CZ307715B6

CZ307715B6 - Způsob lyofilizace vodné farmaceutické formulace faktoru VIII prosté albuminu

Info

Publication number: CZ307715B6
Application number: CZ2008-828A
Authority: CZ
Inventors: Marc Besman; Erik Bjornson; Feroz Jameel; Ramesh Kashi; Michael Pikal; Serguei Tchessalov; John Carpenter
Original assignee: University Of Connecticut; Baxalta Incorporated; Baxalta GmbH
Priority date: 1999-02-22
Filing date: 2000-02-22
Publication date: 2019-03-06
Also published as: BR0008405B1; DK1154796T3; US20060205661A1; EP2193809A1; US20120083446A1; JP2018172413A; ES2394755T3; WO2000048635A1; PL204701B1; CY1113969T1; ATE365052T1; US7087723B2; EP2921180A1; MXPA01008515A; CN101683522A; JP6038003B2; HK1106705A1; EP2193809B1; PT2193809E; HK1139862A1

Abstract

Způsob lyofilizace vodné farmaceutické formulace faktoru VIII prosté albuminu, obsahující krystalizované objemové činidlo a NaCl, který spočívá v tom, že zahrnuje kroky a) mrazení farmaceutické formulace při teploty nižší než −30 °C; b) žíhání farmaceutické formulace při teplotě mezi −30 a −9 °C; c) snižování teploty farmaceutické formulace na teplotu nižší než −50 °C; d) žíhání farmaceutické formulace při teplotě mezi −30 a −39 °C, a poté e) sublimační sušení farmaceutické formulace.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu lyofílizace vodné farmaceutické formulace faktoru VIII prosté albuminu.

Dosavadní stav techniky

Faktor VIII je protein nacházející se v krevní plazmě, který se jako kofaktor účastní kaskády reakcí vedoucích ke srážení krve. Nedostatečná aktivita faktoru VIII v krvi má za následek poruchu srážlivosti krve známou jako hemofilie A, dědičný stav postihující především muže. Hemofilie A je v současné době léčena terapeutickými přípravky odvozenými z lidské plazmy nebo vytvořenými použitím technologie rekombinantní DNA. Tyto přípravky jsou aplikovány v případech náhlého krvácení (okamžitá terapie) nebo několikrát, v pravidelných intervalech, jako prevence nekontrolovatelného krvácení (profylaxe).

U faktoru VIII je známo, že je v terapeutických přípravcích relativně nestabilní. V krevní plazmě je faktor VIII obvykle komplexován s dalším plazmatickým proteinem, von Willebrand faktorem (vWF), který jev plazmě přítomen ve velkém molámím přebytku vůči faktoru VIII, a má se za to, že chrání faktor VIII před předčasným rozpadem. Dalším proteinem v plazmě je albumin, který může také hrát významnou roli ve stabilizaci faktoru VIII in vivo. Proto u přípravků obsahujících faktor VIII prodávaných v současné době, se v první řadě spoléhá na použití albuminu a/nebo vWF proteinu ke stabilizaci faktoru VIII během jejich výroby a uskladnění.

Ačkoliv albumin a vWF používané v přípravcích faktoru VIII dostupných na současném trhu jsou odvozené z lidské krevní plazmy, má použití těchto materiálů jisté nevýhody. Protože velký molámí přebytek albuminu ve srovnání s faktorem VIII je přidáván za účelem zvýšení stability faktoru VIII v těchto přípravcích, je těžké charakterizovat protein faktor VIII v těchto přípravcích jako takový. Přídavek lidského albuminu do faktoru VIII je chápán jako nevýhoda, pokud jde o přípravky faktoru VIII produkované rekombinantním postupem. Je to proto, že přípravky rekombinantního faktoru VIII, bez přítomnosti albuminu, by takto neměly obsahovat žádný lidský protein a teoretické riziko přenosu viru by mělo být redukováno.

Bylo popsáno mnoho pokusů připravit faktor VIII bez albuminu nebo vWF (nebo s relativně nízkým obsahem těchto nosičů). Např. v patentu US 5 565 427 (EP 508 194) (patřící firmě Behringwerke) Freudenberg popisuje přípravky faktoru VIII, které obsahují určité kombinace detergentů a aminokyselin, specificky argininu a glycinu, vedle vehikul jako jsou chlorid sodný a sacharóza. Detergent polysorbát 20 nebo polysorbát 80, je přítomen v množství 0,001 až 0,5 % (obj./obj.), zatímco arginin a glycin jsou přítomny v množství 0,01 až 1 mol/1. Obsah sacharózy je 0,1 až 10 %. Příklad 2 tohoto vynálezu poukazuje na fakt, že roztoky (1), které obsahují 0,75 % sacharózy, 0,4 M glycinu a 0,15 M NaCl, a (2), které obsahují 0,01 M citrátu sodného, 0,08 M glycinu, 0,016 M lysinu, 0,002 5 M chloridu vápenatého a 0,4 M chloridu sodného, byly po 16 hodinách nestabilní, zatímco roztoky (3), které obsahují 1 % sacharózy, 0,14 M argininu, 0,1 M chloridu sodného a (4), které obsahují 1 % sacharózy, 0,4 M glycinu, 0,14 M argininu, 0,1 M chloridu sodného, a 0,05 % Tween 80 byly stabilní.

V patentu US 5763401 (EP 818 204) (patřící firmě Bayer) Nayer také popisuje terapeutickou formulaci faktoru VIII bez albuminu, obsahující 15 až 60 mM sacharózy, do 50 mM NaCl, do 5 mM chloridu vápenatého, 65 až 400 mM glycinu a do 50 mM histidinu. Následná specifická složení byla identifikována jako stabilní: (1) 150 mM NaCl, 2,5 mM chloridu vápenatého a 165 mM mannitolu; a (2) 1% sacharózy, 30 mM chloridu sodného, 2,5 mM chloridu vápenatého, 20 mM histidinu a 290 mM glycinu. Bylo zjištěno, že složení obsahující větší množství cukru

- 1 CZ 307715 B6 (10 % maltóz, 50 mM NaCl, 2,5 mM chloridu vápenatého a 5 mM histidinu) vykazuje nízkou stabilitu v lyofilizováném stavu, v porovnání se složením (2).

V patentu US 5733873 (EP 627924) (patricí firmě Pharmacia & Upjohn) Osterberg popisuje formulace, které obsahují 0,01 až 1 mg/ml povrchově aktivní látky. Tento patent popisuje formulace, které mají následující obsah vehikul: polysorbát 20 nebo 80 v množství nejméně 0,01 mg/ml, výhodně 0,02 až 1,0 mg/ml; nejméně 0,1 M NaCl; nejméně 0,5 mM vápenaté soli a nejméně 1 mM histidinu. Zvláště pak se zabývá následujícími specifickými formulacemi: (1) 14,7 až 50 až 65 mM histidinu, 0,31 až 0,6 M NaCl, 4 mM chloridu vápenatého, 0,001 až 0,02 až 0,025 % polysorbátu 80, s nebo bez 0,1 % PEG 4000 nebo 19,9 mM sacharózy a (2) 20 mg/ml mannitolu, 2,67 mg/ml histidinu, 18 mg/ml NaCl, 3,7 mM chloridu vápenatého a 0,23 mg/ml polysorbátu 80.

