CZ300547B6

CZ300547B6 - Nové formulace faktoru VIII prosté albuminu

Info

Publication number: CZ300547B6
Application number: CZ20012996A
Authority: CZ
Inventors: Besman@Marc; Bjornson@Erik; Jameel@Feroz; Kashi@Ramesh; Pikal@Michael; Tchessalov@Serguei; Carpenter@John
Original assignee: University Of Connecticut; Baxter International Inc.
Priority date: 1999-02-22
Filing date: 2000-02-22
Publication date: 2009-06-10
Also published as: ES2435141T3; PT2193809E; JP2003520764A; PL203893B1; DK1154796T3; ES2288843T3; MXPA01008515A; HK1133583A1; JP5006832B2; JP2009046499A; JP5140539B2; US8372800B2; US7247707B2; DE60035260D1; CA2362927C; JP6155442B2; BR0008405B1; CN101810854A; EP2130554A1; CY1108030T1

Abstract

Kompozice faktoru VIII formulovaná bez albuminu, obsahuje krome faktoru VIII následující formulacní vehikula: 4 % až 10 hmotn./obj. % objemového cinidla, vybraného ze skupiny sestávající z mannitolu, glycinu a alaninu; 1 % až 4 hmotn./obj. % stabilizacního cinidla vybraného ze skupiny sestávající ze sacharózy, trehalózy, rafinózy, argininu; 1 až 5 mM vápenaté soli; 100 až 300 mM NaCl a pufrovací cinidlo pro udržení pH v rozmezí 6 až 8. Použití této kompozice pro prípravu léciva pro lécení hemofilie.

Description

(57) Anotace:

Kompozice faktoru VIJI formulovaná bez albuminu, obsahuje kromě faktoru VIII následující formulační vehikula: 4% až 10 hmotn./obj. % objemového činidla, vybraného ze skupiny sestávající z mannitolu, glycinua alaninu; 1 % až hmotn./obj. % stabilizačního činidla vybraného ze skupiny sestávající ze sacharózy, trehalózy, rafinózy, argininu; 1 až mM vápenaté solí; 100 až 300 mM NaCl a pufrovací činidlo pro udržení pH v rozmezí 6 až 8. Použití této kompozice pro přípravu léčiva pro léčení hemofilíe.

Nové formulace faktoru VIII prosté albuminu

Oblast techniky

Vynález se týká nových formulací faktoru VIII prostých albuminu.

Dosavadní stav techniky to

Faktor VIII je protein nacházející se v krevní plazmě, který se jako kofaktor účastní kaskády reakcí vedoucích ke srážení krve. Nedostatečná aktivita faktoru VIII v krvi má za následek poruchu srážlivosti krve známou jako hemofilie A, dědičný stav postihující především muže. Hemofilie A je v současné době léčena terapeutickými přípravky odvozenými z lidské plazmy nebo vytvořenými použitím technologie rekombinantní DNA. Tyto přípravky jsou aplikovány v případech náhlého krvácení (okamžitá terapie) nebo několikrát, v pravidelných intervalech, jako prevence nekontrolovatelného krvácení (profylaxe).

U faktoru VIII je známo, že je v terapeutických přípravcích relativně nestabilní. V krevní plazmě je faktor VIII obvykle komplexován s dalším plazmatickým proteinem, von Willebrand faktorem (vWF), který je v plazmě přítomen ve velkém molárním přebytku vůči faktoru VIII, a má se za to, že chrání faktor VIII před předčasným rozpadem. Dalším proteinem v plazmě je albumin, který může také hrát významnou roli ve stabilizaci faktoru VIII in vivo. Proto u přípravků obsahující faktor VIII prodávaných v současné době, se v první řadě spoléhá na použití albuminu a/nebo vWF proteinu ke stabilizaci faktoru VIII během jejich výroby a uskladnění.

Ačkoliv albumin a vWF používané v přípravcích faktoru VIII dostupných na současném trhu jsou odvozené z lidské krevní plazmy, má použití těchto materiálů jisté nevýhody. Protože velký molámí přebytek albuminu ve srovnání s faktorem VIII je přidáván za účelem zvýšení stability faktoru VIII v těchto přípravcích, je těžké charakterizovat protein faktor VIII v těchto přípravcích jako takový. Přídavek lidského albuminu do faktoru VIII je chápán jako nevýhoda, pokud jde o přípravky faktoru VIII produkované rekombinantním postupem. Je to proto, že přípravky rekombinantního faktoru Vlil, bez přítomností albuminu, by takto neměly obsahovat žádný lidský protein a teoretické riziko přenosu viru by mělo být redukováno.

Bylo popsáno mnoho pokusů připravit faktor VIII bez albuminu nebo vWF (nebo s relativně nízkým obsahem těchto nosičů). Např. v patentu US 5 565 427 (EP 508 194) (patřící firmě Behringwerke) Freudenberg popisuje přípravky faktoru VIII, které obsahují určité kombinace detergentů a aminokyselin, specificky argininu a glycinu, vedle vehikul jako jsou chlorid sodný a sacharóza. Detergent polysorbát 20 nebo polysorbát 80, je přítomen v množství 0,001 až 0,5 % (obj./obj.), zatímco arginin a glyein jsou přítomny v množství 0,01 až 1 mol/1. Obsah sacharózy je 0,1 až 10 %. Příklad 2 tohoto vynálezu poukazuje na fakt, že roztoky (1), které obsahují 0,75 % sacharózy, 0,4 M glycinu a 0,15 M NaCI, a (2), které obsahují 0,01 M citrátu sodného, 0,08 M glycinu, 0,016 M lysinu, 0,0025 M chloridu vápenatého a 0,4 M chloridu sodného, byly po 16 hodinách nestabilní, zatímco roztoky (3), které obsahují 1 % sacharózy, 0,14 M argininu, 0,1 M chloridu sodného a (4), které obsahují 1 % sacharózy, 0,4 M glycinu, 0,14 M argininu, 0,1 M chloridu sodného, a 0,05 % Tween 80 byly stabilní.

V patentu US 5 763 401 (EP 818 204) (patřící firmě Bayer) Nayer také popisuje terapeutickou formulaci faktoru VIII bez albuminu, obsahující 15 až 60 mM sacharózy, do 50 mM NaCI, do 5 mM chloridu vápenatého, 65 až 400 mM glycinu a do 50 mM histidinu. Následná specifická složení byla identifikována jako stabilní: (1) 150mM NaCI, 2,5 mM chloridu vápenatého a 165 mM mannitolu; a (2) 1 % sacharózy, 30 mM chloridu sodného, 2,5 mM chloridu vápenatého, 20 mM histidinu a 290 mM glycinu. Bylo zjištěno, že složení obsahující větší množství cukru

- 1 CZ 300547 B6 (10% maltózy, 50 mM NaCI, 2,5 mM chloridu vápenatého a 5 mM histídinu) vykazuje nízkou stabilitu v lyofílizovaném stavu, v porovnání se složením (2).

