TW202317188A - 於癌症中治療靶向鈣黏蛋白11 - Google Patents

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麥可 布倫奈
許亞瑪拉 馬赫斯瓦倫
大衛 Ｔ 丁
道格拉斯 米卡立茲
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美商通用醫院公司
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Abstract

本發明係關於用於治療癌症(例如乳癌或胰臟癌)之方法、用途及組合物。更特定言之，本發明係關於用具有特異性單株抗體純系23C6或3H10之抗鈣黏蛋白11單株抗體對癌症患者進行治療以治療性抑制癌細胞生長及轉移。

Description

於癌症中治療靶向鈣黏蛋白11
本發明係關於治療癌症(例如抗鈣黏蛋白11 (CDH11)抗體)的方法、組合物及其用途。
癌症之特徵在於無法控制細胞亞群之生長。癌症為發達世界之主要死亡病因及為發展中國家之第二大死亡病因，其中每年診斷出新癌症病例逾1400萬且發生逾八百萬癌症死亡。癌轉移或腫瘤細胞擴散至遠端器官為大部分實體腫瘤惡性病中主要死亡病因。癌症照護因此代表著顯著且不斷增長的社會負擔。因此，研發有效免疫療法之需求尚未得到滿足。
一般而言，本發明之特徵在於抗鈣黏蛋白11 (CDH11)抗體及免疫結合物及其使用方法。
在一個態樣中，本發明之特徵在於一種用於治療或延遲個體之癌症進展之方法，該方法包括投與有效量的結合CDH11之抗體，該抗體包括CDR-H1，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 1；CDR-H2，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 2；CDR-H3，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 3；CDR-L1，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 4；CDR-L2，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 5；及CDR-L3，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 6；其中該癌症表現CDH11。
在前述態樣之一些實施例中，該方法抑制癌轉移。
在前述態樣之一些實施例中，該方法包括新輔助療法(例如化學療法、放射線療法、激素療法、靶向療法、免疫療法或其他生物療法)。
在前述態樣之一些實施例中，該方法包括輔助療法(例如，化學療法、放射線療法、激素療法、靶向療法或生物療法)。
在前述態樣之一些實施例中，該方法包括投與一或多種化學治療劑。
在前述態樣之一些實施例中，該方法包括投與放射線療法。
在前述態樣之一些實施例中，個體患有癌症。
在前述態樣之一些實施例中，抗體結合至細胞毒性劑。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種偵測來自受試者之樣品中的循環腫瘤細胞(CTC)之存在的方法，該方法包括：提供包括來自受試者之血液的樣品；及將該樣品與結合CDH11之抗體接觸，該抗體包括CDR-H1，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 1；CDR-H2，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 2；CDR-H3，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 3；CDR-L1，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 4；CDR-L2，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 5；及CDR-L3，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 6；及偵測該抗體與該CTC之結合，藉此偵測該樣品中該CTC之存在。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種診斷受試者之癌症的方法，該方法包括：提供包括來自受試者之血液的樣品；及在足以允許該抗體與表現CDH11之細胞結合的條件下，使該樣品與結合CDH11之抗體接觸，該抗體包括CDR-H1，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 1；CDR-H2，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 2；CDR-H3，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 3；CDR-L1，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 4；CDR-L2，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 5；及CDR-L3，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 6；及偵測該抗體與該樣品中之細胞上所存在的癌細胞表面標記物之結合，其中存在與該樣品中之細胞之結合指示該受試者患有癌症。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種用於表徵樣品中之一或多個CTC的方法，該方法包括：(a)測定樣品中CDH11基因之表現量；及(b)比較該CDH11基因之該表現量與該CDH11基因之參考量。
在前述態樣之一些實施例中，本方法進一步包括：(c)確定來自受試者之血液樣品中的該CDH11基因之表現量相對於該CDH11基因之參考量增加；及(d)投與有效量的結合CDH11之抗體，該抗體包括CDR-H1，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 1；CDR-H2，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 2；CDR-H3，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 3；CDR-L1，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 4；CDR-L2，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 5；及CDR-L3，其包括胺基酸序列SEQ ID NO: 6。
在前述態樣之一些實施例中，確定來自受試者之血液樣品中的該CDH11基因之表現量相對於該CDH11基因之參考量增加鑑別出受試者可能對用於延遲癌症進展之治療起反應。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種用於表徵樣品中之一或多個癌症相關纖維母細胞(CAF)的方法，該方法包括：(a)測定樣品中CDH11基因之表現量；及(b)比較該CDH11基因之該表現量與該CDH11基因之參考量。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，樣品為來自受試者之活體組織切片。在一些實施例中，活體組織切片為血液樣品。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種免疫結合物，其包括：(i)結合CDH11之抗體；及(ii)細胞毒性劑。
在前述態樣之一些實施例中，該抗體包括與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性的CDR-H1；與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性的CDR-H2；與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性的CDR-H3；與SEQ ID NO: 4之胺基酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性的CDR-L1；與SEQ ID NO: 5之胺基酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性的CDR-L2；與SEQ ID NO: 6之胺基酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性的CDR-L3。
在前述態樣之一些實施例中，該抗體包括：包括胺基酸序列SEQ ID NO: 1之CDR-H1；包括胺基酸序列SEQ ID NO: 2之CDR-H2；包括胺基酸序列SEQ ID NO: 3之CDR-H3；包括胺基酸序列SEQ ID NO: 4之CDR-L1；包括胺基酸序列SEQ ID NO: 5之CDR-L2；及包括胺基酸序列SEQ ID NO: 6之CDR-L3。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，細胞毒性劑為抗癌劑。在一些實施例中，抗癌劑為SN-38。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，抗體結合至CTC。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，該抗體包括：(a)與SEQ ID NO: 7之胺基酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性的重鏈可變區(HCVR)序列；(b)與SEQ ID NO: 8之胺基酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性的輕鏈可變區(LCVR)序列；或(c)如(a)中之HCVR序列及如(b)中之LCVR序列。
在前述態樣之一些實施例中，HCVR及/或LCVR包括至少一個取代。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，抗體包括有包括SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的HCVR及包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的LCVR。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，抗體為全長抗體。替代地，在前述態樣中之任一者的一些實施例中，抗體為結合至CDH11的抗體片段。在一些實施例中，抗體片段係選自由Fab、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段組成之群。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，免疫結合物進一步包括連接子。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，癌症為轉移癌。在一些實施例中，轉移癌為轉移性乳癌。在一些實施例中，轉移癌為轉移性胰臟癌。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，癌症為局部癌症。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種編碼抗人類CDH11抗體之HCVR的核酸分子，其中核酸分子包括以下CDR編碼序列：SEQ ID NO: 27 (CDR-H1)、SEQ ID NO: 28 (CDR-H2)及SEQ ID NO: 29 (CDR-H3)。
在前述態樣之一些實施例中，核酸分子包括編碼以下之序列：(a) SEQ ID NO: 9之重鏈構架1 (HC-FR1)序列；(b) SEQ ID NO: 10之重鏈構架2 (HC-FR2)序列；(c) SEQ ID NO: 11之重鏈構架3 (HC-FR3)序列；(d) SEQ ID NO: 12之重鏈構架4 (HC-FR4)序列；及/或(e) (a)-(d)中之任何一或多者的變異體，該變異體與其參考序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性，其中該等序列按以下次序：HC-FR1、CDR-H1、HC-FR2、CDR-H2、HC-FR3、CDR-H3及HC-FR4。
在前述態樣之一些實施例中，該核酸分子包括(a)由SEQ ID NO: 17編碼的SEQ ID NO: 9之HC-FR1序列；(b)由SEQ ID NO: 18編碼的SEQ ID NO: 10之HC-FR2序列；(c)由SEQ ID NO: 19編碼的SEQ ID NO: 11之HC-FR3序列；(d)由SEQ ID NO: 20編碼的SEQ ID NO: 12之HC-FR4序列；及/或(e) (a)-(d)中之任一或多者的HC-FR之變異體，該變異體由參考序列中之任一或多者的變異體編碼。
在前述態樣之一些實施例中，該核酸分子包括編碼該等HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3及HC-FR4中之各者的序列，其中視情況該等HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3及HC-FR4中之一或多者經與其參考序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性之其變異體置換。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，HCVR係由SEQ ID NO: 25之序列或其編碼與SEQ ID NO: 7具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性之序列之變異體的變異體編碼。
在前述態樣之一些實施例中，核酸分子編碼包括該抗人類CDH11抗體之該重鏈可變區的重鏈。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種編碼抗人類CDH11抗體之LCVR的核酸分子，其中核酸分子包括以下CDR編碼序列：SEQ ID NO: 30 (CDR-L1)、SEQ ID NO: 31 (CDR-L2)及SEQ ID NO: 32 (CDR-L3)。
在前述態樣之一些實施例中，該核酸分子包括編碼以下之序列：(a) SEQ ID NO: 13之輕鏈構架1 (LC-FR1)序列；(b) SEQ ID NO: 14之輕鏈構架2 (LC-FR2)序列；(c) SEQ ID NO: 15之輕鏈構架3 (LC-FR3)序列；(d) SEQ ID NO: 16之輕鏈構架4 (LC-FR4)序列；及/或(e) (a)-(d)中之任何一或多者的變異體，該變異體與其參考序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性，其中該等序列按以下次序：LC-FR1、CDR-L1、LC-FR2、CDR-L2、LC-FR3、CDR-L3及LC-FR4。
在前述態樣之一些實施例中，該核酸分子包括(a)由SEQ ID NO: 21編碼的SEQ ID NO: 13之LC-FR1序列；(b)由SEQ ID NO: 22編碼的SEQ ID NO: 14之LC-FR2序列；(c)由SEQ ID NO: 23編碼的SEQ ID NO: 15之LC-FR3序列；(d)由SEQ ID NO: 24編碼的SEQ ID NO: 16之LC-FR4序列；及/或(e) (a)-(d)中之任一或多者的HC-FR之變異體，該變異體由參考序列中之任一或多者的變異體編碼。
在前述態樣之一些實施例中，核酸分子包括編碼該等LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3及LC-FR4中之各者的序列，其中該等LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3及LC-FR4中之一或多者視情況經與其參考序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性之其變異體置換。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，輕鏈可變區由SEQ ID NO: 26之序列或其編碼與SEQ ID NO: 8具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性之變異序列的變異體編碼。
在前述態樣之一些實施例中，核酸分子編碼包括該抗人類CDH11抗體之該輕鏈可變區的輕鏈。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種核酸分子，其包括一或多個前述態樣中之任一者之核酸分子。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，核酸分子編碼(a)抗體重鏈；(b)抗體輕鏈；(c)抗體重鏈及抗體輕鏈；(d)HCVR；(e)LCVR；(f)HCVR及LCVR；(g)抗體片段；或(h)單鏈抗體。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種包括一或多個前述態樣中之任一者之核酸分子的載體。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種包括一或多個前述態樣中之任一者之核酸分子或前述態樣之載體的細胞。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種產生抗人類CDH11抗體的方法，該方法包括表現前述態樣中之任一者之核酸分子。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種由前述態樣中之任一者之核酸分子編碼的抗體，其中該抗體不包括鼠類重鏈恆定區及/或鼠類輕鏈恆定區。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種抗人類CDH11抗體，其包括：(a)重鏈可變區，其包括：(i) SEQ ID NO: 1之CDR-H1，(ii) SEQ ID NO: 2之CDR-H2，及(iii) SEQ ID NO: 3之CDR-H3；及/或(b)輕鏈可變區，其包括：(i) SEQ ID NO: 4之CDR-L1，(ii) SEQ ID NO: 5之CDR-L2，及(iii) SEQ ID NO: 6之CDR-L3，其中該抗體包括相對於該等所列舉序列在該等CDR序列中之一者中之至少一個取代，及/或為單鏈抗體。
在前述態樣之一些實施例中，抗體包括重鏈，該重鏈包括該抗人類CDH11抗體之該重鏈可變區，及/或該抗體包括輕鏈，該輕鏈包括該抗人類CDH11抗體之該輕鏈可變區。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，抗體係：(a)單株、單特異性、多特異性或雙特異性；(b)人類、嵌合或人類化抗體；及/或(c) IgG抗體，其視情況選自IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3及IgG4。
在前述態樣中之任一者之一些實施例中，抗體包括視情況為單鏈抗體(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、Dab、奈米抗體或Fv之抗體片段。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種針對人類CDH11之單鏈抗體或其融合物，其中該單鏈抗體包括以下CDR序列中之一或多者：CDR-H1 (SEQ ID NO: 1)、CDR-H2 (SEQ ID NO: 2)、CDR-H3 (SEQ ID NO: 3)、CDR-L1 (SEQ ID NO: 4)、CDR-L2 (SEQ ID NO: 5)及/或CDR-L3 (SEQ ID NO: 6)，且視情況CDR中之一或多者包括在該等所列舉序列中之一或多者內的一或多個取代。
在前述態樣之一些實施例中，該抗體或其單鏈抗體或融合物包括：(a) (i) SEQ ID NO: 9之HC-FR1序列；(ii) SEQ ID NO: 10之HC-FR2序列；(iii) SEQ ID NO: 11之HC-FR3序列；(iv) SEQ ID NO: 12之HC-FR4序列；及/或(v) (a) (i)-(iv)中之任何一或多者的變異體，該變異體與其參考序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性，其中該等序列按以下次序：HC-FR1、CDR-H1、HC-FR2、CDR-H2、HC-FR3、CDR-H3及HC-FR4；及/或(b) (i) SEQ ID NO: 13之LC-FR1序列；(ii) SEQ ID NO: 14之LC-FR2序列；(iii) SEQ ID NO: 15之LC-FR3序列；(iv) SEQ ID NO: 16之LC-FR4序列；及/或(v) (b) (i)-(iv)中之任何一或多者的變異體，該變異體與其參考序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性，其中該等序列按以下次序：LC-FR1、CDR-L1、LC-FR2、CDR-L2、LC-FR3、CDR-L3及LC-FR4。
在前述態樣之一些實施例中，該抗體或其單鏈抗體或融合物包括：(a)該等HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3及HC-FR4中之各者，其中視情況該等HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3及HC-FR4中之一或多者經與其參考序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性的其變異體置換；及/或(b)該等LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3及LC-FR4中之各者，其中視情況該等LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3及LC-FR4中之一或多者經與其參考序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性的其變異體置換。
在前述態樣之一些實施例中，單鏈抗體或其融合物包括(a) HCVR，其包括SEQ ID NO: 7之序列或與SEQ ID NO: 7具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性之其變異體；及/或(b) LCVR，其包括SEQ ID NO: 8之序列或與SEQ ID NO: 8具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)序列一致性之其變異體。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，其變異體包括至少一個取代。在前述態樣中之任一者的一些實施例中，至少一個取代包括在接觸殘基處及/或在其相鄰殘基處之取代。在一些實施例中，接觸殘基或其相鄰殘基係由抗原-抗體複合物之晶體結構決定，其中該抗體係23C6且抗原係CDH11。在一些實施例中，接觸殘基包括：相對於SEQ ID NO: 7之Phe 2、Gly 26、Tyr 27、Ser 28、Thr 30、Asp 31、Tyr 32、Asn 54、Tyr 55、Thr 57、Arg 98、Tyr 100、Tyr 101、Gly 102、Ser 103、Arg 104、Tyr 105及Asp 107。在一些實施例中，接觸殘基包括：相對於SEQ ID NO: 8之Ser 30、Ser 31、Ser 32、Tyr 33、His 35、Tyr 50、Ser 51、Ser 53、Asn 54、Leu 55、Ala 56、Ser 57、Gly 58、Val 59、Ala 61、Tyr 92及His 93。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，單鏈抗體包括2、3、4、5或所有6個該等CDR。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，單鏈抗體之可變輕鏈部分經由連接子連接至單鏈抗體之可變重鏈部分。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，單鏈抗體或其融合物包括視情況在單鏈抗體之可變輕鏈序列之C端融合至該單鏈抗體之Fc序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種編碼如前述態樣中任一項之抗體、單鏈抗體或融合物的核酸分子或包括該核酸分子之載體。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種包括前述態樣中之任一者之抗體、單鏈抗體或融合物的醫藥組合物。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種治療個體之癌症的方法，該方法包括投與有效量之前述態樣中任一項之免疫結合物或前述態樣之醫藥調配物。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種治療受試者之癌症的方法，該方法包括向該受試者投與前述態樣中之任一者之抗體或前述態樣之醫藥組合物。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，抗體與細胞毒性劑結合。在一些實施例中，該細胞毒性劑為SN-38。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，抗體結合至CDH11 (例如人類CDH11)及CDH1 (例如人類CDH1)。
