ES2617853T3 - Compuestos resistentes a proteasas útiles como transportadores a través de la barrera hematoencefálica y construcciones de transportador-carga - Google Patents

Compuestos resistentes a proteasas útiles como transportadores a través de la barrera hematoencefálica y construcciones de transportador-carga Download PDF

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Abstract

Un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, R1-(X) K-P-Y (I) en la que: R1 es el grupo unido al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P, de forma opcional a través del ligando X, y se selecciona del grupo que consiste en H, CH3C(>=O)- y maleimida; X es un birradical seleccionado del grupo que consiste en -NH-(CH2)r-C(>=O)-, -C(>=O)-(CH2)r-C(>=O)-, -S(CH2)r-, -S-(CH2)r-C(>=O)-, -O-(CH2)r-, -S-CH2-CH(NH2)-C(>=O)-, -O-(CH2)r-C(>=O)-, -(CH2)r-C(>=O)-, -NH-O-CH2-C(>=O)-NH- (CH2)r-CH(NH2)-C(>=O)-, -(CH2)r-C(>=O)-NH-(CH2)r-CH(NH2)-C(>=O)- y -NH-(CH2)r-CH(NHC(>=O)CH2NH2)-C(>=O)-; en la que el birradical X está unido a R1 y al N de la secuencia P como sigue: R1 -NH-(CH2)r-C(>=O)-N(H)m-, R1- C(>=O)-(CH2)r-C(>=O)-N(H)m-, R1-S-(CH2)r-N(H)m-, R1-S-(CH2)r-C(>=O)-N(H)m-, R1-O-(CH2)r-N(H)m-, R1-S-CH2- CH(NH2)-C(>=O)-N(H)m, R1-O-(CH2)r-C(>=O)-N(H)m-, R1-(CH2)r-C(>=O)- N(H)m, R1-NH-O-CH2-C(>=O)-NH-(CH2)r- CH(NH2)-C(>=O)-N(H)m, R1-(CH2)r-C(>=O)-NH-(CH2)r-CH(NH2)-C(>=O)-N(H)m y R1-NH-(CH2)r- CH(NHC(>=O)CH2NH2)-C(>=O)-N(H)m; r es un número entero de 1 a 5; P es un birradical de una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp- D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr (SEQ ID NO: 1); Y es el grupo unido al C terminal del último aminoácido de la secuencia P, y se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -OH, -OR2 y -NHR2; R2 es un radical seleccionado del grupo que consiste en (C1-C6)-alquilo y (CH2)2-NH-C(>=O)-CH2-O-NH2; k es un número entero de 0 a 2; m es un número entero de 0 a 1; a condición de que cuando el birradical X es -C(>=O)(CH2)rC(>=O)-, entonces R1 es H; a condición de que cuando el N del aminoácido de la secuencia P al cual está unido el birradical X es un birradical -NH-, entonces m es 1, y cuando es un birradical -N-, entonces m es 0; y a condición de que cuando R1 es maleimida entonces el birradical X es -C(>=O)-(CH2)r-C(>=O)-, -CH(NH2)-C(>=O)-, -(CH2)r-C(>=O)- y -(CH2)r-C(>=O)-NH-(CH2)r-CH(NH2)-C(>=O)-.

Description

Compuestos resistentes a proteasas útiles como transportadores a través de la barrera hematoencefálica y construcciones de transportador-carga
5 La presente invención se refiere a los campos de la medicina, la investigación y el diagnostico, y de forma más concreta a compuestos nuevos que actúan como transportadores a través de la barrera hematoencefálica (BHE) para el suministro de sustancias que no pueden cruzar la BHE por sí mismas. También se refiere a construcciones de transportador-carga y su uso en la terapia o el diagnóstico.
Técnica antecedente
Varios trastornos graves de la salud requieren tratamiento del cerebro. Estos incluyen enfermedades neurodegenerativas tales como las enfermedades de Parkinson y Alzheimer, pero también enfermedades del
15 sistema nervioso central tales como la esquizofrenia, la epilepsia o el trastorno bipolar, el cáncer de cerebro, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) e incluso determinados aspectos de la obesidad. Las dianas farmacéuticas de estas enfermedades están localizadas dentro del cerebro.
La BHE es un filtro natural dentro del cuerpo, que regula el paso de sustancias de la sangre al cerebro, permitiendo
20 que solo determinadas sustancias crucen de la sangre al cerebro. Es un mecanismo natural de defensa diseñado para mantener las sustancias nocivas fuera del cerebro. Controla la composición del fluido extracelular cerebral independientemente de las fluctuaciones en la sangre. También es impermeable para muchos compuestos y fármacos del entorno.
25 La base anatómica de la BHE son, principalmente, las uniones estrechas de las células endoteliales de los microvasos cerebrales, las cuales forman una membrana continua sin comunicaciones. Transportadores específicos median el acceso de determinadas moléculas importantes para el cerebro, tales como la glucosa, aminoácidos aislados e iones. Otros compuestos pueden usar la BHM mediante un proceso de difusión pasiva a través de las células endoteliales que forman los microvasos cerebrales. Sin embargo, este proceso requiere un determinado
30 grado de lipofilia de estos compuestos. Este tipo de transporte tiene la desventaja de ser muy selectivo y de estar regulado hasta cierto punto por las bombas de eflujo, localizadas en la membrana de las células endoteliales que forman la BHE, lo que impide la acumulación en el sistema nervioso de sustancias potencialmente tóxicas o innecesarias.
35 En las áreas terapéuticas mencionadas anteriormente se conocen para su tratamiento muchos compuestos promisorios, sin embargo, no se desarrollan adicionalmente debido a sus problemas de transporte en la BHE. La investigación en estos campos ha adoptado varias estrategias.
Algunos métodos de administración de fármacos al cerebro ya sea para la terapia o el diagnostico, son técnicas
40 invasivas, tales como la administración intracraneal, administración que altera la integridad de la BHE, o la alteración osmótica. Sin embargo, estos métodos implican un riesgo de infección y toxicidad y, además, necesitan personal calificado.
Otra estrategia es la modificación del fármaco. Estas modificaciones incluyen, por ejemplo, la reducción del tamaño
45 del fármaco o el aumento de la lipofilia del fármaco, pero no siempre es posible introducir tales modificaciones. En el caso de la introducción de una modificación irreversible, es necesario que no modifique la actividad del fármaco una vez que accede al sitio diana. En el caso de una modificación biorreversible, es necesario encontrar un proceso enzimático o químico que recupere el fármaco activo una vez que el profármaco esté dentro del sistema nervioso central.
50 Otra estrategia es la administración del fármaco mediante conjugación con un soporte biológico. Esta estrategia es a base de la conjugación del fármaco con un sustrato de un receptor de proteína específico o con un anticuerpo que reconozca de manera selectiva un dado receptor, por ejemplo, el receptor de transferrina o el receptor de LDL. Un receptor particular puede reconocer este conjugado de fármaco-soporte y experimentar un proceso de endocitosis
55 mediada por receptor en el sistema nervioso, de tal manera que compuestos con un uso terapéutico potencial que no pueden cruzar la BHE por sí mismos se vuelvan capaces de cruzar esta barrera cuando se conjugan con el soporte.
Para finalizar, otra estrategia comprende una estrategia de péptido mediada por vector en la cual se ligan fármacos
60 que no pueden transportarse a péptidos que tienen la capacidad de cruzar la BHE (ver también J. Temsamani et al., "Improved Brain Uptake and Pharmacological Activity Profile of Morpholine-6-Glucuronide Using a Peptide Vector-Mediated Strategy" en J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005 vol. 313, pág. 712-719). Esta estrategia se ha utilizado para mejorar la captación de varios fármacos en el cerebro, tales como doxorrubicina, penicilina, el análogo de encefalina dilargina, paclitaxel y morfina-6-glucurónido. En algunos casos, esta conjugación incluso aumentó la solubilidad del
fármaco y eludió la glicoproteína P expresada en la BHE.
El documento WO2008025867 describe varios compuestos a base de la estructura de la dicetopiperazina, que actúan como vehículos para el suministro de principios farmacéuticos activos en el cerebro mediante difusión pasiva
5 a través de la BHE, debido a que tienen la capacidad de portar fármacos que carecen de la capacidad de pasar la BHE. La permeabilidad de la construcción carga-transportador a través de la BHE se estudió por medio del ensayo PAMPA (acrónimo del inglés: parallel artificial membrane permeability assay, ensayo de permeabilidad de membranas artificiales paralelas), como un modelo in vitro de BHE.
10 Asimismo, el documento WO2012007625 describe el uso de péptidos rico en fenil prolina (PhPro) como transportadores de compuestos que no tienen la capacidad de cruzar la BHE. Los péptidos descritos pueden facilitar el transporte de estos compuestos en el sistema nervioso central. Esta solicitud de patente, como el documento WO2008025867, es a base del uso de transportadores que tienen la capacidad de cruzar la BHE mediante un mecanismo de difusión pasiva. Este hecho limita su uso como transportadores de moléculas pequeñas.
15 Se han descrito varios péptidos cuyo mecanismo de transporte a través de la BHE es a través de un proceso de transporte activo de transcitosis mediada por receptor.
El documento WO200244329 describe un péptido, THRPPMWSPVWP (L-aminoácidos), que tiene la capacidad de
20 unirse al receptor de transferrina humano (hTfR) e internalizarse en células que expresan hTfR. Este péptido puede ligarse a otras moléculas, tales como otros péptidos o proteínas, para facilitar el transporte de estas moléculas dentro de células que expresan hTfR. El péptido y su capacidad de unirse a hTfR también está descrito en Lee et al., en Eur J. Biochem. 2001, vol. 268, pág. 2004-2012.
25 El documento WO2007098415 describe que el péptido THRPPMWSPVWP (L-aminoácidos) puede utilizarse in vivo para dirigir macromoléculas dentro de células que expresan hTfR. En particular, se indica que potencia la liberación de derivados de péptido que inhiben la interacción del antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA, sigla del inglés: proliferating cell nuclear antigen) de una manera específica y, así, reduce la proliferación celular de células malignas que expresan una isoforma especifica de cáncer caPCNA. Desafortunadamente, el péptido
30 THRPPMWSPVWP (L-aminoácidos) muestra un tiempo de semivida breve en suero humano, limitando así sus aplicaciones.
Para finalizar, el documento WO2009008725 describe péptidos o peptidomiméticos que comprenden la secuencia THRPPMWSPVWP (L-aminoácidos), así como los conjugados que comprenden estos péptidos y moléculas 35 biológicas o de diagnóstico, y su uso para dirigir moléculas biológicas de diagnóstico a través de la barrera hematoencefálica, de células cerebrales, de células neuronales o de células tumorales de origen neuroectodérmico,
o de neuronas, para el tratamiento de trastornos relacionados. Los peptidomiméticos descritos se refieren a variantes del péptido anterior que comprenden una sustitución de aminoácido en la secuencia por otro aminoácido o un derivado de este. También describe que el péptido puede consistir por completo en L-aminoácidos o puede
40 contener una o más modificaciones en la estructura o en las cadenas laterales. Todos los ejemplos de la solicitud se refieren a L-aminoácidos.
Sobre la base de los resultados existentes, sería conveniente tener un compuesto con la capacidad de cruzar la BHE que tenga la capacidad de transportar cargas a través de ella de una manera eficaz. Asimismo, sería
45 interesante que estos compuestos tuvieran una estabilidad elevada en condiciones fisiológicas para evitar efectos secundarios y mejorar su eficacia.
Resumen de la invención
50 Los inventores han encontrado que el péptido PWVPSWMPPRHT (D-aminoácidos) y el péptido GPWVPSWMPPRHT (D-aminoácidos excepto la glicina, que no tiene quiralidad) tienen la capacidad de cruzar la BHE y son capaces de facilitar el transporte hacia dentro del cerebro de fármaco sus otras sustancias útiles para el diagnóstico, denominadas “cargas”, que no pueden cruzar la BHE por sí mismas. Los péptidos son biocompatibles, tienen ausencia de toxicidad y antigenicidad dado que están hechos de aminoácidos. A partir de ahora, estos
55 péptidos se denominarán compuestos transportadores.
El mecanismo de transporte a través de la BHE de los péptidos de la invención es por medio de una transcitosis mediada por receptor a través del receptor de transferrina. Este mecanismo depende de la configuración L o D de los aminoácidos. A diferencia de lo que se esperaba, los compuestos peptídicos de la presente invención también
60 son reconocidos por el receptor hTfR y tienen una sorprendente capacidad mejorada para funcionar como transportadores respecto al péptido THRPPMWSPVWP (L-aminoácidos). Los péptidos tienen la capacidad de internalizarse en las células endoteliales del cerebro y los astrocitos. Además de esto, tienen una permeabilidad aparente a través de la BHE mejorada en comparación con la secuencia THRPPMWSPVWP (L-aminoácidos).
Los compuestos peptídicos de la presente invención también muestran una buena solubilidad en agua y una elevada estabilidad frente a las proteasas que se encuentran en la sangre. Para ser más preciso, los péptidos tienen tiempos de semivida extensos en plasma humano, dado que son resistentes a las proteasas encontradas en este. Los péptidos también muestran una elevada estabilidad frente a las peptidasas asociadas con los microvasos
5 cerebrales. Esta propiedad de los compuestos de la invención permite mejorar la dosis de administración, dado que la cantidad de solución que contiene la construcción a administrar será menor.
Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a la proporción de compuestos transportadores de fórmula (I) o sus sales farmacéuticamente aceptables, 10 R1-(X)K -P-Y, (I),
en la que: R1 es el grupo unido al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P, de forma opcional a través del ligando X, y se selecciona del grupo que consiste en H, CH3C(=O)-y maleimida; X es un birradical seleccionado del 15 grupo que consiste en -NH-(CH2)r-C(=O)-, -C(=O)-(CH2)r-C(=O)-, -S(CH2)r-, -S-(CH2)r-C(=O)-, -O-(CH2)r-, -S-CH2CH(NH2)-C(=O)-, -O-(CH2)r-C(=O)-, -(CH2)r-C(=O)-, -NH-O-CH2-C(=O)-NH-(CH2)r-CH(NH2)-C(=O)-, -(CH2)r-C(=O)NH-(CH2)r-CH(NH2)-C(=O)-y -NH-(CH2)r-CH(NHC(=O)CH2NH2)-C(=O)-; en la que el birradical X está unido a R1 y al N de la secuencia P como sigue: R1 -NH-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-, R1-C(=O)-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-, R1-S-(CH2)r-N(H)m-, R1-S-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-, R1O-(CH2)rN(H)m-, R1S-CH2-CH(NH2)-C(=O)-N(H)m, R1-O-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-, R120 (CH2)r-C(=O)-N(H)m, R1-NH-O-CH2-C(=O)-NH-(CH2)r-CH(NH2)-C(=O)-N(H)m, R1-(CH2)r-C(=O)-NH-(CH2)r-CH(NH2)C(=O)-N(H)m y R1-NH-(CH2)r-CH(NHC(=O)CH2NH2)-C(=O)-N(H)m; r es un número entero de 1 a 5; P es un birradical de una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr (SEQ ID NO: 1); Y es el grupo unido al C terminal del último aminoácido de la secuencia P y se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -OH, -OR2 y -NHR2; R2 es un radical seleccionado del 25 grupo que consiste en (C1-C6)-alquilo y (CH2)2-NH-C(=O)-CH2-O-NH2; k es un número entero de 0 a 2; m es un número entero de 0 a 1; a condición de que cuando el birradical X es -C(=O)(CH2)rC(=O)-, entonces R1 es H; a condición de que cuando el N del aminoácido de la secuencia P al cual está unido el birradical X es un birradical -NH-, entonces m es 1, y cuando es un birradical -N-, entonces m es 0; y a condición de que cuando R1 es maleimida, entonces el birradical X es -C(=O)-(CH2)r-C(=O)-, -CH(NH2)-C(=O)-, -(CH2)r-C(=O)-y -(CH2)r-C(=O)-NH
30 (CH2)r-CH(NH2)-C(=O)-.