V patentu US 5 733 873 (EP 627 924) (patřící firmě Pharmacia & Upjohn) Osterberg popisuje formulace, které obsahují 0,01 až 1 mg/ml povrchově aktivní látky. Tento patent popisuje formulace, které mají následující obsah vehikul: polysorbát 20 nebo 80 v množství nejméně 0,01 mg/ml, výhodně 0,02 až 1,0 mg/ml; nejméně 0,1 M NaCI; nejméně 0,5 mM vápenaté soli a nejméně 1 mM histidinu. Zvláště pak se zabývá následujícími specifickými formulacemi: (1) 14,7 - 50 65 mM histidinu, 0,31 až 0,6 M NaCI, 4 mM chloridu vápenatého, 0,001-0,02io 0,025 % polysorbátu 80, s nebo bez 0,1 % PEG 4 000 nebo 19,9 mM sacharózy a (2) 20 mg/ml mannitolu, 2,67 mg/ml histidinu, 18 mg/ml NaCI, 3,7 mM chloridu vápenatého a 0,23 mg/ml polysorbátu 80.

Byly také popsány další pokusy použít nízké nebo vysoké koncentrace chloridu sodného. V pa15 tentu US 4 877 608 (EP 315 968) (patřící firmě Rhone-Poulenc Rorer) Lee popisuje formulace s relativně nízkou koncentrací chloridu sodného, jmenovitě formulace obsahují 0,5 mM až 15 mM NaCI, 5 mM chloridu vápenatého, 0,2 mM až 5 mM histidinu, 0,01 až 10 mM lysinhydrochloridu a do 10 % cukru. „Cukrem“ může být až do 10 % maltózy, 10 % sacharózy nebo 5 % manitolu.

V patentu US 5 605 884 (EP 0 314 095) (patřící firmě Rhone-Poulenc Rorer) Lee popisuje použití formulací s relativně vysokou koncentrací chloridu sodného. Tyto formulace obsahují 0,35 M až 1,2 M NaCI, 1,5 až 40 mM chloridu vápenatého, 1 mM až 50 mM histidinu a do 10 % „cukru“ jako je mannitol, sacharóza nebo maltóza. Formulace obsahující 0,45 M NaCI, 2,3 mM chloridu vápenatého a 1,4 mM histidinu je doložen příkladem.

Mezinárodní patentová přihláška WO 96/22107 (patřící firmě Quadrant Holdings Cambridge Limited) Roser popisuje formulace, které obsahují cukr trehalózu. Tyto formulace obsahují: (1) 0,1 M NaCI, 15 mM chloridu vápenatého, 15 mM histidinu a 1,27 M (48 %) trehalózy nebo (2) 0,011 % chloridu vápenatého, 0,12 % histidinu, 0,002 % Tris, 0,002 % Tween 80, 0,004 %

PEG 3350, 7,5 % trehalózy a buď 0,13 %, nebo 1,03 % NaCI.

Další terapeutické formulace faktoru VIII ze stavu techniky obecně obsahují albumin a/nebo vWF za účelem stabilizace faktoru VIII, a tudíž nejsou důležité pro současný vynález. Např.

v patentu US 5 328 694 (EP 511 234) (patřící firmě Octapharma AG) Schwinn popisuje formulaci, která obsahuje 100 až 650 mM disacharidu a lOOmMaž 1,0 M aminokyseliny. Specificky jsou popsány následující formulace: (1) 0,9 M sacharózy, 0,25 M glycinu, 0,25 M lysinu a 3 mM chloridu vápenatého; a (2) 0,7 M sacharózy, 0,5 M glycinu a 5 mM chloridu vápenatého.

Přestože bylo učiněno několik pokusů vytvořit faktor VIII bez albuminu nebo vWF, stále je zde potřeba terapeutických formulací faktoru VIII, kteréjsou stabilní bez přítomnosti albuminu nebo jiných proteinů.

Podstata vynálezu

1. Současný vynález se týká terapeutických kompozic faktoru VIII, které jsou stabilní bez přítomnosti albuminu. Zvláště se tento vynález týká Kompozice faktoru VIII, formulovaná bez přídavku albuminu k uvedené kompozici, vyznačující se tím, že kromě faktoru VIII obsahuje následující formulační vehikula:

% až 10 hmotn./obj. % objemového činidla vybraného ze skupiny sestávající z mannitolu, glycinu a alaninu; 1 % až 4 hmotn./obj. % stabilizátoru vybraného ze skupiny sestávající ze sacharózy, trehalózy, rafinózy a argininu; 1 až 5 mM vápenaté soli; 100 až 300 mM NaCI; a pufrovací činidlo pro udržení pH na hodnotě mezi 6 a 8. Tato kompozice může případně obsahovat

-2CZ 300547 B6 povrchově aktivní látku jako polysorbát 20, polysorbát 80, Pluronie F68 nebo Brij 35. Je-li povrchově aktivní látka polysorbát 80, může být přítomna v množství menším než 0,1 hmotn./ obj. %.

Výhodná koncentrace pufrovacího činidla kompozic faktoru VIII tohoto vynálezu je od 10 do

50 mM, a je vybráno ze skupiny sestávající z histidinu, Tris, BIS-Tris Propanu, PIPES, MOPS,

HEPES, MES a ACES. Výhodné pufrovací činidlo je buď histidin nebo Tris. Kompozice faktoru VIII tohoto vynálezu může dále obsahovat antioxidant.

Kompozice faktoru VIII tohoto vynálezu zahrnují jak objemové činidlo tak stabilizátor. Objemoio vé činidlo může být přítomno v množství od asi 6 % do asi 8 hmotn./obj. %, výhodně asi hmotn./obj. %. Výhodné množství stabilizátoru je asi 2 hmotn./obj. %. V těchto kompozicích je také zastoupen chlorid sodný, výhodné v množství od 150 do 350 mM a výhodněji v množství asi 225 mM. Vápenatou solí v kompozici je také výhodně chlorid vápenatý, a to výhodně v lyofilizované formě.

V dalším provedení může tento vynález obsahovat kompozici faktoru VIII, utvořenou bez přídavku albuminu, která zahrnuje následující složky, kromě faktoru VIII: 2 % až 6 hmotn./obj. % hydroxyethyl ováného škrobu; 1 % až 4 hmotn./obj. % stabilizátoru vybraného ze skupiny sestávající ze sacharózy, trehalózy, rafínózy, argininu; 1 až 5 mM vápenaté soli; 100 až 300 mM NaCI a pufrovacího činidla pro udržení pH přibližně mezi hodnotami 6 a 8. Výhodně takové kompozice obsahuji asi 4 hmotn./obj. % hydroxyethy lo váného škrobu a NaCI v množství 200 mM. Výhodné množství stabilizátoru je asi 2 hmotn./obj. %.

V dalším provedení tohoto vynálezu kompozice faktoru VIII, utvořená bez albuminu, obsahuje

3 00 až 500 mM NaCI; 1 % až 4 hmotn./obj. % stabilizátoru vybraného ze skupiny sestávající ze sacharózy, trehalózy, rafínózy, argininu, 1 až 5 mM vápenaté soli a pufrovací činidlo pro udržení pH přibližně mezi hodnotami 6 a 8. Výhodně je koncentrace NaCI asi 400 mM.