在前述態樣中之任一者之一些實施例中，抗體結合至人類CDH11及人類CDH1。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，抗體結合至人類CDH11之胞外域。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，抗體結合至人類CDH11之抗原決定基，該抗原決定基包含LGMLCHSHAFAPERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRSKRGWVWNQFFVIEEYTGPDPVLVGRLHSDIDSGDGNIKYILSGEGAGTIFVIDDKS (SEQ ID NO: 33)或 APKFAAPYEGFICESDQTKPLSNQPIVTISADDKDDTANGPRFIFSLPPEIIHNPNFTVRDNRDNTAGVYARRGGFSRQKQDLYLLPIVISDGGIPPMSSTNTLT (SEQ ID NO: 34)。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，抗體結合至人類CDH1或鼠類CDH1之胞外域。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，抗體結合至人類CDH1及鼠類CDH1之胞外域。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，抗體結合至人類CDH1之胞外域。
在前述態樣中之任一者的一些實施例中，抗體結合至人類CDH1之抗原決定基，該抗原決定基包含LNTVGHHHRPPPHQASVSGIQAELLTFPNSSPGLRRQKRDWVIPPISCPENEKGPFPKNLVQIKSNKDKEGKVFYSITGQGADTPPVGVFIIERET (SEQ ID NO: 35)或 APIPEPRTIFFCERNPKPQVINIIDADLPPNTSPFTAELTHGASANWTIQYNDPTQESIILKPKMALEVGDYKINLKLMDNQNKDQVTTLE (SEQ ID NO: 36)。
在另一態樣中，本發明之特徵在於結合至CDH11 (例如人類CDH11)及CDH1 (例如人類CDH1)之抗體。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種免疫結合物，其包含：(i)結合CDH11及CDH1之抗體；及(ii)細胞毒性劑。
本文中所描述之免疫結合物之特徵在於抗CDH11抗體之抗原結合能力，其轉而使其具有高目標特異性、高目標親和力及低固有毒性之有用特徵，以及細胞毒性劑之重要特徵，包括殺死癌細胞的能力。因此，本發明為有利的，因為此類免疫結合物可增加免疫清除率及/或充當向患有癌症之受試者遞送細胞毒性劑的媒劑。另外，抗CDH11抗體能夠靶向血液中之轉移性細胞CTC。靶向轉移性細胞之能力能夠實現本文所描述之免疫結合物靶向除原發性腫瘤及/或已存在之腫瘤以外之相應轉移性過程的優勢。在一些實施例中，免疫結合物中所包括的抗體結合至CDH11 (例如人類CDH11)及CDH1 (例如人類CDH1)。
本發明之其他特徵及優勢將自以下實施方式及申請專利範圍顯而易見。
序列表  本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。該ASCII複本於2022年6月17日創建，命名為51569-002TW2_Sequence_Listing_6_17_22_ST25且大小為12,323個位元組。
本發明部分地基於以下發現：某些鈣黏蛋白表現於諸如乳癌細胞或上皮細胞向間葉細胞轉化(EMT)癌細胞或此兩者之癌症循環腫瘤細胞(CTC)上，且因此可用以用基於抗體之治療劑靶向使此等細胞。某些鈣黏蛋白通常實質上不存在於正常血細胞中，但存在於多種癌細胞上。此允許偵測、鑑別、分離、監測及治療性靶向血液、原發性腫瘤及癌轉移中之CTC及EMT癌細胞。鈣黏蛋白為已涉及廣泛多種癌症之表面抗原(例如參見Berx, G.及F. van Roy, Cold Spring Harb Perspect Biol, 1(6): a003129 (2009); Kim, D.S.等人, Cancer, 110(12):2785-92 (2007); Peinado, H.等人. Int J Dev Biol, 48(5-6):365-75 (2004))且提供癌症之潛在治療目標。鈣黏蛋白11 (CDH11)為在EMT及CTC細胞表面上表現之特定基因，藉此提供可用中和抗CDH11抗體治療性干預之目標，該抗體可增加免疫清除及/或充當遞送細胞毒性劑的媒劑。
定義  在詳細描述本發明之前，應理解，本發明不限於特定組合物或生物系統，其可理所當然有所變化。亦應瞭解，本文所用術語僅為了描述特定實施例，而非為了限制。
除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一個(種) (a/an)」及「該(the)」包括複數個(種)指示物。因此，舉例而言，提及「分子」視情況包括兩個或更多個此類分子之組合及其類似物。
應理解，本文所述之本發明之態樣及實施例包括「包含」態樣及實施例、「由」態樣及實施例「組成」及「基本上由」態樣及實施例「組成」。
如本文所用，術語「約」係指此技術領域之技術人員易於知曉之相應值的常見誤差範圍。本文中對「約」一值或參數之提及包括(且描述)本身係關於彼值或參數之實施例。
在本文中以最廣泛意義使用的術語「抗體」涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。舉例而言，「抗體」可指包含由二硫鍵互連之至少兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)的糖蛋白或其抗原結合部分。各重鏈由重鏈可變區(HCVR)及重鏈恆定區(CH)構成。重鏈恆定區可包含三個域，即，CH1、CH2及/或CH3。各輕鏈由輕鏈可變區(LCVR)及輕鏈恆定區(CL)構成。HCVR及LCVR區域可進一步再分成高變區，稱為「互補決定區」(CDR)，其穿插有更保守之區域，稱為「構架區」(FR)。各HCVR及LCVR可由例如三個CDR及四個FR構成，其自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，該等組織或因子包括免疫系統之多種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)。
抗體可變區由間雜有三個「抗原結合位點」之構架區組成，使用各種術語定義該等位點：互補決定區(CDR)，HCVR中之三個(HCDR1、HCDR2及HCDR3)及LCVR中之三個(LCDR1、LCDR2及LCDR3)係基於序列變化(Wu等人, J. Exp. Med. 132:211-250, 1970; Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)；
「構架」或「構架序列」係除定義為抗原結合位點(例如CDR)之可變區序列以外的其餘可變區序列。因為抗原結合位點可由如上文所描述之各種術語定義，所以構架之準確胺基酸序列視抗原結合位點如何定義而定。將在指定CDR之情形中考慮本文所提供之序列中所描述之構架序列。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原之結合的域。天然抗體之重鏈及輕鏈可變域(分別為HCVR及LCVR)通常具有類似的結構，其中各域包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(HVR)。(參見例如Kindt等人. Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., 第91頁 (2007))。單一HCVR或LCVR域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用HCVR或LCVR域自結合該抗原之抗體分離以分別篩選互補LCVR或HCVR域庫。參見例如Portolano等人, J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson等人, Nature352:624-628 (1991)。
「經分離抗體」為已經鑑別出且與其天然環境之組分分離及/或自其回收的抗體及/或實質上不含具有不同抗原特異性的其他抗體(例如特異性結合至CDH11的經分離抗體實質上不含特異性結合除CDH11以外之抗原的抗體)。其天然環境之污染物組分係會干擾抗體之診斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，將抗體(1)純化至如藉由勞立法(Lowry method)所測定，大於抗體之95重量%，且最佳大於99重量%，(2)純化至足以藉由使用旋杯定序儀獲得至少N端或內部胺基酸序列之15個殘基的程度，或(3)藉由SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用Coomassie™藍或較佳銀染色純化至均質。經分離抗體包括原位在重組細胞內之抗體，因為抗體之天然環境之至少一個組分將不存在。類似地，經分離抗體包括培養基中重組細胞周圍的抗體。然而，通常，經分離抗體將藉由至少一個純化步驟來製備。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換使用且係指結構實質上類似於天然抗體結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。
術語「人類抗體」包括具有人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區(若存在)的抗體。人類抗體可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變誘導之突變)(參見Lonberg, N.等人. (1994) Nature368(6474): 856-859); Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology113:49-101; Lonberg, N. 及Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol.第13卷: 65-93, 及Harding, F.及Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci764:536-546)。然而，術語「人類抗體」不包括來源於另一種哺乳動物物種，諸如小鼠之生殖系的CDR序列已移植於人類構架序列(亦即人類化抗體)上之抗體。
經分離人類化抗體可為合成的。人類抗體雖然衍生自人類免疫球蛋白序列，但可使用諸如噬菌體顯示併入合成CDR及/或合成構架之系統產生，或可經受活體外突變誘發以改良抗體特性，從而活體內產生不天然存在於人類抗體生殖系譜系內之抗體。
「人類化抗體」係指其中抗原結合位點(例如，CDR)來源於非人類物種且可變區構架衍生自人類免疫球蛋白序列或經突變使得其序列及/或功能比原始構架序列更接近人類構架序列的抗體。人類化抗體可因此包括另一物種之構架區中的取代，此使得構架更接近人類構架。因此，人類化抗體中之構架可不為所表現人類免疫球蛋白或生殖系基因序列之準確複本。熟習此項技術者可使用例如構架同源方法使例如鼠類或其他非人類抗體人類化，且經由此過程，可改變某些殘基以對人類序列閉合且亦可維持某些非人類殘基(例如游標區胺基酸)。替代地，可將來自另一物種之CDR插入人類可變區骨架中，如此項技術中已知。
如本文所用，術語「單株抗體」係指對特定抗原決定基顯示單一結合特異性及親和力之抗體。因此，術語「人類單株抗體」或「HuMab」係指顯示單一結合特異性且具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。在一個實施例中，人類單株抗體由融合瘤產生，該融合瘤包括與永生化細胞融合的自轉殖基因非人類動物(例如轉殖基因小鼠)獲得的B細胞，其具有包含人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉殖基因之基因體。
術語「抗原決定基」係指抗體所特異性結合之抗原之一部分。抗原決定基通常由諸如胺基酸或多醣側鏈之部分的化學活性(諸如極性、非極性或疏水性)表面基團組成，且可具有特定三維結構特徵，以及荷質比特徵。抗原決定基可由形成構形空間單元之相鄰及/或不相鄰胺基酸構成。對於不相鄰抗原決定基，來自抗原之線性序列之不同部分的胺基酸經由蛋白質分子之摺疊而在3維空間中緊密臨近。
「抗體片段」係指包含完整抗體中特異性結合該完整抗體所結合之抗原(CDH11或其片段)的部分的除完整抗體以外之分子。抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。此等抗體片段係使用習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式篩選片段供使用。抗體片段可藉由重組DNA技術，或藉由完整免疫球蛋白之酶促或化學裂解來產生。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中在序列上具有高變性及/或形成結構上定義之環(「高變環」)的各區域。一般而言，原生四鏈抗體包含六個HVR；三個位於HCVR中(H1、H2、H3)，且三個位於LCVR中(L1、L2、L3)。HVR通常包含來自高變環及/或來自「互補決定區」(CDR)的胺基酸殘基，後者具有最高的序列可變性及/或與抗原識別相關。例示性高變環出現在胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)處。(Chothia及Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987))。例示性CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基24-34、L2之胺基酸殘基50-56、L3之胺基酸殘基89-97、H1之胺基酸殘基31-35B、H2之胺基酸殘基50-65及H3之胺基酸殘基95-102處。(Kaba等人 , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。除HCVR中之CDR1以外，CDR一般包含形成高變環之胺基酸殘基。
「變異體」係指與參考多肽或參考多核苷酸相差一或多個修飾(例如取代、插入或缺失)的多肽或多核苷酸。
「有效量」為至少實現特定病症之可量測改善或預防所需之最小量。本文中之有效量可根據諸如以下因素而變化：患者之疾病病況、年齡、性別及體重，以及抗體引發個體發生所需反應之能力。有效量亦為治療有利效應超過治療之任何毒性或不利效應的量。對於防治性用途而言，有益或所需結果包括諸如以下之結果：消除或降低疾病之風險、減輕疾病之嚴重程度，或延遲疾病發作，疾病包括疾病、其併發症及在疾病發展期間所呈現之中間病理學表型之生物化學、組織學及/或行為症狀。對於治療用途而言，有益或所需結果包括諸如以下之臨床結果：減少由疾病引起之一或多種症狀、提高患病者之生活品質、降低治療疾病所需之其他藥物的劑量、增強另一藥劑之作用(諸如經由靶向)、延遲疾病進展及/或延長存活期。在癌症或腫瘤之情況下，有效量之藥物可在以下方面具有作用：減少癌細胞之數目；減小腫瘤尺寸；抑制(亦即在一定程度上減緩或宜停止)癌細胞浸潤於周邊器官中；抑制(亦即在一定程度上減緩及希望停止)腫瘤癌轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；及/或在一定程度上緩解與病症相關之一或多種症狀。有效量可以一或多次投藥投與。對本發明而言，藥物、化合物或醫藥組合物之有效量為足以直接或間接實現預防性或治療性處理之量。如在臨床情形下所瞭解，藥物、化合物或醫藥組合物之有效量可或不可連同另一藥物、化合物或醫藥組合物一起達成。因此，在投與一或多種治療劑之情形下可考慮「有效量」，且若結合一或多種其他藥劑可達成或達成所要結果，則單一藥劑可視為以有效量給予。
「鈣黏蛋白」為涉及廣泛多種癌症之表面抗原；參見例如Berx及van Roy, Cold Spring Harb Perspect Biol, 1(6):a003129 (2009); Kim等人, Cancer, 110(12):2785-92 (2007); Peinado等人. Int J Dev Biol, 48(5-6):365-75 (2004)。
如本文所用，術語「鈣黏蛋白11」及「CDH11」涵蓋全長、未經處理之CDH11，以及由細胞中之處理得到的任何形式之CDH11，以及CDH11之任何天然存在之變異體(例如剪接變異體或對偶基因變異體)。CDH11係指來自介導鈣依賴性細胞-細胞黏附之鈣黏蛋白超家族之整合膜蛋白質。作為鈣黏蛋白，CDH11含有較大N端胞外域、單一跨膜域及小型且高度保守的C端域。人類CDH11具有NCBI基因ID NO 1009。例示性野生型人類1型CDH11 (例如同功異型物1)核酸序列提供於NCBI RefSeq Acc.編號NM_001308392.1中，且例示性野生型1型CDH11 (例如同功異型物1)胺基酸序列提供於NCBI RefSeq Acc.編號NP_001295321.1中。例示性野生型人類2型CDH11 (例如同功異型物2)核酸序列提供於NCBI RefSeq Acc.編號NM_001797.2中，且例示性野生型2型CDH11 (例如同功異型物2)胺基酸序列提供於NCBI RefSeq Acc.編號NP_001788.2中。
如本文中所使用，「結合」係指除一種處理形式以外亦投與另一種處理形式。因此，「結合」係指在向個體投與一種治療形式之前、期間或之後投與另一種治療形式。
如本文所，「腫瘤」係指所有贅生性細胞生長及增殖，無論惡性或良性，及所有癌前及癌細胞及組織。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中通常特徵為不受調控細胞生長之生理病況。癌症之實例包括但不限於癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病或淋巴惡性病。此類癌症之更特定實例包括但不限於胰臟癌及乳癌。在某些實施例中，能夠藉由抗體治療之癌症包括乳癌及胰臟癌。
如本文所用，術語「細胞毒性劑」係指對細胞有害(例如引起細胞死亡、抑制增殖、或以其他方式阻礙細胞功能)之任何藥劑。細胞毒性劑包括但不限於放射性同位素；化學治療劑；生長抑制劑；酶及其片段，諸如核分解酶；及毒素，諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素，包括其片段及/或變異體。例示性細胞毒性劑可選自抗微管劑、鉑配位錯合物、烷基化劑、抗生素劑、拓樸異構酶II抑制劑、抗代謝物、拓樸異構酶I抑制劑、激素及激素類似物、信號轉導路徑抑制劑、非受體酪胺酸激酶血管生成抑制劑、免疫治療劑、促凋亡劑、LDH-A之抑制劑、脂肪酸生物合成之抑制劑、細胞週期信號傳導抑制劑、HDAC抑制劑、蛋白酶體抑制劑及癌症代謝之抑制劑。在一些實施例中，該細胞毒性劑為SN-38。
「免疫結合物」為結合至一或多個異源分子(包括但不限於細胞毒性劑)之抗體。在一些實施例中，免疫結合物為與細胞毒性劑結合的抗CDH11抗體。在一些實施例中，該細胞毒性劑為SN-38。
「化學治療劑」包括適用於治療癌症之化合物。化學治療劑之實例包括SN-38、5-氟尿嘧啶(5FU)、伊立替康(irinotecan)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、卡鉑、順鉑、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、白蛋白結合型太平洋紫杉醇、多烯紫杉醇(docetaxel)、吉西他濱(gemcitabine)、抗PD1、抗PDL1及抗CTLA4。
「放射線療法」意謂使用導引γ射線或β射線來誘導對細胞足夠之損傷以限制其正常發揮作用之能力或完全破壞細胞。應瞭解，將存在此項技術中已知的多種方式來測定治療之劑量及持續時間。典型治療以單次投與形式提供且典型劑量在每日10至200個單位(戈雷(Gray))範圍內。
如本文所用，術語「核酸分子」意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單股或雙股，但較佳為雙股DNA。
如本文所用，參看編碼與CDH11結合之抗體或抗體部分(例如HCVR、LCVR、CDR)的核酸分子，術語「經分離核酸」意欲指編碼該抗體或抗體部分之核苷酸序列不含編碼結合除CDH11以外之抗原的抗體的其他核苷酸序列的核酸分子，其他序列可天然地側接人類基因體DNA中之核酸。
與本文所描述之抗體實質上一致的抗體包括於本發明中。術語「實質上一致」意謂所比較之抗體HCVR或LCVR胺基酸序列一致或具有「非實質差異」。非實質差異可包括抗體LCVR及/或LCVR中不會不利地影響抗體特性之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸之取代。在一些實施例中，若序列與本文中所列舉之參考序列具有至少90%、95%、98%或100%一致性，則其包括於本發明之範疇內。在一些實施例中，序列與參考序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%一致。百分比一致性可例如藉由使用Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA)之AlignX模組之預設設置來逐對比對來確定。本發明之蛋白質序列可用作查詢序列，以針對公共或專利資料庫執行檢索來例如鑑別相關序列。用以執行此類檢索之例示性程式為XBLAST或BLASTP程式(http_//www_ncbi_nlm/nih_gov)或使用預設設置之GenomeQuest™ (GenomeQuest, Westborough, MA)套件。本發明方法中所用的可對特異性結合LC之抗體進行的例示性取代為例如用具有類似電荷、疏水性或立體化學特徵之胺基酸進行的保守取代。亦可進行保守取代以改良抗體特性，例如穩定性或親和力，或改良抗體效應功能。在一些實施例中，可例如對抗LC之HCVR及/或LCVR進行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸取代。
術語「醫藥組合物」係指所呈形式允許其中所含活性成分之生物活性有效發揮，且不含對調配物將投與之受試者具有不可接受毒性之其他組分的製劑。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中之除活性成分外之對受試者無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包括但不限於緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文中所使用，術語「特異性結合」、「選擇性結合」、「選擇性地結合」及「特異性地結合」係指抗體結合至預定抗原上之抗原決定基。通常，當在BIACORE 3000儀器中藉由表面電漿子共振(SPR)技術測定時，抗體以大約小於10 −7M，諸如大約小於10 −8M、10 −9M或10 −10M或甚至更低的親和力(KD)結合，該測定可例如使用重組CDH11作為分析物且抗體作為配位體進行。在一些實施例中，抗體與預定抗原之結合的親和力比其與除預定抗原或緊密相關抗原以外之非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)之結合的親和力大至少兩倍。片語「識別抗原之抗體」及「對抗原具有特異性之抗體」在本文中可與術語「特異性結合至抗原之抗體」互換使用。
「受試者(subject)」或「個體(individual)」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於家養動物(例如牛、羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔、鹿及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，該受試者或個體為人類。
「持續反應」係指在停止治療之後，對降低腫瘤生長之持續作用。舉例而言，與投與階段開始時之尺寸相比，腫瘤尺寸可保持相同或更小。在一些實施例中，持續反應之持續時間至少與治療持續時間相同，持續時間為治療持續時間之至少1.5倍、2.0倍、2.5倍或3.0倍長。
如本文中所使用，術語「治療」係指經設計以改變所治療之個體或細胞在臨床病理學之病程期間的天然病程的臨床介入。所需治療效應包括降低疾病進展速率、改善或緩和疾病況態及緩解或改良預後。舉例而言，若與癌症相關之一或多種症狀得到減輕或消除，包括但不限於降低癌細胞(例如轉移性細胞)增殖(或破壞癌細胞)、減少由疾病引起之症狀、提高罹患疾病者之生活品質、降低治療疾病所需之其他藥物的劑量及/或延長個體之存活期，則個體得到成功地「治療」。
如本文所用，「延遲疾病進展」意謂延緩、阻礙、減緩、阻滯、穩定及/或延遲疾病(諸如癌症)之發展。此延遲可具有不同時間長度，視所治療之疾病及/或個體之病史而定。如熟習此項技術者顯而易見，充分或顯著延遲可實際上涵蓋預防，使得該個體不發展該疾病。舉例而言，可延遲晚期癌症，諸如癌轉移發展。
如本文所用，「投與」意謂一種向受試者給予一定劑量之化合物(例如本發明的抗CDH11抗體或編碼本發明的抗CDH11抗體的核酸)或組合物(例如醫藥組合物，例如包括本發明的抗CDH11抗體的醫藥組合物)的方法。用於本文所描述之方法中的組合物可例如經肌肉內、靜脈內、皮內、經皮、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、表面、腫瘤內、腹膜、皮下、結膜下、囊泡內、經黏膜、心包內、臍內、眼內、經口、表面、局部、藉由吸入、藉由注射、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由直接局部灌注浸浴目標細胞、藉由導管、藉由灌洗、以乳膏形式或以脂質組合物形式投與。投與方法可取決於各種因素(例如所投與化合物或組合物及所治療之病況、疾病或病症之嚴重度)而變化。