En una realización preferente, los compuestos de fórmula (I) son aquellos en donde: R1 es el grupo unido al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P, opcionalmente a través del ligando X, y se selecciona del grupo que consiste en H y CH3C(=O)-; X es un birradical seleccionado del grupo que consiste en -NH-(CH2)r-C(=O)-, 35 C(=O)-(CH2)r-C(=O)-, S (CH2)r-, -S-(CH2)r-C(=O)-, -O-(CH2)r--S-CH2-CH(NH2)-C(=O)-y -O-(CH2)r-C(=O)-; en las que el birradical X está unido a R1 y el N de la secuencia P es como sigue: R1 -NH-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-, R1-C(=O)(CH2)r-C(=O)-N(H)m-, R1-S-(CH2)r-N(H)m-, R1-S-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-, R1-O-(CH2)r-N(H)m-, R1-S-CH2-CH(NH2)C(=O)-N(H)m y R1-O-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-; r un número entero de 1 a 3; P es un birradical de una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His
40 D-Thr (SEQ ID NO: 1); Y es el grupo unido al C terminal del último aminoácido de la secuencia P y se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -OH, -OR2 y -NHR2; R2 es un radical (C1-C6)-alquilo; k es un número entero de 0 a 2; m es un número entero de 0 a 1; a condición de que cuando el birradical X es -C(=O)(CH2)rC(=O) entonces R1 es H y a condición de que cuando el N del aminoácido de la secuencia P al que está unido el birradical X es un birradical -NH-, entonces m es 1, y cuando es un birradical -N-, entonces m es 0.
45 Los compuestos de fórmula (I) o sus sales pueden existir en formas solvatadas, así como no solvatadas, incluyendo formas hidratadas. Por lo tanto, en su estructura pueden contener cantidades estiquiométricas de disolvente en el caso de solvatos o de agua en el caso de los hidratos. Debe entenderse que la presente invención abarca todas las formas solvatadas, así como las no solvatadas. La obtención de solvatos e hidratos depende del disolvente utilizado
50 y de las condiciones de cristalización, que un experto en la materia puede determinar.
En una realización preferente, los compuestos peptídicos de fórmula (I) son aquellos en los que P es un birradical que consiste en la SEQ ID NO: 1 y m es 0.
55 En otra realización preferente, los compuestos peptídicos de fórmula (I) son aquellos en los que P es un birradical basado en la secuencia Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr (SEQ ID NO: 2) y m es 1.
En una realización más preferente, los compuestos de fórmula (I) son aquellos en los que Y es -NH2, -OH o -NHR2.
60 En otra realización aún más preferente, los compuestos de fórmula (I) son aquellos en los que Y es -NH2. En otra realización preferente, los compuestos de fórmula (I) son aquellos en los que Y es -NHR2, en los que R2 es (CH2)2-NH-C(=O)-CH2-O-NH2.
Preferentemente, los compuestos de fórmula (I) son aquellos en donde k es 0 o 1.
Los compuestos peptídicos de fórmula (I) más preferentes son los seleccionados del grupo que consiste en:
H-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2; y 5 H-Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2.
En el presente documento se hace referencia a estos péptidos como se indica anteriormente o como PWVPSWMPPRHT (D-aminoácidos) o GPWVPSWMPPRHT (D-aminoácidos), respectivamente.
10 Como se explica en el Ejemplo 21, los compuestos de fórmula (I) tienen la capacidad de transportar sustancias hacia dentro del cerebro, denominadas cargas, que no pueden cruzar la BHE por sí mismas. Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de estos compuestos de fórmula (I) como transportadores de BHE. El uso de estos compuestos hace posible, por ejemplo, que la investigación sobre nuevos fármacos no esté solo limitada a los compuestos que pueden cruzar la BHE por sí mismos. Como se ilustra mediante los ejemplos comparativos, los
15 compuestos de fórmula (I) son mejores transportadores de BHE que los compuestos más cercanos de la técnica anterior.
Los compuestos de fórmula (I) tienen grupos funcionales apropiados adecuados para la unión covalente de cargas, manteniendo la actividad original de la carga hasta que alcance el sitio de acción. Por lo tanto, otro aspecto de la
20 presente invención es la proporción de construcciones de fórmula (II) o sus sales farmacéuticamente aceptables, que se denominan construcciones de transportador de BHE-carga,
(Z)q-(X)K-P-Y, (II)
25 en la que: X, P, Y, k son como se define anteriormente; q es un número entero de 1 a 2, y Z es un radical de una sustancia biológicamente activa o una sustancia para su uso en un método de diagnóstico, siendo dicha sustancia sustancialmente incapaz de cruzar la BHE por sí misma. En la que cuando q es 1, entonces Z está unido al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P, opcionalmente a través del ligando X, y cuando q es 2, entonces está unida una Z al N terminal del primer aminoácido de las secuencias P, opcionalmente a través del ligando X, y la
30 otra Z está unida a un nitrógeno del birradical X.
En una realización preferente, en las construcciones de fórmula (II) o sus sales farmacéuticamente aceptables, q es 1 y tiene la siguiente fórmula
35 Z-(X)K-P-Y, (II')
en donde: X, P, Y, k son como se define anteriormente para los compuestos de fórmula (I) y Z es un radical de una sustancia biológicamente activa o una sustancia para su uso en un método de diagnóstico, la cual es sustancialmente incapaz de cruzar la BHE por sí misma.
40 La expresión “sustancialmente incapaz de cruzar la BHE” significa que no tiene la capacidad de cruzar la BHE o, si lo hace, es en una cantidad que es terapéuticamente no eficaz.
Los valores preferentes de X, P, Y y k para el compuesto de fórmula (I) son también valores preferentes para la 45 construcción de fórmula (II).
Por lo tanto, en una realización preferente, las construcciones de fórmula (II) son aquellas en donde P se selecciona del grupo que consiste en un birradical de secuencia SEQ ID NO: 2 y un birradical de secuencia SEQ ID NO: 1.
50 En otra realización preferente, las construcciones de fórmula (II) son aquellas en donde k es un número entero de 0 a 1.
En otra realización preferente, la construcción de fórmula (II) son aquellas en la que Y es -NH2, -OH o -NHR2. En una realización más preferente, Y es NH2. En otra realización preferente, Y es -NHR2, en el que R2 es (CH2)2-N H-C(=O)
55 CH2-O-N H2.
Las sustancias a partir de las cuales se obtiene el radical Z incluyen una amplia variedad de sustancias que tiene utilidad farmacológica o en el diagnóstico. Estas sustancias pueden ser principios farmacéuticos activos, en particular, agentes antirretrovíricos, agentes anticancerosos, agentes antipsicóticos, agentes antineurodegenerativos
60 o fármacos antiepilépticos. En una realización preferente, Z es un radical obtenido de un principio farmacéutico activo que tiene la capacidad de formar un enlace amida, un enlace éster, un enlace disulfuro. Como alternativa, Z es un radical obtenido de un principio farmacéutico activo que tiene la capacidad de formar un enlace tioéter, un enlace oxima, un enlace amina o un enlace hidrazona con X, siendo el principio activo mencionado incapaz de cruzar la BHE por sí mismo.
Un ejemplo de principio farmacéutico activo es la dopamina. La dopamina es un neurotransmisor clave en el sistema nervioso central, en particular, el empobrecimiento de la dopamina estriatal está asociado con las afecciones clínicas del parkinsonismo. La dopamina ha mostrado propiedades interesantes como fármaco, pero no puede cruzar la
5 BHE. En particular, como se ilustra en los Ejemplos, las construcciones de fórmula (II) permiten a la dopamina ser útil como un fármaco, sin tener los efectos secundarios no deseados de la terapia actual, y ser una técnica más simple y no invasiva en comparación con las existentes.
Otras cargas posibles son, por ejemplo, péptidos, proteínas, polímeros y anticuerpos, los que tienen aplicaciones
10 como agentes terapéuticos o de diagnóstico, pero que son incapaces de cruzar la BHE de forma apropiada. En una realización particular, el péptido es H-D-Ala-D-NMePhe-D-Nal(2)-D-Val-D-Leu-D-Lys-D-Lys (SEQ ID NO: 3). Este péptido es útil para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. En una realización particular se utilizan anticuerpos como cargas. En una realización preferente, el anticuerpo es bevacizumab (Avastin). Este anticuerpo es útil para el tratamiento del cáncer.
15 Las sustancias obtenidas a partir de Z también incluyen otras sustancias que sería interesante transportar al cerebro pero que no lo hacen por sí mismas de forma apropiada, por ejemplo, agentes de contraste para la formación de imágenes por resonancia magnética (IRM). Entre los dispositivos clínicos utilizados para el diagnóstico clínico del cáncer, la IRM destaca como una modalidad de formación de imágenes no invasiva y no destructiva poderosa, que
20 proporciona imágenes internas de organismos vivos sin límite en la profundidad del análisis y con una resolución de 10 a 100 micrómetros. Es una técnica valiosa utilizada ampliamente en el diagnóstico del cáncer y en investigación. Para la detección temprana del cáncer (así como de otras enfermedades), es interesante el uso de agentes de contraste que puedan dirigirse de forma selectiva a marcadores específicos emplazados en determinados tejidos, creando una pequeña acumulación de agente de contraste en este tejido. Esta pequeña acumulación de agente de
25 contraste es suficiente para detectar de forma inequívoca la existencia de, por ejemplo, un tumor en fases muy tempranas. Los agentes de contraste pueden utilizarse también como métodos de diagnóstico para otras enfermedades del sistema nervioso central, tales como la enfermedad de Alzheimer, o como una herramienta para la exploración prequirúrgica por IRM que guiará al cirujano. En todos estos casos el agente de contraste utilizado necesita cruzar la BHE. Los ejemplos de agentes de contraste típicos incluyen quelatos de elementos
30 paramagnéticos, tales como gadolinio o manganeso (efecto sobre T1) o el uso de nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro (nanopartículas SPION (sigla del inglés: small superparamagnetic iron oxide nanoparticles)) (efecto T2). Las nanopartículas de óxido de hierro son partículas de óxido de hierro con diámetros entre aproximadamente 1 y 100 nanómetros. Las dos formas principales son la magnetita (Fe3O4) y su forma oxidada maghemita (-Fe2O3). Han atraído un gran interés debido a sus propiedades superparamagnéticas y sus
35 aplicaciones potenciales en muchos campos (aunque el Cu, el Co y el Ni también son materiales elevadamente magnéticos, son tóxicos y se oxidan con facilidad). El superparamagnetismo es una forma de magnetismo, que aparece en pequeñas micro o nanopartículas ferromagnéticas o ferrimagnéticas, consistiendo cada partícula en un dominio magnético. Un dominio magnético es una región dentro de un material magnético que tiene magnetización uniforme. Esto significa que los momentos magnéticos individuales de los átomos están alineados entre sí y apuntan
40 en la misma dirección.
Otros agentes de diagnóstico no IRM incluye colorantes y sondas fluorescentes tales como carboxifluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, o el uso de puntos cuánticos (nanopartículas formadas por materiales semiconductores con un campo cuántico de elevada fluorescencia). Los últimos, combinados con el uso de
45 microscopía de dos fotones, como en la técnica de IRM, permiten la formación de imágenes in vivo de organismos vivos de una manera no invasiva, permitiendo así su uso como la herramienta de diagnóstico.
Un punto cuántico es una porción de materia (por ejemplo, semiconductora) cuyos excitones están confinados en las tres dimensiones espaciales. En consecuencia, tales materiales tienen propiedades electrónicas intermedias entre 50 las de los semiconductores másicos y las de las moléculas discretas. Los puntos cuánticos son semiconductores cuyas características electrónicas están estrechamente relacionadas con el tamaño y la forma de los cristales individuales. En general, cuanto más pequeño es el tamaño del cristal más grande es el hueco de banda, mayor se hace la diferencia de energía entre la banda de valencia más alta y la banda de conducción más baja, por lo tanto, se necesita más energía para excitar el punto y, de forma simultánea, más energía se libera cuando el cristal vuelve
55 a su estado de reposo.
Además, en una realización preferente, la carga Z incluye anticuerpos útiles en métodos de diagnóstico.
Las construcciones más preferentes de fórmula (II) son las seleccionadas del grupo que consiste en:
60 L-Dopa-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 ((IIa); SEQ ID NO: 1 con una L-dopa como carga o grupo Z);
H-D-Ala-D-NMePhe-D-Nal(2)-D-Val-D-Leu-D-Lys-D-Lys-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D
Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 ((IIb); SEQ ID NO: 1 con la SEQ ID NO:3 como carga o grupo Z);
5(6)-Carboxifluoresceína-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 ((IIc); SEQ ID NO: 1 con 5(6)-Carboxifluoresceína como carga o grupo Z);
5 Punto cuántico-Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 ((IId); SEQ ID NO: 2 con punto cuántico como carga o grupo Z); y
SPION-Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 ((IIe); SEQ ID 10 NO: 2 con SPION como carga o grupo Z).
En una realización particular, las construcciones de fórmula (II) son las seleccionadas del grupo que consiste en:
5(6)-Carboxifluoresceína-L-Lys(Anticuerpo)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D15 His-D-Thr-NH2 ((IIf); SEQ ID NO: 1 con 5(6)-Carboxifluoresceína y un anticuerpo como cargas o grupos Z); y
Rodamina b-L-Lys(Anticuerpo)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2((IIg); SEQ ID NO: 1 con rodamina b y un anticuerpo como cargas o grupos Z).
20 Como se menciona anteriormente, de acuerdo con la carga de las construcciones de fórmula (II), estas serán útiles en terapia o en diagnóstico.
Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a estructuras de formula (II) como se define anteriormente, en las que Z es un radical de una sustancia biológicamente activa que es sustancialmente incapaz de
25 cruzar la BHE por sí misma, para su uso como un medicamento. Preferentemente, las sustancias con actividad biológica son principios activos farmacéuticos, en particular seleccionados del grupo de principios activos mencionados anteriormente.
Otro aspecto de la invención se refiere a estructuras de fórmula (II) en donde Z es un radical de dopamina para su
30 uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Esto puede formularse también como el uso de construcciones de fórmula (II) en donde Z es un radical de dopamina, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Por lo tanto, este aspecto está relacionado con un método de tratamiento y/o de profilaxis de un mamífero, incluyendo un ser humano, que padece o es susceptible de desarrollar enfermedad de Parkinson; este método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un
35 compuesto de fórmula (II), con Z siendo un radical de dopamina, junto con excipientes y vehículos farmacéuticamente aceptables.
Otro aspecto de la invención se refiere a estructuras de fórmula (II) en donde Z es un radical peptídico del péptido HD-Ala-D-NMePhe-D-Nal(2)-D-Val-D-Leu-D-Lys-D-Lys-NH2 (SEQ ID NO: 3) para su uso en el tratamiento de la 40 enfermedad de Alzheimer.
