ES2900592T3 - Péptidos transportados activamente y resistentes a proteasas como lanzaderas de la BHE y construcciones de lanzadera - carga - Google Patents

Abstract

Un compuesto peptídico de fórmula R1-(V)k-P-(W)s-Y (I) en donde: R1 es el grupo conectado al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P, a través del birradical V, y se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, CH3C(=O)- y maleimida; V es un birradical seleccionado del grupo que consiste en -NH-(CH2)r-C(=O)-, -NH-CH-((CH2)rNH2)-C(=O)-, -C(=O)- (CH2)r-C(=O)-, -S-(CH2)r-, -S-(CH2)r-C(=O)-, -O-(CH2)r-, -S-CH2-CH(NH2)-C(=O)-, -O-(CH2)r-C(=O)-, -(CH2)rC(=O)- , -NH-O-CH2-C(=O)-NH-(CH2), -CH(NH2)-C(=O)- y -C≡C-(CH2)rC(=O)-; conectándose el birradical V a R1 y al N de la secuencia P de la siguiente manera: R1-NH-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-, R1NH-CH-((CH2)rNH2)-C(=O)-N(H)m, R1-rC(=O)-(CH2)rC(=O)-N(H)m-, RrS-(CH2)rN(H)m-, R1-S-(CH2)r-C(=O)-N(H)m- , R1-O-(CH2)r-N(H)m-, R1-S-CH2-CH(NH2)-C(=O)-N(H)m, R1-O-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-, R1-(CH2)r-C(=O)-N(H)m, R1- NH-O-CH2-C(=O)-NH-(CH2)r-CH(NH2)-C(=O)-N(H)m; y R1 -C≡C-(CH2)rC(=O)-N(H)m; P es un birradical de: (a) un péptido que tiene una longitud de 9-20 restos de aminoácidos que tiene al menos un enlace intrapeptídico que es un enlace disulfuro, y comprende una secuencia de aminoácidos que es: CKAPETALCAAA (SEQ ID NO:7); que tiene al menos un enlace disulfuro intrapeptídico entre las cisteínas 1 y 9, o un péptido que tiene una longitud de 9-11 restos de aminoácidos que tiene al menos un enlace intrapeptídico que es un enlace disulfuro y que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en CKAPETALC (SEQ ID NO:4); CKAPETALCA (SEQ ID NO:5); y CKAPETALCAA (SEQ ID NO:6); que tiene al menos un enlace disulfuro intrapeptídico entre las cisteínas 1 y 9; o, como alternativa, (b) P tiene 16 restos de aminoácidos y comprende la secuencia de aminoácidos CNCKAPETALCAAACH (SEQ ID NO:9) con un enlace disulfuro intrapeptídico entre la primera y la tercera cisteína que son las cisteínas 1 y 11, y entre la segunda y la cuarta cisteína que son las cisteínas 3 y 15, o como alternativa; (c) P comprende la secuencia de aminoácidos DapKAPETALD (SEQ ID NO:12) con un enlace intrapeptídico entre Dap y D, que es un enlace amida; W es un birradical seleccionado del grupo que consiste en -NH-(CH2)r-C(=O)- y -NH-CH((CH2)rNH2)-C(=O)-; conectándose el birradical W al C=O de la secuencia P y a Y de la siguiente manera: -C(=O)-NH-(CH2)r- C(=O)-Y o -C(=O)-NH-CH((CH2)rNH2)-C(=O)-Y; Y es el grupo conectado al C terminal del último aminoácido de la secuencia P, y se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -OH, -OR2 y -NHR2; R2 es un radical seleccionado del grupo que consiste en (C1-C6)-alquilo y (CH2)2-NH-C(=O)-CH2-O-NH2; r es un número entero de 1 a 5; k es un número entero de 0 a 1; m es un número entero de 0 a 1; s es un número entero de 0 a 1; con la condición de que: cuando el birradical V es -C(=O)(CH2)rC(=O)-, entonces R1 es hidrógeno; cuando el N del aminoácido de la secuencia P al que está conectado el birradical V es un birradical -NH-, entonces m es 1, y cuando el N del aminoácido de la secuencia P al que está unido el birradical -V es un birradical -N-, entonces m es 0; y cuando R1 es maleimida, entonces el birradical V es -(CH2)r-C(=O)-.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos transportados activamente y resistentes a proteasas como lanzaderas de la BHE y construcciones de lanzadera - carga

La presente invención se refiere a los campos de la medicina, investigación y diagnóstico, y más específicamente, a nuevos compuestos peptídicos que actúan como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica (BHE) para el suministro de sustancias que no pueden atravesar dicha barrera por sí mismas. También se refiere a construcciones de lanzadera - carga y a su uso en terapia o diagnóstico.

Estado de la técnica

Desde un punto de vista terapéutico, uno de los objetivos más interesantes de los nuevos medicamentos, son, entre otros, los relacionados con el SNC, tales como el Parkinson, Alzheimer, tumores cerebrales o enfermedades candidatas a la terapia de reemplazo proteico ya que son cada día más comunes en los países desarrollados donde la mayor esperanza de vida implica una mayor incidencia de enfermedades degenerativas. Superar la dificultad de suministrar agentes terapéuticos a regiones específicas del cerebro presenta un reto importante para el tratamiento de estos trastornos cerebrales. En su función neuroprotectora, la barrera hematoencefálica (BHE) actúa impidiendo la llegada de muchos compuestos al cerebro.

La BHE es una interfaz dinámica que separa el cerebro del sistema circulatorio y protege el sistema nervioso central (SNC) de sustancias químicas posiblemente dañinas al tiempo que regula el transporte de moléculas esenciales y mantiene un entorno estable. Está formada por células endoteliales sumamente especializadas que recubren los capilares cerebrales y transducen señales desde el sistema vascular y desde el cerebro. Estas células limitan la difusión de objetos microscópicos (por ejemplo, bacterias) y de moléculas grandes o hidrófilas en el cerebro, al tiempo que permite la difusión de moléculas hidrófobas pequeñas (O2, CO2, hormonas). Las células de la barrera transportan activamente productos metabólicos, tales como glucosa, a través de la barrera, con transportadores específicos.

La estructura y función de la BHE depende de la compleja interacción entre los diferentes tipos de células (tales como las células endoteliales, astrocitos y pericitos) y la matriz extracelular del cerebro y el flujo sanguíneo en los capilares.

Ciertos fármacos de molécula pequeña pueden atravesar la BHE a través de la difusión libre mediada por lípidos, la mayoría de los cuales tienen un peso molecular inferior a 400 uma (unidad de masa atómica), un log p inferior a 5, no más de 3 donadores de enlaces de hidrógeno y menos de 7 aceptores de enlaces de hidrógeno. Estas propiedades químicas faltan en la mayoría de los fármacos de molécula pequeña y en todos los fármacos de molécula grande. Las moléculas terapéuticas, por ejemplo, y los anticuerpos, que podrían ser muy útiles en el diagnóstico y/o sumamente eficaces como terapia, no atraviesan la BHE en cantidades adecuadas, por lo que la industria farmacéutica demanda extremadamente nuevas formas de atravesarla.

Existen diferentes estrategias para atravesar la BHE y las más prometedoras en cuanto al transporte de moléculas grandes son las basadas en caballos de Troya moleculares (CTM) o lanzaderas de la BHE. Un CTM es un péptido endógeno o un anticuerpo monoclonal (mAb, monoclonal antibody) peptidomimético, que atraviesa la BHE en un sistema de transporte mediado por receptores (TMR) específico. Moléculas tales como la insulina o la transferrina de por sí, no son viables como CTM, dado que la insulina causa hipoglucemia y la transferrina tiene una concentración muy alta en plasma. De manera alternativa, los CTM específicos de los TMR, pueden ser mAb peptidomiméticos que se unen a epítopos exofaciales en el receptor de la BHE, que se eliminan espacialmente del sitio de unión al ligando endógeno. Una vez unido al sistema de t Mr en la BHE, el CTM se somete a TMR a través de la BHE. Una lanzadera de la BHE es un péptido capaz de atravesar la BHE con una carga, que por sí misma no puede atravesar la BHE. Lamentablemente, la mayoría de los péptidos lanzadera de la BHE muestran un tiempo de semivida bajo en el suero humano, lo que limita sus aplicaciones.

Por otra parte, hasta la fecha, se sospecha que solo una pequeña cantidad de componentes conocidos del veneno penetran en la BHE sin causar inflamación. Entre las pocas toxinas peptídicas de origen animal de las que se ha informado que llegan al cerebro después de una inyección intravenosa, la clorotoxina y la apamina son las más conocidas. La primera es un péptido de 36 meros (unidades monoméricas) que se encuentra en el veneno de escorpión, en estudios clínicos de fase II para el tratamiento del glioma. Se ha demostrado que se internaliza en las células endoteliales in vitro y llega al parénquima cerebral in vivo. La otra es un péptido de 18 meros que se encuentra en el veneno de abeja, que se acumula en cantidades significativas en el cerebro y la médula espinal.

La apamina representa el 2 % del peso seco del veneno de las abejas (Apis mellifera) y fue uno de los primeros bloqueadores de los canales de K+ que se describieron. Aunque se han realizado estudios de biodistribución en ratones, la permeabilidad de la BHE a la apamina es controvertida. Aunque se ha demostrado la acumulación de este péptido en el cerebro y en la médula espinal después de inyección intravenosa, la selectividad con respecto a estos órganos no está bien establecida. Los restos más importantes de la apamina son los 4 restos de cisteína (que forman 2 enlaces disulfuro importantes para la estructura, pero aparentemente no es demasiado relevante para el transporte a través de la BHE) y 2 restos de arginina responsables de su toxicidad (véase C. Devaux et al., European Journal of Biochemistry, vol. 231, págs. 544-550).

Las modificaciones de la apamina para reducir la toxicidad son referidas por algunos autores como Vincent et al. (véase Biochemistry, 1975, vol. 14, págs. 2521-2525), que describen modificaciones químicas de varios residuos, concluyendo que los más eficaces sobre la toxicidad son Arg13 y Arg14. En otra publicación de L.W. Cosand et al. (véase Proc Natl Acad Sci USA, 1977, vol. 74, págs. 2772-2775) se describe la sustitución de estos dos restos por los de ornitina, que suprime la toxicidad. Sin embargo, en esta publicación no se investiga si el derivado de ornitina es capaz de atravesar la BHE, ya que podría haber perdido toxicidad porque ya no puede alcanzar su diana dentro del cerebro.

En el documento US2009318341 se desvela que tanto la posición 13 como la 14 de la apamina pueden sustituirse por alanina.

Finalmente, B. T: Brazil et al., en Journal of Biological Chemistry, 1997, vol. 72, págs. 5105-5111, desvelan péptidos híbridos en donde la parte del N terminal comprende la secuencia CNCKAPETALC derivada de la apamina, en donde la lisina está marcada con fluoresceína y la parte del C terminal comprende una secuencia derivada de la proteína rodanasa. La fluoresceína está unida a la cadena lateral de la lisina. La secuencia se utiliza como un modelo de conformación alfa helicoidal para estudiar el reconocimiento de estructuras secundarias por la Chaperonina GroEL. Sin embargo, en este documento no se encuentra ninguna mención al transporte a través de la BHE.

De lo que se conoce en la técnica, se deduce que el diseño de moléculas pequeñas que sean capaces de atravesar de manera eficaz la BHE, es un reto y uno que es inviable para la mayoría de las moléculas grandes. Por lo tanto, todavía existe la necesidad de encontrar vectores (lanzaderas de la BHE) que puedan transportar estas cargas a través de la BHE para conseguir suministrar fármacos al cerebro.

Resumen de la invención

Los inventores han descubierto que algunos péptidos específicos, con una longitud relativamente reducida de sus secuencias, que comprenden el fragmento ^kA^p ETAL, tienen la capacidad de atravesar la BHE y son capaces de facilitar el transporte al cerebro de fármacos u otras sustancias útiles para el diagnóstico, denominadas "cargas", que por sí mismas no pueden atravesar la BHE. En particular, los altos valores de permeabilidad obtenidos junto con la evidencia de un mecanismo de transporte activo hacen que estos péptidos sean lanzaderas muy prometedoras de la BHE.

Por tanto, estos péptidos, que son derivados de la apamina, no son tóxicos y pueden atravesar la BHE. Contrariamente a lo que cabría esperar, los derivados de la invención no pierden su toxicidad porque no puedan entrar en el cerebro, sino muy probablemente porque disminuye la afinidad por su diana. Asimismo, estos resultados muestran que los restos de apamina implicados en la toxicidad no son necesarios para el transporte.

El hecho de que un péptido atraviese la BHE no significa que pueda ser una lanzadera para otros péptidos y proteínas, ya que puede atravesar dicha barrera mediante difusión pasiva. La principal ventaja de los péptidos de la invención es el uso de un mecanismo de transporte activo para atravesar la BHE, ya que permiten en este sentido transportar al cerebro grandes cargas que modifican sustancialmente el tamaño y las propiedades fisicoquímicas de las lanzaderas (tales como proteínas, anticuerpos, etc.) y que es de gran interés para el desarrollo de los nuevos fármacos más prometedores: anticuerpos monoclonales u otras proteínas recombinantes terapéuticas. Por otra parte, dado que permiten un gran transporte de carga, pueden anclarse a nanopartículas, que pueden utilizarse tanto para terapias como para técnicas de diagnóstico por imágenes.

Otra ventaja es la alta estabilidad a diferentes valores de pH y temperaturas y la alta estabilidad de proteasas, principalmente debido a las estructuras cíclicas proporcionadas por los puentes intrapeptídicos. Esta propiedad deseada que normalmente se consigue incorporando D-aminoácidos costosos, en los péptidos de la invención se consigue utilizando L-aminoácidos. Asimismo, estos péptidos son biocompatibles, carecen de toxicidad y son fáciles de fabricar.

Se describe un compuesto peptídico de fórmula

R¹-(V)k-P-(W)s-Y

en donde: R1 es el grupo conectado al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P, a través del birradical V, y se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, CH³C(=O)- y maleimida; V es un birradical seleccionado del grupo que consiste en -NH-(CH2)r-C(=O)-, -NH-CH-((CH2)rNH2)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2)r-C(=O)-, -S-(CH2)r-, -S-(CH2)r-C(=O)-, -O-(CH2)r-, -S-CH2-CH(NH2)-C(=O)-, -O-(CH2)rC(=O)-, -(CH2)rC(=O)-, -NH-O-CH2-C(=O)-NH-(CH2)r-CH(NH2)-C(=O)-, y

-C=C-(CH2)rC(=O)-; conectándose el birradical V a R1 y al N de la secuencia P de la siguiente manera: R1-NH-(CH²)rC(=O)-N(H)m-, R¹-NH-CH-((CH²)rNH²)-C(=O)-N(H)m, R¹-C(=O)-(CH²),-C(=O)-N(H)m-, R¹-S-(CH²)r-N(H)m-l R1-S-(CH²)rC(=O)-N(H)m-l R¹-O-(CH²)rN(H)m-l R¹-S-CH²-CH(NH²)-C(=O)-N(H)m, R¹-O-(CH²)rC(=O)-N(H)m-, R¹-(CH²)rC(=O)-N(H)m, Ri =N-O-CH2-C(=O)-NH-(CH2)rCH(NH2)-C(=O)-N(H)m; y Ri -CEC-(CH2)rC(=O)-(NH)m P es un birradical de un péptido que tiene una longitud de 9-20 restos de aminoácidos que tiene al menos un enlace intrapeptídico seleccionado del grupo que consiste en un enlace disulfuro, un enlace amida; un enlace tioéter, un enlace Se-Se, un enlace C-C y un enlace C=C; y que comprende la secuencia de aminoácidos

Xaa¹KAPETALXaa²(A)n¹(A)n²(A)n³ (SEQ ID NO:1)

Xaa¹ y Xaa² son un aminoácido seleccionado independientemente de C, D, E, K, O, Dap, Dab, Sec, Pen, AlGly y alfa-Me-alfa-alqGli; en donde m , n2 y n³ son números enteros seleccionados independientemente de 0 y 1; W es un birradical seleccionado del grupo que consiste en -NH-(CH2)r-C(=O)- y -NH-CH((CH2)rNH2)-C(=O)-; conectándose el birradical W al C=O de la secuencia P y a Y de la siguiente manera: -C(=O)-NH-(CH2)r-C(=O)-Y, -C(=O)-NH-CH((CH2)rNH2)-C(=O)-Y; Y es el grupo conectado al C terminal del último aminoácido de la secuencia P, y se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -OH, -OR2 y-NHR2; R2 es un radical seleccionado del grupo que consiste en (C1-C6)-alquilo y (CH2)2-NH-C(=O)-CH2-O-NH2; r es un número entero de 1 a 5; k es un número entero de 0 a 1; m es un número entero de 0 a 1; s es un número entero de 0 a 1; con la condición de que: cuando al menos uno de m, n2 y n³ sea 0, entonces al menos un enlace intrapeptídico está entre Xaa¹ y Xaa²;

cuando el birradical V es -C(=O)(CH2)rC(=O)-, entonces R1 es hidrógeno; cuando el N del aminoácido de la secuencia P al que está conectado el birradical V es un birradical -NH-, entonces m es 1, y cuando es un birradical -N-, entonces m es 0; y cuando R1 es maleimida, entonces el birradical V es -(CH2)rC(=O)-.