V ještě dalším provedení tento vynález zahrnuje postup lyofilizace vodné kompozice faktoru VIII v nádobě za použití lyofilizéru, přičemž postup zahrnuje počáteční mrazicí krok a počáteční mrazicí krok dále zahrnuje kroky: (a) snižování teploty v lyofilizační komoře na teplotu nejméně asi -45 °C; (b) zvyšování teploty v lyofilizační komoře na hodnotu mezi asi -15 a-25 °C a následné (c) snižováni teploty v lyofilizační komoře na teplotu nejméně asi -45 °C. V tomto postupu je výhodné, je-li teplota v komoře snižována nebo zvyšována v rozmezí mezi 0,5 a

1,0 °C za minutu. V kroku (a) je teplota udržována výhodně po dobu 1 hodiny a je snižována na teplotu asi -55 °C. V kroku (b) je teplota udržována výhodně mezi -15 a -25 °C po dobu 1 až 3 hodiny a výhodněji je-li teplota -22 °C, a teplota v kroku (c) je výhodně udržována po dobu 1 hodiny. Preferovaná kompozice faktoru VIII použitého v tomto postupu obsahuje mezi 4 % a 10 hmotn./obj. % činidla vybraného ze skupiny sestávající z mannitolu, glycinu a alaninu a dále obsahuje mezi 1 % a 4 hmotn./obj. % činidla vybraného ze skupiny sestávající ze sacharózy, trehalózy, rafínózy a argininu. Dále kompozice faktoru VIII použitá v tomto postupu také obsahuje mezi 100 a 300 mM NaCI.

Podrobný popis vynálezu

Definice

Jak zde bude používáno, termíny uvedené níže a jejich obměny jsou definovány následovně, není—li uvedeno jinak:

Faktor VIII — molekula faktoru VIII se vyskytuje přirozeně a v terapeutických přípravcích jako heterogenní distributor polypeptidů vznikajících jako produkt jednoho genu (viz, např. Andersson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83, 2979-2983, květen 1986). Termín „faktor Vlil“, jak bude dále používáno, se vztahuje na všechny takové polypeptidy, ať už odvozené z krevní plazmy

-3CZ 300547 B6 nebo produkované za použití techniky rekombinantní DNA. Příklady komerčně dostupných terapeutických přípravků obsahujících faktor VIII, zahrnují přípravky prodávané pod obchodními názvy HEMOFIL M a RECOMBINATE (patřící firmě Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, Illinois, U.S.A.). Další přípravky v současném vývoji obsahují jednoduchou subpopulaci molekul faktoru VIII, která postrádá část domény B molekuly.

Mezinárodní jednotka, IU-Intemational Unit nebo IU, je jednotka měření aktivity srážlivosti krve (účinnosti) faktoru VIII, měřená standardními testy, jako jsou následující:

Jednostupňový test. Jednostupňové testy jsou odborníkům známé, takovým testem je např. test popsaný v Lee, Martin L, et al., An Effeet of Predilution on Potency Assays of Factor VIII Concentrates, Thrombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30, 511-519(1983).

Chromogenní test. Chromogenní testy mohou být k zakoupení, jako např. Coatest Factor VIII, dostupný od firmy Chromogenix AB, Molndal, Švédsko.

Žíhání - termín „žíhání“ může být použit jako označení kroku v lyofilizacním postupu pro farmaceutické přípravky podstupující lyofilizaci, přednostně pro sublimační sušení přípravků, při kterém je teplota přípravku zvýšena z nízké teploty na vyšší a poté, po určitém čase opět snížena.

Objemové Činidlo - pro účely této patentové přihlášky jsou objemová činidla takové chemické látky, které zajistí strukturu „koláče“ nebo tvoří zbytkovou pevnou hmotu farmaceutických přípravků po jejich lyofilizaci a chrání je před rozpadem. Objemová činidla schopná krystalizovat, jsou míněna objemová činidla popsaná v přihlášce, která mohou krystalizovat během lyofilizace, jinak než chlorid sodný. HES není zahrnut v této skupině krystalizovatelných objemových činidel.

Sublimační sušení, mrazení, lyofilizace - termín „sublimační sušení“, pokud není v textu uvedeno jinak, se používá pro označení části lyofilizačního postupu, ve které se teplota farmaceutických přípravků zvyšuje za účelem odstranění vody z těchto přípravků. Termín „mrazicí“ kroky lyofilizačního postupu jsou ty kroky, které se objevují hlavně před stavem lyofilizace. Termín „lyofilizace“, není-li uvedeno jinak, se vztahuje na celý lyofilizační postup, který zahrnuje jak mrazící kroky, tak kroky sublimačního sušení.

Není—li poznamenáno jinak, termíny v procentech vyjadřují hmotnostní/objemová procenta a teploty jsou ve stupních Celsia.

Složení komponent

Kompozice faktoru VIII tohoto vynálezu zahrnují objemová činidla, stabilizátory, pufrovací činidla, chlorid sodný, vápenaté soli a výhodně další vehikula. Tato vehikula jsou vybrána za účelem maximalizovat stabilitu faktoru VIII v lyofilizovaných přípravcích. Stejně tak jsou kompozice faktoru VIII podle předkládaného vynálezu stabilní v tekutém stavu.

Objemová činidla použitá v předkládaných formulacích, která tvoří krystalickou část lyofilizovaného produktu (kromě případu HES), jsou vybrána ze skupiny sestávající z mannitolu, glycinu, alaninu a hydroxyethylovaného škrobu (HES). Mannitol, glycin nebo alanin jsou přítomny v množství 4 až 10 %, výhodně 6 až 9 %, a výhodněji asi 8 %. Je-li použit HES jako objemové činidlo, je přítomen v množství 2 až 6 %, výhodně 3 až 5 %, a výhodněji asi 4 %.

Stabilizátory použité ve formulacích podle vynálezu jsou vybrány ze skupiny sestávající z sacharózy, trehalózy, rafínózy a argininu. Tato činidla jsou ve formulacích podle tohoto vynálezu přítomna v množství mezi 1 až 4 %, výhodně 2 až 3 %, výhodněji asi 2 %. Sorbitol a glycerol byly ohodnoceny jako možné stabilizátory, ale jejích stabilizační schopnosti v tomto vynálezu byly nedostačující. Chlorid sodný je v tomto vynálezu přítomen v množství 100 až 300 mM, výhodně

-4CZ 300547 B6

150 až 50 mM a výhodněji asi 225 mM. V jednom provedení současného vynálezu může být chlorid sodný použit bez výše uvedených objemových činidel, přičemž by byl přítomen v množství mezi 300 a 500 mM NaCl, výhodně 350 až 450 mM NaCl a výhodněji asi 400 mM NaCl.

Dále jsou v těchto přípravcích pufrovací činidla, jelikož se má za to, že molekula faktoru VIII může být nepříznivě poškozena změnou pH během lyofílizace. Hodnota pH by měla být v průběhu lyofilizace udržována v rozmezí hodnot 6 až 8 a výhodněji asi hodnoty pH 7. Pufrovací činidla mohou být fyziologicky akceptovatelné chemické látky nebo kombinace chemických látek, které mají schopnost fungovat jako pufry. Jsou to histidin, Tris, BIS-Tris Propan, PIPES, MOPS, HEPES, MES a ACES. Kompletní chemické pojmenování těchto pufrovacích činidel je uvedeno níže v tabulce 1. Standardní koncentrace použitých pufrovacích činidel je 10 až 50 mM. Je-li v přípravcích použit histidin, jsou použity koncentrace přes 20 mM a výhodně asi 25 mM. Používá se samotný nebo v kombinaci s dalšími pufrovacími činidly jako je Tris. Obzvláště je histidin preferován pro kompozice tohoto vynálezu, jak se podrobně popisuje níže.

