KR20110076918A - 단백질의 산화성 분해를 방지하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

단백질의 산화성 분해를 방지하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20110076918A
KR20110076918A KR1020117008149A KR20117008149A KR20110076918A KR 20110076918 A KR20110076918 A KR 20110076918A KR 1020117008149 A KR1020117008149 A KR 1020117008149A KR 20117008149 A KR20117008149 A KR 20117008149A KR 20110076918 A KR20110076918 A KR 20110076918A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
formulation
protein
oxidation
antibody
antibodies
Prior art date
Application number
KR1020117008149A
Other languages
English (en)
Inventor
준얀 에이. 지
유창 존 왕
보얀 장
Original Assignee
제넨테크, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제넨테크, 인크. filed Critical 제넨테크, 인크.
Publication of KR20110076918A publication Critical patent/KR20110076918A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4415—Pyridoxine, i.e. Vitamin B6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 단백질 및 유리 메티오닌을 단백질내 방향족 아미노산 잔기의 산화를 방지할 수 있는 하나 이상의 화합물과 함께 포함하는 약제학적 제형에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 산화-민감성 치료제의 안정화된, 약제학적으로 효과적인 제제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 치료제의 산화를 억제하는 방법에 관한 것이다.

Description

단백질의 산화성 분해를 방지하기 위한 조성물 및 방법{Compositions and methods for the prevention of oxidative degradation of proteins}
본 발명은 단백질의 산화성 분해를 방지하는 안정화제로서 방향족 화합물의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 산화-민감성 치료제의 안정화된, 약제학적으로 효과적인 제제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 치료제의 산화를 억제하는 방법에 관한 것이다.
단백질은 정제 및 저장 동안 다양한 정도의 분해를 겪는다. 산화는 단백질의 주요 분해 경로 중 하나이며, 단백질 안정성 및 효능에 있어 파괴적인 효과를 갖는다. 산화 반응은 아미노산 잔기의 파괴, 펩타이드 결합 가수분해, 및 이어서 단백질의 3차 구조 및 단백질 응집의 변경으로 인하여 단백질 불안정성을 유발한다[참조: Davies, J. Biol. Chem. 262: 9895-901 (1987)]. 단백질 약제의 산화는 뉴옌(Nguyen)[참조: Formulation and Delivery of Protein and Peptides, Chapter 4 (1994)], 호보르카(Hovorka)[참조: J. Pharm Sci. 90:25369 (2001)] 및 리(Li)[참조: Biotech Bioengineering 48:490-500 (1995)]에 의해 고찰되어 왔다.
단백질 산화의 원인
산화는 많은 상이하고 상호연관된 경로를 통해 발생하며 승온, 산소 농도, 수소 이온 농도(pH) 및 전이 금속, 과산화물 및 광에 대한 노출을 포함하는, 각종의 유발 조건(triggering condition)에 의해 촉매된다. 통상적으로 단백질의 산화성 분해을 유발하는 중요한 인자는 산소, 반응성 산소 종 및 금속에 대한 노출이다. 특정의 부형제가 단백질 응집에 대해 보호하기 위해 약제학적 조성물 속에 제형화되고 있지만, 이들 제제는 또한 반응성 산소 종을 함유하기 때문에 산화를 증진시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리소르베이트 80(일반적으로 트윈으로 알려짐)과 같은, 일반적으로 사용된 표면활성제는 표면활성제의 추가의 산화를 유발하여 낮은 농도의 금속의 존재하에서 보다 많은 양의 반응성 산소 종을 생성할 수 있는 미량의 과산화물 오염물을 함유한다[참조: Ha et al., J Pharm Sci 91:2252-2264 (2002); Harmon et al., J Pharm Sci 95:2014-2028 (2006)]. 이에 의해 산소 라디칼 및 금속의 오염은 산화를 위한 촉매 환경을 제공함으로써, 표면활성제와 함께 제형화된 단백질의 분해를 제공한다. 액체 또는 동결건조된 제형에서 단백질의 산화는 또한 폴리소르베이트 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 다른 제형 부형제내 과산화물 및 철 또는 구리와 같은 미량의 금속에 의해 유발되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 약제학적 제제는 일반적으로 편리한 저장 및 적용을 위해 저 밀도 폴리에틸렌(LDPE) 또는 폴리프로필렌으로 제조된 플라스틱 용기속에 포장된다. 그러나, 이들 플라스틱 용기는 산소에 대한 투과성이 용이하다. 산소는 메티오닌의 메티오닌 설폭사이드로의 산화와 같은, 약제학적 단백질내 산화-민감성 잔기(들)의 급속한 산화를 유발하는 반응성 산소 종을 형성한다[참조: Manning et al., Pharmaceutical Research, Vol. 6, No. 11, (1989)].
민감성 순서에 따라, 시스테인(Cys), 메티오닌(Met), 트립토판(Trp), 히스티딘(His), 및 타이로신(Tyr) 잔기의 측쇄가 산화에 특히 취약하다. 이들 아미노산 잔기의 산화에 대한 민감성은 이웃하는 이중 결합상으로 비편재화(delocalization)에 의해 안정화된 방향족 환과 함께 형성된 부가 종의 결과이다. Cys에서 티올 그룹은 라디칼에 의해 용이한 수소 추출을 제공하므로, 가장 반응성인 작용 그룹이며, 이러한 이유로 아주 약간의 약제학적 단백질만 유리 Cys를 함유한다.
Met 설폭사이드(Met[O])를 형성하는 메티오닌 산화
메티오닌 산화는 Met 설폭사이드(Met[O])를 형성하며, 극도의 조건하에서, 설폰을 형성한다. 다음 실시예는 Met 산화를 나타내는 약제학적 단백질을 나타내며 각각의 연구에 사용된 산화제가 확인되어 있다: 성장 호르몬[hGH, 참조: Teh, L-C, J. Biol Chem 262:6472-7, (1987) H2O2 사용, Pearlman R, Chapter 1, Pharmaceutical Biotechnology vol 5 (1993), Zhao F, J. Biol Chem 272:9019-9029 (1997), Asc/Cu(II)/O2 사용], IL-2[참조: Sasaoki K, Chem Pharm Bull 37:2160-4 (1989) 100x 배의 H2O2 사용, Cade JA, Pharm Res. 18:1461-7 (2001) 퍼옥소디설페이트 사용, Ha E, J Pharm Sci 91:2252-64, (2002) 트윈 사용], 소 펩타이드[참조: Li, Pharm Res 12: 348-55 (1995)], 렐락신[참조: Nguyen TH, Pharm Res. 10:1563-71 (1993) 및 Chapter 5 in Pharmaceutical Biotechnology vol 9 (1996) 2000x H2O2 사용, Li, Biochem 34: 5762-72 (1995) Asc/Cu(II)/O2 사용], rhGCSF[참조: Lu HS, Arch Biochem Biophys 362:1-11 (1999), Herman AC, Chapter 7 in Pharmaceutical Biotechnology vol 9 (1996), Yin, Pharm Res 21: 2377-83 (2004) 및 Pharm Res 22: 141-7 (2005) H2O2 사용], rhVEGF[참조: Duenas ET, Pharm Res. 18:1455-60 (2001), H2O2 및 tBHP 사용], IGF-1[참조: Fransson, Pharm Res 13:1252 (1996), 용해된 O2, Fe(III) EDTA 사용], rhCNF 및 rhNGF[참조: Knepp V, PDA J Pharm Sci Tech. 50:163-171 (1996), H2O2 사용], BDNF[참조: Jensen JL, Pharm Res. 17:190-6 (2000), Asc/Cu(II)/O2 사용], rhLeptin[참조: Liu JL, Pharm Res. 15:632-40 (1998) tBHP 및 H2O2 사용], 악티뮨 및 악타바제[참조: Keck RG, Anal Biochem. 236, 56-62 (1996), tBHP 사용], 헤르켑틴[참조: Shen FJ, Techniq. Protein Chem. VII. 275-284 (1996) tBHP 사용, Lam XM, J Pharm Sci 86:1250-5 (1997) 열, 광 및 스테인레스 강 사용] 및 PTH[참조: Yin et al., Pharm Res 22:141-7 (2004), Chu et al., Biochem 43: 14139-48 (2004) 및 Chu et al., J Pharm Sci 93:3096-102 (2004), H2O2 사용], 및 모노클로날 항체[참조: Wei et al. Anal Chem. 79: 2797-805, 2007; tBHP, UV 조사 및 오존 사용]. 과거 20년 동안 매우 다양한 산화제가 단백질의 산화를 연구하기 위해 사용되어 왔음은 주목할만 하다. tBHP 및 H2O2가 주로 사용되어 왔다. 아스코르베이트를 제외하고, 모든 것은 금속 비함유 산화제이다.
옥소-히스티딘을 형성하는 히스티딘 산화
His 산화는 주로 옥소-히스티딘을 형성하지만 또한 산화 조건에 따라, 각종의 다른 산화 생성물을 형성한다. Asc/Cu(II)/O2를 사용함으로써, 리 등(참조: J Pharm Sci. 85:868-72, 1996)은 렐락신에서 His 잔기의 산화를 관측하였다. 사람 성장 호르몬을 사용하여 짜오(Zhao) 등(참조: J Biol Chem 272:9019-9029, 1997)은, 동일한 산화시스템을 사용하여 금속-결합 부위에서 금속-촉매된 산화를 자극하는 경우, 옥소-히스티딘을 관측하였다. His의 산화 생성물로서 아스파르트산 및 아스파라긴은 또한 Cu(II)/H2O2의 존재하에서 β-아밀로이드 펩타이드 속에서 검출되었다[참조: Kowalik-Jankowska et al., J Inorg Biochem 98 (6):940-950, 2004].
트립토판 산화
트립토판 산화와 관련하여, 다수의 생성물이 형성된다. 수용액에서 트립토판의 안정성 연구[참조: Lee, J Parent Sci Tech 42: 20-2 (1988)] 및 소 펩타이드 및 라이소자임에서 트립토판 잔기의 안정성 연구[참조: Simat TJ, J Agric Food Chem 46:490-8 (1998)] 및 소 α-결정에서 트립토판 잔기의 안정성 연구[참조: Finley EL, Protein Sci 7:2391-7 (1998)]는 5-하이드록시-트립토판, 옥시-인돌 알라닌, 키누레닌 및 N-포르밀키누레닌인 주요 분해제를 명확히 확인하였다. 아미노산 산화의 다른 형태와 비교하여, 약제학적 단백질내 Trp의 산화에 있어서의 문헌은 상대적으로 거의 없다. 데이비스(Davies) 등(참조: J Biol Chem. 262: 9902-7, 1987)은 코발트 조사로부터 생성된 산소 라디칼에 의해 소 혈청 알부민을 산화하였고, 우치다(Uchida) 등(참조: Agric Biol Chem 53:3285-92, 1989)은 Fe(II)/EDTA/Asc를 사용하여 알부민에 스트레스를 제공하고 Trp 및 His의 선택적인 산화를 검출하였다. 최근에, 모노클로날 항체에서 Trp 산화는 암젠(Amgen)(참조: Yang et al. J Chrom. A. 1156: 174-82, 2007)에 의해 보고되었고, 메드임뮨(MedImmune)(참조: Wei et al. Anal Chem. 79: 2797-805, 2007)은 오존 및 UV 조사로 스트레스를 제공하였다. 제넨테크(Genentech)에서, Trp 산화는 항-VEGF, 항-CD40, 항-CD22 및 Apomab 항체에서 검출하였다. Apomab를 사용하면, 효능 감소가 Trp 산화의 정도와 관련되었다.
산화 메카니즘
위의 분석을 기초로 하여, 단백질은 도 1에 나타낸 특정의 또는 모든 3개의 분해 메카니즘을 통한 산화성 공격, 및 광-유도된 산화에 민감성일 수 있다. H2O2와의 친핵성 반응은, 단백질 생성물이 단백질 분리제 중 무균제로서 사용된 H2O2를 증발시키기 위해 노출되거나, 폴리소르베이트(예를 들면, 트윈) 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 일반적으로 사용된 부형제의 분해로부터 관측된 산화 반응일 수 있다. 미량의 금속(철, 구리 또는 크롬)이 예를 들면, 스테인레스 강과의 접촉으로 제형 용액 내로 도입되는 경우, H2O2와 Fe(II)의 펜톤 반응(Fenton reaction)이 작동된다. 제3 분해 메카니즘은 위에서 기술한 바와 같이, 분해된 트윈으로부터 올 수 있는 알킬퍼옥사이드를 경유한다(참조: Jaeger J, J Biochem Biophys Methods 29: 77-81, 1994).
산화를 겪는 단백질 약제는 흔히 단백질의 변형 및 효능 손실을 초래한다. 모노클로날 항체-함유 용액과 같은 단백질의 산화는 항체의 분해, 응집 및 단편화를 초래함으로써, 항체 활성의 손실을 초래할 수 있다. 다른 경우에, 심지어 단백질 약제가 산화 후 여전히 생물학적으로 활성인 경우, 성장 인자는 예를 들면, 고 수준의 메티오닌 설폭사이드가 존재하는 경우, FDA와 같은 행정 관청의 표준에 따른 약제학적 용도에 허용되지 않을 수 있다. 제제의 제조 및 포장 동안 산소를 배제시키기 위한 현재의 방지 과정은 약제학적 단백질의 유의적인 산화를 방지하는데 효과적이지 않은 것으로 입증되어 있다. 당해 결과는, 약제학적 제제가 산화 반응이 억제될 수 있는 잠재적인 가능성보다 더욱 짧은 효능기를 가진다는 것이다. 따라서, 장기간에 걸쳐 산화 조건을 견딜 수 있는 안정한 단백질-함유 약제학적 조성물을 제공하기 위하여, 단백질 분해의 가속화를 처리할 물리적 조건 및 화학적 조건을 확인하는 것이 당해 분야에서 요구되고 있다. 따라서, 다양한 유발 인자로 인한 산화성 손상으로부터 단백질을 보호할 부형제를 지닌 펩타이드- 및 항체-함유 약제학적 조성물을 제형화하는 것이 요구되고 있다.