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto peptídico de fórmula

R1-(V)k-P-(W)s-Y (I)

en donde:

R1 es el grupo conectado al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P, a través del birradical V, y se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, CH³C(=O)- y maleimida;

V es un birradical seleccionado del grupo que consiste en -NH-(CH2)r-C(=O)-, -NH-CH-((CH2)rNH2)-C(=O)-, -C(=O)-(CH²)rC(=O)-, -S-(CH²)r-, -S-(CH²)r-C(=O)-, -O-(CH²)r-, -S-CH²-CH(NH²)-C(=O)-, -O-(CH²)rC(=O)-, -(CH²)rC(=O)-, -NH-O-CH2-C(=O)-NH-(CH2)r-CH(NH2)-C(=O)- y -CEC-(CH2)rC(=O)-;

conectándose el birradical V a R1 y al N de la secuencia P de la siguiente manera: R1-NH-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-, R¹-NH-CH-((CH²)rNH²)-C(=O)-N(H)m, R¹-C(=O)-(CH²)r-C(=O)-N(H)m-, RrS-(CH²)r-N(H)m-, RrS-(CH²)r-C(=O)-N(H)m-, R¹-O-(CH²)r-N(H)m-, R¹-S-CH²-CH(NH²)-C(=O)-N(H)m, R¹-O-(CH²)r-C(=O)-N(H)m-, R¹-(CH²)rC(=O)-N(H)m, R1-NH-O-CH²-C(=O)-NH-(CH²)r-CH(NH²)-C(=O)-N(H)m; y R¹-CEC-(CH²)rC(=O)-(NH)m;

P es un birradical de:

(a) un péptido que tiene una longitud de 9-20 restos de aminoácidos que tiene al menos un enlace intrapeptídico que es un enlace disulfuro, y comprende una secuencia de aminoácidos que es:

CKAPETALCAAA (SEQ ID NO:7);

que tiene al menos un enlace disulfuro intrapeptídico entre las cisteínas 1 y 9,

o un péptido que tiene una longitud de 9-11 restos de aminoácidos que tiene al menos un enlace intrapeptídico que es un enlace disulfuro y que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

CKAPETALC (SEQ ID NO:4);

CKAPETALCA (SEQ ID NO:5); y

CKAPETALCAA (SEQ ID NO:6); que tiene al menos un enlace disulfuro intrapeptídico entre las cisteínas 1 y 9; o, como alternativa,

(b) P tiene 16 restos de aminoácidos y comprende la secuencia de aminoácidos CNCKAPETALCAAACH (SEQ ID NO:9)

con un enlace disulfuro intrapeptídico entre la primera y la tercera cisteína que son las cisteínas 1 y 11, y entre la segunda y la cuarta cisteína que son las cisteínas 3 y 15, o como alternativa;

(c) P comprende la secuencia de aminoácidos

DapKAPETALD (SEQ ID NO:12)

con un enlace intrapeptídico entre Dap y D, que es un enlace amida;

W es un birradical seleccionado del grupo que consiste en -NH-(CH2)r-C(=O)- y -NH-CH((CH2)rNH2)-C(=O)-; conectándose el birradical W al C=O de la secuencia P y a Y de la siguiente manera: -C(=O)-NH-(CH2)r-C(=O)-Y o -C(=O)-NH-CH((CH2)rNH2)-C(=O)-Y;

Y es el grupo conectado al C terminal del último aminoácido de la secuencia P, y se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -OH, -OR2 y -NHR2;

R2 es un radical seleccionado del grupo que consiste en (C1-C6)-alquilo y (CH2)2-NH-C(=O)-CH2-O-NH2; r es un número entero de 1 a 5;

k es un número entero de 0 a 1;

m es un número entero de 0 a 1;

s es un número entero de 0 a 1;

con la condición de que:

cuando el birradical V es -C(=O)(CH2)rC(=O)-, entonces R1 es hidrógeno;

cuando el N del aminoácido de la secuencia P al que está conectado el birradical V es un birradical -NH-, entonces m es 1, y cuando el N del aminoácido de la secuencia P al que está conectado el birradical -V- es un birradical -N-, entonces m es 0; y

cuando R1 es maleimida, entonces el birradical V es -(CH2)r-C(=O)-.

Los compuestos peptídicos de fórmula (I) tienen grupos funcionales apropiados, adecuados para la conexión covalente de cargas manteniendo la actividad original de la carga hasta que alcanza el sitio de acción. También pueden utilizarse otros péptidos con una longitud relativamente reducida de sus secuencias que comprenden el fragmento KAPETAL, ya que pueden facilitar el transporte al cerebro de fármacos u otras sustancias útiles para el diagnóstico. Por tanto, un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una construcción de fórmula (II), o a una sal de la misma farmacéuticamente aceptable,

(R¹ )e-(Z)q¹-(V)k-P-(W)s-(Z)q²-(Y)f, (II)

en donde: P es un birradical de un péptido seleccionado del grupo que consiste en un péptido como se ha definido para el compuesto de fórmula (I) y un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos KAPETAL (SEQ ID NO:10); R1, Y, W, k, s, son como se ha definido para el compuesto de fórmula (I), V es como se ha definido en el compuesto de fórmula (I), o como alternativa, V se selecciona del grupo que consiste en V1, V2 y V3,

siendo V1

siendo V2

y siendo V³

en donde los enlaces 1 y 2 están conectados a la cadena lateral de una lisina de la carga que es una proteína o un anticuerpo;

Z es un radical seleccionado independientemente de una sustancia biológicamente activa que es un principio farmacéutico activo capaz de formar un enlace amida, un enlace éster, un enlace disulfuro, un enlace tioéter, un enlace oxima, un enlace amina, un enlace 1,2,3-triazol (enlace triazol) 1,4-disustituido o un enlace hidrazona con V o un enlace amida o un enlace éster con W, y se selecciona del grupo que consiste en agentes antirretrovíricos, agentes antineoplásicos, agentes antipsicóticos, agentes antineurodegenerativos, una proteína terapéutica para la terapia de reemplazo proteico y agentes antiepilépticos; o una sustancia para su uso en un método de diagnóstico seleccionada del grupo que consiste en 5(6)-carboxifluoresceína, biotina, sulforodamina B, puntos cuánticos y nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro (Spion); siendo dicha sustancia sustancialmente incapaz de atravesar por sí misma la BHE;

q1 y q2 son números enteros de 0 a 2, siendo q1 y/o q2 diferentes de 0 y siendo la suma de q1 y q2 de 1 o 2; e y f son números enteros de 0 a 1;

con la condición de que:

cuando q1 es 2 y el birradical V tiene un nitrógeno no terminal, entonces un Z se conecta al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P a través del birradical V, y el otro Z se conecta al nitrógeno no terminal birradical V, y k es 1;

cuando q2 es 2 y el birradical W tiene un nitrógeno no terminal, entonces un Z se conecta al C=O terminal del último aminoácido de la secuencia P, a través del birradical W, y el otro Z se conecta al nitrógeno no terminal de los birradicales W y s es 1; y

cuando q1 es 2 entonces e es 0, cuando q2 es 2 entonces f es 0,

cuando q1 es 1, entonces Z se conecta al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P, opcionalmente a través del birradical V, y e es 0; y

cuando q2 es 1, entonces Z se conecta al C=O terminal del último aminoácido de la secuencia P, opcionalmente a través del birradical W, y f es 0.

Los enlaces 1 y 2 del enlazador V3 están conectados a la cadena lateral de una lisina de la carga que es una proteína o un anticuerpo de la siguiente manera:

V3 se re resenta

Una lisina

se representa con enlaces discontinuos.

Esta lisina puede ser cualquier lisina que forme parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína. La técnica de conjugación utilizada comprende transformar la amina del lado (-NH2) en una azida (-N³). Después, la azida reacciona con el triple enlace del N terminal del péptido que forma el 1,2,3-triazol 1,4-disustituido.

Los birradicales V1 , V2 y V³ están conectados a (R1 )e-(Z)q1 por el lado izquierdo de las fórmulas representadas y al N terminal de la secuencia P por el otro lado de las fórmulas representadas.

Los compuestos peptídicos de fórmula (I) de la invención, así como el KAPETAL-NH2, muestran diversas propiedades que hacen que sean útiles como lanzaderas de la BHE. Se desvela el uso de un péptido seleccionado de un péptido como se ha indicado anteriormente y KAPETAL-NH2, como una lanzadera a través de la BHE.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una construcción de fórmula (II) como se ha definido anteriormente, donde Z es un radical de una sustancia biológicamente activa, para su uso como medicamento, en donde la sustancia biológicamente activa es un principio farmacéutico activo capaz de formar un enlace amida, un enlace éster, un enlace disulfuro, un enlace tioéter, un enlace oxima, un enlace amina, un enlace 1,2,3-triazol (enlace triazol) 1,4-disustituido o un enlace hidrazona con V o un enlace amida o un enlace éster con W, y se selecciona del grupo que consiste en agentes antirretrovíricos, agentes antineoplásicos, agentes antipsicóticos, agentes antineurodegenerativos, una proteína terapéutica para la terapia de reemplazo proteico y agentes antiepilépticos.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una construcción de fórmula (II) como se ha definido anteriormente, en donde Z es una nanopartícula superparamagnética de óxido de hierro o un complejo de gadolinio, para su uso como agente de contraste para un método de diagnóstico de obtención de imágenes por resonancia magnética. Otro aspecto de la presente invención se refiere a una construcción de fórmula (II) como se ha definido anteriormente, en donde Z se selecciona del grupo que consiste en 5(6)-carboxifluoresceína, rojo Texas, rodamina y puntos cuánticos, para su uso como una sonda fluorescente para un método de diagnóstico de obtención de imágenes.

Finalmente, otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica o a una composición con fines de diagnóstico que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción como se ha definido anteriormente, junto con cantidades apropiadas de transportadores o excipientes farmacéuticamente aceptables y/o aceptables para el diagnóstico.

Descripción detallada de la invención

A menos que se indique de otro modo, los aminoácidos citados en el presente documento son L-aminoácidos. Los códigos de 1 y 3 letras se han utilizado indistintamente. Para los siguientes aminoácidos se han utilizado las siguientes abreviaturas: ácido diaminopropiónico (Dap), ácido diaminobutírico (Dab), selenocisteína (Sec), penicilamina (Pen), ornitina (O), alil glicina (AlGli) y alfa-metil, alfa-alquenilglicina (alfa-Me-alfa-alqGli). En el contexto de la presente invención, la penicilamina solo incluye D-penicilamina.

La expresión "enlace intrapeptídico" como se indica en el presente documento, se refiere a un enlace entre las cadenas laterales de dos restos de aminoácidos.

Como se ha mencionado anteriormente, los compuestos peptídicos de fórmula Ri -(V)k-P-(W)s-Y (I), forman parte de la invención, en donde: Ri , V, P, W, k y s tienen los significados mencionados anteriormente.

La longitud de la secuencia de aminoácidos P puede variar de 9-20 aminoácidos, preferentemente, entre 9-16 aminoácidos. En realizaciones particulares puede tener una longitud que consista en 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 y 16 aminoácidos. Comprende al menos la secuencia de aminoácidos contigua KAPETAL y un enlace intrapeptídico. Las modificaciones de aminoácidos que sustancialmente no afectan a la capacidad de transporte a través de la barrera BHE están dentro del alcance de la protección. La secuencia de aminoácidos P de la invención se forma a partir de aminoácidos que no confieren toxicidad aguda general al péptido. En consecuencia, la secuencia de aminoácidos P de la invención carece al menos del aminoácido R. La secuencia de aminoácidos P de la invención también puede carecer del aminoácido Q.

Algunos de los aminoácidos que pueden estar formando la secuencia de aminoácidos P junto con el fragmento KAPETAL son C, N, L, A, M, D, E, K, O, H, G, F, Y, W, I, V, P, S, T, Dap, Dab, Sec, Pen, AIGli o alfa-Me-alfa-alqGli. Preferentemente, los compuestos peptídicos de la invención son aquellos en los que m, n2 y n³ son igual a 1. Además, preferentemente, los compuestos peptídicos de la invención tienen uno o dos enlaces intrapeptídicos. Además, preferentemente, los enlaces intrapeptídicos son enlaces amida o enlaces disulfuro.

Además, preferentemente, los compuestos peptídicos de la invención tienen entre 9 y 16 aminoácidos.

Cualquier intervalo dado en este documento pretende incluir los valores finales del intervalo.

En una realización particular, los compuestos peptídicos de la invención son aquellos en los que el péptido P comprende la secuencia de aminoácidos: DapKAPETALD (SEQ ID NO: 12) con un enlace intrapeptídico formado entre Dap y D que es un enlace amida.

En otra realización particular, el compuesto peptídico de fórmula (I) es aquel donde P es SEQ ID NO: 12, k y s son 0 y R1 es H e Y es NH2: H-DapKAPETALD-NH2.

En otra realización particular, los compuestos peptídicos de fórmula (I) son aquellos en los que en el péptido P, Xaa¹ es Dap y Xaa² es D y el enlace intrapeptídico se forma entre Dap y D y es un enlace amida, comprendiendo el péptido P la secuencia de aminoácidos: DapKAPETALD y V es S-CH2-CH(nH2)-C(=O), es decir, la secuencia de aminoácidos CDapKAPETALD (SEQ ID NO:18).

En otra realización particular, el compuesto peptídico de fórmula (I) es aquel donde P es SEQ ID NO: 12, V es S-CH2-CH(NH2)-C(=O), k es 1 y s es 0, R1 es H e Y es NH2: H-CDapKAPETALD-NH2.

Los compuestos peptídicos de la invención son aquellos en los que Xaa1 y Xaa2 en el péptido P son cisteínas y el enlace intrapeptídico es un enlace disulfuro entre las cisteínas 1 y 9, comprendiendo el péptido P la secuencia de aminoácidos: CKAPETALC(A)m(A)n²(A)n³ (SEQ ID NO:2), en donde m, n2 y n³ son números enteros seleccionados independientemente de 0 a 1; con la condición de que cuando n³ es cero, entonces el péptido tiene 9-11 restos de aminoácidos y consiste en la secuencia: CKAPETALC(A)n1(A)n2 (SEQ ID NO:3), siendo m y n2 números enteros seleccionados independientemente de 0 y 1.

En una realización particular preferida, los compuestos peptídicos de fórmula (I) de la invención son los mencionados anteriormente donde P comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: CKAPETALC (SEQ ID NO:4); CKAPETALCA (SEQ ID NO:5); CKAPETALCAA (SEQ ID NO:6); y CKAPETALCAAA (SEQ ID NO:7), que tiene un enlace disulfuro intrapeptídico entre las dos cisteínas de cada una de las secuencias de aminoácidos anteriores.

