ES2551892T3 - Rhabdovirus oncolítico - Google Patents

Abstract

Un rhabdovirus oncolítico para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el rhabdovirus oncolítico codifica: (a) una proteína G que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 5, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 5; (b) una proteína N que tiene al menos un 96 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2; (c) una proteína M que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 4, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 4; (d) una proteína P que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 3, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 3; o (e) una proteína L que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 6, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 6.

Description

Rhabdovirus oncolítico

5 Antecedentes de la invención

I. Campo de la invención

Esta invención se refiere en líneas generales a virología y medicina. En ciertos aspectos la invención se refiere a virus oncolíticos, particularmente rhabdovirus oncolíticos no VSV y rhabdovirus oncolíticos que comprende una glucoproteína no VSV.

II. Antecedentes

15 Varios virus han demostrado replicarse en y eliminar una amplia diversidad de células tumorales in vitro (virus Sindbis (Unno et al., 2005); virus Sendai (Kinoh et al., 2004); virus Coxackie (Shafren et al., 2004); virus del Herpes simple (Mineta et al., 1995); Parvovirus (Abschuetz et a., 2006); Adenovirus (Heise et al., 2000); Polio virus (Gromeier et al., 2000); virus de la enfermedad de Newcastle (Sinkovics y Horvath, 2000); virus de la estomatitis Vesicular (Stojdl et al., 2000); virus del sarampión (Grote et al., 2001); Reovirus (Coffey et al., 1998); Retrovirus (Logg et al., 2001); Vaccinia (Timiryasova et al., 1999); e Influenza (Bergmann et al., 2001)). Además, dichos virus han mostrado eficacia en el tratamiento de modelos animales de cáncer.

El virus de la estomatitis vesicular (VSV), un rhabdovirus bien conocido y bien estudiado, ha demostrado eliminar líneas celulares tumorales en experimentos de cultivo celular, y ha mostrado eficacia en diversos modelos de cáncer

25 en roedor (Stojdl et al., 2000; Stojdl et al., 2003). Sin embargo, VSV no elimina todas las células cancerosas.

El documento EP 1 218 019 describe el uso de un virus para la fabricación de un medicamento para reducir la viabilidad de una célula tumoral, donde el virus es una cepa atenuada de virus de la estomatitis vesicular y donde la célula tumoral es una célula cancerosa hematopoyética, un melanoma, un sarcoma, un tumor neuroendocrino, un carcinoma pulmonar o un carcinoma de colon.

El documento US 2004/170607 A1 describe un método para reducir la viabilidad de una célula tumoral que implica administrar un virus que no es un patógeno humano común a la célula tumoral. Preferiblemente, el virus muestra susceptibilidad diferencial, porque las células normales no se ven afectadas por el virus. Esta susceptibilidad

35 diferencial es más pronunciada en presencia de interferón. La célula tumoral se caracteriza porque tiene bajos niveles, o ausencia, de actividad PKR, o porque es PKR-/-, STAT1-/-o tanto PKR-/-como STAT1-/-. El virus se selecciona entre el grupo que consiste en Rhabdovirus y picornavirus, y preferiblemente es el virus de la estomatitis vesicular (VSV) o un derivado del mismo.

Sumario de la invención

Varios rhabdovirus recién identificados son mucho más eficaces en la eliminación de cánceres particulares o líneas celulares cancerosas que VSV. Además, VSV y mutantes atenuados de VSV son neurovirulentos y causan patología del SNC en roedores y primates. Varios rhabdovirus no infectan el SNC (es decir, Muir Springs y Bahia Grande:

45 Kerschner et al., 1986), y muestran un perfil de seguridad más aceptable. Además, las terapias basadas en los nuevos rhabdovirus pueden usarse para tratar cánceres del SNC, tanto primarios como secundarios. Los rhabdovirus de la invención (y/u otros agentes oncolíticos) pueden usarse en sucesión para evitar la respuesta inmune del hospedador contra uno o más virus terapéuticos particulares. Esto permitiría una terapia prolongada y mejoraría la eficacia.

La presente invención se refiere a un rhabdovirus oncolítico para su uso en el tratamiento del cáncer, donde el rhabdovirus oncolítico codifica:

(a) una proteína G que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 5, o 55 que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 5,

(b)

una proteína N que tiene al menos un 96 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2;

(c)

una proteína M que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 4, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 4;

(d)

una proteína P que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 3, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 3, o

(e)

una proteína L que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 6, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 6.

(a)

una proteína G que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 5, o

La presente invención también se refiere a un rhabdovirus oncolítico que codifica 65

que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 5,

(b)

una proteína N que tiene al menos un 96 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2;

(c)

una proteína M que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 4, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 4;

5 (d) una proteína P que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 3, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 3, o

(e) una proteína L que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 6, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 6.

Dichos rhabdovirus poseen propiedades de eliminación de células tumorales in vitro e in vivo.

Como se usa en este documento, un rhabdovirus no VSV incluye uno o más de los siguientes virus o variantes de los mismos: virus Arajas, virus Chandipura, virus Cocal, virus Isfahan, virus Maraba, virus Piry, virus Alagoas de la estomatitis vesicular, virus BeAn 157575, virus Boteke, virus Calchaqui, virus de la anguila americana, virus Gray 15 Lodge, virus Jurona, virus Klamath, virus Kwatta, virus La Joya, virus Malpais Spring, virus del murciélago de Mount Elgon, virus Perinet, virus Tupaia, Farmington, virus Bahia Grande, virus Muir Springs, virus Reed Ranch, virus Hart Park, virus Flanders, virus Kamese, virus Mosqueiro, virus Mossuril, virus Barur, virus Fukuoka, virus Kern Canyon, virus Nkolbisson, virus Le Dantec, virus Keuraliba, virus Connecticut, virus New Minto, virus Sawgrass, virus Chaco, virus Sena Madureira, virus Timbo, virus Almpiwar, virus Aruac, virus Bangoran, virus Bimbo, virus Bivens Arm, virus del cangrejo azul, virus Charleville, virus de la planicie costera, virus DakArK 7292, virus Entamoeba, virus Garba, virus Gossas, virus Humpty Doo, virus Joinjakaka, virus Kannamangalam, virus Kolongo, virus Koolpinyah, virus Kotonkon, virus Landjia, virus Manitoba, virus Marco, virus Nasoule, virus Navarro, virus Ngaingan, virus Oak-Vale, virus Obodhiang, virus Oita, virus Ouango, virus Parry Creek, virus de los cíclidos de Rio Grande, virus Sandjimba, virus Sigma, virus Sripur, virus Sweetwater Branch, virus Tibrogargan, virus Xiburema, virus Yata, Rhode Island,

25 virus del Río Adelaide, virus Berrimah, virus Kimberley, o virus de la fiebre efímera bovina. En ciertos aspectos, rhabdovirus no VSV puede referirse al subgrupo de Dimarhabdovirus (definido como rhabdovirus capaz de infección tanto de células de insecto como de mamífero). En realizaciones específicas, el rhabdovirus no es VSV. En aspectos particulares el rhabdovirus no VSV es un virus Carajas, virus Maraba, Farmington, virus Muir Springs, y/o virus Bahia Grande, incluyendo variantes de los mismos.

El rhabdovirus oncolítico para su uso de acuerdo con la presente invención puede usarse en métodos de tratamiento del cáncer que incluyen un segundo virus terapéutico, tal como un virus oncolítico o deficiente en la replicación. Oncolítico normalmente se refiere a un agente que es capaz de eliminar, lisar, o detener el crecimiento de una célula cancerosa. En términos de un virus oncolítico el término se refiere a un virus que puede replicarse en algún grado en

35 una célula cancerosa, causar la muerte, lisis, o cese de crecimiento de la célula cancerosa y normalmente tiene efectos tóxicos mínimos sobre células no cancerosas. Un segundo virus incluye, aunque sin limitación, un adenovirus, un virus vaccinia, un virus de la enfermedad de Newcastle, un alfavirus, un parvovirus, un herpes virus, un rhabdovirus, un rhabdovirus no VSV y similares. En otros aspectos, la composición es una composición farmacéuticamente aceptable. La composición también puede incluir un segundo agente antineoplásico, tal como un agente quimioterapéutico, radioterapéutico, o inmunoterapéutico.

El rhabdovirus oncolítico para su uso de acuerdo con la presente invención puede usarse en métodos que incluyen el tratamiento de un paciente con cáncer, comprendiendo los métodos administrar una cantidad eficaz de una composición de rhabdovirus oncolítico.

45 En ciertos aspectos de la invención, una célula puede estar comprendida en un paciente y puede ser una célula hiperproliferativa, neoplásica, pre-cancerosa, cancerosa, metastásica, o metastatizada. De acuerdo con la descripción, un rhabdovirus no VSV para su uso en un método de tratamiento del cáncer puede administrase a un paciente que tenga una célula susceptible a eliminación por al menos un rhabdovirus no VSV o un régimen terapéutico o composición que incluye un rhabdovirus no VSV. La administración de las composiciones terapéuticas puede hacerse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más rhabdovirus no VSV o rhabdovirus no VSV recombinantes, solos o en diversas combinaciones. La composición administrada puede tener 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, o más partículas virales o unidades formadoras de placas (pfu). La administración puede ser por administración intraperitoneal, intravenosa, intraarterial,

55 intramuscular, intradérmica, subcutánea, o intranasal. En ciertos aspectos, las composiciones se administran por vía sistémica, particularmente por administración intravascular, que incluye inyección, perfusión y similares. Los métodos pueden comprender adicionalmente administrar una segunda terapia antineoplásica, tal como un segundo virus terapéutico. En aspectos particulares un virus terapéutico puede ser un virus oncolítico, más particularmente un rhabdovirus no VSV. En otros aspectos, un segundo agente antineoplásico es un agente quimioterapéutico, radioterapéutico, inmunoterapéutico, cirugía o similares.

Otras realizaciones de la invención se analizan durante toda esta solicitud. Cualquier realización analizada con respecto a un aspecto de la invención se aplica a otros aspectos de la invención también, y viceversa.

65 Los términos "inhibir", "reducir" o "prevenir", o cualquier variación de estos términos, cuando se usan en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva incluyen cualquier disminución medible o inhibición completa para

conseguir un resultado deseado. Los resultados deseados incluyen, aunque sin limitación, paliación, reducción, ralentización, o erradicación de una afección cancerosa o hiperproliferativa, así como una calidad mejorada o prolongación de la esperanza de vida.

5 El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede indicar "uno", pero también es coherente con el significado de "uno o más", "al menos uno", y "uno o más de uno".

Durante toda esta memoria descriptiva, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la desviación típica del error para el dispositivo o método que se está empleando para determinar el valor.

El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para indicar "y/o" salvo que se indique explícitamente para hacer referencia a alternativas solamente o las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la descripción apoya una definición que se refiere a solamente alternativas y "y/o".

15 Como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las palabras "que comprende" (y cualquier forma de que comprende, tal como "comprende" y "comprenden"), "que tiene" (y cualquier forma de que tiene, tal como "tiene" y "tienen"), "que incluye" (y cualquier forma de que incluye, tal como "incluye" y "incluyen")o "que contiene" (o cualquier forma de que contiene, tal como "contiene" y "contienen") son inclusivas o no limitantes y no excluyen elementos o etapas de método adicionales, no indicadas.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención llegarán a ser evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones específicas de la invención, se dan a modo de ilustración solamente.

Descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en este documento.

FIG. 1. Relaciones filogenéticas entre rhabdovirus basadas en una alineación GDE de una región relativamente conservada de la proteína N (119 aminoácidos), y usando el paramixovirus virus 1 de parainfluenza humana (HPIV-1) como el grupo de referencia. El árbol se generó por el método de conjuntar los vecinos y los valores de

35 arranque (indicados para cada nudo de ramificación) se estimaron usando 1000 réplicas de árbol. Las longitudes de las ramificaciones son proporcionales a las distancias genéticas. La barra de escala corresponde a sustituciones por sitio de aminoácido (cortesía de H. Badrane y P.J. Walker).

FIG. 2. Resumen del ensayo de eliminación de células tumorales in vitro. Las células del panel celular NCI 60 se infectaron durante 96 horas con una serie de dilución de diversos virus. La viabilidad celular se ensayó usando tinción con violeta cristal para detectar las células viables residuales. El EC50 se calculó a partir de las curvas resultantes de eliminación celular y se resumieron en formato de tabla. Por motivos de claridad, los valores de EC50 se han convertido a un valor de 1-7 como se describe en la leyenda. Además, el sombreado se ha usado para indicar el intervalo de EC50 (es decir, más oscuro a más claro representa los valores mayor de EC50 a menor

45 de EC50). Los virus se abrevian del siguiente modo: MS = Muir Springs, BG = Bahia Grande, NGG = Ngaingan, TIB = Tibrogargan, FMT = Farmington, MRB = Maraba, CRJ = Carajas, VSVHR = Cepa HR del virus de la Estomatitis Vesicular y VV = Virus Vaccinia JX-963. Estos datos demuestran que no todos los rhabdovirus son igualmente oncolíticos, de hecho rhabdovirus estrechamente relacionados se comportan de forma muy diferente en las mismas líneas celulares tumorales. Por tanto, no existe actualmente un método para predecir qué rhabdovirus tienen potencial oncolítico. Es necesario ensayo empírico para identificar buenos virus candidatos oncolíticos.

FIG. 3A-3B. Productividad de rhabdovirus en líneas celulares tumorales. Se infectaron las líneas celulares de glioblastoma humano SNB19 y carcinoma pulmonar humano NCI H226 con diversos rhabdovirus (MOI=3) y se

55 controlaron en el tiempo para la producción de virus por ensayo de placa. Los datos muestran que no todos los rhabdovirus tienen la misma capacidad de replicarse en estas líneas celulares tumorales. La célula NCI H226 revela una gran disparidad en la productividad de virus con Bahia Grande que no produce virus en absoluto mientras que el virus Maraba es capaz de producir copiosos viriones infecciosos.

FIG. 4. Esquema del sistema de rescate para recuperar rhabdovirus recombinantes a partir de una forma de ADN plasmídico. En este ejemplo, se ha clonado el virus Maraba en un plásmido de ADN entre el promotor T7 y una secuencia de ribozima del virus de la hepatitis D. Se infectan células A549 con virus vaccinia que expresa T7 y después se transfectan posteriormente con un vector del genoma Maraba modificado por ingeniería para expresar GFP. Los viriones rescatados se purifican y después se usan para infectar células Vero durante 24

65 horas, provocando una expresión de GFP en estas células cuando se visualizan por microscopia de fluorescencia.

FIG. 5. Bioselección de cepas mejoradas de rhabdovirus oncolíticos. Los rhabdovirus son cuasi-especies. Bahia Grande no es neuropatogénico pero tiene la capacidad de eliminar células de glioblastoma humanas. Los inventores contemplaron mejorar su virulencia manteniendo al mismo tiempo su selectividad por células cancerosas. Para mejorar la virulencia de un rhabdovirus para una célula tumoral, los inventores seleccionaron mutantes del virus con capacidad aumentada de replicación en una línea celular de glioblastoma humano. En resumen, se infectaron 5 x 105 células SNB19 con 2,5 x 106 partículas virales, dando una MOI de 5. El inóculo inicial tenía un volumen de 200 µl y se dejó 1 hora para la infección antes de lavar las células 10 veces con PBS. El último lavado se analizó para las partículas virales por ensayo de placa para asegurar una eliminación apropiada del virus introducido. En puntos temporales crecientes, se recogió el sobrenadante completo y se reemplazó con medio fresco. El medio recogido se usó para infectar nuevas células para amplificación y se analizó por ensayo de placa para la presencia de partículas virales. Para el primer pase, las recogidas sucedieron a las 4, 8, 12 y 24 hpi (horas post-infección) hasta que se determinó el tiempo inicial para la liberación viral. Los virus del punto temporal más temprano se amplificaron de nuevo a una población de 106 y después se volvieron a pasar.

FIG. 6. Bioselección de cepas mejoradas de rhabdovirus oncolíticos. En este ejemplo, el virus Bahia Grande experimentó hasta 6 ciclos iterativos de bioselección. La cepa precursora (WT) junto con los pases 4-6 se controlaron para la producción de virus en células SNB19 a las 4, 6 y 8 horas post-infección. Es evidente una mejora clara y progresiva en la velocidad de replicación inicial del virus durante rondas crecientes de bioselección. MTB = Maraba se incluye como ejemplo de replicación rápida y deseable de virus en la línea celular cancerosa.

FIG. 7. Bahia Grande P13 experimentó 13 rondas de bioselección. Este virus mostró una replicación mejorada del virus no solamente en el glioblastoma humano usado durante el protocolo de bioselección, sino en un glioblastoma humano no relacionado y una línea celular de carcinoma de ovario humano. Esto demuestra que los rhabdovirus pueden bioseleccionarse para mejorar sus propiedades oncolíticas y estas mejoras son eficaces sobre otros cánceres distintos.

FIG. 8. Se infectaron ratones Balb/C de forma intracraneal con los virus indicados un se controlaron para la morbilidad y/o mortalidad. Tanto el VSV de tipo silvestre (cepa HR) como la cepa mutante delta M51 de VSV eran extremadamente neurotóxicas, demostrando parálisis de las extremidades posteriores en días desde la infección, mientras que los virus Bahia Grande y Muir Springs no mostraron neurotoxicidad. Bahia Grande P6 es una cepa bioseleccionada de Bahia Grande con replicación mejorada en células de glioblastoma humano. Esta cepa también mostró ausencia de neurotoxicidad, lo que demuestra que los rhabdovirus pueden bioseleccionarse para virulencia mejorada sobre células tumorales, manteniendo al mismo tiempo su perfil de seguridad en tejido sano normal.

FIG. 9. Eficacia in vivo de los rhabdovirus Maraba y Carajas en comparación con Chandripura y WT VSV y delta 51 VSV. Se establecieron tumores 4T1 (que expresan luciferasa de luciérnaga) en ratones hembra Balb/C de 5-8 semanas de edad inyectando 106 células tumorales en la glándula mamaria izquierda posterior. Después de una semana, se inyectó a los ratones por vía intravenosa en el día 1 y 2 (cada dosis = 107 pfu de WT VSV, Δ51 GFP VSV, Maraba o Chandipura; o 108 pfu de Carajas). Se midieron las respuestas tumorales por imágenes de bioluminiscencia usando un IVIS 200 (Xenogen) (medido como fotones/s/cm2).

FIG. 10. Infectividad de VSV sin G pseudotipado con proteína G de Isfahan y proteína G de VSV.

FIG. 11. Una curva de crecimiento de una etapa con virus VSV WT, Isfahan y RVR_IsG1.

FIG. 12. RVR que comprende una proteína G de Isfahan sigue siendo oncolítica. La citotoxicidad de los virus Isfahan, VSV d51 y RVR IsfG1 se evaluaron en diversas líneas celulares cancerosas.

FIG. 13A-13C. RVR que comprende Isf G1 es capaz de escapar a la respuesta inmune contra VSV in vivo. Se usó detección de luciferasa in vivo para determinar la cantidad de virus en ratones inoculados con RVR IsfG1 o VSV. FIG.13A, detección in vivo de virus recombinante inyectado en ratones vírgenes. FIG. 13B, detección in vivo de VSV inyectado en ratones inmunizados con VSV. FIG. 13C, detección in vivo de virus RVR IsfG1 recombinante inyectado en ratones inmunizados con VSV.

FIG. 14. Producciones de virus a partir de tumores infectados. Los tumores se infectaron con virus recombinante VSV en presencia o ausencia de inmunización con VSV (como se indica). Los datos en el gráfico muestran la cantidad de virus resultante de la infección del tumor.

FIG. 15. Una curva de crecimiento de una etapa de VSV WT, virus chandipura y RVRChaG1. Los resultados muestran que el recombinante produce la misma cantidad de virus que VSV.

FIG. 16. Citotoxicidad de VSV WT, virus chandipura y RVRChaG1. Los resultados muestran que el recombinante

es tan citotóxico como VSV.

FIG. 17. Una curva de crecimiento de una etapa de VSV WT, virus Maraba y RVRMarG1. Los resultados muestran que el título de virus recombinante era mayor que VSV a las 48 y 72 h.

5 FIG. 18. Citotoxicidad de VSV WT, virus Maraba y RVRMarG1. Los resultados muestran que tanto Maraba como RVRMarG1 son citotóxicos en líneas celulares tumorales y que generalmente son más citotóxicos para las células tumorales que VSV WT.

Descripción detallada de la invención

Los aspectos de la invención se basan en la eliminación por rhabdovirus no VSV o rhabdovirus pseudotipados de varias clases o tipos de células cancerosas, que son resistentes a la eliminación por VSV. Algunas de las ventajas de estos rhabdovirus oncolíticos y rhabdovirus recombinantes incluyen las siguientes: (1) Los anticuerpos contras los

15 rhabdovirus de la invención serán raros a no existentes en la mayoría de poblaciones del mundo. (2) Los rhabdovirus se replican más rápidamente que otros virus oncolíticos tales como adenovirus, reovirus, sarampión, parvovirus, retrovirus, y HSV. (3) Los rhabdovirus crecen a altos títulos y se pueden filtrar a través de un filtro de 0,2 micrómetros. (4) Los rhabdovirus oncolíticos y recombinantes de los mismos tienen un amplio intervalo de hospedador, capaces de infectar muchos tipos diferentes de células cancerosas y no se limitan por los receptores en una célula particular (por ejemplo, coxsackievirus, sarampión, adenovirus). (5) El rhabdovirus de la invención es susceptible a manipulación genética. (6) El rhabdovirus también tiene un ciclo vital citoplasmático y no integra en el material genético de la célula hospedadora, lo que confiere un perfil de seguridad más favorable.

I. Familia Rhabdoviridae (Rhabdovirus)

25 Los rhabdovirus arquetípicos son el virus de la rabia y de la estomatitis vesicular (VSV), los más estudiados de esta familia de virus. Aunque estos virus comparten morfologías similares, son muy diferentes en su ciclo vital, rango de hospedador, y patología. Los rhabdovirus son una familia de virus con forma de bala que tienen genomas ARN con sentido (-) no segmentados. Existen más de 250 rhabdovirus conocidos que infectan mamíferos, peces, insectos, y plantas. La familia está dividida en al menos 5 géneros: (1) Lyssavirus: incluyendo el virus de la rabia, otros virus de mamífero, algunos virus de insecto; (2) Vesiculovirus: incluyendo el virus de la estomatitis vesicular (VSV); (3) Ephemerovirus: incluyendo el virus de la fiebre efímera bovina (vertebrados); (4) Cytorhabdovirus: incluyendo el virus del amarillamiento necrótico de la lechuga (plantas); y (5) Nucleorhabdovirus: incluyendo el virus de la patata amarilla enana (plantas). También se ha sugerido que existe un supergrupo de rhabdovirus indicado

35 Dimarhabdovirus que incluye diversos rhabdovirus que infectan tanto a mamíferos como a insecto.

La familia Rhabdovirus incluye, aunque sin limitación: virus Arajas, virus Chandipura (AF128868 / gi:4583436, AJ810083 / gi:57833891, AY871800 / gi:62861470, AY871799 / gi:62861468, AY871798 / gi:62861466, AY871797 / gi:62861464, AY871796 / gi:62861462, AY871795 / gi:62861460, AY871794 / gi:62861459, AY871793 / gi:62861457, AY871792 / gi:62861455, AY871791 / gi:62861453), virus Cocal (AF045556 / gi:2865658), virus Isfahan (AJ810084 / gi:57834038), virus Maraba (SEC ID Nº 1-6), virus Carajas (SEC ID Nº 7-12, AY335185 / gi:33578037), virus Piry (D26175 / gi:442480, Z15093 / gi:61405), virus Alagoas de la estomatitis vesicular, virus BeAn 157575, virus Boteke, virus Calchaqui, virus de la anguila americana, virus Gray Lodge, virus Jurona, virus Klamath, virus Kwatta, virus La Joya, virus Malpais Spring, virus del murciélago de Mount Elgon (DQ457103 /

45 gi|91984805), virus Perinet (AY854652 / gi:71842381), virus Tupaia (NC_007020/ gi:66508427), Farmington, virus Bahia Grande (SEC ID Nº 13-18), virus Muir Springs, virus Reed Ranch, virus Hart Park, virus Flanders (AF523199 / gi:25140635, AF523197 / gi:25140634, AF523196 / gi:25140633, AF523195 / gi:25140632, AF523194 / gi:25140631, AH012179 / gi:25140630), virus Kamese, virus Mosqueiro, virus Mossuril, virus Barur, virus Fukuoka (AY854651 / gi:71842379), virus Kern Canyon, virus Nkolbisson, virus Le Dantec (AY854650 / gi:71842377), virus Keuraliba, virus Connecticut, virus New Minto, virus Sawgrass, virus Chaco, virus Sena Madureira, virus Timbo, virus Almpiwar (AY854645 / gi:71842367), virus Aruac, virus Bangoran, virus Bimbo, virus Bivens Arm, virus del cangrejo azul, virus Charleville, virus de la planicie costera, virus DakArK 7292, virus Entamoeba, virus Garba, virus Gossas, virus Humpty Doo (AY854643 / gi:71842363), virus Joinjakaka, virus Kannamangalam, virus Kolongo (DQ457100 / gi|91984799 ARNm de nucleoproteína (N), cds parcial); virus Koolpinyah, virus Kotonkon (DQ457099 / gi|91984797,

55 AY854638 / gi:71842354); virus Landjia, virus Manitoba, virus Marco, virus Nasoule, virus Navarro, virus Ngaingan (AY854649 / gi:71842375), virus Oak-Vale (AY854670 / gi:71842417), virus Obodhiang (DQ457098 / gi|91984795), virus Oita (AB116386 / gi:46020027), virus Ouango, virus Parry Creek (AY854647 / gi:71842371), virus de los cíclidos de Rio Grande, virus Sandjimba (DQ457102 / gi|91984803), virus Sigma (AH004209 / gi:1680545, AH004208 / gi:1680544, AH004206 / gi:1680542), virus Sripur, virus Sweetwater Branch, virus Tibrogargan (AY854646 / gi:71842369), virus Xiburema, virus Yata, Rhode Island, virus del Rio Adelaide (U10363 / gi:600151, AF234998 / gi:10443747, AF234534 / gi:9971785, AY854635 / gi:71842348), virus Berrimah (AY854636 / gi:71842350]), virus Kimberley (AY854637 / gi:71842352), o virus de la fiebre efímera bovina (NC_002526 / gi:10086561).

