurde für Proteinexpression ausgewählt. Die einzelne Kolonie wurde in 5 ml Luria-Nährmedium – 100 mg/ml Carbenicillin 5 bis 8 Stunden lang bei 37 °C wachsen gelassen. Die 5 ml Kultur wurden zu 500 ml AP5 – 50 μg/ml Carbenicillin zugesetzt und 20 Stunden lang in einem 4-l-Schüttelkolben mit Prallflächen bei 30 °C wachsen gelassen. AP5-Medium be steht aus 1,5g Glucose, 11,0g Hycase SF, 0,6g Hefeextrakt (zertifiziert), 0,19 g MgSO₄ (wasserfrei), 1,07 g NH₄Cl, 3,73 g KCl, 1,2 g NaCl, 120 ml 1 M Triethanolamin, pH 7,4, und Wasser auf 1 l Wasser und wird anschließend durch 0,1-mm-Sealkeen-Filter sterilfiltriert. Zellen wurden durch Zentrifugation in einer 1-l-Zentri-fugenflasche bei 3.000 g geerntet, und der Überstand wurde entfernt. Nach einstündigem Einfrieren wurde das Pellet in 25 ml kaltem 10 mM Tris – 1 mM EDTA – 20 Saccharose, pH 8,0, resuspendiert. 250 ml von 0,1 M Benzamidin (Sigma, St. Louis, MO) wurden zugesetzt, um Proteolyse zu hemmen. Nach sanftem Rühren auf Eis über 3 Stunden hinweg wurde die Probe bei 40.000 g 15 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde dann auf eine Protein-G-Sepharose-CL-4B-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) (0,5 ml Bettvolumen) aufgetragen, die mit 10 mM Tris – 1 mM EDTA, pH 7,5, äquilibriert war. Die Säule wurde mit 10 ml von 10 mM Tris – 1 mM EDTA, pH 7,5, gewaschen und mit 3 ml 0,3 M Glycin, pH 3,0, in 1,25 ml 1 M Tris, pH 8,0, eluiert. Das F(ab) wurde dann in PBS unter Verwendung eines Centricon-30 (Amicon, Beverly, MA) Pufferausgetauscht und zu einem Endvolumen von 0,5 ml konzentriert. SDS-PAGE-Gele von allen F(ab)s wurden laufen gelassen, um Reinheit sicherzustellen, und das Molekulargewicht von jeder Variante wurde mittels Elektro spray-Massenspektrometrie überprüft.
Konstruktion und Expression von chimärem und humanisiertem IgG: Zur Bildung von menschlichen IgG1-Varianten von chimärem (chIgG1) und humanisiertem (huIgG1) A4.6.1 wurden die geeigneten Maus- oder humanisierten VL- und VH-(F(ab)-12, Tabelle 2) Domänen in getrennte, zuvor beschriebene pRK-Vektoren subkloniert (Eaton et al., Biochemistry 25, 8343-8347 (1986)). Die DNA, die für die gesamte leichte und die gesamte schwere Kette jeder Variante kodiert, wurde durch Didesoxynucleotid-Sequenzierung überprüft.
Für vorübergehende Expression von Varianten wurden Schwer- und Leichtkettenplasmide in menschliche 293-Zellen (Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59-74 (1977)) unter Verwendung eines Hochleistungsverfahrens (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2, 3-10 (1990)) co-transfiziert. Das Medium wurde zu serumfreiem Medium ausgetauscht und wurde täglich fünf Tage lang geerntet. Antikörper wurden aus den gesammelten Überständen unter Verwendung von Protein-A-Sepharose CL-4B (Pharmacia) geerntet. Der eluierte Antikörper wurde unter Verwendung eines Centricon-30 (Amicon) in PBS Pufferausgetauscht, zu 0,5 ml konzentriert, unter Verwendung eines Millex-GV (Millipore, Redford, MA) sterilfiltriert und bei 4 °C gelagert.
Für stabile Expression der humanisierten IgG1-Endvariante (rhuMAb VEGF) wurden Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zellen mit dicistronischen Vektoren transfiziert, deren Aufgabe es ist, sowohl Schwer- als auch Leichtketten zu co-exprimieren (Lucas et al., Nucleic Acid Res. 24, 1774-1779 (1996)). Plasmide wurden in DP12-Zellen, ein geschütztes Derivat der CHO-K1-DUX-B11-Zelllinie, die von L. Chasin (Columbia University) entwickelt wurde, über Lipofektion eingeführt und zum Züchten in GHT-freiem Medium ausgewählt (V. Chisholm, High efficiency gene transfer in mammalian cells. In: DM Glover, BD Hames, DNA Cloning 4. Mammalian systems. Oxford Univ. Press, Oxford, 1-41 (1996)). Etwa 20 nicht amplifizierte Klone wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und in 96-Well-Platten neuerlich überimpft. Relative spezifische Produktivität von jeder Kolonie wurde unter Verwendung einer ELISA beobachtet, um das menschliche Volllängen-IgG, das sich in jedem Well nach 3 Tagen angesammelt hatte, und einen fluoreszierenden Farbstoff, Calcien AM, als einen Ersatzmarker der lebensfähigen Zellanzahl pro Well zu quantifizieren. Auf Grundlage dieser Daten wurden mehrere nicht amplifizierte Klone für weitere Amplifikation in Gegenwart von steigenden Konzentrationen von Methotrexat ausgewählt. Einzelne Klone, die bei 10, 50 und 100 nM Methotrexat überlebten, wurden ausgewählt und zum Produktivitäts-Screenen in 96-Well-Platten transferiert. Ein Klon, der in Bezug auf Reproduktion hohe spezifische Produktivität aufzeigte, wurde in T-Kolben vermehrt und verwendet, um eine Spinner-Kultur zu inokulieren. Nach mehreren Passagen wurden die Suspensions-adaptierten Zellen verwendet, um Produktionskulturen in GHT-hältigem, serumfreiem Medium, das mit verschiedenen Hormonen und Proteinhydrolysaten ergänzt war, zu inokulieren. Geerntetes Zellkulturfluid, das rhuMAb VEGF enthielt, wurde unter Verwendung von Protein-A-Sepharose-CL-4B gereinigt. Die Reinheit nach diesem Schritt belief sich auf ~99 %. Unter Verwendung eines Ionenaustausch-Chromatographie-Schritts wurde daraufhin weitere Reinigung bis zur Homogenität durchgeführt. Der Endotoxingehalt des gereinigten Endantikörpers betrug < 0,20 eu/mg.
F(ab)- und IgG-Quantifizierung: Zum Quantifizieren von F(ab)-Molekülen wurden ELISA-Platten mit 2 μg/ml Ziegen-Anti-Human-IgG-Fab (Organon Teknika, Durham, NC) in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, bei 4 °C über Nacht beschichtet und mit PBS - 0,5 % Rinderserumalbumin (Blockpuffer) bei Raumtemperatur 1 h lang blockiert. Standards (0,78-50 ng/ml menschliches F(ab)) wurden bei Chemicon (Temecula, CA) erworben. Verdünnungsreihen von Proben in PBS – 0,5 % Rinderserumalbumin - 0,05 % Polysorbat 20 (Testpuffer) wurden an den Platten 2 h lang inkubiert. Gebundenes F(ab) wurde unter Verwendung von mit Meerrettichperoxidase markiertem Ziegen-Anti-Human-IgG-F(ab) (Organon Teknika) nachgewiesen, gefolgt von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (Kirkegaard & Perry Laborstories, Gaithersburg, MD) als Substrat. Die Platten wurden zwischen den Schritten gewaschen. Absorption wurde bei 450 nm an einem Vmax-Plattenleser (Molecular Devices, Menlo Park, CA) gelesen. Die Standardkurve wurde unter Verwendung eines nicht linearen Vier-Parameter-Regressionskurven-Anpassungsprogramms angepasst. Datenpunkte, die in den Bereich der Standardkurve fielen, wurden zur Berechnung der F(ab)-Konzentrationen von Proben verwendet. Die Konzentration von Volllängen-Antikörper wurde unter Verwendung von Ziegen-Anti-Human-IgG-Fc (Cappel, Westchester, PA) zum Einfangen und von mit Meerrettichperoxidase markiertem Ziegen-Anti-Human-Fc (Cappel) zur Detektion bestimmt. Menschliches IgG1 (Chemicon) wurde als Standard verwendet.
VEGF-Bindungstest: Zum Messen der VEGF-Bindungsaktivität von F(ab)s wurden ELISA-Platten mit 2 μg/ml Kaninchen-F(ab')₂ an menschliches IgG-Fc (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) beschichtet und mit Blockpuffer blockiert (s.o.). Verdünntes konditioniertes Medium mit 3 ng/ml KDR-IgG (Park et al., J. Biol. Chem. 269, 25646-25645 (1994)) in Blockpuffer wurden auf der Platte 1 h lang inkubiert. Standards (6,9-440 ng/ml chimäres F(ab)) und zweifache Serien von Proben wurden mit 2 nM biotinyliertem VEGF 1 h lang in Röhrchen inkubiert. Die Lösungen aus den Röhrchen wurden dann auf die ELISA-Platten transferiert und 1 h lang inkubiert.
Nach dem Waschen wurde biotinyliertes VEGF, das an KDR gebunden war, unter Verwendung von Meerrettichperoxidase-markiertem Streptavidin (Zymed, South San Francisco, CA, oder Sigma, St. Louis, MO) nachgewiesen, woraufhin 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin als Substrat folgte. Titrationskurven wurden mit einem nicht linearen Vier-Parameter-Regressionskurven-Anpassungsprogramm (KaleidaGraph, Synergy Software, Reading, PA) angepasst. Die Konzentrationen von F(ab)-Varianten, die der Mittelpunktabsorption der Titrationskurve des Standards entsprechen, wurden berechnet und dann durch die Konzentration des Standards, der der Mittelpunktsabsorption der Standardtitrationskurve entspricht, dividiert. Tests für Volllängen-IgG waren dieselben wie für die F(ab)s, außer dass der Testpuffer 10 % menschliches Serum enthielt.
