MXPA01008515A

MXPA01008515A - Formulaciones novedosas de factor viii libres de albumina.

Info

Publication number: MXPA01008515A
Application number: MXPA01008515A
Authority: MX
Inventors: Marc Besman
Original assignee: Baxter Int
Priority date: 1999-02-22
Filing date: 2000-02-22
Publication date: 2003-06-06
Also published as: US20170000854A1; JP2016040310A; US9669076B2; PL203893B1; JP6155442B2; ES2288843T3; US9352027B2; DK1820516T3; US20040116345A1; CA2634663A1; BR0008405A; US8765665B2; JP2012072198A; JP2008201801A; HK1133583A1; BR0008405B1; PT1820516E; DE60035260T2; JP2003520764A; EP2193809B1

Abstract

La presente invencion se relacionan a composiciones terapeuticas de Factor VIII que son estables en la ausencia de albumina. Especificamente, la presente invencion esta compuesto por una composicion de Factor VIII, compuesto por, aparte de Factor VIII: 4% a 10% de un agente de volumen seleccionado de un grupo que consiste en mannitol, glicina alance 1% a 4% de un agente estabilizador seleccionado de un grupo que consiste en sucrosa, trehalosa rafinosa, arginina; 1 mM a 5mM sal de calcio; 100mM a 300mM NaCI; y un agente de defensa para mantener el pH a aproximadamente entre 6 y 8. Esta composicion puede estar compuesto adicionalmente por un surfactante tal como polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronico F68, o Brij 35. Cuando el surfactante es polisorbato 80, este debe de estar presente en una cantidad menor a 0.1%. La defensa de composiciones de Factor Vise segun la presente invencion de preferencia esta presente en una concentracion de entre 10 mM a 50 mM, y se selecciona del grupo compuesto por histidina, Tris, Propano BIS-Tris, PIPES, MOPS, HEPES, MES y ACES. De preferencia el agente de defensa es o Histidina o Tris. La composicion del Factor VIII de la presente invencion puede ser compuesto por un antioxidante. La composicion de Factor VIII de la presente invencion incluye tanto un agente de volumen como un agente estabilizador. El agente estabilizador puede estar presente en una cantidad de entre alrededor de 6% a alrededor de 8%, de preferencia alrededor de 8%. El agente estabilizador, de preferencia esta presente en una cantidad de alrededor de 2%. Tambien esta presente cloruro de sodio en estas composiciones, de preferencia en una cantidad de entre 150 y 350 mM, y de mas preferencia en una cantidad de alrededor de 225 mM. La sal de calcio de la composicion es de preferencia cloruro de calcio, y la composicion en si es de preferencia en forma liofilizada. En otra incorporacion, la presente invencion puede componerse por una composicion de Factor VIII formulada sin agregar albumina que incluye las siguientes excipientes aparte del Factor VIII: 2% a &% almidon hidroxietil; 1% a 4% de un agente estabilizador seleccionado del grupo que consiste en sucrosa, trehalosa, rafinosa y arginina; 1 mM a 5 mM sal de calcio; 100 mM a 300 mM NaCI; y un agente para mantener un pH de aproximadamente entre 6 y 8. De preferencia, tal composicion esta compuesto por alrededor de 4% almidon hidroxietil, y el NaCl esta presente en una cantidad de 200 mM. El agente estabilizador tambien esta presente de preferencia en una cantidad de alrededor de 2%. En otra incorporacion, la presente invencion incluye una composicion de Factor VIII, formulada sin albumina, compuesto por: 300mM a 500mM NaCl, 1% a 4% de un agente estabilizador seleccionado del grupo que consiste en sucrosa, trehalosa, rafinosa, arginina; 1 mM a 5 mM sal de calcio; y un agente que mantiene el nivel de pH entre aproximadamente 6 y 8. De preferencia, la NaCl esta presente en una concentracion de alrede.

Description

FORMULACIONES NOVEDOSAS DE FACTOR VIII LIBRES DE ALBÚMINA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El Factor VIII es una proteína que se encuentra en las plasma de la sangre y que actúa como cofactor en una serie de reacciones que llevan a la coagulación de la sangre. Una deficiencia de la cantidad de la actividad de Factor VIII en la sangre resulta en una desorden de coagulación conocido como hemofilia A, una condición heredada que se encuentra principalmente en varones. En la actualidad, la hemofilia A se trata con preparaciones terapéuticas de Factor VIII derivado de la plasma humana o fabricado utilizando una tecnología de recominaciona de DNA. Tales preparaciones se administran ya sea como respuesta a un episodio de sangrado (terapia sobre demanda) o a intervalos frecuentes, regulares para prevenir el sangrado no controlado (profilaxis).

Se conoces que Factor VIII es relativamente inestable en preparaciones terapéuticas. En plasma de sangre, Factor VIII normalmente se combina con otra proteína de plasma, factor von Willegrand (vWF), que se encuentra en la plasma en un exceso molar grande a Factor VIII y se cree que este protege Factor VIII de una degradación prematuro. Otra proteína de plasma circulante es albúmina que también puede tomar parte en la estabilización de Factor VIII in vivo. Las preparaciones de Factor VIII que hoy en día se venden, entonces cuentan principalmente con el uso de albúmina y/o vWF para estabilizar Factor VIII durante la fabricación y almacenaje de este.

Sin embargo la albúmina y vWF utilizados en las preparaciones Factor VIII que se • encuentran en el mercado hoy en día se derivan de la plasma de sangre humana, y el uso de tales materiales tiene ciertas desventajas. Como se le agrega un exceso grande molar de albúmina comparado con Factor VIII para incrementar la estabilidad de Factor VIII en tales preparaciones, es difícil caracterizar la proteína del Factor VIII en si en estas preparaciones. El agregar albúmina derivada de sangre humana al Factor VIII también se percibe como desventaja con respecto a preparaciones de Factor VIII producido recombinante. Esto es porque la preparación de Factor VIII derivado de recombinado, en la ausencia de tal albúmina agregada, de otro modo no contendría ninguna proteína derivada de plasma humana, y el riesgo teorético de la transmisión de un virus se reduciría.