65 Ciertos serotipos no asignados incluyen (1) grupo Bahia Grande (virus Bahia Grande (BGV), virus Muir Springs (MSV), virus Reed Ranch (RRV); (2) grupo Hart Park (virus Flanders (FLAV), virus Hart Park (HPV), virus Kamese

(KAMV), virus Mosqueiro (MQOV), virus Mossuril (MOSV); (3) grupo Kern Canyon (virus Barur (BARV), virus Fukuoka (FUKAV), virus Kern Canyon (KCV), virus Nkolbisson (NKOV); (4) grupo Le Dantec (virus Le Dantec (LDV), virus Keuraliba (KEUV), (5) grupo Sawgrass (virus Connecticut (CNTV), virus New Minto (NMV), virus Sawgrass (SAWV); (6) grupo Timbo (virus Chaco (CHOV), virus Sena Madureira (SMV), virus Timbo (TIMV); y (7) otros virus

5 no asignados (virus Almpiwar (ALMV), virus Aruac (ARUV), virus Bangoran (BGNV), virus Bimbo (BBOV), virus Bivens Arm (BAV), virus del cangrejo azul (BCV), virus Charleville (CHVV), virus de las planicies costeras (CPV), virus DakArK 7292 (DAKV-7292), virus Entamoeba (ENTV), virus Garba (GARV), virus Gossas (GOSV), virus Humpty Doo (HDOOV), virus Joinjakaka (JOIV), virus Kannamangalam (KANV), virus Kolongo (KOLV), virus Koolpinyah (KOOLV), virus Kotonkon (KOTV), virus Landjia (LJAV), virus Manitoba (MNTBV), virus Marco (MCOV), Ngaingan, virus Nasoule (NASV), virus Navarro (NAW), virus Ngaingan (NGAV), virus Oak-Vale (OVRV), virus Obodhiang (OBOV), virus Oita (OITAV), virus Ouango (OUAV), virus Parry Creek (PCRV), virus de los cíclidos de Rio Grande (RGRCV), virus Sandjimba (SJAV), virus Sigma [X91062] (SIGMAV), virus Sripur (SRIV), virus Sweetwater Branch (SWBV), virus Tibrogargan (TIBV), virus Xiburema (XIBV), virus Yata (YATAV).

15 Aspectos de la invención pueden incluir, aunque sin limitación, la selección de rhabdovirus no VSV o rhabdovirus pseudotipados basada en su crecimiento en líneas celulares de mamífero, la ausencia de o toxicidad mínima en ratones adultos (animales), la ausencia de o toxicidad mínima en ratones lactantes (animales).

A. Genoma rhabdoviral

Normalmente el genoma de rhabdovirus es de aproximadamente 11 -15kb con un líder 3' de aproximadamente 50 nucleótidos y una región 5' no traducida de aproximadamente 60 nucleótidos de un ARN viral con sentido (-) (ARNv). Normalmente, el ARNv de rhabdovirus tiene 5 genes que codifican 5 proteínas. Los rhabdovirus tienen una señal de poliadenilación conservada al final de cada gen y una corta región intergénica entre cada uno de los 5 genes. Todos 25 los rhabdovirus contienen 5 genes que codifican la proteína de nucleocápsida (N), fosfoproteína (P, también denominada NS), proteína de matriz (M), glucoproteína (G), y proteína grande (L). Normalmente estos genes están ordenados en el ARNv de sentido negativo de siguiente modo: 3'-N-P-M-G-(X)-L-5'. El orden de los genes es importante ya que dictamina la proporción de proteínas sintetizadas. Cualquier manipulación de un genoma de rhabdovirus normalmente incluirá al menos 5 dominios de transcripción para mantener la capacidad de infectar y replicarse a altos niveles. Los rhabdovirus tienen ARN polimerasa endógena para la transcripción del ARN mensajero con sentido más (ARNm). El gen X no existe en todos los rhabdovirus. El gen X codifica una proteína no estructural encontrada en el primer virus infeccioso de necrosis hematopoyética (GenBank DQ164103 / gi|76262981; DQ164102 / gi|76262979; DQ164101 / gi|76262977; DQ164100 / gi|76262975; DQ164099 / gi|76262973; AB250935 / gi|112821165; AB250934 / gi|112821163; AB250933 / gi|112821161; AB250932 / gi|112821159; AB250931 /

35 gi|112821157; AB250930 / gi|112821155; AB250929 / gi|112821153; AB250928 / gi|112821151; AB250927 / gi|112821149, que describen la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína G), una glucoproteína no estructural en el virus de la fiebre efímera bovina y un pseudogen en el virus de la rabia. El gen extra (X) se ha encontrado en diferentes localizaciones en el genoma de rhabdovirus. La síntesis de la proteína M en células infectadas es citopática a la célula, y finalmente provocará muerte celular.

La transmisión de rhabdovirus varía dependiendo del virus/hospedador, pero la mayoría se transmiten por contacto directo -por ejemplo, transmisión de la rabia por mordedura de animal o vector de insecto. Existe un largo periodo de incubación in vivo, pero esto no se refleja en la cinética de la replicación del virus en cultivo. Las espinas de proteína G se unen a receptores en la superficie de células hospedadoras y los virus entran en la célula por

45 endocitosis y fusión con la membrana de la vesícula, mediada por la proteína G.

Sin intención de limitarse a ninguna teoría particular, las moléculas receptoras para rhabdovirus se cree que son fosfolípidos en lugar de proteínas específicas. La replicación rhabdoviral sucede en el citoplasma -ambas proteínas tanto L y NS son necesarias para transcripción -ni funcionan solas. Se producen cinco ARNm monocistrónicos, con un capuchón en el extremo 5' y poliadenilados en el extremo 3' y cada uno contiene la secuencia líder desde el extremo 3' del ARNv en el extremo 5' del mensaje. Estos ARNm se elaboran por transcripción secuencial de las ORF en el genoma del virus y se ha demostrado que la secuencia intergénica es responsable de la terminación y reinicio de la transcripción por la polimerasa entre cada gen, produciendo de este modo transcritos diferentes.

55 El ARNv descendiente se elabora a partir de un intermedio con sentido (+). El genoma se replica por el complejo de polimerasa L + P (como en la transcripción), pero también son necesarios factores adicionales de la célula hospedadora. Es característico de los rhabdovirus que estos eventos sucedan todos en una parte del citoplasma que actúa como una "fábrica" de virus y aparece como un cuerpo de inclusión citoplasmático característico.

B. Variantes de proteínas virales

En ciertas realizaciones, un rhabdovirus o un rhabdovirus no VSV comprenderá una variante de una o más de las proteínas N, P, M, G, y/o L como se ha definido anteriormente. En ciertos aspectos de la invención estas variantes de proteínas virales pueden estar comprendidas en una composición proteica, que se define adicionalmente a 65 continuación. Las composiciones proteicas incluyen partículas virales y otras composiciones que tienen uno o más componentes proteicos virales. Estas variantes polipeptídicas pueden modificarse por ingeniería o seleccionarse

para una modificación en una o más características fisiológicas o biológicas, tales como rango de célula hospedadora, especificidad de célula hospedadora, toxicidad a células u organismos no diana, replicación, citotoxicidad a una célula diana, eliminación de células cancerosas, estasis de células cancerosas, infectividad, parámetros de fabricación, tamaño de partícula viral, estabilidad de partículas virales, eliminación in vivo, 5 inmunorreactividad, y similares. Estas variantes polipeptídicas pueden modificarse por ingeniería usando diversas metodologías conocidas en la técnica, incluyendo diversas técnicas de mutagénesis descritas, véase a continuación.

C. Rhabdovirus recombinantes

10 El rhabdovirus recombinante puede producirse (1) completamente usando ADNc o (2) una combinación de ADNc transfectado en una célula hospedadora, o (3) ADNc transfectado en una célula, que se infecta adicionalmente con un minivirus que proporciona en trans los componentes o actividades restantes necesarios para producir un rhabdovirus recombinante infeccioso o no infeccioso. Usando cualquiera de estos métodos (por ejemplo, minivirus, línea celular auxiliar, o transfección con ADNc solamente), los componentes mínimos requeridos son una molécula

15 de ARN que contiene las señales de acción en cis para (1) la encapsidación del ARN genómico (o antigenómico) por la proteína N de Rhabdovirus, y (2) la replicación de un ARN genómico o antigenómico (intermedio replicativo) equivalente.

Mediante un elemento de replicación o replicón, los inventores indican una hebra de ARN que contiene

20 mínimamente en los extremos 5' y 3' la secuencia líder y la secuencia tráiler de un rhabdovirus. En el sentido genómico, el líder está en el extremo 3' y el tráiler está en el extremo 5'. Cualquier ARN colocado entre estas dos señales de replicación se replicará a su vez. Las regiones líder y tráiler deben contener adicionalmente los elementos de acción en cis mínimos para propósitos de encapsidación por la proteína N y para la unión de la polimerasa que son necesarios para iniciar la transcripción y la replicación.

25 Para preparar rhabdovirus modificados por ingeniería, un minivirus que contenga el gen G también contendría una región líder, una región tráiler y un gen G con las señales apropiadas de inicio y terminación para producir un ARNm de proteína G. Si el minivirus comprende adicionalmente un gen M, las señales apropiadas de inicio y terminación para producir el ARNm de la proteína M también deben estar presentes.

30 Para cualquier gen contenido dentro del genoma de rhabdovirus modificado por ingeniería, el gen estaría flanqueado por las señales apropiadas de inicio y terminación de la transcripción que permitirán la expresión de esos genes y la producción de los productos proteicos. Particularmente, un gen heterólogo, que es un gen que normalmente no está codificado por un rhabdovirus aislado de la naturaleza o contiene una región codificante de rhabdovirus en una

35 posición, forma o contexto en que se encuentra normalmente, por ejemplo, una proteína G quimérica.

Para producir rhabdovirus modificado por ingeniería "no infeccioso", el rhabdovirus modificado por ingeniería debe de tener los elementos mínimos de replicón y las proteínas N, P, y L y debe contener el gen M (un ejemplo es la construcción ΔG o sin G, que ha perdido la región codificante para la proteína G). Esto produce partículas virales

40 que se geman desde la célula, pero son partículas no infecciosas. Para producir partículas "infecciosas", las partículas virales deben comprender adicionalmente proteínas que puedan mediar la unión y fusión de la partícula viral, tal como a través del uso de una proteína de unión o ligando de receptor. El ligando de receptor nativo de rhabdovirus es la proteína G.

45 Una "célula adecuada" o "célula hospedadora" significa cualquier célula que permitiría el ensamblaje del rhabdovirus recombinante.

Para preparar partículas virales infecciosas, primero se infecta una línea celular apropiada (por ejemplo, células BHK) con virus vaccinia vTF7-3 (Fuerst et al., 1986) o equivalente que codifica un ARN polimerasa T7 u otra

50 polimerasa adecuada de bacteriófago tal como las polimerasas T3 o SP6 (véase Usdin et al., 1993 o Rodríguez et al., 1990). Las células después se transfectan con ADNc individuales que contienen los genes que codifican las proteínas de rhabdovirus G, N, P, L y M. Estos ADNc proporcionarán las proteínas para construir una partícula de rhabdovirus recombinante. Las células pueden transfectarse por cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, liposomas, electroporación, etc.).

55 También se transfecta en la línea celular un "ADNc policistrónico" que contiene el ARN genómico de rhabdovirus equivalente. Si se pretende que la partícula de rhabdovirus recombinante infeccioso sea lítica en una célula infectada, entonces los genes que codifican las proteínas N, P, M y L deben estar presentes así como cualquier segmento de ácido nucleico heterólogo. Si no se pretende que la partícula de rhabdovirus recombinante infecciosa

60 sea lítica, entonces el gen que codifica la proteína M no se incluye en el ADN policistrónico. Por "ADNc policistrónico" se entiende un ADNc que comprende al menos unidades de transcripción que contiene los genes que codifican las proteínas N, P y L. El ADN policistrónico de rhabdovirus recombinante también puede contener un gen que codifica una proteína variante o fragmento polipeptídico de la misma, o un ácido nucleico terapéutico. Como alternativa, puede suministrarse en trans cualquier proteína a asociar inicialmente con la partícula viral producida

65 primero o fragmento de la misma.

Otra realización contemplada es un ADNc policistrónico que comprende un gen que codifica una proteína indicadora

o proteína fluorescente (por ejemplo, proteína fluorescente verde y sus derivados, β-galactosidasa, fosfatasa alcalina, luciferasa, cloranfenicol acetiltransferasa, etc.), los genes N-P-L o N-P-L-M, y/o una proteína de fusión o un ácido nucleico terapéutico. Otro ADN policistrónico contemplado puede contener un gen que codifica una variante

5 proteica, un gen que codifica un indicador, un ácido nucleico terapéutico, y/o cualquiera de los genes N-P-L o los genes N-P-L-M.

La primera etapa en la generación de un rhabdovirus recombinante es la expresión de un ARN que es un equivalente genómico o antigenómico de un ADNc. Después ese ARN se empaqueta por la proteína N u después se replica por las proteínas P/L. El virus así producido puede recuperarse. Si la proteína G está ausente del genoma del ARN recombinante, entonces normalmente se suministra en trans. Si ambas proteínas G y M están ausentes, entonces ambas se suministran en trans.

Para preparar partículas "de rhabdovirus no infeccioso", el procedimiento puede ser el mismo que el anterior,

15 excepto que el ADNc policistrónico transfectado en las células contendría los genes N, P y L del rhabdovirus solamente. El ADNc policistrónico de partículas de rhabdovirus no infecciosas puede contener adicionalmente un gen que codifica una proteína indicadora o un ácido nucleico terapéutico. Para una descripción adicional respecto a los métodos para producir un rhabdovirus recombinante que carezca del gen que codifica la proteína G, véase Takada et al. (1997).

1. Cultivo de células para producir virus

Las células transfectadas habitualmente se incuban durante al menos 24 horas a la temperatura deseada, habitualmente aproximadamente 37ºC. Para partículas virales no infecciosas, el sobrenadante se recoge y se aíslan

25 las partículas virales. Para partículas virales infecciosas, el sobrenadante que contiene el virus se recoge y se transfiere a células frescas. Las células frescas se incuban durante aproximadamente 48 horas, y se recoge el sobrenadante.

2. Purificación del Rhabdovirus recombinante

Los términos "aislamiento" o "aislar" un Rhabdovirus significa el proceso de cultivar y purificar las partículas virales de modo que permanezca muy poco desecho celular. Un ejemplo sería recoger el sobrenadante que contiene virión y pasarlo a través de un filtro de tamaño de poro de 0,1-0,2 micrómetros (por ejemplo, Millex-GS, Millipore) para retirar el virus y los desechos celulares. Como alternativa, los viriones pueden purificarse usando un gradiente, tal

35 como un gradiente de sacarosa. Después las partículas de rhabdovirus recombinante pueden sedimentarse y resuspenderse en cualquier excipiente o vehículo que se desee. Los títulos pueden determinarse por inmunofluorescencia indirecta usando anticuerpos específicos para proteínas particulares.

3. Métodos para preparar Rhabdovirus recombinantes usando ADNc y un minivirus o una línea celular auxiliar

Tanto los "minivirus" como las "células auxiliares" (también conocidas como "líneas celulares auxiliares") proporcionan la misma cosa: proporcionar una fuente de proteínas de rhabdovirus para el ensamblaje de viriones de rhabdovirus. Un ejemplo de un minivirus de rhabdovirus es el minivirus VSV que expresa solamente la proteína G y

45 M, como se indica por Stillman et al., (1995). Los virus auxiliares y minivirus se usan como métodos para proporcionar proteínas de rhabdovirus que no se producen a partir del ADNc transfectado que codifica los genes para proteínas de rhabdovirus.

Cuando se usa un minivirus, las células se infectan con virus vaccinia como se ha descrito anteriormente con el fin de proporcionar ARN polimerasa T7. El ARN policistrónico deseado, y los plásmidos que contienen los genes N, P y L se transfectan en las células. La mezcla de transfección se retira después de aproximadamente 3 horas, las células se infectan con el minivirus a una multiplicidad de infección (m.o.i.) de aproximadamente 1. El minivirus suministra las proteínas G y/o M perdidas. El ARN policistrónico transfectado en la célula dependerá de si se quiere un rhabdovirus recombinante infeccioso o no infeccioso.

55 Como alternativa, podría usarse un minivirus para proporcionar los genes N, P, y L. El minivirus también podría usarse para producir la proteína M además de N, P, y L. El minivirus también puede producir la proteína G.

Cuando se usa una línea celular auxiliar, los genes que codifican las proteínas perdidas de rhabdovirus se producen por la línea celular auxiliar. La línea celular auxiliar tiene proteínas N, P, L, y G para la producción de partículas de rhabdovirus recombinante que no codifica proteína G de tipo silvestre. Las proteínas se expresan a partir de genes o ADN que no son parte del genoma viral recombinante. Estos plásmidos u otro sistema de vector se incorporan de forma estable en el genoma de la línea celular. Las proteínas después se producen a partir del genoma de la célula y no a partir de un replicón en el citoplasma. La línea celular auxiliar después puede transfectarse con un ADN 65 policistrónico y ADNc plasmídicos que contienen los otros genes de rhabdovirus no expresados por el virus auxiliar. El ARN policistrónico usado dependerá de si se desea un rhabdovirus recombinante infeccioso o no infeccioso. Por

lo demás, el suministro de los productos génicos perdidos (por ejemplo, G y/o M) se conseguiría como se ha descrito anteriormente.

II. Composiciones virales

5 La presente invención se refiere a rhabdovirus que son ventajosos en el estudio y tratamiento de células hiperproliferativas o neoplásicas (por ejemplo, células cancerosas) y afecciones hiperproliferativas o neoplásicas (por ejemplo, cáncer) en un paciente. Puede referirse, aunque sin limitación, a rhabdovirus con una neurovirulencia reducida, por ejemplo, rhabdovirus no VSV. En ciertos aspectos el rhabdovirus que codifica o contienen uno o más componentes proteicos (proteínas N, P, M, G, y/o L) o un genoma de ácido nucleico distinto de los de VSV (es decir, al menos o como mucho 10, 20, 40, 50, 60, 70, 80 % idéntico a nivel de aminoácidos o nucleótidos), y/o que se ha construido con una o más mutaciones o variaciones en comparación con un virus o proteínas virales de tipo silvestre de modo que el virus tenga propiedades deseables para uso contra células cancerosas, siendo al mismo tiempo menos tóxico o no tóxico para células no cancerosas que el virus aislado originalmente o VSV. Los contenidos

15 descritos a continuación proporcionan diversos ejemplos de protocolos para implementar métodos y composiciones de la invención. Proporcionan antecedentes para generar virus mutados o variantes a través del uso de bioselección

o tecnología de ADN o ácido nucleico recombinante.

A.

Composiciones proteicas

Las composiciones proteicas incluyen partículas virales y composiciones que incluyen las partículas virales, así como polipéptidos aislados. En ciertos aspectos, se generan o aíslan rhabdovirus oncolíticos pseudotipados o no VSV (rhabdovirus que lisan, eliminan, o retardan el crecimiento de células cancerosas). En ciertas realizaciones, los rhabdovirus se modificarán por ingeniería para incluir variantes polipeptídicas de proteínas de rhabdovirus (N, P, M,

25 G, y/o L) y/o ácidos nucleicos terapéuticos que codifican polipéptidos terapéuticos. Otros aspectos incluyen el aislamiento de rhabdovirus que carecen de uno o más polipéptidos o proteínas funcionales. En otras realizaciones, la presente invención se refiere a rhabdovirus y se usa en combinación con o incluidos dentro de composiciones proteicas como parte de una formulación farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en este documento, una "proteína" o "polipéptido" se refiere a una molécula que comprende un polímero de restos de aminoácido. En algunas realizaciones, se emplea una versión de tipo silvestre de una proteína o polipéptido, sin embargo, en muchas realizaciones de la invención, todo o una parte de una proteína viral o polipéptido está ausente o alterada de modo que vuelve al virus más útil para el tratamiento de un paciente. Los términos descritos anteriormente pueden usarse de forma intercambiable en este documento. Una "proteína 35 modificada" o "polipéptido modificado" o "proteína variante" o "polipéptido variante" se refiere a una proteína o polipéptido cuya estructura química o secuencia de aminoácidos está alterada con respecto a la proteína o polipéptido de tipo silvestre o de referencia. En algunas realizaciones, una proteína o polipéptido modificado tiene al menos una actividad o función modificada (reconociendo que las proteínas o polipéptidos pueden tener múltiples actividades o funciones). La actividad o función modificada puede estar reducida, disminuida, eliminada, potenciada, mejorada, o alterada de algún otro modo (tal como especificidad de infección) con respecto a esa actividad o función en una proteína o polipéptido de tipo silvestre, o las características del virus que contiene dicho polipéptido. Se contempla que una proteína o polipéptido modificado puede alterarse con respecto a una actividad o función reteniendo aún la actividad o función de tipo silvestre o inalterada en otros aspectos. Como alternativa, una proteína modificada puede ser completamente no funcional o su secuencia de ácido nucleico afín puede haberse alterado de

45 modo que el polipéptido ya no se exprese en absoluto, esté truncado, o exprese una secuencia diferente de aminoácidos como resultado de un desplazamiento de fase u otra modificación.

En ciertas realizaciones, el tamaño de una proteína o polipéptido recombinante puede comprender, aunque sin limitación, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500 o más restos de moléculas de aminoácido, y

55 cualquier intervalo derivable en el mismo. Se contempla que los polipéptidos pueden modificarse por truncamiento, volviéndolos más cortos que su forma correspondiente inalterada o por fusión o reordenamiento de dominios que puede volver a la proteína alterada más larga.

Como se usa en este documento, una "molécula amino" se refiere a cualquier aminoácido, derivado de aminoácido,

o mimético de aminoácido que sería conocida para un especialista en la técnica. En ciertas realizaciones, los restos de la molécula proteica son secuenciales, sin ninguna molécula no amino que interrumpa la secuencia de restos de moléculas amino. En otras realizaciones, la secuencia puede comprender uno o más restos de moléculas no amino. En realizaciones particulares, la secuencia de restos de la molécula proteica puede estar interrumpida por uno o más restos de moléculas no amino. Por consiguiente, la expresión "composición proteica" abarca secuencias de

65 moléculas amino que comprenden al menos uno de los 20 aminoácidos comunes en proteínas sintetizadas de forma natural, o al menos un aminoácido modificado o inusual.

Las composiciones proteicas pueden prepararse por cualquier técnica conocida para los especialistas en la técnica, incluyendo la expresión de proteínas, polipéptidos, o péptidos a través de técnicas convencionales de biología molecular, el aislamiento de compuestos proteicos a partir de fuentes naturales, o la síntesis química de materiales 5 proteicos. Las secuencias de nucleótidos y polipéptidos para diversos genes o genomas de rhabdovirus se han descrito previamente, y pueden encontrarse en bases de datos computarizadas conocidas para los especialistas en la técnica. Una de dichas bases de datos es la base de datos GenBank y GenPept del National Center for Biotechnology Information's, a las que puede accederse mediante internet en el ncbi.nlm.nih.gov/. Las regiones codificantes para estos genes y virus conocidos pueden amplificarse y/o expresarse usando las técnicas descritas

10 en este documento o serían conocidas para los especialistas en la técnica.