El uso del péptido H-D-Ala-D-NMePhe-D-Nal(2)-D-Val-D-Leu-D-Lys-D-Lys-NH2 (SEQ ID NO: 3) para el tratamiento del Alzheimer se describe en el documento WO2008050133. Este aspecto también puede formularse como el uso de construcciones de fórmula (II) en donde Z es un radical peptídico del péptido H-D-Ala-D-NMePhe-D-Nal(2)-D-Val45 D-Leu-D-Lys-D-Lys-NH2 (SEQ ID NO: 3), para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, este aspecto también se refiere a un método para el tratamiento y/o la profilaxis de un mamífero, incluyendo un ser humano, que padece o que es susceptible de desarrollar enfermedad de Alzheimer; este método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (II), con Z siendo un radical peptídico del péptido H-D-Ala-D-NMePhe-D-Nal(2)-D-Val-D-Leu-D-Lys-D-Lys
50 NH2, junto con excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Otro aspecto de la invención se refiere a estructuras de fórmula (II) en donde Z es un anticuerpo para su uso en el tratamiento del cáncer. El uso de anticuerpos tales como bevacizumab para el tratamiento del cáncer se describe en el documento EP973804, pero para el caso de cáncer de cerebro (por ejemplo: glioblastoma), el transporte de este 55 anticuerpo a través de la BHE está lejos de ser óptimo. Esto puede formularse también como el uso de construcciones de formula (II) en donde Z es un anticuerpo para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. Por lo tanto, este aspecto también se refiere a un método para el tratamiento y/o la profilaxis de un mamífero, incluyendo un ser humano, que padece o que es susceptible de desarrollar cáncer; este método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de formula (II), con Z siendo
60 un anticuerpo, junto con diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Otro aspecto de la invención se refiere a estructuras de fórmula (II) en donde Z es una nanopartícula de óxido de hierro superparamagnético (nanopartícula SPION), un complejo de gadolinio o manganeso, para el uso como agente de contraste en un método de diagnóstico para la formación de imágenes por resonancia magnética. Esta técnica se
utiliza para la localización e identificación de tumores malignos, metástasis de estos o recurrencias. También se utiliza para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Este aspecto también puede formularse como el uso de una construcción de fórmula (II) en donde Z es una nanopartícula de óxido de hierro superparamagnético (nanopartícula SPION), un complejo de gadolinio o manganeso, para la preparación de un agente de contraste para
5 un método de formación de imágenes por resonancia magnética. Preferentemente, Z es una nanopartícula de óxido de hierro superparamagnético (nanopartícula SPION).
También se considera parte de la invención un método para el diagnóstico de una enfermedad que comprende administrar a un mamífero, incluyendo un ser humano, que necesite tal diagnóstico, una cantidad terapéuticamente
10 eficaz de la construcción de fórmula (II) en la que Z es una nanopartícula de óxido de hierro superparamagnético, un complejo de gadolinio o manganeso, junto con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables y/o aceptables para el diagnóstico, para generar una imagen mediante formación de imágenes por resonancia magnética, y hacer un diagnóstico utilizando esta imagen.
15 La expresión “agente de contraste” se refiere a agentes que potencian la visibilidad de determinadas estructuras, que de otra forma serían difíciles de ver durante la exploración. Estos agentes se utilizan para la inyección en el sistema vascular hasta una presentación local.
Otro aspecto de la invención se refiere a estructuras de fórmula (II) en donde Z es un radical de un compuesto
20 fluorescente para su uso como una sonda fluorescente en un método de formación de imágenes utilizando microscopía de dos fotones, obteniendo la formación de imágenes in vivo de organismos vivos de un modo no invasivo, que sirve como una herramienta de diagnóstico. Este aspecto también puede formularse como el uso de una construcción de fórmula (II) en donde Z es un compuesto fluorescente para la preparación de una sonda fluorescente para un método de formación de imágenes, por ejemplo, utilizando microscopía de dos fotones. Los
25 ejemplos de compuestos fluorescentes adecuados son 5(6)-carboxifluoresceína, rojo Texas, rodamina o puntos cuánticos. Preferentemente, el compuesto fluorescente es 5(6)-carboxifluoresceína o puntos cuánticos.
La invención también se refiere a un método para el diagnóstico de una enfermedad que comprende administrar a un mamífero, incluyendo un ser humano, que necesite tal diagnóstico, una cantidad terapéuticamente eficaz de la
30 construcción de fórmula (II) en donde Z es 5(6)-carboxifluoresceína o un punto cuántico, junto con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables y/o aceptables para el diagnóstico, para la generación de una imagen utilizando microscopía de dos fotones y el diagnóstico utilizando esta imagen.
La invención también se refiere a un método para el diagnóstico de una enfermedad, que comprende administrar a
35 un mamífero, incluyendo un ser humano, que necesite tal diagnóstico, una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de fórmula (II) en donde Z es un anticuerpo con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables y/o aceptables, para el diagnóstico por un método de formación de imágenes.
Los compuestos peptídicos de fórmula (I) y las construcciones transportador-carga de fórmula (II) pueden generarse
40 de forma completa o parcial mediante síntesis química. Los aminoácidos necesarios para la preparación de compuestos de fórmula (I) están disponibles de forma comercial. Los compuestos de fórmula (I) y la construcción de fórmula (II) pueden prepararse fácilmente, por ejemplo mediante síntesis en fase líquida o, preferentemente, mediante síntesis de péptidos en fase sólida, para lo cual existen varios procedimientos publicados (ver también M. Amblard, et al., "Methods and protocols of modern solid-phase peptide synthesis. Molecular Biotechnology 2006, Vol.
45 33, pág. 239-254). Los compuestos de fórmula (I) o las construcciones de fórmula (II) también pueden prepararse mediante cualquier combinación de síntesis en fase líquida y/o síntesis en fase sólida. Por ejemplo, sintetizando el cuerpo del transportador a través de síntesis en fase sólida y, posteriormente, eliminando los grupos protectores en solución. La unión de la carga al transportador puede realizarse en fase sólida o en solución. En los ejemplos se divulgan con más detalle el transportador particular y la unión a las cargas específicas.
50 Otro aspecto de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de las construcciones transportador-carga de fórmula (II) como se define anteriormente, en donde Z es un radical de una sustancia biológicamente activa, junto con cantidades apropiadas de diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
55 La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” como se utiliza en el presente documento se refiere a una cantidad de un compuesto que, cuando se administra, es suficiente para prevenir el desarrollo de, o aliviar en algún grado, uno o más síntomas de la enfermedad que se trata. La dosis particular de compuesto administrada de acuerdo con la presente invención se determinará, por supuesto, por las circunstancias particulares que rodean el caso,
60 incluyendo el compuesto administrado, la vía de administración, la afección particular a tratar y consideraciones similares.
La expresión “composición farmacéutica” se refiere a una mezcla de un compuesto descrito en el presente documento con otros componentes químicos, tales como diluyentes o vehículos. La composición farmacéutica
facilita la administración del compuesto a un organismo.
La expresión “excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables” se refiere a un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable. Cada componente debe ser farmacéuticamente aceptable en el sentido de
5 ser compatible con los otros ingredientes de la composición farmacéutica. Además, debe ser adecuado para su uso en contacto con tejidos u órganos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, inmunogenicidad, u otros problemas o complicaciones, acorde con una proporción beneficio/riesgo.
Una composición que comprende una construcción de acuerdo con la presente invención puede administrarse sola o 10 en combinación con otros tratamientos, ya sea de forma simultánea o secuencial, dependiendo de la afección a tratar.
Para finalizar, también forman parte de la invención las composiciones con fines diagnósticos, a las que se las ha llamado agente de contraste o sondas fluorescentes, dependiendo del radical Z de la construcción de fórmula (II). 15 Estas composiciones comprenden una cantidad eficaz de las construcciones transportador-carga de fórmula (II) como se define anteriormente, en donde Z es un radical de una sustancia para su uso en un método de diagnóstico para IRM o espectroscopia de dos fotones, siendo esta sustancia incapaz de cruzar la BHE por sí misma, junto con cantidades apropiadas de excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables y/o aceptables para el diagnóstico.
20 La expresión “aceptables para el diagnóstico” se refiere a los excipientes o vehículos adecuados para su uso en la tecnología de diagnóstico. No deben afectar de forma adversa a la estabilidad, seguridad o eficacia de la composición. En general, los excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables y/o aceptables para el diagnóstico son medios estériles fisiológicamente aceptables, es decir, soluciones acuosas isotónicas.
25 Las composiciones de la presente invención pueden administrarse en una forma parenteral adecuada para inyección, infusión o implantación en el cuerpo.
En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un kit que comprende en un recipiente el agente de contraste de acuerdo con la presente invención, junto con instrucciones para su uso en la formación de imágenes 30 por resonancia magnética para diagnóstico.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un kit que comprende en un recipiente la sonda fluorescente de acuerdo con la presente invención, junto con instrucciones para su uso en un método de diagnóstico mediante microscopía de dos fotones.
35 En toda la descripción y las reivindicaciones no se pretende que la palabra “comprende” y las variaciones de la palabra, excluyan otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Además, la palabra “comprende” abarca el caso de “que consiste en”. Los objetivos, ventajas y características adicionales de la invención se harán evidentes para los expertos en la materia después del examen de la descripción, o pueden aprenderse mediante la
40 práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferentes descritas en el presente documento.
Ejemplos
45 Los aminoácidos protegidos, las manipulaciones y las resinas los suministraron: Luxembourg Industries (Tel-Aviv, Israel), Neosystem (Estrasburgo, Francia), Calbiochem-Novabiochem AG (Laufelfingen, Suiza), Bachem AG (Bubendorf, Suiza) o Iris Biotech (Marktredwitz, Alemania). En la Tabla 1 se resumen otros reactivos y disolventes utilizados.
50 Tabla 1 Proveedores y reactivos comerciales utilizados. El DCM se pasó a través de una columna de Al2O3. La DMF se almacenó sobre tamices moleculares de 4A y el nitrógeno se burbujeó para eliminar agentes volátiles.
Proveedor comercial
Reactivos y disolventes
Albatros Chem. Inc.
N-hidroxibenzotriazol (HOBt)
Aldrich
L-dopa, piperidina, ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (ACH), lecho mixto DOWEX MR-3, rojo disperso I, 1,8-diazabiciclo-[5.4.0]-undec-7-eno (DBU), bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT), triisopropilsilano (TIS), 1,2-etanoditiol (EDT), bórax, ácido bórico, ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico hidratado (MES), N-etil-N’-(3 dimetilaminopropil)carbodiimida, 5(6)-carboxifluoresceína, HEPES, amarillo lucifer, NaCl, KCI, CaCl2, MgCl2, NaHCO3, glucosa, HBSS, piridoxal 5’-fosfato, NalO4 2-iminotiolano, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), ditiotreitol (DTT), tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0), fenilsilano, rodamina b, cloruro de tritilo, ditioetilcarbamato de sodio, ácido 6maleimidohexanoico
Proveedor comercial
Reactivos y disolventes
Applied GL Biochem Shangai
1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt)
Cell applications
Células endoteliales de cerebro bovino
Charles river
Ratas wistar
Corning Costar
Transpocillos (0,33 cm2; tamaño de poro 0,4 µm)
Jescuder
NaOH
KaliChemie
Ácido trifluoroacético (TFA)
Lonza
Medio de cultivo
Merck
Tamices moleculares de 4 Å, capas de cromatografía en capa fina (TLC)
Micromod
Nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (79-02-201)
Millipore
Filtros de difluoruro de polivinilideno (PVDF) 0,45 μm
Novabiochem
benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio hexafluorofosfato (PyBOP), N-hidroxisuccinimida (NHS), resina de hidroxilamina Novatag™
Scharlau
diclorometano (DCM), dimetilformamida (DMF), MeOH, terc-butilmetil éter
SDS
acetona, MeCN, tolueno
Thermo Scientific
Flotadores para dispositivos de diálisis Slide-A-Lizer MINI
GE-Healthcare
Columnas de desalado Nap-5, Vivaspin 500 LPM (límite de peso molecular) 50 kDa
Iris Biotech
Todos los aminoácidos excepto que se especifique otra cosa.
Farmacia del hospital Vall d’Hebron
Bevacizumab (Avastin®)
Consideraciones generales acerca de la síntesis. La elongación de los péptidos en fase sólida y otras manipulaciones en fase sólida se llevaron a cabo de forma manual en jeringas de polipropileno equipadas con un disco poroso de polietileno. Los disolventes y los reactivos solubles se eliminaron mediante succión. Los lavados
5 entre las distintas etapas de síntesis se llevaron a cabo con dimetilformamida (DMF) (5 x 0,5 min) y diclorometano (DCM) (5 x 0,5 min) utilizando cada vez 10 ml de disolvente/gramo de resina.
Pruebas de identificación. La prueba utilizada para la identificación y control de la síntesis fue la siguiente: A) ensayo colorimétrico de Kaiser para la detección de aminas primarias unidas a fase sólida. (E. Kaiser et al., "Color test for 10 detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides"; Anal. Biochem. 1970, vol. 34, pág. 595-598); la prueba de Kaiser se realizó lavando una pequeña muestra de resina (aprox. 1 mg) en DMF (4 x 1 min) y DCM (4 x 1 min). Se añadieron a la resina tres gotas de reactivo A y seis gotas de reactivo B, la mezcla resultante se calentó a 110 °C durante 3 minutos. La resina azul indica la presencia de esferas de aminas primarias libres. B) prueba de p-nitrofeniléster para aminas secundarias unidas a fase sólida (A. Madder et al., "A novel sensitive 15 colorimetric assay for visual detection of solid-phase bound amines". Eur. J. Org. Chem. 1999, pág. 2787-2791). El ensayo de p-nitrofeniléster se realiza lavando en primer lugar una muestra pequeña de la resina (aprox. 1 mg) con DMF (4x1 minutos) y DCM (4x1 minutos). Se añaden a la resina diez gotas de solución de reactivo (p-nitrofeniléster de rojo disperso 1 0,002 M en MeCN) y la mezcla resultante se calentó a 70 °C durante 10 minutos. Después, se decanta la solución y la resina se lava con DMF hasta obtener un sobrenadante transparente. Las esferas de resina
20 de color rojo indican la presencia de aminas secundarias.
Protocolos utilizados durante la síntesis de las construcciones de fórmula (I) y (II). Las construcciones se sintetizaron a una escala de 200 μmol utilizando los siguientes métodos y protocolos:
25 Acondicionamiento inicial de la resina. La resina Fmoc-Rink amida p-MBHA se acondicionó lavando con DCM (5 x 30 s) y DMF (5 x 30 s) seguido de una solución de piperidina al 20 % en DMF (2 x 1 min y 1 x 10 min) para eliminar el grupo Fmoc. Para finalizar, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s).
Eliminación del grupo Fmoc. La eliminación del grupo protector 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) se realizó con
30 piperidina al 20 % (p/p) en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (al 5 %, 5 %, 20 %, 70 %) (2 x 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias (prolina).
Métodos de acoplamiento: 35
Acoplamiento del primer aminoácido en la resina Rink amida p-MBHA: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido N-protegido (4 eq) y TBTU (4 eq) en DMF seguido de DIEA (8 eq). Se dejó la muestra reaccionar con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión; la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser.
5 Acoplamiento del segundo aminoácido y de los siguientes aminoácidos en la resina Rink amida p-MBHA: el procedimiento fue el mismo que para el primero, excepto en que los acoplamientos sobre la prolina se realizaron utilizando 4 eq de aminoácido N-protegido, 4 eq de PyBOP, 12 eq de HOAt y 12 eq de DIEA, la reacción se llevó a cabo en DMF y se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente (3 x 1,5 h). La eliminación del grupo
10 Fmoc de las prolinas, así como el grado de acoplamiento, se comprobó mediante la prueba de p-nitrofeniléster.
Acoplamiento a la carga (Z): dependiendo de la naturaleza de la carga, se unirá al transportador de BHE en fase sólida o en solución.
15 Acoplamiento de la carga en fase sólida: dependiendo de la naturaleza de la carga, se unirá al transportador de BHE a través de distintos tipos de enlaces químicos. Para cargas con un grupo funcional COOH (por ejemplo L-dopa, 5(6)-carboxifluoresceína) el acoplamiento de la carga en el transportador de BHE se realizó en fase sólida: se utilizó el transportador de BHE provisto de un grupo NH2 y se hizo reaccionar durante 2 h con 4 eq de carga-COOH, utilizando 4 eq de PyBOP y 12 eq de HOAt como reactivos de acoplamiento, y 12 eq de DIEA como una base en
20 DMF. La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió dos veces más. El grado de acoplamiento se comprobó mediante la prueba de p-nitrofenilo.