당해 분야에서의 산화 안정화제
폴리소르베이트 및 폴록사머 등과 같은 표면활성제와 함께 특정의 아미노산 및 이의 각종 조합물을 사용하여 펩타이드 및 단백질 조성물을 안정화시켜 왔다(참조: 예를 들면, Yu-Chang John Wang and Musetta A. Hansen, "Parenteral Formulations of proteins and Peptides: Stability and Stabilizers", Journal of Parenteral Science and Technology, 42:S14, 1988). 모든 주사가능한 생성물에 대한 항산화제의 선택은 니마(Neema) 등[참조: J Pharm Sci Tech 51: 166-71(1997)]에 의해 편집되었으며, 여기서, 바이설파이트, 아스코르베이트, 부틸화된 하이드록실 아니솔, 시스테인 등이 나열되었다. 그러나, 나열된 제제 중 어느 것도 산화성 분해 메카니즘, 단백질내 메티오닌뿐 아니라 트립토판 및 다른 방향족 아미노산 잔기의 오염된 산화의 전체 범위를 취급하는데 있어 효과적이지 않은 것으로 여겨진다. 산화제로서, 유리 메티오닌이 미국 특허 제5,272,135호(Takruri, 1993) 및 또한 미국 특허원 제2003/0104996 A1호(Li, 2003)에서 처음 인용되었다. 유리 메티오닌은 데포(depo)-subQ 프로베라(Provera), 폴리스팀(Follistim) AQ, Gonal-f RFF, 루트로핀-α와 같은 다수의 시판된 비경구 생성물에서 발견될 수 있다. 히스티딘 또한 미국 특허 제5,849,700호(Sorensen et al., 1998)에 강력한 항산화제로서 기술되어 있다. 소렌센(Sorensen) 등은, 성장 호르몬 및 히스티딘 또는 히스티딘 유도체를 첨가제 또는 완충제로서 포함하는 약제학적 제제가 탈아미드화, 산화(설폭사이드 농도에 의해 측정된 것으로서) 및 펩타이드 결합의 분해에 대해 매우 높은 안정성을 입증함을 기술하고 있다. 단백질의 산화를 조절할 수 있는 다른 제제는 교재 및 고찰 문헌에 광범위하게 인용된, 금속 킬레이트제(예를 들면, EDTA) 및 유리 라디칼 스캐빈저(scavengers)(예를 들면, 만니톨)을 포함한다[참조: 예를 들면, Yu-Chang John Wang and Musetta A. Hansen, "Parenteral Formulations of proteins and Peptides: Stability and Stabilizers", Journal of Parenteral Science and Technology, 42:S14, 1988]. N-아세틸 트립토파네이트는 저온살균동안 사람 혈청 알부민을 안정화시키기 위해 특수 부위에 결합하는 리간드로서 옥타노에이트와 함께 사용되어 왔다[참조: Peters Biochemistry, genetics, and medical applications. Academic Press, NY, 1995]. 그러나, 아미노산 또는 표면활성제 중 어느 것도 분해된 표면활성제로부터 기원할 수 있는 알킬퍼옥사이드를 통한 산화를 중지시키지 못한다. 따라서, 산화성 공격에 민감한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 약제학적 비히클에서 산화의 다중 메카니즘을 억제하는 방법이 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 산화로 인한 손상으로부터 단백질을 보호하기 위한 개선된 조성물 및 방법을 제공한다. 당해 조성물은 트립토판, 타이로신 또는 히스티딘 잔기가 통상적으로 산화되도록 하는 유리 라디칼 매개된 산화를 효과적으로 감소시킬 수 있는 하나 이상의 화합물과 함께 제형화된, 산화에 대해 민감한 하나 이상의 단백질을 함유한다. 당해 조성물은 산화로부터 증가된 내성을 나타내어, 예를 들면, 보다 긴 제품 보관 기간, 실온 저장을 허용하는 보다 큰 안정성 및/또는 제품 포장에 있어서 보다 큰 적응성을 초래한다. 따라서, 본 발명은 항체 조성물과 같이, 심지어 다중-단위 단백질 조성물도 보호(즉, 안정화)하기 위한 중요한 수단을 제공한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 단백질내 방향족 아미노산 잔기의 산화를 방지할 수 있는 하나 이상의 화합물과 함께 제형화된(예를 들면, 실험실-등급과 같은 제제 또는 약제학적 조성물) 단백질을 포함하는 약제학적 제형이 제공된다. 바람직한 양태는 메티오닌과 함께 유리 방향족 아미노산, 뉴클레오타이드 또는 비타민 및 이들의 유도체를 이용하며, 이는 함께 대부분의 일반적인 단백질 산화 메카니즘 모두에 대해 효과적으로 보호한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 하기에 기술된 바와 같은 단백질 내에 방향족 아미노산 잔기의 산화를 방지할 수 있는 하나 이상의 화합물과 함께 메티오닌을 단백질과 제형화시킴으로써 안정화시킨 단백질 조성물을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하는데 효과적인 양의, 단백질-계 치료제 및 당해 제제 내 방향족 아미노산 잔기의 산화를 방지할 수 있는 하나 이상의 화합물을 포함하는 제형을 포유동물에게 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하기 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 단백질 및 당해 단백질내 방향족 아미노산 잔기의 산화를 방지할 수 있는 하나 이상의 화합물을 포함하는 제형을 제조하는 단계, 및 당해 제형 내 단백질의 물리학적 안정성, 화학적 안정성 또는 생물학적 활성을 평가하는 단계를 포함하는 약제학적 제형의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 단백질내 방향족 아미노산 잔기의 산화를 억제하기에 충분한 양의 메티오닌 또는 하나 이상의 화합물을, 단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 추가하는 것을 포함하는, 당해 단백질의 약제학적 조성물을 안정화시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 단백질 조성물에, 표면활성제의 양 및 상기 표면활성제의 분해로부터 생성된 산화 종을 무력화시키기에 충분한 양의 화합물을 추가하는 것을 포함하는, 약제학적 제형의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 방향족 아미노산, 뉴클레오타이드, 비타민 및 이들의 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 화합물과 함께 메티오닌을 추가함을 포함하는, 민감한 단백질내 방향족 아미노산 잔기의 산화를 방지하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 제한하는 것으로 고려되지 않는 다음의 상세한 기술 및 실시예로부터 명백할 것이다. 본 출원 전체에서 인용된 모든 참조 문헌, 특허 및 발표된 특허원의 내용은 본원에 참조로 표현하여 인용된다.
바람직한 양태의 상세한 기술
I. 정의
단백질의 화학적 불안정성은 단백질 주요 구조물과의 공유 결합의 분해 또는 형성을 포함할 수 있다. 단백질내 몇가지 산화 반응이 보고되어 있다. 염기성 또는 중성 매질 속에서, 아미노산 시스테인, 히스티딘, 메티오닌, 트립토판 및 타이로신의 잔기는 특히 산화되는 경향이 있다. 그러나, 산성 조건에서, 메티오닌은 민감성이다. 흔히 산화 반응은 생물학적 활성 및 심지어 면역원성에 있어서 큰 손실을 유발한다. 본 발명은 주로 산화로 인한 손상에 대해 단백질을 보호하기 위한 개선된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 조성물은 트립토판, 타이로신 또는 히스티딘 잔기를 통상적으로 산화시키는 유리 라디칼 매개된 산화를 효과적으로 감소시키기 위해 하나 이상의 방향족 화합물과 함께 제형화된 산화에 민감한 하나 이상의 화합물을 함유한다.
방향성(뉴클레오타이드내 퓨린 및 피리미딘의 방향족 환 또는, 특히 아미노산 트립토판내 인돌에서 예시되는 바와 같이)은, 방향족 화합물이 유리 라디칼과 반응하는 경우, 추가의 전자를 비편재화시킬 수 있기 때문에, 생성물은 전자 비편재화에 의해 안정화된다. 결과적으로, 방향족 화합물과 유리 라디칼 사이의 반응은 촉진된다. 전체 결과는, 유리 라디칼이 방향족 화합물내로 흡수되어 다른 분자에 추가로 손상을 입힐 수 없다는 것이다. 이러한 이유로, 방향족 화합물은 제형 부형제로서 가해지는 경우, 유리 라디칼의 산화성 손상 효과를 중화시키는 효과적인 제제로서 제공된다.
생리학적으로 적합한 방향족 화합물의 2개의 주요 부류는 뉴클레오타이드 및 아미노산이다. 이들 화합물들은 체내 화학의 천연 성분들이므로, 이들은 촉진성 안정성 프로파일을 가지며 비경구 제품용 부형제로 사용하기에 적합하다. 유리 메티오닌은 항산화제로서 통상적으로 사용되어 왔으며 다수의 시판된 비경구 제품 속에서 발견될 수 있다. 그러나, 이들 아미노산 단독은 산화의 모든 메카니즘에 대해 보호하지 않으며 메티오닌 또는 시스테인 잔기의 친핵성 산화를 억제하는데 가장 효과적이다. DNA가 유리 라디칼에 의한 손상에 고도로 민감하며 유리 라디칼과 우호적으로 반응하기 위한 핵산 유도체의 사용을 지지한다는 사실은 잘 공지되어 있다. 지금까지, 제형 부형제로서 핵산 유도체를 사용하는 것에 대해 거의 알려진 바가 없으며 시장 제품에서 제형 부형제로서 핵산을 이용하는 것은 없다.
본 발명의 하나의 측면에서, 본 발명의 조성물은 통상적으로 트립토판, 히스티딘, 타이로신 및 페닐알라닌으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 방향족 아미노산을 함유한다. 분해된 표면활성제로부터 흔히 생성되는 알킬퍼옥사이드를 통한 산화를 경감시키는 바람직한 방향족 아미노산은 트립토판 또는 이의 유도체, 나트륨 N-아세틸 트립토파네이트이다. 메티오닌 또는 메티오닌 유도체를 제형에 가하는 경우, 메티오닌 또는 시스테인의 친핵성 산화가 또한 억제될 수 있다. 따라서, 유리 트립토판과 메티오닌의 조합은 산화의 다중 메카니즘을 효과적으로 억제한다. 트립토판이 제형 속에 존재하는 조성물은 통상적으로 약 2 내지 10mg/ml 범위의 양을 함유한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 트립토판 단독 또는 하나 이상의 추가의 방향족 아미노산 및 메티오닌과 함께 제형화된(예를 들면, 실험실-등급 또는 약제학적 조성물과 같은, 제제속에) 생물학적으로 활성인 제제를 포함하는 약제학적 제형에 관한 것이다. 아미노산의 바람직한 조합은 단백질 산화의 가장 일반적인 메카니즘 모두에 대해 함께 효과적으로 보호하는 트립토판 및 메티오닌이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 조성물은 또한 유리 뉴클레오타이드 또는 이의 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 유도체는 단백질 및 펩타이드의 비경구 제형에 단독으로 또는 메티오닌과 함께 가해질 수 있다. 하나 이상의 유리 뉴클레오타이드가 안정화제로서 존재하는 제형은 통상적으로 약 0.1 내지 10mg/mL 범위의 양을 함유한다. 특수 양태에서, 하나 이상의 유리 뉴클레오타이드는 하나 이상의 유리 방향족 아미노산과 조합된다. 바람직한 양태는 메티오닌과 조합된 유리 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 조성물은 또한 트롤록스(6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산; 수용성 비타민 유도체) 및 피리독신(비타민 B6로서 일반적으로 공지됨)과 같은 비타민 유도체를 포함할 수 있다. 특수 양태에서, 하나 이상의 비타민 유도체는 하나 이상의 유리 방향족 아미노산과 조합된다. 바람직한 양태는 메티오닌과 조합된 비타민 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 산소의 유리 라디칼(즉, ROS 스캐빈저)를 중화시키는 하나 이상의 제제를 추가로 함유할 수 있다. 적합한 ROS 스캐빈저는 예를 들면, 만니톨, 메티오닌 및/또는 히스티딘을 함유한다. 따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 방향족 아미노산과 함께 제형화된 하나 이상의 단백질, 및 만니톨, 메티오닌 및/또는 히스티딘과 같은 하나 이상의 ROS 스캐빈저를 함유하는 조성물을 제공한다. EDTA와 같은 금속 킬레이트제 또한 ROS 생성의 개시를 억제할 수 있으므로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 단백질 응집을 억제하는 하나 이상의 제제를 포함할 수 있다. 특수 양태에서, 제제는 트윈(TWEEN), 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 글리세롤 및 폴록사머 중합체 중에서 선택된다. 조성물은 여전히 조성물의 pH를 바람직하게는 약 5.0 내지 약 8.0로 유지하는 완충제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 완충제는 예를 들면, 히스티딘, 트리스, 아세테이트, MES, 석신산, PIPES, 비스-트리스, MOPS, ACES, BES, TES, HEPES, EPPS, 에틸렌디아민, 인산 및 말레산을 포함한다. 조성물은 또한 염화나트륨, 아르기닌 염 등과 같은 탄력제(tonicifier)를 함유할 수 있다.
"표면활성제"는, 용액속에서 분자들이 응집하도록 함으로써 미셀(micelle)을 형성하도록 하는 잘 구분된 극성 및 비-극성 영역을 갖는 분자이다. 극성 부위의 특성에 따라서, 표면활성제는 비-이온성, 음이온성, 양이온성 및 양쪽성일 수 있다. 가장 비경구적으로 허용되는 비이온성 표면활성제는 폴리소르베이트 또는 폴리에테르 그룹으로부터 온다. 폴리소르베이트 20 및 80은 시판되는 단백질 제형 속에서 현재의 표면활성제 안정화제이다.
퍼옥사이드는 비-이온성 표면활성제의 공지된 오염물이다. 폴리소르베이트내 퍼옥사이드는 단백질의 산화성 분해를 초래할 수 있다. 제형은 퍼옥사이드 오염에 대해 단백질 제형내 폴리소르베이트 및 기타 중합체성 첨가물의 공급원을 스크리닝하고, 첨가물로서 사용하기 위한 퍼옥사이드 특정을 확립하는 경향이 있다. 달리는, 산화제의 혼입을 사용함으로써 산소-민감성 단백질에 대한 산화성 촉매로서 비-이온성 표면활성제가 이용될 가능성을 극복하는데 도움을 준다.
산화에 민감한 흥미있는 어떠한 적합한 단백질 또는 폴리펩타이드도 본 발명에 따라 보호됨으로써 안정화될 수 있다(즉, 본원에 기술된 바와 같은 산화 보호된 조성물 속에 제형화될 수 있다). 단백질은 이의 천연형(예를 들면, 원래의) 상태로 존재할 수 있거나, 예를 들면, 미세캡슐화 또는 접합(conjugation)에 의해 변형될 수 있다. 단백질은 치료학적 또는 진단학적일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들면, 산화성 손상에 대한 면역글로불린, 펩타이드, 단백질 및 이의 유사체를 포함한다.
또한, 산화성 손상, 단백질 응집 및 파괴에 특히 민감하여 이들을 진단학적으로 및 치료학적으로 비-작용성이 되도록 하는, 항체와 같은 다중-아단위 단백질을 본 발명에 따라 보호할 수 있다. 특수 양태에서, 본 발명은 완전한 사람 항체를 포함하는 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하는 조성물, 및 이의 단편 및 면역접합체(즉, 예를 들면, 독소, 중합체, 영상화제 또는 약물과 같은 치료제와 접합된 항체)를 포함하는 조성물과 같은 보호된(즉, 안정화된) 항체 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 양태가 산화로 인한 손상에 대해 단백질을 보호하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이지만, 생물학적으로 활성인 제제를 또한 펩타이드, 소 분자, 탄수화물, 핵산, 지질, 단백질, 항체 및/또는 이의 유사체로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있다.
본원에서, 용어 "약"의 서문으로 시작하는 수치 범위 또는 양은 표현적으로 당해 정확한 수치 범위 또는 정확한 수치 양을 포함한다.
용어 "약제학적 제형"은 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며, 제형이 투여되는 대상체에 대해 허용되지 않게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다.
항체는, 제공된 시간에 항체의 생물학적 활성이 항원에 결합하여 측정가능한 생물학적 반응을 초래하는 시험관내 또는 생체내 항체의 능력에 의해 측정된 것으로서, 약제학적 제형이 제조된 시간에 나타낸 생물학적 활성의 약 10%(검정 오차내)인 경우, 약제학적 제형 속에서 "생물학적 활성"을 보유한다.
"안정한" 제형은, 내부 단백질이 저장시 자체의 물리학적 및/또는 화학적 안정성을 필수적으로 보유하는 것이다. 안정성은 선택된 온도에서 선택된 기간 동안 측정할 수 있다. 바람직하게는, 제형은 실온(~30℃) 또는 40℃에서 적어도 1개월 동안 안정하고/하거나 약 2 내지 8℃에서 적어도 1년 동안 및 바람직하게는 적어도 2년 동안 안정하다. 예를 들어, 저장 동안 응집 정도는 단백질 안정성의 지표로서 사용될 수 있다. 따라서, "안정한" 제형은, 약 10% 미만 및 바람직하게는 약 5% 미만의 단백질이 제형 속에 응집물로 존재하는 경우의 것일 수 있다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 각종의 분석 기술이 당해 분야에 유용하며 예를 들면, 문헌[참조: Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]에서 고찰된다.
