ES2609071T3 - Rhabdovirus oncolítico - Google Patents

Abstract

Un rhabdovirus oncolítico que comprende: una proteína M que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un triptófano en la posición correspondiente a la posición 123 de SEQ ID NO: 4, y una proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, o una proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una arginina en la posición correspondiente a la posición 242 de SEQ ID NO: 5 y una proteína M que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un triptófano en la posición correspondiente a la posición 123 de SEQ ID 15 NO: 4.

Description

Rhabdovirus oncolítico

Antecedentes de la invención

I. Campo de la invención

Esta invención se refiere en general a virología y medicina. En ciertos aspectos la invención se refiere a virus oncolíticos, particularmente rhabdovirus oncolíticos.

II. Antecedentes

Se ha mostrado que un número de virus se replican en y destruyen una amplia variedad de células tumorales in vitro (virus Sindbis (Unno et al., 2005); virus Sendai (Kinoh et al., 2004); virus Coxackie (Shafren et al., 2004); virus herpes simple (Mineta et al., 1995); parvovirus (Abschuetz et al., 2006); adenovirus (Heise et al., 2000); virus de la polio (Gromeier et al., 2000); virus de la enfermedad de Newcastle; virus de la estomatitis vesicular (Stojdl et al., 2000); virus del sarampión (Grote et al., 2001); reovirus (Coffey et al., 1998); retrovirus (Logg et al., 2001); vaccinia (Timiryasova et al., 1999); y gripe (Bergmann et al., 2001)). Además, tales virus han demostrado eficacia al tratar modelos animales de cáncer. Permanece una necesidad para agentes terapéuticos adicionales para tratar cáncer.

El documento WO2009016433 divulga un rhabdovirus que tiene una proteína G de SEQ ID NO: 5, y una proteína M como se define en SEQ ID NO: 4, es decir, virus Maraba. El documento WO2009016433 propone manipular mutaciones atenuantes en el gen M para atenuar selectivamente el virus oncolítico en células normales.

Compendio de la invención

En el presente documento se describe una plataforma oncolítica novedosa y un sistema recombinante para manipular genéticamente el virus Maraba. Se ha generado un doble mutante de Maraba (“DM”) y demuestra seguridad y eficacia mediante administración sistémica en múltiples modelos tumorales, tanto inmunocompetentes como de xenoinjerto humano.

Varios rhabdovirus recientemente identificados son mucho más eficaces destruyendo cánceres particulares o líneas de células cancerosas que el VSV. Además, el VSV y mutantes atenuados de VSV son neurovirulentos y producen patología en el SNC en roedores y primates. Varios rhabdovirus no infectan el SNC (es decir, Muir Springs y Bahía Grande: Kerschner et al., 1986), y demuestran un perfil de seguridad más aceptable. Además, las terapias basadas en los rhabdovirus novedosos se pueden usar para tratar cánceres del SNC, tanto primarios como secundarios. Los rhabdovirus de la invención (y/u otros agentes oncolíticos) se pueden usar en sucesión para eludir la respuesta inmunitaria del huésped contra un virus terapéutico(s) particular(es). Esto permitiría terapia prolongada y mejora la eficacia.

Las formas de realización de la invención incluyen composiciones y usos relacionados con rhabdovirus y su uso como agentes terapéuticos anticancerosos. Tales rhabdovirus poseen propiedades destructoras de células tumorales in vitro e in vivo.

Como se usa en el presente documento, rhabdovirus puede ser virus Maraba o una variante manipulada del virus Maraba. Los virus descritos en el presente documento se pueden usar en combinación con otros rhabdovirus. Otros rhabdovirus incluyen uno o más de los siguientes virus o variantes de los mismos: virus Carajas, virus Chandipura, Virus Cocal, virus Isfahán, virus Piry, virus de la estomatitis vesicular Alagoas, virus BeAn 157575, virus Boteke, virus Calchaqui, virus de anguilas americano, virus Gray Lodge, virus Jurona, virus Klamath, virus Kwatta, virus La Joya, virus Malpais Spring, virus de murciélago Mount Elgon, virus Perinet, virus Tupaia, Farmington, virus Bahía Grande, virus Muir Springs, virus Reed Ranch, virus Hart Park, virus Flanders, virus Kamese, virus Mosqueiro, virus Mossuril, virus Barur, virus Fukuoka, virus Kern Canyon, virus Nkolbisson, virus Le Dantec, virus Keuraliba, virus Connecticut, virus New Minto, virus Sawgrass, virus Chaco, virus Sena Madureira, virus Timbo, virus Almpiwar, virus Aruac, virus Bangoran, virus Bimbo, virus Bivens Arm, virus del cangrejo azul, virus Charleville, virus Coastal Plains, virus DakArK 7292, virus Entamoeba, virus Garba, virus Gossas, virus Humpty Doo, virus Joinjakaka, virus Kannamangalam, virus Kolongo, virus Koolpinyah, virus Kotonkon, virus Landjia, virus Manitoba, virus Marco, virus Nasoule, virus Navarro, virus Ngaingan, virus Oak-Vale, virus Obodhiang, virus Oita, virus Ouango, virus Parry Creek, virus de cíclidos Rio Grande, virus Sandjimba, virus Sigma, virus Sripur, virus Sweetwater Branch, virus Tibrogargan, virus Xiburema, virus Yata, Rhode Island, virus del río Adelaida, virus Berrimah, virus Kimberley, o virus de la fiebre efímera de bovinos. En ciertos aspectos, rhabdovirus se puede referir al supergrupo de Dimarhabdovirus (definido como rhabdovirus capaces de infectar células tanto de insecto como de mamíferos). En formas de realización específicas el rhabdovirus no es VSV. En aspectos particulares el rhabdovirus es un virus Carajas, virus Maraba, Farmington, virus Muir Springs, y/o virus Bahía grande, incluyendo variantes de los mismos. Cualesquiera 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 12 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 o más, incluyendo

todos los números enteros o intervalos entre ellos, de estos virus se pueden excluir específicamente del ámbito de las reivindicaciones.

Una forma de realización de la invención incluye usos y composiciones que comprenden un virus Maraba oncolítico que codifica una proteína M y/o G variante que tiene una identidad de aminoácidos de al menos o como mucho el 80, 85, 90, 92, 94, 96, 99, 100%, incluyendo todos los intervalos y porcentajes entre ellos, respecto a la proteína M o G del virus Maraba. Un rhabdovirus oncolítico comprende el aminoácido 123 de la proteína M (SEQ ID NO: 4) mutado. Otro rhabdovirus oncolítico comprende tanto el aminoácido 242 de la proteína G (SEQ ID NO: 5) como el aminoácido 123 de la proteína M (SEQ ID NO: 4) mutados. El aminoácido 242 se sustituye con una arginina (Q242R) que atenúa el virus. El aminoácido 123 se sustituye con un triptófano (L123W) que atenúa el virus. En ciertos aspectos dos mutaciones separadas individualmente atenúan el virus en células sanas normales. Tras la combinación de los mutantes el virus se vuelve más virulento en células tumorales que el virus de tipo salvaje. Por tanto, el índice terapéutico del Maraba DM aumenta inesperadamente.

Por tanto, en un aspecto la invención se refiere a un rhabdovirus oncolítico que comprende: una proteína M que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un triptófano en la posición correspondiente a la posición 123 de SEQ ID NO: 4, y una proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, o

una proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una arginina en la posición correspondiente a la posición 242 de SEQ ID NO: 5 y una proteína M que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un triptófano en la posición correspondiente a la posición 123 de SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto la proteína G tiene una secuencia de aminoácidos que es el 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 excepto por una arginina en la posición correspondiente a la posición 242 de SEQ ID NO: 5, y la proteína M tiene una secuencia de aminoácidos que es el 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 excepto por un triptófano en la posición correspondiente a la posición 123 de SEQ ID NO: 4.

Los usos y composiciones de la invención pueden incluir un segundo virus terapéutico, tal como un virus oncolítico o deficiente en replicación. Oncolítico típicamente se refiere a un agente que es capaz de destruir, lisar o parar el crecimiento de una célula cancerosa. En términos de un virus oncolítico el término se refiere a un virus que se puede replicar hasta un cierto grado en una célula cancerosa, producir la muerte, lisis (oncolisis), o suspensión del crecimiento de una célula cancerosa y típicamente tiene efectos tóxicos mínimos sobre células no cancerosas. Un segundo virus incluye, pero no está limitado a un adenovirus, un virus vaccinia, un virus de la enfermedad de Newcastle, un alfavirus, un parvovirus, un virus herpes, un rhabdovirus, un rhabdovirus y similares. En otros aspectos, la composición es una composición farmacéuticamente aceptable. La composición también puede incluir un segundo agente anticáncer, tal como un agente quimioterapéutico, radioterapéutico o inmunoterapéutico.

Formas de realización adicionales de la invención incluyen usos en destruir una célula hiperproliferativa que comprende poner en contacto la célula con un rhabdovirus oncolítico aislado de la invención.

Usos aún adicionales incluyen el tratamiento de un paciente de cáncer que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición de rhabdovirus oncolítico descrita en el presente documento.

En ciertos aspectos de la invención, una célula puede estar comprendida en un paciente y puede ser una célula hiperproliferativa, neoplásica, precancerosa, cancerosa, metastásica o metastatizada. Se puede administrar un rhabdovirus (por ejemplo, virus Maraba) a un paciente que tiene una célula susceptible a destrucción por al menos un rhabdovirus o una pauta o composición terapéutica que incluye un rhabdovirus. La administración de las composiciones terapéuticas se puede hacer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más rhabdovirus o rhabdovirus recombinantes, solo en varias combinaciones. La composición administrada puede tener 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 o más partículas víricas o unidades formadores de placa (ufp). La administración puede ser por administración intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intradérmica, subcutánea o intranasal. En ciertos aspectos, las composiciones se administran sistémicamente, particularmente por administración intravascular, que incluye inyección, perfusión y similares. Los usos de la invención pueden comprender además administrar una segunda terapia anticáncer, tal como un segundo virus terapéutico. En ciertos aspectos un virus terapéutico puede ser un virus oncolítico, más particularmente un virus Maraba. En otros aspectos, un segundo agente anticáncer es un agente quimioterapéutico, radioterapéutico, inmunoterapéutico, cirugía o similares.

Formas de realización de la invención incluyen composiciones y usos relacionados a un rhabdovirus que comprende una proteína G heteróloga (virus pseudotipado) y su uso como agente terapéutico anticáncer. Tales rhabdovirus poseen propiedades destructoras de células tumorales in vitro e in vivo. Por tanto, un virus Maraba como se describe en el presente documento se puede modificar adicionalmente por asociación de una proteína G heteróloga también. Como se usa en el presente documento, una proteína G heteróloga incluye proteína G de rhabdovirus. Los rhabdovirus incluirán uno o más de los siguientes virus o variantes de los mismos: virus Carajas, virus Chandipura,

virus Cocal, virus Isfahán, virus Maraba, virus Piry, virus de la estomatitis vesicular Alagoas, virus BeAn 157575, virus Boteke, virus Calchaqui, virus de anguilas americano, virus Gray Lodge, virus Jurona, virus Klamath, virus Kwatta, virus La Joya, virus Malpais Spring, virus de murciélago Mount Elgon, virus Perinet, virus Tupaia, Farmington, virus Bahía Grande, virus Muir Springs, virus Reed Ranch, virus Hart Park, virus Flanders, virus Kamese, virus Mosqueiro, virus Mossuril, virus Barur, virus Fukuoka, virus Kern Canyon, virus Nkolbisson, virus Le Dantec, virus Keuraliba, virus Connecticut, virus New Minto, virus Sawgrass, virus Chaco, virus Sena Madureira, virus Timbo, virus Almpiwar, virus Aruac, virus Bangoran, virus Bimbo, virus Bivens Arm, virus del cangrejo azul, virus Charleville, virus Coastal Plains, virus DakArK 7292, virus Entamoeba, virus Garba, virus Gossas, virus Humpty Doo, virus Joinjakaka, virus Kannamangalam, virus Kolongo, virus Koolpinyah, virus Kotonkon, virus Landjia, virus Manitoba, virus Marco, virus Nasoule, virus Navarro, virus Ngaingan, virus Oak-Vale, virus Obodhiang, virus Oita, virus Ouango, virus Parry Creek, virus de cíclidos de Rio Grande, virus Sandjimba, virus Sigma, virus Sripur, virus Sweetwater Branch, virus Tibrogargan, virus Xiburema, virus Yata, Rhode Island, virus del rio Adelaida, virus Berrimah, virus Kimberley, o virus de la fiebre efímera de bovinos. En ciertos aspectos, rhabdovirus se puede referir al supergrupo de Dimarhabdovirus (definido como rhabdovirus capaces de infectar células tanto de insecto como de mamíferos). En aspectos particulares el rhabdovirus es un virus Carajas, virus Maraba, Farmington, virus Muir Springs, y/o virus Bahía grande, incluyendo variantes de los mismos.

Formas de realización adicionales de la invención incluyen usos en destruir una célula hiperproliferativa que comprende administrar o poner en contacto la célula con una composición de virus Maraba oncolítico. Usos aún adicionales incluyen el tratamiento de un paciente de cáncer que comprende administrar una cantidad eficaz de tal composición vírica.

En ciertos aspectos de la invención, una célula puede estar comprendida en un paciente y puede ser una célula hiperproliferativa, neoplásica, precancerosa, cancerosa, metastásica o metastasizada. Se puede administrar un virus de la invención a un paciente que tiene una célula susceptible a destrucción por al menos un virus o una pauta o composición terapéutica que incluye un virus. La administración de composiciones terapéuticas se puede hacer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más virus, solo en varias combinaciones. La composición administrada puede tener 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 o más partículas víricas o unidades formadores de placa (ufp). La administración puede ser por administración intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intradérmica, subcutánea o intranasal. En ciertos aspectos, las composiciones se administran sistémicamente, particularmente por administración intravascular, que incluye inyección, perfusión y similares. Los usos de la invención pueden comprender además administrar una segunda terapia anticáncer, tal como un segundo virus terapéutico. En aspectos particulares un virus terapéutico puede ser un virus oncolítico, tal como un virus Maraba como se describe en el presente documento. En otros aspectos, un segundo agente anticáncer es un agente quimioterapéutico, radioterapéutico, inmunoterapéutico, cirugía o similares.

Otras formas de realización de la invención se discuten a lo largo de esta solicitud. Cualquier forma de realización discutida con respecto a un aspecto de la invención aplica a otros aspectos de la invención también, y viceversa. Las formas de realización en las secciones Descripción Detallada y Ejemplos se entiende que son formas de realización no limitantes de la invención que son aplicables a todos los aspectos de la invención.

Los términos “inhibir”, “reducir” o “prevenir” o cualquier variación de estos términos, cuando se usan en las reivindicaciones y/o la especificación incluyen cualquier disminución medible o inhibición completa para alcanzar un resultado deseado, por ejemplo, tratamiento de cáncer. Los resultados deseados incluyen, pero no están limitados a, paliación, reducción, ralentización o erradicación de un estado canceroso o hiperproliferativo o síntomas relacionados con cáncer, así como una calidad mejorada o extensión de vida.

El uso de la palabra “un” o “una” cuando se usa junto el término “comprender” en las reivindicaciones y/o la especificación significa “uno”, pero también es consistente con el significado de “uno o más”, “al menos uno” y “uno o más de uno”.

A lo largo de esta solicitud, el término “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la desviación estándar del error para el dispositivo o uso que se emplea para determinar el valor.

El uso del término “o” en las reivindicaciones se usa para significar “y/o” a menos que se indique explícitamente que se refiera a alternativas solo o las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación apoya una definición que se refiere solo a alternativas y “y/o”.

Como se usa en esta especificación y reivindicación(es), las palabras “comprender” (y cualquier forma de comprender, tal como “comprenden” y “comprende”), “tener” (y cualquier forma de tener, tal como “tienen” y “tiene”), “incluir” (y cualquier forma de incluir, tal como “incluye” e “incluyen”) o “contener” (y cualquier forma de contener, tal como “contiene” y “contienen”) son inclusivas o abiertas y no excluyen elementos o pasos de método adicionales, no enumerados.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada. Se debe entender, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, mientras que

indican formas de realización específicas de la invención, se dan a modo de ilustración solo, ya que varios cambios y modificaciones serán aparentes para los expertos en la materia a partir de esta descripción detallada.

Descripción de las figuras

Las siguientes figuras forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor por referencia a una o más de estas figuras en combinación con la descripción detallada de formas de realización específicas presentadas en el presente documento.

Figuras 1A-1B. El rhabdovirus Maraba novedoso demuestra alta productividad vírica en células cancerosas. Se usó una curva de crecimiento de un paso para cuantificar la productividad vírica de Maraba, Carajas, Farmington y Bahía Grande en la figura 1A células NCI H226 y figura 1B SNB19. Maraba consistentemente se replica a títulos más altos en ambas líneas celulares comparado con los otros virus.

Figuras 2A-2F. Los mutantes de Maraba retienen su potencia destructora en células cancerosas sin embargo están atenuados en células normales. (Fig. 2B) Ilustración del genoma de Maraba virus Maraba manipulado como un agente oncolítico delineando los varios sitios de mutación para nuestros mutantes individuales (L123W, V221Y, Q242R) y doble mutante (Q242R L123W). (Fig. 2C) Las mutaciones en la proteína G y M atenúan la capacidad de Maraba de destruir células GM38. Se realizaron ensayos de viabilidad en células GM38 72 horas tras la infección con Maraba, y los mutantes de Maraba indicados. (Fig. 2D) La introducción de la mutación L123W en el mutante de Maraba Q242R revierte los tamaños de las placas al fenotipo de tipo salvaje. Se realizó el ensayo de placa en células SNB19 infectadas con Maraba de tipo salvaje, variantes individuales y DM. El diámetro se midió y el área de la placa se calculó usando la siguiente fórmula A=TTr2. (Fig. 2E) Maraba y variantes de Maraba son muy líticos en una variedad de líneas de células tumorales. Imágenes de células PC3, ES2 y SW620 48 horas después de la infección con Maraba de tipo salvaje y variantes de Maraba. (Fig. 2F) Se ensayaron células infectadas con Maraba WT y las variantes de Maraba usando resazurina para viabilidad. La viabilidad se reduce drásticamente en todas las líneas celulares tratadas 48 horas tras la infección con Maraba y sus variantes.

Figuras 3A-3C. Los mutantes de Maraba varían en su capacidad de bloquear la producción de interferón. Se infectaron células PC-3 con las variantes de Maraba y el sobrenadante se usó para proteger células Vero de infección posterior con virus Maraba de tipo salvaje. (Fig. 3A) El mutante Q242R bloquea interferón similar a Maraba de tipo salvaje. (Fig. 3B) El mutante L123W, mutante V221Y, Maraba ΔM51, y el doble mutante L123W-M/Q242R-G permiten que se produzca interferón después de la infección de células PC3. (Fig. 3C) rMaraba bloquea el transporte nuclear/citoplásmico de IFN-β. La inducción del ARNm de IFN-β no se detecta en la fracción citoplásmica después de la infección con rMaraba o Maraba Q242R determinado por qRTPCR. Las células infectadas con Δ51M, L123W y Maraba DM muestran inducción de ARNm de IFN-β en el citoplasma después de la infección.

Figuras 4A-4D. La administración sistémica de Maraba DM es eficaz en modelos tumorales en ratón singénico y de xenoinjerto. (Fig. 4A) Maraba DM es eficaz en tratar un modelo de tumor bilateral CT-26 (i) DMGFP y DM-FLUC se replican selectivamente en el sitio del tumor 24 horas tras la inyección IV (5x108 ufp). (ii) Supervivencia durable de ratones Balb/C con tumores CT26 bilaterales tras tratamiento con Maraba DM. (iii) Se calcularon los volúmenes tumorales de forma bisemanal. Las barras de error indican EEM. (iv) Pesos de los ratones medidos antes de y después del tratamiento con Maraba DM y control. Las barras de error indican EEM. (Fig. 4B) Tratamiento sistémico de tumores CT-26 diseminados. (i) Se trataron tumores de pulmón CT-26 por vía intravenosa con PBS, virus Carajas

o Maraba DM el día 10 tras la implantación del tumor. El día 17 los animales se sacrificaron y se capturaron imágenes de los pulmones. (ii) Tratamiento tumoral eficaz con 6 dosis intravenosas de Maraba DM (5x108 ufp/dosis). (Fig. 4C) Maraba DM es eficaz en un modelo de xenoinjerto ovárico humano (ES-2) (inyecciones IP, 1x104 ufp/dosis). (i) Imágenes IVIS que demuestran una regresión tumoral rápida después del tratamiento con el virus. (ii) Gráfico del flujo bioluminescente que cuantifica una reducción significativa en carga tumoral abdominal en respuesta al tratamiento con el virus. (iii) El gráfico de Kaplan Meier demuestra supervivencia aumentada después del tratamiento con virus. (Fig. 4D) Maraba DM es superior a VSV Δ51 en tratar tumores de xenoinjerto ES-2 (inyecciones IV 1x105-1x107 ufp/dosis). (i-ii) Los gráficos de Kaplan Meier demuestran supervivencia aumentada en animales tratados con Maraba DM comparado con VSV Δ51.

Figura 5. Destrucción celular mediada por rhabdovirus en el panel de células NCI 60. Las células del panel de células NCI 60 se sembraron en placas de 96 pocillos a una confluencia del 90%. Estas células se infectaron a diluciones logarítmicas con varios rhabdovirus, como se indica. Después de 48 o 96 tras la infección con virus Maraba manipulado como un agente oncolítico, las monocapas se lavaron, fijaron y tiñeron con solución de violeta cristal al 1%. Las monocapas teñidas se solubilizaron posteriormente en SDS al 1% en agua para crear lisados homogéneos. Se leyó la absorbancia a 595 nm y para puntuar para células viables. Se puntuaron MOI CE50 en intervalos como se indica en la figura.

Descripción detallada de la invención

Aspectos de la invención se basan en la destrucción por rhabdovirus (por ejemplo, virus Maraba) o rhabdovirus pseudotipados de varias clases o tipos de células cancerosas. Algunas de las ventajas de estos rhabdovirus oncolíticos y rhabdovirus recombinantes incluyen las siguientes: (1) Los anticuerpos contra los rhabdovirus inventivos serán de raros a no existentes en la mayoría de las poblaciones del mundo. (2) Los rhabdovirus se replican más rápidamente que otros virus oncolíticos tal como adenovirus, reovirus, sarampión, parvovirus, retrovirus y HSV. (3) Los rhabdovirus crecen a títulos altos y son filtrables a través de filtros de 0,2 micrómetros. (4) Los rhabdovirus oncolíticos y recombinantes de los mismos tienen una amplia gama de huéspedes, capaces de infectar muchos tipos diferentes de células cancerosas y no están limitados por receptores en una célula particular (por ejemplo, coxsackie, sarampión, adenovirus). (5) Los rhabdovirus de la invención son susceptibles a manipulación genética. (6) El rhabdovirus también tiene un ciclo de vida citoplásmico y no se integra en el material genético de una célula huésped, lo que imparte un perfil de seguridad más favorable.

Como se ha descrito en el presente documento, se identificó un virus oncolítico novedoso para servir como una plataforma para construir terapias contra el cáncer basadas en virus eficaces. Los Rhabdoviridae se cribaron para un virus con propiedades que contribuyeran a efectos oncolíticos fuertes. La administración sistémica es un método anticipado de administración y es un aspecto beneficioso en tratar cánceres diseminados en el ámbito clínico. En ciertos aspectos, un virus se administra por vía intravenosa y puede iniciar la infección en sitios tumorales dispares. Se postula que una de las limitaciones in vivo para la terapia eficaz podría ser que la administración del virus al lecho tumoral pueda ser limitante. De hecho, se han observado umbrales de dosis por debajo de los cuales el virus no se administra eficazmente al tumor en modelos de ratón, y estas dosis no eran eficaces (Stojdl et al., 2003). Por tanto, los inventores estaban interesados en encontrar virus capaces de destruir células tumorales a bajas multiplicidades de infección (“MOI”), que se replican rápidamente, y que producen grandes números de progenie para maximizar la probabilidad y magnitud de la infección del lecho tumoral. Para este fin se diseñó un ensayo en placa multipocillo para identificar virus capaces de destruir una amplia gama de células tumorales a baja MOI. Posterior a los ensayos de MOI, los virus más potentes se ensayaron para cinética de crecimiento y cantidad de virus producidos. Se identificó el virus Maraba como un candidato prometedor.