如本文所用，術語「載體」意謂包括但不限於核酸分子(例如能夠輸送其已連接之另一核酸的核酸分子)、病毒(例如慢病毒或腺病毒，例如重組腺相關病毒(rAAV))、陽離子脂質(例如脂質體)、陽離子聚合物(例如多核糖體)、病毒體、奈米粒子或樹狀物。因此，一種載體為病毒載體，其中其他DNA區段(例如，轉殖基因，例如編碼本發明之抗CDH11抗體之重鏈及/或輕鏈基因的轉殖基因)可接合至病毒基因體中，且病毒載體可接著向受試者投與(例如，藉由電穿孔，例如電穿孔至肌肉組織中)以允許以類似於基因療法的方式進行轉殖基因表現。另一類型之載體為「質體」，指可接合額外DNA區段之環狀雙股DNA環。某些載體能夠在其所引入之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)當引入至宿主細胞中時可整合至宿主細胞之基因體中，且進而與宿主基因體一起複製。此外，某些載體能夠導引其以可操作方式連接的基因之表現。此類載體在本文中稱作「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。一般而言，在重組DNA技術中有用之表現載體通常呈質體形式。
核酸分子及抗體本發明之特徵在於編碼抗體之核酸分子，包括抗體片段及融合物。此外，本發明之特徵在於其中本文所述之抗體中之任一者結合至細胞毒性劑的抗體結合物。在一些實施例中，本發明之抗體與例如SN-38結合。
在一些實施例中，核酸分子編碼抗人類CDH11抗體之重鏈可變區(HCVR)，其中核酸分子包含以下互補決定區(CDR)編碼序列：SEQ ID NO: 27 (CDR-H1)、SEQ ID NO: 28 (CDR-H2)及SEQ ID NO: 29 (CDR-H3)。
在一些實施例中，核酸分子包含編碼以下之序列：(a) SEQ ID NO: 9之重鏈構架1 (HC-FR1)序列；(b) SEQ ID NO: 10之重鏈構架2 (HC-FR2)序列；(c) SEQ ID NO: 11之重鏈構架3 (HC-FR3)序列；(d) SEQ ID NO: 12之重鏈構架4 (HC-FR4)序列；及/或(e) (a)-(d)中之任何一或多者的變異體，該變異體與其參考序列具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性，其中該等序列按以下次序：HC-FR1、CDR-H1、HC-FR2、CDR-H2、HC-FR3、CDR-H3及HC-FR4。
在一些實施例中，(a) SEQ ID NO: 9之該HC-FR1序列由SEQ ID NO: 17編碼；(b) SEQ ID NO: 10之該HC-FR2序列由SEQ ID NO: 18編碼；(c) SEQ ID NO: 11之該HC-FR3序列由SEQ ID NO: 19編碼；(d) SEQ ID NO: 12之該HC-FR4序列由SEQ ID NO: 20編碼；及/或(e) (a)-(d)中之任何一或多者之HC-FR之變異體由該等參考序列中之任何一或多者之變異體編碼。
在一些實施例中，核酸分子包含編碼HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3及HC-FR4中之各者的序列，其中該等HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3及HC-FR4中之一或多者視情況經與其參考序列具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性之其變異體置換。
在一些實施例中，HCVR包含SEQ ID NO: 7之序列或與SEQ ID NO: 7具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性之其變異體。
在一些實施例中，HCVR由SEQ ID NO: 25之序列或其編碼與SEQ ID NO: 7具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性之序列之變異體的變異體編碼。
在一些實施例中，核酸分子編碼包含該抗人類CDH11抗體之該重鏈可變區的重鏈。
本發明之特徵亦在於編碼抗人類CDH11抗體之輕鏈可變區(LCVR)的核酸分子，其中核酸分子包含以下CDR編碼序列：SEQ ID NO: 30 (CDR-L1)、SEQ ID NO: 31 (CDR-L2)及SEQ ID NO: 32 (CDR-L3)。
在一些實施例中，核酸分子包含編碼以下之序列：(a) SEQ ID NO: 13之輕鏈構架1 (LC-FR1)序列；(b) SEQ ID NO: 14之輕鏈構架2 (LC-FR2)序列；(c) SEQ ID NO: 15之輕鏈構架3 (LC-FR3)序列；(d) SEQ ID NO: 16之輕鏈構架4 (LC-FR4)序列；及/或(e) (a)-(d)中之任何一或多者的變異體，該變異體與其參考序列具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性，其中該等序列按以下次序：LC-FR1、CDR-L1、LC-FR2、CDR-L2、LC-FR3、CDR-L3及LC-FR4。
在一些實施例中，(a) SEQ ID NO: 13之該LC-FR1序列由SEQ ID NO: 21編碼；(b) SEQ ID NO: 14之該LC-FR2序列由SEQ ID NO: 22編碼；(c) SEQ ID NO: 15之該LC-FR3序列由SEQ ID NO: 23編碼；(d) SEQ ID NO: 16之該LC-FR4序列由SEQ ID NO: 24編碼；及/或(e) (a)-(d)中之任何一或多者之HC-FR之變異體由該等參考序列中之任何一或多者之變異體編碼。
在一些實施例中，核酸分子包含編碼該等LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3及LC-FR4中之各者的序列，其中該等LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3及LC-FR4中之一或多者視情況經與其參考序列具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性之其變異體置換。
在一些實施例中，LCVR包含SEQ ID NO: 8之序列或與SEQ ID NO: 8具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性之其變異體。
在一些實施例中，LCVR係由SEQ ID NO: 26之序列或其編碼與SEQ ID NO: 8具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性之變異序列的變異體編碼。
在一些實施例中，核酸分子編碼包含該抗人類CDH11抗體之該輕鏈可變區的輕鏈。
本發明之特徵亦在於編碼重鏈或其部分(例如，一或多個CDR、其可變區、恆定區或恆定區之Fc部分)及/或輕鏈或其部分(例如，一或多個CDR、其可變區或恆定區)之核酸分子。
在一些實施例中，核酸分子編碼(a)抗體重鏈，(b)抗體輕鏈，(c)抗體重鏈及抗體輕鏈，(d)HCVR，(e)LCVR，(f)HCVR及LCVR，(g)抗體片段，或(h)單鏈抗體。
本發明之特徵亦在於包含一或多種本文所述之核酸分子之載體，以及包含一或多種該等核酸分子或載體之細胞。
此外，本發明之特徵在於產生抗人類CDH11抗體的方法，該等方法包含表現如本文所述之核酸分子。
本發明之特徵在於由本文所述之核酸分子編碼之抗體。在一些實施例中，抗體不包含鼠類重鏈恆定區及/或鼠類輕鏈恆定區。
在一些實施例中，抗體係：(a)單株、單特異性、多特異性或雙特異性；(b)人類、嵌合或人類化抗體；及/或(c) IgG抗體，其視情況選自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。在一些實施例中，抗體包含視情況為單鏈抗體(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、Dab、奈米抗體或Fv之抗體片段。
本發明之特徵在於一種抗人類CDH11抗體，其包含：(a)重鏈可變區，其包含：(i) SEQ ID NO: 1之CDR-H1；(ii) SEQ ID NO: 2之CDR-H2；及(iii) SEQ ID NO: 3之CDR-H3；及/或(b)輕鏈可變區，其包含：(i) SEQ ID NO: 4之CDR-L1；(ii) SEQ ID NO: 5之CDR-L2，及(iii) SEQ ID NO: 6之CDR-L3，其中該抗體包含相對於該等所列舉序列在該等CDR序列中之一者中之至少一個取代，及/或為單鏈抗體。
在一些實施例中，該抗體包含：(a) (i) SEQ ID NO: 9之HC-FR1序列；(ii) SEQ ID NO: 10之HC-FR2序列；(iii) SEQ ID NO: 11之HC-FR3序列；(iv) SEQ ID NO: 12之HC-FR4序列；及/或(v) (a) (i)-(iv)中之任何一或多者的變異體，該變異體與其參考序列具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性，其中該等序列按以下次序：HC-FR1、CDR-H1、HC-FR2、CDR-H2、HC-FR3、CDR-H3及HC-FR4；及/或(b) (i) SEQ ID NO: 13之LC-FR1序列；(ii) SEQ ID NO: 14之LC-FR2序列；(iii) SEQ ID NO: 15之LC-FR3序列；(iv) SEQ ID NO: 16之LC-FR4序列；及/或(v) (b) (i)-(iv)中之任何一或多者的變異體，該變異體與其參考序列具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性，其中該等序列按以下次序：LC-FR1、CDR-L1、LC-FR2、CDR-L2、LC-FR3、CDR-L3及LC-FR4。
在一些實施例中，該抗體包含：(a)該等HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3及HC-FR4中之各者，其中視情況該等HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3及HC-FR4中之一或多者經與其參考序列具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性的其變異體置換；及/或(b)該等LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3及LC-FR4中之各者，其中該等LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3及LC-FR4中之一或多者視情況經與其參考序列具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性之其變異體置換。
在一些實施例中，(a) HCVR包含SEQ ID NO: 7之序列或與SEQ ID NO: 7具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性之其變異體；及/或(b) LCVR包含SEQ ID NO: 8之序列或與SEQ ID NO: 8具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性之其變異體。
在一些實施例中，抗體包含重鏈，該重鏈包含該抗人類CDH11抗體之該重鏈可變區，及/或該抗體包含輕鏈，該輕鏈包含該抗人類CDH11抗體之該輕鏈可變區。
在一些實施例中，抗體係：(a)人類、嵌合或人類化抗體；及/或(b) IgG抗體，其視情況選自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。在一些實施例中，抗體包含視情況為單鏈抗體(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、Dab、奈米抗體或Fv之抗體片段。
本發明之特徵亦在於針對人類CDH11之單鏈抗體或其融合物，其中單鏈抗體包含以下CDR序列中之一或多者：CDR-H1 (SEQ ID NO: 1)、CDR-H2 (SEQ ID NO: 2)、CDR-H3 (SEQ ID NO: 3)、CDR-L1 (SEQ ID NO: 4)、CDR-L2 (SEQ ID NO: 5)及/或CDR-L3 (SEQ ID NO: 6)，且視情況CDR中之一或多者包含在該等所列舉序列中之一或多者內的一或多個取代。
在一些實施例中，單鏈抗體包含：(a) (i) SEQ ID NO: 9之重鏈構架1 (HC-FR1)序列；(ii) SEQ ID NO: 10之重鏈構架2 (HC-FR2)序列；(iii) SEQ ID NO: 11之重鏈構架3 (HC-FR3)序列；(iv) SEQ ID NO: 12之重鏈構架4 (HC-FR4)序列；及/或(v) (a) (i)-(iv)中之任何一或多者的變異體，該變異體與其參考序列具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性，其中該等序列按以下次序：HC-FR1、CDR-H1、HC-FR2、CDR-H2、HC-FR3、CDR-H3及HC-FR4；及/或(b) (i) SEQ ID NO: 13之輕鏈構架1 (LC-FR1)序列；(ii) SEQ ID NO: 14之輕鏈構架2 (LC-FR2)序列；(iii) SEQ ID NO: 15之輕鏈構架3 (LC-FR3)序列；(iv) SEQ ID NO: 16之輕鏈構架4 (LC-FR4)序列；及/或(v) (b) (i)-(iv)中之任何一或多者的變異體，該變異體與其參考序列具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性，其中該等序列按以下次序：LC-FR1、CDR-L1、LC-FR2、CDR-L2、LC-FR3、CDR-L3及LC-FR4。
在一些實施例中，單鏈抗體或其融合物包含(a)該等HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3及HC-FR4中之各者，其中視情況該等HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3及HC-FR4中之一或多者經與其參考序列具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性的其變異體置換；及/或(b)該等LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3及LC-FR4中之各者，其中視情況該等LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3及LC-FR4中之一或多者經與其參考序列具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性之其變異體置換。
在一些實施例中，(a) HCVR包含SEQ ID NO: 7之序列或與SEQ ID NO: 7具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性之其變異體；及/或(b) LCVR包含SEQ ID NO: 8之序列或與SEQ ID NO: 8具有至少90% (例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%)序列一致性之其變異體。
在一些實施例中，單鏈抗體包含2、3、4、5或所有6個該等CDR。
在一些實施例中，單鏈抗體之可變輕鏈部分經由連接子連接至單鏈抗體之可變重鏈部分，其視情況包含連接子。
如本文所述，例示性抗CDH11抗體由併入表1 (下文)中之一或多個序列例示。 表 1. 抗 CDH11 抗體之例示性序列
SEQ ID NO: 描述 序列
1 CDR-H1 GYSFTDYN
2 CDR-H2 INPNYGTT
3 CDR-H3 TRLYYGSRYFDV
4 CDR-L1 SSVSSSY
5 CDR-L2 STS
6 CDR-L3 HQYHRSPPT
7 HCVR EFQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYNMNWVKQSNGKSLEWIGAINPNYGTTSYNQKFKGKATLTVDQSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCTRLYYGSRYFDVWGTGTTVTVSS
8 LCVR QIVVTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDVATYYCHQYHRSPPTFGGGAKLEIK
9 HC-FR1 EFQLQQSGPELVKPGASVKISCKAS
10 HC-FR2 MNWVKQSNGKSLEWIGA
11 HC-FR3 SYNQKFKGKATLTVDQSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYC
12 HC-FR4 WGTGTTVTVSS
13 LC-FR1 QIVVTQSPAIMSASLGERVTMTCTAS
14 LC-FR2 LHWYQQKPGSSPKLWIY
15 LC-FR3 NLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDVATYYC
16 LC-FR4 FGGGAKLEIK
17 HC-FR1 GAGTTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCC
18 HC-FR2 ATGAACTGGGTGAAGCAGAGCAATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGCA
19 HC-FR3 AGTTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACCAATCTTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGT
20 HC-FR4 TGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAG
21 LC-FR1 CAAATTGTTGTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGC
22 LC-FR2 TTGCACTGGTACCAGCAAAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTAT
23 LC-FR3 AACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTATTATTGC
24 LC-FR4 TTCGGTGGAGGCGCCAAGCTGGAAATCAAA
25 HCVR    GAGTTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCCGGTTACTCATTCACTGACTATAATATGAACTGGGTGAAGCAGAGCAATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGCAATTAATCCTAACTATGGTACTACTAGTTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACCAATCTTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTACAAGACTTTACTACGGTAGTAGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAG
26 LCVR    CAAATTGTTGTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAAAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTATTATTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCACCGACGTTCGGTGGAGGCGCCAAGCTGGAAATCAAA
27 CDR-H1 GGTTACTCATTCACTGACTATAAT
28 CDR-H2 ATTAATCCTAACTATGGTACTACT
29 CDR-H3 ACAAGACTTTACTACGGTAGTAGGTACTTCGATGTC
30 CDR-L1 TCAAGTGTAAGTTCCAGTTAC
31 CDR-L2 AGCACATCC
32 CDR-L3 CACCAGTATCATCGTTCCCCACCGACG
在一些實施例中，抗體結合至CDH11 (例如人類CDH11)及CDH1 (例如人類CDH1)。
在一些實施例中，抗體結合至人類CDH11及人類CDH1。
在一些實施例中，抗體結合至人類CDH11之胞外域。
在一些實施例中，抗體結合至人類CDH11之抗原決定基，該抗原決定基包含LGMLCHSHAFAPERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRSKRGWVWNQFFVIEEYTGPDPVLVGRLHSDIDSGDGNIKYILSGEGAGTIFVIDDKS (SEQ ID NO: 33)或 APKFAAPYEGFICESDQTKPLSNQPIVTISADDKDDTANGPRFIFSLPPEIIHNPNFTVRDNRDNTAGVYARRGGFSRQKQDLYLLPIVISDGGIPPMSSTNTLT (SEQ ID NO: 34)，或其部分。
在一些實施例中，抗體結合至人類CDH11之抗原決定基，該抗原決定基包含LGMLCHSHAFAPERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRSKRGWVWNQFFVIEEYTGPDPVLVGRLHSDIDSGDGNIKYILSGEGAGTIFVIDDKS (SEQ ID NO: 33)或由其組成。
在一些實施例中，抗體結合至人類CDH11之抗原決定基，該抗原決定基包含 APKFAAPYEGFICESDQTKPLSNQPIVTISADDKDDTANGPRFIFSLPPEIIHNPNFTVRDNRDNTAGVYARRGGFSRQKQDLYLLPIVISDGGIPPMSSTNTLT (SEQ ID NO: 34)或由其組成。
在一些實施例中，抗體結合至人類CDH1或鼠類CDH1之胞外域。
在一些實施例中，抗體結合至人類CDH1及鼠類CDH1之胞外域。
在一些實施例中，抗體結合至人類CDH1之胞外域。
在一些實施例中，抗體結合至人類CDH1之抗原決定基，該抗原決定基包含LNTVGHHHRPPPHQASVSGIQAELLTFPNSSPGLRRQKRDWVIPPISCPENEKGPFPKNLVQIKSNKDKEGKVFYSITGQGADTPPVGVFIIERET (SEQ ID NO: 35)或 APIPEPRTIFFCERNPKPQVINIIDADLPPNTSPFTAELTHGASANWTIQYNDPTQESIILKPKMALEVGDYKINLKLMDNQNKDQVTTLE (SEQ ID NO: 36)，或其部分。
在一些實施例中，抗體結合至人類CDH1之抗原決定基，該抗原決定基包含LNTVGHHHRPPPHQASVSGIQAELLTFPNSSPGLRRQKRDWVIPPISCPENEKGPFPKNLVQIKSNKDKEGKVFYSITGQGADTPPVGVFIIERET (SEQ ID NO: 35)或由其組成。
在一些實施例中，抗體結合至人類CDH1之抗原決定基，該抗原決定基包含 APIPEPRTIFFCERNPKPQVINIIDADLPPNTSPFTAELTHGASANWTIQYNDPTQESIILKPKMALEVGDYKINLKLMDNQNKDQVTTLE (SEQ ID NO: 36)或由其組成。
取代、插入及缺失變異體在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之CDH11抗體變異體或抗體片段及其融合物。用於取代型突變誘發之相關位點包括HVR及構架區。保守取代展示於表2中之標題「較佳取代」下。更多實質性變化提供於表2中標題「例示性取代」下，且如下文關於胺基酸側鏈類別進一步描述。胺基酸取代可引入至CDH11抗體中，且根據所需活性進行篩選的產物例如保持/改善抗原結合及/或減小免疫原性。 表 2. 例示性及較佳胺基酸取代
初始殘基 例示性取代 較佳取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp, Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據共有側鏈特性來進行分組： (1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性：Asp、Glu； (4)鹼性：His、Lys、Arg； (5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro； (6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代將引起此等類別中之一者之成員換成另一個類別。
一種類型之取代型變異體涉及取代親本抗體之一或多個HVR殘基。一般而言，選用於進一步研究之所得變異體相對於親本抗體將在某些生物特性方面具有修飾(例如改善) (例如親和力提高、免疫原性降低)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物特性。例示性取代型變異體為親和力成熟抗體，其可例如，使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術便利地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且針對特定生物活性(例如結合親和力)篩選在噬菌體上顯示之變異抗體。