용어 "수용액"은 물이 용해 매질 또는 용매인 용액을 말한다. 물질이 액체 속에 용해되는 경우, 혼합물을 용액이라고 명명한다. 용해된 물질은 용질이고, 용해하는 액체(이 경우는 물)는 용매이다.
산화를 "억제하는"은 적어도 하나의 산화 억제제를 포함하는 단백질-함유 용액 속에 존재하는 산화의 양을 적어도 하나의 산화 억제제를 포함하지 않는 단백질-함유 용액 속에 존재하는 산화의 양과 비교하여 측정한, 산화의 양을 방지하거나, 환원시키거나, 감소시키는 것으로 의도된다.
본원의 "산화된" 단백질 또는 항체는, 하나 이상의 이의 아미노산 잔기(들)가 산화된 것이다.
"산화에 민감한" 단백질 또는 항체는 산화하는 경향이 있는 것으로 밝혀진 하나 이상의 잔기(들)을 포함하는 것이다.
단백질의 산화를 측정하기 위해 본 발명에서 사용할 수 있는 방법은 겔 전기영동, 등전 포커싱, 모세 전기영동, 크기 배제 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피 및 역-상 고 성능 액체 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피, 펩타이드 맵핑, 올리고사카라이드 맵핑, 질량 분광법, 자외선 흡수 분광법, 형광성 분광법, 원형 광이색성 분광법, 등온 적정 열량측정법, 차등 주사 열량측정법, 분석 초-원심분리, 역학적 광 산란, 단백질분해 및 가교결합, 혼탁도 측정, 여과기 지연 검정, 면역학적 검정, 형광성 염료 결합 검정, 단백질-염색 검정, 현미경 및 기타 결합 검정을 포함한다.
"폴리펩타이드" 또는 "단백질"은, 쇄 길이가 충분하여 보다 큰 수준의 3차 및/또는 4차 구조를 생산하는 아미노산 서열을 의미한다. 따라서, 단백질은 또한 이러한 구조를 갖지 않은 아미노산-계 분자인 "펩타이드"로부터 구별된다.
제형화되는 단백질은 바람직하게는 필수적으로 순수하며 바람직하게는 필수적으로 동질(즉, 오염 단백질이 없는)이다. "필수적으로 순수한" 단백질은 조성물의 총 중량을 기준으로 하여, 단백질을 적어도 약 90 중량%, 바람직하게는 적어도 95 중량% 포함하는 조성물을 의미한다. "필수적으로 동질인" 단백질은 조성물의 총 중량을 기준으로 하여, 단백질을 적어도 약 99 중량% 포함하는 조성물을 의미한다.
특정 양태에서, 단백질은 항체이다. 본원에서 항체는 관심 "항원"에 대해 지시된다. 바람직하게는 항원은 생물학적으로 중요한 단백질이며 질환 또는 장애로 고생하는 포유동물에 항체의 투여는 이러한 포유동물에서 치료학적 잇점을 초래할 수 있다. 그러나, 비-단백질 항원(종양-관련 당지질 항원과 같은; 참조: 미국 특허 제5,091,178호)에 대해 지시된 항체가 또한 고려된다. 항원이 단백질인 경우, 이는 막전이 분자(예를 들면, 수용체) 또는 성장 인자와 같은 리간드일 수 있다. 예시적인 항원은 위에서 논의된 단백질을 포함한다. 본 발명에 포함되는 항체에 대한 바람직한 분자 표적은 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 및 CD40와 같은 CD 폴리펩타이드, EGF 수용체 (HER1), HER2, HER3 또는 HER4 수용체와 같은 HER 수용체 계열의 구성원; α 또는 β 아단위(예를 들면, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체)를 포함하는 LFA-1, Mac1, p150, 95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 av/b3 인테그린과 같은 세포 부착 분자; CRIg와 같은 대식구 수용체, TRAIL/Apo-2와 같은 종양 괴사 인자, 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF)와 같은 성장 인자; IgE; 혈액 그룹 항원; flk2/flt3 수용체; 비만(OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 폴리펩타이드 C 등을 포함한다. 다른 예시적인 단백질은 사람 성장 호르몬(hGH) 및 소 성장 호르몬(bGH)을 포함하는 성장 호르몬(GH); 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상샘 호르몬; 갑상샘 자극 호르몬; 지단백질; α-1-안티트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체화 호르몬; 글루카곤; 인자 VIIIC, 인자, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트(von Willebrands) 인자와 같은 응괴 인자; 단백질 C와 같은 항-응괴 인자; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 표면활성제; 유로키나제 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성인자(t-PA)와 같은 플라스미노겐 활성인자; 봄바진; 트롬빈; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 엔케팔리나제; RANTES(정상적으로 T-세포 발현되고 분비된 활성화시 조절); 사람 대식구 염증 단백질(MIP-1-α); 사람 혈청 알부민(HSA)과 같은 혈청 알부민; 뮐러(mullerian)-억제 물질; 렐락신 A-쇄; 렐락신 B-쇄; 프로렐락신; 마우스 고나도트로핀-관련 펩타이드; DNase; 인히빈; 악티빈; 호르몬 또는 성장 인자용 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 골-기원한 향신경 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6)와 같은 향신경 인자, NGF-β와 같은 신경 성장 인자; 혈소판-기원한 성장 인자(PDGF); αFGF 및 βFGF와 같은 섬유모세포 성장 인자; 상피 성장 인자(EGF); TGF-α 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5와 같은 TGF-β와 같은 형질전환 성장 인자(TGF); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); 데스(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I); 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP); 적혈구형성인자(EPO); 트롬보포이에틴(thrombopoietin)(TPO); 골유도 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질(BMP); 인터페론-α, -β, 및 -γ와 같은 인터페론; 콜로니 자극 인자(CSF), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터루킨(IL), 예를 들면, IL-1 내지 IL-10; 슈퍼옥사이드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자(DAF); 예를 들면, AIDS 엔벨로프의 일부와 같은 바이러스 항원; 운반 단백질; 귀소(homing) 수용체; 아드레신(addressin); 조절 단백질; 면역부착; 항체; 및 상기-나열한 폴리펩타이드 중 어느 것의 생물학적으로 활성인 단편 또는 변이체를 포함한다. 많은 다른 항체 및/또는 다른 단백질이 본 발명에 따라 사용될 수 있으며, 상기 나열은 제한하는 것을 의미하지 않는다.
임의로 다른 분자와 접합된 가용성 항원 또는 이의 단편은 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 수용체와 같은 막전이 분자의 경우, 이들의 단편(예를 들면, 수용체의 세포외 도메인)을 면역원으로서 사용할 수 있다. 달리는, 막전이 분자를 발현하는 세포를 면역원으로 사용할 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원(예를 들면, 암 세포주)으로부터 기원할 수 있거나 막전이 분자를 발현하기 위한 재조합체 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다.
본원에서 제형화될 항체의 예는 트라스투주마브(HERCEPTIN®)[참조: Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), 미국 특허 제5,725,856호] 및 페르투주마브(OMNITARGTM)(참조: 제WO01/00245호)를 포함하는 HER2 항체; CD20 항체(하기 참조); IL-8 항체[참조: St John et al., Chest, 103:932 (1993), 및 국제 특허 공보 제WO 95/23865호); 사람화된 VEGF 항체 huA4.6.1 베바키주마브(AVASTIN®) 및 라니비주마브(LUCENTIS®)[참조: Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992), 1998년 10월 15일자로 발표된 국제 특허 공보 제WO 96/30046호, 및 제WO 98/45331호]와 같은 사람화되고/되거나 친화성 성숙된 VEGF 항체를 포함하는 VEGF 또는 VEGF 수용체 항체; PSCA 항체(참조: 제WO01/40309호); 에팔리주마브(RAPTIVA®)[참조: 미국 특허 제6,037,454호, 미국 특허 제5,622,700호, 제WO 98/23761호, Stoppa et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), 및 Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)]를 포함하는 CD11a 항체; 오말리주마브(XOLAIR®)[참조: Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993), 및 국제 특허 공보 제WO 95/19181호; 1998년 2월 3일자로 허여된 미국 특허 제5,714,338호, 또는 1992년 2월 25일자로 허여된 미국 특허 제5,091,313호, 1993년 3월 4일자로 발표된 제WO 93/04173호, 또는 1998년 6월 30일자로 출원된 국제 특허원 제PCT/US98/13410호, 미국 특허 제5,714,338호]를 포함하는 IgE에 결합하는 항체; CD18 항체(참조: 1997년 4월 22일자로 허여된 미국 특허 제5,622,700호, 또는 1997년 7월 31일자로 발표된 제WO 97/26912호에서와 같은); Apo-2 수용체 항체 항체(참조: 1998년 11월 19일자로 발표된 제WO 98/51793호); 조직 인자(TF) 항체(참조: 1994년 11월 9일자로 승인된 유럽 특허 제0 420 937 B1호); α4-α7 인테그린 항체(참조: 1998년 2월 19일자로 발표된 제WO 98/06248호); EGFR 항체(참조: 예를 들면, 1996년 12월 19일자로 발표된 제WO96/40210호에서와 같은 키메라화되거나 사람화된 225 항체, 세툭시마브, ERBUTIX®); OKT3(참조: 1985년 5월 7일자로 허여된 미국 특허 제4,515,893호)와 같은 CD3 항체; CHI-621(SIMULECT®) 및 ZENAPAX®(참조: 1997년 12월 2일자로 허여된 미국 특허 제5,693,762호)와 같은 CD25 또는 Tac 항체; cM-7412 항체[참조: Choy et al., Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996)]와 같은 CD4 항체; CAMPATH-1H(ILEX/Berlex)[참조: Riechmann et al., Nature 332:323-337 (1988)]와 같은 CD52 항체; Fc에 대해 지시된 M22 항체[참조: Graziano et al., J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995)에서와 같은 RI]와 같은 Fc 수용체 항체; hMN-14[참조: Sharkey et al., Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995)]와 같은 암배아 항원(CEA) 항체; huBrE-3, hu-Mc 3 및 CHL6을 포함하는 유방 상피 세포에 대해 지시된 항체[참조: Ceriani et al., Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995); 및 Richman et al., Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)]; C242와 같이 결장 암종 세포에 결합하는 항체[참조: Litton et al., Eur J. Immunol. 26(1):1-9 (1996)]; CD38 항체, 예를 들면, AT 13/5[참조: Ellis et al., J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)]; Hu M195[참조: Jurcic et al., Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995)] 및 CMA-676 또는 CDP771와 같은 CD33 항체; 17-1A(PANOREX®)와 같은 EpCAM 항체; 압킥시마브 또는 c7E3 Fab(REOPRO®)와 같은 GpIIb/IIIa 항체; MEDI-493(SYNAGIS®)과 같은 RSV 항체; PROTOVIR®과 같은 CMV 항체; PRO542와 같은 HIV 항체; Hep B 항체 OSTAVIR®과 같은 간염 항체; 항-MUC16[참조: 제WO2007/001851호; Yin, BWT 및 Lloyd, KO, J. Biol. Chem. 276:27371-27375 (2001)] 및 오바렉스를 포함하는 CA125 항체; 이디오타입 GD3 에피토프 항체 BEC2; αvβ3 항체(예를 들면, VITAXIN®; Medimmune); ch-G250와 같은 사람 신장 세포 암종 항체; ING-1; 항-사람 17-1An 항체(3622W94); 항-사람 결장직장 종양 항체(A33); GD3 강글리오사이드에 대해 지시된 항-사람 흑색종 항체 R24; 항-사람 편평세포 암종(SF-25); Smart ID10와 같은 사람 백혈구 항원(HLA) 항체 및 항-HLA DR 항체 온콜림(Oncolym)(Lym-1); TRU 016(Trubion)과 같은 CD37 항체; IL-21 항체(Zymogenetics/Novo Nordisk); 항-B 세포 항체(Impheron); B 세포 표적화 MAb(Immunogen/Aventis); 1D09C3(Morphosys/GPC); 림포라드(LymphoRad) 131(HGS); Lym-1Y-90 (USC) 또는 항-Lym-1 온코림(USC/Peregrine)과 같은 Lym-1 항체; LIF 226(Enhanced Lifesci.); BAFF 항체(예를 들면, 제WO 03/33658호); BAFF 수용체 항체(참조: 예를 들면, 제WO 02/24909호); BR3 항체; 벨리무마브와 같은 Blys 항체; LYMPHOSTAT-BTM; ISF 154(UCSD/Roche/Tragen); 고밀릭시마(Idec 152; Biogen Idec); 알틀리주마브(ACTEMRATM; Chugai/Roche]와 같은 IL-6 수용체 항체; HuMax-Il-15(Genmab/Amgen)과 같은 IL-15 항체; CCR2 항체(예를 들면, MLN1202; Millieneum)과 같은 케모킨 수용체 항체; C5 항체(예를 들면, 에쿨리주마브, 5G1.1; Alexion)과 같은 항-상보체 항체; 사람 면역글로불린의 경구 제형(예를 들면, IgPO; Protein Therapeutics); ABT-874(CAT/Abbott)와 같은 IL-12 항체; 테넬릭시마브(BMS-224818; BMS); S2C6 및 이의 사람화된 변이체(참조: 제WO00/75348호) 및 TNX 100(Chiron/Tanox)를 포함하는 CD40 항체; cA2 또는 인플릭시마브(REMICADE®)를 포함하는 TNF-α항체, CDP571, MAK-195, 아달리무마브(HUMIRATM), CDP-870(Celltech), D2E7(Knoll)과 같은 페길화된 TNF-α 항체 단편, 항-TNF-α 폴리클로날 항체(예를 들면, PassTNF; Verigen); LL2 또는 에프라트주마브 Y-90 및 에프라트주마브 I-131를 포함하는 에프라투주마브(LYMPHOCIDE®; Immunomedics), Abiogen의 CD22 항체(Abiogen, 이탈리아 소재), CMC 544(Wyeth/Celltech), 콤보톡스(UT Soutwestern), BL22(NIH), 및 LympoScan Tc99(Immunomedics)와 같은 CD22 항체, 및 항-아밀로이드 베타(Abeta), 항-CD4(MTRX1011A), 항-EGFL7 (EGF-유사-도메인 7), 항-IL13, 아포마브[항-DR5-표적화된 전구-세포자멸사 수용체 효능제(PARA)], 항-BR3(CD268, BLyS 수용체 3, BAFF-R, BAFF 수용체), 항-베타 7 인테그린 아단위, 다체투주마브(항-CD40), GA101(항-CD20 모노클로날 항체), MetMAb(항-MET 수용체 타이로신 키나제), 항-뉴로필린-1(NRP1), 옥렐리주마브(항-CD20 항체), 항-OX40 리간드, 항-산화된 LDL(oxLDL), 페르투주마브(HER 이합체화 억제제(HDIs), 및 rhuMAb IFN 알파를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