BIAcore^TM-Biosensortest: VEGF-Bindung an die humanisierten und chimären F(ab)s wurde unter Verwendung eines BIAcore^TM-Biosensors (Karlsson et al., Methods: A Comparison to Methods in Enzymology 6, 97-108 (1994)) verglichen. Die Konzentrationen von F(ab)s wurden durch quantitative Aminosäureanalyse bestimmt. VEGF wurde über primäre Amingruppen an einen CM-5-Biosensorchip gemäß den Anweisungen des Herstellers (Pharmacia) gebunden. Off-Rate-Kinetik wurde durch Sättigen des Chips mit F(ab) (35 μl von 2 μM F(ab) bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 20 μl/min) und anschließendem Wechseln zum Puffer (PBS – 0,05 % Polysorbat 20) gemessen. Datenpunkte von 0-4.500 s wurden zur Off-Rate-Kinetik-Analyse verwendet. Die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (k_off) wurde aus dem Anstieg des Diagramms von In (R0/R) über die Zeit erhalten, worin R0 das Signal bei t=0 ist und R für das Signal zu jedem Zeitpunkt steht.
On-Rate-Kinetik wurde unter Verwendung von zweifachen Reihenverdünnungen von F(ab) (0,0625-2 mM) gemessen. Der Anstieg K_S wurde unter Verwendung der BIAcore^TM-Kinetikbewertungs-Software, wie im Handbuch von Pharmacia Biosensor beschrieben wird, aus dem Diagramm von In (–dR/dt) über die Zeit für jede F(ab)-Konzentration erhalten. R ist das Signal bei Zeitpunkt t. Die Daten zwischen 80 und 168, 148, 128, 114, 102 und 92 s wurden für 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, 1 bzw. 2 mM F(ab) verwendet. Die Assoziationsgeschwindigkeitskonstante (k_on) wurde aus dem Anstieg des Diagramms von K_S über die F(ab)-Konzentration erhalten. Am Ende jedes Zyklus wurde gebundenes F(ab) durch Injizieren von 5 μl von 50 mM HCl bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 20 μl/min entfernt, um den Chip zu regenerieren.
Test zum Endothelzellwachstum: Aus der Rindernebennierenrinde stammende Kapillarendothelzellen wurden in Gegenwart von Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit geringem Glucosegehalt (GIBCO), ergänzt mit 10 % Kälberserum, 2 mM Glutamin und Antibiotika (Wachstumsmedium), im Wesentlichen wie zuvor beschrieben (Leung et al., Science 246, 1306-1309 (1989)) kultiviert. Für mitogene Tests wurden Endothelzellen bei einer Dichte von 6 × 10³ Zellen pro Well in 6-Well-Platten in Wachstumsmedium geimpft. Entweder muMAb VEGF A4.6.1 oder rhuMAb VEGF wurde dann bei Konzentrationen im Bereich zwischen 1 und 5.000 ng/ml zugesetzt. Nach 2-3 h wurde gereinigtes, von E. coli exprimiertes rhVEGF165 in einer Endkonzentration von 3 ng/ml zugesetzt. Zur Spezifitätskontrolle wurde jeder Antikörper den Endothelzellen bei einer Konzentration von 5.000 ng/ml, alleine oder in Gegenwart von 2 ng/ml bFGF, zugesetzt. Nach fünf oder sechs Tagen wurden die Zellen durch Aussetzen gegenüber Trypsin dissoziiert und in einem Coulter-Zähler (Coulter Electronics, Hialeah, FL) gezählt. Die Abweichung vom Mittel überstieg die 10-%-Grenze nicht. Die Daten wurden durch ein Vier-Parameter-Kurven-Anpassungsprogramm (KaleidaGraph) analysiert.
Tumorstudien in vivo: Menschliche A673-Rhabdomyosarkom-Zellen (ATCC; CRL 1598) wurden wie zuvor beschrieben in DMEM/F12, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 2 mM Glutamin und Antibiotika, kultiviert (Kim et al., Nature 362, 841-844 (1993), und Borgström et al., Cancer Res. 56, 4032-4039 (1996)). Weiblichen BALB/c-Nacktmäusen, 6-10 Wochen alt, wurden 2 × 10⁶ Tumorzellen im Bereich des Rückens in einem Volumen von 200 μl subkutan injiziert. Die Tiere wurden dann mit muMAb VEGF A4.6.1, rhuMAb VEGF oder einem Kontroll-MAb, der gegen das gp120-Protein gerichtet ist, behandelt (Kim et al., Nature 263, 841-844 (1993)). Beide Anti-VEGF-MAbs wurden in den Dosen 0,5 und 5 mg/kg verabreicht; der Kontroll-MAb wurde in einer Dosis von 5 mg/kg verabreicht. Jeder MAb wurde zweimal wöchentlich intraperitoneal in einem Volumen von 100 μl verabreicht, wobei 24 h nach der Tumorzellinokulation begonnen wurde. Jede Gruppe bestand aus 10 Mäusen. Die Tumorengröße wurde in wöchentlichen Intervallen bestimmt. Vier Wochen nach der Tumorzellinokulation wurden die Tiere getötet, und die Tumoren wurden entfernt und gewogen. Eine statistische Analyse wurde mittels ANOVA durchgeführt.
ERGEBNISSE
Humanisierung: Die Consensus-Sequenz für die menschliche Schwerketten-Untergruppe III und die Leichtketten-Untergruppe κI wurden als Gerüst für die Humanisierung verwendet (Kabat et al., s.o.) (1A und 1B). Dieses Gerüst wurde bereits erfolgreich zur Humanisierung von anderen Maus-Antikörpern verwendet (Werther et al., s.o.; Carter et al., s.o.; Presta et al., J. Immunol. 151, 2623-2632 (1993); und Eigenbrot et al., Proteins 18, 49-62 (1994)). CDR-H1 enthielten die Reste H26-H35. Die anderen CDRs entsprachen den Ausführungen von Kabat et al., s.o. Alle humanisierten Varianten wurden anfänglich hergestellt und als in E. coli exprimierte F(ab)s gescreent. Typische Ausbeuten von 500-ml-Schüttelkolben betrugen 0,1-0,4 mg F(ab).
Das chimäre F(ab) wurde als Standard in Bindungstests verwendet. In der anfänglichen Variante, F(ab)-1, wurden die CDR-Reste vom Maus-Antikörper zum menschlichen Gerüst übertragen, und basierend auf den Modellen der Maus- und humanisierten F(ab)s wurde der Rest an Position H49 (Ala beim Menschen) gegen das Maus-Gly getauscht. Darüber hinaus wurden F(ab)s, die aus der chimären Schwerkette/F(ab)-1-Leichtkette (F(ab)-2) und der F(ab)-1-Schwerkette/chimäre Leichtkette (F(ab)-3) bestanden, gebildet und auf Bindung getestet. F(ab)-1 zeigte eine Bindungsaffinität, die mehr als 1.000fach geringer als jene des chimären F(ab) war (Tabelle 2). Ein Vergleich der Bindungsaffinitäten von F(ab)-2 und F(ab)-3 ließ darauf schließen, dass die Gerüstreste in der F(ab)-1-VH-Domäne verändert werden mussten, um Bindungsaktivität zu verstärken.
Tabelle 2: Bindung von humanisierten Anti-VEGF-F(ab)-Varianten an VEGF^a

^a Anti-VEGF-F(ab)-Varianten wurden mit biotinyliertem VEGF inkubiert und dann auf ELISA-Platten, die mit KDR-IgG beschichtet waren, transferiert (Park et al., s.o.)
^b Maus-Reste sind unterstrichen; die Nummern der Reste entsprechen jenen aus Kabat et al., s.o.
^c Mittelwert und Standardabweichung stellen den Durchschnitt der Verhältnisse dar, der für jeden der voneinander unabhängigen Tests berechnet wurde; das EC50 für chimäres F(ab) betrug 0,049 ± 0,013 mg/ml (1,0 nM).

Das Tauschen der menschlichen Reste H71 und H73 gegen ihre Maus-Gegenstücke in F(ab)-4 verbesserte das Binden um das Vierfache (Tabelle 2). Eine Untersuchung der Modelle der Maus- und humanisierten F(ab)s ließ darauf schließen, dass der Rest 146, der an der VL-VH-Grenzfläche verborgen liegt und mit CDR-H3 (2) wechselwirkt, auch eine Rolle spielen könnte, entweder zur Bestimmung der Konformation von CDR-H3 und/oder zur Beeinflussung der Beziehung der VL- und VH-Domänen untereinander. Wenn das Maus-Val gegen das menschliche Leu bei 146 (F(ab)-5) ausgetauscht wurde, stieg die Bindungsaffinität um beinahe das Vierfache (Tabelle 2). Drei andere verborgene Gerüstreste wurden auf Grundlage des Moleküllodells bewertet: H49, H69 und H78. Position H69 kann die Konformation von CDR-H2 beeinflussen, während Position H78 die Konformation von CDR-H1 beeinflussen kann (2). Wurde jedes einzeln vom menschlichen zum Maus-Gegenstück getauscht, so verbesserte sich die Bindung in jedem Fall um das Zweifache (F(ab)-6 und F(ab)-7, Tabelle 2). Wurden beide gleichzeitig getauscht, so war die Verbesserung der Bindung ein Achtfaches (F(ab)-8, Tabelle 2). Der Rest H49 war ursprünglich als das Maus-Gly eingebunden; wurde er gegen das menschliche Consensus-Gegenstück Ala getauscht, so wurde die Bindung um das 15fache reduziert (F(ab)-9, Tabelle 2).