Se obtuvieron la secuencia del genoma completo de Maraba (SEQ ID NO: 1) y Carajas (CRJ) (SEQ ID NO: 7).

Una vez se identificó el virus Maraba como candidato, los inventores realizaron estudios de ingeniería genética para mejorar su selectividad tumoral. Dos mutaciones interesantes se identificaron originalmente en estudios para seguir la aptitud biológica de virus de ARN en cambiar entornos. En un artículo previo, tanto L123W como H242R (Q242R en Maraba) eran capaces individualmente de aumentar la replicación de VSV en células BHK21. Además, se describió que la combinación de estas dos mutaciones retuvo este fenotipo de aptitud biológica. Las mutaciones L123W/Q242R proporcionan un virus con un índice terapéutico de al menos 3 log (CE50 <10-3 MOI en algunas células tumorales; CE50 = 3 MOI en fibroblastos GM38). Las mutaciones Q242R y L123W son atenuantes en fibroblastos normales. La mutación L123W parece funcionar lo mismo que ΔM51 y V221Y, produciendo un defecto en la capacidad para bloquear el transporte nuclear/citoplásmico inhibiendo de esta manera la cascada transcripcional de IFN del huésped. Según el conocimiento de los inventores, esta es la primera demostración de un papel para esta región de la proteína de matriz en mitigar las defensas inmunitarias innatas del huésped. Previamente, se ha descrito que mutaciones en esta región afectan la traducción del ARNm del virus (Connor et al., 2006). La mutación Q242R reduce severamente la citólisis por virus Maraba de células normales, pero de una manera independiente de IFN. Estas propiedades forman la base de una potente selectividad tumoral que produce un aumento significativo en el índice terapéutico para esta novedosa plataforma de virus oncolítico basada en Maraba.

Como se predice de sus resultados in vitro, la variante Maraba DM era significativamente menos tóxica que el virus de tipo salvaje cuando se administró por vía intravenosa a ratones Balb/C. La dosis máxima tolerada (“DMT”) era 100 veces mayor que el virus WT. Esto permitía dosificar muy por debajo de la DMT para alcanzar regresiones tumorales significativas en ambos modelos tumorales. En el modelo CT26, por ejemplo, 6 dosis de virus Maraba DM eran suficientes para proporcionar curas completas durables en todos los ratones. Particularmente importante para el ámbito clínico, Maraba DM era eficaz en tratar tanto un tumor de xenoinjerto humano como un modelo tumoral singénico inmunocompetente por administración sistémica. Se demostró replicación del virus en el sitio tumoral en el modelo de tumor CT26 después de la inyección intravenosa, consistente con oncolisis mediada por virus como un contribuyente a la eficacia. De hecho, Maraba DM parece ser más eficaz que candidatos previos VSV ΔM51 en el modelo de xenoinjerto ES2. Esto es consistente con los datos in vitro que demuestran que Maraba DM es más eficaz en destruir células tumorales que incluso el virus WT. Varios estudios han demostrado definitivamente que la respuesta inmunitaria del huésped desempeña un papel positivo y negativo en la eficacia de virus oncolíticos (Dhar et al., 2008; Altomonte et al., 2008; Endo et al., 2008; Chiocca et al., 2008).

Las formas de realización de la invención incluyen composiciones y usos relacionados a virus Maraba o rhabdovirus pseudotipados y su uso como agentes terapéuticos anticáncer.

I. Familia Rhabdoviridae (rhabdovirus)

Los rhabdovirus arquetípicos son el virus de rabia y de la estomatitis vesicular (VSV), los más estudiados de esta familia. Aunque estos virus comparten morfologías similares, son muy diferentes en su ciclo de vida, gama de huéspedes, y patología. Los rhabdovirus es una familia de virus con forma de bala que tienen genomas de ARN de sentido (-) no segmentados. Hay más de 250 rhabdovirus conocidos que infectan mamíferos, peces, insectos y plantas.

La familia de los rhabdovirus incluye, pero no está limitada a: virus Carajas, virus Chandipura (AF128868 / gi:4583436, AJ810083 / gi:57833891, AY871800 / gi:62861470, AY871799 / gi:62861468, AY871798 / gi:62861466, AY871797 / gi:62861464, AY871796 / gi:62861462, AY871795 / gi:62861460, AY871794 / gi:62861459, AY871793 / gi:62861457, AY871792 / gi:62861455, AY871791 / gi:62861453), virus Cocal (AF045556 / gi:2865658), virus Isfahan (AJ810084 / gi:57834038), virus Maraba (SEQ ID NO:1-6), virus Carajas (SEQ ID NO:7-12, AY335185 / gi:33578037), virus Piry (D26175 / gi:442480, Z15093 / gi:61405), virus de la estomatitis Vesicular Alagoas, virus BeAn 157575, virus Boteke, virus Calchaqui, virus de anguila americano, virus Gray Lodge, virus Jurona, virus Klamath, virus Kwatta, virus La Joya, virus Malpais Spring, virus de murciélagos Mount Elgon (DQ457103 / gi|91984805), virus Perinet (AY854652 / gi:71842381), virus Tupaia (NC_007020/ gi:66508427), Farmington, virus Bahía Grande (SEQ ID NO:13-18), virus Muir Springs, virus Reed Ranch, virus Hart Park, virus Flanders (AF523199 / gi:25140635, AF523197 / gi:25140634, AF523196 / gi:25140633, AF523195 / gi:25140632, AF523194 / gi:25140631, AH012179 / gi:25140630), virus Kamese, virus Mosqueiro, virus Mossuril, virus Barur, virus Fukuoka (AY854651 / gi:71842379), virus Kern Canyon, virus Nkolbisson, virus Le Dantec (AY854650 / gi:71842377), virus Keuraliba, virus Connecticut, virus New Minto, virus Sawgrass, virus Chaco, virus Sena Madureira, virus Timbo, virus Almpiwar (AY854645 / gi:71842367), virus Aruac, virus Bangoran, virus Bimbo, virus Bivens Arm, virus de cangrejo azul, virus Charleville, virus Coastal Plains, virus DakArK 7292, virus Entamoeba, virus Garba, virus Gossas, virus Humpty Doo (AY854643 / gi:71842363), virus Joinjakaka, virus Kannamangalam, virus Kolongo (DQ457100 / gi|91984799 ARNm de nucleoproteína (N), cds parcial); virus Koolpinyah, virus Kotonkon (DQ457099 / gi|91984797, AY854638 / gi:71842354); virus Landjia, virus Manitoba, virus Marco, virus Nasoule, virus Navarro, virus Ngaingan (AY854649 / gi:71842375), virus Oak-Vale (AY854670 / gi:71842417), virus Obodhiang (DQ457098 / gi|91984795), virus Oita (AB116386 / gi:46020027), virus Ouango, virus Parry Creek (AY854647 / gi:71842371), virus de cíclidos de Rio Grande, virus Sandjimba (DQ457102 / gi|91984803), virus Sigma (AH004209 / gi:1680545, AH004208 / gi:1680544, AH004206 / gi:1680542), virus Sripur, virus Sweetwater Branch, virus Tibrogargan (AY854646 / gi:71842369), virus Xiburema, virus Yata, Rhode Island, virus del rio Adelaida (U10363 / gi:600151, AF234998 / gi:10443747, AF234534 / gi:9971785, AY854635 / gi:71842348), virus Berrimah (AY854636 / gi:71842350]), virus Kimberley (AY854637 / gi:71842352), o virus de la fiebre efímera de bovinos (NC_002526 / gi:10086561).

A. Genoma rhabdovírico

Típicamente el genoma de rhabdovirus es aproximadamente 11-15 kb con una región líder en 3’ de aproximadamente 50 nucleótidos y una región 5’ no traducida de aproximadamente 60 nucleótidos de un ARN vírico (ARNv) de sentido (-). Típicamente, el ARNv de rhabdovirus tiene 5 genes que codifican 5 proteínas. Los rhabdovirus tienen una señal de poliadenilación conservada en el extremo de cada gen y una región intergénica corta entre cada uno de los 5 genes. Todos los rhabdovirus contienen al menos cinco genes que codifican la proteína de la nucleocápside (N), fosfoproteína (P, también designada NS), proteína de matriz (M), glucoproteína (G) y proteína grande (L). Típicamente estos genes se ordenan en el ARNv de sentido negativo como sigue: 3’-N-P-MG-(X)-L-5’ (SEQ ID NO: 29). El orden de los genes es importante ya que dicta la proporción de proteínas sintetizadas. Cualquier manipulación de un genoma de rhabdovirus típicamente incluirá al menos cinco dominios de transcripción para mantener la capacidad para infectar y replicarse a altos niveles. Los rhabdovirus tienen una ARN polimerasa endógena para la transcripción del ARN mensajero (ARNm) de sentido positivo. El gen X no se produce en todos los rhabdovirus. El gen X codifica una proteína no estructural encontrada en el virus de necrosis hematopoyética infecciosa de peces (GenBank DQ164103 / gi|76262981; DQ164102 / gi|76262979; DQ164101 / gi|76262977; DQ164100 / gi|76262975; DQ164099 gi|76262973; AB250935 / gi|112821165; AB250934 / gi|112821163; AB250933 / gi|112821161; AB250932 / gi|112821159; AB250931 / gi|112821157; AB250930 / gi|112821155; AB250929 / gi|112821153; AB250928 / gi|112821151; AB250927 / gi|112821149, que describe la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína G), una glucoproteína estructural en el virus de la fiebre efímera de bovinos y un pseudogén en el virus de la rabia. El gen extra (X) se ha encontrado en diferentes localizaciones en el genoma de rhabdovirus. La síntesis de la proteína M en células infectadas es citopática para la célula, y finalmente producirá muerte celular.

La transmisión de rhabdovirus varía dependiendo de virus/huésped, pero la mayoría se transmitan por contacto directo -por ejemplo, transmisión de la rabia por mordeduras de animales o vector insecto. Hay un periodo de incubación largo in vivo, pero esto no se refleja en la cinética de la replicación del virus en cultivo. Las espículas de proteína G se unen a receptores en la superficie de células huésped y los virus entran en la célula por endocitosis y fusión con la membrana de la vesícula, mediada por la proteína G.

Sin intención de estar limitado a una teoría particular, se cree que las moléculas de receptor para rhabdovirus son fosfolípidos o hidratos de carbono más que proteínas específicas. La replicación rhabdovírica se produce en el citoplasma – tanto las proteínas L como NS son necesarias para la transcripción – ninguna funciona sola. Se producen cinco ARNm monocistrónicos, protegidos en el extremo 5’ y poliadenilados en el extremo 3’ y cada uno

contiene la secuencia líder del extremo 3’ del ARNv en el extremo 5’ del mensajero. Estos ARNm se hacen por transcripción secuencial de las ORF en el genoma del virus y se ha mostrado que la secuencia intergénica es responsable para la terminación y reinicio de la transcripción por la polimerasa entre cada gen, produciendo de esta manera transcritos separados.

El ARNv progenie se hace de un intermedio de sentido (+). El genoma se replica por el complejo polimerasa L + P (como en la transcripción), pero también se requieren factores de la célula huésped adicionales. Es característico de los rhabdovirus que estos sucesos se produzcan todos en una porción del citoplasma que actúa como una ‘fábrica’ de virus y aparece como un cuerpo de inclusión citoplásmico característico.

B. Variantes de proteínas víricas

En ciertas formas de realización, un virus Maraba o un rhabdovirus comprenderá una variante de una o más de las proteínas N, P, M, G y/o L. Estas variantes de proteínas víricas pueden estar comprendidas en un virus terapéutico,

o una composición proteinacea, que se define adicionalmente posteriormente. Las composiciones proteinaceas incluyen partículas víricas y otras composiciones que tienen uno o más componentes de proteína vírica. Esta(s) variante(s) de polipéptido se pueden manipular o seleccionar para una modificación en una o más características fisiológicas o biológicas, tal como gama de célula huésped, especificidad de célula huésped, toxicidad a células u órganos no diana, replicación, citotoxicidad a una célula diana, destrucción de células cancerosas, estasis de las células cancerosas, infectividad, parámetros de producción, tamaño de la partícula vírica, estabilidad de las partículas víricas, depuración in vivo, inmunorreactividad, y similares. Estas variantes polipeptídicas se pueden manipular usando una variedad de metodologías conocidas en la técnica, incluyendo varias técnicas de mutagénesis. En ciertas divulgaciones, las proteínas N, P, M, G y/o L pueden ser heterólogas a un virus (por ejemplo, un VSV puede comprender una proteína G de Isfahán o variante de la misma).

C.

Rhabdovirus recombinantes

Los rhabdovirus recombinantes se pueden producir (1) usando enteramente ADNc o (2) una combinación de ADNc transfectados en una célula auxiliar, o (3) ADNc transfectados en una célula, que se infecta además con un minivirus que proporciona en trans los restantes componentes o actividades necesarios para producir un rhabdovirus recombinante infeccioso o no infeccioso. Usando cualquiera de estos métodos (por ejemplo, minivirus, línea celular auxiliar, o transfección de ADNc solo), los componentes requeridos mínimos son una molécula de ARN que contiene las señales que actúan en cis para (1) encapsidación del ARN genómico (o antigenómico) por la proteína N del rhabdovirus, y (2) replicación de un equivalente de ARN genómico o antigenómico (intermedio replicativo).

Mediante un elemento de replicación o replicón, los inventores quieren decir una hebra de ARN que contiene mínimamente en los extremos 5’ y 3’ la secuencia líder y la secuencia remolque de un rhabdovirus. En el sentido genómico, el líder está en el extremo 3’ y el remolque está en el extremo 5’. Cualquier ARN situado entre estas dos señales de replicación se replicará a su vez. Las regiones líder y remolque deben contener además los elementos que actúan en cis mínimos para fines de encapsidación por la proteína N y para la unión de la polimerasa que son necesarios para iniciar la transcripción y replicación.

Para preparar rhabdovirus manipulados un minivirus que contiene el gen G también contendría una región líder, una región remolque y un gen G con las señales de iniciación y terminación apropiadas para producir un ARNm de la proteína G. Si el minivirus comprende además un gen M, las señales de iniciación y terminación apropiadas para producir el ARNm de la proteína M también deben estar presentes.

Para cualquier gen contenido en el genoma del rhabdovirus manipulado, el gen estaría flanqueado por las señales de iniciación y terminación de transcripción apropiadas lo que permitiría la expresión de esos genes y la producción de los productos proteicos. Particularmente un gen heterólogo, que es un gen que típicamente no está codificado por un rhabdovirus aislado de la naturaleza o contiene una región codificante de rhabdovirus en una posición, forma o contexto que típicamente no se encuentra, por ejemplo, una proteína G quimérica.

Para producir un rhabdovirus manipulado “no infeccioso”, el rhabdovirus manipulado debe tener elementos de replicón mínimos y las proteínas N, P y L y debe contener el gen M (un ejemplo es la construcción ΔG o G menos, que carece de la región codificante de la proteína G). Esto produce partículas víricas que geman de la célula, pero son partículas no infecciosas. Para producir partículas “infecciosas”, las partículas víricas deben comprender además proteínas que pueden mediar la unión de la partícula vírica y fusión, tal como mediante el uso de una proteína de unión o ligando de receptor. El ligando del receptor nativo de rhabdovirus es la proteína G.

Una “célula adecuada” o “célula huésped” significa cualquier célula que permitiría el ensamblaje del rhabdovirus recombinante. Un método para preparar partículas víricas infecciosas, una línea celular apropiada (por ejemplo, células BHK) se infecta primero con virus vaccinia vTF7-3 (Fuerst et al., 1986) o equivalente que codifica una ARN polimerasa de T7 u otra polimerasa de bacteriófago adecuada tal como la polimerasa de T3 o SP6 (véase Usdin et al., 1993 o Rodriguez et al., 1990). Las células se transfectan después con ADNc individual que contiene los genes que codifican las proteínas de rhabdovirus G, N, P, L y M. Estos ADNc proporcionarán las proteínas para construir

una partícula de rhabdovirus recombinante. Las células se pueden transfectar por cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, liposomas, electroporación, etc.).

También se transfecta en células un “ADNc policistrónico” que contiene el equivalente del ARN genómico del rhabdovirus. Si la partícula de rhabdovirus infecciosa, recombinante se pretende que sea lítica en una célula infectada, entonces los genes que codifican las proteínas N, P, M y L deben estar presentes, así como cualquier segmento de ácido nucleico heterólogo. Si la partícula de rhabdovirus infecciosa, recombinante no se pretende que sea lítica en una célula infectada, entonces el gen que codifica la proteína M no se incluye en el ADN policistrónico. Mediante “ADNc policistrónico” se quiere decir un ADNc que comprende al menos unidades de transcripción que contienen los genes que codifican las proteínas N, P y L. El ADN policistrónico de rhabdovirus recombinante también puede contener un gen que codifica una variante de proteína o fragmento polipeptídico de la misma, o un ácido nucleico terapéutico. Alternativamente, cualquier proteína que se va a asociar inicialmente con la partícula vírica primero producida o fragmento de la misma se puede suministrar en trans.

Otra forma de realización contemplada es un ADNc policistrónico que comprende un gen que codifica una proteína indicadora o proteína fluorescente (por ejemplo, proteína fluorescente verde y sus derivados, β-galactosidasa, fosfatasa alcalina, luciferasa, cloranfenicol acetiltransferasa, etc.), los genes N-P-L o N-P-L-M, y/o una proteína de fusión o un ácido nucleico terapéutico. Otro ADN policistrónico contemplado puede contener un gen que codifica una variante de proteína, un gen que codifica un indicador, un ácido nucleico terapéutico, y/o los genes N-P-L o los genes N-P-L-M.

El primer paso en generar un rhabdovirus recombinante es la expresión de un ARN que es un equivalente genómico

o antigenómico de un ADNc. A continuación, ese ADN se empaqueta por la proteína N y después se replica por las proteínas P/L. El virus así producido se puede recuperar. Si la proteína G está ausente del genoma de ARN recombinante, entonces típicamente se suministra en trans. Si tanto la proteína G como la M están ausentes, entonces ambas se suministran en trans.

Para preparar partículas de “rhabdovirus no infecciosas”, el procedimiento puede ser el mismo que antes, excepto que el ADNc policistrónico transfectado en las células contendría los genes N, P y L del rhabdovirus solo. El ADNc policistrónico de partículas de rhabdovirus no infecciosas puede además contener un gen que codifica una proteína indicadora o un ácido nucleico terapéutico. Para una descripción adicional respecto a métodos de producir un rhabdovirus recombinante que carece del gen que codifica la proteína G, véase Takada et al., (1997).

1.

Cultivo de células para producir virus

Las células transfectadas habitualmente se incuban durante al menos 24 h a la temperatura deseada, habitualmente aproximadamente 37ºC. Para partículas víricas no infecciosas, el sobrenadante se recoge y las partículas de virus se aíslan. Para partícula víricas infecciosas, el sobrenadante que contiene el virus se recoge y se transfiere a células frescas. Las células frescas se incuban durante aproximadamente 48 horas, y el sobrenadante se recoge.

2.

Purificación de rhabdovirus recombinante

Los términos “aislamiento” o “aislar” un rhabdovirus significa el proceso de cultivar y purificar las partículas de virus de modo que permanezcan muy pocos restos celulares. Un ejemplo sería tomar el sobrenadante que contiene el virión y pasarlo a través de un filtro de tamaño de poro de 0,1-0,2 micrómetros (por ejemplo, Millex-GS, Millipore) para eliminar los restos de virus y celulares. Alternativamente, los viriones se pueden purificar usando un gradiente, tal como un gradiente de sacarosa. Las partículas de rhabdovirus recombinantes se pueden precipitar después y resuspender en cualquier excipiente o soporte deseado. Se pueden determinar los títulos por inmunofluorescencia indirecta usando anticuerpos específicos para proteínas particulares.

3.

Métodos de hacer rhabdovirus recombinantes usando ADNc y un minivirus o una línea celular auxiliar

Tanto “minivirus” como “células auxiliares” (también conocidas como “líneas celulares auxiliares”) proporcionan la misma cosa: para proporcionar una fuente de proteínas de rhabdovirus para el ensamblaje del virión de rhabdovirus. Un ejemplo de un minivirus de rhabdovirus es el minivirus de VSV que expresa solo las proteínas G y M, como describe Stillman et al., (1995). Los virus auxiliares y minivirus se usan como métodos de proporcionar proteínas de rhabdovirus que no se producen del ADN transfectado que codifica los genes de proteínas de rhabdovirus.

Cuando se usa un minivirus, las células se infectan con el virus vaccinia como se ha descrito anteriormente para fines de proporcionar ARN polimerasa de T7. El ARN policistrónico deseado, y los plásmidos que contienen los genes N, P y L se transfectan en células. La mezcla de transfección se elimina después de aproximadamente 3 h, y las células se infectan con el minivirus a una multiplicidad de infección (m.o.i.) de aproximadamente 1. El minivirus suministra las proteínas G y/o M que faltan. El ARN policistrónico transfectado en la célula dependerá de si se quiere un rhabdovirus recombinante infeccioso o no infeccioso.

Alternativamente, se podría usar un minivirus para proporcionar los genes N, P y L. También se podría usar el minivirus para producir la proteína M además de N, P y L. El minivirus también puede producir la proteína G.

Cuando se usa una línea celular auxiliar, los genes que codifican las proteínas de rhabdovirus que faltan se producen por la línea celular auxiliar. La línea celular auxiliar tiene proteínas N, P, L y G para la producción de partículas de rhabdovirus recombinantes que no codifican la proteína G de tipo salvaje. Las proteínas se expresan de genes o ADN que no son parte del genoma del virus recombinante. Estos plásmidos u otro sistema de vectores se incorporan de forma estable en el genoma de la línea celular. Las proteínas se producen después del genoma de la célula y no de un replicón en el citoplasma. La línea celular auxiliar se puede transfectar después con un ADN policistrónico y ADNc de plásmido que contienen los otros genes de rhabdovirus no expresados por el virus auxiliar. El ARN policistrónico usado dependerá de si se desea un rhabdovirus recombinante infeccioso o no infeccioso. De otra manera, el suministro de los productos génicos que faltan (por ejemplo, G y/o M) se lograría como se ha descrito anteriormente.

II. Composiciones víricas

La presente invención se refiere a rhabdovirus que son ventajosos en el estudio y tratamiento de células hiperproliferativas y neoplásicas (por ejemplo, células cancerosas) y estados hiperproliferativos y neoplásicos (por ejemplo, cáncer) en un paciente. Se puede referir, pero no está limitada a, rhabdovirus con una neurovirulencia reducida, por ejemplo, rhabdovirus tal como el virus Maraba. En ciertos aspectos, el rhabdovirus que codifica o contiene uno o más componentes proteicos (proteínas N, P, M, G y/o L) o un genoma de ácido nucleico distinto de los de VSV (es decir, al menos o como mucho el 10, 20, 40, 50, 60, 70, 80% idéntico a nivel de aminoácidos o nucleótidos), y/o que se han construido con una o más mutaciones o variaciones comparados con un virus o proteínas víricas de tipo salvaje de modo que el virus tiene propiedades deseables para uso contra células cancerosas, mientras que es menos tóxico o no tóxico para células no cancerosas que el virus aislado originalmente

o VSV. Las enseñanzas descritas posteriormente proporcionan varios ejemplos de protocolos para implementar los usos y composiciones de la invención. Proporcionan antecedentes para generar virus mutados o variantes mediante el uso de tecnología de bioselección o ADN recombinante o ácidos nucleicos.