Se han descrito varios intentos de la formulación de Factor VIII sin albúmina ni vWF (o con niveles relativamente bajos de estos excipientes). Por ejemplo, el Patente U.S. No. 5,565,427 (EP 508 194) a Freudenberg (asignado a Behringwerke) describe preparaciones de Factor VIII que contienen combinaciones especificas de detergente y amino ácidos, específicamente arginina y glicina, aparte de excipientes tales como cloruro do de sodio y sucrosa. El detergente, polisorbato 20 o polisorbato 80, se describe como presente en cantidades de entre 0.001 y 0.5% (v/v), mientras arginina y glicina se encuentran en cantidades de entre 0.01 y 1 mol/1. Se describe la presencia de la sucrosa en cantidades de entre 0.1 y 10%. El ejemplo 2 de este patente muestra que soluciones de 1) 0.75% sucrosa, 0.4 M glicina, y 0.15 M NaCl, y 2) 0.01 M citrato de sodio, 0.08 M glicina, 0.016 M lisina, 0.0025 M cloruro de calcio, y 0.4 M cloruro de sodio no se mantenían estables en una solución después de 16 horas, mientras soluciones de 3) 1% sucrosa, 0.14 M arginina, 0.1 M cloruro de sodio, y 4) 1% sucrosa, 0.4 M glicina, 0.14 M arginina, 0.1 M cloruro de sodio , y 0.05% Tween 80 mostraron estabilidad.

El Patente U.S. No. 5,763,401 (EP 818 204) a Nayer (asignado a Bayer) también describe una formulación terapéutica de Factor VIII sin albúmina, compuesta por 15-60 mM sucrosa, hasta 50 mM NaCl, hasta 5 mM cloruro de calcio, 65-400 mM glicina, y hasta 50 mM histidina. Se identificaron las siguientes formulaciones como estables: 1) 150mM NaCl, 2.5 mM cloruro de calcio, y 165 mM mannitol; y 2) 1% sucrosa, 30 mM cloruro de sodio, 2.5 mM cloruro de calcio, 20 mM hisitidine, y 290 mM glicina.. Una formulación con mayores cantidades de azúcar (10% maltosa, 50mM NaCl, 2.5 mM cloruro de calcio, y 5 mM histidina) exhibía estabilidad pobre en el estado liofilizado comparado con la formulación 2.

El Patente U.S. No 5,733,873 (EP 627 924) a Osterberg (asignado a Pharmacia y Upjohn) muestra formulaciones que incluye un surfactante de entre 0.01-1 m'g/ml. Este patente revela formulaciones que tengan los siguientes rangos de excipientes: polisorbate 20 o 80 en una cantidad de por lo menos 0.01 mg/ml, de preferencia 0.02-1.0 mg/ml; por lo menos 0.1 M NaCl; por lo menos 0.5 mM sal de calcio; y por lo menos 1 mM histidina. Mas específicamente, se revelan las siguientes formulaciones especificas: 1) 14.7-50-65 mM histidina, 0.31-0.6 M NaCl, 4 mM cloruro de calcio, 0.001-0.02-0.025 % polisorbate 80, con o sin 0.1 % PEG 4000 o 19.9 mM sucrosa; y 2) 20 mg/ml mannitol, 2.67 mg/ml histidina, 18 mg/ml NaCl, 3.7 cloruro de calcio , y 0.23 mg/ml polisorbate 80.

Otros intentos para utilizar concentraciones altas o bajas de cloruro de sodio también se han revelado. Patente U.S. No. 4,877,608 (EP 315 968) a Lee (asignado a Rhone-Poulenc Rorer) muestra formulaciones con concentraciones relativamente bajas de cloruro de sodio, específicamente formulaciones compuestos por 0.5 mM-15mm NaCl, 5 mM cloruro de calcio, 0.2 mM-5mM histidina, 0.01-10 mM hidrocloruro de lisina y hasta 10% azúcar. El "azúcar" puede ser de hasta 10% maltosa, 10% sucrosa o 5 % mannitol.

El Patente U.S. 5,605,884 (EP 0 314 095) a Lee (asignado a Rhone-Poulenc Rorer) revela el uso de formulaciones con concentracioines relativamente altas de cloruro de sodio. Estas formulaciones incluyen 0.35 M-l.2 M NaCl, 1.5-40 mM cloruro de calcio, 1 mM-50 M histidina, y hasta 10% "azúcar" tal como mannitol, sucrosa, o maltosa. SE ejemplifica una formulación compuesto por 0.45 M NaCl, 2.3 mM cloruro de calcio, y 1.4 mM histidina.

La solicitud para Patente Internacional WO 96/22107 a Roser (asignado a Quadrant Holdings Cambridge Limimted) describe formulaciones que incluyen el azúcar trehalosa. Estas formulaciones están compuestas por: 1) 0.1 M NaCl, 15 mM cloruro de calcio, 15 mM histidina, y 1.27 M (48%) trehalosa;o 2) 0.011% cloruro de calcio, 0.12 histidina, 0.002% Tris, 0.002% Tween 80, 0.004% PEG 3350, 7.5% trehalosa, y o 0.13% o 1.03% NaCl.

Otras formulaciones terapéuticas de Factor VIII de arte anterior generalmente incluyen albúmina y/o vWF con el propósito de estabilizar el Factor VIII y por lo tanto no son relevantes a la presente invención. Por ejemplo, el Patente U.S. No. 5,328,694 (EP 511 234) a Schwinn (asignado Octapharma AG) describe una formulación que incluye 100-650 mM disacárido y lOOmM- 1.0 M amino ácido. Específicamente, se revelan las siguientes formulaciones: 1) 0.9 M sucrosa, 0.25 M glicina, y 5mM cloruro de calcio.

Mientras se han varios intentos de formular Factor VIII sin albúmina o vWF, existe todavía una necesidad de formulaciones de Factor VIII terapéuticas estables en la ausencia de albúminas o otras proteínas.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relacionan a composiciones terapéuticas de Factor VIII que son estables en la ausencia de albúmina. Específicamente, la presente invención esta compuesto por una composición de Factor VIII, compuesto por, aparte de Factor VIII: 4% a 10 % de un agente de volumen seleccionado de un grupo que consiste en mannitol, glicina alance 1% a 4% de un agente estabilizador seleccionado de un grupo que consiste en sucrosa, trehalosa rafinosa, arginina; 1 mM a 5mM sal de calcio; lOOmM a 300mM NaCl; y un agente de defensa para mantener el pH a aproximadamente entre 6 y 8. Esta composición puede estar compuesto adicionalmente por un surfactante tal como polisorbato 20, polisorbato 80, Plurónico F68, o Brij 35. Cuando el surfactante es polisorbato 80, este debe de estar presente en una cantidad menor a 0.1 %.

La defensa de composiciones de Factor Vise según la presente invención de preferencia esta presente en una concentración de entre 10 mM a 50 mM, y se selecciona del grupo compuesto por histidina, Tris, Propano BIS-Tris, PIPES, MOPS, HEPES, MES y ACES. De preferencia el agente de defensa es o Histidina o Tris. La composición del Factor VIII de la presente invención puede ser compuesto por un antioxidante.

