KR102486180B1 - 항-her2 항체-메이탄신 컨쥬게이트 및 이것의 사용 방법 - Google Patents

항-her2 항체-메이탄신 컨쥬게이트 및 이것의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시물은 항-HER2 항체-메이탄신 컨쥬게이트 구조를 제공한다. 본 개시물은 또한 이러한 컨쥬게이트의 생산 방법, 뿐만 아니라 이것들의 사용 방법을 포함한다.

Description

항-HER2 항체-메이탄신 컨쥬게이트 및 이것의 사용 방법{ANTI-HER2 ANTIBODY-MAYTANSINE CONJUGATES AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원에 대한 교차 -참조
35 U.S.C. §119(e)에 의거하여, 본 출원은 2014년 6월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 62/008,980의 출원일에 대한 우선권을 주장하며, 이것의 개시물은 본원에 참고로 포함된다.
도입
단백질-소분자 치료적 컨쥬게이트의 분야는 크게 발전해왔으며, 다가올 수년간 더 많은 것들을 제공하겠다는 약속과 함께 많은 임상적으로 유익한 약물을 제공하였다. 단백질-컨쥬게이트 치료제는, 예를 들어, 특이성, 기능의 다양성 및 상대적으로 낮은 오프-타겟(off-target) 활성으로 인해 여러 이점을 제공할 수 있으며, 더 적은 부작용을 초래한다. 단백질의 화학적 변형은 그것들을 더 강력하거나, 안정하거나, 또는 다양해지게 하여 이러한 이점들을 확장할 수도 있다.
많은 표준 화학적 형질전환은 단백질에 대한 번역 후 변형을 생성하고 조작하는데 흔히 사용된다. 많은 방법이 존재하는데 그 중 하나는 특정 아미노산의 측쇄를 선택적으로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 카르복시산 측쇄 (아스파르테이트 및 글루타메이트)는 수용성 카르보디이미드 시약을 이용한 초기 활성화 및 아민과의 후속 반응에 의해 표적화될 수도 있다. 유사하게, 리신은 활성화된 에스터 또는 아이소티오시아네이트의 사용을 통해 표적화될 수 있고, 시스테인 티올은 말레이미드 및 α-할로-카르보닐로 표적화될 수 있다.
화학적으로 변질된 단백질 치료제 또는 시약의 생성에 대한 하나의 큰 장애물은 생물학적으로 활성이고, 균질한 형태의 단백질 생산이다. 폴리펩타이드에 약물 또는 검출 가능한 라벨의 컨쥬게이션은 제어하기 어려우며, 부착된 약물 분자의 수 및 화학적 컨쥬게이션의 위치가 다른 컨쥬게이트의 불균질한 혼합물을 초래할 수 있다. 일부 경우에서, 폴리펩타이드 상에서 화학적 결합의 정확하고 선택적인 형성을 지시하는 합성 유기화학적 도구를 사용하여 컨쥬게이션의 부위 및/또는 폴리펩타이드에 컨쥬게이션된 약물 또는 검출 가능한 라벨을 제어하는 것이 바람직할 수도 있다.
US 2014/0141025 A1 (2014. 5. 22.) US 2013/0108620 A1 (2013. 5. 2.)
요약
본 개시물은 항-HER2 항체-메이탄신 컨쥬게이트 구조를 제공한다. 본 개시물은 또한 이러한 컨쥬게이트의 생산 방법, 뿐만 아니라 이것들의 사용 방법을 포함한다.
본 개시물의 양태는 식 (I)의 적어도 하나의 변형된 아미노산 잔기를 포함하는 컨쥬게이트를 포함한다:
Figure 112016123593442-pct00001
상기 식에서
Q1은 C 또는 N이며, Q1이 N이면, Y1은 없고;
Y1은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
R1은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
R2 및 R3는 각각 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R2 및 R3는 선택적으로 환형으로 연결되어 5 또는 6-원자 헤테로사이클릴을 형성하고;
L은 -(T1-Z1)a-(T2-Z2)b-(T3-Z3)c-(T4-Z4)d-를 포함하는 링커이며, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 0 또는 1이고, a, b, c 및 d의 합은 1 내지 4이고;
T1, T2, T3 및 T4는 각각 (C1-C12)알킬, 치환된 (C1-C12)알킬, (EDA)w, (PEG)n, (AA)p, -(CR13OH)h-, 피페리딘-4-아미노 (4AP), 아세탈 기, 히드라진, 및 에스터로부터 독립적으로 선택되고, EDA는 에틸렌 디아민 모이어티이고, PEG는 폴리에틸렌 글리콜 또는 변형된 폴리에틸렌 글리콜이고, AA는 아미노산 잔기이고, w는 1 내지 20의 정수이고, n은 1 내지 30의 정수이고, p는 1 내지 20의 정수이고, h는 1 내지 12의 정수이고;
Z1, Z2, Z3 및 Z4는 각각 공유 결합, -CO-, -NR15-, -NR15(CH2)q-, -NR15(C6H4)-, -CONR15-, -NR15CO-, -C(O)O-, -OC(O)-, -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -SO2NR15-, -NR15SO2- 및 -P(O)OH-로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, q는 1 내지 6의 정수이고;
각각의 R13은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 및 치환된 아릴로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R15는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택되고;
W1은 메이탄시노이드이고;
W2는 항-HER2 항체이다.
특정 구체예에서,
T1은 (C1-C12)알킬 및 치환된 (C1-C12)알킬로부터 선택되고;
T2, T3 및 T4는 각각 (EDA)w, (PEG)n, (C1-C12)알킬, 치환된 (C1-C12)알킬, (AA)p, -(CR13OH)h-, 피페리딘-4-아미노 (4AP), 아세탈 기, 히드라진, 및 에스터로부터 독립적으로 선택되고;
Z1, Z2, Z3 및 Z4는 각각 공유 결합, -CO-, -NR15-, -NR15(CH2)q-, -NR15(C6H4)-, -CONR15-, -NR15CO-, -C(O)O-, -OC(O)-, -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -SO2NR15-, -NR15SO2-, 및 -P(O)OH-로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
상기 식에서:
(PEG)n는
Figure 112016123593442-pct00002
이고, n은 1 내지 30의 정수이고;
EDA는 다음 구조를 가지는 에틸렌 디아민 모이어티이며:
Figure 112016123593442-pct00003
, y는 1내지 6의 정수이고 r은 0 또는 1이고;
피페리딘-4-아미노는
Figure 112016123593442-pct00004
이고;
각각의 R12 및 R15는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 아릴 및 치환된 아릴로부터 독립적으로 선택되고, 어떤 두 개의 인접한 R12 기기가 환형으로 연결되어 피페라지닐 고리를 형성할 수도 있다.
특정 구체예에서, T1, T2, T3 및 T4 및 Z1, Z2, Z3 및 Z4는 다음 표로부터 선택된다:
Figure 112016123593442-pct00005
특정 구체예에서, L은 다음 구조 중 하나로부터 선택된다:
Figure 112016123593442-pct00006
Figure 112016123593442-pct00007
Figure 112016123593442-pct00008
상기 식에서
각각의 f는 독립적으로 0 또는 1 내지 12의 정수이고;
각각의 y는 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이고;
각각의 n는 독립적으로 0 또는 1 내지 30의 정수이고;
각각의 p는 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이고;
각각의 h는 독립적으로 0 또는 1 내지 12의 정수이고;
각각의 R은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴이고;
각각의 R'은 독립적으로 H, 아미노산의 측쇄 기, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴이다.
특정 구체예에서, 메이탄시노이드는 다음 식과 같다:
Figure 112016123593442-pct00009
상기 식에서
Figure 112016123593442-pct00010
는 메이탄시노이드와 L 사이의 부착점을 나타낸다.
특정 구체예에서, 항-HER2 항체는 서열 번호:1의 아미노산 529-625 내에서 에피토프에 결합한다.
특정 구체예에서, 항-HER2 항체는 서열 번호:1의 아미노산 561-625 내에서 에피토프에 결합한다.
특정 구체예에서, 항-HER2 항체는 서열 번호:2(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSS)의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 서열 번호:3 (DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT)의 경쇄 CDR을 포함하는 항체와 결합에 대하여 경쟁한다.
특정 구체예에서, 항-HER2 항체는 서열 번호:20 (DTYIH), 서열 번호:21 (RIYPTNGYTRYADSVKG), 및 서열 번호:22 (WGGDGFYAMDV)의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄를 가진 항체와 결합에 대하여 경쟁한다.
특정 구체예에서, 항-HER2 항체는 서열 번호:20 (DTYIH), 서열 번호:21 (RIYPTNGYTRYADSVKG), 및 서열 번호:22 (WGGDGFYAMDV)의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:23 (RASQDVNTAVA), 서열 번호:24 (SASFLES), 및 서열 번호:25 (QQHYTTPPT)의 CDR을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구체예에서, 항-HER2 항체는 서열 번호:2 (EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSS)에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:3 (DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT)에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구체예에서, 항-HER2 항체는 huMAb4D5-8이다.
특정 구체예에서, 항-HER2 항체는 식 (II)의 서열을 포함한다:
Figure 112016123593442-pct00011
상기 식에서
FGly'는 식 (I)의 변형된 아미노산 잔기이고;
Z20은 프롤린 또는 알라닌 잔기이고;
Z30은 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
X1은 존재하거나 존재하지 않을 수도 있으며, 존재할 때는, 임의의 아미노산일 수 있고, 단 서열이 컨쥬게이트의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고;
X2 및 X3는 각각 독립적으로 임의 아미노산이다.
특정 구체예에서, 서열은 L(FGly')TPSR (서열 번호:222)이다.
특정 구체예에서,
Z30은 R, K, H, A, G, L, V, I, 및 P로부터 선택되고;
X1은 L, M, S, 및 V로부터 선택되고;
X2 및 X3는 각각 S, T, A, V, G, 및 C로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구체예에서, 변형된 아미노산 잔기는 항-HER2 항체의 중쇄 불변 영역의 C-말단에 위치한다.
특정 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 식 (II)의 서열을 포함한다:
Figure 112016123593442-pct00012
상기 식에서
FGly'는 식 (I)의 변형된 아미노산 잔기이고;
Z20은 프롤린 또는 알라닌 잔기이고;
Z30은 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
X1은 존재하거나 존재하지 않을 수도 있으며, 존재할 때는, 임의의 아미노산일 수 있고, 단 서열이 컨쥬게이트의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고;
X2 및 X3는 각각 독립적으로 임의의 아미노산일 수 있고,
서열은 아미노산 서열 SLSLSPG (서열 번호:223)에 대하여 C-말단이다.
특정 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 서열 SPGSL(FGly')TPSRGS (서열 번호:224)를 포함한다.
특정 구체예에서,
Z30은 R, K, H, A, G, L, V, I, 및 P로부터 선택되고;
X1은 L, M, S, 및 V로부터 선택되고;
X2 및 X3는 각각 S, T, A, V, G, 및 C로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구체예에서, 변형된 아미노산 잔기는 항-HER2 항체의 경쇄 불변 영역에 위치한다.
특정 구체예에서, 경쇄 불변 영역은 식 (II)의 서열을 포함한다:
Figure 112016123593442-pct00013
상기 식에서
FGly'는 식 (I)의 변형된 아미노산 잔기이고;
Z20은 프롤린 또는 알라닌 잔기이고;
Z30은 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
X1은 존재하거나 존재하지 않을 수도 있으며, 존재할 때는, 임의의 아미노산일 수 있고, 단 서열이 컨쥬게이트의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고;
X2 및 X3는 각각 독립적으로 임의 아미노산이고,
서열은 서열 KVDNAL (서열 번호:123)에 대하여 C-말단이고, 및/또는 서열 QSGNSQ (서열 번호:124)에 대하여 N-말단이다.
특정 구체예에서, 경쇄 불변 영역은 서열 KVDNAL(FGly')TPSRQSGNSQ (서열 번호:125)를 포함한다.
특정 구체예에서,
Z30은 R, K, H, A, G, L, V, I, 및 P로부터 선택되고;
X1은 L, M, S, 및 V로부터 선택되고;
X2 및 X3은 각각 S, T, A, V, G, 및 C로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구체예에서, 변형된 아미노산 잔기는 항-HER2 항체의 중쇄 CH1 영역에 위치한다.
특정 구체예에서, 중쇄 CH1 영역은 식 (II)의 서열을 포함한다:
Figure 112016123593442-pct00014
상기 식에서
FGly'는 식 (I)의 변형된 아미노산 잔기이고;
Z20은 프롤린 또는 알라닌 잔기이고;
Z30은 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
X1은 존재하거나 존재하지 않을 수도 있으며, 존재할 때는, 임의의 아미노산일 수 있고, 단 서열이 컨쥬게이트의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고;
X2 및 X3는 각각 독립적으로 임의 아미노산이고,
서열은 아미노산 서열 SWNSGA (서열 번호:126)에 대하여 C-말단이고 및/또는 아미노산 서열 GVHTFP (서열 번호:127)에 대하여 N-말단이다.
특정 구체예에서, 중쇄 CH1 영역은 서열 SWNSGAL(FGly')TPSRGVHTFP (서열 번호:128)를 포함한다.
특정 구체예에서,
Z30은 R, K, H, A, G, L, V, I, 및 P로부터 선택되고;
X1은 L, M, S, 및 V로부터 선택되고;
X2 및 X3은 각각 S, T, A, V, G, 및 C로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구체예에서, 변형된 아미노산 잔기는 항-HER2 항체의 중쇄 CH2 영역에 위치한다.
특정 구체예에서, 변형된 아미노산 잔기는 항-HER2 항체의 중쇄 CH3 영역에 위치한다.
본 개시물의 양태들은 본 개시물의 컨쥬게이트, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.
본 개시물의 양태들은 대상체에게 본 개시물의 컨쥬게이트의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
본 개시물의 양태들은 대상체에게 본 개시물의 컨쥬게이트를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 암 치료 방법을 포함하며, 투여는 대상체의 암 치료에 효과적이다.
본 개시물의 양태는 대상체의 표적 부위로 약물을 전달하는 방법을 포함하며, 방법은 대상체에게 본 개시물의 컨쥬게이트를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 투여는 대상체의 표적 부위에서 컨쥬게이트로부터 약물의 치료적 유효량을 방출하기에 효과적이다.
도 1, 패널 A는 표준 분자생물학적 기술을 사용하여 항체의 백본을 따라 원하는 위치에 삽입된 포르밀글리신-생성 효소 (FGE) 인식 서열을 도시한다. 발현시, 진핵세포에 내인성인 FGE는 공통 서열 내에서 포르밀글리신 잔기 (FGly)로 Cys의 전환을 촉진한다. 도 1, 패널 B는 히드라지노-아이소-피테트-스펭글러 (Hydrazino-Iso-Pictet-Spengler; HIPS) 링커와 반응된 알데하이드 모이어티 (항체 당 2개)를 가지고 있는 항체 및 부위-특이적으로 컨쥬게이션된 ADC를 생성하기 위한 페이로드(payload)를 도시한다. 도 1, 패널 C는 HIPS 화학반응을 도시하며, 이것은 안정한 C-C 결합을 생성하기 위해 중간 히드라조늄 이온에 이어서 친핵성 인돌을 이용하는 분자 내 알킬화를 통해 진행된다.
도 2 (상단)는 경쇄에서 한 위치 (LC) 및 중쇄에서 7개의 위치 (A-G로 라벨링됨)에서 알데하이드 태그를 도시한다. 상이한 부위에서 컨쥬게이션된 ADC 제조의 제1 단계로서 이 태그를 함유하는 항체들이 생산되고 분석되었다. 도 2 (하단)는 HIPS-Glu-PEG2-메이탄신 (20)의 구조를 도시하며, 이것은 이 연구에 사용된 ADC에 대한 링커 및 세포독성 페이로드의 역할을 한다.
도 3은 균질한 ADC로 LC-, CH1-, 및 CT-태그된 항체의 전환에 대한 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 분석의 그래프를 도시한다. 하나의 피크로서 용출된 컨쥬게이션되지 않은 항체. HIPS-Glu-PEG2-메이탄신으로 컨쥬게이션 후, 디-컨쥬게이션된 재료로서 용출된 ADC (우측). 컨쥬게이션되지 않은 재료로부터 컨쥬게이션된 것들의 깔끔한 분리는 컨쥬게이트 풍부화 및 약물-대-항체 비율 (DAR)의 간단한 결정을 허용하였다.
도 4는 호모 사피엔스(Homo sapiens) HER2 수용체의 아미노산 서열 (서열 번호:1)을 제공한다.
도 5A 및 5B는 인간화된 항-HER2 항체의 VH (도 5A) (서열 번호:2)및 VL (도 5B) (서열 번호:3) 영역의 아미노산 서열을 제공한다.
도 6A-E는 항-HER2 항체의 야생형 (WT) 및 변형된 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 아미노산 서열을 제공한다 (WT HC - 서열 번호:4; WT LC - 서열 번호:5; 초1-3.1 HC - 서열 번호:6; CT-1.1 HC - 서열 번호:7; LC-3.1 LC - 서열 번호:8). 볼드체 잔기는 VH 및 VL 영역이다. 볼드체 및 밑줄 그어진 LCTPSR 잔기는 FGly로 전환되는 시스테인을 포함한다.
도 7은 크기-배제 크로마토그래피 분석의 그래프를 도시하며, 이것은 다양한 위치에서 알데하이드 태그를 함유하는 αHER2 ADC의 제조시 최소한의 응집을 보여준다. 지시된 위치에서 태그된, 컨쥬게이션되지 않은 및 HIPS-Glu-PEG2-메이탄신 컨쥬게이션된 ADC는 SEC로 분석되었다. 모든 경우에서 총 응집은 ≤5%였다.
도 8A 및 8B는 HIPS-Glu-PEG2-AF488 및 HIPS-Glu-PEG2-메이탄신 구조의 비교를 도시하며, 이것은 페이로드 부착점에서 상이한 화학적 결합을 가진다는 것을 보여준다. 도 8A는 아릴 아미드 결합을 통해 PEG2 모이어티에 부착된 Alexa Fluor 488을 도시한다. 도 8B는 메이탄신이 에스터 결합을 통해 PEG2 모이어티에 부착된다는 것을 도시한다.
도 9 패널 A 및 B는 혈장 내에서 알데하이드-태그된 HIPS 컨쥬게이트는 37 ℃에서 안정하였지만, 페이로드 부착은 역할을 하였다는 것을 나타내는 그래프를 도시한다. HIPS-Glu-PEG2를 사용하여 Alexa Fluor 488 (AF488) (도 9, 패널 A), 또는 메이탄신 (도 9, 패널 B)에 컨쥬게이션된 LC-, CH1-, 및 CT-태그된 항체의 혈장 안정성이 테스트되었다. 컨쥬게이트는 래트 혈장에서 37 ℃에서 최대 13 d 동안 인큐베이션되었다. ELISA에 의해 총 페이로드 및 총 항체에 대하여 분석될 때, 태그 배치에 관계없이, AF488 컨쥬게이트에 대하여 총 항체 신호에 대한 총 페이로드 신호의 손실은 관찰되지 않았다. 메이탄신 컨쥬게이트에 대해서는, 37 ℃에서 시간이 흐름에 따라 일부 탈컨쥬게이션(deconjugation)이 일어났다는 증거가 관찰되었다. 안정성은 태그 배치에 따라 달랐는데, CT-태그가 페이로드-대-항체 신호 (84%)의 최고 보존을 나타내며, CH1 (72%), 및 LC (65%)가 뒤따른다.
도 10은 페이로드 위치가 NCI-N87 표적 세포에 대한 알데하이드-태그된 αHER2 ADC의 시험관 내 효력에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타내는 그래프를 도시한다. HER2를 과발현하는 NCI-N87 세포는 6일 분석에서 시험관 내 세포독성에 대한 표적으로 사용되었다. 유리 메이탄신은 양성 대조군으로 포함되었고, 특이성을 나타내기 위해서 아이소타입 대조군 ADC가 음성 대조군으로 사용되었다. 경쇄 (LC), 또는 중쇄의 CH1 또는 C-말단 (CT) 영역에서 알데하이드 태그를 함유하는 αHER2 HIPS-Glu-PEG2-메이탄신 ADC는 비슷한 활성을 나타냈다. IC50 값 (유리 약물의 경우를 제외하고 항체 농도를 반영함)은 다음과 같이 측정되었다: 유리 메이탄신, 214 pM; 아이소타입 대조군 ADC, 결정 불가; LC ADC, 87 pM; CH1 ADC, 132 pM; CT ADC, 114 pM.
도 11A 및 11B는 페이로드 배치가 마우스에서 NCI-N87 이종이식에 대한 알데하이드-태그된 αHER2 ADC의 생체 내 효능을 변형시킨다는 것을 나타내는 그래프를 도시한다. CB.17 SCID 마우스 (8마리/군)는 NCI-N87 세포로 피하로 이식되었다. 종양이 ~113 mm3에 도달했을 때, 동물에게 단일 5 mg/kg 용량의 트라스투주맙 단독, 아이소타입 ADC, 또는 경쇄 (LC)에, 또는 중쇄의 CH1 또는 C-말단 (CT) 영역에 컨쥬게이션된 αHER2 HIPS-Glu-PEG2-메이탄신 ADC가 제공되었다. αHER2-DM1은 비교기로서 포함되었다. 도 11A는 주 2회 모니터링된 종양 성장에 대하여 평균 종양 부피 (mm3) 대 투여 후 일의 그래프를 도시한다. 도 11B는 테스트된 태그 배치 중에서 효능 차이의 그래프를 도시하며, 이것들은 생존 곡선에 반영되었다. 동물들은, 종양이 800 mm3에 도달했을 때, 안락사되었다.
도 12는 αHER2 HIPS-Glu-PEG2-메이탄신 ADC가 태그 배치에 관계없이 매우 안정하다는 것을 나타내는 그래프를 도시한다. BALB/c 마우스에 경쇄 (LC)에, 또는 중쇄의 CH1 또는 C-말단 (CT) 영역에 컨쥬게이션된 알데하이드-태그된 αHER2 HIPS-Glu-PEG2-메이탄신 ADC 5 mg/kg이 투여되었다. αHER2-DM1은 비교기로서 포함되었다. 혈장은 지시된 시점에 샘플링되었고 ELISA로 분석되었다. 곡선 아래 면적 (AUC)은 GraphPad Prism을 사용하여 결정되었다. 총 ADC AUC/총 항체 AUC의 비율은 퍼센트로 표시된다.
도 13은 본 개시물의 구체예에 따라 αHERs ADC에 대한 % 생존률 대 Log ADC 농도 (nM)의 그래프를 도시한다.
도 14A 및 14B는 본 개시물의 구체예에 따라, NCI-N87 종양 모델에서 알데하이드-태그된 αHER2 ADC의 생체 내 효능에 대한 링커 조성의 효과를 나타내는 그래프를 도시한다.
도 15는 본 개시물의 구체예에 따라, 마우스 체중 (g) 대 처치 후 일의 그래프를 도시한다. SCID 마우스에 HIPS 화학반응을 사용하여 링커-메이탄신 페이로드에 컨쥬게이션된 αHER2 ADC 5 mg/kg의 처치는 체중에 영향을 주지 않았다.
도 16A는 본 개시물의 구체예에 따라, 더 작은 종양 (180 mm3)에 대한 다회수 용량 효능 연구에 대하여 평균 종양 부피 (mm3) 대 시간 (일)의 그래프를 도시하고, 도 16B는 더 큰 종양 (400 mm3)에 대한 다회수 용량 효능 연구에 대하여 평균 종양 부피 (mm3) 대 시간 (일)의 그래프를 도시한다.
도 17A는 알데하이드 태그된 Ig 폴리펩타이드의 생성에 대하여 가능한 변형 부위를 보여주는 부위 지도를 도시한다. 상부 서열은 IgG1 경쇄 폴리펩타이드의 보존된 영역의 아미노산 서열 (서열 번호:9)이고 Ig 경쇄에서 가능한 변형 부위를 도시한다; 하부 서열은 Ig 중쇄 폴리펩타이드의 보존된 영역의 아미노산 서열 (서열 번호:10; GenBank Accession No. AAG00909)이고 Ig 중쇄에서 가능한 변형 부위를 도시한다. 중쇄 및 경쇄 넘버링(numbering)은 전장 중쇄 및 경쇄를 기준으로 한다.
도 17B는 IgG1 (서열 번호:11), IgG2 (서열 번호:12), IgG3 (서열 번호:13), IgG4 (서열 번호:14), 및 IgA (서열 번호:15)에 대한 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 정렬을 도시하며, 알데하이드 태그가 면역글로불린 중쇄에서 제공될 수 있는 변형 부위를 나타낸다. 중쇄 및 경쇄 넘버링은 전장 중쇄 및 경쇄를 기준으로 한다.
도 17C는 면역글로불린 경쇄 불변 영역 (Seq1 - 서열 번호:9; Seq2 - 서열 번호:16; Seq3 - 서열 번호:17; Seq4 - 서열 번호:18; Seq5 - 서열 번호:19)의 정렬을 도시하며, 알데하이드 태그가 면역글로불린 경쇄에서 제공될 수 있는 변형 부위를 나타낸다.
도 18은 본 개시물의 구체예에 따라, HIPS-4AP 링커에 부착된 메이탄신 페이로드에 컨쥬게이션된 중쇄 C-말단 (CT) 태그된 αHER2 항체의 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 분석의 그래프를 도시한다 (실시예 4 참조). 미가공 약물-대-항체 비율 (DAR)은 HIC에 의해 1.64인 것으로 결정되었다.
도 19는 본 개시물의 구체예에 따라, HIPS-4AP 링커에 부착된 메이탄신 페이로드에 컨쥬게이션된 중쇄 C-말단 (CT) 태그된 αHER2 항체의 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 분석의 그래프를 도시한다 (실시예 4 참조). 최종 약물-대-항체 비율 (DAR)은 HIC에 의해 1.86인 것으로 결정되었다.
도 20은 본 개시물의 구체예에 따라, HIPS-4AP 링커에 부착된 메이탄신 페이로드에 컨쥬게이션된 중쇄 C-말단 (CT) 태그된 αHER2 항체의 예의 폴리머 역상 (PLRP) 크로마토그래피 분석의 그래프를 도시한다 (실시예 4 참조). 최종 약물-대-항체 비율 (DAR)은 PLRP에 의해 1.84인 것으로 결정되었다.
도 21은 본 개시물의 구체예에 따라, HIPS-4AP 링커에 부착된 메이탄신 페이로드에 컨쥬게이션된 중쇄 C-말단 (CT) 태그된 αHER2 항체의 예의 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 분석의 그래프를 도시한다 (실시예4 참조)
도 22는 본 개시물의 구체예에 따라, 래트 혈장에서 CT에서 37 ℃에서 14 일 동안 HIPS-4AP-메이탄신에 컨쥬게이션된 αHER2 ADC의 시험관 내 안정성을 결정하기 위해 항-메이탄신 신호/항-인간 Fc 신호 (표준화됨)의 그래프를 도시한다.
도 23은 본 개시물의 구체예에 따라, 다양한 분석물 농도 (HIPS-4AP-메이탄신 및 메이탄신에 컨쥬게이션된 αHER2 ADC)에 대하여 % 생존률 대 분석물 농도 (nM)의 그래프를 도시하며, NCI-N87 세포에 대한 αHER2 CT HIPS-4AP-메이탄신의 시험관 내 효력을 나타낸다.
도 24는 본 개시물의 구체예에 따라, 야생형 αHER2와 비교하여 αHER2 CT HIPS-4AP-메이탄신의 항원 결합을 나타내는, 흡광도 (A.U.) 대 농도 (ng/mL)의 그래프를 도시한다.
도 25는 본 개시물의 구체예에 따라, NCI-N87 이종이식 모델에 대한 αHER2 CT HIPS-4AP-메이탄신 ADC의 생체 내 효능을 나타내는 종양 부피 대 일의 그래프를 나타낸다.
정의
하기 용어들은 달리 지시되지 않으면 하기 의미를 가진다. 임의 한정되지 않은 용어들은 업계에서 인식된 의미를 가진다.
"알킬"은 10 탄소 원자 및, 예를 들어, 1 내지 6개의 탄소 원자, 또는 1 내지 5개, 또는 1 내지 4개, 또는 1 내지 3개의 탄소 원자를 가지는 1가 포화된 지방족 하이드로카르빌 기를 말한다. 이 용어는, 예로서, 선형 및 분지형 하이드로카르빌 기, 예를 들어, 메틸 (CH3-), 에틸 (CH3CH2-), n-프로필 (CH3CH2CH2-), 아이소프로필 ((CH3)2CH-), n-부틸 (CH3CH2CH2CH2-), 아이소부틸 ((CH3)2CHCH2-), sec-부틸 ((CH3)(CH3CH2)CH-), t-부틸 ((CH3)3C-), n-펜틸 (CH3CH2CH2CH2CH2-), 및 네오펜틸 ((CH3)3CCH2-)을 포함한다.
용어 "치환된 알킬"은 본원에서 한정된 알킬 기를 말하며 알킬 사슬 내 하나 이상의 탄소 원자 (C1 탄소 원자 제외)는 헤테로원자, 예를 들어, -O-, -N-, -S-, -S(O)n- (여기에서 n은 0 내지 2이다), -NR- (여기에서 R은 수소 또는 알킬이다)로 선택적으로 대체되었고 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카르복실, 카르복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-아릴, -SO2-헤테로아릴, 및 -NRaRb로 구성된 군으로부터 선택된 1 내지 5개의 치환기를 가지고 있으며, R' 및 R''는 같거나 다를 수도 있고 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로환형으로부터 선택된다.
"알킬렌"은 직쇄형 또는 분지형이고, -O-, -NR10-, -NR10C(O)-, -C(O)NR10- 등으로부터 선택된 하나 이상의 군으로 선택적으로 방해되는, 바람직하게는 1 내지 6개 및 더 바람직하게는 1 내지 3개의 탄소 원자를 가지는 2가 지방족 하이드로카르빌 기를 말한다. 이 용어는, 예로서, 메틸렌 (-CH2-), 에틸렌 (-CH2CH2-), n-프로필렌 (-CH2CH2CH2-), 아이소-프로필렌 (-CH2CH(CH3)-), (-C(CH3)2CH2CH2-), (-C(CH3)2CH2C(O)-), (-C(CH3)2CH2C(O)NH-), (-CH(CH3)CH2-), 등을 포함한다.
"치환된 알킬렌"은 하기 "치환된"의 정의에서 탄소에 대하여 기술된 바와 같이 치환기로 치환된 1 내지 3개의 수소를 가지는 알킬렌 기를 말한다.
용어 "알케인"은 본원에서 기술된 바와 같이 알킬 기 및 알킬렌 기를 말한다.
용어 "알킬아미노알킬", "알킬아미노알케닐" 및 "알킬아미노알키닐"은 기 R'NHR''를 말한다 - 여기에서 R'은 본원에서 한정된 알킬 기이고 R''는 본원에서 한정된 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키닐렌 기를 말한다.
용어 "알카릴" 또는 "아랄킬"은 기 -알킬렌-아릴 및 -치환된 알킬렌-아릴을 말하며 알킬렌, 치환된 알킬렌 및 아릴은 본원에서 한정된다.
"알콕시"는 기 -O-알킬을 말하며, 알킬은 본원에서 한정된 바와 같다. 알콕시는, 예로서, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 아이소프로폭시, n-부톡시, t-부톡시, sec-부톡시, n-펜톡시, 등을 포함한다. 용어 "알콕시"는 또한 기 알케닐-O-, 사이클로알킬-O-, 사이클로알케닐-O-, 및 알키닐-O-를 말하며, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 알키닐은 본원에서 한정된 바와 같다.
용어 "치환된 알콕시"는 기 치환된 알킬-O-, 치환된 알케닐-O-, 치환된 사이클로알킬-O-, 치환된 사이클로알케닐-O-, 및 치환된 알키닐-O-를 말하며 치환된 알킬, 치환된 알케닐, 치환된 사이클로알킬, 치환된 사이클로알케닐 및 치환된 알키닐은 본원에서 한정된 바와 같다.
용어 "알콕시아미노"는 기 -NH-알콕시를 말하며, 알콕시는 본원에서 한정된 바와 같다.
용어 "할로알콕시"는 기 알킬-O-를 말하며 알킬 기에서 하나 이상의 수소 원자가 할로 기로 치환되었고, 예로서, 기, 예를 들어, 트리플루오로메톡시, 등을 포함한다.
용어 "할로알킬"은 상기 기술된 바와 같이 치환된 알킬 기를 말하며, 알킬 기에서 하나 이상의 수소 원자는 할로 기로 치환되었다. 이러한 기들의 예는, 제한 없이, 플루오로알킬 기, 예를 들어, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로에틸 등을 포함한다.
용어 "알킬알콕시"는 기 -알킬렌-O-알킬, 알킬렌-O-치환된 알킬, 치환된 알킬렌-O-알킬, 및 치환된 알킬렌-O-치환된 알킬을 말하며 알킬, 치환된 알킬, 알킬렌 및 치환된 알킬렌은 본원에서 한정된 바와 같다.
용어 "알킬티오알콕시"는 기 -알킬렌-S-알킬, 알킬렌-S-치환된 알킬, 치환된 알킬렌-S-알킬 및 치환된 알킬렌-S-치환된 알킬을 말하며 알킬, 치환된 알킬, 알킬렌 및 치환된 알킬렌 본원에서 한정된 바와 같다.
"알케닐"은 2 내지 6개의 탄소 원자 및 바람직하게는 2 내지 4개의 탄소 원자를 가지고 적어도 1개 바람직하게는 1 또는 2개의 이중 결합 불포화 부위를 가지는 직쇄 또는 분지형 하이드로카르빌 기를 말한다. 이 용어는, 예로서, 바이-비닐, 알릴, 및 부트-3-엔-1-일을 포함한다. 씨스 및 트랜스 이성질체 또는 이 이성질체들의 혼합물이 이 용어 내에 포함된다.
용어 "치환된 알케닐"은 본원에서 한정된 바와 같이 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카르복실, 카르복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴 및 -SO2-헤테로아릴로부터 선택된 1 내지 5개의 치환기, 또는 1 내지 3개의 치환기를 가지는 알케닐 기를 말한다.
"알키닐"은 2 내지 6개의 탄소 원자 및 바람직하게는 2 또는 3개의 탄소 원자를 가지고 적어도 1개 및 바람직하게는 1 또는 2개의 삼중 결합 불포화 부위를 각지는 직쇄 또는 분지형 1가 하이드로카르빌 기를 말한다. 이러한 알키닐 기의 예는 아세틸레닐 (-C=CH), 및 프로파르길 (-CH2C=CH)을 포함한다.
용어 "치환된 알키닐"은 본원에서 한정된 바와 같이 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카르복실, 카르복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴, 및 -SO2-헤테로아릴로부터 선택된 1 내지 5개의 치환기, 또는 1 내지 3개의 치환기를 가지는 알키닐 기를 말한다.
"알키닐옥시"는 기 -O-알키닐을 말하며, 알키닐은 본원에서 한정된 바와 같다. 알키닐옥시는, 예로서, 에티닐옥시, 프로피닐옥시, 등을 포함한다.
"아실"은 기 H-C(O)-, 알킬-C(O)-, 치환된 알킬-C(O)-, 알케닐-C(O)-, 치환된 알케닐-C(O)-, 알키닐-C(O)-, 치환된 알키닐-C(O)-, 사이클로알킬-C(O)-, 치환된 사이클로알킬-C(O)-, 사이클로알케닐-C(O)-, 치환된 사이클로알케닐-C(O)-, 아릴-C(O)-, 치환된 아릴-C(O)-, 헤테로아릴-C(O)-, 치환된 헤테로아릴-C(O)-, 헤테로사이클릴-C(O)-, 및 치환된 헤테로사이클릴-C(O)-을 말하며, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로환형, 및 치환된 헤테로환형은 본원에서 한정된 바와 같다. 예를 들어, 아실은 "아세틸" 기 CH3C(O)-를 포함한다.
"아실아미노"는 기 -NR20C(O)알킬, -NR20C(O)치환된 알킬, N R20C(O)사이클로알킬, -NR20C(O)치환된 사이클로알킬, -NR20C(O)사이클로알케닐, -NR20C(O)치환된 사이클로알케닐, -NR20C(O)알케닐, -NR20C(O)치환된 알케닐, -NR20C(O)알키닐, -NR20C(O)치환된 알키닐, -NR20C(O)아릴, -NR20C(O)치환된 아릴, -NR20C(O)헤테로아릴, -NR20C(O)치환된 헤테로아릴, -NR20C(O)헤테로환형, 및 -NR20C(O)치환된 헤테로환형을 말하며, R20은 수소 또는 알킬이고 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로환형, 및 치환된 헤테로환형은 본원에서 한정된 바와 같다.
"아미노카르보닐" 또는 용어 "아미노아실"은 기 -C(O)NR21R22를 말하며, R21 및 R22는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로환형, 및 치환된 헤테로환형으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고 R21 및 R22는 그것들에 결합된 질소와 함께 선택적으로 결합되어 헤테로환형 또는 치환된 헤테로환형 기를 형성하였고, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로환형, 및 치환된 헤테로환형은 본원에서 한정된 바와 같다.
"아미노카르보닐아미노"는 기 -NR21C(O)NR22R23을 말하며 R21, R22, 및 R23은 수소, 알킬, 아릴 또는 사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 두 개의 R 기가 결합되어 헤테로사이클릴 기를 형성한다.
용어 "알콕시카르보닐아미노"는 기 -NRC(O)OR을 말하며 각각의 R은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 또는 헤테로사이클릴이고 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로사이클릴은 본원에서 한정된 바와 같다.
용어 "아실옥시"는 기 알킬-C(O)O-, 치환된 알킬-C(O)O-, 사이클로알킬-C(O)O-, 치환된 사이클로알킬-C(O)O-, 아릴-C(O)O-, 헤테로아릴-C(O)O-, 및 헤테로사이클릴-C(O)O-를 말하며 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로사이클릴은 본원에서 한정된 바와 같다.
"아미노설포닐"은 기 -SO2NR21R22를 말하며, R21 및 R22는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로환형, 치환된 헤테로환형으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고 R21 및 R22는 그것들에 결합된 질소와 함께 선택적으로 결합되어 헤테로환형 또는 치환된 헤테로환형 기를 형성하였고, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로환형 및 치환된 헤테로환형은 본원에서 한정된 바와 같다.
"설포닐아미노"는 기 -NR21SO2R22를 말하며, R21 및 R22는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로환형, 및 치환된 헤테로환형으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고 R21 및 R22는 그것들에 결합된 원자와 함께 선택적으로 결합되어 헤테로환형 또는 치환된 헤테로환형 기를 형성하였고, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로환형, 및 치환된 헤테로환형은 본원에서 한정된 바와 같다.
"아릴" 또는 "AR''은 단일 고리 (예를 들어, 페닐 기에 존재함) 또는 다수의 축합 고리 (이러한 방향족 고리 시스템의 예는 나프틸, 안트릴 및 인다닐을 포함한다)를 가진 고리 시스템을 가지는, 6 내지 18개의 탄소 원자의 1가 방향족 카르보환형 기를 말하며, 이 축합 고리는 방향족일 수도 있거나 아닐 수도 있고, 단 부착점이 방향족 고리의 원자를 통한 것이다. 이 용어는, 예로서, 페닐 및 나프틸을 포함한다. 아릴 치환기에 대한 정의에 의해 달리 제한되지 않으면, 이러한 아릴 기는 아실옥시, 하이드록시, 티올, 아실, 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 알킬, 치환된 알콕시, 치환된 알케닐, 치환된 알키닐, 치환된 사이클로알킬, 치환된 사이클로알케닐, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아실아미노, 알카릴, 아릴, 아릴옥시, 아지도, 카르복실, 카르복실알킬, 시아노, 할로겐, 나이트로, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 아미노아실옥시, 옥시아실아미노, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴, -SO2-헤테로아릴 및 트리할로메틸로부터 선택된 1 내지 5개의 치환기, 또는 1 내지 3개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다.
"아릴옥시"는 기 -O-아릴을 말하며, 아릴은 본원에서 한정된 바와 같이, 예로서, 페녹시, 나프톡시, 등을 포함하고, 또한 본원에서 한정된 바와 같이 선택적으로 치환된 아릴 기를 포함한다.
"아미노"는 기 -NH2를 말한다.
용어 "치환된 아미노"는 기 -NRR을 말하며 각각의 R은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로사이클릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 단 적어도 하나의 R은 수소가 아니다.
용어 "아지도"는 기 -N3을 말한다.
"카르복실", "카르복시" 또는 "카르복실레이트"는 -CO2H 또는 이것의 염을 말한다.
"카르복실 에스터" 또는 "카르복시 에스터" 또는 용어 "카르복시알킬" 또는 "카르복실알킬"은 기 -C(O)O-알킬, -C(O)O-치환된 알킬, -C(O)O-알케닐, -C(O)O-치환된 알케닐, -C(O)O-알키닐, -C(O)O-치환된 알키닐, -C(O)O-아릴, -C(O)O-치환된 아릴, -C(O)O-사이클로알킬, -C(O)O-치환된 사이클로알킬, -C(O)O-사이클로알케닐, -C(O)O-치환된 사이클로알케닐, -C(O)O-헤테로아릴, -C(O)O-치환된 헤테로아릴, -C(O)O-헤테로환형, 및 -C(O)O-치환된 헤테로환형을 말하며, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로환형, 및 치환된 헤테로환형은 본원에서 한정된 바와 같다.
"(카르복실 에스터)옥시" 또는 "카보네이트"는 기 -O-C(O)O-알킬, -O-C(O)O-치환된 알킬, -O-C(O)O-알케닐, -O-C(O)O-치환된 알케닐, -O-C(O)O-알키닐, -O-C(O)O-치환된 알키닐, -O-C(O)O-아릴, -O-C(O)O-치환된 아릴, -O-C(O)O-사이클로알킬, -O-C(O)O-치환된 사이클로알킬, -O-C(O)O-사이클로알케닐, -O-C(O)O-치환된 사이클로알케닐, -O-C(O)O-헤테로아릴, -O-C(O)O-치환된 헤테로아릴, -O-C(O)O-헤테로환형, 및 -O-C(O)O-치환된 헤테로환형을 말하며, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로환형, 및 치환된 헤테로환형은 본원에서 한정된 바와 같다.
"시아노" 또는 "나이트릴"은 기 -CN을 말한다.
"사이클로알킬"은 융합된, 브리지된(bridged), 및 스피로(spiro) 고리 시스템을 포함하는 단일 또는 다중 환형 고리를 가지는 3 내지 10개의 탄소 원자의 환형 알킬 기를 말한다. 적합한 사이클로알킬 기의 예는, 예를 들어, 아다만틸, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로옥틸 등을 포함한다. 이러한 사이클로알킬 기는, 예로서, 단일 고리 구조, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로옥틸, 등, 또는 다중 고리 구조, 예를 들어, 아다만타닐, 등을 포함한다.
용어 "치환된 사이클로알킬"은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카르복실, 카르복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴 및 -SO2-헤테로아릴로부터 선택된 1 내지 5개의 치환기, 또는 1 내지 3개의 치환기를 가지는 사이클로알킬 기를 말한다.
"사이클로알케닐"은 단일 또는 다중 고리를 가지고 적어도 하나의 이중 결합 및 바람직하게는 1 내지 2개의 이중 결합을 가지는 3 내지 10개의 탄소 원자의 비-방향족 환형 알킬 기를 말한다.
용어 "치환된 사이클로알케닐"은 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 케토, 티오케토, 카르복실, 카르복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴 및 -SO2-헤테로아릴로부터 선택된 1 내지 5개의 치환기, 또는 1 내지 3개의 치환기를 가지는 사이클로알케닐 기를 말한다.
"사이클로알키닐"은 단일 또는 다중 고리를 가지고 적어도 하나의 삼중 결합을 가지는 5 내지 10개의 탄소 원자의 비-방향족 사이클로알킬 기를 말한다.
"사이클로알콕시"는 -O-사이클로알킬을 말한다.
"사이클로알케닐옥시"는 -O-사이클로알케닐을 말한다.
"할로" 또는 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오드를 말한다.
"하이드록시" 또는 "하이드록실"은 기 -OH를 말한다.
"헤테로아릴"은 고리 내에서 산소, 질소, 및 황으로 구성된 군으로부터 선택된 1 내지 15개의 탄소 원자, 예를 들어, 1 내지 10개의 탄소 원자 및 1 내지 10개의 헤테로원자의 방향족 기를 말한다. 이러한 헤테로아릴 기는 고리 시스템 내에서 단일 고리 (예를 들어, 피리디닐, 이미다졸릴 또는 푸릴) 또는 다수의 축합 고리 (예를 들어, 기, 예를 들어, 인돌리지닐, 퀴놀리닐, 벤조푸란, 벤즈이미다졸릴 또는 벤조티에닐에서와 같음)를 가질 수 있으며, 고리 시스템 내 적어도 하나의 고리는 방향족이고 고리 시스템 내 적어도 하나의 고리는 방향족이며, ㄷ단 부착점은 방향족 고리의 원자를 통한 것이다. 특정 구체예에서, 헤테로아릴 기의 질소 및/또는 황 고리 원자(들)는 N-옥시드 (NO), 설피닐, 또는 설포닐 모이어티를 제공하도록 선택적으로 산화된다. 이 용어는, 예로서, 피리디닐, 피롤릴, 인돌릴, 티오페닐, 및 푸라닐을 포함한다. 헤테로아릴 치환기에 대한 정의에 의해 달리 제한되지 않으면, 이러한 헤테로아릴 기는 아실옥시, 하이드록시, 티올, 아실, 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 알킬, 치환된 알콕시, 치환된 알케닐, 치환된 알키닐, 치환된 사이클로알킬, 치환된 사이클로알케닐, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아실아미노, 알카릴, 아릴, 아릴옥시, 아지도, 카르복실, 카르복실알킬, 시아노, 할로겐, 나이트로, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 아미노아실옥시, 옥시아실아미노, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴 및 -SO2-헤테로아릴, 및 트리할로메틸로부터 선택된 1 내지 5개의 치환기, 또는 1 내지 3개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다.
용어 "헤테로아랄킬"은 기 -알킬렌-헤테로아릴을 말하며 알킬렌 및 헤테로아릴은 본원에서 한정된다. 이 용어는, 예로서, 피리딜메틸, 피리딜에틸, 인돌릴메틸, 등을 포함한다.
"헤테로아릴옥시"는 -O-헤테로아릴을 말한다.
"헤테로환", "헤테로환형", "헤테로사이클로알킬", 및 "헤테로사이클릴"은 융합된, 브리지된 및 스피로 고리 시스템을 포함하는, 단일 고리 또는 다수의 축합 고리를 가지고, 1 내지 10개의 헤테로 원자를 포함하는, 3 내지 20개의 고리 원자를 가지는 포화된 또는 불포화된 기를 말한다. 이 고리 원자는 질소, 황, 또는 산소로 구성된 군으로부터 선택되며, 융합된 고리 시스템에서, 고리 중 하나 이상은 사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴일 수 있고, 단 부착점은 비-방향족 고리를 통한 것이다. 특정 구체예에서, 헤테로환형 기의 질소 및/또는 황 원자(들)는 N-옥시드, -S(O)-, 또는 -SO2- 모이어티를 제공하도록 선택적으로 산화된다.
헤테로환 및 헤테로아릴의 예는 아제티딘, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 인돌리진, 아이소인돌, 인돌, 디하이드로인돌, 인다졸, 퓨린, 퀴놀리진, 아이소퀴놀린, 퀴놀린, 프탈라진, 나프틸피리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 프테리딘, 카르바졸, 카르볼린, 페난트리딘, 아크리딘, 페난트롤린, 아이소티아졸, 페나진, 아이속사졸, 페녹사진, 페노티아진, 이미다졸리딘, 이미다졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌린, 프탈리미드, 1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀린, 4,5,6,7-테트라하이드로벤조[b]티오펜, 티아졸, 티아졸리딘, 티오펜, 벤조[b]티오펜, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐 (티아모르폴리닐로도 불림), 1,1-디옥소티오모르폴리닐, 피페리디닐, 피롤리딘, 테트라하이드로푸라닐, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
헤테로환형 치환기에 대한 정의에 의해 달리 제한되지 않으면, 이러한 헤테로환형 기는 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카르복실, 카르복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴, -SO2-헤테로아릴, 및 융합된 헤테로환으로부터 선택된 1 내지 5개, 또는 1 내지 3개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다.
"헤테로사이클릴옥시"는 기 -O-헤테로사이클릴을 말한다.
용어 "헤테로사이클릴티오"는 기 헤테로환형-S-를 말한다.
용어 "헤테로사이클렌"은 헤테로환으로 형성된 2가 라디칼 기를 말하며, 본원에서 한정된 바와 같다.
용어 "하이드록시아미노"는 기 -NHOH를 말한다.
"나이트로"는 기 -NO2를 말한다.
"옥소"는 원자 (=O)를 말한다.
"설포닐"은 기 SO2-알킬, SO2-치환된 알킬, SO2-알케닐, SO2-치환된 알케닐, SO2-사이클로알킬, SO2-치환된 사이클로알킬, SO2-사이클로알케닐, SO2-치환된 사이클로알케닐, SO2-아릴, SO2-치환된 아릴, SO2-헤테로아릴, SO2-치환된 헤테로아릴, SO2-헤테로환형, 및 SO2-치환된 헤테로환형을 말하며, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로환형, 및 치환된 헤테로환형은 본원에서 한정된 바와 같다. 설포닐은, 예로서, 메틸-SO2-, 페닐-SO2-, 및 4-메틸페닐-SO2-를 포함한다.
"설포닐옥시"는 기 -OSO2-알킬, OSO2-치환된 알킬, OSO2-알케닐, OSO2-치환된 알케닐, OSO2-사이클로알킬, OSO2-치환된 사이클로알킬, OSO2-사이클로알케닐, OSO2-치환된 사이클로알케닐, OSO2-아릴, OSO2-치환된 아릴, OSO2-헤테로아릴, OSO2-치환된 헤테로아릴, OSO2-헤테로환형, 및 OSO2 치환된 헤테로환형을 말하며, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로환형, 및 치환된 헤테로환형은 본원에서 한정된 바와 같다.
