MX2011002372A - Composiciones y metodos para la prevencion de la degradacion oxidativa de proteinas. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con formulaciones farmacéuticas que comprenden una proteína y metionina libre en combinación con uno o más compuestos capaces de prevenir la oxidación de residuos de aminoácidos aromáticos dentro de una proteína. Más específicamente, la invención se relaciona con preparaciones estabilizadas, farmacéuticamente efectivas de agentes terapéuticos sensibles a la oxidación. La invención se relaciona, además, con un método para inhibir la oxidación de estos agentes terapéuticos.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS PARA LA PREVENCION DE LA DEGRADACION OXIDATIVA DE PROTEINAS Campo de la Invención La invención se relaciona con el uso de compuestos aromáticos como estabilizadores para evitar la degradación oxidativa de las proteínas. Más específicamente, la invención se relaciona con preparaciones estabilizadas, farmacéuticamente efectivas de agentes terapéuticos sensibles a la oxidación. La invención se relaciona, además, con un método para inhibir la oxidación de estos agentes terapéuticos.

Antecedentes de la Invención Las proteínas sufren diversos grados de degradación durante la purificación y almacenamiento. La oxidación es una de las principales vías de degradación de las proteínas, y tiene un efecto destructivo sobre la estabilidad y la potencia de las proteínas. Las reacciones de oxidación causan destrucción de los residuos de aminoácidos, la hidrólisis del enlace peptídico, y por lo tanto inestabilidad de las proteínas debido a la alteración de la estructura terciaria de la proteína y la agregación de proteínas (Davies, J. Biol . Chem 262:. 9895-901 (1987)). La oxidación de productos farmacéuticos de proteínas se revisó por Nguyen (Capítulo 4 en Formulation and Delivery of Protein and Peptides (1994) ) , REF.:217910 Hovorka, (J. Pharm Sci. 90:25369 (2001)) y Li (Biotech Bioengineering 48:490-500 (1995)).

Causas de la oxidación de proteínas La oxidación se produce a través de muchas vías diferentes y conectadas entre sí, y es catalizada por una variedad de condiciones desencadenantes, que incluyen temperatura elevada, niveles de oxígeno, niveles de iones hidrógeno ( H) , y exposición a metales de transición, peróxidos y luz. Por lo general, un factor importante que causa la degradación oxidativa de las proteínas es la exposición al oxígeno, las especies reactivas del oxígeno y los metales. Algunos excipientes se formularon en composiciones farmacéuticas para proporcionar protección contra la agregación de las proteínas, pero estos fármacos también pueden mejorar la oxidación, ya que contienen especies reactivas del oxígeno. Por ejemplo, los tensioactivos de uso común, tales como Polisorbato 80 (comúnmente conocido como T een) , contiene cantidades trazas de contaminantes de peróxido, lo cual puede causar la posterior oxidación del tensioactivo para generar una mayor cantidad de especies reactivas del oxígeno (radicales de oxígeno) en presencia de bajas concentraciones de metales (Ha y otros, J Pharm Sci 91:2252-2264 (2002); Harmon y otros, J Pharm Sci 95:2014-2028 (2006)). La combinación de los radicales de oxígeno y los metales proporciona un ambiente catalítico para la oxidación y, por tanto, la degradación de la proteína formulada con el tensioactivo . La oxidación de las proteínas en formulaciones líquidas o liofilizadas también se destaca por ser provocada por el peróxido en polisorbatos u otros excipientes de la formulación, tales como, polietilenglicol (PEG) y trazas de metales como el hierro o el cobre. Además, los preparados farmacéuticos comúnmente se envasan en recipientes de plástico hechos de polietileno de baja densidad (LDPE) o de polipropileno para su almacenaje y su aplicación. Sin embargo, estos envases de plástico son fácilmente permeables al oxígeno. El oxígeno forma especies reactivas del oxígeno que causan la oxidación rápida de residuo (s) sensible (s) a la oxidación en la proteína farmacéutica, tales como la oxidación de la metionina a sulfóxido de metionina. (Manning y otros, Pharmaceutical Research, Vol . 6, No. 11, (1989)).

Las cadenas laterales de los residuos Cisteína (Cys) , Metionina (Met) , Triptófano (Trp) , Histidina (His) y Tirosina (Tyr) son especialmente vulnerables a la oxidación, en orden de sensibilidad. La sensibilidad de estos residuos de aminoácidos a la oxidación es un resultado de las especies aducto formadas con los anillos aromáticos, los cuales se estabilizan por deslocalización en los dobles enlaces vecinos. El grupo tiol en Cys es el grupo funcional más reactivo, ya que el grupo tiol ofrece la extracción de hidrógenos dispuestos por los radicales, y por eso muy pocas proteínas farmacéuticas contienen Cys libre.

La oxidación de metionina forma Met sulfóxido ( et [0] ) .

La oxidación de metionina forma Met sulfóxido (Met [0] ) y en condiciones extremas, sulfona. Los ejemplos siguientes representan las proteínas farmacéuticas que presentan oxidación Met y los oxidantes usados en cada estudio se identifican: la hormona del crecimiento (hGH, Teh, L-C, J. Biol Chem 262:6472-7, (1987) usando H202 , Pearlman R, Capítulo 1, Pharmaceutical Biotechnology vol 5 (1993), Zhao F, J. Biol Chem 272:9019-9029 (1997), usando Asc/Cu (II) /02), IL-2 (Sasaoki K, Chém Pharm Bull 37:2160-4 (1989) usando H202 100 veces x, el Cadé JA, Pharm Res. 18:1461-7 (2001) usando peroxodisulfato, Ha E, J Pharm Sci 91:2252-64, (2002) usandoTween) , péptidos pequeños (Li, Pharm Res 12: 348-55 (1995)), relaxina (Nguyen TH, Pharm Res. 10:1563-71 (1993) y capítulo 5 Pharmaceutical Biotechnology vol 9 (1996) usando H202 2000 x, Li, Biochem 34: 5762-72 (1995) usando Asc/Cu (II) /02), rhGCSF (Lu HS , Arch Biochem Biophys 362:1-11 (1999) , Hermán AC, Capitulo 7 en Pharmaceutical Biotechnology vol 9 (1996), Yin, Pharm Res 21: 2377-83 (2004) y Pharm Res 22: 141-7 (2005) usando H202) , rhVEGF (Dueñas ET, Pharm Res. 18:1455-60 (2001), usando H202 & tBHP) , IGF-1 (Fransson, Pharm Res 13:1252 (1996), usando 02 disuelto, Fe(III) con EDTA) , rhCNF y rhNGF (Knepp V, PDA J Pharm Sci Tech. 50:163-171 (1996), usando H202) , BDNF (Jensen JL, Pharm Res. 17:190-6 (2000), usando Asc/Cu (II) /02), rhLeptin (Liu JL, Pharm Res. 15:632-40 (1998) usando tBHP y H202) , Actimmune y Activase (Keck RG, Anal Biochem. 236, 56-62 (1996), usando tBHP), Herceptin (Shen FJ, Techniq. Protein Chem. VII. 275-284 (1996) usando tBHP, Lam XM, J Pharm Sci . 86:1250 -5 (1997) usando calor, luz y acero inoxidable), y PTH (Yin y otros, Pharm Res 22:141-7 (2004.), Chu y otros, Biochem 43:. 14139-'48 (2004) y (Chu y otros, J Pharm Sci 93:3096-102 (2004), usando H202) , y un anticuerpo monoclonal (Wei y otros Anal Chem 79 :.2797-805 , 2007; usando tBHP, radiación UV y ozono). Cabe señalar que en los últimos 20 años, una gran variedad de oxidantes se usaron para estudiar la oxidación de las proteínas. El tBHP y el H202 se usaron predominantemente. Excepto el ascorbato, todos fueron oxidantes libres de metal.

La oxidación de la histidina forma oxo-histidina .

La oxidación de His forma predominantemente oxo- histidina, pero también forma una variedad de otros productos de oxidación, en dependencia de las condiciones de oxidación. Mediante el uso de Asc/Cu (II) /02, Li y otros (J Pharm Sci. 85:868-72, 1996) observaron la oxidación de residuos His en la relaxina. Con la hormona de crecimiento humano, Zhao y otros (J Biol Chem. 272:9019-9029, 1997) observaron oxo- histidina cuando el mismo sistema de oxidación se usó para simular la oxidación catalizada por metales en el sitio de unión de metal. El ácido aspártico y la asparagina como productos de la oxidación de His también se detectaron en el péptido b-amiloide en presencia de Cu(II)/H202 ( owalik-Jankowska y otros, J Biochem Inorg 98 (6):940-950, 2004).

Oxidación de triptófano Con respecto a la oxidación de triptófano, varios productos se forman. Los estudios de estabilidad de triptófano en solución acuosa (Lee, J Padres Sci Tech 42: 20-2 (1988)) y los residuos de triptófano en péptidos pequeños y en lisozima (Simat TJ, J Agrie Food Chem. 46:490-8 (1998)) y en a-cristalina bovina (Finley EL, Protein Sci 7:2391-7 (1998)) claramente identificaron que los productos de degradación principales son 5-hidroxi-triptófano, oxi-indol alanina, quinurenina y formilquinurenina-N. En comparación con las otras formas de oxidación de los aminoácidos, hay relativamente pocos artículos sobre la oxidación de Trp en proteínas farmacéuticas. Davies y otros (J Biol Chem 262:. 9902-7, 1987) oxidaron la albúmina de suero bovino mediante los radicales de oxígeno generados por la radiación de cobalto, Uchida y otros (Agrie Biol Chem 53:3285-92, 1989) estresaron la albúmina con Fe ( II ) /EDTA/Asc y detectaron la oxidación selectiva de Trp e His. Recientemente, la oxidación de Trp en anticuerpos monoclonales fue reportada por Amgen (Yang y otros, J Chrom A. 1156.: 174-82, 2007) y Medlmmune (Wei y otros, Anal Chem 79:. 2797-805, 2007) estresada por ozono y radiación UV) . En Genentech, la oxidación de Trp se detectó en los anticuerpos anti-VEGF, anti-CD40, anti-CD22 y Apomab. Con Apomab la disminución de la potencia se correlacionó con el grado de oxidación Trp.

Mecanismos de oxidación Basado en los análisis anteriores, las proteínas pueden ser susceptibles al ataque oxidativo a través de cualquiera o de los tres mecanismos de degradación que se muestran en la Figura 1, así como la oxidación inducida por luz. La reacción nucleofílica con H202 puede ser la reacción de oxidación observada cuando el producto proteico se expone al vapor de H202 que se usa como agente aséptico en los aisladores de proteína, o de la degradación de los excipientes de uso común, tales como polisorbatos (por ejemplo, Tween) o glicoles de polietileno. Cuando las trazas de metal (hierro, cobre o cromo) se llevan a la solución de formulación, por ejemplo, a partir del contacto con el acero inoxidable, tendrá lugar una reacción de Fenton, H202 con Fe (II) . Un tercer mecanismo de degradación es a través de los alquilperóxidos que podrían proceder . del Tween degradado, como se describió anteriormente. (Jaeger J, J Biochem Biophys Methods 29: 77-81, 1994).

Las proteínas farmacéuticas sujetas a la oxidación, a menudo resultan en la modificación y la pérdida de la potencia de las proteínas. La oxidación de proteínas, tales como soluciones que contienen anticuerpos monoclonales , pueden dar lugar a la degradación, la agregación y la fragmentación de los anticuerpos, y por lo tanto la pérdida de actividad de los anticuerpos. En otros casos, aunque la proteína farmacéutica sigue siendo biológicamente activa después de la oxidación, el factor de crecimiento no puede ser aceptable para uso farmacéutico de acuerdo a las normas de las agencias reguladoras, tales como la FDA, por ejemplo, cuando están presentes altos niveles de sulfóxido de metionina. Los procedimientos preventivos actuales para eliminar el oxígeno durante la fabricación y envasado de la preparación demostraron ser ineficaces en la prevención de la oxidación significativa de proteínas farmacéuticas. El resultado es que la preparación farmacéutica tiene una vida eficaz más corta que la que es potencialmente posible si la reacción de oxidación pudiera ser inhibida. Por lo tanto, hay una necesidad en la técnica de identificar las condiciones físicas y químicas que remediarían la aceleración de la degradación de las proteínas, a fin de proporcionar composiciones farmacéuticas que contengan proteínas estables que puedan soportar las condiciones de oxidación en un período de tiempo. Por tanto, es deseable formular composiciones farmacéuticas que contengan péptidos y anticuerpos con excipientes que protegerán a las proteínas del daño oxidativo debido a una serie factores desencadenantes .