B. Aspectos funcionales

Cuando la presente solicitud se refiere a la función o actividad de proteínas o polipéptidos virales, se entiende que

15 hace referencia a la actividad o función de esa proteína o polipéptido viral en condiciones fisiológicas, salvo que se especifique de otro modo. Por ejemplo, la proteína G está implicada en la especificidad y eficacia de unión e infección de tipos celulares particulares. La determinación de cuales de las moléculas poseen esta actividad puede conseguirse usando ensayos familiares para los especialistas en la técnica, tales como ensayos de infectividad, ensayos de unión a proteína, ensayos de placa y similares.

C. Variantes de polipéptidos virales

Las variantes de secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de la presente descripción pueden ser variantes de sustitución, inserción o deleción. Una mutación en un gen que codifica un polipéptido viral puede afectar a 1, 2, 3, 4, 25 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más aminoácidos no contiguos o contiguos (es decir, segmento) de un polipéptido, en

30 comparación con un polipéptido de tipo silvestre o no alterado u otro polipéptido de referencia. Diversos polipéptidos codificados por rhabdovirus pueden identificarse por referencia a los números de acceso a GenBank y las entradas relacionadas en base de datos públicas para cada uno de los virus descritos en este documento.

Las variantes de deleción carecen de uno o más restos de la proteína nativa, inalterada o de tipo silvestre. Pueden

35 delecionarse restos individuales, o puede delecionarse todo o parte de un dominio (tal como un dominio catalítico o de unión). Puede introducirse un codón de parada (por sustitución o inserción) en una secuencia de ácido nucleico codificante para generar una proteína truncada. Los mutantes de inserción normalmente implican la adición de material en un punto no terminal en el polipéptido, un tipo específico de inserto es un polipéptido quimérico que incluye partes homólogas o similares de una proteína relacionada en lugar de la parte relacionada de una proteína

40 diana. Esto puede incluir la inserción de un epítopo inmunorreactivo o simplemente uno o más restos. También pueden generarse adiciones terminales, normalmente llamadas proteínas de fusión.

Las variantes de sustitución normalmente contienen el intercambio de uno aminoácido por otro en uno o más sitios dentro de la proteína, y pueden diseñarse para modular una o más propiedades del polipéptido, con o sin la pérdida 45 de otras funciones o propiedades. Las sustituciones pueden ser conservativas, es decir, se remplaza un aminoácido con uno de forma y carga similares. Las sustituciones conservativas son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina a serina; arginina a lisina; asparagina a glutamina o histidina; aspartato a glutamato; cisteína a serina; glutamina a asparagina; glutamato a aspartato; glicina a prolina; histidina a asparagina o glutamina; isoleucina a leucina o valina; leucina a valina o isoleucina; lisina a arginina; metionina a leucina o

50 isoleucina; fenilalanina a tirosina, leucina o metionina; serina a treonina; treonina a serina; triptófano a tirosina; tirosina a triptófano o fenilalanina; y valina a isoleucina o leucina. Como alternativa, las sustituciones pueden ser no conservativas de modo que se vea afectada una función o actividad del polipéptido. Los cambios no conservativos normalmente implican sustituir un resto con uno que sea químicamente diferente, tal como un aminoácido polar o cargado por un aminoácido no polar o no cargado, y viceversa.

55 La expresión "codón funcionalmente equivalente" se usa en este documento para hacer referencia a codones que codifican el mismo aminoácido, tal como los seis codones para arginina o serina, y también se refiere a codones que codifican aminoácidos biológicamente equivalentes (véase la Tabla 1, a continuación).

Tabla 1. Tabla de codones

Aminoácidos

Codones

Alanina

Ala A GCA GCC GCG GCU

Cisteína

Cys C UGC UGU

Ácido aspártico

Asp D GAC GAU

Ácido glutámico

Glu E GAA GAG

Fenilalanina

Phe F UUC UUU

Glicina

Gly G GGA GGC GGG GGU

Histidina

His H CAC CAU

Isoleucina

Ile I AUA AUC AUU

Lisina

Lys K AAA AAG

Leucina

Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Metionina

Met M AUG

Asparagina

Asn N AAC AAU

Prolina

Pro P CCA CCC CCG CCU

Glutamina

Gln Q CAA CAG

Arginina

Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

Serina

Ser US AGC AGU UCA UCC UCG UCU

Treonina

Thr T ACA ACC ACG ACA

Valina

Val V GUA GUC GUG GUU

Triptófano

Trp W UGG

Tirosina

Tyr Y UAC UAU

También se entenderá que las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico pueden incluir restos adicionales, tales como aminoácidos adicionales N-o C-terminales o secuencias 5' o 3', y ser todavía esencialmente como se expone en este documento, incluyendo tener una cierta actividad biológica. La adición de secuencias terminales

5 particularmente se aplica a secuencias de ácido nucleico que pueden incluir, por ejemplo, diversas secuencias no codificantes que flanquean cualquiera de las partes 5' o 3' de la región codificante o pueden incluir diversas secuencias internas, es decir, intrones, que se sabe que existen dentro de los genes.

Lo siguiente es un análisis basado en el cambio de los aminoácidos de una proteína N, P, L, o G para crear una

10 molécula equivalente, o incluso mejorada. Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o sitios de unión sobre moléculas de sustrato. Como es la capacidad y naturaleza interactiva de una proteína lo que define esa actividad funcional biológica de la proteína, pueden hacerse ciertas sustituciones de aminoácidos en una secuencia proteica, y en su secuencia

15 codificante de ADN subyacente, y no obstante producir una proteína con propiedades similares. Por tanto se contempla por los inventores que pueden hacerse diversos cambios en las secuencias de ADN del rhabdovirus sin pérdida apreciable de la utilidad o actividad biológica de interés, como se analiza a continuación.

En la elaboración de dichos cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia

20 del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica a una proteína está comprendido en líneas generales en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo de un aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares.

25 También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse de forma eficaz basada en la hidrofilicidad. La patente de Estados Unidos 4.554.101, establece que la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, regida por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la patente de Estados Unidos 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los restos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato

30 (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (0,5); histidina *-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tenga un valor similar de hidrofilicidad y aún produce una proteína biológicamente equivalente e inmunológicamente equivalente. En dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2, son

35 particularmente preferidos aquellos que están dentro de ±1, y son incluso más particularmente preferidos aquellos dentro de ±0,5.

Como se ha resumido anteriormente, las sustituciones de aminoácidos generalmente se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral del aminoácido, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga,

40 tamaño, y similares. Las sustituciones ejemplares que toman en consideración las diversas características anteriores son bien conocidas para los especialistas en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

III. Moléculas de ácido nucleico

45 La presente invención incluye polinucleótidos que pueden aislarse de células que son capaces de expresar todo o parte de una proteína o polipéptido viral. En algunas realizaciones de la invención, afecta a todo o partes de un genoma viral que se ha mutado o alterado específicamente para generar un virus o polipéptido viral, por ejemplo, un polipéptido rhabdoviral o virus pseudotipado o no VSV, con ciertas propiedades y/o características. Los

polinucleótidos pueden codificar un péptido o polipéptido que contenga todo o parte de una secuencia de aminoácidos viral o heteróloga o se haya modificada por ingeniería de modo que no codifique dicho polipéptido viral

o codifique un polipéptido viral que tenga al menos una función o actividad añadida, aumentada, reducida, añadida, disminuida, o ausente. Las proteínas recombinantes pueden purificarse de las células de expresión para producir

5 proteínas activas. El genoma de miembros de rhabdovirus puede encontrarse en los números de acceso a GenBank en la base de datos del NCBI o bases de datos similares.

A. Polinucleótidos que codifican proteínas nativas o modificadas

Como se usa en este documento, la expresión " segmento de ARN, ADN, o ácido nucleico" se refiere a una molécula de ARN, ADN, o ácido nucleico que se ha aislado libre de ADN genómico total u otros contaminantes. Por lo tanto, un segmento de ácido nucleico que codifica un polipéptido se refiere a un segmento de ácido nucleico que contiene secuencias de tipo silvestre, polimórficas, o mutantes codificantes de polipéptido pero que están aisladas de, o purificadas libres de, uno o más nacidos nucleicos genómicos. Se incluyen dentro de la expresión "segmento de

15 ácido nucleico" polinucleótidos, segmentos de ácido nucleico más pequeños que un polinucleótido, y vectores recombinantes incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus, y similares.

Como se usa en esta solicitud, la expresión "polinucleótido de rhabdovirus" puede referirse a una molécula de ácido nucleico rhabdoviral pseudotipada o no VSV que codifica al menos un polipéptido de rhabdovirus no VSV. En ciertas realizaciones, el polinucleótido se ha aislado libre de otros ácidos nucleicos. Asimismo, un "polinucleótido de virus Maraba, virus Carajas, virus Muir Springs y/o virus Bahia Grande" se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido virus Maraba, virus Carajas, virus Muir Springs y/o virus Bahia Grande que se ha aislado de otros ácidos nucleicos. Un "genoma de rhabdovirus" o un "genoma de virus Maraba, virus Carajas, virus Muir Springs y/o virus Bahia Grande" se refiere a una molécula de ácido nucleico VSV o no VSV que pueden

25 proporcionarse a una célula hospedadora para producir una partícula viral, en presencia o ausencia de un virus auxiliar o regiones codificantes complementarias que suministran otros factores en trans. El genoma puede haberse mutado de forma recombinante o no en comparación con un virus de tipo silvestre o no alterado.

El término "ADNc" pretende hacer referencia a un ADN preparado usando ARN como molde. Puede haber ocasiones en que se prefiere la secuencia genómica completa o parcial.

También se contempla que un polipéptido particular de una especie dada puede estar representado por variantes naturales que tienen secuencias de ácido nucleico ligeramente diferentes pero, a pesar de ello, codifican la misma proteína (véase la Tabla 1 anterior).

35 Asimismo, un polinucleótido que codifica un polipéptido aislado o purificado de tipo silvestre o modificado se refiere a un segmento de ADN que incluye secuencias que codifican polipéptido de tipo silvestre o mutante y, en ciertos aspectos, secuencias reguladoras, sustancialmente aisladas de otros genes de origen natural o secuencias codificantes de proteína. A este respecto, el término "gen" se usa por simplicidad para hacer referencia a una unidad de ácido nucleico que codifica una proteína, polipéptido, o péptido (incluyendo cualquier secuencia necesaria para la apropiada transcripción, modificación post-traduccional, o localización). Como entenderán los especialistas en la técnica, este término funcional incluye secuencias genómicas, secuencias de ADNc, y segmentos más pequeños de ácido nucleico modificados por ingeniería que expresan, o pueden adaptarse para expresar, proteínas, polipéptidos, dominios, péptidos, proteínas de fusión, y mutantes. Un ácido nucleico que codifica todo o parte de un polipéptido

45 nativo o modificado puede contener un ácido nucleico contiguo de: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000, o más nucleótidos, nucleósidos, o pares de bases.

En realizaciones particulares, la invención se refiere a segmentos aislados de ácido nucleico y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más polipéptidos de rhabdovirus de

55 tipo silvestre o mutantes que incluyen dentro de su secuencia de aminoácidos una secuencia de aminoácidos contiguos de acuerdo con, o esencialmente correspondiente a un polipéptido nativo como se define por las reivindicaciones. El término "recombinante" puede usarse junto con un polipéptido o el nombre de un polipéptido específico, y éste se refiere en líneas generales a un polipéptido producido a partir de una molécula de ácido nucleico que se ha manipulado in vitro o que es el producto replicado de dicha molécula.

En otras realizaciones, la invención se refiere a segmentos aislados de ácido nucleico y vectores recombinantes que incorporan secuencias nucleicas que codifican un polipéptido o péptido como se define en las reivindicaciones que incluye dentro de su secuencia de aminoácidos una secuencia de aminoácidos contiguos de acuerdo con, o esencialmente correspondiente a uno o más polipéptidos de rhabdovirus.

65 Los segmentos de ácido nucleico usados en la presente invención como se define por las reivindicaciones,

independientemente de la longitud de la propia secuencia codificante, pueden combinarse con otras secuencias de ácido nucleico, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios adicionales de enzimas de restricción, sitios de clonación múltiple, otros segmentos codificantes, y similares, de modo que su longitud global puede variar considerablemente. Por lo tanto se contempla que puede emplearse un fragmento de ácido nucleico de casi

5 cualquier longitud, estando limitada la longitud total preferiblemente por la facilidad de preparación y uso en el protocolo pretendido de ácido nucleico recombinante.

Se contempla que las construcciones de ácido nucleico de la presente invención que se definen por las reivindicaciones pueden codificar uno o más polipéptidos de longitud completa de cualquier fuente o codificar una 10 versión truncada o modificada del o los polipéptidos, por ejemplo un polipéptido truncado de rhabdovirus, de modo que el transcrito de la región codificante representa la versión truncada. El transcrito truncado después puede traducirse en una proteína truncada. Como alternativa, una secuencia de ácido nucleico puede codificar una secuencia polipeptídica de longitud completa con secuencias codificantes heterólogas adicionales, por ejemplo para permitir la purificación del polipéptido, su transporte, secreción, modificación post-traduccional, o para beneficios

15 terapéuticos tales como direccionamiento o eficacia. Como se ha analizado anteriormente, puede añadirse una marca u otro polipéptido heterólogo a la secuencia que codifica el polipéptido modificado, donde "heterólogo" se refiere a un polipéptido o segmento del mismo que no es igual que el polipéptido modificado o se encuentra asociado con o codificado por el virus de origen natural.

20 En un ejemplo no limitante, puede prepararse una o más construcciones de ácido nucleico que incluyan un tramo contiguo de nucleótidos idéntico a o complementario a un segmento viral particular, tal como un gen N, P, M, G, o L de rhabdovirus como se define por las reivindicaciones. Una construcción de ácido nucleico puede ser de al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 15.000, 20.000, 30.000, 50.000,

25 100.000, 250.000, 500.000, 750.000, hasta al menos 1.000.000 nucleótidos de longitud, así como construcciones de mayor tamaño, hasta e incluyendo tamaños cromosómicos (incluyendo todas las longitudes intermedias e intervalos intermedios). Se entenderá fácilmente que "longitudes intermedias" e "intervalos intermedios", como se usan en este documento, significan cualquier longitud o intervalos incluyendo o entre los valores citados (es decir, todos los números enteros incluyendo y entre dichos valores).

30 Los segmentos de ácido nucleico usados en la presente invención abarcan ácidos nucleicos modificados como se define por las reivindicaciones que codifican polipéptidos modificados. Dichas secuencias pueden surgir como una consecuencia de redundancia de codones y equivalencia funcional que se sabe que sucede de forma natural dentro de las secuencias de ácido nucleico y las proteínas así codificadas. Como alternativa, pueden crearse proteínas o

35 péptidos funcionalmente equivalentes mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante, en que pueden diseñarse por ingeniería cambios en la estructura proteica, basada en consideraciones de las propiedades de los aminoácidos que se están intercambiando. Los cambios diseñados por el ser humano pueden introducirse a través de la aplicación de técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, para introducir mejoras a la antigenicidad o ausencia de la misma de la proteína, para reducir los efectos de toxicidad de la proteína in vivo para un sujeto al que

40 se ha dado la proteína, o para aumentar la eficacia de cualquier tratamiento que implique la proteína o un virus que comprenda dicha proteína.

En otras ciertas realizaciones, la invención se refiere a segmentos aislados de ácido nucleico y vectores recombinantes que incluyen dentro de su secuencia una secuencia contigua de ácido nucleico desde la mostrada en

45 secuencias identificadas en este documento, es decir, como se define por las reivindicaciones. Dichas secuencias, sin embargo, puede mutarse para producir un producto proteico cuya actividad esté alterada con respecto al tipo silvestre.

También se entenderá que esta descripción no se limita a las secuencias particulares de ácido nucleico y

50 aminoácidos de estas secuencias identificadas. Por lo tanto los vectores recombinantes y segmentos aislados de ácido nucleico pueden incluir diversamente regiones codificantes de rhabdovirus en sí mismas, regiones codificantes que albergan alteraciones o modificaciones seleccionadas en la región codificante básica, o pueden codificar polipéptidos más grandes que no obstante incluyen regiones codificantes de rhabdovirus, o pueden codificar proteínas o péptidos equivalentes biológicamente funcionales que tienen secuencias variantes de aminoácidos.

55 Los segmentos de ácido nucleico de la presente invención se definen por las reivindicaciones y pueden codificar proteínas o péptidos de rhabdovirus que son el equivalente funcional biológico de, o variantes o mutantes de rhabdovirus que aumentan el beneficio terapéutico del virus. Dichas secuencias pueden surgir como consecuencia de la redundancia de codones y equivalencia funcional que se sabe que sucede de forma natural dentro de las

60 secuencias de ácido nucleico y las proteínas así codificadas. Como alternativa, pueden crearse proteínas o péptidos funcionalmente equivalentes mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante, en que pueden diseñarse por ingeniería cambios en la estructura proteica, basada en consideraciones de las propiedades de los aminoácidos que se están intercambiando. Los cambios diseñados por el hombre pueden introducirse a través de la aplicación de técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, para introducir mejoras en la unión a células cancerosas de

65 una proteína viral.

B. Mutagénesis de polinucleótidos de rhabdovirus

En diversas realizaciones, el polinucleótido de rhabdovirus definido por las reivindicaciones puede alterarse o mutagenizarse. Las alteraciones o mutaciones pueden incluir inserciones, deleciones, mutaciones puntuales,

5 inversiones, y similares y puede provocar la modulación, activación y/o inactivación de ciertas proteínas o mecanismos moleculares, así como la alteración de la función, localización, o expresión de un producto génico, en particular las que vuelven a un producto génico no funcional. Cuando se emplea, la mutagénesis de un polinucleótido que codifica todo o parte de un rhabdovirus puede conseguirse por diversos procedimientos mutagénicos convencionales (Sambrook et al., 2001). La mutación es el proceso por el cual suceden cambios en la cantidad o estructura de un organismo. La mutación puede implicar modificación de la secuencia de nucleótidos de un único gen, bloques de genes o genomas completos. Los cambios en genes individuales pueden ser la consecuencia de mutaciones puntuales que implican la eliminación, adición o sustitución de una única base nucleotídica dentro de una secuencia de ADN, o pueden ser la consecuencia de cambios que implican la inserción o deleción de grandes cantidades de nucleótidos.

1. Mutagénesis aleatoria

a. Mutagénesis de inserción

La mutagénesis de inserción se basa en la inactivación de un gen mediante inserción de un fragmento conocido de ácido nucleico. Como implica la inserción de algún tipo de fragmento de ácido nucleico, las mutaciones generadas son generalmente de pérdida de función, en lugar de mutaciones de ganancia de función. Sin embargo, existen varios ejemplos de inserciones que generan mutaciones de ganancia de función. La mutagénesis de inserción puede conseguirse usando técnicas convencionales de biología molecular.

b. Mutagénesis química

La mutagénesis química ofrece ciertas ventajas, tales como la capacidad de encontrar un rango completo de mutaciones con grados de severidad fenotípica, y es fácil y barata de realizar. La mayoría de los carcinógenos químicos producen mutaciones en el ADN. El benzo[a]pireno, N-acetoxi-2-acetil aminofluoreno y aflotoxina B1 causan transversiones GC a TA en bacterias y células de mamífero. El benzo[a]pireno también puede producir sustituciones de bases tales como AT a TA. Los compuestos de N-nitroso producen transiciones GC a AT. La alquilación de la posición 04 de la timina inducida por exposición a n-nitrosourea provoca transiciones de TA a CG.

35 c. Mutagénesis por radiación

Las moléculas biológicas se degradan por radiación ionizante. La adsorción de la energía incidente conduce a la formación de iones y radicales libres, y la rotura de algunos enlaces covalentes. La susceptibilidad a daño por radiación parece bastante variable entre moléculas, y entre diferentes formas cristalinas de la misma molécula. Depende de la dosis total acumulada, y t de la tasa de dosis (ya que una vez están presentes los radicales libres, el daño molecular que causan depende de su tasa de difusión natural y por tanto del tiempo real). El daño se reduce y se controlar preparando la muestra lo más fría posible. La radiación ionizante causa daño en el ADN, generalmente proporcional a la tasa de dosis.

45 En la presente descripción, la expresión "radiación ionizante" significa radiación que comprende partículas o fotones que tienen suficiente energía o pueden producir suficiente energía para producir ionización (ganancia o pérdida de electrones). Una radiación ionizante ejemplar y preferida es una radiación x. La cantidad de radiación ionizante necesaria en una célula dada o para una molécula particular generalmente depende de la naturaleza de esa célula o molécula y la naturaleza de la diana de mutación. Los medios para determinar una cantidad eficaz de radiación son bien conocidos en la técnica.

d. Mutagénesis por exploración in vitro

También puede introducirse mutagénesis aleatoria usando PCR propensa a errores. La tasa de mutagénesis puede

55 aumentarse realizando PCR en múltiples tubos con diluciones de moldes. Una técnica particularmente útil de mutagénesis es mutagénesis por exploración con alanina en que varios restos se sustituyen individualmente con el aminoácido alanina de modo que puedan determinarse los efectos de perder interacciones de cadenas laterales, minimizando al mismo tiempo el riesgo de perturbaciones a gran escala en la conformación proteica (Cunningham et al., 1989).

La mutagénesis de saturación por exploración in vitro proporciona un método rápido para obtener una gran cantidad de información de estructura-función incluyendo: (i) identificación de restos que modulan la especificidad de unión a ligando, (ii) una mejor comprensión de la unión a ligando basada en la identificación de esos aminoácidos que retienen la actividad y esos que anulan la actividad en una localización dada, (iii) una evaluación de la plasticidad

65 global de un sitio activo o subdominio proteico, (iv) identificación de sustituciones de aminoácidos que provocan unión aumentada.

2. Mutagénesis dirigida al sitio

La mutagénesis dirigida al sitio guiada por estructura representa una poderosa herramienta para la disección y

5 diseño de interacciones proteína-ligando (Wells, 1996; Braisted et al., 1996). La técnica proporciona la preparación y ensayo de variantes de secuencia introduciendo uno o más cambios de secuencia de nucleótidos en un ADN seleccionado.

C. Vectores

Para generar mutaciones en un genoma de rhabdovirus, pueden codificarse polipéptidos nativos y modificados por una molécula de ácido nucleico comprendida en un vector. El término "vector" se usa para hacer referencia a una molécula de ácido nucleico vehículo en que puede insertarse una secuencia exógena de ácido nucleico para su introducción en una célula donde puede replicarse. Una secuencia de ácido nucleico puede ser "exógena", que

15 significa que es foránea a la célula en que se está introduciendo el vector o que la secuencia es homóloga a una secuencia en la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula hospedadora en que la secuencia no se encuentra habitualmente. Los vectores incluyen plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus de animales, y virus de plantas), y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC). Un especialista en la técnica estaría bien equipado para construir un vector a través de técnicas recombinantes convencionales, que se describen en Sambrook et al. (2001) y Ausubel et al. (1994).

Además de codificar un polipéptido modificado tal como proteína N, proteína P, proteína M, proteína G, o proteína L modificada, un vector puede codificar secuencias polipeptídicas no modificadas tales como una marca o molécula de direccionamiento. Los vectores útiles que codifican dichas proteínas de fusión incluyen vectores pIN (Inouye et al.,

25 1985), vectores que codifican un tramo de histidinas, y vectores pGEX, para su uso en la generación de proteínas de fusión solubles de glutatión S-transferasa (GST) para posterior purificación y separación o escisión. Una molécula de direccionamiento es una que dirige el polipéptido modificado a un órgano, tejido, célula, u otra localización particular en el cuerpo de un sujeto. Como alternativa, la molécula de direccionamiento altera el tropismo de un organismo, tal como rhabdovirus por ciertos tipos celulares, por ejemplo, células cancerosas.

La expresión "vector de expresión" se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte de un producto génico capaz de transcribirse. En algunos casos, se traducen moléculas de ARN en una proteína, polipéptido, o péptido. En otros casos, estas secuencias no se traducen, por ejemplo, en la producción de moléculas antisentido o ribozimas. Los vectores de expresión pueden contener diversas "secuencias de control",

35 que se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de una secuencia codificante unida de forma funcional en un organismo hospedador particular. Además de secuencias de control que rigen la transcripción y la traducción, los vectores y vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que cumplen otras funciones también y se describen infra.