La composición de Factor VIII de la presente invención incluye tanto un agente de volumen como un agente estabilizador. El agente estabilizador puede estar presente en una cantidad de entre alrededor de 6% a alrededor de 8%, de preferencia alrededor de 8 %. El agente estabilizador, de preferencia esta presente en una cantidad de alrededor de 2%. También esta presente cloruro de sodio en estas composiciones, de preferencia en una cantidad de entre 150 y 350 mM, y de mas preferencia en una cantidad de alrededor de 225 mM. La sal de calcio de la composición es de preferencia cloruro de calcio, y la composición en si es de preferencia en forma liofilizada.

En otra incorporación, la presente invención puede componerse por una composición de Factor VIII formulada sin agregar albúmina que incluye las siguientes excipientes aparte del Factor VIII: 2% a &% almidón hidroxietil; 1% a 4% de un agente estabilizador seleccionado del grupo que consiste en sucrosa, trehalosa, rafinosa y arginina; 1 mM a 5 mM sal de calcio; 100 mM a 300 mM NaCl; y un agente para mantener un pH de aproximadamente entre 6 y 8. De preferencia, tal composición esta compuesto por alrededor de 4% almidón hidroxietil, y el NaCl esta presente en una cantidad de 200 mM. El agente estabilizador también esta presente de preferencia en una cantidad de alrededor de 2%.

En otra incorporación, la presente invención incluye una composición de Factor VIII, formulada sin albúmina, compuesto por: 300mM a 500mM NaCl, 1% a 4% de un agente estabilizador seleccionado del grupo que consiste en sucrosa, trehalosa, rafinosa, arginina; 1 mM a 5 mM sal de calcio; y un agente que mantiene el nivel de pH entre aproximadamente 6 y 8. De preferencia, la NaCl esta presente en una concentración de alrededor de 400 mM.

En todavía otra incorporación, la presente invención se compone de un proceso para la liofilización de una composición acuosa de Factor VIII en un contenedor utilizando un liofilizador, dentro del cual el proceso esta compuesto por una primera etapa de congelación, y la primera etapa de congelación también esta compuesto por los pasos: a) bajar la temperatura en la cámara liofilizador a por lo menos alrededor de -45 grados C; b) subir la temperatura en la cámara a entre alrededor de -15 grados C y -25 grados C; y subsecuentemente c) bajar al temperatura en la cámara a por lo menos alrededor de -45 grados C. Dentro de este proceso, de preferencia la temperatura de la cámara se baja o se sube a una velocidad de entre alrededor de 0.5°C y alrededor de 1.0°C por minuto. En el paso (a), de preferencia la temperatura se mantiene durante alrededor de una hora, y se ' baja a alrededor de -15°C y -25°C por un período de 1 a 3 horas y de mas preferencia a -22°C, y la temperatura en el paso (c) de preferencia se mantiene durante alrededor de 1 hora. La composición del Factor VIII utilizado en este proceso de preferencia esta compuesto de entre 4% u 10% de un agente seleccionado de entre el grupo que consiste en mannitol, glicina y alanina, y también de preferencia compuesto entre 1% y 4% de un agente seleccionado del grupo que consiste en sucrosa, trehalosa, rafinosa, y arginina. Además, la composición del Factor ]VIII utilizado en este proceso de preferencia también esta compuesto por entre 100 mM y 300 mM NaCl.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Los abajo mencionados términos y variaciones de estos mismos dentro de la presente revelación se definirán como sigue, a lo menos que se indique lo contrario: Factor VIII-La molécula del Factor VIII existe naturalmente y en preparaciones terapéuticas como una distribución heterogéneo de polipéptidos que origen de un producto de un solo gene (ver, e.g. Anderson, et al., Proc. Nati.. Acad. Sci. USA, 83. 2979-2983, mayo 1986). El término "Factor VIH" como se utiliza dentro de esta revelación refiere a todos aquellos polipéptidos, ya sea los que se deriven de la plasma de la sangre o las producidas a través de la técnica de recombinación de DNA. Ejemplos comerciales disponibles de preparaciones terapéuticas que contiene Factor VIII incluyen aquellos que se venden bajo los nombres registrados de HEMOFIL M y RECOMBINATE (disponible de Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, Illinois, U.S.A.). Otras preparaciones en desarrollo hoy en día componen principalmente una sola subpoblación de moléculas de Factor VIII a los que les falta la porción del dominio B de la molécula.

Unidad Internacional, IU-es una unidad de medida de la actividad de la coagulación de la sangre (potencia) del Factor VIII medida por una prueba estandard, tal como una de las siguientes: Prueba de un solo paso. Las pruebas de un solo paso se conocen dentro del campo, tal como aquélla descrita en Lee, Martín L.,et al., An Effect of Predilution on Potency Assays of Factor VIII Concentrates, Trombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30, 511-519 (1983). Prueba cromogénica. Las pruebas cromogénicas se pueden comprar comercialmente , tal como el Factor VIII de Coatest, disponible de Chromogenix AB, Molndal, Suecia.

Anneal-El termino anneal se utilizará para indicar un paso en el proceso de liofilización de una preparación farmacéutica que se esta sometiendo a liofilización, antes de la preparación, en la cual la temperatura de la preparación se incrementa desde una temperatura mas baja a una mas alta y que de nuevo se enfría después de un periodo de tiempo. Agente de volumen- Para los propósitos de esta aplicación, los agentes de volumen son aquellos entidades químicas que proporcionan las estructuras a la patilla o masa sólido residual de una preparación farmacéutica después de que este ha sido liofilizado y el cual inhibe un colapso. Un agente de volumen cristalizable referirá a un agente de volumen como aquí se describe que se puede cristalizar durante liofilización, que no sea cloruro de sodio. HES no se incluye en este grupo de agentes de volumen cristalizables.

Congelación en seco, congelación, liofilización-"Congelación en seco", si no se indica lo contrario por el contexto en el cual aparece, se utilizará para indicar la porción del proceso de liofilización en la cual la temperatura de una preparación farmacéutica se eleva para eliminar el agua de la preparación. Los pasos de "congelación" del proceso de liofilización son los que ocurren antes del paso de congelación en seco. "Liofilización, si no se indica lo contrario, referirá al proceso completo de liofilización, incluyendo tanto los pasos de congelación como los pasos de congelación en seco.

Si no se indica lo contrario, los términos de porcentaje expresan porcentajes peso/volumen y temperaturas son en la escala Celsius.

Componentes de la Formulación Las composiciones del Factor VIII de la presente invención incluyen agentes de volumen, agentes estabilizadores, agentes de defensa, cloruro de sodio, sales de calcio, y ventajosamente, otros excipientes. Estos excipientes han sido escogidos para maximizar la estabilidad del Factor VIII en preparaciones liofilizadas. Sin embargo, las composiciones del Factor VIII de la presente invención muestran estabilidad también en el estado liquido.