Etapa de escisión final:
25 Se llevó a cabo tratando resina con TFA (al 94 %), H2O (al 2,5 %), EDT (al 2,5 %) y TIS (al 2,5 %) (1 x 1 h). Se añadió terc-butil éter al producto obtenido y la mezcla se centrifugó (2 x 8 min). El sobrenadante se descartó y el sedimento se resuspendió en una mezcla de H2O y MeCN (1:1). El producto se filtró y se liofilizó.
30 Acoplamiento de la carga en solución:
Etapa de escisión de la resina:
Se llevó a cabo tratando resina con TFA (al 94 %), H2O (al 2,5 %), EDT (al 2,5 %) y TIS (al 2,5 %) (1 x 1 h). Se
35 añadió terc-butil éter al producto obtenido y la mezcla se centrifugó (2x8 min). El sobrenadante se descartó y el sedimento se resuspendió en una mezcla de H2O y MeCN (1:1). El producto se filtró y se liofilizó.
El acoplamiento de la carga con el grupo funcional COOH (por ejemplo puntos cuánticos, nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético) en solución se realizó utilizando el siguiente protocolo: se añadieron N-(3
40 dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida 0,01 mmol (2 mg) y N-hidroxisuccinimida 0,025 mmol (3 mg) a 4 ml de una solución de puntos cuánticos o a nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (2 mg) en MES (50 mM, pH 6,5), se dejó reaccionar la mezcla durante 30 minutos y se añadieron 0,08 μmoles del transportador (0,12 mg). Se dejó reaccionar la mezcla durante 24 h con agitación suave. El péptido en exceso y los reactivos sin reaccionar se eliminaron mediante diálisis a 4 °C frente a agua durante 36 h. El agua se cambió cada 12 horas.
45 El acoplamiento de las cargas de anticuerpo:
El ligamiento del anticuerpo al transportador de BHE pudo realizarse mediante una de las siguientes tecnologías.
50 En todos los casos, los excipientes se eliminan de la formulación de anticuerpo (es decir, formulación de bevacizumab (Bv)) utilizando cromatografía de exclusión por tamaño seguida de una etapa de concentración utilizando filtración ultracentrífuga para obtener una solución de 20 mg/ml. Esta solución se denominará como "BvW".
55 Tec. 1 -Conjugación al extremo N
Se diluyeron 25 μl de solución de anticuerpo (es decir, BvW) (3,3·10-9 mol, 5,0·10-4 g) con 75 μl de tampón fosfato 25 mM pH 6,5. Se disolvió piridoxal 5’-fosfato (PLP) (298 eq, 1,0·10-7 mol, 2,5·10-5 g) en 100 μl de tampón fosfato 25 mM, y el pH se llevó a 6,5 con HCl 1 M. La solución de BvW se mezcló con la solución de PLP y se incubó a
60 20 °C durante 48 h. Se utilizó una columna de exclusión por tamaño Nap-5 para separar las moléculas pequeñas en exceso del anticuerpo derivatizado, utilizando tampón fosfato 25 mM pH 6,2. El anticuerpo se concentró hasta 100 μl utilizando Vivaspin 500 con LPM de 50 kDa y se lavó dos veces con tampón fosfato 25 mM pH 6,2. El péptido que portaba un grupo funcional aminoxi (60 eq, 2,0·10-7 mol) se disolvió en 50 μl de tampón fosfato 25 mM y el pH se llevó a 6,2 con HCl 1 M acuoso. El anticuerpo transaminado procedente de la columna Nap-5 se mezcló con la
solución de péptido y con 50 μl de una solución de anilina 4·10-3 M (60 eq, 2,0·10-7 mol, 1,9·10-5 g); la mezcla se dejó reaccionar durante 48 h. Los reactivos en exceso se eliminaron utilizando una columna de exclusión por tamaño Nap-5 con tampón fosfato 25 mM pH 6,2.
5 Tec. 2 -Conjugación de hidratos de carbono
Se diluyeron 25 μl de solución de anticuerpo (es decir, BvW) (3,3·10-9 mol, 5,0·10-4 g) con 75 μl de PBS pH 7,2 y se mezcló con 10 μl de NalO4 0,1 M en agua (54 eq, 1,0·10-6 mol, 2,1·10-4 g). La mezcla se dejó reaccionar 2 h a 4 °C preservándola de la luz. Se utilizó una columna de exclusión por tamaño Nap-5 para separar las moléculas 10 pequeñas en exceso del anticuerpo derivatizado utilizando tampón fosfato 50 mM pH 6,2. El péptido que portaba un grupo funcional aminoxi (60 eq, 2,0·10-7 mol) se disolvió en 50 μl de tampón fosfato 25 mM y el pH se llevó a 6,2 con HCl 1 M acuoso. El anticuerpo transaminado procedente de la columna Nap-5 se mezcló con la solución de péptido y con 50 μl de una solución de anilina 4·10-3 M (60 eq, 2,0·10-7 mol, 1,9·10-5 g); la mezcla se dejó reaccionar durante 48 h. Los reactivos en exceso se eliminaron utilizando una columna de exclusión por tamaño Nap-5 con tampón
15 fosfato 25 mM pH 6,2.
Tec. 3 -Conjugación a través de lisinas
Se diluyeron 25 μl de solución de anticuerpo (es decir, BvW) (3,3·10-9 mol, 5,0·10-4 g) con 75 μl de PBS pH 7,2 y se
20 incubó con 2-iminotiolano (30 eq, 1,0·10-7 mol, 1,4·10-5 g) durante 1 h a 20 °C. Se utilizó una columna de exclusión por tamaño Nap-5 para separar el 2-iminotiolano que no reaccionó del anticuerpo tiolado, utilizando PBS pH 7,2. El péptido que portaba un grupo funcional maleimida (10 eq, 3,3·10-8 mol) se disolvió en 50 μl de PBS y se mezcló con anticuerpo oxidado. La mezcla se deja reaccionar durante 2 h a 20 °C. El péptido en exceso se elimina utilizando una columna de exclusión por tamaño Nap-5 utilizando, PBS pH 7,2.
25 Tec. 4. Reducción-alquilación de disulfuros de anticuerpo intercadenas
4.1 Reducción de disulfuros limitada:
30 4.1.A. Reducción con DTT:
La solución de anticuerpo (es decir, BvW) se diluyó (2 mgml-1, 500 μl) y se redujo de forma parcial mediante DTT (3,25 eq) en borato de sodio 0,025 M pH 8, NaCl 0,025 M, EDTA 1 mM durante 2 h a 37 °C. El exceso de DTT se purificó del anticuerpo parcialmente reducido mediante exclusión por tamaño (Nap 5, GE Healthcare, siguiendo las
35 instrucciones del fabricante). La concentración de los tioles de las cisteínas de anticuerpo producidos se determinó titulando con DTNB, dando normalmente como resultado 3,0 a 4,0 tioles/anticuerpo.
4.1.B. Reducción con TCEP
40 La solución de anticuerpo (es decir, BvW) se diluyó (2 mgml-1, 500 μl) y se redujo de forma parcial mediante TCEP (2,5 eq respectivamente) en borato de sodio 0,025 M pH 8, NaCl 0,025 M, EDTA 1 mM, durante 2 h a 37 °C. No se necesitó purificación. La concentración de los tioles de las cisteínas de anticuerpo producidos se determinó titulando con DTNB, dando normalmente como resultado 3,0 a 4,0 tioles/anticuerpo.
45 4.2 Reoxidación parcial con DTNB después de la reducción total con DTT
La solución de anticuerpo (es decir, BvW) se diluyó (2 mgml-1, 500 μl) y se redujo totalmente mediante DTT (150 eq) en borato de sodio 0,025 M pH 8, NaCl 0,025 M, EDTA 1 mM, durante 2 h a 37 °C. El exceso de DTT se purificó del anticuerpo parcialmente reducido mediante exclusión por tamaño (Nap 5, GE Healthcare, siguiendo las instrucciones
50 del fabricante). El anticuerpo completamente reducido se enfrió hasta 0 °C y después se trató con 2,0 equivalentes de DTNB (0 °C, 20 min). Sin purificación adicional, el anticuerpo se alquiló siguiendo el protocolo anterior (alquilación 1).
4.3 Alquilación
55 El anticuerpo parcialmente reducido se alquiló con 1,1 equiv. molares de 5(6)-carboxifluoresceína-L-Lys(maleimido)D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 o rodamina b-L-Lys(maleimido)D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2/tiol. La reacción de activación se realizó a 0 °C durante 30 min. Se utilizó cisteína (1 mM final) para agotar cualquier exceso de 5(6)
60 carboxifluoresceína-L-lys(maleimido)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 o de rodamina b-L-Lys(maleimido)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-DThr-NH que no haya reaccionado. El exceso de péptido se eliminó del anticuerpo parcialmente reducido mediante exclusión por tamaño (Nap 5, GE Healthcare, siguiendo las instrucciones del fabricante).
La concentración de anticuerpo se cuantificó utilizando Nanodrop (coef. de ext. molar = 222714 M-1 cm-1).
Caracterización de productos:
5 La identidad de los distintos compuestos sintetizados con fórmula I y II (transportador o combinación de transportador-carga) se confirmó utilizando espectrometría de masas “espectrometría de masas por desorción/ionización de láser asistida por matriz” (MALDI) (Instrumento: MALDI tiempo de vuelo (TOF) Voyager DE RP PE Biosystem) o HPLC-MS (Instrumento: Waters modelo Alliance 2796, bomba cuaternaria, detector de UV/Vis modelo 2487, ESI-MS modelo Micromass ZQ y programa informático Masslynx versión 4.0) utilizando un columna
10 Symmetry 300 C18 300 A (150 x 3,9 mm x 5 μm), utilizando un flujo de 1 ml/min; disolventes: A: H2O con ácido fórmico al 0,1 %; B: MeCN con ácido fórmico al 0,07 %. Su pureza se comprobó mediante HPLC de fase inversa utilizando una columna Symmetry C18 (150 x 4,6 mm x 5 μm, 100 A, Waters) y una columna Sunfire C18 (100 x 4,6 mm x 3,5 μm, 100 A, Waters), flujo 1 ml/min; disolventes: A: H2O con TFA al 0,045 %; B: MeCN con TFA al 0,036 %, instrumento: Waters modelo Alliance 2695 constituido por una bomba cuaternaria, un detector de serie de
15 diodos modelo 966, controlado por el programa informático Millenium versión 3.5.
Las construcciones que incluían un anticuerpo se caracterizaron utilizando espectrometría de masas “espectrometría de masas por desorción/ionización de láser asistida por matriz” (MALDI) (Instrumento: MALDI tiempo de vuelo (TOF) Voyager DE RP PE Biosystem), SDS page.
20 La electroforesis en SDS-PAGE se llevó a cabo utilizando el sistema de BioRad (celda Miniprotean), gel en Tris al 7,5 %, Tris 25 mM, glicina 192 mM, tampón de corrida de SDS al 0,1 %). Los pesos moleculares de las proteínas se aproximaron mediante comparación con un marcador de proteínas (Marcadores de Proteína Perfect 15-150 kDa de Novagen). Los geles se visualizaron mediante tinción de coomassie (solución de tinción: AcOH al 10 %, azul brillante
25 0,25 g; solución de descoloración: MeOH al 20 %, AcOH glacial al 3 %, en agua). Se utilizó secuenciación de Edman (primeros 4 ciclos) para cuantificar la cantidad de péptidos conjugados en el extremo N.
Los compuestos se purificaron mediante HPLC utilizando una columna Symmetry C18 (100 x 30 mm x 5 μm, 100 A, Waters), flujo 15 ml/min, disolventes: A: H2O con TFA al 0,1 %; B: MeCN con TFA al 0,1 %, Instrumento: sistema
30 Waters con una bomba cuaternaria, autoinyector Simple Manager 2700, detector de UV/Vis modelo 2487 y un colector de fracciones II, controlado por el programa informático Masslynx versión 3.5.
Ejemplos
35 Ejemplo 1: Preparación de H-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 1)
La síntesis se realizó en una escala de 200 μmol. Para el acoplamiento del primer aminoácido en la resina Fmoc-Rink amida p-MBHA se utilizó el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el derivado del 40 primer aminoácido protegido (Fmoc-D-Thr(tBu)-OH, 4 eq, 800 μmoles, 318 mg) y el agente de acoplamiento TBTU (4 eq, 800 μmoles, 257 mg) disueltos en DMF (1-3 ml/g de resina), seguido de la adición de DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 μI). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con piperidina al 20 % (p/p) en DMF (p/p)
45 utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de 10 minutos.
El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido se acopló al primer aminoácido anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-DHis(Trt)-OH, 4 eq 800 μmoles, 496 mg), TBTU (4 eq, 800 μmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina),
50 posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 μl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p) utilizando dos tratamientos de 1 min y 1 tratamiento de 10 minutos.
55 El derivado de aminoácido protegido del tercer aminoácido se acopló al segundo aminoácido ya anclado a la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-DArg(Pbf)-OH, 4 eq, 800 μmoles, 519 mg), TBTU (4 eq, 800 μmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 μl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual
60 intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p) utilizando dos tratamientos de 1 min y 1 tratamiento de 10 minutos.
El derivado de aminoácido protegido del cuarto aminoácido se acopló al tercer aminoácido ya anclado a la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-D-Pro-OH, 4 eq, 800 μmoles, 270 g), TBTU (4 eq, 800 μmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 μl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual
5 intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p) utilizando dos tratamientos de 1 min y 1 tratamiento de 10 minutos, y el tratamiento con DBU, tolueno, piperidina, DMF (al 5 %, 5 %, 20 %, 70 %) (2 x 5 min), para asegurar la eliminación del grupo Fmoc.
10 El derivado de aminoácido protegido del quinto aminoácido se acopló al cuarto aminoácido ya anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-D-Pro-OH, 4 eq 800 μmoles, 270 g), PyBOP (4 eq, 800 μmoles, 416 mg), HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (12 eq, 2,4 mmol, 408 μl). La mezcla se dejó reaccionar con
15 agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). La reacción de acoplamiento se llevó a cabo dos veces en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de p-nitrofeniléster. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p) utilizando dos tratamientos de 1 min y 1 tratamiento de 10 minutos, y el tratamiento con DBU, tolueno, piperidina, DMF (al 5 %, 5 %, 20 %, 70 %) (2 x 5 min), para asegurar la
20 eliminación del grupo Fmoc.
El derivado de aminoácido protegido del sexto aminoácido se acopló al quinto aminoácido ya anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-D-Met-OH, 4 eq, 800 μmoles, 297 g), PyBOP (4 eq, 800 μmoles, 416 mg) HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg) disuelto en DMF 25 (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (12 eq, 2,4 mmol, 408 μl). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). La reacción de acoplamiento se llevó a cabo dos veces en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de p-nitrofeniléster. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p) utilizando dos tratamientos de 1 min y 1 tratamiento de 10
30 minutos.
El derivado de aminoácido protegido del séptimo aminoácido se acopló al sexto aminoácido ya anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-DTrp(Boc)-OH, 4 eq, 800 μmoles, 421 mg), TBTU (4 eq, 800 μmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina),
35 posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 μl). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p) utilizando dos tratamientos de 1 min y 1 tratamiento de 10 minutos.
40 El derivado de aminoácido protegido del octavo aminoácido se acopló al séptimo aminoácido ya anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-DSer(tBu)-OH, 4 eq, 800 μmoles, 307 mg), TBTU (4 eq, 800 μmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 μl). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual
45 intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p) utilizando dos tratamientos de 1 min y 1 tratamiento de 10 minutos.
50 El derivado de aminoácido protegido del noveno aminoácido se acopló al octavo aminoácido ya anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-D-Pro-OH, 4 eq, 800 μmoles, 270 mg), TBTU (4 eq, 800 μmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 μl). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM
55 (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante la reacción colorimétrica de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p) utilizando dos tratamientos de 1 min y 1 tratamiento de 10 minutos, y el tratamiento con DBU, tolueno, piperidina, DMF (al 5 %, 5 %, 20 %, 70 %) (2 x 5 min), para asegurar la eliminación del grupo Fmoc.