Tabulka 1 - Pufrovací činidla

Tris	tris-(hydroxymethy 1 )-aminomethan
BIS-Tris Propan	l,3-bis-[tris-(hydroxy-methyl)inethylamino]-propan
PIPES	piperazin-N,N'-bis-(2-ethansulfonová kyselina)
MOPS	3- (N-morpholino)propansulfonová kyselina
HEPES	N-2-hydroxyethyl-piperazin-N'-2-ethansulfonová kyselina
MES	2-(N-morpholino)ethansulfonová kyselina
ACES	N-2-acetamido-2-aminoethansulfonová kyselina

Za účelem zachování aktivity faktoru VIII tohoto vynálezu, je důležité, aby formulace obsahovaly vápník nebo jiné dvojmocné kationy, které jsou schopné interagovat s faktorem VIII a udržovat tak jeho aktivitu, pravděpodobně spojováním těžkých a lehkých řetězců faktoru VIII. Lze použít koncentraci mezi 1 a 5 mM vápenaté soli, výhodně 3 až 4 mM a výhodněji asi 4 mM. Preferovaná vápenatá sůl je chlorid vápenatý, ale mohou být použity i jiné vápenaté soli glukonát vápenatý, glubionát vápenatý nebo gluceptát vápenatý.

Kompozice faktoru VIII také výhodně obsahují povrchově aktivní látky, výhodně v množství 0,1 % nebo méně, nebo výhodněji v množství asi 0,03 %. Povrchově aktivní látky mohou být vybrány ze skupiny sestávající z polysorbátu 20, polysorbátu 80, pl uroň i ckých polyolů a Brij 35 (póly oxy ethy len 23 lauryl ether). Jsou dostupné některé druhy pluronických polyolů (prodávané pod obchodním názvem Pluronic, vyrobené firmou BASF Wyandotte Corporation). Tyto poiyoly různých molekulových hmotností (od 1000 do 16 000) a s odlišnými ťýzikálněchemickými vlastnostmi jsou použity jako povrchově aktivní látky. Pluronic F-38 s molekulární hmotností 5000 a Pluronic F-68, molekulární hmotnost 9000, obsahují 80 % (hmotnostních) hydrofilníeh polyoxyethylenových skupin a 20 % hydrofobních polyoxy propy lenových skupin. Tween-80, komerční polysorbát, je používán v těchto přípravcích, zvláště pak rostlinný Tween-80.

Formulace faktoru VIII tohoto vynálezu zahrnují také antioxidanty. Zjistilo se, že přidáním antioxidantů do lyofilizovaných přípravků tohoto vynálezu se zvyšuje stabilita těchto přípravků, a tím také jejich životnost. Použité antioxidanty musí být vhodné pro použití ve farmaceutických přípravcích a kromě toho jsou výhodně rozpustné ve vodě. Jsou-li do přípravků přidávány antioxidanty, preferuje se jejich přidání těsně před lyofílizaci, čímž se zamezí spontánní oxidaci antioxidantů. V tabulce 2 jsou vhodné antioxidanty, kteréjsou komerčně dostupné přes společnosti jako je Calbiochem a Sigma.

-5CZ 300547 B6

Tabulka 2-Antioxydanty N-acetyl-L-cystein/Homocystein Glutathion

6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylová kyselina (Trolox)

Lipoová kyselina

Methionin

Thiosulfát sodný

Platina

Glycin-glycin-histidin (tripeptid)

Butylovaný hydroxytoluen (BHT)

Ze zmíněných antioxidantů je výhodný glutathion. Koncentrace asi 0,05 mg/ml až do asi

1,0 mg/ml zvyšují stabilitu kompozicí faktoru VIII a má se za to, že i vyšší koncentrace by také mohly být účinné (do okamžiku jakýchkoliv toxických projevů nebo nepříznivých jevů, jako je např. snížení teploty přeměny skla lyofilizovaných produktů). Je zjištěno, že zvláště kombinace histidinu a glutathionu má prospěšný vliv na stabilitu kompozicí faktoru Vlil. Histidin použitý jako pufr, může také působit jako chelátor kovů. Inaktivace faktoru VIII je do značné míry způio sobena kovy indukovanou oxidací, histidin tedy může stabilizovat faktor VIII vázáním oxidačních kovových iontů. Má se za to, že navázáním těchto kovových iontů glutathion (nebo jakýkoliv jiný přítomný antioxidant) zajistí ochranu proti další oxidaci, protože oxidační účinek kovových iontů vázaných histidinem byl potlačen.

V kompozicích tohoto vynálezu mohou být také použita jiná chelataČní činidla. Tato činidla přednostně vážou kovy jako jsou měď a železo s větší afinitou než vápník, je-li v kompozici použita vápenatá sůl. Jedním takovým chelátorem je deferoxamin, který usnadňuje odstranění AI++ a železa. Deferoxaminmesylát, C₂₅I I4xN<s()_s*CI I₄O<S. je možné získat od firmy Sigma (Sigma Prod. No. D9533). Je to chelátor hliníku a železa (II), který váže pouze železo (jako 1 : 1 chelatační komplex) v oxidačním stavu 3+, nikoliv v oxidačním stavu 2+, ale může také vázat ionty manganu a jiných kovů. Deferoxamin může být použit výhodně v množství 0,25 mg/1.

Faktor VIII použitý v kompozicích tohoto vynálezu může být buď velice čistý faktor VIII z lidské plazmy, nebo výhodněji faktor Vlil vytvořený rekombinantní technikou. Rekombinantní fak25 tor VIII může být produktem buněk vaječníku čínského křečka (CHO) transfektovaných s vektorem, který nese sekvenci DNA kódující molekulu faktoru VIII. Metody přípravy transfektních CHO buněk popisuje Toole, Jr, mimo jiné, v patentu US4 757 006, ale alternativní metody jsou odborníkům také známé (viz. např. patent US 4 868 112, také od Tooleho, Jr. a PCT mezinárodní patentová přihláška WO-A 91/09122). Metody použití pro kultury buněk CHO k produkci faktoru Vlil jsou odborníkům také známé, např. evropská patentová přihláška EP 0 362 21 8 pro Genetics Institute, nazvaná „Vylepšená metoda produkce faktoru VIII: proteiny typu - C“. Rekombinantní faktor VIII však může být produkován i jinými buňkami, jako jsou např. buňky ledvin malého křečka (BHK). Samotná molekula faktoru VIII, je—li připravena rekombinantně, může být buď celá molekula faktoru Vlil, nebo jen její část, jako např. B doména molekuly faktoru VIII.