용어 "아미노카르보닐옥시"는 기 -OC(O)NRR을 말하며 각각의 R은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 또는 헤테로환형이고 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로환형은 본원에서 한정된 바와 같다.
"티올"은 기 -SH를 말한다.
"티옥소" 또는 용어 "티오케토"는 원자 (=S)를 말한다.
"알킬티오" 또는 용어 "티오알콕시"는 기 -S-알킬을 말하며, 알킬은 본원에서 한정된 바와 같다. 특정 구체예에서, 황은 -S(O)-로 산화될 수도 있다. 설폭시드는 하나 이상의 입체이성질체로서 존재할 수도 있다.
용어 "치환된 티오알콕시"는 기 -S-치환된 알킬을 말한다.
용어 "티오아릴옥시"는 기 아릴-S-를 말하며 아릴 기는 본원에서 한정된 바와 같고 본원에서도 한정된 선택적으로 치환된 아릴 기를 포함한다.
용어 "티오헤테로아릴옥시"는 기 헤테로아릴-S-를 말하며 헤테로아릴 기는 본원에서 한정된 바와 같고 본원에서도 한정된 선택적으로 치환된 아릴 기를 포함한다.
용어 "티오헤테로사이클로옥시"는 기 헤테로사이클릴-S-를 말하며 헤테로사이클릴 기는 본원에서 한정된 바와 같고 본원에서도 한정된 선택적으로 치환된 아릴 기를 포함한다.
본원의 개시물 이외에, 용어 "치환된"은, 명시된 기 또는 라디칼을 변형시키는데 사용될 때, 하기 한정된 바와 같이, 명시된 기 또는 라디칼의 하나 이상의 수소 원자가 각각, 서로 독립적으로, 같거나 다른 치환기로 대체된다는 것을 의미할 수도 있다.
본원에서 개개의 용어에 대하여 개시된 기 이외에, 명시된 기 또는 라디칼의 포화된 탄소 원자에서 하나 이상의 수소를 치환하는 치환기 (단일 탄소에서 임의 두 개의 수소가 =O, =NR70, =N-OR70, =N2 또는 =S로 치환될 수 있다)는, 달리 명시되지 않으면, -R60, 할로, =O, -OR70, -SR70, -NR80R80, 트리할로메틸, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -SO2R70, -SO2O-M+, -SO2OR70, -OSO2R70, -OSO2O-M+, -OSO2OR70, -P(O)(O-)2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)2, -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -C(O)O-M+, -C(O)OR70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OC(O)O-M+, -OC(O)OR70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70CO2 -M+, -NR70CO2R70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 및 -NR70C(NR70)NR80R80이며, R60은 선택적으로 치환된 알킬, 사이클로알킬, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 사이클로알킬알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 및 헤테로아릴알킬로 구성된 군으로부터 선택되고, 각각의 R70은 독립적으로 수소 또는 R60이고; 각각의 R80은 독립적으로 R70이거나 또는 대안으로, 두 개의 R80은, 그것들이 결합되는 질소 원자와 함께, O, N 및 S로 구성된 군으로부터 선택된, 같거나 다른 추가적인 헤테로원자 중 1 내지 4개를 선택적으로 포함할 수도 있는 5-, 6- 또는 7-원자 헤테로사이클로알킬을 형성하며, 이것들 중에서 N은 -H 또는 C1-C3 알킬 치환을 가질 수도 있고; 각각의 M+는 네트(net) 단일 양전하를 가진 반대 이온이다. 각각의 M+는 독립적으로, 예를 들어, 알칼리 이온, 예를 들어, K+, Na+, Li+; 암모늄 이온, 예를 들어, +N(R60)4; 또는 알칼리 토금속 이온, 예를 들어, [Ca2+]0.5, [Mg2 +]0.5, 또는 [Ba2 +]0.5일 수도 있다 ("아래 첨자 0.5는 이러한 2가 알칼리 토금속 이온에 대한 반대 이온 중 하나가 본 발명의 화합물의 이온화된 형태이고 다른 하나가 전형적인 반대 이온, 예를 들어, 염소이거나, 또는 본원에서 개시된 두 개의 이온화된 화합물이 이러한 2가 알칼리 토금속 이온에 대한 반대 이온의 역할을 할 수 있거나, 또는 본 발명의 이중으로 이온화된 화합물이 이러한 2가 알칼리 토금속 이온에 대한 반대 이온의 역할을 할 수 있다는 것을 의미한다). 구체적인 예로서, -NR80R80은 -NH2, -NH-알킬, N-피롤리디닐, N-피페라지닐, 4N-메틸-피페라진-1-일 및 N-모르폴리닐을 포함하는 것을 의미한다.
본원의 개시물 이외에, "치환된" 알켄, 알카인, 아릴 및 헤테로아릴 기의 불포화된 탄소 원자에서 수소에 대한 치환기는, 달리 명시되지 않으면, -R60, 할로, -O-M+, -OR70, -SR70, -S-M+, -NR80R80, 트리할로메틸, -CF3, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, -N3, -SO2R70, -SO3 -M+, -SO3R70, -OSO2R70, -OSO3 -M+, -OSO3R70, -PO3 -2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)2, -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -CO2 -M+, -CO2R70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OCO2 -M+, -OCO2R70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70CO2 -M+, -NR70CO2R70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 및 -NR70C(NR70)NR80R80이며, R60, R70, R80 및 M+는 앞서 한정된 바와 같고, 단 치환된 알켄 또는 알카인의 경우에, 치환기는 -O-M+, -OR70, -SR70, 또는 -S-M+가 아니다.
본원에서 개개의 용어에 대하여 개시된 기 이외에, "치환된" 헤테로알킬 및 사이클로헤테로알킬 기의 질소 원자에서 수소에 대한 치환기는, 달리 명시되지 않으면, -R60, -O-M+, -OR70, -SR70, -S-M+, -NR80R80, 트리할로메틸, -CF3, -CN, -NO, -NO2, -S(O)2R70, -S(O)2O-M+, -S(O)2OR70, -OS(O)2R70, -OS(O)2O-M+, -OS(O)2OR70, -P(O)(O-)2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)(OR70), -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -C(O)OR70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OC(O)OR70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70C(O)OR70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 및 -NR70C(NR70)NR80R80이며, R60, R70, R80 및 M+는 앞서 한정된 바와 같다.
본원의 개시물 이외에, 특정 구체예에서, 치환된 기는 1, 2, 3, 또는 4개의 치환기, 1, 2, 또는 3개의 치환기, 1 또는 2개의 치환기, 또는 1 치환기를 가진다.
상기 한정된 모든 치환된 기에서, 치환기를 그것들 자체에 대한 추가의 치환기로 한정함으로써 도착된 폴리머 (예를 들어, 치환된 아릴 기로 자체로 치환된 치환기로서 치환된 아릴 기를 가지는 치환된 아릴, 이것은 치환된 아릴 기, 등으로 추가로 치환된다)는 본원에 포함되지 않는 것으로 생각된다. 이러한 경우에, 이러한 치환의 최대 수는 세 개이다. 예를 들어, 본원에서 구체적으로 고려된 치환된 아릴 기의 일련의 치환은 치환된 아릴-(치환된 아릴)-치환된 아릴로 제한된다.
달리 지시되지 않으면, 본원에서 명확하게 한정되지 않은 치환기의 명명법은 작용기의 말단 부분에 이어서 부착점에 인접한 작용기를 명명함으로써 도착된다. 예를 들어, 치환기 "아릴알킬옥시카르보닐"은 기 (아릴)-(알킬)-O-C(O)-를 말한다.
하나 이상의 치환기를 함유하는, 본원에서 개시된 기들 중 어느 것에 관하여, 당연히, 이러한 기들은 입체적으로 비현실적인 및/또는 합성적으로 실현 불가능한 어떠한 치환 또는 치환 패턴도 함유하지 않는 것으로 생각된다. 이에 더하여, 대상 화합물은 이 화합물들의 치환으로부터 발생하는 모든 입체화학적 이성질체를 포함한다.
용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 환자, 예를 들어, 포유동물에게 투여가 허용 가능한 염 (주어진 투약 요법이 허용 가능한 포유류 안전성을 가지는 반대 이온을 가진 염)을 의미한다. 이러한 염은 약학적으로 허용 가능한 무기 또는 유기 염기 및 약학적으로 허용 가능한 무기 또는 유기 산으로부터 유래될 수 있다. "약학적으로 허용 가능한 염"은 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염을 말하며, 이 염들은 업계에 잘 공지되어 있는 다양한 유기 및 무기 반대 이온으로부터 유래되고, 단지 예로서, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄, 등; 및 분자가 염기성 작용기를 함유할 때, 유기 또는 무기 산의 염, 예를 들어, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포르메이트, 타르트레이트, 베실레이트, 메실레이트, 아세테이트, 말레에이트, 옥살레이트, 등을 포함한다.
용어 "이것들의 염"은 산의 일부가 양이온, 예를 들어, 금속 양이온 또는 유기 양이온 등으로 대체될 때 형성된 화합물을 의미한다. 적용 가능할 때, 염은 약학적으로 허용 가능한 염이지만, 이것은 환자에게 투여하려는 것이 아닌 중간 화합물의 염에 필요하지 않다. 예로서, 본 화합물의 염은
화합물이 무기 또는 유기 산에 의해 양자화되어 양이온을 형성하는 것들을 포함하며, 염의 음이온성 구성요소로서 무기 또는 유기 산의 컨쥬게이트 염기로 양이온을 형성하는 것들을 포함한다.
"용매 화합물"은 용질의 분자 또는 이온과 용매 분자의 조합에 의해 형성된 복합체를 말한다. 용매는 유기 화합물, 무기 화합물, 또는 둘 다의 혼합물일 수 있다. 용매의 몇몇 예들은 메탄올, N,N-디메틸포름아미드, 테트라하이드로푸란, 디메틸설폭시드, 및 물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 용매가 물일 때, 형성된 용매 화합물은 하이드레이트이다.
"입체이성질체" 및 "입체이성질체"는 공간에서 원소 연결성이 같지만 원자 배열이 다른 화합물을 말한다. 입체이성질체는 씨스-트랜스 이성질체, E 및 Z 이성질체, 거울상체, 및 부분입체이성질체를 포함한다.
"호변체(Tautomer)"는 원자의 전자 결합 및/또는 양성자의 위치만이 다른 분자의 대체 형태, 예를 들어, 에놀-케토 및 이민-에나민 호변체, 또는 -N=C(H)-NH- 고리 원자 배열을 함유하는 헤테로아릴 기의 호변이성 형태, 예를 들어, 피라졸, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 트리아졸, 및 테트라졸을 말한다. 당업자들은 다른 호변이성 고리 원자 배열이 가능한 것으로 인식할 것이다.
염, 용매 화합물 및 입체이성질체의 모든 순열, 예를 들어, 대상 화합물의 입체이성질체의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매 화합물을 포함하도록 의도된 것으로 이해될 것이다.
"약학적 유효량" 및 "치료적 유효량"은 명시된 장애 또는 질환 또는 그것의 증상 중 하나 이상을 치료하고 및/또는 상기 질환 또는 장애의 발생을 예방하기에 충분한 화합물의 양을 말한다. 종양 형성성 증식성 질환에 관하여, 약학적 또는 치료적 유효량은, 다른 것들 중에서, 종양이 수축되게 하거나 종양의 성장 속도를 감소시키기에 충분한 양을 포함한다.
"환자"는 인간 및 비-인간 대상체, 특히 포유류 대상체를 말한다.
용어 "치료" 또는 "처치"는 본원에서 사용된 바와 같이 환자, 예를 들어, 포유동물 (특히 인간)의 질환 또는 질병의 치료 또는 처치를 의미하며 다음을 포함한다: (a) 질환 또는 질병의 발생을 방지, 예를 들어, 대상체의 예방적 처치; (b) 질환 또는 질병의 개선, 예를 들어, 환자의 질환 또는 질병의 제거 또는 퇴행 유발; (c) 예를 들어, 환자의 질환 또는 질병의 발달을 둔화시키거나 저지함으로써 질환 또는 질병의 억제; 또는 (d) 환자의 질환 또는 질병의 증상 완화.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", 및 "단백질"은 임의 길이의 아미노산의 폴리머 형태를 나타내도록 본원에서 교체 가능하게 사용된다. 달리 구체적으로 지시되지 않으면, "폴리펩타이드", "펩타이드", 및 "단백질"은 유전적 암호화된 및 비-암호화된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도된 아미노산, 및 변형된 펩타이드 백본을 가지는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 용어는 이종 기원 아미노산 서열과의 융합 단백질, 이종 기원 및 상동성 선도 서열과의 융합체, 적어도 하나의 N-말단 메티오닌 잔기를 함유하는 단백질 (예를 들어, 재조합 박테리아 숙주 세포에서 생산을 용이하게 하도록); 면역학적으로 태그된 단백질; 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 융합 단백질을 포함한다.
"고유한 아미노산 서열" 또는 "모체 아미노산 서열"은 변형된 아미노산 잔기를 포함하기 위한 변형 이전의 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 나타내도록 본원에서 교체 가능하게 사용된다.
용어 "아미노산 유사체", "비천연 아미노산", 등은 교체 가능하게 사용될 수도 있고, 자연 발생 단백질에서 흔히 발견되는 하나 이상의 아미노산 (예를 들어, Ala 또는 A, Cys 또는 C, Asp 또는 D, Glu 또는 E, Phe 또는 F, Gly 또는 G, His 또는 H, Ile 또는 I, Lys 또는 K, Leu 또는 L, Met 또는 M, Asn 또는 N, Pro 또는 P, Gln 또는 Q, Arg 또는 R, Ser 또는 S, Thr 또는 T, Val 또는 V, Trp 또는 W, Tyr 또는 Y)과 구조 및/또는 전체적인 형상이 유사한 아미노산-유사 화합물을 포함한다. 아미노산 유사체는 또한 변형된 측쇄 또는 백본을 가진 천연 아미노산을 포함한다. 아미노산 유사체는 또한 아미노산 유사체의 자연 발생한 D형, 뿐만 아니라 L형과 같은 입체화학적 성질을 가진 아미노산 유사체를 포함한다. 일부 경우에서, 아미노산 유사체는 하나 이상의 천연 아미노산의 백본 구조, 및/또는 측쇄 구조를 공유하며, 차이(들)는 분자에서 하나 이상의 변형된 기이다. 이러한 변형은 관련된 원자 (예를 들어, S)에 대한 원자 (예를 들어, N)의 치환, 기 (예를 들어, 메틸, 또는 하이드록실, 등) 또는 원자 (예를 들어, Cl 또는 Br, 등)의 추가, 기의 결실, 공유 결합 (이중 결합에 대한 단일 결합, 등)의 치환, 또는 이것들의 조합을 포함할 수도 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 아미노산 유사체는 α-하이드록시 산, 및 α-아미노산, 등을 포함할 수도 있다.
용어 "카르보하이드레이트" 등은 단당류, 이당류, 올리고당, 및 다당류의 모노머 유닛 및/또는 폴리머를 나타내는데 사용될 수도 있다. 용어 당은 더 작은 카르보하이드레이트, 예를 들어, 단당류, 이당류를 나타내는데 사용될 수도 있다. 용어 "카르보하이드레이트 유도체"는 원하는 카르보하이드레이트의 하나 이상의 작용기가 치환되거나 (어떤 편리한 치환기로 대체됨), 변형되거나 (어떤 편리한 화학법을 사용하여 또 다른 기로 전환됨) 또는 없는 (예를 들어, 제거되거나 H로 대체됨) 화합물을 포함한다. 다양한 카르보하이드레이트 및 카르보하이드레이트 유도체는 대상 화합물 및 컨쥬게이트에서 이용 가능하고 이것의 사용에 적용될 수도 있다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며 단클론성 항체 (전장 단클론성 항체 포함), 다클론성 항체, 및 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 인간화된 항체, 단일 사슬 항체, 키메라 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab 단편), 등을 포함한다. 항체는 표적 항원에 결합할 수 있다 (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). 표적 항원은 에피토프로도 불리는 하나 이상의 결합 부위를 가질 수 있으며, 항체의 하나 이상의 가변 영역에 의해 형성된 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 인식된다.
용어 "천연 항체"는 다세포 유기체의 면역 시스템에 의해 항체의 중쇄 및 경쇄가 만들어지고 쌍을 이루는 항체를 말한다. 비장, 림프절, 골수 및 혈청은 천연 항체를 생산하는 조직의 예이다. 예를 들어, 항원으로 면역화된 제1 동물로부터 분리된 항체 생산 세포에 의해 생산된 항체는 천연 항체이다.
용어 "인간화된 항체" 또는 "인간화된 면역글로불린"은 인간 항체의 해당하는 위치에 있는 아미노산으로 치환된 하나 이상의 아미노산 (예를 들어,프레임워크 영역, 불변 영역 또는 CDR에서)을 함유하는 비-인간 (예를 들어, 마우스 또는 토끼) 항체를 말한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 같은 항체의 비-인간화된 버전과 비교하여, 인간 숙주에서 감소된 면역 반응을 생산한다. 항체는, 예를 들어, CDR-그래프팅(CDR-grafting) (EP 239,400; PCT 공개 WO 91/09967; 미국 특허 번호 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089), 베니어링(veneering) 또는 리서페이싱(resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)), 및 사슬 셔플링(shuffling) (미국 특허 번호 5,565,332)을 포함하는, 업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다. 특정 구체예에서, 프레임워크 치환은 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR 및 프레임워크 잔기 상호작용의 모델링 및 특정 위치에서 특이한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988) 참조). 본 발명에서 사용에 대하여 고려되는 항체를 인간화하기 위한 추가적인 방법은 미국 특허 번호 5,750,078; 5,502,167; 5,705,154; 5,770,403; 5,698,417; 5,693,493; 5,558,864; 4,935,496; 및 4,816,567, 및 PCT 공개 WO 98/45331 및 WO 98/45332에서 기술된다. 특정 구체예에서, 대상 토끼 항체는 US20040086979 및 US20050033031에서 제시된 방법에 따라 인간화될 수도 있다. 따라서, 상기 기술된 항체는 업계에 공지된 방법을 사용하여 인간화될 수도 있다.
용어 "키메라 항체"는 전형적으로 유전적 조작에 의해 다른 종에 속하는 항체 가변 및 불변 영역 유전자로부터 경쇄 및 중쇄 유전자가 구성된 항체를 말한다. 예를 들어, 마우스 단클론성 항체의 유전자의 가변 세그먼트는 인간 불변 세그먼트, 예를 들어, 감마 1 및 감마 3에 결합될 수도 있다. 치료적 키메라 항체의 예는 마우스 항체의 가변 또는 항원-결합 도메인 및 인간 항체의 불변 또는 효과기 도메인으로 구성되지만, 다른 포유류 종의 도메인이 사용될 수도 있는 하이브리드(hybrid) 단백질이다.
면역글로불린 폴리펩타이드 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR''로도 불리는 세 개의 초가변 영역에 의해 개입된 프레임워크 영역 (FR)으로 구성된다. 프레임워크 영역 및 CDR의 크기는 한정되더 있다 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, 1991 참조). 구성 경쇄 및 중쇄의 결합된 프레임워크 영역인, 항체의 프레임워크 영역은 CDR을 배치하고 정렬하는 역할을 한다. CDR은 항원의 에피토프로의 결합의 주된 원인이다.
본 개시물 전반에 걸쳐, 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄에서 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)에서와 같고, 본원에 참고로 명확하게 포함된다.
"모체 Ig 폴리펩타이드"는 본원에서 기술된 바와 같이 알데하이드-태그된 불변 영역이 결핍된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다. 모체 폴리펩타이드는 고유한 서열 불변 영역을 포함할 수도 있거나, 또는 기존의 아미노산 서열 변형 (예를 들어, 추가, 결실 및/또는 치환)을 가진 불변 영역을 포함할 수도 있다.
Ig 폴리펩타이드의 맥락에서, 용어 "불변 영역"은 업계에서 잘 알려져 있으며, Ig 중쇄, 또는 Ig 경쇄의 C-말단 영역을 말한다. Ig 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2, 및 CH3 도메인 (그리고 중쇄가 μ 또는 ε 중쇄인 경우, CH4 도메인)을 포함한다. 고유한 Ig 중쇄에서는, CH1, CH2, CH3 (그리고, 존재하면, CH4) 도메인은 중쇄 가변 (VH) 영역 (이것에 대한 C-말단) 바로 다음에 시작하고, 각각 길이가 약 100개의 아미노산 내지 약 130개의 아미노산이다. 고유한 Ig 경쇄에서는, 불변 영역은 경쇄 가변 (VL) 영역 (이것에 대한 C-말단) 바로 다음에 시작하고, 길이가 약 100개의 아미노산 내지 120개의 아미노산이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CDR'' 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견된 비-연속적 항원 결합 부위를 의미한다. CDR은 Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); 및 MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)에 의해 기술되었고, 정의는 서로 비교될 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 부분집합을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이식된 항체 또는 이것들의 변이체의 CDR을 나타내기 위한 정의의 적용은 본원에서 한정되고 사용된 용어의 범위 내에 있다. 상기 인용된 참고문헌에 의해 한정된 바와 같이 CDR을 포함하는 아미노산 잔기는 비교대상으로서 하기 표 1에서 제시된다.
CDR 정의
Kabat1 Chothia2 MacCallum3
VH CDR1 31-35 26-32 30-35
VH CDR2 50-65 53-55 47-58
VH CDR3 95-102 96-101 93-101
VL CDR1 24-34 26-32 30-36
VL CDR2 50-56 50-52 46-55
VL CDR3 89-97 91-96 89-96
1 잔기 넘버링은 Kabat et al., 상기의 명명법에 따른다
2 잔기 넘버링은 Chothia et al., 상기의 명명법에 따른다
3 잔기 넘버링은 MacCallum et al., 상기의 명명법에 따른다
폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열에 관하여 사용된 바와 같이 "유전적으로 암호화 가능한"은 아미노산 서열을 암호화하는 핵산의 전사 및 번역에 의해 생산 가능한 아미노산 잔기로 구성된다는 것을 의미하며, 전사 및/또는 번역은 세포 또는 무세포 시험관 내 전사/번역 시스템에서 일어날 수도 있다.
용어 "대조군 서열"은 특정 발현 시스템, 예를 들어, 포유류 세포, 박테리아 세포, 무세포 합성, 등에서 작동 가능하게 연결된 암호화 서열의 발현을 용이하게 하는 DNA 서열을 말한다. 원핵세포 시스템에 적합한 대조군 서열은, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터(operator) 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵세포 시스템은 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서를 이용할 수도 있다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과의 기능적 관계로 배치될 때 "작동 가능하게 연결된다". 예를 들어, 전구 서열에 대한 DNA 또는 분비형 선도 서열은 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현되면 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 암호화 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역의 개시를 용이하게 하도록 배치되면 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 분비형 선도 서열의 경우에는, 인접하고 리딩 프레임(reading frame) 내에 있다는 것을 의미한다. 연결은 결찰에 의해 또는 증폭 반응을 통해 달성된다. 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커는 통상적인 실시에 따라 서열을 연결하는데 사용될 수도 있다.
용어 "발현 카세트"는 본원에서 사용된 바와 같이 핵산으로 삽입될 수 있는 (예를 들어, 원하는 구조물로의 결찰과 호환 가능한 제한 부위의 사용에 의해 또는 원하는 구조물 또는 숙주 세포 게놈으로의 상동 재조합에 의해) 핵산의 세그먼트, 보통은 DNA를 말한다. 일반적으로, 핵산 세그먼트는 원하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 카세트 및 제한 부위는 전사 및 번역에 적합한 리딩 프레임 내에서 카세트의 삽입을 용이하게 하도록 설계된다. 발현 카세트는 또한 숙주 세포에서 원하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 용이하게 하는 요소들을 포함할 수 있다. 이 요소들은 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서, 반응 요소, 종결자 서열, 폴리아데닐화 서열, 등을 포함할 수도 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "단리된"은 화합물이 자연적으로 발생하는 것과는 다른 환경에 있는 원하는 화합물을 기술하기 위한 것이다. "단리된"은 원하는 화합물이 실질적으로 풍부하고 및/또는 원하는 화합물이 부분적으로 또는 실질적으로 정제되는 샘플 내에 있는 화합물을 포함하기 위한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 정제된"은 천연 환경으로부터 제거되고 자연적으로 회합되는 다른 구성요소들로부터 적어도 60% 없는, 적어도 75% 없는, 적어도 80% 없는, 적어도 85% 없는, 적어도 90% 없는, 적어도 95% 없는, 적어도 98% 없는, 또는 98% 이상이 없는 화합물을 말한다.
용어 "생리학적 조건"은 살아있는 세포와 호환 가능한 상기 조건, 예를 들어, 살아있는 세포와 호환 가능한 온도, pH, 염도, 등의 주로 수성 조건을 포함하기 위한 것이다.
"반응 파트너"는 반응 생성물을 생산하기 위해 또 다른 반응 파트너와 특이적으로 반응하는 분자 또는 분자 모이어티를 의미한다. 예시의 반응 파트너는 설파타제 모티프(motif)의 시스테인 또는 세린 및 반응하여 모티프에서 시스테인 또는 세린 대신에 포르밀글리신 (FGly)을 함유하는 전환된 알데하이드 태그의 반응 생성물을 형성하는 포르밀글리신 생성 효소 (FGE)를 포함한다. 다른 예시의 반응 파트너는 전환된 알데하이드 태그의 fGly 잔기의 알데하이드 (예를 들어, 반응성 알데하이드 기) 및 원하는 알데하이드-반응성 기 및 모이어티를 포함하고, 반응하여 변형된 fGly 잔기를 통해 변형된 폴리펩타이드에 컨쥬게이션된 원하는 모이어티를 가지는 변형된 알데하이드 태그된 폴리펩타이드의 반응 생성물을 형성하는 "알데하이드-반응성 반응 파트너"를 포함한다.
"N-말단"은 유리 아민 기를 가진 폴리펩타이드의 말단 아미노산 잔기를 말하며, 비-N-말단 아미노산 잔기에서 이 아민 기는 보통 폴리펩타이드의 공유 결합 백본의 일부를 형성한다.
"C-말단"은 유리 카르복실 기를 가진 폴리펩타이드의 말단 아미노산 잔기를 말하며, 비-C-말단 아미노산 잔기에서 이 카르복실 기는 보통 폴리펩타이드의 공유 결합 백본의 일부를 형성한다.
"내부 부위"는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 관하여 사용된 바와 같이 N-말단 또는 C-말단에 있지 않은 폴리펩타이드의 영역을 의미한다.
본 발명이 더 기술되기 전에, 본 발명은 기술된 특정 구체예에 제한되지 않으며, 이러한 것들은, 물론, 변경될 수도 있다고 생각되어야 한다. 또한 본 발명의 범위는 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되기 때문에, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술하려는 목적을 위한 것이며, 제한하려는 것은 아니라고 생각되어야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 상기 범위의 상한 및 하한 사이에서, 문맥상 달리 분명하게 지시되지 않으면 하한의 유닛의 10분의 1까지의, 각각의 사이 값 및 어떤 다른 명시된 값 또는 상기 명시된 범위 내 사이 값은 본 발명 내에 포함되는 것으로 생각된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 더 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수도 있으며, 또한 본 발명 내에 포함되고, 명시된 범위에서 어떤 특이적으로 제외된 한계가 적용된다. 명시된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 상기 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 제외하는 범위 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 일부 특징들은, 명확성을 위해서, 별도의 구체예의 맥락으로 기술되며, 또한 단일 구체예로 조합으로 제공될 수도 있다. 반대로, 본 발명의 다양한 특징들은, 간결성을 위해서, 단일 구체예의 맥락으로 기술되며, 또한 별도로 또는 어떤 적합한 부분 조합으로 제공될 수도 있다. 본 발명에 적용되는 구체예의 모든 조합은 모든 조합이 개별적으로 및 명확하게 개시된 것처럼, 이러한 조합이, 예를 들어, 안정한 화합물인 화합물 (즉, 제조되고, 단리되고, 특성화되고, 생물학적 활성에 대하여 테스트될 수 있는 화합물)인 소재를 포함하는 정도로, 본 발명에 구체적으로 포함되고 본원에서 개시된다. 이에 더하여, 다양한 구체예 및 이것들의 요소 (예를 들어, 이러한 변수를 기술하는 구체예에서 나열된 화학적 기의 요소)의 모든 부분 조합은 또한 모든 이러한 부분 조합이 개별적으로 및 명확하게 본원에서 개시된 것처럼 본 발명에 구체적으로 포함되고 본원에서 개시된다.
달리 한정되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속한 업계의 당업자들에 의해 흔히 이해되는 바와 같은 의미를 가진다. 본원에서 기술된 것들과 유사하거나 동등한 어떤 방법 및 재료들이 또한 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 기술된다. 본원에서 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용되는 것에 관한 방법 및/또는 재료를 개시하고 기술하기 위해 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an", 및 "the"는 문맥상 달리 분명하게 지시되지 않으면 복수의 지시대상을 포함한다는 것을 알아야 한다. 또한 청구범위는 어떤 선택적인 요소를 제외하도록 작성될 수도 있다는 것을 알아야 한다. 이와 같이, 이러한 진술은 청구 요소의 열거에 관하여 "전적으로", "단지" 등과 같은 배타적 용어의 사용, 또는 "부정적" 한정의 사용에 대한 선행 근거의 역할을 하도록 의도된다.
본 발명의 일부 특징들은, 명확성을 위해서, 별도의 구체예의 맥랙에서 기술되며, 또한 단일 구체예로 조합으로 제공될 수도 있다. 반대로, 본 발명의 다양한 특징들은, 간결성을 위해서, 단일 구체예의 맥락으로 기술되며, 또한 별도로 또는 어떤 적합한 부분 조합으로 제공될 수도 있다.
본원에서 논의된 간행물들은 본 출원의 출원일 이전에 전적으로 그것들의 개시를 위해서만 제공된다. 본원에서 본 발명은 이전 발명에 의해 이러한 간행물보다 선행할 자격이 없는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 제공된 공개일은 실제 공개일과 다를 수도 있으며 독립적으로 확인되어야 할 필요가 있을 수도 있다.
상세한 설명
본 개시물은 항-HER2 항체-메이탄신 컨쥬게이트 구조를 제공한다. 본 개시물은 또한 이러한 컨쥬게이트의 생산 방법, 뿐만 아니라 이것의 사용 방법을 포함한다. 각각의 구체예는 하기 섹션에서 더 상세히 기술된다.
컨쥬게이트
본 개시물은 컨쥬게이트를 제공한다. "컨쥬게이트"는 제2 모이어티와 안정하게 회합된 제1 모이어티를 의미한다. "안정하게 회합된"은 모이어티가 표준 조건 하에서 또 다른 모이어티 또는 구조에 결합된다는 것을 의미한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 모이어티는 하나 이상의 공유 결합을 통해 서로 결합된다.
특정 구체예에서, 컨쥬게이트는 제2 모이어티에 컨쥬게이션된 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 컨쥬게이트이다. 특정 구체예에서, 폴리펩타이드에 컨쥬게이션된 모이어티는 원하는 다양한 모이어티, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 검출 가능한 라벨, 약물, 수용성 폴리머, 또는 막 또는 표면으로 폴리펩타이드의 고정을 위한 모이어티 중 어느 것도 될 수 있다. 원하는 모이어티는 포리펩타이드의 어떤 바람직한 부위에서도 폴리펩타이드에 컨쥬게이션될 수 있다. 따라서, 본 개시물은, 예를 들어, 폴리펩타이드의 C-말단의 부위 또는 그것의 근처에서 컨쥬게이션된 모이어티를 가진 변형된 폴리펩타이드를 제공한다. 다른 예는 폴리펩타이드의 N 말단의 위치에서 또는 그것의 근처에서 컨쥬게이션된 모이어티를 가지는 변형된 폴리펩타이드를 포함한다. 예는 또한 폴리펩타이드의 C-말단 및 N-말단 사이의 위치에서 (예를 들어, 폴리펩타이드의 내부 부위에서) 컨쥬게이션된 모이어티를 가진 변형된 폴리펩타이드를 포함한다. 변형된 폴리펩타이드가 둘 이상의 모이어티에 컨쥬게이션되는 경우 상기의 조합이 또한 가능하다.
본 개시물의 구체예는 폴리펩타이드가 하나 이상의 모이어티, 예를 들어, 2개의 모이어티, 3개의 모이어티, 4개의 모이어티, 5개의 모이어티, 6개의 모이어티, 7개의 모이어티, 8개의 모이어티, 9개의 모이어티, 또는 10개 이상의 모이어티에 컨쥬게이션되는 컨쥬게이트이다. 모이어티는 폴리펩타이드의 하나 이상의 부위에서 폴리펩타이드에 컨쥬게이션될 수도 있다. 예를 들어, 하나 이상의 모이어티는 폴리펩타이드의 단일 아미노산 잔기에 컨쥬게이션될 수도 있다. 일부 경우에서, 하나의 모이어티는 폴리펩타이드의 아미노산 잔기에 컨쥬게이션된다. 다른 구체예에서, 두 개의 모이어티가 폴리펩타이드의 같은 아미노산 잔기에 컨쥬게이션될 수도 있다. 다른 구체예에서, 제1 모이어티는 폴리펩타이드의 제1 아미노산 잔기에 컨쥬게이션되고 제2 모이어티는 폴리펩타이드의 제2 아미노산 잔기에 컨쥬게이션된다. 예를 들어, 폴리펩타이드가 제1 아미노산 잔기에서 제1 모이어티에 컨쥬게이션되고 제2 아미노산 잔기에서 두 개의 다른 모이어티에 컨쥬게이션되는 경우 상기의 조합이 또한 가능하다. 다른 조합, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 제1 아미노산 잔기에서 제1 및 제2 모이어티에 컨쥬게이션되고 제2 아미노산 잔기에서 제3 및 제4 모이어티에 컨쥬게이션되는 폴리펩타이드, 등이 또한 가능하다.
하나 이상의 모이어티에 컨쥬게이션된 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기는 자연 발생한 아미노산, 비천연 아미노산, 또는 이것들의 조합일 수도 있다. 예를 들어, 컨쥬게이트는 폴리펩타이드의 자연 발생 아미노산 잔기에 컨쥬게이션된 모이어티를 포함할 수도 있다. 다른 경우에는, 컨쥬게이트는 폴리펩타이드의 비천연 아미노산 잔기에 컨쥬게이션된 모이어티를 포함할 수도 있다. 하나 이상의 모이어티는 상기 기술된 바와 같이 단일 천연 또는 비천연 아미노산 잔기에서 폴리펩타이드에 컨쥬게이션될 수도 있다. 폴리펩타이드에서 하나 이상의 천연 또는 비천연 아미노산 잔기는 본원에서 기술된 바와 같이 모이어티 또는 모이어티들에 컨쥬게이션될 수도 있다. 예를 들어, 두 개의 (또는 그 이상의) 아미노산 잔기 (예를 들어, 천연 또는 비천연 아미노산 잔기)는 폴리펩타이드에서 다수의 부위가 변형되도록 하나 또는 두 개의 모이어티에 각각 컨쥬게이션될 수도 있다.
본원에서 기술된 바와 같이, 폴리펩타이드는 하나 이상의 모이어티에 컨쥬게이션될 수도 있다. 특정 구체예에서, 원하는 모이어티는 화학적 실체물, 예를 들어, 약물 또는 검출 가능한 라벨이다. 예를 들어, 약물이 폴리펩타이드에 컨쥬게이션될 수도 있거나, 또는 다른 구체예에서는, 검출 가능한 라벨이 폴리펩타이드에 컨쥬게이션될 수도 있다. 따라서, 예를 들어, 본 개시물의 구체예는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 폴리펩타이드 및 약물의 컨쥬게이트; 폴리펩타이드 및 검출 가능한 라벨의 컨쥬게이트; 둘 이상의 약물 및 폴리펩타이드의 컨쥬게이트; 둘 이상의 검출 가능한 라벨의 컨쥬게이트; 등.
특정 구체예에서, 원하는 폴리펩타이드 및 모이어티는 커플링 모이어티를 통해 컨쥬게이션된다. 예를 들어, 원하는 폴리펩타이드 및 모이어티는 각각 커플링 모이어티에 결합 (예를 들어, 공유 결합)되고, 따라서 커플링 모이어티를 통해 간접적으로 원하는 폴리펩타이드 및 모이어티를 함께 결합시킨다. 일부 경우에서, 커플링 모이어티는 히드라지닐-피롤로 화합물 또는 히드라지닐-피롤로 화합물의 유도체를 포함한다. 예를 들어, 히드라지닐-피롤로 커플링 모이어티 (예를 들어, 히드라지노-아이소-피테트-스펭글러 (HIPS) 커플링 모이어티)를 통해 폴리펩타이드에 원하는 모이어티를 커플링하기 위한 일반적인 계획은 하기 일반적인 반응 계획으로 나타난다.
Figure 112016123593442-pct00015
상기 반응 계획에서, R'''는 폴리펩타이드에 컨쥬게이션된 원하는 모이어티일 수도 있다. 본원에서 기술된 바와 같이, 모이어티는 다양한 모이어티, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 화학적 실체물, 예를 들어, 검출 가능한 라벨, 또는 약물 (예를 들어, 메이탄시노이드) 중 어느 것도 될 수 있다. R' 및 R''는 각각 독립적으로 어떤 원하는 치환기, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴일 수도 있다. Q10, Q20, Q30 및 Q40은 CR11, NR12, N, O 또는 S일 수도 있으며, Q10, Q20, Q30 및 Q40 중 하나는 선택적이고 R11 및 R12는 어떤 바람직한 치환기일 수도 있다.
특정 구체예에서, 폴리펩타이드는 원하는 모이어티에 컨쥬게이션될 수도 있으며, 폴리펩타이드는 원하는 모이어티로의 컨쥬게이션 전에 변형된다. 폴리펩타이드의 변형은 원하는 모이어티로의 컨쥬게이션에 적합한 하나 이상의 반응성 기를 함유하는 변형된 폴리펩타이드를 생성할 수도 있다. 일부 경우에서, 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 잔기에서 원하는 모이어티 (예를 들어, 상기 기술된 바와 같이 커플링 모이어티, 예를 들어, 히드라지닐-피롤로 커플링 모이어티를 포함하는 모이어티)로의 컨쥬게이션에 적합한 하나 이상의 반응성 기를 제공하도록 변형될 수도 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 반응성 알데하이드 기 (예를 들어, 반응성 알데하이드)를 포함하도록 변형될 수도 있다. 반응성 알데하이드는 "알데하이드 태그" 또는 "ald-태그"에 포함될 수도 있으며, 이것은 본원에서 사용된 바와 같이 포르밀글리신 생성 효소 (FGE)의 작용에 의해 2-포르밀글리신 잔기 (본원에서 "FGly"로 불림)를 함유하도록 전환된 설파타제 모티프 (예를 들어, L(C/S)TPSR (서열 번호:221))로부터 유래된 아미노산 서열을 말한다. FGE로부터 생성된 FGly 잔기는 또한 "포르밀글리신"로도 불릴 수 있다. 달리 진술하면, 용어 "알데하이드 태그"는 본원에서 "전환된" 설파타제 모티프 (즉, 시스테인 또는 세린 잔기가 FGE의 작용에 의해 FGly로 전환된 설파타제 모티프, 예를 들어, L(FGly)TPSR (서열 번호:222))를 포함하는 아미노산 서열을 나타내는데 사용된다. 전환된 설파타제 모티프는 "비전환된" 설파타제 모티프 (즉, 시스테인 또는 세린 잔기가 FGE에 의해 FGly로 전환되었지만, 전환될 수 없는 설파타제 모티프, 예를 들어, 서열 L(C/S)TPSR (서열 번호:221)을 가지는 비전환된 설파타제 모티프)를 포함하는 아미노산 서열로부터 유래될 수도 있다. "전환"은 설파타제 모티프에서 포르밀글리신 생성 효소 (FGE)의 작용의 맥락에서 사용된 바와 같이 설파타제 모티프에서 포르밀글리신 (FGly) 잔기로의 시스테인 또는 세린 잔기의 생화학적 변형 (예를 들어, Cys를 FGly로, 또는 Ser를 FGly로)을 말한다. 알데하이드 태그의 추가적인 양태 및 부위-특이적 단백질 변형에 있어서 이것의 사용은 U.S. 7,985,783 및 U.S. 8,729,232에서 기술되며, 이것들 각각의 개시물은 본원에 참고로 포함된다.
일부 경우에서, FGly 잔기를 함유하는 변형된 폴리펩타이드는 FGly와 화합물 (예를 들어, 상기 기술된 바와 같이 히드라지닐-피롤로 커플링 모이어티를 함유하는 화합물)의 반응에 의해 원하는 모이어티에 컨쥬게이션될 수도 있다. 예를 들어, FGly-함유 폴리펩타이드는 폴리펩타이드로의 약물의 컨쥬게이션을 제공하기에 적합한 조건 하에 반응 파트너-함유 약물과 접촉될 수도 있다. 일부 경우에서, 반응 파트너-함유 약물은 상기 기술된 바와 같이 히드라지닐-피롤로 커플링 모이어티를 포함할 수도 있다.
특정 구체예에서, 본 개시물의 컨쥬게이트는 적어도 하나의 변형된 아미노산 잔기를 가지는 폴리펩타이드 (예를 들어, 항체, 예를 들어, 항-HER2 항체)를 포함한다. 폴리펩타이드의 변형된 아미노산 잔기는 상기 기술된 바와 같이 히드라지닐-피롤로 모이어티를 함유하는 약물에 커플링될 수도 있다. 특정 구체예에서, 폴리펩타이드 (예를 들어, 항-HER2 항체)의 변형된 아미노산 잔기는 상기 기술된 바와 같이 FGly 잔기로 전환된 시스테인 또는 세린 잔기로부터 유래될 수도 있다. 특정 구체예에서, 약물이 히드라지닐-피롤로 모이어티를 통해 폴리펩타이드에 컨쥬게이션되는 경우 본 개시물의 컨쥬게이트를 제공하기 위해서 FGly 잔기는 상기 기술된 바와 같이 히드라지닐-피롤로 모이어티를 함유하는 약물에 컨쥬게이션된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 FGly'는 원하는 모이어티 (예를 들어, 약물, 예를 들어, 메이탄시노이드)에 커플링된 폴리펩타이드 (예를 들어, 항-HER2 항체)의 변형된 아미노산 잔기를 말한다.
특정 구체예에서, 컨쥬게이트는 식 (I)의 적어도 하나의 변형된 아미노산 잔기를 포함한다:
Figure 112016123593442-pct00016
상기 식에서
Q1은 C 또는 N이며, Q1이 N이면, Y1은 없고;
Y1은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
R1은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
R2 및 R3는 각각 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R2 및 R3는 선택적으로 환형으로 연결되어 5 또는 6-원자 헤테로사이클릴을 형성하고;
L은 -(T1-Z1)a-(T2-Z2)b-(T3-Z3)c-(T4-Z4)d-를 포함하는 링커이며, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 0 또는 1이고, a, b, c 및 d의 합은 1 내지 4이고;
T1, T2, T3 및 T4는 각각 (C1-C12)알킬, 치환된 (C1-C12)알킬, (EDA)w, (PEG)n, (AA)p, -(CR13OH)h-, 피페리딘-4-아미노 (4AP), 아세탈 기, 히드라진, 및 에스터로부터 독립적으로 선택되고, EDA는 에틸렌 디아민 모이어티이고, PEG는 폴리에틸렌 글리콜 또는 변형된 폴리에틸렌 글리콜이고, AA는 아미노산 잔기이고, w는 1 내지 20의 정수이고, n은 1 내지 30의 정수이고, p는 1 내지 20의 정수이고, h는 1 내지 12의 정수이고;
Z1, Z2, Z3 및 Z4는 각각 공유 결합, -CO-, -NR15-, -NR15(CH2)q-, -NR15(C6H4)-, -CONR15-, -NR15CO-, -C(O)O-, -OC(O)-, -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -SO2NR15-, -NR15SO2- 및 -P(O)OH-로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, q는 1 내지 6의 정수이고;
각각의 R13은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 및 치환된 아릴로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R15는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택되고;
W1은 메이탄시노이드이고;
W2는 항-HER2 항체이다.
특정 구체예에서, Q1은 C 또는 N이며, Q1이 N이면, Y1은 없다. 특정 구체예에서, Q1은 C이다. 특정 구체예에서, Q1은 N이고 Y1은 없다.
특정 구체예에서, Y1은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 특정 구체예에서, Y1은 수소이다. 특정 구체예에서, Y1은 할로겐, 예를 들어, F, Cl, Br 또는 I이다. 특정 구체예에서, Y1은 알킬 또는 치환된 알킬, 예를 들어, C1-6 알킬 또는 C1-6 치환된 알킬, 또는 C1-4 알킬 또는 C1-4 치환된 알킬, 또는 C1-3 알킬 또는 C1-3 치환된 알킬이다. 특정 구체예에서, Y1은 알케닐 또는 치환된 알케닐, 예를 들어, C2-6 알케닐 또는 C2-6 치환된 알케닐, 또는 C2-4 알케닐 또는 C2-4 치환된 알케닐, 또는 C2-3 알케닐 또는 C2-3 치환된 알케닐이다. 특정 구체예에서, Y1은 알키닐 또는 치환된 알키닐이다. 특정 구체예에서, Y1은 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 특정 구체예에서, Y1은 아미노 또는 치환된 아미노이다. 특정 구체예에서, Y1은 카르복실 또는 카르복실 에스터이다. 특정 구체예에서, Y1은 아실 또는 아실옥시이다. 특정 구체예에서, Y1은 아실 아미노 또는 아미노 아실이다. 특정 구체예에서, Y1은 알킬아미드 또는 치환된 알킬아미드이다. 특정 구체예에서, Y1은 설포닐이다. 특정 구체예에서, Y1은 티오알콕시 또는 치환된 티오알콕시이다. 특정 구체예에서, Y1은 아릴 또는 치환된 아릴, 예를 들어, C5-8 아릴 또는 C5-8 치환된 아릴, 예를 들어, C5 아릴 또는 C5 치환된 아릴, 또는 C6 아릴 또는 C6 치환된 아릴이다. 특정 구체예에서, Y1은 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴, 예를 들어, C5-8 헤테로아릴 또는 C5-8 치환된 헤테로아릴, 예를 들어, C5 헤테로아릴 또는 C5 치환된 헤테로아릴, 또는 C6 헤테로아릴 또는 C6 치환된 헤테로아릴이다. 특정 구체예에서, Y1은 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬, 예를 들어, C3-8 사이클로알킬 또는 C3-8 치환된 사이클로알킬, 예를 들어, C3-6 사이클로알킬 또는 C3-6 치환된 사이클로알킬, 또는 C3-5 사이클로알킬 또는 C3-5 치환된 사이클로알킬이다. 특정 구체예에서, Y1은 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴, 예를 들어, C3-8 헤테로사이클릴 또는 C3-8 치환된 헤테로사이클릴, 예를 들어, C3-6 헤테로사이클릴 또는 C3-6 치환된 헤테로사이클릴, 또는 C3-5 헤테로사이클릴 또는 C3-5 치환된 헤테로사이클릴이다.
특정 구체예에서, R1은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 특정 구체예에서, R1은 수소이다. 특정 구체예에서, R1은 알킬 또는 치환된 알킬, 예를 들어, C1-6 알킬 또는 C1-6 치환된 알킬, 또는 C1-4 알킬 또는 C1-4 치환된 알킬, 또는 C1-3 알킬 또는 C1-3 치환된 알킬이다. 특정 구체예에서, R1은 알케닐 또는 치환된 알케닐, 예를 들어, C2-6 알케닐 또는 C2-6 치환된 알케닐, 또는 C2-4 알케닐 또는 C2-4 치환된 알케닐, 또는 C2-3 알케닐 또는 C2-3 치환된 알케닐이다. 특정 구체예에서, R1은 알키닐 또는 치환된 알키닐, 예를 들어, C2-6 알케닐 또는 C2-6 치환된 알케닐, 또는 C2-4 알케닐 또는 C2-4 치환된 알케닐, 또는 C2-3 알케닐 또는 C2-3 치환된 알케닐이다. 특정 구체예에서, R1은 아릴 또는 치환된 아릴, 예를 들어, C5-8 아릴 또는 C5-8 치환된 아릴, 예를 들어, C5 아릴 또는 C5 치환된 아릴, 또는 C6 아릴 또는 C6 치환된 아릴이다. 특정 구체예에서, R1은 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴, 예를 들어, C5-8 헤테로아릴 또는 C5-8 치환된 헤테로아릴, 예를 들어, C5 헤테로아릴 또는 C5 치환된 헤테로아릴, 또는 C6 헤테로아릴 또는 C6 치환된 헤테로아릴이다. 특정 구체예에서, R1은 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬, 예를 들어, C3-8 사이클로알킬 또는 C3-8 치환된 사이클로알킬, 예를 들어, C3-6 사이클로알킬 또는 C3-6 치환된 사이클로알킬, 또는 C3-5 사이클로알킬 또는 C3-5 치환된 사이클로알킬이다. 특정 구체예에서, R1은 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴, 예를 들어, C3-8 헤테로사이클릴 또는 C3-8 치환된 헤테로사이클릴, 예를 들어, C3-6 헤테로사이클릴 또는 C3-6 치환된 헤테로사이클릴, 또는 C3-5 헤테로사이클릴 또는 C3-5 치환된 헤테로사이클릴이다.
특정 구체예에서, R2 및 R3는 각각 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R2 및 R3는 선택적으로 환형으로 연결되어 5 또는 6-원자 헤테로사이클릴을 형성한다.