A.

Composiciones proteinaceas

Las composiciones proteinaceas incluyen partículas víricas y composiciones que incluyen las partículas víricas. La divulgación también se refiere a generar o aislar rhabdovirus (por ejemplo, virus Maraba), rhabdovirus pseudotipados u oncolíticos (rhabdovirus que lisan, destruyen o retrasan el crecimiento de células cancerosas). En ciertas formas de realización, los rhabdovirus se manipularán para incluir variantes polipeptídicas de proteínas de rhabdovirus (N, P, M, G y/o L) y/o ácidos nucleicos terapéuticos que codifican polipéptidos terapéuticos. Otros aspectos de la divulgación incluyen el aislamiento de rhabdovirus que carecen de uno o más polipéptidos o proteínas funcionales. En otras formas de realización, la presente invención se refiere a rhabdovirus y su uso en combinación con o incluidos en composiciones proteinaceas como parte de una formulación farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en el presente documento, una “proteína” o “polipéptido” se refiere a una molécula que comprende un polímero de residuos de aminoácidos. En algunas divulgaciones, se emplea una versión de tipo salvaje de una proteína o polipéptido, sin embargo, en muchas divulgaciones, todo o parte de una proteína o polipéptido vírico está ausente o alterado de modo que el virus se hace más útil para el tratamiento de un paciente. Los términos usados anteriormente se pueden usar de forma intercambiable en el presente documento. Una “proteína modificada” o “polipéptido modificado” o “proteína variante” o “polipéptido variante” se refiere a una proteína o polipéptido cuya estructura química o secuencia de aminoácidos está alterada con respecto a la proteína o polipéptido de tipo salvaje

o de referencia. En algunas formas de realización, una proteína o polipéptido modificado tiene al menos una actividad o función modificada (reconociendo que proteínas o polipéptidos pueden tener múltiples actividades o funciones). La actividad o función modificada puede estar reducida, disminuida, eliminada, potenciada, mejorada o alterada en alguna otra manera (tal como especificidad de infección) con respecto a esa actividad o función en una proteína o polipéptido de tipo salvaje, o las características de virus que contiene tal polipéptido. Se contempla que una proteína o polipéptido modificado pueda estar alterado con respecto a una actividad o función y aún retener actividad o función de tipo salvaje o inalterada en otros respectos. Alternativamente, una proteína modificada puede ser completamente no funcional o su secuencia de ácido nucleico relacionada se puede haber alterado de modo que el polipéptido ya no se exprese más, esté truncado, o exprese una secuencia de aminoácidos diferente como resultado de un cambio de fase de lectura u otra modificación.

En ciertas formas de realización el tamaño de una proteína o polipéptido recombinante puede comprender, pero no está limitado a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500 o más residuos de moléculas amino, y cualquier intervalo derivable en el mismo. Se contempla que se puedan modificar polipéptidos por truncación,

haciéndolos más cortos que su correspondiente forma inalterada o por fusión o cambio de dominios lo que puede hacer la proteína alterada más larga.

Como se usa en el presente documento, una “molécula amino” se refiere a cualquier aminoácido, derivado de aminoácido, o mimético de aminoácido como conocería un experto en la materia. En ciertas formas de realización, los residuos de la molécula proteinacea son secuenciales, sin ninguna molécula no amino interrumpiendo la secuencia de residuos de moléculas amino. En otras formas de realización, la secuencia puede comprender una o más fracciones de moléculas no amino. En formas de realización particulares, la secuencia de residuos de la molécula proteinacea puede estar interrumpida por una o más fracciones de moléculas no amino. Según esto, el término “composición proteinacea” abarca secuencias de moléculas amino que comprenden al menos uno de los 20 aminoácidos comunes en proteínas sintetizadas naturalmente, o al menos un aminoácido modificado o inusual.

Las composiciones proteinaceas se pueden hacer por cualquier técnica que conocen los expertos en la materia, incluyendo la expresión de proteínas, polipéptidos o péptidos mediante técnicas de biología molecular estándar, el aislamiento de compuestos proteinaceos de fuentes naturales, o la síntesis química de materiales proteinaceos. Las secuencias de nucleótidos y polipeptídicas para varios genes o genomas de rhabdovirus se han divulgado previamente, y se pueden encontrar en bases de datos computarizadas que conocen los expertos en la materia. Una de tales bases de datos es la base de datos GenBank y GenPept del Centro Nacional para Información en Biotecnología, a la que se puede acceder a través de Internet en ncbi.nlm.nih.gov/. Las regiones codificantes de estos genes y virus conocidos se pueden amplificar y/o expresar usando las técnicas divulgadas en el presente documento o como conocerían los expertos en la materia.

B. Aspectos funcionales

Cuando la presente solicitud se refiere a la función o actividad de proteínas o polipéptidos víricos, se pretende que se refiera a la actividad o función de esa proteína o polipéptido vírico en condiciones fisiológicas, a menos que se especifique de otra manera. Por ejemplo, la proteína G está implicada en especificidad y eficacia de unión e infección de tipos celulares particulares. La determinación de qué moléculas poseen esta actividad se puede alcanzar usando ensayos familiares a los expertos en la materia, tal como ensayos de infectividad, ensayos de unión de proteínas, ensayos de placa y similares.

C. Variantes de polipéptidos víricos

Las variantes de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de la presente invención pueden ser variantes de sustitución, inserción o deleción. Una mutación en un gen que codifica un polipéptido vírico puede afectar a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más aminoácidos no contiguos o contiguos (es decir, segmento) de un polipéptido, comparado con un polipéptido de tipo salvaje o inalterado u otro polipéptido de referencia.

Las variantes de deleción carecen de uno o más residuos de la proteína nativa, inalterada o de tipo salvaje. Los residuos individuales se pueden delecionar, o todo o parte de un dominio (tal como un dominio catalítico o de unión) se puede delecionar. Se puede introducir un codón de terminación (por sustitución o inserción) en una secuencia de ácido nucleico codificante para generar una proteína truncada. Los mutantes de inserción típicamente implican la adición de material en un punto no terminal en el polipéptido, un tipo específico de inserto es un polipéptido quimérico que incluye porciones homólogas o similares de una proteína relacionada en lugar de la porción relacionada de una proteína diana. Esto puede incluir la inserción de un epítopo inmunorreactivo o simplemente uno

o más residuos. También se pueden generar adiciones terminales, típicamente llamadas proteínas de fusión.

Las variantes de sustitución típicamente contienen el intercambio de un aminoácido por otro en uno o más sitios en la proteína, y se pueden diseñar para modular una o más propiedades del polipéptido, con o sin la pérdida de otras funciones o propiedades. Las sustituciones pueden ser conservadoras, es decir, un aminoácido se sustituye con uno de forma y carga similar. Las sustituciones conservadoras se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina a serina; arginina a lisina; asparragina a glutamina o histidina; aspartato a glutamato; cisteína a serina; glutamina a asparragina; glutamato a aspartato; glicina a prolina; histidina a asparragina o glutamina; isoleucina a leucina o valina; leucina a valina o isoleucina; lisina a arginina; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a tirosina; tirosina a triptófano o fenilalanina; y valina a isoleucina o leucina. Alternativamente, las sustituciones pueden ser no conservadoras de modo que una función o actividad del polipéptido esté afectada. Los cambios no conservadores típicamente implican sustituir un residuo con uno que es químicamente distinto, tal como un aminoácido polar o cargado por un aminoácido no polar o no cargado, y viceversa.

El término “codón funcionalmente equivalente” se usa en el presente documento para referirse a codones que codifican el mismo aminoácido, tal como los seis codones para arginina o serina, y también se refiere a codones que codifican aminoácidos biológicamente equivalentes (véase la tabla 1, a continuación).

Tabla 1. Tabla de codones

Aminoácidos

Codones

Alanina Ala

A

Cisteína Cys

C

Ácido aspártico Asp

D

Ácido glutámico Glu

E

Fenilalanina Phe

F

Glicina Gly

G

Histidina His

H

Isoleucina Ile

I

Lisina Lys

K

Leucina Leu

L

Metionina Met

M

Asparragina Asn

N

Prolina Pro

P

Glutamina Gln

Q

Arginina Arg

R

Serina Ser

S

Treonina Thr

T

Valina Val

V

Triptófano Trp

W

Tirosina Tyr

Y

GCA

GCC GCG GCU

UGC

UGU

GAC

GAU

GAA

GAG

UUC

UUU

GGA

GGC GGG GGU

CAC

CAU

AUA

AUC AUU

AAA

AAG

UUA

UUG CUA CUC CUG CUU

AUG

AAC

AAU

CCA

CCC CCG CCU

CAA

CAG

AGA

AGG CGA CGC CGG CGU

AGC

AGU UCA UCC UGC UCU

ACA

ACC ACG ACU

GUA

GUC GUC GUU

UGG

UAC

UAU

También se entenderá que las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos pueden incluir residuos adicionales, tal como aminoácidos N-o C-terminales o secuencias en 5’ o 3’, y aún ser esencialmente como se muestra en el presente documento, incluyendo tener una cierta actividad biológica. La adición de secuencias terminales aplica particularmente a secuencias de ácidos nucleicos que pueden, por ejemplo, incluir varias secuencias no codificantes que flanquean cualquiera de las porciones 5’ o 3’ de la región codificante o pueden incluir varias secuencias internas, es decir, intrones, que se sabe que se producen en los genes.

Lo siguiente es una discusión basada en el cambio de aminoácidos de una proteína N, P, L, M o G para crear una molécula equivalente o incluso mejorada. Por ejemplo, ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígenos de anticuerpos o sitios de unión en moléculas de sustratos. Puesto que es la capacidad interactiva y naturaleza de una proteína lo que define la actividad biológica funcional de esa proteína, se pueden ciertas sustituciones de aminoácidos en una secuencia de proteína, y en su secuencia codificante de ADN subyacente, y no obstante producir una proteína con propiedades similares. Por tanto, se contempla por los inventores que se pueden hacer varios cambios en las secuencias de ADN de rhabdovirus sin pérdida apreciable de utilidad o actividad biológica de interés, como se discute posteriormente.

Al hacer tales cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos en conferir una función biológica a una proteína generalmente se entiende en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos parecidos se puede hacer eficazmente en base a la hidrofilicidad, La patente en EE UU 4.554.101 expone que la mayor hidrofilicidad media local de una proteína, regida por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la patente en EE UU 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparragina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina ( 0,5); histidina *-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina ( 2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido se puede sustituir por otro que tiene valor de hidrofilicidad similar y aún produce una proteína biológicamente equivalente e inmunológicamente equivalente. En tales cambios, la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2 es preferida, esos que están en ±1 son particularmente preferidos, y esos en ±0,5 son incluso más particularmente preferidos.

Como se ha esbozado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos generalmente se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de las cadenas laterales de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y similares. Las sustituciones ejemplares que consideran las varias características anteriores las conocen bien los expertos en la materia e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparragina; y valina, leucina e isoleucina.

III. Moléculas de ácidos nucleicos

La presente invención incluye polinucleótidos aislables de las células que son capaces de expresar todo o parte de una proteína o polipéptido vírico. En algunas divulgaciones, se refiere a todo o partes de un genoma vírico que se ha mutado o alterado específicamente para generar un virus o polipéptido vírico, por ejemplo, un polipéptido o virus pseudotipado o rhabdovírico, con ciertas propiedades y/o características. Los polinucleótidos pueden codificar un péptido o polipéptido que contiene toda o parte de una secuencia de aminoácidos vírica o heteróloga o manipularse de modo que no codifican tal polipéptido vírico o codifiquen un polipéptido vírico que tiene al menos una función o actividad añadida, aumentada, reducida, disminuida, o ausente. Se pueden purificar proteínas recombinantes de células que las expresan para dar proteínas activas. El genoma de miembros de rhabdovirus se puede encontrar en los números de registro de GenBank en la base de datos del NCBI o bases de datos similares.

A. Polinucleótidos que codifican proteínas nativas o modificadas

Como se usa en el presente documento, el término “segmento de ARN, ADN o ácido nucleico” se refiere a una molécula de ARN, ADN o ácido nucleico que se ha aislado libre de ADN genómico total u otros contaminantes. Por tanto, un segmento de ácido nucleico que codifica un polipéptido se refiere a un segmento de ácido nucleico que contiene secuencias codificantes de polipéptido de tipo salvaje, polimórfico o mutantes, aun se aísla de, o se purifica libre de, ácido(s) nucleico(s) genómico(s). Incluidos en el término “segmento de ácido nucleico” están los polinucleótidos, segmentos de ácido nucleico menores que un polinucleótido, y vectores recombinantes incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus, y similares.

Como se usa en esta solicitud, el término “polinucleótido de rhabdovirus” se puede referir a una molécula de ácido nucleico pseudotipada o rhabdovírica que codifica al menos un polipéptido de rhabdovirus. En ciertas formas de realización el polinucleótido se ha aislado libre de otros ácidos nucleicos. Similarmente, un polinucleótido de virus Maraba, virus Carajas, virus Muir Springs y/o virus Bahía Grande se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de virus Maraba, virus Carajas, virus Muir Springs y/o virus Bahía Grande que se ha aislado de otros ácidos nucleicos. Un “genoma de rhabdovirus” o un genoma de virus Maraba, virus Carajas, virus Muir Springs y/o virus Bahía Grande se refiere a un VSV o una molécula de ácido nucleico que se puede proporcionar a una célula huésped para dar una partícula vírica, en presencia o ausencia de un virus auxiliar o regiones codificantes complementarias que suministran otros factores en trans. El genoma se puede o no haber mutado recombinantemente comparado con un virus de tipo salvaje o inalterado.

El término “ADNc” se pretende que se refiere a ADN preparado usando ARN como molde. Puede haber veces cuando la secuencia genómica completa o parcial sea preferida.

También se contempla que un polipéptido particular de una especie determinada esté representado por variantes naturales que tienen secuencias de ácido nucleico ligeramente diferentes, pero, no obstante, codifican la misma proteína (véase la tabla 1 anteriormente).

Similarmente, un polinucleótido que codifica un polipéptido de tipo salvaje o modificado aislado o purificado se refiere a un segmento de ADN incluyendo secuencias codificantes de polipéptido de tipo salvaje o mutante y, en ciertos aspectos, secuencias reguladoras, aisladas sustancialmente de otros genes o secuencias codificantes de proteínas naturales. A este respecto, el término “gen” se usa por simplicidad para referirse a una unidad de ácido nucleico que codifica una proteína, polipéptido o péptido (incluyendo cualquier secuencia requerida para la transcripción, modificación postraduccional, o localización apropiadas). Como entenderán los expertos en la materia, este término funcional incluye secuencias genómicas, secuencias de ADNc, y segmentos de ácidos nucleicos manipulados menores que expresan, o se pueden adaptar para que expresen, proteínas, polipéptidos, dominios, péptidos, proteínas de fusión y mutantes. Un ácido nucleico que codifica todo o parte de un polipéptido nativo o modificado puede contener un ácido nucleico contiguo de: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000, o más nucleótidos, nucleósidos o pares de bases.

En formas de realización particulares, la divulgación se refiere a segmentos de ácido nucleico aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptido(s) de rhabdovirus de tipo salvaje o mutantes que incluyen en su secuencia de aminoácidos una secuencia de aminoácidos contiguos según, o que corresponde esencialmente a un polipéptido nativo. El término “recombinante” se puede usar junto con un polipéptido o el nombre de un polipéptido específico, y esto generalmente se refiere a un polipéptido producido de una molécula de ácido nucleico que se ha manipulado in vitro o que es el producto replicado de tal molécula.

En otras formas de realización, la divulgación se refiere a segmentos de ácido nucleico aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido o péptido que incluye en su secuencia de aminoácidos una secuencia de aminoácidos contiguos según, o que corresponde esencialmente con uno o más polipéptidos de rhabdovirus.

Los segmentos de ácido nucleico usados en la presente divulgación, independientemente de la longitud de la secuencia codificante misma, se pueden combinar con otras secuencias de ácido nucleico, tal como promotores, señales de poliadenilación, sitios adicionales de enzimas de restricción, sitios de clonación múltiples, otros segmentos codificantes, y similares, de modo que si longitud global puede variar considerablemente. Por tanto, se contempla que se pueda emplear un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, con la longitud total preferiblemente estando limitada por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ácido nucleico recombinante pretendido.

Se contempla que las construcciones de ácido nucleico de la presente divulgación puedan codificar polipéptido(s) de longitud completa de cualquier fuente o codificar una versión truncada o modificada del/de los polipéptido(s), por ejemplo, un polipéptido de rhabdovirus truncado, tal que el transcrito de la región codificante represente la versión truncada. El transcrito truncado se puede traducir después a una proteína truncada. Alternativamente, una secuencia de ácido nucleico puede codificar una secuencia de polipéptido de longitud completa con secuencias codificantes heterólogas adicionales, por ejemplo, para permitir la purificación del polipéptido, transporte, secreción, modificación postraduccional, o beneficios terapéuticos tal como direccionamiento o eficacia. Como se ha discutido anteriormente, se puede añadir una etiqueta u otro polipéptido heterólogo a la secuencia codificante de polipéptido modificado, en donde “heterólogo” se refiere a un polipéptido o segmento del mismo que no es el mismo que el polipéptido modificado o encontrado asociado con o codificado por el virus natural.

En un ejemplo no limitante, se pueden preparar una o más construcciones de ácido nucleico que incluyan un tramo contiguo de nucleótidos idénticos a o complementarios a un segmento vírico particular, tal como un gen N, P, M, G o L de rhabdovirus. Una construcción de ácido nucleico puede tener de al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 15.000, 20.000, 30.000, 50.000, 100.000, 250.000, 500.000, 750.000, hasta al menos 1.000.000 de nucleótidos de longitud, así como construcciones de mayor tamaño, hasta e incluyendo tamaños cromosómicos (incluyendo todas las longitudes intermedias e intervalos intermedios). Se entenderá fácilmente que “longitudes intermedias” e “intervalos intermedios”, como se usan en el presente documento, significa cualquier longitud o intervalo incluyendo o entre los valores citados (es decir, todos los números enteros incluyendo y entre tales valores).

Los segmentos de ácido nucleico usados en la presente invención abarcan ácidos nucleicos modificados que codifican polipéptidos modificados. Tales secuencias pueden surgir como consecuencia de redundancia de codones y equivalencia funcional que se sabe que se producen de forma natural en secuencias de ácidos nucleicos y las proteínas así codificadas. Alternativamente, se pueden crear proteínas o péptidos funcionalmente equivalentes mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante, en la que se pueden manipular cambios en la estructura de la proteína, basados en consideraciones de las propiedades de los aminoácidos que se intercambian. Se pueden introducir cambios diseñados por el hombre mediante la aplicación de técnicas de mutagénesis dirigida, por ejemplo, para introducir mejoras a la antigenicidad o falta de la misma de la proteína, para reducir efectos de toxicidad de la proteína in vivo a un sujeto al que se da la proteína, o para aumentar la eficacia de cualquier tratamiento que implica la proteína o un virus que comprende tal proteína.

En ciertas otras formas de realización, la divulgación se refiere a segmentos de ácido nucleicos aislados y vectores recombinantes que incluyen en su secuencia una secuencia de ácido nucleico contigua de la mostrada en las secuencias identificadas en el presente documento. Sin embargo, tales secuencias se pueden mutar para dar un producto proteico cuya actividad está alterada con respecto al tipo salvaje.

También se entenderá que esta divulgación no está limitada a las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos particulares de estas secuencias identificadas. Por tanto, los vectores recombinantes y segmentos de ácido nucleico aislados pueden incluir diversamente regiones codificantes de rhabdovirus mismas, regiones codificantes que tienen alteraciones o modificaciones seleccionadas en la región codificante básica, o pueden codificar polipéptidos mayores que no obstante incluyen regiones codificantes de rhabdovirus, o pueden codificar proteínas o péptidos biológicamente equivalentes funcionales que tienen secuencias de aminoácidos variantes.

Los segmentos de ácido nucleico de la presente divulgación pueden codificar proteínas y péptidos de rhabdovirus que son el equivalente biológico funcional de, o variantes o mutantes de rhabdovirus que aumentan el beneficio terapéutico del virus. Tales secuencias pueden surgir como consecuencia de redundancia de codones y equivalencia funcional que se sabe se producen de forma natural en secuencias de ácidos nucleicos y las proteínas así codificadas. Alternativamente, se pueden crear proteínas o péptidos funcionalmente equivalentes mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante, en la que se pueden manipular cambios en la estructura de la proteína, basados en consideraciones de las propiedades de los aminoácidos que se intercambian. Se pueden

introducir cambios diseñados por el hombre mediante la aplicación de técnicas de mutagénesis dirigida, por ejemplo, para introducir mejoras en la unión celular de una proteína vírica.

B. Mutagénesis de polinucleótidos de rhabdovirus

En varias formas de realización, el polinucleótido de rhabdovirus se puede alterar o mutagenizar. Las alteraciones o mutaciones pueden incluir inserciones, deleciones, mutaciones puntuales, inversiones, y similares y pueden producir la modulación, activación y/o inactivación de ciertas proteínas o mecanismos moleculares, así como alterar la función, localización o expresión de un producto génico, en particular dando un producto génico no funcional. Donde se emplea, la mutagénesis de un polinucleótido que codifica todo o parte de un rhabdovirus se puede lograr por una variedad de procedimientos mutagénicos estándar (Sambrook et al., 2001). La mutación es el proceso mediante el que se producen cambios en la cantidad o estructura de un organismo. La mutación puede implicar la modificación de la secuencia de nucleótidos de un único gen, bloques de genes o genomas completos. Los cambios en genes individuales pueden ser la consecuencia de mutaciones puntuales que implican la eliminación, adición o sustitución de una única base nucleotídica en una secuencia de ADN, o pueden ser la consecuencia de cambios que implican la inserción o deleción de grandes números de nucleótidos.

1. Mutagénesis al azar

a. Mutagénesis de inserción

La mutagénesis de inserción se basa en la inactivación de un gen mediante la inserción de un fragmento de ácido nucleico conocido. Puesto que implica la inserción de algún tipo de fragmento de ácido nucleico, las mutaciones generadas generalmente son mutaciones de pérdida de función, más que de ganancia de función. Sin embargo, hay varios ejemplos de inserciones que generan mutaciones de ganancia de función. La mutagénesis de inserción se puede lograr usando técnicas de biología molecular estándar.

b. Mutagénesis química

La mutagénesis química ofrece ciertas ventajas, tal como la capacidad de encontrar una gama completa de mutaciones con grados de severidad fenotípica, y es fácil y económica de realizar. La mayoría de los carcinógenos químicos produce mutaciones en el ADN. Benzo[a]pireno, N-acetoxi-2-acetil aminofluoreno y aflotoxina B1 producen transversiones GC a TA en bacterias y células de mamíferos. Los compuestos N-nitrosos producen transiciones de GC a AT. La alquilación de la posición O4 de la timina inducida por exposición a n-nitrosourea produce transiciones de TA a CG.

c. Mutagénesis por radiación

Las moléculas biológicas se degradan por radiación ionizante. La adsorción de la energía incidente produce la formación de iones y radicales libres, y rotura de algunos enlaces covalentes. La susceptibilidad al daño por radiación parece bastante variable entre moléculas, y entre diferentes formas cristalinas de la misma molécula. Depende de la dosis acumulada total, y también de la tasa de dosis (ya que una vez están presentes los radicales libres, el daño molecular que producen depende que su velocidad natural de difusión y por tanto en tiempo real). El daño se reduce y controla haciendo la mezcla tan fría como sea posible. La radiación ionizante produce daño en el ADN, generalmente proporcional a la tasa de dosis.