1. Promotores y potenciadores

Un "promotor" es una secuencia de control que es una región de una secuencia de ácido nucleico en que están controlados el inicio y la tasa de transcripción. Puede contener elementos genéticos que se unen a proteínas y moléculas reguladoras, tales como ARN polimerasa y otros factores de transcripción. Las expresiones "posicionado

45 de forma funcional", "acoplado de forma funcional", "unido de forma funcional", "bajo control", y "bajo control transcripcional" significan que un promotor está en una localización y/u orientación funcional correcta en relación a una secuencia de ácido nucleico para controlar el inicio de la transcripción y/o expresión de esa secuencia. Un promotor puede usarse o no junto con un "potenciador", que se refiere a una secuencia reguladora de acción en cis implicada en la activación de la transcripción de una secuencia de ácido nucleico.

Un promotor puede ser uno asociado de forma natural con un gen o secuencia, que pueden obtenerse por aislamiento de las secuencias no codificantes 5' localizadas cadena arriba del segmento codificante y/o exón. Dicho promotor pueden mencionarse como "endógeno". Asimismo, un potenciador puede ser uno asociado de forma natural con una secuencia de ácido nucleico, localizado cada abajo o cadena arriba de esa secuencia. Como

55 alternativa, se obtendrán ciertas ventajas posicionando el segmento de ácido nucleico codificante bajo el control de un promotor recombinante o heterólogo, que se refiere a un promotor que no está normalmente asociado con una secuencia de ácido nucleico en su entorno natural. Un potenciador recombinante o heterólogo se refiere también a un potenciador no asociado normalmente con una secuencia de ácido nucleico en su entorno natural. Dichos promotores o potenciadores pueden incluir promotores o potenciadores de otros genes, y promotores o potenciadores aislados de otras células procariotas, virus, o células eucariotas, y promotores o potenciadores que no "existen de forma natural", es decir, que contienen diferentes elementos de diferentes regiones reguladoras de la transcripción, y/o mutaciones que alteran la expresión.

Además de producir secuencias de ácido nucleico de promotores y potenciadores de forma sintética, las secuencias

65 pueden producirse usando tecnología de clonación recombinante y/o amplificación de ácido nucleico, incluyendo PCR™, en relación a las composiciones descritas en este documento (véase la patente de Estados Unidos

4.683.202, la patente de Estados Unidos 5.928.906). Además, se contempla que pueden emplearse también las secuencias de control que dirigen la transcripción y/o expresión de secuencias dentro de orgánulos no nucleares tales como mitocondrias, cloroplastos, y similares.

5 Naturalmente, puede ser importante emplear un promotor y/o potenciador que dirija de forma eficaz la expresión del segmento de ADN en el tipo celular, orgánulo, y organismo elegidos para la expresión. Los especialistas en la técnica de biología molecular generalmente conocen el uso de promotores, potenciadores, y combinaciones de tipo celular para la expresión de proteínas, por ejemplo, véase Sambrook et al. (2001). Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos de tejido, selectivos de célula (es decir, más activos en un tipo celular en comparación con otro), inducibles, y/o útiles en las condiciones apropiadas para dirigir un alto nivel de expresión del segmento de ácido nucleico introducido, tal como es ventajoso en la producción a gran escala de proteínas y/o péptidos recombinantes. El promotor puede ser heterólogo o endógeno.

Varios elementos/promotores que pueden emplearse, en el contexto de la presente invención, para regular la

15 expresión de un gen. Esta lista no pretende ser exhaustiva de todos los elementos posibles implicados en la promoción de la expresión sino, simplemente, es ejemplar de los mismos. También se proporcionan ejemplos de elementos inducibles, que son regiones de una secuencia de ácido nucleico que pueden activarse en respuesta a un estímulo específico. El promotor/potenciador (referencias) incluyen: cadena pesada de inmunoglobulina (Banerji et al., 1983; Gilles et al., 1983; Grosschedl et al., 1985; Atchinson et al., 1986, 1987; Imler et al., 1987; Weinberger et al., 1984; Kiledjian et al., 1988; Porton et al.; 1990); cadena ligera de inmunoglobulina (Queen et al., 1983; Picard et al., 1984); receptor de células T (Luria et al., 1987; Winoto et al., 1989; Redondo et al.; 1990); HLA DQ a y/o DQ β (Sullivan et al., 1987); interferón β (Goodbourn et al., 1986; Fujita et al., 1987; Goodbourn et al., 1988); interleuquina2 (Greene et al., 1989); receptor de interleuquina-2 (Greene et al., 1989; Lin et al., 1990); MHC Clase II 5 (Koch et al., 1989); MHC Clase II HLA-DRα (Sherman et al., 1989); β-actina (Kawamoto et al., 1988; Ng et al.; 1989); creatina

25 quinasa muscular (MCK) (Jaynes et al., 1988; Horlick et al., 1989; Johnson et al., 1989); prealbúmina (transtiretina) (Costa et al., 1988); elastasa I (Omitz et al., 1987); metalotioneína (MTII) (Karin et al., 1987; Culotta et al., 1989); colagenasa (Pinkert et al., 1987; Angel et al., 1987); albúmina (Pinkert et al., 1987; Tronche et al., 1989, 1990); αfetoproteína (Godbout et al., 1988; Campere et al., 1989); γ-globina (Bodine et al., 1987; Perez-Stable et al., 1990); β-globina (Trudel et al., 1987); c-fos (Cohen et al., 1987); c-HA-ras (Triesman, 1986; Deschamps et al., 1985); insulina (Edlund et al., 1985); molécula de adhesión de células neurales (NCAM) (Hirsh et al., 1990); α1-antitripaína (Latimer et al., 1990); histona H2B (TH2B) (Hwang et al., 1990); colágeno de ratón y/o tipo I (Ripe et al., 1989); proteínas reguladas por glucosa (GRP94 y GRP78) (Chang et al., 1989); hormona de crecimiento de rata (Larsen et al., 1986); amiloide A de suero humano (SAA) (Edbrooke et al., 1989); troponina I (TN I) (Yutzey et al., 1989); factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (Pech et al., 1989); distrofia muscular de Duchenne (Klamut et al.,

35 1990); SV40 (Banerji et al., 1981; Moreau et al., 1981; Sleigh et al., 1985; Firak et al., 1986; Herr et al., 1986; Imbra et al., 1986; Kadesch et al., 1986; Wang et al., 1986; Ondek et al., 1987; Kuhl et al., 1987; Schaffner et al., 1988); polioma (Swartzendruber et al., 1975; Vasseur et al., 1980; Katinka et al., 1980, 1981; Tyndell et al., 1981; Dandolo et al., 1983; de Villiers et al., 1984; Hen et al., 1986; Satake et al., 1988; Campbell et al., 1988); retrovirus (Kriegler et al., 1982, 1983; Levinson et al., 1982; Kriegler et al., 1983, 1984a, b, 1988; Bosze et al., 1986; Miksicek et al., 1986; Celander et al., 1987; Thiesen et al., 1988; Celander et al., 1988; Chol et al., 1988; 1Reisman et al., 1989); virus de papiloma (Campo et al., 1983; Lusky et al., 1983; Spandidos y Wilkie, 1983; Spalholz et al., 1985; Lusky et al., 1986; Cripe et al., 1987; Gloss et al., 1987; Hirochika et al., 1987; Stephens et al., 1987); virus de la hepatitis B (Bulla et al., 1986; Jameel et al., 1986; Shaul et al., 1987; Spandau et al., 1988; Vannice et al., 1988); virus de la inmunodeficiencia humana (Muesing et al., 1987; Hauber et al., 1988; Jakobovits et al., 1988; Feng et al., 1988;

45 Takebe et al., 1988; Rosen et al., 1988; Berkhout et al., 1989; Laspia et al., 1989; Sharp et al., 1989; Braddock et al., 1989); citomegalovirus (CMV) (Weber et al., 1984; Boshart et al., 1985; Foecking et al., 1986); y virus de la leucemia del simio gibón (Holbrook et al., 1987; Quinn et al., 1989).

Los elementos inducibles (elemento/inductor (referencias)) incluyen: MT II/éster de forbol (TFA), metales pesados (Palmiter et al., 1982; Haslinger et al., 1985; Searle et al., 1985; Stuart et al., 1985; Imagawa et al., 1987, Karin et al., 1987; Angel et al., 1987b; McNeall et al., 1989); MMTV (virus del tumor mamario del ratón)/glucocorticoides (Huang et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors et al., 1983; Chandler et al., 1983; Lee et al., 1984; Ponta et al., 1985; Sakai et al., 1988); interferón β/poli(rI)x, poli(rc) (Tavernier et al., 1983); Adenovirus 5 E2/E1A (Imperiale et al., 1984); colagenasa/éster de forbol (TPA) (Angel et al., 1987a); estromelisina/éster de forbol (TPA) (Angel et al., 1987b);

55 SV40/éster de forbol (TPA) (Angel et al., 1987b); gen MX murino/interferón, virus de la enfermedad de Newcastle (Hug et al., 1988); gen GRP78/A23187 (Resendez et al., 1988); α-2-macroglobulina/IL-6 (Kunz et al., 1989); vimentina/suero (Rittling et al., 1989); gen H-2Kb de MHC clase I/interferón (Blanar et al., 1989); HSP70/ElA, antígeno T grande de SV40 (Taylor et al., 1989, 1990a, 1990b); proliferina/éster de forbol-TPA (Mordacq et al., 1989); factor de necrosis tumoral/PMA (Hensel et al., 1989); y gen α de hormona estimuladora de tiroides/hormona tiroides (Chatterjee et al., 1989).

La identidad de promotores o elementos específicos de tejido o selectivos de tejido (es decir, promotores que tienen una actividad mayor en una célula en comparación con otra), así como ensayos para caracterizan su actividad, es bien conocida para los especialistas en la técnica. Ejemplos de dichas regiones incluyen el gen LIMK2 humano 65 (Nomoto et al. 1999), el gen del receptor 2 de somatostatina (Kraus et al., 1998), el gen de unión a ácido retinoico

del epidídimo murino (Lareyre et al., 1999), CD4 humana (Zhao-Emonet et al., 1998), alfa2 (XI) colágeno de ratón (Tsumaki, et al., 1998), gen del receptor de dopamina D1A (Lee, et al., 1997), factor II de crecimiento tipo insulina (Wu et al., 1997), molécula-1 de adhesión celular endotelial de plaquetas humanas (Almendro et al., 1996), y el promotor SM22a.

5 Promotores virales adicionales, promotores/potenciadores celulares y promotores/potenciadores inducibles que podrían usarse en combinación con la presente invención se enumeran en este documento. Además también podría usarse cualquier combinación de promotor/potenciador (según la base de datos de promotores eucariotas EPDB) para dirigir la expresión de genes estructurales que codifican enzimas de procesamiento de oligosacáridos,

10 proteínas accesorias de plegamiento de proteínas, proteínas marcadoras de selección o una proteína heteróloga de interés. Como alternativa, puede emplearse un promotor específico de tejido para terapia génica contra el cáncer (Tabla 2) o el direccionamiento a tumores (Tabla 3) con las moléculas de ácido nucleico de la presente invención.

Tabla 2. Promotores candidatos específicos de tejido para terapia génica contra el cáncer

Promotor específico de tejido

Cánceres en que el promotor es activo Células normales en que el promotor es activo

Antígeno carcinoembrionario (CEA)*

La mayoría de carcinomas colorrectales; 50 % de carcinomas de pulmón; 40-50 % de carcinomas gástricos; la mayoría de carcinomas pancreáticos; muchos carcinomas de mama Mucosa colónica; mucosa gástrica; epitelio pulmonar; glándulas sudoríparas ecrinas; células en testículos

Antígeno específico de próstata (PSA)

La mayoría de carcinomas de próstata Epitelio de próstata

Péptidos intestinal vasoactivo (VIP)

La mayoría de cánceres pulmonares no microcíticos Neuronas; linfocitos; mastocitos; eosinófilos

Proteína tensioactiva A (SP-A)

Muchas células de adenocarcinomas pulmonares Neumocitos tipo II; Clara

Homólogo humano de achaete-scute (hASH)

La mayoría de cánceres pulmonares microcíticos Células neuroendocrinas en pulmón

Mucina-1 (MUC1)**

La mayoría de adenocarcinomas (que se originan a partir de cualquier tejido) Células epiteliales glandulares en mama y en tracto respiratorio, gastrointestinal, y genitourinario

Alfa-fetoproteína

La mayoría de carcinomas hepatocelular; posiblemente muchos cánceres testiculares Hepatocitos (en ciertas condiciones); testículos

Albúmina

La mayoría de carcinomas hepatocelulares Hepatocitos

Tirosinasa

La mayoría de melanomas Melanocitos; astrocitos; células de Schwann; algunas neuronas

Proteína de unión a tirosina (TRP)

La mayoría de melanomas Melanocitos; astrocitos, células de Schwann; algunas neuronas

Queratina 14

Presumiblemente muchos carcinomas de células escamosas (por ejemplo: cánceres de cabeza y cuello) Queratinocitos

EBV LD-2

Muchos carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello Queratinocitos del tracto digestivo superior

Proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP)

Muchos astrocitomas Astrocitos

Proteína básica de mielina (MBP)

Muchos gliomas Oligodendrocitos

Enzima convertidora de angiotensina específico de testículo (ACE específica de testículo)

Posiblemente muchos cánceres testiculares Espermatazoo

Osteocalcina

Posiblemente muchos osteosarcomas Osteoblastos

Tabla 3. Promotores candidatos para su uso con un direccionamiento específico de tejido de tumores

Promotor

Cánceres en que el promotor es activo Células normales en que el promotor es activo

Promotor regulado por E2F

Casi todos los cánceres Células en proliferación

HLA-G

Muchos carcinomas colorrectales; muchos melanomas; posiblemente muchos otros cánceres Linfocitos; monocitos; espermatocitos; trofoblastos

FasL

La mayoría de melanomas; muchos carcinomas pancreáticos; la mayoría de Leucocitos activados: neuronas; células endoteliales;

astrocitomas posiblemente muchos otros cánceres

queratinocitos; células en tejidos inmunoprivilegiados; algunas células en pulmones, ovarios, hígado, y próstata

Promotor regulado por Myc

La mayoría de carcinomas pulmonares (tanto microcíticos como no microcíticos); la mayoría de carcinomas colorrectales Células en proliferación (solamente algunos tipos celulares): células epiteliales mamarias (incluyendo no proliferantes)

MAGE-1

Muchos melanomas; algunos carcinomas pulmonares no microcíticos; algunos carcinomas de mama Testículo

VEGF

70 % de todos los cánceres (sobre-expresión constitutiva en muchos cánceres) Células en sitios de neovascularización (pero a diferencia de tumores, la expresión es transitoria, menos fuerte, y nunca constitutiva)

bFGF

Presumiblemente muchos cánceres diferentes, ya que la expresión de bFGF se induce por condiciones isquémicas Células en sitios de isquemia (pero a diferencia de tumores, la expresión es transitoria, menos fuerte, y nunca constitutiva)

COX-2

La mayoría de carcinomas colorrectales; muchos carcinomas pulmonares; posiblemente muchos otros cánceres Células en sitios de inflamación

IL-10

La mayoría de carcinomas colorrectales; muchos carcinomas pulmonares; muchos carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello; posiblemente muchos otros cánceres Leucocitos

GRP78/BiP

Presumiblemente muchos cánceres diferentes, ya que la expresión de GRP7S se induce por condiciones específicas de tumor Células en sitios de isquemia

Elementos CarG de Egr-1

Inducidos por radiación de ionización, de modo que de forma concebible la mayoría de los tumores tras radiación Células expuestas a radiación ionizante; leucocitos

2. Señales de inicio y sitios internos de unión al ribosoma

5 También puede ser necesaria una señal de inicio específica para una traducción eficaz de secuencias codificantes. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG o secuencias adyacentes. Puede necesitarse proporcionar señales exógenas de control de la traducción, incluyendo el codón de inicio ATG. Un especialista en la técnica sería fácilmente capaz de determinar esto y proporcionar las señales necesarias. Es bien sabido que el codón de inicio debe estar "en fase" con la fase de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción del

10 inserto completo. Las señales exógenas de control de la traducción y codones de inicio pueden ser naturales o sintéticos. La eficacia de expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos apropiados potenciadores de la transcripción.

En ciertos aspectos de la invención, el uso de sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) se usa para crear

15 mensajes multigén, o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de superar el modelo de exploración con ribosoma de la traducción dependiente de capuchón metilado 5' y comenzar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988). Se han descrito los elementos IRES de dos miembros de la familia de picornavirus (polio y encefalomiocarditis) (Pelletier y Sonenberg, 1988), así como un IRES de un mensaje de mamífero (Macejak y Sarnow, 1991). Los elementos IRES pueden ligarse a fases de lectura abierta heterólogas. Pueden transcribirse

20 múltiples fases de lectura abierta juntas, cada una separada por un IRES, creando mensajes policistrónicos. En virtud del elemento IRES, cada fase de lectura abierta es accesible a los ribosomas para una traducción eficaz. Pueden expresarse de forma eficaz múltiples genes usando un único promotor/potenciador para transcribir un único mensaje (véanse las patentes de Estados Unidos 5.925.565 y 5.935.819).

3. Sitios de clonación múltiple

Los vectores pueden incluir un sitio de clonación múltiple (MCS), que es una región de ácido nucleico que contiene múltiples sitios de enzimas de restricción, cualquiera de los cuales puede usarse junto con tecnología recombinante

5 convencional para digerir el vector. (Véase Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, y Cocea, 1997). "Digestión con enzima de restricción" se refiere a escisión catalítica de una molécula de ácido nucleico con una enzima que funciona solamente en localizaciones específicas en una molécula de ácido nucleico. Muchas de estas enzimas de restricción están disponibles en el mercado. El uso de dichas enzimas está ampliamente comprendido por los especialistas en la técnica. Frecuentemente, se linealiza o fragmenta un vector usando una enzima de restricción que corta dentro del MCS para posibilitar que secuencias exógenas se liguen al vector: "Ligamiento" se refiere al proceso de formar enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico, que pueden estar contiguos o no entre sí. Las técnicas que implican enzimas de restricción y reacciones de ligamiento son bien conocidas para los especialistas en la técnica de tecnología recombinante.

15 4. Señales de terminación

Los vectores o construcciones de la presente invención generalmente comprenderán al menos una señal de terminación. Una "señal de terminación" o "terminador" está compuesto por secuencias de ARN implicadas en la terminación específica de un transcrito de ARN por una ARN polimerasa. Por tanto, en ciertas realizaciones se contempla una señal de terminación que finaliza la producción de transcrito de ARN. Un terminador puede ser necesario in vivo para conseguir niveles deseables de mensaje.

En virus de ARN con sentido negativo, incluyendo rhabdovirus, la terminación se define por un motivo de ARN.

25 Los terminadores contemplados para su uso en la invención incluyen cualquier terminador conocido de la transcripción descrito en este documento o conocido para los especialistas en la técnica, incluyendo aunque sin limitación, por ejemplo, las secuencias de terminación de genes, tales como por ejemplo el terminador de la hormona del crecimiento bovino o secuencias virales de terminación, tales como por ejemplo el terminador de SV40. En ciertas realizaciones, la señal de terminación puede ser una ausencia de secuencia transcribible o traducible, tal como debido a un truncamiento de secuencia.

5. Señales de poliadenilación

En expresión, particularmente expresión eucariota, normalmente se incluirá una señal de poliadenilación para

35 efectuar la apropiada poliadenilación del transcrito. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la práctica satisfactoria de la invención, y/o puede emplearse cualquiera de estas secuencias. Realizaciones preferidas incluyen la señal de poliadenilación de SV40 y/o la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino, conveniente y/o conocida por funcionar bien en diversas células diana. La poliadenilación puede aumentar la estabilidad del transcrito o puede facilitar el transporte citoplasmático.

6. Orígenes de replicación

Para propagar un vector en una célula hospedadora, puede contener uno o más orígenes de sitios de replicación (a menudo llamados "ori"), que es una secuencia específica de ácido nucleico en que se inicia la replicación. Como 45 alternativa puede emplearse una secuencia de replicación autónoma (ARS) si la célula hospedadora es de levadura.

7. Marcadores de selección y exploración

En ciertos aspectos de la invención, las células que contienen una construcción de ácido nucleico de la presente invención pueden identificarse in vitro o in vivo incluyendo un marcador en el vector de expresión. Dichos marcadores conferirían un cambio identificable a la célula que permite una fácil identificación de células que contienen el vector de expresión. Generalmente, un marcador de selección es uno que confiere una propiedad que permite su selección. Un marcador de selección positiva es uno en que la presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador de selección negativa es uno en que su presencia evita su selección. Un

55 ejemplo de un marcador de selección positiva es un marcador de resistencia a fármaco.

Habitualmente la inclusión de un marcador de selección por fármaco ayuda en la clonación e identificación de transformantes, por ejemplo, genes que confieren resistencia a neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol son marcadores de selección útiles. Además de marcadores que confieren un fenotipo que permite la discriminación de transformantes basada en la implementación de condiciones, también se contemplan otros tipos de marcadores incluyendo marcadores de exploración tales como GFP, cuya base es el análisis colorimétrico. Como alternativa, pueden utilizarse enzimas de exploración tales como la timidina quinasa (tk) del virus del herpes simple o la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Un especialista en la técnica también conocería el modo de emplear marcadores inmunológicos, posiblemente junto con análisis FACS. No se cree que el marcador 65 usado sea importante, siempre que sea capaz de expresarse simultáneamente con el ácido nucleico que codifica un producto génico. Ejemplos adicionales de marcadores de selección y exploración son bien conocidos para los

especialistas en la técnica.

D. Células hospedadoras

5 Como se usa en este documento, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular" pueden usarse de forma intercambiable. Todas estas expresiones también incluyen su descendencia, que es todas y cada una de las generaciones posteriores. Se entiende que toda la descendencia puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o accidentales. En el contexto de la expresión de una secuencia heteróloga de ácido nucleico, "célula hospedadora" se refiere a una célula procariota o eucariota, e incluye cualquier organismo transformable que sea

10 capaz de replicar un vector y/o expresar un gen heterólogo codificado por un vector. Una célula hospedadora puede usarse, y se ha usado, como receptora de vectores o virus (que no se califica como vector si no expresa polipéptidos exógenos). Una célula hospedadora puede estar "transfectada" o "transformada", que se refiere a un proceso por el cual el ácido nucleico exógeno, tal como una secuencia codificante de proteína modificada, se transfiere o introduce en la célula hospedadora. Una célula transformada incluye la célula objeto primaria y su descendencia.

15 Las células hospedadoras pueden derivarse de procariotas o eucariotas, incluyendo células de levadura, células de insecto, y células de mamífero, dependiendo de si el resultado deseado es la replicación del vector o la expresión de parte o todas las secuencias de ácido nucleico codificadas en el vector. Están disponibles numerosas líneas celulares y cultivos para su uso como una célula hospedadora, y pueden obtenerse a través de la American Type

20 Culture Collection (ATCC), que es una organización que sirve como archivo para cultivos vivos y materiales genéticos (www.atcc.org). Un hospedador apropiado puede determinarse por un especialista en la técnica basada en la estructura de vector y el resultado deseado. Un plásmido o cósmido, por ejemplo, puede introducirse en una célula hospedadora procariota para su replicación en muchos vectores. Las células bacterianas usadas como células hospedadoras para la replicación y/o expresión del vector incluyen DH5α, JM109, y KC8, así como varios

25 hospedadores bacterianos disponibles en el mercado tales como células competentes SURE® y células SOLOPACK™ Gold (STRATAGENE® La Jolla, CA). Como alternativa, podrían usarse células bacterianas tales como E. coli LE392 como células hospedadoras para virus fágicos. Las células de levadura apropiadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, y Pichia pastoris.

30 Ejemplos de células hospedadoras eucariotas para la replicación y/o expresión de un vector incluyen HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, Cos, CHO, Saos, y PC12. Están disponibles muchas células hospedadoras de diversos tipos celulares y organismos y serían conocidas para los especialistas en la técnica. Asimismo, puede usarse un vector viral junto con una célula hospedadora eucariota o procariota, particularmente una que sea permisiva para la replicación o expresión del vector.

35 Algunos vectores pueden emplear secuencias de control que les permiten replicarse y/o expresarse en células tanto procariotas como eucariotas. Un especialista en la técnica comprendería adicionalmente las condiciones bajo las cuales incubar todas las células hospedadoras descritas anteriormente para mantenerlas y para permitir la replicación de un vector. También se entienden y conocen las técnicas y condiciones que permitirían la producción a

40 gran escala de vectores, así como la producción de los ácidos nucleicos codificados por vectores y sus polipéptidos, proteínas, o péptidos afines.