Estabilizadores de la oxidación en la técnica Algunos aminoácidos, y varias combinaciones de los mismos, junto con tensioactivos , como polisorbato y poloxámero y similares, se usaron para estabilizar composiciones de péptidos y proteínas. Véase, por ejemplo, ' Yu-Chang John Wang y Musetta A. Hansen, "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers " , Journal of Parenteral Science and Technology, 42:S14, 1988. Una colección de antioxidantes para todos los productos inyectables se elaboró por Neema y otros (J Pharm Sci Tech 51: 166-71(1997)) donde se enumeraron el bisulfito, ascorbato, anisol hidroxilo butilado, cisteína, etc. Sin embargo, ninguno de los agentes que figuran parece ser eficaz en el tratamiento con todo el espectro de los mecanismos de degradación oxidativa y la oxidación concomitante no sólo de la metionina, sino también del triptófano y otros residuos de aminoácidos aromáticos en una proteína. Como antioxidante, la metionina libre se citó por primera vez en la patente de los Estados Unidos 5,272,135 (Takruri, 1993) y también en una solicitud de patente de los Estados Unidos 2003/0104996 Al (Li, 2003) . La metionina libre se puede encontrar en una serie de productos parenterales comercializados, tales como: depo-subQ Provera, AQ Follistim, Gonal-f RFF, Lutropina-a. La histidina también se divulgó como un antioxidante potencial en la patente del os Estados Unidos 5,849,700 (Sorensen y otros, 1998) . Sorensen y otros revelan que una preparación farmacéutica que comprende una hormona de crecimiento e histidina o un derivado de la histidina como aditivo o sustancia tampón demostró una estabilidad muy alta contra la desamidación, la oxidación (medida por las concentraciones de sulfóxido) y la escisión de los enlaces peptídicos. Otros fármacos que pueden controlar la oxidación de proteínas incluyen los agentes quelantes de metales (por ejemplo, EDTA) y depuradores de radicales libres (por ejemplo, manitol) , que se citaron ampliamente en los libros de texto y artículos de revisión. Véase, por ejemplo, Yu-Chang John Wang y Musetta A. Hansen, "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers " , Journal of Parenteral Science and Technology, 42:S14, 1988. El N-acetil triptofanato se usó, junto con octanoato como ligando que se une a sitios específicos para estabilizar la albúmina de suero humano durante la pasteurización (Peters Biochemistry, genetics, and medical applications . Academic Press, NY, 1995). Sin embargo, ninguno de los aminoácidos o de los tensioactivos se usa para impedir la oxidación a través de alquilperóxidos que podrían proceder de tensioactivos degradados. Por lo tanto, hay una necesidad de un método de inhibición de múltiples mecanismos dé oxidación en vehículos farmacéuticos de polipéptidos que tienen una secuencias de aminoácidos susceptibles al ataque oxidativo .

Sumario de la Invención La presente invención proporciona composiciones y métodos mejorados para la protección de las proteínas contra el daño debido a la oxidación. Las composiciones contienen una o más proteínas sensibles a la oxidación formuladas junto con uno o varios compuestos capaces de restringir eficazmente la libre circulación de la oxidación mediada por radicales que típicamente causan la oxidación de los residuos tirosina, triptófano, o histidina. Las composiciones muestran aumento de conformidad con la resistencia a la oxidación dando lugar a, por ejemplo, una mayor vida útil del producto, mayor estabilidad que permite el almacenaje a temperatura ambiente, y/o una mayor flexibilidad en el envasado del producto. En consecuencia, la presente invención proporciona un medio importante para la protección (es decir, estabilización) , incluso de composiciones de proteínas de múltiples unidades, tales como composiciones de anticuerpos.

En una modalidad de la presente invención, se proporciona una formulación farmacéutica que abarca una proteína formulada (por ejemplo, en forma de preparado, tal como una composición con calidad de laboratorio o farmacéutica) con uno o varios compuestos capaces de prevenir la oxidación de los residuos de aminoácidos aromáticos en la proteína. Las modalidades preferidas usan aminoácidos aromáticos libres, nucleótidos o vitaminas y sus derivados en combinación con metionina, que en conjunto protegen eficazmente contra todos los mecanismos más comunes de oxidación de proteínas.

En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para preparar una composición de proteína estabilizada mediante la formulación de una proteína, junto con la metionina en combinación con uno o varios compuestos capaces de prevenir la oxidación de los residuos de aminoácidos aromáticos en la proteína como se describe a continuación.

En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero que comprende la administración al mamífero de la formulación que comprende un agente terapéutico basado en una proteína y uno o varios compuestos capaces de prevenir la oxidación de los residuos de aminoácidos aromáticos dentro del agente, en una cantidad eficaz para prevenir o tratar la enfermedad o trastorno.

En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método de preparar una formulación farmacéutica que comprende la preparación de la formulación que comprende una proteína y uno o varios compuestos capaces de prevenir la oxidación de los residuos de aminoácidos aromáticos en la proteína y la evaluación de la estabilidad física, estabilidad química, o la actividad biológica de la proteína en la formulación.

En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para estabilizar una composición farmacéutica de una proteína que comprende la adición de metionina y uno o más compuestos de la composición en una cantidad suficiente para inhibir la oxidación de los residuos de aminoácidos aromáticos en la proteína.

En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para preparar una formulación farmacéutica que comprende la adición de una cantidad de un tensioactivo a una composición de proteína en una cantidad del compuesto suficiente para negar la especie oxidativa generada por la degradación del tensioactivo.

En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para prevenir la oxidación de residuos de aminoácidos aromáticos dentro de una proteína sensible, el cual comprende la adición de metionina en combinación con uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de aminoácidos aromáticos, nucleótidos, vitaminas y sus derivados .

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y ejemplos, los cuales no se deben interpretar como una limitación. El contenido de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente citadas en esta solicitud son expresamente incorporados aquí como referencia.

Breve Descripción las Figuras Figura 1. Un esquema que representa las posibles rutas para la oxidación de la metionina, triptófano e histidina.

Figura 2. Un esquema que representa AIBN, un compuesto azo que genera radical alquilo por calentamiento, cuando se combina con oxígeno forma alquilperóxido (círculo) . AAPH, otro compuesto azo, también se muestra con su estructura.

Figura 3. Una ilustración del cromatograma rp-HPLC de la PTH degradada por H202. Reacción a 40° C, y las muestras se retiraron a las 2, 4 y 6 horas. Se muestra el aumento de la altura máxima de PTH mono-oxidada y di -oxidada.

Figura 4. Un cromatograma de PTH tratada con AAPH, se muestran los picos predominantemente Trp[0]-PTH. Reacción a 40° C, y las muestras se retiraron a las 2, 4 y 6 horas.

Figura 5. Estructuras químicas del triptóf no degradado (oxidación) . Sus masas se denotan, como +4, +16 y +32.

Figura 6. Cromatograma rp-HPLC de la solución oxidada de PTH por AAPH, H202 más hierro, y H202. La reacción se lleva a cabo a 40° C, 6 horas. Las muestras estaban con o sin adición de 2 mg/ml de metionina libre.

Figura 7. Cromatograma rp-HPLC de la solución oxidada de PTH por AAPH, H202 más hierro, y H202. La reacción se lleva a cabo a 40° C, 6 horas. Las muestras estaban con o sin adición de 15% de manitol o 6% de sacarosa.

Figura 8. Cromatograma rp-HPLC de la solución oxidada de PTH por AAPH, H202 más hierro, y H202. La reacción se lleva a cabo a 40° C, 6 horas. Las muestras estaban con o sin adición de EDTA mg/ml .

Figura 9. Cromatograma rp-HPLC de la solución oxidada de PTH por AAPH, H202 más hierro, y H202. La reacción se lleva a cabo a 40° C, 6 horas. Las muestras estaban con o sin adición de triptófano libre a 2 mg/ml.

Figura 10. Cromatograma rp-HPLC de la solución oxidada de PTH por AAPH, H202 más hierro, y H202. La reacción se lleva a cabo a 40° C, 6 horas. Las muestras estaban con o sin adición de metionina y triptófano libre, ambos a 2 mg/ml.

Figura 11. Gráfico de los datos que muestran la oxidación sitio específico de la PTH por AAPH y las funciones de protección diferente del Trp y Met en comparación con otros reactivos. La identificación de la oxidación de los residuos individuales Trp23, Met8 y etl8 se asignó sobre la base de los espectros de fragmentación S/MS de sus péptidos trípticos correspondientes. El nivel de oxidación relativa se cuantificó sobre la base de los cromatogramas integrados de los iones extraídos de péptidos oxidados y no oxidados.

Figura 12. Gráfico de los datos que muestran la oxidación específica del sitio de la PTH por H202/Fe y las funciones de protección diferente del Trp y Met en comparación con otros reactivos. La identificación de la oxidación de los residuos individuales Trp23, Met8 y Metl8 se asignó sobre la base de los espectros de fragmentación MS/MS de sus péptidos trípticos correspondientes. El nivel de oxidación relativa se cuantificó sobre la base de los cromatogramas integrados de los iones extraídos de péptidos ; oxidados y no oxidados .

Figura 13. Cromatograma IEC de diversas muestras de anti-VEGF. H202 no generó ninguna especie oxidativa en la región de base, AAPH si. Los picos de base fueron prominentes en el lote de calificación cuando se usó un lote malo de Tween.

Figura 14. IEC del anticuerpo anti-VEGF cuando se oxida por AAPH (sin Trp) , a continuación, 2 o 10 mg/ml de Trp libre se añadió a la formulación. AcM oxidado eluyó en la región de base. Estos picos de base se redujeron a la línea de base con la adición de Trp.

Figura 15. Cromatograma rp-HPLC de la solución oxidada de PTH por AAPH, H202 más hierro, y H202. La reacción se lleva a cabo a 40° C, 6 horas. Las muestras estaban con o sin adición de Trolox libre (ácido 6-hidroxi-2, 5, 7, 8- tetrametilcroman-2-carboxílico; un derivado de vitamina soluble en agua) a 2 mg/ml.

Figura 16. Cromatograma rp-HPLC de la solución oxidada dé PTH por AAPH, H02/ además de hierro, y H202. La reacción se lleva a cabo a 40° C, 6 horas. Las muestras estaban con o sin adición de piridoxina libre (comúnmente conocida como la vitamina B6) a 2 mg/ml .

Descripción Detallada de la Invención Definiciones La inestabilidad química de las proteínas puede implicar la ruptura o formación de enlaces covalentes con la estructura primaria de la proteína. Se han reportado varias reacciones de oxidación en las proteínas. En medio alcalino o neutro, los residuos de los aminoácidos cisteína, histidina, metionina, triptófano y tirosina son especialmente propensos a la oxidación. En condiciones de acidez, sin embargo, la metionina es sensible. A menudo, las reacciones de oxidación causan una gran pérdida en la actividad biológica e incluso en la inmunogenicidad. La presente invención se refiere principalmente a las composiciones y los métodos mejorados para la protección de las proteínas contra el daño debido a la oxidación. Las composiciones contienen una o más proteínas sensibles a la oxidación formuladas junto con uno o más compuestos aromáticos para reducir eficazmente la oxidación mediada por los radicales libres que típicamente causan la oxidación de los residuos de tirosina, triptófano, o histidina .

Debido a que la aromaticidad (como se ejemplifica en los anillos aromáticos de las purinas y pirimidinas en nucleótidos o, específicamente, indol en el aminoácido triptófano) puede deslocalizar el electrón extra cuando un compuesto aromático reacciona con un radical libre, el producto se estabiliza por deslocalización electrónica. En consecuencia, se favorece la reacción entre los compuestos aromáticos y los radicales libres. El resultado neto es que el radical libre es absorbido por el compuesto aromático, y es incapaz de hacer daño a otras moléculas. Por esta razón, los compuestos aromáticos, cuando se añaden como excipientes de la formulación, sirven como agentes eficaces para neutralizar los efectos dañinos oxidativos de los radicales libres .

Dos clases principales de compuestos aromáticos que son fisiológicamente compatibles son los nucleótidos y los aminoácidos . Dado que estos compuestos son componentes naturales de la química del cuerpo, ellos tienen perfiles de seguridad favorable y son adecuados para ser usados como excipientes de productos parenterales. La metionina libre se usa sistemáticamente como un antioxidante y se puede encontrar en una serie de productos parenterales comercializados. Sin embargo, este aminoácido por sí solo no protege contra todos los mecanismos de oxidación y es más eficaz en la inhibición de la oxidación nucleofílica de los residuos metionina o cisteína. También es bien sabido que el ADN es muy susceptible al daño por radicales libres, un hecho que apoya el uso de derivados del ácido nucleico para reaccionar favorablemente con los radicales libres. Hasta la fecha, poco se sabe acerca del uso de derivados del ácido nucleico como excipientes de formulaciones y ningún producto en el mercado usa ácido nucleico como excipiente de las formulaciones .