改變(例如取代)可發生於HVR中以例如改良抗體親和力。可在HVR「熱點」(亦即由在體細胞成熟過程期間經歷高頻率突變之密碼子所編碼之殘基(參見例如Chowdhury, Methods Mol. Biol.207:179-196 (2008))，及/或接觸抗原之殘基)中用待測試結合親和力之所得變異型HCVR或LCVR進行此類更改。藉由構建二級庫及自二級庫再選擇來達成親和力成熟已描述於Hoogenboom等人之 Methods in Molecular Biology178:1-37 (O'Brien等人編, Human Press, Totowa, NJ, (2001))。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向突變誘發)中之任一者將多樣性引入為了成熟所選之可變基因中。隨後產生二級庫。隨後篩選該庫以鑑別具有所需親和力之任何抗體變異體。另一種引入多樣性之方法涉及HVR導引之方法，其中將若干HVR殘基(例如，一次4-6個殘基)隨機分組。可特異性地鑑別抗原結合所涉及之HVR殘基，例如使用丙胺酸掃描突變誘發或建模來鑑別。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此類更改不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守更改(例如如本文所提供之保守取代)。此類更改可例如在HVR中接觸抗原之殘基之外。在某些實施例中，各HVR未改變或含有超過一個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)胺基酸取代。
用於鑑別可針對突變誘發經靶向之抗體之殘基或區域的適用方法為藉由抗原-抗體複合物之晶體結構確定抗原接觸殘基，如 實例 5中所描述。此類接觸殘基及其相鄰殘基可作為取代候選者而經靶向或消除。可篩選變異體以確定其是否含有所需特性。替代地或另外，用於鑑別可經靶向之殘基或區域的適用方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如由Cunningham及Wells (1989) Science, 244: 1081-1085所描述。在此方法中，殘基或靶殘基之群(例如，帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)經鑑別出，且經中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以判定抗體與抗原之相互作用是否受影響。可在對初始取代展現功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。
在一些實施例中，抗CDH11抗體變異體或抗體片段及其融合物包括一或多個在下表3中描述之胺基酸處發生的取代及/或缺失。 表 3 ： 用於導引胺基酸取代之例示性 CDH11 殘基位點
重鏈 殘基位點 輕鏈 殘基位點
Phe 2、Gly 26、Tyr 27、Ser 28、Thr 30、Asp 31、Tyr 32、Asn 54、Tyr 55、Thr 57、Arg 98、Tyr 100、Tyr 101、Gly 102、Ser 103、Arg 104、Tyr 105及Asp 107 Ser 30、Ser 31、Ser 32、Tyr 33、His 35、Tyr 50、Ser 51、Ser 53、Asn 54、Leu 55、Ala 56、Ser 57、Gly 58、Val 59、Ala 61、Tyr 92及His 93
在一些實施例中，核酸分子編碼抗CDH11抗體變異體之HCVR及/或LCVR，其包括在上文表3中描述之胺基酸處發生的一或多個取代及/或缺失。
舉例而言，在一些實施例中，一或多個取代及/或缺失在以下殘基處發生：相對於SEQ ID NO: 7之Phe 2、Gly 26、Tyr 27、Ser 28、Thr 30、Asp 31、Tyr 32、Asn 54、Tyr 55、Thr 57、Arg 98、Tyr 100、Tyr 101、Gly 102、Ser 103、Arg 104、Tyr 105及Asp 107。
在一些實施例中，一或多個取代及/或缺失發生在以下處：相對於SEQ ID NO: 8之Ser 30、Ser 31、Ser 32、Tyr 33、His 35、Tyr 50、Ser 51、Ser 53、Asn 54、Leu 55、Ala 56、Ser 57、Gly 58、Val 59、Ala 61、Tyr 92及His 93。
免疫結合物本發明之特徵亦在於包含本文中之抗CDH11抗體與一或多種細胞毒性劑(諸如化學治療劑或藥物，例如SN-38)結合的免疫結合物。
免疫結合物允許藥物部分靶向遞送至腫瘤且在一些實施例中其中在胞內累積，其中全身性投與未結合藥物可對正常細胞造成不可接受之毒性水準(Polakis P. (2005) Current Opinion in Pharmacology5:382-387)。
抗體-藥物結合物(ADC)為靶向化學治療性分子，其藉由使強效細胞毒性藥物(SN-38)靶向表現抗原之腫瘤細胞來組合抗體與細胞毒性藥物兩者之特性(Teicher, B. A. (2009) Current Cancer Drug Targets9:982-1004)，藉此藉由最大化功效及最小化脫靶毒性而增強治療指數(Carter, P. J.及Senter P. D. (2008) The Cancer Jour: 14(3):154-169；Chari, R. V. (2008) ACC. Chen. Res.41.98-107)。
本發明之ADC化合物包括具有抗癌活性之化合物。在一些實施例中，ADC化合物包括結合(亦即共價連接)於藥物部分之抗體。在一些實施例中，抗體經由連接子共價連接於藥物部分。本發明之ADC選擇性地遞送有效劑量之藥物至腫瘤組織，從而可達成較大選擇性，亦即較低有效劑量，同時增加治療指數(「治療窗」)。
抗體-藥物結合物(ADC)之藥物部分(D)可包括具有細胞毒性或細胞生長抑制作用之任何化合物、部分或基團。藥物部分可藉由包括但不限於微管蛋白結合、DNA結合或嵌入及抑制RNA聚合酶、蛋白質合成及/或拓樸異構酶來賦予其細胞毒性及細胞生長抑制作用。例示性藥物部分包括但不限於類美登素(maytansinoid)、海兔毒素(dolastatin)、阿瑞他汀(auristatin)、卡奇黴素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮呯(PBD)、奈莫柔比星(nemorubicin)及其衍生物、PNU-159682、蒽環黴素(anthracycline)、倍癌黴素(duocarmycin)、長春花生物鹼、紫杉烷(taxane)、單端孢黴烯族毒素、CC1065、喜樹鹼(camptothecin)、依利奈法德(elinafide)及具有細胞毒活性之其立體異構體、電子等排體、類似物及衍生物。此類免疫結合物之非限制性實例進一步詳細論述於下文中。
例示性抗體-藥物結合物  抗體-藥物結合物(ADC)化合物之一例示性實施例包含靶向腫瘤細胞抗體(Ab)、藥物部分(D)及連接Ab與D之連接子部分(L)。在一些實施例中，抗體經由一或多個胺基酸殘基，諸如表面胺連接至連接子部分(L)。
一種例示性ADC具有式I： Ab-(L-D) p其中p為1至約20。在一些實施例中，可結合至抗體之藥物部分的數目受游離胺殘基之數目限制。在一些實施例中，將游離胺殘基引入抗體胺基酸序列中。式I之例示性ADC包括但不限於具有1、2、3或4個經工程改造之胺基酸的抗體。在一些實施例中，一或多個游離胺殘基不使用工程改造已存在於抗體中，在此情況下現有游離胺殘基可用於使抗體與藥物結合。
a) 例示性抗體在一些實施例中，免疫結合物包含結合至一或多個藥物部分分子的抗CDH11抗體。
如本文所述，例示性抗CDH11抗體由併入上表1中所示之一或多個序列例示。
在另一實例中，免疫結合物包含：(i)結合CDH11及CDH1、與一或多個藥物部分分子(例如細胞毒性劑)結合的抗體。
b) 例示性藥物部分在一些實施例中，免疫結合物包含與一或多個SN-38分子結合之抗體。SN-38為伊立替康之活性代謝物且藉由羧酯酶經由伊立替康水解且藉由UGT1A1經由葡萄糖醛酸反應而形成。
SN-38藥物部分係抗體-藥物結合物中具有吸引力之藥物部分，因為其有效針對多種腫瘤細胞株。
SN-38藥物部分包括具有以下結構之藥物部分：
Figure 02_image001
。
c) 例示性連接子「連接子」(L)為可用於連接一或多個藥物部分(D)於抗體(Ab)以形成式I之抗體-藥物結合物(ADC)的雙官能或多官能部分。在一些實施例中，抗體-藥物結合物(ADC)可使用具有用於共價連接於藥物及抗體之反應性官能基之連接劑製備。舉例而言，在一些實施例中，抗體(Ab)之胺可與連接子或藥物-連接子中間物之反應性官能基形成鍵以形成ADC。
在一個態樣中，連接子具有能夠與抗體上存在之游離胺反應形成共價鍵的官能基。非限制性例示性此類反應性官能基包括順丁烯二醯亞胺、鹵乙醯胺、α-鹵乙醯基、活化酯(諸如丁二醯亞胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯)、酸酐、酸氯化物、磺醯氯、異氰酸酯及異硫氰酸酯。參見例如Klussman等人(2004), Bioconjugate Chemistry15(4):765-773第766頁中之結合方法，及本文實例。
連接子可包含一或多種連接子組分。例示性連接子組分包括本文所描述之可釋放酯連接子。各種連接子組分為此項技術中已知的。
製備免疫結合物之方法式I之ADC可藉由若干途徑，採用熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑製備，包括以下：(1)抗體之親核性基團與二價連接子試劑反應，經由共價鍵形成Ab-L，接著與藥物部分D反應；及(2)藥物部分之親核性基團與二價連接子試劑反應，經由共價鍵形成D-L，接著與抗體之親核性基團反應。
抗體上之親核性基團包括但不限於：(i) N端胺基；(ii)側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；及(iv)糖羥基或胺基，其中抗體發生糖基化。胺、硫醇及羥基為親核性的且能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電性基團反應形成共價鍵，該等親電性基團包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；及(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基。某些抗體具有可還原鏈間二硫鍵，亦即半胱胺酸橋鍵。藉由用諸如DTT (二硫蘇糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)之還原劑處理，使得抗體完全或部分還原，可使抗體具有反應性，以與連接子試劑結合。理論上各半胱胺酸橋鍵將因此形成兩個反應性硫醇親核體。可經由例如使離胺酸殘基與2-亞胺基硫雜環戊烷(妥特氏試劑(Traut's reagent))反應，修飾離胺酸殘基，使胺轉化成硫醇，而將額外親核性基團引入抗體中。亦可藉由引入一個、兩個、三個、四個或更多個半胱胺酸殘基(例如藉由製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之變異抗體)，而將反應性硫醇基引入至抗體中。
ADC亦可藉由抗體上之親電性基團(諸如醛或酮羰基)與連接子試劑或藥物上之親核性基團之間發生反應來產生。連接子試劑上之適用親核性基團包括但不限於醯肼、肟、胺基、肼、硫半卡巴肼、肼羧酸酯及芳基醯肼。在一個實施例中，抗體經修飾以引入能夠與連接子試劑或藥物上之親核性取代基反應之親電性部分。在另一實施例中，糖基化抗體之糖可例如用過碘酸鹽氧化試劑氧化，以形成醛基或酮基，其可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應。所得亞胺希夫鹼(Schiff base)基團可形成穩定鍵，或可例如藉由硼氫化物試劑還原，以形成穩定之胺鍵。在一個實施例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉反應可在抗體中產生羰基(醛及酮)，其可與藥物(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上之適當基團反應。在另一個實施例中，含有N端絲胺酸或蘇胺酸殘基之抗體可與偏過碘酸鈉反應，產生醛代替第一胺基酸(Geoghegan及Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852)。此類醛可與藥物部分或連接子親核試劑反應。
藥物部分上之例示性親核性基團包括但不限於：能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基反應形成共價鍵的胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫半卡巴肼、肼羧酸酯及芳基醯肼基團，該等親電子基包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；及(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基。
可用於製備ADC之非限制性例示性交叉連接子試劑為可釋放酯連接子。使用此類交叉連接子試劑連接兩個部分(包括蛋白質部分及化學部分)之方法為此項技術中已知的。在一些實施例中，包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白可例如藉由重組技術或肽合成來製備。重組DNA分子可包含編碼結合物之抗體及細胞毒性部分的區域，該等區域彼此相鄰或由編碼不破壞結合物之所需特性之連接子肽的區域分離。
製備免疫結合物之例示性方法一般而言，該等方法包括例如如PerKit™抗體SN38結合套組(CM11408及CM11408x3)使用者參考指南中所述之方法： A. 製備用於標記實驗之位點及試劑A1.自-20℃冷凍櫃移出含有O-丁二醯基SN38 NHS酯之盒1且升溫至室溫，隨後打開袋。 A2.自冰箱移出盒2。 A3.簡短旋轉含有SN38之離心管。將SN38管置放於化學通風櫃內部之管架中且等待直至抗體備好用於結合。 A4.將培育箱或震盪器之溫度設定為25℃。
B. 製備用於結合之抗體樣品B1.將過濾裝置插入所提供之收集管(連接有蓋子之微量離心管)中之一者中。基於以下條件執行該步驟。若抗體以凍乾固體形式供應，則將抗體溶解於500 μL去離子水中且接著將全部內含物轉移至過濾裝置中。若抗體供應於＜500 μL緩衝液中，則將抗體樣品直接轉移至過濾裝置。添加緩衝液A以使總體積達500 μL且將其蓋上。若抗體樣品之體積在500與1000 μL之間，則將體積分裝入兩個離心過濾裝置中。添加緩衝液A以使各過濾裝置中之總體積達500 μL且將其蓋上。若抗體樣品之體積＞1000 μL，則向兩個過濾裝置中之各者中添加500 μL樣品且將其蓋上。重複步驟B1-B4直至所有抗體樣品進入過濾裝置。繼續進行步驟B5。對於最後一次再填充，添加緩衝液A以使各裝置中之總體積達500 μL。 B2.將封端之過濾裝置置放於離心機轉子中，使帽帶朝向轉子之中心對準；與類似裝置進行平衡。 B3.在14,000×g下旋轉過濾裝置8分鐘(較佳地冷卻至4℃)以濃縮至＜100 µL (旋轉時間視許多因素而定)。對於500 µL樣品而言，典型的旋轉時間為大約8至20分鐘。在4℃下在Eppendorf 5417R上旋轉8分鐘之後，典型體積為約40 µL。) B4.自離心機移出經組裝之裝置且自收集管分離過濾裝置。將濾液自收集管轉移至清潔離心管中。在進行實驗之前儲存濾液。 B5.將過濾器裝置插回至收集管中。添加400-450 μL緩衝液A以使總體積達500 μL。接著，將封端之過濾裝置置於離心機轉子中，使蓋帶朝向轉子之中心對準；與類似裝置進行平衡。在14,000×g下旋轉裝置以濃縮至＜100 µL。自離心機移出經組裝之裝置且自收集管分離過濾裝置。將濾液自收集管轉移至清潔離心管(未提供)中。在進行實驗之前儲存濾液。 B6.再重複步驟B5兩次。 B7.將經濃縮之樣品自過濾器裝置轉移至1.5 mL微量離心管中。 B8.將50-100 µL緩衝器A添加至過濾裝置中用以沖洗(所添加之緩衝器A之實際體積將視步驟B10中計算之總體積而定)。用移液管尖端對其緩慢攪拌，接著將全部內含物轉移至步驟B7之1.5 mL微量離心管中。 B9.重複步驟B8一次。 B10.將緩衝液A添加至步驟B9之1.5 mL微量離心管中，以使樣品之總體積達618 +/- 5 μL且將其蓋上。 較少抗體(Ab)之計算1： 步驟B10中之抗體總體積(μL)=Ab (單位mg)×206。 B11.渦旋合併之抗體樣品30秒且接著短暫離心。
C. SN38 標記C1.旋轉CM01006以確保在開蓋之前蓋中無液體。添加132 µL CM01006至步驟A3之SN38管。渦流30秒至1分鐘以溶解試劑，且接著短暫離心。 C2.將來自步驟C1之全部SN38溶液轉移至來自步驟B11之抗體溶液中。當添加SN38溶液時，將移液管尖端置放於抗體溶液內且接著緩慢分配SN38同時旋動移液管尖端。將移液管尖端及SN38管棄置於固體廢物袋中。 較少抗體(Ab)之計算2： 步驟C2中待轉移之SN38溶液之體積(μL)=Ab (單位mg)×44。 C3.將該離心管蓋上。在25℃或室溫下混合4小時或隔夜(小於16小時)。
免疫結合物之純化 D1.在化學通風櫃中，將脫鹽柱牢固地連接至支架、實驗室框架或任何支撐桿。自管柱移出頂蓋及底帽且允許過量液體藉由重力流過。在燒瓶中收集液體。 D2.添加5 mL PBS緩衝液且允許緩衝液藉由重力流完全進入凝膠床。 D3.重複步驟D2兩次。 D4.在打開SN38之前旋轉步驟C3之經標記抗體溶液。將全部抗體溶液添加至管柱。使樣品完全進入凝膠床。將離心管棄置於固體廢物袋中。 D5.添加250 µL PBS緩衝液且允許液體完全進入凝膠床。 較少抗體(Ab)之計算5： 步驟D5中之儲存緩衝液之體積(μL)=1000-Ab(單位mg)×250。 D6.將2.0 mL離心管置放在管柱下。添加1.25 mL PBS緩衝液至管柱中。藉由重力收集溶離劑且使緩衝液完全進入凝膠床。 較少抗體(Ab)之計算6： 步驟D6中之儲存緩衝液之體積(μL)=500+Ab(單位mg)×250。 D7.將該管標記為產物。在4℃下儲存結合物。 D8.測定濃度且藉由UV/Vis分光光度法估算DAR。 D9.若ADC在數天內不用於實驗，則向步驟D7之ADC添加穩定PBS緩衝液(5×)。若ADC之總體積為1.25 mL，則添加312.5 µL之穩定PBS緩衝液。等分試樣且將結合物儲存於＜-20℃冷凍櫃中或凍乾至乾燥以用於長期儲存。
實例  以下為本文中所描述之方法及組合物之實例。應瞭解，考慮到上文提供之一般描述，可實施各種其他實施例。
實例 1. 材料及方法 細胞培養乳癌循環腫瘤細胞(CTC)株(Brx-82、Brx-142、Brx-394、Brx-189、Brx-390、Brx-121、Brx-292、Brx-319、Brx-250、Brx-140、Brx-401、Brx-07、Brx-29、Brx-50、Brx-61、Brx-68及Brx-330)在超低吸附培養盤(Corning)之腫瘤球形培養基中懸浮生長，該培養基由以下組成：具有GlutaMAX之RPMI-1640，補充有表皮生長因子(EGF；20 ng/ml)、纖維母細胞生長因子(FGF；20 ng/ml)、1X B27及1X抗生素/抗黴劑(Life Technologies)於4% O 2中。使乳癌細胞株MDA-MB-231、胰管腺癌(PDAC)細胞(PDAC9、PDAC3、PDAC2、PDAC5、PDAC7、PDAC6及PDAC8)及癌症相關纖維母細胞(CAF)在黏合組織培養盤上的補充有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之高葡萄糖DMEM中生長。常規檢查細胞株之黴漿菌(MycoAlert, Lonza)，且藉由RNA定序及DNA定序認證。
RNA定序分析 使用Mini套組(Qiagen)萃取RNA。為了產生RNA定序(RNA-Seq)庫，根據製造商說明書使用SMART-Seq HT套組(Takara Bio USA)。在NextSeq定序器上定序所彙集之庫。
西方墨點分析對用放射性免疫沈澱分析(RIPA)緩衝液製備之全細胞萃取物進行西方墨點分析。蛋白質在4-15%聚丙烯醯胺梯度-十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠(Bio-Rad)上分離且轉移至硝化纖維素膜(Invitrogen)上。用增強之化學發光(Perkin-Elmer)觀測西方墨點。針對GAPDH (1:2000；Millipore ABS16)及鈣黏蛋白11 (23C6 [1:500]或3H10 [1:500])使用初級抗體。
shRNA 減弱MDA-MB-231細胞使用Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies)，用對照短髮夾(shRNA；反義序列，5 CCGCAGGTATGCACGCGT-3')或用靶向鈣黏蛋白11之shRNA C9 (反義序列，5'-CAATGTGGGAACGTCAGTAAT-3')、C11 (反義序列，5-CCACTTTCCAACCAGCCAATT-3')或G12 (反義序列，5-CCACTTTCCAACCAGCCAATT-3')進行轉染，且在轉染之後48小時收集以用於進一步分析。
組織學、免疫組織化學及免疫螢光法將腫瘤固定在10%福馬林中隔夜，接著保存在70%乙醇中。將該組織包埋於石蠟中且切成5-µm切片。
對於組織學分析，用蘇木精及曙紅對切片染色或進行免疫組織化學染色。使組織滲透，且在1×檸檬酸鹽緩衝液(pH 6)中進行抗原修復15分鐘。載片經洗滌且用5%山羊血清阻斷30分鐘。切片在室溫下與初級抗體鈣黏蛋白11(23C6 [1:200]或3H10 [1:200)一起培育1小時。將載片與HRP抗兔抗體(DAKO)一起培育30分鐘。用PBS洗滌之後，將切片在3,3'-二胺基聯苯胺(Vector Laboratories)中培育10分鐘。細胞用Gill的2號蘇木精對比染色10-15秒。使用Aperio CSO (Leica Biosystems)數位化染色組織切片。
對於免疫螢光研究，在用針對鈣黏蛋白11之Alexa 488結合抗體隨後與Alexa-488 (Invitrogen)結合之二級抗體染色之後，在BioView成像系統上計數MDA-MB-231細胞。
跨孔遷移分析使用具有含有8微米孔之聚對苯二甲酸伸乙酯(PET)膜之24孔改質Boyden腔室跨孔(BD BioCoat)進行活體外遷移分析。將經感染MDA-MB-231細胞之穩定池維持在生長培養基中直至分析當天。將100 μL分析培養基中之15,000個細胞接種於上部腔室中，且將500 μL含或不含20 ng/mL EGF之分析培養基添加至下部腔室中。細胞在37℃下培育24小時，接著固定於70%乙醇中20分鐘，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)沖洗且用2.3%晶體劇烈染色。用棉簽以機械方式移除留在上表面上之細胞。對留在下面之細胞計數(每跨孔以20×放大率為5個欄位)。將跨孔細胞一式三份塗鋪且對結果求平均值。
小鼠研究在每樣品4隻雌性嚴重免疫功能不全NOD以及免疫缺陷介白素2受體次單位γ 空(NSG)小鼠中皮下注射穩定表現綠色螢光蛋白(GFP)及螢光素酶之MDA-MB-231及PDAC9細胞。在腹膜內注射D-螢光素(Sigma)之後，使用IVIS Lumina II (PerkinElmer)經由活體內成像來量測轉移性生長。當小鼠出現不良身體病況時將其處死，且在免疫組織化學之前，將肺及肝臟收集至10%福馬林中固定24小時。對於原位異種移植物注射，將2.0×10 5個細胞注射至每個樣品4隻雌性NSG小鼠之第四個乳腺脂肪墊中之各者中。
存活率分析對於存活率分析，如上文所述向小鼠注射MDA-MB-231或PDAC9細胞。每1-2天監測小鼠之不良身體病況徵象。當根據IACUC方案小鼠出現不良身體病況時使其安樂死，且將此確定為死亡日期。對小鼠存活進行卡本-麥爾分析(Kaplan-Meier analysis)。
實例 2. 乳癌抗 CDH11 抗體療法轉移之能力為不存在於腫瘤之所有癌細胞中之特徵，使得此異質性之特徵在於癌細胞對傳統治療干預起動態反應之機制。因此，靶向此腫瘤細胞子集之能力在阻斷最後將導致死亡之腫瘤細胞擴散方面至關重要。
此實例描述用於治療乳癌之抗CDH11抗體之研發，例如藉由鑑別CDH11在乳癌患者之多個CTC株中之表現及針對在原發性乳癌轉移之小鼠模型中的轉移負荷之降低，測試兩種抗CDH11單株抗體純系3H10及23C6來進行。
材料及方法材料及方法描述於實例1中。
結果 圖 1為來自乳癌患者之CTC株Brx-82、Brx-142、Brx-394 AVG、Brx-189、Brx-390、Brx-121、Brx-292、Brx-319、Brx-250、Brx-140或Brx-401中細胞黏附分子之RNA表現量。細胞黏附分子CDH11以RNA含量在多個乳房CTC細胞株中表現(圖1，黑色輪廓)。展示CDH11之概況的西方墨點產生類似結果，其中在高度轉移性乳癌細胞株MDA-MB-231 (通篇縮寫可與MDA-MB-231或231互換)及CTC株Brx-142 (142)、Brx-330 (330)、Brx-390 (390)及Brx-401 (401)中，CDH11在抗CDH11單株抗體純系3H10 (3H10； 圖 2，左圖)及純系23C6 (23C6； 圖 2，右圖)下產生可偵測之蛋白質表現。在控制抗體特異性的研究中，吾等發現當偵測到具有23C6之CDH11蛋白質被MDA-MB-231細胞中之短髮夾RNA (shRNA)減弱時，CDH11減少(圖3)。
為了表徵CDH11在腫瘤細胞中之定位，在第一個實驗中，MDA-MB-231細胞，細胞在培養物中用3H10預處理大約18小時。免疫螢光證實，MDA-MB-231細胞展現非均質點狀細胞表面及經抗CDH11 3H10 ( 圖 4)及23C6 ( 圖 5)抗體染色的細胞-細胞界面。在第二個實驗中，將衍生自Brx142細胞株原位異種移植腫瘤注射至NSG小鼠乳腺中。用抗CDH11 23C6 ( 圖 6，左)及3H10 ( 圖 6，右)抗體對此等原位異種移植腫瘤進行免疫組織化學染色，展現不同染色強度，其中23C6具有膜染色且3H10缺乏染色。此等結果指示23C6對CDH11具有更佳結合親和力且充當治療癌症的較佳治療性抗體。為了使用23C6抗體進一步表徵跨越癌細胞株之CDH11表現模式，使MDA-MB-231、CTC Brx-142或CTC Brx-401細胞株在培養下生長且進行免疫組織化學。跨越三種細胞株，細胞塊之免疫組織化學染色展現細胞膜染色( 圖 7)，指示23C6可結合許多類型之CTC細胞株以及高度轉移性MDA-MB-231細胞株。為了在原發性乳癌轉移模型中活體內測試CDH11表現模式之變化，分別將衍生自CTC Brx-07、Brx-29、Brx-50、Brx-61、Brx-68、Brx-330、Brx-142或Brx-401株之原位異種移植腫瘤注射至NSG小鼠乳腺中。用抗CDH11 23C6抗體對此等原位異種移植腫瘤進行免疫組織化學染色，展現在所有細胞株中之細胞膜染色( 圖 8)。