Byly také popsány další pokusy použít nízké nebo vysoké koncentrace chloridu sodného. V patentu US 4877608 (EP 315 968) (patřící firmě Rhone-Poulenc Rorer) Lee popisuje formulace s relativně nízkou koncentrací chloridu sodného, jmenovitě formulace obsahují 0,5 až 15 mM NaCl, 5 mM chloridu vápenatého, 0,2 až 5 mM histidinu, 0,01 až 10 mM lysinhydrochloridu a do 10 % cukru. Cukrem může být až do 10 % maltóz, 10 % sacharózy nebo 5 % manitolu.

V patentu US 5605884 (EP 0 314 095) (patřící firmě Rhone-Poulenc Rorer) Lee popisuje použití formulací s relativně vysokou koncentrací chloridu sodného. Tyto formulace obsahují 0,35 až 1,2 M NaCl, 1,5 až 40 mM chloridu vápenatého, 1 až 50 mM histidinu a do 10 % cukru jako je mannitol, sacharóza nebo maltóza. Formulace obsahující 0,45 M NaCl, 2,3 mM chloridu vápenatého a 1,4 mM histidinu je doložen příkladem.

V mezinárodní patentové přihlášce WO 96/22107 (patřící firmě Quadrant Holdings Cambridge Limited) Roser popisuje formulace, které obsahují cukr trehalózu. Tyto formulace obsahují: (1) 0,1 M NaCl, 15 mM chloridu vápenatého, 15 mM histidinu a 1,27 M (48 %) trehalózy, nebo (2) 0,011 % chloridu vápenatého, 0,12 % histidinu, 0,002 % Tris, 0,002 % Tween 80, 0,004 % PEG 3350, 7,5 % trehalózy a buď 0,13 %, nebo 1,03 % NaCl.

Další terapeutické formulace faktoru VIII ze stavu techniky obecně obsahují albumin a/nebo vWF za účelem stabilizace faktoru VIII, a tudíž nejsou důležité pro současný vynález. Např. v patentu US 5 328 694 (EP 511 234) (patřící firmě Octapharma AG) Schwinn popisuje formulaci, která obsahuje 100 až 650 mM disacharidu a 100 mM až 1,0 M aminokyseliny. Specificky jsou popsány následující formulace: (1) 0,9 M sacharózy, 0,25 M glycinu, 0,25 M lysinu a 3 mM chloridu vápenatého; a (2) 0,7 M sacharózy, 0,5 M glycinu a 5 mM chloridu vápenatého.

Přestože bylo učiněno několik pokusů vytvořit faktor VIII bez albuminu nebo vWF, stále je zde potřeba terapeutických formulací faktoru VIII, které jsou stabilní bez přítomnosti albuminu nebo jiných proteinů.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje způsob lyofilizace vodné farmaceutické formulace faktoru VIII prosté albuminu, obsahující krystalizovatelné objemové činidlo a NaCl, spočívající vtom, že uvedený způsob zahrnuje kroky:

(a) mrazení vodné farmaceutické formulace při teplotě nižší než -30 °C;

(b) žíhání farmaceutické formulace při teplotě mezi -30 °C a -19 °C;

(c) snižování teploty farmaceutické formulace na teplotu nižší než -50 °C;

-2CZ 307715 B6 (d) žíhání farmaceutické formulace při teplotě mezi -30 °C a -39 °C, a poté (e) sublimační sušení farmaceutické formulace.

Rovněž se popisují terapeutické kompozice faktoru VIII, které jsou stabilní bez přítomnosti albuminu. Zvláště se tento vynález týká kompozice faktoru VIII obsahující kromě faktoru VIII: 4 až 10 % objemového činidla, vybraného ze skupiny sestávající z mannitolu, glycinu a alaninu; 1 až 4 % stabilizátoru vybraného ze skupiny sestávající ze sacharózy, trehalózy, rafinózy, argininu; 1 až 5 mM vápenaté soli; 100 až 300 mM NaCl a pufrovací činidlo pro udržení pH přibližně mezi hodnotami 6 a 8. Tato kompozice může případně obsahovat povrchově aktivní látku jako polysorbát 20, polysorbát 80, Pluronic F68 nebo Brij 35. Je-li povrchově aktivní látka polysorbát 80, může být přítomna v množství menším než 0,1 %.

Výhodná koncentrace pufirovacího činidla kompozic faktoru VIII tohoto vynálezu je od 10 do 50 mM, a je vybráno ze skupiny sestávající z histidinu, Tris, BIS-Tris Propanu, PIPES, MOPS, HEPES, MES a ACES. Výhodné pufrovací činidlo je buď histidin nebo Tris. Kompozice faktoru VIII tohoto vynálezu může dále obsahovat antioxidant.

Kompozice faktoru VIII zde popsané, zahrnují jak objemové činidlo, tak stabilizátor. Objemové činidlo může být přítomno v množství od asi 6 do asi 8 %, výhodně asi 8 %. Výhodné množství stabilizátoru je asi 2 %. V těchto kompozicích je také zastoupen chlorid sodný, výhodně v množství od 150 do 350 mM a výhodněji v množství asi 225 mM. Vápenatou solí v kompozici je také výhodně chlorid vápenatý, a to výhodně v lyofilizované formě.

Dále se zde popisuje kompozice faktoru VIII, utvořená bez přídavku albuminu, která zahrnuje následující složky, kromě faktoru VIII: 2 až 6 % hydroxyethylovaného škrobu; 1 až 4 % stabilizátoru vybraného ze skupiny sestávající ze sacharózy, trehalózy, rafinózy, argininu; 1 až 5 mM vápenaté soli; 100 až 300 mM NaCl a pufirovacího činidla pro udržení pH přibližně mezi hodnotami 6 a 8. Výhodně takové kompozice obsahují asi 4 % hydroxyethylovaného škrobu a NaCl v množství 200 mM. Výhodné množství stabilizátoru je asi 2 %.

Dále se zde popisuje kompozice faktoru VIII, utvořená bez albuminu, která obsahuje 300 až 500 mM NaCl; 1 až 4 % stabilizátoru vybraného ze skupiny sestávající ze sacharózy, trehalózy, rafinózy, argininu, 1 až 5 mM vápenaté soli a pufrovací činidlo pro udržení pH přibližně mezi hodnotami 6 a 8. Výhodně je koncentrace NaCl asi 400 mM.