Los compuestos peptídicos de fórmula (I) más preferidos son los seleccionados de la siguiente lista, donde las secuencias de aminoácidos tienen un enlace disulfuro intrapeptídico entre las dos cisteínas:

H-CKAPETALC-NH2 (SEQ ID NO:4, R1 es H e Y es NH2);

H-CKAPETALCA-NH2 (SEQ ID NO:5, R1 es H e Y es NH2);

H-CKAPETALCAA-NH2 (SEQ ID NO:6, R1 es H e Y es NH2); y

H-CKAPETALCAAA-NH2 (SEQ ID NO:7, R1 es H e Y es NH2),

En otra realización preferida, los compuestos peptídicos de la invención son los que tienen 16 restos de aminoácidos y comprenden la secuencia de aminoácidos CKAPETALCAAA de la siguiente manera: Xaa³Xaa⁴CKAPETALCAAAXaa⁵Xaa⁶ (SEQ ID NO:8), en donde Xaa³ y Xaa⁵ se seleccionan independientemente del grupo que consiste en C, Sec, Pen, Dab, Dap, K, O, D, E, AIGli y alfa-Me-alfa-alqGli; Xaa⁴ se selecciona del grupo que consiste en H, N, L, A, G, F, Y, W, I, V, P, S, T, D, E, K y M y Xaa⁶ se selecciona del grupo que consiste en H, G, F, Y, W, I, V, P, N, L, A, S, T, D, E, K y M, en donde cuando Xaa³ y Xaa⁵ son iguales a la cisteína, entonces el péptido comprende la secuencia de aminoácidos: CXaa⁴CKAPETALCAAACXaa⁶ (SEQ ID NO: 17), con un enlace disulfuro intrapeptídico entre la primera y la tercera cisteína, que son las cisteínas 1 y 11, y entre la segunda y la cuarta cisteína, que son las cisteínas 3 y 15. Los inventores han descubierto que el patrón de enlace disulfuro de la apamina no es necesario para el transporte a la BHE, lo que abre la posibilidad de utilizar lanzaderas peptídicas con diferente conectividad de enlace disulfuro.

En otra realización más preferida, los péptidos de la invención son los mencionados anteriormente donde Xaa³ y Xaa⁵ se seleccionan independientemente del grupo que consiste en C, Sec, Pen, Dab, Dap, K, O, D y E, Xaa⁴ se selecciona del grupo que consiste en N, L, A y M y Xaa⁶ es H donde cuando Xaa³ y Xaa⁵ son diferentes a la cisteína, entonces el péptido P tiene al menos un enlace disulfuro intrapeptídico entre las cisteínas 3 y 12; y en donde cuando Xaa³ y Xaa⁵ son iguales a la cisteína, entonces el péptido comprende la secuencia de aminoácidos: CXaa⁴CKAPETALCAAACXaa⁶ (SEQ ID NO: 17), con un enlace disulfuro intrapeptídico entre la primera y la tercera cisteína que son las cisteínas 1 y 11, y entre la segunda y la cuarta cisteína que son la cisteínas 3 y 15.

En una realización más preferida, el compuesto peptídico de fórmula (I) es aquel donde P es CNCKAPETALCAAACH (SEQ ID NO: 9), R1 es H e Y es NH2: H-CNCKAPETALCAAACH-NH2, con un enlace disulfuro intrapeptídico entre la primera y la tercera cisteína y entre la segunda y la cuarta cisteína.

En una realización particular, el compuesto peptídico de la invención es aquel donde k es 0 y R1 es hidrógeno. En otra realización particular, el compuesto peptídico de la invención es aquél donde s es 0 e Y es NH2.

En otra realización particular, los compuestos peptídicos de la invención son los de fórmula (I) donde k es 0 y s es 0, teniendo el compuesto la siguiente fórmula (I1 ) siendo R1, P e Y como se definen para los compuestos de fórmula (I): R1-P-Y (I1 ).

Preferentemente, en cualquiera de los compuestos peptídicos anteriores, Y se selecciona de -NH2, -OH y -NH2. Más preferentemente, Y es -NH2.

Como se ha mencionado anteriormente, los péptidos de la invención han demostrado ser realmente bien transportados en el modelo in vitro basado en células de la barrera hematoencefálica que muestra una buena correlación con la situación in vivo, tener una semivida en suero superior a 24 h y no ser tóxicos en ratones ni en peces cebra. Como se ilustra en los ejemplos, los compuestos peptídicos de fórmula (I), así como el KAPETAL, tienen la capacidad de transportar sustancias, denominadas cargas, al cerebro, que por sí mismas no pueden atravesar la BHE. El uso de estos compuestos como lanzaderas de la BHE hace posible, por ejemplo, que la investigación de nuevos fármacos no se limite únicamente a los compuestos que pueden atravesar la BHE por sí mismos.

Los compuestos de fórmula (I) tienen grupos funcionales apropiados, adecuados para la conexión covalente de cargas manteniendo la actividad original de la carga, hasta que lleguen al lugar de la acción. Por tanto, como se ha mencionado anteriormente, también son parte de la invención, las construcciones de fórmula (II) o sus sales farmacéuticamente aceptables, que se conocen como construcciones de lanzadera - carga de la BHE,

(R1 )e-(Z)q1-(V)k-P-(W)s-(Z)q2-(Y)f, (II)

en donde: P es un birradical de un péptido seleccionado del grupo que consiste en un péptido como se ha definido anteriormente, R1, V, W, Y, k y s son como se ha definido anteriormente, preferentemente, V es como se ha definido en el compuesto de fórmula (I), Z es un radical seleccionado independientemente de una sustancia biológicamente activa que es un principio farmacéutico activo capaz de formar un enlace amida, un enlace éster, un enlace disulfuro, un enlace tioéter, un enlace oxima, un enlace amina, un enlace 1,2,3-triazol (enlace triazol) 1,4-disustituido o un enlace hidrazona con V o un enlace amida o un enlace éster con W, y se selecciona del grupo que consiste en agentes antirretrovíricos, agentes antineoplásicos, agentes antipsicóticos, agentes antineurodegenerativos, una proteína terapéutica para la terapia de reemplazo proteico y agentes antiepilépticos; o una sustancia para su uso en un método de diagnóstico seleccionada del grupo que consiste en 5(6) carboxifluoresceína, biotina, sulforodamina B, puntos cuánticos y nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro (Spion); siendo dicha sustancia sustancialmente incapaz de atravesar por sí misma la BHE;

q1 y q2 son números enteros de 0 a 2, siendo q1 y/o q2 diferentes de 0 y siendo la suma de q1 y q2 de 1 o 2; e y f son números enteros de 0 a 1;

con la condición de que:

cuando q1 es 2 y el birradical V tiene un nitrógeno no terminal, entonces un Z se conecta al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P a través del birradical V, y el otro Z se conecta al nitrógeno no terminal birradical V, y k es 1;

cuando q2 es 2 y el birradical W tiene un nitrógeno no terminal, entonces un Z se conecta al C=O terminal del último aminoácido de la secuencia P, a través del birradical W, y el otro Z se conecta al nitrógeno no terminal de los birradicales W y s es 1; y

cuando q1 es 2 entonces e es 0, cuando q2 es 2 entonces f es 0,

cuando q1 es 1, entonces Z se conecta al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P, opcionalmente a través del birradical V, y e es 0; y

cuando q2 es 1, entonces Z se conecta al C=O terminal del último aminoácido de la secuencia P, opcionalmente a través del birradical W, y f es 0.

También son parte de la invención, las construcciones de fórmula (II) donde el P birradical es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos KAPETAL (SEQ ID NO: 10) y donde el resto de los valores de las construcciones de fórmula (II) es como se ha definido anteriormente.

La expresión "sustancialmente incapaz de atravesar la BHE" significa que no es capaz de atravesar la BHE o, si lo hace, está en una cantidad que no es terapéuticamente eficaz.

Las sustancias de las que deriva el radical Z incluyen una amplia gama de sustancias que tienen utilidad farmacológica o diagnóstica. Estas sustancias pueden ser principios farmacéuticos activos, en particular, agentes antirretrovíricos, agentes antineoplásicos, agentes antipsicóticos, agentes antineurodegenerativos, fármacos antiepilépticos o agentes de terapia de reemplazo. En una realización preferida, Z es un radical derivado de un principio farmacéutico activo capaz de formar un enlace amida, un enlace éster, un enlace disulfuro, un enlace tioéter, un enlace oxima, un enlace amina, un enlace 1,2,3-triazol (enlace triazol) 1,4-disustituido o un enlace hidrazona con V o un enlace amida o un enlace éster con W, siendo el principio activo mencionado incapaz de atravesar por sí mismo la BHE.

Un ejemplo de principio farmacéutico activo es la dopamina. La dopamina es un neurotransmisor clave del sistema nervioso central; en particular, el empobrecimiento de dopamina estriatal se asocia a afecciones clínicas de parkinsonismo. La dopamina mostró propiedades interesantes como fármaco, pero no puede atravesar la BHE. En particular, como se ilustra en los ejemplos, las construcciones de fórmula (II) permiten que la dopamina sea útil como fármaco sin tener los efectos secundarios no deseados de la terapia real y que sea una técnica más sencilla y no invasiva en comparación con las existentes.

En una realización preferida, las construcciones de la invención son aquellas en las que el agente activo farmacéutico es L-dopamina.

Otras posibles cargas son, por ejemplo, péptidos, proteínas, polímeros y anticuerpos, que tienen aplicaciones como agentes terapéuticos o de diagnóstico pero que no pueden atravesar adecuadamente la BHE. En una realización particular, el péptido es el péptido LPFFd (s Eq ID NO: 11). En otra realización particular, el péptido es el péptido KQIEIKKFK (SEQ ID NO: 20).

En una realización particular, los anticuerpos se utilizan como cargas. En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo útil para el tratamiento del cáncer. Son ejemplos de anticuerpos que pueden usarse cetuximab y bevacizumab.

En otra realización particular, las proteínas se utilizan como cargas. En una realización preferida, la proteína es una proteína terapéutica para la terapia de reemplazo proteico.

Las sustancias derivadas de Z también incluyen otras sustancias que pueden ser interesantes de transportar al cerebro pero no lo hacen adecuadamente por sí mismas, por ejemplo, agentes de contraste para la obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM). Entre los dispositivos clínicos utilizados para el diagnóstico clínico del cáncer, La RM destaca como una potente modalidad de obtención de imágenes no invasiva y no destructiva que proporciona imágenes internas de organismos vivos sin límites en la profundidad de análisis y con una resolución de 10 a 100 micrómetros. Es una técnica valiosa ampliamente utilizada en el diagnóstico y la investigación del cáncer. Para la detección precoz del cáncer (así como de otras enfermedades) es interesante el uso de agentes de contraste, que pueden dirigirse selectivamente a marcadores específicos ubicados en determinados tejidos, creando una pequeña acumulación de agente de contraste en este tejido. Esta pequeña acumulación de agente de contraste es suficiente para detectar inequívocamente la existencia de, por ejemplo, un tumor en estados muy tempranos. Los agentes de contraste también pueden utilizarse como métodos de diagnóstico de otras enfermedades del sistema nervioso central, tal como la enfermedad de Alzheimer, o como una herramienta de RM (resonancia magnética) preoperatoria que guiará al cirujano. En todos estos casos, el medio de contraste utilizado debe atravesar la BHE. Como ejemplos de agentes de contraste habituales se incluyen quelatos de elementos paramagnéticos tales como gadolinio o manganeso (efecto en T1), o el uso de nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro (nanopartículas SPION) (efecto T2). Las nanopartículas de óxido de hierro son partículas de óxido de hierro con diámetros entre aproximadamente 1 y 100 nanómetros. Las dos formas principales son la magnetita (Fe³O⁴) y su forma oxidada maghemita (Y-Fe²O³). Estas han atraído un gran interés debido a sus propiedades superparamagnéticas y a sus posibles aplicaciones en muchos campos (aunque el Cu, el Co y el Ni también son materiales sumamente magnéticos, son tóxicos y se oxidan fácilmente). El superparamagnetismo es una forma de magnetismo, que aparece en pequeñas micro o nanopartículas ferromagnéticas o ferrimagnéticas, consistiendo cada partícula en un dominio magnético. Un dominio magnético es una región dentro de un material magnético que tiene una magnetización uniforme. Esto significa que los momentos magnéticos individuales de los átomos están alineados entre sí y apuntan en la misma dirección.

Otros agentes de diagnóstico que no son de RM incluyen tintes o sondas fluorescentes tales como carboxifluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, o el uso de puntos cuánticos (nanopartículas formadas por materiales semiconductores con alto rendimiento cuántico de fluorescencia). Lo último, combinado con el uso de microscopía bifotónica, al igual que en la técnica de RM, permite la obtención de imágenes in vivo de organismos vivos de manera no invasiva, permitiendo por tanto su uso como herramienta de diagnóstico.

Un punto cuántico es una parte de materia (por ejemplo, un semiconductor) cuyos excitones están confinados en las tres dimensiones espaciales. Por consiguiente, dichos materiales tienen propiedades electrónicas intermedias entre las de los semiconductores aparentes y las de las moléculas diferenciadas. Los puntos cuánticos son semiconductores cuyas características electrónicas están estrechamente relacionadas con el tamaño y la forma del cristal individual. En general, cuanto menor sea el tamaño del cristal, mayor es el hueco de banda, mayor es la diferencia de energía entre la banda de valencia más alta y la banda de conducción más baja, por lo tanto, se necesita más energía para excitar el punto y, al mismo tiempo, se libera más energía cuando el cristal vuelve a su estado de reposo.

También en una realización preferida, la carga Z incluye anticuerpos útiles en métodos de diagnóstico. En otra realización preferida, las construcciones de la invención son aquellas en las que Z es un radical de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, 5(6)-carboxifluoresceína, biotina, sulforodamina B, puntos cuánticos y Spion. Otras posibles cargas son las nanopartículas de oro.

Los valores preferidos de P para el compuesto de fórmula (I) también son valores preferidos para la construcción de fórmula (II), opcionalmente, en combinación con cualquier otra realización mencionada anteriormente o más adelante.

En una realización particular, las construcciones de la invención son aquellas en las que el péptido P tiene al menos un enlace disulfuro intrapeptídico entre cisteínas y comprende la secuencia de aminoácidos CKAPETALC(A)m(A)n²(A)n³ (SEQ ID NO:2), m, n2 y n³ son números enteros seleccionados independientemente de 0 y 1; con la condición de que al menos uno de m, n2 y n³ sea 0, entonces hay un enlace intrapeptídico entre las dos cisteínas de la SEQ ID NO: 2.

En otra realización particular, las construcciones de la invención son aquellas en las que el péptido P tiene al menos un enlace disulfuro intrapeptídico entre cisteínas y comprende la secuencia de aminoácidos CKAPETALC(A)m(A)n²(A)n³ (SEQ ID NO:2), m, n2 y n³ son números enteros seleccionados independientemente de 0 y 1; con la condición de que al menos uno de m, n2 y n³ sea 0, entonces el péptido tiene 9-11 restos de aminoácidos y consiste en la secuencia CKAPETALC(A)n1(A)n2 (SEQ ID NO:3) siendo m y n2 números enteros seleccionados independientemente de 0 y 1.

En una realización preferida, las construcciones de fórmula (II) son aquellas que tienen la fórmula (II1 ) en donde: V, P, y k son como se ha definido anteriormente, y Z es un radical de una sustancia biológicamente activa o una sustancia para su uso en un método de diagnóstico, siendo dicha sustancia sustancialmente incapaz de atravesar por sí misma la BHE: Z-((V)k-P-NH (II1 ).

En una realización más preferida, las construcciones de la invención son aquellas, donde el fragmento P-Y se selecciona del grupo que consiste en:

un birradical de CKAPETALC-NH2 (SEQ ID NO: 4 e Y es NH2);

un birradical de CKAPETALCA-NH2 (SEQ ID NO: 5 e Y es NH2);

un birradical de CKAPETALCAA-NH2 (SEQ ID NO: 6 e Y es NH2);

un birradical de CKAPETALCAAA-NH2 (SEQ ID NO: 7 e Y es NH2); y

un birradical de CNCKAPETALCAAACH-NH2 (SEQ ID NO: 9 e Y es -NH2).