E. Sistemas de expresión

45 Existen numerosos sistemas de expresión que comprenden al menos todo o parte de las composiciones analizadas anteriormente. Pueden emplearse sistemas basados en procariotas y/o eucariotas para su uso con la presente invención para producir secuencias de ácido nucleico, o sus polipéptidos, proteínas y péptidos afines. Muchos de estos sistemas están disponibles en el mercado y ampliamente.

50 El sistema de célula de insecto/baculovirus puede producir un alto nivel de expresión de proteína de un segmento heterólogo de ácido nucleico, tal como se describe en las patentes de Estados Unidos 5.871.986 y 4.879.236, y que puede comprarse, por ejemplo, con el nombre MAXBAC® 2.0 de INVITROGEN® y el SISTEMA DE EXPRESIÓN EN BACULOVIRUS BACPACK™ de CLONTECH®.

55 Además de los sistemas de expresión descritos de la invención, otros ejemplos de sistemas de expresión incluyen el sistema de expresión de mamífero inducible COMPLETE CONTROL™ de STRATAGENE®, que implica un receptor sintético inducible por ecdisona, o su sistema de expresión pET, un sistema de expresión de E. coli. Otro ejemplo de un sistema de expresión inducible está disponible en INVITROGEN®, que porta el sistema T-REX™ (expresión regulada por tetraciclina), un sistema de expresión de mamífero inducible que usa el promotor CMV de longitud

60 completa. INVITROGEN® también proporciona un sistema de expresión de levadura llamado el sistema de expresión de Pichia metanolica, que está diseñado para producción de alto nivel de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia metanolica. Un especialista en la técnica conocería el modo de expresar un vector, tal como una construcción de expresión, para producir una secuencia de ácido nucleico o su polipéptido, proteína, o péptido afín.

F. Detección de ácido nucleico

Además de su uso para dirigir la expresión de proteínas, polipéptidos y/o péptidos de poxvirus, las secuencias de ácido nucleico descritas en este documento tienen una otros diversos usos. Por ejemplo, tienen utilidad como

5 sondas o cebadores para realizaciones que implican hibridación de ácidos nucleicos. Pueden usarse en métodos de diagnóstico o selección de la presente invención. La detección de ácidos nucleicos que codifican rhabdovirus o moduladores polipeptídicos de rhabdovirus están abarcada por la invención.

1. Hibridación

El uso de una sonda o cebador entre 13 y 100 nucleótidos, preferiblemente entre 17 y 100 nucleótidos de longitud, o en algunos aspectos de la invención hasta 1-2 kilobases o más de longitud, permite la formación de una molécula dúplex que es tanto estable como selectiva. Generalmente se prefieren moléculas que tienen secuencias complementarias sobre tramos contiguos mayores de 20 bases de longitud, para aumentar la estabilidad y/o

15 selectividad de las moléculas híbridas obtenidas. Generalmente se prefiere diseñar moléculas de ácido nucleico para hibridación que tengan una o más secuencias complementarias de 20 a 30 nucleótidos, o incluso más largas donde se desee. Dichos fragmentos pueden prepararse fácilmente, por ejemplo, sintetizando directamente el fragmento por medios químicos o introduciendo secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para producción recombinante.

Por consiguiente, las secuencias de nucleótidos de la descripción pueden usarse por su capacidad de formar de forma selectiva moléculas dúplex con tramos complementarios de ADN y/o ARN o para proporcionar cebadores para amplificación de ADN o ARN a partir de muestras. Dependiendo de la aplicación concebida, se desearía emplear condiciones variables de hibridación para conseguir grados variables de selectividad de la sonda o cebadores por la

25 secuencia diana.

Para aplicaciones que requieren alta selectividad, normalmente se deseará emplear condiciones de rigurosidad relativamente elevada para formar los híbridos. Por ejemplo, condiciones de contenido salino relativamente bajo y/o alta temperatura, tal como se proporciona por aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,10 M de NaCl a temperaturas de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 70ºC. Dichas condiciones de alta rigurosidad toleran poco, si lo hay, desapareamiento entre la sonda o los cebadores y el molde o hebra diana y serían particularmente adecuadas para el aislamiento de genes específicos o para detectar transcritos específicos de ARNm. Es generalmente apreciado que las condiciones pueden volverse más rigurosas mediante la adición de cantidades crecientes de formamida.

35 Para ciertas aplicaciones, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, se aprecia que se prefieren condiciones de menor rigurosidad. En estas condiciones, la hibridación puede suceder incluso aunque las secuencias de las hebras de hibridación no sean perfectamente complementarias, sino que están desapareadas en una o más posiciones. Las condiciones pueden volverse menos rigurosas aumentando la concentración salina y/o disminuyendo la temperatura. Por ejemplo, podrían proporcionarse condiciones de rigurosidad media por aproximadamente 0,1 a 0,25 M de NaCl a temperaturas de aproximadamente 37ºC a aproximadamente 55ºC, mientras que podrían proporcionarse condiciones de baja rigurosidad por aproximadamente 0,15 M a aproximadamente 0,9 M de sal, a temperaturas que varían de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 55ºC. Las condiciones de hibridación pueden manipularse fácilmente dependiendo de los resultados deseados.

45 En otras realizaciones, la hibridación puede conseguirse en condiciones de, por ejemplo, Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), KCl 75 mM, MgCl2 3 mM, ditiotreitol 1,0 mM, a temperaturas entre aproximadamente 20ºC a aproximadamente 37ºC. Otras condiciones de hibridación utilizadas podrían incluir aproximadamente Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, a temperaturas que varían de aproximadamente 40ºC a aproximadamente 72ºC.

En ciertos aspectos, será ventajoso emplear ácidos nucleicos de secuencias definidas de la presente invención en combinación con un medio apropiado, tal como un marcador, para determinar la hibridación. Se conoce una amplia diversidad de medios indicadores apropiados en la técnica, incluyendo ligandos fluorescentes, radiactivos, enzimáticos u otros ligandos, tales como avidina/biotina, que son capaces de detectarse. En realizaciones

55 preferidas, puede desearse emplear un marcador fluorescente o una marca enzimática tal como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en lugar de reactivos radiactivos u otros reactivos ambientalmente indeseables. En el caso de marcas enzimáticas, se conocen sustratos indicadores colorimétricos que pueden emplearse para proporcionar un medio de detección que es visiblemente o espectrofotométricamente detectable, para identificar hibridación específica con muestras que contienen ácido nucleico complementario.

En general, se concibe que las sondas o cebadores descritos en este documento serán útiles como reactivos en hibridación en solución, como en PCR™, para la detección de expresión de genes correspondientes, así como en aspectos que emplean una fase sólida. Aquí, el ADN de ensayo (o ARN) se adsorbe o fija de otro modo a una matriz

o superficie seleccionada. Este ácido nucleico monocatenario fijado después se somete a hibridación con sondas

65 seleccionadas en condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas dependerán de las circunstancias particulares (dependiendo, por ejemplo, del contenido de G+C, tipo de ácido nucleico diana, fuente de ácido

nucleico, tamaño de la sonda de hibridación, etc.). La optimización de las condiciones de hibridación para la aplicación particular de interés es bien conocida para los especialistas en la técnica. Después de lavar las moléculas hibridadas para retirar moléculas de sonda unidas de forma no específica, se detecta la hibridación, y/o cuantifica, determinando la cantidad de marcador unido. Se describen métodos de hibridación en fase sólida representativos en 5 las patentes de Estados Unidos 5.843.663, 5.900.481 y 5.919.626. Se describen otros métodos de hibridación que pueden usarse en la práctica de la presente invención en las patentes de Estados Unidos 5.849.481, 5.849.486 y

5.851.772.

2. Amplificación de ácidos nucleicos

10 Los ácidos nucleicos usados como molde para amplificación pueden aislarse de células, tejidos u otras muestras de acuerdo con metodologías convencionales (Sambrook et al., 2001). En ciertas realizaciones, el análisis se realiza sobre homogenados de células completas o tejido o muestras de fluido biológico sin purificación sustancial del ácido nucleico molde. El ácido nucleico puede ser ADN genómico o ARN celular fraccionado o completo. Cuando se usa

15 ARN, puede desearse convertir primero el ARN en ADN complementario.

Se entiende que el término "cebador", como se usa en este documento, abarca cualquier ácido nucleico que sea capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un proceso dependiente de molde. Normalmente, los cebadores son oligonucleótidos de diez a veinte y/o treinta pares de bases de longitud, pero pueden emplearse

20 secuencias más largas. Los cebadores pueden proporcionarse en forma bicatenaria y/o monocatenaria, aunque se prefiere la forma monocatenaria.

Se ponen en contacto pares de cebadores diseñados para hibridar de forma selectiva con ácidos nucleicos correspondientes a secuencias de genes identificados en este documento con el ácido nucleico molde en

25 condiciones que permiten hibridación selectiva. Dependiendo de la aplicación deseada, pueden seleccionarse condiciones de hibridación de alta rigurosidad que solamente permitirán la hibridación con secuencias que son completamente complementarias a los cebadores. En otras realizaciones, la hibridación puede suceder en rigurosidad reducida para permitir la amplificación de ácidos nucleicos que contienen uno o más desapareamientos con las secuencias cebadoras. Una vez hibridado, el complejo molde-cebador se pone en contacto con una o más

30 enzimas que facilitan la síntesis de ácido nucleico dependiente de molde. Se realizan múltiples rondas de amplificación, también mencionadas como "ciclos", hasta que se produce una cantidad suficiente de producto de amplificación.

Están disponibles varios procesos dependientes de molde para amplificar las secuencias oligonucleotídicas

35 presentes en una muestra de molde dada. Uno de los mejores métodos de amplificación conocidos es la reacción en cadena de la polimerasa (mencionada como PCR™) que se describe con detalle en las patentes de Estados Unidos 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159, y en Innis et al., 1988.

Puede realizarse un procedimiento de amplificación por PCR™ con transcriptasa inversa para cuantificar la cantidad

40 de ARNm amplificado y es bien conocido (véase Sambrook et al., 2001; documento WO 90/07641; y patente de Estados Unidos 5.882.864).

Otro método para amplificación es la reacción en cadena de la ligasa ("LCR"), descrita en la solicitud europea Nº 320

308. La patente de Estados Unidos 4.883.750 describe un método similar a LCR para unir pares de sondas a una

45 secuencia diana. También puede usarse un método basado en PCR™ y ensayo de ligasa de oligonucleótidos (OLA), descrito en la patente de Estados Unidos 5.912.148. Se describen métodos alternativos para la amplificación de secuencias de ácido nucleico diana que pueden usarse en la práctica de la presente invención en las patentes de Estados Unidos 5.843.650, 5.846.709, 5.846.783, 5.849.546, 5.849.497, 5.849.547, 5.858.652, 5.866.366, 5.916.776, 5.922.574, 5.928.905, 5.928.906, 5.932.451, 5.935.825, 5.939.291 y 5.942.391, la solicitud GB Nº 2 202

50 328, y en la solicitud PCT Nº PCT/US89/01025. La Qbeta Replicasa, descrita en la solicitud PCT Nº PCT/US87/00880, también puede usarse como método de amplificación en la presente invención. También puede usarse la amplificación isotérmica como se describe por Walker et al. (1992). Así como la amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), descrita en la patente de Estados Unidos 5.916.779.

55 Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico incluyen sistemas de amplificación basados en transcripción (TAS), incluyendo amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA) y 3SR (Kwoh et al., 1989; solicitud PCT WO 88/10315). La solicitud europea Nº 329 822 describe un proceso de amplificación de ácido nucleico que implica sintetizar de forma cíclica ARN monocatenario ("ARNmc"), ADNmc, y ADN bicatenario (ADNbc), que puede usarse de acuerdo con la presente invención.

60 La solicitud PCT WO 89/06700 describe un esquema de amplificación de secuencia de ácido nucleico basado en la hibridación de una región promotora/secuencia cebadora con un ADN monocatenario ("ADNmc") diana seguida de la transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Otros métodos de amplificación incluyen "RACE" y "PCR unilateral" (Frohman, 1990; Ohara et al., 1989).

3. Detección de ácidos nucleicos

Después de cualquier amplificación, puede ser deseable separar y/o aislar el producto de amplificación del molde y/o el exceso de cebador. En un aspecto los productos de amplificación se separan por electroforesis en gel de agarosa, 5 agarosa-acrilamida, o poliacrilamida usando métodos convencionales (Sambrook et al., 2001).

La separación de ácidos nucleicos también puede realizarse por técnicas cromatográficas conocidas en la técnica. Existen muchos tipos de cromatografía que pueden usarse en la práctica de la presente invención, incluyendo cromatografía de adsorción, reparto, intercambio iónico, en hidroxilapatita, con tamiz molecular, en fase inversa, en

10 columna, en papel, en capa fina, y de gases sí como HPLC.

Los métodos típicos de visualización incluyen tinción de un gel con bromuro de etidio y visualización de las bandas bajo luz UV. Como alternativa, si los productos de amplificación se marcan de forma integral con nucleótidos marcados radio-o fluorométricamente, los productos de amplificación separados pueden exponerse a película de

15 rayos x o visualizarse en los espectros de excitación apropiados.

En aspectos particulares la detección es por transferencia de Southern e hibridación con una sonda marcada. Las técnicas implicadas en transferencia de Southern son bien conocidas para los especialistas en la técnica (véase Sambrook et al., 2001). Un ejemplo de lo anterior se describe en la patente de Estados Unidos 5.279.721, que

20 describe un aparato y método para la electroforesis y transferencia automatizada de ácidos nucleicos.

Otros métodos de detección de ácidos nucleicos que pueden usarse en la práctica de la presente invención se describen en las patentes de Estados Unidos 5.840.873, 5.843.640, 5.843.651, 5.846.708, 5.846.717, 5.846.726, 5.846.729, 5.849.487, 5.853.990, 5.853.992, 5.853.993, 5.856.092, 5.861.244, 5.863.732, 5.863.753, 5.866.331, 25 5.905.024, 5.910.407, 5.912.124, 5.912.145, 5.919.630, 5.925.517, 5.928.862, 5.928.869, 5.929.227, 5.932.413 y

5.935.791.

4. Otros ensayos

30 Pueden usarse otros métodos para selección genética dentro del alcance de la presente descripción por ejemplo, para detectar mutaciones en ácidos nucleicos genómicos, ADNc y/o muestras de ARN. Los métodos usados para detectar mutaciones puntuales incluyen electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante ("DGGE"), análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción ("RFLP"), métodos de escisión química o enzimática, secuenciación directa de regiones diana amplificadas por PCR™ (véase anteriormente), análisis de polimorfismos

35 de conformación monocatenaria ("SSCP") y otros métodos bien conocidos en la técnica. Un método para seleccionar mutaciones puntuales se basa en escisión con RNasa de desapareamientos de pares de bases en heterodúplex de ARN/ADN o ARN/ARN. Como se usa en este documento, el término "desapareamiento" se define como una región de uno o más nucleótidos no apareados o mal apareados en una molécula bicatenaria de ARN/ARN, ARN/ADN o ADN/ADN. Esta definición por tanto incluye desapareamientos debidos a mutaciones de inserción/deleción, así

40 como mutaciones puntuales de una o múltiples bases (por ejemplo, véase la patente de Estados Unidos 4.946.773. Se describen métodos alternativos para la detección de mutaciones de deleción, inserción o sustitución que pueden usarse en la práctica de la presente invención en las patentes de Estados Unidos 5.849.483, 5.851.770, 5.866.337,

5.925.525 y 5.928.870.

45 G. Métodos de transferencia génica

Se cree que los métodos adecuados para suministro de ácidos nucleicos para efectuar la expresión de composiciones de la presente descripción incluyen casi cualquier método por el cual puede introducirse un ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo vectores virales y no virales) en un orgánulo, una célula, un tejido o 50 un organismo, como se describe en este documento o como conocería un especialista en la técnica. Dichos métodos incluyen, aunque sin limitación, suministro directo de ácido nucleico tal como por inyección (patentes de Estados Unidos 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y 5.580.859), incluyendo microinyección (Harland y Weintraub, 1985; patente de Estados Unidos 5.789.215); por electroporación (patente de Estados Unidos 5.384.253); por precipitación con fosfato de calcio (Graham y Van Der 55 Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); usando DEAE dextrano seguido de polietilenglicol (Gopal, 1985); por carga sónica directa (Fechheimer et al., 1987); por transfección mediada por liposomas (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al.., 1991); por bombardeo con microproyectiles (solicitudes PCT Nº WO 94/09699 y 95/06128; patentes de Estados Unidos 5.610.042; 5.322.783, 5.563.055, 5.550.318, 5.538.877 y 5.538.880); por agitación con fibras de carburo de silicio

60 (Kaeppler et al., 1990; patentes de Estados Unidos 5.302.523 y 5.464.765); por transformación mediada por Agrobacterium (patentes de Estados Unidos 5.591.616 y 5.563.055); o por transformación mediada por PEG de protoplastos (Omirulleh et al., 1993; patentes de Estados Unidos 4.684.611 y 4.952.500); por captación de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus et al., 1985). A través de la aplicación de técnicas tales como éstas, puede transformarse de forma estable o transitoria uno o más orgánulos, células, tejidos u organismos.

H. Componentes y restos lipídicos

En ciertos aspectos, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden uno o más lípidos asociados con un ácido nucleico, una molécula de aminoácido, tal como un péptido, u otro compuesto de molécula pequeña.

5 En cualquiera de los ejemplos analizados en este documento, la molécula puede ser un polipéptido de rhabdovirus o un modulador polipeptídico de rhabdovirus, por ejemplo un ácido nucleico que codifica todo o parte de cualquiera de un polipéptido de rhabdovirus, o como alternativa, una molécula de aminoácidos que codifica todo o parte del modulador polipeptídico de rhabdovirus. Un lípido es una sustancia que es característicamente insoluble en agua y se puede extraer con un disolvente orgánico. Compuestos diferentes a los descritos específicamente en este documento son entendidos por un especialista en la técnica como lípidos, y están abarcados por las composiciones y métodos de la presente invención. Un componente lipídico y un no lípido pueden unirse entre sí, de forma covalente o no covalente.

Un lípido puede ser de origen natural o sintético (es decir, diseñado o producido por el hombre). Sin embargo, un

15 lípido es habitualmente una sustancia biológica. Los lípidos biológicos son bien conocidos en la técnica, e incluyen por ejemplo, grasas neutras, fosfolípidos, fosfoglicéridos, esteroides, terpenos, lisolípidos, glucoesfingolípidos, glucolípidos, sulfátidos, lípidos con ácidos grasos ligados por éter y éster y lípidos polimerizables, y combinaciones de los mismos.

Una molécula de ácido nucleico o molécula de aminoácidos, tal como un péptido, asociada con un lípido puede dispersarse en una solución que contiene un lípido, disolverse con un lípido, emulsionarse con un lípido, mezclarse con un lípido, combinarse con un lípido, unirse covalentemente a un lípido, contenerse en forma de una suspensión en un lípido o asociarse de otro modo con un lípido. Una composición asociada a lípido o lípido/virus de la presente invención no está limitada a ninguna estructura particular. Por ejemplo, también pueden simplemente esparcirse en

25 una solución, posiblemente formando agregados que no son uniformes en tamaño o forma. En otro ejemplo, pueden estar presentes en una estructura bicapa, como micelas, o con una estructura "colapsada". En otro ejemplo no limitante, también se contempla un complejo de lipofectamina (Gibco BRL)-poxvirus o Superfect (Qiagen)-virus.

En ciertos aspectos, una composición lipídica puede comprender aproximadamente un 1 %, aproximadamente un 2 %, aproximadamente un 3 %, aproximadamente un 4 % aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 6 %, aproximadamente un 7 %, aproximadamente un 8 %, aproximadamente un 9 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 11 %, aproximadamente un 12 %, aproximadamente un 13 %, aproximadamente un 14 %, aproximadamente un 15 %, aproximadamente un 16 %, aproximadamente un 17 %, aproximadamente un 18 %, aproximadamente un 19 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 21 %, aproximadamente un 22 %, 35 aproximadamente un 23 %, aproximadamente un 24 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 26 %, aproximadamente un 27 %, aproximadamente un 28 %, aproximadamente un 29 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 31 %, aproximadamente un 32 %, aproximadamente un 33 %, aproximadamente un 34 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 36 %, aproximadamente un 37 %, aproximadamente un 38 %, aproximadamente un 39 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 41 %, aproximadamente un 42 %, aproximadamente un 43 %, aproximadamente un 44 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 46 %, aproximadamente un 47 %, aproximadamente un 48 %, aproximadamente un 49 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 51 %, aproximadamente un 52 %, aproximadamente un 53 %, aproximadamente un 54 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 56 %, aproximadamente un 57 %, aproximadamente un 58 %, aproximadamente un 59 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 61 %, aproximadamente un 62 %, 45 aproximadamente un 63 %, aproximadamente un 64 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 66 %, aproximadamente un 67 %, aproximadamente un 68 %, aproximadamente un 69 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 71 %, aproximadamente un 72 %, aproximadamente un 73 %, aproximadamente un 74 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 76 %, aproximadamente un 77 %, aproximadamente un 78 %, aproximadamente un 79 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 81 %, aproximadamente un 82 %, aproximadamente un 83 %, aproximadamente un 84 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 86 %, aproximadamente un 87 %, aproximadamente un 88 %, aproximadamente un 89 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, aproximadamente un 99 %, aproximadamente un 100 %, o cualquier intervalo derivable de los mismos, de un lípido

55 particular, tipo lipídico, o componente no lipídico tal como un fármaco, proteína, azúcar, ácidos nucleicos u otro material descritos en este documento o que conociera un especialista en la técnica. En un ejemplo no limitante, una composición lipídica puede comprender aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 20 % de lípidos neutros, y aproximadamente un 33 % a aproximadamente un 34 % de un cerebrósido, y aproximadamente un 1 % de colesterol. Por tanto, se contempla que las composiciones lipídicas de la presente invención pueden comprender cualquiera de los lípidos, tipos de lípidos, u otros componentes en cualquier combinación o intervalo porcentual.

IV. Formulaciones farmacéuticas y regímenes de tratamiento

En un aspecto de la presente invención, se contempla un método de tratamiento para una enfermedad

65 hiperproliferativa o neoplásica, tal como cáncer, mediante el suministro de un rhabdovirus no VSV, tal como virus Maraba, virus Carajas, virus Muir Springs, y/o virus Bahia Grande. Ejemplos de cáncer contemplados para el

tratamiento incluyen cáncer pulmonar, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer óseo, cáncer testicular, cáncer cervical, cáncer gastrointestinal, linfomas, lesiones preneoplásicas, lesiones pre-neoplásicas en el pulmón, cáncer de colon, melanoma, cáncer de vejiga y cualquier otro cáncer o tumor que pueda tratarse, incluyendo cánceres metastásicos o distribuidos de forma sistémica.

5 Una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, generalmente, se define como esa cantidad suficiente para ralentizar, mejorar, reducir, minimizar, o limitar de forma detectable y repetida el grado de la enfermedad o sus síntomas. Pueden aplicarse definiciones más rigurosas, incluyendo eliminación, erradicación, o cura de la enfermedad.

Preferiblemente, los pacientes tendrán una función adecuada de la médula ósea (definida como un recuento absoluto de granulocitos periféricos de > 2.000/mm3 y un recuento de plaquetas de 100.000/mm3), una función hepática adecuada (bilirrubina < 1,5 mg/dl) y una función renal adecuada (creatinina < 1,5 mg/dl).

15 A. Administración

Para eliminar células, inhibir el crecimiento celular, inhibir la metástasis, disminuir el tamaño del tumor o tejido, y revertir de otro modo, suspender, o reducir el fenotipo maligno de células tumorales, usando los métodos y composiciones de la presente invención, generalmente se pondría en contacto una célula hiperproliferativa o neoplásica con una composición terapéutica tal como un virus o una construcción de expresión que codifica un polipéptido. Las vías de administración variarán, naturalmente, con la localización y naturaleza de la lesión, e incluyen, por ejemplo, administración y formulación intradérmica, transdérmica, parenteral, intravascular, intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutánea, regional, percutánea, intratraqueal, intraperitoneal, intra-arterial, intravesical, intratumoral, por inhalación, perfusión, lavado, inyección directa, alimentaria, y oral.

25 Para lograr un efecto terapéutico con respecto a una afección o enfermedad vascular, se pondría en contacto una célula vascular con el compuesto terapéutico. Cualquiera de las formulaciones y vías de administración analizadas con respecto al tratamiento o diagnóstico del cáncer también puede emplearse con respecto a enfermedades y afecciones vasculares.