Dále se zde popisuje způsob lyofilizace vodné kompozice faktoru VIII v nádobě za použití lyofilizéru, přičemž postup zahrnuje počáteční mrazicí krok a počáteční mrazicí krok dále zahrnuje kroky: (a) snižování teploty v lyofilizační komoře na teplotu nejméně asi -45 °C; (b) zvyšování teploty v lyofilizační komoře na hodnotu mezi asi -15 a -25 °C a následné (c) snižování teploty v lyofilizační komoře na teplotu nejméně asi -45 °C. V tomto postupu je výhodné, je-li teplota v komoře snižována nebo zvyšována v rozmezí mezi 0,5 a 1,0 °C za minutu. V kroku (a) je teplota udržována výhodně po dobu 1 hodiny a je snižována na teplotu asi -55 °C. V kroku (b) je teplota udržována výhodně mezi -15 a -25 °C po dobu 1 až 3 hodiny a výhodněji je-li teplota -22 °C, a teplota v kroku (c) je výhodně udržována po dobu 1 hodiny. Preferovaná kompozice faktoru VIII použitého v tomto postupu obsahuje mezi 4 a 10 % činidla vybraného ze skupiny sestávající z mannitolu, glycinu a alaninu a dále obsahuje mezi 1 a 4 % činidla vybraného ze skupiny sestávající ze sacharózy, trehalózy, rafinózy a argininu. Dále kompozice faktoru VIII použitá v tomto postupu také obsahuje mezi 100 mM a 300 mM NaCl.

-3CZ 307715 B6

Podrobný popis vynálezu

Definice

Jak zde bude používáno, termíny uvedené níže a jejich obměny jsou definovány následovně, není-li uvedeno jinak:

Faktor VIII - molekula faktoru VIII se vyskytuje přirozeně a v terapeutických přípravcích jako heterogenní distributor polypeptidů vznikajících jako produkt jednoho genu (viz, např. Andersson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83, 2979-2983, květen 1986). Termín faktor VIII, jak bude dále používáno, se vztahuje na všechny takové polypeptidy, ať už odvozené z krevní plazmy nebo produkované za použití techniky rekombinantní DNA. Příklady komerčně dostupných terapeutických přípravků obsahujících faktor VIII, zahrnují přípravky prodávané pod obchodními názvy HEMOFIL M a RECOMBINATE (patřící firmě Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, Illinois, U.S.A.). Další přípravky v současném vývoji obsahují jednoduchou subpopulaci molekul faktoru VIII, která postrádá část domény B molekuly.

Mezinárodní jednotka, IU-Intemational Unit nebo IU, je jednotka měření aktivity srážlivosti krve (účinnosti) faktoru VIII, měřená standardními testy, jako jsou následující:

Jednostupňový test. Jednostupňové testy jsou odborníkům známé, takovým testem je např. test popsaný v Lee, Martin L, et al., An Effect of Predilution on Potency Assays of Factor VIII Concentrates, Thrombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30,511-519(1983).

Chromogenní test. Chromogenní testy mohou být k zakoupení, jako např. Coatest Factor VIII, dostupný od firmy Chromogenix AB, Molndal, Švédsko.

Žíhání - termín žíhání může být použit jako označení kroku v lyofilizačním postupu pro farmaceutické přípravky podstupující lyofilizaci, přednostně pro sublimační sušení přípravků, při kterém je teplota přípravku zvýšena z nízké teploty na vyšší a poté, po určitém čase opět snížena.

Objemové činidlo - pro účely této patentové přihlášky jsou objemová činidla takové chemické látky, které zajistí strukturu koláče nebo tvoří zbytkovou pevnou hmotu farmaceutických přípravků po jejich lyofilizaci a chrání je před rozpadem. Objemová činidla schopná krystalizovat, jsou míněna objemová činidla popsaná v přihlášce, která mohou krystalizovat během lyofilizace, jinak než chlorid sodný. HES není zahrnut v této skupině krystalizovatelných objemových činidel.

Sublimační sušení, mrazení, lyofilizace - termín sublimační sušení, pokud není v textu uvedeno jinak, se používá pro označení části lyofilizačního postupu, ve které se teplota farmaceutických přípravků zvyšuje za účelem odstranění vody z těchto přípravků. Termín mrazicí kroky lyofilizačního postupu jsou ty kroky, které se objevují hlavně před stavem lyofilizace. Termín lyofilizace, není-li uvedeno jinak, se vztahuje na celý lyofilizační postup, který zahrnuje jak mrazicí kroky, tak kroky sublimačního sušení.

Není-li poznamenáno jinak, termíny v procentech vyjadřují limotnostní/objcmová procenta a teploty jsou ve stupních Celsia.

Složení komponent

Kompozice faktoru VIII tohoto vynálezu zahrnují objemová činidla, stabilizátory, pufrovací činidla, chlorid sodný, vápenaté soli a výhodně další vehikula. Tato vehikula jsou vybrána za účelem maximalizovat stabilitu faktoru VIII v lyofilizováných přípravcích. Stejně tak jsou kompozice faktoru VIII podle předkládaného vynálezu stabilní v tekutém stavu.

-4CZ 307715 B6

Objemová činidla použitá v předkládaných formulacích, která tvoří krystalickou část lyofilizovaného produktu (kromě případu HES), jsou vybrána ze skupiny sestávající z mannitolu, glycinu, alaninu a hydroxyethylovaného škrobu (HES). Mannitol, glycin nebo alanin jsou přítomny v množství 4 až 10 %, výhodně 6 až 9 %, a výhodněji asi 8 %. Je-li použit HES jako objemové činidlo, je přítomen v množství 2 až 6 %, výhodně 3 až 5 %, a výhodněji asi 4 %.

Stabilizátory použité ve formulacích podle vynálezu jsou vybrány ze skupiny sestávající ze sacharózy, trehalózy, rafinózy a argininu. Tato činidla jsou ve formulacích podle tohoto vynálezu přítomna v množství mezi 1 až 4 %, výhodně 2 až 3 %, výhodněji asi 2 %. Sorbitol a glycerol byly ohodnoceny jako možné stabilizátory, ale jejich stabilizační schopnosti v tomto vynálezu byly nedostačující.

Chlorid sodný je v tomto vynálezu přítomen v množství 100 až 300 mM, výhodně 150 až 250 mM a výhodněji asi 225 mM. V jednom provedení současného vynálezu může být chlorid sodný použit bez výše uvedených objemových činidel, přičemž by byl přítomen v množství mezi 300 a 500 mM NaCl, výhodně 350 až 450 mM NaCl a výhodněji asi 400 mM NaCl.