Las construcciones más preferidas son las seleccionadas del grupo que consiste en:

L-Dopa-CNCKAPETALCAAACH-NH2;

L-Dopa-CKAPETALC-NH2;

H-LPFFDGCNCKAPETALCAAACH-NH2 (R1 es H, Z es SEQ ID NO: 11, V es G, P es SEQ ID NO: 9, Y es NH2, siendo el fragmento de aminoácido LPFFDGCNCKAPETALCAAACH (SEQ ID NO: 13));

H-CNCKAPETALCAAACHGLPFFD-NH2 (R1 es H, P es SEQ ID NO: 9, W es G, Z es SEQ ID NO: 11, Y es NH2, siendo el fragmento de aminoácido CNCKAPETALCAAACHGLPFFD (SEQ ID NO: 14));

H-LPFFDGCKAPETALC-NH2 (R1 es H, Z es SEQ ID NO: 11, V es G, P es SEQ ID NO: 4, Y es NH2, siendo el fragmento de aminoácido LPFFDGCNCKAPETALCAAACH (SEQ ID NO: 15));

5(6)-carboxifluoresceína-CNCKAPETALCAAACH-NH2;

Biotina-CNCKAPETALCAAACH-NH2;

Sulforodamina B-GCNCKAPETALCAAACH-NH2;

Sulforodamina B-GCKAPETALC-NH2;

Lisozima-V3-CNCKAPETALCAAACH-NH2.

Otras construcciones que se encuentran entre las más preferidas son las seleccionadas del grupo que consiste en:

L-Dopa-(Dap)KAPETAL-NH2;

H-(Dap)KAPETALDKQIEIKKFK-NH2;

Cetuximab-V3-CNCKAPETALCAAACH-NH2;

Cetuximab-V2-DapKAPETALD-NH2;

Punto cuántico-PEG-NH-V1-DapKAPETALD-NH2; y

Nanopartícula de oro-CDapKAPETALD-NH2;

siendo V1

siendo V2

y siendo V3

en donde los enlaces 1 y 2 están conectados a la cadena lateral de una lisina de la carga que es una proteína o un anticuerpo.

Los compuestos peptídicos de fórmula (I) y fórmula (II), así como sus sales pueden existir en formas solvatadas y no solvatadas, incluyendo formas hidratadas. Por tanto, en su estructura pueden contener cantidades estequiométricas de disolvente en el caso de solvatos, o agua en el caso de hidratos. Debe entenderse que esta invención abarca todas las formas solvatadas, así como no solvatadas. La obtención de solvatos e hidratos depende del disolvente utilizado y de las condiciones de cristalización que puede determinar el experto en la materia.

Como se ha mencionado anteriormente según la carga de las construcciones de fórmula (II), serán útiles en la terapia o el diagnóstico.

Las construcciones de fórmula (II) definidas anteriormente, en donde Z es un radical de una sustancia biológicamente activa que es sustancialmente incapaz de atravesar por sí misma la BHE, para su uso como medicamento, forman parte de la invención. Preferentemente, las sustancias con actividad biológica son principios activos farmacéuticos, en particular, seleccionados del grupo de principios activos mencionados anteriormente.

También forman parte de la invención las construcciones de fórmula (II) donde Z es un radical de dopamina para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Esto también puede formularse como el uso de construcciones de fórmula (II) donde Z es un radical de dopamina en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Por lo tanto, este aspecto está relacionado con un método de tratamiento y/o profilaxis de un mamífero, incluyendo un ser humano, que padece o es susceptible de desarrollar la enfermedad de Parkinson, este método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (II) siendo Z un radical de dopamina, junto con excipientes y/o transportadores farmacéuticamente aceptables.

También forman parte de la invención las construcciones de fórmula (II) donde Z es un péptido radical del péptido LPFFD (SEQ ID NO: 11) para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. El uso del péptido LPFFD (SEQ ID NO: 9) para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer se describe en C. Soto et al., Nature Medicine 1998, vol.4, págs. 822-826. Este aspecto también puede formularse como el uso de construcciones de fórmula (II) donde Z es un radical peptídico del péptido LPFFD (SEQ ID NO: 11) para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, este aspecto también se refiere a un método para el tratamiento y/o la profilaxis de un mamífero, incluyendo un ser humano, que padece o es susceptible de desarrollar la enfermedad de Alzheimer, este método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (II), siendo Z un radical peptídico del péptido LPFFD (SEQ ID NO: 11) junto con excipientes o transportadores farmacéuticamente aceptables.

También forman parte de la invención las construcciones de fórmula (II) donde Z es un radical peptídico del péptido KQIEIKKFK (SEQ ID NO: 20), un bloqueador selectivo de hemicanales, para su uso en el tratamiento de la isquemia o la epilepsia. Este aspecto también puede formularse como el uso de construcciones de fórmula (II) donde Z es un radical peptídico del péptido KQIEIKKFK (SEQ ID NO: 20) para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la isquemia o la epilepsia. Por lo tanto, este aspecto también se refiere a un método de tratamiento de un mamífero, incluyendo un ser humano, que padece isquemia o epilepsia, este método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (II), siendo Z un radical peptídico del péptido KQIEIKKFK (SEQ ID NO: 20) junto con excipientes o transportadores farmacéuticamente aceptables.

También forman parte de la invención las construcciones de fórmula (II) donde Z es un anticuerpo para su uso en el tratamiento del cáncer. Son ejemplos de anticuerpos para su uso en el tratamiento del cáncer bevacizumab o cetuximab.

También son parte de la invención las construcciones de fórmula (II), donde Z es una nanopartícula de oro para su uso en terapias fototérmicas y fotodinámicas, así como para el suministro de fármacos y genes.

También se consideran parte de la invención las construcciones de fórmula (II), donde Z es una nanopartícula superparamagnética de óxido de hierro (nanopartícula SPION), un complejo de gadolinio o manganeso, para su uso como agente de contraste en un método de diagnóstico de obtención de imágenes por resonancia magnética. Esta técnica se utiliza para la localización e identificación de tumores malignos, metástasis de estos o recidivas. También se utiliza para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Este aspecto también puede formularse como el uso de una construcción de fórmula (II), donde Z es una nanopartícula superparamagnética de óxido de hierro (nanopartícula SPION), un complejo de gadolinio o manganeso, para la preparación de un agente de contraste para un método de obtención de imágenes por resonancia magnética. Preferentemente, Z es una nanopartícula superparamagnética de óxido de hierro (nanopartícula SPION).

La expresión "agente de contraste" se refiere a agentes que potencian la visibilidad de determinadas estructuras que, de otro modo, serían difíciles de observar durante la exploración. Estos agentes se utilizan para su inyección en el sistema vascular para una presentación local.

También son parte de la invención las construcciones de fórmula (II), donde Z es un radical de un compuesto fluorescente para su uso como sonda fluorescente en un método de obtención de imágenes utilizando microscopía bifotónica, obtención de imágenes in vivo de organismos vivos de manera no invasiva, sirviendo como herramienta de diagnóstico. Son ejemplos de compuestos fluorescentes adecuados 5(6)-carboxifluoresceína, rojo Texas, rodamina, sulforodamina o puntos cuánticos. Preferentemente, el compuesto fluorescente es 5(6)-carboxifluoresceína o puntos cuánticos.

Los compuestos peptídicos de fórmula (I) y las construcciones lanzadera - carga de fórmula (II) pueden generarse total o parcialmente mediante síntesis química. En el comercio se dispone de aminoácidos necesarios para la preparación de compuestos de fórmula (I). Los compuestos de fórmula (I) y las construcciones de fórmula (II) pueden prepararse fácilmente, por ejemplo, mediante síntesis en fase líquida o, preferentemente, mediante síntesis peptídica en fase sólida, para los que hay diversos procedimientos publicados (véase. M. Amblard, et al., "Methods and protocols of modern solid-phase peptide synthesis. Molecular Biotechnology 2006, Vol. 33, págs. 239-254). Los compuestos de fórmula (I) o las construcciones de fórmula (II) también pueden prepararse mediante cualquier combinación de síntesis en fase líquida y/o síntesis en fase sólida. Por ejemplo, sintetizando el cuerpo de la lanzadera mediante síntesis en fase sólida y, posteriormente eliminando los grupos protectores en solución. La unión de la carga a la lanzadera puede realizarse en fase sólida o en solución. La lanzadera particular y la unión a cargas específicas se desvelan con más detalle en los ejemplos.

Los péptidos de la invención también pueden obtenerse mediante la generación de un molde de ADN y la subclonación en un vector de expresión. (J.H. Lee et al. Eur. J. Biochem. 2001. vol. 268. págs. 2004-2012)

También forman parte de la invención las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de las construcciones lanzadera - carga de fórmula (II) definidas anteriormente, donde Z es un radical de una sustancia biológicamente activa, junto con cantidades apropiadas diluyentes y/o transportadores farmacéuticamente aceptables.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de un compuesto que, cuando se administra, es suficiente para impedir que se desarrollen, o aliviar en cierta medida, uno o más síntomas de la enfermedad que se esté tratando. La dosis particular del compuesto administrado según la presente invención, se determinará, por supuesto, según las circunstancias particulares del caso, incluido el compuesto administrado, la vía de administración, la afección particular a tratar y cuestiones similares.

La expresión "composición farmacéutica" se refiere a una mezcla de un compuesto descrito en el presente documento con otros componentes químicos, tales como diluyentes o transportadores. La composición farmacéutica facilita la administración del compuesto a un organismo.

La expresión "excipientes o transportadores farmacéuticamente aceptables" se refiere a un material, una composición o un vehículo farmacéuticamente aceptable. Cada componente debe ser farmacéuticamente aceptable en el sentido de ser compatible con los otros principios de la composición farmacéutica. También debe ser adecuado para su uso en contacto con los tejidos u órganos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, inmunogenicidad u otros problemas o complicaciones en consonancia con una relación de beneficio/riesgo. Una composición que comprende una construcción según la presente invención, puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, ya sea de manera simultánea o secuencial, dependiendo de la afección que se vaya a tratar.

Finalmente, también forman parte de la invención las composiciones con fines diagnósticos, que se han denominado agente de contraste o sondas fluorescentes en función del radical constructivo Z de fórmula (II). Estas composiciones comprenden una cantidad eficaz de las construcciones de lanzadera - carga de fórmula (II) definidas anteriormente, donde Z es un radical de una sustancia para su uso en un método de diagnóstico por RM o espectroscopia bifotónica, no pudiendo esta sustancia atravesar la BHE por sí misma, junto con cantidades apropiadas de excipientes o transportadores farmacéuticamente aceptables y/o aceptables para el diagnóstico.

La expresión "diagnóstico aceptable" se refiere a aquellos excipientes o transportadores adecuados para su uso en tecnología de diagnóstico. No deben afectar negativamente a la estabilidad, seguridad o eficacia de la composición. En general, los excipientes o transportadores farmacéuticamente aceptables y/o aceptables para el diagnóstico son un medio estéril fisiológicamente aceptable, es decir, soluciones acuosas isotónicas.

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse en forma parenteral adecuada para inyección, infusión o implantación en el cuerpo.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un kit que comprende el agente de contraste, según la presente invención, en un recipiente junto con instrucciones para su uso en un diagnóstico de obtención de imágenes por resonancia magnética.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un kit que comprende la sonda fluorescente, según la presente invención, en un recipiente junto con instrucciones para su uso en un método de diagnóstico mediante microscopía bifotónica.

A lo largo de toda la descripción y en las reivindicaciones, la palabra "comprende" y variaciones de la misma, no pretende excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Por otra parte, la palabra "comprende" abarca el caso de "consiste en". Otros objetos, ventajas y características de la invención, resultarán obvios para los expertos en la materia después de examinar la descripción o pueden aprenderse poniendo en práctica la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo ilustrativo y no pretenden limitar la presente invención. Por otra parte, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas descritas en el presente documento.

Ejemplos

Los aminoácidos protegidos, las asas y las resinas fueron suministrados por: Luxembourg Industries (Tel-Aviv, Israel), Neosystem (Estrasburgo, Francia), Calbiochem-Novabiochem AG (Laufelfingen, Suiza), Bachem AG (Bubendorf, Suiza) o Iris Biotech (Marktredwitz, Alemania). En la Tabla 1 se resumen otros reactivos y disolventes utilizados. Tabla 1 Proveedores comerciales y reactivos utilizados. El DCM se hizo pasar a través de una columna de AbO3. La DMF lm n n mi m l l r 4Á r nir n r limin r l n v l il .

Consideraciones generales sobre la síntesis. El alargamiento peptídico en fase sólida y otras manipulaciones en fase sólida, se llevaron a cabo manualmente en jeringas de polipropileno provistas de un disco poroso de polietileno. Los disolventes y reactivos solubles se eliminaron por succión. Se llevaron a cabo lavados entre diferentes etapas sintéticas con dimetilformamida (DMF) (5 x 0,5 min) y diclorometano (DCM) (5 x 0,5 min) utilizando 10 ml de disolvente/g de resina cada vez.

Ensayos de identificación. El ensayo utilizado para la identificación y el control de la síntesis fue el siguiente: A) Ensayo colorimétrico de Kaiser para la detección de aminas primarias unidas en fase sólida (E. Kaiser et al., Anal. Biochem.

1970, vol. 34, págs. 595-598); B) ensayo del éster p-nitrofenílico para aminas secundarias unidas a la fase sólida (A. Madder et al., Eur. J. Org. Chem. 1999, págs. 2787-2791).

Protocolos utilizados durante la síntesis de los compuestos peptídicos de fórmula (I) y las construcciones de fórmula (II). Las construcciones se sintetizaron a una escala de 100 pmol utilizando los siguientes métodos y protocolos: Escala de las síntesis. Todas las síntesis se realizaron en una escala de 100 pmol.

Acondicionamiento inicial de la resina. La resina Rink amide ChemMatrix se acondicionó lavando con MeOH (5 x 30 s), DMF (5 x 30 s), DCM (5 x 30 s), TFA al 1 % en DCM (1 x 30 s y 2 x 10 min), DCM (5 x 30 s), DMF (5 x 30 s), DCM (5 x 30 s), DOEA al 5 % en DCM (1 x 30 s, 2 x 10 min), DCM (5 x 30 s), DMF (5 x 30 s).

Eliminación del grupo Fmoc. La eliminación del grupo protector 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), se realizó con piperidina al 20 % (v/v) en DMF utilizando un tratamiento de 30 s seguido de dos tratamientos de 10 minutos cada uno. Para garantizar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias (prolina), se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5 %, 5 %, 20 %, 70 %) (2 x 5 min).

Métodos de acoplamiento descritos para escala de 100 umol:

Método de acoplamiento 1: A la resina, se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (4 eq., 400 umol), TBTU (4 eq., 400 umoles, 128 mg) disueltos en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (8 eq, 800 umol, 136 ul). Durante 1 h se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente. El disolvente se eliminó por succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser. Se eliminó el grupo Fmoc.

Método de acoplamiento 2: A la resina, se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (4 eq., 400 umoles), PyBOP (4 eq., 400 umoles, 208 mg), HOAt (12 eq., 1,2 mmol, 163 mg) disueltos en DMF (1-3 ml/g de resina), posteriormente se añadió DIEA (12 eq, 1,2 mmol, 204 ul). Durante 1 h se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente. El disolvente se eliminó por succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). La reacción de acoplamiento se llevó a cabo dos veces en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo colorimétrico de p-nitrofenil éster. Se eliminó el grupo Fmoc.

Acoplamiento de la carga (Z): Dependiendo de la naturaleza de la carga, estará ligado a la lanzadera de la BHE en fase sólida o en solución.

Acoplamiento de la carga en fase sólida: Dependiendo de la naturaleza de la carga, estará ligado a la lanzadera de la BHE a través de diferentes tipos de enlaces químicos.