항-CD20 항체의 예는 현재 "리툭시마브"("RITUXAN®")(참조: 미국 특허 제5,736,137)로 불리고 있는 "C2B8"; 제조원(IDEC Pharmaceuticals, Inc.)로부터 시판되는 "Y2B8" 또는 "이브리투모마브 티욱세탄"(ZEVALIN®)으로 지정된 이트륨-[90]-표지된 2B8 쥐 항체(참조: 미국 특허 제5,736,137호; 1993년 6월 22일자로 ATCC 수탁번호 HB11388하에 기탁된 2B8); 임의로 131I로 표지되어 "131I-B1"을 생성하며 또한 "토시투모마브"로 명명된 쥐 IgG2a "B1" 또는 Corixa로부터 시판되는 "요오드 I131 토시투모마브" 항체(BEXXARTM)(참조: 또한, 미국 특허 제5,595,721호); 쥐 모노클로날 항체 "1F5"[참조: Press et al., Blood 69(2):584-591 (1987)] 및 "골격 패치된(framework patched)" 또는 사람화된 1F5을 포함하는 이의 변이체(참조; 제WO 2003/002607호, Leung, S.; ATCC 기탁번호 제HB-96450호); 쥐 2H7 및 키메라 2H7 항체(미국 특허 제5,677,180호); 사람화된 2H7(제WO 2004/056312호, Lowman et al.); 2F2(HuMax-CD20), B-세포의 세포 막내 CD20 분자에서 표적화된 완전한 사람의, 고-친화성 항체[Genmab, 덴마크 소재; 참조: 예를 들면, Glennie and van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) 및 Cragg et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); 제WO 2004/035607호; 제US2004/0167319호]; 제WO 2004/035607호 및 제US2004/0167319호(Teeling et al.,)에 설정된 사람 모노클로날 항체; 제US 2004/0093621호(Shitara et al.,)에 기술된 Fc 영역에 결합된 복합체 N-글리코시드-연결된 당 쇄를 갖는 항체; HB20-3, HB20-4, HB20-25, 및 MB20-11와 같은 CD20에 결합하는 모노클로날 항체 및 항원-결합 단편(참조: 제WO 2005/000901호, Tedder et al.); 항체의 AME 계열과 같은 CD20 결합 분자, 예를 들면, 제WO 2004/103404호 및 제US2005/0025764호(Watkins et al., Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, AME)에 설정된 AME 33 항체; 제US 2005/0025764호(Watkins et al.,)에 기술된 것들과 같은 CD20 결합 분자; 키메라 또는 사람화된 A20 항체(각각 cA20, hA20) 또는 IMMU-106(참조: 제US 2003/0219433호, Immunomedics)와 같은 A20 항체 또는 이의 변이체; 제US 2005/0069545A1호 및 제WO 2005/16969호(Carr et al .,)에서와 같이, IL-2에 임의로 접합된, 에피토프-고갈된 Leu-16, 1H4, 또는 2B8을 포함하는 CD20-결합된 항체; CD22 및 CD20에 결합하는 이특이적인 항체, 예를 들면, hLL2xhA20(제WO2005/14618호, Chang et al.,); 국제 백혈구 유형 워크숍(International Leukocyte Typing Workshop)[참조: Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)]에서 이용가능한 모노클로날 항체 L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2; 1H4[참조: Haisma et al., Blood 92:184 (1998)]; 항-CD20 아우리스타틴 E 접합체(Seattle Genetics); 항-CD20-IL2(EMD/Biovation/City of Hope); 항-CD20 MAb 치료요법(EpiCyte); 항-CD20 항체 TRU 015(Trubion)을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "항체"는 모노클로날 항체(면역글로불린 Fc 영역을 갖는 완전한 길이의 항체 포함), 다중에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중특이적인 항체[예를 들면, 이특이적인 항체, 디아바디, 및 단일 쇄 분자, 및 항체 단편(예를 들면, Fab, F(ab')2, 및 Fv]을 포함한다. 용어 "면역글로불린"(Ig)은 본원에서 "항체"와 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질인 항체의 집단으로부터 수득된 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 존재하는 돌연변이 및/또는 해독후 변형(예를 들면, 이성체화, 아미드화)를 제외하고 동일한 집단을 포함하는 개개의 항체를 말한다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 지시되며, 고도로 특이적이다. 또한, 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 통상적으로 포함하는 통상의(폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원상에서 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이들의 특이성 외에, 모노클로날 항체는, 이들이 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성되므로 유리하다. 변형인자 "모노클로날"은 항체의 실질적인 동질 집단으로 부터 수득되는 것으로서 항체의 특징을 나타내며, 어떠한 특수 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 고려되지 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용된 모노클로날 항체는 문헌[참조: Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]에 처음 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합체 DNA 방법(참조: 미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 문헌[참조: 예를 들면, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기술된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 상세하게는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특수 종으로부터 기원하거나 특수 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체내 상응하는 서열과 동일하거나 이에 대해 상동성이나, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 기원하거나 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체내 상응하는 서열과 동일하거나 이에 대해 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린), 및 이들이 목적한 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다[참조: 미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]. 본원에서 목적한 키메라 항체는 비-사람 영장류[예를 들면, 구세기 원숭이(Old World Monkey), 유인원 등)로부터 기원한 가변 도메인 항원-결합 서열 및 사람 고정 영역 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함한다.
용어 "치료학적 항체"는 질환의 치료시 사용되는 항체를 말한다. 치료학적 항체는 다양한 작용 메카니즘을 가질 수 있다. 치료학적 항체는 항원과 연합된 표적에 결합하고 이의 정상적인 작용을 중화할 수 있다. 예를 들면, 암 세포의 생존에 요구되는 단백질의 활성을 차단하는 모노클로날 항체는 세포의 사멸을 유발한다. 다른 치료학적 모노클로날 항체는 항원과 관련된 표적에 결합하여 이의 정상적인 작용을 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 세포상의 단백질에 결합하여 세포자멸사 시그날을 유발할 수 있다. 여전히 다른 모노클로날 항체는 질환이 있는 조직상에서만 발현하는 표적 항원에 결합할 수 있으며; 모노클로날 항체에 대한 화학치료제 또는 방사선활성제와 같은 독성 페이로드(payload: 유효 제제)의 접합은 독성 페이로드를 질환이 있는 조직으로 특이적으로 전달하여, 건강한 조직에 대한 유해성을 감소시키는 제제를 생성할 수 있다. 치료학적 항체의 "생물학적으로 작용성인 단편"은 완전한 항체의 기여하는, 표적 항원에 대한 적어도 특이적인 결합을 포함하는 생물학적 작용 중 적어도 하나, 그렇지 않으면 일부 또는 모두를 나타낼 것이다.
"완전한" 항체는 항원-결합 부위 및 CL, 및 적어도 중쇄 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 고정 도메인은 천연의 서열 고정 도메인(예를 들면, 사람의 천연 서열 고정 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 완전한 항체는 하나 이상의 효과기 작용을 갖는다.
"항체 단편"은 완전한 항체의 일부, 바람직하게는 완전한 항체의 항원 결합 및/또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체(참조: 미국 특허 제5,641,870호, 실시예 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); 단일 쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적인 항체를 포함한다.
항체의 "생물학적으로 작용성인 단편"은 완전한 항체의 일부만을 포함하며, 여기서, 일부는 적어도 하나, 및 완전한 항체 속에 존재하는 경우 이러한 일부와 정상적으로 관련된 작용 중 가능한 대부분 또는 모두를 보유한다. 하나의 양태에서, 항체의 생물학적으로 작용성인 단편은 완전한 항체의 항원 결합 부위를 포함하므로 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 다른 양태에서, 항체의 생물학적으로 작용성인 단편, 예를 들어, Fc 영역을 포함하는 것은 완전한 항체 속에 존재하는 경우, Fc 영역과 정상적으로 관련된 생물학적 작용 중 적어도 하나, 예를 들면, FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 작용 및 보체 결합을 보유한다. 하나의 양태에서, 항체의 생물학적으로 작용성인 단편은 완전한 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 항체의 이러한 생물학적으로 작용성인 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 암(arm)을 포함할 수 있다.
비-사람(예를 들면, 쥐) 항체의 "사람화된" 형태는 키메라 면역글로불린, 비-사람 면역글로불린으로부터 기원한 최소의 서열을 함유하는, 대부분 사람 서열인 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편[예를 들면, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 아서열]이다. 대부분의 경우, 사람화된 항체는 사람 면역글로불린(수용체 항체)이며 여기서, 수용체의 초가변 영역(또한 CDR)으로부터의 잔기는 바람직한 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은 비-사람 종(공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 치환된다. 일부 예에서, 사람 면역글로불린의 Fv 골격 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-사람 잔기로 치환된다. 또한, 본원에 사용된 것으로서 "사람화된 항체"는 또한 수용체 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 또한 항체 수행능을 재정의하고 최적화하기 위해 이루어진다. 사람화된 항체는 임의로 또한 통상적으로 사람 면역글로불린의 면역글로불린 고정 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌[참조: Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
본원에 기술된 각종 폴리펩타이드 및 항체를 기술하는데 사용되는 경우 "분리된"은 이의 생산 환경의 성분으로부터 확인되고, 분리되고/되거나 회수된 항체 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 바람직하게는, 분리된 폴리펩타이드는 이의 생산 환경으로부터의 모든 다른 성분과의 연합에서 유리된다. 재조합체 형질감염된 세포로부터 초래되는 것과 같은, 이의 생산 환경의 오염 성분은 폴리펩타이드에 대한 진단학적 또는 치료학적 용도를 통상적으로 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 폴리펩타이드는 (1) 스피닝 컵 서열분석기(spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하는데 충분한 정도, 또는 (2) 꼬마지에 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용한 비-환원 또는 환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의한 균질성까지 정제될 것이다. 그러나, 통상적으로, 분리된 폴리펩타이드 또는 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"치료"는 치료학적 처리 및 예방학적 또는 방지 수단 둘다를 말한다. 치료가 요구되는 대상체는, 질환이 방지되어야 하는 대상체들 및 질환을 이미 지닌 대상체들을 포함한다.
치료 목적을 위한 "포유동물"은 사람, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들면, 개, 말, 토끼, 소, 돼지, 햄스터, 저빌(gerbil), 마우스, 족제비, 랫트, 고양이 등을 포함하는, 포유동물로 분류된 임의의 동물을 말한다. 바람직하게는, 포유동물은 사람이다.
"질환"은 단백질을 사용한 치료가 유리할 수 있는 특정 조건이다. 이는, 포유동물이 문제의 질환에 걸리기 쉬운 병리학적 상태를 포함하는 만성 및 급성 질환 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료될 질환의 비-제한적 예는 암종 및 염증을 포함한다.
"치료학적 유효량"은 특수 질환의 측정가능한 개선 또는 예방을 달성하는데 필요한 적어도 최소한의 농도이다. 공지된 단백질의 치료학적 유효량은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 이후 발견된 단백질의 유효량은 통상의 생리학자와 같은 당해 분야의 숙련가내에 있는 표준 기술에 의해 측정할 수 있다.
II. 본 발명을 수행하기 위한 방식
모노클로날 항체 후보물에서 최근의 산화 현상은, 본 발명자가 Met, Trp 및 His 잔기에 있어서의 산화 메카니즘을 시험하고, 적합한 안정화제를 조사하도록 촉발시켰다. 모델 단백질, 부갑상샘 호르몬(PTH, 1-34)을 사용함으로써, rp-HPLC, 펩타이드 맵핑 및 LC/MS/MS 분석의 보조로, 본 발명자들은 상이한 산화제에 의해 유발된 이들 취약한 잔기에서 산화를 확인하고 정량할 수 있었다.
A. 산화적 손상의 특성화
산화된 메티오닌(Met[O])이 다수의 약제학적 단백질에서 용이하게 검출된다는 사실은 H2O2 단독 만이 아닌 산화제에 대한 이의 민감성에 기여할 수 있다. 광, tBHP, 및/또는 퍼옥소디설페이트는 다양한 실험실에서 사용되어 Met[O]를 생성하였다. 정상적인 저장 조건하에서 약제학적 단백질내 Trp 또는 His의 산화는 매우 서서히 진행될 수 있다. 산화를 촉진시키기 위해, 하나 이상의 스트레스 모델을 일반적으로 사용한다.
많은 단백질 제형은 폴리소르베이트(20 및 80)를 함유한다. 노화된 폴리소르베이트 속에 존재하는 산화제는 주로 H2O2(75% 까지)로 이루어진다는 것이 보고되어 있다[참조: Jaeger et al., Biochem Biophys Methods 29:77-81, (1994)]. 하(Ha) 등은 문헌[참조: J Pharm Sci 91:2252-2264 (2002)]에서 노화된 폴리소르베이트에 의한 인터루킨-2 돌연변이체의 증가된 산화를 보고하였다. 폴리소르베이트는 단백질 약물 생성물내 산화제의 공급원이므로, 표면활성제 함유 제형에서 산화 반응을 자극하는 방법으로서 H2O2를 사용하는 것을 고려할 수 있다. 또한, H2O2는 멸균 생성물을 충진시키는데 사용된 분리인자용 방부제로서 사용되어 왔다. 잔류성 H2O2는 약물 생성물에서 발견될 수 있다. 이러한 이유로, H2O2에 의한 산화에 대해 단백질의 민감성을 측정하는 것이 중요하다.
Trp 및 His 산화는 금속-촉매되거나 유리 라디칼-매개된 산화로서 고려된다[참조: Davies et al. 1987, Hawkins and Davies 2001). 이론적으로, 금속-촉매된 산화는 유용한 모델로서 제공될 수 있다. 그러나, 실험적 설계시, 금속(예를 들면, 철 또는 구리)의 선택, 및 킬레이트제(예를 들면, EDTA)의 첨가 또는 비첨가는 실험 결과의 도출에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 다음 실시예는 금속을 포함하는 산화로부터 달성된 결과의 복잡성을 나타낸다. 아스코르베이트/Cu(II)/O2와 같은, 산화 시스템내 금속의 첨가로, 렐락신에서 2개의 Met 및 하나의 His 잔기가 산화되나, 2개의 트립토판 잔기의 어느 것도 산화되지 않았다. 소 혈청 알부민을 사용하면, Fe(II)/EDTA/아스코르베이트 시스템으로부터 생성된 유리 라디칼은 트립토판을 선호하는 반면, Cu(II)/아스코르베이트(EDTA 제외)는 히스티딘을 선호한다(참조: Uchida K, Agric Biol Chem 53:3285-92, 1989). H2O2/Fe(II)/EDTA 및 H2O2/Cu(II)는 알부민 분해의 상이한 패턴을 생성하였다[참조: Kocha et al., Biochim Biophys Acta 1337:319-26 (1997)]. 금속 촉매된 산화를 통해, α-결정내 트립토판 및 메티오닌 잔기는 H2O2/Fe(II)/EDTA에 의해 산화되었다[참조: Finley et al., Protein Sci. 7:2391-7, (1998)].
약제 생산 동안, 재조합체 단백질은 스테인레스 강에 필수적으로 노출됨으로써; 단백질 용액은 미량의 철 또는 기타 금속을 함유할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명자의 약물 후보물의 산화 효능을 평가하기 위한 스트레스 조건으로서 - 일반적으로 공지된 펜톤 반응(Fenton reaction) - H2O2와 Fe(II)을 선택하였다.