60 El derivado de aminoácido protegido del décimo aminoácido se acopló al noveno aminoácido ya anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-D-Val-OH, 4 eq, 800 μmoles, 271 mg), PyBOP (4 eq, 800 μmoles, 416 mg) HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg), disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (12 eq, 2,4 mmol, 408 μl). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con
DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). La reacción de acoplamiento se llevó a cabo dos veces en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de p-nitrofeniléster. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p) utilizando dos tratamientos de 1 min y 1 tratamiento de 10 minutos.
5 El derivado de aminoácido protegido del undécimo aminoácido se acopló al décimo aminoácido ya anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-D-Trp(Boc)-OH, 4 eq, 800 μmoles, 421 mg), TBTU (4 eq, 800 μmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 μl). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual
10 intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p) utilizando dos tratamientos de 1 min y 1 tratamiento de 10 minutos.
15 El derivado de aminoácido protegido del duodécimo aminoácido se acopló al undécimo aminoácido ya anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-D-Pro-OH, 4 eq, 800 μmoles, 270 mg), TBTU (4 eq, 800 μmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 μl). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM
20 (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p) utilizando dos tratamientos de 1 min y 1 tratamiento de 10 minutos, y el tratamiento con DBU, tolueno, piperidina, DMF (al 5 %, 5 %, 20 %, 70 %) (2 x 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc.
25 La etapa de escisión se realizó tratando la resina con una mezcla de TFA (al 94 %), H2O (al 2,5 %), EDT (al 2,5 %) y TIS (al 1%) (1 x 1h). Se añadió terc-butilmetil éter al producto obtenido y la mezcla se centrifugó (2 x 8 min). Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en una mezcla de H2O y MeCN (1:1). El producto se filtró y se liofilizó.
30 Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 al 100 % en H2O en 8 minutos, utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; tiempo de retención: 5,3 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M + H]+: 1489,6; rendimiento (síntesis y purificación): el 8,3 %.
35 Ejemplo 2: Preparación de H-Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 2)
El procedimiento del Ejemplo 1 se repitió hasta el acoplamiento del duodécimo aminoácido.
40 Para el acoplamiento del resto glicina al transportador de BHE anclado en la resina se utilizó el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina Fmoc-Gly-OH (4 eq, 800 μmoles, 238 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq, 800 μmoles, 416 mg) y HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg), seguido de la adición de 12 eq de DIEA (2,4 mmol, 408 μl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió dos
45 veces en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se comprobó utilizando la prueba de p-nitrofeniléster. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min, un tratamiento de 10 minutos.
La etapa de escisión se realizó tratando la resina con una mezcla de TFA (al 94 %), H2O (al 2,5 %), EDT (al 2,5 %) y
50 TIS (al 1%) (1 x 1h). Se añadió terc-butilmetil éter al producto obtenido y la mezcla se centrifugó (2 x 8 min). Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en una mezcla de H2O y MeCN (1:1). El producto se filtró y se liofilizó.
Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN desde el 0 al 100 % en H2O en 8
55 minutos, utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; tiempo de retención: 4,3 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M + H]+: 1849,3; rendimiento (síntesis y purificación): el 4,7 %.
Ejemplo 3: Preparación de H-Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr60 aminoxi (SEQ ID NO: 2-Aminoxi)
El procedimiento del Ejemplo 2 se repitió hasta el acoplamiento del trigésimo aminoácido, utilizando resina de hidroxilamina de Novabiotag™ con una sustitución de 0,56 mmol/g.
La etapa de escisión se realizó tratando la resina con una mezcla de TFA (al 94 %), H2O (al 2,5 %) y TIS (al 2,5 %) (1 x 2 h). Se añadió terc-butilmetil éter al producto obtenido y la mezcla se centrifugó (2 x 8 min). El sobrenadante se retiró y el sedimento se resuspendió en una mezcla de H2O y MeCN (1:1). El producto se filtró y se liofilizó.
5 Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 17 al 23 % en H2O en 8 minutos utilizando, una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; tiempo de retención: 6,4 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M + H]+: 1663,9;
Ejemplo 4: Preparación de 5(6)-carboxifluoresceína-L-Lys(Aminoxi)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D10 Pro-D-Pro-D-Ara-D-His-D-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 1 para la incorporación de dos cargas)
El procedimiento del Ejemplo 1 se repitió hasta el acoplamiento del duodécimo aminoácido.
Para el acoplamiento del resto lisina al transportador de BHE anclado en la resina se utilizó el siguiente protocolo: se
15 añadieron de forma secuencial a la resina Fmoc-Lys(Boc2-AoA)-OH (4 eq, 800 μmoles, 513 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq, 800 μmoles, 416 mg) y HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg), seguido de la adición de 12 eq de DIEA (2,4 mmol, 408 μl). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al
20 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de 10 minutos.
Para el acoplamiento de la (5)6-carboxifluoresceína al transportador de BHE anclado en la resina se utilizó el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina rodamina b (4 eq, 800 μmoles, 383 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq, 800 μmoles, 416 mg) y HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg), seguido de la adición de
25 12 eq de DIEA (2,4 mmol, 408 μl). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min, un tratamiento de 10 minutos.
30 La etapa de escisión se realizó tratando la resina con una mezcla de TFA (al 95 %), H2O (al 2,5 %) y TIS (al 2,5 %) (1 x 2 h). Se añadió terc-butilmetil éter al producto obtenido y se centrifugó la mezcla (2 x 8 min). Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en una mezcla de H2O y MeCN (1:1). El producto se filtró y se liofilizó.
35 Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 al 100 % en H2O en 8 minutos, utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; tiempo de retención: 5,0 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M + H]+: 2021,9;
Ejemplo 5: Preparación de maleimida-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D40 Thr-NH2 (SEQ ID NO: 1 con maleimida como R1)
El procedimiento del Ejemplo 1 se repitió hasta el acoplamiento del duodécimo aminoácido.
Para el acoplamiento de la maleimida al transportador de BHE anclado en la resina se utilizó el siguiente protocolo:
45 se añadieron de forma secuencial a la resina ácido 6-maleimidohexanoico (4 eq, 800 μmoles, 169 mg) en DMF (13 ml/g de resina), PyBOP (4 eq, 800 μmoles, 416 mg) y HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg), seguido de la adición de 12 eq de DIEA (2,4 mmol, 408 μl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser.
50 La etapa de escisión se realizó tratando la resina como una mezcla de TFA (al 95 %), H2O (al 2,5 %) y TIS (al 2,5 %) (1 x 2 h). Se añadió terc-butilmetil éter al producto obtenido y se centrifugó la mezcla (2 x 8 min.). El sobrenadante se retiró y el sedimento se resuspendió en una mezcla de H2O y MeCN (1:1). El producto se filtró y se liofilizó.
55 Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: el gradiente lineal de MeCN del 0 al 100 % en H2O en 8 minutos, utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; tiempo de retención: 5,3 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M + H]+: 2172,7;
Ejemplo 6: Preparación de rodamina b-L-Lys(Maleimida)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro60 D-Ara-D-His-D-Thr-NH2 ((SEQ ID NO:1 para la incorporación de dos cargas)
El procedimiento del Ejemplo 1 se repitió hasta el acoplamiento del duodécimo aminoácido.
Para el acoplamiento del resto lisina al transportador de BHE anclado en la resina se utilizó el siguiente protocolo: se
añadieron de forma secuencial a la resina Fmoc-Lys(alloc)-HO (4 eq, 800 µmoles, 362 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq, 800 µmoles, 416 mg) y HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg), seguido de la adición de 12 eq de DIEA (2,4 mmol, 408 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se
5 controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de 10 minutos.
Para el acoplamiento de la rodamina b al transportador de BHE anclado en la resina se utilizó el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina rodamina b (4 eq, 800 µmoles, 383 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), 10 PyBOP (4 eq, 800 µmoles, 416 mg) y HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg), seguido de la adición de 12 eq de DIEA (2,4 mmol, 408 µl). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min un
15 tratamiento de 10 minutos.
Para la desprotección del grupo protector Alloc se utilizó el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (0,1 eq, 20 µmol, 23 mg) en DCM (1-3 ml/g de resina) y fenilsilano (10 eq, 2,0 mmol, 247 µl). Se dejó reaccionar la mezcla durante 15 min. El disolvente se eliminó mediante succión. La
20 desprotección se repitió dos veces en las mismas condiciones. La peptidil-resina se lava con 3 ml de dietilditiocarbamato de sodio 0,02 M.
Para el acoplamiento de la maleimida al transportador de BHE anclado en la resina se utilizó el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina ácido 6-maleimidohexanoico (4 eq, 800 µmoles, 169 mg) en DMF (1
25 3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq, 800 µmoles, 416 mg) y HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg), seguido de la adición de 12 eq de DIEA (2,4 mmol, 408 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser.
30 La etapa de escisión se realizó tratando la resina con una mezcla de TFA (al 95 %), H2O (al 2,5 %) y TIS (al 2,5 %) (1 x 2 h). Se añadió terc-butilmetil éter al producto obtenido y se centrifugó la mezcla (2 x 8 min.) Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en una mezcla de H2O y MeCN (1:1). El producto se filtró y se liofilizó.
Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 al 100 % en H2O en 8 minutos,
35 utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; tiempo de retención: 4,4 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M + H]+: 1869,1;
Ejemplo 7: Preparación de 5(6)-Carboxifluoresceína-L-Lys(Maleimida)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-MetD-Pro-D-Pro-D-Ara-D-His-D-Thr-NH2 (SEQ ID NO:1 para la incorporación de dos cargas)
40 El procedimiento del Ejemplo 1 se repitió hasta el acoplamiento del duodécimo aminoácido.
Para el acoplamiento del resto lisina al transportador de BHE anclado en la resina se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron de forma secuencial a la resina Fmoc-Lys(alloc)-OH (4 eq, 800 µmoles, 362 mg) en DMF (1-3 ml/g de
45 resina), PyBOP (4 eq, 800 µmoles, 416 mg) y HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg), seguido de la adición de 12 eq de DIEA (2,4 mmol, 408 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado del acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de 10 minutos.
50 Para el acoplamiento de (5)6-carboxifluoresceína al transportador de BHE anclado a la resina se utilizó el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina rodamina b (4 eq, 800 µmoles, 383 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq, 800 µmoles, 416 mg) y HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg), seguido de la adición de 12 eq de DIEA (2,4 mmol, 408 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente
55 se eliminó mediante succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p) utilizando dos tratamientos de 1 min, un tratamiento de 10 minutos.
60 Para la tritilación de los grupos funcionales fenol de la carboxifluoresceína se utilizó el siguiente protocolo: se añadió a la resina cloruro de tritilo (12 eq, 2,4 mmol, 223 mg). La mezcla se dejó reaccionar durante 16 h. El disolvente se eliminó mediante succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s).
Para la desprotección del grupo protector Alloc se utilizó el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a
la resina tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (0,1 eq, 20 µmol, 23 mg) en DCM (1-3 ml/g de resina) y fenilsilano (10 eq, 2,0 mmol, 247 µl). La mezcla se dejó reaccionar durante 15 min. El disolvente se eliminó mediante succión. La desprotección se repitió dos veces en las mismas condiciones. La peptidil-resina se lavó con 3 ml de dietilditiocarbamato de sodio 0,02 M.
5 Para el acoplamiento de la maleimida al transportador de BHE anclado en la resina se utilizó el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina ácido 6-maleimidohexanoico (4 eq, 800 µmoles, 169 mg) en DMF (13 ml/g de resina), PyBOP (4 eq, 800 µmoles, 416 mg) y HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg), seguido de la adición de 12 eq de DIEA (2,4 mmol, 408 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El
10 disolvente se eliminó mediante succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser.
La etapa de escisión se realizó tratando la resina con una mezcla de TFA (al 95 %), H2O (al 2,5 %) y TIS (al 2,5 %) (1 x 2 h). Se añadió terc-butilmetil éter al producto obtenido y se centrifugó la mezcla (2 x 8 min). Se retiró el
15 sobrenadante y se resuspendió el sedimento en una mezcla de H2O y MeCN (1:1). El producto se filtró y se liofilizó.
Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 al 100 % en H2O en 8 minutos, utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; tiempo de retención: 5,3 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M + H]+: 2172,7;
20 Ejemplo 8: Preparación del compuesto L-dopa-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trip-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (SEQ ID NO: con una L-dopa como carga o grupos Z)
El procedimiento del Ejemplo 1 se repitió hasta el acoplamiento del duodécimo aminoácido.
25 Para el acoplamiento de la carga (L-dopa) al transportador de BHE anclado en la resina se utilizó el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina la carga-COOH (Fmoc-L-Dopa-OH) (4 eq, 800 µmoles, 324 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq, 800 µmoles, 416 mg) y HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg), seguido de la adición de 12 eq de DIEA (2,4 mmol, 408 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual
30 intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió dos veces en las mismas condiciones. El grado del acoplamiento se controló utilizando la prueba de p-nitrofeniléster. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de 10 minutos.
35 La etapa de escisión se realizó tratando la resina con una mezcla de TFA (al 94 %), H2O (al 2,5 %) y TIS (al 1 %) (1 x 1 h). Se añadió terc-butilmetil éter al producto obtenido y se centrifugó la mezcla (2 x 8 min). Se retiró el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en una mezcla de H2O y MeCN (1:1). El producto se filtró y se liofilizó.
Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 al 100 % en H2O en 8 minutos,
40 utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; tiempo de retención: 4,51 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M + H]+: 1670,2; rendimiento (síntesis y purificación): el 3,8 %.
Ejemplo 9: Preparación del compuesto 5(6)-Carboxifluoresceína-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D45 Pro-D-Pro-D-Ara-D-His-D-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 1 con 5(6)-Carboxifluoresceína como carga o grupo Z)
El procedimiento se repitió como en el Ejemplo 1 hasta el acoplamiento del duodécimo aminoácido.
Para el acoplamiento de la carga (5)6-carboxifluoresceína al transportador de BHE anclado en la resina, se utilizó el
50 siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina la carga-COOH (5(6)-carboxifluoresceína) (4 eq, 800 µmoles, 301 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq, 800 µmoles, 416 mg) y HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg), seguido de la adición de 12 eq de DIEA (2,4 mmol, 408 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió dos veces en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se
55 controló utilizando la prueba de p-nitrofeniléster.
La etapa de escisión se realizó tratando la resina con una mezcla de TFA (al 94 %), H2O (al 2,5 %), EDT (al 2,5 %) y TIS (al 1%) (1 x 1 h). Se añadió terc-butilmetil éter al producto obtenido y se centrifugó la mezcla (2 x 8 min). Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en una mezcla de H2O y MeCN (1:1). El producto se filtró y se
60 liofilizó.
Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 al 100 % en H2O en 8 minutos, utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; tiempo de retención: 5,06 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M + H]+: 1849,3; rendimiento (síntesis y purificación):
el 4,2 %.
Ejemplo 10: Preparación de punto cuántico-Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 2 con punto cuántico como carga o grupo Z) 5 El procedimiento se repitió como en el Ejemplo 1 hasta el acoplamiento del duodécimo aminoácido.
En este ejemplo se utilizó como un espaciador entre el trasportador y la carga una molécula de glicina. La glicina se añadió al transportador anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la 10 resina el aminoácido protegido (Fmoc-Gly-OH, 4 eq, 800 µmoles, 190 mg), PyBOP (4 eq, 800 µmoles, 416 mg), HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (12 eq, 2,4 mmol, 408 µl). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). La reacción acoplamiento se llevó a cabo dos veces en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo
15 colorimétrico de p-nitrofeniléster. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de 10 minutos.