Dále jsou v těchto přípravcích pufirovací činidla, jelikož se má za to, že molekula faktoru VIII může být nepříznivě poškozena změnou pH během lyofilizace. Hodnota pH by měla být v průběhu lyofilizace udržována v rozmezí hodnot 6 až 8 a výhodněji asi hodnoty pH 7. Pufirovací činidla mohou být fyziologicky akceptovatelné chemické látky nebo kombinace chemických látek, které mají schopnost fungovat jako pufry. Jsou to histidin, Tris, BIS-Tris Propan, PIPES, MOPS, HEPES, MES a ACES. Kompletní chemické pojmenování těchto pufirovacích činidel je uvedeno níže v tabulce 1. Standardní koncentrace použitých pufirovacích činidel je 10-50 mM. Je-li v přípravcích použit histidin, jsou použity koncentrace přes 20 mM a výhodně asi 25 mM. Používá se samotný nebo v kombinaci s dalšími pufirovacími činidly jako je Tris. Obzvláště je histidin preferován pro kompozice tohoto vynálezu, jak se podrobně popisuje níže.

Tabulka 1 - Pufirovací činidla

Tris	tri s-(hydroxymethyl)-am.inometh an
BIS-Tris Propan	l,3-bis-\|tris-(hydroxy-methyl)methylamino]-propan
PIPES	piperazin-N,N'-bis-(2-ethansulfonová kyselina)
MOPS	3- (N-morpholino)propansulfonová kyselina
HEPES	N-2-hydroxyethyLpiperazin-N’-2-ethansulfonová kyselina
MES	2-(N -morpholino)ethansulfondvá kyselina
ACES	N-2-acetamído-2“aininoethansu1fonová kyselina \|

Za účelem zachování aktivity faktoru VIII tohoto vynálezu, je důležité, aby formulace obsahovaly vápník nebo jiné dvoj mocné kationty, které jsou schopné interagovat s faktorem VIII a udržovat tak jeho aktivitu, pravděpodobně spojováním těžkých a lehkých řetězců faktoru VIII. Lze použít koncentraci mezi 1 a 5 mM vápenaté soli, výhodně 3 až 4 mM a výhodněji asi 4 mM. Preferovaná vápenatá sůl je chlorid vápenatý, ale mohou být použity i jiné vápenaté soli glukonát vápenatý, glubionát vápenatý nebo gluceptát vápenatý.

Kompozice faktoru VIII také výhodně obsahují povrchově aktivní látky, výhodně v množství 0,1 % nebo méně, nebo výhodněji v množství asi 0,03 %. Povrchově aktivní látky mohou být vybrány ze skupiny sestávající z polysorbátu 20, polysorbátu 80, pluronických polyolů a Brij 35 (polyoxyethylen 23 lauryl ether). Jsou dostupné některé druhy pluronických polyolů (prodávané pod obchodním názvem Pluronic, vyrobené firmou BASF Wyandotte Corporation). Tyto polyoly

-5CZ 307715 B6 různých molekulových hmotností (od 1000 do 16 000) a s odlišnými fyzikálně-chemickými vlastnostmi jsou použity jako povrchově aktivní látky. Pluronic F-38 s molekulární hmotností 5000 a Pluronic F-68, molekulární hmotnost 9000, obsahují 80 % (hmotnostních) hydrofilních polyoxyethylenových skupin a 20 % hydrofobních polyoxypropylenových skupin. Tween-80, 5 komerční polysorbát, je používán v těchto přípravcích, zvláště pak rostlinný Tween-80.

Formulace faktoru VIII tohoto vynálezu zahrnují také antioxidanty. Zjistilo se, že přidáním antioxidantů do lyofilizovaných přípravků tohoto vynálezu se zvyšuje stabilita těchto přípravků, a tím také jejich životnost. Použité antioxidanty musí být vhodné pro použití ve farmaceutických ío přípravcích, a kromě toho jsou výhodně rozpustné ve vodě. Jsou-li do přípravků přidávány antioxidanty, preferuje se jejich přidání těsně před lyofilizací, čímž se zamezí spontánní oxidaci antioxidantů. V tabulce 2 jsou vhodné antioxidanty, které jsou komerčně dostupné přes společnosti jako je Calbiochem a Sigma.

Tabulka 2-Antioxidanty

N-acelyl-L-cysíeín/IIomDcysteín.

Glutathion

6-hydroxy-2_?5,7-8-ietraniethylchroman-2-karboxylová kyselina (Trolox)

Lipoová kyselina

Methíonin

Thiosulfát sodný

Platina

Glycm-glycin-histídin (tripeptid)

Butylovaný hydroxytoiuen (BLÍT)

Ze zmíněných antioxidantů je výhodný glutathion. Koncentrace asi 0,05 mg/ml až do asi

1,0 mg/ml zvyšují stabilitu kompozicí faktoru VIII a má se za to, že i vyšší koncentrace by také mohly být účinné (do okamžiku jakýchkoliv toxických projevů nebo nepříznivých jevů, jako je např. snížení teploty přeměny skla lyofilizovaných produktů). Je zjištěno, že zvláště kombinace histidinu a glutathionu má prospěšný vliv na stabilitu kompozicí faktoru VIII. Histidin použitý 25 jako pufr, může také působit jako chelátor kovů. Inaktivace faktoru VIII je do značné míry způsobena kovy indukovanou oxidací, histidin tedy může stabilizovat faktor VIII vázáním oxidačních kovových iontů. Má se za to, že navázáním těchto kovových iontů glutathion (nebo jakýkoliv jiný přítomný antioxidant) zajistí ochranu proti další oxidaci, protože oxidační účinek kovových iontů vázaných histidinem byl potlačen.

V kompozicích tohoto vynálezu mohou být také použita jiná chelatační činidla. Tato činidla přednostně vážou kovy jako jsou měď a železo s větší afinitou než vápník, je-li v kompozici použita vápenatá sůl. Jedním takovým chelátorem je deferoxamin, který usnadňuje odstranění A1++ a železa. Deferoxaminmesylát, CTdkxNTVCILCFS, je možné získat od firmy Sigma 35 (Sigma Prod. No. D9533). Je to chelátor hliníku a železa (II), který váže pouze železo (jako 1 : 1 chelatační komplex) v oxidačním stavu 3+, nikoliv v oxidačním stavu 2+, ale může také vázat ionty manganu a jiných kovů. Deferoxamin může být použit výhodně v množství 0,25 mg/1.