특정 구체예에서, R2는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 특정 구체예에서, R2는 수소이다. 특정 구체예에서, R2는 알킬 또는 치환된 알킬, 예를 들어, C1-6 알킬 또는 C1-6 치환된 알킬, 또는 C1-4 알킬 또는 C1-4 치환된 알킬, 또는 C1-3 알킬 또는 C1-3 치환된 알킬이다. 특정 구체예에서, R2는 알케닐 또는 치환된 알케닐, 예를 들어, C2-6 알케닐 또는 C2-6 치환된 알케닐, 또는 C2-4 알케닐 또는 C2-4 치환된 알케닐, 또는 C2-3 알케닐 또는 C2-3 치환된 알케닐이다. 특정 구체예에서, R2는 알키닐 또는 치환된 알키닐이다. 특정 구체예에서, R2는 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 특정 구체예에서, R2는 아미노 또는 치환된 아미노이다. 특정 구체예에서, R2는 카르복실 또는 카르복실 에스터이다. 특정 구체예에서, R2는 아실 또는 아실옥시이다. 특정 구체예에서, R2는 아실 아미노 또는 아미노 아실이다. 특정 구체예에서, R2는 알킬아미드 또는 치환된 알킬아미드이다. 특정 구체예에서, R2는 설포닐이다. 특정 구체예에서, R2는 티오알콕시 또는 치환된 티오알콕시이다. 특정 구체예에서, R2는 아릴 또는 치환된 아릴, 예를 들어, C5-8 아릴 또는 C5-8 치환된 아릴, 예를 들어, C5 아릴 또는 C5 치환된 아릴, 또는 C6 아릴 또는 C6 치환된 아릴이다. 특정 구체예에서, R2는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴, 예를 들어, C5-8 헤테로아릴 또는 C5-8 치환된 헤테로아릴, 예를 들어, C5 헤테로아릴 또는 C5 치환된 헤테로아릴, 또는 C6 헤테로아릴 또는 C6 치환된 헤테로아릴이다. 특정 구체예에서, R2는 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬, 예를 들어, C3-8 사이클로알킬 또는 C3-8 치환된 사이클로알킬, 예를 들어, C3-6 사이클로알킬 또는 C3-6 치환된 사이클로알킬, 또는 C3-5 사이클로알킬 또는 C3-5 치환된 사이클로알킬이다. 특정 구체예에서, R2는 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴, 예를 들어, C3-6 헤테로사이클릴 또는 C3-6 치환된 헤테로사이클릴, 또는 C3-5 헤테로사이클릴 또는 C3-5 치환된 헤테로사이클릴이다.
특정 구체예에서, R3는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 특정 구체예에서, R3는 수소이다. 특정 구체예에서, R3는 알킬 또는 치환된 알킬, 예를 들어, C1-6 알킬 또는 C1-6 치환된 알킬, 또는 C1-4 알킬 또는 C1-4 치환된 알킬, 또는 C1-3 알킬 또는 C1-3 치환된 알킬이다. 특정 구체예에서, R3는 알케닐 또는 치환된 알케닐, 예를 들어, C2-6 알케닐 또는 C2-6 치환된 알케닐, 또는 C2-4 알케닐 또는 C2-4 치환된 알케닐, 또는 C2-3 알케닐 또는 C2-3 치환된 알케닐이다. 특정 구체예에서, R3는 알키닐 또는 치환된 알키닐이다. 특정 구체예에서, R3는 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 특정 구체예에서, R3는 아미노 또는 치환된 아미노이다. 특정 구체예에서, R3는 카르복실 또는 카르복실 에스터이다. 특정 구체예에서, R3는 아실 또는 아실옥시이다. 특정 구체예에서, R3는 아실 아미노 또는 아미노 아실이다. 특정 구체예에서, R3는 알킬아미드 또는 치환된 알킬아미드이다. 특정 구체예에서, R3는 설포닐이다. 특정 구체예에서, R3는 티오알콕시 또는 치환된 티오알콕시이다. 특정 구체예에서, R3는 아릴 또는 치환된 아릴, 예를 들어, C5-8 아릴 또는 C5-8 치환된 아릴, 예를 들어, C5 아릴 또는 C5 치환된 아릴, 또는 C6 아릴 또는 C6 치환된 아릴이다. 특정 구체예에서, R3는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴, 예를 들어, C5-8 헤테로아릴 또는 C5-8 치환된 헤테로아릴, 예를 들어, C5 헤테로아릴 또는 C5 치환된 헤테로아릴, 또는 C6 헤테로아릴 또는 C6 치환된 헤테로아릴이다. 특정 구체예에서, R3는 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬, 예를 들어, C3-8 사이클로알킬 또는 C3-8 치환된 사이클로알킬, 예를 들어, C3-6 사이클로알킬 또는 C3-6 치환된 사이클로알킬, 또는 C3-5 사이클로알킬 또는 C3-5 치환된 사이클로알킬이다. 특정 구체예에서, R3는 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴, 예를 들어, C3-8 헤테로사이클릴 또는 C3-8 치환된 헤테로사이클릴, 예를 들어, C3-6 헤테로사이클릴 또는 C3-6 치환된 헤테로사이클릴, 또는 C3-5 헤테로사이클릴 또는 C3-5 치환된 헤테로사이클릴이다.
특정 구체예에서, R2 및 R3는 선택적으로 환형으로 연결되어 5 또는 6-원자 헤테로사이클릴을 형성한다. 특정 구체예에서, R2 및 R3는 환형으로 연결되어 5 또는 6-원자 헤테로사이클릴을 형성한다. 특정 구체예에서, R2 및 R3는 환형으로 연결되어 5-원자 헤테로사이클릴을 형성한다. 특정 구체예에서, R2 및 R3는 환형으로 연결되어 6-원자 헤테로사이클릴을 형성한다.
특정 구체예에서, 식 (I)의 화합물은 링커, L을 포함한다. 링커는 하나 이상의 원하는 모이어티 및/또는 하나 이상의 폴리펩타이드에 커플링 모이어티를 결합시키는데 이용될 수도 있다. 일부 구체예에서, 링커는 폴리펩타이드 또는 화학적 실체물에 커플링 모이어티를 결합시킨다. 링커는 어떠한 편리한 위치에서도 커플링 모이어티 (예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같음)에 결합 (예를 들어, 공유 결합)될 수도 있다.
특정 구체예에서, L은 커플링 모이어티를 W1에 부착시키고, 따라서 커플링 모이어티는 링커 L을 통해 W1에 간접적으로 결합된다.
어떠한 편리한 링커도 대상 컨쥬게이트 및 화합물에서 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, L은 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실 아미노, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된 기를 포함한다. 특정 구체예에서, L은 알킬 또는 치환된 알킬 기를 포함한다. 특정 구체예에서, L은 알케닐 또는 치환된 알케닐 기를 포함한다. 특정 구체예에서, L은 알키닐 또는 치환된 알키닐 기를 포함한다. 특정 구체예에서, L은 알콕시 또는 치환된 알콕시 기를 포함한다. 특정 구체예에서, L은 아미노 또는 치환된 아미노 기를 포함한다. 특정 구체예에서, L은 카르복실 또는 카르복실 에스터 기를 포함한다. 특정 구체예에서, L은 아실 아미노 기를 포함한다. 특정 구체예에서, L은 알킬아미드 또는 치환된 알킬아미드 기를 포함한다. 특정 구체예에서, L은 아릴 또는 치환된 아릴 기를 포함한다. 특정 구체예에서, L은 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴 기를 포함한다. 특정 구체예에서, L은 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬 기를 포함한다. 특정 구체예에서, L은 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴 기를 포함한다.
특정 구체예에서, L은 폴리머를 포함한다. 예를 들어, 폴리머는 폴리알킬렌 글리콜 및 이것의 유도체를 포함할 수도 있으며, 폴리에틸렌 글리콜, 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 글리콜 호모폴리머, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 코폴리머 (예를 들어, 호모폴리머 및 코폴리머는 치환되지 않거나 한 단부에서 알킬 기로 치환된다), 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 에틸 에테르, 폴리비닐피롤리돈, 이것들의 조합, 등을 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리머는 폴리알킬렌 글리콜이다. 특정 구체예에서, 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜이다. 하기 더 자세히 상세히 기술된 컨쥬게이트 및 화합물에서 나타난 바와 같이, 다른 링커들 또한 가능하다.
일부 구체예에서, L은 식 -(L1)a-(L2)b-(L3)c-(L4)d-에 의해 기술된 링커이며, L1, L2, L3 및 L4는 각각 독립적으로 링커 유닛이고, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 0 또는 1이고, a, b, c 및 d의 합계는 1 내지 4이다.
특정 구체예에서, a, b, c 및 d의 합계는 1이다. 특정 구체예에서, a, b, c 및 d의 합계는 2이다. 특정 구체예에서, a, b, c 및 d의 합계는 3이다. 특정 구체예에서, a, b, c 및 d의 합계는 4이다. 특정 구체예에서, a, b, c 및 d는 각각 1이다. 특정 구체예에서, a, b 및 c는 각각 1이고 d는 0이다. 특정 구체예에서, a 및 b는 각각 1이고 c 및 d는 0이다. 특정 구체예에서, a는 1이고 b, c 및 d는 0이다.
특정 구체예에서, L1은 히드라지닐-피롤로 모이어티에 부착된다 (예를 들어, 상기 식 (I)에서 나타난 바와 같다). 특정 구체예에서, L2는, 존재하면, W1에 부착된다. 특정 구체예에서, L3는, 존재하면, W1에 부착된다. 특정 구체예에서, L4는, 존재하면, W1에 부착된다.
어떠한 편리한 링커 유닛도 대상 링커에서 이용될 수 있다. 원하는 링커 유닛은 폴리머의 유닛, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 및 폴리아크릴레이트, 아미노산 잔기(들), 카르보하이드레이트-기반 폴리머 또는 카르보하이드레이트 잔기 및 이것의 유도체, 폴리뉴클레오타이드, 알킬 기, 아릴 기, 헤테로환형 기, 이것들의 조합, 및 이것들의 치환된 버전을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, L1, L2, L3 및 L4 (존재하면) 각각은
폴리에틸렌 글리콜, 변형된 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 잔기, 알킬 기, 치환된 알킬, 아릴 기, 치환된 아릴 기, 및 디아민 (예를 들어, 알킬렌 디아민을 포함하는 연결 기)으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기를 포함한다.
일부 구체예에서, L1 (존재하면)는 폴리에틸렌 글리콜, 변형된 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 잔기, 알킬 기, 치환된 알킬, 아릴 기, 치환된 아릴 기, 또는 디아민을 포함한다. 일부 구체예에서, L1은 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구체예에서, L1은 변형된 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구체예에서, L1은 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, L1은 알킬 기 또는 치환된 알킬을 포함한다. 일부 구체예에서, L1은 아릴 기 또는 치환된 아릴 기를 포함한다. 일부 구체예에서, L1은 디아민 (예를 들어, 알킬렌 디아민을 포함하는 연결 기)을 포함한다.
일부 구체예에서, L2 (존재하면)는 폴리에틸렌 글리콜, 변형된 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 잔기, 알킬 기, 치환된 알킬, 아릴 기, 치환된 아릴 기, 또는 디아민을 포함한다. 일부 구체예에서, L2는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구체예에서, L2는 변형된 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구체예에서, L2은 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, L2는 알킬 기 또는 치환된 알킬을 포함한다. 일부 구체예에서, L2는 아릴 기 또는 치환된 아릴 기를 포함한다. 일부 구체예에서, L2는 디아민 (예를 들어, 알킬렌 디아민을 포함하는 연결 기)을 포함한다.
일부 구체예에서, L3 (존재하면)는 폴리에틸렌 글리콜, 변형된 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 잔기, 알킬 기, 치환된 알킬, 아릴 기, 치환된 아릴 기, 또는 디아민을 포함한다. 일부 구체예에서, L3는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구체예에서, L3는 변형된 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구체예에서, L3는 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, L3는 알킬 기 또는 치환된 알킬을 포함한다. 일부 구체예에서, L3는 아릴 기 또는 치환된 아릴 기를 포함한다. 일부 구체예에서, L3는 디아민 (예를 들어, 알킬렌 디아민을 포함하는 연결 기)을 포함한다.
일부 구체예에서, L4 (존재하면)는 폴리에틸렌 글리콜, 변형된 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 잔기, 알킬 기, 치환된 알킬, 아릴 기, 치환된 아릴 기, 또는 디아민으로부터 독립적으로 선택된 군을 포함한다. 일부 구체예에서, L4는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구체예에서, L4는 변형된 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구체예에서, L4는 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, L4는 알킬 기 또는 치환된 알킬을 포함한다. 일부 구체예에서, L4는 아릴 기 또는 치환된 아릴 기를 포함한다. 일부 구체예에서, L4는 디아민 (예를 들어, 알킬렌 디아민을 포함하는 연결 기)을 포함한다.
일부 구체예에서, L은 -(L1)a-(L2)b-(L3)c-(L4)d-를 포함하는 링커이며, 상기 식에서:
-(L1)a-는 -(T1-Z1)a-이고;
-(L2)b-는 -(T2-Z2)b-이고;
-(L3)c-는 -(T3-Z3)c-이고;
-(L4)d-는 -(T4-Z4)d-이고,
T1, T2, T3 및 T4는, 존재하면, 테더(tether) 기이고;
Z1, Z2, Z3 및 Z4는, 존재하면, 공유 결합 또는 연결 작용기이고;
a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 0 또는 1이며, a, b, c 및 d의 합계는 1 내지 4이다.
상기 기술된 바와 같이, 특정 구체예에서, L1은 히드라지닐-피롤로 모이어티에 부착된다 (예를 들어, 상기 식 (I)에서 나타난 바와 같다). 이와 같이, 특정 구체예에서, T1은 히드라지닐-피롤로 모이어티에 부착된다 (예를 들어, 상기 식 (I)에서 나타난 바와 같다). 특정 구체예에서, Z1은 W1에 부착된다. 특정 구체예에서, L2는, 존재하면, W1에 부착된다. 이와 같이, 특정 구체예에서, T2는, 존재하면, W1에 부부착되거나, 또는 Z2는, 존재하면, W1에 부착된다. 특정 구체예에서, L3는, 존재하면, W1에 부착된다. 이와 같이, 특정 구체예에서, T3는, 존재하면, W1에 부부착되거나, 또는 Z3는, 존재하면, W1에 부착된다. 특정 구체예에서, L4는, 존재하면, W1에 부착된다. 이와 같이, 특정 구체예에서, T4는, 존재하면, W1에 부부착되거나, 또는 Z4는, 존재하면, W1에 부착된다.
테더 기, T1, T2, T3 및 T4에 관하여, 어떠한 편리한 테더 기도 대상 링커에서 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, T1, T2, T3 및 T4 각각은 (C1-C12)알킬, 치환된 (C1-C12)알킬, (EDA)w, (PEG)n, (AA)p, -(CR13OH)h-, 피페리딘-4-아미노 (4AP), 아세탈 기, 히드라진, 및 에스터로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기를 포함하는데, w는 1 내지 20의 정수이고, n은 1 내지 30의 정수이고, p는 1 내지 20의 정수이고, h는 1 내지 12의 정수이다.
특정 구체예에서, a, b, c 및 d의 합계가 2이고 T1-Z1, T2-Z2, T3-Z3, 또는 T4-Z4 중 하나가 (PEG)n-CO일 때, n은 6이 아니다. 예를 들어, 일부 경우에서, 링커는 다음 구조를 가질 수도 있으며:
Figure 112016123593442-pct00017
,
상기 식에서 n은 6이 아니다.
특정 구체예에서, a, b, c 및 d의 합계가 2이고 T1-Z1, T2-Z2, T3-Z3, 또는 T4-Z4 중 하나가 (C1-C12)알킬-NR11일 때, (C1-C12)알킬은 C5-알킬이 아니다. 예를 들어, 일부 경우에서, 링커는 다음 구조를 가질 수도 있으며:
Figure 112016123593442-pct00018
,
상기 식에서 g는 4가 아니다.
특정 구체예에서, 테더 기 (예를 들어, T1, T2, T3 및/또는 T4)는 에틸렌 디아민 (EDA) 모이어티, 예를 들어, 테더를 함유하는 EDA를 포함한다. 특정 구체예에서, (EDA)w는 하나 이상의 EDA 모이어티를 포함하는데, 예를 들어, w는 1 내지 50, 예를 들어, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 12 또는 1 내지 6, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 정수이다. 연결된 에틸렌 디아민 (EDA) 모이어티는 선택적으로 하나 이상의 편리한 위치에서 어떠한 편리한 치환기, 예를 들어, 알킬, 치환된 알킬, 아실, 치환된 아실, 아릴 또는 치환된 아릴로 치환될 수도 있다. 특정 구체예에서, EDA 모이어티는 다음 구조로 기술되며:
Figure 112016123593442-pct00019
상기 식에서 y는 1 내지 6의 정수이고, r은 0 또는 1이고, 각각의 R12는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구체예에서, y는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 특정 구체예에서, y는 1이고 r은 0이다. 특정 구체예에서, y는 1이고 r은 1이다. 특정 구체예에서, y는 2이고 r은 0이다. 특정 구체예에서, y는 2이고 r은 1이다. 특정 구체예에서, 각각의 R12는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구체예에서, EDA의 어떠한 두 개의 인접한 R12 기는 환형으로 연결되어, 예를 들어, 피페라지닐 고리를 형성한다. 특정 구체예에서, y는 1이고 두 개의 인접한 R12 기는 알킬 기이며, 환형으로 연결되어 피페라지닐 고리를 형성한다. 특정 구체예에서, y는 1이고 인접한 R12 기는 수소, 알킬 (예를 들어, 메틸) 및 치환된 알킬 (예를 들어, 저급 알킬-OH, 예를 들어, 에틸-OH 또는 프로필-OH)로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 테더 기는 피페리딘-4-아미노 (4AP) 모이어티 (본원에서 4-아미노-피페리딘, 4AP로도 불림)를 포함한다. 4AP 모이어티는 하나 이상의 편리한 위치에서 어떠한 편리한 치환기, 예를 들어, 알킬, 치환된 알킬, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 아실, 치환된 아실, 아릴 또는 치환된 아릴로 선택적으로 치환될 수도 있다. 특정 구체예에서, 4AP 모이어티는 다음 구조로 기술되며:
Figure 112016123593442-pct00020
상기 식에서 R12는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 변형된 폴리에틸렌 글리콜), 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 특정 구체예에서, R12는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티이다. 특정 구체예에서, R12는 카르복시 변형된 폴리에틸렌 글리콜이다. 특정 구체예에서, R12는 다음 구조로 표현될 수도 있는 식 (PEG)k로 기술되는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하며:
Figure 112016123593442-pct00021
상기 식에서 k는 1 내지 20, 예를 들어, 1 내지 18, 또는 1 내지 16, 또는 1 내지 14, 또는 1 내지 12, 또는 1 내지 10, 또는 1 내지 8, 또는 1 내지 6, 또는 1 내지 4, 또는 1 또는 2의 정수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 일부 경우에서, k는 2이다. 특정 구체예에서, R17은 OH, COOH, 또는 COOR로부터 선택되며, R은 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 특정 구체예에서, R17은 COOH이다.
특정 구체예에서, 테더 기 (예를 들어, T1, T2, T3 및/또는 T4)는 (PEG)n이며 (PEG)n는 폴리에틸렌 글리콜 또는 변형된 폴리에틸렌 글리콜 연결 유닛이다. 특정 구체예에서, (PEG)n는 다음 구조로 기술되며:
Figure 112016123593442-pct00022
상기 식에서 n은 1 내지 50, 예를 들어, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 12 또는 1 내지 6의 정수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 일부 경우에서, n은 3이다. 일부 경우에서, n은 6이다. 일부 경우에서, n은 12이다.
특정 구체예에서, 테더 기 (예를 들어, T1, T2, T3 및/또는 T4)는 (AA)p를 포함하며, AA는 아미노산 잔기이다. 어떠한 편리한 아미노산이 이용될 수도 있다. 원하는 아미노산은 L- 및 D-아미노산, 자연 발생 아미노산, 예를 들어, 20개의 주요 알파-아미노산 중 어느 것 및 베타-알라닌, 비-자연 발생 아미노산 (예를 들어, 아미노산 유사체), 예를 들어, 비-자연 발생 알파-아미노산 또는 비-자연 발생 베타-아미노산, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구체예에서, p는 1이다. 특정 구체예에서, p는 1 내지 50, 예를 들어, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 12 또는 1 내지 6의 정수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다.
특정 구체예에서, 테더 기 (예를 들어, T1, T2, T3 및/또는 T4)는 식 -(CR13OH)h-로 기술된 모이어티를 포함하며, h는 0이거나 또는 n은 1 내지 50, 예를 들어, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 12 또는 1 내지 6의 정수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12이다. 특정 구체예에서, R13은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 특정 구체예에서, R13은 수소이다. 특정 구체예에서, R13은 알킬 또는 치환된 알킬, 예를 들어, C1-6 알킬 또는 C1-6 치환된 알킬, 또는 C1-4 알킬 또는 C1-4 치환된 알킬, 또는 C1-3 알킬 또는 C1-3 치환된 알킬이다. 특정 구체예에서, R13은 알케닐 또는 치환된 알케닐, 예를 들어, C2-6 알케닐 또는 C2-6 치환된 알케닐, 또는 C2-4 알케닐 또는 C2-4 치환된 알케닐, 또는 C2-3 알케닐 또는 C2-3 치환된 알케닐이다. 특정 구체예에서, R13은 알키닐 또는 치환된 알키닐이다. 특정 구체예에서, R13은 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 특정 구체예에서, R13은 아미노 또는 치환된 아미노이다. 특정 구체예에서, R13은 카르복실 또는 카르복실 에스터이다. 특정 구체예에서, R13은 아실 또는 아실옥시이다. 특정 구체예에서, R13은 아실 아미노 또는 아미노 아실이다. 특정 구체예에서, R13은 알킬아미드 또는 치환된 알킬아미드이다. 특정 구체예에서, R13은 설포닐이다. 특정 구체예에서, R13은 티오알콕시 또는 치환된 티오알콕시이다. 특정 구체예에서, R13은 아릴 또는 치환된 아릴, 예를 들어, C5-8 아릴 또는 C5-8 치환된 아릴, 예를 들어, C5 아릴 또는 C5 치환된 아릴, 또는 C6 아릴 또는 C6 치환된 아릴이다. 특정 구체예에서, R13은 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴, 예를 들어, C5-8 헤테로아릴 또는 C5-8 치환된 헤테로아릴, 예를 들어, C5 헤테로아릴 또는 C5 치환된 헤테로아릴, 또는 C6 헤테로아릴 또는 C6 치환된 헤테로아릴이다. 특정 구체예에서, R13은 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬, 예를 들어, C3-8 사이클로알킬 또는 C3-8 치환된 사이클로알킬, 예를 들어, C3-6 사이클로알킬 또는 C3-6 치환된 사이클로알킬, 또는 C3-5 사이클로알킬 또는 C3-5 치환된 사이클로알킬이다. 특정 구체예에서, R13은 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴, 예를 들어, C3-8 헤테로사이클릴 또는 C3-8 치환된 헤테로사이클릴, 예를 들어, C3-6 헤테로사이클릴 또는 C3-6 치환된 헤테로사이클릴, 또는 C3-5 헤테로사이클릴 또는 C3-5 치환된 헤테로사이클릴이다.
특정 구체예에서, R13은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 및 치환된 아릴로부터 선택된다. 이러한 구체예에서, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 및 치환된 아릴은 상기 R13에 대하여 기술된 바와 같다.
Z1, Z2, Z3 및 Z4에 관하여, 어떠한 편리한 연결 작용기도 대상 링커에서 이용될 수 있다. 원하는 연결 작용기는 아미노, 카르보닐, 아미도, 옥시카르보닐, 카르복시, 설포닐, 설폭시드, 설포닐아미노, 아미노설포닐, 티오, 옥시, 포스포, 포스포르아미데이트, 티오포스포르아미데이트, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, Z1, Z2, Z3 및 Z4는 각각 독립적으로 공유 결합, -CO-, -NR15-, -NR15(CH2)q-, -NR15(C6H4)-, -CONR15-, -NR15CO-, -C(O)O-, -OC(O)-, -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -SO2NR15-, -NR15SO2- 및 -P(O)OH-이며, q는 1 내지 6의 정수이다. 특정 구체예에서, q는 1 내지 6의 정수 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6)이다.
일부 구체예에서, 각각의 R15는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구체예에서, R15는 수소이다. 특정 구체예에서, R15는 알킬 또는 치환된 알킬, 예를 들어, C1-6 알킬 또는 C1-6 치환된 알킬, 또는 C1-4 알킬 또는 C1-4 치환된 알킬, 또는 C1-3 알킬 또는 C1-3 치환된 알킬이다. 특정 구체예에서, R15는 알케닐 또는 치환된 알케닐, 예를 들어, C2-6 알케닐 또는 C2-6 치환된 알케닐, 또는 C2-4 알케닐 또는 C2-4 치환된 알케닐, 또는 C2-3 알케닐 또는 C2-3 치환된 알케닐이다. 특정 구체예에서, R15는 알키닐 또는 치환된 알키닐이다. 특정 구체예에서, R15는 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 특정 구체예에서, R15는 아미노 또는 치환된 아미노이다. 특정 구체예에서, R15는 카르복실 또는 카르복실 에스터이다. 특정 구체예에서, R15는 아실 또는 아실옥시이다. 특정 구체예에서, R15는 아실 아미노 또는 아미노 아실이다. 특정 구체예에서, R15는 알킬아미드 또는 치환된 알킬아미드이다. 특정 구체예에서, R15는 설포닐이다. 특정 구체예에서, R15는 티오알콕시 또는 치환된 티오알콕시이다. 특정 구체예에서, R15는 아릴 또는 치환된 아릴, 예를 들어, C5-8 아릴 또는 C5-8 치환된 아릴, 예를 들어, C5 아릴 또는 C5 치환된 아릴, 또는 C6 아릴 또는 C6 치환된 아릴이다. 특정 구체예에서, R15는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴, 예를 들어, C5-8 헤테로아릴 또는 C5-8 치환된 헤테로아릴, 예를 들어, C5 헤테로아릴 또는 C5 치환된 헤테로아릴, 또는 C6 헤테로아릴 또는 C6 치환된 헤테로아릴이다. 특정 구체예에서, R15는 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬, 예를 들어, C3-8 사이클로알킬 또는 C3-8 치환된 사이클로알킬, 예를 들어, C3-6 사이클로알킬 또는 C3-6 치환된 사이클로알킬, 또는 C3-5 사이클로알킬 또는 C3-5 치환된 사이클로알킬이다. 특정 구체예에서, R15는 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴, 예를 들어, C3-8 헤테로사이클릴 또는 C3-8 치환된 헤테로사이클릴, 예를 들어, C3-6 헤테로사이클릴 또는 C3-6 치환된 헤테로사이클릴, 또는 C3-5 헤테로사이클릴 또는 C3-5 치환된 헤테로사이클릴이다.
특정 구체예에서, 각각의 R15는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택된다. 이러한 구체예에서, 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴 치환기는 상기 R15에 대하여 기술된 바와 같다.
일부 구체예에서, 대상 링커에서:
T1은 (C1-C12)알킬 및 치환된 (C1-C12)알킬로부터 선택되고;
T2, T3 및 T4는 각각 (C1-C12)알킬, 치환된 (C1-C12)알킬, (EDA)w, (PEG)n, (AA)p, -(CR13OH)h-, 피페리딘-4-아미노 (4AP), 아세탈 기, 히드라진, 및 에스터로부터 독립적으로 선택되고;
Z1, Z2, Z3 및 Z4는 각각 공유 결합, -CO-, -NR15-, -NR15(CH2)q-, -NR15(C6H4)-, -CONR15-, -NR15CO-, -C(O)O-, -OC(O)-, -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -SO2NR15-, -NR15SO2- 및 -P(O)OH-로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되며, q는 1 내지 6의 정수이고;
상기 식에서
(PEG)n는
Figure 112016123593442-pct00023
이고, n은 1 내지 30의 정수이고;
EDA는 다음 구조를 가진 에틸렌 디아민 모이어티이며:
Figure 112016123593442-pct00024
, y는 1내지 6의 정수이고 r은 0 또는 1이고;
피페리딘-4-아미노는
Figure 112016123593442-pct00025
이고;
AA는 아미노산 잔기이며, p는 1 내지 20의 정수이고;
각각의 R11 및 R12는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로부터 독립적으로 선택되고, 어떤 두 개의 인접한 R12 기는 환형으로 연결되어 피페라지닐 고리를 형성할 수도 있고;
R13은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 및 치환된 아릴로부터 선택된다.
특정 구체예에서, T1, T2, T3 및 T4 및 Z1, Z2, Z3 및 Z4 는 다음 표, 예를 들어, 다음 표의 한 열에서 선택된다:
Figure 112016123593442-pct00026
특정 구체예에서, L은 -(L1)a-(L2)b-(L3)c-(L4)d-를 포함하는 링커이며, -(L1)a-는 -(T1-Z1)a-이고; -(L2)b-는 -(T2-Z2)b-이고; -(L3)c-는 -(T3-Z3)c-이고; -(L4)d-는 -(T4-Z4)d-이다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (AA)p이고, Z2는 -NR15-이고, T3는 (PEG)n이고, Z3는 -CO-이고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (EDA)w이고, Z2는 -CO-이고, T3는 (CR13OH)h이고, Z3는 -CONR15-이고, T4는 (C1-C12)알킬이고 Z4는 -CO-이다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (AA)p이고, Z2는 -NR15-이고, T3는 (C1-C12)알킬이고, Z3는 -CO-이고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CONR15-이고, T2는 (PEG)n이고, Z2는 -CO-이고, T3는 없고, Z3는 없고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (AA)p이고, Z2는 없고, T3는 없고, Z3는 없고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CONR15-이고, T2는 (PEG)n이고, Z2는 -NR15-이고, T3는 없고, Z3는 없고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (AA)p이고, Z2는 -NR15-이고, T3는 (PEG)n이고, Z3는 -NR15-이고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (EDA)w이고, Z2는 -CO-이고, T3는 없고, Z3는 없고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CONR15-이고, T2는 (C1-C12)알킬이고, Z2는 -NR15-이고, T3는 없고, Z3는 없고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CONR15-이고, T2는 (PEG)n이고, Z2는 -CO-이고, T3는 (EDA)w이고, Z3는 없고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (EDA)w이고, Z2는 없고, T3는 없고, Z3는 없고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CONR15-이고, T2는 (PEG)n이고, Z2는 -CO-이고, T3는 (AA)p이고, Z3는 없고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (EDA)w이고, Z2는 -CO-이고, T3는 (CR13OH)h이고, Z3는 -CO-이고, T4는 (AA)p이고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (AA)p이고, Z2는 -NR15-이고, T3는 (C1-C12)알킬이고, Z3는 -CO-이고, T4는 (AA)p이고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (AA)p이고, Z2는 -NR15-이고, T3는 (PEG)n이고, Z3는 -CO-이고, T4는 (AA)p이고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (AA)p이고, Z2는 -NR11-이고, T3는 (PEG)n이고, Z3는 -SO2-이고, T4는 (AA)p이고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (EDA)w이고, Z2는 -CO-이고, T3는 (CR13OH)h이고, Z3는 -CONR15-이고, T4는 (PEG)n이고 Z4는 -CO-이다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (CR13OH)h이고, Z2는 -CO-이고, T3는 없고, Z3는 없고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CONR15-이고, T2는 치환된 (C1-C12)알킬이고, Z2는 -NR15-이고, T3는 (PEG)n이고, Z3는 -CO-이고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1는 -SO2-이고, T2는 (C1-C12)알킬이고, Z2는 -CO-이고, T3는 없고, Z3는 없고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CONR15-이고, T2는 (C1-C12)알킬이고, Z2는 없고, T3는 (CR13OH)h이고, Z3는 -CONR15-이고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (AA)p이고, Z2는 -NR15-이고, T3는 (PEG)n이고, Z3는 -CO-이고, T4는 (AA)p이고 Z4는 -NR15-이다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (AA)p이고, Z2는 -NR15-이고, T3는 (PEG)n이고, Z3는 -P(O)OH-이고, T4는 (AA)p이고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (EDA)w이고, Z2는 없고, T3는 (AA)p이고, Z3는 없고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (EDA)w이고, Z2는 -CO-이고, T3는 (CR13OH)h이고, Z3는 -CONR15-이고, T4는 (C1-C12)알킬이고 Z4는 -CO(AA)p-이다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CONR15-이고, T2는 (C1-C12)알킬이고, Z2는 -NR15-이고, T3는 없고, Z3는 -CO-이고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CONR15-이고, T2는 (C1-C12)알킬이고, Z2는 -NR15-이고, T3는 없고, Z3는 -CO-이고, T4는 (C1-C12)알킬이고 Z4는 -NR15-이다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 (EDA)w이고, Z2는 -CO-이고, T3는 (CR13OH)h이고, Z3는 -CONR15-이고, T4는 (PEG)n이고 Z4는 -CO(AA)p-이다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 4AP이고, Z2는 -CO-이고, T3는 (C1-C12)알킬이고, Z3는 -CO-이고, T4는 (AA)p이고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, T1은 (C1-C12)알킬이고, Z1은 -CO-이고, T2는 4AP이고, Z2는 -CO-이고, T3는 (C1-C12)알킬이고, Z3는 -CO-이고, T4는 없고 Z4는 없다.
특정 구체예에서, 링커는 다음 구조 중 하나로 기술된다:
Figure 112016123593442-pct00027
Figure 112016123593442-pct00028
Figure 112016123593442-pct00029
Figure 112016123593442-pct00030
.
상기 도시된 링커 구조의 특정 구체예에서, 각각의 f는 독립적으로 0 또는 1 내지 12의 정수이고; 각각의 y는 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이고; 각각의 n는 독립적으로 0 또는 1 내지 30의 정수이고; 각각의 p는 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이고; 각각의 h는 독립적으로 0 또는 1 내지 12의 정수이고; 각각의 R은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴이고; 각각의 R'은 독립적으로 H, 아미노산의 측쇄, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴이다. 상기 도시된 링커 구조의 특정 구체예에서, 각각의 f는 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; 각각의 y는 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; 각각의 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; 각각의 p는 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; 각각의 h는 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 상기 도시된 링커 구조의 특정 구체예에서, 각각의 R은 독립적으로 H, 메틸 또는 -(CH2)m-OH이며 m은 1, 2, 3 또는 4 (예를 들어, 2)이다.
특정 구체예에서, W1은 메이탄시노이드이다. 메이탄시노이드는 하기 섹션에서 더 상세히 기술된다.
특정 구체예에서, W2는 항-HER2 항체이다. 항-HER2 항체는 하기 섹션에서 더 상세히 기술된다.
상기 구조에서 제시된 화학적 실체물, 링커 및 커플링 모이어티 중 어느 것도 대상 화합물 및 컨쥬게이트에서의 사용에 적용될 수 있다.
히드라지닐-인돌 화합물 및 컨쥬게이트의 제조 방법에 관한 추가적인 개시물은 2013년 3월 11일에 출원된 미국 출원 번호 13/794,159에서 발견되며, 이 개시물은 본원에 참고로 포함된다.
항- Her2 항체
상기 언급된 바와 같이, 대상 컨쥬게이트는 치환기 W2로서 항-HER2 항체를 포함할 수 있으며, 항-HER2 항체는 2-포르밀글리신 (FGly) 잔기를 포함하도록 변형되었다. 본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산은 그것들의 표준 명칭, 표준 3문자 약어 및/또는 표준 1문자 약어, 예를 들어,: 알라닌 또는 Ala 또는 A; 시스테인 또는 Cys 또는 C; 아스파르트산 또는 Asp 또는 D; 글루탐산 또는 Glu 또는 E; 페닐알라닌 또는 Phe 또는 F; 글리신 또는 Gly 또는 G; 히스티딘 또는 His 또는 H; 아이소류신 또는 Ile 또는 I; 리신 또는 Lys 또는 K; 류신 또는 Leu 또는 L; 메티오닌 또는 Met 또는 M; 아스파라긴 또는 Asn 또는 N; 프롤린 또는 Pro 또는 P; 글루타민 또는 Gln 또는 Q; 아르기닌 또는 Arg 또는 R; 세린 또는 Ser 또는 S; 트레오닌 또는 Thr 또는 T; 발린 또는 Val 또는 V; 트립토판 또는 Trp 또는 W; 및 티로신 또는 Tyr 또는 Y로 불릴 수도 있다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2의 도메인 I 내에서, 예를 들어, 도 4에서 나타난 HER2 아미노산 서열의 아미노산 23-217 내에서 에피토프에 결합한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2의 도메인 II 내에서, 예를 들어, 도 4에서 나타난 HER2 아미노산 서열의 아미노산 218-341 내에서 에피토프에 결합한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2의 도메인 III 내에서, 예를 들어, 도 4에서 나타난 HER2 아미노산 서열의 아미노산 342-510 내에서 에피토프에 결합한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2의 도메인 IV 내에서, 예를 들어, 도 4에서 나타난 HER2 아미노산 서열의 아미노산 511-636 내에서 에피토프에 결합한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 도 4에서 나타난 바와 같이 서열 번호:1의 아미노산 529-625 내에서 에피토프에 결합한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 도 4에서 나타난 바와 같이 서열 번호:1의 아미노산 561-625 내에서 에피토프에 결합한다.
일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 내에서 에피토프에 결합에 대하여 제2 항-HER2 항체와 결합하고 및/또는 HER2 내에서, 제2 항-HER2 항체로서, 같은 에피토프에 결합한다. 일부 경우에서, HER2 내에서 에피토프에 결합에 대하여 제2 항-HER2 항체와 경쟁하는 항-HER2 항체는 또한 제2 항-HER2 항체로서 에피토프에 결합한다. 일부 경우에서, HER2 내에서 에피토프에 결합에 대하여 제2 항-HER2 항체와 경쟁하는 항-HER2 항체는 제2 항-HER2 항체에 의해 결합된 에피토프와 공통되는 에피토프에 결합한다.
대상 컨쥬게이트에서의 사용에 적합한 항-HER2 항체는 일부 경우에서 HER2를 과발현하는 인간 종양 세포의 증식을 억제하는데, 억제는 시험관 내, 생체 내, 또는 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 일어난다. 예를 들어, 일부 경우에서, 대상 컨쥬게이트에서의 사용에 적합한 항-HER2 항체는 HER2를 과발현하는 인간 종양 세포의 증식을 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 80% 이상, 예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%까지 억제한다.
일부 경우에서, 대상 컨쥬게이트에서의 사용에 적합한 항-HER2 항체는 HER3로의 HER2의 다이머화 및/또는 다른 EGFR 수용체를 억제한다. 일부 경우에서, 대상 컨쥬게이트에서의 사용에 적합한 항-HER2 항체는 HER3로의 HER2의 다이머화 및/또는 다른 EGFR 수용체를 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 80% 이상, 예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%까지 억제한다.
4D5
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 도 4에서 나타난 바와 같이, 서열 번호:1의 아미노산 511-636 내에서 에피토프에 결합한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 도 4에서 나타난 바와 같이, 서열 번호:1의 아미노산 529-625 내에서 에피토프에 결합한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 도 4에서 나타난 바와 같이, 서열 번호:1의 아미노산 561-625 내에서 에피토프에 결합한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 IV 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 511-636 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 529-625 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 561-625 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 DTYIH (VH CDR1; 서열 번호:20), RIYPTNGYTRYADSVKG (VH CDR2; 서열 번호:21), 및 WGGDGFYAMDV (VH CDR3; 서열 번호:22)로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 IV 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 511-636 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 529-625 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 561-625 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 RASQDVNTAVA (VL CDR1; 서열 번호:23), SASFLES (VL CDR2; 서열 번호:24), 및 QQHYTTPPT (VL CDR3; 서열 번호:25)로부터 선택된 경쇄 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 IV 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 511-636 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 529-625 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 561-625 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 VH CDR DTYIH (VH CDR1; 서열 번호:20), RIYPTNGYTRYADSVKG (VH CDR2; 서열 번호:21), 및 WGGDGFYAMDV (VH CDR3; 서열 번호:22)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 IV 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 511-636 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 529-625 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 561-625 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 VL CDR RASQDVNTAVA (VL CDR1; 서열 번호:23), SASFLES (VL CDR2; 서열 번호:24), 및 QQHYTTPPT (VL CDR3; 서열 번호:25)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 IV 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 511-636 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 529-625 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 561-625 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 VH CDR DTYIH (VH CDR1; 서열 번호:20), RIYPTNGYTRYADSVKG (VH CDR2; 서열 번호:21), 및 WGGDGFYAMDV (VH CDR3; 서열 번호:22) 및 VL CDR RASQDVNTAVA (VL CDR1; 서열 번호:23), SASFLES (VL CDR2; 서열 번호:24), 및 QQHYTTPPT (VL CDR3; 서열 번호:25)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 VH CDR DTYIH (VH CDR1; 서열 번호:20), RIYPTNGYTRYADSVKG (VH CDR2; 서열 번호:21), 및 WGGDGFYAMDV (VH CDR3; 서열 번호:22)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 VL CDR RASQDVNTAVA (VL CDR1; 서열 번호:23), SASFLES (VL CDR2; 서열 번호:24), 및 QQHYTTPPT (VL CDR3; 서열 번호:25)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 VH CDR DTYIH (VH CDR1; 서열 번호:20), RIYPTNGYTRYADSVKG (VH CDR2; 서열 번호:21), 및 WGGDGFYAMDV (VH CDR3; 서열 번호:22) 및 VL CDR RASQDVNTAVA (VL CDR1; 서열 번호:23), SASFLES (VL CDR2; 서열 번호:24), 및 QQHYTTPPT (VL CDR3; 서열 번호:25)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 다음 아미노산 서열을 포함하는 항-HER2 VH 영역에 존재하는 VH CDR을 포함한다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSS (서열 번호:2). 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 다음 아미노산 서열을 포함하는 항-HER2 VL 영역에 존재하는 VL CDR을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT (서열 번호:3). 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSS (서열 번호:2)에 존재하는 VH CDR 및 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT (서열 번호:3)에 존재하는 VL CDR을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 VH 아미노산 서열 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSS (서열 번호:2)를 포함한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 VL 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT (서열 번호:3)를 포함한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 VH 아미노산 서열 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSS (서열 번호:2); 및 VL 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT (서열 번호:3)를 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 VH 아미노산 서열 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSS (서열 번호:2)을 포함하며, 중쇄 불변 영역은 FGly 잔기를 포함하도록 변형된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 VL 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT (서열 번호:3)를 포함하며, 경쇄 불변 영역은 FGly 잔기를 포함하도록 변형된다.
인간화된 2C4
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2의 도메인 II 내에서, 예를 들어, 도 4에서 나타난 아미노산 서열의 아미노산 218-341 내에서 에피토프에 결합한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2에서 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 II 내에서 에피토프; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 218-341 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 GFTFTDYTMX로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 항체와 경쟁하며, X는 D 또는 S (VH CDR1; 서열 번호:26); DVNPNSGGSIYNQRFKG (VH CDR2; 서열 번호:27); 및 NLGPSFYFDY (VH CDR3; 서열 번호:28)이다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2에서 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 II 내에서 에피토프; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 218-341 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 KASQDVSIGVA (VL CDR1; 서열 번호:29); SASYX1X2X3 (여기에서 X1은 R 또는 L이고, X2는 Y 또는 E이고, 및 X3은 T 또는 S이다) (VL CDR2; 서열 번호:30); 및 QQYYIYPYT (VL CDR3; 서열 번호:31)로부터 선택된 경쇄 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2에서 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 II 내에서 에피토프; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 218-341 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 중쇄 CDR GFTFTDYTMX (여기에서 X는 D 또는 S이다) (VH CDR1; 서열 번호:26); DVNPNSGGSIYNQRFKG (VH CDR2; 서열 번호:27); 및 NLGPSFYFDY (VH CDR3; 서열 번호:28)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2에서 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 II 내에서 에피토프; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 218-341 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 경쇄 CDR KASQDVSIGVA (VL CDR1; 서열 번호:29); SASYX1X2X3 (여기에서 X1은 R 또는 L이고, X2는 Y 또는 E이고, X3는 T 또는 S이다) (VL CDR2; 서열 번호:30); 및 QQYYIYPYT (VL CDR3; 서열 번호:31)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2에서 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 II 내에서 에피토프; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 218-341 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 중쇄 CDR GFTFTDYTMX (여기에서 X는 D 또는 S이다) (VH CDR1; 서열 번호:26); DVNPNSGGSIYNQRFKG (VH CDR2; 서열 번호:27); 및 NLGPSFYFDY (VH CDR3; 서열 번호:28)를 포함하고; 및 경쇄 CDR KASQDVSIGVA (VL CDR1; 서열 번호:29); SASYX1X2X3 (여기에서 X1은 R 또는 L이고, X2는 Y 또는 E이고, X3는 T 또는 S이다) (VL CDR2; 서열 번호:30); 및 QQYYIYPYT (VL CDR3; 서열 번호:31)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 중쇄 CDR GFTFTDYTMX (여기에서 X는 D 또는 S이다) (VH CDR1; 서열 번호:26); DVNPNSGGSIYNQRFKG (VH CDR2; 서열 번호:27); 및 NLGPSFYFDY (VH CDR3; 서열 번호:28)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 경쇄 CDR KASQDVSIGVA (VL CDR1; 서열 번호:29); SASYX1X2X3 (여기에서 X1은 R 또는 L이고, X2는 Y 또는 E이고, X3는 T 또는 S이다) (VL CDR2; 서열 번호:30); 및 QQYYIYPYT (VL CDR3; 서열 번호:31)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 중쇄 CDR GFTFTDYTMX (여기에서 X는 D 또는 S이다) (VH CDR1; 서열 번호:26); DVNPNSGGSIYNQRFKG (VH CDR2; 서열 번호:27); 및 NLGPSFYFDY (VH CDR3; 서열 번호:28)를 포함하고; 경쇄 CDR KASQDVSIGVA (VL CDR1; 서열 번호:29); SASYX1X2X3 (여기에서 X1은 R 또는 L이고, X2는 Y 또는 E이고, X3는 T 또는 S이다) (VL CDR2; 서열 번호:30); 및 QQYYIYPYT (VL CDR3; 서열 번호:31)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 중쇄 CDR GFTFTDYTMD (VH CDR1; 서열 번호:219); DVNPNSGGSIYNQRFKG (VH CDR2; 서열 번호:27); 및 NLGPSFYFDY (VH CDR3; 서열 번호:28)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 경쇄 CDR KASQDVSIGVA (VL CDR1; 서열 번호:29); SASYRYT (VL CDR2; 서열 번호:220); 및 QQYYIYPYT (VL CDR3; 서열 번호:31)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 중쇄 CDR GFTFTDYTMD (VH CDR1; 서열 번호:219); DVNPNSGGSIYNQRFKG (VH CDR2; 서열 번호:27); 및 NLGPSFYFDY (VH CDR3; 서열 번호:28)를 포함하고; 경쇄 CDR KASQDVSIGVA (VL CDR1; 서열 번호:29); SASYRYT (VL CDR2; 서열 번호:220); 및 QQYYIYPYT (VL CDR3; 서열 번호:31)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 다음 아미노산 서열을 포함하는 항-HER2 VH 영역에 존재하는 VH CDR을 포함한다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32). 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 다음 아미노산 서열을 포함하는 항-HER2 VL 영역에 존재하는 VL CDR을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (서열 번호:33). 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 다음 아미노산 서열, EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32)를 포함하는 항-HER2 VH 영역에 존재하는 VH CDR을 포함하고; 다음 아미노산 서열, DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (서열 번호:33)를 포함하는 항-HER2 VL 영역에 존재하는 VL CDR을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 아미노산 서열 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32)를 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (서열 번호:33)를 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 아미노산 서열 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32)를 포함하는 VH 영역을 포함하고; 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (서열 번호:33)를 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 아미노산 서열 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32)를 포함하는 VH 영역을 포함하며, 중쇄 불변 영역은 FGly 잔기를 포함하도록 변형된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (서열 번호:33)를 포함하는 VL 영역을 포함하며, 경쇄 불변 영역은 FGly 잔기를 포함하도록 변형된다.