Zatímco kompozice faktoru VIII popsané v této patentové přihlášce mohou být lyofilizovány a rozředěny v daných koncentracích, odborníkům v oboru je zřejmé, že tyto přípravky mohou být zředěny na zředčnější formu. Např. přípravek podle tohoto vynálezu, který je normálně lyofili40 zován a/nebo rozředěn v 2 ml roztoku, může být také rozředěn ve větším množství, např. v 5 ml.

-6 CZ 300547 B6

Toto ředění je zvláště vhodné při přímé aplikaci přípravku faktoru VIII pacientovi, nicméně v tomto případě faktor VIII neztrácí svou aktivitu tak rychle, jako je tomu ve zředěnějších roztocích faktoru VIII.

Formulace a provedení lyofilizace

Za účelem dosažení maximální stability jsou kompozice faktoru VIII tohoto vynálezu lyofíl izovány. Během lyofilizace je faktor VIII přeměněn z vodné fáze na amorfní pevnou fázi, čímž je protein chráněn před chemickou a/nebo konformační nestabilitou. Lyofíl izované přípravky obsahují nejen amorfní fáze, ale i složky, které krystalizují během lyofilizace. Záměrem je rychlé proběhnutí lyofilizace kompozice faktoru VIII a utvoření co nejlepšího koláče (tzn. koláče, který je co nejméně smrštěný ze stran kontejneru, ve kterém byl lyofílizován). V přípravcích tohoto vynálezu jsou obsaženy stabilizátory, které existují zejména v amorfní fázi lyofílizovaného produktu, zatímco objemová činidla (kromě HES) krystalizují během mrazení.

Jak faktor VIII, tak stabilizátor jsou rozptýleny v amorfní fázi lyofílizovaného koláče. Hmota stabilizátoru je také srovnatelná s dalšími vehikuly v amorfní formě. Dále výhodná teplota zdánlivé přeměny skla (Tg') amorfní fáze je relativně vysoká během sublimačního sušení a výhodná teplota přeměny skla (Tg) pevné láky je rovněž vysoká během skladování. Bylo zjištěno, že krystalizace chloridu sodného v produktu je žádoucí, dokud amorfní chlorid sodný nepotlačí Tg' amorfní fáze.

Za účelem vyhnout se zborcení koláče jednotlivých kompozic, se první sušení provádí při teplotě produktu, která je nižší než teplota zdánlivého přechodu skla zmrazeného koncentrátu. Prodloužení doby sušení může být také požadováno pro kompenzaci snížení Tg'. Další informace o lyofilizaci je možné nalézt v Carpenter, J. F. a Chang, B. S., Lyophilization of Protein Pharmaceuticals, Biotechnology and Biopharmaceutical Manufacturing, Processing and Preservation, Κ. E. Avis and V. L. Wu, eds. (Buffalo Grove, IL: Interpharm Press, Inc.), pp. 199264(1996).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Účinky koncentrace faktoru VIII a přídavku stabilizátoru na regeneraci faktoru VIII byly předmětem několika studií. Tyto studie byly provedeny za použití mannitolu jako modelového objemového činidla a sacharózy jako modelového stabilizátoru. V těchto studiích byly zkoumány tri vzorky popsané níže v tabulce 3. Všechny studované vzorky obsahovaly 10 mM Tris, 200 mM

NaCl, 8 % mannitolu, 4 mM CaCh a 0,02 % Tween-80 a byly měřeny při pH 7,0.

Tabulka 3

Vzorek I.D.	Počáteční faktor VIII (IU/ml)	Sacharóza %
IA	600	-
IB	60	-
IC	60	2

Tyto vzorky byly lyofílizovány cyklem sublimačního sušení, popsaným v tabulce 4 níže, za účelem udržení teploty produktu pod teplotou zdánlivé přeměny skla (Tg'). Diferenciální kalorimetrické snímání (DSC) určilo přeměnu při přibližně -40 °C ve složení obsahujícím mannitol. Za účelem udržet teplotu produktu pod touto hranicí byla limitní teplota během prvního sušení

-7CZ 300547 B6 nastavena na -32 °C. První sušení za těchto podmínek probíhalo po dobu 55 hodin a celková doba cyklu byla asi 80 hodin.

Tabulka 4

Metody	Popis
I (mrazení)	Zchladit na +5 °C Zchladit na -5 °C při 1 °C/minutu,udržet po dobu 20 minut; Zchladit na -20 °C + 5 °C při 1 °C/mÍnutu, udržet po dobu 1 hodiny (do 3 hodin); Zchladit na-45 °C při 0,5 °C/minutu,udržet po dobu 1 hodiny.
II	Mrazení metodou I Udržet při -35 °C po dobu 48 hodin
III	Mrazení metodou I Udržet při -35 °C po dobu 48 hodin Udržet při -20 °C po dobu 48 hodin
IV (sublimační sušení)	Podložka teplota -32 °C během prvního sušení po dobu asi 55 hodin (do 100 hodin) Produkt < -40 °C během prvního sušení; Pokles z -32 °C na +40 °C při 0,2 °C/minutu; Podložka teplota +40 °C během druhého sušení po dobu 3 hodiny.

Aktivita faktoru VIII těchto vzorků, určená pomocí jednostupňového testu, byla porovnávána s kontrolním vzorkem udržovaným při —45 °C. Výsledky testu jsou shrnuty v tabulce 5.

io Tabulka 5

Proces Metoda	% ztráty aktivity faktoru Vlil během každého z kroků
	Formulace IA (600 IU/ml)	Formulace IB (60 IU/ml)	Formulace IC (60 IU/ml, 2 % sacharosy)
I	6,7	37,5	41,7
II	2,0	9,3	3,9
III	7,3	11,6	5,0
IV (lyofilizace)	20,0	24,2	18,3

Tyto výsledky ukazují na to, že koncentrace proteinu má vliv na regeneraci faktoru VIII během mrazení. Formulace obsahující 60 IU/ml ztratí během mrazicího kroku přibližně 37 až 42% z

-8CZ 300547 B6 počáteční aktivity faktoru VIII, zatímco formulace obsahující 600 IU/ml ztratí 6,7 % aktivity faktoru VIII. Tyto výsledky ukazují, že vyšší koncentrace proteinu má ochranný efekt během mrazení. Ačkoliv sacharóza vykazuje určitou ochranu faktoru VIII během střední teploty stejně dobře jako během sublimačního sušení, její schopnost ochrany se ztrácí během počátečního mrazicího kroku.

Příklad 2

Následuje vylepšení lyofilizačního postupu naznačeného v příkladu 1 a dále optimalizace tohoto postupu. Zjistilo se, že lyofilizované kompozice, které vyšší teplotu přeměny skla (a teoreticky lepší stabilitu faktoru VIII) mohou být vytvářeny: (1) snížením počáteční mrazící teploty na 45 °C nebo nižší (jako např. snížením teploty na -50 nebo -55 °C); (2) zvýšením teploty na 20 nebo -22 °C (±5 °C) a potom (3) opětným snížením teploty na —45 °C nebo nižší. Teplota je snižována nebo zvyšována podle potřeby o 0,5 až asi 1,0 °C za minutu. V okamžiku dosažení požadované teploty se kompozice udržuje při této teplotě po dobu mezi 1 a 3 hodinami. Tento vylepšený mrazicí cyklus je popsán v tabulce 6.