Faktor VIII použitý v kompozicích tohoto vynálezu může být buď velice čistý faktor VIII z 40 lidské plazmy, nebo výhodněji faktor VIII vytvořený rekombinantní technikou. Rekombinantní

-6CZ 307715 B6 faktor VIII může být produktem buněk vaječníku čínského křečka (CHO) transfektováných s vektorem, který nese sekvenci DNA kódující molekulu faktoru VIII. Metody přípravy transfektních CHO buněk popisuje Toole, Jr, mimo jiné, v patentu US 4 757 006, ale alternativní metody jsou odborníkům také známé (viz. např. patent US 4868112, také od Tooleho, Jr. a PCT mezinárodní patentová přihláška WO-A 91/09122). Metody použití pro kultury buněk CHO k produkci faktoru VIII jsou odborníkům také známé, např. evropská patentová přihláška EP 0362218 pro Genetics Institute, nazvaná Vylepšená metoda produkce faktoru VIII: proteiny typu - C. Rekombinantní faktor VIII však může být produkován i jinými buňkami, jako jsou např. buňky ledvin malého křečka (BHK). Samotná molekula faktoru VIII, je-li připravena rekombinantně, může být buď celá molekula faktoru VIII nebo jen její část, jako např. B doména molekuly faktoru VIII.

Zatímco kompozice faktoru VIII popsané v této patentové přihlášce mohou být lyofilizovány a rozředěny v daných koncentracích, odborníkům v oboru je zřejmé, že tyto přípravky mohou být zředěny na zředěnější formu. Např. přípravek podle tohoto vynálezu, který je normálně lyofilizován a/nebo rozředěn v 2 ml roztoku, může být také rozředěn ve větším množství, např. v 5 ml. Toto ředění je zvláště vhodné při přímé aplikaci přípravku faktoru VIII pacientovi, nicméně v tomto případě faktor VIII neztrácí svou aktivitu tak rychle, jako je tomu ve zředěnějších roztocích faktoru VIII.

Formulace a provedení lyofilizace

Za účelem dosažení maximální stability jsou kompozice faktoru VIII tohoto vynálezu lyofilizovány. Během lyofilizace je faktor VIII přeměněn z vodné fáze na amorfní pevnou fázi, čímž je protein chráněn před chemickou a/nebo konformační nestabilitou. Lyofilizované přípravky obsahují nejen amorfní fáze, ale i složky, které krystalizují během lyofilizace. Záměrem je rychlé proběhnutí lyofilizace kompozice faktoru VIII a utvoření co nej lepšího koláče (tzn. koláče, který je co nejméně smrštěný ze stran kontejneru, ve kterém byl lyofilizován). V přípravcích tohoto vynálezu jsou obsaženy stabilizátory, které existují zejména v amorfní fázi lyofilizovaného produktu, zatímco objemová činidla (kromě HES) krystalizují během mrazení.

Jak faktor VIII, tak stabilizátor jsou rozptýleny v amorfní fázi lyofilizovaného koláče. Hmota stabilizátoru je také srovnatelná s dalšími vehikuly v amorfní formě. Dále výhodná teplota zdánlivé přeměny skla (Tg') amorfní fáze je relativně vysoká během sublimačního sušení a výhodná teplota přeměny skla (Tg) pevné láky je rovněž vysoká během skladování. Bylo zjištěno, že krystalizace chloridu sodného v produktu je žádoucí, dokud amorfní chlorid sodný nepotlačí Tg' amorfní fáze.

Za účelem vyhnout se zborcení koláče jednotlivých kompozic, se první sušení provádí při teplotě produktu, která je nižší než teplota zdánlivého přechodu skla zmrazeného koncentrátu. Prodloužení doby sušení může být také požadováno pro kompenzaci snížení Tg'. Další informace o lyofilizaci je možné nalézt v Carpenter, J. F. a Chang, B. S., Lyophilization of Protein Pharmaceuticals, Biotechnology and Biopharmaceutical Manufacturing, Processing and Preservation, K. E. Avis and V. L. Wu, eds. (Buffalo Grove, IL: Interpharm Press, lne.), pp. 199264 (1996).

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Účinky koncentrace faktoru VIII a přídavku stabilizátoru na regeneraci faktoru VIII byly předmětem několika studií. Tyto studie byly provedeny za použití mannitolu jako modelového objemového činidla a sacharózy jako modelového stabilizátoru. V těchto studiích byly zkoumány

-7 CZ 307715 B6 tri vzorky popsané níže v tabulce 3. Všechny studované vzorky obsahovaly 10 mM Tris, 200 mM NaCl, 8 % mannitolu, 4 mM CaCL a 0,02 % Tween-80 a byly měřeny při pH 7,0.

Tyto vzorky byly lyofilizovány cyklem sublimačního sušení, popsaným v tabulce 4 níže, za účelem udržení teploty produktu pod teplotou zdánlivé přeměny skla (Tg¹). Diferenciální kalorimetrické snímání (DSC) určilo přeměnu při přibližně -40 °C ve složení obsahujícím mannitol. Za účelem udržet teplotu produktu pod touto hranicí byla limitní teplota během prvního sušení nastavena na -32 °C. První sušení za těchto podmínek probíhalo po dobu 55 hodin a celková doba cyklu byla asi 80 hodin.

Tabulka 4

! Metody	Popis j
I	Zchladit na +5 °Č \|
(mrazení)	Zchladit na -5 °C při l°/minutu_# udržet po dobu 20 minut; \| Zchladit na -20 °C ± 5 °C při I °/minutu, udržet po dobu 1 hodiny (do 3 hodin); Zchladit na-45 °C při 0,5 7minutu, udržet po dobu 1 hodiny.
II	Mrazení metodou I Udržet při -35 °C po dobu 48 hodin
III	Mrazení metodou I Udržet při -35 °C po dobu 48 hodin
	Udržet při -20 °C po dobu 48 hodin !
IV	Podložka teplota -32 °C během prvního sušení po dobu asi 55 hodin \|
(sublimační	(do 100 hodin) \|
1 sušení)	Produkt < -40 °C během prvního sušení;
\|	Pokles z -32 °C na +40 °C pří 0,2 °C/minutu;
\|	Podložka teplota +40 °C během, druhého sušení po dobu 3 hodiny. j

Aktivita faktoru VIII těchto vzorků, určená pomocí jednostupňového testu, byla porovnávána s kontrolním vzorkem udržovaným při -45 °C. Výsledky testu jsou shrnuty v tabulce 5.

Tabulka 5

Proces Metoda	% ztráty aktivity faktoru Vili během každého z kroků
	Formulace 1A (600 IU/ml)	Formulace IB (60 IU/ml)	Formulace IC (60 IU/ml, 2 % sacharosy)
1	6,7	37,5	41,7
II	2,0	9,3	3,9
III	7,3	11,6	5,0
IV (lyofilizace)	20,0	24,2	18,3

Tyto výsledky ukazují na to, že koncentrace proteinu má vliv na regeneraci faktoru VIII během mrazení. Formulace obsahující 60 IU/ml ztratí během mrazicího kroku přibližně 37 až 42 % z počáteční aktivity faktoru VIII, zatímco formulace obsahující 600 IU/ml ztratí 6,7 % aktivity faktoru VIII. Tyto výsledky ukazují, že vyšší koncentrace proteinu má ochranný efekt během mrazení. Ačkoliv sacharóza vykazuje určitou ochranu faktoru VIII během střední teploty stejně dobře jako během sublimačního sušení, její schopnost ochrany se ztrácí během počátečního mrazicího kroku.