La etapa de escisión del transportador con el espaciador se realizó tratando la resina con una mezcla de TFA (al 94 %), H2O (al 2,5 %), EDT (al 2,5 %) y TIS (al 1 %) (1 x 1 h). Se añadió terc-butilmetil éter al producto obtenido, se 20 centrifugó la mezcla resultante (2 x 8 min). Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en una mezcla de H2O y MeCN (1:1). El producto se filtró y se liofilizó.
El acoplamiento del transportador equipado con la glicina espaciadora a la carga (punto cuántico) se realizó en solución, de acuerdo con el siguiente protocolo: se añadió N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodimida 0,01 mmol
25 (2 mg) y N-hidroxisuccinimida 0,025 mmol (3 mg) a 4 ml de una solución de puntos cuánticos (12 mg) en MES (50 mM, pH 6,5), se dejó reaccionar la mezcla durante 30 minutos. Después de esto se añadieron 0,08 µmoles (0,2 mg) del transportador con el espaciador de glicina. Se dejó reaccionar esta mezcla durante 24 h con agitación suave. El péptido en exceso y el reactivo que no reaccionó se eliminaron mediante diálisis a 4 ºC frente a agua durante 36 h. El agua se cambió cada 12 horas.
30 Caracterización del producto. El producto se caracterizó mediante mediciones del potencial zeta a pH 7,4. El producto carga-transportador presentó un potencial zeta de -33,8 mV (los puntos cuánticos no ligados al transportador mostraron un potencial zeta de -37,4 mV).
35 Ejemplo 11: Preparación de óxido de hierro superparamagnético de nanopartículas (SPION)-Gly-D-Pro-D-Trp-D-ValD-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 2 con SPION como carga o grupo Z).
El Ejemplo 10 se repitió hasta la etapa de escisión del transportador con el espaciador incluido.
40 La unión del transportador con un espaciador de glicina a la nanopartícula de óxido de hierro superparamagnético en solución se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo: se añadió N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida 0,01 mmol (2mg) y N-hidroxisuccinimida 0,025 mmoles (3mg) a 4 ml de una solución de nanopartículas (2mg) en MES (50 mM, pH 6,5), se dejó reaccionar durante 30 minutos y se añadieron 0,08 µmol (0,12 mg) de espaciador de glicina de transportador. Se dejó reaccionar durante 24 h en agitación suave. El péptido en exceso y los reactivos
45 que no reaccionaron se eliminaron mediante diálisis a 4 ºC frente a agua durante 36 h. El agua se cambió cada 12 horas.
Caracterización del producto. El producto se caracterizó mediante mediciones del potencial zeta a pH 7,4. El producto mostró un pospotencial Z de transportador de -31 mV (las nanopartículas no unidas al transportador 50 mostraron en un potencial zeta de -37,1 mV).
Ejemplo 12: Preparación de H-D-Ala-D-NMePhe-D-Nal(2)-D-Val-D-Leu-D-Lys-D-Lys-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 4 = SEQ ID NO: 1 con SEQ ID NO: 3 como carga o grupo Z)
55 El procedimiento se repitió como en el Ejemplo 1 hasta el acoplamiento del duodécimo aminoácido.
En este ejemplo la carga se sintetizó mediante síntesis en fase sólida de forma directa en el transportador anclado en la resina. El primer derivado de aminoácido protegido de la carga se acopló al transportador de BHE anclado en 60 la resina, utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-D-Lys(Boc)-OH, 4 eq, 800 µmoles, 375mg), PyBOP (4 eq, 800 µmoles, 416 mg), HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327mg) disuelto en DMF (1-3mUg de resina), posteriormente se añadió DIEA (12 eq, 2,4 mmol, 408 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). La reacción de acoplamiento se repitió dos veces en las mismas
condiciones. El grado de acoplamiento se comprobó utilizando el ensayo colorimétrico de p-nitrofeniléster. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min, un tratamiento de 10 minutos.
5 El derivado de aminoácido protegido de la segunda posición de la carga se acopló en el primer aminoácido de la carga anclada en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-D-Lys(Boc)-OH, 4 eq, 800 µmoles, 375 mg) y TBTU (4 eq, 800 µmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó
10 con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de 10 minutos.
El derivado de aminoácido protegido de la tercera posición de la carga se acopló al segundo aminoácido de la carga
15 anclada en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-D-Leu(Boc)-OH, 4 eq, 800 µmoles, 283 mg) y TBTU (4 eq, 800 µmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El
20 grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de 10 minutos.
El derivado de aminoácido protegido de la cuarta posición de la carga se acopló a la posición del tercer aminoácido de la carga anclada en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el
25 aminoácido protegido (Fmoc-D-Val-OH, 4 eq, 800 µmoles, 271 mg) y TBTU (4 eq, 800 µmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y
30 un tratamiento de 10 minutos.
El derivado de aminoácido protegido de la posición del quinta de la carga se acopló al cuarto aminoácido de la carga anclada en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-D-Nal(2)-OH, 4 eq, 800 µmoles, 350 mg) y TBTU (4 eq, 800 µmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1
35 3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 ml). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de 10 minutos.
40 El derivado de aminoácido protegido de la sexta posición de la carga se acopló al quinto aminoácido de la carga anclada en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-D-NMePhe-OH, 4 eq, 800 µmoles, 321 mg) y TBTU (4 eq, 800 µmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con
45 agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante la reacción colorimétrica de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de 10 minutos, y el tratamiento con DBU, tolueno, piperidina, DMF (al 5 %, 5 %, 20 %, 70 %) (2 x 5 min), para evaluar la eliminación del grupo Fmoc.
50 El derivado de aminoácido protegido de la posición séptima de la carga se acopló al sexto aminoácido de la carga anclada en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-D-Ala-OH, 4 eq, 800 µmoles, 249 mg), PyBOP (4 eq, 800 µmoles, 416 mg), HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (12 eq, 2,4 mmol, 408 µl). La mezcla
55 se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). La reacción de acoplamiento se llevó a cabo dos veces en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de p-nitrofeniléster. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de 10 minutos.
60 La etapa de escisión de la construcción carga-trasportador se realizó tratando la resina con una mezcla de TFA (al 94 %), H2O (al 2,5 %), EDT (al 2,5 %) y TIS (al 1 %) (1 x 1 h). Se añadió terc-butilmetil éter al producto obtenido y se centrifugó la mezcla (2 x 8 min). Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en una mezcla de H2O y MeCN (1:1). El producto se filtró y se liofilizó.
Caracterización de la construcción carga-transportador. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 al 100 % en H2O en 8 minutos, utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; tiempo de retención: 4,52 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M + H]+: 2387,3; rendimiento
5 (síntesis y purificación): el 9,5 %.
Ejemplo 13: Preparación de H-Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Ara-D-His-D-Thr-Anticuerpo (SEQ ID NO: 2 con un anticuerpo como carga o grupo Z, utilizando la tec. 1.
10 El Ejemplo 3 se repitió hasta la etapa de escisión. La unión del transportador con el anticuerpo se realizó siguiendo la tec. 1 de aminoxi, en solución; se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo: se diluyeron 25 µl de BvW (3,3·10-9 mol, 5,0·10-4 g) con 75 µl de tampón fosfato 25 mM pH 6,5. Se disolvió piridoxal 5’-fosfato (PLP) (298 eq, 1.0·10-7 mol, 2,5·10-5 g) en 100 µl de tampón fosfato 25 mm y el pH se llevó a 6,5 con HCl 1 M. La solución de BvW se mezcló con la solución de PLP y se incubó a 20 ºC durante 48 h. Se utilizó una columna de exclusión por tamaño
15 Nap-5 para separar las moléculas pequeñas en exceso del anticuerpo derivatizado, utilizando tampón fosfato 25 mM pH 6,2. El anticuerpo se concentró hasta 100 µl utilizando una Vivaspin 500 con LPM de 50 kDa y se lavó dos veces con tampón fosfato 25 mM pH 6,2. Se disolvió H-Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-DArg-D-His-D-Thr-aminoxi (60 eq, 2,0·10-7mol) en 50 µl de tampón fosfato 25 mM y el pH se llevó hasta 6,2 con HCl 1 M acuoso. El anticuerpo transaminado procedente de la columna Nap-5 se mezcló con la solución de péptido y
20 con 50 µl de una solución de anilina 4·10-3 M (60 eq, 2,0·10-7 mol, 1,9·10-5 g); la mezcla se dejó reaccionar durante 48 h. Los reactivos en exceso se eliminaron utilizando una columna de exclusión por tamaño Nap-5, con tampón fosfato 25 mM pH 6,2.
Los conjugados se caracterizaron mediante MALDI-TOF MS y la cantidad de péptido se cuantificó utilizando 3 ciclos 25 de secuenciación de Edman (1-2 péptidos/Ac).
Ejemplo 14: Preparación de H-Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-Anticuerpo (SEQ ID NO: 2 con un anticuerpo como carga o grupo Z) utilizando la tec. 2
30 El Ejemplo 3 se repitió hasta la etapa de escisión. La unión del transportador con el anticuerpo se realizó siguiendo la tec. 2 de aminoxi, en solución; se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo: se diluyeron 25 µl de BvW (3,3·10-9 mol, 5,0·10-4 g) con 75 µl de PBS pH 7,2, y se mezcló con 10 µl de NaIO4 0,1 M en agua (54 eq, 1,0·10-6mol, 2,1·10-4 g). Se dejó reaccionar la mezcla 2 h a 4 ºC preservando de la luz. Para separar las moléculas pequeñas en exceso del anticuerpo derivatizado se utilizó una columna de exclusión por tamaño Nap-5, utilizando
35 tampón fosfato 50 mM pH 6,2. Se disolvió H-Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-ArgD-His-D-Thr-aminoxi (60 eq, 2,0·10-7 mol, 3,4·10-4 g) en 50 µl de tampón fosfato 25 mM y el pH se llevó a 6,2 con HCl 1 M acuoso. El anticuerpo transaminado procedente de la columna Nap-5 se mezcló con la solución de péptido y con 50 µl de una solución de anilina 4·10-3 M (60 eq, 2,0·10-7mol, 1,9·10-5 g); se dejó reaccionar la mezcla durante 48 h. Los reactivos en exceso se eliminaron utilizando una columna de exclusión por tamaño Nap-5, con tampón
40 fosfato 25 mM pH 6,2.
Los conjugados se caracterizaron por MALDI-TOF MS (1-2 péptidos/Ac).
Ejemplo 15: Preparación de 5(6)-Carboxifluoresceína-L-Lys(Anticuerpo)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D45 Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 1 con 5(6)-Carboxifluoresceína y un anticuerpo como cargas
o grupos Z en el compuesto de fórmula (II)) utilizando la tec. 3
El Ejemplo 7 se repitió hasta la etapa de escisión. La unión del transportador con el anticuerpo se realizó siguiendo la tec. 3 de maleimido, en solución; se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo: se diluyeron 25 µl de BvW 50 (3,3·10-9mol, 5,0·10-4 g) con 75 µl de PBS pH 7,2, y se incubó con 2-iminotiolano (30 eq, 1,0·10-7mol, 1,4·10-5 g) durante 1 h a 20 ºC. Para separar el 2-iminotiolano que no reaccionó del anticuerpo tiolado se utilizó una columna de exclusión por tamaño Nap-5, utilizando PBS pH 7,2. Se disolvió carboxifluoresceína-L-Lys(maleimida)-D-Pro-D-TrpD-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (10 eq, 3,3·10-8 mol, 7,2·10-5 g) en 50 µl de PBS y se mezcló con el anticuerpo oxidado. Se dejó reaccionar la mezcla durante 2 h a 20 ºC. El péptido en exceso
55 se eliminó utilizando una columna de exclusión por tamaño Nap-5 utilizando PBS pH 7,2.
Los conjugados se caracterizaron por MALDI-TOF MS y por electroforesis en gel. (2 péptidos/Ac).
Ejemplo 16: Preparación de 5(6)-Carboxifluoresceína-L-Lys(Anticuerpo)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D60 Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 1 con 5(6)-Carboxifluoresceína y un anticuerpo como cargas
o grupos Z en el compuesto de fórmula (II)) utilizando la tec. 4.1.A y 4.3.
El Ejemplo 7 se repitió hasta la etapa de escisión. La unión del transportador con el anticuerpo se realizó siguiendo la tecnología de maleimido tec. 4.
Se redujo parcialmente una solución de anticuerpo (1 mgml-1, 500 µl) mediante DTT (3,25 eq, 2,2 µl, 10 mM) o TCEP (2,75 eq, 1.8 µl, 10 mM) en borato de sodio 0,025 M pH 8, NaCl 0,025 M, EDTA 1 mM, durante 2 h a 37°C. El exceso de DTT se purificó del anticuerpo parcialmente reducido mediante exclusión por tamaño (Nap 5, GE
5 Healthcare, siguiendo las instrucciones de fabricante). La concentración de los tioles de las cisteínas de anticuerpo producidos se determinó titulando con DTNB, dando como resultado normalmente 3,0 a 4,0 tioles/anticuerpo.
El anticuerpo parcialmente reducido se alquiló con 1,1 equiv. molares de 5(6)-carboxifluoresceína-L-Lys(maleimido)D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2/tiol de cisteínas del anticuerpo (4
10 eq, 5,8 µl, DMSO 10 mgml-1). La reacción de alquilación se realizó a 0 ºC durante 30 min. Se utilizó cisteína (1 mM final) para agotar cualquier exceso de 5(6)-carboxifluoresceína-L-Lys(maleimido)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 que no hubiere reaccionado. El exceso de péptido se eliminó del anticuerpo parcialmente reducido mediante exclusión por tamaño (Nap 5, GE Healthcare, siguiendo las instrucciones de fabricante).
15 La concentración del anticuerpo se cuantificó utilizando Nanodrop (coef. ext. molar = 222714 M-1 cm-1).
Caracterización del producto. El producto se caracterizó por MALDI-TOF. MS: 25827; SDS page y LC MS (1 a 3 péptidos/Ac).
20 Ejemplo 17: Preparación de rodamina b-L-Lys(Anticuerpo)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 1 con rodamina b y un anticuerpo como cargas o grupos z en el compuesto de fórmula (II)) utilizando la tec. 3.
25 El ejemplo 6 se repitió hasta la etapa de escisión. La unión del transportador con el anticuerpo se realizó siguiendo la tec. 3 de maleimido en solución; se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo: se diluyeron 25 µl de BvW (3,3·10-9 mol, 5,0·10-4 g) con 75 µl de PBS pH 7,2 y se incubó con 2-iminotiolano (30 eq, 1,0·10-7mol, 1,4·10-5 g) durante 1 h a 20 ºC. Para separar el 2-iminotiolano que no había reaccionado del anticuerpo tiolado se utilizó una columna de exclusión por tamaño Nap-5, utilizando PBS pH 7,2. Se disolvió rodamina b-L-Lys(maleimida)-D-Pro-D
30 Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (10 eq, 3,3·10-8mol, 7,4·10-5 g) en 50 µl de PBS y se mezcló con el anticuerpo oxidado. La mezcla se dejó reaccionar durante 2 h a 20 ºC. El péptido en exceso se eliminó utilizando una columna de exclusión por tamaño Nap-5 utilizando PBS pH 7,2.
Los conjugados se caracterizaron por MALDI-TOF MS y por electroforesis en gel. (5 péptidos/Ac).
35 Ejemplo 18: Preparación de rodamina b-L-Lys(Anticuerpo)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 1 con rodamina b y un anticuerpo como cargas o grupos Z en el compuesto de fórmula (II)) utilizando la tec. 4.1.A y 4.3.