In F(ab)-10 und F(ab)-11 wurden zwei Reste in der Gerüstschleife 3, FR-3, gegen ihre Maus-Gegenstücke ausgetauscht: AsnH76 gegen Maus-Ser (F(ab)-10) und Lys-H75 gegen Maus-Ala (F(ab)-11). Beide bewirkten eine relativ geringe Verbesserung der Bindung (Tabelle 2). Schließlich weisen an Position H94 menschliche und Maus-Sequenzen sehr häufig ein Arg auf (Kabat et al., s.o.). In F(ab)-12 wurde dieses Arg durch das seltene Lys, das im Maus-Antikörper gefunden wurde, ersetzt (1A), und dies führte zu Bindung, die weniger als das Zweifache von jener des chimären F(ab) betrug (Tabelle 2). F(ab)-12 wurde auch mit dem chimären F(ab) unter Verwendung des BIAcore^TM-Systems (Pharmacia) verglichen. Unter Verwendung dieses Verfahrens war die K_d des humanisierten F(ab)-12 um das zweifache schwächer als jene des chimären F(ab), was sowohl auf eine langsamere k_on als auch eine schnellere k_off zurückzuführen war (Tabelle 3).
Tabelle 3: Bindung von Anti-VEGF-F(ab)-Varianten an VEGF unter Verwendung des BIAcore^TM-Systems^a

^a Die Menge an gebundenem F(ab) in Resonanzeinheiten (RU) wurde unter Verwendung eines BIAcore^TM-Systems gemessen, wenn 2 μg F(ab) auf einen Chip injiziert wurden, der 2480 RU immobilisierten VEGF enthielt. Off-Rate-Kinetik (k_off) wurde durch Sättigen des Chips mit F(ab) und anschließendes Beobachten der Dissoziation nach dem Wechseln zum Puffer gemessen. On-Rate-Kinetik (k_on) wurde unter Verwendung von zweifachen Reihenverdünnungen von F(ab) gemessen. K_d, die Gleichgewichtsdissoziationskonstante, wurde als k_off/k_on berechnet.
^b chim-F(ab) ist ein chimäres F(ab) mit Maus-VL- und -VH-Domänen, die an menschliche CL- und CH1-Schwerdomänen fusioniert sind.

Volllängen-MAbs wurden durch Fusionieren der VL- und VH-Domänen des chimären F(ab) und der Variante F(ab)-12 an die konstanten Domänen von menschlicher κ-Leichtkette und menschlicher IgG1-Schwerkette konstruiert. Das Volllängen-12-IgG1 (F(ab)-12, fusioniert an menschliches IgG1) wies Bindung auf, die um das 1,7fache schwächer als das chimäre IgG1 war (Tabelle 4). Sowohl 12-IgG1 als auch das chimäre IgG1 banden etwas weniger gut als der originale Maus-MAb A4.6.1 (Tabelle 4).
Tabelle 4: Bindung von Anti-VEGF-IgG-Varianten an VEGF^a

^a Anti-VEGF-IgG-Varianten wurden mit biotinyliertem VEGF inkubiert und dann auf ELISA-Platten, beschichtet mit KDR-IgG (Park et al. (1994), s.o.), transferiert.
^b chIgG1 ist chimäres IgG1 mit Maus-VL- und -VH-Domänen, fusioniert an menschliche CL- und IgG1-Schwerketten; das EC50 für chIgGl betrug 0,113 ± 0,013 μg/ml (0,75 nM)
^c murIgG1 ist muMAb VEGF A461, gereinigt aus Ascites
^d 12-IgG1 ist F(ab)-12-VL- und -VH-Domänen, fusioniert an menschliche CL- und IgG1-Schwerketten.

Biologische Studien: rhuMAb VEGF und muMAb VEGF A4.6.1 wurden bezüglich ihrer Fähigkeit verglichen, Rinderkapillarendothelzellproliferation als Reaktion auf eine beinahe maximal wirksame Konzentration von VEGF (3 ng/ml) zu hemmen. Wie in 3 veranschaulicht wird, waren die zwei MAbs im Wesentlichen äquivalent, sowohl in Bezug auf Potenz als auch auf Wirksamkeit. Die ED50-Werte waren jeweils 50 ± 5 ng/ml und 48 ± 8 ng/ml (~0,3 nM). In beiden Fällen wurde 90 % Inhibition bei der Konzentration von 500 ng/ml (~3 nM) erreicht. Weder muMAb VEGF A4.6.1 noch rhuMAb VEGF zeigte eine Wirkung auf Grundproliferation oder bFGF-stimulierte Proliferation von Kapillarendothelzellen, was bestätigt, dass die Inhibition spezifisch für VEGF ist.
Um zu bestimmen, ob sich solche Äquivalenz auch auf ein In-vivo-System umlegen lässt, wurden die zwei Antikörper bezüglich ihrer Fähigkeit verglichen, das Wachstum von menschlichen A673-Rhabdomyosarkom-Zellen in Nacktmäusen zu unterdrücken. Frühere Studien zeigten, dass muMAb VEGF A4.6.1 eine drastische Hemmwirkung in diesem Tumormodell hat (Kim et al., Nature 362, 841-844 (1993), und Bergström et al., Cancer Res. 56, 4032-4039 (1996)). Wie 4 zeigt unterdrückten die zwei Antikörper bei beiden getesteten Dosen (0,5 und 5 mg/kg) Tumorwachstum augenscheinlich, wie durch Gewichtsmessungen der Tumoren vier Wochen nach Zellinokulation festgestellt wurde. Die Abnahmen des Tumorgewichts im Vergleich mit der Kontrollgruppe beliefen sich bei den mit muMAb VEGF A4.6.1 behandelten Tieren auf 85 % bzw. 93 % bei den beiden Dosis gegenüber 90 % und 95 % bei jenen Tieren, die mit rhuMAb VEGF behandelt worden waren. Ähnliche Resultate wurden mit der Brustkarzinomzelllinie MDA-MB 435 erhalten.
BEISPIEL 2 (Hintergrund)
In diesem Beispiel wurde der zuvor erläuterte Maus-Anti-VEGF-Antikörper A4.6.1 durch Randomisieren einer geringen Anzahl von Gerüstresten und durch einwertige Präsentation der resultierenden Bibliothek von Antikörpermolekülen an der Oberflä che von filamentösem Phagen humanisiert, um Hochaffinitäts-Gerüstsequenzen über Affinitäts-basierte Selektion zu identifizieren.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Konstruktion von Anti-VEGF-Phagemid- Vektor, pMB4-19: Der Maus-Anti-VEGF-MAb A4.6.1 wurde bereits in Beispiel 1 besprochen. Die erste Fab-Variante von humanisiertem A4.6.1, hu2.0, wurde durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung einer Desoxyuridin-hältigen Matrize von Plasmid pAK2 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285-4289 (1992)) konstruiert, das für ein menschliches V_LκI-Cκ₁-Leichtketten- und ein menschliches V_HIII-C_H1_γ1-Schwerketten-Fd-Fragment kodiert. Die transplantierten A4.6.1-CDR-Sequenzen wurden gemäß der Sequenzdefinition von Kabat et al., s.o., ausgewählt, außer im Fall von CDR-H1, die die Reste 26-35 einband. Die Fab kodierende Sequenz wurde in den Phagemidvektor pHGHamg3 subkloniert (Bass et al., Proteins 8, 309-314 (1990), und Lowman et al., Biochemistry 30, 10832-10838 (1991)). Dieses Konstrukt, pMB4-19, kodiert für das anfänglich humanisierte A4.6.1-Fab, hu 2.0, wobei der C-Terminus der Schwerkette exakt an den Carboxylabschnitt des M13-Gen-III-Hüllproteins fusioniert ist. pMB4-19 ist in seinem Aufbau pDH188 ähnlich, einem bereits beschriebenen Plasmid für einwertige Präsentation von Fab-Fragmenten (Garrard et al., Biotechnology 9, 1373-1377 (1991)). Nennenswerte Unterschiede zwischen pMB4-19 und pDH188 umfassen ein kürzeres M13-Gen-III-Segment (Codons 249-406) und die Verwendung eines Amber-Stoppcodons unmittelbar nach dem Anitkörper-Schwerketten-Fd-Fragment. Dies ermöglicht Expression von sekretierten Schwerketten oder Schwerketten-Gen-III-Fusionen in supE-Suppressorstämmen von E. coli.
Expression und Reinigung von humanisiertem A4.6.1-Fab-Fragment: E.-coli-Stamm 34B8, ein Nicht-Suppressor, wurde mit Phagemid pMB4-19 oder Varianten davon transformiert. Einzelkolonien wurden über Nacht bei 37 °C in 5 ml 2YT, das 50 μg/ml Carbenicillin enthielt, gezüchtet. Diese Kulturen wurden in 200 ml AP5-Medium (Chang et al., Gene 55, 189-196 (1987)), das 20 μg/ml Carbenicillin enthielt, ver dünnt und 26 h lang bei 30 °C inkubiert. Die Zellen wurden bei 4.000 × g pelletiert und bei –20 °C zumindest 2 h lang eingefroren. Zellpellets wurden dann in 5 ml von 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), das 1 mM EDTA enthielt, resuspendiert, bei 4 °C 90 min lang geschüttelt und bei 10.000 × g 15 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine 1-ml-Streptokokken-Protein-G-Sepharosesäule (Pharmacia) aufgetragen und mit 10 ml von 10 mM MES (pH 5,5) gewaschen. Das gebundene Fab-Fragment wurde mit 2,5 ml 100 mM Essigsäure eluiert und umgehend mit 0,75 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0, neutralisiert. Fab-Präparate wurden in PBS Puffergetauscht und unter Verwendung von Centricon-30-Konzentratoren (Amicon) konzentriert. Typische Ausbeuten von Fab betrugen ~1 mg/l Kultur nach Protein-G-Reinigung. Gereinigte Fab-Proben wurden durch Elektrospray-Massenspektrometrie charakterisiert, und Konzentrationen wurden durch Aminosäureanalyse bestimmt.