En un aspecto de la invención, las composiciones de la presente invención típicamente contienen aminoácido aromático seleccionado del grupo que consiste en triptófano, histidina, tirosina y fenilalanina . El aminoácido aromático preferido para mitigar la oxidación a través de alquilperóxidos , los cuales a menudo son generados a partir de tensioactivos degradados, es triptófano o su derivado sódico, N-acetil triptofanato . Cuando los derivados de la metionina o la metionina se agregan a la formulación, la oxidación nucleofílica de la metionina o cisteína también se puede inhibir. Por lo tanto, una combinación de triptófano libre y metionina inhibe eficazmente múltiples mecanismos de oxidación. Las composiciones en donde el triptófano está presente en la formulación, normalmente contienen una cantidad que se encuentra en el intervalo de 2 - 10 mg/ml . En una modalidad, la invención se refiere a una formulación farmacéutica que comprende un agente biológicamente activo formulado (por ejemplo, en forma de un preparado, tal como una composición con calidad de laboratorio o farmacéutica) con triptófano solo o en combinación con uno o más aminoácidos aromáticos adicionales y metionina. Una combinación preferida es la de los aminoácidos triptófano y metionina que juntos protegen eficazmente contra todos los mecanismos más comunes de oxidación de las proteínas.

En otro aspecto de la invención, las composiciones de la presente invención también pueden comprender nucleótidos 'libres o análogos de la misma. Derivados de ácidos nucleicos se pueden añadir a las formulaciones parenterales de proteínas y péptidos, individualmente o en combinación con metionina. Las formulaciones en donde uno o más nucleótidos libres están presentes como estabilizadores suelen contener una cantidad que se encuentra en el intervalo de 0.1 a 10 mg/ml . En una modalidad particular, uno o más nucleótidos libres se combinan con uno o más aminoácidos libres aromáticos. Una modalidad preferida comprendería nucleótidos libres combinados con metionina.

, En otro aspecto de la invención, las composiciones de la presente invención también pueden comprender derivados de vitamina como Trolox (ácido 6-hidroxi-2, 5, 7, 8- tétrametilcroman-2-carboxílico, un derivado de vitamina soluble en agua) y la piridoxina (comúnmente conocida como vitamina B6) . En una modalidad particular, uno o más derivados de la vitamina se combinan con uno o más aminoácidos aromáticos libres. Una modalidad preferida comprendería derivados de la vitamina combinada con metionina .

Las composiciones de la presente invención pueden contener uno o más agentes que neutralizan los radicales libres de oxígeno (es decir, un depurador de ROS) . Los depuradores de ROS apropiados incluyen, por ejemplo, manitol, metionina y/o histidina. Por lo tanto, en otra modalidad, la invención proporciona una composición que contiene una o más proteínas formuladas junto con un aminoácido aromático, y uno o más depuradores de ROS, tales como manitol, metionina y/o histidina. Los agentes quelantes de metales, tales como EDTA, también se pueden usar, ya que pueden inhibir el inicio de la generación de ROS.

Las composiciones de la presente invención también pueden incluir uno o más agentes que inhiben la agregación de proteínas. En una modalidad particular, el agente se selecciona de TWEEN, polisorbato 80, polisorbato 20, polímeros de glicerol y poloxámero. Las composiciones pueden incluir, además, un tampón que mantenga el pH de la composición preferentemente de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0. Los tampones adecuados incluyen, por ejemplo, histidina, Tris, acetato, MES, ácido succínico, PIPES, Bis-Tris, MOPS, ACES, BES, TES, HEPES, EPPS, etilendiamina, ácido fosfórico y ácido maleico. Las composiciones pueden contener también modificadores de la tonicidad tales como cloruro de sodio, sales de arginina, etc .

Los "tensioactivos" son moléculas con regiones polares y no polares bien definidas, las que les permiten agregarse en solución para formar micelas. En dependencia de la naturaleza de la zona polar, los tensioactivos pueden ser no iónicos, aniónicos, catiónicos y anfotéricos. La mayoría de los tensioactivos parenterales aceptables no iónicos provienen de los grupos polisorbato o poliéter. Los Polisorbatos 20 y 80 son estabilizadores tensioactivos contemporáneos en las formulaciones de proteína comercializadas.

Los peróxidos son conocidos contaminantes de los tensioactivos no iónicos. Los peróxidos en los polisorbatos pueden dar lugar a la degradación oxidativa de las proteínas. Los formuladores tienden a seleccionar las fuentes de polisorbatos y otros aditivos poliméricos en formulaciones de proteínas por la contaminación con peróxido y establecen las especificaciones de peróxido para el uso del aditivo. Por otra parte, la incorporación de un antioxidante se usa para ayudar a superar el potencial de los tensioactivos no iónicos para servir como catalizadores de oxidación de las proteínas sensibles al oxígeno.

Cualquier proteína adecuada o polipéptido de interés que es susceptible a la oxidación se puede proteger y, por tanto, estabilizar de acuerdo con la presente invención (es decir, se pueden formular en una composición protegida de oxidación como se describe en la presente) . La proteína puede, estar en su forma natural (por ejemplo, nativa) , o puede estar : modificada, por ejemplo, microencapsulación o conjugación. La proteína puede ser terapéutica o de diagnóstico. Estas proteínas incluyen, por ejemplo, inmunoglobulinas , péptidos, proteínas y análogos de los mismos contra el daño oxidativo.

Además, las proteínas de varias subunidades, como los anticuerpos, que son particularmente susceptibles al daño oxidativo, a la agregación de proteínas y a la descomposición, que los hacen diagnóstica y terapéuticamente no funcionales, pueden ser protegidos de acuerdo con la presente invención. En una modalidad particular, la invención proporciona composiciones de anticuerpos protegidas (es decir, estabilizadas) , como las que contienen uno o más anticuerpos monoclonales , que incluyen anticuerpos totalmente humanos, así como fragmentos de los mismos e inmunoconjugados (es decir, anticuerpos conjugados a agentes terapéuticos, por ejemplo, como una toxina, un polímero, un agente para imagen o un fármaco) .

Mientras que las modalidades preferidas de la invención se relacionan con las composiciones y métodos para proteger las proteínas contra el daño debido a la oxidación, el agente biológicamente activo también puede ser seleccionado entre el grupo que consiste de péptidos, moléculas pequeñas, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, lípidos, proteínas, anticuerpos y/o análogos de los mismos.

En la presente, los intervalos numéricos o cantidades, precedidos de la expresión "aproximadamente" incluyen expresamente el intervalo exacto o la cantidad numérica exacta .

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en forma tal que permita que la actividad biológica del principio activo sea eficaz, y no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente tóxicos a un sujeto al que la formulación se administraría.

Un anticuerpo posee "actividad biológica" en una formulación farmacéutica, si la actividad biológica de los anticuerpos en un momento dado está aproximadamente dentro del 10% (dentro de los errores de la prueba) de la actividad biológica exhibida en el momento en que la formulación farmacéutica se preparó, determinada por la capacidad de los anticuerpos de unirse in vitro o in vivo a antígenos y provocar una respuesta biológica medible.

Una formulación "estable" es aquélla en la que la proteína en ella conserva su esencia física y/o estabilidad química durante el almacenamiento. La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada para un período de tiempo seleccionado. Preferiblemente, la formulación es estable a temperatura ambiente (~ 30° C) o a 40° C al menos durante 1 mes y/o estable a aproximadamente 2-8° C durante al menos 1 año y preferiblemente durante al menos 2 años. Por ejemplo, el grado de agregación durante el almacenamiento puede ser usado como un' indicador de la estabilidad de las proteínas. Por lo tanto, una formulación "estable" puede ser una en donde menos de aproximadamente un 10% y preferentemente menos de aproximadamente un 5% de la proteína está presente como un agregado en la formulación. Existen en la técnica diversas técnicas de análisis para medir la estabilidad de proteínas y son revisadas, por ejemplo, en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed. , Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Pubs . (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993).

El término "solución acuosa" se refiere a una solución en la que el agua es el medio de disolución o disolvente. Cuando una sustancia se disuelve en un líquido, la mezcla se denomina una solución. La sustancia disuelta es el soluto, y el líquido que hace la disolución (en este caso el agua) es el disolvente.

Por "inhibición" de la oxidación se entiende cómo prevenir, reducir o disminuir la cantidad de oxidación, medida en comparación con la cantidad de oxidación presente en una solución que contiene proteína que comprende al menos un inhibidor de la oxidación con la cantidad de oxidación presente en una solución que contiene proteína que no comprenden al menos un inhibidor de la oxidación.

Una proteína o anticuerpo "oxidado" en la presente es aquella en la cual uno o más residuos de aminoácidos de éste se oxidaron.

Una proteína o un anticuerpo que es "susceptible a la oxidación" es uno que comprende uno o más residuos propensos a la oxidación.

Los métodos que pueden encontrar uso en la presente invención para la medición de la oxidación de las proteínas ¡incluyen la electroforesis en gel, enfoque isoeléctrico, electroforesis capilar, cromatografía, como la cromatografía de exclusión por tamaño, la cromatografía de intercambio iónico, y la cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa, mapeo de péptidos, mapeo de oligosacáridos , espectrometría de masa, espectroscopia de absorción ultravioleta, la espectroscopia de fluorescencia, espectroscopia de dicroísmo circular, calorimetría de titulación isotérmica, calorimetría diferencial de barrido, últra-centrifugación analítica, dispersión de luz dinámica, proteólisis, reticulación, medición de la turbidez, ensayos de retraso de filtro, ensayos inmunológicos , ensayos de unión a tinte fluorescente, ensayos de tinción de proteínas, microscopía, y otros ensayos de unión.

Por "polipéptido" o "proteína" se entiende una secuencia de aminoácidos para el cual la longitud de la cadena es suficiente para producir los niveles más altos de estructura terciaria y/o cuaternaria. Por lo tanto, las proteínas se distinguen de los "péptidos", que también son moléculas que : se basan en aminoácidos que no tienen tal estructura.

La proteína que se formula es preferentemente, en esencia, pura y deseable, en esencia, homogénea (es decir, libre de proteínas contaminantes) . Una proteína "en esencia pura" significa una composición que comprende al menos aproximadamente 90% en peso de la proteína, basada en el peso total de la composición, preferentemente al menos aproximadamente 95% en peso. Una proteína "en esencia homogénea" significa una composición que comprende al menos aproximadamente 99% en peso de proteínas, basada en el peso total de la composición.