Los agente de volumen utilizados en las presentes formulaciones, que forman la porción cristalina del producto liofilizado (excepto en el caso de HES) se seleccionan del grupo compuesto por mannitol, glicina,alanina,hydroxethyl almidón (HES). Mannitol, glicina o alanina están presentes en una cantidad de 4%-10%, de preferencia 6%-9%, y mas preferente de alrededor de 8%. Cuajado el HES se utiliza como el agente de volumen, se encuentro presente en una cantidad de 2%-6%, de preferencia de 3%-5%, y mas preferente de alrededor de 4%.

Los agentes estabilizadores que se utilizan en las formulaciones de la presente invención se seleccionan del grupo compuesto por sucrosa, trehalosa, rafinosa y arginina. Estos agentes se encuentran en las formulaciones de la presente invención en una cantidad de entre l%-4%, de preferencia entre 2%-3%, y mas preferente de alrededor de 2%. Se evaluaron sorbitol y glicerol como posibles agentes estabilizadores pero se encontró que eran estabilizadores pobres en las presentes formulaciones.

Cloruro de sodio se incluye en las presentes formulaciones en una cantidad de 100- 300mM, de preferencia de 150-250mM, y mas preferente de alrededor de 225mM. En una revelación de la presente invención, cloruro de sodio mismo se puede utilizar sin ninguno de los antes mencionados agentes de volumen, en cual caso se incluiría en la formulación en una cantidad de entre 300mM y 500mM NaCl, de preferencia 350 mM a 459 mM NaCl y mas preferente alrededor de 400 mM NaCl.

Además, agentes de defensa se encuentran en estas formulaciones porque se cree que la molécula del Factor VIII se puede afectar adversamente por cambios en el pH durante el proceso de liofilización. De preferencial el nivel de pH se debería de mantener entre 6 y 8 durante el proceso de liofilización, y mas preferente a un nivel de pH de alrededor de 7. _E1 agente de defensa puede ser cualquier entidad química o combinación de entidades químicas fisiológicamente aceptables y que tengan la capacidad de actuar como agentes de defensa, incluyendo histidina, Tris, Propano BIS-Tris, PIPES, MOPS, HEPES, MES y ACES. Las designaciones químicas completas de estos agentes de defensa se encuentran en la siguiente Tabla 1. Típicamente, el agente de defensa se incluye en una concentración de 10-50 M. Cuando se le agrega histidina a las formulaciones, se utilizan concentraciones mayores a 20 mM y de preferencia de alrededor de 25 mM, solo o en combinación con otros agentes de defensa tales como Tris. Histidina es especialmente preferido para su utilización en las composiciones de la presente invención, como se describe en mas detalle abajo.

Tabla 1 - Agentes De defensa Para conservar la actividad del Factor VIII, es importante que las formulaciones de la presente invención también incluyen calcio u otro divalentcación capaz de interaccionar con el Factor VIII y mantener su actividad, supuestamente a través de mantener una asociación de las cadenas pesadas y ligeras del Factor VIII. Se puede utilizar entre 1 mM y 5 mM de un sal de calcio, de preferencia entre 3 mM y 4 mM, y mas preferente alrededor de 4 mM. La sal de calcio de preferencia es cloruro de calcio, pero también pueden ser otros sales de calcio tales como gluconato de calcio, glubionato de calcio o gluceptato de calcio.

Las composiciones de Factor VIII de la presente invención de preferencia también incluyen un surfactante, de preferencia en una cantidad de 0.1% o menos, y mas preferente en una cantidad de alrededor de 0.03%. El surfactante puede, por ejemplo seleccionarse del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, polioles plurónicos, y Brij 35 (polioxietileno 23 lauril ether). Varios grados de polioles plurónicos ( vendidos bajo el nombre registrado de Plurónico, fabricado por BASF Wyandotte Coforation) están disponibles. Estos polyols, de diversificados pesos moleculares (desde 1,000 amas de 16,000) y diversificados propiedades physiocochemicals se han utilizado como surfactantes. Plurónico F-38 con un peso molecular de 5000 y Plurónico F-68 con un peso molecular de 9000 contienen ( por peso) 80% grupos hidrofílico polyosyethyleney 20% grupos hidrofóbico polyoxypropylene. Tween-80, un polisorbato comercial, sin embargo, es preferido en las presentes formulaciones, en particular Tween-80, derivado de vegetales.

La formulación del Factor VIII de la presente invención también de preferencia incluyen un antioxidante. Se ha descubierto que la adición de antioxidantes en las formulaciones liofilizadas de la invención mejoran la estabilidad de estas formulaciones, y así extienden su vida de anaquel. Las antioxidantes que se utilizan tienen que ser compatibles para uso con una preparación farmacéutica y aparte de preferencia deberán ser solubles en agua. Cuando se agregan antioxidantes a una formulación, es preferente agregar dichos antioxidantes tan tarde en el proceso como sea posible antes de la lioifilización, para evitar oxidación espontánea del antioxidante. La Tabla 2 muestra antioxidantes adecuados, que están disponibles comercialmente a través de compañías como Calbiochem y Sigma.

Tabla 2- Antioxidantes N — -acetil-L-Cisteine/Homocisteína Glutathione 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrmethilcroman-2-acido carboxilico (Trolox) Ácido lipoic Methionine Sodium Thiosuilfate Platino Clycine-glicina-histidina (tripéptido) Butylatedhydroxytoluene (BHT) Entre los arriba mencionados antioxidantes, se prefiere glutatione. Se ha descubierto que concentraciones en un rango de alrededor de 0.05 mg/ml a mas de 1.0 mg/ml mejoran la estabilidad de las composiciones de Factor VIII, y se cree que concentraciones mas altas también pueden ser útiles (hasta el punto en que hayan cualquier efecto toxico o efectos adversos de manufactura, tales como una depresión en la glass transition temperature del producto liofilizdo).

En particular se ha descubierto que la combinación de histidina y gluathione produce efectos sinergisticamente benéficos en la estabilidad de las composiciones de Factor VIII. Histidina, aparte de actuar como agente de defensa, también puede actuar como chelator de metales. Al grado que la in activación del Factor VIII es causada por oxidación inducida por metal, entonces histidina puede actual como estabilizador del Factor VIII uniendo tales ions metales oxidantes. Se cree que con la unión de estos metales, el glutatione (o, de hecho, cualquier otro antioxidante que este presente) puede así proporcionar mas protección antioxidante, ya que el efecto oxidante de los ions de metal unidos por el histidina se ha contenido.