Konstruktion der Anti-VEGF-Fab-Phagemid-Bibliothek: Die humanisierte A4.6.1-Phagemidbibliothek wurde durch ortsgerichtete Mutagenese gemäß dem Verfahren von Kunkel et al., Methods Enzymol. 204, 125-139 (1991), konstruiert. Ein Derivat von pMB4-19, das TAA-Stopptripletts bei V_H-Codons 24, 37, 67 und 93 enthielt, wurde für die Verwendung als Mutagenesematrize hergestellt (alle Sequenznummern gemäß Kabat et al., s.o.). Diese Modifikation wurde angebracht, um nachfolgende Hintergrundkontamination durch Wildtypsequenzen zu unterbinden. Die Codons, die für die Randomisierung Targets waren, waren 4 und 71 (Leichtkette) und 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 und 94 (Schwerkette).
Um die Schwerketten-Codons 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 und 94 mit einem einzelnen mutagenen Oligonucleotid zu randomisieren, wurden zwei 126-mer-Oligonucleotide zuerst aus 60- und 66-mer-Fragmenten durch Matrizen-unterstützte enzymatische Bindung vorangeordnet. Insbesondere wurden 1,5 nmol von 5'-phosphoryliertem Oligonucleotid 503-1 (5'-GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TOT AGA GAC AAC TCC AAA AAC ACA BYT TAC CTG OAG ATG AAC-3' (Seq.-ID Nr. 22)) oder 503-2 (5'-GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TOT TTA GAC ACC TCC GCA AGC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC-3' (Seq.-ID Nr. 23)) mit 1,5 nmol von 503-3 (5'-AGC CTG CCC GCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT DYA ARG TAC CCC CAC TAT TAT GGG-3' (Seq.-ID Nr. 24)) (unterstrichen sind randomisierte Codons; N=A/G/T/C; W=A/T; B=G/T/C; D=G/A/T; R=A/G; Y=C/T) kombiniert. Anschließend wurden 1,5 nmol von Matrizenoligonucleotid (5'-CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT CTG CAG GTA-3' (Seq.-ID Nr. 25)), mit Komplementaritätssequenz zu den 5'-Enden von 503-1/2 und den 3'-Enden von 503-3, zugesetzt, um an jedes Ende der Ligationsverbindung zu hybridisieren. Taq-Ligase (thermostabile Ligase von New England Biolabs) und Puffer wurden zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde 40 Durchgängen Wärmezyklieren unterzogen (95 °C 1,25 min; 50 °C 5 min), um das Matrizenoligonucleotid zwischen ligierten und unligierten Verbindung zyklieren zu lassen. Das Produkt 126-mer-Oligonucleotide wurden auf einem 6 % Harnstoff/TBE-Polyacrylamidgel gereinigt und aus dem Polyacrylamid in Puffer extrahiert. Die zwei 126-mer-Produkte wurden zu gleichen Anteilen kombiniert, mit Ethanol gefällt und schließlich in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA solubilisiert. Das 126-mer-Oligonucleotidproduktgemisch wurde als 504-01 markiert.
Randomisierung von ausgewählten Gerüstcodons (V_L 4, 71; V_H 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 93, 94) erfolgte in zwei Schritten. Zuerst wurde V_L-Randomisierung durch Herstellen von drei zusätzlichen Derivaten der modifizierten pMB4-19-Matrize erreicht. Gerüstcodons 4 und 71 in der leichten Kette wurden einzeln oder paarweise mittels zwei mutagener Oligonucleotide 5'-GCT GAT ATC CAG TTG ACC CAG TCC CCG-3' (Seq.-ID Nr. 26) und 5'-TCT GGG ACG GAT TAC ACT CTG ACC ATC-3' (Seq.-ID Nr. 27) ersetzt. Eine Desoxyuridin-hältige Matrize wurde von jedem dieser neuen Derivate hergestellt. Zusammen mit der originalen Matrize kodierten diese vier Konstrukte für jede der vier möglichen Leichtketten-Gerüstsequenz-Kombinationen (Tabelle 5).
Oligonucleotide 504-1, ein Gemisch aus zwei 126-mer-Oligonucleotiden (siehe oben), und 5'-CGT TTG TCC TGT GCA RYT TCT GGC TAT ACC TTC ACC AAC TAT GGT ATG AAC TGG RTC CGT CAG GCC CCC GGT AAG-3' (Seq.-ID Nr. 28) wurden verwendet, um Schwerketten-Gerüstcodons unter Verwendung jeder der vier soeben beschriebenen Matrizen zu randomisieren. Die vier Bibliotheken wurden in E.-coli-XL-1-Blue-Zellen (Stratagene) Elektroporation unterzogen und kombiniert. Die Gesamtanzahl unabhängiger Transformanten wurde auf > 1,2 × 10⁸ geschätzt, eine Anzahl, die etwa um das 1.500fache höher ist als die maximale Anzahl an DNA-Sequenzen in der Bibliothek.
Zahlreiche verschiedene Systeme wurden für die funktionelle Präsentation von Antikörperfragmenten an der Oberfläche von filamentösen Phagen entwickelt. Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12, 433 (1994). Diese umfassen die Präsentation von Fab oder einkettigen Fv-(scFv-)Fragmenten als Fusionen an entweder das Gen-III- oder Gen-VIII-Hüllprotein des M13-Bakteriophagen. Das hierin ausgewählte System ist jenem ähnlich, das in Garrard et al., Biotechn. 9, 1373 (1991), beschrieben wurde, in dem ein Fab-Fragment einwertig als eine Gen-III-Fusion präsentiert wird (7). Dieses System hat zwei nennenswerte Eigenschaften. Insbesondere haben, anders als scFvs, Fab-Fragmente keine Neigung, dimere Spezies zu bilden, deren Gegenwart aufgrund von Aviditätswirkungen die Selektion der festesten Bindeelemente unterbinden kann. Darüber hinaus eliminiert die Einwertigkeit des präsentierten Proteins eine zweite mögliche Quelle für Aviditätswirkungen, die anderenfalls durch die Gegenwart von vielfachen Kopien eines Proteins an jedem Phagemidteilchen entstehen würden. Bass & Wells, Proteins 8, 309 (1990), und Lowman et al., Biochemistry 30, 10832 (1991).
Phagemidteilchen, die die humanisierten A4.6.1-Fab-Fragmente aufwiesen, wurden in E.-coli-XL-1-Blue-Zellen vermehrt. Kurz zusammengefasst wurden Zellen, die das randomisierte pMB4-19-Konstrukt in sich trugen, über Nacht bei 37 °C in 25 ml 2YT-Medium, das 50 μg/ml Carbenicillin und etwa 10¹⁰ M13K07-Helferphagen enthielt (Vieira & Messing, Methods Enzymol. 153, 3-11 (1987)), gezüchtet. Phagemidmaterialen wurden durch Fällung mit einer Salzlösung-Polyethylenglykollösung aus Kulturüberständen gereinigt und in 100 μl PBS (~10¹⁴ Phagemid/ml) resuspendiert.
Auswahl von humanisierten A4.6.1-Fab-Varianten: Gereinigter VEGF₁₂₁ (100 μl bei 10 μg/ml in PBS) wurde auf einen Mikrotiterplatten-Well über Nacht bei 4 °C aufge schichtet. Die Beschichtungslösung wurde verworfen, und dieser Well, zusätzlich zu einem nicht beschichteten Well, wurde mit 6 % Magermilch 1 h lang blockiert und mit PBS, die 0,05 % TWEEN 20^TM (Detergens) enthielt, gewaschen. Dann wurden 10 μl Phagemidmaterial, verdünnt zu 100 μl mit 20 mM Tris (pH 7,5), das 0,1 % BSA und 0,05 % TWEEN 20^TM enthielt, jedem Well zugesetzt. Nach 2 Stunden wurden die Wells gewaschen, und der gebundene Phage wurde mit 100 μl von 0,1 M Glycin (pH 2,0) eluiert und mit 25 μl von 1 M Tris, pH 8,0, neutralisiert. Eine Aliquote hiervon wurde verwendet, um die Zahl des eluierten Phagen zu titrieren. Der verbleibende Phage, der aus dem mit VEGF beschichteten Well eluiert worden war, wurde zur Verwendung im nächsten Selektionszyklus vermehrt. Insgesamt wurden 8 Selektionsdurchgänge durchgeführt, wonach 20 einzelne Klone selektiert und sequenziert waren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)).
Bestimmung von VEGF-Bindungsaffinitäten: Assoziations-(k_on) und Dissoziations-(k_off) Geschwindigkeitskonstanten für die Bindung von humanisierten A4.6.1-Fab-Varianten an VEGF₁₂₁ wurden durch Oberflächenplasmonresonanz (Karlsson et al., J. Immun. Methods 145, 229-240 (1991)) an einem Pharmacia-BIAcore-Instrument gemessen. VEGF₁₂₁ wurde kovalent am Biosensorchip über primäre Aminogruppen immobilisiert. Bindung von humanisierten A4.6.1-Fab-Varianten wurde durch Fließenlassen von Lösungen von Fab in PBS/0,05 % TWEEN 20^TM über den Chip bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 20 μl/min gemessen. Nach jeder Bindungsmessung wurde verbleibendes Fab vom immobilisierten Liganden durch Waschen mit 5 μl 50 mM wässriger HCl bei 3 μl/min gestrippt. Bindungsprofile wurden durch nichtlineare Regression unter Verwendung eines einfachen einwertigen Bindungsmodells analysiert (BIA-Auswertungssoftware v2.0; Pharmacia).