A) Para cargas con un residuo COOH (por ejemplo, L-dopa, 5(6)-carboxifluoresceína, biotina) el acoplamiento de la carga a la lanzadera de la BHE se realizó en fase sólida: se utilizó la lanzadera de la BHE provista de un grupo NH2 y se hizo reaccionar con 4 eq de Carga-COOH, utilizando 4 eq de PyBOP y 12 eq de HOAt como reactivos de acoplamiento y 12 eq de DIEA como base en DMF durante 2 h. Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente. El disolvente se eliminó por succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió una vez. El grado de acoplamiento se comprobó mediante el ensayo de p-nitrofenilo. B) Para cargas con un cloruro de sulfonilo (por ejemplo, cloruro de sulfonilo de sulforodamina b) el acoplamiento de la carga a la lanzadera de la BHE se realizó en fase sólida: la lanzadera de la BHE provista de un grupo NH2 se utilizó y se hizo reaccionar con 2 eq. de Carga-SO2Cl utilizando 4 eq. de DIEA como base en DMF durante 1,5 h a 50 °C. Se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente. El disolvente se eliminó por succión y la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió una vez durante la noche.

Escisión final de la resina y desprotección de la cadena lateral: Se llevó a cabo tratando la resina con TFA (95 %), H2O (2,5 %) y TIS (2,5 %) (2 h). Al producto obtenido se le añadió terc-butiléter y la mezcla se centrifugó (3 x 8 min). Se descartó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en una mezcla de H2O, MeCN y TFA (1000: 1000: 1). El producto se filtró y se congeló.

El acoplamiento de las cargas proteicas:

El enlace de las cargas proteicas con la lanzadera de la BHE puede realizarse mediante una de las siguientes tecnologías.

Tecnol. 1 - Conjugación mediante una cicloadición de azida a alquino: El acoplamiento de lisozima a través de restos de lisina se realizó en solución utilizando el protocolo descrito en S.F.M. van Dongen et al.; Bioconjugate Chem. 2009, vol. 20, págs. 20-23 con algunas modificaciones. Resumiendo, a 25 ul de solución de carga (3,3-10" ⁹ mol) se añadió una solución acuosa de K2CO3 (10 ul, 2 mg/ml) junto con 0,7 ul de Cu²SO⁴ H2O. Después de mezclar, se añadió una solución de clorhidrato de imidazol-1-sulfonil azida en agua milliQ (2,7 ul, 25 mg/ml, 100 eq) y la reacción se agitó durante la noche. El tampón proteico se cambió por PBS utilizando una columna desalinizadora PD10 G25. A esta solución se añadieron 20 ul de péptido 5 mM. 450 ul de la solución resultante se mezclaron con 20 ul de ácido-hexinoico-péptido, 33,75 ul de 12,5 ul de CuSO⁴ premezclado con 25,0 ul de ligando (Tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina), 112,5 ul de aminoguanidina, 112,5 ul de ascorbato de sodio, 171,25 ul de PBS.

Tecnol. 2. Reducción-Alquilación de disulfuros de carga entre cadenas

2.1. Reducción limitada de disulfuro con DTT: La solución de carga se diluyó (2 mg ml^-1, 500 |jl) y se redujo parcialmente mediante DTT (3,25 eq) en borato de sodio 0,025 M pH 8, NaCl 0,025 M, EDTA 1 mM durante 2 h a 37 °C. El exceso de DTT se purificó de la carga parcialmente reducida por exclusión de tamaño (Nap 5, GE Healthcare siguiendo las instrucciones del fabricante). La concentración de tioles de cisteína-carga producida se determinó titulando con DTNB, normalmente dando como resultado de 3,0 a 4,0 tioles/carga. El conjugado se produce por alquilación de tioles libres con el péptido portador de malimida.

2.2. Reducción limitada de disulfuro con TCEP: La solución de carga se diluyó (2 mg ml^-1, 500 jl) y se redujo parcialmente por TCEP (2,5 eq respectivamente) en borato de sodio 0,025 M pH 8, NaCl 0,025 M, EDTA 1 mM durante 2 h a 37 °C. No se necesitó purificación. La concentración de tioles de cisteína-carga producida se determinó titulando con DTNB, normalmente dando como resultado de 3,0 a 4,0 tioles/carga. El conjugado se produce por alquilación de tioles libres con el péptido portador de malimida.

2.3. Reducción completa seguida de reoxidación parcial: Esta reacción se realiza con DTNB después de la reducción total con DTT: La solución de carga se diluyó (2 mg ml^-1, 500 jl) y se redujo totalmente por DTT (150 eq) en borato de sodio 0,025 M pH 8, NaCl 0,025 M, EDTA 1 mM durante 2 h a 37 °C. El exceso de DTT se purificó de la carga parcialmente reducida por exclusión de tamaño (Nap 5, GE Healthcare siguiendo las instrucciones del fabricante). La carga totalmente reducida se enfrió a 0 °C y después se trató con 2,0 equivalentes de DTNB (0 °C, 20 min). Sin purificación adicional, la carga se alquiló siguiendo el protocolo anterior (alquilación 1).

Alquilación: La carga parcialmente reducida se alquiló con 1,1 equiv molar de 5(6)-carboxifluoresceína-L-Lys(maleimido)-lanzadera de la BHE-NH2 o rodamina b-L-Lys(maleimido)-lanzadera de la BHE-NH2/tiol. La reacción de alquilación se realizó a 0 °C durante 30 min. Se utilizó cisteína (1 mM final) para inactivar cualquier exceso de 5(6)-carboxifluoresceína-L-Lys (maleimido)-lanzadera de la BHE-NH2 o rodamina b-L-Lys(maleimido)-lanzadera de la BHE-NH2 sin reaccionar. El exceso de péptido se eliminó de la carga parcialmente reducida por exclusión de tamaño (Nap 5, GE Healthcare siguiendo las instrucciones del fabricante). La concentración de carga se cuantificó utilizando Nanodrop.

Tecnol. 3 - Conjugación en el N terminal: 25 j l de solución de carga (3,310^-9 mol) se diluyeron con 75 j l de tampón fosfato 25 mM pH 6,5. Se disolvió piridoxal 5'-fosfato (PLP) (298 eq, 1,010^-7 mol, 2,510^-5 g) en 100 j l de tampón fosfato 25 mM y el pH se llevó a 6,5 con HCl 1 M. La solución de carga se mezcló con la solución de PLP y se incubó a 20 °C durante 48 h. Se utilizó una columna de exclusión por tamaño de Nap-5 para separar el exceso de moléculas pequeñas de la carga derivatizada utilizando tampón fosfato 25 mM pH 6,2. La carga se concentró a 100 j l utilizando un Vivaspin 500 con un MWCO (corte de peso molecular) de 50 kDa y se lavó dos veces con tampón fosfato 25 mM pH 6,2. El péptido lanzadera de la BHE portador de un residuo aminooxi (60 eq, 2,0-10' ⁷ mol) se disolvió en 50 j l de tampón fosfato 25 mM y el pH se llevó a 6,2 con HCl acuoso 1 M. La carga transaminada de la columna Nap-5 se mezcló con la solución peptídica y con 50 j l de una solución de anilina 410 ­ ³ M (60 eq, 2,010 ^-7 mol, 1,9-10^-5 g); la mezcla se dejó reaccionar durante 48 h. El exceso de reactivos se eliminó utilizando una columna de exclusión por tamaño Nap-5 con tampón fosfato 25 mM pH 6,2.

Tecnol. 4 - Conjugación en carbohidratos: 25 j l de solución de carga (3,310^-9 mol) se diluyeron con 75 j l de PBS pH 7,2 y se mezclaron con 10 j l de NalO⁴ 0,1 M en agua (54 eq, 1,0-10^-6 mol, 2,110^-4 g). La mezcla se dejó reaccionar durante 2 h a 4 °C preservada de la luz. Se utilizó una columna de exclusión por tamaño de Nap-5 para separar el exceso de moléculas pequeñas de la carga derivatizada utilizando tampón fosfato 50 mM pH 6,2. El péptido lanzadera de la BHE portador de un residuo aminooxi (60 eq, 2,010^-7 mol) se disolvió en 50 j l de tampón fosfato 25 mM y el pH se llevó a 6,2 con HCl acuoso 1 M. La carga transaminada de la columna Nap-5 se mezcló con la solución peptídica y con 50 j l de una solución de anilina 410 ^-3 M (60 eq, 2,010 ^-7 mol, 1,910^-5 g); la mezcla se dejó reaccionar durante 48 h. El exceso de reactivos se eliminó utilizando una columna de exclusión por tamaño Nap-5 con tampón fosfato 25 mM pH 6,2.

Métodos de ciclación:

La ciclación puede realizarse antes o después de conectar la carga a la lanzadera de la BHE.

Método de ciclación 1: enlace disulfuro o enlace Se-Se: La ciclación se realizó en solución. El péptido se disolvió a una concentración de 100 jM en tampón de bicarbonato de amonio acuoso 10 mM y a un pH de 8,0. La solución se agitó durante 24 h a temperatura ambiente. Después de eso, el producto se acidificó con TFA a un pH de 2-3, se congeló y se liofilizó.

Método de ciclación 2: enlace amida: La ciclación se realizó sobre resina. Los grupos OAII y Alloc se desprotegieron primero mediante la adición de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) (0,1 eq, 10 jM, 12 mg), fenilsilano (10 eq, 1000 jmol, 123 mg) en DCM (3 x 15 min). La resina se lavó con dietilcarbamato de sodio 0,02 M en DCM (3 x 5 min). El acoplamiento del grupo amino de Dap y el grupo carboxilato del ácido aspártico se logró después mediante la adición de PyBOP (4 eq, 400 jmoles, 208 mg), HOAt (12 eq, 1,2 mmol, 163 mg), DMF (1-3 ml/g de resina) y DIEA (12 eq, 1,2 mmol, 204 jl). El acoplamiento se permitió durante 1,5 h y se repitió durante la noche.

Método de ciclación 3: enlace C=C: La ciclación se realiza sobre resina. La ciclación se logra mediante metátesis de olefinas utilizando el catalizador de primera generación de Grubb como se describe en G.L. Verdine et al., Methods in Enzymology. 2012. vol. 503. págs. 3-33.

Método de ciclación 4: enlace C-C: La ciclación se realiza sobre resina. Siguiendo el método de ciclación 3 se forma un enlace C=C y el péptido resultante se hidrogena utilizando el catalizador de Wilkinson en un disolvente desoxigenado seco (MeOH al 10 %/DCM) como se describe en A.N. Whelan et al., Tetrahedron letters. 2004. vol.

20. págs. 9545-9547.

Método de ciclación 5: enlace tioéter: El enlace tioéter se logra mediante la desulfuración y posterior ciclación de un puente de cistina como se describe en J. Malcor. et al. J. Med. Chem. 2012. vol 55. págs. 2227-2241.

Caracterización de productos: La identidad de los diferentes compuestos peptídicos sintetizados con fórmula I y II (lanzadera o combinación de lanzadera-carga peptídica), se confirmó utilizando espectrometría de masas "Desorción/lonización láser asistida por matriz-Espectrometría de masas" (MALDI, Matrix Assisted Laser Desorption/lonization-Mass Spectrometry) (Instrumento: MALDI Voyager DE RP tiempo de vuelo (TOF, time-of-flight) PE Biosystem) o HPLC-MS (Instrumento: Waters modelo Alliance 2695, bomba cuaternaria, detector UV/Vis modelo 2998, ESI-MS modelo Micromass ZQ y el programa informático Masslynx versión 4.1) utilizando una columna Sunfire C18 (100 x 2,1 mm x 3,5 pm) de 100 A con un flujo de 0,3 ml/min; disolventes: A: H2O con ácido fórmico al 0,1 %; B: MeCN con ácido fórmico al 0,07 %. Su pureza se comprobó mediante HPLC (high performance liquid chromatography, cromatografía líquida de alto rendimiento) de fase inversa utilizando una columna Sunfire (100 x 4,6 mm x 5 pm, 100 A, Waters) y una columna Sunfire C18 (100 x 4,6 mm x 3,5 pm, 100 A, Waters), flujo 1 ml/min; disolventes: A: H2O con TFA al 0,045 %; B: MeCN con TFA al 0,036 %, Instrumento: Waters modelo Alliance 2695 constituido por una bomba cuaternaria, un detector de matriz de diodos modelo 2998, controlado por el programa informático EmpowerPro 2. Análisis de aminoácidos: El contenido y la proporción de aminoácidos presentes en una muestra que contiene péptidos se determinaron mediante análisis cromatográfico de intercambio iónico después de hidrólisis ácida. La hidrólisis se realizó con HCl 6 M a 110 °C durante 16 h. Después de ese tiempo, la mezcla se evaporó hasta la sequedad a presión reducida. El residuo se disolvió en HCl acuoso 20 mM, se derivatizó utilizando el protocolo AccQ Tag de Waters y finalmente se analizó con HPLC de intercambio iónico.

Los conjugados proteicos se caracterizaron por HPLC-ESI MS utilizando un LCT-Premier (Waters) con un cromatógrafo Acquity UPLC binary Sol MGR (Waters) y una columna BioSuite pPhenyl 1000RPC de 2,0 x 75 mm, 10 pm. Eluyentes: A: agua y B: acetonitrilo, ambos con ácido fórmico al 0,1 %. Gradiente: del 5 % al 80 % (eluyente B) en 60 min y a un caudal de 100 pl/min.

La electroforesis SDS-PAGE se llevó a cabo utilizando el sistema BioRad (celda Miniprotean), gel Tris al 7,5 %, Tris 25 mM, glicina 192 mM, tampón de ejecución SDS al 0,1 %). Los pesos moleculares de las proteínas se aproximaron por comparación con un marcador de proteínas (Perfect Protein Markers 15-150 kDa de Novagen). Los geles se visualizaron mediante tinción de Coomassie (solución de tinción: AcOH al 10 %, 0,25 g de azul brillante; solución decolorante: MeOH al 20 %, AcOH glacial al 3 %, en agua). Para cuantificar la cantidad de péptidos conjugados en el N-terminal, se utilizó la secuenciación de Edman (4 primeros ciclos).

Los compuestos peptídicos se purificaron mediante HPLC utilizando una columna Sunfire C18 (100 x 19 mm x 5 pm 100 A, Waters), flujo 15 ml/min, disolventes: A: H2O con TFA al 0,1 %; B: MeCN con TFA al 0,1 %, Instrumento: Sistema Waters con una bomba cuaternaria, Autoinyector Simple Manager 2700, Detector UVNis modelo 2487 y un colector de fracciones II, controlado con el programa informático Masslynx versión 3.5.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de H-Cvs-Asn-Cvs-Lvs-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cvs-Ala-Ala-Ala-Cvs-His-NH? (compuesto de fórmula (I) donde P es SEQ ID NO: 9, R1 es H e Y es NH? )

Para el acoplamiento con la resina del primer aminoácido protegido, se aplicó el método de acoplamiento 1 utilizando Fmoc-His(Trt)-OH (248 mg). Los siguientes aminoácidos se acoplaron secuencialmente de la siguiente manera utilizando el método de acoplamiento 1:

El péptido se escindió y se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 1.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 4,2 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 1600,7; Rendimiento (síntesis y purificación): 5 %.

Ejemplo 2: Preparación de H-Cys-Lys-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cys-NH2 (SEQ ID NO: 4, R1 es H e Y es NH2) Para el acoplamiento con la resina del primer aminoácido protegido, se aplicó el método de acoplamiento 1 utilizando Fmoc-Cys(Trt)-OH (234 mg). Los siguientes aminoácidos se acoplaron secuencialmente de la siguiente manera utilizando el método de acoplamiento 1:

El péptido se escindió y se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 1.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 4,0 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 934,4; Rendimiento (síntesis y purificación): 10 %. Ejemplo 3: Preparación de H-Dap-Lvs-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Asp-NH? (compuesto de fórmula (I) donde P es SEQ ID NO: 12, R1 es H e Y es NH? )

Para el acoplamiento con la resina del primer aminoácido protegido, se aplicó el método de acoplamiento 1 utilizando Fmoc-Asp(OAII)-OH (155 mg). Los siguientes aminoácidos se acoplaron secuencialmente de la siguiente manera utilizando el método de acoplamiento 1:

Para la conexión de Fmoc-Dap(Alloc)-OH se aplicó el método de acoplamiento 1 utilizando 171 mg de aminoácido pero no se eliminó el grupo Fmoc. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 2. El grupo Fmoc se eliminó del N terminal. A continuación, el péptido se escindió y se liofilizó.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 3,9 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 912,5; Rendimiento (síntesis): 40 %.