Se contempla la inyección intratumoral, o inyección en la vasculatura tumoral para tumores concretos, sólidos, accesibles. También se contempla la administración local, regional o sistémica, particularmente para aquellos cánceres que están diseminados o tienen probabilidad de diseminarse de forma sistémica. Las partículas virales pueden administrarse mediante al menos o como mucho 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 inyecciones.

35 En el caso de intervención quirúrgica, la presente invención puede usarse de forma preoperatoria, para dejar a un tumor inoperable expuesto a resección. Como alternativa, la presente invención puede usarse en el momento de la cirugía, y/o después de ello, para tratar la enfermedad residual o metastásica. Por ejemplo, un lecho de tumor resecado puede inyectarse o perfundirse con una formulación que comprende un polipéptido de rhabdovirus o un rhabdovirus, que puede albergar o no una mutación, que es ventajosa para el tratamiento del cáncer o células cancerosas. La perfusión puede continuarse después de la resección, por ejemplo, dejando un catéter implantado en el sitio de la cirugía. También se concibe el tratamiento post-quirúrgico periódico.

También puede aplicarse administración continua cuando sea apropiado, por ejemplo, cuando se escinde un tumor y

45 el lecho del tumor se trata para eliminar la enfermedad residual, microscópica. Se prefiere el suministro mediante una jeringa o cateterización. Dicha perfusión continua puede tener lugar durante un periodo de aproximadamente 12 horas, a aproximadamente 2-6 horas, a aproximadamente 6-12 horas, a aproximadamente 12-24 horas, a aproximadamente 1-2 días, a aproximadamente 1-2 semanas o más tiempo después del inicio del tratamiento. Generalmente, la dosis de la composición terapéutica mediante perfusión continua será equivalente a la dada mediante una única inyección o múltiples inyecciones, ajustada para un periodo de tiempo durante el cual sucede la perfusión. Se contempla adicionalmente que puede usarse la perfusión en las extremidades para administrar composiciones terapéuticas de la presente invención, particularmente en el tratamiento de melanomas y sarcomas.

Los regímenes de tratamiento también pueden variar, y a menudo dependen del tipo de tumor, la localización del

55 tumor, la progresión de la enfermedad, y la salud y edad del paciente. Obviamente, ciertos tipos de tumor requerirán tratamiento más agresivo, mientras que al mismo tiempo, ciertos pacientes no pueden tolerar protocolos más duros. El médico será el más adecuado para tomar dichas decisiones basándose en la eficacia y toxicidad conocidas (si las hay) de las formulaciones terapéuticas.

En ciertos aspectos, el tumor que se está tratando puede no ser, al menos inicialmente, resecable. Los tratamientos con construcciones virales terapéuticas pueden aumentar la resecabilidad del tumor debido a encogimiento en los márgenes o por eliminación de ciertas partes particularmente invasivas. Después de los tratamientos, puede ser posible la resección. Tratamientos adicionales posteriores a la resección servirán para eliminar la enfermedad residual microscópica en el sitio del tumor.

65 Un curso típico de tratamiento, para un tumor primario o un lecho tumoral post-escisión, implicará múltiples dosis. El

tratamiento típico de tumores primarios implica una aplicación de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más dosis sobre un periodo de 1, 2, 3, 4, 5, 6 semanas o más. Puede repetirse un régimen de dos semanas una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más veces. Durante un curso de tratamiento, puede re-evaluarse la necesidad de completar las dosificaciones planificadas.

5 Los tratamientos pueden incluir diversas "dosis unitarias". La dosis unitaria se define como la que contiene una cantidad predeterminada de la composición terapéutica. La cantidad a administrarse, y la vía particular y formulación, pertenecen a las habilidades de los especialistas en la técnica clínica. Una dosis unitaria no tiene que administrarse como una única inyección sino que puede comprender infusión continua sobre un periodo establecido de tiempo. La dosis unitaria de la presente invención puede describirse convenientemente en términos de unidades formadoras de placas (pfu) o partículas virales para construcciones virales. Las dosis unitarias varían de 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 pfu o vp y mayor. Como alternativa, dependiendo del tipo de virus y el título que se puede obtener, se suministrarán de 1 a 100, 10 a 50, 100-1000, o hasta aproximadamente 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013, 1 x 1014, o 1 x 1015 o más partículas virales

15 (vp) infecciosas al paciente o a las células del paciente.

B. Composiciones y formulaciones inyectables

El método preferido para el suministro de una construcción de expresión o virus que codifica todo o parte de un genoma de rhabdovirus a células cancerosas o tumorales en la presente invención es mediante inyección intravascular. Sin embargo, las composiciones farmacéuticas descritas en este documento pueden administrarse, como alternativa, por vía intratumoral, parenteral, intravenosa, intra-arterial, intradérmica, intramuscular, transdérmica o incluso intraperitoneal como se describe en las patentes de Estados Unidos 5.543.158, 5.641.515 y

5.399.363.

25 La inyección de construcciones de ácido nucleico puede suministrarse mediante una jeringa o cualquier otro método usado para inyección de una solución, siempre que la construcción de expresión pueda pasar a través del calibre particular de aguja necesario para la inyección (por ejemplo véanse las patentes de Estados Unidos 5.846.233 y 5.846.225).

Pueden prepararse soluciones de los compuestos activos como bases libres o sales farmacológicamente aceptables en agua adecuadamente mezclados con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de

35 microorganismos. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones o dispersiones inyectables estériles (patente de Estados Unidos 5.466.468). En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida al grado que exista una fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y deben conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. La apropiada fluidez puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y

45 antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse adecuadamente si fuera necesario y el diluyente líquido primero debe volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratumoral, e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles que pueden emplearse serán conocidos para los especialistas en la técnica a la luz de la presente descripción. Por ejemplo,

55 puede disolverse una dosificación en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente aparecerá alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para administración a seres humanos, las preparaciones deben cumplir normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridas por los gobiernos de los países en que se están usando las composiciones.

Las composiciones descritas en este documento pueden formularse en una forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptable incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres de la

65 proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos

carboxilo libres también puede obtenerse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio, amonio, calcio, o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de un modo compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en diversas formas

5 de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Como se usa en este documento, "vehículo" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, tampones, soluciones de vehículo, suspensiones, coloides, y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse ingredientes activos suplementarios en las composiciones.

15 La expresión "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o adversa similar cuando se administran a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como ingrediente activo es bien comprendida en la técnica. Normalmente, dichas composiciones se preparan como inyectables, en forma de soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido antes de su inyección.

C. Tratamientos de combinación

Los compuestos y métodos de la presente descripción pueden usarse en el contexto de enfermedades/afecciones

25 hiperproliferativas o neoplásicas incluyendo cáncer y aterosclerosis. Para aumentar la eficacia de un tratamiento con las composiciones de la presente invención, tal como rhabdovirus, puede ser deseable combinar estas composiciones con otros agentes eficaces en el tratamiento de esas enfermedades y afecciones. Por ejemplo, el tratamiento de un cáncer puede implementarse con compuestos terapéuticos de la presente invención y otras terapias anti-neoplásicas, tales como agentes anti-neoplásicos o cirugía.

Pueden emplearse diversas combinaciones; por ejemplo, un rhabdovirus no VSV, tal como virus Maraba, virus Carajas, virus Muir Springs, y/o virus Bahia Grande, es "A" y la terapia anti-neoplásica secundaria es "B", que puede incluir un segundo rhabdovirus:

35 A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

La administración del virus terapéutico o construcciones virales de la presente descripción a un paciente seguirá protocolos generales para la administración de esa terapia secundaria particular, teniendo en cuenta la toxicidad, si la hubiera, del tratamiento con virus. Se espera que los ciclos de tratamiento se repitan según lo necesario. También se contempla que pueden aplicarse diversas terapias convencionales, así como intervención quirúrgica, en combinación con la terapia descrita con la célula cancerosa o tumoral.

45 1. Terapia anti-neoplásica

Un agente "anti-neoplásico" es capaz de afectar de forma negativa al cáncer en un sujeto, por ejemplo, eliminando las células cancerosas, induciendo apoptosis en las células cancerosas, reduciendo la tasa de crecimiento de las células cancerosas, reduciendo la incidencia o cantidad de metástasis, reduciendo el tamaño del tumor, inhibiendo el crecimiento del tumor, reduciendo el suministro sanguíneo a un tumor o células cancerosas, promoviendo una respuesta inmune contra las células cancerosas o un tumor, previniendo o inhibiendo la progresión del cáncer, o aumentando la longevidad de un sujeto con cáncer. Los agentes anti-neoplásicos incluyen agentes biológicos (bioterapia), agentes quimioterapéuticos, y agentes radioterapéuticos. Más generalmente, estas otras composiciones se proporcionarían en una cantidad combinada eficaz para eliminar o inhibir la proliferación de la célula. Este

55 proceso puede implicar el contacto de las células con virus o construcción viral y el uno o más agentes o múltiples factores a la misma vez. Esto puede conseguirse poniendo en contacto la célula con una única composición o formulación farmacológica que incluye ambos agentes, o poniendo en contacto la célula con dos composiciones o formulaciones distintas, a la misma vez, donde una composición incluye el virus y la otra incluye el segundo agente o agentes.

La resistencia de las células tumorales a agentes quimioterapéuticos y radioterapéuticos representa un problema principal en oncología clínica. Un objetivo de la actual investigación sobre el cáncer es encontrar modos de mejorar la eficacia de la quimio-y radioterapia combinándola con terapia génica. Por ejemplo, el gen de la timidina quinasa del herpes simple (HS=tK), cuando se suministró a tumores cerebrales por un sistema de vector retroviral, indujo de 65 forma satisfactoria la susceptibilidad al agente antiviral ganciclovir (Culver et al., 1992). En el contexto de la presente invención, se contempla que podría usarse terapia con poxvirus de forma similar junto con intervención

quimioterapéutica, radioterapéutica, inmunoterapéutica, u otra intervención biológica, además de otros agentes proapoptóticos o reguladores del ciclo celular.

Como alternativa, una terapia viral puede preceder o seguir al otro tratamiento por intervalos que varían de minutos

5 a semanas. En realizaciones donde el otro agente y el virus se aplican por separado a la célula, generalmente se aseguraría que no concluya un periodo significativo de tiempo entre el momento de cada suministro, de modo que el agente y el virus aún sean capaces de ejercer un efecto ventajosamente combinado sobre la célula. En dichos casos, se contempla que puede ponerse en contacto la célula con ambas modalidades en aproximadamente 12-24 h entre sí y, más preferiblemente, en aproximadamente 6-12 h entre sí. En algunas situaciones, puede ser deseable prolongar el periodo de tiempo para el tratamiento significativamente, sin embargo, donde transcurren varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8) entre las respectivas administraciones.

a. Quimioterapia

15 Las terapias contra el cáncer también incluyen diversas terapias de combinación con tratamientos tanto basados en agentes químicos como en radiación. Las quimioterapias de combinación incluyen, por ejemplo, cisplatino (CDDP), carboplatino, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalán, clorambucilo, busulfán, nitrosurea, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicomicina, mitomicina, etopósido (VP16), tamoxifeno, raloxifeno, agentes de unión al receptor de estrógenos, taxol, gemcitabina, navelbina, inhibidores de la farnesil-proteína transferasa, transplatino, 5-fluorouracilo, vincristina, vinblastina y metotrexato, temazolomida (una forma acuosa de DTIC), o cualquier análogo o derivado variante de los anteriores. La combinación de quimioterapia con terapia biológica se conoce como bioquimioterapia.

b. Radioterapia

25 Otros factores que causan daño al ADN y se han usado de forma extensiva incluyen los que se conoce comúnmente como rayos γ, rayos X, haces de protones, y/o el suministro dirigido de radioisótopos a células tumores. También se contemplan otras formas de factores que dañan el ADN tales como microondas y radiación UV. Es muy probable que todos estos factores logren un amplio intervalo de daños sobre el ADN, sobre los precursores de ADN, sobre la replicación y reparación del ADN, y sobre el ensamblaje y mantenimiento de los cromosomas. Los intervalos de dosificación para rayos X varían de dosis diarias de 50 a 200 roentgen durante periodos prolongados de tiempo (3 a 4 semanas), a dosis únicas de 2000 a 6000 roentgen. Los intervalos de dosificación para radioisótopos varían ampliamente, y dependen de la semi-vida del isótopo, la fuerza y tipo de la radiación emitida, y la captación por las células neoplásicas.

35 Las expresiones "en contacto" y "expuesta", cuando se aplican a una célula, se usan en este documento para describir el proceso por el cual una construcción terapéutica y un agente quimioterapéutico o radioterapéutico se suministran a una célula diana o se colocan en yuxtaposición directa con la célula diana. Para conseguir eliminación

o estasis celular, ambos agentes se suministran a una célula en una cantidad combinada eficaz para eliminar la célula o evitar que se divida.

c.

Inmunoterapia

Los agentes inmunoterapéuticos, generalmente, se basan en el uso de células efectoras y moléculas inmunes para

45 abordar y destruir células cancerosas. El efector inmune puede ser, por ejemplo, un anticuerpo específico para algún marcador sobre la superficie de una célula tumoral. El anticuerpo en solitario puede servir como efector de terapia o puede reclutar otras células para lograr realmente la eliminación celular. El anticuerpo también puede conjugarse con un fármaco o toxina (quimoterapéutico, radionúclido, cadena A de ricina, toxina colérica, toxina de pertussis, etc.) y sirve simplemente como agente de direccionamiento. Como alternativa, el efector puede ser un linfocito que porta una molécula superficial que interacciona, directa o indirectamente, con una diana celular tumoral. Diversas células efectoras incluyen células T citotóxicas y células NK. La combinación de modalidades terapéuticas, es decir, actividad citotóxica directa e inhibición o reducción de ciertos rhabdovirus o polipéptidos de rhabdovirus proporcionaría beneficio terapéutico en el tratamiento del cáncer.

55 La inmunoterapia también podría usarse como parte de una terapia combinada. El enfoque general para terapia combinada se analiza a continuación. En un aspecto de inmunoterapia, la célula tumoral debe albergar algún marcador que sea susceptible a direccionamiento, es decir, no esté presente en la mayoría de las demás células. Existen muchos marcadores tumorales y cualquiera de éstos puede ser adecuado para direccionamiento en el contexto de la presente invención. Los marcadores tumorales comunes incluyen antígeno carcinoembrionario, antígeno específico de próstata, antígeno asociado a tumor urinario, antígeno fetal, tirosinasa (p97), gp68, TAG-72, HMFG, Sialil antígeno Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de estrógenos, receptor de laminina, erb B y p155. También pueden usarse lisados de células tumorales en una composición antigénica.

Un aspecto alternativo de inmunoterapia es combinar efectos antineoplásicos con efectos inmunoestimuladores. Las

65 moléculas inmunoestimuladoras incluyen: citoquinas tales como IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, IFNγ, quimioquinas tales como MIP-1, MCP-1, IL-8 y factores de crecimiento tales como ligando FLT3. Combinar moléculas

inmunoestimuladoras, como proteínas o usar suministro génico en combinación con un supresor tumoral ha demostrado potenciar los efectos anti-tumorales (Ju et al., 2000).

Como se ha analizado anteriormente, ejemplos de inmunoterapias actualmente en investigación o en uso son

5 adyuvantes inmunes (por ejemplo, Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dinitroclorobenceno y compuestos aromáticos) (patentes de Estados Unidos 5.801.005 y 5.739.169; Hui y Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998), terapia con citoquinas (por ejemplo, interferones α, β y γ; IL-1, GM-CSF y TNF) (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998), terapia génica (por ejemplo, TNF, IL-1, IL-2, p53) (Qin et al., 1998; Austin-Ward y Villaseca, 1998; patentes de Estados Unidos 5.830.880 y 5.846.945) y anticuerpos monoclonales (por

10 ejemplo, anti-gangliósido GM2, anti-HER-2, anti-p185) (Pietras et al., 1998; Hanibuchi et al., 1998; patente de Estados Unidos 5.824.311). Herceptin (trastuzumab) es un anticuerpo monoclonal quimérico (ratón-humano) que bloquea el receptor HER2-neu (Dillman, 1999). La terapia de combinación del cáncer con herceptin y quimioterapia ha demostrado ser más eficaz que las terapias individuales. Por tanto, se contempla que puede emplearse una o más terapias anti-neoplásicas con las terapias relacionadas con rhabdovirus descritas en este documento.

(1) Inmunoterapia pasiva

Existen varios enfoques diferentes para inmunoterapia pasiva del cáncer. Pueden clasificarse ampliamente en los siguientes: inyección de anticuerpos solos; inyección de anticuerpos acoplados a toxinas o agentes

20 quimioterapéuticos; inyección de anticuerpos acoplados a isótopos radiactivos; inyección de anticuerpos anti-idiotipo; y finalmente, purga de células tumorales en médula ósea.

Preferiblemente, se emplean anticuerpos monoclonales humanos en inmunoterapia pasiva, ya que producen pocos

o ningún efecto secundario en el paciente. Sin embargo, su aplicación está algo limitada por su escasez y hasta

25 ahora se han administrado solamente de forma intralesional. Los anticuerpos monoclonales humanos contra antígenos de gangliósido se han administrado de forma intralesional a pacientes que padecen melanoma cutáneo recurrente (Irie y Morton, 1986). Se observó regresión en seis de diez pacientes después de inyecciones intralesionales, diarias o semanales. En otro estudio, se consiguió éxito moderado a partir de inyecciones intralesionales de dos anticuerpos monoclonales humanos (Irie et al., 1989).

30 Puede ser favorable administrar más de un anticuerpo monoclonal dirigido contra dos antígenos diferentes o incluso anticuerpos con múltiple especificidad antigénica. Los protocolos de tratamiento también pueden incluir la administración de linfoquinas u otros potenciadores inmunes como se describe por Bajorin et al. (1988). El desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos se describe en detalle adicional en otra parte en la memoria descriptiva.

(2) Inmunoterapia activa

En inmunoterapia activa, se administra un péptido, polipéptido o proteína antigénica, o una composición de células tumorales autólogas o alogénicas o "vacuna", generalmente con a un adyuvantes bacteriano distinto (Ravindranath y

40 Morton, 1991; Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990; Mitchell et al., 1993). En inmunoterapia de melanoma, los pacientes que producen una alta respuesta de IgM a menudo sobreviven mejor que aquellos que no producen o producen pocos anticuerpos IgM (Morton et al., 1992). Los anticuerpos IgM a menudo son anticuerpos transitorios y la excepción a la norma parece ser los anticuerpos anti gangliósido o anticarbohidrato.

45 (3) Inmunoterapia adoptiva

En inmunoterapia adoptiva, los linfocitos en circulación del paciente, o los linfocitos infiltrados en tumor, se aíslan in vitro, se activan por linfoquinas tales como IL 2 o se transducen con genes para necrosis tumoral, y se readministran (Rosenberg et al., 1988; 1989). Para conseguir esto, se administraría a un animal, o paciente humano, una cantidad 50 inmunológicamente eficaz de linfocitos activados en combinación con una composición de péptido antigénico incorporado a adyuvante como se describe en este documento. Los linfocitos activados serán más preferiblemente las propias células del paciente que se aislaron previamente de una muestra de sangre o tumor y se activaron (o "expandieron") in vitro. Esta forma de inmunoterapia ha producido varios casos de regresión de melanoma y carcinoma renal, pero el porcentaje de respondedores fue pequeño en comparación con el de los que no

55 respondieron.

d. Genes

En otro ejemplo más, el tratamiento secundario es una terapia génica en que un polinucleótido terapéutico se

60 administra antes, después, o al mismo tiempo que se administra un rhabdovirus. El suministro de un rhabdovirus junto con un vector que codifica uno de los siguientes productos génicos tendrá un efecto anti-neoplásico combinado sobre tejidos diana. Como alternativa, el rhabdovirus puede modificarse por ingeniería como un vector viral para incluir el polinucleótido terapéutico. Se abarca diversas proteínas dentro de la invención, algunas de las cuales se describen a continuación. La Tabla 4 enumera diversos genes que pueden abordarse para terapia génica de alguna

65 forma en combinación con la presente invención.

(1) Inductores de proliferación celular

Las proteínas que inducen proliferación celular recaen adicionalmente en diversas categorías dependientes de la función. El elemento en común de todas estas proteínas es su capacidad de regular la proliferación celular. Por

5 ejemplo, una forma de PDGF, el oncogén sis, es un factor de crecimiento secretado. Los oncogenes raramente surgen de genes que codifican factores de crecimiento, y actualmente, sis es el único factor de crecimiento oncogénico de origen natural conocido. En una realización de la presente invención, se contempla que se usa ARNm anti-sentido dirigido a un inductor particular de proliferación celular para evitar la expresión del inductor de proliferación celular.

(2) Inhibidores de proliferación celular

Los oncogenes supresores tumorales funcionan inhibiendo la excesiva proliferación celular. La inactivación de estos genes destruye su actividad inhibidora, provocando proliferación no regulada. Los supresores tumorales incluyen

15 p53, p16 y C-CAM. Otros genes que pueden emplearse de acuerdo con la presente invención incluyen Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1 p73, VHL, MMAC1/PTEN, DBCCR-1, FCC, rsk-3, p27, fusiones p27/p16, fusiones p21/p27, genes anti-trombóticos (por ejemplo, COX-1, TFPI), PGS, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, gsp, hst, abl, E1A, p300, genes implicados en angiogénesis (por ejemplo, VEGF, FGF, trombospondina, BAI-1, GDAIF, o sus receptores) y MCC.

(3) Reguladores de la muerte celular programada

La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso esencial para el desarrollo embrionario normal, que mantiene la homeostasis en tejidos adultos, y que suprime la carcinogénesis (Kerr et al., 1972). La familia Bcl-2 de

25 proteínas y proteasas tipo ICE han demostrado ser importantes reguladores y efectores de la apoptosis en otros sistemas. La proteína Bcl 2, descubierta en asociación con linfoma folicular, desempeña un papel prominente en el control de la apoptosis y la potenciación de la supervivencia celular en respuesta a diversos estímulos apoptóticos (Bakhshi et al., 1985; Cleary y Sklar, 1985; Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto y Croce, 1986). La proteína Bcl-2 evolutivamente conservada está ahora reconocida como un miembro de una familia de proteínas relacionadas, que pueden clasificarse como agonistas de muerte o antagonistas de muerte.

Después de su descubrimiento, se demostró que Bel 2 actúa suprimiendo la muerte celular desencadenada por diversos estímulos. Además, ahora es evidente que existe una familia de proteínas reguladoras de muerte celular Bcl-2 que comparten en común homologías estructurales y de secuencia. Estos diferentes miembros de la familia

35 han demostrado poseer funciones similares a Bel 2 (por ejemplo, BclXL, BclW, BclS, Mcl-1, A1, Bfl-1) o contrarrestar la función Bel 2 y promover la muerte celular (por ejemplo, Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri).

e. Cirugía

Aproximadamente el 60 % de las personas con cáncer experimentará cirugía de algún tipo, que incluye cirugía preventiva, de diagnóstico o estadificación, curativa y paliativa. La cirugía curativa es un tratamiento contra el cáncer que puede usarse junto con otras terapias, tales como el tratamiento de la presente invención, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia génica, inmunoterapia y/o terapias alternativas.

45 La cirugía curativa incluye resección en que todo o parte del tejido canceroso se retira físicamente, escinde, y/o destruye. La resección tumoral se refiere retirada física de al menos parte de un tumor. Además de la resección del tumor, el tratamiento por cirugía incluye cirugía láser, criocirugía, electrocirugía, y cirugía controlada de forma microscópica (cirugía de Mohs). Se contempla adicionalmente que la presente descripción puede usarse junto con la retirada de cánceres superficiales, pre-cánceres, o cantidades incidentales de tejido normal.