En ciertas modalidades, la proteína es un anticuerpo. El anticuerpo en la presente se dirige contra una "antígeno" de interés. Preferentemente, el antígeno es una proteína biológicamente importante y la administración del anticuerpo a un mamífero que sufre una enfermedad o trastorno puede dar lugar a un beneficio terapéutico en ese mamífero. Sin embargo, los anticuerpos dirigidos contra antígenos no proteicos (como antígenos glicolípidos asociados a tumores, ver la patente de los Estados Unidos 5,091,178) también se contemplan. Cuando el antígeno es una proteína, puede ser. una molécula transmembrana (por ejemplo, el receptor) o ligando tal como un factor de crecimiento. Los antígenos ejemplares incluyen aquellas proteínas discutidas arriba. Las dianas moleculares preferidas de los anticuerpos que abarca la presente invención incluyen polipéptidos CD tales como CD3 , CD4, CD8 , CD19, CD20, CD34 y CD40, los miembros de la familia del receptor HER tal como el receptor de EGF (HERI), HER2 , HER3 o HER4 , moléculas de adhesión celular, tales como LFA-1, , Macl, pl50, 95, VLA-4, ICAM-1, VCA y la integrina av/b3 que .incluye tanto subunidades a o b de la misma (por ejemplo, anticuerpos anti-CDlla, anti-CD18 o anti-CDllb) , receptor de ,macrófagos tal como CRIg, factores de necrosis tumoral como TRAIL/Apo-2, factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) ; IgE, antígenos de grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB) ; receptor mpl; CTLA-4, polipéptido C, etc. Otras proteínas ejemplares incluyen la hormona del crecimiento GH) , que incluye la hormona del crecimiento humano (hGH) y ía hormona de crecimiento bovina (BGH) , el factor de liberación de la hormona de crecimiento; la hormona paratiroidea, hormona estimulante de la tiroides, lipoproteínas ; a-l-antitripsina, cadena A de la insulina, cadena B de insulina, proinsulina, hormona folículo estimulante, calcitonina, hormona luteinizante , glucagón, factores de coagulación como el factor VIIIC, factor, factor tisular y el factor de von Willebrand, factores anticoagulantes tales como la proteína C, factor natriurético auricular, tensioactivo pulmonar, un activador del plasminógeno, tal como urocinasa o activador del plasminógeno tisular (t-PA) ; bombasina, trombina, factor de necrosis tumoral a y b; encefalinasa ; A TES (regulado en la activación de células T normalmente expresadas y secretadas) , proteína inflamatoria de los macrófagos humanos (???-1-a) , albúmina de suero como la albúmina sérica humana (HSA) , sustancia inhibidora de Müller; cadena A de conformidad con la relaxina; cadena B de conformidad con la relaxina; prorelaxin; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; ;DNasa, inhibina, activina, receptores de hormonas o factores de crecimiento, una integrina, proteína A o D, factor reumatoide, un factor neurotrófico como el factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF) , neurotrofina-3 , -4 , -5, ó -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso, tal como NGF-b, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento de fibroblastos, tal como aFGF y bFGF, factor de crecimiento épidérmico (EGF) , factor de crecimiento transformante (TGF) , como el TGF-a y TGF-b, incluyendo el TGF-bl, TGF-b2, TGF-b3, el TGF-b4, o TGF-b5; factor de crecimiento insulínico tipo I y II (IGF-I e IGF-II); des (1-3) -IGF-I (IGF-I de cerebro), proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, (IGFBP) , eritropoyetina (EPO) , trombopoyetina (TPO) , factores osteoinductivos ; inmunotoxinas ; una proteína morfogenética ósea (BMP) , un interferón como el interferón-a , -b, y -g, factores estimulantes de colonias (CSF) , por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF, interleucinas (ILS) , por ejemplo, la IL-1 a IL-10, la superóxido dismutasa, receptores de células T, las proteínas de superficie de la membrana; factor de aceleración del decaimiento (DAF) , un antígeno viral como, por ejemplo, una parte de la capside del SIDA; proteínas de transporte; receptores mensajeros; adresinas; proteínas reguladoras; inmunoadhesinas , anticuerpos y fragmentos biológicamente activos o variantes de cualquiera de los polipéptidos antes mencionados. Muchos otros anticuerpos y/u otras proteínas pueden ser usados de conformidad con la presente invención, y la lista anterior no está destinada a ser limitante.

Los antígenos solubles o fragmentos de los mismos, opcionalmente , conjugados con otras moléculas, pueden ser usados como inmunógenos para la generación de anticuerpos. Para moléculas transmembrana, tales como receptores, fragmentos de éstos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) se pueden usar como inmunógenos. Por otra parte, las células que expresan la molécula transmembrana se puede usar como inmunógeno. Estas células se pueden derivar de una fuente natural (por ejemplo, líneas celulares de cáncer) o pueden ser las células que se transformaron por técnicas recombinantes para expresar la molécula de transmembrana.

Los ejemplos de anticuerpos que se formulan en la presente incluyen, pero no se limitan a: anticuerpos HER2 que incluye trastuzumab (HERCEPTIN®) (Cárter y otros, Proc . Nati. ; Acad. Sci. Estados Unidos, 89:4285-4289 (1992), patente de Estados Unidos núm. 5,725,856) y pertuzumab (OM ITARG™) (WO 01/00245) ; anticuerpos CD20 (véase más adelante) ; anticuerpos IL-8 (St John y otros, Chest, 103:932 (1993), y publicación internacional núm. WO 95/23865); VEGF o anticuerpos del receptor de VEGF incluyendo el anticuerpo humanizado y/o el anticuerpo VEGF madurado por afinidad tal como el anticuerpo humanizado VEGF huA4.6.1 bevacizumab (AVASTIN®) y ranibizumab (LUCENTIS ®) (Kim y otos, Growth Factors, 7:53-64 (1992), publicación internacional núm. WO 96/30046, y WO 98/45331, publicado el 15 de octubre 1998) ; anticuerpos PSCA (WO 01/40309) ; anticuerpos CDlla que incluyen efalizumab (RAPTIVA®) (patente de los Estados Unidos núm. 6,037,454, patente de los Estados Unidos núm 5,622,700, WO 98/23761, Stoppa y otros, Transplant Intl. 4:3-7 (1991), y Hourmant y otros, Transplantation 58:377-380 (1994)); anticuerpos que se unen a IgE que incluyen omalizumab (XOLAIR ®) (Presta y otros, J. Immunol 151:2623-2632 (1993), y publicación internacional núm. W095/19181; patente de los Estados Unidos núm. 5,714,338, concedida el 03 de febrero de 1998 o la patente de los Estados Unidos núm. 5,091,313, concedida el 25 de febrero de 1992, WO 93/04173 publicada el 04 de marzo de 1993, o la solicitud internacional núm. PCT/US98/13410 presentada el 30 de junio de 1998, patente de los Estados Unidos núm. 5,714,338) ; anticuerpos CD18 (patente de los Estados Unidos núm. 5,622,700, concedida el 22 de abril de 1997, o como en WO 97/26912, publicada el 31 de julio de 1997) ; anticuerpos anti receptor de Apo-2 (WO 98/51793 publicada el 19 de noviembre de 1998) ; anticuerpos de factor tisular (FT) (patente europea núm. 0 420 937 concedida el 09 de noviembre de 1994) Bl; anticuerpos integrina a4 , -ot7 (WO 98/06248 publicada el 19 de febrero de 1998) ; anticuerpos EGFR (por ejemplo, anticuerpo 225 quimerizado o humanizado, cetuximab, ERBUTIX O como en WO 96/40210 publicada 19 de diciembre de 1996); anticuerpos CD3 tal como OKT3 (patente de los Estados Unidos núm. 4,515,893 concedida el 07 de mayo de 1985) ; anticuerpos CD25 o Tac tal como CHI-621 (SIMULECT®) y ZENAPAX® (Véase la patente de los Estados Unidos núm. 5,693,762 concedida el 2 de diciembre de 1997); anticuerpos CD4 tal como el anticuerpo cM-7412 (Choy y otros, Arthritis Rheum 39(l):52-56 (1996)); anticuerpos CD52, tales como CAMPATH- 1H ( ILEX/Berlex) (Riechmann y otros, Nature 332:323-337 (1988)); anticuerpos del receptor Fe, tales como el anticuerpo 22 dirigido contra Fe RI ( como en Graziano y otros, J. Immunol . 155 (10) : 4996-5002 (1995)); el antígeno carcinoembrionario (CEA) anticuerpos tales como hMN-14 (Sharkey y otros, Cáncer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995) ) ; anticuerpos dirigidos contra células epiteliales de las mamas que incluye huBrE-3, hu-Mc 3 y CHL6 (Ceriani y otros, Cáncer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995), y Richman y otros, Cáncer Res. 55(23 Supp) : 5916s-5920s (1995)); ; anticuerpos que se unen a las células de carcinoma de colon tales como el C242 (Litton y otros, Eur J. Immunol . 26(1) :l-9 : (1996)); anticuerpos CD38, por ejemplo, A 13/5 (Ellis y otros, J Immunol. 155 (2) : 925-937 (1995)); anticuerpos CD33 tal como HuM195 (Jurcic y otros, Cáncer Res 55(23 Suppl) :5908s-5910s (1995)) y CMA-676 o CDP771; anticuerpos EpCAM tales como 17-1A (PANOREX®) ; anticuerpos GpIIb/lIIa tales como abciximab o c7E3 Fab (REOPRO®) ; anticuerpos contra el RSV tales como MEDI-493 (SYNAGIS®) ; anticuerpos CMV, tales como PROTOVIR®; anticuerpos VIH como PR0542; anticuerpos de hepatitis tales como el anticuerpo Hep B OSTAVIR®; anticuerpo CA125 que incluye anti-MUC16 (WO 2007/001851; Yin, B T y Lloyd, KO, J. Biol.. Chem. 276:27371-27375 (2001)) y OvaRex; ánticuerpo idiotípico BEC2 epítopo GD3 ; anticuerpo a?ß3 (por ejemplo, VITAXIN®; Medimmune) ; anticuerpos de carcinoma de células renales humanos tal como ch-G250; ING-1, anti-humano 17-1. Un anticuerpo (3622W94); anticuerpo anti-tumor colorrectal humano (A33); anticuerpo anti -melanoma humano R24 dirigido contra el gangliósido GD3 , el anti-carcinoma de células escamosas humano (SF-25) ; anticuerpo antígeno leucocitario humano (HLA) , tales como anticuerpo Smart ID10 y el anti-HLA DR Oncolym (Lym-1) ; anticuerpo CD37 tal como TRU 016 (Trubion) ; anticuerpo IL-21 (ZymoGenetics/Novo Nordisk) , anticuerpo anti-células B (Impheron) ; MAb de orientación a células B ( Immunogen/Aventis) ; 1D09C3 (MorphoSys/GPC) ; : LymphoRad 131 (HGS) ; anticuerpo Lym-un, tal como Lym-lY-90 (USO o anti-Lym-1 Oncolym (USC/Peregrine) ; LIF 226 (Enhanced Lifesci) ; anticuerpos BAFF (por ejemplo, WO 03/33658); anticuerpos receptor BAFF (véase, por ejemplo, WO 02/24909); anticuerpo BR3 , anticuerpo BLyS tal como belimumab; LYMPHOSTAT-B™ ; ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen) ; gomilixima (Idee 152; Biogen Idee), anticuerpo receptor de IL-6 tal como atlizumab (ACTEMRA™ ; Chugai/Roche) , anticuerpo IL-15 tal como el anticuerpo HuMax-Il-15 (Genmab/Amgen) ; anticuerpo del receptor de quimiocinas, tal como un anticuerpo CCR2 (por ejemplo, MLN1202; Millieneum) ; anticuerpo anti-complemento, tal como el anticuerpo C5 (por ejemplo, eculizumab 5G1.1 ; Alexion) ; formulación oral de inmunoglobulina humana (por ejemplo, IgPO; Protein Therapeutics) ; anticuerpo IL-12 tal como el ABT-874 (CAT/Abbott) ; Teneliximab (BMS-224818, BMS) , anticuerpos CD40, que incluyen S2C6 y variantes humanizadas del mismo (WO 00/75348) y TNX 100 (Chiron/Tanox) ; anticuerpos TNF-OÍ que incluyen cA2 o infliximab (REMICADE®) , CDP571, MAK- 195, el adalimumab (HUMIRA™) , fragmento de anticuerpo TNF- pégilado tal como el CDP-870 (Celltech) , D2E7 (Knoll) , anticuerpo policlonal anti-TNF-a (por ejemplo, PassTNF; Verigen) ; anticuerpos CD22 tales como LL2 o epratuzumab (LYMPHOCIDE® ; Immunomedics) , que incluye epratuzumab Y- 90 y epratuzumab 1-131, el anticuerpo de Abiogen CD22 (Abiogen, Italia) , CMC 544 (Wyeth/Celltech) , combotox (UT Soutwestern) , BL22 (NIH) y LympoScan Tc99 (Immunomedics) , así como, beta anti-amiloide (Abeta) , anti-CD4 (MTRX1011A) , anti -EGFL7 (dominio 7 similar a EGF) , anti-IL13, Apomab (agonista del receptor pro-apoptótico orientado a anti-DR5 (PARA) , anti-BR3 (CD268, receptor BLyS 3, BAFF-R, receptor BAFF) , contra la subunidad beta 7 de integrina, dacetuzumab (anti-CD40) , GA101 (anticuerpo monoclonal anti-CD20) , MetMAb (anti-MET receptor de la tirosina cinasa) , anti-neuropilina-1 (NRP1) , ocrelizumab (anticuerpo anti-CD20) , anti-ligando 0X40, anti-LDL oxidadas (LDLox) , pertuzumab (inhibidores de la dimerización de HER (IDHs) , y rhuMAb IFN alfa.