ERGEBNISSE
Konstruktion von humanisiertem A4.6.1: Ein anfängliches humanisiertes A4.6.1-Fab-Fragment wurde konstruiert (hu2.0, 5A und 5B), in dem die CDRs aus A4.6.1 auf das menschliche V_LκI-V_HIII-Gerüst aufgepfropft wurden. Alle anderen Reste in hu2.0 wurden als die menschliche Sequenz beibehalten. Bindung dieser Variante an VEGF war so schwach, dass sie nicht nachweisbar war. Basierend auf der relativen Affinität der schwächer bindenden humanisierten A4.6.1-Varianten wurde die K_D für Bindung von hu2.0 auf > 7 μM geschätzt. Dies steht im Gegensatz zu einer Affinität von 1,6 nM für ein chimäres Fab-Konstrukt, das aus den intakten V_L- und V_H-Domänen aus Maus-A4.6.1- und menschlichen Konstantdomänen besteht. Somit war die Bindung von hu2.0 an VEGF im Vergleich zur Chimäre zumindest 4.000fach reduziert.
Entwurf von Antikörper-Bibliothek: Die Veränderung der Gerüst-Gruppe zur menschlichen Gerüstsequenz hierin ist in Tabelle 5 und 6 gezeigt.
Tabelle 5: Zentrale Gerüstreste, die für Antigenbindung wichtig sind und für Randomisierung ein Target darstellen

^a Aminosäurendiversität in Phagemidbibliothek
^b V_H 71, 73, 75, 76 randomisiert, um die Ganz-Maus-(L71/T73/A75/S76) oder Ganz-Mensch-(R71/D73/K75/N76) V_HIII-Tetrade zu ergeben

Ein Bedenken im Entwurf der humanisierten A4.6.1-Phagemid-Bibliothek war, dass Reste, die Targets für Randomisierung darstellten, weit über die V_L- und V_H-Sequenzen verteilt waren. Einschränkungen bezüglich der Länge von synthetischen Oligonucleotiden erfordern, dass gleichzeitige Randomisierung für jede dieser Gerüstpositionen durch die Verwendung von multiplen Oligonucleotiden erreicht werden kann. Steigt jedoch die Gesamtanzahl an Oligonucleotiden, sinkt die Effizienz der Mutagenese (d.h. der Anteil an erhaltenen Mutanten, die sich in die aus allen mutagenen Oligonucleotiden abgeleitete Sequenz einbinden). Um dieses Problem zu umgehen, wurden zwei Eigenschaften in die Bibliothekskonstruktion eingebunden. Das erste war, vier verschiedene Mutagenesematrizen herzustellen, die für jede der möglichen V_L-Gerüstkombinationen kodieren. Dies war aufgrund der limitierten Diversität des Leichtkettengerüsts (nur 4 verschiedene Sequenzen) einfach zu bewerkstelligen, war jedoch von Vorteil, da es den Bedarf an zwei Oligonucleotiden aus der Mutagenesestrategie erübrigte. Zweitens wurden zwei 126-Basen-Oligonucleotide aus kleineren synthetischen Fragmenten vorangeordnet. Dies machte Randomisierung von V_H-Codons 67, 69, 71, 73, 75, 76, 93 und 94 mit einem einzelnen langen Oligonucleotid, und nicht mit zwei kleineren, möglich. In der schließlichen Randomisierungs-Mutagenese-Strategie wurden daher nur zwei Oligonucleotide gleichzeitig auf vier verschiedenen Matrizen angewendet.
Selektion von stark bindenden, humanisierten A4.6.1-Fabs: Varianten aus der humanisierten A4.6.1-Fab-Phagemidbibliothek wurden basierend auf Bindung an VEGF ausgewählt. Die Anreicherung von funktionellem Phagemid, die durch Vergleichen von Titern für Phagen, eluiert aus einem VEGF-beschichteten Mikrotiterplatten-Well und aus einem unbeschichteten Mikrotiterplatten-Well, gemessen wurde, stieg bis zum siebenten Durchgang des Affinitäts-Pannings an. Nach einem zusätzlichen Durchgang des Sortierens wurden 20 Klone sequenziert, um bevorzugte Gerüstreste zu identifizieren, die an jeder randomisierten Position ausgewählt wurden. Diese Ergebnisse, zusammengefasst in Tabelle 6, zeigten starken Consensus unter den ausgewählten Klonen. Zehn von zwanzig Klonen wiesen eine identische DNA-Sequenz auf, die als hu2.10 bezeichnet wurde. Von den dreizehn randomisierten Gerüstpositionen wurden acht Substitutionen in hu2.10 selektiert (V_L 71; V_H 37, 71, 73, 75, 76, 78 und 94). Interessanterweise wurden die Reste V_H 37 (He) und 78 (Val) weder als die menschliche V_HIII- noch die Maus-A4.6.1-Sequenz selektiert. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass manche Gerüstpositionen von einer Ausdehnung der Diversität über die menschlichen Target-Gerüstsequenzen und Ausgangs-Maus-Gerüstsequenzen hinaus profitieren können.
Tabelle 6: Sequenzen, ausgewählt aus der humanisierten A4.6.1-Phagemid-Fab-Bibliothek

Unterschiede zwischen hu2.0 und Maus-A4.6.1-Antikörpern sind unterstrichen. Die Anzahl an identischen Klonen, die für jede Phagen-selektierte Sequenz identifiziert ist, ist in Klammern angegeben. Striche in den Sequenzen von Phagen-selektierten Klonen bezeichnen Selektion der menschlichen V_LκI-V_HIII-Gerüstsequenz (d.h. wie in hu2.0).

Es gab vier andere einzigartige Aminosäuresequenzen unter den verbleibenden zehn Klonen, die analysiert wurden: hu2.1, hu2.2, hu2.6 und hu2.7. Alle diese Klone, zusätzlich zu hu2.10, enthielten identische Gerüstsubstitutionen an den Positionen V_H 37 (IIe), 78 (Val) und 94 (Lys), behielten jedoch die menschliche V_HIII-Consensussequenz an den Positionen 24 und 93 bei. Vier Klone hatten die Leichtketten-Kodiersequenz verloren und banden VEGF nicht, wenn sie in einem Phagen-ELISA-Test getestet wurden (Cunningham et al., EMBO J. 13, 2508-2510 (1994)). Solche Arte fakte können oft durch Reduzieren der Anzahl an Sortierzyklen oder durch Vermehren von Bibliotheken auf festem Medium minimiert werden.
Expression und Bindungsaffinität von humanisierten A4.6.1-Varianten: Phagenselektierte Varianten hu2.1, hu2.2, hu2.6, hu2.7 und hu2.10 wurden in E. coli unter Verwendung von Schüttelkolben exprimiert, und Fab-Fragmente wurden aus periplasmatischen Extrakten durch Protein-G-Affinitätschromatographie gereinigt. Die erzielten Ausbeuten von Fab dieser fünf Klone lagen im Bereich von 0,2 (hu2.6) bis 1,7 mg/l (hu2.1). Die Affinität von jeder dieser Varianten gegenüber Antigen (VEGF) wurde durch Oberflächenplasmonresonanz an einem BIAcore-Instrument (Tabelle 7) gemessen. Eine Analyse dieser Bindungsdaten zeigte auf, dass der Consensusklon hu2.10 unter den fünf getesteten Varianten die höchste Affinität für VEGF besaß. Somit wurde die Fab-Phagemidenbibliothek selektiv für den am festesten bindenden Klon angereichert. Der berechnete Wert für K_D für hu2.10 betrug 55 nM, zumindest um das 125fache fester als der Wert für hu2.0, der keine Gerüständerungen aufweist (K_D > 7 μM). Die anderen vier ausgewählten Varianten wiesen alle schwächere Bindung an VEGF bis hinunter zu einer K_D von 360 nM für die schwächste Variante (hu2.7) auf. Interessanterweise war die K_D für hu2.6, 67 nM, nur marginal schwächer als jene von hu2.10, und dennoch wurde nur eine Kopie dieses Klons unter den 20 sequenzierten Klonen gefunden. Dies kann auf einen geringeren Grad an Expression und Präsentation zurückzuführen sein, wie es auch der Fall war, als das lösliche Fab dieser Variante exprimiert wurde. Trotz der niedrigeren Expressionsrate ist diese Variante als ein humanisierter Antikörper nützlich.
Tabelle 7: VEGF-Bindungsaffinität von humanisierten A4.6.1-Fab-Varianten

^* hu2.10V = hu2.10 mit Mutation V_L Leu → Val Geschätzte Fehler bezüglich der Biacore-Bindungsmessungen belaufen sich auf +/– 25 %.
^** Zu schwach, um gemessen zu werden; Schätzung von geringer Bindung

Zusätzliche Verbesserung der humanisierten Variante hu2.1: Trotz der großen Verbesserung der Antigenaffinität im Vergleich zur anfänglichen humanisierten Variante war Bindung von hu2.10 an VEGF stets um das 35fache schwächer als eines chimären Fab-Fragments, das die Maus-A4.6.1-V_L- und -V_H-Domänen enthielt. Dieser beträchtliche Unterschied ließ darauf schließen, dass weitere Optimierung des humanisierten Gerüsts durch zusätzliche Mutationen möglich sein kann. Von den Vernier-Resten, die von Foote & Winter, J. Mol. Biol. 224, 487-499 (1992), identifiziert wurden, unterschieden sich nur die Reste V_L 46, V_H 2 und V_H 48 im A4.6.1 gegenüber dem menschlichen V_LκI-V_HIII-Gerüst (5A und 5B), wurden jedoch in der Phagemid-Bibliothek der Erfinder nicht randomisiert. Ein molekulares Modell des humanisierten A4.6.1-Fv-Fragments zeigte, dass V_L 46 an der V_LV_H-Grenzfläche sitzt und die Konformation von CDR-H3 beeinflussen könnte. Weiters ist diese Aminosäure beinahe immer in den meisten V_Lκ-Gerüsten Leucin (Kabat et al., s.o.), ist jedoch in A4.6.1 Valin. Demgemäß wurde eine Leu → Val-Substitution an dieser Position im Hintergrund von hu2.10 durchgeführt. Eine Analyse der Bindungskinetik dieser neuen Variante, hu2.10V, zeigte eine weitere 6fache Verbesserung der Kp bezüglich VEGF-Bindung, was die Bedeutung von Valin an Position V_L 46 in Antikörper A4.6.1 untermauert. Die K_D für hu2.10V (9,3 nM) lag somit innerhalb des 6fachen jener der Chimäre. Im Gegensatz zu V_L 46 wurde keine Verbesserung der Bindungsaffinität von hu2.10 bei der Ersetzung von entweder V_H 2 oder V_H 48 durch den entsprechenden Rest von Maus-A4.6.1 beobachtet.