앞서의 단락에서 논의한 바와 같이, 금속의 존재는 산화 연구의 복잡성을 증가시킨다. AAPH(2,2'-아조비스(2-아미디노프로판)디하이드로클로라이드)는 금속-이온 독립적인, 반응성-산소-종(ROS) 생성 시스템이다(참조: Niki et al. Methods Enzymology. 186: 100-8, 1990). 지정된 속도에서, 이는 수성의 통기성 용액 속에서 분해하여 알킬 라디칼 및 알킬퍼옥사이드를 생성한다. 알킬퍼옥사이드의 화학적 구조 및 생성은 도 2에 나타낸다. AAPH를 사용한 처리는 간 단백질내 Met, Tyr 및 Trp 잔기의 산화를 가져온다[참조: Chao et al., Proc Natl Acad Sci 94:2969-74, (1997)]. 동일한 연구에서, 산화로부터의 다른 아미노산 유도체, 디타이로신이 또한 검출되었다. 글루타민 신테타제가 AAPH에 4시간 동안 노출되는 경우, Trp 잔기 둘다, 16개의 His중 2개, 17개의 Tyr 중 6개 및 16개의 Met중 5개가 손실되었다[참조: Ma et al., Arch Biochem Biophys 363:129-134, (1999)]. 이들 2개의 보고는, AAPH가 Met외에 광범위한 아미노산의 산화를 가져옴을 나타내었다. 보다 최근에, 소 분자 약물과 관련하여, 둘다 AAPH와 유사한 아조 화합물인, AIBN(2,2'-아조비스이소부티로니트릴) 및 ACVA(4,4'-아조-비스-4-시아노발레르산)을 산화성 강제된 분해 연구에서 사용하기 위해 평가하였다[참조: Nelson ED, J Pharm Sci 95:1527-39, (2006)]. 아조 화합물은 금속과 상관없이, 재생가능한 양의 라디칼을 생성할 수 있으므로, AAPH는 Trp-산화된 단백질을 생성하는 특이적인 이의 능력으로 인해 모델 산화제이다.
비-부위-특이적인 산화를 위해, 부갑상선 호르몬(1-34)(PTH)을 이의 최소의 3차 구조[참조: Barden et al., J Biochem, 32:7126-32 (1993)] 및 모든 3개의 바람직한 아미노산을 함유하는 이의 서열(1 Trp, 2 Met 및 3 His) 때문에 모델 단백질로서 선택하였으며, 용이성으로 이를 역-상 고-성능 액체 크로마토그래피(rp-HPLC) 및 이의 유용성에 의해 평가할 수 있다. 기관(Massachusetts Institute of Technology)의 트로우트(Trout) 그룹은 H2O2에 의해서만 스트레스받은 PTH에서 Met 산화를 연구하였으며, Met8 및 Met18의 상이한 산화율이 2-쉘 수 배위수(2-shell water coordination number)에 상응하는 것으로 밝혀졌다[참조: Chu et al., Biochem 43: 14139-48 (2004) 및 J Pharm Sci 93:3096-102 (2004)]. 1.5배 미만의 차이는 본 발명자들이 본 연구로부터 도출한 결론에 영향을 미치기에 충분히 유의적이지 않았다. 성장 호르몬[참조: The et al., J Biol Chem 262:6472-7, (1987)] 및 rhVEGF [참조: Duenas et al., Pharm Res 18:1455-60, (2001)]에서 상이한 Met 잔기의 산화율은 용매 노출의 상이한 정도에 주로 영향받았다. 본 발명자들은, PTH, 성장 호르몬 및 rhVEGF에서 완전한 용매-노출된 Met의 산화율이 비교가능한 것으로 예측할 수 있었다. 따라서, PTH 상에서 2개의 Met 잔기는 모든 단백질에서 용매 노출된 Met를 자극할 수 있다. 단지 하나의 Trp로 인하여, LC/MS에 의한 분석 용이성은, PTH가 본 발명자들의 연구를 위한 우수한 모델 단백질이 되도록 한다.
H2O2, Fe(II)의 존재 및 부재하에서 tBHP는 주로 2개의 Met 잔기를 산화한 반면, AAPH 및 H2O2와 Fe(II)는 Met 및 Trp 잔기를 산화하였고, 전자는 후자보다 Trp[O] 종을 보다 잘 생성할 수 있다. 금속-독립적인 유리 라디칼 생성인자인, AAPH는 분해된 트윈으로부터 생성된 반응성 산화 종을 자극시킨, 알킬퍼옥사이드를 생산하였다.
한편, 부위-특이적인 금속-촉매된 산화는 H2O2 만을 사용하여 생성시킨 반응과는 약간 다를 것이다. 예를 들면, 렐락신에서, Met-B(25)는 Met-B(4)보다 더 빠르게 H2O2와 반응하였다. 렐락신이 Asc/Cu(II)와 금속 촉매된 반응의 방법으로 반응한 경우 순서가 바뀌었으며, 금속 결합 부위 근처에 있는 Met-B(4)는 빠르게 산화하는 경향이 있다[참조: Li et al., Biochem 34:5762-72 (1995)]. 본 발명자의 연구에서, 본 발명자들은 사람화된 항-VEGF 항체 단편을 사용하였으며, Trp50(H2) 산화가 EDTA의 첨가에 의해 억제될 수 있으며, 더우기, 이웃하는 His가 돌연변이 제거되는 경우, Trp 50(H2)가 안정화됨(제제에서 사본)을 발견하였기 때문에, 부위-특이적인 금속-촉매된 산화에 대해 민감한 단백질로서, 신생혈관(습윤) 연령-관련 황반 변성의 치료용으로 제시하였다. 본 발명자들은 또한 건선의 발달을 초래하는 T-세포의 활성화, 반응성화 및 트래피킹(trafficking)을 선택적으로 및 가역적으로 차단하도록 설계된 항-CD11a 항체의 산화를 연구하였는데, 이는, 당해 항체가, 상이한 Met[O] 생성물이 관측되는 각종 조건에서 산화되기 때문이었다. 그러나, 이들 스트레스 조건, 항-VEGF 항체보다 매우 상이한 행위하에서 항-CD11a 항체에서 Trp 산화가 발견되지 않았다. 이러한 이유로, 항-CD11a 항체는 본 연구에 포함시켰다.
B. 산화성 분해를 방지하기 위한 안정화제의 스크리닝
본 연구의 주요 목적은 안정화제를 스크리닝하는 것이었다. 당해 스트레스 연구에서 생성된 정보는 본 발명자들을 약제학적으로 효과적인 제제에서 사용하기 위한 신규 안정화제로 이끌었다. H2O2, H2O2와 Fe(II) 및 AAPH는 무균제로서 일반적으로 사용된 증기 H2O2로부터 강력한 공격을 나타내므로, 이들과, 분해된 트윈으로부터의 H2O2 및 스테인레스 강 표면으로부터의 금속 및 분해된 트윈으로부터 또한 알킬퍼옥사이드 각각을 사용하여 안정화제를 스크리닝하는 것이 유리하다. 본 발명자의 스크리닝 연구로부터, 본 발명자들은 1) 유리 메티오닌이 H2O2 및 H2O2와 Fe(II)에 대해 PTH 산화를 보호하였고, 2) 만니톨 및 EDTA가 H2O2와 Fe(II)에 대해 효과적이며, 3) 유리 트립토판이 AAPH에 의한 산화에 대해서만 효과적인 반면, Trp 및 Met의 조합은 모든 3개의 산화 조건에 대해 효과적이었음을 측정하였다.
항-VEGF 항체 산화는 부위-특이적인 금속-촉매된 산화를 나타낸다. AAPH는 문제있는 자격 로트로서 IEC 크로마토그램에서 기본 영역내 추가의 피크를 나타낸 항-VEGF 항체 분해제(degradant)를 생성할 수 있다. 유리 Trp는 AAPH에 의해 산화되는 경우 항-VEGF 항체에서 산화를 경감시키는데 효과적이었다. 이들 결과는, 유리 Trp가 부위-특이적인 금속-촉매된 산화에 대해 효과적임을 제시한다. 메티오닌, 트립토판 및 가능하게는 히스티딘과 같은 모든 취약한 아미노산 잔기가 보호되도록 보증하기 위하여, 메티오닌 및 트립토판 조합의 조합물이 효과적인 수단일 것이다.
메티오닌과의 조합시 우수한 안정화제인 트립토판 이외에, 본 발명자들은 또한, 트롤록스(6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산; 수용성 비타민 유도체) 및 피리독신(일반적으로 비타민 B6로 공지됨) 둘다가 단백질에서 트립토판 잔기의 탁월한 보호를 나타내었음을 입증하였다(도 15 및 16). 이들 안정화제 각각은 2 mg/mL 농도에서 0.1 mg/mL의 PTH의 단백질 용액, pH 5.0를 첨가하여 별도로 시험하였다. 단백질 용액은 1 mM의 AAPH를 첨가하여 후속적으로 스트레스를 가하고, 40℃에서 6시간 동안 항온처리하였다. 트롤록스 또는 피리독신의 보호가 없는 경우, PTH는 이의 트립토판 잔기에서 현저한 양의 산화를 나타낸 반면, 트롤록스 또는 피리독신의 존재하에서, 트립토판 잔기는 잘 보호되었다(도 15 및 16). 당해 결과는 단백질내 트립토판 잔기를 보호하기 위해 유리 라디칼 스캐빈저를 사용하는 용도를 입증하였다.
도 1은 메티오닌, 트립토판 및 히스티딘의 산화를 위한 가능한 경로를 묘사하는 개략도이다.
도 2는 가열시 알킬 라디칼을 생성하는 아조 화합물인, AIBN이, 산소와 결합하는 경우 알킬퍼옥사이드를(원) 형성함을 묘사하는 개략도이다. 다른 아조 화합물인, AAPH 또한 이의 구조와 함께 나타낸다.
도 3은 H2O2에 의해 분해된 PTH의 rp-HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 40℃에서 반응 및 시료를 2, 4, 및 6시간 째에 제거하였다. 일산화된 PTH 및 이산화된 PTH의 증가된 피크 높이를 나타낸다.
도 4는 AAPH로 처리된 PTH의 크로마토그램, 주로 Trp[O]-PTH 피크를 나타낸다. 40℃에서 반응, 및 시료는 2, 4, 및 6시간째에 제거하였다.
도 5는 분해된(산화된) 트립토판의 화학 구조를 나타낸다. 이들의 질량은 +4, +16 및 +32로 표시된다.
도 6은 AAPH, H2O2와 철, 및 H2O2에 의해 산화된 PTH 용액의 rpHPLC 크로마토그램을 나타낸다. 반응은 40℃에서, 6시간 동안 수행하였다. 시료에는 유리 메티오닌 2mg/mL이 첨가되거나 첨가되지 않았다.
도 7은 AAPH, H2O2와 철 및 H2O2에 의해 산화된 PTH 용액의 rpHPLC 크로마토그램을 나타낸다. 반응은 40℃에서, 6시간 동안 수행되었다. 시료에는 15% 만니톨 또는 6% 슈크로즈가 첨가되거나 첨가되지 않았다.
도 8은 AAPH, H2O2와 철, 및 H2O2에 의해 산화된 PTH 용액의 rpHPLC 크로마토그램을 나타낸다. 반응은 40℃에서, 6시간 동안 수행되었다. 시료에는 EDTA mg/mL가 첨가되거나 첨가되지 않았다.
도 9는 AAPH, H2O2와 철, 및 H2O2에 의해 산화된 PTH 용액의 rpHPLC 크로마토그램을 나타낸다. 반응은 40℃에서, 6시간 동안 수행되었다. 시료에는 2mg/mL에서의 유리된 트립토판이 첨가되거나 첨가되지 않았다.
도 10은 AAPH, H2O2와 철, 및 H2O2에 의해 산화된 PTH 용액의 rpHPLC 크로마토그램을 나타낸다. 반응은 40℃에서, 6시간 동안 수행되었다. 시료에는 2mg/mL에서의 유리된 트립토판 및 메티오닌 둘다가 첨가되거나 첨가되지 않았다.
도 11은 AAPH에 의한 PTH의 부위 특이적인 산화 및 다른 시약과 비교하여 Trp 및 Met의 상이한 보호 역활을 나타내는 데이타의 그래프를 나타낸다. 개개의 Trp23, Met8 및 Met18 잔기의 산화의 확인은 이들의 상응하는 트립신 펩타이드의 MS/MS 단편화 스펙트럼을 기초로 하여 지정되었다. 상대적인 산화 수준은 산화된 펩타이드 및 산화되지 않은 펩타이드의 통합되어 추출된 이온 크로마토그래피를 기초로 하여 정량하였다.
도 12는 H2O2/Fe에 의한 PTH의 부위 특이적인 산화 및 다른 시약과 비교하여 Trp 및 Met의 상이한 보호 역활을 나타내는 데이타의 그래프이다. 개개의 Trp23, Met8 및 Met18 잔기의 산화의 확인은 이들의 상응하는 트립신 펩타이드의 MS/MS 단편화 스펙트럼을 기초로 하여 지정되었다. 상대적인 산화 수준은 산화된 펩타이드 및 산화되지 않은 펩타이드의 통합되어 추출된 이온 크로마토그래피를 기초로 하여 정량하였다.
도 13은 각종 항-VEGF 시료의 IEC 크로마토그램이다. H2O2는 AAPH와 같이, 염기성 영역내 산화성 종을 생성하지 않았다. 기본 피크는 배드 로트(bad lot)의 트윈이 사용된 경우 자격 로트(qualification lot)에서 우세하였다.
도 14는 AAPH(Trp 부재)로 산화한 후, 2 또는 10 mg/mL의 유리된 Trp를 제형에 가하는 경우 항-VEGF의 IEC를 나타낸다. 산화된 MAb는 기본 영역에서 용출되었다. 이들 기본 피크는 Trp 첨가시 기본선으로 강하하였다.
도 15는 AAPH, H2O2와 철, 및 H2O2에 의해 산화된 PTH 용액의 rpHPLC 크로마토그램을 나타낸다. 반응은 40℃에서, 6시간 동안 수행하였다. 시료에는 유리된 트롤록스(6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산. 수용성 비타민 유도체) 2mg/mL가 첨가되거나 첨가되지 않았다.
도 16은 AAPH, H2O2와 철, 및 H2O2에 의한 PTH 용액의 rpHPLC 크로마토그램을 나타낸다. 반응은 40℃에서, 6시간 동안 수행되었다. 시료에는 유리 피리독신(일반적으로 비타민 B6로서 공지됨) 2mg/mL가 첨가되거나 첨가되지 않았다.
실시예 1
단백질 산화의 연구: 산화성 분해 메카니즘에 대한 효과적인 안정화제로서 메티오닌 및 트립토판
당해 실시예는 트립토판 단독 및 메티오닌과의 혼합물의 항체 및 단백질의 산화를 방지하기 위한 용도를 나타낸다.
실험 방법
물질:
AAPH(2,2'-아조비스(2-아미디노프로판)디하이드로클로라이드)(로트 번호 D00024287)는 CalBiochem(미국 뉴저지 깁스타운 소재)으로부터 시판되었다. 부갑상선 호르몬(1-34)(SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF, 로트 번호 U07046A1)는 American Peptide Company(미국 캘리포니아 서니베일 소재)로부터 시판되었다. 당해 보고에서, 이는 단순히 PTH로 언급된다.
L-메티오닌 및 EDTA 이나트륨(로트 번호 E05643)는 J. T. Baker(미국 뉴저지 필립스부르그 소재)로부터 시판되었다. 나트륨 아세테이트, 암모늄 아세테이트, H2O2, t-BHP, L-트립토판(로트 번호 1152333), 및 염화제2철 육수화물(로트 번호 53H0619)는 Sigma-Aldrich(미국 미주리 세인트 루이스 소재)로 부터 시판되었다. 염화제2철 사수화물(로트 번호 NA1759)는 EMD(미국 뉴저지 깁스타운 소재)로부터 시판되었다. 만니톨(G10303, 로트 번호 139476) 및 슈크로즈(G20244, 로트 번호 292426)는 Genentech, Inc.에서 입수하였다. 서열 분석 등급의 트립신(TPCK 처리됨)은 Promega(미국 위스콘신 매디슨 소재)로부터 시판되었다. HPLC 등급 아세토니트릴(ACN) 및 물은 Fisher Scientific(미국 뉴저지 페어라운 소재)로부터 시판되었다. 시료 제조 실험에 사용된 물은 밀리-Q 플러스 정제 시스템[Milli-Q Plus Purification system, Millipore(미국 매사츄세츠 베드포드 소재)]으로부터 수득하였다.