Los ejemplos de anticuerpos anti-CD20 incluyen: "C2B8," que ahora se llama "rituximab" ( "RITUXAN ®") (patente de los Estados Unidos núm. 5,736,137), el anticuerpo murino 2B8 marcado con itrio- [90] designado "Y2B8" o "Ibritumomab Tiuxetan" (ZEVALIN®) disponible en el mercado por IDEC Pharmaceuticals, Inc. (patente de los Estados Unidos núm. 5,736,137; 2B8 depositado con la ATCC con el núm. de acceso HB11388 el 22 de junio de 1993.); la IgG2a murina "B1 " , también llamado "Tositumomab" opcionalmente marcado con 131I para generar el anticuerpo "1311 -Bl" o "iodo 1131 tositumomab" (BEXXAR™) disponible en el mercado por Corixa (véase, también, la patente de los Estados Unidos núm. 5,595,721); anticuerpos monoclonales murinos "1F5" (Press y , otros, Blood 69 (2) : 584-591 (1987)) y variantes del mismo, que incluyen "región de marco de parches" o 1F5 humanizado ( O 2003/002607, Leung, S.; ATCC depósito HB-96450); anticuerpos ', 2H7 murino y 2H7 quimérico (patente de los Estados Unidos núm. 5,677,180); 2H7 humanizado (WO 2004/056312, Lowman y otros) . 2F2 (HuMax-CD20) , un anticuerpo totalmente humano, de alta afinidad dirigido a la molécula CD20 en la membrana ;celular de las células B. (Genmab, Dinamarca, véase, por ejemplo, Glennie y van de inkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) y Cragg y otros, Blood 101: 1045-1052 (2003); WO 2004/035607; US 2004/0167319); los anticuerpos monoclonales humanos establecidos en el documento WO 2004/035607 y US2004/0167319 (Teeling y otros) ; . los anticuerpos que tienen cadenas de azúcares enlazadas a N- glucósido complejas unidas a la región Fe se describen en US 2004/0093621 (Shitara y otros) ; anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión al antígeno que se unen a CD20 (WO 2005/000901, Tedder y otros), como HB20-3, HB20-4, HB20-25, y MB20-11; moléculas de unión a CD20 tal como la serie de anticuerpos AME, por ejemplo, anticuerpos AME 33 como se establece en el documento WO 2004/103404 y US 2005/0025764 ( atkins y otros, Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, AME.); moléculas de unión a CD20 tales como las descritas en ; US 2005/0025764 (Watkins y otros) ; anticuerpo A20 o variantes ; del mismo tales como anticuerpo A20 quimérico o humanizado 1 (cA20, hA20, respectivamente) o IMMU-106 (US 2003/0219433, Immunomedics) ; anticuerpos de unión a CD20, que incluyen epítopo-agotado-Leu- 16 , 1H4 , o 2B8, opcionalmente conjugado con IL-2, como en US 2005/0069545A1 y WO 2005/16969 (Carr y 1 otros) ; anticuerpos biespecifieos que se unen a CD22 y CD20 , por ejemplo, hLL2xhA20 ( WO 2005/14618, Chang y otros), 'anticuerpos monoclonales L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl o NU-B2 disponible en el Taller Internacional de Tipaje de Leucocitos (Valentine y otros, In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed. , p. 440, Oxford University Press (1987));1H4 (Haisma y otros, Blood 92:184 (1998.)); anti-CD20 auristatin E conjugado (Seattle Genetics) , anti-CD20-IL2 (EMD/Biovation/City of Hope) , terapia de anticuerpo monoclonal anti-CD20 (EpiCyte) , anticuerpo anti-CD20 TRU 015 (Trubion) .

El término "anticuerpo" que se usa en este documento incluye anticuerpos monoclonales (que incluye los anticuerpos de larga duración que tienen una región Fe de inmunoglobulina) , las composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, los anticuerpos biespecificos , diacuerpos, y las moléculas de cadena sencilla, así como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab')2, y Fv) . El término " inmunoglobulina (Ig) se usa en la presente indistintamente con "anticuerpo" .

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son \ idénticos salvo por posibles mutaciones de origen natural y/o ¡modificaciones post-traducción (por ejemplo, isomerizaciones , ; amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, se dirigen contra un sitio antigénico. Además, a diferencia de los anticuerpos convencionales (policlonal) , que suelen incluir distintos anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un factor determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales tienen la ventaja de que son sintetizados mediante el cultivo del hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas . El modificador "monoclonal" indica el carácter de los anticuerpos que se obtienen de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se interpretará como una exigencia de la producción de anticuerpos por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usan de acuerdo con la presente invención pueden ser hechos por el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y otros, Nature, 256: 495 (1975), o se pueden hacer por métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Pat . de los Estados Unidos núm. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales " , también se ; ueden aislar de las bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas, por ejemplo, en Clackson y ¡ otros, Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y otros, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).

Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de una especie en particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es (son) idéntica (s) u homologas a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de estos anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada (Pat de los Estados Unidos núm. 4,816,567; Morrison y otros, Proc Nati. Acad. Sci. Estados Unidos, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "primatizados " que comprenden secuencias de unión al antígeno en el dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, Oíd World Monkey, Ape, etc.) y secuencias humanas de región constante .

El término "anticuerpo terapéutico" se refiere a un anticuerpo que se usa en el tratamiento de la enfermedad. Un anticuerpo terapéutico puede tener varios mecanismos de acción. Un anticuerpo terapéutico puede unirse y neutralizar la función normal de una diana asociada a un antígeno. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que bloquea la actividad de la proteína necesaria para la supervivencia de una célula de cáncer causa la muerte de la célula. Otro anticuerpo monoclonal terapéutico puede unirse y activar la función normal de una diana asociada a un antígeno. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal puede unirse a una proteína en una célula y desencadenar una señal de apoptosis. Sin embargo, otro anticuerpo monoclonal puede enlazar a un antígeno diana que se expresa sólo en el tejido enfermo; la conjugación de una carga tóxica (agente eficaz) , como un agente quimioterapéutico o radiactivo, con los anticuerpos monoclonales puede crear un agente para la entrega específica de la carga tóxica al tejido enfermo, lo cual reduce los daños al tejido sano. Un "fragmento biológicamente funcional" de un anticuerpo terapéutico presentará al menos una, si no todas o algunas de las funciones biológicas atribuidas a los anticuerpos intactos, la función comprende al menos la unión específica al antígeno diana.

Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende un sitio de unión al antígeno, así como una CL y por lo menos los dominios, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios nativos de secuencia constante (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o secuencias de aminoácidos variantes de los mismos. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

, Un "fragmento de anticuerpo" abarca una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente el de unión al antígeno y/o el de conformidad con la región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', (Fab')2 y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (véase pat . de los Estados Unidos núm. 5,641,870, Ejemplo 2; Zapata y otros, Protein Eng. 8(10): 1057-1062

[1995] ) ; moléculas de anticuerpos de una sola cadena y anticuerpos multiespecífieos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Un "fragmento biológicamente funcional" de un anticuerpo comprende sólo una parte de un anticuerpo intacto, en donde la porción conserva al menos una, y tantas como la mayoría o todas las funciones que normalmente se asocian con la porción cuando está presente en un anticuerpo intacto. En una modalidad, un fragmento biológicamente funcional de un anticuerpo comprende un sitio de unión al antígeno del anticuerpo intacto y por lo tanto mantiene la capacidad de unión al antígeno. En otra modalidad, un fragmento biológicamente funcional de un anticuerpo, por ejemplo uno que comprende conformidad con la región Fe, conserva al menos una de las funciones biológicas que normalmente se asocian con la región Fe cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como la unión a FcRn, la modulación, la vida media del anticuerpo, la función ADCC y la unión del complemento. En una modalidad, un fragmento biológicamente funcional de un anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una vida media in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, tal fragmento biológicamente ifuncional de un anticuerpo que puede comprender un brazo de unión al antígeno unido con una secuencia de Fe capaz de Conferir estabilidad in vivo al fragmento.

Las formas "humanizadas", de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de éstas (tales como Fv, Fab, Fab 1 , F(ab')2 u otros subsecuencias de anticuerpos de unión al antígeno) secuencias en su mayoría humanas, las cuales contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en el que los residuos de una región hipervariable (también CDR) del receptor se sustituyen por los residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) , tales como ratón, rata o conejo, que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos ; Fv de conformidad con la región de marco (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituye por los correspondientes residuos no-humanos. Además, "los anticuerpos humanizados" ; como se usan en la presente también comprenden residuos que no se encuentran ni en el aríticuerpo receptor ni en el -anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para perfeccionar . y optimizar el rendimiento de los anticuerpos. El anticuerpo humanizado óptimo también comprenderá al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente, de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, ver Jones y otros, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann y otros, Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct . Biol . , 2:593-596 (1992).

"Aislado" cuando se usa para describir los diferentes polipéptidos y anticuerpos divulgados en la presente, significa un polipéptido o anticuerpo identificado, separado y/o recuperado de un componente de su entorno de producción. Preferentemente, el polipéptido aislado está libre de asociación con todos los demás componentes de su entorno de producción. Los componentes contaminantes de su entorno de producción, tales como los que resultan de células récombinantes transíectadas , son materiales que normalmente interfieren con los usos de diagnóstico o terapéutico para el polipéptido, y puede incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En modalidades preferidas, el polipéptido se purificará (1) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos interna o N-terminal o mediante el uso de un secuenciador de j taza rotatoria, o (2) para la homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones de no reducción o de reducción y se usa Coomassie azul o, preferentemente, la tinción de plata. Por lo general, sin embargo, un polipéptido aislado o anticuerpo será preparado por lo menos en un paso de purificación.

"Tratamiento" se refiere al tratamiento terapéutico y profiláctico o medidas preventivas. Aquellos que necesitan de tratamiento incluyen, los que ya están con el trastorno, asi como aquellos en los que el trastorno se quiere evitar.

"Mamíferos" a los efectos del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, y del zoológico, deportes o animales de compañía, como perros, caballos, conejos, vacas, cerdos, hámster, jerbos, ratones, hurones, ratas, gatos, etc. Preferentemente, el mamífero es humano .

Un "trastorno" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con la proteína. Esto incluye los trastornos crónicos y agudos o enfermedades como las patologías que predisponen al mamífero con el trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de los trastornos que se tratan en la presente son los carcinomas y las inflamaciones.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es por lo menos la concentración mínima necesaria para efectuar una mejora apreciable o prevención de una enfermedad en particular. Las cantidades terapéuticamente eficaces de las proteínas conocidas son bien conocidas en la materia, mientras que la cantidad eficaz de las proteínas descubiertas en lo sucesivo se puede determinar por técnicas convencionales que están en conformidad con la experiencia de un experto en la materia, tales como un médico normal .

II. Modos de realizar la invención Los eventos recientes de oxidación de los anticuerpos monoclonales candidatos nos llevó a investigar el mecanismo de oxidación en los residuos de Met, Trp e His, para buscar estabilizadores adecuados. Mediante el uso de una proteína modelo, la hormona paratiroidea (PTH 1-34) , ayudados por rp-HPLC, mapeo de péptidos y LC/MS/MS, hemos sido capaces de identificar y cuantificar la oxidación de estos residuos vulnerables causados por diferentes oxidantes.

; A. Caracterización del daño oxidativo El hecho de que la metionina oxidada (Met [O] ) es fácilmente detectada en numerosas proteínas farmacéuticas se puede atribuir a su susceptibilidad a los agentes oxidantes y no sólo a H202 solo. Luz, tBHP, y/o peroxodisulfato se usaron por varios laboratorios para generar Met [O] . La oxidación de Trp o His en proteínas farmacéuticas, en condiciones normales ; de almacenamiento puede ser muy lenta. Para acelerar la oxidación, uno o varios modelos de estrés son de uso común.

Hay muchas formulaciones de proteínas que contienen polisorbato (20 y 80) . Se ha informado que los oxidantes presentes en polisorbato envejecido consisten en su mayor parte de H202 (hasta un 75%) (Jaeger y otros, Biochem Biophys Methods 29:77-81, (1994)). Ha y otros, (J Pharm Sci 91:2252- 2264 (2002)) informaron un aumento en la oxidación de la interleucina-2 mutante por polisorbato envejecido. Dado que el polisorbato es la fuente de antioxidantes en el medicamento proteico, se puede considerar el uso de H202 como una forma de simular la reacción de oxidación en las formulaciones que contienen tensioactivos . Además, el H202 se ha usado como agente aislante aséptico en el llenado de productos estériles. H202 residual puede ser el que se encuentra en el medicamento. Por esta razón, es importante determinar la sensibilidad de la proteína a la oxidación por H202.