심포겐 항- HER2
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 GFTFSSYG (서열 번호:34), GFNIKDIF (서열 번호:35), GYTFTNYW (서열 번호:36), GYTFTDYY (서열 번호:37), GYTFTDYS (서열 번호:38), GYTFTSHW (서열 번호:39), GYTFTGYW (서열 번호:40), GYTFTSYW (서열 번호:41), 및 GYSFTDYN (서열 번호:42)으로부터 선택된 VH CDR1; 및/또는 ISGGGSYT (서열 번호:43), IDPANDNP (서열 번호:44), IHPSDSDV (서열 번호:45), INPNNGGT (서열 번호:46), INTATGEP (서열 번호:47), INPSNGGT (서열 번호:48), ILPGSGST (서열 번호:49), IHPNSGSI (서열 번호:50), ILPGGYT (서열 번호:51), 및 IDPYNGGT (서열 번호:52)로부터 선택된 VH CDR2; 및/또는 CARKGNYGNYGKLAYW (서열 번호:53), CAGGPAYFDYW (서열 번호:54), CAKSYYDSAMDYW (서열 번호:55), CVPGGLRSYFDYW (서열 번호:56), CTAWAYEPYFDYW (서열 번호:57), CARAYYDFSWFVYW (서열 번호:58), CARWGDGSFAYW (서열 번호:59), CAGYGNGPMDYW (서열 번호:60), CARGSSGYPYYFDYW (서열 번호:61), 및 CARGAGYALDYW (서열 번호:62)로부터 선택된 VH CDR3를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 ENIYSN (서열 번호:63), QDVIAA (서열 번호:64), KSVTTSGYSY (서열 번호:65), QDVSAA (서열 번호:66), QDVFTA (서열 번호:67), QDISNY (서열 번호:68), QNVGTA (서열 번호:69), SSVSY (서열 번호:70), 및 QDVGTA (서열 번호:71)로부터 선택된 VL CDR1; 및/또는 AAT, WAS, VAS, SAS, IS, STS, RTS, 및 LTS로부터 선택된 VL CDR2; 및/또는 CQHFWGTPWTF (서열 번호:72), CQQHYSTPWTF (서열 번호:73), CHHSRELPWTF (서열 번호:74), CQQHYTTPPTF (서열 번호:75), CQQHFGIPWTF (서열 번호:76), CQQGNTLPLTF (서열 번호:77), CQQYRSYPFTF (서열 번호:78), CQQYHNYPLTF (서열 번호:79), CQQYSSYPYMYTF (서열 번호:80), 및 CQQWSSTPYTF (서열 번호:81)로부터 선택된 VL CDR3을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 다음과 같이 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR 서열 GFTFSSYG (서열 번호:34), ISGGGSYT (서열 번호:43), 및 CARKGNYGNYGKLAYW (서열 번호:53)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR 서열 GFNIKDIF (서열 번호:35), IDPANDNP (서열 번호:44), 및 CAGGPAYFDYW (서열 번호:54)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR 서열 GYTFTNYW (서열 번호:36), IHPSDSDV (서열 번호:45), 및 CAKSYYDSAMDYW (서열 번호:55)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR 서열 GYTFTDYY (서열 번호:37), INPNNGGT (서열 번호:46), 및 CVPGGLRSYFDYW (서열 번호:56)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR 서열 GYTFTDYS (서열 번호:38), INTATGEP (서열 번호:47), 및 CTAWAYEPYFDYW (서열 번호:57)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR 서열 GYTFTSHW (서열 번호:39), INPSNGGT (서열 번호:48), 및 CARAYYDFSWFVYW (서열 번호:58)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR 서열 GYTFTGYW (서열 번호:40), ILPGSGST (서열 번호:49), 및 CARWGDGSFAYW (서열 번호:59)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR 서열 GYTFTSYW (서열 번호:41), IHPNSGSI (서열 번호:50), 및 CAGYGNGPMDYW (서열 번호:60)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR 서열 GYTFTNYW (서열 번호:36), ILPGGYT (서열 번호:51), 및 CARGSSGYPYYFDYW (서열 번호:61)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR 서열 GYSFTDYN (서열 번호:42), IDPYNGGT (서열 번호:52), CARGAGYALDYW (서열 번호:62)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 상기 구체예들 중 어느 것에서도, 항체는 인간화될 수 있다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 다음과 같이 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VL CDR 서열 ENIYSN (서열 번호:63), AAT, 및 CQHFWGTPWTF (서열 번호:72)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VL CDR 서열 QDVIAA (서열 번호:64), WAS, 및 CQQHYSTPWTF (서열 번호:73)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VL CDR 서열 KSVTTSGYSY (서열 번호:65), VAS, 및 CHHSRELPWTF (서열 번호:74)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VL CDR 서열 QDVSAA (서열 번호:66), WAS, 및 CQQHYTTPPTF (서열 번호:75)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VL CDR 서열 QDVFTA (서열 번호:67), SAS, 및 CQQHFGIPWTF (서열 번호:76)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VL CDR 서열 QDISNY (서열 번호:68), IS, 및 CQQGNTLPLTF (서열 번호:77)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VL CDR 서열 QNVGTA (서열 번호:69), STS, 및 CQQYRSYPFTF (서열 번호:78)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VL CDR 서열 SSVSY (서열 번호:70), RTS, 및 CQQYHNYPLTF (서열 번호:79)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VL CDR 서열 QDVGTA (서열 번호:71), WAS, 및 CQQYSSYPYMYTF (서열 번호:80)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VL CDR 서열 SSVSY (서열 번호:70), LTS, 및 CQQWSSTPYTF (서열 번호:81)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 상기 구체예들 중 어느 것에서도, 항체는 인간화될 수 있다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 다음과 같이 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하고, VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR GFTFSSYG (서열 번호:34), ISGGGSYT (서열 번호:43), 및 CARKGNYGNYGKLAYW (서열 번호:53)를 포함하고; VL CDR ENIYSN (서열 번호:63), AAT, 및 CQHFWGTPWTF (서열 번호:72)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR GFNIKDIF (서열 번호:35), IDPANDNP (서열 번호:44), 및 CAGGPAYFDYW (서열 번호:54)를 포함하고; VL CDR QDVIAA (서열 번호:64), WAS, 및 CQQHYSTPWTF (서열 번호:73)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR GYTFTNYW (서열 번호:36), IHPSDSDV (서열 번호:45), 및 CAKSYYDSAMDYW (서열 번호:55)를 포함하고; VL CDR KSVTTSGYSY (서열 번호:65), VAS, 및 CHHSRELPWTF (서열 번호:74)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR GYTFTDYY (서열 번호:37), INPNNGGT (서열 번호:46), 및 CVPGGLRSYFDYW (서열 번호:56)를 포함하고; VL CDR QDVSAA (서열 번호:66), WAS, 및 CQQHYTTPPTF (서열 번호:75)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR GYTFTDYS (서열 번호:38), INTATGEP (서열 번호:47), 및 CTAWAYEPYFDYW (서열 번호:57)를 포함하고; VL CDR QDVFTA (서열 번호:67), SAS, 및 CQQHFGIPWTF (서열 번호:76)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR GYTFTSHW (서열 번호:39), INPSNGGT (서열 번호:48), 및 CARAYYDFSWFVYW (서열 번호:58)를 포함하고; VL CDR QDISNY (서열 번호:68), IS, 및 CQQGNTLPLTF (서열 번호:77)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR GYTFTGYW (서열 번호:40), ILPGSGST (서열 번호:49), 및 CARWGDGSFAYW (서열 번호:59)를 포함하고; VL CDR QNVGTA (서열 번호:69), STS, 및 CQQYRSYPFTF (서열 번호:78)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR GYTFTSYW (서열 번호:41), IHPNSGSI (서열 번호:50), 및 CAGYGNGPMDYW (서열 번호:60)를 포함하고; VL CDR SSVSY (서열 번호:70), RTS, 및 CQQYHNYPLTF (서열 번호:79)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR GYTFTNYW (서열 번호:36), ILPGGYT (서열 번호:51), 및 CARGSSGYPYYFDYW (서열 번호:61)를 포함하고; VL CDR QDVGTA (서열 번호:71), WAS, 및 CQQYSSYPYMYTF (서열 번호:80)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR GYSFTDYN (서열 번호:42), IDPYNGGT (서열 번호:52), CARGAGYALDYW (서열 번호:62)를 포함하고; VL CDR SSVSY (서열 번호:70), LTS, 및 CQQWSSTPYTF (서열 번호:81)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 상기 구체예들 중 어느 것에서도, 항체는 인간화될 수 있다.
Alper BioTech 2HE
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 HER2 폴리펩타이드의 도메인 II 내에서 에피토프, 예를 들어, 아미노산 LVTYNTDTFE (서열 번호:82) 내에서, 아미노산 SMPNPEGRYT (서열 번호:83)내에서, 또는 아미노산 YNYLSTDVGS (서열 번호:84)내에서 에피토프에 결합한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드의 도메인 III 내에서 에피토프, 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 ETLEEITGYL (서열 번호:85) 내에서, 아미노산 YISAWPDSLP (서열 번호:86) 내에서, 또는 아미노산 YSLTLQGLGI (서열 번호:87) 내에서 에피토프에 결합한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩타이드의 도메인 IV 내에서 에피토프, 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 PREYVNARHC (서열 번호:88) 내에서, 아미노산 ADQCVACAHY (서열 번호:89) 내에서, 또는 아미노산 PSGVKPDLSY (서열 번호:90) 내에서 에피토프에 결합한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 에피토프에 결합에 대하여 GFSLTSYV (VH CDR1; 서열 번호:91), IWTGGGT (VH CDR2; 서열 번호:92), 및 ASLSYDGFDYW (VH CDR3; 서열 번호:93)로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 에피토프에 결합에 대하여 SSVSY (VL CDR1; 서열 번호:70), DTS (VL CDR2), 및 QQWSSNPLT (VL CDR3; 서열 번호:94)로부터 선택된 경쇄 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR GFSLTSYV (VH CDR1; 서열 번호:91), IWTGGGT (VH CDR2; 서열 번호:92), 및 ASLSYDGFDYW (VH CDR3; 서열 번호:93)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 에피토프에 결합에 대하여 VL CDR SSVSY (VL CDR1; 서열 번호:70), DTS (VL CDR2), 및 QQWSSNPLT (VL CDR3; 서열 번호:94)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 에피토프에 결합에 대하여 VH CDR GFSLTSYV (VH CDR1; 서열 번호:91), IWTGGGT (VH CDR2; 서열 번호:92), 및 ASLSYDGFDYW (VH CDR3; 서열 번호:93)를 포함하고; VL CDR SSVSY (VL CDR1; 서열 번호:70), DTS (VL CDR2), 및 QQWSSNPLT (VL CDR3; 서열 번호:94)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 VH CDR GFSLTSYV (VH CDR1; 서열 번호:91), IWTGGGT (VH CDR2; 서열 번호:92), 및 ASLSYDGFDYW (VH CDR3; 서열 번호:93)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 VL CDR SSVSY (VL CDR1; 서열 번호:70), DTS (VL CDR2), 및 QQWSSNPLT (VL CDR3; 서열 번호:94)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 VH CDR GFSLTSYV (VH CDR1; 서열 번호:91), IWTGGGT (VH CDR2; 서열 번호:92), 및 ASLSYDGFDYW (VH CDR3; 서열 번호:93)를 포함하고; VL CDR SSVSY (VL CDR1; 서열 번호:70), DTS (VL CDR2), 및 QQWSSNPLT (VL CDR3; 서열 번호:94)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 다음 VH 아미노산 서열에 존재하는 VH CDR을 포함한다: GPGLAAPSQSLSITCTVSGFSLTSYVISWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGGTNYNSALKSRLSISKDNSKSQVSLKMNSLQTDDTARYYCASLSYDGFDYWGQGTTVT (서열 번호:95). 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 다음 VL 아미노산 서열에 존재하는 VL CDR을 포함한다: ILMTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLEIK (서열 번호:96). 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 다음 VH 아미노산 서열에 존재하는 VH CDR을 포함하고: GPGLAAPSQSLSITCTVSGFSLTSYVISWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGGTNYNSALKSRLSISKDNSKSQVSLKMNSLQTDDTARYYCASLSYDGFDYWGQGTTVT (서열 번호:95); 다음 VL 아미노산 서열에 존재하는 CL CDR을 포함한다: ILMTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLEIK (서열 번호:96). 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다.
변형된 불변 영역 서열
상기 언급된 바와 같이, 항-HER2 항체의 아미노산 서열은 생체 내에서 (예를 들어, 세포에서 ald 태그-함유 단백질의 번역시) 또는 시험관 내에서 (예를 들어, 무세포 시스템에서 ald 태그-함유 단백질을 FGE와 접촉시킴으로써) 포르밀글리신 생성 효소 (FGE)의 작용에 의해 2-포르밀글리신 (FGly)으로 전환 (산화)될 수 있는 세린 또는 시스테인 잔기를 함유하는 설파타제 모티프를 포함하도록 변형된다. 이러한 설파타제 모티프는 또한 본원에서 FGE-변형 부위로도 불릴 수 있다.
설파타제 모티프
알데하이드 태그의 최소 설파타제 모티프는 보통 길이가 5 또는 6개의 아미노산 잔기, 보통 길이가 6개 이하의 아미노산 잔기이다. Ig 폴리펩타이드에서 제공된 설파타제 모티프는 길이가 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 또는 7개 미만의 아미노산 잔기의 설파타제 모티프를 한정하기 위해서, 길이가 적어도 5 또는 6개의 아미노산 잔기이고, 예를 들어, 5 내지 16, 6-16, 5-15, 6-15, 5-14, 6-14, 5-13, 6-13, 5-12, 6-12, 5-11, 6-11, 5-10, 6-10, 5-9, 6-9, 5-8, 또는 6-8개의 아미노산 잔기일 수 있다.
특정 구체예에서, 원하는 폴리펩타이드는 폴리펩타이드에서 설파타제 모티프의 서열을 제공하기 위해 고유한 아미노산 서열에 관하여 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어, 2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 이상, 또는 5개 이상, 또는 6개 이상, 또는 7개 이상, 또는 8개 이상, 또는 9개 이상, 또는 10개 이상, 또는 11개 이상, 또는 12개 이상, 또는 13개 이상, 또는 14개 이상, 또는 15개 이상, 또는 16개 이상, 또는 17개 이상, 또는 18개 이상, 또는 19개 이상, 또는 20개 이상의 아미노산 잔기가 삽입, 결실, 치환 (대체)된 것들을 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 고유한 아미노산 서열에 관하여 아미노산 서열의 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 미만의 아미노산 잔기의 변형 (삽입, 추가, 결실, 및/또는 치환/대체)을 포함한다. 폴리펩타이드 (예를 들어, 항-HER2 항체)에 고유한 아미노산 서열이 바람직한 설파타제 모티프의 하나 이상의 잔기를 함유하는 경우, 잔기 변형의 총 개수는, 예를 들어, 바람직한 설파타제 모티프의 서열을 제공하기 위해 고유한 아미노산 잔기를 플랭킹(flanking)하는 아미노산 잔기의 부위-특수화 변형 (삽입, 추가, 결실, 치환/대체)에 의해 감소될 수 있다. 특정 구체예에서, 삽입, 결실, 치환 (대체), 또는 추가되는 (예를 들어, N- 또는 C-말단에) 아미노산 잔기의 수를 최소화하기 위해서, 표적 항-HER2 폴리펩타이드의 고유한 아미노산 서열의 변형의 정도가 최소화된다. 표적 항-HER2 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변형의 정도를 최소화하는 것은 항-HER2 기능 및/또는 구조에 대하여 이러한 변형이 가질 수도 있는 영향을 최소화할 수도 있다.
특히 원하는 알데하이드 태그는 적어도 최소 설파타제 모티프 ("공통 설파타제 모티프"로도 불림)를 포함하는 것인 한편, 더 긴 알데하이드 태그는 본 개시물에 의해 고려되고 포함되고 본 개시물의 조성물 및 방법에서 용도를 발견할 수 있다는 것은 쉽게 인정될 것이다. 따라서 알데하이드 태그는 5 또는 6개의 잔기의 최소 설파타제 모티프를 포함할 수 있거나, 더 길 수도 있고 추가적인 아미노산 잔기에 의해 모티프의 N- 및/또는 C-말단 측면에 플랭킹될 수 있는 최소 설파타제 모티프를 포함할 수 있다. 예를 들어, 5 또는 6개의 아미노산 잔기의 알데하이드 태그, 뿐만 아니라 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 아미노산 잔기의 더 긴 아미노산 서열이 고려된다.
알데하이드 태그는 Ig 중쇄의 C-말단에 또는 그것의 근처에 존재할 수 있다; 예를 들어, 알데하이드 태그는 고유한, 야생형 Ig 중쇄의 C-말단의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 내에 존재할 수 있다. 알데하이드 태그는 Ig 중쇄의 CH1 도메인 내에 존재할 수 있다. 알데하이드 태그는 Ig 중쇄의 CH2 도메인 내에 존재할 수 있다. 알데하이드 태그는 Ig 중쇄의 CH3 도메인 내에 존재할 수 있다. 알데하이드 태그는 Ig 경쇄 불변 영역, 예를 들어, 카파 경쇄 불변 영역 또는 람다 경쇄 불변 영역에 존재할 수 있다.
특정 구체예에서, 사용된 설파타제 모티프는 다음 식으로 기술될 수도 있으며:
Figure 112016123593442-pct00031
상기 식에서
Z10은 시스테인 또는 세린이고 ((C/S)로도 표현될 수 있다);
Z20은 프롤린 또는 알라닌 잔기이고 ((P/A)로도 표현될 수 있다);
Z30은 염기성 아미노산 (예를 들어, 아르기닌 (R), 그리고 리신 (K) 또는 히스티딘 (H), 예를 들어, 리신일 수도 있다), 또는 지방족 아미노산 (알라닌 (A), 글리신 (G), 류신 (L), 발린 (V), 아이소류신 (I), 또는 프롤린 (P), 예를 들어, A, G, L, V, 또는 I)이고;
X1는 존재하거나 존재하지 않으며, 존재할 때는, 임의의 아미노산, 예를 들어, 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성, 비대전된 아미노산 (즉, 방향족 아미노산 또는 대전된 아미노산 외에), 예를 들어, L, M, V, S 또는 T, 예를 들어, L, M, S 또는 V일 수 있고, 단 설파타제 모티프가 표적 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고;
X2 및 X3는 독립적으로 임의의 아미노산일 수 있지만, 보통은 지방족 아미노산, 극성, 비대전된 아미노산, 또는 황 함유 아미노산 (즉, 방향족 아미노산 또는 대전된 아미노산 외에), 예를 들어, S, T, A, V, G 또는 C, 예를 들어, S, T, A, V 또는 G이다.
항-HER2 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열은 식 X1Z10X2Z20X3Z30의 적어도 5개의 아미노산의 서열을 제공하도록 변형될 수 있으며, 상기 식에서
Z10은 시스테인 또는 세린이고;
Z20은 프롤린 또는 알라닌 잔기이고;
Z30은 지방족 아미노산 또는 염기성 아미노산이고;
X1는 존재하거나 존재하지 않으며, 존재할 때는, 임의의 아미노산이고, 단 이종 기원 설파타제 모티프가 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고;
X2 및 X3는 각각 독립적으로 임의의 아미노산일 수 있고,
서열은 Ig 불변 영역의 용매-접근 가능한 루프 영역 내에 있거나 그것에 인접하고, 서열은 Ig 중쇄의 C-말단에 없다.
설파타제 모티프는 무세포 시험관 내 방법에서 선택된 FGE, 예를 들어, 알데하이드 태그된 폴리펩타이드가 발현되는 숙주 세포에 존재하는 FGE 또는 알데하이드 태그된 폴리펩타이드와 접촉될 FGE에 의해 전환 가능해지도록 일반적으로 선택된다.
예를 들어, FGE가 진핵세포 FGE (예를 들어, 인간 FGE를 포함하는 포유류 FGE)인 경우, 설파타제 모티프는 다음 식의 것일 수 있으며:
Figure 112016123593442-pct00032
상기 식에서
X1은 존재하거나 존재하지 않을 수도 있으며, 존재할 때는, 임의의 아미노산, 예를 들어, 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성, 비대전된 아미노산 (즉, 방향족 아미노산 또는 대전된 아미노산 외에), 예를 들어, L, M, S 또는 V이고, 단 설파타제 모티프가 표적 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고;
X2 및 X3는 독립적으로 임의의 아미노산, 예를 들어, 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성, 비대전된 아미노산 (즉, 방향족 아미노산 또는 대전된 아미노산 외에), 예를 들어, S, T, A, V, G, 또는 C, 예를 들어, S, T, A, V 또는 G일 수 있고;
Z30은 염기성 아미노산 (예를 들어, 아르기닌 (R), 그리고 리신 (K) 또는 히스티딘 (H), 예를 들어, 리신일 수도 있다), 또는 지방족 아미노산 (알라닌 (A), 글리신 (G), 류신 (L), 발린 (V), 아이소류신 (I), 또는 프롤린 (P), 예를 들어, A, G, L, V, 또는 I)이다.
설파타제 모티프의 구체적인 예는 LCTPSR (서열 번호:97), MCTPSR (서열 번호:98), VCTPSR (서열 번호:99), LCSPSR (서열 번호:100), LCAPSR (서열 번호:101), LCVPSR (서열 번호:102), LCGPSR (서열 번호:103), ICTPAR (서열 번호:104), LCTPSK (서열 번호:105), MCTPSK (서열 번호:106), VCTPSK (서열 번호:107), LCSPSK (서열 번호:108), LCAPSK (서열 번호:109), LCVPSK (서열 번호:110), LCGPSK (서열 번호:111), LCTPSA (서열 번호:112), ICTPAA (서열 번호:113), MCTPSA (서열 번호:114), VCTPSA (서열 번호:115), LCSPSA (서열 번호:116), LCAPSA (서열 번호:117), LCVPSA (서열 번호:118), 및 LCGPSA (서열 번호:119)를 포함한다.
FGly-함유 서열
변형된 항-HER2 중쇄 및/또는 경쇄에서 FGE의 작용시, 설파타제 모티프의 세린 또는 시스테인은 FGly로 변형된다. 따라서, FGly-함유 설파타제 모티프는 다음 식의 것일 수 있으며:
Figure 112016123593442-pct00033
상기 식에서
FGly는 포르밀글리신 잔기이고;
Z20은 프롤린 또는 알라닌 잔기이고 ((P/A)로도 표현될 수 있다);
Z30은 염기성 아미노산 (예를 들어, 아르기닌 (R), 그리고 리신 (K) 또는 히스티딘 (H), 보통 리신일 수도 있다), 또는 지방족 아미노산 (알라닌 (A), 글리신 (G), 류신 (L), 발린 (V), 아이소류신 (I), 또는 프롤린 (P), 예를 들어, A, G, L, V, 또는 I)이고;
X1은 존재하거나 존재하지 않을 수도 있으며, 존재할 때는, 임의의 아미노산, 예를 들어, 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성, 비대전된 아미노산 (즉, 방향족 아미노산 또는 대전된 아미노산 외에), 예를 들어, L, M, V, S 또는 T, 예를 들어, L, M 또는 V일 수 있고, 단 설파타제 모티프가 표적 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고;
X2 및 X3는 독립적으로 임의의 아미노산, 예를 들어, 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성, 비대전된 아미노산 (즉, 방향족 아미노산 또는 대전된 아미노산 외에), 예를 들어, S, T, A, V, G 또는 C, 예를 들어, S, T, A, V 또는 G일 수 있다.
상기 기술된 바와 같이, FGly 잔기를 함유하는 변형된 폴리펩타이드는 FGly'-함유 설파타제 모티프를 생성하기 위해 약물 (예를 들어, 상기 기술된 바와 같이 히드라지닐-피롤로 커플링 모이어티를 함유하는 약물)과 FGly의 반응에 의해 약물 (예를 들어, 메이탄시노이드)에 컨쥬게이션될 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 FGly'는 약물, 예를 들어, 메이탄시노이드 (예를 들어, 식 (I)의 변형된 아미노산 잔기)에 커플링되는 설파타제 모티프의 변형된 아미노산 잔기를 말한다. 따라서, FGly'-함유 설파타제 모티프는 다음 식의 것이며:
Figure 112016123593442-pct00034
상기 식에서
FGly'는 식 (I)의 변형된 아미노산 잔기이고;
Z20은 프롤린 또는 알라닌 잔기이고 ((P/A)로도 표현될 수 있다);
Z30은 염기성 아미노산 (예를 들어, 아르기닌 (R), 그리고 리신 (K) 또는 히스티딘 (H), 보통 리신일 수도 있다), 또는 지방족 아미노산 (알라닌 (A), 글리신 (G), 류신 (L), 발린 (V), 아이소류신 (I), 또는 프롤린 (P), 예를 들어, A, G, L, V, 또는 I)이고;
X1은 존재하거나 존재하지 않을 수도 있으며, 존재할 때는, 임의의 아미노산, 예를 들어, 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성, 비대전된 아미노산 (즉, 방향족 아미노산 또는 대전된 아미노산 외에), 예를 들어, L, M, V, S 또는 T, 예를 들어, L, M 또는 V일 수 있고, 단 설파타제 모티프가 표적 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고;
X2 및 X3는 독립적으로 임의의 아미노산, 예를 들어, 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성, 비대전된 아미노산 (즉, 방향족 아미노산 또는 대전된 아미노산 외에), 예를 들어, S, T, A, V, G 또는 C, 예를 들어, S, T, A, V 또는 G일 수 있다.
특정 구체예에서, 식 (I)의 변형된 아미노산 잔기는 항-HER2 항체의 중쇄 불변 영역의 C-말단에 위치한다. 일부 경우에서, 중쇄 불변 영역은 식 (II)의 서열을 포함한다:
Figure 112016123593442-pct00035
상기 식에서
FGly'는 식 (I)의 변형된 아미노산 잔기이고;
Z20은 프롤린 또는 알라닌 잔기이고 ((P/A)로도 표현될 수 있다);
Z30은 염기성 아미노산 (예를 들어, 아르기닌 (R), 그리고 리신 (K) 또는 히스티딘 (H), 보통 리신일 수도 있다), 또는 지방족 아미노산 (알라닌 (A), 글리신 (G), 류신 (L), 발린 (V), 아이소류신 (I), 또는 프롤린 (P), 예를 들어, A, G, L, V, 또는 I)이고;
X1은 존재하거나 존재하지 않을 수도 있으며, 존재할 때는, 임의의 아미노산, 예를 들어, 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성, 비대전된 아미노산 (즉, 방향족 아미노산 또는 대전된 아미노산 외에), 예를 들어, L, M, V, S 또는 T, 예를 들어, L, M 또는 V일 수 있고, 단 설파타제 모티프가 표적 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고;
X2 및 X3는 독립적으로 임의의 아미노산, 예를 들어, 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성, 비대전된 아미노산 (즉, 방향족 아미노산 또는 대전된 아미노산 외에), 예를 들어, S, T, A, V, G 또는 C, 예를 들어, S, T, A, V 또는 G일 수 있고;
서열은 아미노산 서열 QKSLSLSPGS (서열 번호:120)에 대하여 C-말단이고, 서열은 고유한, 야생형 중쇄 Ig 불변 영역에 존재하지 않는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 5 내지 10개의 아미노산을 포함할 수도 있다.
특정 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 Ig 중쇄의 C-말단에서, 예를 들어, 고유한 SLSLSPGK (서열 번호:122) 서열을 대신해서 서열 SLSLSPGSL(FGly')TPSRGS (서열 번호:121)를 포함한다.
특정 구체예에서, 식 (I)의 변형된 아미노산 잔기는 항-HER2 항체의 경쇄 불변 영역에 위치한다. 특정 구체예에서, 경쇄 불변 영역은 식 (II)의 서열을 포함한다:
Figure 112016123593442-pct00036
상기 식에서
FGly'는 식 (I)의 변형된 아미노산 잔기이고;
Z20은 프롤린 또는 알라닌 잔기이고 ((P/A)로도 표현될 수 있다);
Z30은 염기성 아미노산 (예를 들어, 아르기닌 (R), 그리고 리신 (K) 또는 히스티딘 (H), 보통 리신일 수도 있다), 또는 지방족 아미노산 (알라닌 (A), 글리신 (G), 류신 (L), 발린 (V), 아이소류신 (I), 또는 프롤린 (P), 예를 들어, A, G, L, V, 또는 I)이고;
X1은 존재하거나 존재하지 않을 수도 있으며, 존재할 때는, 임의의 아미노산, 예를 들어, 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성, 비대전된 아미노산 (즉, 방향족 아미노산 또는 대전된 아미노산 외에), 예를 들어, L, M, V, S 또는 T, 예를 들어, L, M 또는 V일 수 있고, 단 설파타제 모티프가 표적 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고;
X2 및 X3는 독립적으로 임의의 아미노산, 예를 들어, 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성, 비대전된 아미노산 (즉, 방향족 아미노산 또는 대전된 아미노산 외에), 예를 들어, S, T, A, V, G 또는 C, 예를 들어, S, T, A, V 또는 G일 수 있고;
서열은 아미노산 서열 KVDNAL (서열 번호:123)에 대하여 C-말단이고 및/또는 아미노산 서열 QSGNSQ (서열 번호:124)에 대하여 N-말단이다.
특정 구체예에서, 경쇄 불변 영역은 서열 KVDNAL(FGly')TPSRQSGNSQ (서열 번호:125)를 포함한다.
특정 구체예에서, 식 (I)의 변형된 아미노산 잔기는 항-HER2 항체의 중쇄 CH1 영역에 위치한다. 특정 구체예에서, 중쇄 CH1 영역은 식 (II)의 서열을 포함한다:
Figure 112016123593442-pct00037
상기 식에서
FGly'는 식 (I)의 변형된 아미노산 잔기이고;
Z20은 프롤린 또는 알라닌 잔기이고 ((P/A)로도 표현될 수 있다);
Z30은 염기성 아미노산 (예를 들어, 아르기닌 (R), 그리고 리신 (K) 또는 히스티딘 (H), 보통 리신일 수도 있다), 또는 지방족 아미노산 (알라닌 (A), 글리신 (G), 류신 (L), 발린 (V), 아이소류신 (I), 또는 프롤린 (P), 예를 들어, A, G, L, V, 또는 I)이고;
X1은 존재하거나 존재하지 않을 수도 있으며, 존재할 때는, 임의의 아미노산, 예를 들어, 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성, 비대전된 아미노산 (즉, 방향족 아미노산 또는 대전된 아미노산 외에), 예를 들어, L, M, V, S 또는 T, 예를 들어, L, M 또는 V일 수 있고, 단 설파타제 모티프가 표적 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고;
X2 및 X3는 독립적으로 임의의 아미노산, 예를 들어, 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성, 비대전된 아미노산 (즉, 방향족 아미노산 또는 대전된 아미노산 외에), 예를 들어, S, T, A, V, G 또는 C, 예를 들어, S, T, A, V 또는 G일 수 있고;
서열은 아미노산 서열 SWNSGA (서열 번호:126)에 대하여 C-말단이고 및/또는 아미노산 서열 GVHTFP (서열 번호:127)에 대하여 N-말단이다.
특정 구체예에서, 중쇄 CH1 영역은 서열 SWNSGAL(FGly')TPSRGVHTFP (서열 번호:128)를 포함한다.
변형 부위
상기 언급된 바와 같이, 항-HER2 항체의 아미노산 서열은 생체 내에서 (예를 들어, 세포에서 ald 태그-함유 단백질의 번역시) 또는 시험관 내에서 (예를 들어, 무세포 시스템에서 ald 태그-함유 단백질을 FGE와 접촉시킴으로써) FGE의 작용에 의해 FGly 잔기로 전환 (산화)될 수 있는 세린 또는 시스테인 잔기를 함유하는 설파타제 모티프를 포함하도록 변형된다. 본 개시물의 컨쥬게이트를 생성하는데 사용된 항-HER2 폴리펩타이드는 적어도 Ig 불변 영역, 예를 들어, Ig 중쇄 불변 영역 (예를 들어, 적어도 CH1 도메인; 적어도 CH1 및 CH2 도메인; CH1, CH2, 및 CH3 도메인; 또는 CH1, CH2, CH3, 및 CH4 도메인), 또는 Ig 경쇄 불변 영역을 포함한다. 이러한 Ig 폴리펩타이드는 본원에서 "표적 Ig 폴리펩타이드" 또는 "표적 항-HER2 항체" 또는 "표적 항-HER2 Ig 폴리펩타이드"로도 불린다.
설파타제 모티프가 도입되는 항-HER2 항체 내 부위는 어떠한 편리한 부위도 될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 일부 경우에서, 삽입, 결실, 치환 (대체), 또는 추가되는 (예를 들어, N- 또는 C-말단에) 아미노산 잔기의 수를 최소화하기 위해서, 표적 항-HER2 폴리펩타이드의 고유한 아미노산 서열의 변형의 정도가 최소화된다. 표적 항-HER2 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변형의 정도를 최소화하는 것은 항-HER2 기능 및/또는 구조에 대하여 이러한 변형이 가질 수도 있는 영향을 최소화할 수도 있다.
항-HER2 항체 중쇄 불변 영역은 어떠한 중쇄 아이소타입의 Ig 불변 영역, 비-자연 발생 Ig 중쇄 불변 영역 (공통 Ig 중쇄 불변 영역 포함)도 포함할 수 있다. Ig 불변 영역은 알데하이드 태그를 포함하도록 변형될 수 있으며, 알데하이드 태그는 Ig 불변 영역의 용매-접근 가능한 루프 영역 내에 또는 그것에 인접하게 존재한다. Ig 불변 영역은 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프의 아미노산 서열을 제공하기 위해서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개의 아미노산, 또는 16개 이상의 아미노산의 삽입 및/또는 치환에 의해 변형될 수 있다.
일부 경우에서, 알데하이드-태그된 항-HER2 항체는 알데하이드-태그된 Ig 중쇄 불변 영역 (예를 들어, 적어도 CH1 도메인; 적어도 CH1 및 CH2 도메인; CH1, CH2, 및 CH3 도메인; 또는 CH1, CH2, CH3, 및 CH4 도메인)을 포함한다. 알데하이드-태그된 Ig 중쇄 불변 영역은 IgA, IgM, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아이소타입 중쇄의 중쇄 불변 영역 서열 또는 FGly-변형된 Ig 폴리펩타이드를 생성하기 위해 FGE에 의해 변형될 수 있는 적어도 하나의 설파타제 모티프를 포함하도록 변형된, 그것들의 어떠한 동종이인자형(allotypic) 변이체, 예를 들어, 인간 중쇄 불변 영역 서열 또는 마우스 중쇄 불변 영역 서열, 하이브리드 중쇄 불변 영역, 합성 중쇄 불변 영역, 또는 공통 중쇄 불변 영역 서열, 등을 포함할 수 있다. Ig 중쇄의 동종이인자형 변이체는 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Jefferis and Lefranc (2009) MAbs 1:4 참조.
일부 경우에서, 알데하이드-태그된 항-HER2 항체는 알데하이드-태그된 Ig 경쇄 불변 영역을 포함한다. 알데하이드-태그된 Ig 경쇄 불변 영역은 FGly-변형된 항-HER2 항체 폴리펩타이드를 생성하기 위해 FGE에 의해 변형될 수 있는 적어도 하나의 설파타제 모티프를 포함하도록 변형된 카파 경쇄, 람다 경쇄의 불변 영역 서열, 예를 들어, 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역, 하이브리드 경쇄 불변 영역, 합성 경쇄 불변 영역, 또는 공통 경쇄 불변 영역 서열, 등을 포함할 수 있다. 예시의 불변 영역은 인간 감마 1 및 감마 3 영역을 포함한다. 설파타제 모티프를 제외하고, 변형된 불변 영역은 야생형 아미노산 서열을 가질 수도 있거나, 또는 야생형 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 가질 수도 있다.
일부 구체예에서, 설파타제 모티프는 Ig 폴리펩타이드 중쇄의 C-말단 이외의 위치에 있거나, 또는 이것에 부가된 위치에 있다. 상기 언급된 바와 같이, 단리된 알데하이드-태그된 항-HER2 폴리펩타이드는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형된 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있으며, 설파타제 모티프는 항-HER2 폴리펩타이드 중쇄 불변 영역의 표면-접근 가능한 루프 영역 내에 있거나 그것에 인접하다.
일부 경우에서, 표적 항-HER2 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 122-127; 2) 아미노산 137-143; 3) 아미노산 155-158; 4) 아미노산 163-170; 5) 아미노산 163-183; 6) 아미노산 179-183; 7) 아미노산 190-192; 8) 아미노산 200-202; 9) 아미노산 199-202; 10) 아미노산 208-212; 11) 아미노산 220-241; 12) 아미노산 247-251; 13) 아미노산 257-261; 14) 아미노산 269-277; 15) 아미노산 271-277; 16) 아미노산 284-285; 17) 아미노산 284-292; 18) 아미노산 289-291; 19) 아미노산 299-303; 20) 아미노산 309-313; 21) 아미노산 320-322; 22) 아미노산 329-335; 23) 아미노산 341-349; 24) 아미노산 342-348; 25) 아미노산 356-365; 26) 아미노산 377-381; 27) 아미노산 388-394; 28) 아미노산 398-407; 29) 아미노산 433-451; 및 30) 아미노산 446-451 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 도 17B에서 도시된 바와 같이 인간 IgG1의 아미노산 넘버링을 근거로 한다.
일부 경우에서, 표적 항-HER2 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11 (인간 IgG1 불변 영역; 17B에서 도시된 서열)에서 나타난 바와 같이 인간 IgG1의 아미노산 넘버링을 근거로 한다.
IgG1 중쇄의 예시의 표면-접근 가능한 루프 영역은 도 17A 및 17B에서 도시된 바와 같이 1) ASTKGP (서열 번호:129); 2) KSTSGGT (서열 번호:130); 3) PEPV (서열 번호:131); 4) NSGALTSG (서열 번호:132); 5) NSGALTSGVHTFPAVLQSSGL (서열 번호:133); 6) QSSGL (서열 번호:134); 7) VTV; 8) QTY; 9) TQTY (서열 번호:135); 10) HKPSN (서열 번호:136); 11) EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG (서열 번호:137); 12) FPPKP (서열 번호:138); 13) ISRTP (서열 번호:139); 14) DVSHEDPEV (서열 번호:140); 15) SHEDPEV (서열 번호:141); 16) DG; 17) DGVEVHNAK (서열 번호:142); 18) HNA; 19) QYNST (서열 번호:143); 20) VLTVL (서열 번호:144); 21) GKE; 22) NKALPAP (서열 번호:145); 23) SKAKGQPRE (서열 번호:146); 24) KAKGQPR (서열 번호:147); 25) PPSRKELTKN (서열 번호:148); 26) YPSDI (서열 번호:149); 27) NGQPENN (서열 번호:150); 28) TPPVLDSDGS (서열 번호:151); 29) HEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호:152); 및 30) SLSPGK (서열 번호:153)를 포함한다.
일부 경우에서, 표적 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 13-24; 3) 아미노산 33-37; 4) 아미노산 43-54; 5) 아미노산 58-63; 6) 아미노산 69-71; 7) 아미노산 78-80; 8) 87-89; 9) 아미노산 95-96; 10) 114-118; 11) 122-126; 12) 134-136; 13) 144-152; 14) 159-167; 15) 175-176; 16) 184-188; 17) 195-197; 18) 204-210; 19) 216-224; 20) 231-233; 21) 237-241; 22) 252-256; 23) 263-269; 24) 273-282; 25) 아미노산 299-302 중 하나 이상에 해당하는 IgG2 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:12에서 제시된 아미노산 서열 (인간 IgG2; 도 17B에서도 도시됨)을 근거로 한다.
IgG2 중쇄의 예시의 표면-접근 가능한 루프 영역은 도 17B에서 도시된 바와 같이 1) ASTKGP (서열 번호:129); 2) PCSRSTSESTAA (서열 번호:154); 3) FPEPV (서열 번호:155); 4) SGALTSGVHTFP (서열 번호:156); 5) QSSGLY (서열 번호:157); 6) VTV; 7) TQT; 8) HKP; 9) DK; 10) VAGPS (서열 번호:158); 11) FPPKP (서열 번호:138); 12) RTP; 13) DVSHEDPEV (서열 번호:140); 14) DGVEVHNAK (서열 번호:142); 15) FN; 16) VLTVV (서열 번호:159); 17) GKE; 18) NKGLPAP (서열 번호:160); 19) SKTKGQPRE (서열 번호:161); 20) PPS; 21) MTKNQ (서열 번호:162); 22) YPSDI (서열 번호:149); 23) NGQPENN (서열 번호:150); 24) TPPMLDSDGS (서열 번호:163); 25) GNVF (서열 번호:164); 및 26) HEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호:152)을 포함한다.
일부 경우에서, 표적 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 13-22; 3) 아미노산 33-37; 4) 아미노산 43-61; 5) 아미노산 71; 6) 아미노산 78-80; 7) 87-91; 8) 아미노산 97-106; 9) 111-115; 10) 147-167; 11) 173-177; 16) 185-187; 13) 195-203; 14) 210-218; 15) 226-227; 16) 238-239; 17) 246-248; 18) 255-261; 19) 267-275; 20) 282-291; 21) 아미노산 303-307; 22) 아미노산 313-320; 23) 아미노산 324-333; 24) 아미노산 350-352; 25) 아미노산 359-365; 및 26) 아미노산 372-377 중 하나 이상에 해당하는 IgG3 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:13에서 제시된 아미노산 서열 (인간 IgG3; 도 17B에서도 도시됨)의 넘버링을 근거로 한다.
IgG3 중쇄의 예시의 표면-접근 가능한 루프 영역은 도 17B에서 나타난 바와 같이 1) ASTKGP (서열 번호:129); 2) PCSRSTSGGT (서열 번호:165); 3) FPEPV (서열 번호:155); 4) SGALTSGVHTFPAVLQSSG (서열 번호:166); 5) V; 6) TQT; 7) HKPSN (서열 번호:136); 8) RVELKTPLGD (서열 번호:167); 9) CPRCPKP (서열 번호:168); 10) PKSCDTPPPCPRCPAPELLGG (서열 번호:169); 11) FPPKP (서열 번호:138); 12) RTP; 13) DVSHEDPEV (서열 번호:140); 14) DGVEVHNAK (서열 번호:142); 15) YN; 16) VL; 17) GKE; 18) NKALPAP (서열 번호:145); 19) SKTKGQPRE (서열 번호:161); 20) PPSREEMTKN (서열 번호:170); 21) YPSDI (서열 번호:149); 22) SSGQPENN (서열 번호:171); 23) TPPMLDSDGS (서열 번호:163); 24) GNI; 25) HEALHNR (서열 번호:172); 및 26) SLSPGK (서열 번호:153)를 포함한다.
일부 경우에서, 표적 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-5; 2) 아미노산 12-23; 3) 아미노산 32-36; 4) 아미노산 42-53; 5) 아미노산 57-62; 6) 아미노산 68-70; 7) 아미노산 77-79; 8) 아미노산 86-88; 9) 아미노산 94-95; 10) 아미노산 101-102; 11) 아미노산 108-118; 12) 아미노산 122-126; 13) 아미노산 134-136; 14) 아미노산 144-152; 15) 아미노산 159-167; 16) 아미노산 175-176; 17) 아미노산 185-186; 18) 아미노산 196-198; 19) 아미노산 205-211; 20) 아미노산 217-226; 21) 아미노산 232-241; 22) 아미노산 253-257; 23) 아미노산 264-265; 24) 269-270; 25) 아미노산 274-283; 26) 아미노산 300-303; 27) 아미노산 399-417 중 하나 이상에 해당하는 IgG4 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:14에서 제시된 아미노산 서열 (인간 IgG4; 도 17B에서도 도시됨)의 넘버링을 근거로 한다.
IgG4 중쇄의 예시의 표면-접근 가능한 루프 영역은 도 17B에서 나타난 바와 같이 1) STKGP (서열 번호:173); 2) PCSRSTSESTAA (서열 번호:154); 3) FPEPV (서열 번호:155); 4) SGALTSGVHTFP (서열 번호:156); 5) QSSGLY (서열 번호:157); 6) VTV; 7) TKT; 8) HKP; 9) DK; 10) YG; 11) CPAPEFLGGPS (서열 번호:174); 12) FPPKP (서열 번호:175); 13) RTP; 14) DVSQEDPEV (서열 번호:176); 15) DGVEVHNAK (서열 번호:142); 16) FN; 17) VL; 18) GKE; 19) NKGLPSS (서열 번호:177); 20) SKAKGQPREP (서열 번호:178); 21) PPSQEEMTKN (서열 번호:179); 22) YPSDI (서열 번호:149); 23) NG; 24) NN; 25) TPPVLDSDGS (서열 번호:151); 26) GNVF (서열 번호:164); 및 27) HEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열 번호:152)를 포함한다.
일부 경우에서, 표적 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-13; 2) 아미노산 17-21; 3) 아미노산 28-32; 4) 아미노산 44-54; 5) 아미노산 60-66; 6) 아미노산 73-76; 7) 아미노산 80-82; 8) 아미노산 90-91; 9) 아미노산 123-125; 10) 아미노산 130-133; 11) 아미노산 138-142; 12) 아미노산 151-158; 13) 아미노산 165-174; 14) 아미노산 181-184; 15) 아미노산 192-195; 16) 아미노산 199; 17) 아미노산 209-210; 18) 아미노산 222-245; 19) 아미노산 252-256; 20) 아미노산 266-276; 21) 아미노산 293-294; 22) 아미노산 301-304; 23) 아미노산 317-320; 24) 아미노산 329-353 중 하나 이상에 해당하는 IgA 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:15에서 제시된 아미노산 서열 (인간 IgA; 도 17B에서도 도시됨)의 넘버링을 근거로 한다.
IgA 중쇄의 예시의 표면-접근 가능한 루프 영역은 도 17B에서 나타난 바와 같이 1) ASPTSPKVFPLSL (서열 번호:180); 2) QPDGN (서열 번호:181); 3) VQGFFPQEPL (서열 번호:182); 4) SGQGVTARNFP (서열 번호:183); 5) SGDLYTT (서열 번호:184); 6) PATQ (서열 번호:185); 7) GKS; 8) YT; 9) CHP; 10) HRPA (서열 번호:186); 11) LLGSE (서열 번호:187); 12) GLRDASGV (서열 번호:188); 13) SSGKSAVQGP (서열 번호:189); 14) GCYS (서열 번호:190); 15) CAEP (서열 번호:191); 16) PE; 17) SGNTFRPEVHLLPPPSEELALNEL (서열 번호:192); 18) ARGFS (서열 번호:193); 19) QGSQELPREKY (서열 번호:194); 20) AV; 21) AAED (서열 번호:195); 22) HEAL (서열 번호:196); 및 23) IDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY (서열 번호:197)를 포함한다.
Ig 중쇄의 이러한 변형 부위의 이 아미노산 서열들 중 하나 이상의 내에서 또는 그것들에 근접한 설파타제 모티프가 제공될 수 있다. 예를 들어, Ig 중쇄 폴리펩타이드는 이 변형 부위들에 대하여 인접한 N-말단에서 및/또는 인접한 C-말단에서 설파타제 모티프를 제공하도록 이 아미노산 서열들 중 하나 이상에서 변형될 수 있다 (예를 들어, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다). 대안으로 또는 이에 더하여, Ig 중쇄 폴리펩타이드는 Ig 중쇄 변형 부위들 중 어떠한 두 개의 잔기 사이에서도 설파타제 모티프를 제공하도록 이 아미노산 서열들 중 하나 이상에서 변형될 수 있다 (예를 들어, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다). 일부 구체예에서, Ig 중쇄 폴리펩타이드는 두 개의 모티프를 포함하도록 변형될 수도 있는데, 이것들은 서로 인접할 수도 있거나, 또는 하나, 또는 둘, 셋, 넷 또는 그 이상 (예를 들어, 약 1 내지 약 25, 약 25 내지 약 50, 또는 약 50 내지 약 100개, 또는 그 이상)의 아미노산으로 분리될 수도 있다. 대안으로 또는 이에 더하여, 고유한 아미노산 서열이 설파타제 모티프 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기를 제공하는 경우, 변형 부위에서 설파타제 모티프를 제공하기 위해서 Ig 중쇄 폴리펩타이드 아미노산 서열의 변형 부위의 선택된 아미노산 잔기가 변형될 수 있다 (예를 들어, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다).
따라서 표면-접근 가능한 루프 영역의 아미노산 서열은 설파타제 모티프를 제공하도록 변형될 수 있으며, 변형은 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형이 CH1 도메인에서 이루어지는 경우, 예를 들어, 설파타제 모티프가 서열 LCTPSR (서열 번호:97)을 갖도록 NSGALTSG (서열 번호:132) 서열의 "TS" 잔기가 "CTPSR" (서열 번호:199)로 대체되는 경우, 표면-접근 가능한 루프 영역은 아미노산 서열 NSGALTSG (서열 번호:132)을 가질 수 있고, 및 알데하이드-태그된 서열은, 예를 들어, NSGALCTPSRG (서열 번호:198)일 수 있다. 또 다른 예로서, 변형이 CH2 도메인에서 이루어지는 경우, 예를 들어, 설파타제 모티프가 서열 LCTPSR (서열 번호:97)을 갖도록 NKALPAP (서열 번호:145) 서열의 "KAL" 잔기가 "LCTPSR" (서열 번호:97)로 대체되는 경우, 표면-접근 가능한 루프 영역은 아미노산 서열 NKALPAP (서열 번호:145)을 가질 수 있고, 알데하이드-태그된 서열은, 예를 들어, NLCTPSRAP (서열 번호:200)일 수 있다. 또 다른 예로서, 변형이 CH2/CH3 도메인에서 이루어지는 경우, 예를 들어, 설파타제 모티프가 서열 LCTPSR (서열 번호:97)을 갖도록 KAKGQPR (서열 번호:147) 서열의 "GQP" 잔기가 "LCTPS" (서열 번호:202)로 대체되는 경우, 표면-접근 가능한 루프 영역은 아미노산 서열 KAKGQPR (서열 번호:147)을 가질 수 있고, 알데하이드-태그된 서열은, 예를 들어, KAKGLCTPSR (서열 번호:201)일 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 단리된 알데하이드-태그된 항-HER2 Ig 폴리펩타이드는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형된 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있으며, 설파타제 모티프는 Ig 폴리펩타이드 경쇄 불변 영역의 표면-접근 가능한 루프 영역 내에 있거나 또는 그것에 인접하다. 경쇄 불변 영역의 표면-접근 가능한 루프 영역의 예는 도 17A 및 17C에서 제공된다.
일부 경우에서, 표적 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 130-135; 2) 아미노산 141-143; 3) 아미노산 150; 4) 아미노산 162-166; 5) 아미노산 163-166; 6) 아미노산 173-180; 7) 아미노산 186-194; 8) 아미노산 211-212; 9) 아미노산 220-225; 10) 아미노산 233-236 중 하나 이상에 해당하는 Ig 경쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 도 17C에서 도시된 바와 같이 인간 카파 경쇄의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 표적 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 경쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다.
Ig 경쇄 (예를 들어, 인간 카파 경쇄)의 예시의 표면-접근 가능한 루프 영역은 도 17A 및 17C에서 나타난 바와 같이 1) RTVAAP (서열 번호:203); 2) PPS; 3) Gly (예를 들어, 도 17C에서 도시된 인간 카파 경쇄 서열의 위치 150에서 Gly 참조); 4) YPREA (서열 번호:204); 5) PREA (서열 번호:205); 6) DNALQSGN (서열 번호:206); 7) TEQDSKDST (서열 번호:207); 8) HK; 9) HQGLSS (서열 번호:208); 및 10) RGEC (서열 번호:209)를 포함한다.
Ig 람다 경쇄의 예시의 표면-접근 가능한 루프 영역은 도 17C에서 나타난 바와 같이 QPKAAP (서열 번호:210), PPS, NK, DFYPGAV (서열 번호:211), DSSPVKAG (서열 번호:212), TTP, SN, HKS, EG, 및 APTECS (서열 번호:213)를 포함한다.
일부 경우에서, 표적 면역글로불린은 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 121-22; 4) 아미노산 31-37; 5) 아미노산 44-51; 6) 아미노산 55-57; 7) 아미노산 61-62; 8) 아미노산 81-83; 9) 아미노산 91-92; 10) 아미노산 102-105 중 하나 이상에 해당하는 래트 Ig 경쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:19에서 제시된 래트 경쇄 (도 17C에서 도시된 서열)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다.
일부 경우에서, 설파타제 모티프는 항-HER2 중쇄 불변 영역의 CH1 영역으로 도입된다. 일부 경우에서, 설파타제 모티프는 항-HER2 중쇄의 C-말단에서 또는 그것의 근처에서 (예를 들어, 그것의 1 내지 10개의 아미노산 내에서) 도입된다. 일부 경우에서, 설파타제 모티프는 경쇄 불변 영역에서 도입된다.