Otros agentes de combinación también se podrían utilizar en la composición de la presente invención. Tales agentes probablemente deberían unir metales tales como cobre y fiero con mayor afinidad que el calcio, si se esta utilizando una sal de calcio en la composición. Uno de estos chelator es deferoxamina, un agente de combinación que facilita la remoción de A1++ y hierro. Deferoxamina Mesilate, C25H48N608 CH403S, se puede obtener de Sigma (Sigma Prod. No. D9533). Es un chelator de aluminio y hierro (II) chelator que combinars hierro (como un complejo combinar de 1: 1) solo en el estado de oxidación +3, no en el estado de oxidación +2, y también puede unir ions de manganeso con otros metales. Deferoxamina se puede utilizar ventajosamente en una cantidad de 0.25 mg/l.

El Factor VIII utilizado en las presentes formulaciones puede ser o Factor VIII derivado de altamente purificada plasma humana o de preferencia puede ser Factor VIII producido recombinante. El Factor VIII recombinante se puede producir de células transfectadas de ovarios de hámsteres Chinos (CHO) que han sido transfectadas con un vector que lleva un código de secuencia de DNA para la molécula del Factor VIII. Métodos para la creación de células CHO transfectadas describen, inter alia, en Patente U.S. No 4,757,006 a Toóle, Jr. aunque se conocen también métodos alternos de la tecnología (ver, e.g. Patente U.S. No 4,868,112, también a Toóle, Jr., y Solicitud PCT internacional WO-A-91/09122). Los métodos utilizados para cultivar dichas células CHO para producir el Factor VIII también se conocen en el campo, por ejemplo en la Solicitud par Patente Europeo No. 0362218 a Genetics Institute, titulado "Improved method for producing Factor VIII: C-type proteins" (Método mejorado para producir proteínas de Factor VIII tipo C). Factor VIII Recombinante puede, sin embargo, producirse también en otras líneas de células, tales como células de riñon de hámster bebe (BHK). La molécula del Factor VIII en si, si se produce recombinantemente, puede ser o Factor VIII de largo entero o un derivado por omisión del mismo, tal como una molécula de Factor VIII de omisión del dominio B.

Mientras las composiciones del Factor VIII descrito en esta aplicación se pueden liofilizar y reconstituir en las concentraciones indicadas, un conocedor del campo entenderá que estas preparaciones también se pueden reconstituir en formas mas diluidas. Por ejemplo, una preparación según la presente invención que se liofiliza y/o se reconstituya normalmente en una solución de 2 ml también se puede reconstituir en un mayor volumen de diluente, tal como 5 ml. Este es particularmente apropiado cuando la preparación de Factor VIII se va a inyectar en un paciente de inmediato, porque en este caso el Factor VIII tiene menos posibilidad de perder actividad, lo cual puede ocurrir mas rápidamente en soluciones mas diluidos de Factor VIII.

DESARROLLO DE FORMULACIÓN Y LIOFILIZACION Para obtener una máxima estabilidad, las composiciones de Factor VIII de la presente invención son de preferencia liofilizadas. Durante el proceso de liofilización, el Factor VIII se convierte de estar en una fase acuosa a estar en una fase sólido amorfa, que se cree protege la proteína de inestabilidad conformacional y/o químico. La preparación liofilizada no solamente contiene una fase amorfa, sino también un componente que se cristaliza durante el proceso de liofilización. Se cree que esto permite la liofilización rápido de la composición del Factor VIII y la formación de una pastilla mas elegante <8eso es, una pastilla con un mínimo de encogimiento de los lados del contenedor dentro del cual se liofiliza). En las formulaciones de la presente invención los agentes estabilizadores han sido seleccionados para existir principalmente en una fase amorfa del producto liofilizado, mientras que los agentes de volumen (excepto HES) han sido seleccionados para cristalizarse durante el proceso de congelación.

Tanto el Factor VIII y el estabilizador se dispersan de preferencia en una fase amorfa de la pastilla liofilizado. La masa del estabilizador también es grande comparado con otros excipientes en la forma amorfa. Además, la temperatura aparente de transición de vidrio (Tg) del sólido también de preferencia alta durante el almacenamiento. Se encontró como deseable la cristalización en el cloruro de sodio en el producto porque cloruro de sodio amorfo rebajará la Tg' de la fase amorfa.

Con el fin de evitar el colapso de la pastilla de una composición específica, el proceso de secado se lleva a cabo de preferencia a una temperatura de producto debajo de la temperatura aparente de transición de vidrio del concentrado de congelación. También se puede requerir de un incremento en el tiempo de secado para contrarrestar una rebaja en Tg. Se puede encontrar mas información sobre liofilización en Carpenter, J.F. and Chang, B.S., Liophilization of Protein Pharmaceuticals, Biotechnology and Biopharmaceutical Manufacturing, Processing and Preservation, K.E. Avis y V. L Weu, eds. (Buffalo Grove, II: Interpharm Press, Inc.), pp. 199-264 (1996).

Ejemplo 1 Los efectos de la concentración de Factor VIII y la adición de un estabilizador en la recuperación de Factor VIII se han investigado en varios estudios. Se llevar a cabo estos estudios utilizando mannitol como el agente de volumen modelo y sucrosa como el estabilizador modelo. Las tres formulaciones ejemplares que se describen en la Tabla 3 abajo se utilizaron en estos estudios. Todas las formulaciones utilizadas en estos estudios incluyen 10 mM Tris, 200 mM NaCl, 8% mannitol, 4 mM CaCl ,y 0.02% Tween'80 y se llevaron a cabo con un pH 7.0: Tabla 3 Estas muestras se liofilizaron utilizando el ciclo de secado por congelación mostrado en la Tabla 4 abajo con el fin de mantener una temperatura de producto debajo de la temperatura aparente de transición de vidrio (Tg'). Estudios diferenciales de escaneo calorimétricos (DSC) indicaron la presencia de una transición a aproximadamente -40 grados C en las formulaciones de mannitol. Con el fin de mantener una temperatura de producto debajo de este valor, la temperatura de alojamiento se fijó en -32 grados C durante el proceso de secado primario. El proceso de secado primario se llevó a cabo bajo estas condiciones durante alrededor de 55 horas, con un tiempo total del ciclo de alrededor de 80 horas.

Tabla 4 La actividad del Factor VIII de estas muestras, como se determina en un experimento de una sola etapa, se comparó con una muestra de control que se mantuvo a -45 grados C. Los resultados del experimento se muestran en la Tabla 5 abajo.

Tabla 5 Estos resultados indican que la concentración de proteína tiene un efecto en la recuperación del Factor VIII durante la congelación. Formulaciones que contienen 60 IU/ml perpieron aproximadamente 37%-42% de la actividad inicial del Factor VIII durante el paso de congelación, mientras 6.7% de la actividad del Factor VIII se perdió para la formulación que contiene 600 IU/ml. Estos resultados indican que una concentración de proteína tiene un efecto protector durante el proceso de congelación. Aunque la sucrosa proporcionó alguna protección al Factor VIII durante los procesos de mantener la temperatura intermedio y durante el proceso de congelación en seco, no logró proteger la proteína durante le paso inicial del congelamiento.