시료 제조
PTH(0.1 mg/mL)를 H2O2, H2O2/Fe(II), t-BHP, t-BHP/Fe(II), 또는 AAPH 각각과 1:42(단백질 : 산화제)의 몰 비율로 20mM 암모늄 아세테이트 완충액, pH 5.0 속에서 혼합하였다. Fe(II)의 농도는 0.2mM이었다. 조성물의 세부사항은 표 1에 나타낸다. 괄호내, 시험 시료내 최종 농도에서 나타낸 바와 같이, 만니톨(15%), 슈크로즈(6%), Met(2mg/mL), EDTA(0.04%), 및 Trp(2mg/mL)를 이들 시료에 안정화제로서 각각의 농도에서 가하였다. 항-VEGF 항체 시료의 경우, 2 및 10 mg/mL에서 Trp 농도를 시험하였다. 40℃에서 6 및 24시간 동안 항온처리한 후, 시료의 분취량을 메탄올 및 Met와 혼합하여 rp-HPLC 분석, 펩타이드 맵핑, 및 액체 크로마토그래피/질량 분광법/질량 분광법(LC/MS/MS) 전에 반응물을 퀀칭하였다. 액체 형의 재구성된 항-CD11a 항체 동결건조된 제형을 92 mg/mL에서 31 mM의 AAPH를 사용하여 시험하였다. 변성 조건에서, 5 mg/mL의 항-CD11a 항체를 6M 구아니딘 HCl을 사용하여 변성시키고 1.7 mM AAPH를 가하였다.
역-상 크로마토그래피(rp-HPLC)
시험을 Waters HPLC 장치상에서 C4(Vydac, 214TP, 5m, 2.1 x 250 mm)을 사용하여 수행하였다. 용매 A는 H2O 중 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)이고 용매 B는 아세토니트릴 중 0.08% TFA이었다. 시료를 20% B 내지 80% B의 선형 구배를 사용하여 0.2 mL/분의 유동 속도로 45분내에 분석하였다. 컬럼 온도는 30℃에서 설정하였다. UV 검출은 214 nm로 설정하였다.
트립신 분해
시료의 pH는 1M 중탄산알루미늄을 첨가하여 >7.5로 조절하였다. 5μl의 0.5 mg/mL 트립신을 200μL의 시료에 가하고, 이를 37℃에서 3 내지 4시간 동안 항온처리하였다. 분해물을 0.1% TFA로 퀀칭시켰다.
트립신 펩타이드 맵의 LC/MS/MS 특성화:
트립신 분해 후 PTH 시료를 아질런트(Agilent) 1200 계열 HPLC 시스템으로 분리하고 펩타이드의 질량 및 서열을 온라인-커플링된 LTQ 선형 이온-트랩 질량 분광계(Thermo Electron, 미국 캘리포니아 산 조세 소재)으로 측정하였다. Jupiter Proteo 1.0 x 150 mm 컬럼[입자 크기 4μm, 공극 크기 90Å; Phenomenex(미국 캘리포니아주 토란스 소재)]을 사용하였다; 이의 온도는 30℃에서 조절되었고, 컬럼 용출은 214 nm에서 모니터되었다. 유동 속도는 150μL/분에서 조절되었고, 이동 상은 수중 0.1% TFA(A) 및 아세토니트릴중 0.1% TFA(B)이었다. 100μL 용적의 시료를 주입하였다. 최적화된 구배(%B당 분으로 표현)는 0/2%, 3/2%, 10/8%, 15/8%, 60/40%, 61/95%, 65/95%, 66/2%, 및 76/2%이었다. HPLC로부터의 유출물은 LTQ 전기분무 이온화 공급원내로 직접 주입하였다. 양성 이온 방식에서 전기분무 이온화는 4.5 kV의 침 분무 전압 및 44 V의 모세관 전압을 사용하여 달성하였다. LC/MS/MS 실험에서, 300 내지 2000 m/z 범위의 완전한 스캔을 포함하는, 9개의 스캔 현상이 4개 주기의 줌 스캔 및 4개의 가장 강력한 이온상의 MS/MS 스캔에 이어 수반되었다.
MS/MS 스펙트럼 해석 및 펩타이드 정렬은 BioWorks Browser version 3.2 소프트웨어(Thermo Electron)을 사용하는 SEQUEST 알고리즘을 사용한 자동화된 데이타베이스 조사 및 각각의 매취된 생성물 이온 스펙트럼의 수동 조사로 달성하였다. PTH의 FASTA 단일-단백질 데이타베이트를 생성시키고 조사 표적으로 사용하였다. 산화 생성물을 확인하기 위하여, 산화-관련 변형을 가변적인 것(PTH에 대해 비교하여, Trp의 경우 +4, +16, 및 +32 Da; Met의 경우 +16 Da; 및 His의 경우 +16, -22, 및 -23 Da)으로 정의하였다. 만족한 상관관계-인자 값(단일 하전된 펩타이드 이온의 경우 Xc>1.5, 이중 하전된 펩타이드 이온의 경우 >2.0, 및 삼중 하전된 펩타이드 이온의 경우 >2.5)을 갖는 펩타이드 매치를 산화-변형된 펩타이드에 대해 매우 현저한 매치로 선택하였다. 후속적으로, 매치된 펩타이드 이온의 줌-스캔 질량 스펙트럼 및 MS/MS 스펙트럼의 수동 관측을 수행하여 거짓 양성 확인을 제거하였다. 줌-스캔 MS 프로파일을 시험하여 매치된 펩타이드의 하전된 상태 및 단일동위원소 질량을 확인하였다. 각각의 산화 부위에 대한 산화 수준을 평가하기 위해서, 상응하는 펩타이드의 추출된 이온 크로마토그램을 Xcalibur Qual Browser를 사용하여 수동으로 적분하엿다. 산화의 상대적인 비율은 후속적으로 산화된 펩타이드 이온의 피크 영역을 산화된 펩타이드 및 산화되지 않은 펩타이드의 피크 영역의 합으로 나누어 계산하였다.
결과 및 토의
비-부위 특이적인 산화, PTH:
금속 결합 부위를 함유하지 않는 PTH는 비-부위-특이적인 산화를 연구하기 위한 모델 단백질이다. 반응은 용매 노출된 잔기상에서 수행한다. 0.1 mg/mL에서 PTH가 40℃에서 산화제와 모두 1mM에서, 6 및 24시간 동안 반응하도록 하였다. PTH에 대한 산화제의 몰 비는 41.2이었다. 총 5개의 산화제, 즉, AAPH, Fe(II)가 있거나 없는 H2O2 및 tBHP를 사용하였다. 반응제는 표 1에 요약한다. 시료를 rp-HPLC 및 트립신 펩타이드 맵핑에 이어서 LC/MS/MS 특성화로 분석하였다.
PTH H2O2 Fe2+ t-BHP AAPH [O]/PTH 비
0.1mg/ml 대조군
0.1mg/ml 34ppm(1mM) 41.2
0.1mg/ml 34ppm 50ppm(1mM) 41.2
0.1mg/ml 90ppm(1mM) 41.2
0.1mg/ml 50ppm 90ppm 41.2
0.1mg/ml
1mM 41.2
도 3은 H2O2와 반응한 PTH의 rp-HPLC 크로마토그램을 나타내며, 여기서, Met18-변형된, Met8-변형된, 및 이중 변형된 PTH 종이 검출되었다. 당해 경향성은 Met8보다 더 산화된 Met18을 사용하여 rp-HPLC에 의해 검출한 후 이중 산화한 것으로서 3개의 Met-산화된 종을 보고하는 문헌[참조: Chu et al., Biochem 43:14139-48 (2004)]에 의해 생성된 데이타와 일치한다. 도 4는 AAPH와 반응한 PTH의 rp-HPLC 크로마토그램을 나타내며 도 3에 나타낸 것과는 매우 상이한 패턴을 나타낸다. 2개 세트의 삼중 피크가 PTH 및 Met[O] 피크사이이 보유 시간에서 나타났다. 비록 개개의 피크가 완전히 특성화되지 않았다고 해도, 이는 후에 트립신 분해에 이은 LC/MS/MS에 의해 확인되었으며, 이들 새로운 피크는 Trp[O]-변형된 PTH 종이었다. PTH 분해물의 트립신 펩타이드 맵핑으로, Met 산화 생성물 외에, 분자량이 M+4, M+32, M+16(여기서, M은 PTH이 트립신 펩타이드 VGWLR의 질량이다)인 3개의 트립신 펩타이드 종이 PTH를 AAPH로 처리하는 경우에 생성되었다. 펩타이드 종의 MS/MS 스펙트럼의 분석은 3개의 Trp 산화 유도체, 즉, 키누레닌 (M+4), N-포르밀키누레닌(M+32) 및 5-하이드록시트립토판 또는 옥스-인돌 알라닌 (M+16)으로서 이들의 정렬을 초래하였다. 이들의 화학적 구조는 도 5에 나타낸다. 3개의 모델 산화제(예를 들면, H2O2, H2O2와 Fe(II), 및 AAPH)에 의해 PTH를 시험하기 위한 비는 위에 논의되어 있다. tBHP 및 tBHP와 철을 또한 시험하였는데, 이는, tBHP가 분해된-시료 제조를 위한 프로토콜에서 현재 선택된 산화제이기 때문이다.
표 2는 이들 분해된 시료에서 PTH의 Met8 및 Trp23의 전체적인 산화를 요약한다. 모두 함께, 43% 및 84%의 PTH의 Trp 잔기가 6시간 및 24시간 동안 각각 처리되는 경우 AAPH에 의해 산화되었다. 따라서, 도 2에 나타낸 새로운 피크는 Trp[O]-변형된 PTH 종으로 확인되었다. 실험에서 His 산화는 관측되지 않았다. 트립신 펩타이드를 함유하는 산화된 Met18은 역-상 컬럼 상에 보유되지 않았다. 표 2는 이들 분해된 시료에서 PTH의 Met 8 및 Trp 23의 전체적인 산화를 요약한다.
펩타이드 맵핑에 의한 PTH 산화(Trp23, Met8)의 정량
산화제 Met 8 Met+16 Trp 23 총 Trp[O] Trp+16 Trp+32 Trp+4
AAPH 6시간 71 29 57 43 35.1 6.4 1.3
24시간 42 58 16 84 61 20.3 2.9
H2O2 6시간 59 41 99 1 0.6 0.5 0.1
24시간 17 83 98 2 0.8 0.5 0.2
H2O2+Fe 6시간 44 55 82 18 11.3 5.3 1.1
24시간 9 91 65 35 22.1 10.8 2.2
tBHP 6시간 91 9 100 0 0 0 0
24시간 82 18 100 0 0 0 0
tBHP+Fe 6시간 90 10 97 3 2 0.8 0.2
24시간 78 22 97 3 2.1 0.6 0.2
대조군 6시간 100 0 100 0 0 0 0
24시간 99 1 100 0 0 0 0
이들 결과로부터의 주요 관측은 다음과 같다:
a. 3개의 조건, 철의 존재 또는 부재하의 tBHP, 및 H2O2는 최소량의 Trp 산화를 생성하였다.
b. 3개의 His 잔기 중 어느 것도 영향받지 않았다.
c. 단지 AAPH 및 펜톤 반응물, H2O2와 Fe(II)가 Trp 산화를 생성하였다.
d. 다른 종(+4 및 +32)보다 더 많은 +16 Trp[O]가 생성되었다.
e. 비교가능한 정도의 Trp 산화에 이르기 위해, 6시간 동안의 AAPH 처리는 Met8에서 43%의 Trp[O] 및 29%의 Met[O]를 생성한 반면, 24시간 동안의 H2O2/Fe(II) 처리는 35% Trp[O], 그러나 Met8에서 훨씬 보다 많은 양(91%)의 Met[O]를 생성하였다. 당해 비교는, AAPH 처리가 펜톤 반응보다 Trp 산화에 대해 보다 특이적임을 나타낸다.
퍼옥시다제(H2O2, tBHP, 또는 다른 ROOH 종)에 의한 티오에테르(메티오닌)의 산화 메카니즘은 퍼옥사이드-양성자성 용매 복합체상의 설파이드의 1-단계 친핵성 공격이며 이후 일련의 합동의 전자 교체에 의해 황 원자에 대해 산소의 이전이 초래되어, Met 설폭사이드, Met[O]가 생성되는 것이다(참조: Li et al. Biotechnol Bioeng. 48: 490-500, 1995). 이러한 반응 메카니즘은, 퍼옥사이드 산소가 친핵성임을 암시한다. 따라서, t-부틸과 같은 전자-공여 그룹은 산소의 친핵성을 감소시킴에 의해 반응을 감속시킨다. 이러한 이유로, 표 2에서 tBHP가 산화의 양을 거의 생성하지 않는다는 사실은 놀라운 것이 아니다. 케크(Keck)[참조: Anal Biochem 236:56(1996)]가 우선 재조합체 인터페론 감마(rIFN-γ; 악티뮨) 및 재조합체 조직 플라스미노겐 활성인자(rtPA; 알터플라제, ACTIVASE®)를 시험한 경우 보고하였던 바와 같이 tBHP는 노출된 메티오닌만을 산화시키는 장점을 제공한다는 것을 지적할 수 있다. PTH내 3차 구조가 거의 존재하지 않으므로, 본 발명자들은, PTH내 어떠한 Met도 t-BHP에 의해 선택적으로 산화될 것으로 예상하지 않았다.
비록 친핵성 공격 메카니즘이 특이적인 산 촉매 성분을 예측한다고 해도, 반응 속도는 PTH를 사용하여 밝혀진 바와 같이, pH 2 내지 8의 범위에서 현저히 변하지 않았다[참조: Chu et al., Proc Natl Acad Sci 94:2969-74 (2004)]. 이러한 이유로, 아세테이트 완충액 속에서 pH 5를 사용하여 생성된 데이타는 단백질 제형에서 발견된 통상적인 pH 범위, pH 5 내지 7에 적용될 수 있다.
AAPH 및 펜톤 반응만이 Trp 산화를 생성하였다. 당해 결과는, H2O2 단독의 친핵성 반응이 Trp를 산화시킬 수 없음을 지지한다. 본 발명자는 본 발명자의 실험에서 모두 His 산화가 전적으로 관측되지 않았음에 놀랐다. 소 혈청 알부민이 Fe(II)/EDTA/아스코르베이트 또는 Cu(II)/아스코르베이트와 반응한 경우, 전자는 Trp 상에서 산화를 더욱 유발한 반면, 후자는 His 산화를 더욱 잘 유발하였다[참조: Uchida et al. Agric Biol Chem. 53: 3285-92 (1989)]. 다른 시험실에서, AscA/Cu(II)에 의한 렐락신 산화는 His 산화 중 현저한 양을 및 AscA/Fe(III)에 의한 렐락식 산화는 소량을 생성하였으며, 동시에 Trp 또는 Tyr 산화가 주목되지 않았다[참조: Li et al., Biochem 34: 5762-72 (1995)]. 실험실 둘다로부터의 결과는 H2O2 + Fe(II)가 사용되는 경우 PTH에 있어서 His 산화의 전체적인 부재를 예측한다. His 산화는 구리의 존재에 의존한다는 것이 가능하다.