La oxidación de Trp e His se consideran como la oxidación mediada por radicales libre o catalizada por metal. (Davies y otros, 1987, Hawkins y Davies 2001) Teóricamente, la oxidación catalizada por metales serviría como un modelo Como se discutió en el apartado anterior, la presencia de metal aumenta la complejidad | de los estudios de la oxidación. AAPH (2, 21 -azobis (2 -amidinopropano) dihidrocloruro) es un sistema de generación de especies de oxígeno reactivo (ROS) , independiente del ionmetálico (Niki y otros, Methods Enzymology. 186: 100 1990) . A una velocidad definida, esta se descompone soluciones acuosas, aeróbicas, para producir radicales álquilo y alquilperóxidos ' La estructura química y la generación de alquilperóxidos se muestran en la Figura 2. El tratamijento con AAPH llevó a la Oxidación de los residuos Met, Tyr y Trp en las proteínas del hígado (Chao y otros, Proc Nati Acad Sci 9 :2969-74, (1997) ) . En el mismo estudio, otro aminoácido derivado de la oxidación, ditirosina también se detectó. Cuando la glutamina sintetasa se expuso a AAPH durante 4 horas, ambos residuos de Trp, 2 de 16 His, 6 de 17 de Tyr y 5 de 16 Met se perdieron ;(Ma y otros, Arch Biochem Biophys 363:129-134, (1999)). Éstos dos informes indican que AAPH llevó a la oxidación de una amplia gama de aminoácidos, además de Met . Más recientemente, con respecto a los fármacos de molécula pequeña, AIBN (2, 2 ' -azobisisobutironitrilo) y ACVA ácido (4, 4 ' -azobis-4-cianovalérico, ambos compuestos azoicos similares a AAPH, se evaluaron para su uso en los estudios de degradación de oxidación forzada (Nelson ED, J Pharm Sci 95:1527-39, (2006)). Dado que los compuestos azoicos pueden generar cantidades reproducibles de radicales, independientemente de los metales, AAPH es un oxidante modelo por su capacidad específicamente de generar proteínas con Trp oxidado.

; Para la oxidación no específica del sitio, la hormona paratiroidea (1-34) (PTH) se eligió como una proteína modelo debido a su estructura terciaria mínima (Barden y otros J Biochem, 32:7126-32 (1993)) y su secuencia que contiene los tres aminoácidos deseables (1 Trp, 2 Met y 3 His) , la ' facilidad con que pueden ser analizadas por cromatografía de fase inversa de alto rendimiento líquido (RP-HPLC) , y su disponibilidad. El grupo de Trout en el Instituto de Tecnología de Massachusetts estudiaron la oxidación de Met en PTH estresada sólo por H202, las diferentes tasas de oxidación de Met8 y Metl8 se correlacionan con el número de coordinación de depósito de agua 2 (Chu y otros, Biochem 43: 14139-48 (2004) y J Pharm Sci 93:3096-102 (2004)). La diferencia, menor de 1.5 veces, no fue lo suficientemente importante para influir en la conclusión que queremos sacar de nuestro estudio. Las tasas de oxidación de los diferentes residuos de Met en la hormona de crecimiento (The y otros, J Biol Chem 262:6472-7, (1987)) y rhVEGF (Dueñas y otros, Pharm Res 18:1455-60, (2001)) se atribuyeron principalmente a diferentes grados de exposición al solvente. Es de esperar q e la velocidad de oxidación de la Met totalmente expuesta al disolvente en PTH, hormona de crecimiento y rhVEGF sea comparable. Por lo tanto, los dos residuos de Met en la PTH pueden simular Met expuesta al disolvente en todas las proteínas. Se facilita el análisis por LC/MS, porque un solo Trp, hace de la PTH un buen modelo proteico para nuestro estudio.

Mientras H202, tBHP con y sin Fe (II) oxidaron , principalmente los dos residuos Met, AAPH y H202 más Fe (II) oxidaron los residuos Met y Trp, la primera con más capacidad ? para generar especies de Trp [O] que la segunda. AAPH, un generador de radicales libres independiente del metal, produjo alquilperóxidos , los cuales simularon las especies reactivas oxidantes generadas a partir de Tween degradado.

Por otra parte, la oxidación del sitio específico catalizada por metal será muy diferente de una reacción generada sólo con H202. Por ejemplo, en la relaxina, la Met-B (25) reaccionó con H202 más rápido de lo que lo hizo Met-B (4) . El orden se invierte cuando la relaxina reaccionó con Asc/Cu(II) mediante una reacción catalizada por metales, Met- B (4) la cual está cerca del sitio de unión de metales, tiende a oxidarse rápidamente (Li y otros, Biochem 34:5762-72 (1995) ) . En nuestro estudio, se usó un fragmento de anticuerpo humanizado anti-VEGF, indicado para el tratamiento de la degeneración neovascular (húmeda) macular relacionada con la edad, como proteína sensible a la oxidación del sitio específico catalizada por metal, porque hemos encontrado que la oxidación del Trp 50 (H2) puede ser inhibida por la adición de EDTA, por otra parte, cuando la His vecina se mutó, el Trp 50 (H2) se estabilizó (manuscrito en preparación) . También se estudió la oxidación de un anticuerpo anti-CDlla diseñado para de manera selectiva y reversible bloquear la activación, reactivación y el tráfico de células T que dan lugar al desarrollo de la psoriasis, ya que se oxidó en diversas condiciones, en los que diferentes productos Met [0] se observaron. Sin embargo, no hay oxidación Trp en los anticuerpos anti-CDlla en estas condiciones de estrés, un comportamiento muy diferente al anticuerpo anti-VEGF. Por esta razón, el anticuerpo anti-CDlla se incluyó en nuestro estudio.

B . Detección de estabilizadores para la prevención de la degradación oxidativa '. Un objetivo clave en este estudio fue evaluar los estabilizadores. Se prevé que la información generada en éstos estudios de estrés nos puede llevar a un nuevo éstabilizador para el uso en preparados farmacéuticamente eficaces. Es prudente detectar estabilizadores mediante el uso de de H202, H202 más Fe (II) y AAPH, ya que representan ataques potenciales de vapor de H202 de uso general como agente aséptico, H202 de Tween degradado y el metal de la superficie de acero inoxidable y también alquilperóxidos también de Tween degradado, respectivamente. De nuestro estudio de detección se determinó que: 1) la metionina libre protegió la oxidación de PTH contra H202 y H202 más Fe (II) , 2) , el manitol y EDTA fueron eficaces contra H202 más Fe (II) , * 3) el triptofano libre fue eficaz únicamente contra la oxidación por AAPH, mientras que la combinación de Trp y Met fue eficaz contra las tres condiciones oxidantes.

La oxidación de anticuerpos anti-VEGF representa la oxidación del sitio específico catalizada por metal. AAPH podría generar productos de degradación de anticuerpos anti- VEGF, los cuales mostraron picos adicionales en la región de base en los cromatogramas IEC como el lote de calificación problema. El Trp libre fue eficaz en mitigar la oxidación de ,los anticuerpos anti-VEGF cuando se oxidaron por AAPH. Estos resultados sugieren que el Trp libre es eficaz contra la oxidación del sitio específico catalizada por metal. Con el fin de asegurar que todos los residuos de aminoácidos vulnerables tales como la metionina, triptofano, y posiblemente histidina estén protegidos, una combinación de metionina y triptofano será una medida eficaz.

Además del triptofano, que es un buen estabilizador en combinación con la metionina, también demostramos que trolox (ácido 6-hidroxi-2, 5, 7, 8-tetrametilcroman-2-carboxílico, un derivados de vitamina soluble en agua) y la piridoxina (comúnmente conocido como vitamina B6) , ambos mostraron una excelente protección de los residuos de triptófano en una proteína (Figuras 15 y 16). Cada uno de * estos estabilizadores se probó por separado a una concentración de 2 mg/ml por adición a la solución de proteína PTH a 0.1 mg/ml, pH 5,0. La solución de proteína se destacó posteriormente por la adición , de 1 mM de AAPH, y se incubó a 40° C durante 6 horas. Sin la protección de trolox o piridoxina, la PTH mostró gran cantidad de oxidación en su residuo de triptófano, mientras que en presencia de trolox o piridoxina, el residuo de triptófano estuvo bien protegido (Figuras 15 y 16) . Estos resultados confirmaron la utilidad de usar un depurador de radicales libres para proteger a los residuos de triptófano en una proteína.

Ejemplo 1 Un estudio de la oxidación de proteínas: Metionina y triptófano como estabilizadores eficaces contra los mecanismos de degradación oxidativa Este ejemplo ilustra el uso de triptófano solo y en combinación con metionina para evitar la oxidación de los anticuerpos y las proteínas.

Métodos Experimentales Material : AAPH (dihidrocloruro de 2, 21 -azobis (2-amidinopropano) (lote núm. D00024287) se adquirió de CalBiochem (Gibbstown, NJ) . La hormona paratiroidea (1-34) (SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF, lote núm. U07046A1) se adquirió de American Peptide Company (Sunnyvale, CA) . En este informe, se refiere simplemente como la PTH.

La L-Metionina y EDTA disódico (lote núm. E05643) se adquirieron de JT Baker (Phillipsburg, NJ) . El acetato de sodio, acetato de amonio, H202, t-BHP, L-triptófano (lote núm. 1152333), y cloruro férrico hexahidratado (lote núm. 53H0619) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . El cloruro ferroso tetrahidratado (lote núm. NA1759) se adquirió de EMD (Gibbstown, NJ) . Manitol (G10303, lote núm. 139476) y sacarosa (G20244, lote núm. 292426) se obtuvieron dentro de Genentech, Inc. La tripsina, con calidad para secuenciación (tratado con TPCK) , se adquirió de Promega (Madison, WI) . El acetonitrilo con calidad para HPLC (ACN) y agua se adquirieron de Fisher Scientific (Fairlawn, NJ) . El agua que se usó en los experimentos de preparación de la muestra se obtuvo de un sistema de purificación Milli-Q Plus (Millipore, Bedford, MA) .

Preparación de la muestra PTH (0.1 mg/ml) se mezcló con H202, H202/Fe(II), t-BHP, t-BHP/Fe (II) , o AAPH, respectivamente, en una proporción molar de 1:42 (proteína: oxidante) en tampón acetato amónico 20 mM a pH 5.0. La concentración de Fe (II) fue de 0.2 mM. Los detalles de las composiciones se presentan en la Tabla 1. Como se muestra entre paréntesis la concentración final en las muestras de ensayo, manitol (15%) , sacarosa (6%) , et (2 mg/ml), EDTA (0,04%), y Trp (2 mg/ml) se añadieron a las muestras como estabilizadores, a las respectivas concentraciones. Para las muestras de anticuerpos anti-VEGF, 1 se probaron las concentraciones de Trp a 2 y 10 mg/ml. Después de la incubación a 40° C durante 6 y 24 horas, las , alícuotas de las muestras se mezclaron con metanol y Met para apagar la reacción antes del análisis por rp-HPLC, mapeo de péptidos, y la cromatografía líquida /espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC/MS/MS) . La formulación del anticuerpo anti-CDlla liofilizado, reconstituido en forma líquida, se probó a los 92 mg/ml con 31 mM de AAPH. En un estado desnaturalizado, 5 mg/ml del anticuerpo anti-CDlla se desnaturalizó con guanidina 6M HCl y 1.7 mM AAPH se añadió. Cromatografía de fase inversa (rp-HPLC) ¡ Los experimentos se realizaron en un instrumento de Waters HPLC con una C4 (Vydac, 214TP, 5 m, 2.1 x 250 mm) . El disolvente A fue de 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA) en H20 y el disolvente B fue de 0.08% TFA en acetonitrilo . Las muestras se analizaron con un gradiente lineal de 20% de B a 8:0% de B, con una tasa de flujo de 0.2 ml/min en 45 min. La temperatura de la columna se fijó en 30° C. La detección UV se fijó en 214 nm.

Digestión con tripsina El pH de las muestras se ajustó a > 7.5 mediante la adición de bicarbonato de amonio 1 M. Se añadieron cinco microlitros de 0.5 mg/ml de tripsina a muestras de 200 µ? , que se incubaron a 37° C durante 3 a 4 horas. La digestión se i apagó con TFA al 0.1%.