Ejemplo 2 Siguiendo el desarrollo del proceso de liofilización explicado en el Ejemplo 1, se llevó a cabo mas optimización de este proceso. Se ha descubierto que una composición con una temperatura mayor de transición de vidrio, (y, en teoría, mejor estabilidad del Factor VII) se puede producir por; (1) bajar la temperatura de congelación inicialmente a -45 ° C o menos (tal como alrededor de -50 grados C o -55 grados C); (2) subir la temperatura a -20 grados C o -22 grados C (+5 grados C); y luego (3) bajar la temperatura de nuevo a -45 grados C o menos. La temperatura se sube o se baja según el caso, a una velocidad de entre alrededor de 0.5° C y 1.0 grados C por minuto. Una vez que se llega a la temperatura deseada, la composición se mantiene a esa temperatura por entre 1 y 3 horas. Este ciclo de congelación mejorado se muestra en la Tabla 6 abajo.

Tabla 6 Si no se indica lo contrario, la temperatura a que se refiere en esto y en otros ejemplos es la temperatura de almacenamiento del liofilizador y no la temperatura del producto per se. Después del ciclo de congelación mejorado, el resto del proceso de liofilización se puede llevar a cabo como se describió en el Ejemplo 1 arriba, o utilizando otro método aquí descrito o conocido dentro del campo.

Este proceso mejorado de liofilización resultó útil para las formulaciones que incluyen glicina como el agente de volumen así como las que utilizan mannitol. Se cree que también se puede aplicar a formulaciones que utilicen otros agentes de volumen de la presente invención también.

Ejemplo 3 Se cree que con el fin de producir un productos congelado en seco con apariencia de la pastilla y glass transition temperature aceptables, el agente de volumen de preparaciones farmacéuticas liofilizadas que contienen cloruro de sodio, tales como glicina o mannitol, puede ser necesario la cristalización. Por eso se desarrolló el siguiente proceso de liofilización para la cristalización de agentes de volumen.

Tabla 7a-Pasos de congelación Tabla 7b-Pasos de Congelación en Seco En los pasos de congelación, cambios de temperatura ocurrieron a una tasa de entre alrededor de 0.5°C/minuto y l°C/minuto. Se cree que pasos de mas larga duración también serían efectivos.

Antes del primer paso de congelación, se baja la temperatura a entre alrededor de 2°C y 8°C durante alrededor de media hora con el propósito de llevar a todas las ampolletas a aproximadamente la miasma temperatura. Después se enfría el liofilizador a -5°C. El primer paso de congelación se debería llevarse a cabo a una temperatura menos a -30°C, de preferencia debajo de -35°C, y mas preferente a alrededor de -40°C. Luego, la primera etapa de recocido se debe de llevar a cabo a alrededor de entre -30°C y -19°C, de preferencia a alrededor de entre -25°C y -28°C (si el agente de volumen es glicina) la temperatura mas preferida siendo -23°C y -26°C; a cual temperatura se cree que se cristalizan por lo menos parcialmente los agentes de volumen cristalizables. Sin embargo, el rango menor alrededor de -'27% no se recomienda para formulaciones que contengan mannitol y arginina. Este paso de preferencia se lleva a cabo durante 3 horas.

Después de la primera etapa de cocimiento, se baja la temperatura , de preferencia a menos de alrededor de -50°C y mas preferente a menos de -55°C, durante una hora. Se cree que en este momento se nuclea el cloruro de sodio en la preparación.

Durante la segunda etapa de cocimiento, la temperatura de la preparación farmacéutica se sube a entre alrededor de -30°C y -39°C, y de preferencia a alrededor de -33°C para composiciones que contengan mannitol y a -36°C para composiciones que contengan glicina. Se cree que el crecimiento del cristal de NaCl ocurre, por lo menos en parte, en este momento. Esta etapa de preferencia se lleva a cabo en aproximadamente 4 horas. Después de eso, se reduce la temperatura del liofilizador a alrededor de -50°C, de preferencia durante alrededor de 1 hora para reducir la temperatura de la preparación.

En los siguientes pasos de congelación en seco, cambios de temperatura ocurren a una tas de alrededor de 0.1°C/minuto y 0.5°C/minuto. Después de reducir la presión en el liofilizador a alrededor de 65 mTorr, se sube la temperatura entre alrededor de -32°C y -35°C para el secado primario. A esta temperatura los cristales de hiel en la preparación se separaran. Este paso se lleva a cabo por hasta 100 horas, o hasta que la mayor parte del hielo se haya separado de la preparación. El punto en el cual la mayor parte del hielo se haya separados se puede determinar, por ejemplo, utilizando un censor de dewpoint que indica el fin de la separación del hielo cuando bajen las lecturas ( el punto de inflexión).

Después del secado primario, se sube la temperatura a +40°C, de preferencia a una velocidad de 0.2°C/minuto, para iniciar el secado secundario con el fin de remover mas agua de la preparación. De preferencia se mantiene esta temperatura durante alrededor de tres horas. Los segundos y terceros pasos de secado secundario siguen a este primer paso, en donde se sube la temperatura a alrededor de +45°C durante alrededor de tres horas y luego a alrededor de +50°C durante tres horas mas con el fin de reducir la humedad en la pastilla liofilizada a menos de 2% (w/w)..

Ejemplo 4 Se llevaron a cabo mas estudios para examinar específicamente el efecto de histidina en composiciones liofilizadas de Factor VIII que contengan glicina o mannitol como agentes de volumen. Se utilizó flujo de calor no reversible (DSC Modulado, mDSC) para detectar la cristalización de aquellos agentes de volumen mientras se enfriaban. Tanto la temperatura de cristalización como el calor total de cristalización se determinaron desde el exotermo de la cristalización. Se utilizó la apariencia de eutectic melt endotherm derretido de NaCl para detectar la cristalización de NaCl. En mDSC, la extensión de la cristalización se determinó como un ratio of the enthalpy of melting of the formulation to the enthalpy of melting of puré NaCl solution utilizando la señal de flujo total de calor. Además, análisis de difracción de rayos-X se utilizaron para determinar la magnitud de la cristalización en las formulaciones liofilizadas. Mientras la concentración de Histidina menor a 20mN no impactó significativamente en la cristalización de la glicina, 50 mM de histidina redujo magnitud de la cristalización de glicina. No se observaron exotermos de cristalización de NaCl bien definidos durante el enfriamiento de formulaciones que contenían glicina. Sin embargo, la presencia de endotermos eutecticos de derretir durante el proceso de calentamiento indicaron que NaCl se cristalizó (>50%) después de enfriar a menos de -50°C y recocer a -30°C, -35°C y -40°C. La inclusión de 50 mM de histidina en la formulación que contenga glicina retardó la cristalización de NaCl. En consecuencia, el tiempo de recocer se incrementó 3 veces para tales formulaciones con el fin de obtener una cristalización equivalente.