일부 경우에서, 설파타제 모티프는 항-HER2 중쇄 불변 영역의 CH1 영역으로, 예를 들어, 도 6A에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-219 내에서 도입된다. 예를 들어, 일부 경우에서, 설파타제 모티프는 아미노산 서열: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE (서열 번호:214)로 도입된다. 예를 들어, 이 구체예들 중 일부에서, 아미노산 서열 GALTSGVH (서열 번호:215)은 GALCTPSRGVH (서열 번호:216)로 변형되며, 설파타제 모티프는 LCTPSR (서열 번호:97)이다. 한 비-제한 구체예에서, 항-HER2 항체는 설파타제 모티프를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하며, 중쇄 불변 영역은 도 6C에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, 예를 들어, 중쇄 불변 영역은 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453을 포함한다.
일부 경우에서, 설파타제 모티프는 항-HER2 중쇄의 C-말단에서 또는 그것의 근처에서 도입되고, 예를 들어, 설파타제 모티프는 항-HER2 중쇄의 C-말단의 1개의 아미노산, 2개의 아미노산 (aa), 3개의 aa, 4개의 aa, 5개의 aa, 6개의 aa, 7개의 aa, 8개의 aa, 9개의 aa, 또는 10개의 aa 내에서 도입된다. 한 비-제한 예로서, 항-HER2 중쇄의 C-말단 리신 잔기는 아미노산 서열 SLCTPSRGS (서열 번호:217)로 대체될 수 있다. 한 비-제한 구체예에서, 항-HER2 항체는 설파타제 모티프를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하며, 중쇄 불변 영역은 도 6D에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, 예를 들어, 중쇄 불변 영역은 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458을 포함한다.
일부 경우에서, 설파타제 모티프는 항-HER2 항체의 경쇄의 불변 영역으로 도입된다. 한 비-제한 예로서, 일부 경우에서, 설파타제 모티프는 항-HER2 항체의 경쇄의 불변 영역으로 도입되며, 설파타제 모티프는 KVDNAL (서열 번호:123)에 대한 C-말단에 있고, 및/또는 QSGNSQ (서열 번호:124)에 대한 N-말단에 있다. 예를 들어, 일부 경우에서, 설파타제 모티프는 LCTPSR (서열 번호:97)이고, 항-HER2 경쇄는 아미노산 서열 KVDNALLCTPSRQSGNSQ (서열 번호:218)를 포함한다. 한 비-제한 예로서, 설파타제 모티프를 포함하는 항-HER2 경쇄는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, 예를 들어, 경쇄 불변 영역은 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219를 포함한다.
예시의 항- HER2 항체
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 IV 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 511-636 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 529-625 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 561-625 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 DTYIH (VH CDR1; 서열 번호:20), RIYPTNGYTRYADSVKG (VH CDR2; 서열 번호:21), 및 WGGDGFYAMDV (VH CDR3; 서열 번호:22)로부터 선택된 중쇄 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 IV 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 511-636 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 529-625 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 561-625 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 RASQDVNTAVA (VL CDR1; 서열 번호:23), SASFLES (VL CDR2; 서열 번호:24), 및 QQHYTTPPT (VL CDR3; 서열 번호:25)로부터 선택된 경쇄 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 122-127; 2) 아미노산 137-143; 3) 아미노산 155-158; 4) 아미노산 163-170; 5) 아미노산 163-183; 6) 아미노산 179-183; 7) 아미노산 190-192; 8) 아미노산 200-202; 9) 아미노산 199-202; 10) 아미노산 208-212; 11) 아미노산 220-241; 12) 아미노산 247-251; 13) 아미노산 257-261; 14) 아미노산 269-277; 15) 아미노산 271-277; 16) 아미노산 284-285; 17) 아미노산 284-292; 18) 아미노산 289-291; 19) 아미노산 299-303; 20) 아미노산 309-313; 21) 아미노산 320-322; 22) 아미노산 329-335; 23) 아미노산 341-349; 24) 아미노산 342-348; 25) 아미노산 356-365; 26) 아미노산 377-381; 27) 아미노산 388-394; 28) 아미노산 398-407; 29) 아미노산 433-451; 및 30) 아미노산 446-451 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 도 17B에서 도시된 바와 같이 인간 IgG1의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 IV 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 511-636 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 529-625 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 561-625 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 VH CDR DTYIH (VH CDR1; 서열 번호:20), RIYPTNGYTRYADSVKG (VH CDR2; 서열 번호:21), 및 WGGDGFYAMDV (VH CDR3; 서열 번호:22)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 IV 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 511-636 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 529-625 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 561-625 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 VL CDR RASQDVNTAVA (VL CDR1; 서열 번호:23), SASFLES (VL CDR2; 서열 번호:24), 및 QQHYTTPPT (VL CDR3; 서열 번호:25)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 기반으로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 IV 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 511-636 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 529-625 내에서; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 561-625 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 VH CDR DTYIH (VH CDR1; 서열 번호:20), RIYPTNGYTRYADSVKG (VH CDR2; 서열 번호:21), 및 WGGDGFYAMDV (VH CDR3; 서열 번호:22) 및 VL CDR RASQDVNTAVA (VL CDR1; 서열 번호:23), SASFLES (VL CDR2; 서열 번호:24), 및 QQHYTTPPT (VL CDR3; 서열 번호:25)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 VH CDR DTYIH (VH CDR1; 서열 번호:20), RIYPTNGYTRYADSVKG (VH CDR2; 서열 번호:21), 및 WGGDGFYAMDV (VH CDR3; 서열 번호:22)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 VL CDR RASQDVNTAVA (VL CDR1; 서열 번호:23), SASFLES (VL CDR2; 서열 번호:24), 및 QQHYTTPPT (VL CDR3; 서열 번호:25)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 VH CDR DTYIH (VH CDR1; 서열 번호:20), RIYPTNGYTRYADSVKG (VH CDR2; 서열 번호:21), 및 WGGDGFYAMDV (VH CDR3; 서열 번호:22) 및 VL CDR RASQDVNTAVA (VL CDR1; 서열 번호:23), SASFLES (VL CDR2; 서열 번호:24), 및 QQHYTTPPT (VL CDR3; 서열 번호:25)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 다음 아미노산 서열을 포함하는 항-HER2 VH 영역에 존재하는 VH CDR을 포함한다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSS (서열 번호:2). 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 다음 아미노산 서열을 포함하는 항-HER2 VL 영역에 존재하는 VL CDR을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT (서열 번호:3). 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSS (서열 번호:2)에 존재하는 VH CDR 및 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT (서열 번호:3)에 존재하는 VL CDR을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 VH 아미노산 서열 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSS (서열 번호:2)를 포함한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 VL 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT (서열 번호:3)를 포함한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 VH 아미노산 서열 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSS (서열 번호:2)를 포함하고; VL 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT (서열 번호:3)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다.
일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고; 도 6E에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고; 도 6E에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
추가의 예시의 항- HER2 항체
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2에서 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 II 내에서 에피토프; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 218-341 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 GFTFTDYTMX (여기에서 X는 D 또는 S이다) (VH CDR1; 서열 번호:26); DVNPNSGGSIYNQRFKG (VH CDR2; 서열 번호:27); 및 NLGPSFYFDY (VH CDR3; 서열 번호:28)로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2에서 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 II 내에서 에피토프; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 218-341 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 KASQDVSIGVA (VL CDR1; 서열 번호:29); SASYX1X2X3 (여기에서 X1은 R 또는 L이고, X2는 Y 또는 E이고, X3는 T 또는 S이다) (VL CDR2; 서열 번호:30); 및 QQYYIYPYT (VL CDR3; 서열 번호:31)로부터 선택된 경쇄 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2에서 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 II 내에서 에피토프; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 218-341 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 중쇄 CDR GFTFTDYTMX (여기에서 X는 D 또는 S이다) (VH CDR1; 서열 번호:26); DVNPNSGGSIYNQRFKG (VH CDR2; 서열 번호:27); 및 NLGPSFYFDY (VH CDR3; 서열 번호:28)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2에서 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 II 내에서 에피토프; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 218-341 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 경쇄 CDR KASQDVSIGVA (VL CDR1; 서열 번호:29); SASYX1X2X3 (여기에서 X1은 R 또는 L이고, X2는 Y 또는 E이고, X3는 T 또는 S이다) (VL CDR2; 서열 번호:30); 및 QQYYIYPYT (VL CDR3; 서열 번호:31)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 HER2에서 에피토프 (예를 들어, HER2의 도메인 II 내에서 에피토프; 예를 들어, 도 4에서 도시된 HER2 아미노산 서열의 아미노산 218-341 내에서 에피토프)에 결합에 대하여 중쇄 CDR GFTFTDYTMX (여기에서 X는 D 또는 S이다) (VH CDR1; 서열 번호:26); DVNPNSGGSIYNQRFKG (VH CDR2; 서열 번호:27); 및 NLGPSFYFDY (VH CDR3; 서열 번호:28)를 포함하고; 경쇄 CDR KASQDVSIGVA (VL CDR1; 서열 번호:29); SASYX1X2X3 (여기에서 X1은 R 또는 L이고, X2는 Y 또는 E이고, X3는 T 또는 S이다) (VL CDR2; 서열 번호:30); 및 QQYYIYPYT (VL CDR3; 서열 번호:31)를 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 중쇄 CDR GFTFTDYTMX (여기에서 X는 D 또는 S이다) (VH CDR1; 서열 번호:26); DVNPNSGGSIYNQRFKG (VH CDR2; 서열 번호:27); 및 NLGPSFYFDY (VH CDR3; 서열 번호:28)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 경쇄 CDR KASQDVSIGVA (VL CDR1; 서열 번호:39); SASYX1X2X3 (여기에서 X1은 R 또는 L이고, X2는 Y 또는 E이고, X3는 T 또는 S이다) (VL CDR2; 서열 번호:30); 및 QQYYIYPYT (VL CDR3; 서열 번호:31)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 중쇄 CDR GFTFTDYTMX (여기에서 X는 D 또는 S이다) (VH CDR1; 서열 번호:26); DVNPNSGGSIYNQRFKG (VH CDR2; 서열 번호:27); 및 NLGPSFYFDY (VH CDR3; 서열 번호:28)를 포함하고; 경쇄 CDR KASQDVSIGVA (VL CDR1; 서열 번호:29); SASYX1X2X3 (여기에서 X1은 R 또는 L이고, X2는 Y 또는 E이고, X3는 T 또는 S이다) (VL CDR2; 서열 번호:30); 및 QQYYIYPYT (VL CDR3; 서열 번호:31)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 중쇄 CDR GFTFTDYTMD (VH CDR1; 서열 번호:219); DVNPNSGGSIYNQRFKG (VH CDR2; 서열 번호:27); 및 NLGPSFYFDY (VH CDR3; 서열 번호:28)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 경쇄 CDR KASQDVSIGVA (VL CDR1; 서열 번호:29); SASYRYT (VL CDR2; 서열 번호:220); 및 QQYYIYPYT (VL CDR3; 서열 번호:31)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 중쇄 CDR GFTFTDYTMD (VH CDR1; 서열 번호:219); DVNPNSGGSIYNQRFKG (VH CDR2; 서열 번호:27); 및 NLGPSFYFDY (VH CDR3; 서열 번호:28)를 포함하고; 경쇄 CDR KASQDVSIGVA (VL CDR1; 서열 번호:29); SASYRYT (VL CDR2; 서열 번호:220); 및 QQYYIYPYT (VL CDR3; 서열 번호:30)를 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 다음 아미노산 서열을 포함하는 항-HER2 VH 영역에 존재하는 VH CDR을 포함한다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32). 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 다음 아미노산 서열을 포함하는 항-HER2 VL 영역에 존재하는 VL CDR을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (서열 번호:33). 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 아미노산 서열, EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32)를 포함하는 항-HER2 VH 영역에 존재하는 VH CDR을 포함하고; 아미노산 서열, DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (서열 번호:33)를 포함하는 항-HER2 VL 영역에 존재하는 VL CDR을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 아미노산 서열 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32)를 포함하는 VH 여역을 포함한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (서열 번호:33)을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 아미노산 서열 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32)를 포함하는 VH 영역을 포함하고; 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (서열 번호:33)을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 아미노산 서열 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32)를 포함하는 VH 영역을 포함하며, 중쇄 불변 영역은 FGly 잔기를 포함하도록 변형된다. 일부 경우에서, 적합한 항-HER2 항체는 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (서열 번호:33)를 포함하는 VL 영역을 포함하며, 경쇄 불변 영역은 FGly 잔기를 포함하도록 변형된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 인간화된다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 16-22; 3) 아미노산 34-47; 4) 아미노산 42-49; 5) 아미노산 42-62; 6) 아미노산 34-37; 7) 아미노산 69-71; 8) 아미노산 79-81; 9) 아미노산 78-81; 10) 아미노산 87-91; 11) 아미노산 100-121; 12) 아미노산 127-131; 13) 아미노산 137-141; 14) 아미노산 149-157; 15) 아미노산 151-157; 16) 아미노산 164-165; 17) 아미노산 164-172; 18) 아미노산 169-171; 19) 아미노산 179-183; 20) 아미노산 189-193; 21) 아미노산 200-202; 22) 아미노산 209-215; 23) 아미노산 221-229; 24) 아미노산 22-228; 25) 아미노산 236-245; 26) 아미노산 217-261; 27) 아미노산 268-274; 28) 아미노산 278-287; 29) 아미노산 313-331; 및 30) 아미노산 324-331 중 하나 이상에 해당하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:11에서 나타난 인간 IgG1 (도 17B에서 도시된 인간 IgG1 불변 영역)의 아미노산 넘버링을 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6C에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-453에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6D에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 121-458에서 나타난 바와 같이 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 상기 기술된 바와 같이 설파타제 모티프를 포함하도록 변형되며, 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환을 포함하고; 예를 들어, 설파타제 모티프는 1) 아미노산 1-6; 2) 아미노산 12-14; 3) 아미노산 21; 4) 아미노산 33-37; 5) 아미노산 34-37; 6) 아미노산 44-51; 7) 아미노산 57-65; 8) 아미노산 83-83; 9) 아미노산 91-96; 10) 아미노산 104-107 중 하나 이상에 해당하는 Ig 카파 불변 영역의 영역 내에 있거나, 또는 그것에 인접하며; 아미노산 넘버링은 서열 번호:9 (인간 카파 경쇄; 도 17C에서 도시된 아미노산 서열)를 근거로 한다. 일부 경우에서, 항-HER2 항체는 도 6E에서 도시된 아미노산 서열의 아미노산 108-219에서 나타난 바와 같이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
폴리펩타이드에 컨쥬게이션을 위한 약물
본 개시물은 약물-폴리펩타이드 컨쥬게이트를 제공한다. 약물의 예는 소분자 약물, 예를 들어, 암 화학치료제를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드가 종양 세포에 대하여 특이성을 가지는 항체 (또는 이것의 단편)인 경우, 항체는 변형된 아미노산을 포함하도록 본원에서 기술된 바와 같이 변형될 수 있으며, 이것은 추후 암 화학치료제, 예를 들어, 미소관에 영향을 미치는 약제에 컨쥬게이션될 수 있다. 특정 구체예에서, 약물은 항증식성 활성을 가지는 미소관에 영향을 미치는 약제, 예를 들어, 메이탄시노이드이다. 특정 구체예에서, 약물은 메이탄시노이드이며, 다음과 같은 구조를 가진다:
Figure 112016123593442-pct00038
상기 식에서
Figure 112016123593442-pct00039
은 식 (I)에서 메이탄시노이드 및 링커, L 사이의 부착점을 나타낸다. "부착점"은
Figure 112016123593442-pct00040
부호가 식 (I)에서 메이탄시노이드의 N 및 링커, L 사이의 결합을 나타낸다는 것을 의미한다. 예를 들어, 식 (I)에서, W1은 메이탄시노이드, 예를 들어, 상기 구조의 메이탄시노이드이며,
Figure 112016123593442-pct00041
은 메이탄시노이드 및 링커, L 사이의 부착점을 나타낸다.
특정 구체예에서, L1은 히드라지닐-피롤로 모이어티에 부착된다 (예를 들어, 상기 식 (I)에서 나타난 바와 같다). 특정 구체예에서, L2는, 존재하면, W1 (메이탄시노이드)에 부착된다. 특정 구체예에서, L3, 존재하면, W1 (메이탄시노이드)에 부착된다. 특정 구체예에서, L4는, 존재하면, W1 (메이탄시노이드)에 부착된다.
상기 기술된 바와 같이, 특정 구체예에서, L1은 히드라지닐-피롤로 모이어티에 부착된다 (예를 들어, 상기 식 (I)에서 나타난 바와 같다). 이와 같이, 특정 구체예에서, T1은 히드라지닐-피롤로 모이어티에 부착된다 (예를 들어, 상기 식 (I)에서 나타난 바와 같다). 특정 구체예에서, Z1은 W1 (메이탄시노이드)에 부착된다. 특정 구체예에서, L2는, 존재하면, W1 (메이탄시노이드)에 부착된다. 이와 같이, 특정 구체예에서, T2는, 존재하면, W1 (메이탄시노이드)에 부착되거나, 또는 Z2는, 존재하면, W1 (메이탄시노이드)에 부착된다. 특정 구체예에서, L3는, 존재하면, W1 (메이탄시노이드)에 부착된다. 이와 같이, 특정 구체예에서, T3는, 존재하면, W1 (메이탄시노이드)에 부착되거나, 또는 Z3는, 존재하면, W1 (메이탄시노이드)에 부착된다. 특정 구체예에서, L4는, 존재하면, W1 (메이탄시노이드)에 부착된다. 이와 같이, 특정 구체예에서, T4는, 존재하면, W1 (메이탄시노이드)에 부착되거나, 또는 Z4는, 존재하면, W1 (메이탄시노이드)에 부착된다.
본 개시물의 구체예는 폴리펩타이드 (예를 들어, 항-HER2 항체)가 하나 이상의 약물 모이어티 (예를 들어, 메이탄시노이드), 예를 들어, 2개의 약물 모이어티, 3개의 약물 모이어티, 4개의 약물 모이어티, 5개의 약물 모이어티, 6개의 약물 모이어티, 7개의 약물 모이어티, 8개의 약물 모이어티, 9개의 약물 모이어티, 또는 10개의 또는 그 이상의 약물 모이어티에 컨쥬게이션된 컨쥬게이트를 포함한다. 약물 모이어티는 본원에서 기술된 바와 같이 폴리펩타이드의 하나 이상의 부위에서 폴리펩타이드에 컨쥬게이션될 수 있다. 특정 구체예에서, 컨쥬게이트는 0.1 내지 10, 또는 0.5 내지 10, 또는 1 내지 10, 예를 들어, 1 내지 9, 또는 1 내지 8, 또는 1 내지 7, 또는 1 내지 6, 또는 1 내지 5, 또는 1 내지 4, 또는 1 내지 3, 또는 1 내지 2의 범위 내의 평균 약물-대-항체 비율 (DAR) (몰 비율)을 가진다. 특정 구체예에서, 컨쥬게이트는 1 내지 2, 예를 들어, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2의 평균 DAR을 가진다. 특정 구체예에서, 컨쥬게이트는 1.7의 평균 DAR을 가진다. 특정 구체예에서, 컨쥬게이트는 3 내지 4, 예를 들어, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 또는 4의 평균 DAR를 가진다. 특정 구체예에서, 컨쥬게이트는 3.4의 평균 DAR을 가진다. 평균은 산술 평균을 의미한다.
제형화
본 개시물의 컨쥬게이트 (항체 컨쥬게이트 포함)는 다양한 다른 방법으로 제형화될 수 있다. 일반적으로, 컨쥬게이트가 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트이면, 컨쥬게이트는 폴리펩타이드에 컨쥬게이션되는 약물, 처리되는 조건, 및 사용되는 투여 경로에 호환 가능한 방식으로 제형화된다.
컨쥬게이트 (예를 들어, 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트)는 어떠한 적합한 형태, 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로서 제공될 수 있고, 어떠한 적합한 투여 경로, 예를 들어, 경구, 국소적 또는 비경구 투여를 위해 제형화될 수도 있다. 컨쥬게이트가 주사 가능한 액체로서 제공되는 경우 (예를 들어, 상기 구체예에서 그것들이 정맥 내로 또는 조직에 직접적으로 투여되는 경우), 컨쥬게이트는 사용 준비된 투약 형태로서, 또는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제로 구성된, 복원 가능한 저장-안정한 분말 또는 액체로서 제공될 수 있다.
컨쥬게이트를 제형화하는 방법은 쉽게 이용 가능한 것들로부터 적용될 수 있다. 예를 들어, 컨쥬게이트는 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용 가능한 담체 (예를 들어, 식염수)의 치료적 유효량을 포함하는 약학적 조성물로 제공될 수 있다. 약학적 조성물은 선택적으로 다른 첨가제 (예를 들어, 버퍼, 안정화제, 보존제, 등)를 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 제형은 포유동물에게 투여에 적합하고, 예를 들어, 이것들은 인간에게 투여에 적합하다.
치료 방법
본 개시물의 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트는 모체 약물 (즉, 폴리펩타이드에 컨쥬게이션되기 전의 약물)의 투여에 의해 치료되기 쉬운 대상체의 질병 또는 질환의 치료에서의 용도를 발견하였다. "치료"는 적어도 숙주를 괴롭히는 질병에 관한 증상의 개선이 달성되는 것을 의미하며, 개선은 넓은 의미에서 적어도 치료되는 질병에 관한 파라미터, 예를 들어, 증상의 심각성의 감소를 나타내는데 사용된다. 이와 같이, 치료는 또한 숙주가 더 이상 질병, 또는 적어도 상기 질병을 특징으로 하는 증상으로 고통받지 않도록, 병리학적 질병, 또는 적어도 그것과 관련된 증상이 완전히 억제되는, 예를 들어, 발생이 예방되거나, 또는 중단되는, 예를 들어, 종결되는 상황을 포함한다. 따라서 치료는 (i) 예방, 즉, 임상적 증상의 발달의 위험의 감소, 임상적 증상이 발달하지 않게 하는 것, 예를 들어, 해로운 상태로의 질환 진행을 예방하는 것 포함; (ii) 억제, 즉, 임상적 증상의 발달 또는 추가의 발달의 정지, 예를 들어, 활성 질환의 경감 또는 완전한 억제; 및/또는 (iii) 구제, 즉, 임상적 증상의 퇴행 유발을 포함한다.
암의 맥락에서, 용어 "치료"는 고체 종양의 성장 감소, 암세포의 복제 억제, 전체적인 종양 크기의 감소 및 암과 관련된 하나 이상의 증상의 개선 모두를 포함한다.
치료되는 대상체는 치료가 필요한 것일 수 있으며, 치료되는 숙주는 모체 약물을 사용하여 치료되기 쉬운 것이다. 따라서, 다양한 대상체는 본원에서 개시된 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트를 사용하여 치료되기 쉬울 수도 있다. 일반적으로, 이러한 대상체는 "포유동물"이며, 인간이 바람직하다. 다른 대상체는 애완동물 (예를 들어, 개 및 고양이), 가축 (예를 들어, 소, 돼지, 염소, 말, 등), 설치류 (예를 들어, 마우스, 기니피그, 및 래트, 예를 들어, 질환의 동물 모델에서와 같음), 뿐만 아니라 비-인간 영장류 (예를 들어, 침팬지, 및 원숭이)를 포함할 수 있다.
투여되는 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트의 양은 처음에는 모체 약물의 용량 및/또는 투약 요법의 안내에 근거하여 결정될 수 있다. 일반적으로, 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트는 결합된 약물의 표적화된 전달 및/또는 향상된 혈청 반감기를 제공할 수 있으며, 따라서 투약 요법의 감소된 용량 또는 감소된 투여 중 적어도 하나를 제공한다. 따라서, 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트는 본 개시물의 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트에서 컨쥬게이션되기 이전의 모체 약물에 비해 투약 요법의 감소된 용량 및/또는 감소된 투여를 제공할 수 있다.
게다가, 상기 언급된 바와 같이, 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트가 약물 전달의 제어된 화학량을 제공할 수 있기 때문에, 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트의 투약량은 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트 기반으로 제공된 약물 분자의 수에 근거하여 계산될 수 있다.
일부 구체예에서, 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트의 다회수 용량이 투여된다. 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트의 투여 빈도는 다양한 인자, 예를 들어, 증상의 심각도, 대상체의 상태, 등 중 어느 것에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트는 월 1회, 월 2회, 월 3회, 격주마다 (qow), 주 1회 (qw), 주 2회 (biw), 주 3회 (tiw), 주 4회, 주 5회, 주 6회, 격일마다 (qod), 매일 (qd), 하루 2회 (qid), 또는 하루 3회 (tid) 투여된다.
암 치료 방법
본 개시물은 암에 걸린 개체에게 암 화학치료제를 전달하는 방법을 제공한다. 방법은 암종(carcinoma), 육종(sarcoma), 백혈병(leukemia), 및 림프종(lymphoma)을 포함하는 다양한 암의 치료에 유용하다.
대상 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암종은 식도 암종(esophageal carcinoma), 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma) (피부암의 형태), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma) (다양한 조직), 이행 세포 암종(transitional cell carcinoma) (방광의 악성 신생물)을 포함하는 방광 암종(bladder carcinoma), 기관지원성 암종(bronchogenic carcinoma), 결장 암종(colon carcinoma), 결장 직장 암종(colorectal carcinoma), 위 암종(gastric carcinoma), 폐의 소세포 암종(small cell carcinoma) 및 비-소세포 암종(non-small cell carcinoma)을 포함하는 폐 암종(lung carcinoma), 부신피질 암종(adrenocortical carcinoma), 감상선 암종(thyroid carcinoma), 췌장 암종(pancreatic carcinoma), 유방 암종(breast carcinoma), 난소 암종(ovarian carcinoma), 전립선 암종(prostate carcinoma), 선암종(adenocarcinoma), 한선 암종(sweat gland carcinoma), 피지선 암종(sebaceous gland carcinoma), 유두상 암종(papillary carcinoma), 유두상 선암종(papillary adenocarcinoma), 낭선암종(cystadenocarcinoma), 수질 암종(medullary carcinoma), 신세포 암종(renal cell carcinoma), 유관 상피 내 암종(ductal carcinoma in situ) 또는 담관 암종(bile duct carcinoma), 융모암종(choriocarcinoma), 정상피종(seminoma), 배아 암종(embryonal carcinoma), 빌름스 종양(Wilm's tumor), 자궁경부 암종(cervical carcinoma), 자궁 암종(uterine carcinoma), 고환 암종(testicular carcinoma), 골원성 암종(osteogenic carcinoma), 상피 암종(epithelial carcinoma), 및 인두 암종(nasopharyngeal carcinoma), 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
대상 방법을 사용하여 치료될 수 있는 육종은 섬유 육종(fibrosarcoma), 점액 육종(myxosarcoma), 지방 육종(liposarcoma), 연골 육종(chondrosarcoma), 척색종(chordoma), 골원성 육종(osteogenic sarcoma), 골 육종(osteosarcoma), 혈관 육종(angiosarcoma), 내피 육종(endotheliosarcoma), 림프관 육종(lymphangiosarcoma), 림프관 내피 육종(lymphangioendotheliosarcoma), 활막종(synovioma), 중피종(mesothelioma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 평활근 육종(leiomyosarcoma), 횡문근 육종(rhabdomyosarcoma), 및 다른 연조직 육종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
대상 방법을 사용하여 치료될 수 있는 다른 고체 종양은 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 수모세포종(medulloblastoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 상의세포종(ependymoma), 송과체종(pinealoma), 혈관아세포종(hemangioblastoma), 청신경종(acoustic neuroma), 핍지교종(oligodendroglioma), 수막종(menangioma), 흑색종(melanoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 및 망막아종(retinoblastoma)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
대상 방법을 사용하여 치료될 수 있는 백혈병은 a) 만성 골수증식 증후군(chronic myeloproliferative syndrome) (다능성 조혈모세포의 신생물 질환); b) 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia) 제한된 계통 잠재력의 다능성 조혈모세포 또는 조혈성 세포의 신생 세포 형질전환); c) B-세포 CLL, T-세포 CLL 전림프구성(prolymphocytic) 백혈병, 및 모세포 백혈병(hairy cell leukemia)을 포함하는 만성 림프구성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia; CLL; 면역학적으로 미성숙하고 기능적으로 무능한 작은 림프구의 클론 증식); 및 d) 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia) (림프아세포의 축적이 특징임)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 대상 방법을 사용하여 치료될 수 있는 림프종은 B-세포 림프종 (예를 들어, 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma)); 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma); 비-호지킨 B 세포 림프종(non-Hodgkin's B cell lymphoma); 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
실시예
하기 실시예들은 당업자에게 본 발명의 제조 및 사용 방법의 완벽한 개시 및 설명을 제공하기 위해서 제안되고, 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것이 아니고 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험이 아니라는 것을 나타내려는 것은 아니다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 온도, 등)에 관하여 정확도를 보장하려는 노력이 이루어졌지만 몇몇 실험적 오차 및 편차는 해명되어야 한다. 달리 지시되지 않으면, 일부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 그 근처이다. "평균"은 산술 평균을 의미한다. 표준 약어, 예를 들어, bp, 염기쌍(들); kb, 킬로베이스(들); pl, 피코리터(들); s 또는 sec, 초(들); min, 분(들); h 또는 hr, 시간(들); aa, 아미노산(들); kb, 킬로베이스(들); bp, 염기쌍(들); nt, 뉴클레오타이드(들); i.m., 근육 내(로); i.p., 복강 내(로); s.c., 피하(로); 등이 사용될 수도 있다.
일반적인 합성 과정
개시된 화합물을 합성하는데 유용한 흔히 공지되어 있는 화학적 합성 계획 및 조건을 제공하는 많은 일반적인 참고문헌들이 이용 가능하다 (예를 들어, Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, Wiley-Interscience, 2001; 또는 Vogel, A Textbook of Practical Organic Chemistry, Including Qualitative Organic Analysis, Fourth Edition, New York: Longman, 1978 참조).
본원에서 기술된 화합물들은 크로마토그래피, 예를 들어, HPLC, 예비 박막 크로마토그래피, 플래시 컬럼 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는, 업계에 공지되어 있는 어떠한 정제 프로토콜에 의해서도 정제될 수 있다. 정상 및 역상, 뿐만 아니라 이온성 수지를 포함하는 어떤 적합한 고정상도 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 개시된 화합물은 실리카 겔(silica gel) 및/또는 알루미나 크로마토그래피를 통해 정제된다. 예를 들어, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2nd Edition, ed. L. R. Snyder and J. J. Kirkland, John Wiley and Sons, 1979; 및 Thin Layer Chromatography, ed E. Stahl, Springer-Verlag, New York, 1969 참조.
대상 화합물의 제조 공정 중 어느 것 중에는, 관련된 분자 중 어느 것에서도 민감성 또는 반응성 기를 보호하는 것이 필요하고 및/또는 바람직할 수도 있다. 이것은 표준 작업, 예를 들어, J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London and New York 1973, T. W. Greene and P. G. M. Wuts , "Protective Groups in Organic Synthesis", Third edition, Wiley, New York 1999, "The Peptides"; Volume 3 (editors: E. Gross and J. Meienhofer), Academic Press, London and New York 1981, "Methoden der organischen Chemie", Houben-Weyl, 4th edition, Vol. 15/l, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, H.-D. Jakubke and H. Jescheit, "Aminosauren, Peptide, Proteine", Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, and Basel 1982, 및/또는 Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide and Derivate", Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974에서 기술된 바와 같이 통상적인 보호 기에 의해 달성될 수도 있다. 보호 기는 업계에 공지된 방법을 사용하여 편리한 후속 스테이지에서 제거될 수도 있다.
대상 화합물은 상업적으로 이용 가능한 시작 물질 및/또는 통상적인 합성 방법에 의해 제조된 시작 물질을 사용하여 다양한 다른 합성 경로를 통해 합성될 수 있다. 본원에서 개시된 화합물을 합성하는데 사용될 수 있는 합성 경로의 다양한 예는 하기 계획에서 기술된다.
실시예 1
부위-특이적으로 컨쥬게이션된 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)를 생성하기 위한 실험을 수행하였다. 부위-특이적 ADC 생성은 단백질 서열에 포르밀글리신 (FGly), 비-천연 아미노산의 통합을 포함하였다. FGly를 설치하기 위해 (도 1), 짧은 공통 서열, CXPXR (여기에서 X는 세린, 트레오닌, 알라닌, 또는 글리신이다)을 표준 분자 생물학 클로닝 기술을 사용하여 항체 중쇄 또는 경쇄의 보존된 영역의 바람직한 위치에 삽입하였다. 이 "태그된" 구조물을 포르밀글리신-생성 효소 (FGE)를 동시 발현하는 세포에서 재조합에 의해 생성하였는데, 이것은 태그 내 시스테인을 동시 번역에 의해 FGly 잔기로 전환시키며, 알데하이드 작용기 (본원에서 알데하이드 태그로도 불림)를 생성한다. 알데하이드 작용기는 생물 직교(bioorthogonal) 컨쥬게이션을 위한 화학 손잡이의 역할을 한다. 히드라지노-아이소-피테트-스펭글러 (HIPS) 결찰을 사용하여 페이로드 (예를 들어, 약물, 예를 들어, 세포독소)를 FGly에 연결시켰으며, 세포독소 페이로드와 항체 사이에서 안정한, 공유 C-C 결합의 형성을 초래한다. 이 C-C 결합은 순환 및 FcRn 재활용 중에 ADC가 직면하는 생리학적으로 관련된 문제, 예를 들어, 프로테아제, 낮은 pH, 및 환원제에 대하여 안정할 것으로 예상되었다. 알데하이드 태그를 함유하는 항체는 다양한 위치에서 생산될 수도 있다. 경쇄의 한 부위 및 중쇄의 7개의 부위에서 알데하이드 태그 삽입의 효과를 테스트하기 위한 실험을 수행하였다. HIPS 링커를 통한 메이탄신 페이로드로의 컨쥬게이션에 의해 만들어진 결과로 생긴 ADC 중 세 개에서 생물물리학적 및 기능적 특성화를 수행하였다. 컨쥬게이션 부위의 조절은 항체 효능 및 PK에 대하여 상당한 효과를 갖고 있었다.
실험 과정
일반
쥐 항-메이탄신 항체를 자체적으로 제조하고 검증하였다. 토끼 항-AF488 항체를 Life Technologies (Grand Island, NY)로부터 구입하였다. 염소 항-인간 IgG-특이적 및 염소 항-인간 Fab-특이적 항체, 및 당나귀 항-토끼, 염소 항-마우스 IgG 서브클래스 I-특이적, 및 염소 항-인간 Fc-특이적 HRP-컨쥬게이트는 Jackson Immunoresearch (West Grove, PA)의 것이었다.
태그된 항체의 클로닝 , 발현, 및 정제
알데하이드 태그 서열을 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 경쇄 및 중쇄 공통 영역의 다양한 지점에 삽입하였다. 소규모 생산을 위해서는, CHO-S 세포를 인간 FGE 발현 구조물로 트랜스펙션하였고 FGE-과발현 세포의 풀(pool)을 항체의 일시적 생산에 사용하였다. 대규모 생산을 위해서는, GPEx 기술 (Catalent, Inc., Somerset, NJ)을 사용하여 인간 FGE를 과발현하는 클론 세포주 (GPEx)를 생성하였다. 이어서, FGE 클론을 사용하여 항체-발현 세포의 대량의 안정한 풀을 생성하였다. 항체를 단백질 A 크로마토그래피 (MabSelect, GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA)를 사용하여 조정 배지로부터 정제하였다. 정제된 항체를 급속 냉동하여 추가로 사용할 때까지 -80 ℃에서 저장하였다.
생체 컨쥬게이션 , 정제, 및 HPLC 분석
알데하이드-태그된 항체 (15 mg/mL)를 0.85% DMA 및 0.085% Triton X-100을 함유하는 50 mM 나트륨 시트레이트, 50 mM NaCl pH 5.5 중에서 37 ℃에서 72시간 동안 HIPS-Glu-PEG2-메이탄신 (8 mol. 당량 약물:항체)에 컨쥬게이션하였다. 유리 약물을 접선 유동 여과를 사용하여 제거하였다. 컨쥬게이션되지 않은 항체를 이동상 A: 1.0 M 암모늄 설페이트, 25 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.0, 및 이동상 B: 25% 아이소프로판올, 18.75 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.0을 구비한 예비-규모 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC; GE Healthcare 17-5195-01)를 사용하여 제거하였다. 33% B의 등용매 구배를 사용하여 컨쥬게이션되지 않은 물질을 용출한 후 이어서 41-95% B의 선형 구배를 사용하여 단일- 및 이중-컨쥬게이션된 종을 용출하였다. 최종 생성물의 DAR을 결정하기 위해서, ADC를 이동상 A: 1.5 M 암모늄 설페이트, 25 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.0, 및 이동상 B: 25% 아이소프로판올, 18.75 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.0을 구비한 분석적 HIC (Tosoh #14947)로 검사하였다. 응집을 결정하기 위해서, 샘플을 300 mM NaCl, 25 mM 나트륨 포스페이트 pH 6.8의 이동상을 구비한 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (SEC; Tosoh #08541)를 사용하여 분석하였다.
시험관 내 안정성
항체-형광단 및 항체-약물 컨쥬게이트를 ~ 1 pmol (페이로드)/mL로 래트 혈장에 넣었다. 샘플을 앨리쿼트하여 사용할 때까지 -80 ℃에서 저장하였다. 앨리쿼트를 지시된 시간 동안 5% CO2 하에 37 ℃에 둔 다음, ELISA로 분석하여 항-메이탄신 및 항-Fab 신호를 평가하였다. 분석을 위한 첫 번째 단계로서, 검정의 선형 범위 (20-40 ng/mL) 내에 있다는 것을 보장하기 위해서 1% 소 혈청 알부민으로 분석물의 희석 시리즈를 수행하였다. 적절한 희석이 결정되었으면, 샘플을 인큐베이터로부터 제거하여 테스트하였다. 갓 해동된 앨리쿼트를 컨쥬게이션에 대한 기준 시작값으로 사용하였다. 모든 분석물을 한 플레이트 상에서 함께 측정하여 전체 시점에 걸친 비교를 가능하게 하였다. 분석물을 항-인간 Fab-특이적 항체로 코팅된 플레이트 상에서 캡쳐하였다. 이어서, 페이로드를 항-AF488 또는 항-메이탄신 항체에 이어서 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체로 검출하였다; 총 항체를 직접적으로 컨쥬게이션된 항-인간 Fc-특이적 항체로 검출하였다. 결합된 2차 항체를 TMB 기질을 이용하여 가시화하였다. 비색 반응을 H2SO4로 중단시켰고, 450 nm에서의 흡광도를 플레이트 리더를 사용하여 결정하였다. 데이터 분석을 엑셀에서 수행하였다. 각 샘플을 4배수로 분석하였고, 평균값을 사용하였다. 항-Fab 신호에 대한 항-메이탄신 신호의 비율을 항체 컨쥬게이션의 측정값으로 사용하였다.
시험관 내 세포독성
HER2-양성 유방 암종 세포주, NCI-N87를 ATCC로부터 얻었고 10% 태아 소 혈청 (Invitrogen, Grand Island, NY) 및 Glutamax (Invitrogen)가 보충된 RPMI-1640 배지 (Cellgro, Manassas, VA)에서 유지하였다. 플레이팅 24 h 전에, 지수증식기 성장을 보장하기 위해서 세포를 계대배양하였다. 플레이팅 당일에, 5000개 세포/웰을 10 IU 페니실린 및 10 μg/mL 스트렙토마이신 (Cellgro)이 보충된 90 μL 정상 성장 배지에서 96-웰 플레이트 상에 분주하였다. 세포에 희석된 분석물 10 μL을 다양한 농도로 처리하였고, 플레이트를 5% CO2의 대기에서 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 6 d 후, 100 μL/웰의 Cell Titer-Glo 시약 (Promega, Madison, WI)을 첨가하였고, 발광을 Molecular Devices SpectraMax M5 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 IC50 계산을 포함하는 데이터 분석에 사용하였다.
이종이식 연구
암컷 C.B-17 SCID 마우스에 50% Matrigel 중 1 x 107 NCI-N87 종양 세포를 피하로 접종하였다. 종양이 평균 112 mm3에 도달했을 때, 동물에게 단일 5 mg/kg 용량의 ADC, 트라스투주맙 항체 (태그되지 않음), 또는 비히클 단독을 제공하였다. 동물을 체중 및 종양 크기에 대하여 주 2회 모니터링하였다. 종양 부피를 다음 식을 사용하여 계산하였다:
Figure 112016123593442-pct00042
상기 식에서 w = 종양 너비, 및 l = 종양 길이이다.
마우스의 네 개의 군들의 종양 성장 속도 곡선의 평균을 계산하여 종양 배가 시간을 얻었다. 이어서, log10 세포 살해를 다음 식을 사용하여 추정하였다:
Figure 112016123593442-pct00043
PK 분석
수컷 BALB/c 마우스에 항체 컨쥬게이트의 단일 5 mg/kg 볼루스(bolus)를 정맥 내로 투여하였다. 혈장을 투여 후 1 h, 8 h 및 20 h, 및 2, 4, 6, 8, 10, 14, 21, 및 28일에 수거하였으며, 시점 당 세 마리의 동물을 이용하였다. 단일 동물을 주 2회 이상 샘플링하지 않았다. 혈장 샘플을 -80℃에서 저장하였고, 전체 항체의 농도 및 총 ADC를 ELISA로 정량화하였다. 전자를 위해서는, 컨쥬게이트를 항-인간 IgG-특이적 항체로 캡쳐하였고 HRP-컨쥬게이션된 항-Fc-특이적 항체로 검출하였다. 후자를 위해서는, 컨쥬게이트는 항-인간 Fab-특이적 항체로 캡쳐하였고 마우스 항-메이탄신 1차 항체에 이어서, HRP-컨쥬게이션된 항-마우스 IgG-서브클래스 1-특이적 2차 항체로 검출하였다. 결합된 2차 항체를 Ultra TMB One-Step ELISA 기질 (Thermo Fisher, Waltham, MA)을 사용하여 검출하였다. 황산과의 반응을 퀸칭(quenching)한 후, SoftMax Pro 소프트웨어를 구비한 Molecular Devices Spectra Max M5 플레이트 리더에서 450 nm에서 흡광도를 취하여 신호를 판독하였다. 데이터를 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 시간이 흐름에 따라 측정된 농도는 다음 방정식을 이용하여 Y 값의 평균의 비선형 회귀 (1/Y2에 의해 가중됨)에 의한 2-구획 모델에 적용하였다:
Figure 112016123593442-pct00044
결과로 얻은 지수형 붕괴 상수 (τβ)를 사용하여 t½을 계산하였다.
열 형광 발광
FcRN
FcRn (Sino Biologicals, #CT009-H08H)을 제조사의 지시에 따라 NHS-LC-Biotin (Pierce, #21336)을 사용하여 비오티닐화하였다. FcRn 검정을 위한 모든 희석 및 결합 단계를 "운동 버퍼": 20 mM 포스페이트, 150 mM NaCl, 0.02 % Tween-20, 0.05% 나트륨 아지드, 0.1 mg/mL 소 혈청 알부민에서 실행하였다. 버퍼는 달리 언급된 경우를 제외하면 pH 6.0에 있었다. SA Biosensors (ForteBio, #1305291)를 검정 96웰 플레이트에서 10분 동안 200 μL의 운동 버퍼에서 사전 수화시켰다. 그 다음에 팁을 ForteBio Octet Red biosensor에 로딩하였고 베이스라인 신호를 1분 동안 확립하였다. 이어서, 팁을 1.5 μg/mL 비오티닐화된 FcRn에 배치하였으며, 이것을 320 s 동안 캡쳐하였다. 두 번 이상의 1분 베이스라인 단계 이후, IgG (100 nM)가 5분 동안 결합하게 하였다. 마지막으로, 팁을 pH 7.3에서 운동 버퍼를 함유한 웰로 제거하였고, 해리를 5분 동안 모니터링하였다.
면역원성
iTope™을 사용하는 태그된 및 태그되지 않은 서열의 분석을 태그를 함유하는 영역에 걸쳐있는 중첩 9mer를 이용하여 수행하였으며, 이것들을 34개의 인간 MHC 등급 II 대립 유전자 각각에 대하여 테스트하였다. 각각의 9mer를 잠재적 '핏(fit)' 및 MHC 등급 II 분자와의 상호작용을 기반으로 점수를 매겼다. 소프트웨어에 의해 계산된 펩타이드 점수는 0 내지 1에 있다. 높은 평균 결합 점수 (iTope™ 점수화 함수에서 >0.55)를 생산하는 펩타이드가 강조되었다. MHC 등급 II 결합 펩타이드 중 ≥50% (즉, 34개의 대립 유전자 중 17)이 높은 결합 친화도를 가지며 (점수 >0.6), 이러한 펩타이드를 "무차별 고친화도"로 한정하였다. 대립 유전자 중 ≥50%에 결합하는 MHC 등급 II 결합 펩타이드는 점수 > 0.55를 가지며 "무차별 중간 친화도"로 한정되었다. 이전에 확인된 T 세포 에피토프에 대하여 어떤 동일성 또는 높은 서열 상동성을 확인하기 위해 서열을 또한 사용하여 BLAST 검색에 의해 TCED™ (T 세포 에피토프 데이터베이스)로부터 정보를 얻었다.
HIPS- Glu - PEG2 - 메이탄신의 합성
계획 1
Figure 112016123593442-pct00045
( S )-5-(3-( tert - 부톡시 )-3- 옥소프로필 )-1-(9 H - 플루오렌 -9-일)-3,6- 디옥소 -2,10,13-트리옥사-4,7-디아자헥사데칸-16-오익 산 (3)의 제조
아민 2 (710.3 mg, 4.0 mmol), 및 Na2CO3 (637.9 mg, 6.0 mmol)를 교반 막대를 함유하는 20 mL 유리 신틸레이션(scintillation) 바이알에 첨가하였다. 물 (10.0 mL)을 첨가하였고 용액을 20 ℃에서 5분 동안 교반하여, 투명한 무색 용액을 제공하였다. 펜타플루오로페닐 에스터 1 (1185.7 mg, 2.0 mmol)를 별도의 20 mL 유리 신틸레이션 바이알에 첨가하였고 10.0 mL 1,4-디옥산에 용해시켰다. 바이알을 1분 동안 보텍싱(vortex)하여, 투명한 무색 용액을 제공하였으며 이것을 상기 제조된 용액에 적가하여, 흰색 침전물을 제공하였다. 반응물을 20 ℃에서 4 h 동안 교반하였고, 물 70 mL에 첨가하였고, 1 M HCl의 적가에 의해 pH 3으로 산성화하였고, 2 x 50 mL EtOAc로 추출하였고, Na2SO4 위에서 건조시켰다. 유기 분획을 여과, 증발, 및 용리제로서 0-100% CH3CN-H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 생성물을 높은 진공 하에 건조시켜서 끈적거리는 흡습성 흰색 고체로서 1137.3 mg (97%)의 화합물 3을 공급하였다.
( S )-7-아미노-2,2-디메틸-4,8- 디옥소 -3,12,15-트리옥사-9- 아자옥타데칸 -18-오익 산 ( 4)의 제조
아민 화합물 3 (2638.7 mg, 4.513 mmol)을 DMF (8.92 mL) 중 피페리딘 (2.23 mL, 22.57 mmol) (20 부피% 피페리딘)의 용액에 용해시켰고 20 ℃에서 1 h 동안 교반하였다. 흰색 침전물이 형성되었다. 반응물을 여과하여, 투명한 연노란색 용액을 제공하였다. 용액을 증발시켰고 용리제로서 0-100% CH3CN-H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 단리된 생성물을 높은 진공 하에 건조하여, 투명한 점성 오일로서 813.1 mg (50%)의 화합물 4를 제공하였다.
계획 2
Figure 112016123593442-pct00046
( S )-7-(3-(2-((2-(((9 H - 플루오렌 -9-일) 메톡시 )카르보닐)-1,2- 디메틸히드라지닐 )메틸)-1 H -인돌-1-일)프로판아미도)-2,2-디메틸-4,8-디옥소-3,12,15-트리옥사-9-아자옥타데칸-18-오익 산 ( 6)의 제조
아민 화합물 4 (582.4 mg, 1.607 mmol)를 건조된 교반 막대를 함유하는 건조된 20 mL 유리 신틸레이션 바이알에 첨가하였다. 무수 DMF (5 mL) 및 (i-Pr)2NEt (0.84 mL, 4.82 mmol)를 첨가하였고, 용액을 20 ℃에서 5분 동안 교반하여, 투명한 매우 연한 노란색의 용액을 제공하였다. 에스터 5 (1253.7 mg, 1.930 mmol)를 5분 동안 나누어서 첨가하였고 반응물을 20 ℃에서 2 h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 추가적인 처리 없이 용리제로서 0-100% CH3CN-H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 생성물을 높은 진공 하에 건조시켜서 흰색 막으로서 406.3 mg (49%)의 화합물 6을 공급하였다.
계획 3
Figure 112016123593442-pct00047
2-((( tert - 부틸디메틸실일 ) 옥시 ) 메틸 )-1 H -인돌 (8)
오븐에서 건조된 플라스크를 인돌-2-메탄올, 7 (1.581 g, 10.74 mmol), TBSCl (1.789 g, 11.87 mmol), 및 이미다졸 (2.197 g, 32.27mmol)로 충전하였고, 이 혼합물을 CH2Cl2 (40 mL, 무수)에 현탁하였다. 16 h 후, 반응 혼합물을 오렌지색 잔기로 농축하였다. 미가공 혼합물을 Et2O (50 mL)에 용해시켰고, 수성 AcOH (5 부피%, 3 x 50 mL) 및 소금물 (25 mL)로 세척하였다. 결합된 유기층을 Na2SO4에서 건조하고 농축시켜 추가의 정제 없이 사용되는 결정성 고체로서 2.789 g (99%)의 화합물 8을 제공하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.29 (s, 1H), 7.57 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.37 (dd, J = 8.1, 0.6 Hz, 1H), 7.19 - 7.14 (m, 1H), 7.12 - 7.07 (m, 1H), 6.32 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 4.89 (s, 2H), 0.95 (s, 9H), 0.12 (s, 6H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 138.3, 136.0, 128.6, 121.7, 120.5, 119.8, 110.9, 99.0, 59.4, 26.1, 18.5, -5.2. C15H24NOSi [M+H]+에 대한 HRMS (ESI) 계산치: 262.1627; 실측치: 262.1625.