為了測試23C6及3H10處理對活體外MDA-MB-231細胞之遷移能力的影響，進行功能性研究以及跨孔遷移分析。將15,000個MDA-MB-231細胞分別以一定血清梯度及5 μg/mL或50 μg/mL之23C6或3H10抗CDH11抗體塗鋪於含有8 μm孔的跨孔插入物上20小時。相比於對照組，用5 μg/mL或50 μg/mL之23C6或50 μg/mL之3H10處理之MDA-MB-231細胞在作為化學引誘劑之含血清培養基存在下，在跨孔遷移分析中，細胞運動性顯著增加( 圖 9)。值得注意地，23C6比3H10更有效，符合兩種抗體間免疫組織化學及免疫螢光染色之觀測差異( 圖 6)。
為了鑑別23C6或3H10抗CDH11抗體處理是否影響原發性乳癌之活體內小鼠模型中的轉移負荷，進行進一步的功能研究。將用GFP-螢光素酶標記之MDA-MB-231細胞原位注射至經安慰劑、23C6或3H10 (0.2毫克/週)處理5.5週之NSG小鼠之乳腺中。切除原發性腫瘤之後，小鼠在切除後持續1週繼續接受用安慰劑、23C6或3H10 (0.2毫克/週)處理。在腹膜內注射D-螢光素之後，量測MDA-MB-231轉移性生長。在針對肺部界定之所關注區域自仰臥視角獲得之NSG小鼠影像(ROI)中，在第71天，經23C6抗體及3H10抗體處理之小鼠均展現轉移負荷之顯著下降，如藉由生物發光所量測( 圖 10 及圖 11)。此等結果展現CDH11抗體在原發性乳癌轉移之小鼠模型中減少轉移負荷。當分析相同小鼠但以俯臥視角量測全身發光時，觀測到類似結果模式，其中用CDH11抗體處理減少轉移負荷( 圖 12 及圖 13)。當隨時間推移量測此實驗之小鼠的生存率時，經23C6或3H10抗CDH11抗體處理之小鼠相比於安慰劑對照組展現更大的存活可能性，表現為百分比形式( 圖 14)。
使用類似方法及相同小鼠進行離體分析，當器官外植且針對轉移負荷使肺及肝臟成像時，與安慰劑對照組相比，經23C6抗體及3H10抗體處理之小鼠在肝臟中展現降低之轉移負荷，且經23C6抗體處理之小鼠另外展現肺轉移之抑制( 圖 15)。總之，此等研究提供23C6抗CDH11抗體及3H10抗CDH11抗體抑制乳癌活體內模型中之轉移性擴散的證據。此等結果亦支持23C6相比於3H10之相對較高功效。
實例 3. 胰臟癌抗 CDH11 抗體療法此實例描述抗用於治療胰臟癌之CDH11抗體的研發，例如藉由鑑別CDH11在患有胰管腺癌之患者之多個PDAC株中之表現及針對原發性胰臟癌轉移小鼠模型中的轉移負荷之降低，測試抗CDH11單株抗體純系23C6。
材料及方法 材料及方法描述於實例 1 中。
結果圖16為患者衍生之PDAC株(PDAC9、PDAC3、PDAC2、PDAC5、PDAC7、PDAC6及PDC8)、共培養PDAC及CAF細胞株(PDAC9 CO-CULTURE、PDAC3 CO-CULTURE、PDAC2 CO-CULTURE、PDAC5 CO-CULTURE、PDAC7 CO-CULTURE、PDAC6 CO-CULTURE及PDAC8 CO-CULTURE)及乳癌患者之CAF細胞中之細胞黏附分子CDH11及鈣黏蛋白1 (CDH1)的RNA表現量。細胞黏附分子CDH11以RNA含量在多種PDAC細胞株，包括PDAC9、PDAC7及PDAC6中高度表現。在共培養組中，吾等觀測到在PDAC3、PDAC2、PDAC5及PDAC8中誘導CDH11表現。CDH11亦高度表現於CAF細胞株中，指示抗CDH11療法可能破壞CAF功能且對腫瘤微環境具有額外作用。CDH1 RNA在不包括CAF的所有細胞株中表現。
基於PDAC9具有最高CDH11表現之觀測結果( 圖 16)，PDAC9用於後續功能研究以測試23C6抗CDH11抗體處理在原發性胰臟癌的活體內小鼠模型中對轉移負荷的作用。將用GFP-螢光素酶標記之PDAC9細胞皮下注射至經安慰劑或23C6抗CDH11抗體(0.2毫克/週)處理之NSG小鼠中。在腹膜內注射D-螢光素之後，量測PDAC9轉移性生長。在自俯臥視角獲得之NSG小鼠影像中，在第25天，經23C6抗體處理之小鼠與安慰劑對照組相比展現原發性腫瘤生長之顯著減緩( 圖 17 及圖 18)以及降低之轉移負荷，其藉由在切除活動物中之原發性腫瘤之後隨時間推移的全身發光測定( 圖 19)。
使用類似方法及相同小鼠進行離體分析，當器官外植且針對轉移負荷進行肺成像時，與安慰劑對照組相比，經23C6抗體處理之小鼠展示癌轉移之顯著減少( 圖 20)。總之，此等發現提供證據表明23C6抗CDH11抗體作用於PDAC原發性腫瘤且在胰臟癌活體內模型中抑制轉移能力。
實例 4 ： 抗 CDH11 抗體 SN38 結合 SN38 製備為了製備SN38以結合至23C6抗CDH11抗體(23C6)，使含有O-丁二醯基SN38 NHS酯(SN38)之離心管在-20℃下儲存升溫至室溫(RT)且短暫離心。
23C6 製備為了製備23C6以用於結合，將455 μL之23C6抗體添加至兩個過濾裝置中之各者中且封蓋。在各裝置中將總體積調節至500 μL以用於最後再填充，使得使用了1 mg 23C6。隨後，含有23C6之過濾裝置在14,000×g下在℃下旋轉8分鐘以濃縮至＜100 μL。將來自收集管之濾液轉移至乾淨管。將400-450 μL緩衝液A (CellMosaic)添加至收集管中，總體積達500 μL且在14,000×g下旋轉，使濃度＜100 μL。將來自收集管之濾液轉移至第二個乾淨管。將400-450 μL緩衝液A(CellMosaic)再添加至收集管中兩次，總體積打500 μL且在14,000×g下旋轉，使濃度＜100 μL。每次，將來自收集管之濾液轉移至該第二個乾淨管中。隨後，將來自過濾裝置之濃縮樣品轉移至1.5 mL微量離心管中，且添加50-100 μL緩衝液A (CellMosaic)以沖洗。將來自過濾裝置之全部內含物轉移至該1.5 mL微量離心管中。再次，添加50-100 μL緩衝液A (CellMosaic)以沖洗過濾裝置，且將全部內含物轉移至該1.5 mL微量離心管中。將緩衝液A (CellMosaic)添加至1.5 mL微量離心管以使樣品之總體積達206±5 μL。將抗體樣品渦旋30秒且接著短暫離心。
SN38 標記為了製備用於標記之SN38，如SN38製備之最終步驟中所述，將44 μL CM01006 (CellMosaic)添加至SN38管。渦旋該含SN38之管30-60秒且短暫離心。之後，如23C6製備物之最終步驟中所述，將整個SN38溶液轉移至含有抗體溶液之微量離心管中。在旋渦之後，將套管在25℃或室溫下混合4小時或隔夜。
結合物之純化在化學通風櫃中，將5 mL PBS添加至脫鹽管柱(CellMosaic)中，且使緩衝液藉由重力流完全進入凝膠床。將更多5 mL PBS添加至脫鹽管柱(CellMosaic)中且使其完全進入凝膠床。如 SN38標記之最終步驟中所述，將經2N38標記之23C6添加至管柱以及250 μL PBS緩衝液中。將2.0 mL離心管置於管柱下，且將1.25 mL PBS緩衝液添加至管柱中。收集溶離劑(例如經SN38標記之23C6)且儲存在4℃下。為了長期儲存，添加穩定PBS緩衝液(5×) (CellMosaic)。舉例而言，當經2N38標記之23C6之總體積為1.25 mL時，添加312.5 μL穩定PBS緩衝液，且溶液儲存於＜-20℃下。
為了測定經2N38標記之23C6之濃度，藉由UV/Vis分光光度法進行DAR。
實例 5 ： 鑑別靶向突變誘發之 23C6 之殘基或區域 ， 其藉由 23C6:CDH11 複合物之晶體結構確定 方法23C6之預測結構展示於 圖 21中。23C6胺基酸序列使用I-TASSER多重模板線程方法，例如參見Roy等人, I-TASSER: a unified platform for automated protein structure and function prediction. Nature Protocols. 2010. 5:4; 725-73; Roy等人, COFACTOR: An accurate comparative algorithm for structure-based protein function annotation . Nucleic Acids Research. 2012. 40: W471-W477; Pei等人, PROMALS3D: a tool for multiple protein sequence and structure alignments. Nucleic Acids Research. 2008. 36:7, 2295-300(其以引用之方式併入)，在NovaFold應用軟體(DNASTAR Inc., Madison, WI). New York, NY中建模。
蛋白質-蛋白質對接應用程式使用基於SwarmDock之演算法，該演算法基於粒子可運動最佳化演算法進行對接預測。在兩種蛋白質-蛋白質結合搭配物(例如23C6及CDH11)間預測結合相互作用。各結合搭配物可由一或多條蛋白鏈組成。本申請案需要僅使用標準殘基且不缺失殘基及原子之完整蛋白質結構。
在建模期間，NovaFold抗體針對來自PDB之數千個非冗長蛋白質抗體結構搜索23C6輸入序列且發現鏈或複合物之最佳模板匹配。特別考慮了互補決定區(CDR)環。NovaFold抗體使CDR-H3環建模限制為十五個或更少殘基。最後，進行能量最小化計算以構築23C6抗體鏈或複合物之最終預測結構模型。
結果產生具有相同7成員叢集之兩個模型。吾等觀測到此等前兩個模型在N端IgG域(CAD5域)之相同抗原決定基上幾乎為相同結合( 圖 22；最佳配適及第二最佳配適)。選擇具有最穩定能量之模型作為最佳預測( 圖 22；最佳適配)。另一種可行方案在不同IgG域或N端域之不同定向上具有23C6 Fab ( 圖 23；第三最佳方案及第四最佳方案)。為了比較，前四個預測結構模型繪製於同一CDH11分子上( 圖 24)。對C端IgG域(CAD1域)進行相同分析。
經鑑別CAD5及CAD1 23C6 F(ab)接觸殘基分別列於下 表 4及 表 5中： 表 4 ： CAD5 域接觸殘基
23C6 F(ab) 接觸殘基 CDH11 接觸殘基
重鏈接觸
Gly 26 Thr 585
Tyr 27 Ser 583
Ser 28 Ala 485、Asn 484、Met 582、Ser 583及Ser 584
Thr 30 Ala 485、Asn 484、Asp 483、Lys 487及Met 582
Asp 31 Ala 485、Lys 487、Pro 486及Ser 584
Tyr 32 Ser 584及Thr 585
Asn 54 Asn 484、Glu 449及Lys 487
Tyr 55 Glu 449
Arg 98 Thr 585
Tyr 100 Asn 586、Lys 487、Phe 488、Pro 486、Ser 584及Thr 585
Tyr 101 Lys 487及Phe 488
Gly 102 Ala 489、Ala 490、Phe 488及Pro 491
Ser 103 Ala 489、Ala 490、Asn 586、Phe 488及Pro 491
Arg 104 Pro 491
Tyr 105 Asn 586、Pro 491、Thr 585及Thr 587
輕鏈接觸
Tyr 50 Leu 588、Pro 491、Thr 587、Thr 589及Tyr 492
Ser 51 Pro 491
Ser 53 Glu 493及Lys 591
Asn 54 Glu 493、Lys 591及Thr 589
Leu 55 Leu 567、Leu 569、Thr 587及Thr 589
Ala 56 Leu 569及Thr 587
Ser 57 Glu 534、Leu 569、Leu 570、Leu 588、Pro 571及Thr 587
Gly 58 Leu 569
Val 59 Leu 569
Ala 61 Leu 567
表 5 ： CAD1 域接觸殘基
23C6 F(ab) 接觸殘基 CDH11 接觸殘基
重鏈接觸
Phe 2 Glu 40及Lys 41
Tyr 27 Glu 40及Lys 43
Asp 31 Lys 43
Asn 54 Leu 139
Tyr 55 Glu 140、Leu 139及Pro 138
Thr 57 Asn 87
Arg 98 Glu 40
Tyr 100 Glu 40、His 19、His 39及Lys 43
Gly 102 Arg 32及His 21
Ser 103 Arg 32、Gly 37及His 19
Arg 104 Arg 32、Asp 82、Ile 81、Leu 31、Phe 35及Ser 83
Tyr 105 Glu 40、Gly 37、His 38、His 39及Lys 41
Asp 107 Glu 40、His 38及Lys 41
輕鏈接觸
Ser 30 Arg 27、Arg 28、Gly 29及His 30
Ser 31 Gly 29及His 30
Ser 32 Gly 29、His 30及Leu 31
Tyr 33 Arg 27、Arg 28、Asp 82、Leu 31及Ser 79
His 35 Leu 31
Tyr 50 Gly 37、His 36、His 38及Phe 35
Ser 51 Arg 32、His 30、Leu 31及Phe 35
Asn 54 Phe 35及Ser 34
Leu 55 His 38
Ala 56 His 38
Ser 57 His 38及Lys 41
Gly 58 Lys 41
Tyr 92 Asp 82
His 93 Arg 28
在某些實施例中，CDH11抗體變異體經設計以在如本文所述之F(ab)接觸殘基及/或其相鄰殘基處具有一或多個胺基酸取代。
實例 6 ： 使用雙重鈣黏蛋白抗體靶向乳房及胰臟癌轉移下文將針對鈣黏蛋白之抗體(23C6)描述為有效抑制三陰性乳癌及胰臟癌之小鼠同基因及異種移植模型中之血源性癌轉移。23C6抗體是因為其識別上皮E-鈣黏蛋白(CDH1)及間葉OB-鈣黏蛋白(CDH11)，因此克服整個腫瘤細胞之相當大的異質性。儘管抗體在循環中針對單個細胞有功效，但該抗體不會抑制原發性腫瘤形成，其亦不會在正常上皮器官中引起可偵測之毒性，在該等正常上皮器官中，鈣黏蛋白可能在細胞間接合點內接合且因此無法發生抗體結合。在經匹配之具有免疫能力之小鼠模型及免疫缺陷小鼠模型中，抗體所介導的轉移抑制作用是具有可比性的。此等研究表明，靶向血管結構內之CTC的抗體可抑制血源性癌轉移。
結果 鈣黏蛋白表現之異質性及與抗體 23C6 之結合為了研究鈣黏蛋白作為合理設計抗體治療劑之潛在目標，吾等檢查原發性癌症及轉移癌患者之循環腫瘤細胞(CTC)中之鈣黏蛋白表現的前景。在不同組織學類型之原發性癌症的TCGA資料集中，鈣黏蛋白家族之RNA表現展示超出血液科惡性病範圍之高表現量(圖25A)。E-鈣黏蛋白(CDH1)在上皮癌中最高度表現(在16種上皮癌中97.2%之樣品以RNA含量表現＞5 FPKM)，但在其他鈣黏蛋白家族成員中之顯著異質性明顯，其中N-鈣黏蛋白(CDH2) (38.4%)、P-鈣黏蛋白(CDH3) (60.4%)及OB-鈣黏蛋白(CDH11) (38.9%)為上皮癌症中表現之顯性家庭成員。
為了進一步表徵鈣黏蛋白表現之異質性，分析自患有轉移性激素受體陽性(HR+)乳癌之患者分離的CTC之單細胞RNA-Seq。與原發性腫瘤相比，CTC展現顯著較高的鈣黏蛋白表現之變化：E-鈣黏蛋白再次為乳房CTC中主要鈣黏蛋白，但僅32.1%之各個CTC表現＞5 RPM (34/106個來自32位患者之CTC) ( 圖 25B)。將所有鈣黏蛋白在＞5 RPM下組合獲得61.3%之CTC覆蓋率。相比之下，鈣黏蛋白家族在造血細胞中之表現相較於上皮組織中之表現極低( 圖 26)。總之，此分析指示靶向多個鈣黏蛋白家族成員將具有解決整個CTC中個別基因家族成員表現之異質性的優勢。
小鼠單株抗體23C6最初針對CDH11之胞外域研發(Lee等人. Science 315, 1006-1010 (2007))。在對其可變域進行定序且對其與鈣黏蛋白-11之潛力結合建模後，鑑別出胞外域內之兩個潛在結合位點( 圖 25C)，兩者在CDH1中高度保守(對於潛在結合位點1及2分別具有58.5%及42.9%胺基酸同源性) ( 圖 25D)。西方墨點分析揭露對重組人類CDH11，以及未觀測到具有獨立CDH11抗體(3H10)的人類及鼠類CDH1具有強反應性( 圖 25E)，與保守區之識別一致。觀測到對人類CDH2之較低反應性( 圖 27)。為了確認23C6抗體之雙特異性，在MDA-MB-231細胞中產生不表現CDH1 ( 圖 28)且藉由西方墨點觀測到偵測CDH11之信號損失( 圖 29A-B)的shCDH11減弱細胞株。此外，CDH1在PDAC9細胞中之表現減弱，該等細胞主要表現CDH1且藉由流動式細胞測量術展現對23C6抗體之反應性發生變化( 圖 27 、圖 33C-E)。為了確定對23C6抗體具有反應性之乳癌譜，將由HR+、HER2+及三陰性(TNBC)乳癌組成之96種乳癌之腫瘤陣列染色。免疫組織化學染色展現細胞膜染色模式，其中所有乳癌中之79%具有強腫瘤細胞染色，包括88%之HR+及60%之TNBC亞型乳癌( 圖 25F及 圖 25G)。
在23C6抗體識別CDH1及CDH11的條件下，評估此等兩個鈣黏蛋白家族成員在不同癌症類型中在RNA及蛋白質含量上之表現。除血液科惡性病之外，對於此等鈣黏蛋白基因中之至少一者，幾乎所有癌症表現可偵測之RNA及蛋白質( 圖 25H ，圖 30)。吾等發現624/921 (67.8%)表現高含量(＞5 RPM)的此等兩種鈣黏蛋白中之至少一者( 圖 31)。最後，在轉移性乳癌患者中，47.1% (8/17)在其CTC中具有組合的CDH1及CDH11平均表現，大於＞20 RPM，且41.2% (7/17)的患者有大於三分之一之其CTC表現CDH1或CDH11 ( 圖 25I)。
在小鼠乳房腫瘤模型中藉由 23C6 抗體抑制癌轉移為了評定23C6抗體之潛在抗轉移活性，選擇第一種鼠類TNBC相關4T1乳癌細胞，其同基因型小鼠中之致瘤性提供ADCC及免疫相關功能之模型。原位乳腺接種4T1細胞之後，每週兩次抗體處理(5 mg/kg腹膜內注射)來處理小鼠( 圖 32A)。在經安慰劑及23C6處理之小鼠間，原發性腫瘤生長無明顯差異( 圖 32B)。在20天之後切除腫瘤(中值尺寸200 mm 3)，隨後繼續進行抗體處理，且在36天之後評定肺中之轉移負荷。經抗體處理之小鼠展示轉移負荷在癌轉移沈積物之數目及尺寸上顯著下降(腫瘤百分比為50.3相對於5.8%；p=0.0015)，表明在此模型中23C6削弱血源性癌轉移(圖32C)。
為了測試23C6抗體之作用是否視完整免疫系統而定，在NSG免疫功能不全小鼠中重複4T1腫瘤形成實驗。相較於免疫勝任模型，4T1細胞在NSG小鼠中產生較大原發性腫瘤，但同樣23C6抗體處理不影響原發性腫瘤細胞生長( 圖 32D)。然而，與在免疫勝任模型中一樣，用23C6抗體處理之小鼠中的肺部轉移負荷顯著下降( 圖 32E)。因此，獨立於免疫細胞活化，抗體治療有效減少血源性癌轉移。
23C6 抗體在人類腫瘤異種移植物中的功效延伸對NSG免疫缺乏小鼠之不同人類異種移植模型中之23C6抗體功效的研究。MDA-MB-231細胞株係TNBC亞型乳癌的侵襲性及易於癌轉移模型，缺乏CDH1表現但表現CDH11 ( 圖 28)。由此等細胞形成原位乳腺腫瘤並未受23C6處理顯著影響( 圖 33A)，但在切除原發腫瘤之前及之後4天投與抗體持續39天足以顯著抑制肺部及肝臟中之轉移負荷( 圖 33B-C)。在此等細胞中，使用兩個獨立構築體之shRNA介導之減弱(68%及83%減弱)削弱轉移生長在不影響原發性腫瘤形成( 圖 34)。此等觀測結果表明，CDH11依賴性功能可能由於抗體結合或基因減弱而遭破壞，且在此模型中存在相當的癌轉移結果。
為了研究23C6抗體是否直接影響癌細胞，用23C6抗體處理活體外生長之MDA-MB-231細胞且評定生存率、生長情況及侵襲性。即使在高劑量下，用23C6抗體處理亦不影響細胞生存率，且不削弱細胞增殖( 圖 35A-B)。然而，在高劑量及低劑量之23C6抗體下，23C6抗體處理減少經由Boyden腔室之MDA-MB-231細胞遷移，指示動力削弱可促成所觀測到之抗轉移活性( 圖 35C)。
如同TNBC亞型乳癌，胰管腺癌(PDAC)代表具有有限治療選擇及不同鈣黏蛋白之異質表現的高度侵襲性惡性病。測試患者源胰臟細胞株PDAC9 (在皮下注射之後自發地產生轉移)中之23C6抗體。西方墨點法分析展現E-鈣黏蛋白之蛋白質表現及對23C6抗體之反應性( 圖 29C-E)。在NSG小鼠中PDAC9細胞之原發性腫瘤形成未藉由用23C6抗體連續處理而顯著減少( 圖 33D)。然而，在切除原發性腫瘤之後，經23C6抗體治療之小鼠經由全身發光量測之轉移負荷降低25倍(p=0.01) ( 圖 33E)。重要的是，在此高度血管侵襲性腫瘤模型中，計數末端時間點處血液中之CTC數目。經抗體處理之小鼠展現CTC數目減少100倍(中值238相對於每毫升血液之4個CTC，p=0.01) ( 圖 33F)。總之，此等異種移植研究證實，雙重鈣黏蛋白靶向抗體在不同腫瘤類型中、甚至在免疫抑制小鼠模型中抑制上皮癌所致之血源性癌轉移的功效。
隨後，23C6抗體與SN-38 (拓樸異構酶I抑制劑伊立替康之高效代謝物結合(Bailly等人, Pharmacol Res 148, 104398 (2019))。藉由HPLC確認成功結合( 圖 36)，且藥物:抗體比值經計算為1.84。在已患有PDAC9衍生之腫瘤之小鼠中產生足夠量之23C6-ADC以供單次投與。在處理後8天的組織學分析證實，與單獨接受等莫耳裸23C6抗體(1%，p=0.002)或等莫耳SN-38藥物(1.3%，p=0.019)之小鼠相比，在經23C6-ADC處理之小鼠(2.2%)中的凋亡腫瘤細胞(裂解凋亡蛋白酶-3)分率增加( 圖 33G)。
抗體 23C6 對正常上皮組織缺乏毒性鈣黏蛋白表現在正常上皮組織中普遍存在，此增加了對此等蛋白質之治療靶向可能誘發正常器官中抗體介導之發炎及毒性的極大擔憂。23C6抗體識別重組鼠類E-鈣黏蛋白( 圖 25E)，係一種藉由其針對小鼠4T1腫瘤細胞之有效性支持的交叉反應。為了檢驗抗體處理對正常小鼠器官之影響，用23C6抗體(5 mg/kg，每週兩次，持續32天)處理具有免疫活性之BALBC小鼠，隨後對多個器官進行組織學分析。多種組織(包括腎臟、肝臟、大腸及肌肉)之組織學外觀在經抗體及安慰劑處理之小鼠間不可區分，無細胞死亡(裂解凋亡蛋白酶-3)增加、上皮邊界或血管(CD34)受損或免疫細胞浸潤(CD45)之跡象( 圖 37A-C ，圖 38)。在32天時，經抗體處理之小鼠與對照物不能在外觀上區分，維持相同的活性水準及質量水準(安慰劑之平均質量20.7 g，相較於23C6處理之小鼠的20.6 g)、屍檢時之器官質量( 圖 37D-E)、血液中之白血球計數及血紅素含量( 圖 39)。因此，儘管其在正常組織中廣泛表現，但靶向鈣黏蛋白CDH1及CDH11並不引起明顯毒性。
跨越癌症組織學之 23C6 抗體之反應性為了確定對23C6抗體具有潛在反應性之癌譜，對具有124個來源於18種不同人類癌症之個別樣品的腫瘤組織陣列進行染色。除神經管胚細胞瘤、睪丸癌及膀胱癌之外，所有實體腫瘤類型使用23C6抗體對膜染色具有超過50%之呈陽性樣品(圖40A-B)。在所有組織學亞型中,乳癌展示最高比例之腫瘤，其中對23C6強染色。然而，其他普遍癌症類型(包括胰臟癌、大腸癌及肺癌)常常展示對23C6抗體之高反應性，擴展23C6抗體對其他常見癌症之潛在活性。
此處，吾等已展示靶向多種在上皮(CDH1)及間葉(CDH11)細胞類型中表現之鈣黏蛋白的抗體似乎對正常組織無毒，且無法抑制原發性腫瘤形成，但有效抑制向肺部及其他遠端器官之血源性癌轉移擴散( 圖 40C)。
上述結果係使用以下材料及方法產生。
材料及方法 抗體產生23C6抗體如先前所述產生(Lee等人, Science 315, 1006-1010 (2007))。融合瘤衍生之23C6純系經擴增以用於生物反應器產生，經純化且濃縮(Antibody Solutions Santa Clara, CA)。使用PerKitTM抗體SN38結合套組(Cell Mosaic)進行23C6抗體之結合。簡言之，製備1 mg之23Cg，且隨後添加至O-丁二醯基SN38 NHS酯中，且在室溫下根據製造商建議培育隔夜。隨後結合物使用脫鹽管柱純化，洗滌且溶離。使用HPLC進行抗體結合物之分析且測定經SN38標記之23C6濃度，藉由UV/Vis分光光度法進行DAR。藥物與抗體比值為約1.84且聚集為約8%。
抗體結合建模下一代定序用於測定來自融合瘤之23C6之重鏈及輕鏈之V區之RNA序列。在NovaFold應用軟體(DNASTAR Inc., Madison, WI)中使用I-TASSER (Roy等人, Nat Protoc 5, 725-738 (2010), Roy等人, Nucleic Acids Res 40, W471-477 (2012))多重模板線程方法對蛋白質胺基酸序列建模。產生針對23C6抗體之Fab之預測結構的3-D分析。SwarmDock用於蛋白質-蛋白質對接分析(Torchala等人, Methods Mol Biol 1137, 181-197 (2014))。
西方墨點分析對用RIPA緩衝液製備之全細胞萃取物進行西方墨點分析。蛋白質在4-15%聚丙烯醯胺梯度-SDS凝膠(Bio-Rad)上分離，且轉移至硝化纖維素膜(Invitrogen)上。利用增強之化學發光(Perkin-Elmer)觀測免疫墨點。針對鈣黏蛋白(1:5000；BDBiosciences純系36)、鈣黏蛋白(1:500；EBiosciences純系8C11)及GAPDH (1:2000；Millipore ABS16)，使用初級抗體。對於西方墨點分析，23C6亦用作初級抗體(1:250)。如下獲得重組蛋白：人類CDH1 (R&D系統8505-EC-050)、鼠類CDH1 (R&D系統8875-EC-050)、人類CDH2 (R&D系統1388NC050)及人類CDH11 (Elabscience編號PKSH032136)。
定量實時 PCR使用RNeasy Mini套組(Qiagen)分離RNA。使用Superscript III First Strand Synthesis Supermix (Invitrogen)將RNA反轉錄。使用TaqMan探針及CDH11及GAPDH之引子組。