Ejemplo 4: Preparación de H-Cys-Lys-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cys-NH2 con un puente de lantionina que liga los dos restos terminales del péptido (compuesto de fórmula (I) donde P es SEQ ID NO: 4, R1 es H e Y es NH2 con un enlace tioéter intrapeptídico)

El procedimiento del Ejemplo 2 se repitió hasta la etapa de ciclación. La cistina (enlace disulfuro) se transformó después en una lantionina (enlace tioéter) mediante el método de ciclación 5.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Xselect C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 130 A, Waters, columna protectora de 20 mm), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 5,8 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 900,5; Rendimiento (transformación de Ap5ba después de la purificación): 18 %.

Ejemplo 5: Preparación de H-Lys-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-NH2 (compuesto de fórmula (I) donde P es SEQ ID NO: 10, R1 es H e Y es NH2)

Para el acoplamiento con la resina del primer aminoácido protegido, se aplicó el método de acoplamiento 1 utilizando Fmoc-Leu-OH (141 mg). Los siguientes aminoácidos se acoplaron secuencialmente de la siguiente manera:

El péptido se escindió y se liofilizó.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 3,8 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 728,5; Rendimiento (síntesis y purificación): 30 %.

Ejemplo 6: Preparación de H-CEC(CH2)rC(C=O)-Cys-Asn-Cys-Lys-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cys-Ala-Ala-Ala-Cys-His-NH2 (compuesto de fórmula (I) donde P es SEQ ID NO: 9, V es -CECÍCH? )rCÍC=O)-. R1 es H e Y es NH? )

El procedimiento del Ejemplo 1 se repitió hasta el acoplamiento del decimosexto aminoácido. Para el acoplamiento del ácido hexinoico a la lanzadera de la BHE anclada sobre la resina, se utilizó el siguiente protocolo: a la resina se añadieron secuencialmente ácido hexinoico (4 eq., 400 pmoles, 45 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq., 400 pmoles, 208 mg) y HOAt (12 eq., 1,2 mmol, 163 mg) seguido de la adición de 12 eq. de DIEA (1,2 mmol, 204 pl). Durante 1 h, se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser. El péptido se escindió y se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 1.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 4,6 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 1695,0; Rendimiento (síntesis y purificación): 4 %.

Ejemplo 7: Preparación de H-CEC(CH2)rC(C=O)-Cys-Lys-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cys-NH2 (compuesto de fórmula (I) donde P es SEQ ID NO: 4, V es -CEC(CH2)rC(C=O)-, R1 es H e Y es NH2)

El procedimiento del Ejemplo 2 se repitió hasta el acoplamiento del noveno aminoácido. Para el acoplamiento del ácido hexinoico a la lanzadera de la BHE anclada sobre la resina, se utilizó el siguiente protocolo: a la resina se añadieron secuencialmente ácido hexinoico (4 eq., 400 pmoles, 45 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq., 400 pmoles, 208 mg) y HOAt (12 eq., 1,2 mmol, 163 mg) seguido de la adición de 12 eq. de DIEA (1,2 mmol, 204 pl). Durante 1,5 h, se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser. El péptido se escindió y se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 1.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 4,5 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 1048,6; Rendimiento (síntesis): 35 %.

Ejemplo 8: Preparación de male¡m¡da-ÍCH2)s-CÍ=O)-Dap-Lvs-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Asp-NH2 (compuesto de fórmula (I) donde P es SEQ ID NO: 12, V es -(CH2)s-C(=O)-. R1 es maleimida e Y es NH2)

El procedimiento del Ejemplo 2 se repitió hasta la etapa de ciclación. Para el acoplamiento del ácido maleimidohexanoico a la lanzadera de la BHE anclada sobre la resina, se utilizó el siguiente protocolo: se eliminó el grupo protector Fmoc, después, a la resina se añadieron secuencialmente ácido maleimidohexanoico (4 eq., 400 pmoles, 45 mg) en DmF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq., 400 pmoles, 208 mg) y HOAt (12 eq., 1,2 mmol, 163 mg) seguido de la adición de 12 eq de DIEA (1,2 mmol, 204 pl). Durante 1,5 h, se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser. El péptido se escindió y se liofilizó.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de 0 a 100 % MeCN en H2O en 8 minutos utilizando un Sunfire C18 columna (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 3,7 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 1105,2; Rendimiento (después de la síntesis y purificación): 10 %.

Ejemplo 9: Preparación de H-Cys-Dap-Lys-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Asp-NH? (compuesto de fórmula (I) donde P es SEQ ID NO: 12, V es S-CH?-CH(NH? )-C (= O), R1 es H e Y es NH2)

El procedimiento del Ejemplo 3 se repitió hasta la etapa de ciclación. Para el acoplamiento de Fmoc-Cys(Trt)-OH a la lanzadera de la BHE anclada sobre la resina, se utilizó el siguiente protocolo: se eliminó el grupo protector Fmoc del péptido, después, a la resina se añadieron secuencialmente Fmoc-Cys(Trt)-OH (4 eq., 400 pmoles, 234 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq., 400 pmoles, 208 mg) y HOAt (12 eq.,1,2 mmol, 163 mg) seguido de la adición de 12 eq. de DIEA (1,2 mmol, 204 pl). Durante 1,5 h, se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser. Se eliminó el grupo Fmoc de Cys. El péptido se escindió y se liofilizó.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de 0 a 100 % MeCN en H2O en 8 minutos utilizando un Sunfire C18 columna (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 3,7 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 1015,5; Rendimiento (después de la síntesis y purificación): 9 %.

Ejemplo 10: Preparación de 5(6)-carboxifluoresceína-Cys-Asn-Cys-Lys-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cys-Ala-Ala-Ala-Cys-His-NH2 (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO: 9 y 5(6)-carboxifluoresceína como carga o grupo Z)

El procedimiento del Ejemplo 1 se repitió hasta el acoplamiento del decimosexto aminoácido. Para el acoplamiento de la (5)6-carboxifluoresceína a la lanzadera de la BHE anclada sobre la resina, se utilizó el siguiente protocolo: a la resina se añadieron secuencialmente 5(6)-carboxifluoresceína (4 eq., 400 pmoles, 151 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq., 400 pmoles, 208 mg) y HOAt (12 eq., 1,2 mmol, 163 mg) seguido de la adición de 12 eq. de DIEA (1,2 mmol, 204 pl). Durante 1,5 h, se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser. Los ésteres bencílicos que pudieran haberse formado se eliminaron mediante tres tratamientos de 1 min con una solución al 20 % de piperidina en DMF (v/v). El péptido se escindió y se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 1. Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 5,0 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 1962,9; Rendimiento (síntesis y purificación): 3 %. Ejemplo 11: Preparación de 5(6)-carboxifluoresceína-Gly-Cys-Asn-Cys-Lys-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cys-Ala-Ala-Ala-Cys-His-NH2 (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO: 9, Gly como V y 5(6)-carboxifluoresceína como carga o grupo Z)

El procedimiento del Ejemplo 1 se repitió hasta el acoplamiento del decimosexto aminoácido. A continuación, se ligó Fmoc-Gly-OH utilizando el método de acoplamiento 1. Para el acoplamiento de la (5)6-carboxifluoresceína a la lanzadera de la BHE anclada sobre la resina, se utilizó el siguiente protocolo: a la resina se añadieron secuencialmente 5(6)-carboxifluoresceína (4 eq., 400 pmoles, 151 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq., 400 pmoles, 208 mg) y HOAt (12 eq., 1,2 mmol, 204 mg) seguido de la adición de 12 eq. de DIEA (1,2 mmol, 204 pl). Durante 1,5 h, se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser. Los ásteres bencílicos que pudieran haberse formado se eliminaron mediante tres tratamientos de 1 min con una solución al 20 % de piperidina en DMF (v/v). El péptido se escindió y se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 1.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 5.0 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 2019,8; Rendimiento (síntesis y purificación): 5 %.

Ejemplo 12: Preparación de 5(6)-carboxifluoresceína-Gly-Dap-Lys-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cys-Asp-NH² (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO: 12, Gly como V y 5(6)-carboxifluoresceína como carga o grupo Z)

El procedimiento del Ejemplo 3 se repitió hasta el acoplamiento del noveno aminoácido. Después de la eliminación del grupo Fmoc, se ligó una glicina utilizando el método de acoplamiento 1. Para el acoplamiento de la (5)6-carboxifluoresceína a la lanzadera de la BHE anclada sobre la resina, se utilizó el siguiente protocolo: a la resina se añadieron secuencialmente 5(6)-carboxifluoresceína (4 eq., 400 pmoles, 151 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq., 400 pmoles, 208 mg) y HOAt (12 eq., 1,2 mmol, 163 mg) seguido de la adición de 12 eq. de DIEA (1,2 mmol, 204 pl). Durante 1,5 h, se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser. Los ésteres bencílicos que pudieran haberse formado se eliminaron mediante tres tratamientos de 1 min con una solución al 20 % de piperidina en DMF (v/v). El péptido se escindió y se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 1.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 5.0 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 1327,6; Rendimiento (síntesis y purificación): 7 %.

Ejemplo 13 Preparación de sulforodamina b-Glv-Cvs-Asn-Cvs-Lvs-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cvs-Ala-Ala-Ala-Cvs-His-NH2 (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO:9, Gly como V y sulforodamina b como carga o grupo Z)

El procedimiento del Ejemplo 1 se repitió hasta el acoplamiento del decimosexto aminoácido. Para el acoplamiento del espaciador (Gly) a la lanzadera de la BHE anclada sobre la resina, se aplicó el método de acoplamiento 1 utilizando Fmoc-Gly-OH (4 eq. 400 pmoles, 119 mg), TBTU (4 eq., 400 pmoles, 128 mg).

Para el acoplamiento de la sulforodamina b a la lanzadera H-Gly de la BHE anclada sobre la resina, se utilizó el siguiente protocolo: a la resina se añadió sulforodamina b (2 eq., 200 pmoles, 115 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina) seguido de la adición de 4 eq. de DIEA (400 pmol, 68 pl). Se dejó reaccionar la mezcla durante la noche a 50 °C. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió en las mismas condiciones. El péptido se escindió y se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 1.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 5,3 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 2199,0; Rendimiento (síntesis y purificación): 1 %.

Ejemplo 14: Preparación de sulforodamina b-Glv-Cvs-Lvs-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cvs-NH? (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO:4, Gly como V y sulforodamina b como carga o grupo Z)

El procedimiento del Ejemplo 2 se repitió hasta el acoplamiento del noveno aminoácido. Para el acoplamiento del espaciador (Gly) a la lanzadera de la BHE anclada sobre la resina, se aplicó el método de acoplamiento 1 utilizando Fmoc-Gly-OH (4 eq. 400 pmoles, 119 mg), TBTU (4 eq., 400 pmoles, 128 mg).

Para el acoplamiento de la sulforodamina b a la lanzadera H-Gly de la BHE anclada sobre la resina, se utilizó el siguiente protocolo: a la resina se añadió sulforodamina b (2 eq.,200 pmoles, 115 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina) seguido de la adición de 4 eq. de DIEA (400 pmol, 68 pl). Se dejó reaccionar la mezcla durante la noche a 50 °C. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió en las mismas condiciones. El péptido se escindió y se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 1.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Sunfire Ci ⁸ (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 5,3 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 1531,6; Rendimiento (síntesis): 4 %.

Ejemplo 15: Preparación de biotina-Cys-Asn-Cys-Lys-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cys-Ala-Ala-Ala-Cys-H¡s-NH2 (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO: 9 y biotina como carga o grupo Z)

El procedimiento del Ejemplo 1 se repitió hasta el acoplamiento del decimosexto aminoácido. Para el acoplamiento de la biotina a la lanzadera de la BHE anclada sobre la resina, se utilizó el siguiente protocolo: a la resina se añadieron secuencialmente biotina (4 eq., 400 pmoles, 98 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq., 400 pmoles, 208 mg) y HOAt (12 eq., 1,2 mmol, 163 mg) seguido de la adición de 12 eq. de DIEA (1,2 mmol, 204 pl). Durante 1,5 h, se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser. El péptido se escindió y se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 1.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 4,6 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 1868,9; Rendimiento (síntesis y purificación): 5 %.

Ejemplo 16: Preparación de L-Dopa-Cys-Asn-Cys-Lys-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cys-Ala-Ala-Ala-Cys-His-NH2 (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO: 9 y L-Dopa como carga o grupo Z)

El procedimiento del Ejemplo 1 se repitió hasta el acoplamiento del decimosexto aminoácido. Para el acoplamiento de la L-dopa a la lanzadera de la BHE anclada sobre la resina, se utilizó el siguiente protocolo: a la resina se añadieron secuencialmente L-dopa (4 eq., 400 pmoles, 79 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq., 400 pmoles, 208 mg) y HOAt (12 eq., 1,2 mmol, 163 mg) seguido de la adición de 12 eq. de DIEA (1,2 mmol, 204 pl). Durante 1,5 h, se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser. El péptido se escindió y se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 1.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 4.2 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 1779,8; Rendimiento (síntesis y purificación): 4 %.

Ejemplo 17: Preparación de L-Dopa-Cys-Lys-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cys-NH2 (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO: 4 y L-Dopa como carga o grupo Z)

El procedimiento del Ejemplo 2 se repitió hasta el acoplamiento del noveno aminoácido. Para el acoplamiento de la L-dopa a la lanzadera de la BHE anclada sobre la resina, se utilizó el siguiente protocolo: a la resina se añadieron secuencialmente L-dopa (4 eq., 400 pmoles, 79 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq., 400 pmoles, 208 mg) y HOAt (12 eq., 1,2 mmol, 163 mg) seguido de la adición de 12 eq. de DIEA (1,2 mmol, 204 pl). Durante 1,5 h, se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser. El péptido se escindió y se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 1.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 4,0 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 1111,6; Rendimiento (síntesis): 20 %.

Ejemplo 18: Preparación de L-Dopa-Dap-Lvs-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Asp-NH? (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO: 12 y L-Dopa como carga o grupo Z)

El procedimiento del Ejemplo 3 se repitió hasta el acoplamiento del noveno aminoácido y la ciclación. Para el acoplamiento de la L-dopa a la lanzadera de la BHE anclada sobre la resina, se utilizó el siguiente protocolo: El grupo Fmoc se desprotegió, a la resina se añadieron secuencialmente L-dopa (4 eq., 400 pmoles, 79 mg) en DMF (1-3 ml/g de resina), PyBOP (4 eq., 400 pmoles, 208 mg) y HOAt (12 eq., 1,2 mmol, 163 mg) seguido de la adición de 12 eq. de DIEA (1,2 mmol, 204 pl). Durante 1,5 h, se dejó reaccionar la mezcla con agitación manual intermitente. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 x 30 s). El acoplamiento se repitió en las mismas condiciones. El grado de acoplamiento se controló utilizando el ensayo colorimétrico de Kaiser. El péptido se escindió y se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 1.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Xselect C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 130 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 5.2 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 1091,6; Rendimiento (síntesis y purificación): 8 %.

Ejemplo 19: Preparación de H-Leu-Pro-Phe-Phe-Asp-Glv-Cvs-Asn-Cvs-Lvs-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cvs-Ala-Ala-Ala-Cvs-His-NH? (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO: 13 que corresponde a la SEC ID NO: 9, Glv como V v Leu-Pro-Phe-Phe-Asp (SEQ ID NO: 11) como carga o grupo Z)

El procedimiento del Ejemplo 1 se repitió hasta el acoplamiento del noveno aminoácido. Para el acoplamiento del espaciador (Glv) (acoplamiento 17) a la lanzadera de la BHE anclada sobre la resina, se aplicó el método de acoplamiento 1 utilizando Fmoc-Glv-OH (4 eq. 400 pmoles, 119 mg), TBTU (4 eq., 400 pmoles, 128 mg).