En la presente invención, el término “radiación ionizante” significa radiación que comprende partículas o fotones que tienen suficiente energía para producir ionización (ganancia o pérdida de electrones). Una radiación ionizante preferida ejemplar es una radiación x. La cantidad de radiación ionizante necesaria en una célula determinada o para una molécula particular generalmente depende de la naturaleza de esa célula o molécula y la naturaleza de la diana de mutación. En la técnica se conocen bien medios para determinar una cantidad eficaz de radiación.

d. Mutagénesis de barrido in vitro

La mutagénesis al azar también se puede introducir usando PCR propensa a error. La tasa de mutagénesis se puede aumentar realizando PCR en múltiples tubos con diluciones de moldes. Una técnica de mutagénesis particularmente útil es la mutagénesis por barrido de alanina en la que un número de residuos se sustituyen individualmente con el aminoácido alanina de modo que se pueden determinar los efectos de perder las interacciones de la cadena lateral, al tiempo que se minimiza el riesgo de perturbaciones a gran escala en la conformación de la proteína (Cunningham et al., 1989).

La mutagénesis de saturación por barrido in vitro proporciona un método rápido para obtener una gran cantidad de información estructura-función incluyendo: (i) identificación de residuos que modulan la especificidad de unión al ligando, (ii) un mejor entendimiento de la unión del ligando basado en la identificación de esos aminoácidos que retienen actividad y esos que suprimen actividad en una localización determinada, (iii) una evaluación de la

plasticidad global de un sitio activo o subdominio de proteína, (iv) identificación de sustituciones de aminoácidos que producen unión aumentada.

2. Mutagénesis dirigida

La mutagénesis dirigida guiada por estructura representa una herramienta poderosa para la disección y manipulación de interacciones proteína-ligando (Wells, 1996; Braisted et al., 1996). La técnica proporciona la preparación y ensayo de variantes de secuencia introduciendo uno o más cambios en la secuencia de nucleótidos en un ADN seleccionado.

C. Vectores

Para generar mutaciones en un genoma de rhabdovirus, los polipéptidos nativos y modificados pueden estar codificados por una molécula de ácido nucleico comprendida en un vector. El término “vector” se usa para referirse a una molécula de ácido nucleico portadora en la que se puede insertar una secuencia de ácido nucleico exógeno para la introducción en una célula donde se pueda replicar. Una secuencia de ácido nucleico puede ser “exógena”, que significa que es extraña para la célula en la que se introduce el vector o que la secuencia es homóloga a una secuencia en la célula, pero en una posición en el ácido nucleico de la célula huésped en que la secuencia no se encuentra normalmente. Los vectores incluyen plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus animales, virus de plantas), y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC). El experto en la materia estaría bien equipado para construir un vector mediante técnicas recombinantes estándar, que se describen en Sambrook et al., (2001) y Ausubel et al., (1994).

Además de codificar un polipéptido modificado tal como proteína N, proteína P, proteína M, proteína G o proteína L modificada, un vector puede codificar secuencias de polipéptidos no modificados tal como una etiqueta o molécula de direccionamiento. Los vectores útiles que codifican tales proteínas de fusión incluyen vectores pIN (Inouye et al., 1985), vectores que codifican un tramo de histidinas y vectores pGEX, para uso en generar proteínas de fusión solubles de glutatión S-transferasa (GST) para la posterior purificación y separación o corte. Una molécula de direccionamiento es una que dirige el polipéptido modificado a un órgano, tejido, célula particular, u otra localización en el cuerpo de un sujeto. Alternativamente, la molécula de direccionamiento altera el tropismo de un organismo, tal como rhabdovirus para ciertos tipos celulares, por ejemplo, células cancerosas.

El término “vector de expresión” se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte de un producto génico capaz de ser transcrito. En algunos casos, las moléculas de ARN se traducen a una proteína, polipéptido o péptido. En otros casos, estas secuencias no se traducen, por ejemplo, en la producción de moléculas antisentido o ribozimas. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de “secuencias control”, que se refiere a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente traducción de una secuencia codificante operativamente unida en un organismo huésped particular. Además de las secuencias control que rigen la transcripción y traducción, los vectores y vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que sirven otras funciones también y se describen posteriormente.

1. Promotores y potenciadores

Un “promotor” es una secuencia control que es una región de una secuencia de ácido nucleico en la que se controlan la iniciación y velocidad de transcripción. Puede contener elementos genéticos que unen proteínas y moléculas reguladoras, tal como ARN polimerasa y otros factores de transcripción. Las frases “operativamente colocado”, “operativamente acoplado”, “operativamente unido”, “bajo control” y “bajo control transcripcional” significan que un promotor está en una localización y/u orientación funcional correcta en relación a una secuencia de ácido nucleico para controlar la iniciación transcripcional y/o expresión de esa secuencia. Un promotor se puede usar o no junto con un “potenciador”, que se refiere a una secuencia reguladora que actúa en cis implicada en la activación transcripcional de una secuencia de ácido nucleico.

Un promotor puede ser uno asociado de forma natural con un gen o secuencia, como se puede obtener aislando las secuencias no codificantes 5’ localizadas antes del segmento codificante y/o exón. Tal promotor se puede denominar “endógeno”. Similarmente, un potenciador puede ser uno naturalmente asociado con una secuencia de ácido nucleico, localizado o bien después o antes de esa secuencia. Alternativamente, se ganarán ciertas ventajas colocando el segmento de ácido nucleico codificante bajo el control de un promotor recombinante o heterólogo, que se refiere a un promotor que no está normalmente asociado con una secuencia de ácido nucleico en su medio natural. Un potenciador recombinante o heterólogo se refiere a un potenciador normalmente no asociado con una secuencia de ácido nucleico en su medio natural. Tales promotores o potenciadores pueden incluir promotores o potenciadores de otros genes, y promotores o potenciadores aislados de cualquier otra célula procariota, vírica o eucariota, y promotores o potenciadores no “naturales”, es decir, que contienen diferentes elementos de diferentes regiones reguladoras transcripcionales, y/o mutaciones que alteran la expresión.

Además de producir secuencias de ácido nucleico de promotores y potenciadores sintéticamente, se pueden producir secuencias usando clonación recombinante y/o tecnología de amplificación de ácidos nucleicos, incluyendo

PCR™, en relación con las composiciones divulgadas en el presente documento (véase, la patente en EE UU 4.683.202, la patente en EE UU 5.928.906). Además, se contempla que también se puedan emplear las secuencias control que dirigen la transcripción y/o expresión de secuencias en orgánulos no nucleares tal como mitocondrias, cloroplastos, y similares.

Naturalmente, puede ser importante emplear un promotor y/o potenciador que dirija eficazmente la expresión del segmento de ácido nucleico en el tipo celular, orgánulo, y organismo elegido para la expresión. Los expertos en la materia de la biología molecular en general conocen el uso de promotores, potenciadores y combinaciones de tipo celular para la expresión de proteínas, por ejemplo, véase, Sambrook et al., (2001). Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos de tejido, selectivos de célula (es decir, más activos en un tipo celular comparado con otro), inducible, y/o útiles en las condiciones apropiadas para dirigir alto nivel de expresión del segmento de ácido nucleico introducido, de modo que es ventajoso en la producción a gran escala de proteínas y/o péptidos recombinantes. El promotor puede ser heterólogo o endógeno.

Varios elementos/promotores que se pueden emplear, en el contexto de la presente invención, para regular la expresión de un gen. Esta lista no se pretende que sea exhaustiva de todos los elementos posibles implicados en el fomento de la expresión sino simplemente, que sea ejemplar de los mismos. También se proporcionan ejemplos de elementos inducibles, que son regiones de una secuencia de ácido nucleico que se pueden activar en respuesta a un estímulo específico. Promotor/potenciador (referencias) incluyen: cadena pesada de la inmunoglobulina (Banerji et al., 1983; Gilles et al., 1983; Grosschedl et al., 1985; Atchinson et al., 1986, 1987; Imler et al., 1987; Weinberger et al., 1984; Kiledjian et al., 1988; Porton et al.; 1990); cadena ligera de inmunoglobulina (Queen et al., 1983; Picard et al., 1984); receptor de células T (Luria et al., 1987; Winoto et al., 1989; Redondo et al.; 1990); HLA DQ α y/o DQ β (Sullivan et al., 1987); β Interferón (Goodbourn et al., 1986; Fujita et al., 1987; Goodbourn et al., 1988); interleuquina2 (Greene et al., 1989); receptor de Interleuquina-2 (Greene et al., 1989; Lin et al., 1990); MHC de clase II 5 (Koch et al., 1989); MHC de clase II HLA-DRα (Sherman et al., 1989); β-actina (Kawamoto et al., 1988; Ng et al.; 1989); creatina quinasa de músculo (MCK) (Jaynes et al., 1988; Horlick et al., 1989; Johnson et al., 1989); prealbúmina (transtiretina) (Costa et al., 1988); elastasa I (Omitz et at, 1987); metalotioneína (MTII) (Karin et al., 1987; Culotta et al., 1989); colagenasa (Pinkert et al., 1987; Angel et al., 1987); albúmina (Pinkert et al., 1987; Tronche et al., 1989, 1990); α-fetoproteína (Godbout et al., 1988; Campere et al., 1989); γ-globina (Bodine et al., 1987; Perez-Stable et al., 1990); β-globina (Trudel et al., 1987); c-fos (Cohen et al., 1987); c-HA-ras (Triesman, 1986; Deschamps et al., 1985); insulina (Edlund et al., 1985); molécula de adhesión de célula neural (NCAM) (Hirsh et al., 1990); α1-antitripaína (Latimer et al., 1990); histona H2B (TH2B) (Hwang et al., 1990); colágeno de ratón y/o tipo I (Ripe et al., 1989); proteínas reguladas por glucosa (GRP94 y GRP78) (Chang et al., 1989); hormona de crecimiento de rata (Larsen et al., 1986); amiloide sérico A humano (SAA) (Edbrooke et al., 1989); troponina I (TN I) (Yutzey et al., 1989); factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (Pech et al., 1989); distrofia muscular de Duchenne (Klamut et al., 1990); SV40 (Banerji et al., 1981; Moreau et al., 1981; Sleigh et al., 1985; Firak et al., 1986; Herr et al., 1986; Imbra et al., 1986; Kadesch et al., 1986; Wang et al., 1986; Ondek et al., 1987; Kuhl et al., 1987; Schaffner et al., 1988); polioma (Swartzendruber et al., 1975; Vasseur et al., 1980; Katinka et al., 1980, 1981; Tyndell et al., 1981; Dandolo et al., 1983; de Villiers et al., 1984; Hen et al., 1986; Satake et al., 1988; Campbell et al., 1988); retrovirus (Kriegler et al., 1982, 1983; Levinson et al., 1982; Kriegler et al., 1983, 1984a, b, 1988; Bosze et al., 1986; Miksicek et al., 1986; Celander et al., 1987; Thiesen et al., 1988; Celander et al., 1988; Chol et al., 1988; Reisman et al., 1989); virus del papiloma (Campo et al., 1983; Lusky et al., 1983; Spandidos y Wilkie, 1983; Spalholz et al., 1985; Lusky et al., 1986; Cripe et al., 1987; Gloss et al., 1987; Hirochika et al., 1987; Stephens et al., 1987); virus de la hepatitis B (Bulla et al., 1986; Jameel et al., 1986; Shaul et al., 1987; Spandau et al., 1988; Vannice et al., 1988); virus de la inmunodeficiencia humana (Muesing et al., 1987; Hauber et al., 1988; Jakobovits et al., 1988; Feng et al., 1988; Takebe et at, 1988; Rosen et al., 1988; Berkhout et al., 1989; Laspia et al., 1989; Sharp et al., 1989; Braddock et al., 1989); citomegalovirus (CMV) (Weber et al., 1984; Boshart et al., 1985; Foecking et al., 1986); y virus de la leucemia del mono gibón (Holbrook et al., 1987; Quinn et al., 1989).

Los elementos inducibles (elemento/inductor (referencias)) incluyen: MT II/éster de forbol (TNFA), metales pesados (Pal miter et al., 1982; Has linger et al., 1985; Searle et al., 1985; Stuart et al., 1985; Magana et al., 1987, Karin et al., 1987; Angel et al., 1987b; McNeal et al., 1989); MMTV (virus del tumor mamario de ratón)/glucocorticoides (Huang et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors et al., 1983; Chandler et al., 1983; Lee et al., 1984; Ponta et al., 1985; Sakai et al., 1988); β-interferón/poli(rI)x, poli(rc) (Tavernier et al., 1983); adenovirus 5 E2/E1A (Imperiale et al., 1984); colagenasa/éster de forbol (TPA) (Angel et al.,1987 a); estromelisina/éster de forbol (TPA) (Angel et al., 1987b); SV40/éster de forbol (TPA) (Angel et al., 1987b); gen MX murino/interferón, virus de la enfermedad de Newcastle (Hug et al., 1988); Gen GRP78/A23187 (Resendez al., 1988); α-2-macroglobulina/IL-6 (Kunz et al., 1989); vimentina/suero (Rittling et al., 1989); gen H-2κb de MHC de clase I/interferón (Blanar et al., 1989); HSP70/E1A, antígeno T grande de SV40 (Taylor et at, 1989, 1990a, 1990b); proliferina/éster de forbol-TPA (Mordacq et al., 1989); factor de necrosis tumoral/PMA (Hensel et al., 1989); y gen de la hormona estimulante del tiroides α/hormona del tiroides (Chatterjee et at , 1989).

La identidad de promotores o elementos específicos de tejido o selectivos de tejido (es decir, promotores que tienen mayor actividad en una célula comparada con otra), así como ensayos para caracterizar su actividad, es bien conocida para los expertos en la materia. Los ejemplos de tales regiones incluyen, el gen LIMK2 humano (Nomoto et al. 1999), el gen del receptor de somatostatina 2 (Kraus et al., 1998), gen de unión a ácido retinoico epididímico

murino (Lareyre et al., 1999), CD4 humano (Zhao-Emonet et a 1998), colágeno alfa2 (XI) de ratón (Tsumaki, et al., 1998), gen del receptor de dopamina D1A (Lee, et al., 1997), factor de crecimiento insulínico II (Wu et al., 1997), molécula de adhesión de célula endotelial de plaqueta humana 1 (Almendro et al., 1996), y el promotor SM22α.

5 Promotores víricos, promotores/potenciadores celulares y promotores/potenciadores inducibles adicionales que se podrían usar en combinación con la presente invención se enumeran en el presente documento. Además, cualquier combinación de promotor/potenciador (según la Base de Datos de Promotores Eucariotas EPDB) también se podría usar para dirigir la expresión de genes estructurales que codifican enzimas de procesamiento de oligosacáridos, proteínas accesorias de plegamiento de proteínas, proteínas marcadoras seleccionables o una proteína heteróloga

10 de interés. Alternativamente, se puede emplear un promotor específico de tejido para terapia génica contra el cáncer (Tabla 2) o el direccionamiento a tumores (tabla 3) con las moléculas de ácido nucleico de la presente divulgación.

Tabla 2. Promotores específicos de tejido candidatos para terapia génica contra el cáncer.

Promotor específico de tejido

Cánceres en los que el promotor es activo Células normales en las que el promotor es activo

Antígeno carcinoembrionario (CEA)*

La mayoría de los carcinomas colorrectales; el 50% de carcinomas de pulmón; el 40-50% de carcinomas gástricos; la mayoría de los carcinomas pancreáticos; muchos carcinomas de mama Mucosa colónica; mucosa gástrica; epitelio pulmonar; glándulas sudoríparas ecrinas; células en los testículos

Antígeno específico de próstata (PSA)

La mayoría de los carcinomas de próstata Epitelio de la próstata

Péptido intestinal vasoactivo (VIP)

La mayoría de los cánceres de pulmón no microcíticos Neuronas; linfocitos; células cebadas; eosinófilos

Proteína surfactante A (SP-A)

Muchas células de adenocarcinomas de pulmón Pneumocitos de tipo II; Clara

Homólogo humano de achaetescute (hASH)

La mayoría de los cánceres de pulmón microcíticos Células neuroendocrinas en el pulmón

Mucina-1 (MUC1)**

La mayoría de los adenocarcinomas (originarios de cualquier tejido) Células epiteliales glandulares en mama y en aparatos respiratorio, digestivo y genitourinario

Alfa-fetoproteína

La mayoría de los carcinomas hepatocelulares; posiblemente muchos cánceres testiculares Hepatocitos (en ciertas condiciones); testículos

Albúmina

La mayoría de los carcinomas hepatocelulares Hepatocitos

Tirosinasa

La mayoría de los melanomas Melanocitos; astrocitos; células de Schwann; algunas neuronas

Proteína de unión a tirosina (TRP)

La mayoría de los melanomas Melanocitos; astrocitos; células de Schwann; algunas neuronas

Queratina 14

Presumiblemente muchos carcinomas de células escamosas (por ejemplo, cánceres de cabeza y cuello) Queratinocitos

EBV LD-12

Muchos carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello Queratinocitos del aparato digestivo superior

Proteína ácida fibrilar glial (GFAP)

Muchos astrocitomas Astrocitos

Proteína básica de la mielina (MBP)

Muchos gliomas Oligodendrocitos

Enzima convertidora de angiotensina específica de testículos (ACE específica de testículos)

Presumiblemente muchos cánceres testiculares Espermatozoides

Osteocalcina

Posiblemente muchos osteosarcomas Osteblastos

15 Tabla 3. promotores candidatos para uso con un direccionamiento de tumores especifico de tejidos

Promotor

Cánceres en los que el promotor es activo Células normales en las que el promotor es activo

Promotor regulado por E2F

Casi todos los cánceres Células en proliferación

HLA-G

Muchos carcinomas colorrectales; muchos melanomas; posiblemente muchos otros cánceres Linfocitos; monocitos; espermatocitos; trofoblastos

FasL

La mayoría de los melanomas; muchos carcinomas pancreáticos; Leucocitos activados; neuronas; células endoteliales; queratinocitos;

la mayoría de los astrocitomas, posiblemente muchos otros cánceres

células en tejidos inmunoprivilegiados; algunas células en pulmones, ovarios, hígado y próstata

Promotor regulado por Myc

La mayoría de los carcinomas de pulmón (tanto microcíticos como no microcíticos); la mayoría de los carcinomas colorrectales Células en proliferación (solo algunos tipos celulares); células epiteliales mamarias (incluyendo las que no proliferan)

MAGE-1

Muchos melanomas; algunos carcinomas de pulmón no microcíticos; algunos carcinomas de mama Testículos

VEGF

El 70% de todos los cánceres (sobreexpresión constitutiva en muchos cánceres) Células en sitios de neovascularización (pero improbable en tumores, la expresión es transitoria, menos fuerte, y nunca constitutiva)

bFGF

Presumiblemente muchos cánceres diferentes, ya que la expresión de bFGF se induce por condiciones isquémicas Células en sitios de neovascularización (pero improbable en tumores, la expresión es transitoria, menos fuerte, y nunca constitutiva)

COX-2

La mayoría de los carcinomas colorrectales; muchos carcinomas de pulmón; posiblemente muchos otros cánceres Células en sitios de inflamación

IL-10

La mayoría de los carcinomas colorrectales; muchos carcinomas de pulmón; muchos carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello; posiblemente muchos otros cánceres Leucocitos

GRP78/BiP

Presumiblemente muchos cánceres diferentes, ya que la expresión de GRP78 está inducida por condiciones específicas de tumores Células en sitios de isquemia

Elementos CarG de Egr-1

Inducido por radiación ionizante, así que concebiblemente la mayoría de los tumores tras irradiación células expuestas a radiación ionizante; leucocitos

2. Señales de iniciación y sitios internos de unión al ribosoma

También se puede requerir una señal de iniciación específica para la traducción eficaz de secuencias codificantes.

5 Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG o secuencias adyacentes. Puede ser necesario proporcionar señales de control de la traducción exógenas, incluyendo el codón de iniciación ATG. El experto en la materia será capaz fácilmente de determinar esto y proporcionar las señales necesarias. Se sabe bien que el codón de iniciación debe en estar “en el mismo marco de lectura” que el de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción del inserto entero. Las señales de control de la traducción y codones de iniciación exógenos pueden ser

10 naturales o sintéticos. La eficacia de la expresión se puede aumentar por la inclusión de elementos potenciadores de transcripción adecuados.

En ciertas divulgaciones, el uso de elementos de sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) se usan para crear mensajes multigénicos, o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de evitar el modelo de barrido del 15 ribosoma de traducción dependiente de caperuza metilada en 5’ y empezar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988). Se han descritos elementos IRES de dos miembros de la familia picornavirus (polio y encefalomiocarditis) (Pelletier y Sonenberg, 1988), así como un IRES de un mensaje de mamífero (Macejak y Sarnow, 1991). Los elementos IRES se pueden unir a marcos abiertos de lectura heterólogos. Se pueden transcribir múltiples marcos abiertos de lectura juntos, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. En

20 virtud del elemento IRES, cada marco abierto de lectura es accesible a los ribosomas para la traducción eficaz. Se pueden expresar múltiples genes eficazmente usando un único promotor/potenciador para transcribir un único mensaje (véanse las patentes en EE UU 5.925.565 y 5.935.819).

3. Sitios de clonación múltiples 25

Los vectores pueden incluir un sitio de clonación múltiple (MCS), que es una región de ácido nucleico que contiene múltiples sitios de enzimas de restricción cualquiera de los cuales se puede usar junto con tecnología recombinante estándar para digerir un vector (véase Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, y Cocea, 1997). “Digestión con enzimas de restricción” se refiere al corte catalítico de una molécula de ácido nucleico con una enzima que funciona solo en localizaciones específicas en una molécula de ácido nucleico. Muchas de estas enzimas de restricción están comercialmente disponibles. El uso de tales enzimas lo entienden ampliamente los expertos en la materia. Frecuentemente, un vector se lineariza o fragmenta usando una enzima de restricción que corta en el MCS para permitir que se secuencias exógenas se liguen al vector. “Ligación” se refiere al proceso de formar enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico, que pueden o no ser contiguos entre sí. Las técnicas que implican enzimas de restricción y reacciones de ligación las conocen bien los expertos en la materia de la tecnología de recombinación.

4. Señales de terminación

Los vectores o construcciones de la presente divulgación generalmente comprenderán al menos una señal de terminación. Una “señal de terminación” o “terminador” está compuesto de las secuencias de ARN implicadas en la terminación específica de un transcrito de ARN por una ARN polimerasa. Por tanto, en ciertas formas de realización, se contempla una señal de terminación que finaliza la producción de un transcrito de ARN. Un terminador puede ser necesario in vivo para alcanzar niveles de mensaje deseables.

En virus de ARN de sentido negativo, incluyendo rhabdovirus, la terminación se define por un motivo de ARN. Los terminadores contemplados en el presente documento incluyen cualquier terminador de transcripción conocido descrito en el presente documento o conocido para el experto en la materia, incluyendo, pero no limitado a, por ejemplo, las secuencias terminadoras de genes, tal como, por ejemplo, el terminador de la hormona de crecimiento bovina o secuencias de terminación víricas, tal como, por ejemplo, el terminador de SV40. En ciertas formas de realización, la señal de terminación puede ser una falta de secuencia transcribible o traducible, tal como debido a un truncamiento de secuencia.

5.

Señales de poliadenilación

En expresión, particularmente expresión eucariota, típicamente se incluirá una señal de poliadenilación para realizar la poliadenilación apropiada del transcrito. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la práctica exitosa de la invención, y/o se puede emplear cualquier de tal secuencia. Formas de realización preferidas incluyen la señal de poliadenilación de SV40 y/o la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, conveniente y/o sabido que funcionan bien en varias células diana. La poliadenilación puede aumentar la estabilidad del transcrito o puede facilitar el transporte citoplásmico.

6.

Orígenes de replicación

Para propagar un vector en una célula huésped, puede contener uno o más orígenes de sitios de replicación (con frecuencia llamados “ori”), que es una secuencia de ácido nucleico específica en la que se inicia la replicación. Alternativamente, se puede emplear una secuencia que se replica autónomamente (ARS) si la célula huésped es levadura.