BEISPIEL 3
In diesem Beispiel wurden CDR-Randomisierung, Affinitätsreifung durch einwertige Fab-Phagen-Präsentation und kumulative Kombination von Mutationen verwendet, um die Affinität eines humanisierten Anti-VEGF-Antikörpers zu steigern.
Konstruktion von humanisiertem Antikörper pY0101: Phagen-präsentierter Antikörpervektor phMB4-19-1.6 (siehe die 8A-E) wurde als Ausgang verwendet. In diesem Konstrukt ist Anti-VEGF als ein Fab-Fragment exprimiert, wobei seine Schwerkette an den N-Terminus des trunkierten g3p fusioniert ist. Sowohl Leicht- als auch Schwerketten stehen unter der Steuerung von phoA-Promotor mit einer Stromauf-stII-Signalsequenz zur Sekretion in das Periplasma. Punktmutationen außerhalb der CDR-Regionen wurden durch ortsgerichtete Mutagenese durchgeführt, um Affinität für VEGF mit Oligonucleotiden HL-242, HL-243, HL-245, HL-246, HL-254, HL-256 und HL-257, wie in Tabelle 8 nachstehend gezeigt ist, zu verbessern: Tabelle 8: Oligonucleotide für gerichtete Mutationen
Die resultierende Variante wurde als Y0101 (9A und 9B) bezeichnet.
Konstruktion der ersten Generation von Antikörper-Phagen-Bibliotheken: Um die Verunreinigung durch Wildtyp-Sequenz zu unterbinden, wurden Matrizen mit dem TAA-Stoppcodon an den Targetstellen für Randomisierung hergestellt und zur Konstruktion von Bibliotheken durch ortsgerichtete Mutagenese mit Oligonucleotiden unter Verwendung des degenerierten NNS-Codons (worin N ein ausgeglichenes Gemisch aus A, G, C und T ist, während S ein ausgeglichenes Gemisch von G und C ist) zur Sättigungsmutagenese verwendet. VL1 und VH3 wurden als potentielle Kandidaten zur Affinitätssteigerung ausgewählt (9A und B). Innerhalb der CDR wurden zwei Bibliotheken aus der pY0101-Matrize konstruiert. VL1 wurde unter Verwendung von Stopp-Matrizen-Oligonucleotiden HL-248 und HL-249 (Tabelle 9) und Bib liotheks-Oligonucleotiden HL-258 und HL-259 (Tabelle 10) mutiert. Demähnlich wurden drei Bibliotheken für VH3 unter Verwendung von Matrizen-Oligonucleotiden HL-250, HL-251 und HL-252 (Tabelle 9) und Bibliotheks-Oligonucleotiden HL-260, HL-261 und HL-262 (Tabelle 10) konstruiert. Bibliothekskonstruktion ist in den nachstehenden Tabellen 9 und 10 zusammengefasst.
Tabelle 9: Matrizen-Oligonculeotide zur Mutagenese
Tabelle 10: Zufalls-Oligoneuleotide zur Bibliothekskonstruktion
Die Produkte von Zufallsmutagenesereaktionen wurden in XL1-Blue-E.-coli-Zellen (Stratagene) Elektroporation unterzogen und durch 15- bis 16-stündiges Züchten mit M13K07-Helferphagen amplifiziert. Die Komplexität jeder Bibliothek in einem Bereich von 2 × 10⁷ bis 1,5 × 10⁸ wurde auf Grundlage des Ausplattierens der anfänglichen Transformation auf Carbenicillinplatten geschätzt.
Anfängliche Affinitätsselektionen: Für jeden Selektionsdurchgang wurden etwa 10⁹-10¹⁰ Phagen auf Bindung an Platten (Nunc Maxisorp 96-Well), beschichtet mit 2 μg/ml VEGF (rekombinant, Rest-9-109-Version) in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, und blockiert mit 5 % Instant-Milch in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, gescreent. Nach 1-2 Stunden Bindung bei Raumtemperatur in Gegenwart von 0,5 % Rinderserumalbumin und 0,05 % TWEEN 20^TM in PBS wurde die Phagenlösung entfernt, und die Platte wurde zehnmal mit PBS/TWEEN^TM (0,05 % TWEEN 20^TM in PBS-Puffer) gewaschen. Um auf verstärkte Affinitätsvarianten mit geringeren Dissoziationsraten zu selektieren, wurden die Platten typischerweise mit PBS/TWEEN^TM-Puffer über eine Zeitspanne hinweg inkubiert, die in jedem Selektionsdurchgang schrittweise verlängert wurde (von 0 Minuten im ersten Durchgang auf 3 h im neunten Selektionsdurchgang). Nachdem der PBS/TWEEN^TM-Puffer entfernt worden war, wurden die verbleibenden Phagen mit 0,1 M HCl eluiert und unverzüglich mit 1/3 Volumen von 1 M Tris, pH 8,0, neutralisiert. Die eluierten Phagen wurden durch Infizieren von XL1-Blue-E.-coli-Zellen (Stratagene) für den nächsten Selektionsdurchgang vermehrt.
Sequenzierungsdaten zeigten, dass beide VL1-Bibliotheken, sogar nach dem achten/neunten Sortierdurchgang, noch verschieden blieben und verschiedene Arten von Resten an den Stellen der Randomisierung tolerierten. Im Gegensatz dazu behielten die VH3-Bibliotheken nur Wildtyp-Reste bei oder hatten sehr konservative Substitutionen. Dies ließ darauf schließen, dass die VL1 dem Lösungsmittel stärker ausgesetzt war und außerhalb der Bindungsgrenzfläche lag. Im Gegensatz dazu zeigte VH3 keine drastisch unterschiedlichen Seitenkettensubstitutionen und können daher enger in Antigenbindung eingebunden werden.
Phagen-ELISA-Test von Bindungsaffinitäten: Aus jeder dieser Bibliotheken wurden repräsentative Klone (jene, die durch zahlreiche Sequenzen repräsentiert waren) auf ihre Affinitäten im Vergleich mit jener vom Ausgangsklon pY0101 in einem Phagen-ELISA-Test getestet. In solch einem Test wurden die Phagen zuerst reihenverdünnt, um einen fraktionierten Sättigungstiter zu bestimmen, der dann konstant gehalten und verwendet wurde, um mit verschiedenen Konzentrationen an VEGF (beginnend bei 200 nM bis 0 nM) in Lösung zu inkubieren. Das Gemisch wurde dann auf Platten transferiert, die mit VEGF (2 μg/ml) vorbeschichtet und mit 5 % Instant-Milch blockiert waren, und 1 h lang bei Raumtemperatur äquilibrieren gelassen. Hiernach wurde die Phagenlösung entfernt und die verbleibenden gebundenen Phagen mit einer Lösung von Kaninchen-Anti-Phagen-Antikörper, gemischt mit Ziegen-Anti-Kaninchen-Konjugat von Meerrettichperoxidase, nachgewiesen. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Platte mit einem chromogenen Substrat, o-Phenylendiamin (Sigma), entwickelt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 1/2 Volumen von 2,5 M H₂SO₄ gestoppt. Optische Dichte bei 492 nm wurde an einem spektralphotometrischen Plattenleser gemessen.
Obwohl alle der selektierten Klone aus diesen fünf Bibliotheken im Phagen-ELISA-Test entweder schwächere oder ähnliche Affinitäten als oder wie jene des Wildtyps pY0101 aufwiesen, zeigte eine bestimmte Variante (pY0192) aus der Bibliothek HL-258 im Vergleich zu pY0101 einen augenscheinlichen Vorteil (etwa 10fach) hinsichtlich Expressionsgrad oder Phagen-Display auf. Dieser Klon enthielt Mutationen S24R, S26N, Q27E, D28Q und I29L in der VL-Region (9A). Zusätzlich wurde erkannt, dass diese Variante eine unechte Mutation, M34I, in VH aufwies. Diese Variante zeigte im Vergleich zur pY0101-Variante keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich ihrer Bindungsaffinität an VEGF. Um den Grad von Fab-Präsentation am Phagen und das Signal-Rausch-Verhältnis für Phagen-ELISA-Tests zu verbessern, wurden die entsprechenden Substitutionen in pY0192 bei VL1 in den Matrizenhintergrund zur Konstruktion sowohl von CDR-Ala-Mutanten als auch der zweiten Generation von Anti-VEGF-Bibliotheken eingebunden.
Ala-Scanning der CDRs von Anti-VEGF: Um die Energetik, die durch jede der Aminosäuren in den CDR-Regionen beigesteuert wird, zu bestimmen und somit Target-Reste zur Randomisierung besser selektieren zu können, wurden die CDR-Regionen durch Substituieren von Alanin anstelle jedes Rests gescreent. Jede Ala-Mutante wurde unter Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese mit einem synthetischen Oligonucleotid, das für die spezifische Alaninsubstitution kodiert, konstruiert. War Ala der Wildtyp-Rest, so wurde Ser substituiert, um die Wirkung einer Seitenketten-Substitution zu testen. Phagenklone mit einer einzelnen Ala-Mutation wurden gereinigt und in Phagen-ELISA wie zuvor beschrieben getestet. Resultate des Ala-Scans zeigten, dass Ala-Substitution an verschiedenen Positionen eine Wirkung haben können, die im Bereich von 2- bis > 150facher Reduktionen auf Antigenbin dungsaffinität (im Vergleich zu pY0192) liegen können. Darüber hinaus bestätigte er eine frühere Beobachtung, dass VH3, jedoch nicht VL1, in Antigenbindung eingebunden ist. Ergebnisse des CDR-Ala-Scans sind nachstehend in Tabelle 11 zusammengefasst.