: Caracterización por LC/MS/MS del mapa tríptico de péptidos: Las muestras de PTH después de la digestión tríptica se separaron con un sistema de HPLC Agilent Serie 1200, y las masas y las secuencias de los péptidos se determinaron con un espectrómetro de masas con trampa de iones lineal en línea con acoplamiento LTQ (Thermo Electron, San José, CA) . Una columna Júpiter Proteo de 1.0 x 150 mm (4 µt? de tamaño de partícula, tamaño de poro 90 Á; Phenomenex, Torrance, CA) se usó; la temperatura se controló a 30° C, y el efluente de la columna se monitoreó a 214 nm. El flujo se controló a 150 úl/min, y las fases móviles que se usaron fueron de 0.1% TFA én agua (A) y el 0.1% de TFA en acetonitrilo (B) . Un volumen de 100 µ? de la muestra se inyectó. Los gradientes optimizados (expresados en minutos por B%) fueron de 0/2%, 3/2%, 10/8%, 15/8%, 60/40%, 61/95% , 65/95% , 66/2% y 76/2%. El efluente de HPLC se infundió directamente a la fuente de ionización por electrospray LTQ. La ionización por electrospray en modo de iones positivos se logró mediante el uso de un voltaje de la aguja de pulverización de 4.5 kV y una tensión capilar de 44 V. En los experimentos LC/MS/MS, los nueve eventos de análisis que incluyen un análisis completo en el intervalo de 300 a 2000 m/z, fueron seguidos de cuatro ciclos de captura de las exploraciones y ; exploraciones MS/MS de los cuatro iones más intensos.

La interpretación de los espectros MS/MS y la asignación I de péptidos se realizó con una búsqueda automática en base de datos con un algoritmo SEQUEST usando el software BioWorks Browser versión 3.2 (Thermo Electron) y la investigación manual de cada producto del espectro de iones armonizado. Una base de datos FASTA solo de proteínas PTH se creó y usó como destino de búsqueda. Para la identificación de los productos de oxidación, las modificaciones relacionadas con la oxidación se definieron como las variables (+4, +16, y +32 Da para Trp; +16 Da para Met; y +16, -22, y -23 Da para His, relativo a PTH) . El péptido coincide con valores del factor de correlación satisfactorios (Xc> 1.5 para una sola carga, 2.0 para carga doble, y >2 .5 para los iones de péptidos triplemente cargados) se seleccionaron como equivalente potencialmente significativos para un péptido modificado por oxidación. Posteriormente, la investigación manual de captura de las exploraciones de los espectros de masa y los espectros MS/MS de los iones de péptidos armonizados se llevó a cabo para eliminar las identificaciones falsas positivas. Los perfiles MS de la captura de las exploraciones se examinaron para confirmar el estado de carga y la masa monoisotópica de péptidos armonizados. Para estimar el nivel de oxidación para cada sitio de oxidación, los cromatogramas de iones extraídos de los péptidos correspondientes se integraron de forma manual por medio del uso de un navegador Xcalibur Qual. El porcentaje relativo de la oxidación se calculó posteriormente, mediante la división del área del pico del ion del péptido oxidado por la suma de las áreas de los picos de péptidos oxidados y no oxidados.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Oxidación de la PTH no específica del sitio: La PTH que no contiene sitio de unión a metales, es una proteína modelo para estudiar la oxidación no específica del sitio. La reacción tiene lugar en los residuos expuestos al disolvente. PTH, a 0.1 mg/ml se dejó reaccionar a 40° C con oxidantes, todos a 1 mM, por 6 y 24 horas. La relación molar del oxidante a la PTH fue de 41.2. Un total de cinco oxidantes se usaron, a saber, AAPH, H202 y tBHP con o sin Fe (II). Los reactivos se resumen en la Tabla 1. Las muestras se analizaron por rp-HPLC y mapeo tríptico de péptidos Seguido por caracterización LC/MS/MS.

Tabla 1 PTH H202 Fe2t t-BHP AAPH Relación [0] /PTH 0.1 mg/ml control 0.1 mg/ml 34 ppm (InM) 41.2 PTH H202 Fe2+ t-BHP AAPH Relación [0] /PTH 0.1 mg/ml 34 ppm 50 ppm 41.2 (InM) 0.1 mg/ml 90 ppm 41.2 (InM) 0.1 mg/ml 50 ppm 90 ppm 41.2 0.1 mg/ml lmM 41.2 La Figura 3 muestra los cromatografías por rp-HPLC de la PTH que reaccionó con H202, en los cuales Metl8 modificada, Met8 modificada, y especies de PTH doblemente modificadas se detectaron. Esta tendencia es consistente con los datos generados por Chu y otros, Biochem 43:14139-48 (2004)) que reportaron las tres especies de Met-oxidada según lo detectado por rp-HPLC, con Metl8 oxidada más que Met8, seguido por el doble oxidado. La Figura 4 muestra los cromatogramas de rp-HPLC de la PTH que reaccionó con AAPH y revela un patrón muy diferente al que se mostró en la Figura 3. Dos conjuntos de picos triplete aparecieron en los tiempos de retención entre los picos de PTH y Met [0] . A pesar de que los picos individuales no se caracterizaron completamente, se confirmó más tarde por digestión tríptica, seguido por LC/MS/MS, que estos nuevos picos eran Trp [O] de especie de PTH modificada. El mapeo tríptico de péptidos de la PTH digerida encontró que, además de los productos de la oxidación de Met, tres especies de péptidos trípticos con masas moleculares de M+4 , M+32, M+16 (donde M es la masa del péptido tríptico de la PTH, VGWLR) se produjeron cuando la PTH se trató con AAPH . El análisis de espectros MS/MS de las especies de péptidos dieron lugar a su nombramiento como tres derivados de la oxidación de Trp, a saber, quinurenina (M+4) , N- formi lquinurenina (M+32) y 5 -hidroxi t riptófano u ox-indol alanina (M+16) . Sus estructuras químicas se muestran en la Figura 5. Las razones para las pruebas de PTH por tres oxidantes modelos (por ejemplo, H202, H202, más Fe(II), y AAPH) se discutieron más arriba. Se probaron también tBHP y hierro más tBHP porque tBHP es actualmente el oxidante de elección en los protocolos para la preparación de muestras degradadas .

La Tabla 2 resume la oxidación total de Met8 y Trp23 de la PTH en estas muestras degradadas. En total, el 43% y 84% de los residuos de Trp de la PTH se oxidaron por AAPH cuando se trataron durante 6 horas y 24 horas, respectivamente. Por lo tanto, los picos nuevos que se muestran en la Figura 2 se identificaron como Tr [0] de las especies de PTH modificada. No se observó oxidación de la His en el experimento. La Metl8 oxidada que contienen péptidos trípticos no se retuvo en la columna de fase inversa. La Tabla 2 resume la oxidación total de Met 8 y Trp 23 de PTH en estas muestras degradadas.

Guantif icación de la oxidación PTH (Trp23, Met8) por mapeo de péptidos Tabla 2 Las observaciones claves de estos resultados son las siguientes: a. Tres condiciones, tBHP con o sin hierro, y H202, generaron una cantidad mínima de oxidación de Trp. b. Ninguno de los tres residuos His se afectó. c. Sólo AAPH y la reacción de Fenton, H202 más Fe (II) , generaron oxidación Trp. d. Se generaron mas +16 Tr [0] que otras especies ((+4 and +32) . e. Para alcanzar un grado comparable de oxidación de Trp, el tratamiento de AAPH durante 6 horas generó el 43% de Trp [O] y el 29% de Met [0] en Met8, mientras que el tratamiento con H202/Fe(II) por 24 horas generó el 35% de Trp [0] pero una cantidad mucho mayor (91%) de Met [0] en Met8. Ésta comparación demuestra que el tratamiento AAPH es más éspecífico hacia la oxidación Trp que la reacción de Fenton. i El mecanismo de oxidación de tioéter (metionina) por peróxidos (H202, tBHP, o de otras especies R00H) es un ataque riucleofílico de un solo paso de sulfuro en un complejo disolvente de peróxido prótico seguido por una serie de desplazamientos electrónicos concertados que permiten la transferencia de oxígeno al átomo de azufre, y dan lugar a sulfóxido de Met, Met [0] . (Li y otros, Biotechnol Bioeng. 48: 490-500, 1995) Este mecanismo de reacción implica que el peróxido de oxígeno es electrofílico . Por lo tanto el grupo donador de electrones, tales como t-butil desaceleran la reacción mediante la disminución de la electrofilicidad del oxígeno. Por esta razón, el hecho de que tBHP genera menos cantidad de oxidación en la Tabla 2, no es sorprendente. Cabe señalar que tBHP ofrece la ventaja de oxidar sólo la metionina expuesta como eck (Anal Biochem 236:56 (1996)) informó por primera vez cuando el interferón gamma recombinante (rIFN-?; Actimmune) y el activador del plasminógeno tisular recombinante (rtPA alteplasa, Activase0) se investigaron. Dado que hay poca estructura terciaria de la PTH, no se espera que cualquier Met de la PTH se oxide i selectivamente por t-BHP.

Aunque el mecanismo de ataque nucleófilico predice un componente específico de catálisis ácida, la velocidad de reacción no varía significativamente en el intervalo de pH 2-8, como se muestra con PTH (Chu y otros, Proc Nati Acad Sci 94:2969-74 (2004)). Por esta razón, los datos generados mediante el uso de pH 5 en tampón acetato pueden ser aplicables a un intervalo de pH típico, pH 7-5, que se encuentra en las formulaciones de proteínas.

Sólo AAPH y la reacción de Fenton generaron la oxidación Trp. Este resultado apoya la idea de que la reacción nucleofílica de H202 por sí sola no puede causar que el Trp se oxide . Nos sorprendimos al observar que no había ninguna oxidación de His en nuestro experimento. Cuando la albúmina de suero bovino reacciona con Fe ( II ) /EDTA/ascorbato o Cu ( II) /ascorbato, el primero causó más oxidación en Trp, mientras que la segunda causó más oxidación en His (Uchida y otros, Agrie Biol Chem. 53: 3285-92 (1989)). En otro laboratorio, la oxidación de conformidad con la relaxina por ASCA/Cu(II) resultó en una cantidad significativa, y ASCA/Fe (III) , en una cantidad pequeña, de oxidación de His, y al mismo tiempo, no se observó oxidación ni de Trp ni tampoco de Tyr (Li y otros, Biochem 34: 5762-72 (1995)). Los resultados de ambos laboratorios, contradicen la ausencia total de oxidación de His en la PTH cuando se usó <H202 + Fe (II). Es posible que su oxidación dependa de la presencia de cobre .

Selección del estabilizador, PTH: Basados en el análisis anterior, se propone que la proteína puede ser susceptible al ataque oxidativo a través de cualquiera o todos los tres mecanismos de degradación de la Figura 1, así como la oxidación inducida por luz. Una reacción nucleofílica con H202 (y no metal) puede ser la reacción de oxidación observada cuando el producto proteico se expone al vapor de H202 que se usa como agente aséptico en el aislador, o para el H202 resultante de la degradación de Tween (Jaeger y otros, Biophy Method 29:77-81 (1994)). Cuando trazas de metal (hierro, cobre o cromo) se introducen en la sólución de formulación como resultado del contacto con el acero inoxidable, la reacción de Fenton-H202 con Fe (II) funciona. El tercer mecanismo es a través de alquilperóxidos que podrían proceder de Tween degradado. (Jaeger y otros, Biophy Method 29:77-81 (1994)) . En el presente estudio, AAPH se usó para simular las especies reactivas de oxígeno resultantes de alquilperóxidos (Figura 2) . j Metionina: Met Libre neutralizó el efecto de los oxidantes H202 como se esperaba, si el hierro está presente o no. La Met libre redujo significativamente la oxidación de los residuos de Met en la PTH, como que los picos correspondientes a Met [O] -PTH no aparecen (Figura 6) . La Met libre no tuvo efecto sobre la oxidación de Trp, como que el pico de Trp [O] persistió. anitol, sacarosa: El manitol es un conocido hidroxilo depurador de radicales libres. La Figura 7 muestra una I protección completa de conformidad con la reacción de Fenton por manitol, como se demostró por la ausencia de cualquier Met [O] y Trp [O] derivados de PTH cuando se estresó con H202/Fe(II) . Sin embargo, cuando se estresó por AAPH o H202, la PTH no estuvo protegida en absoluto por manitol, porque el manitol no reacciona con los alquilperóxidos o H202. La sacarosa generó resultados similares, excepto que fue menos efectiva que el manitol, cuando protegió la PTH contra un radical libre hidroxilo. Los polioles se consideraron un estabilizador universal en contra de ambas degradaciones física y química. Como se señaló en una revisión por Li y I otros, (Biotech Bioeng 48:490-500 (1995)) , la hemoglobina puede ser liofilizada sin oxidación con el uso de ciertos azúcares. Los resultados de nuestro modelo usando AAPH sugieren que la proteína con pdlioles se puede dejar sin protección frente a alquilperóxidos .