Tabulka 6

Mrazicí metoda	Popis
I	Zchladit na +5 °C Zchladit na -5 °C při 05 až 1 °C/minutu, udržet po dobu 20 minut; Zchladit na teplotu mezi -55 a -45 °C při 0,5 až 1 °C/minutu, udržet po dobu asi 1 hodiny; Ohřát na -22 °C (±5 °C)při 0,5 až 1 °C/ minutu, udržet po dobu 1 až 3 hodiny; Zchladit na -45 °C při 0,5 až l°C/minutu, udržet po dobu asi 1 hodiny.

Pokud není uvedeno jinak, teploty uvedené v tomto příkladě a v dalších příkladech se vztahují na teplotu podložky v lyofilízéru a nikoliv na teplotu produktu per se. Následuje vylepšený mrazicí cyklus, zbytek lyofilizačního procesu může být proveden jak bylo naznačeno výše v příkladu 1, nebo jak zde bude dále popsáno, nebo podle stanovení odborníků v oboru.

Tento lyofilizační postup je zejména vhodný pro formulace, které obsahují glycin, jakožto objemové činidlo, a také pro formulace obsahující mannitol. Dále se má za to, že je použitelný i pro formulace tohoto vynálezu, které obsahují jiná objemová činidla.

Příklad 3

Má se za to, že pro tvorbu sublimačně sušeného produktu s akceptovatelným vzhledem koláče a teplotou přeměny skla, je potřeba, aby objemová činidla lyofilizovaných farmaceutických přípravků, které obsahují chlorid sodný, jako např. glycin nebo mannitol, krystalizovala. Proto byl vypracován vylepšený lyofilizační postup pro krystalizaci objemových činidel.

-9CZ 300547 B6

Tabulka 7a - Mrazicí kroky

Krok	Teplota	Doba trvání kroku
Počáteční mrazení	-40 °C nebo méně	1 hodina
První žíhání	mezi -23°Ca-27°C	3 hodiny
Druhé mrazení	-55 °C	1 hodina
Druhé žíhání	-36 °C	4 hodiny
Třetí mrazení	-50 °C	1 hodina

Tabulka 7b - Kroky sublimačního sušení

Krok	Teplota	Doba trvání kroku
První sušení	-35 °C	do 100 hodin
Druhé sušení: první krok	40 °C	3 hodiny
Druhé sušení: druhý krok	45 °C	3 hodiny
Druhé sušení: třetí krok	50 °C	3 hodiny

Změny teplot mrazicích kroků jsou prováděny v rozmezí 0,5 °C/mínutu a 1°C /minutu. Ovšem má se za to, že i kroky delšího trvání by mohly být efektivní.

io Před prvním mrazicím krokem je třeba udržet teplotu mezi asi 2 a 8 °C po dobu asi jedné hodiny, aby všechny nádobky měly přibližně stejnou teplotu. Poté je lyofilizér zchlazen na teplotu -5 °C. První lyofílizaění krok by měl být prováděn při teplotě nižší než -30 °C, výhodně pod -35 °C, a výhodněji asi —40 °C. Poté následuje první žíhací krok, který se provádí při teplotě mezi -30 a -19 °C, výhodněji buď mezi -25 a-28 °C (je- li použit glycin jako objemové činidlo) nebo, mezi -21 a-24°C (je-li použit mannitol jako objemové činidlo), a nejvýhodněji při teplotě -23 a -26 °C. Při těchto teplotách by měla objemová činidla alespoň částečně krystalizovat. Nižší stupeň, asi -27 °C, však není doporučován zejména pro formulace obsahující mannitol a argínin. Tento krok trvá po dobu asi 3 hodin.

Následuje první žíhací krok, teplota se sníží na teplotu nižší než asi -50 °C a výhodněji až na -55 °C a níže, po dobu asi 1 hodiny. Při této teplotě chlorid sodný v přípravcích vytváří zárodky.

Během druhého žíhacího kroku se teplota farmaceutického přípravku zvýší na teplotu mezi -30 a -39 °C, výhodná teplota pro kompozice obsahující mannitol je -33 ^QC a pro kompozice obsa25 hující glycin je tato teplota -36 °C. Při této teplotě by měly, alespoň částečně, růst krystaly NaCI. Tento krok probíhá po dobu asi 4 hodin. Poté je teplota v lyofilizéru snížena na -50 °C, výhodně na dobu asi 1 hodiny, čímž se sníží teplota přípravků.

V následujících krocích sublimačního sušení se mění teplota o hodnoty 0,1 °C/minutu a

0,5 °C/minutu. Po zredukování tlaku na asi 8,66 Pa (65 mTorr) se teplota zvýší na -32 až -35 °C pro první sušení. Při této teplotě sublimují ledové krystaly v přípravcích. Tento krok trvá do 100 hodin, nebo do doby dokud většina ledu nevysublimuje z přípravků. Okamžik, ve kterém většina ledu vysublimovala se dá určit např. senzorem bodu orosení, který indikuje konec sublimace poklesem křivky (inflexní bod).

Následuje první sušení, při kterém se teplota zvýší na +40 °C, výhodně při hodnotách 0,2 °C/minutu, čímž se započne druhé sušení pro odstranění vody z přípravku. Tuto teplotu je výhodně udržovat po dobu asi 3 hodin. V druhém a třetím sušení následujícím po prvním kroku se teplota zvýší na teplotu asi +45 °C na dobu asi 3 hodin, a poté na teplotu asi +50 °C na dobu 3

-10CZ 300547 B6 hodiny a více. Tímto se zredukuje vlhkost lyofil izačního koláče na hodnotu menší než 2 % (hmotn/hmotn).

Příklad 4

Další studie byly prováděny pro zjištění specifického efektu histidinu na lyofilizované kompozice faktoru VIII, které obsahovaly glycin nebo mannitol jako objemové činidlo. Pro detekci krystalizace těchto objemových činidel během mrazení byl použit nevratný tepelný tok (Modulated DSC, io mDSC). Jak teplota krystalizace tak celkové teplo byly určeny z krystalizační exotermy. Určený eutektícký bod tání endotermy NaCl během ohřívání byl použit pro určení krystalizace NaCl.

Pomocí mDSC a použitím signálu celkového tepelného toku bylo určeno prodloužení krystalizace jako poměr entalpie tání přípravku a entalpie tání čistého roztoku NaCl. Dále byla provedena rentgenová difrakční analýza za účelem odhadnout krystalizací v lyofilizovaných přípravcích.

Zatímco koncentrace histidinu menší než 20 mM nemá zásadní vliv na krystalizací glycinu, koncentrace 50 nM histidinu redukuje rozsah krystalizace glycinu. Během mrazení formulací, které obsahují glycin nebyly pozorovány definované krystalizační exotermy NaCl. Avšak, endotermy eutektického tání během zahřívání ukazují, že NaCl krystalizovala (>50 %) po mrazení při teplotě nižší než -50 °C a žíhání při -30 až 35 a —40 °C. Zahrnutí 50 mM histidinu do přípravků obsahujících glycin zpomaluje krystalizací NaCl. Následkem toho je trojnásobné prodloužení doby žíhání, aby bylo dosaženo ekvivalentní krystal i čnosti.