Tabelle 11: Relative VEGF-Affinitäten von Ala-Scan-Fab-Varianten
Alle Varianten sind im Hintergrund von pY0192 ("wt", siehe 9A-B). IC50 wurden in einem Konkurrenz-Phagen-ELISA-Test bestimmt.
Die größten Wirkungen von Ala-Substitutionen sind in den CDRs H1, H2 und H3, einschließlich Y27A (34fache Reduktion der Affinität), N31A, Y32A, W50A, N52A, Y99A, S106A und W108A (jeweils > 150fache Reduktion); N35A (66fache Reduktion), P100A (38fache Reduktion) und F110A (25fache Reduktion) zu beobachten.
Im Gegensatz dazu hatte nur eine VL-Substitution eine große Wirkung auf Bindungsaffinität, W96A (> 150fache Reduktion). Diese Resultate heben die drei VH-CDRs als die Haupt-Energetikdeterminanten von Fab-Bindung an VEGF hervor, wobei ein gewisser Beitrag von VL3 kommt.
Entwurf von CDR-Mutationsbibliotheken der zweiten Generation: Zwei zusätzliche Bibliotheken, die existierende Reste in Anti-VEGF-Version Y0192 randomisierten, wurden auf Grundlage einer Untersuchung der Kristallstruktur entworfen. In VH2 wurden die Reste 52-55 randomisiert, da sie innerhalb der Bindungsgrenzfläche mit VEGF liegen. Eine zusätzliche Region des Fab, bezeichnet als "CDR7" (siehe 10B), wurde auch als Target zur Randomisierung herangezogen, da mehrere Reste in dieser Schleife, die VEGF nicht kontaktieren, Kontakte mit den VH-Schleifen des Antikörpers haben. Diese stellten potentielle Stellen für Affinitätsverbesserung durch sekundäre Wirkungen auf die Grenzflächenreste dar. Reste 172, T74 und S77 wurden in dieser CDR7-Bibliothek randomisiert.
Auch auf Grundlage der Kristallstruktur wurde eine der ursprünglichen CDR-Bibliotheken rekonstruiert, um das Potential zur Affinitätsreifung in der VH1-CDR neuerlich zu testen. Reste 27, 28 und 30-32 wurden unter Verwendung des neuen Y0192-Hintergrunds randomisiert.
Selektionen von Anti-VEGF-Bibliotheken der zweiten Generation: Basierend auf Ala-Scan-Ergebnissen sowie auf der Kristallstruktur des Antigen-Antikörper-(F(ab)-12) Komplexes wurde eine Gesamtanzahl von siebzehn Bibliotheken unter Verwendung der pY0192-Matrize und von Stopp-Matrizen-Oligonucleotiden (die für ein Stoppcodon an den Target-Stellen für Randomisierung kodieren) YC-80, YC-100, YC-102, HL-263 und HL-264 (Tabelle 9, s.o.) konstruiert. Die entsprechenden Randomisierungs-Oligonucleotide (die NNS an den Target-Stellen für Randomisierung verwenden) waren YC-81, YC-101, YC-103, HL-265 und HL-266 (Tabelle 10, s.o.). Die resultierenden Transformanten ergaben Bibliotheken mit Komplexitäten im Bereich von 6 × 10 bis 5 × 10⁸, die darauf schließen lassen, dass die Bibliotheken umfassend alle möglichen Varianten abdeckten. Phagenbibliotheken wurden 7-8 Durchgänge lang unter Verwendung von in Tabelle 12 beschriebenen Bedingungen (siehe unten) sortiert.
Tabelle 12: Bedingungen für sekundäre Selektion von Fab-Varianten
ELISA-Puffer enthielt 0,5 % Rinderserumalbumin und 0,05 % TWEEN 20^TM in PBS. VEGF wurde in den Inkubationspuffer inkludiert, um neuerlich Bindung von Phagen an VEGF, ausgestrichen auf der Oberfläche der Platte, zu minimieren. Sortieren dieser Bibliotheken ergab Phagenanreicherung über 7 bis 8 Selektionsdurchgänge hinweg.
Phagen-ELISA-Test von Klonen zweiter Generation: Nach acht Selektionsdurchgängen wurden zehn bis zwanzig Klone aus jeder Bibliothek aus Carbenicillin-hältigen Platten, die E.-coli-(XL1) Kolonien aufwiesen, welche mit einem eluierten Phagenpool infiziert worden waren, isoliert. Die Kolonien wurden isoliert und mit Helferphagen gezüchtet, um Einzelstrang-DNA zum Sequenzieren zu erhalten. CDR-Substitutionen, die für günstigere Bindung an VEGF selektiert wurden, wurden aus den DNA-Sequenzen von Phagemid-Klonen abgeleitet. Eine Probennahme selektierter Klone ist in der nachstehenden Tabelle 13 dargestellt.
Tabelle 13: Proteinsequenzen von Anti-VEGF-Varianten aus Fab-Phagenbibliotheken der zweiten Generation
Die Sequenz der randomisierten Region allein wird wie von DNA-Sequenzieren abgeleitet gezeigt.
Wurde eine Anzahl an Klonen zusammen mit dem Ausgangsklon pY0192 im Phagen-ELISA-Test getestet, zeigte keiner eine ausgesprochene Verbesserung gegenüber dem Ausgangsklon. Dies könnte durch die Zeitspanne erklärt werden, über die hinweg der Test durchgeführt wurde (< 3 Stunden).
Um die Verbesserung der Antigenbindung gegenüber einem Ausgangsklon zu quantifizieren, wurden mehrere DNA von Anti-VEGF-Varianten in E.-coli-Stamm 34B8 transformiert, als Fab exprimiert und durch Passieren des periplasmatischen Shockate durch eine Protein-G-Säule (Pharmacia) gereinigt, wie in Beispiel 2 zuvor beschrieben wurde.
CDR-Kombinationsvarianten: Um VEGF-Bindungsaffinität weiter zu verbessern, wurden Mutationen, die durch Phagen-Display gefunden wurden, in verschiedenen CDRs kombiniert, um Mehrfach-CDR-Mutanten zu bilden. Insbesondere wurden die Mutationen, die in den am stärksten Affinitäts-verbesserten Phagenvarianten aus VH1-, VH2- und VH3-Bibliotheken identifizierten wurden, kombiniert (Tabelle 14), um sie auf Additivität ihrer Beiträge zur Bindungsaffinität zu testen.
Tabelle 14: Kombination von CDR-Anti-VEGF-Varianten
Mutationen von den angegebenen Augangsvektoren wurden mit jenen von dem angegebenen Oligonucleotid durch ortsgerichtete Mutagenese kombiniert, um die aufgelisteten Kombinationsvarianten zu ergeben.
Version Y0317 ist äquivalent mit Y0313-1, außer dass die Hintergrundmutation in VL1 entfernt wurde und ihre Sequenz zu jener in pY0101 rückmutiert wurde. Die Wirkungen des Mutierens von H101Y und S105T wurden durch Konstruieren einer Reversionsmutante aus Y0238-3 getestet.
BIAcore-Analyse: Die VEGF-Bindungsaffinitäten von Fab-Fragmenten wurden aus Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeits-Konstanten, gemessen unter Verwendung eines BIAcore-2000^TM-Oberflächenplasmonresonanzsystems (BIAcore, Inc. Piscataway, NJ), berechnet. Ein Biosensorchip wurde für kovalente Kupplung von VEGF unter Verwendung von N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) gemäß den Anweisungen des Herstellers (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) aktiviert. VEGF wurde in 20 mM Natriumacetat, pH 4,8, Puffergetauscht und auf etwa 50 μg/ml verdünnt. Eine Aliquote (35 μl) wurde bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 2 μl/min injiziert, um etwa 700- 1.400 Reaktionseinheiten (RE) von gekuppeltem Protein zu erhalten. Schließlich wurde 1 M Ethanolamin als ein Blockiermittel injiziert.
Für Kinetik-Messungen wurden zweifache Reihenverdünnungen von Fab in PBS/TWEEN^TM-Puffer (0,05 % TWEEN 20^TM in phosphatgepufferter Salzlösung) bei 25 °C bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 10 μl/min injiziert. On-Rates und Off-Rates wurden unter Verwendung von standardmäßigen Arbeitsvorschriften (Karlsson et al., J. Immun. Methods 145, 229-240 (1991)) berechnet. Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten, Kd's aus Oberflächenplasmonresonanz-(SPR-)Messungen wurden als k_off/k_on berechnet. Die Daten sind nachstehend in Tabelle 15 dargestellt.
Tabelle 15: Kinetik von Fab-VEGF-Bindung aus BIAcore^TM-Messungen

^* Die beobachtete Dissoziationsgeschwindigkeit spiegelt eine Obergrenze für die tatsächliche Dissoziationsgeschwindigkeit in diesen Experiment wider, da die Off-Rate nahe der Nachweisgrenze von BIAcore liegt.

Die BIAcore^TM-Daten in Tabelle 15 zeigen, dass mehrere Varianten verbesserte Affinität gegenüber Y0192 aufwiesen. Beispielsweise zeigte eine CDRH1-Variante, Y0243-1, um das 4,1fache verbesserte Affinität, die durch die Mutationen T28D und N31H entstand. Die Variante Y0238-3 zeigte zumindest eine 14fache Verbesserung der Bindungsaffinität gegenüber Y0192. Beide CDRH3-Mutationen tragen zur ver besserten Affinität von Y0238-3 bei, da eine Rückmutation von T105 zu S (Variante Y0313-3) die Affinität von Y0238-3 auf 0,15 nM bis 0,65 nM reduziert (siehe Tabelle 15). Die stärkere Affinitätsverbesserung in Bezug auf Y0192 wurde bei Y0313-1 beobachtet, die CDRH3-Mutationen in Kombination mit CDRH1-Mutationen enthielt.