7.

Marcadores seleccionables y cribables

En ciertas divulgaciones, las células que contiene una construcción de ácido nucleico de la presente divulgación se pueden identificar in vitro o in vivo incluyendo un marcador en el vector de expresión. Tales marcadores conferirían un cambio identificable a la célula que permite la fácil identificación de las células que contienen el vector de expresión. Generalmente, un marcador seleccionable es uno que confiere una propiedad que permite la selección. Un marcador seleccionable positivo es uno en que la presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador seleccionable negativo es uno en que su presencia previene la selección. Un ejemplo de un marcador seleccionable positivo es un marcador de resistencia a fármaco.

Habitualmente la inclusión de un marcador de selección de fármaco ayuda en la clonación e identificación de los transformantes, por ejemplo, genes que confieren resistencia a neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol son marcadores seleccionables útiles. Además de marcadores que confieren un fenotipo que permite la discriminación de transformantes basado en la implementación de condiciones, también se contemplan otros tipos de marcadores incluyendo marcadores cribables tal como GFP, cuya basa es el análisis colorimétrico. Alternativamente, se pueden utilizar enzimas cribables tal como la timidina quinasa del virus del herpes simple (tk) o cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). El experto en la materia también sabría cómo emplear marcadores inmunológicos, posiblemente junto con análisis por FACS. No se cree que el marcador usado sea importante, siempre que sea capaz de expresarse simultáneamente con el ácido nucleico que codifica un producto génico. El experto en la materia conoce bien ejemplos adicionales de marcadores seleccionables y cribables.

D. Células huésped

Como se usan en el presente documento, los términos “célula”, “línea celular” y “cultivo celular” se pueden usar intercambiablemente. Todos estos términos también incluyen su progenie, que es cualquiera y todas las generaciones posteriores. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas

o inadvertidas. En el contexto de expresar una secuencia de ácido nucleico heteróloga, “célula huésped” se refiere a una célula procariota o eucariota, e incluye cualquier organismo transformable que sea capaz de replicar un vector y/o expresar un gen heterólogo codificado por un vector. Una célula huésped se puede usar, y se ha usado, como un receptor para vectores o virus (que no califica como vector si no expresa polipéptidos exógenos). Una célula huésped se puede “transfectar” o “transformar”, que se refiere a un proceso por el cual un ácido nucleico exógeno, tal como una secuencia que codifica una proteína modificada, se transfiere o introduce en la célula huésped. Una célula transformada incluye la célula objeto primaria y su progenie.

Las células huésped pueden derivar de procariotas o eucariotas, incluyendo células de levadura, células de insecto, y células de mamífero, dependiendo de si el resultado deseado es la replicación del vector o la expresión de parte o todo de las secuencias de ácido nucleico codificadas por el vector. Numerosas líneas celulares y cultivos están disponibles para uso como una célula huésped, y se pueden obtener a través de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), que es una organización que sirve como un archivo para cultivos vivos y materiales genéticos (www.atcc.org). El experto en la materia puede determinar un huésped apropiado basado en el esqueleto del vector y el resultado deseado. Un plásmido o cósmido, por ejemplo, se puede introducir en una célula huésped procariota para la replicación de muchos vectores. Las células bacterianas usadas como células huésped para la replicación y/o expresión del vector incluyen DH5α, JM109 y KC8, así como un número de huéspedes bacterianos comercialmente disponibles tal como células competentes SURE® y Células SOLOPACK™ Gold (STRATAGENE®, La Jolla, CA). Alternativamente, se pueden usar células bacterianas tal como E. coli LE392 como células huésped para virus fagos. Las células de levadura apropiadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, y Pichia pastoris.

Los ejemplos de células huésped eucariotas para replicación y/o expresión de un vector incluyen HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, Cos, CHO, Saos, y PC12. Muchas células huésped de varios tipos celulares y organismos están disponibles y el experto en la materia las conocería. Similarmente, se puede usar un vector vírico junto con una célula huésped eucariota o procariota, particularmente una que sea permisiva para la replicación o expresión del vector.

Algunos vectores pueden emplear secuencias de control que permiten que se replique y/o exprese en células tanto procariotas como eucariotas. El experto en la materia entendería además las condiciones en las que incubar todas las células huésped descritas anteriormente para mantenerlas y permitir la replicación del vector. También se entienden y conocen técnicas y condiciones que permitirían la producción a gran escala de vectores, así como la producción de los ácidos nucleicos codificados por vectores y sus polipéptidos, proteínas o péptidos relacionados.

E. Sistemas de expresión

Existen numerosos sistemas de expresión que comprenden al menos todo o parte de las composiciones discutidas anteriormente. Se pueden emplear sistema basados en procariotas y/o eucariotas para uso con la presente invención para producir secuencias de ácidos nucleicos, o sus polipéptidos, proteínas y péptidos relacionados. Muchos sistemas están comercial y ampliamente disponibles.

El sistema de células de insecto/baculovirus puede producir un alto nivel de expresión de proteína de un segmento de ácido nucleico heterólogo, tal como se describe en las patentes en EE UU 5.871.986 y 4.879.236, y que también se puede comprar, por ejemplo, bajo el nombre MAXBAC® 2.0 de INVITROGEN® y BACPACK™ BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM de CLONTECH®.

Además de los sistemas de expresión divulgados, otros ejemplos de sistemas de expresión incluyen sistema de expresión de mamíferos inducible COMPLETE CONTROL™ de STRATAGENE®, que implica un receptor inducible de ecdisona sintético, o su sistema de expresión pET, un sistema de expresión en E. coli. Otro ejemplo de un sistema de expresión inducible está disponible de INVITROGEN®, que lleva el sistema T-REX™ (expresión regulada por tetraciclina), un sistema de expresión de mamífero inducible que usa el promotor de CMV de longitud completa. INVITROGEN® también proporciona un sistema de expresión en levaduras llamado Sistema de expresión en Pichia methanolica, que está diseñado para la producción a alto nivel de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia methanolica. El experto en la materia sabría cómo expresar un vector, tal como una construcción de expresión, para producir una secuencia de ácido nucleico o su polipéptido, proteína o péptido relacionado.

F. Detección de ácidos nucleicos

Además de su uso en dirigir la expresión de proteínas, polipéptidos y/o péptidos de poxvirus, las secuencias de ácido nucleico divulgadas en el presente documento tienen una variedad de otros usos. Por ejemplo, tienen utilidad como sondas o cebadores para formas de realización que implican hibridación de ácidos nucleicos. Se pueden usar

en métodos diagnósticos o de cribado divulgados en el presente documento. También se divulga la detección de ácidos nucleicos que codifican rhabdovirus o moduladores polipéptidos de rhabdovirus.

1. Hibridación

El uso de una sonda o cebador de entre 13 y 100 nucleótidos, preferiblemente entre 17 y 100 nucleótidos de longitud, o en algunos aspectos de la invención hasta 1-2 kilobases o más de longitud, permite la formación de una molécula dúplex que es tanto estable como selectiva. Las moléculas que tienen secuencias complementarias a lo largo de tramos contiguos de más de 20 bases de longitud son generalmente preferidas, para aumentar la estabilidad y/o selectividad de las moléculas híbridas obtenidas. Generalmente se preferirá diseñar moléculas de ácido nucleico para hibridación que tengan una o más secuencias complementarias de 20 a 30 nucleótidos, o incluso más largas donde se desee. Tales fragmentos se pueden preparar fácilmente, por ejemplo, sintetizando directamente el fragmento por medios químicos o introduciendo secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para producción recombinante.

Según esto, las secuencias de nucleótidos de la divulgación se pueden usar por su capacidad de formar selectivamente moléculas dúplex con tramos complementarios de ADN y/o ARN o para proporcionar cebadores para la amplificación de ADN o ARN de muestras. Dependiendo de la aplicación prevista, se desearía emplear condiciones variables de hibridación para alcanzar grados variables de selectividad de la sonda o cebadores para la secuencia diana.

Para aplicaciones que requieren alta selectividad, típicamente se desearía emplear condiciones de relativamente alta rigurosidad para formar los híbridos. Por ejemplo, condiciones de relativamente baja sal y/o alta temperatura, tal como las proporcionadas por NaCl de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,10 M a temperaturas de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 70ºC. Tales condiciones de alta rigurosidad toleran poco, si alguno, mal apareamiento entre la sonda o cebadores y el molde o hebra diana y serían particularmente adecuados para aislar genes específicos o para detectar transcritos de ARNm específicos. Generalmente se aprecia que las condiciones se pueden volver más rigurosas por la adición de cantidades crecientes de formamida.

Para ciertas aplicaciones, por ejemplo, mutagénesis dirigida, se aprecia que se prefieren condiciones de menor rigurosidad. En estas condiciones, la hibridación se puede producir incluso aunque las secuencias de las hebras que hibridan no sean perfectamente complementarias, sino que tengan malos apareamientos en una o más posiciones. Las condiciones se pueden volver menos rigurosas aumentando la concentración de sal y/o disminuyendo la temperatura. Por ejemplo, una condición de rigurosidad media podría estar proporcionada por NaCl de aproximadamente 0,1 a 0,25 M a temperaturas de aproximadamente 37ºC a aproximadamente 55ºC, mientras que una condición de baja rigurosidad podría estar proporcionada por sal de aproximadamente 0,15 M a aproximadamente 0,9 M a temperaturas que varían de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 55ºC. Las condiciones de hibridación se pueden manipular fácilmente dependiendo de los resultados deseados.

En otras formas de realización, la hibridación de puede alcanzar en condiciones de, por ejemplo, Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), KCl 75 mM, MgCl2 3 mM, ditiotreitol 1,0 mM, a temperaturas entre aproximadamente 20ºC hasta aproximadamente 37ºC. Otras condiciones de hibridación podrían incluir Tris-HCl aproximadamente 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, a temperaturas que varían de aproximadamente 40ºC hasta aproximadamente 72ºC.

En ciertas formas de realización, será ventajoso emplear ácidos nucleicos de secuencias definidas de la presente divulgación en combinación con un medio apropiado, tal como un marcador, para determinar la hibridación. Se conocen en la técnica una amplia variedad de medios indicadores apropiados, incluyendo ligandos fluorescentes, radioactivos, enzimáticos u otros, tal como avidina/biotina, que se pueden detectar. En formas de realización preferidas, se puede desear emplear un marcador fluorescente o una etiqueta enzimática tal como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en lugar de reactivos radioactivos u otros medioambientalmente indeseables. En el caso de etiquetas enzimáticas, se conocen sustratos indicadores colorimétricos que se pueden emplear para proporcionar un medio de detección que sea visible o espectrofotométricamente detectable, para identificar la hibridación específica con muestras que contienen ácidos nucleicos complementarios.

En general, se prevé que las sondas o cebadores descritos en el presente documento serán útiles como reactivos en hibridación en solución, tal como en PCR™, para la detección de la expresión de genes correspondientes, así como en formas de realización que emplean una fase sólida. En formas de realización que implican una fase sólida, el ADN (o ARN) de prueba se adsorbe o fija de otra manera a una matriz o superficie seleccionada. Este ácido nucleico monocatenario fijado se somete después a hibridación con sondas seleccionadas en condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas dependerán de las circunstancias particulares (dependiendo, por ejemplo, del contenido en G+C, el tipo de ácido nucleico diana, fuente de ácido nucleico, tamaño de la sonda de hibridación, etc.). La optimización de las condiciones de hibridación para la aplicación particular de interés la conocen bien los expertos en la materia. Después de lavar las moléculas hibridadas para eliminar moléculas de sonda unidas no específicamente, la hibridación se detecta, y/o cuantifica, determinando la cantidad de marcador unido. Se divulgan métodos representativos de hibridación en fase sólida en las patentes en EE UU 5.843.663, 5.900.481 y 5.919.626.

Se divulgan otros métodos de hibridación que se pueden usar en la práctica de la presente invención en las patentes en EE UU 5.849.481, 5.849.486 y 5.851.772.

2. Amplificación de ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos usados como molde para la amplificación se pueden aislar de células, tejidos u otras muestras según metodologías estándar (Sambrook et al., 2001). En ciertas formas de realización, se realiza el análisis en células completas u homogenizados de tejidos o muestras de fluidos biológicos sin purificación sustancial del ácido nucleico molde. El ácido nucleico puede ser ADN genómico o ARN celular fraccionado o entero. Donde se usa ARN, se puede desear convertir primero el ARN a un ADN complementario.

El término “cebador”, como se usa en el presente documento, se pretende que abarque cualquier ácido nucleico que sea capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un proceso dependiente de molde. Típicamente, los cebadores son oligonucleótidos de diez a veinte y/o treinta pares de bases de longitud, pero se pueden emplear secuencias más largas. Los cebadores se pueden proporcionar en forma bicatenaria o monocatenaria, aunque la forma monocatenaria es preferida.

Se ponen en contacto pares de cebadores diseñados para hibridar selectivamente con ácidos nucleicos que corresponden a secuencias de genes identificados en el presente documento con el ácido nucleico molde en condiciones que permiten la hibridación selectiva. Dependiendo de la aplicación deseada, se pueden seleccionar condiciones de hibridación muy rigurosas que solo permitirán la hibridación con secuencias que son completamente complementarias a los cebadores. En otras formas de realización, la hibridación se puede producir en rigurosidad reducida para permitir la amplificación de ácidos nucleicos que contienen uno o más malos emparejamientos con las secuencias del cebador. Una vez hibridado, el complejo molde-cebador se pone en contacto con una o más enzimas que facilitan la síntesis de ácido nucleico dependiente de molde. Se realizan múltiples rondas de amplificación, también denominadas “ciclos”, hasta que se produce una cantidad suficiente de producto de amplificación.

Están disponibles un número de procesos dependientes de molde para amplificar las secuencias de oligonucleótidos en una muestra de molde determinada. Uno de los métodos de amplificación mejor conocidos es la reacción en cadena de la polimerasa (denominada PCR™) que se describe en detalle en las patentes en EE UU 4.683.195,

4.683.202 y 4.800.159, y en Innis et al., 1988.

Se puede realizar un procedimiento de transcripción inversa PCR™ para cuantificar la cantidad de ARNm amplificado y se conoce bien (véase, Sambrook et al., 2001, documento WO 90/07641 y patente en EE UU 5.882.864).

Otro método para la amplificación es la reacción en cadena de la ligasa (“LCR”) divulgada en la solicitud europea No. 320 308. La patente en EE UU 4.883.750 describe un método similar a LCR para unir pares de sondas a una secuencia diana. También se puede usar un método basado en PCR™ y un ensayo de ligasa de oligonucleótido (OLA), divulgado en la patente en EE UU 5.912.148. Se divulgan métodos alternativos para la amplificación de secuencias de ácido nucleico diana que se pueden usar en la práctica de la presente invención en las patentes en EE UU 5.843.650, 5.846.709, 5.846.783, 5.849.546, 5.849.497, 5.849.547, 5.858.652, 5.866.366, 5.916.776, 5.922.574, 5.928.905, 5.928.906, 5.932.451, 5.935.825, 5.939.291 y 5.942.391, solicitud GB No. 2 202 328, y en la solicitud PCT No. PCT/US89/01025. También se puede usar Qbeta Replicasa, descrita en la solicitud PCT No. PCT/US87/00880, como un método de amplificación en la presente invención. También se puede usar la amplificación isotérmica como se describe por Walker et al. (1992). Así como amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA), divulgada en la patente en EE UU 5.916.779.

Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico incluyen sistemas de amplificación basados en transcripción (TAS), incluyendo amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA) y 3SR (Kwoh et al., 1989; solicitud PCT WO 88/10135). La solicitud europea No. 329 822 divulga un proceso de amplificación de ácido nucleico que implica sintetizar cíclicamente ARN monocatenario (“ARNmc”), ADNmc y ADN bicatenario (ADNbc), que se pueden usar según la presente invención.

La solicitud PCT WO 89/06700 divulga un esquema de amplificación de secuencia de ácido nucleico basado en la hibridación de una secuencia región promotora/cebador a un ADN monocatenario (“ADNmc”) diana seguido por transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Otros métodos de amplificación incluyen “RACE” y “PCR unilateral” (Frohman, 1990; Ohara et al., 1989).

3. Detección de ácidos nucleicos

Después de cualquier amplificación, puede ser deseable separar y/o aislar el producto de amplificación del molde y/o el exceso de cebador. En una forma de realización, los productos de amplificación se separan por electroforesis en gel de agarosa, agarosa-acrilamida o poliacrilamida usando métodos estándar (Sambrook et al., 2001).

La separación de ácidos nucleicos se puede realizar por métodos cromatográficos conocidos en la técnica. Hay muchos tipos de cromatografía que se pueden usar en la práctica de la presente invención, incluyendo cromatografía de adsorción, de reparto, de intercambio iónico, en hidroxilapatita, de tamiz molecular, de fase inversa, en columna, en papel, de capa fina, y de gas, así como HPLC.

Los métodos de visualización típicos incluyen tinción de un gel con bromuro de etidio y visualización de bandas con luz UV. Alternativamente, si los productos de amplificación están integralmente marcados con nucleótidos radio o fluorométricamente marcados, los productos de amplificación separados se pueden exponer a película de rayos x o visualizar con los espectros excitadores apropiados.

En formas de realización particulares, la detección es por transferencia Southern e hibridación con una sonda marcada. Las técnicas implicadas en la transferencia Southern las conocen bien los expertos en la materia (véase, Sambrook et al., 2001). Un ejemplo de los anterior se describe en la patente en EE UU 5.279.721 que divulga un aparato y método para la electroforesis y transferencia automatizadas de ácidos nucleicos.

Otros métodos de detección de ácidos nucleicos que se pueden usar en la práctica de la presente invención se divulgan en las patentes en EE UU 5.840.873, 5.843.640, 5.843.651, 5.846.708, 5.846.717, 5.846.726, 5.846.729, 5.849.487, 5.853.990, 5.853.992, 5.853.993, 5.856.092, 5.861.244, 5.863.732, 5.863.753, 5.866.331, 5.905.024, 5.910.407, 5.912.124, 5.912.145, 5.919.630, 5.925.517, 5.928.862, 5.928.869, 5.929.227, 5.932.413 y 5.935.791.

4. Otros ensayos

Se pueden usar otros métodos para el cribado genético dentro del ámbito de la presente invención, por ejemplo, para detectar mutaciones en muestras de ácidos nucleicos genómicos, ADNc y/o ARN. Los métodos usados para detectar mutaciones puntuales incluyen electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (“DGGE”), análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (“RFLP”), métodos de corte químico o enzimático, secuenciación directa de regiones diana amplificadas por PCR™ (véase anteriormente), análisis de polimorfismo de conformación de hebra sencilla (“SSCP”) y otros métodos bien conocidos en la técnica. Un método de cribado para mutaciones puntuales se basa en corte con RNasa de malos emparejamientos de pares de bases en heterodúplex de ARN/ADN o ARN/ARN. Como se usa en el presente documento, el término “mal emparejamiento” se define como una región de uno o más nucleótido no apareados o mal apareados en una molécula de ARN/ARN, ARN/ADN o ADN/ADN bicatenaria. Esta definición incluye malos emparejamientos debido a mutaciones de inserción/deleción, así como a mutaciones puntuales de bases únicas o múltiples (por ejemplo, véase la patente en EE UU 4.946.773. Los métodos alternativos para la detección de mutaciones de deleción, inserción o sustitución que se pueden usar en la práctica de la presente invención se divulgan en las patentes en EE UU 5.849.483, 5.851.770, 5.866.337,

5.925.525 y 5.928.870.

G. Métodos de transferencia génica

Se cree que los métodos para la administración de ácidos nucleicos para realizar la expresión de composiciones de la presente invención incluyen virtualmente cualquier método por el que un ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo vectores víricos y no víricos) se puede introducir en un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo, como se describe en el presente documento o como sabría un experto en la materia. Tales métodos incluyen, pero no están limitados a, administración directa de ácido nucleico tal como por inyección (patentes en EE UU 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y 5.580.859), incluyendo microinyección (Harland y Weintraub, 1985; patente en EE UU 5.789.215); por electroporación (patente en EE UU 5.384.253); por precipitación con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); usando DEAE dextrano seguido por polietilenglicol (Gopal, 1985); por carga sónica directa (Fechheimer et al., 1987); por transfección mediada por liposomas (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991); por bombardeo con microproyectiles (solicitudes PCT Nos. WO 94/09699 y 95/06128; patentes en EE UU 5.610.042; 5.322.783 5.563.055, 5.550.318, 5.538.877 y 5.538.880); por agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler et al., 1990; patentes en EE UU 5.302.523 y 5.464.765); por transformación mediada por Agrobacterium (patentes en EE UU 5.591.616 y 5.563.055); o por transformación de protoplastos mediada por PEG (Omirulleh et al., 1993; patentes en EE UU 4.684.611 y 4.952.500); por absorción de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus et al., 1985). Mediante la aplicación de técnicas tales como estas, se pueden transformar orgánulo(s), célula(s), tejido(s), u organismo(s) de forma estable o transitoria.

H. Componentes y fracciones lipídicas

En ciertas formas de realización, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden uno o más lípidos asociados con un ácido nucleico, una molécula de aminoácidos, tal como un péptido, u otro compuesto de molécula pequeña. En cualquiera de las formas de realización discutidas en el presente documento, la molécula puede ser o bien un polipéptido de rhabdovirus o un modulador de polipéptido de rhabdovirus, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica todo o parte de un polipéptido de rhabdovirus, o alternativamente, una molécula de aminoácidos que codifica todo o parte de un modulador de polipéptido de rhabdovirus. Un lípido es una sustancia que es característicamente insoluble en agua y extraíble con un solvente orgánico. El experto en la materia entiende

como lípidos compuestos diferentes de los descritos específicamente en el presente documento, y están abarcados por las composiciones y usos de la presente invención. Un componente lipídico y un no lípido pueden estar unidos entre sí, de forma covalente o no covalente.

Un lípido puede ser natural o sintético (es decir, diseñado o producido por el hombre). Sin embargo, un lípido habitualmente es una sustancia biológica. Los lípidos biológicos se conocen bien en la técnica, e incluyen, por ejemplo, grasas neutras, fosfolípidos, fosfoglicéridos, esteroides, terpenos, lisolípidos, glucoesfingolípidos, glucolípidos, sulfátidos, lípidos con ácidos grasos unidos por éter y éster y lípidos polimerizables, y combinaciones de los mismos.

Una molécula de ácido nucleico o molécula de aminoácidos, tal como un péptido, asociada con un lípido se puede dispersar en una solución que contiene un lípido, disolver con un lípido, emulsionar con un lípido, mezclar con un lípido, combinar con un lípido, unir covalentemente con un lípido, contener como una suspensión en un lípido o asociar de otra manera con un lípido. Un lípido o composición lípido/virus asociado de la presente invención no está limitado a ninguna estructura particular. Por ejemplo, simplemente pueden estar entremezclados en una solución, posiblemente formando agregados que no son uniformes en tamaño o forma. En otro ejemplo, pueden estar presentes en una estructura en bicapa, como micelas, o con una estructura “colapsada”. En otro ejemplo no limitante, también se contempla un complejo lipofectamina (Gibco BRL)-poxvirus o Superfect (Qiagen)-virus.