40 El ejemplo 6 se repitió hasta la etapa de escisión. La unión del transportador con el anticuerpo se realizó siguiendo la tecnología tec. 4 de maleimido. Se redujo parcialmente una solución de anticuerpo (1 mgml-1, 500 µl) mediante DTT (3,25 eq, 2,2 µl, 10 mM) o TCEP (2,75 eq, 1,8 µl, 10 mM) en borato de sodio al 0,025 M pH 8, NaCl 0,025 M, EDTA 1 mM durante 2 h a 37 ºC. El exceso de DTT se purificó del anticuerpo parcialmente reducido mediante exclusión por tamaño (Nap 5, GE Healthcare siguiendo las instrucciones del fabricante). La concentración de los
45 tioles de las cisteínas de anticuerpo producidos se determinó titulando con DTNB, dando normalmente como resultado 3,0 a 4,0 tioles/anticuerpo.
El anticuerpo parcialmente reducido se alquiló con 1,1 equiv. molares de rodamina b-L-Lys(maleimido)-D-Pro-D-TrpD-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2/tiol de cisteínas de anticuerpo (DMSO 4 eq,
50 5,8 µl, 10 mgml-1). La reacción de alquilación se realizó a 0 ºC durante 30 min. Se utilizó cisteína (1 mM final) para agotar cualquier exceso de rodamina b-L-Lys(maleimido)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 que no hubiese reaccionado. El exceso de péptido se eliminó del anticuerpo parcialmente reducido mediante exclusión por tamaño (Nap 5, GE Healthcare, siguiendo las instrucciones del fabricante).
55 La concentración de anticuerpo se cuantificó utilizando a Nanodrop (coef. ext. molar = 222714 M-1 cm-1).
Caracterización del producto. El producto se caracterizó por MALDI-TOF. MS: 25827; SDS page y LC MS (2 a 3 péptidos/Ac).
60 Ejemplo 19: Preparación de rodamina b-L-Lys(Anticuerpo)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 1 con rodamina b y un anticuerpo como cargas o grupos Z en el compuesto de fórmula (II)) utilizando la tec. 4.1.B y 4.3.
El Ejemplo 6 se repitió hasta la etapa de escisión. La unión del transportador con el anticuerpo se realizó siguiendo la tecnología tec. 4 de maleimido. Se redujo de forma parcial una solución de anticuerpo (1 mgml-1, 500 µl) mediante TCEP (2,75 eq, 1,8 µl, 10 mM) en borato de sodio 0,025 M pH 8, NaCl 0,025 M, EDTA 1 mM, durante 2 h a 37 ºC. La concentración de los tioles de las cisteínas de anticuerpo producidos se determinó titulando con DTNB, dando como
5 resultado normalmente 3,5 a 4,0 tioles/anticuerpo.
El anticuerpo parcialmente reducido se alquiló con 1,1 equiv. molares de rodamina b-L-Lys(maleimido)-D-Pro-D-TrpD-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2/tiol de cisteína de anticuerpo (DMSO 4 eq, 5,8 µl, 10 mgml-1). La reacción de alquilación se realizó a 0 ºC durante 30 min. Se utilizó cisteína (1 mM final) para
10 agotar cualquier exceso de rodamina b-L-Lys(maleimido)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 que no hubiese reaccionado. El exceso de péptido se eliminó del anticuerpo parcialmente reducido mediante exclusión por tamaño (Nap 5, GE Healthcare, siguiendo las instrucciones del fabricante).
15 La concentración de anticuerpos se cuantificó utilizando Nanodrop (coef. ext. molar = 222714 M-1 cm-1).
Caracterización del producto. El producto se caracterizó por MALDI-TOF. MS: 150707-155257; SDS page y LC MS (2 a 3 péptidos/Ac).
20 Ejemplo 20: Preparación de rodamina b-L-Lys(Anticuerpo)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 1 con rodamina b y un anticuerpo como cargas o grupos Z en el compuesto de fórmula (II)) utilizando la tec. 4.2 y 4.3.
El Ejemplo 6 se repitió hasta la etapa de escisión. La unión del transportador con el anticuerpo se realizó siguiendo 25 la tecnología tec. 4 de maleimido.
Se redujo de forma total una solución de anticuerpo (2,8 mgml-1, 500 µl) mediante DTT (150 eq) en borato de sodio 0,025 M pH 8, NaCl 0,025, EDTA 1 mM, durante 2 h a 37 ºC. El exceso de DTT se purificó del anticuerpo parcialmente reducido mediante exclusión por tamaño (Nap 5, GE Healthcare, siguiendo las instrucciones del 30 fabricante). El anticuerpo completamente reducido se enfrió hasta 0 ºC y después se trató con 2,0 equivalentes de DTNB (1,85 µl, 4 mgml-1, 0°C, 20 min). El anticuerpo se alquiló sin purificación adicional con 1,1 equiv. molares de rodamina b-L-Lys(maleimido)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2/tiol de cisteínas de anticuerpo (DMSO 9 eq, 18 µl, 10 mgml-1). La reacción de alquilación se realizó a 0 ºC durante 30 minutos. Se utilizó cisteína (1 mM final) para agotar cualquier exceso de rodamina b-L-Lys(maleimido)-D-Pro-D-Trp
35 D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 que no hubiese reaccionado. El exceso de péptido se eliminó del anticuerpo parcialmente reducido por exclusión por tamaño (Nap 5, GE Healthcare, siguiendo las instrucciones del fabricante).
La concentración de anticuerpo se cuantificó utilizando un Nanodrop (coef. ext. molar = 222714 M-1 cm-1).
40 Caracterización del producto. El producto se caracterizó por MALDI-TOF. MS: 167061,9; SDS page y LC MS (8 péptidos/Ac).
Ejemplo comparativo 1: Preparación de H-L-Thr-L-His-L-Arg-Pro-L-L-Pro-L-Met-L-Trp-L-Ser-Pro-L-L-Val-L-Trp-L-Pro45 NH2 (SEQ ID NO:5)
Se realizó la síntesis en una escala de 200 µmol. Para el acoplamiento del primer aminoácido en la resina Fmoc-Rink amida p-MBHA se utilizó el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el primer aminoácido protegido (Fmoc-L-Pro-OH, 4 eq, 800 µmoles, 270 mg), TBTU (4 eq, 800 µmoles, 257 mg) disuelto en 50 DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de 10 minutos, y el tratamiento con DBU, tolueno, piperidina, DMF (al 5 %, 5 %, 20 %, 70 %) (2 x
55 5 min), para evaluar la eliminación del grupo Fmoc.
El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido se acopló al primer aminoácido anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-LTrp(Boc)-OH, 4 eq, 800 µmoles, 421 mg), PyBOP (4 eq, 800 µmoles, 416 mg), HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg) 60 disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (12 eq, 2,4 mmol, 408 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. Se eliminó el disolvente mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). La reacción de acoplamiento se llevó a cabo dos veces en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de p-nitrofeniléster. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un
tratamiento de 10 minutos.
El derivado protegido del tercer aminoácido se acopló al segundo aminoácido ya anclado a la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-L-Val-OH, 4 eq, 5 800 µmoles, 271 mg) y el agente de acoplamiento TBTU (4 eq, 800 µmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina) seguido de la adición de DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 µl). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento
10 de 10 minutos.
El derivado de aminoácido protegido del cuarto aminoácido se acopló al tercer aminoácido anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-L-Pro-OH, 4 eq, 800 µmoles, 270 mg), TBTU (4 eq, 800 µmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina),
15 posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de 10 minutos, y el tratamiento con DBU, tolueno, piperidina, DMF (al 5 %, 5 %, 20 %, 70 %) (2 x 5 min), para
20 evaluar la eliminación del grupo Fmoc.
El derivado de aminoácido protegido del quinto aminoácido se acopló al cuarto aminoácido anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-LSer(tBu)-OH, 4 eq, 800 µmoles, 307 mg), PyBOP (4 eq, 800 µmoles, 416 mg), HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg)
25 disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (12 eq, 2,4 mmol, 408 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). La reacción de acoplamiento se llevó a cabo dos veces en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de p-nitrofeniléster. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p) utilizando dos tratamientos de 1 min y un
30 tratamiento de 10 minutos, y el tratamiento con DBU, tolueno, piperidina, DMF (al 5 %, 5 %, 20 %, 70 %) (2 x 5 min), para evaluar la eliminación del grupo Fmoc.
El derivado de aminoácido protegido del sexto aminoácido se acopló al quinto aminoácido anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadió de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-L
35 Trp(Boc)-OH, 4 eq, 800 µmoles, 421 mg), TBTU (4 eq, 800 µmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento
40 de 10 minutos.
El derivado de aminoácido protegido del séptimo aminoácido se acopló al sexto aminoácido anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-L-Met-OH, 4 eq, 800 µmoles, 297 mg), TBTU (4 eq, 800 µmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina),
45 posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de 10 minutos.
50 El derivado de aminoácido protegido del octavo aminoácido se acopló al séptimo aminoácido anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-L-Pro-OH, 4 eq, 800 µmoles, 270 mg), TBTU (4 eq, 800 µmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual
55 intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de 10 minutos, y el tratamiento con DBU, tolueno, piperidina, DMF (al 5 %, 5 %, 20 %, 70 %) (2 x 5 min), para evaluar la eliminación del grupo Fmoc.
60 El derivado de aminoácido protegido del noveno aminoácido se acopló al octavo aminoácido anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-L-Pro-OH, 4 eq, 800 µmoles, 270 mg), PyBOP (4 eq, 800 µmoles, 416 mg), HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (12 eq, 2,4 mmol, 408 µl). Se dejó reaccionar la mezcla
con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). La reacción de acoplamiento se llevó a cabo dos veces en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de p-nitrofeniléster. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p) utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de
5 10 minutos, y el tratamiento con DBU, tolueno, piperidina, DMF (al 5 %, 5 %, 20 %, 70 %) (2 x 5 min), para evaluar la eliminación del grupo Fmoc.
El derivado de aminoácido protegido del décimo aminoácido se acopló al noveno aminoácido anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc-L-Arg 10 (Pbf)-OH, 4 eq, 800 µmoles, 519 mg), PyBOP (4 eq, 800 µmoles, 416 mg), HOAt (12 eq, 2,4 mmol, 327 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (12 eq, 2,4 mmol, 408 µl). La mezcla dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). La reacción de acoplamiento se llevó a cabo dos veces en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de p-nitrofeniléster. El grupo Fmoc se
15 eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p) utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de 10 minutos.
El derivado de aminoácido protegido del undécimo aminoácido se acopló al décimo aminoácido ya anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (Fmoc20 L-His(Trt)-OH, 4 eq, 800 µmoles, 496 mg), TBTU (4 eq, 800 µmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min, un tratamiento de
25 10 minutos.
El derivado de aminoácido protegido del duodécimo aminoácido se acopló al undécimo aminoácido anclado en la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron de forma secuencial a la resina el aminoácido protegido (FmocL-Thr (tBu)-OH, 4 eq, 800 µmoles, 257 mg), TBTU (4 eq, 800 µmoles, 257 mg) disuelto en DMF (1-3 ml/g de resina),
30 posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 1,3 mmol, 267 µl). Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente durante 1,5 h. El disolvente se eliminó mediante succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (p/p), utilizando dos tratamientos de 1 min y un tratamiento de 10 minutos.
35 La etapa de escisión se realizó tratando la resina con una mezcla de TFA (al 94 %), H2O (al 2,5 %), EDT (al 2,5 %) y TIS (al 1 %) (1 x 1 h). Se añadió al producto obtenido terc-butilmetil éter y la mezcla se centrifugó (2 x 8 min). Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en una mezcla de H2O y MeCN (1:1). El producto se filtró y se liofilizó.
40 Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 al 100 % en H2O en 8 minutos, utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; tiempo de retención: 4,95 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M + H]+: 1489,6; rendimiento (síntesis y purificación): el 12%.
45 Ejemplo comparativo 2: Preparación de H-D-Thr-D-His-D-Arg-D-Pro-D-Pro-D-Met-D-Trp-D-Ser-D-Pro-D-Val-D-TrpD-Pro-NH2 (SEQ ID NO: 5)
Se repitió el Ejemplo comparativo 1 pero utilizando los correspondientes D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos.
50 Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 al 100 % en H2O en 8 minutos, utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; tiempo de retención: 4,3 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M + H]+: 1489,6; rendimiento (síntesis y purificación): el 9,8 %.
55 Ejemplo 21: Evaluación del transporte a través de la BHE utilizando un ensayo celular in vitro
El método de evaluación elegido para probar los compuestos de fórmula (I) y (II) de la invención fue un ensayo a base de células que consiste en un cocultivo de células endoteliales de cerebro y astrocitos, el cual permite evaluar 60 o predecir el transporte de compuestos a través de la BHE. El método de cocultivo utilizado fue el descrito por Gaillard y de Boer en 2008 (Gaillard, PJ et al. "2B-Trans technology: targeted drug delivery across the blood-brain barrier" Methods Mol Biol 2008, vol. 437 pág. 161-175) y consiste en la siembra de astrocitos de rata en un lado de un filtro del policarbonato (transpocillo) y la siembra de células endoteliales de cerebro bovino en el otro lado del filtro. En estas condiciones, las células endoteliales tienen la capacidad de alcanzar la confluencia imitando la BHE.
El sistema permite el estudio del transporte de compuestos que pueden cruzar la BHE mediante un mecanismo de transporte pasivo y/o activo. Es un modelo utilizado comúnmente para estudios de permeación y de toxicidad de compuestos a través de la BHE.
5 El ensayo de cocultivo se utilizó para determinar la capacidad de las construcciones carga-transportador para cruzar la BHE. La permeabilidad aparente de los compuestos se midió por triplicado a una concentración de 50 µM para los Ejemplos 1, 2, 3, 4 y 7, y a una concentración de 0,75 nM (referido a la concentración de partícula) para los Ejemplos 5 y 6. Todos los ensayos se realizaron con valores de resistencia eléctrica transendotelial iguales o mayores que 125 Ω · cm2 y se llevaron a cabo en presencia de amarillo lucifer para evaluar la integridad de la
10 membrana celular durante la prueba. Las pruebas de permeabilidad de revisaron en tampón Ringer-HEPES a pH 7,4. El compuesto de interés se disolvió en el tampón hasta la concentración deseada.
Una vez que las células endoteliales se encontraban confluentes en los filtros (transpocillos), estas se lavaron con tampón Ringer-HEPES. El pocillo aceptor se llenó con 800 µl de tampón Ringer-HEPES y el pocillo donante con
15 200 µl de la solución del compuesto a estudiar. El sistema se incubó a 37 ºC y CO2 al 5 % durante 2 h. Después de ese tiempo, el contenido de los compartimentos aceptor y donante se analizaron mediante HPLC, ICP (siglas del inglés inductively coupled plasma: plasma acoplado de forma inductiva) o mediciones de fluorescencia (dependiendo de la carga anclada al transportador). El transporte se confirmó también por espectrometría de masas MALDI-TOF.
20 La permeabilidad aparente se calculó utilizando la siguiente ecuación:
Pap = (dQ/dt) * (1/A) * (1/C0) (cm/s)
En donde (dQ/dt) es la cantidad de compuesto presente en el compartimento aceptor en función del tiempo (nmol/s).
25 A es el área del filtro (cm2) y C0 es la concentración inicial del compuesto aplicado en el compartimento donante (nmol/ml).
En la Tabla 2 se puede observar cómo el uso de la construcción transportador-carga permite que las cargas que no cruzan por sí mismas son capaces de hacerlo por medio del transportador de BHE. Siendo el transportador del
30 ejemplo 1 notablemente más eficaz que el ejemplo comparativo 1 con L-aminoácidos o que el ejemplo comparativo 2 con D-aminoácidos. La versión de enantiómero retro con D-aminoácidos tiene, de forma sorprendente, un transporte elevado a través de la barrera hematoencefálica.