Zellbasierter Test von VEGF-Inhibition: Mehrere Versionen des A4.6.1-Anti-VEGF-Antikörpers wurden auf ihre Fähigkeit getestet, VEGF (rekombinant, Version 1-165) bei der Induktion des Wachstums von HuVECs (menschliche Nabelvenenendothelzellen) zu antagonisieren. Die 96-Well-Platten wurden mit 1.000 HuVECs pro Well überimpft und in Testmedium 24 h lang fixiert (F12:DMEM 50:50, ergänzt mit 1,5 % diafiltriertem fötalem Rinderserum). Die Konzentration von VEGF, die zum Induzieren der Zellen verwendet wurde, wurde durch erstes Titrieren für die Menge von VEGF, die 80 % von maximaler DNA-Synthese stimulieren kann, bestimmt. Frisches Testmedium, das bestimmte Mengen von VEGF (0,2 nM Endkonzentration) enthielt, und steigende Konzentrationen von Anti-VEGF-Fab oder -MAb wurden dann zugesetzt. Nach 40 h Inkubation wurde DNA-Synthese durch Einbindung von tritiiertem Thymidin gemessen. Die Zellen wurden mit 0,5 μCi pro Well von [3H]-Thymidin 24 h lang gepulst und zur Zählung mittels eines TopCount-γ-Zählers geerntet.
Die Ergebnisse (11) zeigen, dass die Volllängen-IgG-Form von F(ab)-12 VEGF-Aktivität signifikant stärker hemmte als die Fab-Form (hier wurde Y0192 verwendet). Beide Varianten, Y0238-3 und Y0313-1, zeigten jedoch noch stärkere Inhibition von VEGF-Aktivität als der Y0192-Fab oder F(ab)-12-MAb. Im Vergleich der Fab-Formen schien die Variante Y0313-1 >30-mal so stark zu sein wie das Wildtyp-Fab. Es gilt anzumerken, dass die Menge von VEGF (0,2 nM), die in diesem Test verwendet wurde, eventuell zur Bestimmung eines exakten 1050 für die Mutante limitierend wirkt. Beispielsweise wird, sofern die Bindungsaffinität (Kd) der Mutante tatsächlich <0,2 nM ist, 1050 in diesem Experiment höher scheinen als unter Bedingungen mit geringerer VEGF-Konzentration. Das Ergebnis unterstützt daher die Schlussfolgerung, dass die Affinitäts-verbesserte Variante in ihrer Affinität zu VEGF zumindest 30fach verbessert ist und dass sie VEGF-Aktivität in vitro wirksam blockiert. Da sich die Variante Y0317 von Y0313-1 nur in der Rückmutation der VL1-Sequenz zum Wildtyp unterscheidet (10A), wird vorausgesagt, dass Y0317 ähnliche Aktivität wie Y0313-1 aufweisen wird.
Die Variante Y0317 (Fab) und die humanisierte Variante F(ab)-12 aus Beispiel 1 (volle Länge und Fab) wurden unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Tests hinsichtlich ihrer Fähigkeit verglichen, Rinderkapillarendothelzellen-Proliferation als Reaktion auf eine beinahe maximal wirksame Konzentration von VEGF zu hemmen. Wie in 12 veranschaulicht ist, war Y0317 in diesem Test bedeutend wirksamer beim Hemmen von Rinderkapillarendothelzellen-Proliferation als die Volllängen- und Fab-Formen von F(ab)-12. Das affinitätsgereifte Y0317-Fab wies in diesem Test einen ED50-Wert auf, der zumindest etwa 20fach niedriger war als jener von F(ab)-12-Fab.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Variante eines Anti-Gefäßendothelwachstumsfaktor-(VEGF-)Ausgangsantikörpers, wobei der Anti-VEGF-Ausgangsantikörper eine variable Schwerkettendomäne, welche die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 7 umfasst, und eine variable Leichtkettendomäne, welche die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 8 umfasst, aufweist, worin: (i) die Variante einen menschlichen VEGF mit stärkerer Bindungsaffinität bindet als der Ausgangsantikörper und zumindest in der hypervariablen Region CDRH1 und/oder in der hypervariablen Region CDRH3 der variablen Schwerkettendomäne des Ausgangsantikörpers eine Aminosäuresubstitution umfasst, (ii) die Variante eine variable Schwerkettendomäne aufweist, welche die folgenden Aminosäuresequenzen der hypervariablen Regionen umfasst: CDRH1: GYX₁X₂X₃X₄YGX₅N (Seq.-ID Nr. 117), worin X₁ D, T oder E ist, X₂ F, W oder Y ist, X₃ T, Q, G oder S ist, X₄ H oder N ist und X₅ M oder I ist; und CDRH3: YPX₁YX₂X₃X₄X₅HWYFDV (Seq.-ID Nr. 119), worin X₁ H oder Y ist, X₂ Y, R, K, I, T, E oder W ist, X₃ G, N, A, D, Q, E, T, K oder S ist, X₄ S, T, K, Q, N, R, A, E oder G ist und X₅ S oder G ist, und (iii) die Variante eine Aminosäuresequenz mit zumindest 90 % Aminosäureidentität mit der variablen Schwer- oder Leichkettendomäne des Ausgangsantikörpers der Seq.-ID Nr. 7 oder Seq.-ID Nr. 8 aufweist.
Antikörpervariante nach Anspruch 1, Substitutionen in sowohl CDRH1 als auch CDRH3 der variablen Schwerkettendomäne umfassend.
Antikörpervariante nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, die menschlichen VEGF mit einem K_d-Wert von nicht mehr als etwa 1 × 10^-8 M bindet.
Antikörpervariante nach Anspruch 3, die einen menschlichen VEGF mit einem K_d-Wert von nicht mehr als etwa 5 × 10^-9 M bindet.
Antikörpervariante nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die einen ED₅₀-Wert für die Hemmung einer VEGF-induzierten Proliferation von Endothelzellen in vitro aufweist, der zumindest 10fach geringer ist als der des Ausgangsantikörpers.
Antikörpervariante nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Identitätsgrad zumindest 95 % beträgt.
Antikörpervariante nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die eine variable Schwerkettendomäne aufweist, welche folgende Aminosäuresequenz der hypervariablen Region CDRH2 umfasst: WINTX₁TGEPTYAADFKR (Seq.-ID Nr. 118), worin X₁ Y oder W ist.
Antikörpervariante nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die eine variable Schwerkettendomäne aufweist, welche die folgenden Aminosäuresequenzen der hypervariablen Regionen umfasst: CDRH1: GYX₁FTX₂YGMN (Seq.-ID Nr. 128), worin X₁ T oder D ist und X₂ N oder H ist; CDRH2: WINTYTGEPTYAADFKR (Seq.-ID Nr. 2); und CDRH3: YPX₁YYGX₂SHWYFDV (Seq.-ID Nr. 129), worin X₁ Y oder H ist und X₂ S oder T ist.
Antikörpervariante nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die CDRH1 die Aminosäuresequenz GYDFTHYGMN (Seq.-ID Nr. 26) aufweist.
Antikörpervariante nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die CDRH3 die Aminosäuresequenz YPYYYGTSHWYFDV (Seq.-ID Nr. 127) aufweist.
Antikörpervariante nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die eine variable Leichtkettendomäne aufweist, welche die folgenden Aminosäuresequenzen der hypervariablen Regionen umfasst: CDRL1: X₁AX₂X₃X₄X₅SNYLN (Seq.-ID Nr. 121), worin X₁ R oder S ist, X₂ S oder N ist, X₃ Q oder E ist, X₄ Q oder D ist und X₅ I oder L ist; CDRL2: FTSSLHS (Seq.-ID Nr. 122); CDRL3: QQYSX₁X₂PWT (Seq.-ID Nr. 123), worin X₁ T, A oder N ist und X₂ V oder T ist.
Antikörpervariante nach Anspruch 11, worin: in CDRL1 X₁ S ist, X₂ S ist, X₃ Q ist, X₄ D ist und X₅ I ist; und in CDRL3 X₁ T ist und X₂ V ist.
Antikörpervariante nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die variable Schwerkettendomäne die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 116 umfasst.
Antikörpervariante nach Anspruch 13, worin die variable Leichtkettendomäne folgende Aminosäuresequenz umfasst: DIQX₁TQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (Seq.-ID Nr. 124), worin X₁ M oder L ist.
Antikörpervariante nach Anspruch 14, worin die variable Leichtkettendomäne die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 115 umfasst.
Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem es sich um einen Antikörper voller Länge handelt.
Antikörper nach Anspruch 16, bei dem es sich um menschliches IgG handelt.
Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem es sich um ein Antikörperfragment handelt.
Antikörper nach Anspruch 18, bei dem es sich um ein Fab oder Fab' handelt.
Antikörper nach Anspruch 18, bei dem es sich um ein F(ab')₂ handelt.
Zusammensetzung, einen Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassend.
Isolierte Nucleinsäure, die für einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 20 kodiert.
Vektor, die Nucleinsäure nach Anspruch 22 umfassend.
Wirtszelle, den Vektor nach Anspruch 23 umfassend.
Verfahren zur Herstellung eines humanisierten Anti-VEGF-Antikörpers, das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 24 umfassend, sodass die Nucleinsäure exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 25, weiters das Gewinnen des humanisierten Anti-VEGF-Antikörpers aus der Wirtszellkultur umfassend.
Medikament, einen humanisierten Anti-VEGF-Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 20 umfassend, zur Verwendung bei der Hemmung von VEGF-induzierter Angiogenese in einem Säugetier, worin das Medikament dem Säugetier in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht werden kann.
Medikament nach Anspruch 27, worin das Säugetier ein Mensch ist.
Medikament nach Anspruch 27 oder Anspruch 28, worin das Säugetier einen Tumor aufweist.
Medikament nach Anspruch 27 oder Anspruch 28, worin das Säugetier ein Retinaleiden aufweist.