안정화제, PTH의 스크리닝:
상기 분석을 기초로 하여, 본 발명자는, 단백질이 도 1에 나타낸 어떠한 또는 모든 3개의 분해 메카니즘을 통해 및 광-유도된 산화를 통해 산화성 공격에 대해 민감할 수 있음을 제안한다. H2O2(및 금속의 부재)와의 친핵성 반응은, 단백질 생성물이 분리기내 방부제로서 사용된 증기 H2O2, 또는 H2O2에 노출되어 트윈의 분해를 초래하는 경우 관측된 산화반응일 수 있다[참조: Jaeger et al., Biophy Method 29:77-81 (1994)]. 미량의 금속(철, 구리 또는 크롬)이 제형 용액내로 스테인레스 강과의 접촉 결과로서 도입되는 경우, 펜톤 반응-H2O2와 Fe(II)-는 작동성이다. 제3 메카니즘은 분해된 트윈으로부터 기원할 수 있는 알킬퍼옥사이드를 통한다[참조: Jaeger et al., Biophy Method 29:77-81 (1994)]. 본 연구에서, AAPH는 알킬퍼옥사이드로부터 생성된 반응성 산소 종을 자극시키는데 사용되었다(도 2).
메티오닌: 철이 존재하는 것에 상관없이, 유리 Met는 예측되는 바와 같이 산화제 H2O2의 효과를 중화하였다. 유리 Met는 Met[O]-PTH에 상응하는 피크가 나타나지 않으므로, PTH내 Met 잔기의 산화를 현저히 감소시켰다(도 6). 유리 Met는, Trp[O] 피크가 지속되므로, Trp의 산화에 영향을 미치지 않았다.
만니톨, 슈크로즈: 만니톨은 잘 알려진 하이드록실 유리 라디칼 스캐빈저이다. 도 7은 H2O2/Fe(II)에 의해 스트레스받는 경우 특정의 Met[O]- 및 Trp[O]- 기원한 PTH의 부재에 의해 입증되는 바와 같이, 만니톨에 의한 펜톤 반응의 완전한 보호를 나타낸다. 그러나, AAPH 또는 H2O2에 의해 스트레스받는 경우, PTH는 만니톨에 의해 전적으로 보호되지 않았는데, 이는, 만니톨이 알킬퍼옥사이드 또는 H2O2와 반응하지 않기 때문이다. 슈크로즈는 하이드록실 유리된 라디칼에 대해 PTH를 보호하는 경우 만니톨보다 거의 효과적이지 않았다는 것을 제외하고는, 유사한 결과를 생성하였다. 폴리올은 물리적 및 화학적 분해 둘다에 대해 공통의 안정화제인 것으로 고려되었다. 리(Le) 등의 문헌[참조: Biotech Bioeng 48:490-500 (1995)]에 의한 고찰에서 주목하는 바와 같이, 헤모글로빈은 특정의 당을 사용한 산화없이 동결건조될 수 있다. AAPH를 사용한 본 발명자의 모델로부터의 결과는, 폴리올을 사용한 단백질이, 알킬퍼옥사이드와 직면하는 경우 보호되지 않은 상태로 남을 수 있음을 제안한다.
EDTA: 도 8에 나타낸 바와 같이, EDTA는 H2O2/Fe(II)에 의해 스트레스받는 경우 PTH를 완전히 보호하였다. 당해 예에서, EDTA는 유리 라디칼의 생성만을 완화한 것이 아니라 H2O2의 산화 효과도 완화하였다. EDTA는 H2O2 단독에 의해 스트레스받는 경우, PTH를 보호하지 않았다. EDTA는 AAPH 산화를 강화하는 것으로 보이며, 이는, 풍부한 Met[O]- 및 Trp[O]-PTH 피크가 존재한다는 사실로 제공된다. EDTA 또는 다른 금속 킬레이트제(예를 들면, EGTA)의 효과의 보고가 혼합되었다. 금속 킬레이트는 금속-촉매된 반응을 향상시키거나 억제할 수 있다. EDTA는, 구리를 효과적으로 봉쇄하기 때문에, 구리-촉매된 반응을 억제한다고 개괄하여 말할 수 있다. 이는 철에 있어서 모든 5개의 균형을 커버할 수 없기 때문에, DETA-철 복합체는 때때로 매우 반응성이다. EDTA가 PTH 및 AAPH의 반응 혼합물에 가해지는 경우 산화가 더욱 관측되는 이유는 알려져 있지 않으나, 이러한 관측은 본 연구의 영역을 초과하는 것이다.
문헌에 흔히 기술된 것으로서, 생체내 Met, Trp 또는 His 잔기의 산화는 금속 촉매된 산화(MCO)에 기여하여 왔다. 본 실험에서, 금속이 가해지지 않고, AAPH에 의해 산화된 PTH는 현저한 양의 Met 및 Trp를 생성하였으며, 이는, Met 또는 Trp 산화 어느 것도 금속 촉매에 전적으로 의존하지 않음을 제안한다.
유리 트립토판: 문헌에서, 많은 물질이 유리 라디칼에 대한 스캐빈저로서 인용되었다. 티오우레아, 메탄올 및 우릭산이 예이나, 이들은 단백질 제형에 사용하기에 적합하지 않다. 또한, 부틸화된 하이드록실-아니솔(BHA) 및 -톨루엔(BHT)은 지질로부터 라디칼을 퀀칭하는데 있어서 매우 효과적인 라디칼 쇄 반응 종결인자이다. 이들의 낮은 수용성으로 인하여, 이들은 단백질의 수성 제형에 적합하지 않다. 적절한 양의 표면활성제를 사용하여, BHA 및 BHT를 수성 제형에 도입시킴으로써 일부 산화성 보호를 제공할 수 있다.
비경구 제형에서 항-산화제로서 유리 Trp의 사용은 문헌에 언급되어 있지 않다. 유리 Met의 사용과 유사하게, 이는 산하에 대해 PTH를 보호할 수 있다. 도 9는, PTH가 AAPH 또는 펜톤 반응에 의해 스트레스받는 경우, PTH내 Trp 잔기의 산화로부터 유리 Trp가 우수한 보호를 제공함을 나타낸다. Met[O]-PTH 피크는 AAPH 스트레스 경우에 우세하며 펜톤 반응의 경우에 그렇게 거의 우세하지 않다. 유리 Trp 단독은 H2O2에 의한 산화성 스트레스에 대해 보호를 제공하지 않았다.
트립토판 및 메티오닌의 조합: 당해 조합은 모든 3개의 산화 조건하에서 PTH의 거의 완전한 보호를 제공하였다(도 10). 유리 Trp 및 Met이 알킬퍼옥사이드 및 H2O2의 효과 각각을 중화할 것임을 추측할 수 있다. Trp 및 Met가 함께 사용되는 경우, 단백질 제형은 도 1에 나타낸 모든 3개의 메카니즘, 및 광-유도된 산화에 의한 공격을 지탱할 수 있다.
위에서 기술한 분석은 각각의 rp-HPLC 크로마토그램상에서 피크의 정성적 실험으로부터 기원하였다. AAPH 및 펜톤 반응에 의해 산화된 시료를 트립신 펩타이드 맵핑 및 LC/MS/MS 특성화에 의해 추가의 정량적이고 잔기-특이적인 분석에 적용하였다. 질량 시그날의 상응하는 EIC(추출된 이온 크로마토그램)을 통합함으로써 수득된 상대적인 정량화 결과에 따라, 유리 Met 단독은 Met 산화를 현저히 억제하였고 유리 Trp 단독은 Trp 산화를 현저히 억제하였다(도 11). Trp 및 Met의 조합은 AAPH(도 11) 또는 펜톤 반응(도 12)에 의한 산화에 대해 가장 효과적인 보호를 제공하였다.
부위 특이적인 금속 촉매된 산화:
자격 로트가 30℃에서 1개월 동안 저장시 주요 피크 손실의 보다 높은 정도를 나타낸 경우 항-VEGF 항체의 Trp50 산화를 우선 주목하였다. Trp 50에서 자동촉매적 산화는 불량하게-취급된 트윈 20에 의해 유발된 것으로 후에 밝혀졌으며, 이는 IEC 분석에 있어 기본 피크의 증가 및 주요 피크의 손실을 초래하였다. 추가의 연구는, H2O2가 항-VEGF 항체 산화를 유발하지 않음으로써 IEC 크로마토그래프적 패턴에 대한 변화를 초래하지 않았음을 나타내었다. 안정화제로서 EDTA의 첨가 및 주변 His의 돌연변이는 Trp 산화와 관련하여 항-VEGF 항체의 증가된 안정성을 초래하였다. 이러한 데이타를 기초로 하여, 항-VEGF 항체 산화가 부위-특이적인, 금속 촉매된 반응이라는 것이 가능하다.
항-VEGF 항체 용액에 대한 AAPH의 첨가는 또한 IEC 크로마토그램의 기본 영역에 있어서 추가의 피크를 생성하였으며, 이들 피크는, 유리 라디칼이 문제의 자격 로트에 의해 나타낸 것으로서 항-VEGF 항체 분해제를 생성하였음을 나타내었다(도 13). 비록, 분해된 단백질의 이들 피크가 자격 로트로부터의 분해된 피크의 비교가능한 위치내에 있다고 해도, 프로파일은 동일하지 않다. 추가의 분석이, 이들 피크가 Trp 산화에 관련되어 있는지를 확인하기 위해 요구된다.
제형에 대한 유리 트립토판의 첨가는 IEC 크로마토그램에서 기본 피크의 부재에 의해 입증되는 바와 같이, AAPH에 대한 탁월한 보호를 제공하였다(도 14). 항-VEGF 항체내 Met 잔기는 H2O2에 의해 산화될 수 없으므로, 유리 Met가 항-VEGF 항체에 요구되지 않을 수 있음을 충분히 예측할 수 있다.
Trp 산화가 예측되지 않는 항- CD11a 항체:
항-CD11a 항체에서 Met 잔기의 산화가 집중적으로 연구되었다. 항-CD11a 항체는 4개의 반응성 메티오닌 - Met 256, Met 432, Met 362 및 Met 50(중쇄)을 갖는다. 표 3은, H2O2, tBHP, 및 열 스트레스가 Met 256의 산화를 유발하였으며 Met 50의 산화를 보다 적은 정도로 유발하였음을 나타낸다. 금속(주로 스테인레스 강 탱크로부터의 용해된 금속)의 존재하에서, Met 50에서의 산화는 Met 256의 것과 비교가능한 수준으로 증가하였다. 산화는 Lys-C 펩타이드 맵핑에 의해 측정하였다. 반응성의 순서에 있어서의 차이는 적용된 산화 스트레스 유형에 의존하였다.
산화 조건 메티오닌 산화의 순서
(가장 반응성 ---> 최소한의 반응성
1 tBHP Met256 > Met432 > Met362 > Met 50
2 광 Met256 > Met 432 (다른 산화는 없음)
3 열 Met 256 > Met 432 ~ Met 50 > Met 362
4 촉매된 금속 Met 256 ~ Met 50 > Met 432 > Met 362
5 H2O2 Met 256 > Met 432 > Met 50
AAPH를 항-CD11a 항체에 가한 경우, Met 50의 수준은 증가하였으며, 이는, 스테인레스 강 탱크내 반응 및 AAPH와의 반응이 비교가능함을 제안하며, Met 50에서 증가된 산화를 초래함을 제안한다(표 4). Met50은, 금속 또는 유리 라디칼이 관여하는 경우 산화 부위임을 추정할 수 있다. 이들 조건하에서, Trp, His 또는 Tyr 잔기가 산화되지 않았음은 매우 중요하다. 그러나, 변성제를 사용하는 경우, Trp는 다양한 부위에서 산화될 수 있다.
산화된 %
HC-M256 HC-M50 HC-M362 HC-M35
t=0 5.3 1.6 0.6 0.5
t=8시간 14.3 8.2 1.2 2.3
t=24시간 31.6 20 3.2 4.1
참조물 3 0.7 1 0.4
단백질에 대한 산화제의 비율이 증가하고 단백질의 3차 구조가 구아니딘이 첨가에 의해 교란되는 경우, AAPH에 의한 Trp 잔기의 산화가 풍부해졌다. 또한, 이러한 조건하에서, Met50의 우선적인 산화는 관측되지 않았다(데이타는 제공되지 않음). 당해 결과는 또한, 모델 산화제로서 AAPH의 용도를 지지한다. AAPH는, 적절한 산화제/단백질 비가 사용되는 경우 Trp 산화를 신뢰성 있게 유발한다. AAPH는, 항-CD11a 항체를 사용하는 경우에서와 같이, 정상의 취급 조건이 Trp 산화를 생성하지 않는 경우 Trp 산화를 유발하지 않는다.
결론
당해 보고에서, 본 발명자는, AAPH가 단백질내 Trp 잔기를 산화시킬 수 있는 우수한 모델 산화제임을 입증하였다. H2O2, H2O2와 철 및 AAPH(도 1)을 함께 사용하여 Met 및 Trp 잔기의 산화에 대해 보호하기 위한 안정화제를 스크리닝하는 것이 바람직하다. 당해 시스템은 단백질 약제의 제조 및 저장 동안 발생할 수 있는 모든 가능한 산화 경로의 개선된 자극을 허용한다. 항-VEGF 항체 분해는 금속 촉매된 산화로서 별도로 입증되었다.
본 발명자들은 또한, 유리 Trp가, 단백질-함유 제형에 가해지는 경우, 트립토판 잔기의 산화를 효과적으로 차단하였음을 처음으로 입증하였다. AAPH를 사용함으로써 자극된 산화성 스트레스하에서, 트립토판은 항-VEGF 항체에서의 산화 반응을 효과적으로 차단하였다. 당해 결과는, 유리 Trp가 부위-특이적인 금속-촉매된 산화에 대해 효과적임을 제안한다. Met, Trp, 및 가능하게는 His와 같은 모든 취약한 아미노산 잔기를 보호하는 것을 보증하기 위해, Met 및 Trp의 조합이 고려될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. <120> Compositions and Methods for the Prevention of Oxidative Degradation of Proteins <130> GNE-0337PCT <140> PCT/US2008/056365 <141> 2009-09-09 <150> US 61/095,878 <151> 2008-09-10 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Val Gly Trp Leu Arg 1 5

Claims (32)

  1. 단백질, 유리 메티오닌 및 당해 단백질내 방향족 아미노산 잔기의 산화를 방지할 수 있는 하나 이상의 화합물을 포함하는 약제학적 제형.
  2. 청구항 1에 있어서, 단백질이 펩타이드, 단백질, 항체 및 이의 유사체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 제형.
  3. 청구항 2에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 제형.
  4. 청구항 1에 있어서, 단백질이 항-VEGF 모노클로날 항체인 제형.
  5. 청구항 1에 있어서, 단백질이 항-혈관형성 특성을 갖는 제형.
  6. 청구항 1에 있어서, 단백질이 항-CD20 모노클로날 항체인 제형.
  7. 청구항 1에 있어서, 단백질이 항-CD11a 모노클로날 항체인 제형.
  8. 청구항 1에 있어서, 단백질이 산화에 민감한 제형.
  9. 제1항에 있어서, 단백질이 응집에 민감한 제형.
  10. 청구항 1에 있어서, 단백질내 방향족 아미노산 잔기가 트립토판, 히스티딘, 타이로신 및 페닐알라닌으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 제형.
  11. 청구항 1에 있어서, 수성인 제형.
  12. 청구항 1에 있어서, 산화를 방지할 수 있는 화합물이 비경구 주사에 적합한 제형.
  13. 청구항 1에 있어서, 화합물이 약리학적 효과에 기여하지 않는 제형.