組織學及免疫組織化學將腫瘤及多個器官固定在10%福馬林中隔夜，接著保存在70%乙醇中。將該組織包埋於石蠟中且切成5-µm部分。對於組織學分析，用蘇木精及曙紅對切片染色或進行免疫組織化學染色。使組織滲透，且在1×檸檬酸鹽緩衝液(pH 6)中進行抗原修復15分鐘。載片經洗滌且用5%山羊血清阻斷30分鐘。切片在室溫下與針對23C6 (1:250)、CD45 (1:2000；Abcam ab281586)、CD34 (1: 2000；Abcam ab81289)、裂解凋亡蛋白酶-3 (1:1000；Signaling Technology 9664S)之初級抗體一起培育1小時。將載片與HRP抗兔抗體(DAKO)一起培育30分鐘。用PBS洗滌之後，將切片在3,3'-二胺基聯苯胺(Vector Laboratories)中培育10分鐘。細胞用Gill的2號蘇木精對比染色10-15秒。使用Aperio CSO (Leica Biosystems)或Vectra Polaris (Perkin Elmer)數位化染色組織切片。藉由Halo成像軟件(Indica Labs)定量肺中之腫瘤病灶。組織及腫瘤陣列獲自US Biomax且如上文所描述製備及染色。
細胞培養常規檢查細胞株之黴漿菌(MycoAlert, Lonza)，且細胞株係獲自ATCC。如ATCC所建議使4T1及MDA-MB-231生長。PDAC9如先前所描述生長(Porter等人, Proc Natl Acad Sci U S A, (2019))。在用不同濃度之23C6抗體或PBS對照物處理後48小時時進行生存率分析。使用Cell Titer Glo試劑(Promega)測定生存率。藉由用如所指示之單次劑量之23C6抗體或PBS對照及時間點處理MDA-MB-231細胞進行增殖分析，其中使用Cell TiterGlo試劑測定相對細胞數目。對於遷移分析，用胰蛋白酶收集MDA-MB-231細胞，且將細胞懸浮於無血清培養基中。將細胞懸浮液添加至Boyden腔室細胞培養盤插入物之上部腔室中，其中梯度係藉由在下部腔室中添加全血清培養基產生。用23C6或對照處理細胞懸浮液，且48小時後，藉由結晶紫染色及使用Image J自動計數個別細胞之顯微鏡成像測定經由膜遷移之細胞數目。對於siRNA減弱，獲得ONTARGETplus siRNA smartpools (Horizon Discovery)且使用Lipofectamine RNAiMax試劑(Invitrogen)轉染且在5天之後收集細胞用於分析。對於流動式細胞測量術，簡言之，細胞用4% PFA固定，用含5% BSA之PBS阻斷且與23C6抗體以1:500，接著抗小鼠IgG-AlexaFlour 555一起培育，且接著在BD Fortessa機器上分析。
慢病毒產生HEK293T細胞在補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素之高葡萄糖DMEM中生長。細胞在約80%匯合下用Lipofectamine (Invitrogen)轉染。轉染24小時之後，更換培養基。轉染後48小時收集病毒上清液，經由0.45 μm PVDF過濾器過濾。
慢病毒轉導MDA-MB-231細胞在6孔盤中在補充有6 μg/mL凝聚胺之2 mL培養基中經編碼慢病毒之shCDH11轉導。感染之後24小時，更換培養基。感染後72小時，使用嘌呤黴素(3 μg/mL)選擇細胞7天。
小鼠實驗自The Jackson Laboratory獲得NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)及BALB/cj小鼠。4T1、MDA-MB-231及PDAC9細胞株用GFP-螢光素酶標記以活體內成像。向大約6週齡雌性小鼠之第四個乳腺中注射10,000個4T1細胞或200,000個MDA-MB-231細胞。對於PDAC9，在側腹皮下注射200,000個細胞。所有注射均用生長因子耗乏基質膠之1:1混合物進行。在腹膜內注射D-螢光素(Sigma)之後，使用IVIS Lumina II (PerkinElmer)經由活體內成像每週量測原發性及轉移性生長。對於4T1活體內注射至BALB/c小鼠中，將腫瘤測徑規量測用於原發腫瘤。在原發性腫瘤切除時，用異氟醚麻醉小鼠且藉由使用電灼法在無菌條件下切除腫瘤。經口鎮痛劑根據標準動物方案與丁基原啡因一起投與。每週監測小鼠2-3次。在末端時間點，向小鼠注射用於離體器官生物發光成像之D-螢光素或自心臟取樣獲得之血液。用每週兩次以5 mg/kg給藥腹膜內注射安慰劑(無菌PBS)或23C6抗體來處理小鼠。對於23C6-ADC實驗，PDAC9衍生的原發性腫瘤藉由在側腹皮下注射500,000個細胞而產生。在注射後第14天形成原發性腫瘤後，經由腹膜內注射投與單次劑量之等莫耳23C6、23C6-SN-38或SN38。在另外7天之後處死小鼠且收集腫瘤用於IHC。對於23C6毒性實驗，持續31天每週兩次在5 mg/kg給藥下腹膜內注射安慰劑(無菌PBS)或23C6抗體，來處理雌性BALB/c小鼠。每週兩次監測體重。在此實驗結束時，器官經收集，稱重且製備以用於IHC。收集血液樣品以用於全血球計數分析。
CTC 分離及鑑別平均每隻小鼠，在最終時間點處經由眶後收集獲得440 µL血液，直接入EDTA中，最終濃度為5 mM。如所述，腫瘤衍生細胞及細胞叢集隨後經濃縮且在10 psi輸入壓力下藉由基於尺寸之分選使用吾等之微流體CTC叢集晶片與白血球、紅血球、血小板及血漿分離(Edd等人, Lab Chip 20, 558-567 (2020))。此分離成清潔緩衝液(含0.2% F127之PBS)之後，經純化CTC及CTC叢集(0.5% PFA，10分鐘)經固定，使用Shandon EZ巨漏斗(Thermo Fisher)及Cytospin細胞離心機(2000 rpm，5分鐘)塗鋪至載片上，且隨後處理以用於自動免疫螢光成像。染色突出顯示CTC上之人類HLA (AlexaFluor 488中之純系W6/32，BioLegend)、白血球上之小鼠CD45 (AlexaFluor 647中之30-F11純系，BioLegend)及CD16+CD32 (AlexaFluor 647中之2.4G2純系，LSBio)及細胞核(DAPI)。捕獲切片影像且用Vectra Polaris多譜成像(PerkinElmer)數位化。使用Halo成像軟體(Akoya Biosciences)進行圖像分析以鑑別潛在CTC，且隨後人工評估及計數。
生物資訊分析為了分析TCGA資料，自cBioPortal獲取跨癌症類型之CDH基因家族的RNA-Seq資料。利用表示每數百萬之轉錄物數的值，且在熱圖或散佈圖上繪製各個別癌症類型的平均表現值，其中SD值由誤差條表示。為了分析乳癌CTC之單細胞RNA-Seq資料集，分離CTC，分離RNA且如先前所述進行對RNA-Seq資料之處理(Ebright等人, Science 367, 1468-1473 (2020))。CDH家族基因之表現經測定為log10(RPM+1)形式且在根據個別患者及個別CTC分組之熱圖上展現。為了分析CCLE，自(sites.broadinstitute.org/ccle/datasets)下載RPKM形式之資料集。資料經對數變換且使用OriginLab於3維軸上繪製。為了分析ProteinAtlas中跨越血細胞類型之CDH表現，自(www.proteinatlas.org/about/download)下載資料且在熱圖上繪製TPM值。計算且繪製對於CDH1、CDH2及CDH11蛋白質具有強至中度染色之患者的比例。除非另外指出，否則使用GraphPad產生標繪圖及曲線圖。用Biorender軟體產生模型。
其他實施例  本說明書中提及之所有公開案、專利及專利申請案以引用的方式併入本文中，其引用的程度如各獨立公開案或專利申請案經特別及單獨地指示以引用之方式併入一般。
儘管本發明已結合其特定實施例進行描述，但應瞭解，其能夠進行進一步修改，且本申請案意欲涵蓋本發明之任何變化、使用或改編，其大體上遵循本發明之原理且包括在關於本發明之此項技術內已知或慣用實踐範圍內出現之與本發明之該等偏離，且可應用於上文闡述之基本特徵，且遵循申請專利範圍之範疇。
其他實施例係在申請專利範圍內。
1:潛在結合位點 2:潛在結合位點 3:潛在結合位點 4:潛在結合位點
圖 1展示熱圖，其描繪分別在乳癌循環腫瘤細胞(CTC)株Brx-82、Brx-142、Brx-394 AVG、Brx-189、Brx-390、Brx-121、Brx-292、Brx-319、Brx-250、Brx-140及Brx-401中細胞黏附分子(y軸)，包括鈣黏蛋白11 (CDH11；黑色輪廓)之RNA表現量的倍數變化。x軸標記指示相應CTC株。陰影強度表示log 2(RNA轉錄物讀數/百萬(RPM)+1)。 圖 2為西方墨點，其展示以甘油醛3-磷酸酯脫氫酶(GAPDH)標準化之乳癌細胞株MDA-MB-231 (231)及乳癌CTC株Brx-142 (142)、Brx-330 (330)、Brx-390 (390)及BRX-401 (401)中之CDH11蛋白質表現。左右自動放射照片描繪使用不同CDH11單株抗體(3H10，左；及23C6，右)之西方墨點。 圖 3為西方墨點法，其展示使用23C6抗CDH11抗體量測且以GAPDH標準化的CDH11靶向短髮夾RNA (shRNA)在乳癌細胞株MDA-MB-231 (231)中引發CDH11減弱。自左至右，免疫墨點色帶描繪對照shRNA或靶向shRNA C9、C11或G12之鈣黏蛋白11。 圖 4為顯微照片，其展示在培養物中用3H10抗CDH11抗體預處理大約18小時之乳癌細胞株MDA-MB-231 (231)的免疫螢光染色。 圖 5為顯微照片，其展示用23C6抗CDH11抗體在培養物中預處理大約18小時之乳癌細胞株MDA-MB-231 (231)的免疫螢光染色。 圖 6為顯微照片，其展示來源於嚴重免疫功能不全NOD以及免疫缺陷介白素2受體次單位γ 空(NSG)小鼠之乳腺中生長之乳癌細胞株MDA-MB-231 (231)之細胞的原位異種移植腫瘤的免疫組織化學染色。左右影像描繪用不同CDH11抗體(23C6，左；及3H10，右)進行之免疫組織化學染色。 圖 7為顯微照片，其展示分別來源於使用23C6抗CDH11抗體在培養及染色下的乳癌細胞株MDA-MB-231 (231)、乳癌CTC株Brx-142 (142)及乳癌CTC株Brx-401 (401)之細胞塊的免疫組織化學染色。 圖 8為顯微照片，其展示分別來源於使用23C6抗CDH11抗體在NSG小鼠之乳腺中生長的乳癌CTC株Brx-07、Brx-29、Brx-50、Brx-61、Brx-68、Brx-330、Brx-142及Brx-401之原位異種移植腫瘤的免疫組織化學染色。 圖 9為條形圖，其展示來自以一定血清梯度塗鋪20小時且分別用50 µg/mL或5 µg/mL之23C6或3H10抗CDH11抗體處理的乳癌細胞株MDA-MB-231 (231)之15,000個細胞的跨孔遷移。y軸單元指示在跨孔遷移分析中231個細胞遷移之數目。x軸標記指示處理組。誤差條指示平均值之標準誤差。* p ＜ 0.05，*** p ＜ 0.001。 圖 10展示描繪呈仰臥位之NSG小鼠之肺影像的切除後生物發光(y軸)的一系列圖式，NSG小鼠乳腺中注射有來源於經綠色螢光蛋白質(GFP)螢光素酶標記的乳癌細胞株MDA-MB-231 (231)之原位異種移植腫瘤，且分別用安慰劑或3H10或23C6抗CDH11抗體(CDH11 Ab Tx; 0.2mg/週)處理。x軸單位指示時間(注射後天數)。誤差條指示平均值之標準誤差。**p=0.0048 (3H10條件)，***p=0.0006 (23C6條件)，相比於安慰劑。上下圖展示隨時間推移不同時間粒度下的腫瘤之生物發光。 圖 11展示NSG小鼠之照片，如圖10中在第71天所述。框ROI 1及ROI 2指示用於量測生物發光之所關注區域(ROI)，如圖10中所描述，而陰影強度指示生物發光信號/部分/平方公分。 圖 12展示描繪資料集之圖式，如圖10中所描述，但其中生物發光(y軸)自NSG小鼠俯臥視角及針對各小鼠全身界定的ROI獲得之影像定量。x軸單位指示時間(注射後天數)。誤差條指示平均值之標準誤差。**p=0.0021 (3H10條件)，***p=0.0001 (23C6條件)，與安慰劑相比。左右圖式展示腫瘤隨時間推移不同時間粒度下之生物發光。 圖 13展示NSG小鼠，如圖11中所述，但其中ROI針對各小鼠全身界定。震盪強度指示生物發光信號/部分/平方公分。 圖 14為展示來自圖10中所述之實驗之隨時間推移(y軸)存活NSG小鼠百分比(x軸)的圖式。 圖 15為展示具有來源於經GFP螢光素酶標記之乳癌細胞株MDA-MB-231 (231)的原位異種移植腫瘤之經切除離體肺及肝臟之生物發光(y軸)的圖式，該等腫瘤分別經注射至經安慰劑(對照)或3H10或23C6抗CDH11抗體(0.2毫克/週)處理之NSG小鼠之器官中。x軸標記指示處理組。誤差條指示平均值之標準誤差。 圖 16為展示分別胰臟管腺癌(PDAC)細胞株(PDAC9、PDAC3、PDAC2、PDAC5、PDAC7、PDAC6及PDAC8)、經共培養之PDAC及癌症相關纖維母細胞(CAF)細胞株(PDAC9 CO-CULTURE、PDAC3 CO-CULTURE、PDAC2 CO-CULTURE、PDAC5 CO-CULTURE、PDAC7 CO-CULTURE、PDAC6 CO-CULTURE及PDAC8 CO-CULTURE)及CAF細胞中之分別鈣黏蛋白1 (CDH1)或CDH11 (y軸)之RNA表現量的圖式。x軸標記指示相應細胞株。 圖 17展示在皮下注射來源於經GFP螢光素酶標記之PDAC9細胞之異種移植腫瘤且分別用安慰劑或23C6抗CDH11抗體(0.2毫克/週)處理之後的呈俯臥位之NSG小鼠。震盪強度指示生物發光信號/部分/平方公分。 圖 18為展示呈俯臥位之NSG小鼠影像之生物發光(y軸)的圖式，該等NSG小鼠分別皮下注射有來源於經GFP螢光素酶標記且用安慰劑或23C6抗CDH11抗體(CDH11 Ab Tx)處理之PDAC9細胞的異種移植腫瘤，如圖17中所述。x軸單位指示時間(注射後天數)。誤差條指示平均值之標準誤差。*** p ＜ 0.0001. 圖 19為展示呈俯臥位之NSG小鼠影像之切除後相對生物發光(y軸)的圖式，該等NSG小鼠皮下注射有來源於經GFP螢光素酶標記且分別用安慰劑或23C6抗CDH11抗體(0.2毫克/週；CDH11 Ab 23C6)處理之PDAC9細胞的異種移植腫瘤，如圖17中所述。x軸單位指示時間(注射後天數)。誤差條指示平均值之標準誤差。 圖 20為展示獲自NSG小鼠之離體肺部之生物發光(y軸)的圖式，該等小鼠皮下注射有來源於經GFP螢光素酶標記且分別用安慰劑(對照)或23C6抗CDH11抗體(0.2毫克/週)處理之PDAC9細胞的異種移植腫瘤，如圖17中所描述。x軸標記指示處理組。誤差條指示平均值之標準誤差。 圖 21展示如帶狀圖中所示之23C6:CDH11複合物之結構。接觸殘基以最暗灰色展示。 圖 22-23為展示自不同視角之與小鼠CDH11結合之23C6 Fab的晶體結構示意圖，鑑別23C6 (互補位殘基)及CDH11 (抗原決定基殘基)之某些關鍵接觸殘基，自「最佳配適」至「第四最佳方案」排序。 圖 24為與小鼠CDH11結合之23C6 Fab之晶體結構示意圖，比較了23C6 Fab之四個潛在結合位點。 圖 25展示(A)對來自全基因體TCGA泛癌分析的RNA-Seq資料之分析，其中對於各癌症類型及各鈣黏蛋白家族成員之FPKM取平均值，(B)對來自用iChip微流體裝置由全血富集且分離成單細胞之CTC的RNA-seq之分析。表現值表示log10(RPM+1)。灰色水平線劃分個別患者。(C)展示CDH11之胞外域上的23C6抗體之抗原結合區之前兩個對接位點(帶狀模型)的3維建模(空間填充模型)。上圖ΔE=-46.4及下圖模型ΔE=-32.6。(D)使用CDH11相比於CDH1之蛋白質序列上之23C6抗體之兩個對接位點的Clustal omega進行蛋白質序列比對。著色劑表示胺基酸特性：紅色=小；藍色=酸性；洋紅色=鹼性；綠色=羥基、硫氫基或胺。符號：「*」=保守殘基；「:」=具有強類似特性之保守；「.」=具有弱類似特性之保守。(E)展示用23C6抗體或CDH11特異性抗體3H10偵測到之重組純化hCDH1、hCDH11及mCDH1蛋白質的西方墨點分析。「h」指示人類且「m」指示鼠類。內參考物用麗春紅(Ponceau)染色。(F)展示乳癌瘤陣列之代表性切片之H&E染色(左圖)及23C6免疫組織化學染色(右圖)。(G)根據0 (無染色)至3+ (強染色)之標度的膜染色強度之分佈圖(上圖)及ER陽性及陰性腫瘤分解圖(下圖)。(H)展示對來自全基因體之TCGA泛癌分析的RNA-Seq資料之分析，其中對於CDH1及CDH11之FPKM取平均值。誤差條表示SD。誤差條表示SD。(I)展示來自由轉移性乳癌患者之全血富集之單細胞CTC的RNA-seq。(左圖)患者比例與在指定範圍內CDH1與CDH11之組合總和之平均表現。(右圖)個別患者內具有CDH1及CDH11之＞5 RPM表現之CTC之比例。 圖 26展示對呈18種血球類型之CDH家族成員、總周邊血液單核細胞及代表性上皮組織的人類蛋白Atlas血球轉錄物表現量的RNA分析。數值表示標準化轉錄物/百萬份(nTPM)。 圖 27展示用23C6抗體偵測到之重組純化CDH蛋白質之西方墨點分析。「h」指示人類且「m」指示鼠類。 圖 28展示4T1、MDA-MB-231及PDAC9全細胞溶解物中之抗E-鈣黏蛋白抗體或23C6抗體之西方墨點分析。GAPDH為內參考物。 圖 29展示(A)表現shRNA對照或shRNA CDH11減弱的MDA-MB-231細胞中之CDH11 RNA表現之定量PCR分析。(B)展示由23C6偵測到之鈣黏蛋白在shRNA對照及兩種shRNA CDH11減弱細胞株中之表現的西方墨點分析。GAPDH為內參考物。(C)展示在CDH1之siRNA減弱之後，PDAC9中抗E-鈣黏蛋白抗體或23C6抗體之西方墨點分析。(D)展示具有經23C6抗體染色之siControl或siCDH11減弱的PDAC9細胞之流動式細胞測量術直方圖。針對單峰及活細胞閘控細胞。(E)展示基於指定閘對陽性細胞或陰性細胞的流動式細胞測量術定量。 圖 30展示來自各指定癌症類型之人類蛋白質Atlas版本21.0之CDH1、CDH2或CDH11之中至強膜免疫組織化學染色的患者百分比。 圖 31展示在癌細胞株百科全書(CCLE)中3維散佈圖上的CDH1、CDH2及CDH11之RNA表現。藍色指示CDH1、CDH2或CDH11表現高於1 RPKM的細胞株。紅色指示CDH1、CDH2及CDH11表現低於1 RPKM的細胞株。 圖 32展示(A)新輔助安慰劑或23C6處理之小鼠模型的圖解，(B)展示在切除之前第20天用安慰劑或23C6抗體處理之具有免疫能力之BALBC小鼠中4T1原位乳腺腫瘤的腫瘤體積量測結果。(C)展示經安慰劑及23C6處理之小鼠中心肺全形包埋(用虛線勾勒肺)的代表性H&E切片。代表性肺癌轉移之高倍放大部分。右圖為腫瘤面積定量百分比。(D)展示在切除之前第20天用安慰劑或23C6抗體處理之NSG免疫功能不全小鼠中4T1原位乳腺腫瘤之腫瘤體積量測結果。(E)展示經安慰劑及23C6處理之小鼠中之代表性全身生物發光影像。右圖為全身生物發光成像之定量。誤差條表示SEM。P值藉由非配對曼-懷特尼檢定(Mann-Whitney Test)計算。 圖 33展示(A)在切除之前第36天用安慰劑或23C6抗體處理之NSG免疫功能不全小鼠中之MDA-MB-231原位乳腺腫瘤的原發性腫瘤生物發光量測結果。(B)展示經安慰劑及23C6處理之小鼠中之MDA-MB-231細胞之全身生物發光成像定量之左圖。P值藉由非配對曼-懷特尼檢定計算。右圖為代表性的全身生物發光影像。(C)展示在第74天解剖之後，用安慰劑或23C6處理之小鼠之肺及肝臟之離體生物發光信號的定量。(D)展示在切除之前第32天用安慰劑或23C6抗體處理之NSG免疫功能不全小鼠中PDAC9皮下側腫瘤之原發性腫瘤生物發光量測結果。(E)展示經安慰劑及23C6處理之小鼠中PDAC9細胞之全身生物發光成像之定量。P值藉由非配對曼-懷特尼檢定計算。(F)用DAPI(藍色)、人類特異性HLA抗體(綠色)或小鼠特異性CD45 (紅色)染色之單一及叢集CTC的母豬免疫螢光成像。白箭頭指示CTC，且黑色箭頭指示CD45陽性細胞。右圖為經PDAC9注射、經安慰劑及23C6處理之小鼠中之CTC數目之定量。藉由雙尾非配對t檢定計算出P值。(G)展示指示原發性腫瘤中之凋亡細胞的裂解之凋亡蛋白酶3之代表性免疫組織化學染色，該等原發性腫瘤來源於用裸23C6、與SN38或等莫耳SN-38結合之23C6處理之小鼠中之PDAC9細胞。右圖為呈裂解之凋亡蛋白酶3陽性細胞之百分比形式的定量。藉由雙尾非配對t檢定計算出P值。誤差條表示SEM。 圖 34展示(A)來源於在切除之前第35天原位注射MDA-MB-231 shRNA對照或shRNA CDH11減弱細胞株之原發性腫瘤生物發光量測結果。誤差條表示SEM。(B)展示MDA-MB-231 shRNA對照、shRNA CDH11減弱細胞株或用23C6處理之全身生物發光成像之定量。誤差條表示SEM。藉由最小平方方法擬合曲線。P值藉由額外平方和F測試來計算。 圖 35展示(A)用逐漸增加之劑量之23C6抗體進行活體外處理之MDA-MB-231細胞的細胞生存率。(B)展示用安慰劑或23C6抗體單次處理進行活體外處理之MDA-MB-231細胞的增殖。(C)展示用安慰劑或23C6抗體單次處理進行活體外處理之MDA-MB-231細胞經跨孔之遷移。數值表示穿過膜之細胞之數目。藉由雙尾非配對t檢定計算出P值。誤差條表示SD。 圖 36展示23C6-SN38 (紅色)及裸23C6 (藍色)之HPLC追蹤。 圖 37展示(A) H&E染色，(B)裂解之凋亡蛋白酶3，且(C)來源於經安慰劑或23C6處理之BALBC小鼠之器官切片的CD34免疫組織化學染色。陽性對照針對插圖中裂解之凋亡蛋白酶3及CD34。(D)展示用安慰劑或23C6抗體處理下隨時間推移的小鼠質量之量測結果。(E)展示在屍檢時用安慰劑或23C6處理31天後器官重量之量測結果。誤差條表示SEM。 圖 38展示來源於用安慰劑或23C6處理43天之BALBC小鼠之器官切片之CD45免疫組織化學染色。 圖 39展示來自用安慰劑或23C6處理31天之BALBC小鼠的白血球計數(左圖)及血紅素量測結果(右圖)。誤差條表示SEM。 圖 40展示(A)用23C6對乳癌、胰臟癌、大腸癌及肺癌、神經管胚細胞瘤及睪丸癌切片進行之代表性免疫組織化學染色。T=腫瘤，S=基質。(B)展示根據0 (無染色)至3+ (強染色)之標度的來自腫瘤陣列之腫瘤切片的膜染色強度之定量。(C)展示23C6抗轉移活性之模型。原發性腫瘤細胞作為CTC進入循環，且隨後作為癌轉移之前驅體，在遠距離器官部位離開血管結構。23C6抗體減少循環中之CTC數目且抑制轉移性擴散，而不影響原發性腫瘤生長或正常器官及身體組織。 

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                 美國布萊翰婦女醫院(The Brigham and Women's Hospital, Inc.)
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          Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 
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          Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
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              50                  55                  60                  
          Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 
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          Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Leu Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly 
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          Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
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          Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 
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          Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 
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          <![CDATA[<400>  9]]>
          Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser 
                      20                  25  
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ala 
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  38]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp 
                      20                  25                  30          
          Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 
                  35              
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Gln Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile 