En ciertas formas de realización, una composición lipídica puede comprender aproximadamente el 1%, aproximadamente el 2%, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 4% aproximadamente el 5%, aproximadamente el 6%, aproximadamente el 7%, aproximadamente el 8%, aproximadamente el 9%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 11%, aproximadamente el 12%, aproximadamente el 13%, aproximadamente el 14%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 16%, aproximadamente el 17%, aproximadamente el 18%, aproximadamente el 19%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 21%, aproximadamente el 22%, aproximadamente el 23%, aproximadamente el 24%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 26%, aproximadamente el 27%, aproximadamente el 28%, aproximadamente el 29%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 31%, aproximadamente el 32%, aproximadamente el 33%, aproximadamente el 34%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 36%, aproximadamente el 37%, aproximadamente el 38%, aproximadamente el 39%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 41%, aproximadamente el 42%, aproximadamente el 43%, aproximadamente el 44%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 46%, aproximadamente el 47%, aproximadamente el 48%, aproximadamente el 49%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 51%, aproximadamente el 52%, aproximadamente el 53%, aproximadamente el 54%, aproximadamente el 55%, aproximadamente el 56%, aproximadamente el 57%, aproximadamente el 58%, aproximadamente el 59%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 61%, aproximadamente el 62%, aproximadamente el 63%, aproximadamente el 64%, aproximadamente el 65%, aproximadamente el 66%, aproximadamente el 67%, aproximadamente el 68%, aproximadamente el 69%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 71%, aproximadamente el 72%, aproximadamente el 73%, aproximadamente el 74%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 76%, aproximadamente el 77%, aproximadamente el 78%, aproximadamente el 79%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 81%, aproximadamente el 82%, aproximadamente el 83%, aproximadamente el 84%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 86%, aproximadamente el 87%, aproximadamente el 88%, aproximadamente el 89%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99%, aproximadamente el 100%, o cualquier intervalo derivable en el mismo, de un lípido particular, tipo de lípido o componente no lipídico tal como un fármaco, proteína, azúcar, ácidos nucleicos u otro material divulgado en el presente documento o como sabría un experto en la materia. En un ejemplo no limitante, una composición lipídica puede comprender de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 20% de lípidos neutros, y de aproximadamente el 33% a aproximadamente el 34% de un cerebrósido, y aproximadamente el 1% de colesterol. Por tanto, se contempla que las composiciones de lípidos de la presente invención puedan comprender cualquiera de los lípidos, tipos de lípidos u otros componentes en cualquier combinación o intervalo de porcentaje.

IV. Formulaciones farmacéuticas y pautas de tratamiento

En una forma de realización de la presente invención, se contempla un uso en el tratamiento para una enfermedad hiperproliferativa o neoplásica, tal como cáncer, mediante la administración de un rhabdovirus, tal como virus Maraba, virus Carajas, virus Muir Springs, y/o virus Bahía Grande. Los ejemplos de cáncer contemplados para tratamiento incluyen cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer óseo, cáncer testicular, cáncer cervical, cáncer gastrointestinal, linfomas, lesiones preneoplásicas, lesiones preneoplásicas en el pulmón, cáncer de colon, melanoma, cáncer de vejiga y cualquier otro cáncer o tumor que se pueda tratar incluyendo cánceres metastásicos o sistémicamente distribuidos.

Una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, generalmente, se define como esa cantidad suficiente para detectable y repetidamente ralentizar, aliviar, reducir, minimizar o limitar la extensión de la enfermedad o sus

síntomas. Se pueden aplicar definiciones más rigurosas, incluyendo la eliminación, erradicación o cura de la enfermedad.

Preferiblemente, los pacientes tendrán función de la médula ósea adecuada (definida como un recuento de granulocitos periféricos absoluto de > 2.000/mm3 y un recuento de plaquetas de 100.000/mm3), función hepática adecuada (bilirrubina < 1,5 mg/dl) y función renal adecuada (creatinina < 1,5 mg/dl).

A. Administración

Para destruir células, inhibir el crecimiento celular, inhibir metástasis, disminuir el tamaño del tumor o tejido, y de otra manera revertir, mantener o reducir el fenotipo maligno de células tumorales, los usos y composiciones de la presente invención, generalmente se pondría en contacto una célula hiperproliferativa o neoplásica con una composición terapéutica tal como un virus o una construcción de expresión que codifica un polipéptido. Las vías de administración variarán, naturalmente, con la localización y naturaleza de la lesión, e incluyen, por ejemplo, administración y formulación intradérmica, transdérmica, parenteral, intravascular, intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutánea, regional, percutánea, intratraqueal, intraperitoneal, intraraterial, intravesical, intratumoral, inhalación, perfusión, lavado, inyección directa, alimentaria y oral.

Para realizar un beneficio terapéutico con respecto a una afección o enfermedad vascular, se pondría en contacto una célula vascular con el compuesto terapéutico. Cualquiera de las formulaciones y vías de administración discutidas con respecto al tratamiento o diagnóstico de cáncer también se puede emplear con respecto a enfermedades y afecciones vasculares.

La inyección intratumoral, o inyección en la vasculatura del tumor se contempla para tumores distintos, sólidos, accesibles. La administración local, regional o sistémica también se contempla, particularmente para esos cánceres que están diseminados o es probable que se diseminen sistémicamente. Las partículas víricas se pueden administrar en al menos o como mucho 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 inyecciones.

En el caso de intervención quirúrgica, la presente invención se puede usar preoperativamente, para hacer un tumor inoperable objeto de resección. Alternativamente, la presente invención se puede usar en el momento de la cirugía, y/o después de ella, para tratar la enfermedad residual o metastásica. Por ejemplo, un lecho tumoral extirpado se puede inyectar o perfundir con una formulación que comprende un polipéptido de rhabdovirus o un rhabdovirus, que puede tener o no una mutación, que sea ventajoso para el tratamiento de cáncer o células cancerosas. La perfusión puede seguir tras la resección, por ejemplo, dejando un catéter implantado en el sitio de la cirugía. También se prevé tratamiento postquirúrgico periódico.

También se puede aplicar administración continua donde sea apropiada, por ejemplo, donde un tumor se extirpa y el lecho tumoral se trata para eliminar enfermedad residual, microscópica. La administración a través de jeringa o cateterización es preferida. Tal perfusión continua puede tener lugar durante un periodo desde aproximadamente 1-2 horas, hasta aproximadamente 2-6 horas, hasta aproximadamente 6-12 horas, hasta aproximadamente 12-24 horas, hasta aproximadamente 1-2 días, hasta aproximadamente 1-2 semanas o más largo después del inicio del tratamiento. Generalmente, la dosis de la composición terapéutica a través de la perfusión continua será equivalente a la dada por una única inyección o múltiples, ajustadas a lo largo de un periodo de tiempo durante el que se produce la perfusión. Se contempla además que se pueda usar la perfusión de las extremidades para administrar composiciones terapéuticas de la presente invención, particularmente en el tratamiento de melanomas y sarcomas.

Las pautas de tratamiento pueden variar también, y con frecuencia dependen del tipo de tumor, localización del tumor, evolución de la enfermedad, y salud y edad del paciente. Obviamente, ciertos tipos de tumores requerirán un tratamiento más agresivo, mientras que al mismo tiempo, ciertos pacientes no pueden tolerar más protocolos agotadores. El médico será el más adecuado para tomar tales decisiones basadas en la eficacia y toxicidad (si alguna) conocidas de las formulaciones terapéuticas.

En ciertas formas de realización, el tumor que se trata puede no ser, al menos inicialmente, extirpable. Los tratamientos con construcciones víricas terapéuticas pueden aumentar la extirpabilidad del tumor debido a encogimiento en los márgenes o por eliminación de ciertas porciones particularmente invasivas. Después de los tratamientos, la resección puede ser posible. Los tratamientos adicionales posteriores a la resección servirán para eliminar la enfermedad microscópica residual en el sitio tumoral.

Un ciclo de tratamiento típico, para un tumor primario o lecho tumoral tras la escisión, implicará múltiples dosis. El tratamiento de tumor primario típico implica una aplicación de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más dosis durante un periodo de 1, 2, 3, 4, 5, 6 semanas o más. Se puede repetir una pauta de dos semanas una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más veces. Durante un ciclo de tratamiento, la necesidad de completar las dosis planeadas se puede reevaluar.

Los tratamientos pueden incluir varias “dosis unitarias”. Se define dosis unitaria como que contiene una cantidad predeterminada de la composición terapéutica. La cantidad que se va a administrar, y la vía y formulación particular, están dentro de las capacidades de los expertos en las artes médicas. Una dosis unitaria no se necesita administrar

como una única inyección, sino que puede comprender infusión continua durante un periodo de tiempo ajustado. Una dosis unitaria de la presente invención se puede describir convenientemente en términos de unidades formadoras de placa (ufp) o partículas víricas para construcciones víricas. Las dosis unitarias varían desde 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 ufp o pv o más. Alternativamente, dependiendo del tipo de virus y el título obtenible, se administrarán de 1 a 100, de 10 a 50, 100-1000, o hasta aproximadamente 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013, 1 x 1014, o 1 x 1015 o más partículas víricas (pv) infecciosas al paciente o a las células del paciente.

B. Composiciones y formulaciones inyectables

El método preferido para la administración de una construcción de expresión o virus que codifica todo o parte del genoma de rhabdovirus a células cancerosas o tumorales en la presente invención es a través de inyección intravascular. Sin embargo, las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento se pueden alternativamente administrar por vía intratumoral, parenteral, intravenosa, intraarterial, intradérmica, intramuscular, transdérmica o incluso intraperitoneal como se describe en las patentes en EE UU 5.543.158, 5.641.515 y

5.399.363.

La inyección de construcciones de ácido nucleico se puede administrar por jeringa o cualquier otro método usado para la inyección de una solución, siempre que la construcción de expresión pueda pasar a través del calibre particular de la aguja requerida para la inyección (por ejemplo, véanse las patentes en EE UU 5.846.233 y 5.846.225).

Se pueden preparar soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacéuticamente aceptables en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos. Las formas farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (patente en EE UU 5.466.468). En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado de que exista fácil jeringabilidad. Debe ser estable en condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe conservar contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El soporte puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede provocar por varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede producir por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para la administración parenteral en solución acuosa, por ejemplo, la solución se debe tamponar adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido hacer primero isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratumoral e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles que se pueden emplear los conocerán los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosis se puede disolver en 1 ml de solución de NaCl isotónica y bien añadir a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectar en el sitio de infusión propuesto, (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª Edición, páginas 1035-1038 y 15701580). Se producirá necesariamente alguna variación en la dosis dependiendo del estado del sujeto que se trata. La persona responsable para la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para la administración humana, las preparaciones deben cumplir los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por los gobiernos de los países en los que se usan las composiciones.

Las composiciones divulgadas en el presente documento se pueden formular en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición ácida (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tal como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o tales ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivar de bases inorgánicas tal como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y tales bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación farmacéutica y en tal cantidad como sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas farmacéuticas tal como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Como se usa en el presente documento, “soporte” incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retrasadores de

absorción, tampones, soluciones soporte, suspensiones, coloides y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar principios activos suplementarios en las composiciones.

La frase “farmacéuticamente aceptable” o “farmacológicamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o adversa similar cuando se administra a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como un principio activo se entiende bien en la técnica. Típicamente, tales composiciones se preparan como inyectables, bien como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección.

C. Tratamientos de combinación

Los compuestos y usos de la presente invención se pueden usar en el contexto de enfermedades/afecciones hiperproliferativas o neoplásicas incluyendo cáncer y ateroesclerosis. Para aumentar la eficacia de un tratamiento con las composiciones de la presente invención, tal como rhabdovirus, puede ser deseable combinar estas composiciones con otros agentes eficaces en el tratamiento de esas enfermedades y afecciones. Por ejemplo, el tratamiento de un cáncer se puede implementar con compuestos terapéuticos de la presente invención y otras terapias anticáncer, tal como agentes anticáncer o cirugía.

Se pueden emplear varias combinaciones; por ejemplo, un rhabdovirus tal como el virus Maraba, es “A” y la terapia secundaria anticáncer es “B”, que puede incluir un segundo rhabdovirus u otro virus oncolítico:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

La administración del virus terapéutico o construcciones víricas de la presente invención a un paciente seguirá protocolos generales para la administración de esa terapia secundaria particular, considerando la toxicidad, si la hay, del tratamiento con virus. Se espera que los ciclos de tratamiento se repitan según sea necesario. También se contempla que varias terapias estándar, así como intervención quirúrgica, se puedan aplicar en combinación con la terapia contra el cáncer o células tumorales descrita.

1. Terapia anticáncer

Un agente “anticáncer” es capaz de afectar negativamente un cáncer en un sujeto, por ejemplo, destruyendo células cancerosas, induciendo apoptosis en células cancerosas, reduciendo la velocidad de crecimiento de las células cancerosas, reduciendo la incidencia o número de metástasis, reduciendo el tamaño del tumor, inhibiendo el crecimiento del tumor, reduciendo el suministro de sangre a un tumor o células cancerosas, fomentando una respuesta inmunitaria contra células cancerosas o un tumor, previniendo o inhibiendo la evolución del cáncer, o aumentando la vida de un sujeto con cáncer. Los agentes anticáncer incluyen agentes biológicos (bioterapia), agentes de quimioterapia, y agentes de radioterapia. Más generalmente, estas otras composiciones se proporcionarían en una cantidad combinada eficaz para destruir o inhibir la proliferación de la célula. Este proceso puede implicar poner en contacto las células con el virus o construcción vírica y el/los agente(s) o factor(es) múltiples al mismo tiempo. Esto se puede lograr poniendo en contacto la célula con una única composición o formulación farmacológica que incluya ambos agentes, o poniendo en contacto la célula con dos composiciones o formulaciones distintas, al mismo tiempo, en donde una composición incluye el virus y la otra incluye el segundo agente.

La resistencia de células tumorales a agentes de quimioterapia y radioterapia representa un problema principal en oncología clínica. Un fin de la investigación sobre cáncer actual es encontrar modos de mejorar la eficacia de quimio-y radioterapia combinándola con terapia génica. Por ejemplo, el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple (HS-tK), cuando se administra a tumores cerebrales por un sistema de vector retrovírico, induce con éxito susceptibilidad al agente antiviral ganciclovir (Culver et al., 1992). En el contexto de la presente invención, se contempla que se podría usar terapia con poxvirus similarmente junto con intervención quimioterapéutica, radioterapéutica, inmunoterapéutica, u otra biológica, además de otros agentes proapoptóticos o reguladores del ciclo celular.

Alternativamente, una terapia vírica puede preceder o seguir el otro tratamiento por intervalos que varían desde minutos a semanas. En formas de realización donde el otro agente y el virus se aplican por separado a la célula, generalmente se aseguraría que no transcurre un periodo significativo de tiempo entre el momento de cada administración, de modo que el agente y el virus serían todavía capaces de ejercer un efecto ventajosamente combinado sobre la célula. En tales casos, se contempla que se puede poner en contacto la célula con ambas modalidades en aproximadamente de 12-24 horas entre sí y, más preferiblemente, en aproximadamente 6-12 horas entre sí. En algunas situaciones, puede ser deseable extender el periodo de tiempo para el tratamiento

significativamente, sin embargo, donde transcurren de varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8) entre las respectivas administraciones.

a. Quimioterapia

Las terapias contra el cáncer también incluyen una variedad de terapias de combinación tanto con tratamientos químicos como basados en radiación. Las quimioterapias de combinación incluyen, por ejemplo, cisplatino (CDDP), carboplatino, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalán, clorambucilo, busulfán, nitrosurea, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicomicina, mitomicina, etopósido (VP16), tamoxifeno, raloxifeno, agentes de unión al receptor de estrógeno, taxol, gemcitabina, navelbina, inhibidores de farnesil-proteína transferasa, transplatino, 5-fluorouracilo, vincristina, vinblastina y metotrexato, Temazolomida (una forma acuosa de DTIC), o cualquier análogo o derivado variante de los anteriores. La combinación de quimioterapia con terapia biológica se conoce como bioquimioterapia.

b. Radioterapia

Otros factores que causan daño en el ADN y que se han usado extensamente incluyen lo que se conoce comúnmente como rayos γ, rayos X, haces de protones y/o la administración dirigida de radioisótopos a células tumorales. También se contemplan otras formas de factores que dañan el ADN tal como microondas e irradiación UV. Lo más probable es que estos factores produzcan una amplia gama de daño en el ADN, en los precursores del ADN, en la replicación y reparación de ADN, y en el ensamblaje y mantenimiento de cromosomas. Los intervalos de dosis para rayos X varían de dosis diarias de 50 a 200 roentgen durante periodos prolongados de tiempo (de 3 a 4 semanas), a dosis únicas de 2000 a 6000 roentgen. Los intervalos de dosis para radioisótopos varían ampliamente, y dependen del periodo de semidesintegración del isótopo, la potencia y tipo de radiación emitida, y la absorción por las células neoplásicas.

Los términos “puesto en contacto” y “expuesto”, cuando se aplican a una célula, se usan en el presente documento para describir el proceso por el que una construcción terapéutica y un agente quimioterapéutico o radioterapéutico se administran a una célula diana o se colocan en yuxtaposición directa con la célula diana. Para alcanzar destrucción de células o estasis, ambos agentes se administran a una célula en una cantidad combinada eficaz para destruir la célula o prevenir que se divida.

c. Inmunoterapia

Los agentes inmunoterapéuticos, generalmente, dependen del uso de células y moléculas efectoras inmunitarias para dirigirse a y destruir células cancerosas. El efector inmunitario puede ser, por ejemplo, un anticuerpo específico para algún marcador en la superficie de una célula tumoral. El anticuerpo solo puede servir como un efector de terapia o puede reclutar otras células para realizar realmente la destrucción de células. El anticuerpo también se puede conjugar a un fármaco o toxina (quimioterapéutico, radionúclido, cadena A de ricina, toxina del cólera, toxina pertúsica, etc.) y servir simplemente como un agente de direccionamiento. Alternativamente, el efector puede ser un linfocito que tiene una molécula de superficie que interacciona, sea directa o indirectamente, con una diana celular tumoral. Varias células efectoras incluyen células T citotóxicas y células NK. La combinación de modalidades terapéuticas, es decir, actividad citotóxica directa e inhibición o reducción de ciertos rhabdovirus o polipéptidos de rhabdovirus proporcionaría beneficio terapéutico en el tratamiento del cáncer.

También se podría usar inmunoterapia como parte de una terapia combinada. El enfoque general para la terapia combinada se discute posteriormente. En un aspecto de la inmunoterapia, la célula tumoral debe tener algún marcador que sea sensible a direccionamiento, es decir, no está presente en la mayoría de otras células. Existen muchos marcadores tumorales y cualquiera de estos puede ser adecuado para el direccionamiento en el contexto de la presente invención. Los marcadores tumorales comunes incluyen antígeno carcinoembrionario, antígeno específico de próstata, antígeno asociado a tumor urinario, antígeno fetal, tirosinasa (p97), gp68, TAG-72, HMFG, antígeno sialil Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de estrógenos, receptor de laminina, erbB y p115. También se pueden usar lisados de células tumorales en una composición antigénica.

Un aspecto alternativo de la inmunoterapia es combinar efectos anticáncer con efectos inmunoestimulantes. Las moléculas inmunoestimulantes incluyen: citoquinas tal como IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, IFNγ, quimioquinas tal como MIP-1, MCP-1, IL-8 y factores de crecimiento tal como ligando de FLT3. Se ha mostrado que combinar moléculas inmunoestimulantes, sea como proteínas o usando administración de genes en combinación con un supresor tumoral aumenta los efectos antitumorales (Ju et al., 2000).

Como se ha discutido anteriormente, los ejemplos de inmunoterapias actualmente en investigación o en uso son adyuvantes inmunitarios (por ejemplo, Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dinitroclorobenceno y compuestos aromáticos) (patentes en EE UU 5.801.005 y 5.739.169; Hui y Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998), terapia de citoquinas (por ejemplo, interferones α, β y γ; IL-1, GM-CSF y TNF) (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998) terapia génica (por ejemplo, TNF, IL-1, IL-2, p53) (Qin et al., 1998; Austin-Ward y Villaseca, 1998; patentes en EE UU 5.830.880 y 5.846.945) y anticuerpos monoclonales (por ejemplo,

anti-gangliósido GM2, anti-HER-2, anti-p185) (Pietras et al., 1998; Hanibuchi et al., 1998; patente en EE UU 5.824.311). Herceptin (trastuzumab) es un anticuerpo monoclonal quimérico (ratón-humano) que bloquea el receptor HER2-neu (Dillman, 1999). Se ha mostrado que la terapia de combinación de cáncer con herceptin y quimioterapia es más eficaz que las terapias individuales. Por tanto, se contempla que se puedan emplear uno o más terapias anticáncer con las terapias relacionadas con rhabdovirus descritas en el presente documento.

(1) Inmunoterapia pasiva

Existen un número de diferentes enfoques para la inmunoterapia pasiva. Se pueden categorizar en sentido amplio en los siguientes: inyección de anticuerpos solos; inyección de anticuerpo acoplados a toxinas o agentes quimioterapéuticos; inyección de anticuerpos acoplados a isótopos radioactivos; inyección de anticuerpo antiidiotipo; y, por último, purga de células tumorales en médula ósea.

Preferiblemente, se emplean anticuerpos monoclonales humanos, en inmunoterapia pasiva, ya que producen pocos

o ningún efecto secundario en el paciente. Sin embargo, su aplicación está de alguna manera limitada por su escasez y solo se han administrado hasta ahora por vía intralesional. Los anticuerpos monoclonales humanos contra antígenos gangliósidos se han administrado por vía intralesional a pacientes que padecen melanoma recurrente cutáneo (Irie y Morton, 1986). Se observó regresión en seis de diez pacientes que seguían inyecciones intralesionales diarias o semanales. En otro estudio, se logró éxito moderado de inyecciones intralesionales de dos anticuerpos monoclonales humanos (Irie et al., 1989).

Puede ser favorable administrar más de un anticuerpo monoclonal dirigido contra dos antígenos diferentes o incluso anticuerpos con múltiple especificidad de antígeno. Los protocolos de tratamiento también pueden incluir la administración de linfoquinas u otros potenciadores inmunitarios como se describe por Bajorin et al., (1988). El desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos se describe en más detalle en otro lugar en la especificación.

(2)

Inmunoterapia activa

En inmunoterapia activa, se administra un péptido, polipéptido o proteína antigénica, o una composición de células tumorales autólogas o alogénicas o “vacuna”, generalmente con un adyuvante bacteriano distinto (Ravindranath y Morton, 1991, Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990; Mitchell et al., 1993). En inmunoterapia de melanoma, esos pacientes que provocan alta respuesta de IgM con frecuencia sobreviven mejor que esos que provocan ninguno o pocos anticuerpos IgM (Morton et al., 1992). Los anticuerpos IgM con frecuencia son anticuerpos transitorios y la excepción a la regla parece ser anticuerpos anti gangliósido o anti hidrato de carbono.

(3)

Inmunoterapia adoptiva

En la inmunoterapia adoptiva, los linfocitos circulantes del paciente, o linfocitos infiltrados en tumor, se aíslan in vitro, se activan por linfoquinas tal como IL-2 o se transducen con genes para necrosis tumoral, y se readministran (Rosenberg et al., 1988; 1989). Para lograr esto, se administraría a un animal, o paciente humano, una cantidad inmunológicamente eficaz de linfocitos activados en combinación con una composición de péptido antigénico con adyuvante incorporado como se describe en el presente documento. Los linfocitos activados serán lo más preferiblemente las propias células del paciente que se aislaron anteriormente de una muestra de sangre o tumor y se activaron (o “expandieron”) in vitro. Esta forma de inmunoterapia ha producido varios casos de regresión de melanoma y carcinoma renal, pero el porcentaje de respondedores eran pocos comparado con esos que no respondieron.

d. Genes

En aún otra forma de realización, el tratamiento secundario es una terapia génica en la que se administra un polinucleótido terapéutico antes, después, o al mismo tiempo que se administra un rhabdovirus. La administración de un rhabdovirus junto con un vector que codifica uno de los siguientes productos génicos tendrá un efecto anticáncer combinado en tejidos diana. Alternativamente, el rhabdovirus se puede manipular como un vector vírico para incluir el polinucleótido terapéutico. En la invención están abarcadas una variedad de proteínas, algunas de las cuales se describen posteriormente. La tabla 4 enumera varios genes que pueden ser diana para terapia génica de alguna forma en combinación con la presente invención.