Sin embargo, el efecto de 20 mM de histidina en la cristalización de NaCl en las formulaciones que contenían glicina fue mínimo. En estudios de congelación en seco, se observó visualmente el colapso de las pastillas liofilizadas en formulaciones que contenían glicina y que contenían 50 mM de histidina. Datos de difracción de polvo de Rayos-X indicaron que una disminución en la cristalización de NaCl en muestras que contienen histidina. En formulaciones que contienen mannitol, típicamente entre 83%-90% del cloruro de sodio cristalizó durante del proceso de enfriamiento entre — 40°C y -50°C sin la necesidad de recocer. Mientras la inclusión de 20 mM de histidina a la formulación suprimió la cristalización de NaCl durante el proceso de enfriamiento, recocido resultó en aproximadamente 40% cristalización de NaCl.

Por eso, en formulaciones que contengan un agente de volumen de cristalización, tales como glisina o mannitol, y NaCl, la inclusión de histidina puede reducir la magnitud de la cristalización de NaCl. Aunque en algunos casos esto podría llevar al colapso de la pastilla que se forma durante el proceso de liofilización, el uso de concentraciones relativamente mas bajas de histidina en tales formulaciones puede mitigar este efecto. Sin embargo, se han formado pastillas aceptables con concentraciones de histidina de 35mM y 50 mM. Histidina también puede ser preferible a HEPES como agente de defensa en formulaciones con base mannitol y glicina,, porque se ha observado que el uso de HEPES puede reducir el Tg en una mayor magnitud que una cantidad similar de histidina.

Ejemplo 5 En otro estudio se evaluaron las características físicas de varios formulaciones potenciales de Factor VIII incluyendo siete candidatos a estabilizadores y cinco agentes xxx. Además de un agente xxx y un estabilizador, todas las formulaciones de la Tabla 8 abajo /excepto la formulación 11) contiene 10 mM Tris HCl, 200 mM NaCl, 0.02% Tween-80, 4 mM CaCl y todos tenían una pH de 7.0. La Formulación 11 contenía 10 mM Tris HCl, 0.02% Tween-80, y 4 mM CaCl , también con un pH de 7.0. Todas la medidas del pH se tomaron a temperatura ambiente.

Tabla 8 Las medidas de temperaturas de colapso por microscopía de congelación en seco y medidas de transición termal por medio de DSC se utilizaron para predecir el comportamiento de la congelación en seco. También se utilizaron DSC, difracción de polvo con rayos-X y microscópica con luz polarizada para determinar la cristalización de muestras liofilizadas. También se evaluaron el tiempo de reconstitución y la apariencia de las muestras. La Tabla 9 abajo es un resumen de todos estos resultados de mediciones.

Tabla 9 *Sorbitol y Glicerol tienen glass transition a < 10°C. El rango de escaneo DSC no incluyeron temperaturas en este rango. N/c=no claro Tpc=Temperatura a la cual ocurre el colapso parcial en un microscopio de congelado en seco Tc=Temperatura a la cual ocurre el colapso total en un microscopio de congelado en seco. Tg=Glass Transition Temperature.

Con la excepción de mannito lisina, todas las formulaciones tenían apariencia física adecuada. La lisina interfirió con la cristalización de mannitol y glicina, que causo una depresión en la temperatura de transición de vidrio y un colapso en la pastilla liofilizada.

Ejemplo 6 La composición del Factor VIII que se describió en la Tabla 8 arriba se metieron a almacenamiento a -70°C, 25°C, 40°C y 50°C durante duraciones de tiempo variadas para poder evaluar su estabilidad. Loa niveles de la actividad del Factor VIII se evaluaron después de 2 semanas, 1 mes, 2 meses y 3 meses y los resultados se resuman en la Tabla 10 abajo. Dos de las muestras, uno que utilizó mannitol como el agente de volumen y sorbitol con el estabilizador, y el otro que utilizó mannitol como el agente xxx y glicerol como el estabilizador, mostraron estabilidad pobre. Las otras formulaciones mostraron la habilidad de estabilizar el Factor VIII.

Tabla 10 Ejemplo 7 Basado en la información desarrollado durante los estudios que fueron descritos en los Ejemplos 5 y 6, se decidió que las formulaciones a candidatos con los excipientes que se muestran en la Tabla 11 abajo se desarrollarán mas.

Tabla 11 Se desarrollaron las siguientes formulaciones específicas basadas en los parámetros: Tabla 12 Formulación Formulación Formulación Formulación Formulación #1 #2 #3 #4 #5 10 mM 10 mM 10 25 mM 10 mM HEPES HEPES mMHEPES Histidina HEPES 20 mM Tris 20 mM Tris 20 mM Tris 20 mM Tris 20 mM Tris 225 mM NaCl 225 mM NaCl 225 mM NaCl 225 mM NaCl 225 mM NaCl 0.03% (v/v) 0.03% (v/v) 0,03% (v/v) 0.03% (v/v) 0.03% (v/v) Tween-80 Tween-80 Tween-80 Tween-80 Tween-80 8% (w/v) 8% (w/v) 8% (w/v) 8% (w/v) 8 % (w/v) mannitol glicina mannitol glicina mannitol 2% (w/v) 2% (w/v) 2% (w/v) 2% (w/v) 2 % (w/v) trehalosa trehalosa arginina trehalosa trehalosa 0.2 mg/ml 0.2 mg/ml 0.2 mg/ml 0.2 mg/ml 0.2 mg/ml glutatione glutatione glutatione glutatione glutatione reducido reducido reducido reducido reducido 4 mM CaC12 4 mM CaC12 4 mM CaC12 4 mM CaC12 4 mM CaC12

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición de Factor VIII formulada sin la agregación de albúmina a dicha composición, compuesta por los siguientes excipientes de formulación aparte del Factor VIII: 4% a 19 % del agente de volumene seleccionado de este grupo consiste en mannitol, glicina y alanina; 1% a 4% del agente estabilizador seleccionado de este grupo consiste en sucrosa, trehalosa,rafinosa, y arginina; 1 mM a 5 mM sal de calcio; 100 mM a 300 mM NaCl; y un agente de defensa para mantener el nivel de pH aproximadamente entre 6 y 8.

2. La composición del Factor VIII de la Reivindicación 1, también compuesto por un surfactante.

3. La composición del Factor VIII de la Reivindicación 2, dentro de la cual dicho surfactante se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Plurónico F68, y Brij 35.

4. La composición del Factor VIII de la Reivindicación 3, dentro de la cual dicho surfactante es polisorbato 80, y dentro de la cual dicho polisorbato 80 esta presente en una cantidad menor a 0.1%.