          1               5                   10                  15      
          Tyr 
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  36]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Val Ala 
                      20                  25                  30          
          Thr Tyr Tyr Cys 
                  35      
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Phe Gly Gly Gly Ala Lys Leu Glu Ile Lys 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  75]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          gagttccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggcgcttc agtgaagata       60
          tcctgcaagg cttcc                                                        75
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  51]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          atgaactggg tgaagcagag caatggaaag agccttgagt ggattggagc a                51
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  114]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          agttacaatc agaagttcaa gggcaaggcc acattgactg tagaccaatc ttccagcaca       60
          gcctacatgc agctcaacag cctgacatct gaggactctg cagtctatta ctgt            114
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  34]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          tggggcacag ggaccacggt caccgtctcc tcag                                   34
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  78]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          caaattgttg tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc       60
          atgacctgca ctgccagc                                                     78
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  51]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          ttgcactggt accagcaaaa gccaggatcc tcccccaaac tctggattta t                51
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  108]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          aacctggctt ctggagtccc agctcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct       60
          ctcacaatca gcagcatgga ggctgaagat gttgccactt attattgc                   108
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          ttcggtggag gcgccaagct ggaaatcaaa                                        30
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  358]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          gagttccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggcgcttc agtgaagata       60
          tcctgcaagg cttccggtta ctcattcact gactataata tgaactgggt gaagcagagc      120
          aatggaaaga gccttgagtg gattggagca attaatccta actatggtac tactagttac      180
          aatcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagacc aatcttccag cacagcctac      240
          atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtac aagactttac      300
          tacggtagta ggtacttcga tgtctggggc acagggacca cggtcaccgt ctcctcag        358
          <![CDATA[<210> ]]> 26
          <![CDATA[<211>  324]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          caaattgttg tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc       60
          atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcaaaag      120
          ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca      180
          gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag      240
          gctgaagatg ttgccactta ttattgccac cagtatcatc gttccccacc gacgttcggt      300
          ggaggcgcca agctggaaat caaa                                             324
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          ggttactcat tcactgacta taat                                              24
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          attaatccta actatggtac tact                                              24
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  36]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          acaagacttt actacggtag taggtacttc gatgtc                                 36
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          tcaagtgtaa gttccagtta c                                                 21
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          agcacatcc                                                                9
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          caccagtatc atcgttcccc accgacg                                           27
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  94]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          Leu Gly Met Leu Cys His Ser His Ala Phe Ala Pro Glu Arg Arg Gly 
          1               5                   10                  15      
          His Leu Arg Pro Ser Phe His Gly His His Glu Lys Gly Lys Glu Gly 
                      20                  25                  30          
          Gln Val Leu Gln Arg Ser Lys Arg Gly Trp Val Trp Asn Gln Phe Phe 
                  35                  40                  45              
          Val Ile Glu Glu Tyr Thr Gly Pro Asp Pro Val Leu Val Gly Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          His Ser Asp Ile Asp Ser Gly Asp Gly Asn Ile Lys Tyr Ile Leu Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Glu Gly Ala Gly Thr Ile Phe Val Ile Asp Asp Lys Ser 
                          85                  90                  
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  105]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          Ala Pro Lys Phe Ala Ala Pro Tyr Glu Gly Phe Ile Cys Glu Ser Asp 
          1               5                   10                  15      
          Gln Thr Lys Pro Leu Ser Asn Gln Pro Ile Val Thr Ile Ser Ala Asp 
                      20                  25                  30          
          Asp Lys Asp Asp Thr Ala Asn Gly Pro Arg Phe Ile Phe Ser Leu Pro 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Ile Ile His Asn Pro Asn Phe Thr Val Arg Asp Asn Arg Asp 
              50                  55                  60                  
          Asn Thr Ala Gly Val Tyr Ala Arg Arg Gly Gly Phe Ser Arg Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Asp Leu Tyr Leu Leu Pro Ile Val Ile Ser Asp Gly Gly Ile Pro 
                          85                  90                  95      
          Pro Met Ser Ser Thr Asn Thr Leu Thr 
                      100                 105 
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  96]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          Leu Asn Thr Val Gly His His His Arg Pro Pro Pro His Gln Ala Ser 
          1               5                   10                  15      
          Val Ser Gly Ile Gln Ala Glu Leu Leu Thr Phe Pro Asn Ser Ser Pro 
                      20                  25                  30          
          Gly Leu Arg Arg Gln Lys Arg Asp Trp Val Ile Pro Pro Ile Ser Cys 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Asn Glu Lys Gly Pro Phe Pro Lys Asn Leu Val Gln Ile Lys 
              50                  55                  60                  
          Ser Asn Lys Asp Lys Glu Gly Lys Val Phe Tyr Ser Ile Thr Gly Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Ala Asp Thr Pro Pro Val Gly Val Phe Ile Ile Glu Arg Glu Thr 
                          85                  90                  95      
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  91]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          Ala Pro Ile Pro Glu Pro Arg Thr Ile Phe Phe Cys Glu Arg Asn Pro 
          1               5                   10                  15      
          Lys Pro Gln Val Ile Asn Ile Ile Asp Ala Asp Leu Pro Pro Asn Thr 
                      20                  25                  30          
          Ser Pro Phe Thr Ala Glu Leu Thr His Gly Ala Ser Ala Asn Trp Thr 
                  35                  40                  45              
          Ile Gln Tyr Asn Asp Pro Thr Gln Glu Ser Ile Ile Leu Lys Pro Lys 
              50                  55                  60                  
          Met Ala Leu Glu Val Gly Asp Tyr Lys Ile Asn Leu Lys Leu Met Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Gln Asn Lys Asp Gln Val Thr Thr Leu Glu 
                          85                  90
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012

Claims (121)

  1. 一種用於治療或延遲個體中癌症進展之方法，該方法包含投與有效量的結合鈣黏蛋白-11 (cadherin-11；CDH11)之抗體，該抗體包含CDR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1；CDR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 2；CDR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 3；CDR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 4；CDR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 5；及CDR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 6；其中該癌症表現CDH11。
  2. 如請求項1之方法，其中該抗體結合至循環腫瘤細胞(circulating tumor cell；CTC)。
  3. 如請求項1之方法，其中該癌症為局部癌症。
  4. 如請求項1之方法，其中該方法抑制癌轉移。
  5. 如請求項1之方法，其中該方法包含新輔助療法(例如與化學療法、放射線療法、激素療法、靶向療法、免疫療法或其他生物療法組合)。
  6. 如請求項1之方法，其中該方法包含輔助療法(例如單獨或與化學療法、放射線療法、激素療法、靶向療法或生物療法組合)。
  7. 如請求項1之方法，其中該癌症為轉移癌。
  8. 如請求項7之方法，其中該轉移癌為乳癌。
  9. 如請求項7之方法，其中該轉移癌為胰臟癌。
  10. 如請求項1之方法，其中該方法包含投與一或多種化學治療劑。
  11. 如請求項1之方法，其中該方法包含投與放射線療法。
  12. 如請求項1之方法，其中該個體患有癌症。
  13. 如請求項1之方法，其中該抗體包含： (a)與SEQ ID NO: 7之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的重鏈可變區(heavy chain variable region；HCVR)序列； (b)與SEQ ID NO: 8之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的輕鏈可變區(light chain variable region；LCVR)序列；或 (c)如(a)中之HCVR序列及如(b)中之LCVR序列。
  14. 如請求項13之方法，其中該HCVR及/或該LCVR包含至少一個取代。
  15. 如請求項14之方法，其中該至少一個取代包含在接觸殘基處及/或在其相鄰殘基處之取代。
  16. 如請求項1之方法，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之HCVR及包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區。
  17. 如請求項1之方法，其中該抗體為單株抗體。
  18. 如請求項1之方法，其中該抗體為人類化抗體、嵌合抗體或雙特異性抗體。
  19. 如請求項1之方法，其中該抗體為全長抗體。
  20. 如請求項1之方法，其中該抗體為結合至CDH11之抗體片段。
  21. 如請求項20之方法，其中該抗體片段係選自由Fab、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段組成之群。
  22. 如請求項1之方法，其中該抗體係IgG1、IgG2a或IgG2b抗體。
  23. 如請求項1之方法，其中該抗體結合至細胞毒性劑。
  24. 如請求項23之方法，其中該細胞毒性劑較佳為SN-38。
  25. 一種偵測來自受試者之樣品中CTC之存在的方法，該方法包含：提供包含來自受試者之血液的樣品；及使該樣品與結合CDH11之抗體接觸，該抗體包含CDR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1；CDR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 2；CDR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 3；CDR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 4；CDR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 5；及CDR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 6；及偵測該抗體與該CTC之結合，藉此偵測該樣品中該CTC之存在。
  26. 一種診斷受試者中癌症之方法，該方法包含：提供包含來自該受試者之血液的樣品；及在足以允許該抗體與表現CDH11之細胞結合的條件下，使該樣品與結合CDH11之抗體接觸，該抗體包含CDR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1；CDR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 2；CDR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 3；CDR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 4；CDR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 5；及CDR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 6；及偵測該抗體與該樣品中之細胞上所存在的癌細胞表面標記物之結合，其中存在與該樣品中之細胞之結合指示該受試者患有癌症。
  27. 一種用於表徵樣品中之一或多個CTC的方法，該方法包含： (a)測定樣品中CDH11基因之表現量；及 (b)比較該CDH11基因之該表現量與該CDH11基因之參考量。
  28. 如請求項27之方法，其中該樣品為來自受試者之活體組織切片。
  29. 如請求項28之方法，其中該活體組織切片為血液樣品。
  30. 一種用於表徵樣品中之一或多個癌症相關纖維母細胞(cancer associated fibroblast；CAF)的方法，該方法包含： (a)測定樣品中CDH11基因之表現量；及 (b)比較該CDH11基因之該表現量與該CDH11基因之參考量。
  31. 如請求項30之方法，其中該樣品為來自受試者之活體組織切片。