(1) Inductores de proliferación celular

Las proteínas que inducen proliferación celular adicionalmente están en varias categorías dependiendo de la función. Lo común de todas estas proteínas es su capacidad para regular la proliferación celular. Por ejemplo, una forma de PDGF, el oncogén sis, es un factor de crecimiento secretado. Los oncogenes raramente surgen de genes que codifican factores de crecimiento, y actualmente, sis es el único factor de crecimiento oncogénico natural conocido. En una forma de realización de la presente invención, se contempla que se use un ARNm antisentido dirigido a un inductor particular de proliferación celular para prevenir la expresión del inductor de proliferación celular.

(2)

Inhibidores de proliferación celular

Los oncogenes supresores de tumores funcionan para inhibir la proliferación celular excesiva. La inactivación de estos genes destruye su actividad inhibidora, produciendo proliferación no regulada. Los supresores de tumores incluyen p53, p16 y C-CAM. Otros genes que se pueden emplear según la presente invención incluyen Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, VHL, MMAC1 / PTEN, DBCCR-1, FCC, rsk-3, p27, fusiones p27/p16, fusiones p21/p27, genes anti-trombóticos (por ejemplo, COX-1, TFPI), PGS, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, gsp, hst, abl, E1A, p300, genes implicados en angiogénesis (por ejemplo, VEGF, FGF, trombospondina, BAI-1, GDAIF, o sus receptores) y MCC.

(3)

Reguladores de muerte celular programada

La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso esencial para el desarrollo embrionario normal, mantenimiento de la homeostasis en tejidos adultos, y supresión de carcinogénesis (Kerr et al., 1972). Se ha demostrado que la familia Bcl-2 de proteínas y las proteasas de tipo ICE son importantes reguladores y efectores de apoptosis en otros sistemas. La proteína Bcl 2, descubierta en asociación con linfoma folicular, desempeña un papel prominente en controlar la apoptosis y aumentar la supervivencia celular en respuesta a diversos estímulos apoptóticos (Bakhshi et al., 1985; Cleary y Sklar, 1985; Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto y Croce, 1986). La proteína Bcl-2 evolutivamente conservada se reconoce ahora que es un miembro de una familia de proteínas relacionadas, que se pueden categorizar como agonistas de muerte o antagonistas de muerte.

Posterior a su descubrimiento, se mostró que Bcl-2 actúa para suprimir la muerte celular desencadenada por una variedad de estímulos. Además, ahora es aparente que hay una familia de proteínas reguladoras de muerte celular Bcl-2 que comparten en común homologías estructurales y de secuencia. Se ha mostrado que estos diferentes miembros de la familia bien poseen funciones similares a Bcl 2 (por ejemplo, BclXL, BclW, BclS, Mcl-1, A1, Bfl-1) o contrarrestan la función de Bcl 2 y fomentan la muerte celular (por ejemplo, Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri).

e. Cirugía

Aproximadamente el 60% de las personas con cáncer se someterán a cirugía de algún tipo, que incluye cirugía preventiva, diagnóstica o de estadificación, curativa y paliativa. La cirugía curativa es un tratamiento contra el cáncer que se puede usar junto con otras terapias, tal como el tratamiento de la presente invención, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia génica, inmunoterapia y/o terapias alternativas.

La cirugía curativa incluye la resección en la que todo o parte del tejido canceroso se elimina, extirpa y/o destruye físicamente. La resección tumoral se refiere a la eliminación física de al menos parte de un tumor. Además de la resección tumoral, el tratamiento por cirugía incluye cirugía láser, criocirugía, electrocirugía y cirugía microscópicamente controlada (cirugía de Mohs). Se contempla además que la presente invención se puede usar junto con la eliminación de cánceres superficiales, precánceres, o cantidades incidentales de tejido normal.

Tras la extirpación de parte o todo de las células cancerosas, tejido o tumor, se puede formar una cavidad en el cuerpo. El tratamiento se puede lograr por perfusión, inyección directa o aplicación local del área con una terapia anticáncer adicional. Tal tratamiento se puede repetir, por ejemplo, cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, o cada 1, 2, 3, 4, y 5 semanas o cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses. Estos tratamientos pueden ser de dosis variables también.

f. Otros agentes

Se contempla que se pueden usar otros agentes en combinación con la presente invención para mejorar la eficacia terapéutica del tratamiento. Estos agentes adicionales incluyen agentes inmunomoduladores, agentes que afectan el aumento de receptores de superficie celular y uniones GAP, agentes citostáticos y de diferenciación, inhibidores de adhesión celular, agentes que aumentan la sensibilidad de las células hiperproliferativas a inductores apoptóticos, u otros agentes biológicos. Los agentes inmunomoduladores incluyen factor de necrosis tumoral; interferón α, β y γ; IL2 y otras citoquinas; F42K y otros análogos de citoquinas; o MIP-1, MIP-1β, MCP-1, RANTES, y otras quimioquinas. Se contempla además que el aumento de receptores de superficie celular o sus ligandos tal como Fas/ligando de Fas, DR4 o DR5/TRAIL (ligando de Apo-2) potenciaría la capacidad de inducir apoptosis de la presente invención por establecimiento de un efecto autocrino o paracrino en las células hiperproliferativas. Los aumentos en la señalización intercelular elevando el número de uniones GAP aumentaría los efectos antiproliferativos en la población de células hiperproliferativas vecinas. En otras formas de realización, se pueden usar agentes citostáticos

o de diferenciación en combinación con la presente invención para mejorar la eficacia antiproliferativa de los tratamientos. Se contemplan los inhibidores de adhesión celular para mejorar la eficacia de la presente invención. Los ejemplos de inhibidores de adhesión celular son inhibidores de quinasa de adhesión focal (FAK) y lovastatina. Se contempla además que otros agentes que aumentan la sensibilidad de una célula hiperproliferativa a apoptosis, tal como el anticuerpo c225, se pudieran usar en combinación con la presente invención para mejorar la eficacia de tratamiento.

Ha habido muchos avances en la terapia contra el cáncer después de la introducción de fármacos quimioterapéuticos citotóxicos. Sin embargo, una de las consecuencias de la quimioterapia es el desarrollo/adquisición de fenotipos resistentes a fármacos y el desarrollo de multirresistencia a fármacos. El desarrollo de resistencia a fármacos permanece un obstáculo principal en el tratamiento de tales tumores y, por tanto, hay una necesidad obvia para enfoques alternativos tal como terapia vírica.

Otra forma de terapia para uso junto con quimioterapia, terapia de radiación o terapia biológica incluye hipertermia, que es un procedimiento en el que el tejido de un paciente se expone a altas temperaturas (hasta 106ºF). Pueden estar implicados dispositivos de calentamiento externos o internos en la aplicación de hipertermia local, regional o de cuerpo entero. La hipertermia local implica la aplicación de calor a un área pequeña, tal como un tumor. El calor se puede generar externamente con ondas de alta frecuencia dirigidas a un tumor desde un dispositivo fuera del cuerpo. El calor interno puede implicar una sonda estéril, incluyendo cables finos, calentados o tubos huecos rellenos con agua caliente, antenas de microondas implantadas, o electrodos de radiofrecuencia.

Se calienta un órgano o extremidad de un paciente para terapia regional, que se logra usando dispositivos que producen alta energía, tal como imanes. Alternativamente, parte de la sangre del paciente se puede retirar y calentar antes de perfundirla en un área que se calentará internamente. El calentamiento del cuerpo entero también se puede implementar en casos donde el cáncer se ha extendido por todo el cuerpo. Se pueden usar mantas de agua templada, cera caliente, bobinas inductoras, y cámaras térmicas para este fin.

También se puede usar terapia hormonal junto con la presente invención o en combinación con cualquier otra terapia contra el cáncer previamente descrita. Se puede emplear el uso de hormonas en el tratamiento de ciertos cánceres tal como cáncer de mama, próstata, ovárico o cervical para disminuir el nivel o bloquear los efectos de ciertas hormonas tal como testosterona o estrógenos. Este tratamiento se usa con frecuencia en combinación con al menos otra terapia contra el cáncer como tratamiento.

V. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se dan con el fin de ilustrar varias formas de realización de la invención y no se pretende que limiten la presente invención en modo alguno. El experto en la materia apreciará enseguida que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como esos objetos, fines y ventajas inherentes en el presente documento. Los presentes ejemplos, junto con los usos descritos en el presente documento son ahora representativos de formas de realización preferidas, son ejemplares, y no se pretenden como limitaciones en el ámbito de la invención.

A. Resultados

El virus Maraba demuestra potentes propiedades oncolíticas in vitro. La familia de rhabdovirus es vasta y genética y geográficamente diversa. Los inventores seleccionaron un panel de rhabdovirus con capacidad previamente documentada para replicarse en células de mamífero como punto de partida. Se seleccionaron siete virus para el cribado in vitro para identificar esos con capacidad citolítica de células tumorales potente (Tabla 4). Se realizaron ensayos de destrucción celular en formato de 96 pocillos en líneas celulares del panel de células tumorales NCI 60 y un surtido de líneas tumorales de ratón (Fig. 5). Se demostró que varias especies eran altamente líticas en líneas tumorales humanas con puntuaciones de CE50 de menos de 0,1 MOI por unidades formadoras de placa (ufp) para la mayoría de las líneas celulares ensayadas. En particular, los virus Maraba (Travassos da Rosa et al., 1984), Carajas (CRJ) (Travassos da Rosa et al., 1984) y Farmington (FMT) (Travassos da Rosa et al., 2002) parecen ser muy eficaces destruyendo líneas tumorales humanas de todas las indicaciones de cáncer representadas en el panel celular. Se observó una notable excepción para el virus FMT que tenía dificultad en destruir líneas celulares derivadas de tumores de colon. De forma interesante, no todos los rhabdovirus poseen la capacidad de destruir eficazmente células cancerosas. Virus tales como Muir Springs (MS) (Kerschner et al., 1986), Bahía Grande (BG) (Kerschner et al., 1986), Ngaingin (NGG) (Doherty et al., 1973) y Tibrogargan (TIB) (Cybinski et al., 1980) mostraron actividad en una proporción muy pequeña de células tumorales. Actualmente, los mecanismos que rigen la restricción de estos virus permanecen desconocidos.

Tabla 4. Las cepas novedosas de rhabdovirus sin caracterizar son muy líticas en el panel de células NCI 60. * porcentaje de líneas celulares de NCI 60 por tipo tumoral consideradas muy sensibles a infección por virus. Los números en paréntesis indican el número de líneas celulares ensayadas en cada agrupamiento de indicación de cáncer. El virus se puntuó como muy lítico para una línea celular con una CE50 <0,1 MOI después de 96 horas de infección

MS BG NGG TIB FMT CRJ MRB VSV VV

Mama (5) 0* 0 0 0 100 80 100 100 100 SNC (8) 25 38 0 13 100 100 100 100 100 Colon (5) 0 20 0 0 40 80 100 100 80 Melanoma (5) 0 0 0 0 100 60 100 100 100 Pulmón (5) 0 0 0 0 100 80 100 80 100

32 5

Ovárico (3) 0 33 0 33 67 100 100 100 100 Próstata (2) 0 0 0 0 100 50 100 100 100 Renal (4) 0 0 0 0 75 50 100 100 100

Total (37) 6 14 0 5 86 78 100 97 97

* Porcentaje de líneas celulares del panel NCI 60 por tipo tumoral consideradas muy sensibles a infección por virus. Los números en paréntesis indican el número de líneas celulares ensayadas en cada agrupamiento de indicación de cáncer. El virus se puntuó como muy lítico para una línea celular con una CE50 <0,1 MOI después de 96 horas de infección.

Para caracterizar adicionalmente estos virus, se realizaron curvas de crecimiento de un solo paso tanto en una línea celular susceptible (SNB19) así como en una línea celular relativamente resistente (NCI H226) para seguir las velocidades de replicación y para cuantificar las cantidades de virus producidos. Los inventores fueron incapaces de detectar virus después de la infección de las células NCI H226 con virus BG, que es consistente con la observación de que BG solo es pobremente citolítico en esta línea celular. Sin embargo, BG pudo replicarse a un grado similar que FMT y CRJ en las células SNB19, de nuevo correlacionándose con su capacidad citolítica. Tanto FMT como CRJ produjeron progenie con cinética similar y con cantidades de virus producidos equivalentes cuando se ensayaron en células NCI H226. FMT parecía replicarse a títulos más altos que CRJ en células SNB19, aunque ambos claramente produjeron suficiente progenie para producir la destrucción rápida de esta línea celular susceptible (Fig. 1). MRB produjo virus con cinética igual o más rápida que las otras 3 cepas, y a un título mucho más alto que los otros virus tanto en células SNB19 como NCI H226.

El virus MRB demostró buena actividad citolítica contra líneas tumorales, producción de virus rápida, y gran número de virus producidos. Estas son todas propiedades que contribuyen a una buena actividad oncolítica. Se seleccionó Maraba como virus oncolítico para desarrollar adicionalmente.

Virus Maraba. Como preludio a manipular genéticamente el virus Maraba, se empleó un enfoque de “secuenciación aleatoria” para obtener la secuencia genómica de longitud completa para esta cepa. Se realizó análisis filogenético posterior alineando la secuencia de aminoácidos de la proteína L de Maraba con miembros de los 6 géneros conocidos de la familia de rhabdovirus (Fig. 2A). El virus tiene la estructura genómica esperada común a otros rhabdovirus, con 5 cistrones distintos separados por secuencias de parada/inicio transcripcional responsables para delinear los genes N, P, M, G y L del virus (Fig. 2B).

Mutantes de virus Maraba manipulados muestran selectividad de células cancerosas mejorada. Se clonó la secuencia antigenómica de longitud completa en un vector dirigido por el promotor de T7 y los genes N, P y L en construcciones de expresión dirigidas por el promotor de CMV. Esta estrategia se ha usado con éxito para desarrollar sistemas genéticos inversos para varios virus de ARN de hebra negativa (Schnell et al., 1994; Whelan et al., 1995; Lawson et al., 1995; Nakaya et al., 2001). El virus resultante se rescató por transfección de la construcción del genoma, plásmidos de N, P y L en células A549 previamente infectadas con virus vaccinia que expresa la polimerasa de T7 y se llamó rMaraba WT (Maraba recombinante de tipo salvaje).

Los inventores introdujeron mutaciones para mejorar las propiedades de destrucción selectiva de tumores del virus maraba de tipo salvaje. Los inventores habían demostrado previamente que una deleción de metionina 51 en la proteína M de VSV hacía el virus deficiente para bloquear la respuesta de interferón en células infectadas (Stojdl et al., 2003). Similarmente, los inventores habían mostrado que una doble mutación en la proteína M de VSV en los aminoácidos V221F y S226R también hacía el virus incapaz de bloquear el transporte nuclear citoplásmico de ARNm de huésped y permitía de esta manera que la célula huésped propagara una respuesta de IFN (Stojdl et al., 2003). Considerando que la cepa Glasgow de VSV también tiene una variación S226R en su proteína de matriz, se hipotetizó que el fenotipo atenuante para el doble mutante V221F S226R puede surgir de la mutación V221F sola. Por tanto, los inventores construyeron y rescataron el virus recombinante Maraba ΔM51, y una cepa mutante de Maraba V221Y como posibles variantes atenuadas (Fig. 2B).

Dos otras mutaciones al parecer mejoraron la replicación de VSV en células BHK-21 (proteína M L123W y proteína L H242R) (Sanjuan et al., 2004). Al alinear la secuencia de Maraba con VSV, la mutación correspondiente es L123W y Q242R en la secuencia de Maraba de las proteínas M y L, respectivamente. Se construyeron virus Maraba recombinantes con las mutaciones individuales de la proteína M L123W o la proteína G Q242R, o ambas L123W y Q242R (de aquí en adelante denominada Maraba DM) (Fig. 2B).

Se probó la citotoxidad de rMaraba WT y las cepas mutantes en fibroblastos de piel humanos primarios (células GM38) para detectar y cuantificar cualquier atenuación resultante de las mutaciones manipuladas (Fig. 2C). El virus maraba ΔM51 está atenuado en estas células primarias (CE50 >> 10 MOI) comparado con rMaraba WT (CE50 = 0,01 MOI). El V221Y también estaba atenuado, aunque a un nivel ligeramente menor que ΔM51 (CE50 = 3 MOI). Sorprendentemente, los mutantes tanto L123W como Q242R también estaban muy atenuados (CE50 = 3 MOI). Además, el doble mutante que combina las mutaciones L123W y Q242R estaba igualmente atenuado comparado con los mutantes individuales, produciendo un aumento de 100 veces en la CE50 después de 72 horas de infección de fibroblastos humanos primarios (CE50 = 3 MOI). Estos resultados eran sorprendentes dado que se esperaba que

ambas mutaciones mejoraran la replicación, no atenuaran el virus. Estos fenotipos se correlacionaban con la formación de placas también. Después de la infección de fibroblastos de GM38, placas pequeñas pero detectables se hicieron visibles una semana después de la infección con rMaraba WT. Sin embargo, no eran visibles placas durante el mismo intervalo de tiempo para los varios mutantes individuales de Maraba o Maraba DM. Esto demostró de nuevo la naturaleza severamente atenuada de V221Y, L123W y Maraba DM en fibroblastos primarios normales. En contraste, se formaron grandes placas en una línea tumoral (SNB19) después de solo 24 horas de infección con rMaraba WT, V221Y, L123W o Maraba DM (Fig. 2D). Sin embargo, el mutante Q242R produjo placas más pequeñas comparado con las otras cepas, lo que sugiere que esta mutación puede alterar ligeramente la replicación de esta cepa en células tumorales también. De forma interesante, sin embargo, el doble mutante, que contiene la mutación Q242R, claramente no demostró tal alteración en células malignas (Fig. 2D).

En contraste con esta observación en fibroblastos normales, todas las cepas mutantes permanecieron altamente líticas cuando se ensayaron en un panel de líneas celulares malignas (Fig. 2E). Después de 48 horas de exposición a virus, se cuantificó la capacidad lítica de las varias cepas usando colorante vital azul alamar (Fig. 2E). La cepa L123W parecía ser tan citolítica como rMaraba WT en células tumorales y por tanto demostró un índice terapéutico in vitro mejorado comparado con la cepa WT. Maraba Q242R era muy citolítico en las tres líneas tumorales, aunque parecía ser menos citolítico que su cepa parental rMaraba WT; en línea con las observaciones del tamaño de placa. Sin embargo, el doble mutante demostró una inversión interesante de este fenotipo ya que no mostró alteración en la citotoxicidad debido a la mutación Q242R que tiene. De hecho, Maraba DM consistentemente parecía ser la cepa más lítica en líneas de células cancerosas (Fig. 2E), incluso más citolítica que el WT parental. Parece que la combinación de L123W y Q242R da lugar a una cepa de Maraba que es selectivamente hipervirulenta solo en células cancerosa, aunque permanece atenuada en fibroblastos normales. Esto también era evidente cuando se ensayó la producción de proteína vírica a lo largo del tiempo en células de carcinoma ovárico humano OVCAR4 (Fig. 2F). Las cepas rMaraba WT y L123W mostraron inducción de proteína vírica rápida, mientras que el mutante Q242R se quedaba retrasado. Aquí de nuevo el Maraba doble mutante Q242R L123W no mostró alteración en cinética de proteína vírica.

Los mutantes de Maraba son variablemente defectuosos en bloquear las respuestas anti víricas de IFN del huésped. Habiendo establecido varias cepas mutantes de Maraba como que están selectivamente atenuadas en fibroblastos primarios normales, los inventores buscaron entender si esta atenuación era debida a defectos en el bloqueo inmunitario innato. Por ejemplo, se había mostrado previamente que las mutaciones ΔM51 y V221 en VSV hacen el virus incapaz de bloquear el transporte de ARNm nuclear/citoplásmico, inhibiendo de esta manera la cascada transcripcional de IFN del huésped. Cuando células PC3 se infectaron con control o se infectaron con rMaraba WT, los inventores no pudieron detectar producción de IFN, consistente con la capacidad del virus parental de bloquear respuestas inmunitarias innatas (Fig. 3A). Como se esperaba, los mutantes ΔM51 y V221Y mostraron defectos en la capacidad de bloquear la producción de IFN medida en un bioensayo (Fig. 3B). De forma interesante, el mutante L123W también demostró un defecto en su capacidad de bloquear la producción de IFN a una magnitud similar que el mutante V221Y (Fig. 3B). Sin embargo, el mutante Q242R era similar al virus WT en su capacidad para bloquear la producción de citoquinas en células PC3, concluyendo de esta manera que este mutante no tiene defecto en el bloqueo de IFN. Por tanto, la profunda atenuación del mutante Q242R, parece no estar relacionada con las respuestas de IFN del huésped. Cuando se combinan las dos mutaciones individuales en la variante Maraba DM, el virus resultante era indistinguible del mutante individual L123W (Fig. 3B). Además, se observó que el transporte del ARNm de interferón beta del compartimento nuclear al citoplasma se bloqueaba después de la infección con Maraba WT o el mutante Q242R (Fig. 3C). Estos resultados, son consistentes con artículos previos que indican que ciertos virus dependen de sus proteínas de matriz para inhibir la cascada transcripcional de IFN por varios mecanismos incluyendo bloquear el transporte del ARNm al citoplasma (Ferran y Lucas-Lenard, 1997; Terstegen et al., 2001; Stojdl et al., 2003). Estos resultados indican que el virus Maraba emplea la misma estrategia. En contraste, Maraba ΔM51, la cepa L123W y Maraba DM mostraron todos una “fuga” de ARNm de IFN beta detectable en el citoplasma después de la infección del virus, y esta deficiencia en el bloqueo de ARNm se correlacionaba con la capacidad de los virus para bloquear las respuestas de IFN medidas en el bioensayo (Fig. 2B).

Maraba DM es menos tóxico in vivo. Se determinaron la DL50 y la dosis tolerable máxima (DTM) para Maraba WT y varias cepas atenuadas. Puesto que la vía de administración terapéutica deseada para tratar tumores diseminados es administración intravenosa, se trataron ratones en un intervalo de dosis por vía intravenosa con virus WT o dos cepas mutantes. Los inventores observaron que el virus Maraba se tolera bien después de la inyección intravenosa en ratones Balb/C. Como se predijo de los datos in vivo (Fig. 2C), Maraba DM tiene una DTM 2 log mayor que el Maraba WT parental (tabla 5). Los animales que recibieron dosis letales de WT, V221Y o DM muestran signos de infección del SNC y tenían títulos significativos del virus en sus cerebros (datos no mostrados). A dosis por debajo de la DTM, los ratones generalmente mostraron pérdida de peso transitoria, deshidratación, piloerección consistente con una infección vírica. Estos síntomas se resolvieron en 3-4 días tras la infección y no se detectó virus en los cerebros de estos ratones sacrificados el día 12 tras la infección.

Tabla 5. Toxicidad de dosis única intravenosa de cepas de virus rMaraba. a dosis única DL50 ensayada en ratones Balb/C (hembras de 5-8 semanas de edad) y calculada usando el método de Spearman Karber. b La dosis tolerable máxima (DTM) es igual a la dosis mayor que no produce morbilidad durable medido por comportamiento y peso Intravenoso DL50a (LOG10) DTMb

(LOG10)

rMaraba

8,45 7

rMaraba DM

9,45 9

rMaraba V221Y

9,5 9

a Dosis única DL50 ensayada en ratones Balb/C (hembras de 5-8 semanas de edad) y calculada usando el método de Spearman Karber. b La dosis tolerable máxima (DTM) es igual a la dosis mayor que no produce morbilidad durable medido por comportamiento y peso.