Los aminoácidos de la carga se acoplaron secuencialmente de la siguiente manera:

El péptido se escindió v se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 1.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 4,8 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 2276,9; Rendimiento (síntesis v purificación): 3 %.

Ejemplo 20: Preparación de H-Leu-Pro-Phe-Phe-Asp-Glv-Cvs-Lvs-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cvs-NH2 (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO: 15 que corresponde a la SEQ ID NO: 4. Glv como V v Leu-Pro-Phe-Phe-Asp (SEQ ID NO: 11) como carga o grupo Z)

El procedimiento del Ejemplo 2 se repitió hasta el acoplamiento del decimosexto aminoácido. Para el acoplamiento del espaciador (Glv) (acoplamiento 10) a la lanzadera de la BHE anclada sobre la resina, se aplicó el método de acoplamiento 1 utilizando Fmoc-Glv-OH (4 eq. 400 pmoles, 119 mg), TBTU (4 eq., 400 pmoles, 128 mg).

Los aminoácidos de la carga se acoplaron secuencialmente de la siguiente manera:

El péptido se escindió v se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 1.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 4,9 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 1610,9; Rendimiento (síntesis): 30 %.

Ejemplo 21: Preparación de l¡soz¡ma-V³-Cvs-Asn-Cvs-Lvs-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cvs-Ala-Ala-Ala-Cvs-H¡s-NH? (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO: 9, V3 como V v lisozima como carga o grupo Z)

El ejemplo 6 se repitió hasta la etapa de escisión. El acoplamiento de lisozima a través de restos de lisina se realizó en solución utilizando la conjugación mediante una cicloadición de azida a alquino (Tecnol. 1). El espectro EM MALDI-TOF, reveló la formación de conjugados portadores de 0-5 péptidos con un promedio de 0,4 péptidos/molécula de lisozima.

Ejemplo 22: Preparación de cetuximab-V³-Cvs-Asn-Cvs-Lvs-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cvs-Ala-Ala-Ala-Cvs-His-NH² (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO: 9, V3 como V v cetuximab como carga o grupo Z) El ejemplo 6 se repitió hasta la etapa de escisión. El acoplamiento de cetuximab a través de restos de lisina se realizó en solución utilizando la conjugación mediante una cicloadición de azida a alquino (Tecnol. 1). El espectro de masas HPLC-ESI v la SDS-PAGE revelaron la formación de conjugados portadores de 0-6 péptidos con un promedio de 2 péptidos/molécula de cetuximab.

Ejemplo 23: Preparación de cetuximab-Vy-Dap-Lvs-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Asp-NH? (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO: 12, V? como V v cetuximab como carga o grupo Z)

El ejemplo 8 se repitió hasta la etapa de escisión. El acoplamiento de cetuximab a través de los restos de cisteína intercadena parcialmente reducidos se realizó en solución utilizando Tecnol. 2.1. El espectro de masas HPLC-ESI y la SDS-PAGE revelaron la formación de conjugados portadores de 0-4 péptidos con un promedio de 2 péptidos/molécula de cetuximab.

Ejemplo 24: Preparación de punto cuántico-PEG-NH-Vi -Dap-Lvs-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Asp-NH2 (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO: 12, Vi como V v punto cuántico-PEG-NHy como carga o grupo Z) El ejemplo 9 se repitió hasta la etapa de escisión. El acoplamiento de punto cuántico-PEG-NH2 se realizó según lo descrito por W. Cai et al., Nature Protocols 2008, vol. 3, págs. 89-96. Utilizando análisis de aminoácidos, se cuantificaron 52 péptidos por punto cuántico.

Ejemplo 25: Preparación de nanopartícula de oro-Cvs-Dap-Lvs-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Asp-NH2 (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO: 12, Cvs como V v Cetuximab como carga o grupo Z)

El ejemplo 9 se repitió hasta la etapa de escisión. La síntesis de nanopartículas de oro v la conjugación con la lanzadera peptídica se realizó según lo descrito por Prades. et al. Biomaterials 2012, vol. 33, págs. 7194-7205. Utilizando análisis de aminoácidos, se cuantificaron 1205 péptidos por nanopartícula de oro.

Ejemplo 26: Preparación de H-Cvs-Asn-Cvs-Lvs-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cvs-Ala-Ala-Ala-Cvs-His-Glv-Leu-Pro-Phe-Phe-Asp-NH2 (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO: 14 que corresponde a la SEQ ID NO: 9, Glv como V v Leu-Pro-Phe-Phe-Asp-NH2 como carga en el C terminal o grupo Z)

Para el acoplamiento con la resina del primer aminoácido protegido, se aplicó el método de acoplamiento 1 utilizando Fmoc-His(Trt)-OH (248 mg). Los siguientes aminoácidos se acoplaron secuencialmente de la siguiente manera utilizando el método de acoplamiento 1:

El péptido se escindió v se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 1.

La etapa de escisión se realizó tratando la resina con una mezcla de TFA (95 %) v H2O (2,5 %) (1 x 2 h). Al producto obtenido se le añadió terc-butilmetiléter v la mezcla se centrifugó (3 x 8 min). Se eliminó el sobrenadante v el sedimento se resuspendió en una mezcla de H2O, MeCN v TFA (1000: 1000: 1). El producto se filtró, se congeló v se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método 1.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 100 A, Waters), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 5,0 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 2276,9; Rendimiento (síntesis v purificación): 7 %.

Ejemplo 27: Preparación de H-Dap-Lvs-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Asp-Lvs-Gln-Ile-Glu-Ile-Lvs-Lvs-Phe-Lvs-NH? (Compuesto de fórmula (II) que comprende la SEQ ID NO: 19 que corresponde a la SEQ ID NO: 12 v Lvs-Gln-Ile-Glulle-Lvs-Lvs-Phe-Lvs-NH2 (SEQ ID NO: 20) como carga en el C terminal o grupo Z)

Para el acoplamiento con la resina del primer aminoácido protegido, se aplicó el método de acoplamiento 1 utilizando Fmoc-Lvs(Boc)-OH (182 mg).

Los siguientes aminoácidos se acoplaron secuencialmente de la siguiente manera utilizando el método de acoplamiento 1:

El Fmoc-Dap (Alloc)-OH se acopló utilizando 164 mg de aminoácido protegido utilizando el método de acoplamiento 1 pero sin eliminar Fmoc. La ciclación se realizó siguiendo el método de ciclación 2. El péptido se escindió v se liofilizó. La etapa de escisión se realizó tratando la resina con una mezcla de TFA (95 %) v H2O (2,5 %) (1 x 2 h). Al producto obtenido se le añadió terc-butilmetiléter v la mezcla se centrifugó (3 x 8 min). Se eliminó el sobrenadante v el sedimento se resuspendió en una mezcla de H2O, MeCN v TFA (1000: 1000: 1). El producto se filtró, se congeló v se liofilizó. La ciclación se realizó siguiendo el método 1.

Caracterización del producto. HPLC de fase inversa: gradiente lineal de MeCN del 0 a 100 % en H2O en 8 minutos utilizando una columna Xselect C18 (100 mm x 4,6 mm, 3,5 mm, 130 A, Waters, columna protectora de 20 mm), flujo de 1 ml/min; Tiempo de retención: 5,9 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): [M H]+: 2055,2; Rendimiento (síntesis v purificación): 6 %.

Ejemplo 28: Evaluación del transporte a través de la BHE utilizando un ensavo in vitro con células bovinas

El método de evaluación elegido para ensavar los compuestos de fórmula (I) v (II) de la invención fue un ensavo basado en células que consistía en un cocultivo de células endoteliales cerebrales v astrocitos, que permite evaluar o predecir el transporte de compuestos a través de la BHE. El método de cocultivo utilizado fue descrito por Gaillard v de Boer en 2008 (Gaillard, Pj et al. "2B-Trans technologv: targeted drug deliverv across the blood-brain barrieñ' Methods Mol Biol 2008, vol. 437 págs. 161-175) v consiste en sembrar astrocitos de rata en un lado de un filtro de policarbonato (transwell) v células endoteliales de cerebro bovino en el otro lado del filtro. En estas condiciones, las células endoteliales pueden alcanzar la confluencia imitando a la BHE. El sistema permite estudiar el transporte de compuestos que pueden atravesar la BHE mediante un mecanismo de transporte pasivo v/o activo. Es un modelo habitualmente utilizado en estudios de penetración v toxicidad de compuestos a través de la BHE.

El ensavo de cocultivo se utilizó para determinar la capacidad de las construcciones de lanzadera - carga para atravesar la BHE. La permeabilidad aparente de los compuestos se midió por triplicado a una concentración de 200 pM en los Ejemplos 1, 2, 3, 5, 10, 13, 15, 16, 17 v 19 v a una concentración de 1,75 pM en el Ejemplo 21. Todos los ensavos se realizaron con valores de resistencia eléctrica transendotelial iguales o superiores a 100 O cm2 v se llevaron a cabo en presencia de amarillo lucifer para evaluar la integridad de la membrana celular durante el ensavo. Los ensavos de permeabilidad se realizaron en tampón Ringer-HEPES a pH 7,4. El compuesto de interés se disolvió en el tampón hasta la concentración deseada.

Una vez que las células endoteliales llegaron a la confluencia en los filtros (transwells), estos se lavaron con tampón Ringer-HEPES. El pocillo aceptor se llenó con 800 pl de tampón Ringer-HEPES v el pocillo donador con 200 pl de la solución del compuesto a estudiar. El sistema se incubó durante 2 h a 37 °C v con CO2 al 5 %. Pasado ese tiempo, el contenido de los compartimentos aceptor y donador, se analizó mediante HPLC-UV, ELISA directo o fluorescencia (dependiendo de la carga anclada a la lanzadera). El transporte de todos los péptidos también se confirmó mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. La permeabilidad aparente se calculó utilizando la siguiente ecuación: Pap = (dQ/dt) * (1/A) * (1/CO) (cm/s), donde (dQ/dt) es la cantidad de compuesto presente en el compartimento aceptor en función del tiempo (nmol/s). A es el área del filtro (cm2) y CO es la concentración inicial del compuesto aplicado en el compartimento donador (nmol/ml). La Tabla 2 muestra que todas las construcciones de lanzadera - carga de la BHE atraviesan de manera eficaz la barrera hematoencefálica (Pap > 10-6 cm/s).

Tabla 2: Permeabilidad aparente (Pap) y porcentaje de transporte después de un ensayo de 2 horas en el modelo celular bovino de los Ejemplos 1, 2, 3, 5, 10, 13, 15, 16, 17, 19 y 21. Las cargas L-dopa, biotina, 5(6)-carboxifluoresceína, sulforodamina b, el péptido H-Leu-Pro-Phe-Phe-Asp-NH2 y la lisozima, no se detectaron en los compartimentos aceptores mediante EM MALDI-TOF después del ensayo de 2 h.

El ejemplo comparativo 1 muestra claramente que la apamina tiene una permeabilidad significativamente inferior (p <0,0001, prueba de la t para datos independientes) en comparación con las lanzaderas peptídicas descrita en el presente documento (ejemplos 1, 2, 3, 4 y 5).

El ejemplo comparativo 2 muestra que las lanzaderas peptídicas descritas en el presente documento mejoran el transporte de pequeñas proteínas, tales como la lisozima, a pesar de un bajo rendimiento de conjugación (ejemplo 12).

Ejemplo 29: Evaluación del transporte a través de la BHE utilizando un ensayo in vitro de células humanas Debido al gran interés por saber si los conjugados de lanzadera - carga de la BHE se transportarían a través de células endoteliales del cerebro humano, algunas de las cargas más relevantes para la terapia y el diagnóstico, se ensayaron en un nuevo modelo de células de la BHE basado en seres humanos. En este caso, el método de cocultivo utilizado fue el descrito por Cecchelli et al. (Cecchelli et al. PloS One. 2014. vol 9. págs. e99733) y consiste en sembrar pericitos bovinos en el fondo de una placa de 12 pocillos y células endoteliales humanas derivadas de células madre hematopoyéticas en un filtro transwell. En estas condiciones, las células endoteliales pueden alcanzar la confluencia imitando a la BHE humana. El sistema permite estudiar el transporte de compuestos que pueden atravesar la BHE mediante un mecanismo de transporte pasivo y/o activo.

La permeabilidad aparente de los compuestos se midió por triplicado a una concentración de 200 pM en los Ejemplos 3, 4, 5 y de 27, 25 nM en los Ejemplos 22 y 23, de 30 nM en el Ejemplo 24 y de 5 nM en el Ejemplo 25. Para evaluar la integridad de la membrana celular durante el ensayo, todos los ensayos se realizaron en presencia de amarillo lucifer. Los ensayos de permeabilidad se realizaron en tampón Ringer-HEPES a pH 7,4. El compuesto de interés se disolvió o se intercambió con tampón y se diluyó a la concentración deseada.

Los conjugados de cetuximab y cetuximab se radiomarcaron para analizarlos en el modelo celular. Siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante, se utilizaron perlas de yodación Pierce(R).

Una vez que las células endoteliales llegaron a la confluencia en los filtros (transwells), estos se lavaron con tampón Ringer-HEPES. El pocillo aceptor se cargó con 1500 pl de tampón Ringer-HEPES y el pocillo donador con 500 pl de la solución del compuesto a estudiar. El sistema se incubó durante 2 h a 37 °C y con CO2 al 5 %. Pasado ese tiempo, el contenido de los compartimentos aceptor y donador, se analizó mediante HPLC-UV, recuento gamma o ICP-MS (dependiendo de la carga anclada a la lanzadera). El transporte de todos los péptidos también se confirmó mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. La permeabilidad aparente se calculó utilizando la misma ecuación que la del modelo de células bovinas.

Tabla 3: Permeabilidad aparente (Pap) y porcentaje de transporte después de un ensayo de 2 horas en el modelo de células humanas de los Ejemplos 2, 4, 18, 22, 23, 24, 25 y 27.

El ejemplo 3 ensayado en el modelo humano muestra que la permeabilidad es comparable. Sin embargo, en el modelo humano, los valores se consideran más relevantes porque los receptores y los mecanismos activos son más similares a los que se encuentran en los seres humanos.

El ejemplo comparativo 3 muestra que las lanzaderas peptídicas descritas en el presente documento mejoran el transporte de grandes proteínas terapéuticas, tales como anticuerpos monoclonales (ejemplos 13 y 18)

El ejemplo comparativo 4 muestra que las lanzaderas peptídicas descritas en el presente documento mejoran el transporte de nanopartículas con gran potencial para el diagnóstico, tales como puntos cuánticos (ejemplo 19) El ejemplo comparativo 5 muestra que las lanzaderas peptídicas descritas en el presente documento mejoran el transporte de nanopartículas con gran potencial para terapias, tales como nanopartículas de oro (ejemplo 20)

Experimento 30: Pruebas de transporte activo

inhibición de NaNs: la azida sódica (NaN3) es un inhibidor de la vía respiratoria y, por consiguiente, disminuye los procesos dependientes de energía, tales como la transcitosis. El transporte de SEQ ID NO 9, se inhibió de manera muy significativa (p <0,001) mediante un tratamiento de 30 min con azida sódica 1,5 mM antes del ensayo de permeabilidad.

2) saturación: Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 28, se ensayaron tres concentraciones del compuesto con SEQ ID NO 9.

Los resultados están en consonancia con un mecanismo de transporte saturable considerando que la región meseta se ha alcanzado en 100 pM.

3) disminución drástica de la permeabilidad a temperatura reducida: Se siguió el procedimiento del Ejemplo 28 hasta que las células endoteliales alcanzaron la confluencia. Para realizar el experimento, los filtros (transwells) se lavaron con tampón Ringer-HEPES. El compartimento abluminal se llenó con 800 pl de Ringer-HEPES y el compartimento luminal se llenó con 200 pl del compuesto con SEQ ID NO 9 en Ringer-HEPES (200 pM). El sistema se incubó durante 2 h a 4 °C y con CO2 al 5 %. Pasado ese tiempo, el contenido de los compartimentos aceptor y donador se analizó mediante HPLC-UV. El transporte de todos los péptidos también se confirmó mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. La permeabilidad a 4 °C es de 0,23±0,04) 10^-6 cm/s, que es drásticamente inferior (P <0,0001, prueba de la t para datos independientes) que a 37 °C. Este bajo transporte está en consonancia con un proceso dependiente de energía.