메틸 3-(2-((( tert - 부틸디메틸실일 ) 옥시 ) 메틸 )-1 H -인돌-1-일) 프로파노에이 트 (10)
CH3CN (25 mL) 중 인돌 8 (2.789g, 10.67 mmol)의 용액에 메틸 아크릴레이트, 9 (4.80 mL, 53.3 mmol)에 이어서 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔 (800 μL, 5.35 mmol)을 첨가하였고, 결과로 생긴 혼합물을 재환류시켰다. 18 h 후, 용액을 냉각시켰고 오렌지색 오일로 농축하였으며 이것을 실리카 겔 크로마토그래피 (9:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 3.543 g (96%)의 화합물 10, 무색 오일을 수득하였다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.58 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.23 - 7.18 (m, 1H), 7.12 - 7.07(m, 1H), 6.38 (s, 1H), 4.84 (s, 2H), 4.54 - 4.49 (m, 2H), 2.89 - 2.84 (m, 2H), 0.91 (s, 9H), 0.10 (s, 6H). 13CNMR (101 MHz, CDCl3) δ 172.0, 138.5, 137.1, 127.7, 122.0, 121.0, 119.8, 109.3, 101.8, 58.2, 51.9, 39.5, 34.6, 26.0, 18.4, -5.2. C19H30NO3Si [M+H]+에 대한 HRMS (ESI) 계산치: 348.1995; 실측치: 348.1996.
메틸 3-(2-( 하이드록시메틸 )-1 H -인돌-1-일) 프로파노에이트 (11)
0 ℃에서 THF (20 mL) 중 화합물 10 (1.283 g, 3.692 mmol)의 용액에 THF (3.90 mL, 3.90 mmol) 중 테트라부틸암모늄 플루오라이드의 1.0 M 용액을 첨가하였다. 15 분 후, 반응 혼합물을 Et2O (20 mL)로 희석하였고, NaHCO3 (포화된 수용액, 3 x 20 mL)로 세척하였고, 연녹색 오일로 농축하였다. 오일을 실리카 겔크로마토그래피 (2:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 흰색 결정성 고체로서 822 mg (95%)의 화합물 11을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.60 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.34 (dd, J = 8.2, 0.4 Hz, 1H), 7.27 - 7.23 (m, 1H), 7.16 - 7.11 (m, 1H), 6.44 (s, 1H), 4.77 (s, 2H), 4.49 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 3.66 (s, 3H), 2.87 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.64 (s, 1H). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 172.3, 138.5, 137.0, 127.6, 122.2, 121.1, 119.9, 109.3, 102.3, 57.1, 52.0, 39.1, 34.3. C13H15NNaO3 [M+Na]+에 대한 HRMS (ESI) 계산치: 256.0950; 실측치: 256.0946.
메틸 3-( 2-포르밀 -1 H -인돌-1-일) 프로파노에이트 (12)
데스-마틴(Dess-Martin) 페리오디난 (5.195 g, 12.25 mmol)을 CH2Cl2(20 mL) 및 피리딘 (2.70 mL, 33.5 mmol)의 혼합물에 현탁하였다. 5분 후, 결과로 생긴 흰색 현탁액을 CH2Cl2 (10 mL) 중 메틸 3-(2-(하이드록시메틸)-1H- 인돌-1-일)프로파노에이트 (화합물 11; 2.611 g, 11.19 mmol)의 용액으로 옮겼으며, 그 결과 적갈색 현탁액이 형성되었다. 1 h 후, 반응물을 나트륨 티오설페이트 (10% 수용액, 5 mL) 및 NaHCO3 (포화된 수용액, 5 mL)로 퀸칭하였다. 수층을 CH2Cl2 (3 x 20 mL)으로 추출하였고; 결합된 추출물을 Na2SO4 위에서 건조시켰고, 여과하였고, 갈색 오일로 농축하였다. 실리카 겔 크로마토그래피 (헥산 중 5-50% EtOAc)로의 정제는 무색 오일로서 2.165 g (84%)의 화합물 12를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.87 (s, 1H), 7.73 (dt, J = 8.1, 1.0 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 8.6, 0.9 Hz, 1H), 7.45 - 7.40 (m, 1H), 7.29 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 7.18 (ddd, J = 8.0, 6.9, 1.0 Hz, 1H), 4.84 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.62 (s, 3H), 2.83 (t, J = 7.2 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 182.52, 171.75, 140.12, 135.10, 127.20, 126.39, 123.46, 121.18, 118.55, 110.62, 51.83, 40.56, 34.97. C13H13NO3Na [M+Na]+에 대한 HRMS (ESI) 계산치: 254.0793; 실측치: 254.0786.
3-(2- 포르밀 -1 H -인돌-1-일)프로판산 (13)
디옥산 (100 mL)에 용해된 인돌 12 (2.369 g, 10.24 mmol)의 용액에 LiOH (4 M 수용액, 7.68 mL, 30.73 mmol)를 첨가하였다. 두꺼운 흰색 침전물이 수회에 걸쳐 점차적으로 형성되었다. 21 h 후, HCl (1 M 수용액, 30 mL)을 적가하여 pH = 4인 용액을 제공하였다. 용액을 농축하여 결과로 생긴 연갈색 오일을 EtOAc (50 mL)에 용해시켰고 물 (2 x 50 mL) 및 소금물 (20 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 위에서 건조하였고, 여과하였고, 오렌지색 고체로 농축하였다. 실리카 겔 크로마토그래피 (0.1% 아세트산이 들어있는 헥산 중 10-50% EtOAc)로의 정제는 연노란색 고체로서 1.994 g (84%)의 화합물 13을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.89 (s, 1H), 7.76 (dt, J = 8.1, 0.9 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 8.6, 0.9 Hz, 1H), 7.48 - 7.43 (m, 1H), 7.33 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 7.21 (ddd, J = 8.0, 6.9, 1.0 Hz, 1H), 4.85 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.91 (t, J = 7.2 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 182.65, 176.96, 140.12, 135.02, 127.33, 126.42, 123.53, 121.27, 118.76, 110.55, 40.19, 34.82. C12H10NO3 [M-H]-에 대한 HRMS (ESI) 계산치: 216.0666; 실측치: 216.0665.
3-(2-((2-(((9H- 플루오렌 -9-일) 메톡시 )카르보닐)-1,2- 디메틸히드라지닐 ) 메틸 )-1 H -인돌-1-일)프로판산 (15)
1,2-디클로로에탄 (무수, 25 mL) 중 화합물 13 (1.193 g, 5.492 mmol) 및 (9H-플루오렌-9-일)메틸 1,2-디메틸히드라진카르복실레이트, 14 (2.147 g, 7.604 mmol)의 용액에 나트륨 트리아세트옥시보로하이드라이드 (1.273 g, 6.006 mmol)를 첨가하였다. 결과로 생긴 노란색 현탁액을 2 h 동안 교반한 다음 NaHCO3 (포화된 수용액, 10 mL)로 퀸칭한 후 이어서, HCl (1 M 수용액)을 pH 4까지 첨가하였다. 유기층을 분리하였고, 수층을 CH2Cl2 (5 x 10 mL)로 추출하였다. 풀링된(pooled) 유기 추출물을 Na2SO4 위에서 건조하였고, 여과하였고, 오렌지색 오일로 농축하였다. C18 실리카 겔 크로마토그래피 (수중 20-90% CH3CN)로의 정제는 유광 분홍색 고체로서 1.656 g (62%)의 화합물 15를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.76 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.70 - 7.47 (br m, 3H), 7.42 - 7.16 (br m, 6H), 7.12 - 7.05 (m, 1H), 6.37 (s, 0.6H), 6.05 (s, 0.4H), 4.75 - 4.30 (br m, 4H), 4.23 (m, 1H), 4.10 (br s, 1H), 3.55 (br d, 1H), 3.11 - 2.69 (m, 5H), 2.57 (br s, 2H), 2.09 (br s, 1H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 174.90, 155.65, 143.81, 141.42, 136.98, 134.64, 127.75, 127.48, 127.12, 124.92, 122.00, 120.73, 120.01, 119.75, 109.19, 103.74, 67.33, 66.80, 51.39, 47.30, 39.58, 39.32, 35.23, 32.10. C29H30N3O4 [M+H]+에 대한 HRMS (ESI) 계산치: 484.2236; 실측치: 484.2222.
(9 H - 플루오렌 -9-일) 메틸1 ,2-디메틸-2-((1-(3-옥소-3-( 퍼플루오로페녹시 )프로필)-1 H -인돌-2-일)메틸)히드라진-1-카르복실레이트 (5)
화합물 15 (5.006 g, 10.4 mmol)를 건조된 교반 막대를 함유하는 건조된 100 mL 2구 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 무수 EtOAc, 40 mL를 주사기로 첨가하였고 용액을 20 ℃에서 5분 동안 교반하여 투명하고 연한 연두색 용액을 제공하였다. 용액을 차가운 수조에서 0 ℃로 냉각하였고 3 mL 무수 EtOAc 중 펜타플루오로페놀 (2098.8 mg, 11.4 mmol)을 적가하였다. 용액을 0 ℃에서 5분 동안 교반하였다. 7 mL 무수 EtOAc 중 DCC (2348.0 mg, 11.4 mmol)를 주사기로 천천히 적가하였다. 용액을 0 ℃에서 5분 동안 교반한 다음, 수조에서 제거하여 20 ℃로 가온하였다. 반응물을 2 h 동안 교반하였고, 0 ℃로 냉각하였고, 여과하여 투명하고, 연한 연두색 용액을 제공하였다. 용액을 50 mL EtOAc로 희석하였고, 2 x 25 mL H2O, 1 x 25 mL 5 M NaCl로 세척하였고, Na2SO4 위에서 건조시켰다. 용액을 여과, 증발, 및 높은 진공 하에 건조하여, 초록빛 흰색 고체로서 6552.5 mg (97%)의 화합물 5를 제공하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 780 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.58 (m, 3H), 7.45-7.22 (m, 6H), 7.14 (dd(appt. t), J = 7.4 Hz, 1H), 6.42 & 6.10 (2 br s, 1H), 4.74 (dd(appt. t), J = 5.4 Hz, 2H), 3.65-3.18 (br, 3H), 3.08 & 2.65 (2 br s, 3H), 2.88 (s, 3H).
계획 4
Figure 112016123593442-pct00048
(9 H - 플루오렌 -9-일) 메틸 1,2-디메틸히드라진-1- 카르복실레이트 (14)
MeNHNHMe·2HCl, 화합물 16 (5.0 g, 37.6 mmol)을 MeCN (80 mL)에 용해시켰다. Et3N (22 mL, 158 mmol)을 첨가하였고 형성된 침전물을 여과에 의해 제거하였다. 잔류 MeNHNHMe 용액에, FmocCl (0.49 g, 18.9 mmol, 0.5 eq)의 용액을 -20 ℃에서 2.5 h 동안 적가하였다. 이어서 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하였고, H2O, 소금물로 세척하였고, Na2SO4 위에서 건조하였고, 진공에서 농축하였다. 잔기를 실리카 (헥산/EtOAc = 3:2) 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 3.6 g (34%)의 화합물 14를 제공하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.75-7.37 (m, 8 H), 4.48 (br s, 2H), 4.27 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.05 (s, 3H), 2.55 (br s, 3H).
계획 5
Figure 112016123593442-pct00049
메이탄시놀 3-(2 S ,15 R )-19-(2-((2-(((9 H -플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)-1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1 H -인돌-1-일)-15-(2-( t -부톡시카르보닐)에틸)-2,3-디메틸-4,14,17-트리옥소-7,10-디옥사-3,13,16-트리아자노나데카노에이트 (18)
3.0 mL DMF 중 메이탄시놀 3-(S)-α-N-메틸아미노프로피오네이트 (화합물 17) (0.426 g, 0.655 mmol), 카르복시산 6 (0.597 g, 0.721 mmol), 및 (i-Pr)2NEt (0.35 mL, 2.00 mmol)의 용액을 HATU (0.277 g, 0.729 mmol)를 첨가하면서 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 2.5 h 동안 교반하였고 회전 증발로 농축하였다. 생성물을 0-10% MeOH-CH2Cl2 구배를 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피로 단리시켰다. 생성물-함유 분획을 결합하였고, 농축하였고, 0-100% CH3CN-H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 플래시 크로마토그래피를 다시 실시하여 흰색 고체로서 0.721 g (75%)의 메이탄시노이드 18을 수득하였다.
C75H95ClN8O17 [M+Na]+에 대한 MS (ESI) 계산치: 1458.7; 실측치: 1481.8.
메이탄시놀 3-(2 S ,15 R )-19-(2-((2-(((9 H -플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)-1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1 H -인돌-1-일)-15-(2-(카르복시)에틸)-2,3-디메틸-4,14,17-트리옥소-7,10-디옥사-3,13,16-트리아자노나데카노에이트 (19)
1.0 mL 무수 CH2Cl2 중 메이탄시노이드 18 (110.5 mg, 0.08 mmol)의 용액을 CH2Cl2 (0.378 mL, 0.378 mmol) 중 SnCl4의 1.0 M 용액을 적가하면서 0 ℃에서 교반하였다. 노란색 침전물이 형성되었다. 반응 혼합물을, 추가적인 처리 없이, 용리제로서 0-100% CH3CN-H20 구배를 사용하여 C18 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 흰색 막으로서 65.6 mg (62%)의 메이탄시노이드 19를 공급하였다.
C73H91ClN8O18 [M-H]-에 대한 MS (ESI) 계산치: 1401.6 실측치: 1401.1.
메이탄시놀 3-(2 S ,15 R )-19-(2-(2-(1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1 H -인돌-1-일)-15-(2-(카르복시)에틸)-2,3-디메틸-4,14,17-트리옥소-7,10-디옥사-3,13,16-트리아자노나데카노에이트 (20)
453.6 mL DMA 중 피페리딘 (90.7 μL, 0.92 mmol)의 용액을 메이탄시노이드 19 (64.5 mg, 0.05 mmol)를 첨가하면서 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을, 추가적인 처리 없이, 용리제로서 0-100% CH3CN-H20 구배를 사용하여 C18 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 흰색 막으로서 49.1 mg (90%) 메이탄시노이드 20을 공급하였다.
C58H82ClN8O16 [M+H]+에 대한 MS (ESI) 계산치: 1181.6 실측치: 1181.3.
결과 및 논의
항체 태그-배치 라이브러리의 개발 및 초기 스크리닝
인간 IgG1 결정 구조를 조사하여 중쇄 및 경쇄 불변 영역 내에서 노출되고, 상대적으로 비구조화된 면적을 확인하였다. 태그를 고유한 IgG 구조를 최소한으로 교란시키는 위치에 설치하였지만, 컨쥬게이션을 위해 접근 가능하게 유지하였다. 알데하이드 태그 배치를 위해 8개의 부위를 선택하였다. 각각의 태그는 각각의 항체가 두 개의 알데하이드 기를 포함하도록 중쇄 또는 경쇄 중 하나에 포함되었다. 경쇄 내 하나의 내부 부위 및 중쇄 내 7개의 부위를 선택하였다: CH1에서 세 개, CH2에서 두 개, CH3에서 하나, 및 C-말단에서 하나 (도 2, 상단). 이 부위들을 N-에서 C-말단으로 그것들의 순서에 따라 알파벳 순으로 라벨링하였다 (즉, 태그 A-G). 경쇄 태그를 "LC"로 지정하였다. 선택된 태그 부위를 원형 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄의 불변 영역으로 클로닝하였다. 단백질을 공통 서열 내에서 fGly로 Cys의 효율적인 전환을 보장하도록 세포 과발현 인간 FGE의 대량의 풀에서 일시적으로 생산하였다. 항체를 단백질 A를 사용하여 정제하였고 PBS에 저장하였다.
인 실리코(in silico) 분석에 의해 면역원성에 대하여 알데하이드 태그된 항체를 테스트하기 위한 실험을 수행하였다. 공지된 MHC 등급 II 펩타이드 결합 모티프 (iTope™) 및 이전에 확인된 면역원성 서열 (TCED™) 둘 다를 포함하는 소프트웨어를 사용하여 많은 MHC 맥락에서 높은 및 중간 친화도로 무차별적으로 결합할 수도 있는 펩타이드를 확인하였다. 이 분석을 근거로 하여, 면역원성일 가능성이 큰 펩타이드를 생성하기 위해 태그 B를 결정하였다. 그 다음에, 항체 안정성에 대한 태그 배치의 효과를 해결하기 위해, 응집을 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)로 분석하였다. 태그된 항체 중 여섯 개는 매우 적은 응집을 나타냈다 (표 2). CH2 및 CH3 도메인에서 각각 태그 D 및 F를 함유하는 두 개의 항체는 상당한 응집을 나타냈다.
알데하이드 태그는 항체 백본을 따라 다양한 위치로 삽입될 때 내약성(well-tolerated)이었다.
태그 지정 태그 도메인 태그에 접한 잔기* % 응집
A CH1 G118, V121 0
B CH1 P123, S128 0
C CH1 A165, G169 2.3
D CH2 D283, E285 31.5
E CH2 N344, A349 4.5
F CH3 G361, E366 76
G C-말단 K478 7
LC LC A153, Q155 0
* Kabat 넘버링.
항체 트라스투주맙 및 세포독소 페이로드 메이탄신을 포함하는 부위-특이적 ADC를 생성하기 위한 실험을 수행하였다. 트라스투주맙을 LC, 태그 C, 또는 태그 G 위치에서 알데하이드 태그로 발현시켰으며, 이것은 항체 도메인에 걸쳐 분포된 컨쥬게이션 부위를 나타냈다. 이 태그 배치들은 양호한 항체 역가를 생성하였고, 낮은 응집을 가지고 있었으며, 잘 갖추어진(well-behaved) ADC를 생산하기 위해 용이한 컨쥬게이션을 거쳤으며, 크로마토그래피 분석, 뿐만 아니라 생물물리학적 및 기능적 테스트에 의해 결정된 바와 같다. 이에 더하여, 실험에서 비교기로서 사용하기 위해 통상적인 리신 화학반응을 통해 트라스투주맙을 SMCC-DM에 컨쥬게이션하여 ADC (αHER2-DM1)을 제조하였다.
알데하이드 - 태그된 αHER2 항체 상의 세 개의 다른 위치로의 세포독성 페이로드의 부위-특이적 컨쥬게이션은 안정한 ADC를 수득하였다
인간 포르밀글리신-생성 효소 (FGE)를 과발현하는 세포의 대량의 풀에서 경쇄 (LC), CH1 도메인 (태그 C), 또는 중쇄 C-말단 (CT, 태그 G)에서 알데하이드 태그를 함유하도록 변형된 트라스투주맙 항체를 생산하였다. LC, CH1, 또는 CT에서 태그된 항체 각각에 대하여 165, 546, 및 660 mg/L의 UTiter를 얻었다. Cys에서 fGly로의 전환 효율에 관하여, 86%, 92%, 및 98% 전환을 LC, CH1, 및 CT, 각각에서 얻었으며, 질량 분석법에 의해 측정된 바와 같다. 37 ℃에서 fGly-태그된 항체에 0.85% DMA 및 0.085% Triton X-100을 함유하는 50 mM 나트륨 시트레이트, 50 mM NaCl pH 5.5 중 HIPS-Glu-PEG2-메이탄신을 처리하여 컨쥬게이션 반응을 수행하였고, 반응의 진행을 분석적 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)로 추적하였다. 완료시, 과도한 페이로드를 접선 유동 여과로 제거하였고 컨쥬게이션되지 않은 항체를 예비 HIC로 제거하였다. 이 반응들은 CH1 및 CT 태그 부위에서 fGly로 HIPS 링커 페이로드의 >90% 컨쥬게이션 효율, 및 LC 태그 부위에서 75% 컨쥬게이션 효율을 수득하였다. 최종 생성물의 HIC 분석을 도 3에서 도시한다. 컨쥬게이트의 SEC 분석은 최소한의 응집을 나타냈다 (도 7). 지시된 위치에서 태그된, 컨쥬게이션되지 않은 ADC 및 HIPS-Glu-PEG2-메이탄신 컨쥬게이션된 ADC를 SEC로 분석하였다. 총 응집체는 모든 경우에서 ≤5%였다.
항체 구조에 대한 태그 통합의 효과를 평가하기 위해서, 이 항체들의 열 안정성을 열 형광 발광으로 검사하였다. 태그되지 않은 서열 뿐만 아니라 LC, CH1, 또는 CT 위치에서 태그된 항체를 포함하는 테스트된 αHER2 항체 (범위 67.6 - 68 ℃) 중에서 Tm1 (가장 낮은 관찰된 열 전이)에서 검출 가능한 차이는 없었다 (표 3).
알데하이드 태그 삽입 및 ADC 생산은 열 형광 발광에 의해 측정된 바와 같이 열 안정성에 영향을 주지 않는다.
태그되지 않은 αHER2 αHER2 CH1 αHER2 CT αHER2 LC αHER2 CT HIPS-Glu-PEG2-May
판독 1* 67 68 67 68 67
판독 2 68 68 68 68 67
판독 3 68 68 68 68 66
평균 67.7 68.0 67.7 68.0 66.7
표준 편차 0.6 0.0 0.6 0.0 0.6
* 숫자는 ℃ 단위의 처음 관찰된 열 전이를 나타낸다.
HIPS-Glu-PEG2-메이탄신과 CT-태그된 항체의 컨쥬게이션은 Tm1에 대하여 작은 효과를 가지며, 태그되지 않은 항체와 비교하여 단지 1도만큼 용융 온도를 감소시켰다. 그 다음에, FcRn 결합에 대한 태그 배치 및 페이로드 컨쥬게이션의 효과를 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 분석으로 결정하였다. FcRn은 항체 약물동력학에서 큰 역할을 할 수도 있으며, pH 6.0에서의 회합 및 pH 7.3에서의 해리 둘 다는 항체의 순환 반감기와 연관성이 있고, 후자의 값은 전자보다 더 큰 영향력을 가진다. 두 파라미터 모두를 결정하였다 (표 4).
알데하이드 태그 삽입 및 페이로드 컨쥬게이션은 항체 FcRn 결합 특성에 최소한으로 영향을 미치고, pH 7.3에서 αHER2-DM1에 비해 개선된 해리를 나타낸다.
측정된 값 태그되지 않은 αHER2 αHER2 CH1 태그 αHER2 CT 태그 αHER2 LC 태그 αHER2 CH1 ADC αHER2 CT ADC αHER2 LC ADC αHER2-DM1 ADC
aKa (~pH 6.0에서 해리) 5.2 ± 1.3 5.2 ± 1.9 5.8 ± 0.7 4.7 ± 1.2 4.8 ± 1.0 4.4 ± 1.1 4.8 ± 1.0 5.0 ± 0.2
pH 7.3에서 5초 후 결합된 % 8.6 ± 0.8 9.9 ± 1.0 9.9 ± 1.7 11.0 ± 1.2 9.5 ± 0.9 b 12.0 ± 1.4 b 10.9 ± 0.6 c 14.9 ± 0.8
a 평균 Ka 값은 일원 ANOVA에 의해 결정된 바와 같이 통계적으로 유의하게 다르지 않다.
b 태그되지 않은 αHER2와 유의하게 다름, p < 0.03, 양측 t-테스트.
c 모든 다른 분석물과 유의하게 다름, p < 0.04, 양측 t-테스트.
대조군은 태그되지 않은 αHER2 및 αHER2-DM1을 포함하였다. 알데하이드 태그 배치 또는 페이로드 컨쥬게이션의 효과는 pH 6.0에서 FcRn KD에서 발견되지 않았다. 그에 반해, pH 7.3에서 해리는 5초 후 결합된 채로 유지되는 항체의 퍼센트에서 차이를 나타냈다. 트라스투주맙은 최소량의 보유된 항체를 가지고 있었고, 알데하이드 태그의 포함은 보유량을 약간 증가시켰지만, 유의하지 않았다. 항체의 컨쥬게이션은 pH 7.3에서 해리에 영향을 주었지만, 알데하이드-태그된 ADC는 αHER2-DM1과 비교하여 덜 영향을 받았다. 후자의 컨쥬게이트 보유량은 모든 다른 측정된 분석물과 유의하게 달랐다. 이 경향은 항체로의 알데하이드 태그의 삽입이 FcRn 결합을 유의하게 조절하는 것은 아니고, 알데하이드-매개 부위-특이적 ADC 생산은 비-특이적으로 컨쥬게이션된 αHER2-DM1과 비교하여 야생형 항체와 더 유사한 FcRn 해리 특성을 가진 ADC를 수득하였다는 것을 나타냈다.
LC, CH1, 및 CT 태그의 면역원성 프로파일을 추가로 분석하기 위해서, 이 구조물의 컨쥬게이션되지 않은 것 및 ADC 버전이 HLA 동종이형의 세계 인구를 대표하는 50명의 건강한 공여체의 백혈구와 함께 인큐베이션되는 생체 외 인간 T-세포 검정 (EpiScreen™)을 수행하였다. 증식 및 IL-2 사이토카인 분비를 평가함으로써 T-세포 반응을 측정하였다. 이 기능적 측정에 의해, LC-, CH1-, 및 CT-태그된 항체의 컨쥬게이션되지 않은 것 및 ADC 버전은 불량한 면역원성이었다 (표 5). 분석물은 양성 대조군, 임상적 면역원성 데이터가 이용 가능한 상대적으로 면역원성인 단클론성 항체인 인간화된 A33에 의해 유도된 샘플 중 22%에서의 증식과 비교하여 단지 2-10%의 공여체 백혈구에서만 T-세포 증식을 유도하였다.
LC, CH1, 및 CT 알데하이드 태그는 세계적인 MHC 등급 II 동종이형을 대표하는 공여체의 T-세포에서 면역 반응을 유도하지 않는다.
샘플 % 반응*
야생형 αHER2 4
컨쥬게이션되지 않은 αHER2 CH1 8
컨쥬게이션되지 않은 αHER2 CT 10
컨쥬게이션되지 않은 αHER2 LC 2
αHER2 CH1 ADC 4
αHER2 CT ADC 6
αHER2 LC ADC 8
대조군 1, 인간화된 A33** 22
대조군 2, KLH*** 74
* % 반응은 T-세포 증식 검정의 결과를 요약한다.
** 벤치마크 임상적 면역원성 데이터가 이용 가능한 상대적으로 면역원성 항체.
*** 광범위하게 인식되는 면역자극 단백질.
다른 항체 백본을 사용하지만 같은 세 개의 태그 배치를 사용하는 유사한 실험 세트에서, 알데하이드-태그된 HIPS 컨쥬게이트의 안정성을 37 ℃에서 혈장에서 테스트하였다. 형광단 (Alexa Fluor 488, AF488) 또는 세포독소 페이로드 (메이탄신)에 부착된 HIPS-Glu-PEG2 링커를 가지고 있는 항체를 테스트하였다. 링커로의 페이로드 부착 (예를 들어, 에스터 대 아릴 아미드 결합, 도 8A 및 8B 참조)의 차이가 어떻게 안정성에 영향을 주는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 결과는 HIPS 화학반응이 매우 안정하다는 것을 나타냈다. AF488 컨쥬게이트에 대하여, 페이로드 신호의 손실은, 태그 배치와 관계없이, 래트 혈장에서 37 ℃에서 12 d 동안 관찰되지 않았다. (도 9A). 하지만, 이 안정성은 메이탄신 컨쥬게이트로 완전히 변형되지 않았으며, 이것은 시간이 흐름에 따른 페이로드 신호의 일부 손실을 나타냈다 (도 9B). 페이로드 손실의 양은 태그 배치에 따라 달랐는데, CT 부위는 가장 큰 안정성을 나타냈으며, CH1 및 LC 부위가 뒤따른다. AF488 및 메이탄신 컨쥬게이트 간의 안정성의 차이는 링커의 PEG2 부분에 페이로드를 결합시키는 다른 결합에 관한 것일 수도 있다 (도 8A 및 8B). AF488은 안정한 아릴 아미드 결합에 의해 PEG2에 부착되는 한편, 메이탄신 페이로드를 연결하는 에스터 결합이 높은 pH에서 화학적으로 유리하다. 그러므로, 세 개의 ADC의 안정성에서 관찰된 차이는 세 개의 부착 부위에서, pH 효과를 포함하는, 별개의 국소적 환경을 반영할 수도 있다.
LC-, CH1-, 및 CT- 태그된 ADC는 시험관 내 및 생체 내에서 종양 표적에 대하여 강력한 활성을 나타냈다
효능을 측정하기 위해서, ADC를 시험관 내에서 HER2-과발현 세포주, NCI-N87에 대하여 테스트하였다. 유리 메이탄신을 비교기로 사용하였다. 세 개의 αHER2 HIPS-Glu-PEG2-메이탄신 ADC 컨쥬게이트는 모두 pM 활성을 나타냈는데, 이것은 유리 메이탄신과 동등하였다 (도 10). IC50 측정값은 이 분석물들 중에서는 크게 다르지 않았다. 그에 반해, 아이소타입 대조군 CT-태그된 컨쥬게이트는 근본적으로 활성을 나타내지 않았다.
LC-, CH1-, 및 CT-태그된 αHER2 ADC의 생체 내 효능을 SCID 마우스의 NCI-N87 이종이식 모델을 사용하여 평가하였다. 트라스투주맙 단독 및 아이소타입 대조군 CT-태그된 HIPS-Glu-PEG2-메이탄신 ADC를 음성 대조군으로 사용하였고, αHER2-DM1 (DAR 3.4)를 비교기로서 포함하였다. 모든 화합물을 연구의 시작시 단일 5 mg/kg 용량으로 투여하였다. 트라스투주맙 또는 아이소타입 대조군 ADC가 처치된 마우스에서 종양은 계속해서 성장하는 한편, αHER2-표적화된 ADC의 단일 용량은 처치된 동물에서 ~30일 동안 종양 성장을 중단시키기에 충분하였다 (도 11A). 종양이 결국 다시 성장하기 시작할 때, 종양 크기는 LC- 또는 CT-태그된 ADC 처치된 동물들과 비교하여, CH1-태그된 ADC 또는 αHER2-DM1이 처치된 동물에서 더 컸다. 이 효과를 조사하기 위해서, 다양한 처리로 투여된 종양에 대하여 log10 세포 살해를 결정하였다 (표 6). 결과는 CH1-태그된 ADC의 처리가 다른 ADC의 처리와 비교하여 더 적은 종양 세포를 살해하였다는 것을 나타냈다. CT-태그된 ADC가 가장 효과적인 컨쥬게이트인 것으로 나타났으며 가장 높은 log10 세포 살해를 초래한다. 이 증가된 효력은 CT-태그된 ADC 처치된 동물에 대한 상당한 생존 이점으로 변형되었다 (도 11B).
단일 5 mg/kg ADC 투여에 의해 달성된 NCI-N87 종양 세포의 생체 내 log10 세포 살해
처리 Log10 세포 살해
αHER2 CT ADC 1.24
αHER2 CH1 ADC 0.83
αHER2 LC ADC 1.08
αHER2-DM1 ADC 1.03
항체 상의 다른 위치에서 페이로드를 가지고 있는 ADC는 별개의 약물동력학을 나타냈다
ADC의 PK 프로파일을 평가하기 위해 실험을 수행하였다. 마우스에 LC-, CH1-, 또는 CT-태그된 ADC 5 mg/kg, 또는 비교기로서 트라스투주맙 또는 αHER2-DM1을 투여하였다. 혈장을 마우스로부터 수거하였고 총 ADC 및 총 항체 농도를 정량화하기 위해 ELISA로 분석하였다. 총 ADC를 측정하기 위해서, 분석물을 항-인간 Fab-특이적 항체로 캡쳐하였고 항-메이탄신 항체로 검출하였다. 총 항체를 측정하기 위해서, 분석물을 항-인간 IgG-특이적 항체로 캡쳐하였고 항-인간 Fc-특이적 항체로 검출하였다. 시간이 흐름에 따라 측정된 농도를 비선형 회귀에 의한 2-구획 모델에 적용하여 반감기를 결정하였다 (표 7). 각각의 알데하이드-태그된 ADC에 대한 총 항체 반감기는 트라스투주맙과 같거나, 더 길었으며, 알데하이드 태그 삽입 및 HIPS 컨쥬게이션이 항체의 근본적인 PK 속성을 변화시키지 않았다는 것을 나타낸다. 그에 반해, αHER2-DM1 컨쥬게이트의 총 항체 반감기는 비-특이적 컨쥬게이션 화학반응 (초과-컨쥬게이션된 종으로 이어짐)이 PK에 대하여 부정적인 효과를 가진다는 것을 나타낸다. 컨쥬게이션된 항체 (총 ADC) 반감기를 또한 측정하였는데, 이것은 가장 큰 생존 이점을 종양-함유 마우스에 부여하는 CT-태그된 ADC가 또한 가장 긴 총 ADC 반감기를 가진다는 것을 나타냈다. αHER2-DM1, 및 CH1- 및 LC-태그된 ADC의 컨쥬게이트 반감기는 CT-태그된 컨쥬게이트보다 더 짧았다. 이 숫자는 컨쥬게이션 부위가 ADC 반감기를 통제하는데 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 나타냈다. 모든 경우에서, 알데하이드-태그된 컨쥬게이트는 순환시 안정하였으며, 총 항체 농도에 대한 총 ADC의 퍼센트 곡선 아래 면적 비율은 76-81%의 범위에 있다 (도 12). αHER2-DM1 컨쥬게이트는 72%의 비율을 갖고 있었다.
총 항체 및 총 ADC 반감기는 태그 배치 및 컨쥬게이션 화학반응에 의해 영향을 받았다.
분석물 총 ADC 반감기 (일) 총 항체 반감기 (일) % 비율 AUC*
αHER2 CT ADC 7.1 ± 0.4 17.2 ± 2 81
αHER2 LC ADC 5.63 ± 0.2 14 ± 1.7 79
αHER2 CH1 ADC 5.6 ± 0.2 13.12 ± 1 76
αHER2-DM1 ADC 6 ± 0.3 10.7 ± 0.7 72
트라스투주맙 n.a.** 13.65 ± 1 n.a.**
* 비율 곡선 아래 면적 (총 ADC/총 항체).
** 적용 불가능.
ADC 구조-활성 관계 맵핑 (mapping)
HIPS 화학반응과 커플링된 알데하이드 태그가 항체 중쇄 및 경쇄에 세포독성 페이로드를 부위-특이적으로 컨쥬게이트하는데 사용될 수 있다는 것을 보여주는 실험을 수행하였다. 실험은 SAR 공간의 분석에 관하여 유연성을 허용하는, 내부의 컨쥬게이션 배치, 뿐만 아니라 N- 또는 C-말단 부위의 변화 및 ADC 구조의 최적화를 포함하였다. 이 접근법은 통상적인 컨쥬게이트와 비교하여, 감소된 약물 로딩으로 개선된 PK 및 동등하거나 더 나은 효능을 가지는 ADC를 생성하였다. 알데하이드-태그된 ADC는 또한 PK 실험에서 테스트된 총 항체 농도에 대한 총 ADC의 높은 곡선 아래 면적 비율로 나타난 바와 같이 생체 내에서 매우 안정하였다. 이러한 관찰된 안정성은 HIPS 화학반응 때문일 가능성이 크며, 이것은 항체 및 페이로드 사이에서 C-C 결합을 형성하였다.
별개의 항체 도메인에서 컨쥬게이션 부위를 가진 세 개의 알데하이드-태그된 ADC를 테스트하여 CT-태그된 ADC가 CH1- 및 LC-태그된 ADC와 비교하여 우수한 PK 및 생체 내 효능을 가진다는 것을 관찰하였다. 세 개의 태그 위치에서 발명자들이 관찰한 ADC 안정성의 차이는 항체에 링커/페이로드를 결합시키는 HIPS 화학반응보다는 PEG2 링커에 메이탄신을 연결하는 에스터 결합의 효과 때문일 수도 있다. 에스터 결합은 더 높은 pH에서 분열되기 쉬울 수도 있다; 그러므로, LC, CH1, 및 CT 위치에서 컨쥬게이션된 메이탄신의 안정성의 차이는 상기 부위에서 국소적 pH 효과의 변화를 반영할 수도 있다. 예를 들어, 1) 안정한 아릴 아미드 결합에 의해 PEG2에 결합되는 AF488 컨쥬게이트는 태그 배치에 관계없이 시험관 내 안정성 검정에서 페이로드의 손실을 나타내지 않았고; 2) 가장 안정한 컨쥬게이션 부위, CT 태그는 노출된 최고의 용매일 것으로 예상되었고, 따라서 단백질에 영향을 받은 국소적인 pH 효과보다는 주위 용매의 pH를 경험할 가능성이 더 크다는 것을 관찰하였다.
실시예 2
링커 부분에서 달라지는 항-HER2 ADC를 생산하였다. 메이탄신 페이로드로의 히드라지닐-아이소-피테트-스펭글러 (HIPS) 결찰을 사용하여 컨쥬게이션된 알데하이드-태그된 항-HER2 단백질을 사용하여 ADC를 제조하였다. 결과로 생긴 ADC는 균질하였으며, 잘 한정된 약물-대-항체 비율 (DAR)은 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)로 평가된다. 링커 디자인의 차이는 단일 및 다회수 용량 효능 이종이식 연구 둘 다에서 이 컨쥬게이트 들의 효능에 영향을 주었다.
알데하이드 태그를 화학적 변형을 위해 단백질을 부위-특이적으로 기능화하는데 사용하였다. 유전적으로 암호화된 태그는 포르밀글리신-생성 효소 (FGE)에 의해 특이적으로 인식되는 펜타펩타이드 서열 (CXPXR)을 포함하였다. 세포에서 단백질 발현 중에, 서열 내 시스테인 잔기는 FGE에 의해 인식되고 포르밀글리신으로 동시-번역에 의해 산화되었다. 결과로 생긴 알데하이드를 결찰을 위한 생물 직교 화학 손잡이로 사용하였다. 2-((1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1H-인돌에서 종결되는 링커는 아이소-피테트-스펭글러 반응에 의해 알데하이드와 반응하여 아자카르볼린을 형성하며, 그 결과 항체 및 페이로드를 결합하는 안정한 C-C 결합이 형성되었다.
메이탄신 -함유 약물-링커 구조물의 구조
Figure 112016123593442-pct00050
일반적인 합성 계획
계획 6
Figure 112016123593442-pct00051
다양한 링커 조성의 효과를 검사하기 위해서, 알데하이드-태그된 αHER2 항체의 C-말단에 공유 결합에 의해 결찰된 다섯 개의 다른 메이탄신 컨쥬게이트를 제조하였다. ADC는 상기 화합물 101-105의 구조에서 나타난 바와 같이 그것들의 링커 조성에 관하여 달랐다. 가용성을 돕기 위해 작용기를 포함시켰다. 링커 구조 101, 102, 103, 및 104는 PEG2 스페이서를 함유하는 한편, 링커 105에서는 C3 스페이서를 사용하였다. 링커는 반응성 2-((1,2-디메틸히드라지닐)메틸)인돌 (HIPS) (101, 102, 103, 및 105) 또는 2-((1,2-디메틸히드라지닐)메틸)피롤로[2,3-b]피리딘 (아자HIPS) (104)에서 종결되었다. 링커는 음전하로 대전된 또는 중성 측쇄를 가진 아미노산을 포함하였다. 대표적인 링커의 합성은 상기 일반적인 합성 계획, 계획 6에서 나타난다. 링커 101을 도시하는 예에서, peg화된, 보호된 아미노산을 펜타플루오로페닐 에스터 109에 커플링하였다. 그 후 생성물 110을 HATU를 사용하여 N-데아세틸메이탄신에 커플링한 후 이어서 tert-부틸 에스터를 가수분해하고 피페리딘으로 Fmoc-보호기를 제거하였다.
C-말단에 태그된 αHER2 항체로 약물/링커의 컨쥬게이션을 37 ℃에서 항체에 0.85% DMA 및 0.085% Triton X-100을 함유하는 50 mM 나트륨 시트레이트, 50 mM NaCl pH 5.5 중 8-10 당량의 링커-메이탄신을 처리하여 수행하였고, 반응의 진행을 분석적 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)로 관찰하였다. 완료시, 과도한 페이로드를 접선 유동 여과로 제거하였고 컨쥬게이션되지 않은 항체를 예비 HIC로 제거하였다. 이 반응들은 >90% 컨쥬게이션 효율을 가지고 있었다. 정제 후, ADC는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 결정된 바와 같이 1.7의 평균 약물-대-항체 비율 (DAR)을 함유하였다 (데이터 미도시). 조제물은 크기-배제 크로마토그래피로 평가된 바와 같이 ≥95% 모노머였다 (데이터 미도시).
혈장에서 37 ℃에서 14일 동안 HIPS-결찰된 ADC의 안정성을 항-Fc 신호에 대한 항-페이로드의 비율을 비교하는 ELISA-기반 방법을 사용하여 결정하였다. 집단적으로, 컨쥬게이트는 높은 정도의 안정성을 나타냈으며, 단지 작은 차이만 있었다 (표 8 참조). ADC의 시험관 내 세포독성을 HER2-과발현 세포주, NCI-N87에 대하여 테스트하였다. 모든 ADC는 피코몰 활성을 가지며 (도 13), IC50 값은 유리 메이탄신의 처리 후 관찰된 것과 유사하거나 더 낫다.
HER2를 과발현하는 NCI-N87 세포를 6일 분석에서 시험관 내 세포독성에 대한 표적으로 사용하였다. 유리 메이탄신을 양성 대조군으로서 포함시켰고, 아이소타입 대조군 ADC를 음성 대조군으로 사용하여 특이성을 나타냈다. IC50 값 (유리 약물의 경우를 제외하고 항체 농도를 반영함)을 다음과 같이 측정하였다: 유리 메이탄신, 250 pM; 링커 101, 170 pM; 링커 102, 160 pM; 링커 103, 110 pM; 링커 104, 96 pM; 링커 105, 120 pM; 아이소타입 대조군 ADC, 결정 불가. 도 13 참조.
다른 링커로 제조된 ADC는 혈장에서 37 ℃에서 유사한 안정성을 나타낸다
ADC 7일 후에 남아있는 % 컨쥬게이트 14일 후에 남아있는 % 컨쥬게이트
αHER2-링커 101 93 81
αHER2-링커 102 85 74
αHER2-링커 103 93 77
αHER2-링커 104 97 83
αHER2-링커 105 95 77
ADC의 생체 내 효능을 SCID 마우스에서 마우스 NCI-N87 이종이식 모델을 사용하여 평가하였다. 화합물을 연구의 시작시 단일 5 mg/kg 용량으로서 투여하였다. 종양 성장을 정지시켰고, 일부 종양은 αHER2 ADC의 처리 후 크기가 감소되었지만 (도 14A), 아이소타입 대조군 ADC (링커 101을 사용하여 컨쥬게이션됨)의 처리 후에는 그렇지 않았다. 결국, 종양은 처치에 사용된 ADC에 따라 모든 동물에서, 일부 군에서는 다른 군보다 더 빨리, 재성장하기 시작하였다. 투여 후 60-70일까지, αHER2 ADC가 처치된 군들 중에서 평균 종양 부피의 차이가 있었다; 구체적으로는, 평균 종양 부피의 범위는 제60 일에 249 내지 487이었다 (도 14A). 다양한 처리로 투여된 종양에 대한 log10 세포 살해를 결정하였다 (표 9). 결과는 링커 101 및 104에 컨쥬게이션된 ADC의 처리가 다른 ADC의 처리와 비교하여 더 많은 종양 세포를 살해하였다는 것을 나타냈다. 이 두 개의 링커는 서로 결찰 중에 형성된 아자카르볼린의 질소 기가 달랐다. 이 증가된 효력은 링커 101 또는 104에 컨쥬게이션된 ADC가 처치된 동물에 대하여 큰 생존 이점을 초래하였다 (도 14B). 링커 105의 효능은 글루탐산 모이어티를 공유하는 링커 101 및 104와 비교하여 감소되었다. 이 링커 시리즈의 결과는, 이 맥락에서, C3 스페이서의 포함은 PEG2 스페이서와 비교하여 효력을 감소시켰다는 것을 나타냈다. 다른 아미노산을 포함하는 두 개의 다른 링커는 다양한 효능을 가지고 있었다. 링커 102는 중간 log10 세포 살해 값 (연구의 과정 전반에 걸쳐 살해된 세포를 반영함)을 나타냈지만, 연구의 처음 10일에서 가장 큰 생체 내 효능을 가지며, 다른 처리보다 더 많이 종양 부피를 감소시킨다 (도 14A). 가장 낮은 생체 내 효능을 가지는 링커 103은 또한 110 pM의 IC50 값에도 불구하고, 시험관 내에서 NCI-N87 표적 세포의 불완전한 살해를 초래한다. 모든 ADC는 내약성이며 동물은 처치 후 최대 40일까지 >15% 중량 손실을 나타내지 않는다 (도 15). 마우스에 제0 일에 ADC의 단일 5 mg/kg 볼루스를 투여하였고 처음 5일 동안 매일 및 이어서 그 이후에는 격주마다 체중을 모니터링하였다 (도 15). SCID 마우스에 HIPS 화학반응을 사용하여 링커-메이탄신 페이로드에 컨쥬게이션된 αHER2 ADC 5 mg/kg의 처치는 체중에 영향을 주지 않았다.
CB.17 SCID 마우스 (8마리/군)에 NCI-N87 세포를 피하로 이식하였다. 종양이 ~113 mm3에 도달하였을 때, 동물에게 링커 101-105에 컨쥬게이션된 αHER2 또는 링커 101에 컨쥬게이션된 아이소타입 대조군 항체의 단일 5 mg/kg 용량을 제공하였다. 도 14A는 주 2회 모니터링된 종양 성장의 그래프를 나타낸다. 도 14B는 생존 곡선의 그래프를 나타내며, 이것은 테스트된 태그 배치 중에서 효능의 차이를 나타낸다. 종양이 800 mm3에 도달했을 때 또는 연구의 제112 일에, 어느 쪽이 먼저 일어나든, 동물을 안락사시켰다.
단일 5 mg/kg ADC 용량에 의한 NCI-N87 종양 세포의 생체 내 log10 세포 살해
αHER2 ADC 링커 조성 Log10 세포 살해
링커 101 1.24
링커 102 0.82
링커 103 0.65
링커 104 1.22
링커 105 0.92
두 개의 링커를 다회수 용량 효능 연구에 사용하였다. 종양 성장, log10 세포 살해, 및 생존에 의해 측정된 바와 같이 전반적인 효력 때문에 링커 101을 사용하였다. 링커 102를 가장 빠른 초기 종양 감소를 나타내기 때문에 사용하였으며, 이것은 다회수 용량 설정에서 증가된 효능을 초래할 수도 있다. 다회수 용량 연구는 SCID 마우스에서 NCI-N87 종양을 사용하였다. 동물에 4주 동안 주 1회 투여하였다 (5 mg/kg). 실험은 두 팔을 사용하였으며 - 종양이 180 또는 400 mm3의 평균 부피에 도달했을 때 투여를 시작하였다. 링커 101 및 102 둘 다로 제조된 αHER2 ADC는 더 작은 종양에 대하여 매우 활성이었고 (도 16A), 유사한 수준의 종양 제어를 초래하였다. 더 큰 종양에 대해서는, 링커 102로 제조된 αHER2 ADC가 더 큰 효능을 나타냈으며, 링커 101로 제조된 ADC와 비교하여 더 큰 수준의 종양 억제를 초래하였다 (도 16B). 제42 일에 처리된/대조군 종양 부피는 각각 링커 101 및 102에 대하여 0.39 및 0.26이었다.
상기 논의된 바와 같이, 다른 링커를 함유하는 C-말단으로 컨쥬게이션된 αHER2 ADC의 패널을 생성하였고, 링커의 구조적 변화가 NCI-N87 종양 모델에 대하여 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 ADC 효력의 큰 차이로 이어진다는 것을 관찰하였다.
실험 과정
생체 컨쥬게이션 , 정제, 및 HPLC 분석
알데하이드-태그된 항체 (15 mg/mL)를 0.85% DMA 및 0.085% Triton X-100을 함유하는 50 mM 나트륨 시트레이트, 50 mM NaCl pH 5.5에서 37 ℃에서 72 h 동안 메이탄신-함유 약물 링커 (8 mol. 당량 약물:항체)에 컨쥬게이션하였다. 유리 약물을 접선 유동 여과를 사용하여 제거하였다. 컨쥬게이션되지 않은 항체를 이동상 A: 1.0 M 암모늄 설페이트, 25 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.0, 및 이동상 B: 25% 아이소프로판올, 18.75 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.0을 구비한 예비-규모 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC; GE Healthcare 17-5195-01)를 사용하여 제거하였다. 33% B의 등용매 구배를 사용하여 컨쥬게이션되지 않은 물질을 용출한 후 이어서 41-95% B의 선형 구배를 사용하여 단일- 및 이중-컨쥬게이션된 종을 용출하였다. 최종 생성물의 DAR을 결정하기 위해서, ADC를 이동상 A: 1.5 M 암모늄 설페이트, 25 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.0, 및 이동상 B: 25% 아이소프로판올, 18.75 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.0을 구비한 분석적 HIC (Tosoh #14947)로 검사하였다. 응집을 결정하기 위해서, 샘플을 300 mM NaCl, 25 mM 나트륨 포스페이트 pH 6.8의 이동상을 구비한 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (SEC; Tosoh #08541)를 사용하여 분석하였다.