EDTA: Como se muestra en la Figura 8, el EDTA protegió completamente cuando la PTH se estresó mediante el H202/Fe(II). En este caso, el EDTA no sólo mitigó la generación de radicales libres, sino también el efecto oxidante del H202. El EDTA no protegió la PTH cuando se destacó por H202 solo. El EDTA parecía agravar la oxidación por AAPH, dado que habían abundantes picos Met [0] y Trp [0] de PTH. Informes del efecto de los quelantes EDTA (por ejemplo, EGTA) u otros metales han sido mixtos. Los quelantes del metal pueden aumentar o inhibir una reacción catalizada por metales. Se puede generalizar y decir que el EDTA, ya que secuestra eficazmente el cobre, inhibe las reacciones catalizadas por cobre. Debido a que no pueden cubrir las cinco valencias en el hierro, el complejo EDTA-hierro a veces ejs muy reactivo. No se sabe por qué se observó más oxidación cuando el EDTA se añadió a una mezcla de reacción de PTH y AAPH, pero esa investigación está fuera del alcance de este estudio .

Frecuentemente descrita en la literatura, la oxidación de residuos Met, Trp o His in vivo se atribuyó a la oxidación catalizada por metales (MCO) . En el presente experimentó, la PTH oxidada por AAPH sin metal añadido generó gran cantidad de Met y Trp, lo que sugiere que ni la oxidación de Met ni la de Trp dependen únicamente de la catálisis metálica.

Triptófano libre: En la literatura, muchas sustancias se citaron como depuradores de radicales libres. La tiourea, el metanol y el ácido úrico, son ejemplos, sin embargo, no son adecuados para su uso en la formulación de proteínas. Además, el butil-hidroxi anisol (BHA) y tolueno (BHT) son radicales terminadores de conformidad con la reacción en cadena que son muy eficaces en apagar radicales de los lípidos. Debido a su baja solubilidad en agua, ellos no son adecuados para la formulación acuosa de proteínas. Con la cantidad apropiada de tensioáctivo, BHA y BHT pueden ser introducidos en una formulación acuosa para ofrecer cierta protección oxidativa.

El uso del Trp libre como un anti -oxidante en la I formulación parenteral no se mencionó en la literatura. Similar al usó de Met libre, éste puede proteger contra la oxidación de PTH. La Figura 9 muestra que el Trp libre ofrece una buena protección contra la oxidación de los residuos de Trp en PTH cuando la PTH se estresó por AAPH o la reacción de Fenton. Los picos Met [0] de PTH fueron prominentes en el caso del estrés AAPH y mucho menos en el caso de conformidad con la reacción de Fenton. El Trp libre solo, no ofrece ninguna protección contra el estrés oxidativo por H202.

Combinación de triptófano y metionina: Esta combinación proporciona protección casi completa de la PTH en las tres condiciones oxidantes (Figura 10) . Uno puede conjeturar que el Trp libre y Met contrarrestará el efecto de alquilperóxidos y H202, respectivamente. Cuando Trp y Met se usan en combinación, una formulación de proteínas debe ser capaz de soportar el asalto de los tres mecanismos que se muestran en la Figura 1, así como la oxidación inducida por luz .

El análisis descrito anteriormente se deriva de un examen cualitativo de los picos en los cromatogramas I respectivos rp-HPLC. Las muestras oxidadas por AAPH y la reacción de Fenton se sometieron a análisis cuantitativos y específicos de residuos mediante el mapeo de péptidos trípticos y caracterización por LC/MS/MS. De acuerdo con los resultados de la cuantificación relativa obtenida mediante la integración de la correspondiente EIC (cromatograma de iones i extraídos) de las señales de masa, Met libre sola suprimió la oxidación de Met de manera significativa y el Trp libre solo suprimió la oxidación Trp significativamente (Figura 11) . La combinación de Trp y Met proporcionaron la protección más eficaz contra la oxidación por AAPH (Figura 11) o la reacción de Fenton (Figura 12) .

Oxidación de sitios específicos catalizada por metales: La oxidación de Trp 50 del anticuerpo anti-VEGF se observó por primera vez cuando un lote de calificación mostró mayor grado de pérdida del pico principal cuando se almacenó a 30° C durante un mes. La oxidación autocatalítica de Trp 50 más adelante mostró que es causada por la mala manipulación del Tween 20, lo cual resultó en la pérdida del pico principal y el aumento de los picos de base en el análisis de la CIE. Los estudios posteriores mostraron que el H202 no causó la oxidación del anticuerpo anti-VEGF y, por tanto, no se alteró el patrón cromatográfico IEC. La adición de EDTA como estabilizador y la mutación de la His cercana resultó en una mayor estabilidad de los anticuerpos anti-VEGF con respecto a la oxidación de Trp. En base a estos datos, es posible que la oxidación de anticuerpos anti-VEGF sea la reacción de un sitio específico, catalizada por metales.

Adición de AAPH a la solución del anticuerpo anti-VEGF también produjo picos adicionales en la región de base de un cromatograma IEC, estos picos representan los radicales libres generados por los productos de degradación del anticuerpo anti-VEGF, según lo exhibido por el lote de calificación problemática (Figura 13) . A pesar de que estos picos de proteínas degradadas están en situación comparable a los picos degradados a partir de lotes de calificación, los perfiles no son idénticos. Se requieren más estudios para confirmar si estos picos están relacionados con la oxidación de Trp.

¡ La adición de triptófano libre a la formulación ofreció una excelente protección contra AAPH, como lo demostró la ausencia de picos de base en los cromatogramas IEC (Figura 14) . Dado que los residuos Met en el anticuerpo anti-VEGF no se pueden oxidar mediante el H202, es razonable esperar que la Mét libre no fuera necesaria para los anticuerpos anti-VEGF. Anticuerpo anti-CDlla, donde no se espera la oxidación de ! La oxidación de residuos Met en los anticuerpos anti-CDlla se estudió ampliamente. El anticuerpo anti-CDlla tiene cuatro metioninas reactivas Met 256, Met 432, Met 362 y Met 50 (cadena pesada) . La Tabla 3 muestra que el H202, tBHP, y el estrés térmico provocó la oxidación de Met 256 y, en menor medida, Met 50. En presencia del metal (metal supuestamente disuelto del tanque de acero inoxidable) la oxidación en Met 50 aumentó a un nivel comparable al de Met 256. La oxidación sé midió mediante el mapeo del péptido Lys-C. Las diferencias en el orden de reactividad dependieron del tipo de estrés oxidativo aplicado.

Tabla 3 4 Catalizada por Met 256 * Met 50 > Met 432 > et 362 metal 5 H202 Met 256 > Met 432 > Met 50 Cuando AAPH se añadió a los anticuerpos anti-CDlla, el nivel de Met 50 aumentó, lo que sugiere que las reacciones en un tanque de acero inoxidable y la reacción con AAPH son comparables, resultando en aumento de su oxidación en Met 50 (¡Tabla 4) . Se puede suponer que Met50 es el sitio de la j oxidación cuando el metal o los radicales libres están implicados. Es muy importante tener en cuenta que en estas condiciones los residuos de Trp, His o Tyr no se oxidaron. Sin embargo, cuando se usa desnaturalizante, Trp se puede oxidar en varios lugares .

Tabla 4 Cuando la relación de oxidante a proteína aumentó y cuando la estructura terciaria de la proteína se perturbó por la adición de guanidina, la oxidación de los residuos de Trp por AAPH fue abundante. Por otra parte, en estas condiciones, se observó la oxidación no preferencial de Met50 (datos no mostrados) . Estos resultados apoyan aún más el uso de AAPH como agente oxidante modelo. AAPH realmente provoca la oxidación Trp cuando la relación oxidante/proteína adecuada se usa. AAPH no causa la oxidación Trp cuando las condiciones normales de manipulación no generan oxidación Trp como es el caso con el anticuerpo anti-CDlla.

CONCLUSIÓN En este informe hemos demostrado que AAPH es un buen modelo oxidante que puede oxidar los residuos de Trp en una proteína. Es prudente usar H202 , H202 más hierro y AAPH (Figura 1) , juntos para detectar estabilizadores para la protección contra la oxidación de los residuos Met y Trp. Este sistema permite la mejor simulación de todas las rutas oxidativas posibles que pueden suceder durante la fabricación y el almacenamiento de las proteínas farmacéuticas . La degradación de anticuerpos anti-VEGF se demostró por separado como una oxidación catalizada por i metal .

También hemos demostrado por primera vez que el Trp libre, cuando se añadió a las formulaciones que contienen proteína, bloqueó la oxidación de los residuos de triptófano. En situaciones de estrés oxidativo simuladas mediante el uso de AAPH, el triptófano bloqueó la reacción de oxidación en el anticuerpo anti-VEGF. Este resultado sugiere que el Trp libre es eficaz contra la oxidación de un sitio específico catalizada por metal.

Para asegurarse de que todos los residuos de aminoácidos vulnerables tales como Met, Trp, y posiblemente His estén protegidos, una combinación de Met y Trp se debe i considerar . i Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (32)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : i

1. Una formulación farmacéutica caracterizada porque comprende una proteína, metionina libre y uno o más compuestos capaces de prevenir la oxidación de residuos de aminoácidos aromáticos dentro de la proteína. 1

2. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína se selecciona del grupo que consiste de péptidos, proteínas, anticuerpos y análogos de los mismos.

3. La formulación de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

. La formulación de conformidad con la 1 reivindicación 1, caracterizada porque la proteína es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF.

5. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína tiene propiedades anti-angiogénicas .

6. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína es un anticuerpo monoclonal anti-CD20.

7. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína es un anticuerpo monoclonal anti-CDll.

8. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína es susceptible de oxidación.

9. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína es susceptible de agregación.

! 10. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los residuos de aminoácidos aromáticos dentro de la proteína se seleccionan del grupo que consiste en triptófano, histidina, tirosina y fenilalanina .

11. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es acuosa.

12. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los compuestos capaes de prevenir la oxidación son adecuados para inyección parenteral .

: 13. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los compuestos no aportan efectos farmacológicos.

14. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los compuestos comprenden aminoácidos aromáticos libres o análogos de los mismos .

15. La formulación de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el aminoácido aromático se selecciona del grupo que consiste de triptófano, I histidina, tirosina y fenilalanina . I j

16. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el compuesto es triptófano .

17. La formulación de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el triptófano está presente en la formulación en una cantidad que está en el intervalo de aproximadamente 0.1-10 mg/ml.

18. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el triptófano libre se combina con uno o más aminoácidos aromáticos adicionales.

; 19. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el compuesto comprende nucleótidos libres o análogos de los mismos.

; 20. La - formulación de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque los nucleótidos libres están presentes en la formulación en una cantidad que está en el intervalo de aproximadamente 0.1-10 mg/ml.

21. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque uno o más nucleótidos libres se combinan con uno o más aminoácidos aromáticos libres.

22. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los compuestos comprenden una o más vitaminas o derivados de vitaminas . 1

23. La formulación de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la vitamina o derivado de vitamina es el ácido 6-hidroxi-2, 5, 7, 8-t;etrametileromán-2-carboxílico.

24. La formulación de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la vitamina o derivado de la vitamina es piridoxina.

25. La formulación de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la vitamina antioxidante o derivado de la vitamina está presente en la fprmulación en una cantidad que está en el intervalo de aproximadamente 0.1-10 mg/ml.

26. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además contiene un tensioactivo .

I 27. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además contiene nVanitol .

28. Un método para prevenir o tratar una j enfermedad o trastorno en un mamífero caracterizado porque comprende la administración de la formulación de conformidad con la reivindicación 1 al mamífero en una cantidad efectiva para prevenir o tratar la enfermedad o trastorno.

29. Un método para hacer una formulación farmacéutica caracterizado porque comprende la preparación de la formulación de conformidad con la reivindicación 1 y la ejvaluación de la estabilidad física, la estabilidad química o la actividad biológica de la proteína en la formulación.

; 30. Un método para estabilizar una composición farmacéutica de una proteína caracterizado porque comprende l¡a adición de metionina y uno o más compuestos a la composición en una cantidad suficiente para inhibir la oxidación de residuos de aminoácidos aromáticos dentro de la proteína.

31. Un método para hacer una formulación farmacéutica caracterizado porque comprende la adición de una cantidad de un tensioactivo a una composición de proteína y una cantidad del compuesto suficiente para negar la especie oxidativa generada por la degradación del tensioactivo. i

32. Un método para prevenir la oxidación de residuos de aminoácidos aromáticos dentro de una proteína susceptible, caracterizado porque comprende la adición de metionina en combinación con uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de aminoácidos aromáticos, nucleótidos, vitaminas y sus derivados.