Tabla 2: Permeabilidad aparente (Pap) y porcentaje de transporte tras un ensayo de 2 horas para los Ejemplos 11,
35 2, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 16, 17, 18 y 20. Se muestran como controles los ejemplos comparativos 1 y 2. Las cargas L-dopa, 5(6)-carboxifluoresceína, rodamina b, puntos cuánticos, nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPION), el péptido H-D-Ala-D-NMePhe-D-Nal(2)-D-Val-D-Leu-D-Lys-D-Lys-NH2 y el anticuerpo Avastin, no se detectaron en los compartimentos aceptores tras el ensayo de 2 h.
Compuesto de referencia
Compuesto Pap (x 106) cm/s Transporte (%) (2 h)
Ejemplo comparativo 1
H-L-Thr-L-His-L-Arg-L-Pro-L-Pro-L-Met-L-Trp-L-Ser-L-Pro-L-Val-L-Trp-L-Pro-NH2 12,5±5,2 14,9±2,5
Ejemplo comparativo 2
H-D-Thr-D-His-D-Arg-D-Pro-D-Pro-D-Met-D-Trp-D-Ser-D-Pro-D-Val-D-Trp-D-Pro-NH2 9,9±1,6 11,7±6,4
Carga
L-Dopa - --
Carga
5(6)-carboxifluoresceína - --
Carga
Rodamina b - --
Carga
Punto cuántico - --
Carga
SPION - --
Carga
H-D-Ala-D-NMePhe-D-Nal(2)-D-Val-D-Leu-D-Lys-D-Lys-NH2 - --
Carga
Anticuerpo Avastin parcialmente reducido y retenido con reactivo de Ellman 0,054±0,005 0,064±0,006
Ejemplo 1:
H-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 21,4±2,1 25,1 ±3
Ejemplo 2:
H-Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-TrpD-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 19,4±1,8 22,3±2,6
Ejemplo 8:
L-Dopa-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 8,46±2,1 10,1 ± 1,3
Ejemplo 9:
5(6)-carboxifluoresceína-D-Pro-D-Trp-D-Val-DPro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 16,2±1,3 17,1±2,6
Ejemplo 10:
Punto cuántico-Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-DSer-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 0,27±0,03 0,31 ±0,02
Ejemplo 11:
SPION-Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 0,19±0,07 0,22±0,05
Ejemplo 12:
H-D-Ala-D-NMePhe-D-Nal(2)-D-Val-D-Leu-DLys-D-Lys-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 0,14±0,01 0,2±0,04
Compuesto de referencia
Compuesto Pap (x 106) cm/s Transporte (%) (2 h)
Ejemplo 17:
Rodamina b-L-Lys(Anticuerpo)-D-Pro-D-Trp-DVal-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 tec. 3 (5 péptidos/Ac). 0,16±0,10 0,13±0,08
Ejemplo 18:
Rodamina b-L-Lys(Anticuerpo)-D-Pro-D-Trp-DVal-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 tec. 4.1.A y 4.3 (2-3 péptidos/Ac). 0,18±0,05 0,15±0,04
Ejemplo 20:
Rodamina b-L-Lys(Anticuerpo)-D-Pro-D-Trp-DVal-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 tec. 4.2 y 4.3 (8 péptidos/Ac). 0,36±019 0,30±0,16
Los valores de permeabilidad iguales a o mayores que 1x10-6 cm/s se consideran excepcionalmente buenos y los valores iguales a o mayores que 0,1 x 10-6 cm/s se consideran buenos. Los valores de permeabilidad dependen de 5 forma elevada de la carga utilizada. Para una carga grande, tal como los puntos cuánticos o SPION, los valores próximos a 0,1 x 10-6 cm/s se consideran que son muy buenos.
Ejemplo 22: Estabilidad del transportador en suero humano
10 Una de las ventajas principales de los transportadores de la presente invención, a diferencia de la gran mayoría de los péptidos compuestos exclusivamente de L-aminoácidos (los cuales se metabolizan rápidamente por una serie de enzimas presentes en el suero de la sangre, limitando así sus efectos terapéuticos), es que estos están preparados con D-aminoácidos, por lo tanto, las enzimas metabólicas presentes en el suero no los reconocen, aumentando de este modo de manera significativa su semivida en suero.
15 Con respecto a los estudios de estabilidad de los transportadores de BHE en suero humano (ejemplos 1 y 2) y los péptidos presentados en los ejemplos comparativos 1 y 2, estos se incubaron a una concentración de 150 µM en tampón HBSS a 37 ºC en presencia de suero humano al 90 %. Se recogieron alícuotas de 50 µl en una serie de tiempos a las que se añadieron metanol para precipitar las proteínas séricas. Las muestras se centrifugaron, se
20 filtraron y analizaron mediante HPLC para determinar el grado de degradación del transportador de BHE.
En la Tabla 3, puede observarse cómo los transportadores con D-aminoácidos muestran un aumento dramático de su tiempo de semivida en suero humano, mientras que la versión con L-aminoácidos (Ejemplo comparativo 1) se degrada rápidamente.
25 En resumen, los ejemplos 1 y 2 son sobre transportadores estables a proteasas que tienen un transporte sorprendentemente alto a través de la barrera hematoencefálica.
Tabla 3: tiempo de semivida del transportador de BHE. Como control se muestra el Ejemplo comparativo 1. 30
Compuesto de referencia
Compuesto Tiempo de semivida en suero
Ejemplo comparativo 1
H-L-Thr-L-His-L-Arg-L-Pro-L-Pro-L-Met-L-Trp-L-Ser-L-Pro-L-Val-L-TrpL-Pro-NH2 < 1 h
Ejemplo comparativo 2
H-D-Thr-D-His-D-Arg-D-Pro-D-Pro-D-Met-D-Trp-D-Ser-D-Pro-D-Val-D-Trp-D-Pro-NH2 > 24 h
Ejemplo 1
H-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 > 24 h
Ejemplo 2
H-Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 > 24 h
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Universitat de Barcelona Fundació Privada Institut de Recerca Biomèdica 5
<120> Compuestos resistentes a proteasas útiles como transportadores a través de la barrera hematoencefálica y construcciones de transportador-carga
<130> AVCRI173 10 <150> ES P201230294
<151>
<160> 6 15 <170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Transportador peptídico de D-aminoácidos 25 <400> 1
<210> 2 30 <211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 35 <223> Transportador peptídico de D-aminoácidos
<400> 2
40
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
45
<220>
<223> D-aminoácidos de carga
<220>
50
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa en la posición 2 es N-metilfenilalanina
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa en la posición 3 es N-naftilalanina
<400> 3
10 <210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Carga acoplada al péptido transportador
<220>
<221> MOD_RES
<222>
(2)..(2) 20 <223> Xaa en la posición 2 es N-metilfenilalanina
<220>
<221> MOD_RES
<222>
(3)..(3) 25 <223> Xaa en la posición 3 es N-naftilalanina
<400> 4
30
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
35
<220>
<223> péptido de L-aminoácidos
<400> 5
40
<210> 6
<211> 12 45 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> péptido de D-aminoácidos 50
<400> 6

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
    5 R1-(X) K-P-Y (I)
    en la que:
    R1 es el grupo unido al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P, de forma opcional a través del
    10 ligando X, y se selecciona del grupo que consiste en H, CH3C(=O)-y maleimida; X es un birradical seleccionado del grupo que consiste en -NH-(CH2)r-C(=O)-, -C(=O)-(CH2)r-C(=O)-, -S(CH2)r-, -S-(CH2)r-C(=O)-, -O-(CH2)r-, -S-CH2-CH(NH2)-C(=O)-, -O-(CH2)r-C(=O)-, -(CH2)r-C(=O)-, -NH-O-CH2-C(=O)-NH(CH2)r-CH(NH2)-C(=O)-, -(CH2)r-C(=O)-NH-(CH2)r-CH(NH2)-C(=O)-y -NH-(CH2)r-CH(NHC(=O)CH2NH2)-C(=O)-; en la que el birradical X está unido a R1 y al N de la secuencia P como sigue: R1 -NH-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-, R1
    15 C(=O)-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-, R1-S-(CH2)r-N(H)m-, R1-S-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-, R1-O-(CH2)r-N(H)m-, R1-S-CH2CH(NH2)-C(=O)-N(H)m, R1-O-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-, R1-(CH2)r-C(=O)-N(H)m, R1-NH-O-CH2-C(=O)-NH-(CH2)rCH(NH2)-C(=O)-N(H)m, R1-(CH2)r-C(=O)-NH-(CH2)r-CH(NH2)-C(=O)-N(H)m y R1-NH-(CH2)rCH(NHC(=O)CH2NH2)-C(=O)-N(H)m; r es un número entero de 1 a 5;
    20 P es un birradical de una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr (SEQ ID NO: 1); Y es el grupo unido al C terminal del último aminoácido de la secuencia P, y se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -OH, -OR2 y -NHR2; R2 es un radical seleccionado del grupo que consiste en (C1-C6)-alquilo y (CH2)2-NH-C(=O)-CH2-O-NH2;
    25 k es un número entero de 0 a 2; m es un número entero de 0 a 1; a condición de que cuando el birradical X es -C(=O)(CH2)rC(=O)-, entonces R1 es H; a condición de que cuando el N del aminoácido de la secuencia P al cual está unido el birradical X es un birradical -NH-, entonces m es 1, y cuando es un birradical -N-, entonces m es 0; y
    30 a condición de que cuando R1 es maleimida entonces el birradical X es -C(=O)-(CH2)r-C(=O)-, -CH(NH2)-C(=O)-, -(CH2)r-C(=O)-y -(CH2)r-C(=O)-NH-(CH2)r-CH(NH2)-C(=O)-.
  2. 2. El compuesto peptídico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:
    35 R1 es el grupo unido al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P, de forma opcional a través del ligando X, y se selecciona del grupo que consiste en H y CH3C(=O)-; X es un birradical seleccionado del grupo que consiste en -NH-(CH2)r-C(=O)-, -C(=O)-(CH2)r-C(=O)-, -S(CH2)r-, -S-(CH2)r-C(=O)-, -O-(CH2)r--S-CH2-CH(NH2)-C(=O)-y -O-(CH2)r-C(=O)-; en el que el birradical X está unido a R1 y al N de la secuencia P como sigue: R1-NH-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-,
    40 R1-C(=O)-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-, R1-S-(CH2)r-N(H)m-, R1-S-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-, R1-O-(CH2)rN(H)m-, R1-S-CH2CH(NH2)-C(=O)-N(H)m y R1-O-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-; r es un número entero de 1 a 3; P es un birradical de una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr (SEQ ID NO: 1);
    45 Y es el grupo unido al C terminal del último aminoácido de la secuencia P y se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -OH, -OR2 y -NHR2; R2 es un radical (C1-C6)-alquilo; k es un número entero de 0 a 2; m es un número entero 0 a 1;
    50 a condición de que cuando el birradical X es -C(=O)(CH2)rC(=O)-, entonces R1 es H y a condición de que cuando el N del aminoácido de la secuencia P al cual está unido el birradical X es un birradical -NH-, entonces m es 1, y cuando es un birradical -N-, entonces m es 0.
  3. 3. El compuesto peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el cual P se selecciona del
    55 grupo que consiste en un birradical que consiste en la SEQ ID NO: 1 y un birradical que es la secuencia Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-(SEQ ID NO: 2).
  4. 4. El compuesto peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que k es un número entero
    de 0 a 1. 60
  5. 5.
    El compuesto peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que Y se selecciona de -NH2, -OH and -NHR2.
  6. 6.
    El compuesto peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, el cual se selecciona del grupo que
    consiste en: H-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (Ia): y H-Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (Ib).
    5 7. Una construcción de fórmula (II) o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma,
    (Z)q-(X)K-P-Y, (II)
    en la que:
    10 X, P, Y, k son como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1-6; q es un número entero de 1 a 2, y Z es un radical de una sustancia biológicamente activa o una sustancia para su uso en un método de diagnóstico, siendo dicha sustancia sustancialmente incapaz de cruzar la BHE por sí misma; en la que cuando q
    15 es 1, entonces Z está unido al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P, de forma opcional a través del ligando X, y cuando q es 2, entonces un Z está unido al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P, de forma opcional a través del ligando X, y el otro Z está unido a un nitrógeno del birradical X.
  7. 8. La construcción de fórmula (II) de acuerdo con la reivindicación 7, la cual tiene la fórmula (II’)
    20 Z-(X)K-P-Y (II’)
    en la que:
    25 X, P, Y, k son como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, q es 1, y Z es un radical de una sustancia biológicamente activa o una sustancia para su uso en un método de diagnóstico, siendo dicha sustancia sustancialmente incapaz de cruzar la BHE por sí misma.
  8. 9. La construcción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-8, en la que Z es un radical de un principio
    30 farmacéutico activo que tiene la capacidad de formar un enlace amida, un enlace éster, un enlace disulfuro, un enlace tioéter, un enlace oxima, un enlace amina o un enlace hidrazona con X, y se selecciona del grupo que consiste en agentes antirretrovíricos, agentes anticancerosos, agentes antipsicóticos, agentes antineurodegenerativos, agentes de terapia sustitutiva y agentes antiepilépticos.
    35 10. La construcción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-8, la cual se selecciona del grupo que consiste en:
    L-Dopa-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (IIa); H-D-Ala-D-NMePhe-D-Nal(2)-D-Val-D-Leu-D-Lys-D-Lys-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D
    40 Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (IIb); 5(6)-carboxifluoresceína-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (IIc); Punto cuántico-Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (IId); SPION-Gly-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (IIe), 5(6)-Carboxifluoresceína-L-Lys(Anticuerpo)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D
    45 His-D-Thr-NH2 (IIf); y Rodamina b-L-Lys(Anticuerpo)-D-Pro-D-Trp-D-Val-D-Pro-D-Ser-D-Trp-D-Met-D-Pro-D-Pro-D-Arg-D-His-D-Thr-NH2 (IIg).
  9. 11. Una composición farmacéutica o una composición para fines diagnósticos que comprende una cantidad
    50 terapéuticamente eficaz de la construcción como se define en cualquiera de las reivindicaciones 7-10, junto con cantidades apropiadas de vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables y/o aceptables para el diagnóstico.
  10. 12. Compuesto de fórmula (I), como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para su uso como un
    transportador a través de la barrera hematoencefálica. 55
  11. 13.
    La construcción de fórmula (II), como se define en cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en la que Z es un radical de una sustancia biológicamente activa, para su uso como un medicamento.
  12. 14.
    La construcción de fórmula (II), como se define en cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde Z es un
    60 radical de dopamina para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, o en donde Z es un radical peptídico del péptido H-D-Ala-D-NMePhe-D-Nal(2)-D-Val-D-Leu-D-Lys-D-Lys-NH2 (SEQ ID NO: 3), para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
  13. 15. La construcción de fórmula (II), en la que Z es una nanopartícula de óxido de hierro superparamagnético o un
    complejo de gadolinio, para su uso como un agente de contraste para un método de diagnóstico de formación de imágenes de resonancia magnética o en donde Z se selecciona del grupo que consiste en 5(6)-carboxifluoresceína, rojo Texas, rodamina y puntos cuánticos, para su uso como una sonda fluorescente para un método de diagnóstico por imagen.
    REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN
    Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden 5 excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.
    Documentos de patentes citados en la descripción
    10 • WO 2008025867 A [0010] [0011]
    •
    WO 2012007625 A [0011]
    •
    WO 200244329 A [0013]
    •
    WO 2007098415 A [0014]
    • WO 2009008725 A [0015] 15 • WO 2008050133 A [0050]
    •
    EP 973804 A [0051]
    •
    ES P201230294 [0219]
    Literatura diferente de patentes citada en la descripción
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    Using a Peptide Vector-Mediated Strategy. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2005, vol. 313, 712-719 [0009] 25 • LEE et al. Eur J. Biochem, 2001, vol. 268, 2004-2012 [0013]
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    • GAILLARD, PJ et al. 2B-Trans technology: targeted drug delivery across the blood-brain barrier. Methods Mol Biol, 2008, vol. 437, 161-175 [0208]
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