시험관 내 안정성
ADC를 ~ 1 pmol (페이로드)/mL로 래트 혈장에 첨가하였다. 샘플을 앨리쿼트하여 사용할 때까지 -80 ℃에서 저장하였다. 앨리쿼트를 지시된 시간 동안 5% CO2 하에 37 ℃에 둔 다음, ELISA로 분석하여 항-메이탄신 및 항-Fab 신호를 평가하였다. 갓 해동된 앨리쿼트를 컨쥬게이션에 대한 기준 시작값으로 사용하였다. 모든 분석물을 한 플레이트 상에서 함께 측정하여 전체 시점에 걸친 비교를 가능하게 하였다. 먼저, 분석물을 블로킹 버퍼(blocking buffer)에서 20 ng/mL (검정의 선형 범위 내)로 희석하였다. 이어서, 분석물을 항-인간 Fab-특이적 항체로 코팅된 플레이트 상에서 캡쳐하였다. 그 다음에, 페이로드를 항-메이탄신 항체에 이어서 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체로 검출하였다; 총 항체를 직접적으로 컨쥬게이션된 항-인간 Fc-특이적 항체로 검출하였다. 결합된 2차 항체를 TMB 기질을 이용하여 가시화하였다. 비색 반응을 H2SO4로 중단시켰고, 450 nm에서의 흡광도를 Molecular Devices SpectraMax M5 플레이트 리더를 사용하여 결정하였다. 데이터 분석을 엑셀에서 수행하였다. 각 샘플을 4배수로 분석하였고, 평균값을 사용하였다. 항-Fab 신호에 대한 항-메이탄신 신호의 비율을 항체 컨쥬게이션의 측정값으로 사용하였다.
시험관 내 세포독성
HER2-양성 유방 암종 세포주, NCI-N87를 ATCC로부터 얻었고 10% 태아 소 혈청 (Invitrogen) 및 Glutamax (Invitrogen)가 보충된 RPMI-1640 배지 (Cellgro)에서 유지하였다. 플레이팅 24 h 전에, 지수증식기 성장을 보장하기 위해서 세포를 계대배양하였다. 플레이팅 당일에, 5000개 세포/웰을 10 IU 페니실린 및 10 μg/mL 스트렙토마이신 (Cellgro)이 보충된 90 μL 정상 성장 배지에서 96-웰 플레이트 상에 분주하였다. 세포에 희석된 분석물 10 μL을 다양한 농도로 처리하였고, 플레이트를 5% CO2의 대기에서 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 6 d 후, 100 μL/웰의 Cell Titer-Glo 시약 (Promega)을 첨가하였고, 발광을 Molecular Devices SpectraMax M5 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 IC50 계산을 포함하는 데이터 분석에 사용하였다.
이종이식 연구
암컷 C.B-17 SCID 마우스에 50% Matrigel 중 1 x 107 NCI-N87 종양 세포를 피하로 접종하였다. 종양이 평균 112 mm3에 도달했을 때, 동물에게 단일 5 mg/kg 용량의 ADC, 트라스투주맙 항체 (태그되지 않음), 또는 비히클 단독을 제공하였다. 동물을 체중 및 종양 크기에 대하여 주 2회 관찰하였다. 종양 부피를 다음 식을 사용하여 계산하였다:
Figure 112016123593442-pct00052
상기 식에서 w = 종양 너비, 및 l = 종양 길이이다.
마우스의 네 개의 군들의 종양 성장 속도 곡선의 평균을 계산하여 종양 배가 시간을 얻었다. 이어서, log10 세포 살해를 다음 식을 사용하여 추정하였다:
Figure 112016123593442-pct00053
합성 과정
계획 7
Figure 112016123593442-pct00054
( S )-5-(3-( tert - 부톡시 )-3- 옥소프로필 )-1-(9 H - 플루오렌 -9-일)-3,6- 디옥소 -2,10,13-트리옥사-4,7-디아자헥사데칸-16-오익 산 (110)의 제조
아민 109 (710.3 mg, 4.0 mmol), 및 Na2CO3 (637.9 mg, 6.0 mmol)을 교반 막대를 함유하는 20 mL 유리 신틸레이션 바이알에 첨가하였다. 물 (10.0 mL)을 첨가하였고 용액을 20 ℃에서 5분 동안 교반하여, 투명한 무색 용액을 제공하였다. 펜타플루오로페닐 에스터 108 (1185.7 mg, 2.0 mmol)을 별도의 20 mL 유리 신틸레이션 바이알에 첨가하였고 10.0 mL 1,4-디옥산에 용해시켰다. 바이알을 1분 동안 보텍싱하여 투명한 무색 용액을 제공하였으며 이것을 상기 제조된 용액에 적가하여, 흰색 침전물을 제공하였다. 반응물을 20 ℃에서 4 h 동안 교반하였고, 물 70 mL에 첨가하였고, 1 M HCl의 적가에 의해 pH 3으로 산성화하였고, 2 x 50 mL EtOAc로 추출하였고, Na2SO4 위에서 건조시켰다. 유기 분획을 여과, 증발, 및 용리제로서 0-100% CH3CN-H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 생성물을 높은 진공 하에 건조시켜서 끈적거리는 흡습성 흰색 고체로서 1137.3 mg (97%)의 화합물 110을 공급하였다.
( S )-7-아미노-2,2-디메틸-4,8- 디옥소 -3,12,15-트리옥사-9- 아자옥타데칸 -18-오익 산 ( 111)의 제조
화합물 110 (2638.7 mg, 4.513 mmol)을 DMF (8.92 mL) 중 피페리딘 (2.23 mL, 22.57 mmol) (20 부피% 피페리딘)의 용액에 용해시켰고 20 ℃에서 1 h 동안 교반하였다. 흰색 침전물이 형성되었다. 반응물을 여과하여, 투명한 연노란색 용액을 제공하였다. 용액을 증발시켰고 용리제로서 0-100% CH3CN-H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 단리된 생성물을 높은 진공 하에 건조하여 투명한 점성 오일로서 813.1 mg (50%)의 화합물 111을 제공하였다.
( S )-7-(3-(2-((2-(((9 H - 플루오렌 -9-일) 메톡시 )카르보닐)-1,2- 디메틸히드라지닐 )메틸)-1 H -인돌-1-일)프로판아미도)-2,2-디메틸-4,8-디옥소-3,12,15-트리옥사-9-아자옥타데칸-18-오익 산 (113)의 제조
화합물 111 (582.4 mg, 1.607 mmol)을 건조된 교반 막대를 함유하는 건조된 20 mL 유리 신틸레이션 바이알에 첨가하였다. 무수 DMF (5 mL) 및 (i-Pr)2NEt (0.84 mL, 4.82 mmol)를 첨가하였고, 용액을 20 ℃에서 5분 동안 교반하여, 투명한 매우 연한 노란색의 용액을 제공하였다. 에스터 112 (1253.7 mg, 1.930 mmol)를 5분 동안 나누어서 첨가하였고 반응물을 20 ℃에서 2 h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 추가적인 처리 없이 용리제로서 0-100% CH3CN-H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 생성물을 높은 진공 하에 건조시켜서 흰색 막으로서 406.3 mg (49%)의 화합물 113을 공급하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.78 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.62 (m, 2H), 7.54 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.42 (m, 1H), 7.41 (dd (app. t), J = 7.4 Hz, 2H), 7.32 (m, 2H), 7.23 (m, 1H), 7.10 (dd (app. t), J = 7.4 Hz, 1H), 7.06 (m, 1H), 4.76 (m, 1H), 4.70-4.42 (m, 4H), 4.26 (m, 1H), 4.03 (m, 2H), 3.80 (m, 1H), 3.75 (m, 1H), 3.70-3.42 (m, 9H), 3.37(m, 1H), 2.81 (s, 3H), 2.70-2.48 (m, 5H), 2.25-1.80 (m, 4H), 1.42 (s, 9H).
계획 8
Figure 112016123593442-pct00055
2-((( tert - 부틸디메틸실일 ) 옥시 ) 메틸 )-1 H -인돌 (115)
오븐에서 건조된 플라스크를 인돌-2-메탄올, 114 (1.581 g, 10.74 mmol), TBSCl (1.789 g, 11.87 mmol), 및 이미다졸 (2.197 g, 32.27mmol)로 충전하였고, 이 혼합물을 CH2Cl2 (40 mL, 무수)에 현탁하였다. 16 h 후, 반응 혼합물을 오렌지색 잔류물로 농축하였다. 미가공 혼합물을 Et2O (50 mL)에 용해시켰고, 수성 AcOH (5 부피%, 3 x 50 mL) 및 소금물 (25 mL)로 세척하였다. 결합된 유기층을 Na2SO4에서 건조하고 농축시켜 추가의 정제 없이 사용되는 결정성 고체로서 2.789 g (99%)의 화합물 115를 제공하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.29 (s, 1H), 7.57 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.37 (dd, J = 8.1, 0.6 Hz, 1H), 7.19 - 7.14 (m, 1H), 7.12 - 7.07 (m, 1H), 6.32 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 4.89 (s, 2H), 0.95 (s, 9H), 0.12 (s, 6H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 138.3, 136.0, 128.6, 121.7, 120.5, 119.8, 110.9, 99.0, 59.4, 26.1, 18.5, -5.2. C15H24NOSi [M+H]+에 대한 HRMS (ESI) 계산치: 262.1627; 실측치: 262.1625.
메틸 3-(2-((( tert - 부틸디메틸실일 ) 옥시 ) 메틸 )-1 H -인돌-1-일) 프로파노에이 트 (117)
CH3CN (25 mL) 중 인돌 115 (2.789g, 10.67 mmol)의 용액에 메틸 아크릴레이트, 116 (4.80 mL, 53.3 mmol)에 이어서 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔 (800 μL, 5.35 mmol)을 첨가하였고, 결과로 생긴 혼합물을 재환류시켰다. 18 h 후, 용액을 냉각시켰고 오렌지색 오일로 농축하였으며 이것을 실리카 겔 크로마토그래피 (9:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 무색 오일로서 3.543 g (96%)의 화합물 117을 수득하였다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.58 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.23 - 7.18 (m, 1H), 7.12 - 7.07(m, 1H), 6.38 (s, 1H), 4.84 (s, 2H), 4.54 - 4.49 (m, 2H), 2.89 - 2.84 (m, 2H), 0.91 (s, 9H), 0.10 (s, 6H). 13CNMR (101 MHz, CDCl3) δ 172.0, 138.5, 137.1, 127.7, 122.0, 121.0, 119.8, 109.3, 101.8, 58.2, 51.9, 39.5, 34.6, 26.0, 18.4, -5.2. C19H30NO3Si [M+H]+에 대한 HRMS (ESI) 계산치: 348.1995; 실측치: 348.1996.
메틸 3-(2-( 하이드록시메틸 )-1 H -인돌-1-일) 프로파노에이트 (118)
0 ℃에서 THF (20 mL) 중 화합물 117 (1.283 g, 3.692 mmol)의 용액에 THF (3.90 mL, 3.90 mmol) 중 테트라부틸암모늄 플루오라이드의 1.0 M 용액을 첨가하였다. 15 분 후, 반응 혼합물을 Et2O (20 mL)로 희석하였고 NaHCO3 (포화 수용액, 3 x 20 mL)로 세척하였고, 연녹색 오일로 농축하였다. 오일을 실리카 겔 크로마토그래피 (2:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 흰색 결정성 고체로서 822 mg (95%)의 화합물 118을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.60 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.34 (dd, J = 8.2, 0.4 Hz, 1H), 7.27 - 7.23 (m, 1H), 7.16 - 7.11 (m, 1H), 6.44 (s, 1H), 4.77 (s, 2H), 4.49 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 3.66 (s, 3H), 2.87 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.64 (s, 1H). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 172.3, 138.5, 137.0, 127.6, 122.2, 121.1, 119.9, 109.3, 102.3, 57.1, 52.0, 39.1, 34.3. C13H15NNaO3 [M+Na]+에 대한 HRMS (ESI) 계산치: 256.0950; 실측치: 256.0946.
메틸 3-(2- 포르밀 -1 H -인돌-1-일) 프로파노에이트 (119)
데스-마틴 페리오디난 (5.195 g, 12.25 mmol)을 CH2Cl2 (20 mL) 및 피리딘 (2.70 mL, 33.5 mmol)의 혼합물에 현탁하였다. 5분 후, 결과로 생긴 흰색 현탁액을 CH2Cl2 (10 mL) 중 메틸 3-(2-(하이드록시메틸)-1H-인돌-1-일)프로파노에이트 (화합물 118; 2.611 g, 11.19 mmol)의 용액으로 옮겼으며, 그 결과 적갈색 현탁액이 형성되었다. 1 h 후, 반응물을 나트륨 티오설페이트 (10% 수용액, 5 mL) 및 NaHCO3 (포화된 수용액, 5 mL)로 퀸칭하였다. 수층을 CH2Cl2 (3 x 20 mL)으로 추출하였고; 결합된 추출물을 Na2SO4 위에서 건조시켰고, 여과하였고, 갈색 오일로 농축하였다. 실리카 겔 크로마토그래피 (헥산 중 5-50% EtOAc)로의 정제는 무색 오일로서 2.165 g (84%)의 화합물 119를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.87 (s, 1H), 7.73 (dt, J = 8.1, 1.0 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 8.6, 0.9 Hz, 1H), 7.45 - 7.40 (m, 1H), 7.29 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 7.18 (ddd, J = 8.0, 6.9, 1.0 Hz, 1H), 4.84 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.62 (s, 3H), 2.83 (t, J = 7.2 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 182.52, 171.75, 140.12, 135.10, 127.20, 126.39, 123.46, 121.18, 118.55, 110.62, 51.83, 40.56, 34.97. C13H13NO3Na [M+Na]+에 대한 HRMS (ESI) 계산치: 254.0793; 실측치: 254.0786.
3-(2- 포르밀 -1 H -인돌-1-일)프로판산 (120)
디옥산 (100 mL)에 용해된 인돌 119 (2.369 g, 10.24 mmol)의 용액에 LiOH (4 M 수용액, 7.68 mL, 30.73 mmol)를 첨가하였다. 두꺼운 흰색 침전물이 수회에 걸쳐 점차적으로 형성되었다. 21 h 후, HCl (1 M 수용액, 30 mL)을 적가하여 pH = 4인 용액을 제공하였다. 용액을 농축하여 결과로 생긴 연갈색 오일 EtOAc (50 mL)에 용해시켰고 물 (2 x 50 mL) 및 소금물 (20 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 위에서 건조하였고, 여과하였고, 오렌지색 고체로 농축하였다. 실리카 겔 크로마토그래피 (0.1% 아세트산이 들어있는 헥산 중 10-50% EtOAc)로의 정제는 연노란색 고체로서 1.994 g (84%)의 화합물 120을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.89 (s, 1H), 7.76 (dt, J = 8.1, 0.9 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 8.6, 0.9 Hz, 1H), 7.48 - 7.43 (m, 1H), 7.33 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 7.21 (ddd, J = 8.0, 6.9, 1.0 Hz, 1H), 4.85 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.91 (t, J = 7.2 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 182.65, 176.96, 140.12, 135.02, 127.33, 126.42, 123.53, 121.27, 118.76, 110.55, 40.19, 34.82. C12H10NO3 [M-H]-에 대한 HRMS (ESI) 계산치: 216.0666; 실측치: 216.0665.
3-(2-((2-(((9H- 플루오렌 -9-일) 메톡시 )카르보닐)-1,2- 디메틸히드라지닐 ) 메틸 )-1 H -인돌-1-일)프로판산 (122)
1,2-디클로로에탄 (무수, 25 mL) 중 120 (1.193 g, 5.492 mmol) 및 (9H-플루오렌-9-일)메틸 1,2-디메틸히드라진카르복실레이트, 121 (2.147 g, 7.604 mmol)의 용액에 나트륨 트리아세트옥시보로하이드라이드 (1.273 g, 6.006 mmol)를 첨가하였다. 결과로 생긴 노란색 현탁액을 2 h 동안 교반한 다음 NaHCO3 (포화된 수용액, 10 mL)로 퀸칭한 후 이어서, HCl (1 M 수용액)을 pH 4까지 첨가하였다. 유기층을 분리하였고, 수층을 CH2Cl2 (5 x 10 mL)로 추출하였다. 풀링된 유기 추출물을 Na2SO4 위에서 건조하였고, 여과하였고, 오렌지색 오일로 농축하였다. C18 실리카 겔 크로마토그래피 (수중 20-90% CH3CN)로의 정제는 유광 분홍색 고체로서 1.656 g (62%)의 화합물 122를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.76 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.70 - 7.47 (br m, 3H), 7.42 - 7.16 (br m, 6H), 7.12 - 7.05 (m, 1H), 6.37 (s, 0.6H), 6.05 (s, 0.4H), 4.75 - 4.30 (br m, 4H), 4.23 (m, 1H), 4.10 (br s, 1H), 3.55 (br d, 1H), 3.11 - 2.69 (m, 5H), 2.57 (br s, 2H), 2.09 (br s, 1H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 174.90, 155.65, 143.81, 141.42, 136.98, 134.64, 127.75, 127.48, 127.12, 124.92, 122.00, 120.73, 120.01, 119.75, 109.19, 103.74, 67.33, 66.80, 51.39, 47.30, 39.58, 39.32, 35.23, 32.10. C29H30N3O4 [M+H]+에 대한 HRMS (ESI) 계산치: 484.2236; 실측치: 484.2222.
(9 H - 플루오렌 -9-일) 메틸1 ,2-디메틸-2-((1-(3-옥소-3-( 퍼플루오로페녹시 )프로필)-1 H -인돌-2-일)메틸)히드라진-1-카르복실레이트 (112)
화합물 122 (5.006 g, 10.4 mmol)를 건조된 교반 막대를 함유하는 건조된 100 mL 2구 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 무수 EtOAc, 40 mL를 주사기로 첨가하였고 용액을 20 ℃에서 5분 동안 교반하였다. 투명하고 연한 연두색 용액을 제공하였다. 용액을 차가운 수조에서 0 ℃로 냉각하였고 3 mL 무수 EtOAc 중 펜타플루오로페놀 (2098.8 mg, 11.4 mmol)을 적가하였다. 용액을 0 ℃에서 5분 동안 교반하였다. 7 mL 무수 EtOAc 중 DCC (2348.0 mg, 11.4 mmol)를 주사기로 천천히 적가하였다. 용액을 0 ℃에서 5분 동안 교반한 다음, 수조에서 제거하여 20 ℃로 가온하였다. 반응물을 2 h 동안 교반하였고, 0 ℃로 냉각하였고, 여과하여 투명하고, 연한 연두색 용액을 제공하였다. 용액을 50 mL EtOAc로 희석하였고, 2 x 25 mL H2O, 1 x 25 mL 5 M NaCl로 세척하였고, Na2SO4 위에서 건조시켰다. 용액을 여과, 증발, 및 높은 진공 하에 건조하여, 초록빛 흰색 고체로서 6552.5 mg (97%)의 화합물 112를 제공하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 780 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.58 (m, 3H), 7.45-7.22 (m, 6H), 7.14 (dd(appt. t), J = 7.4 Hz, 1H), 6.42 & 6.10 (2 br s, 1H), 4.74 (dd(appt. t), J = 5.4 Hz, 2H), 3.65-3.18 (br, 3H), 3.08 & 2.65 (2 br s, 3H), 2.88 (s, 3H).
계획 9
Figure 112016123593442-pct00056
(9 H - 플루오렌 -9-일) 메틸 1,2-디메틸히드라진-1- 카르복실레이트 (121)
MeNHNHMe·2HCl, 화합물 123 (5.0 g, 37.6 mmol)을 MeCN (80 mL)에 용해시켰다. Et3N (22 mL, 158 mmol)을 첨가하였고 형성된 침전물을 여과에 의해 제거하였다. 잔류 MeNHNHMe 용액에 FmocCl (0.49 g, 18.9 mmol, 0.5 eq)의 용액을 -20 ℃에서 2.5 h 동안 적가하였다. 이어서 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하였고, H2O, 소금물로 세척하였고, Na2SO4 위에서 건조하였고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 실리카 (헥산/EtOAc = 3:2) 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 3.6 g (34%) 화합물 121을 제공하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.75-7.37 (m, 8 H), 4.48 (br s, 2H), 4.27 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.05 (s, 3H), 2.55 (br s, 3H).
계획 10
Figure 112016123593442-pct00057
메이탄시놀 3-(2 S ,15 R )-19-(2-((2-(((9 H -플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)-1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1 H -인돌-1-일)-15-(2-( t -부톡시카르보닐)에틸)-2,3-디메틸-4,14,17-트리옥소-7,10-디옥사-3,13,16-트리아자노나데카노에이트 (125)
3.0 mL DMF 중 메이탄시놀 3-(S)-α-N-메틸아미노프로피오네이트 (화합물 124) (0.426 g, 0.655 mmol), 카르복시산 113 (0.597 g, 0.721 mmol), 및 (i-Pr)2NEt (0.35 mL, 2.00 mmol)의 용액을 HATU (0.277 g, 0.729 mmol)를 첨가하면서 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 2.5 h 동안 교반하였고 회전 증발로 농축하였다. 생성물을 0-10% MeOH-CH2Cl2 구배를 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피로 단리시켰다. 생성물-함유 분획을 결합하였고, 농축하였고, 0-100% CH3CN-H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 플래시 크로마토그래피를 다시 실시하여 흰색 고체로서 0.721 g (75%) 메이탄시노이드 125를 수득하였다.
C75H95ClN8O17 [M+Na]+에 대한 MS (ESI) 계산치: 1458.7; 실측치: 1481.8.
메이탄시놀 3-(2 S ,15 R )-19-(2-((2-(((9 H -플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)-1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1 H -인돌-1-일)-15-(2-(카르복시)에틸)-2,3-디메틸-4,14,17-트리옥소-7,10-디옥사-3,13,16-트리아자노나데카노에이트 (126)
1.0 mL 무수 CH2Cl2 중 메이탄시노이드 125 (110.5 mg, 0.08 mmol)의 용액을 CH2Cl2 (0.378 mL, 0.378 mmol) 중 SnCl4의 1.0 M 용액을 적가하면서 0 ℃에서 교반하였다. 노란색 침전물이 형성되었다. 반응 혼합물을, 추가적인 처리 없이, 용리제로서 0-100% CH3CN-H20 구배를 사용하여 C18 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 흰색 막으로서 65.6 mg (62%)의 메이탄시노이드 126을 공급하였다.
C73H91ClN8O18 [M-H]-에 대한 MS (ESI) 계산치: 1401.6 실측치: 1401.1.
메이탄시놀 3-(2 S ,15 R )-19-(2-(2-(1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1 H -인돌-1-일)-15-(2-(카르복시)에틸)-2,3-디메틸-4,14,17-트리옥소-7,10-디옥사-3,13,16-트리아자노나데카노에이트 (101)
453.6 mL DMA 중 피페리딘 (90.7 μL, 0.92 mmol)의 용액을 메이탄시노이드 126 (64.5 mg, 0.05 mmol)을 첨가하면서 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을, 추가적인 처리 없이, 용리제로서 0-100% CH3CN-H20 구배를 사용하여 C18 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 흰색 막으로서 49.1 mg (90%) 링커 101을 공급하였다.
C58H82ClN8O16 [M+H]+에 대한 MS (ESI) 계산치: 1181.6 실측치: 1181.3.
계획 11
Figure 112016123593442-pct00058
( 2 S ,15 S )-1-(((1 4 S ,1 6 S ,3 2 S ,3 3 S ,2 R ,4 S ,10 E ,12 E ,14 R )-8 6 - 클로로 -1 4 - 하이드록 시-8 5 ,14-디메톡시-3 3 ,2,7,10-테트라메틸-1 2 ,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나사이클로테트라데카페인-10,12-디엔-4-일)옥시)-15-(3-(2-((1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1 H -인돌-1-일)프로판아미도)-2,3-디메틸-1,4,14-트리옥소-7,10-디옥사-3,13-디아자헵타데칸-17-오익 산 (102)
3.0 mL DMF 중 0.492 g (0.35 mmol)의 화합물 127의 용액을 0.7 mL (7.09 mmol)의 피페리딘을 첨가하면서 r.t.에서 교반하였다. 반응 혼합물을 1 시간 동안 교반하였고 생성물을 용리제로서 0-100% CH3CN-H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 직접적 플래시 크로마토그래피로 단리시켜 연한 노란색 고체로서 0.335 g (81%)의 링커 102를 공급하였다.
C57H79ClN8O16 [M+H]+에 대한 MS-ESI (m/z) 계산치: 1167.5; 실측치: 1167.0; [M+Na]+: 1189.5, 실측치: 1189.0.
계획 12
Figure 112016123593442-pct00059
(1 4 S ,1 6 S ,3 2 S ,3 3 S ,2 R ,4 S ,10 E ,12 E ,14 R )-8 6 -클로로-1 4 -하이드록시-8 5 ,14-디메톡시-3 3 ,2,7,10-테트라메틸-1 2 ,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나사이클로테트라데카페인-10,12-디엔-4-일(2 S ,15 S )-19-(2-((1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1 H -인돌-1-일)-2,3-디메틸-4,14,17-트리옥소-15-(4-(포스포노옥시)벤질)-7,10-디옥사-3,13,16-트리아자노나데카노에이트 (103)
0.8 mL DMA 중 0.2 mL (2.0 mmol)의 피페리딘의 용액을 0.141 g (0.1 mmol)의 화합물 128을 첨가하면서 r.t.에서 교반하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 교반하였고 생성물을 용리제로서 0-100% CH3CN-H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 직접적 플래시 크로마토그래피로 단리시켜 흰색 막으로서 0.108 g (90%)의 링커 103를 공급하였다.
C62H84ClN8O18P [M-H]-에 대한 MS-ESI (m/z) 계산치: 1293.5; 실측치: 1293.1.
계획 13
Figure 112016123593442-pct00060
(+/-)-3-(( 2 S ,3 R )-4-((2-(3-(2-((2-(((9 H - 플루오렌 -9-일) 메톡시 )카르보닐)-1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1 H -인돌-1-일)프로판아미도)에틸)아미노)-2,3-비스(( tert -부틸디메틸실일)옥시)-4-옥소부탄아미도)프로판산 (130)의 합성
5 mL DMA 중 0.206 g (0.3 mmol)의 인돌 112, 0.236 g (0.5 mmol)의 화합물 129, 및 0.134 g (1.6 mmol)의 NaHCO3를 r.t.에서 1 h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 부었고 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 소금물로 세척하였고, Na2SO4 위에서 건조하였고, 및 디캔팅하였다(decant). 용매를 회전 증발로 제거하였고 잔류물을 0-100% CH3CN-H2O 구배를 사용하여 C-18 상에서 정제하여 흰색 고체로서 0.23 g의 카르복시산 130 (76%)을 공급하였다.
C50H72N6O9Si2 [M+H]+에 대한 MS-ESI (m/z) 계산치: 957.5; 실측치: 957.0; [M+Na]+: 979.5, 실측치: 979.5.
계획 14
Figure 112016123593442-pct00061
(1 4 S ,1 6 S ,3 2 S ,3 3 S ,2 R ,4 S ,10 E ,12 E ,14 R )-8 6 - 클로로 -1 4 - 하이드록시 -8 5 ,14- 디메톡시 -3 3 ,2,7,10-테트라메틸-1 2 ,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나사이클로테트라데카페인-10,12-디엔-4-일(2 S ,9 R ,10 S )-18-(2-((2-(((9 H -플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)-1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1 H -인돌-1-일)-9,10-비스(( tert -부틸디메틸실일)옥시)-2,3-디메틸-4,8,11,16-테트라옥소-3,7,12,15- 테트라아자옥타데카노에이트 ( 131)의 합성
0.5 mL DMA 중 0.129 g (0.1 mmol)의 카르복시산 130 및 0.096 g (0.1 mmol)의 N-데아세틸 메이탄신 124, 0.052 g (0.1 mmol)의 HATU, 및 0.036 mL (0.3 mmol)의 후니그 염기(Hunig's base)의 용액을 r.t.에서 3 h 동안 교반하였다. 생성물을 용리제로서 0-100% CH3CN-H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 직접적 플래시 크로마토그래피로 단리시켰다. 단리물의 분석은 <90%의 순도를 나타냈다. 물질에 0-10% MeOH-CH2Cl2 구배를 사용하여 실리카 겔 상에서 제2 플래시 크로마토그래피를 실시하여 흰색 고체로서 0.103 g (48%)의 화합물 131을 공급하였다.
C82H114ClN9O17Si2 [M+Na]+에 대한 MS-ESI (m/z) 계산치: 1610.8, 실측치: 1610.7.
계획 15
Figure 112016123593442-pct00062
(1 4 S ,1 6 S ,3 2 S ,3 3 S ,2 R ,4 S ,10 E ,12 E ,14 R )-8 6 - 클로로 -1 4 - 하이드록시 -8 5 ,14- 디메톡시 -3 3 ,2,7,10-테트라메틸-1 2 ,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나사이클로테트라데카페인-10,12-디엔-4-일(2 S ,9 R ,10 S )-18-(2-((1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1 H -인돌-1-일)-9,10-디하이드록시-2,3-디메틸-4,8,11,16-테트라옥소-3,7,12,15-테트라아자옥타데카노에이트 (106)
0.6 mL THF 중 0.102 g (0.06 mmol)의 화합물 131을 THF 중 TBAF의 1.0M 용액의 0.225 mL (0.23 mmol)를 첨가하면서 0 ℃에서 교반하였다. 35분 후 반응 혼합물을 용리제로서 0-75% CH3CN-H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 직접적 플래시 크로마토그래피로 단리시켜 황백색 고체로서 0.045 g (60%)의 링커 106을 공급하였다.
C55H76ClN9O15 [M+H]+에 대한 MS-ESI (m/z) 계산치: 1138.5; 실측치: 1138.3; [M+Na]+: 1160.5, 실측치: 1160.5.
계획 16
Figure 112016123593442-pct00063
( S )-5-((4-((( S )-1-(((1 4 S ,1 6 S ,3 2 S ,3 3 S ,2 R ,4 S ,10 E ,12 E ,14 R )-8 6 -클로로-1 4 -하이드록시-8 5 ,14-디메톡시-3 3 ,2,7,10-테트라메틸-1 2 ,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나사이클로테트라데카페인-10,12-디엔-4-일)옥시)-1-옥소프로판-2-일)(메틸)아미노)-4-옥소부틸)아미노)-4-(3-(2-((1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1 H -인돌-1-일)프로판아미도)-5-옥소펜탄산 (105)
0.4 mL DMA 중 0.1 mL (1.0 mmol)의 피페리딘의 용액을 0.049 g (0.04 mmol)의 화합물 132를 첨가하면서 r.t.에서 교반하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 교반하였고 생성물을 용리제로서 0-100% CH3CN-H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 직접적 플래시 크로마토그래피로 단리시켜 흰색 막으로서 0.040 g (99%)의 링커 105를 공급하였다.
C55H75ClN8O14 [M+H]+에 대한 MS-ESI (m/z) 계산치: 1107.5; 실측치: 1107.3; [M+Na]+: 1129.5, 실측치: 1129.4.
계획 17
Figure 112016123593442-pct00064
1-( tert -부틸) 2-에틸 2- 하이드록시 -2,3- 디하이드로 -1 H - 피롤로[2,3- b ]피리딘 -1,2-디카르복실레이트 (134)
(3-메틸-피리딘-2-일)-카르밤산 tert-부틸 에스터 (화합물 133; 60 g, 288 mmol, 1.0 eq) 및 THF (900 mL)를 자력 교반기가 장착된 2 L 3구 플라스크에 배치하였고 질소 대기 하에 유지하였다. t-BuLi (600 mL, 1.3 M, 777 mmol, 2.7 eq)를 적가하는 한편, 온도를 -78 ℃ 아래로 유지하였다. -45 ℃에서 1 h 동안 교반한 후, 이렇게 하여 얻어진 리튬화된 유도체를 건조 테트라하이드로푸란 (50 mL) 중 디에틸 옥살레이트 (126.5 g, 865 mmol, 3.0 eq)의 용액에 첨가하였고 -80 ℃의 온도에서 유지하였다. 반응 매체를 2 h 동안 -50 ℃로 가온한 다음, 실온으로 가온하였고 밤새도록 교반하였다. 물을 첨가하였고 혼합물을 EA로 추출하여, Na2SO4 위에서 건조하였고 농축하였으며 이것을 실리카 (PE/EA = 40:1-2:1) 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 노란색 오일로서 화합물 134 (19.3 g, 22%)를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.24 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.87 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.57 (br s, 1H), 4.25-4.23 (m, 2H), 3.35 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 3.14 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 1.49 (s, 9H), 1.23 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
에틸 1 H - 피롤로[2,3- b ]피리딘 -2- 카르복실레이트 (135)
HCl (50 mL, 6 N) 용액 중 화합물 134 (9.7 g, 31.4 mmol, 1 eq)의 혼합물을 50 ℃에서 2 h 동안 및 r.t.에서 밤새도록 교반하였다. 반응 혼합물을 고체 K2CO3을 이용하여 pH 13로 조정하였고 EA로 추출하였다. 유기상을 나트륨 설페이트 위에서 건조하였고, 여과하였고 감소된 압력 하에 증발시켜서 화합물 135 (6.0 g, 100%)를 제공하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 11.12 (br s, 1H), 8.59 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 8.05 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H), 7.19 (s, 1H), 7.18-7.15 (m, 1H), 4.46 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.44 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
(1 H - 피롤로[2,3- b ]피리딘 -2-일)메탄올 (136)
THF (200 mL) 중 에스터 135 (9 g, 47.3 mmol, 1.0 eq)의 용액에 LiAIH4 (3.0 g, 78.9 mmol, 1.5 eq)를 0 ℃에서 N2 하에 천천히 첨가하였고 1 h 동안 실온으로 가온하였다. 현탁액을 물로 퀸칭하였고 흰색 침전물을 여과로 제거하였다. 여과물을 Na2SO4 위에서 건조하였고 농축하였다. 잔류물을 실리카 (PE/EA = 9:1) 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 약간 노란색 고체로서 화합물 136 (6.5 g, 93%)을 제공하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.47 (s, 1H), 8.10 (dd, J = 6.4, 1.2 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.97 (dd, J = 7.6, 4.8 Hz, 1H), 6.27 (s, 1H), 5.23 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.57 (d, J = 5.6 Hz, 2H).
2-((( tert - 부틸디메틸실일 ) 옥시 ) 메틸 )-1 H - 피롤로[2,3- b ]피리딘 (137)
오븐에서 건조된 플라스크를 화합물 136 (7.5 g, 50.6 mmol, 1.0 eq), TBSCl (8.4 g, 55.7 mmol, 1.1 eq), 및 이미다졸 (10.3 g, 152.0 mmol, 3.0 eq)로 충전하였고, 이 혼합물을 CH2Cl2 (100 mL)에 현탁하였다. 16 h 후, 반응 혼합물을 오렌지색 잔류물로 농축하였다. 미가공 혼합물을 Et2O (50 mL)에 용해시켰고, 소금물 (25 mL)로 세척하였다. 유기층을 농축하여 결정성 고체 (화합물 137; 11.8 g, 89%)를 제공하였고 추가의 정제 없이 사용하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.56 (br s, 1H), 8.25 (s, 1H), 7.84 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.04 (dd, J = 7.6, 4.4 Hz, 1H), 6.27 (s, 1H), 4.90 (s, 2H), 0.93 (s, 9H), 0.11 (s, 6H).
메틸 3-(2-((( tert - 부틸디메틸실일 ) 옥시 ) 메틸 )-1 H - 피롤로[2,3- b ]피리딘 -1-일)프로파노에이트 (138)
아세토나이트릴 (120 mL) 중 아자인돌 137 (11.5 g, 43.9 mmol, 1.0 eq)의 용액에 메틸 아크릴레이트 (18.9 g, 220 mmol, 5.0 eq)에 이어서 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]-운덱-7-엔 (DBU, 335 μL, 22 mmol, 0.50 eq)을 첨가하였고, 결과로 생긴 혼합물을 18 h 동안 재환류시켰다. 용액을 냉각시켰고 오렌지색 오일로 농축하였으며, 이것을 실리카 (PE/EA = 9:1) 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 화합물 138 (15 g, 98%)로서 무색 오일을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.28 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 7.83 (dd, J = 8.0, 0.8 Hz, 1H), 7.03 (dd, J = 7.6, 4.8 Hz, 1H), 6.33 (s, 1H), 4.87 (s, 2H), 4.62 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.66 (s, 3H), 2.98 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 0.91 (s, 9H), 0.10 (s, 6H).
메틸 3-(2-( 하이드록시메틸 )-1 H - 피롤로[2,3- b ]피리딘 -1-일) 프로파노에이트 (139)
0 ℃에서 THF (150 mL) 중 화합물 138 (15 g, 43.1 mmol, 1.0 eq)의 용액에 테트라부틸암모늄 플루오라이드 (THF 중 1.0 M, 45.6 mL, 45.6 mmol, 1.06 당량)을 첨가하였다. 15분 후, 반응 혼합물을 디에틸 에테르 (100 mL)로 희석하였고 수성 NaHCO3로 세척하였고, 오일 잔류물로 농축하였으며, 이것을 실리카 (PE/EA = 4:1) 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 흰색 고체로서 화합물 139를 수득하였다 (8 g, 80%).
LC-MS: 235 (M+1). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.28 (dd, J = 4.8,1.6 Hz, 1H), 7.84 (dd, J = 8.0, 1.2 Hz, 1H), 7.05 (dd, J = 7.8, 4.4 Hz, 1H), 6.40 (s, 1H), 4.85 (s, 2H), 4.61 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.63 (s, 3H), 3.10 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.03 (br s, 1H).
메틸 3-(2- 포르밀 -1 H - 피롤로[2,3- b ]피리딘 -1-일) 프로파노에이트 (140)
40 mL CH2Cl2 중 2.335 g (5.5 mmol)의 데스-마틴 페리오디난 및 1.21 mL (15.0 mmol)의 피리딘의 용액을 20 mL CH2Cl2 중 1.171 g (5.0 mmol)의 화합물 139의 용액을 적가하면서 r.t.에서 교반하였다. 반응 혼합물을 1 h 동안 교반하였고 Na2S2O3의 10% 수용액 20 mL 및 NaHCO3의 1.2 M 수용액 20 mL의 혼합물로 퀸칭하였다. 층들을 분리하였고 수층을 CH2Cl2로 추출하였다. 유기층을 결합시켰고, Na2SO4 위에서 건조하였고, 및 여과하였다. 용매를 회전 증발로 제거하였고 및 생성물을 용리제로서 30% EtOAc-헥산을 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피로 단리시켜 연한 노란색 오일로서 1.005 g (87%)의 화합물 140을 공급하였다.
(9 H - 플루오렌 -9-일) 메틸2 -((1-(3- 메톡시 -3- 옥소프로필 )-1 H - 피롤로[2,3- b ]피리딘 -2-일)메틸)-1,2-디메틸히드라진-1-카르복실레이트 (141)
r.t.에서 3.0 mL DCE 중 0.129 g (0.56 mmol)의 알데하이드 140의 용액에 0.228 g (0.81 mmol)의 히드라진 121에 이어서 0.129 g (0.60 mmol)의 NaB(OAc)3H를 나누어서 첨가하였다. 반응 혼합물을 24 h 동안 교반하였고 H2O 10 mL의 추가로 퀸칭하였다. 혼합물을 CH2Cl2로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 위에서 건조하였고, 여과하였고, 농축하였다. 생성물을 용리제로서 0-100% CH3CN:H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 플래시 크로마토그래피로 단리시켜 0.197 g (73%)의 화합물 141을 공급하였다.
3-(2-((2-(((9 H - 플루오렌 -9-일) 메톡시 )카르보닐)-1,2- 디메틸히드라지닐 ) 메 틸)-1 H -피롤로[2,3- b ]피리딘-1-일)프로판산 (142)
1.54 mL THF 중 269.7 mg (0.50 mmol)의 화합물 141의 용액을 LiOH의 1.0 M 수용액 0.51 mL를 적가하면서 0 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 1 h 동안 교반하였고 생성물을 용리제로서 0-100% CH3CN:H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 직접적 크로마토그래피로 단리시켜 흰색 막으로서 124.5 mg (50%)의 화합물 142를 제공하였다.
계획 18
Figure 112016123593442-pct00065
18-( tert -부틸)1-((1 4 S ,1 6 S ,3 2 R ,3 3 R ,2 R ,4 S ,10 E ,12 E ,14 R )-8 6 - 클로로 -1 4 - 하이 드록시-8 5 ,14-디메톡시-3 3 ,2,7,10-테트라메틸-1 2 ,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나사이클로테트라데카페인-10,12-디엔-4-일)(2 S ,15 S )-15-(3-(2-((2-(((9 H -플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)-1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1 H -피롤로[2,3- b ]피리딘-1-일)프로판아미도)-2,3-디메틸-4,14-디옥소-7,10-디옥사-3,13-디아자옥타데칸디오에이트 (144)
0.3 mL 무수 DMF 중 69.4 mg (1.3 mmol)의 PyAOP 및 0.65 mL (3.7 mmol)의 디아이소프로필에틸아민의 용액을 0.2 mL 무수 DMF 중 64.1 mg (0.06 mmol)의 화합물 143의 용액을 적가하면서 r.t.에서 교반하였다. 2 h 후, 생성물을 용리제로서 0-100% CH3CN:H20 구배를 사용하여 C18 상에서 직접적 크로마토그래피로 단리시켜 흰색 막으로서 133.2 mg (74%)의 화합물 144를 제공하였다.
계획 19
Figure 112016123593442-pct00066
( 2 S ,15 S )-15-(3-(2-((2-(((9 H - 플루오렌 -9-일) 메톡시 )카르보닐)-1,2- 디메틸히드라지닐 )메틸)-1 H -피롤로[2,3- b ]피리딘-1-일)프로판아미도)-1-(((1 4 S ,1 6 S ,3 3 S ,2 R ,4 S ,10 E ,12 E ,14 R )-8 6 -클로로-1 4 -하이드록시-8 5 ,14-디메톡시-3 3 ,2,7,10-테트라메틸-1 2 ,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나사이클로테트라데카페인-10,12-디엔-4-일)옥시)-2,3-디메틸-1,4,14-트리옥소-7,10-디옥사-3,13-디아자옥타데칸-18-오익 산 (146)
0.133 g (0.09 mmol)의 화합물 145의 용액을 1.0 mL 무수 CH2Cl2에 용해시켰고 CH2Cl2 중 SnCl4의 1.0 M 용액 0.456 mL (0.46 mmol)를 적가하면서 0 ℃에서 교반하였다. 노란색 침전물이 형성되었다. 반응 혼합물을 N2 하에서 1 h 동안 교반하였다. 생성물을 용리제로서 0-100% CH3CN:H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 직접적 크로마토그래피로 단리시켜 흰색 고체로서 0.112 g (87%)의 화합물 146을 제공하였다.
계획 20
Figure 112016123593442-pct00067
( 2 S ,15 S )-1-(((1 4 S ,1 6 S ,3 2 S ,3 3 S ,2 R ,4 S ,10 E ,12 E ,14 R )-8 6 - 클로로 -1 4 - 하이드록시 -8 5 ,14-디메톡시-3 3 ,2,7,10-테트라메틸-1 2 ,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나사이클로테트라데카페인-10,12-디엔-4-일)옥시)-15-(3-(2-((1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1 H -피롤로[2,3- b ]피리딘-1-일)프로판아미도)-2,3-디메틸-1,4,14-트리옥소-7,10-디옥사-3,13-디아자옥타데칸-18-오익 산 (104)
0.4 mL DMA 중 0.1 mL (1.0 mmol)의 피페리딘의 용액을 0.048 g (0.04 mmol)의 화합물 147을 첨가하면서 r.t.에서 교반하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 교반하였고 생성물을 용리제로서 0-100% CH3CN:H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 직접적 플래시 크로마토그래피로 단리시켜 흰색 막으로서 0.034 g (85%)의 링커 104를 공급하였다.
C57H80ClN9O16 [M+H]+에 대한 MS-ESI (m/z) 계산치: 1182.6; 실측치: 1182.5; [M+Na]+: 1204.5, 실측치: 1204.5.
계획 21
Figure 112016123593442-pct00068
2-( tert - 부틸디메틸실일옥시 ) 에탄아민 (149)
건조 DCM (1 L) 중 2-아미노에탄올 (50 g, 0.82 mol), 트리에틸아민 (124 g, 1.23 mol), 및 DMAP (2 g)의 교반된 용액에 TBSCl (135 g, 0.9016 mol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반하였고, 수성 NH4Cl로 퀸칭하였다. 혼합물을 DCM (3x)으로 추출하였다. 결합된 유기층을 물로 세척하였고, MgSO4 위에서 건조하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제된 잔류물을 제공하기 위해 용매를 감소된 압력 하에 제거하여 30.5 g (22%)의 화합물 149를 제공한다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.6 (t, J=5.5 Hz, 2H), 2.74 (t, J=5.5 Hz, 2H), 1.36 (brs, 1 H), 0.87 (s, 9H), 0.04 (s, 6H).
벤질 3-((2-(( tert - 부틸디메틸실일 ) 옥시 )에틸)아미노) 프로파노에이트 (151)
0 ℃에서 메탄올 (25 mL) 및 THF (25 mL) 중 리튬 염소 (20 mg) 및 2-(tert-부틸디메틸실일옥시)에탄아민 (1.0 g, 5.71 mmol)의 교반된 용액에 아크릴레이트 150 (1.0 g, 6.28 mmol)을 10분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 점차적으로 실온으로 가온하였고 r.t.에서 밤새도록 교반하였다. 반응 혼합물을 감소된 압력 하에 건조 농축하였고, EtOAc (250 mL), 및 소금물 (200 mL)로 추출하였다. 유기층을 무수 나트륨 설페이트 위에서 건조하였고, 감소된 압력 하에 건조 증발시켰다. 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (석유 에테르:EtOAc = 5:1 내지 0:1)로 정제하여 화합물 151 (0.7 g, 37%)을 공급하였다.
벤질 3-(2- 브로모 - N -(2-(( tert - 부틸디메틸실일 ) 옥시 )에틸) 아세트아미도 ) 프로파노에이트 (153)
0 ℃에서 질소 하에 THF (20 mL) 중 화합물 151 (0.7 g, 2.07 mmol)의 용액에 Et3N (1.2 당량, 0.25 g, 2.49mmol) 및 브로마이드 152 (1.2 당량, 0.5 g, 2.49 mmol)를 첨가하였다. 0 ℃에서 1 h 동안 교반한 후, 결과로 생긴 혼합물을 EtOAc (10 mL)로 희석하였고 여과하였다. 고체를 EtOAc로 씻어냈고, 순수한 화합물 153 (0.3 g, 31%)을 제공하기 위해 여과물을 농축하고 진공에서 건조하여 플래시 컬럼 크로마토그래피 (석유 에테르:EtOAc = 10:1 내지 5:1)로 정제된 미가공 브로모아세틸 아미드 153을 수득하였다.
MS+: 459[M+H]+.
벤질 10-(2-(( tert - 부틸디메틸실일 ) 옥시 )에틸)-2,2,3,3- 테트라메틸 -9-옥소-4-옥사-7,10-디아자-3-실라트리데칸-13-오에이트 (154)
0 ℃에서 질소 하에 THF (350 mL) 중 화합물 153 (36.8 g, 80.3 mmol, 1.0 eq)의 용액에 Et3N (16.3 g, 160.7 mmol, 2 eq) 및 2-(tert-부틸디메틸실일옥시)에탄아민 (28.1 g, 160.7 mmol, 2 eq)을 첨가하였다. r.t.에서 밤새도록 교반한 후, 결과로 생긴 혼합물을 EtOAc (100 mL)로 희석하였고 여과하였다. 고체를 EtOAc로 씻어냈고 화합물 154 (27 g, 60 %)을 제공하기 위해 여과물을 농축하고 진공에서 건조하여 플래시 컬럼 크로마토그래피 (석유 에테르:EtOAc = 3:1)로 정제된 미가공 아민을 수득하였다.
벤질 7-(((벤질옥시)카르보닐)글리실)-10-(2-(( tert -부틸디메틸실일)옥시)에틸)-2,2,3,3-테트라메틸-9-옥소-4-옥사-7,10-디아자-3-실라트리데칸-13-오에이트 (156)
0 ℃에서 DCM (20 mL) 중 Cbz-글리신 (2.5 g, 12 mmol) 및 EDCI (2.5 g, 13 mmol) HOBT (1.75 g, 13 mmol)의 용액에 iPr2NEt (4.2 g, 32.5 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0 ℃에서 30분 동안 교반하였다. 용액에 아민 154 (6 g, 11 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 r.t.에서 밤새도록 교반하였고, 건조 증발시켰고, DCM에 현탁하였다. 혼합물을 여과하였고, 여과물을 물 및 소금물로 세척하였고, 나트륨 설페이트 위에서 건조하였고, 농축하였다. 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 156 (3.01 g, 38%)을 공급하였다.
10-(2-(( tert - 부틸디메틸실일 ) 옥시 )에틸)-7-글리실-2,2,3,3- 테트라메틸 -9-옥소-4-옥사-7,10-디아자-3-실라트리데칸-13-오익 산 (157)
Parr 셰이커에서 EtOAc (50 mL) 중 화합물 156 (1.9 g, 2.55 mmol) 및 Pd/C (500 mg)의 혼합물을 H2 (50 psi) 하에 r.t.에서 밤새도록 교반하였다. 혼합물을 Celite의 패드를 통해 여과하고 농축하여 화합물 157 (730mg, 55%)을 제공하였다.
LC-MS: 520 (M+1).
계획 22
Figure 112016123593442-pct00069
7-((3-(2-((2-(((9 H - 플루오렌 -9-일) 메톡시 )카르보닐)-1,2- 디메틸히드라지닐 )메틸)-1 H -인돌-1-일)프로파노일)글리실)-10-(2-(( tert -부틸디메틸실일)옥시)에틸)-2,2,3,3-테트라메틸-9-옥소-4-옥사-7,10-디아자-3-실라트리데칸-13-오익 산 (158)의 합성
5.0 mL DMA 중 0.220 g (0.3 mmol)의 인돌 112 및 0.264 g (0.5 mmol)의 펩토이드(peptoid) 157의 용액을 0.120 g (1.4 mmol)의 NaHCO3를 첨가하면서 r.t.에서 교반하였다. 6 h 후, 반응 혼합물을 물로 희석하였고 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 위에서 건조하였고 디캔팅하였다. 용매를 회전 증발로 제거하였다. 생성물을 0-100% CH3CN:H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 플래시 크로마토그래피로 단리시켜 흰색 고체로서 0.184 g (55%)의 카르복시산 158을 제공하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.80 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.62 (m, 2H), 7.55 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.41 (dd(app. t), J = 7.4 Hz, 2H), 7.30 (m, 4H), 7.22 (m, 1H), 7.10 (m, 1H), 4.72-4.30(m, 5H), 4.29-4.08 (m, 3H), 3.95-3.66 (m, 7H), 3.62-3.41 (m, 5H), 2.86 (m, 4H), 2.63 (m, 6H), 2.11(m, 1H), 0.90 (m, 18H), 0.60 (m, 12H).