Příklad 2

Následuje vylepšení lyofílizačního postupu naznačeného v příkladu 1 a dále optimalizace tohoto postupu. Zjistilo se, že lyofilizované kompozice, které vyšší teplotu přeměny skla (a teoreticky lepší stabilitu faktoru VIII) mohou být vytvářeny: (1) snížením počáteční mrazicí teploty na -45 °C nebo nižší (jako např. snížením teploty na -50 nebo -55 °C); (2) zvýšením teploty na -20 nebo -22 °C (±5 °C) a potom (3) opětným snížením teploty na-45 °C nebo nižší. Teplota je snižována nebo zvyšována podle potřeby o 0,5 °C a asi 1,0 °C za minutu. V okamžiku dosažení požadované teploty se kompozice udržuje při této teplotě po dobu mezi 1 a 3 hodinami. Tento vylepšený mrazicí cyklus je popsán v tabulce 6.

Tabulka 6

í Mrazící metoda	Popis \|
I í t	Zchladit na +5 ^cC _pjj 0.5 j χ í Zchladit na -5 =<: pří 0,5 až f °c/minutu, udržet po dobu 201 minut; 1 Zchladit na teplotu mezi -55 a -45 ^CC při 0,5 až 1 °C/minutu, udržet po dobu asi 1 hodiny; Ohřát na -22 ⁰C (±5 ^eC)pH 0,5 až 1 -'C/minutu, udržet po \| t dobu 1 až 3 hodiny; i Zchladit na -45 °C při 0,5 až 1 'V/minutu, udržet po dobu \| asi 1 hodiny \|

-9CZ 307715 B6

Pokud není uvedeno jinak, teploty uvedené v tomto příkladě a v dalších příkladech se vztahují na teplotu podložky v lyofilizéru, a nikoliv na teplotu produktu per se. Následuje vylepšený mrazicí cyklus, zbytek lyofílizačního procesu může být proveden, jak bylo naznačeno výše v příkladu 1, nebo jak zde bude dále popsáno, nebo podle stanovení odborníků v oboru.

Tento lyofilizační postup je zejména vhodný pro formulace, které obsahují glycin, jakožto objemové činidlo, a také pro formulace obsahující mannitol. Dále se má za to, že je použitelný i pro formulace tohoto vynálezu, které obsahují jiná objemová činidla.

Příklad 3

Má se za to, že pro tvorbu sublimačně sušeného produktu s akceptovatelným vzhledem koláče a teplotou přeměny skla, je potřeba, aby objemová činidla lyofilizováných farmaceutických přípravků, které obsahují chlorid sodný, jako např. glycin nebo mannitol, krystalizovala. Proto byl vypracován vylepšený lyofilizační postup pro krystalizaci objemových činidel.

Tabulka 7a - Mrazicí kroky

Krok	Teplota	Doba trvání kroku
j Počáteční mrazení	-40 C nebo méně	1 hodina
i První žíhání	mezi -23 a -27 °C	3 hodiny
\| Druhé mrazení	-55 °C	1 hodina
i Druhé žíhání	-36 °C	4 hodiny
i Třetí mrazení í	-50 C	1 hodina

Tabulka 7b - Kroky sublimačního sušení

Krok	Teplota	Doba trvání kroku
První sušení	-35 °C	do 100 hodin
Druhé sušení: první krok	40 °C	3 hodiny
Druhé sušení: druhý krok	45 °C	3 hodiny
Druhé sušení: třetí krok	50 °C	3 hodiny ........

Změny teplot mrazicích kroků jsou prováděny v rozmezí 0,5 °C/minutu a 1 °C/minutu. Ovšem má se za to, že i kroky delšího trvání by mohly být efektivní.

Před prvním mrazicím krokem je třeba udržet teplotu mezi asi 2 a 8 °C po dobu asi jedné hodiny, aby všechny nádobky měly přibližně stejnou teplotu. Poté je lyofilizér zchlazen na teplotu -5 °C. První lyofilizační krok by měl být prováděn při teplotě nižší než -30 °C, výhodně pod -35 °C, a výhodněji asi -40 °C. Poté následuje první žíhací krok, který se provádí při teplotě mezi -30 a -19 °C, výhodněji buď mezi -25 a -28 °C je-li použit glycin jako objemové činidlo) nebo, mezi -21 a -24 °C (je-li použit mannitol jako objemové činidlo), a nejvýhodněji při teplotě -23 a -26 °C. Při těchto teplotách by měla objemová činidla alespoň částečně krystalizovat. Nižší

- 10CZ 307715 B6 stupeň, asi -27 °C, však není doporučován zejména pro formulace obsahující mannitol a arginin. Tento krok trvá po dobu asi 3 hodin.

Následuje první žíhací krok, teplota se sníží na teplotu nižší než asi -50 °C a výhodněji až na -55 °C a níže, po dobu asi 1 hodiny. Při této teplotě chlorid sodný v přípravcích vytváří zárodky.

Během druhého žíhacího kroku se teplota farmaceutického přípravku zvýší na teplotu mezi -30 a -39 °C, výhodná teplota pro kompozice obsahující mannitol je -33 °C a pro kompozice obsahující glycin je tato teplota -36 °C. Při této teplotě by měly, alespoň částečně, růst krystaly NaCl. Tento krok probíhá po dobu asi 4 hodin. Poté je teplota v lyofilizéru snížena na -50 °C, výhodně na dobu asi 1 hodiny, čímž se sníží teplota přípravků.

V následujících krocích sublimačního sušení se mění teplota o hodnoty 0,l°C/minutu a 0,5 °C/minutu. Po zredukování tlaku na asi 8,666 Pa (65 mTorr) se teplota zvýší na -32 až

-35 °C pro první sušení. Při této teplotě sublimují ledové krystaly v přípravcích. Tento krok trvá do 100 hodin, nebo do doby, dokud většina ledu nevysublimuje z přípravků. Okamžik, ve kterém většina ledu vysublimovala, se dá určit např. senzorem teploty orosení, který indikuje konec sublimace poklesem křivky (inflexní bod).

Následuje první sušení, při kterém se teplota zvýší na +40 °C, výhodně při hodnotách 0,2 °C/minutu, čímž se započne druhé sušení pro odstranění vody z přípravku. Tuto teplotu je výhodně udržovat po dobu asi 3 hodin. V druhém a třetím sušení následujícím po prvním kroku se teplota zvýší na teplotu asi +45 °C na dobu asi 3 hodin, a poté na teplotu asi +50 °C na dobu 3 hodiny a více. Tímto se zredukuje vlhkost lyofilizačního koláče na hodnotu menší než 2 % (hmotn./hmotn).