Avšak vliv 20 mM histidinu na krystalizací NaCl ve formulacích obsahujících glycin byl mini25 mální. Pomocí studií sublimačního sušení bylo zjištěno, že ve formulacích glycinu obsahujících 50 mM histidinu, se vyskytuje viditelné zborcení lyofilizovaného koláče. Data získaná rentgenovou práškovou difrakční analýzou dokazují snížení krystalizace NaCl ve vzorcích, které obsahují histidin. V přípravcích, které obsahují mannitol, krystalizuje obvykle 83 až 90 % chloridu sodného, bez potřeby žíhání, během mrazení pří teplotách mezí -40 a-50 °C. Zatímco zahrnutí 20 mM histidinu do přípravků potlačuje krystalizací NaCl během mrazení, výsledkem žíhání je přibližně 40% krystalizace NaCl.

Proto v přípravcích obsahujících objemová činidla jako glycin a mannitol, a NaCl, může přídavek histidinu snižovat rozsah krystalizace NaCl. Ačkoliv toto může vést k poničení koláče utvoře35 ného během lyofilizace, použití relativně nízké koncentrace histidinu může v přípravcích tento efekt zmírnit. Nicméně přijatelný koláč byl vytvořen i s koncentracemi histidinu 35 a 50 mM. Histidin může být také přidán do HEPES, jako objemové činidlo v přípravcích, které obsahují glycin nebo mannitol. Použití HEPES snižuje Tg' ve větším rozsahu než obdobné množství histidinu.

Příklad 5

Předmětem dalších studií bylo měření fyzikálních charakteristik několika možných formulací faktoru VIII, které zahrnují sedm stabilizátorů přicházejících v úvahu a pět objemových činidel. Kromě objemového činidla a stabilizátoru, všechny formulace uvedené v tabulce 8 níže (kromě formulace 11) obsahují 10 mM Tris^eHCl, 200 mM NaCl, 0,02% Tween-80,4 mM CaCl₂ a při pH 7,0. Formulace 11 obsahuje 10 mM Tris*HCl, 0,02% Tween-80, a 4 mM CaCl₂, také při pH 7,0. Všechna pH měření byla prováděna při teplotě okolí.

- 11 CZ 300547 B6

Tabulka 8

Vzorek TD.	Objemové činidlo	Stabilizátor proteinu
1	8% Mannitol	2% Sacharosa
2	8% Mannitol	2% Trehalosa
3	8% Mannitol	2% Rafinosa
4	8% Mannitol	2% Arginin
5	8% Mannitol	2% Lysin
6	8% Mannitol	2% Sorbitoí
7	8% Mannitol	2% Glycerol
8	4% Hydroxyethylovaný škrob	2% Sacharosa
9	8% Glycin	2% Sacharosa
10	8% Glycin	2% Trehalosa
11	400 mM NaCI	2% Sacharosa
12	8% Alanin	2% Sacharosa

Pro předurčení chování během sublimačního sušení byly měřeny teplota zborcení, pomocí 5 sublimačního mikroskopu, a termální přeměny pomocí DSC. DSC, rentgenová prášková difrakční analýza a polarizační mikroskop byly také použity pro určení krystaličnosti lyofilizovaných vzorků. Byly také hodnoceny vzhled a rekonstituční čas vzorků. Výsledky všech měření jsou shrnuty dále v tabulce 9.

io Tabulka 9

Vzorek I.D.	Tpc (°C)	Tc (°C)	T_e(°C)	Rekonstituce (s)	Obsah vody (%)	Vzhled
1	-14	-10	54	64	n/c	Vynikající
2	-20	-15	53	62	1,4	Téměř zborcený
3	-15	-10	54	77	1,7	Vynikající
4						Částečně zborcený
5	-	-	-	-	-	Zborcený
6	n/c	n/c	<10 °c	63	0,6	Vynikající
7	-	-	<10 °c	-	-	Vynikající
8			86	49	0,7	Vynikající, ale po stranách tenký
9	-	-	54	22	0,8	Vynikající
10	-	-	63	18	-	Vynikající
11			66	ll	0,4	Vynikající (vrstva na dně)
12	-	-	-	57	0,5	Vynikající

- 12CZ 300547 B6

Sorbitol a glycerol mají přeměnu skla při <10 °C. DSC neměří teploty v tomto rozsahu n/c = není čistý

Tpc = teplota částečného zborcení, měřená sublimačním mikroskopem T_c = teplota úplného zborcení, měřená sublimačním mikroskopem

T_g = teplota přeměny skla

S výjimkou mannitolu:lysinu, mají všechny formulace přiměřený fyzikální vzhled. Lysin znesnadňuje krystalizaci jak mannitolu tak glycinu, což má za následek snížení teploty přeměny skla a zborcení lyofílizovaného koláče.

Příklad 6

Kompozice faktoru Vlil popsané v tabulce 8 výše, byly skladovány při -70, 25, 40 a 50 °C po 15 dobu různých časových úseků, čímž byla ověřována jejich stabilita. Stupně aktivity faktoru VIII byly měřeny po 2 týdnech, 1 měsíci, 2 měsících a 3 měsících, všechny výsledky jsou shrnuty v tabulce 10 níže. Dva vzorky, první obsahující mannitol jako objemové činidlo a sorbitol jako stabilizátor, a druhý obsahující mannitol jako objemové činidlo a glycerol jako stabilizátor, vykazovaly nízkou stabilitu. Všechny zbývající formulace vykazovaly schopnost stabilizovat faktor

VIII.

Tabulka 10

Popis složení	Teplota (°C)	počáteční % v měsících
		0	0,5	1	2	3
Glyein: Sacharóza	-70	100,00	97,43	101,71	99,89	97,97
	25	100,00				85,44
	40	100,00		79,87	71,52	63,06
	50	100,00	76,34	67,99	52,14	47,64
Glyein :Trehal óza	-70	100,00	89,22	96,00	95,90	94,64
	25	100,00				83,17
	40	100,00		79,93	72,42	68,03
	50	100,00	80,97	64,28	57,60	50,92
Mannitol :Trehalóza	-70	100,00	91,32	97,72	96,10	98,26
	25	100,00				85,79
	40	100,00		82,54	70,72	59,44
	50	100,00	66,16	65,51	48,81	52,06
Mannitol: Sacharóza	-70	100,00	100,45	100,56	105,47	99,22
	25	100,00				87,04
	40	100,00		85,59	80,78	55,42
	50	100,00	81,68	75,53	57,88	43,46
Mannitol: Arginin	-70	100,00	102,26	105,53	103,72	105,08
	25	100,00				95,15