계획 23
Figure 112016123593442-pct00070
(1 4 S ,1 6 S ,3 2 S ,3 3 S ,2 R ,4 S ,10 E ,12 E ,14 R )-8 6 - 클로로 -1 4 - 하이드록시 -8 5 ,14- 디메톡시 -3 3 ,2,7,10-테트라메틸-1 2 ,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나사이클로테트라데카페인-10,12-디엔-4-일( S )-7-((3-(2-((2-(((9 H -플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)-1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1 H -인돌-1-일)프로파노일)글리실)-10-(2-(( tert -부틸디메틸실일)옥시)에틸)-2,2,3,3,14,15-헥사메틸-9,13-디옥소-4-옥사-7,10,14-트리아자-3-실라헥사데칸-16-오에이트 (159)의 합성
0.8 mL DMA 중 0.180 g (0.2 mmol) 카르복시산 158 및 0.123 g의 N-데아실 메이탄신 124 (0.2 mmol), 0.072 g (0.2 mmol)의 HATU, 및 0.051 mL (0.4 mmol)의 후니그 염기의 용액을 r.t.에서 3 h 동안 교반하였다. 생성물을 0-100% CH3CN-H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 직접적 플래시 크로마토그래피에 의해 단리시켜 흰색 고체로서 0.235 g (80%)의 화합물 159를 제공하였다.
C84H118ClN9O17Si2 [M+Na]+에 대한 MS-ESI (m/z) 계산치: 1638.8, 실측치: 1638.8.
계획 24
Figure 112016123593442-pct00071
(1 4 S ,1 6 S ,3 2 S ,3 3 S ,2 R ,4 S ,10 E ,12 E ,14 R )-8 6 - 클로로 -1 4 - 하이드록시 -8 5 ,14- 디메톡시 -3 3 ,2,7,10-테트라메틸-1 2 ,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나사이클로테트라데카페인-10,12-디엔-4-일 N -(3-(2-(2-(3-(2-((1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1 H -인돌-1-일)프로판아미도)- N -(2-하이드록시에틸)아세트아미도)- N -(2-하이드록시에틸)아세트아미도)프로파노일)- N -메틸- L -알라니네이트 (107)의 합성
0.5 mL THF 중 0.114 g (0.07 mmol)의 화합물 159의 용액을 10분 동안 질소와 함께 살포하였다. THF (0.30 mL, 0.3 mmol) 중 1.0 M TBAF의 용액을 첨가하였고 반응 혼합물을 1 h 동안 교반하였다. 생성물을 0-100% CH3CN-H2O 구배를 사용하여 C18 상에서 직접적 크로마토그래피로 단리시켜 황백색 고체로서 0.0417 g (51%)의 링커 107을 제공하였다.
C57H80ClN9O15 [M+H]+에 대한 MS-ESI (m/z) 계산치: 1166.6; 실측치: 1166.4; [M+Na]+: 1188.5, 실측치: 1188.4.
실시예 3
피페리딘-4-아미노 (4AP) 기를 함유하는 링커를 하기 도시된 계획 25에 따라 합성하였다.
계획 25
Figure 112016123593442-pct00072
(9 H - 플루오렌 -9-일) 메틸 4- 옥소피페리딘 -1- 카르복실레이트 ( 200)의 합성
자력 교반 막대를 함유하는 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 피페리딘-4-원 하이드로클로라이드 모노하이드레이트 (1.53 g, 10 mmol), Fmoc 염소 (2.58 g, 10 mmol), 나트륨 카보네이트 (3.18 g, 30 mmol), 디옥산 (20 mL), 및 물 (2 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1 h 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc (100 mL)로 희석하였고 물 (1 x 100 mL)로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 위에서 건조하였고, 여과하였고, 감소된 압력 하에 농축하였다. 결과로 생긴 물질을 진공에서 건조하여 흰색 고체로서 화합물 200을 수득하였다 (3.05 g, 95% 수율).
1H NMR (CDCl3) δ 7.78 (d, 2H, J = 7.6), 7.59 (d, 2H, J = 7.2), 7.43 (t, 2H, J = 7.2), 7.37 (t, 2H, J = 7.2), 4.60 (d, 2H, J = 6.0), 4.28 (t, 2H, J = 6.0), 3.72 (br, 2H), 3.63 (br, 2H), 2.39 (br, 2H), 2.28 (br, 2H).
MS (ESI) m/z: C20H20NO3에 대한 [M+H]+ 계산치 322.4; 실측치 322.2.
(9 H - 플루오렌 -9-일) 메틸4 -((2-(2-(3-( tert - 부톡시 )-3- 옥소프로폭시 ) 에톡시 )에틸)아미노)피페리딘-1-카르복실레이트 ( 201)의 합성
자력 교반 막대를 함유하는 건조된 신틸레이션 바이알에 피페리디논 200 (642 mg, 2.0 mmol), H2N-PEG2-CO2t-Bu (560 mg, 2.4 mmol), 4 Å 분자체(molecular sieve) (활성화된 분말, 500 mg), 및 1,2-디클로로에탄 (5 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1 h 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 나트륨 트리아세트옥시보로하이드라이드 (845 mg, 4.0 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5일 동안 교반하였다. 결과로 생긴 혼합물을 EtOAc로 희석하였다. 유기층을 포화된 NaHCO3 (1 x 50 mL), 및 소금물 (1 x 50 mL)로 세척하였고, Na2SO4 위에서 건조하고, 여과하고, 감소된 압력 하에 농축하여 오일로서 화합물 201을 수득하였으며, 이것을 추가의 정제 없이 수행하였다.
13-(1-(((9 H - 플루오렌 -9-일) 메톡시 )카르보닐)피페리딘-4-일)-2,2-디메틸-4,14-디옥소-3,7,10-트리옥사-13-아자헵타데칸-17-오익 산 ( 202)의 합성
자력 교반 막대를 함유하는 건조된 신틸레이션 바이알에 이전 단계의 N--Fmoc-피페리딘-4-아미노-PEG2-CO2t-Bu (201), 석신산 무수물 (270 mg, 2.7 mmol), 및 디클로로메탄 (5 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 18 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc 및 포화된 NaHCO3 사이에서 구분하였다. 수층을 EtOAc로 추출하였다 (3x). 수층을 pH ~3까지 HCl (1 M)로 산성화하였다. 수층을 DCM으로 추출하였다 (3x). 결합된 유기층을 Na2SO4 위에서 건조하였고, 여과하였고, 감소된 압력 하에 농축하였다. 반응 혼합물을 C18 플래시 크로마토그래피 (10-100% MeCN/물을 0.1% 아세트산으로 용출한다)로 정제하였다. 생성물-함유 분획을 감소된 압력 하에 농축한 다음 잔류 아세트산을 제거하기 위해 톨루엔 (3 x 50 mL)과 공비 화합물을 형성하여(azeotrope) 흰색 고체로서 534 mg (42%, 2 단계)의 화합물 202를 공급하였다.
1H NMR (DMSO-d 6) δ 11.96 (br, 1H), 7.89 (d, 2H, J = 7.2), 7.63 (d, 2H, J = 7.2), 7.42 (t, 2H, J = 7.2), 7.34 (t, 2H, J = 7.2), 4.25-4.55 (m, 3H), 3.70-4.35 (m, 3H), 3.59 (t, 2H, J = 6.0), 3.39 (m, 5H), 3.35 (m, 3H), 3.21 (br, 1H), 2.79 (br, 2H), 2.57 (m, 2H), 2.42 (q, 4H, J = 6.0), 1.49 (br, 3H), 1.37 (s, 9H).
MS (ESI) m/z: C35H47N2O9에 대한 [M+H]+ 계산치: 639.3; 실측치: 639.2.
(2 S )-1-(((1 4 S ,1 6 S ,3 3 S ,2 R ,4 S ,10 E ,12 E ,14 R )-8 6 - 클로로 -1 4 - 하이드록시 -8 5 ,14-디메톡시-3 3 ,2,7,10-테트라메틸-1 2 ,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나사이클로테트라데카페인-10,12-디엔-4-일)옥시)-2,3-디메틸-1,4,7-트리옥소-8-(피페리딘-4-일)-11,14-디옥사-3,8-디아자헵타데칸-17-오익 산 (203)의 합성
2 mL DMF 중 에스터 202 (227mg, 0.356 mmol), 디아이소프로필에틸아민 (174 μL, 1.065 mmol), N-데아세틸 메이탄신 124 (231 mg, 0.355 mmol)의 용액에 PyAOP (185 mg, 0.355 mmol)를 첨가하였다. 용액을 30분 동안 교반하였다. 피페리딘 (0.5 mL)을 반응 혼합물에 첨가하였고 추가로 20 분 동안 교반하였다. 미가공 반응 혼합물을 0-100% 아세토나이트릴:물의 구배를 사용하여 C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 203.2 mg (55%, 2 단계)의 화합물 203을 공급한다.
17-( tert -부틸) 1-((1 4 S ,1 6 S ,3 3 S ,2 R ,4 S ,10 E ,12 E ,14 R )-8 6 -클로로-1 4 -하이드록시-8 5 ,14-디메톡시-3 3 ,2,7,10-테트라메틸-1 2 ,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나사이클로테트라데카페인-10,12-디엔-4-일) (2 S )-8-(1-(3-(2-((2-(((9 H -플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)-1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1 H -인돌-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-2,3-디메틸-4,7-디옥소-11,14-디옥사-3,8-디아자헵타데칸디오에이트 (204)의 합성
1mL DMF 중 피페리딘 203 (203.2 mg, 0.194 mmol), 에스터 5 (126.5 mg, 0.194 mmol), 2,4,6-트리메틸피리딘 (77 μL, 0.582 mmol), HOAT (26.4 mg, 0.194 mmol)의 용액을 30분 동안 교반하였다. 미가공 반응물을 0-100% 아세토나이트릴:0.1% 포름산이 들어있는 물의 구배를 사용하여 C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 280.5 mg (97% 수율)의 화합물 204를 공급하였다.
MS (ESI) m/z: C81H106ClN8O18에 대한 [M+H]+ 계산치: 1513.7; 실측치: 1514.0.
(2 S )-8-(1-(3-(2-((2-(((9 H - 플루오렌 -9-일) 메톡시 )카르보닐)-1,2- 디메틸히드라지닐 )메틸)-1 H -인돌-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-1-(((1 4 S ,1 6 S ,3 3 S ,2 R ,4 S ,10 E ,12 E ,14 R )-8 6 -클로로-1 4 -하이드록시-8 5 ,14-디메톡시-3 3 ,2,7,10-테트라메틸-1 2 ,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나사이클로테트라데카페인-10,12-디엔-4-일)옥시)-2,3-디메틸-1,4,7-트리옥소-11,14-디옥사-3,8-디아자헵타데칸-17-오익 산 (205)의 합성
500 μL 무수 DCM 중 화합물 204 (108 mg, 0.0714 mmol)의 용액에 DCM 중 SnCl4의 1M 용액 357 μL를 첨가하였다. 불균질한 혼합물을 1 h 동안 교반한 다음 0-100% 아세토나이트릴:0.1% 포름산이 들어있는 물의 구배를 사용하여 C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 78.4 mg (75% 수율)의 화합물 205을 공급하였다.
MS (ESI) m/z: C77H96ClN8O18에 대한 [M-H]- 계산치: 1455.7; 실측치: 1455.9.
실시예 4
피페리딘-4-아미노 (4AP) 기를 함유하는 링커를 하기 도시된 계획 26에 따라 합성하였다.
계획 26
Figure 112016123593442-pct00073
tert -부틸 4- 옥소피페리딘 -1- 카르복실레이트 ( 210)의 합성
자력 교반 막대를 함유하는 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 피페리딘-4-원 하이드로클로라이드 모노하이드레이트 (1.53 g, 10 mmol), 디-tert-부틸 디카보네이트 (2.39 g, 11 mmol), 나트륨 카보네이트 (1.22 g, 11.5 mmol), 디옥산 (10 mL), 및 물 (1 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1 h 동안 교반하였다. 혼합물을 물 (100 mL)로 희석하였고 EtOAc (3 x 100 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하였고, Na2SO4 위에서 건조하였고, 여과하였고, 감소된 압력 하에 농축하였다. 결과로 생긴 물질을 진공에서 건조하여 흰색 고체로서 1.74 g (87%)의 화합물 210을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 3.73 (t, 4H, J = 6.0), 2.46 (t, 4H, J = 6.0), 1.51 (s, 9H).
MS (ESI) m/z: C10H18NO3에 대한 [M+H]+ 계산치: 200.3; 실측치: 200.2.
tert -부틸 4-((2-(2-(3-( tert - 부톡시 )-3- 옥소프로폭시 ) 에톡시 )에틸)아미노)피페리딘-1-카르복실레이트 ( 211)의 합성
자력 교반 막대를 함유하는 건조된 신틸레이션 바이알에 tert -부틸 4-옥소피페리딘-1-카르복실레이트 (399 mg, 2 mmol), H2N-PEG2-COOt-Bu (550 mg, 2.4 mmol), 4 Å 분자체 (활성화된 분말, 200 mg), 및 1,2-디클로로에탄 (5 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1 h 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 나트륨 트리아세트옥시보로하이드라이드 (845 mg, 4 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 결과로 생긴 혼합물을 EtOAc 및 포화된 수성 NaHCO3 사이에서 구분하였다. 유기층을 소금물로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조하고, 여과하고, 감소된 압력 하에 농축하여 점성 오일로서 850 mg의 화합물 211을 공급하였다.
MS (ESI) m/z: C21H41N2O6에 대한 [M+H]+ 계산치: 417.3; 실측치: 417.2.
13-(1-( tert - 부톡시카르보닐 )피페리딘-4-일)-2,2-디메틸-4,14- 디옥소 -3,7,10-트리옥사-13-아자헵타데칸-17-오익 산 ( 212)의 합성
자력 교반 막대를 함유하는 건조된 신틸레이션 바이알에 tert-부틸 4-((2-(2-(3-(tert-부톡시)-3-옥소프로폭시)에톡시)에틸)아미노)피페리딘-1-카르복실레이트 211 (220 mg, 0.5 mmol), 석신산 무수물 (55 mg, 0.55 mmol), 4-(디메틸아미노)피리딘 (5 mg, 0.04 mmol), 및 디클로로메탄 (3 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24 h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 플래시 크로마토그래피 (50-100% EtOAc/헥산을 용출함)로 부분적으로 정제하여 투명한 오일로서 117 mg의 화합물 212를 수득하였으며, 이것을 추가의 특성화 없이 수행하였다.
MS (ESI) m/z: C25H45N2O9에 대한 [M+H]+ 계산치: 517.6; 실측치: 517.5.
17-( tert -부틸) 1-((1 4 S,1 6 S,3 3 S,2R,4S,10E,12E,14R)-8 6 -클로로-1 4 -하이드록시-8 5 ,14-디메톡시-3 3 ,2,7,10-테트라메틸-1 2 ,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나사이클로테트라데카페인-10,12-디엔-4-일) (2S)-8-(1-( tert -부톡시 카르보닐 )피페리딘-4- 일 )-2,3- 디메틸 -4,7-디옥소-11,14-디옥사-3,8-디아자헵타데칸디오에이트 (213)의 합성
자력 교반 막대를 함유하는 건조된 신틸레이션 바이알에 13-(1-(tert-부톡시카르보닐)피페리딘-4-일)-2,2-디메틸-4,14-디옥소-3,7,10-트리옥사-13-아자헵타데칸-17-오익 산 212 (55 mg, 0.1 mmol), N-데아실 메이탄신 124 (65 mg, 0.1 mmol), HATU (43 mg, 0.11 mmol), DMF (1 mL), 및 디클로로메탄 (0.5 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 8 h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 C18 플래시 크로마토그래피 (5-100% MeCN/물을 용출함)로 직접 정제하여 흰색 막으로서 18 mg (16%)의 화합물 213을 제공하였다.
MS (ESI) m/z: C57H87ClN5O17에 대한 [M+H]+ 계산치: 1148.6; 실측치: 1148.7.
(2S)-1-(((1 4 S,1 6 S,3 3 S,2R,4S,10E,12E,14R)-8 6 - 클로로 -1 4 - 하이드록시 -8 5 ,14-디메톡시-3 3 ,2,7,10-테트라메틸-1 2 ,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나사이클로테트라데카페인-10,12-디엔-4-일)옥시)-2,3-디메틸-1,4,7-트리옥소-8-(피페리딘-4-일)-11,14-디옥사-3,8-디아자헵타데칸-17-오익 산 (214)의 합성
자력 교반 막대를 함유하는 건조된 신틸레이션 바이알에 메이탄시노이드 213 (31 mg, 0.027 mmol) 및 디클로로메탄 (1 mL)을 첨가하였다. 용액을 0 ℃로 냉각시켰고 주석(IV) 테트라염소 (디클로로메탄, 0.3 mL, 0.3 mmol 중 1.0 M 용액)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 1 h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 C18 플래시 크로마토그래피 (5-100% MeCN/물을 용출함)로 직접 정제하여 흰색 고체 (16 mg, 60% 수율)로서 16 mg (60%)의 화합물 214를 수득하였다.
MS (ESI) m/z: C48H71ClN5O15에 대한 [M+H]+ 계산치: 992.5; 실측치: 992.6.
(2S)-8-(1-(3-(2-((2-(((9H- 플루오렌 -9-일) 메톡시 )카르보닐)-1,2- 디메틸히드라지닐 )메틸)-1H-인돌-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-1-(((1 4 S,1 6 S,3 3 S,2R,4S,10E,12E,14R)-8 6 -클로로-1 4 -하이드록시-8 5 ,14-디메톡시-3 3 ,2,7,10-테트라메틸-1 2 ,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나사이클로테트라데카페인-10,12-디엔-4-일)옥시)-2,3-디메틸-1,4,7-트리옥소-11,14-디옥사-3,8-디아자헵타데칸-17-오익 산 (215)의 합성
자력 교반 막대를 함유하는 건조된 신틸레이션 바이알에 메이탄시노이드 214 (16 mg, 0.016 mmol), (9H-플루오렌-9-일)메틸 1,2-디메틸-2-((1-(3-옥소-3-(퍼플루오로페녹시)프로필)-1H-인돌-2-일)메틸)히드라진-1-카르복실레이트 (5) (13 mg, 0.02 mmol), DIPEA (8 μL, 0.05 mmol), 및 DMF (1 mL)를 첨가하였다. 용액을 실온에서 18 h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 C18 플래시 크로마토그래피 (5-100% MeCN/물을 용출함)로 직접 정제하여 흰색 고체로서 18 mg (77%)의 화합물 215를 수득하였다.
MS (ESI) m/z: C77H98ClN8O18에 대한 [M+H]+ 계산치: 1457.7; 실측치: 1457.9.
(2S)-1-(((1 4 S,1 6 S,3 3 S,2R,4S,10E,12E,14R)-8 6 - 클로로 -1 4 - 하이드록시 -8 5 ,14-디메톡시-3 3 ,2,7,10-테트라메틸-1 2 ,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나사이클로테트라데카페인-10,12-디엔-4-일)옥시)-8-(1-(3-(2-((1,2-디메틸히드라지닐)메틸)-1H-인돌-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-2,3-디메틸-1,4,7-트리옥소-11,14-디옥사-3,8-디아자헵타데칸-17-오익 산 (216)의 합성
자력 교반 막대를 함유하는 건조된 신틸레이션 바이알에 메이탄시노이드 215 (18 mg, 0.012 mmol), 피페리딘 (20 μL, 0.02 mmol), 및 DMF (1 mL)를 첨가하였다. 용액을 실온에서 20 분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 C18 플래시 크로마토그래피 (1-60% MeCN/물을 용출함)로 직접 정제하여 흰색 고체로서 15 mg (98%)의 화합물 216 (본원에서 HIPS-4AP-메이탄신 또는 HIPS-4-아미노-피페리딘-메이탄신으로도 불림)를 수득하였다.
MS (ESI) m/z: C62H88ClN8O16에 대한 [M+H]+ 계산치: 1235.6; 실측치: 1236.0.
실시예 5
생체 컨쥬게이션 , 정제, 및 HPLC 분석
방법:
0.85% DMA를 함유하는 50 mM 나트륨 시트레이트, 50 mM NaCl pH 5.5에서 C-말단에 알데하이드-태그된 αHER2 항체 (15 mg/mL)를 37 ℃에서 72 h 동안 HIPS-4AP-메이탄신 (실시예4 참조) (8 mol. 당량 약물:항체)에 컨쥬게이션하였다. 컨쥬게이션되지 않은 항체를 이동상 A: 1.0 M 암모늄 설페이트, 25 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.0, 및 이동상 B: 25% 아이소프로판올, 18.75 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.0을 구비한 예비-규모 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC; GE Healthcare 17-5195-01)를 사용하여 제거하였다. 33% B의 등용매 구배를 사용하여 컨쥬게이션되지 않은 물질을 용출한 후 이어서, 41-95% B의 선형 구배를 사용하여 단일- 및 이중-컨쥬게이션된 종을 용출하였다. 최종 생성물의 DAR를 결정하기 위해서, 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)를 이동상 A: 1.5 M 암모늄 설페이트, 25 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.0, 및 이동상 B: 25% 아이소프로판올, 18.75 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.0을 구비한 분석적 HIC (Tosoh #14947)로 검사하였다. 응집을 결정하기 위해서, 샘플을 300 mM NaCl, 25 mM 나트륨 포스페이트 pH 6.8의 이동상을 구비한 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (SEC; Tosoh #08541)를 사용하여 분석하였다.
결과:
중쇄 C-말단 (CT)에서 알데하이드 태그를 함유하도록 변형된 αHER2 항체를 상기 기술된 바와 같이 HIPS-4AP 링커에 부착된 메이탄신 페이로드에 컨쥬게이션하였다. 완료시, 컨쥬게이션되지 않은 항체를 예비 HIC로 제거하였고 어떤 잔류 유리 약물을 버퍼 교환 중에 접선 유동 여과로 제거하였다. 이 반응들은 높은 수율을 나타냈는데, 컨쥬게이션 효율은 ≥84%이고 총 수율은 >50%이다. 결과로 생긴 ADC는 1.6-1.9의 약물-대-항체 비율 (DAR)을 가지고 대부분 모노머이다. 도 18-21은 HIC 및 역상 PLRP 크로마토그래피로 결정된 미가공 반응물 및 정제된 ADC의 예의 DAR을 도시하고, SEC에 의해 결정된 모노머 무결성을 도시한다.
도 18은 HIPS-4AP 링커에 부착된 메이탄신 페이로드에 컨쥬게이션된 중쇄 C-말단 (CT) 태그된 αHER2 항체의 예의 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 분석의 그래프를 도시한다 (실시예4 참조). 미가공 생성물 약물-대-항체 비율 (DAR)은 HIC에 의해 1.64인 것으로 결정되었다.
도 19는 HIPS-4AP 링커에 부착된 메이탄신 페이로드에 컨쥬게이션된 중쇄 C-말단 (CT) 태그된 αHER2 항체의 예의 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 분석의 그래프를 도시한다 (실시예4 참조). 최종 생성물 약물-대-항체 비율 (DAR)은 HIC에 의해 1.86인 것으로 결정되었다.
도 20은 HIPS-4AP 링커에 부착된 메이탄신 페이로드에 컨쥬게이션된 중쇄 C-말단 (CT) 태그된 αHER2 항체의 예의 폴리머 역상 (PLRP) 크로마토그래피 분석의 그래프를 도시한다 (실시예4 참조). 최종 생성물 약물-대-항체 비율 (DAR)은 PLRP에 의해 1.84인 것으로 결정되었다.
도 21은 HIPS-4AP 링커에 부착된 메이탄신 페이로드에 컨쥬게이션된 중쇄 C-말단 (CT) 태그된 αHER2 항체의 예의 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 분석의 그래프를 도시한다 (실시예4 참조). 분석적 SEC는 최종 생성물에 대하여 98.5% 모노머를 나타냈다.
시험관 내 안정성
방법:
항체-약물 컨쥬게이트를 40 μg/mL로 래트 혈장에 넣었다. 샘플을 앨리쿼트하여 사용할 때까지 -80 ℃에서 저장하였다. 앨리쿼트를 지시된 시간 동안 5% CO2 하에 37 ℃에 둔 다음, ELISA로 분석하여 항-메이탄신 및 항-Fab 신호를 평가하였다. 갓 해동된 앨리쿼트를 컨쥬게이션에 대한 기준 시작값으로 사용하였다. 샘플을 블로킹 버퍼 (카세인 버퍼, Thermo Fisher)에서 검정의 선형 범위 (20-40 ng/mL) 내에 있도록 희석하였다. 모든 분석물을 한 플레이트 상에서 함께 측정하여 전체 시점에 걸친 비교를 가능하게 하였다. 분석물을 상단 네 개의 행에서 항-인간 Fab-특이적 항체 (항-메이탄신 판독을 위해) 및 하단 네 개의 행에서 항-인간 IgG-특이적 항체 (항-Fc 판독을 위해)로 코팅된 플레이트 상에서 캡쳐하였다. 이어서, 페이로드를 항-메이탄신 항체 (자체적으로 제조되고 검증됨)에 이어서 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체로 검출하였다; 총 항체를 직접적으로 컨쥬게이션된 항-인간 Fc-특이적 항체로 검출하였다. 결합된 2차 항체를 Ultra TMB One-Step ELISA 기질 (Thermo Fisher)을 이용하여 가시화하였다. 비색 반응을 H2SO4로 중단시켰고, 비색 반응을 H2SO4로 중단시켰고, 450 nm에서의 흡광도를 Molecular Devices SpectraMax M5 플레이트 리더를 사용하여 결정하였다. 데이터 분석을 엑셀에서 수행하였다. 각 샘플을 4배수로 분석하였고, 평균값을 사용하였다. 항-Fab 신호에 대한 항-메이탄신 신호의 비율을 항체 컨쥬게이션의 측정값으로 사용하였다.
결과:
CT에서 HIPS-4AP-메이탄신에 컨쥬게이션된 αHER2 ADC의 안정성을 테스트하였다. 혈장에서 37 ℃에서 7일 동안 탈컨쥬게이션의 증거를 관찰할 수 없었으며, 같은 조건 하에서 14일 이후에 페이로드의 최소 (5%) 손실만을 관찰하였다 (도 22).
시험관 내 세포독성
방법:
HER2-양성 위 암종 세포주, NCI-N87를 ATCC로부터 얻었고 10% 태아 소 혈청 (Invitrogen) 및 Glutamax (Invitrogen)가 보충된 RPMI-1640 배지 (Cellgro)에서 유지하였다. 플레이팅 24 h 전에, 지수증식기 성장을 보장하기 위해서 세포를 계대배양하였다. 플레이팅 당일에, 5000개 세포/웰을 10 IU 페니실린 및 10 μg/mL 스트렙토마이신 (Cellgro)이 보충된 90 μL 정상 성장 배지에서 96-웰 플레이트 상에 분주하였다. 세포에 희석된 분석물 (HIPS-4AP-메이탄신 및 메이탄신에 컨쥬게이션된 αHER2 ADC) 10 μL을 다양한 농도로 처리하였고, 플레이트를 5% CO2의 대기에서 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 6 d 후, 100 μL/웰의 Cell Titer-Glo 시약 (Promega)을 첨가하였고, 발광을 Molecular Devices SpectraMax M5 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 데이터 분석에 사용하였다.
결과:
αHER2 CT HIPS-4AP-메이탄신은 시험관 내에서 유리 메이탄신과 비교하여 NCI-N87 세포에 대하여 매우 강력한 활성을 나타냈다 (도 23). IC50 농도는 ADC 및 유리 약물에 대하여 각각 0.032 및 0.35 nM이었다.
직접적 ELISA HER2 항원 결합
방법:
Maxisorp 96-웰 플레이트 (Nunc)를 4 ℃에서 밤새도록 PBS 중 인간 HER2-His (Sino Biological) 1 μg/mL로 코팅하였다. 플레이트를 카세인 버퍼 (ThermoFisher)로 블로킹한 다음, αHER2 야생형 항체 및 ADC를 200 ng/mL로 시작하여 2배 희석의 11 단계 시리즈로 플레이팅하였다. 플레이트를 실온에서 2 h 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. PBS 0.1% Tween-20로 세척한 후, 결합된 분석물을 당나귀 항-인간 Fc-γ-특이적 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)-컨쥬게이션된 2차 항체로 검출하였다. 신호를 Ultra TMB (Pierce)로 가시화하였고 2 N H2SO4로 퀸칭하였다. 450 nm에서의 흡광도를 Molecular Devices SpectraMax M5 플레이트 리더를 사용하여 결정하였고 데이터를 GraphPad Prism을 사용하여 분석하였다.
결과:
도 24에서 도시된 바와 같이, 항원 결합에 대한 알데하이드 태그 배치 또는 HIPS-4AP-메이탄신 컨쥬게이션의 효과를 관찰할 수 없었다. 이 데이터로부터 계산된 EC50 농도는 야생형 및 4AP 컨쥬게이션된 항체에 대하여 각각 6.0 및 5.3 ng/mL였다.
이종이식 연구
방법:
수컷 BALB/c 누드(nude) 마우스에 4.5 x 106개의 NCI-N87 종양 세포를 피하로 접종하였다. 종양이 평균 269 mm3에 도달하였을 때 처치를 시작하였으며, 이때 동물에게 CT-태그된 αHER2 HIPS-4AP-메이탄신 (3 또는 6 mg/kg) 또는 CT-태그된 아이소타입 대조군 HIPS-4AP-메이탄신 컨쥬게이트 (6 mg/kg)를 정맥 내로 투여하였다. 투여를 4주 동안 주 1회 진행하였다. 동물을 체중 및 종양 크기에 대하여 주 2회 관찰하였다. 종양이 1500 mm3에 도달하였을 때 동물들을 안락사키셨다.
결과:
처치 18일 후, αHER2 ADC가 투여된 동물의 모든 종양은 약물에 반응하였다 (도 25). 6 mg/kg으로 투여된 동물에서 가장 큰 성장의 감소를 관찰하였으며, 이것은 25%의 종양 성장 억제율 (T/C)을 나타냈다. 아이소타입 대조군 ADC가 투여된 동물은 비히클-처치된 대조군과 유사한 종양 성장을 나타냈다 (95% T/C 비율).
본 발명은 이것의 구체적인 구체예에 관하여 기술되는 한편, 당업자들에 의해 다양한 변화가 이루어질 수도 있고 동등물들이 본 발명의 진정한 사상 및 범위에서 벗어나지 않으면서 대체될 수도 있다고 생각되어야 한다. 이에 더하여, 특정 상황, 물질, 물질의 조성, 공정, 공정의 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적, 사상 및 범위에 적용하기 위한 많은 변형이 이루어질 수도 있다. 이러한 모든 변형들은 본원에 첨부된 청구범위 내에 있도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Rabuka, David Albers, Aaron E Barfield, Robyn M deHart, Gregory W Drake, Penelope M Kudirka, Romas A Garofalo, Albert M McFarland, Jessie M <120> ANTI-HER2 ANTIBODY-MAYTANSINE CONJUGATES AND METHODS OF USE THEREOF <130> RDWD-012 <140> US 14/723,393 <141> 2015-05-27 <150> US 62/008,980 <151> 2014-06-06 <160> 224 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 867 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys 20 25 30 Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His 35 40 45 Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr 50 55 60 Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val 65 70 75 80 Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu 85 90 95 Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr 100 105 110 Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro 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Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 57 Cys Thr Ala Trp Ala Tyr Glu Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 58 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 58 Cys Ala Arg Ala Tyr Tyr Asp Phe Ser Trp Phe Val Tyr Trp 1 5 10 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 59 Cys Ala Arg Trp Gly Asp Gly Ser Phe Ala Tyr Trp 1 5 10 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 60 Cys Ala Gly Tyr Gly Asn Gly Pro Met Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 61 Cys Ala Arg Gly Ser Ser Gly Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 15 <210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 62 Cys Ala Arg Gly Ala Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 63 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 63 Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 1 5 <210> 64 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 64 Gln Asp Val Ile Ala Ala 1 5 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 65 Lys Ser Val Thr Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr 1 5 10 <210> 66 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 66 Gln Asp Val Ser Ala Ala 1 5 <210> 67 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 67 Gln Asp Val Phe Thr Ala 1 5 <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 68 Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 69 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 69 Gln Asn Val Gly Thr Ala 1 5 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 70 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 71 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 71 Gln Asp Val Gly Thr Ala 1 5 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 72 Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 73 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 73 Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 74 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 74 Cys His His Ser Arg Glu Leu Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 75 Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe 1 5 10 <210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 76 Cys Gln Gln His Phe Gly Ile Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 77 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 77 Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 78 Cys Gln Gln Tyr Arg Ser Tyr Pro Phe Thr Phe 1 5 10 <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 79 Cys Gln Gln Tyr His Asn Tyr Pro Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 80 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 80 Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Met Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 81 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 81 Cys Gln Gln Trp Ser Ser Thr Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 82 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 82 Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu 1 5 10 <210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 83 Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr 1 5 10 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 84 Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser 1 5 10 <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 85 Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu 1 5 10 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 86 Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro 1 5 10 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 87 Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile 1 5 10 <210> 88 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 88 Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys 1 5 10 <210> 89 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 89 Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr 1 5 10 <210> 90 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 90 Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr 1 5 10 <210> 91 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 91 Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Val 1 5 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 92 Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr 1 5 <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 93 Ala Ser Leu Ser Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 94 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 95 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 95 Gly Pro Gly Leu Ala Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr 1 5 10 15 Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Val Ile Ser Trp Val Arg Gln 20 25 30 Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly 35 40 45 Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys 50 55 60 Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 65 70 75 80 Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Ser Tyr Asp Gly Phe 85 90 95 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 <210> 96 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 96 Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp 35 40 45 Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp 65 70 75 80 Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe 85 90 95 Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 97 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 97 Leu Cys Thr Pro Ser Arg 1 5 <210> 98 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 98 Met Cys Thr Pro Ser Arg 1 5 <210> 99 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 99 Val Cys Thr Pro Ser Arg 1 5 <210> 100 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 100 Leu Cys Ser Pro Ser Arg 1 5 <210> 101 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 101 Leu Cys Ala Pro Ser Arg 1 5 <210> 102 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 102 Leu Cys Val Pro Ser Arg 1 5 <210> 103 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 103 Leu Cys Gly Pro Ser Arg 1 5 <210> 104 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 104 Ile Cys Thr Pro Ala Arg 1 5 <210> 105 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 105 Leu Cys Thr Pro Ser Lys 1 5 <210> 106 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 106 Met Cys Thr Pro Ser Lys 1 5 <210> 107 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 107 Val Cys Thr Pro Ser Lys 1 5 <210> 108 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 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<220> <223> Synthetic polypeptide <400> 116 Leu Cys Ser Pro Ser Ala 1 5 <210> 117 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 117 Leu Cys Ala Pro Ser Ala 1 5 <210> 118 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 118 Leu Cys Val Pro Ser Ala 1 5 <210> 119 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 119 Leu Cys Gly Pro Ser Ala 1 5 <210> 120 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 120 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser 1 5 10 <210> 121 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> FORMYLATION, coupled to a moiety <400> 121 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Leu Gly Thr Pro Ser Arg Gly Ser 1 5 10 15 <210> 122 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 122 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1 5 <210> 123 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 123 Lys Val Asp Asn Ala Leu 1 5 <210> 124 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 124 Gln Ser Gly Asn Ser Gln 1 5 <210> 125 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> FORMYLATION, coupled to a moiety <400> 125 Lys Val Asp Asn Ala Leu Gly Thr Pro Ser Arg Gln Ser Gly Asn Ser 1 5 10 15 Gln <210> 126 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 126 Ser Trp Asn Ser Gly Ala 1 5 <210> 127 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 127 Gly Val His Thr Phe Pro 1 5 <210> 128 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> FORMYLATION, coupled to a moiety <400> 128 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Gly Thr Pro Ser Arg Gly Val His Thr 1 5 10 15 Phe Pro <210> 129 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 129 Ala Ser Thr Lys Gly Pro 1 5 <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 130 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 1 5 <210> 131 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 131 Pro Glu Pro Val 1 <210> 132 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 132 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 1 5 <210> 133 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 133 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 1 5 10 15 Gln Ser Ser Gly Leu 20 <210> 134 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 134 Gln Ser Ser Gly Leu 1 5 <210> 135 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 135 Thr Gln Thr Tyr 1 <210> 136 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 136 His Lys Pro Ser Asn 1 5 <210> 137 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 137 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly 20 <210> 138 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 138 Phe Pro Pro Lys Pro 1 5 <210> 139 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 139 Ile Ser Arg Thr Pro 1 5 <210> 140 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 140 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 1 5 <210> 141 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 141 Ser His Glu Asp Pro Glu Val 1 5 <210> 142 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 142 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 1 5 <210> 143 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 143 Gln Tyr Asn Ser Thr 1 5 <210> 144 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 144 Val Leu Thr Val Leu 1 5 <210> 145 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 145 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 1 5 <210> 146 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 146 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 1 5 <210> 147 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 147 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 1 5 <210> 148 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 148 Pro Pro Ser Arg Lys Glu Leu Thr Lys Asn 1 5 10 <210> 149 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 149 Tyr Pro Ser Asp Ile 1 5 <210> 150 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 150 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 1 5 <210> 151 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 151 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 1 5 10 <210> 152 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 152 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Pro Gly Lys <210> 153 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 153 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1 5 <210> 154 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 154 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 1 5 10 <210> 155 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 155 Phe Pro Glu Pro Val 1 5 <210> 156 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 156 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 1 5 10 <210> 157 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 157 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 1 5 <210> 158 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 158 Val Ala Gly Pro Ser 1 5 <210> 159 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 159 Val Leu Thr Val Val 1 5 <210> 160 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 160 Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 1 5 <210> 161 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 161 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 1 5 <210> 162 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 162 Met Thr Lys Asn Gln 1 5 <210> 163 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 163 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 1 5 10 <210> 164 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 164 Gly Asn Val Phe 1 <210> 165 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 165 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly Thr 1 5 10 <210> 166 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 166 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Ser Ser Gly <210> 167 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 167 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp 1 5 10 <210> 168 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 168 Cys Pro Arg Cys Pro Lys Pro 1 5 <210> 169 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 169 Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro 1 5 10 15 Glu Leu Leu Gly Gly 20 <210> 170 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 170 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 1 5 10 <210> 171 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 171 Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 1 5 <210> 172 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 172 His Glu Ala Leu His Asn Arg 1 5 <210> 173 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 173 Ser Thr Lys Gly Pro 1 5 <210> 174 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 174 Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 1 5 10 <210> 175 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 175 Phe Pro Pro Lys Pro 1 5 <210> 176 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 176 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 1 5 <210> 177 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 177 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 1 5 <210> 178 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 178 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 1 5 10 <210> 179 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 179 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 1 5 10 <210> 180 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 180 Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu 1 5 10 <210> 181 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 181 Gln Pro Asp Gly Asn 1 5 <210> 182 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 182 Val Gln Gly Phe Phe Pro Gln Glu Pro Leu 1 5 10 <210> 183 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 183 Ser Gly Gln Gly Val Thr Ala Arg Asn Phe Pro 1 5 10 <210> 184 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 184 Ser Gly Asp Leu Tyr Thr Thr 1 5 <210> 185 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 185 Pro Ala Thr Gln 1 <210> 186 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 186 His Arg Pro Ala 1 <210> 187 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 187 Leu Leu Gly Ser Glu 1 5 <210> 188 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 188 Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val 1 5 <210> 189 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 189 Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro 1 5 10 <210> 190 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 190 Gly Cys Tyr Ser 1 <210> 191 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 191 Cys Ala Glu Pro 1 <210> 192 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 192 Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu 20 <210> 193 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 193 Ala Arg Gly Phe Ser 1 5 <210> 194 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 194 Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr 1 5 10 <210> 195 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 195 Ala Ala Glu Asp 1 <210> 196 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 196 His Glu Ala Leu 1 <210> 197 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 197 Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val 1 5 10 15 Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr 20 25 <210> 198 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 198 Asn Ser Gly Ala Leu Cys Thr Pro Ser Arg Gly 1 5 10 <210> 199 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 199 Cys Thr Pro Ser Arg 1 5 <210> 200 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 200 Asn Leu Cys Thr Pro Ser Arg Ala Pro 1 5 <210> 201 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 201 Lys Ala Lys Gly Leu Cys Thr Pro Ser Arg 1 5 10 <210> 202 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 202 Leu Cys Thr Pro Ser 1 5 <210> 203 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 203 Arg Thr Val Ala Ala Pro 1 5 <210> 204 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 204 Tyr Pro Arg Glu Ala 1 5 <210> 205 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 205 Pro Arg Glu Ala 1 <210> 206 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 206 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 1 5 <210> 207 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 207 Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 1 5 <210> 208 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 208 His Gln Gly Leu Ser Ser 1 5 <210> 209 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 209 Arg Gly Glu Cys 1 <210> 210 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 210 Gln Pro Lys Ala Ala Pro 1 5 <210> 211 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 211 Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val 1 5 <210> 212 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 212 Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 1 5 <210> 213 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 213 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 1 5 <210> 214 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 214 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu <210> 215 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 215 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 1 5 <210> 216 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 216 Gly Ala Leu Cys Thr Pro Ser Arg Gly Val His 1 5 10 <210> 217 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 217 Ser Leu Cys Thr Pro Ser Arg Gly Ser 1 5 <210> 218 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 218 Lys Val Asp Asn Ala Leu Leu Cys Thr Pro Ser Arg Gln Ser Gly Asn 1 5 10 15 Ser Gln <210> 219 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 219 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp 1 5 10 <210> 220 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 220 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 221 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys or Ser <400> 221 Leu Xaa Thr Pro Ser Arg 1 5 <210> 222 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> FORMYLATION, coupled to a moiety <400> 222 Leu Gly Thr Pro Ser Arg 1 5 <210> 223 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 223 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 <210> 224 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> FORMYLATION, coupled to a moiety <400> 224 Ser Pro Gly Ser Leu Gly Thr Pro Ser Arg Gly Ser 1 5 10

Claims (29)

  1. 다음 식 (I)의 컨쥬게이트:
    Figure 112022064548386-pct00074

    상기 식에서
    Q1은 C 또는 N이며, Q1이 N이면, Y1은 없고;
    Y1은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
    R1은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
    R2 및 R3는 각각 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R2 및 R3는 선택적으로 환형으로 연결되어 5 또는 6-원자 헤테로사이클릴을 형성하고;
    L은 -(T1-Z1)a-(T2-Z2)b-(T3-Z3)c-(T4-Z4)d로 구성된 링커이며, a, b, c, 및 d는 각각 독립적으로 0 또는 1이며, a, b, c, 및 d의 합은 3 내지 4이고;
    T1은 (C1-C12)알킬 및 치환된 (C1-C12)알킬로부터 선택되고;
    T2는 피페리딘-4-아미노 (4AP)이고;
    T3은 (C1-C12)알킬 및 치환된 (C1-C12)알킬로부터 선택되고;
    T4는, 존재할 경우, (AA)p이고, 여기서 p는 1 내지 20의 정수이고;
    Z1, Z2, Z3, 및 Z4는 각각 공유 결합 및 -CO- 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    W1은 메이탄시노이드이고;
    W2는 포르밀글리신 잔기를 포함하는 설파타제 모티프를 포함하는 항-HER2 항체이고, 여기서 포르밀글리신 잔기는 링커를 통해 상기 메이탄시노이드에 커플링된다.
  2. 제1 항에 있어서,
    피페리딘-4-아미노는
    Figure 112022064548386-pct00077
    이고;
    R12는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 아릴 및 치환된 아릴로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  3. 제1 항에 있어서, T1, T2, T3, 및 T4 및 Z1, Z2, Z3, 및 Z4는 다음 표로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트:
    Figure 112022064548386-pct00156
  4. 제 1 항에 있어서, L은 다음 구조 중 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트:
    Figure 112022064548386-pct00109
    Figure 112022064548386-pct00110

    Figure 112022064548386-pct00111
    Figure 112022064548386-pct00112

    상기 식에서
    각각의 f는 독립적으로 0 또는 1 내지 12의 정수이고;
    각각의 n는 독립적으로 0 또는 1 내지 30의 정수이고;
    각각의 p는 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이고;
    각각의 R은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴이고;
    각각의 R'은 독립적으로 H, 아미노산의 측쇄 기, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 설포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴이다.
  5. 제1 항에 있어서, 메이탄시노이드는 다음 식인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트:
    Figure 112016123593442-pct00113

    상기 식에서
    Figure 112016123593442-pct00114
    는 메이탄시노이드와 L 사이의 부착점을 나타낸다.
  6. 제1 항에 있어서, 항-HER2 항체는 HER2의 도메인 I, 도메인 II, 도메인 III, 또는 도메인 IV 내에서 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  7. 제1 항에 있어서, 항-HER2 항체는 서열 번호:1의 아미노산 561-625 또는 아미노산 529-625 내에서 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  8. 제1 항에 있어서, 항-HER2 항체는 huMAb4D5-8인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  9. 제1 항에 있어서, 항-HER2 항체는 식 (II)의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트:
    Figure 112022064548386-pct00115

    상기 식에서
    FGly'는 링커를 통해 상기 메이탄시노이드에 커플링된 포르밀글리신 잔기이고;
    Z20은 프롤린 또는 알라닌 잔기이고;
    Z30은 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
    X1은 존재하거나 존재하지 않을 수도 있으며, 존재할 때는, 임의의 아미노산일 수 있고, 단 상기 서열이 컨쥬게이트의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고;
    X2 및 X3는 각각 독립적으로 임의 아미노산이다.
  10. 제9 항에 있어서, 상기 서열은 L(FGly')TPSR인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  11. 제9 항에 있어서,
    Z30은 R, K, H, A, G, L, V, I, 및 P로부터 선택되고;
    X1은 L, M, S, 및 V로부터 선택되고;
    X2 및 X3은 각각 S, T, A, V, G, 및 C로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  12. 제1 항에 있어서, 포르밀글리신 잔기는 항-HER2 항체의 중쇄 불변 영역의 C-말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  13. 제12 항에 있어서, 중쇄 불변 영역은 식 (II)의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트:
    Figure 112022064548386-pct00116

    상기 식에서
    FGly'는 링커를 통해 상기 메이탄시노이드에 커플링된 포르밀글리신 잔기이고;
    Z20은 프롤린 또는 알라닌 잔기이고;
    Z30은 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
    X1은 존재하거나 존재하지 않을 수도 있으며, 존재할 때는, 임의의 아미노산일 수 있고, 단 상기 서열이 컨쥬게이트의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고;
    X2 및 X3는 각각 독립적으로 임의 아미노산이고,
    상기 서열은 아미노산 서열 SLSLSPG에 대하여 C-말단이다.
  14. 제13 항에 있어서, 중쇄 불변 영역은 서열 SPGSL(FGly')TPSRGS를 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  15. 제13 항에 있어서,
    Z30은 R, K, H, A, G, L, V, I, 및 P로부터 선택되고;
    X1은 L, M, S, 및 V로부터 선택되고;
    X2 및 X3은 각각 S, T, A, V, G, 및 C로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  16. 제1 항에 있어서, 포르밀글리신 잔기는 항-HER2 항체의 경쇄 불변 영역에 위치하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  17. 제16 항에 있어서, 경쇄 불변 영역은 식 (II)의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트:
    Figure 112022064548386-pct00117

    상기 식에서
    FGly'는 링커를 통해 상기 메이탄시노이드에 커플링된 포르밀글리신 잔기이고;
    Z20은 프롤린 또는 알라닌 잔기이고;
    Z30은 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
    X1은 존재하거나 존재하지 않을 수도 있으며, 존재할 때는, 임의의 아미노산일 수 있고, 단 상기 서열이 컨쥬게이트의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고;
    X2 및 X3는 각각 독립적으로 임의 아미노산이고,
    상기 서열은 서열 KVDNAL에 대하여 C-말단이고, 및/또는 서열 QSGNSQ에 대하여 N-말단이다.
  18. 제17 항에 있어서, 경쇄 불변 영역은 서열 KVDNAL(FGly')TPSRQSGNSQ를 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  19. 제17 항에 있어서,
    Z30은 R, K, H, A, G, L, V, I, 및 P로부터 선택되고;
    X1은 L, M, S, 및 V로부터 선택되고;
    X2 및 X3은 각각 S, T, A, V, G, 및 C로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  20. 제1 항에 있어서, 포르밀글리신 잔기는 항-HER2 항체의 중쇄 CH1 영역에 위치하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  21. 제20 항에 있어서, 중쇄 CH1 영역은 식 (II)의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트:
    Figure 112022064548386-pct00118

    상기 식에서
    FGly'는 링커를 통해 상기 메이탄시노이드에 커플링된 포르밀글리신 잔기이고;
    Z20은 프롤린 또는 알라닌 잔기이고;
    Z30은 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
    X1은 존재하거나 존재하지 않을 수도 있으며, 존재할 때는, 임의의 아미노산일 수 있고, 단 상기 서열이 컨쥬게이트의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고;
    X2 및 X3는 각각 독립적으로 임의 아미노산이고,
    상기 서열은 아미노산 서열 SWNSGA에 대하여 C-말단이고 및/또는 아미노산 서열 GVHTFP에 대하여 N-말단이다.
  22. 제21 항에 있어서, 중쇄 CH1 영역은 서열 SWNSGAL(FGly')TPSRGVHTFP를 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  23. 제21 항에 있어서,
    Z30은 R, K, H, A, G, L, V, I, 및 P로부터 선택되고;
    X1은 L, M, S, 및 V로부터 선택되고;
    X2 및 X3은 각각 S, T, A, V, G, 및 C로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  24. 제1 항에 있어서, 포르밀글리신 잔기는 항-HER2 항체의 중쇄 CH2 영역에 위치하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  25. 제1 항에 있어서, 포르밀글리신 잔기는 항-HER2 항체의 중쇄 CH3 영역에 위치하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  26. 제1 항 내지 제25 항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트; 및
    약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물.
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
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