Příklad 4

Další studie byly prováděny pro zjištění specifického efektu histidinu na lyofilizované kompozice faktoru VIII, které obsahovaly glycin nebo mannitol jako objemové činidlo. Pro detekci krystalizace těchto objemových činidel během mrazení byl použit nevratný tepelný tok (Modulated DSC, mDSC). Jak teplota krystalizace, tak celkové teplo byly určeny z krystalizační exotermy. Určená eutektická teplota tání endotermy NaCl během ohřívání byl použit pro určení krystalizace NaCl. Pomocí mDSC a použitím signálu celkového tepelného toku bylo určeno prodloužení krystalizace jako poměr entalpie tání přípravku a entalpie tání čistého roztoku NaCl. Dále byla provedena rentgenová difrakční analýza za účelem odhadnout krystalizaci v lyofilizovaných přípravcích.

Zatímco koncentrace histidinu menší než 20 mM nemá zásadní vliv na krystalizaci glycinu, koncentrace 50 nM histidinu redukuje rozsah krystalizace glycinu. Během mrazení formulací, které obsahují glycin, nebyly pozorovány definované krystalizační exotermy NaCl. Avšak, endotermy eutektického tání během zahřívání ukazují, že NaCl krystalizovala (>50 %) po mrazení při teplotě nižší než -50 °C a žíhání při -30, -35 a -40 °C. Zahrnutí 50 mM histidinu do přípravků obsahujících glycin zpomaluje krystalizaci NaCl. Následkem toho je trojnásobné prodloužení doby žíhání, aby bylo dosaženo ekvivalentní krystaličnosti.

Avšak vliv 20 mM histidinu na krystalizaci NaCl ve formulacích obsahujících glycin byl minimální. Pomocí studií sublimačního sušení bylo zjištěno, že ve formulacích glycinu obsahujících 50 mM histidinu, se vyskytuje viditelné zborcení lyofilizovaného koláče. Data získaná rentgenovou práškovou difrakční analýzou dokazují snížení krystalizace NaCl ve vzorcích, které obsahují histidin. V přípravcích, které obsahují mannitol, krystalizuje obvykle 83 až 90 % chloridu sodného, bez potřeby žíhání, během mrazení při teplotách mezi -40 a -50 °C. Zatímco zahrnutí 20 mM histidinu do přípravků potlačuje krystalizaci NaCl během mrazení, výsledkem žíhání je přibližně 40% krystalizace NaCl.

- 11 CZ 307715 B6

Proto v přípravcích obsahujících objemová činidla jako glycin a mannitol, a NaCl, může přídavek histidinu snižovat rozsah krystalizace NaCl. Ačkoliv toto může vést k poničení koláče utvořeného během lyofilizace, použití relativně nízké koncentrace histidinu může v přípravcích tento efekt zmírnit. Nicméně přijatelný koláč byl vytvořen i s koncentracemi histidinu 35mM a 50mM. Histidin může být také přidán do HEPES, jako objemové činidlo v přípravcích, které obsahují glycin nebo mannitol. Použití HEPES snižuje Tg' ve větším rozsahu než obdobné množství histidinu.

Příklad 5

Předmětem dalších studií bylo měření fyzikálních charakteristik několika možných formulací faktoru VIII, které zahrnují sedm stabilizátorů přicházejících v úvahu a pět objemových činidel. Kromě objemového činidla a stabilizátoru, všechny formulace uvedené v tabulce 8 níže (kromě formulace 11) obsahují 10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 0,02% Tween-80, 4 mM CaCL a při pH 7,0. Formulace 11 obsahuje 10 mM Tris-HCl, 0,02% Tween-80, a 4 mM CaCL, také při pH 7,0. Všechna pH měření byla prováděna při teplotě okolí.

Tabulka 8

Vzorek I.D.	Objemové činidlo	Stabilizátor proteinu
1	8% Mannitol	2% Sacharosa
2	8% Mannitol	2% Trehalosa
3	8% Mannitol	2% Rafinosa
4	8% Mannitol	2% Arginin
5	8% Mannitol	2% Lysin
6	8% Mannitol	2% Sorbitol
7	8% Mannitol	2% Glycerol
8	4% Hydroxyethylovaný škrob	2% Sacharosa
9	8% Glycin	2% Sacharosa
10	8% Glycin	2% Trehalosa
11	400 mM NaCl	2% Sacharosa
12	8% Alanin	2% Sacharosa

Pro předurčení chování během sublimačního sušení byly měřeny teplota zborcení, pomocí sublimačního mikroskopu, a termální přeměny pomocí DSC. DSC, rentgenová prášková difirakční analýza a polarizační mikroskop byly také použity pro určení krystaličnosti lyofilizovaných vzorků. Byly také hodnoceny vzhled a rekonstituční čas vzorků. Výsledky všech měření jsou shrnuty dále v tabulce 9.

- 12CZ 307715 B6

Sorbitol a glycerol mají přeměnu skla při <10 °C. DSC neměří teploty v tomto rozsahu, n/c = není čistý

T_pc = teplota částečného zborcení, měřená sublimačním mikroskopem

T_c = teplota úplného zborcení, měřená sublimačním mikroskopem

T_g = teplota přeměny skla

S výjimkou mannitolu: lysinu, mají všechny formulace přiměřený fyzikální vzhled. Lysin znesnadňuje krystalizaci jak mannitolu, tak glycinu, což má za následek snížení teploty přeměny skla a zborcení lyofilizovaného koláče.

Příklad 6

Kompozice faktoru VIII popsané v tabulce 8 výše, byly skladovány při -70, 25, 40 a 50 °C po dobu různých časových úseků, čímž byla ověřována jejich stabilita. Stupně aktivity faktoru VIII byly měřeny po 2 týdnech, 1 měsíci, 2 měsících a 3 měsících, všechny výsledky jsou shrnuty v tabulce 10 níže. Dva vzorky, první obsahující mannitol jako objemové činidlo a sorbitol jako stabilizátor, a druhý obsahující mannitol jako objemové činidlo a glycerol jako stabilizátor, vykazovaly nízkou stabilitu. Všechny zbývající formulace vykazovaly schopnost stabilizovat faktor VIII.