-13CZ 300547 B6

	40	100,00		91,53	80,93	69,19
	50	100,00	82,28	68,06	56,32	45,94
Mannitol :Rafínóza	-70	100,00	93,88	98,41	100,68	103,62
	25	100,00				83,13
	40	100,00		81,09	73,61	67,16
	50	100,00	71,69	68,52	54,25	47,11
Mannitol :GlyceroI	-70
	25
	40
	50
Mannitol: Sorbitol	-70	100,00	104,06
	25	100,00
	40	100,00
	50	100,00	32,73
HES:Sacharóza	-70	100,00	102,74	103,03	100,90
	25	100,00
	40	100,00		76,89	77,47
	50	100,00	71,47	67,40	30,02
NaCbSacharóza	-70	100,00	88,54	88,44	95,58
	25	100,00
	40	100,00		71,56	58,30
	50	100,00	52,71	37,90	30,34
Alanin: Sacharóza	-70	100,00	109,78	109,67	108,96
	25	100,00
	40	100,00		92,99	73,03
	50	100,00	83,25	74,91	57,65
Glycin:Rafinóza	-70	100,00	111,57	114,51	105,25
	25	100,00
	40	100,00		89,20	82,10
	50	100,00	93,21	72,22	53,24

- 14CZ 300547 B6

Příklad 7

Na základě informací dosažených během studií popsaných v příkladech 5 a 6, bylo rozhodnuto, že formulace přicházející v úvahu, které mají vehikula popsaná v tabulce 11 níže, budou vyvíjeny dále.

Tabulka 11

Vehikulum	Koncentrace
mannitol nebo glycin	6 až 9%
arginin nebo trehalóza	1 až 3%
tween 80	0,005 až 0,04%
NaCI	200 až 250 mM
CaCl₂	3 až 5 mM
TRIS	20 až 30 mM
histidin nebo HEPES	10 až 50 mM
glutathion	0,15 až 0,25 mg/ml

Na základě parametrů byly vyvinuty následující specifické formulace:

Tabulka 12

Formulace č. 1	Formulace £.2	Formulace č.3
1 OmM HEPES 20 mM Tris 225 mM NaCI 0,03% (obj./obj.) Tween-80 8% (hmotn./obj.) mannitol 2% (hmotn./obj.) trehalóza 0,2 mg/ml redukovaného glutathionu 4 mM CaCl₂	10 mM HEPES 20 mM Tris 225 mM NaCI 0,03% (obj./obj.)Tween-80 8% (hmotn./obj.) glycin 2% (hmotn./obj.) trehalóza 0,2 mg/ml redukovaného glutathionu 4 mM CaCl₂	lOmM HEPES 20 mM Tris 225 mM NaCI 0,03% (obj./obj.)Tween-80 8% (hmotn./obj.) mannitol 2% (hmotn./obj.) arginin 0,2 mg/ml redukovaného glutathionu 4 mM CaCl₂

Formulace č.4	Formulace č.5
25 mM histidin 20 mM Tris 225 mM NaCI 0,03% (obj./obj.) Tween-80 8% (hmotn./obj.) mannitol 2% (hmotn./obj.) trehalóza 0,2 mg/ml redukovaného glutathionu 4 mM CaCl₂	25mM histidin 20mM Tris 225mMNaCl 0.03% (obj./obj.) Tween-80 8% (hmotn./obj.) glycin 2% (hmotn./obj.) trehalóza 0,2 mg/ml redukovaného glutathionu 4 mM CaCl₂

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kompozice faktoru VIII, formulovaná bez přídavku albuminu k uvedené kompozici, 5 vyznačující se tím, že kromě faktoru VIII obsahuje následující formulační vehikula:

4 % až 10 % hmotn./obj. objemového činidla vybraného ze skupiny sestávající z mannitolu, glycinu a alaninu;

1 % až 4 % hmotn./obj. stabilizátoru vybraného ze skupiny sestávající ze sacharózy, trehalózy, rafinózy a argininu;

ίο 1 až 5 mM vápenaté soli;

100 až 300 mM NaCI; a pufrovaeí činidlo pro udržení pH na hodnotě mezi 6 a 8.
2. Kompozice faktoru VIII podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje dále 15 povrchově aktivní látku.
3. Kompozice faktoru VIII podle nároku 2, vyznačující se tím, že uvedená povrchově aktivní látka je vybrána ze skupiny sestávající z polysorbátu 20, polysorbátu 80, Pluronic F68 a Brij 35.
4. Kompozice faktoru VIII podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedenou povrchově aktivní látkou je polysorbát 80, a kde uvedený polysorbát 80 je přítomen v množství menším než 0,1 % hmotn./obj.

25
5. Kompozice faktoru VIII podle nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že uvedená povrchově aktivní látka je přítomna v množství 0,03 % hmotn./obj.
6. Kompozice faktoru VIII podle nároků 1 až5, vyznačující se tím, že uvedené pufrovaeí činidlo je vybráno ze skupiny sestávající z Tris, BIS - Tris Propan, histidinu, PIPES,

30 MOPS, HEPES, MES a ACES.
7. Kompozice faktoru VIII podle nároku 6, vyznačující se tím, že uvedeným pufrovacím činidlem je Tris.

35
8. Kompozice faktoru VIII podle nároku 7, vyznačující se tím, že Tris je přítomen v množství 20 mM.
9. Kompozice faktoru VIII podle nároku 6, vyznačující se tím, že pufrovaeí činidlo obsahuje od 10 do 50 mM histidinu.
10. Kompozice faktoru VIII podle nároku 9, vyznačující se tím, že histidin je přítomen v množství 25 mM.
11. Kompozice faktoru VIII podle nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že dále 45 obsahuje antioxidant.
12. Kompozice faktoru VIII podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedeným antioxidantem je glutathion.

50
13. Kompozice faktoru VIII podle nároku 12, vyznačující se tím, že glutathion je přítomen v množství od 0,05 do 1,0 mg/ml.

- 16CZ 300547 B6
14. Kompozice faktoru VIII podle nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že uvedené objemové činidlo je přítomno v množství 8 % hmotn./obj.
15. Kompozice faktoru VIII podle nároků laž!4, vyznačující se tím, že uvedeným 5 objemovým činidlem je mannitol.
16. Kompozice faktoru VIII podle nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že uvedeným objemovým činidlem je glycin.

io
17. Kompozice faktoru VIII podle nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že uvedený stabilizátor je přítomen v množství 2 % hmotn ./obj.
18. Kompozice faktoru VIII podle nároků lažI7, vyznačující se tím, že uvedeným stabilizátorem je sacharóza.
19. Kompozice faktoru VIII podle nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že uvedeným stabilizátorem je arginin.
20. Kompozice faktoru VIII podle nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že uvedeným 20 stabilizátorem je trehalóza.
21. Kompozice faktoru VIII podle nároků laž20, vyznačující se tím, že uvedený NaCI je přítomen v množství od 200 do 250 mM.

25
22. Kompozice faktoru VIII podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedený NaCI je přítomen v množství 225 mM.
23. Kompozice faktoru VIII podle nároků 1 až 22, vyznačující se tím, že uvedenou vápenatou solí je chlorid vápenatý.
24. Kompozice faktoru VIII podle nároků laž23, vyznačující se tím, že uvedená kompozice je vhodná pro lyofilizaci.
25. Lyofílizovaná kompozice faktoru VIII získatelná lyofilizaci kompozice faktoru VIII podle 35 nároku 24.
26. Použití kompozice faktoru VIII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 25 pro přípravu léčiva na léčení hemofilie.