Maraba DM es eficaz en modelos tumorales singénicos y de xenoinjerto. Los inventores buscaron determinar si Maraba DM es eficaz en modelos de ratón in vivo de cáncer. Se manipularon cepas de Maraba DM para expresar GFP o luciferasa de luciérnaga y se examinó su replicación en tumores CT26 subcutáneos después de la administración sistémica. Los inventores observaron que el virus Maraba DM se administraba a lechos tumorales y se replicaba en tejido tumoral usando tanto imagenología bioluminiscente en animales enteros, como microscopía fluorescente en explantes de tumor (Fig. 4A(i)). A continuación, se examinó la eficacia de Maraba DM en un modelo de tumor subcutáneo CT26 bilateral (Fig. 4A(ii) y (iii)). Específicamente, se trataron animales con tumores bilaterales que alcanzaban un tamaño de 10-600 mm3 por vía intravenosa con Maraba DM tres veces a la semana durante 2 semanas. Cinco días después del primer tratamiento, los animales control tratados con solución salina alcanzaron el punto final con tumores que alcanzaban un tamaño de 750 mm3 o mayor. Sin embargo, los animales que recibieron 6 dosis sistémicas de Maraba DM respondieron al tratamiento con regresión tumoral completa el día 35, lo que produce curas durables en el 100% de los animales (Fig. 4A(ii) y (iii)). Por último, el tratamiento intravenoso con Maraba DM se toleró bien en los animales, sin mortalidad y con morbilidad mínima. Se observaron piloerección, deshidratación moderada y pérdida de peso transitoria (Fig. 4A(iv)), pero todo se resolvió en 2 semanas del primer tratamiento.

Los inventores también buscaron determinar la utilidad de Maraba DM para reducir la carga tumoral en un modelo de enfermedad diseminada. Por tanto, se inyectaron células CT-26 por vía intravenosa en ratones Balb/C para inducir tumores pulmonares diseminados. Mientras que los animales tratados con solución salina (PBS) y Carajas muestran una carga tumoral masiva, los animales Maraba DM muestran poca o ninguna carga tumoral y muestran un fenotipo pulmonar normal (Fig. 4B(i)). Además, Maraba DM también produjo una prolongación significativa en supervivencia cuando se administró sistémicamente tres veces a la semana durante dos semanas (Fig. 4B(ii)). Estos datos son consistentes con la observación en el modelo subcutáneo y demuestran además la potencia de Maraba DM para tratar eficazmente un modelo tumoral singénico subcutáneo o diseminado agresivo.

Para complementar estos estudios de eficacia vírica en animales inmunocompetentes, se probó Maraba DM usando un modelo de xenoinjerto ovárico ES-2 humano bioluminiscente. Incluso a dosis muy bajas (1 x 104 ufp), los animales tratados con Maraba DM tuvieron una disminución significativa en la carga tumoral (Fig. 4C(i-iii)). En contraste, los ratones tratados control rápidamente desarrollaron ascitis con carga tumoral creciente hasta alcanzar el punto final. El tratamiento sistémico de ratones que tienen el tumor ES2 usando dosis bajas y altas de virus demostró una respuesta tumoral dependiente de la dosis (Fig. 4C(i-ii)). Los inventores probaron Maraba DM frente a una cepa de virus oncolítico previamente desarrollada (VSV ΔM51), y a ambos niveles de dosis Maraba DM mostró eficacia superior a VSV ΔM51.

B. Materiales y Métodos

Líneas celulares. Carcinoma de pulmón A549 humano, carcinoma cervical HeLa, carcinoma de colon CT26 murino (Americcan Type Tissue Collection), fibroblastos primarios GM38 humanos (National Institute of General Medical Sciences Mutant Cell Repository, Camden, NJ) y líneas celulares del panel de células NCI 60 del Developmental Therapuetics Program, National Cancer Institute (Bethesda, MD), se propagaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Hyclone, Logan, UT) suplementado con suero fetal de ternera al 10% (Cansera, Etobicoke, Ontario, Canadá).

Cribado de citotoxicidad in vitro. Las células del panel de células NCI 60 se sembraron en placas de 96 pocillos a una confluencia del 90%. Estas células se infectaron a diluciones logarítmicas con varios rhabdovirus, como se indica. Después de 96 horas tras la infección, las monocapas se lavaron, fijaron y tiñeron con solución de violeta cristal al 1%. Las monocapas teñidas se solubilizaron posteriormente en SDS al 1% en agua para crear lisados homogéneos. Se leyó la absorbancia a 595 nm para puntuar para células viables.

Curvas de crecimiento de un solo paso. Se infectaron células NC1226 y SNB19 con los virus indicados a una multiplicidad de infección de 5 ufp/célula durante 1 hora. Las células se lavaron después con PBS y se incubaron a 37ºC. Se tomaron alícuotas (100 µl) en el momento del punto temporal de 0, 4, 8, 12, 16, 24, 48 y 72 horas y se titularon con células Vero.

Secuenciación y clonación de rhabdovirus Maraba. Se amplificó el rhabdovirus Maraba en células Vero y el ARN se aisló de virus purificado por técnicas estándar (Trizol + RNAeasy®, Invitrogen). Con la excepción de los extremos terminales 5’ y 3’, la secuencia del virus se obtuvo usando el kit de clonación mRNA Complete (Invitrogen). Se completó la secuenciación de los extremos 3’ y 5’ después de la ligación mediada por ARN ligasa de T4 de

cebadores de ADN de T7 a cada extremo seguido por RT-PCR y clonación en pCR2.1-TOPO® (Invitrogen). El ADNc vírico se amplificó en una única reacción de RT-PCR (dando un fragmento > 11 kpb) y se clonó en un vector LC-KAN modificado (Lucigen Corporation) que lleva un promotor de T7 antes de la secuencia líder 5’ antigenómica e inmediatamente después del terminador 3’ una ribozima HDV modificada y una secuencia señal de terminación de la polimerasa de T7.

Análisis filogenético. Las relaciones filogenéticas entre rhabdovirus se basó en un alineamiento Muscle de las secuencias de aminoácidos de la proteína L, y usando la cepa Edmonston del paramixovirus del sarampión como grupo externo. El árbol se generó por el método de unión de vecinos y los valores de remuestreo (indicado para cada nódulo de rama) se estimaron usando 1000 réplicas de árbol. Las longitudes de las ramas son proporcionales a las distancias genéticas. La barra de escala corresponde a sustituciones por sitio de aminoácido.

Sistema de rescate de Maraba recombinante. Células de carcinoma de pulmón A549 sembradas a 3,0 x 105 células por pocillo en placas de 6 pocillos se infectaron 24 h después a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 con virus vaccinia que expresa la ARN polimerasa de T7 en medio OptiMem durante 1,5 horas. Después de la eliminación del virus vaccinia, cada pocillo se transfectó con LC-KAN Maraba (2 µg) junto con construcciones pCIneo que codifican Maraba N (1 µg), P (1,25 µg) y L (0,25 µg) con lipofectamina 2000 (5 µl por pocillo) según las instrucciones del fabricante. El reactivo de transfección se eliminó 5 h después y se sustituyó con DMEM que contenía SBF al 10%. 48 h después de la transfección, el medio se recogió (agrupado de 2 placas), se filtró (0,2 µm) para eliminar el virus vaccinia contaminante y se usó 1 ml para infectar células de glioblastoma SNB-19 en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Los efectos citopáticos visibles 24-48 h después eran indicativos de un rescate exitoso, que se confirmó purificando ARN vírico y RT-PCR con cebadores específicos de Maraba. Todos los virus experimentaron 3 rondas de purificación en placa (en células SNB-19), antes del aumento a escala, purificación en colchón de sacarosa y resuspensión en PBS que contenía glucosa al 15%.

Mutagénesis y variantes de Maraba. Se usaron cebadores mutagénicos fosforilados únicos (45-55 pb) con la enzima de alta fidelidad Phusion (NEB) para crear el panel de mutantes LC-KAN Maraba descritos en el presente documento. Brevemente, se llevó a cabo una reacción de PCR con 100 ng de cebador mutagénico y 100 ng de molde de ADN con adición de inicio en caliente de la enzima (98ºC – 2 min, 80ºC mantenido – añadir la enzima) y ajuste de PCR típico (98ºC – 10 s, 55ºC – 30 s, 72ºC durante 7 min para 30 ciclos). Se añadió dimetilsulfóxido (DMSO) en el intervalo del 0 al 6% en aumentos del 2%. El plásmido parental se digirió con Dpn I (NEB) (37ºC durante 1 h) y se usaron 4 µl de los 25 µl de la mezcla de PCR digeridos con Dpn I para transformar células competentes TOP-10® (Invitrogen). Los clones positivos se cribaron para la introducción de cambios en sitios de restricción cambio no codificante (añadir o eliminar) seguido por secuenciación. Los diferentes mutantes atenuados descritos aquí incluyen la deleción de Met-51 en la proteína M (ΔM51), Leu-123 a Trp en la proteína M (L123W), Val221 a Tyr en la proteína M (V211Y), Gln-242 a Arg en la proteína G (Q242R) y el doble mutante Leu-123 a Trp en la proteína M y Gln-242 a Arg en la proteína G (Maraba DM).

Ensayos de viabilidad. Se sembraron las líneas celulares indicadas a una densidad de 10.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos. Al día siguiente las células se infectaron con los virus indicados a varias multiplicidades de infección (0,0001-10 ufp/célula). Después de una incubación de 48 horas se añadió azul alamar (sal sódica de resazurina (Sigma-Aldrich)) a una concentración final de 20 µg/ml. Después de una incubación de 6 horas se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 573 nm.

Ensayos de placa. Se sembraron células Vero a una densidad de 5x105 células por pocillo de una placa de 6 pocillos. Al día siguiente se prepararon 100 µl de diluciones de virus en serie y se añadieron durante 1 hora a las células Vero. Después de la adsorción vírica, se añadieron 2 ml de capa superior de agarosa (agarosa al 1%:DMEM 2X y SFT al 20% 1:1). Las placas se contaron al día siguiente.

Bioensayos de interferón. Se infectaron células PC-3 con rMaraba WT, ΔM51, V221Y, L123W, Q242R o Maraba DM a una multiplicidad de infección de 3 ufp/célula durante 24 horas. Al día siguiente el sobrenadante se neutralizó con ácido con HCl 0,25 N durante la noche a 4ºC seguido por la adición de NaOH 0,25 para ajustar el pH a 7. Se incubaron células Vero con el sobrenadante neutralizado durante 24 horas y posteriormente se infectaron con rMaraba WT con una multiplicidad de infección que variaba desde 0,0001 a 100 ufp/célula. Cualquier interferón secretado por las células PC-3 en respuesta a Maraba o los mutantes atenuados protegería posteriormente a las células Vero de infección con Maraba. Después de 24 horas, se cuantificó la supervivencia usando un ensayo de violeta cristal. Brevemente, las células se incubaron con solución de violeta cristal al 1%, se lavaron, secaron, resuspendieron en SDS al 1% y se leyeron a una longitud de onda de 595 nm.

RT-PCR cuantitativa para detectar interferón nuclear y citoplásmico. Se separó el ARN nuclear y citoplásmico como se ha descrito previamente. Brevemente, células OVCAR4 bien tratadas control o infectadas con Muraba, ΔM51, L123W, Q242 o Maraba DM se recogieron en PBS, se precipitaron y resuspendieron en 200 µl de tampón de lisis (Tris 25 mM [pH 7,4], NaCl 15 mM, MgCl2 12,5 mM, sacarosa al 5% y NP-40 al 1%). Los lisados se incubaron a 4ºC durante 10 min con agitación ocasional con el vórtex. Los núcleos se recogieron por centrifugación a 1000 × g durante 3 min. El sobrenadante (fracción citoplásmica) se recogió mientras que la fracción nuclear se lavó una vez con 250 µl de tampón de lisis seguido por extracción de ARN total usando el kit RNeasy de Qiagen (según las

instrucciones del fabricante; Qiagen). Se realizó QRTPCR del ARNm de IFN-beta usando el kit de RT-PCR Quantitect SYBR Green de Qiagen con cebadores previamente descritos. Se ensayó el IFN-beta de las fracciones nuclear y citoplásmica y se normalizó al ARNm de HPRT del mismo compartimento. Los valores normalizados se normalizaron de nuevo respecto a valores de fracciones nuclear y citoplásmica sin infectar respectivamente, para determinar los valores de inducción en veces en cada compartimento, después de la infección con el virus. Los valores representados indican la proporción de inducción de ARNm normalizado de los compartimentos citoplásmico a nuclear. Todos los valores de QPCR se calcularon usando el método de delta CT.

Determinación de la toxicidad in vivo. Se inyectaron grupos de 3-5 ratones Balb/C (6-8 semanas de edad) una vez por vía intravenosa en aumentos semilogarítmicos de virus que varían de 3x106 ufp-3x109 ufp. Los animales se siguieron para signos de dolor incluyendo pérdida de peso, morbilidad, piloerección, parálisis de las extremidades posteriores y insuficiencia respiratoria.

Modelo tumoral subcutáneo bilateral. Se inyectaron células de cáncer de colon CT26 murino (3x105) en los flancos izquierdo y derecho de ratones Balb/C de 6-8 semanas de edad. Se dejó que los tumores crecieran hasta un tamaño de 10-600 mm3 seguido por 6 inyecciones intravenosas totales (tres veces a la semana) de 51 VSV o MR-SDM a una dosis de 5x108 ufp. Los tumores se midieron dos veces a la semana después de la inyección inicial. Los animales se siguieron para piloerección, pérdida de peso, morbilidad, parálisis de las patas traseras e insuficiencia respiratoria. Cuando la carga tumoral superó un tamaño de 750 mm3 los animales se sacrificaron. Se usó la siguiente fórmula para calcular el volumen del tumor (L x W2)/2.

Imagenología del virus Maraba DM en un modelo tumoral subcutáneo. Maraba DM se adaptó para imagenología fluorescente o bioluminiscente introduciendo genéticamente eGFP o luciferasa de luciérnaga (FLUC) respectivamente. Se inyectaron DM-GFP y DM-FLUC IV (1x108) en animales Balb/C que tenían tumores CT-26 subcutáneos. Veinticuatro horas después de la infección los animales infectados con DM-GFP se sacrificaron y sus tumores se extrajeron y sometieron a imagenología con un microscopio fluorescente Nikon. Los animales infectados con DM-FLUC se inyectaron con luciferina y se sometieron a imagenología viva usando el sistema IVIS Xenogen

200.

Modelo de tumor pulmonar CT-26. Se establecieron tumores pulmonares por una única inyección intravenosa de 3x105 células de cáncer de colon CT-26 en animales Balb/C de 6-8 semanas de edad. Generalmente los ratones desarrollan insuficiencia respiratoria grave, piloerección y fenotipo encorvado el día 16-18 punto en el que se sacrifican. Los ratones se trataron IV con PBS, carajas, o Maraba DM (5x108 ufp) el día 10, 12 y 14, 17, 19 y 21. Algunos animales se sacrificaron el día 17 y se capturaron imágenes en un microscopio de disección Nikon. Los animales restantes se siguieron para supervivencia.

Modelo de xenoinjerto ovárico. Células ES-2 ováricas humanas se adaptaron para imagenología bioluminiscente momento en el que se inyectaron 1x106 células ES-2 por vía intraperitoneal en ratones desnudos CD-1 atímicos de 6-8 semanas de edad. Los animales CD-1 sin tratar desarrollaron ascitis aproximadamente el día 15-17. Se realizaron inyecciones intraperitoneales e intravenosas (vena de la cola) los días 8, 9, 12, 14 y 16 con 1x104-1x107 ufp de Maraba DM o VSV ΔM51. Se capturaron imágenes tumorales con un sistema Xenogen 200 IVIS (Caliper Ls, EE UU).

Estadística. Para las determinaciones del tamaño de placa, se realizó ANOVA unívoco usando la prueba de comparación múltiple de Bonferroni para derivar un valor P (Graphpad Prism). Para las gráficas de Kaplan Meier, se compararon gráficos de supervivencia usando el análisis del orden logarítmico de Mantel-Cox (Graphpad Prism).

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35 Lista de secuencias

<110> BELL, JOHN STOJDL, DAVID

40 <120> RHABDOVIRUS ONCOLÍTICO

<130> KIRN: 012WO

<140> DESCONOCIDO 45 <141>

<150> 61/285.461

<151>

50 <160> 29

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1 55 <211> 11068

<212> ADN

<213> Virus Maraba

<400> 1

<210> 2

<211> 422

<212> PRT

<213> Virus Maraba N

<400> 2

<210> 3

<211> 265

<212> PRT

<213> Virus Maraba P

<400> 3

<210> 4

<211> 229

<212> PRT

<213> Virus Maraba M

<400> 4

5 <210> 5

<211> 512

<212> PRT

<213> Virus Maraba G

10 <400> 5

<210> 6

<211> 2109

<212> PRT

<213> Virus Maraba L

<400> 6

<210> 7

<211> 10716

<212> ADN

<213> Virus Carajas

<400> 7

<210> 8

<211> 442

<212> PRT

<213> Virus Carajas N

<400> 8

<210> 9

<211> 261

<212> PRT

<213> Virus Carajas P

<400> 9

<210> 10

<211> 228

<212> PRT

<213> Virus Carajas M

<400> 10

<210> 11

<211> 519

<212> PRT

<213> Virus Carajas G

<400> 11

<210> 12

<211> 2109

<212> PRT

<213> Virus Carajas L

<400> 12

<210> 13

<211> 12416

<212> ADN

<213> Bahía grande

<400> 13

<210> 14

<211> 513

<212> PRT

<213> Bahía Grande N

<400> 14

<210> 15

<211> 353

<212> PRT

<213> Bahía Grande P

<400> 15

<210> 16

<213> Bahía Grande M

<220>

<221>

característica mezcla 10 <222> (160)…(160)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<400> 16

<210> 17

<211> 591

<212> PRT

<213> Bahía Grande G

<400> 17

<210> 18

<211> 2175

<212> PRT

<213> Bahía Grande L

<400> 18

<210> 19

<211> 519

<212> PRT

<213> Isf-VSV G quimérica

<400> 19

<210> 20

<211> 1662

<212> ADN

<213> Proteína G de Maraba

<400> 20

<210> 21

<213> Proteína G del virus Muir Spring

<220>

<221>

característica mezcla 10 <222> (384)…(384)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221>

característica mezcla 15 <222> (386)…(386)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221>

característica mezcla 20 <222> (389)…(390)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<400> 21

<210> 22

<211> 2248

<212> ADN

<213> Proteína G del virus Muir Spring

<400> 22

<210> 23

<211> 1948

<212> ADN

<213> Proteína g de VSV

<400> 23

<210> 24

<211> 2031

<212> ADN

<213> PROTEÍNA G DE ÉBOLA

<400> 24

<210> 25

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador sintético 10

<400> 25

<212> PRT

<213> Proteína G de Isfahán

<210> 27

<211> 530

<212> PRT

<213> Proteína G de Chandipura

<400> 27

<210> 28

<211> 611

<212> PRT

<213> Proteína G del retrovirus de ovejas Jaagsietke

<400> 28

<210> 29

<211> 6 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Péptido sintético 10

<220>

<221> característica mezcla

<222> (5)…(5)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido natural 15

<400> 29

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un rhabdovirus oncolítico que comprende:

   una proteína M que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un triptófano en la posición correspondiente a la posición 123 de SEQ ID NO: 4, y una proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5,

   o

   una proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una arginina en la posición correspondiente a la posición 242 de SEQ ID NO: 5 y una proteína M que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un triptófano en la posición correspondiente a la posición 123 de SEQ ID NO: 4.

2. 2.

   El rhabdovirus de la reivindicación 1, en donde la proteína G tiene una secuencia de aminoácidos que es el 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 excepto por una arginina en la posición correspondiente a la posición 242 de SEQ ID NO: 5, y en donde la proteína M tiene una secuencia de aminoácidos que es el 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 excepto por un triptófano en la posición correspondiente a la posición 123 de SEQ ID NO: 4.

3. 3.

   Un rhabdovirus oncolítico aislado para uso en destruir una célula hiperproliferativa, el rhabdovirus codifica:

   una proteína M que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un triptófano en la posición correspondiente a la posición 123 de SEQ ID NO: 4, y una proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5,

   o

   una proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una arginina en la posición correspondiente a la posición 242 de SEQ ID NO: 5 y una proteína M que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un triptófano en la posición correspondiente a la posición 123 de SEQ ID NO: 4.

4. 4.

   El rhabdovirus para uso según la reivindicación 3, en donde la célula está comprendida en un paciente.

5. 5.

   El rhabdovirus para uso según la reivindicación 4, en donde la célula es una célula cancerosa.

6. 6.

   El rhabdovirus para uso según la reivindicación 5, en donde la célula cancerosa es una célula cancerosa metastásica.

7. 7.

   El rhabdovirus para uso según la reivindicación 4, en donde el rhabdovirus oncolítico se formula para administración al paciente.

8. 8.

   El rhabdovirus para uso según la reivindicación 7, en donde el rhabdovirus oncolítico se formula para administración por administración intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intradérmica, intratumoral, subcutánea, o intranasal.

9. 9.

   El rhabdovirus para uso según la reivindicación 3, en donde el rhabdovirus es para destruir la célula hiperproliferativa junto con una segunda terapia anticáncer.

10. 10.

    El rhabdovirus para uso según la reivindicación 9, en donde la segunda terapia anticáncer es un segundo virus oncolítico.

11. 11.

    El rhabdovirus para uso según la reivindicación 10, en donde el segundo virus oncolítico es un vaccinia, herpes, sarampión, enfermedad de Newcastle, adenovirus, alfavirus, parvovirus o rhabdovirus.

12. 12.

    El rhabdovirus para uso según la reivindicación 11, en donde el segundo agente anticáncer es un segundo rhabdovirus oncolítico.

13. 13.

    El rhabdovirus para uso según la reivindicación 12, en donde el segundo rhabdovirus oncolítico es virus de la estomatitis vesicular (VSV), virus Carajas, virus Chandipura, Virus Cocal, virus Isfahán, virus Piry, virus de la

    estomatitis vesicular Alagoas, virus BeAn 157575, virus Boteke, virus Calchaqui, virus de anguilas americano, virus Gray Lodge, virus Jurona, virus Klamath, virus Kwatta, virus La Joya, virus Malpais Spring, virus de murciélago Mount Elgon, virus Perinet, virus Tupaia, Farmington, virus Bahía Grande, virus Muir Springs, virus Reed Ranch, virus Hart Park, virus Flanders, virus Kamese, virus Mosqueiro, virus Mossuril, virus Barur, virus Fukuoka, virus Kern Canyon, virus Nkolbisson, virus Le Dantec, virus Keuraliba, virus Connecticut, virus New Minto, virus Sawgrass, virus Chaco, virus Sena Madureira, virus Timbo, virus Almpiwar, virus Aruac, virus Bangoran, virus Bimbo, virus Bivens Arm, virus del cangrejo azul, virus Charleville, virus Coastal Plains, virus DakArK 7292, virus Entamoeba, virus Garba, virus Gossas, virus Humpty Doo, virus Joinjakaka, virus Kannamangalam, virus Kolongo, virus Koolpinyah, virus Kotonkon, virus Landjia, virus Manitoba, virus Marco, virus Nasoule, virus Navarro, virus Ngaingan, virus Oak-Vale, virus Obodhiang, virus Oita, virus Ouango, virus Parry Creek, virus de cíclidos de Rio Grande, virus Sandjimba, virus Sigma, virus Sripur, virus Sweetwater Branch, virus Tibrogargan, virus Xiburema, virus Yata, Rhode Island, virus del rio Adelaida, virus Berrimah, virus Kimberley, o virus de la fiebre efímera de bovinos.

14. 14.

    El rhabdovirus para uso según la reivindicación 9, en donde la segunda terapia anticáncer es quimioterapéutica, radioterapéutica o inmunoterapéutica.

15. 15.

    Una composición que comprende un rhabdovirus oncolítico aislado que tiene un segmento de ácido nucleico que codifica:

    una proteína M que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un triptófano en la posición correspondiente a la posición 123 de SEQ ID NO: 4, y una proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5,

    o

    una proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una arginina en la posición correspondiente a la posición 242 de SEQ ID NO: 5 y una proteína M que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un triptófano en la posición correspondiente a la posición 123 de SEQ ID NO: 4.