- 13 CZ 307715 B6

Tabulka 10

Popis složení	Teplota (^í:’C)	počáteční % v měsících
		0	0.5	1	2	3
Glycin-.Sacharosa	-70	100,00	97.43	101,71	99.89	97.97
	25	100,00				85,44
	40	100,00		79,87	71,52	63,06
	50	100.00	76,34	67,99	52,14	47,64
GheiirTrehalosa	-70	100.00	89,22	96,00	95,90	94,64
	25	100,00				83,17
	40	100.00		79,93	72,42	68,03
	50	100,00	80,97	64,28	57,60	50,92
M anni t ol: Trehalo sa	-70	100,00	91,32	97,72	96,10	98.26
	25	100,00				85,79
	40	100.00		82,54	70,72	59,44
	50	100.00	66,16	65,51	48,81	52,06
Manni tok Sacharosa	-70	100.00	100,45	100,56	105,47	99,22
	25	100,1X1				87,04
	40	100,00		85,59	80,78	55,42
	50	100,01}	81,68	75,53	57,88	43,46
	-70	100,00	102.26	105,53	103,72	105,08
	35	100,00			s	95.15
	100,00		91,53	80,93 \|	69,19 i
	50	100.00	82,28	............... 68.00 i	56,32	45,94
ManmíetRafínosa	-70	100.00	93.88	98.41	Ϊ60.Μ	193,62
	25	1.00,00				83.13
	40	KK1.00		73..61	67,16
	50	1W0	7L69	68,52	54,25	47.11
MannhukGkeeml	...............S......... '· -70 š
	25				_{::: ::::} J
	40
	50				....................5
	-70	100,00

- 14CZ 307715 B6

	25	100,00	7 2
	40	100 00
	50	100.00	32,73 i
	-70	IO0.00	102,74	103,03	100,96
	25	KO
	40	100,09			37,47
	50	ÍB.oo	71.47	67.40
	-70	1 ¢)0,00 188,54	<44	95,5 8
	25	100.00
	40	100.00		?L5ú	58.30
	50	i 00.00	52,71	37,00	30,34
	-70	100,00		IHó?	108.96
1...................................................	25	100,00
	40	100,00		92.99	73,03
	50	íotw		74.91	W
' G-lyein Rafmosn	-70	100,00	111,57	114,51	IO5J5
	25	100,00
	40	100,00		89,20	82, W
	50	100,00	93,23	72,22	53,24

Příklad 7

Na základě informací dosažených během studií popsaných v příkladech 5 a 6, bylo rozhodnuto, že formulace přicházející v úvahu, které mají vehikula popsaná v tabulce 11 níže, budou vyvíjeny dále.

- 15 CZ 307715 B6

Tabulka 11

Vehikulum	Koncentrace
mannitol nebo glycin	6 až 9 %
arginin nebo trehalosa	laž3 %
tween 80	0,005 až 0,04%
NaCl	200až250 mM
CaCl₂	3 až 5 mM
TRIS	2Óaž30 mM
histidin nebo HEPES	10až50 mM
glutaťhton	0,15 až 0,25 mg/ml

Na základě parametrů byly vyvinuty následující specifické formulace:

Tabulka 12

Formulace Č.l	Formulace č.2	Formulace Č.3
10 mM HEPES	lOmM HEPES	lOmM HEPES
20 mM Tris	20 mM Tris	20 mM Tris
225 mM NaCl	225 mM NaCl	225 mM NaCl
0,03% (obj./obj.) Tween-	0,03% (obj./obj. )Tween-80	0,03% (obj./obj.)Tween-80
80	8% (hmotn./obj.) glycin	8% (hmotn./obj.) mannitol
š 8% (hmotn./obj.) mannitol	2? f íhinmn. bbj n trehalosa	2% (hmotn/obj.) arginin \|
2% (limetu to Oj) trehalosa	0,2 mg/ml redukwanéha	0,2 mg/ml redůkovatJéhn
0,2 mg/ml redukovaného	ghitalhionu	glůtathionu
glúW&kmu	4 mM CaCIj	4 mM CaCl?

mM CaCIz

- 16CZ 307715 B6

Formulace č.4	Formulace č.5
25 mM histidin	25 mM histidin
20 mM Tris	20 mM Tris
225 mM NaCl	225mMNaCl
0,03% (obj./obj.) Tween-80	0,03 % (obj./obj.) Tween-80
8% (hmotn./obj.) mannitol	8 % (hmotn./obj.) glycin
2% (hmotn./obj.) trehalosa	2% (hmotn./obj.) trehalosa
0,2 mg/ml redukovaného	0,2 mg/ml redukovaného
glutathionu	glutathionu
4 mM CaCl₂	4 mM CaCh

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob lyofilizace vodné farmaceutické formulace faktoru VIII prosté albuminu, obsahující krystalizovatelné objemové činidlo aNaCl, vyznačující se tím, že uvedený způsob zahrnuje kroky:

Claims

(a) mrazení farmaceutické formulace při teplotě nižší než -30 °C;

(b) žíhání farmaceutické formulace při teplotě mezi -30 a -19 °C;

(d) žíhání farmaceutické formulace při teplotě mezi -30 a -39 °C, a poté (e) sublimační sušení farmaceutické formulace.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že krok (a) se provádí při teplotě nižší než -35 °C, s výhodou nižší než -40 °C.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že krok (b) se provádí 3 hodiny.

4. Způsob podle kteréhokoliv předchozího nároku, vyznačující se tím, že krok (c) se provádí při teplotě méně než -55 °C.

5. Způsob podle kteréhokoliv předchozího nároku, vyznačující se tím, že krok (c) se provádí 1 hodinu.

6. Způsob podle kteréhokoliv předchozího nároku, vyznačující se tím, že krok (d) se provádí 4 hodiny.

7. Způsob podle kteréhokoliv předchozího nároku, vyznačující se tím, že krystalizovatelné objemové činidlo je mannitol.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že krok (b) se provádí při teplotě mezi -21 a -24 °C.

- 17 CZ 307715 B6

9. Způsob podle nároku 7 nebo 8, vyznačující se tím, že krok (d) se provádí při teplotě -33 °C.

10. Způsob podle kteréhokoliv nároku 1 až 6, vyznačující se tím, že krystalizovatelné objemové činidlo je glycin.

11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že krok (b) se provádí při teplotě mezi -25 a -28 °C.

12. Způsob podle nároku 10 nebo 11, vyznačující se tím, že krok (d) se provádí při teplotě -36 °C.

13. Způsob podle kteréhokoliv předchozího nároku, vyznačující se tím, že po kroku (d) a před krokem (e) je teplota farmaceutické formulace snížena na -50 °C, s výhodou 1 hodinu.

14. Způsob podle kteréhokoliv předchozího nároku, vyznačující se tím, že krok (e) zahrnuje:

(i) snížení tlaku na 8,666 Pa (65 mTorr);

(ii) zvýšení teploty na mezi -32 a -35 °C po dobu až 100 hodin;

(iii) zvýšení teploty na +40 °C na 3 hodiny;

(iv) zvýšení teploty na +45 °C na 3 hodiny; a (v) zvýšení teploty na +50 °C na 3 hodiny.

15. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že vodná farmaceutická formulace obsahuje trehalózu jako stabilizátor, s výhodou při koncentraci od 1 do 4 % hmotn./obj. farmaceutické formulace.