5. La composición del Factor VIII de las Reivindicaciones 1-4, dentro de la cual dicho surfactante esta presente en una cantidad de alrededor de 0.03%.

6. La composición del Factor VIII según las Reivindicaciones 1-5, dentro de la cual dicho agente de defensa se selecciona del grupo que consiste en Tris, Propano de BIS-Tris, histidina, PIPES, MOPS, HEPES, MES y ACES.

7. La composición del Factor VIII de la Reivindicación 6, dentro de la cual el agente de defensa consiste en Tris.

8. La composición del Factor VIII de la Reivindicación 7, dentro de la cual Tris esta presente en una cantidad de alrededor de 20 mM.

9. La composición del Factor VIII de la Reivindicación 6, dentro de la cual dicho agente de defensa esta compuesto de entre alrededor de 10 mM y alrededor de 50 mM histidina.

10. La composición del Factor VIII de la Reivindicación 9, dentro de la cual histidina esta presente in una cantidad de alrededor de 25 mM.

11. La composición del Factor VIII de las Reivindicaciones 1-10, además compuesta por un antioxidante.

12. La composición del Factor VIII de la Reivindicación 11 dentro de la cual dicho antioxidante es glutathione.

13. La composición del Factor VIII de la Reivindicación 12, dentro de la cual dicho glutathione esta presente en una cantidad de entre alrededor de 0.05 mg/ml y alrededor de 1.0 mg/ml.

14. La composición del Factor VIII según las Reivindicaciones 1-13, dentro de la cual dicho agente de volumen esta presente en una cantidad de alrededor de 8%.

15. La composición del Factor VIII según las Reivindicaciones 1-14 dentro de la cual dicho agente de volumen es mannitol.

16. La composición del Factor VIII según las Reivindicaciones 1-14 dentro de la cual dicho agente de volumen es glicina.

17. La composición del Factor VIII según las Reivindicaciones 1-17 dentro de la cual dicho stabilizing agent esta presente en una cantidad de alrededor de 2 %.

18. La composición del Factor VIII según las Reivindicaciones 1-17 dentro de la cual el stabilizing agent es sucrosa.

19. La composición del Factor VIII según las Reivindicaciones 1-17 dentro de la cual dicho stabilizing agent es arginina.

20. La composición del Factor VIII según las Reivindicaciones 1-17 dentro de la cual el stabilizing agent es trehalosa.

21. La composiciones del Factor VIII según las Reivindicaciones 1-20 dentro de la cual NaCl esta presente en una cantidad de ente alrededor de 200mM a alrededor de 250mM.

22. La composición del Factor VIII de la Reivindicación 21 dentro de la cual NaCl esta presente en una cantidad de alrededor de 225 mM.

23. La composición del Factor VIII según las Reivindicaciones 1-22, dentro de la cual la sal de calcio es cloruro de calcio.

24. La composición del Factor VIII según las Reivindicaciones 1-23 dentro de la cual dicha composición esta en forma liofilizada.

25. Una composición del Factor VIII formulado sin agregar albúmina a dicha composición, que consiste en los siguientes excipientes de formulación aparte del Factor VII: 2%-6% almidón hidroxietil; 1%4% de un stabilizing agent seleccionado del grupo que consiste en sucrosa, trehalosa, rafinosa y arginina; lmM a 5mM sal de calcio; 100 mM a 300 mM NaCl; y un agente de defensa para mantener el nivel de pH a aproximadamente entre 6 y 8.

26. La composición del Factor VIII compuesto por alrededor de 4% almidón hidroxietil.

27. La composición del Factor VIII según las Reivindicaciones 25-26 compuesto por alrededor de 200 mM NaCl.

28. La composición del Factor VIII según las Reivindicaciones 25-27 dentro de la cual un stabilizing agent esta presente en una cantidad de alrededor de 2%.

29. La composición del Factor VIII según las Reivindicaciones 25-28 dentro de la cual el stabilizing agent es sucrosa.

30. La composición del Factor VIII según las Reivindicaciones 25-28, dentro de la cual el stabilizing agent es arginina.

31. La composición del Factor VIII según las Reivindicaciones 25-28 dentro de la cual el stabilizing agent es trehalosa.

32. Una composición del Factor VIII formulada sin agregar albúmina a dicha composición, compuesto por los siguientes excipientes de formulación aparte del Factor VIII: 300mM a 500 mM NaCl; 1% a 4% de un stabilizing agent seccionado entre el grupo que consiste en sucrosa, trehalosa, rafinosa, y arginina; lmM a 5mM sal de calcio; y un agente de defensa para mantener el nivel de pH a aproximadamente entre 6 y 8.

33. La composición de la Reivindicación 32 dentro de la cual NaCl esta presente en una cantidad de alrededor de 400mM.

34. El uso de una composición de un Factor VIII según cualquiera de las Reivindicaciones 1-33 para la preparación de un medicamento par el tratamiento de hemofilia.

35. Un método mejorado de liofilización de una formulación farmacéutica aguosa que contiene un agente de volumen cristalizable y NaCl., dentro de la cual el método consiste en los siguientes paso: (a) Congelar la formulación farmacéutica a una temperatura menor a alrededor de -35°C; (b) recocer la formulación farmacéutica a entre alrededor de -30° y -19°C; (c) reducir la temperatura de la formulación farmacéutica a menos de alrededor de -50°C; (d) recocer la formulación farmacéutica a entre alrededor de -30° y -39°C; y luego (e) congelar en seco la formulación farmacéutica.. ABSTRACTO Una composición de un Factor VIII formulado sin albúmina, compuesta por los siguientes excipientes de formulación aparte del Factor VIII: 4% a 10% de un agente de volumen seleccionado de entre el grupo compuesto por mannitol, glicina y alanina; 1% a 4% de un agente estabilizador seleccionado de entre el grupo compuesto por sucrosa, trehalosa, rafinosa y arginina; 1 mM a 5mM sal de calcio; lOOmM a 300 mM NaCl; y un agente de defensa para mantener el nivel de pH a aproximadamente entre 6 y 8. Alternativamente, la formulación puede estar compuesto por 2% a 6% almidón hidroxietil; 1% a 4% de un agente estabilizador seleccionada de entre el grupo compuesto por sucrosa, trehalosa, rafinosa, y arginina; 1 mM a 5 mM sal de calcio; 100 mM a 300 mM NaCl; y un agente de defensa para mantener el nivel de pH a aproximadamente entre 6 y 8. En una presentación mas, la formulación puede estar compuesto por: 300 mM a 500 mM NaCl; 1% a 4% de un agente estabilizador seleccionado de entre el grupo compuesto por sucrosa, trehalosa, rafinosa y arginina; 1 mM a 5 mM sal de calcio; y un agente de defensa.