4) transporte luminal-abluminal > transporte abluminal-luminal: Se siguió el procedimiento del Ejemplo 28 hasta que las células endoteliales alcanzaron la confluencia. Para realizar el experimento, los filtros (transwells) se lavaron con tampón Ringer-HEPES. El compartimento abluminal (en este experimento el donador) se llenó con 800 pl del compuesto con SEQ ID NO 9 en Ringer-HEPES (200 pM) y el compartimento luminal (en este experimento el aceptor) con 200 pl de Ringer-HEPES. El sistema se incubó durante 2 h a 37 °C y con CO2 al 5 %. Pasado ese tiempo, el contenido de los compartimentos aceptor y donador se analizó mediante HPLC-UV. El transporte de todos los péptidos también se confirmó mediante espectrometría de masas MALDITOF.

El transporte abluminal a luminal es (1,06±0,03) 10^{' 6} cm/s, que es significativamente inferior (P < 0,001, prueba de la t para datos independientes) que el transporte luminal a abluminal. Esta asimetría en el transporte indica que no se debe a la difusión pasiva y que el compuesto no es un buen sustrato para una bomba de expulsión.

Ejemplo 31: Evidencia de transporte activo: para determinar la incapacidad del compuesto con SEQ ID NO 9 de atravesar la BHE por difusión pasiva, se utilizó el ensayo PAMPA.

El tampón se preparó con plON a partir de la solución concentrada, siguiendo las instrucciones del fabricante. El pH se ajustó a 7,4 utilizando una solución de NaOH 0,5 M. El sándwich de PAMPA se separó y el pocillo donador se llenó con 195 pl del compuesto con la solución de SEQ ID NO 9 (400 pM) y se añadió un imán de agitación. A continuación, se colocó la placa aceptora en la placa donadora. Después, se añadieron 4 pl de la mezcla de fosfolípidos (PBLEP) de 20 mg/ml en dodecano al filtro de cada pocillo y se añadieron 200 pl de solución tampón a cada pocillo aceptor. A continuación, se cubrió la placa. Se realizaron cuatro repeticiones para cada compuesto. La placa PAMPA se incubó durante 4 h a 20 °C y en atmósfera saturada en un equipo GUT-BOXTM con agitación lo suficientemente enérgica como para reducir la capa de agua sin agitar (UWL, unstirred water layer) a 25 pm. Después de la incubación, se separó el sándwich y se analizó una alícuota de cada pocillo donador y aceptor mediante RP-HPLC-UV y EM MALDI-TOF.

El compuesto no pudo detectarse mediante HPLC-UV y solo en dos de cuatro repeticiones fue encontrado por MALDITOF MS. Como el PAMPA es un modelo de difusión pasiva, la baja permeabilidad del compuesto con SEQ ID NO 9 muestra que el mecanismo de transporte tiene lugar a través de un mecanismo activo.

Ejemplo 32: Estabilidad de las lanzaderas en suero humano

Una de las principales ventajas de las lanzaderas de esta invención es que, a diferencia de la gran mayoría de péptidos compuestos por L-aminoácidos (que son rápidamente metabolizados por una serie de enzimas presentes en el suero de la sangre, limitando así sus efectos terapéuticos), estas secuencias particulares y la naturaleza cíclica de los péptidos aumentan significativamente su semivida en suero.

Con respecto al estudio de estabilidad en suero humano de la lanzadera de la BHE (ejemplos 1,2, 3 y 5), los péptidos se incubaron a una concentración de 400 pM en tampón HBSS a 37 °C en presencia de suero humano al 90 %. En un intervalo de tiempos, se recogieron alícuotas de 100 pl a las que se añadió metanol para precipitar las proteínas del suero. Para determinar el grado de degradación de la lanzadera de la BHE, las muestras se centrifugaron, se filtraron y se analizaron mediante HPLC-UV y EM MALDI-TOF. No se observó degradación en 24 h en los derivados portadores de dos puentes disulfuro (ejemplo 1) o un enlace amida (ejemplo 3). La semivida del derivado portador de un solo enlace disulfuro fue de 3 h (ejemplo 2), mientras que la de la versión lineal no fue superior a 8 min.

Ejemplo 33: Ausencia de toxicidad aguda.

1) En pez cebra: El ensayo se realizó en Neuron Bio (Granada). El protocolo se basó en la evaluación de la toxicidad aguda de sustancias en el pez cebra (Danio rerio) utilizando un método estático. Este método de ensayo de toxicidad a corto plazo reproduce las directrices del documento OECD Draft Guideline for the study of chemicals, Fish Embryo Toxicity (FET) Test (30 de mayo de 2006). Se evaluaron 5 concentraciones (4,6, 10, 22, 46 y 100 mg/l) en agua que contenía DMSO al 0,1 %. Un grupo de control (vehículo: agua y DMSO al 0,1 %) y un grupo con 3,4-dicloroanilina, se establecieron para asegurarse de que las condiciones de ensayo fueran reproducibles.

Ninguno de los parámetros letales estudiados en los embriones tratados con el compuesto con SEQ ID NO: 9 fue diferente de los tratados con el vehículo. Los parámetros de los embriones tratados con 3,4-dicloroanilina estuvieron en el intervalo establecido.

2) En ratones: La ausencia de toxicidad del compuesto con la SEQ ID NO: 9, en comparación con la apamina, se determinó por la letalidad después de inyección intracaudal en ratones. Se disolvió apamina (SEQ ID NO: 16) en solución salina de tampón fosfato (vehículo) de modo que 200 pl contendrían 50 nmol de este péptido (correspondiente a su DL50). El compuesto con SEQ ID NO: 9 se disolvió en el mismo tampón de modo que 200 pl contendrían 1200 nmol de este péptido (cerca del límite de solubilidad). Un primer grupo de seis ratones (ratones

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto peptídico de fórmula

Ri -(V)k-P-(W)s-Y (I)

en donde:

R1 es el grupo conectado al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P, a través del birradical V, y se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, CH3C(=O)- y maleimida;

V es un birradical seleccionado del grupo que consiste en -NH-(CH2)r-C(=O)-, -NH-CH-((CH2)rNH2)-C(=O)-, -C(=O)-(CH²)r-C(=O)-, -S-(CH²)r-, -S-(CH²)r-C(=O)-, -O-(CH²)r-, -S-CH²-CH(NH²)-C(=O)-, -O-(CH²)r-C(=O)-, -(CH²)rC(=O)-, -NH-O-CH2-C(=O)-NH-(CH2), -CH(NH2)-C(=O)- y -C^eC-(CH2>C(=O)-;

conectándose el birradical V a R1 y al N de la secuencia P de la siguiente manera: R1-NH-(CH2)r-C(=O)-N(H)m-, R¹NH-CH-((CH²)rNH²)-C(=O)-N(H)m, R¹-rC(=O)-(CH²)rC(=O)-N(H)m-, RrS-(CH²)rN(H)m-, R¹-S-(CH²)r-C(=O)-N(H)m-, R¹-O-(CH²)r-N(H)m-, R¹-S-CH²-CH(NH²)-C(=O)-N(H)m, R¹-O-(CH²)r-C(=O)-N(H)m-, R¹-(CH²)r-C(=O)-N(H)m, R1-NH-O-CH²-C(=O)-NH-(CH²)r-CH(NH²)-C(=O)-N(H)m; y R1 -CEC-(CH²)rC(=O)-N(H)m;

P es un birradical de:

(a) un péptido que tiene una longitud de 9-20 restos de aminoácidos que tiene al menos un enlace intrapeptídico que es un enlace disulfuro, y comprende una secuencia de aminoácidos que es:

CKAPETALCAAA (SEQ ID NO:7);

que tiene al menos un enlace disulfuro intrapeptídico entre las cisteínas 1 y 9,

o un péptido que tiene una longitud de 9-11 restos de aminoácidos que tiene al menos un enlace intrapeptídico que es un enlace disulfuro y que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

CKAPETALC (SEQ ID NO:4);

CKAPETALCA (SEQ ID NO:5); y

CKAPETALCAA (SEQ ID NO:6); que tiene al menos un enlace disulfuro intrapeptídico entre las cisteínas 1 y 9; o, como alternativa,

(b) P tiene 16 restos de aminoácidos y comprende la secuencia de aminoácidos CNCKAPETALCAAACH (SEQ ID NO:9)

con un enlace disulfuro intrapeptídico entre la primera y la tercera cisteína que son las cisteínas 1 y 11, y entre la segunda y la cuarta cisteína que son las cisteínas 3 y 15, o como alternativa;

(c) P comprende la secuencia de aminoácidos

DapKAPETALD (SEQ ID NO:12)

con un enlace intrapeptídico entre Dap y D, que es un enlace amida;

W es un birradical seleccionado del grupo que consiste en -NH-(CH2)r-C(=O)- y -NH-CH((CH2)rNH2)-C(=O)-; conectándose el birradical W al C=O de la secuencia P y a Y de la siguiente manera: -C(=O)-NH-(CH2)r-C(=O)-Y o -C(=O)-NH-CH((CH2)rNH2)-C(=O)-Y;

Y es el grupo conectado al C terminal del último aminoácido de la secuencia P, y se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -OH, -OR2 y -NHR2;

R2 es un radical seleccionado del grupo que consiste en (C1-C6)-alquilo y (CH2)2-NH-C(=O)-CH2-O-NH2; r es un número entero de 1 a 5;

k es un número entero de 0 a 1;

m es un número entero de 0 a 1;

s es un número entero de 0 a 1;

con la condición de que:

cuando el birradical V es -C(=O)(CH2)rC(=O)-, entonces R1 es hidrógeno;

cuando el N del aminoácido de la secuencia P al que está conectado el birradical V es un birradical -NH-, entonces m es 1, y cuando el N del aminoácido de la secuencia P al que está unido el birradical -V es un birradical -N-, entonces m es 0; y

cuando R1 es maleimida, entonces el birradical V es -(CH2)r-C(=O)-.

2. El compuesto peptídico según la reivindicación 1, en donde P comprende la secuencia de aminoácidos CKAPETALCAAA (SEQ ID NO:7)

3. El compuesto peptídico según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde k es 0 y R1 es hidrógeno, o como alternativa, s es 0 e Y es NH2.

4. Una construcción de fórmula (II) o una sal de la misma farmacéuticamente aceptable,

(R1 )e-(Z)q1-(V)k-P-(W)s-(Z)q2-(Y)f, (II)

en donde:

P es un birradical del péptido P como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o como alternativa, la secuencia de aminoácidos KAPETAL(SEQ ID NO:10); R1, W, Y, k y s son como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3;

V es como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o como alternativa se selecciona del grupo que consiste en V1, V2 y V3,

siendo V1

siendo V2

y siendo V3

en donde los enlaces 1 y 2 están conectados a la cadena lateral de una lisina de la carga que es una proteína o un anticuerpo;

Z es un radical seleccionado independientemente de una sustancia biológicamente activa que es un principio farmacéutico activo capaz de formar un enlace amida, un enlace éster, un enlace disulfuro, un enlace tioéter, un enlace oxima, un enlace amina, un enlace 1,2,3-triazol (enlace triazol) 1,4-disustituido o un enlace hidrazona con V o un enlace amida o un enlace éster con W, y se selecciona del grupo que consiste en agentes antirretrovíricos, agentes antineoplásicos, agentes antipsicóticos, agentes antineurodegenerativos, una proteína terapéutica para la terapia de reemplazo proteico y agentes antiepilépticos; o una sustancia para su uso en un método de diagnóstico seleccionada del grupo que consiste en 5(6)-carboxifluoresceína, biotina, sulforodamina B, puntos cuánticos y nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro (Spion);

siendo dicha sustancia sustancialmente incapaz de atravesar por sí misma la BHE;

q1 y q2 son números enteros de 0 a 2, siendo q1 y/o q2 diferentes de 0 y siendo la suma de q1 y q2 de 1 o 2; e y f son números enteros de 0 a 1;

con la condición de que:

cuando q1 es 2 y el birradical V tiene un nitrógeno no terminal, entonces un Z se conecta al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P a través del birradical V, y el otro Z se conecta al nitrógeno no terminal birradical V, y k es 1;

cuando q2 es 2 y el birradical W tiene un nitrógeno no terminal, entonces un Z se conecta al C=O terminal del último aminoácido de la secuencia P, a través del birradical W, y el otro Z se conecta al nitrógeno no terminal de los birradicales W y s es 1; y

cuando q1 es 2 entonces e es 0, cuando q2 es 2 entonces f es 0,

cuando q1 es 1, entonces Z se conecta al N terminal del primer aminoácido de la secuencia P, opcionalmente a través del birradical V, y e es 0; y

cuando q2 es 1, entonces Z se conecta al C=O terminal del último aminoácido de la secuencia P, opcionalmente a través del birradical W, y f es 0.

5. La construcción según la reivindicación 4, en donde V es como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

6. La construcción según cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en donde el birradical del péptido P es CKAPETALCAAA (SEQ ID NO: 7).

7. La construcción según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde Z es un radical de un principio farmacéutico activo capaz de formar un enlace amida, un enlace éster, un enlace disulfuro, un enlace tioéter, un enlace oxima, un enlace amina, un enlace 1,2,3-triazol (enlace triazol) 1,4-disustituido o un enlace hidrazona con V o un enlace amida o un enlace éster con W, y se selecciona del grupo que consiste en agentes antirretrovíricos, agentes antineoplásicos, agentes antipsicóticos, agentes antineurodegenerativos, una proteína terapéutica para la terapia de reemplazo proteico y agentes antiepilépticos.

8. La construcción según la reivindicación 7, en donde el agente activo farmacéutico se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, L-dopamina y LPFFD (SEQ ID NO: 11).

9. La construcción según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde Z es un radical de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 5(6)-carboxifluoresceína, biotina, sulforodamina B, puntos cuánticos y nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro (Spion).

10. La construcción según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde la construcción se selecciona del grupo que consiste en:

L-Dopa-(Dap)KAPETALD-NH2;

H-(Dap)KAPETALDKQIEIKKFK-NH2;

Cetuximab-V3-CNCKAPETALCAAACH-NH2;

Cetuximab-V2-DapKAPETALD-NH2;

Punto cuántico-PEG-NH-V1-DapKAPETALD-NH2; y

Nanopartícula de oro-CDapKAPETALD-NH2,

siendo V1

siendo V2

y siendo V3

en donde los enlaces 1 y 2 están conectados a la cadena lateral de una lisina de la carga que es una proteína o un anticuerpo.

11. Una composición farmacéutica o una composición con fines de diagnóstico, que comprende una cantidad terapéutica o de diagnóstico eficaz de la construcción definida en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, junto con cantidades apropiadas de transportadores o excipientes farmacéuticamente aceptables y/o aceptables para el diagnóstico.

12. Una construcción de fórmula (II) como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde Z es un radical de una sustancia biológicamente activa, para su uso como un medicamento, en donde la sustancia biológicamente activa es un principio farmacéutico activo capaz de formar un enlace amida, un enlace éster, un enlace disulfuro, un enlace tioéter, un enlace oxima, un enlace amina, un enlace 1,2,3-triazol (enlace triazol) 1,4-disustituido o un enlace hidrazona con V o un enlace amida o un enlace éster con W, y se selecciona del grupo que consiste en agentes antirretrovíricos, agentes antineoplásicos, agentes antipsicóticos, agentes antineurodegenerativos, una proteína terapéutica para la terapia de reemplazo proteico y agentes antiepilépticos.

13. Una construcción de fórmula (II) como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde Z es una nanopartícula superparamagnética de óxido de hierro o un complejo de gadolinio, para su uso como agente de contraste para un método de diagnóstico de obtención de imágenes por resonancia magnética.

14. Una construcción de fórmula (II) como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde, Z se selecciona del grupo que consiste en 5(6)-carboxifluoresceína, rojo Texas, rodamina, sulforodamina y puntos cuánticos, para su uso como una sonda fluorescente para un método de diagnóstico de obtención de imágenes.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

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