Tras la escisión de parte o todas las células cancerosas, tejido, o tumor, puede formarse una cavidad en el cuerpo. El tratamiento puede conseguirse por perfusión, inyección directa o aplicación local del área con una terapia antineoplásica adicional. Dicho tratamiento puede repetirse, por ejemplo, cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 días, o cada 1, 2, 3, 4, y 5 semanas o cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses. Estos tratamientos pueden ser de dosificaciones

55 variables también.

f. Otros agentes

Se contempla que pueden usarse otros agentes en combinación con la presente descripción para mejorar la eficacia terapéutica del tratamiento. Estos agentes adicionales incluyen agentes inmunomoduladores, agentes que afectan a la regulación positiva de receptores de superficie celular y uniones GAP, agentes citostáticos y de diferenciación, inhibidores de adhesión celular, agentes que aumentan la sensibilidad de las células hiperproliferativas a los inductores apoptóticos, u otros agentes biológicos. Los agentes inmunomoduladores incluyen factor de necrosis tumoral; interferón α, β,y γ; IL-2 y otras citoquinas; F42K y otros análogos de citoquinas; o MIP-1, MIP-1β, MCP-1, 65 RANTES, y otras quimioquinas. Se contempla adicionalmente que la regulación positiva de receptores de superficie celular o sus ligandos tales como Fas/ligando de Fas, DR4 o DR5/TRAIL (ligando de Apo-2) potenciaría la capacidad

de inducción apoptótica de la presente invención mediante el establecimiento de un efecto autocrino o paracrino sobre células hiperproliferativas. Aumentos de la señalización intercelular elevando la cantidad de uniones GAP aumentarían los efectos anti-hiperproliferativos sobre la población celular hiperproliferativa adyacente. En otros aspectos, pueden usarse agentes citostáticos o de diferenciación en combinación con la presente invención para

5 mejorar la eficacia anti-hiperproliferativa de los tratamientos. Se contemplan inhibidores de la adhesión celular para mejorar la eficacia de la presente invención. Ejemplos de inhibidores de la adhesión celular son inhibidores de la quinasa de adhesión focal (FAK) y Lovastatina. Se contempla adicionalmente que podrían usarse otros agentes que aumentan la sensibilidad de una célula hiperproliferativa a apoptosis, tal como el anticuerpo c225, en combinación con la presente invención para mejorar la eficacia del tratamiento.

Ha habido muchos avances en la terapia del cáncer después de la introducción de fármacos quimioterapéuticos citotóxicos. Sin embargo, una de las consecuencias de la quimioterapia es el desarrollo/adquisición de fenotipos resistentes a fármacos y el desarrollo de resistencia a múltiples fármacos. El desarrollo de resistencia a fármacos sigue siendo un obstáculo principal en el tratamiento de dichos tumores y por lo tanto, existe una necesidad obvia de

15 enfoques alternativos tales como terapia viral.

Otra forma de terapia para su uso junto con quimioterapia, radioterapia o terapia biológica incluye hipertermia, que es un procedimiento en que el tejido de un paciente se expone a altas temperaturas (hasta 41,11ºC (106ºF)). Dispositivos de calentamiento externo o interno pueden estar implicados en la aplicación de hipertermia local, regional, o del cuerpo entero. La hipertermia local implica la aplicación de calor a una pequeña área, tal como un tumor. El calor puede generarse de forma externa con ondas de alta frecuencia dirigidas a un tumor desde un dispositivo fuera del organismo. El calor interno puede implicar una sonda estéril, incluyendo cables delgados calentados o tubos huecos rellenos con agua caliente, antenas de microondas implantadas, o electrodos de radiofrecuencia.

25 Un órgano o extremidad de un paciente se calienta para terapia regional, que se consigue usando dispositivos que producen alta energía, tales como imanes. Como alternativa, puede retirarse algo de sangre del paciente y calentarse antes de perfundirse en un área que se calentará de forma interna. El calentamiento del organismo completo también puede implementarse en casos donde el cáncer se ha propagado por todo el cuerpo. Pueden usarse mantas de agua caliente, cera caliente, bobinas inductivas, y cámaras térmicas para este propósito.

También puede usarse terapia hormonal junto con la presente invención o en combinación con cualquier otra terapia contra el cáncer descrita previamente. El uso de hormonas puede emplearse en el tratamiento de ciertos cánceres tales como cáncer de mama, próstata, ovario, o cervical para disminuir el nivel o bloquear los efectos de ciertas

35 hormonas tales como testosterona o estrógeno. Este tratamiento a menudo se usa en combinación con al menos una terapia diferente contra el cáncer como tratamiento.

V. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se dan con el fin de ilustrar diversas realizaciones de la invención y no pretenden limitar la presente invención de ningún modo. Un especialista en la técnica apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para realizar los objetos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como aquellos objetos, fines y ventajas inherentes en este documento. Los presentes ejemplos, junto con los métodos descritos en este documento son actualmente representativos de las realizaciones preferidas, son ejemplares, y no se pretenden

45 como limitaciones sobre el alcance de la invención.

Ejemplo comparativo 1

Selección de nuevos rhabdovirus candidatos oncolíticos

Selecciones in vitro. Como selección inicial para identificar nuevos virus oncolíticos, se evaluaron aislados de campo de rhabdovirus para su capacidad de eliminar células tumorales humanas del panel celular NCI 60. Ésta ha sido una estrategia fructífera para los inventores en el pasado para determinar la eficacia relativa de una serie de mutantes VSV como candidatos oncolíticos (que lisan células cancerosas). Inicialmente, los inventores han 55 examinado 13 nuevos rhabdovirus que se ha determinado previamente que se replican en células de mamífero. Se contempla que este procedimiento se ampliará para estudiar rhabdovirus para los cuales existe menos experiencia en cultivo celular. En un esfuerzo por hacer una selección rápida y eficazmente a través de una matriz de 60 células infectadas con 13 virus diferentes, los inventores usan un ensayo rápido y económico en formato de 96 pocillos usando reducción de MTS a formazán, o tinción con violeta cristal de células residuales, para medir el número y la viabilidad celular. Los inventores cultivan líneas celulares hasta el 80 % de confluencia en placas de 96 pocillos y después las exponen en paralelo a nuestros aislados de campo de rhabdovirus a MOI crecientes (MOI = 0,0001 -10 PFU/célula). A las 48 y 96 horas post infección, las células se tiñen con reactivo MTS acuoso (Promega EEUU) y se incuban durante 3 horas para permitir suficiente formación de formazán. Como alternativa, las placas de células infectadas se lavan con tampón para retirar las células muertas, se tienen con colorante violeta cristal, se lavan para 65 retirar el colorante residual, tiempo después del cual el colorante se solubiliza usando detergente. Estas placas después se leen usando el lector de placa multipocillo integrado (Biotek SynergyHT; EEUU), se ajusta la curva de

datos, y se determina la EC50 a partir de esta curva. Normalmente, los ensayos se realizan en sextuplete, con los valores mayor e inferior de EC50 eliminados, y promediando los cuatro restantes EC50 para determinar finalmente un valor e intervalo de confianza. (Por ejemplo véase la FIG. 2)

5 Como contra-selección para evaluar si un virus particular infecta/elimina células humanas normales in vitro, se explorarán cultivos de fibroblastos humanos normales, epitelio y endotelio y cultivos neuronales de la colección de los inventores y los disponibles en el mercado (Cambrex, EEUU). Los cultivos se infectarán con virus candidatos (0,1 a 20 pfu/célula) durante 48 y 96 horas. La viabilidad celular se detectará por ensayo MTS, o ensayo con violeta cristal, y se caracterizará adicionalmente por marcaje con anticuerpo D175 contra caspasa 3 activada (Cell Signaling Technologies, EEUU) y se detectará usando un anticuerpo secundario conjugado con FITC. Los estudios se harán en paralelo con líneas celulares conocidas de tumor humano y de ratón susceptible/resistente. Se ha usado una combinación de células no tratadas y células tratadas con TRAIL y ciclohexamida para establecer el intervalo dinámico del ensayo, con determinaciones de factor z preliminares significativamente por encima de 0,5.

15 Otra eventualidad es que los virus pueden replicarse y propagarse de forma eficaz en cultivos sin eliminación rápida de estas células. Éstos son también virus potencialmente interesantes, con la condición de que su replicación sea de naturaleza selectiva de tumor, ya que su capacidad lítica podría aumentarse posteriormente a través de ingeniería recombinante. Para detectar estos virus, los inventores infectarán células del panel celular NCI 60 con aislados de campo a una baja MOI (0,1 pfu/célula) en pocillos duplicados de una placa de 24 pocillos. Después de 1 hora, los pocillos se lavarán minuciosamente para retirar el virus introducido libre, se añadirá medio y los cultivos se incubarán durante 72 horas adicionales. Estos sobrenadantes de cultivo se titularán posteriormente en una línea celular permisiva (células Vero) para detectar y cuantificar la infección productiva. El lavado final de cada una de éstas se titulará para controlar el virus introducido residual. Los aciertos de virus candidato en este ensayo se confirmarán en células de cultivo tisular usando anticuerpos específicos de virus y microscopía de inmunofluorescencia

25 convencional.

Clasificación basada en todos los parámetros. Varias propiedades contribuyen a la eliminación oncolítica de células tumorales incluyendo: capacidad de inducir apoptosis, tasa de producción de virus, cantidad de virus producido, así como funciones especiales tales como formación de sincitios. Los candidatos prometedores de la selección inicial se caracterizarán adicionalmente con respecto a la inducción de apoptosis (determinada por ensayo TUNEL y tinción de inmunofluorescencia para caspasa-3 activada), y curvas de crecimiento de una etapa para comparar la cinética y para cuantificar la producción de virus. Estos estudios servirán como guía para mejorar estas cepas. Por ejemplo: (1) si un virus elimina células tumorales bien pero muestra toxicidad inaceptable para células normales, los inventores atenuarán este virus usando una o más de las estrategias resumidas a continuación; (2)

35 como alternativa, si un virus muestra cinética más lenta de eliminación manteniendo al mismo tiempo una alta tasa de replicación, entonces los inventores pueden añadir un transgén tóxico o terapéutico; (3) si un virus candidato se replica lentamente pero es un eliminador eficaz, el inventor seleccionará una variante con cinética de crecimiento aumentada para reforzar su potencia.

A partir de la experiencia de los inventores con VSV y otros virus oncolíticos, han identificado tres criterios de entrada in vitro clave para estrechar la lista de candidatos: (1) eliminación selectiva de células tumorales, (2) replicación productiva dentro de células tumorales (independiente de la eliminación), y (3) eficacia sobre líneas tumorales resistentes a VSV (melanoma UACC-62, pulmón A431 y NCI-H226, próstata DU-145, leucemia HL60). Basándose en estos criterios, los resultados de los ensayos de selección descritos anteriormente se integrarán para

45 reducir la lista para evaluación adicional en ensayo in vivo preliminar.

Toxicidad y biodistribución in vivo. Las dos vías de administración relacionadas con un entorno clínico son inyecciones intravenosas (IV) e intracraneales (IC). Los candidatos principales identificados durante selección in vitro para la toxicidad y biodistribución en ratones después de infección se evaluarán por estas vías. Se infectarán grupos de 3 ratones por IV a dosis de 1x105 a 1x109 pfu, o por IC a 1-x102 to 1x106 pfu. Además de la mortalidad, se controlará la morbilidad diariamente para signos de letargia, deshidratación, pérdida de peso y parálisis de las extremidades. Se realizará histopatología sobre 2 ratones del grupo de dosis letal mínima (dosis más lata si no se consigue la dosis letal) de cada infección de virus candidato. La infección con VSV WT y simulada servirán como controles positivo y negativo apropiados respectivamente. Se recogerán los órganos del ratón restante en este

55 grupo, se homogeneizarán y titularán como evaluación preliminar de la biodistribución del virus.

Para virus que presentan un intervalo de dosis letal aceptable, lo inventores evaluarán posteriormente la biodistribución en ratones que albergan tumor para identificar virus compatibles con administración sistémica. El inventor empleará tres de nuestros modelos de cáncer existentes que representan dianas orgánicas muy diferentes de relevancia clínica crítica: (1) carcinoma de colon de ratón CT-26 (1x105 células) inyectado por vía intravenosa para formar tumores pulmonares diseminados en ratones Balb/C singénicos (2), carcinoma de mama de ratón 4T1 (4x105 células) inyectado en la almohadilla grasa de ratones Balb/C singénicos para formar un único tumor primario con metástasis espontánea, y (3) células de glioblastoma humano U87 (1x105 células) implantadas de forma estereotáctica en la corteza de ratones desnudos. Se determinará una dosis tolerable máxima para cada virus y vía 65 (IV o IC) a partir de los experimentos de toxicidad in vivo preliminares. Este valor servirá como dosis terapéutica inicial para estudios de biodistribución en ratones que albergan tumor. En grupos de 3 ratones, los tumores se

establecerán durante 1 semana y después se tratarán IV o IC con una única dosis de cada virus candidato a su respectiva MTD. Cuarenta y ocho horas post tratamiento, los animales se perfundirán con solución salina para enjuagar cualquier virus libre de la circulación, y los tumores y órganos se recogerán, homogeneizarán y titularán para cuantificar el virus infeccioso. De este modo, los inventores determinarán los virus que pueden suministrarse a

5 sitios de tumor por inyección sistémica, así como la selectividad relativa por tumor de la replicación del virus in vivo.

Re-clasificación. Basándose en los perfiles de toxicidad, biodistribución, suministro sistémico y selectividad por tumor en estudios in vivo, los inventores seleccionarán los mejores candidatos para continuación con la caracterización detallada y desarrollo adicional.

Ejemplo 2

Construcción de recombinantes

15 Secuenciación y sistema recombinante. Para facilitar una rápida investigación y desarrollo, la posterior producción de material clínico y para asegurar la seguridad y estabilidad de virus terapéuticos, los inventores clonarán y rescatarán formas recombinantes de virus seleccionados.

Se han clonado y rescatado michos virus ARNmc de hebra negativa usando técnicas recombinantes convencionales. Los inventores emplearán estrategias similares que se han adoptado satisfactoriamente para virus ARNmc recombinantes presentados. En resumen, se aislará el genoma de un virus candidato por extracción de ARN (Qiagen Corp) de 1x109 partículas purificadas de virus. El ARN genómico purificado después se ceba con hexámeros aleatorios y se transcribe de forma inversa en ADNc, posteriormente se convierte en bicatenario y se clona ligando adaptadores EcoRI, se fracciona por tamaño y finalmente se vuelve a ligar en un plásmido bacteriano 25 digerido con EcoRI (pT7Blue; Novagen). El resultado es una biblioteca de fragmentos genómicos que pueden secuenciarse fácilmente por técnicas convencionales. A causa de la naturaleza de cebado aleatorio de esta biblioteca, esta estrategia no "capturará" los extremos 3' y 5' rigurosos. Para hacer esto los inventores ligan oligos a los extremos 3' o 5' del ARN genómico purificado usando ARN ligasa T4. Usando cebadores complementarios los oligos recién ligados que flanquean el genoma, los inventores amplifican por PCR y clonan los extremos del genoma para posterior secuenciación. Esta información de secuencia después se usa para diseñar cebadores específicos de extremo para amplificar el genoma completo, que después se clona en un plásmido especializado. El plásmido flanquea el genoma con un promotor T7 en un extremo y una ribozima de autoescisión de hepatitis delta y la secuencia terminadora T7 en el flanco opuesto. Cuando se transfecta en células A549 que expresan ARN polimerasa T7 (previamente infectadas con un virus vaccinia que expresa T7), este plásmido genera genomas

35 virales en el citoplasma. En paralelo, las secuencias codificantes los virus para los genes N, P y L se clonan en plásmidos de expresión dirigidos por el promotor CMV. La co-transfección de la construcción de genoma con los plásmidos N, P y L en estas células A549 reconstituye el complejo de replicación viral en el genoma viral y provoca el rescate de virus infeccioso. Como prueba de principios, los inventores han clonado, manipulado genéticamente, y rescatado el virus Maraba usando este método. Véanse las FIG. 17 y FIG. 18 para ejemplos de virus relacionados con Maraba.

Ejemplo 3

Optimización/aumento

45 Los rhabdovirus no VSV son virus salvajes; y como con todos los virus oncolíticos presentados hasta ahora, incluyendo VSV, los inventores predicen que estos aislados de campo se beneficiarán de la optimización adicional a través de selección in vitro y/o estrategias de ingeniería recombinante. Algunos candidatos pueden requerir atenuación (por ejemplo, virus Maraba) mientras que algunos pueden requerir aumento de su replicación y/o cinética de eliminación de tumores (por ejemplo, virus Muir Springs). Lo siguiente es un resumen de varias estrategias que emplearán los inventores para maximizar la eficacia de virus terapéuticos recién identificados.

Mutaciones diseñadas por ingeniería. El VSV bloquea el transporte de ARNm nuclear/citoplasmático como medio para vencer la inmunidad innata de la célula hospedadora. Los inventores han descrito previamente el diseño por

55 ingeniería de mutaciones en la proteína M de VSV para desactivar esta actividad y atenuar selectivamente de ese modo este virus en células normales. Dado que otros miembros del genero de los vesiculovirus también han demostrado esta capacidad (Chandipura, y viremia primaveral de la carpa) y la mayoría de los vesiculovirus secuenciados hasta ahora (VSV, Chandripura, Piry, Cocal, viremia primaveral de la carpa, Maraba) tienen el motivo de secuencia crítico requerido por VSV para su función, los inventores contemplan atenuar los rhabdovirus no VSV de un modo análogo al usado para VSV. Sin embargo, otros rhabdovirus tales como el de la rabia y el virus de la fiebre efímera bovina no tienen este motivo y no bloquean el transporte de ARNm nuclear citoplasmático y quizá no serán susceptibles a esta estrategia de atenuación. Como va habiendo más información disponible respecto a la interacción rhabdovirus/hospedador a partir de laboratorios del consorcio y otros, serán posibles manipulaciones adicionales guiadas por la estructura/función para atenuar estos virus.

65 Transgenes. Ahora existen varios informes para "armar" virus oncolíticos con genes suicida o mediadores inmunes

para aumentar su potencia. Los inventores se centrarán en añadir transgenes para aumentar la citotoxicidad de virus candidatos que muestran replicación eficaz, pero insuficiente eliminación tumoral. Los inventores tienen una lista ponderada por prioridad de transgenes que se están modificando por ingeniería actualmente en virus Maraba. Actualmente la clasificación consiste en: (1) factor inductor de apoptosis (AIF) -un homólogo de óxido-reductasa

5 responsable del colapso y degradación de la cromatina de un modo independiente de caspasa. (2) HaraKiri -el más potente del miembro pro-apoptótico solamente BH3 de la familia Bcl-2 responsable de la inducción de apoptosis convencional dependiente de caspasa (PCD Tipo I). (3) XAF1 -un potente gen supresor tumoral e inhibidor directo de la familia IAP. (4) Atg4B -la proteasa clave responsable de iniciar la autofagia (PCD Tipo II).

Finalmente, podrían modificarse por ingeniería miembros de las vías intrínseca o extrínseca de muerte celular con Tat u otros dominios de transducción de proteínas a secretar de células infectadas por virus para inducir eliminación espectadora dentro de la masa tumoral. Los inventores siguen siendo conscientes de que otros efectos espectadores de eliminación pueden estar mediados a través de componentes de la inmunidad del hospedador contra el virus y/o tumor. Por tanto, una estrategia alternativa sería modificar por ingeniería uno o más transgenes

15 para atraer células inmunes a sitios de infección. Las evidencias indican que la infección con virus de tumores pulmonares CT26 induce neutrófilos para infiltrar el tumor y causar un efecto espectador de eliminación apoptótica masiva.

Evolución dirigida para mejorar rhabdovirus oncolíticos. Se han descrito muchos ejemplos de evolución dirigida donde se aumentaba o disminuía la capacidad de replicación de una cepa viral precursora por pases en serie en cultivo celular de mamífero. Los rhabdovirus son particularmente susceptibles a este tipo de procedimiento ya que no existen como entidad individual, sino como una población de capas llamadas cuasi-especie. Los miembros de las cuasi-especies representan mutaciones puntuales del genoma dominante. Cuando se aplica una presión selectiva apropiada, el miembro más fuerte de la población se selecciona, y se convierte en el genoma dominante. Esto tiene 25 tremenda utilidad en los esfuerzo por construir un mejor virus oncolítico porque proporciona una colección ya preparada de mutantes de la cual seleccionar una variante con mejores capacidades oncolíticas. Por tanto, para atenuar un candidato dado, los inventores seleccionarán mutantes de placa pequeña sobre fibroblastos primarios y posteriormente amplificarán este virus clonado en células tumorales para retro-selección frente a mutaciones no productivas (es decir, mutaciones que debilitan de forma uniforme, tales como mutaciones en la polimerasa, en oposición a discapacidades específicas en células/tejidos normales). Realizando esto en ciclos iterativos a alta MOI (10 pfu/célula), los inventores esperan aislar un mutante que mantenga una replicación robusta en células tumorales, pero que haya perdido la capacidad de infectar de forma productiva células normales sanas. Como alternativa, los inventores pueden aumentar la potencia de rhabdovirus no VSV, seleccionando replicadores más rápidos, o eliminadores más letales. Para acelerar la tasa de replicación de un virus candidato, los inventores realizarán rondas 35 iterativas de infección/replicación en líneas celulares tumorales, pero en cada ronda posterior disminuirán el tiempo de recogida post infección. Esta presión de selección forzará a los virus a evolucionar hacia una rápida replicación. Si es deseable una citotoxicidad potenciada, los inventores infectarán líneas celulares tumorales resistentes o recalcitrantes (1x106 células) con virus candidatos (MOI=1). Las células vivas posteriormente se teñirán con colorante vital JC1 para detectar eventos prematuros de apoptosis por citometría de flujo de dos colores. Las células que experimentan apoptosis se almacenarán en monocapas de células Vero para recuperar el virus que se replica dentro de las mismas. Las rondas iterativas de este ensayo, de nuevo con tiempos decrecientes de recogida, seleccionarán un fenotipo letal más rápidamente. Los virus mejorados de este modo se secuenciarán para mapear las alteraciones genéticas y contribuir a nuestros esfuerzos de análisis de estructura/función hacia una mejor comprensión de la biología de los rhabdovirus y la oncolisis. La selección genética reversa permite un enfoque

45 imparcial para mejorar los rhabdovirus, y representa un buen complemento a los esfuerzos por hacer mejoras a través de ingeniería recombinante de transgenes o mutaciones racionales basadas en estudios de estructura/función.

Ejemplo 4

Ensayo in vivo de nuevos rhabdovirus oncolíticos recombinantes

Los inventores han elegido usar modelos ortotópicos de cáncer ya que recapitulan de forma más precisa la enfermedad clínica humana. Sin embargo, a diferencia de modelos de tumores subcutáneos, los tumores ortotópicos 55 no son fácilmente accesibles y por lo tanto son difíciles de evaluar sin sacrificar al animal experimental. Para resolver este problema, se adopta una tecnología de imagen óptica multimodal que permite la formación de imágenes de forma no invasiva, y la medición repetida del crecimiento o regresión de los tumores implantados, así como el desarrollo o regresión de lesiones metastásicas distales. Los inventores tienen una plataforma de imágenes de animal completo completamente integrada y altamente sensible (IVIS 200; Xenogen Corp) que puede detectar fotones emitidos incluso desde el tejido profundo. Puede medir la luz fluorescente emitida por proteínas fluorescentes recombinantes tales como GFP así como detectar bioluminiscencia generada por luciferasa. Usando genes indicadores de luciferasa específicos de sustrato, uno expresado a partir del virus y el otro expresado a partir de células tumorales, los inventores pueden medir la bioluminiscencia resultante de la replicación del virus de forma concurrente con las mediciones del tumor. Para hacer esto los inventores han clonado YFP o una nueva RFP 65 monomérica en fase con luciferasa de luciérnaga o una nueva luciferasa tipo renilla del copépodo marino Gaussia princeps. Entre estas dos secuencias codificante los inventores han diseñado una secuencia de "parada-reinicio" de

la traducción de 30 aminoácidos. Este pequeño motivo proviene del virus de la fiebre aftosa y permite la expresión estequiométrica de dos proteínas a partir de un único ARNm, es muy pequeño y no sufre de variabilidad de una célula a otra como los motivos IRES. Estas construcciones indicadoras duales se clonaron en vectores lentivirales, se empaquetaron en virus, y se usaron para establecer células de glioblastoma humano 4T1, CT26 y U87 marcadas 5 con indicador estable. Estas líneas celulares se usan en tres modelos de tumor de ratón ortotópico: gliomas humanos U87 implantados de forma intracraneal en ratones desnudos CD-1; células de carcinoma de mama de ratón 4T1 implantadas en la almohadilla grasa de hembras Balb/C (modelo de enfermedad metastásica agresiva, espontánea); carcinoma de colon CT-26 inyectado en la vena de cola de ratones Balb/C (tumores diseminados en el pulmón). La elección del modelo ortotópico se predijo según los siguientes criterios: tumor agresivo, de desarrollo

10 rápido, y por lo tanto difícil de tratar; representa dianas orgánicas muy diferentes; abarca sistemas hospedadores tanto inmunocompetentes como inmunocomprometidos.