  14. 청구항 1에 있어서, 화합물이 유리 방향족 아미노산 또는 이의 유사체를 포함하는 제형.
  15. 청구항 11에 있어서, 방향족 아미노산이 트립토판, 히스티딘, 타이로신 및 페닐알라닌으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 제형.
  16. 청구항 1에 있어서, 화합물이 트립토판인 제형.
  17. 청구항 13에 있어서, 트립토판이 제형 속에 약 0.1 내지 10mg/ml 범위의 양으로 존재하는 제형.
  18. 청구항 1에 있어서, 유리 트립토판이 하나 이상의 추가의 방향족 아미노산과 조합되는 제형.
  19. 청구항 1에 있어서, 화합물이 유리 뉴클레오타이드 또는 이의 유사체를 포함하는 제형.
  20. 청구항 17에 있어서, 유리 뉴클레오타이드가 제형 속에 약 0.1 내지 10mg/mL 범위의 양으로 존재하는 제형.
  21. 청구항 1에 있어서, 하나 이상의 유리 뉴클레오타이드가 하나 이상의 유리 방향족 아미노산과 조합되는 제형.
  22. 청구항 1에 있어서, 화합물이 하나 이상의 비타민 또는 비타민 유도체를 포함하는 제형.
  23. 청구항 19에 있어서, 비타민 또는 비타민 유도체가 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산인 제형.
  24. 청구항 19에 있어서, 비타민 또는 비타민 유도체가 피리독신인 제형.
  25. 청구항 19에 있어서, 산화제 비타민 또는 비타민 유도체가 제형 속에 약 0.1 내지 10mg/ml 범위의 양으로 존재하는 제형.
  26. 청구항 1에 있어서, 표면활성제를 추가로 함유하는 제형.
  27. 청구항 1에 있어서, 만니톨을 추가로 함유하는 제형.
  28. 청구항 1에 따른 제형을 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하기에 효과적인 양으로 포유동물에게 투여함을 포함하는, 당해 포유동물에서 상기 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하는 방법.
  29. 청구항 1에 따른 제형을 제조하고 제형내 단백질의 물리학적 안정성, 화학적 안정성 또는 생물학적 활성을 평가함을 포함하는, 약제학적 제형을 제조하는 방법.
  30. 메티오닌 및 하나 이상의 화합물을 단백질의 약제학적 조성물에 단백질내 방향족 아미노산 잔기의 산화를 억제하기에 충분한 양으로 추가함을 포함하는, 상기 단백질의 약제학적 조성물을 안정화시키는 방법.
  31. 표면활성제 및 당해 표면활성제의 분해로부터 생성된 산화성 종을 무력화시키기에 충분한 양의 화합물을 단백질 조성물에 추가함을 포함하는, 약제학적 제형을 제조하는 방법.
  32. 메티오닌을 방향족 아미노산, 뉴클레오타이드 및 비타민 또는 이들의 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 화합물과 함께 추가함을 포함하는, 민감한 단백질 내 방향족 아미노산 잔기의 산화를 방지하는 방법.
KR1020117008149A 2008-09-10 2009-09-09 단백질의 산화성 분해를 방지하기 위한 조성물 및 방법 KR20110076918A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9587808P 2008-09-10 2008-09-10
US61/095,878 2008-09-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20110076918A true KR20110076918A (ko) 2011-07-06

Family

ID=41351722

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117008149A KR20110076918A (ko) 2008-09-10 2009-09-09 단백질의 산화성 분해를 방지하기 위한 조성물 및 방법

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20100068210A1 (ko)
EP (2) EP2334323A2 (ko)
JP (2) JP5705115B2 (ko)
KR (1) KR20110076918A (ko)
CN (2) CN102209554A (ko)
AU (1) AU2009291865A1 (ko)
BR (1) BRPI0918978A2 (ko)
CA (1) CA2734275A1 (ko)
IL (2) IL211234A0 (ko)
MX (1) MX2011002372A (ko)
WO (1) WO2010030670A2 (ko)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX344293B (es) 2008-10-17 2016-12-13 Sanofi Aventis Deutschland Combinacion de una insulina y un agonista de glp-1.
PT2498802E (pt) 2009-11-13 2015-04-13 Sanofi Aventis Deutschland Composição farmacêutica que compreende um agonista de glp-1, uma insulina e metionina
BR112012011403B8 (pt) 2009-11-13 2021-05-25 Sanofi Aventis Deutschland composição farmacêutica líquida compreendendo um agonista glp-1 e metionina e uso da mesma
EP2364690A1 (en) * 2010-02-12 2011-09-14 Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia Orally administrable pharmaceutical pellet of epidermal growth factor
KR101878369B1 (ko) * 2010-03-22 2018-07-16 제넨테크, 인크. 단백질-함유 제제의 안정화에 유용한 조성물 및 방법
RU2546520C2 (ru) 2010-08-30 2015-04-10 Санофи-Авентис Дойчланд Гмбх Применение ave0010 для производства лекарственного средства для лечения сахарного диабета 2 типа
CA3065694A1 (en) * 2010-11-10 2012-05-18 Inregen Methods of forming injectable formulations for providing regenerative effects to an organ such as a kidney
US9821032B2 (en) 2011-05-13 2017-11-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin
CN108195965B (zh) 2011-06-07 2021-02-23 旭化成制药株式会社 含pth肽冷冻干燥制剂的检査方法及包含该含pth肽冷冻干燥制剂的医药品的制造方法
US9408893B2 (en) 2011-08-29 2016-08-09 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for use in glycemic control in diabetes type 2 patients
TWI559929B (en) 2011-09-01 2016-12-01 Sanofi Aventis Deutschland Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease
EA034347B1 (ru) * 2011-10-26 2020-01-30 Амген Инк. Способ инактивации вирусов при получении антител
TWI641381B (zh) 2013-02-04 2018-11-21 法商賽諾菲公司 胰島素類似物及／或胰島素衍生物之穩定化醫藥調配物
BR112015022587A2 (pt) * 2013-03-13 2017-10-24 Eleven Biotherapeutics Inc formulações de citocina quimérica para entrega ocular
LT2968466T (lt) * 2013-03-13 2018-10-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Sumažintos oksidacijos kompozicijos
US20140314778A1 (en) * 2013-03-13 2014-10-23 Genentech, Inc. Formulations with reduced oxidation
AR095399A1 (es) 2013-03-13 2015-10-14 Genentech Inc Formulaciones con oxidación reducida, método
RU2707550C2 (ru) * 2013-03-13 2019-11-27 Дженентек, Инк. Составы со сниженным окислением
RU2015144020A (ru) 2013-03-15 2017-04-21 Дженентек, Инк. Среды для культивирования клеток и способы получения антител
CN105899190B (zh) 2014-01-09 2022-06-14 赛诺菲 门冬胰岛素的稳定化药物制剂
SG11201604708VA (en) 2014-01-09 2016-07-28 Sanofi Sa Stabilized glycerol free pharmaceutical formulations of insulin analogues and/or insulin derivatives
WO2015104314A1 (en) 2014-01-09 2015-07-16 Sanofi Stabilized pharmaceutical formulations of insulin analogues and/or insulin derivatives
LT3229828T (lt) 2014-12-12 2023-06-12 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulino glargino/liksisenatido fiksuoto santykio kompozicija
TWI748945B (zh) 2015-03-13 2021-12-11 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患治療
TW201705975A (zh) 2015-03-18 2017-02-16 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患之治療
WO2017049205A2 (en) * 2015-09-18 2017-03-23 Amunix Operating Inc. Growth hormone formulation
CN114706271A (zh) 2016-03-31 2022-07-05 富士胶片株式会社 半导体制造用处理液及图案形成方法
JP7113429B2 (ja) 2016-11-29 2022-08-05 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 タンパク質組成物、その製造方法及び熱安定性向上方法
CA3075977A1 (en) * 2017-09-22 2019-03-28 Asahi Kasei Pharma Corporation Teriparatide-containing liquid pharmaceutical composition having excellent stability
IL273384B2 (en) * 2017-09-22 2023-12-01 Immunogen Inc Methods to prevent methionine oxidation in immune conjugates
JP2019156805A (ja) * 2018-03-16 2019-09-19 ナガセ医薬品株式会社 容器充填ヒトｐｔｈ（１−３４）液体医薬組成物及びその製造方法
CN112601545A (zh) * 2018-08-07 2021-04-02 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 工艺和疫苗
MX2021001453A (es) * 2018-08-08 2021-04-12 Genentech Inc Uso de derivados de triptofano y l-metionina para una formulacion de proteinas.
JP2020052012A (ja) * 2018-09-28 2020-04-02 株式会社Ｌｓｉメディエンス 不溶性担体を使用する免疫学的測定試薬
CN114404575A (zh) * 2020-12-07 2022-04-29 苏州智核生物医药科技有限公司 一种重组人促甲状腺素注射液

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4515893A (en) 1979-04-26 1985-05-07 Ortho Pharmaceutical Corporation Hybrid cell line for producing complement-fixing monoclonal antibody to human T cells
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5091178A (en) 1986-02-21 1992-02-25 Oncogen Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5091313A (en) 1988-08-05 1992-02-25 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes of IgE present on B cell but not basophil surface
US5720937A (en) 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
WO1989012463A1 (en) 1988-06-21 1989-12-28 Genentech, Inc. Method and therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction
US5078997A (en) * 1988-07-13 1992-01-07 Cetus Corporation Pharmaceutical composition for interleukin-2 containing physiologically compatible stabilizers
US5272135A (en) * 1991-03-01 1993-12-21 Chiron Ophthalmics, Inc. Method for the stabilization of methionine-containing polypeptides
ATE233813T1 (de) 1991-08-14 2003-03-15 Genentech Inc Veränderte immunglobuline für spezifische fc- epsilon rezeptoren
US5849700A (en) * 1991-12-20 1998-12-15 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical formulation
CA2140933A1 (en) 1992-08-21 1994-02-22 Paula M. Jardieu Method for treating an lfa-1 mediated disorder
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5595721A (en) 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
ES2108566T3 (es) 1993-12-10 1997-12-16 Genentech Inc Procedimientos para diagnosticar alergias y para seleccionar agentes terapeuticos antialergicos.
EP0739214B1 (en) 1994-01-18 1998-03-18 Genentech, Inc. A METHOD OF TREATMENT OF PARASITIC INFECTION USING IgE ANTAGONISTS
CA2181787A1 (en) 1994-03-03 1995-09-08 Claire M. Doerschuk Anti-il-8 monoclonal antibodies for treatment of inflammatory disorders
IL117645A (en) 1995-03-30 2005-08-31 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
CA2222231A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
ATE222774T1 (de) 1996-01-23 2002-09-15 Genentech Inc Antikörper gegen cd 18 zur verwendung gegen gehirnschlag
US7147851B1 (en) 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
US6037454A (en) 1996-11-27 2000-03-14 Genentech, Inc. Humanized anti-CD11a antibodies
AU731817C (en) 1996-11-27 2001-11-01 Genentech Inc. Humanized anti-CD11a antibodies
SI1325932T1 (ko) 1997-04-07 2005-08-31 Genentech Inc
EP1860187B1 (en) 1997-05-15 2011-07-13 Genentech, Inc. Apo-2 receptor
CZ307715B6 (cs) * 1999-02-22 2019-03-06 University Of Connecticut Způsob lyofilizace vodné farmaceutické formulace faktoru VIII prosté albuminu
JP2000247903A (ja) * 1999-03-01 2000-09-12 Chugai Pharmaceut Co Ltd 長期安定化製剤
JP3062493B1 (ja) * 1999-03-19 2000-07-10 明治乳業株式会社 ビフィズス因子の光劣化防止剤
EP2112167A3 (en) 1999-06-25 2010-12-22 Genentech, Inc. Humanized ANTI-ERBB2 antibodies and treatment with ANTI-ERBB2 antibodies
ES2309012T3 (es) 1999-10-29 2008-12-16 Genentech, Inc. Composiciones del anticuerpo anti-psca y a sus procedimientos contra celulas cancerigenas que expresen psca.
JP4683810B2 (ja) * 2000-02-29 2011-05-18 中外製薬株式会社 長期安定化製剤
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
US6989138B2 (en) * 2000-10-24 2006-01-24 Diatide, Inc. Stabilization of radiopharmaceutical compositions using hydrophilic thioethers and hydrophilic 6-hydroxy chromans
ES2282326T3 (es) * 2000-10-24 2007-10-16 Cis Bio International Estabilizacion de composiciones radio-farmaceuticas usando tioeteres hidrofilicos o 6-hidroxicromanos hidrofilicos.
US7321026B2 (en) 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
US20030104996A1 (en) * 2001-08-30 2003-06-05 Tiansheng Li L-methionine as a stabilizer for NESP/EPO in HSA-free formulations
WO2003033658A2 (en) 2001-10-17 2003-04-24 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
CN101914158A (zh) 2002-02-14 2010-12-15 免疫医疗公司 抗cd 20抗体及其融合蛋白和使用方法
KR20090088973A (ko) 2002-10-17 2009-08-20 젠맵 에이/에스 Ｃｄ20에 대한 인간 모노클로날 항체
SI2289936T1 (sl) 2002-12-16 2017-10-30 Genentech, Inc. Imunoglobulinske variante in njihove uporabe
CA2897608C (en) 2003-05-09 2018-07-31 Duke University Cd20-specific antibodies and methods employing same
AR044388A1 (es) 2003-05-20 2005-09-07 Applied Molecular Evolution Moleculas de union a cd20
WO2005014618A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Immunomedics, Inc. Bispecific antibodies for inducing apoptosis of tumor and diseased cells
US8147832B2 (en) 2003-08-14 2012-04-03 Merck Patent Gmbh CD20-binding polypeptide compositions and methods
GT200600031A (es) * 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
ATE523525T1 (de) 2005-06-20 2011-09-15 Genentech Inc Anti-tumorassoziiertes antigen tat10772 zum nachweis und behandlung von krebs
EP2212432A4 (en) * 2007-10-22 2011-10-19 Schering Corp COMPLETELY HUMAN ANTI-VEGF ANTIBODIES AND USE PROCEDURES
EP3381445B1 (en) * 2007-11-15 2023-10-25 Amgen Inc. Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration
US9813410B2 (en) 2014-06-26 2017-11-07 Rakuten, Inc. Information processing apparatus, information processing method, and information processing program

Also Published As

Publication number Publication date
EP2684570A1 (en) 2014-01-15
JP2015107973A (ja) 2015-06-11
US20130171162A1 (en) 2013-07-04
CN102209554A (zh) 2011-10-05
CA2734275A1 (en) 2010-03-18
AU2009291865A1 (en) 2010-03-18
IL211234A0 (en) 2011-04-28
US20100068210A1 (en) 2010-03-18
JP5705115B2 (ja) 2015-04-22
JP2012502102A (ja) 2012-01-26
WO2010030670A2 (en) 2010-03-18
IL229180A0 (en) 2013-12-31
WO2010030670A3 (en) 2010-05-06
CN103599541A (zh) 2014-02-26
MX2011002372A (es) 2011-04-04
EP2334323A2 (en) 2011-06-22
BRPI0918978A2 (pt) 2015-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5705115B2 (ja) 蛋白質の酸化的分解の予防のための組成物および方法
US11938189B2 (en) Compositions and methods for stabilizing protein-containing formulations
KR102218495B1 (ko) 단백질-함유 제제의 안정화에 유용한 조성물 및 방법
RU2575830C2 (ru) Композиции и способы, включающие алкилгликозиды, для стабилизации содержащих белки составов

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application