  32. 如請求項27之方法，其中該方法進一步包含： (c)確定來自受試者之血液樣品中該CDH11基因之該表現量相對於該CDH11基因之該參考量增加；及 (d)投與有效量的結合CDH11之抗體，該抗體包含CDR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1；CDR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 2；CDR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 3；CDR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 4；CDR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 5；及CDR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 6。
  33. 如請求項32之方法，其中確定來自受試者之血液樣品中的該CDH11基因之該表現量相對於該CDH11基因之該參考量增加鑑別出受試者可能對用於延遲癌症進展之治療起反應。
  34. 如請求項33之方法，其中該癌症為轉移癌。
  35. 如請求項34之方法，其中該轉移癌為轉移性乳癌。
  36. 如請求項34之方法，其中該轉移癌為轉移性胰臟癌。
  37. 一種免疫結合物，其包含： (i)結合CDH11之抗體；及 (ii)細胞毒性劑。
  38. 如請求項37之免疫結合物，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的CDR-H1；與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的CDR-H2；與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的CDR-H3；與SEQ ID NO: 4之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的CDR-L1；與SEQ ID NO: 5之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的CDR-L2；及與SEQ ID NO: 6之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的CDR-L3。
  39. 如請求項37之免疫結合物，其中該抗體包含CDR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1；CDR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 2；CDR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 3；CDR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 4；CDR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 5；及CDR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 6。
  40. 如請求項37之免疫結合物，其中較佳地，該細胞毒性劑為抗癌劑。
  41. 如請求項40之免疫結合物，其中較佳地，該抗癌劑為SN-38。
  42. 如請求項37之免疫結合物，其中該抗體結合至CTC。
  43. 如請求項37之免疫結合物，其中該抗體包含： (a)與SEQ ID NO: 7之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之HCVR序列； (b)與SEQ ID NO: 8之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之LCVR序列；或 (c)如(a)中之HCVR序列及如(b)中之LCVR序列。
  44. 如請求項43之免疫結合物，其中該HCVR及/或該LCVR包含至少一個取代。
  45. 如請求項44之免疫結合物，其中該至少一個取代包含在接觸殘基處及/或在其相鄰殘基處之取代。
  46. 如請求項45之免疫結合物，其中該接觸殘基或其相鄰殘基係由抗原-抗體複合物之晶體結構決定，其中該抗體為23C6且該抗原為CDH11。
  47. 如請求項45之免疫結合物，其中該接觸殘基包含：相對於SEQ ID NO: 7之Phe 2、Gly 26、Tyr 27、Ser 28、Thr 30、Asp 31、Tyr 32、Asn 54、Tyr 55、Thr 57、Arg 98、Tyr 100、Tyr 101、Gly 102、Ser 103、Arg 104、Tyr 105及Asp 107。
  48. 如請求項45之免疫結合物，其中該接觸殘基包含：相對於SEQ ID NO: 8之Ser 30、Ser 31、Ser 32、Tyr 33、His 35、Tyr 50、Ser 51、Ser 53、Asn 54、Leu 55、Ala 56、Ser 57、Gly 58、Val 59、Ala 61、Tyr 92及His 93。
  49. 如請求項37之免疫結合物，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之HCVR及包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之LCVR。
  50. 如請求項37之免疫結合物，其中該抗體為單株抗體。
  51. 如請求項37之免疫結合物，其中該抗體為人類化抗體、嵌合抗體或雙特異性抗體。
  52. 如請求項37之免疫結合物，其中該抗體為全長抗體。
  53. 如請求項37之免疫結合物，其中該抗體為結合至CDH11之抗體片段。
  54. 如請求項53之免疫結合物，其中該抗體片段係選自由Fab、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段組成之群。
  55. 如請求項37之免疫結合物，其中該抗體係IgG1、IgG2a或IgG2b抗體。
  56. 如請求項37之免疫結合物，其中該免疫結合物另外包含連接子。
  57. 一種醫藥調配物，其包含如請求項37至56中任一項之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。
  58. 一種治療個體中癌症之方法，該方法包含投與有效量的如請求項37至56中任一項之免疫結合物或如請求項57之醫藥調配物。
  59. 如請求項37之方法，其中該癌症為轉移癌。
  60. 如請求項37之方法，其中該癌症為局部癌症。
  61. 一種編碼抗人類CDH11抗體之HCVR的核酸分子，其中該核酸分子包含以下CDR編碼序列：SEQ ID NO: 27 (CDR-H1)、SEQ ID NO: 28 (CDR-H2)及SEQ ID NO: 29 (CDR-H3)。
  62. 如請求項61之核酸分子，其包含編碼以下之序列： (a) SEQ ID NO: 9之重鏈構架1 (HC-FR1)序列； (b) SEQ ID NO: 10之重鏈構架2 (HC-FR2)序列； (c) SEQ ID NO: 11之重鏈構架3 (HC-FR3)序列； (d) SEQ ID NO: 12之重鏈構架4 (HC-FR4)序列；及/或 (e) (a)-(d)中之任何一或多者的變異體，該變異體與其參考序列具有至少90%序列一致性， 其中該等序列按以下次序：HC-FR1、CDR-H1、HC-FR2、CDR-H2、HC-FR3、CDR-H3及HC-FR4。
  63. 如請求項62之核酸分子，其中： (a) SEQ ID NO: 9之該HC-FR1序列由SEQ ID NO: 17編碼； (b) SEQ ID NO: 10之該HC-FR2序列由SEQ ID NO: 18編碼； (c) SEQ ID NO: 11之該HC-FR3序列由SEQ ID NO: 19編碼； (d) SEQ ID NO: 12之該HC-FR4序列由SEQ ID NO: 20編碼；及/或 (e) (a)-(d)中之任何一或多者之HC-FR之變異體由該等參考序列中之任何一或多者之變異體編碼。
  64. 如請求項62或63之核酸分子，其包含編碼該等HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3及HC-FR4中之各者的序列，其中視情況該等HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3及HC-FR4中之一或多者視情況經與其參考序列具有至少90%序列一致性之其變異體置換。
  65. 如請求項61至64中任一項之核酸分子，其中該HCVR包含SEQ ID NO: 7之序列或與SEQ ID NO: 7具有至少90%序列一致性之其變異體。
  66. 如請求項65之核酸分子，其中該HCVR係由SEQ ID NO: 25之序列或其編碼與SEQ ID NO: 7具有至少90%序列一致性之序列之變異體的變異體編碼。
  67. 如請求項65之核酸分子，其中該其變異體包含在相對於SEQ ID NO: 7之殘基Phe 2、Gly 26、Tyr 27、Ser 28、Thr 30、Asp 31、Tyr 32、Asn 54、Tyr 55、Thr 57、Arg 98、Tyr 100、Tyr 101、Gly 102、Ser 103、Arg 104、Tyr 105或Asp 107處的至少一個取代。
  68. 如請求項61至67中任一項之核酸分子，其中該核酸分子編碼包含該抗人類CDH11抗體之該重鏈可變區的重鏈。
  69. 一種核酸分子，其編碼抗人類CDH11抗體之LCVR，其中該核酸分子包含以下CDR編碼序列：SEQ ID NO: 30 (CDR-L1)、SEQ ID NO: 31 (CDR-L2)及SEQ ID NO: 32 (CDR-L3)。
  70. 如請求項69之核酸分子，其包含編碼以下之序列： (a) SEQ ID NO: 13之輕鏈構架1 (LC-FR1)序列； (b) SEQ ID NO: 14之輕鏈構架2 (LC-FR2)序列； (c) SEQ ID NO: 15之輕鏈構架3 (LC-FR3)序列； (d) SEQ ID NO: 16之輕鏈構架4 (LC-FR4)序列；及/或 (e) (a)-(d)中之任何一或多者的變異體，該變異體與其參考序列具有至少90%序列一致性， 其中該等序列按以下次序：LC-FR1、CDR-L1、LC-FR2、CDR-L2、LC-FR3、CDR-L3及LC-FR4。
  71. 如請求項70之核酸分子，其中： (a) SEQ ID NO: 13之該LC-FR1序列由SEQ ID NO: 21編碼； (b) SEQ ID NO: 14之該LC-FR2序列由SEQ ID NO: 22編碼； (c) SEQ ID NO: 15之該LC-FR3序列由SEQ ID NO: 23編碼； (d) SEQ ID NO: 16之該LC-FR4序列由SEQ ID NO: 24編碼；及/或 (e) (a)-(d)中之任何一或多者之HC-FR之變異體由該等參考序列中之任何一或多者之變異體編碼。
  72. 如請求項70之核酸分子，其包含編碼該等LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3及LC-FR4中之各者的序列，其中視情況該等LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3及LC-FR4中之一或多者經與其參考序列具有至少90%序列一致性之其變異體置換。
  73. 如請求項69至72中任一項之核酸分子，其中該LCVR包含SEQ ID NO: 8之序列或與SEQ ID NO: 8具有至少90%序列一致性之其變異體。
  74. 如請求項73之核酸分子，其中該輕鏈可變區由SEQ ID NO: 26之序列或其編碼與SEQ ID NO: 8具有至少90%序列一致性之變異序列的變異體編碼。
  75. 如請求項73之核酸分子，其中該其變異體包含在相對於SEQ ID NO: 8之殘基Ser 30、Ser 31、Ser 32、Tyr 33、His 35、Tyr 50、Ser 51、Ser 53、Asn 54、Leu 55、Ala 56、Ser 57、Gly 58、Val 59、Ala 61、Tyr 92及His 93處之至少一個取代。
  76. 如請求項69至75中任一項之核酸分子，其中該核酸分子編碼包含該抗人類CDH11抗體之該輕鏈可變區的輕鏈。
  77. 一種核酸分子，其包含如請求項61至68中任一項之核酸分子及如請求項69至76中任一項之核酸分子。
  78. 如請求項61至77中任一項之核酸分子，其中該核酸分子編碼 (a)抗體重鏈； (b)抗體輕鏈； (c)抗體重鏈及抗體輕鏈； (d) HCVR； (e)LCVR； (f) HCVR及LCVR； (g)抗體片段；或 (h)單鏈抗體。
  79. 一種載體，其包含一或多種如請求項61至78中任一項之核酸分子。
  80. 一種細胞，其包含一或多種如請求項61至78中任一項之核酸分子或如請求項79之載體。
  81. 一種產生抗人類CDH11抗體的方法，該方法包含表現如請求項61至78中任一項之核酸分子。
  82. 一種由如請求項61至78中任一項之核酸分子編碼的抗體，其中該抗體不包含鼠類重鏈恆定區及/或鼠類輕鏈恆定區。
  83. 如請求項82之抗體，其中該抗體係： (a)單株、單特異性、多特異性或雙特異性； (b)人類、嵌合或人類化抗體；及/或 (c) IgG抗體，其視情況選自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
  84. 如請求項82或83之抗體，其中該抗體包含視情況為單鏈抗體(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、Dab、奈米抗體或Fv之抗體片段。
  85. 一種抗人類CDH11抗體，其包含： (a)重鏈可變區，其包含： (i) SEQ ID NO: 1之CDR-H1， (ii) SEQ ID NO: 2之CDR-H2，及 (iii) SEQ ID NO: 3之CDR-H3；及/或 (b)輕鏈可變區，其包含： (i) SEQ ID NO: 4之CDR-L1， (ii) SEQ ID NO: 5之CDR-L2，及 (iii) SEQ ID NO: 6之CDR-L3， 其中該抗體包含相對於該等所列舉序列在該等CDR序列中之一者中之至少一個取代，及/或為單鏈抗體。
  86. 如請求項85之抗體，其中該抗體包含： (a) (i) SEQ ID NO: 9之HC-FR1序列； (ii) SEQ ID NO: 10之HC-FR2序列； (iii) SEQ ID NO: 11之HC-FR3序列； (iv) SEQ ID NO: 12之HC-FR4序列；及/或 (v) (a) (i)-(iv)中之任何一或多者的變異體，該變異體與其參考序列具有至少90%序列一致性， 其中該等序列按以下次序：HC-FR1、CDR-H1、HC-FR2、CDR-H2、HC-FR3、CDR-H3及HC-FR4；及/或 (b) (i) SEQ ID NO: 13之LC-FR1序列； (ii) SEQ ID NO: 14之LC-FR2序列； (iii) SEQ ID NO: 15之LC-FR3序列； (iv) SEQ ID NO: 16之LC-FR4序列；及/或 (v) (b) (i)-(iv)中之任何一或多者的變異體，該變異體與其參考序列具有至少90%序列一致性， 其中該等序列按以下次序：LC-FR1、CDR-L1、LC-FR2、CDR-L2、LC-FR3、CDR-L3及LC-FR4。
  87. 如請求項86之抗體，其包含： (a)該等HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3及HC-FR4中之各者，其中視情況該等HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3及HC-FR4中之一或多者經與其參考序列具有至少90%序列一致性之其變異體置換；及/或 (b)該等LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3及LC-FR4中之各者，其中視情況該等LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3及LC-FR4中之一或多者經與其參考序列具有至少90%序列一致性之其變異體置換。
  88. 如請求項85至87中任一項之抗體，其中： (a)該HCVR包含SEQ ID NO: 7之序列或與SEQ ID NO: 7具有至少90%序列一致性之其變異體；及/或 (b)該LCVR包含SEQ ID NO: 8之序列或與SEQ ID NO: 8具有至少90%序列一致性之其變異體。
  89. 如請求項88之抗體，其中該其變異體包含至少一個取代。
  90. 如請求項89之抗體，其中該至少一個取代包含在接觸殘基處及/或在其相鄰殘基處之取代。
  91. 如請求項90之抗體，其中該接觸殘基或其相鄰殘基係由抗原-抗體複合物之晶體結構決定，其中該抗體為23C6且該抗原為CDH11。
  92. 如請求項90之抗體，其中該接觸殘基包含：相對於SEQ ID NO: 7之Phe 2、Gly 26、Tyr 27、Ser 28、Thr 30、Asp 31、Tyr 32、Asn 54、Tyr 55、Thr 57、Arg 98、Tyr 100、Tyr 101、Gly 102、Ser 103、Arg 104、Tyr 105及Asp 107。
  93. 如請求項90之抗體，其中該接觸殘基包含：相對於SEQ ID NO: 8之Ser 30、Ser 31、Ser 32、Tyr 33、His 35、Tyr 50、Ser 51、Ser 53、Asn 54、Leu 55、Ala 56、Ser 57、Gly 58、Val 59、Ala 61、Tyr 92及His 93。
  94. 如請求項85至93中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈，該重鏈包含該抗人類CDH11抗體之該重鏈可變區，及/或該抗體包含輕鏈，該輕鏈包含該抗人類CDH11抗體之該輕鏈可變區。
  95. 如請求項85至94中任一項之抗體，其中該抗體係： (a)人類、嵌合或人類化抗體；及/或 (b) IgG抗體，其視情況選自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
  96. 如請求項85至95中任一項之抗體，其中該抗體包含視情況為單鏈抗體(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、Dab、奈米抗體或Fv之抗體片段。
  97. 一種針對人類CDH11之單鏈抗體或其融合物，其中該單鏈抗體包含以下CDR序列中之一或多者：CDR-H1 (SEQ ID NO: 1)、CDR-H2 (SEQ ID NO: 2)、CDR-H3 (SEQ ID NO: 3)、CDR-L1 (SEQ ID NO: 4)、CDR-L2 (SEQ ID NO: 5)及/或CDR-L3 (SEQ ID NO: 6)，且視情況該等CDR中之一或多者包含在該等所列舉序列中之一或多者內的一或多個取代。
  98. 如請求項97之單鏈抗體或其融合物，其中該單鏈抗體包含： (a) (i) SEQ ID NO: 9之HC-FR1序列； (ii) SEQ ID NO: 10之HC-FR2序列； (iii) SEQ ID NO: 11之HC-FR3序列； (iv) SEQ ID NO: 12之HC-FR4序列；及/或 (v) (a) (i)-(iv)中之任何一或多者的變異體，該變異體與其參考序列具有至少90%序列一致性， 其中該等序列按以下次序：HC-FR1、CDR-H1、HC-FR2、CDR-H2、HC-FR3、CDR-H3及HC-FR4；及/或 (b) (i) SEQ ID NO: 13之LC-FR1序列； (ii) SEQ ID NO: 14之LC-FR2序列； (iii) SEQ ID NO: 15之LC-FR3序列； (iv) SEQ ID NO: 16之LC-FR4序列；及/或 (v) (b) (i)-(iv)中之任何一或多者的變異體，該變異體與其參考序列具有至少90%序列一致性， 其中該等序列按以下次序：LC-FR1、CDR-L1、LC-FR2、CDR-L2、LC-FR3、CDR-L3及LC-FR4。
  99. 如請求項98之單鏈抗體或其融合物，其包含： (a)該等HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3及HC-FR4中之各者，其中視情況該等HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3及HC-FR4中之一或多者經與其參考序列具有至少90%序列一致性之其變異體置換；及/或 (b)該等LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3及LC-FR4中之各者，其中視情況該等LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3及LC-FR4中之一或多者經與其參考序列具有至少90%序列一致性之其變異體置換。
  100. 如請求項97至99中任一項之單鏈抗體或其融合物，其中： (a)該HCVR包含SEQ ID NO: 7之序列或與SEQ ID NO: 7具有至少90%序列一致性之其變異體；及/或 (b)該LCVR包含SEQ ID NO: 8之序列或與SEQ ID NO: 8具有至少90%序列一致性之其變異體。
  101. 如請求項100之單鏈抗體，其中該其變異體包含至少一個取代。
  102. 如請求項101之單鏈抗體，其中該至少一個取代包含在接觸殘基處及/或在其相鄰殘基處之取代。
  103. 如請求項102之單鏈抗體，其中該接觸殘基或其相鄰殘基係由抗原-抗體複合物之晶體結構決定，其中該抗體為23C6且該抗原為CDH11。
  104. 如請求項102之單鏈抗體，其中該接觸殘基包含：相對於SEQ ID NO: 7之Phe 2、Gly 26、Tyr 27、Ser 28、Thr 30、Asp 31、Tyr 32、Asn 54、Tyr 55、Thr 57、Arg 98、Tyr 100、Tyr 101、Gly 102、Ser 103、Arg 104、Tyr 105及Asp 107。
  105. 如請求項102之單鏈抗體，其中該接觸殘基包含：相對於SEQ ID NO: 8之Ser 30、Ser 31、Ser 32、Tyr 33、His 35、Tyr 50、Ser 51、Ser 53、Asn 54、Leu 55、Ala 56、Ser 57、Gly 58、Val 59、Ala 61、Tyr 92及His 93。
  106. 如請求項97至105中任一項之單鏈抗體或其融合物，其中該單鏈抗體包含2、3、4、5或所有6個該等CDR。
  107. 如請求項97至106中任一項之單鏈抗體或其融合物，其中該單鏈抗體之該可變輕鏈部分經由連接子連接至該單鏈抗體之該可變重鏈部分。
  108. 如請求項97至107中任一項之單鏈抗體或其融合物，其包含視情況在該單鏈抗體之可變輕鏈序列的C端融合至該單鏈抗體之Fc序列。
  109. 一種核酸分子或包含其之載體，該核酸分子編碼如請求項82至108中任一項之抗體、單鏈抗體或融合物。
  110. 一種醫藥組合物，其包含如請求項82至108中任一項之抗體、單鏈抗體或融合物。
  111. 一種治療受試者之癌症的方法，該方法包含向該受試者投與如請求項82至108中任一項之抗體或如請求項110之醫藥組合物。
  112. 如請求項111之方法，其中該抗體結合至細胞毒性劑。
  113. 如請求項112之方法，其中該細胞毒性劑較佳為SN-38。
  114. 如請求項1至26、32至36、58至60、81及111至113中任一項之方法、如請求項37至56中任一項之免疫結合物、如請求項57之醫藥調配物、如請求項61至78及104中任一項之核酸分子、如請求項79之載體、如請求項80之細胞、如請求項82至96中任一項之抗體、如請求項97至108中任一項之單鏈抗體或如請求項110之醫藥調配物，其中該抗體結合至CDH11及CDH1。
  115. 如請求項114之方法、免疫結合物、醫藥調配物、核酸分子、載體、細胞、抗體、單鏈抗體或醫藥組合物，其中該抗體結合至人類CDH11及人類CDH1。
  116. 如請求項114或115之方法、免疫結合物、醫藥調配物、核酸分子、載體、細胞、抗體、單鏈抗體或醫藥組合物，其中該抗體結合至人類CDH11之胞外域。
  117. 如請求項114至116中任一項之方法、免疫結合物、醫藥調配物、核酸分子、載體、細胞、抗體、單鏈抗體或醫藥組合物，其中該抗體結合至人類CDH11之抗原決定基，該抗原決定基包含LGMLCHSHAFAPERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRSKRGWVWNQFFVIEEYTGPDPVLVGRLHSDIDSGDGNIKYILSGEGAGTIFVIDDKS (SEQ ID NO: 33)或 APKFAAPYEGFICESDQTKPLSNQPIVTISADDKDDTANGPRFIFSLPPEIIHNPNFTVRDNRDNTAGVYARRGGFSRQKQDLYLLPIVISDGGIPPMSSTNTLT (SEQ ID NO: 34)。
  118. 如請求項114至117中任一項之方法、免疫結合物、醫藥調配物、核酸分子、載體、細胞、抗體、單鏈抗體或醫藥組合物，或如請求項110、114及115中任一項之醫藥組合物，其中該抗體結合至人類CDH1或鼠類CDH1之胞外域。
  119. 如請求項114至118中任一項之方法、免疫結合物、醫藥調配物、核酸分子、載體、細胞、抗體、單鏈抗體或醫藥組合物，其中該抗體結合至人類CDH1之抗原決定基，該抗原決定基包含LNTVGHHHRPPPHQASVSGIQAELLTFPNSSPGLRRQKRDWVIPPISCPENEKGPFPKNLVQIKSNKDKEGKVFYSITGQGADTPPVGVFIIERET (SEQ ID NO: 35)或 APIPEPRTIFFCERNPKPQVINIIDADLPPNTSPFTAELTHGASANWTIQYNDPTQESIILKPKMALEVGDYKINLKLMDNQNKDQVTTLE (SEQ ID NO: 36) 。
  120. 一種抗體，其與CDH11及CDH1結合。
  121. 一種免疫結合物，其包含： (i)結合CDH11及CDH1之抗體；及 (ii)細胞毒性劑。
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