Los primeros estudios serán para evaluar las características de respuesta a dosis en nuestros modelos para identificar una dosis óptima. A partir de experimentos preliminares de toxicidad, los inventores habrán definido una 15 MTD para cada una de nuestras cepas candidatas en animales Balb/C que no albergan tumor. Por lo tanto, los inventores ensayarán dosis a partir de la MTD, disminuyendo en intervalos semi-log hasta 1x103 pfu. Usando el IVIS para replicación de imágenes en los tumores establecidos, se estudiará la cinética del suministro de virus inicial y la duración de la posterior replicación como una función de la dosis. En estudios paralelos, los ratones se sacrificarán durante este curso de tiempo y se examinarán usando microscopía de fluorescencia para determinar el modo en que 20 la dosis afecta a la capacidad de alcanzar todas las partes del tumor y las lesiones metastásicas distales. Se examinará el tejido sano para evaluar la replicación específica de tumor. Finalmente, se determinará la seguridad de cada dosis controlando los ratones para cualquier signo de morbilidad tal como pérdida de peso, deshidratación, y cambios en el comportamiento. Se evaluarán las respuestas del tumor a los virus en comparaciones lado a lado después de tratamiento IV de una única dosis. La sensibilidad y naturaleza cuantitativa de la tecnología de imágenes 25 ópticas la hace idealmente adecuada para este propósito. Por tanto se establecerán tumores como se ha descrito anteriormente y se controlará el crecimiento o regresión tumoral después de la dosificación del virus y se compararán estos resultados con controles de virus inactivados por UV. Basándose en trabajos previos con VSV, se contempla que una dosis única puede no ser suficiente para regresiones completas y duraderas de los tumores. Esto necesita una serie de experimentos para determinar la cantidad y cronología de dosis más eficaces. En una 30 estrategia similar a la descrita anteriormente, los inventores usarán modelos de tumor para desarrollar estrategias de dosificación máximamente eficaces. Esto se hará controlando al mismo tiempo el suministro del virus al tumor, la replicación, duración de la replicación en el lecho tumoral y la propagación a sitios tumorales distantes, en concierto con crecimiento/regresión tumoral. Además, los inventores examinarán la infiltración y activación de células inmunes en lechos tumorales y ganglios linfáticos adyacentes usando citometría de flujo e inmunohistoquímica como otro

35 parámetro de actividad oncolítica. Finalmente, la eficacia se confirmará controlando estos ratones para supervivencia global, y/o el tiempo hasta progresión; comparando grupos tratados con virus con los tratados con virus inactivado por UV como controles. Un ejemplo del modelo animal puede encontrarse en la FIG. 13.

Retorno a optimización/aumento. Puede ser que se requieran varios ciclos de optimización y después re-ensayo

40 para desarrollar finalmente un virus terapéutico máximamente eficaz. Por lo tanto, los inventores usarán los resultados del ensayo in vivo para guiar rondas adicionales de optimización biológica y/o recombinante y después re-ensayar en modelos de tumor.

Tabla 5. Comparación focalizada entre cuatro rhabdovirus. Las células del panel celular NCI 60 se sembraron en placas de 6 pocillos hasta una confluencia del 90 %. Estas células se infectaron a diluciones log con diversos rhabdovirus, como se indica. Después de 48 horas, las monocapas se lavaron, se fijaron y se tiñeron con violeta cristal para valorar las células viables. Los valores representan las pfu requeridas para eliminar el 50 % de las

5 células en 48 h.

Chandipura Maraba Carajas VSV WT

Pulmón A549 < 102 < 102 104 > 106

H226 >106 >106 104 <102

Melanoma M14 103 < 102 103 105

Malme 3M 103 105 105 105

UACC-62 < 102 103 > 106 Leucemia K562 105 103

Ovario OVCAR4 103 < 102 105 103

OVCAR8 < 106 > 106 103

SK-OV-3 < 102 105 105 104

SNC SF268 < 102 104 104

SF539 < 102 < 102 103 105

Colon HCT-15 105 104 105 103

Mama HS578T > 106 > 106 104

Renal 786-O 104 < 102 105 105

ACHN 105 103 105 < 102 Próstata DU-145 < 102 > 106

PC-3 < 106 < 102

Las diferencias entre VSV y otros rhabdovirus sobre el panel celular NCI 60 incluyen: (1) eliminación preferencial por virus Maraba en comparación con VSV de pulmón A549, melanoma M14, melanoma UACC-62, SNC SF268, SNC SF539, renal 786-O, próstata DU-145; (2) eliminación preferencial por virus Carajas en comparación con VSV para

10 melanoma M14, melanoma UACC-62, SNC SF539; eliminación preferencial por VSV para pulmón H226, leucemia K562, ovario OVCAR-8, mama HCT-15, HS578T, y próstata PC-3. Todas las demás líneas celulares del panel celular 60 muestran susceptibilidades similares a VSV, Maraba y Carajas y Chandipura.

Tabla 6. Eliminación in vitro de células transformadas e inmortalizadas seleccionadas por nuevos rhabdovirus. Las

15 células se sembraron en placas de 6 pocillos y se permitió que alcanzaran un 75 % de confluencia. Estas células se infectaron posteriormente con cada virus a un título fijo. Los cultivos se valoraron visualmente para muerte celular después de 96 h. 4+ = 100 % destruido, 3+ = 75-90 % muerto, 2+ = 50 % muerto, 1+= <30 % muerto. --= sin muerte.

Farmington

Muir Springs Rio Grande Ngaingan Tibrogargan Le Dantec Kwatta

Humano

293T ++++ ++++ +++ ++ +

Ratón

4T1 + + ++ +

Humano

SW620 +++ +++ +++ +

Hámster

BHKT7 + +++ +++ +++ +++

Humano

U2OS ++++ ++ ++++ ++++

Mono

Vero +++ ++++ +++ ++++

20 Ejemplo 5

Rhabdovirus quiméricos

Un problema potencial con composiciones virales oncolíticas es el potencial de una respuesta inmune en un

25 paciente. Dicha respuesta inmune puede mitigar la eficacia de aplicaciones adicionales de virus oncolítico ya que una parte significativa del virus aplicado puede neutralizarse por el sistema inmune del paciente. Para evitar este problema sería preferible tener una pluralidad de composiciones virales oncolíticas que sean inmunológicamente distintas. En este caso puede aplicarse un virus oncolítico diferente a un paciente para cada terapia posterior proporcionando de ese modo actividad oncolítica sostenida que está mínimamente afectada por la respuesta inmune

de un hospedador. Para este fin, se construyeron varias composiciones virales pseudotipadas y se ensayaron para su capacidad de infectar células.

Para estudiar la posibilidad de usar rhabdovirus oncolíticos que comprendan diversas proteínas G de rhabdovirus se

5 construyeron diversos virus recombinantes. Cada recombinante incluía la estructura tipo silvestre de VSV Indiana (genes N, P, M y L) salvo que se especifique de otro modo. Además, los recombinantes incluían un gen indicador de luciferasa, de luciérnaga (FL) o Renilla (RL) entre el gen G y el L. La nomenclatura general usada para hacer referencia a los recombinantes es RVRaGx, donde RVR significa Rhabdovirus recombinante, (a) indica el origen de la proteína G o gen tipo proteína G y (x) indica el número de versión.

RVR con proteína G de Isfahan. Se clonó un genoma RVR en el vector pXN2VSV de modo que sitios de restricción XhoI y NheI flanquearan los genes G o tipo G. La secuencia de inicio y parada viral se añadió al extremo 3' de todos los genes G o tipo G que codificaba la siguiente secuencia: CTCGAGGGTATGAAAAAAACTAACAGATATCACGGC TAG (SEC ID Nº 25). El virus recombinante se pseudotipó con la proteína G de Isfahan que tiene una identidad de

15 secuencia proteica del 37 % en comparación con VSV G Ind. El RVR que comprenden el gen indicador FL se denominó RVRIsf (Isfahan) G1 (donde la versión 1 indica la presencia del gen indicador FL).

Además estudios de neutralización con anticuerpos mostraron que suero que comprendía anticuerpos de ratones inmunizados con VSV WT no neutralizaban significativamente la actividad de RVR Isf G1 in vitro.

Además, cuando a ratones inmunizados con VSV-WT se les inyectó RVRIsfG1, el virus con el polipéptido Isf G es capaz de evadir el sistema inmune. Como se muestra en la FIG. 6C, RVRIsfG1 fue detectable en diversas localizaciones en ratones inmunizados después de inoculación viral. El nivel de RVRIsfG1 detectado en los ratones inmunizados fue similar al nivel detectado en animales de control vírgenes (FIG. 6A). Por otro lado, no se detectó

25 virus en ratones inmunizados que se inocularon con VSV (FIG. 6B). Por tanto, los virus oncolíticos que comprenden el polipéptido Isf G escapan a la respuesta inmune del hospedador contra el VSV administrado previamente in vivo.

Estos resultados se confirmaron adicionalmente inyectando tumores en ratones vírgenes inmunizados con VSV o virus recombinante y se determinó la producción de virus de partir de las infecciones. Como se muestra en la FIG. 7, el virus recombinante inyectado en tumores de ratones inmunizados o vírgenes produjo grandes cantidades de virus descendiente. Por otro lado, la propagación de VSV inyectado en ratones inmunizados fue apenas detectable.

También se construyeron dos RVR adicionales que comprenden el Isf. RVRIsfG2 comprende un gen indicador RL en lugar del gen indicador FL de RVRIstG1. Además, RVRIsfG3 comprende una proteína quimérica VSV-Isf G. La

35 proteína quimérica (SEC ID Nº 19) comprende el ectodominio de G de Isfahan con el dominio transmembrana y la cola citoplasmática de G de VSV.

RVR con proteína G de Chandipura. Chandipura G tiene una homología de secuencia proteica del 42 % con VSV G (Indiana). Se usó la misma estrategia de clonación descrita anteriormente para construir RVRChaG1. Una curva de crecimiento de una etapa con RVRChaG1 mostró que produce cantidades similares de virus en comparación con VSV (FIG. 8). Además, el RVR tenía citotoxicidad similar en comparación con VSV (FIG. 9).

RVR con proteína G de Maraba. Maraba G tiene una homología de secuencia proteica del 83 % con VSV G (Indiana). Éste es el primer informe de la secuencia de la proteína G de Maraba proporcionada como una secuencia

45 de ADN en la SEC ID Nº 20. Se usó la misma estrategia de clonación descrita anteriormente para construir RVRMarG1. Una curva de crecimiento de una etapa con RVRMarG1 mostró que el título de virus recombinante era mayor que VSV a las 48 y 72 h. Por tanto, el cambio de proteína G puede estabilizar el virus y potenciar de ese modo la producción (FIG. 10). Además, el RVRMarG1 demostró ser citotóxico (FIG. 11). Además, los ensayos de neutralización con anticuerpo mostraron que el suero de ratones inmunizados con VSV WT no neutralizaba la activad de RVRMarG1 lo que indica que el RVR tiene capacidad de evasión inmune.

RVR con proteína G de Muir Springs. Muir Springs G tiene una homología de secuencia proteica del 25,4 % con VSV G (Indiana). La secuencia de Muir Springs G se proporciona en la SEC ID Nº 21 (aminoácidos) y la SEC ID Nº 22 (ADN). Se usó la misma estrategia de clonación descrita anteriormente para construir RVRMurG1.

55 RVR con proteína G de virus Klamath. Experimentos de pseudotipado confirmaron que la proteína G de Klamath es funcional en un entorno de bajo pH (6,8), a diferencia de VSV G. Esto es de gran importancia ya que se sabe que el núcleo del tumor es hipóxico y ácido. Por tanto, puede ser una ventaja tener un virus que pueda replicarse en dicho entorno. Se generaron VSV HRGFP-Klamath pseudotipados de modo que los viriones contuvieran el genoma de un virus pero las proteínas de envuelta de ambos virus por coinfección en células CT26. A las 24 horas después de la coinfección, se recogió el sobrenadante y se titularon las partículas pseudotipadas. Después se usó el virus pseudotipado (junto con virus de control para infectar células diana en medios de dos tipos diferentes de acidez. Los resultados muestran que la proteína G de Klamath era responsable de la capacidad del virus de infectar a bajo pH.

65 Se usó esencialmente la misma estrategia de clonación descrita anteriormente para construir RVRKlaG2. Sin embargo, a diferencia de las estrategias previas, este recombinante incluye Klamath G además de la VSV G original.

(Indiana). RVR con proteína G del virus Farmington (Far). El virus Farmington es un no vesiculovirus que es no neurotrópico y muestra formación de sincitios grandes.

5 RVR con proteína G del virus Bahia Grande (Bah). El virus Bahia Grande es un no vesiculovirus que es no neurotrópico.

RVR con proteína Env retroviral JSR. Como el VSV tiene neurotoxicidad conocida, sería ventajosa una estrategia por la cual un VSV recombinante no infectara neuronas. JSR Env es originalmente del gen de envuelta (Env) no neutrópico del retrovirus JSRV (un virus no neurotrópico). Se genera una quimera que comprende el ectodominio de JSRV Env con el dominio transmembrana y la cola citoplasmática de G de VSV (secuencia de ADN proporcionada como SEC ID Nº 23).

RVR con proteína G de Ébola. Ébola es un virus no neurotrópico con una glucoproteína que funciona uniéndose al

15 receptor y mediando la fusión de membrana. La proteína G contiene un sitio de escisión por furina en la posición del aminoácido 497-501. Los productos de escisión (GP1 y GP2) se ligan mediante enlaces disulfuro y se cree que actúan como posible señuelo para anticuerpos neutralizantes o inmunomoduladores. Sin embargo, el sitio de escisión por furina no es necesario para la infección o tropismo. La secuencia de ADN de la proteína G de Ébola se proporciona como SEC ID Nº 24.

Referencias

Patente de Estados Unidos 4.554.101 Patente de Estados Unidos 4.683.195 25 Patente de Estados Unidos 4.683.202 Patente de Estados Unidos 4.684.611 Patente de Estados Unidos 4.800.159 Patente de Estados Unidos 4.879.236 Patente de Estados Unidos 4.883.750 Patente de Estados Unidos 4.946.773 Patente de Estados Unidos 4.952.500 Patente de Estados Unidos 5.220.007 Patente de Estados Unidos 5.279.721 Patente de Estados Unidos 5.284.760 35 Patente de Estados Unidos 5.302.523 Patente de Estados Unidos 5.322.783 Patente de Estados Unidos 5.354.670 Patente de Estados Unidos 5.366.878 Patente de Estados Unidos 5.384.253 Patente de Estados Unidos 5.389.514 Patente de Estados Unidos 5.399.363 Patente de Estados Unidos 5.464.765 Patente de Estados Unidos 5.466.468 Patente de Estados Unidos 5.538.877 45 Patente de Estados Unidos 5.538.880 Patente de Estados Unidos 5.543.158 Patente de Estados Unidos 5.550.318 Patente de Estados Unidos 5.563.055 Patente de Estados Unidos 5.580.859 Patente de Estados Unidos 5.589.466 Patente de Estados Unidos 5.591.616 Patente de Estados Unidos 5.610.042 Patente de Estados Unidos 5.635.377 Patente de Estados Unidos 5.641.515 55 Patente de Estados Unidos 5.656.610 Patente de Estados Unidos 5.702.932 Patente de Estados Unidos 5.736.524 Patente de Estados Unidos 5.739.169 Patente de Estados Unidos 5.780.448 Patente de Estados Unidos 5.789.166 Patente de Estados Unidos 5.789.215 Patente de Estados Unidos 5.798.208 Patente de Estados Unidos 5.801.005 Patente de Estados Unidos 5.824.311 65 Patente de Estados Unidos 5.830.650 Patente de Estados Unidos 5.830.880

Patente de Estados Unidos 5.840.873 Patente de Estados Unidos 5.843.640 Patente de Estados Unidos 5.843.650 Patente de Estados Unidos 5.843.651 5 Patente de Estados Unidos 5.843.663 Patente de Estados Unidos 5.846.225 Patente de Estados Unidos 5.846.233 Patente de Estados Unidos 5.846.708 Patente de Estados Unidos 5.846.709 Patente de Estados Unidos 5.846.717 Patente de Estados Unidos 5.846.726 Patente de Estados Unidos 5.846.729 Patente de Estados Unidos 5.846.783 Patente de Estados Unidos 5.846.945 15 Patente de Estados Unidos 5.849.481 Patente de Estados Unidos 5.849.483 Patente de Estados Unidos 5.849.486 Patente de Estados Unidos 5.849.487 Patente de Estados Unidos 5.849.497 Patente de Estados Unidos 5.849.546 Patente de Estados Unidos 5.849.547 Patente de Estados Unidos 5.851.770 Patente de Estados Unidos 5.851.772 Patente de Estados Unidos 5.851.772 25 Patente de Estados Unidos 5.853.990 Patente de Estados Unidos 5.853.992 Patente de Estados Unidos 5.853.993 Patente de Estados Unidos 5.856.092 Patente de Estados Unidos 5.858.652 Patente de Estados Unidos 5.861.244 Patente de Estados Unidos 5.863.732 Patente de Estados Unidos 5.863.753 Patente de Estados Unidos 5.866.331 Patente de Estados Unidos 5.866.337 35 Patente de Estados Unidos 5.866.366 Patente de Estados Unidos 5.871.986 Patente de Estados Unidos 5.882.864 Patente de Estados Unidos 5.900.481 Patente de Estados Unidos 5.905.024 Patente de Estados Unidos 5.910.407 Patente de Estados Unidos 5.912.124 Patente de Estados Unidos 5.912.145 Patente de Estados Unidos 5.912.148 Patente de Estados Unidos 5.916.776 45 Patente de Estados Unidos 5.916.779 Patente de Estados Unidos 5.919.626 Patente de Estados Unidos 5.919.630 Patente de Estados Unidos 5.922.574 Patente de Estados Unidos 5.925.517 Patente de Estados Unidos 5.925.525 Patente de Estados Unidos 5.925.565 Patente de Estados Unidos 5.928.862 Patente de Estados Unidos 5.928.869 Patente de Estados Unidos 5.928.870 55 Patente de Estados Unidos 5.928.905 Patente de Estados Unidos 5.928.906 Patente de Estados Unidos 5.929.227 Patente de Estados Unidos 5.932.413 Patente de Estados Unidos 5.932.451 Patente de Estados Unidos 5.935.791 Patente de Estados Unidos 5.935.819 Patente de Estados Unidos 5.935.825 Patente de Estados Unidos 5.939.291 Patente de Estados Unidos 5.942.391 65 Patente de Estados Unidos 5.945.100 Patente de Estados Unidos 5.981.274

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LISTADO DE SECUENCIAS 60

<110> STOJDL, DAVID BROWN, CHRISTOPHER BELL, JOHN

65 <120> RHABDOVIRUS ONCOLÍTICO

<130> FUL-338 EP

5

<140> 07 875 168.2 <141> <150> 60/844.726 <151>

10

<160> 28 <170> PatentIn versión 3.3

15

<210> 1 <211> 11068 <212> ADN <213> Desconocido

20

<220> <223> Virus Maraba <400> 1

<210> 2

<211> 422 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Maraba 10

<400> 2

<210> 3

<211> 265 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Maraba 10

<400> 3

<210> 4

<211> 229 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Maraba 10

<400> 4

<210> 5

<211> 512 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Maraba 10

<400> 5

<210> 6

<211> 2109 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Maraba 10

<400> 6

<210> 7

<211> 10716 5 <212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Carajas 10

<400> 7

<210> 8

<211> 442 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Carajas 10

<400> 8

<210> 9

<211> 261

<212> PRT 5 <213> Desconocido

<220>

<223> Virus Carajas

10 <400> 9

<210> 10

<211> 228 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Carajas 10

<400> 10

<210> 11

<211> 519 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Carajas 10

<400> 11

<210> 12

<211> 2109 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Carajas 10

<400> 12

<210> 13

<211> 12416 5 <212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Bahia Grande 10

<400> 13

<210> 14

<211> 513 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Bahia Grande 10

<400> 14

<210> 15

<211> 353 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Bahia Grande 10

<400> 15

<210> 16

<211> 220 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223>

Virus Bahia Grande 10

<220>

<221> misc_feature

<222> (160)..(160)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 15

<400> 16 <210> 17

<211> 591 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Bahia Grande 10

<400> 17

<210> 18

<211> 2175 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Bahia Grande 10

<400> 18

<210> 19

<211> 519 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Isf-VSV quimérico 10

<400> 19

<210> 20

<211> 1662

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Maraba

<400> 20

<210> 21

<211> 518

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Muir Spring

<220>

<221> misc_feature

<222> (384)..(384)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> misc_feature

<222> (386)..(386)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> misc_feature

<222> (389)..(390)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 21

<210> 22

<211> 2248

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Virus Muir Spring

<400> 22

<210> 23

<211> 1948 5 <212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> VSV 10

<400> 23

<210> 24

<211> 2031

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> virus del Ébola

<400> 24

5

<210> 25 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

10

<220> <223> Cebador sintético <400> 25 ctcgagggta tgaaaaaaac taacagatat cacggctag 39

15

<210> 26 <211> 523 <212> PRT <213> Desconocido

20

<220> <223> Virus Isfahan

<400> 26

<210> 27

<211> 530

<212> PRT 5 <213> Desconocido

<220>

<223> Virus Chandipura

10 <400> 27

<210> 28

<211> 611 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> retrovirus ovino Jaagsiekte 10

<400> 28

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un rhabdovirus oncolítico para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el rhabdovirus oncolítico codifica:

   (a)

   una proteína G que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 5, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 5;

   (b)

   una proteína N que tiene al menos un 96 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2;

   (c)

   una proteína M que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 4, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 4;

   (d)

   una proteína P que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 3, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 3; o

   (e)

   una proteína L que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 6, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 6.

2. 2.

   El rhabdovirus oncolítico para el uso de la reivindicación 1, en donde el cáncer es un cáncer metastásico.

3. 3.

   El rhabdovirus oncolítico para el uso de la reivindicación 1, en donde el tratamiento es mediante administración intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intradérmica, intratumoral, subcutánea, para administración intranasal.

4. 4.

   El rhabdovirus oncolítico para el uso de la reivindicación 1, en donde el tratamiento comprende adicionalmente la administración de una segunda terapia contra el cáncer, siendo preferiblemente la segunda terapia anti-neoplásica quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, o cirugía, o comprendiendo preferiblemente la segunda terapia contra el cáncer un segundo virus oncolítico tal como un virus vaccinia, un herpes virus, un virus del sarampión, un virus de la enfermedad de Newcastle, un adenovirus, un alfavirus, un parvovirus o un rhabdovirus.

5. 5.

   El rhabdovirus oncolítico para el uso de la reivindicación 4, en donde el segundo rhabdovirus es virus de la estomatitis vesicular (VSV), virus Arajas, virus Cocal, virus Isfahan, virus Maraba, virus Piry, virus Alagoas de estomatitis vesicular, virus BeAn 157575, virus Boteke, virus Calchaqui, virus de la anguila americana, virus Gray Lodge, virus Jurona, virus Klamath, virus Kwatta, virus La Joya, virus Malpais Spring, virus del murciélago de Mount Elgon, virus Perinet, virus Tupaia, Farmington, virus Bahia Grande, virus Muir Springs, virus Reed Ranch, virus Hart Park, virus Flanders, virus Kamese, virus Mosqueiro, virus Mossuril, virus Barur, virus Fukuoka, virus Kern Canyon, virus Nkolbisson, virus Le Dantec, virus Keuraliba, virus Connecticut, virus New Minto, virus Sawgrass, virus Chaco, virus Sena Madureira, virus Timbo, virus Almpiwar, virus Aruac, virus Bangoran, virus Bimbo, virus Bivens Arm, virus del cangrejo azul, virus Charleville, virus de la planicie costera, virus DakArK 7292, virus Entamoeba, virus Garba, virus Gossas, virus Humpty Doo, virus Joinjakaka, virus Kannamangalam, virus Kolongo, virus Koolpinyah, virus Kotonkon, virus Landjia, virus Manitoba, virus Marco, virus Nasoule, virus Navarro, virus Ngaingan, virus Oak-Vale, virus Obodhiang, virus Oita, virus Ouango, virus Parry Creek, virus de los cíclidos de Rio Grande, virus Sandjimba, virus Sigma, virus Sripur, virus Sweetwater Branch, virus Tibrogargan, virus Xiburema, virus Yata, Rhode Island, virus del Río Adelaide, virus Berrimah, virus Kimberley o virus de la fiebre efímera bovina.

6. 6.

   Un rhabdovirus oncolítico que codifica:

   (a)

   una proteína G que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 5, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 5;

   (b)

   una proteína N que tiene al menos un 96 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2;

   (c)

   una proteína M que tiene al menos un 85 % de identidad de aminoácidos con la SEC ID Nº 4, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 4;

   (d)

   una proteína P que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 3, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 3; o

   (e)

   una proteína L que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 6, o que tiene al menos 40 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 6.

7. 7.

   El rhabdovirus oncolítico de la reivindicación 6 para su uso en medicina.